(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を分析するための蛍光プローブであって、
単一ラベルポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含むことを特徴とし、
前記単一ラベルポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、前記標的核酸の部位の相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列、および、
前記プローブの末端ヌクレオチドに付着する蛍光ラベルを含むことを特徴とし、
前記末端ヌクレオチドは、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシドから成るグループから選ばれる塩基アナログであることを特徴とする、蛍光プローブ。
【請求項２】
前記標的核酸は、前記塩基アナログの位置に対して相補的な一つの位置にＣ残基を有することを特徴とする請求項１のプローブ。
【請求項３】
標的核酸を分析するためのハイブリダイゼーションプローブであって、
蛍光検出体を含むことを特徴とし、
前記蛍光検出体は、前記標的核酸の部位の相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含む単一ラベルオリゴヌクレオチド、および、
前記オリゴヌクレオチドの塩基アナログを含む内部残基に結合する蛍光ラベルを含むことを特徴とし、
前記塩基アナログは、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシドから成るグループから選ばれることを特徴とするハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４】
前記蛍光ラベルは、フルオレセン、フルオレセン誘導体、および、フルオレセン−シアニン結合体から成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のプローブ。
【請求項５】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
単一ラベルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを前記標的核酸と混合する工程であって、
前記プローブは、前記標的核酸の部位の相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド配列と、前記オリゴヌクレオチド配列の内部ヌクレオチドと結合する蛍光ラベルとを含み、
前記内部ヌクレオチドは、５−ニトロインドール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、および、５−イオド−２’−シチジンから成るグループから選ばれることを特徴とする塩基アナログであって、
前記プローブの前記標的核酸へのハイブリダイゼーションにより前記内部ヌクレオチドに対しＧ残基が＋１、０、または−１の位置に配され、
前記蛍光ラベルは、前記Ｇ残基によって消光が可能なように屈曲性に富むリンカーで前記内部ヌクレオチドに結合されており、前記プローブがハイブリダイゼーション依存性蛍光発光の増加を呈することを特徴とする工程と；
前記プローブを照射する工程と；
ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程であって、
前記蛍光発光の増加が前記標的核酸の存在を示すことを特徴とする工程と；
を含む方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、
前記プローブと前記標的核酸との混合物を一対のオリゴヌクレオチド・プライマーと混合する工程であって、
前記オリゴヌクレオチド・プライマーは、前記標的核酸の選択された分節を増幅するために使用されることを特徴とする工程と；
ポリメラーゼを添加する工程と；
前記標的核酸の前記選択された分節を増幅する工程と；
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、
前記増幅する工程が、アニーリング温度と変性温度の間の熱サイクルを有し、
前記プローブのＴｍ値が、前記アニーリング温度より０〜１０℃低いことを特徴とする方法。  
【請求項８】
請求項６または７の方法であって、
前記標的核酸の前記選択された分節を、鎖変位増幅（ＳＤＡ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、縦列回転サイクル増幅（ＣＲＣＡ）、Ｑベータ複製増幅、等温性キメラプライマー依拠核酸増幅（ＩＣＡＮ）、および、転写性増幅（ＴＭＡ）から成るグループから選択される方法によって増幅する工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６〜８の何れか１項に記載の方法であって、
前記蛍光ラベルが、フルオレセン、フルオレセン誘導体、シアニン誘導体、および、フルオレセン−シアニン結合体から成るグループから選択され、
前記プローブの前記標的核酸に対するハイブリダイゼーションにより、前記蛍光ラベルがＧ以外の残基に対する相補位置に配されることによって、蛍光発光の増加を呈することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であって、
前記Ｇ以外の残基がＡであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項６〜９の何れか１項に記載の方法であって、
前記蛍光発光が、温度の関数としてモニターされることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項５〜１１の何れか１項に記載の方法であって、
前記モニターする工程は、前記標的核酸からのプローブが解離した後の蛍光の減少をモニターすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記標的核酸の部位が、前記内部ヌクレオチドに対する相補位置にＣ残基を有することを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド配列の前記標的核酸に対するハイブリダイゼーションによって、突き出し部が前記標的核酸の前記Ｃ残基に隣接して形成されることを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記蛍光ラベルの位置に対してポジション−１、＋１および＋２にＧ以外の残基が配されることを特徴とする請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記蛍光ラベルの位置に対し、前記標的核酸のポジション−１と＋１にグアニン残基が存在しないことを特徴とする、請求項１４または１５の方法。
【請求項１７】
前記プローブとサンプルは、ｐＨ＞８．０の液の中で混合されることを特徴とする、請求項５〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液は、２００  ｍＭのトリス濃度を有することを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記蛍光ラベルは、フルオレセン、フルオレセン誘導体、および、フルオレセン−シアニン結合体から成るグループから選ばれ、かつ、陽イオン濃度が５０−２００  ｍＭであることを特徴とする、請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
前記溶液は、トリス＋、トリシン＋、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、および、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロペンジオールから成るグループから選ばれるバッファーをさらに含むことを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項２１】
前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光が非対称ＰＣＲ実行時においてモニターされていることを特徴とする、請求項５の方法。
【請求項２２】
４５ＰＣＲサイクルが実行され、かつ、一対のＰＣＲプライマーが１：４比で与えられることを特徴とする、請求項２１の方法。
【請求項２３】
６０ＰＣＲサイクルが実行され、かつ、一対のＰＣＲプライマーが１：８比で与えられることを特徴とする、請求項２１の方法。
【請求項２４】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
前記生物サンプルを、前記標的核酸の選択された分節を増幅するために使用される一対のプライマー、および、単一ラベルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含む蛍光検出体と混合する工程であって、
前記プローブは、前記標的核酸の選択された分節の部位の相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むオリゴヌクレオチド、および、前記プローブの末端ヌクレオチドに付着する蛍光ラベルを含むことを特徴とし、
前記蛍光ラベルは配列特異的なハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を呈し、
前記末端ヌクレオチドは、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシドから成るグループから選ばれる塩基アナログであり、
前記プローブが前記部位にハイブリダイズすると、ハイブリダイゼーション依存性蛍光ラベルの発光が増加する工程と；
ポリメラーゼを添加し、複数の増幅サイクルを通じて前記標的核酸の前記選択された分節を増幅する工程と；
前記生物サンプルを照射する工程と；
前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光の増加をモニターする工程であって、前記蛍光発光の増加が前記標的核酸の存在を示す工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記プローブが前記標的核酸から解離する際に、−ｄＦ／ｄＴ最大値を確定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記蛍光ラベルが、前記プローブの塩基アナログと結合し、かつ、前記塩基アナログが、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、および、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシドから成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項２４または２５の方法。
【請求項２７】
