(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒ワクチニアウイルスLC16m8株を有効成分として含有するワクチンのワーキングシード液の調製方法であって、下記（１）〜（３）の工程からなることを特徴とする前記方法：
（１）LC16m8株含有液を１〜n群（nは整数）の動物細胞に接種・培養する工程、
（２）各群の培養液の一部を希釈し、該希釈液をRK-13細胞とVero細胞に接種・培養する工程、
（３）RK-13細胞にプラークを生じ、Vero細胞にプラークを生じない各群の培養液を選択・回収する工程。
【請求項２】
前記（２）の希釈液中のウイルス含量が1×104PFU以上である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動物細胞が初代細胞である、請求項１又は２の何れか一項記載の方法。
【請求項４】
初代細胞がウサギ腎臓由来である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れか一項記載の方法により得られたワーキングシード液を動物細胞に接種・培養し、培養物からウイルス液を回収することを特徴とする、リバータント含有率3％以下の痘瘡ワクチンの製造方法。
【請求項６】
ワーキングシードウイルス液のMOIが0.001〜5、及び動物細胞数が1×105〜1×1012個である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
ワーキングシードウイルス液のMOIが0.1〜1、及び動物細胞数が0.5×108〜3×108個である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
動物細胞が初代細胞である、請求項５ないし７の何れか一項記載の製造方法。
【請求項９】
初代細胞がウサギ腎臓由来である、請求項８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養中に容易にリバータントを生じる弱毒ワクチニアウイルスを有効成分とする痘瘡生ワクチンの製造方法に関する。より詳細には、弱毒ワクチニアウイルスのマスターシード液を、適当数の群（1〜n：nは整数）のウサギ腎細胞に接種・培養する工程、各群の培養液の一部をRK-13細胞とVero E6細胞に接種・培養し、RK-13細胞にプラークを生じ、Vero細胞にプラークを生じない各群の培養液を選択・回収する工程、該培養液（ワーキングシード液）を用いてワクチン原液を調製する工程、からなる痘瘡生ワクチンの製造方法及び当該方法により得られる痘瘡生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然痘（smallpox）は、痘瘡（variola）ともよばれ、かつてはもっとも恐れられたウイルス感染症である。天然痘ウイルスを含むオルソポックスウイルス属のウイルス遺伝子は、全長約180〜200kbpで、中央部の約100kbpがオルソポックスウイルス間できわめてよく保存されている。この領域に感染防御抗原がコードされているため、オルソポックスウイルス間では感染防御免疫はほぼ完全に交差する（例えば、非特許文献１参照）。通常、生ウイルスワクチンは病原ウイルスの弱毒株を用いるが、天然痘ワクチン（痘瘡ワクチン）の場合は天然痘ウイルスを起源としないワクチニアウイルスが使用されている。代表的にはLister株、New York City Board of Health株(以下、「NYCBH株」と称することもある)、大蓮株、池田株などが使われてきた。【０００３】
日本では、Listerや大蓮・池田株をウシに接種して生じた痘疱組織を原材料とする痘瘡ワクチンが用いられてきた。このワクチンは初種痘児100万例に数例の頻度で発生する種痘後脳炎などの重篤な副反応があり（例えば、非特許文献２参照）、ウシの皮膚で増殖・継代されてきたため、ワクチン液が無菌ではなく、ウイルスも純化されたものではなかった。このため、橋爪らは、Lister株を親株としてウサギ腎初代細胞に低温馴化して、温度感受性の弱毒ウイルス株を作製した。最終的には、鶏卵漿尿膜で形成されるポックの小さいクローンを純化したLC16m8株が用いられ、臨床治験の後1975年に国内で承認されている（例えば、非特許文献３参照）。弱毒ワクチニアウイルスLC16m8株は、親株であるLister株を始めとして、米国で承認されている痘瘡ワクチンDryvaxの親株であるNYCBH株などと比較して神経毒力がきわめて弱くなっているが（例えば、非特許文献３、４参照）、LC16m8株によって誘導される中和抗体の量はLister株によって誘導される中和抗体の量とほぼ同等であった（例えば、非特許文献５参照）。また、細胞培養による弱毒痘瘡ワクチンとして認可されている唯一のものである。【０００４】
LC16m8株は、親株であるLC16mO株を低温培養3代後に小さなポックを形成するウイルスとしてクローニングされたものであり、その原因がB5R遺伝子のフレームシフト変異によるB5R蛋白の欠失であることが明らかになっている（例えば、非特許文献６参照）。B5R蛋白は、オルソポックスウイルスの細胞外外皮ウイルスの主要構成蛋白であるため、この欠失により隣接する細胞への感染効率が低下し、小さなポックを形成するといわれている（例えば、非特許文献７参照）。【０００５】
一方、B5R蛋白の欠失は、B5R遺伝子の一塩基欠失であるため、比較的容易にLC16mO型の先祖返り（リバータント）株が出現する（例えば、非特許文献８参照）。このリバータント株のB5R遺伝子の塩基配列を解析すると、ヌクレオチド274G近辺の1塩基の重複、4塩基の重複、2塩基の欠失によりORFのリーディングフレームが復帰したものであることがわかった。リバータントウイルスの生物学的性状を比較した結果、RK-13細胞やVero E6細胞でLC16mO株より小さいがLC16m8株より大きなプラークを形成することが確認された。また、ふ化鶏卵漿尿膜上でLC16mOと同等の大きさのポックを形成した。ヒトの皮膚での増殖性と相関があるとされているウサギ皮膚での増殖性はリバータントウイルスの含有率が4%程度までは有意差がでなかったが、それ以上になると有意差が出ると想定された（例えば、非特許文献９参照）。【０００６】
【非特許文献１】Moss, B. 2001. Poxviridae: the viruses and their replication, p. 2849-2883. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 4th ed., vol. 2. Lippincott/ The Williams & Wilkins Co., Philadelphia, Pa.
