(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
0005231062.tif 000024
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩と、
硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式２：
【化２】
0005231062.tif 000025
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩の製造方法。
【請求項２】
前記化学式１で示される化合物に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記加熱反応の温度は、１９０〜２６０℃である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記加熱反応の反応時間は、０．５〜５時間である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、
前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程と、を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記固体を水から再結晶する工程をさらに含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６の製造方法で得られる、化学式２で示される化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分測定のための酸化発色化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つとして、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている。（例えば特許文献１参照）
このような測定法の一つとして、被測定物質に特異的な酸化酵素を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する方法がある。
【０００３】
ここで使用される酵素としては、例えばグルコースの測定ではグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定ではコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は被測定物質である基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０００４】
また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによって、その吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
【０００５】
１分子で機能するものには、ロイコ型色素等があげられる。化合物としては、ベンチジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、２、２’−アミノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、ビス−（４−ジエチルアミノ）−２−スルホフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、ビス［４−（Ｎ−アルキル−Ｎ−スルホプロピル）−２，６−ジメチルフェニル］メタン（Ｂｉｓ−ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＭＰ）などがあげられる。
【０００６】
２分子で機能する代表的なものには、カプラーとトリンダー試薬とを酸化的にカップリングさせる方法がある。（例えば、非特許文献１および２参照）
前記カプラーとしては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。
【０００７】
トリンダー試薬としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸、などがあげられる。アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などがあげられる。
【０００８】
一般に、発色試薬を組成物とした場合、１分子で機能する色素より２分子で機能する色素の方が保存安定性は良い傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラーとしては前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが多く用いられ、トリンダー試薬としては安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。
【０００９】
このように、従来のカプラーに変わる新規な発色化合物の開発が進められており、例えば、特許文献２には、酵素の活性を阻害しないアミノアンチピリン誘導体およびその製造方法が開示されている。さらに、上記特許文献２には、ヒドラジン系化合物とアセト酢酸エチルエステルとから環化反応によりピラゾロン環を合成した後、ｐ−トルエンスルホン酸メチルにより２位をメチル化している手法が記載されている。
【００１０】
また、非特許文献３には、メタノール溶媒中、塩基非存在下、オートクレーブ中で加熱反応を行なう手法が記載されている。
【特許文献１】特開２００４−２２３１１５号公報
【特許文献２】特公平６−９９４０３号公報
【非特許文献１】Ｔｒｉｎｄｅｒ，  Ｐ．，  Ａｎｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６，  ２４，  １９６９
【非特許文献２】Ｂａｒｈａｍ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｔｒｉｎｄｅｒ，  Ｐ．，  Ａｎａｌｙｓｔ  （Ｌｏｎｄｏｎ），  ９７，  １４２，  １９７２
【非特許文献３】ＪＵＳＴＵＳ  ＬＩＥＢＩＧ’Ｓ，ＡＮＮＡＬＥＮ  ＤＥＲ  ＣＨＥＭＩＥ，２９３，７−８，１８９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に使用されるメチル化剤としては、上記特許文献２や非特許文献３等でも使用されているように、有機酸（ジ）メチル、無機酸（ジ）メチル、ハロゲン化メチル等が挙げられる。前記有機酸（ジ）メチルとしては、トルエンスルホン酸メチル、炭酸ジメチルなどが挙げられ、前記無機酸（ジ）メチルとしては、硫酸ジメチルなどが挙げられ、ハロゲン化メチルとしては、ヨウ化メチル、臭化メチル、塩化メチルなどが挙げられる。これらのメチル化剤を用いて反応を行なう場合、上記特許文献２や非特許文献３等に示されているように、通常溶媒を用い、また塩基の共存下で反応が行なわれる。
【００１２】
しかしながら、上記のメチル化剤を用いて、溶媒を用い、塩基共存下で反応を行なった場合、総じて副生成物が多く生じ目的化合物の収率は極めて低いという問題があった。
【００１３】
さらに、上記非特許文献３に示される、メタノール溶媒中、塩基非存在下、オートクレーブ中で加熱反応を行なった場合、目的物は得られるが、収率は２０〜２５％と低かった。さらに、不純物が多く生成する為、目的物の精製が困難であり、また純度も高くないことが判明した。また、高圧反応装置が必要であり、大量に合成するには制約が大きく、製造コストも高い。また、反応時間や後処理に要する時間が長いという問題点もある。
【００１４】
また、上記の発色原理を用いた製品の価値を上げるためには、測定精度をさらに向上させる、あるいは経時的劣化を低減させる必要がある。また、より微量な成分の検出には、現存のものよりさらに感度のよい検出系が必要となる。それらの目的において、より高性能の発色試薬の開発が望まれている。さらに、これら発色試薬は簡便で安価に製造できることが望まれている。
【００１５】
すなわち、本発明者らは、性能の高い新規酸化発色化合物の新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく種々検討を重ねた結果、高い性能を持つ新規酸化発色化合物を見いだし、それを製造するための中間体となる化合物の簡便で安価な製造方法を見いだすに至った。具体的には、我々は、新規な発色化合物としてピラゾロン環骨格に着目し、まずは当該新規な発色化合物の合成過程におけるメチル化法を検討したところ、メチル化剤として硫酸ジメチルを用い、溶媒を用いず、塩基非存在下で加熱反応を行うことによって、極めて高い反応率で目的物が得られることが明らかとなった。本条件では、目的物の精製も容易で、得られる目的物の純度も高かった。
【００１７】
本発明は、下記（１）〜（７）で示される、高い性能を持つ新規酸化発色化合物を製造するにあたり重要な中間体となる、スルホフェニルジメチルピラゾロンの製造方法を提供する。
（１）下記化学式１：
【００１８】
【化１】
0005231062.tif 000002
【００１９】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩と、
硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式２：
【００２０】
【化２】
0005231062.tif 000003
【００２１】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩の製造方法。
（２）前記化学式１で示される化合物に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルである、（１）に記載の製造方法。
（３）前記加熱反応の温度は、１９０〜２６０℃である、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記加熱反応の反応時間は、０．５〜５時間である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（５）前記加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、
前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程と、を含む（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造方法。
（６）前記固体を水から再結晶する工程をさらに含む、（５）に記載の製造方法。
（７）（１）〜（６）の製造方法で得られる、化学式２で示される化合物またはその塩。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の製造方法においては、従来の方法に比較し下記（ア）〜（オ）で優れている。
（ア）製造装置の簡略化：従来行なわれていた方法では高圧反応装置が必要であり、大量に合成するには制約が大きく、製造コストも高かった。本発明に係る製造方法では常圧で加熱するだけで反応が進行するので、特別な反応装置を要しない。