前記蛍光ラベルが、前記プローブの塩基アナログと結合し、かつ、前記塩基アナログが、イノシン、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、および、ネブラリン・デオキシヌクレオシドから成るグループから選ばれる請求項２４または２５の方法であって、
グアニン以外の残基が、標的核酸上において蛍光ラベルの位置に対してポジション＋１に配されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記蛍光ラベルが、シアニン染料およびＬＣＲｅｄ  ７０５から成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項２４〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記蛍光検出体が表面に固定化されており、前記混合工程が、サンプルを前記表面に接触させることを含むことを特徴とする、請求項２４〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２４〜２９の何れか１項に記載の方法であって、
第２の単一ラベルオリゴヌクレオチドプローブから成る第２の蛍光検出体を提供する工程であって、
前記第２の単一ラベルオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的核酸の第２の選択された分節に対して少なくとも８０％の相同性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列、および、その配列の末端に結合される第２の蛍光ラベルを有する第２のオリゴヌクレオチド配列を含み、
第２の蛍光ラベルは、第１のプローブの蛍光発光とは異なる波長の、配列特異的なハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を呈し、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２選択分節に対するハイブリダイゼーションは、第２のラベルからの蛍光発光を増加させ、かつ、この第２の蛍光シグナル変化は、第１の蛍光検出体の蛍光発光とは独立している工程と；
第２のプローブの前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光の増加をモニターする工程と；
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
前記生物サンプルを、単一ラベルオリゴヌクレオチドプローブを含む蛍光検出体と混合する工程であって、
前記プローブは、前記標的核酸の一つの部位の相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド配列、および、前記オリゴヌクレオチドの５‘末端ヌクレオチドに付着した蛍光ラベルを含み、
前記末端ヌクレオチドは５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシドから選ばれる塩基アナログであって、
前記蛍光ラベルはハイブリダイゼーション依存性発光を示し、前記プローブの前記部位に対するハイブリダイゼーションは前記蛍光ラベルからの蛍光発光を増加させる工程と；
前記生物サンプルと前記プローブを、第２のオリゴヌクレオチドとポリメラーゼと混合する工程であって、
前記プローブと第２のオリゴヌクレオチドは増幅において一対のプライマーとして作動する工程と；
前記標的核酸を増幅する工程と；
前記生物サンプルを照射する工程と；
ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光の増加をモニターする工程であって、
蛍光発光の増加は前記標的核酸の存在を示すことを特徴とする工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
核酸配列を含む生物サンプル分析用キットであって、
ａ．オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドに蛍光ラベルを結合させた単一ラベルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含む蛍光検出体であって、
前記末端ヌクレオチドは塩基アナログであり、
前記塩基アナログは、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシドから選ばれ、
前記プローブは、前記核酸配列の一本鎖部位にハイブリダイズすると、前記プローブの前記部位に対するハイブリダイゼーションによって前記蛍光ラベルからの蛍光発光量が増加する蛍光検出体と、
ｂ．前記核酸配列増幅用成分であって、
前記成分は、前記核酸配列の一分節を増幅するための一対のオリゴヌクレオチド・プライマー、および、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、を含むことを特徴とするキット。
【請求項３３】
請求項３２のキットであって、
第２の一本鎖部位を含む、前記核酸配列の第２分節を増幅するための第２の一対のプライマーと；
前記オリゴヌクレオチドの内部または末端ヌクレオチドに結合する第２の蛍光ラベルを含む第２の単一ラベルオリゴヌクレオチドプローブとを含む、第２の蛍光検出体であって、
前記第２のプローブは、前記第２の部位にハイブリダイズすると、この第２のプローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションによって第２の蛍光ラベルからの蛍光発光が増加することを特徴とする第２の蛍光検出体と、
をさらに含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
＜発明の分野＞
本発明は、単一ラベルのオリゴヌクレオチド・プローブであって、その蛍光発光が、プローブ−標的ハイブリダイゼーションおよび解離に応じて変化することを特徴とするプローブの使用による核酸配列の斉一な検出分析法に関し、特に、前記プローブによる１個または多数個の核酸部位の分析法に関する。本発明はさらに、解離曲線分析、遺伝子型決定および病原体検出のための単一ラベルのプローブにおける蛍光変化の使用、および、核酸増幅のリアルタイムモニターにおける特異的配列の定量法に関する。
【０００２】  ＜発明の背景＞
プローブ・ハイブリダイゼーションは、核酸配列の検出、分析および定量のために店く用いられている方法である。広く用いられる技法としてはサザーンハイブリダイゼーション、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、および、溶液による斉一定量法が含まれるが、これらはしばしばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と併用される。これらの技法に使用される基本的装置としては、電気泳動ゲル、スライドグラス上に固定されたＤＮＡアレイ、ビーズ、膜または微細滴定プレート、および、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および、ｉＣｙｃｌｅｒ装置  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のような斉一定量用装置、などが挙げられる。増幅工程と一緒に用いられる斉一定量法・検出法は、一つの連続的な流れの中で増幅と分析を実行するので、この二つの工程間でサンプルを移動する必要性を無くす、または、極小にする。斉一定量を有効に動作させるための一つのキー要素は、プローブー標的ハイブリダイゼーションから生じ、遊離プローブの洗浄・除去を要することなく検出可能なレポーター・シグナルである。
【０００３】  現在の斉一定量法は、核酸結合染料、例えば、臭化エチジウムとＳＹＢＲグリーンＩ染料をレポーター分子として用いるか（Ｈｉｇｕｃｈｉ、米国特許第５，９９４，０５６号、および、Ｗｉｔｔｗｅｒ等、米国特許第６，１７４，６７０号）、または、プローブ上に固定された最小２個の蛍光体を用いるか、そのいずれかである。この２個の蛍光体は、別々のオリゴヌクレオチドに個別に付着する、供与体・受容体ペアであってもよく（米国特許第６，１７４，６７０号、および、Ｄｉ  Ｃｅｓａｒｅ、米国特許第５，７１６，７８４号）、または、単一オリゴヌクレオチドに付着するレポーター・消光体ペアであってもよい（Ｍａｙｒａｎｄ、米国特許第５，６９１，１４６号、Ｐｉｔｎｅｒ等、米国特許第５，８８８，７３９号、および、Ｌｉｖａｋ等、米国特許第６，０３０，７８７号）。ＤＮＡ結合色素を用いた斉一定量は便利ではあるが、限定した配列情報しか得られない。二染料系に基づく方法は、その染料同士が供与体−受容体の染料の組み合わせであれ、供与体−消光体の染料の組み合わせであれ、より高い検出特異性を与える。この方法は、ハイブリダイゼーション・プローブ定量法（米国特許第６，１７４，６７０号）、Ｔａｑｍａｎ定量法（米国特許第５，６９１，１４６号）、分子ビーコン定量法（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：３５９−３６３）、および、その変法である、スコルピオンズ・プライマー装置（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４−８０７）などの系に使用されている。
【０００４】  ハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイでは、ある特定の配列の有無を検出するのに２個のオリゴヌクレオチド・プローブを用いる。プローブを標的にアニールさせることによって、二つの染料を接近させると、一方のプローブ上の供与体染料と、他方のプローブ上の受容体の間に、蛍光共鳴エネルギー転移が生じ、この時レポーターシグナルが検出される。一旦これらのプローブがハイブリダイズすると、一方のプローブ下の領域に、配列変異が無いかどうかを調べることが可能である。これは、そのサンプルを加熱して、そのプローブの解離（「融解」とも呼ばれる）によってシグナル消失の起こる温度をモニターすることによって実現される。配列変異は、参照サンプルに対する、融解温度（Ｔｍ）の移動によって検出され、このＴｍ変位は、ソフトウェアによる計算（Ｓｃｈｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２７：１２１８−１２２４）によって予測が可能である。しかしながら、２番目のプローブ下の領域は、配列変異の有無に関して分析にあずからない「盲点域」となる可能性がある。このような盲点域の存在は、大きなＤＮＡ断片に対し、配列変異に関して分析する必要があって、複数のプローブペアを用いなければならない場合に問題となるだろう。
