(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を有するＲＮＡを複数種類含有する核酸試料と、それぞれの前記標的塩基配列に対応する塩基配列を有し、５’末端において基板表面に固定された複数種類の固相プライマーとを用いて、複数種類のＲＮＡを同一基板上で定量する方法であって、
（１）３’末端側にそれぞれのＲＮＡの前記標的塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端側に互いに同一なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する、前記複数種類のＲＮＡのそれぞれを鋳型とする複数種類の液相キメラプライマーと、逆転写酵素とを用いて前記ＲＮＡの標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するｃＤＮＡ鎖を合成し、複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を得る工程、
（２）工程（１）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のそれぞれの、ＲＮＡ鎖のみを分解する工程、
（３）工程（２）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖を、各々対応する前記固相プライマーとハイブリダイズさせた後、二本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（４）工程（３）で合成した複数種類の二本鎖ＤＮＡ上にそれぞれ存在する同一の前記プロモーター配列を介して複数種類の一本鎖ＲＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）で合成された複数種類の一本鎖ＲＮＡを、各々対応する前記固相プライマーとハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡ鎖を合成し、複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を得る工程、
（６）工程（５）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のそれぞれの、ＲＮＡ鎖のみを分解する工程、
（７）前記液相キメラプライマーにおける、３’末端側の前記標的塩基配列に相補的な塩基配列以外の塩基配列と相同的な塩基配列からなる１種類の液相ユニバーサルプライマーと、工程（６）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖のそれぞれとをハイブリダイズさせた後、複数種類の二本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（８）工程（３）及び（７）で合成された複数種類の二本鎖ＤＮＡをそれぞれ定量する工程、
を少なくとも備えることを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項２】
反応の全工程が、１の反応溶液中で行われることを特徴とする請求項１に記載の核酸の定量方法。
【請求項３】
前記液相ユニバーサルプライマーの濃度が、前記液相キメラプライマーの濃度の１０倍以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸の定量方法。
【請求項４】
前記基板が複数の凹部を有する基板であって、前記固相プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の定量方法。
【請求項５】
前記基板上に設けられた複数の前記凹部を全て覆うことが可能であるカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする請求項４に記載の核酸の定量方法。
【請求項６】
核酸増幅により合成された二本鎖ＤＮＡを、標識試薬を用いて定量することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸の定量方法。
【請求項７】
前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする請求項６に記載の核酸の定量方法。
【請求項８】
前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする請求項７に記載の核酸の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅技術を用いた核酸の定量方法に関するものであり、より詳しくは、ＤＮＡマイクロアレイ技術と核酸増幅とを組み合わせた核酸の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺炎は日本人の死因別死亡率で第４位、がん等の基礎疾患の合併症としてもしばしば起こり、罹患者数が非常に多い疾患として知られている。従来肺炎の原因となる微生物（原因菌）の探索試験として行われている培養検査は少なくとも数日の時間を要し、更に培養された原因菌について薬剤感受性試験を行うと１週間近くもかかることから、治療選択に十分寄与する検査方法にはなっていない。救急救命病室（ＩＣＵ）に入院が必要な重症の肺炎に関しては、迅速で正確な原因菌の決定が治療選択において極めて重要であり、適切な初期治療は肺炎患者の救命確率を確実に上昇させることが報告されている。しかし実際には、依然として培養法に代わる原因菌同定技術が確立されていないため、原因菌が不明の状態で治療を行わなければならないのが現状である。そのため、経験治療による抗生物質の使用がやむを得ず、耐性菌の出現にも繋がる虞がある。