【非特許文献２】福田 芳郎，高木 俊孝：種痘後脳炎の病理．臨床とウイルス 2:53-58, 1974
【非特許文献３】橋爪 莊：新しい弱毒痘苗LC16m8株の基礎．臨床とウイルス 3:13-19, 1975
【非特許文献４】Hashizume S., Yoshizawa H., Morita M., Suzuki K.: Properties of attenuated mutant of vaccinia virus, LC16m8, derived from Lister strain. Vaccinia Virus as Vectors for Vaccine Antigens, Quinnan, Ed. Elsvier Scienced Publishing Col, Inc 87-99, 1985
【非特許文献５】窪谷 弘子：乾燥細胞培養痘そうワクチン「LC16・チバ」成人接種の評価．千葉衛研報告 第28号 11-14 2004年
【非特許文献６】Takahashi-Nishimaki, Funahashi F., Miki S. et al.: Regulation of plaque size and host range by a vaccinia virus gene related to complement system proteins. Virology 181: 158-164, 1991
【非特許文献７】Engelstad M. and Smith G.: The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. Virology 194, 627-637, 1993
【非特許文献８】Kidokoro, M., M. Tashiro, and H. Shida. 2005. Genetically stable and fully effective smallpox vaccine strain constructed from highly attenuated vaccinia LC16m8. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:4152-4157, 2005
【非特許文献９】西條 政幸 他  LC16mO型リバータントウイルスの含まれるLC16m8株のウサギ皮膚増殖試験  厚生労働科学研究研究費補助金  厚生労働科学特別研究事業  細胞培養痘そうワクチンの品質管理に関する研究（H15-特別-43）平成15年度
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、ウサギ腎初代細胞でワクチニアウイルスLC16m8株の継代を重ねるとLC16m8株に特徴的な小さなプラークに比較してやや大きなプラーク（middle size plaque；「MSP」と称することもある）を形成するリバータント（以下、「MSP株」と称することもある）が出現する。継代を重ねる毎にMSP株の含有割合は増加（図１参照）するので、一般にウイルスクローニングに用いられる限界希釈法やプラーク単離法ではMSP株を除去することが難しい。したがって、本発明の目的は、MSPの含有率を低く抑えたより安全な痘瘡生ワクチン及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、RK-13細胞及びVero E6細胞におけるLC16m8株の増殖性がMSP株と異なることから、この2つの細胞を用いることによりMSP株を選択・排除できることを発見した。すなわち、LC16m8株は、RK-13細胞で小型のプラークを形成し目視により容易に識別できるが、Vero E6細胞では極針状のプラークしか形成しないため、目視では識別しがたい。一方、MSP株は、RK-13細胞及びVero E6細胞で中型のプラークを形成する。更に、ウイルスを一定の範囲のMOIでRK-13細胞とVero E6細胞に感染させたとき、RK-13細胞で十分なプラークを形成し、Vero E6細胞でMSP株由来のプラークを形成しないウイルス液をワーキングシードとして用いることにより、ワクチン原液中のMSP株含有率を低く抑えることに成功し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、以下に示す細胞培養痘瘡生ワクチン及びその製造方法を提供するものである。【０００９】
１．リバータントを生じる変異ウイルスを有効成分として含有するワクチンのワーキングシード液の調製方法であって、下記（１）〜（３）の工程からなることを特徴とする前記方法：
（１）変異ウイルス含有液を1〜n群（nは整数）の動物細胞に接種・培養する工程、
（２）各群の培養液の一部を希釈し、該希釈液をRK-13細胞とVero細胞に接種・培養する工程、
