(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖の両端に同一の塩基配列である第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に同一の塩基配列である第２のタグ配列とを含む標的ポリヌクレオチドを増幅する第１の工程と、
前記第１のタグ配列および／または第２のタグ配列と相補的な塩基配列を含む回収用ポリヌクレオチドに、前記標的ポリヌクレオチドを、第１のタグ配列および／または第２のタグ配列を介して固定する第２の工程とを含む、二本鎖核酸の遺伝子増幅産物からセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を回収する、遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項２】
前記第２の工程後に、
前記固定化された前記標的ポリヌクレオチドを遊離・回収する第３の工程を含む、請求項１に記載の遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項３】
タグ配列を含むフォワードプライマーと、このタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを用いて、標的ポリヌクレオチドを増幅する、請求項１または２に記載の遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項４】
センス鎖の両端に設けられた第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に設けられた第２のタグ配列とが、同一の塩基配列または異なる塩基配列である、請求項１ないし３のいずれかに記載の遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項５】
前記回収用ポリヌクレオチドは、担体に固定化されている、請求項１ないし４のいずれかに記載の遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項６】
前記回収用ポリヌクレオチドには標識が結合されており、前記担体には、この標識と特異的に親和性のある物質が固定化されている、請求項１ないし４のいずれかに記載の遺伝子増幅産物の回収方法。
【請求項７】
標的ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖においてそれぞれの両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む遺伝子増幅産物の回収キットであって、
前記タグ配列を含むフォワードプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含む回収用ポリヌクレオチドと
を含む、遺伝子増幅産物の回収キット。
【請求項８】
標的ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖においてそれぞれの両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む遺伝子増幅産物の回収キットであって、
前記タグ配列を含むフォワードプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含む回収用ポリヌクレオチドが固定化された担体と
を含む、遺伝子増幅産物の回収キット。
【請求項９】
標的ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖においてそれぞれの両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む遺伝子増幅産物の回収キットであって、
前記タグ配列を含むフォワードプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、
前記タグ配列に相補的な配列を含み、かつ標識を結合した回収用ポリヌクレオチドと、
前記標識と特異的親和性のある物質が固定化された担体と
を含む、遺伝子増幅産物の回収キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子増幅産物の回収方法および遺伝子増幅産物の回収キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の発展に伴い、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、「ＰＣＲ反応」という）法を始めとする遺伝子増幅法が盛んに用いられている。遺伝子増幅法を用いて、増幅されたポリヌクレオチドは、制限酵素反応、シークエンス法など、ポリヌクレオチドの使用目的により、未反応の原料や酵素の除去やバッファー置換が必要となる。
【０００３】
実際にどのような処理をするかについては、ポリヌクレオチドの使用目的により処理方法を適宜選択する必要がある。処理方法の一つにゲルろ過法がある。ゲルろ過法では、増幅されたポリヌクレオチドを、ゲルを充填したカラム内を通過させる。これにより、目的分子量のポリヌクレオチドを分取することができる。また、フィルターカラムろ過法が知られている。フィルターカラムろ過法では、カラム内に設けたフィルターで、ポリヌクレオチドを捕捉する。フィルターを洗浄した後に、ポリヌクレオチドを再抽出する。このため、未反応物の除去率が高い。