【０００３】
肺炎の原因となる原因菌は、発生頻度の高い菌種が全体の５０％近くを占め、ウイルスまで含めた主な原因菌は２０−３０種類程度である。この中には通常の手法で培養できないものもあり、培養法による原因菌決定が困難である場合も多い。また、原因菌の種類によって最適な治療薬が異なるが、原因菌決定前に治療を開始するのも医療倫理上やむを得ない実情である。これらの問題を解決するために、複数の菌種の中から特定の菌を迅速かつ定量に検出可能な手法の開発が待たれていた。
【０００４】
細菌の同定に関しては、従来から用いられてきた培養を介した同定法や染色による同定法、ＡＴＰなど細菌の代謝に係る物質を計測する方法に加え、マイクロアレイ技術を用いた細菌同定法が開発されている。特に、ある細菌の遺伝子配列に特異的な塩基配列を有する核酸をプローブとして合成し、これを基板上に固定して検体から増幅された遺伝子とハイブリダイズさせる手法は、各菌種が持つ特異的な塩基配列を用いるため、正確な検出が可能であり、現在様々な形で応用が進められている（特許文献１−４、非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、従来のＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた微生物の検出方法では、わずかな感染量でも肺炎を起こす肺炎原因菌の検出や、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出するには有効であったが、定量的に再現よく解析することには問題があった。特に、菌量に依存して抗生物質を適宜選択して治療する必要がある肺炎においては、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することと、検出されたシグナルの定量的な解析が非常に重要である。定量的に解析する方法の一つとして、例えばリアルタイムＰＣＲによる検出方法がる。このリアルタイムＰＣＲでは、微量の検体量を用いて定量的に検出することが可能ではあるが、検査に時間を要し、また、再現良く定量を行うためには、鋳型やプライマー毎に定量に適したサイクル数を予め調べておく必要があり、操作が煩雑となる。
【０００６】
その他、複数種類の肺炎原因菌を検出し得る方法として、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法がある。ＮＡＳＢＡ法は、転写反応を利用したＲＮＡ特異的核酸増幅方法である。４１℃の一定の温度下で、ＲＮＡを鋳型として短時間で核酸増幅が行えるため、常温で反応が可能であり、温度調節機器等を必要としない。また、プライマーのＴｍ値等を考慮する必要もないため、簡便に複数種類の核酸を検出することが可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲとは異なり、ＤＮＡ存在下でＲＮＡの増幅、及び検出が行えるため、細菌の生存を評価することで死んだ細菌による擬陽性の可能性を取り除くことができる。このように、ＮＡＳＢＡ法は、複数種類の核酸を同時に、簡便に検出することは可能であるが、定量的に簡便に検出することは困難である。
【特許文献１】特開２００２−５１２６８８号公報
【特許文献２】特開２００６−０２５７９１号公報
【特許文献３】特開２００６−０６１１５５号公報
【特許文献４】特開２００６−３００２６８号公報
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３（２０）：１０６１４−９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、核酸増幅にＮＡＳＢＡを用い、簡便に定量測定が可能となる新しいマイクロアレイ技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の請求項１に係る核酸の定量方法は、標的塩基配列を有するＲＮＡを複数種類含有する核酸試料と、それぞれの前記標的塩基配列に対応する塩基配列を有し、５’末端において基板表面に固定された複数種類の固相プライマーを用いて、複数種類のＲＮＡを同一基板上で定量する方法であって、（１）３’末端側にそれぞれのＲＮＡの前記標的塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端側に互いに同一なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する、前記複数種類のＲＮＡのそれぞれを鋳型とする複数種類の液相キメラプライマーと、逆転写酵素とを用いて前記ＲＮＡの標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するｃＤＮＡ鎖を合成し、複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を得る工程、（２）工程（１）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のそれぞれの、ＲＮＡ鎖のみを分解する工程、（３）工程（２）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖を、各々対応する前記固相プライマーとハイブリダイズさせた後、二本鎖ＤＮＡを合成する工程、（４）工程（３）で合成した複数種類の