（イ）反応容量の少量化：本発明に係る製造方法では溶媒を使用しないため、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きい。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。
（ウ）反応時間の短縮：従来の高圧反応では反応時間が１０時間以上必要であったのに対し、今回の反応は２時間以内で完了する。
（エ）反応収率の向上：従来法では収率が２０％程度であったのに比較し、本発明に係る製造方法では５０％以上の収率が得られる。
（オ）反応後の精製操作が簡便：精製過程において、溶媒の蒸発留去の過程を必要とせず、晶析と再結晶のみで高純度の目的物が得られるので、操作が簡便であり製造全体の所要時間も短い。
【００２３】
本発明の方法によって製造された中間体であるスルホフェニルジメチルピラゾロン（化合物Ｉ）を用いて、下記の反応式１に示す経路を経て高性能の発色試薬化合物を合成することができる。
【００２４】
【化３】
0005231062.tif 000004
【００２５】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。）
本発明の製造方法にて得られたスルホフェニルジメチルピラゾロンを用いて合成した酸化発色化合物および／またはその塩（以下、本発明に係る酸化発色化合物／その塩と称する。）は、その呈色性能において下記（カ）〜（ケ）の点でこれまでの試薬より優れている。特に担体に保持した試験具として使用する場合、その効果が最も顕著である。
（カ）測定時間の短縮：本発明に係る酸化発色化合物／その塩は水溶性が高いので、特に担体に保持して使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる。
（キ）感度が高い：呈色反応によって生成した色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。それによって感度が高く安定した測定が可能となる。
（ク）精度が高い：本発明に係る酸化発色化合物／その塩は溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。また、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。以上、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。
（ケ）経時安定性に優れる：本発明に係る酸化発色化合物／その塩は親水性が向上し分子量が大きくなっている為、保管中の昇華による試薬の損失を押さえることができる。また、本化合物は試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、当該化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る酸化発色化合物／その塩の親水性官能基は担体への吸着性を高め、担体内での当該化合物の安定性を向上させる。以上の点から、経時劣化を低減させ有効期間を延ばすことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
＜本発明の第一＞
本発明の第一は、下記化学式１：
【００２７】
【化４】
0005231062.tif 000005
【００２８】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩と、
硫酸ジメチルと、を混合し無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式２：
【００２９】
【化５】
0005231062.tif 000006
【００３０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩の製造方法である。
【００３１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。
【００３２】
また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの２つがスルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ４である。
【００３３】
なお、スルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、スルホン酸基の塩であってもよい。
【００３４】
この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。
【００３５】
なお、後述する化学式１〜化学式６における「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」は、いずれも、上記化学式１において行った「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」の定義と同様である。
【００３６】
本発明に係る製造方法のように、溶媒を用いずに（無溶媒で）合成できる利点は、反応容量を少量化でき、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きいことがあげられる。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。また、塩基を用いずに合成することもできる。
（反応条件）
次に反応条件の詳細について説明する。
【００３７】
本発明に係る製造方法において使用される化学式１で示される化合物は、市販のものを使用しても合成してもよく、合成する場合は公知の合成方法を使用することができ特に制限されることはないが、例えば以下の方法が挙げられる。
【００３８】
すなわち、下記化学式（３）：
【００３９】
【化６】
0005231062.tif 000007
【００４０】
で示される化合物［以下、「化合物（３）」とも称する］と、
下記化学式（４）：
【００４１】
【化７】
0005231062.tif 000008
【００４２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）
で示される化合物［以下、「化合物（４）」とも称する］とを所定量混合して、好ましくは２０〜２００℃、より好ましくは、８０〜１５０℃の温度で、好ましくは０．５〜５時間、より好ましくは１〜１．５時間加熱攪拌する。次いで、放冷後析出した固体を濾集し、メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコールで洗浄後、乾燥して本発明に係る化学式１で示される化合物を得ることができる。
【００４３】
また、上記反応は、無溶媒下で行なってもよく、あるいは溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の、アルコール類；ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジオキサン等の、エーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましい。化合物（３）と化合物（４）との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えることによって生成物を固化させることによって、原料化合物と分離回収することができる。
【００４４】
上記の化合物（３）と化合物（４）とを反応させる場合の、化合物（３）及び（４）の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物（３）及び（４）をそれぞれ等モル混合する、あるいは化合物（３）を化合物（４）に対してやや多めに混合することが好ましい。後者の場合、化合物（３）は、化合物（４）１モルに対して、０．８〜２モル、より好ましくは１〜１．２モル程度の割合で、混合することが好ましい。
【００４５】
また、本発明の製造方法に用いられる硫酸ジメチルは、市販のものを使用しても合成して使用してもよく、特に制限されることはない。
【００４６】
本発明に係る化学式１で示される化合物に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルであることが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．３倍モルがさらに好ましい。
【００４７】
本発明に係る化学式１で示される化合物に対する硫酸ジメチルの添加量が、１．０倍モル未満だと、反応効率の観点で不利であり、２．０倍モルを越えると副生成物の生成の観点で不利である。
【００４８】
本発明に係る硫酸ジメチルの添加の方法としては、滴下ロート、ピペットなどを用いることができるが、外気中の水分による硫酸ジメチルの加水分解を防ぐために滴下ロートを用いて反応系を密閉して行なうのが好ましい。
【００４９】
本発明に係る硫酸ジメチルを滴下する際の滴下速度は、１〜１０００ｍｌ／分であることが好ましい。
【００５０】
また、室温、１ａｔｍにおいて本発明に係る上記化学式（１）の化合物と、硫酸ジメチルとを混合する際には、液体である硫酸ジメチルに完全に溶解させてもまたは溶解させなくてもよく、両者がどのような状態であろうが混合していればよい。
【００５１】
本発明に係る製造方法に用いられる反応容器としては、ガラス、ステンレス、ホーロー、テフロン（登録商標）製のフラスコが好ましく、摺合せのガラス製フラスコが特に好ましい。
【００５２】
前記ガラス製の反応容器としては、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコを用いることができるが、これらは、仕込み量や加熱効率を考慮して選択される。
【００５３】
本発明に係る製造方法に用いられる冷却器としては、通常の合成反応に用いられる還流冷却器を用いることができ、リービッヒ冷却器、玉入冷却器（アーリン氏タイプ）、ジムロート冷却器、蛇管冷却器（グラハムタイプ）が好ましく、リービッヒ冷却器、玉入冷却器が特に好ましい。
【００５４】
また、本発明に係る製造方法における加熱反応中、外気からの水分の混入を防ぐ為に、塩化カルシウム管、窒素バブラーを取り付けることが好ましい。
【００５５】
本発明に係る製造方法における加熱反応の加熱方法としては、マントルヒーター、油浴、砂浴（バーナー直火）が好ましく、マントルヒーターが特に好ましい。必要に応じて、センサー付き温度コントローラーを用いることができる。
【００５６】
本発明に係る製造方法における加熱反応の温度としては、１９０〜２６０℃が好ましく、２００〜２５０℃が特に好ましく、２２０〜２４０℃がさらに好ましい。
【００５７】
上記加熱反応の温度が１９０℃未満だと、反応効率の観点で不利であり、２６０℃超だと、副生成物の生成の観点で不利である。
【００５８】
本発明に係る製造方法における加熱反応の反応時間としては、０．５〜５時間が好ましく、０．５〜３時間が特に好ましく、１〜２時間がさらに好ましい。
【００５９】
上記加熱反応の反応時間が０．５時間未満だと、反応効率の観点で不利であり、５時間超だと、副生成物の生成の観点で不利である。
【００６０】
