(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）結晶性セルロースを原料として球状セルロースを得る工程と、
（ｂ）該球状セルロースを架橋して架橋球状セルロースを得る工程と、
（ｃ）該架橋球状セルロースをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む水溶性溶媒を用いた液置換によって脱水処理する工程と、
（ｄ）脱水処理した架橋球状セルロースを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を用いて硫酸エステル化処理する工程と、
（ｅ）硫酸エステル化処理した架橋球状セルロースをアルカリで中和する工程と
を含むことを特徴とする架橋球状硫酸化セルロースの製造方法。
【請求項２】
硫酸エステル化処理が０〜７０℃で行われることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法によって製造しうる１〜６重量％の硫黄濃度を有する架橋球状硫酸化セルロース。
【請求項４】
請求項１または２に記載の製造方法によって製造しうる、１〜６重量％の硫黄濃度を有し、かつ、真球度が０．９〜１．０であることを特徴とする架橋球状硫酸化セルロース。
【請求項５】
請求項３または４に記載の架橋球状硫酸化セルロースを含む蛋白質吸着剤。
【請求項６】
請求項５に記載の蛋白質吸着剤を用いることを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、球状硫酸化セルロース、特にアフィニティクロマトグラフィ用基材や医療用基材などとして有用な球状硫酸化セルロース及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
群特異性を有し、蛋白質やウィルスなどの生体物質の分離精製用基材として、球状硫酸化セルロースがある。球状硫酸化セルロースは、架橋または非架橋のセルロースの固体粒状粒子をその固体粒状状態を保持しながら硫酸エステル化した後、アルカリで中和して得られるゲル状物であり、ヘパリンと類似した生物学的親和性を有することが知られている（特公平４−２３７５１号公報（特許文献１）、特公平４−２３７５２号公報（特許文献２）参照）。
しかしながら、従来の方法で得られた球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は０．１５％程度と低く（特許文献１の実施例１参照）、蛋白質の吸着能が十分ではなかった。
【特許文献１】特公平４−２３７５１号公報
【特許文献２】特公平４−２３７５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記状況を考慮して、硫黄濃度が高く、蛋白質の吸着能に優れた球状硫酸化セルロース及びその製造方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の硫酸エステル化剤を用いることによって、球状セルロースに導入される硫黄濃度が高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下に示すような球状硫酸化セルロース及びその製造方法、並びに球状硫酸化セルロースを含む蛋白質吸着剤等を提供するものである。
【０００６】
（１）球状セルロースをN,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を用いて硫酸エステル化処理する工程を含むことを特徴とする球状硫酸化セルロースの製造方法。
（２）球状セルロースが結晶性セルロースを原料として得られるものであることを特徴とする、上記（１）に記載の製造方法。
（３）球状セルロースが架橋したものであることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）硫酸エステル化処理が０〜７０℃で行われることを特徴とする、上記（１）〜（３）の何れかに記載の製造方法。
（５）球状セルロースを脱水処理する工程を含むことを特徴とする、上記（１）〜（４）の何れかに記載の製造方法。
（６）脱水処理が水溶性溶媒を用いた液置換によって行われるものであることを特徴とする、上記（５）に記載の製造方法。
（７）水溶性溶媒がN,N-ジメチルホルムアミドを含むものであることを特徴とする、上記（６）に記載の製造方法。
（８）硫酸エステル化処理した球状セルロースをアルカリで中和処理する工程を含むことを特徴とする、上記（１）〜（７）の何れかに記載の製造方法。
【０００７】
（９）上記（１）〜（８）の何れかに記載の製造方法によって製造しうる１〜１０重量％の硫黄濃度を有する球状硫酸化セルロース。
【０００８】
（１０）（ａ）球状セルロースをN,N-ジメチルホルムアミドを含む水溶性溶媒を用いた液置換によって脱水処理する工程と、
（ｂ）脱水処理した球状セルロースを、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を用いて硫酸エステル化処理する工程と、
（ｃ）硫酸エステル化処理した球状セルロースをアルカリで中和する工程と、
を含むことを特徴とする球状硫酸化セルロースの製造方法。
（１１）球状セルロースが結晶性セルロースを原料として得られるものであることを特徴とする、上記（１０）に記載の製造方法。
（１２）球状セルロースが架橋したものであることを特徴とする、上記（１０）または（１１）に記載の製造方法。
（１３）硫酸エステル化処理が０〜７０℃で行われることを特徴とする、上記（１０）〜（１２）の何れかに記載の製造方法。
