(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの凍結乾燥した抗原性成分および溶解助剤を含有してなる、安定な圧縮されたワクチン組成物であって、前記抗原性成分は生バクテリアまたは生ウイルスであり、前記溶解助剤は発泡剤であるワクチン組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記圧縮されたワクチン組成物は硬質錠剤の形態である組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、完全かつ迅速に水に溶解する組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、滅菌されている組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物であって、前記溶解助剤は一対の発泡剤である組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記凍結乾燥された成分は当該組成物の80重量％以下である組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記組成物は希釈剤と接触したときに80秒以内で完全に溶解することを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項７に記載のワクチン組成物であって、前記完全な溶解は、組成物に対する希釈剤の比率が、組成物200mg当り希釈剤0.5mL〜組成物400mg当り希釈剤100mLのときに生じる組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記組成物の安定性は、37℃で5日後の力価喪失が109.7EID50/mLと109.2EID50/mLの間の差以下であること、または4℃で9ヶ月後の力価喪失が109.7EID50/mLと109.3EID50/mLの間の差以下であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記抗原性成分は、使用前に凍結温度以下の乾燥窒素雰囲気下で維持された、予め力価測定された凍結乾燥物である組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、更に、抗原性成分の存在を示すインジケータを含有する組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のワクチン組成物であって、前記抗原性成分は、ニューカッスル病ウイルス、ニューカッスル病VH株、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス、家禽ポックスウイルス、喉頭気管炎ウイルス、鳥類の伝染性気管支炎ウイルス、ガンボロウインターフィールド病ウイルス、伝染性気管支炎（IB-H120）、ヒツジポックスウイルス、牛疫ウイルス、およびこれらの一以上の混合物からなる群から選ばれる生ウイルスであり、天然に存在するウイルス、組換えウイルスまたは修飾されたウイルスの何れかであるか；または、
前記抗原性成分は、炭疽芽胞、サルモネラSPP、大腸菌、およびこれらの一以上の混合物からなる群から選択され、天然に存在するもの、組換え体または修飾体の何れかであるか；または、
前記抗原性成分は生ウイルスであり、更に、前記組成物は、該ウイルスに対する中和抗体を含有する組成物。
【請求項１３】
疾患に対する保護を与えるための請求項１、３、７、８、または１２の何れか1項に記載のワクチン組成物の使用であって、希釈剤で溶解することにより、対象（ヒトを除く）を疾患に対して免疫感作するための溶液を形成する工程を含む使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、前記溶液は、注射、前記溶液から形成されたエアロゾル、点眼液の形態、または経口摂取により投与するために配合される使用。
【請求項１５】
請求項１３に記載の使用であって、前記溶液は、in-ovoで前記対象に投与するために配合される使用。
【請求項１６】
請求項１または１１に記載のワクチン組成物を含むパッケージ。
【請求項１７】
前記パッケージがブリスターパックおよび滅菌シリンジからなる群より選択される、請求項１６に記載のパッケージ。
【請求項１８】
真空または不活性ガスを充填したバイアルである、請求項１６に記載のパッケージ。
【請求項１９】
前記パッケージがサシェである、請求項１６に記載のパッケージ。
【請求項２０】
緻密化されたワクチン組成物を含む滅菌シリンジであって、前記ワクチン組成物は、請求項１〜１２の何れか1項に記載のワクチン組成物を含んでなる滅菌シリンジ。
【請求項２１】
以下の工程を含んでなるワクチン溶液の使用：
（a）疾患に対する保護を与えるためのワクチン組成物であって、少なくとも1の凍結乾燥された生バクテリアまたは生ウイルスである抗原性成分および溶解助剤としての発泡剤を含有する安定な圧縮されたワクチン組成物を、希釈剤で溶解して溶液を形成する工程と；
（b）得られた溶液を、前記疾患に対して哺乳動物（ヒトを除く）を免疫感作するのに有効な量で哺乳動物（ヒトを除く）に投与する工程。
【請求項２２】
請求項２１に記載の使用であって、前記哺乳動物は、ヒト、ウシ、およびヒツジからなる群より選択される使用。
【請求項２３】
少なくとも1の凍結乾燥された抗原性成分、第2の凍結乾燥された成分、および溶解助剤としての発泡剤を含有する安定な圧縮されたワクチン組成物であって、前記抗原性成分は生バクテリアまたは生ウイルスであり、前記第2の凍結乾燥された成分が前記凍結乾燥された抗原性成分に対する中和抗体を含有するワクチン組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の安定な圧縮されたワクチン組成物であって、
（a）少なくとも1の生バクテリアまたは生ウイルスである抗原性成分を凍結乾燥する工程と；
（b）前記抗原性成分に対する中和抗体を前記抗原性成分とは別々に凍結乾燥する工程と；
（c）凍結乾燥された抗原性成分および凍結乾燥された中和抗体のそれぞれの力価を測定する工程と；
（d）ステップ(c)で得られた力価に基づいて決定された割合で、前記凍結乾燥された抗原性成分と前記凍結乾燥された中和抗体とを混合する工程と；
（e）前記凍結乾燥された抗原性成分と前記凍結乾燥された中和抗体との混合物を、少なくとも1の溶解助剤としての発泡剤とともに圧縮することにより、安定な圧縮されたワクチン組成物を形成する工程とを含んでなる方法により製造されるワクチン組成物。
【請求項２５】
（a）少なくとも1の生バクテリアまたは生ウイルスである抗原性成分を凍結乾燥する工程と；
（b）前記抗原性成分に対する中和抗体を前記抗原性成分とは別々に凍結乾燥する工程と；
（c）凍結乾燥された抗原性成分および凍結乾燥された中和抗体のそれぞれの力価を測定する工程と；
（d）ステップ(c)で得られた力価に基づいて決定された割合で、前記凍結乾燥された抗原性成分と前記凍結乾燥された中和抗体とを混合する工程と；
（e）前記凍結乾燥された抗原性成分と前記凍結乾燥された中和抗体との混合物を、少なくとも1の溶解助剤としての発泡剤とともに圧縮することにより、安定な圧縮されたin-ovoのワクチン組成物を形成する工程と
により調製される、安定な圧縮されたワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本出願は１９９９年８月２４日に出願された米国仮出願番号第60/150.514号の一部継続出願であり、その優先権を主張するものである。上記出願の内容は、本明細書の一部をなすものとして本出願に援用する。
【０００２】  本出願を通して、多くの文献が著者およびその全引用によって同定される。従って、これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に詳述するために、本明細書の一部として本出願に援用する。
【発明の分野】
【０００３】  本発明は、一以上の凍結乾燥抗原性成分と可溶化手段を含有する緻密化された固形型の安定で圧縮された錠剤ワクチン組成物に関する。この安定で緻密化されたワクチン組成物は、その凍結乾燥成分のあらゆる長所、すなわち安定性および希釈に際しての完全迅速な溶解性を保持する。更に、本発明のワクチン組成物は、これまで知られていた凍結乾燥製剤の短所をまぬがれている。この安定なワクチン組成物を使ってワクチン溶液を作り、被験者（動物）を免疫する方法も提供される。
【発明の背景】
【０００４】  ワクチンのような溶液中の生物学的材料が熱、酸化剤、塩、ｐＨ、およびタンパク分解酵素などの様々な影響を受けやすいことはよく知られている。
【０００５】  一般的にも特異的にも、とりわけ貯蔵中のワクチンの安定性を改善することにおいて、こうした有害な影響を減らすためのいくつかの方法が知られている。例えば、0°C以下、−70°C程度での貯蔵はよく知られた方法である。それより低温、例えば液体窒素中において、生きた細胞を含む多くの生物学的材料が何年間も成功裡に保存できる。しかしながら、こうした方法は、たとえば放し飼いの家畜類の接種を含む状況においては常に便利であるわけではない。
【０００６】  凍結乾燥は、ワクチンとして使用するための生細胞や生ウイルスの保存法として知られるもう一つの方法である。
【０００７】  凍結乾燥では、生物学的材料を含有する溶液はまず凍結され、次いで、通常は高度真空と０°Ｃ以下の温度で昇華によって水分が蒸発される。これまでのアプローチは、ウイルスワクチンを形成するために凍結乾燥およびその他の技術を使用してきたが、安定な最終投与体を調製し投与する点では未だ困難性を示している。
【０００８】  例えば、米国特許第4,251,509号(HansonとAbegunde)は、乾燥状態で様々な家畜類に経口投与することを意図した特殊なウイルスワクチンを開示した。しかしながら、開示された投与体はペレットを作るためにペイストを濃縮したものであった。
【０００９】  その選択はウイルスに依存するが、熱安定性を促進するために抗酸化剤が要求される。こうした製品は調製がより複雑で、免疫前にワクチンを可溶化することが望まれるような状況にはとりわけ適しているとはいえない。
