(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における過度の鼓脹、鼓腸、膨満または腹痛を特徴とする過敏性腸症候群を治療もしくは予防するための組成物を製造するための少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の使用であって、少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株がラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス種に属する、使用。
【請求項２】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が該哺乳類の自己株である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が消化管で生存能力がある、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４】
哺乳類がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が、それが結腸で活性となる形態で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株を含有する組成物が経口または直腸投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が嫌気環境でパッケージングされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
組成物が消化器環境で少なくとも１種類の株の活性を増強する少なくとも１つの添加剤を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
組成物が、目的とする少なくとも１つの病状に対して活性である少なくとも１つの別の薬剤もまた含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
組成物が医薬上許容される担体もまた含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、消化ガスの発生に関連する胃腸障害を治療もしくは予防する、および／または哺乳類の消化器生態系の細菌バランスを調整する組成物を製造するための非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の使用に関するものである。
【０００２】
西欧人口の機能性消化器障害または機能性腸疾患の罹患率は、成人人口の約２５％〜３０％であることが統計的に予測され、極めて高いものになっている。また、これらの消化器系障害が胃腸病学的診察を受ける主な理由の１つにもなっている（診察の約５０％）。これらの腸障害の症状は腸管滞留性の改変、鼓腸(meteorism)、腹痛および膨満(bloating)など多様である。これらの機能性障害の原因はさしあたり完全には明確になっていないが、結腸内での消化中に発生するガスが過度の鼓脹(flatulence excess)、腹部膨張(abdominal distension)（膨満(bloating)）および関連痛などのある症状の発症に重要な役割を果たしているものと推測される。例えば、活性炭、シメチコン、スメクタイト、鎮痙薬、および発酵性物質（サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ビフィズス菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)）、植物もしくは繊維（オリゴフルクトース、フェンネル、藻、オート麦、カンキツ属の果実など）を含有する、または鉱物構造（オクタライトなど）を有するある栄養補助食品など、いくつかの治療が提案されてきた。しかしながら、結腸内でのガス発生に関連した症状に対するこれらの治療の効果は不十分であり、選択的に作用するものでもない。本発明では、結腸内でのガス発生に関連した消化器系の不快感の治療および予防の両面から先行技術の欠点を補うことを考える。
【０００３】
これに関し、本発明は水素依存性酢酸生成細菌の生理学的特性、すなわち消化発酵ガス（Ｈ２およびＣＯ２）の全容積を減少させるそれらの能力と消化器生態系において他の水素依存性微生物に比べて重要な生態環境上の利点をそれらに与えるそれらの栄養多様性とをもとにしたものである。
【０００４】
ヒトでは、小腸で消化および吸収されなかった食物炭水化物は結腸に到着し、そこでそれらは複合マイクロフローラによって発酵される。有機物質のこの嫌気分解によって最終代謝産物が代謝（酢酸塩、プロピオン酸塩）または栄養（酪酸塩）特性を有する揮発性脂肪酸およびガス（Ｈ２、ＣＯ２および、ある個体ではＣＨ４）として生成される。
【０００５】
これらの発酵ガスのうち、Ｈ２はヒト結腸内での有機物質の分解の継続および有効性において重大な役割を果たしている。一部のＨ２は呼吸および直腸経路を介して排出されるが、このガスのほとんどのものは腸内細菌叢によりin situで再び使用されている。後者のものは水素依存性細菌叢と呼ばれるものであり、硫黄還元細菌およびメタン生成古細菌で構成されている。
【０００６】
硫黄還元細菌は全ての個体の消化器マイクロフローラで見られる(Pochard et al. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 98 p225)。これらはＨ２Ｓを合成するが、これは真核生物細胞に対して著しい毒性産物であり、さらにいくつかの消化器系疾患、特に潰瘍性大腸炎と関係していると考えられるものである(Roediger et al. (1993), Gastroenterology, 104, p802)。
【０００７】
メタン生成古細菌はＣＨ４を生成するが、これは非毒性ガスである。このメタン産生はごく少数のヒト個体群（インド人成人の約２１％、アフリカ黒人青年の地方人口の９５％、および西欧人口の４０％）でのみ見られ、これは呼吸経路を介して排出される、またはこれが排出されて鼓腸状態になると考えられている(Segal et al. (1988) Gut 29 p608; Pochart et al. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 98 p225)。これらの個体はメタン排泄者と呼ばれ、かなり多くの個体数のメタン生成古細菌が宿っている（＞１０８／乾燥糞便抽出物ｇ）(Durand et al. (1996) in: Malkki Y and Cummings JH (欧州共同体刊行物版, p58)。これらの個体では、メタン産生がＨ２排出の主要経路となっている。
【０００８】
メタン排泄者ではない個体は、その中に還元的酢酸生成が存在する別の機構によりＨ２を再使用する。非メタン排泄者ではこの経路がＨ２を使用する重大な代謝プロセスを構成している。
【０００９】
