(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）から以下の（ａ）または（ｂ）
（ａ）配列表の配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載の塩基配列からな
るＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、これを微生物に組み込んだと
きに菌体表面に莢膜が発現するＤＮＡ
であるラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を検出することを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法。
【請求項２】
莢膜合成遺伝子群の検出を、配列表の配列番号２および配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いて莢膜合成遺伝子群の塩基配列を増幅させることにより行う請求項１記載の病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法を用いて、飲食品に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエを検出することを特徴とする飲食品の安全性確認方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法を用いて、魚類に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエを検出することを特徴とする魚類のα連鎖球菌症診断方法。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）からなることを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群。
（ａ）配列表の配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載の塩基配列からな
るＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、これを微生物に組み込んだと
きに菌体表面に莢膜が発現するＤＮＡ
【請求項６】
請求項５記載の病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項８】
配列表の配列番号２および配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマー。
【請求項９】
請求項８記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出キット。
【請求項１０】
請求項８記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とする飲食品に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエ検出用の飲食品の安全性確認キット。
【請求項１１】
請求項８記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とする魚類に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエ検出用の魚類のα連鎖球菌症診断キット。
【請求項１２】
請求項５記載の病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を機能しないようにしたことを特徴とする変異ラクトコッカス・ガルビエ。
【請求項１３】
ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）から以下の（ａ）または（ｂ）
（ａ）配列表の配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載の塩基配列からな
るＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、これを微生物に組み込んだと
きに菌体表面に莢膜が発現するＤＮＡ
であるラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を検出することを特徴とするラクトコッカス・ガルビエの病原性判断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は菌体表面に莢膜を発現することにより病原性を有するラクトコッカス・ガルビエの検出方法、前記検出方法に用いられるプライマー等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）は、魚類にα連鎖球菌症を引き起こす原因菌の一つとして知られている。本菌種の病原性は、菌体表面に存在する莢膜に依存し、宿主のマクロファージによって貪食（殺菌）されないために、全身性の敗血症を誘発すると報告されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
一方で、ラクトコッカス・ガルビエの中には、エクオール産生菌として有用視されている菌株もある。その場合、ヒトの消化管または食品から分離されたこと、および視覚で莢膜の無いこと確認し、安全性を推定している（非特許文献４〜５）。
【０００４】
しかしながら、ヒト消化管および食品からの分離は、一過性に存在する細菌を分離したかもしれず、安全性を完全に証明する理由にはならない。すなわち、必ずしもすべての生物種（特に魚類）に対して安全である保障はないし、また、視覚による莢膜の確認は曖昧なものである。
【非特許文献１】Yoshida T, Eshima T, Wada Y, Yamada Y,Kakizaki E, Sakai M, Kitao T, and Inglis V. 1996. Phenotypic variationassociated with an anti-phagocytic factor in the bacterial fish pathogen Enterococcusseriolicida. Dis Aquat Org, 25: 81-86.
【非特許文献２】Yoshida T, Endo M, Sakai M, Inglis V.1997. A cell capsule with possible involvement in resistance toopsonophagocytosis in Enterococcus seriolicida isolated from yellowtail Seriolaquinqueradiata. Dis Aquat Org, 29: 233-235.
【非特許文献３】Hirono I, Yamashita H, Park C, YoshidaT, Aoki T. 1999. Identification of genes in a KG- phenotype of Lactococcusgarvieae, a fish pathogenic bacterium, whose proteins react with anti-KG-rabbit serum. Microb Pathog, 27: 407-417.