【０００５】  Ｔａｑｍａｎおよび分子ビーコンアッセイはいずれも、レポーターと消光体染料を結合した単一オリゴヌクレオチド・プローブを用いる。このオリゴヌクレオチド・プローブが標的配列にハイブリダイズすると、レポーターと消光体は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性か、または、標的配列にハイブリダイズする際に生じる構造変化か、そのいずれかによって分離される。現在の方法では、これらの二重ラベルプローブを合成するのは比較的難しい。さらに、Ｔａｑｍａｎプローブは、ハイブリダイゼーションの間接的な測定にしかならない。なぜなら、レポーターと消光体とが、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性で分離されると、シグナルが出続けるからである。
【０００６】  エネルギー転移以外の手段によって蛍光体の蛍光効率に変化をもたらすやり方が従来から報告されている。フルオレセン族に属する様々な染料はｐＨに対して感受性を持つが、その発光強度は、そのｐＫａよりも低いｐＨでは減少し、そのｐＫａ以上のｐＨでは増加する（Ｓｊｏｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  Ａ５１，Ｌ７）。さらに、フルオレセンは、生体高分子に結合させると５０％以上消光する（Ｄｅｒ−Ｂａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７３：９）。これらは、外的因子によって誘発される一般的蛍光変化である。さらに、蛍光ラベルオリゴヌクレオチドと、その未ラベル相補鎖とがアニールすると、プローブ蛍光の消光や、また、二重鎖ＤＮＡの形成と同時に発光波長の移動をもたらすことも知られている（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：９２６１−９２６８；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２０：３７７−３８３；  Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４１：２３８−２４７）。蛍光強度変化は、下記を用いても起こることが明らかにされている。すなわち、未結合染料と個別のヌクレオチドまたはヌクレオチド分子（Ｓｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  １００：５５４１−５５４３）、ＲＮＡ基質とリボザイムとの相互作用（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  ＲＮＡ  ３：３９２−４０４）、および、非対称シアニン染料でラベルしたプローブによる核酸二重鎖形成（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：４９９２−４９９７；  Ｓｖａｎｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：２６−３５）である。しかしながら、これらの参考文献は、配列依存性の蛍光を利用するプローブの構築を教示しない。
【０００７】  上記から、本発明は、複数のオリゴヌクレオチド・プローブであって、それぞれが単一の蛍光染料を有するオリゴヌクレオチド・プローブを目的とする。これらのオリゴヌクレオチド・プローブは、プローブが標的配列にハイブリダイズすると、その蛍光染料の蛍光発光が影響されるように構築されている。本発明の一つの実施態様では、プローブが標的配列にハイブリダイズすると、蛍光染料がグアニン残基に近接して設置されることとなり、そのために蛍光発光が消光する。別の実施態様では、蛍光体は、オリゴヌクレオチド・プローブ構造の内の一つの塩基を置換し、ハイブリダイゼーション時において、この「仮想ヌクレオチド」がＧ残基に対して相補的な位置に置かれることとなり、そのために蛍光が消光する。その他の実施態様では、ハイブリダイゼーションが起こると蛍光発光が増加するようにプローブが構築される。そのような一つの実施態様では、蛍光体はＧ残基に付着し、そのために、ハイブリダイゼーション時蛍光が増加する。別のそのような実施態様では、蛍光体は塩基アナログに付着し、そのために、ハイブリダイゼーション時蛍光が増加する。さらに別のそのような実施態様では、蛍光体は、柔軟なリンカーを介して内部残基に付着し、そのために、ハイブリダイゼーション時蛍光発光に変化をもたらす。最後に、プローブ・システムの様々な実施例が提供される。
【０００８】
本発明の一つの態様において、標的核酸を分析するためにプローブが提供される。このプローブは、蛍光検出体であって、標的核酸のある部位にほぼ相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドから事実上成る蛍光検出体、および、そのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドに結合する蛍光ラベルを含み、このプローブの前記オリゴヌクレオチド配列は、同プローブが標的核酸の部位にハイブリダイズすると、蛍光ラベルが、標的核酸のグアニン残基の近くに位置し、そのために蛍光ラベルの蛍光強度が消光するように選ばれることを特徴とする。一つの実施態様では、グアニン残基は、蛍光ラベルした末端ヌクレオチドの位置に対してポジション０、＋１、＋２、＋３または＋４に配される。
【０００９】
本発明の別の態様では、標的核酸を分析するためのプローブが提供される。このプローブは、標的核酸のある部位にほぼ相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、さらに、仮想ヌクレオチドを有する残基を含み、蛍光染料が塩基によって置換され、従って、プローブが標的核酸にハイブリダイズすることによって蛍光染料からの蛍光発光量が変化する。
【００１０】
本発明のさらに別の態様では、標的核酸を分析するための蛍光プローブシステムが提供される。このプローブシステムは、核酸のある部位に対してほぼ相補的な配列と、それに結合する蛍光ラベルとを含む単一ラベルのポリヌクレオチドから事実上成り、この単一ラベルポリヌクレオチドがその核酸部位にハイブリダイズすると、蛍光ラベルが、標的核酸の一残基に近接して設置されることとなり、そのために蛍光ラベルの蛍光強度が増大することを特徴とする。この増強プローブに関する様々な実施例が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、標的核酸を分析するためのプローブが提供される。このプローブは、蛍光検出体であって、標的核酸のある部位に対してほぼ相補的な配列を有する単一ラベルオリゴヌクレオチドから事実上成る蛍光検出体、および、そのオリゴヌクレオチドの内部残基に結合する蛍光ラベルを含み、このプローブのオリゴヌクレオチド配列は、同プローブが標的核酸のその部位にハイブリダイズすると、蛍光ラベルからの蛍光発光強度が変化を受けるように選ばれる。
【００１２】  さらに、サルモネラ属由来の標的核酸の有無を検出するためのオリゴヌクレオチド・プローブが提供される。このプローブは、下記のものから成るグループから選ばれる一つのヌクレオチド配列を含む、すなわち、
５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号：３）、
５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣ（配列番号：４）、
５’ＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号：５）、
５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ（配列番号：６）、
５’ＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ（配列番号：７）、
５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣ（配列番号：８）、
５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号９）、および
５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ（配列番号：１０）。
【００１３】
本発明の別の態様では、本発明のプローブを使用する方法が提供される。一つのそのような実施態様では、生物サンプルにおける標的核酸の有無を決定するための方法が提供される。この方法は、第一の単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブと、サンプルとを混合する工程であって、前記第一プローブは、標的核酸配列のある部位に対してほぼ相補的なオリゴヌクレオチド配列と、このオリゴヌクレオチド配列の末端に結合する蛍光ラベルとを有し、蛍光ラベルはハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を示し、第一プローブが標的核酸にハイブリダイズすることによって、蛍光ラベルが、標的核酸上のグアニン残基と相互作用をもつことができ、そのために、ラベルからの蛍光発光量が減少することになることを特徴とする工程；前記生物サンプルに照射する工程；および、ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程を含む。
【００１４】
本発明のさらに別の態様では、生物サンプルにおける標的核酸配列の有無を決定するための方法が提供される。この方法は、単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブとサンプルを混合する工程であって、前記プローブは、標的核酸配列のある部位に対してほぼ相補的なオリゴヌクレオチド配列と、このオリゴヌクレオチド配列のＧ残基に結合する蛍光ラベルとを有し、蛍光ラベルはハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を示し、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸配列にハイブリダイズすると、蛍光ラベルと標的核酸上のグアニン残基との相互作用が変化し、そのために、ラベルからの蛍光発光量が増加することになることを特徴とする工程、生物サンプルを照射する工程、および、ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程を含む。
