(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板上に配置される金属膜を備えて、生理活性物質に特異的に結合する被験分子を検出する表面プラズモン共鳴用バイオセンサーであって、
（１）（ａ）前記生理活性物質が固定化されている第一の反応部であって、前記生理活性物質と前記被験分子との結合反応と、前記生理活性物質による生理活性反応とを行うための第一の反応部と、（ｂ）前記生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子が固定化されている第二の反応部であって、前記反応生成物と、前記反応生成物に特異的に結合する分子との結合反応を行うための第二の反応部とを同一エリア内に含み、かつ、
（２）前記第一の反応部における結合反応と、前記第二の反応部における結合反応を求める測定部を有し、前記第一の反応部における結合反応を求める測定部と、前記第二の反応部における結合反応を求める測定部とがともに表面プラズモン共鳴測定装置を備え、
（３）前記生理活性物質が酵素であり、かつ前記第二の反応部における前記反応生成物に特異的に結合する分子との結合反応が抗原抗体反応であることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサー。
【請求項２】
前記第一の反応部を二つ以上保持している、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記第二の反応部を二つ以上保持している、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記第一の反応部と前記第二の反応部とがエアギャップにより遮断されている、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記エアギャップが移動可能なエアギャップである、請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記第一の反応部における結合反応と前記第二の反応部における結合反応の変化が、誘電率の変化である、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記測定部が導波路である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質の結合と反応生成物を同時に検出できるバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的反応を非標識で直接検出する方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使った屈折率の変化から特異的結合を検出する方法が実用化され、低分子量分子でも特異的に検出することができるようになったことから薬剤スクリーニングなどにも応用が見られる。
【０００３】
例えば、特開２００２−１４８１８７号公報には、表面プラズモン共鳴装置に用いるセンシング用のセンサーチップにおいて、光学的に透明な基板上に金または銀の金属薄膜が形成され、この金属薄膜上は金属薄膜および酵素の両方と電子移動反応を起こす膜により修飾されていることを特徴とする表面プラズモン共鳴酵素センサーチップが記載されている。また、特開２００３−２３２７２５号公報には、プリズムに金属薄膜を形成し、該金属薄膜の表面にサンプルが直接接触するようにサンプルが流れる厚さが３０μｍ以下の平面状の微小流路を形成したセンサチップと、前記プリズムを通して前記金属薄膜の裏面に光線を全反射で照射する光源手段と、少なくともセンサチップからの反射光の屈曲率の空間分布を経時的に測定できるように構成された測定手段とを備え、前記平面状の微小流路を通過するようにサンプルを流し、該サンプルの物理応答または化学反応によって引き起こされる屈折率の空間分布を経時的に測定し、その測定結果に基づいてサンプルの物理応答または化学反応の反応速度を測定するように構成したことを特徴とする表面プラズモン共鳴測定法を用いる化学反応解析センサが記載されている。
【０００４】
薬剤のスクリーニングの対象となる蛋白としては、酵素などの機能性蛋白が多く、機能性蛋白の活性に影響を与えるような化合物を得ることが創薬では重要である。しかし、化合物と蛋白との結合だけをSPR信号で検出した場合には、その結合が蛋白活性部位への結合に由来するものか、他の部位への結合によるものか、失活した蛋白への結合によるものかなど判断できないという問題があった。
【０００５】
そこで、化合物と機能性蛋白の結合を検出したあとに、機能性蛋白の活性に由来する反応生成物を再度測定することができれば、はじめの化合物の結合が活性に影響を与えるものかどうかを判断できる。
【０００６】
この考え方とは違うが、特開２００５−２４４８３号公報では、生体分子の特異的結合に関与する分子を検出するバイオセンサーであって、(i)a)特異的結合反応と、b)酵素反応とを行う反応部と、(ii)反応a)およびb)によって生じた酸化還元性反応生成物と酸化還元物質膜が反応する検出部と、(iii)酸化還元反応生成物との反応による酸化還元物質膜の状態の変化を測定し、誘電率の変化を求める測定部とを含むことを特徴とするバイオセンサーが記載されている。特開２００５−２４４８３号公報は、微小流路中でも酵素による増幅効果が得られるバイオセンサーを目的とするものであり、特異的結合反応と酵素増幅を使った高感度測定法において、酵素反応の生成物を微小流路の下流で捕捉する膜を設け、この膜の誘電率測定からこの捕捉の進行状態を測定することにより、微小流路中で連続して基質を流す場合にも、流路体積の制限を受けずに酵素増幅の効果が得られ、低い検出限界濃度を達成できるとしている。しかしこのバイオセンサーでは、反応生成物としては、酸化還元反応生成物に限られるため、すべての機能性蛋白に対する化合物結合の評価には供しない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４８１８７号公報
【特許文献２】特開２００３−２３２７２５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４４８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、化合物と機能性蛋白の結合を検出したあとに、機能性蛋白の活性に由来する反応生成物を再度測定することが可能なバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生理活性物質が固定化されている第一の反応部と、前記生理活性物質による生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子が固定化されている第二の反応部とを同一エリア内に設けることによって、上記課題を解決したバイソセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、生理活性物質に特異的に結合する被験分子を検出するバイオセンサーであって、
（１）（ａ）前記生理活性物質が固定化されている第一の反応部であって、前記生理活性物質と前記被験分子との結合反応と、前記生理活性物質による生理活性反応とを行うための第一の反応部と、（ｂ）前記生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子が固定化されている第二の反応部であって、前記反応生成物と、前記反応生成物に特異的に結合する分子との結合反応を行うための第二の反応部とを同一エリア内に含み、かつ、
（２）前記第一の反応部における結合反応と、前記第二の反応部における結合反応を求める測定部を有することを特徴とするバイオセンサーが提供される。
