(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルパッドと、
ガラス繊維と有機高分子繊維よりなる複合繊維材料に、標的物質と結合する標識された第１の生体分子が保持されたコンジュゲートパッドと、
前記コンジュゲートパッドに連結されており、前記の標識された第１の生体分子と前記標的物質とを含む複合体を捕捉するための第２の生体分子が固定化された判定部を有する、前記コンジュゲートパッドとは異なる材料から構成されるメンブレンと、
吸収パッドと
をこの順に連結してなるラテラルフロー用テストストリップであって、
前記複合繊維材料は、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が２０〜６０秒であり、
前記コンジュゲートパッドの、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が、前記メンブレンの、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間よりも短く、その差が４５〜１５０秒である、
ラテラルフロー用テストストリップ。
【請求項２】
前記複合繊維材料が下記（Ａ）〜（Ｅ）を満たす、請求項１に記載のラテラルフロー用テストストリップ：
（Ａ）前記ガラス繊維の太さが０．５〜２０μｍ、前記有機高分子繊維の太さが０．０５〜２μｍであり、
（Ｂ）前記複合繊維材料の空隙率が８０〜９１％であり、
（Ｃ）前記複合繊維材料中、前記ガラス繊維の存在密度が１００〜２１０ｍｇ／ｃｍ３、前記有機高分子繊維の存在密度が１〜１００ｍｇ／ｃｍ３であり、且つ、前記ガラス繊維と前記有機高分子繊維との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）が体積比で１〜２００であり、
（Ｄ）前記有機高分子繊維が、酢酸セルロース繊維、ニトロセルロース繊維、ポリエステル繊維、ポリエチレン繊維、ポリプロピレン繊維及びナイロンからなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、
（Ｅ）前記メンブレンの材料がニトロセルロースである。
【請求項３】
コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、２０分経過後に、メンブレンの前記コンジュゲートパッド側の端から判定部の手前までに存在する標識された第１の生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識された第１の生体分子の量の１質量％以下となる、請求項１又は２に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
【請求項４】
前記複合繊維材料が親水処理されたものであり、
コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、２０分経過後に、前記コンジュゲートパッドに残存する標識された第１の生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識された第１の生体分子の量の２０質量％以下となる、請求項１〜３のいずれかに記載のラテラルフロー用テストストリップ。
【請求項５】
親水処理が、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン又は合成高分子を用いたブロッキング処理である、請求項４に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
【請求項６】
前記第１の生体分子の標識が、蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップを含むイムノクロマトグラフィー装置。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップを用いたイムノクロマト方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテラルフロー用テストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラテラルフロー法は、検体液中の標的物質（被検物質）を簡易・迅速に検出できるため、臨床分野、食品分野、環境検査分野等において広く用いられている。このラテラルフロー法には、一般に、試料添加用部材であるサンプルパッドと、標的物質と特異的に結合する標識された生体分子（標識生体分子）が存在するコンジュゲートパッドと、標的物質と標識生体分子とを含む複合体を捕捉するための別の生体分子（捕捉分子）が局所的に固定化された多孔質支持体からなるメンブレンと、検体液を一定の方向に流すためにメンブレンから検体液を吸い上げる吸収パッドとがこの順に連結されたテストストリップが用いられる。
【０００３】
ラテラルフロー法の一形態としてイムノクロマトグラフィー（イムノクロマト法）が汎用されている。イムノクロマト法の代表的な形態では、２種類の抗体で標的物質を挟み込むサンドイッチ法の原理が用いられる。具体的には、前記標識生体分子としての標識抗体がコンジュゲートパッドに含まれており、ここに標的物質（抗原）を含む検体液が流入すると、標識抗体と抗原との免疫複合体が形成される。この免疫複合体は毛細管現象によりメンブレンを移動し、メンブレンに局所的（例えば、ライン状）に固定化された免疫複合体捕捉用抗体に効率良く接触し、標的物質を介して捕捉される。これにより、メンブレンに局所的に免疫複合体が濃縮され、この複合体に含まれる標識を検出することによって標的物質の有無等を判定する。
【０００４】
上記イムノクロマト法は下記（ａ）〜（ｃ）の特徴を有するとされる。
（ａ）判定までに要する時間が通常２０分以下であり迅速な検査が可能である。
（ｂ）通常のイムノアッセイで行われるＢ／Ｆ分離等の操作を要しないため、検体液を滴下するだけで測定できる。したがって検体数が多くても測定が容易である。
（ｃ）特別な検出装置を必要とせず判定が容易なため、被検者が自身で検査することもできる。
【０００５】
臨床検査においては、近年、ポイント  オブ  ケア  テスティング（ＰＯＣＴ）と呼ばれる、ベッドサイドや診療現場で行われる迅速且つ高感度な検査の重要性が高まっている。患者検体を採取し、その場で測定を行って迅速に結果を出すことが求められるＰＯＣＴの手法として上記の特徴を備えたイムノクロマト法が注目されてきており、実際に妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬等として実用化されている。
また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用されている。
【０００６】
ラテラルフロー法で用いられるテストストリップの一般的な構造を図１に示す。一般にテストストリップは、サンプルパッド（２）とコンジュゲートパッド（３）、コンジュゲートパッド（３）とメンブレン（４）、メンブレン（４）と吸収パッド（５）がそれぞれ部分的に重ね合うように連結された構造となっている。サンプルパッド（２）に検体液を滴下すると、順にコンジュゲートパッド（３）、メンブレン（４）、吸収パッド（５）へと検体液が毛細管現象（毛管力）により移動していく。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
使用済のテストストリップでは、コンジュゲートパッドとメンブレンとの境界付近に標識生体分子（この標識生体分子には標的物質との複合体も含まれる。）の集積が認められる。この現象は、特に、標識物質としてシリカ粒子や金コロイド等のナノ粒子を用いた場合に顕著となる。
本発明者らは、標識生体分子あるいは標的物質と標識生体分子とを含む複合体を、コンジュゲートパッド側からメンブレン側へと滞りなくスムーズに移動させることができれば、標的物質と標識生体分子とを含む複合体を、メンブレンに固定化された前記複合体を捕捉するための生体分子へより多く捕捉させることができ、結果としてより高感度な標的物質の検出が可能になると考えた。ここで、メンブレンに固定化された生体分子とは、例えば後述するテストラインやコントロールラインに固定化された生体分子を言う。