（３）RK-13細胞にプラークを生じ、Vero細胞にプラークを生じない各群の培養液を選択・回収する工程。
２．前記（２）の希釈液中のウイルス含量が1×104PFU以上である、上記１の方法。
３．動物細胞が初代細胞である、上記１又は２の何れかの方法。
４．初代細胞がウサギ腎臓由来である、上記３の方法。
５．変異ウイルスが弱毒ワクチニアウイルスである、上記１ないし４の何れかの方法。
６．弱毒ワクチニアウイルスがLC16m8株である、上記５の方法。
７．上記５又は６の何れかの方法により得られたワーキングシード液を動物細胞に接種・培養し、培養物からウイルス液を回収することを特徴とする、痘瘡ワクチンの製造方法。
８．ワーキングシードウイルス液のMOIが0.001〜5、好ましくは、0.1〜1、及び動物細胞数が1×105〜1×1012個、好ましくは、0.5×108〜3×108個である、上記７の製造方法。
９．動物細胞が初代細胞である、上記７又は８の何れかの製造方法。
１０．初代細胞がウサギ腎臓由来である、上記９の製造方法。
１１．上記７ないし１０の何れかの製造方法により得られた痘瘡生ワクチン。
１２．リバータント含有率が3％以下である、上記１１の痘瘡生ワクチン。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従えば、MSP株の含有量が抑えられた弱毒ワクチニアウイルスを有効成分とする痘瘡生ワクチンが提供される。本発明の痘瘡生ワクチンは、MSP株の含有量が低く抑えられているので、該MSP株による副作用を排除することができる。すなわち、ヒトに投与されたとき、強い皮膚反応が起こるのを防ぐことができる。また、本発明の方法に従えば、MSP株を低減したワクチン原液の製造方法が提供される。斯かる製造方法は、弱毒ワクチニアウイルスからなるワクチン原液だけでなく、培養中にリバータントを生じやすい他のウイルスからなるワクチン原液を製造する際にも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、LC16m8株ウイルスの継代数とウイルス液に含まれるMSP含有量の推移を示す図面である。
【００１２】
【図２】図２は、SCIDマウス腹腔内接種実験において、ウイルス接種後の生存曲線を示す図面である。
【００１３】
【図３】図３は、SCIDマウス腹腔内接種実験において、ウイルス接種後の体重の変化を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法は、弱毒ワクチニアウイルスのマスターシード液から動物細胞を用いてリバータント含有率の低いワーキングシードを調製し、該ワーキングシードからワクチン原液を製造する方法によって特徴付けられる。【００１５】
本発明では、主として弱毒したワクチニアウイルスについて記述するが、ワクチニアウイルスに限らず、ある種の方法、例えば、遺伝子組換え技術、低温馴化法、異種細胞継代法、紫外線照射法、放射線照射法などにより変異させたウイルス、あるいは自然に変異したウイルス（以下、これらを「変異ウイルス」と称することもある）であって、培養中に容易にリバータントを生じるウイルスが本発明の対象となる。ここで、リバータントとは、変異により獲得した性質の一部又は全部が消失し、変異前のウイルスが有する性質の一部又は全部を再獲得したウイルスと定義される。このような性質として、例えば、プラーク形成能、プラークサイズ、ポックサイズ、病原性、増殖性、温度感受性、宿主感受性、組織指向性、皮膚増殖性、神経毒性などが挙げられる。【００１６】
本発明に使用できる動物細胞は、対象とする変異ウイルスが増殖する細胞であれば如何なるものも使用できる。好ましくは、ワクチン製造に実績のあるヒト肺、ヒト羊膜、サル腎臓、ウサギ腎臓、イヌ腎臓、トリ胚由来の動物細胞が使用される。動物初代細胞を用いる場合は、サル腎臓、ウサギ腎臓、イヌ腎臓、トリ胚由来の動物初代細胞が好ましい。弱毒ワクチニアウイルスを増殖させる場合は、ウサギ腎臓から調製した初代ウサギ腎細胞を使用するのがより好ましい。動物細胞を調製するときは、一般に使用される調製方法を用いれば良い。例えば、以下の方法により、初代ウサギ腎細胞の浮遊液が調製される。7日齢のSPF哺乳ウサギより腎臓を取り出し、400mg力価／Lの硫酸ストレプトマイシン及び50mg力価／Lのエリスロマイシンを含むリン酸緩衝液(以下、「PBS(-)/2ES」と称することもある）で洗浄後、ハサミを用いて1〜2mmくらいの大きさに切り刻む。再度PBS(-)/2ESで洗浄後、0.3%ディスパーゼ、0.5%ラクトアルブミン及び4.5%仔牛血清を含むハンクス平衡塩類溶液（以下、「ディスパーゼ液」と称することもある）に入れ、4℃で一晩、撹拌しながら消化させる。消化後、遠心分離によりディスパーゼ液を除去し、細胞沈査を適当な培地に浮遊させてウサギ腎初代細胞浮遊液とする。このとき、メッシュを用いてろ過を行うと均一な細胞浮遊液を得ることができる。【００１７】
