(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）スペーサーを介して腸管コレステロール吸収の阻害剤と共有結合している可能性のある重合体を含む化学抱合体の準備、
ｂ）タンパク質を含む準備された細胞の破砕、
ｃ）ｂ）からの破砕された細胞をａ）からの化学抱合体と接触させること、
ｄ）化学抱合体から、未結合タンパク質およびｂ）からの破砕された物質のその他の分子を分離すること、
ｅ）ｃ）におけるとおりの接触後に化学抱合体と安定に結合したタンパク質の溶離および、適当な場合にはさらに精製すること
を含み、ここで工程のａ）の重合体は下記の式Ｉ、IIまたはIIIの化合物：
【化１】
0005342729.tif 000008
に共有結合している、
上記タンパク質を得るための方法。
【請求項２】
細胞が哺乳動物の腸管細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スペーサーを介して、請求項１で定義された式Ｉ、IIまたはIIIの化合物と共有結合している可能性のある重合体より成る化学抱合体。
【請求項４】
式Ｉ
【化２】
0005342729.tif 000009
の化合物。
【請求項５】
式II
【化３】
0005342729.tif 000010
の化合物。
【請求項６】
式III
【化４】
0005342729.tif 000011
の化合物。
【請求項７】
準備された細胞またはそのオルガネラもしくはタンパク質画分中のタンパク質を検出するための、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項８】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物およびタンパク質を検出するための検定を実施するための試薬を含む診断用キット。
【請求項９】
化合物４−［３−（３−ブロモ−３−フェニルプロピル）−２−（４
−メトキシフェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］ベンゾニトリル。
【請求項１０】
化合物４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］ベンゾニトリル。
【請求項１１】
化合物１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オン。
【請求項１２】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の化合物を製造するための請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、コレステロールを吸収する脊椎動物腸管タンパク質に関する。このタンパク質は、高親和性架橋化合物によって識別される。本発明は、さらに腸管におけるコレステロール輸送を阻害する化合物を識別する（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）方法を実施するためのタンパク質の使用に関する。
【０００２】  ヒトにおいては、平均で約５０％のコレステロールが腸管の内腔に存在する。腔内コレステロールは、主に食物にそして胆汁に由来する。１日に約２ｇのコレステロールが胆汁から排出される。腸管コレステロール吸収は、大いに胆汁酸塩の存在に依存している。こうして胆汁酸塩の再取り込みの阻害剤または胆汁酸塩金属イオン封鎖剤の投与の効果は、腸管コレステロール吸収を阻害することである。
【０００３】  腸管コレステロール吸収の阻害は、脂質障害、アテローム性動脈硬化症または心臓血管障害の治療の重要な目的である。専門家の間の有力な意見は、腸管コレステロール吸収が物理化学的拡散によって起こるということである。
【０００４】  タンパク質が関係していることを示すコレステロール輸送に関連する多数の観察が公知である。腸管コレステロール吸収は、大きな個々の変動を受けやすい。試験管内実験からの生物化学的データは、タンパク質が腸管の小単層板状小胞と刷子縁小胞との間のコレステロール交換に関係することを示す。β−シトステロールおよびカンペステロール［これらは、メチル基（β−シトステロール）およびエチル基（カンペステロール）においてのみ異なっている］のような植物ステロールの腸管吸収において大きな差異を観察することが可能であった。ヒトにおいて、β−シトステロールは、とりわけコレステロール吸収の阻害を示した。管腔投与したとき腸管コレステロール吸収を阻害する２種の高活性化合物がある。これらの化合物は、一方ではチクエシド（ｔｉｑｕｅｓｉｄｅ）およびパマクエシド（ｐａｍａｑｕｅｓｉｄｅ）のようなサポニンから誘導される化合物であり、他方では特定の２−アゼチジノンの誘導体である。コレステロール吸収の阻害剤としての２−アゼチジノンの誘導体は、Ｃｌａｄｅｒ外、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９、３６８４−３６９３、１９９６に記載されている。本発明の目的のためには、吸収は、物質のタンパク質への結合およびこのタンパク質の助けによるこの物質の輸送を意味することを意図している。
【０００５】  いくつかのタンパク質は、今までのところコレステロール吸収に関連すると考えられてきた。しかしながら、まだ、腸管におけるコレステロール吸収に明白に関係するタンパク質は、記載されていない。このことは、特異的な腸管コレステロール吸収の阻害剤を識別するための合理的な手順の探求において多くを不利益に導く。これは、また腸管コレステロール吸収の阻害剤がすべての型の脂質障害、アテローム性動脈硬化症および心臓血管障害の治療のために特に適当であるので、特に重要である。コレステロールは、膜の脂質二重層および脂質小胞の両方におけるすべての細胞中に均一に分配される。小胞または細胞を用いた輸送測定は、そのため非常に複雑であり、干渉を受けやすい。
【０００６】  そのため腸管コレステロール吸収に関係するタンパク質を提供することは、本発明の目的である。
