(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変され、さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたバチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
【請求項２】
前記バチルス属細菌は、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊すること、または、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下したバチルス属細菌である請求項１に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項３】
前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項２に記載のプリン系物質の製造法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記バチルス属細菌は、さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項５】
前記バチルス属細菌は、さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項６】
前記バチルス属細菌は、プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする請求項５に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項７】
前記バチルス属細菌は、さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項８】
前記バチルス属細菌は、さらに、ＩＭＰ脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項９】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１〜８のいずれか
一項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項１０】
前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項１１】
前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−５'−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は５’−イノシン酸および５’−グアニル酸を代表とするプリンヌクレオチド、並びにこれらの合成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシド、などのプリン系物質の製造法、及びそれに用いられるバチルス属細菌に関する。プリン系物質は、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるイノシンおよびグアノシンの生産に関しては、アデニン要求株、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属の微生物（特許文献１〜８参照）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特許文献９、１０又は非特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。【０００３】
このような変異株を取得するには、従来、微生物に紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。【０００４】
一方で、遺伝子工学技術を用いたプリン系物質生産株の育種もバチルス属の微生物（特許文献１１〜２０参照）、ブレビバクテリウム属の微生物（特許文献２１参照）、およびエシェリヒア属の微生物（特許文献２２参照）で行われている。具体的には、例えば、プリンオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子（purR）が破壊されたバチルス属細菌を用いて、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニン及びアデニン等の核酸系物質を効率よく製造する方法（特許文献２３参照）が開示されている。【０００５】
バチルス・ズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、ＡＭＰ生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子（非特許文献２参照）、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するｇｌｙＡ遺伝子（非特許文献３参照）およびヒポキサンチン／グアニンのトランスポーターをコードするｐｂｕＧ遺伝子（非特許文献４参照）などの発現を調節することが知られている。【０００６】
さらに、ｐｕｒＲ遺伝子破壊に加えて、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA）を破壊してアデニン要求性を付与すること、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を破壊して、イノシンのヒポキサンチンへの分解を抑制することによって、イノシンを効率的に製造する微生物、及びそれを用いたイノシンの製造法が開示されている（特許文献８参照）。【０００７】
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の一つであり、セドヘプツロース７−リン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸からＤ−エリトロース４−リン酸とＤ−フルクトース６−リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素である。この酵素とプリン系物質の生合成経路との関係はあまり知られておらず、同酵素活性を低下させてプリン系物質生産菌を育種するという試みはなされていなかった。
【特許文献１】特公昭３８−２３０９９号公報
【特許文献２】特公昭５４−１７０３３号公報
【特許文献３】特公昭５５−２９５６号公報
【特許文献４】特公昭５５−４５１９９号公報
【特許文献５】特公昭５７−１４１６０号公報
【特許文献６】特公昭５７−４１９１５号公報
【特許文献７】特開昭５９−４２８９５号公報
【特許文献８】特開２００４−２４２６１０号公報
【特許文献９】特公昭５１−５０７５号公報
【特許文献１０】特公昭５８−１７５９２号公報
【特許文献１１】特開昭５８−１５８１９７号公報
【特許文献１２】特開昭５８−１７５４９３号公報
【特許文献１３】特開昭５９−２８４７０号公報
【特許文献１４】特開昭６０−１５６３８８号公報
【特許文献１５】特開平１−２７４７７号公報
【特許文献１６】特開平１−１７４３８５号公報
【特許文献１７】特開平３−５８７８７号公報
【特許文献１８】特開平３−１６４１８５号公報
【特許文献１９】特開平５−８４０６７号公報
【特許文献２０】特開平５−１９２１６４号公報
【特許文献２１】特開昭６３−２４８３９４号公報
【特許文献２２】国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
【特許文献２３】米国特許第６，２８４，４９５号
【非特許文献１】Agric.Biol.Chem., 1978, 42, 399-405
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
【非特許文献３】J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
【非特許文献４】J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシド及び／又はプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を製造するために好適なバチルス属細菌を創製すること、及び同細菌を用いたプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、バチルス属細菌において、ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼの酵素活性を低下させることによって、プリンヌクレオシドやプリンヌクレオチドの生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。【００１０】
（１）プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌。
（２）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記バチルス属細菌。
（３）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記バチルス属細菌。
（４）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊することまたは、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下した前記バチルス属細菌。
（５）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である前記バチルス属細菌。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ酵素活性を有するタンパク質。
