(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含む２１〜４９塩基長のポリヌクレオチドであって、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得るｓｉＲＮＡを提供することができることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２６に示される塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
固形腫瘍を処置するための医薬用組成物であって、
配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含む２１〜４９塩基長のポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得る二本鎖ＲＮＡ；
該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または
該ＤＮＡが挿入されたベクター
のいずれか１つを含有していることを特徴とする医薬用組成物。
【請求項４】
第２のＲＮＡをコードするＤＮＡが、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求の範囲３に記載の医薬用組成物。
【請求項５】
第２のＲＮＡが配列番号２９に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることを特徴とする請求の範囲３に記載の医薬用組成物。
【請求項６】
第１のＲＮＡが配列番号３０に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることを特徴とする請求の範囲３に記載の医薬用組成物。
【請求項７】
前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号２７に示される塩基配列を含んでいることを特徴とする請求の範囲３に記載の医薬用組成物。
【請求項８】
前記二本鎖ＲＮＡが、配列番号２９に示される塩基配列を含むＲＮＡと配列番号３０に示される塩基配列を含むＲＮＡとが対合してなることを特徴とする請求の範囲３に記載の医薬用組成物。
【請求項９】
固形腫瘍を処置するための医薬用キットであって、
配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含む２１〜４９塩基長のポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得る二本鎖ＲＮＡ；
該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または
該ＤＮＡが挿入されたベクター
のいずれか１つを備えていることを特徴とする医薬用キット。
【請求項１０】
固形腫瘍を処置するための医薬を製造するための二本鎖ＲＮＡの使用であって、
該二本鎖ＲＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含む２１〜４９塩基長のポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得るものであり、
該医薬は、固形腫瘍を形成する細胞に対して投与された際に該二本鎖ＲＮＡが発現可能となるものである
ことを特徴とする使用。
【請求項１１】
前記投与が、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含むポリヌクレオチドを挿入したベクターの、目的の細胞への導入によることを特徴とする請求の範囲１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＴ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡおよびその利用に関するものであり、より詳細には、本発明は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いた固形腫瘍の増殖抑制および細胞死誘導に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１遺伝子）は、ジンクフィンガー型の転写因子をコードする遺伝子である。ＷＴ１遺伝子は、ＷＴ１遺伝子のエキソン５からなる１７アミノ酸（１７ＡＡ）部位およびジンクフィンガー３とジンクフィンガー４との間の３アミノ酸（ＫＴＳ）部位の２ヶ所で選択的スプライシングを生じ、その結果、４つのアイソフォーム（１７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（＋）、１７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（−）、１７ＡＡ（−）ＫＴＳ（＋）および１７ＡＡ（−）ＫＴＳ（−））を生じることが知られており、これら４つ全てがヒト固形腫瘍および白血病細胞において発現している（例えば、非特許文献１および２を参照のこと）。【０００３】
ＷＴ１遺伝子は、従来は癌抑制遺伝子と考えられていたが、近年、癌遺伝子として機能しているという知見が示されている。例えば、本発明者らは、変異を有していない野生型ＷＴ１遺伝子がほとんど全ての白血病細胞において高発現されており、その発現レベルは白血病患者の予後と逆相関を示すこと（例えば、非特許文献３および４を参照のこと）、ＷＴ１アンチセンスＤＮＡを導入することにより白血病細胞の増殖が特異的に抑制されたこと（例えば、非特許文献５を参照のこと）、マウス正常骨髄系前駆細胞および骨髄系前駆細胞株３２Ｄ  ｃｌ３が、ＷＴ１遺伝子を強制発現させることにより好中球への分化が抑制されて増殖すること（例えば、非特許文献６を参照のこと）をこれまでに報告し、ＷＴ１遺伝子が造血系細胞の白血病化に関与していることを示している。また、本発明者らは、野生型ＷＴ１遺伝子が、種々の固形腫瘍において高発現していることも報告している（例えば、非特許文献７〜１４を参照のこと）。【０００４】
上述した４つのアイソフォームはそれぞれ異なる機能を有していると考えられている。例えば、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（＋）アイソフォームは、癌細胞の増殖に寄与していると考えられており（非特許文献１５を参照のこと）、１７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（−）アイソフォームは、悪性リンパ腫の腫瘍形成に関与していると考えられている（非特許文献１６を参照のこと）。【０００５】
近年、本発明者らは、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームに特異的なｓｉＲＮＡが、ＷＴ１を発現する白血病細胞株に対してアポトーシスを誘導することを示した（非特許文献１７を参照のこと）。
【非特許文献１】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １００：２９７（２００２）
【非特許文献２】Ｓｉｅｈｌ  Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  ８３：７４５（２０００）
【非特許文献３】Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８４：３０７１（１９９４）
【非特許文献４】Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：１４０５（１９９７）
【非特許文献５】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：２８７８（１９９６）
【非特許文献６】Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：２９６９（１９９８）
【非特許文献７】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９０：１９４（１９９９）
【非特許文献８】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；１００：２９７−３０３（２００２）
【非特許文献９】Ｕｅｄａ  Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：２７１（２００３）
【非特許文献１０】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：５２３（２００３）
【非特許文献１１】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：６０６（２００３）
【非特許文献１２】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９４：７１２（２００３）
【非特許文献１３】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ５１：１７（２００４）
【非特許文献１４】Ｏｊｉ  Ｙ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３４：７４（２００４）
【非特許文献１５】Ｈｕｂｉｎｇｅｒ  Ｇ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １０：  １２２６−１２３５（２００１）
【非特許文献１６】Ｌｉ  Ｈ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７７：  ４６３−４７０（２００３）
【非特許文献１７】Ｉｔｏ  Ｋ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ；Ｍａｒ  ６：１（２００６）
【非特許文献１８】Ｅｎｇｌｅｒｔ  Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：  １４２９−１４３４（１９９７）
【非特許文献１９】Ｌｏｅｂ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：  ９６５−９７１（２００３）。
【発明の開示】
【０００６】
上述したように、癌遺伝子様機能を担っているＷＴ１の機能を抑制することにより、癌細胞特異的に分子標的治療を行い得ると考えられる。しかし、これまでに行われているＷＴ１遺伝子の発現を抑制する方法として用いられているアンチセンスオリゴＤＮＡ技術またはリボザイム技術では、ＷＴ１遺伝子の発現抑制効率および特異性について十分な効果が得られなかった。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＷＴ１の機能を首尾よく制御する、癌細胞特異的な分子標的治療を実現することにある。
【０００８】
上述したように、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームについては、癌遺伝子様機能が示されているが、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）ＫＴＳ（＋）アイソフォームについては、その機能は未だ不明であるが、１７ＡＡ（−）ＫＴＳ（−）アイソフォームについては、骨肉腫細胞においてＧ１アレストを誘導すること（非特許文献１８を参照のこと）および骨髄系前駆細胞株３２Ｄ  ｃｌ３細胞においてＧ１／Ｓ期の進行を阻害して分化を促進することが報告されている（非特許文献１９を参照のこと）。また、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームに特異的なｓｉＲＮＡはＷＴ１を発現する白血病細胞株およびＷＴ１を発現していないリンパ腫細胞株に対してアポトーシスを誘導しなかった（非特許文献１７を参照のこと）。
【０００９】
本発明者らは、固形腫瘍由来の細胞においてＷＴ１  １７ＡＡ（−）ＫＴＳ（−）アイソフォームが、アクチン結合タンパク質（コフィリン、アクチニン、ゲルソリン）の発現レベルを調節して細胞骨格を変化させ、その結果、細胞の形態変化、インビトロでの細胞運動の亢進、および細胞浸潤能の亢進を誘導するという、癌遺伝子様の機能を発揮することを初めて明らかにし、さらに、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害することにより腫瘍細胞特異的に細胞死を誘導し得ることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含んでいることを特徴としており、配列番号２６に示される塩基配列からなることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記構成を有することにより、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得るｓｉＲＮＡを提供することができる。
【００１２】
本発明に係る医薬用組成物は、固形腫瘍を処置するために、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡ；該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または、該ＤＮＡが挿入されたベクター、のいずれか１つを含有していることを特徴としている。
