(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚を移植した免疫不全非ヒト動物の当該移植皮膚に、４０〜１００ｍＪ／ｃｍ2のＢ波長紫外線を一日１回の照射頻度で、一週間に５〜６回、６〜８週間毎週照射し、しわを形成させることを特徴とするヒト光老化モデル皮膚の作成方法。
【請求項２】
免疫不全非ヒト動物が、ＳＣＩＤマウスである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＳＣＩＤマウスが、ＢＡＬＢ  ｃＡ−ｎｕ／ｓｃｉｄ又はＢ−１７／Ｉｃｒ−Ｓｃｉｄである請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｂ波長紫外線の照射量を、照射開始第１週〜第３週までは、１週間ごとに１０ｍＪ／ｃｍ2ずつ増加し、第３週以降は６０〜１００ｍＪ／ｃｍ2を維持する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により作成されたヒト光老化モデル皮膚。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により作成されたヒト光老化皮膚モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの光老化皮膚を備えたヒト光老化モデル皮膚、モデル動物及びそれらの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の皮膚は年齢と共にしわやたるみを生じ老化する。特に顔面や首筋、肩など太陽光のあたる部分の皮膚では、慢性的な紫外線の影響によりしわやたるみの形成やしみ、そばかすの形成が、他の光のあたらない部分と比較し顕著となる。同時に紫外線の影響により皮膚の弾力性の低下、皮膚の黒化、黄ばみの増加、角質水分量の減少なども誘導される。これら紫外線暴露部で起こる特異な皮膚老化の現象を光老化と呼んでいる。
【０００３】
従って、斯かる皮膚光老化のメカニズムを解明したり、光老化の悪影響、すなわちしわやしみ、そばかすの予防・改善に有用な化粧料、医薬品等を評価するためには、ヒトの光老化皮膚をより忠実に反映した光老化モデル皮膚の存在が有用となる。
【０００４】
光老化モデル皮膚やモデル動物の作成法としては、慢性的な紫外線へ暴露する系が最も汎用され、これまで、ヘアレスマウス背部皮膚やラットの足底の皮膚に紫外線を毎日、数週間連続照射する方法（非特許文献１、非特許文献２）や、in  vitroではあるが３次元皮膚モデルに単回の紫外線を照射する方法（非特許文献３）が知られている。
【０００５】
また、ヒト皮膚を利用したモデルとしては、ヒト皮膚が移植されたヌードマウスに単回の紫外線照射を行う方法が知られているが（非特許文献４）、毎日、数週間連続照射するモデル系ではない。従って、この方法によっては、用いる皮膚はヒト由来ではあるが短期間での紫外線照射のため、移植されたヒトの皮膚に十分な光老化状態を引き起こすことはできないため、ヒト光老化モデル皮膚としては不十分である。
【０００６】
かように、ヒトの光老化皮膚をより忠実に反映したヒト光老化皮膚を持つヒトモデル皮膚やモデル動物はこれまでに得られていない。
【非特許文献１】Bissett DL, Hannon DP, Orr TV, Photochem Photobiol. 1987;46(3):367-78、
【非特許文献２】Imayama S, Nakamura K, Takeuchi M, Hori Y, Takema Y, Sakaino Y, Imokawa G, J Dermatol Sci. 1994 7(1):32-8
【非特許文献３】Nelson D, Gay RJ, Photochem Photobiol. 1993;57(5):830-7
【非特許文献４】Del Bino S, Vioux C, Rossio-Pasquier P, Jomard A, Demarchez M, Asselineau D, Bernerd F, Br J Dermatol. 2004;150(4):658-67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、化粧料、医薬部外品等の老化予防及び改善効果を評価するために有用なヒト光老化モデル皮膚、ヒト光老化モデル動物及びその作成方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト皮膚移植動物における皮膚老化について検討したところ、移植皮膚に、特定量のＢ波長紫外線を６週間以上連続照射することにより、光老化に極めて近いヒト光老化皮膚を備えたモデル動物を作成できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒト皮膚を移植した免疫不全非ヒト動物の当該移植皮膚に、４０〜１００ｍＪ／ｃｍ2のＢ波長紫外線を６週間以上連続照射することを特徴とするヒト光老化モデル皮膚の作成方法に係るものである。
