(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを導入することによって、その転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換された植物体を用いて水圏の余剰なリンを除去する工程を包含する水質浄化法であって、前記転写因子が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質である、前記方法。
【請求項２】
前記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物体がペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、またはニーレンベルギアである、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機リン酸を高蓄積する植物体（例えば、ペチュニア、トレニア等）およびその利用に関する。特に、本発明は、リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を植物体に導入することを特徴とするリン酸を高蓄積する植物体の生産方法、その生産方法を用いて得られる植物体、および水質浄化におけるその植物体の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境意識の高まりと共に水質汚染が大きな問題となっており、河川や湖沼などの水圏における水質浄化の必要性が増している。水質汚染の主な原因としては、ダイオキシンや重金属などの毒性物質の混入やリンや窒素等の過剰な流入などがあげられる。
【０００３】
過剰量のリンや窒素は農地からの排水、家畜の糞尿、生活排水や工業排水などによりもたらされ、水圏の富栄養化を促し、アオコや赤潮などの発生の直接的原因となる藻類、微生物類などの一次生産者の増殖を招く。通常、一次生産者の制限要素になる元素は窒素かリンであるが、水中では窒素固定藻類は普通に存在し、また陸上からの流出水のために硝酸イオンは豊富なことが多い。このため、一次生産者の成長に対して一般的に制約的な元素はリンとなる。リンは大気から供給されることはなく、また多価の負の電荷をもったリン酸イオンは土壌中の鉱物粒子に強く結合しており、施肥していない土地からの流出水へリンが入ることは少ない（地球環境の化学、Ｔ．Ｇ．Ｓｐｉｒｏ他著、学会出版センター、２０００年）。逆に言えば、水中からリンを除去することにより効果的に一次生産者の増殖を抑制できることになる。
【０００４】
人間の日常の生産活動による湖沼、河川、海洋の富栄養化が問題になって久しいが、下水処理場などで通常行われている活性汚泥法による下水処理ではリンや窒素などの無機イオンがほとんど除去されず、富栄養化を改善できないのが現状である。
【０００５】
リンや窒素を水域から除去することは水質汚染を解決するために有効な手段であり、物理的な方法、化学的な方法、生物学的な方法などの様々な手法で、リンや窒素の除去を目的とした水質浄化が行われており、低コストで効率の高い方法が求められている（水質浄化マニュアル、本橋敬之助著、海文堂出版、２００１年）。
【０００６】
物理的および化学的な方法（電解法、晶析法、凝集分離法など）は、除去効率の面では優位性が高いが、大仰な設備を必要とし、薬品の継続使用などでコストも高くなることが問題点となっている。また、生物学的方法については、活性汚泥法、フォストリップ法（活性汚泥法に凝集剤添加を組み合わせた手法）なども広く用いられているが、近年では浄化能力の向上とともにコストアップが問題となっている。
【０００７】
一方、ファイトレメディエーション（ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）と呼ばれる植物を用いた環境浄化法が、一般的に利用されるようになり、水質浄化に関しても植物を利用する試みが盛んに行われている。水質汚染の原因となるリンや窒素は植物に必須の栄養素であるので、植物はこれらの物質を積極的に根から吸収する。そこで、リンや窒素などの吸収力が比較的高く生育の旺盛なホテイアオイやヨシ等の水生植物を用いてファイトレメディエーションを試みた例が多く報告されている（水質浄化マニュアル、本橋敬之助著、海文堂出版、２００１年）。しかしながら、ホテイアオイなどの水生植物は回収にコストがかかり管理が難しいことや生態系に影響を与えることなどが問題視されている（水質浄化マニュアル、本橋敬之助著、海文堂出版、２００１年）。また、回収した植物バイオマスを有効利用することはほとんど出来ずに、バイオマスを廃棄するために余分なコストがかかってしまうことも大きな問題である。回収したバイオマスを直接肥料として利用できれば低コストな処理法と成り得るが、浄化に用いられる既存の植物の吸収能力には限界があり、リンや窒素の含有量が低いために肥料用途に用いることが出来ないのが現状である。
【０００８】
美観と浄化を両立させるために陸生花卉植物を用いた水上栽培装置なども開発されているが（例えば、特開平９−５６２７８号公報）、開花後の植物バイオマスの処理法については現在のところ有効な手段はない。
【０００９】
また、食用野菜などを水質浄化に用い、回収した植物の有効利用を目指した例も知られているが、一般消費者に水質が汚染されている水圏で育てた野菜が容易に受け入れられるとは考えにくい。
【００１０】
リンが植物にどのように吸収・蓄積され、利用されるかについての研究は現在に至るまで行われてきている。リンは植物に必須の栄養素であり、リン酸はまず根から取り込まれ、導管に輸送された後、地上部に供給され利用される。リン酸は多くの生命現象に関わっており、リン脂質、ヌクレオチド、リン酸化タンパク質などに形を変え利用されるほか、細胞内では液胞に蓄積され、必要に応じて細胞質内に供給される。また、種子中ではより安定なイノシトール６リン酸（フィチン酸）の形態で蓄積されている。
【００１１】
植物が取り込めるリンの形態は、無機リン酸（以下、「リン酸」と呼ぶ）だけであり、その他の不溶性有機リン酸などは取り込むことができない。一般に、土壌中のリン酸濃度は低く、植物にとって欠乏状態であるので、植物は積極的にリン酸を取り込むシステムを発達させている。リン酸を根から植物内に取り込むための要となるタンパク質は細胞膜上に存在するリン酸トランスポーターである。シロイヌナズナでは、高親和性トランスポーター９種類と葉緑体局在性のトランスポーター１種類が知られている。高親和性で細胞膜局在性のあるリン酸トランスポーターＰＨＴ１をタバコの培養細胞で過剰発現させることにより、リン酸の取り込みが上昇し、細胞の生長速度が増加したことが報告されている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，７０９８−７１０２，１９９７）。しかしながら、オオムギの植物体でリン酸トランスポーターを過剰発現させた場合には、リン酸取り込みの増加は確認されないという報告があり（Ｆｕｎｃ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ３１，１４１−１４８，２００４）、単純にリン酸トランスポーター数が増加しただけでは、リン酸の取り込み量の増加につながらないと考えられる。また、９種類ある高親和性リン酸トランスポーターのうち、根で強く発現しているものは２種類であり、その他のトランスポーターは花器官などで発現が確認されており、植物内での輸送にもリン酸トランスポーターは機能していると考えられている（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３０，２２１−２３３，２００２）。植物内ではリン酸を有効利用するために古い葉から新しい葉へリン酸の受け渡しが行われるが、こうした現象にもトランスポーターが関わっていると考えられる。