【非特許文献４】内山成人、上野友美および鈴木淑水、２００７年、新規エクオール産生乳酸菌のヒト糞便からの単離・同定、腸内細菌学雑誌、２１：２１７−２２０
【非特許文献５】内山成人、木村弘之、上野友美、鈴木淑水、只野健太郎および石見佳子、２００７年、Lactococcus garvieaeの食品中からの検出およびヒト腸内常在性、腸内細菌学雑誌、２１：２２１−２２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明はラクトコッカス・ガルビエの病原性を、その分離源や視覚による曖昧な基準ではなく、遺伝子レベルで明確に判断する手段を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、病原性を有するラクトコッカス・ガルビエから莢膜の発現にかかわる莢膜合成遺伝子群を見出した。すなわち、病原性を有するラクトコッカス・ガルビエ Ｌｇ２株の全ゲノム配列１,９６３,９６４ｂｐと、病原性の無いラクトコッカス・ガルビエ ＡＴＣＣ  ４９１５６Ｔ株の全ゲノム配列１,９５０,１３５ｂｐを決定し、その比較ゲノム解析から、この莢膜合成遺伝子群を検出することによりラクトコッカス・ガルビエの安全性が判断できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明はラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）の莢膜合成遺伝子群を検出することを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法である。
【０００８】
また、本発明は飲食品に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を検出することを特徴とする食品検査方法である。
【０００９】
更に、本発明は魚類に含まれる病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を検出することを特徴とする魚類のα連鎖球菌症診断方法である。
【００１０】
また更に、本発明は以下の（ａ）または（ｂ）からなることを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群である。
（ａ）配列表の配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載の塩基配列からな
るＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、これを微生物に組み込んだときに菌体表面に莢膜が発現するＤＮＡ
【００１１】
更にまた、本発明は上記病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群の塩基配列に相補な配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび前記プライマーを含むことを特徴とする病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出キット、食品検査キットならびに魚類のα連鎖球菌症診断キットである。
【００１２】
また、本発明は病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を機能しないようにしたことを特徴とする変異ラクトコッカス・ガルビエである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、病原性を有するラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群のＤＮＡ配列を明らかにした。そしてこの配列を基にプライマー等を作製し、これを利用することによりラクトコッカス・ガルビエが病原性を有するか否かを遺伝子レベルで明確に判断することができた。
【００１４】
また、本発明によれば、上記の莢膜合成遺伝子群を、例えば、飲食品中から検出することにより飲食品の安全性確認検査が行うことができ、莢膜合成遺伝子群を魚類、特にブリ属魚類から検出することによりα連鎖球菌症の診断に用いることができる。また、ラクトコッカス・ガルビエは、ブロッコリスプラウトやカイワレダイコン等生鮮野菜からの分離例もあるので、莢膜合成遺伝子群の検出により、これら野菜の流通時の汚染防止はもちろん、生食の際の安全性を診断することもできる。
【００１５】
更に、病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群は、その前後にtransposase（truncatedのものも含む）を有するため病原島（genomic island）と考えられ、それらのため莢膜合成遺伝子群は水平伝播する可能性がある。これにより、現在、安全だと考えられているラクトコッカス・ガルビエを含めた全ての微生物に病原性が発現する可能性もある。そのため、微生物を飲食品、医薬品、添加物等に使用する際に、これらの原料に予め莢膜合成遺伝子群があるかどうかを確認しておきことにより、微生物を飲食品、医薬品、添加物等の安全性を裏付けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出方法は、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）の莢膜合成遺伝子群を遺伝子レベルで検出するものである。なお、本明細書において、病原性ラクトコッカス・ガルビエとは、菌体表面に莢膜を有し、これをブリ属魚類に投与した場合に、α連鎖球菌症を発症するものをいう。病原性ラクトコッカス・ガルビエの投与方法は特に限定されず、例えば、ブリ属魚類の腹腔内に、１０の４乗程度の菌数で摂取させる方法が挙げられる。
【００１７】