【００１３】
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームについてのこれまでの報告に鑑みれば、癌抑制遺伝子として機能すると考えられているＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡが癌抑制機能を発揮することは予想され得ることではなかった。
【００１４】
本発明に係る医薬用組成物において、第２のＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る医薬用組成物において、第２のＲＮＡは配列番号２９に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましい。
【００１６】
本発明に係る医薬用組成物において、第１のＲＮＡは配列番号３０に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る医薬用組成物において、上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは配列番号２７に示される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る医薬用組成物において、上記二本鎖ＲＮＡは、配列番号２９に示される塩基配列を含むＲＮＡと配列番号３０に示される塩基配列を含むＲＮＡとが対合してなることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る医薬用組成物において、上記細胞は、膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌（例えば、扁平上皮細胞頭頚部癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、消化管腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃癌、小腸腫瘍、大腸腫瘍、神経膠腫、および中皮腫などからなる群より選択されることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る医薬用キットは、固形腫瘍を処置するために、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡ；該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または、該ＤＮＡが挿入されたベクター、のいずれか１つを備えていることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る固形腫瘍を処置する方法は、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを、固形腫瘍を形成する細胞に対して発現可能に投与する工程、を包含することを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る固形腫瘍を処置する方法において、上記投与する工程は、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含むポリヌクレオチドを挿入したベクターの、目的の細胞への導入によることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る細胞死誘導剤は、固形腫瘍を形成する細胞にアポトーシスを誘導するために、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡ；該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または、該ＤＮＡが挿入されたベクター、のいずれか１つを含有していることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る細胞死誘導剤において、第２のＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る細胞死誘導剤において、第２のＲＮＡは配列番号２９に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る細胞死誘導剤において、第１のＲＮＡは配列番号３０に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る細胞死誘導剤において、上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは配列番号２７に示される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る細胞死誘導剤において、上記二本鎖ＲＮＡは、配列番号２９に示される塩基配列を含むＲＮＡと配列番号３０に示される塩基配列を含むＲＮＡとが対合してなることが好ましい。
【００２９】
本発明に係る細胞死誘導剤において、上記細胞は、膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌（例えば、扁平上皮細胞頭頚部癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、消化管腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃癌、小腸腫瘍、大腸腫瘍、神経膠腫、および中皮腫などからなる群より選択されることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る細胞死誘導用キットは、固形腫瘍を形成する細胞にアポトーシスを誘導するために、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡ；該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または、該ＤＮＡが挿入されたベクター、のいずれか１つを備えていることを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る細胞死を誘導する方法は、固形腫瘍を形成する細胞にアポトーシスを誘導するために、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを、細胞に対して発現可能に投与する工程、を包含することを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る細胞死を誘導する方法において、上記投与する工程は、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含むポリヌクレオチドを挿入したベクターの、目的の細胞への導入によることが好ましい。
【００３３】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１ａ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、ＴＹＫ卵巣癌細胞における形態学的変化の誘導を示す図であり、４つのＴＹＫ細胞株（各々が異なる４つのＷＴ１アイソフォームを導入している）におけるＷＴ１タンパク質の発現を示すウエスタンブロット解析の結果を例示的に示す。
【図１ｂ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、ＴＹＫ卵巣癌細胞における形態学的変化の誘導を示す図であり、ＴＹＫ細胞における各ＷＴ１アイソフォームの安定的な発現による細胞形態の変化を例示的に示す。
【図１ｃ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、ＴＹＫ卵巣癌細胞における形態学的変化の誘導を示す図であり、３つの細胞クローンからの８個以上の個々の細胞の相対的な面積の平均を示す。
【図２ａ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、種々の型の癌細胞における形態学的変化の誘導を示す図であり、ＧＦＰタグを付加したＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを、種々の型のガン細胞（例えば、ＺＲ−７５、ＨＴ−１０８０、ＭＫＮ２８、ＳＫＢｒ３およびＴＥ１０）に一過性に発現させ、トランスフェクションの４８〜７２時間後の細胞を、共焦点顕微鏡を使用して形態学的に解析した。
【図２ｂ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、種々の型の癌細胞における形態学的変化の誘導を示す図であり、９個以上の個々の細胞の相対的な面積の平均を示す。
【図３ａ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの安定的な発現による、細胞−基質間接着の抑制を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、細胞接着アッセイにより細胞−基質間接着について解析した。
【図３ｂ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの安定的な発現による、細胞−基質間接着の抑制を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、細胞剥離アッセイにより細胞−基質間接着の強度について解析した。
【図４ａ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による細胞移動の増強を示す図であり、ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現している個々のＴＹＫ細胞の運動または発現していない個々のＴＹＫ細胞の運動を、Ｔｉｍｅ  ｌａｐｓｅビデオレコーダを用いて２分間隔で５時間記録した。細胞の速度を算出した。
【図４ｂ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による細胞移動の増強を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム発現ベクターを導入したＴＹＫ細胞（■）またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞（□）を、創傷治癒アッセイによって集団的な移動について解析した。
【図４ｃ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による細胞移動の増強を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム発現ベクターを導入したＴＹＫ細胞（■）またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞（□）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって、５％ＦＢＳを含むＤｅｌｂｕｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍに対する走化性について解析した。
【図５ａ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、Ｆ−アクチン、接着斑タンパク質ビンキュリンおよび核について免疫組織染色した結果を示す。
【図５ｂ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、コントロールベクターを導入した個々の細胞からの溶解物（レーン１および２）、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した個々の細胞からの溶解物（レーン３および４）を、総アクチン、Ｆ−アクチン、α−チュブリンまたはＧＡＰＨに特異的な抗体でイムノブロットした。
【図５ｃ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、コントロールベクターを導入した、個々に単離したＴＹＫ細胞クローン（ｎ＝３、レーン１〜３）またはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した、個々に単離したＴＹＫ細胞クローン（ｎ＝３、レーン４〜６）におけるｍＲＮＡの発現を、表１に示した条件下でＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【図５ｄ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、コントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞クローン（レーン１および２）またはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞クローン（レーン３〜４）を、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。