非メタン排泄個体の糞便マイクロフローラが主にＨ２およびＣＯ２を代謝によって酢酸塩とし、一方、メタン排泄個体のものはＨ２およびＣＯ２を使用してメタンを生成することが研究により実際に分かってきた(Lajoie et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 p2733; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p193)。同時に、Dore et al.(1995 FEMS Microbiol. Ecol. 17 p279)によってヒト結腸内のメタン生成古細菌数と酢酸生成細菌数との間に負の相関関係が存在することが示された。よって、非メタン排泄個体では結腸内にほとんどまたは全くメタン生成古細菌が宿っていないため、それらの酢酸生成活性の最大限の発現が可能なのである(Lajoie et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 p2733; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p193)。
【００１０】
水素依存性酢酸生成細菌叢は重要な分類学的多様性により同定される。これは特にクロストリジウム(Clostridium)、ラミノコッカス(Ruminococcus)および連鎖球菌(Streptococcus)属に属する細菌種(Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p94)、さらにユーバクテリウム(Eubacterium)属のある種(Schink (1994) in: Drake HL (ed) Acetogenesis. New York: Chapman and Hall p197)で構成されている。
【００１１】
「水素依存性酢酸生成細菌」とは、それらがＨ２／ＣＯ２を使用して独立栄養増殖する際に、またそれらが有機基質を使用して従属栄養増殖する際に、酢酸塩を合成する還元経路（またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路）によりこの代謝産物を生成する細菌種を意味するものである。これらの水素依存性酢酸生成細菌は、実際には大きな栄養学的可能性を有するものであり、Ｈ２／ＣＯ２を使用することのほか、多数の糖類および有機化合物を発酵させることが可能である(Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p94)。
【００１２】
本発明の水素依存性酢酸生成細菌株はＨ２およびＣＯ２ガスから短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、特に酢酸塩を生成する。このＳＣＦＡの生成は宿主に種々の病状の予防（防御）または治療などの生理学的利点を与えるものである（下記を参照）。
培地中に有機化合物とＨ２／ＣＯ２が同時に存在する（ヒト結腸内で遭遇するものと同じ条件）ことから、水素依存性酢酸生成細菌株によって２つの基質が同時に使用されることになる(Breznak and Blum (1991), Arch. Microbiol., 156 p105)。この現象は混合栄養と呼ばれるものであり、細菌がより多くのエネルギーを得ることでより早く増殖することが可能になる。
【００１３】
そのため、数多くの有機基質を使用する能力および混合栄養により増殖する能力と組み合わさったＨ２／ＣＯ２消費能力によって、限定数の基質（Ｈ２、蟻酸塩）しか使用しないメタン生成微生物群およびそれらのＨ２代謝が硫酸塩の存在に依存している硫黄還元個体群と比べ、かなりの生態学的利点が酢酸生成細菌に与えられる。
【００１４】
プロピオン酸菌、乳酸桿菌(lactobacilli)、ビフィズス菌(Bifidobacteria)などの細菌を含有するあるプロバイオティック製品を使用することである患者の結腸内細菌叢を改変することが可能になる(Bougle et al. (1999) Scand. J. Gastroenterol. 34 p144; Venturi et al. (1999) Aliment. Pharmacol. Ther. 13 p1103)。
【００１５】
従って、酢酸生成細菌のＨ２／ＣＯ２代謝能力によって、発酵ガスの全容積を減少させる、および宿主がそのエネルギー源を代謝できる酢酸塩を生成することで結腸内での発酵を最適な状態にすることができることから、酢酸生成細菌を食品医薬品または栄養補助食品として使用できる製品において、Fuller(1989, J. Appl. Bact., 66 p365)により定義されたプロバイオティクスとして使用することが目的の著しく革新的な経路であることが分かる。このように、消化ガスを減少させることがこれらのガスの蓄積に関連する消化器系障害の予防および／または治療の有力な手段であると考えられる。
【００１６】
従って、本発明の目的は上記の消化器系障害を調節する、および／または哺乳類の細菌叢バランスを調整する非病原性水素依存性酢酸生成株の使用である。
【００１７】
本発明の哺乳類は、好ましくは反芻動物などの複胃哺乳類とは対照的な単胃哺乳類である。ネコ科の動物およびイヌ科の動物、特に家畜哺乳類（ネコおよびイヌ）、さらにヒトが特に意図される。
【００１８】
「非病原性」とは、その細菌種の存在と関係のある宿主において病理が立証されていない細菌種（ＧＲＡＳ（一般に安全と認識される）株）を意味するものである。
【００１９】
かかる使用は多方面に構想し得るものである。本発明は、ある消化器系障害を予防および／または治療するための予防または治療的使用に関する。この予防および／または治療は細菌叢を調整することにより結腸内で発生するガスの調節を介して行われる。この種の使用は医師または保健専門家の指導の下で計画され得るものである。この場合、保健専門家が投与量、治療期間、さらに目的とする消化器系障害の予防および／または治療に有効な非病原性水素依存性酢酸生成株とその他の有効成分との有力な組合せを決める。かかる使用には、後に記載する本発明の分析方法を用いた非病原性水素依存性酢酸生成株のモニタリングが必要である。
【００２０】
本発明はまた、使用者自身が非病原性水素依存性酢酸生成株の投与を決める治療および／または予防的使用に関する。ここでの所望の目的は、例えば生活の質の向上を望む使用者の不快感を軽減することである。
【００２１】
特に、本発明が目的としている消化器系障害は、その患者の生活の質に影響を及ぼす。
【００２２】
患者は生じた消化器系の不快の程度および／または各人のこれらの障害への耐力によって医師の診察を受けるかどうかを決めている。
【００２３】
特に、本発明は、以下の用途：
（１）消化器機能性障害を予防および／または治療する、
（２）酢酸生成細菌の活性を有利に高め、特にメタン生成および硫黄還元細菌叢を不利にすることにより結腸内の細菌叢バランスを調整すること
に向けた組成物を製造するための水素依存性酢酸生成株の使用に関する。
【００２４】
後の事項の特徴として以下の：
（１）ＣＨ４ガスの形成を減少させる、
（２）消化器系の病状の起こりおよび／または発症に関連したＨ２Ｓ、毒性産物 の産生を減少させる
（３）宿主の健康によい代謝産物の生成を助ける
という利点がある。
【００２５】
