(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式
【化１】
0005251125.tif 000015
（この一般式は単に組成を示す。式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同じであっても異なってもよく、鎖の途中にカルボニル基を有していてもよい炭素数が１〜１８の炭化水素鎖を表し、Ｒ３は天然核酸又は非天然核酸を表し、Ｘ１及びＸ２は、−Ｎ−を表し、Ｘ３はアミノ酸残基若しくはオリゴペプチド残基を表し、Ｙ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＺは共にポリペプチド残基又はオリゴペプチド残基を構成し、ｍは１以上ｎは０以上でｍ＋ｎが２〜５０の整数を表し、ｌは０以上の整数を表す。）で表されるユニバーサル塩基含有ポリマー。
【請求項２】
ＤＮＡ又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドを含む溶液に請求項１に記載のユニバーサル塩基含有ポリマーを混合することによりこれらの塩基対を形成させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＤＮＡ又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドと塩基対を形成することのできる新規なユニバーサル塩基含有ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然核酸塩基と非特異的に擬似塩基対を形成する人工核酸塩基、即ちユニバーサル塩基を得る試みは多く成されている。しかし、一般にユニバーサル塩基と呼ばれているものはインターカレーターの類であり、これは天然核酸塩基と疑似塩基対を形成することはない。一方、疑似塩基対を形成するユニバーサル塩基としてイノシンをベースとした誘導体が知られているが（特許文献１、２等）、グアニンとしてのみふるまうことが最近の研究で明らかとなっている（非特許文献１）。
本発明において、発明者がユニバーサル塩基のベースとして利用したピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4,5,7-テトラオン及びその誘導体は、天然核酸塩基と疑似塩基対を形成するとは考えられていなかった（非特許文献２）。【０００３】
【特許文献１】特表2005-511096
【特許文献２】特表2003-528883
【非特許文献１】Ohtsuka, E. et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608(1985)
【非特許文献２】Niess, R., Robins, R. K. J.Heterocyclic. Chem.,7, 243-244(1970)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の核酸塩基と塩基対を形成可能なユニバーサル塩基から成るオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル核酸としての機能の実現には至っていなかった。
本発明は、ＤＮＡ又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドと非特異的に塩基対を形成するポリマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、既にピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4,5,7-テトラオンに基づいて、４種のいずれの天然核酸塩基と非特異的に塩基対を形成することが確認された下式
【化２】
0005251125.tif 000002
（式中、Ｒは、水素原子を除く、一価の基を表す。）で表されるユニバーサル塩基を用いて、これをＰＮＡ（1991年にNielsenらにより開発された人工核酸で、N-2-アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造を持つ。）に結合させ単量体とし、これを重合してポリマーを合成することに成功した。【０００６】
即ち、本発明は、下式
【化１】
0005251125.tif 000003
（この一般式は単に組成を示す。式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同じであっても異なってもよく、鎖の途中にカルボニル基を有していてもよい炭素数が１〜１８の炭化水素鎖を表し、Ｒ３は天然核酸又は非天然核酸を表し、Ｘ１及びＸ２は、−Ｎ−を表し、Ｘ３はアミノ酸残基若しくはオリゴペプチド残基を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ及びＺは共にポリペプチド残基又はオリゴペプチド残基を構成し、ｍは１以上ｎは０以上でｍ＋ｎが２〜５０の整数を表し、ｌは０以上の整数を表す。）で表されるユニバーサル塩基含有ポリマーである。
