(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応槽と、
（ａ）遺伝子多型の第１のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第１のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）前記遺伝子多型の第２のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第２のオリゴヌクレオチド、並びに
（ｃ）第３のオリゴヌクレオチド
を含み、前記複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されているプローブ溶液
とを備える遺伝子多型判定チップと、
核酸、Flapエンドヌクレアーゼ、及び前記プローブ溶液を混合する混合装置と、
前記濃度毎に、前記核酸にハイブリダイズした前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の計測値と、前記核酸にハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の計測値とを測定する計測装置と、
前記濃度毎における前記第１及び第２の計測値から、前記核酸の接合型を判定する判定装置
とを備え、ここで、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれのハイブリダイズ領域の最も5’側が、標的配列の遺伝子多型部位の塩基と相補的であり、それぞれのフラップ領域はハイブリダイズ領域の最も5’側に隣接しており、前記第３のオリゴヌクレオチドは、標的配列の遺伝子多型部位から3’側の塩基と相補的である、
遺伝子多型判定システム。
【請求項２】
前記濃度毎における前記接合型の判定結果がホモ接合体とヘテロ接合体に別れた場合に、前記判定装置が、前記濃度が低い方の前記判定結果を採用することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子多型判定システム。
【請求項３】
複数の反応槽と、
（ａ）遺伝子多型の第１のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第１のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）前記遺伝子多型の第２のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第２のオリゴヌクレオチド、並びに
（ｃ）第３のオリゴヌクレオチド
を含み、前記複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されているプローブ溶液
とを備え、ここで、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれのハイブリダイズ領域の最も5’側が、標的配列の遺伝子多型部位の塩基と相補的であり、それぞれのフラップ領域はハイブリダイズ領域の最も5’側に隣接しており、前記第３のオリゴヌクレオチドは、標的配列の遺伝子多型部位から3’側の塩基と相補的である、
遺伝子多型判定チップ。
【請求項４】
核酸を用意するステップと、
（ａ）遺伝子多型の第１のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第１のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）前記遺伝子多型の第２のアレルを有する標的配列と相補的なハイブリダイズ領域及び標的配列と相補的でないフラップ領域を有する第２のオリゴヌクレオチド、並びに
（ｃ）第３のオリゴヌクレオチド
を含むプローブ溶液
を用意するステップと、
前記核酸と、Flapエンドヌクレアーゼと、前記プローブ溶液とを、前記プローブ溶液の濃度を複数に振って反応させるステップと、
前記濃度毎に、前記核酸にハイブリダイズした前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の計測値と、前記核酸にハイブリダイズした前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の計測値とを測定するステップと、
前記濃度毎における前記第１及び第２の計測値から、前記核酸の接合型を判定するステップ
とを含み、ここで、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれのハイブリダイズ領域の最も5’側が、標的配列の遺伝子多型部位の塩基と相補的であり、それぞれのフラップ領域はハイブリダイズ領域の最も5’側に隣接しており、前記第３のオリゴヌクレオチドは、標的配列の遺伝子多型部位から3’側の塩基と相補的である、
遺伝子多型判定方法。
【請求項５】
前記判定するステップにおいて、前記濃度毎における前記接合型の判定結果がホモ接合体とヘテロ接合体に別れた場合に、前記濃度が低い方の前記判定結果を採用することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子多型判定方法。
【請求項６】
前記核酸をポリメラーゼ連鎖反応法で増幅するステップを更に含むことを特徴とする請求項４又は５に記載の遺伝子多型判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子の解析技術に関し、特に遺伝子多型判定システム、遺伝子多型判定チップ及び遺伝子多型判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の生命科学研究によって、デオキシリボ核酸(DNA)の塩基配列中の一塩基のみの変異が、疾患や薬物耐性等に個体差をもたらすことが明らかになった。この現象は一塩基多型（SNP : Single Nucleotide Polymorphism）と呼ばれている。一塩基多型の解明は個体毎に適した医療方法の提供を可能とする。そのため、一塩基多型の解析方法の研究が進められている（例えば、特許文献1参照。）。特に遺伝子多型検出法の一つとして、インベーダ法が知られている（例えば、特許文献2参照。）。また遺伝子多型判定のための反応基板と、反応基板を用いた遺伝子多型判定装置も知られている（例えば、特許文献3乃至5参照。）。しかし遺伝子多型の判定結果には誤判定が生じることもあるという問題があった。
【特許文献１】特開2002-300894号公報
【特許文献２】特表2005-160481号公報
【特許文献３】国際公開第2006/106867号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2006/104213号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2006/054690号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、遺伝子多型を高い精度で判定可能な遺伝子多型判定システム、遺伝子多型判定チップ及び遺伝子多型判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第1の特徴は、（イ）複数の反応槽と、複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されている、遺伝子多型の第1のアレルを有する標的配列と相補的な第1のオリゴヌクレオチド及び遺伝子多型の第2のアレルを有する標的配列と相補的な第2のオリゴヌクレオチドとを備える遺伝子多型判定チップと、（ロ）核酸、並びに第1及び第2のオリゴヌクレオチドを混合する混合装置と、（ハ）濃度毎に、核酸に結合した第1のオリゴヌクレオチドの第1の計測値と、核酸に結合した第2のオリゴヌクレオチドの第2の計測値とを測定する計測装置と、（ニ）濃度毎における第1及び第2の計測値から、核酸の接合型を判定する判定装置とを備える遺伝子多型判定システムであることを要旨とする。
【０００５】
本発明の第2の特徴は、（イ）複数の反応槽と、（ロ）複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されている、遺伝子多型の第1のアレルを有する標的配列と相補的な第1のオリゴヌクレオチドと、（ハ）複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されている、遺伝子多型の第2のアレルを有する標的配列と相補的な第2のオリゴヌクレオチドとを備える遺伝子多型判定チップであることを要旨とする。