細胞培養に用いる培地として、その形状から寒天培地、液体培地、その種類からM-199、MEM、YMM-01、DMEM、RPMI、αMEM、平衡塩類溶液などが使用されるが、細胞や培養目的、或は培養段階に応じて適宜選択すれば良い。好ましくは、0.5%ラクトアルブミン、5%ウシ胎児血清、5%仔牛血清を含むハンクス平衡塩類溶液が用いられる。細胞の拡張に用いる培地（以下、「増殖培地」と称することもある）としては、血清、アミノ酸、ビタミン、糖、抗生物質、pH調整用緩衝液などを添加したものが使用される。【００１８】
細胞が十分に増殖した後にウイルスを接種する。増殖培地を吸引除去し、0.01%の二塩化マグネシウム、0.014%の二塩化カルシウム、200mg力価／Lの硫酸ストレプトマイシン及び25mg力価／Lのエリスロマイシンを含むリン酸緩衝液(以下、「PBS(-)/ES」と称することもある)を用いて細胞を洗浄後、適当な濃度に希釈したウイルス液を加える。ウイルスが十分に吸着するまで1〜2時間30℃で培養を行う。その後、ウイルスの増殖に用いる培地（以下、「維持培地」と称することもある）を追加し、培養を行う。維持培地としては、無血清又は低蛋白濃度の培地が使用される。好ましくは、200mg力価／Lの硫酸ストレプトマイシン、25mg力価／Lのエリスロマイシン及び、0.2％ゼラチンを含む199培地が用いられる。培地のpHは6〜8、培養温度は30℃〜39℃の範囲が設定される。培地の量、添加物及び培養時間は、培養スケールに合わせて適宜調節される。【００１９】
本発明の実施例では、弱毒ワクチニアウイルスのマスターシードとして、橋爪らにより調製されたLC16m8株を使用する（臨床とウイルス Vol.3, No.3, p229-235, 1975）。LC16m8株は、臨床分離株（Lister株）から得られた温度変異株で、40.8℃以上で増殖することができず、鶏卵漿尿膜に小型のポックを形成する性質を有する。これを動物細胞で継代を繰り返すと中間サイズのプラーク（MSP）を形成するリバータント（MSP株）が出現する。LC16m8株のマスターシードは、千葉県血清研究所より供与されたものである。【００２０】
ワーキングシードは、LC16m8株のマスターシード液を、適当数の群（1〜n：nは整数）の初代ウサギ腎細胞に接種・培養する工程、各群の培養液の一部をRK-13細胞とVero E6細胞に接種・培養し、10,000PFU以上のウイルスを接種したときに、RK-13細胞にプラークを生じ、Vero E6細胞にMSP株由来のプラークを生じない各群の培養液を選択・回収する工程により調製される。マスターシード液を初代ウサギ腎細胞に接種するときは、通常、ウイルスの増殖培養に用いられるウイルス感染価MOI=0.001〜0.3が使用される。好ましくは、MOI=0.003〜0.01の範囲である。マスターシード液中に、既にMSP株が混在する場合は、MSP株が混入しない範囲のMOIを使用するのが好ましい。例えば、マスターシードに10-5の割合でMSP株が混在するときは、培養容器に接種されるLC16m8株のウイルス量が理論上105PFUより少なくなるように調節される。実際には、混在するMSP株の含有量により、細胞数を上げるまたは接種MOIを下げる方法が取られる。【００２１】
ウサギ腎初代細胞浮遊液を培養容器（プレート、フラスコ、ローラーボトル等）に蒔くときは、1×105〜1×109個、好ましくは、約3〜6×106個の細胞が使用される。適当数の群（1〜n）は、ワクチン原液の製造スケールにより決定される。【００２２】
より具体的には、以下の方法が取られる。増殖培地に調製した初代ウサギ腎細胞浮遊液を適当数の培養容器に蒔き、細胞が単一のシートを形成するまで培養する。これに維持培地で希釈したマスターウイルスシードを接種し、細胞変性効果が十分に見られるまで培養を行った後、凍結融解を行う。各群の培養容器からウイルス液を少量採取し、MSP株の検出試験を行う。各群の培養容器は、検出試験の結果が出るまで-80℃で凍結保管される。【００２３】
MSP株の検出試験には、アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞（Vero細胞）とウサギ腎臓由来の株化細胞（RK-13細胞）が使用される。LC16m8株は、RK-13細胞で小型のプラークを形成するが、Vero細胞では極針状のプラークしか形成しない。一方、LC16m8株のリバータント（MSP株）は、Vero細胞及びRK-13細胞で中間サイズのプラーク（MSP）を形成する。MSP株の検出はこの性質を利用して行なわれる。1%非働化FBSを含むMEM培地で適当に希釈した各群のウイルス液をモノシート状のVero細胞及びRK-13細胞に接種した後、5%非働化FBS及び0.6%アガロースを含むMEM培地を重層し培養する。