更に、本発明は、ＤＮＡ又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドを含む溶液にこのユニバーサル塩基含有ポリマーを混合することによりこれらの塩基対を形成させる方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のユニバーサル塩基含有ポリマーは下式で表される。但し、この一般式は単に組成を示し、構造を示すものではない。即ち、各単位はランダムに結合していてもよい。
【化１】
0005251125.tif 000004
Ｒ１及びＲ２は、ポリマーの主鎖にユニバーサル塩基、天然塩基又はその他の基を結合させるための２価の鎖であり、その機能を果たせば構造に特に制限はない。即ち、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同じであっても異なってもよく、置換基を有していてもよい炭素数が１〜１８の炭化水素鎖を表す。置換基としては、水酸基、アミノ基、チオール基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバモイル基、エステル基、ヘテロ原子（Ｓ，Ｏ，Ｎなど）を含んでもよい炭化水素基、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基などなどが挙げられ、また、鎖の途中にカルボニル、イミド、カーボナート、エステル、ウレタン、アミド、アミン、エーテル、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン等を有していてもよい。【０００８】
このポリマーは塩基対を形成するためにユニバーサル塩基のみを有していてもよいが、天然核酸や本発明のユニバーサル塩基以外の非天然核酸を有していてもよい。
Ｒ３は天然核酸又は非天然核酸を表す。天然核酸としては、下式
【化３】
0005251125.tif 000005
（式中、＊は結合手を表す。）に示すようなアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）に適当な結合手を設けたものでもよい。また、非天然核酸としてイノシンをベースとしたユニバーサル塩基（特表2005-511096、特表2003-528883等）を用いてもよい。【０００９】
Ｘ１及びＸ２は、上記のユニバーサル塩基や、天然核酸又は非天然核酸をポリマー主鎖に結合させるものであり、−Ｎ−を表す。
【００１０】
Ｘ３は、アミノ酸残基若しくはオリゴペプチド残基である。
【００１１】
Ｙ及びＺは、ポリマーの末端であり、特に制限はない。即ち、Ｙ及びＺは、それぞれ同じであっても異なってもよく、一価の残基を表す。
Ｙ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＺは共にポリペプチド残基又はオリゴペプチド残基を構成する。
【００１２】
本発明のユニバーサル塩基含有ポリマーに含まれるユニバーサル塩基は、その結合を軸とした回転により、プリン型、ピリミジン型の両塩基になりうる。即ち、下式に示すように、相対する塩基がアミジン型の塩基であるアデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）の場合はアミド型の配置、アミド型塩基であるグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）の場合はアミジン型配置をとり、すべての天然核酸塩基と塩基対を形成することができる。
【化４】
0005251125.tif 000006
（式中、Ｒ１は、上記と同様を表す。）
従って、本発明のユニバーサル塩基含有ポリマーはＤＮＡ又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドと非特異的に塩基対を形成することができる。
本発明のユニバーサル塩基含有ポリマーをＤＮＡ等と塩基対を形成させる場合に用いる溶媒は、一般的には非プロトン性有機溶媒が好ましいが、生体内で使うことを想定した場合には緩衝液、オリゴヌクレオチドの合成や利用を考えた場合は水やアルコール、ヌクレオシドの吸着を考えた場合にはＤＭＳＯやＤＭＦが好ましい。この塩基対形成においてはユニバーサル塩基含有ポリマーやＤＮＡ等の濃度は通常１ｍＭ程度である。
【実施例】
【００１３】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
ユニバーサル塩基含有オリゴマーを合成するため、ユニバーサル塩基（化２）をＰＮＡに結合させて単量体とした。即ち、下式（化５）で表されるユニバーサル塩基含有モノマー（以下「PPT」という。）を用いた。このモノマーの合成法は後記の合成例１に記す。
【化５】
0005251125.tif 000007
【００１４】
次に天然塩基として下式のPNA-A〜T（アプライドバイオシステムズジャパン社製、PNA-A:GEN063014, PNA-G:GEN063016, PNA-C:GEN063015, PNA-T:GEN063017）（以下「PNAモノマー」という。）を用いた。
【化６】
0005251125.tif 000008
* Fmoc: fluorenylmethyloxycarbonyl, Bhoc: benzylhydroxycarbonyl【００１５】
