(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流から、
E-Box配列又は１乃至２個の塩基が置換されたE-Box配列と、
６乃至７塩基からなるスペーサー配列と、
E-Box配列又は１乃至２個の塩基が置換されたE-Box配列と、
からなり、配列番号４、８、９又は１５のいずれか一の配列番号で表される塩基配列からなるプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターを少なくとも用いた、前記プロモーターと結合する結合分子の検出又は定量方法。
【請求項３】
請求項１記載のプロモーターを少なくとも用いた、前記プロモーターと結合する結合分子のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１記載のプロモーターを少なくとも用いた、前記プロモーターと前記分子との結合を阻害する結合阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１記載のプロモーターを少なくとも用いた、前記プロモーターと前記分子との結合を促進する結合促進物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子の新規プロモーターに関する。より詳しくは、概日転写活性を有する新規プロモーター、及び該プロモーターを用いた概日転写に関わる物質の検出、定量又はスクリーニング方法、並びに概日リズム調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子（時計遺伝子）を有し、近年では、該時計遺伝子の機能の研究がいたる所で行われている。
【０００３】
概日リズムは、光などの外界の環境に生体のリズムを同調させる入力機構と、生体を約２４時間のリズムに維持する時計発振機構と、時計発振に基づいて体内のホルモンの分泌や代謝などに概日リズムをつける出力機構とから構成されている。近年の研究からは、時計遺伝子がこれら３つの機構全てに関与することが明らかになってきた。
【０００４】
具体的な時計遺伝子としては、Per遺伝子（Per１、Per２、Per３）、Clock遺伝子、Bmal遺伝子（Bmal１、Bmal２、Bmal３）、Cry遺伝子（Cry１、Cry２）、Dec遺伝子（Dec１、Dec２）、Dbp遺伝子、E４Bp４遺伝子、Rev-erb遺伝子（Rev-erbα、Rev-erbβ）などが報告されている。
【０００５】
最近の研究では、時計遺伝子発現の概日リズムには、時計遺伝子のプロモーター上に存在するE-Box配列、PORE配列、DBPE配列などが重要であることが分かってきた（非特許文献１）。また、Per２遺伝子のプロモーター上に、E-Box配列と１個の塩基が置換された配列（以下「E-Box-like配列」と称する。）が発見され、E-Box-like配列も時計遺伝子発現の概日リズムに重要であることが報告された（非特許文献２）。
【０００６】
時計遺伝子発現の概日リズムは、上記の配列に、転写促進因子が結合し時計遺伝子の発現誘導が促進され、逆に、転写抑制因子の働きにより転写活性が抑制されるという一連の流れが繰り返されることにより、調整されると考えられている。
【０００７】
E-Box配列を例に挙げて説明すると、転写促進因子としてCLOCK及びBMALからなる複合体が、Cry遺伝子やPer遺伝子のプロモーター領域に存在するE-Box配列に結合して転写を促進する。そして、その翻訳産物であるCRYやPERが転写抑制因子となり、CLOCK及びBMALからなる複合体の転写促進活性を抑制し、転写を負に制御する。
【０００８】
近年、このようなメカニズムを利用した技術が開発されつつある。例えば、特許文献１には、DEC１及びDEC２を用いることを特徴とするＥボックス・エンハンサを通してCLOCKとBMAL１の誘発する転写活性化を制御する方法が、特許文献２には、RORα（retinoic acid binding-receptor alpha）を用いてBmal１の発現誘導を促進する方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２０４５０１号公報。
【特許文献２】特開２００６−２７３７６０号公報。
【非特許文献１】Yamamoto T, Nakahata Y, Soma H, Akashi M, Mamine T, Takumi T:Transcriptional oscillation of canonical clock genes in mouse peripheraltissues. BMC Mol Biol 2004, 5:18.
【非特許文献２】Yoo SH, Ko CH, Lowrey PL, Buhr ED, Song EJ, Chang S, Yoo OJ,Yamazaki S, Lee C, Takahashi JS: A noncanonical E-box enhancer drivesmouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102:2608-13.
