(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒中に生体吸収性高分子材料を入れて攪拌し溶解した溶液を広げ、その後、凍結乾燥して５〜１００μｍの孔を有する厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得るか又は自然乾燥し直径０.１〜３ｍｍの孔をパンチングにより形成させた厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得、このシート状の生体吸収性高分子材料を長さ５〜５０ｍｍ，幅０.１〜２０ｍｍ，厚さ０.０１〜１ｍｍの短冊状の小片に切断したものを不規則に纏めて型に入れ、５００〜３０００ｇ／ｃｍ2の加圧条件と６０〜２００℃の加熱条件で加圧・加熱を行って空隙率１０〜９０％を占める不定形な連続空隙を有するブロック状細胞工学用支持体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織の代替品として使用される形状安定性に優れ且つ内部に細胞を播種及び／又は培養させることが可能な広い空隙を有する生体吸収性高分子材料から成るブロック状細胞工学用支持体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、手術，外傷等によって喪失した生体組織を体細胞，幹細胞等によって再構築し、それを患者に移植することにより喪失した生体組織を再生する治療方法が行われている。その治療において生体組織を再生するためには、播種する細胞が生体組織を再建するまでの足場となる支持体（マトリックス）が重要となる。
【０００３】
従来の支持体としては、乳酸，グリコール酸，カプロラクトン等から成る生体吸収性高分子材料をジオキサンのような有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させて作製された孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の細胞工学用支持体がある（例えば、特許文献１参照。）。また、このようなスポンジ状の細胞工学用支持体の作製時に溶液中に粒子径が約５０〜約５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生分解性高分子体を作製し、その後水等を用いて粒子状物質を取り除くことで作製される約５０〜約５００μｍの円形開放大孔と２０μｍ以下の円形開放小孔とを持つ多孔質構造の生体吸収性高分子材料を細胞の支持体がある（例えば、特許文献２参照）。しかし、これらの多孔質構造を持つ生体吸収性高分子から成る支持体はスポンジ状のブロックであるため強度が低く、必要とされる形状を生体内で維持できないという問題があった。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２３４８４４号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１９２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞が十分内部まで行き渡る空隙を持ち、なお且つ播種細胞が表面並びに内部へ増殖し易いような広い面を有し、更に支持体の強度も低下しない生体吸収性高分子材料から成るブロック状細胞工学用支持体を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シート状の生体吸収性高分子材料を短冊状の小片に切断したものを不規則に纏めて型に入れ特定の空間を持つように特定の加圧・加熱条件で加圧・加熱してブロック状細胞工学用支持体を製造すると前述の問題が解決できることを見出して本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、有機溶媒中に生体吸収性高分子材料を入れて攪拌し溶解した溶液を広げ、その後、凍結乾燥して５〜１００μｍの孔を有する厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得るか又は自然乾燥し直径０.１〜３ｍｍの孔をパンチングにより形成させた厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得、このシート状の生体吸収性高分子材料を長さ５〜５０ｍｍ，幅０.１〜２０ｍｍ，厚さ０.０１〜１ｍｍの短冊状の小片に切断したものを不規則に纏めて型に入れ、５００〜３０００ｇ／ｃｍ2の加圧条件と６０〜２００℃の加熱条件で加圧・加熱を行って空隙率１０〜９０％を占める不定形な連続空隙を有するブロック状細胞工学用支持体を製造するである。
