(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体が透過可能な、泡状の空隙が連続した３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜に、生体分子が固定化されている生体分子固定化炭素膜であって、
前記多孔質炭素膜は、多孔質ポリイミドフィルムを炭素化して得られた多孔質炭素膜であって、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇであり、
前記生体分子が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼおよびビリルビンオキシダーゼからなる群より選ばれ、
前記生体分子と、前記生体分子が有する電荷と反対の電荷を有する第１の高分子電解質とが、交互に積層されて、静電相互作用によるイオンコンプレックスを形成して、前記多孔質炭素膜の細孔表面に固定化されていること
を特徴とする生体分子固定化炭素膜。
【請求項２】
前記生体分子が有する電荷と同じ電荷を有する第２の高分子電解質をさらに有し、前記生体分子と第２の高分子電解質が混合した状態で、前記第１の高分子電解質とイオンコンプレックスを形成していることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定化炭素膜。
【請求項３】
前記多孔質炭素膜は、生体分子を導入する前に、表面にアニオン基が導入されていることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子固定化炭素膜。
【請求項４】
前記多孔質炭素膜は、生体分子を導入する前に、表面にアニオン基を導入した後、カチオン基を有する化合物が導入されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜を電極に使用するセンサー。
【請求項６】
多孔質ポリイミドフィルムを炭素化して得られた泡状の空隙が連続した３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
正電荷を帯びた１種以上の高分子電解質を含有する溶液（ａ）および負電荷を帯びた１種以上の高分子電解質を含有する溶液（ｂ）であって、前記正電荷を帯びた高分子電解質または負電荷を帯びた高分子電解質の少なくとも１つが、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼおよびビリルビンオキシダーゼからなる群より選ばれる生体分子である溶液（ａ）および溶液（ｂ）を用意する工程と、
前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程と、
前記多孔質炭素膜を前記溶液（ａ）に浸漬して減圧処理するサブ工程（ａ）と、前記多孔質炭素膜を前記溶液（ｂ）に浸漬して減圧処理するサブ工程（ｂ）とを、交互に行う交互積層工程を有する請求項１記載の生体分子固定化炭素膜の製造方法。
【請求項７】
前記交互積層工程において、サブ工程（ａ）から先に行うことを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記の多孔質炭素膜を酸化処理する工程の後、酸化処理後の多孔質炭素膜の表面にカチオン基を導入する工程を有し、
次いで前記交互積層工程において、サブ工程（ｂ）から先に行うことを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
前記の酸化処理後の多孔質炭素膜の表面にカチオン基を導入する工程が、カチオン基を有する化合物のアルコール溶液で処理することを含むことを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記溶液（ａ）および溶液（ｂ）の一方に生体分子が含有され、残りの一方にメディエーターが含有されている請求項６〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記溶液（ａ）および溶液（ｂ）の一方に、生体分子とメディエーターの両方が含有されている請求項６〜９のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質炭素膜、詳しくは生体分子を固定化した炭素膜、およびその炭素膜の電極、電池材料、センサー、半導体デバイス等の用途における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素等の電極上に生体分子を固定化し、センサーや、発電素子として応用する研究が進んでいる（特許文献１、２、および非特許文献１〜４）。電極上にどれだけの生体分子を固定化できるかは、センサーの感度、発電素子の出力を左右するきわめて重要な要素である。【０００３】
例えば、特開２００５−８３８７３号公報（特許文献１）には、炭素材の表面に、塩化シアヌルなどの分子を介して共有結合的に、または吸着により、酵素等の生体由来分子を固定したバイオセンサーが記載されている。電極炭素材は、塩素化塩化ビニル樹脂等と黒鉛微粒子を混合した後に焼成して得られている。しかし、この炭素材は、液不透過性であり多孔性材料ではないため、電極のプレート面に生体由来分子が固定されているに過ぎない。【０００４】
また、特開２００５−６０１６６号公報（特許文献２）には、基板に垂直な柱状孔を有するシリコン等の多孔体の表面をカーボンで被覆したカーボン被覆電極が記載されている。この電極では、炭素表面積は増大しているが、複合材料であり製造が煩雑である。また、気体および液体の透過性がなく、また隣接する孔同士でのつながりもないため、用途が制限される。【０００５】
生体分子電極を機能させるためには、一般に、酸化還元反応を仲介をするメディエーターが必要である。従来、主にアミノ基を有する成分にエポキシ樹脂などを加えて形成した三次元ゲル中に酵素とメディエーターをとじ込めて、電極上に、固定化する方法が知られている。非特許文献３では、酵素とメディエーターを、この三次元ゲル化法により、直径７μｍのＣａｒｂｏｎ  Ｆｉｂｅｒに固定化してバイオ燃料電池を構成し、１３７μＷ／ｃｍ２の出力を得ている。また、非特許文献５には、固体基板を正、負それぞれの高分子電解質水溶液に交互に浸漬する交互積層法（あるいは、交互吸着法ｌａｙｅｒ  ｂｙ  ｌａｙｅｒ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）により、酵素−メディエーターを共固定化する方法が記載されている。三次元ゲル化法と交互積層法との比較では、非特許文献６に記載のように、グラッシーカーボン電極上にメディエーターと酵素の固定化を三次元ゲル化と、交互積層法の両方法にての比較では、三次元ゲル法の方が優れていたと報告されている。
【特許文献１】特開２００５−８３８７３号公報
【特許文献２】特開２００５−６０１６６号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２（２），２９９−３１６（１９９９）
【非特許文献２】Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５（２００２）２９−３２
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００１，  １２３，  ８６３０−８６３１
【非特許文献４】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２００４，  １０４，  ４８６７−４８８６
【非特許文献５】Analytical Chemistry vol78，399，  2006
【非特許文献６】第9回  生体触媒化学シンポジウム  （2006年1月27日）  ポスター発表  加納ら  P10
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、従来から、生体分子、または生体分子とメディエーターとを電極上に固定化することが試みられてきたが、性能的に不満足であり、改良が求められていた。【０００７】
本発明は、固定化された生体分子の量が多く、生体分子の機能を従来より高いレベルで有する生体分子固定化炭素膜を提供することを目的とする。また、本発明の１態様は、酵素活性または電気的レスポンスに優れたセンサーおよびバイオ燃料電池を提供することを目的とする。さらに本発明の１態様は、生体分子の固定化に適した新規な機能性膜を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、以下の事項を開示している。特に特許請求の範囲に係る発明において、多孔質炭素膜は、泡状の空隙が連続した３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜である。多孔質炭素膜は、多孔質ポリイミドフィルムを炭素化して得られたものが好ましい。
【０００９】
１．  液体が透過可能な３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜に、生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化炭素膜。【００１０】
２．  前記多孔質炭素膜の透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃであり、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇであることを特徴とする上記１記載の生体分子固定化炭素膜。【００１１】
３．  前記多孔質炭素膜の表面と前記生体分子との静電相互作用により、前記生体分子の固定化が生じていることを特徴とする上記１または２記載の生体分子固定化炭素膜。【００１２】
４．  前記多孔質炭素膜は、酸化処理されて表面にアニオン基が導入され、この表面アニオン基と前記生体分子中の正電荷との静電相互作用により、前記生体分子の固定化が生じていることを特徴とする上記３記載の生体分子固定化炭素膜。【００１３】
５．  前記多孔質炭素膜は、酸化処理後に表面にカチオン基を有する化合物が導入され、この表面カチオン基と前記生体分子中の負電荷との静電相互作用により、前記生体分子の固定化が生じていることを特徴とする上記３記載の生体分子固定化炭素膜。【００１４】
６．  前記多孔質炭素膜の表面と前記生体分子との間の共有結合により、前記生体分子の固定化が生じていることを特徴とする上記１または２記載の生体分子固定化炭素膜。【００１５】
７．  前記多孔質炭素膜の表面と前記生体分子との物理的相互作用により、前記生体分子の固定化が生じていることを特徴とする上記１または２記載の生体分子固定化炭素膜。【００１６】
８．  前記生体分子が有する電荷と反対の電荷を有し、前記生体分子と静電相互作用によるイオンコンプレックスを形成している第１の高分子電解質を含有することを特徴とする上記１または２記載の生体分子固定化炭素膜。【００１７】
９．  前記生体分子および前記第１の高分子電解質は、交互に積層されてイオンコンプレックスを形成していることを特徴とする上記８記載の生体分子固定化炭素膜。【００１８】
１０．  前記生体分子が有する電荷と同じ電荷を有する第２の高分子電解質をさらに有し、前記生体分子と第２の高分子電解質が混合した状態で、前記第１の高分子電解質とイオンコンプレックスを形成していることを特徴とする上記８または９記載の生体分子固定化炭素膜。【００１９】
１１．  前記多孔質炭素膜は、生体分子を導入する前に、表面にアニオン基が導入されていることを特徴とする上記８〜１０のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜。【００２０】
１２．  前記多孔質炭素膜は、生体分子を導入する前に、表面にアニオン基を導入した後、カチオン基を有する化合物の有機溶媒溶液で処理されていることを特徴とする上記８〜１０のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜。【００２１】
１３．  前記生体分子が、タンパク質またはヌクレオチドであることを特徴とする上記１〜１２のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜。【００２２】
１４．  上記１〜１２のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜を電極に使用するセンサー。【００２３】
１５．  上記１〜１２のいずれかに記載の生体分子固定化炭素膜を電極に使用するバイオ燃料電池。【００２４】
１６．  ３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程と、
酸化処理後の多孔質炭素膜を生体分子を含有する溶液に浸漬して、前記生体分子を前記多孔質炭素膜に固定する工程とを有する生体分子固定化炭素膜の製造方法。【００２５】
１７．  ３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程と、
酸化処理後の多孔質炭素膜の表面にカチオン基を導入する工程と、
カチオン基を導入した後の多孔質炭素膜を生体分子を含有する溶液に浸漬して、前記生体分子を前記多孔質炭素膜に固定する工程とを有する生体分子固定化炭素膜の製造方法。【００２６】
１８．  ３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程と、
前記多孔質炭素膜と生体分子を共有結合により固定する工程とを有する生体分子固定化炭素膜の製造方法。【００２７】
１９．  ３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
生体分子と架橋性化合物を含有する混合物と、前記多孔質炭素膜を接触させて、前記生体分子を前記多孔質炭素膜に固定する工程とを有する生体分子固定化炭素膜の製造方法。【００２８】
２０．  液体が透過可能な３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜の表面が酸化された後に、カチオン基を有する化合物が導入されていることを特徴とする機能性炭素膜。【００２９】
２１．  前記多孔質炭素膜の透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃであり、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇであることを特徴とする上記２０記載の機能性炭素膜。【００３０】
