(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌群に属する細菌による汚染の汚染源を特定する方法であって、
試料を採取する工程と、当該試料中に含まれる所定の核酸を検出する第１および第２の検出工程とを含み、
大腸菌群に属する細菌が有するｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列中に含まれる下記配列（Ａ）から（Ｅ）：
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、または
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
で示される配列を有する核酸のうち、
第１の検出工程で、配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｂ）を有する核酸からなる群より選ばれる１種または２種の核酸を検出し、当該試料中における、大腸菌群に属する細菌の量を推定し、
第２の検出工程で、配列（Ｃ）を有する核酸、配列（Ｄ）を有する核酸、および配列（Ｅ）を有する核酸からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸を検出し、当該試料中における、配列（Ｃ）、（Ｄ）、または（Ｅ）に特異的に対応する細菌の量を推定し、
配列（Ｃ）が検出された場合、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌および／またはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定し、
配列（Ｄ）が検出された場合、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定し、
配列（Ｅ）が検出された場合、クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、およびラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌のうちのいずれか１種または２種以上が存在すると判定し、
前記配列（Ａ）および／または（Ｂ）が検出され、かつ、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のいずれも検出されない場合、ブチオーキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属に属する細菌、エンテロバクター  アムニゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）に属する細菌、エンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）に属する細菌、エンテロバクター  サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉ）に属する細菌、エシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に属する細菌、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属に属する細菌、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）に属する細菌、ラウルテラ  オルニチノリティカ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ）に属する細菌、およびラウルテラ  プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）に属する細菌のうちのいずれか１種または２種以上が存在すると判定し、
第１および第２の検出工程により推定された細菌の量と種類から、当該試料における大腸菌群の構成相を求め、汚染源となり得る箇所特有の大腸菌群の構成相と対比することにより、当該試料の汚染源を特定する、細菌による汚染の汚染源特定方法。
【請求項２】
前記第１の検出工程において、
第１のプライマーが前記配列（Ａ）または（Ｂ）のいずれか一方の配列を有する核酸であり、第２のプライマーがｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記第１のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増副産物の量から、当該試料中における、大腸菌群に属する細菌の量を推定する、請求項１に記載の汚染源特定方法。
【請求項３】
前記第１の検出工程において、
前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｂ）を有する核酸を一対のプライマーセットとして配列（Ａ）および（Ｂ）で挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中に含まれる大腸菌群に属する細菌の量を推定する、請求項１に記載の汚染源特定方法。
【請求項４】
前記第２の検出工程において、
第１のプライマーが前記配列（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）の配列を有する核酸であり、第２のプライマーがｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記第１のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列（Ｃ）、（Ｄ）、または（Ｅ）に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。
【請求項５】
前記第２の検出工程において、
前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列（Ｃ）に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項１から４いずれか一項に記載の汚染源特定方法。
【請求項６】
前記第２の検出工程において、
前記配列（Ａ）を有する核酸と前記配列（Ｄ）を有する核酸とを一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列（Ｄ）に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。
【請求項７】
前記第２の検出工程において、
前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列（Ｅ）に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項１から６のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。
【請求項８】
前記第２の検出工程において、
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、それぞれの増幅産物の量から、当該試料中における、配列（Ｃ）、（Ｄ）、または（Ｅ）に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項１から７のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。
【請求項９】
下記配列（Ａ）を有する核酸フラグメント、下記配列（Ｂ）を有する核酸フラグメント、下記配列（Ｃ）を有する核酸フラグメント、下記配列（Ｄ）を有する核酸フラグメント、及び下記配列（Ｅ）を有する核酸フラグメントを含む、細菌による汚染の汚染源特定するためのプローブセット。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
【請求項１０】
下記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸のいずれかの核酸と、
下記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸とを一対とする、細菌による汚染の汚染源特定するための、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の検出方法に関し、詳しくは大腸菌群に属する細菌を検出する方法並びにこれに用い得るプローブおよびプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌による汚染は、食品、医療、衛生管理、環境などの様々な分野で大きな問題となり得る。細菌による汚染に対しては、予防、拡散防止、殺菌処理などその状況に応じて様々な対応が取られる。細菌による汚染は皆無であることが望ましいが、万が一細菌による汚染が発生した場合には、可及的速やかに対処することが求められる。そのためには細菌の検出、汚染源の特定を迅速に行うことが重要となる。
【０００３】
例えば、食品中より大腸菌群が検出された場合、その食品が製造された工場での原材料、水、各種装置、大気、人、動物・昆虫類、床等の構築物、その他のどの箇所が汚染源となったのかを特定し、該汚染源における大腸菌群を根絶している。そのためにはまず検出された大腸菌群がどの汚染源に由来するものであるかを特定するため、製造過程中で汚染源となる可能性のある全ての箇所で大腸菌群を検査し、大腸菌群の検出の有無から汚染源の推定を行なっていた。そして、当該箇所を清浄化し汚染源を除去した後の製品中から大腸菌群が根絶するまで、これらの検査、清浄化を繰り返していた。
【０００４】
上記のように大腸菌群による汚染の拡大を抑制するには、汚染源の特定が極めて重要である。そのため予め汚染源となり得る箇所特有の大腸菌群の種類の構成（以下、本明細書中では、大腸菌群の種類の構成のことを「大腸菌群の構成相」という場合がある）を把握し、これをデータベース化し、検査時に大腸菌群が検出された場合には、その構成から汚染源を推定するという手法が開発されている（例えば、特許文献１）。しかしながら、そこに記載された手法では、複数の培地を用いて細菌を培養することによって検出し、大腸菌群の構成相を求めるため、およそ１６〜２４時間程度の時間を要していた。細菌による汚染の拡大抑制は一刻を争う場合が多いことから、大腸菌群の構成相に係る情報を得るためのさらに迅速な大腸菌群の検出方法が求められていた。
【０００５】
迅速に大腸菌などの微生物を検出するための方法として、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用して所定の遺伝子領域を増幅する方法が考案されている（例えば、特許文献２、非特許文献１および２など）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−４３９２１号公報
【特許文献２】特開２００７−１２９９３５号公報
【非特許文献１】Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：４４−４６，１９９４