実施例１
ユニバーサル塩基含有オリゴマーを、マニュアル固相合成法にて合成し、固相担体は TENTA GEL S RAM(渡辺化学社製A00213、0.27 mmol/g)を用いた。合成オリゴマーの溶解性の向上と自己会合の抑制を図るためにリシンを導入した。固相担体を30% piperidine/DMF 処理後、Fmoc-Lys(Boc)-OH（渡辺化学社製、K00443）(10 equiv)、PyBOP（(benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate、Novabiochem社製 01-62-0016）(10 equiv)、HOBt(1-hydroxybenzotriazole、Nacalai tesque社製 18513-24)(10 equiv)、Nメチルモルホリン(NMM,20 equiv)をあらかじめジメチルアセトアミド（DMA、和光純薬工業社製）中で反応させておいたものを用いてカップリングさせることによりリシンを導入した。反応の進行はKaiser test により確認した。(Kaiser test: negative)【００１６】
続く固相合成は表１に従って行った。反応は全て室温(25℃)で行った。
【表１】
0005251125.tif 000009
step 1〜6を繰り返すことにより鎖長反応を行った。この鎖長反応において、PNAモノマー(PNA monomer)として、1-3サイクルは上記PNA-T、4サイクルは上記ユニバーサル塩基含有モノマー、5-7サイクルはPNA-Tを使用した。【００１７】
各反応の進行は、kaiser test により確認した。最後のモノマーを導入・Fmoc 基の脱保護後、N 末端アミノ基のアシル転位からの環状アミド生成による自己崩壊を防ぐために、Fmoc-Gly-OH（NovaBiochem社製、04-12-1001）(10 equiv)、PyBOP(10 equiv)、HOBt(10 equiv)、NMM(20 equiv)を用いてグリシンを導入した。固相担体から切り出した後の合成オリゴマーの精製を容易にするために、グリシンの Fmoc 基はそのままにしておいた。
固相担体からの切り出しにはトリフルオロ酢酸を用いた(2 h)。これによりC末端のリシンのアミノ基を保護しているBoc 基も除去できた。得られたオリゴマーを、逆相分取カラム COSMOSIL 5C18-AR-300を用いることにより精製し、下式で表されるH2N-Lys-TTT(PPT)TTT-Gly-NHFmoc(m/z 1179.66; Calcd for(C101H124N34O34)(M + 2H+): m/z 1179.45)を得た。
【化７】
0005251125.tif 000010
【００１８】
さらに得られたオリゴマーを 20% piperidine/water で処理し Fmoc基を脱保護した後に、上記同様の逆相分取カラムを用いて精製することにより、目的とする PNA オリゴマー H2N-Lys-TTT(PPT)TTT- Gly-NH2(m/z 1068.63; Calcd for(C86H114N34O32)(M + 2H+): m/z 1068.42)を 47%の収率で得ることができた。
精製後のこのオリゴマーの高速液体クロマトグラフ(HPLC)を下記条件で測定した。
HPLC装置：日本分光社製Gulliver高圧グラジエントシステム
カラム：COSMOSIL 5C18-MS column
溶出液：溶出液A 0.1% TFA/water; 溶出液 B 0.1 % 
trifluoroacetic acid/acetonitrile を用い、A液をB液に対して0-100% まで35分かけて直線勾配した。
溶出速度 1 mL/分
分析温度：55℃
UV検出波長UV： 260 nm
そのHPLCチャートを図１に示す。図中の大きなピークが目的のオリゴマーを示すものであり、他のピークはほとんど検出されないことから、得られたオリゴマーの純度が高いことが分かる。【００１９】
実施例２
本実施例では、実施例１と同様に、下式（H2N-Lys-CCT(PPT)TCC-Gly-NH2）で表されるユニバーサル塩基含有オリゴマーを合成した。
【化８】
0005251125.tif 000011
【００２０】
モノマーとしては、上記PPT(ユニバーサル塩基含有モノマー）とPNAモノマーを用い、固相合成を表２に従って行った。
【表２】
0005251125.tif 000012
1,2,6,7サイクルはPNA-C、3,5サイクルはPNA-T、4サイクルはユニバーサル塩基含有モノマーを使用した。
質量分析の結果はm/z 1038.5; Calcd for (C82H110N38O28) (M+2): m/z 1038.4であった。
このオリゴマーのHPLCを実施例1と同様に測定した。そのHPLCチャートを図２に示す。図中の大きなピークが目的のオリゴマーを示すものであり、他のピークはほとんど検出されないことから、得られたオリゴマーの純度が高いことが分かる。【００２１】
実施例３
本実施例では、実施例２と同様に、下式（H2N-Lys-TGCA(PPT)(PPT)(PPT)ACGT-Gly-NH2）で表されるユニバーサル塩基含有オリゴマーを合成した。
