(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定装置であって、
前記培養細胞を撮像する撮像部と、
前記撮像部からの撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定する剥離状態判定部と、
前記剥離状態判定部により前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する制御部と、を備える細胞剥離判定装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する請求項１に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項３】
細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定装置であって、
前記培養細胞を撮像する撮像部と、
前記撮像部からの撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定する剥離状態判定部と、
前記剥離状態判定部により前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する制御部と、を備え、
前記制御部は、前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する細胞剥離判定装置。
【請求項４】
前記輝度情報は、前記培養容器の全体の平均輝度情報、または前記培養容器の総和の輝度情報である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項５】
前記培養容器内の細胞の培養状況を表す情報を取得する情報取得部と、
前記情報取得部で取得した前記細胞の培養状況を表す情報に基づき、前記培養状況に応じて異なる前記輝度閾値を算出する閾値算出部とを更に備える請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項６】
前記細胞の培養状況は、前記培養容器内の培養される細胞の種類、前記培養容器内の培養される細胞の密度、前記細胞の培養に用いる培地の種類、前記添加される場合の分解酵素の量、前記培養される間の湿度、前記培養される間の温度の少なくとも一つを含む請求項５に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項７】
前記制御部は、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示してから開始するまでの所定時間を算出し、前記算出される所定時間前に、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示する、請求項２または請求項３に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項８】
前記撮像部で撮像した前記細胞の撮像データから輝度値が所定値以上となる領域を抽出し、その領域の合計面積を算出する面積算出部を更に備え、
前記剥離状態判定部は、前記面積算出部で算出した合計面積に基づいて前記培養容器内の輝度情報を求め、前記培養細胞の剥離状態を判定する請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項９】
前記細胞の撮像データは、位相差観察法によって得られる位相差像である請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項１０】
前記撮像部は、所定時間間隔で繰り返し前記培養細胞を撮像し、
前記剥離状態判定部は、前記撮像部から繰り返し得られる前記撮像データに基づいて前記培養容器内の画像情報の変化を捉え、前記培養細胞の剥離状態を判定する請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項１１】
前記剥離状態判定部は、前記培養容器内の画像情報の変化が所定のレベルを下回った際に、前記培養細胞が剥離したことを判定する請求項１０に記載の細胞剥離判定装置。
【請求項１２】
細胞を剥離するための分解酵素を培養容器内に添加する添加部と、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置と、
前記細胞剥離判定装置からの指示に基づいて、細胞培養容器内の前記分解酵素を中和する中和部、または前記細胞剥離判定装置から前記分解酵素を除去する除去部の少なくともいずれか一方とを備える細胞培養装置。
【請求項１３】
前記中和部による前記分解酵素の中和、または前記除去部による前記分解酵素の除去が行われた後、前記細胞の継代を行う継代部をさらに備える請求項１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定方法であって、
前記培養細胞を撮像し、
撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定し、
前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する細胞剥離判定方法。
【請求項１５】
