(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞遊走刺激活性を有する、ペプチドＩｌｅ - Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＩＧＤ）、ペプチドＩｌｅ - Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＩＧＤＳ）又はペプチドＩｌｅ - Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ（ＩＧＤＱ）のいずれかである化合物。
【請求項２】
請求項１に記載される化合物及び薬学的に許容される運搬体を含んでいる薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１に記載されるペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６】
ヒト以外の動物体内の線維芽細胞遊走を刺激する方法であって、その方法は請求項１に記載される化合物の効果的な量を線維芽細胞遊走の刺激が必要とされているヒト以外の動物体内の部位に投与することを含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載される化合物を含む、線維芽細胞遊走を刺激するための薬学的組成物。
【請求項８】
動物体内における線維芽細胞遊走を刺激するための医薬品のその製造における請求項１に記載される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明はペプチド及び関連化合物に関し、特に細胞遊走に影響するペプチド及び関連化合物に関する。
ファイブロネクチンは、大部分の細胞外細胞間質、細胞質中（300μg/ml）及びその他の体液中において高濃度で存在し幅広く分散している糖タンパク質である。ファイブロネクチンは、顕著な接着性タンパク質であり且つ遊走を含む細胞外細胞間質での細胞相互作用の多様な側面を仲介する。その原則的な機能は発育（develop）及び創傷治癒、細胞の成長及び分化の制御及びうっ血症（haemostasis）/血栓症における細胞遊走において見られる。
ファイブロネクチンは、COOH末端において1対のジスルフィド結合によって共有的に結合した２つの非相同的なサブユニットの２両体である。そのサブユニット間のその相違は、IIIＣＳ（又はＶ）領域の可変的スプライシングによって決定される。この不溶性ファイブロネクチンの細胞間質型においてはその２量体はジスルフィド結合したオリゴマー及びフィブリルに接合している、しかし可溶型においては体液ファイブロネクチンは２量体型優位的である。ファイブロネクチンの３つの領域は選択的スプライシングに支配されており且つ一般的にその分子の細胞間質型はそれらの断片をその可溶型よりも多く含んでいる。そのヒトIIIＣＳ領域は５つの潜在的変異を含んでおり、ラット、ウシ及びニワトリの配列ではそれぞれ３，３及び２個の変異を含んでいる。それぞれのサブユニットは、フレキシブルなポリペプチド断片によって結合された一連の構造的に独立なドメインから構成される。その一次配列段階では、そのファイブロネクチン分子の主要分子の起源は３タイプのポリペプチド繰返しの末端重複によって説明される。異なるファイブロネクチンは細胞外細胞間質巨大分子、又はバクテリア（細菌）のあるいは真核生物の膜受容体に結合するように分化している。その中心的細胞結合ドメインは、そのインテグリン受容体α３β１，α５β１，αＶβ１，αIIｂβ３，αＶβ３，αＶβ５及びαＶβ６を介してほとんどの接着細胞によって認識される。そのIIIＣＳ/ＨｅｐII細胞結合ドメインは、そのα４β１，α４β７インテグリンを介してリンパ系の細胞、神経冠派生物（neural crest derivatives）及び筋芽細胞によって認識される。いくつかのペプチド活性部位がそれらのドメインにおいて同定されてきた。
細胞質ファイブロネクチンはゼラチン及びヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組合せによって精製される。細胞接合ファイブロネクチンは培養単層から１Ｍ尿素によって抽出される。ファイブロネクチンについて更に詳しくは、“細胞外細胞間質の事実書”（The Extracellar Matrix Facts Book）, Ayad等（eds）, Academic Press, Harcourt Brace & Company, Londonに記載されている。
限定されたタンパク質分解は、結果としてその細胞表面（即ち、その細胞結合ドメイン）1での他のマトリックス巨大分子又はインテグリン受容体への特異的接着によって特徴付けられる多数の機能的ドメインの放出をする。そのトランスメンブレン分析は一貫してファイブロネクチン及びその精製された機能ドメインの細胞遊走におけるインビボでの効果を測定するために使われてきた。本質的には、この方法はその仮想的なエフェクター分子を含んだ上部と下部培地区画に分離している接着タンパク質（通常、ゼラチン）で覆われたポリカーボネイト膜を介して細胞移動を評価することを含んでいる。先行する研究は、ナノ〜マイクロＭ（モラー）濃度のファイブロネクチン及びその精製された細胞結合ドメインが広範囲の細胞タイプの遊走を刺激することをそのトランスメンブレン分析2,3によって明らかにしている。関連する研究において、天然のファイブロネクチンとその細胞結合ドメイン両方の効果の仲介におけるそのRGDアミノ酸モチーフ（第１０タイプIII繰返しモジュールに位置する）を暗示している。十分には、小さなRGD含有合成ペプチドは細胞遊走を刺激しなかった；実際には、それらのペプチドは、受容体連結4への競合によってそのRGDモチーフを含む巨大タンパク質ドメインのその接着及び遊走刺激活性を阻害した。その細胞結合ドメインの活性とは反対に、ファイブロネクチンのゼラチン結合ドメインはそのトランスメンブレン分析2,5において遊走刺激活性を欠くということが矛盾なく報告されてきた。
Schor等（1994）Progress in Growth Factor Research 5, 223-248は、細胞移動のサイトカインコントロール及びその細胞外細胞間質によるその活性調節及び仲介を概説している。
Schor等（1993）Cell Behaviour：粘着及び移動（ed. G. Evans, C. Wigley and R. Warn）実験生物学学会シンポジウムNo. 47、ページ235-251は、遊走刺激因子（migration stimulating factor: MSF）に関する。
Grey等（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2438-2442は、胎児及び乳癌患者線維芽細胞により生産されたそのMSFの精製に関する。
US5,300,630は、ファイブロネクチンに関する癌進行的に（oncodevelopmentally）制御される抗原に関する。
US5,510,328は、タンパク質を使った創傷収縮を減少又は阻害する方法に関する。
US5,354,736は、コラーゲンに関する細胞結合を促進した化合物に関する。
US4,976,734は、補綴装置（prosthetic）に対する細胞遊走刺激の方法に関する。
US4,980,279は、ファイブロネクチンの一部分に関する。
US5,049,658は、ヒトファイブロネクチンの細胞分散活性を有するポリペプチドに関する。
US5,124,155は、ファイブロネクチンを凝結させることによって調整された創傷治療薬に関する。
US5,453,489は、ファイブロネクチン−ファイブロネクチン結合部位を示し且つファイブロネクチン細胞間質集合を阻害することができるポリペプチドに関する。
US5,192,746は、細胞接着を活性調節する特性を有している化合物に関する。
US5,491,130は、そのゼラチン結合ドメインに結合するヒト内皮細胞トロンボスポンディング（thrombosponding）由来のペプチドに関する。
我々は前もって天然Ｉ型コラーゲン繊維6のゲル中における細胞移動の評価に関する他の遊走分析法を改良してきた。この分析法を使って、最近我々は天然のファイブロネクチン及びその細胞結合ドメインは不活性7だが、フェムトＭ濃度のゼラチン結合ドメインはヒト皮膚線維芽細胞の遊走を刺激したということを報告した。