【０００７】  本発明はそのため、下記工程：
ａ）哺乳動物の腸管細胞またはこれらの腸管細胞の部分の準備、
ｂ）腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用し、光不安定（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）基を含む放射能標識化合物の準備、
ｃ）ａ）からの哺乳腸管細胞またはこれらの腸管細胞の部分をｂ）からの化合物と接触させること、
ｄ）ｃ）からの混合物に紫外線を照射すること、
ｅ）ｄ）におけるとおりの照射後の細胞の破砕、
ｆ）ｅ）におけるとおりの破砕後の破砕された細胞の成分の分画、
ｇ）ｆ）におけるとおりの分画後に、ｂ）からの結合化合物を含有するタンパク質を検出すること、
によって得ることができる哺乳動物の腸管組織からのコレステロール吸収タンパク質に関する。
【０００８】  腸管細胞の準備は、例えば動物からの腸管の離断およびそれに続く浄化、結合組織の酵素的破砕および単個細胞の等張緩衝溶液中での懸濁によって行うことができる。腸管細胞の準備のために適当な腸管組織は、なかんずく、屠殺後に残留している動物の相当する部分である。腸管細胞は、また、腸管の部分が手術で得られた後のヒトの腸管組織から供給されることもできる。腸管細胞はまた、細胞培養技術の適用によって本発明の目的のために供給される腸管細胞培養株より成ることもできる。腸管細胞の部分は、腸管細胞のオルガネラであることができる。オルガネラは、特に、腸管細胞の膜である。腸管細胞の膜は、これらの細胞の破砕後の分画遠心分離によって得ることができる。腸管細胞の部分は、特にまたタンパク質画分でもある。腸管細胞または腸管細胞の部分の準備は、当業者、この場合は生物化学者、にはよく知られている。特に下記の教科書を参照する：
“Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９４）、編集者：Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ”および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２０００）、編集者：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、Ｄ．Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ”。
【０００９】  本発明の好ましい態様においては、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウス、ウサギまたはハムスターからの腸管細胞が使用される。
【００１０】  腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用し、光不安定基を含む化合物として好ましく使用される化合物は、下記の式Ｉ
【化７】
0005342729.tif 000002
の化合物であり、この化合物は、放射能標識されている。
【００１１】  式Ｉの化合物の名称は、Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンジル｝アセトアミドである。
【００１２】  本発明のもう一つの好ましい態様においては、腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用し、光不安定基を含む化合物として使用される化合物は、下記の式II
【化８】
0005342729.tif 000003
の化合物であり、この化合物は、放射能標識されている。
【００１３】  式IIの化合物の名称は、４−アジド−Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンジル｝ベンズアミドである。
【００１４】  腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用し、光不安定基を含む化合物として好ましく使用されるさらに別の化合物は、下記の式III
【化９】
0005342729.tif 000004
の化合物であり、この化合物は、放射能標識されている。
【００１５】  式IIIの化合物の名称は、３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）−１−（４−｛［２−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）−アゼチジン−２−オンである。
【００１６】  式Ｉ、IIおよびIIIの化合物の合成は、本明細書中で後に実施例中の項に記載される。
【００１７】  本発明のタンパク質は、優先的に腸管コレステロール吸収の阻害剤を結合することができる。このタンパク質は、特に好ましくは、アゼチジノンまたはサポニンを結合する。コレステロールを結合することができることもまたこのタンパク質にとって好ましい。腸管コレステロール吸収の阻害は、例えば単離されたヒトまたは動物の腸管細胞、腸管細胞株、またはヒトまたは動物の腸管の部分を使用して、決定される。このことは、標識コレステロールを使用して上記の細胞上への吸収を決定することによって行われる。コレステロール上の標識は、放射能標識または別の標識より成ることができる。放射能標識として3Ｈ、14Ｃ、または当業者には公知の合成法によってコレステロールの分子構造内に挿入することができるその他の同位体を使用することが可能である。腸管コレステロール吸収の阻害剤は、腸管細胞によって吸収されるコレステロールの量を減少させる。
【００１８】  本発明の好ましい態様においては、タンパク質またはその部分は、１５０ないし２５ｋＤａのサイズを有する。特に好ましい態様においては、タンパク質またはその部分は、１５０ｋＤａないし３２ｋＤａのサイズを有する。別の特に好ましい態様においては、タンパク質またはその部分は、１５０ｋＤａないし４２ｋＤａのサイズを有する。非常に好ましい態様においては、タンパク質、特にその部分は、１４５ｋＤａのサイズを有する。
