(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性デンプン分解酵素の酵素活性が野生株に比べて向上したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｍ４２（受託番号：NITE P−170）の生産する、配糖化される糖が単糖であり、単糖と桂皮酸から縮合反応によって桂皮酸配糖体を合成し得る桂皮酸配糖化酵素。
【請求項２】
縮合反応を行うときの受容体が、桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸のいずれか１つである請求項１に記載の桂皮酸配糖化酵素。
【請求項３】
糖基質が単糖であり、
受容体が、桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸のいずれか１つから選択され、
請求項１に記載の桂皮酸配糖化酵素の存在下で、上記の基質および受容体を縮合反応させて、桂皮酸配糖体を合成させることを特徴とする桂皮酸配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な桂皮酸配糖体の製造方法に関し、詳しくは桂皮酸配糖体合成酵素を生産する微生物を改良することにより、桂皮酸の桂皮酸配糖体への変換を効率よく行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
桂皮酸配糖体は、桂皮酸の糖エステルであり、糖が結合していることから水に対する溶解性が増し、抗酸化剤などの食品添加物として有用であるほか、医薬品中間体としても有用な物質である。
桂皮酸配糖体として最も一般的なものとして、カフェー酸グルコシドが挙げられる。カフェー酸グルコシドは、天然にはシソ科植物やトマトなどに含有することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
また、カフェー酸のベンゼン環部分の水酸基が一ヶ所メトキシ（OCH3）化しているフェルラ酸について、そのグルコシドの生理機能についての研究がなされており、フェルラ酸グルコシドは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α）産生抑制効果を有し、フェルラ酸そのものよりも効果があることが知られている。同じく桂皮酸類に属するカフェー酸のグルコースエステルも同様の効果があるものとして期待される。
【０００４】
フェノール酸糖エステルの製造法としては、フェノール酸アルコールエステルと糖とを、エステル結合を切断し得る酵素を用いて溶媒中で反応させる方法が提示されている。（例えば、特許文献１参照。）
【０００５】
さらにカフェー酸グルコシドを合成する方法として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈuｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから成る群から選択される細菌の生成する酵素を利用することが挙げられている。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｋ−５３１−８６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ IFO３９５１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ２５９７２およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ IFO１４１４１が挙げられている。（例えば、特許文献２参照。）
【０００６】
同じく桂皮酸配糖体を合成する方法として、ネオプルラナーゼ、シクロマルトデキストリナーゼ、マルトジェニックα−アミラーゼおよびサイクロデキストリン合成能を有する糖化型アミラーゼを用い、糖とフェノール誘導体とを酵素の存在下で反応させて、フェノール誘導体配糖体を形成する方法が開示されている。（例えば、特許文献３参照。）。
【０００７】
しかし、上記先行技術（特許文献１）においては、グルコースとカフェー酸からリパーゼを使用してカフェー酸グルコシドを合成する技術が挙げられているが、直接グルコースとカフェー酸からカフェー酸グルコシドを合成することは出来ず、まずカフェー酸をアルコールエステル化してから、リパーゼのエステル交換反応によりカフェー酸グルコシドを合成する２段階の工程を有しているため、簡便な方法とはいえない。
【０００８】
また、上記先行技術（特許文献２、特許文献３）においては、可溶性デンプンやマルトオリゴ糖を基質とし、マルトース分解能を有しない酵素を使用するため、反応液中にマルトースをはじめグルコース重合度の異なる糖類が生成し、それに応じて複数の種類のフェニルプロパノイド配糖体が生成する。この反応液から目的とする桂皮酸配糖体を採取するには、更に上記反応液に対して、グルコアミラーゼ処理をしなければならず、操作が繁雑である問題点を有している。
【０００９】