各群の培養液は、プラークアッセイに好ましいウイルス量となるように、10〜5,000倍、好ましくは、100〜2,000倍に希釈される。RK-13細胞を用いて全ウイルス量を求める場合は、1,000〜100,000倍に希釈される。10,000PFU以上のウイルスを接種したときに、RK-13細胞にプラークを生じ、Vero細胞でMSP株由来のプラークを形成しなかった各群の培養液を回収する。各群のウイルス液について、Vero細胞とRK-13細胞にそれぞれに出現したプラーク数から全ウイルス量に対するMSP株の含有率が算出され、適切な力価を有し、且つMSP株の含有率を低減した培養液が選択される。MSP株の全ウイルスに対する含有率が、0.015％以下、好ましくは、0.01％以下のウイルス液がワーキングシードとしてワクチン原液の製造のために使用される。ワーキングシードとして選択された各群のウイルス液は、培養スケールに応じてプールされることもある。【００２４】
こうして得られたワーキングシードがワクチン原液の製造に使用される。細胞を増殖させる方法として、静置培養法、ローラーボトル培養法、浮遊培養法などが知られている。浮遊培養法には、細胞を付着させるためのマイクロキャリアーが使用されることもある。マイクロキャリアーは、サイズ、形状、密度、表面荷電及び表面コート材質などタイプの異なる種々のマイクロビーズが市販されているので、この中から適宜選択して用いれば良い。例えば、サイトデックス、バイオシロン（ナルジェヌンクインターナショナル）、CELLYARD（ペンタックス社）などのマイクロビーズが挙げられるが、細胞の種類や使用条件に合わせて使用すればよい。サイトデックス（CytodexI，アマシャムバイオサイエンス社）の場合、その使用量は、培養液1Lあたり、1〜10g、好ましくは、3〜5gである。【００２５】
細胞へのウイルス接種は、MOI=0.001〜5の範囲で可能であるが、MOI=0.1〜1で接種するのが好ましい。細胞及びウイルスを増殖させる際の培養温度及び培養期間は、細胞の種類、ウイルス接種量、培養スケール・方法等の組合せにより調節される。例えば、ローラーボトル法により、ウサギ腎初代細胞で上記のワーキングシードを用いる場合は以下の方法が取られる。【００２６】
増殖培地中に懸濁したウサギ腎初代細胞浮遊液を、1〜2×108個／ローラーボトルで蒔き、37℃、4〜6日間培養する。細胞がモノシートを形成していることを確認した後に培地を吸引除去し、細胞をPBS/ESで洗浄する。これに維持培地で適当な濃度に希釈したウイルス液（MOI=0.1〜1）を加える。ウイルスが十分に吸着するまで30℃、セルローラー上に1〜2時間放置する。その後、維持培地を追加し、30℃で培養を行う。細胞変性効果が十分に確認されるまで培養を行う。ついで、ローラボトルを激しく振とうすることにより、ウイルス感染細胞をローラボトルから剥がし、これを回収する。低速遠心（1,000〜3,000rpm、15〜30分間）または連続遠心（12,000rpm、100〜700mL/分）により細胞と培養液を分離後、上清の約9割を吸引により除去し、ピペッティングにより細胞沈査を浮遊させる。これを超音波破砕機にかけるかまたは凍結融解により細胞を破壊した後、遠心分離（1,000〜3,000rpm、15〜30分間）により細胞と上清を分離し、上清を回収しウイルス液とする。該ウイルス液を用いて上記と同様に培養を繰り返すことができる。こうして得られるウイルス液は、ワクチン原液として使用される。このワクチン原液に、ポリソルベート80、ペプトン、アミノ酸及びソルビトール、ラクトースやスクロース等の糖等の安定剤を適宜選択して添加することにより製剤化が行われる。また、賦形剤としての効果を有するソルビトール、ラクトース、スクロース等の糖を添加した場合、凍結乾燥製剤として製剤化することも可能である。本発明の痘瘡生ワクチンでは、ワクチン原液に安定剤としてペプトン、ソルビトールを添加して最終バルクを調製する。洗浄及び乾熱滅菌した無色ガラスバイアル、好ましくは容量2mLの無色ガラスバイアルに、最終バルクを、好ましくは容量2mLのバイアルの場合は0.5mLを充填し、凍結乾燥することにより小分製品が作られる。このようにして得られる本発明のワクチンは、リバータント（MSP株）の含有率が3％以下であり、より安全なワクチンとして使用することができる。【００２７】
MSP株の安全性に対する影響は、皮膚増殖性実験や、小動物、例えば、マウスを用いた症状の変化を見ることにより調べることができる。皮膚増殖性実験には、感受性の強いウサギを用いるのが一般的である。生後12〜17週のウサギの背臀部を毛刈りし、適当に段階希釈したワクチン原液の一定量を皮内接種し、接種後2〜5日目に生じた発赤（発疹）の直径を測定する。陽性コントロールとして、LC16m8株の親株であるLO株、LC16m0株が用いられ、陰性コントロールには、ウイルスを含まない培地やPBSが用いられる。本発明においては、発赤径が10mm以上のものを陽性と判定し、各検体の50%発赤量(ErD50)をReed-Muench法（黒川正身 他 1978年 バイオアッセー 近代出版 p154〜p158）を用いて算出し、50%発赤量の比較により安全性が評価される。【００２８】
