(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）蛍光システイン誘導体と被験物質とを混合させる工程；及び、
（ｂ）結合物の有無を機器分析により判定する工程
を有する化学物質の感作性検定方法であって、蛍光システイン誘導体が、式（１）
0005223391.tif 000030
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は相異なり、蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、及び置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が蛍光色素であり、前記蛍光色素が、式（２）
0005223391.tif 000031
（式中、Ｒ３はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。Ｘ、Ｙ、及びＺは、それぞれ独立に０から２０の整数を表わす。Ｒ4は直接結合又は、−Ｏ−、 −ＣＨ２−、 −ＮＨＣＯＯ−、 −ＣＯＮＨ−、 −ＣＯＯ−、 −ＳＯ２ＮＨ−, −ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、 −Ｓ−、 −ＮＲ−、 、−ＮＡｒ−、 −ＣＨ＝ＣＨ−、 −Ｃ≡Ｃ−、 −Ａｒ−、及び −ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を表わす。ここでＲはアルキル基を表わし、Ａｒはアリール基を表わす。
Ｒ5は、−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。）
で表される蛍光色素である。）
で表される蛍光システイン誘導体、システイニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、システイニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、｛4-アミノ-4-[3-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、システイニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[5-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、システイニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エトキシカルボニル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル又はアセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステルである、化学物質の感作性検定方法。
【請求項２】
機器分析の手段が、液体クロマトグラフィーである請求項１に記載の感作性検定方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーの検出器が、蛍光検出器である請求項１または２に記載の感作性検定方法。
【請求項４】
液体クロマトグラフィーの検出器が、質量分析装置である請求項１〜３のいずれかに記載の感作性検定方法。
【請求項５】
式（１）
0005223391.tif 000032
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は相異なり、蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、及び置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が蛍光色素であり、前記蛍光色素が、式（２）
0005223391.tif 000033
（式中、Ｒ３はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。Ｘ、Ｙ、及びＺは、それぞれ独立に０から２０の整数を表わす。Ｒ4は直接結合又は、−Ｏ−、 −ＣＨ２−、 −ＮＨＣＯＯ−、 −ＣＯＮＨ−、 −ＣＯＯ−、 −ＳＯ２ＮＨ−, −ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、 −Ｓ−、 −ＮＲ−、 、−ＮＡｒ−、 −ＣＨ＝ＣＨ−、 −Ｃ≡Ｃ−、 −Ａｒ−、及び −ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を表わす。ここでＲはアルキル基を表わし、Ａｒはアリール基を表わす。
Ｒ5は、−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。）
で表される蛍光色素である。）
で表される蛍光システイン誘導体。
【請求項６】
蛍光システイン誘導体が、式（3）
0005223391.tif 000034
で表される化合物である請求項５記載の蛍光システイン誘導体。
【請求項７】
蛍光システイン誘導体が、式（4）
0005223391.tif 000035
で表される化合物である請求項５記載の蛍光システイン誘導体。
【請求項８】
蛍光システイン誘導体が、請求項５〜７のいずれかに記載の蛍光システイン誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の感作性検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド蛍光誘導体及びそれを用いる感作性検定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化学物質が皮膚に接触するとアレルギー反応が惹起されることがあることから、例えば医・農薬や化粧品等の化学物質を含む製品を工業的に開発するにあたっては、その化学物質の感作性を検定することが必要となる。近年、従来から行われている動物実験での感作性検定方法の煩雑さを回避するため、システイン誘導体と被験物質との結合物の有無を液体クロマトグラフィー等で判定する方法が報告されている。（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。しかしながら、従来の方法では、液体クロマトグラフィー分析においてUV検出器を用いているため、製品の微量成分が感作性に関与している場合はペプチドとの結合物が夾雑ピークやベースラインの盛り上がりのため判別しにくく、感度の向上が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−０１４７６１号公報
【特許文献２】特開２００７−１８３２０８号公報
【非特許文献１】The Journal of Toxicological Sciences 2003, 28(1), 19-24.