【００１０】
また本発明は、上記方法により作成されたヒト光老化モデル皮膚に係るものである。
【００１１】
また本発明は、上記方法により作成されたヒト光老化皮膚モデル動物に係るものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、安定して皮膚老化状態を呈するヒト光老化モデル皮膚及びモデル動物が短期間で作成でき、これを用いることにより、ヒトの皮膚老化メカニズムの解明や皮膚老化防止・改善物質の評価をより正確に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のヒト光老化モデル皮膚の作成方法は、ヒト皮膚を移植した免疫不全動物の当該移植皮膚に、４０〜１００ｍＪ／ｃｍ2のＢ波長紫外線を６週間以上連続照射するものである。
【００１４】
本発明において、ヒト光老化モデル皮膚とは、自然老化に極めて近い老化状態（例えば、しわ、たるみ、しみ、そばかす、皮膚の弾力性の低下、皮膚の黒化、黄ばみの増加、角質水分量の減少など）を呈するヒト光老化皮膚を備えたヒト光老化皮膚モデル動物における当該皮膚を意味する。
【００１５】
本発明の方法における動物は、免疫不全非ヒト動物が用いられ、ＳＣＩＤマウス（例えばＢＡＬＢ  ｃＡ−ｎｕ／ｓｃｉｄ、Ｂ−１７／Ｉｃｒ−Ｓｃｉｄ等）、athymic nudeマウス等の免疫不全マウス、Ｆ３４４  Ｊｃ１−ｒｎｕ等の免疫不全ラット等が挙げられ、紫外線の長期照射に耐えうるなどの点から、免疫不全マウスを用いることが好ましく、ＳＣＩＤマウスを用いるのがより好ましい。
これらの動物は、ＳＰＦの環境下で１匹／１ケージの条件下で飼育することが好ましい。斯かる動物は、日本クレア株式会社やTaconic（NY）より入手可能である。
【００１６】
斯かる免疫不全非ヒト動物へ移植されるヒト皮膚としては、光があたっていない皮膚例えば、新生児の包皮や成人用由来のものであれば腹部皮膚を用いるのが好ましい。尚、当該皮膚は、割礼、美容整形手術により供給される皮膚、スキンセンターにより供給される死体皮膚を使用することができる。
【００１７】
当該ヒト皮膚は、２〜５mmの厚さで無菌的に採取し、動物に移植するまでの間は、適当な培養液、例えばL-グルタミンとantibiotic/antimycotic（Invitrogen, CA）を含むDMEM中で、２〜４℃に維持し、過密しない状態で保存するのが好ましい。
【００１８】
動物への皮膚移植は、公知の方法（Demarchez M, Hartmann DJ, Herbage D, Ville G, Dev Biol. 1987; 121(1): 119-29.）に準じて行えばよいが、例えば以下の方法により行うことができる。
【００１９】
動物をイソフルオラン／酸素（isofluorane/oxygen）やネンブタール等で麻酔後、その背部に２×２ｃｍ〜３×３ｃｍの皮膚の欠損部を作成する。この際、剃毛をしておくのが好ましい。その後、同様の大きさのヒト皮膚移植片を動物背部の皮膚欠損部に移植する。次いで、ナイロン系糸にて１０〜２０針縫合する。縫合後、移植皮膚とマウス皮膚の境界に局所麻酔薬、例えば「sensorcaine」（塩酸ブピバカイン）等を添加し、感覚脱脂失の処理を行うことが好ましい。
麻酔から覚めるまでの間、マウスは３７℃のインキュベーター内で維持される。
【００２０】
紫外線の照射は、移植皮膚の治癒が完了した後、すなわち移植から約１０週間程度経過した後に、開始するのが好ましい。
【００２１】
照射される紫外線は、２９０〜３２０ｎｍ領域のＢ波長紫外線であり、特に３０２ｎｍ付近にピークを持つものを使用するのが好ましい。
【００２２】
照射は、紫外線ランプと動物（移植皮膚）までの距離を、５〜８０ｃｍ、好ましくは３０〜５０ｃｍ程度とするのが紫外線の当たりむらを排除できる点は操作性の点からよい。
【００２３】
照射線量は、４０〜１００ｍＪ／ｃｍ2であればよく、例えば４０〜６０ｍＪ／ｃｍ2、６０〜１００ｍＪ／ｃｍ2、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ2が挙げられる。
当該照射線量は、移植皮膚の最小紅斑量（MED）を基準として適宜決定することができ、例えば０．８〜１．６MEDに相当する照射線量から決定すればよい。最小紅斑量は、移植皮膚に種々の量の紫外線を照射し、24時間後の紅斑を目視で判定することにより求められる。
