(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＮＨａｓｅ遺伝子クラスターに存在する遺伝子の発現を促進させるタンパク質
【請求項２】
以下の(a)のDNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリル代謝に関わる発現調節因子、及び当該発現調節因子を利用した遺伝子高発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、既に放線菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウスJ1(FERM BP-1478)由来のタンパク質（H-ニトリルヒドラターゼ）誘導発現系を開発している（非特許文献１参照）。この発現系は、尿素を誘導剤として培地に添加した場合、無細胞抽出液中の全可溶性タンパク質の50％以上を占めるほどのH-ニトリルヒドラターゼ（ニトリルをアミドに水和する酵素）を大量に発現する。即ち、当該発現系では非常に強力な転写活性を持つ誘導型プロモーターが関与している。
【０００３】
しかしながら、上記知見は、ロドコッカス・ロドクロウスJ1株という一部の放線菌のみについて得られたものであるため、発現系の応用範囲を広げるためには他の属に属する菌由来の発現系を利用できるようにすることが望まれている。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.93, p.4267-4272 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、ロドコッカス属微生物で開発されたタンパク質（H-ニトリルヒドラターゼ）の誘導型発現調節機構以外にもニトリル代謝に関わる発現調節因子を開発することを目的とする。さらに、当該発現系を用いて種々のタンパク質又は生理活性物質の大量生産への応用を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)Ｂ23株がニトリル代謝に関わる発現調節因子を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００６】
（１）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、遺伝子発現の調節活性を有するタンパク質
（２）以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、遺伝子発現の調節活性を有するタンパク質をコードするDNA
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、シュードモナス属細菌由来のニトリル代謝発現調節因子が、ニトリル代謝経路に関わる各種酵素遺伝子の発現を調節していることが明らかとなった。この発現調節因子は、目的遺伝子の高発現系として利用できるため、各種有用物質の生産菌として工業的に広く利用されている種々の微生物にも応用することが可能となる。さらに、本発明の発現系は、ニトリルヒドラターゼ以外の有用タンパク質の大量発現系を可能にするものであり、抗生物質又は生理活性物質の生産、あるいは有用酵素の生産等を必須とする各分野に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)B23株のニトリル代謝経路の発現調節を司るNhpR遺伝子(nhpR)に関するものである。NhpR遺伝子の発現産物であるNhpRによりAldoxime dehydratase遺伝子及びその下流の遺伝子が発現してニトリル代謝経路が機能するようになる（図１）。
本発明は、NhpR遺伝子と、NhpR遺伝子により制御されるプロモーターとの構築物、あるいは当該構築物に目的タンパク質遺伝子を連結させた遺伝子発現カセットを作製して宿主細菌に導入することで、目的遺伝子（構造遺伝子）の発現物質を極めて高効率で生産することができる点に特徴を有するものである。
本発明において用いるB23株では、誘導剤としてアミドを用いることによりニトリルヒドラターゼ（NHase）が全可溶性タンパク質の50％も発現する。本発明者はこの点に着目し、B23株には、非常に強い誘導型プロモーターが存在するものと考え鋭意検討を行った。そして、誘導剤と各種の酵素活性を測定したところ、酵素の反応産物で誘導がかかることを見出した。
一般的には基質で誘導がかかるが、産物で誘導がかかる誘導型プロモーターはこれまでに知られていなかった。他の一般的な誘導型プロモーターの系では、添加した誘導剤が基質としても利用されるため時間の経過とともに実効誘導剤濃度が減少するが、この系を利用すれば、添加した誘導剤が分解されずに済むため、実効持続時間が長く保たれ実用的である。
また、本発明においては、無毒性かつ安価なアミドを誘導剤として利用することができるため、異種タンパク質生産や有用物質生産への応用が可能である。さらに、NhpR遺伝子は、染色体上１コピーであるにも関わらず全可溶性タンパク質の50％を占める発現量をもたらす。この発現系は、現在までに報告のある大量発現量を凌駕するものであり、本発明の誘導型高発現系は大腸菌でのlac, tacプロモーターやT7発現系等のツールとしての貢献も期待できる。
【０００９】
１．NhpR遺伝子の作製
NhpR遺伝子は、化学的合成法、ＰＣＲ法、遺伝子ウォーキング法、又は当該塩基配列を有する遺伝子 断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法等によって得ることができる。本発明では、B23株からゲノムDNAを採取し、Aldoxime dehydratase遺伝子の上流をウォーキング（染色体歩行）により取得すればクローニングできる。
化学合成、染色体歩行、PCR、ハイブリダイゼーション法の技術は、当分野において周知であり、使用する試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。
ニトリル代謝経路の発現調節機構を担うNhpR遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、配列番号1によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明においては、配列番号2に示すアミノ酸配列のほか、当該アミノ酸配列において１個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、NhpR活性を有するタンパク質（変異型NhpR）も本発明に含まれる。また、配列番号１に示す塩基配列を含むDNAのほか、当該塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NhpR活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子（変異型NhpR遺伝子）も、本発明に含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。
NhpR活性とは、NHase遺伝子クラスターを構成する遺伝子群とNitR自身を正に調節する活性をいう。
【００１０】
２．発現用DNA構築物の作製