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：２４２９−２４３２，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような遺伝子工学的な解析方法を利用する場合には、大腸菌群に特異的な配列を見出し、その配列を基にしてプライマーなどを設計する。しかしながら、特異的な配列を用いれば常にうまくいくというものではない。上記非特許文献１に記載の所定のプライマーセットでは大腸菌群に属する細菌の種類の７０％程度しか検出することができず、非特許文献１および２にも示されるように、より高い割合で大腸菌群を検出し得るプライマーの開発が求められていた。さらに、単に大腸菌群を網羅的に検出しただけでは、大腸菌群の構成相を割り出すには至らない。そのため、大腸菌群の構成相を迅速に割り出す方法が求められていた。
【０００８】
以上のような状況の下、本発明は、大腸菌群についてより迅速に検出することを課題とする。また、本発明は、大腸菌群をいくつかの種類ごとに迅速に検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を進めたところ、上記課題を解決し得る核酸内の所定部位を見出し、この知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。本発明は、下記に示す大腸菌群に属する細菌の検出方法、並びに、これに用いられる核酸を提供するものである。
【００１０】
〔１〕大腸菌群に属する細菌が有するｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列中に含まれる下記配列（Ａ）から（Ｅ）からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸配列を、試料中から検出して、大腸菌群に属する細菌を検出する方法。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
〔２〕前記配列（Ａ）および／または（Ｂ）が検出された場合に、前記試料中に、大腸菌群に属する細菌が存在すると判定する、上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔３〕前記配列（Ｃ）が検出された場合に、前記試料中に、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌および／またはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定する、上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔４〕前記配列（Ｄ）が検出された場合に、前記試料中に、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定する、上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔５〕前記配列（Ｅ）が検出された場合に、前記試料中に、
クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌、
エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、および
ラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌、のうちのいずれか１種または２種以上が存在すると判定する、上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔６〕前記配列（Ａ）および／または（Ｂ）が検出され、かつ、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のいずれも検出されない場合に、
前記配列（Ｅ）が検出された場合に、前記試料中に、
クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌、
エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、および
ラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌、のうちのいずれか１種または２種以上が存在すると判定する、請求項１に記載の細菌を検出する方法。
のうちのいずれか１種または２種以上が存在すると判定する、上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔７〕前記配列（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選ばれる１種または２種の核酸配列を、試料中から検出する第１の検出工程と、
前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸配列を検出する、第２の検出工程を含む、
上記〔１〕に記載の細菌を検出する方法。
〔８〕前記第２の検出工程において、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）の検出を行い、前記第２の検出工程の結果から、前記配列（Ｃ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、前記配列（Ｄ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、前記配列（Ｅ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、これら以外の細菌群の４つのグループに大腸菌群を分類する工程を含む、上記〔７〕に記載の細菌を検出する方法。
〔９〕第１のプライマーが前記配列（Ａ）または（Ｂ）のいずれか一方の配列を有する核酸であり、第２のプライマーがｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記第１のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して前記配列（Ａ）または（Ｂ）を検出する、請求項１または２に記載の細菌を検出する方法。
〔１０〕前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｂ）を有する核酸を一対のプライマーセットとして配列（Ａ）および（Ｂ）で挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して前記配列（Ａ）および（Ｂ）を検出する、上記〔１〕または〔２〕に記載の細菌を検出する方法。
〔１１〕第１のプライマーが前記配列（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）の配列を有する核酸であり、第２のプライマーがｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記第１のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して、前記第１のプライマーに該当する前記配列（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかの配列を検出する、上記〔１〕、〔３〕、〔４〕または〔５〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１２〕前記第１の検出工程において、前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｂ）を有する核酸を一対のプライマーセットとして前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列（Ａ）および（Ｂ）を検出する、上記〔７〕または〔８〕に記載の細菌を検出する方法。
〔１３〕前記第２の検出工程において、前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列（Ｃ）を検出する、上記〔７〕から〔１０〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１４〕前記第２の検出工程において、前記配列（Ａ）を有する核酸と前記配列（Ｄ）を有する核酸とを一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列（Ｄ）を検出する、上記〔７〕から〔１０〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１５〕前記第２の検出工程において、前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列（Ｅ）を検出する、上記〔７〕から〔１０〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１６〕前記第２の検出工程において、
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および前記配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、それぞれの増幅産物を検出し、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）を検出する、上記〔７〕から〔１０〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１７〕前記増幅産物の量を定量し、増産物の量から、試料中に含まれる大腸菌群に属する細菌の量を推定する、上記〔９〕から〔１６〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔１８〕下記配列（Ａ）から（Ｅ）からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸である、大腸菌群検出用プローブ。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列  
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
〔１９〕下記配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｂ）を有する核酸を一対とする、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列  
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
〔２０〕前記配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸のいずれかの核酸と、
下記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸とを一対とする、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、大腸菌群に属する多くの細菌について迅速に検出し得る。また、本発明により大腸菌群をいくつかの種類ごとに迅速に検出し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ、詳細に説明する。本発明は以下の記述によって限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。本発明における生化学的な手法あるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版、村松ら編、羊土社（２００３年）、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第１版、１９９８年）、タンパク質実験ノート（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第２版、１９９９年）などのような種々の実験マニュアルの記載を参照し得る。本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。