【化９】
0005251125.tif 000013
【００２２】
モノマーとしては、上記PPT(ユニバーサル塩基含有モノマー）と上記PNAモノマーを用い、固相合成を表２に従って行った。1, 11サイクルはPNA-T、2,10サイクルはPNA-G、3,9サイクルはPNA-C、4,8サイクルはPNA-C、5,6,7サイクルはユニバーサル塩基含有モノマーを使用した。
質量分析の結果はm/z 1126.74; Calcd for (C130H160N68O44) (M+3): m/z 1126.76であった。
このオリゴマーのHPLCを実施例1と同様に測定した。そのHPLCチャートを図３に示す。図中の大きなピークが目的のオリゴマーを示すものであり、他のピークはほとんど検出されないことから、得られたオリゴマーの純度が高いことが分かる。【００２３】
実施例４
本実施例では、実施例２で作製したユニバーサル塩基含有オリゴマー（H2N-Lys-CCT(PPT)TCC-Gly-NH2）と天然型オリゴヌクレオチドとの複合体形成実験を行った。
天然型オリゴヌクレオチドとして、デオキシリボオリゴヌクレオチドd(GGAxAGG) (x = A, G, C or T)（ODN、ジーンデザイン社より購入）を用いた。
これらを用いて、複合体形成と複合体の安定性について温度勾配UVスペクトル測定による融解曲線と変曲点の温度（融解温度、Tm）を指標として調査した。
温度勾配UVスペクトル測定はペルチェ式温度コントローラーETC-505Tを装備した日本分光社製V-550 スペクトロメータを用いて、10 mMリン酸緩衝液(pH 7.0) に4.0μMのPNA-ODN混合物（1：1）を溶解した溶液を95℃で5分間インキュベーション、8時間以上かけて室温まで戻した後に5℃に冷却、1℃/minで70℃まで昇温させて、その過程を1℃毎にサンプリングし、紫外領域の吸光度変化を下記の条件で測定した。
−測定装置  JASCO V-550  SERIAL NO. C02951260
−温度コントローラー  JASCO ETC-505T
−セル  GL Science Type : M25-B（光路長 10mm）
−測定波長 : 260nm
溶液温度に対して吸光度をプロットして得られるグラフを解析した。
吸光度変化を図５に示す。いずれのPNA-ODN混合溶液においても融解曲線が得られ、融解温度は32.4-20.8℃まで様々であるがPNA-ODN複合体の形成が示唆され、ユニバーサル塩基として機能していることが明らかとなった。この結果はユニバーサル塩基含有PNAが配列未特定部を含む遺伝子に対するプローブとして有効であることを示している。【００２４】
比較例１
本比較例では、PPT(ユニバーサル塩基含有モノマー）を用いずに、実施例２と同様に、下式（H2N-Lys-CCTTTCC-Gly-NH2）で表される天然型オリゴヌクレオチドを合成した。
【化１０】
0005251125.tif 000014
モノマーとしては、上記PNAモノマーを用い、固相合成を表２に従って行った。1,2,6,7サイクルはPNA-C、3,5サイクルはPNA-Tを用いた。
質量分析の結果はm/z 1003.45; Calcd for (C82H110N38O28)(M+2): m/z 1003.43であった。
このオリゴマーのHPLCを実施例1と同様に測定した。そのHPLCチャートを図４に示す。図中の大きなピークが目的のオリゴマーを示すものであり、他のピークはほとんど検出されないことから、得られたオリゴマーの純度が高いことが分かる。【００２５】
比較例２
更に、比較例1で得た天然型オリゴヌクレオチドを用いて、実施例４と同様に複合体形成実験を行った。
天然塩基のみで構成されたPNAと配列中1カ所のみ塩基を入れ換えた4種のODNの温度勾配UVスペクトル解析において、図６に示す通り相補的な組み合わせ（マッチ）においては融解曲線が得られ、Tmが29.1℃を示すのに対して、相補的でない組み合わせ（ミスマッチ）のいずれの場合においても融解曲線は得られないことから、ミスマッチではPNA-ODN複合体が形成していないことが示唆される。【００２６】
合成例１
この合成例では、ユニバーサル塩基含有モノマーを合成した。この反応スキームを図７と図８に示す。【００２７】
１−ヒドロキシエチル−６−アミノウラシル（化合物１）の合成
フッ素樹コートした撹拌子を備えた２００ｍＬナス型フラスコに、無水エタノール９０ｍＬを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム２．８ｇ(120mmol)を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、２−ヒドロキシエチルウレア６.３ｇ(60mmol)とシアノ酢酸エチル６．４ｍＬ(60mmol)を加え、７時間還流させた。得られた反応溶液をろ過した後、エタノールで洗い、水に溶解させて１．０Ｍ希塩酸で中和した後にろ過をし、得られる白色固体を水で再結晶させることにより、白色結晶として化合物１を得た(6.1g, 35.6mmo1、収率５９.４％)；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 3.54(t, 2H, NCH2CH2, 9.6 Hz), 3.83(t, 2H, CH20H, 9.6 Hz), 4.57(br, 1H, CHCNH2), 5.09(br, 1H, OH), 6,61(br, 2H, NH2), lO.32(br, 1H, NH); 13C NMR(DMSO-d6, 100MHz): δ 44.13(NaC2CH2), 59.28(CH20H), 76.52(CHCNH2), 151.87, 157.04, 162.89。【００２８】