【非特許文献３】Akashi M, Ichise T, Mamine T, Takumi T: Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol Biol Cell 2006, 17:555-65.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の通り、E-Box配列やE-Box-like配列のように、時計遺伝子発現の概日リズムに重要な配列はいくつか報告されている。しかし、上記非特許文献３に記載されているように、時計遺伝子発現の概日リズムには、上記の配列だけでなく、その下流領域に存在する配列も重要との見解も示されていることから、E-Box配列やE-Box-like配列のような単体配列と他の領域とが具体的にどのように関わっているかに関しては、まだまだ開発の途が残されている。
【００１１】
そこで、本発明では、E-Box配列やE-Box-like配列と他の領域とが、時計遺伝子発現の概日リズムに如何に関与しているかを解明することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、時計遺伝子発現の概日リズムのメカニズムについて研究を行ったところ、E-Box配列やE-Box-like配列単体では、時計遺伝子の発現量は概日リズムを示さないことが分かった（後述の実施例３参照）。そこで、更に研究を進めたところ、時計遺伝子発現の概日リズムには、E-Box配列やE-Box-like配列のみではなく、他の配列との組み合わせが重要であることを突き止めた。
【００１３】
本発明では、まず、上流から、E-Box配列又は１乃至２個の塩基が置換されたE-Box配列と、６乃至７塩基からなるスペーサー配列と、E-Box配列又は１乃至２個の塩基が置換されたE-Box配列と、からなるプロモーターを提供する。
前記プロモーターを少なくとも用いることにより、前記プロモーターと結合する結合分子を検出又は定量、若しくはスクリーニングすることができる。
また、前記プロモーターを少なくとも用いることにより、前記プロモーターと前記結合分子との結合を阻害する結合阻害物質、又は、前記プロモーターと前記結合分子との結合を促進する結合促進物質をスクリーニングすることができる。
本発明では、また、前記結合分子、前記結合阻害物質、前記結合促進物質の中から選択されるいずれか一の分子又は物質を少なくとも含有する概日リズム調整剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る新規プロモーターは、生体における概日リズムの更なる解明及び概日リズムの調整に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１６】
＜本発明に係るプロモーター＞
本発明に係るプロモーターについて、以下、図１を用いて説明する。図１は、本発明に係るプロモーターの構成例を示す模式図である。
【００１７】
図１に示す通り、本発明に係るプロモーター１は、上流から、E-Box配列又は１乃至２個の塩基が置換されたE-Box配列（以下「E-Box-like配列」と称する。）１１と、６乃至７塩基からなるスペーサー配列１２と、E-Box配列又はE-Box-like配列１１と、から構成される。
【００１８】
前記E-Box配列１１は、一般に塩基配列CANNTGで表され、例えば、代表的な時計遺伝子であるPer遺伝子のプロモーター領域には、塩基配列CACGTG（配列番号１）で表されるE-Box配列が存在する。
【００１９】
前記E-Box-like配列１１は、前記E-Box配列中１乃至２個の塩基が置換された配列であり、例えば、代表的な時計遺伝子であるPer遺伝子のプロモーター領域には、塩基配列TGTGTG（配列番号２）で表されるE-Box-like配列が存在する。
【００２０】
前記スペーサー配列１２は、６乃至７塩基からなる配列であれば、その塩基配列は特に限定されない。一例を挙げると、代表的な時計遺伝子であるPer遺伝子のプロモーター領域には、塩基配列CGCCCG（配列番号３）で表され、前記スペーサー配列１２となり得る配列が存在する。
【００２１】
本発明に係るプロモーター１は、概日転写活性を示す。本発明において「概日転写活性」とは、時計遺伝子の発現量を約２４時間のサイクルで変動させる機能をいう。従来、E-Box配列やE-Box-like配列が、時計遺伝子発現の概日リズムに重要であることまでは分かっていた。しかし、後述の実施例３に示す通り、本願発明者らは、E-Box配列やE-Box-like配列単体配列では、概日転写活性を示さないことを見出した。ところが、上流よりE-Box配列又はE-Box-like配列+６乃至７塩基からなるスペーサー+ E-Box配列又はE-Box-like配列と構成することにより、概日転写活性を示すことを突き止めた。
【００２２】