前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する請求項１４に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項１６】
細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定方法であって、
前記培養細胞を撮像し、
撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定し、
前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示し、
前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する細胞剥離判定方法。
【請求項１７】
前記輝度情報は、前記培養容器の全体の平均輝度情報、または前記培養容器の総和の輝度情報である請求項１４から請求項１６のいずれか一項に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項１８】
前記培養容器内の細胞の培養状況を表す情報を取得し、
取得した前記細胞の培養状況を表す情報に基づき、前記培養状況に応じて異なる前記輝度閾値を算出する請求項１４から請求項１７のいずれか一項に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項１９】
前記細胞の培養状況は、前記培養容器内の培養される細胞の種類、前記培養容器内の培養される細胞の密度、前記細胞の培養に用いる培地の種類、前記添加される場合の分解酵素の量、前記培養される間の湿度、前記培養される間の温度の少なくとも一つを含む請求項１８に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項２０】
前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示してから開始するまでの所定時間を算出し、
前記算出される所定時間前に、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示する、請求項１５または請求項１６に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項２１】
撮像した前記細胞の撮像データから輝度値が所定値以上となる領域を抽出し、その領域の合計面積を算出し、
算出した合計面積に基づいて前記培養容器内の輝度情報を求め、前記培養細胞の剥離状態を判定する請求項１４から請求項２０のいずれか一項に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項２２】
前記細胞の撮像データは、位相差観察法によって得られる位相差像である請求項１４から請求項２１のいずれか一項に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項２３】
所定時間間隔で繰り返し前記培養細胞を撮像し、
繰り返し得られる前記撮像データに基づいて前記培養容器内の輝度情報の変化を捉え、前記培養細胞の剥離状態を判定する請求項１４から請求項２２のいずれか一項に記載の細胞剥離判定方法。
【請求項２４】
前記培養容器内の輝度情報の変化が所定のレベルを下回った際に、前記培養細胞が剥離したことを判定する請求項２３に記載の細胞剥離判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着の剥離を判定するための細胞剥離判定装置、細胞剥離判定方法、および細胞剥離判定装置を搭載した細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
次のような剥離細胞回収装置が特許文献１によって知られている。この剥離細胞回収装置は、培養容器内にトリプシン溶液を添加した後、トリプシン処理時間があらかじめ定めた時間を経過した時点で剥離細胞を回収する。【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２３５５４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の装置によれば、トリプシンを添加してから細胞が剥離するまでの時間は、細胞の種類や周囲の温度、湿度などに依存することから一律に設定することが困難であり、さらに細胞が十分に剥離した後のトリプシン回収のタイミングが遅れた場合には細胞にダメージを与えてしまう可能性があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１の発明は、細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定装置であって、前記培養細胞を撮像する撮像部と、前記撮像部からの撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定する剥離状態判定部と、前記剥離状態判定部により前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する制御部と、を備える。