２２．  前記生体分子が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ジアフォラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アビジンおよびビオジンからなる群より選ばれることを特徴とする上記１３記載の生体分子固定化膜。【００３１】
２３．  ３次元網目状の細孔を有し、透気度が１０〜２０００秒／１００ｃｃ、比表面積が１〜１０００ｍ２／ｇである多孔質炭素膜を用意する工程と、
正電荷を帯びた１種以上の高分子電解質を含有する溶液（ａ）および負電荷を帯びた１種以上の高分子電解質を含有する溶液（ｂ）であって、前記正電荷を帯びた高分子電解質または負電荷を帯びた高分子電解質の少なくとも１つが生体分子である溶液（ａ）および溶液（ｂ）を用意する工程と、
前記多孔質炭素膜を前記溶液（ａ）に浸漬するサブ工程（ａ）と、前記多孔質炭素膜を前記溶液（ｂ）に浸漬するサブ工程（ｂ）とを、交互に少なくとも１回行う交互積層工程を有する生体分子固定化炭素膜の製造方法。【００３２】
２４．  前記交互積層工程に先立ち、前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程を有し、
次いで前記交互積層工程において、サブ工程（ａ）から先に行うことを特徴とする上記２３記載の製造方法。【００３３】
２５．  前記交互積層工程に先立ち、前記多孔質炭素膜を酸化処理する工程と、酸化処理後の多孔質炭素膜の表面にカチオン基を導入する工程とを有し、
次いで前記交互積層工程において、サブ工程（ｂ）から先に行うことを特徴とする上記２３記載の製造方法。【００３４】
２６．  前記溶液（ａ）および溶液（ｂ）の一方に生体分子が含有され、残りの一方にメディエーターが含有されている上記２３〜２５のいずれかに記載の製造方法。【００３５】
２７．  前記溶液（ａ）および溶液（ｂ）の一方に、生体分子とメディエーターの両方が含有されている上記２３〜２６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、固定化された生体分子の量が多く、生体分子の機能を従来より高いレベルで有する生体分子固定化炭素膜を提供することができる。本発明の生体分子固定化炭素膜は、通常、生体分子が膜全体に分散された状態で固定化されるために、酵素活性に代表される生体分子活性に優れる。従って、本発明の生体分子固定化炭素膜をセンサーの電極に使用すると、大きな電気的レスポンスが得られ、高感度、低濃度検出、小型化が可能になる。さらに、本発明の生体分子固定化炭素膜をバイオ燃料電池の電極に使用すると、出力が大きいため、実用化に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】参考例２で製造された多孔質炭素膜の表面の走査型電子顕微鏡像である。
【図２】参考例２で製造された多孔質炭素膜の断面の走査型電子顕微鏡像である。
【図３】（ａ）ＰＥＩ化処理前および（ｂ）ＰＥＩ化処理後の多孔質炭素膜のＸＰＳスペクトルである。
【図４】フェリチン固定化前の多孔質炭素膜表面の走査型電子顕微鏡写真像である。
【図５】フェリチン固定化後の多孔質炭素膜表面の走査型電子顕微鏡写真像である。
【図６】フェリチン固定化後、さらに焼成後の多孔質炭素膜表面の走査型電子顕微鏡写真像である。
【図７】未処理、硝酸処理後、ＰＥＩ処理後、ＰＥＩ処理−ＧＯＸ固定後の多孔質炭素膜について、（ａ）細孔分布、および（ｂ）表面積を示すグラフである。
【図８】本発明のＧＤＨ固定電極および比較例のＧＤＨ固定電極について、低グルコース濃度領域の電流出力を示すグラフである。
【図９】フェリチン固定化後の膜の断面をＥＰＭＡ（電子線プローブマイクロアナライザー）分析した結果である。ラインプロファイルにおいて、上下が膜断面の距離、右側がＦｅ濃度を示す。また画像中、濃い黒の方が濃度が高いことを示す。
【図１０】交互積層法による積層数を変えたときの応答電流を表すグラフである。
【図１１】交互積層法を、多孔質炭素膜に適用した電極とカーボンペーパーに適用した電極について、低グルコース濃度領域の電流出力を示すグラフである。
【図１２】交互積層法を適用する際のポリアクリル酸の分子量を比較したグラフである。
【図１３Ａ】フローインジェクションアナリシス用のセンサー構造の１例を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ａに示すセンサー構造の断面図である。
【図１４】フローインジェクションアナリシスによるグルコース濃度と出力電流との関係を示すグラフである。
【図１５Ａ】チップ型バイオ燃料電池の構造の１例を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ａに示すチップ型バイオ燃料電池の構造の断面図である。
【図１５Ｃ】図１５Ａに示すチップ型バイオ燃料電池に使用する単セルの構成例を示す図である。
【図１６】高分子電解質膜型バイオ燃料電池の構造の１例を示す図である。
【図１７】実施例１１に従って作製したフェリチン固定化後の膜の断面のＥＰＭＡ分析結果である。
【図１８】実施例１７に従って作製したフェリチン固定化後の膜の断面のＥＰＭＡ分析結果である。
【図１９】実施例１７に従って作製したフェリチン固定化後の膜の断面の走査型電子顕微鏡写真像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
＜３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜＞
本発明で用いられる３次元網目状の細孔を有する多孔質炭素膜は、膜の細孔が互いに連通して、気体および液体の流通が可能なものである。細孔の連通の程度をＪＩＳ  Ｐ８１１７に準じて測定した透気度で表したとき（詳細は後述する。）、１〜２０００秒／１００ｃｃが好ましく、特に１０〜２０００秒／１００ｃｃを示すものが好ましい。ＢＥＴ比表面積は、通常１〜１０００ｍ２／ｇであり、好ましくは３〜２００ｍ２／ｇ、特に好ましくは５〜３０ｍ２／ｇである。また、空孔率としては、好ましくは２０〜８０％、特に好ましくは３０〜６０％である。空孔率は、真密度を求めて、重量法により算出できる。平均孔径は、バブルポイント法（ＡＳＴＭ  Ｆ３１６、ＪＩＳＫ３８３２）による評価で（詳細は後述する。）、好ましくは１０〜１０００ｎｍ、特に５０〜５００ｎｍである。【００３９】
多孔質炭素膜の炭素の含有率は、使用目的に合わせて適宜変更することができるが、好ましくは８０原子％以上であり、用途によっては９５原子％以上が好ましい。本発明は、特にセンサーの電極、バイオ燃料電池の電極に使用されるので、炭素含有量が多く、電気伝導性が高いものが好ましい。その結果、膜基材の電気伝導性を利用した電極を構成できるために、補助的に導電剤等を使用しなくてもよい。【００４０】
多孔質炭素膜は、このような性質を有するものであれば、その形態等は特に限定されず、用途によっては、繊維状の炭素が絡み合ってネットワークを形成している形態の膜でもよいが、一般には、泡状の空隙が連続した多孔質膜が好ましい。後者の膜は、例えば特開２０００−３３５９０９号公報および特開２００３−１２８４０９号公報に記載されているように、ポリイミド系、セルロース系、フルフラール樹脂系、フェノール樹脂系等の高耐熱性樹脂製の多孔質膜を炭素化して得られる。特に好ましい多孔質炭素膜は、ポリアミック酸等のポリイミド前駆体溶液からポリイミド前駆体を析出させて多孔質化し、その後ポリイミド化、炭素化したものである。【００４１】
＜多孔質炭素膜の表面処理＞
本発明では、生体分子を固定化する多孔質炭素膜としては、多孔質炭素膜表面に（１）アニオン基を導入したもの、（２）カチオン基を導入したもの、および（３）何も処理しないかまたは疎水性の状態のものの３種類がありうる。炭素化した膜の表面は、通常は疎水性であるため、前記（３）の疎水性の表面を求めるときは、通常は何もしないで、生体分子の固定化を行う。【００４２】
ここで、アニオン基とは、生体分子を固定化する際の周囲ｐＨにより、負電荷を帯びる基（すでに負電荷になっている場合を含む）を意味し、例えば−ＣＯＯＨ（または−ＣＯＯ−）、−ＳＯ３Ｈ（または−ＳＯ３−）、−ＰＯ４Ｈ２（または−ＰＯ４Ｈ−）等の酸基が表面に導入されたものが挙げられる。この場合、炭素表面に直接に導入されていても、上記のアニオン基が分子の一部として導入されていてもよい。アニオン基としては、特に−ＣＯＯＨ（または−ＣＯＯ−）が好ましい。【００４３】
アニオン基の導入は、導入する基に合わせた処理により行うことができるが、簡便な方法として、表面を酸化処理する方法が挙げられ、これによりＣＯＯＨ基が導入されていると考えられる。好ましくは、硝酸水溶液による処理（硝酸酸化）、過酸化水素酸化、水蒸気存在下での空気中での高温処理、酸素プラズマ処理等、より好ましくは硝酸水溶液による処理を挙げることができる。条件を選ぶことで、アニオン基の導入量を調節できる。硝酸酸化の場合では、硝酸濃度、反応時間、反応温度を選ぶことで表面のカルボン酸量を変えることができる。硝酸濃度は、好ましくは５〜６９％、特に好ましくは１０〜６０％である。反応温度は、好ましくは１０℃〜１２０℃、特に好ましくは５０℃〜１２０℃である。反応時間は、好ましくは０．５〜６０時間、特に好ましくは１〜３０時間である。また、酸化処理により導入した表面のカルボン酸基との反応により、アニオン基を導入することもできる。【００４４】
次に、カチオン基とは、生体分子を固定化する際の周囲ｐＨにより、正電荷を帯びる基（すでに正電荷になっている場合を含む）を意味し、例えば、１級アミノ基｛−ＮＨ２｝、２級アミノ基｛（−）２ＮＨ｝、３級アミノ基｛（−）３Ｎ｝、４級アミノ基｛（−）４Ｎ＋｝、イミダゾール等を挙げることができる。これらの基は、炭素表面に直接に導入されても、これらのカチオン基が化合物の一部として導入されてもよい。特に、カチオン基が化合物の一部として導入されることが好ましい。【００４５】
カチオン基の導入は、導入する基に合わせた処理により行うことができる。たとえば、アンモニア存在下の酸素プラズマ処理なども挙げられるが、より好ましくは、未処理の炭素膜の表面には官能基が少ないので、まず表面を酸化処理することでカルボン酸基を導入し官能基の量を増大させておき、その後カルボン酸基に対して種々の反応を行うことで、カチオン基を導入することである。【００４６】
特に、カチオン基を有する化合物分子を導入する場合には、導入化合物分子は、カチオン基と共に、炭素膜表面のＣＯＯＨ等の官能基と反応する反応基（この反応基は、カチオン基であってもよい）を有している。多孔質炭素膜のＣＯＯＨを、例えば塩化チオニル等で処理して酸クロリド化して反応性を高め、その上でカチオン基を導入することも好ましい。多孔質炭素膜表面の−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＣｌ基と反応し得る基として、１級アミノ基｛−ＮＨ２｝、２級アミノ基｛（−）２ＮＨ｝、水酸基{−ＯＨ}、等を挙げることができる。【００４７】
カチオン基を有する化合物としてポリエチレンイミンを例にとると、多孔質炭素膜の表面に次のようにして、導入することができる。【００４８】
【化１】
0005251130.tif 000002
【００４９】
このポリエチレンイミン化合物において、エチレンイミン単位の繰り返し数は、必要とされる性能にあわせて適宜変更することができる。【００５０】
ポリエチレンイミン化合物以外にも、炭素膜表面のＣＯＣｌと反応しうる１級または２級アミノ基等の官能基と、カチオン基として１級〜３級アミノ基等を有する化合物は、上記スキームと同様にして多孔質炭素膜表面に導入できる。例えば、リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸のポリマーまたはオリゴマー、これらの塩基性アミノ酸を含むその他のポリまたはオリゴペプチド等を挙げることができる。尚、上記のスキームでは、ポリエチレンイミンが、炭素膜表面と１箇所でのみ結合しているが、複数点で結合していてもよい。【００５１】
また、上記のスキームでは、炭素表面のＣＯＯＨと共有結合している図を示したが、表面のＣＯＯＨ基が電離したＣＯＯ−との静電的結合により、カチオン基を有する化合物（上記のポリエチレンイミン等）が導入されてもよい。【００５２】
これらのカチオン基を有する化合物を導入するには、上記化合物が液体である場合にはその状態で炭素膜と接触させてもよいし、液体または固体である場合には水および／または有機溶媒等の溶媒に溶解した溶液を炭素膜と接触させてもよい。溶媒を使用するときは、炭素膜との親和性が高く、また粘度の低いものが好ましい。静電的結合により、カチオン基を有する化合物を導入する場合には、例えばメタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。【００５３】
このように、３次元網目構造の細孔を有する多孔質炭素膜の表面にカチオン基を導入した膜は従来には存在しなかった新規な機能性炭素膜であり、生体分子の固定の他にも、表面のカチオン基を利用した種々の反応、および例えば金属微粒子を担持させるときの担体としての利用等、種々の用途において有用である。特に、電気伝導性を合わせて利用した用途に有用である。【００５４】
＜生体分子の固定＞
本発明で、多孔質炭素膜に固定される生体分子としては、酵素、抗原および抗体等のタンパク質；オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび遺伝子等の核酸；脂質；および糖質等が挙げられる。特に好ましくは、酵素、抗原および抗体等のタンパク質である。【００５５】
本発明において、生体分子を多孔質炭素膜に固定する方法としては、（１）多孔質炭素膜の表面の電荷と生体分子の電荷との静電相互作用を利用する方法、（２）多孔質炭素膜の表面と生体分子との間を必要により分子団を介して共有結合させる方法、（３）多孔質炭素膜の表面と生体分子との物理的相互作用により、必要により他の化合物の物理的作用も利用する方法が挙げられる。【００５６】
（１）多孔質炭素膜の表面の電荷と生体分子の電荷との静電相互作用を利用する方法は、上記の３つの中でも最も好ましい。生体分子は一般に電離可能な基を有しているものが多く、水溶液のｐＨにより正電荷または負電荷を帯びる。酵素、抗原および抗体等のタンパク質は、等電点より低いｐＨで正電荷（カチオン）を帯び、等電点より高いｐＨで負電荷（アニオン）を帯びる。【００５７】
