(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤が周囲に乾燥固着されたリン酸カルシウムナノ結晶の凝集体からなる多孔質リン酸カルシウム粒子が、生体親和性高分子マトリックス中に多数含有されており、
前記薬剤が抗癌剤であり、
前記生体親和性高分子がアルギン酸であり、
前記多孔質リン酸カルシウム粒子が粒子径１×１０２μｍ以下、比表面積３０ｍ２／ｇ以上の球形粒子であり、
薬剤徐放性製剤が１〜３ｍｍの大きさの粒状であることを特徴とする、薬剤徐放性製剤。
【請求項２】
前記薬剤が水難溶性の薬剤であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤徐放性製剤。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムが、カルシウムとともに、あるいはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム、およびバリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種以上の二価金属を含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬剤徐放性製剤。
【請求項４】
前記抗癌剤が１４日以上放出されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤徐放性製剤。
【請求項５】
前記リン酸カルシウムナノ結晶の粒子径が１〜１×１０３ｎｍであることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の薬剤徐放性製剤。
【請求項６】
以下の工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載の薬剤徐放性製剤の製造方法。
（ａ）リン酸カルシウムナノ結晶と、抗癌剤の薬剤との水／有機溶媒分散懸濁液をスプレイドライし、薬剤を周囲に加熱固着したリン酸カルシウムナノ結晶の凝集体からなる多孔質リン酸カルシウム粒子を得る工程、
（ｂ）上記多孔質リン酸カルシウム粒子をアルギン酸の生体親和性高分子水溶液に混合分散した後、硬化水溶液に滴下し、生体親和性高分子マトリックス中に前記粒子を含有させた目視可能な大きさの生体親和性高分子粒子を作る工程、
（ｃ）上記生体親和性高分子粒子を回収・洗浄する工程、
（ｄ）上記生体親和性高分子粒子を乾燥する工程。
【請求項７】
硬化水溶液が、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、及び亜鉛から成る群から選ばれる二価金属の塩の水溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内にあって治療薬を徐々にかつ長期間にわたって放出する薬剤徐放性製剤とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬剤による治療効果を高め副作用を軽減する目的で、薬剤を必要な時に、必要な量で、必要な部位に供給する「ドラッグデリバリーシステム（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＤＤＳ）の研究が活発に行われている。ＤＤＳの主たる役割は、薬剤を一定期間にわたって一定速度で放出する徐放化（薬剤の徐放化）と、目的とする患部に選択的に輸送するターゲッティング（薬剤のターゲッティング）である。薬剤の徐放化のために、これまで様々な無機材料や高分子材料が開発されている。たとえば水酸アパタイトは生体内で緩徐に分解され、また、種々の薬剤を結合または封入できる性質を有しているため、種々の薬剤の安全なキャリアとして利用されている。
一方、アルギン酸ナトリウムやコラーゲンなどの生体親和性高分子化合物を架橋することにより得られるハイドロゲルもまたゲル内に薬剤を封入でき、また、緩徐に分解して薬剤を放出できるため、医薬のみならず、食品、化粧品にも用いられている。また、両者のハイブリッド材料も開発されている。
アパタイト／アルギン酸複合体を薬剤放出粒子として用いる報告として、Ｗ．Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１６（１９９７）２０５０−２０５１には、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を水酸アパタイト／アルギン酸複合マイクロ粒子から徐放させることが開示されている。この複合マイクロ粒子は、２００〜４００μｍの水酸アパタイト粒子をゲンタマイシン溶液に浸漬し、乾燥させることで薬剤との複合体化を行い、これをアルギン酸溶液と混合後、一軸圧縮して作製されているが、薬剤の徐放時間は２４時間程度にすぎない。Ｅ．Ｋｒｙｌｏｖａ，Ａ．Ｉｖａｎｏｖ，Ｖ．Ｏｒｌｏｖｓｋｉ，Ｇ．Ｅｌ−Ｒｅｇｉｓｔａｎ，Ｓ．Ｂａｒｉｎｏｖ，Ｊ．Ｍａｔｅｉ，Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．，１３（２００２）８７−９０では、アパタイト粒子をアルギン酸溶液と混合し、硬化水溶液に滴下・乾燥後、エタノールに分散させた薬剤（Ｂｉｏｃｉｄｅ１）を該乾燥粒子表面に滴下することによって製剤化しているが、徐放時間について、従来に比し向上しているものとの確認はできていない。Ｍ．Ｓｉｖａｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｐ．Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，６５Ａ（２００３）２２２−２２８では、珊瑚由来の水酸アパタイトとアルギン酸との混合溶液を、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）溶液に滴下・攪拌させた後に架橋剤として塩化カルシウムを加えて複合マイクロ粒子を作製している。本文献では、薬剤の複合マイクロ粒子への担持は、薬剤を溶解させたリン酸緩衝溶液に該粒子を浸漬させることによって行われており、徐放時間については０次元放出（３日程度）と記載されている。また、Ｃ．Ｃ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｒｒｉａｓ，Ｍ．Ａ．Ｂａｒｂｏｓａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，２５（２００４）４３６３−４３７３では、アパタイト／アルギン酸複合体による薬物送達（ＤＤＳ）には、薬剤の担持方法が重要であり、薬剤（酵素）をアパタイト粒子に吸着させてからアルギン酸と複合させる方法が最も徐放性に優れていたことが報告されている。
