(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法であって、
（１）２つの反応系のそれぞれにおいて鋳型用核酸及び該鋳型用核酸にハイブリダイズするプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程であって、
各反応系の鋳型用核酸が互いに対応する領域の塩基配列を含む同一起源の２つの異なる核酸分子に由来し、かつ
一方の反応系ではフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子を担持しており、他方の反応系ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持している前記核酸増幅工程、
（２）前記各反応系内で増幅した核酸断片を一本鎖に変性させる一本鎖調製工程、
（３）前記選択分子の有する特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する選択工程、
（４）前記各反応系で得られた一本鎖増幅核酸断片を混合する混合工程、
（５）前記異なる起源に由来する一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせて二本鎖核酸断片を形成させる二本鎖調製工程、及び
（６）ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する分離工程
を含む前記調製方法。
【請求項２】
ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法であって、
（１）異なる起源に由来し、かつ対応する領域の塩基配列を含む２つの鋳型用核酸、並びに該鋳型用核酸のそれぞれにハイブリダイズし、かつ一方のプライマー対ではフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子を担持しており、他方のプライマー対ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持している２対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程、
（２）増幅した核酸断片を一本鎖に変性させる一本鎖調製工程、
（３）前記選択分子の有する特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する選択工程、
（４）前記異なる起源に由来する一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせて二本鎖核酸断片を形成させる二本鎖調製工程、及び
（５）ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する分離工程
を含む前記調製方法。
【請求項３】
選択分子が磁性ビーズである、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片をアフィニティー分離法によって分離する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項５】
検出試薬がミスマッチ結合リガンドNC-link(MBL)又はミスマッチ修復酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記起源が同種のゲノムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
前記起源が同種の遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜７の調製方法によって得られたヘテロ二本鎖核酸断片の各鎖の塩基配列決定を行ない、該核酸断片間に存在する一塩基置換を同定する一塩基置換検出方法。
【請求項９】
２組のプライマー対及び検出試薬を包含する点突然変異検出用キットであって、
前記２組のプライマー対は、互いに対応する領域の塩基配列を含む同一又は異なる起源の２つの異なる鋳型用核酸に対してそれぞれハイブリダイズするように構成されており、かつ、２組のプライマー対のうち一方のプライマー対は、フォワード／リバースプライマーのいずれか一方が選択分子を担持しており、他方のプライマー対は、それとは逆方向のプライマーが選択分子を担持しており、さらに
前記検出試薬がミスマッチ結合リガンドNC-link(MBL)又はミスマッチ修復酵素である
前記キット。
【請求項１０】
選択分子が磁性ビーズである、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の核酸断片の混合物からミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を高効率に調製する方法、及び核酸塩基配列における一塩基置換を効率的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物種内における個体間のゲノム塩基配列中には様々な変異が存在する。その多くは、一塩基のみが置換した変異(一塩基置換)である。このような一塩基置換の中で生物種集団内において１％以上の頻度で存在する変異は、特に一塩基多型（SNPs：Single Nucleotide Polymorphisms）と呼ばれ、ヒトゲノムにおいては約１０００塩基に１つの割合で存在することが知られている。一塩基多型は、個々人の疾患易罹患性や薬剤反応性に関する情報を得る上で、またテーラーメイド医療の開発上においても有用なことから、近年、その解析が急がれている。
【０００３】
ところが、一塩基多型は、ゲノム塩基配列上に比較的ランダムに存在しているため、その探索は非常に困難である。従来、一塩基多型の探索には制限酵素断片長多型（RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism）法が利用されてきた（非特許文献１）。この方法は日覆い領域の分析が可能であるが、制限酵素部位と関連しない一塩基多型は検出できないという問題があった。一方、ある特定の領域に存在する一塩基多型を網羅的に探索するには、ポジショナルクローニングを行った後、該領域内の全ての塩基配列を決定し、変異部分を同定するという方法が用いられてきた（非特許文献２）。しかしながら、この方法は、一度に分析できる領域が狭いため、結果を得るまでに膨大な時間、労力、及びコストを要するという問題があった。
【０００４】
上記問題を解決するために、最近では、異種間の相補する一本鎖DNAどうし会合させたキメラ二本鎖DNA、すなわちヘテロ二本鎖DNA中に存在するミスマッチ塩基対を検出して一塩基多型を網羅的に探索するという新たな方法が開発されている（特許文献１、非特許文献３）。これは、同種２個体の同一遺伝子等を混合し、変性後にアニーリングさせることによって、個体間に存在する一塩基置換をミスマッチ塩基対として検出する手法である。ところが、この方法ではアニーリングの工程において目的とするヘテロ二本鎖DNA以外にも自身の相補鎖どうしが再アニーリングしてしまう。その結果、産物中に不要なホモ二本鎖DNAが必ず混在するという問題があった。このようなホモ二本鎖DNAの混入量は、理論的にはアニーリング後の産物の実に半分にも及ぶ。それ故、ホモ二本鎖DNAの混入は、一塩基置換の検出感度を低下させるばかりでなく、一塩基置換の誤同定の原因となる危険性を孕んでいる。しかしながら、このようなホモ及びヘテロ二本鎖DNA混合物から目的とするヘテロ二本鎖DNAのみを選択的に分離するには極めて煩雑な工程を経ねばならず、結果的にこの新たな網羅的一塩基多型方法も効率が良いとは言えない現状にあった。
【０００５】
【特許文献１】特許第３７０５９７５号
【非特許文献１】Wyman AR, White R., 1980, Proc Natl Acad Sci U S A. 77(11):6754-8
【非特許文献２】Clifford R, Edmonson M, Hu Y, Nguyen C, Scherpbier T, Buetow KH., 2000, Genome Res. 10(8):1259-65
【非特許文献３】Sando S, et al.，2000, Nucleic Acid Symp Ser, 44:119-120
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題を鑑み、ホモ及びヘテロ二本鎖核酸断片の混合物よりミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片のみを効率的に調製する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、２種類の核酸塩基配列間に存在する一塩基置換の位置、塩基を効率的に、及び／又は網羅的に検出する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、ヘテロ二本鎖間に存在する一塩基置換を効率的に、及び／又は網羅的に検出するための一塩基置換検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本願は以下の発明を提供する。
一の実施形態において、本発明は、（１）２つの反応系のそれぞれにおいて鋳型用核酸及び該鋳型用核酸にハイブリダイズするプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程であって、各反応系の鋳型用核酸が互いに対応する領域の塩基配列を含む同一起源の２つの異なる核酸分子に由来し、かつ一方の反応系ではフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子を担持しており、他方の反応系ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持している前記核酸増幅工程、（２）前記各反応系内で増幅した核酸断片を一本鎖に変性させる一本鎖調製工程、（３）前記選択分子の有する特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する選択工程、（４）前記各反応系で得られた一本鎖増幅核酸断片を混合する混合工程、（５）前記異なる起源に由来する一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせて二本鎖核酸断片を形成させる二本鎖調製工程、及び（６）ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する分離工程を含むミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法を提供する。
