(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するものにおいて、Ｅ４１８Ｎ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ４２０Ｎ、Ｅ４２０Ｑ、Ｅ４２０Ｋ、Ｅ４２０Ｒ、Ｅ４１８Ｎ及びＥ４２０Ｄ、Ｅ４１８Ｎ及びＥ４２０Ｎ、Ｅ４１８Ｎ及びＥ４２０Ｑ、Ｅ４１８Ｑ及びＥ４２０Ｎ若しくはＥ４１８Ｑ及びＥ４２０Ｑのうち少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる野生型ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）に比べて、サプレッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が高められたことを特徴とする変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項２】
前記４１８位及び４２０位のグルタミン酸がそれぞれアスパラギンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載の変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項３】
さらに配列番号２で表されるアミノ酸配列において、４２３位のスレオニンが疎水性アミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項１又は２に記載の変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項４】
前記疎水性アミノ酸がバリンである請求項３に記載の変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の変異体ＳｅｐＲＳにおいて、４１８位、４２０位及び４２３位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホセリン及びサプレッサーｔＲＮＡの両方に対する結合親和性を有することを特徴とする変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項６】
前記サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡ又はオパールサプレッサーｔＲＮＡである請求項１〜５何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳ。
【請求項７】
請求項１〜６何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項８】
宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で請求項１〜６何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳを産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、請求項７に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする真正細菌。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
【請求項１１】
（ａ）ホスホセリンに対する請求項１〜６何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳと、
（ｂ）前記請求項１〜６何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳの存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
をホスホセリンの存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とするホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞抽出液と、
（ｂ）請求項１〜６何れか記載の変異体ＳｅｐＲＳと、
（ｃ）前記変異体ＳｅｐＲＳの存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、
を含むホスホセリン組み込みタンパク質合成キット。
【請求項１３】
真正細菌のタンパク質合成系において、サプレッサーｔＲＮＡをホスホセリンでアミノアシル化し得る変異体ＳｅｐＲＳのスクリーニング方法であって、
（ａ）古細菌由来のＳｅｐＲＳと、ｔＲＮＡＣｙｓとの複合体の立体構造に基づいて、該ｔＲＮＡＣｙｓのアンチコドンループの塩基との相互作用に関与するＳｅｐＲＳの、配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８位及び４２０位のグルタミン酸残基並びに４２３位のスレオニン残基から、１又は２以上のアミノ酸残基を選択し、
（ｂ）前記選択されたアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異体ＳｅｐＲＳを合成し、
（ｃ）野生型ＳｅｐＲＳ及び前記変異体ＳｅｐＲＳのサプレッッサーｔＲＮＡに対する結合親和性を測定し、そして
（ｄ）サプレッッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が、野生型ＳｅｐＲＳよりも高い変異体ＳｅｐＲＳを選択する
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）、及び該合成酵素を用いてタンパク質へ部位特異的にホスホセリンを導入したホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法、並びにそのためのベクター、及びキット等に関する。
本願は、２００６年６月２８日に出願された特願２００６−１７８６４２の優先権を主張し、その明細書の全体を引用によって本書に繰り込む。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常のタンパク質合成に関わる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（非天然型アミノ酸）で置換した、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質（以下、「アロタンパク質」という）は、タンパク質の機能・構造解析のための有効な手段である。例えば、非天然型アミノ酸を含むタンパク質は、分子内標識、タンパク質同士のクロスリンク、Ｘ線やＮＭＲによる構造解析（例えば、非特許文献１参照）、及びシグナル伝達系の解析（例えば、非特許文献２参照）に用いられている。部位特異的に非天然型アミノ酸を導入したアロタンパク質を効率よく生産するためには、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ａａＲＳ」と記載する。）のｔＲＮＡやアミノ酸に対する特異性を改変することで、遺伝暗号系を拡張することが不可欠である。