このように、薬剤をアパタイト／アルギン酸複合体へ担持させるためには様々な方法が試みられているが、その薬剤徐放性については、せいぜい数時間から数日間にすぎない。しかしながら、薬剤が抗癌剤である場合は、このような徐放性では足りず、少なくとも１４日以上の長期間の徐放性が要求される。これまで、抗癌剤の徐放製剤に関する研究も行われており、その多くは高分子素材を中心とした粒子である。代表的には酢酸リュープリンをポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）のような生体分解性高分子に封入したマイクロカプセル粒子があるが、疎水性であるが故に細胞接着性に乏しいという欠点がある。さらに、抗癌剤のなかには水難溶性のものが多く、その水溶液を調製して複合体に含浸させることが困難である。
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明の課題は、従来には望めなかった長期間の徐放が可能であり、また、徐放する薬剤が水難溶性である例えば抗癌剤のようなものであっても、同様な長期の徐放が可能な薬剤徐放性製剤とその製造方法を提供することにある。
また、本発明のさらなる課題は、骨転移した癌組織を対象とする場合にも、骨組織との親和性が優れ、骨形成を阻害せず、骨内移植に耐えられる材料強度を保持するとともに、骨欠損部位の形状に適合可能な変形特性を有している薬剤徐放性製剤とその製造方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下の発明を提供するに至った。
（１）薬剤が周囲に乾燥固着されたリン酸カルシウムナノ結晶の凝集体からなる多孔質リン酸カルシウム粒子が、生体親和性高分子マトリックス中に多数含有されており、前記薬剤が抗癌剤であり、前記生体親和性高分子がアルギン酸であり、前記多孔質リン酸カルシウム粒子が粒子径１×１０２μｍ以下、比表面積３０ｍ２／ｇ以上の球形粒子であり、薬剤徐放性製剤が１〜３ｍｍの大きさの粒状であることを特徴とする、薬剤徐放性製剤。
（２）前記薬剤が水難溶性の薬剤であることを特徴とする、（１）に記載の薬剤徐放性製剤。
（３）前記リン酸カルシウムが、カルシウムとともに、あるいはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム、およびバリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種以上の二価金属を含有することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の薬剤徐放性製剤。
（４）前記抗癌剤が１４日以上放出されることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の薬剤徐放性製剤。
（５）前記リン酸カルシウムナノ結晶の粒子径が１〜１×１０３ｎｍであることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載の薬剤徐放性製剤。
（６）以下の工程を含む、（１）から（５）のいずれかに記載の薬剤徐放性製剤の製造方法。
（ａ）リン酸カルシウムナノ結晶と、抗癌剤の薬剤との水／有機溶媒分散懸濁液をスプレイドライし、薬剤を周囲に加熱固着したリン酸カルシウムナノ結晶の凝集体からなる多孔質リン酸カルシウム粒子を得る工程、
（ｂ）上記多孔質リン酸カルシウム粒子をアルギン酸の生体親和性高分子水溶液に混合分散した後、硬化水溶液に滴下し、生体親和性高分子マトリックス中に前記粒子を含有させた目視可能な大きさの生体親和性高分子粒子を作る工程、
（ｃ）上記生体親和性高分子粒子を回収・洗浄する工程、
（ｄ）上記生体親和性高分子粒子を乾燥する工程。
（７）硬化水溶液が、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、及び亜鉛から成る群から選ばれる二価金属の塩の水溶液であることを特徴とする、（６）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、スプレイドライ処理により作製した各粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す（試料Ａ：パクリタキセルなし、試料Ｂ：パクリタキセル２．４％、試料Ｃ：パクリタキセル７．３％）。
図２は、パクリタキセル含有（２．４％）アパタイト粒子（試料Ｂ）の粒度分布測定結果を示す。
図３は、スプレイドライ処理で得られた各粒子の熱分析（ＴＧ−ＤＴＡ）を示す（試料Ａ：パクリタキセルなし、試料Ｂ：パクリタキセル２．４％、試料Ｃ：パクリタキセル７．３％）。
図４は、スプレイドライ処理で得られた各粒子のＩＲスペクトルを示す（試料Ａ：パクリタキセルなし、試料Ｂ：パクリタキセル２．４％、試料Ｃ：パクリタキセル７．３％）。
図５は、作製した粒子の圧縮前と圧縮後の形態の写真を示す（左側：圧縮前、右側：９０％圧縮後）。
図６は、硬化水溶液浸漬時間による作製した粒子の圧縮強度変化を示す。
図７は、作製した粒子の直径と強度の相関を示す。
図８は、作製した粒子のアパタイト含有量による圧縮強度変化を示す。
図９は、作製した粒子のアルギン酸濃度による圧縮強度変化を示す。
図１０は、作製したパクリタキセル含有粒子製剤のＴｗｅｅｎ−８０を添加したＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）中での薬剤溶出試験の結果を示す。
図１１は、パクリタキセル含有粒子と培養した細胞の写真を示す（（ａ）一週目、（ｂ）四週目）。
図１２は、局所治療群とコントロール群の下肢運動機能評価（Ｂ−Ｂ−Ｂスコア）結果を示す。
図１３は、局所治療群とコントロール群のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
図１４は、ラット乳癌脊椎転移モデルの病理組織切片の図を示す（左図：正常脊柱管、右図：腫瘍組織が侵入した組織）。
図１５は、ラット乳癌脊椎転移モデルの脊椎の断面図（腫瘍に冒された脊椎、Ｈ＆Ｅ染色×４０）を示す（ＳＣ：脊髄、ＶＢ：椎体、Ｔ：腫瘍）。バー＝５００μｍ。
図１６は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子の断面のＳＥＭ写真およびＥＤＸ分析を示す。
図１７は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子の膨張率を示す。
図１８は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子からのパクリタキセルの累積放出量を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００６年７月１０日に出願された日本国特許出願２００６−１８９２５９号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