【００１９】  本発明のタンパク質のサイズにおける記載された差異は、前駆体タンパク質の最初の形成によって生じることができて、この前駆体タンパク質は、その後の加工によってサイズを異にしている部分に分けられる。タンパク質の部分は、酵素によるかまたは酵素によらない開裂、実験的操作中のタンパク質の分解またはその他の工程によって生成されることができる。
【００２０】  本発明のタンパク質の態様は、サイズ１４０−１５０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７２ｋＤａ、６５ｋＤａ、６３ｋＤａ、６０ｋＤａ、５８ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、３６ｋＤａ、３３ｋＤａ、３２ｋＤａまたは２５ｋＤａを有する。さらに別の態様においては、本タンパク質は、サイズ１４０−１５０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、９０ｋＤａ、８７ｋＤａ、８０ｋＤａまたは４１ｋＤａを有する。他の態様においてはまた、本タンパク質は、サイズ１４０−１５０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、５８ｋＤａ、３２ｋＤａを有する。特に好ましい態様においては、本タンパク質は、サイズ１４５ｋＤａを有する。タンパク質のサイズは、例えば、サイズマーカーと比較する変性ポリアクリルアミド電気泳動を使用することによって、サイズマーカーと比較する高速液体クロマトグラフィー、サイズマーカーと比較するゲルクロマトグラフィー、質量分析またはその他の方法によって、決定することができる。
【００２１】  タンパク質の好ましい態様は、グリコシル化されている。このグリコシル化された形のタンパク質は、このタンパク質をグリコシダーゼで処理したとき、タンパク質のサイズが小さくなることによって確認される。グリコシル化をチェックするための適当な方法の詳細は、当業者によって“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０（１９９９）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８９６０３−５６３−８、編集者Ｃ．Ｂｕｃｋｅ”中に見出されるはずである。
【００２２】  腸管細胞はまたはこれらの腸管細胞の部分、特に膜、と腸管コレステロール吸収の阻害剤および光不安定基を含む放射能標識化合物との接触は、例えばエッペンドルフ容器、遠心分離管またはガラスフラスコのような一般的な実験室用容器中で行うことができる。基礎となる媒質は、水溶液中に例えば緩衝物質、栄養培地成分、塩、微量元素などを含有する。
【００２３】  分子中の光不安定基は、直接隣接して位置する分子、特にタンパク質、への共有結合を生成するために使用されることができる。この目的のためには、光不安定基を有する化合物を最初に、共有結合を生成されるべき分子の直接隣に持ってくる。このことは、例えば、タンパク質の特異的阻害剤―この場合はコレステロール吸収の―として作用する別の部分によって、行うことができる。これらの分子の接触に続いて、紫外線を照射する。紫外線照射は、光不安定基を活性化させ、そして相互作用する分子、特にタンパク質、との共有結合の生成を開始する。光不安定基として適当であるものは、例えばジアジリン、アジドまたはカルボニル官能基である。
【００２４】  例えば挿入された臭化エチジウムを使用してポリヌクレオチドを可視化するためまたは実験室表面または光化学反応器（なかんずく“Ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈａｍｄｅｎ、コネチカット”から入手可能）を滅菌するために、使用されるような通常のＵＶランプを照射のために使用することができる。紫外線照射後の細胞の破砕は、細胞破砕のために通常使用される方法を用いて実施される。その例は、繰り返される凍結および融解、超音波による細胞の処理、フレンチプレスの使用または洗浄剤および酵素の添加である。細胞溶解産物のタンパク質の分画は、例えば、硫酸アンモニウムを用いる沈殿により、分画遠心分離またはクロマトグラフィー技術の適用によって実施することができる。この目的のために適当なクロマトグラフィー技術は、例えば、１または２次元の変性または未変性ポリアクリルアミド電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーである。これらの技術は、当業者にはよく知られており、例えば先に言及した“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”において詳細に扱われている。
【００２５】  分画後のタンパク質の検出は、腸管コレステロール吸収の阻害剤および光不安定基を含む化合物の放射能標識付けによって行う。この目的のために使用することができる放射性同位体は、例えば3Ｈまたは14Ｃである。適当な検出法は、例えば、タンパク質がポリアクリルアミドゲル電気泳動の助けによってポリアクリルアミドゲル上に導入された後に、Ｘ−線写真のために使用されるフィルム材料によって共有結合した化合物を含有するタンパク質を検出することである。その他の適当な検出法は、液体シンチレーション計数またはフラットベッド走査である。
【００２６】  本発明はさらに、本発明のタンパク質を含む医薬に関する。この医薬は、例えば、コレステロール取り込みまたはコレステロール排出の障害、脂質障害、アテローム性動脈硬化症または心臓血管障害の治療のために使用することができる。この医薬は、例えばこの医薬を安定化するかまたは製剤化するために必要であるその他の物質または賦形剤を含有することができる。この医薬の効果へのタンパク質の寄与は、例えば腸管内のコレステロールの結合によって起こることができる。