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに関しては、炭疽病の病原菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの近縁種であり、交雑することがわかっているため、安全面での難点があった。
【００１０】
【特許文献１】特開平９−３２２７９４号
【特許文献２】特許第２６６４５８６号
【特許文献３】ＷＯ０１／０７３１０６号
【非特許文献１】Phytochemistry、３０巻、４９７頁（１９９１）；同誌、３１巻、１６７頁（１９９２）；同誌、３７巻、１６８９頁（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述した問題点を解決すべく、桂皮酸から桂皮酸配糖体を簡便な方法で合成する方法を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、このような事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ の産生する可溶性デンプン分解酵素が、桂皮酸配糖体合成に最も適していることの知見を得て、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを変異改良することにより、可溶性デンプン分解能力を有する酵素の生産能力を向上させた変異株Ｍ４２を得、さらにこの微生物が生産する可溶性デンプン分解酵素を使用し、単糖と桂皮酸から縮合反応によって、一工程で桂皮酸配糖体を合成することの知見を得て、本発明に至った。すなわち、本発明は以下の発明を提供する。
【００１３】
（１）Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを変異誘起剤として変異誘導し、可溶性デンプン分解酵素の酵素活性が野生株に比べて向上したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ変異株の生産する、配糖化される糖が単糖であり、単糖と桂皮酸から縮合反応によって桂皮酸配糖体を合成し得る桂皮酸配糖化酵素。
（２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ変異株は、寒天を0.1〜1.0％含有する培地で培養することにより製造されたものである上記（１）の桂皮酸配糖化酵素。
（３）桂皮酸配糖化酵素は、分子量が59.5ｋＤａである上記（１）又は（２）の桂皮酸配糖化酵素。
（４）可溶性デンプン分解酵素の酵素活性が野生株に比べて向上したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｍ４２（受託番号：NITE P−170）の生産する、配糖化される糖が単糖であり、単糖と桂皮酸から縮合反応によって桂皮酸配糖体を合成し得る桂皮酸配糖化酵素。
（５）縮合反応を行うときの受容体が、桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸のいずれか１つである上記（１）又は（４）の桂皮酸配糖化酵素。
（６）Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを変異誘起剤として変異誘導し、可溶性デンプン分解酵素の酵素活性が野生株に比べて向上したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ変異株を得るステップと、糖基質が単糖であり、受容体が桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸のいずれか１つから選択され、上記の変異株が生産する酵素の存在下で、上記の基質および受容体を縮合反応させて、桂皮酸配糖体を合成させるステップと、を備える桂皮酸配糖体の製造方法。
（７）糖基質が単糖であり、受容体が、桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸のいずれか１つから選択され、上記（４）の桂皮酸配糖化酵素の存在下で、上記の基質および受容体を縮合反応させて、桂皮酸配糖体を合成させる桂皮酸配糖体の製造方法。
【００１４】
なお、本微生物は国際寄託機関である独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）  に２００６年１月３０日に寄託されており、その菌受託番号はNITE  P−１７０である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、単糖と桂皮酸から桂皮酸配糖体を合成する新規の製造方法を提供し、桂皮酸配糖体合成酵素を生産する微生物を突然変異させ、酵素の生産能力を向上させることにより、桂皮酸の桂皮酸配糖体への変換を効率よく行う方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に使用する微生物の親株としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓであるが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを変異させて酵素生産能力が向上したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｍ４２（受託番号：NITE P−170）が生産する酵素の使用がより好ましい。