以下に、本発明について詳細に述べる。
（１）薬剤徐放性製剤
本発明の薬剤徐放性製剤は、薬剤が周囲に乾燥固着されたリン酸カルシウムナノ結晶の凝集体からなる多孔質リン酸カルシウム粒子が、生体親和性高分子のマトリックス中に多数包含されていることを特徴とする。
本発明の薬剤徐放性製剤は粒状であり、その大きさは、リン酸カルシウムの混合量・生体親和性高分子濃度・滴下装置の針の径・液滴の大きさ・滴下方法・硬化水溶液の種類・濃度及び硬化時間などによって制御できるが、目視可能な大きさ、具体的には０．１〜５ｍｍ、好ましくは１〜３ｍｍ程度である。
なお、上記の「大きさ」とは、最低５個以上のゲル粒子の粒子径を測定して平均を算出することにより得られる値をいう。
本発明の薬剤徐放性製剤に包含される多孔質リン酸カルシウム粒子は、上記のようにリン酸カルシウムナノ結晶と薬剤との水／有機溶媒分散懸濁液をスプレイドライすることによって作製され、焼成は行わない。従って、焼成による比表面積の低下がなく、その比表面積は３０ｍ２／ｇ以上、好ましくは５０ｍ２／ｇ以上である。
本発明において、「リン酸カルシウム」とは、一般式Ｃａ１０（ＰＯ４Ｘ）６Ｙ２（Ｘは炭酸基または欠損を、Ｙは水酸基、炭酸基、ハロゲン基、または欠損を示す）で表される水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイトなどを含む概念である。また、カルシウムとともにまたはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム、およびバリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種以上の二価金属を含有してもよい。
前記多孔質アパタイト粒子は球形のマイクロ粒子であり、その粒子径は１×１０２μｍ以下、好ましくは１〜５×１０μｍである。
生体親和性高分子としては、たとえば、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、デキストランナトリウム、カラギーナン、ベクチン、キトサン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの誘導体からなる群より選ばれる多糖類が挙げられ、これらの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。このうち、アルギン酸ナトリウムが最も好ましい。
本発明の薬剤徐放性製剤における薬剤の含有量は徐放期間によって異なるが、リン酸カルシウム重量に対して１×１０−３〜１×１０２重量％、好ましくは１〜５×１０重量％である。
また、本発明の薬剤徐放性製剤が十分な強度を有するためには、該粒子中の多孔質リン酸カルシウム粒子の含有量は１〜５×１０重量％、好ましくは１×１０〜３×１０重量％、生体親和性高分子の含有量は１×１０−３〜１×１０重量％、好ましくは１〜３重量％とすることが例示できる。
本発明の薬剤徐放性製剤の徐放性は、生体親和性高分子の種類、生体親和性高分子の濃度、アパタイト含有量などにより制御でき、少なくとも１４日以上、好ましくは、３０日以上にわたる徐放が可能である。
（２）薬剤徐放性製剤の製造方法
本発明の薬剤徐放性製剤は、次のような方法で製造できる。
まず、リン酸カルシウムナノ結晶と薬剤との水／有機溶媒分散懸濁液をスプレイドライし、薬剤を結晶周囲に乾燥固着させ、この結晶の凝集体である多孔質リン酸カルシウム粒子を作製する。
ここで用いるリン酸カルシウムナノ結晶としては、その粒子径が１〜１×１０３ｎｍ、好ましくは１×１０〜１×１０２ｎｍのものであればよく、その製造は、例えば、水酸アパタイトナノ結晶を製造する場合、湿式法で行うことが好ましく、下式に従い行うことができる。
１０Ｃａ（ＯＨ）２＋６Ｈ３（ＰＯ４）３→Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２
薬剤を分散させる有機溶媒としては、薬剤の種類に応じて用いる有機溶媒の種類、水との比率を決定すればよいが、例えば、有機溶媒としては、エタノール、メタノール等を用いることができ、水と有機溶媒の混合比は１×１０４：１〜１：１×１０４の範囲とすればよい。
薬剤の種類としては、特に限定はされないが、水溶液の形態にしてリン酸カルシウム粒子に含浸させることが困難である水難溶性薬剤も使用できる。この内、水難溶性の抗癌剤としては、例えば、パクリタキセル、アドリアマイシン、カンプトテシン、シスプラスチン、ダウノマイシン、ピノルビン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、エトポシド、ゲフィチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸トポテカン、ドセタキソール、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、酒石酸ビノレルビン、ブスルファン、カルボコン、チオテパ、シクロホスファミド、メルファラン、リン酸エストラムスチンナトリウム、塩酸メクロレタミンオキシド、イホスファミド、ラニムスチン、塩酸ニムスチン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチンスチマラート、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、塩酸ダウノルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、バルルビシン、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フルオロウラシル、テガフール、シタラビン、塩酸ゲムシタビン、シタラビンオクホスファート、カペシタビン、レンチナン、オキサリプラチンド、キシフルリジン、カルモフール、エノシタビン、ネダプラチン、カルボプラチン、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ビカルタミド、フルタミド、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、トレチノイン、ペントスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、ソブゾキサン、トラスツズマブ、リツキシマブ、メシル酸イマチニブ、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、アスクレ、カルボクリン、キノレスパン、クレスチン、ピシバニール、およびその誘導体などが挙げられるが、これらに限定はされない。また。上記の抗癌剤は一種を用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。