【図５ｅ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームまたはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンについて免疫組織染色し、細胞の核をヨウ化プロピジウムで染色した。
【図５ｆ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、コントロールベクターまたはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＨＴ−１０８０細胞クローンを、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。
【図５ｇ】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、繊維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図であり、コントロールベクターまたはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＥ１０細胞クローンを、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。
【図６ａ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、α−アクチニンおよびコフィリンの発現レベルをウエスタンブロット分析により決定した結果を示す。
【図６ｂ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、細胞をＭａｙＧｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した結果を示す。
【図６ｃ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して細胞の面積を算出した結果を示す（１：ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞クローン；２および３：それぞれ異なるＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞クローン）。
【図６ｄ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、剥離アッセイにより決定した細胞−基質間接着を示す。
【図６ｅ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、創傷治癒アッセイにより評価した集団的な細胞移動を示す。細胞移動を、異なる３つの部位での最初の細胞を剥離した幅に対する突出長の割合（パーセント）の平均として決定した。
【図６ｆ】α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトし、ウエスタンブロット分析により決定したゲルソリンの発現レベルを示す。
【図７ａ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、ウエスタンブロット分析により決定したゲルソリンタンパク質の発現レベルを示す。
【図７ｂ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、細胞をＭａｙＧｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した結果を示す。
【図７ｃ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞クローンおよびＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ細胞クローンの面積をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した結果を示す。
【図７ｄ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、剥離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）アッセイによって決定した細胞−基質間接着を示す。
【図７ｅ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、創傷治癒アッセイにより評価した集団的な細胞運動性を示す。
【図７ｆ】ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図であり、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入し、ウエスタンブロット解析により決定したα−アクチニン１およびコフィリンの発現レベルを示す。
【図８】細胞骨格ダイナミクスの調節におけるＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの役割の可能性を示す図である。
【図９】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡベクターの標的部位を示す概略図である。
【図１０】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡベクターの導入による、ＷＴ１発現細胞またはＷＴ１非発現細胞におけるアポトーシス誘導の有無を示す図である。
【図１１】ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現の抑制による、ヒト腫瘍細胞を皮下に移植したマウスでの腫瘍形成の抑制を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
〔１〕ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡ
本発明は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡを提供するためのポリヌクレオチドに関する。【００３６】
近年、分子標的治療法としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術が注目されている。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始されるＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡによって相同なＲＮＡの分解が引き起こされる、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングプロセスである。【００３７】
ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的な発現抑制を行うためには十分な長さを有していることが必要とされるが、哺乳動物細胞中での悪影響を回避するために十分に短いことが必要とされる。よって、ｓｉＲＮＡは、１５〜４９塩基長からなるヌクレオチドの塩基対であることが好ましく、１５〜３０塩基長からなるヌクレオチドの塩基対であることがより好ましい。【００３８】
すなわち、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むことを特徴としている。上述したように、ＷＴ１遺伝子は、２ヶ所で選択的スプライシングを生じ、４つのアイソフォーム（１７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（＋）（配列番号３２および３３）、１７ＡＡ（＋）ＫＴＳ（−）（配列番号３４および３５）、１７ＡＡ（−）ＫＴＳ（＋）（配列番号３６および３７）および１７ＡＡ（−）ＫＴＳ（−）（配列番号３８および３９））を生じることが知られている。配列番号２６および配列番号２７に示される塩基配列は、１７ＡＡでの選択的スプライシングによって生じるので、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記構成を有することにより、ＷＴ１  １７ＡＡ（＋）アイソフォームの発現を阻害することなく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に阻害し得るｓｉＲＮＡを提供することができる。【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。【００４０】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００４１】
ポリヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。【００４２】
本発明に係るポリヌクレオチドを用いて提供されたｓｉＲＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡであることが好ましいが、二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとして提供されても、または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクターとして提供されてもよい。【００４３】
本明細書中で使用される場合、「ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡ」は「１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡ」と交換可能に使用される。１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは，標的配列として上記ポリヌクレオチドが提供されているので、当該分野において公知の任意の方法に従えば容易に作製され得、例えば、化学合成されても、組換え発現されてもよい。【００４４】
上述したように１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは、１５〜４９塩基長からなるヌクレオチドの塩基対であることが好ましく、１５〜３０塩基長からなるヌクレオチドの塩基対であることがより好ましい。なお、本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡにおいて、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合している部分以外は、完全に対合している必要はなく、ミスマッチなどの不対部分が存在してもよい。【００４５】
また、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは、その末端部分が突出していてもいなくてもよく、突出している場合は、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る塩基数であれば限定されない。【００４６】
好ましくは、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡにおいて、第２のＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。【００４７】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法に従って行われ得る。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、検出用プローブとしても有用である。【００４９】
１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡとして提供される場合、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは、配列番号２９に示される塩基配列を含むＲＮＡと配列番号３０に示される塩基配列を含むＲＮＡとが対合してなることが好ましい。【００５０】
また、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡが該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターとして提供される場合、第２のＲＮＡは配列番号２９に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましく、第１のＲＮＡは配列番号３０に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基を含んでいることが好ましい。また上述したヘアピン（ステムループ）状のＲＮＡを生成するために、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡ（またはこれらをコードするＤＮＡ）は配列番号３１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドで連結されていることが好ましいがこれに限定されない。【００５１】