【００１０】
また、他の実施形態において、本発明は、（１）異なる起源に由来し、かつ対応する領域の塩基配列を含む２つの鋳型用核酸、並びに該鋳型用核酸のそれぞれにハイブリダイズし、かつ一方のプライマー対ではフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子を担持しており、他方のプライマー対ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持している２対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程、（２）増幅した核酸断片を一本鎖に変性させる一本鎖調製工程、（３）前記選択分子の有する特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する選択工程、（４）前記異なる起源に由来する一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせて二本鎖核酸断片を形成させる二本鎖調製工程、及び（５）ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する分離工程を含むミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法によって得られたヘテロ二本鎖核酸断片の各鎖の塩基配列決定を行ない、該核酸断片間に存在する一塩基置換を同定する一塩基置換検出方法を提供する。
【００１２】
そして、本発明は、前記ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法を用いる一塩基置換検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法によれば、ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片のみを高効率で調製することができる。
【００１４】
また、本発明の一塩基置換検出方法によれば、ヘテロ二本鎖間に存在する一塩基置換を効率的に、及び／又は網羅的に検出することができる。
【００１５】
さらに、本発明の一塩基置換検出用キットによれば、ヘテロ二本鎖間に存在する一塩基置換を効率的に、及び／又は網羅的に検出するためのキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜定義＞
本明細書で使用する以下の用語について、その定義を説明する。
【００１７】
「鋳型用核酸」とは、本工程で鋳型となる核酸分子である。本核酸分子は、通常、DNA（一本鎖を含む）である。例えば、ゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNA若しくはクロロプラストDNA、又はそれらの断片を含むDNAが該当する。より具体的な例として、鋳型用核酸には、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーが挙げられる。この他、鋳型用核酸は、mRNA、hnRNA、tRNA、rRNA、snRNA、又はそれらの断片を含むRNAとすることもできる。ただし、鋳型用核酸がRNAの場合には、逆転写反応により一旦cDNAに変換したものを最終的な鋳型用核酸として用いる。鋳型用核酸は、天然由来の配列（2種以上の異種生物に由来するキメラ配列を含む）有する核酸分子、前記天然由来の配列の全部若しくは一部ヌクレオチドが改変（例えば、遺伝子操作等による変異導入や官能基の付加）された核酸分子、前記天然由来の配列の全部若しくは一部に人工合成された塩基配列（例えば、マルチクローニング部位）を含む核酸分子、又はそれらの組み合わせであってもよい。鋳型用核酸の塩基配列の長さは、特に限定はしないが、60base〜5Mb(Mega base)の範囲内にあればよい。
【００１８】
「同一起源の核酸分子」とは、本明細書では源が共通する核酸分子をいう。「源が共通する」とは、例えば、限定はしないが、属、種、品種（亜種）、民族、年齢、性別、個体、疾患、遺伝子のような源となるカテゴリーが同一であることをいう。それ故、「同一起源の２つの異なる核酸分子」の具体例としては、同じ種に属する２つの異なるメンバー（例えば、個体）のゲノム、同一民族に属する２つの異なるメンバーのゲノム、同じ種に属する異なるメンバーの同種の遺伝子、又は同一個体内で、かつ互いに相同的な異なる遺伝子（すなわち、パラログ（paralog））等が挙げられる。
【００１９】
「対応する領域」とは、本発明において増幅すべき標的領域であり、前記同一起源の２つの異なる核酸分子に由来する鋳型用核酸間で互いに相同な領域をいう。例えば、同じ種に属する２つの異なる個体のゲノム間における同一領域、同じ種に属する２つの異なる個体の同種の遺伝子間における全領域若しくは共通する一部領域、又は同一個体内の２つの異なるパラログ間における全領域若しくは共通する一部領域が該当する。対応する領域の塩基配列の塩基長は、特に限定はしないが、30base〜5Mbの範囲内にあればよい。対応する領域は、プラスミド、ファージ等のベクター内に挿入されていてもよい。また、対応する領域の5’末端、及び／又は3’末端にタグ配列が付加されていてもよい。対応する領域の塩基配列は、目的とする一塩基置換を含み得る。
【００２０】
本発明で用いる場合、センス鎖／アンチセンス鎖とは、二本鎖核酸における一方の鎖をセンス鎖とした場合に、それと相補する鎖をアンチセンス鎖と呼称するが、通常は、本発明の実施者が前記対応する領域において5’側（上流側）と判断する側に5’末端を有する鎖をセンス鎖として処理すればよい。
【００２１】
「一塩基置換」とは、ある塩基配列において一のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換した変異である。例えば、一塩基多型（SNP：single nucleotide polymorphism）は、一塩基置換の典型である。
【００２２】
「プライマー」は、当該分野で使用される用語と同義である。本発明のプライマーは、DNA若しくはRNA、又はそれらの組み合わせから成るオリゴヌクレオチドで構成される。これらは、必要に応じてLNA（Locked Nucleic Acid）、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドのような人工核酸分子を含んでいてもよい。また、プライマーを構成する塩基のうち、核酸増幅反応におけるプライマー伸長を阻害しない任意の塩基を、適当な官能基(例えば、チオール基)で修飾することもできる。このようなプライマーは、当該分野の公知の技術により化学合成によって作製することができる。また、所望の塩基配列や修飾基を有するプライマーを核酸合成受託会社等に委託することも可能である。
【００２３】
各プライマーの塩基配列は、鋳型用核酸上の所望の核酸領域を増幅可能な位置にハイブリダイズする塩基配列であれば、特に限定はしない。いずれのプライマーも、融解温度（Tm）が核酸増幅反応におけるアニーリング温度よりも高くなるように、構成する塩基配列を選択することが好ましい。プライマーの塩基長は、鋳型用核酸にハイブリダイズする領域が少なくとも10〜50base、好ましくは15〜40base、より好ましくは20〜35baseであればよい。また、必要に応じて各プライマーは、5’側に、適当な長さ（5〜50base）の付加配列を有していてもよい。このような付加配列は、制限酵素部位を導入できる他、後述する選択分子や支持体を5’末端側に結合する際のスペーサー配列としても機能し得る。各プライマー対の間で増幅される塩基配列の長さは、検証する鋳型用核酸の種類、長さ、使用する核酸ポリメラーゼの種類等に応じて適宜定めればよい。好ましくは100base〜3kb(kiro base)、より好ましくは150base〜2kb、さらに好ましくは200base〜1.5kbの範囲内である。
【００２４】
また、プライマーは、例えば、増幅率若しくは特異性を高めるために、必要に応じて、例えば、Nestedプライマーのような多段階的プライマーを使用することもできる。このような巧妙なプライマーの使用は、後述する本発明の構成を逸脱しない範囲で、当業者に公知の技術範囲において、当業者によって適宜判断されればよい。
【００２５】
本発明のプライマーにおけるフォワード／リバースの表記は、前記対応する領域の塩基配列の方向性を基準とする。すなわち、フォワードとは、対応する領域のセンス鎖と同方向を意味し、リバースとは、対応する領域のアンチセンス鎖と同方向を意味する。前述のように異なる起源に由来する２つの鋳型用核酸間において、対応する領域のセンス鎖／アンチセンス鎖の方向性は同一である。それ故、両鋳型用核酸間におけるプライマーの方向性も同一となる。ここで、本発明のプライマーは、フォワード／リバースプライマーのいずれか一方が選択分子を担持していることを特徴としている。
【００２６】