【非特許文献２】Toxicological Sciences 2004, 81,332-343.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような状況のもと、本発明者らは、微量感作性物質を感度良く判別する方法を開発すべく鋭意検討したところ、蛍光基を有する感作性判定試薬を新たに見出すとともに、本感作性判定試薬と感作性化合物を混合した後、蛍光検出器を有する液体クロマトグラフィーで結合物を夾雑物やベースライン盛り上がりの影響を受けることなく高感度に容易に結合物の有無を判別することができることを見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち本発明は、
１．（ａ）蛍光システイン誘導体と感作性物質とを混合させる工程；及び、
（ｂ）結合物の有無を機器分析により判定する工程
を有する化学物質の感作性検定方法。
２．蛍光システイン誘導体が、システインと、該システインを標識する蛍光色素を含む蛍光システイン誘導体であって、該蛍光色素が発色部構造と上記システインと発色部とを結合するスペーサー構造を有することを特徴とする化合物である上記１に記載の感作性検定方法；
３．機器分析の手段が液体クロマトグラフィーである上記１及び２に記載の感作性検定方法；
４．液体クロマトグラフィーの検出器が蛍光検出器である上記１〜３に記載の感作性検定方法；
５．液体クロマトグラフィーの検出器が質量分析装置である上記１〜３に記載の感作性検定方法；
６．式（１）
0005223391.tif 000002
（式中、R1,R2は蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、R1とR2の少なくとも一方が蛍光色素である。）で表される化合物である蛍光システイン誘導体；
７．上記蛍光色素が式（２）
0005223391.tif 000003
（式中、R3はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。x,y,zは、それぞれ独立に0〜20までの整数を表わす。R4は直接結合又は、-O-, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-, -NAr-,-CH=CH-, -C≡C-, -Ar-, -CO-Ar-NR-からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を表わす。Rはアルキル基を表わす。Arはアリール基を表わす。R5は−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。）で表される上記６に記載の蛍光システイン誘導体；
８．上記蛍光システイン誘導体が、式（3）
0005223391.tif 000004
で表される上記６又は７記載の蛍光システイン誘導体；
９．上記蛍光システイン誘導体が、式（4）
0005223391.tif 000005
で表される上記６又は７記載の蛍光システイン誘導体；
１０．蛍光システイン誘導体が上記６〜９に記載の蛍光システイン誘導体である上記１〜５記載の感作性検定方法；を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、医・農薬や化粧品の感作性判定において、蛍光検出器により微量成分でも高感度に結合物の同定をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の検定方法について説明する。
本発明の感作性検定方法において使用しうる蛍光システイン誘導体としては、少なくとも、システインと、該システインを標識する蛍光色素を含む蛍光システイン誘導体であって、該蛍光色素が発色部構造と上記システインと発色部とを結合するスペーサー構造を有する蛍光システイン誘導体を挙げることができる。
【０００８】
上記スペーサーは-O-, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-(Rはアルキル基)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-、-CO-Ar-NR-もしくはアミノ酸及びペプチドの部分構造からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を含む。
【０００９】
該蛍光システイン誘導体の合成は、通常、両末端がチオール基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボニル基、マレイミド基、もしくは塩素、臭素、ヨウ素などのハロアルキル基、ハロカルボニル基等であるスペーサー原料を用い、順次、該スペーサー原料の一方の末端と蛍光誘導体化試薬のクロロスルホニル基、フルホロスルホニル基、クロロカルボニル基、カルボキシル基、マレイミド基、アミノ基、イソチオシアニル基、塩素、臭素、ヨウ素などのハライドとの反応により発色部と連結し、もう一方の末端をシステイン誘導体のアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基などとの縮合により連結することにより行うことができる。
【００１０】