ｓｉＲＮＡ発現ベクター、すなわち、ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡを外来ＤＮＡ断片として挿入してなるＤＮＡベクターを用いれば、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを体内で効果的に発現させかつ作用させることができる。このようなＤＮＡベクターとしては、当該分野において公知の種々のベクター系が適宜選択され得る。なお、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡ断片は、当該分野において公知の方法に従えば容易に調製され得る。【００５２】
上述した発現ベクターとしては、プロモータの下流に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に対応するＤＮＡ配列とアンチセンス鎖に対応するＤＮＡ配列が１本のＤＮＡにコードされている「ヘアピン型」または「ステムループ型」が知られており、このようなベクターに挿入されたＤＮＡ断片は、体内で転写されてヘアピン（ステムループ）状のＲＮＡを生成し、酵素反応によってｓｉＲＮＡを生成する。【００５３】
ｓｉＲＮＡの発現ベクターは、当業者に公知の方法で作製され得、このような発現ベクターとしては、例えば、各種ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）が挙げられるが、これらに限定されない。アデノウイルスベクターは、分裂速度が遅い細胞（例えば、神経細胞等）にも遺伝子導入を可能とし、かつ、導入効率が非常に高い。【００５４】
ＲＮＡ自体は不安定な物質であり、血液中に注入された場合は、ＲＮＡ分解酵素などによって分解されてしまう。しかし、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは、当該分野で公知のドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）などを用いることにより、固形腫瘍の処理に適用され得る。１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡは、機能性リポソーム、高分子ミセルなどのキャリア内に封入されるか、あるいは両端をＰＥＧなどにより修飾されることにより、血液および／または細胞内での安定性を得ることができる。【００５５】
〔２〕ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡの利用
（１）医療用組成物
本発明は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡ（１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡ）を含有している医薬用組成物を提供する。本発明に係る医薬用組成物は、固形腫瘍を処置するために有効である。【００５６】
本発明に係る医薬用組成物は、配列番号２６に示される塩基配列の連続する少なくとも１５塩基からなりかつ配列番号２７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡと、第１のＲＮＡに対合し得る第２のＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡ；該二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；または、該ＤＮＡが挿入されたベクター、のいずれか１つを含有していることが好ましい。【００５７】
「腫瘍」は新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）としても知られ、新生物細胞を含む新生物（ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ）である。また「新生物細胞」は増殖疾患を有する細胞としても知られており、異常に高速に増殖する細胞が意図される。新生物は異常な組織成長物であり、概して別個の集団を形成し、それらは正常な組織成長物よりもより急速な細胞増殖により成長する。新生物は部分的または全体的に、正常組織との構造的な組織化、および／または機能的協調の欠陥を呈する。【００５８】
腫瘍は良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍は、大きく３つの主要タイプに分類され得る。上皮構造から発生した悪性腫瘍は、癌腫と呼ばれる。筋肉、軟骨組織、脂肪、または骨のような結合組織由来の悪性腫瘍は肉腫と呼ばれ、免疫系成分を含む造血構造（血液細胞形成に関連する構造）に影響する悪性腫瘍は白血病またはリンパ腫と呼ばれる。他の新生物として、神経線維腫が挙げられるが、これに限定されない。【００５９】
癌（腫瘍）には、白血病のように造血組織またはリンパ組織であっても、悪性化したあとは常時血液中を移動しながら増殖して、全身の造血組織およびその他の臓器に広がるもの、ならびに、白血病以外の多くの腫瘍のように特定の組織臓器に腫瘍塊として存在しているものとが存在する。本明細書中で使用される場合、用語「固形腫瘍」は、白血病以外の腫瘍が意図されるが、本発明に係る医薬用組成物が適用され得る固形腫瘍としては、膀胱癌、腎癌、皮膚扁平上皮癌、頭頚部癌（例えば、扁平上皮細胞頭頚部癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、消化管腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃癌、小腸腫瘍、大腸腫瘍、神経膠腫、および中皮腫などが特に意図される。【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。「固形腫瘍を処置する」とは、固形腫瘍の成長（増殖）を抑制または阻止することが意図される。固形腫瘍を処理する方法を適用することにより、固形腫瘍が、この方法により処理されていない同一の腫瘍と比較して、低重量化または小型化することが意図される。腫瘍の成長（増殖）は、腫瘍の重量または大きさにおける正味の減少が生じる程度まで抑制されることが好ましい。【００６１】
上述したｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現ベクターを活性成分として含有する組成物は、その目的、成分などに応じて、緩衝液および／または補助剤などの当業者に公知の任意の成分を含有している。【００６２】
本実施形態に係る医薬用組成物の形態は、血中にて高濃度をもたらし得る形態、すなわち、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射に適切な「注入可能な形態」であることが好ましいがこれらに限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含むが、徐放性であることが好ましい）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤であってもよい。本発明に係る医薬用組成物は、毒性が低いので経口的または非経口的に投与され得る。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【００６３】
本発明に係る医薬用組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与され得る。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与され得る。【００６４】
本発明に係る医療用組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る医療用組成物における１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医療用組成物を用いて後述の投与量範囲で１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを投与できるような量であれば特に限定されない。【００６５】
なお、組成物は一般に、物質Ａ単独を含有する組成物、物質Ａと物質Ｂとを含有する単一の組成物、または物質Ａ単独を含有する組成物と物質Ｂ単独を含有する組成物のいずれかであり得る。これらの組成物は、物質Ａおよび物質Ｂ以外に他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係る医療用組成物は、物質Ａとして上述した１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを含有することを特徴としているので、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを含有する組成物を他の成分（物質Ｂ）を含有する組成物と併用する場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。【００６６】
なお、１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを被験体に投与する工程を包含する固形腫瘍を処置する方法もまた、本発明の範囲内であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【００６７】
（２）医療用キット
本発明はまた、上述した１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡを備えている、医療用キットを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えている」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係る医療用キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係る医療用キットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係る医療用キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係る医療用キットは、治療法に適用するために必要な器具をあわせて備えてもよい。【００６８】
本発明に係る医療用キットにおける１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡおよびその他の物質の使用方法は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【００６９】
（３）治療法
本発明はさらに、治療法を提供する。本発明に係る方法は、上述した本発明に係る化合物を被験体に投与する工程を包含することを特徴としている。【００７０】
本発明に係る方法における１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡおよびその他の物質の適用は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【００７１】
ＷＴ１遺伝子は癌細胞に高発現しているのでＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現抑制による細胞死の誘導は、癌細胞に特異的に現れ、正常細胞には生じ得ない。よって本発明を用いれば、癌細胞特異的な分子標的治療を行うことができる。【００７２】
本明細書において、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡの用途を固形腫瘍の処置を例に挙げて説明してきたが、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡによって固形腫瘍を形成する細胞にアポトーシスを誘導し得る観点から、固形腫瘍を形成する細胞にアポトーシスを誘導するための細胞死誘導剤、細胞死誘導用キットおよび細胞死誘導方法もまた本発明に包含されることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【００７３】
本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００７４】
〔材料および方法〕
［１．細胞培養］
ヒトの癌細胞株（卵巣癌細胞（ＴＹＫ−ｎｕ．ＣＰ−ｒ細胞（以下、ＴＹＫ細胞と称する。））、胃癌細胞（ＭＫＮ２８細胞）、乳癌細胞（ＺＲ−７５細胞およびＳＫＢｒ３細胞）、食道癌細胞（ＴＥ１０細胞）、膵癌細胞（ＭｉａＰａＣａ２細胞）、結腸癌細胞（ＳＷ４８０細胞）および子宮頸癌細胞（ＨｅｌａＡＧ細胞））およびヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ−１０８０細胞）を、実験に用いた。ＴＥ１０細胞およびＳＷ４８０細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。他の細胞株を、１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。【００７５】
［２．ベクター構築］