また、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等の蛍光性ナノ粒子を用いた場合には、これがコンジュゲートパッドとメンブレンとの界面に集積して強い蛍光を発し、これによりバックグラウンドレベルが上昇して検出感度が低下しうるが、標識生体分子あるいは標的物質と標識生体分子とを含む複合体をコンジュゲートパッド側からメンブレン側へとスムーズに移動させることができれば、この問題も解消できると考えた。
【０００８】
本発明は、コンジュゲートパッドとメンブレンとの界面付近に標識生体分子の集積が生じにくいラテラルフロー用テストストリップ及びラテラルフロー装置を提供することを課題とする。
また、本発明は、標識生体分子が溶出しやすく、しかもコンジュゲートパッドからメンブレンへの標識生体分子の移動をスムーズになしうるラテラルフロー用コンジュゲートパッドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
コンジュゲートパッドに存在する標識生体分子はコンジュゲートパッドから容易に溶出されて検体液と共に移動していく必要があるため、コンジュゲートパッドの材料には一般的に標識生体分子に対する吸着力が弱いガラス繊維が用いられている。一方、メンブレンに固定化される生体分子については、検体液が通過する際に溶出されてしまうとメンブレン上で標的物質と標識生体分子とを含む複合体を捕捉することができなくなるため、メンブレンの材料には生体分子が比較的強固に吸着するニトロセルロースやナイロン等が用いられている。このように、ラテラルフロー用テストストリップのコンジュゲートパッドとメンブレンとは材質特性が大きく異なる。
本発明者らは、この材質特性の相違が、コンジュゲートパッドとメンブレンの界面において液の流れ方を大きく変化させ、結果として、当該界面付近に標識生体分子や、標的物質と標識生体分子とを含む複合体の集積が生じやすくなると考えた。この考えの下に鋭意検討を行った結果、ガラス繊維と高分子繊維とからなる複合繊維材料をコンジュゲートパッドの材料として用いることで、テストストリップを構成するコンジュゲートパッドとメンブレンとの界面付近に標識生体分子の集積が生じにくくなることを見い出した。
また、本発明者らは、上記複合繊維材料にさらに親水処理を施したものを用いてコンジュゲートパッドを作製することで、コンジュゲートパッドに塗布した標識生体分子を、より効率良く溶出させることができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
＜１＞サンプルパッドと、
ガラス繊維と有機高分子繊維よりなる複合繊維材料に、標的物質と結合する標識された第１の生体分子が保持されたコンジュゲートパッドと、
前記コンジュゲートパッドに連結されており、前記の標識された第１の生体分子と前記標的物質とを含む複合体を捕捉するための第２の生体分子が固定化された判定部を有する、前記コンジュゲートパッドとは異なる材料から構成されるメンブレンと、
吸収パッドと
をこの順に連結してなるラテラルフロー用テストストリップであって、
前記複合繊維材料は、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が２０〜６０秒であり、
前記コンジュゲートパッドの、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が、前記メンブレンの、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間よりも短く、その差が４５〜１５０秒である、
ラテラルフロー用テストストリップ。
＜２＞前記複合繊維材料が下記（Ａ）〜（Ｅ）を満たす、上記＜１＞に記載のラテラルフロー用テストストリップ：
（Ａ）前記ガラス繊維の太さが０．５〜２０μｍ、前記有機高分子繊維の太さが０．０５〜２μｍであり、
（Ｂ）前記複合繊維材料の空隙率が８０〜９１％であり、
（Ｃ）前記複合繊維材料中、前記ガラス繊維の存在密度が１００〜２１０ｍｇ／ｃｍ３、前記有機高分子繊維の存在密度が１〜１００ｍｇ／ｃｍ３であり、且つ、前記ガラス繊維と前記有機高分子繊維との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）が体積比で１〜２００であり、
（Ｄ）前記有機高分子繊維が、酢酸セルロース繊維、ニトロセルロース繊維、ポリエステル繊維、ポリエチレン繊維、ポリプロピレン繊維及びナイロンからなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、
（Ｅ）前記メンブレンの材料がニトロセルロースである。
＜３＞コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、２０分経過後に、メンブレンの前記コンジュゲートパッド側の端から判定部の手前までに存在する標識された第１の生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識された第１の生体分子の量の１質量％以下となる、上記＜１＞又は＜２＞に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
＜４＞前記複合繊維材料が親水処理されたものであり、
コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、２０分経過後に、前記コンジュゲートパッドに残存する標識された第１の生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識された第１の生体分子の量の２０質量％以下となる、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のラテラルフロー用テストストリップ。
＜５＞親水処理が、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン又は合成高分子を用いたブロッキング処理である、上記＜４＞に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
＜６＞前記第１の生体分子の標識が、蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子である、上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のラテラルフロー用テストストリップ。
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のラテラルフロー用テストストリップを含むイムノクロマトグラフィー装置。
＜８＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のラテラルフロー用テストストリップを用いたイムノクロマト方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のラテラルフロー用テストストリップ及びラテラルフロー装置は、標識生体分子並びに標識生体分子と標的物質とを含む複合体をコンジュゲートパッドからメンブレンに向けてスムーズに移動させることができるので、コンジュゲートパッドとメンブレンとの界面付近に標識生体分子の集積が生じにくい。その結果、標識生体分子と標的物質とを含む複合体と、メンブレンに固定化された生体分子との接触頻度が増えて、メンブレンに固定化された生体分子に捕捉される複合体の量が増加しうるため、検体中の標的物質を高感度に検出することができる。この効果は、標識物質がナノ粒子である場合に特に顕著となる。
また、本発明のラテラルフロー用テストストリップは、上記のようにコンジュゲートパッドとメンブレンとの界面付近に標識生体分子の集積が生じにくい結果、標識に由来する信号のバックグラウンドレベルが抑えられる。したがって、検体中の標的物質を高感度に検出することができる。この効果は、標識物質が蛍光色素を含むナノ粒子である場合に特に顕著となる。