【０００６】
本発明の第3の特徴は、（イ）核酸を用意するステップと、（ロ）遺伝子多型の第1のアレルを有する標的配列と相補的な第1のオリゴヌクレオチドを用意するステップと、（ハ）遺伝子多型の第2のアレルを有する標的配列と相補的な第2のオリゴヌクレオチドを用意するステップと、（ニ）核酸と、第1及び第2のオリゴヌクレオチドとを、第1及び第2のプローブの濃度を複数に振って反応させるステップと、（ホ）濃度毎に、核酸に結合した第1のオリゴヌクレオチドの第1の計測値と、核酸に結合した第2のオリゴヌクレオチドの第2の計測値とを測定するステップと、（ヘ）濃度毎における第1及び第2の計測値から、核酸の接合型を判定するステップとを含む遺伝子多型判定方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、遺伝子多型を高い精度で判定可能な遺伝子多型判定システム、遺伝子多型判定チップ及び遺伝子多型判定方法を提供可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【０００９】
UDPグルクロン酸転移酵素 (UGT : UDP-glucuronosyltransferase) は、薬物、異物あるいは内在性物質であるビリルビン、ステロイドホルモン、及び胆汁酸等にグルクロン酸を付加する反応を触媒する。UGTをコードするUGT1A1遺伝子には遺伝子多型が存在する。UGT1A1遺伝子のプロモータ領域にはチミン(T)とアデニン(A)の繰り返し配列があるが、TとAの繰り返しが6回であるTA6正常型が存在し、その他にTとAの繰り返しが7回であるUGT1A1*28アレルが存在する。UGT1A1のTAが6回繰り返されるTA6正常型アレルをホモ接合体で持つ患者に対し、UGT1A1*28アレルのホモ接合体を持つ患者のUGTの活性は低い。そのためUGT1A1*28アレルを持つ患者に抗ガン剤の塩酸イリノテカン（CPT-11）を投与すると、白血球減少や激しい下痢など重篤な副作用が生じやすい。またエクソン1の211番目のヌクレオチドがグアニン(G)からアデニン(A)になっているUGT1A1*6アレルを持つ患者においても、抗ガン剤の副作用が生じやすい。
【００１０】
したがってUGT1A1遺伝子の遺伝子多型を検査することは、抗ガン剤の副作用の予測や回避に重要である。UGT1A1遺伝子の遺伝子多型の検査方法として、インベーダ（登録商標）法がある。インベーダ法による遺伝子多型判定法は、特許文献1, 2等に詳細に開示されている。インベーダ法で判定対象の核酸にUGT1A1*28アレルの存在を検査する場合、図1に示すように、UGT1A1*28アレルを有する標的配列10と特異的に結合する配列を有するオリゴヌクレオチドであるUGT1A1*28アレルプローブ20と、インベーダプローブ30とを用意する。UGT1A1*28アレルプローブ20はUGT1A1*28アレルを有する標的配列10とハイブリダイズし、相補鎖を形成するハイブリダイズ領域121と、標的配列10とハイブリダイズしないフラップ領域122を含む。ハイブリダイズ領域121の最も5'側が、UGT1A1*28アレルを有する標的配列10のSNP部位の塩基と相補的である。
【００１１】
これに対し、インベーダプローブ30は、UGT1A1*28アレルを有する標的配列10のSNP部位から3'側に相補的にハイブリダイズする。そのため標的配列10のSNP部位において、標的配列10とUGT1A1*28アレルプローブ20の間に、インベーダプローブ30が侵入する。ここで、インベーダプローブ30に侵入されたUGT1A1*28アレルプローブ20の構造を認識し、フラップ領域122とハイブリダイズ領域121とを切断するクリベース（登録商標）という切断酵素(FEN-1: Flapエンドヌクレアーゼ）を添加すると、図2に示すように、フラップ領域122はUGT1A1*28アレルプローブ20からUGT1A1*28フラップ断片222として遊離する。
【００１２】
インベーダ法では、図3に示すUGT1A1*28フレットプローブ40をさらに用いる。UGT1A1*28フレットプローブ40は、5'末端から一定の領域が自己相補的なオリゴヌクレオチドである。またUGT1A1*28フレットプローブ40の5'末端の塩基は蛍光分子141で標識されている。蛍光分子141には、レドモンド・レッド(Redmond RED、登録商標）等が使用可能である。赤色に観察されるRedmond REDの最大励起波長は580nmであり、最大蛍光波長は605nmである。またUGT1A1*28フレットプローブ40の5'末端近傍の塩基には、励起エネルギー吸収剤等の抑制分子142が付加されている。近傍に抑制分子142が存在するため、蛍光分子141の蛍光は観察することができない。
【００１３】
UGT1A1*28フレットプローブ40の3'末端側は自己相補的ではなく、図2に示すUGT1A1*28フラップ断片222のオリゴヌクレオチド配列と相補的である。そのため図4に示すように、遊離していたUGT1A1*28フラップ断片222はUGT1A1*28フレットプローブ40と相補的に結合する。この際、UGT1A1*28フラップ断片222の3'末端がUGT1A1*28フレットプローブ40の自己相補鎖に侵入する。そこでクリベースはUGT1A1*28フラップ断片222に侵入されたUGT1A1*28フレットプローブ40の構造を認識し、UGT1A1*28フレットプローブ40の5'末端の塩基を切断する。そのため図5に示すようにUGT1A1*28フレットプローブ40から蛍光分子141が遊離し、抑制分子142の影響を受けなくなり、蛍光分子141の蛍光を観察することが可能となる。したがって蛍光分子141の蛍光が観察された場合、判定対象の核酸にUGT1A1*28アレルを有する標的配列10が存在していると判定することが可能となる。
【００１４】
さらにUGT1A1*28部位が正常型であるアレルを有する標的配列と特異的に結合する配列を有するUGT1A1TA6正常型アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブのフラップ断片と特異的に結合し、例えば蛍光分子としてRedmond REDとは異なるFAM（登録商標）で修飾されたUGT1A1TA6正常型フレットプローブを用意すれば、UGT1A1TA6正常型アレルの存在も確認することが可能となる。緑色に観察されるFAMの最大励起波長は494nmであり、最大蛍光波長は520nmである。
【００１５】
したがって、波長605nmの蛍光のみが観察された場合、判定対象の核酸のUGT1A1遺伝子はUGT1A1*28アレルのホモ接合体であり、(TA)7/(TA)7変異型(Mutant)と判定される。波長520nmの蛍光のみが観察された場合、判定対象の核酸のUGT1A1遺伝子はUGT1A1TA6正常型アレルのホモ接合体であり、(TA)6/(TA)6野生型(Wild)と判定される。波長520nmの蛍光と波長605nmの蛍光の両方が観察された場合、判定対象の核酸のUGT1A1遺伝子はUGT1A1TA6正常型アレルとUGT1A1*28アレルのヘテロ接合体であり、(TA)6/(TA)7ヘテロ型(Hetero)と判定される。
【００１６】
ここで実施の形態に係る遺伝子多型判定システムは、図6に示すように、複数の反応槽と、複数の反応槽のそれぞれに異なる濃度で保存されている、遺伝子多型の第1のアレルを有する標的配列と相補的な第1のプローブ及び遺伝子多型の第2のアレルを有する標的配列と相補的な第2のプローブとを備える遺伝子多型判定チップ100、判定対象のDNA、並びに第1及び第2のプローブを混合する混合装置68、濃度毎に、判定対象のDNAに結合した第1のプローブの第1の計測値と、判定対象のDNAに結合した第2のプローブの第2の計測値とを測定する計測装置64、及び濃度毎における第1及び第2の計測値から、判定対象のDNAの接合型を判定する判定装置69を備える。ここで第1のアレルと第2のアレルは、遺伝子多型部位にそれぞれ異なる塩基を有する。
【００１７】
遺伝子多型判定システムはステージ60をさらに備え、遺伝子多型判定チップ100はステージ60上に着脱可能に配置される。遺伝子多型判定チップ100は、上面図である図7、及び側面図である図8に示すように、複数の反応槽118a, 118b, 118c…が設けられた基板110を備える。基板110の材料には、例えばポリカーボネート等の低蛍光性透明樹脂が使用可能である。基板110の厚さは、例えば0.3〜4mm、あるいは1〜2mmである。
【００１８】