【０００４】
しかし、ろ過を用いる方法は、遠心機などの大型装置を必要とする。このため、装置構成が大型化するという問題がある。また、ゲルやフィルターに捕捉されない分子量の小さいポリヌクレオチドは回収できないという問題がある。
【０００５】
このような問題を解決するためにろ過を用いる方法以外の方法が開発されている。例えば、ポリヌクレオチドを静電的に吸着して回収する方法や、ビオチン化したプライマーを用い、ストレプトアビジンを固定化した担体で捕捉する方法（例えば、特許文献１、２参照）などが知られている。
【特許文献１】特開２００７−８９４４６号公報
【特許文献２】特表２００４−５０００６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１、２に記載されているようにビオチン化プライマーを用いる方法は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を単離することはできる。しかし、ビオチン−アビジンの結合は強固である。このため、得られたポリヌクレオチドを遊離・回収することはできない。したがって、得られたポリヌクレオチドを用いて、一塩基多型を検出するための一塩基伸長反応のような酵素反応に用いることができない。
【０００７】
また、ｍＲＮＡの回収方法として、標的ポリヌクレオチド中のｐｏｌｙＡ配列を、回収用ポリヌクレオチドとしてｐｏｌｙＴ配列を用いる手法が、一般的に知られている。この手法では、回収効率は、標的ポリヌクレオチドと回収用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズ効率とビオチン−ストレプトアビジン結合効率とが掛かる。このため、回収効率が極めて低いという問題がある。特に、標的ポリヌクレオチドとビオチン標識ｐｏｌｙＴとのハイブリダイズ効率は、低い。このため、ビオチン標識ｐｏｌｙＴの添加量を増加すると、未反応のビオチン標識ｐｏｌｙＴがストレプトアビジンと反応する。この結果、回収効率は向上しない。
【０００８】
また、標的ポリヌクレオチドと回収用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズに、Ａ−Ｔ水素結合よりも結合力が強いＧ−Ｃ水素結合を用いた場合には、Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値が上がる。このため、標的ポリヌクレオチドの遊離・回収が困難になる。
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、遺伝子増幅産物を、選択的かつ高効率に回収する方法および回収キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、本発明を完成した。本発明では、まず、タグ配列を含むフォワードプライマーとこのタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを用いて標的ポリヌクレオチドを増幅することで、一本鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む標的ポリヌクレオチドが得られる。これにより、標的ポリヌクレオチドと回収用ポリヌクレオチドのハイブリダイズ効率を向上できる。この結果、標的ポリヌクレオチドの回収効率が向上する。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
本発明の遺伝子増幅産物の回収方法は、センス鎖の両端に同一の塩基配列である第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に同一の塩基配列である第２のタグ配列とを含む標的ポリヌクレオチドを増幅する第１の工程と、前記第１のタグ配列および／または第２のタグ配列と相補的な塩基配列を含む回収用ポリヌクレオチドに、前記標的ポリヌクレオチドを、第１のタグ配列および／または第２のタグ配列を介して固定する第２の工程とを含む、二本鎖核酸の遺伝子増幅産物からセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を回収する、遺伝子増幅産物の回収方法である。
【００１２】
前記第２の工程後に、前記固定化された前記標的ポリヌクレオチドを遊離・回収する第３の工程を含んでいてもよい。
【００１３】
標的ポリヌクレオチドの増幅は、タグ配列を含むフォワードプライマーと、このタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを用いて行う。
【００１４】
センス鎖の両端に設けられた第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に設けられた第２のタグ配列とが、同一の塩基配列または異なる塩基配列であってもよい。
【００１５】
前記回収用ポリヌクレオチドは、担体に固定化されているとよい。また、前記回収用ポリヌクレオチドには標識が結合されており、前記担体には、この標識と特異的に親和性のある物質が固定化されていてもよい。前記担体が磁性微粒子であると好ましい。前記タグ配列と前記回収用ポリヌクレオチドとは、非天然型核酸を含むとよい。
【００１６】