【００１１】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、前記第一の反応部を二つ以上保持している。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、前記第二の反応部を二つ以上保持している。
好ましくは、前記第一の反応部と前記第二の反応部とがエアギャップにより遮断されている。
【００１２】
好ましくは、前記エアギャップが移動可能なエアギャップである。
好ましくは、前記第一の反応部における結合反応と前記第二の反応部における結合反応の変化は、誘電率の変化である。
好ましくは、前記測定部は導波路である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のバイオセンサーによれば、化合物と機能性蛋白の結合を検出したあとに、機能性蛋白の活性に由来する反応生成物を再度測定することが可能であり、反応を非標識かつ非蛍光で検出できる。本発明のバイオセンサーによれば、機能性蛋白への結合と活性に及ぼす影響を一度に非標識かつ非蛍光で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のバイオセンサーは、生理活性物質に特異的に結合する被験分子を検出するバイオセンサーであって、
（１）（ａ）前記生理活性物質が固定化されている第一の反応部であって、前記生理活性物質と前記被験分子との結合反応と、前記生理活性物質による生理活性反応とを行うための第一の反応部と、（ｂ）前記生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子が固定化されている第二の反応部であって、前記反応生成物と、前記反応生成物に特異的に結合する分子との結合反応を行うための第二の反応部とを同一エリア内に含み、かつ、
（２）前記第一の反応部における結合反応と、前記第二の反応部における結合反応との変化を求める測定部を有することを特徴とするバイオセンサーである。
【００１５】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１６】
前記の第一の反応部の数は特に限定されず、一つの第一の反応部を設置してもよいし、二つ以上の第一の反応部を設置してもよい。また、前記第二の反応部の数も特に限定されず、一つの第二の反応部を設置してもよいし、二つ以上の第二の反応部を設置してもよい。従来のバイオセンサーでは、いくつかの反応部をまとめると、各反応部における反応を独立で行わせることが困難であり、またセンサーが大型化しコストアップや試料の損失につながる問題があった。
【００１７】
第一の反応部と第二の反応部とは、遮断して設置することが好ましく、好ましくはエアギャップにより遮断して設置することができる。エアギャップは移動可能なエアギャップでもよい。エアギャップによる遮断は、その大きさを一定にし、位置を正確に固定することが難しく、バイオセンサーにおける反応部の液体を遮断することに用いるのは困難であった。
【００１８】
本発明で用いる生理活性物質を固定するための基板は、金属表面又は金属膜を有することが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記担体への付着性を考慮して、担体と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１９】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０.１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０.１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２０】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２１】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２２】
本発明における基板は、好ましくは、反応基を有する親水性高分子で被覆された担体である。反応基を有する親水性高分子は、上記したような金属表面又は金属膜に対して、直接又は中間層を介して結合することができる。
【００２３】
親水性高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００２４】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下の親水性高分子が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下の親水性高分子を用いることができる。
【００２５】
センサー表面に固定する親水性高分子化合物は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子化合物固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子化合物膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００２６】
親水性高分子の一例であるポリヒドロキシ化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００２７】
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、EDC単独で活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００２８】
生理活性物質の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定した態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００２９】
本発明において、反応基を有する親水性高分子は、金属表面又は金属膜に、直接又は中間層を介して結合することができる。ここで言う中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。
【００３０】
疎水性高分子化合物とは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００３１】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３２】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００３３】
疎水性高分子化合物の担体へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００３４】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００３５】
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。即ち、本発明においては、親水性高分子は、有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００３６】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００３７】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００３８】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００３９】
本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４０】
