(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量１．９万Ｄａ以上のタンパク質またはポリペプチドが内包された、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、酸性アミノ酸、その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロックコポリマーを含有する高分子ミセル組成物であって、前記ブロックコポリマーと前記タンパク質またはポリペプチドとを混合し、当該タンパク質またはポリペプチドの等電点（ｐＩ）とは異なるｐＨに当該混合液のｐＨを調整することで当該ブロックコポリマーから構成されるミセルの疎水性コア領域に当該タンパク質またはポリペプチドを内包させる工程を含んでなる方法により調製され、
ここで当該タンパク質またはポリペプチドのｐＩ、当該ブロックコポリマーの疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体の等電点（ｐＩ’）及び前記ｐＩとは異なるｐＨは、
ｐＩ＞ｐＨ＞ｐＩ’
の関係にあり、故に当該ｐＨにおいて当該ブロックコポリマーの疎水性セグメントは負に帯電し、かつ当該タンパク質またはポリペプチドは正に帯電するか、または
ｐＩ’＞ｐＨ＞ｐＩ
の関係にあり、故に当該ｐＨにおいて当該ブロックコポリマーの疎水性セグメントは正に帯電し、かつ当該タンパク質またはポリペプチドは負に帯電し、
前記ｐＨが前記タンパク質またはポリペプチドのｐＩから１以上離れており、前記ブロックコポリマーが、下記式(I)または（II）である高分子ミセル組成物：
【化１】
0005294858.tif 000019
または
【化２】
0005294858.tif 000020
上記各式中Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アルキル基を表し、Ｒ2は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ1〜Ｃ29脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、Ｒ4は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ1〜Ｃ30脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し、Ｒ5は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ6は、水素原子、フェニル基、−（ＣＨ2）4−フェニル基、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換されたＣ4〜Ｃ16アルキル基、またはベンジル基を表し、Ｒ7はメチレン基を表し、ｎは１０〜２５００の整数であり、ｘは１０〜３００となる整数であり、ｍは０〜３００となる整数であり（但し、ｍが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ)のユニットと（ＣＯＲ7ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在し、Ｒ6は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて任意に選択可能であり、ランダムに存在するが、Ｒ6が水素原子である場合はＲ6全体の６０％以下である）、ｙは１又は２の整数を表し、Ｌ1は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ2−、−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−および−ＯＣＯ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ1〜Ｃ6アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ2が−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ここで、ＺはＣ1〜Ｃ6アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。
【請求項２】
前記ブロックコポリマーが、ポリアミノ酸側鎖のエステル化又はアミド化率４０〜１００％である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質またはポリペプチドの等電点（ｐＩ）が３〜１１.５である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
高分子ミセルに内包される前記タンパク質又はポリペプチドの量が、前記内包工程に代えて当該タンパク質又はポリペプチドのｐＩと等しいｐＨに設定した内包工程を経て調製された高分子ミセルにおける内包量に比べて増大した状態にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を高含量で含有する、生体投与可能で、生体中において安定な、高分子ミセルおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作技術の進歩により多くの生理活性ポリペプチド及びタンパク質が細胞培養法で安定に供給できるようになり、疾病の治療や予防へと活用されつつある。しかし、これらポリペプチドは、一般に生体内で酵素分解、代謝等を非常に速やかに受けるため半減期が短く、薬剤として投与した場合、十分な効果が得られないことが多い。この問題を解決するため今日まで、高分子による修飾や徐放性製剤等、数多くの研究が成されてきた。
例えば、現在臨床で使われている高分子修飾技術として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化が挙げられる。インターフェロン等において、生体内の半減期を延長し、効果の持続化をある程度達成できている。実際、投与回数を減らし患者の負担を軽減しているが、これら高分子修飾タンパク質は、一般に修飾により活性が低下し、修飾部位及び修飾率を再現性よくコントロールするのが難しいという問題点がある。
次に、徐放化技術としては、マイクロカプセルが現在臨床で使われている。この技術は、生体内で分解するポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸共重合体を基剤に用いて薬物を微粒子内に封入することにより、達成できたものである。しかし、粒子径は一般にマイクロメートルの領域であり、静脈内投与には適さない。これらマイクロカプセルの粒子径をナノサイズにまで小さくし、また、表面修飾により、静脈内投与後の肝臓や脾臓等の細網内皮系への取り込みを抑制したという報告もある（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１７，３１−４８（１９９５））。しかしながら、これらの方法で得られる粒子径は小さくとも数百ナノメートルであり（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４９，４３−４９（１９９７））、また表面修飾に手間がかかる上、臓器分布を再現性よくコントロールすることも難しいという問題点がある。
リン脂質を用いるリポソームも、現在臨床で使われている徐放化技術の例として挙げられる（Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．Ｊａｐａｎ  １９，９９−１１０（２００３））。リポソームの利点は、リン脂質が生体成分のため毒性や抗原性が低いこと、脂質組成を変えることにより、水溶性薬物、脂溶性薬物、高分子、タンパク質、核酸等の多くの生理活性物質が封入可能という点である。しかしながら、これらリポソームは薬物の保持率が必ずしも十分ではない。即ち、単位リポソーム薬剤の中に封入できる薬物量が十分ではなく、さらに効率のよい方法が望まれているのが現状である。加えて、生体内での安定性が十分ではない、工業的な製造が困難である等の問題点は、未だ十分には解決されていない。
これらの問題を解決するため、現在臨床で検討されつつある徐放化技術として、高分子ミセルが挙げられる（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９３，６７８−６９７（２００５）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２，１２４０−１２４６（２００５））。高分子ミセルは親水性高分子と疎水性高分子からなるブロックコポリマーを用いて製造することが可能である。一般に、水中で疎水性セグメントをコアとしたミセルを形成するため、高分子ミセルは脂溶性薬物の内包化・可溶化及び徐放化に対し、優れた性質を有する（特許第２７７７５３０号公報）。
このような高分子ミセルを水溶性薬物の内包化および徐放化に適応するため、種々の検討が成されている。例えば、水溶性の化合物であるアドリアマイシンの高分子ミセルへの封入に関しては、疎水性高分子の側鎖に薬物を化学的に結合させることによって封入させる方法が提案されている（特許第２６９４９２３号公報）。また、別法として、荷電性の性質を有する薬物、たとえば正荷電を有する塩基性のペプチドなどに対しては、ブロックコポリマー中の疎水性セグメントの側鎖に負荷電を有する官能基を導入する（特許第２６９０２７６号公報）、或いはポリ乳酸またはポリ乳酸グリコール酸等のカルボキシル基を有する生分解性高分子を共存させること（ＷＯ２００５／０２３２３０）で、高分子ミセルとペプチド両者の間に静電的な相互作用を導くことによって効率よく封入する方法が開示されている。しかしながら、分子量の大きな水溶性薬物、特にタンパク質やポリペプチドに応用できるものではない。上記特許第２６９０２７６号公報はその実施例においてタンパク質をミセルに内包させる例を示しているが、ミセルは疎水性部分をもたず、電荷のみで形成されており、ミセル自体の安定性が弱く、実際に生体内に投与した場合、直ちに崩壊するものと考えられる。
高分子電解質を内包するミセルの安定化方法として、親水性セグメント及び荷電性セグメントとを含むブロックコポリマーと高分子電解質とから形成されるコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルに関し、コア部を形成する荷電性セグメントに少なくとも１個のチオール基を担持させ、該荷電性セグメント間でそれらに担持させたチオール基を介するジスフィド結合の架橋安定を形成させることによる安定化方法が開示されている（特開２００１−１４６５５６号公報）。しかし、実際の使用に際しては、静脈内注射による投与後の希釈や血清タンパク質との相互作用によってミセルが解離してしまうことや、分子内にＳＳ結合を有するタンパク質との相互作用が予測され、該当タンパク質の失活やミセルの不安定化が起こるため、広範なタンパク質やポリペプチドに適応できるものではない。
上記のように、生理活性ポリペプチド及びタンパク質による治療効果を高めるためには、生理活性ポリペプチド及びタンパク質を安定に効率よく内包させ、制御された速度で遊離できる高分子ミセルが必要であり、免疫応答が軽微で、広範な生理活性ポリペプチド及びタンパク質に応用できるものは未だ得られていないのが現状である。
また、これまでに提案された次に挙げる技術は、生理活性ポリペプチド及びタンパク質による治療効果を高めるため、上述の仕様を満たそうと試みているが全てに成功している訳ではない。
