(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チラミンオキシダーゼを含む溶液に、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、ピルビン酸または、それらの塩よりなる群から選択される少なくとも一つの物質であるキレート剤を共存させることを特徴とする、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【請求項２】
一般式（１）または、一般式（２）で表されるアニリン系水素供与体を共存させる、請求項１に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【化１】
0005326324.tif 000013
［一般式（１）］
【化２】
0005326324.tif 000014
［一般式（２）］
（式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５またはＨのいずれか、Ｒ２はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれか、Ｒ３はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれかである。）
【請求項３】
さらに、ペルオキシダーゼを共存させる、請求項２に記載の安定化方法。
【請求項４】
安定化が、光に対する安定性を向上させるものである、請求項１−３のいずれかに記載の安定化方法。
【請求項５】
チラミンオキシダーゼを含む溶液が、チロシン測定試薬に含まれるものである、請求項１−４のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【請求項６】
チロシン測定試薬が、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、キレート剤を第一試液に含み、チロシンデカルボキシラーゼおよびカップラーを第二試液に含む構成を有する、請求項１−５のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【請求項７】
カップラーが４−アミノアンチピリンである、請求項６に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法および該方法により安定化された組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
チラミンオキシダーゼは、これまで生体アミンの測定や、食品分野におけるチラミン測定、およびＢＴＲ（Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｔｙｒｏｓｉｎ    Ｒａｔｉｏ）測定におけるチロシン測定試薬に使用されてきている。
例えば、特許文献１にはチラミンオキシダーゼを用いた生体アミンの測定方法が開示されている。また、特許文献２においては、チラミンオキシダーゼを用いたチラミンの測定方法が開示されており、食品の品質管理用途としての利用が記載されている。特許文献３には電気化学的手法を用いたチラミンとヒスタミンの分別定量方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−２８０２０１号公報
【特許文献２】特公平０７−５００６９号公報
【特許文献３】特開２００６−３８６１２号公報
【０００３】
また、特許文献４および５には、電極を用いない酵素法を用いたチロシン測定法が開示されており、臨床診断用途としての利用が記載されている。
特許文献４には、チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させ、この過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン。別名Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン）と４−アミノアンチピリンを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にてチロシンを測定する方法が開示されている。
特許文献５には、上記のチロシン測定方法において、チロシンデカルボキシラーゼ（ビタミンＢ６酵素）の活性発現を安定化させることにより、チロシン測定試薬の安定性を向上させる方法が開示されている。
【特許文献４】特公平０６−９８０３６号公報
【特許文献５】特開２００６−７５１１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまで、病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。慢性肝炎から肝硬変への移行診断に用いられる、ＢＴＲ測定用試薬（総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定試薬）は、ＢＣＡＡ（総分岐鎖アミノ酸）測定試薬とＴＹＲ（チロシン）測定試薬がセットになっており、ＢＴＲ測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。なお、総分岐鎖アミノ酸とはＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンのことを指す。
一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＢＴＲ測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
【０００５】
また、上記以外の新たな問題点として、本発明者らは、試薬中のチラミンオキシダーゼが光照射の影響により失活することを見出した。特に、ＪＩＳ照度基準が定める一般的な生活環境下における照度範囲である７５〜７５０ルクスにおいても、光照射の影響により失活が見られた。特に、３００ルクス以上の光照射条件下においては、失活がより顕著であった。すなわち、製造中、輸送中、使用先での保存中など日常考えうる範囲内での光照射条件下において、チラミンオキシダーゼが光により失活することを見出した。
【０００６】
上記の様に、チラミンオキシダーゼを用いる試薬においては、液状化および自動化のニーズに合致した形態をとることが課題である。すなわち、本発明が解決しようとする課題は、自動分析機での測定において、他の測定項目に影響を及ぼさない形態であり、かつ（試薬中で長期に渡って冷蔵条件、加温条件、光照射条件において安定であるチラミンオキシダーゼ組成物を提供することにある。
【０００７】