二本鎖ＤＮＡ上にそれぞれ存在する同一の前記プロモーター配列を介して複数種類の一本鎖ＲＮＡを合成する工程、（５）工程（４）で合成された複数種類の一本鎖ＲＮＡを、各々対応する前記固相プライマーとハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡ鎖を合成し、複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を得る工程、（６）工程（５）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のそれぞれの、ＲＮＡ鎖のみを分解する工程、（７）前記液相キメラプライマーにおける、３’末端側の前記標的塩基配列に相補的な塩基配列以外の塩基配列からなる１種類の液相ユニバーサルプライマーと、工程（６）で得られた複数種類のｃＤＮＡ鎖のそれぞれとをハイブリダイズさせた後、複数種類の二本鎖ＤＮＡを合成する工程、（８）工程（３）及び（７）で合成された複数種類の二本鎖ＤＮＡをそれぞれ定量する工程、を少なくとも備えることを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項２に係る核酸の定量方法は、請求項１において、反応の全工程が、１の反応溶液中で行われることを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項３に係る核酸の定量方法は、請求項１または２において、前記液相ユニバーサルプライマーの濃度が、前記液相キメラプライマーの濃度の１０倍以上であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項４に係る核酸の定量方法は、請求項１〜３のいずれか一項において、前記基板が複数の凹部を有する基板であって、前記固相プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項５に係る核酸の定量方法は、請求項４において、前記基板上に設けられた複数個の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項６に係る核酸の定量方法は、請求項１〜５のいずれか一項において、核酸増幅により合成された二本鎖ＤＮＡを、標識試薬を用いて定量することを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項７に係る核酸の定量方法は、請求項６において、前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項８に係る核酸の定量方法は、請求項７において、前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の核酸の定量方法によれば、標的塩基配列を有する核酸と基板上に固定した固相プライマーとを介して、核酸増幅により基板上に形成された二本鎖ＤＮＡを定量することが可能となる。そのため、標的塩基配列を有する核酸試料から、目的の標的塩基配列を有する単一または複数種類の核酸を同一基板上で簡便に定量することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の第一実施形態は、基板に固定した固相プライマーを介してＮＡＳＢＡ法により核酸増幅を行い、基板上に合成されたこの増幅産物を定量する方法である。
以下、図面を参照して説明する。
【００２１】
まず、図１(ａ)に示すように、基板１の表面１ａに固相プライマー２を固定した後、図１（ｂ）に示すように液相プライマー３、標的塩基配列を有する核酸４、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素、リボヌクレアーゼ、デオキシヌクレオチド、及び標識試薬、を含む反応溶液を基板上に導入し、反応（ＮＡＳＢＡ）を開始する。反応温度は、使用する各酵素を考慮して適宜決定することができる。例えば、４０℃〜４２℃が好ましい。
【００２２】
基板としては、熱可塑性樹脂を用いたプラスチック材料が好適である。このような熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂、等を用いることができる。このうち、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に優れた飽和環状ポリオレフィンを使用することが好ましい。
また、基板の形状としては特に限定されるものではなく、例えば、９６穴等のマルチプレートが挙げられる。また、板状の他に、例えば、フィルム状やシート状、チューブ状等を用いることができる。
【００２３】
固相プライマーは、各標的塩基配列に対応した配列を有する。ここで、対応した配列とは、標的塩基配列に相補的な、または相同的な配列である。複数種類の核酸を一度に定量するときは、非特異的増幅やプライマーダイマーの形成が起こらないように設計する。
また、５´側には基板と結合するためのリンカー部を有していることが好ましい。リンカー部は、基板に固定されるために用いられるのであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板表面上に活性エステル基がある場合、このエステル基との反応性を高めるため、５´側にアミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基を導入された固相プライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上に固定することができる。
