(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  試料中のARMET（変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ）タンパク質の濃度を測定する工程、および
(b)  工程(a)の測定結果を癌の検出に使用する工程
を含む、インビトロでの肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌の検出方法であって、前記試料は血清または血漿であり、ARMETタンパク質の増大した濃度は肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌を示す、方法。
【請求項２】
(a')  該試料中の癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、および
(b')  工程(a')の測定結果を、肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌の検出に使用する工程
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌が肺癌であることをさらに特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記工程(b')の1つ以上の他のマーカーが、Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよび/またはNNMTからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該濃度が、免疫学的方法により測定されることをさらに特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌の検出における、試料中のARMET（変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ）タンパク質の使用であって、ARMETタンパク質の増大した濃度は肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌を示し、該使用は、以下の工程：
(a)  試料中のARMETタンパク質の濃度を測定する工程、および
(b)  工程(a)の測定結果を癌の検出に使用する工程
により実施される、使用。
【請求項７】
肺癌および/または結腸癌の検出における、請求項６記載の使用。
【請求項８】
肺癌の検出における、請求項６記載の使用。
【請求項９】
該肺癌が非小細胞肺癌（NSCLC）である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌のインビトロ検出における、試料中のARMET（変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ）タンパク質に対する抗体の使用であって、ARMETタンパク質の増大した濃度が肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌を示し、該使用は、以下の工程：
(a)  試料中のARMETタンパク質の濃度を該抗体を用いて測定する工程、および
(b)  工程(a)の測定結果を癌の検出に使用する工程
により実施される、使用。
【請求項１１】
肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌のインビトロ検出における、試料中のARMET（変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ）タンパク質を含むマーカーパネルの使用であって、ARMETタンパク質の増大した濃度が肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌を示し、該使用は、以下の工程：
(a)  試料中のARMETタンパク質の濃度を測定する工程、および
(b)  工程(a)の測定結果を癌の検出に使用する工程
を含む方法により実施される、使用。
【請求項１２】
該マーカーパネルが、癌の1つ以上の他のマーカーをさらに含み、該方法が、
(a')   試料中の該癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、および
(b')  工程(a’)の測定結果を、肺癌、結腸癌、乳癌または卵巣癌の検出に使用する工程
をさらに含む、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
該1つ以上の他のマーカーが、Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよび/またはNNMTからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
肺癌の検出における、請求項１１〜１３いずれか記載の使用。
【請求項１５】
該肺癌が非小細胞肺癌（NSCLC）である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
ARMETタンパク質を特異的に測定するために必要な試薬を含む、請求項１記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
ARMETタンパク質を特異的に測定するために必要な試薬および癌の1つ以上の他のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、請求項２記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、癌の評価の補助方法に関する。本発明は、異なる種類の癌のユニバーサルマーカーとしての転移型初期腫瘍内アルギニンリッチタンパク質(arginine-rich metastasized in early tumors protein)(=ARMET)の使用を開示する。ARMETは、肺性癌もしくは肺癌(LC)または結腸癌、例えば非小細胞肺癌(NSCLC)または結腸直腸癌(CRC)の評価だけでなく、おそらく他の特定の型の癌の評価も補助する。かかる特定の癌の型は、例えば、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃または胆管の癌である。さらに、本発明は、特に、個体由来の液体試料中のARMETの測定による、前記試料からの癌の評価方法に関する。ARMETの測定は、癌の早期検出または手術を受けている患者のサーベイランスに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
検出および治療の進歩にも関わらず、癌は主要な公衆衛生課題のままである。癌細胞は、癌関連マーカータンパク質の生成を特徴とする。癌関連タンパク質は、癌細胞を有する個体の組織中および体液中の両方に見られる。これらのレベルは、通常、癌進行の初期病期で低く、疾患進行中に増大し、まれな場合にのみタンパク質が疾患進行の経過中に減少したレベルを示して観察される。これらのタンパク質の感度の高い検出は、癌の診断、特に癌の初期病期の診断の有利で有望なアプローチである。最も罹病率が高い癌の型は、乳癌(BC)、肺癌(LC)および結腸直腸癌(CRC)である。
【０００３】
固形腫瘍のための最も重要な治療アプローチは、
a)腫瘍の外科切除、
b)化学療法、
c)放射線療法、
d)生物製剤、例えば抗腫瘍抗体または抗脈管形成抗体を用いた治療、および
e)上記方法の組み合わせ
である。
【０００４】
腫瘍の外科切除は、初期病期の固形腫瘍の第一線治療として広く受け入れられている。しかし、ほとんどの癌は、症状が出た場合、即ち患者が既に疾患進行のかなり後期病期にある場合にのみ検出される。
【０００５】
癌の病期分類は、程度、進行、および重症度の点での疾患の分類である。これは、一般化が予後および治療の選択について行われ得るように、癌患者を分類する。
【０００６】
CRCの種々の病期はデュークス病期A〜Dに従って分類されていた。今日、TNMシステムは、癌の解剖学的程度の最も広く使用される分類である。これは、国際的に受け入れられた統一病期分類システムを表す。3つの基本変数: T(原発性腫瘍の程度)、N(限局的リンパ節の状態)およびM(遠位転移の存在または非存在)がある。TNM基準は、UICC(国際対癌連合), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (編): TNM Classification of Malignant Tumours, 第6版, (2002))によって公表されている。TNM状態が決定されると、患者は、I〜IVのローマ数字で示される病期に分類され、IVが最も進行した病期となる。TNM病期分類およびUICC病期は、Sobin and Wittekind (編)上掲から得られる以下の表に示されるように互いに対応する。
【０００７】
0005368579.tif 000002
【０００８】
特に重要なことは、癌、例えばCRCの早期診断が非常に良好な予後に解釈されることである。CRCにおいて、結腸直腸の悪性腫瘍は、良性腫瘍、即ち腺腫から生じる。従って、最良の予後は腺腫病期で診断される患者にある。病期Tis、N0、M0またはT1〜3；N0；M0ほどの早期で診断された患者は、適切に治療されると、遠位転移が既に存在するときに診断された患者のわずか10％の5年生存率と比べて、診断後の90％を超える5年の生存機会を有する。
【０００９】
現在の検出方法、例えば、X線または核共鳴画像化などの画像化方法は、理論的に、一般的なスクリーニングツールとしての使用に少なくとも部分的に適切であり得る。しかし、これらは、非常に費用がかかり、多数の被験体、特になにも腫瘍症状がない被験体のマススクリーニングにおける一般的で広範な使用のための健康管理システムには価格が手頃ではない。
【００１０】
従って、本発明の課題は、腫瘍評価の単純で費用効率的な手順を提供すること、例えば癌を有すると疑われる個体を同定することである。この目的のために、体液、例えば血液または血清または血漿で検出可能な一般腫瘍マーカーあるいはかかるマーカーのパネルが望ましい。
【００１１】
多くの血清腫瘍マーカーが既に臨床使用にある。例えば、サイトケラチン19(CYFRA 21-1)の可溶性30kDa断片、癌胎児性抗原(CEA)、神経特異的エノラーゼ(NSE)および扁平上皮癌抗原(SCC)が最も顕著なLCマーカーである。しかし、これらのいずれもがスクリーニングツールに必要な感度および特異性の基準を満たさない(Thomas, L., Labor und Diagnose TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany(2000))。
【００１２】
臨床で有用であるために、単一マーカーとしての新規診断マーカーが、当該技術分野で公知の他のマーカーに匹敵すべきであるか、または該マーカーよりも優れているべきである。即ち、それぞれ単独でまたは1つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用される場合のいずれかで、新規マーカーが診断感度および／または特異性における進歩をもたらすべきである。試験の診断感度および／または特異性は受信者動作特性によって最も評価され、これを以下で詳細に記載する。
【００１３】
全血、血清または血漿は、臨床ルーチンで最も広く使用される試料の供給源である。信頼性の高い癌検出を補助し、または初期予後情報を提供する初期腫瘍マーカーの同定によって、この疾患の診断および管理を大いに補助する方法がもたらされる。従って、癌、特にLCのインビトロ評価を改善するための緊急の臨床必要性が存在する。早期に診断される患者の生存機会が疾患の進行した段階で診断される患者と比べて非常に高いために、癌、例えばLCの早期診断を改善することが特に重要である。
【００１４】
肺癌における生化学マーカーの臨床有用性が最近概説された(Duffy, M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262)。
【００１５】
CYFRA 21-1は、肺癌について現在公知の腫瘍マーカーのうちで最良のものであると現在みなされている。臓器特異的ではないが、これは主に肺組織で見られる。肺癌のためのCYFRA 21-1の感度は、他の良性肺疾患に対して95％の特異性で46〜61％であると記載されている。CYFRA 21-1の増大した血清レベルはまた、顕著な良性肝臓疾患、腎臓機能不全および浸潤性膀胱癌と関連している。CYFRA 21-1試験は、手術後治療サーベイランスに推奨される。
【００１６】
CEAは癌胎児抗原の群に属し、通常胚発生中に生成される。CEAは、臓器特異的ではなく結腸直腸癌のモニタリングに主に使用される。悪性疾患の他にも、いくつかの良性疾患、例えば肝硬変、気管支炎、膵臓炎および自己免疫疾患がCEA血清レベルの増大と関連している。良性肺疾患に対する95%特異性で、肺癌の感度は29〜44%であると報告されている。CEAの主な使用は、特に転移した場合の結腸癌のモニタリングにおいてである。しかしながら、乳癌などの種々の癌が高レベルのCEAを産生し得る。CEAの好ましい使用は、肺癌の治療サーベイランスである。
【００１７】