スプレイドライは、例えばＢｕｃｈｉ社、ヤマト科学社、大川原工業社などの二流体ノズル及び四流体ノズルを装備した市販の装置を用いて定法により行うことができるが、表面積を大きくするために、混合液を１〜５×１０２μｍ程度の微細な液滴にし、１００〜３００℃の熱風中に噴出させ、乾燥させる。
次に得られた多孔質リン酸カルシウム球形粒子を生体親和性高分子水溶液に混合分散した後、硬化水溶液に滴下し粒状にする。製造される粒子が十分な強度を有するために、この粒子を硬化水溶液に滴下したままで、１分〜２時間程度、硬化水溶液中に浸漬することが好ましい。
生体親和性高分子水溶液としては、前記の多糖類の水溶液を用いればよい。生体親和性高分子水溶液の濃度は、製造される粒子が十分な強度を有するためには、１×１０−３〜１×１０重量％、好ましくは１〜３重量％とする。また、多孔質リン酸カルシウム粒子は、生体親和性高分子水溶液に対し、１〜５×１０重量％、好ましくは１×１０〜３×１０重量％とする。
硬化水溶液は、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、及び亜鉛から成る群から選ばれる二価金属の塩の水溶液を用いることができる。塩は無機酸、有機酸の塩のいずれであってもよく、具体的には、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化バリウム、塩化ストロンチウム、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛等を用いることができるが、塩化カルシウムが特に好ましい。硬化水溶液における二価金属イオンの濃度は、１×１０−３〜５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは２×１０−２〜２ｍｏｌ／ｌとする。また、硬化水溶液は予めｐＨ５〜８程度に調整するのが好ましい。
多孔質リン酸カルシウム球形粒子を生体親和性高分子水溶液に分散することによって、多孔質リン酸カルシウム球形粒子上に生体親和性高分子がコーティングされ、これを硬化水溶液に滴下すると、生体親和性高分子の金属塩（例えばアルギン酸カルシウム）が形成され、３次元の網目構造となりゲル化する。
多孔質リン酸カルシウム球形粒子を分散した生体親和性高分子水溶液を硬化水溶液に滴下する場合は、目的とする粒子の大きさにもよるが、滴下粒子が微細粒となるようにマイクロピペット、注射器等で滴下するのが好ましい。
最後に得られた粒子を回収・洗浄する。回収は濾過等によって行い、回収した粒子は、必要に応じてさらに分級することにより、所望の粒子径分布を有する粒子を得ることができる。
また、洗浄後、乾燥処理をすると、保存や滅菌の点で好ましい。乾燥は、例えば、０〜１００℃で６〜１２時間を行う。
（３）薬剤徐放性医薬
本発明の薬剤徐放性製剤は、少なくとも１４日以上の長期間の徐放性を発揮する。また、当該薬剤徐放性製剤は、骨内に移植しても十分な強度を持ち、骨組織と親和性が優れるという機能を有する。従って、本発明の薬剤徐放性製剤は単独で、あるいは薬学的に許容される添加物とともに薬剤徐放性医薬、特には癌治療用薬剤徐放性医薬として用いることができる。治療対象となる癌の種類は、限定はされないが、骨に病変をつくる癌、例えば、骨肉種、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などの原発性骨腫瘍、他の臓器・器官（肺、胃、乳腺、甲状腺、腎、前立腺など）の癌が骨に転移を起こした転移性骨腫瘍、骨髄腫やリンパ腫などの血液癌にも有効である。
本発明の薬剤徐放性医薬は、各種製剤形態に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
本発明の徐放性医薬が薬剤として抗癌剤を含み、上記の癌治療に用いる場合は、投与経路としては、注射による投与が好ましく、剤型が注射剤であるのが好ましい。注射による投与としては、皮下投与、腹腔内投与、動脈投与、静脈投与等が例示できる。このうち、患部付近の動脈への動脈注射又は患部への直接投与が最も好ましい。また、本発明の徐放性医薬が薬剤として抗癌剤を含み、上記の癌治療に用いる場合は、癌の治療で用いられる他の薬剤を含有させてもよい。このような薬剤としては、リピオドール等の造影剤または血管閉塞剤、スタウロスポリン等のアポトーシス誘導剤、ステロイド、シクロスポリン等の免疫抑制剤、血管新生抑制剤、モルヒネ等の痛み止めのための麻薬等が例示できる。
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。例えば、包含される薬剤の有効量ととして、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて投与するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
パクリタキセル含有多孔質アパタイト粒子の製造と粒子形態
０．２５ｍｏｌ／ｌの水酸化カルシウム懸濁液（２リットル）中に０．１５ｍｏｌ／ｌのリン酸水溶液（１リットル）を滴下してアパタイト懸濁液を合成した。合成した懸濁液を１２０℃で乾燥させてアパタイト含有量を測定し、懸濁液単位量当たりのアパタイト重量を算出した。１５０ｍｇのパクリタキセル（タキソール；和光純薬社  Ｃａｔ  Ｎｏ．１６３−１８６１４，Ｌｏｔ  Ｎｏ．ＣＥＧ１５８５，分子量８５３．９１，ａｓｓａｙ  ９７％（ＨＰＬＣ））を１００ｍｌのエタノールに分散し、５００ｍｌのアパタイト懸濁液（約６ｇのアパタイト含有量）に混合した。得られたアパタイト／パクリタキセル／エタノール懸濁液、ならびにパクリタキセルを含有していないアパタイト／エタノール懸濁液をＢｕｃｈｉ社製のスプレイドライヤーにより噴霧乾燥を行い、多孔質球形粒子を作製した（試料Ａ：パクリタキセルなし、試料Ｂ：パクリタキセル２．４％含有）。作製した粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真像を図１に示す。ＳＥＭ像より明らかなように、パクリタキセルの混合によらず、作製した粒子はいずれも球形を呈していた。１００個の粒子から測長した粒子径（直径）は試料Ａ（パクリタキセルなし）では３．３１±０．８３μｍ（最大６．１μｍ、最小１．９μｍ）、試料Ｂ（パクリタキセル２．４％含有）では３．４２±１．１３μｍ（最大９．１μｍ、最小１．８μｍ）であった。パクリタキセルの混合による粒子形態および粒子径への変化は観測されなかった。また、試料Ｂ（パクリタキセル２．４％含有）の粒度分布測定の結果を図２に示す。スプレイドライ処理した粒子はいずれも１から２０μｍに分布していることが分かる。この結果から、１０μｍ以上の粒子は測定中に凝集した結果と考えられる。また、平均粒子径は試料Ａ（パクリタキセルなし）では４．０±０．２μｍ、試料Ｂ（パクリタキセル２．４％含有）では４．０±０．２μｍであった。従って、パクリタキセルを混合することで粒度分布に違いは観測されなかった。