また、照射は、６週間以上連続照射されるが、例えば６〜１２週間が挙げられ、好ましくは６〜１０週間、更に好ましくは６〜８週間である。
【００２４】
また、照射開始第１週〜第３週までは、１週間ごとに１０ｍＪ／ｃｍ2ずつ増加し、第３週以降は６０〜１００ｍＪ／ｃｍ2を維持するのが、紫外線の急性の影響を排除する点から好ましい。すわなち、紫外線照射開始第１週間目の照射線量は、４０ｍＪ／ｃｍ2、第２週間目は５０ｍＪ／ｃｍ2、第３週間目は６０ｍＪ／ｃｍ2とし、照射開始第３週間目以降は６０〜１００ｍＪ／ｃｍ2をとするのが好ましい。
【００２５】
尚、斯かる紫外線照射は、上記線量の紫外線を一日に１回の照射頻度で、一週間に５〜６回行なうのがよい。
【００２６】
上記のような条件で紫外線照射された、ヒト移植皮膚は、照射終了後速やかに老化状態を発現する。
【００２７】
斯くして発現した老化状態は、図１に示すように、しわの形成等の光老化皮膚と極めて近似し、この状態は、8週間は持続する。また、当該皮膚においては、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンVI、エラスチン（オキシタランファイバー）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）1、ＭＭＰ２、ＭＭＰ13、ケラチン６、ケラチン１２、ケラチン１６、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン等のタンパク質の発現増加あるいは低下といった光老化で皮膚に起こるタンパク質の発現変化を伴う。
【００２８】
斯くして得られた、本発明のヒト光老化モデル皮膚及びモデル動物は、ヒトの皮膚老化メカニズムの解明や皮膚老化防止・改善物質の評価、再生医療等に有用である。
【実施例】
【００２９】
１．皮膚移植方法
4-6週齢の免疫不全マウス（メス）に皮膚を移植した。実験の全期間を通して、マウスは無菌条件下で飼育された。皮膚を移植する直前に背部の毛を電気シェーバーを用いて除毛し、イソフルオラン／酸素（3%/0.8 liter）で麻酔した。移植手術中はイソフルオラン／酸素（2%/0.7 liter）の環境下で麻酔状態を維持した。マウス背部の皮膚を直径約2.0-3.0 cmの皮膚欠損（wound bed）が出来るように削除し、腹部由来皮膚を縫合し移植した。供給された皮膚は移植されるまでの間、L-グルタミンとantibiotic/antimycotic（Invitrogen, CA）を含むDMEM中で維持した（2-4℃）。縫合後、移植皮膚とマウス皮膚の境界にsensorcaineを添加し、感覚脱脂失の処理を行った。麻酔から覚めるまでの間、マウスは37℃ のインキュベーター内で維持した。
【００３０】
２．Ｂ波長紫外線（UVB）照射
UVBの照射は治癒が完了した少なくとも移植から10週間後に開始した。UVBのランプは302 nm の波長近くにピークを持つものを使用し、ランプから移植皮膚までの間隔は約30cmほどになるようにした。
【００３１】
移植皮膚の最小紅斑量（MED）が40 mJ/cm2に相当することが明らかになったため、慢性的なUVBの照射は、40 mJ/cm2から開始することにした。週に5日間照射し、6週間連続照射を行った。3週目までは10 mJ/cm2ずつ照射量を上げていき、3週目から6週目までは60 mJ/cm2を維持した。照射中、マウスは100cm2の透明容器内を自由に動けるようにした。
【００３２】
３．老化皮膚状態の評価
（１）照射開始後、移植皮膚表面を、Charm View（登録商標；Moritex, Japan）により、反射した透過光を用いて肉眼にて観察すると共に、２週間毎にディジタル画像を撮影した。
【００３３】
（２）レプリカ剤を用いて当該移植皮膚のレプリカを作成し、得られたレプリカについて、以下に示す方法により粗さ解析を行った。
【００３４】
＜レプリカ粗さ解析＞
レプリカの作成は試験開始前、開始から3、6週目に行った。レプリカを作成する際も、イソフルオラン／酸素（2%/0.7 liter）の環境下で麻酔状態を維持した。
SILFLO（Flexico developments）で得られた移植皮膚のレプリカを、さらに別種のレプリカ剤（GC exafine）を用いて、極力平坦化されるように板などで圧力を加えることで得られたレプリカを解析対象とした。
レプリカの3次元形状をPRIMOS  Compact（GF Messtechnik社）により測定した。計測後、フィルターにてうねりを除去した。
【００３５】
