(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水及び/又は土壌に対して、該地下水及び/又は土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む判定方法。
（Ａ）揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水、又は地下水と土壌を採取する工程、
（Ｂ）採取した地下水を嫌気性条件下で培養するか、又は採取した土壌と地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で用いる地下水と同じ地下水を工程（Ｂ）の培養物に供給して、供給した地下水と同量の培養物を回収する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）で回収した培養物を分析して、地下水及び/又は土壌中の嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を分解しているか否かを判断する工程。
【請求項２】
工程（Ｂ）〜（Ｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
工程（Ｂ）において、採取した地下水の現場温度の±５℃の温度条件下で、地下水、又は土壌と地下水を培養することをさらに含む、請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
工程（Ｂ）において、地下水、又は土壌と地下水に、揮発性有機塩素化合物、有機資材及び栄養塩の少なくとも１つを添加して、地下水、又は土壌と地下水を培養することをさらに含み、該有機資材は廃蜜糖又はポリ乳酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項５】
嫌気性微生物がデハロコッコイデス属細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水及び/又は土壌に対して、該地下水及び/又は土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法であって、以下の工程（Ｅ）〜（Ｉ）を含む判定方法。
（Ｅ）揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水、又は地下水と土壌を採取する工程、
（Ｆ）採取した土壌と地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｇ）工程（Ｆ）とは別に、採取した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｈ）工程（Ｆ）の培養物を工程（Ｇ）の培養物に供給して、供給した培養物と同量の工程（Ｇ）の培養物を回収する工程、及び
（Ｉ）工程（Ｈ）で回収した培養物を分析して、地下水及び/又は土壌中の嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を分解しているか否かを判断する工程。
【請求項７】
工程（Ｆ）〜（Ｉ）を繰り返すことをさらに含む、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
採取した地下水の現場温度の±５℃の温度条件下で、工程（Ｆ）において土壌と地下水を培養し、且つ工程（Ｇ）において地下水を培養することをさらに含む、請求項６又は７に記載の判定方法。
【請求項９】
工程（Ｆ）において、土壌と地下水に、揮発性有機塩素化合物、有機資材及び栄養塩の少なくとも１つを添加して、土壌と地下水を培養し、且つ工程（Ｇ）において、地下水に、揮発性有機塩素化合物、有機資材及び栄養塩の少なくとも１つを添加して、地下水を培養することをさらに含み、該有機資材は廃蜜糖又はポリ乳酸である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項１０】
嫌気性微生物がデハロコッコイデス属細菌である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性微生物浄化法は、汚染された地盤に対し有機資材を注入し、地盤内に適切な嫌気環境を作り出すことで有用な脱塩素化微生物を活性化させ、ＶＯＣ分子中の塩素を水素に置換（脱塩素化）する浄化技術である。地盤中の酸化還元電位を人為的に調整することで、ＶＯＣの脱塩素化は以下のように進行すると考えられる。
(i)有機物供給等によって酸素、硝酸イオンが微生物により消費され、脱塩素化に必要である嫌気環境が形成される。
(ii)形成された嫌気環境により、脱塩素化に関与する微生物が活性化し、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）→トリクロロエチレン（ＴＣＥ）→ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）の脱塩素化が進行する。
(iii)還元環境が一定期間継続されると、嫌気環境下で増殖・活性化した脱塩素化微生物によりｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ→塩化ビニル（ＶＣ）→エチレン、エタンの脱塩素化が進行する。
【０００３】