（６）さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（７）さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（８）プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、または、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（９）さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌
（１０）さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１１）さらに、ＩＭＰ脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１２）バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである前記バチルス属細菌。
（１３）前記バチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
（１４）プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、前記方法。
（１５）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記方法。
（１６）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記方法。
（１７）前記方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。【００１１】
＜１＞本発明のバチルス属細菌
（Ｉ）プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌である。【００１２】
「プリン系物質」とはプリン骨格を含む物質をいうが、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５’−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５’−リン酸  以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシンー５’−リン酸  以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５’−モノリン酸以下「AMP」ともいう）などが含まれる。【００１３】
「プリン系物質生産能」とは、本発明のバチルス属細菌を培地中で培養したときに、プリン系物質を細胞又はまたは培地から回収できる程度に細胞内または培地中に生成、分泌、蓄積できる能力をいう。なお、本発明のバチルス属細菌は、上記プリン系物質のうちの２種類以上の生産能を有するものであってもよい。【００１４】
プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌としては、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよいが、以下に示すようなバチルス属細菌を、変異法や組換えＤＮＡ法を利用して、プリン系物質生産能を有するように改変することによって得られるものでもよい。また、後述するようにしてトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによってプリン系物質生産能が付与又は増強されたバチルス属細菌であってもよい。【００１５】
尚、本発明において、「酵素活性が低下する」とは、前記トランスアルドラーゼ、又は後述するプリン系物質を分解する酵素、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素等の酵素活性が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における活性よりも低いこと、及び、活性が実質的に消失していることを含む。また、後述するプリンオペロンリプレッサーの活性についても同様である。【００１６】
本発明のバチルス属細菌を得るために用いられるバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。【００１７】
プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌は、上記のようなバチルス属細菌に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５参照）。栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エチルメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。【００１８】
プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株（168 Marburg）の誘導体である（特開２００４−２４２６１０、ＵＳ２００４１６６５７５Ａ１）。また、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４）等を使用することもできる。【００１９】
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平３−５８７８７）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平４−２８３５７）等が挙げられる。【００２０】
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。【００２１】
また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いた方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。【００２２】
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。  前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase  [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる【００２３】
ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。【００２４】
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Ｒｏｔｈ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開２００４−２４２６１０号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。本発明に利用出来るホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号３に記載のバチルス属細菌由来のｐｒｓ遺伝子（Genbank Accession No. X16518）が挙げられるが、他の細菌由来の遺伝子、動植物由来の遺伝子でもバチルス属でホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れも用いることが出来る。【００２５】
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるＰＲＰＰが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはｐｕｒＥＫＢ−ｐｕｒＣ（ｏｒｆ）ＱＬＦ−ｐｕｒＭＮＨ（Ｊ）−ｐｕｒＤオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。Genbank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。【００２６】
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。【００２７】
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。【００２８】
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの−３５、−１０領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。【００２９】
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの−３５配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、−１０配列はＴＡＡＧＡＴであり、コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287）。したがって、−１０配列（ＴＡＡＧＡＴ）をコンセンサス配列あるいはコンセンサス配列に近づけることにより、ＴＡＴＡＡＴ、またはＴＡＴＧＡＴ、もしくはＴＡＡＡＡＴとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。【００３０】
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（ＵＳＰ６，２８４，４９５号）。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。【００３１】
プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。【００３２】
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964（コード領域は塩基番号54439〜55293；配列番号５）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。【００３３】