【００１３】
本明細書において用いられる用語は、基本的に、化学、生命科学、遺伝子工学、工業化学などの科学または工学分野における標準的な意味に従って用いられるが、以下、本発明をより明確に説明するために、本発明を説明するための用語の一部について説明する。
【００１４】
本明細書において、ｌａｃＺ遺伝子（ｌａｃＺ  ｇｅｎｅ）とは、ＬａｃＺタンパク質、すなわち大腸菌群に属する細菌が保有するβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝情報およびその遺伝情報が化体する核酸のことをいう。ｌａｃＺ遺伝子をコードするとは、ｌａｃＺ遺伝子の遺伝情報を保存していることを意味する。ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列とは、すなわち、β−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列とも言い換え得る。
【００１５】
本明細書において、核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびこれらのハイブリッド核酸が含まれ、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本明細書、図面および配列表においては、核酸が有する塩基について、アデニン：Ａ、チミン：Ｔ、ウラシル：Ｕ、グアニン：Ｇ、およびシトシン：Ｃの省略記号が用いられる場合がある。また、混合塩基について、以下の省略記号を用いられる場合がある。Ｒ＝（ＡまたはＧ）、Ｙ＝（ＣまたはＴ）、Ｍ＝（ＡまたはＣ）、Ｋ＝（ＧまたはＴ）、Ｓ＝（ＧまたはＣ）、Ｗ＝（ＡまたはＴ）、Ｈ＝（Ａ，ＣまたはＴ）、Ｂ＝（Ｇ，ＴまたはＣ）、Ｖ＝（Ｇ，ＣまたはＡ）、Ｄ＝（Ｇ，ＡまたはＴ）、Ｎ＝（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）。なお、ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）は、ＲＮＡ中ではウラシル（Ｕ）に該当する。ＤＮＡとしての配列情報はＲＮＡとしての配列情報をも包含する。
【００１６】
本明細書において、大腸菌群（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）とは、広義の大腸菌を意味し、衛生細菌学的に大腸菌と呼ばれる一群の細菌をいう。大腸菌群には、例えば、以下の属に属する細菌が含まれる。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属、ブチオーキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）属、などの属に属する細菌が含まれる。より具体的には、例えば、下記表５および９に示される細菌種が挙げられる。
【００１７】
＜１．本発明の検出方法＞
本発明の大腸菌群に属する細菌を検出する方法（以下、本明細書において、「本発明の検出方法」という場合がある）では、大腸菌群に属する細菌を検出する。本発明においては、大腸菌群に属する細菌が保有するｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列中に含まれる下記配列（Ａ）から（Ｅ）からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸配列を、試料中から検出し、これらを指標として細菌を検出する。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
【００１８】
【表１】
0005310997.tif 000002
【００１９】
上記（Ａ）から（Ｅ）の配列は、下記実施例の欄にて別途詳説されるとおり、大腸菌群に属する細菌を検出するために、本発明者らによって新規に特定された配列である。これらの配列を利用することにより、迅速に大腸菌群を検出することができる。
【００２０】
本発明の検出方法の一実施形態においては、配列（Ａ）若しくは（Ｂ）のいずれか一方、またはこれらの双方について試験を行い、これらの配列のいずれか一方または双方が検出された場合に、試料中に大腸菌群に属する細菌が存在すると判定する。配列（Ａ）および（Ｂ）は、大腸菌群の細菌が有するｌａｃＺ遺伝子中の核酸配列において、幅広く共有されている保存性の高い配列である。そのため、これらの配列を検出することにより、大腸菌群に属する細菌が試料中に存在する蓋然性が高い。配列（Ａ）および（Ｂ）は一方のみについて試験を行うことは、試験の簡便化をより優先する場合に好適である。また、双方について試験を行うことにより、より正確に大腸菌群の細菌を検出し得るため、精度をより重視する場合には、双方について試験を行うことが好適である。
【００２１】
図１−１から１−６に、シトロバクター属の１種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ、略号：Ｃｋｏｓ）、エシェリキア属に属する細菌の１種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、略号：Ｅｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の２種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、略号：Ｅｎｔｓａｋ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｌｏａｃａｅ、略号：Ｅｎｔｃｌ）、およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の１種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、略号：Ｋｐｎｅｕ）の５種の細菌におけるｌａｃＺ遺伝子の核酸配列のアライメントを示す。なお、各核酸配列は、配列表中において、シトロバクター  コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ）は配列番号６、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は配列番号８、エンテロバクター  サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）は配列番号１０、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は配列番号１２、エンテロバクター  クロアカ亜種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｌｏａｃａｅ）は配列番号１４にそれぞれ記載の配列に対応する。
【００２２】
図１−１から１−６において、「＊」印はすべての配列に共通する部位を示し、配列中の「−」印はギャップを示す。図１−１から図１−６および図２−１から図２−４において、矢印１Ｆ、１Ｒ、２Ｆ、２Ｒ、ＡＲ、ＢＲおよびＣＲは、それぞれ対応する領域をプライマー又は鋳型とするＰＣＲを行った際のプライマー領域および核酸の合成方向を示す。また、菌株名の表示において、ＮＢＲＣはＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒの略号であり、ＩＡＭはＩＡＭ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの略号であり、ＪＣＭはＪａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓの略号であり、ＡＴＣＣはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの略号である。これらは微生物等の公的寄託機関である。これらの略号および番号等の記号が付された菌株は、それぞれの寄託機関において登録または保存されている菌株であることを示す。
【００２３】
配列（Ａ）は、図１−２中に示される領域ｒｆ１に基づく。配列（Ｂ）は、図１−３に示される領域ｒｆ２に基づく。領域ｒｆ１およびｒｆ２におけるアライメントの結果が示すとおり、これらの領域は、大腸菌群に属する細菌種間内において保存性が高い連続した領域を形成している。
【００２４】
本発明の検出方法は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ラウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）属、ブチオーキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）属、などの属に属する細菌の検出に好適であり、より好ましくは、下記の細菌種の検出に用い得る。なお、以下の細菌種名は学名である。
【００２５】
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ  
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ
Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ
Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ
Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ａｇｒｅｓｔｉｓ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｌｏａｃａｅ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｖｕｌｎｅｒｉｓ
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ
Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ
Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ
Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ
Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ
【００２６】