この莢膜合成遺伝子群は、病原性ラクトコッカス・ガルビエから得られるものであり、具体的には、α連鎖球菌症を発症したブリ属魚類から分離された病原性ラクトコッカス・ガルビエから見出されるものである。α連鎖球菌症を発症したブリ属魚類の身を磨り潰し、生理食塩水で適当な段階希釈の後、Ｔｏｄｄ−Ｔｅｗｉｔｔ寒天培地（ＢＤ社製）に塗抹後、３７℃で培養して得られるコロニーを得る。その後は、次の性状を有し、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列が、ラクトコッカス・ガルビエの１６Ｓ ｒＤＮＡ（配列表の配列番号１４）と９８％以上の相同性があるものを病原性ラクトコッカス・ガルビエとして選抜する。
【００１８】
＜菌の性状＞
菌の形態：球菌
生育性試験：１０℃と４５℃で生育する。
６.５％塩化ナトリウム含有培地で生育する。
【００１９】
上記のようにしてよりα連鎖球菌症を発症したブリ属魚類から分離されたラクトコッカス・ガルビエの一例として、ラクトコッカス・ガルビエＬｇ２株が挙げられ、これから莢膜合成遺伝子群が得られた。これには以下の１５個の遺伝子が含まれる。これら１５個の遺伝子を含む莢膜合成遺伝子群の具体的な塩基配列は配列表の配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載されている。なお、この配列の前後にはtransposase（truncatedのものも含む）があった。
【００２０】
（１）transcription regulator(EpsR)
配列番号１の4,185番目〜4,502番目
（２）conserved hypothetical protein(EpsX)
配列番号１の4,536番目〜5,285番目
（３）chain length determinant protein(EpsA)
配列番号１の5,343番目〜6,092番目
（４）kinase(EpsB)
配列番号１の6,132番目〜6,827番目
（５）phosphatase(EpsC)
配列番号１の6,882番目〜7,631番目
（６）sugar transferase(EpsD)
配列番号１の7,668番目〜8,354番目
（７）rhamnosyltransferase
配列番号１の8,358番目〜9,509番目
（８）glycosyltransferase
配列番号１の9,512番目〜10,822番目
（９）acetyltransferase 
配列番号１の10,816番目〜11,495番目
（１０）glycosyltransferase
配列番号１の11,492番目〜12,607番目
（１１）putative oligosaccharide repeating unit polymerase
配列番号１の12,672番目〜13,793番目
（１２）flippase
配列番号１の13,786番目〜15,221番目
（１３）UDP-glucose 6-dehydrogenase 
配列番号１の15,219番目〜16,385番目
（１４）conserved hypothetical protein(EpsL)
配列番号１の16,407番目〜17,309番目
（１５）conserved hypothetical protein
配列番号１の17,333番目〜18,236番目（アンチセンスで塩基配列は存在）
【００２１】
なお、本発明において莢膜合成遺伝子群とは、前記ＤＮＡだけでなく、これと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、これを微生物、好ましくはグラム陽性菌、より好ましくはグラム陽性菌であってラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ガルビエ等のラクトコッカス属の微生物やラクトバチルス（Lactobacillus）属の微生物、特に好ましくはラクトコッカス・ガルビエに組み込んだときに菌体表面に莢膜が発現するＤＮＡについてもいう。ここでストリンジェントな条件としては、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載された条件等が挙げられる。具体的には、０.５質量％（以下、単に「％」という）のＳＤＳ、０.１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.１％のポリビニルピロリドン、０.１％のフィコール４００、０.０１％の変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０.１５Ｍの塩化ナトリウム、０.０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０を示す）中、５０℃でのインキュベートする条件が例示される。また、上記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、４×ＳＳＣ等の条件および／またはより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃以下、より好ましくは２２℃以下、さらに好ましくは２０℃以下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、５２℃以上、５５℃以上、５８℃以上、６０℃以上、６２℃以上、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションや、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０.５×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃以下、より好ましくは、３０℃以下、さらに好ましくは２５℃以下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行なうことにより、配列番号１の４,１８５番目〜１８,２３６番目に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するものを得ることが可能になる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式により求められる。