NSEはSCLCの腫瘍マーカーである。一般的に、NSE血清レベルの増大は、神経外胚葉腫瘍および神経内分泌腫瘍に関連していることが分かっている。また、増大した血清レベルが、良性肺疾患および脳疾患、例えば髄膜炎または脳の他の炎症疾患および頭部への外傷損傷を有する患者で見られる。95％特異性でのSCLCの感度が60〜87％であると報告されているが、NSCLCのNSE試験の性能は不良である(7〜25％)。NSEは、SCLCの治療サーベイランスに推奨される。
【００１８】
糖脂質上のCA 19-9(糖鎖抗原19-9)、シアリル化ルイス(a)抗原)は、胃腸の癌の腫瘍マーカーである。これは、胎児の胃、腸および膵臓の上皮に生じる。また、肝臓、肺および膵臓の成人組織にも低濃度で見られ得る。腫瘍質量とCA 19-9アッセイ値との間に相関性はない。したがって、CA 19-9の測定を膵臓の癌腫の早期検出に使用することはできない。ムチンは肝臓でのみ分泌されるため、場合によっては、わずかな胆汁欝滞でさえ、明白なCA 19-9血清レベルの上昇をもたらし得る。該マーカーは、主に、確認された膵臓の癌(感度70〜87%)を有する患者の疾患状態のモニタリングにおける補助として使用される。該集団の3〜7%は、ルイスa陰性/b陰性血液型構成を有し、決定基CA 19-9と反応性であるムチンを発現することができない。このことは、所見を解釈する際に考慮されなければならない。
【００１９】
CA 125は、上皮起源の非粘液性卵巣腫瘍において高い割合で見られ、血清中に検出され得る。卵巣癌腫は婦人科系腫瘍の約20%を占める。最も高いCA 125値は、卵巣癌腫に苦しむ患者で生じるが、明白な高値は、子宮内膜、乳房、胃腸管の悪性腫瘍、および種々の他の悪性腫瘍でも観察される。上昇値は、場合によっては、卵巣嚢、卵巣化生、子宮内膜症、子宮筋腫または子宮頚管炎などの種々の良性婦人科系疾患に見られる。また、このマーカーのわずかな上昇は、妊娠初期および種々の良性疾患(例えば、急性および慢性膵炎、良性胃腸の疾患、腎機能不全、自己免疫疾患など)でも起こり得る。顕著に高いレベルが、肝硬変および肝炎などの良性肝臓疾患で見られている。極端な上昇は、悪性疾患および良性疾患により任意の種類の腹水において起こり得る。CA 125は比較的非特異的なマーカーであるが、これは、今日では、漿液性卵巣癌腫を有する患者の治療および進行のモニタリングのための最も重要な腫瘍マーカーである。82〜93%の特異性で69〜79%の感度が報告されている。
【００２０】
PSA (「前立腺関連抗原」)は、血液試験で使用される、一般的に試験される腫瘍マーカーである。PSAは、高い組織特異性を有するようである; この糖タンパク質は、正常前立腺上皮および分泌物中に見られるが、他の組織には見られない。PSAは、前立腺癌の存在に高度に感受性である。その上昇は、病期および腫瘍体積に相関していた。これにより、再発および治療に対する応答が予測される。最後に、この抗原は、手術前に非常に高い値を有する患者は再発する可能性があるという予後値を有する。
【００２１】
NNMT(ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ；Swiss-PROT: P40261)は、29.6kDaの見かけ分子量および5.56の等電点を有する。NNMTは、ニコチンアミドおよび他のピリジンのN-メチル化を触媒する。この活性は多くの薬物および生体異物化合物の生体内変化に重要である。該タンパク質は肝臓で主に発現することが報告されており、細胞質に存在する。NNMTは、ヒト肝臓のcDNAからクローニングされ、264アミノ酸のタンパク質をコードする792ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、29.6kDaの計算分子量を有する(Aksoy, S. et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840)。文献ではヒト癌における酵素の潜在的役割についてはほとんど知られていない。ある論文では、肝臓NNMT酵素活性の増大がマウスにおける癌悪液質のマーカーとして報告された(Okamura, A., et al., Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656)。最近の報告で、放射線感受性細胞株の放射線に応答するNNMT遺伝子の下方調節が示された(Kassem, H., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460)。最近、NNMTがCRCの評価において重要であることが見い出された(WO 2004/057336)。
【００２２】
ProGRPは、SCLCの検出およびモニタリングに有用な腫瘍マーカーである。また、特発性肺性線維症またはサルコイドーシスなどの非悪性肺/胸膜性疾患を有する患者では、血清レベルの増大が見られる。SCLC領域におけるproGRPの感度(95%特異性で)は47〜86%であると報告されているが、NSCLC領域におけるproGRP試験の成績は、感度が10%未満であると報告されているため良好でない。
【００２３】
SCCは、もともと、子宮頚の扁平上皮細胞CAにおいて同定された。LCのSCCの感度は一般に低い(18〜27%)。したがって、SCC試験は、スクリーニングに適していないとみなされている。しかしながら、扁平上皮細胞CAに対する感度は高いため、SCCに対する好ましい使用は治療サーベイランスであるが、一般的には、CYFRA 21-1の方が良好な機能を果たす。
【００２４】
マーカーのプロファイリングに関して、および肺癌の診断の改善を目的として、CYFRA 21-1、NSEおよび一般的な炎症マーカーのC反応性タンパク質(CRP)の血清レベルを組み合わせるファジー論理系分類アルゴリズムを使用する方法が公表された(Schneider, J., ら、Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。筆者らは、95％の特異性で92％の感度を報告している。しかし、この研究で、例えば単一腫瘍マーカーとしてCYFRA 21-1の感度は、95％の特異性で72％であると報告され、これは多くの他の報告された研究よりも有意に高い。Duffy，M.J.，in Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.  38(2001)225-262は、46%〜61%の感度を報告している。Schneiderらによって達成されたこの普通ではない高性能は、ある疑いを引き起こすが、いくつかの事実によるものであり得る。第一に、対照患者の集団は患者集団よりも若いように思われ、即ち両方の集団は年齢で十分適合しておらず、患者集団は多くが後期病期を含む。第二におよびさらにより重要にも、アルゴリズムの性能がファジー論理修飾子の決定に使用された訓練集団の試料について調べられている。したがって、これらの修飾子は、厳密に言うとこの集団に「仕立て」たものであって、独立した確認集団には適用されない。通常の状況下で、大きく、独立し、かつ十分にバランスがとれた確認集団に適用される同じアルゴリズムが有意に減少した全体性能をもたらすことが予期されるはずである。
【発明の概要】
【００２５】
本発明の課題は、癌疾患の評価に使用され得る生化学マーカーが同定され得るかどうかを調べることであった。特に、本発明の発明者らは、組織試料または体液中で、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌などの種々の癌の型を評価するための生化学マーカーが同定され得るかどうかを調べた。
【００２６】
驚くべきことに、生化学マーカーとしてのARMETタンパク質の使用は、当該技術分野の水準で現在公知のマーカーの問題のいくつかを少なくとも部分的に克服し得ることが見出された。
【００２７】
本発明は、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度を試料中で測定する工程、ならびに癌の評価において測定結果、特に測定された濃度を使用する工程を含む、インビトロでの癌の評価方法に関する。
【００２８】
驚くべきことに、試験試料中のARMETタンパク質および／またはその断片の濃度の増大が癌の発生と関連することが見出された。ARMETは、単一型の癌に特異的なマーカーではなく、異なる型の癌のマーカー、即ち一般腫瘍マーカーであることが見出された。ARMETは腫瘍形成プロセスにかなり特異的であるように思われるため、新規腫瘍マーカーARMETは、様々なクラスの腫瘍型について臨床で有用である可能性が高い。
【００２９】
本発明の方法は、多くの種々の型の癌の評価に適切である。正常対照と比べて試料中のARMETタンパク質および／またはその断片の濃度の増大は、特定の型の癌、例えば、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌のそれぞれで見られた。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌などの特定の型の癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３１】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓または前立腺の癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３２】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜または黒色腫の癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺、結腸、乳房、子宮頚、子宮内膜または卵巣の癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３４】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺、結腸、乳房または卵巣の癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺癌(LC)または結腸直腸癌(CRC)などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３６】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、肺癌(LC)などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３７】
本発明の別の好ましい態様によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が、結腸直腸癌(CRC)などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００３８】
本発明の一態様は、おそらく癌のない個体と、「疑いのある」症例として分類され得る個体とを区別するための集団のマススクリーニングに関する。後者の群の個体は、次に例えば画像化方法または他の適切な手段により、さらなる診断手順に供され得る。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、一般的な癌の診断に適切な腫瘍マーカーパネルまたは特定の腫瘍型、例えば肺癌の診断に適切な腫瘍マーカーパネルの改善に関する。
【００４０】
本発明はまた、ARMETタンパク質および／またはその断片ならびに癌に特異的な１つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された測定結果、特に濃度を癌の評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌の評価方法に関する。ARMETと組み合わせた使用に好ましいマーカーは、一方で、一般腫瘍マーカー(即ち、単一腫瘍型に特異的ではないマーカー)または他方で特異的腫瘍マーカー(単一腫瘍型に特異的なマーカー)のマーカーである。例えば、肺癌または結腸癌などの癌の評価に好ましいマーカーは、Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTである。これらのマーカーは、個々にそれぞれまたはARMETと共に任意の組み合わせで使用され得る。
【００４１】
本発明のこの方法により癌が評価される場合、それぞれの癌の1つ以上の他のマーカーは、好ましくはCyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTからなる群より選択される。
【００４２】
したがって、好ましい態様において、本発明はまた、癌、例えば肺癌および／または結腸癌の評価における、少なくともマーカーARMETならびに少なくとも1つの他の腫瘍マーカー、例えばCyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４３】
好ましくは、本発明は、ARMETおよび／またはその断片ならびに１つ以上の他の癌マーカー、例えば肺または結腸の癌の１つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された測定結果、特に濃度を癌の評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌、例えば肺癌または結腸癌の評価方法に関する。１つ以上の他のマーカーは、Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTからなる群より選択されることが好ましい。
