(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌａ修飾により活性化する、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ、又はプロテインＳのコード配列を含む外来性遺伝子を有する、トランスジェニック鳥類並びにその子孫の卵より、抽出、精製、活性化することのいずれか、またはその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法。
【請求項２】
トランスジェニック鳥類が、レトロウイルスベクターを用いて作製したトランスジェニック鳥類である、請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
トランスジェニック鳥類が、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子及び／又はｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ配列を含むレトロウイルスベクターを用いて作製したトランスジェニック鳥類である、請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４】
トランスジェニック鳥類が、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを含むレトロウイルスベクターを用いて作製したトランスジェニック鳥類である、請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
【請求項５】
レトロウイルスベクターが、複製能欠失型のマウス幹細胞ウイルスである、請求項１〜４のいずれかに記載の生産方法。
【請求項６】
トランスジェニック鳥類が、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後２４時間以後の胚へ外来性遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって得られるトランスジェニック鳥類である、請求項１〜５のいずれかに記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類の作製法に関し、トランスジェニック鳥類によるＧｌａ残基を含むタンパク質、セリンプロテアーゼ、及び、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質の発現に関する。更に詳しくは、トランスジェニック鳥類による、Ｇｌａ残基を含む血液凝固の為の生物学的活性を有するタンパク質の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年数多くの医薬用タンパク質が利用されるようになってきた。微生物や哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入する遺伝子組換え技術が開発・応用され、これらの遺伝子組換え体を培養することでタンパク質を工業生産できるようになったためである。医薬用タンパク質が本来持っている生理活性を示す為には、タンパク質が天然に存在するのと同様にフォールディングする必要や糖鎖付加やジスルフィド結合等の翻訳後修飾を受ける必要がある。
【０００３】
微生物培養によりタンパク質を生産する方法は、微生物の増殖速度が早いことや、培地組成が単純であることから、低コストでタンパク質を生産することが可能である。しかし、微生物では目的タンパク質の翻訳後修飾が正しくおこなわれないことが多い。よって、天然型と同様の生理活性を有するタンパク質を十分量得ることが難しく、工業生産の実用化への道のりは遠いのが現状である。
これまでは哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入し、その細胞を培養することによって目的タンパク質を生産する方法が主流となっている。血液凝固因子や血栓溶解剤や抗体医薬といった医薬品タンパク質が、遺伝子組換え哺乳類動物細胞を用いて生産され、販売、使用されている。しかし、哺乳類動物細胞を用いた方法は、専用の培養タンクや培地が必要であり生産コストが高いという問題がある。
【０００４】
これらの問題を克服する為に、動物工場が注目されてきた。遺伝子導入（トランスジェニック）動物を用いて目的タンパク質を生産する技術である。ヤギやヒツジやウシ等を用いてトランスジェニック哺乳類を作製し、その乳汁中に目的タンパク質を生産させる方法が試みられてきた。目的タンパク質にもよるが、抗体が乳汁中に１０ｍｇ／ｍｌ発現したという報告もある（非特許文献１参照）。しかし、この方法にも、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の問題や利用可能な哺乳類は個体が大きく生産、飼育、管理が大変であること、性成熟の期間がヤギやヒツジで８ヶ月、ウシでは１５ヶ月と長いこと等の問題がある。
【０００５】
そこで、トランスジェニック鳥類を用いて卵中に目的タンパク質を発現させる方法が検討されている。この方法は、卵の生産性の高さや、ＢＳＥの問題が存在しないこと、性成熟の期間がニワトリで５ヶ月と短いこと、個体が小さいため大量の個体の飼育が可能であること、人工授精法が確立しており大規模のトランスジェニック群を急速に育成可能であること、一般に卵の中が自然に無菌であること等の利点があげられる。
トランスジェニック鳥類を作製する手法は、レトロウイルスベクターを用いる方法、胚性幹細胞を用いる方法、始原生殖細胞を用いる方法、精子に目的遺伝子を付着させ導入する方法等が研究中であり、この中でレトロウイルスベクターを用いる方法が最も一般的である。これまでに、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）の複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いた研究が報告されている（特許文献１参照）。目的タンパク質としてβラクタマーゼを用い、プロモーター遺伝子としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子を用いている。放卵直後のステージＸの胚盤葉にレトロウイルスベクターを導入し、トランスジェニック鳥類の作製に成功している。発現量は、ウエスタンブロットを用いた分析方法では０．３３ｍｇ／ｍｌ（卵白を４０ｍｌとする）であり、βラクタマーゼ活性からの換算では０．００３〜０．０３３ｍｇ／ｍｌであると報告されている。また、その際のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の出現頻度は２０％である。生殖細胞への導入効率を調べた結果、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類のオスのうち５％程度が精子中に導入遺伝子を有していた。他の報告として、同様の実験で、全身に遺伝子が導入されたＧ２において、多いもので卵白中に１．２μｇ／ｍｌ程度の発現であったという報告もなされている（非特許文献２参照）。またその際のＧ０からＧ１の出現頻度は３／４２２（０．７１％）であった。別の報告では、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターとＶＳＶ−Ｇエンベロープを用い、高いウイルス力価や感染性、発現性を得た報告がなされている（特許文献２参照）。更に、その報告では、レトロウイルスベクターを導入する時期を調節することによっても高発現を実現しており、目的タンパク質として抗プリオン１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用い、卵白、卵黄中に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの発現を実現している。
【０００６】
次に血液凝固因子の背景について述べる。血液凝固ＶＩＩ因子は、外因系血液凝固因子の一つであり、血漿中に０．５μｇ／μｌ存在するセリンプロテアーゼの前駆体である。外因系の血液凝固では、まずＸＩＩａ因子やＸａ、ＩＸａ因子（ａのついているものは活性型、ａのついてないものは前駆体である）等のセリンプロテアーゼによって、ＶＩＩ因子がＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３間のペプチド結合に開裂を受け、活性型のＶＩＩａ因子になる。組織因子がＶＩＩａ因子に結合すると更に活性化する。これにより、ＶＩＩａ因子がＸあるいはＩＸ因子等の活性化能を持ち、ＸａあるいはＩＸａ因子等への活性化が起こる。その後、この作用が連鎖し、増幅していく。増幅の後、活性化したＸａ因子が、プロトロンビンを活性化しトロンビンにし、トロンビンはフィブリノーゲンを限定分解してフィブリンにする。フィブリンは重合してフィブリン網を形成して血液凝固が完成する。血液凝固因子のうちＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子等はビタミンＫ依存性凝固因子と呼ばれ、血液凝固過程で正常に機能するためにビタミンＫを必要とする。なぜならビタミンＫ依存性凝固因子のＮ末端側のグルタミン酸は、ビタミンＫの存在下でＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸）残基へとカルボキシル化され、そこではじめて正常な凝固機能を獲得するからである。具体的な機能として、Ｇｌａ残基はＣａ２＋との結合に関与しており、Ｇｌａ残基にＣａ２＋が結合すると、Ｇｌａドメインがリン脂質膜上に局在化し連鎖反応が促進すると考えられている。また、ＶＩＩ因子では組織因子との相互作用にも寄与していると考えられている（非特許文献３参照）。
【０００７】
これまでに、ＶＩＩ因子は哺乳類動物細胞を用いた生産がおこなわれている。特に、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を用いた生産が一般的である。ＶＩＩ因子はＮ末端側に１０個のＧｌａ残基を持つが、同じ哺乳類であるＢＨＫ細胞を用いた生産においてもそのすべてが完全にＧｌａ化されている訳ではない（非特許文献４参照）。生産性については、培地中への発現量はＥＬＩＳＡを用いた定量方法で９７５ｎｇ／ｍｌであり、活性からの換算した定量方法では６００ｎｇ／ｍｌであった（特許文献３参照）。一方で、ＶＩＩ因子は自己活性化されたり（非特許文献５参照）、精製途中で活性化とは異なる自己分解をおこしたりする（特許文献４参照）ために、生産、調製するのが非常に難しいタンパク質である。