【００１０】  米国特許第3,458,621号と第3,608,030号(Tint)は、小腸管の免疫に経口投与の錠剤を調製するための凍結乾燥ウイルス製剤の使用を開示した。しかしながら、経口投与用のこの錠剤は、分解を遅らせるために腸溶性コーティングで調製された。In-vitro試験ではそれらはすぐには分解されず、刺激された小腸液中ではたった25分以内での分解が観察された。更に、刺激小腸液での分解時間が測定された結果、腸溶性コーティングの効果は減少していた。Tintは更に、圧縮コーティングと非圧縮コーティングを比較することによって示されたように、錠剤は圧縮コーティングされない限り、それらは力価を失うことを強調した。Tintは、非圧縮コーティングの錠剤は、全ての無抗体の個人に抗体反応を引き起こすことができないばかりか、それに加えて、力価上昇の大きさが有意に小さくなることに注目している（第４欄第４０行）。
【００１１】  R.P.Scherer社に譲渡されたPCT特許公報WO99/21579（Seagerら）は、ニューキャッスル病に対する家畜病治療用のワクチンのための、凍結乾燥され且つ緩く圧縮された急速拡散組成物を開示した。この投与形は、米国特許第4,371,516号(英国特許第1,548,022号の対応するもの)に引用された固形泡のように、圧縮形あるいは固形錠剤とは対照的に、「オープンマトリックスネットワーク（open matrix network）」として開示された。更に、このワクチンは経口投与が意図され、粘膜組織に留まるように仕組まれた。アジュバンドは、そこへの吸着のための十分な時間与えるように働く。開示されたワクチン製品は、後期免疫に必要な溶液投与の調製を提供しないし、溶液投与のための安定な定量的なワクチン液も、また後期投与を容易にする安定な圧縮または固形錠剤の凍結乾燥製剤も提供しない。
【００１２】  米国特許第5,587,180号(Allen, Jr.ら)は、急速に溶解する錠剤のための特殊な支持マトリックスを作製するプロセスを詳述した。このプロセスは、凍結乾燥とは全く異なるものを教示しており、標準的な噴霧乾燥技術を使用した。この特殊な支持マトリックスは口腔内に配置されたときの投与には適している。更に、液体投与形でワクチン溶液として適するなワクチン製品は提供されていない。
【００１３】  米国特許第5,336,666号(Newayら）は、液体として再構築されるような錠剤を形成する凍結乾燥液体ワクチンを発表した。しかしながら、このワクチンは特殊な微生物の極性糖ペプチドに限定されており、しかも完全迅速な溶解を提供しない。
【００１４】  生物学的材料の凍結乾燥は、安定なワクチン製剤をつくるための、この分野の熟練者には周知の凍結乾燥方法に従って遂行することができるが、凍結乾燥終了時点における生ウイルスの力価は、典型的には凍結乾燥過程前の溶液におけるそれとは同じではない。一般に、凍結乾燥されるまで溶液は不安定であるために、凍結乾燥前に力価測定を実行することは不可能である。それに加えて、凍結乾燥の過程において、力価は予測できない形で変化する。従って、経験に基づいて初期力価を評価することは、凍結乾燥後の滴定によってのみ有効となる。これらすべての結果として、限定された正確な目標力価を得ることは殆ど不可能である。その物質がすでにバイアル中に封入された形で凍結乾燥が実行されるとしたら、あるバッチを再利用することは典型的にはできず、幾つかの場合には、もし明細に達していなければバッチ全体を放棄しなければならない。
【００１５】  米国特許第5,897,852号(Wilderbekら)は、凍結乾燥ケーキの力価測定における弱点を補うために、「凍結乾燥顆粒(lyospheres)」を伴った異なる「凍結乾燥体(Freeze dried bodies)」を使用することによって、この問題を解決しようと試みた。しかしながら、各々の凍結乾燥顆粒はその固有の力価を持っているので、期待される力価に至るにはたくさんの検体の滴定が必要となる。目的とする力価を得るために混合検体を使用することに起因して、それは最良の場合でも近似に過ぎないので、この方法によっても正確さの要求される力価を得ることはできない。更に、凍結乾燥顆粒の製造は、ケーキや粉末を作るための溶液の直接的な凍結乾燥に比して相対的に困難である。加えて、乾燥後の凍結乾燥顆粒材料の粉砕を防ぐために、特殊なマトリックスがしばしば要求される。一般にこの方法では、それぞれが異なる力価、添加剤およびアジュバンドをもつ別々の溶液の調製が必要となる。この方法では、生ウイルスのバッチの力価がほとんど均一ではなく、バッチごとに変わっていること、および特に凍結機の冷プレートの領域でそうなっているといった問題は解決されない。したがって、バイアルごとに必要な凍結乾燥顆粒の数の決定は、常に近似値となる。
【００１６】  凍結乾燥は、一つ以上の抗原性成分を含有するワクチンに対しても有用である。たとえば、欧州特許第290197A号は凍結乾燥された４価のワクチンを開示している。この方法は４つの生ウイルスワクチン成分を混合し、凍結乾燥することを示している。
【００１７】  現在使われているワクチン調製のための凍結乾燥法の弱点は、そのプロセスが非常に複雑であり、多くの不定要因を持っているため、許容可能な製品と投与量の均一性を再現性を持って実行することを周知のごとく困難にしている。これは、多数ドースが一本のバイアル内で凍結乾燥でされる家畜用ワクチンにとっては特に問題となる。この問題は、ヒト用ワクチン製剤においてはあまり考えられないが、大量接種が必要とされるような、例えば軍隊での使用や汎流行性感染といった状況下では、家畜用と同様に予想される。たとえば、典型的な家禽用ワクチン接種のための一本のワクチンバイアルは、1000または2000ドースを含有し、そのように登録されている。凍結乾燥する前に、その材料の力価に関するおおよその評価がなされるが、力価は凍結乾燥中に予知不可能な形でしばしば減少するため、最終力価は凍結乾燥後にのみ決定される。更に、生きたウイルスまたは生きた細菌の原材料は、凍結乾燥の前には、正確な力価結果を得るために十分に長い期間、安定に保存することができない。
【００１８】  実際に、もともと2000ドース以上含有している容器が、凍結乾燥後には、しばしばたった1900ドースであったりする。その場合、それは典型的には他の公式の登録可能なドースに過ぎないから、そのバイアルは1000ドースバイアルとしてのみ市場に出される。こうした状況では４７％の材料損失が生じ、それに対応するコスト上昇が生じる。この問題は混合ワクチンの場合とも連係している。なぜなら、その場合にはバッチ全体を特徴付けるのに最低の力価を持つ成分のドースが使用されるからである。さらなる弱点として、2000の単一ドースを与えるものとして意図されたバイアルが、市場では1000ドースバイアルとして販売され、1000匹の動物の接種に使われた時に、そのように投与された動物は不必要に過剰曝露される。更に、凍結乾燥前に意図的にドース数を増加させることは、いくつかのワクチンバッチがより効果的に乾燥されるときには、満足な別法とはならない。その場合は、単にその物質（ワクチン製剤）を浪費することになる。
【００１９】  登録当局は現在、正しく規定された上限と下限のあいだの数値にワクチンの投与量が設定されるような登録システムに向かっているので、この問題の解決はますます重要になってきている。製造および凍結乾燥過程での多くの不定要因を仮定すれば、大量生産ベースでこの制限に合わせることは困難であろう。すでに示されたように、この問題は混合ワクチンが要求されるケースでは更に深刻となろう。
【００２０】  しかも、従来の凍結乾燥混合ワクチンのさらなる不都合な点は、多数の作製された混合物を保存しなければならないことにある。混合ワクチン中の多数の成分が典型的には凍結乾燥前に混合されることによって作られる。このように、たとえば２つの病気に対する単一／多成分ワクチンを完全な形で調製しようとすると、３つの異なる製品をストックする必要がある：即ち、（１）抗Ａワクチンを含有する製品（２）抗Ｂワクチンを含有する製品（３）抗Ａおよび抗Ｂワクチンを含有する製品である。３種の病気に対するワクチンのケースでは、７種の異なるワクチン／混合ワクチンを製造し、貯蔵する必要がある。４種の病気ではこの数値は１５種の異なるワクチン／混合ワクチンとなる。したがって、膨大な貯蔵能力を提供し維持することがしばしば必要となる。
【００２１】  米国特許第5,897,569号および第5,871,748号(Whitfillら)は、生きたワクチンウイルスおよびこれに結合した中和抗体を含有するワクチン複合体をin-ovoで投与することによって、鳥類におけるニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に対する能動免疫生じさせる方法を開示した。Whitfillは、中和抗体またはその断片に対するウイルスの比が、免疫が成功するかどうかを決定することを明示した。しかしながら、ＮＶＤに対して効果的に適用されるこうした方法では、鳥を殺すことなしに成功裡に免疫できるためには、狭い範囲の割合値が維持されねばならない。さらに、凍結乾燥されたＨＤＶ（他のウイルス製剤と同様に）を用いた力価の予想困難性は、Whitfillのような方法が容易にはＮＤＶには適用できないことを意味している。したがって、そのようなワクチンを調製するために、より正確な力価のＨＤＶおよび抗体を保証する方法が望まれている。
【００２２】  なお、これまでのワクチン処方および生産方法の別の不都合な点は、実際の凍結乾燥過程において、それがかなりのスペースをとることである。典型的には、最初にワクチンを凍結乾燥することは。可溶化したワクチンをガラスバイアルへ分注することが必要となる。次いで、そのバイアルはゴムストッパーで緩くキャップされ、凍結乾燥チャンバーまたはコンデンサー中のトレイに並べられる。溶解したワクチン材料を非常に小さな容量で高ドースに濃縮することは困難である。
【００２３】  その結果として、多数のワクチンドースのために凍結乾燥で典型的に使用されるバイアルは、常に比較的に大量の水分を含有している。効果的な凍結乾燥は、凍結乾燥される液体の大きな表面積が真空に露出されることを必要とする。したがって、凍結したペレットの表面だけが真空状態にさらされるので、ワクチンは底の広い比較的大きなガラス瓶またはバイアル中で凍結乾燥される。これらのバイアルはしばしば高さ５ｃｍで、さらに２ｃｍがゴムストッパーのために必要となる。したがって、凍結乾燥機中における製品材料の空間に対する比は極端に非効率で、コスト的に非能率な製造プロセスをもたらす。