【０００９】
（１４）上記（１０）〜（１３）の何れかに記載の製造方法によって製造しうる１〜１０重量％の硫黄濃度を有する球状硫酸化セルロース。
【００１０】
（１５）１〜１０重量％の硫黄濃度を有し、かつ、真球度が０．９〜１．０であることを特徴とする球状硫酸化セルロース。
（１６）硫黄濃度が１〜６重量％であることを特徴とする上記（１５）に記載の球状硫酸化セルロース。
【００１１】
（１７）上記（９）、（１４）〜（１６）の何れかに記載の球状硫酸化セルロースを含む蛋白質吸着剤。
【００１２】
（１８）上記（１７）に記載の蛋白質吸着剤を用いることを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用充填剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、高濃度で硫黄を含有する球状硫酸化セルロースを得ることができる。すなわち、本発明によれば、蛋白質の吸着能に優れた球状硫酸化セルロースを提供することができる。本発明の球状硫酸化セルロースは、各種ウィルスや蛋白質の分離精製用の医療用基材、吸着剤、またはクロマトグラフィ用充填剤、特にアフィニティクロマトグラフィ用充填剤などとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の球状硫酸化セルロース及びその製造方法、並びに球状硫酸化セルロースを含む蛋白質吸着剤等について詳細に説明する。
【００１５】
Ａ．球状硫酸化セルロースの製造方法
まず、本発明の球状硫酸化セルロースの製造方法について述べる。
本発明の球状硫酸化セルロースの製造方法は、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を用いて、球状セルロースを硫酸エステル化処理する工程を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明の方法では、このように球状セルロースの硫酸エステル化剤として、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を使用して球状セルロースの硫酸エステル化処理を行う。この混合物中には、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸とによって形成される複合体あるいは錯体が含まれており（下記式参照）、これが球状セルロースの硫酸エステル化に効果的に作用するものと考えられる。
【化１】
0005332090.tif 000002
【００１７】
本発明に用いられる球状セルロースは特に限定されず、通常の架橋または非架橋の球状セルロースを使用できる。球状セルロースは、球状の形態を持った固体粒状粒子であり、通常ゲル状であるが、本発明に用いられる球状セルロースは、真球度が０．８〜１．０であることが好ましい。ここで「真球度」は、球状セルロースの短径／長径を意味する。
【００１８】
このような球状セルロースは、例えば、結晶性セルロースまたは結晶領域と非結晶領域とからなるセルロースを溶解し、再生することにより得ることができる。具体的に球状セルロースの製造方法としては、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報、特公昭５５−４０６１８号公報などに記載される酢酸エステルを経由する方法、特公昭６３−６２２５２号公報などに記載されるチオシアン酸カルシウム塩を用いた溶液から造粒する方法、特開昭５９−３８２０３号公報などに記載されるパラホルムアルデヒド・ジメチルスルホキシド溶液から製造する方法などが挙げられる。また、セルロースを塩化リチウム含有のアミドに溶解させたセルロース溶液から成型する特許第３６６３６６６号特許公報に記載の方法なども挙げられる。
【００１９】
本発明に用いられる球状セルロースとしては、より高濃度で硫黄を含有させることができることから、結晶性セルロースを原料として得られる球状セルロースを用いることが好ましい。結晶性セルロース由来の球状セルロースは、強度が高く、水に溶けにくいので、高濃度で硫黄を含有させても、球状硫酸化セルロースが軟らかくなりすぎないからである。また、本発明に用いられる球状セルロースとしては、このような物理的安定性が高いことから架橋球状セルロースが好ましい。特に、結晶性セルロース由来の球状セルロースを架橋して得られる架橋球状セルロースは、物理的安定性に優れているのでより好ましい。硫酸エステル化が進むにつれて球状セルロースの親水性が増し、球状を保ちにくい場合があるが、物理的安定性の高い球状セルロースを用いることによって、強度が高く、水に溶けにくい球状硫酸化セルロースを製造することができる。
【００２０】
架橋球状セルロースは、非架橋球状セルロースを架橋処理することによって製造することができる。架橋方法は、通常セルロースの架橋に用いられる方法であれば特に限定されない。架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリンなどの多官能エポキシ化合物を例示することができる。
【００２１】
本発明に用いられる球状セルロースとしては市販品を用いることもできる。例えば、非架橋球状セルロースとしては、セルファインＧＣ−１５、ＧＨ−２５、ＧＣ−１００、ＧＣ−２００（製品名・チッソ（株））、アビセル（製品名・旭化成工業（株））などが挙げられる。また、架橋球状セルロースとしては、セルファインＧＣＬ−２５、ＧＣＬ−９０、ＧＣＬ−２０００（製品名・チッソ（株））などが挙げられる。また、ビスコースからの再生セルロース粒子として市販されているビスコパール（製品名・レンゴー（株））、Perloza MTシリーズ（製品名・Iontsorb社）、“Cellulose,Beaded”（カタログコードC8204・Sigma社）などを使用することもできる。