本発明に係るプロモーター１は、上流から、E-Box配列又はE-Box-like配列１１と、６乃至７塩基からなるスペーサー配列１２と、E-Box配列又はE-Box-like配列１１と、から構成されているプロモーター全てを包含する。具体例としては、配列番号４から１５までに示す配列からなるプロモーターを挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るプロモーター１は、上流から、E-Box配列又はE-Box-like配列１１と、６乃至７塩基からなるスペーサー配列１２と、E-Box配列又はE-Box-like配列１１と、から構成されていればよいが、該プロモーター１の最初と最後の３塩基がパリンドロームを形成する構成であると、概日転写活性がより強固となり、より好適である。
【００２４】
＜プロモーターの利用方法＞
本発明に係るプロモーターの利用方法について、以下、図２などを用いて説明する。
【００２５】
図２は、本発明に係るプロモーター１に結合する分子Ａを検出又は定量若しくはスクリーニングする方法の概略図である。
【００２６】
本発明に係るプロモーター１を用いれば、該プロモーター１と結合する分子Ａを検出又は定量若しくはスクリーニングすることができる。分子Ａの結合を検出する方法は、公知のあらゆる方法を用いることができる。一例としては、オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ（oligonucleotide pull-down assay）を用いることができる。
【００２７】
また、例えば、本発明に係るプロモーター１と被検分子Ａを含むサンプルを接触させ、時計遺伝子の発現を測定することで、分子Ａが転写因子となり得るか否かも検出することができる。
【００２８】
図２（II）に示す通り、例えば、本発明に係るプロモーター１に結合し転写を正に調節する分子Ａがサンプル中に含まれている場合には、時計遺伝子が発現する。この時計遺伝子の発現の有無を調べることで、転写因子となり得る分子Ａをスクリーニング等することができる。
【００２９】
時計遺伝子の発現の測定方法は、公知のあらゆる方法を用いることが可能である。一例を挙げると、ルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行うことで時計遺伝子の発現を確認することができる。
【００３０】
図３は、本発明に係るプロモーター１と分子Ａとの結合を阻害する結合阻害物質Ｂをスクリーニングする方法の概略図である。
【００３１】
本発明に係るプロモーター１を用いれば、該プロモーター１と分子Ａとの結合を阻害する結合阻害物質Ｂをスクリーニングすることができる。例えば、分子Ａと物質Ｂとをプロモーター１に接触させ、分子Ａとプロモーター１との結合の有無を確認することで、結合阻害物質となり得る物質Ｂをスクリーニングすることが可能である。分子Ａとプロモーター１との結合を検出する方法は、公知のあらゆる方法を用いることができる。一例としては、オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ（oligonucleotide pull-down assay）を用いることができる。
【００３２】
また、転写因子となる分子Ａと物質Ｂとをプロモーターに接触させ、時計遺伝子の発現を測定することで、物質Ｂが分子Ａの機能を阻害するか否かを検出することができる。例えば、分子Ａが転写を正に調節する因子である場合に、物質Ｂを接触させ、遺伝子の発現が測定できなければ、物質Ｂは分子Ａの機能を阻害することが分かる。従って、この方法を用いれば、物質Ｂのスクリーニングを行うことができる。
【００３３】
時計遺伝子の発現の測定方法は、公知のあらゆる方法を用いることが可能である。一例を挙げると、ルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行うことで時計遺伝子の発現を確認することができる。
【００３４】
図４は、本発明に係るプロモーター１と分子Ａとの結合を促進する結合促進物質Ｃをスクリーニングする方法の概略図である。
【００３５】
本発明に係るプロモーター１を用いれば、該プロモーター１と分子Ａとの結合を促進する結合促進物質Ｃをスクリーニングすることができる。例えば、分子Ａと物質Ｃとをプロモーター１に接触させ、分子Ａとプロモーター１との結合の有無を確認することで、結合促進物質となり得る物質Ｃをスクリーニングすることが可能である。分子Ａとプロモーター１との結合を検出する方法は、公知のあらゆる方法を用いることができる。一例としては、オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ（oligonucleotide pull-down assay）を用いることができる。
【００３６】
また、転写因子となる分子Ａと物質Ｃとをプロモーターに接触させ、時計遺伝子の発現を測定することで、物質Ｃが分子Ａの転写調節機能を促進するか否かを検出することができる。
【００３７】
図４（II）に示す通り、例えば、分子Ａが通常は転写調節因子となり得ないが、物質Ｃを接触させた時にのみ、プロモーター１に結合し、時計遺伝子を発現させる場合は、物質Ｃは、分子Ａの転写調節機能を正に促進することが分かる。
【００３８】
時計遺伝子の発現の測定方法は、公知のあらゆる方法を用いることが可能である。一例を挙げると、ルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行うことで時計遺伝子の発現を確認することができる。
【００３９】
図５は、本発明に係るプロモーター１を利用した、図２から４とは別の実施形態に係る方法を示す概略図である。