この本発明方法に用いるシート状の生体吸収性高分子としては、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し凍結乾燥させて作製された５〜１００μｍの孔を有する厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料か、又は生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し乾燥させて作製された厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料に、直径０.１〜３ｍｍの孔を形成させたシート状の生体吸収性高分子材料を使用するのであり、また長さ５〜５０ｍｍ，幅０.１〜２０ｍｍ，厚さ０.０１〜１ｍｍの短冊状のシート状の生体吸収性高分子材料を使用するのである。
そして、加圧・加熱条件としては、加圧を５００〜３０００ｇ／ｃｍ2、加熱を６０〜２００℃の範囲で行うのである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るブロック状細胞工学用支持体の製造方法で製造されるブロック状細胞工学用支持体は、従来の多孔質構造を持つ生体吸収性高分子材料から成る生体組織材料の優れた特徴を維持しつつ、更に強度を有するブロック状細胞工学用支持体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いる生体吸収性高分子としては、生体に安全であり、体内でその形態を一定期間維持できる、例えば、従来から用いられているポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができ、中でもポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体が米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子の重量平均分子量は５,０００〜２,０００,０００であることが好ましく、より好ましくは１０,０００〜５００,０００である。
【００１０】
本発明に係るブロック状細胞工学用支持体の製造方法は、厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を作製し、その後、該材料を不規則に纏めて型に入れ加圧・加熱することにより空隙率１０〜９０％を占める不定形な連続空隙を有するブロック状細胞工学用支持体を製造する方法である。
【００１１】
この厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を作製方法は、生体吸収性高分子を有機溶媒中に溶解し、この生体吸収性高分子が溶解された有機溶媒を薄く延ばし広げた後、凍結乾燥させ有機溶媒を除去して５〜１００μｍの孔を有する厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を作製する方法や、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し乾燥させて作製された厚さ０.０１〜１ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料に、直径０.１〜３ｍｍの孔をパンチングにより形成させたシート状の生体吸収性高分子材料を作製する方法がある。
このシート状の生体吸収性高分子材料の厚さは０.０１〜１ｍｍである必要がある。０.０１ｍｍ未満又は１ｍｍを超えると、製造したブロック状細胞工学用支持体の強度が不足したり細胞が増殖する空間が不足するので好ましくない。
【００１２】
有機溶媒は、使用する生体吸収性高分子材料によって適宜選択して使用することになるが、一般的にはクロロホルム，ジクロロメタン，四塩化炭素，アセトン，ジオキサン，テトラハイドロフランから選ばれる少なくとも一種が好ましく使用できる。溶解過程では、熱処理や超音波処理を併用してもよく、生体吸収性高分子の濃度は有機溶媒中に均一に分散できれば特に限定されないが、有機溶媒中に１〜２０重量％が好ましい。
【００１３】
乾燥方法は換気された常温常気圧の条件下で自然に乾燥してもよいし、凍結乾燥のような乾燥方法を用いてもよい。凍結乾燥を行うとシート状の生体吸収性高分子に孔径５０μｍ程度の小孔が形成されるので体液や培養液の行き渡りの観点からも好ましい。
【００１４】
本発明に係るブロック状細胞工学用支持体の製造方法は、前記したような方法で作製したシート状の生体吸収性高分子材料を特定寸法の短冊状の小片に切断したものを所望の型内に不規則に纏めて折り畳まれるように充填し、特定条件で加圧・加熱することによって空隙率１０〜９０％を占める不定形な連続空隙を有するブロック状細胞工学用支持体とする方法である。このブロック状細胞工学用支持体が空隙率１０〜９０％を占める不定形な連続空隙を有さなければならないのは、１０％未満では不定形な連続空隙の量が少なすぎてブロック状細胞工学用支持体内の細胞の数が減ってしまい培養の効率の悪い支持体となってしまい、９０％を超えると不定形な連続空隙部分が大きすぎて細胞が支持体内に留まらず足場としての機能を低下させることになったり、支持体の強度が低下するので好ましくないからである。
【００１５】
