(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法を用いて試料中の牛由来成分を検出する方法において、プライマーとして、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーで構成されるプライマー対又は配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマーで構成されるプライマー対を使用することを特徴とする牛由来成分の検出方法。
【請求項２】
ＰＣＲ法を用いて試料中の牛由来成分を検出する方法であって、試料中のＤＮＡを抽出する工程、請求項１記載のプライマー対を使用して試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅させる工程、増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むことからなる牛由来成分の検出方法。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマーで構成される牛由来成分検出用プライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は牛由来成分の検出方法に関する。より詳細には、食品、飼料などの試料中に含まれるおそれのある牛由来成分をＰＣＲ法で検出する方法及びその際に使用されるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こす。近年は、このような食物アレルギー患者が増加の傾向を示している。そこで、食物アレルギーの方の適切な食品選択を助けることを目的に、食物アレルギーの原因食品（食品衛生法では特定原材料と呼ばれている）を僅かでも含む加工食品にあっては、平成１４年４月以降、その旨を表示することが食品衛生法により義務付けられた。その中で、表示が義務づけられている原材料は患者数の多いものや重篤な症状を起こす５品目（卵、牛乳、小麦、そば及び落花生）で、それ以外に推奨項目としてアレルギー症状を惹起した実績のある20品目が定められている。牛肉は推奨20品目の中に含まれている食品である。
【０００３】
食品、飼料などの試料中に含まれる牛由来成分を検出する測定系としては、特異的抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法がある。抗体を用いた系は、蛋白質そのものを検出する系であることや簡易測定法に適用できることなどの利点があるが、反面、抗原の中には熱変性に弱いものがあったり、非常に近縁な動物種同士を区別するのが困難であるという欠点がある。また、抗原抗体反応による検出感度は、PCR法のそれよりも低いという欠点がある。
その点、遺伝子配列を用いたPCR法は、操作に熟練を要する、核酸成分が溶出しにくい検体から検出するのは困難である、といった欠点はあるものの、近縁な動物同士でもわずかな配列の違いを利用して区別することが可能である。
【０００４】
これまでPCR法を用いた牛由来成分検出方法としては、ミトコンドリアチトクロームb遺伝子を利用した方法（特許文献１）、ATP合成酵素サブユニット8遺伝子を利用した方法（特許文献２）、12SリボゾームRNA遺伝子を利用した方法(非特許文献１)などが知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開2003-230383公報
【特許文献２】特開2003-164287公報
【非特許文献１】J. Food Prot. 67 (1),172-177 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食肉加工品においては、その製造過程において、加熱、凍結、高圧処理などが行われており、また食肉熟成期間中の自己消化により、DNAの塩基配列の一部が変性、欠失、置換などを受けていることが多い。PCR産物である増幅DNA断片の増幅サイズは使用するプライマー対によって決まるが、増幅サイズが大きいと、上記塩基配列の変性などによりPCR反応の進行が停止してしまい、十分に増幅できないことがある。前述した従来のPCR法による牛由来成分の検出方法での増幅サイズは126〜299bpであるが、本発明者らが種々検討した結果、加熱、凍結などの処理がされた加工食品においては、この増幅サイズは大きすぎ、より高精度で測定（検出）するには、増幅サイズを上記サイズより小さくする方が好ましいことが判明した。増幅サイズについて、更に検討したところ、増幅サイズを100bp以下になるようにプライマー対を設定するのが好ましいことが明らかとなった。
また、複数種の食肉混合物（例えば合挽きミンチなど）中の牛肉の比率を定量的に測定する場合においては、リアルタイムPCRの系を用いた測定方法の開発が求められる。一般的にリアルタイムPCR用のプライマー対としては、その増幅サイズが50〜100bpであることが望ましいとされている。つまり、50〜100bpの増幅サイズのプライマー対は、リアルタイムPCR用のプライマーとしても応用しうる。