破壊型遺伝子で、宿主染色体上の正常遺伝子を置換するには、例えば以下のようにすればよい。なお、以下の例では、ｐｕｒＲ遺伝子を例として説明するが、他の遺伝子、例えば後述のｐｕｒＡ、ｄｅｏＤ、ｇｕａＢ、ｆｂｐ又はｙｗｊＨ遺伝子についても、同様にして遺伝子破壊を行うことができる。【００３４】
染色体上の配列と相同性を有する配列を持ち、バチルス属細菌内で複製できないプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることがある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子が破壊型ｐｕｒＲ遺伝子に置換された菌株を取得することができる。【００３５】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒＲ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のｐｕｒＲ遺伝子配列と染色体上のｐｕｒＲ遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。【００３６】
遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させたり、ｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）を挿入したり、部位特異的変異法（Kramer, W. and Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154, 350-367）またはリコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press (1989)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさたりして、コードされるリプレッサーの活性が低下したか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写が低下したものを選択することにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。欠失させるｐｕｒＲ遺伝子の一定領域は、ｐｕｒＲ遺伝子の５’末端側、内部、３’末端側のいずれであってもよいが、ｐｕｒＲ遺伝子の全長の９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上であると、リプレッサーの活性が低下する確実性が高くなる。また、ｐｕｒＲ遺伝子のコード領域中に塩基を欠失又は挿入させ、フレームシフト変異を起こさせる場合は、複数箇所で塩基の欠失又は挿入を起こさせること、及び、３’末端側で塩基の欠失又は挿入を起こさせることが、リプレッサーの活性を確実に低下させ得る点で好ましい。【００３７】
また、プリンリプレッサーの活性の低下は、上記の遺伝子破壊による以外に、通常の変異処理法によって、染色体上のpurR遺伝子に、細胞中のプリンリプレッサーの活性が低下するような変異を導入すればよい。例えば、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る。また、染色体上のpurR遺伝子にトランスポゾンを挿入することによっても、リプレッサーの活性を低下させることができる。【００３８】
また、プリンリプレッサーの活性の低下は、染色体ＤＮＡ上のｐｕｒＲ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を微弱なものに置換することによっても達成される。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開Ｗ０００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より微弱なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。このRBSの改変は、目的遺伝子の転写を減少させることと組み合わせてもよい。【００３９】
更に、purR遺伝子より転写されたメッセンジャーＲＮＡを不安定化するような変異を導入した組換えＤＮＡを作製し、これをバチルス属細菌宿主に導入して形質転換してもよい。
後述のｐｕｒＡ、ｄｅｏＤ、ｇｕａＢ、ｆｂｐ又はｙｗｊＨ遺伝子についても、上記と同様にしてコードされる酵素の活性を低下させることができる。【００４０】
なお、ｐｕｒＲ遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、ｐｕｒＲ遺伝子を取得することができる。バチルス・ズブチリス１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ株では、ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列が報告されている（GenBank accession No.D26185（コード領域は塩基番号118041〜118898）、NC_000964(コード領域は塩基番号54439〜55296)）。ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列表の配列番号５及び６に示す（特開２００４−２４２６１０号参照）。【００４１】
ｐｕｒＲ遺伝子を得るためのＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕｒＲ遺伝子の一部あるいは全長を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号１７（GAAGTTGATGATCAAAA）及び配列番号１８（ACATATTGTTGACGATAAT）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。【００４２】
破壊型遺伝子の作製に用いるｐｕｒＲ遺伝子は、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、各遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いるバチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。しかし、通常は、目的とするバチルス属細菌と同じ細菌に由来する遺伝子を用いることが好ましい。【００４３】
前記マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス  ジェネチック  ストック  センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子は、バチルス  ジェネチック  ストック  センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリＥＣＥ９１株から、プラスミドｐＤＧ６４６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）由来カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス  ジェネチック  ストック  センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ９４株から、プラスミドｐＤＧ７８３を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。さらに、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のクロラムフェニコール耐性遺伝子は、バチルス  ジェネチック  ストック  センター（BGSC）より市販されているバチルス・ズブチリス１Ｅ１７株から、プラスミドｐＣ１９４を調製し、該プラスミドを鋳型としてＰＣＲにより増幅することで、取得することができる。ストレプトコッカス・アガラクティア由来のテトラサイクリン耐性遺伝子は、エシェリヒア・コリECE99株からプラスミドpDG1513を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる(Gene 1995 167:335-336)。【００４４】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のｐｕｒＲ遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ｐｕｒＲ遺伝子破壊株が得られる。染色体上のｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、これらの遺伝子を増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲにより、行うことができる。【００４５】
また、プリンオペロンの発現は、プロモーター下流に位置するｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列（以下、アテニュエーター配列と称する）により制御されていることが知られている（Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141）。したがって、アテニュエーター配列を欠損させることで、プリンオペロンの発現量を上昇させることができる。アテニュエーター配列の欠損はｐｕｒＲ破壊と同様の方法で行うことが出来る。【００４６】
なお、プリンオペロン転写をさらに増大させるためには、上記方法を組み合わせてもよく、例えば、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊し、さらに、アテニュエーター配列を欠損させたプリンオペロンをプラスミドで増幅するか、あるいは、このようなプリンオペロンを染色体上で多コピー化させてもよい。【００４７】