【００２４】  ガラスバイアル中に内包されるべく処方された凍結乾燥ワクチンの従来の組成物の別の不都合な点は、凍結乾燥の最中に、ゴムストッパーが、バイアルからコンデンサーへの水分子の自由な移行の妨害をすることである。これはバイアル中の蒸発ガスの分圧を上げると同時に、凍結乾燥製剤が破砕する危険を高める。ガラスはまた熱移行を妨害し、効果的な凍結乾燥に影響を与える。凍結乾燥にトレイを用いることによって、ガラスバイアルと共にゴムストッパーを排除するようなワクチン処方、その効率を増加させるであろう。さらに、凍結乾燥は時間がかかる。ワクチン組成物は、水野昇華時間を短縮するために氷点下の少し下の温度に維持される。しかしながら、より長期の乾燥時間はほとんど不可避的に力価を減少させる。ストッパーとアルミのフタを持つガラスバイアルは一般に厄介物とみなされる。製品としていえば、それらは最終ワクチンのコストの５０％以上を占める。実際の使用状況では、希釈液がバイアルに注入され、生じた溶液は必要に応じてさらに抽出および希釈される。これは、たとえば鶏舎のような使用現場には必ずしも適さない不便さである。こうした状況での操作においては、間違って自動的に注入してしまうといったことも珍しいわけではない。しかもこうしたワクチン包装および調製のもつ別の不都合は、濃縮溶液の一部がバイアル中に残存してしまうことである。したがって、保存中に起こる消失ならびに製品の非均一性および生産における損失を補うために、バイアル中の表示よりも過剰な内臓量を持つことが一般に認められている。ガラスバイアルは安全に破棄される必要があり、それ自体が健康および環境のハザードにもなりうる。
【００２５】  結果として、これまでの凍結乾燥ワクチン処方の使用はコストも高く、現場での使用にも困難な複雑な調製技術を内包している。したがって、こうした従来のワクチン処方は、経済的および作業現場の条件が高コストの作戦を許さない未開発国のワクチン接種において、あるいは、生物兵器やその他の天災、疫病などに対する防衛において必要とされる大量免疫においては、あまり適していない。
【００２６】  したがって、望まれることは、投与におけるガラスバイアルの使用を回避して、より低コストで別の包装手段を提供するワクチン処方である。もう一つ望まれることは、単一もしくは多重ワクチン処方において、安定性、滅菌性、溶解性、均一性を維持しながら、より高い投与ドースの正確さおよび使用に際しての手軽さを提供するワクチン処方およびその使用法である。より正確で再現性があり、効率的な投与を容易にするワクチン処方および改良された免疫方法は、より良い現場特性、高い安全性、コスト効率、少ない浪費、および改善された環境遵守の野利点を提供する。
【発明の概要】
【００２７】  従って、固形物で凍結乾燥した濃縮され安定な形のワクチンを希釈液に単純に溶解することによって、ガラスバイアルの必要性をなくし、一方でドースの精度を大きく高めると同時に、使用に際しての容易さをもたらすワクチン組成物および免疫方法を提供することが本発明の目的である。
【００２８】  本発明のさらなる目的は、調製の際、および商用ワクチンとしての保存に必要とされる期間、充分に強力な抗原活性を保持できる、緊密化され、圧縮され、または高密度の安定な固形物として錠剤化された、凍結乾燥した生ワクチン、もしくは不活性化ワクチンを提供することにある。
【００２９】  本発明のさらなる目的は、in-ovoワクチン調製の処方およびその使用を可能にするために、緊密化され、圧縮され、または高密度の安定な固形物として錠剤化された、凍結乾燥した生ワクチン、もしくは不活性化ワクチンを提供することにある。
【００３０】  本発明のさらなる目的は、ワクチンの非バイアル性容器への包装およびその使用を可能にするために、緊密化され、圧縮され、または高密度の安定な固形物として錠剤化された、凍結乾燥した生ワクチン、もしくは不活性化ワクチンを提供することにある。
【００３１】  本発明の別の目的は、処方され使用可能なワクチン接種においてより大きな自由度を持って免疫できるようなワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３２】  本発明の別の目的は、既知の方法に従って作られた包装ワクチンにありがちな不正確な力価を補償する目的で投与される過剰なワクチン材料の必要性を減じるようなワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３３】  本発明の別の目的は、投与されるワクチン処方におけるタイプにより大きな自由度をもたらすようなワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３４】  さらに本発明の別の目的は、多重ドースワクチン溶液およびその使用を可能にするようなワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３５】  本発明の別の目的は、ヒトに対する大量免疫を可能にするようなワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３６】  本発明の別の目的は、コストおよび使用現場の条件が複雑な調製やコストの高くつく作戦を許さない未開発国における、適切で効率的なコストのワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３７】  さらに本発明の別の目的は、大量免疫が絶対必要条件となる生物兵器に対する防御に有効に働くような、ワクチン組成物と免疫方法を提供することにある。
【００３８】  これらのまたはその他の目的は、少なくとも一つの予め力価測定された凍結乾燥した抗原性成分及びその溶解助剤を含有し、固形錠剤の形をしている安定なワクチン組成物に関連した今回の発明によって達成されるであろう。それに加えて、今回の発明はまた、以下のステップを含有する、病気に対して被験者（動物）を免疫する方法を提供する。ワクチン組成物を溶液にするために希釈液に溶解し、そこではワクチン組成物は少なくとも一つの凍結乾燥した抗原性成分及びその溶解助剤を含有し、固形錠剤の形をしている。そこでワクチン組成物はそうした病気に対する保護を提供するため、溶解した溶液を病気に対して効果的に免疫できる分量を被験者（動物）に投与する。
【００３９】  本発明の個々の特徴は、添付された実験例を参考にしながら考察された以下に掲げる詳細な記述によって、より明瞭となろう。以下の詳細は、家禽への応用に絞りながら、本発明によって提供される問題点と解決法の議論を継続している。しかしながら、以下のことは家禽に限られたもの、あるいはヒト免疫には適用不可能なものとして解釈されてはならない。
【発明の詳細な記述】
【００４０】  本発明は、少なくとも一つの凍結乾燥した抗原性成分および溶解助剤を含有してなる、安定な圧縮ワクチン組成物を提供する。
【００４１】  本発明の好ましい態様において、前記ワクチン組成物は硬質錠剤の形態である。
【００４２】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記組成物は完全かつ迅速に水に溶解する。
【００４３】  本発明の好ましい態様において、前記組成物は滅菌されている。
【００４４】  本発明の好ましい態様において、前記溶解助剤は発泡剤または一対の発泡剤であり、この発泡剤対は塩および酸からなっている。
【００４５】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記発泡剤対はクエン酸であり、前記炎は重炭酸塩である。
【００４６】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記ワクチン組成物はバインダおよび潤滑剤を含有する。
【００４７】  本発明の更にもう一つの好ましい態様において、前記組成物は水中で完全かつ迅速に崩壊する。
【００４８】  本発明のもう一つの好ましい態様において、活性物質は予め力価測定された凍結乾燥物であり、使用前には凍結温度以下の乾燥窒素雰囲気下で保持される。
【００４９】  本発明のもう一つの態様において、前記凍結乾燥された成分は当該組成物の80重量％以下である。
【００５０】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記組成物は希釈剤と接触したときに80秒以内で完全に溶解する。
【００５１】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記ワクチン組成物の完全な溶解は、組成物に対する希釈剤の比率が、組成物200mg当り希釈剤0.5mL〜組成物400mg当り希釈剤100mLのときに生じる。
【００５２】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記ワクチン組成物の安定性は、37℃で5日後の力価喪失が、109.7EID50/mLと109.2EID50/mLの間の差以下であることによって特徴付けられる。
【００５３】  本発明の更にもう一つの好ましい態様において、前記抗原性成分は、完全なウイルス、完全なバクテリアまたは完全な微生物である。
【００５４】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記ワクチン組成物の抗原性分は、生バクテリアまたは生ウイルスである。
【００５５】  本発明の好ましい態様において、前記ワクチン組成物は、抗原性成分の存在を示すインジケータを含有する。
【００５６】  本発明の好ましい態様において、前記インジケータは色素である。
【００５７】  本発明は更に、少なくとも一つの凍結乾燥された抗原性成分を含有する安定なワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物は硬質錠剤の形態であり、前記抗原性分はリポ多糖またはタンパク質であり、天然に存在するもの、組換え体または修飾体の何れかである。
【００５８】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記抗原性分は、ニューカッスル病ウイルスもしくはバクテリア、ニューカッスル病VH株、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス、家禽ポックスウイルス、喉頭気管炎ウイルス、鳥類の伝染性気管支炎ウイルス、ガンボロウインターフィールド病ウイルス、伝染性気管支炎（IB-H120）、ヒツジポックスウイルス、牛疫ウイルス、炭疽芽胞、サルモネラSPP、大腸菌、またはこれらの一以上の混合物からなる群から選ばれる生ウイルスであり、天然に存在するウイルス、組換えウイルスまたは修飾されたウイルスの何れかである。