本発明の一実施形態においては、配列（Ｃ）が検出された場合に、試料中に、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌および／またはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定する。図２−１には、シトロバクター属に属する５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の核酸配列のアライメントを示す。配列（Ｃ）は、図２−１中の領域ｒｆ６に基づく。図２−１に示されるとおり、領域ｒｆ６は、シトロバクター属に属する細菌間で保存性が高い連続した領域を形成している。図２−１における領域ｒｆ６は、図１−２における領域ｒｆ３の部位、および、図２−４における領域ｒｆ６〜８の部位に該当する。図１−２中の領域ｒｆ３および図２−４中のｒｆ６〜８のアライメント結果が示すとおり、この領域は、シトロバクター属以外の大腸菌群間で比較した場合には、保存性が低い領域を形成している。したがって、配列（Ｃ）が検出される場合には、シトロバクター属の細菌群が試料中に存在する蓋然性が高いと判定し得る。なお、下記実施例の欄における実験結果から、配列（Ｃ）に基づいて、エルウィニア属に属する細菌も検出し得ることが明らかとなっている。
【００２７】
本発明の一実施形態においては、前記配列（Ｄ）が検出された場合に、試料中に、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌が存在すると判定する。図２−２には、ハフニア属に属する２種の細菌におけるｌａｃＺ遺伝子の核酸配列のアライメントを示す。配列（Ｄ）は、図２−２中の領域ｒｆ７に基づく。図２−２に示されるとおり、領域ｒｆ７は、ハフニア属に属する細菌間で保存性が高い連続した領域を形成している。図２−２における領域ｒｆ７は、図１−２における領域ｒｆ３の部位、および、図２−４中のｒｆ６〜８の部位に該当する。図１−２中の領域ｒｆ３および図２−４中のｒｆ６〜８のアライメント結果が示すとおり、この領域は、ハフニア属以外の大腸菌群間で比較した場合には、保存性が低い領域を形成している。したがって、配列（Ｄ）が検出される場合には、ハフニア属の細菌群が試料中に存在する蓋然性が高いと判定し得る。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、配列（Ｅ）が検出された場合に、試料中に、クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、およびラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌のうち、いずれか１種または２種以上が存在すると判定する。図２−３には、クレブシエラ  オキシトカに属する５種の細菌におけるｌａｃＺ遺伝子の核酸配列のアライメントを示す。配列（Ｅ）は、図２−３中の領域ｒｆ８に基づく。図２−３に示されるとおり、領域ｒｆ８は、クレブシエラ  オキシトカに属する細菌間で保存性が高い連続した領域を形成している。図２−３における領域ｒｆ８は、図１−２における領域ｒｆ３の部位、および、図２−４中のｒｆ６〜８の部位にそれぞれ該当する。図１−２中の領域ｒｆ３および図２−４中のｒｆ６〜８のアライメント結果が示すとおり、この領域は、クレブシエラ  オキシトカ以外の大腸菌群間で比較した場合には、保存性が低い領域を形成している。したがって、配列（Ｅ）が検出される場合には、クレブシエラ  オキシトカの細菌群が試料中に存在する蓋然性が高いと判定し得る。なお、下記実施例の欄における実験結果から、配列（Ｅ）に基づいて、クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌の他、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、およびラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌も検出し得ることが明らかとなっている。
【００２９】
本発明の一実施形態においては、配列（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方が検出され、かつ、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のいずれも検出されない場合に、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）によって特定され得るいずれの細菌とも異なる１種または２種以上の細菌が存在すると判定する。大腸菌群には、上記配列（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）が存在する領域、すなわち、図１−２中においては領域ｒｆ３が、上記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）に示されるいずれの配列とも異なる場合もあり得る。したがって、配列（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方が検出されることによって、大腸菌群に属する細菌の存在が確認され、かつ、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のいずれの配列も検出されない場合には、上記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）によって特定される細菌群とは異なる細菌群が存在する蓋然性が高いと判定し得る。上記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）によって特定される細菌群とは異なる細菌群としては、例えば、ブチオーキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属に属する細菌、エンテロバクター  アムニゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）に属する細菌、エンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）に属する細菌、エンテロバクター  サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉ）に属する細菌、エシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に属する細菌、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属に属する細菌、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）に属する細菌、ラウルテラ  オルニチノリティカ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ）に属する細菌、およびラウルテラ  プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）に属する細菌などが挙げられる。
【００３０】
上記のように、配列（Ａ）から（Ｅ）からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸配列を用いることにより、それぞれの配列に対応した細菌群を検出し得る。本発明のより具体的な一実施形態としては、少なくとも２つの検出工程を有する形態が提供され得る。第１の検出工程では、配列（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選ばれる１種または２種の核酸配列を、試料中から検出する。他方、第２の検出工程では、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群より選ばれる１種または２種以上の核酸配列を検出する。第１の検出工程の結果、実際に配列（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方、より好ましくは双方が検出されることにより、大腸菌群に属する細菌が試料中に存在する蓋然性が高いと判定される。他方、第２の検出工程により、配列（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）のいずれかに属する細菌群またはそのいずれにも細菌群が存在することを判定し得る。
【００３１】
第１の検出工程と第２の検出工程とは、順序に限定はない。また第１および第２の検出工程と同一の実験系内において同時に行ってもよい。さらに、第１の検出工程と、第２の検出工程の作業をそれぞれ並行して実施してもよい。好ましい一実施形態としては、第１の検出工程を先に行い、第１の検出工程で大腸菌群が含まれることが特定された試料についてさらに前記第２の検出工程を実施する形態が挙げられる。このようにすることにより、大腸菌群に汚染されていない試料を除外して第２の検出工程を実施できるので、第２の検出工程によって特定される細菌群の検出工程の作業をより迅速に行うことができる。第２の検出工程だけでは、大腸菌群をすべて網羅していないが、第１の検出工程を先に行っているので、第２の検出工程でいずれの配列も検出されない場合には、それらの配列で特定し得る細菌群以外の細菌の存在を確認し得る。
【００３２】
以上のように、本発明の一実施形態により、試料中の大腸菌群を４つのグループに分けることが可能である。すなわち、本発明の一実施形態として、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）の検出を行い、前記第２の検出工程の結果から、配列（Ｃ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、配列（Ｄ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、前記配列（Ｅ）が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、これら以外の細菌群の４つのグループに大腸菌群を分類する工程を含む形態が提供され得る。このような４つのグループに分類することにより、大腸菌群の種類に関する構成相を解析することができる。
【００３３】
本発明で用いられる核酸の配列として配列（Ａ）から（Ｅ）の各配列が挙げられる。各項の配列は、核酸の相補性、配列の生物学的許容性などの理由により複数の配列が包含され得る。
【００３４】
配列（Ａ）を一例として、より具体的に説明する。配列（Ａ）は、ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列の一部であって、配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列である。
【００３５】
配列（Ａ）に含まれる配列の一つである配列番号１の配列は、図１−２に示す領域ｆｒ１に対応するコード鎖（センス鎖）の配列であり、大腸菌群において保存性の高い領域である。すなわち、大腸菌群の細菌が試料中に存在する場合には、試料中に領域ｒｆ１に対応する核酸フラグメントが含まれている確率が高い。配列（Ａ）の一群として含まれ得る配列は、領域ｒｆ１の有無を特定するために用い得る配列である。領域ｒｆ１の有無を特定するためには、配列番号１で示される配列のみならず、いくつかのバリエーションが生物学的に許容される。
【００３６】
まず、ｒｆ１に示される配列は、生体内において、ｌａｚＺ遺伝子中に存在する。細菌内にてｌａｃＺ遺伝子は、通常、二重らせん構造を有する核酸分子として存在する。したがって、細菌内には、ｒｆ１として示される配列を有する核酸と、これと相補的な配列を有する核酸とが存在する。したがって、配列番号１の配列に対し相補的な配列も、配列番号１の配列と同様に、領域ｒｆ１の特定に利用することができる。
【００３７】