1-(2-t-ブチルジフェニルシラニロキシ)エチル-6-アミノウラシル（化合物２）の合成 
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた50 mLナス型フラスコに、上記で得た化合物１を1.0 g(5.8 mmol), t-ブチルジフェニリルクロロシラン(東京化成製、1.7 mL, 6.4 mmol), イミダゾール（ナカライ製、875 mg, 12.8 mmol),ジメチルホルムアミド（キシダ製）6 mL を加え、60℃で1.5時間反応させた後、撹拌している水１L中に、パスツールピペットを用いてゆっくり滴下した。しばらく撹拌した後、ろ過し、乾燥させることにより、白色固体として化合物２を得た（2.2 g, 5.4 mmol,収率92.0%）。
1H NMR（DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.96（s, 9H, C(CH3)3), 3.76（br, 2H, NCH2), 4.04（br, 2H, CH2OH), 4.60（br, 1H, CHCNH2), 6.70（br, 2H, NH2), 7.41（m, 6H), 7.58（m, 4H), 10.32（br, 1H, NH); 13C NMR（DMSO-d6, 100 MHz):  δ 19.11（SiC(CH3)3), 26.92（SiC(CH3)3), 42.06（NCH2CH2), 61.55（NCH2CH2), 76.15（CHCNH2), 127.96, 128.33, 130.33, 130.08, 134.94, 135.48, 151.85, 158.75, 162.94【００２９】
(6-アミノ-1-[2-（t-ブチルジフェニルシラニロキシ)-エチル]-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-カルボニル）カルバミン酸エチルエステル（化合物３）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 100 mL ナス型フラスコに、上記で得た化合物２を13.7 g（33.3 mmol)とジメチルホルムアミド（40 mL）を加え、室温下で撹拌しながら滴下漏斗でイソシアナトギ酸エチル3.9 g（東京化成製、33.9 mmol）を30分かけて滴下した。その後、室温で24時間撹拌し、減圧濃縮し、減圧乾燥させ、酢酸エチルで洗浄することにより白色固体として化合物３を得た（7.0 g, 13.3 mmol,収率40.1%）。
1H NMR（DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94（s, 9H, Si(CH3)3), 1.22（t, 3H, OCH2CH3, 7.2 Hz), 3.81（br, 2H, NCH2, 4.8 Hz), 4.12（q, 2H, OCH2CH3, 4.8 Hz), 4.18（t, 2H, NCH2CH2, 4.8 Hz), 7.42（m, 6H), 7.53（M, 4H), 8.36（br, 1H), 10.85（br, 1H), 11.35（br, 1H), 12.39（br, 1H); 13C NMR（DMSO-d6, 100 MHz): δ 14.68（OCH2CH3), 19.05（SiC(CH3)3), 26.89（SiC(CH3)3), 43.12（NCH2), 60.61（OCH2CH3), 61.12（NCH2CH2), 81.06（COCCO), 128.30, 130.39, 132.94, 135.42, 148.77, 150.77, 159.94, 164.45, 166.23 【００３０】
1-[2-（t-ブチルジフェニルシラニロキシ)-エチル]-1H,8H-ピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4,5,7-テトラオン（化合物４）の合成   
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた50 mLナス型フラスコに、無水エタノール（ナカライ製）20 mLを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム60 mg（ナカライ製、2.6 mmol）を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、上記で得た化合物３を600 mg（1.1 mmol）を加え、17時間還流させた。得られた反応溶液をろ過することにより得られる固体を1.0 M希塩酸で洗い、減圧乾燥させることにより、白色固体として化合物４（ＰＰＴ）を得た（500 mg, 1.0 mmol,収率91.6%）。
