(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンであって、当該リンカーが−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合しており（ここで、ｎは３または４である）、中性条件で当該−Ｓ−Ｓ−結合が切断可能であり、その結果、水酸基末端を中性条件で生成し得る、核酸合成用レジン。
【請求項２】
前記水酸基末端を有する核酸を中性条件で生成する反応が自発的なものである、請求項１に記載の核酸合成用レジン。
【請求項３】
前記リンカーが切断された場合に、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している中間体を生じる、請求項１または２に記載の核酸合成用レジン（ここで、ｎは３または４である）。
【請求項４】
前記リンカーの切断が還元剤により行われ得る、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸合成用レジン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ，ＲＮＡを含む核酸の固相合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸固相（自動）合成は、２０年以上も前から行われており、自動合成装置もその時点で販売されていた。現在でも、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび核酸の蛍光ラベル等の修飾のためマイルドな条件で核酸を得ることができる核酸原料（アミダイドおよびレジン）の改良が行われている。
【０００３】
従来のリンカーは、使用される核酸の種類によっては分解等を起こすため、好ましくないことが多かった。この問題を緩和できる固相レジンから核酸を回収可能なリンカーとしては、図１に示された構造が既に報告されている（たとえば非特許文献１参照）。しかしながら、この場合には、あらかじめＰｄによるアリルカルバメート基の脱保護が必要であり、実用には向かなかった。なお、本明細書において、ＣＰＧとはレジン（具体的にはControlled Pore Glass）を意味している。
【非特許文献１】Nucleic Acids Research，１９９６年，第２４巻，ｐ．２７９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なリンカーを使用した核酸合成用レジンを提供することを目的としている。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。なお、この場合の核酸には、天然品も合成品も含まれ、更に、天然品や合成品を修飾したものも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様によれば、リンカーを介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンであって、当該リンカーが中性条件で切断可能である、核酸合成用レジンが提供される。
【０００６】
本発明態様により、核酸の分解等を起こさないまたは分解等を起こすことの少ない条件で切断できるリンカーを使用した核酸合成用レジンが得られる。
【０００７】
リンカーの構造としては、−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合していることが好ましい。Ｓ−Ｓ結合が容易に切断でき、環化によって、ＣＯＯ−側結合した核酸を離脱させることができる利点を有する。
【０００８】
別の言い方をすれば、核酸とレジンとに結合したリンカーの構造によらず、リンカーの切断後の構造として、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している中間体を生じるものが好ましいと言える。
【０００９】
なお、これらの構造のリンカーを有する核酸合成用レジンはこれまで知られていない。
【００１０】
リンカーの切断には、ジチオスレイトールまたはＴＣＥＰ｛トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィン｝等の還元剤を使用することが好ましい。これらの還元剤を用いると中性条件で還元を行うことができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規なリンカーを使用した核酸合成用レジンが得られる。また、核酸の分解等を起こさないまたは分解等を起こすことの少ない条件で切断できるリンカーを使用した核酸合成用レジンが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を図、式、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、式、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００１３】
下記に示す新規なリンカーを介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンが開発された。このレジンは、中性条件でリンカーを切断することができる。
中性条件で切断可能なリンカーはこれまで知られていない。
【００１４】
この「中性条件で切断可能なリンカー」を介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンでは、たとえば修飾ＤＮＡのように塩基性や酸性に弱い核酸であっても、分解等を起こさず、または分解等を起こすことが少ない。このため、自動合成が可能になる。なお、この場合の「中性条件」とは、単にｐＨ７．０を指す意味で使用されているにとどまるわけではなく、使用される核酸の塩基性や酸性の程度に応じて幅を持たせて考えることができる。たとえばｐＨ６．０〜８．０の範囲にあってもよい。