図7に示す複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれは、例えば基板に設けられた円形の凹部であり、直径は100μm〜2mm、深さは50μm〜1.5mmである。複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれには、例えばUGT1A1*28アレルを有する標的配列に特異的な第1のオリゴヌクレオチドとしてUGT1A1*28アレルプローブ、TA6回繰り返しの正常型アレルを有する標的配列に特異的な第2のオリゴヌクレオチドとしてTA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液が異なる濃度で保存されている。例えば反応槽118aに保存されたプローブ混合液中のUGT1A1*28アレルプローブ及びTA6正常型アレルプローブの濃度に対し、反応槽118bに保存されたプローブ混合液中のUGT1A1*28アレルプローブ及びUGT1A1TA6正常型アレルプローブのそれぞれの濃度は1/20である。さらに反応槽118aに保存されたプローブ混合液中のUGT1A1*28アレルプローブ及びTA6正常型アレルプローブの濃度に対し、反応槽118cに保存されたプローブ混合液中のUGT1A1*28アレルプローブ及びTA6正常型アレルプローブのそれぞれの濃度は1/50である。
【００１９】
図7及び図8に示すように、基板110にはサンプル槽112、試薬槽114、及びオイル槽116がさらに設けられている。サンプル槽112、試薬槽114、及びオイル槽116のそれぞれも、基板110に設けられた凹部である。サンプル槽112には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR: Polymerase Chain Reaction)で増幅されたDNAを含むサンプル溶液が注入される。試薬槽114にはクリベース、UGT1A1*28フレットプローブ、及びTA6正常型フレットプローブを含む10〜300μlの試薬溶液が保存されている。オイル槽116には、プローブ溶液、サンプル溶液及び試薬溶液のそれぞれよりも比重が軽いミネラルオイル等の不揮発性溶液が保存されている。オイル槽116の容量は、例えば20〜300μlである。
【００２０】
基板110上には、試薬槽114及びオイル槽116を覆うフィルム80が接着している。さらに基板110及びフィルム80上には、サンプル槽112及び複数の反応槽118a, 118b, 118c…を覆うシール82が剥離可能に接着している。フィルム80及びシール82のそれぞれには、アルミニウム箔、あるいはアルミニウム箔とポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムとの積層フィルム等が使用可能である。遺伝子多型判定チップ100が図6に示すステージ60に配置される前に、図9に示すように、フィルム80を残してシール82は基板110から剥がされる。また図10に示すように、例えばピペット26により、サンプル槽112に2〜20μlのサンプル溶液が注入される。
【００２１】
図6に示す遺伝子多型判定システムの混合装置68は、溶液の吸引、排出及び注入が可能である。混合装置68は駆動装置67に接続されており、遺伝子多型判定システムに配置された遺伝子多型判定チップ100上を移動可能である。混合装置68は図11に示すようにフィルム80を穿ち、試薬槽114から試薬溶液を吸引する。さらに混合装置68は吸引した試薬溶液をサンプル槽112に排出する。混合装置68は吸引と排出を繰り返し、サンプル槽112内で試薬溶液とサンプル溶液とを混合させる。さらに混合装置68は試薬溶液とサンプル溶液との混合液をサンプル槽112から吸引し、複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれに排出する。試薬溶液とサンプル溶液との混合液の排出量は例えば0.5〜4μlである。また混合装置68はフィルム80を穿ち、オイル槽116から不揮発性溶液を吸引する。混合装置68は、吸引した不揮発性溶液を、複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれに排出する。不揮発性溶液の排出量は、例えば0.5〜10μlである。複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれにおいては、試薬溶液、サンプル溶液、及びプローブ溶液の混合液が比重の軽い不揮発性溶液で覆われる。そのため、混合液の蒸発が防止される。
【００２２】
図6に示す遺伝子多型判定システムの計測装置64は、複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれにおける蛍光強度を計測する。計測装置64はステージ60の下方に配置される。計測装置64は、図12に示すように、遺伝子多型判定チップ100の下方から複数の反応槽118a, 118b, 118c…のいずれかに広波長帯域の励起光を発する光源92を備える。光源92上には、レンズ94, 96が配置されている。レンズ94は、光源92から発せられた励起光を平行光にする。レンズ96は、レンズ94を透過し平行光にされた励起光を複数の反応槽118a, 118b, 118c…のいずれかに集光する。ここでは、例えば反応槽118aに励起光が集光されたとする。
【００２３】
例えばサンプル溶液に含まれていたDNAが、UGT1A1*28アレルとTA6正常型アレルのヘテロ接合体であった場合、反応槽118a内でUGT1A1*28アレルプローブ（第1のプローブ）とUGT1A1TA6正常型アレルプローブ（第2のプローブ）の両方がDNAに結合し、結果としてFAMが波長520nmの蛍光を発し、Redmond REDが波長605nmの蛍光を発する。反応槽118a内で生じ、下方に進む蛍光は、レンズ96で平行光にされる。レンズ94, 96の間には、ダイクロイックミラー等のスプリッタ98が配置されている。スプリッタ98は光源92からの励起光を透過させ、遺伝子多型判定チップ100からの蛍光を、遺伝子多型判定チップ100と平行な方向に反射する。
【００２４】
スプリッタ98で反射された蛍光の進行方向には、ダイクロイックミラー等のスプリッタ50が配置されている。スプリッタ50は、例えば波長520nmの蛍光を遺伝子多型判定チップ100に対して垂直方向に反射し、波長605nmの蛍光を透過させる。スプリッタ50で反射された波長520nmの蛍光の進行方向には、レンズ52及びデテクタ54が配置されている。レンズ52は波長520nmの蛍光を集光し、デテクタ54は波長520nmの蛍光強度を、DNAに結合した第2のオリゴヌクレオチドの計測値として検出する。スプリッタ50を透過した波長605nmの蛍光の進行方向には、レンズ56及びデテクタ58が配置されている。レンズ56は波長605nmの蛍光を集光し、デテクタ58は波長605nmの蛍光強度を、DNAに結合した第1のオリゴヌクレオチドの計測値として検出する。計測装置64は、他の反応槽118b, 118c…のそれぞれについても、波長毎の蛍光強度を検出する。
【００２５】
判定装置69は計測装置64に接続されている。判定装置69は、計測装置64から複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれにおけるFAMの蛍光強度の計測値と、Redmond REDの蛍光強度の計測値を受信する。ここで、反応前後のFAMの蛍光強度の計測値の増加率がRedmond REDの蛍光強度の計測値の増加率よりも高い場合、判定装置69はDNAがUGT1A1TA6正常型アレルのホモ接合体であると判定する。Redmond REDの蛍光強度の計測値の増加率がFAMの蛍光強度の計測値の増加率よりも高い場合、判定装置69はDNAがUGT1A1*28アレルのホモ接合体であると判定する。Redmond REDの蛍光強度の計測値の増加率とFAMの蛍光強度の計測値の増加率が等しい場合、判定装置69はDNAがUGT1A1TA6正常型アレルとUGT1A1*28アレルのヘテロ接合体であると判定する。
【００２６】
さらに判定装置69は、検査対象のDNAが同一であるにもかかわらず、例えば反応槽118aではヘテロ接合体であると判定され、反応槽118bではホモ接合体であると判定された場合、プローブの濃度が高い反応槽118aでの判定結果は誤判定であると決定し、プローブの濃度が低い反応槽118bでの判定結果を採用する。
【００２７】
（第1の実施例）
次に図13に示すフローチャートを参照して、実施の形態の第1の実施例に係る遺伝子多型判定方法を説明する。
【００２８】