【特許文献１】特表２００１−５２０００９号公報
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【特許文献３】特開平１０−１１７７８７号公報
【特許文献４】特表平８−５０８２６４号公報
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｓｅｐ；１７（９）：３６７−７４．
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ａｐｒ；２０（４）：３９６−９．
【非特許文献３】溝口秀昭、平井久丸、坂田洋一著「血液疾患」医歯薬出版  第１判第１０９〜１１２頁
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８８  Ｏｃｔ  ４；２７（２０）：７７８５−９３．
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８９  Ｎｏｖ  ２８；２８（２４）：９３３１−６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血液凝固因子の中のいくつかは、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ等のようにその活性化にＧｌａ修飾を必要とする。これらの因子は、配列内にセリンプロテアーゼの認識部位を持ち、その認識部位で切断を受け活性化してセリンプロテアーゼ活性を持つ。特に血液凝固ＶＩＩ因子は非常に分解されやすいタンパク質であり、自己活性化や精製途中での切断を受ける不安定なタンパク質である。このようなタンパク質の生産方法として、これまで、ＢＨＫ細胞を用いた血液凝固ＶＩＩ因子の生産が行われてきたが、ヒトの血液凝固ＶＩＩ因子を同じ哺乳類であるＢＨＫ細胞の培養によって生産しても、Ｇｌａ化が完全におこなわれる訳ではないことがわかっている。また、生産性も低いことが報告されている。
本発明では、Ｇｌａ残基を含むタンパク質、セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質等の新規生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
我々は、Ｇｌａ残基を含むタンパク質、セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質を哺乳類動物細胞の培養以外で得ることを目指し、Ｇｌａ残基を持つタンパク質、セリンプロテアーゼとセリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質の生産にトランスジェニック鳥類を用いることを考えた。具体的には、目的タンパク質としてＧｌａ修飾を受けて初めて活性を持つ血液凝固ＶＩＩ因子を用いた。タンパク質の修飾は同一個体内でも組織によって異なる。ましてや、分類学上、綱の異なる鳥類では、哺乳類の血液凝固ＶＩＩ因子が活性を持つようにＧｌａ修飾を受け、ヒト血液凝固活性を示すとは通常では考えづらい。本発明では、活性を持つ血液凝固ＶＩＩ因子の前駆体を産生するトランスジェニック鳥類が得られることから、トランスジェニック鳥類によるＧｌａ残基を持つ外来タンパク質、セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質の生産方法を示す。
【００１０】
すなわち、本発明は、Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質、セリンプロテアーゼ、及び、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質からなる群より選ばれた少なくとも一種のタンパク質又はその前駆体のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類である。
好ましくは、前記外来性遺伝子が、Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子であるか、セリンプロテアーゼ及び／又はその前駆体のタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子であるか、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子である。
上記Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質は、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺのいずれか及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質であることが好ましく、セリンプロテアーゼ及びその前駆体、並びに、上記セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質は、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、プラスミン、プロテインＣ、プラスミノーゲン、アンチプラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーターのいずれか及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質であることが好ましい。
本発明のトランスジェニック鳥類は、レトロウイルスベクターを用いて作製することが好ましい。
本発明のトランスジェニック鳥類は、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子及び／又はｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ配列を含むレトロウイルスベクターを用いて作製することがより好ましい。
本発明のトランスジェニック鳥類は、また、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを含むレトロウイルスベクターを用いて作製することがより好ましい。
本発明のトランスジェニック鳥類は、また、レトロウイルスベクターとして複製能欠失型のマウス幹細胞ウイルスを用いて作製することがより好ましい。
本発明のトランスジェニック鳥類は、また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後２４時間以後の胚へ外来性遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって得ることが好ましい。
本発明は、また、上記のトランスジェニック鳥類並びにその子孫の血液、その体細胞及び／又はその卵より、抽出、精製、活性化することのいずれか、またはその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法である。
本発明は、また、１ｎｍｏｌあたり０．０５〜０．５ｎｍｏｌのＮ−アセチルノイラミン酸を含む活性型血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ及びその前駆体からなる群より選ばれたタンパク質であり、１ｎｍｏｌあたり０．２〜０．４ｎｍｏｌのＮ−アセチルノイラミン酸を含む活性型血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ及びその前駆体からなる群より選ばれたタンパク質が好ましい。
また、上記タンパク質は、活性型血液凝固ＶＩＩ因子及びその前駆体からなる群より選ばれたタンパク質であることが好ましい。
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類は、Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質、セリンプロテアーゼ、及び、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質からなる群より選ばれた少なくとも一種のタンパク質又はその前駆体のコード配列を含む外来性遺伝子を有するものである。
タンパク質とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合したもので、通常ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものも含む。また、アミノ酸は修飾を受けていても良い。タンパク質の分泌のためにはタンパク質のコード配列に分泌シグナル配列が備わっていることが好ましい。また分泌シグナル配列は自己の配列に限定されるものではない。
Ｇｌａとは、４−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸）のことであり、グルタミン酸のγ炭素にカルボキシル基が付加したもののことである。Ｇｌａ修飾をうけるとは、タンパク質の翻訳後にタンパク質中のグルタミン酸残基の少なくとも一つがＧｌａ化（Ｇｌａになる）することである。
【００１２】
Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質として、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺのいずれか及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。
「それらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質」とは、上記Ｇｌａ修飾により活性化するタンパク質のアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加及び／又は置換されたアミノ酸配列であって、生理作用の変わらないものを示し、生理作用が同じであれば活性の大小に関係なく実質的に同一とする。
以下の「実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質」についても同様である。