本発明に係る製造方法において、上記化学式（１）と硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程とを含むことが好ましい。
【００６１】
本発明に係る化学式（２）で示される化合物は、溶媒抽出による回収が困難であるため酸を添加することで強制的に沈殿するいわゆる“酸沈”により回収することが好ましい。これにより、最終目的物を高い純度で得られることができる。
【００６２】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液のアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００６３】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液の濃度（Ｗ／Ｖ％（重量対体積％））としては、１０〜３０Ｗ／Ｖ％が好ましく、１５〜２５Ｗ／Ｖ％が特に好ましく、２０〜２５Ｗ／Ｖ％がさらに好ましい。
【００６４】
また、上記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて得られる反応混合溶液のｐＨは、７〜１４が好ましい。
【００６５】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液中のアルカリの量としては、使用する硫酸ジメチルに対して２〜５倍モルが好ましく、２．５〜４倍モルが特に好ましく、３倍モルがさらに好ましい。
【００６６】
本発明に係る製造方法に用いられる酸としては、有機酸または無機酸のいずれでもよく、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸、濃硫酸、濃硝酸などが用いられるが、塩酸、硫酸、硝酸がより好ましく、塩酸がさらに好ましい。
【００６７】
本発明に係る製造方法において、上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度としては、なるべく水分量を減らすべく濃度が高いものが好ましい。
【００６８】
上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度は、５〜１００Ｗ／Ｖ％が好ましく、１５〜１００Ｗ／Ｖ％がより好ましく、３０〜１００Ｗ／Ｖ％が特に好ましい。例えば、添加する酸として塩酸を用いる場合は、１５〜３６Ｗ／Ｖ％が好ましく、３０〜３６Ｗ／Ｖ％が特に好ましい。
【００６９】
上記反応物混合溶液に添加する酸の量は、１〜１０倍モルが好ましく、１〜５倍モルがより好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましい。
【００７０】
例えば上記反応混合溶液に添加する塩酸の量としては、出発物質の使用量に対して、１〜５倍モルが好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましく、１．８〜２．２倍モルがさらに好ましい。
【００７１】
また、本発明に係る製造方法において酸を加え沈殿を生成させる工程で用いる攪拌装置としては、磁気スターラー、メカニカルスターラーなどを用いることができる。
【００７２】
本発明に係る製造方法において、前記単離工程で得られた固体を水から再結晶する工程をさらに含むことが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、下記の化学式１で示される化合物：
【００７３】
【化８】
0005231062.tif 000009
【００７４】
および硫酸ジメチルを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物を得る工程と、前記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得た後、さらに前記反応混合溶液に酸を加えて固体（上記化学式２に示される化合物を含むもの）を単離する工程と、単離された前記固体を水から再結晶する工程とを含むことが好ましい。
【００７５】
本発明に係る製造方法における再結晶で用いる水の量としては、固体１００ｇ当り、５００ｍｌ〜３０００ｍｌが好ましく、１０００ｍｌ〜２０００ｍｌが特に好ましく、１０００ｍｌ〜１５００ｍｌがさらに好ましい。なお、当該単離された固体は、０．５〜２４時間、室温条件下で減圧乾燥したものが使用される。
【００７６】
上記再結晶工程で固体を水に溶解させる際に、加熱を行なってよい。加熱器具としては、水浴、油浴、マントルヒーター、ホットプレートなどが用いられる。加熱する際の加熱器具の温度設定は、５０℃〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃が特に好ましく、９０〜１１０℃がさらに好ましい。
【００７７】
また上記再結晶のための放置時間は、３０分〜３日が好ましく、１時間〜１日が特に好ましく、１０時間〜１５時間がさらに好ましい。さらに、上記再結晶のための放置時の温度は、０〜４０℃が好ましく、０〜２５℃が特に好ましく、０〜１５℃がさらに好ましい。
【００７８】
本発明に係る製造方法において使用される水は、特に制限されるものではなく、水道水、イオン交換水、純水、超純水、または工業用水などの水洗水を使用することができ、純水が特に好ましい。
【００７９】
本発明に係る製造方法により得られた化学式２に示される化合物等の純度の測定方法は、特に制限されることはなく、例えばＴＬＣ、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーを用いることができる。
【００８０】
本発明の方法によって製造されたスルホフェニルジメチルピラゾロンは、酸化発色化合物の原料として用いるだけでなく、医薬品、ファインケミカル、高分子添加剤、食品添加物、農薬、肥料、土壌改良剤、色素など、種々の化成品の原料としても用いることが出来る。
【００８１】
＜本発明の第二＞
本発明の製造方法によって得られたスルホフェニルジメチルピラゾロン（化学式２）を用いて、本発明に係る酸化発色化合物／その塩（化学式６）を合成することができ、その合成方法は特に制限されることはないが、例えば図１に示す経路で本発明に係る酸化発色化合物／その塩を合成することができる。以下、図１に示したＲｏｕｔｅ  Ａの合成経路と、Ｒｏｕｔｅ  Ｂの合成経路とを説明する。なお、Ｒｏｕｔｅ  Ａの合成経路は、ニトロソ化工程と還元工程とに分けられ、かつニトロソ化工程後、単離して下記化学式５に示される化合物を得る。Ｒｏｕｔｅ  Ｂの合成経路は同一容器内（ワンポット）で本発明に係る酸化発色化合物／その塩を得ることができる。
【００８２】
＜Ｒｏｕｔｅ  Ａ＞
本発明に係る製造方法は、
下記化学式２：
【００８３】
【化９】
0005231062.tif 000010
【００８４】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式５：
【００８５】
【化１０】
0005231062.tif 000011
【００８６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式６：
【００８７】
【化１１】
0005231062.tif 000012
【００８８】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法が好ましい。
【００８９】
従来、所望の発色化合物を得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。
【００９０】
その結果、中間体であるニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、所望の発色化合物の収率減少や純度低下の一因となっていた。
【００９１】
さらに研究を進めていく過程で、本発明の製造方法により製造される発色化合物は、従来のアミノアンチピリンと比較して極めて水溶性が高いため、従来の方法によっては、高純度かつ高収率で所望の酸化発色化合物を得ることができないとの知見も見出した。
【００９２】
よって、ニトロソ化反応、還元反応の条件および精製法等に、様々な技術的工夫を行うことにより、従来法に比較して、より効率的に高純度の発色化合物を合成する方法を見出し、本発明を完成させたのである。
【００９３】
以下、本発明を詳説する。
【００９４】
［ニトロソ化工程］
ニトロソ化を行う対象化合物は、
下記化学式２：
【００９５】
【化１２】
0005231062.tif 000013
【００９６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。
【００９７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。
【００９８】
なお、ここで、化学式５で示される化合物またはその塩を得る方法について下記に説明する。
【００９９】
（亜硝酸塩）
上記化学式２で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する。
【０１００】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩は、特に制限はないが、亜硝酸のカチオン塩が用いられると好ましい。
【０１０１】
カチオン塩としても、特に制限はなく、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが好適に挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、入手し易さの観点で、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１０２】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩の量は、化学式２で示される化合物またはその塩（本明細書中、単に「中間体」とも称する。）の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、１．０〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１０３】
（酸）
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応は、反応性の観点で、酸の存在下において行うとよい。
【０１０４】
ニトロソ化工程に用いられる酸は、上記の酸による粗生成物を固体として単離する工程と同様に特に制限はないが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、濃塩酸、濃硫酸、濃硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いの観点で、塩酸が特に好ましい。
【０１０５】
ニトロソ化工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、中間体の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、０．５〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１０６】