ヒトＷＴ１の４つのアイソフォームのいずれかを含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を構築し、ＴＹＫ細胞においてこれらのＷＴ１アイソフォームの発現に用いた。ｐＵＣ１９ベクターにクローニングしたＷＴ１アイソフォームの配列を、Ｐｆｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ化ＷＴ１アイソフォームの一過性の発現に用いた。ＰＣＲで増幅した配列の全てにおいて、変異がないことを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｅｒｇ，ＮＩ，ＵＳＡ）を用いるｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ法によって確認した。【００７６】
α−アクチニンおよびコフィリンについての発現ベクターを調製するために、ＴＹＫ細胞から単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、Ｐｆｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてこれらの遺伝子の配列をＰＣＲ増幅した。α−アクチニンおよびコフィリンの配列を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。【００７７】
ゲルソリンのｓｉＲＮＡベクターを調製するために、ゲルソリンｍＲＮＡ（５’−ＵＣＣＡＧＧＡＵＧＡＡＧＣＡＧＵＣＧＣＣＡＵＵＧＵＵＧＡＡ−３’：配列番号２５）の配列を標的化する一対のＤＮＡ配列を合成し（Ｊａｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）、アニールし、そして、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターであるｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡ  Ｐｕｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。【００７８】
［３．ベクターの構成的発現］
哺乳動物発現ベクターおよびゲルソリンを標的化するｓｉＲＮＡベクターを、ＰｖｕＩで線状化し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｏｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いるエレクトロポレーションによって細胞に導入した。対応する選択用抗生物質を用いて、ベクターを安定して発現する細胞クローンを単離した。【００７９】
〔ベクターの一過性発現〕
５×１０４細胞／ｍＬの細胞密度で、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を製造業者の指示書に従って用いて、ベクターＤＮＡ（２μｇ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、示した時点で回収し、分析に用いた。【００８０】
［４．逆転写ＰＣＲ］
ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて総ＲＮＡを単離し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水中に溶解した。Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、総ＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに変換した。【００８１】
１１個のアクチン結合タンパク質（ゲルソリン、プロフィリン、ｐ１２５ｆａｋ、パキシリン、α−アクチニン１、ＶＡＳＰおよびグリセロアルデヒド−３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：コントロールとして使用した）を含む）のＰＣＲプライマー配列および増幅条件はＳａｌａｚａｒ  Ｒ  ｅｒ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ；２４９：２２−３２（１９９９）に従った。タリン、コフィリン、エズリン、ラディキシンおよびモエシンについての条件を表１に示した。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル上で分離し、ＵＶ光で可視化した。【００８２】
【表１】
0005231997.tif 000002
【００８３】
（上記のプライマー対を使用して、アクチン結合タンパク質のｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ（アニーリング温度６０℃で２０サイクル）によって増幅した。【００８４】
［５．ウエスタンブロット分析］
細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオトレイトール、４％  ＳＤＳ、１０％スクロースおよび０．００４％ブロモフェノールブルー）で溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）に転写し、ＷＴ１（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧＡＰＤＨ、アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｆ−アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、α−チュブリン、コフィリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ゲルソリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）およびα−アクチニン１（ｃｌｏｎｅ  ＡＴ６／１７２；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）に特異的な抗体でイムノブロットした。【００８５】
［６．免疫組織化学］
ほぼコンフルエントな細胞を回収し、６ウェルプレートの各ウェルに配置した２４×２４ｍｍの滅菌カバーガラス上に５×１０４細胞／ｍＬの細胞密度で１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１ｍＬ中に播いた。一晩培養した後、カバーガラス上の細胞を風乾し、パラホルムアルデヒド（０．５％（アクチンストレスファイバー染色用）または４％（他のタンパク質の染色用））で固定し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで透過性にし（１０分間）、ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０、６．７％グリセリンおよび０．１％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中で３０分間インキュベートし、そしてゲルソリン、α−アクチニン１またはコフィリンに対する一次抗体で１時間イムノブロットした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、細胞を、対応する二次抗体で１時間インキュベートした。アクチンストレスファイバーおよび接着斑タンパク質ビンキュリンを、ＦＡＫ１００  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を製造業者の指示書に従って用いて染色した。これらのタンパク質の発現を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０  ｖｅｒ２．８；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。【００８６】
［７．細胞接着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）アッセイおよび細胞剥離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）アッセイ］
細胞接着アッセイを、Ｙｕ  Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３：２１  １２５−１３１（１９９８）に従って行った。０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中にて一晩血清を枯渇させた後、１０μｇ／ｍＬフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした９６ウェルプレートにて１００μＬの無血清ＤＭＥＭ中で１×１０４細胞／ウェルの細胞密度で、細胞（１×１０４細胞）を播き、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、接着した細胞をトリプシン処理して計数した。【００８７】
細胞剥離アッセイを、Ｇｒｉｌｌｅ  Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：２１７２−８（２００３）に従って行った。２４ウェルプレートにて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１ｍＬ中に細胞を播き、一晩インキュベートして細胞を接着させた。次いで、細胞を。０．２５％トリプシン（Ｔａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で室温にて処理し、トリプシン処理の２分後に回収した。【００８８】
［８．個々の細胞運動の解析］
Ｔｉｍｅ  ｌａｐｓｅの顕微鏡を使用して、個々の細胞運動を解析した。要約すると、細胞を、３０％コンフルエンシーで３５ｍｍディッシュに播き、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を５％Ｏ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２下にて３７℃でインキュベートし、Ｍｅｔａ  ｃａｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、２分間隔で５時間記録した。特定の時点でのトレースした細胞の位置（［Ｘ，Ｙ］）を、Ｃｏｍｍｏｔｉｏｎ  Ｐｒｏ  ４．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｉｎｎａｃｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて決定し、２分間毎に移動した距離を計算した。トレースした細胞の速度（μｍ／ｈ）を、記録した５時間における総移動距離から決定した。【００８９】
［９．創傷治癒アッセイ］
創傷治癒アッセイを、Ｓｔａｈｌｅ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．；１１６：３８３５−４６（２００３）に従って行った。簡単には、細胞懸濁液（２×１０５細胞／２ｍＬ）を、６ウェルプレートにて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ２ｍＬ中に１×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で播き、コンフルエントまで増殖させた。コンフルエントな細胞単層を黄チップで傷付け細胞を剥がし、無血清ＤＭＥＭで穏やかに２回洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。細胞の剥がれた部分を、創傷時および創傷１２時間後に撮影した。細胞移動を、同一の写真上でのいくつかの視野における異なる３つの部位での傷の長さに対する突出した長さの割合（パーセント）の平均として決定した。【００９０】
［１０．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイ］
走化性侵入（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）アッセイを、Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；１００，７２４７−５２（２００３）に従って行った。０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ中での２時間のインキュベートの後、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ２００μＬ中の細胞（３×１０４細胞）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ（ＰＥＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ８μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ；ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）にアプライした。下部チャンバを、０．１％ＢＳＡを含む５％血清ＤＭＥＭで満たした。１８時間後、ＰＥＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅの下側およびウェルの底面まで移動した細胞を、７０％メタノールで固定し、計数した。【００９１】