本発明の遺伝子増幅産物の回収キットは、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖においてそれぞれの両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む遺伝子増幅産物の回収キットであって、前記タグ配列を含むフォワードプライマーと、前記タグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、前記タグ配列に相補的な配列を含む回収用ポリヌクレオチドとを含む。また、回収用ポリヌクレオチドは、担体に固定化されていてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、タグ配列を含むフォワードプライマーとこのタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを用いて標的ポリヌクレオチドを増幅することで、一本鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む標的ポリヌクレオチドが得られる。一本鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列が存在する。このため、回収用ポリヌクレオチドとハイブリダイズする確率が増加する。この結果、標的ポリヌクレオチドの回収効率が向上する。
【００１８】
また、本発明では、標的ポリヌクレオチドを、ビオチン−アビジン結合を用いて捕捉しない。この結果、得られたポリヌクレオチドを容易に遊離・回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の遺伝子増幅産物の回収方法では、（１）相補的なタグ配列を含む２種類のプライマーを用いて、センス鎖の両端に同一の塩基配列である第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に同一の塩基配列である第２のタグ配列とを含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程と、（２）増幅した標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドに固定する工程とを含む。また、（３）固定化された標的ポリヌクレオチドを遊離・回収する工程を含んでもよい。また、本発明の遺伝子増幅産物の回収キットは、上記工程を確実に行うためのキットである。以下に、上記の工程を図面を用いて説明する。図１は、相補的なタグ配列を含む２種類のプライマーを用いて、１本鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程を説明する概念図である。図２は、増幅した標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドに固定する工程と、標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドに固定する工程とを説明する工程図である。
【００２０】
（第１の工程）
図１に示すように、第１の工程では、標的部位１を有する核酸を、タグ配列２を有するフォワードプライマー３と、タグ配列２に相補的な配列３を含むリバースプライマー５とを用いて、ＰＣＲ反応を行う。得られた標的ポリヌクレオチドのセンス鎖６はその両端に「ＡＡＡＡＡ」の第１のタグ配列２を含む。一方、アンチセンス鎖７は、その両端に、タグ配列２に相補的な「ＴＴＴＴＴ」の第２のタグ配列４を含んでいる。
【００２１】
［標的ポリヌクレオチド］
本発明で標的ポリヌクレオチドの対象となる核酸は、特に制限はなく、細胞などから抽出されるゲノムＤＮＡやゲノムＤＮＡから酵素反応を利用して目的領域を増幅したものを用いることができる。目的領域を増幅する場合、目的領域の増幅方法は、特に制限はなく、公知の増幅方法を用いることができる。好ましい増幅方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、ＰＣＲ反応である。
【００２２】
標識ポリヌクレオチドとして使用するのは、二本鎖核酸の遺伝子増幅産物から得られる、センス鎖、アンチセンス鎖、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれでもよい。これらのいずれを用いるかは、標識ポリヌクレオチドの使用目的により異なる。
【００２３】
［プライマー］
本発明で使用するプライマーは、目的領域を増幅でき、かつ回収用ポリヌクレオチドに捕捉されるタグ配列を含むものであればよい。アンチ鎖またはアンチセンス鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列を設けるためには、フォワードプライマーとリバースプライマーのタグ配列は、相補的でなければならない。図１の例では、フォワードプライマーは、「ＡＡＡＡＡ」の第１のタグ配列２を含む。一方、リバースプライマーは、第１のタグ配列２に相補的な「ＴＴＴＴＴ」の第２のタグ配列３を含んでいる。
【００２４】
［タグ配列］
プライマーに含まれるタグ配列は、回収用ポリヌクレオチドと相補的な配列であれば、特に制限はない。好ましくは、ＰＣＲ反応のエラーとならないように、ゲノムＤＮＡなどの鋳型配列にミスハイブリダイゼーションしない配列がよい。また、回収用ポリヌクレオチドに固定化した標的ポリヌクレオチドを遊離・回収する際に、純水で置換して抽出するのが望ましい。このため、室温・低塩濃度で解離できる塩基数およびＴｍ値である、目的領域の配列とのアニール部位が１６〜２２ｍｅｒ（塩基数）、Ｔｍ値が５５〜６５℃のものがよい。