また、プリン生合成に関与する酵素の活性増強は、プリン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、例えば、前記酵素のフィードバック阻害を解除する方法によっても行うことができる（ＷＯ９９／０３９８８）。【００４８】
さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。【００４９】
さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。【００５０】
ＰＲＰＰから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。【００５１】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。ｄｅｏＤ遺伝子、ｐｕｐＧ遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号７）, pupG;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号９））が利用でき、上記ｐｕｒＲ遺伝子破壊と同様の方法で遺伝子破壊株を取得出来る。【００５２】
また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）（配列番号１１）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。【００５３】
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)（配列番号１３）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。【００５４】
また、プリン系物質生産能を増強させるために、フルクトース−ビスフォスファターゼの活性を低下させてもよい。フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子としては、fbp遺伝子が挙げられる。fbp遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は4127053-4129065)（配列番号１５）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。【００５５】
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開２００３−２１９８７６）。【００５６】
上記のようにして破壊されるpurR、deoD、pupG、purA、guaB、もしくはfbp遺伝子、又は発現が増強されるprs遺伝子は、各々保存的バリアントであってよく、例えば各々配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、それぞれプリンリプレッサー、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、サクシニル−AMPシンターゼ、IMP脱水素酵素、又はフルクトース−ビスフォスファターゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。前記「数個」は、例えば２〜５０個、好ましくは、２〜３０個、より好ましくは２〜１０個である。【００５７】
上記のようなアミノ酸配列に対する変更は、通常、タンパク質の活性を維持するような保存的変更である。保存的なアミノ酸置換としては、ｓｅｒまたはｔｈｒによるＡｌａの置換；ｇｌｎ、ｈｉｓまたはｌｙｓによるａｒｇの置換；ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐによるａｓｎの置換；ａｓｎ、ｇｌｕまたはｇｌｎによるａｓｐの置換；ｓｅｒまたはａｌａによるｃｙｓの置換；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐまたはａｒｇによるｇｌｎの置換；ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓまたはａｓｐによるｇｌｕの置換；ｐｒｏによるｇｌｙの置換；ａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒによるｈｉｓの置換；ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｉｌｅの置換；ｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｌｅｕの置換；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇによるｌｙｓの置換；ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｍｅｔの置換；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅまたはｌｅｕによるｐｈｅの置換；ｔｈｒ、ａｌａによるｓｅｒの置換；ｓｅｒまたはａｌａによるｔｈｒの置換；ｐｈｅ、ｔｙｒによるｔｒｐの置換；ｈｉｓ、ｐｈｅまたはｔｒｐによるｔｙｒの置換；およびｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕによるｖａｌが挙げられる。【００５８】
上記purR、deoD、pupG、purA、guaB、fbp遺伝子、又はprs遺伝子の保存的バリアントとしては具体的には、各々配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は３に示す塩基配列を有するＤＮＡと、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は３に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、１回又はそれ以上、好ましくは２回又は３回である。【００５９】
ＤＮＡの相同性の評価は、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索およびＣｒｕｓｔａｌＷ等の計算方法によって行うことができる。
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7）を用いて、得られた結果が有意であると見なす。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡによる迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメントの感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680）。【００６０】
また、破壊型遺伝子の作製に用いられるＤＮＡも、purR、deoD、pupG、purA又はguaB遺伝子の保存的バリアントであってもよい。【００６１】
バチルス属細菌の染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むには、後述するトランスアルドラーゼをコードする遺伝子と同様にして行えばよい。【００６２】
＜２＞トランスアルドラーゼの酵素活性を低下させるための改変
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株をトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。【００６３】
ここでトランスアルドラーゼとは、セドヘプツロース7-リン酸とD-グリセロアルデヒド3-リン酸からD-エリスロース４−リン酸とD−フルクトース6-リン酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素であり、この反応はペントースリン酸経路の反応の一部である。「ペントースリン酸経路」とは、細胞内にとりこまれたグルコースが、グルコースキナーゼによりリン酸化され、グルコース−６−リン酸が生合成され、グルコース−６−リン酸は、酸化的にリボース−５−リン酸へ転換される経路とエピメラーゼ、トランスケトラーゼ（EC：2.2.1.1）、トランスアルドラーゼ（EC：2.2.1.2）の作用により、トリオース、テトロロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースのリン酸エステルが相互変換する可逆過程からなる経路を意味する。【００６４】
トランスアルドラーゼの酵素活性は、以下のような方法で測定出来る。例えば、生成したＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸をトリオースリン酸イソメラーゼによりヒドロキシアセトンリン酸とし、これをグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを用いて測定する方法（Ochoa, T., and Horecker, B. L., 1966, Methods Enzymol., 9, 499-505）で測定出来る。【００６５】
トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変するには、例えば、上記のｐｕｒＲ遺伝子の破壊で示したように、相同組換え法により、染色体上のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子を、正常に機能しない遺伝子（例えば薬剤耐性等のマーカー遺伝子をトランスアルドラーゼをコードする遺伝子内部に挿入した破壊型遺伝子）で置換することにより、達成できる。また、purR遺伝子について述べたように、通常の変異処理法によって、染色体上のトランスアルドラーゼ遺伝子に、細胞中のトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するような変異を導入してもよい。【００６６】