特に、ラミノコッカス、クロストリジウムまたは連鎖球菌属の株、好ましくはラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス(Ruminococcus hydrogenotrophicus)が用いられる。
【００２６】
従って、本発明は、有力な毒性ガスの発生を減少させることにより胃腸障害を予防および／もしくは治療する、ならびに／または哺乳類の消化器生態系の細菌バランスを調整する組成物を製造するための少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の使用に関する。かかる食品または医薬組成物もまた本発明の対象である。
【００２７】
上記の減少および／または上記の調整は、消化発酵中に産生する水素ガス（Ｈ２）および／または二酸化炭素ガス（ＣＯ２）の量を減少させることにより行われる。
【００２８】
また、上記の減少および／または上記の調整は、結腸内の酢酸生成細菌叢の活性を高め、メタン生成および硫黄還元細菌叢に不利にすることによっても行われ得る。
【００２９】
少なくとも１種類の水素依存性酢酸生成細菌株を含有する組成物の使用がその緩和を目的とする胃腸障害は、機能性腸疾患群、特に過敏性腸症候群の主な診断基準である過度の鼓脹(excessive flatulence)、鼓腸(meteorism)、膨満(bloating)および腹痛に含まれるものである。少なくとも１種類の水素依存性酢酸生成細菌株を含有する組成物は潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病の場合にも使用でき、これらの病気の症状を悪化させる原因である結腸内のガス容積を減少させる。
【００３０】
本発明の好ましい具体例では、上記の組成物がＥＣ規制第２５８／９７号で規定される新規食品または食品成分の作製、および特に機能性食品の製造に使用できる食品組成物である。ある食品が生物の１以上の目的の機能に対して通常の栄養学的効果よりも優れた有益な効果を与えることで、健康および安寧状態を向上させる、および／または疾患の危険性を低下させることが十分に立証された場合にはそれは機能的なものと考えられる(Diplock et al. Scientific concepts of functional foods in Europe: consensus document, British Journal of Nutrition, 1999, 81, S1-S27)。
【００３１】
上記の組成物はパッケージングされた、例えばカプセル剤またはゼラチンカプセル剤形態のプロバイオティクスを特に構成する。
【００３２】
このように、消化器系の不快感を軽減することにより、使用者に安寧感を与える非病原性水素依存性酢酸生成株を含有する本発明の食品組成物が使用できる。
【００３３】
本発明のもう１つの好ましい具体例では、上記の組成物が賦形剤を含んでもよい医薬上許容される担体と組み合わせた医薬組成物である。これは好ましくは経口または直接in situ、特に結腸内視鏡検査によりまたは坐剤により直腸投与される。
本発明のもう１つの具体例では、医薬組成物が目的とする少なくとも１つの病状に対して活性である少なくとも１つの別の薬剤もまた含んでなる。
【００３４】
本発明の医薬または食品組成物は、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、錠剤、散剤、粒剤、または経口液剤もしくは懸濁剤の形態で経口投与し得る。少なくとも１種類の細菌株をゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなどの通常の賦形剤と混合することができる。通常の賦形剤の使用を少なくすることもまた有利である。これにより結腸内で活性となるように使用する少なくとも１種類の細菌株の能力を高めることができる。例えば、セロビオース、マルトース、マンノース、サリシン、トレハロース、アミグダリン、アラビノース、メロビオース、ラムノースおよび／またはキシロースを加えてもよい。このリストは網羅的なものではなく、基質は考察した株との関係から選択され、適合される。これらの基質によって組成物に存在する少なくとも１種類の酢酸生成細菌株の従属栄養および／または混合栄養増殖を助けてもよい。
【００３５】
従って、組成物は好ましくは消化器環境で少なくとも１種類の株の活性を増強する少なくとも１つの添加剤を含んでなる。
【００３６】
本発明の特定の具体例では、医薬および／または食品組成物に存在する少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株は、それが結腸で活性となる形態で投与される。特に、少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が消化管、特に結腸内で生存している、または生存能力があることが求められる。少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株生産後、かつ生産方法に応じて、この株を嫌気パッケージング条件下で維持し、その生存状態を持続させることもできる。
【００３７】
好ましい具体例では、少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が嫌気環境でパッケージングされる、すなわちそれが無酸素雰囲気下でパッケージングされる。
【００３８】
本発明のもう１つの好ましい具体例では、組成物に存在する少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株が上記の哺乳類の自己株である、すなわちそれが同属であるその他の哺乳類の消化器系、特に糞便から単離することができる。
【００３９】
好ましくは、特に哺乳類がヒトである場合、少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株はラミノコッカス属に属し、いっそうさらに好ましくはラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス種に属する。その他の水素依存性酢酸生成細菌、特に連鎖球菌またはクロストリジウム属の細菌、とりわけクロストリジウム・ココイデス(Clostridium coccoides)もまた使用できる。
【００４０】
本発明はまた、非病原性水素依存性酢酸生成細菌株を上記のように使用した後、それを哺乳類の消化管で特異的にモニターする方法であって、以下の：
ａ．その検出が所望される非病原性水素依存性酢酸生成細菌株に特異的なヌクレオチド配列（プローブ）を定義し、
ｂ．そのプローブを、糞便細菌叢から抽出された全核酸、またはスライドに付着した糞便細菌とハイブリダイズさせることにより上記の株を検出および／または定量する
工程を含んでなる方法に関する。
【００４１】
かかるモニター方法を行うため、本発明の対象でもある診断キットを開発することができる。かかるキットには、特に糞便内細菌量が測定できる「標準器」が含まれる。
【００４２】
当業者はその他の細菌のＤＮＡとハイブリダイズしない特定の配列を定義することができる。同様に、当業者はそれらに対して利用可能な手段および所望の精度に応じて膜でのハイブリダイゼーションまたはin situハイブリダイゼーションを選択する。