このようなアロタンパク質の発現方法としては、出芽酵母のフェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素・ｔＲＮＡＰｈｅペアを大腸菌に導入し、ｐ−フルオロフェニルアラニンをアンバーコドン特異的に導入する方法が最初に報告された（非特許文献３参照）。現在のところ、遺伝暗号の拡張は、真正細菌である大腸菌、及び真核生物（小麦胚芽抽出液について非特許文献４参照、哺乳動物細胞について非特許文献５参照）で成功している。これらの例は、いずれもＴｙｒＲＳ変異体とアンバーサプレッサー化されたｔＲＮＡＴｙｒペアを導入しているが、真正細菌ＴｙｒＲＳ・ｔＲＮＡＴｙｒと、古細菌／真核生物型ＴｙｒＲＳ・ｔＲＮＡＴｙｒでは、それぞれのグループ内ではアミノアシル化するが、互いのグループ同士ではアミノアシル化できない直交性の関係にあることが鍵となっている。例えば、古細菌メタノコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のＴｙｒＲＳ・ｔＲＮＡＴｙｒペアは大腸菌の系で、逆に大腸菌ＴｙｒＲＳとバチルス・ステアロサーモフィラスｔＲＮＡＴｙｒのペアは哺乳動物細胞の系で直交したペアとなるために、それらの人工遺伝暗号の拡張に使われている（例えば、特許文献１及び非特許文献５参照）。
一方、生体内でシグナル伝達等非常に重要な役割を果たすアミノ酸の一つとしてホスホセリンがある。ホスホセリンは、通常、哺乳動物細胞内において特定のプロテインキナーゼによりタンパク質中のセリン残基がリン酸化されて生じるが、このアミノ酸を、タンパク合成の翻訳段階において部位特異的にタンパク質に導入することに成功した例はない。その主な理由は、ホスホセリンを認識できるような改変体ａａＲＳのデザインが困難なことにある。ところが、最近、天然に存在するメタン生成古細菌がホスホセリンを認識するａａＲＳであるホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素を有することが報告された（例えば、非特許文献６参照）。これによれば、種々のメタン生成古細菌ではシステイニルｔＲＮＡ合成酵素（ＣｙｓＲＳ）を欠損しており、その代わりにホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）によってｔＲＮＡＣｙｓがアシル化され、生成したホスホセリル（Ｓｅｐ）−ｔＲＮＡＣｙｓがＳｅｐ−ｔＲＮＡ：Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ合成酵素によってＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓに変換されるという２段階反応によるＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓの合成ルートが明らかにされている。なお、本明細書において引用される全ての文献は、引用により本書に繰り込まれるものとする。
【特許文献１】国際公開第２００４／０７００２４号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９０  Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１６６５−７２．
【非特許文献２】Ｎｏｗａｋ  Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．４３９−４２．
【非特許文献３】Ｆｕｒｔｅｒ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．４１９−２６．
【非特許文献４】Ｋｉｇａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．９７１５−２０．
【非特許文献５】Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．４６９２−４６９９．
【非特許文献６】Ｓａｕｅｒｗａｌｄ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，Ｖｏｌ．３０７，ｐｐ．１９６９−１９７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、本発明者らの分析によると、メタン生成古細菌の有するＳｅｐＲＳがサプレッサーｔＲＮＡにホスホセリン（Ｓｅｐ）を結合させることができるか否かは明らかではない。また、このような古細菌のＳｅｐＲＳが大腸菌等の真正細菌のａａＲＳ・ｔＲＮＡペアと直交性を有するか否かも明らかではない。従って、本発明は、古細菌由来のＳｅｐＲＳの構造と機能を解析することにより、タンパク質の部位特異的ホスホセリン導入法に適した変異体ＳｅｐＲＳを作製すること、及びそのような変異体ＳｅｐＲＳとサプレッサーｔＲＮＡとを用いて部位特異的ホスホセリン導入方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−ホスホセリンの三者複合体のＸ線構造解析を行い、その立体構造を決定することに成功した。得られた構造から、ＳｅｐＲＳがホモ四量体として存在し、そこに２分子のｔＲＮＡＣｙｓが結合すること、及びＳｅｐＲＳがホスホセリンのリン酸基の３つの酸素原子それぞれを２つの水素結合で認識していることが分かった。また、ＳｅｐＲＳによるｔＲＮＡＣｙｓの認識は、主にアンチコドンループの塩基との水素結合でなされていることが明らかとなり、これらの構造に基づいて、サプレッサーｔＲＮＡと結合可能な変異体ＳｅｐＲＳを設計及び作製することによって本発明を完成した。
すなわち、第一の視点において、本発明の変異体ＳｅｐＲＳは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、４１８位及び４２０位のグルタミン酸の何れか一方又は両方が、それぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる野生型ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）に比べて、サプレッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が高められたことを特徴とする。前記４１８位及び４２０位のグルタミン酸はそれぞれアスパラギンに置換されることが好ましい。さらに好ましい実施形態において、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、４２３位のスレオニンが疎水性アミノ酸に置換されたことを特徴とする。前記疎水性アミノ酸がバリンであることがさらに好ましい。前記変異体ＳｅｐＲＳにおいて、４１８位、４２０位及び４２３位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホセリン及びサプレッサーｔＲＮＡの両方に対する結合親和性を有する変異体ＳｅｐＲＳも本発明に含まれる。さらになお好ましい態様において、前記サプレッサーｔＲＮＡはアンバーサプレッサーｔＲＮＡ又はオパールサプレッサーｔＲＮＡである。