さらに本発明の製造方法によれば、上記ラテラルフロー用テストストリップに用いられうるコンジュゲートパッドであって、標識生体分子が溶出しやすい特性を有するコンジュゲートパッドが製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ラテラルフロー法で用いられるテストストリップの構造を模式的に示した図である。
【図２】コンジュゲートパッドに用いられる材料の構造の一形態を示す写真である。図２中、ａはガラス繊維のみからなる従来の材料を示し、ｂはガラス繊維と有機高分子繊維からなる、本発明に用いうる複合繊維材料を示す。
【図３】実施例において作製したラテラルフロー用テストストリップを用いて試験を行った際の、メンブレン上に存在する蛍光性シリカナノ粒子の分布を示すグラフである。図３中ａは調製例２、ｂは比較例１、ｃは比較例２で調製したテストストリップを用いた結果を示す。
【図４】メンブレンのコンジュゲートパッド側の端から判定部の手前までに集積する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量を測定するために採用した蛍光シグナルの面積を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
【００１４】
本発明のラテラルフロー用テストストリップは、検体中の標的物質を検出するために用いられる。検体としては、ヒトや動物の血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等に代表される臨床検体、液体飲料、半固形食品、固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、海水等の自然界からのサンプリング検体、工場内の生産ラインやクリーンルームのふき取り検体、エアーサンプラーによるサンプリング検体等に代表される環境サンプリング検体等が挙げられる。
検体は液体であればそのまま用いることもできるし、半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
【００１５】
本発明のラテラルフロー用テストストリップは、サンプルパッドと、標的物質と結合する標識された第１の生体分子が保持されたコンジュゲートパッドと、このコンジュゲートパッドに連結されており、前記の標識された第１の生体分子と前記標的物質とを含む複合体を捕捉するための第２の生体分子（捕捉分子）が固定化された判定部を有する、上記コンジュゲートパッドとは異なる材料から構成されるメンブレンと、吸収パッドとを少なくとも含む。前記コンジュゲートパッドは、ガラス繊維と有機高分子繊維よりなる、特定の毛管力を有する複合繊維材料を基材として用いて作製される。また、前記コンジュゲートパッド及び前記メンブレンは特定の毛管力を有する。
【００１６】
前記「標的物質」とは、ラテラルフロー法による検出対象となる分子であり、前記「第１の生体分子」とは、前記標的物質に対する結合能を有する生体分子である。該標的物質と該第１の生体分子の組合せの例は後述する。
【００１７】
前記第１の生体分子には標識物質が結合している。標識物質としては、酵素、放射線同位元素、蛍光色素、発光分子、蛍光色素を含むナノ粒子、金コロイド等の金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、着色シリカナノ粒子等が挙げられるが、中でも蛍光色素を含むナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、着色シリカナノ粒子であることが好ましい。上記の蛍光色素を含むナノ粒子の例としては、蛍光色素を含むシリカナノ粒子（蛍光性シリカナノ粒子）等が挙げられる。上記蛍光色素に特に制限はなく、例えば、有機蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Alexa（いずれも商品名、Invitrogen社製）、Cy（商品名、Applied  Biosystems社製）等）、半導体ナノ粒子（例えば、ＣｄＳｅ、ＩｎＧａＰ、ＺｎＳＳｅ等）等が挙げられる。上記標識物質は通常の方法で調製することができ、例えば、蛍光性シリカナノ粒子は、特開２００９−２２１０５９号公報に記載の方法を参照して作製することもできる。また、上記標識物質として市販品を用いることもできる。
本発明において「ナノ粒子」とはナノスケールの粒子を意味する。ナノスケールの粒子とは、好ましくは粒径１０〜５００ｎｍの粒子である。この粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の標識粒子の合計の投影面積から複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した複合粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）として算出することができる。
【００１８】
これらの標識物質は第１の生体分子に直接結合していてもよいし、他の物質を介して間接的に結合していてもよい。標識物質と第１の生体分子との結合は、疎水的相互作用等により物理的に吸着させる方法、スクシンイミド基とアミノ基との結合やマレイミド基とチオール基との結合のように、官能基を介して化学的に結合させる方法等の常法により行うことができる。標識物質がナノ粒子である場合には、一つの標識物質の表面に複数の第１の生体分子が結合しうる。
【００１９】
本発明に用いるコンジュゲートパッドの製造には、基材としてガラス繊維と有機高分子繊維よりなる所定の複合繊維材料が用いられる。この複合繊維材料は、従来から汎用されてきているガラス繊維のみからなるコンジュゲートパッド用材料（以下、従来型コンジュゲートパッド用材料と呼ぶ。）に比べて毛管力が高い。従来型コンジュゲートパッド用材料では、その一端を水に浸したときに、水面から垂直方向に４ｃｍの高さ（水面から垂直方向４ｃｍ高）まで水を吸い上げることはできない。これに対し、本発明に用いられる複合繊維材料は、毛管力によって、水面から垂直方向に少なくとも４ｃｍ高まで水を吸い上げることができる。本発明に用いられる複合繊維材料は、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が２０〜６０秒であり、２５〜６０秒であることが好ましく、３０〜５０秒であることがより好ましく、３３〜４５秒であることがさらに好ましい。本発明において、「水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間」とは、平板上の被検試料（複合繊維材料、コンジュゲートパッド、メンブレン）を水平に載置したときに、その上面（又は底面）における短辺（以下、単に短辺ということがある。）が５ｍｍ、長辺（以下、単に長辺ということがある。）が６０ｍｍ以上になるように該被検試料を切断し、この長辺と水面とが垂直になるように一端を水に浸したときに、毛管力によって水面から４ｃｍの高さまで水が上昇してくるのにかかる時間を意味する。上記の「水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間」は、本発明においては、２３℃で測定した場合の時間であるが、１０〜３０℃の温度下であれば、温度による差は事実上無視できる。
【００２０】
上記のように水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が特定の範囲内である複合繊維材料を用いることで、この複合繊維材料に標的物質と結合する標識された第１の生体分子（以下、標識生体分子と呼ぶことがある。）が保持されたコンジュゲートパッドとメンブレンとの間の毛管力のバランスを後述するような特定の範囲内とすることができる。また、これにより、該コンジュゲートパッドからメンブレンへの検体液の流れに滞流等の乱れが生じにくくなり、標識生体分子を含む検体液をスムーズにメンブレンに送り出すことができる。
【００２１】