また、一般的に、ＴＣＥからジクロロエチレン（ＤＣＥ）、およびｃｉｓ−１，２−ＤＣＥからＶＣ、エチレン、エタンへの脱塩素化には、図１で示す酸化還元電位の還元環境が必要である。ＶＯＣの完全脱塩素化は、有用な脱塩素化微生物が地盤中に存在しないと進行しないことが報告されている（非特許文献１）。したがって、汚染サイトに嫌気性微生物浄化法を適用するためには、事前に嫌気性微生物浄化法の浄化適合性を検証することが重要と考えられている。
【０００４】
ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥやＶＣの脱塩素化にはデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌の関与が明らかにされているため、嫌気性微生物浄化法の浄化適合性を判断する方法として、これらの有用菌や有用菌による分解遺伝子をＤＮＡ検出技術により確かめることが有効であると報告されている（非特許文献１〜３、特許文献１）。また、遺伝子解析による地下水中のデハロコッコイデス属の検出と、室内培養試験の併用より適合性を確認している事例も有る（非特許文献１、４および５）。
【０００５】
一方、実際に汚染されている土壌および地下水を用いて培養試験を行い、ＶＯＣが脱塩素化されることを確認することで有用細菌が存在することを確かめる方法も存在している（特許文献２および３）。
【０００６】
しかしながら、上記分解微生物および分解に係る遺伝子のＤＮＡ検出による判定では、ＤＮＡ検出技術において、環境中のサンプルから微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって検出する技術が一般的に用いられており、一方、汚染地盤の環境サンプルにはゲノムＤＮＡの取得やＰＣＲを阻害する物質が地盤環境中に存在している可能性もあるため、デハロコッコイデス属の細菌数が相対的に少ない場合には、正確な情報を得られないケースも有る（非特許文献６）。また、有害物質による脱塩素化の阻害影響等も報告されており（非特許文献７）、遺伝子解析によりデハロコッコイデス属が存在したという結果だけで脱塩素化が可能と判断することには浄化適合性を誤診する可能性を伴う。
【０００７】
実際の汚染サイトから得られた土壌や地下水を用いて培養試験を行いＶＯＣが脱塩素化されることを確認する浄化適合性試験方法は、有用な脱塩素化微生物の存在を汚染物質の脱塩素化を確認しながら調べることができる点で優れている。しかしながら、その浄化適合性試験方法で行われる培養試験には以下の問題点が有る。
(1)培養操作が煩雑であり、熟練を要する。
(2)汚染地盤における人為的な活性化方法を室内培養条件に忠実に再現ができないと、意図する結果を得られない。または、間違った診断をする可能性がある。
(3)培養には長期の試験期間を要する。
【０００８】
具体的な例を挙げると、これまで報告されている培養方法の場合、温度設定が実際の地盤環境と異なるため、培養後に優占種となる微生物相が実地盤で活性化した場合の微生物相と異なる恐れがある（特許文献２および３）。また、脱塩素化の対象となる地下水に硫化ナトリウムなどの還元試薬を用いて連続培養する方法（特許文献４）は、有機資材を用いて嫌気環境を形成する方法とは異なるため、上記と同様の問題が残る。
【０００９】
したがって、培養装置および方法はできるだけ実地盤における活性化方法を的確に再現できる培養方法を必要とするが、十分な検討は行われていなかった。また、有機資材を投入した後の脱塩素化の傾向として、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ以降の脱塩素化が進行するまでに２〜１２ヶ月程度の停滞期間が存在することが確認されている。そのため、培養装置には培養期間が長期化しても定期的に試料を採取して培養状況を評価する必要があるが、長期的な培養にも対処可能な培養方法も確立されていなかった。
【００１０】
従来から嫌気性微生物の培養によく用いられる回分式培養法は、浄化対象とする地盤より採取した地下水と有機資材を密閉型のバイアル瓶に入れて培養する方法であり、汚染濃度を経時的に測定して適合性を評価することができ、回分式培養法の利点としては、ブチルゴム栓により密閉できるため嫌気性微生物の培養が容易にできること、比較的小さいスケールで培養可能であり、多数の条件の比較試験等に適した培養法であることが挙げられる。
【００１１】
しかしながら、ＶＯＣの脱塩素化試験では、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ以降の脱塩素化が停滞することがあり、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ以降の脱塩素化を確認する試験では、本発明者らの検討（後述）により、以下のような問題が生じることがあることがわかった。
(4)培養本数が多く必要である。
(5)培養が予定より長期化し、培養結果が得られない場合がある。
(6)栄養源が不足した場合に栄養源が供給できない。
(7)酸化還元電位が安定しない。
【００１２】
【特許文献１】特開２００２−３４５４７３号公報
【特許文献２】特開２００６−２１４７８２号公報
【特許文献３】特開２００６−２６５５３号公報
【特許文献４】特開２００６−２６２８４２号公報
【非特許文献１】Hendrickson, E. R., et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:485-495