線粗さ解析は、得られたレプリカの長さ７−９mmの直線である解析線を引き、この部分の線粗さパラメーター数値を求めた。その際、極力シワに起因すると思われる以外の、疣などの形状を取りこまないようにした。面解析は先のレプリカの中央部分を４−５mm×７−９mm程度の長方形の範囲を指定し、その範囲内の面粗さ解析を行った。この際も極力疣などの形状を取りこまないように任意で範囲を選択した。
【００３６】
パラメーターとしては、Ra及びSa（算術平均粗）及びRz及びSz（十点平均粗さ）を用いて比較した。Ra及びRzは１次元パラメーターを、Sa及びSzは２次元パラメーターを表す。
Ra、Sa：算術平均粗さ
Rz、Sz：十点平均粗さ（最高の山から高い順に５番目までの山高さの平均と、最深の谷から深い順に５番目までの谷深さの和）
【００３７】
（３）遺伝子発現分析
移植された皮膚は最後にＵＶＢを照射してから２４時間後に採取した。トータルＲＮＡはTrizol 試薬 (Invitrogen, CA)で抽出し、RNeasy mini kit (Qiagen, CA)にて精製した。ＲＮＡサンプルの純度(28s/18s)はAligent bioanalyzerを用いて確認した。ビオチン標識された目的のｃＲＮＡ はAffymetrix社のプロトコールに従って行った。簡単には、ダブルストランドｃＤＮＡをT7 (-dT) 24 プライマー 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTAT AGGGAGGCGG-3'(配列番号１)及びSuperscript II reverse transcriptaseを用いて作製した。各サンプルからのｃＲＮＡはHuman Genome U133 plus 2.0 chip にハイブリダイズさせた。
【００３８】
４．結果
（１）外観
図１に、移植皮膚にＵＶＢを６週間照射した時点での皮膚外観のコントロール（ＵＶＢ非照射群）との比較を示した。図１から明らかなようにコントロールでは皮膚表面形状に大きな変化はないのに対し、ＵＶＢ照射した場合にはしわ様の線上の形状変化が観察され、増加していることが観察された。
【００３９】
（２）レプリカ解析
【００４０】
図２に、腹部由来皮膚を用いた場合の、ＵＶＢ照射3、6週間照射後での皮膚レプリカの３次元粗さ解析結果のコントロールとの比較を示した。図２から明らかな様に、コントロールでは粗さパラメーターRa及びSa（算術平均粗さ、図２Ａ、Ｃ）、Rz及びSz（10点平均粗さ、図２Ｂ、Ｄ）ともにほとんど変化は認められない、すなわち、皮膚表面の粗さに変化が認められないが、それに対し、ＵＶＢ照射した群では、ＵＶＢを 6週間照射した時点でＲａ、Ｒｚ、Ｓａ及びＳｚ値の増大が認められた。すなわち図１に示したしわ様の概観の凹凸変化が現れたことを示している。
【００４１】
（３）遺伝子発現プロフィール
ＲＮＡの精製度を確認の後、ＵＶＢ照射した腹部皮膚移植片での遺伝子発現プロファイルを、ＵＶＢを照射していないコントロール群を対照として作製した。コントロール群とＵＶＢを照射された群間のｍＲＮＡ転写物濃度の変化量を対数―対数プロットで示した。腹部皮膚移植片において、ＵＶＢ照射により発現が増加した遺伝子としてケラチン６、ケラチン１６、ケラチン１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１、インボルクリン及びフィラグリンがあった。発現が抑制された遺伝子としてはコラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV及びコラーゲンVIがあった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】コントロール（Ａ、Ｃ及びＥ）及びＵＶＢ照射群（Ｂ、Ｄ及びＦ）におけるＳＣＩＤマウス移植皮膚の外観変化を示した図。Ａ及びＢ：ＵＶＢ照射開始０週間後、Ｃ及びＤ：照射開始３週間後、Ｅ及びＦ：照射後開始６週間後（Bar = 3 mm）。
【図２】腹部由来皮膚を用いた場合での、ＵＶＢ照射開始０、３及び６週間後のレプリカの３次元粗さ解析から得られた算術平均粗さRa及びSa（Ａ、Ｃ）及び十点平均粗さRz及びSz（Ｂ、Ｄ）を示したグラフ。四角印はコントロール、丸印はＵＶＢ照射群を示す。  Error Bar = ±SD (n=4〜6)、* p<0.05  ** p<0.01（0週との比較）。
【図１】
0005294577.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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