発色部としては、ベンゾフラン誘導体、ジヒドロキノキサリノン誘導体、フタルイミジニル誘導体、ダンシル誘導体、クマリン誘導体、アクリジン誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾキサジアゾール誘導体、フルオロセイン誘導体、ローダミン誘導体、シコニン誘導体等を挙げることができ、通常、スペーサーへの発色部の導入には蛍光誘導体化試薬が用いられ、具体的には、4-(5,6-ジメトキシ-N-フタルイミジニル)ベンゼンスルホン酸クロリド (DPS-Cl)、4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-Cl)、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミンBイソチオシアネート(RBITC)、4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NDB-F)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-F)、4-(N-フタルイミジニル)ベンゼンスルホン酸クロリド(Phisyl-Cl)、4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(ABD-F)、N-[4-(6-ジメチルアミノ-2-ベンゾフラニル)フェニル]マレイミド(DBPM)、2-(4-マレイミドフェニル)-6-メチルベンゾチアゾール(MBPM)、N-(9-アクリジニル)マレイミド(NAM)、4-クロロ-7-スルホベンゾフラザン アンモニウム塩(SBD-Cl)、7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-F)、1,2-ジアミノ-4,5-ジメトキシベンゼン(DDB)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-ヒドラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-H)、4-ヒドラジノ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾールヒドラジン(DBD-H)、2,2'-ジチオジ(1-ナフチルアミン) (DTAN)、4-アミノ-3-ペンテン-2-オン(Fluoral-P)、1,2-アミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン(MDB)、4-(5,6-ジメトキシベンゾチアゾール-2-イル)安息香酸ヒドラジド(BHBT)、4-(N,N-ジメチルアミノスルフホニル)-7-(N-ヒドラジノカルボニルメチル-N-メチル)アミノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (DBD-CO-Hz)、4-(N-ヒドラジノカルボニルメチル-N-メチルアミノ)-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-CO-Hz)、3-ブロモメチル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-1,2-ジヒドロキノキサリン-2-オン(Br-DMEQ)、4-ブロモメチル-7-メトキシクマリン(Br-MMC)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-ピペラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-PZ)、4-ニトロ-7-ピペラジノ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (NBD-PZ)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-(2-アミノエチルアミノ)-2,1,3-ベンゾキサジアゾール (DBD-ED)、3-クロロカルボニル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-2(1H)-キノキサリノン(DMEQ-COCl)、2-(5-クロロカルボニル-2-オキサゾールイル)-5,6-メチレンジオキシベンゾフラン(OMB-COCl)等が挙げられる。
【００１１】
また、式（１）
0005223391.tif 000006
で表される蛍光システイン誘導体を用いることができる。
【００１２】
ここで、R1,R2は蛍光色素、ヒドロキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいフェノキシ基の群から選ばれ、R1とR2の少なくとも一方が蛍光色素である。
【００１３】
ここで、上記蛍光色素（FL）が、式（２）
0005223391.tif 000007
である上記式（１）記載の蛍光システイン誘導体を用いることができる。
【００１４】
ここで、R3はニトロ基、無置換アミノスルホニル基、スルホン酸基、アンモニウムスルホン酸基のいずれかを表わすか、もしくはアルキルアミノ基や４級アンモニウム基等の置換基を有していても良いアルキルアミノスルホニル基を表わす。x,y,zは、それぞれ独立に0から20の整数を表わす。R2は直接結合又は、-O-, -CH2-, -NHCOO-, -CONH-, -COO-, -SO2NH-, -HN-C(=NH)-NH-, -S-, -NR-, -CH=CH-, -C≡C-, -Ar-, -CO-Ar-NR-からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を表わす。Rはアルキル基を表わす。Arはアリール基を表わす。R5は−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を表わす。
【００１５】
かくして、本発明の感作性検定方法において使用し得る蛍光システイン誘導体を具体的に示すと、γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、システイニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-アミド、
【００１６】
γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、システイニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、｛4-アミノ-4-[3-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[3-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-プロピル]-アミド、