【非特許文献２】Miller, J. A., et al. 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:4880-4888
【非特許文献３】Krajmlnik-Brown R. et al. 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:6347-6351
【非特許文献４】Fennell D. E, et al., 2001, Environ. Sci. Technol.1830-1839
【非特許文献５】F. E. Loffler, et al. 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66:1369-1374
【非特許文献６】中島誠ほか，２００５，地下水土壌汚染とその防止対策に関する研究集会，２４２−２４７
【非特許文献７】新庄尚史ほか，２００６，地下水土壌汚染とその防止対策に関する研究集会，１６３−１６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、上記(1)〜(7)の問題に対応すべく、従来とは異なる培養法を用いて、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＶＯＣに汚染された土壌、地下水の現場環境に近い条件下で、土壌、地下水に含まれる嫌気性微生物を半連続培養法（下記の工程（Ｂ）〜（Ｃ）または工程（Ｆ）〜（Ｈ）を繰り返す培養法）で培養することにより、上記(1)〜(7)の問題を回避でき、実際の地盤環境に即した、より適切な判定が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
〔１〕揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む判定方法。
（Ａ）揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水、または地下水と土壌を採取する工程、
（Ｂ）採取した地下水を嫌気性条件下で培養するか、または採取した土壌を添加した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で用いる地下水と同じ地下水を工程（Ｂ）の培養物に供給して、供給した地下水と同量の培養物を回収する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で回収した培養物を分析して地下水および／または土壌中の嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を分解しているか否かを判断する工程。
【００１６】
〔２〕工程（Ｂ）〜（Ｄ）を繰り返すことをさらに含む、〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕工程（Ｂ）において、採取した地下水の現場温度の±５℃の温度条件下で、地下水を培養することをさらに含む、〔１〕または〔２〕に記載の判定方法。
〔４〕工程（Ｂ）において、地下水に、揮発性有機塩素化合物、有機資材および栄養塩の少なくとも１つを添加して、地下水を培養することをさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の判定方法。
【００１７】
〔５〕嫌気性微生物がデハロコッコイデス属細菌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の判定方法。
〔６〕揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法であって、以下の工程（Ｅ）〜（Ｉ）を含む判定方法。
（Ｅ）揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水と土壌を採取する工程、
（Ｆ）採取した土壌を添加した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｇ）工程（Ｆ）とは別に、採取した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｈ）工程（Ｆ）の培養物を工程（Ｇ）の 培養物に供給して、供給した培養物と同量の工程（Ｇ）の培養物を回収する工程、および
（Ｉ）工程（Ｈ）で回収した培養物を分析して、地下水および／または土壌中の嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を分解しているか否かを判断する工程。
【００１８】
〔７〕工程（Ｆ）〜（Ｉ）を繰り返すことをさらに含む、〔６〕に記載の判定方法。
〔８〕工程（Ｆ）および（Ｇ）において、採取した地下水の現場温度の±５℃の温度条件下で、地下水を培養することをさらに含む、〔６〕または〔７〕に記載の判定方法。
〔９〕工程（Ｆ）および（Ｇ）において、地下水に、揮発性有機塩素化合物、有機資材および栄養塩の少なくとも１つを添加して、地下水を培養することをさらに含む、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の判定方法。