【００２４】
本発明において、プライマーの設計、合成は当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。また、核酸増幅で増幅される塩基対数は、鋳型とする核酸の塩基配列や用いるポリメラーゼの活性等を考慮して適宜設定することができる。但し、長すぎると増幅精度が落ちるため、例えば、５０〜５００塩基対長であることが好ましい。
【００２５】
基板に固相プライマーを固定する方法としては、公知のものであれば限定されるものではなく、例えば、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が挙げられる。このプライマーを溶解または分散した液体としては、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができ、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）などが挙げられる。
【００２６】
特に、基板の表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、カルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が基板表面に存在するような場合には、この高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００２７】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００２８】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液等で洗浄するのが好ましい。洗浄後はプライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うのが好ましい。
【００２９】
このようなアルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等が挙げられる。
【００３０】
また、一級アミノ基を有する化合物としては、例えばグリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００３１】
ｓ  洗浄後は、７５〜８５℃の温度で1時間加熱することが好ましい。加熱処理の後、１２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを照射し、ＤＮＡを更に固定化することがより好ましい。また、固相プライマーの固定の際には、図１（ａ）に示すようにプライマーを立てて固定することが好ましい。プライマーを立てることにより、ｃＤＮＡから産生されたＲＮＡ鎖が捕捉されやすく、反応性が促進する。また、プライマーを立てることで、固相プライマーを起点として作製された二本鎖ＤＮＡに液相プライマーが結合しやすくなる利点もある。
【００３２】
また、基板上にゲルを展開させ、このゲルに固相プライマーを結合させることもできる。この場合、固相プライマーを三次元で固定できるので、より効率よく反応を進めることができる。このようなゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が挙げられる。
【００３３】
標的塩基配列を有する核酸とは、ｒＲＮＡやｍＲＮＡ等のＲＮＡである。また、天然の核酸でもよく合成された核酸でもよい。合成された核酸としては、例えばＲＮＡ増幅から得られたＲＮＡ等が挙げられる。
【００３４】
核酸試料としては特に限定されるものではなく、生体試料や、生体試料から得られた培養物、及びこれらの試料から主に核酸を抽出した試料であってもよい。また、株化した細胞、ＰＣＲにより合成した試料等を用いることもできる。これら核酸の抽出方法としては、特に限定されるものではなく、例えばチオシアン酸グアニジンを用いた方法等で行うことができる。その他、市販のキット等を用いてもよい。
【００３５】
デオキシヌクレオチドに関しては、通常ＮＡＳＢＡ法において用いられるものであれば特に限定されず、公知のものを用いることができ、また、標識等がされたものを用いてもよい。
【００３６】
次に、ＮＡＳＢＡによる反応として、まず図１（ｃ）に示すように、液相キメラプライマー３ａと逆転写酵素とを介して標的塩基配列を有する核酸（ＲＮＡ鎖）４のｃＤＮＡ鎖５を合成し、ＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を得る。その後、図１（ｄ）に示すようにＲＮＡ分解酵素を用いてＲＮＡ鎖を分解し、ｃＤＮＡ鎖５を一本鎖化する。
【００３７】
液相キメラプライマーは、固相プライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができるプライマーであって、各標的塩基配列に対応した配列を有し、かつ５´側にプロモーター配列を有する。
例えば、固相プライマーが標的塩基配列に相補的な塩基配列を有している場合、液相キメラプライマーは相同的な塩基配列を有している。プロモーター配列としては、ＲＮＡ合成酵素のプロモーターとして通常公知のものを適宜選択して用いることができ、例えば、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ−３´）、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ−３´）、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−３´）などが挙げられる。このうちＴ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列が好ましい。