【００１３】
次にセリンプロテアーゼの認識部位について説明する。セリンプロテアーゼは、一般にアルギニン、リシンのカルボニル側のペプチド結合を選択的に切断する。よって、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質とは、アルギニン、リシン残基を含むタンパク質である。セリンプロテアーゼによる切断のためには、アルギニン、リシン残基を含むペプチド鎖がタンパク質の三次構造の表面に露出していることがより好ましい。三次構造の表面に露出しているか否かは、目的タンパク質とセリンプロテアーゼを、セリンプロテアーゼが作用し得る適当な反応液中で反応させ、目的タンパク質がセリンプロテアーゼによって切断されるか否かによって調べられる。セリンプロテアーゼ及びその前駆体、及び、セリンプロテアーゼの認識部位を持つタンパク質として血液凝固Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ因子、プレカリクレイン、プラスミン、プロテインＣ、組織プラスミノーゲンアクチベーター及びその前駆体などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、プラスミン、プロテインＣ、プラスミノーゲン、アンチプラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーターのいずれか及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。
【００１４】
本発明のトランスジェニック鳥類は、また、セリンプロテアーゼ及び／又はその前駆体のタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むものである。
セリンプロテアーゼは、活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼの総称である。セリンプロテアーゼは、不活性型または活性の弱い前駆体から限定分解されて活性型となる。セリンプロテアーゼとして血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、プラスミン、プロテインＣ、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーターなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
外来性遺伝子としては特に限定されず、鳥類以外の遺伝子はもちろん、鳥類のものを含んでも良い。トランスジェニック鳥類の作製に用いる個体が有する配列であっても、その個体が本来有する全遺伝子にあらたに遺伝子を導入するので外来性遺伝子と呼ぶ。
本発明において、外来性遺伝子はタンパク質のコード配列を含んでおり、コード配列の境界は５’末端の開始コドン、及び開始コドンに対応する３’末端の終始コドンにより決定される。５’末端の開始コドン近傍はコザックのコンセンサス配列を含むことが好ましい。コード配列の上流にはリボソーム結合部位が存在していることが好ましい。
外来性遺伝子は、鳥類細胞内で発現するために適当なプロモーター遺伝子の少なくとも一部または全部を含んでいることが好ましい。プロモーター遺伝子とは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。
外来性遺伝子は上記以外の非翻訳領域を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のトランスジェニック鳥類の作製には、レトロウイルスベクターを用いることが好ましい。レトロウイルスベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、パッケージング細胞の異なる形態を含む。パッケージング細胞とはウイルス粒子の複製に必要なタンパク質の少なくとも一つをコードする遺伝子を導入した細胞である。
本発明で使用するレトロウイルスベクターは、安全性を考慮して、複製能を欠失していることが好ましい。複製能の欠失方法としては、ウイルス粒子の複製に必要な内部コアに含まれるタンパク質（ｇｒｏｕｐ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ｇａｇ）、逆転写酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ｐｏｌ）及びエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ：ｅｎｖ）のうちいずれか又はその組み合わせが発現しないように、コード配列または発現に必要な配列の少なくとも一部または全部を欠失するか、それらが発現不能なように置換、挿入変異を含むことが好ましい。レトロウイルスベクターは、ウイルス毎に挿入可能な遺伝子の長さが限定を受ける為、欠失変異が好ましく、安全性や挿入断片の長さを増やす観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの複数を欠失させることが好ましい。
レトロウイルスベクターは、ウイルス粒子にパッケージされる目印として機能するウイルスパッケージングシグナル（ｐｈｉ）を含んでいることが好ましい。ｇａｇ領域の一部はウイルスパッケージングシグナルとして機能することもあるため、ウイルス力価向上の観点から、ウイルスベクターは発現不能としたｇａｇ領域の少なくとも一部を含んでいることが好ましい（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８７  Ｍａｙ；６１（５）：１６３９−４６．）。
【００１７】
レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等が挙げられる。モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルスが好ましいが、鳥類の胚へ感染させるため、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）やマウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等、胚細胞や幹細胞への感染性の高いウイルスを用いることが好ましい。より好ましくは、複製能欠失型のマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である。本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の複製能欠失型レトロウイルスベクターは、組織特異的なプロモーター遺伝子、又は、組織非特異的なプロモーター遺伝子を含むものが好ましい。
組織特異的なプロモーター遺伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別に活性の強いプロモーター遺伝子のことである。組織特異的なプロモーター遺伝子を用いることにより、目的タンパク質の発現が鳥類の発生や生存に悪影響を与える可能性を減少または排除できる利点がある。
組織特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、卵管特異的なプロモーター遺伝子の一部又は全部をあげることができる。卵管組織は性成熟後に活発に活動することから性成熟後に強く誘導されることが多い。
卵管特異的なプロモーター遺伝子としては、鳥類由来のオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２グロブリン、Ｇ３グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子等をあげることができ、これらの一部又は全部を含むことが好ましい。これらの卵管特異的なプロモーター遺伝子を用いた場合、目的タンパク質を卵白中に高発現させることができ、特に好ましい。
【００１９】
組織非特異的なプロモーター遺伝子とは、組織特異的なプロモーター遺伝子でないプロモーター遺伝子のことである。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、鳥類のほぼ全ての体細胞で活性のあるものをいう。その場合、目的タンパク質が血中にも発現するため、雛の段階で発現の可否を検出できるという利点がある。
組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、βアクチンプロモーター遺伝子、ＥＦ１αプロモーター遺伝子、チミジンキナーゼプロモーター遺伝子やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター遺伝子等のウイルス由来プロモーター遺伝子が挙げられる。他に、テトラサイクリン誘導型プロモーター遺伝子のような、組織非特異的な誘導型プロモーター遺伝子を用いても良い。上記βアクチンプロモーター遺伝子としては、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子等が挙げられ、上記組織非特異的なプロモーター遺伝子としては、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の複製能欠失型レトロウイルスベクターは、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含んでいてもよい。転写エンハンサーは、プロモーター遺伝子からの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。本来機能しているものとは異なるプロモーター遺伝子に連結した場合にも機能することが多いので、プロモーター遺伝子との組み合わせについては特に限定しない。転写エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ由来のチミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節エレメントとしては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が好ましい。
【００２１】