［１１．インビボでのｓｈＲＮＡの導入］
ＷＴ１を発現するヒト腫瘍細胞ＨＴ−１０８０（５×１０６個）を１００μｌのＰＢＳで懸濁し、これを５０μｌのマトリゲル（ＢＤ）と混和した後に６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの腹側の皮下に移植した。移植３日目よりＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームを標的とするＷＴ１−ｓｈＲＮＡ（５０μｇ）またはコントロールのｓｈＲＮＡベクター（５０μｇ）をｌｉｎｅａｒ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｌ−ＰＥＩ）を用いて、１週間に２回麻酔下にて腫瘍細胞移植部位に投与し、腫瘍細胞移植部位の腫瘤の長径および短径を２週間後に測定した。腫瘍容積を（長径）×（短径）×（短径）／２と定義した。【００９２】
［１２．統計学的解析］
試験群の平均の間における差異の統計学的な有意差を、対応のないｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて評価した。【００９３】
［１３．図面に関する説明］
図１は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、ＴＹＫ卵巣ガン細胞における形態学的変化の誘導を示す図である。（ａ）は、４つのＴＹＫ細胞株（各々が異なる４つのＷＴ１アイソフォームを導入している）におけるＷＴ１タンパク質の発現を示すウエスタンブロット解析の結果を例示的に示す図である。（ｂ）は、ＴＹＫ細胞における各ＷＴ１アイソフォームの安定的な発現による細胞形態の変化を例示的に示す図である。スケールバーは１０μｍである。（ｃ）は、３つの細胞クローンからの８個以上の個々の細胞の相対的な面積の平均を示す図である。面積をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した。【００９４】
図２は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、種々の型のガン細胞における形態学的変化の誘導を示す図である。（ａ）は、ＧＦＰタグを付加したＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを、種々の型のガン細胞（例えば、ＺＲ−７５、ＨＴ−１０８０、ＭＫＮ２８、ＳＫＢｒ３およびＴＥ１０）に一過性に発現させた結果を示す図である。トランスフェクションの４８〜７２時間後の細胞を、共焦点顕微鏡を使用して形態学的に解析した。上パネルは透過光イメージであり、下パネルは蛍光イメージである。矢印は、ＧＦＰタグを付加したＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現している細胞を示す。スケールバーは１０μｍである。（ｂ）は、９より多い個々の細胞の相対的な面積の平均を示す図である。面積をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した。【００９５】
図３は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの安定的な発現による、細胞−基質間接着の抑制を示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞クローンの細胞数の平均を（■）で、コントロールベクターを導入した細胞クローンの細胞数の平均を（□）で示す。実験を、各細胞クローンについて独立して３回行った。（ａ）ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、細胞接着アッセイにより細胞−基質間接着について解析した。（ｂ）ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、細胞剥離アッセイにより細胞−基質間接着の強度について解析した。【００９６】
図４は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による細胞運動の増強を示す図である。（ａ）ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現している個々のＴＹＫ細胞の運動または発現していない個々のＴＹＫ細胞の運動を、Ｔｉｍｅ  ｌａｐｓｅビデオレコーダを用いて２分間隔で５時間記録した。細胞の速度を算出した。ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現している細胞の速度の平均を（■）で示し、発現していない細胞の速度の平均を（□）で示す。バーはＳＥを示す。実験を、独立して１０回行った。（ｂ）ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム発現ベクターを導入したＴＹＫ細胞（■）またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞（□）を、創傷治癒アッセイによって集団的な移動について解析した。実験を各細胞クローンについて独立して３回行った。細胞移動を、異なる３つの部位での最初にチップで細胞を剥離した幅に対する突出長の割合（パーセント）の平均として決定した。バーは５０μｍである。（ｃ）ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム発現ベクターを導入したＴＹＫ細胞（■）またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞（□）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって、５％ＦＢＳを含むＤｅｌｂｕｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍに対する走化性について解析した。実験を各細胞クローンについて独立して３回行った。上部チャンバから下部チャンバへ侵入した細胞を、ＭａｙＧｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、計数した。バーは５０μｍである。【００９７】
図５は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、線維性アクチン（Ｆ−アクチン）およびアクチン結合タンパク質（ＡＢＰ）の発現の変化を示す図である。（ａ）は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞またはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、Ｆ−アクチン、接着斑タンパク質ビンキュリンおよび核について免疫組織染色した結果を示す図である。スケールバーは１０μｍである。（ｂ）は、コントロールベクターを導入した個々の細胞からの溶解物（レーン１および２）、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した個々の細胞からの溶解物（レーン３および４）を、総アクチン、Ｆ−アクチン、α−チュブリンまたはＧＡＰＨに特異的な抗体でイムノブロットした。スケールバーは１０μｍである。（ｃ）は、コントロールベクターを導入した、個々に単離したＴＹＫ細胞クローン（ｎ＝３、レーン１〜３）またはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した、個々に単離したＴＹＫ細胞クローン（ｎ＝３、レーン４〜６）におけるｍＲＮＡの発現を、表１に示した条件下でＲＴ−ＰＣＲによって分析した。スケールバーは１０μｍである。（ｄ）は、コントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞クローン（レーン１および２）またはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞クローン（レーン３〜４）を、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。（ｅ）は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームまたはコントロールベクターを導入したＴＹＫ細胞を、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンについて免疫組織染色し、細胞の核をヨウ化プロピジウムで染色した。スケールバーは１０μｍである。（ｆ）は、コントロールベクターまたはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＨＴ−１０８０細胞クローンを、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。（ｇ）は、コントロールベクターまたはＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＥ１０細胞クローンを、α−アクチニン１、コフィリンおよびゲルソリンに特異的な抗体でイムノブロットした。【００９８】
図６は、α−アクチニンおよびコフィリンの安定的な発現が、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの導入によって誘導されるＴＹＫ細胞の表現型を、その親ＴＹＫ細胞の表現型へ回復することを示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、α−アクチニン発現ベクターおよびコフィリン発現ベクター（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ）またはコントロールベクター（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）を同時トランスフェクトした。（ａ）は、α−アクチニンおよびコフィリンの発現レベルをウエスタンブロット分析により決定した結果を示す。（ｂ）は、細胞をＭａｙＧｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した結果を示す。（ｃ）は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して細胞の面積を算出した結果を示す。１：ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞クローン；２および３：それぞれ異なるＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞クローン。スケールバーは１０μｍである。ＴＷ／ＡＣＴＮＣＦＬ細胞を（■）で示し、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞を（□）で示す。（ｄ）は、剥離アッセイにより決定した細胞−基質間接着を示す。ＴＷ／ＡＣＴＮＣＦＬ細胞を（■）で示し、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞を（□）で示す。（ｅ）は、創傷治癒アッセイにより評価した集団的な細胞移動を示す。細胞移動を、異なる３つの部位での最初の細胞を剥離した幅に対する突出長の割合（パーセント）の平均として決定した。ＴＷ／ＡＣＴＮＣＦＬ細胞を（■）で示し、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞を（□）で示す。（ｆ）は、ウエスタンブロット分析により決定したゲルソリンの発現レベルを示す。【００９９】
図７は、ゲルソリンの発現抑制が細胞移動を低減するが形態または細胞−基質間接着には影響しないことを示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞に、ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクター（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）またはコントロールベクター（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）とともに導入した。（ａ）は、ウエスタンブロット分析により決定したゲルソリンタンパク質の発現レベルを示す。異なる３つの細胞クローンを試験した。（ｂ）は、細胞をＭａｙＧｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した結果を示す。スケールバーは１０μｍである。（ｃ）は、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞クローンおよびＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ細胞クローンの面積をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した結果を示す。ゲルソリンに特異的なｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（■）で示し、Ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（□）で示す。（ｄ）は、剥離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）アッセイによって決定した細胞−基質間接着を示す。ゲルソリンに特異的なｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（■）で示し、Ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（□）で示す。（ｅ）は、創傷治癒アッセイにより評価した集団的な細胞運動性を示す。ゲルソリンに特異的なｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（■）で示し、Ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡベクターを導入した細胞クローンを（□）で示す。（ｆ）は、ウエスタンブロット解析により決定したα−アクチニン１およびコフィリンの発現レベルを示す。【０１００】