【００２７】  本発明はまた、コレステロール取り込みまたはコレステロール排出の障害、脂質障害、アテローム性動脈硬化症または心臓血管障害の治療のための医薬の製造のための上記のとおりのタンパク質の使用にも関する。
【００２８】  本発明はさらに、下記工程：
ａ）本発明のタンパク質の準備、
ｂ）化合物の準備、
ｃ）ａ）からのタンパク質をｂ）からの化合物と接触させること、
ｄ）ｂ）からの化合物のａ）からのタンパク質への結合の決定、
を含む、腸管コレステロール吸収を阻害する化合物を確認する方法に関する。
【００２９】  上記の方法を実施するための本発明のタンパク質の準備のために原則としてそのようなタンパク質を生成するすべての細胞、そして特に哺乳動物の腸管組織の刷子縁からの細胞、を使用することが可能である。これらの腸管細胞が得られる哺乳動物として、例えばヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは別の脊椎動物種を選択することが可能である。この準備は、このような生物の腸管の刷子縁組織からの細胞懸濁液の調製によって行うことができる。適当な腸管材料は、例えば外科手術手順によって得られる。その他の源は、屠殺後に残留する動物の部分から誘導することができる。腸管細胞株の細胞は、同程度に適当である。適当な細胞調製物を調製するためには、腸管組織に酵素処理を行って単個細胞を解放し、その後分画遠心分離を行う。得られる細胞またはオルガネラを次に適当な水性媒質中に取り込ませる。これらの水性媒質は、緩衝物質、塩、タンパク質および、加えて賦形剤を含有することができる。
【００３０】  本方法を実施するためのタンパク質の準備はまた、試験管内系を使用して行うこともできる。この目的のためには、本発明のタンパク質は、クロマトグラフィー技術の助けによって、例えば哺乳動物の腸管の刷子縁の、細胞から得ることができる。先述の方法のための化合物の準備は、例えば化学的合成によって行う。この化合物は、完了した合成プログラムからの化合物の貯蔵所および目録から得られるもののような化合物のコレクション（“化合物ライブラリー”と呼ばれる）の一部分であることができる。この化合物は、その他の場合には微生物、特に細菌、真菌または動物または植物種によって産生されたものであることができる（天然物質）。天然物質の場合には、準備は、また適当な生物からの単離によって行うこともできる。本方法を実施するためのタンパク質と化合物との接触は、しばしば水溶液中で行い、この水溶液には例えばジメチルスルホキシドまたはエタノールのような特定の比率の溶媒を混合させることができる。この水溶液は、通常また、緩衝物質、イオンまたはタンパク質、グリセロールまたはその他のもののような安定化添加剤をも含有する。例えば温度、ｐＨ、イオン条件、タンパク質または化合物の濃度、または体積についての特定の一定条件は、この接触のために有利であることができる。こうして、例えば、接触の間温度を３７℃または室温に一定に保持することは、有益であろう。この接触を実施した後の化合物のタンパク質への結合の決定は、例えば、放射能標識付けしているかまたは別の方法で標識付けしたコレステロールとの相互作用によって、タンパク質に対する化合物の親和性の尺度としてのコレステロールの置き換えを使用して、行われる。
【００３１】  本発明はまた、腸管コレステロール吸収を阻害する化合物を確認する方法を使用して腸管コレステロール阻害剤として確認することが可能である化合物を含む医薬にも関する。本発明はさらに、コレステロール取り込みまたはコレステロール排出の障害、脂質障害、アテローム性動脈硬化症または心臓血管障害の治療のための医薬を製造するための、本発明の方法によって確認された化合物の使用に関する。
【００３２】  本発明はまた、下記工程：
ａ）本発明のタンパク質を含む細胞の準備、
ｂ）スペーサーを介して腸管コレステロール吸収の阻害剤と多分共有結合している重合体を含む化学抱合体の準備、
ｃ）ａ）からの細胞の破砕、
ｄ）ｃ）からの破砕された物質をｂ）からの化学抱合体と接触させること、
ｅ）化学抱合体から、未結合タンパク質およびｃ）からの破砕された物質のその他の分子を分離すること、
ｆ）ｄ）におけるとおりの接触後に化学抱合体と安定に結合しているタンパク質の溶離および、適当な場合にはそれ以上の精製
を含む、本発明のタンパク質を得るための方法にも関する。
【００３３】  脊椎動物腸管細胞は、本発明のタンパク質を含有する細胞として使用することができる。そのような腸管細胞が得られる哺乳動物として、例えばヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウス、ウサギまたはハムスターを選択することが可能である。その準備は、腸管の刷子縁組織からの細胞懸濁液の調製によって行うことができる。適当な腸管材料は、例えば外科手術手順によって得られる。その他の源は、屠殺後に残留する動物の部分であることができる。腸管細胞株の細胞もまた適当である。単個細胞を解放するためには、腸管組織に例えば酵素処理または分画遠心分離を行う。次に、得られる細胞またはオルガネラの調製物を適当な水性媒質中に取り込ませる。これらの水性媒質は、緩衝物質、塩、タンパク質および、加えて賦形剤を含有することができる。この細胞調製物を、本発明のタンパク質を得るために破砕する。細胞の破砕は、細胞破砕のために通常使用される方法を用いて実施される。その例は、繰り返される凍結および融解、超音波による細胞の処理、フレンチプレスの使用または洗浄剤および酵素の添加である。
【００３４】  スペーサーを介して腸管コレステロール吸収の阻害剤と多分共有結合している重合体より成る化学抱合体の準備は、化学的合成によって行う。この合成の後、この抱合体を水性または有機溶媒中に取り込ませる。タンパク質のこの化学抱合体への安定な結合は、親水性または疎水性相互作用によるかまたは別の方法での親和結合によって起こることができる。タンパク質の化学抱合体へのこの結合は、適当な溶離剤を導入することによって再解除することができる。このような適当な溶離剤は、例えば高濃度の、親和性または他の相互作用との競争者として行動する物質を含む。