【００５９】  本発明の更にもう一つの好ましい態様において、前記抗原性成分は、炭疽芽胞、サルモネラSPP、大腸菌、またはこれらの一以上の混合物からなる群から選択され、天然に存在するもの、組換え体または修飾体の何れかである。
【００６０】  本発明の更にもう一つの好ましい態様において、前記抗原性成分は生ウイルスであり、更に、該ウイルスに対する中和抗体を含有する。
【００６１】  本発明は更に、対象を疾患に対して免疫感作する方法であって：少なくとも一つの凍結乾燥された抗原成分および溶解助剤を含有し、硬質錠剤の形態であり、上記の疾患に対する保護を与える請求項１に記載のワクチン組成物を、希釈剤で溶解して溶液を形成する工程と；得られた溶液を、前記疾患に対して前記対象を免疫感作するのに有効な量で、前記対象に投与する工程とを具備する方法を提供する。
【００６２】  本発明の好ましい態様において、前記免疫感作方法の溶解工程は、前記ワクチン組成物の完全な溶解によって更に特徴付けられる。
【００６３】  本発明の更にもう一つの好ましい態様において、前記免疫感作方法の溶解工程の際の完全な溶解は、組成物に対する希釈剤の比率が、組成物200mg当り希釈剤0.5mL〜組成物400mg当り希釈剤100mLのときに生じる。
【００６４】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記免疫感作方法の溶解工程は、希釈剤と接触したときに80秒以内に生じることによって更に特徴付けられる。
【００６５】  本発明のもう一つの態様において、前記投与する工程は、前記溶液を前記対象に注射することを含む。
【００６６】  本発明のもう一つの態様において、前記投与する工程は、前記溶液から形成ざれたエアロゾルを前記対象にスプレーすることを含む。
【００６７】本発明の更にもう一つの態様において、前記投与する工程は、前記溶液を点眼液の形態で前記対象に適用することを含む。
【００６８】  本発明の更にもう一つの態様において、前記投与する工程は、前記溶液を経口摂取により与えることを含む。
【００６９】  本発明の好ましい態様において、前記免疫感作方法は鶏類である対象に適用され、また前記疾患はニューカッスル病、伝染性ファブリーキウス嚢病、家禽ポックス、喉頭気管炎、鳥類の伝染性気管支炎からなる群から選択される。
【００７０】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記溶液はin-ovoで前記対象に投与される。
【００７１】  本発明はまた、少なくとも一つの凍結乾燥された抗原性成分および溶解助剤を含有するワクチン組成物を含むパッケージであって、前記ワクチン組成物は硬質錠剤の形態であり、更に、前記抗原性成分の存在のインジケータを含むパッケージを提供する。
【００７２】  本発明の好ましい態様において、前記パッケージはブリスターパックである。
【００７３】  本発明のもう一つの好ましい態様において、前記パッケージは滅菌シリンジである。
【００７４】  本発明はまた、緻密化されたワクチン組成物を含む滅菌シリンジであって、前記ワクチン組成物は、少なくとも凍結乾燥された抗原性成分および溶解助剤を含有する滅菌シリンジを提供する。
【００７５】  本発明の一つの態様において、前記滅菌シリンジの緻密化されたワクチン組成物は圧縮された組成物である。
【００７６】  本発明の好ましい態様において、前記滅菌シリンジの圧縮されたワクチン組成物は硬質錠剤の形態である。
【００７７】  本発明は更に、対象を疾患に対して免疫感作する方法であって、緻密化されたワクチン組成物を含む滅菌シリンジに希釈剤を加えて該シリンジの中にワクチン溶液を形成することと、得られたワクチン溶液を前記対象に投与することとを含む方法であって、前記ワクチン組成物は少なくとも一つの凍結乾燥された抗原性成分および溶解助剤を含有するか、または前記滅菌シリンジの緻密化されたワクチン組成物は圧縮された組成物として更に特徴付けられるか、または前記滅菌シリンジの圧縮されたワクチン組成物は硬質錠剤の形態である方法を提供する。
【００７８】  本発明のワクチン組成物の溶解から得られる溶液は、如何なる適切な手段によって投与されてもよい。本発明による、疾患に対して対象を免疫感作する方法は、前記ワクチン組成物によって形成された溶液を投与するために多くの方法を用いることができる。投与方法の例は、筋肉内注射、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、点眼、飲料水を介するもの、エアロゾル、または鼻スプレーである。治療すべき動物が鳥であるとき、この鳥は孵化したばかりのひな鳥（即ち、孵化後約１日齢）、若鳥、または熟年鳥の何れであってもよい。本発明のワクチンは、Sharmaに付与された米国特許第4,458,630号に記載されているように、in-ovoで鳥に投与するために有用であり得る。
【００７９】  凍結乾燥され、予め力価測定された本発明のワクチン組成物は、少なくとも一つの痺結乾燥された予め力価測定された抗原性ワクチン成分、賦形剤、および任意に種々の添加剤で構成され、高密度の形態に緻密化または圧縮された製剤として理解される。
【００８０】  ここで用いる「高密度」の用語は、当該ワクチン組成物1.0g/ccよりも大きな密度を有することを意味する。通常、当該ワクチン組成物の密度は、1.5g/ccよりも大きいであろう。典型的には、当該ワクチン組成物の密度範囲は、約1.5g/cc〜2.5g/ccであろう。
【００８１】  このワクチン組成物は緻密化されてもよく、圧縮されてもよく、または硬質錠剤の形態であってもよい。
【００８２】  ここで用いる「緻密化された」の用語は、ワクチン組成物が1.0g/ccよりも大きい密度を有するが、Strong-Cobb単位（SCU）で測定したとき、およびERWEKA錠剤硬度試験機モデルTBH20で硬さを試験したときに、測定可能な硬さをもたないことを意味する。
【００８３】  ここで用いる「圧縮された」の用語は、ワクチン組成物が少なくとも2.0 SCUの硬さを有することを意味し、「硬質錠剤」の用語は、ワクチン組成物が少なくとも3.0SCUの硬さを有する錠剤または他の高密度形態であることを意味する。
【００８４】  緻密化された、圧縮された、および硬質錠剤のワクチン組成物は、12mmの平坦にベベル加工されたMANESTY F3単一パンチ、または6mmの標準凹型パンチで製造することができる。
【００８５】  硬質錠剤の形態のワクチン組成物は、最大４トンの圧力で製造された。これらの錠剤の硬度について、上記で述べたERWEKA錠剤硬度試験機モデルTBH20で試験したところ、全て3.0 SCUよりも大きな硬度を有することが分かった。
【００８６】  通常は治療剤を伴う古典的な錠剤は、このような「錠剤」であると理解される。しかし、それは、医薬の分野ではそれほど頻繁には使用されないものを含めて、如何なる緻密化または圧縮化された高密度形態をも意図すると理解される。例えば、最終用途が大容積の物質を必要とするならば、大きな「ブリケット（briquette）」も適切なものであろう。
【００８７】  希釈剤中で「完全に」かつ「迅速に」崩壊または溶解する製剤は、目的とする用途が純水で使用するものではなく、溶液（例えば食塩水）または非水担体と共に使用するものであったとしても、純水中でそのように崩壊または溶解できる製剤であると理解される。
【００８８】  「完全に溶解する」の用語によって、可溶性の成分は溶解しないまま残らないことが理解される。「迅速に崩壊または溶解する」の用語によって、小容量の圧縮された凍結乾燥ワクチン組成物について大容量の水、例えば400mgの発泡性錠剤について100mLの水が用いられたときには、崩壊または溶解は略数分以下で完了することが理解される。希釈剤の容積が相対的に減少された場合には、この時間は増大する。従って、同じ錠剤であっても、10mLの水では70秒を要し、2mLの水では80秒を要することがあり得るであろう。
【００８９】  上記で述べた崩壊または溶解時間は、計量された室温の水の中に攪拌せずに配置されたときに、錠剤の溶解または崩壊のために要する時間である。
【００９０】  「安定な」の用語によって、本発明の組成物は、製造の際、および商業的ワクチンの棚置き保存のために必要な時間において、それらの（潜在的な）免疫感作能力を維持するであろうことが理解される。
【００９１】  以下の例を参照することによって示されるように、本発明によるワクチン組成物および免疫感作方法は、以下で説明するように多くの利点を有する。
【００９２】  本発明の方法を、1000回投与量のワクチン成分を含むワクチン組成物の製造について、以下で一般的に例示する。ワクチン成分の溶液はトレー内で凍結乾燥される。この乾燥された材料を粉砕する。凍結乾燥後の均一に混合されたサンプルの力価は、該凍結乾燥物を-20℃の密閉された容器内で窒素雰囲気下に維持しながら測定される。凍結乾燥された材料の力価が100mg当り625ドースであると決定されれば、この材料を圧縮したワクチン製剤当り160mgだけ計量して、正確に必要な力価を達成するためには十分である。次いで、この材料は任意および／または機能的な材料と混合され、製剤を圧縮または錠剤化される。この圧縮された凍結乾燥ワクチン製剤は、次いで、当業者に既知および／またはここに説明する方法の何れかによってパッケージすることができる。
【００９３】  賦形剤の用語は、当該ワクチン組成物の処方に使用される希釈剤または担体のための包括的な用語である。賦形剤には、希釈剤もしくは充填剤、バインダもしくは接着剤、溶解助剤、潤滑剤付着防止剤、滑剤もしくは流動促進剤、着色剤、香料、甘味剤および吸着剤が含まれ得る。
【００９４】  より詳細には、錠剤充填剤は、錠剤のバルクを希釈する物質であり、主にキャリアとして作用する。典型的な錠剤充填剤には、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、澱粉、修飾澱粉（カルボキシメチル澱粉など）、微結晶セルロース、ラクトース、スクロース、デキストロース、マンニトール、およびソルビトールが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】  錠剤充填剤のレベルは、錠剤の約0〜90重量％である。