また、添加する酸は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。なお、添加する酸を、後述する溶媒で希釈した場合も同様の温度に制御しておくとよい。
【０１０７】
（溶媒）
ニトロソ化工程において、中間体と上記亜硝酸塩、酸を混合する場合、それぞれを予め溶媒に含有させておいてもよい。
【０１０８】
つまり、溶媒に、それぞれの原末（中間体と亜硝酸塩）または原液（酸）を加えていく方法や、中間体を溶媒に含有させた溶液（本明細書中、「中間体の溶液」とも称する）に、亜硝酸塩、酸を溶媒に含有させた溶液（それぞれ、「亜硝酸塩の溶液」、「酸の溶液」とも称する。）を添加する方法を用いてもよい。
【０１０９】
好ましくは、反応効率の観点で、中間体の溶液に、亜硝酸塩の溶液および酸の溶液を添加する方法である。つまり、酸の溶液と、亜硝酸塩の溶液とを、化学式１で示される化合物またはその塩の溶液に滴下して添加する。
【０１１０】
この際、添加する亜硝酸塩の溶液は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。また、添加する亜硝酸塩の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１１１】
また、添加する酸の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１１２】
また、中間体の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｍｏｌ／ｌである。
【０１１３】
また、予め中間体の溶液を、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃にしておくとよい。
【０１１４】
前記溶媒は、特に制限はないが、水、有機溶媒またはこれら混合物（混合溶媒）が用いられうる。なお、本明細書中、溶媒として「水」を主成分（好ましくは、全部）とした溶液の名称を「水溶液」とも称する。なお、本明細書中、「水を主成分とする」とは、全溶液中に水の占める割合が、１０〜１００質量％（v／v％）である事を意味する。
【０１１５】
有機溶媒としては、特に制限はないが、アルコール、エーテル類、ケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。
【０１１６】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１１７】
エーテル類としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１１８】
ケトン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）及びシクロヘキサノンなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１１９】
これらのうち、反応性の観点で、水単独または水とアルコールとの混合物が好ましく、水単独が特に好ましい。
【０１２０】
水および有機溶媒の混合溶媒を用いる際は、例えば、好ましくは水／有機溶媒（容積比）＝０／１００〜１００／０、より好ましくは水／有機溶媒（容積比）＝１０／９０〜１００／０程度がよい。この際、有機溶媒の含有量が、混合溶媒中、５０容積％を超えると、亜硝酸塩の析出の虞れもある。
【０１２１】
また、上記の通り、中間体と、亜硝酸塩と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを、攪拌下で、中間体の溶液に添加する方法が好ましい。さらには、添加する条件は、副生成物の生成を抑える観点で、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を、ほぼ同じ速度で、同時に添加することが好ましい。
【０１２２】
ここで、「同時に添加する」とは、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを添加しているある時点が、一瞬でも互いに重複すればよいが、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を開始する時点と、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を終了する時点とが、実質的に同じであると好ましい。
【０１２３】
このように、「同じ速度で添加する」および「同時に添加する」ことで、亜硝酸を一定で連続的に発生させるとの効果を奏しうる。
【０１２４】
なお、この際の、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液の添加の方法にも特に制限はないが、ピペット、シリンジ、滴下ロートなどを用いて行なわれることが好ましい。また、これらの添加に要する時間は、生成物の安定性の観点で、グラムスケールの反応においては、１〜１０分が好ましく、３〜７分が特に好ましく、４〜６分がさらに好ましい。
【０１２５】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１２６】
さらに、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液と、を添加した後、そのまま静置しておいてもよいが、反応が添加後時間とともに進行するため、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは１〜１０分程度、より好ましくは３〜５分程度、激しく攪拌するとよい。この際、「激しく攪拌する」の攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは３００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは６００〜１０００ｒｐｍである。
【０１２７】
（反応時間）
ニトロソ化工程における反応時間にも特に制限はないが、反応時間が短すぎると、反応が不十分で出発中間体の残留が生じる虞れがある。一方、反応時間が長過ぎると、生成したニトロソ体の分解が起こる虞れがある。
【０１２８】
反応時間は、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を添加する時間を含めて、グラムスケールの反応では１〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましく、７〜１２分がさらに好ましい。
【０１２９】
（反応温度）
ニトロソ化工程において設定される反応温度としては、副生成物の生成を抑える観点で、０〜１５℃が好ましく、１〜１０℃がより好ましく、１〜５℃がさらに好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴等を用いればよい。
【０１３０】
（反応容器）
ニトロソ化工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はないが、ガラス製、ステンレス製、ホーロー製、テフロン（登録商標）製などが好適に例示でき、ガラス製が特に好ましい。また、反応容器の形状としても、特に制限はないが、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコなどが挙げられる。
【０１３１】
上記ニトロソ化工程を経ることにより、
下記化学式５：
【０１３２】
【化１３】
0005231062.tif 000014
【０１３３】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される化合物またはその塩を得ることができる。
【０１３４】
［単離工程］
本発明においては、上記ニトロソ化工程の後、化学式５で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程を経る。つまり、本発明においては、ニトロソ化工程終了後、そのままワンポットで、一気に後述の還元工程を行わず、単離工程を必須の工程として有する点に特徴の一つを有する。
【０１３５】
上記の通り、所望の発色化合物を、高純度かつ高収率で得るために、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。そして、その予測は正しく、中間体であるニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、収率減少や目的物の純度低下の一因となっていることを見出したのである。
【０１３６】
つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）を適切な精製を行なうと、最終生成物たる化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩の収率増加や純度上昇という結果に直結するのである。
【０１３７】
具体的には、本発明の製造方法におけるニトロソ化工程によれば、化学式５で示される化合物またはその塩のみが、沈殿分離するため、容易に単離精製することができる。また、上記にて、亜硝酸塩、酸を、それぞれ化学式５で示させる化合物またはその塩に対して、ほぼ等量で添加するのも、副生成物の生成をより抑え、ひいては化学式５で示される化合物またはその塩を容易に単離精製させるために他ならない。
【０１３８】
上記の通り、ニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）を固体として単離することによって、不純物が除去され、次の還元工程が効率的に進行するため、最終的に得られるアミノ体（化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩）の純度が高くなり、また還元工程における収率も向上するのである。
【０１３９】
以下、単離工程における、ニトロソ体を単離する方法について詳説する。
【０１４０】
ニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）を単離する具体的方法としては、特に制限はないが、ニトロソ化工程終了後に得られた反応混合物を、濾過したり、遠心分離したりすることなどによって行なわれるとよい。なお、かようにして得られたものを、「ニトロソ化物固体」とも称する。
【０１４１】
この際の濾過方法や条件としては、特に制限ないが、ろ紙を用いた吸引ろ過によって行なわれる。
【０１４２】
なお、得られたニトロソ化物固体は、溶媒で洗浄することにより、さらに純度が高くなる。
【０１４３】
この洗浄に用いられうる溶媒は、特に制限はないが、有機溶媒、またはこれらの混合物が用いられる。これらのうち、ニトロソ体の安定性の観点で、有機溶媒は、アルコールが好ましい。アルコールとしても特に制限はなく、上記にて列挙した具体例が同様に妥当であるが、ニトロソ体の安定性および純度の観点で、メタノールが特に好ましい。
【０１４４】
この際、洗浄に用いるアルコールは、ニトロソ体の安定性の観点から、好ましくは−２０〜１０℃程度、より好ましくは０〜５℃程度に冷却しておくと良い。
【０１４５】