【００１５】  本発明のさらに別の局面では、標的核酸配列を含むサンプルを分析するための方法が提供される。この方法は、サンプルとオリゴヌクレオチド・プローブとを混合して、標的・プローブ混合物を生成する工程であって、そのプローブは蛍光ラベルを有する仮想ヌクレオチドを含み、蛍光ラベルは、プローブが標的核酸配列にハイブリダイズすると、それによって、蛍光ラベルからの蛍光発光量が変更されるようなやり方で位置づけられる工程；前記混合物を照明する工程；および、蛍光発光を温度の関数としてモニターする工程、の諸工程を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、生物サンプルにおける標的核酸配列の有無を決定するための方法が提供される。この方法は、生物サンプルと、単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る蛍光検出体とを混合する工程であって、前記単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブは標的核酸配列のある部位に対して相補的な配列と、それに付着するハイブリダイゼーション依存性発光を示す蛍光ラベルとを有するオリゴヌクレオチドを含み、プローブが標的核酸配列の内のある選択された分節にハイブリダイズすると蛍光ラベルの蛍光発光の増加がもたらされる工程；前記生物サンプルを照射する工程；および、ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程を含む。そのような一つの実施態様では、蛍光ラベルはオリゴヌクレオチド・プローブの一塩基に結合し、この塩基は、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、および、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオチドから成るグループから選ばれる。別のそのような実施態様では、蛍光ラベルはグアニン残基に付着し、モニター工程は、プローブが標的核酸にハイブリダイズした時に生ずる蛍光ラベルからの蛍光発光の増加をモニターすることを含む。さらに別の実施態様では、蛍光ラベルは、シアニン染料とＬＣＲｅｄ  ７０５から成るグループから選ばれる。
【００１７】
本発明のさらに別の局面は、核酸配列を含む生物サンプルの分析用キットであり、このキットは、蛍光ラベルに結合するオリゴヌクレオチドを有する単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る蛍光検出体を含み、前記プローブは、同プローブが核酸分節のある部位にハイブリダイズすると、蛍光ラベルからの蛍光発光量が増加するように構成される蛍光検出実体；および、前記核酸配列の増幅のための諸成分とを含む。
【００１８】  本発明の、さらなる特長は、下記の好ましい実施態様に関する詳細な説明を考察することによって当事者には自ずから明白となろう。ただし、下記の好ましい実施態様は、現在考えられる、本発明を実行するに際しての最善の方式を例示するものであるに過ぎない。
【００１９】  ＜詳細な説明＞
ある例示する実施態様では、本発明のプローブは斉一定量系（homogeneous assay system）で用いられる。この系では、核酸配列の検出と分析とが、標的ポリヌクレオチドの増幅と並行して実行される。別法として、本発明のプローブは、標的の増幅とは独立な、完了時点検出定量法（end-point detection assay）において使用されてもよい。単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブの結合部位は、一般に、標的核酸の内部に、通常は、標的増幅に使用されるプライマーの間に配される。しかしながら、ある実施態様では、プローブの標的配列に対するハイブリダイゼーションは、標的配列の末端近傍または末端で起こり、またある実施態様では、プローブ自身が標的増幅のプライマーとしても機能する方法と同様、プローブ−標的ハイブリダイゼーションが平滑末端を形成する。
【００２０】  本申請書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然または修飾されたモノマーから成る直線的オリゴマー、または、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、蛋白核酸ヌクレオシド等を含む連結体であって、塩基対相互作用によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能なものを含む。
【００２１】  本申請書で使用される「単一ラベルオリゴヌクレオチド」という用語は、一つの蛍光ラベルを有するオリゴヌクレオチドを含む。このラベルは様々なやり方でオリゴヌクレオチドに与えられることが可能である。その方法としては、例えば、リン酸糖骨格の末端やオリゴヌクレオチドの一塩基に結合させる等のやり方が挙げられる。あるいは、「仮想ヌクレオチド」構造の一部として、染料が一塩基を置換するのに使われてもよい。しかしながら、「単一ラベルオリゴヌクレオチド」という用語は、Ｔａｑｍａｎプローブのような、多数の蛍光染料を付着させた構築体は除外する。
【００２２】  オリゴヌクレオチドを文字の配列で表す場合は、別様に注記しない限り必ず、“Ａ”はデオキシアデノシンを、“Ｔ”はチミジンを、“Ｇ”はデオキシグアノシンを、“Ｃ”はデオキシシチジンを表示するものと理解しなければならない。
“（Ｆ）”は蛍光ラベルを表示する。
【００２３】  「塩基」という用語は、オリゴヌクレオチドにおける位置を示すのに使用される場合、５−ニトリオール−２−デオキシヌクレオシドのような塩基アナログをも含む。
【００２４】  「相補的」という用語は、互いに塩基が対になった二重螺旋を形成することが可能な核酸配列同士を指す。オリゴヌクレオチドを論ずる場合、「相補的」という用語は、対向する一本鎖を指し、オリゴヌクレオチドの個々の塩基を論ずる場合は、「相補的」という用語は、対向する一本鎖における位置または塩基を指す。「ほぼ相補的な」配列とは、少なくとも８０％の相同性を有する２本の核酸配列同士である。従って、このような配列同士は、ミスマッチを有するものの、相互に塩基が対になった二重螺旋構造を形成するのに十分な相同性を持っている。
【００２５】  本発明の一つの方法によれば、単一ラベルプローブは、プローブ−標的二重鎖の形成時や解離時に、蛍光発光効率（または強度）が変化するが、この方法は、標的鎖上の特定の残基の位置に関してある条件が満足されるようにプローブを位置づけることを含む。
【００２６】  本発明の一つの実施態様では、特定の残基とは、標的鎖上の単一Ｇ残基である。この実施態様では、二重鎖形成および解離時の蛍光変化は、下記に模式的に示すように（垂直線は塩基対合を示す）、Ｇが蛍光ラベル（Ｆ）に対して、最初の突き出しているヌクレオチド（overhanging nucleotide）として配される場合もっとも顕著となる。
0005213297.tif 000002
これら二つの位置はそれぞれ「ポジション＋１」を含む。蛍光変化は、より小さくはなるが、Ｇが下記のポジションの内のいずれにあっても観察される。
0005213297.tif 000003
一方、下に示すようにポジション＋３とポジション−１に単一Ｇ残基がある場合、検出蛍光に対してほとんど影響を与えない。
0005213297.tif 000004
Ｇ残基がポジション＋４にある場合にも僅かな蛍光変化が観察されている。
【００２７】  標的鎖に１個以上のＧがある場合、複数のＧ残基が、ポジション０、＋１、＋２、＋３および＋４の内のいずれにあっても、それらは、検出蛍光を変化させるのに有効である。上記のポジションは「割り当てポジション」である。割り当てポジションの前記表記法はＧ残基に関して示されたものであるが、割り当てポジションに対する同じ表記法が、この明細書全体を通じて他の実施態様に関しても用いられる。
【００２８】  別の実施態様は「仮想ヌクレオチド」を組み込んでいる。この場合、蛍光染料そのものが塩基を置換する。この実施態様では、蛍光体は、標的鎖の相補位置（ポジション０）に位置するグアニン残基に直接アクセスする。グアニンが、５’方向か、３’方向かのどちらの＋１にあっても蛍光変化は可能である。ポジション０にＧ以外の塩基があっても、仮想ヌクレオチド生成のために使用される蛍光染料によっては蛍光変化を生じるのに有効であるかもしれない。例えば、フルオレセンを仮想染料として用い、かつ、Ａ残基がポジション０にあっても、ハイブリダイゼーション時蛍光の増加が観察されることがある。仮想ヌクレオチドは末端塩基であってもよく、あるいは、オリゴヌクレオチドの内部位置を占めていてもよい。
【００２９】  本発明の別の実施態様では、Ｇ残基に付着するラベル付きプローブを用いることによって、二重鎖の形成や解離時に蛍光変化を容易にするととを可能とする。この実施態様でフルオレセンおよびフルオレセン誘導体を用いると、そのフルオレセンの付着するＧそのものが、プローブが遊離してフリーになると、ラベルの消光に影響する。プローブ−標的二重鎖が形成されると、フルオレセンは、その付着していたＧから切り離され、脱消光が起こり、蛍光が再び回復する。蛍光体がＧ残基に付着する場合も、ミスマッチ（mismatching）のＡまたはＴが０ポジションにある場合も、同様の結果が生ずることが考えられる。この実施態様では、−１や＋１ポジションにＧ残基が無い場合に最善の結果が得られる。
【００３０】  ある類似の実施態様では、蛍光体は、屈曲性に富むリンカーを介して残基に付着してもよい。この残基がＡまたはＴである場合、ハイブリダイゼーション時蛍光の増加が予想される。適当な屈曲性を与えるためにＣ６ｄＴヌクレオチド（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  スターリング、バージニア州）を用いることによってこのようなプローブを構築してもよい。この構築体は、標的配列の検出にも、突然変異の検出にも、有効に使用可能と思われる。突然変異検出の場合、ミスマッチが、蛍光体と、蛍光体が結合する塩基との間の立体配置関係に影響を及ぼすことのないように、蛍光体は突然変異から十分に離れた場所に配されるだろう。
【００３１】  本発明においては、多種多様な蛍光体がプローブ用ラベルとして使用が可能である。そのようなグループとしては、フルオレセンおよびその誘導体、例えば、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、オレゴン緑色染料、エリスロシンおよびエオジン、Ｂｉｇ  Ｄｙｅｓのようなフルオレセン・シアニン結合体（conjugate）、および、ＢＯＤＩＰＹのようなビスピロメテン・ボロン−ジフロリド染料が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらの染料をオリゴヌクレオチド・プローブに付着させると、標的が割り当てポジション（単数または複数）にＧ残基を持つ場合、プローブが相補的な標的鎖にアニーリングすると、蛍光は通常、消光する。しかしながら、前述したように、本発明の別の実施態様では、蛍光体をプローブのＧ残基に付着させることによって、蛍光変化の方向を逆転させることが可能である。この場合、相補鎖の割り当てポジションにはさらに別のＧ（単数または複数）が存在しないことが好ましい。
【００３２】
同様に、本発明の別の実施態様では、蛍光体が５−ニトロインドール・２’−デオキシヌクレオチドのような「塩基アナログ」に付着している場合、蛍光増加が観察される。一般に、正常塩基と比較的安定な対合を形成する塩基アナログ、例えば、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、４−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、６−ニトロインドール・デオキシヌクレオシド、および、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシドも有用である。その他の塩基アナログ、例えば、イノシン、５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシド、および、ネビュラリン・デオキシドヌクレオシドも正常塩基と弱い塩基対合を形成するが、一般に、二重鎖形成時および解離時に蛍光変化が観察可能となるためには、ポジション＋１にＧ残基の無いことが必要である。