バチルス・ズブチリスのトランスアルドラーゼは、配列番号２に示す２１２個のアミノ酸から構成されるタンパク質が挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号１（ywjH遺伝子；Genbank Accession No. NC_000964）の塩基配列を有する遺伝子を改変に用いることができる。なお、ｙｗｊＨ遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上３２５度近傍に存在する。【００６７】
トランスアルドラーゼをコードする遺伝子も、前述の各遺伝子と同様に、ywjH遺伝子の保存的バリアントであってもよい。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、トランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、１回又はそれ以上、好ましくは２回又は３回である。【００６８】
上記のようなトランスアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、これら酵素をコードする塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。【００６９】
目的とする遺伝子は、例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、目的とする遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189参照）によって、取得することができる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 1963, 72, 619-629、生物工学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風館、1992年参照）等により調製することができる。ＰＣＲ用プライマーは、バチルス属細菌の公知の遺伝子配列に基づいて、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されている領域の情報に基づいて、調製することができる。【００７０】
バチルス属細菌の染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むためのベクターとしては、ｐＨＶ１２４８（Prtit, M.-A., et. al., J. Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740）等の温度感受性複製起点をもつベクターやｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−（Stratagene）等のＥ．ｃｏｌｉ用ベクター等が挙げられる。【００７１】
目的遺伝子とバチルス属細菌で機能するマーカーを搭載したベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。【００７２】
上記のように調製した組換えＤＮＡをバチルス属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）、又は、宿主細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115）が挙げられる。【００７３】
＜２＞プリン系物質の製造法
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、細菌の細胞内又は培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。【００７４】
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。【００７５】
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、トレハロース、リボース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロールやマンニトールなどのアルコール類が使用され、その他、グルコン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。【００７６】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩または大豆加水分解物などの有機窒素等が使用される。【００７７】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。【００７８】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。【００７９】
培養条件は、用いるバチルス属細菌の種類によるが、例えばバチルス・ズブチリスでは、発酵温度２０〜５０℃、ｐＨを４〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして４０時間〜３日間程度培養することにより、培養液中にプリンヌクレオシドが蓄積される。【００８０】
培養終了後、培養液中に蓄積されたイノシンを採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。【００８１】
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又イノシンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。【００８２】
さらに、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシンに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、５’−イノシン酸あるいは５’−グアニル酸が得られる。【００８３】
また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ホスホトランスフェラーゼを作用させることによってリン酸化し、プリンヌクレオチド（ヌクレオシド−５’−燐酸エステル）を生産することも可能である（特開2000-295996）。例えば、エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア属細菌を用いるプリンヌクレオチドの製造法（WO91/08286号パンフレット）、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いたプリンヌクレオチドの製造法（WO96/30501号パンフレット）を採用することができる。【００８４】
また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物や、酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）を作用させることによって、プリンヌクレオチド（ヌクレオシド−５’−燐酸エステル）を生産することも可能である。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物は、プリンヌクレオシドをプリンヌクレオチドに変換する能力を有するものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開パンフレットＷＯ９６３７６０３号に記載されたような微生物が挙げられる。【００８５】
また、特開平０７−２３１７９３に開示されているようなエシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）JCM 1650、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）ATCC 33105、クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola）IFO 14939 (ATCC 33531)、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318 (ATCC 8724)、クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）IFO 14941 (ATCC 33257)、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO 3168、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 13534 (ATCC 13048)、クロモバクテリウム・フルヴィアティレ（Chromobacterium fluviatile）IAM 13652、クロモバクテリウム・ヴィオラセウム（Chromobacterium violaceum）IFO 12614、セデセア・ラパゲイ（Cedecea lapagei）JCM 1684、セデセア・ダヴィシエ（Cedecea davisiae）JCM 1685、セデセア・ネテリ（Cedecea neteri）JCM 5909などを用いることもできる。【００８６】
酸性フォスファターゼとしては、例えば、特開２００２−０００２８９に開示されているようなものを用いることができ、より好ましくはヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平１０−２０１４８１参照）やヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（ＷＯ９６３７６０３参照）、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（特開２００１−２４５６７６）などを用いることができる。【００８７】