（ａ）特表２００４−５２５９３９号公報は、ポリアミノ酸のブロックと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレングリコールタイプの親水ポリマーのブロックをベースとするナノ粒子のコロイド懸濁液に関する。薬物（タンパク質やポリペプチド）のナノ粒子化が、薬物のナノ粒子への吸着に基づいているため、ナノ粒子表面にタンパク質やポリペプチドが存在することになる。すなわち、生体内では消化酵素等の攻撃により、ナノ粒子表面のタンパク質等は比較的速やかに分解され、失活すると考えられる。加えて、内包させるタンパク質及びポリペプチドの等電点を考慮してナノ粒子を形成している訳ではないため、遊離が比較的速やかに起こると考えられ、持続的な効果は期待できない。
（ｂ）欧州特許公報ＥＰ１０８４１７２Ｂ１号は、コレステロール存在下のもと、パルミトイルポリＬリジンポリエチレングリコールやパルミトイルポリＬオルニチンポリエチレングリコールを用いた、特に核酸のデリバリーに関する。この技術で得られる微粒子の粒子径は、小さくとも数百ナノメートルであり、静脈内投与後に細網内皮系に速やかに集積してしまうため、持続的な効果を期待するのは難しい。
（ｃ）特開平１１−２６９０９７号公報は、疎水性セグメントとして生体内分解性ポリマーを、親水性セグメントとしてポリアミノ酸を有するブロックコポリマーを基剤とする、臓器指向性及び徐放能などの機能を有する微粒子に関する。親水性セグメントに生体内分解性のポリアミノ酸を使用する点が特徴であるが、ポリエチレングリコールと比較し、免疫原性が高く、静脈内投与後の血清タンパク質との相互作用も増加することが予想され、該微粒子の血中滞留性は短縮し、長時間に亘る効果は期待できない。
（ｄ）米国特許第６０９０９２５号は、内包させたい低分子化合物やペプチドの水溶液に対し、ポリエチレングリコールとポリビニルピロリドンの酢酸またはリン酸等の緩衝液を添加し、その緩衝液のｐＨ付近に等電点を持つ血清アルブミン等の高分子を共存させ、加熱−冷却行程によりマイクロパーティクルを形成させる方法を開示する。７０℃程度の加熱行程が含まれるため、熱に不安定なタンパク質等には適応が難しいと考えられる。
【発明の開示】
【０００３】
生理活性ポリペプチド及びタンパク質は塩基性に限らず、例えば、インターフェロンα、Ｇ−ＣＳＦ、インスリン等、等電点が弱酸性から中性のものが多く存在する。このように広範な生理活性タンパク質やペプチド類にも応用可能で、安定に効率よく内包でき、かつ制御された速度で遊離できる高分子ミセル組成物は未だ得られていない。本発明の目的は、このような仕様を満たすブロックコポリマー組成物およびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記現状を鑑み、鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、酸性アミノ酸、その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロックコポリマーを用いることで、生理活性ポリペプチド及びタンパク質を効率よく高分子ミセルに内包させることを見出した。更に、高分子ミセルを調製する際のｐＨを、生理活性ポリペプチド及びタンパク質の等電点を考慮し調整することで、より効率よく内包することに成功した。そして、本発明者らは、この方法は酸性または塩基性に関わらず多くの生理活性ポリペプチド及びタンパク質に適応可能であり、用いるブロックコポリマーを代えることで、その疎水性セグメントとポリペプチドまたはタンパク質の疎水的相互作用も関与させることにより、薬物の内包率並びに放出速度を調整できること、特に、ブロックコポリマー中の疎水性側鎖の構造が薬物遊離速度に大きく関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
本願発明は以下の態様を含む。
［１］生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が内包された、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、酸性アミノ酸、その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物よりなる群から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロックコポリマーからなる高分子ミセル組成物。
［２］前記酸性アミノ酸の疎水性誘導体が、酸性アミノ酸アルキルエステルまたは酸性アミノ酸アルキルアミドである、［１］記載の組成物。
［３］前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、［１］記載の組成物。
［４］ブロックコポリマーが、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）である［１］記載の組成物。
0005294858.tif 000002
上記各式中Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し、Ｒ５は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ６は、水素原子、フェニル基、−（ＣＨ２）４−フェニル基、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、またはベンジル基を表し、Ｒ７はメチレン基を表し、ｎは１０〜２５００の整数であり、ｘは１０〜３００となる整数であり、ｍは０〜３００となる整数であり（但し、ｍが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ７ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在し、Ｒ６は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて任意に選択可能であり、ランダムに存在するが、Ｒ６が水素原子である場合はＲ６全体の６０％以下である）、ｙは１又は２の整数を表し、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−および−ＯＣＯ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ２が−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ここで、ＺはＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。
［５］前記ブロックコポリマーが、ポリアミノ酸側鎖のエステル化又はアミド化率４０〜１００％である、［４］記載の組成物。
［６］前記タンパク質またはポリペプチドの等電点（ｐＩ）が３〜１１．５である、［１］〜［５］のいずれか１項記載の組成物。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の高分子ミセル組成物の調製方法であって、前記ブロックコポリマーと前記生理活性ポリペプチド及びタンパク質とを混合し、当該生理活性ポリペプチド及びタンパク質の等電点（ｐＩ）とは異なるｐＨに当該混合液のｐＨを調整することで当該ブロックコポリマーから構成されるミセルの疎水性コア領域に当該生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を内包させる工程を含んでなり、
ここで当該生理活性ポリペプチド及びタンパク質のｐＩ、当該ブロックコポリマーの疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体の等電点（ｐＩ’）及び前記ｐＩとは異なるｐＨは、
ｐＩ＞ｐＨ＞ｐＩ’
の関係にあり、故に当該ｐＨにおいて当該ブロックコポリマーの疎水性セグメントは負に帯電し、かつ当該当該生理活性ポリペプチド及びタンパク質は正に帯電する、
ことを特徴とする、方法。
［８］前記ｐＨが前記水溶性高分子薬物のｐＩから１以上離れている、［７］記載の方法。
本発明により、生理活性ポリペプチド及びタンパク質といった高分子量の薬物を高分子ミセル内に効率よく内包させることができ、しかもその遊離速度も調節できるという利点が享受される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、各種ＩｇＧ内包高分子ミセルからのＩｇＧの遊離率の経時的変化を示す。
図２は、各種インターフェロン−α内包高分子ミセルを生体内投与した後のインターフェロン−αの血漿中濃度の経時的変化を示す。
図３は、ＦＩＴＣ標識リゾチウム内包高分子ミセルまたはＦＩＴＣ標識リゾチウム溶液をラットに静脈内投与した後の血漿中濃度の経時変化を示す。
図４は、インターフェロン−α内包高分子ミセルまたはインターフェロン−α溶液をラットに静脈内投与した後の血漿中濃度の経時変化を示す。
図５は、インターフェロン−α内包高分子ミセルまたはインターフェロン−α溶液をラットに静脈内投与した後の血漿中濃度の経時変化を示す。
図６は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子内包高分子ミセル、またはヒト顆粒球コロニー刺激因子溶液をラットに静脈内投与した後の血漿中濃度の経時変化を示す。
図７は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子内包高分子ミセル、またはヒト顆粒球コロニー刺激因子溶液をラットに静脈内投与した後の血漿中濃度の経時変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の一つの好ましい形態では、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、酸性アミノ酸、その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物からなる群より選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロックコポリマーを用いることで、生理活性ポリペプチドやタンパク質を効率よく高分子ミセルに内包させることができる。
本発明の他の好ましい形態では、内包させたい生理活性ポリペプチド及びタンパク質の等電点（ｐＩ）に応じて、高分子ミセルを調製する際のｐＨを調整することで、高分子ミセルを形成するブロックコポリマーから構成される当該ミセルの疎水性コア領域に生理活性ポリペプチドやタンパク質をより効率よく内包させることができる。
生理活性ポリペプチドやタンパク質をポリマーミセル内により効率よく内包させるには、高分子ミセルの調製の際のｐＨを生理活性ポリペプチドやタンパク質のｐＩとは異なる値に調整することが好ましい。高分子ミセルの調製の際のｐＨは、その生理活性ポリペプチドやタンパク質が変性しない限り当該生理活性ポリペプチド及びタンパク質のｐＩとは離れていることが望ましく、具体的には１以上離れていることが好ましい。また、生理活性ポリペプチドやタンパク質をより効率よく内包させるには、高分子ミセルを調製する際のｐＨにおいて、ブロックコポリマーの疎水性セグメント、即ちポリマーミセルのコアを形成する部分と生理活性ポリペプチドやタンパク質は反対の電荷を帯びていることが好ましい。例えば、高分子ミセルの調製の際のｐＨにおいて、生理活性ポリペプチドやタンパク質が正電荷を帯びている場合、ブロックコポリマーの疎水性セグメントは負電荷を帯びていることが好ましく、生理活性ポリペプチドやタンパク質が負電荷を帯びている場合、ブロックコポリマーの疎水性セグメントは正電荷を帯びていることが好ましい。このような好ましい状態において、例えば生理活性ポリペプチドやタンパク質のｐＩ、ブロックコポリマーの疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体の等電点（ｐＩ’）及び高分子ミセルの調製の際のｐＨが、