【００３３】  本発明のさらに別の実施態様では、ＴＯＴＯ，  ＹＯＹＯ，  ＴＯ−ＰＲＯ，  Ｃｙ３，  Ｃｙ５，  Ｃｙ５．５，  Ｃｙ７等のような、シアニンダイマー（二量体）およびモノマー（単量体）、あるいは、ＬＣＲｅｄ  ７０５等のような染料を蛍光染料として使用してもよい。これらの蛍光染料を組み込んだプローブは、プローブハイブリダイゼーション時に、消光ではなく蛍光増強を示すことが明らかになっている。
【００３４】  本発明のキットは単一蛍光染料によってラベルされたプローブを含む。このキットは、サンプルにおける特定の核酸配列の有無を検出するのに用いることも可能であるし、あるいは、標的をＰＣＲのような増幅工程によって調製している際に、または、調製後に用いることも可能である。多数のプローブを、Ｔｍや色、または、蛍光変化の方向に応じて多重に使用してもよい。複数の色から成るレポーターシグナルの検出は、単一波長励起によって、または、複数波長励起によって行われることができるだろう。本キットはさらに、分析対象の初期濃度の定量分析に用いることも可能である。
【００３５】  本発明の標的増幅法には、オリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズすることが可能な１個以上の標的の核酸配列を生成することができる、従来技術において核酸を増幅するための既知の適当な方法が含まれる。そのような適当な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖変位増幅（ＳＤＡ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、縦列回転サイクル増幅（ＣＲＣＡ）、Ｑベータ複製増幅、等温性キメラプライマー依拠核酸増幅（ＩＣＡＮ）、転写性増幅（ＴＭＡ）等が挙げられる。従って、ＰＣＲという用語を用いる場合、それは、別の、代替となり得る増幅法をも含むものと理解しなければならない。
【００３６】
分析は、斉一定量系における増幅時に実行してもよい。例えば、米国特許第６，１７４，６７０号を参照されたい。別法として、標的の核酸を、増幅後に融解曲線分析を通じて調べてもよい。他の終末点分析法も本発明の技術的範囲内にあり、また、固定プローブや、ビオチンのような非蛍光性タグと共に用いられるプローブの使用も本発明の範囲に含まれる。また、増幅と無関係な核酸分析法も本発明の範囲内にあることを理解しなければならない。本発明のプローブをＰＣＲによる斉一定量に用いる場合、プローブは、プライマー間に位置する一つの部位に対して相補的であってよい。別法として、プローブ自身が、プライマーの一つとして機能してもよい。
【００３７】  病原体の速やかで特異的な検出が、単一ラベルプローブを用い、リアルタイムＰＣＲや、ＰＣＲ後融解分析において実行可能である。病原体としては、サルモネラ菌、病原性大腸菌（例えば大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、および、ボツリヌス菌が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。ＰＣＲに適用可能な標本としては、食品サンプル、大便、組織ホモジェネート、洗浄液等が挙げられる。単一ラベルプローブは突然変異検出にも使用が可能である。突然変異の実例としては、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、ヘモグロビンＣおよびＳ等の突然変異、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクダーゼの熱不安定性突然変異、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ突然変異、ヘモクロマトーシス関連性突然変異Ｃ１８７ＧおよびＧ８４５Ａ、および、嚢胞性線維症Ｆ５０８ｄｅｌ突然変異が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらのリストはただ例示のために挙げるものであって、完全網羅的なものを意図するものではないことを理解しなければならない。
【００３８】（実施例）
実施例１：グアニン消光用の例示の単一ラベルプローブと標的配列
下記は、標的配列の検出または突然変異の検出に使用が可能なプローブの実施例である。ＰＣＲ増幅に使用が可能なプライマーの実施例も提供される。
サルモネラ菌検出には、遺伝子ＳｐａＱ（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス＃Ｕ２９３６４）由来のＤＮＡ断片は、例えば、ＳＱＦ（５’ＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣ（配列番号：１））とＳＱＲ（５’ＣＧＣＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣ（配列番号：２））をプライマーとして用いてＰＣＲで増幅が可能であり、増幅を検出するには様々のプローブの使用が可能である。
ＳＱＰ１  ５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号：３）
ＳＱＰ２  ５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣ  （配列番号：４）
ＳＱＰ３  ５’ＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ  （配列番号：５）
ＳＱＰ４  ５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ    （配列番号：６）
ＳＱＰ５  ５’ＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ      （配列番号：７）
ＳＱＰ６  ５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣ      （配列番号：８）
ＳＱＰ７  ５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ    （配列番号：９）
ＳＱＰ８  ５’ＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴ        （配列番号：１０）
ここに蛍光ラベルは、プローブの３’または５’末端のいずれかに付着される。５’末端ラベルのプローブは、３’リン酸の添加によってその伸張を阻止されていてもよい。前記プローブは、下記の標的配列の一つにハイブリダイズし、その配列は、前記プライマーによって増幅される分節の中に含まれる。
ＳＱＴ１  ５’ＡＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣ
（配列番号：１１）
ＳＱＴ２  ５’ＡＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＣ
（配列番号：１２）
ＳＱＴ３  ５’ＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＣ
（配列番号：１３）
この設計により、Ｇ残基は、どのプローブを用いるかに応じて、標的鎖のポジション−１と０、０と＋１、または、＋１と＋２に配される。用いる特定の蛍光ラベルに応じて、蛍光消光または増光が、プローブ−標的二重鎖の解離によって観察されることになる。融解曲線分析を用いることによって、サルモネラ属の中のいくつかの亜種を検出するに際し、高度の選択性と感度が実現される。融解曲線分析は、ＰＣＲ増幅中に、または、その後に実行してもよい。
【００３９】  第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ（Ｇ１６９１Ａ）の突然変異の遺伝子型の決定は、下記のような単一ラベルプローブを用いたＰＣＲ融解分析によって実行することが可能である。そのプローブとは、
ＦＶＰ１  ５’ＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣ  （配列番号：１４）
ＦＶＰ２  ５’ＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣ    （配列番号：１５）
ＦＶＰ３  ５’ＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＴ    （配列番号：１６）
このプローブは、５’末端で（好ましくは３’リン酸を添加して）、または、３’末端のいずれかでラベルが可能である。これらのプローブは、下記のいずれかの配列、または、少なくとも約８０％のホモロジーを有するＦＶＴ１またはＦＶＴ２の変種配列を有する第Ｖ因子遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃Ｌ３２７６４）の分節にハイブリダイズするように使用される。
ＦＶＴ１  ５’ＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴ
（配列番号：１７）
（野生型）
ＦＶＴ２  ５’ＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴ
（配列番号：１８）
（Ｌｅｉｄｅｎ突然変異）、
プローブの標的に対するハイブリダイゼーションによってＧ残基は、標的鎖のポジション０と＋１、または、＋１と＋２のいずれかに配される。第Ｖ遺伝子の標的配列を含む断片は、下記のようなプライマーによって、すなわち、ＦＶＦ（５’ＧＡＧＡＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＡ  （配列番号：１９））およびＦＶＲ  （５’ＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号：２０））で増幅が可能である。第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ突然変異（一つのＣ：Ａミスマッチ）は二重鎖が不安定であり、これが融解分析で検出可能なＴｍの低下を招くことから、正常型とは区別される。
【００４０】  ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）およびＳ（ＨｂＳ）突然変異（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃Ｕ０１３１７）の遺伝子型分析は、下記のような単一ラベルプローブによるＰＣＲ後融解分析によって実現が可能である。すなわち、そのプローブとは、