【００１２】
トランスポーター以外にも、シロイヌナズナを用いた突然変異体の解析から、いくつかのリン酸関連遺伝子が同定されている（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ９，５４８−５５５，２００４）。根から吸収されたリン酸の多くは地上部へ導管を経由して輸送され、利用されるが、ＰＨＯ１突然変異体では地上部への輸送が阻害される。これは吸収されたリン酸を根の細胞から導管へ輸送するためにＰＨＯ１タンパク質が機能していることを示している。また、ｐｈｏ２突然変異体はリン酸が地上部に過剰に蓄積する突然変異体で、ＰＨＯ２遺伝子は根から地上部への輸送を制御するタンパク質をコードすると考えられている。このようにリン酸の植物内での輸送に関する遺伝子のいくつかは明らかになっているが、植物のリン酸取り込みの分子レベルの詳細は不明な点も多い。
【００１３】
また、植物はリン酸欠乏に対して様々な戦略で、より多くのリン酸を外界から取り込もうとしている（Ａｎｎａｌｓ  Ｂｏｔａｎｙ，９４  ３２３−３３２，２００４）。リン酸の欠乏した状態を感知した植物は、クエン酸などの有機酸や酸性フォスファターゼを根から土壌に放出し、不溶性の有機リン酸を可溶性の無機リン酸に変換し吸収しようとする。リン酸欠乏になると根の形態も変化し、側根が増え、根毛が伸張し、より広範囲のリン酸を吸収できるようになる。また、リン酸の欠乏は植物内の代謝系にも影響を与え、光合成系の遺伝子発現が抑制されたり、アントシアニンの蓄積が増加したりすることなどが知られている。細胞内のヌクレアーゼやフォスファターゼ活性も上昇し、細胞内に存在するリンの再利用も行われる。
【００１４】
このようなリン酸欠乏に対する植物の反応は、リン酸の欠乏した状態を植物が感知して起こる一連の反応であり、この反応の制御因子および制御機構の解明が待たれているが、その知見はいまだ限られている。多くのリン酸関連遺伝子が同定されているが（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ９，５４８−５５５，２００４）、植物に導入することによってリン酸の吸収力が上がったという報告は、知られていない。
【特許文献１】特開平９−５６２７８号公報
【非特許文献１】地球環境の化学、Ｔ．Ｇ．Ｓｐｉｒｏ他著、学会出版センター、２０００年
【非特許文献２】水質浄化マニュアル、本橋敬之助著、海文堂出版、２００１年
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，７０９８−７１０２，１９９７
【非特許文献４】Ｆｕｎｃ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ３１，１４１−１４８，２００４
【非特許文献５】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３０，２２１−２３３，２００２
【非特許文献６】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ９，５４８−５５５，２００４
【非特許文献７】Ａｎｎａｌｓ  Ｂｏｔａｎｙ，９４  ３２３−３３２，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述のような状況下で、低コストで、効率の高い水質浄化方法が求められている。特に、浄化に用いる植物のリン蓄積能力を増大させる方法、およびリン蓄積能力が増大された植物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１遺伝子を構成的発現プロモーターの下流に連結し、さらにターミネーターを付加して、同一のベクター上に配置した組換え発現ベクターを作製し、これをペチュニア、およびトレニアに導入することにより、リン酸を高蓄積する植物を作製することに成功し、本発明を完成させた。従って、本発明は、次のような植物体、その植物体の生産方法、その植物体の生産に使用する組換え発現ベクター、およびその植物体の利用法を提供する。
【００１７】
（１）リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換された植物体。
（２）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１である、上記（１）に記載の植物体。
（３）上記Ｍｙｂ様転写因子ＰＨＲ１が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記（２）に記載の植物体。
（４）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記（１）に記載の植物体。
（５）ペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、またはニーレンベルギアである、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の植物体。
（６）リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように植物体を形質転換する工程を包含する植物体の生産方法。
（７）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを上記植物体に導入することによって、上記植物体を形質転換する、上記（６）に記載の方法。
（８）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１である、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）上記Ｍｙｂ様転写因子ＰＨＲ１が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記（６）または（７）に記載の方法。
（１１）上記植物体が、ペチュニアである、上記（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）上記植物体が、トレニアである、上記（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）上記（６）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法によって生産される植物体。
（１４）リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターであって、植物体に導入したときに、上記転写因子をコードする遺伝子を発現することができるように構成された、ベクター。