本発明に用いるレトロウイルスベクターには、マーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は、正しく遺伝子導入された細胞の同定及び単離の目印となるタンパク質をコードする遺伝子である。マーカー遺伝子としては特に限定されないが、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）やシアン・フルオレッセント・プロテイン（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質の遺伝子；ネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏｒ）等の薬剤耐性遺伝子；他にチミジンキナーゼ、ジヒドロフォレート・レダクタ−ゼ、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子は、プロモーター遺伝子や発現に必要な要素を伴っていることが好ましい。
【００２２】
レトロウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙＡ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。レトロウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる際は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。レトロウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙＡシグナルを含まないことが好ましい。
【００２３】
次に、本発明で好適に用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターは複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を欠失していることが好ましい。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的タンパク質を発現可能な複製能欠失型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
【００２４】
上記ウイルス液において、複製能欠失型レトロウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０８〜１×１０１４ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９〜１×１０１４ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
上記ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション  ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約９．４ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定する。
【００２５】
次に、複製能欠失型レトロウイルスベクターの鳥類胚への感染について説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類は、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって得られる。
胚とは、多細胞動物の個体発生初期のものであり、卵膜または卵殻に包まれているか、母体内にあって、独立して食物をとる以前のものである。孵化とは、胚が卵膜または卵殻から出ること及び独立して食物をとるようになることである。
複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる胚は、孵卵開始から２４時間以上経過していることが好ましい。より好ましくは、孵卵開始から３２時間以後７２時間以前の胚である。更に好ましくは、孵卵開始から４８時間以後６４時間以前の胚である。レトロウイルスベクターを感染させる、つまりレトロウイルスベクターを導入する場所としては、心臓内あるいは血管内が好ましい。本発明においては、遺伝子導入効率の高いＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製する上で、心臓の拍動を観察することができる初期の段階（心臓が拍動を開始してから６時間以内）に、遺伝子を導入することが好ましい。それは、血流に乗せて全身に遺伝子を運ぶという観点と、細胞数が少ないという観点による。
【００２６】
マイクロインジェクションは、顕微鏡下で先端を細くした微小ガラス管等を用い、特定の場所に直接ウイルス液を導入する方法である。本発明では、心臓や血管という特定の場所にウイルス液を導入するため、リポフェクション法やエレクトロポレーション法といった他の遺伝子導入法より、マイクロインジェクションが好ましい。
孵卵の条件としては特に限定されず、例えばニワトリならば温度が立体孵卵器で３７．２〜３７．８℃（平面孵卵器等では卵の上端で３８．９〜３９．４℃）、湿度が４０〜７０％程度の条件が発生に最適な環境であるが、この環境に限定されない。また、孵卵の際には転卵をおこなう。転卵は、角度３０°以上で１日２回以上おこなうのが好ましいが、その限りではない。
【００２７】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されないが、家畜として利用可能な家禽であることが好ましい。家禽としては、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ、アヒル等を挙げることができる。なかでもニワトリは入手が容易で、産卵種としても多産であり、卵も大きく大量飼育方法が確立している点で特に好ましい。
【００２８】
上述のように、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類が得られる。
生殖細胞に外来性遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させ、孵化したヒナを選別することによりＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は全ての細胞に外来性遺伝子が導入される確立は低く、ほとんどの場合外来性遺伝子が導入された細胞と野生型の細胞との異なる遺伝子型の細胞が共存しているキメラ状態である。一方で、上記の方法で得られたＧ１トランスジェニック鳥類は、ほぼ全ての体細胞に均一に導入遺伝子を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認は、血液や体細胞、精子、卵由来のＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲ法等によって行うことができる。また、目的タンパク質の発現からも判断できる。目的タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡ法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測定等によって調べる事ができる。
【００２９】
Ｇ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を交配させることにより作製される。交配型は、Ｇ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ１オスに対し複数の野生型メスを交配させることができるため、効率の点から好ましい。
本発明の目的タンパク質の生産方法は、前述のトランスジェニック鳥類から目的タンパク質を回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類及びその子孫の血液、その体細胞及び／又はその卵から目的タンパク質を抽出、精製、活性化することのいずれか又はその組み合わせにより回収することを特徴とする。抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。特にＧｌａ残基を含むタンパク質は２価金属陽イオンの存在によりコンホメーション変化を起こすことがあり、２価金属陽イオンの有無によるコンホメーション変化を認識して目的タンパク質への吸着度の変わる抗体を利用して精製することが好ましい。また、必要に応じて目的タンパク質を活性化してもよい。特に、目的タンパク質が血液凝固因子の場合は、必要に応じて適当なセリンプロテアーゼで活性化しても良い。
目的タンパク質が血液凝固ＶＩＩ因子の場合、カルシウムイオン、マンガンイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオンおよびストロンチウムイオンから選ばれる２価の金属陽イオンの存在濃度に依存して前駆体血液凝固ＶＩＩ因子及び／又は活性型血液凝固ＶＩＩ因子に結合するモノクローナル抗体を用いて精製することが好ましい。
血液凝固ＶＩＩ因子には前駆体と活性型があるが、上述の生産方法で得られた血液凝固ＶＩＩ因子は、主に前駆体血液凝固ＶＩＩ因子からなり、活性型血液凝固ＶＩＩ因子を含むこともある。
【００３０】
本発明のトランスジェニック鳥類から得られるタンパク質は、１ｎｍｏｌあたり０．０５〜０．５ｎｍｏｌのＮ−アセチルノイラミン酸を含む血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ及びその前駆体からなる群より選ばれたタンパク質であり、上記タンパク質は０．２〜０．４ｎｍｏｌのＮ−アセチルノイラミン酸を含むものが好ましい。