【００１７】
γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、システイニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、｛4-アミノ-4-[5-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチルカルバモイル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-N-[5-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-3-オキサ-ペンチル]-アミド、
【００１８】
γ-グルタミル-システイニル-グリシニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、システイニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、｛4-アミノ-4-[2-(7-ニトロベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エトキシカルボニル]-ブチリル｝-システイニル−グリシン、フェニルアラニル-トレオニル-ロイシニル-システイニル-フェニルアラニル-アルギニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、アセチル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニル-アラニル-システイニル-アラニル-アラニル-[2-(7-ニトロ-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ)-エチル]-エステル、等を挙げることができる。
【００１９】
かかる蛍光システイン誘導体を、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩の無機塩類や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩などの有機酸塩等を含む水性緩衝液、もしくは水、又はこれらとアセトニトリルなどの有機溶媒との混合溶媒に、例えば、約0.01μmol/L〜約1mol/L程度の濃度、通常、約0.1μmol/L〜約10mmol/L程度の濃度となるように溶解する。被験物質は、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒又はこれらの混合溶媒に、例えば、約0.01μmol/L〜約1mol/L程度の濃度、通常、約0.1μmol/L〜約50mmol/L程度の濃度となるように溶解する。次いで、上記のペプチド蛍光誘導体溶液と被験物質溶液とを、ペプチド蛍光誘導体と被験物質のモル濃度比が例えば1:100〜100:1となるように混合し反応させる。該反応には、蛍光システイン誘導体溶液と被験物質との混合液を、例えば約４℃〜約60℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約10分間〜約2日間程度振とう、撹拌、もしくは静置する。
【００２０】
かかる反応により生成した被験物質と蛍光システイン誘導体との結合物の有無は、蛍光システイン誘導体溶液と被験物質溶液との混合液を次のようにして分析することにより測定される。混合液の分析方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー（TLC）、質量分析（MS）等を挙げることができる。特にHPLC,TLCの検出器としては紫外吸光度検出器、可視吸光度検出器、蛍光検出器等を挙げることができる。また、HPLC、GC、TLCのいずれかとMSとを組み合わせた分析方法(LC-MS、GC-MS、TLC-MS)等を用いることもできる。該方法によれば、試料に複数成分が含まれていてもそれらを個々に分離し、それぞれについて質量分析することができる。上記のHPLC又はTLCに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販HPLCカラムやTLCプレートとしては、例えば、HPLCカラムとしては、SUMIPAX ODSA-212（住化分析センター製）、L-column ODS(財団法人化学物質評価研究機構)、ワコーシル5C18(和光純薬製)、コスモシール5C18-AR-II（ナカライテスク製）、SUMIPAX SIL S-05(住化分析センター製)、LiChrosorb Si 60 (メルク製)、TLCプレートとしては、Silica gel 60 Plate (メルク製)、ＴＬＣプレートＲＰ‐１８Ｆ２５４Ｓ（メルク製）などを挙げることができる。また、質量分析で利用することのできるイオン化法としては、例えば、マトリクス支援レーザーイオン化(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法、大気圧イオン化(API)法、電子衝突イオン化(EI)法、高速電子衝撃イオン化(FAB)法などを挙げることができる。このようなイオン化法に使用可能な市販のイオン源としては、MALDI法の場合、島津/KRATOS製、PEバイオシステム製、マイクロマス製、Bruker製等のイオン源が挙げられる。また、ESIの場合、Finnigan Mat製、マイクロマス製、サイエックス製、Hewlett-Packard製、PEバイオシステム製等のイオン源が挙げられる。質量分析計としては、磁場型、四重極型、イオントラップ型、フーリエー変換-イオンサイクロトロン型、飛行時間型の質量分析計を挙げることができる。上記のようにして得られた混合液の分析結果を、例えば、蛍光システイン誘導体溶液のみを保温した試料及び被験物質溶液のみを保温した試料各々の分析結果とを比較し、蛍光システイン誘導体溶液のみを保温した試料及び被験物質溶液のみを保温した試料からは検出されず、かつ保温後の蛍光システイン誘導体溶液と被験物質溶液の混合溶液からのみ検出される成分の有無を調べることにより、蛍光システイン誘導体と被験物質との結合物の有無を測定することができる。かかる分析に、MS、LC-MS、GC-MS、TLC-MS等の質量分析法を用いると、各成分について、質量スペクトルから得られる情報に基いて質量、構造等を解析してその組成や構造を確認することにより、蛍光システイン誘導体と被験物質との結合物を特定することもできる。