上記特許文献１ないし５には、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法に関して特に記載はなく、また、そのような方法を示唆するような記載もない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者らは、鋭意検討した結果、チラミンオキシダーゼを含む溶液に、キレート剤を共存させることにより、長期（冷蔵）保存安定性、熱安定性、および光に対する安定性を向上させることに成功し本発明の完成に至った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］  
チラミンオキシダーゼを含む溶液に、キレート剤を共存させることを特徴とする、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項２］  
一般式（１）または、一般式（２）で表されるアニリン系水素供与体を共存させる、項１に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
【化３】
0005326324.tif 000002
［一般式（１）］
【化４】
0005326324.tif 000003
［一般式（２）］
（式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５またはＨのいずれか、Ｒ２はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれか、Ｒ３はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれかである。）
［項３］
キレート剤が、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸、クエン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピルビン酸または、それらの塩よりなる群から選択される少なくとも一つの物質である、項１または２に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項４］ 
チラミンオキシダーゼを含む溶液が、チロシン測定試薬に含まれるものである、項１〜３のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項５］ 
チロシン測定試薬が、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、キレート剤を第一試液に含み、チロシンデカルボキシラーゼおよびカップラーを第二試液に含む構成を有する、項１〜４のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項６］ 
カップラーが４−アミノアンチピリンである、項５に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項７］ 
項１〜６のいずれかに記載の方法により安定化された、チラミンオキシダーゼを含有する溶液。
［項８］ 
項７に記載の溶液を含む、チロシン測定試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、チラミンオキシダーゼを含む溶液において、チラミンオキシダーゼの冷蔵安定性、熱安定性、および光に対する安定性を著しく向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において「安定」とは以下の３種の保存状態において、未処理の試薬と比較した場合のチラミンオキシダーゼの残存活性が、以下（１）〜（３）の条件をすべて満たすことを指す。
（１）冷蔵安定性；１０℃保存における安定性。具体的には、１０℃で１４日間保存後の安定性が未処理の試薬と比較し８５％以上であること。
（２）熱安定性；加温処理後の安定性。具体的には、３７℃で１４日間加温処理後の安定性が未処理の試薬と比較し６０％以上であること。
（３）光安定性；光照射後の安定性。具体的には、１０℃の保存条件で、褐色容器内に試薬を保管し、試薬を含有する該容器を５００ルクスで１４日間処理した後の安定性が、未処理の試薬と比較し６０％以上であること。容器の材質としては、臨床化学分野で診断薬に用いられものであれば特に限定されないが、ポリエチレンやポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
【００１１】
本発明の安定化方法の対象は、チラミンオキシダーゼを含む溶液である。
そのような溶液の一形態としては、下記の［１］に例示するチロシン測定方法を実施するためのチロシン測定試薬に含まれるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
［１］チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させる。この発生した過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、水素供与体とカップラーを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にて測定する、チロシン測定方法。
【００１３】
特に、下記の式（１）で表される反応を用いることが好ましい。
【数１】
0005326324.tif 000004
［式（１）］
【００１４】
また、そのようにして安定化された、チラミンオキシダーゼを含む溶液、または、該溶液を含むチロシン測定試薬も、本発明に包含される。
【００１５】
本発明のチロシン測定試薬における試薬構成としては、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、キレート剤を第一試液に含み、チロシンデカルボキシラーゼおよびカップラーを第二試液に含むことを特徴とするチロシン測定液状試薬が考えられる。なお、ペルオキシダーゼは第一試薬、および第二試薬のどちらに配置されても良いが、第一試薬に配置されることがチラミンオキシダーゼの安定性向上の観点からより好ましい。
【００１６】
本発明のチロシン測定試薬に含まれるチラミンオキシダーゼを含む溶液は、凍結乾燥試薬（液状で不安定な酵素などを凍結乾燥しておき、使用時に溶解液と混合し、液状にして用いる試薬）、ドライケミストリー試薬（分析に必要な全ての試薬が乾燥状態で用意されており、使用時に試料から持ち込まれる水分を利用して反応させる試薬）、液状試薬、のいずれの形態であってもよいが、特に液状試薬であることが好ましい。
本発明のチロシン測定試薬は、汎用自動分析装置で取り扱える試薬構成であれば、特に限定されないが、２ないし４のパーツで構成されることが望ましい。（好ましくは２つのパーツで構成される２試薬系がよい。）