【００４０】
図５（Ｉ）に示すように、符号Ａ１とＡ２で示す分子は、それぞれ単独では、プロモーター１に結合しない分子である。しかし、図５（II）に示すように、分子Ａ１とＡ２が結合又は相互作用、若しくは複合体を形成することによりプロモーター１と結合する分子となる場合、分子Ａ１Ａ２のプロモーター１との結合の有無を検出することで、分子Ａ１又はＡ２自体、若しくはＡ１とＡ２の相互作用等を検出することができる。また、Ａ１又はＡ２が未知の物質である場合等には、Ａ１又はＡ２をスクリーニングすることも可能である。
【００４１】
更に、図５（III）に示すように、分子Ａ１とＡ２が通常は転写調節因子となり得ないが、分子Ａ１とＡ２が結合又は相互作用、若しくは複合体を形成することにより、プロモーター１に結合し、時計遺伝子を発現させる場合は、時計遺伝子の発現の有無を確認することにより、分子Ａ１又はＡ２の転写調節機能のメカニズムを解析し、Ａ１又はＡ２自体、若しくはＡ１とＡ２の相互作用等を検出することができる。
【００４２】
図６は、本発明に係るプロモーター１を利用した、図２から５とは別の実施形態に係る方法を示す概略図である。
【００４３】
図６（Ｉ）に示す通り、分子Ａは、物質Ｄと結合したままでは、プロモーター１に結合しない分子である。しかし、図６（II）に示す通り、分子Ａから物質Ｄが遊離することによりプロモーター１と結合する分子となる場合、分子Ａのプロモーター１との結合の有無を検出することで、分子Ａから物質Ｄが遊離したことを検出することができる。また、図示しないが、この方法により、分子Ａと物質Ｄとの結合を阻害する物質をスクリーニングすることも可能である。
【００４４】
更に、図６（III）に示すように、分子Ａは、物質Ｄと結合したままでは転写調節因子となり得ないが、分子Ａから物質Ｄが遊離することによりプロモーター１に結合し、時計遺伝子を発現させる場合は、時計遺伝子の発現の有無を確認することにより物質Ｄの機能を解析し、分子Ａから物質Ｄが遊離したことを検出することができる。また、前記と同様、図示しないが、分子Ａと物質Ｄとの結合を阻害する物質をスクリーニングすることも可能である。
【００４５】
＜概日リズム調整剤＞
本発明に係るプロモーターを利用して検出、又は定量、若しくはスクリーニングした前記分子Ａ、Ａ１、Ａ２、物質Ｂ、Ｃ、Ｄ等を有効成分として薬剤に含有させれば、概日リズム調整を行うことが可能である。
【００４６】
本発明に係る概日リズム調整剤は、前記分子Ａ、Ａ１、Ａ２、物質Ｂ、Ｃ、Ｄ等を有効成分として少なくとも含有する薬剤全てを包含する。
【００４７】
本発明に係る概日リズム調整剤は、単独で用いることもでき、また既存のあらゆる薬剤等と併用することができる。更には、本発明の概日リズム調整作用を損なわない範囲において、既存のあらゆる薬剤等と合剤とすることもできる。
【００４８】
本発明に係る医薬品の剤型は特に限定されない。一例としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤等の経口剤、外用液剤、外用ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、点鼻液剤、坐剤等の外用剤、又は注射剤として用いることができる。
【００４９】
前記経口剤には、前記有効成分に加え、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
【００５０】
前記外用剤には、前記有効成分に加え、例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００５１】
前記注射剤には、前記有効成分に加え、例えば、溶剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、等張化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【実施例１】
【００５２】
実施例１では、時計遺伝子中に本発明に係るプロモーターが存在することを見出し、それぞれを比較した。時計遺伝子として、ヒト、サル、ラット、マウス、フクロネズミのPer１遺伝子、Per２遺伝子、及びPer３遺伝子を用いて行った。各遺伝子の塩基配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子データベースを用いて取得した。
【００５３】
NCBIの遺伝子データベースを用いて、上記遺伝子上流において、概日転写活性に重要と考えられているE-Box配列及びE-Box-like配列を検索した。検索の結果を図７に示す。
【００５４】
図７に示す通り、上記の全ての遺伝子において、Tss(transcriptional start site)近傍に、２つのE-Box配列又はE-Box-like配列が一定の間隔（６塩基）を開けて存在することが分かった。
【００５５】
また、上記E-Box配列又はE-Box-like配列（以下「E１配列」と称する。）+６塩基からなるスペーサー（以下「スペーサー配列」と称する。）+E-Box配列又はE-Box-like配列（以下「E２配列」と称する。）は、哺乳類の時計遺伝子Per１遺伝子、Per２遺伝子、及びPer３遺伝子間で保存されていることが分かった。
【実施例２】
【００５６】