また、後述のユニバーサルプライマーで説明するように、該ユニバーサルプライマーのプロモーター配列の下流に１〜２０塩基を付加した場合、液相キメラプライマーにおいても、プロモーター配列と標的塩基配列との間に、１〜２０塩基を付加することが好ましい。このような塩基配列としてはユニバーサルプライマーと相同な配列であって、ＡＧやＡＧＡＡＧＧ等が好ましく、ＡＧＡＡＧＧに更に７塩基を付加した配列が特に好ましい。
【００３８】
逆転写酵素には、Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｙｓ Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）から精製されるＡＭＶ逆転写酵素、または、Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素の組換え体クローンを発現する大腸菌から精製されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素等が挙げられるが、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素よりも高い伸長活性をもち、かつ活性温度が高いＡＭＶ逆転写酵素を用いることがより好ましい。
ここで説明した逆転写酵素により、試料中に含まれたＲＮＡ鎖から、ｃＤＮＡ鎖が合成され、ｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体が得られる。
【００３９】
ｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のＲＮＡ鎖の分解には、ＲＮＡ分解酵素を用い、特にＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のＲＮＡ鎖を分解するＲＮａｓｅＨを用いることが好ましい。
このＲＮＡ分解酵素によって、ＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のＲＮＡ鎖が分解され、一本鎖ｃＤＮＡが得られる。
【００４０】
次いで、図１（ｅ）に示すように、この一本鎖ｃＤＮＡ５を、固相に固定した固相プライマー２とハイブリダイズさせた後、二本鎖ＤＮＡ６を合成する。
逆転写酵素として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性能を併せ持つ逆転写酵素を用いた場合には、この逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により、二本鎖ＤＮＡが合成される。例えば、ＡＭＶ逆転写酵素を用いた場合には、このＡＭＶ逆転写酵素がＤＮＡ鎖を合成する。
また、逆転写酵素とは別に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを加えても良い。
【００４１】
次に、図２（ａ）に示すように、二本鎖ＤＮＡ６上に存在するプロモーター配列８を介して一本鎖ＲＮＡ９を合成し、固相プライマー２とハイブリダイズさせる。
【００４２】
一本鎖ＲＮＡの合成には、ＲＮＡ合成酵素を用いる。このＲＮＡ合成酵素には、通常公知のものを用いることができ、例えばＴ７ＲＮＡ合成酵素、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素などが挙げられ、液相キメラプライマーに存在するプロモーター配列に応じて適宜使用する。
このＲＮＡ合成酵素によって、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＲＮＡが得られる。
【００４３】
次に、図２（ｂ）に示すように、固相プライマー２を介してｃＤＮＡ鎖１０を合成し、ｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体を作製した後、このｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のＲＮＡ鎖を分解して、一本鎖ｃＤＮＡ１０を得る。
ｃＤＮＡ鎖１０は、一本鎖ＲＮＡを鋳型として上記で説明した逆転写酵素によって合成され、ｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体が得られる。
ｃＤＮＡ鎖−ＲＮＡ鎖複合体のＲＮＡ鎖の分解は、上記で説明したＲＮＡ分解酵素によって行われ、一本鎖ｃＤＮＡが得られる。
【００４４】
次に、図２（ｃ）に示すように、ｃＤＮＡ鎖１０を液相ユニバーサルプライマー３ｂとハイブリダイズさせる。
【００４５】
液相ユニバーサルプライマーは、液相キメラプライマー間で異なる増複効率を同一にするために用いるものである。該液相ユニバーサルプライマーの塩基配列は、上記液相キメラプライマーで用いたプロモーター配列と相同な塩基配列を有する。
また、プロモーター配列の下流に１〜２０塩基を付加しても良い。このような塩基配列としてはＡＧやＡＧＡＡＧＧ等が好ましく、ＡＧＡＡＧＧに更に７塩基を付加した配列が特に好ましい。
【００４６】
その後、図２（ｄ）に示すように液相ユニバーサルプライマー３ｂを介して二本鎖ＤＮＡ６を合成する。
この二本鎖ＤＮＡの合成は、上記で説明した逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により行われる。