【００２２】
本発明に用いられる球状セルロースの平均粒子径は、好ましくは１μｍ〜１，０００μｍであり、より好ましくは１００μｍ〜５００μｍであり、さらに好ましくは２５０μｍ〜３００μｍである。平均粒子径は使用用途に応じて適宜選択することができる。例えば、球状セルロースを原料として得られる本発明の球状硫酸化セルロースをクロマトグラフィ用の充填剤として用いる場合、平均粒子径が大きすぎると空隙率が高くなり、一定の分離能を得ることが困難になる傾向があり、逆に、小さすぎると圧がかかり変形するおそれがある。そこで、球状セルロースの平均粒子径は５０μｍ〜２５０μｍが好ましく、５０μｍ〜１２５μｍがより好ましい。
一方、本発明の球状硫酸化セルロースを医療用途に用いる場合には、平均粒子径が小さすぎると血液中の血小板や血球成分等が球状セルロース間の空隙に目詰まりを生じることがあるため、球状セルロースの平均粒子径は５０μｍ〜１０００μｍが好ましく、３００μｍ〜７００μｍがより好ましい。
【００２３】
なお、本発明において、球状セルロースの平均粒子径は、電気抵抗法を用いて測定された粒子径（算術径）から算出することができる。電気抵抗法は、粒子が感応領域を通過する際に生じる２電極間の電気抵抗の変化を利用する方法である。電気抵抗は粒子の体積に比例することから、電気抵抗の変化を測定し、これを粒子径に換算することによって、球状セルロースの粒子径を測定することができる。このように測定された「算術径」値の全データを平均して平均粒子径とする。測定装置としては、ベックマンコールター株式会社の精密粒度分布測定装置（製品名「Multisizer 3」）などを用いることができる。
【００２４】
本発明に用いられる球状セルロースは、２，０００〜３，０００，０００の排除限界分子量を有することが好ましい。球状セルロースの排除限界分子量は、吸着対象である蛋白質やウィルスのサイズ等によって大きく異なるものであるので適宜決定すればよい。ここで、排除限界分子量は、カラムに球状セルロースを充填し、分子量既知の物質を流し、それぞれの物質の溶出ピークの体積（あるいは溶出時間）と分子量のプロットから求めることができる。排除限界分子量は球状セルロース中の細孔に入り込む事ができない分子量である。排除限界分子量以上の分子量の物質の溶出体積（あるいは溶出時間）は同じ値として測定される。なお、分子量既知の物質として排除限界分子量の測定に用いる事ができるものとしては、タンパク質、糖類、ポリエチレングリコール、ポリオエチレンオキサイドなどの合成高分子などがある。
【００２５】
（脱水処理）
球状セルロースは、通常、遠心脱水処理後であっても自重の約９０％の水分を含んでいる。このように多量の水分が存在する状態で球状セルロースの硫酸エステル化を行った場合、硫酸エステル化剤がこの水分により失活し、硫酸エステル化が効率よく進まないことがある。このため、本発明では、硫酸エステル化処理を行う前に球状セルロースを脱水処理し、予め水分をできるだけ除去しておくことが好ましい。
【００２６】
脱水処理は、球状セルロースの形状を損なうことなく、球状セルロース中の水分を十分に除去できるものであれば特に限定されない。脱水処理方法としては、例えば、加熱乾燥や水溶性溶媒を用いた液置換などが挙げられる。加熱乾燥は、真空条件下で行うこともできる。
【００２７】
加熱乾燥は水分を除去する方法として簡便ではあるが、球状セルロースの収縮や破壊を伴うことがある。このため、本発明の方法では、このような収縮や破壊が生じにくい液置換を用いることが好ましい。液置換によれば、球状セルロースの形状を保持した状態で水分を除去することができる。特に、結晶性セルロース由来の球状セルロースは密度が低く、加熱乾燥による収縮や破壊が生じやすいので、液置換を用いることが好ましい。
【００２８】
液置換は、球状セルロースを水溶性溶媒と共に容器中で十分に撹拌し、静置後、上澄み液をデカンテーションすることなどによって行うことができる。この操作を繰り返すことによって、球状セルロース中の水分を十分に取り除くことができる。この操作を、上澄み液中の水分が、好ましくは２重量％以下に、より好ましくは１重量％以下に、特に好ましくは０．３重量％以下になるまで繰り返し、水分を除去することによって、次の硫酸エステル化処理をより効率よく行うことができる。
【００２９】
本発明に用いられる水溶性溶媒としては、水に対して親和性を有するものであり、かつ、
硫酸エステル化処理の進行を妨げないものであれば特に限定されない。このような水溶性溶媒としては、非プロトン性有機溶媒が好ましい。非プロトン性有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ピリジン、トリエチルアミン、ピペリジンなどが挙げられる。
【００３０】
これらの中でも、水溶性溶媒としては、硫酸エステル化処理をより効率良く行える点で、硫酸エステル化剤にも使用されているN,N-ジメチルホルムアミドを含むことが好ましく、N,N-ジメチルホルムアミドを単独で、またはN,N-ジメチルホルムアミドと他の水溶性溶媒との混合液を用いることが好ましい。特に、N,N-ジメチルホルムアミドを単独で使用することが好ましい。
【００３１】
（硫酸エステル化処理）
次に、硫酸エステル化処理を行う。