（１５）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１である、上記（１４）に記載のベクター。
（１６）上記Ｍｙｂ様転写因子ＰＨＲ１が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記（１５）に記載のベクター。
（１７）上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記（１４）に記載のベクター。
（１８）上記（１）〜（５）のいずれか、または上記（１３）に記載の植物体の繁殖材料。
（１９）上記（１）〜（５）のいずれか、または上記（１３）に記載の植物体を用いて水圏の余剰なリンを除去する工程を包含する、水質浄化法。
（２０）上記（１４）〜（１７）のいずれかのベクターを導入され、形質転換された、植物体へ再生可能な植物細胞。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、低コストで、効率の高い水質浄化方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法により、遺伝子組換え技術を用いて植物のリン蓄積量を増加させることができる。本発明により、実用化に有利な水質浄化植物、およびその作製方法が提供される。
【００２０】
本発明のリン蓄積量の増大した植物を使用することにより水質の浄化能力とリン酸の再利用性の向上が実現し得る。
【００２１】
また、本発明の方法により、遺伝子導入によって園芸花卉植物のリン酸蓄積能を高め、美観と高浄化能を兼ね備えた植物による水質浄化も実現可能となる。
【００２２】
リンは、現在輸入量の８０％以上が肥料として使用されているが、植物が吸収したリンは肥料として還元することが最も理にかなっている。本発明により植物当たりのリン蓄積量が増加すると、植物そのものをリン肥料として利用し得る。したがって、本発明のリン酸高蓄積植物体により、回収後のバイオマスを肥料化、さらにはリン抽出に有効利用することができる。本発明のリン酸高蓄積植物体の生産方法を用いて、既存のリン酸蓄積能の高い植物に遺伝子導入することによって、より多くのリン酸を蓄積できる植物の作製も可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
植物がリン酸欠乏状態に陥ったときの制御因子の一つとして知られるのが、シロイヌナズナのＰＨＲ１遺伝子である。ＰＨＲ１遺伝子はリン酸の欠乏した状態に応答してリン酸関連遺伝子の転写を活性化すると考えられている転写因子をコードしている（Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．  １５，２１２２−２１３３，２００１）。ｐｈｒ１突然変異体はアントシアニンの蓄積などのリン酸飢餓反応を示さなくなり、複数のリン酸関連遺伝子の転写が低下している。よって、ＰＨＲ１遺伝子はリン酸飢餓反応の上流部に位置し、いくつかの遺伝子の転写活性を上げることによって、植物のリン酸の取り込み能を上昇させると考えられる。本発明者らは、このようなリン酸飢餓反応の制御因子を植物に導入し、植物のリン酸飢餓状態を維持することが出来れば、リン酸をより効率的に吸収する植物を作製できると考えた。そして実際に植物に導入した結果、リン酸の高蓄積を確認し、本発明を完成させるに至った。
【００２５】
すなわち、本発明は、リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換された、リン酸高蓄積植物体を提供する。
【００２６】
本明細書中、「リン酸飢餓反応」とは、植物にとってリン酸が欠乏した状態に置かれたときにその植物が示す、リン酸を必要量獲得するための一連の適応反応を指す。そのような適応反応の例としては、例えば、リン酸の欠乏した状態を感知した植物が、クエン酸などの有機酸や酸性フォスファターゼを根から土壌に放出し、不溶性の有機リン酸を可溶性の無機リン酸に変換し吸収しようとする反応が含まれる。リン酸欠乏になると根の形態も変化し、側根が増え、根毛が伸張し、より広範囲のリン酸を吸収できるようになる。また、リン酸の欠乏は植物内の代謝系にも影響を与え、光合成系の遺伝子発現が抑制されたり、アントシアニンの蓄積が増加したりすることなども知られている。細胞内のヌクレアーゼやフォスファターゼ活性も上昇し、細胞内に存在するリンの再利用も行われる。「リン酸飢餓反応」には、このようなリン酸の飢餓状態を植物が感知したときに起こる一連の反応が含まれるものとする。
【００２７】
本明細書中、「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」とは、リン酸の欠乏した状態において植物がリン酸を体内に取り込み、蓄積する機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子のことをいい、例えば、植物の細胞膜上に存在するリン酸トランスポーターをコードする遺伝子が「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」に含まれる。例えば、シロイヌナズナにおける９種類の高親和性トランスポーター（例えば、ＰＨＴ１）および１種類の葉緑体局在性トランスポーターなどが代表例として挙げられる。しかしながら、「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」はこれらに限定されず、リン酸の欠乏した状態において遺伝子発現の増大または減少が確認される遺伝子は全て、本発明における「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」に含まれる。なお、本明細書中、句（ｐｈｒａｓｅ）「リン酸飢餓応答遺伝子」は、句「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」と同義のものとして使用される。
【００２８】
本明細書中、「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子」とは、上記「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子」の植物体内での転写を制御する因子のことを指す。「転写を制御する因子」には、転写を抑制または活性化する因子が含まれるが、本発明においては、主として転写を活性化する因子のことを指すものとする。しかしながら、リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、結果としてリン酸飢餓反応を進行させるように働く場合には、転写を抑制する因子も本明細書中で使用する「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子」に含まれるものとする。一般に「転写因子」はタンパク質複合体を形成して機能しているが、本発明においては、主として、タンパク質複合体の構成要素であるタンパク質またはペプチドを指すものとする。「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子」の代表的な例には、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１（配列番号２）が含まれるが、これに限定されず、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜数個（例えば、６個））のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化もしくは抑制する機能を有するタンパク質などもまた、本明細書中で使用する「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子」に含まれる。