【００９６】  バインダは、粉末を一緒に保持して顆粒を形成するための「糊」として作用する。バインダには、澱粉もしくはアカシアガム、トラガカンスおよびゼラチンのような天然ポリマー、またはＰＶＰ、メチル-、エチル-およびヒドロキシプロピルセルロースのような合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】  バインダのレベルは、当該組成物の約0〜20重量％である。
【００９８】  溶解助剤は、当該ワクチン組成物の溶解を促進する。典型的な例には、発泡剤、崩壊剤、表面活性剤および可溶化剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】  崩壊剤は、圧縮された錠剤を破壊させる。典型的な例には、澱粉、微結晶セルロース、精製ウール澱粉、アルギン酸、ナトリウム澱粉グリコレート、グアーガム、架橋ポリビニルピロリドン（PVP）、イオン交換樹脂、並びにメチルセルロース、クロスカーメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース類が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】  溶解助剤のレベルは、当該組成物の約1〜95重量％である。
【０１０１】  潤滑剤は、圧縮および排出の際に、圧縮すべき材料とダイ壁との間の摩擦を低減する。殆どの潤滑剤は水に不溶性であり、ステアリン酸塩類（マグネシウム、カルシウムおよびナトリウム）、ステアリン酸、タルクおよびワックス類が含まれる。水溶性の潤滑剤には、PEG類、安息香酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびラウリル硫酸マグネシウムが含まれる。
【０１０２】  潤滑剤のレベルは、当該組成物の約0〜5重量％である。
【０１０３】  着色剤は、美的および機能的な目的のために、錠剤形態のようなワクチン処方剤のタイプを認識するのを補助するために添加されものであり、例えば、イスラエル特許第64189号の例Ａ〜Ｄに開示されている色素であるが、これに限定されない。
【０１０４】  着色剤のレベルは、当該組成物の約1％未満である。
【０１０５】  本発明のワクチン組成物は、当業者に公知の方法、例えばH.A. Lieberman, L.Lachman, J.B. Schwartz編の薬学的投与形態、錠剤、第二版（1989）に従って錠剤化することができる。
【０１０６】  好ましい態様において、本発明の組成物は、溶解助剤として発泡剤を有するように調製された硬質錠剤である。当業者が理解するように、発泡性錠剤は、溶解するときに適切な反応が起きて二酸化炭素および炭酸を発生するように、発泡剤対のような塩基性成分および酸性成分を含有しなければならない。適切な発泡性成分には、塩基性化合物の炭酸塩ファミリーおよび無機または有機の酸性化合物が含まれる。
【０１０７】  塩基性化合物の炭酸塩ファミリーの中で、本発明の組成物に使用するために好ましい発泡剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸アトリウム、炭酸グリシン、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸二水素カリウム、および炭酸カルシウムである。最も好ましい塩基性化合物は重炭酸ナトリウムである。
【０１０８】  本発明の組成物に使用するための好ましい酸性成分は、クエン酸、アジピン酸、酒石酸、マレイン酸、ホウ酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、メトキシ安息香酸、マンデル酸、マロン酸、乳酸、ピルビン酸、グルタル酸、アスパラギン酸、塩酸、蓚酸、サリチル酸、コハク酸、および酢酸である。最も好ましい酸性発泡剤成分はクエン酸である。
【０１０９】  上記で述べた塩基性および酸性の発泡性錠剤成分に加えて、本発明の錠剤組成物は、従来用いられている他の賦形剤を含んでいてもよい。
【０１１０】  本発明の錠剤組成物は、当該技術で公知の錠剤化法を使用して得られる。一般に、本発明のために使用される錠剤化法は次のように要約される。即ち、各成分を篩分けし、混合し、これをMANESTY F3錠剤プレスで直接圧縮して、必要な重量、寸法および硬さの錠剤にする。
【０１１１】  本発明の発泡性錠剤組成物は、通常の水または単純な食塩水溶液中に溶解されればよい。
【０１１２】  抗原性ワクチン成分は、該ワクチン成分が誘導された起源である抗原（類）に対して、免疫応答を特異的にトリガーする成分である。このような成分は、一つのウイルスまたは微生物を起源とするもの（組換え体を含む）、例えば抗原性リポ多糖および抗原性タンパク質、または、例えば二つの異なる抗原性タンパク質であってもよい。それらはまた、タンパク質または多糖の抗原性部分からなっていてもよい。これらの成分は、一般にサブユニット成分と呼ばれる。幾つかの場合、このワクチン成分は完全なウイルスまたは微生物（組換え体を含む）からなっている。ワクチン成分は、例えばバクテリン、または生の弱毒化されたバクテリアもしくはウイルス、不活性化されたバクテリアもしくはウイルス、または死んだバクテリアもしくはウイルス（何れも組換え体または修飾体を含む）であることができる。好ましくは、ワクチン成分は生のバクテリアもしくはウイルス（組換え体を含む非毒性または部分的に毒性の修飾体）である。その例にはサルモネラ菌、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリーキウス嚢病（Gumboro）ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、または炭疽芽胞ワクチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】  混合ワクチン類は、種々のワクチン成分からなるワクチンである。混合ワクチンもまた、二以上の異なるウイルスまたは微生物に由来する抗原性成分を含有する。
【０１１４】  より複雑な組合わせも可能である。こうして、上記で述べたタイプの一つのワクチン、並びにそれらの混合物は、混合ワクチンと称される。これらはまた、公知のアジュバントの何れかを含むことができる。
【０１１５】  「パッケージ」は、安定な圧縮されたワクチン製剤の保存に有用な何れかのパッケージであると理解される。
【０１１６】  該パッケージは、例えば、錠剤の包装または保存のために一般に使用されるガラスもしくはプラスチック（例えば高密度ポリエチレン）の容器であるが、これに限定されない。使用の準備ができたワクチンを作製するには、安定な圧縮された凍結乾燥ワクチン製剤を希釈剤に添加して、該製剤を均一に溶解させれば十分である。本発明の圧縮された凍結乾燥ワクチンのためのもう一つのパッケージング形態は、ブリスターパックである。ブリスターパックの一例は、製剤を含む穴の列を備えたプラスチックシート（トレイ）であり、これは好ましくは乾燥窒素下で、アルミ箔の蓋でヒートシールされる。感受性製品のために有用なもう一つの種類のブリスターパックは、アルミニウム／アルミニウムブリスターと称され、トレイおよび蓋の両者が、アルミニウムまたはアルミニウムと種々のプラスチックとのラミネートに基づくものである。これは、最終ユーザが一般に使用しないワクチンを包装および保存するために使用される、高価で且つスペースを占めるガラス瓶の使用を回避するであろう。
【０１１７】  本発明は、一以上の圧縮された凍結乾燥ワクチン組成物を、ブリスターパックから、例えば飲料水またはエアロゾル噴霧系に使用されるバケツの水に直接添加して、首尾よいワクチン接種を保証することを可能にする。
【０１１８】  これは、通常はその場で、例えば鶏舎において達成される。獣医学的ワクチン接種もまた、雲霧法（fogging）、ベントブラシ（vent brush）、穿刺（piercing）、全身スプレー、または点眼によって達成することができる。同様の方法で得られたワクチン溶液は、米国特許第5,397,569号および第5,871,748号に記載された胚のin-ovo免疫感作のための別法として使用できるであろう。
【０１１９】  圧縮された固体を収容するために使用できる如何なる装置も、本発明に使用できることは明らかである。希釈剤は水でもよく、或いは、バッファーおよびアジュバントの複雑な混合物でもよい。これは主に、凍結乾燥前の溶液または圧縮前の製剤に、何れの添加剤が添加されるかに依存する。
【０１２０】  公知の凍結乾燥法は、ワクチン成分（類）を含むケーキをバイアル中に生じる。この方法は、先に述べたように空間および時間を浪費するものである。抗原性ワクチン成分（類）が溶液のトレー内で凍結乾燥されるときは、処理の際に凍結乾燥機中の冷プレートの全表面が利用される。加えて、崩壊が起きたり、または凍結乾燥プロセスにおいて他の何等かの問題が生じても、材料を容易に回収することができる。凍結乾燥の前に、材料が予めガラスバイアルの中に充填されるときはそうではない。更に、当該処理のこの部分には高さを要するバイアルが含まれないから、冷プレートを高密度で積み上げることができる。その結果、凍結乾燥器の能力が実質的に増大し、実際上はコンデンサの能力によってのみ制限される。当然の帰結として、遥かに小さい凍結乾燥器を本発明のために使用して、遥かに大きな乾燥機でバイアル瓶を用いたときと同じ結果を達成することができるであろう。
【０１２１】  従って、一つの好ましい態様において、ワクチン組成物はトレーの中で乾燥され、粉末に粉砕され、次いで錠剤化されて、最終的な溶解を補助する滅菌添加剤と混合された滅菌済みの凍結乾燥された抗原性材料から圧縮される。次いで、この滅菌された組成物は、乾燥窒素ガスの下で、水分およびガスに対する高い障壁をもった滅菌ブリスターストリップパックの中に包装される。
【０１２２】  一つの好ましい態様において、凍結乾燥された材料は生の弱毒化ウイルスである。
【０１２３】  もう一つの好ましい態様において、先に乾燥された複数のウイルス成分の組み合わせを含む混合物が、溶解を補助する添加剤および任意に摂取のために望ましいアジュバントと共に一つの製剤に圧縮される。