【００２５】
タグ配列は、非天然型核酸であってもよい。ここで、非天然型核酸とは、自然界に存在しない核酸を意味する。非天然型核酸としては、核酸に含まれる糖が、Ｌ体であるものや、修飾されているものなどが挙げられる。非天然型核酸の中には、天然型核酸であるゲノムＤＮＡやその他の鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズしないものがある。したがって、タグ配列に非天然型核酸を用いると、ＰＣＲ反応におけるミス増殖を抑制することができる。
【００２６】
図１の例では、センス鎖のタグ配列とアンチセンス鎖のタグ配列は異なる。したがって、この図の例では、センス鎖またはアンチセンス鎖のみを回収する場合、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖を別個の回収用ポリヌクレオチドで回収する場合に有効である。一方、センス鎖とアンチセンス鎖とを同一の回収用ポリヌクレオチドで回収する場合は、回収用ポリヌクレオチドは、５’末端、３’末端のいずれのタグ配列の一部とハイブリダイスできる配列を有すればよい。例えば、センス鎖の第１のタグ配列とアンチセンス鎖の第２のタグ配列とを、例えば、「・・・ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ・・・」のような、繰り返し配列を含む配列にする。この場合に、回収用ポリヌクレオチドが、「ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ・・・」の配列を有すれば、センス鎖の第１のタグ配列とアンチセンス鎖の第２のタグ配列の少なくとも一部は、回収用ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。この結果、センス鎖とアンチセンス鎖とを同一の回収用ポリヌクレオチドで回収することができる。このように、本明細書中では、センス鎖とアンチセンス鎖とを、同一の回収用ポリヌクレオチドで回収することができるタグ配列を有する場合を、「センス鎖の両端に設けられた第１のタグ配列と、アンチセンス鎖の両端に設けられた第２のタグ配列とが、同一の塩基配列」という。
【００２７】
（第２の工程）
図２に示すように、第１の工程で得られたセンス鎖・アンチセンス鎖複合体８を含むＰＣＲ産物を加熱して、センス鎖６、アンチセンス鎖７を解離させる。このＰＣＲ産物に、タグ配列２と相補的な塩基配列を含む回収用ポリヌクレオチド９を接触させる。この図の例によると、第１のタグ配列「ＡＡＡＡＡ」を有するセンス鎖６が、回収用ポリヌクレオチド９中に含まれ、このタグ配列と相補的な塩基配列である「ＴＴＴＴＴ」とハイブリダイズする。回収用ポリヌクレオチド９には、標識１０が結合されている。この図の例では、担体１１に標識と特異的に親和性のある物質１２が固定化されている。標識と、標識と特異的に親和性のある物質とを結合させて、標的ポリヌクレオチドを担体に固定化させる。標的ポリヌクレオチドの遊離・回収は、例えば純水で洗浄することで行う。
【００２８】
［回収用ポリヌクレオチド］
回収用ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのタグ配列と相補的な配列を含み、担体に固定化可能なものであれば、特に制限はない。標的ポリヌクレオチドのタグ配列が非天然型核酸である場合は、回収用ポリヌクレオチドにおいても、非天然型核酸であれば好ましい。
【００２９】
［固定化方法］
回収用ポリヌクレオチドは、あらかじめ担体に固定されていてもよく、標識ポリヌクレオチドをハイブリダイズした後に、担体に固定化してもよい。ＰＣＲ産物への回収用ポリヌクレオチドの拡散性および標的ポリヌクレオチドと回収用ポリヌクレオチドの接触確率を向上させるためには、標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズした後に、担体に固定化してもよい。特に、回収用ポリヌクレオチドに標識を導入したものを用いて、標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズした後に、標識と担体上に固定化されている標識の受容体（標識と特異的に親和性のある物質）と特異的結合させる方法が好ましい。利用できる特異的結合としては、例えば、ビオチン−アビジン反応、抗原抗体反応、化学結合、ライゲーション反応などが挙げられる。標識は、回収用ポリヌクレオチドのどちらかの末端に導入してもよく、また配列中に導入してもよい。このように、本発明では、回収用ポリヌクレオチドの担体への固定化方法は、標的ポリヌクレオチドと回収用ポリヌクレオチドの結合強度、結合方法と、回収用ポリヌクレオチドと担体との結合強度、結合方法とが異なるものを用いる。これにより、標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドから遊離・回収するのが容易となる。
【００３０】
［担体］
回収用ポリヌクレオチドを固定化する担体は、ＤＮＡの非特異的吸着が少ないものであれば、特に制限はない。例えば、粒子（金属粒子、ガラス粒子、ポリマー粒子、シリコン粒子、磁性微粒子など）、光学補足ビーズ、ガラススライド、樹脂製基板、紙、ゲル、ニトロセルロース、ナイロンなどが挙げられる。これらの担体は、回収用ポリヌクレオチドを固定するための表面処理がされていることが必要である。例えば、回収用ポリヌクレオチドがビオチンで標識されている場合には、担体表面がアビジン化されている、回収用ポリヌクレオチドに導入されたアミノ基を用いて化学結合させる場合には、担体表面にカルボキシル基などの官能基を導入するなどである。