(1) プロモーター
本発明は、NhpR遺伝子及び該遺伝子により制御されるプロモーターを含むDNA構築物に関する。また、上記DNA構築物に、NHase遺伝子クラスターに含まれるタンパク質をコードする遺伝子及び/又は発現の目的遺伝子が連結された遺伝子発現カセットに関する。
【００１１】
NHase遺伝子クラスターとは、NhpRにより制御されるプロモーターにより発現調節される複数の遺伝子群を意味し、クラスターに含まれる遺伝子の種類と転写開始点により３種類のクラスターが存在する。
すなわち、NHase遺伝子クラスターには、NhpRをコードする遺伝子（nhpR）、アルドキシム デヒドラターゼ(Aldoxime dehydratase)をコードする遺伝子(oxdA)、アミダーゼ(Amidase)をコードする遺伝子(amiA)、ニトリルヒドラターゼ(NHaseα及びβ)をコードする遺伝子（それぞれnhpA、nhpB）、機能未知のタンパク質をコードする遺伝子(nhpC)、機能未知タンパク質をコードする遺伝子(nhpS)及びアシルCoA合成酵素をコードする遺伝子(acsA)が存在し、oxdA上流、nhpA上流及びacsA上流の３カ所に転写開始点が存在する（図２）。そして、oxdAからnhpCまで（oxdA-nhpC）、nhpAからnhpCまで（nhpA-nhpC）及びnhpSからacsAまで（nhpS-acsA）の３つの転写単位が存在する（図２の(1)〜(3)の矢印）。さらに、NhpRはoxdAからacsAまでの転写とnhpR自身の転写を促進する。
本発明のDNA構築物は、NhpR発現調節機構を利用するものである。このNhpR発現調節機構は、発現目的の遺伝子の上流域にコードされている転写開始点がその下流に存在する転写活性化タンパク質遺伝子の発現を制御するという機構が考えられる（図２）。
本発明では、このNHase発現調節機構のうち、NhpR遺伝子、以下のプロモーターとそれにより転写調節されるタンパク質遺伝子を誘導型高発現系モデルの構築のために用いている。
【００１２】
NhpR遺伝子により制御されるプロモーター1〜3、及びこれらのプロモーターにより転写される遺伝子クラスターを以下に示す。
(i)プロモーター1
存在位置：oxdAの上流
転写調節する遺伝子クラスター：oxdA、amiA、nhpA、nhpB及びnhpC（oxdA-nhpC）
(ii)プロモーター2
存在位置：nhpAの上流
転写調節する遺伝子クラスター： nhpA、nhpB及びnhpC（nhpA-nhpC）
(iii)プロモーター3
存在位置：nhpSの上流
転写調節する遺伝子クラスター： nhpS及びacsA（nhpS-acsA）
【００１３】
本発明において用いることができる上記プロモーターは、NHase遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことが可能であるが、切り出すために都合の良い制限酵素部位が存在するとは限らない。そこで、適当な制限酵素認識部位を設けたプライマーを設計し、NHaseの構造遺伝子の上流領域中の所望のプロモーター領域を鋳型としてPCRにより増幅することにより、本発明において用い得るプロモーター領域のDNA断片を得ることができる。また、本発明において判明したプロモーターの塩基配列情報に基づいて、化学合成することも可能である。
【００１４】
ここで、「プロモーター活性」とは、本発明のプロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性を意味する。例えば、プロモーター１のプロモーター活性は、oxdA-nhpCの転写を調節する活性を意味し、プロモーター2のプロモーター活性は、nhpA-nhpCの転写を調節する活性を意味し、プロモーター3のプロモーター活性は、nhpS-acsAの転写を調節する活性を意味する。
また、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。
【００１５】
上記プロモーターへの変異の導入は、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばTaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等（タカラバイオ社製））、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）等を用いて行うことができる。
【００１６】
(2) 制御タンパク質遺伝子
本発明において、oxdA遺伝子、nhpA遺伝子、nhpB遺伝子、nhpC遺伝子、nhpS遺伝子、及びacsA遺伝子は、NHase遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことが可能であるが、切り出すために都合の良い制限酵素部位が存在するとは限らない。そこで、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望の遺伝子領域を増幅することにより上記遺伝子のDNA断片を得ることができる。また、既に判明している塩基配列情報をもとにして、上記遺伝子を化学合成することも可能である。
【００１７】
本発明において使用される上記遺伝子の塩基配列及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
0005183265.tif 000002
【００１８】
また、本発明においては、表１に示す遺伝子の変異体（変異型遺伝子）を使用することも可能である。変異型遺伝子は、プロモーターに変異を導入する方法と同様の手法で作製することができる。
【００１９】
上記遺伝子の変異型は、以下の(a)〜(c)のいずれかのものを含む。
(a)表１に示すアミノ酸配列において１個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、それぞれの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(b) 表１に示す遺伝子の塩基配列のうち1個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってそれぞれの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c) 表１に示す遺伝子の塩基配列又は上記(a)若しくは(b)の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、それぞれのタンパク質の活性は以下の通りである。
OxdA：アルドキシムデヒドラターゼ活性
NhpA：NHaseを構成するαサブユニット
NhpB：NHaseを構成するβサブユニット
NhpC：機能未知
NhpS：機能未知
AcsA：アシルCoA合成酵素活性
【００２０】
また、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。
【００２１】
上記遺伝子への変異の導入は、前記プロモーターの項で説明した方法と同様、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて行うことができる。
【００２２】