また、上記タンパク質は、活性型血液凝固ＶＩＩ因子及びその前駆体からなる群より選ばれたタンパク質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、Ｇｌａ残基を持つタンパク質、セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼの認識部位を含むタンパク質を産生するトランスジェニック鳥類、及びその作製方法が提供される。その結果として、血液凝固ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロテインＣ等の前駆体、場合によっては前駆体とその活性型タンパク質を発現するトランスジェニック鳥類の作製が可能となる。それと同時に、セリンプロテアーゼの認識部位やセリンプロテアーゼ活性を持つという不安定なタンパク質を発現するトランスジェニック鳥類の作製をも可能とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。遺伝子操作について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（小山秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京、第１判）。商品名を記載している場合は、特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。
【００３３】
（実施例１）
ヒト血液凝固ＶＩＩ因子遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩの構築
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ（配列番号１）は、公知文献（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９４  ＭＡＲ；１（２）：１３６−８．）とインターネットの情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ＮＩＨ．ｇｏｖ／他）を元に全合成し、ｐＵＣ１９（ジェンバンク  アクセッション番号Ｘ０２５１４）のＥｈｅＩ（２３５）〜ＰｖｕＩＩ（６２８）間に挿入した（東洋紡績社製）。これを、ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ（タカラバイオ社製）処理後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した（実施例１ベクター断片）。
ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＶＩＩは、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯのＰＣＲ産物挿入部位に５’−ｇｔｃｇａｃｃｃａｃｃＡＴＧｇ・・・ＴＡＧｃｔｃｇａｃ−３’（配列番号１７、下線部はＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位、大文字は開始コドン及び終始コドン）という配列でＡＴＧｇ・・・ＴＡＧに血液凝固ＶＩＩ因子の配列（配列番号２）をコードする。
ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＶＩＩを鋳型として、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｔｃａｇ−３’（配列番号３）及び５’−ｃｇａｔａａｇｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｔａｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇ−３’（配列番号４）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより増幅した断片を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収し、ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で切断した。これを、１％アガロースゲルで電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した（実施例１インサート断片）。
実施例１ベクター断片と実施例１インサート断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用い連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に形質転換した。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天培地に塗布し、３７℃で１２〜１５時間培養した。生えてきたコロニーを５ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で、３７℃で６〜１２時間培養した後、プラスミドを抽出した。プラスミドをＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）で制限酵素処理し、１％アガロースゲル電気泳動した。図１の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩとした。
なお、図１中のマーカー遺伝子ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ、ウイルスパッケージングシグナル配列ｐｈｉ＋、マーカー遺伝子Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ、組織非特異的なプロモーター遺伝子ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、並びに、長い反復配列５ＬＴＲ及び３ＬＴＲはすべて、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔに由来するものである。
【００３４】
（実施例２）
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩとｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
以後特に記述の無い限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）を用いた（ギブコ社製）。培養は３７℃、ＣＯ２５％でおこなった。レトロウイルスベクターに用いるプラスミドＤＮＡはＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００３５】
実施例１で構築したプラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩよりレトロウイルスベクターを調製するため、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を持つパッケージング細胞ＧＰ２９３を、直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに細胞を５×１０６個（７０％コンフルエント）となるように播種した（翌日９０％コンフルエントとなるようにする）。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキン（シグマ社製）を加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分間おいた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを、培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、更に２４時間培養した。
【００３６】
培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集めた。超遠心機ＣＳ１００ＧＸＬ（日立工機社製）を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００ｇ）で１．５時間遠心分離した。沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機で１２０００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルター（アドバンテック社製）に通しウイルス液とした。
【００３７】
（実施例３）
ヒト血液凝固ＶＩＩ因子安定パッケージング細胞の選択
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレートにＧＰ２９３細胞を１．５×１０４個／ウェルとなるよう播種し培養した。ウイルス感染の当日、１０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する培地１ｍｌと交換した。これに、実施例２で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローニングする。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０個／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し（ウェルに一個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が早く、ＧＰ２９３と形態の近い細胞を選択し、ヒト血液凝固ＶＩＩ因子安定パッケージング細胞クローンを得た。
【００３８】
（実施例４）
ヒト血液凝固ＶＩＩ因子安定パッケージング細胞とｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに実施例３で得られたヒト血液凝固ＶＩＩ因子安定パッケージング細胞を５×１０６個（７０％コンフルエント）となるように播種した。翌日９０％コンフルエントとなるようにする。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキンを加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁し、室温で５分間おいた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを、培養ディッシュに加え、６時間培養した。培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２４時間培養した。培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集めた。超遠心機を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００ｇ）で１．５時間遠心分離した。沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機で１２０００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルターに通しウイルス液とした。このようにして、１０８  ｃｆｕ／ｍｌ以上の力価を持つウイルス液が得られた。