加圧の条件は、シート状の生体吸収性高分子材料の材質，形状や大きさによって異なるが、５００〜３０００ｇ／ｃｍ2であり、５００ｇ／ｃｍ2未満ではブロック状細胞工学用支持体の強度が不足する虞があり、３０００ｇ／ｃｍ2を超えると細胞が十分に増殖可能な空隙、即ち孔や空間が残り難い。より好ましくは１０００〜２０００ｇ／ｃｍ2である。
【００１６】
加熱の条件もシート状の生体吸収性高分子材料の材質，形状や大きさによって異なる。前記の加圧を行った状態で体積を保って加熱するのであれば、６０〜２００℃の範囲であればよい。６０℃未満ではシート状の生体吸収性高分子同士の結合が弱くなり、ブロック状を形成し難くなる。一方、２００℃を超えると生体吸収性高分子が変性してしまう虞がある。
【実施例】
【００１７】
＜実施例１＞
ジオキサン中に乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸：グリコール酸＝７５：２５，重量平均分子量約２５０,０００）を８重量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した。得られた溶液をガラス板上に０.１ｇ/ｃｍ2の条件で流して広げ、その後、フリーザー（商品名：MDf-0281AT，三洋電機社製）にて−３０℃の条件で凍結させ、次いで真空乾燥機（商品名：DP43，ヤマト科学社製）にて減圧下で４８時間乾燥させることによってジオキサンを取り除いた。得られた厚さ約０.７ｍｍの生体吸収性高分子を加圧プレスすることで平均孔径が５０μｍで厚さ約０.２５ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得た。この材料を縦×横が約１０×５ｍｍ程の小片に切断した。切断した短冊状の生体吸収性高分子材料を下底を封した内径１０ｍｍ、高さ２０ｍｍのチタン製の型に８枚を不規則に纏めて順次入れ、上部より直径１０ｍｍのチタン製の棒で１５００ｇ／ｃｍ2の条件で加圧し、そのときの体積を保ったまま８０℃で１０分間加熱して図１の電子顕微鏡写真に示したブロック状細胞工学用支持体を作製した。このブロック状細胞工学用支持体は直径１０ｍｍ×高さ約２ｍｍの円柱形状でありその空隙率は約８４％で不定形な連続空隙であった。
【００１８】
＜実施例２＞
ジオキサン中に乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸：グリコール酸＝７５：２５，重量平均分子量約２５０,０００）を８重量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した。得られた溶液をガラス板上に０.０６ｇ/ｃｍ2の条件で流して広げ、その後、２３℃にて４８時間自然乾燥させることによってジオキサンを取り除き、直径２ｍｍの孔を１ｃｍ2当り１個パンチングした厚さ約０.０４ｍｍのシート状の生体吸収性高分子材料を得た。この材料を縦×横が約２０×１５ｍｍ程の小片に切断し、下底を封した内径１０ｍｍ、高さ２０ｍｍのチタン製の型に２枚を不規則に纏めて順次入れ、上部より径１０ｍｍのチタン製の棒で１５００ｇ／ｃｍ2で加圧した状態の体積を保って８０℃で１０分間加熱して図２に電子顕微鏡写真に示したブロック状細胞工学用支持体を作製した。このブロック状細胞工学用支持体は直径１０ｍｍ×高さ約２ｍｍの円柱形状でありその空隙率は約８５％で不定形な連続空隙であった。
【００１９】
＜比較例＞
ジオキサン中に乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸：グリコール酸＝７５：２５，重量平均分子量約２５０,０００）を１２重量％の濃度となるように入れ、攪拌機で攪拌し溶解した。得られた溶液に塩化ナトリウム粉末（粒子径３００〜７００μｍ）を濃度が約１.１８ｇ/ｃｍ3となるように略均一に混合し、内径１０ｍｍ×高さ３０ｍｍのガラス容器内に高さが約３ｍｍとなるように入れた。その後、フリーザー（商品名：MDf-0281AT，三洋電機社製）にて−３０℃の条件で凍結させ、次いで真空乾燥機（商品名：DP43，ヤマト科学社製）にて減圧下で４８時間乾燥させることによってジオキサンを取り除いて塩化ナトリウム粉末を略均一に含有した高分子体を得た。この高分子体に蒸留水を加え塩化ナトリウムを取り除いた後、真空乾燥機で４８時間乾燥させ平均孔径３００〜７００μｍであって壁面に平均孔径約５μｍの小孔構造を有するスポンジ状の直径１０ｍｍ×高さ約２ｍｍの円柱形状をしたブロック状細胞工学用支持体を作製した。
【００２０】
前記各実施例及び比較例の円柱形状をしたブロック状細胞工学用支持体の円柱の軸方向に圧縮荷重を付加してその破壊強度を求めた。結果を纏めて表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１のブロック状細胞工学用支持体の電子顕微鏡写真である。
【図２】実施例２のブロック状細胞工学用支持体の電子顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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