(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの検査方法であって、
ヒト又は非ヒト動物の全血を被験試料として、以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）EBV BALF5遺伝子における配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列、
（ｂ）CMV IE遺伝子における配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:NC001347）の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列、及び
（ｃ）HHV-6のU31遺伝子における配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706）の第46661番目から46883番目）又はその相補配列をターゲットとして、リアルタイムＰＣＲを実施する工程、
を備え、
前記リアルタイムＰＣＲ工程は、
前記（ａ）のターゲットは、それぞれ配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを用い、
前記（ｂ）のターゲットは、それぞれ配列番号：３に記載の塩基配列及び配列番号：４に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを用い、
前記（ｃ）のターゲットは、それぞれ配列番号：５に記載の塩基配列及び配列番号：６に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを用いるとともに、
前記（ａ）のターゲットは、配列番号：７に記載の塩基配列を有するプローブを用い、
前記（ｂ）のターゲットは、配列番号：８に記載の塩基配列を有するプローブを用い、
前記（ｃ）のターゲットは、配列番号：９に記載の塩基配列を有するプローブを用いる、
前記全血中のＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６を同時に検査する、方法。
【請求項２】
前記（ａ）のターゲットは、１５０ｎＭ以上２５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅し、
前記（ｂ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅し、
前記（ｃ）のターゲットは、１００ｎＭ以上２００ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ａ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせ、
前記（ｂ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせ、
前記（ｃ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブは、いずれも５’末端を蛍光物質で標識し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドプローブであり、前記蛍光物質は、６−carboxyfluorescein（ＦＡＭ）、６−carboxy−4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein（ＪＯＥ）及びcabocyanine 5(Ｃｙ５)から選択される互いに異なる蛍光物質である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ウイルス関連合併症の検査方法である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒト又は非ヒト動物の全血を被験試料として前記全血中のＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６をリアルタイムＰＣＲにより同時に検査するためのウイルスの検査キットであって、
以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）EBV BALF5遺伝子における配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列、
（ｂ）CMV IE遺伝子における配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:NC001347）の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列、及び
（ｃ）HHV-6のU31遺伝子における配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706）の第46661番目から46883番目）又はその相補配列をターゲットとする、プライマーとプローブを備え、
前記（ａ）のターゲットには、それぞれ配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを備え、
前記（ｂ）のターゲットには、それぞれ配列番号：３に記載の塩基配列及び配列番号：４に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを備え、
前記（ｃ）のターゲットには、それぞれ配列番号：５に記載の塩基配列及び配列番号：６に記載の塩基配列からなる５’プライマー及び３’プライマーを備え、
前記（ａ）のターゲットには、配列番号：７に記載の塩基配列を有するプローブを備え、
前記（ｂ）のターゲットには、配列番号：８に記載の塩基配列を有するプローブを備え、
前記（ｃ）のターゲットには、配列番号：９に記載の塩基配列を有するプローブを備える、キット。
【請求項７】