まず、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を調製する。N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合比は、N,N-ジメチルホルムアミドが無水硫酸に対して過剰になる範囲であれば特に限定されない。上記混合物中の無水硫酸の濃度は１０〜３０重量％であることが好ましい。無水硫酸の濃度がこの範囲であれば、硫酸エステル化反応が十分に進行し、硫黄濃度の制御が容易である。上記混合物中の無水硫酸の濃度は、特に１８重量％であることが好ましい。なお、無水硫酸の濃度は、例えば、上記混合物中に水を加えて無水硫酸を硫酸にした後、苛性ソーダで中和滴定することによって測定することができる。無水硫酸と水は１：１で反応するので、上記中和滴定で測定された硫酸の濃度（モル濃度）がそのまま無水硫酸の濃度（モル濃度）を意味する。
【００３２】
N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物は、N,N-ジメチルホルムアミドに無水硫酸を滴下し混合することによって調製できる。なお、混合の際に発熱を伴う場合があることから、混合は氷浴などを用いて５℃以下の温度条件にして行うことが好ましい。
【００３３】
次に、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を球状セルロース及びN,N-ジメチルホルムアミドの分散液に滴下する。本発明では、反応を均一に行うために、球状セルロース及びN,N-ジメチルホルムアミドの分散液を、例えば氷浴などを用いて５℃以下の低温に保持した状態で、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を滴下することが好ましい。
【００３４】
球状セルロースの硫酸エステル化処理は、例えば、反応容器中に用意した球状セルロースとN,N-ジメチルホルムアミドの分散液中に、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸の混合物を徐々に滴下した後、十分に攪拌することによって行う。この硫酸エステル化処理は、０〜７０℃で行うことが好ましく、より好ましくは０〜５０℃、さらに好ましくは０〜３５℃、特に好ましくは０〜３０℃で行う。アミン系溶媒による球状硫酸化セルロースへの着色が懸念される場合には、硫酸エステル化反応は０〜３０℃で行うことが好ましい。撹拌時間は、硫酸エステル化反応が十分に進行できる範囲であれば特に限定されないが、通常１〜１０時間であり、好ましくは２〜６時間、より好ましくは２〜４時間である。
【００３５】
なお、上記球状セルロースとN,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物の混合方法は一例であり、硫酸エステル化反応を均一に行うことができるものであれば、上記方法には限定されない。また、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物の使用量は、球状セルロースの硫酸化を行うのに必要十分な範囲であればよく、当業者であればその範囲を適宜決定することができる。例えば、球状セルロースの質量をグルコース（単位構造物質）相当の分子量で割った値を球状セルロースのモル数として、その１〜５倍モルの無水硫酸を含むように該混合物の使用量を調整することが好ましく、より好ましくは１〜３倍モル、更に好ましくは１〜１．５倍モルの無水硫酸を含むように該混合物の使用量を調整する。
【００３６】
（中和処理）
硫酸エステル化処理した球状セルロースは、濾過分離などによって回収し、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒を用いて洗浄した後、アルカリで中和処理することが好ましい。
【００３７】
中和処理は、球状硫酸化セルロースを製造する際に通常用いられる方法により行うことができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリを溶解させた水溶液またはアルコール溶液を用いて行うことができる。
中和処理後、生成物をイオン交換水などを用いて洗浄し、目的の球状硫酸化セルロースを得ることができる。
【００３８】
本発明の方法に従えば、硫黄濃度が高く、吸着能に優れた球状硫酸化セルロースを簡便な方法で得ることができる。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法は、
（ａ）球状セルロースを、N,N-ジメチルホルムアミドを含む水溶性溶媒を用いた液置換によって脱水処理する工程と、
（ｂ）脱水処理した球状セルロースを、N,N-ジメチルホルムアミドと無水硫酸との混合物を用いて硫酸エステル化処理する工程と、
（ｃ）硫酸エステル化処理した球状セルロースをアルカリで中和する工程と、
を含む。なお、各工程の詳細は前述したとおりであるので、ここでは説明を繰り返さない。
【００４０】
Ｂ．球状硫酸化セルロース
このようにして製造しうる球状硫酸化セルロースは、高濃度で硫黄を含有することができる。本発明の球状硫酸化セルロースは、好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは１〜６重量％、さらに好ましくは１〜４重量％の硫黄濃度を有する。ここで、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は、球状硫酸化セルロースの乾燥重量あたりの硫黄含有量をいい、誘導結合プラズマ(Inductively Coupled Plasma)法により測定することができる。具体的には、日本ジャーレルアッシュ社製の誘導結合プラズマ発光分析装置（型番ＩＲＩＳ−ＡＰ）を使用し、硫黄の測定波長を１８２．０３４ｎｍとして測定することができる。なお、球状硫酸化セルロースは通常ゲル状であるので、測定には、球状硫酸化セルロースを予め分解処理したものを試料として用いる。