【００２９】
本明細書中、「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子」とは、上記「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子」をコードする遺伝子を指す。「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子」の代表的な例としては、シロイヌナズナ由来のＭｙｂ様転写因子ＰＨＲ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ３１０７９９：配列番号１）が挙げられるが、これに限定されず、上記ＰＨＲ１遺伝子の誘導体、例えば、（ａ）配列番号１に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム（またはＣＤＳ）を含む遺伝子、または（ｂ）配列番号１に示される塩基配列もしくはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化もしくは抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた、「リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子」に含まれるものとする。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ．  ２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００３１】
本明細書中、「遺伝子を発現するように形質転換された」とは、遺伝子を一過性または安定的に発現するように形質転換されたことを意味するが、好ましくは、安定的に発現されるように形質転換されることを意味する。
【００３２】
植物の形質転換は、通常、所望の遺伝子を担持した発現用ベクターを植物に導入することによって遺伝子工学的に行われる。したがって、本発明はまた、別の態様において、リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００３３】
本発明のベクターは、通常、それらを導入すべき宿主の種類などに依存した適切なプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域および複製起点等を含有する。例えば、遺伝子を植物細胞内で発現させるためには、（１）植物細胞内で機能可能なプロモーター、（２）遺伝子、および（３）植物細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で有するＤＮＡ分子（発現カセット）を作製し、植物細胞に導入する。このようなＤＮＡ分子は、プロモーターに加え、転写をさらに増強するためのＤＮＡ配列、例えば、エンハンサー配列を含んでいてもよい。用いられるプロモーターとしては、植物細胞内で機能するものであれば特に制限はないが、例えば、３５Ｓ（Ｓｈｃｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１１７６−１１８３）、Ｎｏｓ（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１１７６−１１８３）、ｒｂｃＳ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、ＰＲ１ａ（Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｍ．ら、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：９５−１０６）、ＡＤＨ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、ｐａｔａｔｉｎ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、Ｃａｂ（Ｂｅｎｅｆｙ，Ｐ．Ｎ．およびＮ−Ｈ．Ｃｈｕａ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１）、）、およびＰＡＬ（Ｌｉａｎ，Ｘ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２８４−９２８８）等が挙げられる。
【００３４】
上記のようなベクターの構築は、公知の制限酵素等を用いて、常法に従って行い得る。例えば、アグロバクテリウムを用いる場合には、ｐＢＩ１２１などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合には、ｐＵＣ１９などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該ベクターで形質転換された植物細胞を、例えば、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、目的の遺伝子で形質転換された植物体を得ることができる。なお、本明細書中、用語「植物」と「植物体」とは、同義のものとして使用される。
【００３５】
植物細胞へのベクターの導入は、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスやアグロバクテリウム・リゾゲネスを利用した間接導入法（Ｈｅｉｅｉ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４、Ｔａｋａｉｗａ，Ｆ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１１，３９−４９，１９９５）や、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，Ｙ．ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，８０，４７５，１９９０）、ポリエチレングリコール法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２０，６１９−６２９，１９９２）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２，２７５−２８１，１９９２、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，８３３−８３９，１９９０）などに代表される直接導入法を用いることが可能である。本発明において遺伝子導入を行う植物細胞としては、植物体に再生可能であれば特に制限がなく、例えば、懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉の切片などを構成する細胞などが含まれる。したがって、本発明はまた、１つの態様において、本発明のリン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換され、かつ植物体に再生可能な植物細胞を提供する。