【００１７】
微生物の変異誘導は既知の方法によって行うことができる。例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を変異誘起剤として使用する化学的手段によって行うことができる。
【００１８】
変異株の分離方法についても公知の手法が適用できる。つまり、変異処理した菌株を培養し、形成されたコロニーについて変異の有無を検討する直接的な方法、或いはこの方法を改良したレプリカ法ならびにこれらを適宜に組み合わせた方法などが適用できる。
【００１９】
以上の知見をもとに、本発明者らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを親株として変異処理して、可溶性デンプン分解酵素の生産能力が向上した変異株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｍ４２株（以下、「Ｍ４２」という）を構築・分離した。
【００２０】
Ｍ４２を培養し酵素を得るための特に好適な培地成分は、炭素源(例えば、可溶性デンプン）、窒素源(例えば、ポリペプトン、脱脂大豆、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、コラーゲンおよびゼラチン等)、無機塩類(例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルト、カルシウム、酸化モリブデンなどの硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等)およびビタミン類(例えば、ビオチン、ビタミンＢ1、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、ビリドキサール、ピリドキサミン、ニコチン酸ｐ−アミノ安息香酸および葉酸等)を適宜使用すればよい。好適な培地は、可溶性澱粉、ポリペプトンおよび塩化ナトリウムを主成分とし、さらに無機酸の金属塩、例えば、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅および硫酸マンガン等を適宜含有する水性培地である。微生物と基質の接触は回分方式でもよく、また微生物を固定化したカラムを使用した連続方式も可能である。
【００２１】
酵素を得るためのさらに好ましい方法としては、培地に寒天を添加し固体の培地で培養する方法であり、菌体がより多くの空気と接することで更に酵素の生産能力が向上することが明らかになった。寒天の添加量は、培地がかろうじて固体化する濃度であり、なおかつ培地を回収、粉砕、抽出しやすい濃度であればよく、０．１〜１％の範囲で添加するのが好ましいが、より好ましい範囲は０．２〜０．５％である。
【００２２】
本発明法は、上記の培養法によって得られた培養物そのもの、もしくは培養ろ液のいずれも使用可能であるが、上記の培養法によって得られる培養物を必要に応じて精製処理してもよい。その方法は特に限定的ではなく、従来から酵素の精製法として知られているような、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過などによる方法を適宜採用すればよい。
【００２３】
この微生物を培養し、その酵素を使用することで、可溶性デンプンと桂皮酸から桂皮酸配糖体を合成することができたが、さらに簡便に合成できる方法を検討した結果、本菌株の生産する酵素は、基質が可溶性デンプンではなく、ヘキソースを使用したときも、桂皮酸とともにインキュベートすることにより、縮合反応によって桂皮酸配糖体を合成できることが可能となった。
【００２４】
縮合反応を行うときの受容体としては、桂皮酸、カフェー酸、フェルラ酸、o-クマル酸、p-クマル酸、m-クマル酸、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、3-フェニルプロピオン酸、シナピン酸を挙げることができる。このうち最も容易に入手が可能なのはフェルラ酸、あるいはカフェー酸である。
【００２５】
フェルラ酸、カフェー酸は試薬として市販されているので、それを用いることができるほか、クロロゲン酸類をエステラーゼで分解することによっても容易に得ることが出来る。クロロゲン酸類は、アカネ科植物、キク科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、タケ科植物、モチノキ科植物など、クロロゲン酸類を含む天然物から抽出することもできる。これら植物からの抽出液に対し、クロロゲン酸エステラーゼ、あるいはタンナーゼで処理することでクロロゲン酸がカフェー酸とキナ酸、あるいはフェルラ酸とキナ酸に分解し、カフェー酸、あるいはフェルラ酸を含む液体が得られる。フェルラ酸においてはタケノコや米ぬかなどに多く含まれることから、これらを抽出して得ても良い。
【００２６】
また単糖としては、例えば、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコース、Ｄ−マンノースなどが挙げられる。