すなわち、２ないし４のパーツで構成される液状試薬であることが好ましい。（好ましくは２つのパーツで構成される液状試薬がよい。）
【００１７】
本発明のチロシン測定試薬の測定対象物である生体試料としては、特に限定されないが、血清あるいは血漿もしくは、全血あるいは、尿であることが好ましい。
【００１８】
本発明に用いるチラミンオキシダーゼは、ＥＣ１．４．３．４に分類されるアミンオキシダーゼであり、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ由来のものが、東洋紡社、旭化成ファーマ社から入手できるが、起源および入手先は特に限定されない。
本発明試薬における、チラミンオキシダーゼの添加配置としては、第一試液および第二試液のどちらでも良いが、第一試液に添加することがより好ましい。
本発明で用いられるチラミンオキシダーゼ濃度の好ましい下限としては、試薬中に０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌである。好ましい上限としては、試薬中に２０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは１０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌである。
また、チラミンオキシダーゼを含有する試薬のｐＨの好ましい下限としては、ｐＨ５．５、さらに好ましくは、ｐＨ６．０である。好ましい上限としては、ｐＨ９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
【００１９】
本発明で用いられるキレート剤としては、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸、クエン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピルビン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロトリスメチレンホスホン酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、または、それらの塩が挙げられる。
本発明の構成は、これらの群より選ばれる少なくとも１種以上のキレート剤をチラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体を含む試薬に含むことからなる。
チラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体を含む試薬中への、キレート剤の添加濃度の好ましい下限としては、０．０１ｍＭ、さらに好ましくは０．０５ｍＭ、さらに好ましくは０．０７５ｍＭである。好ましい上限としては、２００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ、さらに好ましくは１０ｍＭである。
【００２０】
本発明に用いる、一般式（１）で表されるアニリン系水素供与体としては、例えば表１のものが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。
本発明で用いられるアニリン系水素供与体の濃度の好ましい下限としては、試薬中に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限としては、試薬中に５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、アニリン系水素供与体は、チラミンオキシダーゼを含む試薬に添加されることが好ましい。本発明におけるアニリン系水素供与体の本来の使用用途は、カップラーと組み合わせて発色定量させることであるが、チラミンオキシダーゼをさらに安定化させる効果も有している点で好ましい。特に、発色定量用途にロイコ色素を用いる場合、好ましい安定化効果を有する。
【００２１】
【表１】
0005326324.tif 000005
【００２２】
本発明で用いられる、チロシンデカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．２５に分類され、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｃｈａｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｙｒｉｎｇａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ  ｒｕｇｏｓｕｍ由来のものが挙げられるが、特に起源は特に限定されない。
添加配置としては、チラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体およびキレート剤を含む試薬と別配置であることが好ましい。
濃度としては、好ましい下限としては試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌである。好ましい上限としては試薬中１００Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは１０Ｕ／Ｌである。
また、チロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬のｐＨとしては、チロシンデカルボキシラーゼの長期冷蔵安定性を鑑み、好ましい下限はｐＨ５．５、さらに好ましくはｐＨ６．０である。好ましい上限はｐＨ９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
【００２３】
本発明で用いるチロシンデカルボキシラーゼの補酵素としては、ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）、ピリドキサミン５’−リン酸（ＰＭＰ）が挙げられる。添加配置は、チロシンデカルボキシラーゼを含有しない試薬、すなわちチロシンデカルボキシラーゼと別配置にすることがチロシンデカルボキシラーゼの安定性を向上させるうえで好ましい。濃度としては、好ましい下限は試薬中で０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は試薬中で１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。
【００２４】
本発明で用いられるカップラーとしては、４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられるが、４-アミノアンチピリンを用いることがより好適である。カップラーの濃度としては、好ましい下限は試薬中に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は試薬中に５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