〔１０〕嫌気性微生物がデハロコッコイデス属細菌である、〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の判定方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、揮発性有機塩素化合物に汚染された地下水および／または土壌の現場環境と近い条件下で嫌気性微生物を培養する培養方法により、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを、適切に判断できる。また、現時点で揮発性有機塩素化合物を脱塩素化することが知られているデハロコッコイデス属細菌だけでなく、未知の微生物による浄化についても判定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、揮発性有機塩素化合物(ＶＯＣ)で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＶＯＣで汚染された地下水、または地下水と土壌を採取する工程、
（Ｂ）採取した地下水を嫌気性条件下で培養するか、または採取した土壌を添加した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で用いる地下水と同じ地下水を工程（Ｂ）の培養物に供給して、供給した地下水と同量の培養物を回収する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で回収した培養物を分析して、地下水および／または土壌中の嫌気性微生物がＶＯＣを分解しているか否かを判断する工程
を含む。
【００２１】
ＶＯＣは、例えば、塩素を持つテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、また、それらの分解生成物であるｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）などである。
【００２２】
地下水および／または土壌に存在し、ＶＯＣを分解する嫌気性微生物として、デハロコッコイデス属細菌が挙げられるが、これに限定されず、同定されていない未知の微生物でもよい。
【００２３】
工程（Ａ）において、ＶＯＣで汚染された地下水、または地下水と土壌を採取する。このとき、採取した地下水の現場温度を測定しておくことが好ましい。採取した地下水は、工程（Ｂ）で培地として培養に用いる。また地下水と土壌を採取した場合は、地下水に土壌を添加し、培養に用いる。
【００２４】
以下、工程（Ｂ）と（Ｃ）について、これらの工程で好ましく用いられる培養装置１（図２）を参照しながら説明するが、培養装置はこれに限定されない。
【００２５】
図２において、滅菌した地下水培養瓶１（ねじ口ガラス瓶など、容量は好ましくは０．５〜１０Ｌ、より好ましくは２Ｌ以上）に、工程（Ａ）で採取した地下水を入れる。嫌気条件下で培養するため、地下水は、地下水培養瓶１がいっぱいになるように入れることが好ましい。攪拌培養するときは回転子１０を入れる。また、有機資材（例えば廃蜜糖、ポリ乳酸など、濃度は好ましくは０．０２重量％〜０．１重量％）、栄養塩（例えばＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、硝酸塩、アンモニウム塩、酵母エキスなど、濃度は好ましくは有機物の炭素量（Ｃ）に対してＰ量が５％以下）、ＶＯＣなどを添加してもよい。工程（Ａ）で土壌も採取した場合は、土壌を地下水培養瓶１にさらに入れる。土壌量は、地下水の５〜２０重量％が好ましい。また、地下水培養瓶１に担体を入れてもよく、担体として、例えば珪砂、ガラスビーズ、高分子材料等が挙げられ、特に限定されない。土壌、担体の存在は、ミクロな還元環境の形成に役立ち、培養期間の短縮に寄与すると考えられる。
【００２６】
地下水培養瓶１を、ステンレスチューブ２と３を挿入した密栓可能な蓋で閉じる。この蓋は、ブチルゴム栓４にステンレスチューブ２と３が挿入され、プラスチックキャップ５で固定するものである。なお、蓋は、内側にテフロンコーティングを施したプラスチックキャップにステンレスチューブを固定した構造でもよい。ステンレスチューブ２の先端は、回転子の影響のない範囲で地下水培養瓶１の中央部より下部に設置する（地下水培養瓶１の底部から３ｃｍの位置が好ましい）。ステンレスチューブ３の先端は、地下水の上面に接する位置に設置する（蓋下部から、１ｃｍ程度出るように挿入することが好ましい）。ステンレスチューブ２と３に、ステンレス製のバルブ６を取り付け、培養中は両バルブを閉めておく。
【００２７】
滅菌した交換地下水貯留瓶８（ねじ口ガラス瓶など、容量は好ましくは０．５〜１０Ｌ、より好ましくは２Ｌ以上）に、地下水（地下水培養瓶１に入っているものと同じ地下水、または地下水を濾過滅菌処理したもの）を入れる。この地下水が、工程（Ｃ）で供給する地下水となる。地下水に、上記有機資材、栄養塩、ＶＯＣなどをさらに添加してもよい。
【００２８】
交換地下水貯留瓶８は、地下水培養瓶１と同様にしてブチルゴム栓とプラスチックキャップで密栓する。ブチルゴム栓には、ステンレスチューブ２とステンレスチューブ１３が挿入されている。ステンレスチューブ１３で、交換地下水貯留瓶８と窒素ガスで充填されたテフロンフィルムパック７とを連結し、ステンレスチューブ１３にバルブ６を取り付ける。交換地下水貯留瓶８の気相部を、テフロンフィルムパック７からステンレスチューブ１３を通って送られる（窒素ガスライン）窒素ガスで置換しておく。またステンレスチューブ２に、液送ポンプ１１を備える。