請求項３の発明は、細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定装置であって、前記培養細胞を撮像する撮像部と、前記撮像部からの撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定する剥離状態判定部と、前記剥離状態判定部により前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する制御部と、を備え、前記制御部は、前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する。
請求項１２の発明による細胞培養装置は、細胞を剥離するための分解酵素を培養容器内に添加する添加部と、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の細胞剥離判定装置と、前記細胞剥離判定装置からの指示に基づいて、細胞培養容器内の前記分解酵素を中和する中和部、または前記細胞剥離判定装置から前記分解酵素を除去する除去部の少なくともいずれか一方とを備える。
請求項１４の発明は、細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定方法であって、前記培養細胞を撮像し、撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定し、前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示する。
請求項１６の発明は、細胞培養容器内で培養された細胞である培養細胞の培養容器からの剥離状態を判定する細胞剥離判定方法であって、前記培養細胞を撮像し、撮像データに基づいて、前記培養容器内の輝度情報を求め、前記輝度情報が輝度閾値を上回った際に前記培養細胞が剥離したことを判定し、前記培養細胞が剥離したと判定される際に、前記培養容器内の分解酵素の中和または前記分解酵素の除去を指示し、前記培養容器内の輝度情報と前記輝度閾値とを比較して、前記培養容器内の分解酵素の中和、または前記培養容器内からの前記分解酵素の除去を指示するタイミングを算出する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞培養容器内の細胞の画像に基づいて細胞の剥離状態を判定するため、細胞の種類等の諸条件関わらず細胞の剥離状態を精度高く判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】細胞剥離判定装置の一実施の形態の構成を示すブロック図である。
【図２】細胞培養容器Ａの側面方向から見た場合の細胞の剥離状態の変化を模式的に示した図である。
【図３】位相差画像の具体例を示す図である。
【図４】細胞培養容器Ａにトリプシン溶液を添加してからの経過時間とハロの領域の面積比との関係を示す図である。
【図５】細胞剥離判定装置１００の処理を示すフローチャート図である。
【図６】細胞が剥離した状態を示した図である。
【図７】画像輝度に基づく判定および画像形状に基づく判定処理の流れを示すフローチャート図である。
【図８】自動培養装置２００の構成を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
図1は、本実施の形態における細胞剥離判定装置の一実施の形態の構成を示すブロック図である。細胞剥離判定装置１００は、インキュベータ１０１と、ステージ１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、制御装置１０５と、照明装置１０６と、操作スイッチ１０７と、モニタ１０８と、環境制御装置１０９とを備えている。なお、ステージ１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、制御装置１０５と、照明装置１０６は顕微鏡を構成する。【０００９】
インキュベータ１０１内は密閉されており、その内部環境は、環境制御装置１０９によって細胞の培養に適した環境に維持されている。例えば、インキュベータ１０１内のＣＯ２濃度はＣＯ２混合機１０９ａによって５％に維持され、湿度は湿度調整機１０９ｂによって９５％以上に維持され、温度は温度調整機１０９ｃによって３７℃に維持されている。また、インキュベータ１０１内には、ステージ１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、照明装置１０６とが設置されている。【００１０】
ステージ１０１には、後述するように細胞の剥離状態を判定する対象となる細胞培養容器Ａが載せられる。ここで細胞培養容器Ａは、例えば３５ｍｍディッシュが使用される。照明装置１０６は、光源として例えばＬＥＤを備えており、このＬＥＤを発光させて細胞培養容器Ａに上部から照明光（透過光）を照射する。【００１１】
顕微鏡は、対物レンズ１０３を介して、照明装置１０６から照明されている細胞培養容器Ａの透過光により、ステージ１０１上にセットされた細胞培養容器Ａ内の細胞を位相差観察法によって観察することができる。カメラ１０４は、ＣＣＤなどの撮像素子を備えており、対物レンズ１０３を通して入力される像、すなわち細胞培養容器Ａを透過する光の像を撮像して顕微鏡像を撮像（撮影）する。これによって位相差画像を取得することができる。【００１２】