本発明のDNA構築物においては、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、選択マーカー、ターミネーターなどを連結することができる。
【００２３】
また、本発明のDNA構築物には、上記(5)のターミネーターとは別のターミネーターを連結してもよく、当該ターミネーター領域は、例えば、H-NHase遺伝子プロモーターの上流に存在させることが好ましい。
【００２４】
３．目的構造遺伝子の発現
(1) 組換え発現ベクターの作製
本発明の組換え発現ベクター は、ベクターDNA中に、前記本発明のDNA構築物を機能的に含むものである。ここで、「機能的に」とは、本発明のDNA構築物が発現又は機能するように、という意味であり、後述の宿主に導入したときにそれぞれの遺伝子が発現し得る状態を意味する。
【００２５】
ベクターDNAに本発明のDNA構築物を連結及び挿入する順序は、上記「機能的」である限り（転写方向が考慮されている限り）限定されるものではなく任意であるが、NhpR遺伝子、プロモーター、発現の目的遺伝子の順序で連結されていることが好ましい。
【００２６】
発現目的の遺伝子（目的遺伝子）に、予めプロモーター及びターミネーターが連結された遺伝子発現カセットを作製しておいて、これをベクター に組み込むことも可能である。
【００２７】
本発明の組換え発現ベクター は、宿主細胞に保持され、当該宿主菌体内において自立複製に関与するものであることが必要である。従って、本発明の組換え発現ベクターは、本発明のDNA構築物と、宿主菌体内において自律複製に関与するDNAとをそれぞれ機能的に含むベクターである。但し、インテグレーションベクターとして用いる場合は、当該宿主菌体内において自立複製に関与しないベクターとすることもできる。
【００２８】
ここで、「自立複製に関与する」とは、宿主菌体内での自立複製を司る機能に関与するという意味であり、この自立複製は、複製起点を含む配列により行われる。
【００２９】
上記自立複製に関与するベクター としては、例えば、プラスミド DNA、ウイルス、バクテリオファージ、細菌の染色体等が挙げられる。また、ゲノムインテグレーションにより導入するための発現用組換えDNA断片として、PCR法又は化学合成により作製されたものを使用することも可能である。
【００３０】
プラスミド DNAとしては、例えば、放線菌由来のプラスミド（例えば、pIJ486）、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13, YEp24, YCp50）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11）等が挙げられる。
【００３１】
また本発明の発現ベクター は、所望の宿主内で安定な発現ベクターとして機能し得る。NhpR遺伝子と、上記プロモーターとを含む遺伝子構築物を宿主に組み込んで、当該構築物の発現制御機能により、宿主中に存在する目的遺伝子を発現させることが可能である。例えば、NhpR遺伝子と前記プロモーター１との構築物を宿主に導入すると、宿主におけるoxdA、amiA、nhpA、nhpB及びnhpCの遺伝子クラスターの転写活性を生ずることができる。また、NhpR遺伝子と前記プロモーター3との構築物を宿主に導入すると、宿主におけるnhpS及びacsAの遺伝子クラスターの転写活性を生ずることができる。プロモータ１とプロモーター３を組み合わせると、宿主において、図２に示すすべての遺伝子クラスターの転写活性を生ずることが可能である。
【００３２】
(2) 目的構造遺伝子
本発明においては、発現目的の構造遺伝子（目的遺伝子）を所望のプラスミドのマルチクローニングサイト（MCS）等に組み込んで用いることも可能である。
【００３３】
目的遺伝子としては、動物由来遺伝子、植物由来遺伝子及び微生物由来遺伝子等から任意に選択することができ、限定されるものではない。具体的には、ニトリラーゼ遺伝子、アルドキシムデヒドラターゼ遺伝子、ニトリルヒドラターゼ遺伝子、イソニトリルヒドラターゼ遺伝子、カテコール2,3ジオキシゲナーゼ遺伝子、N-置換ホルムアミド分解酵素遺伝子、アミダーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子及びコレステロールオキシダーゼ遺伝子等が好ましく例示できる。 以下、ニトリルヒドラターゼ(NHase)遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を構造遺伝子とする場合を例に説明する。
【００３４】
(i) NHase遺伝子
本発明において、発現の目的となるNHase構造遺伝子を有する細菌は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有し、ニトリル化合物を水和して対応するアミド化合物を生成させることができる細菌であれば特に制限はされるものではない。例えば、以下の微生物を好適な例として挙げることができる。
【００３５】
シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)B23株
ノカルジア・エスピー(Nocardia sp.)N-775（特公昭56-17918号）
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J-1（特公平06-55148号）
クレブシエラ・エスピー(Klebsiella sp.）MCI2609（特開平05-30982号）
エアロモナス・エスピー(Aeromonas sp.）MCI2614（特開平05-30983号）
シトロバクター・フロンディ(Citrobacter freundii)MCI2615（特開平05-30984号）
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)IAM13570及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) （特開平05-103681号) 
キサントバクター・フラブス(Xanthobacter flavas)JCM1204（特開平05-161495号）
エルウィニア・ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens)MAFF03-01435
エンテロバクター・エスピー(Enterobacter sp.）MCI2707（特開平05-236975号）
ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.）MCI2691（特開平05-236976号）
リゾビウム・エスピー(Rhizobium sp.)MCI2610、リゾビウム・エスピー MCI2643、リゾビウム・ロティ（Rhizobium loti)IAM13588、リゾビウム・レグミノサーラム(Rhizobium legminosarum)IAM12609及びリゾビウム・メリオティ(Rhizobium merioti)IAM12611（特開平05-236977号）
【００３６】