【００２１】
本蛍光システイン誘導体の製造方法は、例えば、公知化合物から公知の合成方法等を利用すればよいが、以下に、代表的な化合物の製造方法について、説明する。
【００２２】
たとえば、式（5）及び式（6）
0005223391.tif 000008
【００２３】
0005223391.tif 000009
(式中、R3,R4,R5,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される蛍光グルタチオン誘導体を製造する場合、
グルタチオンに保護基を導入した、式（7）及び式（8）
0005223391.tif 000010
【００２４】
0005223391.tif 000011
で示される保護グルタチオン誘導体と、式（9）
0005223391.tif 000012
(式中、R4,R5,x,y及びzは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物の共存溶液中、式（10）
0005223391.tif 000013
（R3は前記と同じ意味を表わす。Hal、はフッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子を表わす。）
で示されるベンゾキサジアゾール誘導体とを加え、
系内に式（11）
0005223391.tif 000014
(式中、R3,R4,R5,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で表わされる蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物を調製した後、式（11）を単離することなく脱水縮合剤を系内に加え前記式（7）及び式（8）で示される保護システイン誘導体のカルボキシル基と縮合反応を行い、式（12）及び式（13）
0005223391.tif 000015
(式中、R3,R4,R5,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
0005223391.tif 000016
(式中、R3,R4,R5,x,y及び,zは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される保護蛍光グルタチオン誘導体を調整した後、脱保護することにより製造することができる（下記スキーム１参照）。
【００２５】
0005223391.tif 000017
【００２６】
グルタチオンに保護基を導入する場合、Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545、Synthesis 1994,1063-1066等に記載の方法に準じ保護基を導入する。保護基としては、通常、チオール基に対してはトリフェニルメチル基（Tｒｔ基）、アミノ基に対してはtert-ブトキシカルボニル基（Boc基）、カルボキシル基に対しては、tert-ブチル基(t-Bu基)を用いる。また、保護する順序は、通常、まず、チオール基、次にアミノ基、最後にカルボキシル基の順で行う。
【００２７】
グルタチオンへの保護基導入は、まず、チオール基をトリフルオロ酢酸存在下、トリフェニルメタノールと反応させ、式（１４）
0005223391.tif 000018
で表わされるチオール保護体に変換し、チオール基を保護する（スキーム２参照）。
0005223391.tif 000019
【００２８】
次に、トリエチルアミン存在下ジ-tert-ブチルジカルボネートと反応させ、式(15)
0005223391.tif 000020
で示されるチオール／アミン保護体に変換しアミノ基を保護する（スキーム３参照）
0005223391.tif 000021
【００２９】
さらに、チオール／アミン保護体をテトラヒドロフラン-tert-ブタノール溶媒中、ジメチルアミノピリジン存在下、ジ-tert-ブチルジカルボネートと反応させ、式(5)及び／又は式(6)で示される保護グルタチオン誘導体を得ることができる（スキーム４参照）。
なお、ジ-tert-ブチルジカルボネートは、通常、２倍当量用いる。
0005223391.tif 000022
【００３０】
式（９）
0005223391.tif 000023
(式中,R4,R5,x,y,及びzは、前記と同じ意味を表わす。)
で示される両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物としては、1,2-ジアミノエタン、1,3-ジアミノプロパン、2-アミノエタノール、2,2'-オキシビス(エチルアミン)、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン等が挙げられ、通常市販されているものが用いられる。
【００３１】
両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物の使用量は、保護グルタチオン誘導体のカルボキシル基に対して、通常０．５〜５モル倍以上であり、好ましくは0.8〜1.2モル倍である。
【００３２】
