(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、吸着材料。
【請求項６】
請求項５に記載の吸着材料であって、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
【請求項７】
請求項６に記載の吸着材料であって、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体誘導体、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
【請求項８】
請求項７に記載の吸着材料であって、ヒトＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体誘導体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料。
【請求項９】
請求項６に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体誘導体、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体誘導体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を用いた、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と結合する新規なポリペプチドに関する。また、本発明は、該ポリペプチドを担持させた吸着材料に関する。また、本発明は、該吸着材料を用いたＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製する方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換体、該ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＧ蛋白質は、細菌ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）より見出された蛋白質であり（以下、ＳｐＧ蛋白質と称する）、ＳｐＧ蛋白質はヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を持つ。その性質の原因はＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメインおよびｂｅｔａ−３ドメインにある。それら３種類のドメインはいずれも、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位およびヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ部位の両構造を分子認識し、特異的に結合するとされている（非特許文献１、２）。ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメインおよびｂｅｔａ−３ドメインのアミノ酸配列は、それらの由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。ＳｐＧ蛋白質のうち、いくつかの亜種はｂｅｔａ−３ドメインを欠く。野生型ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメインのアミノ酸配列の一例として配列番号５を、野生型ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−２ドメインのアミノ酸配列の一例として配列番号６をそれぞれ示す。ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメインおよびｂｅｔａ−２ドメインは互いに配列相同性が高く、両者を一括りとしてプロテインＧ−ｂｅｔａドメインと呼ばれる（以下、ＳｐＧｂポリペプチドと称する）。ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法として、ＳｐＧ蛋白質あるいはＳｐＧｂポリペプチドを担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が知られている（特許文献１〜３）。この精製法においては、ＳｐＧｂポリペプチドがＩｇＧ−Ｆｃ部位を特異的に認識し、比較的強く結合するというＳｐＧｂポリペプチドの性質が主として利用されている。該方法により分離精製されたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体は、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として、産業利用されている。
【０００３】
一方、ＩｇＧ抗体分子の一部分であるＩｇＧ−Ｆａｂドメイン（以下、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）と称する）もまた、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として利用されている。ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製する方法の一つとして、ＳｐＧ蛋白質あるいはＳｐＧｂポリペプチドを担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が一般的に利用されている。ＳｐＧｂポリペプチドの別の特徴的な性質として、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体を特異的に認識し、結合することもできるためである。しかしながら、ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体との結合能は、ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆｃ部位との結合能に比べて弱く、アフィニティ・カラム・クロマトグラフィ用途のリガンド分子としては改良の余地があった。
【特許文献１】特表平１−５０２０７６号公報
【特許文献２】特表平３−５０１８０１号公報
【特許文献３】特開平３−１２８４００号公報
【特許文献４】特許第３９０８２７８号明細書
【特許文献５】特表２００２−５２７１０７号公報
【非特許文献１】Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．                    、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９５年、３巻、２６５頁