図３に、配列番号１の配列を示す。配列Ｐ１−１は、配列番号１の配列そのものである。配列Ｐ１−１中には選択的な塩基を示すＹおよびＳが含まれている。Ｙは塩基シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）である。また、Ｓは塩基グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）を示す。したがって、核酸配列の許容性の観点から、配列Ｐ１−１は、２3種（８種）の配列を含む。さらにＤＮＡとＲＮＡの違いを考慮するときには、１６種類の核酸配列を包含する。
【００３８】
さらに、配列（Ａ）には、連続した少なくとも２０ｂｐ以上の配列、好ましくは連続した２３ｂｐ以上の配列、さらに好ましくは連続した２５ｂｐ以上の配列、さらに好ましくは連続した２８以上の配列、さらに好ましくは連続した３０以上の配列、さらに好ましくは３２ｂｐの配列が含まれる。連続した２０ｂｐ以上の配列としては、図３に示すように、その５末端から連続した２０ｂｐの配列Ｐ１−２、５末端から２つ目の塩基から連続した２０ｂｐの配列Ｐ１−３、以下同様にして、配列Ｐ１−１３までの配列が含まれる。さらに、同様にして、連続した２１ｂｐ以上３２ｂｐ以下の配列についても同様に配列を設定し得る。
【００３９】
配列（Ｂ）に含まれる配列の一つである配列番号２の配列は、図１−３の領域ｒｆ２に対応する。配列（Ｃ）に含まれる配列の一つである配列番号３の配列は、図２−１の領域ｒｆ６に対応する。配列（Ｄ）に含まれる配列の一つである配列番号４は、図２−２の領域ｒｆ７に対応する。配列（Ｅ）に含まれる配列の一つである配列番号５は、図２−３の領域ｒｆ８に対応する。配列（Ｂ）から（Ｅ）の各配列においても、配列（Ａ）と同様にして、複数の配列が包含され得る。
【００４０】
本発明の方法において用いられる試料は、大腸菌群に属する細菌を検出しようとする対象物である。試料は、細菌が付着したり繁殖している可能性が推定される基材を含んでも良い。試料は適宜調整され、微生物中の核酸を検出し得るように調整される。試料の採取場所には特に制限はないが、例えば、食品、医薬品、工場の壁、工場の床、食品等の搬送路、原材料、食品等の残渣、動植物、昆虫、その他、細菌の感染経路と推定される箇所など様々である。
【００４１】
配列（Ａ）などの配列を検出する方法は、遺伝子工学的な手法により、様々な方法を採用し得る。一つの実施形態としては、例えば、試料中から核酸分子を抽出し、塩基配列を決定して、その核酸配列を電子情報化し、生物情報科学的な手法を用いて、その中から所定の配列を検索し得る。また、他の実施形態としては、配列（Ａ）などの配列を有する核酸に特異的に結合し得る捕捉分子を設計し、これに標識物質を付属して捕捉分子−標識物質複合体作製し、これと試料とを所定の条件下で混合して、標識物質を検出するなどの形態も採用し得る。捕捉分子としては、抗体、相互作用タンパク質などのタンパク質、相補的な配列を有する核酸フラグメントなどが挙げられる。核酸フラグメントしては、例えば、配列（Ａ）から（Ｅ）に包含されるいずれかの配列を有する核酸フラグメントが挙げられる。このような核酸フラグメントは、それぞれの配列を試料中から検出するためのプローブとして用いる。配列（Ａ）を有する核酸フラグメントは、試料中から配列（Ａ）を検出するために用い得る。配列（Ｂ）から（Ｅ）についてもそれぞれ同様である。遺伝子工学的な手法として具体的には、例えば、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡチップを利用する方法、ＤＮＡ定量チップを利用する方法などが挙げられる。
【００４２】
上記のように、各配列を検出するために、配列（Ａ）から（Ｅ）を利用したＰＣＲを利用することもできる。配列（Ａ）から（Ｅ）に基づいて所定のプライマーセットを調製し、ＰＣＲの増幅産物を検出することにより極めて迅速に試料中から各配列を検出し得る。以下、ＰＣＲを利用した実施形態例についてより詳しく説明する。
【００４３】
ＰＣＲを利用する第１の実施形態例として、第１のプライマーが配列（Ａ）または（Ｂ）のいずれか一方の配列を有する核酸であり、第２のプライマーがｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記第１のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して配列（Ａ）または（Ｂ）を検出する形態が挙げられる。配列（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ大腸菌群の細菌が有するｌａｃＺ遺伝子において保存性の高い配列であり、しかも、その配列は塩基数２０から３２の範囲であり、プライマーとして適切な長さである。第２のプライマーは、第１のプライマーと対をなして、ＰＣＲを行うことができるものであればよく、ｌａｃＺ遺伝子をコードする配列中から適宜設計し得る。
【００４４】
配列（Ａ）または（Ｂ）を少なくとも一方のプライマーとして用いて、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、そのプライマーに相補的な核酸配列が試料中に含まれていることを意味する。したがって、増幅産物の検出によって、ｒｆ１またはｒｆ２に相当する配列を有する核酸が試料中に含まれ、試料中には大腸菌群に属する細菌が存在していたことを確認し得る。増幅産物が検出されなければ、試料中には大腸菌群に属する細菌が存在する可能性が低いことが推定される。
【００４５】
ＰＣＲを利用する第２の実施形態例として、前記配列（Ａ）を有する核酸および前記配列（Ｂ）を有する核酸を一対のプライマーセットとして配列（Ａ）および（Ｂ）で挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して配列（Ａ）および（Ｂ）を検出する形態が挙げられる。配列（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ大腸菌群の細菌が有するｌａｃＺ遺伝子において保存性の高い配列であり、しかも、その配列は塩基数２０から３２の範囲であり、プライマーとして適切な長さである。さらに、この一対のプライマーが挟む領域はおよそ５２０ｂｐ前後であり、ＰＣＲによる増幅を円滑かつ正確に実施するのにも適している。
【００４６】
配列（Ａ）および（Ｂ）を一対のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、これらのプライマーに相補的な核酸配列が試料中に含まれていることを意味する。したがって、増幅産物の検出によって、ｒｆ１およびｒｆ２に相当する配列を有する核酸が試料中に含まれ、試料中には大腸菌群に属する細菌が存在していたことを確認できる。増幅産物が検出されなければ、試料中には大腸菌群に属する細菌が存在する可能性が低いことが推定される。
【００４７】
配列（Ａ）および（Ｂ）を一対のプライマーセットとする場合、一方の配列群からフォワードプライマーが、他方の配列群からリバースプライマーが設計される。例えば、配列番号１の配列を有する核酸フラグメントをフォワードプライマーとして設計した場合、リバースプライマーとしては、配列番号１６に示す配列がリバースプライマーとして好適に用いられる。プライマーの長さは、ＰＣＲの条件等により適宜設定してよく、各配列の許容範囲、すなわち、２０ｂｐ以上３２ｂｐ以下の範囲で適宜調整し得る。
【００４８】
ＰＣＲを利用する第３の実施形態例として、一対のプライマーセットの第１のプライマーが、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群より選ばれるいずれか１種の配列を有し、第２のプライマーが、ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸中に含まれる２０ｂｐ以上、３２ｂｐ以下の配列であって、前記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）とは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第１および第２のプライマー挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して、前記第２のプライマーに対応する配列（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかの配列を検出する形態が挙げられる。一対のプライマーセットのうちの一方のプライマーが、配列（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかの配列を有するものを用いて、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、そのプライマーに相補的な核酸配列が試料中に含まれていることを意味する。したがって、増幅産物の検出によって、ｒｆ６からｒｆ８のいずれかに相当する配列を有する核酸が試料中に含まれ、試料中にはそれぞれに対応する種類の細菌が存在していたことを確認できる。増幅産物が検出されなければ、試料中には、対応する細菌が存在する可能性が低いことが推定される。
【００４９】
配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のいずれも、２０ｂｐ以上３２ｂｐ以下の配列を有し、プライマーとして適切な長さである。他方のプライマー、すなわち第２のプライマーは、第１のプライマーと対をなして、ＰＣＲを行うことができるものであればよく、ｌａｃＺ遺伝子をコードする配列中から適宜設計し得る。
【００５０】
ＰＣＲを利用する他の実施形態例として、第１の検出工程と、第２の検出工程において、それぞれＰＣＲを利用する形態が挙げられる。ＰＣＲを利用する第４の実施形態例としては、ＰＣＲを利用する実施形態例１を第１の検出工程に採用する形態が挙げられる。ＰＣＲを利用する第５の実施形態例としては、ＰＣＲを利用する実施形態例２を第１の検出工程に採用する形態が挙げられる。さらにＰＣＲを利用する第６の実施形態例としては、ＰＣＲを利用する実施形態例３を第２の検出工程に採用する形態が挙げられる。
【００５１】
ＰＣＲを利用する第７の実施形態例として、第２の検出工程において、配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、配列（Ｂ）を有する核酸および配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、配列（Ｃ）を検出する形態が挙げられる。配列（Ａ）を有する核酸または配列（Ｂ）を有する核酸を第１のプライマーとし、配列（Ｃ）を有する核酸を第２のプライマーとするプライマーセットを用いた場合、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、これらのプライマーに対し相補的な配列を有する核酸が試料中に含まれることを意味する。配列（Ａ）および（Ｂ）は、大腸菌群に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において保存性の高い配列であり、配列（Ｃ）はシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において、保存性の高い配列である。したがって、増幅産物が検出されれば、シトロバクター属に属する細菌が試料中に存在していたことが確認できる。増幅産物が検出されなければ、試料中には、シトロバクター属に属する細菌が存在する可能性は低いことが推定される。なお、下記実施例の欄における実験結果から、配列（Ｃ）の検出に基づいて、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する細菌も検出し得ることが明らかとなっている。