実施例２では、本発明に係るプロモーターが概日転写活性を有するか否かの確認を行った。具体的には、実施例１で見出したヒトのPer１遺伝子、Per２遺伝子、及びPer３遺伝子上に見出した配列番号４、８、９に示す塩基配列からなるプロモーターを用いてルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行った。
【００５７】
ルシフェラーゼは、生物発光を触媒する酵素タンパク質である。例えば、所定の遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼをコードする遺伝子とを連結させた組換え遺伝子を作製し、その組換え遺伝子を培養細胞に組み込んだ場合、その遺伝子の発現が誘導されると、ルシフェラーゼが発現する。従って、ルシフェラーゼによる生物発光を測定し、ルシフェラーゼの発現レベルを取得することにより、その遺伝子の発現誘導レベルを推定することができる。
【００５８】
まず、プラスミドを以下の方法で構築した。配列番号４、８、９に示す塩基配列を用いて、ヒトPer１遺伝子、Per２遺伝子、及びPer３遺伝子二本鎖のオリゴヌクレオチドを合成した。そして、二本鎖オリゴヌクレオチドの各々のフラグメントを、制限酵素SacI及びNheIで消化したGL3ベクターに挿入した。また、このベクターのSV40プロモーター領域を制限酵素BglI及びNcoIを用いて消化した。更に、pGL3ベクターの持つマルチクローニングサイト内に、他の時計遺伝子CLOCK/BMAL1が結合する配列が存在する可能性を排除するために、マルチクローニングサイトも削除した。
【００５９】
次に、10%牛胎児血清を含むOpti-MEM倍地中（直径3.5 cm培養器）で1.0 x 105個のNIH3T3細胞培養し、LipofectAMINE plus試薬を用いて前記プラスミドを前記細胞に導入した。プラスミドを導入してから24時間後に、培地を、50%牛新生児血清、抗生物質を含むDMEM培地に交換し、L-グルタミン、ソディウムピルベートを加え、さらに2時間経過後、1%牛胎児血清、0.1mM ルシフェリン、10 mM HEPESを含むOpti-MEM培地に交換した。その後、蛍光の強度を測定した。
【００６０】
結果を図８から１０に示す。Per１遺伝子上に見出した配列番号４の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図８に、Per２遺伝子上に見出した配列番号８の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図９に、Per３遺伝子上に見出した配列番号９の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図１０にそれぞれ示す。各図中の符号NCはネガティブコントロールを示す。
【００６１】
図８から１０に示す通り、Per１遺伝子、Per２遺伝子、及びPer３遺伝子で異なる活性結果が得られた。Per２遺伝子が最も強い概日振動を示し、Per１遺伝子がもっとも弱い概日振動を示した。この結果は、プロモーター領域の長さと相関関係があると考えられる。
【００６２】
また、Per１遺伝子及びPer３遺伝子のE２配列のE-Box配列とのミスマッチの数は２であるところ、最も強い概日振動を示したPer２遺伝子のE２配列のE-Box配列とのミスマッチの数は１である。従って、概日振動の幅は、E２配列のE-Box配列とのミスマッチの数にも関与しているものと考えられる。
【００６３】
実際、Per３遺伝子上に見出したE２配列のうち最後の部分GAGをからGTGに変換した場合、即ちE２配列のE-Box配列とのミスマッチの数を２から１へ減少させた場合、野生型（GAG）よりも変異型（GTG）遺伝子の方が、高い概日振動を示すことも分かった（図１１参照）。図１１中符号WTは野生型を、符号mutは変異型を示す。
【００６４】
更に、Per１遺伝子、Per２遺伝子、Per３遺伝子、及びPer３遺伝子の変異型の概日振動の結果から、プロモーター配列の最初と最後の３塩基でパリンドロームを形成することが、概日転写活性をより強固にすることが示唆された。
【実施例３】
【００６５】
実施例３では、概日転写活性には、E１配列とE２配列のどちらが重要であるかを調べた。具体的には、Per２遺伝子上に見出したE１配列とE２配列それぞれについて変異型（mutant vector）を作成し、実施例２と同様の方法でルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行った。E１配列（CACGTT）にのみ変異を入れたものをE１ｍ（GCTAGG）、E２配列（TATGTG）にのみ変異を入れたものをE２ｍ（GCTAGG）、E１配列とE２配列の両方に変異を入れたものをE１ｍE２ｍとした。
【００６６】
結果を図１２から１４に示す。E１ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図１２に、E２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図１３に、E１ｍE２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図１４にそれぞれ示す。各図中符号WTは、野生型（変異を加えなかったもの）を示す。