ベンゾキサジアゾール誘導体としては、4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-Cl)、4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(NBD-F)、4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DBD-F)、4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(ABD-F)、4-クロロ-7-スルホベンゾフラザン アンモニウム塩(SBD-Cl)、7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-F)、4-(ジメチルアミノエチルアミノスルホニル)-7-クロロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール(DAABD-Cl)、7-クロロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-4-スルホニルアミノエチル トリメチルアンモニウム塩酸塩(TAABD-Cl)等が挙げられる。
通常市販されているものが用いられ、使用量は両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物と同じモル量を用い、保護グルタチオン誘導体中の無保護カルボキシル基に対して、通常１〜５モル倍以上であり、好ましくは0.8〜1.2モル倍である。
【００３３】
脱水縮合剤としては、例えばN,N′-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N′-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、テトラフルオロほう酸２-（１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウム(TBTU)、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェイト（PyBOP）が挙げられ、その使用量は、保護グルタチオン誘導体中の無保護カルボキシル基に対して、通常１〜１０モル倍以上であり、好ましくは１〜３モル倍である。
【００３４】
両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物とベンゾキサジアゾール誘導体の反応による蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物の合成は、通常保護グルタチオン誘導体と両末端に求核性官能基をもちかつ少なくとも一方の末端がアミノ基であるリンカー化合物を溶媒中混合し、ベンゾキサゾール誘導体を加えることにより実施される。次に、この系内に脱水縮合剤を加えることにより、系内で調製された蛍光基と求核性官能基とを有するリンカー化合物と未反応で残っている保護グルタチオン誘導体とで縮合反応が起こり、保護蛍光グルタチオン誘導体が生成する。
【００３５】
溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、例えばトルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、例えばクロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、例えばアセトニトリル等のニトリル系溶媒、例えば酢酸エチル等のエステル系溶媒等の単独もしくは混合溶媒が挙げられる。かかる溶媒の使用量は特に制限されない。
【００３６】
反応温度は、通常−５０〜１００℃である。
【００３７】
反応終了後、反応液をそのままもしくは濃縮処理した後、水及び必要に応じて水に不溶の有機溶媒を加えて抽出処理し、得られる有機層を濃縮処理することにより、保護蛍光システイン誘導体を取り出すことができる。取り出した保護蛍光グルタチオン誘導体は、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィ等の通常の精製手段によりさらに精製してもよい。
【００３８】
保護蛍光グルタチオン誘導体の保護基を除去する場合、例えば、Tetrahedron  Letter 1989, 30, 2739に準じ、トリアルキルシランが含有した含水トリフルオロ酢酸と混合することにより実施できる。トリアルキルシランとして、トリエチルシラン、トリイソプロピルシラン等を挙げることができ、通常、トリフルオロ酢酸に対して体積比0.01〜0.5体積部使用する。目的物である蛍光グルタチオン誘導体は、ジエチルエーテル等の有機溶媒を加えて沈殿させることで、容易に取り出すことが可能である。取り出した保護蛍光グルタチオン誘導体は、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィ等の通常の精製手段によりさらに精製してもよい。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
S-トリチルグルタチオンの合成
0005223391.tif 000024
Crichらの方法（Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.）に従い調製した。還元型グルタチオン（25g, 81.3mmol）とトリフェニルメタノール(21.2 g, 81.3 mmol)を１Ｌフラスコに仕込み、トリフルオロ酢酸(150mL)を室温で滴下した。1時間室温で攪拌後、ジエチルエーテル(300mL)を仕込み、析出した白色固体をろ過した。ジエチルエーテル(300mL)で固体を洗浄しS-トリチルグルタチオン(S-trityl glutathione)の粗生成物40gを得た。
【００４０】
［実施例２］
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオンの合成
0005223391.tif 000025