一方、この固定化方法に利用される多孔質炭素膜は、膜表面にアニオン基またはカチオン基が導入されたものであり、適当なｐＨにて水溶媒中で電離する。そこで、適当なｐＨ下で、多孔質炭素膜と生体分子溶液とを接触させることで、静電的に生体分子が膜表面に固定される。特に、本発明では、多孔質炭素膜として表面にアニオン基が導入されたもの、および表面にカチオン基が導入されたもののどちらも提供することができるため、固定化のｐＨ、および生体分子固定膜が使用されるｐＨ等を考慮して、表面処理された適当な多孔質炭素膜を選択できる。従って、固定化可能な生体分子の範囲が極めて広い。さらに、静電相互作用では、生体分子の変化が小さく、生体分子の活性の低下が少ないために、この点でも、適用できる生体分子の範囲が極めて広い。また、表面に導入したアニオン基またはカチオン基との静電相互に基づくために、生体分子が均一に分散性よく固定されやすい。また、生体分子が炭素表面の近傍に存在するので、炭素とのインターラクションが大きく、電子の授受等にきわめて有利である。センサーの電極、バイオ燃料電池の電極のような機能性電極として好ましい。【００５８】
固定化の具体的な例としては、後述するフェリチンは、硝酸酸化した多孔質炭素膜に、等電点４．７９未満のｐＨ、例えばｐＨ４．３付近で固定することができる。また、グルコースオキシダーゼは、中性付近では負電荷を帯びるので、硝酸酸化した後にポリエチレンイミンを表面に導入し、表面にカチオン基を導入した多孔質炭素膜に、ｐＨ７付近で固定することができる。ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、中性付近では正電荷を帯びるので、硝酸酸化した多孔質炭素膜に、ｐＨ７付近で固定することができる。【００５９】
この方法で、多孔質炭素膜表面に固定できる生体分子としては、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ依存型及びＰＱＱ依存型）、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ジアフォラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素、アビジン、ビオジンなどのタンパク質を挙げることができる。【００６０】
次に、（２）多孔質炭素膜の表面と生体分子との間を必要により分子団を介して共有結合させる方法について説明する。この方法では、生体分子中の官能基を共有結合に関与させて、多孔質炭素膜の表面に固定する。【００６１】
具体的方法としては、特開２００５−８３８７３号公報に記載されているような、塩化シアヌル法、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン−グルタルアルデヒド法、カルボジイミド脱水縮合法、および塩化チオニル法等を公知の方法を応用することが可能である。例えば、塩化シアヌル法では、多孔質炭素膜に対して硝酸酸化等の処理を適宜行った後、塩化シアヌルを接触させた後、タンパク質等と接触させることにより、シアヌル化合物とタンパク質のアミノ基との間で共有結合を生させる。タンパク質の糖鎖との反応を利用することも可能である。また、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン−グルタルアルデヒド法では、多孔質炭素膜をγ−アミノプロピルトリエトキシシランで処理することで、表面に（−Ｏ−）３Ｓｉ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２基を導入した後、グルタルアルデヒドの一方のアルデヒド基とシッフベースを形成させ、さらにもう一方のアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させてシッフベース形成により共有結合を生じさせる。カルボジイミド脱水縮合法および塩化チオニル法では、いずれも最終的にタンパク質のアミノ基との間の反応により、アミド結合を生じさせることができる。また、生体分子のＯＨ基とエステル結合を生じさせることもできる。【００６２】
共有結合により生体分子を固定する方法では、生体分子が反応に関与する官能基を有していることが必要であり、固定に利用される生体分子中の官能基としては、上述のとおり例えば１級アミノ基および２級アミノ基、ＯＨ基が挙げられる。タンパク質の場合、リジン残基を有する場合にはそのＮＨ２を利用することができる。さらに、共有結合で固定する場合には、反応により、生体分子の機能（酵素活性、抗原抗体反応）が大きく低下しないようなものが選ばれる。その点で、静電的結合と比較すると、固定される生体分子に制約が生じる場合が多くなる。また、この方法でも、生体分子が均一に分散性よく固定されやすく、生体分子が炭素表面の近傍に存在するので、炭素とのインターラクションが大きく、電子の授受等に有利である。センサーの電極、バイオ燃料電池の電極のような機能性電極として好ましい。【００６３】
この方法で、多孔質炭素膜表面に固定できる生体分子としては、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ依存型及びＰＱＱ依存型）、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ジアフォラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素、アビジン、ビオジンなどのタンパク質などを挙げることができる。【００６４】
（３）多孔質炭素膜の表面と生体分子との物理的相互作用により固定する方法は、生体分子は、多孔質炭素膜の表面と化学的な結合はなく、疎水結合のような物理的吸着を利用する方法である。物理的相互作用による場合でも、特に、生体分子を架橋させると分子の脱落が少なくなり固定化がより強固になる（以下、架橋法ともいう。）。例えば、グルタルアルデヒドと生体分子のアミノ基の間でシッフ塩基を形成させて生体分子を架橋させることが好ましい。このとき、アミノ基が全て反応すると生体分子の機能（酵素活性、抗原抗体反応）が大きく低下する場合があるので、ウシ血清アルブミンのような他のタンパク質や、ポリリジン、ポリエチレンイミンを混合することも好ましい。【００６５】
この方法で、多孔質炭素膜表面に固定できる生体分子としては、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ依存型及びＰＱＱ依存型）、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ジアフォラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素、アビジン、ビオジンなどのタンパク質等を挙げることができる。【００６６】
上記（１）〜（３）の固定方法の具体的操作において、多孔質炭素膜の細孔内で生体分子を含む液を接触させるためには、多孔質炭素膜を生体分子溶液に浸し、一旦減圧にして細孔内を脱気した後、常圧にもどすと、細孔内までに溶液が浸透するので、細孔内まで生体分子の固定を行うことができる。【００６７】
このように製造される本発明の生体分子固定化炭素膜は、好ましい実施形態においては、生体分子固定化後でも３次元網目構造を保持しており、透気度が１〜２０００秒／１００ｃｃ、特に好ましくは１０〜２０００秒／１００ｃｃである。これは、本発明の方法では、条件等を適切に選ぶことにより、生体分子の凝集の発生が少なく、細孔表面に固定化できることに基づく。【００６８】
＜交互積層法による生体分子の固定＞
交互積層法（交互吸着法：Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ（ＬＢＬ））は、基板を正、負それぞれの高分子電解質溶液に交互に浸漬し、逐次的に水に不溶なポリイオンコンプレックスを調製する方法である。センサーやバイオ燃料電池の電極用途では、利用可能な形態の生体分子を多量に電極上に固定することが重要である。本発明者は、交互積層法を適用することで、多孔質炭素膜の細孔を閉塞することなく透気度を維持した状態で、生体分子の固定化量を増大させることができることを見いだした。【００６９】
本発明では、多孔質炭素膜に対して、サブ工程（ａ）：正電荷を帯びた高分子電解質を含有する溶液（ａ）に浸漬するサブ工程、およびサブ工程（ｂ）：負電荷を帯びた高分子電解質を含有する溶液（ｂ）に浸漬するサブ工程を、１回以上実行する。その際、溶液（ａ）に含有される正電荷を帯びた高分子電解質および溶液（ｂ）に含まれる負電荷を帯びた高分子電解質の少なくとも１つとして生体分子を用いることで、この生体分子を多孔質炭素膜上に固定することができる。【００７０】
ここで、高分子電解質は、溶液中（通常は水溶液）で溶解し、電荷を帯びるものであればよく、天然高分子、ポリマーのような合成高分子等が挙げられる。分子量は特に限定されないが、一般に、質量平均分子量として、１０００以上、特に５０００以上のものが好ましい。【００７１】
溶液（ａ）に含まれる正電荷を帯びた高分子電解質、溶液（ｂ）に含まれる負電荷を帯びた高分子電解質は、それぞれ１種類であっても、複数の種類であってもよい。【００７２】
この工程により、生体分子と、前記生体分子が有する電荷と反対の電荷を有する第１の高分子電解質とが、静電相互作用によるイオンコンプレックスを形成して、多孔質炭素膜上に固定化される。ここで、生体分子が溶液（ａ）に含まれる場合には、第１の高分子電解質は、溶液（ｂ）に含まれる高分子電解質のひとつである。生体分子が溶液（ｂ）に含まれる場合には、第１の高分子電解質は、溶液（ａ）に含まれる高分子電解質のひとつである。【００７３】
前記生体分子が含有される溶液中に、さらに第２の高分子電解質（前記生体分子が有する電荷と同じ電荷を有する）が含有される場合には、前記生体分子と第２の高分子電解質が混合した状態で、前記第１の高分子電解質とイオンコンプレックスを形成して、多孔質炭素膜に固定化される。【００７４】
固定化される生体分子は、溶液（ａ）または溶液（ｂ）中で、それぞれ正電荷または負電荷を帯びる性質のものであれば、酵素、抗原および抗体等のタンパク質；オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび遺伝子等の核酸；脂質；および糖質等のいずれでもよい。具体的には、前述の＜生体分子の固定化＞の項で、静電相互作用を利用して固定化できる生体分子として挙げたものが利用できる。【００７５】
固定化される生体分子（即ち、機能を発揮させる目的で固定化される生体分子）以外の高分子電解質としては、正電荷を帯びることができる官能基を有する高分子化合物、負電荷を帯びることのできる官能基を有する高分子化合物であればよいが、それら官能基を複数個有するポリカチオンおよびポリアニオンが好ましい。【００７６】
ポリカチオンとしては、例えばアミノ基などの正電荷を帯びることのできる官能基を複数有する高分子化合物が挙げられる。具体的には、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリリジン、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジンなどが挙げられる。【００７７】
ポリアニオンとしては、例えばカルボン酸基、スルホン酸基などの負電荷を帯びることのできる官能基を複数有する高分子化合物が挙げられる。具体的には、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレン硫酸、ポリマレイン酸などの合成高分子、カルボキシメチルセルロースナトリウム、フコイダンなどの多糖、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸などが挙げられる。【００７８】
これらの高分子電解質は、水又は有機溶媒に可溶であり、特に水に可溶であることが好ましい。また、ホモポリマーに限定されず、共重合体であってもよい。【００７９】
さらに、高分子電解質として、ポリマー中に、フェロセンや、オスミウムビピリジン系或いはルテニウムビピリジン系などの金属錯体を共有結合または配位結合で導入したものも用いることができる。【００８０】
生体分子およびその他の高分子電解質を含有する溶液は、基本的に水溶液であるが、水に相溶性のある有機溶媒（メタノールなど）を含有させることも可能である。水溶液のｐＨは、荷電の状態を保つように調整されていることが望ましい。高分子電解質中のアミノ基や、カルボン酸基などの解離性官能基を用いて、ｐＨ調整することも可能であるし、リン酸塩などの緩衝液成分にて調整することも可能である。【００８１】
浸漬に用いる溶液の濃度は、特に規定しないが、生体分子溶液で、１００ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｌ、通常１ｍｇ／ｍｌ程度を用いる。その他の高分子電解質の濃度も同様に１００ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｌ程度であるが、高分子電解質がポリマーで、液体の場合、ポリマーそのものを用いることも可能である。【００８２】
また、１つの溶液の中に、複数種の高分子電解質を存在させるときは、溶液中の電荷が同じものを選ぶことが好ましい。また、高分子電解質と共に、単分子電解質化合物を共存させることもできる。例えば、フェリシアン化イオンのような単分子アニオンと、ポリアクリル酸のようなポリアニオンを共存させ、ポリイオンコンプレックスに取り込む形で同時に固定化することもできる。このような単分子電解質化合物も、溶液中の電荷が同じものを選ぶことが好ましい。【００８３】
多孔質炭素膜の浸漬工程（サブ工程（ａ）および（ｂ））では、まず多孔質炭素膜が十分に浸漬するだけの量の溶液を用意して、その中に多孔質炭素膜を浸漬すればよい。浸漬時間は、特に限定されないが、例えば1〜60分が好ましい。浸漬処理中は、静置したままでも、振とうしても、どちらでもかまわないが、細孔への拡散を促進するために振とうする方が好ましい。【００８４】
さらに、多孔質炭素膜の細孔内へ、溶液を接触させるために、浸漬中、一旦減圧にして細孔内を脱気した後、常圧に戻すことで、細孔内を置換する操作を加えることも望ましい。また、同様に浸漬中に、遠心操作などを加えることで、全体に重力をかけることで、溶液の細孔への置換を促進させることも望ましい。【００８５】
浸漬時の温度についても、特に制限は無いが、水溶液と生体分子を用いることから、０℃から６０℃、さらに好ましくは、０℃から３０℃が好ましい。【００８６】