［数１］
Ｔｍ＝８１.５−１６.６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である）
【００２２】
上記莢膜合成遺伝子群を検出するには、検体から遺伝子を検出するための常法に従って行えば良く、その方法は特に制限されないが、例えば、莢膜合成遺伝子群の塩基配列に相補な配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いて莢膜合成遺伝子群の塩基配列を増幅させることにより行う方法（ＰＣＲ法）や、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これに莢膜合成遺伝子群の塩基配列に相補な配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイゼーションを行う方法（プローブ法）等や挙げられる。
【００２３】
上記ＰＣＲ法に用いられるプライマーとしては、例えば、上記莢膜合成遺伝子群の塩基配列に相補な配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドからなるもの、好ましくは莢膜合成遺伝子群の塩基配列に相補な配列の両端から１０〜３５塩基程度のオリゴヌクレオチドからなるプライマーや、更に、前記プライマーに莢膜合成遺伝子群の内部の塩基配列に相補な配列の１０〜３５塩基程度のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを追加したものが挙げられる。もし、検体中に莢膜合成遺伝子群が無い場合は、両端どうしのプライマーでは、１９ｋｂより短い断片が増幅され、莢膜合成遺伝子群内部の配列とその両端とのＰＣＲでは、増幅断片が得られない。
【００２４】
上記の具体的なプライマーとしては配列表の配列番号２および配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドからなる以下のものが挙げられる。
【００２５】
ｃａｐｓｕｌｅ−Ｆ：５'−ＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧ−３'
ｃａｐｓｕｌｅ−Ｒ：５'−ＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡ−３'
【００２６】
なお、本発明においては上記プライマーの他にもNational Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のウェブサイトで種々の細菌の莢膜合成遺伝子群の検索することにより得られる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーも用いることができる。
【００２７】
＜検索条件＞
プライマー最大長：３５
プライマーの最小長：１０
Ｔｍ最大値（℃）：６５
Ｔｍ最小値（℃）：５５
ＧＣ含量（％）の最大値：５５
ＧＣ含量（％）の最小値：４５
回帰文を避ける：５
ＧＣの連続を避ける：５
同一の塩基の並びを避ける：７
【００２８】
具体的に、上記のようにして得られたプライマーを用いてラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群をＰＣＲ法で検出するには、ｄＮＴＰが４００μＭ、上記プライマーが各０.５μＭ、塩化マグネシウムが２.５ｍＭ、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）が０.０５ｕｎｉｔｓ、マグネシウムイオンを含まない１０×ＬＡ ＰＣＲ反応緩衝液、鋳型ＤＮＡを約１ｎｇ、蒸留水を２９.５μｌ加え、全量を５０μｌとしたものを試料とし、これをｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、初期変性を６８℃で３分間、熱変性を９５℃で３０秒、アニーリングを６２℃で３０秒、伸長反応を６８℃で５分、のセットで３０サイクル増幅させ、最後に終伸長反応を７２℃で１０分とする反応条件で行えばよい。鋳型ＤＮＡは、菌体からゲノムＤＮＡ精製したもの、もしくはコロニーＰＣＲで行なってもよく寒天培地のコロニーを直接、鋳型ＤＮＡとして用いても良い。莢膜合成遺伝子群の塩基配列を増幅させ、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法で塩基長を見積もり、更に、ＤＮＡシークエンサーで配列を決定し、予想された配列かどうかを確認する。そして、本明細書に示した莢膜合成遺伝子群のＤＮＡ配列と相同性の高い配列（前記ＤＮＡ配列をアミノ酸配列に直して４０％以上、好ましくは５０以上％、より好ましくは６０％以上の相同性）であれば、ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群があると判断する。
【００２９】
上記のようにしてラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を検出することができる。そしてラクトコッカス・ガルビエから莢膜合成遺伝子群が検出されれば、このラクトコッカス・ガルビエは病原性を有するものと判断することができる。
【００３０】