Crichらの方法（Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2544-2545.）に若干の変更を加え調製した。前記実施例１で得られたS-トリチルグルタチオンの粗生成物全量をトリエチルアミン(50mL)−水(150mL)に溶かし、ジ-tert-ブチルジカルボナート(20 g, 90.4 mmol)のエーテル溶液(200mL)を滴下した。18時間室温で攪拌した後、飽和重曹水(200mL)でクエンチした。水層を3回酢酸エチル(100mL×3)で洗浄した後、固体の硫酸水素カリウムを加えて水層のpHを酸性に合わせた。3回酢酸エチル(100mL×3)で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮乾固した。ヘキサンで結晶化し、N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン(32g, 2ステップ収率61%)の白色固体を得た。
【００４１】
［実施例３］
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン モノ-tert-ブチルエステルの合成
0005223391.tif 000026
Takedaらの報告（Synthesis 1994, 1063-1066）と同様の反応条件で合成した。前記実施例２で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン(1g, 1.54mmol)とジ-tert-ブチルジカルボナート(0.67g, 3.08 mmol)のtert-ブタノール-THF溶液(1：1、40mL)にN,N-ジメチルアミノピリジン(0.062g, 0.51mmol)を加え、室温で撹拌した。18時間後、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、1mmol/mL硫酸水素カリウム水溶液（50mL）と酢酸エチル(50mL)を加えて分液操作を行った。有機層を2回1mmol/mL硫酸水素カリウム水溶液（2×50mL）で洗浄した後、エバポレーターで濃縮乾固し、N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン tert-ブチルエステルの異性体混合物を得た。
【００４２】
［実施例４］
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン モノ−tert-ブチルエステル モノ−N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの合成
0005223391.tif 000027
前記実施例３で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン モノtert-ブチルエステル(1.0g, 1.54mmol)及び1,2-エチレンジアミン(0.19g, 3.08mmol)のテトラヒドロフラン溶液(30mL)に7-クロロ-4-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（0.61g, 3.08mmol）のTHF溶液(20mL)溶液を滴下した。1時間室温で撹拌後、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(0.39g, 3.08mmol)を加え、さらに18時間室温で撹拌した。エバポレータ−で溶媒を除去後、クロロホルムを加え不溶物をろ過により除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル60、クロロホルム→クロロホルム−メタノール50:1→25:1）で精製しN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン モノtert-ブチルエステル モノN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの異性体混合物（0.40g, 29%）を得た。
ESI(+)-MS: m/z 911 [MH+ calcd. for C46H54N8O10S 911.37]
【００４３】
グルタチオン N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミドの合成
0005223391.tif 000028
前記実施例４で調製したN-(tert-ブトキシカルボニル)-S-トリチルグルタチオン モノtert-ブチルエステル モノN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミド3mgとトリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水(100:5:5)の混液 0.1mLを混合し、20分間室温で撹拌した。ジエチルエーテル1mLを加え、遠心分離により沈殿した結晶を残して上澄みを除去した。同様にジエチルエーテル洗浄を3回繰り返した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣプレートＲＰ-１８Ｆ２５４Ｓ、THF−H2O  １：２）により精製し、グルタチオン N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノエチルアミド(1.2 mg, 71%)を得た。  ESI(+)-MS:m/z 513 [MH+ calcd. for C18H24N8O8S 513.14]
【００４４】
［実施例６］
シンナムアルデヒド(皮膚感作性陽性。質量132)を0.2mg/mL(1.5mM)となるようアセトニトリルに溶解した溶液0.1mLと、グルタチオン蛍光誘導体(以下、n-GSHと記す。質量512)を0.7mg/mL(1.4mM)となるよう0.1M NaHPO4-Na2HPO4水溶液(pH7)に溶解した溶液0.1mLとを混合し、44℃で保温した後、水−アセトニトリル混液（１：１）1.5mLで希釈し、その10μLを以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムを（図３）を、上記のn-GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラム（図１及び図２）と比較した。その結果、n-GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものを分析して得られるクロマトグラムには認められないピークが検出された。上記のn-GSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液を、以下に記載の条件にてLC-MSに供したところ。上記のn-GSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液のみに認められるピークに相当するMSスペクトル（図４）から、これらのピークに相当する化合物の質量数は626と推定された。該質量数はn-GSHとシンナムアルデヒドとが脱水縮合してなる化合物の質量数と一致する。