マウスを用いてMSP株の安全性に対する影響を評価する場合は、生後3〜5日齢のマウスを用いることができる。より具体的には、本発明で得たワクチン原液の一定量が、マウスの脳内に接種される。陽性コントロール及び陰性コントロールは、前記と同じものが使用される。接種後21日間生存の有無を観察し、観察21日目の生存率と平均生存日数（日）を算出し、その値を用いて評価される。【００２９】
また、生後5〜７週齢の免疫不全マウス（以下、「SCIDマウス」と称することもある）を使用することもできる。より具体的には、本発明で得たワクチン原液の一定量が、マウスの腹腔内に接種される。接種後25〜30日間、毛並や体重の変化、麻痺、発痘、行動異常、生存の有無を観察し、それぞれの症状をスコア化し、スコア値の合計からMSP株の安全性に対する影響が評価される。陽性コントロール及び陰性コントロールは、前記と同じものが使用される。
以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。【００３０】
参考例：継代によるリバータント（MSP株）出現の確認
（１）限界希釈法による分離の試み
初代ウサギ腎細胞をT25フラスコに単層になるように調製し、高度に希釈したマスターウイルスシードを接種し、30℃で培養した。十分なCPE（cytopathic effect）が確認されるまで培養を行い、-80℃で凍結した。凍結融解を3回繰り返した後、得られたウイルス液のMSP株の含量を測定した。MSP株の含量が検出限界を下回ったウイルス液について、さらに新しくT25に調製した初代ウサギ腎細胞に接種し、30℃で培養した。3日間培養を行い、十分なCPEが確認された後に-80℃で凍結した。凍結融解を3回繰り返した後、得られたウイルス液をさらに新しくT25に調製した初代ウサギ腎細胞に接種し、30℃で培養した。上記と同様の作業をさらに3回繰り返して、得られたウイルス液のMSP株の含量を測定した。その結果を表１に示す。この結果より、マスターウイルスシードから限界希釈法により得られたLC16m8株ウイルスは5代継代を行うことによりMSP株が検出限界よりも上回るものが出現することが確認された。【００３１】
【表１】
0005326155.tif 000002
【００３２】
（２）プラーククローニングによる分離の試み
初代ウサギ腎細胞を6ウェルプレートに単層になるように調製し、適度に希釈したマスターウイルスシードを接種し、30℃で培養した。MSPの見られないクローンを回収し、T25フラスコに調製した初代ウサギ腎細胞に接種し、30℃で培養した。3日間培養を行い、十分なCPEが確認された後に-80℃で凍結した。凍結融解を3回繰り返した後、得られたウイルス液をさらに新しくT25に調製した初代ウサギ腎細胞に接種し、30℃で培養した。上記と同様の作業をさらに4回繰り返して、得られたウイルス液のMSP株力価を測定した。その結果を表２に示す。この結果より、マスターウイルスシードからプラーククローニングにより得られたLC16m8株ウイルスは5代継代を行うことによりMSPが検出限界よりも上回るものが出現することが確認された。【００３３】
【表２】
0005326155.tif 000003
【実施例１】
【００３４】
1継代ワーキングシードの調製
（１）６ウェルプレートによる調製
7日齢のSPFウサギより無菌的に腎臓を取り出し、滅菌したPBS/2ESで洗浄後、細切してディスパーゼ液に入れた。4℃で撹拌させながら一晩消化させた後に再度PBS/2ESで洗浄した。遠心により細胞を回収し、増殖培地に浮遊させたものを初代ウサギ腎細胞浮遊液とした。これを24ウェルプレートに分注し、37℃で細胞が単一のシートを形成するまで培養した。マスターウイルスシードを維持培地で希釈し、各ウェルにMOI=0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001となるようにウイルスを接種した。30℃で培養を行い、細胞変性効果が十分に見られるまで培養を行った。その後、-80℃のフリーザーで凍結し、十分に凍結していることを確認した後に流水中で融解した。この凍結から融解までをさらに2回繰り返した。各ウェルからウイルス液を少量採取し、MSP株の検出試験に供試した。試験の結果が出るまで24ウェルプレートは再度-80℃フリーザーで凍結保管した。【００３５】