「選択分子」とは、当該分子が有する特性を利用して特異的に選択することのできる分子をいう。ここでいう「分子」とは、担体、化合物又はそれらの組み合わせを含む。「担体」は、限定はしないが、磁性ビーズ、高分子多糖支持体（例えば、セファロース若しくはセファデックス）、シリカ、ガラス、金属(例えば、金、白金、銀)、プラスチック、セラミックス、ラテックス等を含む。担体の形状は、核酸増幅反応を阻害しない形状であればよい。ビーズのような球体粒子は、結合表面積が大きく、操作性も高いことから、担体の形状として特に好ましい。「化合物」は、蛍光色素（例えば、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC、TAMRA）、発光物質、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等を含む。また、ここでいう「特性」とは、選択分子に特有の性質であって、限定はしないが、例えば、磁力、比重、蛍光、発光、親和力等が含まれる。本発明で用いる選択分子は、核酸と直接的若しくは間接的に結合が可能であり、核酸増幅反応の変性温度及び／又は一本鎖調製工程における変性条件によって、その特性が失活、変性、切断、分解しないものであれば特に限定はしない。磁性ビーズは、上記変性温度や変性条件による磁力の低下がほとんどなく、後述する選択工程での選択操作性も容易であることから、本発明の選択分子として好ましい。
【００２７】
選択分子のプライマーへの担持、すなわち固相化の手段としては直接的又は間接的のいずれであってもよい。本発明における担持は、通常、不可逆的な結合、すなわち、一旦形成された後に逆反応によって解離しない結合、又はその解離が無視できる程度の結合が好ましい。このような不可逆的結合の例としては、官能基間の求核的付加反応、求核置換反応若しくは求電子置換反応といった化学反応による共有結合、又はビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジン間の結合のような高親和力による非共有結合が挙げられる。化学反応による共有結合は、例えば、直接的結合であれば、プライマーと選択分子をそれぞれ官能基で修飾しておき、両官能基間での化学反応による共有結合を形成させることによって達成できる。この場合、両官能基が共有結合を形成し得る組み合わせとなるようにする。このような組み合わせとしては、例えば、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とマレイミド基、アジド基とアセチレン基、アジド基とアミノ基、ヒドラジン基とケトン基、ヒドラジン基とアルデヒド基等が挙げられる。このような化学反応により共有結合を形成させる方法は、当業者には周知の技術である。例えば、PIERCE社マニュアルを参照されたい。プライマーに官能基を導入する場合、その場所は、プライマーのハイブリダイゼーションや伸長を阻害しない位置であればいずれであってもよい。例えば、5’末端及び／又は内部の塩基が挙げられる。このような官能基は、プライマー合成時にプライマーに導入することができる。一方、本発明による調製過程又は調製後等において、必要に応じて選択分子と核酸部分とを解離させたい場合には、本発明における担持を可逆的結合にすることもできる。この場合、選択分子とプライマーが、通常状態(例えば、本発明の各工程下)では、強固に結合しているが、特定の条件下で処理した場合（例えば、酸による処理）のみ解離するようにすればよい。あるいは、プライマーの前記スペーサー配列内に出現頻度の低い制限酵素（例えば、８塩基認識型制限酵素：AscI、FseI、NotI、SgfI、SrfI、SmiI、PmeI、PacI等）部位を導入しておき、調製後、当該制限酵素で処理して選択分子と増幅核酸産物とを切り離してもよい。選択分子は、プライマーのハイブリダイゼーションや伸長を阻害しない場所であれば、プライマー上の任意の部位に担持させることができる。好ましくは5’末端である。
【００２８】
＜実施形態１＞
本発明の第１の実施形態は、ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法に関する。本実施形態は、異なる起源に由来する対応する領域の塩基配列を含む２つの鋳型用核酸を、（１）鋳型用核酸ごとに分けて核酸増幅反応を行い、又は２つの鋳型用核酸を混合して核酸増幅反応を行った後に２つ鋳型用核酸ごとにわけ、（２）それぞれ一本鎖に変性させ、一の鋳型用核酸のセンス鎖を分離し、さらに他方の鋳型用核酸における前記センス鎖の相補鎖であるアンチセンス鎖を分離し、（３）前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とをアニーリングさせて二本鎖を調製し、ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて、該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離することを含むミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法である。
【００２９】
本発明の実施形態の一つを、図１に例を挙げて示す。この図が示すように、本態様のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法は、核酸増幅工程１１、一本鎖調製工程１２、選択工程１３、混合工程１４、二本鎖調製工程１５、及び分離工程１６を含んでいる。図１において、S鎖はセンス鎖を、A鎖はアンチセンス鎖を示し、２つの鋳型核酸１をそれぞれ細線と太線で示している。この図では、一方の鋳型核酸のCG塩基対に対応する他方の鋳型核酸の箇所が一塩基置換によってGC対に変異している。以下、図面を参照して本態様を詳細に説明する。
【００３０】
核酸増幅工程
「核酸増幅工程１１」は、２つの反応系のそれぞれにおいて、鋳型用核酸１及び該鋳型用核酸にハイブリダイズするプライマー対（３１／４１）を用いて核酸増幅反応を行う工程である。各反応系において、該鋳型用核酸は、互いに対応する領域の塩基配列を含む同一起源の２つの異なる核酸分子に由来する。
【００３１】
「核酸増幅反応」とは、特定の核酸領域を核酸ポリメラーゼによって増幅する反応をいう。本反応に用いる核酸増幅方法は、フォワード／リバースプライマーを使用し、これらのプライマーにより鋳型のセンス／アンチセンス両鎖が増幅される方法であれば、当該分野で公知のいずれの方法を使用してもよい。例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、若しくはICAN（等温遺伝子増幅）法、又はそれらの応用的な方法（例えば、リアルタイムPCR法）が挙げられる。好ましくはPCR法である。これは、当該方法が分子生物学の分野において現在世界中で最も広く使用されている方法であり、試薬、キット、及び反応機器等が充実している他、様々な応用技術が知られているためである。
【００３２】
前記反応で用いられる核酸ポリメラーゼは、使用する核酸増幅方法によって適宜定められるが、通常は、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼである。このような核酸ポリメラーゼは、様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。ただし、本発明では、フィデリティー（fidelity）の高い核酸ポリメラーゼを使用することが好ましい。これは、核酸増幅工程において新たな変異を導入させないためである。例えば、DNAポリメラーゼであれば、3’〜5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。一般に、増幅する核酸領域が長くなるに従い、核酸増幅工程の過程で導入される目的外の変異の出現率が高くなる。したがって、500base以上を増幅する場合には、pfu DNAポリメラーゼ若しくはそれと同等以上の高いフィデリティーを有するDNAポリメラーゼを用いることが望ましい。
【００３３】
核酸増幅反応の反応条件は、使用する核酸増幅方法の公知の反応条件を基礎として、増幅させる塩基配列の長さ、鋳型用核酸の量、プライマーのTm値、使用する核酸ポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等の要件を勘案して決定すればよい。例えば、PCR法であれば、各ステップの温度と反応時間は、熱変性ステップを90℃〜98℃で３０秒〜１分間、アニーリングステップを52℃〜60℃で３０秒〜１分間、伸長ステップを70℃〜75℃で４０秒〜３分間程度行えばよい。また、サイクル数は、前記各要件により大きく左右されるが、通常は２５サイクル〜４５サイクルで足りる。好ましくは２８サイクルから４２サイクル、特に好ましくは３０サイクルから４０サイクルである。これらは、反応系内において実行される。
【００３４】
本態様において、２つの反応系における核酸増幅反応の条件を必ずしも同一にする必要はない。それぞれの鋳型用核酸の条件（例えば、濃度、塩基配列の長さ）に応じて、当業者に技術範囲で適当な反応条件をそれぞれの反応系で設定することができる。
【００３５】
本工程は、各反応系におけるプライマー対（３１／４１）に関して、一方の反応系ではフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子２を担持しており、他方の反応系ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持していることを特徴とする。それ故、一方の反応系（図１では第１反応系）では選択分子２を担持する一本鎖核酸断片としてアンチセンス鎖側が生じ、他方の反応系（図１では第２反応系）からは選択分子２を担持する一本鎖核酸断片としてセンス鎖側が生じることとなる。
【００３６】