【００４４】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびCYFRA 21-1を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４５】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびCEAを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４６】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびNSEを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４７】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびCA 19-9を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４８】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびCA 125を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００４９】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびPSAを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５０】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびproGRPを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびSCCを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５２】
本発明はまた、癌、詳しくはLCまたは結腸癌、より詳しくはNSCLCまたは結腸直腸癌の評価における、少なくともARMETおよびNNMTを含むマーカーパネルの使用に関する。本発明はまた、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度の増大が癌を示す、癌の評価におけるARMETタンパク質および／またはその断片の使用に関する。
【００５３】
本発明はまた、いくつかの特定の型の癌、詳しくは肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌の評価におけるARMETの使用に関する。
【００５４】
本発明はまた、ARMETおよび／またはその断片の濃度の増大が癌を示す、癌の評価におけるARMETタンパク質および／またはその断片に対する抗体の使用に関する。
【００５５】
本発明はまた、少なくとも、ARMETタンパク質および／またはその断片ならびに癌の１つ以上の他のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００５６】
本発明はまた、少なくとも、ARMETタンパク質および／またはその断片ならびに任意に癌の１つ以上のマーカー、例えば上記のような肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含み、他のマーカーが個々にまたは任意の組み合わせでそれぞれ使用され得る、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００５７】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびCYFRA 21-1それぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００５８】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびCEAそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００５９】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびNSEそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６０】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびCA 19-9それぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６１】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびCA 125それぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６２】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびPSAそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６３】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびproGRPそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６４】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびSCCそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも、ARMETおよびNNMTそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬ならびに任意に、測定を行うための補助試薬を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００６６】
好ましい態様において、本発明は、a)ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度、b)任意に癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびに(c)癌の評価において工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を使用する工程を含み、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度の増大が癌を示す、インビトロでの癌の評価方法に関する。
【００６７】
用語「測定」は、好ましくは試料中のARMETタンパク質および／またはその断片の定性的、半定性的、または定量的測定を含む。好ましい態様において、測定は、半定量的測定であり、即ち、ARMETの濃度がカットオフ値より上か下にあるかどうかを測定する。当業者に認識されるように、はい(存在)またはいいえ(非存在)アッセイで、アッセイ感度は、通常、カットオフ値に適合するように設定される。例えばカットオフ値は、健常個体の群の試験から決定され得る。好ましくは、カットオフは90％の特異性をもたらすように設定され、また好ましくはカットオフは95％の特異性をもたらすように設定され、あるいはまた好ましくはカットオフは98％の特異性をもたらすように設定される。カットオフ値より上の値は、例えば癌の存在を示し得る。特に、カットオフ値より上の値は、例えば肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌の存在を示し得る。さらに好ましい態様において、ARMETの測定は、定量的測定である。さらなる態様において、ARMETの濃度は、基礎にある診断問題、例えば疾患の病期、疾患進行、または治療への応答などに相関させられる。
【００６８】
別の好ましい態様において、カットオフは90%の感度がもたらされるように設定され、また、好ましいカットオフは95%の感度がもたらされるように設定され、または好ましいカットオフは98%の感度がもたらされるように設定される。
【００６９】
カットオフ値より下の値は、例えば、癌がないことを示すものであり得る。特に、カットオフ値より下の値は、例えば、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌がないことを示すものであり得る。
【００７０】
さらに好ましい態様では、ARMETの測定は定量的測定である。さらなる態様において、ARMETの濃度は、基礎にある診断問題、例えば疾患の病期、疾患進行、または治療への応答などに相関させられる。
【００７１】
ARMET(変異型初期腫瘍内アルギニンリッチ、ARP、Swiss-PROT ID: P55145)タンパク質の生物学的役割および機能は依然として不明なことが多い。配列番号:1 (図6)に示す配列を特徴とするARMETタンパク質は20.3kDaのタンパク質である。ARMETタンパク質は、179アミノ酸からなり、予測シグナル配列(aa 1〜21)を有する。対応する遺伝子は、染色体バンド3p21.1に存在し、最初にShridhar，V. et al.によって特徴付けられた (Oncogene 12 (1996) 1931-1939)。この遺伝子は高度に保存されており、ラット、マウス、ウシおよびハムスターなどの多くの哺乳動物種に見られ得る。ARMETは、初期の研究によって、ARMETがN末端にアルギニンリッチ領域を有する50アミノ酸長であることが示唆されたため、そのまま命名された(Shridhar，V. et al.，Oncogene 12 (1996) 1931-1939; Shridhar，R. et al.，Cancer Res. 56 (1996) 5576-5578; Shridhar，V. et al.，Oncogene 14 (1997) 2213-2216)。しかしながら、より最近の研究では、該アルギニン部分をコードしないより小さいオープンリーディングフレームの転写の証拠が示されている(Tanaka，H. et al.，Oncol. Rep. 7 (2000) 591-593; Mizobuchi，N. et al.，Cell Struct. Funct. 32 (2007) 41-50)。対応タンパク質サイズの補正により、初期に記載された変異コドン(ATG50)は、現在、開始コドンであることが確認されている。
【００７２】
ARMET遺伝子に関する初期の研究により、特定の変異(ATG50 → AGG)が腎細胞癌、非小細胞肺癌、頭部および頚部癌、乳癌、および膵臓癌などの多くの充実腫瘍の試料の特定のサブセットに存在することが示された(Shridhar，V. et al.，Oncogene 12 (1996) 1931-1939; Shridhar，R. et al.，Cancer Res. 56 (1996) 5576-5578; Shridhar，V. et al.，Oncogene 14 (1997) 2213-2216)。しかしながら、より最近の研究では、ARMET多型と膵臓癌間の相関性はないことが示唆されている(Piepoli，A. et al.，World J. Gastroenterology 12 (2006) 6343-6348)。
【００７３】
Petrova，P. et al. (J. Mol. Neurosci. 20 (2003) 173-188)により、ラット中脳1型星状細胞細胞株の条件培地からARMET遺伝子産物が精製され、MANF (中脳星状細胞由来神経栄養因子)と命名された。ごく最近の研究により、ミスフォールディングタンパク質が小胞体(ER) 内に蓄積されるとARMETが活性化されるプロセスである「アンフォールドタンパク質応答」(UPR)によってARMETが上方調節されることが示された(Tanaka，H. et al.，Oncol. Rep. 7 (2000) 591-593; Apostolou、A. et al.，Exp. Cell Res. 314 (2008) 2454-2467)。この研究に基づき、ARMETは、UPRの適応的経路の新規な分泌媒介因子と特徴付けられている。
【００７４】
ATG50の変異に関する研究の他には、ARMETを癌の診断または予後に関連付けるさらなる研究は、文献にみられない。特に、過剰発現に関連する腫瘍は、転写解析においても、該タンパク質の存在に対する研究においても、まだ報告されていない。
【００７５】
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、本項のものと関連する意味を有する。
【００７６】
冠詞「a」および「an」は、１つまたは1つより多く(即ち少なくとも１つ)の冠詞の文法的目的語を示すために本明細書で使用される。例として、「マーカー(aマーカー)」は、1つのマーカーまたは1つより多くのマーカーを意味する。用語「少なくとも」は、任意に1つ以上のさらなる目的語が存在し得ることを示すために使用される。例として、少なくとも(マーカー)ARMETおよびCYFRA 21-1を含むマーカーパネルは、任意に１つ以上の他のマーカーを含み得る。