このように得られたニトロソ体（化学式５で示される化合物またはその塩）の固体は、減圧乾燥などによって乾燥することによって、さらに、保存安定性が向上する。この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜１０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１４６】
かようにして、化学式５で示される化合物またはその塩を単離することができる。
【０１４７】
［還元工程］
本発明における還元工程では、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する。
【０１４８】
かような還元工程を経ることにより、
下記化学式６：
【０１４９】
【化１４】
0005231062.tif 000015
【０１５０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１５１】
本発明の製造方法によると、後述するＲｏｕｔｅ  Ｂの合成経路と比べて無機塩（亜鉛等）を水酸化物として分離除去できるため、精製が非常に容易であり、最終生成物たる化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩の収率が有意に向上する。
【０１５２】
（亜鉛）
還元工程において、亜鉛を必須成分として用いる。ただし、亜鉛以外でも、本発明の効果を奏する範囲であれば、他の還元剤を用いてもよい。他の還元剤としては、ハイドロサルファイド塩、サルファイド塩などが挙げられる。
【０１５３】
還元工程において、亜鉛の量は、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルが好ましく、５〜１０倍モルがより好ましく、７〜８倍モルがさらに好ましい。
【０１５４】
（酸）
還元工程における還元反応は、酸の存在下において行うとよい。
【０１５５】
還元工程に用いられる酸は、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１５６】
還元工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩の量に対して、副生成物を抑える観点で、１〜３０倍モルが好ましく、５〜１５倍モルが特に好ましく、７〜９倍モルがさらに好ましい。
【０１５７】
（溶媒）
化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩の製造のために、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩と、亜鉛と、を用い、上記の通り、還元反応は、酸の存在下で行うとよいが、必要に応じ反応溶媒を用いるとよい。
【０１５８】
反応溶媒としては、特に制限はなく、上記ニトロソ化工程で説明した具体例が、同様に妥当である。
【０１５９】
これら具体例のうち、化学式５で示される化合物の安定性の観点で、アルコール単独が好ましく、中でもメタノール単独が特に好ましい。
【０１６０】
還元工程における溶媒の量は、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩１ｇに対して、反応性の観点で、２０〜１００ｍＬが好ましく、３０〜７０ｍＬがより好ましく、３０〜５０ｍＬがさらに好ましい。
【０１６１】
また、前記単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩と、亜鉛と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜鉛粉末と、酸の溶液とを、攪拌下で、単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩を溶媒に含有した溶液（本明細書中、「単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩の溶液」とも称する）に添加する方法が好ましい。
【０１６２】
より具体的には、単離工程により得られた化学式５で示される化合物またはその塩を、予め溶媒（この溶媒は、上記の通り、メタノールが特に好ましい。また、この際、この溶媒を、安定性の観点で、好ましくは−２０〜１０℃、より好ましくは−１０〜５℃に冷却しておくとよい。）に含有させておき、攪拌しながら、酸を添加し、さらに添加すべき亜鉛を一度に添加することが好ましい。「添加すべき亜鉛を一度に添加する」理由は、ニトロソ体が不安定なため早く反応を終了させるためである。この際、酸と亜鉛の添加順序にも特に制限はないが、ニトロソ体の安定性の観点で、好ましくは、亜鉛を先に添加する。
【０１６３】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１６４】
また、亜鉛、酸の溶液を添加した後、副生成物を抑える観点で、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは５〜２０分程度、より好ましくは５〜１０分程度、攪拌するとよい。また、攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは１００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは３００〜７００ｒｐｍである。
【０１６５】
（反応温度）
還元工程において設定される反応温度としては、−２０〜３５℃が好ましく、−１５〜２５℃が特に好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴、氷浴、またはドライアイス−メタノール浴等を用いればよい。
【０１６６】
（反応容器）
還元工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。
【０１６７】
また、反応容器の形状としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。かような還元工程を経ることにより、前記化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１６８】
［亜鉛除去工程］
上記還元工程終了後、亜鉛を除去することが好ましい。
【０１６９】
上記還元工程終了後、亜鉛は、固体状および／または水溶性の亜鉛の形態で残留しうる。
【０１７０】
固体状で残留している亜鉛は、濾過によって除去することが好ましく、さらに反応溶液中に残留する水溶性の亜鉛の除去を行なうとよい（亜鉛除去工程）。かような亜鉛除去工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１７１】
このような水溶性の亜鉛を除去する方法も特に制限されないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１７２】
すなわち、還元工程終了後の反応混合物を、濾過し、固体状で残留している亜鉛を除去した後、水を添加して洗浄を行う。その後、濾液と洗液をあわせ、濃縮する。そして、もとの化学式５で示される化合物の重量に対し、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、さらに好ましくは１０〜５０質量部の水を添加して、濃縮物の水溶液を準備する。そして、該濃縮物の水溶液に、アルカリ性物質を添加することにより、水酸化亜鉛の形で残留亜鉛を析出させて、濾過によって除去することができる。
【０１７３】
かようにすることで、亜鉛除去工程を経た反応混合物を得ることができる。
【０１７４】
（アルカリ性物質）
水酸化亜鉛を生成させるアルカリ性物質としては、特に制限はないが、水酸化塩が好ましく、より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【０１７５】
水酸化亜鉛を生成させるためのアルカリ性物質は、水溶液の形態（アルカリ性物質水溶液）で添加することができる。添加するアルカリ性物質水溶液の濃度は、残留する亜鉛濃度の観点から、１〜１０規定濃度が好ましく、３〜５規定濃度がさらに好ましい。
【０１７６】
なお、添加するアルカリ性物質の量は、残留亜鉛の除去と化学式６の化合物の安定性の観点から、アルカリ性物質を添加した後、ｐＨが、８．０〜１０．０になるよう設定するのが好ましく、８．５〜９．５になるよう設定するのが特に好ましい。
【０１７７】
［抽出精製工程］
上記亜鉛除去工程を経た後、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物から、さらに残留する無機塩を除くため、抽出精製工程を経ることが好ましい。かような抽出精製工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１７８】
抽出精製工程は、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態とし、溶媒で抽出する方法が用いられうる。抽出精製工程における抽出方法は、反応混合物を粉末状態として溶媒を加えて攪拌する他、一般に用いられる抽出装置を使用して行なってもよい。
【０１７９】
亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態にする方法にも特に制限はないが、例えば、減圧乾燥方法等により蒸発乾固する方法が挙げられる。
【０１８０】
この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜３０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１８１】
抽出精製工程における溶媒としては、最終目的物（化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩）を溶解できるものであれば特に制限されないが、アルコールが好ましく、より具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に使用できる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、抽出効率の観点で、エタノールが特に好ましい。
【０１８２】
本発明の製造方法によると、従来法では、５０％程度であった純度が、少なくとも８０％以上、実際には、９５％以上に向上している。この点においても、本発明は非常に優れていると言える。
【０１８３】
なお、目的物の純度は以下の方法で調べることができ、本明細書における純度の測定は以下の条件で行なっている。
【０１８４】
【表１】
0005231062.tif 000016
【０１８５】
＜Ｒｏｕｔｅ  Ｂ＞
本発明に係る製造方法により得られた中間体（上記化学式２に示される化合物）から、化学式６に示される化合物の合成は、無溶媒下で行なわれても溶媒中で行なわれてもよい。より具体的には、必要により水、有機酸、あるいは両者の混合物を溶媒として用い、塩酸、硝酸（好ましくは塩酸）等で、ｐＨ１〜５、より好ましくはｐＨ１〜２の酸性にまで調整した後、反応温度は、好ましくは−２０℃〜４０℃、より好ましくは０〜２５℃であり、反応時間は、好ましくは５秒〜４０分、より好ましくは１０秒〜１５分で、亜硝酸ナトリウムを加えて攪拌する工程（１）によって行なわれる。ここで、有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、クエン酸などが挙げられ、好ましくは酢酸である。また、亜硝酸ナトリウムの量は、特に制限されないが、通常、出発物と等モルもしくは過剰量で用いられ、好ましくは出発物の、１．０〜４．０当量、より好ましくは１．１〜１．５当量で用いられる。