【０１２４】  混合ワクチンが必要な場合であれば、本発明によって提供される利点は更に顕著である。各成分を高精度の用量で含有する混合ワクチンを達成するために、各タイプの抗原性ワクチン成分の予め十分に力価測定された凍結乾燥物を、圧縮前の製剤に単純に添加するだけで十分である。
【０１２５】  同時に、本発明は、例えば三成分または四成分のワクチンの全ての可能な種類を保存するのに必要な、大きな保存用量の問題に対する解決策を提供する。
【０１２６】  混合ワクチンの凍結乾燥のために必要とされるような、凍結乾燥の前に種々の成分を混合する代りに、各成分が別々に凍結乾燥される。従って、種々の成分を別々に保存することができる。必要なときには、凍結乾燥された夫々の望ましい成分の材料を適切な量だけ混合して、上記で述べたような単一の製剤にし、次いで既述のように該混合物を圧縮およびパッキングすることによって、夫々の望ましい組合わせが容易に作製される。
【０１２７】  これにより、例えば四成分混合ワクチンの場合、必要とされる何れかの単一ワクチン製剤または混合ワクチン製剤を構成するために、夫々が一つの特定のワクチンタイプの凍結乾燥材料のみを収容している四つの容器だけをストックすることが可能になる。以前の方法では、夫々が予め製造された成分または混合物を含む15種類の容器を必要とするであろう。
【０１２８】  更にもう一つの好ましい態様では、当該ワクチン容器は、発泡剤の対（例えば炭酸ナトリウムおよびクエン酸）中の滅菌済み溶解助剤、滅菌済みバインダ（例えばポリビニルピロリドン）および滅菌済み潤滑剤（例えばステアリル酒石酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム）と混合された一以上のワクチン成分の凍結乾燥された材料を圧縮した滅菌錠剤のような、固形剤を収容した滅菌済みブリスターストリップからなる。次いで、これら単一成分もしくは複数成分の製剤を使用して、その場で、既知の力価をもった正確なワクチン溶液を容易に調製することができる。ここに記載したものは、溶解助剤、バインダおよび潤滑剤の例であり、本発明のワクチン組成物に対する限定として解されるべきものではない。
【０１２９】  更にもう一つの態様では、当該ワクチン組成物および免疫感作方法は、二以上の抗原性成分に由来する成分を含有するワクチン組成物を含む。複数の抗原性分からの成分に基づくワクチンは、このようなワクチンの単一の投与だけで、複数の病気に対する防御を十分に誘導するという利点を有する。各ウイルスまたは微生物には、幾つかの異なった抗原性ワクチン組成物の何れもが含まれ得ることを理解すべきである。
【０１３０】  更に別の態様では、夫々の抗原性組成物のための複数の抗原性成分を必要な正確な比率で混合して、マレク病生ワクチン、ＮＤＶ生ワクチンおよびガンボロ生ワクチンのような、in-ovo免疫感作のために必要な複合物を形成することができる。従って、多成分のin-ovoワクチン製剤もまた可能である。このような組合わせのための投与形態は、本発明により、各疾患のための凍結乾燥された抗原性分必要な抗体の混合物を、錠剤化助剤と共に圧縮することによって達成することができる。次いで、このような製剤を使用して、in-ovo接種の直前に、該製剤を規定された条件下で必要な担体中にその場で溶解することにより、望ましいウイルス免疫化因子複合体を得ることができる。
【０１３１】  通常、このワクチン容器は、1〜10,000ドース以上のワクチンを収容することができる。個々のワクチン接種のための単一ドースの容器は、人間での用途および家畜での用途の両方について共通である。
【０１３２】  ヒトポリオウイルスワクチン、ヒト凍結乾燥チフスワクチンまたはイヌパルボウイルスワクチンは、典型的には単一投与ワクチンとして処方される。なお、単一ドースのワクチンについては、複数ドースのワクチンについて説明したのと同様の方法が完全に適用される。
【０１３３】  新生児ニワトリの大きな鶏舎のワクチン接種については、伝染性気管支炎ウイルスまたはＮＤＶに対する大量ワクチン接種のために、10,000ドースのワクチン容器を使用するのが通常の実務である。例えば伝染性のウシ鼻腔気管炎ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスに対する畜牛のような大きな家畜のワクチン接種のためには、10ドースのワクチン容器が通常用いられる。
【０１３４】  本発明に従って調製されたワクチン組成物の一つの利点は、凍結乾燥溶液中には適合しないかもしれない溶解助剤を、凍結乾燥後に含めることができることである。これは、投与手順を迅速化する。意外にも、生弱毒化ウイルス製剤に対して有害であると予想されたクエン酸を発泡剤対の一部として使用することは、力価に対して有意な影響を持たないことが見出された。
【０１３５】  容器のための水分障壁の完全性は、このタイプの処方と共に重要な影響を有しており、パッケージングにおいて有効な水分バリアが形成されることを保証するステップを採るべきである。ブリスターストリップ包装を用いるとき、およびクエン酸の場合のように、選択された添加剤が、濡れているときには潜在的に不安定化させる場合には、特にそのようなステップを採るべきである。
【０１３６】  本発明はまた、疾患に対して対象を免疫感作する方法であって：ワクチン組成物を希釈剤で溶解して溶液を形成する工程（ここで、前記ワクチン組成物は少なくとも一つの凍結乾燥された抗原性成分および溶解助剤を含有し、前記ワクチン組成物は硬質錠剤の形態であり、また前記ワクチン組成物はこのような疾患に対する保護を与える）と；得られた溶液を、前記疾患に対して前記対象を免疫感作するのに有効な量で、前記対象に投与する工程とを具備する方法を提供する。
【０１３７】  或いは、前記凍結乾燥物は、二以上のウイルスまたは微生物に由来する抗原性ワクチン成分を含有してもよい。
【０１３８】  加えて、本発明は、前記ワクチン組成物および希釈剤が一つのパッケージの中に一緒に含まれているワクチン組成物を提供する。このような態様は、投与のための液状ワクチンを形成するための溶解工程を、フィールドにおいてその場で行うことができる免疫感作方法を可能にする。
【０１３９】  なお、圧縮され凍結乾燥された安定なワクチン組成物を収容するワクチンパッケージまたはパックは、ワクチンの有用なパッケージングの何れであってもよいことが理解されるべきである。単純な形態において、該ワクチンパックは、箱の中に説明書と共に包装されたワクチン成分を含むワクチン容器からなる。より複雑な形態のワクチンパックにおいて、該ワクチン容器は、希釈剤およびシリンジを含むことができるであろう。追加の態様において、前記圧縮され凍結乾燥されたワクチンは、滅菌条件下で密封されたシリンジの包装され、従って、この場合には予め充填されたシリンジの内部でワクチンの溶解を行うことができる。この方法において、予め充填されたシリンジのバッチサイズは、凍結乾燥機の中でシリンジが占める空間には依存しない。
【０１４０】  以下の例は、種々の感染性疾患に対して対象を免疫感作するために使用するときの、本発明のワクチン組成物の調製および能力を例示するものである。また、種々のワクチン処方について、圧縮され凍結乾燥された錠剤形態の力価分析を用いた安定性評価も提示される。
【０１４１】  これらの例は、本発明を更に例示および説明するために提示されるものであり、如何なる点においても制限的に解釈されるべきではない。これらの例、並びに明細書および特許請求の範囲において別に指示されない限り、全ての部およびパーセンテージは重要によるものである。温度は℃によるものである。
【実施例】
【０１４２】  例  １
１．１弱毒化されたニューカッスル病ウィルスＶＨ種（これ以後ＮＤＶ−ＶＨとする）を含有する錠剤の調製
特異的病原体を持たない受精卵（ＳＰＦ）にＮＤＶを接種し，卵におけるＮＤＶウィルスの既知の調製方法に従って保温された。【０１４３】  尿膜ヒツジ水液（ＡＡＦ）を採取し、4000g、20分の遠心で精製した。【０１４４】バイアル中での凍結乾燥は既知の標準的方法で完全に行われた。【０１４５】  錠剤は次のように調製された。【０１４６】13.2gの粉砕凍結乾燥物に対して以下のものが加えられた。【０１４７】  60g重炭酸ナトリウム
42gクエン酸無水物
4.2gポリビニールピロリドンＫ−３０
0.3gステアリン酸マグネシウム
含有物は混合され錠剤はそれぞれ400mg重量でパンチされた。【０１４８】  このように精製された各々の錠剤は44mgの凍結乾燥物を含有する。【０１４９】  １．２錠剤の分析
無作為抽出された錠剤のＳＰＦ卵における力価は評価されバイアル中の凍結乾燥物の調整量と比較された。【０１５０】
【表１】
0005209160.tif 000002
＊卵成熟量は５０ユニットである。【０１５１】  一つの錠剤が100mlの水に加えられて、一分以内に完全に、すなわち肉眼では固形物の痕跡は見られない状態に、溶解された。【０１５２】  一つの錠剤を10mlの水に加えたときに、溶解は７０秒で完成した。【０１５３】  一つの錠剤を2mlの水に加えたときに、溶解は８０秒で完成した。【０１５４】  1mlの水では、完全な溶解は達成されたが、この錠剤の発泡性の性質は約４分間を要する完全溶解に関与しているとはみられない。【０１５５】  １．３包装と安定性
錠剤は塩化ポリビニール（ＰＶＣ）発泡剤ストリップにパックされ、その安定性が37℃で試験された結果、５、７および９日間に渡って比較的安定であることが判明した。【０１５６】
【表２】
0005209160.tif 000003
4℃での貯蔵は、9ヵ月以後の錠剤の力価および色にいかなる評価可能な変化もたらさない。【０１５７】
【表３】
0005209160.tif 000004
与えられる力価は、活性物質と同量として算定した錠剤またはバイアルにつきEID50単位である。【０１５８】１．４  ニワトリにおける錠剤化されたNDV-VHの能力試験
【表４】
0005209160.tif 000005
HI＝血液凝集抑制単位．
Ａ：ＮＤＶ−ＶＨ錠剤は20mlの滅菌水に溶かし、0.02mlが18匹のヒヨコに点眼でワクチン化するのに使用された。（４週間分離箱で飼育）
Ｂ：別グループのヒヨコは同時に40mlの滅菌蒸留水に溶かした錠剤化されたＶＨワクチンを接種された。【０１５９】  Ｃ：ＮＤＶ−ＶＨバイアルが滅菌蒸留水に溶解されＡと同様のウィルス濃縮が与えられた。【０１６０】  Ｄ：非ワクチン接種対照