【００７７】
表現「1つ以上」は、1〜50、好ましくは1〜20、また好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、または15を示す。
【００７８】
用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用される場合、患者の試験試料を分析するための標的として使用される分子のことをいう。かかる分子標的の例は、タンパク質またはポリペプチドである。本発明でマーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前記タンパク質の天然バリアントおよび前記タンパク質または前記バリアントの断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことが考えられる。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続アミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるタンパク質または細胞外マトリックスに存在するタンパク質が、例えば炎症中に損傷され得、かかる断片に分解または切断され得ることを理解する。特定のマーカーは不活性化形態で合成され、次にタンパク質分解によって活性化され得る。当業者に認識されるように、タンパク質またはその断片が複合体の一部としても存在し得る。また、かかる複合体は、本発明の意味において、マーカーとして使用され得る。マーカーポリペプチドのバリアントは、同じ遺伝子によってコードされるが、例えば選択的mRNAまたはプレmRNAのプロセッシングの結果として等電点(=PI)または分子量(=MW)あるいは両方で異なり得る。バリアントのアミノ酸配列は、対応するマーカー配列に95％以上同一である。また、もしくはあるいは、マーカーポリペプチドまたはそのバリアントは、翻訳後修飾を有し得る。翻訳後修飾の非限定的な例は、グリコシル化、アシル化、および／またはリン酸化である。
【００７９】
ARMET:
ARMETタンパク質、特に可溶性形態のARMETタンパク質および／またはその断片は、適切な試料で検出される。好ましい試料は、組織試料または体液、例えば血液、血漿、血清、痰、尿、糞便、気管支肺胞洗浄液(BAL)、上皮裏層液(epithelial lining fluid)(ELF)または痰等である。好ましくは、試料は、ヒト被験体、例えば腫瘍患者または腫瘍のリスクがあるヒトあるいは腫瘍を有すると疑われるヒトに由来する。また、ARMETは血清または血漿試料中で検出されることが好ましい。
【００８０】
本発明による好ましい態様において、本発明によれば、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度が測定される。一態様において、マーカーARMETは、特異的結合剤の使用によって試料から特異的に測定される。
【００８１】
特異的結合剤は、例えばARMETのレセプター、ARMETに結合するレクチン、またはARMETに対する抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。特異的結合剤は、好ましくはその標的分子に対して108l/molあるいはまた好ましくは109l/molの親和性を有する。当業者に認識されるように、用語特異的は試料中に存在する他の生体分子がARMETに特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子に結合するレベルは、標的分子に対する結合親和性の最大わずか10％以下、わずか5％以下、わずか2％以下、またはわずか1％以下それぞれの結合親和性を生じる。好ましい特異的結合剤は、親和性および特異性の上記最小基準の両方を満たす。
【００８２】
特異的結合剤は、好ましくはARMETと反応性である抗体である。用語抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の抗原結合断片、単鎖抗体ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物のことをいう。
【００８３】
特異的結合剤の上記基準を満たす任意の抗体断片が使用され得る。抗体は、当該技術の水準の方法によって、例えばTijssen(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays、11、Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam、本全体、特に43-78頁)に記載されるように作製される。また、当業者は、抗体の特異的単離に使用され得る免疫吸着剤に基づく方法を知っている。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の質および従って免疫アッセイにおけるそれらの性能が高められ得る(Tijssen, P., 上掲、108-115頁)。
【００８４】
本発明に開示される成果のために、ウサギにおいて惹起されたポリクローナル抗体が使用され得る。しかし、明らかに、異なる種、例えばヒツジまたはヤギのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体も使用され得る。モノクローナル抗体は任意の必要量で一定した性質で生成され得るために、これらは臨床ルーチンのアッセイの開発における理想的なツールを表す。本発明の方法におけるARMETに対するモノクローナル抗体の作製および使用のそれぞれは、さらに他の好ましい態様を表す。
【００８５】
ここに、当業者は、ARMETが、癌、好ましくは肺癌または結腸癌の評価において有用なマーカーとして同定されたことを認識するため、本発明の成果に匹敵する結果に達するために様々な免疫診断方法が使用され得る。例えば、抗体を作製するための代替的戦略が使用され得る。かかる戦略は、中でも免疫化のためのARMETのエピトープを表す合成ペプチドの使用を含む。あるいは、DNAワクチン接種としても公知のDNA免疫化が使用され得る。
【００８６】
測定のために、個体から得られた試料は、結合剤ARMET複合体の形成に適切な条件下でARMETの特異的結合剤とインキュベートされる。当業者はいかなる発明の努力をすることなく、かかる適切なインキュベーション条件を容易に同定し得るために、かかる条件は特定される必要はない。結合剤ARMET複合体の量が測定され、癌、好ましくは肺癌の評価に使用される。当業者に認識されるように、特異的結合剤ARMET複合体の量を測定する多くの方法が存在し、全ては関連の教科書に詳細に記載されている(例えば、Tijssen, P., 上掲、またはDiamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (編), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)参照)。
【００８７】
好ましくは、ARMETは、サンドイッチ型アッセイ形式で検出される。かかるアッセイにおいて、一方でARMETを捕捉するために第一特異的結合剤が使用され、他方で直接的または間接的に検出可能に標識される第二特異的結合剤が使用される。サンドイッチ型アッセイ形式で使用される特異的結合剤は、ARMETに対して特異的な抗体であり得る。検出は、異なる捕捉抗体および標識抗体、即ちARMETタンパク質上の異なるエピトープを認識する抗体を使用することによって行われ得る。
【００８８】
本発明の意味において「癌のマーカー」、特に「肺癌のマーカー」および「結腸癌のマーカー」は、マーカーARMETと組み合わせた場合に、一般的な癌の評価における癌疾患の評価において、または特定の癌の型の評価において、例えばLCまたはCRCの評価において関連する情報を付加する任意のマーカーである。癌の評価に対して、所定の特異性での感度または所定の感度での特異性それぞれが、マーカーARMETを既に含むマーカー組み合わせに前記マーカーを含ませることによって改善され得る場合に、情報は関連するまたは付加的な価値とみなされる。癌評価の好ましい態様において、感度または特異性それぞれの改善は、p = .05、.02、.01以下の有意さのレベルで統計学的に有意である。好ましくは、1つ以上の他の腫瘍マーカーは、CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTからなる群より選択される。
【００８９】
用語「試料」は、本明細書で使用される場合、インビトロでの評価の目的で得られる生物学的試料のことをいう。本発明の方法において、試料または患者試料は、好ましくは任意の体液を含み得る。好ましい試料は、全血、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液(BAL)、上皮裏層液(ELF)、または痰であり、血漿または血清が最も好ましい。
【００９０】
用語「組織試料」および／または「組織切片」は、本明細書において使用される場合、インビトロ評価目的のための細胞または組織の除去を伴う、手術中に患者から採取された生物学的試料、治療的切除物または生検材料(例えば、切開生検材料、切除生検材料、コア生検材料または穿刺吸引生検材料)をいう。本発明による解析を行なう場合、組織試料物質は、直接または「組織溶解物」としてのいずれかで使用される。また、「組織試料」は、本明細書で使用されるように、通常ミクロトームの使用によって得られる組織薄片をいう。生物学的試料を伴う任意の開示された方法の態様において、かかる生物学的試料は、(必ずしもそうでなくてよいが)顕微鏡スライド上に置かれ得る、組織切片(ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片など)である、および／または新生物形成性組織(肺癌、結腸直腸癌、頭部および頚部癌、胃癌もしくはグリア芽腫など)である。
【００９１】
「組織溶解物」、「細胞溶解物」、「溶解物」、「溶解試料」、「組織抽出物」または「細胞抽出物」は、本明細書において使用される場合、溶解された組織または細胞を含む、すなわち、組織または細胞の構造的完全性が破壊された試料および／または生物学的試料物質をいう。細胞または組織試料の内容物を放出させるため、該物質は、通常、かかる組織または細胞の細胞壁および細胞膜を溶解、分解または破壊するための酵素および／または化学薬品で処理される。当業者は、溶解物を得るための適切な方法に充分精通している。このプロセスは用語「溶解」に包含される。
【００９２】
用語「癌の評価」、特に「肺または結腸の癌の評価」は、本発明の方法が（単独または他のマーカーもしくは変数、例えばUICC(上記参照)に示される基準と共に）、例えば医師が癌、特にLCまたはCRCの非存在または存在を確立または確認することを補助し、あるいは予後、再発の検出(手術後の患者の追跡)および／または治療のモニタリング、特に化学療法のモニタリングにおいて医師を補助することを示すために使用される。
【００９３】
当業者に認識されるように、任意のかかる評価がインビトロで行われる。患者試料が後で廃棄される。患者試料は、本発明のインビトロ診断方法だけに使用され、患者試料の物質は、患者の体に戻されない。典型的に、試料は、液体試料、例えば全血、血清、または血漿である。
【００９４】
特に記載のない限り、技術用語は慣用的用法に従って使用される。細胞分子生物学における一般的な用語の定義は、Lewin，B.，Genes V、published by Oxford University Press(1994)、ISBN 0-19-854287 9)；Kendrew et al.(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.出版(1994)、ISBN 0-632-02182-9)；およびMeyers，R.A.(編)、Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers、Inc.出版(1995)、ISBN 1-56081-569 8) に見られ得る。
【００９５】
好ましい態様において、本発明は、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された濃度を癌、例えばLCの評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌、例えばLCの評価方法に関する。
【００９６】
別の好ましい態様において、本発明は、ARMETタンパク質および／またはその断片の濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された濃度をLCの評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによってLCをインビトロで評価するための方法に関する。
【００９７】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、癌、特に肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌を有する患者に由来する試料から有意な割合でマーカーARMETの濃度の増大を検出できた。さらにより驚くべきことに、発明者らは、個体から得られたかかる試料中のARMETの濃度の増大が癌、特に上記癌疾患の評価において使用され得ることを示すことができた。