【非特許文献２】Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．、                    Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、３３巻、４７１２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、野生型プロテインＧ蛋白質ｂｅｔａドメインと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体とより強く結合する、プロテインＧ蛋白質ｂｅｔａドメイン様の新規なポリペプチドを提供する。さらに本発明は、該ポリペプチドを吸着リガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体吸着剤、ならびに該吸着剤を用いてＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体を分離除去または分離精製する方法を提供する。さらに本発明は該ポリペプチドを形質転換体を用いて生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、蛋白質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、数多くのポリペプチドを分子設計し、形質転換細胞から取得し、該ポリペプチドの物性を比較検討することにより、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有し、かつ、ヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ部分との結合能を有する、変異型プロテインＧ−ｂｅｔａドメインを含むポリペプチドに関する。
【０００７】
さらに本発明は、上記ポリペプチドであって、配列番号５または６に示されるアミノ酸配列において、少なくともＴｈｒ−１７が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【０００８】
さらに本発明は、上記のポリペプチドであって、プロテインＧ−ｂｅｔａドメインが配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるプロテインＧ−ｂｅｔａ−１型であるポリペプチド、あるいは、プロテインＧ−ｂｅｔａドメインが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるプロテインＧ−ｂｅｔａ−２型であるポリペプチドに関する。
【０００９】
さらに本発明は、上記のポリペプチドと他のポリペプチドとが共有結合した融合ポリペプチドに関する。
【００１０】
さらに本発明は、上記のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または／およびアミノ酸側鎖に１〜１００個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドに関する。
【００１１】
さらに本発明は、上記のポリペプチドを１ドメイン単位として、該ドメイン単位２〜１００個を共有結合にて融合させたポリペプチドに関する。
【００１２】
さらに本発明は、上記のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、吸着材料に関する。
【００１３】
さらに本発明は、上記の吸着材料であって、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料に関する。
【００１４】
さらに本発明は、上記の吸着材料を用いることを特徴とする、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【００１６】
さらに本発明は、上記のＤＮＡを有するベクターに関する。
【００１７】
さらに本発明は、上記のベクターにより形質転換された形質転換体に関する。
【００１８】
さらに本発明は、上記の形質転換体を用いた、ポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、野生型ＳｐＧ蛋白質あるいはその断片であるＳｐＧｂポリペプチドと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と特異的により強く結合する性質を有する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドを水不溶性担体に固定化した吸着材料を用いることにより、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体または種々のＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製することが可能となる。また本発明の形質転換細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。
【００２２】
本明細書において、「変異体」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、挿入、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
【００２３】
本明細書において、「ドメイン」とは、蛋白質およびポリペプチドの高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なアミノ酸高分子の単位をいう。
【００２４】
本明細書において、「ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体」とは、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体のＣＬドメイン部分およびＣＨ１ドメイン部分と他生物種ＩｇＧ抗体のいくつかのＶドメイン部分とを融合させたキメラＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体のＣＤＲ部分を除いた残余の部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化ＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、およびそれらに化学的修飾を加えた蛋白質であって、ＩｇＧ抗体のＣＬドメイン部分およびＣＨ１ドメイン部分とを有するＩｇＧ−Ｆａｂ抗体誘導体をいう。
【００２５】
以下、所望の変異体もしくはポリペプチドを取得するための、タンパク質のアミノ酸の変異について説明する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明者らは、野生型ＳｐＧｂポリペプチドのアミノ酸配列を雛形として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体のＣＨ１鎖構造部分およびＣＬ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドの設計を、立体構造のデータを利用した種々の検討およびモデリングによる分析により実施した。これらの設計作業の結果として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ抗体誘導体に結合し得る種々のポリペプチドを考案した。考案したポリペプチドを遺伝子工学的手法により数多く取得し、それらポリペプチドの特徴を種々の科学的手法を用いて解析したところ、いくつかのポリペプチドに野生型ＳｐＧｂポリペプチドと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体とより強く結合する性質を見出した。
【００２７】