【００２９】
工程（Ｂ）の培養は、採取した地下水の現場温度の±５℃、より好ましくは±３℃、更に好ましくは±１℃の範囲の温度で行うことが好ましい。攪拌培養する場合は、スターラー９と回転子１０を用いて、例えば８０〜１００ｒｐｍで攪拌すればよい。
【００３０】
工程（Ｃ）において、地下水培養瓶１で培養した地下水の一部を回収する。回収した地下水は分析用の試料として用いることができる。採取するには、ステンレスチューブ２と３のバルブ６を開け、液送ポンプ１１により、交換地下水貯留瓶８の地下水をステンレスチューブ２の矢印方向に流し（交換地下水流入ライン）、地下水培養瓶１に流入する。流入した量だけ、ステンレスチューブ３の矢印方向に培養した地下水が流れて（培養液採取ライン）採取できる(サンプリング)。採取の際、培養中の地下水を空気に触れずに採取できるので、嫌気環境を壊さない。また、栄養源が不足した場合に新たな地下水（培地）を供給することにより、有機物等を再供給できる。さらに、採取した量と同量の地下水を供給することにより、地下水培養瓶１中の空へき量・圧力を一定に保つことができる。従って、空へきへのＶＯＣの揮発量も一定にすることができる。実際にブランク試験も行っており、揮発による損失は殆どないことが確認されている（データは示さず）。
【００３１】
採取の間隔および量は、特に限定されず、回分試験のように制限を受けずに、頻繁に採取することが可能である。例えば、試験開始直後は、数日おきに測定し、安定した状態（ｃｉｓ１，２−ＤＣＥ停滞期など）では、２週間に１回度程度の採取を行えばよい。採取の量は、後述の分析の項目が多ければ、その分多くすればよい。ＶＯＣの測定のみ行う場合は、例えば１〜５ｍｌの採取でよく、ＴＯＣ、イオン組成、ＯＲＰ、ＡＴＰなど多数測定する場合は、例えば１０〜２５ｍｌ（２Ｌ培養であれば１％程度）を採取すればよい。なお、汚染現場の地下水流量が速い場合などは、地下水の採取量、回数を増やしてもよい。
【００３２】
工程（Ｄ）において、工程（Ｃ）で採取した地下水を分析して、地下水および／または土壌中の嫌気性微生物が、ＶＯＣを分解しているか否かを判断する。
【００３３】
分析方法は特に限定されないが、公知の方法、測定装置を用いることができる。例えばＶＯＣの濃度の測定（ヘッドスペースＧＣ−ＭＳ法など）、全有機体炭素(ＴＯＣ)の測定、酸化還元電位(ＯＲＰ)の測定、ｐＨの測定、イオン組成の分析、ＡＴＰの測定、嫌気性微生物量の測定(ＭＰＮ法など)、嫌気性微生物の遺伝子解析（例えばデハロコッコイデス属細菌の塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋなどのデータベースで検索可能）からプローブを設計し、蛍光物質等で標識したプローブを作製して、分析試料中の細菌をハイブリダイゼーションにより検出したり、プライマーを用いて、分析試料から調製した核酸を鋳型としてＰＣＲで増幅して、細菌を検出、定量する）などを行えばよい。分析方法は複数組合わせて行ってもよい。
【００３４】
上記工程（Ｂ）〜（Ｄ）を繰り返し、経時的に分析結果を得る。
ＶＯＣが経時的に分解され、あるいはＶＯＣを分解する嫌気性微生物が増殖していれば、地下水および／または土壌中の嫌気性微生物がＶＯＣを分解していると判断し、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能であると判定する。
【００３５】
ＶＯＣが分解されず、あるいはＶＯＣを分解する嫌気性微生物が存在しない、増殖しないと判断された場合には、地下水および／または土壌にＶＯＣを分解する嫌気性微生物を移植することや、嫌気性微生物が増殖する環境の整備等の検討を行うことが好ましい。
【００３６】
培養装置１のメリットとして、以下が挙げられる。
(I)培養装置の構造が簡単である。
(II)水質分析、微生物解析に必要な量だけの培養した地下水を回収でき、培養中の地下水を空気に触れずに採取できる（嫌気環境を壊さない）。
(III)分析に必要量の培地を採取してもＯＲＰの上昇は殆どない。例えば２Ｌの培養容器から水質分析等の為に２０ｍｌ採取した場合、培養容器は約１％程度の地下水が交換採取されるが、ＯＲＰの変動は僅かであり、すぐに同等値に戻ることを確認している。
(IV)期間に左右されず、エタン、エチレンまでに至る長期培養期間を最適な条件で培養可能である。
(V)地下水交換、栄養源等の供給が容易なため、集積培養にも適している。
(VI)汚染地盤の土壌を入れた試験にも対応しやすい培養装置である。
(VII)担体を入れた培養にも対応しやすい培養装置である。
(VIII) 汚染源であるＶＯＣを再添加し、長期的な脱塩素化効果を確認する試験法としても用いることができる。
【００３７】
培養装置１のメリット(VI)の土壌を入れる培養方法は、地下水のみを用いる場合と比較して、より地盤環境に近い条件で培養を行うことにより、地盤環境で実際の起こりうる現象を忠実に再現することが可能になる特長がある。しかしながら、地下水培養瓶に直接土壌を添加すると以下の問題が生ずる恐れがある。
・培養地下水中のＶＯＣの土壌粒子への収着
・ＶＯＣ収着土粒子の不均一な混入によるＶＯＣ測定結果のバラツキ
・その他土壌粒子による分析操作の阻害（顕微鏡観察など）
そこで、本発明において、以下の工程（Ｅ）〜（Ｉ）：
（Ｅ）ＶＯＣで汚染された地下水と土壌を採取する工程、