前記プローブは、いずれも５’末端を蛍光物質で標識し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドプローブであり、前記蛍光物質は、６−carboxyfluorescein（ＦＡＭ）、６−carboxy−4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein（ＪＯＥ）及びcabocyanine 5(Ｃｙ５)から選択される互いに異なる蛍光物質である、請求項６に記載の検査キット。
【請求項８】
さらに、リアルタイムＰＣＲ用試薬を備える、請求項６又は７に記載の検査キット。
【請求項９】
ウイルス関連合併症の検査キットである、請求項６〜８のいずれかに記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット、ウイルスの分析方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Epstein-Barr virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV)及びHuman herpesvirus 6 (HHV-6)は、移植後の免疫抑制下に再活性化し、ウイルス関連合併症を起こす。血液中のこれらのウイルスDNA量を定量し、ウイルスの増殖動態を把握することは、診断・治療に有用である。
【０００３】
従来、蛍光標識プローブを用いたリアルタイム−ＰＣＲ法により個々のウイルスDNAが定量測定する方法は存在し（非特許文献１，２）、一部は臨床応用されていた。
【非特許文献１】Heid, C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-94
【非特許文献２】Niesters, H. G. M. 2004. Molecular and diagnostic clinical virology in real time. Clin. Microbio. Infect. 10:5-11
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これらのウイルスはそれぞれ個別に測定しなければならず、このため労力と時間を要していた。一般に、複数種類のウイルスなどのDNAを検出する場合、ウイルスDNAに対する検出用オリゴヌクレオチドの特異性が高くかつオリゴヌクレオチド同士が相互作用せず、しかもそれぞれ精度よく検出される必要がある。しかしながら、これら３種のウイルスについて同時分析又は同時定量の報告は未だなされていない。
【０００５】
そこで、本発明は、移植医療上重要なＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６の３種類のウイルスのうち２種類以上を迅速又は簡易に分析するためのオリゴヌクレオチドセット、その分析方法及び分析キットを提供するこを一つの目的とする。また、本発明は、これら３種類のウイルスのうち２種類以上を同時定量するためのオリゴヌクレオチド、分析方法及び分析キットを提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これら３種のウイルスのうち複数種のウイルスについてマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ法の適用について検討した結果、これら３種のウイルス中複数種類を同時に検出することができるオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ及び条件を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明によれば、ウイルスの分析方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）EBV BALF5遺伝子における配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）CMV IE遺伝子における配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:NC001347）の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド、
（ｃ）HHV-6のU31遺伝子における配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706）の第46661番目から46883番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド
から選択される２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いてＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６から選択される２種以上のウイルスを同時に検出する方法が提供される。
【０００８】
本発明の分析方法においては、ＰＣＲにより前記２種類以上のウイルスを検出してもよいし、リアルタイムＰＣＲ法により前記２種類以上のウイルスを検出してもよい。３種類同時にこれらを検出してもよい。さらに、リアルタイムＰＣＲ法において用いるプローブは、５’末端を蛍光物質で標識し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドプローブを用いることが好ましい。
【０００９】
本発明の分析方法においては、
前記（ａ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含み、
前記（ｂ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：３に記載の塩基配列及び配列番号：４に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含み、