また、この病原性ラクトコッカス・ガルビエは、ヒト等の疾患との関連は定かではないが、例えば、チーズ等の乳製品等の飲食品中やブロッコリスプラウトやカイワレダイコン等の生鮮食品のすべてから、この検出法で試験すれば、飲食品の安全性確認検査が行うことができる。また、病原性ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群は、莢膜合成遺伝子群が水平伝播する可能性がある。これにより、現在、安全だと考えられているラクトコッカス・ガルビエを含めた全ての微生物に病原性が発現する可能性もある。そのため、微生物を飲食品、医薬品、添加物等に使用する際に、これらの原料に予め莢膜合成遺伝子群があるかどうかを確認しておきことにより、微生物を飲食品、医薬品、添加物等の安全性を裏付けることができる。
【００３１】
更に、この病原性ラクトコッカス・ガルビエは、魚類、特にブリ属魚類のα連鎖球菌症と関連があるので、ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群を魚類、特にブリ属魚類の生体から検出することによりα連鎖球菌症の診断を行うことができる。
【００３２】
更にまた、魚類、特にブリ属魚類を含む飲食品については、ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群が検出された場合には、α連鎖球菌症にかかっていた魚類を原料として生産していたと判断することができる。
【００３３】
上記した病原性ラクトコッカス・ガルビエの検出、飲食品の安全性確認検査および魚類のα連鎖球菌症の診断には、上記のプライマー、好ましくは配列表の配列番号２および配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドからなるｃａｐｓｕｌｅ−Ｆおよびｃａｐｓｕｌａ−Ｒのプライマーを含むキットを利用することが好ましい。上記キットに含まれるものとしては、プライマーの他にポリメラーゼ等、一般にＰＣＲに必要な試薬等が挙げられる。
【００３４】
上記のようにして病原性を有すると判断されたラクトコッカス・ガルビエであっても、これの莢膜合成遺伝子群を機能しないようにして変異ラクトコッカス・ガルビエとすれば、病原性を無くすことができる。莢膜合成遺伝子群を機能しないようにする方法としては、特に制限はないが、例えば、今回の莢膜合成遺伝子群配列の中に薬剤耐性能遺伝子を組み込み、２回の相同組み換えによる遺伝子破壊法、あるいはニトロソグアニジン等の突然変異剤を用いた変異誘発法等の方法が挙げられる。
【００３５】
上記のようにして得られる変異ラクトコッカス・ガルビエであれば、病原性を発現することがないので、これを飲食品、医薬品、添加物等に安全に使用することもできる。
【００３６】
また、上記莢膜合成遺伝子群は常法に従い組換えベクターに組み込むことができる。組換えベクターとしては、微生物で発現するベクターなら特に制限されず、例えば、ｐＵＣ１８系やｐＩＬ２５３等が挙げられる。また、この組換えベクターを用いて形質転換される微生物としてはグラム陰性菌と陽性菌のすべて、好ましくはグラム陽性菌、より好ましくはグラム陽性菌であってラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ガルビエ等のラクトコッカス属の微生物やラクトバチルス（Lactobacillus）属の微生物、特に好ましくはラクトコッカス・ガルビエである。
【００３７】
このようにして莢膜合成遺伝子群で形質転換された微生物は、莢膜と病原性の関連を研究する目的や莢膜以外の病原因子の解明に利用できる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００３９】
実  施  例  １
莢膜合成遺伝子群の分離：
α連鎖球菌症を発症したブリ属魚類の身を磨り潰し、生理食塩水で適当な段階希釈の後、Ｔｏｄｄ−Ｔｅｗｉｔｔ寒天培地（ＢＤ社製）に塗抹後、３７℃で培養して得られるコロニーを得た。そのコロニーから、菌の形態（球菌）および生育性試験（１０℃と４５℃で生育する。６.５％塩化ナトリウム含有培地で生育する。）で選抜したものの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を決定した。そして１６Ｓ ｒＤＮＡ配列が、ラクトコッカス・ガルビエの１６Ｓ ｒＤＮＡ（配列表の配列番号１４）と９８％以上の相同性があるものをラクトコッカス・ガルビエＬｇ２株（以下、単に「Ｌｇ２株」という）として得た。なお、このＬｇ２株は単離された後もブリ属魚類に病原性を発現した。一方、ブリ属魚類に病原性を有するものとして単離されていたＡＴＣＣ ４９１５６株（以下、単に「ＡＴＣＣ株」という）は、継代培養により、現在はブリ属魚類にまったく病原性を発現しなくなった菌株である（M. Kawanishi, et al., J.Appl. Microbiol., 101: 496-504, 2006、以下、「参考文献１」という）。
【００４０】
上記Ｌｇ２株とＡＴＣＣ株の全ゲノム解析を行って比較したところ、両者のゲノム配列の違いは約１９ｋｂの領域だけであった（図１）。Ｌｇ２株が病原性を有することおよびＡＴＣＣ株が病原性を有さないことから、この約１９ｋｂの領域が莢膜合成遺伝子群であると推測された。この約１９ｋｂの領域には莢膜合成に関連する１５の遺伝子がコードされていた（図２）。この領域と周辺の塩基配列は配列表の配列番号１に記載のとおりであり、このうち４,１８５番目〜１８,２３６番目が莢膜合成遺伝子群である。
【００４１】
＜莢膜合成遺伝子群＞
（１）transcription regulator(EpsR)
配列番号１の4,185番目〜4,502番目
（２）conserved hypothetical protein(EpsX)
配列番号１の4,536番目〜5,285番目
（３）chain length determinant protein(EpsA)
配列番号１の5,343番目〜6,092番目
（４）kinase(EpsB)
配列番号１の6,132番目〜6,827番目