【００３６】
形質転換された植物細胞は、再生させることにより植物体を作出することができる。このようにして、形質転換したトランスジェニック植物が作製され得る。本発明のリン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換されたリン酸高蓄積植物体も、同様に作製することができる。
【００３７】
したがって、本発明はまた、別の態様において、リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように植物体を形質転換する工程を包含する、リン酸高蓄積植物体の生産方法を提供する。好ましくは、上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを上記植物体に導入することによって、上記植物体が形質転換される。
【００３８】
本発明のベクターで形質転換するのに好ましい植物種としては、形質転換体取得が可能な植物種が挙げられる。このような植物種としては、例えば、ペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、ニーレンベルギア、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、ドルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、チューリップなどが挙げられる。とりわけ、ペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、ニーレンベルギアが好ましい。このうち、植物の成長速度が大きく、体内中のリン濃度が高く、水中の幅広いリン酸濃度に適応して生育する植物種が望ましいが、それに限るものではない。
【００３９】
本発明のベクターを植物体に導入および発現することにより、リン酸が高蓄積された植物体に加えて、その繁殖材料（例えば、種子、後代、切花、塊根、塊茎、切穂など）から得た植物体もまた、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４０】
本発明は、さらに別の態様において、上記植物体を用いて水圏の余剰のリンを除去する工程を包含する、水質浄化法を提供する。
【００４１】
本明細書中で、「水圏の余剰なリン」とは、一次生産者と二次生産者のバランスが維持できる濃度以上のリンを指し、具体的には、アオコ・赤潮の発生が抑制される濃度以上のリンを指す。例えば、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の環境基準では全リン濃度によって湖の栄養状態が分類されており、０．０１ｍｇ／ｌ以下が貧栄養湖、０．０３５ｍｇ／ｌ以上が富栄養湖である。リン以外の要因も関係するので一概には言えないが富栄養湖ではアオコなどが発生しやすい条件となっている。また、本明細書中、「水圏」とは、淡水域のことを意味し、代表的な例としては、湖沼、池、河川などが本明細書中でいう「水圏」に含まれる。
【００４２】
好ましくは、本発明の植物体は汚水の流れ込む貯水池、農業用ため池、公園の池のような余剰なリンの除去による水質浄化を必要とする場所に移植、栽培され、そこで水中に含まれる余剰のリンを吸収することによって環境（例えば、水圏、土壌など）からのリンの除去を行う。リンを高蓄積した植物のバイオマスは、その後回収され、好ましくは、肥料として使用される。肥料として使用するには、回収したバイオマスは、好ましくは、乾燥、粉砕による粉状化などの処理にかけられる。また、植物自体が高いリン酸蓄積を示していれば、無加工で農地や畑地にすき込み、直接肥料化することも可能である。このようにして、本発明の植物体によれば、水質浄化植物の大きな課題であった回収後のバイオマスを、肥料化して、または抽出されたリンという形で有効的に再利用することができる。
【００４３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例において、分子生物学的手法は特に断らない限り、ＷＯ９６／２５５００あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法に従った。
【００４５】
実施例１．ＰＨＲ１発現ベクターの構築
ＰＨＲ１遺伝子は、ＴＯＰＯ―ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社）を用い、解説書に従いｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした。プライマーＰＨＲｆ（５’−ＡＴＧＧＡＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ−３’（配列番号３））とＰＨＲｒ（５’−ＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号４））を用いたＰＣＲ反応で増幅した産物をサブクローニングし、ｐＳＰＢ１８９２とした。エンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ2３５Ｓ）プロモーターとノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有するバイナリーベクターｐＳＰＢ１７６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、ｐＳＰＢ１７６Ａを得た。ｐＳＰＢ１８９２をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、得られたＰＨＲ１遺伝子断片をｐＳＰＢ１７６Ａに挿入し、ｐＳＰＢ１８９８を得た。
【００４６】
３５Ｓプロモーターのエンハンサー配列とマノピンシンターゼプロモーターを連結した（Ｍａｃ）プロモーターとマノピンシンターゼ（ｍａｓ）ターミネーターを有するバイナリーベクターｐＳＰＢ２３１１をＳｍａＩで切断し、ｐＳＰＢ２３１１Ａを得た。ｐＳＰＢ１８９２をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した断片をｐＳＰＢ２３１１Ａに挿入しｐＳＰＢ２３１４を得た。
【００４７】