本発明において金属膜は、アミノ基を有する有機層で被覆された後、活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを上記有機層と反応させることにより、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを作製することができる。
【００４１】
本発明においてアミノ基を有する有機層で金属膜を被覆する方法は、公知の方法を使用することができるが、操作が簡便なことから、自己組織化膜（SAMs）を用いた被覆法が好ましい。自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式Ａ−１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００４２】
【化１】
0005255247.tif 000002
【００４３】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００４４】
【化２】
0005255247.tif 000003
【００４５】
A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００４６】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００４７】
【化３】
0005255247.tif 000004
【００４８】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００４９】
【化４】
0005255247.tif 000005
【００５０】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。
【００５１】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００５２】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００５３】
本発明において基板に固定化される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであり、生理活性反応を行うことができる物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００５４】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５５】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００５６】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００５７】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００５８】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、基板上の反応基に共有結合させることで行うことができる。
【００５９】
被験分子としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する分子であれば特に限定されない。被験分子としては、好ましくは、生理活性物質と相互作用し、該生理活性物質の活性を活性化する作用を有する分子、又は該生理活性物質の活性を阻害する分子を使用することができる。
【００６０】
本発明において、第二の反応部に固定化されている「生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子」の種類は、特に限定されないが、例えば、反応生成物に対する抗体などを挙げることができる。
【００６１】
本発明のバイオセンサーは、市販の測定装置を用いて行うことができる。例えばSPR解析の場合、GEヘルスケア社（Biacore社）製、Biacore3000, 2000, 1000, A100, T100, S51, X, Jや株式会社モリテックス社製、SPR-670、SPR-MACS、東洋紡績株式会社製MulriSPRinter、GWC Technologies社製SPR Imagerなどを挙げることができる。また、コーニング社製Epic System、Farfield Scientific社製AnaLight、株式会社アルバック社（株式会社イニシアム社）製AFFINIXなどを利用することができる。また、特許公報特開2006-194624 段落25〜段落62に記載の装置を利用することもできる。
【００６２】
本発明において、第一の反応部における結合反応と、第二の反応部における結合反応は、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。好ましくは、本発明においては、第一の反応部における結合反応と前記第二の反応部における結合反応の変化を、誘電率の変化として測定することができる。
【００６３】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００６４】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００６５】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００６６】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報の段落番号００１１参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００６７】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００６８】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００６９】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報の段落番号００２５〜００３７に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００７３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００７４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００７５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００７６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１７２６９４号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００７７】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００７８】
本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【００７９】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図に記載されている。
【００８０】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ2，ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ5，ＴｉＯ2，ＴｉＯ2-ＳｉＯ2，ＨｆＯ2，ＺｒＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｓｉ3Ｎ4，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【００８１】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【００８２】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【００８３】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら実施例により詳細に説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００８５】