【００４５】
[HPLC測定条件]
島津製作所製LC-10Avp
カラム：L-column(4.6μm，5mmφ×15cm)
カラム温度：40℃
流量：1mL/min
ピーク検出：紫外吸光度検出器（検出波長：220nm）の次に蛍光検出器(励起波長：470nm、蛍光波長：530nm)を直列に繋いで行った。
溶出液A：蒸留水にトリフルオロ酢酸を0.1%添加した溶液
溶出液B：アセトニトリルにトリフルオロ酢酸を0.1%添加した溶液
溶出条件：溶出液Aが90%、溶出液Bが10%の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、15分かけて溶出液Bの割合を10%から99%に上げながら溶出液Aと溶出液Bの混合液を流し、溶出液Bが99%の割合に達してから5分間その割合を保持した。
[LC-MS設定条件]
LC装置：アジレント製Agillent1100
その他LC条件：上記[HPLC測定条件]に同じ
MS装置：サーモフィッシャーサイエンティフィック製LCQ DECA XP Plus
イオン化：ESI法
スプレー電圧：5kV
キャピラリー温度：250℃
【００４６】
［比較例１］
シンナムアルデヒド(皮膚感作性陽性。質量132)を2mg/mL(15mM)となるようアセトニトリルに溶解した溶液0.1mLと、グルタチオン(以下、GSHと記す。質量307)を10mg/mL(33mM)となるよう0.1M NaHPO4-Na2HPO4水溶液(pH7)に溶解した溶液0.1mLとを混合し、44℃で保温した後、水−アセトニトリル混液（１：１）1.5mLで希釈し、その10μLを実施例１に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムを（図７）を、上記のGSH溶液のみを保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラム（図５及び図６）と比較した。その結果、GSH溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみを保温したものを分析して得られるクロマトグラムには認められないピークが検出された。上記のGSH溶液とシンナムアルデヒドとの溶液の混合液を、実施例6に記載の条件にてLC-MSに供したところ。上記のGSH溶液とシンナムアルデヒド溶液との混合液のみに認められるピークに相当するMSスペクトル（図８）から、これらのピークに相当する化合物の質量数は439と推定された。該質量数はn-GSHとシンナムアルデヒドとがマイケル付加してなる化合物の質量数と一致する。
GSHとn-GSHの結合物同定能力を比較するため実施例6及び比較例１における結合物の合計ピーク面積を比較した（表１）。混合実験に使用したn-GSH又はGSH及びシンナミルアルデヒドとの使用量(mmol)でそれぞれ除した値を比較したところ、結合物を同定する際にn-GSHを用いて蛍光検出した場合は、UV検出を用いた場合と比較して約１００倍の感度が得られると計算できる。
さらに、結合物の判断の容易さを比較すると、n-GSHを用いて蛍光検出した場合はクロマトグラム上に認められるピークは結合物と未反応のn-GSH由来ピークのみであり、結合物を容易に判定できる。
一方、GSHを用いてUV検出で結合物を同定する場合は被験物質であるシンナムアルデヒド中の夾雑物やグラジエント溶出によるベースラインの盛り上がり、ブランクピークの存在などにより感作性物質が微量であれば結合物を判定することは難しい。
【００４７】
【表１】
0005223391.tif 000029
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】蛍光グルタチオン溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。n-GSHは蛍光グルタチオンのピークを示す。
【図２】シンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。
【図３】蛍光グルタチオン溶液とシンナムアルデヒド溶液の混合液を保温したものの液体クロマトグラムである。シンナムアルデヒド・n-GSH結合物は、蛍光グルタチオン溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムでは検出されなかったピークである。
【図４】シンナムアルデヒド・n-GSH結合物のESI-MSスペクトルである。
【図５】グルタチオン溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。GSHはグルタチオンのピークを示す。
【図６】シンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムである。
【図７】グルタチオン溶液とシンナムアルデヒド溶液の混合液を保温したものの液体クロマトグラムである。シンナムアルデヒド・GSH結合物は、グルタチオン溶液のみ保温したもの及びシンナムアルデヒド溶液のみ保温したものの液体クロマトグラムでは検出されなかったピークである。
【図８】シンナムアルデヒド・GSH結合物のESI-MSスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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