【００９８】
診断の理想的なシナリオは、単一の事象またはプロセスがそれぞれの疾患例えば感染性疾患を引き起こす状況である。全ての他の症例において、正確な診断は、特に疾患の病因が、多くの癌の種類、例えばLCについて当てはまるように十分に理解されていない場合に非常に困難であり得る。当業者が理解するように所定の多要因疾患例えばLCについて100％特異性および同時に100％感度で診断する生化学マーカーはない。むしろ、生化学マーカー、例えばCYFRA 21-1、CEA、CA 125、proGRP、SCC、または本明細書に示されるARMETが、特定の可能性または予測値で、例えば疾患の存在、非存在または重症度を評価するために使用され得る。従って、日常業務の臨床診断では、一般的に様々な臨床症状および生物学的マーカーは、基礎にある疾患の診断、治療および管理において共に考慮される。
【００９９】
生化学マーカーは、個々に測定され得るか、または本発明の好ましい態様においてこれらはチップまたはビーズ系アレイ技術の使用によって同時に測定され得るかのいずれかである。生物マーカーの濃度は、次に例えば各マーカーのそれぞれのカットオフを使用して独立して解釈されるか、またはこれらが解釈のために組み合わされるかのいずれかである。
【０１００】
さらに好ましい態様において、本発明の癌の評価は、a)ARMETタンパク質および／またはその断片、b)癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびにc)癌の評価において工程(a)および工程(b)それぞれで測定された測定結果、例えば濃度を使用する工程を含む方法において行われる。
【０１０１】
癌の評価において、マーカーARMETは以下の局面：スクリーニング；診断補助；予後；化学療法、放射線療法、および免疫療法などの療法のモニタリングの1つ以上で有利である。
【０１０２】
スクリーニング：
スクリーニングとは、疾患のインジケータ、例えば癌の存在について、個体、例えば危険性のある個体を同定するための試験の体系的な適用として規定される。好ましくは、スクリーニング集団は、癌のリスクが平均より高いことが知られている個体からなる。例えば、肺癌のスクリーニング集団は、喫煙者、元喫煙者、およびウラン、石英またはアスベスト曝露労働者のような肺癌のリスクが平均より高いことが知られている個体からなる。
【０１０３】
好ましい態様において、組織試料または血漿、血清、便、尿、痰、気管支肺胞洗浄液(BAL)、または上皮裏層液 (ELF)などの任意の体液が、癌、例えば肺癌のスクリーニングにおける試料として使用される。
【０１０４】
LCの別の好ましい態様において、肺癌のスクリーニングにおける試料として痰が使用される。
【０１０５】
多くの疾患について、スクリーニング目的に必要な感度および特異性の基準を常に満たす、循環中の単一の生化学マーカーはない。このことは癌、特に肺癌についてもそうであると思われる。癌のスクリーニングには複数のマーカーを含むマーカーパネルが使用されなければならないと予測されよう。本発明において確立されたデータは、マーカーARMETがスクリーニング目的に適したマーカーパネルの不可欠な部分を形成することを示す。したがって、本発明は、癌マーカーパネル、つまり、ARMETおよび癌スクリーニングのための1つ以上のさらなるマーカーを含むマーカーパネルのマーカーの1つとしてのARMETの使用に関する。特に、本発明は、一般的な癌マーカーの1つのマーカーとしてのARMETの使用に関する。かかるマーカーパネルは、マーカーARMETおよび1つ以上のさらなるマーカー、例えば一般的な癌マーカーおよび/または上記の種類の癌についてのマーカーを含む。
【０１０６】
ARMETはまた、特定の具体的な種類の癌、例えば肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌についてのマーカーパネルに寄与し得る。
【０１０７】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃または胆管の癌である。
【０１０８】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓または前立腺の癌である。
【０１０９】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜または黒色腫の癌である。
【０１１０】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺、結腸、乳房、子宮頚、子宮内膜または卵巣の癌である。
【０１１１】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺、結腸、乳房または卵巣の癌である。
【０１１２】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、肺癌(LC)または結腸癌(CRC)である。
【０１１３】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の好ましい種類は、肺癌（LC）である。
【０１１４】
ARMETを含むマーカーパネルで評価される癌の好ましい種類は、結腸癌(CRC)である。
【０１１５】
本発明のデータは、マーカーの特定の組合せは、癌のスクリーニングに有利であることをさらに示す。例えば、LCまたはCRCのスクリーニングの好ましい態様を参照して、本発明はまた、ARMETおよびCYFRA 21-1を含むマーカーパネル、またはARMETおよびCEAを含むマーカーパネル、またはARMETおよびNSEを含むマーカーパネル、またはARMETおよびCA 19-9を含むマーカーパネル、またはARMETおよびCA 125を含むマーカーパネル、またはARMETおよびPSAを含むマーカーパネル、またはARMETおよびproGRPを含むマーカーパネル、またはARMETおよびSCCを含むマーカーパネル、またはARMETおよびNNMTを含むマーカーパネルまたはARMETおよびCYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよび／またはNNMTからなる群より選択される2つ以上のマーカーを含むマーカーパネルの使用に関する。
【０１１６】
診断補助:
マーカーは、特定の臓器における良性疾患対悪性疾患の鑑別診断を補助し得るか、異なる組織学的腫瘍型の識別を補助し得るか、または手術前のベースラインマーカー値を確立し得るかのいずれかである。
【０１１７】
今日、肺癌の検出に使用される重要な方法は、放射線学および／またはコンピュータ連動断層撮影(CT)スキャンである。小結節、すなわち、疑わしい組織の小領域は、これらの方法によって可視化され得る。しかしながら、これらの結節の多く-CTで90%より多く-は良性組織変化を示し、少数の結節のみが癌性組織を示す。マーカーARMETの使用は、良性対悪性疾患の識別を補助し得る。
【０１１８】
好ましい態様において、マーカーARMETは、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃または胆管の癌、好ましくはLCの異なる組織学的型を確立または確認するために免疫組織学的方法に使用される。
【０１１９】
単独マーカーとしてのARMETは他のマーカーよりも、例えばLCの場合はCEAまたはNSEなどの他のマーカーより卓越し得るため、ARMETは、特に、手術前のベースライン値を確立することにより診断補助として使用されるものと期待されよう。したがって、本発明はまた、手術前の癌のベースライン値を確立するためのARMETの使用に関する。
【０１２０】
予後:
予後インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的または生化学的な特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画を補助すること、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al.，Tumor Biol. 24 (2003) 209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すように思われた。
【０１２１】
ARMETは単独で、癌患者、例えばLCまたはCRC患者と健常対照の識別に有意に寄与するため、ARMETは癌、好ましくはLCまたはCRCに苦しむ患者の予後の評価を補助するものと期待されよう。手術前のARMETのレベルは、たいてい、癌の1種類以上の他のマーカーおよび／またはTNM病期分類システムと組み合わされる。好ましい態様において、ARMETはLCまたはCRCを有する患者の予後に使用される。
【０１２２】
化学療法のモニタリング:
Merle，P. et al.，Int. J. of Biological Markers 19(2004) 310-315では、導入化学療法で治療された局所進行NSCLCを有する患者におけるCYFRA 21-1血清レベルの変化が評価された。彼らは、CYFRA 21-1血清レベルの早期モニタリングが病期III NSCLC患者の腫瘍応答および生存に有用な予後ツールであり得ると結論づけている。また、報告には、LCを有する患者の治療のモニタリングにおけるCEAの使用が記載されている(Fukasawa T. et al.，Gan to Kagaku Ryouho 13(1986) 1862-1867)。これらの研究のほとんどは遡及的で、無作為でなく、少数の患者を含んだ。CYFRA21-1での研究の場合と同様に、CEA研究は、a)化学療法を受けている間にCEAレベルが減少した患者は、一般的に、CEAレベルが減少しなかった患者よりも良好な結果を有し、(b)ほぼすべての患者で、CEAレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示した。
【０１２３】
ARMETは、CYFRA21-1またはCEAそれぞれと少なくとも同程度に良好な化学療法のモニタリングのためのマーカーであることが期待されよう。したがって、本発明はまた、化学療法下の癌患者、好ましくは肺癌（LC）または結腸癌（CRC）患者のモニタリングにおけるARMETの使用に関する。好ましい一態様における治療モニタリングでは、ARMETの測定およびCyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよび/またはNNMTからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの測定は、肺（LC）癌の評価に合わせて使用される。
【０１２４】
追跡:
癌性組織の完全な除去を目的として外科的切除を受けたLC患者の大部分は、後に再発性または転移性の疾患を発症する(Wagner，H.，Chest 117(2000) S110-S118；Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. 75(2003) 973-980)。これらの再発のほとんどは、手術後2〜3年以内に起こる。再発性/転移性疾患は、検出が遅すぎた場合は常に致死的であるため、相当な研究が、初期ひいては潜在的に治療可能な段階での癌の再発に焦点を当てている。
【０１２５】
その結果、多くの癌患者、例えばLC患者は、多くの場合CEAでの定期的モニタリングを含む、術後のサーベイランスプログラムを受ける。外科的切除後1年間のCEAによる連続モニタリングにより、再発性/転移性疾患が、疑わしい症状または徴候がない場合であっても、早期の術後再発性/転移性疾患は、ほぼ97%の特異性でほぼ29%の感度で検出されることが示された(Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. 75(2003) 973-980)。したがって、LCを有する患者の手術後の追跡は、適切な生化学的マーカーの使用の最も重要な分野の1つである。調査したLC患者においてARMETの感度が高いために、ARMETは単独でまたは1種類以上の他のマーカーと組合せて、LC患者の追跡、特に手術後のLC患者の追跡に非常に有用であろう。LC患者の追跡におけるARMETおよび1種類以上のLCの他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらに好ましい態様を示す。
【０１２６】
好ましい態様において、本発明は、癌の診断の分野におけるARMETの使用に関する。好ましくは、ARMETは、肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚、頭部および頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃または胆管のそれぞれの癌の評価に使用される。
【０１２７】