【００３５】  今説明したようにして生成させた破砕細胞をこの化学抱合体と接触させる。この目的のためには、化学抱合体をあらかじめクロマトグラフィーカラム内に懸濁液として導入することができる。カラムの充填後に、破砕物質をアフィニフィークロマトグラフィー材料上に負荷し、そして緩衝物質、塩、タンパク質および賦形剤、特に安定剤、可溶化剤または保存料、を含有することができる水性溶媒で溶離する。この溶離により、化学抱合体から未結合のタンパク質および本発明のタンパク質に相当しないその他の分子を分離する。破砕物質との接触後にこの化学抱合体との安定な結合に入ったタンパク質をその後溶離する。これは、例えばこの化学抱合体中に存在する阻害剤の濃度の増大を使用することによって行うことができる。これに代わる可能性は、別の腸管コレステロール吸収の阻害剤を使用することである。溶離したタンパク質は、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ポリアクリルアミド電気泳動、ゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーのような他のクロマトグラフィー技術によって、別の精製を行うことができる。
【００３６】  上記のような本発明のタンパク質を得るための好ましい方法においては、化学抱合体は、重合体、適当な場合にはリンカー、およびサポニンまたは２−アゼチジノンのシリーズの特に本発明の式Ｉ、IIまたはIIIの化合物、からのコレステロール吸収の阻害剤を含む。
【００３７】  本発明はさらに、スペーサーを介して腸管コレステロール吸収の阻害剤と恐らく共有結合している重合体を含む化学抱合体に関する。このような阻害剤は、好ましい態様においては、サポニンまたは式Ｉ、IIまたはIIIの化合物である。
【００３８】  本発明はさらに、本発明の化学抱合体に関し、この化学抱合体は、本発明の結合タンパク質を含む。
化学合成による化学抱合体の製造は、実施例に記載される。
【００３９】  本発明は、式Ｉの化合物に関する。
【化１０】
0005342729.tif 000005
【００４０】  本発明はさらに、式IIの化合物に関する。
【化１１】
0005342729.tif 000006
【００４１】  本発明はまた、式IIIの化合物にも関する。
【化１２】
0005342729.tif 000007
【００４２】  式Ｉ、IIまたはIIIの化合物は、本発明のタンパク質を検出するために使用することができる（光標識）。式Ｉ、IIまたはIIIの化合物は、また、コレステロール吸収タンパク質の阻害剤としても適当である。本発明は、そのためまた、少なくとも１つの式Ｉ、IIまたはIIIの化合物、および本発明のタンパク質を検出するための検定を実施するための試薬を含む診断用キットにも関する。
【００４３】  本発明はまた、化合物４−［３−（３−ブロモ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］ベンゾニトリル、４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンゾニトリルまたは１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オンにも関する。今言及したこれらの化合物は、式Ｉ、IIまたはIIIの化合物を製造するために使用することができる。
【実施例】
【００４４】  腸管コレステロール吸収の阻害剤を合成した（式Ｉ、IIまたはIIIの化合物）。これらの化合物は、紫外線によって他の分子、特にタンパク質、と架橋することができる光不安定基を含み、そして１Ｃｉ／ミリモルより大きい比活性を有して放射能標識付けされている。これらの化合物は、腸管コレステロール吸収のタンパク質を確認するために使用される。【００４５】実施例１
光親和性および結合研究：
ウサギの小腸の刷子縁組織からの小胞を当業者には公知の方法［Ｋｒａｍｅｒ外、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１８０３５−１８０４６（１９９３）］によって単離した。本発明の式Ｉ、IIまたはIIIの放射能標識化合物を用いる光親和性標識付けは、ラヨネツト（Ｒａｙｏｎｅｔ）  ＲＰＲ−１００型の光化学反応器（“Ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈａｍｄｅｎ、コネチカット”から入手可能）中で実施した。その刷子縁小胞（１００ないし２００μｇのタンパク質）を体積２００μｌの本化合物の１つとともに１０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）／ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝剤（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  マンニトール中、２０℃で暗所で５分間インキュベートした。刷子縁小胞の代わりにオルガネラ、特にその膜、を使用することも可能であった。本明細書中の後の記述は、これらに対応して適用される。暗所でのインキュベーションに続いて２５４ｎｍの紫外線を２０秒または６０秒照射した。次に刷子縁小胞を上記緩衝剤で２回洗浄した。タンパク質を、例えばエタノールの添加、塩または洗浄剤の添加、加熱、繰り返される凍結および融解、または当業者には公知の別の適当な方法のような一般的な技術によって沈殿させ、そしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分画した。放射能標識タンパク質は、ＬＳＣまたはフルオログラフィーによって検出可能であった。刷子縁組織からの標識タンパク質の本化合物に対する親和性は、１ないし１０ｎＭの範囲内であった。【００４６】コレステロールを吸収する腸管タンパク質の確認