本発明の他のいくつかの視点において、上記変異体ＳｅｐＲＳをコードする単離されたＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターによって形質転換された真正細菌が提供される。
本発明の別の視点において、（ａ）ホスホセリンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、をホスホセリンの存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とするホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法が提供される。
さらに異なる視点において、（ａ）細胞抽出液と、（ｂ）前記変異体ＳｅｐＲＳと、（ｃ）前記変異体ＳｅｐＲＳの存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、を含むホスホセリン組み込みタンパク質合成キットが提供される。
さらになお異なる観点において、本発明は、真正細菌のタンパク質合成系において、サプレッサーｔＲＮＡをホスホセリンでアミノアシル化し得る変異体ＳｅｐＲＳのスクリーニング方法であって、（ａ）古細菌由来のＳｅｐＲＳと、ｔＲＮＡＣｙｓとの複合体の立体構造に基づいて、該ｔＲＮＡＣｙｓのアンチコドンループの塩基との相互作用に関与するＳｅｐＲＳの１又は２以上のアミノ酸残基を選択し、（ｂ）前記選択されたアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異体ＳｅｐＲＳを合成し、（ｃ）野生型ＳｅｐＲＳ及び前記変異体ＳｅｐＲＳのサプレッッサーｔＲＮＡに対する結合親和性を測定し、そして（ｄ）サプレッッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が、野生型ＳｅｐＲＳよりも高い変異体ＳｅｐＲＳを選択することを含むことを特徴とする。前記工程（ａ）で選択されたアミノ酸残基が、配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８位及び４２０位のグルタミン酸残基並びに４２３位のスレオニン残基から選択されることが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の変異体ＳｅｐＲＳは、サプレッサーｔＲＮＡＣｙｓに高い効率でホスホセリンを結合させることができる。また、野生型のＳｅｐＲＳは、大腸菌のｔＲＮＡ混合物に対してホスホセリンを結合させる活性を有していたが、本発明の変異体ＳｅｐＲＳは、そのような活性が非常に低く抑えられていた。したがって、本発明の変異体ＳｅｐＲＳ及びサプレッサーｔＲＮＡペアは、タンパク質の部位特異的ホスホセリン導入法に利用することが可能であり、新規なアロタンパク質の作製方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】２分子のｔＲＮＡＣｙｓと複合体を形成したＳｅｐＲＳα４四量体の全体構造を示したモデル図である。
【図２】ＳｅｐＲＳによるホスホセリン（Ｓｅｐ）認識のモデル図である。
【図３】ＳｅｐＲＳによるアンチコドンループ認識のモデル図である。
【図４】野生型及び種々の変異体ＳｅｐＲＳについて、野生型ｔＲＮＡ、アンバーｔＲＮＡ、オパールｔＲＮＡに対するホスホセリン結合活性を示したグラフである。
【図５】野生型及び種々の変異体ＳｅｐＲＳについて、大腸菌、小麦胚芽及び酵母のｔＲＮＡ混合物に対するホスホセリン結合活性を示したグラフである。
【図６】変異体ＳｅｐＲＳによるサプレッサーｔＲＮＡ（（ａ）オパール、（ｂ）アンバー）認識のモデル図、並びに野生型、オパール及びアンバー複合体を重ね合わせた立体映像（ｃ）である。
【図７】野生型及び二重変異体を含む種々の変異体ＳｅｐＲＳについて、野生型ｔＲＮＡ、アンバーｔＲＮＡ、オパールｔＲＮＡに対するホスホセリン結合活性を示したグラフである。
【図８】Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ変異体へ、さらに追加の変異を導入した種々の三重変異体ＳｅｐＲＳのホスホセリン結合活性を示したグラフである。
【図９】野生型及び三重変異体を含む種々の変異体ＳｅｐＲＳについて、大腸菌、小麦胚芽及び酵母のｔＲＮＡ混合物に対するホスホセリン結合活性を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
［ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）］
本発明に係るホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）は、古細菌、特に、メタン生成古細菌から取得した野生型ＳｅｐＲＳを基に、種々の方法で変異を導入して作製することができる。野生型ＳｅｐＲＳとしては、例えば、メタン生成古細菌であるメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、及びメタノカルドコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）や、硫黄還元古細菌アルカエグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）等から取得することできるがこれらに限定されない。これらの古細菌を含む多くの細菌ゲノム塩基配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから塩基配列の相同性検索を行って、他の相同な遺伝子を取得することも可能である。典型的な例として、メタノサルシナ・マゼイ由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００３９０１として、メタノコッカス・マリパルディス由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００５７９１として、メタノカルドコッカス・ジャナシイ由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９０９として、及びアルカエグロブス・フルギダス由来のＳｅｐＲＳは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９１７（ＧｅｎｅＩＤ：１４８３３２２）として登録されている。特に好ましくは、上記アルカエグロブス・フルギダス由来のＳｅｐＲＳであり、その遺伝子の塩基配列を配列番号１に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。これらのＳｅｐＲＳの配列はよく保存されており、例えば、アミノ酸配列の相同性は、凡そ７０％以上である。これらの野生型ＳｅｐＲＳの立体構造を解析し、以下に詳細に説明する方法に従って本発明の変異体ＳｅｐＲＳを作製する。
［ｔＲＮＡ］