本発明の球状硫酸化セルロースは、球形を保持しながらこのように高濃度で硫黄を含有することのできる固体粒状粒子であり、その真球度は、好ましくは０．９〜１．０である。真球度は、顕微鏡観察によって求めることができる。
本発明の球状硫酸化セルロースの排除限界分子量や粒子径は特に限定されない。吸着対象や用途等に応じて適宜決定すればよい。
【００４１】
Ｃ．蛋白質吸着剤及びその用途
本発明の蛋白質吸着剤は、上述した球状硫酸化セルロースを含むことを特徴としている。上述した球状硫酸化セルロースを含むことにより、蛋白質吸着能が高められるので、本発明の蛋白質吸着剤は各種蛋白質やウィルスなどの分離精製に好適に用いられる。
【００４２】
本発明の蛋白質吸着剤は、例えば、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等のクロマトグラフィ用充填剤として有用である。特に、本発明の球状硫酸化セルロースは、ヘパリンと類似の血液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを有している。また、ヘパリン様の群特異的な吸着能を有することから、アフィニティクロマトグラフィ用充填剤として用いることによって、リガンドに対する蛋白質や蛋白質に対するリガンドを探索したり、また、これらリガンドや蛋白質、更には抗体を分離精製することができる。
【００４３】
また、本発明の蛋白質吸着剤は、血液中もしくは血漿中に含まれる病因物質とみられるウイルス、低密度リポ蛋白質（LDL）、免疫複合体、ビリルビン、エンドトキシン等を除去する血液浄化システム用の基材として用いることもできる。なお、本発明の蛋白質吸着剤を用いて病因物質等を除去する場合、除去しようとする病因物質の性質によってその除去方法は異なる。例えば、エンドトキシンは本発明の蛋白質吸着剤には吸着しないので、目的物質を蛋白質吸着剤に吸着させ、そのカラムを良く洗浄することによって、目的物質からエンドトキシンを除去することができる。
【００４４】
本発明の蛋白質吸着剤によって分離精製しうる物質としては、例えば、ヘパリン分解酵素である（ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ）、グリコサミノグリカン分解酵素、DNA結合タンパク質（HMG：ハイモビリティーグループプロテイン、クロマチン、ヒストン）、バクテリオファージ、ウイルスベクター、Adeno-associated Virus(AAV)、センダイウイルス、フォリスタチン（Follistatin）、アクチビン（Activin）、塩基性繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor）、血液凝固因子、リパーゼ、核酸分解酵素などが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例及び比較例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
出発原料の球状セルロースとしては、セルファインＧＨ−２５（製品名・チッソ（株））を使用した。この球状セルロースの粒子径は４４〜１０５μｍであった。なお、この球状セルロースの平均粒子径は６７．０５μｍであり、排除限界分子量は２５００であった。
球状セルロース中の水分を除去するため、５０ｍｌビーカーに含水重量で１０ｇ秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド２０ｍｌを加えて３０分間攪拌した。攪拌後静置し、カールフィッシャー法により上澄み液の水分量を測定した。上澄み液中の水分量が１〜２重量％の範囲に入るまでこの操作を繰り返した。最終的に上澄み液中の水分が１．０５重量％となったので、この脱水処理した球状セルロースを用いて次の硫酸エステル化処理を行った。
まず、氷浴で５℃以下の温度に保持したN,N-ジメチルホルムアミド中に脱水処理した球状セルロースを分散させた。
この分散液に５℃に冷却した１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液１０．９７ｇを徐々に滴下し、反応温度を３０±２℃に保ちながら４時間反応させた。反応終了後は、反応終了液をろ過分別し、ろ過物をメタノールにて洗浄した。なお、１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液は、氷浴にて５℃以下に冷却したN,N-ジメチルホルムアミド２５００ｇ中に無水硫酸２７８ｇを攪拌しながら滴下して調製したものを使用した（以下において同じである。）。この際、滴下速度は、液内の温度が５℃を超えないように調整した。
次いで、ろ過物を１０℃以下に冷却したイオン交換水中へ仕込み、１Ｍ−ＮａＯＨで中和した。その後、イオン交換水で十分洗浄した後、球状硫酸化セルロースを得た。
【００４７】
誘導結合プラズマ(Inductively Coupled Plasma)法により、得られた球状硫酸化セルロースの硫黄濃度を測定した。測定には、球状硫酸化セルロースを下記の方法で前処理したものを用いた。