制御装置１０５は、ＣＰＵ、メモリ、およびその他の周辺回路で構成され、細胞剥離判定装置１００全体を制御する。この細胞剥離判定装置１００においては、使用者は操作スイッチ１０７を操作することによって制御装置１０５に対する種々の指示を出すことができ、制御装置１０５は、使用者からの指示に応じて種々の処理を実行する。【００１３】
細胞培養容器Ａ内で細胞を培養していく過程では、継代の必要が生じた場合や保存のために凍結する必要が生じた場合に、細胞を細胞培養容器Ａから剥離する必要がある。このように、細胞培養容器Ａから細胞を剥離するためには、細胞培養容器Ａ内にたんぱく質分解酵素、例えばトリプシンをＰＢＳに混合した溶液（トリプシン溶液）を細胞培養容器Ａ内に添加（投入）する必要がある。【００１４】
細胞培養容器Ａ内にトリプシン溶液を添加すると細胞が徐々に細胞培養容器Ａの底面（容器底面）から剥離していき、使用者は細胞が十分に剥離した状態で細胞を回収して継代や凍結を行う。このとき、細胞の剥離時間が長くなると、たんぱく質分解酵素は細胞の接着面を剥離するだけでなく、細胞膜に悪影響を及ぼし細胞活性状態が悪くなることが知られている。このため、細胞を回収する際には、細胞が十分に容器底面から剥離した最適なタイミングで細胞培養容器Ａ内に培地を投入してトリプシン溶液を中和する必要がある。なお、トリプシン溶液を中和するのに変えて添加したトリプシン溶液を取り除くために培養溶液を吸引するようにしてもよいが、以下の説明ではトリプシン溶液を中和する場合について説明する。【００１５】
ここで、トリプシン溶液を添加してから細胞が十分に剥離するまでの時間は、細胞培養容器Ａ内の細胞の種類、細胞の密度、培地の種類、添加したトリプシンの量およびインキュベータ１０１内の温度や湿度など、そのときの状況によって異なる。このため、従来は使用者が顕微鏡を使用して細胞の剥離状態を確認しながら細胞の回収タイミングを判断する必要があり手間がかかっていた。また、トリプシン溶液を添加してからあらかじめ設定した所定時間が経過した時点で自動的に細胞を回収する装置も知られているが、上述したように細胞が十分に剥離するまでの時間は状況によって変化することから、一概に回収するまでの時間を決定することは困難である。【００１６】
このため、従来の装置を使用した場合に、細胞を回収するまでの時間を短く設定してしまうと細胞が十分に剥離していない状態で細胞を回収してしまうことになり、逆に、細胞を回収するまでの時間を長く設定してしまうと、トリプシン溶液の中和のタイミングが遅れ、その結果、細胞に悪影響を及ぼしてしまうという問題があった。【００１７】
このような問題を解消するために、本実施の形態における細胞剥離判定装置１００においては、制御装置１０５は、細胞培養容器Ａにトリプシン溶液が添加された後、カメラ１０４および照明装置１０６を制御して、トリプシン溶液添加後の細胞培養容器Ａを撮影した位相差画像を所定時間間隔、例えば１０秒間隔で連続して撮影する。そして、後述するように、この撮影した位相差画像を画像処理し、時間経過に伴う画像の変化を検出して細胞の剥離状態を判定する。なお、細胞培養容器Ａへのトリプシン溶液の添加は、使用者があらかじめ行っておくものとする。【００１８】
制御装置１０５は、まず、上述したように細胞の位相差画像を連続撮影するために、カメラ１０４および照明装置１０６を次のように制御する。すなわち、照明装置１０６を制御してＬＥＤを発光させ、細胞培養容器Ａに上部から照明光を照射する。そして、カメラ１０４を制御して、このときに対物レンズ１０３を通して入力される像を所定時間間隔、例えば１０秒間隔で連続して撮影する。【００１９】
制御装置１０５は、カメラ１０４から位相差画像の入力が開始されると、各位相差画像を解析し、位相差画像の時間変化に基づいて細胞の剥離状態を判定する。具体的には、制御装置１０５は、以下に説明するように、細胞の剥離状態と位相差画像内における輝度値が高い領域の面積との間には相関関係があることに着目して細胞の剥離状態を判定する。そして、細胞が十分に容器底面から剥離し、かつトリプシン溶液が細胞へ悪影響を及ぼさない最適なタイミングを判定し、最適なトリプシン溶液の中和タイミングを提示することができる。【００２０】
図２は、細胞培養容器Ａの側面方向から見た場合の細胞の剥離状態の変化を模式的に示した図である。図２（ａ）は、細胞培養容器Ａ内にトリプシン溶液を添加する前、すなわち細胞が容器底面に接着している通常の状態を示しており、図２（ｂ）は、細胞培養容器Ａにトリプシン容器を添加して所定時間経過したとき、例えばトリプシン容器を添加してから３０秒経過後の細胞の剥離状態を示している。また、図２（ｃ）は、図２（ｂ）に示す状態からさらに時間が経過し、細胞が十分に容器底面から剥離した状態を示している。【００２１】
細胞の剥離状態が図２（ａ）に示す状態にあるときには、このときに撮影される位相差画像においては全体的に小さい位相差の領域しか検出されず、連続して撮影される位相差画像間では比較的小さな位相差変化しか検出されない。これに対して、細胞培養容器Ａ内にトリプシン溶液が添加され、細胞の剥離状態が図２（ｂ）に変化すると、細胞が容器底面２ａから剥離した（浮き上がった）範囲では位相差が大きくなり、位相差画像上でこのような位相差が大きい範囲を撮影した領域が現れるようになる。この位相差画像上での位相差が大きい領域はハロと呼ばれ、このハロの領域は他に比べて極端に画像輝度値が高くなることが知られている。ハロとは像の周りに見られる光の縁取りのような現象のことを言う。【００２２】