我々は、フィルターをゼラチン（先行する研究のほとんどで使われているように）ではなく天然のコラーゲンによって被覆し、このトランスメンブレン分析においてそのゼラチン結合ドメインが本当に細胞遊走性を刺激したことを観測した。ファイブロネクチンのそのゼラチン結合ドメイン内の候補となるアミノ酸配列が細胞遊走のその基層依存刺激に対応しているか、そしてもしそうならば機能的にそのRGDモチーフに関連するかもしれないその様式を決定することが本研究の1つの目的であった。驚くべきことに、我々はそのIGDアミノ酸配列モチーフを含んでいるペプチド及び他の分子が変成していない天然のコラーゲン基質中で線維芽細胞遊走を刺激することを発見した。
本発明の第1の側面は、Ile−Gly−Asp（IGD）ペプチド又はそれを模倣したペプチド又は非ペプチドを含んでいる15000未満の相対分子量を有する化合物を提供する。
好ましくは、その化合物は相対分子量が12000未満であり、更に好ましくは10000未満である。
驚くべきことに、我々は単独であるいは巨大分子の部分として存在するそのペプチドIGDが細胞遊走を活性調節できることを示した。こうして、この発明の好ましい化合物は、この例に記載される条件のような適切な条件下において細胞遊走を活性調節できる化合物である。
IGDの模倣ペプチドに対して、我々はIleがVal,Leu,Phe,Trp又はTyr最も好ましくはVal又はLeuのような他の疎水性アミノ酸によって置換されたものを含めることを意図している。我々は、しかもそのAspがGluによって置換されたものも含めることを意図している。そのGly残基がAlaによって置換されるたものはそれに対して好ましくない。そのペプチド模倣物は、好ましくは実質的にそのペプチド配列IGDを含んだペプチドと同様の細胞遊走活性調節活性を示すものであり、より好ましくは実質的にIGD又はIGDS又はIGDQペプチドのいずれか1つと同様の細胞遊走活性調節活性を示すものである。適切には、そのペプチド模倣物はそのペプチドIGD,IGDS又はIGDQのいずれか1つと同じような荷電分配及び／又は空間配置を実質的に有する部分を含む。
IGDの非ペプチド模倣物に対して、我々はIGD,IGDS又はIGDQペプチドのいずれか１つと同様の荷電分配及び／又は空間配置を有する部分を含めることを意図しており、且つ我々はIGD配列を含むペプチドのそれと同様の細胞遊走活性調節活性を実質的に有する部分を含めることを意図している。
そのRGD配列の非ペプチド代用物は改良されてきており、例えば以下の文献にその記載がある；Greenspoon等（1993）Biochemistry 32, 1001-1008及びHumphries等（1994）Exp. Opin. Ther. Patents 4, 227-235、これらはともに本明細書の一部とされている。そしてこのIGDモチーフに基づく適切な非ペプチド模倣物はRGDのその非ペプチド模倣物においてと同様の原理に基づいて作成できる。
そのペプチドIle−Gly−Asp（IGD）を含んでいるペプチドの細胞遊走活性調節活性と実質的に同様の活性を示す化合物を適切なスクリーニングシステムを使って選択できる。その好ましいスクリーニングシステムは、天然のＩ型コラーゲン基質（例えば、コラーゲンゲル又はコラーゲン被覆膜を使ったトランスメンブレン膜分析）上で細胞遊走を評価している例１に記載される分析法と類似の遊走分析法を使う。模倣物は、実質的にIGD、IGDS又はIGDQペプチドと同様の効果を示し且つそれらの添加物法式で働くかもしれない化合物である。阻害剤はそのIGD,IGDS又はIGDQペプチドの生物活性を阻止するだろう。そのIGDペプチド及びそのゲル結合ドメイン（GBD）は添加剤方式において効く、しかしそのRGDペプチドはそのIGDペプチドの阻害剤である。
そのIGDペプチド配列は、本発明の化合物中に存在する時細胞遊走を十分に活性調節するが、もしそのIle−Gly−Asp−Ser（IGDS）又はIle−Gly−Asp−Glu（IGDQ）ペプチド配列も本発明の化合物中に存在するならばより好ましい。
IGDS、IGDQ又はIGDペプチドの関係について、我々は線維芽細胞遊走の刺激に関してIGDSはIGDQよりも且つIGDQはIGDよりも効力があり、そこでその化合物がそのIGDSペプチドを含んでいるならばより好ましいということを発見した。
本発明の化合物中に存在するIGD又はIGDS又はIGDQペプチド配列内のそのアミノ酸は天然アミノ酸と同様に全てＬ型配座であるならばより好ましい。しかし、本発明のその化合物がIGD、IGDS又はIGDQを含んだペプチドである時そこでそのペプチド（即ち、IGD、IGDS又はIGDQ部分におけるペプチド以外のペプチド）内のその他のアミノ酸はＬ又はＤ配座であっても良いことが分かるかもしれない。それはＤアミノ酸を含んでいるペプチド程おそらくプロテオリシスに対してより抵抗性があることから、Ｄアミノ酸（IGD、IGDS又はIGDQ部分おいて以外）を含んでいる化合物がより好ましいかもしれないからである。
本発明は、相対分子量が15000未満であり前記IGDペプチド又はそのペプチド又は非ペプチド模倣物を含んでいる全ての化合物を範囲とする；しかしながら、それは特にもしその化合物がそのペプチド部分IGDを含んでいるペプチドであるならばより好ましい。別の言い方においては、好ましい化合物はそのペプチド部分IGDを含んでいる３アミノ酸より大きいペプチドである。そのようなペプチドはIGDS及びIGDQペプチドを含みしかもそのモチーフにＮ末端及び/又はＣ末端に付加アミノ酸を有するペプチドを含む。
本発明のその化合物は、そのIGD、IGDS又はIGDQ部分が例えばフリーの-NH2基又は-COOH基を提示する保護基によって遮蔽されているペプチドをも含んでいる。好ましくは、そのような保護基はインビボで容易に、例えば加水分解によって、取り除かれて良い；しかしながら、ある環境においてもしその保護基が実質的に加水分解に対して抵抗性であれば好ましいかもしれない。
しかも、そのIGDペプチドは本発明の化合物である。
その化合物が相対分子量8000未満、好ましくは6000未満、更に好ましくは5000未満そして好ましくは2000未満であるならばより好ましい。本発明のその化合物がペプチドであるとき、もしそのペプチドが４から８０アミノ酸残基の間、より好ましくは４から５０の間、更にもっと好ましくは４から３０の間でありそして望ましくは４から２０アミノ酸残基の間であるならばより好ましい。
本発明のその化合物は線形であるかもしれないしまたそれは分岐型あるいは環状であるかもしれない。本発明のその化合物がペプチドであるとき、それは線形、分岐形または環状であって構わない。
本発明のその化合物は１つ以上のIGDペプチド部分又はそのペプチド又は非ペプチド模倣物を含んでいても良いことが理解できるであろう。ある明確な環境において、本発明のその化合物が２から５０のそのようなペプチド部分、そのペプチド又は非ペプチド模倣物、より好ましくは２から２０でありそして最も好ましくは５から１５のそのようなペプチド部分又はそのペプチド又は非ペプチド模倣物を含むことは有益である。
このように、本発明のペプチドはIGD又はIGDS又はIGDQ又はI、G又はDに対する保守置換（conservative substitution）を含むペプチド配列（IGESのような）の重複繰返しからなっても良く、そしてそれは重複繰返しを含んだ環状形態におけるそれらのあらゆるものから構成されても良い。
本発明のその化合物がペプチドであるとき、それがIGD含有部分（IGDそれ自身又はIGDS又はIGDQ又はその組合せ）のタンデム繰返しをそれが含むことは可能である。
本質的ではないけれど、本発明のペプチドがIGDモチーフ及びそのファイブロネクチン分子由来の側面構成領域（flanking region）を含むならばより好ましい。例えば、その側面構成領域は、そのファイブロネクチン分子においてIGD存在の１つの面あるいは両面上の１，２，３，４，５又はそれ以上アミノ酸残基からなって構わない。そのヒトファイブロネクチン分子のそのアミノ酸配列は図５において与えられる。ファイブロネクチンの側面構成領域を含んでいるペプチドはより短いトリ及びテトラペプチドよりも優れた生物活性を有するかもしれない。これらの側面構成領域はおそらくファイブロネクチンに対する第７（IGDQに対して）及び第９（IGDSに対して）Ｉ型繰返しモジュール由来である。しかも、本発明の化合物がその完全なファイブロネクチンＩ型繰返しモジュール（I7及びI9）であればより好ましい、なぜならそれらはより短い合成ペプチドよりも高い生物活性をおそらく示すからである。それらのＩ型モジュールのそれぞれはおよそ４５アミノ酸を含み、そして好ましくはそれらのモジュールの３つまでがタンデム配列において使われる。