（５）phosphatase(EpsC)
配列番号１の6,882番目〜7,631番目
（６）sugar transferase(EpsD)
配列番号１の7,668番目〜8,354番目
（７）rhamnosyltransferase
配列番号１の8,358番目〜9,509番目
（８）glycosyltransferase
配列番号１の9,512番目〜10,822番目
（９）acetyltransferase 
配列番号１の10,816番目〜11,495番目
（１０）glycosyltransferase
配列番号１の11,492番目〜12,607番目
（１１）putative oligosaccharide repeating unit polymerase
配列番号１の12,672番目〜13,793番目
（１２）flippase
配列番号１の13,786番目〜15,221番目
（１３）UDP-glucose 6-dehydrogenase 
配列番号１の15,219番目〜16,385番目
（１４）conserved hypothetical protein(EpsL)
配列番号１の16,407番目〜17,309番目
（１５）conserved hypothetical protein
配列番号１の17,333番目〜18,236番目（アンチセンスで塩基配列は存在）
【００４２】
上記配列をもとに、図２に示した位置の塩基配列（莢膜合成遺伝子群とその周辺の塩基配列を含む）から、下記のｃａｐｓｕｌｅ−Ｆおよびｃａｐｓｕｌａ−Ｒプライマー（配列表の配列番号２〜３）を作製した。これを用いてＬｇ２株とＡＴＣＣ株の莢膜合成遺伝子群領域の増幅をＰＣＲにより行った。
【００４３】
ｃａｐｓｕｌｅ−Ｆ：５'−ＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧ−３'
ｃａｐｓｕｌｅ−Ｒ：５'−ＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡ−３'
【００４４】
ＰＣＲは、ｄＮＴＰが４００μＭ、上記プライマーが各０.５μＭ、塩化マグネシウムが２.５ｍＭ、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）が０.０５ｕｎｉｔｓ、マグネシウムイオンを含まない１０×ＬＡ ＰＣＲ反応緩衝液、鋳型ＤＮＡを約１ｎｇ、蒸留水を２９.５μｌ加え、全量を５０μｌとしたものを試料とし、これをｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、初期変性を６８℃で３分間、熱変性を９５℃で３０秒、アニーリングを６２℃で３０秒、伸長反応を６８℃で５分、のセットで３０サイクル増幅させ、最後に終伸長反応を７２℃で１０分とする反応条件で行った。
【００４５】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動して塩基数を推定した結果、推定される塩基配列どおり、Ｌｇ２株では約１９ｋｂ、ＡＴＣＣ株では約１ｋｂであった（図３）。そのＰＣＲ産物の塩基配列を決定した結果、Ｌｇ２株では莢膜合成遺伝子群とその周辺の塩基配列が確認され、ＡＴＣＣ株では莢膜合成遺伝子群が抜け落ちた状態のその周辺のみの塩基配列が増幅されていた。
【００４６】
実  施  例  ２
莢膜合成遺伝子群の検出：
市販のブロッコリスプラウトとカイワレダイコンからラクトコッカス・ガルビエが分離され、それらを東京農業大学応用生物科学部菌株保存室（ＮＲＩＣ）にそれぞれＮＲＩＣ０６０７およびＮＲＩＣ０６１１として寄託されている。これら野菜からラクトコッカス・ガルビエ分離されることは特別なことではなく、ラクトコッカス・ガルビエは新鮮な野菜に常在し、それをヒトが普通に生食していると示唆される。カワニシらは、公衆衛生の観点から、これらの菌株が莢膜をもたないことを、抗ＫＧ（−）ウサギ抗血清と抗ＫＧ（＋）ウサギ抗血清による凝集反応によって証明している（M. Kawanishi, et al., L. Appl. Microbiol., 2007, 44:481-487（以下「参考文献２」という））。ＫＧ（−）抗体は、鹿児島県沖で分離されたラクトコッカス・ガルビエ ＫＧ９５０２株の生菌でウサギを免疫した際に得られた抗体で、ラクトコッカス・ガルビエの莢膜を認識する。一方、ＫＧ（＋）抗体は、継代によってＫＧ９５０２株から莢膜をもたない変異株ＮＳＳ９３１０株を分離し、その株の生菌でウサギを免疫した際に得られた抗体で、莢膜のないラクトコッカス・ガルビエに対して反応する（非特許文献３）。すなわち、莢膜が存在し、病原性があるラクトコッカス・ガルビエは必ず血清型が抗ＫＧ（−）であり、莢膜が存在せず病原性のないラクトコッカス・ガルビエは必ず血清型が抗ＫＧ（＋）である（上記非特許文献３）。実施例１で得られたブリ属魚類に病原性のあるＬｇ２株は血清型が抗ＫＧ（−）であった。一方、病原性のないＡＴＣＣ株は抗ＫＧ（＋）であった（参考文献１参照）。同じ手法で、ラクトコッカス・ガルビエ ＮＲＩＣ０６０７とラクトコッカス・ガルビエ ＮＲＩＣ０６１１を評価したところ、両者とも病原性を示さない抗ＫＧ（＋）の血清型を示している（参考文献２参照）。
【００４７】
上記ラクトコッカス・ガルビエ ＮＲＩＣ０６０７とラクトコッカス・ガルビエＮＲＩＣ  ０６１１のゲノムを鋳型ＤＮＡとし実施例１で作製したプライマー（ｃａｐｓｕｌｅ−Ｆとｃａｐｓｕｌａ−Ｒ）とそのＰＣＲ条件を用いて莢膜合成遺伝子群の増幅を試みた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動して塩基数を推定した結果、この２菌株のゲノムからの増幅断片は約１ｋｂであった（図４）。この結果から、この２菌株には莢膜合成遺伝子群が存在しないことを確認した。このことから、これら２菌株が莢膜をもたないことを遺伝子レベルで証明するものであり、安全性を裏付ける重要な知見である。