前記複合繊維材料を構成するガラス繊維は、太さが０．５〜２０μｍであることが好ましく、５〜１５μｍであることがより好ましく、８〜１３μｍであることがさらに好ましい。また、前記複合繊維材料を構成する有機高分子繊維は、太さが０．０５〜２μｍであることが好ましく、０．２〜１．５μｍであることがより好ましく、０．５〜１．０μｍであることがさらに好ましい。上記ガラス繊維の太さ及び上記有機高分子繊維の太さは、各繊維断面の最外径の値を意味する。ここでいう最外径とは、断面が円形であれば直径であり、楕円であれば長径であり、多角形であれば各頂点間距離のもっとも長い値を意味する。前記複合繊維材料を構成する各ガラス繊維は太さが均一である必要はなく、上記特定の太さの範囲内であれば、バラツキがあってもよい。前記複合繊維材料を構成する各有機高分子繊維の太さについても同様のバラツキが許容される。
さらに、前記複合繊維材料は、空隙率が８０〜９１％であることが好ましい。この空隙率は、複合繊維材料中に占める、ガラス繊維と有機高分子繊維の双方が存在しない空間の容積率（体積％）を意味し、平板上の複合繊維材料を水平に載置したときに、その上面（又は底面）において短辺が５ｍｍ、長辺が８ｍｍになるように切断した複合繊維材料における値である。
【００２２】
また、複合繊維材料におけるガラス繊維と有機高分子繊維との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）は体積比で１〜２００であることが好ましく、４〜４０であることがより好ましく、６〜２６であることがさらに好ましい。本発明において、複合繊維材料におけるガラス繊維と有機高分子繊維との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）は、平板上の複合繊維材料を水平に載置したときに、その上面（又は底面）において短辺が５ｍｍ、長辺が８ｍｍになるように切断した複合繊維材料における存在比率である。
【００２３】
ガラス繊維と有機高分子繊維の太さ及び存在比率、並びに空隙率が上記好ましい範囲である複合繊維材料は、上記特定の毛管力を有しうる。
【００２４】
さらに、前記複合繊維材料中のガラス繊維の存在密度は１００〜２１０ｍｇ／ｃｍ３であることが好ましく、１４０〜２００ｍｇ／ｃｍ３であることがより好ましく、１６０〜２００ｍｇ／ｃｍ３であることがさらに好ましい。前記複合繊維材料中の有機高分子繊維の存在密度は１〜１００ｍｇ／ｃｍ３であることが好ましく、５〜５０ｍｇ／ｃｍ３であることがより好ましく、７〜３０ｍｇ／ｃｍ３であることがさらに好ましい。本発明において、複合繊維材料における上記各存在密度は、平板上の複合繊維材料を水平に載置したときに、その上面（又は底面）において短辺が５ｍｍ、長辺が８ｍｍになるように切断した複合繊維材料中に存在するガラス繊維又は有機高分子繊維の質量（ｍｇ）を、上記切断した複合繊維材料の全容積（各繊維体積と空間容積との和、ｃｍ３）で割った値である。
【００２５】
前記複合繊維材料を構成する有機高分子繊維の種類に特に制限はないが、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン等であることが好ましい。前記複合繊維材料は２種以上の上記有機高分子を含んでいてもよく、酢酸セルロース、ニトロセルロース及びポリエステルを含むことがより好ましい。ポリエステルとして、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリエチレンナフタレート等を好適に用いることができる。
【００２６】
前記複合繊維材料は、ガラス繊維からなる従来型コンジュゲートパッド用材料を、有機高分子繊維の材料となる有機高分子が溶解された有機溶剤に浸し、乾燥することで得られうる。具体的には、例えば、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン等から選ばれる１種又は２種以上の有機高分子をトルエン、クロロホルム等の有機溶媒に溶解し、これに従来型コンジュゲートパッド用材料を浸した後、乾燥させることで得られうる。上記有機高分子は上記有機溶媒中に０．０４〜４質量％の濃度で溶解されることが好ましく、０．２〜２質量％の濃度で溶解されることがより好ましく、０．２５〜１．２質量％の濃度で溶解されることがさらに好ましい。前記有機高分子繊維を構成する有機高分子は、市販のものを用いてもよいし、通常の方法で合成したものを用いることもできる。また、当該有機高分子はラテックス状のものを用いてもよい。
【００２７】
前記複合繊維材料は市販品を用いることもできる。市販品としては、例えば、Ｆｕｓｉｏｎ５（商品名、Ｗｈａｔｍａｎ社製）が挙げられる。
【００２８】
本発明に用いられるコンジュゲートパッドは、上記複合繊維材料を用いる以外は、通常の方法により作製することができる。具体的には、複合繊維材料に標識生体分子を塗布した後、これを減圧乾燥、凍結乾燥、熱乾燥等の手段を用いて乾燥させることで作製することができる。複合繊維材料への標識生体分子の塗布方法に特に制限はなく、例えば、標識生体分子が安定に存在できる所定の溶媒に標識生体分子を溶解又は分散させ、この溶液又は分散液をエアスプレーによって複合繊維材料に噴射することで塗布することもできるし、前記の溶液又は分散液に複合繊維材料を浸して、該複合繊維材料に前記の溶液又は分散液を染み込ませることにより塗布することもできる。
ラテラルフロー法においては、コンジュゲートパッドに存在する標識生体分子は、標的物質を含む検体液により容易に溶出され、該検体液と共に移動しながら標的物質と衝突して結合する必要がある。したがって、複合繊維材料に標識生体分子があまり強固に結合しないように、標識生体分子を塗布する前に複合繊維材料を予め親水処理しておくことが好ましい。このような親水処理として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、スキムミルク、カゼイン又はホスホリルコリン基等を有する合成高分子によるブロッキング処理や、酸素プラズマ処理等が挙げられる。複合繊維材料をブロッキング処理する方法に特に制限はなく、通常のブロッキング方法を採用することができる。例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、スキムミルク又はカゼインを用いる場合には、これらを５〜２０質量％濃度に調製した水溶液を調製し、これをシート状の複合繊維材料１ｃｍ２当たり３０〜１００μＬ塗布し、その後、室温下で減圧乾燥させ、又は４０〜８０℃の温度下で２０〜６０分間熱乾燥させることで複合繊維材料のブロッキングを行うことができる。上記のＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、合成高分子は、市販品を用いることができる。
【００２９】
本発明のコンジュゲートパッドには、前記標識生体分子の他にも、標的物質と結合する別の生体分子であって、後述する第２の生体分子に対しても結合能を有する生体分子又は該第２の生体分子に対する結合能を有する物質が導入された生体分子（以下、これらを総称して生体分子（Ａ）と呼ぶことがある。）が保持されていてもよい。この場合において、標識生体分子と、生体分子（Ａ）とは、標的物質との結合において互いに競合しないことが好ましい。互いに競合しない関係とは、標的物質において、標識生体分子との結合部位と、生体分子（Ａ）との結合部位が異なることをいい、標識生体分子と生体分子（Ａ）が、標的物質を介して結合できる状態をいう。例えば、標的物質が抗原であり、標識生体分子と生体分子（Ａ）が共に該抗原に対するモノクローナル抗体である場合には、これらのモノクローナル抗体が結合する抗原上のエピトープが異なることを意味する。また、標識生体分子と他の生体分子のいずれか一方がポリクローナル抗体で他方がモノクローナル抗体であるときには、該ポリクローナル抗体は該モノクローナル抗体とが標的物質の同一のエピトープに対する結合能を有する場合があるが、この場合であっても、該ポリクローナル抗体が該モノクローナル抗体と異なるエピトープに対する結合能も有していれば使用可能である。
【００３０】
本発明に用いるコンジュゲートパッドは、上記複合繊維材料と同様に、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間が２０〜６０秒であり、２５〜６０秒であることが好ましく、３０〜５０秒であることがより好ましく、３３〜４５秒であることがさらに好ましい。
【００３１】