本態様の各反応系における鋳型用核酸は、対応する領域以外の領域においても共通の塩基配列を有することができる。例えば、対応する領域が共通のベクター内に挿入されている場合が挙げられる。また、プライマー対の各塩基配列は、２つの反応系間で同一とすることができる。すなわち、プライマーは、少なくともフォワード及びリバースプライマーの２種類あればよい。この場合、前述のように選択分子を担持するフォワード／リバースプライマーは、２つの反応系間でそれぞれ逆になるようにする。さらに留意すべき点は、プライマーが鋳型用核酸内の対応する領域外にハイブリダイズするのであれば、鋳型用核酸内における対応する領域の塩基配列の方向性を定めるということである。すなわち、対応する領域の塩基配列が２つの鋳型用核酸内で同一方向となるようにしておく必要がある。これは、対応する領域の塩基配列がそれぞれの鋳型用核酸内において逆方向に挿入されていた場合、両反応系から同方向の選択分子を担持した鎖が生じてしまうためである。鋳型用核酸における対応する領域の方向付けは、例えば、ベクターに挿入する場合であれば、対応する領域をベクター上で切断部位が異なる２種類の制限酵素部位間に挿入することによって容易に達成できる。
【００３７】
本工程の終了後、一本鎖調製工程までの間に、得られた増幅核酸断片を必要に応じて精製してもよい。精製によって未反応のデオキシヌクレオチド及びプライマー、又は核酸ポリメラーゼ等を除去することができる。精製方法は、当該分野で公知のいずれの方法であってもよい。例えば、スピン式ゲル濾過カラムを用いた精製方法は、迅速、かつ簡便に核酸を精製することができるので好ましい。このようなカラムは、バイオ関連事業の各社から市販されており、それらを利用することもできる。
【００３８】
一本鎖調製工程
「一本鎖調製工程１２」は、増幅した核酸断片を一本鎖６に変性させる工程である。本工程で反応系中の二本鎖増幅核酸断片を完全に変性させることが望ましい。
【００３９】
変性方法は、当該分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。従来から知られる一般的な変性方法としては、熱変性法、又はアルカリ溶液処理による変性（アルカリ変性）法が挙げられる。このうち熱変性法は、増幅核酸断片にニック(Nick)のような傷が入りにくく、また中和処理が不要で簡便である等の理由から好ましい。
【００４０】
熱変性は、二本鎖状態の核酸断片を加熱処理するだけでよい。変性温度は、対象となる二本鎖増幅核酸断片のGC含量及び／又は塩基長によって左右されることから、これらの条件に応じて適宜調節すればよい。通常は、96℃以上に設定すれば、前記条件にかかわらず完全変性することができる。熱変性時間も同様に、二本鎖増幅核酸断片のGC含量及び／又は塩基長、並びに変性温度によって左右されるため、これらの条件に応じて適宜調節される。通常、95℃であれば１０〜２０分間、98℃であれば５〜１０分間加熱することで上記目的を達成することができる。
【００４１】
本工程で調製された一本鎖増幅核酸断片は、少なくとも下記選択工程において選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片が選択されるまでは一本鎖状態を保持しておく必要がある。したがって、変性方法に応じて、適宜一本鎖状態を保持する処理を行う。例えば、熱変性の場合であれば、加熱後、温度低下によるアニーリング前に直ちに選択工程を行う方法や反応系を直ちに氷中に移す等して急冷する方法が挙げられる。また、アルカリ変性の場合であれば、尿素等の変性剤を変性前、変性間、若しくは変性後に添加する方法が挙げられる。熱変性後、直ちに選択工程を行う方法は、簡便かつ迅速なことから特に好ましい。
【００４２】
選択工程
「選択工程１３」は、前記選択分子の有する特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する工程である。
【００４３】
「選択分子の有する特性」は、上記「定義」で説明した通りである。「特性を利用して該選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片を選択する」とは、例えば、選択分子が有する特性が磁力であれば図１のように磁石(マグネット)７を用いて、比重であれば遠心(密度勾配遠心を含む)によって、蛍光であれば蛍光検出器によって、又は親和力であればその親和力による結合によって、選択することをいう。それぞれの具体的な選択方法は、当業者に公知の技術を用いて選択分子の有する特性に基づいて適宜定めればよく、特に限定はしない。例えば、選択分子が磁性ビーズであれば、前記一本鎖調製工程後、各反応系を行っている反応槽の壁面にマグネットを接触させて選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片及びプライマーを当該壁面に引き付けておき、その間に選択分子を担持しない一本鎖増幅核酸断片及び鋳型用核酸等を含む液相を吸引除去、デカント除去、又は流通除去する方法が挙げられる。また、選択分子がセファロースビーズであれば、前記一本鎖調製工程後、反応系を適当な遠心加速度で遠心して、選択分子を担持する一本鎖増幅核酸断片及びプライマーを沈殿させ、液相を吸引除去する方法が挙げられる。さらに、選択分子がビオチンであれば、アビジン若しくはストレプトアビジンを固定化した反応系に前記一本鎖調製工程後の反応液を移し、両分子を結合させた後、液相を吸引、デカント、又は流通によって洗浄除去する方法が挙げられる。この場合、可逆的結合が可能なビオチン−（ストレプト）アビジン結合を用いることが好ましい。反応槽の壁面に固定化された目的の一本鎖増幅核酸分子を選択工程後に回収するためである。このような可逆的結合の可能なビオチン又は（ストレプト）アビジン試薬は、市販のものを利用することができる。例えば、DSB-XTMビオチン（Invitrogen社）等が挙げられる。
【００４４】
混合工程
「混合工程１４」とは、各反応系から得られた一本鎖増幅核酸断片を一の反応系で混合する工程である。本工程によって、それぞれの反応系で得られた増幅核酸断片どうしを遭遇させることができる。図１においては、選択工程１３後に混合工程１４を行っているが、これに限られない。すなわち、核酸増幅工程１１以後、二本鎖調製工程１５前であればいずれの工程後に行ってもよい。好ましくは、選択工程１３後である。混合前にそれぞれの反応系で得られた一本鎖増幅核酸断片を定量し、両反応系における一本鎖増幅核酸断片を等量混合するように調整することが好ましい。この操作により二本鎖調製工程１５で各反応系由来の一本鎖増幅核酸断片を効率よくアニーリングさせることができる。
【００４５】
二本鎖調製工程
「二本鎖調製工程１５」は、前記同一起源の２つの異なる核酸分子に由来する一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせてヘテロ二本鎖核酸断片を形成させる工程である。本工程により、ヘテロ二本鎖核酸断片が形成される。
【００４６】
本工程において、一本鎖増幅核酸断片の対応する領域の塩基配列は、ヘテロ相補鎖間で可能な限り正確、かつ完全にアニーリングすることが好ましい。このようなアニーリングは、例えば、選択工程後に溶液中の温度を徐々に降下させていくことで達成できる。溶液中に存在する目的の一本鎖増幅核酸断片の濃度が十分高い場合、前記アニーリングは、温度を室温まで一気に降下させた後、当該室温で保持しても達成させることができる。溶液中に目的外の一本鎖増幅核酸断片が多数混在する場合や、ヘテロ相補鎖のいずれか一方の濃度が極端に低い場合には、前記アニーリングは、65〜70℃、好ましくは68℃の温度で長時間保持して達成させるのが好ましい。
【００４７】
分離工程
「分離工程１６」とは、ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬を用いて該検出試薬と関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する工程である。本工程により、前記二本鎖調製工程で得られたヘテロ二本鎖核酸断片の中からミスマッチ塩基対を含むもののみを選択することができる。
【００４８】
「ミスマッチ塩基対と特異的に関連する検出試薬」とは、二本鎖核酸中に存在するミスマッチ塩基対を、（例えば、その立体的歪みによって）特異的に認識し、関連する物質をいう。ここでいう「関連」とは、係り合うことであり、例えば、結合又は付着をいう。検出試薬は、ミスマッチ塩基対を特異的に認識し、関連することができる物質であれば、特に限定はしない。このような検出試薬としては、例えば、ミスマッチ修復酵素（例えば、MutY、MutM、MutH、MutL、MutS、MutD、MutT等）（Modrich P., 1989, J Biol Chem. Apr 25;264(12):6597-600）、及びミスマッチ結合リガンドNC-link(Mismatch-binding Ligand NC-link: MBL)（特許文献１、特開２００６−１０４１５９参照）が挙げられる。中でもMBLは、特に好ましい。MBLは、複数種が知られており、種類によってG（グアニン）-G、G-A(アデニン)、C(シトシン)−T(チミン)、C-A、又はT-T等、特異的に関連するミスマッチ塩基対が異なる。いずれのMBLを使用するかは、目的、用途に応じて適宜定めればよい。もちろん、認識するミスマッチ塩基対が異なるMBLを複数種混合して使用することもできる。
【００４９】
検出試薬は、単独で使用してもよく、又は担体に固相化されていてもよい。ここでいう固相化は、検出試薬が担体となる物質に固定されている状態であれば、特に限定はしない。例えば、検出試薬と担体とが化学的結合（例えば、共有結合）によって結合している状態が挙げられる。担体は、特に限定はしないが、樹脂（例えば、ポリスチレンのようなプラスチック、ポリアクリスアミド等）、高分子多糖類（例えば、アガロース、セファロース若しくはセファデックス）、シリカ、ガラス、セラミックスが挙げられる。また、担体の形状も特に限定はしない。例えば、ビーズ形状や多孔質粒子形状は、表面積が大きく、カラム内に充填することも容易なことから好ましい。
【００５０】