【００２７】
受容体と単糖の混合比は特に限定されないが、例えば、反応液として緩衝液を用いた場合には、モル比で、１０：１〜１：１０とするのが好ましく、１：１とするのが更に好ましい。反応溶媒としては、特に有機溶媒を使用しなくともよい。反応に使用する酵素の量は、基質１g あたり、可溶性デンプン分解活性として１００〜１００００００Uとするのが好ましく、１０００〜１０００００U とするのが更に好ましい。
【００２８】
（酵素活性測定）
酵素活性測定は次のように行っている。先ず、０．１１％(w/v)可溶性デンプン-５０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐH ６．８) ０．４５ｍｌに対し、酵素溶液 ５０μｌを加えて４０℃で１０分間反応させた。そして、０．５Ｎ 塩酸１．０ｍｌを加えて反応を停止させ、５ｍＭ ヨウ素溶液 １．０ｍｌを加え、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、酵素活性の１Ｕは、６６０ｎｍにおける吸光度を１分間に１％低下させる量と定義している。
【００２９】
また、反応温度は、用いる酵素の最適温度となるように設定すればよく、２０〜６０℃が好ましく、４０〜５５℃が更に好ましい。反応時間は、酵素の量、反応温度等により反応速度が異なるので、反応の進み具合に応じて決めればよいが、通常、４８〜７２時間程度で十分な量のカフェー酸グルコシドが生成する。なお、使用する酵素を不溶性担体に固定化することにより、製造した桂皮酸配糖体から酵素を除くステップを省略することもできる。
【００３０】
得られた反応液から桂皮酸配糖体を単離精製するには、まず、反応液を遠心分離（例えば、１５０００rpm ，５分間 ）し、上清を回収する。次に、得られた溶液を濃縮乾固し、蒸留水を加え、水溶性画分を分離する。この水溶液画分から、例えば、ＩｎｅｒｔｏｓｉｌＯＤＳカラムを用いた（溶出液３０％メタノール）ＨＰＬＣで、桂皮酸配糖体を分離することができる。
【００３１】
以下、本発明を参考例、実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（変異株のスクリーニング）
２．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＮＢＲＣ １４１４１懸濁液にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を５００、１０００、２０００μｇ／ｍｌ(終濃度)となるように添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。これを下記表１（８０２平板培地の組成）に示す８０２平板培地に塗抹して３７℃で培養を行い、１２００個のコロニーを単離した。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
これらのコロニーを下記表２（TF培地の組成）に示すＴＦ培地に移植し、３７℃で１５〜１６時間培養してから、５ｍＭ ヨウ素溶液を平板にかけてしばらく室温で保った後、コロニー周辺に形成されたクリアゾーンの直径とコロニーの直径を測定し、(クリアゾーンの直径)／(コロニーの直径)の値を求めた。その結果、野生株よりも値がとくに高かったＭ４２株(親株、５； Ｍ４２株、７)を選出した。
【００３５】
【表２】
0005223128.tif 000003
【００３６】
（Ｔ培地で液体培養した変異株とＮＢＲＣ１４１４１株の酵素活性の比較）
変異株Ｍ４２とＮＢＲＣ１４１４１株を下記表３（T培地の組成）に示すＴ培地  ５ｍｌで３７℃、２４時間前培養し、これを１００ｍｌ  Ｔ培地に１ｍｌ移種し、３７℃で振盪培養して一定時間ごとにサンプリングを行い、濁度と酵素活性を比較した。
【００３７】
【表３】
0005223128.tif 000004
【００３８】
（酵素活性測定）
酵素の活性測定は次のように行った。０．１１％（ｗ／ｖ）可溶性デンプン−５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．８）  ０．４５ｍｌを４０℃、１０分間予備加温し、酵素溶液  ０．０５ｍｌを加えて４０℃で１０分間反応させた。０．５Ｎ  塩酸１．０ｍｌを加えて反応を停止させ、５ｍＭ  ヨウ素溶液  １．０ｍｌを加えて２０分間室温に保って残存しているデンプンを発色させた。６６０ｎｍにおける吸光度をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２６５ＦＳ  分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏ．）で測定した。酵素  １Ｕは６６０ｎｍにおける吸光度を１分間に１％低下させる量と定義した。以後の実験での酵素活性は全てこの方法で測定した。
【００３９】
３株は２５〜３０時間で対数期末期に達し、その後、時間の経過とともに濁度が下がり死滅期に入っていった。Ｔ培地では変異株（Ｍ４２）よりも親株（１４１４１）の方が濁度が高かった（図１）。