本発明に用いられるメンブレンの材料はラテラルフロー用テストストリップに使用されている通常のメンブレン材料を用いることができる。このような材料として、ニトロセルロースやナイロンが挙げられる。市販品としては、例えば、ＨＦ０７５、ＨＦ０９０、ＨＦ１２０、ＨＦ１３５、ＨＦ１８０、ＨＦ２４０（いずれも商品名、ミリポア社製）、ＦＦ６０、ＦＦ８５、ＦＦ１２５（いずれも商品名、Ｗｈａｔｍａｎ社製）等が挙げられる。
【００３２】
本発明に用いられるメンブレンは、上記のメンブレンの材料に第２の生体分子が固定化されてなる。この第２の生体分子は、前記標識生体分子と前記標的物質とを含む複合体に対する結合能を有する。前記コンジュゲートパッドが、標的物質に結合する生体分子として標識生体分子のみを含む場合には、第２の生体分子は標的物質に対する結合能を有する。この場合には、標識生体分子と第２の生体分子とは、標的物質との結合において互いに競合しないことが好ましい。第２の生体分子が上記のような結合能を有することで、メンブレンの第２の生体分子が固定化された判定部において、標識生体分子と標的物質とからなる複合体を標的物質を介して捕捉することが可能になる。「標識生体分子」−「標的物質」−「第２の生体分子」の組合わせの例として、抗体（Ｂ）−抗体（Ｂ）の抗原（Ｃ）−抗原（Ｃ）の抗体（Ｄ）、抗原（Ｅ）−抗原（Ｅ）の抗体（Ｆ）−抗体（Ｆ）の抗体（Ｇ）、核酸（Ｈ）−核酸（Ｈ）に相補的な配列を有する核酸（Ｉ）−核酸（Ｉ）に相補的な配列であって核酸（Ｈ）の配列とは異なる配列を有する核酸（Ｊ）、受容体（Ｋ）−受容体（Ｋ）のリガンド（Ｌ）−リガンド（Ｌ）に対する抗体（Ｍ）、アプタマー（Ｎ）−アプタマー（Ｎ）が特異的に結合するタンパク質（Ｏ）−タンパク質（Ｏ）とアプタマー（Ｎ）とは異なる部位で特異的に結合するアプタマー（Ｐ）、アプタマー（Ｑ）−アプタマー（Ｑ）と特異的に結合するタンパク質（Ｒ）−タンパク質（Ｒ）に対する抗体（Ｓ）等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
また、前記コンジュゲートパッドが上記の生体分子（Ａ）も含む場合には、第２の生体分子は、当該生体分子（Ａ）に対する結合能を有することが好ましい。第２の生体分子が上記のような結合能を有することで、メンブレンの第２の生体分子が固定化された判定部において、標識生体分子と標的物質と生体分子（Ａ）とからなる複合体を当該生体分子（Ａ）を介して捕捉することが可能になる。「標識生体分子」−「標的物質」−「生体分子（Ａ）」の組合わせの例としては、上述した「標識生体分子」−「標的物質」−「第２の生体分子」の組合わせの例が挙げられる。生体分子（Ａ）と第２の生体分子との結合形態に特に制限はなく、第２の生体分子が生体分子（Ａ）に対して特異的に結合する抗体である形態、生体分子（Ａ）にビオチンが導入されており、第２の生体分子がアビジン又はストレプトアビジンである形態、生体分子（Ａ）にアビジン又はストレプトアビジンが導入されており、第２の生体分子がビオチンである形態、生体分子（Ａ）にオリゴヌクレオチドが導入されており、第２の生体分子が該オリゴヌクレオチオに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである形態等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
第２の生体分子は、他の分子を介してメンブレンに固定化されていてもよい。
本発明に用いるメンブレンの、水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間は２９０秒以下であることが好ましく、５０〜２８０秒であることがより好ましく、７０〜２７０秒であることがさらに好ましく、８０〜２６５秒であることが特に好ましい。
【００３４】
本発明における標的物質のより具体的な例として、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ等の腫瘍マーカー、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、ｐ２４抗原等の感染症マーカー、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＰＩＣ、ＡＴIII、ＦＭ等の凝固線溶マーカー、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、トロポニン、ＣＲＰ、ＢＮＰ等の心不全マーカー、ＴＳＨ、ｈＣＧ等のホルモン類、インスリン、トロポミオシン等の食物アレルゲン等を例示できるが、上記標的物質はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明に用いられるメンブレンは、通常の方法で作製することができる。例えば、第２の生体分子を含む溶液を、ＢｉｏＪｅｔ  Ｑｕａｎｔｉ（商品名、ＢｉｏＤｏｔ社製）等の機器を用いてメンブレン材料にライン上に塗布し、これを乾燥させた後、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン等を用いて通常の方法でブロッキング処理を行うことで作製することができる。
【００３６】
本発明のラテラルフロー用テストストリップは、上記コンジュゲートパッドと上記メンブレンとが連結された構造を含む。上記コンジュゲートパッドと上記メンブレンとの連結は通常の方法で行うことができ、例えば、両者を１〜５ｍｍ程重ね合わせて貼付することで連結することができる。
【００３７】
本発明のラテラルフロー用テストストリップでは、これを構成するコンジュゲートパッドの水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間は、メンブレンの水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間よりも短い。すなわち、コジュゲートパッドの方がメンブレンよりも毛管力が大きいが、両者の水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間の差は２２０秒以下であり、好ましくは５〜２００秒、より好ましくは２０〜１５０秒、さらに好ましくは４５〜１２５秒である。この差が２２０秒より大きくなると、コンジュゲートパッドとメンブレンの界面付近における標識生体分子の集積が増加し、検出感度の低下につながりうる。
【００３８】
本発明のラテラルフロー用テストストリップは、サンプルパッドと、コンジュゲートパッドと、メンブレンと、吸収パッドとがこの順に連結された構造である。
この構成のテストストリップにおいて、コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、１０〜３０℃で２０分経過後に、メンブレンの前記コンジュゲートパッド側の端から判定部の手前までに存在する標識生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識生体分子の量の１質量％以下となることが好ましく、０．０１〜０．５質量％となることがより好ましく、０．０１〜０．３質量％となることがさらに好ましい。上記「空間容積」とは、コンジュゲートパッド内の繊維や標識生体分子等の物質が存在しない空隙部分の容積を意味する。
【００３９】
また、上述した親水処理を施したコンジュゲートパッドを用いた本発明のラテラルフロー用テストストリップでは、コンジュゲートパットの空間容積に対して５倍量の水をサンプルパッドに添加すると、１０〜３０℃で２０分経過後に、前記コンジュゲートパッドに残存する標識生体分子の量が、前記コンジュゲートパッドに保持されていた標識生体分子の量の２０質量％以下となることが好ましく、０．０１〜１０質量％となることがより好ましく、０．０１〜５質量％となることがさらに好ましい。
【００４０】