上記ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、当該ＳｅｐＲＳにのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ）という要件を備えなければならない。上記古細菌由来のＳｅｐＲＳは、これらの古細菌内でシステインに対応するｔＲＮＡＣｙｓにホスホセリンを結合させることから、変異体ＳｅｐＲＳに対応するｔＲＮＡは、古細菌由来のｔＲＮＡＣｙｓに類似した立体構造を有し、かつサプレッサーｔＲＮＡとして機能するためには、システインに対するコドン（ＴＧＣ又はＴＧＴ）の代わりに、ナンセンスコドンに相補的なアンチコドンを保持していなければならない。すなわち、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記ホスホセリンに特異的な変異体ＳｅｐＲＳにのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（直交性）、という要件を備えるサプレッサーｔＲＮＡである。
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）又はＵＧＡ（オパール）コドンを用いることが好ましい。また、ナンセンスコドンに代えて、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（以下「フレームシフトコドン」という。）を用いることもできる。
このようなｔＲＮＡは、例えば、上記古細菌ゲノムからｔＲＮＡ−Ｃｙｓに対応する遺伝子を取得し、これに所望の変異を導入して作製することができる。一例として、アルカエグロブス・フルギダス由来の野生型ｔＲＮＡ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９１７（ＧｅｎｅＩＤ：１４８４６８１）として登録され、以下に示す塩基配列を有する。
0005305440.tif 000002
［変異体ＳｅｐＲＳの作製］
本発明は、ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−ホスホセリンの三元複合体の立体構造に基づいて作製した変異体ＳｅｐＲＳを提供する。当該三元複合体の結晶化及びそのＸ線構造解析の具体的な方法は、以下の実施例に記載したとおりである。好熱性硫黄細菌（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＳｅｐＲＳとｔＲＮＡＣｙｓとホスホセリンとの三元複合体の結晶は、空間群がＰ３１２１であり、単位格子がａ＝ｂ＝１４９．１２Å、ｃ＝１５３．９１Åの寸法を有する。ここで、単位格子とは、結晶の最も小さく単純な体積要素を意味し、空間群とは単位格子の対称性を意味する。ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐ三元複合体及びＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ二成分複合体のそれぞれ２．６Å及び２．８Åの分解能で得られた原子座標は、プロテインデータバンク（ＰＤＢ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，Ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）が運営、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／参照）に、それぞれ２ＤＵ３及び２ＤＵ４というコード番号にて登録されている。
上記結晶構造を明らかにすることによって、ＳｅｐＲＳとｔＲＮＡＣｙｓとの結合様式が推定される。そして、これに基づいて本発明者らは、ｔＲＮＡＣｙｓのアンバーサプレッサー及びオパールサプレッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が高められた変異体ＳｅｐＲＳの設計を行い、その有効性を確認した。こうして、本発明の一態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、４１８位及び４２０位のグルタミン酸の何れか一方又は両方が、それぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異体ＳｅｐＲＳを提供する。当該変異体ＳｅｐＲＳの４２３位のスレオニンが疎水性アミノ酸、好ましくはバリンに置換されていることがさらに好ましい。
このような変異体を作製する方法としては、当業者に公知の種々の方法を用いることができ、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて全長の変異体ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡを取得し、これを大腸菌等の宿主細胞を用いて発現させることができる。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はギャップ二重鎖（Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法等の公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができ、これらの手法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−ＫやＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を利用することができる。
さらに、本発明は、上記変異体ＳｅｐＲＳの有するアミノ酸配列において、４１８位、４２０位及び４２３位以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつホスホセリン及びサプレッサーｔＲＮＡの両方に対する結合親和性を有するタンパク質を含む。「１又は数個のアミノ酸」とは、全長アミノ酸残基数の多くとも５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。同様に、本発明の変異体ＳｅｐＲＳは、上記アミノ酸配列中の４１８位、４２０位及び４２３位に所定の変異を有し、所望の活性を維持する限り、その他のアミノ酸残基については、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性を有するものも含まれる。
本発明の好ましい態様において、野生型ＳｅｐＲＳのアミノ酸配列の４１８位及び４２０位のグルタミン酸がそれぞれアスパラギンに置換された変異体ＳｅｐＲＳが上記２種類のサプレッサーｔＲＮＡに対する高い結合親和性が認められた。本明細書において「結合親和性が高い」とは、ＳｅｐＲＳのアンチコドン結合ドメインとサプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンとの結合親和性が高いことを意味し、分子間における静電相互作用や水素結合又はファンデアワールス力等の種々の結合力によって両者の結合が安定化されることによると考えられる。このような結合親和性は、それぞれの分子を精製し、インビトロにおいてＡＴＰ及びホスホセリンの存在下に酵素反応を行うことによって生成するホスホセリル化ｔＲＮＡ（Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ）の量を測定することによって検出することができる。
