(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生株または親株よりも多い量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができ、かつ、腸内細菌由来のｙｈａＭ遺伝子の発現量を低下させること又は同遺伝子を破壊することにより、同遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
【請求項２】
前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１に記載の細菌。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質。
【請求項３】
前記ｙｈａＭ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡによりコード化されるものである、請求項１または２に記載の細菌。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
さらに、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
【請求項８】
前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造法に関し、詳しくはＬ−システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたＬ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。
【０００４】
また、Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
【０００５】
さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ−座、ｅｍｒ−座、ａｃｒ−座、ｃｍｒ−座、ｍｅｘ−遺伝子、ｂｍｒ−遺伝子、ｑａｃＡ−遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒもしくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。
【０００６】
また、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ （特許文献９）が知られている。
【０００７】
ｙｈａＭは、機能未知の遺伝子としてデータベースEcoCyc（非特許文献２）に登録されているが、Ｌ−システイン生産との関連は知られていない。
【特許文献１】特開２００２−２３３３８４
【特許文献２】特開平１１−１５５５７１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号
【特許文献４】米国特許第６２１８１６８号
【特許文献５】特開２００３−１６９６６８
【特許文献６】特開２００５−２４５３１１
【特許文献７】米国特許第５９７２６６３号
【特許文献８】特開２００５−２８７３３３
【特許文献９】国際公開パンフレット第０１／２７３０７号
【非特許文献１】Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)
【非特許文献２】BioCyc Home Page, Summary of Escherichia coli, Strain K-12, version 11.6, E. coli K-12 Gene: yhaM［平成２０年１月２５日検索］、インターネット＜URL：http://biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=G7622＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように細菌を改変することによってＬ−システイン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）前記yhaM遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下した、前記細菌。
（３）前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記細菌。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質。
（４）前記yhaM遺伝子質が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）さらに、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する前記細菌。
（６）前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
（７）前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
（８）前記細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
（９）前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。ここで、Ｌ−システイン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をい
う。また、Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる微生物を意味する。
微生物が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。また、後述するように、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski
T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010号参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。したがって、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システインに加えて、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、例えばＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、もしくはヘミチオケタール、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力も含まれる。
【００１２】
Ｌ−システイン生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。尚、本発明においてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくは前記のような誘導体、またはこれらの混合物を指すことがある。
【００１３】
本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属を用いることが望ましい。
【００１４】
エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１５】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、