ｐＩ＞ｐＨ＞ｐＩ’
の関係にあるとき、当該ｐＨにおいてブロックコポリマーの疎水性セグメントは負に帯電し、かつ当該生理活性ポリペプチドやタンパク質は正に帯電することとなる。尚、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸の等電点はそれぞれ、２．７７と３．２２である。
本発明の一つの好ましい態様に従えば、生理活性ポリペプチドやタンパク質のｐＩが特定できれば、上記条件に適合したブロックコポリマーの疎水性セグメントの選定及び高分子ミセルの調製の際のｐＨの決定を適宜行うことができることなり、広範のｐＩを有する種々の生理活性ポリペプチドやタンパク質に適用できる。例えば、ｐＩが塩基性側にある生理活性ポリペプチドやタンパク質を内包させたい場合、疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体のｐＩ’が当該ｐＩよりも酸性側にあるブロックポリマーを選定し、更には当該ｐＩ値とｐＩ’値の間にあるｐＨを適宜選定し、そのｐＨでミセル形成を行うことで内包を効率よく行うことができる。その逆で、ｐＩが酸性側にある薬物を内包させたい場合、上記ｐＩ’が当該ｐＩよりもより酸性側又はより塩基性側にあるブロックポリマーを選定し、更には当該ｐＩ値とｐＩ’値の間にあるｐＨを適宜選定し、そのｐＨでミセル形成を行うことで内包を効率よく行うことができる。好ましくは、本発明のブロックコポリマーの疎水性セグメントは中性域、例えばｐＨ５〜８の範囲において負電荷を持つ官能基を有するものである。このようなブロックコポリマーを利用することで、ミセル形成の際のｐＨとしてかかる中性域のｐＨを選定することが可能となり、内包すべき生理活性ポリペプチドやタンパク質を極端な酸性又はアルカリ性で取り扱わずにすむことなる。
高分子ミセルの調製の際のｐＨ、生理活性ポリペプチドやタンパク質のｐＩ及び疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体のｐＩ’を考慮する場合、高分子ミセルへの生理活性ポリペプチドやタンパク質の内包は、高分子ミセルを形成するブロックコポリマーと内包すべき生理活性ポリペプチドやタンパク質と水性混合物を用意し、その混合物のｐＨを上述のとおり当該薬物のｐＩ及びブロックコポリマーの疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体のｐＩ’に基づき適宜選定したｐＨに調整することで行うことができる。
一つの好ましい態様においては、ブロックコポリマーを適当な有機溶媒、例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、などの非水混和性有機溶媒、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、などの水混和性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に溶解する。任意に、この溶液を風乾、例えば窒素気流雰囲気下でフィルム状に乾固し、さらに必要であれば減圧下で乾固することで有機溶媒を除去してよい。このようにして処理したブロックコポリマーに、内包すべき水溶性高分子薬物の水性溶液を添加し、混合する。最後にこの混合液のｐＨをゆっくりと所望のｐＨに調整し、高分子ミセルを形成しながら生理活性ポリペプチドやタンパク質を内包させる。
高分子ミセル形成は、例えば上記ブロックコポリマーと生理活性ポリペプチドやタンパク質の混合液を攪拌することで行うことができる。好ましくは、高分子ミセルの形成は超音波の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えばバイオディスラプター（日本精機）を用い、レベル４にて、氷冷しながら行うことができる。照射時間は生理活性ポリペプチドやタンパク質が変性しない限り特に限定されないが、１秒間欠、５秒〜１０分間、好ましくは５秒〜２分間照射することによって行うことができる。
また、別の好ましい態様においては、乾燥状態のブロックコポリマーを乳鉢などによって均一の粉体とし、そこへ粉末の生理活性ポリペプチドやタンパク質または、少量の溶液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加した後に穏やかに混合し、適した緩衝液を添加して２時間から２４時間撹拌し、超音波処理することによっても行うことができる。
更に、別の好ましい態様においては、最初に空ミセルを調製した後に生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加し撹拌または静置するだけで生理活性ポリペプチドやタンパク質を内包した高分子ミセルを調製することができる。具体的には、ブロックコポリマーへ適した緩衝液を添加し、前述のように超音波処理して空ミセルを調製し、そこへ同じ緩衝液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク質、または当該緩衝液で希釈した生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加し、スターラーで穏やかに撹拌するか静置することによっても行うことができる。この際の撹拌時間や静置する時間は２時間から２４時間が好ましく、温度は４℃から３０℃、特に好ましくは４℃である。この方法では、生理活性ポリペプチドやタンパク質を超音波処理せずに済むため生理活性ポリペプチドやタンパク質の安定性の観点から有利である。いずれの場合も適した緩衝液とは、前述のｐＩとｐＨの関係を満たすものであることが好ましい。
本発明の方法に従い、ポリマーミセルに効率よく内包できる生理活性ポリペプチドやタンパク質は特に限定されないが、水溶性であり、分子量１，５００以上、好ましくは２，０００以上の分子量を有する生理活性ポリペプチドやタンパク質が好ましい。生理活性ポリペプチドやタンパク質の例としては、インターフェロンα、β、γ、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、成長ホルモン、インターロイキン類、腫瘍壊死因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞増殖因子、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ等が挙げられる。また、その活性が損なわれない限り、例示した上記タンパク質の誘導体、例えば１つ以上のアミノ酸を置換、付加、削除したものが含まれることは言うまでも無い。
生理活性ポリペプチドやタンパク質は、特に、遺伝子組換えで生産した場合、同じタンパク質であっても糖鎖の有無や高次構造によってその等電点は異なる。従って、高分子ミセルの調製の際のｐＨ、生理活性ポリペプチドやタンパク質のｐＩ及び疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び／又はその誘導体のｐＩ’を考慮して高分子ミセルを調製する場合は、等電点電気泳動などによって内包させるタンパク質等の等電点を求めてから内包させる際のｐＨを決定することが望ましい。
ミセル化のために使用する生理活性ポリペプチドやタンパク質の量は特に制限されないが、一般的にはブロックコポリマーに対する水溶性高分子薬物の重量として、０．０１〜５０、好ましくは０．１〜１０重量％が使用される。
本発明の薬物内包ポリマーミセルを形成するのに用いることのできるポリマーは、ポリエチレングリコールからなる親水性セグメントと、酸性アミノ酸、その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントをからなるブロックコポリマーであり、一つの態様としては、電荷を持つ官能基を有する疎水性セグメントが挙げられる。「電荷を持つ官能基を有する疎水性セグメント」とは、ブロックコポリマーからなるポリマーミセルのコアを形成するために必要となる疎水性をそのセグメント全体として有しており、その疎水性は、そのセグメント内にランダムに存在する該疎水性部分に起因しており、且つ、そのセグメント内に、負の電荷を有する部分も存在する領域を意味する。
本発明に係るブロックコポリマーの疎水性セグメントは疎水性相互作用により内包すべき高分子薬物をしっかりと保持することができ、疎水性セグメントに電荷を有する場合は、静電的相互作用によっても高分子薬物を保持が可能となる。また、本発明者はブロックコポリマーの疎水性セグメント中の疎水基の構造により、内包された生理活性ポリペプチドやタンパク質とブロックコポリマーとの疎水的相互作用を制御し、放出速度を調節することができることも見出した。特に理論に拘束されるものではないが、以降の実施例においても実証されているとおり、ミセルを形成するブロックコポリマーの疎水性セグメントに導入された疎水基の構造がベンジルやフェニルのような平面的構造を有する場合よりも、アルキル基のような線形構造を有する方が、生理活性ポリペプチドやタンパク質がしっかりとミセルコア内に保持されるため、長時間かけて徐放されるものと考えられる。換言すれば、ブロックコポリマーの疎水性セグメントに導入された疎水基の構造を調節することで、生理活性ポリペプチドやタンパク質の放出速度を変えることが可能となる。例えば、薬物の放出速度を速めに調節したい場合、ベンジルやフェニルのような平面的構造を有する疎水基の導入率を高くすればよく、薬物の放出速度を遅めに調節したい場合、アルキル基のような線形構造を有する疎水基の導入率を高くすればよい。さらに、中間的な放出速度が所望される場合、ベンジルやフェニルのような平面的構造を有する疎水基とアルキル基のような線形構造を有する疎水基の導入率の割合を変えることで放出速度を適宜調節することができる。
本発明において有用なブロックコポリマーの具体例には次のようなものが包含される。
限定されるものでないが、親水性セグメントは、ポリ（エチレングリコール）［またはポリ（エチレンオキシド）］からなり、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸あるいはこれらの誘導体由来のセグメントを任意的に含んでいてもよい。ここでポリサッカライドとしては、プルラン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。