(a) ステップS101で、配列番号1の配列を有するDNA鎖を増幅するために、配列番号2の配列を有するオリゴヌクレオチドである*28アレル用フォワードプライマー、及び配列番号3の配列を有するオリゴヌクレオチドである*28アレル用リバースプライマーを用意した。また、配列番号4の配列を有するDNA鎖を増幅するために、配列番号5の配列を有するオリゴヌクレオチドである*6アレル用フォワードプライマー、及び配列番号6の配列を有するオリゴヌクレオチドである*6アレル用リバースプライマーも用意した。またPCRの鋳型DNAとして、米国コリエール医薬研究所（Coriell Institute for Medical Research）のDNAパネルからヒトのゲノムDNAであるPD3、PD5、PD66を入手した。
【００２９】
(b) ステップS102で、2μmol/lの*28アレル用フォワードプライマー、2μmol/lの*28アレル用リバースプライマー、2μmol/lの*6アレル用フォワードプライマー、2μmol/lの*6アレル用リバースプライマー、24μmol/lのdNTP、及び0.75U/10μlのNovaTaqを用い、マルチプレックスPCRによって、配列番号1の配列を有するDNA鎖と、配列番号4の配列を有するDNA鎖を鋳型DNAから増幅した。なお鋳型DNAの濃度は、3.5ng/μl、7ng/μl、35ng/μl、又は350ng/μlのいずれかとした。またPCRの反応条件は、95℃で5分間反応させた後、95℃で2秒間の反応、58℃で2秒間の反応、及び72℃で25秒間の反応を28回繰り返し、その後72℃で1分間反応させた。装置はアプライドバイオシステムズ社の9100サイクラーを用いた。
【００３０】
(c) ステップS103で、PCR反応で得られたPCR反応液の1/10をサンプル溶液として利用した。次にサードウェーブテクノロジーズ社製のUGT1A1*6アレルプローブ又はUGT1A1*28アレルプローブと、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ及びインベーダプローブを含むプローブ溶液を用いて、インベーダ法によりPD3、PD5、PD66の接合型を判定した。0.2mlの8連チューブを容器とし、装置は定量PCRシステム(MX-3000P、登録商標、ストラタジーン社）を用いて加温しながら測定した。具体的には、各チューブのウェル内に0.4μlのプローブ溶液、0.47μｌのフレットプローブ溶液、及び0.13μlのクリベース溶液とサンプル溶液を混合させ、総量が2μlとなるよう純水を添加した。また蒸発防止のため、5μlのミネラルオイルを滴下した。次に95℃で5分間加熱し、61℃で40分間放置した。その後、1分ごとにFAMとRedmond REDの蛍光強度を測定した。なおRedmond REDの測定には、MX-3000PのROX検出系を利用した。プローブ溶液の濃度はサードウェーブテクノロジーズ社のマニュアルに記載された推奨濃度と、推奨濃度の1/20の両方に設定され、試験は行われた。
【００３１】
図14乃至図17は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図14は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図15は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図16は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図17は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図14乃至図17のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりはRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりよりも遅く、PD3がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。
【００３２】
図18乃至図21は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図18は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図19は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図20は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図21は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図18乃至図21のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりはRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりよりも遅く、PD5がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。
【００３３】
図22乃至図25は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図22は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図23は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図24は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図25は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図22乃至図25のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりとRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりはほぼ等しく、PD66がヘテロ接合体であると判定可能である。
【００３４】
図14乃至図25に示した例においては、判定対象のDNAの濃度が変化しても、DNAがホモ接合体か、あるいはヘテロ接合体かを判定するアレルタイピングが可能である。しかし、判定対象のDNAの濃度が変化すると、インベーダ法によるアレルタイピングが困難となる場合がある。
【００３５】
図26乃至図29は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図26は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図27は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図28は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD3が含まれていた場合を示す。図29は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図29に示す場合において、FAMとRedmond REDの両方の蛍光強度の立ち上がりが早い。そのため実際にはPD3はホモ接合体であるにもかかわらず、図29の結果からはPD3はヘテロ接合体と誤判定されうる。
【００３６】
これに対し、図30、図31は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、PD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図30は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図31は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図29に示した場合とPD3の濃度は同じであるにもかかわらず、図31においては、FAMの蛍光強度の立ち上がりと比較してRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、PD3がFAMに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。よって、プローブ溶液の濃度が低い方である、図31に示した判定結果が採用される。
【００３７】