図１は、本発明のバイオセンサーの概略図である。本発明のバイオセンサーは、反応部４と測定装置９を含んでおり、その間に金薄膜基板２を有し、測定装置９がＳＰＲ測定装置である場合は、反応部４と測定装置９の間に、ＳＰＲ測定に用いるプリズム３が設置されている。反応部４は固定部１０と固定部１１を微小流路などを用いて空間的に分けることができる。
【００８６】
ゼオネックス（日本ゼオン社製）のペレットを２４０℃で溶解し、この溶融物を射出成型器で縦８ｍｍ×横１２０ｍｍ×１．５ｍｍの基板を成型した。この基板を縦３０ｍｍ×横１３０ｍｍ×深さ１０ｍｍの密閉構造を有するアルミニウム容器内にセットした。このアルミニウム容器を密閉式インナーカップを有するスピンコート機（MODEL SC408(特)、ナノテック社製）のインナーカップ上に金表面基板が中心から１３５ｍｍの位置に円弧の接線方向が長軸となるよう固定した。マイクロピペットを用いてこの基板上に０．２％の１２−ヒドロキシステアリン酸のエタノール溶液を１００μＬ滴下し、金表面基板全面を塗布液Ａで被覆した。アルミニウム容器を密閉し、３０秒間静置した後、２００ｒｐｍで６０秒間回転させた。この基板に平行平板型６インチ用スパッタ装置（ＳＨ−５５０、アルバック（株）社製）を用いて基板上に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行い、金薄膜基板２を作製した。
金薄膜基板２をModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）中11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
次に、11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面を10質量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。
次に、25質量％のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。
続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返して、親水性膜１を作製した。
【００８７】
反応部４内にある親水性膜１に0.4MのEDCおよび0.1MのNHSを含む溶液を注入し7分静置した。PBSバッファーpH7.4で洗浄後、リン酸化p38蛋白5（Calbiochem)溶液 1.0mg/ml in Acetate Buffer pH5.5 (10μMのp38 阻害剤 SB203580を含む) を注入し15分静置することによりp38蛋白５を固定部１０に固定した。p38蛋白はリン酸化酵素であり蛋白やペプチドのセリンもしくはスレオニン残基をリン酸化する。PBSバッファーpH7.4で洗浄後、エタノールアミンを注入し7分、さらにNaOH 10mMを注入し1分間静置した。 PBSバッファーpH7.4で洗浄後、SPR信号値を測定し、ベースラインに対する変化分を固定量とした。
【００８８】
なお蛋白のカップリング時には10μMの阻害剤であるSB203580を含むAcetate Buffer pH5.5を用いたが、これは阻害剤が活性部位に結合している状態では、ｐ３８の蛋白構造を比較的安定に保たれるという報告があるためである（Analytical Biochemistry vol 325, 126-136, 2004）。
【００８９】
次に同様の手法で、反応部4内にAnti - phospho - Ser / Thr（mixed mouse monoclonal IgG）抗体８（フナコシ）（0.1 mg/ml、70μl）を注入し固定部１１に固定化した。この抗体８は、抗原抗体反応を利用する場合に、抗原を検出分子として使用する場合に用いるのであり、ホルモンを検出分子とする場合にはホルモンに特異的に結合する分子、ＤＮＡを検出分子とする場合は、検出するＤＮＡに特異的に結合する分子などを用いることができる。
【００９０】
この反応部に１X PBS, 10uM ATP, 1mM MgCl2 5% DMSO Bufferに100ng/mlの濃度で溶解したMBP6（ミエリンベーシックプロテイン、和光純薬）を注入し、固定部１０および１１におけるSPR信号を測定した。図２に固定部１０の、図３に固定部１１のセンサグラムを示す。ｐ３８蛋白によりリン酸化された反応生成物であるMBP7は固定部１１のリン酸化特異的抗体により認識され結合信号として検出される。
【００９１】
この反応部を１X PBSで洗浄した後、１X PBS, 10μM ATP, 1mM MgCl2, 5% DMSO Bufferに100ng/mlの濃度で溶解したMBP（ミエリンベーシックプロテイン、和光純薬）と1μM の阻害剤SB203580(フナコシ）を同時に注入し固定部１０および１１におけるSPR信号を測定した。図４に固定部１０の、図５に固定部１１のセンサグラムを示す。固定部１１では化合物の結合に相当する信号が得られるが、一方で、酵素活性がSB203580により阻害されているため、リン酸化MBPが生成されず固定部１１では結合信号が検出されない。このように本発明においては、阻害剤の結合と反応の阻害を同時に検出することができる。SPR装置により阻害剤のスクリーニングを行う場合、しばしば結合はするが活性は阻害しない化合物がヒット阻害剤として検出されるフォールスポジが問題となるが、本発明によりフォールスポジティブ（誤ったポジティブ）を拾うことがなくなり、短時間でトゥルーポジティブ（真のポジティブ）だけを選別することができる。
【００９２】
上記の実施例は、たとえば図６のようにも応用することができる。すなわち、酵素５により基質６から酵素反応により生成された反応生成物７が、固定部１１に固定化された酵素１３を活性することができる。活性化された酵素１３は基質１４から反応生成物１５を生成し、反応生成物１５は特異的結合分子８によって補足し、存在量を測定することができる。このような一連の反応系に阻害剤を添加しスクリーニングを行うことにより、阻害経路の情報や、阻害の特異性を結合と同時に知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、本発明のバイオセンサーの一例の概略図である。
【図２】図２は、被験物質を注入した場合の固定部１０のセンサグラムを示す。
【図３】図３は、被験物質を注入した場合の固定部１１のセンサグラムを示す。
【図４】図４は、被験物質と阻害剤を注入した場合の固定部１０のセンサグラムを示す。
【図５】図５は、被験物質と阻害剤を注入した場合の固定部１１のセンサグラムを示す。
【図６】図６は、本発明のバイオセンサーの別の例の概略図である。
【符号の説明】
【００９４】
１  親水性膜
２  金薄膜基板
３  プリズム
４  反応部
５  酵素
６  基質
７  反応生成物
８  特異的結合分子
９  測定装置
１０  固定部
１１  固定部
１２  固定部
１３  酵素
１４  基質
１５  反応生成物
【図１】
0005255247.tif 000006
【図２】
0005255247.tif 000007
【図３】
0005255247.tif 000008
【図４】
0005255247.tif 000009
【図５】
0005255247.tif 000010
【図６】
0005255247.tif 000011