【００４３】
好ましくは、検出された核酸が全細菌ＤＮＡであるが、ＤＮＡもしくはＲＮＡ混合物、または細菌ＲＮＡ単独であってもよい。
【００４４】
少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の存在は別の方法によっても調べることができる。
【００４５】
特にＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲ、または特定プローブでのハイブリダイゼーション（サザンまたはノーザン）による哺乳類糞便内の少なくとも１種類の非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の検出では、上記の株の存在、および所望によりある遺伝子の発現の検出が可能である。有利な特定の配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列、特に結腸内細菌叢のその他の種には存在しない領域で選択できる。
【００４６】
本発明はまた、上記のその使用に向けたある非病原性水素依存性酢酸生成細菌株の生産方法であって、以下の：
ａ．その株を偏性嫌気条件下、エネルギー源として炭素系基質および／またはＨ２／ＣＯ２の存在下で好適な培地で増殖させ、
ｂ．細菌細胞を回収し、
ｃ．細菌細胞を選択された剤形にパッケージングする
工程を含んでなることを特徴とする方法
に関する。
【００４７】
その株は改変ＡＣ２１培地（実施例１に記載）で発酵槽内３７℃で、好ましくは増殖させる。炭素系基質はグルコースであってよい。
【００４８】
細菌細胞を回収する好ましい方法は、例えば１００００ｇ〜１５０００ｇ間、有利には１２０００ｇ、で１５〜２０分間の遠心分離法である。当業者であればこれらのパラメーターを最適なものにすることができる。
【００４９】
有利には、工程ｂ〜ｃ間に細菌を、特に嫌気リン酸バッファーで、細胞の懸濁、撹拌、およびさらなる遠心分離工程により洗浄してもよい。
【００５０】
細菌ペレット（洗浄したまたは洗浄していない）は選択された剤形に関連してパッケージングされる。有利な方法は凍結乾燥法である。
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００５２】
実施例１：微生物の単離
健康な非メタン排泄ボランティア由来のヒト糞便サンプルを使用する。個体のの呼気により排出されるメタンレベルが大気レベルの１．８ｐｐｍから１ｐｐｍ以内である場合(Bond et al. (1970) Gastroenterology 58 p1035)、およびそれらの糞便抽出物内に含まれるメタン生成微生物数が糞便抽出物の１０７／ｇ未満である場合(Bernalier et al. (1996) Arch Microbiol. 166 p176)、その個体を非メタン排泄者と考える。メタンレベルは水素炎イオン化検出器を備えたクロマトグラフを用いて測定される。新たに採取した糞便サンプルを偏性嫌気条件下、４℃で最大１０時間維持する。
【００５３】
この微生物の濃縮、単離、および培養は偏性嫌気条件下、半合成培地、改変ＡＣ−２１培地(Breznak et al. (1988) Arch Microbiol. 150 p282)で行う(Hungate (1969) in: Norris JR and Gibbons DW (eds) Methods in microbiology Vol.3B, New York: Academic Press p117)。半合成培地ｌ当たりの組成は以下の通りである：
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．２ｇ
ＮＨ４Ｃｌ                                ０．２５ｇ
ＫＣｌ                                    ０．５ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                      ０．１５ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ０．６ｇ
ＮａＳＯ４                                ０．１ｇ
酵母抽出物                                ０．５ｇ
トリプトン                                ２ｇ
微量元素溶液                              １ｍｌ
タングステン酸セレン溶液                  ０．１ｍｌ
ビタミン溶液                              ５ｍｌ
レザズリン溶液（１％、ｗ／ｖ）            １ｍｌ
ＮａＨＣＯ３（１Ｍ）                      ３０ｍｌ
システイン／硫化還元溶液
（１．２５％／１．２５％、ｗ／ｖ）        ２０ｍｌ
【００５４】
微量元素溶液はWiddel et al.(1983, Arch Microbiol., 134, p286)に従って調製し、ビタミン溶液はGreening and Leedle(1989, Arch Microbiol., 151, p399)に従って調製する。タングステン酸塩−セレン溶液は次の組成：２０ｍＭ  ＮａＯＨ中０．１ｍＭ  Ｎａ２ＷＯ４および０．１ｍＭ  Ｎａ２ＳｅＯ３、を有している。
【００５５】
ゲル化剤（２％寒天）を加えて半合成培地を固形化する。試験計画に合わせて、接種後、培地のガスをＨ２／ＣＯ２またはＮ２／ＣＯ２で置き換える。
【００５６】
希釈培地は純粋な無機嫌気性培地である(Dore et al.(1995) FEMS Microbiol. Lett. 130 p7)。原液は糞便サンプルから調製（１／１０ｗ／ｖに希釈）する。連続１０倍希釈物はストック懸濁液から調製する。このように調製した希釈物を唯一のエネルギー源としてＨ２／ＣＯ２（６０：４０ｖ／ｖ、２０２ｋＰａ）を含む半合成液体培地に接種する(Dore et al.(1995) FEMS Microbiol. Lett. 130 p7; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p193; Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p94)。３７℃で２０日間インキュベートした後、最大細菌増殖、ガス消費、および酢酸塩の化学量論生成を示す最大希釈チューブから濃縮物を得る(Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p94)。培養物中のガス圧の低下は、Capsuhelic型圧力計(Dwyer, Instruments, Michigan City, Mich., USA)での分圧の直接測定により確認する。濃縮培養物を３回植え継いだ後、同一寒天培地およびエネルギー源としてＨ２／ＣＯ２を含むロール−チューブによる方法(Hungate (1969) in: Norris JR and Gibbons DW (eds) Methods in microbiology Vol. 3B, New York: Academic Press p117)により細菌コロニーを単離する。３９℃で２０日間インキュベートした後、コロニーを液体培地に移す。ロール−チューブで３〜５回連続して植え継いだ後に精製された培養物を得る。最後に、グラム染色を行い、位相差顕微鏡により培養物の純度を測定する。