このようにして、多孔質炭素膜を溶液（ａ）または溶液（ｂ）に浸漬した後、反対の荷電の高分子電解質を含む溶液に浸漬する。即ち、溶液（ａ）に浸漬した後に、溶液（ｂ）に浸漬し、溶液（ｂ）に浸漬した後に溶液（ａ）に浸漬することで、イオンコンプレックスを形成しながら、生体分子と（場合により第２の高分子電解質と共に）、反対に荷電した第１の高分子電解質とを交互に積層していく。【００８７】
これらの浸漬工程の後に、反対の荷電ポリマー溶液に浸漬する前に、多孔質炭素膜を洗浄することが好ましい。洗浄は、膜全体を純水または緩衝液などで、洗浄するだけでもよいが、洗浄後に、ろ紙などの吸水性シート上で膜中の液を吸収させて除去したり、膜を吸引ろ過したりすることで、膜から液を除去する操作をいれることも好ましい。また、荷電ポリマー液に浸漬する前に、純水に対して、浸漬処理することで、逆の荷電ポリマー液の混入を減らすことも可能である。このような洗浄工程を入れることで、正および負の高分子電荷質同士の凝集の発生を防止し、細孔内の表面に、均一に生体分子を固定化できる。【００８８】
交互積層回数は、特に限定されないが、１回から２０回、好ましくは、１回から１０回である。【００８９】
また、交互浸漬の際に、溶液（ａ）と溶液（ｂ）のｐＨは、溶液中の高分子電荷質が、所定の荷電の状態を保つように調整されていることに加え、膜上に先に積層した高分子電解質も、その荷電の状態を保つように調整されることが好ましい。このためには、溶液（ａ）と溶液（ｂ）のｐＨが、ほぼ同じに調整されることが最も好ましい。【００９０】
また、ポリエチレンイミンのような有機溶媒可溶なポリカチオンを有機溶媒に溶解させたもので、アニオン基を導入した多孔性炭素を処理し、最初のポリイオンコンプレックスを形成させることも好ましい。これは、粘度の低い有機溶媒を用いることで、細孔中の表面コートが促進されるためである。【００９１】
このように交互積層法により製造される生体分子固定化炭素膜においても、好ましい実施形態においては、生体分子固定化後でも３次元網目構造を保持しており、透気度が１〜２０００秒／１００ｃｃ、特に好ましくは１０〜２０００秒／１００ｃｃである。これは、本発明の方法では、条件等を適切に選ぶことにより、生体分子の凝集の発生が少なく、細孔表面に固定化できることに基づく。【００９２】
このような交互積層法によれば、多孔質炭素膜の細孔内の表面に、透気度を維持したまま、生体分子を従来より多量に固定できる。さらに、バイオセンサーの項目等で述べるように、メディエーター化合物等の生体分子と共に働く化合物を多孔質炭素膜に固定することも可能であるため、膜の機能性をより向上し、幅広い用途に応用することが可能になった。【００９３】
＜生体分子が固定された多孔質炭素膜の応用＞
本発明では、連通する細孔を有し、比表面積の大きな多孔質炭素膜に種々の生体分子の固定が可能である。センサーに使用した場合には感度の向上、発電素子に使用した場合には出力の増大の効果が得られる。また、均一な分散を目的とする用途にも使用できる。【００９４】
特に、前述の交互積層法を用いることにより、より多くの生体分子を利用可能な状態で多孔質炭素膜に固定することができる。単一層の積層法により固定した膜に比べて、センサー用途ではより高感度のセンサーが可能になり、バイオ燃料電池用途ではより高出力が可能になる。さらに、交互積層法では、生体分子に加え、メディエーター等の他の化合物を多孔質炭素膜に固定することが容易であるために、センサー用途では測定試料中にメディエーターの添加が不要になり、バイオ燃料電池用途ではシンプルな層構成も可能になる。【００９５】
センサー用途での応用：
適切な酵素、抗原、抗体等を固定した本発明の機能性炭素膜は、センサーの電極として使用することができる。本発明のセンサーでは、本発明で得られた酵素固定化多孔質炭素膜を測定対象物と接触させることで、基質を酸化することに伴いメディエーター分子を還元する。この還元されたメディエーターを陽極酸化する際に流れる電流値をアンペロメトリー法にて測定し、測定対象物濃度を定量する。測定対象化合物は、酵素の基質になるものが上げられ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが固定化された場合は、グルコースを、アルコール脱水素酵素が固定化されていれば、エタノールを測定することができる。本目的のためには、固定化する生体分子は、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素が好ましい。【００９６】
アンペロメトリー法による測定時に印加する電圧は、用いるメディエーターに左右されるが、例えば０．１Ｖ〜０．８Ｖが用いられる。測定は、酵素固定化多孔質炭素膜が測定対象物質に接触できればよく、測定対象物を多孔質炭素膜に流通させながら測定するフローインジェクション分析(Flow-injection analysis:以下FIAと略)に用いることも可能である。【００９７】
例えば、グルコースオキシダーゼまたはＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを上記の方法で固定した機能性膜は、グルコースセンサーの電極として使用できる。最も好ましい固定化方法は、静電的相互作用により固定する方法であり、特に交互積層法による固定化法である。またグルタルアルデヒドを使用した架橋化による物理的相互作用による固定化も可能である。【００９８】
本発明の機能性炭素膜では、大きな表面積と細孔内を液が流通できることにより、反応に関与できる酵素の実質的な量を増大でき、その結果、高感度のセンサーが得られる。【００９９】
センサーを構成するにあたり、酵素を固定した電極以外の部分は、公知の構成を採用することができる。例えば、ハイドロキノン、フェリシアン化カリウム、フェロセンカルボン酸、Ｎ−（２−クロロ−１，４−ナフトキノン）フタルイミド、２，２，４−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，５−ベンゾジアゼピン、２−メチル―１，４−ナフトキノン、２−アミノ３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、オスミウム（ＩＩＩ）−（ビピリジル）−２−イミダゾリル−クロライド等の公知のメディエーターを必要により添加する。【０１００】
さらに、生体分子の固定化に交互積層法を用いる場合にはメディエーターの固定化も可能である。【０１０１】
第１の例として、グルコースオキシダーゼを交互積層法により、メディエーターと共に、多孔質炭素膜に固定する例を示す。表１に、交互積層の際に使用する溶液（ａ）および溶液（ｂ）の例を示す。【０１０２】
【表１】
0005251130.tif 000003
グルコースオキシダーゼは、中性付近で負電荷を帯びるので、アニオン基を導入した多孔性炭素を最初にポリカチオン溶液に浸漬処理し、ついで、グルコースオキシダーゼ溶液にて処理する。この操作を順次繰り返すことで、交互積層による固定化が進行する。表に示すようにポリカチオンとして、例えば、金属錯体を配位したポリカチオン（Poly(1-vinylimidazole) complexed with Os-(4,4-dimethylbipyridine)2Clなど）を用いることで、酵素と共にメディエーターも固定化することができる。【０１０３】
第２の例として、ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを交互積層法により、メディエーターと共に、多孔質炭素膜に固定する例を示す。表２に、交互積層の際に使用する溶液（ａ）および溶液（ｂ）の例を示す。【０１０４】
【表２】
0005251130.tif 000004
ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、中性付近で正電荷を帯びるので、ポリアクリル酸のようなポリアニオンとの組み合わせで、交互積層法により固定化できる。この例では、溶液（ａ）に、ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼと金属錯体を配位したポリカチオン（Poly(1-vinylimidazole) complexed with Os-(4,4-dimethylbipyridine)2Clなど）の混合物を含有させて用いることで、酵素と共にメディエーターを共固定化している。【０１０５】
上記２つの例では、炭素膜に固定するメディエーターとして、ＰＶＩ−ｄｍｅＯｓを用いているが、酵素の活性中心と、電極の間で電子移動を仲介するものであれば、このような高分子電解質型錯体に限らず、単分子電解質化合物でもよい。高分子電解質型としては、フェロセン類や、ルテニウム錯体などを用いることができる。また、錯体に限定されず、キノン系化合物を共有結合したものも用いることができる。【０１０６】
バイオ燃料電池用途での応用：
バイオ燃料電池とは、アノードでは、グルコースやフルクトース、エタノールなどを燃料とする燃料の酸化反応、カソードでは酸素の還元反応が進行する電池である。【０１０７】
アノード側電極としては、アノードには、グルコースなどを基質として酸化する酵素と、必要によっては、補酵素、メディエーターが固定化されたものを用いるのが好ましい。アノード上では、基質の酸化反応が進行し、電子を系外に取り出す。【０１０８】
従って、アノード側は、基本的に前述のセンサー電極と同一の構造のものを使用することができる。また、応答電流の大きさが電池としての能力を左右するために、交互積層法で酵素を固定化したものは特に有利である。【０１０９】
カソード側電極としては、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼなどと必要によっては、メディエーターが固定化されたものを用いることも可能である（後述する）。または、白金などの金属触媒を担持した電極を用いることも可能である。カソードに酵素固定化触媒を用いた場合は、アノード、カソードを同一の燃料溶液に接触させることで電池を構成できる。カソードに白金などの金属触媒を担持した電極を用いた場合は、カソードとアノードをプロトン伝導体を介して接触させ、カソードは燃料溶液と接触し、アノードは、空気や酸素と接触させることで電池を構成できる。プロトン伝導体としては、ナフィオン（デュポン社商品名）などのカチオン交換樹脂膜が上げられる。【０１１０】
バイオ燃料電池カソードを、本発明の生体分子固定化炭素膜で構成する例を説明する。この目的のためには、固定化する生体分子はビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼが好ましい。また、メディエーターを固定化することも可能である。【０１１１】
１例として、ビリルビンオキシダーゼを交互積層法によりメディエーターと共に多孔質炭素膜に固定化する例を示す。表３に、交互積層の際に使用する溶液（ａ）および溶液（ｂ）の例を示す。【０１１２】
【表３】
0005251130.tif 000005
ビリルビンオキシダーゼは、中性で負電荷を帯びるので、アニオン導入した多孔性炭素を最初にポリカチオン溶液に浸漬処理し、ついで、ビリルビンオキシダーゼ溶液にて処理する。この操作を順次繰り返すことで、交互積層による固定化が進行する。表に示すように、ポリカチオンとしては、例えばポリアリルアミンなどを用いることができる。メディエーターとして機能するフェリシアン化イオンを、ビリルビンオキシダーゼと共に溶液（ｂ）に混入することで、ビリルビンオキシダーゼと同時に固定化できる。あるいは、固定化処理後に、フェリシアン化イオン溶液に浸漬することで、フェリシアン化イオンの固定化が可能である。【０１１３】
フェリシアン化イオンの代わりに、タングステンや、モリブデンなどの金属シアノ錯体を用いることも可能である。または、溶液（ａ）中のポリカチオンとしてPoly(1-vinylimidazole)complexed with Os-(4,4-dichloro-2,2’bipyridine)2Clなどを用いることも可能である。【０１１４】
以上のように、バイオ燃料電池は貴金属触媒が不要なうえ、メディエーターレスの構成、又はメディエーターを電極に固定した構成とすることで、セパレーターがなくても機能させることができるため、非常にシンプルな構成が可能である。本発明の酵素を固定した機能性炭素膜では、大きな表面積と細孔内を液が流通できることにより、反応に関与できる酵素の実質的な量を増大でき、その結果、高出力の燃料電池が得られる。【０１１５】
燃料溶液濃度は、とくに限定されないが、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌである。燃料溶液は、静置であっても、循環型であっても良い。【０１１６】
担体としての応用：
本発明の機能性炭素膜は、上記の電極用途以外でも、反応の場を提供する担体としての利用が可能である。例えば、生体分子を固定した機能性炭素膜は触媒的な利用が可能である。【０１１７】
例えばフェリチンは、酸化鉄ナノ粒子を内包するタンパク質であり、酸化鉄ナノ粒子を、コバルト、パラジウムに置換することが可能である。このような金属元素を内包するタンパク質を多孔質炭素膜に固定して得られる機能性炭素膜は、金属元素を均一に高密度で担持している。必要により焼成して有機質を除去すると、炭素膜表面に金属、酸化金属等の無機成分のみが担持された機能性炭素膜が得られる。例えば、フェリチンの酸化鉄をパラジウムに置換したものを固定した多孔質炭素膜を焼成したものは、触媒としての利用が可能である。またフェリチンの酸化鉄をコバルトに置換したものを固定した多孔質炭素膜を焼成したものは、記録材料としての利用も期待される。
【実施例】
【０１１８】
＜参考例１＞
多孔質ポリイミドフィルムの製造
テトラカルボン酸成分として３，３’，４，４’− ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）を、ジアミン成分としてｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）を用い、モノマ−成分の合計重量が８重量％になるようにＮＭＰに溶解し、重合を行って対数粘度（３０℃、濃度；０．５ｇ／１００ｍＬ  ＮＭＰ）が３．３のポリイミド前駆体の溶液を得た。【０１１９】