近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
【００１７】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。
【００１８】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１９】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。
パントエア・アナナティスとして具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株AJ13355（FERM BP-6614）から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。
パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００２０】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。
【００２１】
以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法について述べる。
【００２２】
細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適
用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２３】
Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２４】
具体的には、Ｌ−システイン生産菌としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）をコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli
JM15(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
E. coliでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC産物、特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、トリプトファナーゼ（tnaA産物、特開2003-169668、（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218））、Ｏ−アセチルセリン
スルフヒドリラーゼＢ（cysM遺伝子産物、特開2005-245311）、及び、malY遺伝子産物（特開2005-245311）が知られている。これらのタンパク質の活性を低下させることにより、Ｌ−システイン生産能が向上する。
【００２５】
本発明においては、Ｌ−システイン生産菌は、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持していることが好ましい。エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型SATとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型SAT（特開平11-155571）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型SAT（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型SAT（WO97/15673号国際公開パンフレット、米国特許第6218168号）、野生型SATの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型SAT（米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。実施例に記載した変異型SATをコードするcysE5は、野生型SATの９５位及び９６位のVal残基及びAsp残基が、各々Arg残基及びPro残基に置換されている。
【００２６】
SAT遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、SAT活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。
細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入すれば、Ｌ−システイン生産能が付与される。細菌への変異型SAT遺伝子の導入は、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベク
ターを用いることができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００２７】
SAT遺伝子を含む組換えベクターを細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方法（Methods
in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、エレクトロポーレーションによる方法等、細菌の形質転換に通常用いられている方法を用いることができる。
【００２８】
また、SAT遺伝子のコピー数を高めることによっても、SAT活性を上昇させるこができる。SAT遺伝子のコピー数を高めることは、上記のようなベクターを用いてSAT遺伝子を細菌に導入することによって、又は、SAT遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによって達成できる。細菌の染色体DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００２９】
本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「YhaM」と記載することがある）の活性が低下するように改変することによって得ることができる。ただし、YhaMタンパク質の活性が低下するように改変を行った後に、Ｌ−システイン生産能を付与してもよい。
yhaM遺伝子は、ECK3099、b4470、yhaN遺伝子と同義であり、以前はb3109、又はb3108とも呼ばれていた。
【００３０】
「yhaM遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下する」とは、yhaM遺伝子によりコードされるYhaMタンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味し、活性が完全に消失していることを含む。
【００３１】
YhaMタンパク質の活性を低下させるような改変は、例えば、yhaM遺伝子の発現を低下させることによって達成される。具体的には例えば、染色体上のyhaM遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることによって、前記タンパク質の細胞内の活性を低下させることができる。また、同遺伝子は、yhaO遺伝子とオペロンを形成しており（データーベース「Regulon DB」http://regulondb.ccg.unam.mx/）、YhaMタンパク質の活性の低下は、同オペロンのプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによっても、発現を低下させることができる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上のyhaM遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。さらには、yhaO遺伝子のコード領域又は非コード領域の改変によっても、yhaM遺伝子の発現を低下させることができる。