ＰＨＲ１の転写活性化能を増強するために、単純ヒトヘルペスウイルスのＶＰ１６タンパク質の転写活性化領域とＰＨＲ１遺伝子を連結したキメラタンパク質発現用のベクターも作製した。プライマーＢａｍＰＨＲｆ（５’−ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号５））とＳｐｅＰＨＲｒ（５’−ＣＡＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡ−３’（配列番号６））を用いたＰＣＲ反応で増幅した産物をＢａｍＨＩとＳｐｅＩで切断したＤＮＡ断片Ａと、プライマーＳｐｅＶＰ１６ｆ（５’−ＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号７））とＫｐｎＶＰ１６ｒ（５’−ＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号８））を用いたＰＣＲ反応で増幅した産物をＳｐｅＩとＫｐｎＩで切断したＤＮＡ断片Ｂとを得た。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断したｐＳＰＢ２３１１、ＤＮＡ断片ＡおよびＤＮＡ断片Ｂで３点ライゲーションを行いＰＨＲ１タンパク質のＣ末端側に７９アミノ酸残基からなるＶＰ１６由来のペプチドが連結したキメラタンパク質を発現するためのベクターｐＳＰＢ２３７７を作製した。ｐＳＰＢ１８９８、ｐＳＰＢ２３１４およびｐＳＰＢ２３７７上のＰＨＲ１遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。
【００４８】
実施例２．形質転換体の作製
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５，  ８１，  １９９４）に基づいて、ｐＳＰＢ１８９８もしくはｐＳＰＢ２３１４もしくはｐＳＰＢ２３７７を用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇｌ０株）を形質転換し、このｐＳＰＢ１８９８もしくはｐＳＰＢ２３１４もしくはｐＳＰＢ２３７７を有する形質転換アグロバクテリウムをペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）に感染させた。得られた組換え植物の葉から、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔ（キアゲン）を用いてＲＮＡを抽出し、定法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより導入した遺伝子が発現している系統を選択した。
【００４９】
実施例３．形質転換体のリン酸蓄積量
（１）リン酸濃度測定法
リン酸濃度の測定はＡｍｅｓの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ８，１１５−１１８，  １９６６）を一部改変しておこなった。葉を約１００ｍｇずつ計量しながらサンプリングし、振盪破砕用の２ｍｌチューブに直径４ｍｍのジルコニアビーズと共に封入し、−８０℃で凍結した。凍結したサンプルを室温中に取り出し、チューブ中に１％（Ｖ／Ｖ）酢酸を５００μｌ入れ、振盪破砕機（キアゲン）で６分間振盪破砕した。破砕後、卓上遠心機で１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清５００μｌを得て、リン酸抽出液とした。このリン酸抽出液を１０−１００倍希釈で終量８００μｌとなるように、蒸留水で調製した。この溶液にリン酸測定用試薬（組成は後述）を１６０μｌ加えよく撹拌して１０分間放置した。分光光度計でＡｂｓ８８０を測定し、標準溶液を用いて描いた検量線と比較することによりリン酸濃度を求めた。得られたリン酸濃度と計量したサンプルの重さから１ｇの葉に含まれるリン酸量を算出した。
【００５０】
（リン酸測定試薬の組成）
２．５Ｍ硫酸  １０ｍｌ
０．１Ｍアスコルビン酸  ６ｍｌ
０．２７ｇ／１００ｍｌ  酒石酸アンチモニルカリウム  ３ｍｌ
８ｇ／１００ｍｌ  モリブデン酸アンモニウム  ６ｍｌ
を混合して２０ｍｌの溶液とする。アスコルビン酸は要時調製。
【００５１】
（２）形質転換トレニア、ペチュニアでのリン酸量
得られた形質転換体の葉から上記の方法に従ってリン酸濃度を測定し、新鮮重あたりのリン酸含有量を決定した。表１および図１に示すように、形質転換トレニアでは３５Ｓプロモーターを用いたｐＳＰＢ１８９８とＭａｃプロモーターを用いたｐＳＰＢ２３１４ともに、野生型に比べて約５倍多いリン酸の蓄積を示した。
【表１】
0005213449.tif 000002
【００５２】
トレニアと同様にペチュニア形質転換体においてもＰＨＲ１遺伝子導入株は野生型に比べて高いリン酸蓄積を示した（表２および図２）。ペチュニアではＶＰ１６の転写活性化部位を連結したＰＨＲ１を発現するｐＳＰＢ２３７７を導入した形質転換体が最も高いリン酸の蓄積を示し、ＶＰ１６の転写活性化部位がペチュニアでは有効に働くと考えられた。
【表２】
0005213449.tif 000003
【００５３】
実施例４：水耕栽培における形質転換体のリン酸量
（１）水耕トレニア新鮮重あたりのリン酸量
また、トレニアのｐＳＰＢ１８９８形質転換体を用いて水耕栽培を行い、水耕栽培においてもリン酸吸収能力の上昇が見られるかどうかを確認した。リン酸濃度５ｍｇ／Ｌの水耕溶液中で約１ヶ月間水耕栽培したトレニアの葉をサンプリングし、リン酸濃度を測定した。表３および図３に見られるように形質転換体は野生型に比べて約３倍のリン酸蓄積量を示しており、水耕栽培に用いてもＰＨＲ１遺伝子による吸収能力の増加は確認できた。
【表３】
0005213449.tif 000004
【００５４】
水耕栽培したｐＳＰＢ１８９８形質転換体の形態は野生型と差は見られず、一定期間培養後の植物重量も野生型との差は見られなかったことから、過剰に吸収されたリン酸は植物の生長には使われずに、リン酸のままで植物体内に蓄積していることが示唆された。また、ＰＨＲ１の構成的発現が植物の生長に影響を与えないことも示唆された。
【００５５】
（２）水耕トレニアの乾燥重量当たりのリン酸量
植物体全体でリン酸蓄積量が増加しているかどうかを確認するために、リン酸濃度５ｍｇ／Ｌで約２ヶ月間水耕栽培をおこなったトレニアのｐＳＰＢ１８９８の地上部すべてを回収し、８０℃で約２日間かけて乾燥させ、乾燥重量あたりのリン酸蓄積量を測定した（表４および図４）。野生型と形質転換体各３個体ずつを乾燥し、リン酸濃度を測定し、その平均値を出した。この結果、乾燥させたトレニアに関しても形質転換体は野生型に比べて約２．５倍と高いリン酸蓄積量を示すことがわかり、植物体全体でリン酸の蓄積量が増加していることを確認できた。
【表４】
0005213449.tif 000005
【００５６】
以上のようにＰＨＲ１遺伝子を植物に導入し過剰発現させることにより、植物のリン酸蓄積能を増強させることが出来ることが明らかになった。
【００５７】
実施例５：水耕液からのリン酸吸収量
水耕液からのリン酸吸収量の差を明確にするために、以下の比較実験を行った。野生型トレニアもしくはＰＨＲ１導入形質転換トレニアを、プラスチック製コンテナ（２３Ｘ２３Ｘ１１．５ｃｍ）内で発泡スチロールに穴を開けたものを支持体として浮かべ、脱イオン水に各種塩類を溶かした水耕溶液５リットルを用いて生育させた。水耕溶液のリン濃度は５ｍｇ／Ｌに設定した。各コンテナには４株の植物を用い、経日的に水耕溶液のサンプリングを行い、上述の方法によりリン酸濃度を測定した。また、葉からの蒸散や水面からの蒸発により水耕溶液の液量が減少するため、３日おきに脱イオン水を補充した。
【００５８】
（水耕溶液の調整）
１０リットル中（リン濃度５ｍｇ／Ｌ）
１Ｍ  ＫＮＯ3                                ５ｍｌ