小胞をウサギの腸管の刷子縁膜から調製した。これらを式Ｉ、IIまたはIIIの放射能標識化合物によって標識付けした。タンパク質を沈殿させ、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画した。【００４７】  式Ｉの化合物を使用すると、分子量１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、７２ｋＤａ、６３ｋＤａ、５８ｋＤａ、４１ｋＤａ、３２ｋＤａおよび２５ｋＤａを有するタンパク質を標識付けすることが可能であった（図１ａ）。式IIの化合物を使用すると、分子量１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、８７ｋＤａおよび４１ｋＤａを有する化合物を標識付けすることが可能であった。最大組み込みは、分子量１４５ｋＤａを有するタンパク質によって示された。分子量１４５ｋＤａ、９７ｋＤａ、５８ｋＤａおよび３２ｋＤａを有するタンパク質が内在性膜タンパク質であることは、非イオン性または双性イオン性洗浄剤および炭酸ナトリウムを用いた可溶化実験によって示すことが可能であった。タンパク質の分子量は、用いられるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって引き起こされるがまた他の相当する方法についても公知である、特定範囲の不確定度を仮定して記載されている。分子量の変動は、＋／−１０％までの範囲内である。記載された値は、多数の実験の平均値を表す。記載された分子量１４５ｋＤａを有するタンパク質の場合には、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって相互に独立して実施した１０の実験における分子量の決定は、結果として標準偏差＋／−７．５５ｋＤａを有する平均値１４５．３ｋＤａとなった。【００４８】  さらに別の光標識付け研究を公知のコレステロール吸収の阻害剤を用いて実施した。Ｓ３３０２の誘導体類をこの目的のために製造した。化合物Ｓ３３０２は、コレステロール阻害剤ＳＣＨ  ４８４６１のラセミ化合物である。この化合物は、ウサギ、ハムスター、イヌ、アカゲザルおよびヒトにおいて腸管コレステロール吸収を非常に効果的に阻害する［Ｄａｖｉｓ外、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１０９、１６２−１６３（１９９４）；Ｂｅｒｇｍａｎ外；XII  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｒｕｇｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９５）］。化合物ＳＣＨ  ５８２３５（今言及した参考文献）には、ハムスターにおいて直接比較して５０−倍に増大された効果が示されている。この効果は、Ｒ２位における付加的な（３Ｓ）−ヒドロキシル基の導入によって説明される。生体内実験においてＳＣＨ  ５８２３５と同様の活性を示すＳＣＨ【００４９】  ４８４６１の類似水素誘導体（＝Ｓ６５０３）を製造することができた。Ｓ６５０３は、コレステロール吸収に関するその強い生体内効果に類似して、Ｓ３３０２と比較して分子量１４５ｋＤａを有するタンパク質の標識付けのより大きな阻害を引き起こす。使用したコレステロール吸収の阻害剤のいずれも、生体内実験において胆汁酸塩、グルコース、オリゴペプチド、アラニン、脂肪酸またはＮａ+／胆汁酸塩輸送経路に関して顕著な効果を示さなかった。【００５０】  大量のコレステロールを含む食餌を１０日間与えられたウサギから単離した刷子縁膜を用いた光親和性研究は、分子量１４５ｋＤａを���するタンパク質の明確により大きな標識付けを示した（図２）。【００５１】  腸管コレステロール吸収を引き起こすタンパク質を製造することが可能であったことは、上記の記載から明らかである。こうして本発明の目的を達成することが可能であった。【００５２】実施例２
重合体および腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用する化合物の化学抱合体の準備
腸管コレステロール吸収の阻害剤として作用する化合物、特に本発明の式Ｉ、IIまたはIIIの化合物、のアミノアルキル誘導体（５−１００マイクロモル）を１−５ｍｌの緩衝剤／０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）に溶解させた。例えばスペーサーとしてＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−活性化ヘキシルカルボン酸を有するハイ−トラップ（Ｈｉ−Ｔｒａｐ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような、スペーサーを有するかまたは有しない活性化されたカルボキシル基を含有する高分子保持体を製造業者の使用説明書に従って抱合のために調製した。活性化したマトリックスを上記のコレステロール吸収阻害剤のアミノアルキル誘導体の溶液とともに０．５−５時間インキュベートした。次に未反応の活性化されたカルボキシル基を各々５−１５ｍｌの下記の緩衝剤：
０．５Ｍ  エタノールアミン／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）
０．１Ｍ  酢酸ナトリウム／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）
で数回逐次洗浄することによって中和させた。次にこの抱合体カラムを１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）／１％ｎ−オクチルグルコシドで洗浄することによってアフィニティークロマトグラフィーのために調製した。【００５３】アフィニティークロマトグラフィーによるコレステロール吸収阻害剤に対する結合タンパク質の濃縮