【００５７】
単離された水素依存性酢酸生成株の全ＤＮＡはLawson et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 65 p41)の方法により抽出する。次いで、１６Ｓ  リボソームＲＮＡをコードする遺伝子をユニバーサルプライマーＡＲＩおよびｐＨを用いてＰＣＲにより増幅する。このＰＣＲ産物を精製した後、「ダイ−ジデオキシターミネーターサイクルシーケンス」キットおよびApplied Biosystem３７３Ａ型自動シーケンサーを使用して配列決定する。単離された酢酸生成株とその他の種間で相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の調査はＦＡＳＴＡプログラム（配列データベースはＥＭＢＬおよびＲＤＰのものである）を使用し、さらに示された基本パラメーターを用いて行う。配列アラインメントは手動で確かめる。
【００５８】
この方法を用いてラミノコッカス属のある細菌が単離でき、これをラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス種と同定した。この細菌は２００１年５月１０日にthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen[German Microorganisum Collecton](Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)へＤＳＭ１０５０７、およびＤＳＭ１４２９４として寄託した（ブダペスト条約）。
【００５９】
実施例２：一般特性の検討
１−グラム染色法（常法）、およびBuck(1982 App. Environ. Microbiol. 44 p992)によるＫＯＨ試験により細菌の膜タイプを決める。
２−１ｍｌの細菌懸濁液と数滴のＨ２Ｏ２（３０％）とを混合してカタラーゼ活性を測定する。放出される気泡の発生が幾分激しくなり、カタラーゼの存在が示される。
【００６０】
３−ジメチルｐ−フェニレンジアミンを飽和させた濾紙のディスクに細菌コロニーを置いてシトクロムオキシダーゼ活性を調べる。ディスクが直ちに赤／紫色に発色するとこの試験に対して陽性である。
【００６１】
４−２％酢酸ウラニルでのネガティブ染色法後、位相差顕微鏡および電子顕微鏡により培養物の形態的特徴を調べる。細胞は２％グルタルアルデヒドで予備固定した（４℃で１５時間）後、２％ＯｓＯ４で固定する（４℃で最大１５時間）。次いで、この細胞をＥＰＰＯＮ−８１２に包埋し、ブロックを超薄片に切る。これらの切片を酢酸ウラニルで染色し、酢酸塩に浸漬し、さらに透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ４００）で観察する。
【００６２】
５−Ｏ２存在または不在下の増殖を観察して細菌の呼吸タイプを調べる。
６−半合成培地のＣＯ２／ＮａＨＣＯ３比を改変してｐＨの変化が細菌の増殖に与える影響を調べる(Costilow (1981) American Society for Microbiology, Washington DC p66)。細菌増殖は３７℃で２４または４８時間インキュベートした後に測定する（ＤＯ６００）。最適増殖温度をグルコースを含有する半合成培地で調べ、２０〜４５℃の範囲の温度で増殖を観察する。各試験を３回行う。細菌増殖はＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ分光光度計(Bioblock Scientific, Illkirch, France)を使用してモニターする。
【００６３】
ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカスＤＳＭ１０５０７が胞子未形成偏性嫌気グラム陽性球桿菌であることが分かった。ネガティブ染色では遊走子の不在が示される。細菌細胞は一個体または２つ一組で存在する。この株にはカタラーゼまたはシトクロムオキシダーゼが存在しない。最適増殖温度およびｐＨは各々、３５〜３７℃および６．６である。コロニーは半透明の白色〜わずかに茶色の、規則性のあるエッジを有する円形（直径１〜２ｍｍ間）である。
【００６４】
実施例３：増殖試験、酢酸生成活性の測定
種々の細菌株のＨ２／ＣＯ２代謝能力および酢酸生成能力を調べる。ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス(Ruminococcus hydrogenotrophicus)ＤＳＭ１０５０７、ならびにこれらの分類学的に近いラミノコッカス・プロダクタス(Ruminococcus productus)ＤＳＭ３５０７、ラミノコッカス・プロダクタスＤＳＭ２９５０、ラミノコッカス・ハンセニー(Ruminococcus hansenii)ＤＳＭ２０５８３およびクロストリジウム・ココイデス(clostridium cocoides)ＤＳＭ９３５（ＤＳＭ番号はthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismenに寄託された生物の番号である）株をエネルギー源としてＨ２／ＣＯ２（６０：４０、ｖ／ｖ、２０２ｋＰａ）の存在下、改変ＡＣ−２１培地でインキュベートする。対照培養物はＮ２／ＣＯ２（６０：４０ｖ／ｖ、１５０ｋＰａ）下でインキュベートする。各細菌株に対して３種類の培養物（１対照物および２試験物）を準備する。Ｈ２／ＣＯ２（６０：４０ｖ／ｖ、２０２ｋＰａ）の存在下での９６時間のインキュベーションにより独立栄養増殖を確認する。３７℃で６日間インキュベートした後、酢酸塩生成を酵素試験(Boehringer Mannheim, Meylan, France)により定量する。
【００６５】
Ｈ２／ＣＯ２消費量は
１）消費したガス容積の測定
２）気相の組成物のクロマトグラフィー（ＣＰＧ）分析
により測定する。
【００６６】
酢酸生成株の従属栄養増殖（ＯＤ６００）は唯一のエネルギー源としてグルコース（２ｇ／ｌ）またはフルクトース（２ｇ／ｌ）を加え、細菌を２０時間インキュベートして調べる。
【００６７】
グルコース発酵は２ｇ／ｌのグルコースを含有する半合成培地で、さらに１００％ＣＯ２で構成される雰囲気下で細胞を３７℃で２０時間インキュベートして調べる。インキュベーション終了時に上清の揮発性脂肪酸が第３級ブチルジメチル誘導体へ変換した後、これをクロマトグラフィーにより定量する(Richardson et al. (1989) Lett. Appl. Microbiol. 9 p5)。
【００６８】