前記設計による考案および実施形態を具体的に以下に示す。野生型ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体は複合体を形成し、その立体構造情報は公開データベースであるプロテイン・データ・バンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に、コード番号１ＩＧＣとして登録公開されている。この立体構造情報を種々検討し、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体との結合能を強化すべく、ポリペプチド変異体の分子設計を行った。分子設計により考案された種々のポリペプチドを遺伝子工学的手法により取得し、配列番号１で示される、ＳｐＧｂ様新規ポリペプチドのＴｈｒ−１７残基をＧｌｙへと置換することが特に有効であると判断された。好ましい実施形態としては、配列番号１〜３で示されるＳｐＧｂ様新規ポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜２はＳｐＧのｂｅｔａ−１ドメイン配列を雛形として設計取得した新規ポリペプチドであり、配列番号３はＳｐＧのｂｅｔａ−２ドメイン配列を雛形として設計取得した新規ポリペプチドである。別の実施形態としては、配列番号１〜３のいずれかで示されるポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜３で示されるポリペプチドに対して十分な配列同一性を有するポリペプチドに関しても、本発明によるヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体への結合能を示すことが期待できるためである。配列同一性は、プログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒａｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。
【００２８】
本発明の別の実施形態としては、それらのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基を共有結合により付加したポリペプチドであって、それら付加したアミノ酸残基が該ポリペプチド間のリンカーとして、あるいは担持材料（担体）とのリンカーとして利用できるポリペプチドが挙げられる。好ましくは、ポリペプチド間のリンカーとしてはＩｇＧ抗体との相互作用が少ないＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ等が挙げられ、担体とのリンカーとしてはチオール基を持つＣｙｓ、アミノ基を持つＬｙｓ、カルボキシル基を持つＧｌｕ、Ａｓｐ等が挙げられ、さらにそれらのアミノ酸残基を複数個利用することもできる。さらに別の実施形態としては、それらのポリペプチド単位２〜１０個を共有結合にて融合させ、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を高めた融合ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチド単位２〜５個および前記した各種のリンカー部分を含む融合ポリペプチドが挙げられる。
【００２９】
また本発明の一つの実施態様としては、上記方法で得られたポリペプチドまたは配列番号４で示されるポリペプチド（特許文献４）を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料を提供しうる。さらに、その吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法を提供しうる。
【００３０】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギット  Ｃ２５０Ｌ等を例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本吸着材料の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００３１】
本発明のポリペプチドを前記担体へ固定化する方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化あるいは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００３２】
本発明のポリペプチド結合担体を吸着材料として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ抗体誘導体をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。本発明の精製法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ蛋白質を担持させた吸着材料を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順（特許文献５）により達成することができる。すなわち、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムに通過させ、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティ・カラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体はカラム内の本発明の吸着材料に吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性もしくはアルカリ性の純粋な緩衝液をカラムに通過させ、所望のヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムは、強酸性もしくは強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
【００３３】
さらに本発明の一つの実施態様としては、前記方法により得られたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、またはその組換えＤＮＡがプラスミド又はファージである組換えＤＮＡ、またはその組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。また、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドと細胞での蛋白質発現を補助する作用のある公知の蛋白質との融合蛋白質として取得することができる。すなわち、本発明のポリペプチドと該蛋白質との融合蛋白質をコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。該蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらの蛋白質に限定されるものではない。
【００３４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、ポリペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
【００３５】
本発明のベクターは、前述したポリペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ等をベクターとして用いることができる。
【００３６】
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組み換えベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該融合蛋白質を採取し、該融合蛋白質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。
【００３８】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２０〜４０℃で好気的に６〜２４時間培養することにより本発明のポリペプチドを菌体内に蓄積させ、回収する。