得られたポリイミド前駆体溶液を、厚みが約４００μｍになるように流延し、さらにその上部にドクターナイフを用いてＮＭＰを均一に塗布し１分間静置した後に該積層物をメタノ−ルとイソプロパノールを体積比で１対１の比率で十分に混合した凝固浴槽中に８分間浸漬し、溶媒置換を行うことでポリイミド前駆体の析出、多孔質化を行った。析出したポリイミド前駆体多孔質フィルムを水中に１５分間浸漬した後、基板から剥離し、ピンテンタ−に固定した状態で、大気中にて温度４３０℃、２０分間熱処理を行った。ポリイミド多孔質フィルムのイミド化率は８０％であり、フィルム断面方向に連続孔を有していた。【０１２０】
＜参考例２＞
多孔質炭素膜の製造
参考例１で製造した多孔質ポリイミドフィルムを窒素ガス気流下１６００℃の温度で炭素化して、膜厚み約８０μｍ、透気度１２６秒／１００ｍｌ、空孔率４０％、平均孔径０．１３μｍの多孔質炭素フィルムを得た。また、窒素吸着によるＢＥＴ比表面積は、１３．８ｍ２／ｇであった。得られた炭素膜の表面ＳＥＭ像を図１、断面ＳＥＭ像を図２に示す。【０１２１】
膜の特性は次の方法に従って測定した。【０１２２】
（１）透気度
ＪＩＳ  Ｐ８１１７に準じて測定した。測定装置としてＢ型ガーレーデンソメーター（東洋精機社製）を使用した。試料の膜を直径２８．６ｍｍ、面積６４５ｍｍ2の円孔に締付け、内筒重量５６７ｇにより、筒内の空気を試験円孔部から筒外へ通過させる。空気１００ｃｃが通過する時間を測定し、透気度（ガーレー値）とした。【０１２３】
（２）空孔率
真密度を求めて、重量法により算出した。【０１２４】
（３）平均孔径
バブルポイント法（ＡＳＴＭ  Ｆ３１６、ＪＩＳＫ３８３２）に基いて多孔質膜を評価した。ＰＭＩ社のパ−ムポロメ−タを用いて、バブルポイント法による多孔質膜の貫通パス分布の測定し、平均孔径を平均流量から逆算して求めた。【０１２５】
（４）比表面積
ＢＥＴ法により算出した。【０１２６】
（５）孔径分布
窒素吸着等温線を利用してDollimore-Heal(DH)法により算出した。【０１２７】
＜実施例１＞
（多孔質炭素膜の酸化処理）
３００ｍｌ平底セプラブルフラスコに多孔質炭素膜２．００ｇを計り取り、規定濃度の硝酸１００ｍｌを加え、８時間緩やかに還流した。その後、濾過にて回収し、洗液のｐＨが中性になるまで、純水による洗浄を繰り返した。その後、減圧乾燥を行った。炭素の酸化度の評価法については、一般的に確立されたものは無いので、通常の有機化合物分析で用いる元素分析をこの試料に適用したところ、硝酸処理に応じて酸素の含有量の増加が認められ、酸化度の尺度のひとつとして採用した。その結果を表４に示す。【０１２８】
【表４】
0005251130.tif 000006
【０１２９】
また、ＸＰＳによる表面元素分析結果を表５に示す。【０１３０】
【表５】
0005251130.tif 000007
【０１３１】
＜実施例２＞
（多孔質炭素膜表面へのポリエチレンイミンの導入）
３００ｍｌ平底セプラブルフラスコに３５％硝酸にて酸化処理した多孔質炭素膜約１．０ｇを計り取り、ＤＭＦ０．２ｍｌと塩化チオニル２０ｍｌを加え、ドラフト中、冷却管を付けホットプレート上にて４時間緩やかに還流した。室温まで冷却後、デカンテーションにて塩化チオニルを除去し、減圧乾燥した。【０１３２】
その後、ポリエチレンイミン（以下ＰＥＩと省略（Ｍｎ  ６００，Ｍｗ  ８００））２０ｍｌを加え、デシケーター中で、ポリエチレンイミンの粘度を下げ流動性をあげるために約６０℃に加温しながら０．１Ｍｐａ以下に減圧し、多孔膜から微細な気泡の発生がなくなるまでの約１０分間、減圧状態を保った。その後、常圧に戻し、同じ操作を３回繰り返して、細孔中の空気をＰＥＩに置換した。その後、４０℃で４日間静置した。【０１３３】
反応終了後、温水で繰り返し膜を洗浄し、続いて、温水での洗浄を繰り返して未反応のＰＥＩを除去した。ＰＥＩ化処理前後の多孔質炭素膜で、元素分析を行った。その結果を表６に示す。ＰＥＩ化後のＮ元素量の優位な上昇が認められた。また、ＸＰＳによる表面元素分析結果は、表５に示したとおりである。【０１３４】
【表６】
0005251130.tif 000008
【０１３５】
さらに、図３（ａ）および（ｂ）に示すように、ＰＥＩ化処理前後の多孔質炭素膜ＸＰＳスペクトルの比較により、ＰＥＩ化により、ＮＨ結合の存在が確認できたことから、炭素膜鏡面へのＰＥＩ導入を確認した。【０１３６】
＜実施例３＞
（金属ナノ粒子担持タンパク質（フェリチン）の固定化）
市販フェリチン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ−４５０３）  ７ｍｌ（フェリチン濃度７６ｍｇ／ｍｌ）を透析チューブ（和光  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｔｕｂｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｓｉｚｅ  ２４）中、蒸留水を外液として４℃にて、１６時間透析した。透析後、チューブから回収し、蒸留水にて１０ｍｌにメスアップした（フェリチン濃度５３ｍｇ／ｍｌ）。脱塩処理後のフェリチン水溶液（５３ｍｇ／ｍｌ）９ｍｌ、０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌを加えたのちｐＨ測定したところ、ｐＨが５程度に変化したため希塩酸にてｐＨを４．５に再調整した。【０１３７】
３０ｍｌサンプル管に実施例１の３５％硝酸にて酸化処理した多孔質炭素膜２０ｍｇを移し、上記フェリチン溶液を５ｍｌ加え、容器をデシケーターに入れて、０．１Ｍｐａ以下に減圧し、多孔膜から微細な気泡の発生がなくなるまでの約１０分間、減圧状態を保った。その後、常圧に戻し、再び減圧することを３回繰り返し、その後、４℃にて、振盪器上２４時間緩やかに振盪した。その後、炭素膜を取り出し、純水にて繰り返し洗浄した後、減圧デシケーター中にて、乾燥した。【０１３８】
乾燥後、蛍光Ｘ線分析（ＸＲＦ分析）により、Ｆｅ２Ｏ３の量を定量した。またＳＥＭ観察も行った。そして、Ｎ２気流下（１００ｍｌ／分）、室温から１０℃／分で昇温し、５００℃にて１時間保持して焼成を行った後、放冷した。焼成したサンプルについても、ＳＥＭ観察、蛍光Ｘ線分析を行った。固定化前、固定化後、および焼成後のそれぞれについて、蛍光Ｘ線分析による定量結果を表７に示す。また、それぞれについて、ＳＥＭ写真像を図４、図５、図６に示す。【０１３９】
【表７】
0005251130.tif 000009
【０１４０】
（膜断面方向のＦｅ分析）
固定化後のサンプルについて、断面方向の酵素固定化量を定量するために、ＳＥＭ−ＥＤＳ測定、およびＥＰＭＡ分析を行った。酵素固定化前の多孔質炭素膜には、鉄元素はほとんど含まれておらず、固定化した酵素であるフェリチンは、酸化鉄ナノ粒子を内包するタンパクであることから、鉄元素量と、存在するフェリチン量は比例する。【０１４１】
試料の作成：
フェリチン固定化後の多孔質炭素膜をエポキシ樹脂中に包埋後、ミクロトーム加工により断面を作製し、ＳＥＭ観察中の帯電を軽減するため、Ｐｔコーティングを実施して、試料を作製した。【０１４２】
ＳＥＭ−ＥＤＳ測定：
作製した試料を用いて、ＦＥ−ＳＥＭ（日立製作所製  Ｓ−４２００  電界放射形走査電子顕微鏡）にて、加速電圧３ｋＶ（二次電子像）、１５ｋＶ（反射電子像）にて断面方向を撮影した。鉄元素の存在量をＥＤＳ（使用装置：ＫＥＶＥＸ社製ＳＩＧＭＡ  ２型［５Ｂ〜９２Ｕ］：加速電圧：２０ｋＶ）にて、膜最表面（Ｔｏｐ；表面から約５μｍ）、中間部（ｍｅｄｉｕｍ；両表面から深度約２０μｍ）、膜最表面（ｕｎｄｅｒ；表面から約５μｍ）について、それぞれ二箇所で、スポットサイズ巾２μｍ×高さ１．５μｍのＥＤＳ分析によりＦｅ元素の確認及び定量を行った。その結果を表８に示す。【０１４３】
【表８】
0005251130.tif 000010
【０１４４】
ＥＤＸスペクトル強度と、元素量とは比例関係にあることから、Ｆｅ元素が、膜表面（外側近傍）だけでなく、膜内部（膜内部の表面）にも存在していることが示された。【０１４５】
ＥＰＭＡ（電子線プローブマイクロアナライザー Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）分析：  次に、同じ試料を用いて、ＥＰＭＡ分析により鉄元素の分布を測定した。日本電子製  電子線マイクロアナライザ  ＪＸＡ−８８００Ｒ（波長分散型）を用い、加速電圧１５ｋＶ、照射電流１．０×１０−７Ａ、プローブ径５μｍの条件で測定した。ＥＰＭＡによる断面でのＦｅ濃度測定結果を図９に示す。【０１４６】
ＥＰＭＡによる分析結果においても、Ｆｅ元素が、膜表面（外側近傍）に偏在することなく、膜内部にも存在することが示された。ラインプロファイルより、表面から約５μｍ程度、Ｆｅ濃度の高い層があり、そこからさらに内部の中間部では、鉄濃度はほぼ一定である。【０１４７】
以上から、本発明の生体分子固定化炭素膜、特に本発明の方法により製造される膜では、生体分子が膜の外側近傍に大きく偏在することなく、膜内部にも外側に比べても十分な割合で存在している。【０１４８】
＜実施例４＞
（グルコースオキシダーゼの固定化：静電相互作用による固定）
グルコースオキシダーゼ（アマノエンザイム製、以下Ｇｏｘと略称）５０ｍｇを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解し酵素液とした。４ｃｍガラスシャーレに、実施例２で製造した９５ｍｇのＰＥＩ化炭素膜を入れ、酵素液を膜全体が浸るように加えた。その後、細孔中の空気を酵素液に置換するため容器をデシケーターに入れて、真空ポンプで減圧し、充分に減圧になった後、常圧に戻し、再び減圧すること３回繰り返した。４℃にて一晩放置し、炭素膜を取り出し純水にて繰り返し洗浄したものをデシケーター中にて、減圧乾燥した。得られた膜を、次のＧｏｘ活性測定に供した。尚、測定まで−２０℃にて保管した。【０１４９】
Ｇｏｘ活性測定：
下記試薬を調製した。
Ａ．  アミノアンチピリン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）：  ０．２０ｇのアミノアンチピリンを純水２０ｍｌに溶解後、５０ｍｌに定容して調製した。
Ｂ．  フェノール溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）：  ２．５ｇフェノールを純水２０ｍｌに溶解後、５０ｍｌに定容して調製した。
Ｃ．  ペルオキシダーゼ溶液：
１２５０プルプロガリン・ユニットのペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ）を５０ｍｌの蒸留水に溶解して調製した。（調製後、氷浴に保管）
Ｄ．  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ，ｐＨ７．０）：
Ｅ．  フェノール緩衝溶液：
０．１３ｇのＫＨ２ＰＯ４を８０ｍｌの蒸留水に溶解し、３ｍｌの上記Ｂ．フェノール溶液を加えた後、１Ｎ  ＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整し１００ｍｌに定容して調製した。
Ｆ．  基質溶液：
５．０ｇのＤ−グルコースを５０ｍｌの蒸留水に溶解して調製した。【０１５０】
３０ｍｌサンプル管に数ｍｇの炭素膜片を精秤し、１０．０ｍｌのフェノール緩衝溶液（Ｅ）と２．５ｍｌのペルオキシダーゼ溶液（Ｃ）、０．５ｍｌのアミノアンチピリン溶液（Ａ）を加え、３０℃恒温槽中で、振盪しつつ５分間インキュベーションを行った。その後、あらかじめ３０℃に保温しておいた基質溶液（Ｆ）２．５ｍｌを加えて、反応を開始した。【０１５１】
激しく振盪しながら、２分後、１０分後に１ｍｌ分取し、素早く５００ｎｍの吸光度を測定する。測定後、デカンテーションにより反応液を除去し、蒸留水にて洗浄後、測定を繰り返した。【０１５２】
その結果、測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定にて、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．０４４Ｕの酵素活性が認められた。【０１５３】
図７（ａ）、（ｂ）に、未処理、硝酸処理後、ＰＥＩ処理後、ＰＥＩ処理−ＧＯＸ固定後の多孔質炭素膜について、細孔分布および表面積を示す。【０１５４】
＜実施例５＞
（ＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素の固定化：静電相互作用による固定）
ＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（アマノエンザイム製、以下ＧＤＨと略称）５０ｍｇを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解し酵素液とした。４ｃｍガラスシャーレに、３５％硝酸にて酸化処理した１００ｍｇの硝酸酸化後炭素膜を入れ、酵素液を膜全体が浸るように加えた。その後、細孔中の空気を酵素液に置換するため容器をデシケーターに入れて、真空ポンプで減圧し、充分に減圧になった後、常圧に戻し、再び減圧することを３回繰り返した。４℃にて一晩放置し、炭素膜を取り出し純水にて繰り返し洗浄したものを減圧デシケーター中にて乾燥し、次のＧＤＨ活性測定に供した。尚、測定まで、−２０℃にて保管した。【０１５５】
ＧＤＨ活性測定：
まず、下記試薬を調製した。
Ａ．  ３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと省略）緩衝液：
２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７）に２ｍＭのＣａＣｌ２を添加して調製した。
Ｂ．  ＰＭＳ溶液：
６．１３ｍｇＰＭＳ（フェナジン  メトサルフェート：ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）／１ｍｌ脱イオン水（遮光保存）を調製した。
Ｃ．  ＤＣＩＰ溶液：
１．３ｍｇＤＣＩＰ（ジクロロインドフェノール：Ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ）／１ｍｌ脱イオン水（遮光保存）を調製した。
Ｄ．  Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液：
１．２ＭのＧｌｕｃｏｓｅ溶液を調製した。【０１５６】
２０ｍｌスクリュー管に酵素固定化処理後炭素膜を精秤し、１０．０ｍｌのＭＯＰＳ緩衝液、０．２ｍｌのＰＭＳ溶液、０．２ｍｌのＤＣＩＰ溶液を加え、基質溶液（１．０ｍｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液）を加え反応を開始し、２５℃恒温槽中、１６０ｒｐｍにて往復振盪を行った。基質溶液を加えた後、１分、６分後、反応液を１ｍｌ分取し、ＵＶセルにて６００ｎｍの吸光度を測定した。【０１５７】