本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドを化学的にリン酸化することにより、プリンヌクレオチドを得ることも可能である（Bulletin of the Chemical Society of Japan 42,3505）。また、微生物が有しているATP再生系を利用して、本発明のXMP生産能を有する微生物とXMPアミナーゼ活性を共役させることによってGMPを得る方法、イノシンキナーゼを共役させることによってIMPを得る方法も採用できる（Biosci.Biotech.Biochem.,51,840(1997)  特開昭63-230094）。【００８８】
上記プリンヌクレオチドの製造に用いる、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシン、又はプリンヌクレオシドは、精製されたものであってもよいが、プリンヌクレオシドの発酵液又はプリンヌクレオシドを含む粗精製物であってもよい。【００８９】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００９０】
＜プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするpupG遺伝子およびdeoD遺伝子を欠損した菌株の作製＞
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPPシンセターゼ遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体KMBS310（特願２００５−２８０１８６号）を用いて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。尚、前記プリンオペロン及びPRPPシンセターゼ遺伝子は、各々プロモーター領域及びSD配列の改変により発現が強化されている。【００９１】
KMBS16（purR::spc purA::erm deoD::kan；特開２００４−２４２６１０号公報）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis 168 Marburg株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーの中でスペクチノマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性となっていないコロニーを選択し、それらの内の一株を、KMBS5（deoD::kan）と名づけた。【００９２】
KMBS5より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS310株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンと20μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーを選択し、野生型deoD遺伝子がdeoD::kanで置換されており、かつKMBS310由来のすべての変異が野生型配列と置換されていないことが確認できた形質転換体の内の一株を、KMBS321と名づけた。
【実施例２】
【００９３】
＜フルクトース−ビスフォスファターゼをコードするfbp遺伝子、トランスアルドラーゼをコードするywjH遺伝子、又は両遺伝子を欠損した菌株の作製と培養評価＞
（１）fbp遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。【００９４】
（ｉ）fbp上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。【００９５】
TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA（配列番号１９）
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA（配列番号２０；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）【００９６】
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、fbp遺伝子5’末端領域と上流の約1350 bpを含む増幅断片を得た。【００９７】
（ii）fbp下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、27 merのPCR用プライマーを作製した。【００９８】
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG（配列番号２１；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA（配列番号２２）【００９９】
バチルス・ズブチリス 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、fbp遺伝子3’末端領域と下流の約1770 bp含む増幅断片を得た。【０１００】
（iii）cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。【０１０１】
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２３；小文字の塩基はfbp遺伝子5’末端領域の配列で配列番号２０の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号２４；小文字の塩基はfbp遺伝子3’末端領域の配列で配列番号２１の3’末端領域と相補するようにデザインされている）【０１０２】
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。【０１０３】
（iv）cat遺伝子がfbp領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１９および２２を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がfbp領域に挿入された増幅断片を得た。【０１０４】
（ｖ）fbpを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したfbp領域(fbp::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のfbp領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたfbp領域（fbp::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS133と名づけた。【０１０５】
（２）ywjH遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。【０１０６】
（ｉ）ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。【０１０７】
ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA（配列番号２５）
cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号２６；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）【０１０８】
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約1420 bpを含む増幅断片を得た。【０１０９】
（ii）ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、28 merのPCR用プライマーを作製した。【０１１０】
acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG（配列番号２７；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）【０１１１】
GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT（配列番号２８）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約1370 bp含む増幅断片を得た。【０１１２】
（iii）cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。【０１１３】
gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２９；小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号２６の3’末端領域と相補するようにデザインされている）【０１１４】
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号３０；小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号２７の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。【０１１５】
（iv）cat遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号２５および２８を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。【０１１６】
（ｖ）ywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS135と名づけた。【０１１７】
（３）fbp ywjH二重欠損株の作製