MSP株の検出試験は、まず6ウェルプレートにVero E6細胞のモノシートを形成させ、1×102、3×102、1×103に希釈した個別検体のウイルス液を接種し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で1時間吸着時間をおいた後に5%非働化FBS及び0.6%アガロースを含むMEMを重層し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で2日間培養した。さらに0.0025%ニュートラルレッド、1%非働化FBS及び0.6%アガロースを含むMEMを重層し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で一晩培養した。判定はプラークの数の有無により行った。いずれの希釈でもプラークの出現が見られなかった個別検体を低MSP株含有個別検体として選択した。その結果を表３に示す。選択された個別検体を融解後にプールし、1継代ワーキングシードとした。【００３６】
得られた1継代ワーキングシードの全ウイルス力価を、RK-13細胞を用いて求めた。6ウェルプレートにRK-13細胞のモノシートを形成させ、1×104、1×105、1×106に希釈した1継代ワーキングシードのウイルス液を接種し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で1時間吸着時間をおいた後に5%非働化FBS及び0.6%アガロースを含むMEMを重層し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で2日間培養した。さらに0.0025%ニュートラルレッド、1%非働化FBS及び0.6%アガロースを含むMEMを重層し、35℃の5%炭酸ガスフラン器で一晩培養した。プラークの数をカウントし、希釈倍数を考慮して、力価の値を算出した。MSP株の含有率は全ウイルス力価に対するMSP株力価の割合（%）で求めた。【００３７】
【表３】
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【００３８】
（２）T25フラスコによる調製
実施例１−（１）と同じ手法で初代ウサギ腎細胞浮遊液を調製した。これをT25フラスコに分注し、37℃で細胞が単一のシートを形成するまで培養した。マスターウイルスシードを維持培地で希釈し、各フラスコにMOI=0.01、0.003となるようにウイルスを接種した。30℃で培養を行い、細胞変性効果が十分に見られるまで培養を行った。その後、-80℃のフリーザーで凍結し、十分に凍結していることを確認した後に流水中で融解した。この凍結から融解までをさらに2回繰り返した。各フラスコからウイルス液を少量採取し、MSP検出試験に供試した。試験の結果が出るまでT25フラスコは再度-80℃フリーザーで凍結保管した。【００３９】
実施例１−（１）と同じ手法でMSP株の検出試験を行い、いずれの希釈でもプラークの出現が見られなかった個別検体を低MSP株含有個別検体として選択した。選択された個別検体を融解後にプールし、遠心分離により上清を回収したものを1継代ワーキングシードとした。得られた1継代ワーキングシードの全ウイルス力価、及びMSP株の含有率を実施例１−（１）と同様にして求めた。その結果を表４に示す。【００４０】
【表４】
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【実施例２】
【００４１】
2継代ワーキングシードの調製
（１）T150フラスコによる調製
実施例１−（１）と同じ手法で得た初代ウサギ腎細胞浮遊液をT150フラスコに蒔き、37℃で4日間培養した。細胞がモノシートを形成していることを確認後に増殖培地を吸引除去し、PBS/ESで洗浄後、これに、実施例１−（１）で得られた1継代ワーキングシードを維持培地でMOI=0.1、0.3、1.0となるように希釈し加えた。ウイルスが十分に吸着するまで1〜2時間30℃で培養を行った。その後、維持培地を追加し、30℃で細胞変性効果が十分に確認されるまで培養（3日間）を行った。【００４２】
容器を激しく振とうすることにより、ウイルスに感染した細胞を容器から剥がし、これを回収した。遠心分離（1,200rpm、15分間）によりいったん上清を取り除き、約10分の1の上清を戻して細胞沈査を再浮遊させた。その後、-80℃のフリーザーで凍結し、十分に凍結していることを確認した後に流水中で融解した。この凍結から融解までをさらに2回繰り返した。融解後、遠心分離により上清を回収したものを2継代ワーキングシードとした。このときのウイルス力価及びMSP株の含有率を表５に示す。【００４３】
【表５】
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【００４４】
（２）ローラーボトルによる調製