まず、球状硫酸化セルロース２０ｍｇを１００ｍｌビーカーにはかりとり、硝酸１０ｍｌを加え、ホットプレート上（２５０℃）で茶褐色の色が薄くなるまで分解した。この際、乾固しないように留意した。放冷後、さらに硝酸５ｍｌ、過塩素酸２ｍｌを加え、ホットプレート上で白煙がでるまで分解した。続いて、放冷後、１：１塩酸水溶液（体積比）１０ｍｌを加え溶解させてメスフラスコで１００ｍｌ定容し、測定用試料とした。
【００４８】
測定は、日本ジャーレルアッシュ社製の誘導結合プラズマ発光分析装置（型番ＩＲＩＳ−ＡＰ）を使用し、硫黄の測定波長を１８２．０３４ｎｍとして行った。その結果、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は１．３１重量％であった。
【００４９】
［実施例２］
出発原料は、実施例１で用いたものと同じセルファインＧＨ−２５を使用した。
球状セルロース中の水分を除去するため、２００ｍｌビーカーに含水重量で５２．７ｇ秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド１００ｍｌを加えて３０分間攪拌した。攪拌後静置し、実施例１と同様の方法で上澄み液中の水分が１〜２重量％の範囲に入るまで脱水処理を繰り返した。最終的に上澄み液中の水分は１．６０重量％となったので、この脱水処理した球状セルロースを用いて次の硫酸エステル化処理を行った。
次に、５℃以下の温度にてN,N-ジメチルホルムアミド中に脱水処理した球状セルロースを分散させた。この分散液に５℃に冷却した１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液５４．９９ｇを徐々に滴下した。反応温度を３０±２℃に保ちながら４時間反応させた。反応終了後、反応液をろ過分別し、ろ過物をメタノールにて洗浄した。
次いで、ろ過物を１０℃以下に冷却したイオン交換水中へ仕込み、１Ｍ−ＮａＯＨで中和した。その後、イオン交換水で十分洗浄した後、球状硫酸化セルロースを得た。
実施例１と同様にして球状硫酸化セルロースの硫黄濃度を測定した結果、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は１．８１重量％であった。
【００５０】
［実施例３］
出発原料は、セルファイン（製品名、チッソ（株））を使用した。セルファインの製造工程は次の通りである。
（i）チオシアン酸カルシウム（無水物として）６０重量％を含む水溶液に上記結晶性セルロース０．４６ｋｇを加え、１１０℃に加熱し溶解する。（ii）この溶液に界面活性剤を添加し、１３０〜１４０℃に予め加熱したｏ−ジクロロベンゼン３０ｌ中に溶解液を滴下し攪拌分散する。（iii）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１３ｌを注ぎ粒子を得る。（iv）この懸濁液をろ過分別し、粒子をメタノール１３ｌで洗浄し、ろ過分別する。この洗浄操作を数回行う。（v）さらに大量の水で洗浄した後目的とする球状セルロース粒子を得る。
この球状セルロースの粒子径は４４〜３００μｍであった。平均粒子径は２５０μｍであり、排除限界分子量は３，０００，０００であった。
【００５１】
球状セルロース中の水分を除去するため、２００ｍｌビーカーに含水重量で５０ｇ秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド１００ｍｌを加えて３０分間攪拌した。攪拌後静置し、実施例１と同様の方法で上澄み液中の水分が０．２重量％台になるまで脱水処理を繰り返した。最終的に上澄み液中の水分が０．２３重量％となったので、この脱水処理した球状セルロースを用いて次の硫酸エステル化処理を行った。
まず、氷浴にて５℃以下の温度に保持したN,N-ジメチルホルムアミド中に脱水処理した球状セルロースを分散させた。これに５℃に冷却した１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液１５．１０ｇを徐々に滴下した。反応温度を３０±２℃に保ちながら４時間攪拌した。反応終了後、反応液をろ過分別し、ろ過物をメタノールにて洗浄した。
次いで、ろ過物を１０℃以下に冷却したイオン交換水中化で１Ｍ−ＮａＯＨにて中和した。その後、イオン交換水で洗浄した後、球状硫酸化セルロースを得た。
実施例１と同様にして球状硫酸化セルロースの硫黄濃度を測定した結果、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は２．８０重量％であった。
【００５２】
［実施例４］
球状セルロース中の水分の除去を、５ｌビーカーに含水重量で２０００ｇ秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを４ｌ使用する以外は、実施例３と同様の方法で上澄み液中の水分が０．２１重量％である球状セルロースを得た。
これを全量用い、１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液３７５．０ｇを使用して、実施例３と同様にして硫酸エステル化処理、中和処理を行い、球状硫酸化セルロースを得た。
実施例１と同様にして球状硫酸化セルロースの硫黄濃度を測定した。その結果、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は２．２０重量％であった。
【００５３】
［実施例５］
実施例３で出発原料として用いたものと同じ球状セルロースを使用し、以下の方法で架橋した。