検出試薬で核酸断片を分離する方法については、本発明の条件を勘案し、公知の技術の方法に従って行えばよく、特に限定はしない。例えば、検出試薬を固定化したビーズを充填したカラムに二本鎖調製工程後のサンプルをアプライして分離するアフィニティー分離法が挙げられる（Goto Y, et al., 2007, Anal Bioanal Chem., 388(5-6):1165-1173；Peng T, et al., 2004, Nucleic Acid Symp Ser (Oxf), 48:123-124参照）。或いは、検出試薬に蛍光物質を担持させておき、検出試薬で処理した二本鎖調製工程後のサンプルを洗浄後、蛍光物質を有する二本鎖核酸断片（選択分子にセファロースビーズのような粒子状担体を担持しているものが好ましい）をセルソーターを用いて分離してもよい。一例として、MBLを用いて該MBLと関連したヘテロ二本鎖核酸断片を分離する具体的方法を実施例３に記載する。
【００５１】
本実施形態によれば、核酸増幅工程を介した後でも、ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を極めて効率よく調製することができる。すなわち、従来方法であれば、核酸増幅工程を介した最終産物内には、約半分のミスマッチ塩基対を含まないホモ二本核酸断片を含んでいた（実施例３の結果の項参照）。しかし、本実施形態によれば、そのようなホモ二本核酸断片を100％除去することが可能であり、理論上、ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片のみからなる核酸断片を調製することができる。その結果、一塩基置換のスクリーニング効率及び解析効率を向上させることが可能となり、実質的に網羅的な解析が可能となる。また、本態様によれば、核酸増幅反応、二本鎖調製を効率的に行うことができる。また、核酸増幅反応において必要なプライマーは、少なくとも２種類あればよく、また同一起源の２つの異なる核酸分子に由来する対応する領域の塩基配列が同一ベクター内の同一位置に挿入されていてもよく、既存のゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを利用する上でも便利である。
【００５２】
＜実施形態２＞
本発明の他の実施形態の例を、図２に示す。この図が示すように、実施形態２の基本原理は、実施形態１のそれと変わらない。すなわち、実施形態２も、実施形態１と同様に核酸増幅工程２１、一本鎖調製工程２２、選択工程２３、二本鎖調製工程２４、及び分離工程２５を含んでいる。しかし、実施形態２は、核酸増幅工程２１において異なる起源に由来する２つの鋳型用核酸を混合して核酸増幅反応を行う点、それ故混合工程１４を必要としない点で実施形態１とは異なる。そこで、実施形態１と共通する既述の工程等については、その説明を省略し、ここでは、主として実施形態２に特徴的な構成である核酸増幅工程２１について、以下で図面を参照して本実施形態を詳細に説明することとする。なお、図２も図１と同様に、S鎖はセンス鎖を、A鎖はアンチセンス鎖を表し、２つの鋳型核酸１をそれぞれ細線と太線で示している。また、一方の鋳型核酸のCG塩基対に対応する他方の鋳型核酸の箇所が一塩基置換によってGC対に変異している。
【００５３】
核酸増幅工程
「核酸増幅工程２１」は、２つの反応系のそれぞれにおいて鋳型用核酸及びプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程である。つまり、前記態様の核酸増幅工程が、鋳型用核酸ごとに分けて核酸増幅反応を行うことを特徴としていたのに対し、本態様の核酸増幅工程は、２つの鋳型用核酸を混合して核酸増幅反応を行う点で異なる。
【００５４】
本態様では、独立した２つの核酸増幅反応が一の反応系内で行われる。前述のように対応する領域は、異なる起源に由来する２つの鋳型用核酸において同一若しくは類似の塩基配列を有している。したがって、各鋳型用核酸に対する核酸増幅反応を独立に行うためには、２対のプライマーが必要であり、また各鋳型用核酸は、そのうち１対のプライマーが特異的にハイブリダイズできる塩基配列領域を所望の位置に有する必要がある。これは、例えば、前記対応する領域を挿入するベクター（例えば、プラスミド）の種類を鋳型用核酸間で変えることによって、又は前記対応する領域の末端に付加するタグ配列を鋳型用核酸間で変えることによって、容易に達成することができる。
【００５５】
「２対のプライマー」は、異なる起源に由来する２つの鋳型用核酸のそれぞれを鋳型として独立に所望の核酸領域を増幅することができる。各プライマーは、お互いに異なる塩基配列を有する。それ故、本態様におけるプライマーは、少なくとも４種類必要である。また、２つのプライマー対のそれぞれで増幅される塩基配列の長さが、双方で同一若しくはほぼ同一の長さとなるように予めプライマーを設計しておくことが好ましい。これは、単一反応系内において、両者の核酸増幅産物の収量をなるべく等しくするためである。
【００５６】
実施形態２の特徴的な点は、前記２対のプライマーにおいて、一方のプライマー対のフォワード／リバースプライマーのいずれかが選択分子を担持しており、他方のプライマー対ではそれとは逆方向のプライマーが選択分子を担持していることである。つまり、異なる起源に由来する２つの鋳型用核酸のうち、一方の鋳型用核酸にハイブリダイズするプライマー対においてフォワードプライマーが選択分子を担持している場合、他方の鋳型用核酸にハイブリダイズするプライマー対ではリバースプライマーが選択分子を担持することとなる。核酸増幅工程においても、第１態様と同様に、一方の鋳型用核酸からは選択分子を担持するセンス鎖が、他方の鋳型用核酸からは選択分子を担持するアンチセンス鎖が得られる。
【００５７】
核酸増幅反応条件等については、実施形態１の核酸増幅工程に準じて行えばよい。
本実施形態によれば、作業時間削減やコスト削減が可能となる。さらに、本実施形態は、全反応を原則として１つの反応系で行うことが可能なため、操作が簡便であり、また経済性も高い。
【００５８】
＜一塩基置換検出方法＞
本発明の検出方法は、実施形態１の調製方法によって得られたヘテロ二本鎖核酸断片を用いて当該断片の各鎖の塩基配列決定を行ない、その結果を解析して各核酸断片間に存在する一塩基置換を同定することで達成される。
【００５９】
得られたヘテロ二本鎖核酸断片の各鎖の塩基配列を決定するのに先立ち、必要に応じて当該断片の両末端にシーケンスプライマーがハイブリダイズするリンカー配列をライゲーション反応によって付加してもよい。リンカー配列を末端に付加する方法は、当該分野で公知の技術を用いることができる。
【００６０】
また、必要に応じて、塩基配列決定に先立ち、得られたヘテロ二本鎖核酸断片をサブクローニングすることもできる。サブクローニングは、当該分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、実施形態１又は２で得られたヘテロ二本鎖核酸断片をTAクローニングベクター等のベクター内に挿入した後、大腸菌に導入し、単一形質転換体クローンを単離・培養後、目的のベクターを調製する方法が挙げられる。この方法では、単一クローン中において、ミスマッチ塩基対のそれぞれの鎖に由来する挿入断片をもつ２種類のベクターが得られることとなる。したがって、自動シーケンサを用いた場合、目的のミスマッチ部位は、重複した異なる２つのシグナルピークとして検出される。なお、本発明では、フィデリティーの高い核酸ポリメラーゼを用いることから、核酸増幅工程後に得られるヘテロ二本鎖核酸断片の末端が、A（アデニン）のオーバーハングを有さない場合がある。これは、例えば、プライマー非存在下において当該断片をdNTP又はdATP、及びTaqポリメラーゼ等と共に約72℃で数分間反応させて、Aを3’末端に付加することにより容易に解決できる。
【００６１】
塩基配列決定は、当該分野で周知の技術を用いればよい。通常は、ダイデオキシ法（サンガー法）に基づいた塩基配列決定法が使用される。シーケンサや塩基配列に使用する試薬は、市販の機器（例えば、3130ジェネティックアナライザ（ABI社）、CEQ8000（BECKMAN COULTER社）等）や試薬（例えば、BigDye（登録商標）Terminator（ABI社））を利用することができる。塩基配列決定の方法については、使用するシーケンサや試薬に添付の説明書に従えばよい。
【００６２】
本発明の検出方法によれば、ゲノムや遺伝子中に存在する一塩基置換を検出することができる。特に本検出方法は、ゲノムや遺伝子中に存在する未知の一塩基多型、遺伝疾患若しくは病害虫耐性等の原因遺伝子における点突然変異、を網羅的に探索し、同定することができる。それにより、疾患易罹患性や薬剤反応性に対する情報を従来技術よりも効率的に提供できるばかりでなく、遺伝子診断や植物の品種改良の開発にも寄与し得る。
【００６３】
＜一塩基置換検出用キット＞
本発明の一塩基置換検出用キットは、前記実施形態１又は２に記載のプライマー及び／又は検出試薬を包含し、実施形態１又は２に記載の調製方法を用いて一塩基置換を検出することができる。この他、限定はしないが、核酸増幅反応に必要な試薬（例えば、核酸ポリメラーゼ、dNTP、バッファ）、選択分子の選択に供されるもの（例えば、選択分子が磁性ビーズであればマグネット）、鋳型用核酸の調製に供されるベクター、核酸精製用器具（例えば、ゲル濾過カラム）、反応系として使用する各種チューブ等の容器、及び／又はキットの使用説明書を包含することもできる。
【００６４】
本キットは、最終産物としてミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を調製するのに必要な材料、試薬、及び／又は器具を提供することを目的とする。したがって、得られたヘテロ二本鎖核酸断片をシーケンスして、一塩基置換を同定する段階の試薬等については、市販の塩基配列決定試薬又はそのキットを利用すればよい。例えば、BigDye（登録商標）Terminator（ABI社）を利用することができる。ただし、必要であれば、本キットが、塩基配列決定試薬も包含してもよい。
【００６５】
キット内に包含されるプライマー及び検出試薬等の使用回数（分）量については、適宜定めればよい。
【００６６】
本発明によれば、一塩基置換検出に供されるミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を簡便かつ容易に得ることができる。