【００３２】
また、YhaMタンパク質の活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の
変異処理による改変であってもよい。
【００３３】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、YhaMタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００３４】
yhaM遺伝子のコード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるYhaMタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００３５】
染色体上のyhaM遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するYhaMタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされるYhaMタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）。
【００３６】
yhaM遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。
【００３７】
YhaMタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold
spring Harbor (USA), 2001））。
【００３８】
エシェリヒア・コリのyhaM遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。
検索プログラムPfamによって、YhaMタンパク質のドメインサーチを行った結果、Protein of unknown function (DUF1063)として、エシェリヒア属、サルモネラ属、シゲラ属等をはじめとする計78種類の細菌のタンパク質がヒットし、これらのタンパク質は細菌に広く保存されたタンパク質であることがわかる。このように、細菌が属する種又は菌株によって、yhaM遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、改変するyhaM遺伝子は、配列番号１の塩基配列のバリアントであってもよい。yhaM遺伝子のバリアントは、配列番号１の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、yhaM遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログ、例えば腸内細菌科やコリネ型
細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
【００３９】
エシェリヒア・コリ以外の細菌のyhaM遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のyhaM遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号２０〜３１に示す。カッコ内はNCBI （National Center for Biotechnology Information）データベースのアクセション番号を示す（GenBank Identifier(gi) | RefSeq accession (ref)）。
シゲラ・ボイディイ（Shigella boydii）Sb227（accession：gi|82545369|ref|YP_409316.1）
シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）ATCC BAA-895（accession: gi|157148682|ref|YP_001456001.1）
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）LT2（accession: gi|16766537|ref|NP_462152.1）
アクチノバチルス・プロイロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）serovar 3 str. JL03（accession: gi|165977041|ref|YP_001652634.1）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）subsp. pneumoniae MGH 78578
（accession: gi|152972895|ref|YP_001338041.1|）
ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）ES114（accession: gi|59711248|ref|YP_204024.1|）
【００４０】
また、yhaM遺伝子は、上記のようなYhaMタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４１】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型YhaMタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００４２】
また、yhaM遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば前記遺伝子配列又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、YhaMタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４３】
プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００４４】
上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ等の酵素やそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。
【００４５】
＜２＞本発明のＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。Ｌ−システインの誘導体としては、前記したようなＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール等が挙げられる。
【００４６】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
【００４７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００４８】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４９】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