例えば腸管細胞からの刷子縁膜のようなコレステロール輸送タンパク質を含有する細胞からの生体膜（２−２０ｍｇのタンパク質）を、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．４）／１％ｎ−オクチルグルコシド中タンパク質濃度０．５−２．５ｍｇ／ｍｌで４℃で１時間可溶化させた。残留する粒状物質を遠心分離によって除去した後、可溶化した膜タンパク質を含有する透明な上澄み液を上記の抱合体カラム上に負荷して、タンパク質の溶離に続いてＵＶ吸収を行った。遅延していない（ｕｎｒｅｔａｒｄｅｄ）タンパク質を洗い落とした後、カラムに付着しているコレステロール吸収阻害剤に対する特異結合タンパク質を、１−１０ｍＭの濃度でコレステロール吸収阻害剤を含有するかまたは１−５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性洗浄剤を含有する溶液を適用することによって溶離した。次にこれらの溶出液中のコレステロール吸収阻害剤に対する結合タンパク質を電気泳動分画によって分離して、それらの分子サイズを決定した。それらのアミノ酸配列は、適当なタンパク質バンドを切断することにより当業者にはよく知られている方法による塩基配列決定によって決定することができ、または個々のタンパク質に対する抗体は、種々の動物種において、分画されたタンパク質を含有するゲル片の皮下沈着によって出現させることができた。【００５４】実施例３
式Ｉ、IIまたはIIIの化合物、および式Ｉ、IIまたはIIIの化合物の放射能標識誘導体の製法を以下に説明する：
４−［３−（３−ブロモ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンゾニトリル
１６．０ｇの４−［２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソ−３−（３−フェニルプロピル）アゼチジン−１−イル］ベンゾニトリルを１８０ｍｌのテトラクロロメタンに溶解させ、９．４ｇのＮ−ブロモスクシンイミドおよび９４０ｍｇの過酸化ベンゾイルを加えた。混合物を撹拌しながら加熱して還流させ、そして薄層クロマトグラフィーによって監視した。反応は、約３０−５０分後に完了した。この溶液を室温で酢酸エチルと混合してから、飽和重亜硫酸ナトリウム溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして真空で濃縮した。残留物を、移動相として酢酸エチル／ヘプタン＝１：２を用いてシリカゲル上で精製した。臭化物を粘稠油状物として得た。
ＭＳ（ＦＡＢ）：４７７（Ｍ１＋Ｈ+）、
４７５（Ｍ２＋Ｈ+）［Ｃ26Ｈ23ＢｒＮ2Ｏ2Ｍ＝４７５］。【００５５】  ４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンゾニトリル
１７ｇの４−［３−（３−ブロモ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンゾニトリルを５００ｍｌのジオキサンに溶解させ、そして３４ｍｌの〜４０パーセントトリフルオロ酢酸テトラブチルアンモニウム溶液を添加した後に２４時間加熱して還流させた。混合物を約半分の体積まで濃縮し、水およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルと混合し、そして各相に分離した。有機相を濃縮して、残留物を５００ｍｌのエタノールおよび２００ｍｌの濃アンモニアとともに室温で１時間撹拌した。その後それを真空で再濃縮して、粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／メタノール＝３０：１を用いてシリカゲル上で精製した。アルコールを油状物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：４１３（Ｍ＋Ｈ+）、３９５（Ｍ＋Ｈ+−Ｈ2Ｏ）［Ｃ26Ｈ24Ｎ2Ｏ3Ｍ＝４１２］。【００５６】１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オン
７ｇの４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンゾニトリルを２００ｍｌのエタノールに溶解させ、そして１５ｍｌの濃アンモニアを添加した後に５０バールの水素下で７ｇの５０％水性ラネーニッケルで水素化した。吸引濾過によって触媒を除去し、溶媒を真空で除去した後に得られた粗生成物を、ジクロロメタン／メタノール／アンモニア＝２００：１０：１を用いてシリカゲル上で精製した。アミンを得た。ＭＳ（ＦＡＢ、＋ＬｉＣｌ）：４２３（Ｍ＋Ｌｉ+）  ［Ｃ26Ｈ28Ｎ2Ｏ3Ｍ＝４１６］。【００５７】４−アジド−Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］ベンジル｝ベンズアミド
１４０ｍｇの１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オンを５ｍｌのジオキサンに溶解させ、０．１ｍｌのトリブチルアミンを加えた。この混合物にやわらかな光下で８８ｍｇの４−アジド安息香酸スクシンイミドエステルを加え、続いて約１時間室温で撹拌した。濃縮後に残留する粗生成物を、移動相として酢酸エチル／ヘプタン＝１：１を用いてシリカゲル上で精製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：５６２（Ｍ＋Ｈ+）、５４４（Ｍ＋Ｈ+−Ｈ2Ｏ）［Ｃ33Ｈ31Ｎ5Ｏ4Ｍ＝５６１］。【００５８】  放射能標識ベンズアミドを、トリチウム−または14Ｃ−標識アジド安息香酸活性化エステル（Ａｍｅｒｓｈａｍから）を使用して高度に希釈して小規模で同様にして得て、未標識４−アジド−Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンジル｝ベンズアミドとともに薄層クロマトグラム中で同時溶離した。【００５９】Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］−ベンジル｝アセトアミド