ＢＧＰ１  ５’ＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧ
（配列番号：２１）
ＢＧＰ２  ５’ＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧ
（配列番号：２２）
このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれかでラベルすることが可能である。これらのプローブは、下記の内のいずれか
ＢＧＴ１  ５’ＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴ
（配列番号：２３）
（野生型）
ＢＧＴ２  ５’ＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴ
（配列番号：２４）
（ＨｂＳ突然変異）
ＢＧＴ３  ５’ＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴ
（配列番号：２５）
（ＨｂＣ突然変異）、
または、８０％のホモロジーを有するＢＧＴ１、ＢＧＴ２、または、ＢＧＴ３の変種配列を有する標的配列とハイブリダイズする。プローブ−標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、標的鎖のポジション０と＋１、または、＋１と＋２に配される。前記突然変異を含む断片は、ＢＧＦ（５’ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ（配列番号：２６））およびＢＧＲ  （５’ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ（配列番号：２７））のようなプライマーで増幅が可能である。ＨｂＳ（完全適合）およびＨｂＣ（Ｇ：ＴおよびＴ：Ｔの連続ミスマッチ）遺伝子型は、野生型（Ｔ：Ｔミスマッチ）とＴｍの差に基づいて区別が可能である。
【００４１】  メチレンテトラヒドロ葉酸レダクダーゼ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ、アクセス＃Ｕ０９８０６）の、熱不安定性突然変異の遺伝子型分析は、下記から成るグループから選ばれる単一ラベルプローブを用いた融解分析によって行ってもよい。
ＭＦＰ１  ５’ＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＴＣＣ
（配列番号：２８）
ＭＦＰ２  ５’ＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＴＣ
（配列番号：２９）
ＭＦＰ３  ５’ＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＴ
（配列番号：３０）
このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれかでラベルすることが可能である。これらのプローブは、下記の内のいずれか
ＭＦＴ１  ５’ＣＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣ
（配列番号：３１）
（野生型）
ＭＦＴ２  ５’ＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣ
（配列番号：３２）
（突然変異）
または、８０％のホモロジーを有するその変種配列を有する標的配列とハイブリダイズする。プローブ対標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、５’−ラベルプローブに対してはポジション＋１に配され、また、３’−ラベルプローブに対しては、ポジション０と＋１、０、＋１と＋２、または、＋１、＋２と＋３に配される。
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクダーゼの断片は、ＭＦＦ  （５’ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＧＡ（配列番号：３３）およびＭＦＲ  （５’ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧ（配列番号：３４）のようなプライマーによって、増幅が可能である。この突然変異は、もっとも安定なＧ：Ｔミスマッチをもたらすが、これは、特に増幅後融解分析における、二重鎖の不安定化に基づいて識別が可能である。
【００４２】  第ＩＩ因子（またはプロトロンビンと呼ばれる）Ｇ２０２１０Ａ突然変異（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃Ｍ１７２６２およびＭ３３６９１）の遺伝子型分析は、Ｆ２Ｐ  ５’ＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴ（配列番号：３５）のような単一ラベルプローブによるＰＣＲ後融解分析によって行ってもよい。このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれにラベルしてもよい。これらのプローブは、下記の内のいずれか
Ｆ２Ｔ１  ５’ＧＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＴＧＡＧＡＧＴ
（配列番号：３６）
（野生型）
Ｆ２Ｔ２  ５’ＧＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴ
（配列番号：３７）
（突然変異）、
または、少なくとも約８０％のホモロジーを有するその変種配列を有する標的配列とハイブリダイズする。プローブ−標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、プローブが５’−ラベルされている場合はポジション＋１に配され、プローブが３’−ラベルされている場合はポジション＋１、＋２と＋３に配される。前記突然変異部位を含む断片は、Ｆ２Ｆ  （５’ＡＴＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＧＧＧＧ（配列番号：３８））およびＦ２Ｆ  （５’ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴ（配列番号：３９））のようなプライマーによって、増幅が可能である。この野生型二重鎖はＣ：Ａミスマッチを有するが、その二重鎖の不安定性に基づいて突然変異と区別することが可能である。
【００４３】  ヘモクロマトーシス関連突然変異Ｃ１８７Ｇ（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃Ｚ９２９１０）の遺伝子型分析は、下記の単一ラベルプローブによる融解分析によって行ってもよい。
ＨＨＤＰ1  ５’ＣＡＣＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡＣ
（配列番号：４０）
ＨＨＤＰ2  ５’ＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡＣ
（配列番号：４１）
ＨＨＤＰ3  ５’ＣＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡ
（配列番号：４２）
このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれにラベルしてもよい。これらのプローブは、下記の内のいずれか
ＨＨＤＴ1  ５’ＴＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡ                                      （配列番号：４３）（野生型）
ＨＨＤＴ2  ５’ＴＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡ                                      （配列番号：４４）（突然変異）、
の標的配列、または、少なくとも約８０％のホモロジーを有するその変種とハイブリダイズする。プローブ−標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、５’−ラベルプローブに対してはポジション０と＋１、または、＋１と＋２に配され、３’−ラベルプローブに対しては、ポジション０または＋１に配される。前記突然変異を含む断片は、ＨＨＤＦ  （５’ＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＧ（配列番号：４５）およびＨＨＤＲ  （５’ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＡＣＴＣ（配列番号：４６）のようなプライマーによって、増幅が可能である。この突然変異は野生型と区別が可能である。なぜなら野生型はＣ：Ｃミスマッチを持ち、Ｔｍが低いからである。
【００４４】  ヘモクロマトーシス関連突然変異Ｇ８４５Ａ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ、アクセス＃Ｚ９２９１０）の遺伝子型分析は、下記の単一ラベルプローブによる、ＰＣＲ後の融解分析によって実行が可能である。
ＨＣＹＰ１  ５’ＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＧ
（配列番号：４７）
ＨＣＹＰ２  ５’ＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＧ
（配列番号：４８）
このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれにラベルしてもよい。これらのプローブは、下記の内のいずれか
ＨＣＹＴ１  ５’ＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡ
（配列番号：４９）（野生型）
ＨＣＹＴ２  ５’ＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡ
（配列番号：５０）（突然変異）
の標的配列、または、少なくとも約８０％のホモロジーを有するその変種とハイブリダイズする。プローブ−標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、５’−ラベルプローブにおいてはポジション０と＋１、または、＋１と＋２に配され、３’−ラベルプローブにおいては、ポジション＋１に配される。前記突然変異部位を含む断片は、ＨＣＹＦ  （５’ＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号：５１）およびＨＣＹＲ  （５’ＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号：５２）のようなプライマーによって、増幅が可能である。突然変異（Ｃ：Ａミスマッチ）は、Ｔｍの低いことによって野生型との区別が可能である。