１Ｍ  ＭｇＳＯ4                              ２ｍｌ
１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ3）2                          ２ｍｌ
２０ｍＭ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ                  ２．５ｍｌ
微量元素                                      １ｍｌ
１Ｍ  ＫＰＯ4バッファー（ｐＨ５．５）  １．６１ｍｌ
【００５９】
微量元素液組成（５０ｍｌ中）
３５０ｍＭ  Ｈ3ＢＯ3                      １０ｍｌ
１４０ｍＭ  ＭｎＣｌ2                        ５ｍｌ
５０ｍＭ    ＣｕＳＯ4                    ５００μｌ
１００ｍＭ  ＺｎＳｏ4                    ５００μｌ
２０ｍＭ  Ｎａ2ＭｏＯ4                    ５００μｌ
５Ｍ  ＮａＣｌ                            １００μｌ
１０ｍＭ  ＣｏＣｌ2                        ５０μｌ
【００６０】
測定の結果、ＰＨＲ１形質転換体は野生型に比べ、優れたリン吸収能力を有することが示された（表５および図５）。ｐＳＰＢ１８９８、ｐＳＰＢ２３１４どちらの形質転換体も培養開始後１４日以内に溶液中のほぼ全てのリン酸を吸収し、高い吸収能を示した。また、ほとんど全てのリン酸を吸収していたことから、低濃度域においても積極的にリン酸を吸収していると考えられた。
【表５】
0005213449.tif 000006
【００６１】
４週間（２週間の試験２回分）培養した植物の葉のリン酸量を分析した結果は、実施例３および４におけるトレニアやペチュニアの結果と同じ傾向を示し、形質転換体がリン酸を多く蓄積していた（表６および図６）。また、図７は４週間水耕栽培後のトレニアの地上部を各株ごとに新鮮重を測定し、平均をとって比較したもので、形質転換体の方が野生型に比べ少し小さいが、大きな差ではないことがわかる。このことから、形質転換体では吸収したリン酸を自身の生長に利用するのではなく、蓄えて保持していると考えられた。
【表６】
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【００６２】
以上の結果から、ＰＨＲ１遺伝子を導入した形質転換植物は、リン酸吸収能が増強され、植物を用いた水質浄化に適した形質を獲得したことが示された。
【００６３】
実施例６：他の植物へのＰＨＲ１遺伝子導入
ＰＨＲ１遺伝子によるリン酸吸収能の増大が他の植物でも見られるかどうかを確認するために、インパチェンス、ベゴニア、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギア、バラにＰＨＲ１遺伝子を導入した。
【００６４】
（インパチェンスおよびベゴニアへのＰＨＲ１遺伝子導入）
インパチェンス（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｗａｌｌｅｒｉａｎａ）の形質転換は基本的にＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ６，１２１，５１１に従い、品種グリッターレッド（サカタのタネ）とテンポピンク（タキイ種苗）を用いておこなった。ビトロ苗から切り出した茎頂、節、葉柄、葉片を前培養液体培地（１ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ 添加ＭＳ培地）で５日間前培養後、前培養固形培地（０．０５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ６ｍｇ／Ｌ Ｚｅａｔｉｎ，  ０．３％ゲランガム 添加ＭＳ培地）に４８時間静置した。その後、ｐＳＰＢ２３１４を導入したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇｌ０株）を感染させ、選択培地上（０．０５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ６ｍｇ／Ｌ Ｚｅａｔｉｎ， １００ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， １００ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ， ０．３％ゲランガム添加ＭＳ培地）で４−８週間培養しシュートを得た（表７）。葉片は容易に褐変してしまいシュートは得られなかった。茎頂および節では１つの外植片より多くのシュートが得られたが、偽陽性も多数含まれると考えられた。葉柄からのシュートは出現に時間がかかり、数も少ないが、最も確からしい。
【表７】
0005213449.tif 000008
【００６５】
ベゴニア（Ｂｅｇｏｎｉａ Ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ）の形質転換は品種アンバサダーホワイトとアンバサダースカーレット（サカタのタネ）を用いておこなった。ビトロ苗から葉片と葉柄を切り出し、ｐＳＰＢ２３１４を導入したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇｌ０株）を感染させ、共存培養培地（０．５ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ， ０．１ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ， ０．５％ ＰＶＰ， ２ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３， ２００μＭ Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ， ０．３％ゲランガム添加ＭＳ培地）上で暗黒下３日間培養した。その後、前選択培地（１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ， １ｍｇ／Ｌ Ｚｅａｔｉｎ， ０．１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ５０μＭ Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ， ０．２５％ゲランガム添加MS培地）で３−５日間、選択培地１（２ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ， ０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， １００ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ０．４％寒天添加ＭＳ培地）で２週間、選択培地２（０．２ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ， ０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， １００ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ０．４％寒天添加ＭＳ培地）で２週間、選択培地３（１００ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ０．４％寒天添加MS培地）で３週間連続して培養した。その間に形成されたシュートは直径５ｍｍ以上に成長したところで、周りの組織を削り取り、選択培地４（１５０ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ０．４％寒天添加ＭＳ培地）に移し、さらに２−３週間培養後、発根培地（１００ｍｇ／Ｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ， ５００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｎｔｉｎ， ０．４％寒天添加ＭＳ培地）に移し発根シュートを得た（表８）。