【００３９】
本発明のポリペプチドの精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のポリペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００４０】
前記実施態様の一例として、請求項３に記載のポリペプチド（配列番号３）とＩｇＧ−Ｆａｂとの結合能を、表面プラズモン共鳴現象を利用したＢＩＡＣＯＲＥ分析実験（ビアコア株式会社、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００システム、３３−１１４１４３８−３７１９）にて測定した結合解離曲線を図１に示した。別の例として、請求項１〜４に記載のポリペプチド（配列番号１〜４）それぞれと、ＩｇＧ−Ｆａｂとの結合能（解離定数）をＢＩＡＣＯＲＥ分析実験にて解析した結果を表１に示した。さらに別の例として、配列番号４で示されるポリペプチドをセルロース担体に固定化し、該担体を用いたアフィニティ・クロマトグラフィー精製法により、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子を含む溶液からＩｇＧ−Ｆａｂ分子を選択的に分離精製した実験から得られた、吸着解離プロフィール図を図２に示した。本発明により、配列番号１〜４で示したポリペプチドは、野生型ＳｐＧｂポリペプチドに比べて優れたＩｇＧ−Ｆａｂ吸着解離能力を示し、アフィニティ・クロマトグラム担体としての性能が向上していることは明らかである。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。特に明記していない方法についてはMolecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４２】
なお、以下の実施例１〜６では、野生型ＳｐＧポリペプチドに相当する、配列番号５、６で示される各ポリペプチド、および、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と特異的により強く結合する性質を有する新規なＳｐＧｂポリペプチドとして、配列番号１、２、３で示される各ポリペプチドの取得方法について説明する。以下の配列番号７〜２０のＤＮＡは、後述するように、上記配列番号１〜３、５、６をコードする各々の遺伝子のクローニングのために設計した。上記各種ＤＮＡについて、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社に合成を依頼した。
【００４３】
（実施例１）
配列番号５をコードするＤＮＡの調製
配列番号７および８に記載のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ３００ｐｍｏｌを混合し、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼにはＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ株式会社）を用い、さらに添付のバッファーとｄＮＴＰも反応に用いた。反応液量は０．０５ｍＬとした。反応条件は９６℃５分１回、９６℃２分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを１０回とした。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、約９０ｂｐのサイズに相当するバンドを切り出し、抽出した二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ株式会社）により切断した。
【００４４】
また、配列番号９および１０に記載の合成ＤＮＡ３００ｐｍｏｌを混合し、同様の組成および反応条件でオーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、約１１０ｂｐのサイズに相当するバンドを切り出し、抽出した二本鎖ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社）により切断した。
【００４５】
プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号５をコードするように、配列番号７、８、９、１０のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２１に示した。この配列番号２１のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞（タカラバイオ株式会社）の形質転換を行い、定法によって、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
【００４６】
また、増幅・抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型として、ｐＧＥＸ−３´プライマーおよびｐＧＥＸ−５´プライマー（両者ともＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用いて、配列番号２１に相当する二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅した。鋳型プラスミドＤＮＡを５０ｎｇ、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、ポリメラーゼとしてＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）、および、添付のバッファーとｄＮＴＰを加えて反応を行った。反応液量は０．０５ｍＬとした。反応条件は９４℃３分１回、９４℃１分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを２５回とした。ＰＣＲ反応生成物から、上記と同様にアガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにより切断した後に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。同様に、この配列番号２１のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
【００４７】
（実施例２）
配列番号２をコードするＤＮＡの調製
配列番号１１および１２に記載の合成ＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉにより切断した。この二本鎖ＤＮＡ、および、実施例１において配列番号９および１０に記載の合成ＤＮＡからＰＣＲ反応によって調製したＥｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩで切断済みの二本鎖ＤＮＡを、プラスミドベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号２をコードするように、配列番号９、１０、１１、１２のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２２に示した。実施例１と同様に、配列番号２２のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。
【００４８】