本発明のその化合物がペプチドであるとき、技術的に良く知られた方法を使って合成されて良い。例えば、Lu等（1981）J. Org. Chem. 46, 3433及び本明細書において開示されるようなFmoc-ポリアミド法の固層ペプチド合成によって合成されて構わない。一時的なＮアミノ基保護は、そのフルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基によって行う。この高い塩基置換活性保護基の繰返し開裂はＮ，Ｎ-ジメチルホルムアミド中における２０％ピペリジンを使って行う。側鎖機能は、ブチルエーテル（セリン スレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル派生物（リシン及びヒスチジンの場合）、トリチル派生物（システインの場合）、及び４-メトキシ-２，３，６-トリメチルベンゼンスルホニル派生物（アルギニンの場合）として保護して良い。Ｃ末端がグルタミン又はアスパラギンであるところでは、その側鎖アミノ酸機能の保護は４-４’-ジメトキシベンジドリル基を使う。その固層保持体は、３種類のモノマーであるジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋試薬）及びアクリロイルサルコジンメチルエステル（機能化試薬：functionalising agent）から構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーを基礎とする。使用されたペプチド-樹脂可開裂結合試薬（cleavable linked agent）は酸置換活性４ - ヒドロキシメチル−フェノキシアセティックアシッド派生物である。Ｎ，Ｎ-ジシクロヘキシル-カルボジイミド/１-ヒドロキシベンゾトリアゾール仲介カップリング手法を使って加えるアスパラギンとグルタミンを除いて、全てのアミノ酸派生物をそれらの前もって調整された対照的（symmetrical）無水派生物として加える。全てのカップリングおよび脱保護反応はニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸又はイソチン試験手法を使って定量する。合成が完了したら、５０％の洗浄剤混合物を含んだ９５％トリフロロ酢酸で処理することによって側鎖保護基を付随的に削除しその樹脂保持体からペプチドを切り離す。共通して使われる洗浄剤はエタンジチオール、フェノール、アニソール及び水であり、その合成される構成アミノ酸に依存しているその正確な選択を総合的に行うものとする。トリフロロ酢酸を真空エバポレーションによって取り除き、続いてジエチルエーテルとともにすりつぶすことでペプチド未精製物とする。存在する全ての洗浄剤を、簡易な抽出手法によって取り除き続いてその水層を凍結乾燥してその未精製ペプチドを洗浄剤のない状態にする。ペプチド合成の為の試薬は全般的にCalbiochem-Novabiochem（UK）Ltd.（Nottingham NG7 2QJ、英国）から利用可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび（原理的には）逆層高性能液体クロマトグラフィーのような技術のいずれか１つ又はそれらの組合せによって行って良い。ペプチド分析は薄層クロマトグラフィー、逆層高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析および高速原子分裂（FAB）質量分光分析によって実行して良い。
他には、本発明のペプチドが約５０残基以上のような適切なサイズであるときには、組換えDNA技術によってそのペプチドを生産することが好ましいかもしれない。
本発明のペプチドは、技術的に良く知られた方法によって得られ又は合成されても良い適切なポリヌクレオチドによってコードされても良い。
そのDNAは、本発明の化合物を含んでいるペプチドを生産するための適切な宿主中にて発現される。そこで、本発明の化合物を構成しているそのペプチドをコードしているそのDNAは、本発明のそのペプチドの発現及び生産に適した宿主細胞を形質転換させるために使用される発現ベクターを構築するために、本明細書における指示に鑑みて適切に改良された既知の技術に沿って利用されて構わない。そのような技術は、本明細書の一部とされている米国特許；Rutter等, Patent No.4,440,859（４月３日１９８４年発行）、Weissman, Patent No.4,530,901（７月２３日１９８５年発行）、Crowl, Patent No.4,582,800（４月１５日１９８６年発行）、Mark等, Patent No.4,677,063（６月３０日１９８７年発行）、Goeddel, Patent No.4,678,751（７月７日１９８７年発行）、Itakura等, Patent No.4,704,362（１１月３日１９８７年発行）、Murray, Patent No.4,710,463（１２月１日１９８７年発行）、Toole, Jr. 等, Patent No.4,757,006（７月１２日１９８８年発行）、Goeddel等, Patent No.4,766,075（８月２３日１９８８年発行）、Stalker, Patent No.4,810,648（３月７日１９８９年発行）に開示されているものを含んでいる。
本発明のその化合物を構成するそのペプチドをコードしている前記DNAを適当な宿主への導入のために、種々の他のDNA配列に結合されても良い。そのコンパニオンDNAは、その宿主、その宿主へのそのDNAの導入の方法及びエピゾーマルな維持又は統合が好ましいかどうかに依存するだろう。
一般的に、発現のための適切なオリエンテーションと正しいリーディングフレーム中において、プラスミドのような発現ベクターにそのDNAを挿入する。もし必要ならば、その好ましい宿主によって認識されるその適切な転写及び翻訳制御コントロールヌクレオチド配列にそのDNAを結合しても良い、しかしそのようなコントロールはその発現ベクターにおいて一般に利用可能なものである。そのベクターは標準的な技術によってその宿主に導入される。一般的に、その宿主の全てがそのベクターによって形質転換されることはないだろう。そのため、形質転換された宿主細胞に対して選択をかける事が必要となるだろう。１つの選択技術は、その発現ベクター中にDNA配列を、その形質転換細胞において選択可能な株をコードする抗生物質耐性のようなあらゆる必要なコントロール因子とともに組み込むことを含む。他には、そのような選択可能な株に対するその遺伝子は、その好ましい宿主細胞を共形質転換するために使われる他のベクター上に存在していても良い。
本発明のその組換えDNAによって形質転換された宿主細胞は、そこで再生しうるそのペプチドの発現を可能とするために本明細書において開示される指示の観点からこの技術分野において当業者に知られた十分な時間及び適切な条件下で培養される。
バクテリア（例えば、E. コリ（E.coli）及びバチルスサブティリス（Bacillus subtilis））、酵母（yeast）（例えば、サッカロマイセスセレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae））、放線菌（Filamentous fungi）（例えば、アスペルギルス（Aspergillius））、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞を含んだ、多くの発現系が知られている。
そのベクターは、原核生物中での増殖のためにColE１oriのような原核生物レプリコンを含んでいるが、そのベクターは他の（例えば、非原核生物的な）細胞型、においての発現のためにも使われる。それと共に形質転換されたE. コリのようなバクテリア宿主細胞においてその遺伝子発現（転写及び翻訳）を指示することができる原核生物プロモーターのような適切なプロモーターを含むこともできる。
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合及び転写が起こることを可能とするDNA配列で形成される発現コントロールエレメントである。規範的なバクテリア宿主で両立し得るプロモーター配列が、典型的には本発明のDNA断片の挿入に対して便利な制限部位を有するプラスミドベクター中に備えられる。