他方、全体として、疎水性のセグメントとしては、酸性アミノ酸、特に、ポリ（アスパラギン酸）及び／又はその誘導体、ポリ（グルタミン酸）及び／又はその誘導体を挙げることができる。具体的には、限定されるものではないが、例えばポリ（β−ベンジルアスパルテート）、ポリ（β−ベンジルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アルキルアスパルテート）、ポリ（β−アルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アリルアスパルテート）、ポリ（β−アリルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アリルアスパルテート）、ポリ（β−アラルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アラルキルアスパルテート）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（γ−アルキルグルタメート）、ポリ（γ−アルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタメート）、ポリ（γ−アラルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（β−アルキルアスパルタミド−コ−アスパラギン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタミド−コ−グルタミン酸）などのポリ（酸性アミノ酸誘導体）を挙げることができる。
疎水性セグメントは疎水性側鎖を有することで疎水性を帯びる。かかる疎水性側鎖の例としては、ベンジル基、フェニル基、アルキル基、例えば、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、−（ＣＨ２）４−フェニル基及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。上述のとおり、ポリ（アミノ酸誘導体）セグメントに導入される疎水性側鎖の構造により内包される薬物の遊離速度が調節されることから、速い遊離速度が所望される場合、疎水性側鎖はフェニル又はベンジル基が好ましく、また遅い遊離速度が所望される場合、疎水性側鎖はアルキル、例えばＣ４〜Ｃ１６アルキル基が好ましい。
このようなポリ（アミノ酸誘導体）セグメントは、それ自体公知の、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルから調製することができる。ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルの調製は、片末端が保護され、もう一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール、例えば、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２を開始剤として、脱水されたの有機溶媒中で、Ｎ−カルボキシ−β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ−ＮＣＡ）もしくは、Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（ＢＬＧ−ＮＣＡ）を所望の重合度（アミノ酸ユニット数）となるように添加し、反応させることにより得ることができる。
上記で得られたブロックコポリマーの末端をアセチルクロライドまたは無水酢酸によりアセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去してポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸またはポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸とした後、有機溶媒中で、所望のエステル化率となるようにベンジルアルコールを添加し、縮合剤、例えば、Ｎ−Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ−Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）存在下で反応させることより、部分的にベンジルエステルを有するブロックコポリマーを得ることができる。
さらに、例えば、ベンジルアルコールの代わりに、１−オクタノールを反応させれば、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸オクチルエステル、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸オクチルエステルが得られ、同様に１−ドデカノールを用いれば、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ドデシルエステルが、１−ヘキサデカノールを用いればポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ヘキサデシルエステルをそれぞれ得ることが出来る。
また、アミド結合により疎水性側鎖を導入する場合は、前述の通り、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルをアセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去したカルボキシル基にアミノ基を有する疎水性側鎖を反応させるか、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルと一級アミンを有する化合物を反応させ、アミノリシスを利用してエステル結合からアミド結合へ変換して導入することができる。
さらに、はじめに所望のアミド化率になるように有機溶媒中で１−オクチルアミンなどをポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルに添加して一定時間反応させた後、未変換のベンジルエステルに対して大過剰量の１，８−ジアミノオクタンなどを加えることにより、疎水性基の末端がアミノ基で置換された疎水性側鎖とアミノ基で置換されていない疎水性側鎖が混在するポリ（アミノ酸誘導体）セグメントにすることもできる。エステル化又はアミド化の割合は、アミノ酸ユニット数全体に対して４０％〜１００％である。アスパラギン酸、グルタミン酸は、いずれかの光学活性型のものであるか、それらの混合物であることができる。以上の親水性セグメントと疎水性のセグメントは、それ自体既知の連結基、例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ基、炭素−炭素結合、エーテル結合等を介して連結されうる。
特に、製造容易であり、本発明で都合よく使用できるブロックコポリマーとしては、下記式（Ｉ）および（ＩＩ）で示すことのできるものを挙げることができる。
0005294858.tif 000003
上記各式中Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し、Ｒ５は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ６は、水素原子、フェニル基、−（ＣＨ２）４−フェニル基、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、またはベンジル基を表し、Ｒ７はメチレン基を表し、ｎは１０〜２５００の整数であり、ｘは１０〜３００となる整数であり、ｍは０〜３００となる整数であり（但し、ｍが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ７ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在し、Ｒ６は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて任意に選択可能であり、ランダムに存在するが、Ｒ６が水素原子である場合はＲ６全体の６０％以下である）、ｙは１又は２の整数を表し、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−および−ＯＣＯ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ２が−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ここで、ＺはＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。
保護されていてもよい官能基としては、ヒドロキシル基、アセタール、ケタール、アルデヒド、糖残基、マレイミド基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、活性エステル等が挙げられる。Ｒ１およびＲ３が保護されていてもよい官能基が置換した低級アルキル基を表す場合の親水性セグメントは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０２に記載の方法に従うことができる。低級アルキルとは炭素数が例えば７個以下、好ましくは４個以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味し、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル基などが含まれる。
ミセル形成は、例えばブロックコポリマーと生理活性ポリペプチドやタンパク質を、前述の通り、適した緩衝液に溶解して攪拌することで行うことができる。好ましくは、空ミセルの形成は超音波の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えばバイオディスラプター（日本精機）を用い、レベル４にて、氷冷しながら行うことができる。照射時間は生理活性ポリペプチドやタンパク質が変性しない限り特に限定されないが、１秒間欠、５秒〜１０分間、好ましくは５秒〜２分間照射することによって行うことができる。また、別の方法としては、乾燥状態のブロックコポリマーを乳鉢などによって均一の粉体とし、そこへ粉末の生理活性ポリペプチドやタンパク質または、少量の溶液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加した後に穏やかに混合し、適した緩衝液を添加して２時間から２４時間、４℃で撹拌し、氷冷しながら超音波処理することによっても行うことができる。
更に、別の方法としては、ブロックコポリマーへ適した緩衝液を添加し、前述のように超音波処理して空ミセルを調製し、そこへ同じ緩衝液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク質、または当該緩衝液で希釈した生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加し、スターラーで穏やかに撹拌するか静置することによっても行うことができる。この際の撹拌時間や静置する時間は２時間から５日間が好ましく、温度は４℃から３０℃、特に好ましくは４℃である。この方法では、生理活性ポリペプチドやタンパク質を超音波処理せずに済むため生理活性ポリペプチドやタンパク質の安定性の観点から有利である。いずれの場合も適した緩衝液とは、前述のｐＩとｐＨの関係を満たすものであることが好ましい。
こうして、調製した生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセルについて、その粒子径は生体に投与できるサイズであれば特に限定されないが、１０μｍ以下が好ましく、５μｍ以下であることがより好ましい。特に、静脈内投与で用いる場合は、５００ｎｍ以下であることが好ましく、３００ｎｍ以下であることがより好ましい。必要であれば、生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセルを含有する水性溶液を所望の孔径の親水性フィルターで濾過する。