【００３９】
（実施例５）
ＷＰＲＥ配列を含むヒト血液凝固ＶＩＩ因子遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩｗｐｒｅの構築とレトロウイルスベクターの調製
実施例１で得られたｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩを、ＣｌａＩ（タカラバイオ社製）で切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰで処理後、精製、回収した。精製、回収には、実施例１記載の製品を用いた。これを１％アガロースゲルで電気泳動し、目的断片を精製、回収した（実施例５ベクター断片）。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’（配列番号５）及び５’−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’（配列番号６）（下線部はＣｌａＩ制限酵素部位）をプライマーとし、ＷＰＲＥ配列を含むｐＷＨＶ８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション４５０９７）からＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収しＣｌａＩで切断した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（実施例５インサート断片）。
実施例５ベクター断片と実施例５インサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。形質転換株より図２の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩｗｐｒｅとした。先に述べた実施例と同様にして安定パッケージング細胞やレトロウイルスベクターを調製できる。ＷＰＲＥ配列を用いると高力価の安定パッケージング細胞を得やすい。ＷＰＲＥ配列により転写活性が増強されているためやＲＮＡが安定化されているためだと考えられる。
【００４０】
（実施例６）
ウイルス力価の測定
ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション  ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義した。６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約９．４ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定した。１０６倍希釈で４コロニー現れた場合、ウイルス力価は、４×１０６ｃｆｕ／ｍｌとなる。
具体的には、力価測定開始の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞を６ウェル培養プレートに５×１０４個／ウェルとなるよう播種し培養した。翌日、細胞の培地を９μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する培地９００μｇ／ｍｌと交換し、ウイルス液を培地で１０−１〜１０−５に希釈し、それぞれ１００μｌをウェルに添加して感染させた（ポリブレン終濃度８μｌ／ｍｌ）。４〜６時間培養後、１ｍｌの培地を更に加えた。次の日、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換し、以後３〜４日おきにＧ４１８含有培地と交換した。感染から約２週間後プレートをメチレンブルー液で染色し、得られたコロニー数を測定し力価を求めた。力価測定の結果、後述の実施例７でインジェクションに用いたウイルスの力価は、４．１×１０６〜１．６×１０９であった。結果を表１に示す。
【００４１】
（実施例７）
ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下で行う。ニワトリ受精卵（城山種鶏場）の外側を消毒液（昭和フランキ社製）及びエタノールで除菌する。孵卵機Ｐ−００８（Ｂ）型（昭和フランキ社製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始から約５５時間経過後、孵卵機から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンド刃（刃先径２０ｍｍ、シャフト径２．３５ｍｍ）を付けたミニルーター（プロクソン社製）で切り取った。ニワトリ二黄卵（城山種鶏場）の鋭端部を直径４．５ｃｍに切り取り、中身を捨てた卵殻に受精卵の中身を移し、注射器の内筒で胚を上方へ移動させた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ社製）にウイルス液を注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用い、実施例４（ＷＰＲＥ配列無し）又は実施例５（ＷＰＲＥ配列有り）のウイルス液約２μｌを心臓内にマイクロインジェクションした。
卵白を糊として約８×８ｃｍに切ったサランラップ（旭化成社製）でこの穴を塞ぎ、孵卵機に戻し孵卵を続けた。孵卵機の転卵を３０分毎に３０°転卵に変更した。孵卵開始から２０日目にサランラップに２０Ｇの注射針で２０個程度穴を開け、孵卵機に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。雛がハシ打ちを始めたら卵殻を割って孵化させた。この人工孵化に関する結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0005280001.tif 000002
【００４３】
（実施例８）
血液凝固ＶＩＩ因子発現トランスジェニックニワトリにおける血中、卵中の血液凝固ＶＩＩ因子発現の確認
実施例７により誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（豊橋飼料社製）を用いた。クエン酸三ナトリウム二水和物（和光純薬社製）３．８ｇを溶かし１００ｍｌとし、３．８％クエン酸ナトリウム溶液とした。血液凝固ＶＩＩ因子発現トランスジェニックニワトリからの採血は翼下静脈よりおこなった。１容量の３．８％クエン酸ナトリウム溶液に血液を９容量加え穏やかに混和した。これを、小型高速遠心機で４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を血漿とした。卵からの抽出の際には、卵白及び卵黄を分離した。卵黄からの抽出の際は、卵黄中央にシリンジをさし、卵白が入らないように抜き取った。卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製した。調製したサンプルはアッセイ時まで−８０℃で凍結保存した。凍結融解を避けるため、溶解は３７℃で迅速に行うことが好ましい。
【００４４】
血液凝固ＶＩＩ因子の発現量はＡＳＳＲＡＣＨＲＯＭＲＶＩＩ：Ａｇ（ダイアグノスティカ  スターゴ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社製）を用いたＥＬＩＳＡにより調べた。血液由来の精製品を標準とした。発現量（個体番号３−１）は血漿中２．１μｇ／ｍｌ、卵黄中２．２μｇ／ｍｌ、卵白中２４μｇ／ｍｌであった。
また、血液凝固活性を元にして血液凝固ＶＩＩ因子の発現量を求めた。血液凝固ＶＩＩ因子の血液凝固活性は、欠乏血漿を用いた凝固時間法によって求めた。サンプルは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で適宜希釈した。試薬としてトロンボレルＳ（デイドベーリング社製）、第ＶＩＩ因子欠乏血漿（ジョージ・キング社製）、測定機器としてＢＣＳ（デイドベーリング社製）を用い、正常ヒト血漿を用いた検量線よりサンプルの活性を換算した。正常ヒト血漿の基準値を１００％とした。重量に換算する際には、ヒト血漿中の血液凝固ＶＩＩ因子濃度が０．５μｇ／ｍｌであるとして換算した。
Ｇ０トランスジェニックにおける血液凝固ＶＩＩ因子の発現結果を図３に示す。インジェクション手技習得後（表１の７回目以降）は、誕生した雛のＧ０トランスジェニックの出現頻度は１００％であった。発現量は血漿中で最大１２μｇ／ｍｌ、卵白中で最大３５０μｇ／ｍｌであった。結果を図３に示す。
なお、図３に示す個体番号「３−１」の最初の数字は、マイクロインジェクションの回数を示し、例えば個体番号「３−１」は、３回目のマイクロインジェクションで得られた個体である。
次に、個体番号７−９の血漿中及び卵中由来の血液凝固ＶＩＩ因子のウエスタンブロットを行った。サンプルはｅ・パジェル１２．５％（アトー社製）を用い変性条件で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写後、１０％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングし、抗体としてヒツジ抗ヒトファクターＶＩＩ抗体ＨＲＰ標識（アフィニティー  バイオロジカルズ社製）を用い、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム社製）で検出した。ウエスタンブロットの結果を図４に示す。
【００４５】
（実施例９）
ＰＣＲによるゲノムＤＮＡへの遺伝子導入の確認