［本発明の変異体ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡ含む発現ベクター及び形質転換細胞］
本発明はまた、上記のようにして得られる変異体ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡを包含する。好ましい実施形態において本発明のＤＮＡは、配列番号１で表される野生型ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡにおいて、４１８番目及び４２０番目のグルタミン酸に対応するコドン（ＧＡＧ）がそれぞれアスパラギンに対応するコドン（ＡＡＴ又はＡＡＣ）に置換されたＤＮＡである。さらに４２３番目のスレオニンに対するコドン（ＡＣＧ）が、バリン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧ）に置換されていることがより好ましい。
また、本発明のＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、かつ４１８番目及び４２０番目のアミノ鎖のコドンがそれぞれアスパラギンに対応するコドンからなり、さらに好ましくは４２３番目のアミノ酸のコドンがバリンをコードするＤＮＡをも含む。さらに、上記ＤＮＡ対するＲＮＡ、例えば、上記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ等も含む。
また、上記ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ野生型ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）に比べて、サプレッサーｔＲＮＡに対する結合親和性が高められた変異体ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣとは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる。）を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるためにホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。
本発明はまた、上記本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより、変異体ＳｅｐＲＳを発現することのできる発現ベクターを含む。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で上記変異体ＳｅｐＲＳを産生し得るようにベクターに組み込まれることが好ましい。そこで、本発明のベクターには、プロモーター（例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）の他に、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の発現ベクターを用いて形質転換された形質転換細胞、好ましくは真正細菌細胞や真核細胞も本発明に含まれる。ここで、真正細菌とは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、真核細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。形質転換方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ６９，２１１０−２１１４）、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
［ホスホセリン組み込みタンパク質の製造］
こうして得られた変異体ＳｅｐＲＳは、古細菌又は真核生物のサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、インビトロ又はインビボでのホスホセリン組み込みタンパク質の製造に用いることができる。すなわち、（ａ）ホスホセリンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、をホスホセリンの存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とするホスホセリン組み込みタンパク質の製造方法が提供される。ここで、ＳｅｐＲＳやサプレッサーｔＲＮＡの合成系としては特に制限されることはなく、任意の発現系を用いることができる。例えば、無細胞タンパク質合成系や真正細菌細胞内におけるタンパク質合成系である。
無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。様々な生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
大腸菌の抽出液としては、ズベイら（Ｚｕｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２６７−２８７（１９７３））又はプラットら（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
ホスホセリン組み込みタンパク質の合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となる所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、ホスホセリンを含むアミノ酸、本発明の変異体ＳｅｐＲＳ、前記変異体ＳｅｐＲＳの存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡ、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、アミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸に加えてホスホセリンを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。
さらに、本発明は、（ａ）上記細胞抽出液と、（ｂ）本発明に係る変異体ＳｅｐＲＳと、（ｃ）前記変異体ＳｅｐＲＳの存在下でホスホセリンと結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、を含むホスホセリン組み込みタンパク質合成キットを提供する。これに加えて、ホスホセリンと天然型アミノ酸とのアミノ酸混合物を含むことが好ましい。これらの構成要素は、使用しやすいように一定量ごと分注して、ホスホセリン組み込みタンパク質合成キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【実施例】
【０００８】
１  方法
［タンパク質及びｔＲＮＡの精製］