また３株とも１００時間前後で最も高い活性を示し、その活性はNBRC１４１４１株が１８２４２Ｕ/ｍｌ、M４２株が２０８１０Ｕ/ｍｌであった（図２）。
【００４０】
（ＴＦ培地で培養した変異株とＮＢＲＣ１４１４１株の酵素活性の比較）
変異株Ｍ４２株とＮＢＲＣ１４１４１株を下記表４（T平板培地の組成）に示すＴ平板培地に３７℃で培養して、菌懸濁液を調製し、菌懸濁液をＴＦ培地に接種し、３７℃で６日間培養した。その後培養液を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、その上清を酵素活性の測定に使用した。
【００４１】
【表４】
0005223128.tif 000005
【００４２】
TF培地に生産された酵素活性の最大値はNBRC１４１４１株が１１８４５U/ｍｌ、Ｍ４２株が１９９０６Ｕ/ｍｌであった（図３）。
【００４３】
Ｍ４２株は液体培地で振盪培養するよりも、上記表２に示すＴＦ培地で静置培養したときのほうが良好に酵素を生産し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  １４１４１株よりも高い酵素活性を示した（ｐ＜0.01）。
【００４４】
すなわち今回行ったＮＴＧによる変異処理と、０．４％寒天を含むＴＦ培地で培養したことによって酵素生産能の高い菌株、および酵素生産条件を得ることができた。
【００４５】
（液体培養から粗酵素溶液の調製）
変異株Ｍ４２株を上記表３に示すＴ培地５ｍｌに３７℃で一晩前培養し、３ｍｌをＴ培地３００ｍｌに移種し、３７℃で１２０時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上清を８０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、一晩、８℃で攪拌した。遠心分離して、得られた沈殿物を少量の０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。この溶液を透析したものを粗酵素溶液として、電気泳動用のサンプルに用いた。
【００４６】
（ＴＦ培地から酵素の精製）
変異株Ｍ４２株を上記表４に示すＴ平板培地に３７℃で前培養し、菌懸濁液を調製した。これを上記表２に示すＴＦ培地に移種し、３７℃で６日間培養した。遠心分離して、得られた上清に３０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、一晩、８℃で攪拌した。これを遠心分離して得られた上清に８０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、一晩、８℃で攪拌した。これを再び遠心分離して沈殿物を少量の０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。この溶液を透析したものを粗酵素溶液とした。この粗酵素溶液をフェニルセファロースカラムにアプライして酵素を吸着させ、硫酸アンモニウムの濃度を10％(ｖ／ｖ)から０％にグラジエントをかけることによって酵素を精製し電気泳動用のサンプルに用いた。
【００４７】
（酵素のＰＡＧＥでの活性染色）
前述の調製方法で調製した粗酵素溶液を用いてPAGEを行った。PAGEのアクリルアミドゲル濃度は１０％で、泳動にはトリス-グリシン緩衝液(ｐＨ ８．３)を用い、１２５V、２５mA、８０分間泳動した。さらに３％(w／v)可溶性デンプン-０．５M リン酸緩衝液(pH ６．８)溶液に浸し、４０℃で４０分間インキュベートした後、ゲルを５ｍＭ  ヨウ素溶液に浸してデンプンを染色した。
【００４８】
レーン（１）はＣＢＢ染色した結果で、ほぼ単一のバンドを示した（図４）。またレーン（２）は活性染色した結果で、出現したタンパクバンドの中から最も太いバンドが活性染色で酵素反応を示した。すなわちこの太いバンドが目的とする酵素タンパクである。
【００４９】
（酵素のＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分子量測定）
液体培養した培養液とＴＦ培地で静置培養した培養液から調製した粗酵素溶液をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのアクリルアミドゲル濃度は１０％で、泳動には０．１％ＳＤＳを含んだトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ  ８．３）を用い、１２５Ｖ、２５ｍＡ、８０分間の条件で行った。泳動後のゲルをＣＣＢ染色液にて３０分間染色し、メタノール：酢酸：水／３：１：６（ｖ／ｖ／ｖ）でバックグラウンドが透明になるまで脱色した。
【００５０】
精製した酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し夾雑するバンドの数、分子量の測定、活性バンドの確認を行った。２種類の方法で培養し、精製した酵素はSDS-PAGEにより単一のバンドが得られ、その分子量は５９．５ｋＤａであった（図５、図６）。
【００５１】
（変異株の生産する精製酵素の調製）