図32乃至図35は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液のプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図32は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図33は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図34は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図35は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図35に示す場合において、FAMとRedmond REDの両方の蛍光強度の立ち上がりが早い。そのため実際にはPD5はホモ接合体であるにもかかわらず、図35の結果からはPD5はヘテロ接合体と誤判定されうる。
【００３８】
これに対し、図36、図37は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、PD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図36は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図37は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図35に示した場合とPD5由来増幅DNA断片の濃度は同じであるにもかかわらず、図37においては、Redmond REDの蛍光強度の立ち上がりと比較してFAMの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、PD5がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。よって、プローブ溶液の濃度が低い方である、図37に示した判定結果が採用される。
【００３９】
図38乃至図41は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図38は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図39は、サンプル溶液中に7ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図40は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図41は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図38乃至図41のいずれにおいてもFAMとRedmond REDの蛍光強度はほぼ同時に立ち上がり、PD66がヘテロ接合体であることが判定可能である。
【００４０】
これに対し、図42、図43は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、PD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図42は、サンプル溶液中に35ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図43は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図42、図43に示すように、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20としても、FAMとRedmond REDの蛍光強度はほぼ同時に立ち上がり、なおPD66がヘテロ接合体であることが判定可能である。
【００４１】
インベーダ法では、判定対象のDNAに対して少なくとも2種類のプローブを競合的に反応させる。2種類のプローブのそれぞれと、判定対象のDNAとの融解温度(Tm)が異なる場合、判定対象のDNAと相補的な塩基配列を有するプローブのみがDNAとハイブリダイゼーションする。そのため、判定対象のDNAと相補的でない塩基配列を有するプローブがDNAとハイブリダイゼーションして、アレルタイピングに誤判定をもたらすことはない。しかし、2種類のプローブのそれぞれと、判定対象のDNAとの融解温度(Tm)が非常に近い場合は、判定対象のDNAと相補的でない塩基配列を有するプローブもDNAとハイブリダイゼーションする場合がある。そのため、アレルタイピングに誤判定をもたらす場合がある。
【００４２】
インベーダ法による判定対象のDNAの濃度は、必ずしも一定でない。鋳型DNAの採取量やPCR工程によって、通常、判定対象のDNAの濃度はばらつく。しかし従来においては、判定対象のDNAの濃度にかかわらず、プローブ溶液の濃度はマニュアル推奨値が一律に採用されていた。そのため、実際には判定対象のDNAがホモ接合体であるにもかかわらず、ヘテロ接合体と誤判定されることがあった。またPCR工程において、増幅されるDNAの濃度を常に一定に保つのは困難であった。
【００４３】
これに対し、実施の形態に係る遺伝子多型判定方法によれば、プローブ溶液の濃度を振ることにより、例えばある濃度のプローブ溶液を用いた場合にヘテロ接合型と判定された場合であっても、より低い濃度のプローブ溶液を用いた場合にホモ接合型と判定されれば、ヘテロ接合型との判定結果は誤判定であり、ホモ接合型との判定結果が正しい判定結果であると判断することが可能となる。また、ある濃度のプローブ溶液を用いた場合にヘテロ接合型と判定され、より低い濃度のプローブ溶液を用いた場合にもヘテロ接合型と判定されれば、ヘテロ接合型との判定結果は正しいと判断することが可能となる。したがって、実施の形態に係る遺伝子多型判定システム及び遺伝子多型判定方法によれば、判定対象のDNAの濃度がばらついても、正確にアレルタイピングをすることが可能となる。
【００４４】
（第2の実施例）
第1の実施例においては、PCRに用いた*28アレル用フォワードプライマー、*28アレル用リバースプライマー、*6アレル用フォワードプライマー、及び*6アレル用リバースプライマーのそれぞれの濃度は2μmol/lであった。これに対し、第2の実施例では濃度を5μmol/lとした。その他の条件は第1の実施例と同様にして、インベーダ法を実施した。
【００４５】
図44、図45は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図44は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図45は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図44、図45のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりはRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりよりも遅く、PD3がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。
【００４６】
図46、図47は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図46は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図47は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図46、図47のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりはRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりよりも遅く、PD5がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。
【００４７】
図48、図49は、UGT1A1*6アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、PD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図48は、サンプル溶液中に3.5ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図49は、サンプル溶液中に350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片が含まれていた場合を示す。図48、図49のいずれにおいても、FAMの蛍光強度の立ち上がりとRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりはほぼ等しく、PD66がヘテロ接合体であると判定可能である。