典型的な原核生物的なベクタープラスミドは、Biorad Laboratories（Richmond、カリフォルニア 米国）から利用可能なpUC18、pUC19、pBR322及びpBR329及びPharmacia（Piscataway、ニュージャージー、米国）から利用可能なpTrc99A及びpKK223-3がある。
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドはPharmacia（Piscataway、ニュージャージー、米国）から利用可能なpSVLである。このベクターはSV40後期プロモーターをクローン遺伝子の発現を駆動するために使用しており、その発現の最高レベルはCOS-1細胞のようなＴ抗原生産細胞において発見されている。
誘導可能な哺乳類発現ベクターの例はpMSGであり、そしてPharmaciaから利用可能である。このベクターは、マウス乳房腫瘍ウィルス長末端繰返しのそのグルココルチコイド-誘導プロモーターをそのクローン遺伝子の発現を駆動するために使用している。
有用な酵母プラスミドベクターとしてpRS403-406及びpRS413-416があり且つ一般にStratagene Cloning Systems（ラ ホヤ、カリフォルニア 92037、米国）から利用可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405及びpRS406は酵母インテグレーションプラスミド（YIps）であり且つ酵母選択可能マーカーHIS3、TRP1、LEU2及びURA3を組み込んでいる。
相補的接着末端を介してDNAをベクターに使用可能に結合するために、様々な方法が改良されてきた。例えば、相補的ホモポリマー鎖（tract）がそのベクターDNAに挿入されるべきそのDNA断片に加えられる。そのベクター及びDNA断片はその相補的ホモポリマー的な鎖間の水素結合によって結合し組換えDNA分子を形成する。
1つ又はそれ以上の制限部位を含んでいる合成リンカーはそのDNA断片をベクターに結合する選択的な手法を提供する。前記のようなエンドヌクレアーゼ制限消化によって作られたそのDNA断片は、突出部を除去する酵素であるバクテリオファージT4DNAポリメラーゼ又はE. コリDNAポリメラーゼＩによって、3’-1本鎖末端をその3’-5’-エキソヌクレオチド活性で処理し、そしてそれらのポリメラーゼ活性で処理された３’-末端を補完する。
それ故、それらの活性組合せは不確定末端（blunt-ended）DNAを作り出す。その不確定末端は、バクテリオファージT4DNAリガーゼのような、不確定末端DNA分子の結合を触媒できる酵素の存在下において過剰分子量のリンカー分子と共に培養される。そのように、その反応の生成物は、それらの末端において重合リンカー配列を有するDNA断片である。それらのDNA断片は適切な制限酵素によって開裂され、そのDNA断片と互換性のある末端を生産する酵素で開裂された発現ベクターに結合される。
多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ合成リンカーは、International Biotechnologies Inc,（New Haven、コネチカット、米国）を含む多数の供給源から利用可能である。
本発明のポリペプチドをコードしている前記DNAを修飾する好ましい方法は、Saiki等（1988）Science 239, 487-491に開示されるようなポリメラーゼチェインリアクションを使うことである。
この方法において、酵素的に増幅されるそのDNAはそれら自身その増幅後のDNAに組み込まれることになる２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって両端を固められる。前記特異的プライマーは、技術的に知られた方法を使って発現ベクターへのクローニングに為に使われ得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいても良い。
更に、本発明は本発明を構成するポリヌクレオチドベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。その宿主細胞は原核生物的でも真核生物的のいずれでもありうる。バクテリア細胞は好ましい原核生物的宿主細胞であり典型的には、例えばBethesda Research Laboratories Inc,（Bethesda, MD米国）から利用可能なDH５及びAmerican Type Culture Collection（ATCC）of Rockville、（MD、米国）から利用可能なRR１（No ATCC 31343）のようなE. コリ株がある。好ましい真核的宿主細胞は酵母及び哺乳類細胞を含み、好ましくはマウス、ラット、サル又はヒト線維芽細胞セルライン由来の細胞のような脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞は、一般にStratagene Cloning Systems（ラ ホヤ、カリフォルニア 92037、米国）から利用可能なYPH499, YPH500およびYPH501を含む。好ましい哺乳類宿主細胞は、CCL61としてATCCから利用可能なチャイニーズハムスターオーバリー（CHO）細胞、CRL1658としてATCCから利用可能なNIH Swissマウスエンブリオ細胞NIH/3T3、およびCRL1650としてATCCから利用可能なサル腎臓由来COS-１細胞を含む。
本発明のDNA構築物による細胞宿主の形質転換は、典型的には使用されるベクターのタイプに依存する良く知られた方法によってなされる。原核宿主細胞の形質転換に関して、例えばCohen等（1972）Proc. Natl.Acad.Sci.USA 69,2110およびSambrook等（1989）分子クローニング、実験マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory（Cold Spring Harbor、ニューヨーク、米国）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Sherman等（1986）酵母遺伝学における方法、実験マニュアル、（Cold Spring Harbor、ニューヨーク、米国）に記載されている。Beggs（1978）Nature 275, 104-109の方法も有効である。脊椎動物細胞に関して、例えばカルシウムホスフェートおよびDEAEデキストラン又はリポソーム処法などそのような細胞を形質転換するのに有効な試薬は、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc,.（Gaithersburg、MD20877、米国）から利用可能である。
電気穿孔法（Electroporation）は細胞を形質転換するのに有効であり、酵母細胞、バクテリア細胞および脊椎動物細胞を形質転換するために技術的に良く知られている。
例えば、多くのバクテリア種が、本明細書に一体とされているLuchansky等（1988）Mol. Microbiol.2, 637-646に記載されている方法によって形質転換されても良い。最大数の形質転換体は、一定して以下の２．５X PEBに懸濁されたそのDNA-細胞混合物おける２５μFDで６２５０V/cmの電気穿孔において得られた。
電気穿孔法による酵母の形質転換のための方法が、Becker & Guarente（1990）Methods Enzymol.194,182に開示されている。
上手く形質転換された細胞、即ち本発明のDNA構築物を含む細胞、は良く知られた技術によって同定できる。例えば、本発明の発現構築物導入の結果における細胞は、本発明のペプチドを生産するために培養できる。細胞は回収され溶解され、そしてそれらのDNA含有については、Southern（1975）J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent等（1985）Biotech. 3, 208に記載されるような手法を使ってそのDNAの存在について調査できる。他には、上清中のそのタンパク質の存在を以下に記載するような抗体を使って検出できる。
組換えDNAの存在について直接分析することに加え、成功的な形質転換は、その組換えDNAがそのタンパク質の発現の示唆となれるならば、良く知られた免疫学的方法によって確かめられる。例えば、発現ベクターを有する成功的に形質転換された細胞は適切な抗原性を示しているタンパク質を生産する。形質変換されたと思われる細胞試料は回収されそして適切な抗体を使ってそのタンパク質について分析される。