図８は、細胞骨格ダイナミクスの調節におけるＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの役割の可能性を示す図である。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現は、α−アクチニン１およびコフィリンの両方の発現を下方制御し、ゲルソリンの発現を上方制御する。さらに、α−アクチニン１／コフィリンおよびゲルソリンは、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの下流シグナル伝達において相互に調節されている。よって、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの機能（形態学的な変化の誘導、細胞−基質間接着の減少、および細胞運動の増強）の全てまたは一部は、α−アクチニン１／コフィリンおよびゲルソリンの調節を介して作動する。【０１０１】
〔実施例１：種々の型の癌細胞においてＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、形態学的変化の誘導〕
癌細胞のふるまいに対するＷＴ１遺伝子の効果を試験するために、４つのＷＴ１遺伝子のいずれか１つを、ＴＹＫ卵巣癌細胞に安定的に発現させ、形質導入されたＷＴ１アイソフォームを高レベルで発現するＴＹＫ細胞クローンを単離した（図１ａ）。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの安定な発現は、ＴＹＫ細胞において、小サイズで線維芽細胞様の細胞形態によって特徴付けられる形態学的変化を誘導した（図１ｂ、ｃ）。対照的に、１７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム以外のＷＴ１アイソフォームの安定な発現は、ＴＹＫ細胞において何ら形態学的な変化を誘導しなかった。【０１０２】
さらに、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームがＴＹＫ細胞以外の種々の癌細胞において形態学的変化を誘導するか否かについて試験するために、ＧＦＰタグを付加したＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを、ＭＫＮ２８細胞、ＺＲ−７５細胞、ＳＫＢｒ３細胞、ＴＥ１０細胞、ＭｉａＰａＣａ２細胞、ＳＷ４８０細胞およびＨｅｌａＡＧ細胞、ならびにＨＴ−１０８０細胞に一過性に発現させた（図２）。共焦点顕微鏡解析は、ＧＦＰタグ化ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの一過性の発現は、ＭＫＮ２８細胞、ＺＲ−７５細胞、ＳＫＢｒ３細胞、ＴＥ１０細胞およびＨＴ−１０８０細胞において、細胞サイズ（より小さく）および細胞の三次元形状における形態学的な変化を誘導した。ＧＦＰコントロールベクターの発現は、これらの細胞株において形態学的変化を何ら誘導しなかった。残りの３つの細胞株（ＭｉａＰａＣａ２細胞、ＳＷ４８０細胞およびＨｅｌａＡＧ細胞）において、明白な形態学的変化は観察されなかった（示さず）。【０１０３】
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームのみが癌細胞における形態学的変化を誘導し得ることを検証するために、他の３つのＧＦＰタグを付加したＷＴ１アイソフォームのいずれか１つを、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームが形態学的変化を誘導したＨＴ−１０８０細胞およびＴＥ１０細胞において一過性に発現させた。共焦点顕微鏡解析は、３つのＧＦＰタグを付加したＷＴ１アイソフォームのいずれもがこれら２つの細胞株において形態学的変化を誘導しなかったことを示した（示さず）。【０１０４】
〔実施例２：ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、細胞−基質間接着の抑制〕
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを形質導入した細胞において観察された形態学的な変化が細胞の伸張能の変化に起因するか否かを試験するために、細胞−基質間接着に対するＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現の効果を、ＴＹＫ細胞において解析した。細胞接着アッセイは、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞クローンにおいて（ｎ＝４）、Ｍｏｃｋベクターを導入した細胞クローンと比較して（ｎ＝４）、基質に対する細胞接着が有意に低下することを示した（図３ａ）。さらに、細胞剥離アッセイは、Ｍｏｃｋベクター導入細胞（ｎ＝５）と比較して、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞（ｎ＝５）の細胞−基質間接着の強度が有意に低下したことを示した（図３ｂ）。細胞剥離アッセイにおいて、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム導入細胞の５３．３％が、トリプシン処理の２分後にプラスチック基質から剥離したが、コントロールベクター導入細胞ではその９．８％のみが剥離した。よって、細胞−基質間接着の強度は、コントロールベクター導入細胞と比較してＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム導入細胞において低下した。【０１０５】
〔実施例３：ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、細胞運動の増強〕
細胞移動に対するＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現の効果を試験するために、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを誘導した細胞の、個々の移動、集団的な移動およびインビトロ侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を解析した。【０１０６】
微速度撮影の顕微鏡を用いて、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入したＴＹＫ細胞の個々の細胞の運動を評価した（図４ａ）。ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの一過性の発現あり（ｎ＝１９）または発現なし（ｎ＝１９）の条件下で、個々のＴＹＫ細胞の移動を、２分間隔で５時間記録した。次いで、細胞運動をトレースし、細胞運動の速度を算出した。１０回の独立した実験からの結果は、ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現するＴＹＫ細胞におけるランダムな運動速度が、ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを発現していない細胞と比較して１．８倍増加することを示した。しかし、ＧＦＰ−ｍｏｃｋベクターを発現する個々のＴＹＫ細胞の移動は、ＧＦＰ−ｍｏｃｋベクターを発現していない細胞と有意な差はなかった（示さず）。【０１０７】
ＧＦＰ−ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォーム導入細胞の増強された運動能をさらに明確にするために、創傷治癒アッセイを使用して集団的な移動を解析した（図４ｂ）。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞クローン（ｎ＝４）は、Ｍｏｃｋベクターを導入した細胞（ｎ＝５）と比較して、創傷後１２時間の間の細胞運動の距離が１．８倍増加したことを示した。【０１０８】
さらに、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞クローンのインビトロでの侵入を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイによって試験した（図４ｃ）。膜を通過して侵入した細胞の数を、上側のチャンバに細胞を播いた１８時間後に計数した。ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞クローン（ｎ＝４）のＦＢＳに対する走化性は、Ｍｏｃｋベクターを導入した細胞（ｎ＝５）と比較して８倍に増強されていた。【０１０９】
〔実施例４：ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現による、線維性アクチンおよびアクチン結合タンパク質の発現変化〕
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームの構成的な発現は、ＴＹＫ細胞において、形態学的な変化を誘導し、細胞−基質間接着を減弱させ、そして細胞運動を増強した。これらの結果が細胞骨格構造の変化を示唆するので、免疫細胞化学により解析を行った。予想したとおり、これらの細胞において、線維性アクチン（Ｆ−アクチン）ネットワークは減少し、接着斑は減少していた（図５ａ）。ウエスタンブロット分析は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞において、Ｍｏｃｋベクターを導入した細胞と比較してＦ−アクチンの発現レベルが減少したが、アクチンおよびα−チュブリンの総発現レベルは変化しないままであったことを示した（図５ｂ）。そこで、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞における１１個のアクチン結合タンパク質（α−アクチニン１、コフィリン、ゲルソリン、ＦＡＫ、プロフィリン、ＶＡＳＰ、タリン、エズリン、モエシンおよびラディキシンを含む）のｍＲＮＡ発現を調べた。図５ｃに示すように、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞において、α−アクチニン１およびコフィリンの発現は抑制されており、ゲルソリンの発現は増加していた。α−アクチニン１およびコフィリンの減少およびゲルソリンの増加を、ウエスタンブロット分析によってタンパク質レベルで確認した（図５ｄ）。免疫細胞化学は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞の細胞質において、α−アクチニン１タンパク質およびコフィリンタンパク質の発現が抑制されていることを示し、ゲルソリンタンパク質の発現が増加していることを示した（図５ｅ）。残り８つのアクチン結合タンパク質ｍＲＮＡ発現については、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞とＭｏｃｋベクターを導入した細胞との間で変化していなかった（示さず）。【０１１０】
さらに、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームによるゲルソリン、α−アクチニンおよびコフィリンの発現調節を確認するために、ＨＴ−１０８０細胞およびＴＥ１０細胞にＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを安定的に発現させた。ウエスタンブロット解析を行ったところ、コントロールｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターを導入した細胞と比較してＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞において、α−アクチニン１およびコフィリンの発現が減少しているが、ゲルソリンの発現は増加していることが示された（図５ｆ、ｇ）。【０１１１】