前記（ｃ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：５に記載の塩基配列及び配列番号：６に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１０】
また、本発明の分析方法においては、
前記（ａ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、
前記（ｂ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、
前記（ｃ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１１】
また、本発明によれば、ウイルスの分析方法であって、
以下の（ｄ）〜（ｆ）；
（d）EBV BALF5遺伝子における配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列、
（e）CMV IE遺伝子における配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:NC001347）の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列、
（f）HHV-6のU31遺伝子における配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706）の第46661番目から46883番目）又はその相補配列
から選択される２種類以上をターゲットとして、リアルタイムＰＣＲを実施する工程を備え、
ＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６から選択される２種以上のウイルスを同時に検出する方法が提供される。本発明の分析方法においては、前記３種類のウイルスを同時に検出することもできる。
【００１２】
本発明の分析方法においては、
前記（ｄ）のターゲットは、配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列をそれぞれ有する５’プライマー及び３’プライマーと、配列番号：７に記載の塩基配列を有するプローブとを用いて検出し、
前記（ｅ）のターゲットは、配列番号：３に記載の塩基配列及び配列番号：４に記載の塩基配列をそれぞれ有する５’プライマー及び３’プライマーと、配列番号：８に記載の塩基配列を有するプローブとを用いて検出し、
前記（ｆ）のターゲットは、配列番号：５に記載の塩基配列及び配列番号：６に記載の塩基配列をそれぞれ有する５’プライマー及び３’プライマーと、配列番号：９に記載の塩基配列を有するプローブとを用いて検出することができる。
【００１３】
さらに、前記（ｄ）のターゲットは、１５０ｎＭ以上２５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅し、
前記（ｅ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅し、
前記（ｆ）のターゲットは、１００ｎＭ以上２００ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅することもできる。
【００１４】
また、前記（ｄ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせ、
前記（ｅ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせ、
前記（ｆ）のターゲットは、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記プローブを用いてハイブリダイズさせることもできる。
【００１５】
本発明の分析方法は、ヒト及び非ヒト動物から採取した血液中の前記ウイルスを測定するものであってもよい。さらに、移植患者から採取した血液中の前記ウイルスを測定する方法としてもよい。
【００１６】
本発明によれば、ウイルス関連合併症の診断方法であって、上記いずれかのウイルスの分析方法を用いて前記ウイルスを定量する工程と、前記定量工程において得られるウイルスの定量結果に基づく前記ウイルスの増殖動態を利用してウイルス関連合併症について予測又は診断する工程と、を備える方法が提供される。特に、この診断方法は、造血幹細胞移植患者や臓器移植患者などの移植後に有用である。
【００１７】
本発明によれば、ウイルス検出用オリゴヌクレオチドセットであって、
前記（ａ）〜（ｃ）から選択される２種以上のウイルスを同時に検出するためのオリゴヌクレオチドセットが提供される。これらのオリゴヌクレオチドセットは、
前記（ａ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記（ｂ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：３に記載の塩基配列及び配列番号：４に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記（ｃ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：５に記載の塩基配列及び配列番号：６に記載の塩基配列から選択される１種又は２種以上の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいてもよいし、また、
前記（ａ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記（ｂ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記（ｃ）の１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号：９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよい。
【００１８】