測定終了、デカンテーションにて反応液を除き、膜を蒸留水、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ＥＤＴＡ  ｐＨ７．０）で洗浄した後、再び、酵素測定操作を行い繰り返し活性を測定した。【０１５８】
その結果、測定・洗浄を９回繰り返し、１０回目の測定にて、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．０３７Ｕの酵素活性が認められた。【０１５９】
（透気度の測定）
また、実施例５で得られた酵素固定化炭素膜の透気度を、参考例２と同様に測定した結果、２２０秒／１００ｍｌであり、酵素固定化後でも膜の細孔の連通が十分に存在していることが判った。【０１６０】
＜実施例６＞
（グルコースオキシダーゼの固定化：物理的相互作用（架橋法）による固定）
（実施例６−１）
グルコースオキシダーゼ（アマノエンザイム製、以下Ｇｏｘと略称）５０ｍｇを１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して酵素溶液とし、別途８０ｍｇＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものを調製してＢＳＡ溶液とした。【０１６１】
ガラスシャーレ上に、調製した酵素溶液８００μｌと、ＢＳＡ溶液８００μｌを混合したものに攪拌下、２．５％グルタルアルデヒド水溶液４００μｌを加え固定化酵素液とした。その固定化酵素液に多孔質炭素膜を膜全体が浸るように加えた。その後、細孔中の空気を酵素液に置換するため容器をデシケーターに入れて、真空ポンプで減圧し、充分に減圧になった後、常圧に戻し、再び減圧すること３回繰り返した。その後、室温にて３時間放置後、膜を取り出し、真空ポンプにて減圧乾燥した。その後、炭素膜を純水にて繰り返し洗浄した後、減圧デシケーター中にて乾燥し、ＧＯＸ活性測定に供した。【０１６２】
実施例４と同様に測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定にて、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．０２Ｕの酵素活性が認められた。【０１６３】
比較例として、グルタルアルデヒド水溶液とＢＳＡ溶液を加えず、代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．２ｍｌを加えた以外は、同様の処理をした。得られた炭素膜の測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定では、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．００１Ｕ以下の酵素活性であり、酵素が固定化されているとは言えない結果であった。【０１６４】
（実施例６−２）
実施例６−１で使用したＢＳＡの代わりにＰＥＩを用いて、酵素の架橋化固定を試みた。まず、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ａｌｄｒｉｃｈ製（Ｍｎ１８００，Ｍｗ２０００）、５０％水溶液）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５倍希釈したものをＰＥＩ溶液とした。【０１６５】
酵素溶液８００μｌと、ＰＥＩ溶液１００μを混合したものに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２００μｌ加え、次いで攪拌下、２．５％グルタルアルデヒド水溶液１００μｌを加えたものを固定化酵素液とし、その他は実施例６−１と同様の処理を行った。得られた炭素膜の測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定にて、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．０３Ｕの酵素活性が認められた。【０１６６】
（透気度の測定）
また、実施例６−２で得られた酵素固定化炭素膜の透気度を、参考例２と同様に測定した結果、２０５秒／１００ｍｌであり、酵素固定化後でも膜の細孔の連通が十分に存在していることが判った。【０１６７】
＜実施例７＞
（ＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素の固定化：物理的相互作用（架橋法）による固定）
ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（アマノエンザイム製ＰＱＱ−ＧＤＨ）５０ｍｇを１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して酵素溶液とし、別途ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ａｌｄｒｉｃｈ製（Ｍｎ１８００，Ｍｗ２０００）、５０％水溶液）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５倍希釈したものをＰＥＩ溶液とした。【０１６８】
ガラスシャーレ上に、調製した酵素溶液８００μｌと、ＰＥＩ溶液１００μｌを混合したものに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２００μｌ加え、攪拌下、２．５％グルタルアルデヒド水溶液１００μｌを加え固定化酵素液とした。その固定化酵素液に多孔質炭素膜を膜全体が浸るように加えた。その後、細孔中の空気を酵素液に置換するため容器をデシケーターに入れて、真空ポンプで減圧し、充分に減圧になった後、常圧に戻し、再び減圧すること３回繰り返した。その後、室温にて３時間放置後、膜を取り出し、真空ポンプにて減圧乾燥した。その後、炭素膜を純水にて繰り返し洗浄したものを減圧デシケーター中にて、乾燥し、ＰＱＱ−ＧＤＨ活性測定に供した。【０１６９】
実施例５と同様に測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定にて、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．０２５Ｕの酵素活性が認められた。【０１７０】
比較例として、グルタルアルデヒド水溶液とＰＥＩ溶液を加えず、代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．２ｍｌを加えた以外は、同様の処理をした。得られた炭素膜の測定および洗浄を４回繰り返し、５回目の測定では、固定化多孔質炭素膜１ｍｇにつき０．００１Ｕ以下の酵素活性であり、酵素が固定化されているとは言えない結果であった。【０１７１】
＜センサーの実験例１＞
本発明により酵素を固定化した多孔質炭素膜を、直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極の電極面に測定対照の多孔質炭素膜を物理的に密着させたものを作用電極として、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極にＰｔメッシュ電極を用いた三電極系の電気化学セルを構成して、電気化学測定を行った。【０１７２】
電解液は、固定化酵素がＧｏｘの場合は、１０ｍｌの０．２ＭＫＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。測定前に窒素ガスを２０分間パージして、酸素を置換した。また、メディエーターとして１ｍＭのハイドロキノンを加えた。固定化酵素がＧＤＨの場合は、１０ｍｌの２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０．０２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。メディエーターとして０．１ｍＭのフェロセンカルボン酸を加えた。【０１７３】
規定濃度のグルコースを含む電解液を電気化学セルに加え、マグネチックスターラーにて１５分間攪拌した後、＋０．３Ｖの電圧を印加し、２分後の電流値を測定した。測定中、電解セルは窒素雰囲気下とした。【０１７４】
電気化学測定結果を表９に示す。【０１７５】
＜センサーの比較例：比較電極１、２＞
本発明の多孔質炭素膜電極と比較するために、平滑なグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ社製  直径3ｍｍ）上にグルタルアルデヒドにて酵素を架橋固定化した電極を作製した。【０１７６】
実験法は、Humana Press “Immobilization of
Enzymes and Cells”(1997)、p83”Immobilization of Enzymes on Microelectrodes Using
Chemical Crosslinking”に従って、下記のように行った。【０１７７】
酵素５０ｍｇを１ｍｌの塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液（５．３ｍＭリン酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム  ｐＨ７．２、以下ＰＢＳ緩衝液）に溶解して酵素溶液とし、別途８０ｍｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１ｍｌのＰＢＳ緩衝液に溶解したものを調製してＢＳＡ溶液とした。【０１７８】
調製した酵素溶液５０μｌと、ＢＳＡ溶液２５０μｌを混合したものに攪拌下、２．５％グルタルアルデヒド水溶液１００μｌを加えた。その後、直ちにマイクロピペットにて、２０μｌを分取し、グラッシーカーボン電極の電極面に塗布し、室温にて３ｈ放置し、薄膜を形成させた。その後、測定液に３０分浸漬した後、測定に用いた。【０１７９】
酵素としてＧｏｘを用いたものを比較電極１、酵素としてＧＤＨを用いたものを比較電極２とした。電気化学測定の結果を表９に示す。【０１８０】
【表９】
0005251130.tif 000011
【０１８１】
また、図８に、ＧＤＨ固定電極について、低グルコース濃度領域をグラフに示す。これらの結果から、本発明のセンサーによれば、電流の出力が大きく、また低濃度のグルコースのセンシングにも適している。【０１８２】
さらに、バイオ燃料電池に適応可能であることも明らかである。【０１８３】
＜参考例３＞
オスミウム錯体ポリマーの合成
（ｉ）Os-ビピリジル型錯体の合成
文献法(Inorg.Synth.,24,291-299(1986))に従い、次のスキームに従って合成した。【０１８４】
【化２】
0005251130.tif 000012
（ｉ）Ｏｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌ２の合成
２０ｍｌ丸底フラスコに、カリウムヘキサクロロオスメート（ＩＶ）０．２２５ｇ（０．４６ｍｍｏｌ）と２，２’−ビ−４−ピコリン０．１８ｇ（１．０ｍｍｏｌ）（ＴＣＩ製）を加え、ＤＭＦ４ｍｌに溶解させ、オイルバス中にて、１ｈｒ還流させた。反応後、１時間室温で放冷した後、ろ過した。ろ液にエタノール２ｍｌを加え、激しく攪拌したジエチルエーテル５０ｍｌ中に加え、生成した沈殿をろ取し、乾燥し黒色粉末である［Ｏｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌ２］Ｃｌ  ０．１８７ｇを得た。【０１８５】
分析値：２水和物の計算値は、Ｃ，４１．１２；Ｈ，４．０３  ；Ｎ，７．９９  であり、元素分析の結果は、Ｃ，３９．１；Ｈ，４．１９  ；Ｎ，８．９５であった。【０１８６】
次いで、５０ｍｌビーカー中、［Ｏｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌ２］Ｃｌ  ０．１８ｇをＤＭＦ３．６ｍｌとＭｅＯＨ１．８ｍｌに溶解させた。得られた黒色溶液にジチオン酸ナトリウム水溶液（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４  ０．３６ｇ／水３６ｍｌ）を約１時間で断続的に加えた。反応液は、やや、粘性が認められ、黒色から、黒紫色に変化した。その後、１時間氷浴中で攪拌を続け、生じた沈殿をろ取した。沈殿を水２ｍｌ、ＭｅＯＨ２ｍｌ、ジエチルエーテル２ｍｌで、洗浄後、減圧乾燥し、黒色の目的物であるＯｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌ２  １０４ｍｇを得た。【０１８７】
分析値：２水和物の計算値は、Ｃ，４３．３１；Ｈ，４．２４  ；Ｎ，８．４２  であり、元素分析の結果は、Ｃ，４１．７１；Ｈ，３．６８  ；Ｎ，８．４２であった。【０１８８】
（ｉｉ）ポリ（１−ビニルイミダゾール）の合成
二ツ口１００ｍｌマイヤーにＡＩＢＮ０．５ｇを加え、系中をアルゴンで置換した。セプタムを通してビニルイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ製）６ｍｌを加えた。スターラーで攪拌しながら油浴中にて加熱した。バス温７０℃で、一気に重合が進み、液状のモノマーが黄色の水飴状となった。その後、バス温７０℃にて２時間保った後、室温まで冷却した。固形物をＭｅＯＨ５０ｍｌに溶解し、激しく攪拌したアセトン５００ｍｌ中に加え、生成したうす黄色沈殿をろ取し、乾燥し、目的物であるＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）  ２．２５ｇを得た。【０１８９】
（ｉｉｉ）オスミウム錯体ポリマー：Ｐｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｏｓ−（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌの合成
１００ｍｌ丸底フラスコにポリ（１−ビニルイミダゾール）９４ｍｇ、エタノール３０ｍｌを加え、０．５時間還流し溶解させた。そこに、Ｏｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｐｙ）２Ｃｌ２  ６３ｍｇを１０ｍｌのエタノールに溶解させた溶液を一度に加え、その後、６０時間還流した。反応終了後、溶媒を留去し、残渣を約１５ｍｌのメタノールに溶解して、激しく攪拌したジエチルエーテル１５０ｍｌ中に加え、生成した沈殿をろ取し、乾燥し、黒色粉末の目的物のオスミウム錯体ポリマーＰＶＩ−ｄｍｅＯｓ  １０５ｍｇを得た。【０１９０】