添加配置は、チラミンオキシダーゼを含まない試薬に処方することが好ましい。すなわち、チロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬に配置することが好ましい。
【００２５】
本発明で用いられるペルオキシダーゼは、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくは、カビなどの微生物由来のものが挙げられる。なお、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は、遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
添加配置としては、二試薬系で構成される試薬の場合、第一試薬または第二試薬のいずれでも良いが、チラミンオキシダーゼを含有する試薬に添加することがチラミンオキシダーゼの安定性をより向上させるため好ましい。
濃度としては、好ましい下限は試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌである。好ましい上限は試薬中１００Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは３０Ｕ／Ｌである。
【００２６】
本発明に用いられる緩衝剤としては、（アニリン系水素供与体の非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば）特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。また、自動分析機への適応を考慮した場合は、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤が好適であり、さらに好ましくは、緩衝能力に優れることから、グッド緩衝剤を用いることがより好ましい。
グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられる。
ｐＨはｐＨ５〜１０の範囲で調整されるが、チラミンオキシダーゼおよびチロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬のｐＨの、該酵素の安定化のため好ましい下限はｐＨ５．５、さらに好ましくは、ｐＨ６．０である。好ましい上限はｐＨ９．０、より好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
【００２７】
また、チラミンオキシダーゼを用いた、上記特許文献４および５においては、液状試薬の緩衝液としてマックルバイン緩衝液を用いることが開示されている。このマックルバイン緩衝液は、クエン酸とリン酸を含む緩衝液であるが、近年の測定自動化においては、自動分析機でリン酸を含むバッファーの使用は好ましくない。これは、測定対象となる無機リン酸等にバッファー中のリン酸が影響を及ぼすからである。
【００２８】
本発明で用いられる界面活性剤としては、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルベタインであることが好適である。
【００２９】
ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ、エマルゲン（登録商標）１０５、エマルゲン（登録商標）１０６、エマルゲン（登録商標）１０８、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）１２０、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ、エマルゲン（登録商標）１４７、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０、エマルゲン（登録商標）２２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＳ−２０、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４、エマルゲン（登録商標）４０８、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）４２０、エマルゲン（登録商標）４３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＯ−５０、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００３０】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）７０７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）８１０、エマルゲン（登録商標）８４０Ｓ、エマルゲン（登録商標）９０９、エマルゲン（登録商標）９１０、エマルゲン（登録商標）９３０、エマルゲン（登録商標）９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、エマルゲン（登録商標）Ｂ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−１５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２３０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２０７、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１２、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１５、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドール（登録商標）（登録商標）ＴＷ−Ｌ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｐ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｓ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｏ１２０、レオドール（登録商標）４６０、エマノーン（登録商標）１１１２、エマノーン（登録商標）３１１５、エマノーン（登録商標）３１７０、エマノーン（登録商標）３２９９、エマノーン（登録商標）３１３０