好熱性硫黄細菌（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来の完全長ＳｅｐＲＳ遺伝子は、制限酵素切断部位ＮｄｅＩ及びＳａｌＩを利用してプラスミドｐＥＴ２６ｂ（ノバジェン）にクローン化した。突然変異導入はＰＣＲ法を用いて行った。野生型及び変異体酵素は大腸菌ＢＬ２１コドンプラス（ＤＥ３）株（ストラタジーン）を用いて過剰発現させた。ＳｅｐＲＳタンパク質は８０℃、３０分間の熱処理、及びＱ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア）とｕｎｏＱ（バイオラッド）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製した酵素は、５ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、約９ｍｇ／ｍｌとなるまで濃縮した。セレノメチオニン標識タンパク質は、大腸菌Ｂ８３４コドンプラス（ＤＥ３）株を用いて過剰発現し、天然型酵素と同様の方法で精製した。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のｔＲＮＡＣｙｓとサプレッサーｔＲＮＡは、それらの遺伝子の上流にＴ７プロモーター配列を付加した上でプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローン化し、これらを鋳型としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写反応で合成した。転写されたｔＲＮＡは、フェノール／クロロホルム処理の後、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。なお、サプレッサーｔＲＮＡは、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のｔＲＮＡＣｙｓのアンチコドンＧＣＡを、ＵＣＡ（ｔＲＮＡＣｙｓオパール）又はＣＵＡ（ｔＲＮＡＣｙｓアンバー）にそれぞれ置換した。
［結晶化］
ＳｅｐＲＳとｔＲＮＡＣｙｓは、最終的なＳｅｐＲＳ濃度が６〜８ｍｇ／ｍｌとなるような条件で１：１．１のモル比で混合した。三元複合体を結晶化するために、１００ｍＭのホスホセリン（Ｓｅｐ）溶液を上記混合物に添加し、最終濃度を２ｍＭに調整した。ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓの二成分複合体及びＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐの三元複合体を、２０℃で、ハンギングドロップ蒸気拡散法により成長させた。１μｌのサンプルを１μｌのリザーバー溶液（８％ＰＥＧ６０００、及び１．２Ｍ塩化ナトリウム）と混合した。
［構造解析］
セレノメチオニン導入ＳＡＤ（ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐ）データセット、及び天然型データセット（ＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐ及びＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ）は、スプリング８のビームラインＢＬ４１ＸＵで取得した。収集したデータは、ＨＫＬ２０００を用いて処理した。構造はＳｅ−ＳＡＤデータセットとＳｎＢ及びＭｌｐｈａｒｅを用いて決定した。電子密度の修正はＤＭを用いて行った。ＱｕｅＭｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｅｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｊｐ／ｅｎ／）を用いた反復性モデル構築及びＣＮＳによる精密化を何回か行った。結晶の非対称性単位は２分子のＳｅｐＲＳと１分子のｔＲＮＡＣｙｓを含んでいた。ＳｅｐＲＳ分子Ｂの１０５〜１７３残基に体操する電子密度と、ｔＲＮＡの最後の４ヌクレオチド残基、Ｕｒｉ７３−Ｃｙｔ７４−Ｃｙｔ７５−Ａｄｅ７６に対応する電子密度は乱れていた。
［ｔＲＮＡへのホスホセリン結合アッセイ］
ｔＲＮＡへのホスホセリン結合反応は、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭのＡＴＰ、６０μＭの１４Ｃ標識ホスホセリン、１μＭＳｅｐＲＳ酵素、及び２０μＭのインビトロ転写ｔＲＮＡＣｙｓ又はサプレッサーｔＲＮＡを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．６）中において、５０℃で１０分間行った。所定時間経過後に反応混合液から一定量を取り出し、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で平衡化したろ紙（ワットマン３ｍｍ）上で反応を停止した。ろ紙を５％氷冷ＴＣＡ溶液で３回洗浄し、次に１００％エタノールで１回洗浄した。ろ紙上に沈殿した放射活性をシンチレーションカウンターで計測した。
２  結果
好熱性硫黄細菌（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐ三元複合体及びＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ二成分複合体の夫々２．６Å及び２．８Åの分解能での結晶構造を図１に示す。ＳｅｐＲＳは、図１（ａ）ではリボンモデルで、図１（ｂ）では表面モデルで示した。ｔＲＮＡＣｙｓは黄色のチューブで示し、Ｓｅｐ分子は赤紫色のＣＰＫモデルで示した。この構造において、ＳｅｐＲＳはα４の四量体を形成し、４つのサブユニットはもつれ合っている（図１（ａ）及び（ｂ））。２分子のｔＲＮＡＣｙｓは、ＳｅｐＲＳ四量体に結合している。三元複合体において、ホスホセリン（Ｓｅｐ）分子は、ＳｅｐＲＳ四量体の４つの活性中心部位のすべてに結合している。ＳｅｐＲＳモノマー（単量体）は４つの部分からなり、Ｎ末端側伸長部分（青色の残基１〜４５）、触媒ドメイン（緑色の残基４６から９９）、中央ドメイン（オレンジ色の残基１００〜１７７）及びＣ末端側アンチコドン結合ドメイン（ピンク色の残基３５５から５３４）である（図１（ｃ））。この４つの部分はリンカーループでつなぎ合わされ、４つのうちの何れの２つの部分間もほとんど接触していないことが認められる。その代わりに、それらは四量体の他のサブユニットと広範に接触しており、安定なα４四量体の形成に寄与していると思われる。分析用超遠心分離の結果は、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＳｅｐＲＳ及びＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｊａｎｎａｓｓｃｈｉｉ由来のＳｅｐＲＳは、溶液中でα４四量体を形成することを明確に示した（データ示さず）。