その後、さらに細胞の剥離が進み、細胞の剥離状態が図２（ｃ）に示す状態変化すると、位相差画像内でハロの領域の面積が次第に大きくなっていく。そして、細胞が容器底面から十分に剥離した時点でハロの領域の面積は最大となり、その後はハロの領域の面積はほぼ一定となる。【００２３】
図４（ａ）は、細胞の剥離状態が図２（ｂ）に示す状態にあるときに撮影される位相差画像の具体例を示す図である。この位相差画像においては、輝度が高い領域、すなわち白い領域がハロの領域に相当する。その後、時間の経過とともに細胞の剥離が進むと、図４（ｂ）に示すようにハロの領域、すなわち白い領域の面積がさらに拡大した位相差画像が撮影される。そして、最終的に細胞が十分に剥離して図２（ｃ）に示す状態に変化すると、図４（ｃ）に示すようにさらにハロの領域の面積が拡大した位相差画像が撮影される。【００２４】
図３は、細胞培養容器Ａにトリプシン溶液を添加してからの経過時間（秒）と、上述したハロの領域の面積が細胞培養容器Ａの底面積に占める割合（面積比・％）との関係を示すグラフである。なお、本実施の形態では、位相差画像内で輝度値が所定値以上の領域をハロの領域として抽出し、抽出したハロの領域の面積の合計が細胞培養容器Ａの底面積に占める割合をハロの領域の面積比として算出するものとする。【００２５】
この図３に示すように、細胞培養容器Ａ内にトリプシン溶液を添加してから１７０秒経過するまでの間はハロの領域の面積比が増加し続けており、細胞の剥離が進んでいることがわかる。そして、１７０秒経過した時点でハロの領域の面積比が約３４％になり、その後はその比率がほぼ一定となっていることから、１７０秒以降は細胞の剥離は進んでいないものと考えられ、この間もトリプシン溶液を中和しないで放置した場合には、上述したように細胞に悪影響を及ぼしてしまうことになる。【００２６】
よってこの図３に示す例では、ハロの領域の面積比が最初に飽和状態となった時点、すなわち３４％になった時点で細胞は十分に容器底面から剥離していると判定することができ、この時点で培地を投入してトリプシン溶液を中和すればよいと判定することができる。換言すれば、ハロの領域の面積比が最初に３４％になったときが、上述した最適なトリプシン溶液の中和タイミングであると判定することができる。【００２７】
なお、細胞が十分に剥離したことを判定するために用いる閾値（図３の例では３４％）は、細胞培養容器Ａ内の細胞の種類、細胞の密度、培地の種類、添加したトリプシンの量およびインキュベータ１０１内の温度や湿度などによって変化する。したがって、制御装置１０５は、細胞の剥離状態を判定する度にこれらの細胞の培養状況を表す情報を取得して閾値を算出する必要がある。細胞培養容器Ａ内の細胞の種類、細胞の密度、培地の種類、および添加したトリプシンの量に関する情報は、使用者によって各細胞培養容器ごとにあらかじめ入力されて記録されており、制御装置１０５はこの記録された情報を読み込む。また、インキュベータ１０１内の温度や湿度については、インキュベータ１０１内に設置された不図示の温度計や湿度計から情報を取得する。【００２８】
そして、制御装置１０５は、取得した細胞の培養状況を表す情報に基づいて閾値を算出する。このとき、例えば、上記各条件を組み合わせた様々な環境下であらかじめ実験を行って、それぞれの環境下における閾値を算出しておき、制御装置１０５はこの実験によって得られた閾値の中から現在の条件に一致するものを選択して閾値として設定してもよい。【００２９】
制御装置１０５は、以上説明した細胞の剥離状態と位相差画像内におけるハロの領域の面積との間の相関関係に基づいて次のように剥離状態の判定処理を実行する。まず、連続して入力される各位相差画像に対して、輝度値が所定値以上であるハロの領域を抽出してその合計面積を算出する。そして算出したハロの領域の面積に基づいて、上述したハロの領域の面積比を算出し、算出したハロの領域の面積比と、あらかじめ算出した閾値とを比較して、ハロの領域の面積比が閾値として設定されている面積比に到達したか否かを判断する。【００３０】
制御装置１０５は、ハロの領域の面積比が閾値に到達したと判定した場合には、細胞培養容器Ａ内の細胞が十分剥離した状態になったと判定して、使用者に対してトリプシン溶液の中和を指示する。例えばモニタ１０８にトリプシン溶液の中和を促すメッセージを表示する。これによって、細胞培養容器Ａ内の細胞の剥離状態を精度高く判定することができ、さらに使用者に対して最適な中和タイミングを提示することができる。【００３１】
図５は、本実施の形態における細胞剥離判定装置１００の処理を示すフローチャートである。図５に示す処理は、使用者によって操作スイッチ１０７が操作され、ステージ１０１上にセットされた細胞培養容器Ａ内の細胞の剥離状態を判定するように指示された場合に起動するプログラムとして制御装置１０５によって実行される。なお、ステージ１０１上にセットされた細胞培養容器Ａ内には、当該指示が出される直前または直後に使用者によってトリプシン溶液が添加されるものとする。【００３２】
ステップＳ１０において、上述した位相差画像の連続撮影を開始する。すなわち、照明装置１０６を制御してＬＥＤを発光させ細胞培養容器Ａに上部から照明光を照射し、カメラ１０４を制御してこのときに対物レンズ１０３を通して入力される像を所定時間間隔、例えば１０秒間隔で連続して撮影する。その後、ステップＳ２０へ進み、上述した細胞の培養状況を表す情報に基づいて細胞の剥離状態を判定するための閾値を算出する。その後、ステップＳ３０へ進む。【００３３】