【００３１】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００３２】
さらにアルキルベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール（登録商標）（登録商標）２０ＢＳ、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ、アンヒトール（登録商標）８６Ｂ、アンヒトール（登録商標）２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００３３】
界面活性剤の濃度としては、特に規定はしないが、好ましい下限は０．０１重量％、より好ましくは０．０５重量％、さらに好ましくは０．１重量％添加することが好ましい。好ましい上限は１０重量％、さらに好ましくは５．０重量％添加することが好ましい。
【００３４】
また、界面活性剤のＨＬＢ値は、好ましい下限として８．８、さらに好ましくは１１．０である。好ましい上限は１９．１である。
【００３５】
本発明に用いられる防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤、プロクリン（登録商標）各種などが挙げられる。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．００１重量％、より好ましくは０．０１重量％である。好ましい上限は試薬中１．０重量％、より好ましくは０．１重量％である。
【００３６】
本発明に用いることができる金属化合物としては、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオンと硫酸、硝酸、炭酸などの無機酸との塩、ヨウ素、臭素、塩素等のハロゲン原子との塩、または酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、パンテント酸、エチレンジアミン四酢酸などの有機酸との塩、が挙げられる。特に、チラミンオキシダーゼの安定化に顕著な効果が見られるものとして、塩素原子の金属塩が挙げられ、中でも塩化ナトリウムを用いることが好ましく、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、およびキレート剤が含まれる試薬に配置することでチラミンオキシダーゼの安定性がさらに向上する。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．００１重量％、より好ましくは０．０１重量％、さらに好ましくは０．１％重量％である。好ましい上限は、試薬中１０重量％、より好ましくは５．０重量％、さらに好ましくは２．０％重量％である。
また、生体試料中の還元物質の影響回避剤としては、上記金属化合物のうち、鉄イオンが好ましく、エチレンジアミン四酢酸鉄（III）、塩化第一鉄（III）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられる。金属化合物の濃度としては、好ましい下限として試薬中に０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中に５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
またこれらの金属化合物は複数組み合わせて用いることができる。
【００３７】
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。濃度としては、好ましい下限として試薬中で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中で１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３８】
また、生体試料中のアスコルビン酸の影響回避のために、アスコルビン酸オキシダーゼを使用することができ、本発明で使用するアスコルビン酸オキシダーゼの起源としては、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓｐ．やＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｓｐ．およびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、より好ましくは０．０５Ｕ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中１００Ｕ／Ｌ、より好ましくは５０Ｕ／Ｌである。
また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬のｐＨとしては、酵素の安定性、活性を考慮し、好ましい下限はｐＨ６．０、好ましい上限はｐＨ８．０である。また、添加配置としては、第一試薬に含有させることが好ましい。
【００３９】
本発明において、液状試薬の形態で提供する場合、試薬は、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の形態で提供することができるが、これらの容器を遮光することがより望ましい。
【００４０】
本発明におけるチロシン測定試薬において、検量線での校正方法（キャリブレーション方法）は特に限定されないが、
［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
【００４１】
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。
【００４２】
また、分析方法としては、以下の方法に限定されるものではないが、以下の［１］、［２］、［３］、のいずれかであることが好ましい。
［１］１ポイント法；試薬を添加し、一定時間後の吸光度を測定するエンドポイント法
［２］２ポイント法；測光ポイントを変えて２回測定し、差の吸光度を求めるエンドポイント法
［３］レート法；指定された測光ポイント間の単位時間あたりの吸光度変化を求める方法
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１〜８、および、比較例１〜８］チラミンオキシダーゼと各色素、またはカップラー、共存条件におけるチラミンオキシダーゼの安定性（表２（実施例）、表８（比較例））
本発明の実施形態の１つとしてチロシン測定用試薬が考えられる。特に、自動分析機への適応などを考えた場合、過酸化水素の発生量に基づく発色量を検出できる測定系が望ましい。よってまず、チラミンオキシダーゼと各色素、カップラーとの共存条件におけるチラミンオキシダーゼの安定性について検討した。
【００４５】
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製）      １５．１ｇ／Ｌ    ｐＨ６．５