【００６７】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の具体的例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００６８】
＜鋳型用核酸の調製＞
（目的）
鋳型用核酸として、プラスミドの特定の部位に一塩基置換を導入する。
【００６９】
（材料及び方法）
Quik Change（登録商標） Site-Directed Mutagenesis Kit （Stratgene社）を用いて、プラスミドpBR322に一塩基置換の導入を行った。PCRは、50ngのpBR322を5μlの10×PCRバッファ、5μlの2mM dNTP混合液、2.5μlの各5pmol/μlプライマー（配列番号１及び２）、1μlの2.5U/μl PfuTurbo（登録商標）DNAポリメラーゼと総量50μlとなるように混合し、サーマルサイクラー（DNAengine：BIORAD社）を用いて実行した。反応条件は、95℃で３０秒間変性させた後、95℃で３０秒間、55℃で１分間、68℃で５分３０秒間を１サイクルとして１８サイクル行い、その後、4℃に置いた。なお、使用した各プライマーの合成については、オペロン社に委託した。
【００７０】
前記PCR終了後、前記キットに添付のメチル化DNA特異的制限酵素10U/μl DpnIを1μl添加し、37℃で１時間反応を行った。得られたDpnI処理済サンプル1μlを用いて、前記キットに添付の大腸菌コンピテントセルをキットに添付の説明書に従って形質転換した。形質転換体を培養した後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いて、当該キットに添付の説明書に従い、大腸菌からプラスミドを抽出した。
【００７１】
抽出したプラスミドの塩基配列を決定し、一塩基置換導入の確認を行なった。塩基配列決定は、DTCS Quick Start Master Mix（BECKMAN COULTER社）を用いて、シーケンサCEQ8000（BECKMAN COULTER社）により、同社の使用マニュアルに従った。
【００７２】
（結果）
塩基配列から、目的とするpBR322の796塩基目（Genbank（ACCESSION N0.: J01749）
登録配列の1番目の塩基を１塩基目とする）のCをGに置換した一塩基置換体、すなわち一塩基置換体が得られた事が確認された。この一塩基置換が導入されたプラスミドをpBR322Mと命名し、以降の実施例でpBR322と共に鋳型用核酸として使用した。
【実施例２】
【００７３】
＜プライマーの調製＞
（目的）
選択分子である磁性ビーズを付加した磁性ビーズ担持プライマーと、磁性ビーズを担持しない通常プライマーを調製する。
【００７４】
（材料と方法）
磁性ビーズM-PVA N11（Chemagen社）を活性化するため、以下の操作を行った。まず、100μlの前記ビーズ（3.75μmol NH2/5mg）を1.5mlチューブに移し、マグネットを用いて保存用の懸濁外液を除去した。次に、チューブ内に残ったビーズを100μlのPBS-EDTA（20mM Na-PO4、150mM NaCl、EDTA 1mM pH7.2）溶液で懸濁した後、再度マグネットを用いて当該溶液を除去した。この操作を２回繰り返した後、ビーズをへテロ２架橋試薬である50mM sulfo-LC-SPDP（ピアス社）溶液100μlで懸濁した。続いて、チューブを室温で６０分間インキュベートした後、マグネットを用いて当該溶液を除き、200μlのPBS-EDTAに再懸濁した。この操作を５回繰り返し、最後に375μlのPBS-EDTA溶液で懸濁して10nmol/μlのsulfo-LC-SPDP-ビーズ懸濁液とした。
【００７５】
鋳型となるpBR322又はpBR322Mの特定の部位にハイブリダイズし、それぞれ配列番号３及び４で示す塩基配列からなるフォワード／リバースプライマーを合成した（それぞれ「PBRF」、「PBRR」と呼ぶ）。このとき、前記各プライマーについて、磁性ビーズ担持プライマー調製用に5'末端にチオール基を導入したプライマーと、通常プライマー調製用に5'末端にチオール基のないプライマーとをそれぞれ合成した。合成はオペロン社に委託した。
【００７６】
チオール基導入オリゴヌクレオチドに関しては、磁性ビーズを付加する前に脱保護基処理を行った。脱保護基処理の具体的な方法は、以下の通りである。まず、乾燥状態のチオール基導入オリゴヌクレオチドを500μlの100mM 1,4-ジチオ-DL-トレイトールで溶解して室温に３０分間放置し、その後500μlのMQ水を加えた。予めSep Pak Plus C18カラム（Waters 社製）をアセトニトリル10mlで洗浄し、10mlの2M TEAAを流して平衡化しておいた。このカラムに前記チオール基導入オリゴヌクレオチドの全量をアプライした。Pass画分を再度アプライした後、10mlの5%アセトニトリル／0.1M TEAA溶液で洗浄した。続いて、10mlのMQ水で洗浄した。最後に、3mlの30%アセトニトリニルでカラムから溶出した。得られた溶出液を凍結乾燥し、MQ水で再溶解した。得られたチオール基導入オリゴヌクレオチド溶液の濃度を測定し、0.25nmol/μlに調整した。
【００７７】
磁性ビーズ担持プライマーの調製は、以下の手順でチオール基導入オリゴヌクレオチドを前記活性化処理した磁性ビーズと反応させた。まず、40μlのチオール基導入オリゴヌクレオチド溶液（0.25nmol/μl）と前記10μlのsulfo-LC-SPDP-ビーズ懸濁液（10nmol/1μl）をチューブ内で混合した後、室温で１８時間インキュベートした。次に、マグネットを用いてチューブ内の溶液を除去し、残ったビーズを100μlのPBS-EDTA（組成は上記の通り）溶液で懸濁した。この操作を５回繰り返し、最後に、100μlのPBS-EDTAに再懸濁して、100pmol/mlの磁性ビーズ化プライマーとした。磁性ビーズ化フォワード／リバースプライマーは、それぞれ「Magnet-PBRF」、「Magnet-PBRR」と呼ぶ。
【００７８】
通常プライマーの調製は、フォワード／リバースプライマーのそれぞれについて、合成後の凍結乾燥オリゴヌクレオチドをMQ水で10pmol/μlになるように調製した。
【実施例３】
【００７９】
＜ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製＞
（目的）
本発明のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法を用いて、目的とするミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を調製できることを検証する。
【００８０】
（材料と方法）
１．核酸増幅工程
実施例１で調製したpBR322M及びpBR322を鋳型用核酸として、実施例２で調製した各プライマーを用いて、２本のチューブでPCRを行った。それぞれのチューブにおいて、1μlの鋳型用核酸を5μlの10×PCRバッファ（下記AmpliTaq Gold Polymeraseに添付のもの）、4μlの2.5mM dNTP混合液、3μlの25mM MgCl2、5μlの100pmol/μl磁性ビーズ化プライマー、2.5μlの10pmol/μl通常プライマー、0.25μlの5U/μl DNAポリメラーゼと共に総量50μlとなるように混合した。ここで、第１チューブでは、鋳型用核酸としてpBR322を、また通常プライマー／磁性ビーズ化プライマーの組み合わせとしてPBRF／Magnet-PBRRを使用した。一方、第２チューブでは、鋳型用核酸としてpBR322Mを、また磁性ビーズ化プライマー／通常プライマーの組み合わせとしてMagnet-PBRF／PBRRを使用した。DNAポリメラーゼは、両チューブ共にAmpliTaq Gold Polymerase（Applied Biosystems社）を使用した。反応条件は、95℃で１０分間熱処理した後、95℃で３０秒間、60℃で３０秒間、72℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、72℃で８分間の処理を介して、4℃に置いた。これらの反応は、DNAengine（BIORAD社）を用いて行った。
【００８１】
２．一本鎖調製工程〜二本鎖調製工程
前記核酸増幅工程後に、各チューブのサンプルを96℃で５分間インキュベーションし、増幅した二本鎖核酸断片を一本鎖に変性させた（一本鎖調製工程）。その後、直ちにマグネットをチューブ壁に押し当てて、反応溶液中の磁性ビーズを担持する核酸増幅断片若しくはプライマー、又は磁性ビーズのみを壁面に吸着させ、チューブ内の溶液を全て吸引して除去した（選択工程）。続いて、第１及び第２チューブ内に残ったサンプルを混合した（混合工程）。ここで、PCRによる増幅の成否を確認するため、得られた混合物をアガロースゲルで電気泳動した。その結果、目的とするサイズのバンドが確認された（データ示さず）。次に、混合工程で混合した一本鎖増幅核酸断片をアニーリングさせて二本鎖核酸断片を再構成した（二本鎖調製工程）。アニーリングに関しては、混合後のサンプルを96℃で10分間インキュベートした後、0.2℃／分の速度で25℃まで徐々に温度を降下させた。その後、溶液をエタノール沈殿処理し、得られた沈殿物を、20μlのMQ水で溶解した。これを二本鎖核酸断片サンプルとした。
【００８２】
３．分離工程