また、逆転写酵素とは別に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを加えても良い。
【００４７】
その後、図２（ａ）と同様に、二本鎖ＤＮＡ上のプロモーター配列を介して、ＲＮＡ鎖が合成され、同様な工程を通じて標的塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡが合成される。
このように、核酸増幅に関しては一定の温度で反応が進むため、プライマーのＴｍ値を同程度に設定する必要がないので、複数対のプライマーを同時に用いるマルチプレックスアッセイを行う場合でもプライマー設計を容易に行うことができる。更に、ＰＣＲのようにサーマルサイクラー等の特殊な機器を必要とせず、非常に簡便に行うことが可能である。
【００４８】
このようにして得られた二本鎖ＤＮＡ６は、公知の方法で定量することができる。例えば、標識試薬を予め反応溶液中に入れておいた場合には、二本鎖ＤＮＡ６が合成されると同時に標識試薬７がこの二本鎖ＤＮＡ６を標識する。次いで、標識試薬７を検出することで、二本鎖ＤＮＡ６を定量することができる。
【００４９】
なお、工程ごとに試薬を添加して行うことができるが、全工程に必要となる試薬を予め１の反応溶液として調整し、基板に導入することが好ましい。
【００５０】
液相プライマーを構成する液相ユニバーサルプライマーと液相キメラプライマーの濃度は、液相ユニバーサルプライマーの反応性を高めるため、液相ユニバーサルプライマーの濃度を、液相キメラプライマーの濃度よりも多くすることが必要である。液相ユニバーサルプライマーの濃度が、液相キメラプライマーの濃度の１０倍以上が好ましい。液相ユニバーサルプライマー：液相キメラプライマーの濃度比が、１０：１から１００：１であることがより好ましい。
【００５１】
また基板の表面は、微細加工により小さなマイクロプレート用構造とすることが好ましい。この場合、基板表面に複数の凹部を形成し、この凹部にて固相プライマーを固定することが好ましい。凹部に関しては、深さ１５０〜２５０μｍ、底部直径０．５〜１．５ｍｍのウェルとすることが好ましい。
凹部を形成することで、固相プライマーを介して合成されたＲＮＡが、効率よく固相プライマーとハイブリダイズすることが可能となる。
【００５２】
基板に反応溶液を導入するには、基板上に設けられた複数の凹部を全て覆うことが可能なカバーを基板に被せ、表面張力によって反応溶液を各凹部に導入することが好ましい。
カバーを用いることで、反応溶液を分注する手間が省けるばかりでなく、コンタミネーションの抑制や、反応溶液の総量を軽減することができ、低コスト化が図られる。
また該カバーは、標識試薬の検出が容易となるように、透明であることが好ましい。
【００５３】
本発明の核酸の定量方法を用いることで、微量な核酸試料からも標的塩基配列を有する核酸の定量が可能となる。そのため、生体試料等の検体量が微量である場合に有効である。また、病原微生物由来の核酸を検出する際にも有効で、検出の際に培養を必要としないことから、特に通常の手法では培養できないような微生物等を簡便に、すばやく検出することができる。更に、簡便にマルチプレックスを行えるので、１の試料から複数種類の病原微生物由来の核酸を一度に簡便に定量することができる。
【００５４】
固相プライマー及び液相キメラプライマーは、複数対用いることで、複数種類の標的塩基配列を有する核酸を一度に検出することができる。複数対のプライマーを１の反応溶液中に添加した状態でＮＡＳＢＡを行った場合、ミスアニーリング等による非特異的な核酸増幅をほとんど生じずに行うことができる。
また、基板に設けた各凹部に、それぞれの標的塩基配列に特異的な固相プライマーを固定することで、合成された二本鎖ＤＮＡが基板上で混在することなく、一度に複数種類の核酸を定量することが可能となる。
【００５５】
ユニバーサルプライマーとキメラプライマーとを用いて核酸増幅することにより得られた核酸増幅産物は、プロモーター配列を有する。このプロモーター配列を有する核酸増幅産物は、ユニバーサルプライマーを介して増幅されるようにもなる。核酸増幅に用いるプライマーによって核酸増幅の効率が異なる場合があるが、同一のユニバーサルプライマーを用いて核酸を増幅することで、プライマー間での増幅効率を同一にすることができるため、核酸増幅による定量的な解析が可能となる。上記の液相プライマーを用いた場合、液相ユニバーサルプライマーの濃度は、液相キメラプライマーの濃度の１０倍以上であることが好ましく、より好ましくは、液相ユニバーサルプライマーの濃度と、液相キメラプライマーの濃度比が、１０：１から１００：１、更に好ましくは４０：１である。
このように、液相キメラプライマーと液相ユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅することにより、１の試料中に含まれる多数の肺炎原因菌を、リアルタイムＰＣＲをすることなく、簡便にかつ定量的に検出することが可能となる。また、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量できることから、簡便にかつ迅速に肺炎原因菌を定量的に検出することができる。更に、新たな病原菌を検出する場合においても、新たな病原菌に対する固相プライマーと液相キメラプライマーとを追加するだけで定量的に検出することが可能である。
【００５６】
核酸増幅で増幅された二本鎖ＤＮＡの定量に関しては、特に限定されるものではないが、標識試薬を用いて二本鎖ＤＮＡを標識し、定量に用いることが好ましい。