【００４８】
次に図50は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図50において、FAMとRedmond REDの両方の蛍光強度の立ち上がりが早い。そのため実際にはPD3はホモ接合体であるにもかかわらず、図50の結果からはPD3はヘテロ接合体と誤判定されうる。
【００４９】
これに対し図51は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。また図52は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/50の場合の、350ng/μlのPD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図50に示した場合とPD3由来増幅DNA断片の濃度は同じであるにもかかわらず、図51、図52においては、FAMの蛍光強度の立ち上がりと比較してRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、PD3がFAMに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。よって、プローブ溶液の濃度が低い方である、図52に示した判定結果が採用される。
【００５０】
次に図53は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図53において、FAMとRedmond REDの両方の蛍光強度の立ち上がりが早い。そのため実際にはPD5はホモ接合体であるにもかかわらず、図53の結果からはPD5はヘテロ接合体と誤判定されうる。
【００５１】
これに対し図54は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。また図55は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/50の場合の、350ng/μlのPD5由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図53に示した場合とPD5由来増幅DNA断片の濃度は同じであるにもかかわらず、図54、図55においては、Redmond REDの蛍光強度の立ち上がりと比較してFAMの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、PD5がRedmond REDに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。よって、プローブ溶液の濃度が低い方である、図55に示した判定結果が採用される。
【００５２】
図56は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図57は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合の、350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図58は、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/50の場合の、350ng/μlのPD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【００５３】
図56及び図57においては、FAMとRedmond REDの蛍光強度がほぼ同時に立ち上がり、PD66がヘテロ接合体であることが判定可能である。しかし、図58においては、FAMとRedmond REDの蛍光強度の上昇が遅く、蛍光強度の明確な立ち上がりが検出されないため、PD66のアレルタイピングができない。この場合、図56及び図57の結果を採用すればよい。
【００５４】
図59は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の場合の、3.5ng/μlのPD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図56と図59を比較すると、判定対象のDNAの濃度が低くなると、計測時における蛍光強度の上昇が遅くなることが分かる。
【００５５】
以上示したように、判定対象のDNAの濃度や、増幅前のプライマーの濃度によっても、インベーダ法で検出される蛍光分子の蛍光強度の時間変化は異なってくる。そのため、一定の値のプローブ溶液の濃度のみを用いると、アレルタイピングに誤判定をもたらす場合が生じる。しかし、プローブ溶液の濃度を振ることにより、判定対象のDNAの濃度や、増幅前のプライマーの濃度等が変化しても、正確なアレルタイピングをすることが可能となる。
【００５６】
（第3の実施例）
第1及び第2の実施例では、図13のステップS102における*28アレル用フォワードプライマー及び*28アレル用リバースプライマーのそれぞれの濃度が2μmol/lであった。またステップS103において、市販の定量PCRシステムを利用してインベーダ法が実施された。これに対し第3の実施例においては、ステップS102において*28アレル用フォワードプライマー及び*28アレル用リバースプライマーのそれぞれの濃度を5μmol/lとし、ステップS103において、図6乃至図12に示した本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定システムを用いて、インベーダ法を実施した。
【００５７】
図60乃至図62は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液を用いて、35ng/μlのPD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。なおPD3由来増幅DNA断片は、32サイクルのPCRで増幅された。図60はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/10の場合、図61はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合、図62はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/40の場合を示す。
【００５８】
図60に示す場合において、FAMとRedmond REDの両方の蛍光強度の立ち上がりが早い。そのため実際にはPD3はホモ接合体であるにもかかわらず、図60の結果からはPD3はヘテロ接合体と誤判定されうる。これに対し、図61及び図62においては、FAMの蛍光強度の立ち上がりと比較してRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、PD3がFAMに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。
【００５９】
図63乃至図64は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液を用いて、28サイクルのPCRで増幅された35ng/μlのPD3由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図63はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/10の場合、図64はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合、図65はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/40の場合を示す。
【００６０】
PCRのサイクル数が28回の場合、図63に示すように、プローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/10〜1/40のいずれであっても、PD3がFAMに対応するアレルのホモ接合体であると判定可能である。この場合、いずれの判定結果を採用してもよい。
【００６１】