ニワトリからのゲノムＤＮＡの抽出は、血漿を抽出した際のペレットや血清抽出のペレットもしくは精子から行うことができるが、本実施例では精子からおこなった。抽出はＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＲ  −Ｇｅｎｏｍｅ−及びＭＦＸＲ−２１００（東洋紡績社製）を用いて行った。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃａａｇａａｇａｇａｃｇｔｔｇｇｇｔｔａ−３’（配列番号７）及び５’−ｇｇｔｇａｔｇａｇｇｔｃｔｃｇｇｔｔａ−３’（配列番号８）をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲし、レトロウイルスベクターのｇａｇ領域に対応する９７ｂｐの断片の増幅が可能かどうかを調べることにより、ゲノムＤＮＡへの遺伝子導入の有無を調べた。トランスジェニックニワトリ（個体番号９−１）の精子より、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによる増幅断片を４％アガロースゲル電気泳動した結果、目的断片の増幅を確認できた。結果を図５に示す。
【００４６】
（実施例１０）
ヒト血液凝固ＩＸ因子遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＩＸの構築
精製、回収等には前述の製品を用いた。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｇｃａｇｃｇｃｇｔｇａａｃａｔｇａｔｃａｔｇｇｃａｇａａ−３’（配列番号９）及び５’−ｔｔａａｇｔｇａｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｔｃｃｔｔａａｔｃｃａ−３’（配列番号１０）をプライマーとし、ヒト成人正常肝臓第一鎖ｃＤＮＡ（コスモバイオ社製）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収し、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔにより、末端を平滑化し、リン酸化した。精製、回収後、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（インサート断片）。ｐＵＣ１９をＳｍａＩ（タカラバイオ社製）処理しＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ処理後、精製、回収し、これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（ベクター断片）。上記ベクター断片とインサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。形質転換株よりＦＩＸ（ジェンバンク  アクセッション番号ＮＭ＿０００１３３）の挿入されたプラスミドを選択し、ｐＵＣＦＩＸとした。
次に、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｃａｇｃｇｃｇｔｇａａｃａｔｇａｔｃａｔｇｇｃａｇａａ−３’（配列番号１１）及び５’−ｃｇａｔａａｇｃｔｔａｃｇｃｇｔｔｔａａｇｔｇａｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｔｃｃｔｔａａｔｃｃａ−３’（配列番号１２）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとし、ｐＵＣＦＩＸを鋳型としてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収しＨｉｎｄＩＩＩで切断した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（インサート断片）。ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ処理後、精製、回収した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（ベクター断片）。上記ベクター断片とインサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。実施例１と同様にして、形質転換株よりプラスミドを抽出し、プラスミドをＳｔｕＩ（タカラバイオ社製）で制限酵素処理し、１％アガロースゲルで電気泳動した。図６の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＩＸとした。
【００４７】
（実施例１１）
プロテインＣ遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｐｒｏｔｅｉｎＣの構築
精製、回収等には前述の製品を用いた。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｇｔｇｇｃａｇｃｔｃａｃａａｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃ−３’（配列番号１３）及び５’−ｃｔａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｃｔｔｃ−３’（配列番号１４）をプライマーとし、ヒト成人正常肝臓第一鎖ｃＤＮＡ（コスモバイオ社製）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収し、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔにより、末端を平滑化し、リン酸化した。精製、回収後、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（インサート断片）。ｐＵＣ１９をＳｍａＩ（タカラバイオ社製）処理しＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ処理後、精製、回収し、これを１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（ベクター断片）。上記ベクター断片とインサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。形質転換株よりプロテインＣ（ジェンバンク  アクセッション番号ＮＭ＿０００３１２）の挿入されたプラスミドを選択し、ｐＵＣｐｒｏｔｅｉｎＣとした。
次に、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｔｇｇｃａｇｃｔｃａｃａａｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｃｔｔｃ−３’（配列番号１５）及び５’−ｃｇａｔａａｇｃｔｔａｃｇｃｇｔｃｔａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｃｔｔｃ−３’（配列番号１６）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとし、ｐＵＣｐｒｏｔｅｉｎＣを鋳型としてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収しＨｉｎｄＩＩＩで切断した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（インサート断片）。ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ処理後、精製、回収した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（ベクター断片）。上記ベクター断片とインサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。実施例１と同様にして、形質転換株よりプラスミドを抽出し、プラスミドをＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で制限酵素処理し、１％アガロースゲルで電気泳動した。図７の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｐｒｏｔｅｉｎＣとした。
【００４８】
（実施例１２）
卵白からの血液凝固ＶＩＩ因子の精製
固体番号７−９、９−６の卵白より血液凝固ＶＩＩ因子の精製をおこなった。精製操作はすべて４℃でおこなった。卵白を５倍量の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈し粘性が低くなるまで懸濁した。次に、０．２ＮのＮａＯＨでｐＨを７．４に合わせ、最終濃度５ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を加えた。５０００×ｇで遠心分離し、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターに通し卵白溶液とした。精製には血液凝固ＶＩＩ因子に対する抗体カラムを用いた（参考文献  特許第２８２４４３０号）。抗体カラム（φ２５ｃｍ×２ｃｍ）は０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の平衡化緩衝液で平衡化した。抗体カラムに卵白溶液を通液し、平衡化緩衝液で洗浄後、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの溶出緩衝液で溶出した。精製の各ステップにおけるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図８に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元条件下で５−２０％のグラジエントゲルを用いておこなった。溶出画分の泳動結果は血液凝固ＶＩＩ因子に由来する５０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び２０ｋＤａ付近の３本のバンドがほぼ純粋に確認できる。
上記精製を複数回おこなった。各回における精製収率（％）を表２に示す。収量はＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ  ＶＩＩ：Ａｇ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社製）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４９】
【表２】
0005280001.tif 000003
【００５０】
（実施例１３）