ステップＳ３０では、カメラ１０４から入力される１枚目の位相差画像を読み込んで、位相差画像内で輝度値が所定値以上であるハロの領域を抽出してステップＳ４０へ進む。ステップＳ４０では、位相差画像内から抽出したハロの領域の合計面積を算出して、ステップＳ５０へ進む。【００３４】
ステップＳ５０では、算出したハロの領域の面積に基づいて、細胞培養容器Ａの底面積に対するハロの領域の面積の比率をハロの領域の面積比として算出し、算出したハロの領域の面積比と上述した細胞の培養状況を表す情報に基づいて算出された閾値とを比較する。その結果、ハロの領域の面積比が閾値に到達したか否かを判断する。ハロの領域の面積比が閾値に到達していないと判断した場合には、ステップＳ３０に戻って次のフレームの位相差画像に対してステップＳ３０〜ステップＳ５０の処理を実行する。これに対して、ハロの領域の面積比が閾値に到達したと判断した場合には、ステップＳ６０へ進む。【００３５】
ステップＳ６０では、細胞培養容器Ａ内の細胞の剥離状態が十分剥離した状態になったと判定して、ステップＳ７０へ進む。ステップＳ７０では、ステップＳ１０で開始した位相差画像の連続撮影を終了し、ステップＳ８０へ進む。ステップＳ８０では、使用者に対してトリプシン溶液の中和を促すメッセージをモニタ１０８に表示して、処理を終了する。【００３６】
以上説明した本実施の形態によれば、以下のような作用効果を得ることができる。
（１）トリプシン溶液添加後に細胞培養容器Ａの位相差画像を連続撮影し、時間経過に伴う位相差画像の変化に基づいて細胞の剥離状態を判定するようにした。これによって、従来のように使用者が顕微鏡を使用して細胞の剥離状態を確認する手間が省け、使用者の利便性が向上する。【００３７】
（２）連続して撮影した位相差画像ごとに、細胞培養容器Ａ内全体に対するハロの領域の面積比を算出し、その面積比が所定の閾値に到達した時点で細胞培養容器Ａ内の細胞が容器底面から十分に剥離したと判定するようにした。これによって位相差観察においては、細胞培養容器Ａ内で細胞が容器底面から剥離している範囲は、位相差画像上では輝度値が高い領域、すなわちハロの領域として現れることを加味して、精度高く細胞の剥離状態を判定することができる。【００３８】
（３）細胞が十分に剥離したことを判定するために用いる閾値は、細胞の剥離状態を判定する度に、制御装置１０５が読み込む細胞の培養状況を表す情報に基づいて算出するようにした。これによって、判定対象の細胞培養容器Ａに適した閾値をその都度算出して判定に用いることができ、精度高く細胞の剥離状態を判定することができる。【００３９】
（４）細胞の剥離状態を判定した結果、細胞が十分に容器底面から剥離したと判定した場合には、そのタイミングで使用者に対してトリプシン溶液の中和を指示するようにした。これによって、使用者に対して最適な中和タイミングを提示することができ、トリプシン溶液添加後の過度な時間経過に伴う細胞への悪影響を排除することができる。また、使用者に対して細胞培養容器Ａ内からのトリプシン溶液の除去を指示した場合にも同様の効果が得られる。【００４０】
―変形例―
なお、上述した実施の形態の細胞剥離判定装置は、以下のように変形することもできる。
（１）上述した実施の形態では、細胞培養容器Ａへのトリプシン溶液の添加は使用者が手動で行うようにした。また、図５に示す処理の実行指示は使用者が手動で指示するようにした。さらに、使用者に対して最適な中和タイミングを提示し、その後、使用者が手動で細胞培養容器Ａ内に培地を投入するようにした。すなわち、図５に示す処理以外は、使用者が手動で操作する例について説明した。しかしこれに限定されず、例えば上述した実施の形態の細胞剥離判定装置１００を自動培養装置に搭載して、全ての処理を自動的に実行するようにしてもよい。【００４１】
具体的には、自動培養装置が細胞培養容器Ａごとに継代や凍結のタイミングを管理し、継代や凍結の必要が生じた細胞培養容器Ａにトリプシン溶液を自動で添加した後、その細胞培養容器Ａをインキュベータ１０１内のステージ１０２上にセットして、細胞剥離判定装置１００に対して図５に示す処理の実行を指示する。細胞剥離判定装置１００は、自動培養装置からの指示に応じて図５に示す処理を実行して細胞培養容器Ａ内の細胞の剥離状態を判定し、判定結果に応じてトリプシン溶液の最適な中和タイミングを判定する。そして、最適な中和タイミングとなった時点で、その旨を通知する信号を自動培養装置へ出力する。【００４２】
自動培養装置は、細胞剥離判定装置１００からの出力信号に基づいて細胞培養容器Ａをインキュベータ１０１内から取り出し、細胞培養容器Ａに培地を投入してトリプシン溶液を中和した後、継代や凍結などの処理を自動的に行う。これによって、本発明による細胞剥離判定装置１００を自動培養装置に適用して、自動処理実行時における細胞の剥離状態判定処理の精度を向上することができる。【００４３】
図８は、上述した自動培養装置２００の構成を示す図である。自動培養装置２００は、前述した細胞剥離判定装置１００と、細胞培養容器Ａにトリプシン溶液を添加する添加装置２０１と、細胞培養容器Ａを細胞剥離判定装置１００のインキュベータ１０１内のステージ１０２上にセットしたり取り出したりする転送装置２０２と、細胞培養容器Ａに培地を投入してトリプシン溶液を中和する中和装置２０３と、継代を行う継代装置２０４と、これらを制御する自動培養制御装置２０５などから構成される。なお、中和装置２０３に代えて、細胞培養容器Ａからトリプシン溶液を除去する除去装置２０６を備えるようにしてもよい。【００４４】