本発明のラテラルフロー装置は、上記テストストリップを含む。通常には、上記テストストリップがハウジング（格納）された形態の装置であるが、テストストリップそのものを本発明のラテラルフロー装置として用いることもできる。ラテラルフロー装置が上記テストストリップをハウジングしたものである場合において、当該ハウジング材料は通常には樹脂製である。ハウジング材料には、通常、格納されたテストストリップのサンプルパッドに試料を添加するための窓（穴）とテストラインやコントロールラインの吸光や蛍光を検出できるようにするための窓（穴）とが少なくとも存在する。テストストリップがハウジングされたラテラルフロー装置においてはテストストリップが格納されているために、検査の際や検査後にテストストリップを直接ハンドリングする必要がない。これにより、血液試料等により人体や検査室等が汚染されるリスクが低減される。ラテラルフロー装置の中でも、特に抗原抗体反応により標的物質を検出するための装置は、一般にイムノクロマトグラフィー装置又はイムノクロマト試薬等とも呼ばれる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
［参考例１］  蛍光性シリカナノ粒子の調製
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ＨｉＬｙｔｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３．０ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μＬのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２６０ｎｍのシリカナノ粒子１．６０ｇを得た。収率約９２％。
【００４３】
［参考例２］  蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の調製
参考例１で作製したローダミン６Ｇ含有シリカナノ粒子（平均粒径２６０ｎｍ）の分散液（濃度５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）１００μＬに、蒸留水７７５μＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウム水溶液（重量平均分子量７００００）１００μＬ及び２８質量％のアンモニア水溶液を２５μＬ加え、室温（２３℃）で１時間緩やかに混合した。得られたコロイドを１２，０００×ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を８７５μＬ加え、粒子を再分散させた。続いて、１０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウム水溶液を１００μＬ加え撹拌子でよく撹拌した後、２８質量％のアンモニア水溶液を２５μＬ加え、１時間緩やかに混合した。このコロイドを１２，０００×ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍＬ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水２００μＬに分散させ、ローダミン６Ｇ含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子（平均粒径２６０ｎｍ）のコロイドを得た（収量２．５ｍｇ／ｍＬ×２００μＬ）。
前記ローダミン６Ｇ含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイドに、０．５Ｍの２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅバッファー（ｐＨ６．０）を１００μＬ、蒸留水３９５μＬ、５０ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）水溶液２３０μＬ、及び１９．２ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液７５μＬを順に加えて１０分間混合した。
得られたコロイドを１２，０００×Ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。ここに５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）を３７０μＬと抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ  ｃｌｏｎｅ  ｃｏｄｅｓ／５００８，  Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）２０μＬ（５．８ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１０分間緩やかに混合し、抗ｈＣＧ抗体を前記シリカナノ粒子に共有結合させた。
これに界面活性剤を１０μＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り除いた。ここに保存用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．２）、０．０５％  ＰＥＧ２０，０００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を取り除いた。ここに蒸留水５００μＬと塗布バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（分子量２０，０００）、５％スクロース）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体コロイドを得た（０．５ｍｇ／ｍＬ×１ｍＬ）。
【００４４】
［参考例３］  コンジュゲートパッド用パッド（複合繊維材料）の作製
クロロホルム１００ｍＬに、酢酸セルロース５００ｍｇ、ニトロセルロース２００ｍｇ、ポリエステル（商品名：ユニチカポリエステル樹脂、ＳＡ−１２０６、ユニチカ社製）２００ｍｇを加え溶解した。この溶液をガラス基板上に置いた短辺８ｍｍ×長辺１５０ｍｍの大きさのＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、繊維太さ１０μｍ）に６５０μＬ均一に塗布し、室温で４５分静置した。さらに５０℃の恒温槽に入れ、３０分静置し、コンジュゲートパッド用パッドを作製した。
このコンジュゲートパッド用パッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、３６秒であった。
このコンジュゲートパッド用パッドに含まれる酢酸セルロース、ニトロセルロース及びポリエステルからなる有機高分子繊維の太さは０．６μｍであり、空隙率は８９．７％であった。また、このコンジュゲートパッド用パッドにおけるガラス繊維と有機高分子との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）は体積比で１５．４であった。さらに、このコンジュゲートパッド用パッド中、ガラス繊維の存在密度は１８３ｍｇ／ｃｍ３であり、有機高分子繊維の存在密度は１１．９ｍｇ／ｃｍ３であった。
【００４５】
［調製例１］  コンジュゲートパッドの作製
参考例３で作製したコンジュゲートパッド用パッド（８×１５０ｍｍ）に、１０％スキムミルク溶液８００μＬをピペットで塗布し、デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥を行った。続いて、参考例２で作製した蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体コロイド２４０μＬと塗布バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（分子量２０，０００）、５％スクロース）５６０μＬの混合液（１ｍＬ）をピペットで均一に塗布し、デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥を行った。この乾燥後のコンジュゲートパッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、３６秒であった。
【００４６】
［調製例２］  ラテラルフロー用テストストリップの作製
抗体固定化メンブレン材料としてＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた。
まず始めに、本メンブレンを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、１２４秒であった。