キャンディダ・グイリエモンディ(Candida guilliermondii)NH-2、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)NH-3及びクレブシエラ・ニュウモニアエ・サブスピーシスニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae)NH-26T2（特開平05- 15384号）
アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)SC-C15-1（特開平06-14786号）
バチルス・スミシー(Bacillus smithii) SC-J05-1（特開平07-25494号）
シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)ATCC19285（特開平08-56684号）
シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)JCM3095（特開平09-275978号）
【００３７】
上記菌体からのNHase遺伝子のクローニングは、公知の任意の手法により得ることができる（Sabrook J., Molecular Cloning, CSHL Press (2001), Methods in Enzymology 194 (1991)）。NHaseのアミノ酸配列、NHaseをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、J. Bacteriol. 173 (8), 2465-2472 (1991)に記載されている。
【００３８】
また、本発明においては、NHase遺伝子の変異体（変異型遺伝子）を使用することも可能である。さらに、NHase遺伝子又はその変異型と他の遺伝子又はその変異型との融合遺伝子を含むベクターを構築しておいて、NHase遺伝子及び他の遺伝子の発現により生産されるポリペプチドが融合タンパク質になるように、両遺伝子を結合させることもできる。本発明において、このような2種類以上の遺伝子を結合させ、発現産物が融合タンパク質になるように構築した遺伝子を「融合遺伝子」という。融合遺伝子を作製するには、一方のDNAを適当な制限酵素で切断し、これに、同じ制限酵素で切断しておいた他方のDNAを、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の読み枠がずれないように連結する方法などが採用される。
【００３９】
上記NHase遺伝子の変異型は、以下の(a)〜(c)のいずれかのものを含む。
(a) NHaseのアミノ酸配列において１個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ニトリルヒドラターゼ酵素活性(NHase活性)を有するタンパク質をコードする遺伝子
(b) NHase遺伝子の塩基配列のうち1個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってNHase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００４０】
(c) NHase遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NHase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。また、「NHase活性」とは、ニトリルを水和してアミドを生成する反応を触媒する活性を意味する（下記式I)。
R-CN ＋ H2O → R-CONH2             (I)
なお、上記NHase活性は、ニトリルを基質として反応させ生じるアミドを定量（B23のNHaseの場合は、プロピオニトリルを基質として反応させ生じるプロピオアミドを定量）することにより測定することができる。
【００４１】
(ii)ニトリラーゼ遺伝子
ニトリラーゼ構造遺伝子は、ニトリラーゼ酵素活性を有し、ニトリル化合物を加水分解して対応する有機酸とアンモニアを生成させることができる細菌から得ることができる。ニトリラーゼ構造遺伝子を有する上記細菌としては、例えば、以下の微生物が好ましく例示できる。
【００４２】
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) J1
ロドコッカス・ロドクロウス NCIMB40757（特公2000-501610号）
ロドコッカス・ロドクロウス NCIMB40833（特公2000-501610号）
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属sp. KO-2-4株（特公2002-527106号）
アルカリゲネス・フェカーリス 1650（特公2002-527106号）
アシネトバクター・エスピーAK226(FERM P-08271)（特開2005-176639）
アースロバクター・エスピー NSSC104[FERM BP-5829]（特開2003-274933）
アースロバクター・エスピーNSSC204[FERM BP-7662]（特開2003-274933）
大腸菌（Escherichia coli）（特表2005-509407）
シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)（特表2005-509407）
ストレプトミセス・ディベルサ（Streptomyces diversa）（特表2005-509407）
ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）（特表2005-509407）
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（特表2005-509407）
ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）（特表2005-509407）
枯草菌（Bacillus subtilis）（特表2005-509407）
サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）（特表2005-509407）
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（特表2005-509407）
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（特表2005-509407）
クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（特表2005-509407）
ハンセヌラ・プリモルファ（Hansenula plymorpha）（特表2005-509407）
アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）（特表2005-509407）
上記の各種微生物からのニトリラーゼ遺伝子のクローニングは、公知の任意の手法により行うことができる（Sambrook J., Molecular Cloning, CSHL Press (2001), Methods in Enzymology 194 (1991)）。なお、ニトリラーゼの構造遺伝子の塩基配列、ニトリラーゼのアミノ酸配列は、例えば、J. Biol. Chem. 267 (29), 20746-20751 (1992)に記載されている。