また、３００ｍｇのパクリタキセルを５０ｍｌのエタノールに分散し、上記と同様の方法で合成したアパタイト懸濁液２５０ｍｌ（３ｇのアパタイト含有量）に混合した。混合したアパタイト／パクリタキセル／エタノール懸濁液をＢｕｃｈｉ社製のスプレイドライヤーにより上記と同じ条件で噴霧乾燥を行い、パクリタキセル含有（７．３％）多孔質アパタイト球形粒子を合成した（試料Ｃ）。図１に試料Ｃの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像も示す。
【実施例２】
【０００７】
パクリタキセル含有量分析
実施例１で作製した各粒子中に含まれるパクリタキセル含有量をＵＶ法および熱分析法によりそれぞれ定量した。１０ｍｌの精製水／エタノール混合溶媒（５０：５０）に、試料Ｂ１３．２、１０．６、８ｍｇを分散させて溶出させたパクリタキセルを２３０ｎｍの波長で定量した。その結果、作製した粒子重量あたり２．４±０．２％含有していることが分かった。また、試料Ｃ４．２６、６．０３、７．１９ｍｇを同様の方法で定量を行った。その結果、粒子重量あたり７．３±０．４％含有していることが分かった。
また、熱分析測定の結果を図３に示す。これより、アパタイト単体（試料Ａ）の熱分析では１２００℃までなだらかな重量減少が観測された。重量減少は１１．６ｗｔ％であり、発熱は殆ど観測されなかった。パクリタキセルを含有する試料（試料Ｂ、Ｃ）では、２４２、３４７、４５５℃に発熱ピークが観測された。１２００℃までの重量減少は、それぞれ１３．６％（試料Ｂ）と１９．６％（試料Ｃ）であった。パクリタキセル含有量は、重量減少（試料Ｂ−試料Ａ、試料Ｃ−試料Ａ）の引き算により算出した。その結果、パクリタキセル含有量は２．０ｗｔ％（試料Ｂ）と８．０ｗｔ％（試料Ｃ）であった。これらの結果はＵＶ測定と良く一致していた。
【実施例３】
【０００８】
パクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子のＦＴ−ＩＲ分析
実施例１で作製したパクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子のＦＴ−ＩＲ分析の結果を図４に示す。パクリタキセルに起因する吸収ピークが１７４２、１７１１、１５７７、１３４７、１３１６、１２７６、１２４４、９０７、７７３、７０８ｃｍ−１にそれぞれ観測された。また、パクリタキセル含有量の違いによりこれら吸収ピーク強度が増加していることが明らかであった。また、１４９０、１４５３、１４２２ｃｍ−１に炭酸基に帰属できる吸収ピークが観測された。これは、炭酸基がアパタイト構造中の水酸基やリン酸基に置換していることを示すものである。
【実施例４】
【０００９】
粒子の製造と硬化水溶液中での浸漬時間による強度物性
アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製；粘度５００−６００ｃｐｓ（１ｗ／ｖ％．２０℃）、ｐＨ７．３））を用いて１％アルギン酸水溶液を調製した。セルマスター（Ａｓ  ｏｎｅ社製）により、アルギン酸ナトリウムを精製水に機械的に混合後、１２，０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離（トミー精工社製）を行い、不溶解物の除去と脱泡を行った。１０ｍｌのアルギン酸水溶液に実施例１で作製した純粋な多孔質アパタイト球形粒子（試料Ａ）１ｇを混合した。この混合溶液をマイクロピペット（２００μｌ）を用いて、硬化水溶液（２ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム溶液１００ｍｌ）中に滴下した。得られた粒子はいずれも球形の形態であった。硬化水溶液に浸漬する時間を１０分、１、２、４、２４時間と変化させて、時系列的な強度変化（圧縮試験）を検討した。テクスチャーアナライザーを用いて、精製水中にプローブを速度０．１ｍｍ／ｓで押し込み、９０％圧縮を行った。作製した粒子の外形と圧縮試験後の粒子の形態を図５に示す。
作製した２５個（時系列当たり５個）の粒子の平均粒子直径もテクスチャーアナライザーにより計算した。その平均値は２．０４±０．０３ｍｍ（最大粒子直径：２．０７ｍｍ、最小粒子直径：１．９０ｍｍ）であった。また、１０、２０、３０％の歪応力を与えた場合の強度の時系列変化を図６に示す。１０分の浸漬でも十分に扱いやすい強度を持った粒子が得られた。硬化水溶液に浸漬する時間を変化させることで圧縮強度は若干上昇した。
【実施例５】
【００１０】
粒子径による粒子の強度物性変化
実施例４と同様にして、１％アルギン酸水溶液１０ｍｌに対して純粋な多孔質アパタイト球形粒子（試料Ａ）１ｇを混合した。この混合溶液を、実施例４と同様の硬化水溶液に滴下して１０分間浸漬し、粒子の直径のみを変化させた粒子を５０個作製した。実施例４と同じ条件で圧縮強度試験を行った。図７に粒子直径と強度の相関図を示す。横軸に２ｍｍ直径で規格化した値を、縦軸に最小強度で規格化した値を示す。作製した粒子の直径は、１．４７から２．６９ｍｍの範囲である。図７に示したように直径と強度の相関は、一次関数で近似できる。回帰曲線分析の結果、Ｙ＝１．００７３Ｘ  Ｒ＝０．９５であった。材料強度が直径に依存することが明らかであった。
【実施例６】
【００１１】
アパタイト含有量による粒子の強度物性変化
実施例４と同様に調製した１％アルギン酸水溶液に対して５，１０，２０，３０，４０ｗｔ％の純粋な多孔質アパタイト球形粒子（試料Ａ）を混合し、実施例４と同様の硬化水溶液に滴下して１０分間浸漬し、粒子を作製した。得られた粒子を洗浄し、同様にテクスチャーアナライザーにより圧縮強度試験を行った。各アパタイト濃度で作製した粒子の大きさは、１．８１±０．０３、２．０２±０．０４、２．１１±０．０４、２．２１±０．０１．２．１３±０．０３ｍｍであった。大きさによる強度を補正するため、直径を２ｍｍに補正してプロットした（図８）。アパタイト含有量を増加させることで直線的に強度が高くなることが分かった。
【実施例７】
【００１２】
アルギン酸濃度による粒子の強度物性変化
１、２、３％のアルギン酸水溶液に対してそれぞれ１０ｗｔ％の純粋な多孔質アパタイト球形粒子（試料Ａ）を混合し、実施例４と同様の硬化水溶液に滴下して１０分間浸漬し、粒子を作製した。同様に圧縮強度試験を行い、２ｍｍ直径で規格化した。その結果を図９に示す。図中の％表示は歪み値である。アルギン酸濃度が増加するに従い、対荷重強度が明らかに増加した。
【実施例８】
【００１３】
硬化水溶液の違いによる粒子の強度物性変化