アミノアシルＲＮＡ合成酵素の中でα４構造を明らかにしたのは本発明者らが初めてである。クラスＩａ及びＩｂのアミノアシルＲＮＡ合成酵素はモノマーを形成する。クラスＩｃ、ＩＩａ、及びＩＩｂアミノアシルＲＮＡ合成酵素は通常、α２ダイマー（二量体）を形成する（例外的に、いくつかのアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＡｌａＲＳ）はα４四量体を形成し、いくつかのグリシルｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｙＲＳ）はα２β２四量体を形成する）。２０種類の正規のアミノアシルＲＮＡ合成酵素の中で唯一クラスＩＩアミノアシルＲＮＡ合成酵素のメンバーであるＰｈｅＲＳは、α２β２四量体を形成する（図１（ｄ））（ミトコンドリアのＰｈｅＲＳは単量体である）。ＰｈｅＲＳのαサブユニット（図１（ｄ）では青色及び緑色で示す）は触媒ドメインを含み、βサブユニット（図１（ｄ）では水色及び灰色で示す）は触媒様ドメインを含むが、このβサブユニットはαサブユニットと高い構造類似性をもちながら不活性である。アミノ酸配列の類似性から予想されるように、ＳｅｐＲＳ触媒ドメインの構造は、ＰｈｅＲＳの触媒ドメインの構造と高い相同性を示す（図１（ｅ））。さらに、ＳｅｐＲＳα４四量体の４つの触媒ドメインの構成は、ＰｈｅＲＳのα２β２四量体の触媒及び触媒様ドメインの構成と類似している。その上、４つのドメインに対する２つの結合ｔＲＮＡ（図１（ｄ）では黄色で示す）の配向は、ＳｅｐＲＳとＰｈｅＲＳとの間で類似している。これらの類似性は系統発生学的解析と共に、ＳｅｐＲＳ及びＰｈｅＲＳがα４四量体を形成する共通の祖先を有することを示唆する。祖先型ＳｅｐＲＳ及びＰｈｅＲＳが分岐した後、ＰｈｅＲＳの４つのうちの２つのサブユニットが触媒活性を失い、βサブユニットとなった。ミトコンドリアを除いて分類学上の３つの界における公知のＰｈｅＲＳのすべてがα２β２四量体を形成することを考慮すると、ＳｅｐＲＳは普遍的な祖先型の時代からすでに存在したかなり古い酵素である。１つのｔＲＮＡＣｙｓ分子は、公知のα２ダイマーアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又はｔＲＮＡがサブユニットを交差して結合するＰｈｅＲＳとは異なり、１つのＳｅｐＲＳ単量体のみと接触する。この相違は、アンチコドン結合ドメインが進化の過程で後から付加されたからであろう。
触媒ドメインは、有意なコンフォメーション変化を起こすことなくその活性部位の深い裂け目の中でＳｅｐを認識する（図２）。図２（ａ）はＳｅｐ分子を含まないＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ二成分複合体の活性部位を立体表示したものあり、図２（ｂ）はＳｅｐＲＳ−ｔＲＮＡＣｙｓ−Ｓｅｐ三元複合体における活性部位を立体表示したものである。リン酸部分は密接に認識される；３つの酸素原子の全ては２つの水素結合で認識される。１つの酸素原子はＴｈｒ１８８の側鎖及びＴｈｒ１８８の主鎖ＮＨと水素結合する。もう１つの水素結合は、Ｍｅｔ１８７の主鎖のＮＨ及びＳｅｒ２３１の側鎖である。その他の水素結合はＳｅｒ２３３及びＡｓｎ３２５の側鎖である。正に荷電した側鎖が負に荷電したリン酸部分を認識することはない。Ｓｅｐのα−ＮＨ３＋基は、Ｔｈｒ１８８及びＡｓｎ３２５の側鎖と水素結合する。Ｓｅｐのα−ＣＯＯ−基はＨｉｓ１８６ｔｏＴｈｒ３０５の側鎖と水素結合する。このＳｅｐの密接した認識は、ＳｅｐＲＳが２０種類の正規のアミノ酸ではなくＳｅｐを認識する特異性を説明する。
ＳｅｐＲＳは、もっぱらｔＲＮＡアンチコドンループ（図１（ｃ））と接触することによってｔＲＮＡＣｙｓを認識している。図３は、ＳｅｐＲＳによるアンチコドンループ認識のモデル図を示す。図３（ａ）はＡｄｅ３６、Ｇｕａ３７及びＡｄｅ３８の認識モデルを立体表示したものであり、図３（ｂ）はＧｕａ３４及びＣｙｔ３５の認識モデルを示す。アンチコドンループのヌクレオチドはアンチコドン結合ドメインとの接触によって引き出される。アンチコドントリプレットの最初のヌクレオチドであるＧｕａ３４の塩基は、結晶構造では直接水素結合していない（図３）。２．６Åの分解能では見られない水分子が、例えばＧｌｕ４２０及びＡｒｇ４９２の側鎖によってＧｕａ３４塩基を介して認識しているかもしれない。このことは以下の突然変異導入実験で示唆される。Ｃｙｔ３５塩基はＧｌｕ４２０の側鎖と水素結合している。Ｐｈｅ５２４の側鎖はＣｙｔ３５塩基の上に積み重なっている。Ｇｌｕ４１８の側鎖も水分子を介する認識に関与しているであろう。Ａｄｅ３６塩基はＡｓｎ４３２の側鎖と水素結合している。Ｇｕａ３７塩基はＧｌｙ４４３及びＡｓｐ５２０の主鎖のＣＯと水素結合している。Ａｄｅ３８塩基はＧｌｕ４９５の側鎖と水素結合している。これらの観測された塩基認識様式はすべて配列特異的である。
サプレッション法を用いて部位特異的ホスホセリン導入システムを確立するために、本発明者らは、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のｔＲＮＡＣｙｓのアンチコドン配列ＧＣＡをＣＵＡ（ｔＲＮＡＣｙｓアンバー）及びＵＣＡ（ｔＲＮＡＣｙｓオパール）に置換することにより、２つのサプレッサーｔＲＮＡを調製した。しかしながら、野生型ＳｅｐＲＳは、ｔＲＮＡＣｙｓアンバーもｔＲＮＡＣｙｓオパールも何れもホスホセリル化しなかった（図４）。このことは、Ｇｕａ３４塩基が、結晶構造からは直接的な相互作用は認められないがＳｅｐＲＳによって認識されていることを示す。（図３（ｂ））。そこで、ｔＲＮＡＣｙｓアンバー、及びｔＲＮＡＣｙｓオパールをホスホセリル化しうる変異体ＳｅｐＲＳを取得するために、２つの残基（Ｇｌｕ４１８及びＧｌｕ４２０）を選択し、突然変異導入を行った。これら２つのＧｌｕ残基はＳｅｐＲＳで保存されている。Ｇｌｕ４１８は水分子を介してＣｙｔ３５塩基の認識に関与しているであろう。Ｇｌｕ４２０はＣｙｔ３５塩基を認識し、そして水分子を介してＧｕａ３４塩基の認識にも関与しているであろう。これらの残基の何れかに変異を導入すると、多かれ少なかれ野生型ｔＲＮＡＣｙｓのホスホセリル化活性が影響を受けた（図４）。図４は、野生型ｔＲＮＡＣｙｓ、ｔＲＮＡＣｙｓアンバー及びｔＲＮＡＣｙｓオパールに対する野生型及び種々の変異体ＳｅｐＲＳのホスホセリル化活性を示す。この結果は、これらの残基が実際にｔＲＮＡＣｙｓの認識に関与していることを示す。１つの変異体酵素（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）は、ｔＲＮＡＣｙｓアンバー、及びｔＲＮＡＣｙｓオパールの両方に対して有意なホスホセリル化活性を示した。このＥ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ変異体酵素は、野生型ｔＲＮＡＣｙｓに対するホスホセリル化活性が著しく減少していた。
一方、図５は大腸菌、小麦胚芽及び酵母からのｔＲＮＡ混合物に対する野生型及び種々の変異体ＳｅｐＲＳのホスホセリル化活性を示す。野生型ＳｅｐＲＳは大腸菌のｔＲＮＡ混合物に対してホスホセリル化活性を示すが、小麦胚芽や酵母からのｔＲＮＡ混合物に対してはホスホセリル化活性を示さず、ホスホセリンの部位特異的導入に好ましくない。しかし、このような好ましくない活性は、ＳｅｐＲＳ変異体酵素（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）では減少していた。Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ変異体は、野生型ＳｅｐＲＳに比べて大腸菌ｔＲＮＡ混合物に対するホスホセリル化活性が著しく減少していた。