基質としてＨ２／ＣＯ２（６０：４０、ｖ／ｖ、２０２ｋＰａ）の存在下、改変ＡＣ−２１培地で３７℃では、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスが２６．４時間で２倍になることが観察される。エネルギー源としてグルコースまたはフルクトースを加えた場合には、３７℃においてＲ．ヒドロゲノトロフィカスが約２または３時間で２倍になる。
【００６９】
調べた細菌株が酢酸生成能力を有することが分かる：これはＨ２／ＣＯ２の存在下での独立栄養増殖を示し、主な代謝産物として酢酸塩を生成する（表１）。分類学的に近い種では、Ｃ．ココイデスで酢酸生成活性が認められる。また、かなり弱いものではあるがＲ．ハンセニーおよびＲ．プロダクタスでもそれが認められる。
【００７０】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスＤＭ１０５０７は３７℃で９６時間の培養後、約１２０ｍＭのＨ２を消費している（１時間当たり１．２５ｍＭのＨ２が消費される）。その時の全酢酸塩生成量は３０ｍＭに相当する（化学量論：生成される酢酸塩に対し、４倍のＨ２が消費される）。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
実施例４：１３ＣＯ２の酢酸塩への取り込み定量（ＮＭＲ法）によるＲ．ヒドロゲノトロフィカスの水素依存性酢酸生成活性の測定
Ｈ２存在下で培養したＲ．ヒドロゲノトロフィカスの細胞懸濁液を用いてＮＭＲにより１３ＣＯ２の酢酸塩への取り込みを定量する。細菌を実施例１に記載した２５０ｍｌのＡＣ２１培地、および唯一のエネルギー源としてＨ２／ＣＯ２を含む１リットル容フラスコで培養する。３７℃で増殖させた後、この細菌を遠心分離（１２０００ｇで２０分間）により回収し、２０ｍＭのＮａＨ１３ＣＯ２を含有するリン酸バッファーで再懸濁する(Leclerc et al (1997), Anaerobe, 3, p307)。この懸濁液を１００％Ｎ２（対照）またはＨ２／Ｎ２（８０：２０、ｖ／ｖ）、１０１気圧で構成される雰囲気下で３７℃で２０時間インキュベートする。インキュベーション終了時に懸濁液をさらに１２０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収する。全酢酸塩生成を酵素試験(Boehringer Mannheim kit)により定量する。１３Ｃ標識代謝産物はＮＭＲにより分析する(Bernalier et al, (1996), FEMS Microbiol. Ecol., 19 p193)。
【００７３】
この細菌をＨ２存在下で培養した場合に、１３Ｃ  ＮＭＲにより検出される唯一の代謝産物が酢酸塩である。１３Ｃ酢酸塩はそのメチルおよびカルボキシル基で等しく標識されている。二重標識された酢酸塩は全標識酢酸塩の７２％にあたる。このことからＲ．ヒドロゲノトロフィカスによるＨ２およびＣＯ２からの酢酸塩の合成が還元的酢酸生成経路によって起こることが確認できる。
【００７４】
実施例５：酢酸生成菌の栄養学的能力の測定
酢酸生成菌によるその他の有機基質の代謝を５または１０ｍＭの基質を含有する改変ＡＣ−２１培地を用い、１００％ＣＯ２で構成される雰囲気下で測定する。
【００７５】
同じ基質を含有する培地での植え継ぎを３回繰り返した後に細菌がその増殖を維持している場合、および３７℃で２４時間インキュベートした後に培養物のＯＤ６００が基本半合成培地（有機基質を含まない）で観察されるものの少なくとも２倍に等しい場合、その試験が陽性であると考える。
【００７６】
数多くの有機基質が考察した細菌の従属栄養増殖を可能にしていることが分かる（表II）。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
さらに、ヒト便から単離した種々の水素依存性酢酸生成株のバニリン酸塩、コーヒー酸塩またはシリンギ酸塩などの種々の芳香族化合物の存在下での増殖をＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ分光光度計を使用して６００ｎｍで光学濃度を測定することにより定量する（気相へのＨ２添加によるこれらの培養物の影響も調べる）。分解された基質量を生成された代謝産物の性質からＨＰＬＣにより測定する。
【００７９】
調べた種々の芳香族化合物の代謝能力は考察する水素依存性酢酸生成株によって異なる。クロストリジウム種は増殖し、コーヒー酸塩およびシリンギ酸塩の２０％〜３０％を分解することができるが、培養物にＨ２を添加した場合にはこの分解が１００％に達する。クロストリジウム株のあるものは気相にＨ２が存在する場合のみバニリン酸塩を分解する。この株は第１の工程でバニリン酸塩を脱メチル化してプロトカテキン酸塩にした後、この化合物をＨ２を用いて脱カルボキシル化してカテコールにする。Ｒ．ヒドロゲノトロフィカス株はバニリン酸塩に対して弱い活性しか示さないため、この代謝にはＨ２の存在による影響がないことが分かる。
【００８０】
宿主の酵素により消化できない２種類の有機基質、フルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）およびラクツロースを使用するＲ．ヒドロゲノトロフィカスの能力もまた、本実施例に記載のプロトコールに従って測定する[消化できにくい各基質２ｇ／ｌの存在下で見られる細菌増殖の測定（６００ｎｍでの光学濃度）、および同一基質への植え継ぎを３回繰り返した後のこの増殖の維持]。Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスがこれらの２種類の有機基質を代謝できないことが分かる。
【００８１】
実施例６：水素依存性酢酸生成株ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカスの混合栄養性
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスが混合栄養（有機基質および無機基質の同時使用）により増殖できるかどうかを確認するためにこの株を２種類のエネルギー源、一方の有機はグルコースおよびもう一方の無機はＨ２／ＣＯ２、の存在下で培養する。この培地（実施例１に記載の改変ＡＣ２１培地）は１．４ｍＭのグルコースを含有しており、さらに接種後に気相をＨ２／ＣＯ２（６０：４０、１５６ｋＰａ）の混合物で置き換える。培養物に唯一のエネルギー源をグルコースまたはＨ２／ＣＯ２のいずれかとして得たＲ．ヒドロゲノトロフィカスの予備培養物０．３ｍｌを接種する。３７℃でのインキュベーション間、培養栓に付属の圧力センサーを使用してこの株によるガスの消費をモニターする(Leclerc et al. (1997), Anaerobe, 3, p307)。細菌増殖はＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ分光光度計を使用して６００ｎｍで培養物の光学濃度を測定することにより定量する。培養物上清サンプルを２時間毎に採取し、グルコース消費（Boehringer 酵素法を使用した残留グルコースのアッセイ）および発酵による代謝産物生成（クロマトグラフィーによるアッセイ（実施例３に記載））を定量する。