実施例４と同様の混合・滴下条件にて、各硬化水溶液（塩化カルシウム水溶液、塩化ストロンチウム水溶液、塩化バリウム水溶液）に１０分間浸漬させて、粒子を作製した。実施例４と同じ条件で圧縮強度試験を行った。大きさによる強度を補正するため、直径を２ｍｍに規格化した。各硬化水溶液で作製した粒子の９０％歪みに必要な荷重は、１０１６±７７、１３０３±４５、１５８４±１２６ｇであった。硬化水溶液によって、粒子の強度を増加できることが明らかであった。
【実施例９】
【００１４】
本発明の粒子製剤の薬剤徐放性試験
実施例１で作製したパクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子（パクリタキセル７．３％含有）を用いて、実施例４と同様の方法で粒子（アルギン酸濃度１％；アルギン酸水溶液に対して１０ｗｔ％アパタイト含有）を作製し、本発明の製剤として得た。得られた粒子製剤について、水／エタノール（５０／５０）を用いてパクリタキセルの溶出試験を行った。５ｍｌの溶液に１個の粒子製剤を加えて１２時間まで静置した。上清を採取し、ＵＶ測定（波長：２３０ｎｍ）を行った。その結果、粒子製剤からすべてのパクリタキセルが溶出するには、最低６時間必要であった。一方、１．３ｍｇのパクリタキセルを４ｍｌの溶液に浸漬した場合、わずか１時間以内にすべてのパクリタキセルが溶出した。従って、アルギン酸ゲルによるパクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子のコーティングは、薬剤徐放に有効であることが明らかであった。
同様に、実施例１で作製したパクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子（パクリタキセル２．４％含有）を用いて、実施例４と同様の方法で粒子（アルギン酸濃度１％；アルギン酸水溶液に対して１０ｗｔ％，２０ｗｔ％アパタイト含有）を作製した。得られた粒子（直径約２ｍｍ）中に含まれるパクリタキセル量は、水／エタノール（５０／５０）に５個の粒子を加えて上澄みのＵＶ測定（波長：２３０ｎｍ）から計算した。１０、２０ｗｔ％アパタイト含有粒子製剤には、それぞれ０．０３５ｍｇ／個及び０．０８ｍｇ／個のパクリタキセルが含有されていた。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に０．２５ｍＭのカルシウムと０．１５ｍＭのマグネシウムと０．１ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−８０を加えた溶液２０ｍｌに対して１個の粒子製剤を加えて、１、２、１２、２４時間攪拌を行った。遠心分離により上澄みを採取し、ＵＶ測定（波長：２３０ｎｍ）を行った。その結果を図１０に示す。いずれも２４時間で約２０％から３０％の徐放量であった。
【実施例１０】
【００１５】
培養癌細胞に対する粒子製剤乾燥体の有効性
培養癌細胞としてＣＲＬ−１６６６乳腺癌細胞株（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた。細胞は１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍと８０．５ｐｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎならびに８０．５Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎと１％  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（全ての製品はｆｒｏｍ  Ｇｉｂｃｏ  ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡより購入）にて、３７℃で５％  ＣＯ２加湿気圧の条件で培養した。１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でおよそ３日毎に培地交換を行った。
一方、実施例９で作製したパクリタキセル７．３％含有粒子（アルギン酸濃度１％；アルギン酸水溶液に対して１０ｗｔ％アパタイト含有）を室温にて２４時間乾燥させて乾燥体を得た。この乾燥体を上記の培養細胞と共培養した。顕微鏡下において２日目から細胞の減少を認め、その効果は４週を経過しても維持されていた。図１１に細胞培養の写真（（ａ）一週目、（ｂ）四週目）を示す。
【実施例１１】
【００１６】
本発明の粒子製剤のＩｎ  ｖｉｖｏでの有効性
（１）ラット乳癌脊椎転移モデル
ＣＲＬ−１６６６乳腺癌細胞株（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた。細胞は１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍと８０．５ｐｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎならびに８０．５Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎと１％  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（全ての製品はｆｒｏｍ  Ｇｉｂｃｏ  ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡより購入）にて３７℃で５％  ＣＯ２加湿気圧の条件で培養した。１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でおよそ３日毎に培地交換を行った。コンフルエントとなった細胞は０．０１Ｍ  ＥＤＴＡで剥がし、増殖期の細胞を、８週齢の雌Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（体重１５０−１８０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＪＡＰＡＮ）の腹側の皮下に１ｍｌ＝１×１０６個注入し、移植用固形腫瘍片を作製した。注入後１０日目の腫瘍塊を摘出し、滅菌生理食塩水中に入れて１×１×１ｍｍ大にした。ＣＲＬ−１６６６固形腫瘍片をラットの腰椎に移植し、ラット乳癌脊椎転移モデルを得た。
得られたラット乳癌脊椎転移モデルを、コントロール群と局所治療群に分けた。コントロール群のラットは腫瘍片を入れた骨孔をパクリタキセル非含有粒子製剤で塞いだ。局所治療群は実施例９で作製したパクリタキセル２．４％含有粒子（アルギン酸濃度１％、アルギン酸水溶液に対して１０ｗｔ％アパタイト含有）を投与した。下記の各試験を行い、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いてコントロール群と局所治療群を比較した。統計学的評価は、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
（２）下肢運動機能評価