さらに、前記プローブは、５’末端を蛍光物質で標識し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドプローブとしてもよい。また、前記蛍光物質は、６−carboxyfluorescein（ＦＡＭ）、６−carboxy−4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein（ＪＯＥ）及びcabocyanine 5(Ｃｙ５)から選択されてもよい。
【００１９】
本発明によれば、ウイルス検出用キットであって、上記いずれかの記載のオリゴヌクレオチドセットと、リアルタイムＰＣＲ用試薬と、を備える、キットも提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ウイルスの分析方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）；
（ａ）EBV BALF5遺伝子における配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）CMV IE遺伝子における配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:NC001347）の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド、
（ｃ）HHV-6のU31遺伝子における配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706）の第46661番目から46883番目）又はその相補配列をターゲットとする１種又は２種以上のオリゴヌクレオチド
から選択される２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いてＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６から選択される２種以上のウイルスを同時に検出することに関する。
【００２１】
本発明によれば、こうした各ウイルスの特定部位をターゲットとすることでこれらのウイルスが２種又は３種類以上を同時に検出できる。特に、ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲに適用することで迅速で簡易に複数種類のウイルスを検出又は定量することができる。特に、本発明における（ａ）〜（ｃ）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、１つの検体中の３種類のウイルスを同時に検出できるため、迅速性及び簡便性並びに有用性において優れている。以下、本発明の分析方法、オリゴヌクレオチドセット、診断方法等について順次説明する。
【００２２】
（分析対象）
本発明の分析対象は、Epstein-Barr virus(EBV), Cytomegalovirus (CMV)及びHuman herpesvirus 6 (HHV-6)であり、より具体的にはこれらのウイルスのDNAである。なお、本明細書において、分析とは、単に成分の有無、定性的な反応などを含む検出のほか量的な計測である定量を含んだ概念である。
【００２３】
本発明の分析対象は、これら３種のウイルスのうち1種類であってもよいし、２種類であってもよいし、さらに３種類全部であってもよい。
【００２４】
分析対象であるウイルスDNA（ターゲット）は、好ましくは、EBV BALF5遺伝子であり、より好ましくは配列番号：１０に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AJ507799の第155936番目から第156025番目）又はその相補配列である。また、好ましくはCMV IE遺伝子であり、より好ましくは配列番号：１１に記載の塩基配列（GenBank Accession No:BK000394の第172256番目から第172456番目）又はその相補配列である。さらに、好ましくは、HHV-6のU31遺伝子でありより好ましくは配列番号：１２に記載の塩基配列（GenBank Accession No:AF157706の第46661番目から46883番目）又はその相補配列である。これらのターゲットは、これらのウイルスの３種類を同時に検出するのに有用なターゲットであり、結果として、これらの３種類のウイルスのうちから選択される２種類のウイルスの任意の組み合わせであっても同時に検出することができるターゲットである。
【００２５】
なお、同じウイルスが有するこれらの具体的塩基配列の類似配列もターゲットとすることができる。こうしたターゲット配列としては、例えば、配列番号：１０〜１２のいずれかに記載の塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれかあるいは２種類以上の変異が施された塩基配列が挙げられる。こうした配列は、公知のソフトウエアなどにより適宜検索することができるであろう。
【００２６】
（オリゴヌクレオチド）
本発明の分析方法では、これらのターゲットを検出するためにオリゴヌクレオチドを用いることができる。分析のためのオリゴヌクレオチドとしては、ＰＣＲ等に用いられるプライマーや各種手法によるハイブリダイゼーションに用いられるプローブとが挙げられる。本発明では、これら３種の分析対象を同時に検出可能に、必要なプライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。３種類のウイルスを同時に検出できるオリゴヌクレオチドによれば、3種類を同時に検出することができるとともに、３種類のウイルスから２種類のウイルスを選択する任意の組み合わせを検出できることを意味している。こうしたオリゴヌクレオチドのセットは単に２種類を同時に測定できるオリゴヌクレオチドセットに比較して有用である。
【００２７】