そのようにして形質転換された宿主細胞自身に加え、本発明は、栄養培地におけるそれらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に相同的な）培養、又はモノクローナル培養由来の培養を意図している。
本発明の第３の側面は、本発明のポリヌクレオチドを含んでいるベクターを提供し、そして本発明の第４の側面はポリヌクレオチド又はその発明のベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
本発明の化合物は、細胞遊走を活性調節するのに有効でありそれ故医薬においても有効である。
そのようにして、本発明の第５の側面は本発明の第１の側面に応じた医薬における使用のための化合物を提供する。
本発明の第６の側面は、本発明の第１の側面に応じた化合物を含んでいる薬学的な組成物および薬学的に許容される運搬体を提供する。
その処方は、便宜的には単位投与形態（unit dosage form）であるかもしれないし薬学の技術分野において良く知られている方法のいずれかによって調整されても良い。そのような方法は、その活性成分（本発明の化合物）を１つ又はそれ以上の補助成分と合わせるステップを含む。一般に、その処方は画一的および緊密にその活性成分を液体運搬体又は個体運搬体又はその両方と合わせることによって調整され、そこでもし必要ならばその生成物を成型する。
本発明に従った経口投与に適した調整は、カプセル、カシェット（Cachet）又はタブレットのようなその活性成分の前もって決められた量をそれぞれが含んでいる別々の単位形態として；粉末又は顆粒状として；液体又は非液体中の水溶液または懸濁液として；又はoil-in-water液体乳化物又はwater-in-oil液体乳化物としてであっても構わない。その活性成分は、丸薬、舐剤又はペーストとして提示されても良い。
タブレットは、選択的に１つ又はそれ以上の付属成分と共に圧縮又は鋳型で成型することによって作成しても良い。圧縮されたタブレットは、適切な機械において粉末又は顆粒としての流動状であるその活性成分を圧縮することによって調整されて良く、選択的に接合剤（例えば、ポビドン（povidone）、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ルブリカント（lubricant）、不活性希釈剤、保存料、ディスインテグラント（disintegrant）（例えば、ソディウムスターチグリコレート、架橋ポビドン、架橋ソディウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤又は分散試薬を混ぜても良い。鋳型で成型されたタブレットは、適切な機械において不活性希釈剤で湿らされたその粉末中化合物の混合物を鋳型で成型することによって作られても良い。そのタブレットは、選択的に被覆されたり刻み線を入られても構わないし、例えば好ましい放出特性を提供するためにヒドロキシプロピルメチルセルロースを使ってそれぞれにその活性成分のゆっくりとした又は制御された放出を提供するように処方されても良い。
口における局所的投与に適した処方は、その風味源、通常的には蔗糖およびアカシア（acacia）又はトラガカンス（tragacanth）中にその活性成分を含んでいる錠剤（lozenge）、ゼラチンおよびグリセリン、又は蔗糖及びアカシアのような不活性基盤中にその活性成分を含んでいるトローチ；及び適切な液体運搬体中にその活性成分を含んでいるうがい薬（mouth wash）を含む。
非経口的投与に適した処方は、意図された受容者の血液と等張の処方を溶かした坑酸化剤、緩衝液及び溶質を含んでも良い水溶性及び非水溶性の殺菌注射液；及び試薬及び糊料を懸濁している水溶及び非水溶殺菌懸濁液を含む。その処方は、例えば密封されたアンプル及びバイアルといった単位投与又は多数投与として与えられて良く、例えば注射のための水といった使用の直前に無菌液体運搬体だけを必要とする凍結乾燥状態で保存されても良い。即席的な注射溶液及び懸濁液が、前記の種類の無菌粉末、顆粒及びタブレットから調整されても良い。
より好まれる単位投与処方は、活性成分の連日投与又は単位、連日２次投与又は適切なその一部（fraction）を含んだ処方である。
特に上述されたその成分に加えて本発明の処方は、議論中の処方形態に関する技術分野において従来の他の試薬を含んでもよい、例えば経口投与に対して適切な処法は風味試薬を含んでも良い。
もしこの処方が、例えば創傷部位への局所投与のための処方であれば特に好ましい。
本発明のその化合物のいくつかは塩型であるということが分かるであろう。
診療で便宜状使用されても良い塩は、例えばアルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム）、アンモニウム及びNX+4（ここにおいて、ＸはC1-4アルキル）塩のような適切な塩基由来の生理学的に許容される塩基性塩を含んでいる。生理学的に許容される酸性塩は、塩酸塩、硫酸塩、メシラート、ベシラート（besylate）、リン酸塩及びグルタミン酸塩を含んでいる。
本発明に関する塩は、従来の方法として例えばその元化合物と適切な塩基とで対応した塩基性塩を形成する反応、又は適切な酸とでその対応する酸性塩を形成する反応によって調整されても良い。
本発明の前記化合物又はその処方は経口及び非経口（例えば、皮下又は筋肉内）注射を含んだ従来のあらゆる方法によって投与されて良い。その治療は、ある期間にわたる単一投与又は複数回投与で構成される。
本発明の化合物が単独で投与可能であるとしても、１つ又はそれ以上の許容される運搬体と共にそれを薬学的処方として与えることが好ましい。この運搬体は、本発明の混合物と両立可能であり且つその受容者に有害では無いという意味において”許容可能”でなければならない。典型的には、その運搬体は無菌及び発熱物質を含まない水又は塩溶液であるだろう。
本発明のさらなる側面は細胞遊走を活性調節する方法を提供し、その方法は本発明の第１に側面に従って化合物の効果的な量を細胞遊走の活性制御が必要な部位に投与することを含んでいる。
好ましい化合物は、本発明の第１の側面において好まれる物質である。
細胞遊走は、例えば細胞培養系においてといったインビトロでの本発明のこの側面の方法に対応して活性調節されて良く、又インビボにおいて活性調節されても構わない。
弱体化した細胞遊走は、創傷治癒が最善ではない診療症状の共通の特徴である；それらの症状下における細胞遊走の刺激は有用であることを証明するかもしれない。逆に、上昇した又は不適切な細胞遊走は、腫瘍進行、病理的血管形成、炎症及び線維症を含んだいくつかの病理学的な症状の特徴である。IGD生物活性の阻害因子は、これらの症状の治療において有用であることを証明するかもしれない。IGD生物活性の阻害因子は、本明細書に記載の情報に基づいて当業者に明らかな方法を使用してクリーニングされても良い。
細胞遊走活性調節は、例えば創傷治癒、誘導された（guided）歯周組織再生、腫瘍進行及び転移において望まれるものであり、それらの血管造成（新血管形成）効果のおかげで本発明の化合物は有用である。本発明の化合物は、炎症又は結合組織機能に関連して有用であるかもしれない。
そして、細胞遊走の活性調節の部位は、例えば哺乳類特にはヒトの体である動物の体であればより好ましい。その細胞遊走が活性調節されている細胞が線維芽細胞であるならばより好ましい。我々は、小胞状細胞が本発明の化合物（例えば、IGDS）に対応しているということ、チックヨークサック（chick yolk sack）分析においてIGDSが血管形成を刺激するということを示した。このようにして、本発明の化合物は弱められた創傷治癒のような症状において血管形成を刺激するためにに診療的に有用であると信じられる。
それ故、本発明は、細胞遊走活性調節が必要である動物、例えば哺乳類特にはヒト、を治療する方法を含み、その方法は本発明の第１の側面に応じた化合物の効果的な量をその動物に投与することを含む方法である。
本発明の更なる側面は、特には創傷治癒又は歯周組織再生又は腫瘍進行及び転移の阻害において又は血管形成活性調節において、細胞遊走を活性調節するための本発明の化合物の使用を提供する。
本発明の更なる側面は、動物の体内において細胞遊走を活性調節するための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