【００８２】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスが調べた２種類の基質を同時に使用することができることが分かる。２種類の基質の存在下では細菌の指数増殖期が１度だけ観察される。この指数増殖期ではグルコースおよびＨ２／ＣＯ２の同時消費が認められる。このことから、これら２種類の基質に対してＲ．ヒドロゲノトロフィカスの混合栄養性が示される（Leclerc and Bernalier、刊行物へ提出）。グルコースは指数増殖期の終わりには細菌により完全に消費されてしまっているため、定常増殖期にはこの細菌は残留するＨ２／ＣＯ２を使用することによりその代謝を維持している。
【００８３】
また、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスの甘味剤、フルクトースおよびＨ２／ＣＯ２を同時代謝する能力も調べる。この株をこれらの２種類のエネルギー源の存在下、実施例１に記載の改変ＡＣ２１培地で培養する。気相はＨ２／ＣＯ２（６０：４０、ｖ／ｖ、２０２ｋＰａ）構成のまま、種々の濃度のフルクトース（２、１、０．５および０．２５ｇ／ｌ）を試験する。この際に使用する試験プロトコールは上記のものと同じである。
【００８４】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスがフルクトースおよびＨ２／ＣＯ２を同時代謝することができ、２種類の基質の存在下での細菌増殖が１度だけの指数増殖期を特徴としていることが分かる。培地に存在するフルクトース濃度がいかなるものであっても、さらには細菌接種物の起源がいかなるものであっても（フルクトースまたはＨ２／ＣＯ２もしくはフルクトース＋Ｈ２／ＣＯ２で調製した予備培養物）この混合栄養増殖は観察される。定常増殖期には全てのフルクトースが消費されてしまっているため、この細菌はＨ２／ＣＯ２だけを代謝する。
【００８５】
実施例７：ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカス培養物の凍結乾燥により水素依存活性の発現に与える影響
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスを凍結乾燥形態で保存することによりＨ２／ＣＯ２を使用するその能力を損なわれるかどうかを確認するため、培養、凍結乾燥物の保存、および細菌の再懸濁についての種々の条件を調べる。
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカス培養物を、実施例１に記載した２５０ｍｌのＡＣ２１培地を含み、エネルギー源としてフルクトース（２ｇ／ｌ）、Ｈ２／ＣＯ２（６０：４０ｖ／ｖ、１００ｋＰａ）または両方の基質を添加した１リットル容フラスコで準備する。使用する各基質に対して、これらの培養物を３７℃で２４時間、４８時間または７２時間インキュベートする。次いで、培養物の遠心分離（１５３００×ｇ、３０分、４℃）により細菌ペレットを得、１０ｍｌの嫌気バッファーに溶解する。このようにして得られた懸濁液を２ｍｌずつに分けた後、１４０００×ｇで５分間遠心分離する。次いで、細菌ペレットを−８０℃で冷凍した後、一晩凍結乾燥する。凍結乾燥物は好気または嫌気（１００％ＣＯ２）雰囲気下４℃で保存する。１５〜３０日間保存した後、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカス凍結乾燥物を５ｍｌの嫌気希釈バッファーに溶解する。その後、これらの細菌懸濁液をそのまま、または種々の炭素源を含有する完全培地で３７℃で４８時間濃縮した後に、唯一のエネルギー源としてＨ２／ＣＯ２（６０：４０、ｖ／ｖ、２００ｋＰａ）を含むＡＣ２１培地に接種する。Ｈ２／ＣＯ２の存在下で３７℃で７２時間インキュベートした後、各培養物についてＨ２消費量および生成した酢酸塩量を測定する。
【００８６】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスの凍結乾燥によりその水素依存能力に与える影響は見られない。この株を予備培養するのに使用した基質がいかなるものであっても（フルクトース、Ｈ２／ＣＯ２または両方の基質を同時に）凍結乾燥物を培養状態に置くとＲ．ヒドロゲノトロフィカスの水素依存活性が復帰することがこの理由である。同様に、凍結乾燥物の好気または嫌気的保存方法によっても、この細菌の水素依存能力の発現への影響はほとんどない。しかしながら、最大の水素依存活性はＲ．ヒドロゲノトロフィカスをフルクトースの存在下で予備培養した場合、および凍結乾燥物を嫌気雰囲気下で保存した場合に見られる。同様に、この株を予備培養するのに使用した基質がいかなるものであっても、さらに凍結乾燥物の保存方法がいかなるものであっても、有機基質を多く含む培地で凍結乾燥される細菌を予め培養することによりそれらの水素依存能力の発現は実質的に高められる。この効果は完全培地での凍結乾燥培養物の濃縮によって生じる細菌密度の高まりから説明されよう。
【００８７】
得られた全ての結果から、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカス株を有機基質の存在下で培養し、凍結乾燥形態で好気または嫌気雰囲気下、４℃で保存でき、このことによるその水素依存能力のその後の発現への実質的な影響がないことが示される。
【００８８】
実施例８：Ｈ２生成繊維分解細菌とＲ．ヒドロゲノトロフィカス間のin vitroにおけるＨ２の種間移行
in vitroにおいて繊維分解細菌種により生成されたＨ２をＲ．ヒドロゲノトロフィカスが使用する能力を酢酸生成株とセルロース分解細菌とを組み合わせた同時培養により調べる。調査する２種類のセルロース分解種はヒト便から実験室で単離した。実験室で開発した、唯一の炭素およびエネルギー源としてWhatman Ｎｏ．１濾紙のセルロース小ストリップを含む半合成培地で同時培養物を準備する。これらのセルロース分解種を各々、培養チューブ当たり接種物０．５ｍｌの割合で接種する。３７℃で４８時間インキュベートした後、０．５ｍｌのＲ．ヒドロゲノトロフィカス接種物をこれらのセルロース分解細菌培養物各々に加える。各セルロース分解種の対照単一種培養物も同時に準備する。
【００８９】
培養物を３７℃で１２日間インキュベートすることにより動態が得られる。インキュベーション後、気相のＨ２量をクロマトグラフィーにより分析し、分解されたセルロース量を残留固体の測定により定量し、さらにセルロースの最終発酵産物を気相クロマトグラフィーおよび／または酵素経路（Rocheキット）により確認する。
【００９０】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスを一方またはもう一方のＨ２生成セルロース分解種に加えることにより同時培養物中のこのガスは大いに減少するが、単一種培養物の気相ではこれが蓄積することとなる。
そのため、繊維分解種によりセルロース発酵中にin vitroにおいて生成されたＨ２をＲ．ヒドロゲノトロフィカスは効率的に再使用することができる。Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスとセルロース分解種間のこのＨ２移行により、調査した繊維分解種のセルロース分解活性の改変はほとんどまたは全く起こらない。また、同時培養物ではセルロースは主に酢酸塩に発酵されるが、単一種培養物では混酸型（酢酸塩、コハク酸塩またはエタノールおよび乳酸塩の生成）である。