標識試薬に関しては、二本鎖ＤＮＡを標識する公知のものを用いることができ、例えば、蛍光色素や発色試薬が挙げられる。具体的には、例えば、二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれるインターカレーターであるＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎが上げられる。ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎを反応溶液中に加えることで、基板上で二本鎖ＤＮＡが形成されるときに該ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎが取り込まれ、簡便に標識することが可能である。また、二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれるエチジウムブロマイドを用いて、ＵＶで発色させて二本鎖ＤＮＡを検出することもできる。
デオキシヌクレオチドを予め標識しておくことも可能であり、必要に応じ適宜選択すればよい。デオキシヌクレオチドの標識に関しては特に限定されるものではなく、例えば、ＦＩＴＣ、やローダミン、Ｃｙ３やＣｙ５などのサイアニン等の蛍光色素が挙げられる。また、ビオチンやジゴキシゲニン、ＲＩ等で標識し、アリカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の発色試薬によって発色させてもよい。これら標識されたデオキシヌクレオチドは、基板上における二本鎖ＤＮＡの形成に用いられるため、形成された二本鎖ＤＮＡを簡便に標識することができる。
この二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれた標識試薬の蛍光、あるいは発色試薬による各種の発色を測定することで、核酸を定量することができる。この標識試薬の測定に関しては、公知の方法を用いて行うことができ、用いる標識試薬に応じて適宜調節して行えばよい。例えばマイクロアレイ・スキャナーを用いて、標識試薬がＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎであった場合、４８５ｎｍの励起光で、５２５ｎｍの蛍光を経時的に観察することが好ましい。
【００５７】
また、リアルタイムＰＣＲ等により、定量に用いた蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することも可能である。このようにして得た測定値を積算することにより、得られた核酸増幅産物を定量することができる。
【００５８】
また、本発明の核酸の定量方法を用いた遺伝子検出システムにより、標的塩基配列を有する核酸と基板上に固定した固相プライマーとを介して、核酸増幅により基板上に形成された二本鎖ＤＮＡを定量することが可能となる。そのため、標的塩基配列を有する核酸試料から、目的の標的塩基配列を有する単一または複数種類の核酸を同一基板上で簡便に定量することが可能となる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
ユニバーサルプライマーを用いた標的核酸（ＲＮＡ）の定量的検出
ＮＡＳＢＡ法を行い、標的塩基配列を有する核酸（ＲＮＡ）の定量が行えるかどうかを検討した。
標的核酸としては、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅから抽出した核酸（ＲＮＡ）を用い、ネガティブコントロールとしては、２０塩基対からなるポリＴ配列を用いた。
また、標的核酸に対するプライマーとして、フォワードプライマーにはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１６５位〜１８７位の塩基配列に相同的な塩基配列を有するものを用いた。また、リバースプライマーとしては１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５０２位〜５１９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ５´側にプロモーター配列とその下流に１３塩基を付加したものを用いた。該プロモーター配列に関しては、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ−３´）を用いた。ユニバーサルプライマーとしては、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列の下流に１３塩基を付加したものを用いた。
まず、チューブの表面に活性エステルを有するポリマーをコートし、固相プライマーとして、フォワードプライマーの５´末端に導入したアミノ基との結合機能を付与した。
次に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの抽出核酸（ＲＮＡ）を緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＫＣｌ）に懸濁し、該核酸が１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９コピー含まれるように溶液をそれぞれ調整した。ＮＡＳＢＡ試薬専用マスターミックス１０μｌ（Ｂｉｏｍｅｒｕ社製）に０．０５μＭの液相キメラプライマー、２μＭの液相ユニバーサルプライマー、及びＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ（タカラ社製）１０００ｐｇを混合し、３０秒間９５℃で加熱した。その後、５分間６５℃で静置して、抽出核酸溶液を調整した。