【００６７】
図１２から１４に示す通り、E１ｍE２ｍだけではなく、E１ｍ及びE２ｍも、劇的に概日転写活性をほとんど示さなくなった。従って、概日転写活性には、E１配列とE２配列の両方が必要であることが分かった。
【実施例４】
【００６８】
実施例４では、本発明に係るプロモーターに公知の時計転写因子が結合するか、また、E１配列とE２配列のどちらに前記時計転写因子が結合するかを調べた。具体的には、BMAL１タンパク質、CLOCKタンパク質を用い、オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ（oligonucleotide pull-down assay）を行った。
【００６９】
本実施例で用いた各タンパク質に対する抗体は、以下の方法で用意した。ウサギBMAL１ポリクローナル抗体の抗原には、BMAL１(アミノ酸１から９９)アミノ基とGST融合タンパク質を用いた。抗血清はGST及びGST-BAML１カラムを通して精製した。また、BMAL１及びE4BP4抗体は、各々Tamaru T博士ら（Tamaru T, Isojima Y, van der Horst GT, Takei K, Nagai K, Takamatsu K: Nucleocytoplasmic shuttling and phosphorylation of BMAL1 are regulated by circadian clock in cultured fibroblasts. Genes Cells 2003, 8:973-83.）から提供をうけた。CLOCK抗体（S-19.sc-6927）はSanta Cruz Biotechnology, Inc.から購入した。
【００７０】
マウス肝臓抽出液を、４時間おきに氷冷PBSを用いてホモジェナイズし、そこへ、2 mM EDTA及び10ug/mlアプロチニン・ロイペプシン・ペプスタチン1mM PMSFをプロテアーゼ阻害剤として加えた。沈殿物を、低張緩衝液（50mMトリスpH7.4、２ｍM MgCl2、１ｍM DTT及びプロテアーゼ阻害剤）及び保温緩衝液（50mMトリスpH7.4、50mM NaCl、2mM EDTA、10%グリセロール、1% NP40、1mM DTT、100mM NaF、2mM Na3VO4、10mM Na4P2O7、プロテアーゼ阻害剤）を用いて保温した。遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、沈殿物は超音波で破砕した。さらに上清を遠心分離し、最初の上清と混ぜ、核抽出液を得た。
【００７１】
Per２遺伝子上に見出した配列番号８からなるオリゴヌクレオチド、及び、実施例３と同様に作成したE１ｍ、E２ｍ、E１ｍE２ｍをそれぞれビオチン化し、それぞれストレプトアビジンセファロースビーズに固定化した。前記で得た核抽出液とそれぞれのオリゴヌクレオチドが固定されたビーズとを共に４℃で１時間、保温した。保温緩衝液で洗浄した後、電気泳動を行い、イムノブロットした。
【００７２】
結果を図１５に示す。図１５中符号WTは本発明に係るプロモーター（配列番号８）を示す。
【００７３】
図１５に示す通り、本発明に係るプロモーター（配列番号８）には、 BMAL1及びCLOCKと一致するバンドが得られた（図１５中符号WT）。
【００７４】
また、BMAL1タンパク質及びCLOCKタンパク質は、変異型E1m及びダブル変異型E1mE2mでは、結合してくるタンパク質の量が劇的に減少するか、又は検出限界以下であった。一方、変異型E2mには、BMAL1タンパク質及びCLOCKタンパク質の結合が確認できた。従って、BMAL1タンパク質及びCLOCKタンパク質は、E１配列に結合することが分かった。
【００７５】
前記のように、変異型E2mを用いた場合、共沈するBMAL1タンパク質及びCLOCKタンパク質は、はっきりと検出された。これらの結果から、BMAL1タンパク質とCLOCKタンパク質の複合体がE1配列に結合し、E２配列には、BMAL1タンパク質及びCLOCKタンパク質の代わりとなるような未知の分子が結合することが示唆された。
【実施例５】
【００７６】
実施例５では、本発明に係るプロモーター中のスペーサー配列の長さが、概日転写活性に影響しているか否かを調べた。具体的には、Per２遺伝子上に見出した配列番号８からなるプロモーターのスペーサー配列の塩基数を４から８塩基に変化させ（図１６参照）、実施例２と同様の方法でルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行った。本発明に係るプロモーター（スペーサー配列：６塩基）を符号WTで示し、それぞれスペーサーの塩基数に応じて、符号sp４からsp８で示す。
【００７７】
結果を図１７から２０に示す。スペーサー塩基数を４とした場合の時計遺伝子の発現量を図１７に、スペーサー塩基数を５とした場合の時計遺伝子の発現量を図１８に、スペーサー塩基数を７とした場合の時計遺伝子の発現量を図１９に、スペーサー塩基数を８とした場合の時計遺伝子の発現量を図２０に、それぞれ示す。
【００７８】