また、実施例１と同様の手法によって、配列番号２２に相当する二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にサブクローニングした。この配列番号２２のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。
【００４９】
（実施例３）
配列番号１をコードするＤＮＡの調製
配列番号５をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を鋳型として、配列番号１３および１４の合成ＤＮＡプライマーを用い、クイックチェンジ法で、配列番号５のアミノ酸配列においてＴｈｒ−１７がＧｌｙに変換された変異体、すなわち配列番号１をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を作成した。上記方法で作成した、配列番号１をコードするＤＮＡの配列を、配列番号２３に示す。クイックチェンジ法に関しては、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、添付のプロトコルに従って行った。実施例１と同様に、配列番号２３のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
【００５０】
（実施例４）
配列番号６をコードするＤＮＡの調製
配列番号１５および１６に記載の合成ＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉにより切断した。また同様に、配列番号１７および１８に記載の合成ＤＮＡを用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩにより切断した。上記２種の二本鎖ＤＮＡを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にサブクローニングしたときに、配列番号６をコードするように、配列番号１５、１６、１７、１８のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２４に示した。実施例１と同様に、配列番号２４のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
【００５１】
（実施例５）
配列番号３をコードするＤＮＡの調製
配列番号６をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を鋳型として、配列番号１９および２０の合成ＤＮＡプライマーを用い、実施例３と同様に、クイックチェンジ法で、配列番号６のアミノ酸配列においてＴｈｒ−１７がＧｌｙに変換された変異体、すなわち配列番号３をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を作成した。上記方法で作成した、配列番号３をコードするＤＮＡの配列を、配列番号２５に示した。実施例１と同様に、配列番号２５のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
【００５２】
（実施例６）
各ＤＮＡの配列確認
実施例１〜５で得られた、配列番号２１〜２５のＤＮＡを含む、各々のプラスミドＤＮＡの配列確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、添付のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。
【００５３】
（実施例７）
各ＳｐＧポリペプチド（ＧＳＴ融合蛋白質）の発現
実施例１〜５で得られた、配列番号２１〜２５のＤＮＡのいずれかを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を導入したＤＨ５α細胞を、アンピシリン（和光純薬工業株式会社）を０．１ｇ／Ｌの濃度で含有するＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％乾燥酵母エキス、１％ＮａＣｌ（全て和光純薬工業株式会社））を用い、各々別々に３７℃にて８時間培養した。各々の培養液から２．５ｍＬ分を、アンピシリンを０．１ｇ／Ｌの濃度で含有する０．５Ｌの２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％乾燥酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃にて培養を始めた。接種から２時間後に、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトシド、和光純薬工業株式会社）を添加し、さらにＩＰＴＧ添加後１２時間培養した。培養終了後、各々の培養液を遠心にて集菌し、終濃度１ｍＭのＡＥＢＳＦ（４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ナカライテスク株式会社）、終濃度０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ、和光純薬工業株式会社）、終濃度１ｍＭのＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、和光純薬工業株式会社）を含むＰＢＳ緩衝液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、和光純薬工業株式会社）２５ｍＬに、各々の集菌ペレットを再懸濁した。超音波破砕にて菌体を破砕し、各々の菌体破砕液を遠心分離にて上清画分と沈殿画分とに分画した（本操作は４℃にて行った）。
【００５４】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマルチクローニングサイトに遺伝子を導入した大腸菌を培養し、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導すると、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）がＮ末端に付与した融合蛋白質として発現される。したがって、配列番号２１〜２５のＤＮＡのいずれかを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を導入した大腸菌から、配列１、２、３、５、６のいずれかのＳｐＧポリペプチドがＧＳＴ融合蛋白質として発現された。
【００５５】
各々のＧＳＴが融合したＳｐＧポリペプチドが、ＩＰＴＧの誘導によって発現されたこと、および、菌体破砕液から遠心分離にて得られた上清画分に存在することを、ＳＤＳ電気泳動による分析で確認した。
【００５６】
（実施例８）
各ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドの精製
上記の通り、実施例７において、ＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる各蛋白質は、配列番号１、２、３、５、６のいずれかのＳｐＧポリペプチドが、Ｎ末端側にＧＳＴが付与したＧＳＴ融合蛋白質として発現された。
【００５７】
実施例７で得られた各々の上清画分から、ＧＳＴアフィニティ・クロマトグラフィーによって、ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドを精製した。ＰＢＳ緩衝液にて平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に添加し、ＰＢＳ緩衝液にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｈｉｏｎｅ、ｐＨ  ８．０、全て和光純薬工業株式会社）にてＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドを溶出・分取した。溶出・分取した各々の蛋白質溶液を、ＰＢＳ緩衝液にて透析した。