1H NMR（DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94（s, 9H, SiC(CH3)3), 3.83（t, 2H, NCH2CH2), 4.23（t, 2H, NCH2CH2), 7.38（m, 6H), 7.57（m, 4H), 9.79（br, 1H), 10.53（br, 1H); 13C NMR（DMSO-d6, 100 MHz): δ 19.16（SiC(CH3)3), 27.03（SiC(CH3)3), 42.27（NCH2), 61.12（NCH2CH2), 86.04（COCCO), 128.26, 130.14, 133.56, 135.43, 151.56, 157.86, 161.62, 162.60, 164.78; MS（ESI+）479.21（M +H+ calcd 479.17)【００３１】
1-ヒドロキシエチル-1H,8H- ピリミド [4,5-d] ピリミジン -2,4,5,7- テトラオン（化合物５）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 10 mL ふた付きプラスチック容器に、上記で得た化合物４(1.7 g, 3.6 mmol)とトリエチルアミン三フッ化水素酸 5 mL(30.7 mmol)を加え、室温下で 24時間撹拌させた。得られた反応溶液を、2M KOH水溶液の中に、酸性にならないように注意深く加え、最終的に2M HCl水溶液で中和した後にろ過、ジエチルエーテルで洗浄することにより、 白色固体として化合物５(700 mg, 2.9 mmol, 収率 82.1%)を得た; 1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 3.49(br, 2H, NCH2), 4.02(br, 2H, CH2OH), 4.88(br, 1H, OH), 9.44(br, 1H), 10.20(br, 1H); 13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz):  ? 40.04(NCH2), 58.84(CH2OH), 86.05(COCCO), 151.47, 157.87, 161.30, 162.69, 164.45; MS(ESI+)241.06(M +H+ calcd 241.05)。【００３２】
2,4,5,7-テトラオキソ-3,4,5,6,7,8- ヘキサヒドロ-2H-ピリミド [4,5-d] ピリミジ -1- ニル酢酸（化合物６）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 300 mL ナス型フラスコに、上記で得た化合物5
(1.0 g, 4.2 mmol)、2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニロキシ、フリーラジカル(TEMPO)698 mg(4.2 mmol)と臭化ナトリウム 922 mg(8.4 mmol)を入れた後に 0.4 M 水酸化ナトリウム水溶液を加え pH を 11 に調整し、完全に TEMPO が溶解するまで室温で撹拌した後、反応溶液に次亜塩素酸ナトリウム 11% 水溶液 5.4 mL(8.4 mmol)を加え室温で 1.5 時間撹拌した。pH を 11 に維持するために時折 0.4 M 水酸化ナトリウム水溶液を加えた。反応終了後、エタノールを加えろ過することにより得られる固体を水に溶かして氷浴にうつし、 pH が 1 になるまで 2 M 塩酸を加えて 1 時間そのまま放置した。析出した固体をろ過することにより、白色固体として化合物６(530.3 mg, 2.1 mmol, 収率 50.0%)を得た;  1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ  4.71(s, 2H, CH2CO), 11.05(br, 1H, NH), 11.24(br, 1H, NH), 11.45(br, 1H, NH), 13.25(br, 1H, COOH); 13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz):  δ 44.59(NCH2), 87.45(COCCO), 149.61, 150.33, 155.40, 158.51, 159.70, 169.14(COOH); MS(ESI+)255.04(M +H+ calcd 255.03)。【００３３】