さらに本発明者らは、変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）−ｔＲＮＡＣｙｓオパール−Ｓｅｐ（オパール複合体）及び変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）−ｔＲＮＡＣｙｓアンバー−Ｓｅｐ（アンバー複合体）の結晶を作成し、それぞれ３．２Å及び３．３Åの分解能でＸ腺結晶構造を解析した。なおこれらの原子座標についても、プロテインデータバンクにそれぞれ２ＤＵ５及び２ＤＵ６というコード番号にて登録されている。その結果、図６（ａ）に示したように、オパール複合体では、変異体ＳｅｐＲＳの置換されたＡｓｎ４２０の側鎖が、Ｃ３５塩基のピリミジン環の４位のＮＨ２と水素結合していた。ｔＲＮＡＣｙｓオパールの置換されたＵ３４は、変異体ＳｅｐＲＳと直接的な相互作用はないが、Ａｓｎ４２０の側鎖のＣＯ基が、観測されない水分子を介してＵ３４のピリミジン環の４位のＯと間接的に水素結合しているであろう。変異体ＳｅｐＲＳの置換されたＡｓｎ４１８の側鎖は、主鎖のＬｙｓ４２４及びＬｅｕ４２５のＣＯ基と水素結合していた。
一方、図６（ｂ）に示したように、アンバー複合体では、変異体ＳｅｐＲＳの置換されたＡｓｎ４２０の側鎖が、Ｕ３５塩基のピリミジン環の４位のＯと水素結合していた。Ａｓｎ４２０の側鎖は、置換されたＣ３４塩基と観測されない水分子を介して間接的に水素結合しているであろう。オパール複合体と同様に、変異体ＳｅｐＲＳの置換されたＡｓｎ４１８の側鎖は、主鎖のＬｙｓ４２４及びＬｅｕ４２５のＣＯ基と水素結合していた。このように、置換されたＡｓｎ４２０の側鎖の立体配座の変化により、変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）はｔＲＮＡＣｙｓオパール及びｔＲＮＡＣｙｓアンバーの両方を認識できたと考えられる。図６（ｃ）は、野生型、オパール及びアンバーｔＲＮＡとの複合体を重ね合わせた立体映像を示す。野生型複合体におけるｔＲＮＡの３２〜３６位の立体配座は、オパール及びアンバーの何れとも異なっている。野生型ＳｅｐＲＳのＧｌｕ４２０の側鎖は、ｔＲＮＡＣｙｓオパールにおけるＵ３４のピリミジン環の４位のＯと、そしてｔＲＮＡＣｙｓアンバーにおけるＵ３５塩基のピリミジン環の４位のＯと衝突するであろう。これらの衝突（立体的な障害）は、野生型ＳｅｐＲＳがｔＲＮＡＣｙｓオパール及びｔＲＮＡＣｙｓアンバーを認識することができない原因であろう。
上記のサプレッサーｔＲＮＡとの複合体の構造に基づいて、本発明者らは変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）の４２３位のスレオニン残基及び４９２位のアルギニン残基へさらに追加の変異を導入し、より効率的な変異体ＳｅｐＲＳの構築を試みた。図８は、このようにして作製した種々の三重変異体ＳｅｐＲＳについて、ｔＲＮＡＣｙｓオパール又はｔＲＮＡＣｙｓアンバーに対するホスホセリン結合活性を示したグラフである。その結果、Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ／Ｔ４２３Ｖの三重変異体が、オパール及びアンバーサプレッサーｔＲＮＡの両方に対してＥ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ二重変異体よりも高いホスホセリル化活性を示した（図７（ａ）参照）。ＳｅｐＲＳの４２３位の疎水的なバリンの側鎖は親水的なスレオニンの側鎖よりもサプレッサーｔＲＮＡの３５位の置換された塩基を認識しやすいと推測される。図７（ｂ）は、野生型、Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ二重変異体、及びＥ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ／Ｔ４２３Ｖの三重変異体ＳｅｐＲＳの、ｔＲＮＡＣｙｓ、ｔＲＮＡＣｙｓオパール及びｔＲＮＡＣｙｓアンバーに対するホスホセリル化活性の経時変化を示したものである。これらの結果より、Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ／Ｔ４２３Ｖの三重変異体ＳｅｐＲＳのｔＲＮＡＣｙｓオパール及びｔＲＮＡＣｙｓアンバーに対するホスホセリル化活性（初速度及び最大値）は、野生型ＳｅｐＲＳのｔＲＮＡＣｙｓに対するそれらに比べて、それぞれ約３０％（初速度）及び約６０％（最大値）であった。
さらに、図９（ａ）は大腸菌、小麦胚芽及び酵母からのｔＲＮＡ混合物に対する野生型及び種々の変異体ＳｅｐＲＳのホスホセリル化活性を示す。Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ／Ｔ４２３Ｖの三重変異体ＳｅｐＲＳは、上記何れのｔＲＮＡ混合物に対してもほとんど反応せず、二重変異体酵素（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ）と比べても大腸菌ｔＲＮＡ混合物に対するホスホセリル化活性が有意に減少していた。この結果は、大腸菌ｔＲＮＡ混合物に対するホスホセリル化活性の経時変化の測定結果（図９（ｂ））からも確認された。
以上の結果より、変異体ＳｅｐＲＳ（Ｅ４１８Ｎ／Ｅ４２０Ｎ／Ｔ４２３Ｖ）と、ｔＲＮＡＣｙｓアンバー又はｔＲＮＡＣｙｓオパールとのペアは、タンパク質の部位特異的ホスホセリン残基の導入に極めて有用である。
なお、本明細書の実施例に開示された事項は、本発明者らにより、刊行物Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．４，ｐｐ．２７２−２７９（２００７）に記載されており、その全内容はここに参照により組み込まれるものとする。
本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲（クレーム）の枠内において、種々の開示要素の多様な組み合せないし選択が可能である。
［配列表］
0005305440.tif 000003
0005305440.tif 000004
0005305440.tif 000005
0005305440.tif 000006
0005305440.tif 000007
0005305440.tif 000008
0005305440.tif 000009
【図１】
0005305440.tif 000010
【図２】
0005305440.tif 000011
【図３】
0005305440.tif 000012
【図４】
0005305440.tif 000013
【図５】
0005305440.tif 000014
【図６】
0005305440.tif 000015
【図７】
0005305440.tif 000016
【図８】
0005305440.tif 000017
【図９】
0005305440.tif 000018