【表８】
0005213449.tif 000009
【００６６】
（タバコ、バーベナ、ニーレンベルギアへのＰＨＲ１遺伝子導入）
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、バーベナ（Ｖｅｒｂｅｎａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ  ｓｐ．）の形質転換はそれぞれ公知の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，  １２２９，１９８５；  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２１，  ４５９，  ２００３；  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３，  １９，  ２００６）に基づき行った。得られた植物体の遺伝子導入については、各植物体の葉よりＤＮＡを抽出し、ＰＨＲ１遺伝子をテンプレートとしたＰＣＲにより確認した。タバコで１１個体、バーベナで１６個体、ニーレンベルギアで１個体のＰＨＲ１形質転換植物を取得した。
【００６７】
（バラへのＰＨＲ１遺伝子導入）
ｐＳＰＢ２３１４を有する形質転換アグロバクテリウムの菌液中に無菌苗の葉から誘導したバラ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ）のカルスを５分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地に移植し、２日間暗所で共存培養した。その後、カルベニシリンを４００ｍｇ／ｌ 加えたＭＳ液体培地で洗浄し、継代用培地 にカナマイシン５０ｍｇ／ｌ とカルベニシリン２００ｍｇ／ｌを加えた選抜・除菌用培地へ移植し、選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン ２００ｍｇ／ｌ を添加した再分化用の培地で培養することでカナマイシン耐性のシュート原基が得られており、バラでもＰＨＲ１形質転換植物が得られる見込みが高い。
【００６８】
（形質転換タバコ、形質転換バーベナのリン酸吸収試験）
ＭＳ培地で生育しているＰＨＲ１形質転換タバコの無菌苗より葉をサンプリングし、ＰＨＲ１の発現量をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。その結果発現量の多い系統を選抜系統とし、該系統の無菌苗をＭＳ培地で育苗したのち、葉の一部のサンプリングを行い、葉中のリン酸濃度を既述の方法により測定した。また、ＰＨＲ１形質転換バーベナの鉢上げ個体からもタバコの場合と同様に葉をサンプリングし、ＰＨＲ１の発現量をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。その結果発現量の多い系統を選抜系統とし、該系統の葉をサンプリングしたのち葉中のリン酸濃度を既述の方法により測定した。
【００６９】
その結果、形質転換タバコ、形質転換バーベナいずれの植物においても、野生型と比較して１．５倍程度のリン酸の蓄積が見られた（図８および図９）。
【００７０】
以上のことから、８植物種よりＰＨＲ１遺伝子を導入した形質転換植物を取得することができ、また４植物種のＰＨＲ１導入形質転換植物において、リン酸の蓄積能力が向上する結果が得られた。このことは、ＰＨＲ１形質転換植物を様々な植物種で取得することが可能であり、またＰＨＲ１遺伝子は導入植物種を問わず、リン酸の蓄積に寄与できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上のように、本発明によるリン酸の高蓄積能を付与した形質転換植物を水質浄化に用いることで、水質浄化植物の大きな課題であった回収後のバイオマスを肥料化、さらには抽出されたリンという形で有効的に再利用することができるようになる。またこの技術を用いれば、既存のリン酸蓄積能の高い植物に遺伝子導入することによって、より多くのリン酸を蓄積できる植物の作製も可能になり、水質の浄化という課題に対して有効かつ二次汚染の少ない手法を提供できる。また、花卉園芸植物を遺伝子組換えのホストに用いることにより、美観面でも他の水質浄化手法にはないメリットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の形質転換トレニアの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図２】本発明の形質転換ペチュニアの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図３】本発明の水耕栽培した形質転換トレニアの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図４】本発明の水耕栽培した形質転換トレニアにおける地上部の乾燥重量あたりのリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＤＷ）を示す。
【図５】本発明の形質転換トレニアを培養した水耕液のリン酸濃度変化を経日的に示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸濃度（ｍｇ／Ｌ）、横軸は水耕液交換からの日数を示す。
【図６】本発明の水耕栽培した形質転換トレニアの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図７】本発明の水耕栽培した形質転換トレニアの地上部の新鮮重を示すグラフである。グラフの縦軸は重さ（ｇ）を示す。
【図８】本発明の形質転換タバコの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図９】本発明の形質転換バーベナの葉におけるリン酸蓄積量を示すグラフである。グラフの縦軸はリン酸量（ｍｇ／ｇＦＷ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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