二本鎖調製工程後に得られた二本鎖核酸断片からミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片を分離するために、二本鎖核酸断片を固相化検出試薬によるアフィニティークロマトを実施した。検出試薬には、Mismatch-binding Ligand NC-link（MBL）（特許文献１参照）を用いた。本MBLにはGGミスマッチに結合する能力がある。本検出試薬の合成は、特許文献１に記載の方法に従った。MBLの固相化は、以下の手順で行った。まず、固相担体HiTrap NHS-activated HP（GE Healthcare社）で充填したカラムを6mlの冷却した1mM塩酸で洗浄した。次に、直ちに0.5M NaCl／100mM NaHCO3の溶液に溶解した1.78mg/mlのMBLを1.0ml、カラムに注入した。アウトレットネジを閉め、室温で３０分間放置した。それから、6mlの0.5M NaCl／100mM NaHCO3でカラム内を洗浄した後、6mlの0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)で洗浄した。これらの溶液による洗浄を２回繰り返し、さらに6mlの0.5M NaCl／50mM NaOH溶液で洗浄した後、0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)で洗浄した。これをMBL固相化カラムとした。
【００８３】
前記二本鎖核酸断片サンプル90μlを2ng/μlのColE1 DNA溶液で100倍〜100000倍に希釈し、これを上記カラムにアプライした。アプライ後、カラムを6mlの0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)／0.01％NaN3で洗浄し、6mlの0.5M NaCl／50mM NaOHでアルカリ溶出した。この溶出液(６ml)に12μlの酢酸を加えて中和した。カラムの洗浄は、6mlの0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)／0.01％NaN3で行った。
【００８４】
アプライ前サンプル（希釈液）、及び溶出サンプル（中和済溶出液）をそれぞれリアルタイムPCRによって定量した。測定機器は、PRISM7700（ABI社）を使用した。キットは、SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)（TAKARA社）を用いた。鋳型サンプルの標準物質にはプラスミドpBR322を、プライマーにはPBRF及びPBRRを用いた。PCRは、pBR322を5μlの10×PCRバッファ、5μlの2mM dNTP混合液、2.5μlの各5pmol/μlプライマー（配列番号３及び４）、1μlの2.5U/μl PfuTurbo（登録商標）DNAポリメラーゼを50μlにメスアップして混合した。サーマルサイクラー（DNAengine：BIORAD社）を用いた。反応条件は、50℃で２分間（Ramp time:自動）、95℃で１０分間（Ramp time: 自動）処理した後、95℃で５秒間（Ramp time: 自動）、60℃で３０秒間（Ramp time: 自動）を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、95℃で１５秒間（Ramp time: 自動）、60℃で２０秒間（Ramp time: 自動）、95℃で１５秒間（Ramp time:２０秒間）を介した後、最後に20℃で１分間（Ramp time:自動）処理した。
【００８５】
４．従来方法による比較対照実験
実施例１に記載のpBR322、pBR322Mをそれぞれ鋳型として、前記PBRF及びPBRRをプライマーに用いてPCRを行った。反応条件等は、実施例３に記載の方法に準じた。それぞれの鋳型から得られた増幅産物を定量し、等量を混合して98℃で変性した後、徐々に冷却して二本鎖を再構成させた。これを「３．分離工程」と同様に、ColE1DNA溶液で希釈し、前記MBL固相化カラムにアプライした。カラムを洗浄後、アルカリ溶出した。その後、アプライ前サンプルと溶出サンプルをそれぞれリアルタイムPCRで定量した。
【００８６】
（結果）
本発明のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法による結果を図３に、また従来方法による結果を図４に示す。
【００８７】
図３では、どの希釈倍率においてもアプライ前サンプルと溶出サンプルで、ほぼ等量が回収されていることがわかる。一方、図４では、各希釈倍率においてアプライ前サンプルの約20%が溶出サンプルとして回収された。
【００８８】
ここで、野生型のDNA断片と一の一塩基置換を有するそのDNA断片とを等量混合し、熱変性後にアニーリングさせると、通常、確率的にはヘテロ二本鎖核酸断片である変異型センス鎖と野生型アンチセンス鎖及び野生型センス鎖と変異型アンチセンス鎖、並びにホモ二本鎖核酸断片である変異型センス鎖と変異型アンチセンス鎖及び野生型センス鎖と野生型アンチセンス鎖の４種類が均等に得られることになる。前述のようにMBLは、GGミスマッチ塩基対には結合するがCCミスマッチ塩基対には結合しない。それ故、従来方法では、理論的には全体の１/４、すなわち25%がMBLと結合することになる（ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片自体は全体の１/２である）。実際、図４の結果は、この理論値に近い値(約20％)を示した。
【００８９】
これに対して、本発明のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法では、MBLによる分離工程に先立つ選択工程おいて前記４種類の二本鎖核酸断片からヘテロ二本鎖核酸断片の一方、つまり、変異型センス鎖と野生型アンチセンス鎖、又は野生型センス鎖と変異型アンチセンス鎖のいずれかを構成するセンス／アンチセンス鎖が特異的に選択される。本実施例のように鋳型が２種類のみである場合、選択工程を経た二本鎖調製工程後の時点でアプライ前サンプル中に含まれる核酸断片は、理論的には100％がMBLと結合するミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片であることとなる。実際、図３は、この理論値にほぼ合致した結果を示した。
【００９０】
以上のように、本発明によれば、目的のミスマッチを含むヘテロ二本鎖核酸断片を100％若しくはほぼ100％という究極的効率で調製できることが立証された。
【実施例４】
【００９１】
＜一塩基多型スクリーニングモデルとしての検証＞
（目的）
一塩基多型スクリーニングモデルを作製して、本発明の一塩基多型のスクリーニングにおける有用性を検証する。
【００９２】
（材料と方法）
１．ライブラリーモデルの作製
実施例１で作製した変異導入プラスミドpBR322M、及び野生型プラスミドpBR322を用いて、２種類のDNAライブラリーを作製した。
【００９３】
まず、前記２つのプラスミドをそれぞれ別個に同一の２種類の４塩基認識制限酵素で消化した。制限酵素には、Sau3AI（TAKARA社）、NlaIII（New England Bio Labs.社）を使用した。チューブ１には666ng/μlのpBR322Mを15.0μl、10U/μlのSau3AIを10μl、購入時にSau3AIに添付されていた10×Hバッファを10μl加え、MQ水で100μlにメスアップした。また、チューブ２には612ng/μlのpBR322Mを16.4μl、10U/μlのSau3AIを10μl、購入時にSau3AIに添付された10×Hバッファを10μl加え、MQ水で100μlにメスアップした。両チューブを37℃で２時間インキュベートして酵素反応を行った。その後、サンプルをエタノール沈殿によって精製した。具体的には、溶液に10μlの3M 酢酸ナトリウムと275μlのエタノールを添加し、-80℃で３０分間静置した後、15000rpmで５分間、10℃にて遠心分離を行った。遠心後、上清を除去し、500μlの70％エタノールで沈殿物を洗浄した後、沈殿物を吸引乾燥した。続いて、第２の制限酵素であるNlaIIIによる消化を行った。まず、それぞれのチューブの前記乾燥沈殿物（Sau3AI消化産物）全量に、10U/μlのNlaIIIを10μl、購入時にNlaIIIに添付されていた10×NEB4バッファを10μl加え、MQ水で100μlにメスアップした。両チューブを37℃で２時間インキュベートして酵素反応を行った。その後、サンプルを上記と同様に方法でエタノール沈殿によって精製した。
【００９４】
次に、上記消化断片を挿入するためにライブラリー用プラスミドベクターを調製した。
ライブラリー用プラスミドベクターとしては、pUC19を使用した。制限酵素には、BamHI、SphI（いずれもTAKARA社）を使用した。チューブに154ng/μlのpUC19を32.5μl、10U/μlのBamHIを5μl、10U/μlのSphIを5μl、購入時にいずれかの酵素に添付されていた10×Hバッファを10μl加え、MQ水で100μlにメスアップした。チューブを37℃で２時間インキュベートして酵素反応を行った。
【００９５】
得られたBamHI／SphI消化済みpUC19（ライブラリー用プラスミドベクター）と前記Sau3AI／NlaIII消化済みpBR322M及びpBR322断片（挿入断片）をそれぞれMQ水に溶解した後、DNA濃度を測定して、ライゲーションに用いた。ライゲーション反応にはLigation Kit Ver2.0（TAKARA社）を使用した。反応は、113.5ng/μlのBamHI／SphI消化済みpUC19を1μl、415ng/μlのSau3AI／NlaIII消化済みpBR322M（又は）断片を0.5μl、及びLigation Kit soln Iを1.5μl添加混合して16℃、30minインキュベートして行った。インキュベーション後、ライゲーションサンプルを直接大腸菌の形質転換に用いた。まず、0.5mlのライゲーションサンプルをマイクロチューブに3μl分注し、大腸菌Competent High E.coli  DH5（TOYOBO社製）を30μl添加した。次に、氷上で３０分間インキュベートした後、42℃で４０秒間ヒートショックを行った。これに300μlのSOC Mediumを添加して、37℃で１時間インキュベートした後、全量を100μg/mlのアンピシリンを添加したCircle Grow培養液（BIO101社）10mlに接種し、37℃で１６時間培養した。その後、9mlの培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社）を用いて培養液からプラスミドDNAを抽出した。抽出方法は、添付の使用説明書に従った。pBR322M及びpBR322断片のそれぞれの挿入断片について得られたプラスミド溶液をpBR322Mライブラリー及びpBR322ライブラリーとした。