本発明はここで、以下の図及び例を参照することにより詳しく説明されるであろう
それは；
図１はネガティブコラーゲンゲル分析での細胞遊走におけるの合成ペプチド及びファイブロネクチンドメインの効果を示している。分析は例１の材料及び方法に記載されるようにして実行した。結果は遊走の”相対刺激”として表現することによって標準化され、これは前記特異的実験において得られたコントロール値によってそれぞれの実験点に対するそのゲルマトリックスの細胞の割合を分割することで計算された。データを、５つの実験の平均値±SDとして表す。明確化のために、陰影部はエラーバーを有して図面に記入されていないデータ点に対する標準偏差の広がりを示している。上部パネルは：指摘される合成ペプチドで得られた結果である。下部パネルは：天然のファイブロネクチン（FN）及びその細胞結合（Cell - BD）及びゼラチン結合（Gel - BD）ドメインで得られた結果である。
図２は、そのトランスメンブレン分析における細胞遊走での合成ペプチド及びファイブロネクチンドメインの効果を示している。分析は、例１の材料及び方法に記載されるようにして行った。５つの実験の結果を、平均値±SDとして表した。陰影部は、エラーバーを有して記入されていないデータ点に対する標準偏差の広がりを示している。パネルAは：天然コラーゲン及びゼラチンで被覆された膜状IGDS及びそのゼラチン−結合ドメイン（Gel - BD）によって得られた結果である。パネルBは：RGDS、天然ファイブロネクチン（FN）、及びその細胞結合ドメイン（Cell - BD）によって得られた結果である。
図３は、ファイブロネクチン及びIGDSのゼラチン結合ドメインの刺激活性による遊走における異なるペプチドの効果を示している。そのコラーゲンゲル分析はその指摘されたペプチドの多様な組合せの存在下において実行され、且つそのゲルマトリックス内に存在する細胞の割合は４日間の培養期間後に測定された。データを、３回の実験における平均値±SDとして表現した。パネルA：ゼラチン結合ドメイン（Gel - BD）及びIGDSの組合せ;パネルB:IGDSおよびRGDSの組合せ；パネルC：IGDS及び細胞結合ドメイン（Cell - BD）の組合せである。
図４は、その天然コラーゲンゲル分析におけるそれらの続く遊走での合成ペプチドによる細胞のプレインキュベーションの効果を示している。プラスチック製培養皿上のコンフルエント細胞は、無血清MEM（SF - MEM）で３回洗浄し、無血清MEM中で指示された濃度のIGDSと共に種々の時間培養された。それらをトリプシン処理し、その後遠心分離と無血清MEM中への再懸濁を５回繰り返すことによって洗浄した。それらのプレインキュベーション細胞の態様は、前記のIGDSの不存在下（分析中にIGDS無し、として指摘される）におけるそのコラーゲンゲル分析で評価した。データは３回の実験から得られ且つそれを平均値±SDとして表した。
図５は、ヒトファイブロネクチンの１次アミノ酸構造を示している。
ファイブロネクチンの１次構造
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構造部位
シグナルペプチド：１−２０
プロペプチド：２１ - ３１
Ｉ型繰返し：５２ - ９６，９７ - １４０，１４１ - １８５，１８６ - ２３０，２３１ - ２７２，３０８ - ３４４，４７０ - ５１７，５１８ - ５６０、５６１ - ６０８，２２９７ - ２３４１，２３４２ - ２３８５，２３８６ - ２４２８
II型繰返し：３４５ - ４０４，４０５ - ４６９
III型繰返し：６０９ - ７００，７１９ - ８０９，８１０ - ９０５，９０６ - ９９５，９９６ - １０８５，１０８６ - １１７２，１１７３ - １２６５，１３５７ - １４４７，１４４８ - １５３７，１５３８ - １６３１，１６３２ - １７２１，１８１２ - １９０３，１９０４ - １９９２，１９９３ - ２０８２，２２０３ - ２２７３
選択的（オルタナティブ）スプライシングドメイン：１７２２ - １８１１（ED - A），１２６６ - １３５６（ED - B）、２０８３ - ２２０２（IIICS）
潜在的N結合糖鎖部位：４３０，５２８，５４２，８７７，１００７、１２４４，１２９１，１９０４，２１９９
O結合型糖鎖部位：２１５５
鎖内ジスルフィド結合残基：２４５８，２４６２
RGD細胞接着部位：１６１５ - １６１８
IDAPS細胞接着部位：１９９４ - １９９８
LDV細胞接着部位：２１０２ - ２１０４
REDV細胞接着部位：２１８２ - ２１８５
ヘパリン結合部位：２０２８ - ２０４６（FN - C／HＩ）、２０６８ - ２０８２（FN - C／HII）
ＸIIIa因子トランスグルタミナーゼ架橋部位：３４
図６は、細胞濃度による３次元コラーゲンマトリックス中での線維芽細胞遊走におけるGBDおよびIGDSの効果による活性調節を示している。細胞はコンフルエント又はサブコンフルエント濃度においてまかれた。陰影部は、コントロール値の範囲を示している。
図７は、チックヨークサックメンブレン分析におけるファイブロネクチンのIGDS合成ペプチド及びゼラチン結合ドメインの血管形成活性を示している。その試験試料を含んでいる乾燥メチルセルロースペレット及びコントロールペレット（この試験試料を欠いている）が、例１の材料と方法において記載されるように６日目チック胚のヨークサック膜状に配置された。そこでの引き出された反応は、立体顕微鏡で生きた胚を観察することによって６時間後に一度検定されそして２４時間後に評価された。Ａ．陰性血管形成応答（この場合、コントロールペレットによって引き出される）；Ｂ．典型的陽性血管形成応答（この場合、１．０１gのIGDSを含んでいるペレットによって引き出される）。２４時間後における評価の後、選択された膜をｐＨ７．４で０．２ｍリン酸緩衝液中の２．５％ＥＭ級グルタルアルデヒド中において固定した。それらの調整物を１％のトルイジンで染色し、ライカ（Leica）ＤＭＬＢ顕微鏡を使って撮影した。Ｃ．固定し染色した陽性血管形成応答（この場合、１．０μｇのグルタミン結合ドメインを含んでいるペレットによって引き出される）。
図中の線は２５０μｍ
例１：ＩＧＤアミノ酸モチーフの遊走刺激活性
まとめ
ファイブロネクチンのゼラチン結合ドメインは天然のＩ型コラーゲン中での線維芽細胞遊走を刺激するが、変成したコラーゲン基質に対する細胞接着を有するような活性を欠いている。我々は、そのゼラチン結合ドメイン内の２つの部位に存在するそのIGDモチーフが同様の基質依存性活性を示すということを実施した。μＭ濃度のIDG含有合成ペプチドは、天然型の（しかし、変成していない）コラーゲン基質中において以下の順で線維細胞遊走を刺激した：IGDS＞IGDQ＞IGD。この関連するRGDSペプチドはそれ自身における細胞遊走には影響していなかったが、投与依存形態でIGDSのその生物活性を阻害した。更にIGDSの不存在下において分析したとき、IGDSと共にプレインキュベーションされた細胞は細胞遊走の持続性刺激を示した。IGDS生物活性のこの特徴は、細胞遊走持続的刺激を導くその後期イベントから別にIGDSの働き（例えば、受容体及び後期接合（post-ligation）シグナリング）を研究するための方法を提供する。従って、細胞をIGDS及び阻害因子の多様な組合せと共に培養したその組合せは、（ａ）IGDSの働きの初期及び後期イベントの両方がインテグリンサブユニット（β1及びβ3）及びヘテロダイマーαvβ3に対する機能阻害抗体だけではなく、RGDSによっても効果的に阻害されるということ（ｂ）その”クラシック”ファイブロネクチン結合インテグリンα5β1に対する抗体の中立化は効果が無かったということ、そして（ｃ）PKAのみの阻害は後期イベントに影響したが、チロシンキナーゼ活性の阻害はIGDSの働きの初期イベントを阻害し、MAPキナーゼの阻害は初期及び後期イベント両方を阻害した、ということを指摘した。さらにインビボでの研究が、IGDS合成ペプチドがそのチックヨークサックメンブレンにおいて血管形成応答を引き出したということを示した；対照的に、RGDS及びRGESペプチドは同様の実験条件において不活性であった。IDG合成ペプチドによる（インビボ及びインビトロ両方において）生物学的活性の発現は、その良く研究されたRGDS断片が不活性なことに対して明らかに対照的である、そして診療的に関連する試薬の新規なファミリーを改良する可能性を開いている。