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製）    ０．４ＫＵ／Ｌ  ｐＨ７．０
各発色体または、カップラー    ０．５ｇ／Ｌ
【００４６】
（保存条件）
（１）冷蔵安定性；試薬を１℃〜１０℃に保存。
（２）熱安定性；試薬を３７℃に保存。
（３）光安定性；１０℃以下の保存条件で、褐色容器内に試薬を保管し、試薬を含有する該容器を５００ルクスで照射し保存。容器の材質としては、ポリエチレンテレフタレートのものを使用した。
【００４７】
（チラミンオキシダーゼ活性測定法）
チラミンオキシダーゼの活性測定は以下の測定条件で行った。以下、残存活性の測定には、本方法を用いた。
（１）基質液
１０ｍＭ  チラミン水溶液
（２）発色液
７０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０７１ｇ／Ｌ  ４−アミノアンチピリン
１．１６ｍＭ  ＴＯＯＳ（同仁化学社製）
２．３ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ
（３）測定条件
日立７０７０形自動分析機を用いた。
基質液：発色液＝１：９で混合し測定試薬とした。試料１５μＬに測定試薬２８５μＬを添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。第一反応の単位時間あたりの５７０ｎｍにおける吸高度変化をレート法にて測定し活性を求めた。
（４）キャリブレーション法
精製水、０．２U／mＬチラミンオキシダーゼ溶液を２重測定し、０．２U／mＬチラミンオキシダーゼ溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【００４８】
【表２】
0005326324.tif 000006
【００４９】
【表８】
0005326324.tif 000007
【００５０】
チラミンオキシダーゼと各色素、またはカップラー共存条件におけるチラミンオキシダーゼの各保存条件での安定性を表２（実施例）、表８（比較例）に示す。
実施例では、未処理の試料と比較し、いずれも冷蔵安定性≧８５％、熱安定性≧６０％、光安定性≧６０％であるのに対し、比較例１〜８では、著しい残存活性の低下が見られた。
よって、本発明の実施形態として考えられるチロシン測定試薬においては、以下の反応系がより好ましいが、チラミンオキシダーゼとカップラーを別配置にし、水素供与体を同配置にすることが好ましい。特に水素供与体としては、一般式（１）または（２）および表１で表される化合物が良い。
［反応系］
チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させる。この発生した過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、水素供与体とカップラーを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にて測定する方法。
【００５１】
［実施例９〜１２］チラミンオキシダーゼを含む試薬に水素供与体および/またはキレート剤を添加することによるチラミンオキシダーゼの安定化（表３）
実施例３の試薬に、さらにキレート剤を添加しチラミンオキシダーゼの残存活性を検討した（実施例９〜１１）。また、実施例３の組成からＴＯＯＳ ０．５ｇ/Ｌを除いた試薬に、キレート剤を添加し、チラミンオキシダーゼの残存活性を検討した（実施例１２）。実施例においては、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムニ水和物（ＥＤＴＡ・２Ｎａ/ＭＷ；３７２．２４）を用いているが、これに限定されるものではない。
【００５２】
【表３】
0005326324.tif 000008
【００５３】
結果を表３に示す。表３の実施例９〜１１より水素供与体とチラミンオキシダーゼを試薬に少なくとも０．０１％（約０．２５ｍＭ）以上のキレート剤（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を添加することで、いずれの保存条件においてもチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。また、表３の実施例１２より水素供与体を含まず、キレート剤（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を単独で添加した場合においてもチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。
キレート剤を０．０１ｍＭ〜２００ｍＭの範囲で添加することで同様のチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。
【００５４】
［実施例１３，１４］チラミンオキシダーゼを含む試薬に水素供与体およびキレート剤を添加することによるチラミンオキシダーゼの安定化（表４）
実施例３の試薬に、さらにキレート剤としてクエン酸Ｎａとピルビン酸Ｎａを０．０４％添加しチラミンオキシダーゼの残存活性を検討した。
【００５５】
【表４】
0005326324.tif 000009
【００５６】
結果を表４に示す。表４の実施例１３、１４より水素供与体とチラミンオキシダーゼを試薬にキレート剤（クエン酸Ｎａ、ピルビン酸Ｎａ）を添加することで、いずれの保存条件においてもチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。
実施例においては、キレート剤としてクエン酸Ｎａまたは、ピルビン酸Ｎａを用いているが、これに限定されるものではない。
【００５７】
［実施例１５〜１７、比較例９］水素供与体とチラミンオキシダーゼおよびにキレート剤を含む試薬に、添加剤を加えることによるチラミンンオキシダーゼの安定化検討（表５）
実施例１０の試薬に、測定上添加の可能性のあるＮａＣｌ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ＰＬＰ（ピリドキサール５リン酸）、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を添加し残存活性を検討した。ＰＬＰはチロシン測定試薬に用いるチロシンデカルボキシラーゼの補酵素として、ＦＡＤはチラミンオキシダーゼや、その他アミンオキシダーゼの安定化剤としての利用が考えられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を用いているが、これに限定されるものではない。また、ＮａＣｌ、ＰＯＤ、ＰＬＰ、ＦＡＤの添加量については、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製）      １５．１ｇ／Ｌ    ｐＨ６．５