【００９１】
実施例９：ヒト細菌叢保有ラットでの水素依存性酢酸生成株ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカスがin vivoにおいて結腸内ガス容積を減少させる能力
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスが消化器系混合細菌叢の存在下で結腸内ガス容積を減少させることができるかどうかを確認するため、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスをヒト細菌叢保有ラットに経口投与し、呼吸および直腸経路を介して排出される水素を測定することにより結腸内ガス容積の変化をモニターする。
【００９２】
通常の栄養状態における、および結腸内ガス容積の急激な増大をもたらす発酵性基質（ラクツロース）投与後のＲ．ヒドロゲノトロフィカスの効果を調べる。
【００９３】
使用する動物は雄Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラット、３ヶ月齢（試験開始時）である。無菌状態で生まれたこれらのラットに西洋型食生活を送っている非メタン生成成人ドナーの新鮮なヒト糞便物の百分の１懸濁液１ｍｌを経口接種する。この接種を試験開始前に２週間行う。ラットを隔離装置に収容し、４５ｋＧｙでのγ照射により殺菌した半合成「ヒト型」食事（動物および植物性タンパク質ならびに脂肪；未加工および調理済の単純ならびに複合炭水化物）を与える。食料および飲料水の供給は無制限である。
【００９４】
ａ）通常の栄養状態
試験は１６匹のヒト細菌叢保有ラットを８匹からなる２つの群、対照群および処置群に分けて行う。処置群のラットは２８日間毎朝、１０８〜１０９細菌量を、グルコース（２ｇ／ｌ）を含有するＡＣ２１培地（実施例１に記載）で１８時間培養したＲ．ヒドロゲノトロフィカス培養物１ｍｌとして胃挿管により受ける。対照群は同一条件下でグルコースを含有する滅菌ＡＣ２１培地１ｍｌを受ける。
【００９５】
処置から１、１４、および２８日後、２群のラットを呼吸および直腸経路を介して排出される水素が測定できる各呼吸チャンバーに１２時間置く（下記の呼吸チャンバーについての説明を参照）。０時間〜１２時間の間に呼吸チャンバーの空気サンプルを２つずつ採取する。そのまま水素濃度を気相クロマトグラフィーにより測定する。対照および処置群の結果を反復測定分散分析を用いて比較する。
【００９６】
その処置期間がいずれであっても、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスの投与によって排出される水素の最大量（−５０％〜−８０％）および排出速度（−６０％〜−８０％）が対照群に比べて有意に低くなっている（Ｐ＜０．０１）。この処置が１、１４、または２８日後に有効であることが分かる（図１）。
【００９７】
試験中、異なる時点で２群のラットの糞便の水素依存性酢酸生成細菌叢を計数する(Dore et al, 1995)。Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスを受けていない対照群では、酢酸生成群のレベルは時間に対しておよびドナーのものに比べて安定している、すなわち糞便ｇ当たり約ｌｏｇ６．８酢酸生成菌である。
【００９８】
Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスによる処置によって酢酸生成細菌叢のレベルが高まり、この後、このレベルは処置２４時間の糞便ｇ当たりｌｏｇ７．５に達する。試験終了までこのレベルが維持される。従って、処置ラットにおける酢酸生成細菌叢の増加はこれらの動物によって排出されるＨ２量の減少と同時に起こっている。
【００９９】
試験終了時にラットを安楽死により犠牲にし、解剖する。Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスの投与により体重もしくは肝臓、腎臓および盲腸重量、または盲腸のｐＨに与える有意な影響はない（Ｐ＜０．０５）。同様に、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスで処置したラットの肝臓および腎臓の肉眼で見える外観は正常であり、対照ラットのものと同じである。
【０１００】
ｂ）ラクツロース投与後
この試験は上記と同じプロトコールに従って行う。ラクツロース（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−フルクトース）（結腸内でのこの発酵によってガス容積の急激な増大が起こる）をラット当たり５００ｍｇの割合で胃挿管により投与し、その直後にそれらを呼吸チャンバーに置く。酢酸生成株での処置から１および１４日後にＲ．ヒドロゲノトロフィカスがこの増大に与える影響を調べる。
【０１０１】
結腸内でガスが連続産生するこれらの条件下では、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスの投与によって排出される水素の最大量（−４０％〜−５０％）および排出速度（−４０％〜−５０％）が対照群に比べて有意に低くなっている（Ｐ＜０．０５）。この処置が１、または１４日後に有効であることが分かる（図２）。
【０１０２】
この２つの試験では、Ｒ．ヒドロゲノトロフィカスで処置したラットに行動異常はなく、糞便の外観およびコンシステンシーは対照ラットのものと同じであった。
【０１０３】
使用する呼吸チャンバーは小動物を入れるケージが収容できる透明な硬質ポリビニル製、３０リットル容の密閉独立チャンバーである。これらの呼吸チャンバーには実験隔離装置と連結可能な遮断移動用二重ドアが備わっている。
【０１０４】
この動物の細菌状態を保存するため、これらを滅菌した後に連結する。動物を隔離装置から呼吸チャンバーへ移動させた後、後者のものを隔離装置から外し、閉回路に接続する。ここでは蠕動ポンプを用いて空気を抗菌フィルターならびにＣＯ２除去系（水酸化カリウム溶液を４０％含有する吸収体）および水蒸気（シリカゲル結晶を含有する吸収体）に通過させる。空気中のＯ２含量をセンサーで測定し、電流測定電極、制御装置および電磁弁を用いて２１％で一定に保つ。
【０１０５】
この装置により呼吸および直腸経路を介して排出される、結腸内での発酵に特異的なガス（水素、および適切であればメタン）の蓄積が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカスでの１４日間の処置による通常の栄養状態のヒト細菌叢保有ラットにより排泄される水素量への効果を示すグラフ。
【図２】  ラミノコッカス・ヒドロゲノトロフィカスでの１４日間の処置によるラクツロース投与後のヒト細菌叢保有ラットにより排泄される水素量への効果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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