【００５０】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５１】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００５２】
上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が含まれる。
【００５３】
また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。
また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。以下の記載において、システインはＬ−体である。
【００５５】
（１）E. coli MG1655株からのyhaM遺伝子のクローニング
E. coli MG1655（ATCC No. 47076）の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーECOyhaM-F（CGCGGATCCAAGATGCCTGCCGAGAAGATTAACG：配列番号３）、及びECOyhaM-R（CGCGGATCCGAGCGAGCTGGAAGCTATCG：配列番号４）を用いたPCRによってyhaM遺伝子の上流300bpから下流200bpまでを含むyhaM遺伝子断片を取得した。これらのプライマーの5’末端には制限酵素BamHIのサイトがデザインされている。PCRにはPyrobestポリメラーゼ（Takara社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 2分からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって目的の断片を増幅した。得られた断片をBamHIで処理し、pSTV29（Takara社）のBamHIサイトに挿入し（ベクター上のlacZ遺伝子と逆の向きに挿入）、yhaMがクローニングされたプラスミドpSTV-yhaM7（クロラムフェニコール耐性マーカーを持つ）を取得した。シークエンシングによりPCRによるエラーがないことを確認した。
【００５６】
次に、pSTV-yhaM7よりBamHIによって増幅断片を切り出し、pACYC177（NipponGene社）のBamHIサイトに挿入し（ベクター上のカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きに挿入）、pACYC-M1（カナマイシン耐性マーカーを持つ）を作製した。こうして、同じyhaM領域がクローニングされた、2種類の別の抗生物質耐性マーカーをもつプラスミド（いずれも同じp15A originを持つ）が準備された。
【００５７】
（２）E. coli MG1655株からのyhaM強化株の構築（MG1655/pSTV-yhaM7）
上記のように構築されたプラスミドpSTV-yhaM7で、E. coli MG1655を形質転換し、yhaM強化株MG1655/pSTV-yhaM7株を作製した。また対照株として、空のベクターを導入したMG1655/pSTV29株も同時に作製した。E. coliの形質転換はエレクトロポーレーションによる定法に従い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（クロラムフェニコールの場合25mg/L、カナマイシンの場合20mg/L）を含むLB寒天培地（5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride, 15g/L agar）にて行った。
【００５８】
（３）E. coli MG1655株からのyhaM欠損株の構築（MG1655ΔyhaM株）
yhaM遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）とラムダファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3'側に、それぞれデザインした合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにラムダファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することができる。この「Red-driven integration」とラムダファージ由来の切り出しシステムによってE. coliの遺伝子を欠損させる方法が特開2005-058227AやWO2007/119880A1等に詳細に記述されている。yhaM遺伝子の欠損株の取得も、これらの方法と同じ方法で行った。
【００５９】
yhaM遺伝子の両端の相同配列に抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子（Kmr））が挟まったDNA断片を、PCRによって取得した。プライマーとしてDyhaM-FW（ATGTTTGATTCGACTTTAAATCCGTTATGGCAGCGTTACATCCTCGCCGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA：配列番号５）、DyhaM-RV（TTATCTGGCCTTGCTCGCCATAATCTCGATAATCTGCCGATCCGTTTGCTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA：配列番号６）を使用し、鋳型としてpMW118-(λattL-Kmr-λattR)（WO2006/093322A2）を使用した以外、具体的な実験方法と実験材料については、全て特開2005-058227A1の記載通りに行った。
【００６０】
（４）阻害解除型SAT（セリンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子搭載プラスミドの構築（pMIV-CysE5）
プラスミドpMIV-CysE5にはフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードする遺伝子cysE5（米国特許公開第20050112731(A1)）が搭載されており、これを導入することでシステインを著量生産するシステイン生産菌を作製できることが知られている（米国特許公開第20050112731A1、米国特許第5972663など）。以下にpMIV-CysE5の構築方法を示す。
【００６１】
変異型アレルЕ. coli cysE遺伝子であるcysE5（米国特許公開第20050112731(A1)）は、プライマーcysEplF（5'-agc-tga-gtc-gac-atg-tcg-tgt-gaa-gaa-ctg-gaa-3'：配列番号７）とプライマーcysER（5'-agc-tga-tct-aga-ata-gat-gat-tac-atc-gca-tcc-3'：配列番号８）、鋳型pMW-PompC-cysE5 (EP1650296A1)を用いPCRによって取得した（94℃-0.5分、57℃-0.5分、72 ℃-1分を27サイクル繰返し、その後72℃-7分反応させた）。プライマーcysEplFは、Е. coli cysE遺伝子の開始コドンATG及びその下流の配列に結合するようにデザインされ、5'末端には6merのSalIサイトを有している。プライマーcysERは、Е. coli cysE遺伝子の終止コドン及びその上流の配列に結合するようにデザインされ、5'末端には6merのXbaI サイトを有している。PCRによって得られた約0.7kbのDNA断片をSalIとXbaIで切断した後、同じくSalIとXbaIで切断したプラスミドpMIV-PompCに挿入し、pMIV-CysE5を構築した。