本発明は上記の知見に基づいてなされたもので、PCR法を用いた試料中の牛由来成分の検出方法であって、牛由来成分を特異的に検出する方法、並びにそれに使用されるプライマー及びプライマー対を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するためになされた本発明の牛由来成分の検出方法は、PCR法を用いて試料中の牛由来成分を検出する方法において、プライマーが牛のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する牛特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することからなる。特にプライマー対としては、配列番号１〜６に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号７〜１１に示される塩基配列からなるプライマーの一種との組み合わせが好適であり、更にPCR産物の増幅サイズが100bp以下となるようにプライマー対を設定するのが好ましい。
より好ましい検出方法としては、PCR法を用いて試料中の牛由来成分を検出する方法であって、試料中のDNAを抽出する工程、上記の好適なプライマー対を使用して試料中のDNAを鋳型としてPCR法でDNA断片を増幅させる工程、増幅されたDNA断片を検出する工程を含むことからなる検出方法である。
更に、本発明のプライマーは、上記の方法に使用されるプライマーであって、配列番号１〜１１に示される塩基配列からなる牛由来成分検出用プライマーであり、特に配列番号１〜６に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号７〜１１に示される塩基配列からなるプライマーの一種とで構成される牛由来成分検出用プライマー対が好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、牛に由来するDNAのみを特異的に増幅することができるプライマーが使用されているので、牛由来成分と他の食用肉由来の成分とを識別することができ、試料中の牛由来成分を確実且つ正確に検出することができる。特に増幅サイズが100bp以下となるプライマー対を使用することにより、加工食品のように加熱、加圧などの処理されたような試料であっても、牛由来成分を検出できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は前記の構成よりなり、本発明の牛由来成分の検出方法は、PCR法を用いて試料中の牛由来成分を検出する方法において、プライマーが牛のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する牛特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することからなる。
PCR法を用いて、試料中の牛由来成分を検出する方法は、前記特許文献１及び２並びに非特許文献１に記載されるように公知である。
本発明においては、上記のPCR法により牛由来成分を検出する方法において、プライマー対として、牛のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する牛特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することに特徴がある。また本発明のプライマー対は、リアルタイムPCR等の定量PCR法にも適用できることに特徴がある。
【００１０】
より具体的には、ミトコンドリアDNAは、一個の細胞におおよそ平均で1000個以上も存在し、組織から大量に採取することができ、分析しやすいという特長があることから、本発明者らは、既存のデータベースより、牛、豚、鶏及び羊のミトコンドリア塩基配列を検索し、16SリボゾームRNA遺伝子領域において牛特異的塩基配列で且つ豚、鶏及び羊には存在しない塩基配列が存在し、当該牛特異的な塩基配列からなるDNAをPCR用プライマーとすることにより、牛由来DNAのみが増幅し、豚、羊、馬、鯨、鶏及び鴨由来DNAは増幅しないことが明らかとなった。そして、そのプライマー対を使用することにより、試料中の牛由来成分を特異的に検出し得ることが判明した。
【００１１】
また、前述のように、試料が加工食品や飼料のように、その製造工程において、加熱、凍結、加圧などの処理が行われている場合、試料中のDNAは変性している可能性が高い。このような試料においては、PCR産物の増幅サイズが大きいと、DNAの変性した個所で伸長が停止ししてしまい、それ以上伸長しない頻度が高まる結果、DNAの増幅が不足し、目的とするDNAを検出できない場合がある。
本発明においては、このような問題を回避するためには、PCR産物の増幅サイズを100bp以下に調整することが望ましいことが判明した。