【００１５】
上記において、リンカーが結合するレジンや核酸の種類には特に制限はなく、公知の物から適宜選択することができる。酸性や塩基性で分解しやすい核酸について使用することが好ましいのは上記の通りである。
【００１６】
開発された新規なリンカーは、−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有することが特徴である（ここで、ｎは３または４である）。ＣＯＯ−側に核酸が結合する。したがって、−Ｓ−Ｓ側にレジンが結合する。
【００１７】
リンカーと核酸との結合の様式には、上記以外には特に制限はなく、公知の結合を利用できる。最も容易なのは核酸の水酸基と核酸とリンカー前駆体（すなわち、核酸と結合する前のリンカー）のＣＯＯＨ基との反応による結合である。
【００１８】
リンカーとレジンとの結合の様式にも、上記以外には特に制限はなく、公知の結合を利用できる。合成の都合により、リンカーの−Ｓ−Ｓ結合に、更に、メチレン基、アミノ基、エステル結合等を配し、その末端でレジンとエステル結合で結合する様式を例示することができる。
【００１９】
リンカーが−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している核酸合成用レジン（ここで、ｎは３または４である）を用いると、リンカーの切断による、核酸を含む部分のレジンからの脱離は、Ｓ−Ｓ間の結合の開裂によって生じるものと思われる。この開裂には、どのような手段を使用してもよいが、還元剤を使用し得、好ましい。この開裂は、中性条件以外の塩基性条件または酸性条件で使用されるものであってもよいが、中性条件で切断できれば、「中性条件でリンカーを切断する」条件が充足される。したがって、たとえば修飾ＤＮＡのように塩基性や酸性に弱い核酸であっても、分解等を起こさず、または分解等を起こすことが少なくなる。
【００２０】
このＳ−Ｓ間の結合の開裂によって、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している中間体が得られることが、中間体とマレインイミドとの反応で、ＨＳのＳがマレインイミドと結合した安定な物質を得ることで確認された。このことから、上記の新規な核酸合成用レジンを、リンカーが切断された場合に、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している中間体を生じる核酸合成用レジン（ここで、ｎは３または４である）として把握することも可能である。この場合にも、中性条件で切断可能である。中性条件で切断すれば、たとえば修飾ＤＮＡのように塩基性や酸性に弱い核酸であっても、分解等を起こさず、または分解等を起こすことが少なくなる。
【００２１】
得られた、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−結合を有し、そのＣＯＯ−側に核酸が結合している中間体が環化する際に核酸が切り離されると考えられる。ｎが３または４であるのは、五員環または六員環が構造として安定であるからである。ｎが３のものとｎが４のものが混在してもよい場合がある。
【００２２】
ＣＯＯ結合が、核酸の水酸基と直接結合している場合には、開発されたリンカーは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の３’水酸基が、４−メルカプト酪酸または５−メルカプト吉草酸とエステル結合によりつながれた中間体を経由して切断されることになる。このような核酸合成用レジンを用いると、末端にメルカプト基を有する酪酸結合部分または吉草酸結合部分が環化する際に核酸が切り離されると考えられる。
【００２３】
なお、いずれの場合においても、ＣＯＯ−の右端の「Ｏ」は、リンカーの一部であると考えても核酸の一部と考えてもよい。なお、一般的にはＣＯＯ−の右端の「Ｏ」は核酸の一部と考えられている。
【００２４】
使用される還元剤は、公知のものから適宜選択できる、具体的には、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ｛トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィン｝が好ましい。いずれも中性条件で還元を行うことができる。
【実施例１】
【００２５】
次に上記諸態様の実施例及び比較例を詳述する。
【００２６】
［実施例１］
図２に示す経路で、中性条件で切断可能なリンカーを介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンを合成した。
【００２７】
（１）式（１）で表される化合物〜式（４）で表される化合物までの合成
３，３’−ジチオジ酪酸４．７７ｇ（２０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、２塩化オキサリル５．１４ｍＬおよびジメチルフォルムアミド６２μＬを加え室温で２時間撹拌した。本溶液を減圧濃縮した後、残渣に脱水トルエンを加え減圧濃縮した。
【００２８】
残渣を脱水ジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、トリアゾール３．３５ｇ，ジイソプロピルエチルアミン８．７１ｍＬを加え、室温で１０分撹拌した。この段階で、式（１）で表される化合物が得られたものと考えられる。
【００２９】
ついで、本溶液に５’ジメトキシトリチルチミジン５．４９ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え６時間撹拌した。この段階で、式（２）で表される化合物が得られたものと考えられる。
【００３０】
本溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド４．６０ｇを加え１５分撹拌した。この段階で、式（３）で表される化合物が得られたものと考えられる。
【００３１】
この後、６−ヒドロキシヘキシルアミン４．６９ｇを加え３時間撹拌した。本溶液をジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、式（４）で表される化合物５．１４ｇ（５８％）を得た。図８に示すＮＭＲのチャートから、その構造を確認した。
【００３２】
（２）式（５）で表される化合物〜式（６）で表される構造体までの合成
４３９ｍｇの式（４）で表される化合物（０．５ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を５ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン９９μＬ，無水コハク酸５０ｍｇおよびジメチルアミノピリジン６．１ｍｇを加え、室温にて１日撹拌した。この段階で、式（５）で表される化合物が得られたものと考えられる。
【００３３】
その後、ｇｅｎｏｇｌａｓｓ−ＰＧ−２００−γ−ａｍｉｎｏレジン０．５ｇ（ＮＨ２、１０μｍｏｌ），脱水縮合剤ＨＣＴＵ｛１−［ビス−（ジメチルアミノ）−メチレン］−５−クロロー１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム・ヘキサフルオロフォスフェート・３−オキシド｝２０７ｍｇ，ジイソプロピルエチルアミン２０７μＬを加え２時間室温にて穏やかに撹拌した。レジンをろ過により回収し、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄し、乾燥することにより式（６）で表される構造体を得た。なお、図２において、チミジンの代わりに、デオキシアデノシン誘導体、デオキシシチジン誘導体，デオキシグアノシン誘導体，ウリジン誘導体、アデノシン誘導体、シチジン誘導体，グアノシン誘導体を使用し得ることは言うまでもない。
【００３４】
［実施例２］
実施例１の方法に従って作製したレジンおよび図９に示す経路で合成したｄＡ，ｄＧ，ｄＣアミダイド（図９の左下）を使用し、ＤＮＡ自動合成機（ジーンワールド社製Ｈ８−Ｆ）によりｄＣＧＡＴレジンを合成した。平均合成効率９８％以上の収率で合成できた。
【００３５】
合成されたｄＣＧＡＴレジンに０．０１ＭのＤＢＵ（ジアザビシクロウンデセン）−アセトニトリル溶液５ｍＬを１時間かけて流し、保護基を外した。
【００３６】
その後、アセトニトリル、水で洗浄したのち、０．１ＭのＴＣＥＰ｛トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィン｝−ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．０、２５０μＬ）を４時間かけて流すことにより、Ｓ−Ｓ結合を還元により切断し溶液を回収した。この還元雰囲気のｐＨは７．０であり、中性条件であった。
【００３７】
４時間かけた回収直後の溶液をＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）により解析した。結果を図４，２４時間室温で静置した溶液のＨＰＬＣ解析結果を図５に示した。また、定法に従い合成したｄＣＧＡＴの解析結果を図６に示した。その結果、２４時間静置後の主生成物が、定法に従い合成したｄＣＧＡＴに一致することがわかった。すなわち、図５は図３の（Ｃ）の生成物に対応するものと考えられる。
【００３８】
更に、ＴＣＥＰによる還元直後（すなわち上記４時間後）にマレインイミドを加えた溶液をＨＰＬＣを用いて解析した。結果を図７に示した。図７中、最初の二つの大きなピークはマレインイミドとＴＣＥＰとの反応生成物に対応し、後にあるシャープなピークが化合物（Ｂ）とマレインイミドとの反応物に対応する。このピークの移動度が図６のピークの移動度と異なっていることより、この反応物が、主生成物（Ｃ）とは異なる物質であることが理解される。マレインイミドは−ＳＨと特異的に結合するので、末端にメルカプト基を有する酪酸結合部分の環化が防止され得る。このことから、図４は図３の（Ｂ）の生成物、すなわち中間体、に対応するものと考えられる。本反応物｛図３の（ｃ’）｝の溶液を２４時間室温静置したがなんら変化は見られなかった。
【００３９】
これらの結果、ＤＮＡ切り出しは図３に示した機構で起こっていると考えられる。
【００４０】
なお、図３において、Ｔはチミジンを表す。チミジンの代わりに、デオキシアデノシン誘導体、デオキシシチジン誘導体，デオキシグアノシン誘導体，ウリジン誘導体、アデノシン誘導体、シチジン誘導体，グアノシン誘導体を使用し得ることおよび、ｄＣＧＡの代わりに他の核酸配列を使用し得ることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】従来のリンカーの例を示す図である。
【図２】上記実施態様のリンカーを介して核酸がレジンに結合している核酸合成用レジンの合成経路を示す図である。
【図３】リンカーの推定される切断機構を示す図である。
【図４】ＴＣＥＰ処理の回収直後の溶液のＨＰＬＣ結果を示す図である。
【図５】ＴＣＥＰ処理の回収後２４時間室温で静置した後の溶液のＨＰＬＣ結果を示す図である。
【図６】定法に従って合成したｄＣＧＡＴのＨＰＬＣ結果を示す図である。
【図７】ＴＣＥＰ処理の回収直後にマレインイミドを加えた溶液のＨＰＬＣ結果を示す図である。
【図８】図２の式（４）で表される化合物のＮＭＲである。
【図９】ｄＡ，ｄＧ，ｄＣアミダイドの合成経路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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