本発明に係る生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセルを生体内に投与する場合は、その投与ルートは問わないが、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。本発明の好適な態様の一つとして、各種の糖類および／または各種のポリエチレングリコール（マクロゴール）を、除菌濾過前の薬物内包ポリマーミセル水溶液（または水性溶液）に加える工程をさらに含んでなる方法により製造できる。限定されるものでないが、使用できる糖類としては、マルトース、トレハロース、キシリトール、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、マンニトールおよびデキストリン等が挙げられ、使用できるポリエチレングリコールとしては、分子量が約１０００〜約３５０００であって、例えば、マクロゴール１０００、１５４０、４０００、６０００、２００００および３５０００等が挙げられる。
本発明に係る生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセル製剤は、内包させた生理活性ポリペプチドやタンパク質の安定性に影響を及ぼさない限り凍結乾燥することもできる。凍結乾燥した場合には、乾燥製剤を水または水性溶液を用いて生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセル含有溶液に再溶解または再構成する。
凍結乾燥する場合、凍結乾燥前の溶液に糖類を、その最終濃度が０．１〜１５％（ｗ／ｖ）になるように加えてよく、またはポリエチレングリコールを、その最終濃度が０．５〜１０％（ｗ／ｖ）になるように加えてもよい。通常、ブロックコポリマーと糖類またはポリエチレングリコールとの割合は、それぞれ重量で１：１〜１：１０または１：０．５〜１：１０である。
好ましい態様において、親水性セグメントの末端にターゲット能を有する分子を結合可能な官能基を有していても良い。ターゲット能を有する分子を結合可能な官能基としては、特に限定されないが、ヒドロキシル基、アセタール基、ケタール基、アルデヒド基、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基などが挙げられ、官能基は、保護されていてもよい。ターゲット能を有する分子としては、特に限定されないがリガンド、抗体またはその機能断片、タンパク質、ペプチドなどが挙げられる。官能基にターゲット能を有する分子を結合させる場合は、該分子の構造によって適宜選択され、公知の方法で結合させることができる。
以下に比較例、実施例を示し、本発明を具体的に示す。
以下においては、例えばブロックコポリマーのＰＥＧ鎖の平均分子量１２，０００、ポリアミノ酸鎖の平均が４０残基、ポリアミノ酸側鎖へのベンジルエステルの導入率が約６５％の場合、ブロックコポリマーの後に、１２−４０（６５）と表記し、同様にオクチルエステル等の導入率が約６５％の場合も１２−４０（６５）と表記する。尚、約６５％とは、６２％〜６８％の程度を意味する。
【実施例】
【０００６】
１）内包率の測定
実施例１  （ヒトＩｇＧ内包ミセルの調製１）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡという。本ポリマーにおいて、ベンジルエステルが導入されていないアスパラギン酸残基は、一般式（Ｉ）中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様。また、以下全てのブロックコポリマーは一般式（Ｉ）の
0005294858.tif 000004
）を用いた。ガラスバイアル中に１０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）を精秤し、ジクロロメタン１ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下で１時間程度乾固させた。ここに、精製ヒトＩｇＧ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社）（ｐＩ約８）２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６、１６．５ｍｇ／ｍＬ）を６２μＬ添加し、４℃で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）または２０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８）を徐々に１．９３８ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＩｇＧ濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）により決定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000005
内包率はｐＨ６で調製した時９４％であった。一方、ｐＨ８で調製した時４１％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製する方が、等電点近くで調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例２  （ヒトＩｇＧ内包ミセルの調製２）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＢＬＧという。本ポリマーにおいて、ベンジルエステルが導入されていないグルタミン酸残基は、一般式（Ｉ）中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様。）を用いた。ガラスバイアル中に１０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＧ  １２−４０（６５）を精秤し、ジクロロメタン１ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下で１時間程度乾固させた。ここに、精製ヒトＩｇＧ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社）（ｐＩ約８）リン酸緩衝溶液（ｐＨ６、１６．５ｍｇ／ｍＬ）を６２μＬ添加し、４℃で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）または２０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８）を１．９３８ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＩｇＧ濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）により決定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000006
内包率はｐＨ６で調製した時８３％であった。一方、ｐＨ８で調製した時６３％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製する方が、等電点近くで調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＧ  １２−４０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例３  （ヒトＩｇＧ内包ミセルの調製３）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸オクチルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＯＬＡという。本ポリマーにおいて、オクチルエステルが導入されていないアスパラギン酸残基は、一般式（Ｉ）中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様）を用いた。ガラスバイアル中に１０ｍｇのＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）を精秤し、ジクロロメタン１ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下で１時間程度乾固させた。ここに、精製ヒトＩｇＧ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社）（ｐＩ約８）２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６、１６．５ｍｇ／ｍＬ）を６２μＬ添加し、４℃下で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）または２０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８）を徐々に１．９３８ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＩｇＧ濃度をアミノ酸分析（Ｗａｔｅｒｓ社、ＡｃｃＱ  Ｔａｇ（商標）法）により決定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000007
内包率はｐＨ６で調製した時９７％であった。一方、ｐＨ８で調製した時２４％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製する方が、等電点近くで調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
比較例１  （ヒトＩｇＧ内包ミセルの調製４）
ガラスバイアル中に１０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（１００）を精秤し、ジクロロメタン１ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下で１時間程度乾固させた。ここに、精製ヒトＩｇＧ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社）（ｐＩ約８）２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６、１６．５ｍｇ／ｍＬ）を６２μＬ添加し、４℃下で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）または２０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８）を徐々に１．９３８ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＩｇＧ濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）から決定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000008
内包率はｐＨ６で調製した時２２％であった。一方、ｐＨ８で調製した時６５％であった。この結果は、カルボキル基を持たないＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（１００）を用いる時、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製しても、静電的相互作用の関与はなく、効率よくタンパク質を内包させるのは難しいことを示している。等電点付近で調製する方が疎水的相互作用に基づき、タンパク質が内包されることを示している。