（２）上述した実施の形態では、ハロの領域の面積比が閾値に到達したと判定した場合には、細胞培養容器Ａ内の細胞が十分剥離した状態になったと判定して、使用者に対してトリプシン溶液の中和を指示する例について説明した。しかしこれに限定されず、使用者にトリプシン溶液の中和を指示してから、使用者がトリプシン溶液の中和作業を開始するまでにかかる準備時間を加味して、使用者にトリプシン溶液の中和を指示するタイミングを制御してもよい。【００４５】
すなわち、使用者がトリプシン溶液の中和作業を開始するまでにかかる一般的な準備時間をあらかじめ測定して記憶しておく。そして制御装置１０５は、連続して入力される各位相差画像におけるハロの領域の面積比の時間変化に基づいて、ハロの領域の面積比が閾値に到達する時刻を推定する。そして、その推定した時刻からあらかじめ測定した準備時間を引いた時刻を中和指示タイミングとして設定し、当該中和指示タイミングになった時点で使用者にトリプシン溶液の中和を指示するようにしてもよい。【００４６】
これによって、使用者に対して準備時間を加味して余裕をもったトリプシン溶液の中和指示を行うことができ、使用者はその指示に応じてトリプシン溶液の中和準備を始めれば、細胞培養容器Ａ内の細胞が十分剥離した状態になった最適のタイミングで中和作業を行うことができる。なお、当変形例の内容を変形例（１）に適用して、自動培養装置がトリプシン溶液の中和を開始するまでに要する準備時間を加味するようにしてもよい。【００４７】
（３）上述した実施の形態では、細胞を容器底面から剥離するために、細胞培養容器Ａ内にトリプシン溶液を添加する例について説明したが、トリプシン溶液以外の分解酵素を添加して細胞を剥離する場合にも本発明は適用可能である。【００４８】
（４）上述した実施の形態では、連続して撮影した各位相差画像に対して、ハロの領域の面積比と閾値との比較を行って細胞の剥離状態を判定するようにした。しかし、トリプシン溶液を添加する前に撮影した位相差画像と、トリプシン溶液添加後に連続して撮影される位相差画像とを比較して、トリプシン溶液添加前と添加後のハロの領域の面積変化に基づいて細胞の剥離状態を判定するようにしてもよい。【００４９】
（５）上述した実施の形態では、細胞培養容器Ａ内を位相差観察法により観察して得た位相差画像を画像処理して細胞の剥離状態を判定するようにしたが、その他の細胞観察法によって得た画像に基づいて細胞の剥離状態を判定することも可能である。【００５０】
（６）上述した実施の形態では、細胞の剥離状態を判定するために、細胞培養容器Ａの底面積に対するハロの領域の面積をハロの領域の面積比として算出し、このハロの領域の面積比と閾値とを比較する例について説明した。しかしながら、使用する細胞培養容器の規格が統一されている場合など、細胞培養容器Ａ内の面積が一定の場合には、ハロの領域の面積比を算出せず、ハロの領域の合計面積に基づいて細胞の剥離状態を判定してもよい。【００５１】
また、トリプシン溶液を添加した後に細胞培養容器内の輝度情報、例えば細胞培養容器全体の平均輝度情報または細胞培養容器の総和の輝度情報を求め、当該輝度情報が所定輝度レベルを上回った場合に細胞の剥離が完了したことを判定するようにしてもよい（画像輝度に基づく判定）。あるいは、細胞を所定時間間隔で繰り返し撮像し、繰り返し得られる撮像データに基づいて、トリプシン溶液添加後に細胞の画像情報を変化、例えば細胞形状の変化を捉え、当該画像情報の変化が所定のレベルを下回った際に細胞の剥離が完了したことを判定するようにしてもよい（画像形状に基づく判定）。【００５２】
ここで、画像輝度に基づく判定および画像形状に基づく判定の具体例について、図６および図７を用いて説明する。図６は、細胞が剥離した状態を示した図である。トリプシンを細胞培養容器Ａに注入すると培養細胞の剥離が始まり、図６の矢印で示す剥離した細胞は、細胞培養容器Ａに張り付いている（剥離していない）細胞よりも輝度レベルが高くなり、その形状は円形形状に変形する。この変形例では、これらを加味して細胞の剥離状態を判定し、トリプシン溶液の中和タイミングや培養溶液を取り除くタイミング（吸引処理タイミング）を決定する。【００５３】
図７は、画像輝度に基づく判定および画像形状に基づく判定の処理の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１２０において、細胞培養容器Ａ内の細胞の画像を撮像し、制御装置１０５が備えるメモリ内に初期画像として記憶する。その後、ステップＳ１２１へ進み、取得した初期画像を画像解析して、細胞培養容器Ａ内の細胞の輪郭、形状、輝度、およびサイズに基づいて、細胞を分類する。具体的には、円形形状の細胞、および輝度が所定輝度レベル以上の細胞を抽出する。その後、ステップＳ１２２へ進み、Ｓ１２１で抽出された円形形状の細胞の個数、および輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積を算出する。なお、より正確な測定を行うためには、輝度が所定輝度レベル以上の円形形状の細胞の面積を算出すればよい。その後、後述するステップＳ１３１へ進む。【００５４】