材料と方法
化学物質．この合成ペプチドは、ユニバーシティオブダンディー生化学科において９９％以上の純度に調整された。ファイブロネクチン及びその細胞結合及びゼラチン結合ドメインは前述のようにして精製された7。そのインテグリンサブユニットα２（cat. no. MCA743）及びβ１（MCA1188）に対するモノクローナル抗体はセロテック（Serotec）（オックスフォード、英国）によって提供された；β３（MAB1957）、αvβ３（MAB1976）及びα５β１（MAB1969）に対する抗体はケミコン（Chemicon）（Harrow、英国）によって提供された；α５β１（M0604）はダコ（Dako）（High Wycombe、英国）によって提供された。Genistein（cat. no. 34583−Q）及びPD98059（cat.no.178278-Q）はCalbiochem, Nottinghamから買い入れた。PKA阻害因子ペプチド（cat. no. P6062）はSigma Chemical Co（Poole, Dorset, 英国）から買い入れた。
細胞．実験を、Hoechst 33256で染色することによってマイコプラズマ混入の無いことが示されたヒト皮膚線維芽細胞（SK319およびFSF44、パッセイジ（passage）10 - 18間）の２系統を用いて実行した。同一の結果が両系統から得られた、結果的にはそれらの細胞は図において個々に同定されるものではない。保存培養は、前述されたようにイーグル最小栄養培地（MEM）中において保存された7。
遊走分析．そのコラーゲンゲル分析において、前もって形成された２mlのゲルを、無血清MEM（コントロール）または好ましい最終濃度とするためのエフェクター分子の必用濃度を含んでいる無血清MEMの１mlと共に配置した。トリプシン処理した線維芽細胞を無血清MEMに懸濁し２x１０5mlの接種物とした、そしてその１mlを重複測定（replicate）コントロール及び試験ゲル上に塗布した。３７℃で４日間の培養期間後、そのゲルの表面及び３次元マトリックス中の細胞を１５回の無作為選択領域において顕微鏡観察によって計数し、それらのデータをそのゲルマトリックス中の現存する前細胞の割合を計算するために使用した6。
ポリカルボネイト．このトランスメンブレン分析において使用した膜を、天然のＩ型コラーゲンあるいは熱変成Ｉ型コラーゲン（ゼラチン）のいずれかを１０μg／ml含有している水溶性溶液中において一晩３７℃で浸漬し、その後風乾した。分析は前述されたように実行した7。
チックヨークサックメンブレン血管形成分析．この分析は本質的には、Gush等（1990）J. Med. Engineer. Tech. 14, 205-209の記載のように実行した。したがって、受精四日後の卵をタンブラーに分割し、ペトリ皿で覆いそして３７℃で培養した。２日後に、その試験試料を含んでいる乾燥したメチルセルセルロースペレット及び（この試験試料を欠いている）コントロールペレットをそのヨークサック膜上に配置した。その誘導された血管形成反応を、２４時間後に立体顕微鏡で生きた胚を観察することによって評価した。選択した膜を０．２Mリン酸緩衝液（pH７．４）中の２．５％ＥＭ級グルタルアルデヒド中で固定し、１％トルイジンブルーで染色しそして光学顕微鏡のためのスライドガラス上に載せた。
結果及び考察
そのゼラチン結合ドメインそのアミノ酸配列の調査は、それがその第７及び第９Ｉ型繰返しモジュールにそれぞれ位置する２つのIGDモチーフを有するということを明らかにした。このIGDモチーフはそのＩ型モジュール8の特徴が高度に保存されておりそしてその主要Ｉ型ループのそのアペックスでの位置はその第１０III型繰返し9におけるそのRGDモチーフの配置に相同的であるので、これは特に興味深い。適切なIGD含有合成ペプチドを合成し、そしてヒト皮膚線維芽細胞の遊走におけるその効果をそのコラーゲンゲル分析において調べた。図１Ａにまとめられた結果は、IGDS（第９Ｉ型モジュールにおいて存在）、IGDQ（第７Ｉ型モジュールに存在）及びIGDが、天然Ｉ型コラーゲン中において投与依存形態で細胞遊走を刺激したことを指摘している。比較可能活性はIGDによっては１０ - １００μｍで始めて明らかになったが、IGDSおよびIGDQにおいては０．１μｍの濃度で十分な生物活性を発現した。IGDSはベル型投与応答を示した；これはIGDQあるいはIGDのいずれにおいても調査された濃度範囲にいては得られないものであった。構造的には適切なそのRGDSテトラペプチドはその天然型コラーゲンゲル分析においては遊走刺激活性を欠いていた。タンパク質的（proteolytically）に生産され精製されたファイブロネクチンフラグメント（図１Ｂ）から得られた比較結果は、天然ファイブロネクチン及びその精製された細胞結合ドメインは不活性であるが、その同様の濃度範囲7において試験されたときそのゼラチン結合ドメインは十分な遊走刺激活性を示す、という我々の先行する観測を追認した。図１Ａ及びＢにおいて存在するデータの比較はさらに、細胞遊走刺激を誘導するためにはマイクロＭ濃度範囲のIGDを含んでいる合成ペプチドが要求されるということは、より大きいそのゼラチン結合ドメインにおいて要求されるフェムトＭ濃度範囲よりも数桁高い濃度であるということを指摘する。これらの観測は、IGDのその推定上の細胞表面受容体に対する認識促進及び／又は結合においてそのゼラチン結合ドメイン内の他のアミノ酸モチーフの関係を提起している。この流れの中で、Aota等10はその細胞結合ドメインの第９III型モジュールにおけるそのPHSRN配列がRGD依存生物学的活性に対する”相乗効果的”モチーフのようなものであることを報告している。
IGD含有合成ペプチドのその遊走刺激活性における天然及び変成Ｉ型コラーゲン基質の効果をそのトランスメンブレン分析において評価した。図２Ａにおいて表されるデータは、IGDSが天然コラーゲンで覆われた膜を介して細胞遊走を刺激したが、ゼラチン被覆膜上での活性を欠いていたということを指摘している。同様の結果が、IGDQ及びIGDでも得られた（データは示さない）。これらの観測は、IGD含有合成ペプチドの生物活性が（ａ）細胞の天然コラーゲン基質への接着に依存しており、且つ（ｂ）この基準の条件に含まれるより大きいそのゼラチン結合ドメインの生物活性に類似していることを指摘する。IGD活性のその基質依存性に対応するその機構はまだ決定されるべきものとして残っている。これに関して、天然コラーゲン基質への細胞接着は、特に細胞遊走（例えば、pp125FAKの脱リン酸化およびＰＫＣ - ζの活性）11,12の活性調整に潜在的に関連する多くの細胞的な処理に関係するかもしれない。
図２Ｂにおいて表されるデータは、天然ファイブロネクチン及びその精製された細胞結合ドメインがゼラチン（先の研究で報告されたように）で被覆された膜を介して細胞遊走を刺激することおよびそのPGDS合成ペプチドがコラーゲン及びゼラチン被覆膜の両方において不活性であることを確認している。
IGDS及びその含まれるゼラチン結合ドメインの可能な機構的関係を、それぞれの二次最適化（suboptimal）濃度で細胞を共培養することによってさらに調査した。図３Ａに表される結果は、細胞遊走におけるそのゼラチン結合ドメイン内のそのIGDモチーフがまさに細胞遊走のその刺激に応答しているという仮説と一致する付加的効果をこれらの２つのペプチドが誘導したことを示している。この付加的効果は特に、０．１ｆＭのGBD及び０．０１μＭ（１０7ｆＭ）のIGDSにおいて明らかであった、それらは一方のみでは不活性だが、組み合わせることで活性化する。
IGDS及びRGDSの間における相互作用の可能な機構を同様の共培養実験において研究した。図３Ｂにおいて表される結果はRGDSが効果的にIGDSの遊走刺激活性を阻害することを指摘する。ファイブロネクチン（それはそのRGDSモチーフを含んでいる）のその細胞結合ドメインはIGDS活性を阻害した（図３Ｃ）。予想されるように、IGDS活性の阻害は、RGDSの要求するμＭ濃度と比較するとかなり低い（ナノＭ）濃度で達成された。RGDSと同様の濃度範囲で試験した場合（データは示さない）、そのRGDS合成ペプチドはIGDS遊走刺激活性に効果を有さなかった。