比較例２  （ヒトＦＩＴＣ標識ＩｇＧ内包ミセルの調製）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸（平均残基数が約５０残基、非エステル化）ブロック共重合体、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）、またはＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）の３種を用いた。ガラスバイアル中に２０ｍｇのポリマーを精秤し、ジクロロメタン２ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下１時間程度乾固させた。ここに、ＦＩＴＣ標識ヒトイムノグロブリン（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）リン酸緩衝溶液（シグマ−アルドリッチ社、２０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、４℃で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を徐々に１．９ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）した。沈殿として回収したミセル画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で懸濁し、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＦＩＴＣ−ＩｇＧ濃度をプレートリーダー（大日本住友製薬、パワースキャン（登録商標）ＨＴ）を用い（励起波長：４８５ｎｍ±２０ｎｍ、発光波長：５２８ｎｍ±２０ｎｍ）測定し、内包率を以下の式から求めた。
0005294858.tif 000009
内包率は、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸（平均残基数が約５０残基、非エステル化）ブロック共重合体を用いた場合、６％であった。一方、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）またはＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）を用いた場合、内包率はそれぞれ５１％、６０％であった。この結果は、疎水性を有する置換基と荷電性を有する基が共存する、全体として疎水性セグメントからなるポリマーを用いる方が効率よくタンパク質を内包でき、内包には静電相互作用以外に、疎水的相互作用等も関与していることを示している。また、実施例１−３の結果も合わせた上記の結果は、ブロックコポリマーの疎水性セグメント中の疎水基の構造は、内包率には大きく関与しないことを示している。
実施例４  （ＦＩＴＣ標識ウシ血清アルブミン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に４０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）を精秤し、ジクロロメタン２ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下１時間程度乾固させた。ここに、ＦＩＴＣ標識ウシ血清アルブミン（シグマ−アルドリッチ社）（ｐＩ約５）水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を２００μＬ添加し、４℃下で軽く撹拌しながら、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）または２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６）を徐々に３．８ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）を行った。上清中のＦＩＴＣ標識ウシ血清アルブミン濃度をプレートリーダー（大日本住友製薬、パワースキャン（登録商標）ＨＴ）を用い（励起波長：４８５ｎｍ±２０ｎｍ、発光波長：５２８ｎｍ±２０ｎｍ）測定し、内包率を以下の式から求めた。
0005294858.tif 000010
内包率はｐＨ３．５で調製した時１６％であった。一方、ｐＨ６で調製した時７％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製する方が、等電点近くで調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例５  （ウシヘモグロビン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に２０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）を精秤し、ジクロロメタン２ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下１時間程度乾固させた。ここに、ウシヘモグロビン（シグマ−アルドリッチ社）（ｐＩ約７）水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、４℃下で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）または２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を徐々に１．９ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のヘモグロビン濃度をプレートリーダー（大日本住友製薬、パワースキャン（登録商標）ＨＴ）を用い、測定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000011
内包率はｐＨ６．０で調製した時１９％であった。一方、ｐＨ７．４で調製した時１０％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点より酸性条件下でミセルを調製する方が、等電点よりアルカリ条件下で調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例６  （リコンビナント  ヒトインターフェロン−α内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に、７．０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）を精秤し、ジクロロメタンを０．７ｍＬ加えて溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、更に減圧下で１時間程度乾固させた。そこに、リコンビナント  ヒトインターフェロン−α（ｐＩ約６．０）のＰＢＳ溶液（ＩＦＮ−α，ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（０．２ｍｇ／ｍＬ  ３５μＬ）を加え、続いて０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を２００μＬ添加した。４℃で緩やかに混和してポリマーをほぼ溶解させ、続いて２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、全量を１．４ｍＬとし、４℃で一晩撹拌した。撹拌終了後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）し、上清中のＩＦＮ−α濃度をＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。
他方、ガラスバイアル中に、２．６ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）を秤量し、ジクロロメタンを０．２６ｍＬ加えて溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、更に減圧下で１時間程度乾固させた。そこに、前述と同様のリコンビナント  ヒトインターフェロン−αのＰＢＳ溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ  １２．５μＬ）を加え、続いて０．１Ｍ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を１００μＬ添加した。４℃で緩やかに混和してポリマーをほぼ溶解させ、続いて２０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を４００μＬ添加し、４℃で一晩撹拌した。撹拌終了後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）し、上清中のＩＦＮ−α濃度をＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。それぞれの実験の測定値から、下記の式により内包率を求めた。
0005294858.tif 000012
内包率はｐＨ５．０で調製した時１００％であった。一方、ｐＨ８．０で調製した時３６％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点より酸性条件下でミセルを調製する方が、等電点よりアルカリ条件下で調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例７  （パパイン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に２０ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−４０（６５）を精秤し、ジクロロメタン２ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固し、さらに減圧下１時間程度乾固させた。ここに、パパイン（シグマ−アルドリッチ社）（ｐＩ約８．８）水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、４℃下で軽く撹拌しながら、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）または２０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を徐々に１．９ｍＬ加えた。４℃で終夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射後、ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）を行った。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のパパイン濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）で測定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000013