PCR産物の増幅サイズは使用するプライマー対の選択により決まるので、増幅サイズが上記の範囲になるようなプライマー対を選択するのが好ましい。
【００１２】
このような知見に基づき、本発明で使用するプライマーの好ましい例として、センスプライマーとしては配列番号１〜６に示される塩基配列からなるプライマーが、アンチセンスプライマーとして配列番号７〜１１に示される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。特に、PCR産物の増幅サイズが100bp以下となるプライマー対が好ましく、係るプライマー対としては配列番号１−配列番号７の組み合わせ、配列番号６−配列番号１１の組み合わせなどが挙げられる。
【００１３】
上記のプライマーは、当該配列からなるDNAを常法に準じて、例えばDNA自動合成機を用いて調製することができ、調製されたDNAは必要に応じてHPLCなどの慣用の手段で精製することにより、目的とするプライマーが得られる。
【００１４】
以下、本発明の検出方法を具体的に説明する。
試料としては、食品（例えば生肉、食肉含有加工食品等）、飼料（例えば肉骨粉含有飼料）などが挙げられ、特に本発明の方法は、加熱、加圧などの処理がされた加工食品に好適に使用される。
【００１５】
本発明の方法においては、まず試料の脂肪分をできるだけ除去した後、試料をDNA抽出に好適な状態、例えばミンチ状、スラリー状などに調製し、DNAの抽出を行う。当該DNAの抽出は、常法に準じて、Marmur法、塩化ベンジル法、CTAB法などにより行うことができ、また市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットを使用することもできる。
【００１６】
抽出されたDNAサンプルは、前記のプライマー群から選択されたプライマー対を用いるPCRに供し、目的のDNAを増幅させる。
プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に約0.4μＭで使用することが好ましい。
また、PCR法に使用されるDNAポリメラーゼとしては慣用のポリメラーゼを使用することができ、例えばAmpliTaq
Gold、TaKaRa Taq、ExTaq HSなどが例示できる。
PCR条件としては、目的DNAを増幅し得る条件であれば特に限定されないが、例えば95℃で3分熱処理した後、95℃で30秒、70℃（場合によっては71℃）で30秒、72℃で30秒を40サイクル繰り返し、次いで72℃で7分間反応させる方法が挙げられる。
【００１７】
かくして得られたPCR産物は、慣用のDNAの検出法に供される。係る検出方法としては、PCR産物をアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のDNA断片をエチジウムブロマイド染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示される。試料中に牛由来成分が含まれている場合には、増幅されたDNA断片がゲル上で検出されるので、牛由来成分の含有の有無を判別することができる。
検出限界は、用いるプライマー対の種類及び組み合わせ、試料の量、PCR条件、検出方法などの種々の条件によって適宜設定することができるが、本発明の方法によれば５ｐｇ程度まで検出することができる。
【００１８】
本発明のプライマーは、配列番号１〜１１に示される塩基配列からなる牛由来成分検出用プライマーであり、また本発明のプライマー対は配列番号１〜６に示される塩基配列からなるプライマーの一種（センスプライマー）と、配列番号７〜１１に示される塩基配列からなるプライマーの一種（アンチセンスプライマー）との組み合わせである。特に、PCR産物の増幅サイズが100bp以下となるプライマー対である配列番号１−配列番号７の組み合わせ、配列番号６−配列番号１１の組み合わせなどが好適である。
【００１９】
本発明の方法は上記の説明に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができ、例えば配列番号１〜１１に示される塩基配列からなるプライマーは、牛由来成分を検出し得る限り、当該塩基配列に１又は２以上の塩基が付加したり、１又は２以上の塩基が置換・欠失したものでもよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。なお、サンプルの調製などは以下のとおりである。
試料の処理・DNA抽出
各試料は、脂肪分を極力除去した後に、ミルサーにかけてミンチ状にした。その後、場合により後記実施例に示される各処理（加熱処理、冷蔵処理など）を実施し、処理した試料をそれぞれ100mgずつ採取し、まず、ホモジナイザーで破砕し、PCR反応のための鋳型DNAの抽出はWizard Genomic DNA purification kit(Promega)を用いて行った。