【００４３】
また、本発明においては、ニトリラーゼ遺伝子の変異体（変異型遺伝子）を使用することも可能である。さらに、ニトリラーゼ遺伝子又はその変異型と他の遺伝子又はその変異型との融合遺伝子を含むベクター を構築しておいて、ニトリラーゼ遺伝子及び他の遺伝子の発現により生産されるポリペプチドが融合タンパク質になるように、両遺伝子を結合させることもできる。本発明において、このような2種類以上の遺伝子を結合させ、発現産物が融合タンパク質になるように構築した遺伝子を「融合遺伝子」という。融合遺伝子を作製するには、一方のDNAを適当な制限酵素で切断し、これに、同じ制限酵素で切断しておいた他方のDNAを、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の読み枠がずれないように連結する方法などが採用される。
【００４４】
上記ニトリラーゼ遺伝子の変異型は、以下の(a)〜(c)のいずれかのものを含む。
(a) ニトリラーゼのアミノ酸配列において１個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ニトリラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(b) ニトリラーゼ遺伝子の塩基配列のうち1個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c)ニトリラーゼ遺伝子の塩基配列又は上記(a)若しくは(b)の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。
【００４５】
また、「ニトリラーゼ活性」とは、ニトリル基を加水分解してカルボン酸とアンモニアを生成する反応（下記式(II)）を触媒する活性を意味する。
【００４６】
R-CN + 2H2O → R-COOH + NH3 (II)
なお、上記触媒活性は、ベンゾニトリルを基質として反応させ生じる安息香酸を定量することにより測定することができる。
【００４７】
(3) 形質転換
宿主への発現ベクター の導入（形質転換）は、公知の方法により行うことができる。また、宿主にベクター DNAが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子等）を用いて行うことができる。
【００４８】
本発明において使用される宿主は、グラム陰性菌であることが好ましい。またグラム陰性菌としては、例えば大腸菌、シュードモナス属菌、アグロバクテリウム属菌が挙げられ、シュードモナス属に属するグラム陰性菌が好ましい。
【００４９】
宿主に発現ベクターを組み込むには、当業者に周知の任意の手法を用いることができる。
宿主への組換えベクターの導入方法は特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５０】
４．遺伝子発現産物の生産
本発明において、発現産物としての目的タンパク質（NHase等）又はその変異体は、宿主に目的遺伝子又はその変異型遺伝子が導入された形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。上記NHase等の発現産物は、上記培養物中に蓄積される。
【００５１】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００５２】
培養は、通常、振とう培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、10℃〜40℃、好ましくは28℃で12〜120時間行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
上記培養条件で培養すると、高収率で目的遺伝子の発現産物を生産することができる。
【００５３】
培養後、目的遺伝子の発現産物が菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより、当該発現産物を採取することができる。一方、目的遺伝子の発現産物が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から当該発現産物を採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する。
【００５４】
また本発明においては、生細胞を全く使用することなく反応を人工容器内で進行させる無細胞タンパク質合成法を採用することも可能である。
【００５５】
DNA上に暗号化された遺伝情報は、転写によりmRNAとなり、さらに翻訳されてタンパク質に変換される。人工容器内でこの転写・翻訳過程を再現してタンパク質を合成するためには、リボソーム、tRNA、各種タンパク質因子など、翻訳因子群を安定化し、目的に応じてmRNAを生産するシステムを構築することが必要である。このシステムを構築するため、本発明においては、例えば小麦胚芽を選択することができる。小麦胚芽には、種子が発芽してタンパク質合成を行なうための翻訳因子群が保存されている点で好ましい。
【００５６】
なお、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）などが挙げられる。
【００５７】
遺伝子発現産物が単離精製されたことの確認は、例えばSDS-PAGE等により、また活性の測定は、例えばHPLC等により行うことが可能である。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
NhpRのクローニング
現在までに、クローニングされているB23菌のNHase遺伝子クラスターの最も上流に位置するSphI-PstI断片（0.15-kb）をプローブとして、B23菌の染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーションを行った結果、5.2-kbのPstI断片にシグナルが得られた。そこで、B23菌の染色体DNAをPstI処理後5.2-kbの断片を回収し、PstIで切断したpUC18に連結し、大腸菌DH10B株の形質転換を行った。SphI-PstI断片（0.15-kb）をプローブとしてコロニーサザンハイブリダイゼーションを行い、シグナルが得られた形質転換体をpPCN11とした。プライマーウォーキングにより塩基配列を決定した。その結果、NhpR遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列を有することが分かった。配列番号１に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例２】
【００５９】
NhpRの機能
(1)相同性検索
NhpRの機能推定するため、アミノ酸配列の相同性を調べた。相同性検索は、BLAST検索することにより行った。
その結果、Rhodococcus rhodochrousJ1菌のニトリラーゼの転写を調節するnitRと２６％、Bradyrhizobium sp. Strain HW13のもつ、2,4ジクロロフェノキシ酢酸を分解する遺伝子の転写を調節するタンパク質であるcadRと２２％、Pseudomonas putida MT53のもつ、トルエンやキシレンを分解する遺伝子の転写を調節するXylS1と２３％の相同性を有することが分かった。