【００４７】
次に、本メンブレン（丈２５ｍｍ）の中央付近（コンジュゲートパッドを設置する側の端から約８ｍｍ）に、幅約１ｍｍのテストラインとして、抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＦＳＨ（ＬＨ），ｃｌｏｎｅ  ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量でライン状に塗布した。
続いてコンジュゲートパッドを設置する側の端から約１２ｍｍの部分に、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量でライン状に塗布し、メンブレンを５０℃で３０分乾燥させた。
【００４８】
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー（組成：１００ｍＭホウ酸（ｐＨ８．５）、１質量％カゼイン）中に室温で３０分浸した。
前記メンブレンをメンブレン洗浄／安定バッファー（組成：１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１質量％スクロース、０．１％コール酸ナトリウム）に移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、抗体固定化メンブレンを作製した。この乾燥後の抗体固定化メンブレンを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、１２６秒であった。
【００４９】
サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、上記調製例１で作製したコンジュゲートパッド、前記抗体固定化メンブレン、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上でこの順に組み立て、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図１（ａ）及び（ｂ）に示した構成のテストストリップを得た。
なお、各構成部材は、図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、各々その両端を隣接する部材と２ｍｍ程度重ね合わせて貼付した。
【００５０】
［比較例１］
クロロホルム１００ｍＬに、酢酸セルロース５０ｍｇ、ニトロセルロース２０ｍｇ、ポリエステル（商品名：ユニチカポリエステル樹脂、ＳＡ−１２０６、ユニチカ社製）２０ｍｇを加え溶解した。この溶液をガラス基板上に置いた短辺８ｍｍ×長辺１５０ｍｍの大きさのＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に６５０μＬ均一に塗布し、室温で４５分静置した。さらに５０℃の恒温槽に入れ、３０分静置し、コンジュゲートパッド用パッドを作製した。
本コンジュゲートパッド用パッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、１１秒であった。
このコンジュゲートパッド用パッドを用いて、調製例１と同様の方法でコンジュゲートパッドを作製した。この乾燥後のコンジュゲートパッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、１８秒であった。
このコンジュゲートパッド用パッドに含まれる酢酸セルロース、ニトロセルロース及びポリエステルからなる有機高分子繊維の太さは０．４μｍであり、空隙率は９０．７％であった。また、このコンジュゲートパッド用パッドにおけるガラス繊維と有機高分子との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）は体積比で１５４であった。さらに、このコンジュゲートパッド用パッド中、ガラス繊維の存在密度は１８３ｍｇ／ｃｍ３であり、有機高分子繊維の存在密度は１．２ｍｇ／ｃｍ３であった。
このコンジュゲートパッドを用いてテストストリップを作製した。本作製において抗体固定化メンブレン材料としてＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ２４０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いる以外は、調製例２と同様の方法で行った。尚、本メンブレンを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、２４４秒であった。
【００５１】
［比較例２］
クロロホルム１００ｍＬに、酢酸セルロース５ｇ、ニトロセルロース２ｇ、ポリエステル（商品名：ユニチカポリエステル樹脂、ＳＡ−１２０６、ユニチカ社製）２ｇを加え溶解した。この溶液をガラス基板上に置いた８×１５０ｍｍの大きさのＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に６５０μＬ均一に塗布し、室温で４５分静置した。さらに５０℃の恒温槽に入れ、３０分静置し、コンジュゲートパッド用パッドを作製した。
このコンジュゲートパッド用パッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、８１秒であった。
このコンジュゲートパッド用パッドを用いて、調製例１と同様の方法でコンジュゲートパッドを作製した。この乾燥後のコンジュゲートパッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げるのにかかる時間を室温下（２３℃）で測定した結果、８３秒であった。
このコンジュゲートパッド用パッドに含まれる酢酸セルロース、ニトロセルロース及びポリエステルからなる有機高分子繊維の太さは１．１μｍであり、空隙率は７９．０％であった。また、このコンジュゲートパッド用パッドにおけるガラス繊維と有機高分子との存在比率（ガラス繊維／有機高分子繊維）は体積比で１．５４であった。さらに、このコンジュゲートパッド用パッド中、ガラス繊維の存在密度は１８３ｍｇ／ｃｍ３であり、有機高分子繊維の存在密度は１２０ｍｇ／ｃｍ３であった。
このコンジュゲートパッドを用いて調製例２と同様の方法でテストストリップを作製した。
【００５２】
［従来例］
Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を８×１５０ｍｍの大きさに切断し、従来と同様のコンジュゲートパッド用パッドを作製した。
このコンジュゲートパッド用パッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げたところ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げることはできなかった。
このコンジュゲートパッド用パッドを用いて、調製例１と同様の方法でコンジュゲートパッドを作製した。この乾燥後のコンジュゲートパッドを短辺５ｍｍ×長辺６０ｍｍの短冊状に切り、５ｍｍの辺の一端を下にし、下から４ｍｍの部分が水に浸るように水に浸し、毛管力により垂直方向に水を吸い上げたところ、水面から４ｃｍまで水を吸い上げることはできなかった。
このコンジュゲートパッドを用いて調製例２と同様の方法でテストストリップを作製した。
【００５３】
［試験例１］  ｈＣＧ検出感度比較
調製例２で作製したテストストリップと、上記比較例１及び２並びに上記従来例で作製したテストストリップを用いて、ｈＣＧの検出限界評価を実施した。下記表１には、これら４種類のテストストリップに使用したコンジュゲートパッド用パッド（複合繊維材料又はガラス繊維）の水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間、コンジュゲートパッドの水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間、抗体固定化メンブレンの水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間、並びに当該４種類のテストストリップに使用したコンジュゲートパッドと抗体固定化メンブレンとの間の水面から垂直方向４ｃｍ高までの毛管力による水の吸い上げ時間の差を示した。これらは（２３℃）において測定した値である。