２ｌ容セパラブルフラスコに、球状セルロースを１７６ｇ秤量し、ヘプタン、カチオン界面活性剤（日局塩化ベンザルコニウム）を加え、約３０分間攪拌を行った。その後、３０℃まで昇温し、水素化ホウ素ナトリウム０．１８ｇ、５重量％に調製した水酸化ナトリウム水溶液４２０ｍｌを加え、２時間攪拌した。
次いで、４０℃まで昇温し、エピクロロヒドリンを６０．０ｇ添加し、これをさらに５０±１℃に昇温して４時間攪拌した。その後、約３５℃まで冷却し、酢酸にて中和した後メタノールを加えた。反応液をろ過分別した後、ろ過物をメタノール、水の順で洗浄し、架橋球状セルロースを得た。
架橋球状セルロースの水分の除去は、５００ｍｌビーカーに含水重量で１５０ｇ秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを３００ｍｌ使用する以外は実施例３と同様の方法で行い、上澄み液中の水分が０．２３重量％になるまで脱水処理を行った。
脱水処理した架橋球状セルロースを全量用い、硫酸エステル化剤として１８重量％無水硫酸-ジメチルホルムアミド溶液４７．０ｇを使用した以外は実施例３と同様にして硫酸エステル化処理、中和処理を行い、球状硫酸化セルロースを得た。
実施例１と同様にして球状硫酸化セルロースの硫黄濃度を測定した。その結果、球状硫酸化セルロースの硫黄濃度は４．７０重量％であった。
【００５４】
なお、実施例１〜５で得られた球状硫酸化セルロースのそれぞれ１０００個について、顕微鏡観察を行い、各粒子の長径（Ｒ１）及び短径（Ｒ２）を測定して真球度（Ｒ２／Ｒ１）を求めたところ、各粒子共に真球度は０．９以上であり、球状を保持していることを確認した。
【００５５】
次に、実施例６〜１０において、実施例１〜５で得られた球状硫酸化セルロースのリゾチーム吸着量を測定した。
【００５６】
［実施例６］
まず、実施例１で得られた球状硫酸化セルロースについて、以下の方法によりリゾチーム吸着量を測定した。
メタノール中に保存しておいた球状硫酸化セルロースを減圧ろ過したもの約３gをビーカーに入れ、１００ｍｌのイオン交換水を加えて１０分間マグネチックスターラーで攪拌した後、ろ過分別した。このろ過分別した球状硫酸化セルロースを再びビーカーに戻し、１００ｍｌのイオン交換水を加えて攪拌、ろ過分別する処理をさらに３回繰り返した。
この球状硫酸化セルロースをビーカーに入れ、吸着Buffer１００ｍｌを加え、１時間攪拌した。吸着Bufferは、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸（Ｎａ−Ｎａ）緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。
その後、吸着Buffer中に懸濁させた球状硫酸化セルロース２ｍｌをカラムに充填し、吸着Buffer４０ｍｌを流速４０ｍｌ／時で流して平衡化した。続いてリゾチーム溶液（和光純薬工業（株）・製品名「リゾチーム」）３３３ｍｇに吸着Bufferを加えて１００ｍｌ定容とした調製液３０ｍｌをはかり取り、流速６０ｍｌ／時で１時間循環させた。
【００５７】
続いて、吸着Buffer２０ｍｌを流速５０ｍｌ／時で流し、未吸着リゾチームを除去した。次いで、溶出Buffer５０ｍｌを流速５０ｍｌ／時で流し、４５ｍｌを採取した。この採取液に溶出Buffer５ｍｌを加えて５０ｍｌとし、この液を溶出液とした。なお、溶出Bufferは、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸（Ｎａ−Ｎａ）緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。
また、リゾチーム溶液１ｍｌをとり、これに溶出Bufferを加え、１０ｍｌとした液を調製し、この液を標準液とした。
【００５８】
溶出Bufferを対照として、溶出液及び標準液の吸光度を測定した。測定は石英セルを使用し、波長２８０ｎｍで行った。
測定数値を下記の計算式に代入し、リゾチーム吸着量を算出した。その結果、吸着量は１８ｍｇ／ｍｌであった。
吸着量（ｍｇ／ｍｌ）=０．３３３×２５×（溶出液の吸光度/標準液の吸光度）
【００５９】
［実施例７］
実施例６と同様にして、実施例２で得られた球状硫酸化セルロースのリゾチーム吸着量を測定した結果、吸着量は２４ｍｇ／ｍｌであった。
【００６０】
［実施例８］
未吸着リゾチームを除去した後、溶出Buffer１５０ｍｌを流して１４５ｍｌを採取し、採取液に溶出Buffer５ｍｌ加えて１５０ｍｌとして溶出液を調製した以外は実施例６と同様にして、実施例３で得られた球状硫酸化セルロースのリゾチーム吸着量を測定した。その結果、吸着量は３９．０６ｍｇ／ｍｌであった。
【００６１】
［実施例９］
実施例８と同様にして、実施例４で得られた球状硫酸化セルロースのリゾチーム吸着量を測定した。その結果、吸着量は２６．４１ｍｇ／ｍｌであった。
【００６２】
［実施例１０］
実施例８と同様にして、実施例５で得られた球状硫酸化セルロースのリゾチーム吸着量を測定した。その結果、吸着量は４０．３３ｍｇ／ｍｌであった。
【００６３】
［比較例１］
硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））をサンプルとして、実施例６と同様にしてリゾチーム吸着量を測定した。その結果、吸着量は５ｍｇ／ｍｌであった。なお、硫酸化セルファインの硫黄濃度は、実施例１と同様に測定したところ、硫黄濃度は０．１６重量％であった。
【００６４】