上記表３に示すＴ培地１０mlに変異株Ｍ４２を接種し、一晩前培養した。その菌懸濁液を２５μlずつ、上記表２に示すＴＦ培地１６００mlに移種し、３７℃で６日間静置培養した。培養液を遠心分離し、得られた上清に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩８℃で攪拌した。また遠心分離で得られた上清に５０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、一晩８℃で攪拌した。また遠心分離で得られた上清に８０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、一晩８℃で攪拌した。これを遠心分離して得られた沈殿物を少量の０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。この溶液を透析したものを粗酵素溶液とし、この粗酵素溶液をフェニルセファロースカラムにアプライして酵素を吸着させ、硫酸アンモニウムの濃度を10％(ｖ／ｖ)から０％にグラジエントをかけることによって目的とする酵素を精製した。
【００５２】
（カフェー酸グルコシドの合成）
終濃度２．５％（ｗ／ｖ）となるよう調整したグルコースとカフェー酸／１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．８）、酵素溶液４０００Ｕを１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に加え、４５℃、４０時間攪拌しながら反応させた。
【００５３】
（ＴＬＣ分析）
ＴＬＣ分析にはシリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレートを用い、酢酸エチル：酢酸：水／３：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）で展開後、ＵＶ（２５４ｎｍ）によりスポットを確認した。またエタノール：硫酸＝１：１（ｖ／ｖ）で噴霧後、１１０〜１２０℃で加熱し、発色させることによりスポットを呈色した。
【００５４】
（反応液から生成物の精製）
反応混合物に２倍量のエタノールを添加して反応を停止させた後、遠心分離で得られた上清をシリカゲルカラムにアプライし、まず酢酸エチルで未反応のカフェー酸を溶出させた。その後メタノールで目的物質を溶出させた。この溶液を減圧濃縮し、分取ＨＰＬＣにて分取を行い、合成された生成物を回収した。
ここで、ＨＰＬＣ分取には、PLC−５６１ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ.）を用いた。カラムはＩｎｅｒｔｏｓｉｌ ＯＤＳ-３( ２５０×１９ｍｍ Ｉ．Ｄ．；ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ.)を用いた。移動相には０．２％酢酸−２０％メタノール溶液とメタノールを用い、６０分間でメタノール量が０％から５０％になるようにグラジエントをかけた。カラム温度は４０℃、流速は１５.０ｍｌ/分で行い、３２６ｎｍに吸収のあるピークを回収した。
【００５５】
生成物をＦＡＢ−ＭＳ分析した結果、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅで３４１．１４に分子イオンピークが出現したことから、分子量を３４２と決定し、カフェー酸にグルコースが１個結合した目的とするカフェー酸グルコシドと推測した（図７）。  
ここで、高速原子衝突イオン化質量分析(ＦＡＢ−ＭＳ) には、ＪＥＯＬ Ｔａｎｄｅｍ−ＭＳｔａｔｉｏｎ ＪＭＳ−７００ ＴＫＭ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，）を用いた。
また、測定条件としては、ターゲットガス；Ｘｅ、イオン化エネルギー；６ｋｅＶ、加速電圧；１０ｋＶ、スキャンレンジ；５０〜１０００ｍ/ｚで行った。マトリックスはグリセロールを用い、サンプルをマトリックスに溶解後、イオン源へ導入し測定した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、桂皮酸から桂皮酸配糖体を簡便な方法で合成する製造方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】NBRC１４１４１株と変異株をT培地で培養したときの酵素活性を示す図
【図２】NBRC１４１４１株と変異株をT培地で培養したときの酵素活性を示す図
【図３】TF培地培養時の酵素活性を示す図(n=6) （ｐ＜0.01  v.s. NBRC14141）
【図４】M42株から調製した精製酵素のPAGEを示す図。（（１）タンパク染色，（２）活性染色）
【図５】M42株から調製した粗酵素のSDS-PAGEを示す図（（１）精製した酵素，（２）マーカー(low range)）
【図６】酵素の分子量を示す図
【図７】生成物CのFAB-MS分析結果(negative ion mode)を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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