図１９に示す通り、sp７を用いた場合、概日振動の幅は、本発明に係るプロモーター（配列番号８）を用いたときに比べて、わずかに減少したが、概日転写活性が確認できた。しかし、図１８及び図２０に示す通り、sp５及びsp８は概日振動がほとんどなく、図１７に示す通り、sp４は概日振動が全くなかった。
【００７９】
実施例５の結果より、スペーサー配列は概日リズムを生み出すために重要であり、また、その塩基数は、６乃至７塩基とする必要があることが分かった。
【実施例６】
【００８０】
実施例６では、本発明に係るプロモーターが、Per遺伝子以外の時計遺伝子上に存在するか否かを解析した。
【００８１】
まず、現在、概日発現が確認されている遺伝子をリストアップした。リストアップした１７２７遺伝子のうち、VISTAで配列を所得できた１５２２遺伝子の全てについて、網羅的に、E-Box配列又はE-Box-like配列+６乃至７塩基からなるスペーサー+E-Box配列又はE-Box-like配列の検索を行った。
【００８２】
本発明に係るプロモーター配列が一様にTss (transcriptional start site)近傍に位置していること、及び、検索を簡単にする目的から、上記の配列条件に加え、Tssからの１kbp以内の位置で検索した。
【００８３】
結果を図２１に示す。図２１に示す通り、２９遺伝子で３０個の本発明に係るプロモーター配列を発見した。この中には、Avp遺伝子、Dbp遺伝子、Tef遺伝子をはじめ、分子概日時計の中心的役割を担うNr1d1遺伝子も含まれていた。
【実施例７】
【００８４】
実施例７では、実施例６で検索した本発明に係るプロモーターが、実際に概日転写活性を示すか否かを確認した。具体的には、Dbp遺伝子上に見出した配列番号１５の塩基配列からなるプロモーターを用いて、実施例３、及び５と同様の方法で概日転写活性の有無を調べた。
【００８５】
まず、Dbp遺伝子上に見出したE１配列とE２配列それぞれについて変異型（mutant vector）を作成し、実施例２と同様の方法でルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行った。野生型をWT、E１配列（CACGAG）にのみ変異を入れたものをE１ｍ（GCTAGG）、E２配列（CATGTG）にのみ変異を入れたものをE２ｍ（GCTAGG）、E１配列とE２配列の両方に変異を入れたものをE１ｍE２ｍとした。
【００８６】
結果を図２２から２４に示す。E１ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図２２に、E２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図２３に、E１ｍE２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を図２４にそれぞれ示す。
【００８７】
図２２から２４に示す通り、野生型WTは概日転写活性を示すことが確認できたが、E１ｍ、E２ｍ、E１ｍE２ｍは、概日転写活性をほとんど示さなくなった。これは、実施例３と同様の結果である。従って、Dbp遺伝子上に見出した配列番号１５の塩基配列からなるプロモーターも、概日転写活性を示し、E１配列とE２配列のどちらも必須であることが分かった。
【００８８】
次に、Dbp遺伝子上に見出した配列番号１５からなるプロモーターのスペーサー配列の塩基数を４から８塩基に変化させ（図２５参照）、実施例２と同様の方法でルシフェラーゼアッセイ（IV-ROMS）を行った。本発明に係るプロモーター（スペーサー配列：６塩基）を符号WTで示し、それぞれスペーサーの塩基数に応じて、符号sp４からsp８で示す。
【００８９】
結果を図２６から２９に示す。スペーサー塩基数を４とした場合の時計遺伝子の発現量を図２６に、スペーサー塩基数を５とした場合の時計遺伝子の発現量を図２７に、スペーサー塩基数を７とした場合の時計遺伝子の発現量を図２８に、スペーサー塩基数を８とした場合の時計遺伝子の発現量を図２９に、それぞれ示す。
【００９０】
図２８に示す通り、sp７を用いた場合、概日振動の幅は、本発明に係るプロモーター（配列番号１５）を用いたときに比べて、わずかに減少したが、概日転写活性が確認できた。しかし、図２６、図２７及び図２９に示す通り、sp４、sp５、及びsp８は概日振動がほとんどなかった。この結果も実施例５と同様の結果である。
【００９１】
実施例７の結果より、実施例６で検索した本発明に係るプロモーターも、概日転写活性を示すことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明に係る新規プロモーターを利用すれば、生体における概日リズムの更なる解明及び概日リズムの調整に有効に利用することができる。また、概日リズム調整に有効な物質の探索、創薬等に貢献することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明に係るプロモーター１の構成例を示す模式図である。
【図２】本発明に係るプロモーター１に結合する分子Ａを検出又は定量若しくはスクリーニングする方法の概略図である。
【図３】本発明に係るプロモーター１と分子Ａとの結合を阻害する結合阻害物質Ｂをスクリーニングする方法の概略図である。
【図４】本発明に係るプロモーター１と分子Ａとの結合を促進する結合促進物質Ｃをスクリーニングする方法の概略図である。