図66乃至図68は、UGT1A1*28アレルプローブ、UGT1A1TA6正常型アレルプローブ、及びインベーダプローブを含むプローブ溶液を用いて、35ng/μlのPD66由来増幅DNA断片に対するインベーダ法で検出されたFAMとRedmond REDの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。なおPD66由来増幅DNA断片は、28サイクルのPCRで増幅された。図66はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/10の場合、図67はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合、図68はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/40の場合を示す。図66乃至図68のいずれにおいてもFAMとRedmond REDの蛍光強度はほぼ同時に立ち上がり、PD66がヘテロ接合体であることが判定可能である。この場合、いずれの判定結果を採用してもよい。
【００６２】
（第4の実施例）
図69乃至図71は、CYP2C9*3のヘテロサンプルに対するインベーダ法による解析結果を示す。なお図69はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/10の場合、図70はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/20の場合、図71はプローブ溶液の濃度がマニュアル推奨値の1/40の場合を示す。ヘテロサンプルであるにもかかわらず、図69及び図70においては、FAMの蛍光強度の立ち上がりと比較してRedmond REDの蛍光強度の立ち上がりが遅い。そのため、ホモ接合体と誤判定されうる。これに対し、図71においては、FAMとRedmond REDの蛍光強度はほぼ同時に立ち上がり、ヘテロ接合体であると判定可能である。よって、プローブ溶液の濃度が低い方である、図71に示した判定結果が採用される。
【００６３】
以上示したように、本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定システム及び方法を用いることにより、従来の方法では判定が困難であったSNPs部位の判定が可能となる。また従来の方法では判定が困難であった濃度やPCR増幅効率を有するサンプルのアレルタイピングも可能となる。
【００６４】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。例えば実施の形態において、図7に示す反応槽118bに保存されたプローブ溶液の濃度は反応槽118aの1/20であり、反応槽118cに保存されたプローブ溶液の濃度は反応槽118aの1/50であると説明した。しかし複数の反応槽118a, 118b, 118c…のそれぞれに保存されるプローブ溶液の濃度はこれに限定されない。例えばプローブの濃度は、2乃至10倍、あるいは10乃至100倍に段階希釈されてもよい。また上記の実施の形態においてはインベーダ法を例に説明したが、本発明の実施の形態はタックマンPCR法や、アレル特異的PCR法にも適用可能であることはいうまでもない。以上示したように、この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明からは妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【００６５】
（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号1乃至6は、以下の配列を示す。
【００６６】
［配列番号 : 1]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法で増幅されたDNAの塩基配列。
【００６７】
［配列番号 : 2]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法に用いたフォワードプライマーの塩基配列。
【００６８】
［配列番号 : 3]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法に用いたリバースプライマーの塩基配列。
【００６９】
［配列番号 : 4]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法で増幅されたDNAの塩基配列。
【００７０】
［配列番号 : 5]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法に用いたフォワードプライマーの塩基配列。
【００７１】
［配列番号 : 6]  第1の実施例に係るマルチプレックスPCR法に用いたリバースプライマーの塩基配列。
【００７２】
本明細書において塩基を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号、あるいは当該分野における慣用略号を用いる。以下に、略号の例を示す。
【００７３】
a : アデニン、t : チミン、g : グアニン、c : シトシン、u:ウラシル。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の実施の形態に係るインベーダ法の第１の模式図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るインベーダ法の第２の模式図である。
【図３】本発明の実施の形態に係るインベーダ法の第３の模式図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るインベーダ法の第４の模式図である。
【図５】本発明の実施の形態に係るインベーダ法の第５の模式図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定システムの第１の模式図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定チップの第１の上面図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定チップの第１の側面図である。
【図９】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定チップの第２の側面図である。
【図１０】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定チップの第２の上面図である。
【図１１】本発明の実施の形態に係る遺伝子多型判定チップの第３の側面図である。
【図１２】本発明の実施の形態に係る計測装置の模式図である。
【図１３】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法を示すフローチャートである。
【図１４】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１のグラフである。
【図１５】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２のグラフである。
【図１６】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第３のグラフである。
【図１７】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第４のグラフである。
【図１８】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第５のグラフである。
【図１９】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第６のグラフである。
【図２０】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第７のグラフである。
【図２１】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第８のグラフである。
【図２２】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第９のグラフである。
【図２３】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１０のグラフである。
【図２４】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１１のグラフである。