【００６０】
(2) orfR欠失変異株の作製
次に、B23菌の染色体上のnhpRを欠失させた、nhpR欠失変異株を作製した。
欠失変異株の作製は以下の通り行った。
nhpR遺伝子を含むHindIII-XhoI 断片（2.9-kb）を、クロラムフェニコール耐性かつB23菌で複製しないpSTV29のHindIII、SalIサイトに導入した。これとは別に、pUC-4Kを鋳型としてカナマイシン耐性遺伝子をPCR法で増幅した。本カナマイシン耐性遺伝子はHindIIIとXhoIを保持するため、以下のプライマーを使用し、カナマイシン耐性酵素のアミノ酸配列は変化させずHindIIIとXhoIを保持しないDNAとしてPCR法で増幅した。
Km-F： 5'-ATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3'（配列番号１５)
Km-R：5'-CGAGTGAGTAATCCGTGGGGT-3' （配列番号１６)
HindIII-F：5'-TCCGGTGAGAATGGCAACAGTTTATGCATT-3' （配列番号１７)
HindIII-R：5'-TCTGGAAAGAAATGCATAAACTGTTGCCAT-3' （配列番号１８)
XhoI-F：5'- TGGAATTTAATCGCGGCCTGGAACAAGACG-3' （配列番号１９)
XhoI-R：5'- CAACGGGAAACGTCTTGTTCCAGGCCGCGA-3' （配列番号２０)
増幅したDNAをHincIIで処理し、pSTV29に連結したnhpR遺伝子上のBalIサイトに導入した。この当該プラスミドをエレクトロポレーションでB23菌に導入し、形質転換体をカナマイシン含有プレートとクロラムフェニコール含有プレートにそれぞれストリークした。カナマイシン耐性かつクロラムフェニコール感受性を示す形質転換体を候補とし、PCRとサザンハイブリダイゼーションによりダブルクロスオーバーが起こっていることを確認した。
【００６１】
その結果、カナマイシン耐性遺伝子をnhpRの内部に挿入することで、nhpRが完全に機能できない変異体を作製することができた（図３）。
【００６２】
(3)生育曲線
nhpRがNHase遺伝子クラスターの遺伝子の発現を制御しているかどうかを調べるため、この欠失変異株を用いて野生型（WT）との生育の比較を行った。実験は以下の通り行った。
【００６３】
通常の最小培地として、1% シュクロース, 0.5%  (NH4)2SO4, 0.05% KH2PO4, 0.05% K2HPO4, 0.05%  MgSO4・7H2O および0.001% FeSO4・7H2O (pH 7.0)の組成の培地を使用した。また、N源をメタクリルアミドに変えた培地として、1% シュクロース, 0.5% メタクリルアミド, 0.05% KH2PO4, 0.05% K2HPO4, 0.05% MgSO4・7H2O および0.001% FeSO4・7H2O (pH 7.0)の組成の培地を使用した。それぞれの培地に当該欠失変異株やWTを植菌し、28℃で培養を行った。
【００６４】
結果を図４に示す。
図４において、左の図は通常の最小培地であるが、WTも欠失変異株も同じように生育している。これに対し、右側の図において、N源をメタクリルアミドに変えた培地ではWTは生育するのに対して、欠失変異株はほとんど生育できなくなった。メタクリルアミドをN源として資化するためにはNHase 遺伝子クラスターの遺伝子が発現する必要があるため、nhpRが機能できなくなった欠失変異株ではNHase遺伝子クラスターの遺伝子が発現しなくなったと考えられる。
【００６５】
(4)活性測定
nhpRの欠失変異株ではNHase遺伝子クラスターの遺伝子が発現できなくなっていることをより直接的に示すため、NHase遺伝子クラスター中に存在する、アルドキシムデヒドラターゼとNHaseの二つの酵素について、活性を調べた。
【００６６】
アルドキシムデヒドラターゼ活性測定は嫌気条件下、還元状態でブチルアルドキシムを基質とし生成するブチロニトリルを定量した。アルドキシムデヒドラターゼ活性の1ユニットを１分間に1μmolのブチロニトリルを生成する酵素量と定義した。NHase活性測定はブチロニトリルを基質とし生成するブチルアミドを定量した。NHase活性の1ユニットを１分間に1μmolのブチルアミドを生成する酵素量と定義した。
【００６７】
結果を図５に示す。
WTではメタクリルアミドで誘導をかけると、アルドキシムデヒドラターゼもNHaseも活性が見られるのに対し、欠失変異株ではメタクリルアミドで誘導をかけた状態でもアルドキシムデヒドラターゼもNHaseも活性が見られなかった。このことから、nhpRが機能しないとNHase遺伝子クラスターの遺伝子が発現しない、すなわちnhpRはNHase遺伝子クラスターの転写を促進する機能を有することが示された。
【実施例３】
【００６８】
RT-PCR
本実施例では、nhpRがどのようにNHase遺伝子クラスターの転写を制御しているかを調べるため、まず、このクラスターの転写単位をRT-PCRにより調べた。なお、転写単位とは、クラスター中のどの遺伝子とどの遺伝子がつながって転写されているのか（すなわちオペロンを形成しているのか）を意味する。
RT反応とPCR反応で用いたプライマーの設計位置を図６の矢印に示す。また、各プライマーの塩基配列を及び以下に示す。
【００６９】
RT1：5'-GCGTGGGGCGTGCCGATAAG-3'（配列番号２１）
RT2：5'-ACAGGCAGGCCTTGCGCATC-3'（配列番号２２）
RT3：5'-TTGCGCAGAATGAACCGTTG-3'（配列番号２３）
【００７０】
PCR反応
フォワードプライマー（F1）：5'-CCCATGCATCGACAACGTTC-3'（配列番号２４）
フォワードプライマー（F2）：5'-AAAATGGAAGCTACCGATAC-3'（配列番号２５）
フォワードプライマー（F3）：5'-GCTTGCCGACAGACTGGACC-3'（配列番号２６）
リバースプライマー(R1)：5'-ATAAGGCCTCGGTGTCAAAG-3'（配列番号２７）
リバースプライマー(R2)：5'-TGGGCAGATGGTCGACAAAC-3'（配列番号２８）
【００７１】
RT反応は以下の反応条件で行なった。
全RNAにRTプライマーを混合し、SuperScript III reverse transcriptaseを加え、50℃で200分反応させた。
また、PCR反応は以下の反応液及び反応サイクルで行った。
RT反応後のサンプルにプライマーを混合し、TaKaRa LA Taqを加え、94℃で1分反応後、98℃で10秒-68℃で15分を30サイクル反応させた。
【００７２】
結果を図６に示す。
RT１で逆転写反応を行い、F1とR1でPCRを行った場合、仮にaldoximedehydrataseからnhpCまでがつながって転写されていたとすると5.8kのバンドが出ることになる。