【０１８６】
次に、工程（１）の後、還元剤を添加して０〜４０℃、１分〜２時間攪拌して、適当な溶媒を加えて析出させて濾過、あるいは適当な有機溶媒で抽出することによって目的の生成物（化学式６に示される化合物）が回収される。また回収された生成物は、再結晶、濾過、カラムクロマトグラフィー精製などにより、より純度の高いものが得られる場合がある。
【０１８７】
上記還元剤としては、特に制限されないが、亜鉛等の金属や、ハイドロサルファイトナトリウム等の還元性無機塩が用いられ、反応溶液は中性もしくは水酸化ナトリウムや塩酸の添加で塩基性または酸性に調整して用いられる。好ましくは、反応溶液のｐＨは、１〜１２、より好ましくは１〜５に調節される。
【０１８８】
以上のＲｏｕｔｅ  ＡまたはＲｏｕｔｅ  Ｂの合成経路により、化学式６に示される化合物（本発明に係る酸化発色化合物／塩）を合成することができる。
【０１８９】
＜本発明の第三＞
本実施形態では、本発明の製造方法により製造された中間体（化学式２に示される化合物）から上記Ｒｏｕｔｅ  Ａの合成経路またはＲｏｕｔｅ  Ｂの合成経路などから得られた酸化発色化合物またはその塩、つまり、化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩（本明細書中、「本発明の酸化発色化合物／塩」とも称する）の特に好ましい用途・使用に関する実施形態を説明する。
【０１９０】
本発明の酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つである、酵素を用いた比色分析法に好適に使用される。特に２分子で機能する酸化型発色試薬のうちのカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明の酸化発色化合物／塩は、例えば、前記背景技術の項で記載したトリンダー試薬と共に用いられ、被測定物質の酵素的酸化で生じる過酸化酸素をさらにＰＯＤ酸化して生成した活性酸素によって、２分子が酸化縮合することによって呈色する。
【０１９１】
すなわち、本発明の第三は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む試薬組成物（本明細書中、「本発明の試薬組成物」とも称する）である。
【０１９２】
つまり、本発明の酸化発色化合物／塩は、カプラーとして使用することが特に好ましく、それ以外については従来公知の知見が適宜参照され、特に限定されるものではない。
【０１９３】
本発明に係わる酸化発色化合物／塩は、前述の酵素、トリンダー試薬と組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられる。これら組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等を含んでいてもよい。ドライケミストリーで用いられる試験用具のように担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬を含む層の他、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。また、液体で用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作成した検量線を用いて測定目的物の量に換算することができる。
【０１９４】
（トリンダー試薬）
トリンダー試薬としては、特に制限はなく、従来公知の化合物がいずれも好ましく用いられうる。ただ、中でも中でもＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが、発色強度や波長といった観点で、特に好ましい。
【０１９５】
（測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ）
「測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ」としては、例えば、測定対象物がグルコースである場合、該オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、測定対象物がコレステロールである場合、該オキシダーゼはコレステロールオキシダーゼであり、測定対象物が尿酸である場合、該オキシダーゼはウリカーゼであり、測定対象物がピルビン酸である場合、該オキシダーゼはピルベートオキシダーゼである。これらは測定対象物の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０１９６】
本発明に係る試薬組成物において、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比は、１：１〜２：１であることが好ましく、１．３：１がより好ましい。本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が１：１未満である場合、また、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が２：１を超える場合、発色不良を生じることがある。
【０１９７】
本発明に係る試薬組成物中の、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して、４３３ｋ〜２６００ｋＵであることが好ましく、８６６ｋ〜２６００ｋＵであることがより好ましい。測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して４３３ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、４ＡＡ−ＴＯＯＳ法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１９８】
本発明に係る試薬組成物中のペルオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋ〜１６６６ｋＵであることが好ましく、３３３ｋ〜９９９ｋＵであることがより好ましい。ペルオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記ペルオキシダーゼの含有量は、ピロガロール法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１９９】
本発明に係る試薬組成物は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む。すなわち、「本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ」以外の他の成分を、試薬組成物としての機能を害さない程度含んでいてもよい。該成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等が挙げられる。
【０２００】
なお、これら他の成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総質量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２０１】
本発明に係る酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種である、酵素を用いた比色分析法に好適に使用されるカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と共に用いられ、測定対象物の酵素的酸化で生じる過酸化酸素を、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）酸化して生成した活性酸素によって、本発明に係る酸化発色化合物／塩を含むカプラーと、トリンダー試薬と、が酸化縮合することによって呈色する。そのため本発明の酸化発色化合物／塩は、上記の通り、その化合物自体に特徴を有するものであるが、カプラーとして使用することが特に好ましい。
【０２０２】
上述の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物（本明細書中、「本発明に係る試薬組成物」とも称する）や、該試薬組成物を担体に保持して試験具として使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる点、非常に優れたものである。また、本発明に係る試薬組成物を用いた呈色反応（比色分析法）において、それによって生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなり、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。加えて、本発明の酸化発色化合物／塩は親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２０３】
また、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高め、試験具として使用した場合でも、担体内での化合物の安定性を向上させる。このように本発明に係る試薬組成物を提供することにより、ひいては、経時劣化を低減させ有効期間が延びた試験具を提供することが可能となる。
【０２０４】
＜本発明の第四＞
上記本発明の第三の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、トリンダー試薬と、を組み合わせて、本発明に係る試薬組成物となる。
【０２０５】
本発明の酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられうる。
【０２０６】
これら分析用組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等の成分を含んでいてもよい。
【０２０７】
なお、これら成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明に係る酸化発色化合物またはこれらの塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総重量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２０８】
また、液体に保持して用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。また、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いてもよい。
【０２０９】
このように、本発明に係る試薬組成物は、種々の物に保持して用いることができるが、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いることが好ましい。
【０２１０】