〔実施例５：α−アクチニン１およびコフィリンの両方の構成的な発現による、またはゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡでのゲルソリンの抑制による、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォームを導入した細胞の表現型の回復〕
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞において、α−アクチニン１およびコフィリンの発現低下が形態学的変化、接着斑の減少および細胞移動の増加に関与するか否かを調べるために、α−アクチニン１／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）発現ベクタ−およびコフィリン／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）発現ベクタ−を、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞に同時に導入し、そして、α−アクチニン１およびコフィリンの発現レベルがＴＹＫ親細胞に相当する細胞クロ−ン（ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞を単離した（図６ａ）。ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞の形質を、コントロ−ルｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクタ−を導入したＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞クロ−ン（ＴＷ／Ｍｏｃｋ）と比較した。ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞は、ＴＹＫ親細胞のように十分に伸張した細胞形状へと形態学的な変化を示したが、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞は示さなかった（図６ｂ，ｃ）。細胞剥離アッセイを行ったところ、トリプシン処理２分後のＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞クロ−ン（ｎ＝３）における剥離細胞の数がＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞（ｎ＝３）と比較して減少し、ＴＹＫ親細胞の数と同等であった（図６ｄ）。さらに、創傷治癒アッセイを行ったところ、ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞クロ−ン（ｎ＝３）の細胞運動性が、ＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞クロ−ン（ｎ＝３）と比較して減少し、ＴＹＫ親細胞の細胞運動性と同等であった（図６ｅ）。対照的に、コフィリンまたはα−アクチニン１のいずれか一方の構成的な発現は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞を親ＴＹＫ細胞に匹敵する形質へ回復し得なかった（示さず）。このことは、ＴＹＫ細胞の形態および挙動の調節にはα−アクチニン１およびコフィリンが協働して作用することを示す。【０１１２】
ゲルソリン発現レベルの増加がＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞における形態学的な変化、減少した細胞−基質間接着および増強された細胞運動に関与するか否かを調べるために、これらの細胞にゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクタ−またはＭｏｃｋベクタ−を導入し、ゲルソリンの発現レベルが親ＴＹＫ細胞におけるゲルソリン発現レベルに匹敵する細胞クロ−ンを単離した（ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ）（ｎ＝３）（図７ａ）。ゲルソリン特異的ｓｉＲＮＡベクタ−によるゲルソリン発現抑制は、ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡベクタ−を導入しＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞（ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ）（ｎ＝３）と比較して、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムを導入したＴＹＫ細胞において形態学的な変化を誘導しなかった（図７ｂ，ｃ）。剥離アッセイは、ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ細胞とＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ細胞との間で細胞−基質間接着の強度において差異がないことを示した（図７ｄ）。しかし、創傷治癒アッセイを行ったところ、ＴＷ／ＧＳＮｓｉＲＮＡ細胞の細胞運動が、ＴＷ／ｓｉＭｏｃｋ細胞の細動運動と比較して減少し、抑制されたゲルソリン発現を伴って顕著に低減し、ＴＹＫ親細胞の細胞移動と同等のレベルであった（図７ｅ）。【０１１３】
さらに、アクチニン／コフィリンの発現とゲルソリンの発現が一致するか否かを調べるために、ＴＷ／ＡＣＴＮ−ＣＦＬ細胞およびＴＷ／Ｍｏｃｋ細胞におけるゲルソリンタンパク質発現レベルを調べた。α−アクチニン１およびコフィリンの構成的な発現は、ゲルソリンの発現を抑制した（図６ｆ）。反対に、ゲルソリンの抑制は、α−アクチニン１およびコフィリンの発現を増加させた（図７ｆ）。【０１１４】
要約すると、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムの構成的な発現は、α−アクチニン１およびコフィリンの両方の発現を下方制御し、そしてゲルソリンの発現を上方制御する（図８）。さらに、α−アクチニン１／コフィリン遺伝子発現およびゲルソリン遺伝子発現は、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムの下流シグナル伝達において互いに調節される。よって、形態学的変化を誘導し、細胞−基質間接着を低減させ、そして細胞移動を増強するというＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムの機能の全てまたは一部は、α−アクチニン１／コフィリンおよびゲルソリンの調節を介して作動する。【０１１５】
以上の結果より、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムは、固形腫瘍を形成する細胞において癌遺伝子様の機能を発揮するということがわかった。【０１１６】
〔実施例６：ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム発現抑制による固形腫瘍におけるアポトーシス誘導〕
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡベクターを構築した。具体的には、図９に示すように、１７ＡＡ領域がｓｐｌｉｃｅｄ  ｏｕｔすることにより形成される領域を標的配列とすべく、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの配列５’−ＡＧＣＣＡＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡ−３’（配列番号２６）を標的とした。センス鎖（５’−ａｇｃｃａｃｃｕｕａａａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｕａｕａｇｇｇｕａ（標的配列のセンス鎖に下線部で変異を加えた配列））−ｃｔｔｃｃｔｇｔｃａ（ｈｕｍａｎ  ｐｒｅ−ｍｉＲ−２３のｌｏｏｐ配列）−ｕａｃｃｃｕｇｕｇｃｕｇｕｇｇｃｃｃｕｕｕａａｇｇｕｇｇｃｕ（標的配列のアンチセンス鎖）からなるオリゴヌクレオチド（配列番号２７）の両側に制限酵素部位を付加したオリゴＤＮＡ、および当該オリゴＤＮＡに相補的なオリゴＤＮＡを合成した（Ｊａｐａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）。これらのオリゴＤＮＡをアニーリングした後、ｐｉＧＥＮＥｔＲＮＡ  Ｐｕｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のｔＲＮＡＶａｌプロモータの下流に挿入し、ｌｏｏｐ配列を含むｄｓＲＮＡを転写するＷＲＩ−１７ＡＡ（−）ｓｉＲＮＡベクターを構築した。【０１１７】
ＷＴ１発現細胞株（線維肉腫細胞  ＨＴ−１０８０、胃癌細胞  ＡＺ−５２１、神経膠腫細胞Ａ１７２）およびＷＴ１非発現細胞株（肺癌細胞  ＰＣ−１４）を、５％ＣＯ２存在下にて３７℃で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において培養した。【０１１８】
６ウェルプレートに播き（２×１０５細胞）一日培養した細胞に、ＷＴ１−ｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはＭｏｃｋベクター（２μｇ）を、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いたリポフェクション法により導入した。導入３日後にトリプシン処理を行い、細胞数を計数し、フローサイトメトリー解析に供した。【０１１９】
１．０×１０５個の細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＭＥＢＣＹＴＯ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ、およびＰＩを室温で１５分間反応させて細胞を染色した。これらの細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ  ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ陽性／ＰＩ陰性の細胞をアポトーシス細胞として規定した。【０１２０】
ＷＴ１を発現しているＨＴ−１０８０細胞、ＡＺ−５２１細胞およびＡ１７２細胞において、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡベクターＷＲＩ−１７ＡＡ（−）の導入によりアポトーシスが誘導されたが、ＷＴ１を発現していない細胞株ＰＣ−１４にＷＲＩ−１７ＡＡ（−）を導入してもアポトーシスが誘導されなかった（図１０）。【０１２１】
〔実施例７：ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現の抑制によるインビボでの腫瘍形成の抑制〕
ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームを標的とするＷＴ１−ｓｈＲＮＡ（ＷＲＩ）投与を行った群２匹およびコントロールｓｈＲＮＡベクター（ｍｏｃｋ）投与を行った群２匹における、接種したＨＴ−１０８０細胞により形成された腫瘍のサイズを計測した結果を図１１に示す。示すように、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を抑制することにより、腫瘍の増殖がインビボで抑制された。なお、図には各群の平均を示した。【０１２２】
このように、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）／ＫＴＳ（−）アイソフォ−ムが癌遺伝子様の機能を発揮している固形腫瘍の細胞に、ＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡを適用すれば、腫瘍細胞特異的な細胞死を誘導し、制癌作用を導き出すことができる。【０１２３】
本発明を用いれば、固形腫瘍を形成する細胞を特異的にアポトーシスに誘導し得、固形腫瘍を処置することができる。【０１２４】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
ＷＴ１遺伝子は癌細胞に特異的に高発現しているのでＷＴ１  １７ＡＡ（−）アイソフォームの発現抑制による細胞死の誘導は、癌細胞に特異的に現れ、正常細胞には生じ得ない。よって本発明は癌細胞特異的な分子標的治療法開発のための基盤技術として、医学分野、製薬分野において非常に有用である。
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図９】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
0005231997.tif 000007
【図１ｃ】
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【図２ａ】
0005231997.tif 000009
【図２ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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