【００５４】
【表１】
0005342584.tif 000002
【００５５】
ｈＣＧの検出限界評価は、ｈＣＧの含有量が異なるサンプルをテストストリップのサンプルパッドに７０μＬ滴下し、室温（２３℃）で２０分経過後テストラインの蛍光の判定を行った。
結果を下記表２に示す。表中「＋」はテストラインの蛍光が確認できたもの、「−」はテストラインの蛍光が確認できなかったものである。表１に示すように、調製例２で作製したテストストリップ（本発明のテストストリップ）では、ｈＣＧ０．０１ｍＩＵまでテストラインの蛍光が確認できた。一方、比較例１のテストストリップでは、テストラインの蛍光が確認できたのは０．１ｍＩＵ、比較例２のテストストリップでは、０．０４ｍＩＵ、従来例のテストストリップでは０．２ｍＩＵであった。すなわち、本発明のテストストリップを用いることで、従来のテストストリップを用いた場合に比べて格段に高感度化が可能であることがわかった。
【００５６】
【表２】
0005342584.tif 000003
【００５７】
［試験例２］  蛍光性シリカナノ粒子の集積評価
調製例２、比較例１及び比較例２で作製したテストストリップを用い、水をサンプルとして用いて試験例１と同様に試験を行った。試験開始後２０分経過したのち、テストストリップからサンプルパッドとコンジュゲートパッドを剥がし、メンブレンを露出させた。続いてテストストリップのメンブレン部分を、レーザダイオードを励起光源として照射しフォトダイオードで蛍光を受光するスキャナを使用して、コンジュゲートパッドが設置されていた側から吸収パッド側に前記スキャナを移動させながら測定を行い、メンブレンの蛍光強度分布を測定した。得られた蛍光強度分布からメンブレンの蛍光性シリカナノ粒子の集積量を評価した。
得られた蛍光強度分布を図３に示す。
【００５８】
図３中、横軸は、メンブレンのコンジュゲートパッド側の端からの距離を示している。１２ｍｍに見られる蛍光のピークはコントロールラインである。図３中ｂ、ｃから分かるように、比較例１と比較例２で作製したテストストリップでは、２ｍｍ〜２．５ｍｍに高い蛍光のピークが見られる。このピークの位置は、コンジュゲートパッドとメンブレンの界面付近であり、この部分に蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体が多量に集積していることが分かる。なお、従来例で作製したテストストリップを用いて同様の試験したものも上記と同様に２ｍｍ〜２．５ｍｍに高い蛍光のピークが認められた。
一方、調製例２で作製したテストストリップでは、コンジュゲートパッドとメンブレンの界面部分に上記のような蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積は認められなかった（図３中ａ）。
【００５９】
次に蛍光強度分布のデータから、各テストストリップのメンブレンのコンジュゲートパッド側の端（０ｍｍ、コンジュゲートパッドとメンブレンとの重なり部分におけるコンジュゲートパッドの先端部分）からテストライン部分（８ｍｍ）の手前までに集積する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積量を求めた。ここで蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積量は、図３の蛍光強度分布の図における、位置０ｍｍ〜８ｍｍ領域のグラフがなす領域（図４の斜線部（図４は比較例１を例示して示したものである））の面積を粒子量に換算したものである。前記面積を粒子量に換算するに際しては、試験を実施していないメンブレンに、既知の濃度の蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体分散液（濃度２０〜５００μｇ／ｍｌ）を１μＬ滴下し、乾燥後、これを前記スキャナで測定して得られる、横軸を位置[ｍｍ]、縦軸を蛍光強度[ａ．ｕ．]としたグラフの蛍光ピークの面積を算出して検量線を作成し、この検量線を基に換算を行った。
また、元々コンジュゲートパッドに保持されていた蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量をコンジュゲートパッドに滴下した蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体のコロイドの蛍光強度を蛍光分光光度計（製品名：ＦＰ−６５００、日本分光社製）で測定することで求め、元々コンジュゲートパッドに保持されていた蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量に対するメンブレンのコンジュゲートパッド側の端（０ｍｍ）からテストライン部分（８ｍｍ）の手前までに集積する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積量の割合を求めた。
【００６０】
その結果、メンブレンのコンジュゲートパッド側の端（０ｍｍ）からテストライン部分（８ｍｍ）の手前までに集積する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積量は、元々コンジュゲートパッドに保持されていた蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量の０．４質量％（調製例２で作製したテストストリップ）、８．３質量％（比較例１で作製したテストストリップ）、８．６質量％（比較例２で作製したテストストリップ）であった。また、従来例のテストストリップで同様の試験を実施したところ、メンブレンのコンジュゲートパッド側の端（０ｍｍ）からテストライン部分（８ｍｍ）の手前までに集積する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の集積量は、元々コンジュゲートパッドに保持されていた蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量の２１．３％であった。この結果から、調製例２で作製した本発明のテストストリップでは、蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体がスムーズに、コンジュゲートパッドからメンブレンに向けて移動できていることがわかった。
【００６１】
また、上記試験開始から２０分経過後のコンジュゲートパッドに残存する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量を２０分経過後のコンジュゲートパッドをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で抽出し、抽出液の蛍光強度を蛍光分光光度計（製品名：ＦＰ−６５００、日本分光社製）で測定することで算出した。元々コンジュゲートパッドに保持されていた蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量に対する前記試験開始から２０分経過後のコンジュゲートパッドに残存する蛍光性シリカナノ粒子標識抗ｈＣＧ抗体の量の割合を求めたところ、１４．２質量％（調製例２で作製したテストストリップ）、１１．５質量％（比較例１で作製したテストストリップ）、２６．１質量％（比較例２で作製したテストストリップ）であった。
【００６２】
上述した本発明の効果は、コンジュゲートパッドとメンブレンとの間の毛管力に特定の関係を持たせることで得られるものであり、蛍光性シリカナノ粒子以外の標識物質を用いた場合にも同様の効果が得られる。
【符号の説明】
【００６３】
１    テストストリップ
２    サンプルパッド
３    コンジュゲートパッド
４    抗体固定化メンブレン
４１  判定部（テストライン）
４２  コントロールライン
５    吸収パッド
６    バッキングシート
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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