【００２１】
PCR条件及び検出条件
PCR反応はAmpliTaq Gold (Applied Biosystems)を用いて行った。具体的な反応方法としては、反応液として、キット添付バッファーにdNTP溶液(dATP, dCTP, dGTP及びdTTP各0.2mM)、MgCl2(1.5mM)、センスプライマー(0.4μM)、アンチセンスプライマー（0.4μM）、AmpliTaq Gold（0.75U）に適当量の鋳型DNAを加えたものを使用し、PCRの反応条件は、本検出が有効に行えるように設定した条件を用いた、詳細には、95℃で3分熱処理した後、95℃で30秒、70℃（場合によっては71℃）で30秒、72℃で30秒を40サイクル繰り返し、次いで72℃で7分間反応させた。
DNAの検出方法としては、泳動ゲルとしてアガロースゲル（タカラバイオ）１％のミニゲルを使用し、泳動条件１００V３０分で泳動した。泳動時には、同時にマーカーとして50bpラダー（Invitrogen製）を泳動し、PCR産物の大きさを確認した。
【００２２】
プライマー及びプライマー対
使用したプライマーは、配列番号１〜６（センスプライマー、Ｓ）及び配列番号７〜１１（アンチセンスプライマー、Ａ）からそれぞれ適宜な一種を選択して使用することができるが、下記のプライマー対を使用した。
配列番号1−配列番号７のプライマー対（以下、Ｓ１Ａ１という）
配列番号６−配列番号１１のプライマー対（以下、Ｓ６Ａ５という）
配列番号３−配列番号７のプライマー対（以下、Ｓ３Ａ１という）
なお、Ｓ１Ａ１を使用して増幅されるPCR産物の増幅サイズ97bpであり、Ｓ６Ａ５を使用して増幅されるPCR産物の増幅サイズ86bpであり、Ｓ３Ａ１を使用して増幅されるPCR産物の増幅サイズ213bpである。
【００２３】
実施例１（各品種との交差性の確認）
使用鋳型DNAとして、牛肉、豚肉、羊肉、鶏肉、鴨肉、馬肉及び鯨肉をそれぞれ50ng含む試料を前記の方法で準備した。各試料は表１に示されるプライマー対を用いて、前記記載の反応条件でPCRを行い、増幅の有無を確認した。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１に示されるように、牛肉を豚肉、羊肉、鶏肉、鴨肉、馬肉及び鯨肉と区別することができ、本発明のプライマーの有用性が確認された。
【００２６】
実施例２（検出限界の確認）
使用鋳型DNAとして、牛DNAを50ng, 5ng, 500pg, 50pg, 5pg, 500fg含む試料を前記の方法及び段階希釈で準備した。各試料は表２に示されるプライマー対を用いて、前記記載の反応条件でPCRを行い、検出限界を試験した。その結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
表２に示されるように、5pgが最低検出限界であることが判明した。
【００２９】
実施例３（100℃及び121℃で処理した試料の測定）
使用鋳型DNAとして、牛肉を100℃で0.5、1及び2時間加熱、もしくは121℃で20分加圧加熱処理した後、DNA抽出し、DNAを50ng準備した。各試料は表３に示されるプライマー対を用いて、前記記載の反応条件でPCRを行い、加熱処理された試料における検出試験を行った。その結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
表３に示されるように、プライマー対としてＳ１Ａ１(増幅サイズ：97bp）又はＳ６Ａ５(増幅サイズ：86bp）を使用した場合には、100℃,2時間、または121℃,20分程度の加熱処理された試料においても増幅できることが明らかとなった。一方、プライマー対としてＳ３Ａ１(増幅サイズ：213bp）を使用した場合には、設定通りの増幅が困難であることが明らかとなった。このことから、加熱処理された試料に対しては増幅サイズが100bp以下となるプライマー対を使用する方が好ましいことが判明した。
【００３２】
実施例４（市販加工食品の検出）
使用鋳型DNAとして、牛乳、牛乳を原料とするチーズ（ナチュラルチーズ）、山羊乳を原料とするチーズ、羊乳を原料とするチーズ、牛肉コロッケ、レトルト牛肉カレー、及び牛肉缶詰からそれぞれDNAを抽出したものを使用した。各試料はプライマー対（Ｓ１Ａ１）を用いて、前記記載の反応条件でPCRを行い、増幅の有無を確認した。その結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
表４に示されるように、牛乳及び牛乳を原料として調製されたナチュラルチーズ由来のDNAからは牛特異的成分を検出することが可能であった。一方、山羊乳や羊乳を原料とするチーズからは牛特異的成分は検出されなかった。牛肉を含むコロッケ、レトルトカレー及び缶詰からは牛肉成分の検出が可能であった。
【配列表】
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