ヒト血漿由来及び卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子の物性比較
実施例１２で精製したサンプルを用い、ヒト血漿由来及び卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子のシアル酸含量の測定をおこなった。測定は東レリサーチセンターに依頼した。結果を表３に示す。グリコリルノイラミン酸については検出限界以下であった。
次に、比活性の比較をおこなった。以後の実験は個体番号９−６由来のサンプルについてのみおこなった。活性は血液凝固ＶＩＩ因子欠乏血漿を用いたプロトロンビン（ＰＴ）時間法（参考文献Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９８１；８０：２２８−３７．）により測定した。欠乏血漿０．１ｍｌ、希釈試料０．１ｍｌ、組織トロンボプラスチン溶液０．１ｍｌを混合し３７℃で２分間インキュベートした後、０．０２５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液０．１ｍｌを添加し、凝固するまでの時間を測定した。予め、希釈試料の代わりに段階希釈した正常血漿を用いて標準曲線を作成し、これより試料中の血液凝固ＶＩＩ因子活性を測定した。ヒト血漿由来と卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子では活性化の度合いがことなることからＦａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｉｅｓ社製）によりそれぞれのサンプルを完全に活性化した後、比活性の測定をおこなった。比活性はヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子は４７．４±２．６  ＫＩＵ／ｍｇ、卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子は２４．７±１．１  ＫＩＵ／ｍｇと、卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子はヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子に比べ半分程度の比活性であった。
ヒト血漿由来及び卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子のラット血液中における動態比較をおこなった。血液凝固ＶＩＩ因子５００μｇ／ｋｇを尾静脈より投与し、経時的に採血し、血漿を分離後実施例１２に記載のＥＬＩＳＡ法によって血中の血液凝固ＶＩＩ因子濃度を測定した。半減期はヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子で約２８．８分、卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子で約７．４分であった。結果を図９に示す。
【００５１】
【表３】
0005280001.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１で得られた血液凝固ＶＩＩ因子発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ＦＶＩＩは血液凝固ＶＩＩ因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図２】実施例５で得られた血液凝固ＶＩＩ因子発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩｗｐｒｅの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ＦＶＩＩは血液凝固ＶＩＩ因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子である。
【図３】トランスジェニックニワトリの血漿中及び卵白中の血液凝固活性を示す。正常ヒト血漿の基準値から活性を濃度に換算した（０．５μｇ／ｍｌ／１００％）。雌雄不明は雌雄判定以前に殺処分したものである。（＊）は実施例４のｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩレトロウイルスベクターを用いたトランスジェニックニワトリであり、他は、実施例５のｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩｗｐｒｅレトロウイルスベクターを用いたトランスジェニックニワトリである。
【図４】トランスジェニックニワトリ（個体番号７−９）の血漿及び卵白の抗血液凝固ＶＩＩ因子抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。マーカーは分子量マーカーである。ノボセブン（ノボ  ノルディスク社製）及びＦＶＩＩ（ヒト血液由来血液凝固ＶＩＩ因子の精製品）は標準サンプルであり、野生型は非トランスジェニックニワトリ由来のサンプルである。血液凝固ＶＩＩ因子の分子量は前駆体で５０ｋＤａ、ポリペプチド鎖内に切断を受けて活性化されると３０ｋＤａ及び１８ｋＤａである。ノボセブン及びＦＶＩＩは０．０２ｍｇ／レーン。卵白、血漿はそれぞれ０．２μｌ／レーン、０．４μｌ／レーンを電気泳動した。
【図５】ＰＣＲによるトランスジェニックニワトリ（個体番号９−１）の精子ゲノムＤＮＡへの遺伝子導入の確認の結果を示す。レーンＭは分子量マーカー、レーン１は野生型ニワトリ精子ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、レーン２はトランスジェニックニワトリ（個体番号９−１）精子ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、レーン３はｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩのＰＣＲ産物である。反応液中の初期鋳型濃度は、ゲノムＤＮＡは８ｎｇ／ｍｌ、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＶＩＩは１ｐｇ／ｍｌとし、４０サイクルの反応後５μｌを４％アガロースゲル電気泳動した。レーン１では目的の位置（９７ｂｐ）にバンドを確認できないが、レーン２では目的の位置にバンドを確認できる。
【図６】実施例１０で得られた血液凝固ＩＸ因子発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔＦＩＸの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ＦＩＸは血液凝固ＩＸ因子遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図７】実施例１１で得られたプロテインＣ発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｐｒｏｔｅｉｎＣの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｐｒｏｔｅｉｎＣはプロテインＣ遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。
【図８】実施例１２の精製の各ステップにおけるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。精製は個体番号７−９と９−６由来の卵よりそれぞれおこなった。泳動結果において、卵白は卵白液、卵白溶液は実施例１２の通り調製した液、通過画分はカラムに通し吸着しなかった通過液、洗浄画分は洗浄液の通過液である。溶出液は３つの画分に分けた。ｐｄ  ＦＶＩＩはヒト血漿由来前駆体血液凝固ＶＩＩ因子であり、ｐｄＦＶＩＩａはヒト血漿由来活性型血液凝固ＶＩＩ因子である。ヒト血漿由来前駆体血液凝固ＶＩＩ因子は分子量５０ｋＤａ、ヒト血漿由来活性型血液凝固ＶＩＩ因子は分子量３０ｋＤａ及び２０ｋＤａにバンドを確認できる。精製により溶出画分の泳動結果は血液凝固ＶＩＩ因子に由来する５０ＫＤａ、３０ＫＤａ及び２０ＫＤａ付近の３本のバンドがほぼ純粋に確認できる。
【図９】実施例１３のヒト血漿由来及び卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子の血中動態の結果を示す。ｐｄは活性型ヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子、ｅｇは活性型卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子を示す。５００μｇ／ｋｇを尾静脈より投与し、経時的に採血し、血漿を分離後ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ  ＶＩＩ：Ａｇにて血液凝固ＶＩＩ因子濃度を測定した。グラフの横軸は時間、縦軸は標準ヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子を元にした血液凝固ＶＩＩ因子の換算値を示している。静注後０分の数値は文献値（参考文献：Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９３  Ｓｅｐ  １；７０（３）：４５８−６４）からの推定値である。実験数はＰｄで２回、Ｅｇで３回おこなった。５μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌになる時間より半減期を算出し、ヒト血漿由来血液凝固ＶＩＩ因子は約２８．８分、卵白由来血液凝固ＶＩＩ因子は約７．４分であった。
【図１】
0005280001.tif 000005
【図２】
0005280001.tif 000006
【図３】
0005280001.tif 000007
【図４】
0005280001.tif 000008
【図５】
0005280001.tif 000009
【図６】
0005280001.tif 000010
【図７】
0005280001.tif 000011
【図８】
0005280001.tif 000012
【図９】
0005280001.tif 000013
【配列表】
0005280001000001.app