【００５８】
透析後に回収した各々の蛋白質溶液を、ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、目的のＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドが高純度（９０％以上）で存在することを確認した。したがって、透析後に回収した各々の蛋白質溶液を、ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドの精製サンプルとして、以後の実施例で用いた。
【００５９】
（実施例９）
ポリペプチドの精製
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１マルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）でＧＳＴを切断することが可能な部位も導入された。これにより、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドのみを得ることが可能だが、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断後も、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１側のプロテアーゼ認識サイトと制限酵素サイトに由来するアミノ酸配列が、Ｎ末端側に付与された形で残った。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに目的のポリペプチドをコードするＤＮＡをサブクローニングし、そのＤＮＡプラスミドを用いて形質転換した大腸菌で目的のポリペプチドをＧＳＴが融合した形で発現し、そのＧＳＴ融合ポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断した場合、Ｎ末端側にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配列が付与された形の、目的のポリペプチドが得られた。したがって、実施例１〜８で得られたいずれかのＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断した場合、配列番号１、２、３、５、６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配列が付与したＳｐＧポリペプチドが得られた。本特許の実施例において用いられた、配列番号１、２、３、５、６に対応する各々のＳｐＧポリペプチドは、上記のように、Ｎ末端側に５残基からなるベクター由来のアミノ酸配列が付与したポリペプチドであった。
【００６０】
実施例８で得られた、透析後の各々の蛋白質溶液に、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを、ＧＳＴ融合蛋白質１ｍｇあたり１Ｕｎｉｔ添加し、４℃にて１８時間インキュベートした。各々のプロテアーゼ反応溶液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、素通り画分（正確には、２カラム分のＰＢＳ緩衝液で洗浄した画分も加えている）を回収した。回収した各々の素通り画分について、トリシン‐ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、各々のＳｐＧポリペプチドと考えられるバンドを確認した。したがって、この素通り画分を回収した各々のポリペプチド溶液を、ＳｐＧポリペプチドの精製サンプルとして、以後の実施例で用いた。
【００６１】
（実施例１０）
ＢＩＡＣＯＲＥによるヒトＩｇＧ―Ｆａｂ断片抗体への結合能の検討
表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用した分析機器ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ビアコア株式会社、３３−１１４１４３８−３７１９）を用いて、取得した各々のＳｐＧポリペプチドのヒトＩｇＧ―Ｆａｂへの結合を測定した。ヒトＩｇＧ―ＦａｂをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社、ロット番号１１５０７５４）に固定し、ＳｐＧポリペプチドをチップ上に流し、固定化したヒトＩｇＧ―Ｆａｂへの結合・解離を観測する実験系で両者の解離定数ＫＤ（Ｍ）を算出した。
【００６２】
ヒトＩｇＧ―ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、カップリング剤としてＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ、ビアコア株式会社）およびＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ、ビアコア株式会社）を用い、およびブロッキング剤としてＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ビアコア株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従い、アミンカップリング法で行った。ヒト血漿由来ＩｇＧ−Ｆａｂ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ、ロット番号１５１６７）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．５、ビアコア株式会社）にて０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、注入量を適宜調整しながら、添付のプロトコルに従ってヒトＩｇＧ−Ｆａｂを固定化した。また、ヒト血清アルブミン（シグマ  アルドリッチ株式会社、ロット番号１７５４Ｂ）をＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．５）にて１０００倍希釈し、注入量を適宜調整しながら、添付プロトコルに従ってヒト血清アルブミンを別のフローセルに固定化し、リファレンスセルとした。測定時のランニング緩衝液および試料の希釈液として、ＰＢＳ緩衝液に終濃度０．００５％となるようＰ−２０（ビアコア株式会社）を加えた緩衝液を用いた。配列番号１、２、３、４、５、６に対応する、各々のＳｐＧポリペプチドを、ランニング緩衝液で終濃度２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、４０００ｎＭ、８０００ｎＭになるよう希釈調製した。配列番号１、２、３、５、６に対応するＳｐＧポリペプチドは、実施例１〜８で得られたＳｐＧポリペプチドの精製サンプルを用い、配列番号４に対応するＳｐＧポリペプチドは、特許文献３に開示された方法に従って調製されたＳｐＧポリペプチドの精製サンプル（凍結乾燥サンプル）を用いた。この特許文献３に開示された方法に従って調製されたＳｐＧポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端側にＭｅｔが、および、Ｃ末端側にＣｙｓが付与したポリペプチドとなっていた。