【００５２】
ＰＣＲを利用する第８の実施形態例として、第２の検出工程において、配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列（Ｂ）および配列（Ｄ）を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列（Ｄ）を検出する形態が挙げられる。配列（Ａ）を有する核酸または配列（Ｂ）を有する核酸を第１のプライマーとし、配列（Ｄ）を有する核酸を第２のプライマーとするプライマーセットを用いた場合、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、これらのプライマーに対し相補的な配列を有する核酸が試料中に含まれることを意味する。配列（Ａ）および（Ｂ）は、大腸菌群に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において保存性の高い配列であり、配列（Ｄ）はハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において、保存性の高い配列である。したがって、増幅産物が検出されれば、ハフニア属に属する細菌が試料中に存在していたことが確認できる。増幅産物が検出されなければ、試料中には、ハフニア属に属する細菌が存在する可能性は低いことが推定される。
【００５３】
ＰＣＲを利用する第９の実施形態例として、第２の検出工程において、配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、配列（Ｂ）を有する核酸および配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、配列（Ｅ）を検出する形態が挙げられる。配列（Ａ）を有する核酸または配列（Ｂ）を有する核酸を第１のプライマーとし、配列（Ｃ）を有する核酸を第２のプライマーとするプライマーセットを用いた場合、ＰＣＲによる増幅産物が検出された場合には、これらのプライマーに対し相補的な配列を有する核酸が試料中に含まれることを意味する。配列（Ａ）および（Ｂ）は、大腸菌群に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において保存性の高い配列であり、配列（Ｅ）はクレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌のｌａｃＺ遺伝子において、保存性の高い配列である。したがって、増幅産物が検出されれば、クレブシエラ  オキシトカに属する細菌が試料中に存在していたことが確認できる。増幅産物が検出されなければ、試料中には、クレブシエラ  オキシトカに属する細菌が存在する可能性は低いことが推定される。なお、下記実施例の欄における実験結果から、配列（Ｅ）の検出に基づいて、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、およびラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌も検出し得ることが明らかとなっている。
【００５４】
ＰＣＲを利用する第１０の実施形態例として、第２の検出工程において、
配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および配列（Ｃ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、
配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および配列（Ｄ）を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸および配列（Ｅ）を有する核酸を一対とするプライマーセットをそれぞれ用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）を検出する形態が挙げられる。すなわち、ＰＣＲを利用する第１０の実施形態においては、上記第６から第９の実施形態例における第２の検出工程を、それぞれすべて実施する。配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のすべてについてＰＣＲによる検出を行うことで、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）に対応するそれぞれの細菌群をすべて検出することができる。また、第１の検出工程によって大腸菌群に属する細菌が存在するか否か判別できることから、第１の検出工程によって増幅産物が検出され、かつ、第２の検出工程によっては増幅産物が検出されない場合に、配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）以外の大腸菌群に属する細菌が存在することを確認し得る。配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）以外の大腸菌群に属する細菌としては、例えば、ブチオーキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属に属する細菌、エンテロバクター  アムニゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）に属する細菌、エンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）に属する細菌、エンテロバクター  サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉ）に属する細菌、エシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に属する細菌、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属に属する細菌、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）に属する細菌、ラウルテラ  オルニチノリティカ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ）に属する細菌、およびラウルテラ  プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）に属する細菌などが挙げられる。
【００５５】
培養法を利用して細菌の存在の有無を確認するには、実質的に２〜３日程度の時間を要する場合がある。さらに、培養法を利用して細菌の種類を特定するとなると、種類の異なる培地を何種類も用意し、個別に培養していく必要がある。また、平板培養法の場合、培地上で試料ごとの差を明確に検出する上でのコロニーの数や菌の密度に上限があるため、試料を適切に希釈調整する必要がある。平板培養法の場合、菌の上限が、１つのシャーレ上にコロニーの数が３０〜３００個、または試料中の菌の密度が１０2から１０4ｃｆｕ／ｍｌとなるように、試料を希釈調整する必要がある。それ以上になるとコロニーとしての検出は困難となってしまう。培養法による場合、このような制約から、試験結果を得るために、さらに多くの時間を要する場合もあった。
【００５６】
しかし、上記ＰＣＲを利用する各実施形態に例示されるように、細菌の種類を分類し得る所定のプライマーセットが設計されているので、試験結果を得るための実質的な所要時間は、ＰＣＲにかけるための試料の調製、ＰＣＲ操作、および増幅産物の有無を確認する検出操作に要する時間でのみで足りる。また、ＰＣＲを利用する場合は、細菌の検出上限が平板培養法よりも遙かに高いため、ＰＣＲに供することができるように試料を調整すればよく、平板培養法よりも試料の調製が簡便である。したがって、ＰＣＲを利用した実施形態に示すように、上記のような複数のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、迅速かつ簡便に細菌の種類の特定をすることができる。
【００５７】
また、ＰＣＲを利用した第１１の実施形態例として、増幅産物の量を定量し、増産物の量から、試料中に含まれる大腸菌群に属する細菌の量を推定する形態が挙げられる。ＰＣＲによって増幅産物を定量する手法がすでにいくつも開発されている。そのため、上記の各種所定のプライマーセットを用いた増幅産物の量を指標として、試料中における、各プライマーセットに対応する細菌の量を推定し得る。増幅産物の定量法は、公知の技法を採用し得る。蛍光物質や放射性物質を標識分子として、標識分子を定量する方法などを利用し得る。ＰＣＲを利用した第１０の実施形態例として、リアルタイムＰＣＲを採用しても良い。リアルタイムＰＣＲにより増幅産物の増加を経時的に観測し、ｌａｃＺ遺伝子内の特定領域を定量し得る。
【００５８】
増幅産物量を指標として、試料中に含まれる細菌量を推定し得る。例えば、配列（Ａ）および（Ｂ）を利用したプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲを行うことにより、試料中に含まれる大腸菌群の細菌量を推定し得る。同様に、配列（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）をそれぞれ利用したリアルタイムＰＣＲの結果から、それぞれの配列に対応する細菌群の量を推定し得る。したがって、例えば、ＰＣＲを利用した第９の実施形態例と第１０の実施形態例を組み合わせることにより、それぞれの配列に対応する細菌群の量を迅速に推定し、細菌群の構成相を迅速に割り出すことが可能である。
【００５９】
＜２．本発明のプローブおよびプライマー＞
本発明により、細菌の検出に有用な複数の核酸フラグメントが提供される。すなわち、本発明は、下記配列（Ａ）から（Ｅ）の各核酸を提供する。これらの核酸は、
上記発明の検出方法の欄で説明したとおり、それぞれ大腸菌群検出用プローブ、プライマー等として利用し得る。
（Ａ）配列番号１の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｂ）配列番号２の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｃ）配列番号３の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
（Ｄ）配列番号４の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列、および
（Ｅ）配列番号５の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した２０ｂｐ以上の核酸配列
【００６０】
上記の核酸をプローブとして用いる場合、これらの核酸フラグメントに標識物質を付属させて用いてもよい。すなわち、上記の核酸を標的に対して特異的に結合する捕捉分子とし、捕捉分子−標識物質複合体を形成し得る。標識物質としては、遺伝子工学的な手法において用いられる様々な物質を用いることができ、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、放射性同位体などを用い得る。さらに、捕捉分子に酵素または基質などの物質を付属させ、それらによって生じる酵素反応の結果から標的分子を検出する実験系を構築しても良い。
【００６１】