実施例６〜１０及び比較例１で得られた球状硫酸化セルロースの硫黄濃度とリゾチーム吸着量との関係を図１に示した。図１中、実施例６〜１０の結果を■で示し、比較例１の結果を△で示した。本発明の方法により製造された球状硫酸化セルロースは、従来品の３倍以上のリゾチーム吸着能があることが分かった。
【００６５】
次に、実施例１１において、実施例３の球状硫酸化セルロースと硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））の血液凝固第VIII因子活性の吸着量を比較した。
また、実施例１２において実施例３の球状硫酸化セルロースとHeparin  Sepharose 6 Fast Flow（製品名・アマシャムバイオサイエンス（株））の血液凝固第XII因子の吸着量を比較した。
【００６６】
[実施例１１]
スピッツ管を２本用意し、各スピッツ管にヒト血漿（pool）（抗凝固剤：クエン酸ナトリウム、コスモ・バイオ（株））６ｍｌをはかりとって入れた。次いで、一方のスピッツ管に生理食塩水で洗浄した実施例３の球状硫酸化セルロースを２ｍｌ分加え、他方のスピッツ管に硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））を２ｍｌ分加えて、それぞれ２５℃で２時間振盪撹拌させた。その後、遠心分離によりそれぞれの上澄みをサンプリングし、血液凝固第VIII因子活性の吸着量を測定した。ブランクとしてはゲルを添加していない血漿を用いた。
血液凝固第VIII因子活性の測定は（株）三菱化学ビーシーエルにて行い、APTT法（Activated Prothrombin Time method）にて実施した。
測定値は、標準ヒト血漿を１００％とする相対値で表した。吸着量は下記の計算式によって算出した。結果を表１に示した。
吸着量(%/ml-gel)=（（ブランク測定値×容積）-（サンプル測定値×容積））/２
【００６７】
【表１】
0005332090.tif 000003
【００６８】
実施例３の球状硫酸化セルロースは、市販品の硫酸化セルファインより約５．５倍の吸着能力があることが分かった。
【００６９】
[実施例１２]
比較として、硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））に代えて、Heparin  Sepharose 6 Fast Flow（製品名・アマシャムバイオサイエンス（株））を用いた以外は実施例１１と同様の操作を行い、血液凝固第XII因子の吸着量を比較した。
血液凝固第XII因子活性の測定は（株）三菱化学ビーシーエルにて行い、APTT法（Activated Prothrombin Time method）にて実施した。
測定値は、標準ヒト血漿を１００％とする相対値で表した。吸着量は実施例１１と同様の計算式で算出した。結果を表２に示した。
【００７０】
【表２】
0005332090.tif 000004
【００７１】
実施例３の球状硫酸化セルロースは、市販品のHeparin  Sepharose 6 Fast Flowの２．８倍以上の吸着能力があることが分かった。
【００７２】
次に、実施例１３において、実施例２または３の球状硫酸化セルロース、硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））及びHeparin Sepharose 6 Fast Flow（製品名・アマシャムバイオサイエンス（株））のγ-グロブリンの吸着量を比較した。
【００７３】
[実施例１３]
実施例２または３で得られた球状硫酸化セルロース、硫酸化セルファイン（製品名・チッソ（株））またはHeparin Sepharose 6 Fast Flow（製品名・アマシャムバイオサイエンス（株））をそれぞれ４ｍｌずつ、別々のカラム（７ｍｍφ×１００ｍｍ）に充填し、それぞれ流速２０ｍｌ/ｈｒで吸着Bufferを通して平衡化した。（以下、各液の通液速度は全て２０ｍｌ/ｈｒで行った。）吸着Bufferは、０．０８Ｍ酢酸ナトリウム-塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を使用した。
各カラムにγ-グロブリン溶液（Bovine γ-Globulins（製品名・生化学工業（株）を吸着Bufferで溶解した液）２０ｍｌを通液した。その後、吸着Bufferを通液し、未吸着分を除去した。
次いで、溶出Bufferで溶出し、この液を溶出液とした。溶出Bufferは、０．６Ｍ-ＮａＣｌを含む０．０８Ｍ酢酸ナトリウム-塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を使用した。
溶出Bufferを対照として、溶出液及び標準液（γ-グロブリン溶液１ｍｌをとり、吸着Buffer を加えて５０ｍｌとした調製液）の吸光度を測定した。測定は石英セルを使用し、波長２８０ｎｍで行った。
測定数値を下記の計算式に代入し、γ-グロブリン吸着量を算出した。結果を表３に示した。
吸着量（ｍｇ／ｍｌ）=１００×（溶出液の吸光度/標準液の吸光度）
【００７４】
【表３】
0005332090.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の球状硫酸化セルロースは、各種ウィルスや蛋白質の分離精製用の医療用基材、吸着剤、またはクロマトグラフィ用充填剤などとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】球状硫酸化セルロースの硫黄濃度とリゾチーム吸着量との関係を示したグラフである。
【図１】
0005332090.tif 000006