これらのターゲットを検出するためのオリゴヌクレオチドは、ターゲットを検出できればよい。すなわち、ターゲットの一部あるいは全体を増幅するＰＣＲプライマーであってもよいし、ターゲットを含む広い領域を増幅するＰＣＲプライマーであってもよいし、こうしたＰＣＲ増幅産物若しくは抽出した検体由来の核酸などターゲットの少なくとも一部とハイブリダイズするプローブであってもよい。オリゴヌクレオチドとしては、例えば、これらのターゲットをＰＣＲにて増幅するプライマー、当該増幅産物を検出するためのプローブ、リアルタイムＰＣＲにて増幅し検出するためのプライマーやプローブ、マイクロアレイやマイクロビーズに用いるプローブ等が挙げられる。このようなプライマーやプローブの設計は、それぞれインターネット回線を通じて入手可能なソフトウェアや開示されたソフトウェアなどによることもできる。
【００２８】
例えば、EBV BALF5遺伝子の上記ターゲットに対しては、配列番号：１、配列番号：２に記載の塩基配列をそれぞれ有する（若しくは当該塩基配列からなる）５’プライマー及び３’プライマーが挙げられ、配列番号：７に記載の塩基配列を有する（若しくは当該塩基配列からなる）プローブが挙げられる。CMV IE遺伝子の上記ターゲットに対しては、配列番号：３、配列番号：４に記載の塩基配列をそれぞれ有する（若しくは当該塩基配列からなる）５’プライマー及び３’プライマーが挙げられ、配列番号：８に記載の塩基配列を有する（若しくは当該塩基配列からなる）プローブが挙げられる。HHV-6のU31遺伝子の上記ターゲットに対しては、配列番号：５、配列番号：６に記載の塩基配列をそれぞれ有する（若しくは当該塩基配列からなる）５’プライマー及び３’プライマーが挙げられ、配列番号：９に記載の塩基配列を有する（若しくは当該塩基配列からなる）プローブが挙げられる。これらのプライマーは、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲで用いることができ、プローブは、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、電気泳動などにおける各種ハイブリダイゼーションに用いることができる。これらのそれぞれのターゲットに対するプライマーとプローブとを含むオリゴヌクレオチドセットは、ＰＣＲと電気泳動、ＰＣＲとマイクロアレイなど、プライマーを用いてＰＣＲを実施して得られたＰＣＲ産物を、マイクロアレイや電気泳動ゲル上でのハイブリダイゼーションにおいてプローブを用いてターゲットを検出するのに用いることができるが、好ましくはリアルタイムＰＣＲに用いる。これらのプライマー及びプローブは、同時にリアルタイムＰＣＲに適用して同時に３種類のウイルスDNAを検出し定量することができる。３種類のウイルスを同時に検出できることは、すなわち、３種類のウイルスから２種類のウイルスを選択する任意の組み合わせを検出できることを意味している。したがって、２種類のウイルスＤＮＡを検出可能なオリゴヌクレオチドを選択するのに比較して、３種類のウイルスＤＮＡを検出するオリゴヌクレオチドの組み合わせを選択する困難性は極めて高くなる。
【００２９】
リアルタイムＰＣＲにおいては、EBV BALF5遺伝子の上記ターゲットを増幅するのにあたり、１５０ｎＭ以上２５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅することが好ましく、より好ましくは、それぞれ１７５ｎＭ以上２２５ｎＭ以下及び７５ｎＭ以上１２５ｎＭ以下であり、さらに好ましくは約２００ｎＭ及び約１００ｎＭである。また、CMV IE遺伝子の上記ターゲットに対しては５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅することが好ましく、より好ましくはそれぞれ７５ｎＭ以上１２５ｎＭ以下であり、さらに好ましくはそれぞれ約１００ｎＭである。さらに、HHV-6のU31遺伝子の上記ターゲットに対しては、１００ｎＭ以上２００ｎＭ以下の前記５’プライマー及び５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下の前記３’プライマーを用いて増幅することが好ましく、より好ましくは１２５ｎＭ以上１７５ｎＭ以下及び７５ｎＭ以上１２５ｎＭ以下であり、さらに好ましくは約１５０ｎＭ及び約１００ｎＭである。
【００３０】
また、リアルタイムＰＣＲにおいては、いずれも、５０ｎＭ以上１５０ｎＭ以下のそれぞれ上記プローブを用いることが好ましく、より好ましくは７５ｎＭ以上１２５ｎＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭである。
【００３１】
プローブあるいはリアルタイムＰＣＲに用いるプローブとしては、適宜標識されていてもよい。標識物質としては、一般には蛍光物質などが挙げられる。リアルタイムＰＣＲによる複数種類のウイルス同時アッセイにこれらのプローブを用いる場合、５’末端を蛍光物質で標識し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドプローブとしたいわゆるＴａｑＭＡＮプローブとすることができる。また、前記蛍光物質は、６−carboxyfluorescein（ＦＡＭ）、６−carboxy−4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein（ＪＯＥ）及びcabocyanine 5(Ｃｙ５)から選択することが好ましい。また、クエンチャーとしては、black-hole-quencher (BHQ)1a、BHQ3aの蛍光色素（いずれもバイオサーチテクノロジー社製）を用いることが好ましい。なお、標識物質とクエンチャーの組み合わせとしては、ＦＡＭとＢＨＱ１ａ、ＪＯＥとＢＨＱ１ａ、Ｃｙ５とＢＨＱ３ａの組み合わせが挙げられる。
【００３２】
なお、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ等についての具体的な方法は従来公知の手法やあるいは製造者のプロトコールに従って実施することができる。
【００３３】
（被験試料）