【００３１】
好ましい担体は、アビジンコートされた磁性微粒子である。この担体を用いると、分散させた状態で、回収用ポリヌクレオチドを固定化させることができるので、固定化効率に優れる。また、回収用ポリヌクレオチドを固定化させた磁性微粒子を磁力で固定してから、標的ポリヌクレオチドの遊離・回収処理が行える。この結果、標的ポリヌクレオチドの遊離・回収が容易である。
【００３２】
担体に固定化後、バッファーにて洗浄し、担体ごと新規な酵素反応溶液に入れ、標識反応させるような反応に用いる場合は、上記固定化した状態のままで使用することができる。
【００３３】
（第３の工程）
本発明において、標的ポリヌクレオチドの遊離・回収は、以下のように行う。ＤＮＡ２本鎖の一般的な解離方法としては、温度をあげること、塩濃度を下げること、又はこれらの組合せが挙げられる。具体的には、クエン酸バッファーを用いた洗浄溶液から、純水への溶媒交換によって標的ポリヌクレオチドの遊離・回収を行う。また、標準的な塩濃度の溶液中で５０℃程度に加温して、標的ポリヌクレオチドを遊離・回収してもよい。このため、ＰＣＲ反応により生じた余剰のデオキシヌクレオチド三リン酸などの除去が容易である。
【００３４】
本発明の方法によって回収されるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、標的ポリヌクレオチド中の繰り返し塩基配列の反復数を測定するなど、標的ポリヌクレオチドを用いる情報の分析に利用できる。
【００３５】
本発明の方法によって回収されるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、既存の酵素伸長反応である一塩基伸長反応に用いることができる。一塩基伸長反応では、ＰＣＲ反応後に存在する余剰のデオキシヌクレオチド三リン酸が誤反応の要因となる。本発明では、例えば、りん酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液を用いて、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を洗浄できるので、デオキシヌクレオチド三リン酸を容易に除去できる。したがって、一塩基伸長反応における誤反応を起こしにくい。この結果、ＳＮＰｓの検出を精度よく行うことができる。
【００３６】
［検出キット］
本発明の遺伝子増幅産物の回収キットは、タグ配列を含むフォワードプライマーと、このタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、前記タグ配列にこのタグ配列に相補的な配列を含む回収用ポリヌクレオチドとを含む。
【００３７】
また、本発明の遺伝子増幅産物の回収キットは、タグ配列を含むフォワードプライマーと、このタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、前記タグ配列にこのタグ配列に相補的な配列を含む回収用ポリヌクレオチドが固定化された担体とを含むものであってもよい。
【００３８】
あるいは、タグ配列を含むフォワードプライマーと、このタグ配列に相補的な配列を含むリバースプライマーと、前記タグ配列にこのタグ配列に相補的な配列を含み、かつ標識を結合した回収用ポリヌクレオチドと、前記標識と特異的親和性のある物質が固定化された担体とを含むものであってもよい。
【００３９】
上記担体が磁性粒子であると好ましい。上記タグ配列と上記回収用ポリヌクレオチドとは、非天然型核酸を含むものであってもよい。このような遺伝子増幅産物の回収キットを用いることで、遺伝子増幅産物を、選択的かつ高効率に回収することができる。
【実施例】
【００４０】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
［回収用ポリヌクレオチドにビオチン標識ｐｏｌｙＴを用いたセンス鎖の回収および一塩基伸長反応への利用］
【００４２】
＜ａ．標的ポリヌクレオチドの調製＞
（プライマーの合成）
増幅可能なアニール部位を設計し、フォワードプライマーの５’末端には２５ｍｅｒのＡ（アデニン）（配列番号１）を、リバースプライマーの５’末端には２５ｍｅｒのＴ（チミン）（配列番号２）を付加したフォワードプライマーとリバースプライマーとを合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して行った。
【表１】
0005223267.tif 000002
【００４３】
（ＰＣＲによる増幅）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞を用いて、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（（株）キアゲン製）で、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡに、下記試薬１を添加して、下記条件１により増幅した。
【００４４】
＜試薬１＞
以下の試薬を含む50μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
フォワードプライマー（配列番号１）                    １５  ｐｍｏｌ