【００４５】  嚢胞線維症に関連してよく見られる３塩基対欠失の遺伝子型は、下記から成るグループから選ばれる単一ラベルプローブによって検出が可能である。
ＣＦＰ１  ５’ＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣ
（配列番号：５３）
ＣＦＰ２  ５’ＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴ
（配列番号：５４）
このプローブは、５’末端（３’リン酸の添加を伴う）、または、３’末端のいずれにラベルしてもよく、下記の内のいずれかＣＦＴ１  ５’ＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡ                                  （配列番号：５５）（野生型）
ＣＦＴ２  ５’ＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡ
（配列番号：５６）（欠失突然変異）
または、少なくとも約８０％のホモロジーを有するその変種とハイブリダイズする。プローブ−標的ハイブリダイゼーションによってＧ残基は、５’−ラベルではポジション＋１に、３’−ラベルでは、ポジション＋１に配される。この突然変異部位（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃Ｍ５５１１５）を含む断片は、ＣＦＦ  （５’ＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ（配列番号：５７））および（５’ＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴ（配列番号：５８））のようなプライマーによって、増幅が可能である。突然変異により、二重鎖の不安定化、および、対応するＴｍの低下がもたらされる。
【００４６】  前記実施例の全てにおいて、蛍光体は、５’または３’末端のヌクレオチドに与えられ、かつ、標的鎖の０、＋１または＋２ポジションに少なくとも１個のＧ残基が配される。蛍光体は、それがＧ残基に十分にアクセスできる限りにおいて、オリゴヌクレオチドプローブ末端よりも内側のヌクレオチドの上に配されてもよいことを理解しなければならない。例えば、従来技術で既知の、適当なリンカー構造が与えられる限り、蛍光体は、末端よりも一塩基内側にリンクされてもよく、こうしてもポジション＋１、０または−１（蛍光体の位置に対して）に配されるＧ残基によってその蛍光の消光が可能である。他にも、リンカーに、蛍光体のＧ残基に対するアクセスを可能とするほど十分な弾力性を持たせるような構造があるならば、それは本発明の技術的範囲内にあるものと考えられる。
【００４７】実施例２：３’−ラベルプローブによってモニターされるプローブ−標的解離
表１に示すＤＮＡオリゴヌクレオチドを、従来の脱保護の後、脱塩工程と、セファデックスＧ−２５カラムとＣ８−逆相ＨＰＬＣによる精製工程を伴った固相でのフォスフォラミダイト化学を用いた標準ＤＮＡ合成法によって調製した。このプローブオリゴヌクレオチドの３’末端を、フルオレセンＣＰＧカラムサポート（カタログ番号ＢＧＸ−６１９０−１，  ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．、サンラモン、カリフォルニア州）を用いて、蛍光分子（Ｃ６環状リンカーを備えた５−カルボキシフルオレセン体）でラベルした。
【００４８】  リアルタイム急速ＰＣＲ熱サイクル装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、プローブが標的から変性する（すなわち、解離する）際の蛍光発光の変化をモニターした。サンプルの成分は、０．１  μＭのプローブオリゴヌクレオチド、０．１２または０．２４  μＭの標的、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、および、５０ｍＭのトリスバッファー（あらかじめ調製された結晶、２５℃においてｐＨ８．３）であった。先ず、プローブの標的に対するアニーリングを確実なものにするため、サンプルを９５℃で変性させ、次に急速に冷却した。次に、温度を、加熱勾配０．２℃／秒で４０℃から９７℃に変化させながら、蛍光発光強度を測定した。サンプルの励起は４７０  ｎｍで行った。蛍光出力は、５３０  ｎｍを中心とする２０  ｎｍ帯域フィルターを用いて、装置のステップ測定モードにより検出した。セットＡとＢでは、温度が増加し、プローブの融解温度（Ｔｍ）（セットＡでは７６℃、セットＢでは６６℃）を通過すると蛍光の増加が観察された（図１）。蛍光の増加の程度は、標的の量が大きいほど大きかった。蛍光変化は、蛍光データの一次導関数を、温度に対してプロットすることによってさらに明らかになった（図２）。セットＣでは、蛍光強度は、あったとしても、ごく僅かな変化しか示さなかった。
【００４９】
【表１】
0005213297.tif 000005
【００５０】
実施例３：塩基アナログの蛍光シグナルに対する作用
（実施例２）のセットＢで記載したプローブ３’末端のＧ残基を、表２に示す様々の塩基アナログによって置換した。塩基アナログはフォスフォラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、スターリング、ヴァージニア州）として得、ＤＮＡ合成時にオリゴヌクレオチドの中に取り込ませた。プローブが標的から解離した場合の蛍光強度の変化は実施例２の場合と同様に測定した。プローブが標的にハイブリダイズした場合の蛍光変化は蛍光測定器で測定した。各サンプルは０．１  μＭのプローブと、０．１２  μＭの標的を含んでいた。プローブ−標的のアニーリングの際、蛍光の発光波長にほとんど変化はなかった。塩基アナログ、すなわち、５−ニトロインドール・デオキシヌクレオシドと５−イオド−２’−シチジン・デオキシヌクレオシドを有するサンプルは、プローブ−標的ハイブリダイゼーション時に蛍光増加を示し、プローブが標的から解離した後、蛍光減少を示した。標的鎖においてポジション＋１におけるＧをＴに変えた場合、６−メトキシアミノプリン（これは蛍光変化を生じなかった）を除いては、ハイブリダイゼーション時には蛍光シグナル増加が、プローブ解離時には蛍光消光が、これらの塩基アナログを始め、その他の塩基アナログにも認められた。蛍光変化の方向は、元のＧ残基の場合の逆であった（表２）。
【００５１】
【表２】
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【００５２】実施例４：５’ラベルプローブによってモニターされるプローブ標的解離−グアニンの位置と用量効果
表３に示すオリゴヌクレオチド類は、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（アラメダ、カリフォルニア州）から入手した。これらのプローブオリゴヌクレオチドは２７ヌクレオチド長であり、チオウレア結合Ｃ６アルキル鎖に付着させた５−フルオレセン分子を用いて５’末端でラベルし、３−リン酸により伸張を阻止している。標的ヌクレオチドはプローブに対して相補的であるが、ただし３’末端において４個の余分に突き出したヌクレオチドを有する。プローブ解離時における蛍光強度の変化を観察するため、蛍光の連続モニターを行いながら、プローブ（０．２  μＭ）と標的（０．４  μＭ）との相補的ペアを、５０  ｍＭトリスｐＨ８．３、３  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および、２５０  μｇ／ｍｌ  ＢＳＡの存在下にアニールさせ、０．１℃／秒で９０℃に加熱した。プローブ解離による蛍光の変化率（パーセント）は、融解遷移点の上で測定した蛍光の直線的減少を、融解遷移点未満の値に外挿して決定した。その結果、プローブ−標的解離時に著明な蛍光変化が起きるためには、標的鎖のポジション０、＋１または＋２において少なくとも１個のＧが必要であることが明らかになった。蛍光変化量は、Ｇ残基が三つの全てのポジションを占めた時に最大となった。ポジション＋３はすれすれの所で有効であった。同様の結果から（図示せず）、ポジション＋４における１個のＧもかろうじて有効であることが明らかになった。ポジション−１は、あったとしてもほとんど有効ではなく、その作用は、ポジション−１から＋３まで全くＧ残基が存在しない場合とほぼ匹敵した（表３）。
【００５３】
【表３】
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【００５４】実施例５：５’ラベルプローブによってモニターされるプローブ−標的解離：ラベル下の塩基の作用
実施例４で記載したものと同じ中心構築体を有するオリゴヌクレオチドを、その配列に、表４に示すような僅かな変化を加えて調製した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、実施例４の場合と同様に、プローブ−標的解離時における蛍光発光強度の変化を測定した。結果から、標的鎖のポジション０に１個のＧが存在すると、プローブ標的解離時に、蛍光の有意な増加が得られることが判明した（セットＷ）。
ポジション０にＣ残基があると、蛍光変化は逆方向に起こった。すなわち、Ｃ残基は５’がラベルされたＧ残基による消光に干渉するので、蛍光シグナルは二重鎖の融解時に再び低下した（表４）。しかし、この効果は、一１または＋１ポジションにＧ残基が無い場合にもっとも著明に見られる。
【００５５】
【表４】
0005213297.tif 000008
【００５６】実施例６：５’ラベルしたプローブを用いた蛍光消光による増幅と定量のモニター