次に、上記抽出核酸溶液に、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素、０．４ユニットのＲＮａｓｅＨ、２０ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素混合液（Ｂｉｏｍｅｒｕ社製）を５μｌ添加し、最終容量が２０μｌの反応溶液を調整した。その後、４１℃に設定した恒温槽に各チューブを設置して、ＮＡＳＢＡ法により核酸を増幅した。
次にＮＡＳＢＡ法により増幅されたＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲＮＡが、定量的に増幅されたかを確認するため、増幅産物（ＲＮＡ）の電気泳動を行い確認した。この結果を図３に示す。図３において、横軸は塩基数、縦軸は蛍光強度を示している。
【００６０】
図３より、鋳型となったゲノムのコピー数が増加するにつれ、核酸増幅産物（３６８ｎｔ）の蛍光強度の増加が観察された。即ち、標的核酸が定量的に増幅されたことが確認できた。
【００６１】
（参考例２）
固相プライマーの最適固定量
次に固相プライマーの固定すべき量を検討するため、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対応する固相プライマーの量を１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭとして、固定用のスポッティング溶液（住友ベークライト社製）に溶解させ、この１μｌを各チューブに滴下した。滴下後、各チューブを８０℃で１時間保温し、これを検出用のチューブとした。
その後、１０８コピーのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの抽出核酸（ＲＮＡ）と、上記検出用チューブとを用いた反応溶液を調整し、ＮＡＳＢＡ法により核酸を増幅した。また、ネガティブコントロールとしては、２０塩基対からなるポリＴ配列を用いた。核酸増幅の際、１分ごとに４８５ｎｍの励起光で５２５ｎｍの蛍光を６０分間測定して増幅されたＤＮＡを経時的に検出し、最適なプライマーの量を決定した。この結果を図４に示す。図４において、横軸は時間、縦軸は蛍光強度を示している。
【００６２】
図４より、チューブに固定するプライマーの量が１．２５μＭの際に、最も効率よく標的核酸の増幅が観察された。
【００６３】
（実施例１）
標的核酸（ＤＮＡ）の定量的検出
次に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの抽出核酸（ＲＮＡ）を１０３、１０４、１０５、１０６、１０７コピー含まれるような核酸抽出溶液を参考例１と同様に調整した。該核酸抽出溶液を１．２５μＭの固相プライマーを結合させた各チューブに加え、参考例１と同様にＮＡＳＢＡ法により核酸を増幅した。また、ネガティブコントロールとしては、２０塩基対からなるポリＴ配列を用いた。核酸増幅の際、１分ごとに４８５ｎｍの励起光で５２５ｎｍの蛍光を６０分間測定して増幅されたＤＮＡを経時的に検出した。この結果を、図５に示す。図５において、グラフの縦軸は蛍光強度、横軸は反応時間を示している。
【００６４】
図５より、ＮＡＳＢＡ法による核酸増幅産物(ＤＮＡ)の総量は、各曲線の積分値で表される。抽出核酸のコピー数増加に伴い、核酸増幅産物の量も増加することが観察され、固相プライマーを固定したチューブで、標的塩基配列を有する核酸の定量が行えたことが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明を用いることにより、検出されたシグナルの定量的な解析がなされるため、例えば感染量により病症が異なる原因菌や複数種類の原因菌の検出に有効である。特に、同時に多数の薬剤耐性遺伝子も短時間で正確に検出し、定量することが可能となるため、新たな遺伝子定量検出システムの構築に道を拓くものである。
また、本発明の核酸の定量方法を用いた遺伝子検出システムは、クラミジアやリッケッチアなど培養困難な病原微生物、薬剤耐性菌など院内感染原因菌に対して適切な治療法選択のための臨床診断用簡易検査試薬として利用可能である。更に、本発明では基板に合成樹脂を用いており、取り扱いが簡便で検出用機器に合わせた加工が可能な汎用性の高いシステムを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】第一実施形態に係る模式的な第一工程図である。
【図２】第一実施形態に係る模式的な第二工程図である。
【図３】ユニバーサルプライマーを用いて、ＮＡＳＢＡ法により増幅された標的核酸のＲＮＡを定量的に検出した図である。
【図４】基板に固定するプライマーの量を変えて、ユニバーサルプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法により増幅された標的核酸のＤＮＡを経時的に検出した図である。
【図５】ユニバーサルプライマーを用いて、ＮＡＳＢＡ法により増幅された標的核酸のＤＮＡを定量的・経時的に検出した図である。
【符号の説明】
【００６７】
１  基板に作製した凹部、１ａ  凹部の底面、２  固相プライマー、３  液相プライマー、４  標的核酸、５  ｃＤＮＡ鎖、６  二本鎖ＤＮＡ、７  染色試薬、８  プロモーター配列、９  一本鎖ＲＮＡ、１０  一本鎖ＤＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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