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製）    ０．４ＫＵ／Ｌ  ｐＨ７．０
ＴＯＯＳ（同仁化学社製）    ０．５ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ        ０．４ｇ／Ｌ
ＮａＣｌまたは、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）または、ＰＬＰまたは、ＦＡＤ  
（ＮａＣｌ・・・０．９％、ＰＯＤ（東洋紡社製）・・・５ＫＵ／Ｌ、ＰＬＰ（東京化成社製）・・・１０ｍｇ／Ｌ、ＦＡＤ（ナカライテスク社製）・・・７．５ｍｇ／Ｌ）
【００５９】
【表５】
0005326324.tif 000010
【００６０】
結果を表５に示す。表５より水素供与体とチラミンオキシダーゼ、キレート剤を含む試薬にＮａＣｌ、ＰＯＤ、ＰＬＰを添加することで、いずれの保存条件においても安定化効果が見られた。一方、ＦＡＤ添加試薬についてはチラミンオキシダーゼの安定性不良が見られ、特に光照射による影響を受け易いことが明らかになった。
【００６１】
［実施例１８、比較例１０］本発明におけるチロシン測定用試薬中のチラミンオキシダーゼの長期冷蔵安定性（表６、７、図１）
本発明における実施形態の一つであるチロシン測定用試薬を調製し、チロシン測定試薬中のチラミンオキシダーゼの長期冷蔵安定性について確認を行った。
【００６２】
（試薬の調製）
以下の組成からなるチロシン測定試薬を調製した（実施例１８）。なお、比較例１０は実施例１８の第一試薬よりＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＮａＣｌを除いた試薬である。第二試薬は実施例１８、比較例１０とも共通である。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製）    ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン
（ＴＯＯＳ）  （同仁化学社製）    １ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            ０．４ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                  ０．９ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００    １ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）  ３／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１）  ０．４Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５−リン酸エステル    １０ｍｇ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製）    ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            ０．４ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００    １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン    ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ    ５Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム    ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６３】
【表６】
0005326324.tif 000011
【００６４】
【表７】
0005326324.tif 000012
【００６５】
結果を表６、表７および図１に示す。結果より実施例１８においては、７ヶ月間の長期冷蔵保存においてもチラミンオキシダーゼが高い安定性を保持していることが確認された。
【００６６】
［実施例１８、比較例１０］本発明におけるチロシン測定用試薬を用いた生体試料の測定（図２、３）
上記検討に用いた７ヶ月保存後の実施例１８試薬および実施例１０試薬を用いて生体試料中のチロシンを測定した。
【００６７】
生体試料には以下を用いた。
・血清Ａ・・・液状ネスコールＮ（アルフレッサファーマ社）に３０ｕｍｏｌ／ＬのＬチロシンを追添した血清。
・血清Ｂ・・・液状ネスコールＮ（アルフレッサファーマ社）に１５０ｕｍｏｌ／ＬのＬチロシンを追添した血清。
【００６８】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料７．５μＬに第一試薬  １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６９】
結果を図２および図３に血清Ａ、Ｂ測定のタイムコースデータを示す。結果より、比較例１０においては、タイムコースがエンドポイントになっていないのに対し、実施例１８は、タイムコースがエンドポイントになっていることが確認され、冷蔵７ヶ月保存後においても安定に測定できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、チラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関するものである。
特に臨床診断に用いられる生体成分中のチロシン測定試薬、およびチロシン測定試薬を含むＢＴＲ測定試薬（の総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用試薬）に用いられるチラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関するものである。本発明は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】チラミンオキシダーゼの長期冷蔵保存における安定性を示す（実施例１８、比較例１０）。
【図２】チロシン測定試薬における生体試料の測定タイムコースを示す（実施例１８）。
【図３】チロシン測定試薬における生体試料の測定タイムコースを示す（実施例１０）。
【図１】
0005326324.tif 000015
【図２】
0005326324.tif 000016
【図３】
0005326324.tif 000017