図６のレーン1では5.8kのバンドが出ていることから、AldoximedehydrataseからnhpCまでの５つの遺伝子はオペロンを形成していることが判明した。これに対し、RT2で逆転写反応を行い、F1とR1でPCRを行った場合は、バンドが出なかった（レーン２）。
【００７３】
また、RT3で逆転写反応を行い、F3とR2でPCRを行った場合、2.9kのバンドが確認されたのに対し（レーン３）、F2とR2でPCRを行った場合はバンドは確認できなかった（レーン４）。このことから、nhpSとacsAの転写はつながっており、nhpCとnhpSとの間は転写が途切れていることが判明した。
【実施例４】
【００７４】
転写開始点の同定
実施例３において、amidaseから始まりnhaseβサブユニットで終結するような転写単位、すなわち、Aldoxime dehydrataseからnhpCまでの転写単位と重なっているような転写単位が存在した場合、実施例３のRT-PCRでは把握することができない。そこで本実施例では、primer extension法を用いて、転写開始点を同定する実験を行った。
【００７５】
(1)転写開始点1
primer extension法の実験手法を以下に示す。
使用したプライマー配列：5'-TGTGCAAAGGCCAGGAAGCG-3'（配列番号２９）
γ-[32P] ATP存在下で当該プライマーにT4 polynucleotide kinase を作用させ、プライマーの5'末端を[32P]で標識した。抽出した全RNAに[32P]で標識した当該プライマーを混合し、SuperScript III reverse transcriptaseを加え、伸長反応を行った。
【００７６】
その結果、oxdAの上流に転写開始点が存在することが分かった（図７）。図７の泳動写真のうち、レーン1が誘導条件、レーン2が非誘導条件である。レーン1にのみ見られるバンドが現れた場合、そこに転写開始点があるということを意味し、さらに左側のDNAマーカーを参照することでその位置を特定することができる。
oxdAの転写開始点は翻訳開始コドンから233塩基上流に存在し、また、その上流のプロモーター領域にはシグマ54によって認識される-12,-24のコンセンサス配列が見つかった（図７）。
-12,-24のコンセンサス配列を含む塩基配列を以下に示す。
ACCCATCGCCGTTCCGCCTAGTTTTCACCTCACAGCAGCTCATCCCCGCACTGATGAGGCACCCCATGCATCGACAACGTTCACACCCCTTGCCGGACGCTTCCTGGCCTTTGCACACGC（配列番号３０）
SD配列及びoxdAを含む配列を以下に示す。
TGAAAATAACGAGGAGCCCAAGATGGAATCTGC（配列番号３１）
σ54コンセンサス配列を以下に示す。
TGGCACGnnnnTTGCA（配列番号３２）
転写開始点1付近の配列（電気泳動により配列決定した配列）を以下に示す。
GCCTAGTTTTCACCTCAC（配列番号３３）
原核生物では通常シグマ70が認識する-10,-35のコンセンサス配列が見つかる場合が多いが、oxdAのプロモーター領域には見つからなかった。
【００７７】
(2)転写開始点2
さらに、NHaseαサブユニット遺伝子の上流にも転写開始点を見つけることが出来た（図８）。
使用したプライマー配列：5'-TCGAAGGTGTCGCAGTCGTG-3'（配列番号３４）
翻訳開始コドンの34塩基上流に転写開始点は存在し、シグマ54が認識する-12,-24のコンセンサス配列に相同な配列が見つかった（図８）。
シグマ54が認識する-12,-24のコンセンサス配列、SD配列を含む配列を以下に示す。
TTTTACAGGCGCCGCCCCCCCTGAAGAACGATAAGAAAGACCGGCAAGTTGCAATGACTTTTCAACCGCGTTGACTGATAGGAGTTACCCCATGAGTACATCTATTTCCACGACTGCGACACCTTCGACACCCGGCGAGA（配列番号３５）
転写開始点2付近の配列（電気泳動により配列決定した配列）を以下に示す。
CGGCAAGTTGCAATGACT（配列番号３６）
転写開始点1及び2の配列は、いずれもシグマ54のコンセンサス配列との相同性は高くない。しかしながら、シグマ54はN源として必要な化合物を代謝する際に必要な遺伝子の転写に関わるということがわかっている。また、誘導剤として培地に添加されているメタクリルアミドはN源として代謝される。このため、メタクリルアミドによって誘導的に発現されるoxdAとNHaseのプロモーター領域に、シグマ54のコンセンサス配列と相同な配列が見つかってくることは理にかなっていると考えられる。
【００７８】
(3)転写開始点3
使用したプライマー配列：5'-AGTCGCCGACAACGCTGTCC-3'（配列番号３７）
nhpSの上流にも転写開始点が存在することがわかった(図９）。nhpSの翻訳開始コドンから276塩基上流に転写開始点は位置し、その上流にはシグマ54の認識する-12,-24コンセンサス配列に相同な配列が見つかった(図９）。
シグマ54が認識する-12,-24のコンセンサス配列を含む配列を以下に示す。
GAACTTCATCGAGCCATCGCAATGGCCGCGGGACGAATATCGGTTGCAGGGCATCATGGCCAAGTGGGACAGCGTTGTCGGCGACTGCCGACAGGAGCTGGTCTTCATCGGCCAGGGGCTCGACACCCGCGTCTTGCAGCGCGAACTCGACCATTGTTTG（配列番号３８）
転写開始点3付近の配列（電気泳動により配列決定した配列）を以下に示す。
TCGAGCCATCGCAATGGCC（配列番号３９）
【実施例５】
【００７９】
転写モデルの解析
上記実施例（RT-PCRとprimer extension）の結果から、図2に示す転写モデルが考えられる。このモデルでは、転写単位は３つ存在し、それぞれoxdAからnhpCまで、nhpAからnhpCまで、及びnhpSからacsAまでとなっている。
そこで本実施例では、これらの転写単位のうちnhpRが転写を促進しているのはどのmRNAかを調べるために、リアルタイムPCRを行った。
リアルタイムPCRの実験手法を以下に示す。
全RNAにランダムヘキサマーをプライマーとして混合し、SuperScript III reverse transcriptaseを加え、50℃で50分逆転写反応させた。
逆転写反応後のサンプルにそれぞれのプライマーを混合し、SYBR Premix EX Taqを加え、Thermal Cycler Dice Real Time System を使用して、95℃で10秒反応後、95℃で5秒-60℃で30秒を45サイクル反応させた。
nhpRの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
nhpR-F：5'-ACGAGAAGGTCGAGCAAAGC-3'（配列番号４０)
nhpR-R：5'-ACACGGCAATGGTCCTCGAC-3' （配列番号４１) 
oxdAの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
oxdA-F：5'-ACGCATCTCAAATGCCCACG-3' （配列番号４２)
oxdA-R：5'-TACTGCACGCCGAGATAACC-3' （配列番号４３)