１００ｍｇの１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オンを２０ｍｌのメタノールに溶解させ、０．３ｍｌのピリジンを加え、続いて０．３ｍｌの無水酢酸を加えた。反応は、室温で３０分後に完了し、真空での濃縮の後、移動相として酢酸エチルを用いてシリカゲル上で精製を実施した。ＭＳ（ＥＳＩ）：４５９（Ｍ＋Ｈ+）、４４１（Ｍ＋Ｈ+−Ｈ2Ｏ）［Ｃ28Ｈ30Ｎ2Ｏ4Ｍ＝４５８］。【００６０】  放射能標識アセトアミドを、トリチウム−または14Ｃ−標識無水酢酸を使用して高度に希釈して小規模で同様にして得て、未標識Ｎ−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−（４−メトキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］ベンジル｝アセトアミドとともに薄層クロマトグラム中で同時溶離した。【００６１】３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）−１−（４−｛［２−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）アゼチジン−２−オン
１００ｍｇの１−（４−アミノメチルフェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）アゼチジン−２−オンを５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させ、やわらかな光下で６０−７０℃で６時間トルエン−４−スルホン酸２−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エチルとともに攪拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出した後、溶媒を真空で除去した。その後、乾燥トルエンを加えて、混合物を真空で２回濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／メタノール＝２０：１を用いてシリカゲル上で精製した。
ＭＳ（ＥＳＩ）：４９９（Ｍ＋Ｈ+）［Ｃ30Ｈ34Ｎ4Ｏ3Ｍ＝４９８］。【００６２】  放射能標識アゼチジノンを、トリチウム−または14Ｃ−標識ジアジリンを使用して同様にして得て、未標識３−（３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４−（４−メトキシフェニル）−１−（４−｛［２−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）アゼチジン−２−オンとともに薄層クロマトグラム中で同時溶離した。【００６３】図面の説明
図１ａ、１ｂ：
放射能標識付けした式ＩまたはIIの化合物を用いたウサギの刷子縁膜のタンパク質の標識付け。タンパク質を沈殿させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画した。放射能の量を定量フルオログラフィーによって決定した。適用点からのｃｍでの距離を図形の水平軸上にプロットし、そして3Ｈ  ｄｐｍでの計数の結果を垂直軸上にプロットした。図１ａは、上部においては放射能標識した式IIの化合物を用いた標識付けおよびフルオログラフィーによる検出後の放射能の分布を示す。式Ｉの化合物を図１ａにおける標識付けのために使用し、そして式IIの化合物を図１ｂにおいて使用した。
特異的に標識付けしたタンパク質は、ピークから明らかである。【００６４】図２ａ、２ｂ：
ウサギに、高濃度のコレステロールを含有する食餌を１０日間与えた。その後、これらの動物の刷子縁膜からの小胞を調製して、その後上記のとおりの式ＩまたはIIの化合物で処理し、次にタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画した。放射能の量を定量フルオログラフィーによって決定した。適用点からのｃｍでの距離を図形の水平軸上にプロットし、そして3Ｈ  ｄｐｍでの計数の結果を垂直軸上にプロットした。式Ｉの化合物を図２ａにおける標識付けのために使用し、そして式IIの化合物を図２ｂにおいて使用した。
分子量１４５ｋＤａを有するタンパク質の特異的標識付けを得た。【００６５】省略形：
ｈ                  時間（単数および複数）
ＬＳＣ              液体シンチレーション計数
ＭＳ（ＦＡＢ）      質量スペクトル（高速原子衝突）
ＭＳ（ＥＳＩ）      質量スペクトル（エレクトロスプレーイオン化）
Ｍ                  質量
【図面の簡単な説明】
【図１】  放射能標識付けした式Ｉまたは式IIの化合物を用いて標識付けして得たウサギの刷子縁膜のタンパク質の放射能の量を定量フルオログラフィーによって決定した結果を示し、適用点からのｃｍでの距離を図形の水平軸上にプロットし、そして3Ｈ  ｄｐｍでの計数の結果を垂直軸上にプロットした。ここで式Ｉの化合物を１ａにおける標識付けのために使用し、そして式IIの化合物を１ｂにおける標識付けのために使用した。１ａの上部は、放射能標識付けした式IIの化合物を用いた標識付けおよびフルオログラフィーによる検出後の放射能の分布を示す。
【図２】  高濃度のコレステロールを含有する食餌を１０日間与えたウサギの刷子縁膜からの小胞を調製し、式Ｉまたは式IIの化合物で標識付けしたタンパク質の放射能の量を定量フルオログラフィーによって決定した結果を示し、適用点からのｃｍでの距離を図形の水平軸上にプロットし、そして3Ｈ  ｄｐｍでの計数の結果を垂直軸上にプロットした。ここで式IIの化合物を２ａにおける標識付けのために使用し、式IIの化合物を２ｂにおける標識付けのために使用した。
【図１】
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【図２】
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