実施例１−（１）と同じ手法で得た初代ウサギ腎細胞浮遊液をローラーボトルに蒔き、37℃で5日間培養した。細胞がモノシートを形成していることを確認後に増殖培地を吸引除去し、PBS/ESで洗浄後、これに、実施例１−（２）で得られた1継代ワーキングシードを維持培地でMOI=0.1、0.3、1.0となるように希釈し加えた。ウイルスが十分に吸着するまで1〜2時間30℃で培養を行った。その後、維持培地を追加し、30℃で細胞変性効果が十分に確認されるまで培養（3日間）を行った。【００４５】
容器を激しく振とうすることにより、ウイルスに感染した細胞を容器から剥がし、これ  【００４６】
を回収した。遠心分離（3,000rpm、15分間）によりいったん上清を取り除き、約10分の1の上清を戻して細胞沈査を再浮遊させた。その後、-80℃のフリーザーで凍結し、十分に凍結していることを確認した後に流水中で融解した。この凍結から融解までをさらに2回繰り返した。融解後、遠心分離により上清を回収したものを2継代ワーキングシードとした。このときのウイルス力価及びMSP株の含有率を表６に示す。【００４７】
【表６】
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【実施例３】
【００４８】
ワクチン原液の調製
実施例１−（１）と同じ手法で得た初代ウサギ腎細胞浮遊液をローラーボトルに蒔き、37℃で5日間培養した。細胞がモノシートを形成していることを確認後に増殖培地を吸引除去し、PBS/ESで洗浄後、これに、実施例２−（１）または実施例２−（２）で得られた2継代ワーキングシードを維持培地でMOI=0.1、0.3、1.0となるように希釈し加えた。ウイルスが十分に吸着するまで1〜2時間30℃で培養を行った。その後、維持培地を追加し、30℃で細胞変性効果が十分に確認されるまで培養（3日間）を行った。【００４９】
容器を激しく振とうすることにより、ウイルスに感染した細胞を容器から剥がし、これを回収した。遠心分離（3,000rpm、15分間）によりいったん上清を取り除き、約10分の1の上清を戻して細胞沈査を再浮遊させた。その後、-80℃のフリーザーで凍結し、十分に凍結していることを確認した後に流水中で融解した。この凍結から融解までをさらに2回繰り返した。融解後、遠心分離により上清を回収したものをワクチン原液とした。このときのウイルス力価及びMSP株の含有率を表７に示す。【００５０】
【表７】
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【実施例４】
【００５１】
MSP株の安全性に対する影響
（１）ウサギ皮膚増殖性実験
生後13週（体重2.5〜3.1kg）のウサギ（日本白色種（JW）、雄）の背臀部を毛刈りし、1×102、1×103、1×104、1×105PFU/mLとなるように維持培地で10倍段階希釈した実験検体（MSP含量：0.001%、0.3%、2.1%、3.2%、10.8%）を0.1mLずつを皮内接種した。接種は、各希釈倍率のウイルス液につき2箇所/ウサギで3羽ずつ行った。接種後3日目に生じた発赤（発疹）の直径を測定し、発赤径が10mm以上のものを陽性と判定した。各検体の50%発赤量(ErD50)を、Reed-Muench法を用いて算出した。その結果を表８に示す。ErD50値（ErD50=10n）においてSavege検定（順位検定）を用いて解析を行った。その結果、0.001〜3.2％MSP株含有ウイルス液間では有意な差は認められなかった。【００５２】
【表８】
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【００５３】
（２）SCIDマウス接種実験
生後6週齢のSCIDマウス（雌、C.B-17/Icr Crj-scid/scid）を1群5匹として、維持培地で希釈して107.3 PFU/mLまたは105.6 PFU/mLに調製した実験検体（MSP含量：0.009%、3.2%、10.8%）を0.5mLずつ腹腔内接種した。接種後28日間観察し、観察28日目における生存率及び平均生存期間（日）を算出した。観察期間中、表９に示すスコア基準を用いて各個体の症状を評価し、各観察日における検体接種群毎のスコア合計を算出した。また、観察6日目から3日（一部4日）間隔で体重測定し、各測定日の検体接種群毎の体重平均を算出し、測定開始日（観察6日目）の平均値を基準とする変化率を算出した。その結果を図２及び図３に示す。【００５４】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、リバータント含有率を低下させた、より安全な痘瘡生ワクチンを製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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