内包率はｐＨ６．０で調製した時２７％であった。一方、ｐＨ８．０で調製した時９％であった。この結果は、内包タンパク質の等電点から離れたｐＨ条件下でミセルを調製する方が、等電点近くで調製するよりも、タンパク質とＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−４０（６５）との静電的相互作用に基づき、効率よくタンパク質を内包できることを示している。
また、これまでの実施例の結果は、本発明に基づき広範囲のタンパク質を効率よく高分子ミセルに内包できることを示している。
２）ミセルからのタンパク質遊離率の評価
実施例８  （ヒトＦＩＴＣ標識ＩｇＧ内包ミセルからの遊離評価）
ブロックコポリマーには、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）またはＰＥＧ−ＰＯＬＡ１２−４０（５０）を用いた。バイアルにポリマーをそれぞれ２０ｍｇずつ精秤し、ジクロロメタン２ｍＬを添加して溶解した。その溶液を窒素気流下でフィルム状に乾固させ、減圧下でさらに１時間程度乾固させた。ＦＩＴＣ標識ヒトイムノグロブリン（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）（シグマ−アルドリッチ社、２０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ添加し、軽く撹拌しながら、さらに２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３．９ｍＬを徐々に加えた。４℃にて一晩攪拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）で超音波照射後、超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ、４℃、１時間）にてミセルを得た。回収したミセルを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で懸濁し、ウシ血清中に添加し［最終ウシ血清濃度：５０％（ｖ／ｖ）］、３７℃でインキュベーションした。内包したＦＩＴＣ−ＩｇＧの遊離を評価するため、予め決めたインキュベーション時間の後にサンプル１ｍＬをゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ：〜２φ×３０ｃｍ）した。回収した各フラクション（溶離液：２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のＦＩＴＣ−ＩｇＧ濃度をプレートリーダー（大日本住友製薬、パワースキャン（登録商標）ＨＴ）を用い（励起波長：４８５ｎｍ±２０ｎｍ、発光波長：５２８ｎｍ±２０ｎｍ）測定し、遊離率を以下の式から求めた。
0005294858.tif 000014
（ただし、上記の緩衝液は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）である。）
遊離率の経時変化を図１に示した。この結果は、ミセルに内包されたタンパク質が血清存在下においても初期にバーストすることなく、長時間徐放されることを示している。また、遊離速度は、疎水基の構造に依存することを示している。特に理論に拘束されるものではないが、ミセルを形成するブロックコポリマーの疎水性セグメントに導入された疎水基の構造がベンジルのような平面的構造を有する場合よりも、アルキル基のような線形構造を有する方が、薬物をしっかりと保持し、その放出は制御された状態で達成されると考えられる。
実施例９  （インターフェロン−α静脈内投与試験）
ブロックコポリマーには、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １２−５０（６５）またはＰＥＧ−ＰＯＬＡ１２−４０（６５）を用いた。バイアル中に１０ｍｇのポリマーを精秤し、ジクロロメタン１ｍＬを加え溶解した。その溶液を窒素気流下フィルム状に乾固し、さらに減圧下３時間程度乾固させた。ここに、リコンビナント  ヒトインターフェロン−α  ＰＢＳ溶液（ＩＦＮ−α，ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（０．２ｍｇ／ｍＬ，４６μＬ）を加え、続いて０．２Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）２００μＬを添加した。４℃でゆるやかに撹拌して、ポリマーをほぼ溶解させ、続いて２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を添加して全量を２ｍＬとし、４℃で一昼夜撹拌した。サンプルを超遠心（３０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−１３０ローター）し、内包されなかったＩＦＮ−αを除き、ミセルを沈殿として回収した。このミセルを５％グルコース水溶液で懸濁し、以下の動物実験に用いた。
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを１群２匹に区分し、上記の被験液を１×１０６ＩＵ／ｋｇの投与量になるよう尾静脈より投与した。投与から５分、１、３、６、９及び２４時間後に頸静脈からヘパリンコートしたシリンジを用い、約０．２ｍＬを採血した。直ちに、１３８００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離し（ＥＦ−１３００、ＥＣＯ−Ｆｕｇｅ（商標）、トミー精工）、血漿を回収し、分析まで−３０℃で保存した。ヒトインターフェロン−αＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、血漿中濃度を測定した。
測定結果を図２に示した。ミセル化により血漿中濃度の滞留性が向上した。さらにノンコンパートメントモデルに従い計算した薬物動態パラメーターを下に示す。
0005294858.tif 000015
ミセル化によりＡＵＣは１７倍から３５倍増加した。この結果は、タンパク質内包ミセルが血中においても初期にバーストすることなく、長時間に亘り血中に滞留することを示している。また、生体内におけるタンパク遊離速度は、インビトロの結果と同様に、疎水基の構造に依存することを示している。
実施例１０  （ＦＩＴＣ標識リゾチウム内包ミセルのラット静脈内投与試験）
１）リゾチウムのＦＩＴＣ標識化
リゾチウム（卵白由来）（シグマ−アルドリッチ）１００ｍｇを１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）２ｍＬに溶解後、ＦＩＴＣ（ＰＩＥＲＣＥ）の５０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液１７０μＬを添加した。室温にて１時間攪拌後、ゲルろ過（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、ＰＤ−１０）（溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．４）にて未反応のＦＩＴＣを除いた。さらに水に対し４℃で透析した後、もう一度ゲルろ過（シグマ−アルドリッチ社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂ）（溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．４）にて精製した。
２）ＦＩＴＣ標識リゾチウム内包ミセルの調製とラットＰＫ試験
４０ｍｇのブロックコポリマー、ＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）をガラスバイアル中に精秤し、ＦＩＴＣ標識リゾチウム４ｍｇ（２９．２ｍｇ／ｍＬ、１３７μＬ）、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５００μＬを添加した。４℃で一晩攪拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１０秒間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）超音波照射した。超遠心（８０，０００ｒｐｍ、１時間、４℃、ベックマン社、ＭＬＡ−８０ローター）により、沈殿として回収したミセル画分を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％グルコースに懸濁した後、同様の超遠心操作にて洗浄し、再び、同緩衝液に懸濁した後、以下のラット投与試験に用いた。
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを１群３匹に区分し、上記の被験液を１０ｍｇ／ｋｇのＦＩＴＣ標識リゾチウム投与量になるよう尾静脈より投与した。投与から５分、１、３、６、９及び２４時間後に頸静脈からヘパリンコートしたシリンジを用い、約０．２ｍＬ採血した。直ちに、４℃にて遠心分離して（ＥＦ−１３００、ＥＣＯ−Ｆｕｇｅ（商標）トミー精工）、血漿を回収し、分析まで−３０℃で保存した。ＦＩＴＣ標識リゾチウム溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝  ｐＨ７．４／５％グルコース）も同様に実験した。以下のＨＰＬＣ条件にて、血漿中濃度を測定した。
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（４．６φ×３００ｍｍ）（３０℃）
移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：蛍光（Ｅｘ：４９２ｎｍ、Ｅｍ：５２０ｎｍ）
インジェクション体積：１０μＬ
測定結果を図３に示した。溶液投与の場合と比較し、ミセル化によりにＡＵＣは約１５倍増加した。この結果は、ミセルに内包されたタンパク質が血中においても初期にバーストすることなく、長時間に亘り血中に滞留することを示している。
実施例１１  （インターフェロン−α内包ミセルの静脈投与試験２）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ドデシルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＤＬＡという。本ポリマーは、ドデシルエステルが導入されていないアスパラギン酸残基は、一般式（Ｉ）中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様。）またはポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ヘキサデシルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＨＬＡという。尚、キサデシルエステルが導入されていないアスパラギン酸残基は、一般式中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様）を用いた。ガラスバイアル中に２００ｍｇのＰＥＧ−ＰＤＬＡ１２−４０（６５）またはＰＥＧ−ＰＨＬＡ１２−４０（６５）を精秤し、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を１０ｍＬ加え、４℃で激しく終夜撹拌した。ポリマー分散液をバイオディスラプター（日本精機製作  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１５分間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）超音波処理し、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度となるよう、空ミセル溶液を得た。マイクロチューブ（家田化学）に空ミセル溶液０．６５ｍＬを移し、ここにリコンビナントヒトインターフェロン−αＰＢＳ溶液（ＩＦＮ−α、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）６５μＬと０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、軽くピペッティングした後、４℃で４日間静置した。限外ろ過ユニット［ミリポア  アミコン（登録商標）ウルトラ−４（分画分子量：１００，０００）］で５％グルコース溶液にて洗浄・濃縮し、以下の動物実験に用いた。