分析値：ＰＶＩ−ｄｍｅＯｓ・７Ｈ２Ｏの計算値は、Ｃ，５４．８６；Ｈ，５．９５  ；Ｎ，２１．９７であり、元素分析の結果は、Ｃ，５３．７６；Ｈ，５．８９  ；Ｎ，１８．５４であった。【０１９１】
＜実施例８＞
（オスミウム錯体ポリマーとグルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）の交互積層法による多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液として、参考例３で合成したオスミウム錯体ポリマーを、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解させて調製した。【０１９２】
ポリアニオン溶液として、グルコースオキシダーゼ（アマノエンザイム製２２０ｕ／ｍｇ）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）にて、１ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解させて調製した。【０１９３】
実施例１の酸化処理によって得られた多孔質炭素膜を約２ｃｍ角に切り出して次の操作を行った。【０１９４】
（１）．キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。膜上に水分が無くなったのを確認し、ポリスチレン製６穴プレートのウェル中、ポリカチオン溶液に浸漬、デシケーター中にて、減圧、放圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換した。その後、プレートごと、１５００ｇ  ×１０ｍｉｎ遠心し、プレートシェーカー上にて穏やかに振とうしながら１０分放置する。【０１９５】
（２）．その後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。膜上に水分が無くなったのを確認し、６穴プレート中、純水に浸漬し、デシケーター中にて、減圧、法圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換する。その後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。【０１９６】
（３）．膜上に水分が無くなったのを確認し、６穴プレートのｗｅｌｌ中、ポリアニオン溶液に浸漬し、デシケーター中にて、減圧、放圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換する。その後、プレートごと、１５００ｇ  ×１０ｍｉｎ遠心し、プレートシェーカー上にて穏やかに振とうしながら１０分放置する。【０１９７】
上記１〜３の操作にて、１層の交互積層膜が形成されるので、この操作を繰り返した回数を、積層回数とする。例えば、５回繰り返せば、５層積層膜となる。【０１９８】
この後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄した。膜上に水分が無くなったのを確認した後、減圧デシケーター中にて乾燥し、−２０℃にて保管した。【０１９９】
＜実施例９＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の交互積層法による多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、以下の組成のものを用いた以外は、実施例８と同じ操作を行った。【０２００】
ポリカチオン溶液として、オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（アマノエンザイム製４８００ｕ／ｍｇ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にて、各々１ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解させて調製した溶液を用いた。【０２０１】
ポリアニオン溶液として、ポリアクリル酸（平均分子量２５，０００）を純水に溶解し、１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨにてｐＨ６に調整後、終濃度１ｍｇ／ｍｌに純水にてメスアップした溶液を用いた。【０２０２】
（透気度の測定）
また、実施例９で得られた酵素固定化炭素膜の透気度を、参考例２と同様に測定した結果、３７０秒／１００ｍｌであり、交互積層法による酵素固定化後でも膜の細孔の連通が十分に存在していることが判った。【０２０３】
＜実施例１０＞
（フェリシアン化カリウムとビリルビンオキシターゼの交互積層法による多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、以下の組成のものを用いた以外は、実施例８と同じ操作を行った。【０２０４】
ポリカチオン溶液として、ポリアリルアミン（日東紡製ＰＡＡ−１５  平均分子量１５，０００）を純水に溶解し、１ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌにてｐＨ７に調整後、終濃度１ｍｇ／ｍｌに純水にてメスアップした溶液を用いた。【０２０５】
ポリアニオン溶液として、ビリルビンオキシダーゼ（以下、ＢＯと略称、アマノエンザイム製  ２．４３ｕ／ｍｇ）とＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］  各々１ｍｇ／ｍｌの濃度にて１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を用いた。【０２０６】
（透気度の測定）
また、実施例１０で得られた酵素固定化炭素膜の透気度を、参考例２と同様に測定した結果、２１３秒／１００ｍｌであり、交互積層法による酵素固定化後でも膜の細孔の連通が十分に存在していることが判った。【０２０７】
＜実施例１１＞
（金属ナノ粒子担持タンパク質（フェリチン）の交互積層法による多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、以下の組成のものを用いた以外は、実施例８と同じ操作を行った。【０２０８】
ポリカチオン溶液として、ポリアリルアミン（日東紡製ＰＡＡ−１５  平均分子量１５，０００）を純水に溶解し、１ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌにてｐＨ７に調整後、終濃度１ｍｇ／ｍｌに純水にてメスアップした溶液を用いた。【０２０９】
ポリアニオン溶液として、市販フェリチン（ＳＩＧＭＡ製  ７６ｍｇ／ｍｌ）  ５ｍｌを半透膜に加え、外液（５ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０）  １Ｌに対して、攪拌下、４℃で一晩透析した。透析後、タンパク濃度測定（ＢＣＡ法：２６ｍｇ／ｍｌ）し、１ｍｇ／ｍｌまで、リン酸緩衝液（５ｍＭ  ｐＨ７．０）にて、希釈した溶液を用いた。【０２１０】
５層積層した膜について、実施例３と同様にＥＰＭＡ分析を行った結果を図１７に示す。鉄元素は、膜面の近傍に偏在している割合が高かった。【０２１１】
＜実施例１２＞
（フェリシアン化カリウムとビリルビンオキシターゼの交互積層法による大型多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、実施例１０の組成のものを用いて実施例１０と同じ操作を行った。但し、多孔質炭素膜として、実施例１と同様に処理した多孔質炭素膜を切り出して１８ｃｍ２の大きさで使用した。【０２１２】
＜実施例１３＞
（ポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜の調製）
実施例１の酸化処理によって得られた多孔質炭素膜を約２ｃｍ角に切り出し、０．２重量％ポリエチレンイミン（以下ＰＥＩと略称、アルドリッチ社製平均分子量１０，０００）のエタノール溶液に浸漬し、減圧、放圧を数回繰り返した後、４０℃にて１時間緩やかに振とうした。蒸留水にて、膜を洗浄し、桐山ロート上にて、吸引乾燥させた後、デシケーター中で、減圧乾燥させて、ポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜を得た。このような処理によっても、表面にポリエチレンイミンが導入された多孔質炭素膜が得られる。【０２１３】
＜実施例１４＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)の交互積層法によるポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜上への固定化（ポリアクリル酸分子量２５，０００））
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、実施例９の組成のものを用いた。ポリアクリル酸の分子量は２５，０００である。【０２１４】
実施例１３によって得られたポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜を約２ｃｍ角に切り出し次の操作を行った。【０２１５】
（１）．キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。膜上に水分が無くなったのを確認し、ポリスチレン製６穴プレートのウェル中、ポリアニオン溶液に浸漬し、デシケーター中にて、減圧、放圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換した。その後、プレートごと、１５００ｇ  ×１０ｍｉｎ遠心し、プレートシェーカー上にて穏やかに浸透しながら１０分放置する。【０２１６】
（２）．その後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。膜上に水分が無くなったのを確認し、ガラスシャーレ（直径４ｃｍ）中、純水に浸漬し、デシケーター中にて、減圧、法圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換した。その後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。【０２１７】
（３）．膜上に水分が無くなったのを確認し、６穴プレートのｗｅｌｌ中、ポリカチオン溶液に浸漬し、デシケーター中にて、減圧、放圧を繰り返して、膜中の空気と固定化液を置換した。その後、プレートごと、１５００ｇ  ×１０ｍｉｎ遠心し、プレートシェーカー上にて穏やかに浸透しながら１０分放置する。【０２１８】
上記１〜３の操作にて、１層の交互積層膜が形成されるので、この操作を繰り返した回数を、積層回数とする。例えば、５回繰り返せば、５層積層膜となる。【０２１９】
この後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄した。膜上に水分が無くなったのを確認した後、減圧デシケーター中にて乾燥し、−２０℃にて保管した。【０２２０】
＜実施例１５＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の交互積層法によるポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜上への固定化（ポリアクリル酸分子量５，０００））
ポリアニオン溶液として、ポリアクリル酸（平均分子量５，０００）を純水に溶解し、１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨにてｐＨ６に調整後、終濃度１ｍｇ／ｍｌに純水にてメスアップした溶液を使用した以外は、実施例１４と同じ操作を行った。【０２２１】
＜実施例１６＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)の交互積層法によるポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜上への固定化（ポリアクリル酸分子量２５０，０００））
ポリアニオン溶液として、ポリアクリル酸（平均分子量２５０，０００）を純水に溶解し、１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨにてｐＨ６に調整後、終濃度１ｍｇ／ｍｌに純水にてメスアップした溶液を使用した以外は、実施例１４と同じ操作を行った。【０２２２】
＜実施例１７＞
（金属ナノ粒子担持タンパク質（フェリチン）の交互積層法によるポリエチレンイミンコート多孔質炭素膜上への固定化）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、実施例１１記載の組成のものを用いた以外は、実施例１４と同じ操作を行った。５層積層した膜について、実施例３と同様にＥＰＭＡ分析を行った結果を図１８に示す。実施例１１の結果（図１７）と比べて、鉄元素の分布が改善され、膜面の膜全体にフェリチンが固定されていた。水溶液と比べ、粘性の低い有機溶媒のポリカチオン溶液にて最初に処理した効果が現れていると推定される。また、断面のＳＥＭ画像を図１９に示す。炭素膜の細孔の表面に固定化膜が形成され、その中にフェリチンの粒子が観察される。【０２２３】
＜実施例１８＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の交互積層法による多孔質炭素膜上への固定化；減圧、遠心操作を省略）
ポリカチオン溶液、ポリアニオン溶液として、実施例９記載の組成のものを用いた。【０２２４】
実施例１の酸化処理によって得られた多孔質炭素膜を約２ｃｍ角に切り出し、次の操作を行った。【０２２５】
（１）．ポリスチレン製６穴プレートのウェル中、ポリカチオン溶液に浸漬、プレートシェーカー上にて穏やかに振とうしながら１０分放置する。【０２２６】
（２）．その後、膜を取り出して、純水にて洗浄し、膜に付着した水分をろ紙に接触させることで、除去する。【０２２７】
（３）．６穴プレートのｗｅｌｌ中、ポリアニオン溶液に浸漬、プレートシェーカー上にて穏やかに振とうしながら１０分放置する。【０２２８】
上記１〜３の操作にて、１層の交互積層膜が形成されるので、この操作を繰り返した回数を、積層回数とする。例えば、５回繰り返せば、５層積層膜となる。【０２２９】