amiAの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
amiA-F：5'-ACAGGACATCACCGGGCATC-3' （配列番号４４)
amiA-R：5'-GTCCACCGAGGCTTCAAACG-3' （配列番号４５)
nhpAの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
nhpA-F：5'-TCAAGAGCAAGGAACTCATC-3' （配列番号４６)
nhpA-R：5'-TTCCGTCCTTGAGCAGCAGC-3' （配列番号４７)
nhpBの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
nhpB-F：5'-TGCACCGCACCTCAGAGCAG-3' （配列番号４８)
nhpB-R：5'-CGTCACCCCATAGATCTTTC-3' （配列番号４９)
nhpCの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
nhpC-F：5'-GGACGAATATCGGTTGCAGG-3' （配列番号５０)
nhpC-R：5'-GCACTCAGCAAACAATGGTC-3' （配列番号５１)
nhpSの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
nhpS-F：5'-GACACAGGAAGTCACCCAAC-3' （配列番号５２)
nhpS-R：5'-GCAGCGGTTCCATTCACCTC-3' （配列番号５３)
acsAの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
acsA-F：5'-GATTATCTGCAGAGCGCCAC-3' （配列番号５４)
acsA-R：5'-CATGGCCATCCTGCGCTTCG-3' （配列番号５５)
発現量が一定の内部標準としてリボソームのrpsL遺伝子のmRNAを使用し、各遺伝子のmRNA量は内部標準遺伝子の相対値として比較した。
rpsLの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
rpsL-F：5'-AAACCGTTGGTCAGACGCAC-3' （配列番号５６)
rpsL-R：5'-ACGTCGTGGCGTATGCACTC-3' （配列番号５７)
結果を以下に示す。
【００８０】
(1) リアルタイムPCR（図10）
リアルタイムPCRによって、nhpR欠失変異株でメタクリルアミドによる誘導条件、非誘導条件、さらにWTでの誘導条件、非誘導条件でmRNA量の比較を行った。
oxdA, amidase nhpA, nhpB, nhpC nhpS, acsAいずれの場合もWTの誘導条件でのみmRNAの転写が促進されていることがわかった。また、nhpRについてもmRNA量を調べてみたところ、メタクリルアミドによって誘導的に発現している事がわかった。
(2) 転写モデル（図２）
リアルタイムPCRの結果から、NhpRはメタクリルアミド存在下で、oxdAからacsAまでの、クラスターの遺伝子すべての転写を促進していることが分かった。
本クラスターにはプロモーター領域がoxdA上流, nhpA上流, nhpS上流の３カ所存在しているため、nhpRはこの3カ所のプロモーター領域に作用して転写を促進しているものと考えられる。また、nhpR自身の転写もメタクリルアミド存在下で促進されていることから、nhpR自身がnhpRの転写を促進しているものと考えられる。
【実施例６】
【００８１】
B23菌では、培地中にメタクリルアミドを添加することで、菌の可溶性区分の５０%以上ものNHaseが発現されることが知られている。本発明において判明したモデルではnhpAのすぐ上流にプロモーターがあることから、このプロモーターからの転写が非常に強くなっている可能性があると考えられる。そこで本実施例では、この可能性を調べるために、nhpAから転写されるmRNAの量とoxdAから転写されるmRNAの量を比較する実験を行った。
実験手法を以下に示す。
全RNAにnhpC-Rをプライマーとして混合し、SuperScript III reverse transcriptaseを加え、50℃で200分逆転写反応させた。
逆転写反応後のサンプルにそれぞれのプライマーを混合し、SYBR Premix EX Taqを加え、Thermal Cycler Dice Real Time System を使用して、95℃で10秒反応後、95℃で5秒-60℃で30秒を45サイクル反応させた。
oxdAの転写を調べるためには、oxdA-FおよびoxdA-Rを使用した。
amiAの転写を調べるためには、以下のプライマーを使用した。
amiA2-F：5'-TACCCTCGACCAGGTTTTAG-3' （配列番号５８)
amiA2-R：5'-TAGGCGTCGAAACTCGGTTG-3' （配列番号５９)
nhpAの転写を調べるためには、nhpA-F およびnhpA-Rを使用した。
結果を図11に示す。
リアルタイムPCRにより、メタクリルアミドによる誘導時のoxdA,amidase,nhpAのmRNA量を比較した。
oxdAとamidaseのmRNAの量はoxdA上流から転写されたmRNAの量を反映しており、nhpAのmRNA量はoxdA上流からの転写とnhpAからの転写を合わせたmRNA量を反映している。
実験の結果、nhpAのmRNA量はoxdA, amidaseのmRNA量の約３倍になった。このことから、oxdA上流から転写されるmRNAとnhpA上流から転写されるmRNAの量比は１：２であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】シュードモナス・クロロラフィスB23株のニトリル代謝経路を示す図である。
【図２】NHase遺伝子クラスターの転写モデルを示す図である。
【図３】nhpR欠失変異株の作製の概要を示す図である。
【図４】B23野生株及びnhpR欠失変異株における生存曲線を示す図である。
【図５】B23野生株及びnhpR欠失変異株におけるoxdAとNHaseの活性を比較した図である。
【図６】RT-PCRによる転写単位の解析結果を示す図である。
【図７】oxdAの上流に転写開始点が存在することを示す図である。
【図８】NHaseαサブユニット遺伝子の上流に転写開始点が存在することを示す図である。
【図９】nhpS遺伝子の上流に転写開始点が存在することを示す図である。
【図１０】リアルタイムPCRによる各mRNA量の比較実験の結果を示す図である。
【図１１】リアルタイムPCRによる各mRNA量の比較実験の結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号15〜59：合成DNA
配列番号32：nはa, g, c 又はtを表す（存在位置8-11）。
【図１】
0005183265.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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