リバースプライマー（配列番号２）                      １５  ｐｍｏｌ
緩衝液                                                  ５  μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                        ５  μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                    ２  μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）  １  Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液                                        ５０  ｎｇ
【００４５】
＜増幅条件１＞
９５℃・５分
９５℃・３０秒、５５℃・３０秒、６８℃・３０秒（３０サイクル）
【００４６】
（センス鎖の回収）
ビオチン標識２５ｍｅｒ  ｐｏｌｙＴはＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｐ  ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いた。ＰＣＲ産物を９５℃、１０分間加熱し、ビオチン標識２５ｍｅｒ  ｐｏｌｙＴを３ｐｍｏｌ、１５ｐｍｏｌ添加した。これを、ストレプトアビジンを固定化した磁性微粒子を含むＳＳＣ溶液（０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム二水和物，３Ｍ  ＮａＣｌ溶液）に加え、１０分間反応させた。これを磁石上に置き、上澄みを除去した。２００倍希釈したＳＳＣ溶液を用いて同様の操作を行い、３回洗浄した。最後の上澄みは可能な限り除去し、純水５０μＬを加え、時々攪拌しながら、１分間抽出した。磁石上で磁性微粒子を固定化し、センス鎖を含む上清を回収した。
【００４７】
リバースプライマーの５’末端には２５ｍｅｒのＴ（チミン）（配列番号２）を付加していない、タグなしのリバースプライマーを用いて、同様に、センス鎖を含む上清を回収した。以下には、「片末端のみタグ配列」として示す。
【００４８】
（センス鎖量の測定）
回収した溶液中のＤＮＡ量を測定するためにナノドロップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、標的ポリヌクレオチドが、片末端のみタグ配列のものと、両末端タグ配列のものにおける回収用ポリヌクレオチドの濃度が異なるものの、センス鎖量を、２６０ｎｍの吸光度より算出した。結果を表２に示す。
【表２】
0005223267.tif 000003
【００４９】
表２からわかるように、片末端にタグ配列を付加した場合や、回収用ポリヌクレオチドの添加量を増加した場合よりも、両末端にタグ配列を付加した標的ヌクレオチドの回収量が最も多いことが示された。
【００５０】
また、回収用ポリヌクレオチドが増えると、標的ヌクレオチドとのハイブリダイズ確率は向上する。一方で、ハイブリダイズできなかったものの量も増える。これが、磁性微粒子に結合するため、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズした回収用ポリヌクレオチドの結合量が減ってしまうため、と考えられた。
【００５１】
＜ｂ．一塩基伸長反応への利用＞
上記手法によって回収したセンス鎖を一塩基伸長反応を用いて標識し、ＤＮＡチップ上で検出した。
（センス鎖を用いた標識反応）
上記手法によって回収したセンス鎖を含む下記試薬２を含む２０μｌ溶液を調製し、これを用いて、下記条件２により一塩基伸長反応を行った。下記条件２にて酵素法により標識塩基を取り込ませた。Ｃｙ３用コントロール、Ｃｙ５用コントロールはそれぞれ、Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰが正常に取り込まれるかどうかを確認するためのポリヌクレオチドである。Ｃｙ３用タグ配列付相補的塩基鎖、Ｃｙ５用タグ配列付相補的塩基鎖は、Ｃｙ３用コントロール、Ｃｙ５用コントロールに結合し、Ｃｙ３用コントロール、Ｃｙ５用コントロールを鋳型として一塩基伸長反応させ、それぞれＣｙ３用タグ配列付相補的塩基鎖、Ｃｙ５用タグ配列付相補的塩基鎖の末端を標識化し、反応が正常に進行していることを確認するためのポリヌクレオチドである。また、タグ配列付相補的塩基鎖、Ｃｙ３用コントロール、Ｃｙ３用タグ配列付相補的塩基鎖、Ｃｙ３用コントロール、Ｃｙ５用タグ配列付相補的塩基鎖の塩基配列は、それぞれ表３の配列番号３から７に対応する塩基配列である。
【００５２】
＜試薬２＞
センス鎖回収物（標的ポリヌクレオチド）                        １００  ｎｇ
信号強度検出用タグ配列付相補的塩基鎖（配列番号３）          ２０．３  ｐｍｏｌ
１０  μＭ  Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ                                  １  μｌ
１０  μＭ  Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ                                  １  μｌ