【００６２】
前記プラスミドpMIV-PompCは、以下の方法で構築した。E. coli MG1655株ゲノムDNAを鋳型とし、プライマーPrOMPCF（5'-agc-tga-gtc-gac-aac-cct-ctg-tta-tat-gcc-ttt-a-3'：配列番号９）とプライマーPrOMPCR（5'-agc-tga-gca-tgc-gag-tga-agg-ttt-tgt-ttt-gac-3'：配列番号１０）を用いたPCRによりompC遺伝子のプロモーター領域約0.3kb を含むDNA 断片を取得し、この断片をプラスミドpMIV-5JSのPaeIとSalIサイトに挿入しpMIV-PompCを構築した。プラスミドpMIV-5JSは、プラスミドpM12-ter(thr)（後述）のBamHIとHindIIIサイトに、intJSカセット（後述）の両端にあらかじめデザインされていたBglIIとHindIIIを繋ぐことによって構築した（図１）。
【００６３】
プラスミドpM12-ter(thr)は、合成オリゴヌクレオチド（aagcttaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg cttttttttt cgaccactgc ag：配列番号１１）とその相補鎖である合成オリゴヌクレオチド（ttcgaattgt gtcttttttc gggcgtggac tgtcacgccc gaaaaaaaaa gctggtgacg tc：配列番号１２）のアニーリングにより作製された2本鎖DNAフラグメント（thrLターミネーター；両端にHindIIIとPstIサイトがデザインされている）を、Muファージ由来のインテグレーションカセットを持つプラスミドpM12（EP1486570(A1)）（図２）のHindIIIとMph1103Iサイトに挿入することで構築した（図３）。IntJSカセットは次の手順（
ａ）〜（ｇ）によって構築した(図４)。
【００６４】
（ａ）上流プライマー(ccagatcttg aagcctgctt ttttatacta agttggc：配列番号１３) （BglIIサイトがデザインされている）と下流プライマー(gaaatcaaat aatgatttta ttttg：配列番号１４)（リン酸化されている）、及び、鋳型としてプラスミドpMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB（WO2005/010175）を用いたPCRにより、0.12 kbpのLattLフラグメントを取得した。
【００６５】
（ｂ）上流プライマー(ttacgccccg ccctgccact catcgc：配列番号１５) （リン酸化されている）と下流プライマー(gtcactgcag ctgatgtccg gcggtgcttt tgcc：配列番号１６)（PstIサイトがデザインされている）に鋳型としてプラスミドpACYC184（New England Biolabs）を用いたPCRにより1.03 kbpのCmRフラグメントを取得した。
【００６６】
（ｃ） 上流プライマー(cagctgcagt ctgttacagg tcactaatac c：配列番号１７) （PstIサイトがデザインされている）と下流プライマー(ccgagctccg ctcaagttag tataaaaaag ctgaacg：配列番号１８)（SacIサイトがデザインされている）、及び、鋳型としてプラスミドpMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB（WO2005/010175）を用いたPCRにより、0.16 kbpのLattRフラグメントを取得した。
【００６７】
（ｄ）LattLフラグメントとCmRフラグメントのライゲーションにより1.15 kbpのLattL-CmRフラグメントを取得した。
【００６８】
（ｅ）LattL-CmRフラグメントとLattRフラグメントをPstIで切断後、両断片のライゲーションにより1.31 kbpのLattL-CmR-LattRフラグメントを取得した。
【００６９】
（ｆ）合成オリゴヌクレオチド（cccgagctcg gtacctcgcg aatgcatcta gatgggcccg tcgactgcag aggcctgcat gcaagcttcc：配列番号１９）とその相補鎖である合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより、70bpのマルチクローニングサイト（MCS）を構成する2本鎖DNAフラグメントを取得した。
【００７０】
（ｇ）LattL-CmR-LattRフラグメントと、マルチクローニングサイト（MCS）を構成する前記2本鎖DNAフラグメントをSacIで切断後、両断片のライゲーションにより1.38 kbpのIntJSフラグメントを取得した。
【００７１】
（５）システイン生産能を有し、かつ、yhaMが強化されたE. coliの菌株構築（MG1655/pMIV-CysE5/ pACYC-M1株）
上記のように構築されたyhaM遺伝子を含むプラスミドpACYC-M1（カナマイシン耐性）をMG1655に導入し（MG1655/pACYC-M1）、更に阻害解除型SAT遺伝子搭載プラスミドpMIV-CysE5（クロラムフェニコール耐性）を導入して、システイン生産能を有し、yhaMが強化されたE. coli菌株を構築した（MG1655/pMIV-CysE5/pACYC-M1株）。また、対照株として、pACYC-M1の代わりに空のベクターpACYC177を導入したMG1655/pMIV-CysE5/pACYC177株を作製した。
【００７２】
（６）システイン生産能を有し、かつ、yhaMを欠損したE. coliの菌株構築（MG1655ΔyhaM/pMIV-CysE5株）
上記のように構築されたyhaM欠損株MG1655ΔyhaM株を、プラスミドpMIV-CysE5で形質転換し、yhaMを欠損したシステイン生産菌MG1655ΔyhaM/pMIV-CysE5を作製した。一方、対照株として、野生株MG1655にpMIV-CysE5を導入したMG1655/pMIV-CysE5株を作製した。
【００７３】
（７）E. coli MG1655株におけるyhaM欠損及びyhaM強化のシステイン耐性への効果
yhaM遺伝子のシステイン耐性への影響を調べるため、yhaM欠損株MG1655ΔyhaM株と、yhaM増幅株MG1655/pSTV-yhaM7株、及びそれぞれの対照株MG1655株、MG1655/pSTV29株を、異なる濃度のシステインを含むM9最少培地（Sambrook et al., Molecular cloning, 3rd edition, 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press）で培養し、その生育の立ち上がりの早さから判断して、システイン耐性の違いを評価した。この培養ではシステインへの耐性が高いほど培地のODの立ち上がりが早く、耐性が低いほど長いラグの後にODが立ち上がる。実験の手順は以下の通りである。各株を0.4%グルコースを含むM9最少培地（システインを含まない）にて一晩前培養した後（3ml試験管、37℃、振とう培養）、本培養培地に接種した。その際、前培養のODを測定し、本培養の開始時の各株の菌量がそろうように接種量を調整した。本培養開始時のODは約0.005であった。