ワクチン接種３週間後、鳥は凝結阻害（ＨＩ）試験による抗体滴定のために採血され、すべての実験グループはキムロン動物研究所（イスラエル動物サービス）において
内臓型体内発生ＮＤＶが105.3EID50/1羽の濃度で筋肉注射によって投与された。【０１６１】  この試験の結果は、全てのテストされたワクチンで処理された鶏に良好な保護がなされたことを示した。【０１６２】  例  ２
２．１  ＮＤＨ−ＶＨ含有錠剤の調製
ＳＰＦ受精卵はＮＤＶを接種され、卵にＮＶＤウィルスを調製する既知の方法で保温された。【０１６３】ＡＡＦが採取され4000g、20分の遠心で調製された。凍結乾燥は既知の標準的方法で完全に実行された。【０１６４】  ＮＤＶ−ＶＨウィルスはトレイの中で凍結乾燥された。乾燥粉末は低湿度で滅菌ポリプロピレンバッグに密封し-20℃で保存した。増量する乾燥粉末を含有する発泡錠剤が作られた。錠剤は実験例１に詳述された方法で調製された。【０１６５】
【表５】
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２．２錠剤の分析  錠剤中のＮＤＨ−ＶＨ力価（EID50）はＳＰＦ卵による滴定で得られた。【０１６６】
【表６】
0005209160.tif 000007
活性物濃度とウィルス力価の間に満足のいく直線関係が得られた。【０１６７】  １つの錠剤が100mlの水に加えられたとき，溶解は１分以内で固形物は肉眼では痕跡も見られない程度に完成した。【０１６８】  ２．３包装と安定性
錠剤はアルミニウムラミネートサシェでパックされシリンジに入れられた。【０１６９】注射可能な溶液は希釈液をシリンジに注入して、錠剤を完全に溶解することによって得られた。こうして作られた注射可能な錠剤は個々のワクチン接種に直接に、あるいはより大きな容器で更に希釈した後，多数のワクチン接種に使用された。【０１７０】  例３
３．１  In-Ovoワクチン接種に対するニューキャスル病ウィルス（ＮＤＡ）に対する抗体を含むＮＤＶ−ＶＨを含有する錠剤の調製
ＳＰＦ受精卵にＮＤＶが接種され、卵でＮＤＶ−ＶＨウィルスを調製する既知の方法に従って保温された。【０１７１】  尿膜ヒツジ水液（ＡＡＦ）を採取し、4000g、20分の遠心で精製した。バイアル中での凍結乾燥は既知の標準的方法で完全に行われ、凍結乾燥された物質が力価された。ＮＤＶとＮＤＡの望まれる分量が決定された。【０１７２】  錠剤は次のように調製された。【０１７３】7.0gの粉砕凍結乾燥物に対して以下のものが加えられた。【０１７４】  ＮＤＶに対する凍結乾燥されたハイパー免疫0.36g
13g重炭酸ナトリウム
9.1gクエン酸無水物
0.9gポリビニルピロリドンＫ−３０
0.07gステアリン酸マグネシウム
内容物は混合され500mgの重量でパンチされた。このように作られた各々の錠剤は115mgの凍結乾燥されたウィルス製剤を含有する。【０１７５】  ３．２  錠剤の分析
一つの錠剤を100mlの水に加えたときに、溶解は2.5分以内に完成した。すなわち、肉眼では固形物の痕跡は見られない状態に溶解された。【０１７６】３．３  包装
錠剤は発泡剤ストリップに包装された。【０１７７】  ３．４  In-OvoでのＮＤＡを持つＮＤＶ−ＶＨ錠剤化された強力テスト
商用ブロイラーひよこにＮＤＶ−ＶＨ＋ＮＤＡによるIn-Ovo接種が孵化後２週目と４週目で接種の投与がなされた。胚は、農場において１８日間の保温でIn-ovo注射装置（Embrex U.S.A）で注入された。錠剤は200mlのマレク病ワクチン希釈液で溶解され、0.05mlが各々の卵に注入された。ワクチン投与されたひよこと投与されないひよこはＮＤＶウィルスによる混濁を避けるため分離個室に保管された。【０１７８】
【表７】
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2、4週めに、Kimron獣医学会（イスラエル獣医サービス）において、ひよこは、ＨＩ検査によって抗体検出のために採血され、両方のグループは、１羽あたり105.2EID50のI.M注入によって内臓器性の短潜伏期性NDVを投与された。結果は、孵化後4週で十分な保護がひよこに提供されたことを示す。【０１７９】  例  ４
４．１  弱毒化されたガンボロ病ウィルス（これ以後ＭＢと言う）を含有する錠剤の調整
受精卵（ＳＰＦ）にＭＢウィルスを接種し，卵におけるウィルスの既知の調製方法に従って保温された。【０１８０】  バイアル中での凍結乾燥は既知の標準的方法で完全に行われた。【０１８１】錠剤は次のように調製された。【０１８２】10.0gの粉砕凍結乾燥物に対して以下のものが加えられた。【０１８３】  22.4g重炭酸ナトリウム
15.7gクエン酸無水物
1.7gポリビニールピロリドンＫ−３０
0.1gステアリン酸マグネシウム
含有物は混合され錠剤はそれぞれ350mg重量でパンチされた。【０１８４】このように精製された各々の錠剤は70mgの凍結乾燥物を含有する。【０１８５】  ４．２  錠剤の分析
無作為抽出された錠剤の力価は105.6EID50/錠と評価された。【０１８６】（103.55EID50ワクチン接種量と考えられる）
一つの錠剤を100mlの水に加えたとき、溶解は一分以内に完成した。すなわち、肉眼では固形物の痕跡は見られない状態にまで溶解された。【０１８７】発泡錠剤とバイアルにおけるウィルス滴定
【表８】
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＊同量の免疫感作材料に調製した。【０１８８】４．３包装と安定性
錠剤は塩化ポリビニル（ＰＶＣ）ブリスターストリップにパックされ、その安定性は３７℃で試験された。【０１８９】
【表９】
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例  ５
５．１  鳥禽ポックス生ウィルスを含む発泡錠剤の調製
ＳＰＦ受精卵に鳥禽ポックスウィルスが接種され、卵でウィルスを調製する既知の方法に従って保温された。【０１９０】  胚としょう膜を採取しウィルスはホモジナイズによって抽出された。【０１９１】  凍結乾燥は既知の方法で完全に行われた。【０１９２】  700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０１９３】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０１９４】  ５.２  錠剤の分析
各々の錠剤の力価はＳＰＦ卵で評価され、106.25EID50/錠剤であることがわかった。一つの錠剤が100mlの水に加えられて、２分以内に完成、すなわち肉眼では固形物の痕跡は見られない状態に、溶解された。【０１９５】  例  ６
６．１  喉頭気管炎（鳥禽）生ウィルスを含む発泡錠剤の調製
受精卵（ＳＰＦ）に喉頭気管炎ワクチンウィルスを接種し，卵におけるウィルスの既知の調製方法に従って保温された。胚としょう膜を採取しウィルスはホモジナイズによって抽出された。【０１９６】  凍結乾燥は既知の方法で完全に行われた。700mgの錠剤が実験例１で詳述され．た方法に従って調製された。【０１９７】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。各々の錠剤の力価はＳＰＦ卵のなかで評価され105.53EID50であることが判明した。【０１９８】  例  ７
７．１  感染性気管支炎にわとり生ウィルスを含む発泡錠剤の調製
受精卵（ＳＰＦ）に炎症性気管支炎にわとりウィルスを接種し，卵におけるウィルスの既知の調製方法に従って保温された。胚としょう膜を採取しウィルスはホモジナイズによって抽出された。【０１９９】  凍結乾燥は既知の方法で完全に行われた。700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０２００】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０２０１】  ７．２  錠剤の分析
各々の錠剤の力価はＳＰＦ卵のなかで評価され106.15EID50であることが判明した。【０２０２】  例  ８
８．１  ガンボロウインターフィールド（鳥禽）生ウィルスを含有する発泡錠剤の調製
受精卵（ＳＰＦ）にガンボロウインターフィールド（鳥禽）生ウィルスを接種し，卵におけるウィルス繁殖の既知の調製方法に従って保温された。【０２０３】  胚としょう膜を採取しウィルスはホモジナイズによって抽出された。【０２０４】  凍結乾燥は既知の方法で完全に行われた。700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０２０５】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０２０６】８．２錠剤の分析
各々の錠剤の力価はＳＰＦ卵のなかで評価され106.28EID50であることが判明した。【０２０７】  例  ９
９．１  感染性気管支炎（ＩＢ−ＨＩ２０）＋ＮＤＶ−ＶＨ（鳥禽）生ウィルスを含む発泡錠剤の調製
受精卵（ＳＰＦ）にＩＢ−ＨＩ２０又はＮＤＶ−ＶＨ病ウィルスを接種し，卵におけるウィルス繁殖の既知の調製方法に従って保温された。【０２０８】  尿膜ヒツジ水液（ＡＡＦ）を採取し、4000g、20分の遠心で精製した。【０２０９】  凍結乾燥は既知の方法で完全に行われた。700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０２１０】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０２１１】  ９．２  錠剤の分析
一つの錠剤が100mlの水に加えられて、一分以内に完全に、すなわち肉眼では固形物の痕跡は見られない状態に、溶解された。【０２１２】  各々の錠剤の力価はＳＰＦ卵のなかで評価され、ＩＢ−ＨＩ２０とＮＤＶ−ＶＨ（鳥禽）に対して105.80EID50/錠剤と105.50EID50/錠剤であることが判明した。【０２１３】  例１０
１０．１  ヒツジポックス生ウィルスを含む発泡錠剤の調製
ウィルス繁殖はプラスティックローラー中で成育されたヴェロ細胞でなされた。【０２１４】  凍結乾燥は既知の方法に従って行われた。【０２１５】  700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０２１６】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０２１７】  １０．２  錠剤の分析