各群の下肢運動機能評価をＢａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ｒａｔｉｎｇ  ｓｃａｌｅ（Ｂ−Ｂ−Ｂスコア）を用いて連日行った。Ｂ−Ｂ−Ｂスコアはラット歩容を２１点満点でスコア化したものである。ラットを５７×３８×３０ｃｍのプラスティックの囲いの中に入れて４分間観察した。腫瘍増殖の初期にはつま先や踵の回旋が見られ、２０点から１４点に相当する。神経脱落症状が出ると踏み外しや跛行が出現し、１３点から８点に相当する。脊髄圧迫が進行すると下肢の持続的な運動が見られなくなり７点から０点に相当する。すべてのテストは２重盲目試験で行った。コントロール群は先に報告されたと同様に約２週で下肢麻痺を生じて死に至った。術後１５日での平均Ｂ−Ｂ−Ｂ  ｓｃａｌｅはコントロール群が５．２日、局所治療群が１６．４日であった（図１２）。
（３）麻痺発生期間
麻痺発生までの期間を無病期間（Ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｔｉｍｅ）として、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表し、コントロール群と局所治療群で比較した。麻痺発生までの平均期間は、コントロール群と局所治療群がそれぞれ１１．８、２０．８日であり、局所投与群で有意に延長していた（Ｐ＝０．００６）。
（４）生存期間
各群の生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で表し、平均生存期間をコントロール群と局所治療群で比較した。コントロール群と局所投与群の平均生存期間はそれぞれ１４．０日と２１．６日で、局所投与群では最長で３２日と統計学的に有意な生存期間の延長を認めた（Ｐ＝０．０１４、図１３）。
以上のように、パクリタキセル含有アパタイトゲル製剤は、ラット乳癌脊椎転移モデルで脊椎麻痺の発生を有意に延長し、生存率を改善した。
（５）平均腫瘍重量（腫瘍サイズ）
骨外と骨内の腫瘍を区別して評価した。骨外腫瘍は椎体外軟部組織増殖で評価し、腫瘍の最大径（ａ）×最小径（ｂ）を求め、０．５ａｂ２＊の式から腫瘍重量（ｍｇ）を算出した。全例の骨外病変（椎体外軟部組織）腫瘍重量を下記表１に示す。実験終了時のコントロール群と局所治療群の平均腫瘍重量は、それぞれ６．１４ｇと６．０９ｇであり、統計学的有意差はなかった。
【表１】
0005273657.tif 000002
（６）骨内病変の顕微鏡観察
切開した脊柱と腫瘍を１０％  ホルマリン溶液で固定し、脱灰させ、パラフィン包埋した。腫瘍を含む脊柱を水平方向にカットした３μｍの切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）した。椎体浸潤と脊柱管内占拠の程度を評価した。Ｈ＆Ｅ染色した脊椎の横断切片では腫瘍の強い浸潤像を認め、腫瘍は脊柱管内を広汎に占拠し、脊髄を圧迫していた（図１４、図１５）。
（７）Ｘ線学的評価
実験終了時に骨融解性病変を評価するためにＳＯＦＴＥＸ  ＣＳＭ−２  ｔｙｐｅ（ＳＯＦＴＥＸ  ＣＯ．，Ｔｏｋｙｏ  ＪＡＰＡＮ）Ｘ−ｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いてＸ線学的評価を行った。現像機はＫｏｎｉｃａ  ＳＲＸ−１０１を使用した。ラットは椎体そのものが小さく、骨融解性病変の評価が困難で、Ｂ−Ｂ−Ｂ  ｓｃａｌｅによる下肢運動機能評価の方が腫瘍増殖を質的、空間時間的によく反映していた。
【実施例１２】
【００１７】
本発明の粒子製剤乾燥体のＩｎ  ｖｉｖｏでの有効性
実施例１１と同様な方法でラット乳癌脊椎転移モデル（１３０−１８０ｇのＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラットで８週齢のメス）を作製し、コントロール群、全身治療群（５ｍｇ／Ｋｇのパクリタキセルを術後１，７，１４日に尾静脈から投与）、局所治療群に分類した。局所治療群には、パクリタキセル７．２ｗｔ％含有粒子（アルギン酸濃度１％；アルギン酸水溶液に対して１０ｗｔ％アパタイト含有）の乾燥体を用いた。評価方法は、実施例１１と同様な方法にて行った。
（１）下肢運動機能評価
コントロール群のラットは平均９日で麻痺が発生し始め、平均１４．７５日で死亡した。全身治療群と局所治療群はそれぞれ平均１０．４日、１２．８日で麻痺が発生し始め、それぞれ平均１４．２２日、１７．４５日で死亡した。
（２）麻痺発生期間
単変量解析を用いて治療群（全身治療群と局所治療群）とコントロール群を比較すると、局所治療群では麻痺発生までの期間が１２．８日とコントロール群の９日と比較して有意に延長していた（Ｐ＜０．０５、Ｐ＝０．０４４）。一方、全身治療群は統計学的な有意差を認めなかった。麻痺進行の程度を実験開始から１週、１週から２週まで、２週以降に分けてＡＮＯＶＡ解析による分散分析とＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ検定を用いて３群間を評価した。１週目には３群間に有意差なかったが、１週から２週ではコントロール群と比較して全身投与群と局所投与群は有意に麻痺の進行が遅延していた（Ｐ＝０．０４６とＰ＝０．０３９）。２週目以降は局所治療群の麻痺の進行が、コントロール群と全身治療群と比較して有意に遅延していた（Ｐ＝０．００２８とＰ＝０．００２５）。
以上のように、局所投与群で有意に麻痺発生までの期間が延長しており、しかも全身治療群で認めたような抗癌剤の毒性を示す症例はなかった。
（３）生存期間と体重変化
単変量解析を用いて治療群（全身治療群と局所治療群）とコントロール群の生存期間を比較すると統計学的な有意差を認めなかった（コントロール群１４．７５日、全身治療群１４．２２日、局所治療群１７．４５日；コントロール群に対して全身治療群、局所治療群のｐ値はそれぞれ０．７８、０．１５）。
また、実験開始時のラットの平均体重は１４４．１ｇ（１２９−１８１ｇ）であった。２週目の体重が計測可能であったラットを対象として、各群の体重変化をｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔを用いて評価した。全身治療群では、コントロール群ともに実験開始時と２週で統計学的に有意な違いは認めなかったが、局所投与群は２週での体重変化が少ない傾向を示していた。一方、全身治療群とコントロール群は実験開始時と比較して体重が減少する傾向にあった（コントロール群３．２ｇ、全身治療群５．３ｇ、局所治療群０．１８ｇ；全身治療群に対してコントロール群、局所治療群のｐ値はそれぞれ０．６２、０．１６）。
【実施例１３】
【００１８】
アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製；粘度５００−６００ｃｐｓ（１ｗ／ｖ％，２０℃）、ｐＨ７．３）を１〜３％（ｗ／ｖ）の濃度で蒸留水に溶解し、アルギン酸水溶液を調製した。このアルギン酸水溶液に、実施例１と同様にして作製した５〜４０％（ｗ／ｗ）のパクリタキセル含有多孔質アパタイト球形粒子（パクリタキセル２．６％含有）を室温にて均一に混合した。水酸アパタイト−アルギン酸混合物をマイクロピペット（２００μｌ）を用いて硬化水溶液（２．０Ｍの塩化バリウム溶液）中に滴下し、２．０〜２．８ｍｍの大きさの球形ゲルを調製した。得られた水酸アパタイト−アルギン酸球形ゲルを少なくとも２４時間乾燥させ、堅固な水酸アパタイト−アルギン酸粒子を得た。この粒子をＡｘＨｙ−Ｂａ（ｘとｙはそれぞれアルギン酸濃度、アパタイト含有量を示す）と名づけた。
粒子の内部構造はプラチナにてスパッタ被覆した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）とＥＤＸにて調べた。機械特性はテクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いて調べた。圧縮強度は、速度０．１ｍｍ／ｓの円筒プローブ（５．０ｍｍ直径）を用いて測定した。粒子の膨張率は下式によってＤ−ＰＢＳ中で測定した。
膨張率＝（Ｗ０−Ｗｄ）／Ｗｄ
（式中、Ｗ０とＷｄは膨張粒子および乾燥粒子の重量をそれぞれ示す。）
パクリタキセル放出の挙動は１％  Ｔｗｅｅｎ−８０含有Ｄ−ＰＢＳ中、３７℃にて調べた。パクリタキセルの量は、移動相がアセトニトリルと水（体積比６０：４０）からなり、流速が１．０ｍｌ／ｍｉｎである高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量した。パクリタキセルはＵＶ検出器を用いて２２７ｎｍにて検出した。
図１６は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子の断面のＳＥＭ写真およびＥＤＸ分析を示す。Ａ１Ｈ４０−ＢａのＳＥＭ写真は１〜１０μｍの粒子径を有する水酸アパタイトのマイクロ粒子が粒子内に均一に分散していることを示した。Ａ１Ｈ０５−ＢａおよびＡ３Ｈ０５−Ｂａ上には、水酸アパタイトのマイクロ粒子が現れなかった。一方、ＥＤＸ分析では調べたすべての種類の粒子に水酸アパタイトのマイクロ粒子の均一な分散が示された。アルギン酸と架橋したバリウムイオンもまた粒子中に均一に分散していた。これらの結果は、得られた水酸アパタイト−アルギン酸粒子がその組成に関係なく均一であることを支持するものである。
また、水酸アパタイト−アルギン酸粒子の圧縮強度は、Ａ１Ｈ４０−Ｂａ＜Ａ１Ｈ０５−Ｂａ＜Ａ３Ｈ０５−Ｂａの順で増加した。この結果は、水酸アパタイトに対するアルギン酸の割合が大きくなるほど、圧縮強度が増加することを示す。水酸アパタイトに対するアルギン酸の割合は、水酸アパタイト含有量よりも圧縮強度により影響を与えた。本発明者らによる先の研究において、水酸アパタイト−アルギン酸粒子は圧縮したときアルギン酸のために形状が崩れやすいことが見出されている。これに対し、本発明において得られた水酸アパタイト−アルギン酸粒子はゲルの脱水に伴って堅固になることがわかった。
図１７は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子の膨張率を示す。膨張特性は粒子の組成によって異なっていた。水酸アパタイトに対するアルギン酸の割合が高いほど膨張が良好であった。この結果は、アルギン酸の強い水和性によるものであると考えられた。
図１８は、バリウムイオンで架橋した水酸アパタイト−アルギン酸粒子からのパクリタキセルの累積放出を示す。パクリタキセルは徐々に粒子から培養液に放出された。Ａ１Ｈ０５−ＢａとＡ３Ｈ０５−Ｂａの放出挙動は同じであった。Ａ３Ｈ０５−Ｂａの膨張率はＡ１Ｈ０５−Ｂａよりも高いことから（図１７）、パクリタキセルの放出挙動は粒子の膨張率には関係ないことがわかった。
Ａ１Ｈ２０−Ｂａからの放出挙動はＡ１Ｈ０５−ＢａとＡ３Ｈ０５−Ｂａはほとんど同じであったが、５時間後には、Ａ１Ｈ０５−ＢａとＡ３Ｈ０５−Ｂａはパクリタキセルの放出が認められなったのに対し、Ａ１Ｈ２０−Ｂａは依然として多くのパクリタキセルの放出していた。よって、パクリタキセルの放出挙動は水酸アパタイト−アルギン酸粒子への担持量によると考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明の薬剤徐放性製剤は、徐放性に優れ、少なくとも１４日にわたりその効能を持続させることできる。このような、本発明の薬剤徐放性製剤の従来にはない長期間にわたる徐放性効果は、薬剤をリン酸カルシウムナノ結晶の周囲に乾燥固着させたこと、その凝集体である多孔質リン酸カルシウム粒子を生体親和性高分子マトリックス中に多数含有させたことにより達成されるものと考えられる。すなわち、従来のようにナノ結晶周囲に単に薬剤が吸着されただけのものに比べ、薬剤がナノ結晶周囲に乾燥固着することによってその接着力が大きくなり、薬剤のみが離脱するのではなく結晶の崩壊により薬剤が生体内に放出される部分が多くなる。また、そのようなナノ結晶の凝集体を多数個、生体親和性高分子マトリックス中に含有させることによって、リン酸カルシウムナノ結晶の生体内での崩壊を緩和できる。
また、本発明の薬剤徐放性製剤は、骨内に移植しても十分な強度を持ち、骨組織と親和性が優れ、徐放効果も変わらない。さらに、このような薬剤徐放性製剤を製造するに当たり、スプレイドライ法を利用したことにより、水難溶性の抗癌剤をもリン酸カルシウムナノ結晶に固定できるようになったので、骨癌治療などの従来では徐放作用を利用することが出来なかった疾患に対する使用の可能性を大きく広げることができる。従って、本発明の薬剤徐放性製剤は、特に骨転移癌治療用の徐放性医薬としても非常に有用である。
【図２】
0005273657.tif 000003
【図３】
0005273657.tif 000004
【図４】
0005273657.tif 000005
【図６】
0005273657.tif 000006
【図７】
0005273657.tif 000007
【図８】
0005273657.tif 000008
【図９】
0005273657.tif 000009
【図１０】
0005273657.tif 000010
【図１２】
0005273657.tif 000011
【図１３】
0005273657.tif 000012
【図１７】
0005273657.tif 000013
【図１８】
0005273657.tif 000014
【図１】
0005273657.tif 000015
【図５】
0005273657.tif 000016
【図１１】
0005273657.tif 000017
【図１４】
0005273657.tif 000018
【図１５】
0005273657.tif 000019
【図１６】
0005273657.tif 000020