この後、膜を取り出して、キリヤマ漏斗上にて、吸引ろ過を行いながら、純水にて洗浄する。膜上に水分が無くなったのを確認した後、減圧デシケーター中にて乾燥し、−２０℃にて保管した。【０２３０】
＜比較例１＞
（オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の交互積層法によるカーボンペーパー上への固定化）
多孔質炭素膜の代わりにカーボンペーパー（東レ製：ＴＧＰ−Ｈ−０３０）を用いて、実施例１の酸化処理を行うことで、硝酸処理済みカーボンペーパーを得た。この硝酸処理済みカーボンペーパーを、多孔質炭素膜の代わりに用いた以外は実施例９と同じ操作を行って、カーボンペーパー上に酵素とメディエーターを固定化した。【０２３１】
＜参考例４＞
（多孔質炭素膜へのオスミウム錯体ポリマーとグルコース脱水祖酵素(ＧＤＨ)の三次元固定化）
５ｍｇ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼ溶液９．６μｌ、参考例３で合成した５ｍｇ／ｍｌオスミウム錯体ポリマー溶液２．９μｌ、および１ｍｇ／ｍｌポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（アルドリッチ製平均分子量５２８：以下、ＰＥＧＤＧＥと略称）溶液２．９μｌを、参考例２と同様に製造した多孔質炭素膜（直径３ｍｍ）上に塗布し、風乾後、減圧デシケーター中にて１６時間乾燥して酵素固定化膜を得た後、これを−２０℃にて保管した。【０２３２】
＜参考例５＞
（多孔質炭素膜へのフェリシアン化カリウムとビリルビンオキシダーゼ（ＢＯ）の三次元固定化）
５ｍｇ／ｍｌのビリルビンオキシダーゼ溶液１５μｌ、５ｍｇ／ｍｌのフェリシアン化カリウム溶液６μｌ、５．０ｍｇ／ｍｌのポリアリルアミン溶液６μｌ、および１ｍｇ／ｍｌポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（アルドリッチ製平均分子量５２８）溶液６．０μｌを、参考例と同様に製造した多孔質炭素膜（直径３ｍｍ）上に塗布し、風乾後、減圧デシケーター中にて１６時間乾燥して酵素固定化膜を得た後、これを−２０℃にて保管した。【０２３３】
＜センサーの実験例２＞
電気化学分析装置として、ＢＡＳ製ｍｏｄｅｌ−６００Ａ、グラッシーカーボン電極（ＢＡＳ製  ＩＤ３ｍｍ）電極面に測定対象の多孔質炭素膜を物理的に接触させたものを作用電極とし、参照電極として銀／塩化銀電極（ＢＡＳ製  ＲＥ−１Ｂ）、対極に白金メッシュ（ＢＡＳ製）を用いてセルを構成し、窒素雰囲気、２５℃にて測定を行った。【０２３４】
電解液は、固定化酵素がＧｏｘの場合は、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。ＧＤＨの場合は、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。【０２３５】
規定濃度のグルコースを含む電解液を電気化学セルに加え、マグネチックスターラーにて１５分間攪拌後、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定と、クロノアンペロメトリー測定を行った。ＣＶ測定は、電位走査速度１ｍＶ／ｓにて測定を行った。クロノアンペロメトリー測定は、０Ｖから、＋０．２Ｖの電圧を印加し、５分後の電流値を測定した。【０２３６】
（積層数依存性の測定）
実施例９において、交互積層法により積層数を変えたＧＤＨ固定化膜を有する電極を用意し、１００ｍＭ濃度のグルコース溶液に浸漬して、上記の測定方法により電流値を測定した。その結果、図１０に示すように、積層回数に応じてレスポンスが増大するのが観察された。この結果から、交互積層法により、利用可能な形態の酵素および金属錯体の量が増加していることが示された。【０２３７】
（多孔質炭素膜とカーボンペーパーの比較）
実施例９で５層積層したＧＤＨ固定化多孔質炭素膜と、比較例１で５層積層したＧＤＨ固定化カーボンペーパーを、それぞれ電極としてグルコース濃度依存性を調べた結果を図１１に示す。この結果により、多孔質炭素膜を使用した本発明の方が、レスポンスが良好であることが示された。【０２３８】
（処理、操作の比較）
実施例９、実施例１４および実施例１８において、積層数を５としてＧＤＨ固定化膜を作製し電極を形成し、１００ｍＭ濃度のグルコース溶液中に浸漬してクロノアンペロメトリー測定結果から評価した。【０２３９】
【表１０】
0005251130.tif 000013
実施例１４では、交互積層法により酵素を固定化する際に、多孔質炭素膜を酸化処理した後に、初めに有機溶媒に溶解したポリエチレンイミンで処理して、引き続き交互積層法による酵素の固定化を行った。ポリエチレンイミンコート処理がない実施例９に比べて、さらに電気化学応答の向上が見られた。また、実施例１８は、減圧および遠心処理を行わないで酵素固定化を試みた例である。これら処理を行った実施例９では、電気化学応答が向上しており、生体分子固定化の際に、単純に多孔質炭素膜を固定化対象物溶液に浸漬するだけでなく、浸漬中に系全体を減圧処理したり、遠心処理したりすることが、固定化法として有効であることが明らかになった。【０２４０】
（ポリアニオンの分子量の比較）
実施例１４、実施例１５および実施例１６において、積層数を５としてＧＤＨ固定化膜を作製し、それぞれ電極としてグルコース濃度依存性を調べた結果を図１２に示す。使用したポリアクリル酸の平均分子量は、実施例１４において２５０００、実施例１５において５０００、実施例１６において２５００００であった。いずれの実施例においても、良好なグルコース濃度レスポンスを示した。【０２４１】
＜センサーの実験例３：ＦＩＡ＞
次に、測定対象物を流通させながら測定するフローインジェクション分析（ＦＩＡ）に用いられるセンサーの構成例を説明する。【０２４２】
直径３ｍｍ、膜厚８０μｍの円形の多孔質炭素膜を使用し、実施例９に従って、オスミウム錯体ポリマーとＰＱＱ依存型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を固定化した酵素固定化多孔質炭素膜を得た。得られた炭素膜を使用し、ＢＡＳ社製ラジアルフローセルを利用して、図１３Ａおよび図１３Ｂに示す装置を作製した。このセンサー１０は、図１３Ａに示すように、測定液入り口１１、測定液出口（補助電極を兼ねる）１２、作用電極１３および参照電極１４を備えている。センサー内部には、図１３Ｂに示すように、下側支持枠１８の内側の作用電極１３上に、多孔性のカーボンペーパー１７および酵素固定化多孔質炭素膜１５が載置され、下側支持枠１８と上側支持枠１９の間にテフロンリング１６を介して挟まれている。測定液は、測定液入り口１１から注入され、テフロンリング１６で囲まれた空間を満たして酵素固定多孔質炭素膜１５の膜面に接触し、膜に浸透する。一部の測定液は、炭素膜１５の側方から滲出するが、大部分は膜厚方向に流通して多孔性のカーボンペーパー１７中に流れ、カーボンペーパーの側方から流出し、これが集められて測定液出口１２から流出する。多孔性カーボンペーパーとしては、酵素固定化多孔質炭素膜１５より空孔率が高いものを使用する。また、カーボンペーパーが導電性であるために、酵素固定多孔質炭素膜１５が作用電極１３と電気的に接続されて、作用電極の機能部として働く。【０２４３】
このような装置を用いて、前述の＜センサーの実験例２＞の電解液を移動相とし、１０μｌ／ｍｉｎの流速にて、送液した。規定濃度のグルコースを移動相に溶解した試料を１０μｌインジェクションし、注入と同時にクロノアンペロメトリー測定を開始した。グルコースと反応して生じるピーク電流値をグルコース濃度に対して、プロットした結果を図１４に示す。この結果から、グルコース濃度とピーク電流値に高い相関性が認められた。本発明の生体分子固定化炭素膜は、メディエーターの固定化も可能でかつ透気性および通液性があるために、フロー型センサーにも好適である。【０２４４】
＜バイオ燃料電池の実験例１＞
グラッシーカーボン電極（ＢＡＳ製  ＩＤ３ｍｍ）電極面に、実施例、参考例で作製した生体分子固定化炭素膜を物理的に接触させたものを電極とし、酸素雰囲気下、２５℃にて測定を行った。電解液は、１０ｍｌの０．１Ｍグルコース、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。両極間の負荷を２Ｍ〜１００Ω間で、負荷を変えながら電流、電圧を測定した。その結果を、表１１に示す。【０２４５】
【表１１】
0005251130.tif 000014
ここで、アノードおよびカソードの構成は次のとおりである。【０２４６】
電極構成１
アノード：実施例９において、５層積層した酵素固定化多孔質炭素膜（ＧＤＨおよびオスミウム錯体ポリマー固定）
カソード：実施例１０において、５層積層した酵素固定化多孔質炭素膜（ＢＯおよびフェリシアン化カリウム固定）
電極構成２
アノード：参考例４の３次元固定化による炭素膜（ＧＤＨおよびオスミウム錯体ポリマー固定）
カソード：参考例５の３次元固定化による炭素膜（ＢＯおよびフェリシアン化カリウム固定）
どちらの電極構成でも、出力が得られたが、交互積層法で積層した場合により高い最大出力が得られた。【０２４７】
＜バイオ燃料電池の実験例２：チップ型バイオ燃料電池＞
図１５Ａ〜図１５Ｃに、チップ型バイオ燃料電池の１例を示す。シリコーンゴム（ポリジメチルシロキサン）製の板２１に、大きさ６ｍｍ×１２ｍｍのセル用貫通孔２２と、隣接する貫通孔２２同士をつなぐ流路２３を設けた。図１５Ａのように、白金膜の電極２７を形成した下側ガラス基板２５を用意し、この上に、中央の４個のセル用電極にセル用貫通孔２２が合うように、加工したシリコーンゴムを接着した。セル用貫通孔２２の中に、多孔質炭素膜、メンブランフィルター、多孔質炭素膜をこの順で重ね合わせて載置した。白金膜の電極２８を形成した上側ガラス基板２６を用意し、シリコーンゴム２１の貫通孔２２に、４個のセル用電極の位置を合わせて、シリコーンゴム２１を上下からガラス基板２５、２６で挟み込んだ。【０２４８】
図１５Ｂは、このチップ型バイオ燃料電池の断面図である。上下からガラス基板で挟まれることで、４個のセル２２ａが流路２３で連結された構造となった。また、流路２３の両末端に、グルコース注入口２４ａ、グルコース流出口２４ｂを取り付けた。また、下側ガラス基板２５上の電極２７の末端部は、組み立て後に露出するように構成した。【０２４９】
図１５Ｃは、セルの構成を示す図であり、メンブランフィルター３３を、カソード用多孔質炭素膜３１とアノード用多孔質炭素膜３２で挟んだ構造となっている。この単セルの構造を、隣接するセル間で、上下逆になるようにして貫通孔２２に載置することで、４個の単セルが直列に接続された電池が構成される。【０２５０】
ここで、カソード用多孔質炭素膜として実施例１０、アノード用多孔質炭素膜としては実施例９に従ってそれぞれ作製した５ｍｍ×１０ｍｍ×０．１ｍｍの酵素固定化多孔質炭素膜を使用した。【０２５１】
あらかじめ酸素をバブリングした０．１Ｍグルコース、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を流路中に導入し、２Ｍ〜１００Ω間で、負荷を変えながら電流、電圧を測定した。その結果、燃料電池は開放時電圧０．７５Ｖ、最大出力４８μＷの出力を示した。【０２５２】
＜バイオ燃料電池の実験例３：高分子電解質膜型バイオ燃料電池＞
高分子電解質膜型燃料電池セルとしては、エレクトロケム社製サーペンタインフロー（Ｃ０５−０１ＳＰ−ＲＥＦ：電極面積５ｃｍ２）を用い、アノードには、実施例８、実施例９にて調製した面積５ｃｍ２の多孔質炭素膜を使用し、カソードには、エレクトロケム社製（１ｍｇ／ｃｍ２  Ｐｔ（２０ｗｔ％Ｐｔ／ＸＣ−７２）電極、高分子電解質膜には、酸処理済みのナフィオン１１２を用いた。電池の作製は、酸処理後ナフィオン膜とカソードを熱プレス（１３０℃、１分）した後、酵素固定化炭素膜を室温にて２分間プレスにより行った。電池構成は、図１６に概略を示すように、プロトン伝導体（ナフィオン１１２）４３を正極４１および負極４２ではさみ、それぞれ外側に集電体４４を設けた構造である。【０２５３】
電解液（燃料溶液）４５は、固定化酵素がＧｏｘの場合は、０．１Ｍグルコース、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。ＧＤＨの場合は、０．１Ｍグルコース、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。両極間の負荷を２Ｍ〜１００Ω間で、負荷を変えながら電流、電圧を測定した。発電時は、純酸素２０ｍｌ／ｍｉｎをカソード極に供給し、アノード極には、１ｍｌ／ｍｉｎにて電解液を供給した。その結果を表１２に示す。【０２５４】
【表１２】
0005251130.tif 000015
尚、以上の実施例で示したセンサーおよびバイオ燃料電池の装置の例は、本発明の生体分子固定化炭素膜がセンサーおよびバイオ燃料電池に適用できることを示すために示した１例であり、適切に電極が配置されれば種々の構造の装置が可能であることは、当業者に明らかである。
【図３】
0005251130.tif 000016
【図７】
0005251130.tif 000017
【図８】
0005251130.tif 000018
【図１０】
0005251130.tif 000019
【図１１】
0005251130.tif 000020
【図１２】
0005251130.tif 000021
【図１３Ａ】
0005251130.tif 000022
【図１３Ｂ】
0005251130.tif 000023
【図１４】
0005251130.tif 000024
【図１５Ａ】
0005251130.tif 000025
【図１５Ｂ】
0005251130.tif 000026
【図１５Ｃ】
0005251130.tif 000027
【図１６】
0005251130.tif 000028
【図１】
0005251130.tif 000029
【図２】
0005251130.tif 000030
【図４】
0005251130.tif 000031
【図５】
0005251130.tif 000032
【図６】
0005251130.tif 000033
【図９】
0005251130.tif 000034
【図１７】
0005251130.tif 000035
【図１８】
0005251130.tif 000036
【図１９】
0005251130.tif 000037