上記核酸をＰＣＲ用プライマーとして用いる場合、次のような組み合わせが好適な組み合わせとして例示される。一実施形態例としては、配列（Ａ）を有する核酸および配列（Ｂ）を有する核酸を一対とするプライマーセットである。これらの配列を利用したプライマーによって増幅産物が検出された場合には、大腸菌群に属する細菌を検出し得る。また、リアルタイムＰＣＲなどの手法によって、試料中の細菌量を推定し得る。
【００６２】
プライマーセットの実施形態例としては、配列（Ａ）または（Ｂ）を有する核酸のいずれかの核酸と、下記配列（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）より選ばれるいずれかの配列を有する核酸とを一対とする、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセットがあげられる。配列（Ｃ）を有する核酸をプライマーの一方として用いる場合、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌またはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する細菌を検出し得る。配列（Ｄ）を有するプライマーを一方として用いる場合、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌を検出し得る。配列（Ｅ）を有する核酸をプライマーの一方として用いる場合、クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）に属する細菌、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する細菌、およびラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属に属する細菌を検出し得る。
【００６３】
配列（Ａ）から（Ｅ）のそれぞれにおいて、複数の配列が設定可能であることについては、上記「１．本発明の検出方法」の欄にて説明した通りである。各配列において生物学的に許容されるバリエーションの中から、適宜プローブ、プライマーとして適切な配列を調製し得る。また、プライマーとして用いる場合、一方はフォワードプライマーであり、他方はリバースプライマーであるようにそれぞれ配列は選択される。配列番号１から５はそれぞれｌａｃＺ遺伝子におけるコード鎖（センス鎖：ｍＲＮＡと同じ遺伝情報を有する配列）側の配列を示す。一方のプライマーとしてコード鎖と同じ配列に設定した場合には、他方のプライマーはアンチコード鎖（アンチセンス鎖）側に準じて配列が設計される。
【００６４】
＜３．食品工場における実施形態の一例＞
次に、本発明の検出方法を、食品工場における検査に適用した実施形態の一例を、図４および図５を参照しつつ説明する。
【００６５】
図４に、汚染源を推定する原理を示す。大腸菌群が付着または繁殖している場合、細菌は１種類とは限らず、むしろ複数種である可能性が高い。また、大腸菌群の増殖は環境によって大きく左右されやすいため、場所や材料によって繁殖する大腸菌群の様相も様々となり得る。様々な箇所における試料を採取した場合、試料中の大腸菌群の種別割合は、それぞれの由来に応じて異なる様相を呈する傾向がある。したがって、このような大腸菌群の種別割合を大腸菌群の構成相として汚染源の特定に利用することができる。
【００６６】
図４に示すように原材料の大腸菌群の構成相はグラフｄ１で示される通りである。空気中、動物・昆虫、機械上の残渣、床下、汚水、人、食品（製品）それぞれにおける大腸菌の構成相が、図４に示すグラフｄ２〜ｄ８として表される。グラフｄ１〜ｄ８に示されるように、その構成相は試料の由来によって異なることがわかる。最終製品である食品のグラフｄ８と他のグラフを比較すると、図４に示す例の場合では、汚水ｄ５が最も近似した構成相を呈していることがわかる。この比較分析結果から、図４に示す例の場合には、汚水が汚染源であると推定される。
【００６７】
図５に、本発明の検出方法を応用して、食品工場内での細菌の汚染源特定試験の作業流れ図を示す。食品が汚染されていた想定での作業の流れ図である。まず、試料採取工程ＳＣ１にて、工場内の様々な箇所から試料を採取する。次に、大腸菌群分析工程ＳＣ２において、各試料採取箇所における大腸菌群の構成相を分析する。大腸菌群分析工程ＳＣ２では、まず試料採取工程ＳＣ１にて採取された試料について、それぞれ上記ＰＣＲを利用した実施形態１０により細菌の検出試験を行う。そして、その結果に基づいて大腸菌群の構成相を明らかにする。他方、汚染された食品についても、同様に試料採取工程Ｓｆ１および大腸菌群分析構成Ｓｆ２を経て、食品試料中に含まれる大腸菌群についての構成相を明らかにする。各箇所における構成相と、食品における構成相を対比する。上記のＰＣＲを利用した実施形態１０によれば、大腸菌群を４つのグループに分類でき、その存在量もリアルタイムＰＣＲによって推定される。そこで、各グループの占める割合として構成相は表される。食品における構成相ともっとも近似した相を呈する箇所が汚染源であると推定される。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明が下記実施例により限定されるものではない。
【００６９】
＜調製例１および２＞ｌａｃＺ遺伝子増幅プライマーの設計
（１）実験に供した標準菌株
下記表５に示す代表的な大腸菌群の標準菌株１１属２１種３８株を試験に供した。
【００７０】
（２）培養条件及びゲノム抽出
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地にて３７℃一晩振とう培養した菌液を１．５  ｍｌ分取し、ＩＳＯＰＬＡＮＴキット（ニッポンジーン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００７１】
（３）ＰＣＲプライマーの設計
まず、全ての大腸菌群株を増幅することが可能なプライマーの設計を試みた。ｌａｃＺ遺伝子のうち、保存性が高い場所を複数選び、その中から、最も多くの大腸菌群株でＰＣＲ増幅に成功したプライマーを選抜することにした。ｌａｃＺ遺伝子におけるＰＣＲ増幅領域は以下のようにして決定した。大腸菌群に属する細菌でゲノム配列がインターネット上で公開されているもののうち、シトロバクター  コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ）、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エンテロバクター  サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）から各々のｌａｃＺ遺伝子配列を取得した。それらの配列（配列番号６：Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ：３０７８ｂｐ、配列番号８：Ｅ．ｃｏｌｉ：３０７５ｂｐ、配列番号１０：Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ：３１３２ｂｐ、配列番号１２：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：３１０８ｂｐ、配列番号１４：Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ：３０８７ｂｐ）について、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  プログラムを用いてマルチプルアラインメントを行った。
【００７２】
マルチプルアライメントの結果を図１−１から図１−６に示す。図１−１から図１−６において＊印は、５種の配列において同じ塩基である部位を示す。この結果をもとに、５種の細菌で保存性が高い領域を探し、さらにＰＣＲ用のプライマーとして許容され得る長さであって、安定して増幅しやすい長さの領域を挟むようになる２組のプライマー（１Ｆ−１Ｒおよび２Ｆ−２Ｒ）をそれぞれ設計した。各プライマーの配列は以下のとおりである。
【００７３】
なお、混合塩基については、以下の省略記号を用いる。
Ｒ＝（ＡまたはＧ）、Ｙ＝（ＣまたはＴ）、Ｍ＝（ＡまたはＣ）、Ｋ＝（ＧまたはＴ）、Ｓ＝（ＧまたはＣ）、Ｗ＝（ＡまたはＴ）、Ｈ＝（Ａ，ＣまたはＴ）、Ｂ＝（Ｇ，ＴまたはＣ）、Ｖ＝（Ｇ，ＣまたはＡ）、Ｄ＝（Ｇ，ＡまたはＴ）、Ｎ＝（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）
【００７４】
【表２】
0005310997.tif 000003
【００７５】
【表３】
0005310997.tif 000004
【００７６】
プライマー１Ｆは、図１−２中に示す領域ｒｆ１に対応し、矢印１Ｆの向きに核酸を合成するためのプライマーとなる。プライマー１Ｒは、図１−３中に示す領域ｒｆ２に対応し、矢印の向きに核酸を合成するためのプライマーとなる。プライマー１Ｒの配列は、領域ｒｆ２に示す核酸配列に対し相補的な配列である。プライマー１Ｆおよび１Ｒの組み合わせて用いるＰＣＲにより、図１−２から図１−３に示す領域ＲＧＮ１を増幅し得る。
【００７７】
プライマー２Ｆは、図１−４中に示す領域ｒｆ４に対応し、矢印２Ｆの向きに核酸を合成するためのプライマーとなる。プライマー２Ｒは、図１−４中に示す領域ｒｆ５に対応し、矢印２Ｒの向きに核酸を合成するためのプライマーとなる。プライマー２Ｒの配列は、領域ｒｆ５に示す核酸配列に対し相補的な配列である。プライマー２Ｆおよび２Ｒの組み合わせて用いるＰＣＲにより、図１−４に示す領域ＲＧＮ２を増幅し得る。
【００７８】
＜調製例３＞既存のプライマーの調製
（１）ＰＣＲプライマーの合成
過去の文献にて、ｌａｃＺ遺伝子のＰＣＲによる増幅が報告されている（非特許文献１：Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：４４−４６，１９９４；非特許文献２：Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：２４２９−２４３２，１９９１）。そのプライマーを合成した。
【００７９】
【表４】
0005310997.tif 000005
【００８０】
＜試験例１＞ＰＣＲを利用した大腸群の検出
上記調製例１および２で調製されたプライマーセットＩ〜ＩＩＩを用いて、ＰＣＲを行い、大腸菌群に由来する遺伝子の増幅を以下のようにして検出した。
（１）プライマーＩおよびＩＩを用いたＰＣＲの反応条件
ＰＣＲ反応は総量を５０μｌとし、１×ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、２．５Ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、０．５μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ各プライマー、０．５μｌの鋳型ＤＮＡを含む反応液で行った。増幅反応は、Ｍａｓｔｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製）にて以下のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型ＤＮＡの二本鎖解離のため９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、５５℃で１分３０秒間、７２℃で１分間の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分間反応させ、ＰＣＲ反応を行った。