（Ｆ）採取した土壌を添加した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｇ）工程（Ｆ）とは別に、採取した地下水を嫌気性条件下で培養する工程、
（Ｈ）工程（Ｆ）の培養物を工程（Ｇ）の 培養物に供給して、供給した培養物と同量の工程（Ｇ）の培養物を回収する工程、および
（Ｉ）工程（Ｈ）で回収した培養物を分析して、地下水および／または土壌中の嫌気性微生物がＶＯＣを分解しているか否かを判断する工程
を含む、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水および／または土壌に対して、該地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能かどうかを判定する方法を開発した。
【００３８】
工程（Ｅ）において、ＶＯＣで汚染された地下水と土壌を採取する。このとき、採取した地下水の現場温度を測定しておくことが好ましい。採取した地下水は、工程（Ｇ）で培地として培養に用いる。また、採取した土壌を地下水に添加して、工程（Ｆ）で培養に用いる。
【００３９】
以下、工程（Ｆ）〜（Ｈ）について、これらの工程で好ましく用いられる培養装置２（図３）を参照しながら説明するが、培養装置はこれに限定されない。
【００４０】
培養装置２は、地下水培養瓶１と交換地下水貯留瓶８の間に土壌培養瓶１２を設置した装置である。土壌培養瓶１２で、工程（Ｅ）で採取した土壌を地下水に添加して培養する（工程（Ｆ））。工程（Ｇ）で培養した地下水の一部を採取し、工程（Ｆ）で培養した地下水（土壌上澄み液）を供給する（工程（Ｈ））。このようにすることにより、汚染地盤に存在する地下水だけでなく土壌に付着した微生物によるＶＯＣの脱塩素効果が確認できるため、より地盤環境に近い条件での培養試験結果が得られる。
【００４１】
図３において、滅菌した地下水培養瓶１に、工程（Ｅ）で採取した地下水を入れる。嫌気性条件下で培養するため、地下水は、地下水培養瓶１がいっぱいになるように入れることが好ましい。攪拌培養するときは、回転子１０を入れる。また、上記濃度の有機資材、栄養塩、ＶＯＣなどを添加してもよい。さらに、地下水培養瓶１に担体を入れてもよく、担体としては、例えば珪砂、ガラスビーズ、高分子材料等が挙げられ、特に限定されない。
【００４２】
地下水培養瓶１を、ステンレスチューブ２と３を挿入した密栓可能な蓋で閉じる。ステンレスチューブ２の先端は、回転子の影響のない範囲で地下水培養瓶１の中央部より下部に設置する（地下水培養瓶１の底部から３ｃｍの位置が好ましい）。ステンレスチューブ３の先端は、地下水の上面に接する位置に設置する（蓋下部から、１ｃｍ程度出るように挿入することが好ましい）。ステンレスチューブ２と３に、ステンレス製のバルブ６を取り付け、培養中は両バルブを閉めておく。
【００４３】
滅菌した土壌培養瓶１２に、ＶＯＣに汚染された地盤の土壌（地下水培養瓶１と同じ汚染サイトから採取した土壌が好ましい）と地下水を入れる。土壌量は、地下水の５〜２０重量％が好ましい。攪拌培養するときは回転子１０を入れる。また、上記濃度の有機資材（地下水培養瓶１と同じものが好ましい）、栄養塩、ＶＯＣなどを添加してもよい。嫌気条件下で培養するため、地下水は、土壌培養瓶１２がいっぱいになるように入れることが好ましい。土壌培養瓶１２を、ブチルゴム栓とプラスチックキャップで密栓し、ブチルゴム栓にはステンレスチューブ２と１４が挿入されている。
【００４４】
滅菌した交換地下水貯留瓶８に、地下水（地下水培養瓶１に入っているものと同じ地下水、または地下水を濾過滅菌処理したものが好ましく、有機資材、栄養塩、ＶＯＣなどを添加してもよい）を入れる。交換地下水貯留瓶８を、ブチルゴム栓とプラスチックキャップで密栓し、ブチルゴム栓にはバルブ６付きステンレスチューブ１４とステンレスチューブ１３が挿入されている。ステンレスチューブ１３で、窒素ガスで充填されたテフロンフィルムパック７と交換地下水貯留瓶８を連結し、ステンレスチューブ１３にバルブ６を取り付ける。交換地下水貯留瓶８の気相部を、テフロンフィルムパック７からステンレスチューブ１３を通って送られる（窒素ガスライン）窒素ガスで置換しておく。また、ステンレスチューブ１４に液送ポンプ１１を備える。土壌培養瓶１２の培養中はステンレスチューブ２と１４のバルブ６を閉じておく。
【００４５】
工程（Ｆ）および（Ｇ）の培養は、採取した地下水の現場温度の±５℃、より好ましくは±３℃、更に好ましくは±１℃の範囲の温度で行うことが好ましい。攪拌培養する場合は、スターラー９と回転子１０を用いて、例えば８０〜１００ｒｐｍで攪拌すればよい。
【００４６】
工程（Ｈ）において、地下水培養瓶１で培養した地下水の一部を採取する。採取した地下水は分析用の試料として用いることができる。採取するには、ステンレスチューブ２、３および１４のバルブ６を開け、液送ポンプ１１により、交換地下水貯留瓶８の地下水をステンレスチューブ１４の矢印方向に流して（交換地下水流入ライン）土壌培養瓶１２に流入し、土壌培養瓶１２の土壌上澄み液をステンレスチューブ２の矢印方向に流して（土壌液流入ライン）地下水培養瓶１に流入する。流入した量だけ、ステンレスチューブ３の矢印方向に培養した地下水が流れて（培養液採取ライン）採取できる（サンプリング）。なお、土壌培養瓶１２の土壌上澄み液を地下水培養瓶１へ流入するときに、撹拌をとめて沈降性の土粒子が沈んだ後に上澄み液を流入するようにする(停止の目安は５〜１０分）。また、地下水培養瓶１の培養と土壌培養瓶１２の培養は、同時期に開始してもいいが、土壌培養瓶１２を予め馴養し、土壌上澄み液を地下水培養瓶１への流入に用いてもよい。採取の間隔および量は、工程（Ｃ）と同様にすればよい。