またさらに好ましい態様において、本発明は、癌、例えば一般的な癌または具体的な種類の癌、例えば肺、結腸、食道、頭部および頚部、胃、胆管、膵臓、腎臓、子宮頚部、卵巣、乳房、膀胱、子宮内膜または前立腺の癌のためのマーカー分子としての、癌のための1つ以上のさらなるマーカー分子と組み合わせたARMETの使用に関する。さらなるマーカー分子は、癌型非特異的な、一般的なマーカー分子および/または癌型特異的なマーカー分子、例えば肺または結腸癌のためのマーカー分子であり得る。ARMETおよび少なくとも1つのさらなるマーカーは、個体から得られた液体試料中の癌、例えば肺または結腸癌の評価に使用される。ARMETの測定と合わされ得る選択された好ましい他の癌マーカーは、Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 125、CA 19-9、PSA、proGRP、SCCおよびNNMTである。特に、ARMETの測定と合わされ得る選択された好ましい他のLCマーカーは、Cyfra 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、proGRPおよび/またはNSEである。癌、例えばLCの評価に使用されるまたさらに好ましいマーカーパネルは、ARMETならびにCYFRA 21-1およびCEAからなる群より選択される少なくとも1つの他のマーカー分子を含む。
【０１２８】
当業者が理解するように、調査中の診断的疑問を改善するために、2種類以上のマーカーの測定を使用するには多くの方法がある。全く単純に、しかしながら、しばしば効果的なアプローチにおいて、調査された少なくとも1種類のマーカーについて試料が陽性である場合、陽性の結果が仮定される。このことは、例えばAIDSのような感染性の疾患の診断の場合であり得る。
【０１２９】
しかしながら、多くの場合、マーカーの組み合わせが評価される。好ましくは、マーカーパネルのマーカー、例えばARMETおよびCYFRA21-1についての測定値は、数学的に組み合わされ、組み合わされた値は診断的疑問の原因に相関される。マーカー値は、当該技術分野の技術水準の任意の適切な数学的方法により組み合わされ得る。マーカーの組み合わせと疾患を相関する周知の数学的方法には、識別分析（DA）（即ち、一次、二次、標準化DA)、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化直線モデル（即ちロジスティック回帰）、主成分ベース法（即ちSIMCA）、一般化付加モデル、ファジーロジックベース法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズムベース法などの方法を用いる。当業者は、本発明のマーカーの組み合わせを評価するための適切な方法を問題なく選択する。好ましくは、本発明のマーカーの組み合わせを、例えばLCの有無と相関することに用いられる方法は、DA（即ち一次、二次、標準化識別分析）、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線形モデル（即ちロジスティック回帰）から選ばれる。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献：Ruczinski，I.，et al，J. of Computational and Graphical Statistics，12 (2003)475-511；Friedman，J. H. ，J. of the American Statistical Association 84 (1989)165-175；Hastie，T.， et al., The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics (2001)；Breiman，L.， et al., Classification and regression trees，California：Wadsworth (1984)；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning 45 (2001)5-32；Pepe，M. S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series 28 (2003)；およびDuda，R. O.，et al.，Pattern Classification，Wiley Interscience，第2版 (2001)に見られる。
【０１３０】
生物学的マーカーの基礎的な組合せに対して、最適化された多変量カットオフを使用し、状態Aと状態B、例えば、疾患状態と健常を区別することは、本発明の好ましい態様である。この型の解析では、マーカーは、もはや独立ではなくマーカーパネルを形成する。
【０１３１】
診断方法の精度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M. H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)561-577参照のこと)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られる全ての感度／特異性ペアのプロットである。
【０１３２】
臨床試験の臨床性能は、その診断精度または被験体を臨床的に関連する亜群に正確に分類する能力に依存する。診断精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を評価する。かかる状態は、例えば健常と疾患または良性疾患対悪性疾患である。
【０１３３】
それぞれの場合において、ROCプロットは、判定閾値の全範囲で１−特異性に対して感度をプロットすることにより2つの分布間の重複を示す。Y軸上は感度、すなわち真陽性部分［(真陽性試験結果の数)/(真陽性の数＋偽陰性試験結果の数)として定義される］である。これは、疾患または状態の存在下の陽性度とも称される。これは、罹患亜群のみから算出される。X軸上は偽陽性部分、すなわち1-特異性［(偽陽性結果の数)/(真陰性の数＋偽陽性結果の数)として定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から算出される。真陽性部分および偽陽性部分は、2つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の有病率とは独立している。ROCプロット上のそれぞれの点は、特定の判定閾値に対応する感度/1-特異性のペアを表す。完全識別を伴う試験(結果の2つの分布に重複がない)は、左上の角を通るROCプロットを有し、この場合、真陽性の割合は1.0または100％（完全な感度）であり、偽陽性部分は0（完全な特異性）である。識別のない試験の理論的プロット（2つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かう45°の対角線である。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ROCプロットが45°の対角線の完全に下に含まれる場合、これは「陽性度」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。
【０１３４】
臨床試験の診断精度を定量化するための好ましい方法の１つは、単一の数によりその成績を表すことである。かかる全般的パラメータは、例えば、いわゆる「総エラー」あるいは「曲線下面積=AUC」である。最も一般的な世界的尺度はROCプロット下の面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換えることができる）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の範囲にある。該面積は、対角線に最も近い点または90％特異性での感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットに依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。
【０１３５】
ARMETとCYFRA 21-1またはCEAなどの他のマーカー、またはまだ見出されていないLCの他のマーカーを組み合わせることで、ARMETは、LCの評価においてさらなる改善をもたらす。
【０１３６】
好ましい態様において、本発明は、試料中の少なくともARMETおよびCYFRA21-1の濃度、ならびに任意にCEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCCおよび/またはNNMTの濃度をそれぞれ測定し、測定された濃度を癌、例えばLCの有無と相関させることにより、癌、例えばLC対健常対照の診断精度を改善するための方法であって、改善により、調査されたいずれかの単一マーカー単独に基づいた分類と比べて、健常対照に対してより多くの患者が癌、例えばLCに苦しんでいると正確に分類される方法に関する。
【０１３７】
本発明の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびCYFRA21-1の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１３８】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびCEAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１３９】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびNSEの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４０】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびCA 19-9の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４１】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびCA 125の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４２】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびPSAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４３】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびproGRPの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４４】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびSCCの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４５】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMETおよびNNMTの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４６】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびCEAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４７】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびNSEの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４８】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびCA 19-9の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４９】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびCA 125の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５０】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびPSAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５１】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびproGRPの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５２】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびSCCの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５３】
本発明のなおさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーARMET、CYFRA 21-1およびNNMTの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばLCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５４】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。記載の手順において、本発明の精神から逸脱することなく変更がなされ得ることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図1は、肺癌組織溶解物のウエスタンブロット解析を示す。15μg総タンパク質の10個の腺CA（パネルA）および10個の扁平上皮細胞CA型組織溶解物（パネルB）ならびに適合した対照組織溶解物を、実施例5に記載されるように解析した。M=分子量マーカー；T=腫瘍組織溶解物；N=適合対照組織溶解物；rec Ag=組み換え生成ARMET；矢印はAEMETの位置を示す。B=パネルB、腫瘍試料；A=パネルA、対照試料。