【図５】本発明に係るプロモーター１を利用した、図２から４とは別の実施形態に係る方法を示す概略図である。
【図６】本発明に係るプロモーター１を利用した、図２から５とは別の実施形態に係る方法を示す概略図である。
【図７】実施例１で見出した本発明に係るプロモーターの塩基配列の例を示す図である。
【図８】実施例２において、Per１遺伝子上に見出した配列番号４の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図９】実施例２において、Per２遺伝子上に見出した配列番号８の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１０】実施例２において、Per３遺伝子上に見出した配列番号９の塩基配列からなるプロモーターを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１１】Per３遺伝子のE２配列のうち最後の部分GAGをからGTGに変換した場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１２】実施例３において、E１ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１３】実施例３において、E２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１４】実施例３において、E１ｍE２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１５】実施例４において、イムノブロットの結果を示す図面代用写真である。
【図１６】Per２遺伝子上に見出した配列番号８からなるプロモーターのスペーサー配列の塩基数を４から８塩基に変化させた様子を示す摸式図である。
【図１７】実施例５において、スペーサー塩基数を４とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１８】実施例５において、スペーサー塩基数を５とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図１９】実施例５において、スペーサー塩基数を７とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２０】実施例５において、スペーサー塩基数を８とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２１】実施例６において、Per遺伝子以外の時計遺伝子上に存在する本発明に係るプロモーターを検索した結果を示す図である。
【図２２】実施例７において、E１ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２３】実施例７において、E２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２４】実施例７において、E１ｍE２ｍを用いた場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２５】Dbp遺伝子上に見出した配列番号１５からなるプロモーターのスペーサー配列の塩基数を４から８塩基に変化させた様子を示す摸式図である。
【図２６】実施例７において、スペーサー塩基数を４とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２７】実施例７において、スペーサー塩基数を５とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２８】実施例７において、スペーサー塩基数を７とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【図２９】実施例７において、スペーサー塩基数を８とした場合の時計遺伝子の発現量を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００９４】
１  本発明に係るプロモーター
１１  E-Box配列又はE-Box-like配列（E１及びE2配列）
１２  ６乃至７塩基からなるスペーサー（スペーサー配列）
【図１】
0005205861.tif 000002
【図２】
0005205861.tif 000003
【図３】
0005205861.tif 000004
【図４】
0005205861.tif 000005
【図５】
0005205861.tif 000006
【図６】
0005205861.tif 000007
【図８】
0005205861.tif 000008
【図９】
0005205861.tif 000009
【図１０】
0005205861.tif 000010
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図７】
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【図１５】
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【配列表】
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