６週齢のＷｉｓｔａｒ系ラットを１群３匹に区分し、上記の被験液を１×１０６ＩＵ／ｋｇの投与量になるように尾静脈より投与した。投与から５分、１、３、６および２４時間後に頸静脈からヘパリンコートしたシリンジを用い、約０．２ｍＬ採血した。直ちに、１３，８００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離して（ＥＦ−１３００、ＥＣＯ−Ｆｕｇｅ（商標）トミー精工）、血漿を回収し、分析まで−３０℃で保存した。ヒトインターフェロン−αＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、血漿中濃度を測定した。
インターフェロン−α内包高分子ミセルを生体投与した後のインターフェロン−α血漿中濃度の経時変化を図４に示した。ミセル化によりＡＵＣは、ＰＥＧ−ＰＤＬＡ１２−４０（６５）を用いた場合では３２倍、ＰＥＧ−ＰＨＬＡ１２−４０（６５）を用いた場合では２７倍増加した。
実施例１２  （インターフェロン−α内包ミセルの静脈投与試験３）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸オクチルエステル（以下、ＰＥＧ−ＰＯＬＧという。本ポリマーは、オクチルエステルが導入されていないグルタミン酸残基は、一般式（Ｉ）中のＲ５が−Ｏ−、Ｒ６が水素原子である。以下同様。）を用いた。ガラスバイアル中に１５０ｍｇのＰＥＧ−ＰＯＬＧ１２−４０（６５）を精秤し、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ加え、４℃で激しく終夜撹拌した。ポリマー分散液をバイオディスラプター（日本精機製作  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１５分間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）超音波処理し、３０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度となるよう、空ミセル溶液を得た。クライオバイアル（家田化学）に空ミセル溶液０．６ｍＬを移し、ここにリコンビナントヒトインターフェロン−α溶液（ＩＦＮ−α、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）９０μＬと０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）１１０μＬを加え、軽くピペッティングした後、４℃で３日間静置した。マイクロチューブに４００μＬ分注し、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて５００μＬとした後、限外ろ過ユニット［ミリポア  アミコン（登録商標）ウルトラ−４（分画分子量：１００，０００）］で５％グルコース溶液にて洗浄・濃縮し、以下の動物実験に用いた。
６週齢のＷｉｓｔａｒ系ラットを１群２匹に区分し、上記の被験液を１×１０６ＩＵ／ｋｇの投与量になるように尾静脈より投与した。投与から５分、１、３、６および２４時間後に頸静脈からヘパリンコートしたシリンジを用い、約０．２ｍＬ採血した。直ちに、１３，８００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離して（ＥＦ−１３００、ＥＣＯ−Ｆｕｇｅ（商標）、トミー精工）、血漿を回収し、分析まで−３０℃で保存した。ヒトインターフェロン−αＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、血漿中濃度を測定した。
インターフェロン−α内包高分子ミセルを生体投与した後のインターフェロン−α血漿中濃度の経時変化を図５に示した。ミセル化によりＡＵＣは５７倍増加した。
実施例１３  （メリチン内包ミセルの調製）
ブロックコポリマーには、ＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）またはＰＥＧ−ＰＯＬＧ  １２−４０（６５）を用いた。ガラスバイアル中にポリマーを１５０ｍｇ精秤し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍＬ加え、４℃で激しく撹拌した。ポリマー分散液をバイオディスラプター（日本精機製作  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、約１５分間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）超音波処理し、３０ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度となるよう、空ミセル溶液を得た。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて１０ｍｇ／ｍＬ（１ｍＬ）に調整し、塩基性のポリペプチドであるメリチン（シグマ−アルドリッチ社）（１ｍｇ）を加え、４℃下で終夜静置した後、ゲルろ過（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標登録）ＣＬ−４Ｂ：１φ×３０ｃｍ）を行った。回収したフラクション（溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、フラクション体積：１ｍＬ）中のメリチン濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）で測定した。内包率は以下の式から求めた。
0005294858.tif 000016
内包率はＰＥＧ−ＰＯＬＡ  １２−４０（６５）で７１％、ＰＥＧ−ＰＯＬＧ  １２−４０（６５）で４８％であった。この結果は、分子量が約２，８００のポリペプチドを効率よく内包できることを示している。
実施例１４  （ヒト顆粒球コロニー刺激因子内包ミセルのラット静脈内投与試験１）
ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸オクチルアミド（以下、ＰＥＧ−ＰＯＮＬＡという。本ポリマーは、一般式（Ｉ）中のＲ５が−ＮＨ−、Ｒ６がオクチル基であるアミノ酸残基を５０％有し、Ｒ５が−ＮＨ−、Ｒ６がアミノ基で置換されたオクチル基であるアミノ酸残基を５０％有する。以下同様）を用いた。ガラスバイアル中に３０ｍｇのＰＥＧ−ＰＯＮＬＡ１２−４０（５０）を精秤し、５％グルコース含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍＬ加えた後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、１０分間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射を行い、空ミセルを調製した。ここに、リコンビナント  ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ社）（ｐＩ約６．０）（３００μｇ／ｍＬ、１ｍＬ）を加え、４℃で一昼夜静置した。その後、限外ろ過ユニット［ミリポア  アミコン（登録商標）ウルトラ−４（分画分子量：１００，０００）］により、内包されなかったＧ−ＣＳＦを除き、以下の動物実験用ミセルとした。
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを１群３匹（溶液は１群６匹）に区分し、上記の被験液を１００μｇ／ｋｇの投与量になるよう尾静脈より投与した。投与から５分、１、３、６、２４時間後に頸静脈からヘパリンコートしたシリンジを用い、約０．２ｍＬを採血した。直ちに、１３，８００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離し（ＥＦ−１３００、ＥＣＯ−Ｆｕｇｅ（商標）、トミー精工）、血漿を回収し、分析まで−３０℃で保存した。ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  ｉｎｃ）を用い、血漿中濃度を測定した。
測定結果を図６に、ノンコンパートメントモデルに従い計算した薬物動態パラメーターを表２に示す。ミセル化によりＡＵＣは３倍に増加し、半減期は２倍に延長した。
【表２】
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実施例１５  （ヒト顆粒球コロニー刺激因子内包ミセルのラット静脈内投与試験２）
ブロックコポリマーには、ＰＥＧ−ＰＯＬＧを用いた。ガラスバイアル中に３０ｍｇのＰＥＧ−ＰＯＬＧ１２−４０（６５）を精秤し、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を２ｍＬ加えた後、バイオディスラプター（日本精機製作所  Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用い、氷冷下、１０分間（１秒間欠、出力：Ｌｏｗ）の超音波照射を行い、空ミセルを調製した。ここに、リコンビナント  ヒトＧ−ＣＳＦ溶液（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ社）（３００μｇ／ｍＬ、１ｍＬ）を加え、４℃で一昼夜静置した。その後、限外ろ過ユニット［ミリポア  アミコン（登録商標）ウルトラ−４（分画分子量：１００，０００）］により、内包されなかったＧ−ＣＳＦを除き、５％グルコース含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、動物実験用ミセルとした。ミセルは、実施例１２と同様にＧ−ＣＳＦとして１００μｇ／ｍＬの投与量でラットに静脈内投与した。同じように採血し、血漿中濃度を測定した。
測定結果を図７に、ノンコンパートメントモデルに従い計算した薬物動態パラメーターを表３に示す。ミセル化によりＡＵＣは１５倍に増加、半減期は５倍に延長し、投与１２０時間後においても血漿中濃度を検出することができた。この結果は、タンパク質内包ミセルが血中においても初期バーストすることなく、長時間に亘り血中に滞留することを示している。
【表３】
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これまでの本発明の説明は実例と説明のための例示的なものである。本発明の概念及び範囲を逸脱することなく種々の改変を行い得ることが理解されるべきである。従って、請求の範囲はそのような改変の全てを包含するものと解されることを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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