【００９６】
作製した両ライブラリーが目的どおりに作製できたか否かを確認するために以下の試験を行った。すなわち、上記ライブラリーのプラスミドを鋳型に、ベクター上で挿入領域を挟む位置にある塩基配列にハイブリダイズするプライマー対を用いてPCRを行った。プライマーは、配列番号５、６（それぞれPUCMCSF、PUCMCSRとする：pUC19のマルチクローニング部位におけるフォワード／リバース配列に相当）に記載のDNAを、またDNAポリメラーゼは、AmpliTaq Gold Polymerase（Applied Biosystems社）を使用した。またpBR322Mにおいて実施例１で変異導入した領域が、作製したライブラリー中に含まれていることを確認するために、PBRF及びPBRRプライマー対も使用した。各プライマー対は、フォワード／リバースプライマーが5pmol/μlになるように混合したものを使用した。前記いずれのPCR反応も、1μlのライブラリー、5μlの10×PCRバッファ（AmpliTaq Gold Polymeraseに添付のもの）、3μlの25mM MgCl2、4μlの2.5mM dNTP混合液、5μlの5pmol/μlプライマー対、0.25μlの5U/μl AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを50μlにメスアップして混合した。反応条件は、95℃で１０分間熱処理した後、95℃で３０秒間、60℃で３０秒間、72℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、72℃で８分間の処理を介して、4℃に置いた。これらの反応は、DNAengine（BIORAD社）を用いて行った。
【００９７】
得られた各PCR産物をアガロースゲル電気泳動で解析した。その結果、配列番号５、６により挿入断片はスメアな状態となり（図示せず）、目的通りのポリクローナルなライブラリーが作製されたことが確認された。また、PBRF及びPBRRプライマー対の使用による変異導入した領域に対する電気泳動結果も当該領域に相当するバンドが確認された（図示せず）。
【００９８】
２．ミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片のスクリーニングモデル実験
本発明は未知の一塩基多型をスクリーニングすることを目的として利用されることを想定している。そのために、より実際に使用される状態に近いモデルとして以下の試験を行った。すなわち、数千塩基対のうち１箇所のみが一塩基置換したライブラリー（pBR322Mライブラリー）から、当該置換を有する断片のみを本発明に従って選択的にスクリーニングした。
【００９９】
まず、配列番号５、及び６で表されるPUCMCSF及びPUCMCSRの両プライマーに磁性ビースを担持させた。磁性ビーズ化は、実施例２に記載の方法に従った。完成した磁性化プライマーをそれぞれ、Magnet-PUCMCSF及びMagnet-PUCMCSRとした。当該磁性化プライマーが磁性ビーズを担持していることを確認する目的で、PCR反応を行った。鋳型用核酸には、作成したライブラリーから調製したプラスミド混合物を使用した。DNAポリメラーゼは、AmpliTaq Gold Polymerase（Applied Biosystems社）を使用した。また、プライマー対は、Magnet-PUCMCSF／PUCMCSR、及びPUCMCSF／Magnet-PUCMCSR２対を用いて、それぞれ別個のチューブ（チューブA、B）で反応を行った。それぞれのチューブにおいて、1μlの鋳型用核酸を5μlの10×PCRバッファ（AmpliTaq Gold Polymeraseに添付のもの）、4μlの2.5mM dNTP混合液、3μlの25mM MgCl2、5μlの100pmol/μl磁性ビーズ化プライマー、2.5μlの10pmol/μl通常プライマー、0.25μlの5U/μl AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼと共に総量50μlとなるように混合した。反応条件は、95℃で１０分間熱処理した後、95℃で３０秒間、60℃で３０秒間、72℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、72℃で８分間の処理を介して、4℃に置いた。これらの反応は、DNAengine（BIORAD社）を用いて行った。核酸増幅反応後、各チューブで得られた２本鎖DNA断片を96℃で５分間インキュベーションして１本鎖にした。チューブ蓋を開け、即座にマグネットをチューブ壁面に押し当ててビーズを吸着させた後、液相を全て吸引除去した。続いて、チューブA及びBから得た1本鎖DNA溶液を混合した。混合物を電気泳動したところ目的のサイズのPCR産物が検出され（図示せず）、プライマーの磁性化が正常に行われていることが確認された。
【０１００】
次に、これらの磁性化プライマーを用いて、前記作製した２つのライブラリー（pBR322Mライブラリー及びpBR322ライブラリー）のそれぞれを鋳型用核酸としてPCRによる核酸増幅反応を行った。PCR反応は、前記磁性化ビーズの確認で使用した反応条件に従った。プライマー対については、pBR322Mライブラリーを鋳型とするチューブ（チューブI）にはMagnet-PUCMCSF／PUCMCSRを、pBR322ライブラリーを鋳型とするチューブ（チューブII）にはPUCMCSF／Magnet-PUCMCSRを使用した。PCRによる核酸増幅反応後、各チューブで得られた２本鎖DNA断片をそれぞれ100℃で３分間インキュベーションして１本鎖にした。チューブ蓋を開け、即座にマグネットをチューブ壁面に押し当ててビーズを吸着させた後、液相を全て吸引除去した。続いて、チューブI及びIIから得た１本鎖DNA溶液をそれぞれ50μl混合した。この時点において、混合サンプル中には２つのライブラリーに由来する多種類の核酸増幅産物が混在している。それらがお互いに相補する鎖と正確に２本鎖を形成するように、アニーリングは長時間かけて実施した。すなわち、サーマルサイクラー（DNAengine：BIORAD社）を用いて、混合物を96℃で１０分間変性し、96〜67℃まで0.1℃/秒で冷却後、67℃で１８時間保持した。その後、67〜25℃まで0.1℃/秒で冷却し、25℃下に置くことで完全なアニーリングを行った。なお、スクリーニングモデルである本実施例の場合、目的とするミスマッチ塩基対を含む核酸増幅断片の長さは240bpとなることがわかっている。
【０１０１】
続いて、アニーリングしたサンプルから実施形態３に記載のMBLを用いたアフィニティークロマトによってミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸断片を分離した。具体的には、カラムを6mlの0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)／0.01％NaN3で予め洗浄した後、100μlのアニーリングサンプルを前記カラムにアプライした。6mlの0.5M NaCl／20mM Na-PO4(pH7.0)／0.01％NaN3で洗浄した後、6mlの0.5M NaCl／50mM NaOHでアルカリ溶出した。溶出液は、12μlの酢酸で中和した。溶出液中の目的のミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸断片は、その量が少ないことが予想されるため、PCRによって増幅した。これは、得られた二本鎖核酸断片の有無を電気泳動によって確認するための操作である。プライマー対には、磁性ビーズ化していないプライマー（すなわち、PUCMCSF／PUCMCSR）を用いた。PCRの反応条件は、実施例４に準じて行った。得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１０２】
（結果）
結果を図５に示す。この図に示すように得られた増幅産物は、予想される目的のミスマッチ塩基対を含む核酸断片のサイズ240bpに合致していた。以上より、本発明を用いればライブラリーから一塩基置換を有する断片のみを選択的にスクリーニングできることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の実施形態１の概念図
【図２】本発明の実施形態２の概念図
【図３】本発明のミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法による結果
【図４】従来方法によるミスマッチ塩基対を含むヘテロ二本鎖核酸断片の調製方法による結果
【図５】本発明を用いた一塩基多型スクリーニングモデルにおける結果
【符号の説明】
【０１０４】
１：鋳型用核酸
２：選択分子(磁性ビーズ)
３１：フォワードプライマー１ 
３２：フォワードプライマー２
４１：リバースプライマー１
４２：リバースプライマー２
５：二本鎖増幅核酸断片
６：一本鎖増幅核酸断片 
７：マグネット
８：へテロ二本鎖核酸断片
９：検出試薬
【図１】
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【図２】
0005300335.tif 000003
【図３】
0005300335.tif 000004
【図４】
0005300335.tif 000005
【図５】
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【配列表】
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