【図２５】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１２のグラフである。
【図２６】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１３のグラフである。
【図２７】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１４のグラフである。
【図２８】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１５のグラフである。
【図２９】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１６のグラフである。
【図３０】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１７のグラフである。
【図３１】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１８のグラフである。
【図３２】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１９のグラフである。
【図３３】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２０のグラフである。
【図３４】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２１のグラフである。
【図３５】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２２のグラフである。
【図３６】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２３のグラフである。
【図３７】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２４のグラフである。
【図３８】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２５のグラフである。
【図３９】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２６のグラフである。
【図４０】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２７のグラフである。
【図４１】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２８のグラフである。
【図４２】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２９のグラフである。
【図４３】本発明の実施の形態の第１の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第３０のグラフである。
【図４４】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１のグラフである。
【図４５】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２のグラフである。
【図４６】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第３のグラフである。
【図４７】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第４のグラフである。
【図４８】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第５のグラフである。
【図４９】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第６のグラフである。
【図５０】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第７のグラフである。
【図５１】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第８のグラフである。
【図５２】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第９のグラフである。
【図５３】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１０のグラフである。
【図５４】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１１のグラフである。
【図５５】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１２のグラフである。
【図５６】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１３のグラフである。
【図５７】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１４のグラフである。
【図５８】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１５のグラフである。
【図５９】本発明の実施の形態の第２の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１６のグラフである。
【図６０】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１のグラフである。
【図６１】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２のグラフである。
【図６２】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第３のグラフである。
【図６３】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第４のグラフである。
【図６４】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第５のグラフである。
【図６５】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第６のグラフである。
【図６６】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第７のグラフである。
【図６７】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第８のグラフである。
【図６８】本発明の実施の形態の第３の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第９のグラフである。
【図６９】本発明の実施の形態の第４の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第１のグラフである。
【図７０】本発明の実施の形態の第４の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第２のグラフである。
【図７１】本発明の実施の形態の第４の実施例に係る遺伝子多型判定方法の判定結果を示す第３のグラフである。
【符号の説明】
【００７５】
10…標的配列
20…アレルプローブ
26…ピペット
30…インベーダプローブ
40…フレットプローブ
50, 98…スプリッタ
52, 56, 94, 96…レンズ
54, 58…デテクタ
60…ステージ
64…計測装置
67…駆動装置
68…混合装置
69…判定装置
80…フィルム
82…シール
92…光源
100…遺伝子多型判定チップ
110…基板
112…サンプル槽
114…試薬槽
116…オイル槽
118a, 118b, 118c…反応槽
121…ハイブリダイズ領域
122…フラップ領域
141…蛍光分子
142…抑制分子
222…フラップ断片
【図１】
0005309540.tif 000002
【図２】
0005309540.tif 000003
【図３】
0005309540.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005309540.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
0005309540.tif 000072
【配列表】
0005309540000001.app