【００７４】
本培養は4mlの、各濃度（0mM、0.1mM、0.2mM）のシステインと、0.4%グルコースを含むM9最少培地にて、自動OD測定培養装置BIO-PHOTORECORDER TN-1506（ADVANTEC社）とその専用L字試験管を用いて行った。培養経過（生育曲線）を図５に示す。システインの濃度が上がるにつれ、ODの立ち上がりが遅くなる傾向が認められたが、yhaM強化株MG1655/pSTV-yhaM7株は対照のMG1655/pSTV29株よりも早く生育し、システイン耐性が付与されていることがわかった。また、yhaM欠損株MG1655ΔyhaM株では対照のMG1655株に比べシステイン添加時の生育が遅延していることから、システイン耐性が低下していることがわかった。
【００７５】
（８）システイン生産菌におけるyhaM強化のシステイン生産への効果
yhaM遺伝子強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、yhaMが強化されたシステイン生産菌E. coli MG1655/pMIV-CysE5/pACYC-M1株と、その対照株MG1655/pMIV-CysE5/pACYC177株のシステイン生産能を比較した。培養にはシステイン生産培地（組成：15g/L 硫酸アンモニウム, 1.5g/L リン酸二水素カリウム, 1g/L 硫酸マグネシウム七水和物, 0.1mg/L チアミン塩酸塩, 1.7mg/L 硫酸第一鉄七水和物, 0.15mg/L モリブデン酸ナトリウム二水和物, 0.7mg/L 塩化コバルト六水和物, 1.6mg/L 塩化マンガン四水和物, 0.3mg/L硫酸亜鉛七水和物, 0.25mg/L 硫酸銅五水和物, 0.6g/L トリプトン, 0.3g/L イーストエクストラクト, 0.6g/L 塩化ナトリウム, 20g/L 炭酸カルシウム, 135mg/L L-ヒスチジン塩酸塩一水和物, 4g/L チオ硫酸ナトリウム, 2mg/L ピリドキシン塩酸塩, 40g/L グルコース, 25mg/L クロラムフェニコール, 20mg/L カナマイシン）を使用した。
【００７６】
培養は以下の手順で行った。MG1655/pMIV-CysE5/pACYC-M1株、及びMG1655/pMIV-CysE5/pACYC177株を、クロラムフェニコールとカナマイシンを含有するLB寒天培地に塗り広げ、37℃で一晩前培養を行った。10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml入れたシステイン生産培地中に植菌した。植菌量は、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調整した。32℃にて振とう培養を行い、各株とも培地中のグルコースが完全に消費されたことを確認した後、培養を終了し、培地中に蓄積したシステインを定量した。システインの定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。各株とも6連で実験を行い、そのときのシステイン蓄積量の平均値及び標準偏差を表１に示す。表１のとおり、yhaMの強化はシステイン蓄積量を減少させる効果があることが明らかとなった。
【００７７】
【表１】
0005332237.tif 000002
【００７８】
（９）システイン生産菌におけるyhaM欠損のシステイン生産能への効果
上記のように作製されたyhaMを欠損したシステイン生産菌MG1655ΔyhaM/pMIV-CysE5と、対照であるMG1655/ pMIV-CysE5株のシステイン生産能を比較した。培養にはシステイン生産培地（カナマイシンを含まないこと以外は、（８）に記載の培地と同じ組成）を使用した。
【００７９】
培養は以下の手順で行った。MG1655ΔyhaM/pMIV-CysE5及びMG1655/pMIV-CysE5株をクロラムフェニコール含有のLB寒天培地に塗り広げ、37℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml入れたシステイン生産培地中に植菌した。植菌量は、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調整した。32℃にて振とう培養を行い約15〜17時間後、培地中のグルコースが概ね消費されたことを確認した後（全グルコースのうち95%以上が消費されたことを確認）、培養を終了し、培地中に蓄積したシステインを定量した。システインの定量はGaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。yhaM欠損株は8連で、対照株は4連で実験を行い、そのときのシステイン生産量の平均値及び標準偏差を表２に示す。表2のとおり、yhaMの欠損はシステイン生産能を増加させる効果があることが明らかとなった。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
〔配列表の説明〕
配列番号１：E. coi yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号２：E. coi YhaMのアミノ酸配列
配列番号3〜19：PCRプライマー
配列番号20：Shigella boydii yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号21：Shigella boydii YhaMのアミノ酸配列
配列番号22：Citrobacter koseri yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号23：Citrobacter koseri YhaMのアミノ酸配列
配列番号24：Salmonella typhimurium yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号25：Salmonella typhimurium YhaMのアミノ酸配列
配列番号26：Actinobacillus pleuropneumoniae yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号27：Actinobacillus pleuropneumoniae YhaMのアミノ酸配列
配列番号28：Klebsiella pneumoniae yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号29：Klebsiella pneumoniae YhaMのアミノ酸配列
配列番号30：Vibrio fischeri yhaM遺伝子の塩基配列
配列番号31：Vibrio fischeri YhaMのアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】プラスミドpMIV-5JSの構築を示す図。
【図２】pM12の構築を示す図。
【図３】プラスミドpM12-ter(thr)の構築を示す図。図中の配列は、配列番号１１及び配列番号１２に示した。
【図４】IntJSカセットの構築を示す図。
【図５】yhaM欠損株及びyhaM強化株のＬ−システイン存在下での生育を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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