本発明の分析方法は、ヒトや非ヒト動物から採取された検体として用いることができる。が、検体は、特に限定されないが、血液、髄液、組織液等の体液、生検などによって採取された組織、各種の分泌物や排泄物等が挙げられる。なかでも、全血、血漿の形態の血液を検体とすることが好ましい。特に、全血は、これら３種のウイルスDNAを高感度に検出できるとともに簡易迅速なアッセイが可能となるため好ましい。
【００３４】
（診断等への利用）
本発明にかかる３種のウイルスは、造血幹細胞移植や臓器移植など免疫抑制剤が投与された際などにおけるウイルス関連合併症の原因ウイルスである。したがって、本発明の分析方法によれば、こうした移植患者からの血液などの検体を被験試料とし、移植後の患者におけるこれら３種類のウイルス量を定量することにウイルスの増殖動態をモニタリングできる。さらにこれにより、ウイルス関連合併症の予測又は診断が可能となる。すなわち、ウイルス関連合併症の診断方法も提供されることになる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を具体化した実施例について説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【００３６】
（実施例１：マルチプレックス・リアルタイムPCR法による測定系の確立）
EBV BALF5領域、CMV IE2領域、HHV-6 U31領域にプライマー、プローブを設定し、それぞれ5’末端を6-carboxyfluorescein (FAM), 6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluoresceine (JOE)、carbocyanine 5 (Cy5)で、3’末端をblack-hole-quencher (BHQ)1a、BHQ1a、BHQ3aの蛍光色素（いずれもバイオサーチテクノロジー社製）でプローブを標識した（表１）。プライマー・プローブは既に報告したものから選択した（Kimura, H., M. Morita, Y. Yabuta, K. Kuzushima, K. Kato, S. Kojima, T. Matsuyama, and T. Morishima. 1999. Quantitative analysis of Epstein-Barr virus load by using a real-time PCR assay. J. Clin. Microbiol. 37: 132-136、Tanaka, N., H. Kimura, K. Iida, Y. Saito, I. Tsuge, A. Yoshimi, T. Matsuyama, and T. Morishima. 2000. Quantitative analysis of cytomegalovirus load using a real-time PCR assay. J. Med. Virol. 60:445-462、Tanaka, N., H. Kimura, Y. Hoshino, K. Kato, T. Yoshikawa, Y. Asano, K. Horibe, S. Kojima, and T. Morishima. 2000. Monitoring four herpesviruses in unrelated cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation 26:1193-1197）。プライマーの合成はGreiner bio-one(東京)、プローブの合成・標識はOperon biotechnologies ( Huntsville, USA) に委託した。
【００３７】
マルチプレックス・リアルタイムPCR法はQuantiTect Multiplex PCR キット (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて行った。 PCR 反応液は5 μl の DNA 抽出液、 12.5 μl のQuantitect Multiplex PCR マスターミックス、 後段にて示す各種濃度のそれぞれのプライマー・プローブを加え総量25 μlとした。ウイルス遺伝子の増幅と蛍光色素の検出はMx3000PTMリアルタイムPCR システム (Stratagene, La Jolla, USA)を用い、以下の条件で行った： 95°C 15分に引き続き、95°C 15秒-60°C 1分を50サイクル。なお、EBV BALF5領域、CMV IE2領域、HHV-6 U31領域を組み込んだプラスミドを陽性コントロールとし、10倍希釈したものを用い標準曲線を作成した。未知の検体の定量を行う際には、EBV, CMV, HHV-6の3種のプラスミドをミックスしたものを陽性コントロールとし、標準曲線からウイルスコピー数を算定した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
陽性コントロールプラスミドを用い、マルチプレックス・リアルタイムPCR法による、EBV, CMV, HHV-6 DNAの同時測定についての検討を行った。各種５’−プライマー、３’−プライマー及びプローブについて５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ及び２５０ｎＭの各種濃度設定を行い、色素が干渉なく検出されるかどうかを評価した。その結果、色素が干渉なく検出されるためには、プライマー・プローブの濃度設定も重要で、EBVのプライマーは5’側が200nM, 3’側が100nM, CMVはいずれも100 nM、HHV-6は5’側が150nM, 3’側が100nM、プローブの濃度はEBV,CMV,HHV-6いずれも100nMがもっとも好ましい濃度であり、これらの濃度を中心に隣接する他の濃度ではやや検出性が低下する傾向にあることがわかった。
【００４０】