１０  μＭ  ｄｄＧＴＰ                                            １  μｌ
１０  μＭ  ｄｄＣＴＰ                                            １  μｌ
緩衝液                                                            ２  μｌ
Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ            ８  Ｕ
Ｃｙ３用コントロール（配列番号４）                          １２．５  ｎｇ
Ｃｙ３用タグ配列付相補的塩基鎖（配列番号５）                ２０．３  ｐｍｏｌ
Ｃｙ５用コントロール（配列番号６）                          １２．５  ｎｇ
Ｃｙ５用タグ配列付相補的塩基鎖（配列番号７）                ２０．３  ｐｍｏｌ
【表３】
0005223267.tif 000004
＜反応条件２＞
９５℃・２分
９５℃・２０秒、６０℃・１５秒（３０サイクル）
９５℃・５分
０℃・３分
【００５３】
（ＤＮＡチップの作成）
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板（コスモグラス押し出し板、厚さ：１ｍｍ、（株）クラレ製）を、温度６５℃の１０Ｎの水酸化ナトリウム溶液に１２時間浸漬した。このＰＭＭＡ基板を、純水、０．１Ｎの塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。
【００５４】
各信号強度検出用タグ配列同士のクロスハイブリがないように設計した、５’末端がアミノ化された３種類の信号強度検出用タグ配列のD型核酸相補鎖を合成し、ハイブリダイゼーション用プローブとした。
【００５５】
合成した３種類の信号強度検出用タグ配列の相補鎖ＤＮＡをそれぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度に溶かした後、リン酸緩衝液（ｐＨ  ５．５）を用いて０．０３ｎｍｏｌ／μＬに希釈した。また、基板表面のカルボン酸と固定化ＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。
【００５６】
上記混合溶液を、アレイヤー（日本レーザー電子（株）製：Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、上記のＮａＯＨ処理したＰＭＭＡ基板上面にスポットした。スポット数は、各タグ配列の相補鎖ＤＮＡに対して、それぞれ４点ずつ、計１６点であった。次にこの基板を、密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、２０時間インキュベートした。その後に、基板を純水で洗浄し、ＤＮＡチップを作製した。
【００５７】
（ハイブリダイゼーション溶液の調製）
標識ポリヌクレオチドと上記固定化されたハイブリダイゼーション用プローブとのハイブリダイズは以下のように行った。以下に用いる１５×ＳＳＣは、２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム二水和物, ３Ｍ ＮａＣｌ溶液：シグマ社製）を純水にて３／４に希釈したものを意味する。
【００５８】
３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１５×ＳＳＣ、０．３ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１ｗｔ％サケ精子ＤＮＡ（上記各濃度は、いずれも終濃度）を含む水溶液を作製した。これと上記反応条件２によって調製した標識溶液を3：1で混合し、同一の全量が４０μＬとなるように調製した。
【００５９】
（固定化担体への固定化）
上記固定化担体が担持された基板上に、上記ハイブリダイゼーション溶液４０μＬを載せ、カバーグラスで覆い、４２℃で４時間インキュベートした後、カバーグラスを剥離して洗浄・乾燥した。
【００６０】
（標識量の測定）
上記基板を、ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）にセットして、信号強度を測定した。測定条件は、レーザー出力９０％、フォトマルチプライヤーの感度６０％に調節した。ここで、信号強度とは、各スポット内の蛍光強度の平均値をいう。結果を表４に示す。表４において、Ｃｙ３コントロールにおけるＣｙ５の信号強度、Ｃｙ５コントロールにおけるＣｙ３の信号強度がノイズに当たる。
【表４】
0005223267.tif 000005
【００６１】
表４から、Ｃｙ３コントロールにおけるＣｙ５の信号強度、Ｃｙ５コントロールにおけるＣｙ３の信号強度が非常に弱いことがわかる。すなわち、本回収方法により得られたＰＣＲ産物での一塩基伸長反応では、誤反応によるノイズがないことがわかる。このことから、十分に余剰のｄＮＴＰが除去されており、一塩基伸長反応に適したサンプルを提供できることが示された。
【００６２】
（実施例２）
［非天然型核酸をタグ配列に用いたセンス鎖およびアンチセンス鎖の回収］
（プライマーの合成）