一方、ステップＳ１４０において、細胞培養容器Ａ内へトリプシン溶液が注入されると、細胞培養容器Ａ内での細胞の剥離が進む。そこで、ステップＳ１２３において、その剥離状態を間欠的に撮影することで、細胞の画像を順次取得し、制御装置１０５が備えるメモリ内に記憶していく。その後、ステップＳ１２４へ進み、細胞剥離判定モードとして、画像輝度に基づく判定モードと画像形状に基づく判定モードのいずれが設定されているかを判断する。なお、これらのモードは使用者によって設定される。【００５５】
使用者によって細胞剥離判定モードとして画像輝度に基づく判定モードが設定されていると判断した場合には、ステップＳ１２５へ進み、画像輝度に基づく判定モードの処理を開始して、ステップＳ１２７へ進む。ステップＳ１２７では、トリプシン溶液注入後の細胞の画像から、輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積を算出する。ここでも、より正確な測定を行う場合には、輝度が所定輝度レベル以上の円形形状の細胞の面積を算出すればよい。【００５６】
その後、ステップＳ１２８へ進み、ステップＳ１２７で算出したトリプシン溶液注入後の細胞の画像における輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積、およびステップＳ１２２で算出した初期画像における輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積の比、すなわち面積比を次式（１）によって算出する。
面積比＝トリプシン溶液注入後の細胞の画像における輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積／初期画像における輝度が所定輝度レベル以上の細胞の面積  ・・・（１）
この処理をトリプシン溶液注入後に連続して取得される各画像に対して実行し、画像間での面積比の増加率を算出する。その後、後述するステップＳ１３２へ進む。【００５７】
これに対して、使用者によって細胞剥離判定モードとして画像形状に基づく判定モードが設定されていると判断した場合には、ステップＳ１２６へ進み、画像形状に基づく判定モードの処理を開始して、ステップＳ１２９へ進む。ステップＳ１２９では、トリプシン溶液注入後の細胞の画像から、細胞の輪郭、形状、サイズ、および輝度などに基づいて、円形形状の細胞を抽出する。その後、ステップＳ１３０へ進み、抽出した円形形状の細胞の個数を算出して、ステップＳ１３１へ進む。【００５８】
ステップＳ１３１では、ステップＳ１３０で算出したトリプシン溶液注入後の細胞の画像における円形形状の細胞の個数、およびステップＳ１２２で算出した初期画像における円形形状の細胞の個数の比を次式（２）によって算出する。
個数の比＝トリプシン溶液注入後の細胞の画像における円形形状の細胞の個数／初期画像における円形形状の細胞の個数  ・・・（２）
この処理をトリプシン溶液注入後に連続して取得される各画像に対して実行し、画像間での円形形状の細胞の個数の比の増加率を算出する。その後、ステップＳ１３２へ進む。【００５９】
ステップＳ１３２では、ステップＳ１２８で算出した画像間での面積比の増加率およびステップＳ１３１で算出した画像間での円形形状の細胞の個数の比の増加率のいずれか一方に基づいて、細胞の剥離状態を判定する。すなわち、画像間での面積比の増加率または画像間での円形形状の細胞の個数の比の増加率が所定の変化率（閾値）よりも小さくなったと判定された時点で、細胞の剥離が十分に進んだと判定する。これによって、細胞の剥離が進むと細胞の剥離速度の低下に伴い、細胞の輝度の変化速度が低下すること、および細胞の形状の変化速度が低下することに着目して、精度高く細胞の剥離状態を判定することができる。【００６０】
細胞の剥離が十分に進んだと判定した場合にはステップＳ１３３へ進み、上述したトリプシンの中和、または培養溶液の吸引処理を実行して、処理を終了する。【００６１】
以上説明したように、上記実施の形態や変形例における細胞剥離判定装置は、カメラ１０４で撮像した画像の画像情報に基づいて細胞の剥離状態を判定するようにした。この画像情報は、例えば、画像の各画素の輝度情報である。この輝度情報に基づき、画像全体あるいは所定領域の輝度値を求めることができ、輝度値が所定の値より大きいか否か、あるいはこの輝度値の変化が所定の値より小さいか否かにより、細胞の剥離状態を判断することができる。また、輝度情報に基づき、輝度値が所定値以上の面積（ハロの面積）を求め、この面積が所定値以上かどうかにより細胞の剥離状態を判断することができる。【００６２】
なお、本発明の特徴的な機能を損なわない限り、本発明は、上述した実施の形態における構成に何ら限定されない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。【００６３】
次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２００６年第１４１７２５号（２００６年５月２２日出願）
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005332610.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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