【００４８】
実  施  例  ３
莢膜合成遺伝子群変異試験（莢膜合成がスムーズになされるかどうかの確認試験）：
Ｌｇ２株［抗ＫＧ（−）］をニトロソグアニジンで処理したところ、血清型が抗ＫＧ（−）から抗ＫＧ（＋）となった変異株ラクトコッカス・ガルビエＬｇ２−Ｓ株（以下、単に「Ｌｇ２−Ｓ株」という）が分離されている（参考文献２参照）。Ｌｇ２株のブリ属魚類への病原性は、１０の４.３乗の菌数の腹腔内摂取で１００％ブリ属魚類を死亡させるのに対し、Ｌｇ２−Ｓ株では１０の６.２乗の菌数の腹腔内摂取でもブリ属魚類はまったく死亡しなかった。従って、抗ＫＧ（＋）の菌株が、病原性を示さないことと一致することが示されている（参考文献２参照）。
【００４９】
次にＬｇ２−Ｓ株のゲノムを鋳型ＤＮＡとし上記のプライマー（ｃａｐｓｕｌｅ−Ｆとｃａｐｓｕｌａ−Ｒ）とそのＰＣＲ条件を用いてＰＣＲ産物の増幅を試みた。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法によって塩基数を推定した。その結果は図５のとおり、Ｌｇ２とほぼ同じ約１９ｋｂのＤＮＡ断片が検出され、莢膜合成遺伝子群が増幅されたものと推察された。
【００５０】
上記約１９ｋｂのＤＮＡ断片に莢膜合成遺伝子群が含まれていることを確認するために、莢膜合成遺伝子群を部分的に増幅できる下記のプライマー（配列表の配列番号４〜１１）を配列表の配列番号１に記載の塩基配列を元に設計し、上記と同様の条件でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅して、約１９ｋｂの全塩基配列を決定した。
【００５１】
ＬＧ２ｔｒｆ１−Ｆ：５'−ＡＧＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡ−３'
ＬＧ２ｔｒｆ１−Ｒ：５'−ＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＣＴＡＡＡ−３'
ＬＧ２ｔｒｆ２−Ｆ：５'−ＧＡＡＡＴＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴ−３'
ＬＧ２ｔｒｆ２−Ｒ：５'−ＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＣＴＡＡＡ−３'
３４８２−３５２０：５'−ＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＧＣ−３'
４４３６−４４５５：５'−ＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＴ−３'
６５７１−６５９０：５'−ＴＧＡＣＧＴＣＡＣＧＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧ−３'
７４９９−７４８０：５'−ＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡ−３'
【００５２】
その結果、Ｌｇ２−Ｓ株にはアガロースゲル電気泳動法では検出不可能な１塩基の欠失が判明した。その塩基配列から遺伝子解析を行ったところ、１塩基欠失によるコドンのフレームシフトが起こって、ＥｐｓＤタンパク質をコードするsugar transferase遺伝子の途中に結果的に終止コドンが入り、ＥｐｓＤタンパク質が作られていなかった。ＥｐｓＤタンパク質は莢膜合成に重要なタンパク質であることから、完全な莢膜が形成できなかったものと考えられる。また、Ｌｇ２−Ｓ株の場合、莢膜合成遺伝子群の塩基配列決定によりＥｐｓＤタンパク質以外のタンパク質は作られていると予想された。このことから、莢膜合成に必要な１５の遺伝子群の１つのタンパク質でも不完全な形となれば、機能する莢膜とはならないと考えられる。
【００５３】
以上のことから、ラクトコッカス・ガルビエの莢膜合成遺伝子群が増幅され、約１９ｋｂのＤＮＡ断片が検出された場合であっても、抗ＫＧ（＋）で病原性が無い場合もある。その場合には、塩基配列決定により莢膜合成に必要な１５の遺伝子群の全てがタンパク質を合成しうるかどうかを確認すれば病原性の有無を判断できることがわかった。また、ＫＧ（−）抗体はポリクローナル抗体であることから、不完全な一部の莢膜に反応して抗ＫＧ（−）であっても非病原性の菌株が得られるかもしれない。その場合、上記のプライマーで莢膜合成遺伝子群のＰＣＲ増幅を行い、解明した全塩基配列との照合を行えば、大変な作業であるブリ属魚類への攻撃試験を行わなくても、莢膜合成の様子が明確になり、病原性の有無を明らかにすることができる。視覚的に、莢膜の有無を判断しにくい場合も、塩基配列の方から病原性を確認するのは有効な方法である。
【００５４】
実  施  例  ４
莢膜合成遺伝子群の病原性確認試験：
病原性を示さないＡＴＣＣ株に、莢膜合成遺伝子群を組み込んだ場合に病原性が示されるかどうかを試験した。まず、ラクトコッカス・ガルビエの宿主−ベクター系となるプラスミドｐＩＬ２５３をフランス国立農学研究所（INRA）から分譲してもらった。このプラスミドｐＩＬ２５３はマルチクローニングサイトに、制限酵素ｓａｌＩ消化部位を有する。莢膜合成遺伝子群にはｓａｌＩ消化部位が１箇所あるので、莢膜合成遺伝子群を含まないその前と後の配列に、ｓａｌＩ消化部位を組み込めるプライマー（配列表の配列番号１２〜１３）を設計した。
【００５５】
ＬＧＣ−Ｆ：５'−ＴＡＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＧ−３'
（ＴＡＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＧ（莢膜合成遺伝子群を含まないその前の配列）から１塩基置換）
ＬＧＣ−Ｒ：５'−ＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡ−３'
（ＣＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡ（莢膜合成遺伝子群を含まないその後の配列）から連続しない２塩基置換）
【００５６】
Ｌｇ２株のゲノムをテンプレートにＰＣＲ増幅し、目的のサイズ約１９ｋｂのＰＣＲ断片を得た。この約１９ｋｂのＰＣＲ断片を、ｓａｌＩで部分的に消化して、莢膜合成遺伝子群の中で切断されておらず、両端のプライマー領域がｓａｌＩで切断されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法で確認後に切り出してｐＩＬ２５３に組み込んだ。その構築プラスミドで、ＡＴＣＣ株を形質転換して変異株を得た。この変異株は、抗ＫＧ判定が形質転換前のＫＧ（＋）からＫＧ（−）になった。このことからＡＴＣＣ株は莢膜合成遺伝子群を組み込むことにより莢膜を合成したと考えられた。
【００５７】
実  施  例  ５
莢膜合成遺伝子群以外の遺伝子の病原性確認試験：
α溶血性連鎖球菌症の代表的な細菌にストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）がある。この細菌のα溶血性連鎖球菌症の発現は、全ゲノム解析により、莢膜とヘモリジンの両方の発現により生じると考察されている（Tettelin H,et al., Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae, Science, 293: 498-506 (2001).）。そのことを確かめるために、ラクトコッカス・ガルビエの全ゲノム配列からヘモリジン遺伝子を推定した。
【００５８】
その結果、ラクトコッカス・ガルビエは、病原性株・非病原性株に関わらず、各２つのヘモリジン遺伝子を保持していた。ラクトコッカス・ガルビエ病原性株（Ｌｇ２株）のヘモリジン遺伝子を配列番号１５および１６に、ラクトコッカス・ガルビエ非病原性株（ＡＴＣＣ株）のヘモリジン遺伝子を配列番号１７および１８に示す。これら配列のうち、配列番号１５および１７のものは同一であり、配列番号１６および１８のものは同一である。
【００５９】
ところで、ラクトコッカス・ガルビエはラクトコッカス属に属するが、この属は５菌種２亜種に分類されている（図６）。このうちラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）の２菌種は、チーズスターターとして用いられ、長い食経験のもと安全性の高い（ＧＲＡＳ）細菌として扱われている。これらについても全ゲノム情報から莢膜遺伝子群とヘモリジン遺伝子の有無を確認したところ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクティスＩＬ１４０３では２つのヘモリジン関連の遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＳＫ１１では２つのヘモリジン関連の遺伝子、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＧ１３６３では３つのヘモリジン関連の遺伝子が検出された。本来、ヘモリジンは溶血素と考えられており、多くの病原細菌にみられる因子である。しかし、これらラクトコッカス属の３菌株から莢膜関連遺伝子群は検出されなかった。これら３菌株がＧＲＡＳ細菌であることを考慮すると、ラクトコッカス・ガルビエと同属の菌株においても、ヘモリジン関連の遺伝子の存在のみでは病原性を発現しないことがわかった。
【００６０】
以上の結果より、ラクトコッカス・ガルビエの病原性（安全性）は、ヘモリジン遺伝子の有無に関わらず、莢膜関連遺伝子群の存在が鍵となることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は莢膜合成遺伝子群を検出することによりラクトコッカス・ガルビエが病原性を有するか否かを遺伝子レベルで明確に判断することができる。
【００６２】
また、本発明は、上記の莢膜合成遺伝子群を、例えば、飲食品中から検出することにより飲食品の安全性確認検査が行うことができ、莢膜合成遺伝子群を魚類、特にブリ属魚類から検出することによりα連鎖球菌症の診断に用いることができる。
【００６３】
更に、本発明は微生物を飲食品、医薬品、添加物等に利用する際の安全性を裏付けることに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｌｇ２株とＡＴＣＣ株の全ゲノム解析を行った結果を比較したものである。
【図２】莢膜合成遺伝子群とその周辺の遺伝子の構成を示すものである。
【図３】Ｌｇ２株とＡＴＣＣ株についてｃａｐｓｕｌｅ−Ｆおよびｃａｐｓｕｌａ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果である。
【図４】ＮＲＩＣ０６０７株とＮＲＩＣ０６１１株についてｃａｐｓｕｌｅ−Ｆおよびｃａｐｓｕｌａ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果である。
【図５】Ｌｇ２株とＬｇ２−Ｓ株についてｃａｐｓｕｌｅ−Ｆおよびｃａｐｓｕｌａ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果である。
【図６】ラクトコッカス属（type strain）の１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子配列から作成した系統樹である。
【図１】
0005373301.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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