【図２】図2は、明らかに健常な個体から得られた50個の対照試料と比較した、LCを有する患者から得られた366個の試料の評価について0.86のAUCを有するLC試料中のARMETの受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【図３】図3は、明らかに健常な個体から得られた50個の対照試料と比較した、CRCを有する患者から得られた50個の試料の評価について0.75のAUCを有するCRC試料中のARMETの受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【図４】図4は、明らかに健常な個体から得られた50個の対照試料と比較した、乳癌を有する患者から得られた49個の試料の評価について0.86のAUCを有するBC試料中のARMETの受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【図５】図5は、明らかに健常な個体から得られた50個の対照試料と比較した、卵巣癌を有する患者から得られた43個の試料の評価について0.91のAUCを有するOC試料中のARMETの受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【図６】図6は、ヒトARMETタンパク質のアミノ酸配列(配列番号:1)を示す。
【図７】図7は、ポリクローナル抗体K4344（Pab K4344）、肺正常P1381-TN20、200倍拡大である。図7aは、Pab K4344、肺正常P1381-TN20、200倍拡大である。
【図８】図8は、Pab K4344、肺腺癌725006.8、200倍拡大である。図8aは、Pab K4344、肺扁平上皮癌F060010、200倍拡大である。図8bは、Pab K4344、肺腺癌725006.1、200倍拡大である。
【図９】図9は、Pab K4344、結腸正常F07-2538A3である。図9aは、Pab K4344、結腸癌F08-0978である。
【図１０】図10は、Pab K4344、乳房正常06-1143である。図10aは、Pab K4344、乳癌06-1786である。
【図１１】図11は、Pab K4344、咽頭癌（AST 292）である。図11aは、Pab K4344、卵巣癌（TriStar 2n）である。
【図１２】図12は、Pab K4344、黒色腫（TriStar 4g）である。図12aは、Pab K4344、膵臓癌（Tristar 5K）である。
【０１５６】
配列の説明
配列番号:1は、図6の配列を示す。ヒトARMETタンパク質配列（SwissProtデータベース受託番号:P55145）。
配列番号:2は、合成フォワードプライマーLC56for-EcoRIを示す。
配列番号:3は、合成リバースプライマーLC56rev-BamHIを示す。
配列番号:4は、合成ペプチド伸長を示す。
【実施例】
【０１５７】
実施例1
肺癌の潜在的マーカーとしてのARMETの同定
組織の供給源：
肺癌の潜在的な診断マーカーとして腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミクス法を使用して2種類の異なる組織の解析を行う。
【０１５８】
全部で、11名の肺癌（LC）に苦しむ患者由来の組織被検物を解析する。各患者から、2種類の異なる組織型を、治療的切除により採取する：腫瘍組織（>80%腫瘍）(T)および隣接する健常組織(N)。後者は適合健常対照試料として用いる。切除後、組織をすぐに凍結して、処理まで-80℃に保存する。組織病理学的基準により腫瘍を診断する。
【０１５９】
組織調製：
0.8〜1.2gの凍結した組織を小片に切断し、冷やしたボールミルミキサーのすりつぶしジャーに移し、液体窒素で完全に凍結させる。組織をボールミルで粉砕して、10倍容量（w/v）の溶解バッファー（40mMクエン酸Na、5mM MgCl2、1% Genapol X-080、0.02%アジ化Na、Complete(登録商標) EDTA-free [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1 873 580]）に溶解し、次いでWheaton(登録商標)ガラスホモジナイザー（20xゆるくフィット、20xきつくフィット）中でホモジナイズする。ホモジネートを遠心分離（5,000xgで10分）に供し、上清を別のバイアルに移し、再度遠心分離に供する（20,000xgで15分）。得られた上清は、可溶性タンパク質を含み、さらなる解析に使用する。
【０１６０】
LC-ESI-MSMS-解析用の試料調製：
可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を、Bradfordアッセイを使用して測定する。400μgのそれぞれの試料をLaemmliサンプルバッファで2mg/mlの濃度に希釈し、95℃で10分間インキュベートする。「large precast gels」（30分-25mA、2.5時間-35mA）のBioRadの指示マニュアルに従いゲル電気泳動（3x120μg/試料、BioRad 10〜20% Tris-HCl、16x16cm）を行った。タンパク質分離後、ゲルを50%メタノール/10%酢酸と室温で30分間インキュベートし、続いて還元のために1時間、20mM DTT/100mM NH4HCO3と共にインキュベートし、アルキル化のために2時間、100mMヨードアセトアミド/100mM NH4HCO3と共にインキュベートする。20%メタノール/20%クーマシーブルー（Novex染色キット）を用いて、室温で一晩ゲルの染色を行う。
【０１６１】
マーカータンパク質で示される6〜31kDaの領域を切出し、1mmの大きさの小片にスライスする。0.1M NH4HCO3/30%アセトニトリルとインキュベートして、ゲルから完全に汚れを除く。水で洗浄した後、ゲル片をspeedvac中、45℃、10mbarで乾燥する。トリプシン(プロテオミクスグレード、Roche Diagnostics GmbH)による消化を室温で一晩行ない、続いて35%アセトニトリル/0.1%ギ酸で抽出を行う。抽出溶液をspeedvac中で蒸発させ、試料を100μlの5%アセトニトリル/0.5%酢酸/0.1%ギ酸に再溶解する。
【０１６２】
LC-ESI-MSMS-解析：
トリプシン消化物（100μl）を、Nano-LCシステム（Ultimate, Famos, Switchos; LC Packings, Idstein, Germany）で、二次元HPLC（MudPIT）により分離する。セルフパック二次元カラム（Fused silica: PicoFrit 75μm, New Objective; RP: ProntoSil 120-5-C18 AQ+, Bischoff; SCX: Partisil 10, Whatman）で分離を行う。NH4Acの量を連続的に上げた（0〜1500mM）段階溶出により11SCX画分を生成する。それをカラムのRP部分でさらに分離し、ESI-MSイオントラップ（LCQ deca XP; Thermo Electron, Massachusetts, USA；パラメータについて表Xを参照）によりデータ依存的スキャンを使用してオンライン解析する。それぞれの試料について手順を3回行う。生データを、ベースアルゴリズムとしてSequestを使用して（パラメータ、表X参照）、市販されていないRoche独自のデータ管理システムにより加工する。同定されたペプチドおよびタンパク質の繰り返しにより得られたリストを組み合わせる。
【０１６３】
同定された配列および表2に示す配列の補助によりタンパク質ARMETを同定する。
【０１６４】
肺癌の潜在的マーカーとしてのARMETの検出：
それぞれの患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質および対応するペプチドの数を、隣接する正常組織から得られた一致した結果と比較する。これにより、タンパク質ARMETは、腫瘍組織に特異的に存在するかまたは非常に豊富であり、健常対照組織中では検出されないかほとんど検出されないことがわかる。
【０１６５】
0005368579.tif 000003
【０１６６】
タンパク質ARMETは、肺癌に苦しむ患者由来の腫瘍組織中に強く過剰発現している。タンパク質ARMETの以下のペプチド配列は、腫瘍組織中でデータベース検索形態LCQ-MS2-データにより同定される：
【０１６７】
ARMETに由来する以下の配列は、上記の方法を使用して同定される。
【０１６８】
0005368579.tif 000004
【０１６９】
実施例2
癌マーカータンパク質ARMETに対する抗体の作製
免疫検出アッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングおよびELISAによるARMETの血清レベルおよび血漿レベルおよび血中レベルの測定における抗体のさらなる使用のため、肺癌マーカータンパク質ARMETに対するポリクローナル抗体を作製する。
【０１７０】
大腸菌における組換えタンパク質発現:
ARMETに対する抗体を作製するため、大腸菌において組換え抗原を作製する。したがって、German Resource Center for Genome Research (RZPD、Berlin、Germany)から入手した全長cDNAクローンIRAUp969D0638Dから、プライマー：
フォワードプライマーLC56for-EcoRI:
5’ acgtacgtgaattcattaaagaggagaaattaactatatgagagga tcgcatcaccatcaccatcacattgaaggccgtAGGAGGATGTGGGCCACGCAG (配列番号:2/ EcoRI-部位に下線、コーディングヌクレオチドは大文字)、
リバースプライマーLC56rev-BamHI:
5’ acgtacgtggatcctcattaCAAATCGGTCCGTGCACTGG (配列番号:3/BamHI-部位に下線、コーディングヌクレオチドは大文字)
を使用してARMETコーディング領域をPCR増幅する。
【０１７１】
フォワードプライマーは、（EcoRIクローニング部位およびリボソーム結合部位の他に）ARMETタンパク質にインフレーム導入されたN-末端MRGSHHHHHHIEGRペプチド伸長部(配列番号:4)をコードするオリゴヌクレオチドを特徴とする。EcoRI/BamHI消化されたPCR断片を、対応するpQE-30（Qiagen, Hilden, Germany）ベクター断片に連結し、その後大腸菌XL1-blueコンピテント細胞に形質転換する。配列解析後、製造業者の使用説明書に従ってpQEベクターシリーズのIPTG誘導性T5プロモーター下での発現のために、プラスミドを大腸菌BL21コンピテント細胞に形質転換する。
【０１７２】
MRGSHHHHHHIEGR-ARMET融合タンパク質の精製のために、1lの一晩誘導細菌培養液を遠心分離してペレット化し、100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0、7M塩酸グアニジウム、5mMイミダゾール、20mMチオグリセロールに再懸濁して細胞ペレットを溶解する。不溶性物質を遠心分離してペレット化し、上清をNi-ニトロトリ酢酸（Ni-NTA）金属親和性クロマトグラフィーに供する：カラムを数倍床容量の溶解バッファーで洗浄し、次いでa) 100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0、10mM Tris-HCl、pH8.0、8M尿素、20mMチオグリセロール；b) 100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、20mMチオグリセロール；およびc) 100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0、0.1% SDS、20mMチオグリセロールで洗浄する。最終的に、100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH5.0、0.1% SDS、20mMチオグリセロールを用いて、酸性条件下で抗原を溶出し、同一バッファー中4℃で保存する。
【０１７３】
ポリクローナル抗体の作製:
a) 免疫化
免疫化のため、タンパク質溶液の新鮮エマルジョン(100μg/mlのタンパク質ARMET)および完全フロイントアジュバントを1:1の比で調製する。1、7、14および30、60および90日目に各ウサギを1mlのエマルジョンで免疫化する。血液を採取し、得られた抗ARMET血清を実施例3および4に記載のさらなる実験に使用する。
【０１７４】
b)カプリル酸および硫酸アンモニウムでの連続沈殿によるウサギ血清からのIgG (免疫グロブリンG)の精製