また、陽性コントロールを用いて標準曲線を作成したところ、図１に示すように各ウイルス5〜5×106コピーの範囲で良好な直線性が得られ、検出限界はサンプルチューブあたりEBV, CMV, HHV-6それぞれ2コピー、5コピー, 2コピーであった。また、ヒトDNAをコントロールプラスミド に一定量加え、標的遺伝子以外のDNAが測定系に及ぼす影響を調べたところ、この同時検出システムでは標的遺伝子以外のDNA存在下でも標的遺伝子を特異的かつ高感度で検出できることがわかった。
【００４１】
（実施例２：単独 リアルタイム PCR法とマルチプレックス・リアルタイムPCR法の比較）
患者血液由来で、あらかじめウイルスDNA陽性とわかっているDNA55検体（EBV陽性 20検体、CMV陽性 20検体、HHV-6陽性 15検体）を用いて、それぞれ従来の単独のリアルタイムＰＣＲ測定系およびマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ測定系による定量を行い、結果を比較した。結果を図２〜図４に示す。
【００４２】
図２〜図４に示すように、３種のウイルスのいずれにおいても二つの測定系による定量結果に強い相関が見られた(図２；EBV r=0.978, p＜0.0001、図３；CMV r=0.939, p＜0.0001、図４； HHV-6 r=0.956, p＜0.0001)。以上の結果から、マルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法によれば、これら３種のウイルスについて同時に検出及び定量が単独による測定系と同等に精度良く測定できることがわかった。
【００４３】
（実施例３：臨床検体を用いたウイルス検出システムの有用性の検討）
名古屋大学医学部付属病院、小児科、小児外科、移植外科にて治療を受けた造血幹細胞移植27例、生体肝移植19例から経時的に血液を採取した。得られた血液303検体をそれぞれ全血、血漿に分けた後、DNAを抽出し、EBV、CMV、HHV-6のウイルス量をマルチプレックス・リアルタイムPCRにより定量した。結果を表２に示す。
【表２】
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【００４４】
血液303検体から検出された各ウイルスの内訳は、表2のようになった。また、経時的に血液検体を採取した移植患者46例中、36例（78.3％）の全血、18例（39.1％）の血漿からいずれかのウイルスDNAが検出された。また、全血では13例（28.3％）、血漿で5例から２種類以上のウイルスDNAが検出された。いずれのウイルスも血漿より全血中での陽性率が高かった。
【００４５】
検出されたウイルスDNA量の経時的変化は移植後患者の症状・治療経過と一致した。さらに、EBVについて、全血および血漿から検出されたウイルスDNA量を、有症状期・無症状期に分けて比較した。結果を図５に示す。
【００４６】
図５に示すように、全血においてはEBVに関して有症状期の患者検体から有意に多くのウイルス量が検出された。また、有症状であった患者全血検体はすべてEBV DNA陽性であった。一方、血漿中では有症状期と無症状期でEBV量には差がなく、一部の患者血漿では有症状であったにもかかわらず、ウイルスDNAは検出されなかった。
【００４７】
以上の結果から、移植患者においては、これら３種のウイルスDNA量をモニタリングが診断及び治療方針の決定に有用であることがわかった。また、これら３種のウイルスの検出・定量に関しては、全血を用いることでウイルスを高感度に検出できることがわかった。特に、全血中のＥＢＶについては、患者の有症状期と一致しており、全血中のＥＢＶは臨床上の有用なマーカーとなることがわかった。
【００４８】
今回新たに確立したマルチプレックス・リアルタイム PCR法によるEBV、CMV、HHV-6の同時検出システムはそれぞれを単独で検出する従来の方法と比べて定量性に差はなく、有用な測定系であることが示された。また、造血幹細胞移植・臓器移植患者を対象に血液中のウイルスDNAの定量を行った結果、臨床的にも非常に有用であることが示された。さらに、新たな知見として、全血をサンプルとした時の方がウイルスを高感度で検出できるのみならず、有症状期にウイルス量が多くなることから、全血の方がより臨床経過を反映していることがわかった。従来の単独リアルタイムＰＣＲ法に比べ、マルチプレックス・リアルタイムPCR法を用いることで、3種類の異なったウイルスの複数種あるいは全てを同時に測定できるのみならず、測定時間の短縮、労働の減少も期待できる。以上のことから、本発明の分析システムは、幅広く移植医療で応用される可能性が高い。このシステムによって、より簡便・迅速な移植後ウイルス感染症のモニタリングが可能になり、移植成績の向上にも貢献できると考える。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１〜９：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】陽性コントロールを用いたＥＢＶ、ＣＭＶ及びＨＨＶ−６ウイルスＤＮＡの標準曲線を示す図。
【図２】ＥＢＶウイルスＤＮＡを単独リアルタイム PCR法とマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法とを比較した結果を示すグラフ図。
【図３】ＣＭＶウイルスＤＮＡを単独リアルタイム PCR法とマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法とを比較した結果を示すグラフ図。
【図４】ＨＨＶ−６ウイルスＤＮＡを単独リアルタイム PCR法とマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法とを比較した結果を示すグラフ図。
【図５】全血と血漿とにおけるマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲによるＥＢＶ ＤＮＡ量についての比較を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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