各々の錠剤の力価は105.85TCID50/錠剤と評価された。【０２１８】  ヒツジポックスワクチンのウィルスはヴェロ細胞で滴定された。【０２１９】  例１１
１１．１  リンダーペスト生ワクチンウィルス（キャスル）を含有する発泡錠剤の調製
ウィルス繁殖はプラスティックローラー中で成育されたヴェロ細胞でなされた。【０２２０】  凍結乾燥は既知の方法に従って行われた。【０２２１】  700mgの錠剤が実験例１で詳述された方法に従って調製された。【０２２２】  各々の錠剤は140mgの凍結乾燥物を含有する。【０２２３】  １１．２  錠剤の分析
各々の錠剤の力価は104.1TCID50/錠剤と評価された。【０２２４】リンダーペストワクチンのウィルスはヴェロ細胞で滴定された。【０２２５】  １１．３ワクチン組成物のカラーコーディング
イスラエル特許番号第46189号は、生体組織に対して安全性を持ち、ウイルスの生存も損なわない異なる色素で染色されたカラーコーディングされた家禽に対するウイルスワクチンを開示した。それぞれのワクチンはそれぞれ異なった色素でカラーコーディングされる。適当な色素としては、たとえば、アマランス赤色素、タルトラジン黄色素、インジゴカルミン青色素またはそれらのいずれかの混合物で独特の色合いを生じたものなどがある。【０２２６】  様々な異なるタイプのワクチンを異なったコンストラクトをもつ色で色付けするプロセス（すなわち、カラーコーディング）は、鶏集団を一つの意図されたワクチンとは異なるタイプのワクチンで免疫することによって、実際に免疫しようとした病気に対して無保護の鶏達をさらすことによって農業従事者によってなされる間違いに有用である。そうした間違いはもしあったとしても通常手後れ状態(Too late)で発見され、多くのケースでは、農業従事者にとっては深刻な財政的損失および打撃に加えて、ワクチンそのものに対する不平となる。しかしながら、それ自身は安全な化学的色素は、ウイルスワクチンと組み合わせられるといくつかの問題と危険を惹起する。【０２２７】  家禽のワクチン接種は、生ウイルスの培養が最終産物に含まれるところの生ウイルスワクチンの使用ということを含んでいるし、生ウイルスは非常に繊細で容易に退化するので、技術的問題がたくさん含まれている。異なる着色剤および色素は化学的に活性で、すなわちそれらは酸化したり化学的に還元したりする。生きたウイルスはＰＨ条件、温度、放射、異なる金属イオンおよびその他の環境の変化に非常に敏感であり、それらが接触した化合物によって影響される。メチレン青またはフクシン赤、アニリン色素などの色素化合物は、ウイルスに毒性を持ち、おそらくそれらを注入された鶏や七面鳥に問題を起こす可能性がある。したがって、接触した時にウイルスの生存を損なわず生組織中での使用が安全であるような色素を選択する必要がある。現在養鶏産業で使用されている４種のもっとも一般的で重要なワクチンを特定するために、４種のカラーが選ばれた。すなわち、lentogenic種、またはイスラエルではコマロフchick種と呼ばれるが、でのニューキャッスル病ワクチンを同定するために赤の色素；コマロフーハイファあるいは”pullet”種のニューキャッスル病ワクチンを同定するための黄色素；ラリンゴトラカイテスワクチンを同定とるための青色素；鳥禽ポックスワクチンを同定するための緑色調。【０２２８】  イスラエル特許番号第46189号で開示されたように、様々な濃度のこうした色素が試され、最終的な容器に注入され乾燥（凍結乾燥）される前に、直接湿ワクチンと混合された。これらの色素がワクチンを損なわないことを確認するためいくつかの試験がなされた。【０２２９】  異なる色素添加されたワクチンのバッチが、冷蔵庫での冷却やその他の貯蔵条件下に置かれ繰り返しウイルス濃度を証明する滴定が実行された。色素無添加ワクチンの充分な対照実験が、すべての色素添加ワクチンの試験と平行して実施された。色素添加ワクチンは、その効果が生きた鳥類で直接見られるかどうかも試験された。この実験で使用された４つのタイプのワクチンと４つの色素す��てを用いた繰り返し試験は、これがウイルス滴定結果には悪い影響を持たないことを示した。生きた鳥類での注入実験と、その他の方法によるウイルスワクチンの投与、たとえば飲料水を通したもの、皮膚を通したはりつけ方法（烏禽ポックスワクチン）、vent-brush法（喉頭気管炎ワクチン）などは、色素は鳥に有害な影響は持たないことを示し、筋肉注射で注入した場合は、組織に再吸収され３６時間以内に完全に消失することが分かった。イスラエル特許番号第46189号は生後１日目から市場に出荷される日までこうした色素添加ワクチンを与えた農場のいくつかの群での試験結果を開示した。これらの鶏は市場に出荷されても色素に関する問題は生じなかった。【０２３０】  イスラエル特許番号第46189号によった開示された発明のさらなる詳細は、以下に示される実験例との関連で容易に理解されるし、それらの例はカラーコードされたワクチン処方をこの分野の熟練者が使用できるように例示として選択されたのであって、本発明になんらの制限を与えるものではない。【０２３１】  例  Ａ
アマランス赤色素は、ビネランドニュキャッスル“chick”ワクチンと混合するために、濃縮色素液を作って調製された。この濃縮液は４リットルの蒸留水中に溶解した145グラムの乾燥色素粉末を含有する。この濃縮色素溶液は調製後すぐに20psi、20分間熱滅菌され、暗所で密封ガラス瓶中に保存された。この濃縮色素溶液は1、33%の濃度でビネランドニュキャッスル“chick”ワクチンに添加された。【０２３２】  色素無添加対照と比較された色素添加ワクチンの滴定結果は以下のようであった。【０２３３】  凍結乾燥後２週目の滴定
無添加  109.0 EID50/ml
添加  109.5 EID50/ml
加速滴定
無添加  109.1 EID50/ml
添加  109.3 EID50/ml
凍結乾燥後３０日目の滴定
無添加  109.16 EID50/ml
添加  109.3 EID50/ml
凍結乾燥後３ヶ月目の滴定
無添加  108.86 EID50/ml
添加  109.3 EID50/ml
凍結乾燥後６ケ月日の滴定
試料のみ
添加  109.16 EID50/ml。【０２３４】  例  Ｂ
タルトラジン黄色素は、ビネランドニュキャッスルpullet種ワクチン（メソジェニック・ハイファーコマロフ種）と混合するために、濃縮色素液を作って調製された。この濃縮液は３リットルの蒸留水中に溶解した２００グラムの乾燥色素粉末を含有する。この濃縮色素溶液は調製後すぐに20psi、20分間熱滅菌され、暗所で密封ガラス瓶中に保存された。この濃縮色素溶液は３％の濃度でビネランドニュキャッスルpulletワクチンに添加された。【０２３５】  色素無添加対照と比較された色素添加ワクチンの滴定結果は以下のようであった。【０２３６】  レギュラーワクチンの滴定結果
109.4EID50 / ml
色素添加試料の滴定結果  108.8
凍結乾燥後37°C保温７日目の滴定
無添加  108.3 EID50/ml
添加  108.8 EID50/ml
凍結乾燥後39日目の滴定
無添加  108.66 EID50/ml
添加  108.9 EID50/ml
凍結乾燥後93日目の滴定
無添加  108.66 EID50/ml
添加  108.66 EID50/ml
凍結乾燥後７．５ヶ月日の滴定
無添加  108.53 EID50/ml
添加  108.76 EID50/ml。【０２３７】  例  Ｃ
インジゴカルミン青色素は、ビネランド注入ラリンゴトラカイティスワクチンと混合するために、濃縮色素液を作って調製された。【０２３８】  この濃縮液は３リットルの蒸留水中に溶解した200グラムの乾燥色素粉末を含有する。この濃縮色素溶液は調製後すぐに20psi、20分間熱滅菌され、暗所で密封ガラス瓶中に保存された。この濃縮色素溶液は３％の濃度でビネランド注入ラリンゴトラカイティスワクチンに添加された。【０２３９】  色素無添加対照と比較された色素添加ワクチンの滴定結果は以下のようであった。【０２４０】  凍結乾燥後３週目の滴定
無添加  105.3 EID50/ml
添加  106.46 EID50/ml
加速滴定
無添加  105.0 EID50/ml
添加  104.0 EID50/ml
凍結乾燥後  30日目の滴定
無添加  106.0 EID50/ml
添加  105.0 EID50/ml
凍結乾燥後３ヶ月日の滴定
無添加  105.66 EID50/ml
添加  105.5 EID50/ml
凍結乾燥後７ヶ月日の滴定
無添加  105.5 EID50/ml
添加  105.6 EID50/ml
（これらは色素添加、無添加に対して幾分異常な滴定ドロップであり、加速バッチは加速滴定に関しての１logドロップは、多分バッチ中の高湿度を示している結果である）。【０２４１】例  Ｄ
Ｐ（Poxから）とコードされた緑色調は、インジゴカルミンおよびタルトラジン色素の混合で得られ、ビネランド鳥禽ポックスワクチンとの混合に使用された。３リットルの蒸留水中に100グラムの乾燥色素粉末が溶解された。【０２４２】  実験例２および３と同様な方法が使用され、この溶液は３％の濃度で最終フクローポックスワクチンに添加された。【０２４３】  色素無添加対照と比較された色素添加ワクチンの滴定結果は以下のようであった。【０２４４】  凍結乾燥後７日目の滴定
無添加対照  105.6 EID50/ml
添加ワクチン  105.5 EID50/ml
３ヶ月目の滴定
無添加対照  105.4 EID50/ml
添加ワクチン  105.5 EID50/ml
６ヶ月目の滴定
無添加対照  105.35 EID50/ml
添加ワクチン  105.4 EID50/ml
９ヶ月目の滴定
無添加対照  103.1 EID50/ml
添加ワクチン  105.3 EID50/ml
上記の詳述は、この分野の技術を持つ人が本発明をどのように実行するかについて教示するためのもので、明確な変更、変法のすべてを記述することを意図したものではなく、それは当業者には読んで明らかになるであろう。しかしながら、そうした明白なすべての変更、変法は今回の発明の範囲に含まれており、それは特許請求の範囲によって定義される。