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体TABS133を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。【０１１８】
（ｉ）ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ26 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。【０１１９】
TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG（配列番号３１）
cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号３２；小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）のプロモーター上流域の配列）【０１２０】
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約2250 bpを含む増幅断片を得た。【０１２１】
（ii）ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。【０１２２】
gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG（配列番号３３；小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）の構造遺伝子下流域の配列）
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA（配列番号３４）【０１２３】
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約2280 bp含む増幅断片を得た。【０１２４】
（iii）tet遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.M29725およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。【０１２５】
gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG（配列番号３５；小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号３２の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC（配列番号３６；小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号３３の3’末端領域と相補するようにデザインされている）【０１２６】
テトラサイクリン耐性遺伝子（tet）が搭載されているpDG1513を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約2070 bpの増幅断片を得た。【０１２７】
（iv）tet遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号３１および３４を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 7分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、tet遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。【０１２８】
（ｖ）fbpおよびywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したtet遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::tet)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis TABS133株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::tet）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS174と名づけた。【０１２９】
（４）fbp遺伝子、ywjH遺伝子、あるいは両遺伝子を欠損したイノシン生産菌株のプリンヌクレオシド生産
fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135、両遺伝子を欠損した株TABS174およびコントロール株であるKMBS321を、グアニン20 mg/Lを含むLB培地プレート上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後72時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS321株のそれよりも高かった。また、両遺伝子を欠損させた株のイノシン蓄積は、TABS133株あるいはTABS135株のそれよりも高かった。【０１３０】
[発酵培地組成]
グルコース             30 g/L
KH2PO4                 1 g/L
NH4Cl                  32 g/L
豆濃（T-N）*           1.35 g/L
DL-メチオニン          0.4 g/L
L-トリプトファン       0.02 g/L
アデニン               0.1 g/L
グアノシン             0.075 g/L
MgSO4                  0.4 g/L
FeSO4                  0.01 g/L
MnSO4                  0.01 g/L
アデカノール（消泡剤)  0.5 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム        50 g/L
*：大豆蛋白加水分解物【０１３１】
【表１】
0005251505.tif 000002
【０１３２】
〔配列表の説明〕
配列番号１：ywjH遺伝子の塩基配列
配列番号２：トランスアルドラーゼのアミノ酸配列
配列番号３：prs遺伝子の塩基配列
配列番号４：ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列
配列番号５：purR遺伝子の塩基配列
配列番号６：プリンリプレッサーのアミノ酸配列
配列番号７：deoD遺伝子の塩基配列
配列番号８：deoD遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号９：pupG遺伝子の塩基配列
配列番号10：pupG遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号11：purA遺伝子の塩基配列
配列番号12：サクシニル−AMPシンターゼのアミノ酸配列
配列番号13：guaB遺伝子の塩基配列
配列番号14：IMP脱水素酵素のアミノ酸配列
配列番号15：fbp遺伝子の塩基配列
配列番号16：フルクトース−ビスフォスファターゼのアミノ酸配列
配列番号17：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号18：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号19：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号20：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号21：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号22：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号23：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号25：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号26：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号27：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号28：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号29：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号30：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号31：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号32：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号33：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号34：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号35：tet遺伝子増幅用プライマー
配列番号36：tet遺伝子増幅用プライマー
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明のバチルス属細菌を用いることにより、プリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドの生産効率を向上させることが出来る。
【配列表】
0005251505000001.app