【００８１】
（２）プライマーＩＩＩを用いたＰＣＲの反応条件
プライマーセットＩＩＩによるＰＣＲ反応は、発表された文献（非特許文献１および２）の記載に従って、以下のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型ＤＮＡの二本鎖解離のため９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル繰り返し、７２℃で５分間反応させ、ＰＣＲ反応を行った。
【００８２】
（３）試験結果
プライマーＩ〜ＩＩＩをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、核酸の増幅産物が得られたか否かについての結果を、表５に示す。表５において、ＰＣＲによって増幅が確認された菌株を○として示し、増幅が確認されなかった菌株を×として示した。
【００８３】
【表５】
0005310997.tif 000006
【００８４】
（４）プライマーセットＩおよびＩＩによるＰＣＲ反応の結果
プライマーセットＩによるＰＣＲ反応（図１−２から図１−３におけるＲＧＮ１を増幅）を行った。その結果、表５に示すとおり、プライマーセットＩでは、３８株全て（１００％）で核酸の増幅が確認された。この結果から、プライマーセットＩによるＰＣＲによって、微生物が含まれる試料中から大腸菌群の検出を行うことができることが分かった。また、試料の調製からＰＣＲによる結果の確認まで要した時間はおよそ３時間程度であった。
【００８５】
（５）プライマーセットＩＩによるＰＣＲ反応の結果
プライマーセットＩＩによるＰＣＲ反応（図１−４におけるＲＧＮ２を増幅）を３８菌株について行った。表５に示すように、プライマーセットＩＩでは、２７株（７１％）で核酸の増幅が確認された。プライマーセットＩＩは、プライマーセットＩと同様に、大腸菌群において保存性が高い領域をベースに設計されたが、プライマーセットＩのように、表４に示す大腸菌群のすべてについて検出することはできなかった。
【００８６】
（６）プライマーセットＩＩＩによるＰＣＲ反応の結果
プライマーセットＩＩＩによるＰＣＲ反応を３８菌株について行ったところ、表４に示すように、１０株（２６％）について増幅が確認されたのみであった。過去の文献でも、試験した菌株のうち約７０％の菌株でしかＰＣＲ反応で増幅が確認されず、新たなプライマーの設計の必要性が主張されている（非特許文献１および２）。本試験結果もこれを追認する結果となった。
【００８７】
以上（５）から（６）で示した結果から、今回新たに設計したプライマーセットＩは、過去の試みられたプライマーよりもＰＣＲで増幅される菌株数が大幅に増加しており、大腸菌群の検出に対する有用性が高いことが確認された。
【００８８】
＜調製例４〜６＞種特異的プライマーの設計
（１）種特異的なＰＣＲプライマーの設計
次に、種特異的なプライマーの設計を試みた。表５に示す菌株のうち、代表的な菌株のＲＧＮ１について核酸配列を確認した（約５２０ｂｐ）。その核酸配列の比較から、種内では保存されているが、種間では変化に富んでいる領域を探した。図２−１（配列番号２１−２５）は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する５菌株における領域ＲＧＮ１のアライメントを示す。図２−２（配列番号２６−２７）は、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する２菌株における領域ＲＧＮ１のアライメントを示す。図２−３（配列番号２８−３２）には、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属する５菌株における領域ＲＧＮ１のアライメントを示す。図２−１に示される通り、領域ｒｆ６は、シトロバクター属に属する菌株において保存性が高い領域である。また、図２−２に示される通り、領域ｒｆ７は、ハフニア属に属する菌株において保存性の高い領域である。図２−３示される通り、領域ｒｆ８はクレブシエラ属に属する菌株において保存性の高い領域である。
【００８９】
さらに、図２−４に示すとおり、領域ｒｆ６からｒｆ８は領域ＲＧＮ１に含まれる同領域に該当する。また、領域ｒｆ６から８は、図１−２中においては、領域ｒｆ３として示されれている。これらの図に示されるとおり、領域ＲＧＮ１内の領域ｒｆ６から８によって特定される領域は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属内、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属内、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属内の各属内では保存性の高い領域であるが、これらの属間で比較すると、配列は変化に富んでいる領域となっていることが明らかとなった。そこで、シトロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属のそれぞれに対応する３組の種特異的なプライマーを以下のように設計した。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
【表７】
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【００９２】
【表８】
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【００９３】
＜試験例２＞
（１）種特異的ＰＣＲの反応条件
上記プライマーセットＩＶからＶＩをそれぞれ用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のための溶液として、上記と同様に、反応溶液総量を５０μｌとし、１×ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、２．５Ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、０．５μＭを含む溶液Ａを調製した。また、フォワードプライマーとしては１Ｆを用い、リバースプライマーとしてはＡＲ、ＢＲ、ＣＲのいずれかを用い、０．５μｌの鋳型ＤＮＡを上記溶液Ａに添加した反応液でＰＣＲを行った。増幅反応はＭａｓｔｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社製）にて、添付の説明書を参照し、下記のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型ＤＮＡの二本鎖解離のため９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１５秒間の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分間反応させ、ＰＣＲ反応を行った。
【００９４】
（２）種特異的ＰＣＲ反応の結果
各プライマーセットによるＰＣＲ反応の結果を表９に示す。表９中、ＰＣＲにて増幅が確認された菌株を○として、増幅が確認されなかった菌株を×として示した。プライマーセットＩＶでのみ、ＰＣＲによる増幅が確認された菌株はシトロバクター（Ｃｉｔｏｒｂａｃｔｅｒ）属の６株とエルウィニア  アフィディコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）１株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。プライマーセットＶでのみ、ＰＣＲによる増幅が確認された菌株は、ハフニア  アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）の２株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。プライマーセットＶＩでのみ、ＰＣＲによる増幅が確認された菌株は、クレブシエラ  オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）６株と、エンテロバクター  アエロゲネシス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）２株、ラウルテラ  テリゲナ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）１株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。全てのプライマーセットでＰＣＲによる増幅が確認されなかった菌株は２０種類であった。試料の調製からＰＣＲによる結果の確認まで要した時間はおよそ３時間程度であった。
【００９５】
以上の結果から、プライマーセットＩＶ、ＶおよびＶＩを用いることにより、試料中に含まれる大腸菌群株を４グループに分けられることが明らかとなった。したがって、プライマーセットＩＶ、ＶおよびＶＩを用いた核酸配列の型別により、大腸菌群構成相を求め得る。
【００９６】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、大腸菌群の検出に利用でき、大腸菌群の検出、群構成の分析を要する分野、例えば、食品、衛生、医療、環境などに関わる技術分野において寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１−１】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図１−２】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図１−３】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図１−４】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図１−５】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図１−６】５種の細菌のｌａｃＺ遺伝子の配列のマルチプルアライメントの結果の一部を示す図である。
【図２−１】シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌についてのマルチプルアライメントの結果を示す図である。
【図２−２】ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属に属する細菌についてのマルチプルアライメントの結果を示す図である。
【図２−３】クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属する細菌についてのマルチプルアライメントの結果を示す図である。
【図２−４】異なる種類の細菌間でのマルチプルアライメントの結果を示す図である。
【図３】配列（Ａ）に含まれる配列群を示す図である。
【図４】食品工場における一例において、細菌の構成相から汚染源を推定する様子を示す図である。
【図５】食品工場における一例において、汚染源を推定する工程を示す図である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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