標的ポリヌクレオチドを増幅可能なアニール部位を設計し、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’末端には２３ｍｅｒのＡＴリピートを含むＬ型核酸を用いたタグ配列を合成し、アニール部分はＤ型核酸を用いてポリヌクレオチドを合成した。また、回収用ポリヌクレオチドとして、表５に示す、これに相補的な５’末端をビオチン標識した２４ｍｅｒのＡＴリピート（配列番号８）をＬ型核酸にて合成した。合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して行った。Ｌ型核酸としては、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｎ−ｂｚ）ＣＥＤ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｅｔａ−Ｌ−ｄｅｏｘｙ  Ｔｈｍｉｄｉｎｅ  ＣＥＤ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。
【表５】
0005223267.tif 000006
【００６３】
（ＰＣＲによる増幅）
実施例１に記載のＨＥＫ２９３細胞ゲノムＤＮＡを用い、下記試薬３を添加して、前述の反応条件２により増幅した。
【００６４】
＜試薬３＞
以下の試薬を含む５０μｌ溶液を各サンプルにつき、それぞれ調製した。
フォワードプライマー（配列番号９）                              １５  ｐｍｏｌ
リバースプライマー（配列番号１０）                              １５  ｐｍｏｌ
緩衝液                                                            ５  μｌ
２  ｍＭ  ｄＮＴＰ                                                ５  μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                              ２  μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）              １  Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液                                                  ５０  ｎｇ
【００６５】
（センス鎖およびアンチセンス鎖の回収）
ＰＣＲ産物に回収用ポリヌクレオチドである、ビオチン標識２４ｍｅｒ  ｐｏｌｙＡＴを３ｐｍｏｌ添加した。これを用い、実施例１に示した方法と同様にＰＣＲ産物の回収を行った。また、実施例１と同様に、タグなしのリバースプライマーを用いてＰＣＲ産物の回収を行った（片末端のみタグ配列）。
【００６６】
（ＰＣＲ産物量の測定）
回収した溶液中のＤＮＡ量を測定するためにナノドロップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、２６０ｎｍの吸光度より算出した。結果を表６に示す。
【表６】
0005223267.tif 000007
【００６７】
表６から、本実験においても、両プライマーにタグ配列を有したＰＣＲ産物の方が、片末端のみタグ配列を有するＰＣＲ産物より、高収率であることが示された。
【００６８】
上記ＰＣＲ産物を電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、２％アガロースゲルを、２０×ＴＡＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（（株）インビトロジェン製）を２０倍希釈した展開液を用いて、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液で核酸を染色し、280nmの紫外線照射下で核酸断片を検出した。
【００６９】
エチジウムブロマイドは１本鎖核酸を染色できず、２本鎖核酸のみを染色する試薬である。本試薬において、上記ＰＣＲ産物が染色されたことから、センス鎖およびアンチセンス鎖が回収されたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、相補的なタグ配列を含む２種類のプライマーを用いて、１本鎖の両端に同一の塩基配列であるタグ配列を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程を説明する概念図である。
【図２】図２は、増幅した標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドに固定する工程と、標的ポリヌクレオチドを回収用ポリヌクレオチドに固定する工程とを説明する工程図である。
【符号の説明】
【００７１】
１    標的部位
２    第１のタグ配列
３    フォワードプライマー
４    第２のタグ配列
５    リバースプライマー
６    センス鎖
７    アンチセンス鎖
８    センス鎖・アンチセンス鎖複合体
９    回収用ポリヌクレオチド
１０    標識
１１    担体
１２    標識と特異的に親和性のある物質
１３    標的ポリヌクレオチド（回収されたセンス鎖６）
【図１】
0005223267.tif 000008
【図２】
0005223267.tif 000009
【配列表】
0005223267000001.app