1容量のウサギ血清を4容量の酢酸バッファー(60mM、pH4.0)で希釈する。2M Tris-塩基でpHを4.5に調整する。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離し(13000×g、30分、4℃)、ペレットを廃棄し、上清を回収する。2MのTris-塩基を添加して上清のpHを7.5に調整し、ろ過する（0.2μm）。
【０１７５】
最終濃度2Mまで4M硫酸アンモニウム溶液を滴下して、激しい攪拌下、上清中の免疫グロブリンを沈殿させる。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離(8000×g、15分、4℃)によって回収する。
【０１７６】
上清を廃棄する。ペレットを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaClに溶解し、充分透析する。透析物を遠心分離し(13000×g、15分、4℃)、濾過する(0.2μm)。
【０１７７】
ポリクローナルウサギIgGのビオチン化:
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaClで10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中3.6mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をSuperdex 200 (10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)上でクロマトグラフィー処理する。ビオチン化IgGを含有する画分を回収する。同様の手順に従いモノクローナル抗体をビオチン化する。
【０１７８】
ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化:
10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中でポリクローナルウサギIgGを10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり、50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号1 333 054）（DMSO中3.8mg/ml）を添加する。室温で30分後、試料をSuperdex(登録商標) 200（10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl）上でクロマトグラフィー処理する。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を回収する。同様の手順に従い、モノクローナル抗体をジゴキシゲニンで標識する。
【０１７９】
実施例3
ヒト血清および血漿試料または他の体液中のARMETの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のARMETの検出のために、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉および検出のために、抗ARMETポリクローナル抗体（実施例2参照）のアリコートをビオチンおよびジゴキシゲニンのそれぞれとコンジュゲートする。
【０１８０】
ストレプトアビジン被覆した96ウェルマイクロタイタープレートを、100μlのビオチン化した抗ARMETポリクローナル抗体とともに60分間、10mMリン酸塩、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中、10μg/mlでインキュベートする。インキュベーション後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween 20で3回洗浄する。次いで、ウェルを、標準抗原としての組換えタンパク質(実施例2参照)の連続希釈物、または患者由来の希釈血漿試料のいずれかとともに2時間インキュベートする。ARMETの結合後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween 20で3回洗浄する。結合したARMETの特異的検出のために、ウェルを100μlのジゴキシゲニン化抗ARMETポリクローナル抗体と、10mMリン酸、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中、10μg/mlで60分間インキュベートする。その後プレートを3回洗浄して未結合抗体を除去する。次の工程では、ウェルを20mU/mlの抗ジゴキシゲニンPODコンジュゲート（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1633716）と、10mMリン酸、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中で60分間インキュベートする。次いで、プレートを同バッファーで3回洗浄する。抗原-抗体複合体の検出のために、ウェルを100μlのABTS溶液（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号11685767）とインキュベートし、30〜60分後、ELISAリーダーを用いて405nmでODを測定する。
【０１８１】
実施例4
肺癌のための血清マーカーとしてのARMET
表3に示されたUICC分類で充分に特徴付けられた366名の肺癌患者（148名の腺CA、87名の扁平上皮細胞CA、44名の小細胞CA、87名の他の肺のCA）由来の試料を使用する。
【０１８２】
0005368579.tif 000005
【０１８３】
表3のLC試料中のARMETのレベルを、明らかに健常な個体（=対照コホート）から得られた50の対照試料と比較して評価する、AUCは0.86（図2）。
【０１８４】
実施例5
結腸直腸癌（CRC）の血清マーカーとしてのARMET
表3に示されたUICC分類で充分に特徴付けられた50名の結腸直腸癌患者由来の試料を使用する。
【０１８５】
0005368579.tif 000006
【０１８６】
表4のCRC試料中のARMETのレベルを、明らかに健常な個体（=対照コホート）から得られた50の対照試料と比較して評価する、0.75のAUCが得られる（図3）。
【０１８７】
実施例6
乳癌（BC）の血清マーカーとしてのARMET
表3に示されたUICC分類で充分に特徴付けられた49名の乳癌患者由来の試料を使用する。
【０１８８】
0005368579.tif 000007
【０１８９】
表5のBC試料中のARMETのレベルを、明らかに健常な個体（=対照コホート）から得られた50の対照試料と比較して評価する、0.86のAUCが得られる（図4）。
【０１９０】
実施例7
卵巣癌（OC）の血清マーカーとしてのARMET
表3に示されたUICC分類で充分に特徴付けられた43名の卵巣癌（OC）患者由来の試料を使用する。
【０１９１】
0005368579.tif 000008
【０１９２】
表6のOC試料中のARMETのレベルを、明らかに健常な個体（=対照コホート）から得られた50の対照試料と比較して評価する、0.91のAUCが得られる（図5）。
【０１９３】
実施例8
実施例2で作製したポリクローナル抗体を使用した、ヒト肺癌（LC）組織中のARMETの検出のためのウエスタンブロット
腫瘍試料および健常対照試料由来の組織溶解物を、実施例1の「組織調製」に記載されるように調製する。
【０１９４】
Invitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬および設備を使用してSDS-PAGEおよびウエスタンブロットを行う。試験するそれぞれの組織試料について、15μgの組織溶解物を、還元NuPAGE(登録商標)（Invitrogen）SDS試料バッファーに希釈し、95℃で10分間加熱する。MESランニングバッファー系中4〜12% NuPAGE(登録商標)ゲル（Tris-グリシン）上で、試料を流す。Invitrogen XCell IITMBlot Module（Invitrogen）およびNuPAGE(登録商標)転写バッファー系を使用して、ゲル-分離タンパク質混合物をニトロセルロース膜上にブロッティングする。PBS/0.05% Tween-20で膜を3回洗浄し、Roti(登録商標)-Blockブロッキングバッファー（A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany）で2時間ブロッキングする。一次抗体ポリクローナルウサギ抗ARMET血清（実施例2に記載の作製）を、Roti(登録商標)-Blockブロッキングバッファー中に1:10,000で希釈し、膜と1時間インキュベートする。膜をPBS/0.05% Tween-20で6回洗浄する。特異的に結合した一次ウサギ抗体をPODコンジュゲートポリクローナルヒツジ抗ウサギIgG抗体で標識し、0.5xRoti(登録商標)-Blockブロッキングバッファーで10mU/mlに希釈する。1時間インキュベーション後、膜をPBS/0.05% Tween-20で6回洗浄する。結合したPODコンジュゲート抗ウサギ抗体の検出のために、膜をLumi-LightPLUSウエスタンブロッティング基質（注文番号2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）とインキュベートし、オートラジオグラフフィルムに曝露する。
【０１９５】
ARMETについてのシグナル強度は、20名の異なるLC患者から得た20の腫瘍組織溶解物中18で増加する（図1）。従って、実施例1においてMALDIで検出した場合の腫瘍組織中のARMETの高いアバンダンスは、ウエスタンブロット解析により確認される。
【０１９６】
実施例9
上皮層液（ELF）-気管支鏡マイクロサンプリング中のARMET
気管支鏡マイクロサンプリング（BMS）により、主に非侵襲性の様式で小肺結節の近位の上皮層液を回収する可能性が提供される。その後、悪性結節の同定のために、ELF中の腫瘍マーカーの濃度を測定することが可能である。
【０１９７】
外部がポリエチレン鞘で構成され、内部コットンプローブがステンレススチールガイドとつながっているBMSプローブ（Olympus Medical Systems Corp. Tokyo, Japan, カタログ番号: BC-402C）を、気管支鏡により肺に挿入する。内部プローブを結節の近位に進め、数秒間BMSを行う。その後、内部プローブを引き抜いて外部鞘に戻し、両方のデバイスを同時に引き抜く。コットンチップを切除して-80℃で即座に凍結する。測定のために、コットンチップからELFを溶出して、その後解析し得る。ELF中のARMETの濃度を実施例2に記載されるようにELISAで測定する。
【０１９８】
実施例10
Pab K4344によるARMETの免疫染色
パラフィン包埋組織をRoche腫瘍バンク（MML, Pharma Research Penzberg）から得た。組織を2μm連続切片に切断し、キシレン中で脱パラフィンして（3x5分）一連の濃度のエタノールで再水和し、その後脱イオン水およびPBSで2回洗浄工程を行った（1x2分）。Retrivit pH4.0（Biogenex）を用いて97℃〜100℃で20分間抗原回復を行った。スライドを20分間冷やし、PBSでリンスした（2x1分）。PBS中3% H2O2中で5分間インキュベートして内在性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングし、次いでスライドをPBSで2回その後TBS + Tween 20（LabVision 1666789）で1回、3分間リンスした。免疫グロブリンの非特異的結合のブロッキングは、室温で20分間、PBS中1%のウマ血清（ウマ-ブロッキング血清、Vectastain ABCキット、Elite Universal, Vector PK6200）で行った。ビオチンブロッキングシステム（Dako X0590）を用いて製造業者の指示書に従い内在性ビオチンをブロッキングした。ARMET特異的染色のため、切片を、Antiboby-Diluent（Dako S2022）中、4℃で一晩、3μg/mlに希釈したポリクローナル抗体K4344とインキュベートした。スライドをTBS + Tween 20（LabVision 1666789）（3x2分）で洗浄し、次いでビオチン化二次抗体（5mlのPBS +1%ウマ血清中1滴）（Vectastain ABC kit, Elite Universal, Vector PK6200）と室温で30分間インキュベートした。TBS + Tween 20（3x2分）で洗浄後、切片を、室温で30分間、ABC試薬（5ml PBS中試薬A1滴+試薬B1滴）とインキュベートした。スライドをTBS + Tween 20（2x2分）で洗浄し、最後にジアミノベンジジン色原体溶液（DAB plus、LabVision TA-125-HDX）と10分間反応させ、蒸留水でリンス後、ヘマトキシリンで交差染色してマウントした。
【０１９９】
陰性対照としてウサギIgG画分（Dako X0903）を使用した。
【０２００】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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