tert-ブチル N-[2-(N-9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノエチル]-N-[(2,4,5,7-テトラオキソ-3,4,5,6,7,8- ヘキサヒドロ-2H-ピリミド [4,5-d] ピリミジ -1- ニル酢酸（化合物９）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 50 mL ナス型フラスコに、上記で得た化合物６(723 mg, 2.8 mmol)、tert-ブチル N-[2-(N-9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノエチル] グリシネート（化合物７）1.1 g(2.8 mmol)と 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（化合物８）1.1 g(5.6 mmol)を加え、DMF(ナカライ製)中室温で 24 時間撹拌した。得られた反応溶液を減圧濃縮した後、水を加えろ過することにより得られる白色固体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することにより、白色固体としてブチルエステル体（化合物９）(1.3 g, 2.1 mmol, 収率 73.5%)を得た;  1H NMR(DMSO-d6, 500 MHz): δ 1.37-1.45(m, 9H, C(CH3)3), 3.09-3.42(m, 4H, NHCH2CH2N), 3.89-3.92(br, 1H, Fmoc-H9), 4.14-4.33(m, 4H, NCH2COO and Fmoc-CH2O), 4.73-4.94(m, 2H, NCH2CON), 7.30-7.41(m, 5H, NHCOO and Fmoc-H3, H4, H5, H6), 7.66-7.68(m, 2H, Fmoc-H2, H7), 7.86-7.88(m, 2H, Fmoc-1H, 8H), 10.11-10.95(br, 2H, NH); MS(ESI+)633.29(M +H+ calcd 633.23)。【００３４】
N-[2-(N-9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノエチル]-N-[(2,4,5,7-テトラオキソ-3,4,5,6,7,8- ヘキサヒドロ-2H-ピリミド [4,5-d] ピリミジ -1- ニル酢酸（化合物１０）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 100 mL ナス型フラスコに、上記で得た化合物９(1.9 g, 3.0 mmol)とジクロロメタン 10 mL を入れ撹拌しながらトリフルオロ酢酸 20 mL(250 mmol)を加え室温で 24 時間撹拌した。得られた反応溶液を減圧濃縮した粗生成物をメタノール-ジエチルエーテルで再沈澱させることにより、白色固体として化合物１０(1.5 g, 2.6 mmol, 収率 86.7%)を得た;  1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 3.10-3.64(m, 4H, NHCH2CH2N), 3.99(br, 1H, Fmoc-H9), 4.23-4.37(m, 4H, NCH2COO and Fmoc-CH2O), 4.79-4.97(m, 2H, NCH2CON), 7.28-7.46(m, 5H, NHCOO and Fmoc-H3, H4, H5, H6), 7.65-7.69(m, 2H, Fmoc-H2, H7), 7.87-7.91(m, 2H, Fmoc-1H, 8H), 10.68(br, 1H, NH), 11.16(br, 1H, NH), 12.66(br, 1H, COOH); MS(ESI+)577.19(M +H+ calcd 577.17)。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のユニバーサル塩基含有ポリマーは、配列未特定遺伝子や不特定遺伝子のプローブ、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出、アンチジーン法による不特定遺伝子の発現抑制、核酸成分の高選択的抽出・除去、核酸成分の精製（アフィニティーカラム）などに応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例１で合成したPNAオリゴマーのHPLCチャートを示す。縦軸は吸光度（Abs260, 260nmにおける吸光度）、横軸は時間（分）を表す。
【図２】実施例２で合成したPNAオリゴマーのHPLCチャートを示す。
【図３】実施例３で合成したPNAオリゴマーのHPLCチャートを示す。
【図４】比較例１で合成したPNAオリゴマーのHPLCチャートを示す。
【図５】実施例２のPNAオリゴマーを用いた複合体形成実験結果を示す図である。PNAオリゴマーと天然型オリゴヌクレオチドの混合溶液における吸光度を混合比に対してプロットした。
【図６】比較例１の天然型オリゴヌクレオチドを用いた複合体形成実験結果を示す図である。図１の吸光度を混合比に対してプロットした図である。
【図７】ユニバーサル塩基含有モノマー合成の反応スキームを示す図である。
【図８】ユニバーサル塩基含有モノマー合成の反応スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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