【００４７】
工程（Ｉ）において、工程（Ｈ）で採取した地下水を分析して、汚染された地下水および／または土壌中の嫌気性微生物が、ＶＯＣを分解しているか否かを判断する。分析方法は工程（Ｄ）と同様にすればよい。
【００４８】
上記工程（Ｆ）〜（Ｉ）を繰返し、経時的に分析結果を得る。
地下水および／または土壌中の嫌気性微生物による浄化が可能であるかどうかの判定は、上述のとおりである。
【００４９】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例において、工程（Ｂ）〜（Ｃ）または工程（Ｆ）〜（Ｈ）の繰返しを半連続培養法ということがある。
【実施例】
【００５０】
［比較例１］
回分式培養法（従来培養法）の評価
１００ｍｌバイアル瓶（１５本）にＶＯＣの汚染サイトの地下水と有機資材Ａ（廃蜜糖）を適量（濃度０．０２重量％、参照文献：特開２００６−３２０８４８号公報）入れ、テフロンコーティング加工したブチルゴム栓で密閉し、２０℃で培養した。２０℃は汚染サイトの地下水の温度である。培養経過ごとにバイアル瓶を回収して分析試料とし、ＶＯＣ、ＴＯＣ、ＯＲＰを測定した。なお、ＶＯＣの測定は、ヘッドスペースＧＣ−ＭＳ法（アジレント  テクノロジー）、ＴＯＣの測定は全有機炭素計（島津製作所）、ＯＲＰの測定は酸化還元電位計（堀場製作所）で行った。
【００５１】
結果を図４〜６に示す。
回分試験では、１条件１回のサンプリングに１〜３本のバイアル瓶を回収し、分析試料とした。ＶＯＣの経時変化については（図４）、３ヶ月を経過してもｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化を確認することができなかった。またＴＯＣの経時変化については（図５）、培養初期の有機物消費量が大きく、添加量の８５％以上が培養１ヶ月で消費され、脱塩素化が進まなかった。ＯＲＰの経時変化については（図６）、数値が安定しておらず、テフロン加工したブチルゴム栓を用いても長期の培養により空気が混入するものと考えられる。回分試験では、ブチルゴム栓部に注射針を刺して採取したり、源栄養源を注入していたりする事例があるが、この場合ブチルゴム栓に穴が開くため、ＶＯＣ成分が揮発や空気の混入を誘発して、正しい試験結果が得られないと考えられる。
【００５２】
以上の結果から、回分式培養法は、培養本数が多く必要である、培養が予定より長期化し、培養結果が得られない場合がある、栄養源が不足した場合に栄養源が供給できない、酸化還元電位が安定しない、という問題点があることがわかる。
【００５３】
［実施例１］
半連続培養法による浄化適合性の評価
培養装置１を用いて、地下水培養瓶１に汚染サイト地下水と上記有機資材Ａを入れ、交換地下水貯留瓶８に汚染サイト地下水を入れ、交換地下水貯留瓶８の空気を窒素ガスで置換した。培養は、回転子とスターラーで攪拌しながら２０℃で行った。
【００５４】
サンプリングは、培養６日後に実施し、その後は２週間に１回程度の頻度で行った。交換地下水貯留瓶８の地下水をポンプで地下水培養瓶１に流入し、地下水培養瓶１中の培養した地下水を押出すようにして約１０〜２５ｍｌ採取し、分析試料とした。ＶＯＣとＯＲＰを比較例１と同様にして測定した。
【００５５】
結果を図７および８に示す。ＶＯＣ培養１００日経過頃からｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化、ＶＣの上昇が確認された（図７）。ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化が停滞したため培養が長期化したが、安定した還元状態を維持した（図８）。
【００５６】
［実施例２］
培養装置１と２の比較
〔培養装置１による培養〕
図２の地下水培養瓶１に、有機資材Ａの代わりに有機資材Ｂ（ポリ乳酸（ＨＲＣ））を適量（乳酸ナトリウムとして０．０５重量％、参照文献：２００６−３２０８４８号公報）入れた以外は、実施例１と同様にして培養し、サンプリングし、ＶＯＣを測定した。また培養３００日目に、デハロコッコイデス属細菌の定量をＭＰＮ法で行った。
【００５７】
〔培養装置２による培養〕
図３の地下水培養瓶１に、培養装置１と同じ汚染サイト地下水と有機資材Ｂを入れた。土壌培養瓶１２に、同じく汚染サイト地下水と有機資材Ｂ、さらに汚染サイト土壌を地下水に対して１０重量％入れ、混合した。培養条件は培養装置１と同様にし、２０℃で地下水培養瓶１、土壌培養瓶１２ともに攪拌下で培養した。サンプリングは、土壌培養瓶１２の土壌上澄み液（攪拌停止１０分後の培養した地下水）を用いて地下水培養瓶１へポンプで流入し、地下水培養瓶１中の培養した地下水を押出すようにして約１０〜２５ｍｌ採取し、ＶＯＣを測定した。また培養３００日目にデハロコッコイデス属細菌の定量をＭＰＮ法で行った。
【００５８】
培養装置１のＶＯＣ測定結果を図９、培養装置２のＶＯＣ測定結果を図１０に示す。有機資材Ｂを用いた場合、培養装置１の培養では、３００日以上の培養を経ても、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化は確認できなかったが（図９）、培養装置２の培養では、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥの脱塩素化が培養１００日目以降見られ、ＶＣの脱塩素化が確認された（図１０）。