よって、本発明の第四は、本発明に係る試薬組成物が、担体に保持されてなる試験具である。
【０２１１】
かようなドライケミストリーで用いられる試験用具のように、担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬組成物を含む層の他、これの機能を害さない範囲において、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。このように担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作製した検量線を用いて測定対象物の量に換算することができる。
【０２１２】
（担体）
本発明に係る担体の素材としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質を用いることができるが、特に、発色性能といった点で、高分子膜が好ましい。
【０２１３】
上記高分子膜とは、高分子よりなる水不溶性の多孔質体である。高分子としては、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。これらの高分子は一般的に知られている製膜方法を用いて膜を形成することができる。これらの高分子膜の中でもポリスルフォンまたはポリエーテルスルフォンが、発色性能といった点で、特に好ましい。
【０２１４】
（担体に保持する方法）
本発明に係る試薬組成物を担体に保持する方法にも特に制限はないが、担体に適当な溶剤に溶解させた試薬組成物溶液を担体にコーティングする他、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる等の公知の方法が用いられうる。
【０２１５】
コーティングは、工業用に使用される一般的なコート法を用いることができるが、担体が多孔質の場合には、しばしば塗工直後の液移動や不均一な乾燥に起因するコートむらが問題となる。担体と塗工液の物性や、塗工乾燥の方法、機器、条件がこれらを支配する重要因子となりうる。このため、精密印刷法が有効な場合もある。
【０２１６】
塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減する為には、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作製できることが必須となる。
【０２１７】
例えば、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作製するときの問題点となっていた。しかしながら、本発明の化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作製するに好都合である。
【０２１８】
試薬を担体に保持させた試験具では、検体付与後、検体の液体成分によってまず試薬が溶解し、混合して反応が起こり、色素化合物が生成し、通常試験具の検体付与面の反対側にある読み取り面に移動し、その色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけではなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースかつ均一性が高いというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。したがって、本発明の酸化発色化合物／塩は高い溶解性を有するため、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与できることが期待される。
【０２１９】
例えば、従来公知のカプラーである４−アミノアンチピリンを担体に保持させた試験具として使用した場合、経時的に劣化減少し測定値が上昇するという問題が生じる。減少による測定値上昇の原因としては、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。しかしながら、本発明の化合物は４−アミノアンチピリンと比較して量が増減しても測定値への影響が少なく、４−アミノアンチピリンでみられた問題を改善できた。
【０２２０】
４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、ある担体に保持させた試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題点がある。バルク担体にコートする際むらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合測定値に影響が出るということを示唆している。原因は、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく、化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。これに対して、本発明の酸化発色化合物／塩は４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響が少なく、これらの問題を改善できる。
【０２２１】
本発明の製造方法により得られる中間体から合成された化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩は、トリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させた場合には、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーを用いた場合と比較して吸光度が大きくなり、測定感度が向上することができる。例えば、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン、４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン等は、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）と組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは改善され、測定感度が向上されうる。
【０２２２】
上述の通り、本発明の製造方法により得られる化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物を担体に保持しなる試験具（以下、単に、「本発明に係る試験具」とも称する）を使用する場合、本発明に係る試薬組成物は、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こるため、本発明に係る試験具は、非常に優れたものとして使用されうる。
【０２２３】
また、本発明に係る試験具を用いた場合、本発明に係る試薬組成物の呈色反応において生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。
【０２２４】
本願発明の製造方法により製造された化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。以上、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。すなわち、本発明に係る試験具を用いると、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明の酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０２２５】
加えて、本発明の製造方法により得られる化学式６で示される酸化発色化合物またはその塩は、親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２２６】
また、本発明の酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高める。すなわち、本発明に係る試験具は、担体内での化合物の安定性を向上されている。
【０２２７】
このように本発明に係る試験具は、従来に比べ、経時劣化を低減させ有効期間が有意に延びたものといえる。
【実施例】
【０２２８】
次に実施例によって本発明を説明する。本発明の化合物は以下の実施例の製法で合成される。
【０２２９】
＜実施例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１Ｌナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００  ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２３０】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０  ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１７４ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１１９ｇを得た（収率：５６％）。純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２３１】
【表２】
0005231062.tif 000017
【０２３２】
＜比較例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（高圧法）
６．７５ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製  １３４１６３）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製  ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製  Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ラインに接続して室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。茶色の沈殿が生成することを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上放置した後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．５ｇを得た（収率：２１％）。所要時間３日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２３３】
【表３】
0005231062.tif 000018
【０２３４】
＜実施例２＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（Ｒｏｕｔｅ  Ａの合成経路）
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１１ｍＬを加え、１０分程度攪拌した。
【０２３５】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。
【０２３６】