多くのファイブロネクチンの生物学的活性は、それらはファイブロネクチンのプロテオリティックな断片によって示されるのであってその完全な分子5,13によってではないという意味において”潜在的（cryptic）”である。Fukai等14は、それらの不可解な活性のその発現は天然ファイブロネクチンの変成あるいは／及びその限定されたプロテオリティックな機能ドメインへの分解が活性発現のために必要であるということを実証した。これらの著者等は立体妨害の開放は、これらの働きによる隠れた生物学的活性の遮蔽に基づいているかもしれないと提起している。そのRGDSアミノ酸モチーフによるIGDS誘導細胞遊走の阻害は、天然ファイブロネクチンにおけるIGDS活性の明らかな欠損に対する付加的な機構を提供するかもしれない（図１Ｂ）。
我々は先に２４時間ファイブロネクチンのゼラチン結合ドメインとともにプレインキュベーションした細胞が続いてその不存在下において天然コラーゲンゲル上に配置されたとき遊走活性の上昇を示したことを報告した。図４に表されたデータは、細胞遊走におけるIGDSの効果が類似的に持続するものであり、そしてプレインキュベーションの時間およびペプチド濃度の両方に依存しているということを示している。この上昇した遊走態様はインビトロにおいて１−２パッセイジに続くプレインキュベーション細胞によってまだ発現される（データは示さない）。
IGDS生物活性の維持は、働きのその方式がIGDS（受容体結合及び結合後シグナリングのような）の存在に依存している初期イベント及びもはやIGDSの存在を要求していない後期イベントの一連の事象そして持続的遊走表現系の安定化における究極的な結果に関連することを提起している。初期及び後期イベントなどにおける潜在的阻害分子のその特異的効果は、以下の実験プロトコルを使うことによって調査された：（ａ）IGDS及び阻害因子と共に細胞をプレインキュベーションすること及びその後それらの処理された細胞をIGDS及び阻害因子の両方の不存在下において分析すること（注記：このプロトコルは、IGDS活性を仲介しながら初期イベントにおける阻害因子の効果に関するデータを提供する）、（ｂ）細胞をIGDSあるいは阻害因子のいずれも存在しない中でプレインキュベーションすること及びそれらの両方の存在下で分析すること（初期及び後期イベントの両方における阻害因子の効果）、（c）IGDSのみとともにプレインキュベーションすること及びその後それを阻害因子のみの存在下において分析すること（後期イベントにおける阻害因子の効果）、（ｄ）阻害因子のみと共に細胞をプレインキュベーションすること及びその後データの解釈を混同させるであろう阻害因子の有り得る持続的効果に関するコントロール情報を提供するためにIGDSの存在下においてそれらを分析すること。テーブル１Ａにおいて表されるデータはその合成RGDS及びRGESの効果に関する。我々の結果は、RGDSがIGDS細胞シグナリング及び続く細胞遊走の両方を阻害したことを指摘する。RGESは全ての実験条件下において不活性だった。コントロールデータ（プロトコル”（ｄ）”）は両方のペプチドがIGDS活性において持続的効果を有していなかったことを指摘していた；調査されたその他の阻害因子の全てが同様にそのような潜在的な紛らわしい活性を有してはいたわけではない（データは示さない）。
IGDS誘導細胞遊走におけるRGDSの阻害効果は、受容体結合における競合によって引き起こされるのかもしれない。この可能性に関連するデータを手に入れる目的で、我々はインビトロにおいてヒト皮膚線維芽細胞が発現するいくつかのインテグリンに対する中和抗体の効果を調査しようとして上記のプレインキュベーションプロトコルを用いた15。我々のデータは、そのα2インテグリンサブユニットを認識するそのモノクローナル抗体がIGDSによって誘導される細胞遊走を阻害したが、初期IGDSシグナリング（テーブル１Ｂ）には影響しなかったことを指摘している。この観測は、細胞のコラーゲンに対する接着仲介におけるα2β1の役割及びこの基質における細胞遊走を支えている関係に一致している16。そのインテグリンサブユニットα1およびβ3に対してだけではなくαVβ3ヘテロダイマーに対する抗体が、IGDSシグナリング及び続く細胞遊走の両方の初期イベントを阻止することが分かった。そのαVβ3ヘテロダイマーはそのRGDSモチーフを認識するが、そのβ1およびβ3サブユニットはRGDSを認識するいくつかのインテグリンヘテロダイマー中に存在している15,17。いくつかの先行する研究が細胞遊走の仲介におけるそれらのインテグリンを暗示している16,18。この流れにおいて、そのαVβ3ヘテロダイマーは変成した（しかし天然ではない）コラーゲン中において露出RGD部位に結合することが示されるべきであろう19；αVβ3による変成及び天然Ｉ型コラーゲンのこの相違（differential）結合はここで報告されるIGD含有ペプチドへの線維芽細胞遊走応答の基質依存特性に帰属するかもしれない。その”クラシック”ファイブロネクチン結合α5β1インテグリンに対する２つの抗体は、IGDS誘導細胞遊走に影響しなかった（テーブル１Ｂ）。それらの観測は、インテグリンα5β1が好ましくは遊走というよりもむしろ細胞接着を仲介することを提起する先行する報告と一致している20。最近の研究は、基質、リガンド濃度及び細胞遊走のコントロールにおけるインテグリン機能との間の相互作用を強調している21,22；これらの複雑な因子は、IGD結合及びその結果の基質依存生物学的活性に繋がるその結合後イベントに関連する正確なインテグリン受容体の同定において考慮される必要があるだろう。
シグナルトランスダクション阻害因子により得られた結果は、そのチロシンキナーゼ阻害因子Genisteinは選択的にIGDS誘導細胞シグナリングを阻害したが、細胞遊走には影響しなかった（テーブル１Ｃ）ことを指摘している。この発見は、インテグリンシグナルトランスダクションの仲介において接着接合（adhesion-associated）チロシンキナーゼ（pp125FAKのような）の役割と一致している23。そのMAPキナーゼ阻害因子PD98059は、インテグリン結合によるそのMAPキナーゼカスケードの先に報告された活性を保ちながら、シグナルトランスダクション及び細胞遊走の両方を阻害した24。対照的に、そのPKA阻害因子は細胞遊走を阻害したが、初期IGDS依存イベントには影響しないようであった。
RGDに加えて、ファイブロネクチンにおける他のアミノ酸配列は細胞接着及び遊走を仲介することが報告されている；それらはLDV、REDV及びIDAPSを含む17。全てのそれらのモチーフは、そのそれぞれの可溶性合成ペプチドによって遊走刺激活性が維持されなかったRGDと類似であった。IGD含有合成ペプチドの遊走刺激活性はこの意味で独自のもののようである。生物学的活性は前もってファイブロネクチンにおいて保存されるそのIGDモチーフに帰属されているが、先の研究は細胞外ファイブロネクチンマトリックスの構造において第９Ｉ型繰返し（そのIGDS配列を含んでいる）を暗示している25。ここで示されるデータはこの流れにおいて関連するかもしれないし、かつIGDS結合において機能するかもしれないいくつかのインテグリンを提起するかもしれない。
RGD含有ペプチドのその遊走阻害活性は多くの潜在的診療的応用を有している26,27。構造機能研究は、保存及び非保存アミノ酸置換、タンデムアミノ酸伸長及び環状化が十分にこれらの状況においてそのRGDモチーフの生物学的活性を活性調節するということを指摘してきた28,29。IGD含有合成ペプチドの逆遊走刺激活性が、弱くなった創傷治癒のような診療的に関連する症状において細胞遊走を促進する治療試薬の新しいファミリーを改良するための類似的な基盤を提供するかもしれない。
例２：ラット創傷治癒モデルにおける血管形成応答
そのIGDSペプチドは線維芽細胞遊走及び誘導、及びラット創傷治癒モデルにおける血管形成応答を刺激することが示されてきた。この実験系において、コントロール培地あるいは試験基質を指摘された濃度で含んでいる培地のいずれかをしみ込ませたしたブタ皮膚コラーゲンフィルムの１ｃｍ2片がラット内に皮下移植された。この動物は２８日後に殺されそしてその取り除かれたコラーゲン移植片が固定されそしてイメージ分析のために断片化された。以下のデータが得られたが、それはIGDSが線維芽細胞のそのコラーゲンフィルム中への遊走及び血管形成応答を刺激したことを指摘している。
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引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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