【００６３】
センサーチップＣＭ５上のヒトＩｇＧ−Ｆａｂおよびヒト血清アルブミンが固定化されているレーンに、各々の計６種類のＳｐＧポリペプチドを、上記の通り計６通りの濃度に調製したものを、それぞれ流速０．０２ｍＬ／分で２分間添加した。各々の測定は２５℃で行い、添加している２分間における結合反応曲線、および、添加後２分間における解離反応曲線を得た。解析ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア株式会社)を用いて、各々のＳｐＧポリペプチドの固定化ヒトＩｇＧ−Ｆａｂへの結合・解離反応曲線から固定化ヒト血漿アルブミン（リファレンス）への結合・解離反応曲線を差し引いた結合・解離反応曲線を対象に解析した。各々のＳｐＧポリペプチドと固定化ヒトＩｇＧ−Ｆａｂの解離定数ＫＤ（Ｍ）は、解析ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア株式会社)を用いて、ＳｐＧポリペプチドの各々の濃度に対する平衡状態での結合レスポンス（平衡値）のプロットから解離定数ＫＤ（Ｍ）を算出した。
【００６４】
センサーチップＣＭ５に固定したＩｇＧ−Ｆａｂと配列番号３で示されるＳｐＧポリペプチドとの結合・解離反応曲線を図１に示した。図中の横軸は通液時間（秒）、縦軸は共鳴強度（ＲＵ）を示す。各々の結合・解離反応曲線について、図中下部より上部に向かってそれぞれ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、４０００ｎＭ、８０００ｎＭの配列番号３で示されるＳｐＧポリペプチドを流した時の反応曲線を示す。
【００６５】
（表１）配列番号１〜４で示されるポリペプチドおよび２種の野生型ＳｐＧｂとＩｇＧ−Ｆａｂの解離定数
【００６６】
【表１】
0005236311.tif 000002
【００６７】
（実施例１１）
ＳｐＧポリペプチドの水不溶性担体への固定化
ＳｐＧポリペプチドをリガンドとして固定化した担体のＩｇＧ−Ｆａｂ吸着能を検証するため、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化した担体を作製した。ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０２６７８６において開示される、水不溶性担体にエポキシ基を導入し、そのエポキシ基の開環・酸化反応によりアルデヒド基を生成させて得られた担体にリガンドを固定化する方法によって、本ＳｐＧポリペプチド固定化担体を作製した。
【００６８】
セルロース系多孔質硬質ゲルであるＣＫＡ（チッソ株式会社、ロット番号０４０２２０−５）６０ｍＬ（自然沈降体積）に水２４．６ｍＬ、４Ｎ  ＮａＯＨ（和光純薬株式会社）３３．６ｍＬを加え４０℃で３０分加温した後、エピクロロヒドリン（和光純薬株式会社）３３ｍＬを加え４０℃で２時間攪拌し、エポキシ化反応を行った。反応後、担体の４０倍量の水で洗浄した。
【００６９】
次にエポキシ化担体４４ｍＬ(自然沈降体積)を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（和光純薬株式会社）で置換した。配列番号４に対応するＳｐＧポリペプチド４４０ｍｇをゲルと等量の０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解し、上記のゲルに加えて４０℃で８時間攪拌した。反応後、２０倍量の水で洗浄し、反応前後の上清をＨＣｌ（和光純薬株式会社）で中和した。
【００７０】
（実施例１２）
ＳｐＧポリペプチド固定化担体のＩｇＧ−Ｆａｂアフィニティ・カラムクロマト実験
実施例１０で得た、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化した担体がＩｇＧ−Ｆａｂに対してアフィニティ・カラムの様相を示すことを確認するため、以下に示す条件で評価を行った。
【００７１】
カラム中での担体の高さが約５ｃｍとなるよう、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化したＣＫＡ担体、および、固定化を施していないＣＫＡ担体を、内径１ｃｍの空カラムに流し入れ、脱泡水で４００ｃｍ／ｈで１時間通液した。さらに、結合用緩衝液（０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）４０ｍＬで、各々のカラムを平衡化した。通液するＩｇＧ−Ｆａｂは、ヒト免疫グロブリン製剤であるガンマガード（バクスター株式会社、ロット番号ＪＫ１０９Ｔ）から、非特許文献３に開示される方法にて調製した。なお、パパイン消化には、調製したＩｇＧ−Ｆａｂにパパインが混入しないよう、パパインが固定化されたゲルである、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ（シグマ  アルドリッチ株式会社、ロット番号０９４Ｋ７０１７）を使用した。また、パパイン消化後の副産物であるＩｇＧ−Ｆｃを除くために、ＩｇＧ−Ｆｃを吸着するｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社、ロット番号３１１２７２）も精製に利用した。精製したＩｇＧ−Ｆａｂを結合用緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈したもの２０ｍＬ分を、各々のカラムに通液した。ＩｇＧ−Ｆａｂ通液後、各々のカラムを１２０ｍＬの結合用緩衝液で洗浄し、８０ｍＬの溶出用緩衝液（０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０、和光純薬工業株式会社）で溶出した。さらに、４０ｍＬの結合用緩衝液で再平衡化した。溶出した画分の回収に利用した試験管には、あらかじめ２２．５％量の１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を中和液として投入した。一連の工程において、カラム通過後の溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。さらに、２８０ｎｍにおいて高い吸光度を示した画分に、ＩｇＧ−Ｆａｂが含まれているかどうか、ＳＤＳ電気泳動によって確認した。
【００７２】
配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体および何も固定化していないＣＫＡ担体を用いて、ＩｇＧ−Ｆａｂをアフィニティ・クロマトグラフィー精製した際の吸着解離プロフィール図を図２に示した。図中の横軸は通算通液量（ｍＬ）、縦軸は波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を示す。ＣＫＡ−Ｓｅｑ−４は配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体を、ＣＫＡは何も固定化していないＣＫＡ担体をそれぞれ示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】配列番号３で示されるポリペプチドとＩｇＧの結合反応曲線
【図２】配列番号４で示されるポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体を用いて、ＩｇＧ−Ｆａｂをアフィニティ・クロマトグラフィー精製した際の吸着解離プロフィール
【図１】
0005236311.tif 000003
【図２】
0005236311.tif 000004
【配列表】
0005236311000001.app