その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成）２５ｇを得た。なお、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンに対する収率は、７５％であった。
【０２３７】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１３４ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２３８】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１５６ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１００ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１０８ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続けた。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行った。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２３９】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．７ｇを得た。なお、４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン対する収率は、９０％であった。
【０２４０】
２工程の収率は６８％（（１）×（２）＝６８％）であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２４１】
【表４】
0005231062.tif 000019
【０２４２】
＜実施例３＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（Ｒｏｕｔｅ  Ｂの合成経路）
実施例１で得られた１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン  ０．５ｇを０．４Ｎ塩酸１０ｍＬに溶解し、氷冷下４０％亜硝酸ナトリウム水溶液０．３５ｍＬを加えて１分間攪拌し、亜鉛末５００ｍｇを加え、さらに室温で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、目的物０．４１ｇを得た。収率は３６％、純度は５０％（ＨＰＬＣ測定により）であった。
【０２４３】
【表５】
0005231062.tif 000020
【０２４４】
＜実施例４＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１０００ｍＬナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００  ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら固形物を溶解した。溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２４５】
反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過を行ない濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０  ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１８０ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１２５ｇを得た（収率：６０％）。所要時間２日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ測定により）。
【０２４６】
【表６】
0005231062.tif 000021
【０２４７】
以上のことから、比較例に比べて本発明の製造方法で製造された実施例１または実施例４では、同規模の反応装置ではるかに仕込み量が大きく出来ることにより効率化された。また、所要時間は１日、収率は３８％程度向上している。
【０２４８】
＜比較例２＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
６．７５ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製  ５５６８９０）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製  ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製  Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。
【０２４９】
反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で、乾固するまで減圧濃縮を行なった。さらに、真空ラインに接続して、室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え、１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。これに、すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。ここで、茶色の沈殿が生成したことを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上（一昼夜）放置した。
【０２５０】
放置後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．４ｇを得た（収率：２０％）。なお、純度は９５％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２５１】
【表７】
0005231062.tif 000022
【０２５２】
＜実施例５＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（Ｒｏｕｔｅ  Ａの合成経路）
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例４で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を、乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１０ｍＬを加え、１０分攪拌した。
【０２５３】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下する。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。目的物２５ｇを得た（収率７５％）。
【０２５４】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２５５】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１６０ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続ける。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行なった。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２５６】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。
【０２５７】
水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。
【０２５８】
ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。
【０２５９】
ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。
【０２６０】
塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．６ｇを得た（収率８７％）。
【０２６１】
２工程（「ニトロソ化工程」および「還元工程」の２工程）の収率は６５％であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２６２】
【表８】
0005231062.tif 000023
【０２６３】
＜実施例６＞
試験片による性能評価
０．１３Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に、実施例２で合成した４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン  ０．４６ｇ  、  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン  ０．９５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ３．０ｇ、グルコースオキシダーゼ  １５０Ｋ  ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ  ２５０Ｋ  ｕｎｉｔを溶解して塗工液を作成した。ポリエーテルスルフォン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）に塗工液を塗布し、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、試験片を得た。試験片を反射分光光度計検出部に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。ヘマトクリット値４０、種々のグルコース濃度の血液で測定した値から検量線を作成し、定量感度を観察した。（図２）反射吸光度値はそれぞれの試験片に対して最高となる時間の値を用いた。図２中、ｘ軸に反射吸光度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。
図２から示されるように、本発明の製造方法により合成した中間体を用いて合成された４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを用いた試験片の検量線の傾きは、従来から広く使用されている４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いた場合より改善され、測定感度を有意に向上させることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】本発明の酸化発色化合物／塩の合成経路
【図２】実施例３における、本発明の酸化発色化合物／塩および４−アミノアンチピリンの反射吸光度値の時間変化を表した図である。
【図１】
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【図２】
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