【００５９】
培養装置１および２の細菌定量結果を図１１に示す。脱塩素化に関与するデハロコッコイデス属細菌の増殖が培養装置２の培養では顕著に観測された。
以上から、本発明の判定方法において、特に培養装置２が有用であることがわかる。
【００６０】
［実施例３］
ＶＯＣの供給による長期的脱塩素化能
汚染源であるＶＯＣを定期的に供給し、ＶＯＣの脱塩素化能が長期的に可能であるか、培養装置１を用いて試験した。地下水培養瓶１に、以下の（ａ）〜（ｃ）の地下水を定期的に交換地下水貯留瓶８から供給し、攪拌下、２０℃で培養し、ＶＯＣを測定した。
（ａ）ＴＣＥ添加
（ｂ）有機物添加、ＴＣＥ添加
（ｃ）有機物＋栄養塩添加、ＴＣＥ添加
（栄養塩は、有機物（Ｃ）：りん酸塩（Ｐ）：硝酸塩（Ｎ）＝１００：５：１の比とした。また、リンは、ＫＨ２ＰＯ４  ２１．９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２８．１ｇ／Ｌの濃度で作製したりん酸緩衝液を有機物の炭素量（Ｃ）に対して、Ｐ量が１％となるように配合した。有機物は乳酸ナトリウムであり、有機物量は０．０２重量％とした。参照文献：２００６−３２０８４８号公報）
【００６１】
初期５６日目までの結果では、（ｂ）と（ｃ）に大きな差は見られなかった（図１２及び図１３参照）。また、ＴＣＥの添加回数が増加するに従い（培養期間が長期化した場合）、（ｃ）の（有機物＋栄養塩）の条件の有用性が確認された（図１４〜図１６）。
【００６２】
以上から、ＴＣＥ、有機物（＋栄養塩）を繰り返し添加することが可能であり、培養条件の有用性を長期的に確認することできることがわかった。即ち、本発明に用いる培養方法は、ＶＯＣの脱塩素化微生物の集積培養法として用いることもできる。
【００６３】
［実施例４］
リンの添加による効果
リンを定期的に供給し、その効果を培養装置１を用いて試験した。地下水培養瓶１に、以下の（ｄ）、（ｅ）の地下水を交換地下水貯留瓶８から定期的に供給し、攪拌下、２０℃で培養し、ＶＯＣを測定した。
（ｄ）乳酸ナトリウム添加
（ｅ）乳酸ナトリウム添加、リン添加
（リンは、ＫＨ２ＰＯ４  ２１．９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２８．１ｇ／Ｌの濃度で作製したりん酸緩衝液を有機物の炭素量（Ｃ）に対して、Ｐ量が１％となるように配合した。乳酸ナトリウム添加量は０．０２重量％とした。参照文献：特開２００６−３２０８４８号公報）
【００６４】
結果を図１７、図１８に示す。リンの添加量が多くても、脱塩素化を阻害することはないが、環境保全上なるべく低濃度の添加が望ましく、効果の得られる添加量として１ｍｇ／Ｌ程度とすることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の判定方法は、有機物に汚染された地下水および／または土壌の浄化技術に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】脱塩素化に適した酸化還元電位を示す。
【図２】本発明に用いる培養装置１の概略を示す。
【図３】本発明に用いる培養装置２の概略を示す。
【図４】回分式培養法によるＶＯＣの経時変化を示す。
【図５】回分式培養法によるＴＯＣの経時変化を示す。
【図６】回分式培養法によるＯＲＰの経時変化を示す。
【図７】半連続培養法によるＶＯＣの経時変化を示す。
【図８】半連続培養法によるＯＲＰの経時変化を示す。
【図９】半連続培養法（培養装置１）によるＶＯＣの経時変化を示す。
【図１０】半連続培養法（培養装置２）によるＶＯＣの経時変化を示す。
【図１１】デハロコッコイデス属細菌の定量結果を示す。
【図１２】交換地下水貯留瓶の地下水にＶＯＣと有機物を添加した場合の水培養後５６日目までのＶＯＣの変化を示す。
【図１３】交換地下水貯留瓶の地下水にＶＯＣ、栄養塩及び有機物を添加した場合の培養後５６日目までのＶＯＣの変化を示す。
【図１４】交換地下水貯留瓶の地下水にＶＯＣを添加（有機物無添加）した場合のＶＯＣの経時変化を示す。
【図１５】交換地下水貯留瓶の地下水に有機物とＶＯＣを添加した場合のＶＯＣの経時変化を示す。
【図１６】交換地下水貯留瓶の地下水に有機物、栄養塩及びＶＯＣを添加した場合のＶＯＣの経時変化を示す。
【図１７】交換地下水貯留瓶の地下水に乳酸ナトリウムを添加した場合のＶＯＣの経時変化を示す。
【図１８】交換地下水貯留瓶の地下水に乳酸ナトリウムとリンを添加した場合のＶＯＣの経時変化を示す。
【符号の説明】
【００６７】
１    地下水培養瓶
２    ステンレスチューブ
３    ステンレスチューブ
４    ブチルゴム栓
５    プラスチックキャップ
６    バルブ
７    テフロンフィルムパック
８    交換地下水貯留瓶
９    スターラー
１０  回転子
１１  液送ポンプ
１２  土壌培養瓶
１３  ステンレスチューブ
１４  ステンレスチューブ
【図１】
0005236222.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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