３’末端をリン酸でブロックした５’−フルオレセンラベル２７ヌクレオチド長オリゴヌクレオチド・プローブ５’ＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴ（配列番号：６２）を用いて、リポ蛋白リパーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃ＡＦ０５０１６３）由来の断片の増幅を検出した。プローブは、標的鎖がフルオレセンラベルに対してポジション０と＋１にＧ残基を持つように、位置決めした。ＰＣＲ反応は、それぞれ０．２  ｍＭのｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ、０．１  μＭプローブ、３  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、セントルイス、ミズーリ州、０．４Ｕ／反応）、５０  ｍＭトリス（ｐＨ８．３，  ２５℃）、ＢＳＡ（５００  μｇ／ｍｌ）を用いて行った。プライマーは、５’ＧＡＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡ（配列番号：６３）（０．２５  μＭ）、および、５’ＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡ（配列番号：６４）（０．５  μＭ）であった。スタートの鋳型は、反応当たり１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１００、１０および０コピーの精製ＰＣＲ産物である。蛍光モニターと共に、急速サイクルＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置を用いて１０  μｌの容量で行った。増幅は、９４℃で変性、５０℃でアニーリング、１℃／秒で５４℃に遷移、３℃／秒で７４℃に遷移、および、７４℃で１０秒間伸張し、１６９ｂｐの産物を得た。蛍光は、５４℃で、サイクル毎に一度得た。増幅は４５サイクルで３９分を要した。図３は、背景レベルを越える消光の相対値を、サイクル数に対してプロットした蛍光データを示す。元の蛍光データは、１）逆数（蛍光値の逆数）を取ること、２）関係するサイクルのインターバルをこえて各曲線についてバックグラウンドレベルの比例調整（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのソフトウェア）すること、３）各サイクルにおいて各サンプル値から、鋳型不在の場合の対照値を差し引くこと、によって調整した。その結果、本システムでは反応当たり僅か１コピーでも検出可能であり、かつ、鋳型の初期コピー数を安定に定量化することが可能であることが示された。
【００５７】実施例７：３’−ラベルプローブによる増幅、検出、およびサルモネラ菌株の遺伝子型分析
サルモネラ基準株収集体Ｃ由来の１６種のサルモネラ抗原性亜種を、カナダ、カルガリー大学のサルモネラ遺伝子保存センターより入手した。これらの亜種（疾病予防センターの株番号１５１−８５，  ３４７２−６４，  ３４６−８６，  ４０９−８５，  １５６−８７，  ６７８−９４，  ２５８４−６８，  ２８７−８６，  ７５０−７２，  ２７０３−７６，  １３６３−６５，  ３４７−７８，  ２４３９−６４，  ５０３９−６８、および、株Ｓ６６２３と、パスツール研究所のＥ８８．３７４）は、サルモネラの遺伝的に多様な側面を表している。なぜなら、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉｉの７種の亜種すべてを代表しているからである。大腸菌基準収集体由来の５種の大腸菌株についてもネガティブ・コントロールとして入手した。これらの細菌をルリア培地で一晩培養し、そのゲノムＤＮＡを鋳型調製キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、高純度ＰＣＲ鋳型調製キット）を用いて精製した。オリゴヌクレオチド・プライマーＳＱＦ（配列番号：１）とＳＱＲ（配列番号：２）を用いてＳｐａＱ遺伝子を増幅した。プローブＳＱＰ１（配列番号：３）、ＳＱＰ２（配列番号：４）およびＳＱＰ３（配列番号：５）は、実施例２で記載したのと同様にして、その３’末端をカルボキシフルオレセンでラベルした。プローブＳＱＰ８（配列番号：１０）は、実施例４で記載したのと同様に、フルオレセンで５’末端をラベルした。ＰＣＲ反応を実施例６と同様にして行った。ただし以下を例外条件とした、すなわち、０．５  μＭのプライマーＳＱＦ、０．２５  μＭのプライマーＳＱＲ、ｄＴＴＰの代わりに０．６  ｍＭのｄＵＴＰ、前記プローブの内の一つを０．２  μＭ、４  ｍＭのＭｇＣｌ２、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州、１０  ｎｇ／反応）の添加、ＢＳＡ（２５０  μｇ／ｍｌ）、および、反応当たり各ＤＮＡ２  ｎｇである。蛍光モニター下で、ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置を用いて１０  μｌ容量のサンプルに対して行った。増幅条件は、９４℃（０秒、２０℃／秒の遷移速度）、５５℃（１０秒、２０℃／秒の遷移速度）、７４℃（１０秒、２℃／秒の遷移速度）であった。融解曲線分析を、４０ＰＣＲサイクルの終了時に、０．２℃／秒の昇温速度を用いて行った。１６種類のサルモネラ亜種の全てが、融解曲線分析によって検出された。すなわち、曲線分析により相応のＴｍにおいて融解ピークが得られた（プローブＳＱＰ１（配列番号：３）では６４℃と５４℃；ＳＱＰ２（配列番号：４）では６２℃と５２℃；ＳＰＱ３（配列番号：５）では６１℃と５１℃；およびプローブＳＱＰ８（配列番号：１０）では６０℃と５０℃）。一方、大腸菌種は全く検出されなかった。サルモネラ亜種ＩＶとＶＩは、プローブ・アンプリコン二重鎖の融解温度が１０℃移動することに基づいて、他の亜種と容易に区別された。
【００５８】実施例８：５’−ラベルしたプローブによる遺伝子型分析
下記の実施例全てにおいて、実施例６で行ったのと同様な蛍光モニターによるＰＣＲを実施した。ただし、各反応サンプルは、０．５  μＭの各プライマー、ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼの代わりに０．４ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）、および、５０  ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを含んでいた。温度遷移速度は、２０℃／秒となるようにプログラムされ、別様に指示しない限り維持時間は０秒を用いた。融解曲線分析は、９５℃に加熱し、４０℃で６０秒アニーリングし、フルオレセン蛍光を連続測定下における０．１℃／秒８０℃加熱による融解することによって行った。ここで示される全ての対立遺伝子について、その特徴的なＴｍ移動を表５にまとめた。この表はまた、単一ラベルプローブは予測的ツールとしての利用が可能であることを示す。
【００５９】第Ｖ因子――第Ｖ遺伝子Ｌｅｉｄｅｎに対して未知の遺伝子型を持つ１００個のゲノムＤＮＡサンプルを、地域大学病理学者連合（ＡＲＵＰ、ソールトレーク市、ユタ州）に委託された臨床サンプルから入手した。第Ｖ因子遺伝子座を、プライマーＦＶＦ（配列番号：１９）とＦＶＲ（配列番号：２０）を用いて増幅し、単一フルオレセン５’−ラベルプローブＦＶＰ１（配列番号：１４）によって分析した。急速サイクルＰＣＲを、９４℃における変性、５０℃における１０秒間のアニーリング、１℃／秒で７２℃への遷移のサイクルを４５サイクル実施し、２２２ｂｐの産物を得た。ＰＣＲ後、９４℃へ加熱、４０℃における２分間のアニーリング、フルオレセン蛍光を連続的に測定しながら０．１℃／秒で７５℃への遷移を行って自動的に融解曲線分析を実行した。増幅には４１分を、融解プロトコールには９分を要した。結果を、供与体−レポーター染料結合による通例のハイブリダイゼーション・プローブ定量法（Ｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：２２６２−２２６７）による結果と比較した。両方法における一致度は１００％であった。特徴的なＴｍ移動により、８７個の野生型サンプル、１２個のヘテロサンプル、および、１個のホモ突然変異サンプルが特定された（図４）。
【００６０】ベータグロビン――急速サイクルＰＣＲ（プライマーＢＧＦ（配列番号：２６）およびＢＧＲ（配列番号：２７））を、９４℃における変性、５０℃における１０秒間のアニーリング、１℃／秒での７０℃への遷移を３５サイクル実施し、１１０ｂｐの産物を得た。ＰＣＲ後、９５℃へ加熱、４０℃における３０秒間のアニーリング、フルオレセン蛍光を連続的に測定しながら０．１℃／秒で８０℃加熱による融解を行って自動的に融解曲線分析を実行した。増幅には３５分を、融解プロトコールには９分を要した。３種全ての対立遺伝子（野生型、ＨｂＳ、ＨｂＣ）の遺伝子型が特徴的なＴｍ変位によって同定された。
【００６１】メチレンテトラヒドロ葉酸レダクダーゼ――急速サイクルＰＣＲ（プライマーＭＦＦ（配列番号：３３）およびＭＦＲ（配列番号：３４））において、９４℃における変性、および、６０℃における２０秒間のアニーリング／伸張というサイクルを４０サイクル実施し、１９８ｂｐの産物を得た。各反応にＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体（８８  ｎｇ）を加えた。増幅には２７分を、融解プロトコールには８分を要した。遺伝子型分析は５’−フルオレセン−ラベルプライマーＭＦＰ１（配列番号：２８）を用いて行った。野生型、突然変異型の遺伝子型を特徴的なＴｍ変位によって特定した。
【００６２】第ＩＩ因子（プロトロンビン）――急速サイクルＰＣＲ（プライマーＦ２Ｆ（配列番号：３８）およびＦ２Ｒ（配列番号：３９））において、９４℃における変性、５８℃における１５秒間のアニーリング、および、１℃／秒で７２℃への遷移というサイクルを３５サイクル実施し、１５４ｂｐの産物を得た。融解曲線分析を、５’−フルオレセン−ラベルプローブＦ２Ｐ（配列番号：３５）を用いて実施した。増幅には２９分を、融解プロトコールには８分を要した。突然変異および野生型対立遺伝子を特徴的Ｔｍ変位によって区別した。
【００６３】遺伝性ヘモクロマトーシス――急速サイクルＰＣＲ（突然変異Ｃ１８７ＧについてはプライマーＨＨＤＦ（配列番号：４５）およびＨＨＤＲ（配列番号：４６）、および、突然変異Ｇ８４５ＡについてはプライマーＨＣＹＦとＨＣＹＦ）において、９４℃における変性、６０℃における１０秒間のアニーリング、および、１℃／秒で７２℃への遷移というサイクルを３５−５０サイクル実施した。融解曲線分析を、Ｃ１８７Ｇ対立遺伝子については５’−フルオレセンーラベルプローブＨＨＤＰ１（配列番号：４０）を、Ｇ８４５Ａ対立遺伝子については同様プローブＨＣＹＰ１（配列番号：４７）を用いて実施した。野生型および突然変異対立遺伝子を特徴的なＴｍ変位によって特定した。
【００６４】嚢胞遷移症――急速サイクルＰＣＲ（プライマーＣＦＦ（配列番号：５７）およびＣＦＲ（配列番号：５８））において、９５℃における変性、６０℃における２０秒間のアニーリングというサイクルを４４サイクル実施し、２５６ｂｐの産物を得た。ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（８８  ｎｇ）を各反応に加えた。融解分析を５’−フルオレセンラベルプライマーＣＦＰ１（配列番号：５３）を用いて行った。欠失対立遺伝子を、その特徴的Ｔｍ変位により野生型対立遺伝子と区別した。
【００６５】
【表５】
0005213297.tif 000009
【００６６】実施例９：プローブ多重化による突然変異検出
３’−フルオレセンラベルオリゴヌクレオチド・プローブＹ５’ＣＴＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣ（Ｆ）（配列番号：６５）、および、その５’末端をブラックホール消光染料（ＢＨ１、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ノバト、カリフォルニア州）でラベルした第二のオリゴヌクレオチドプローブＺ５’（Ｆ）ＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡ（配列番号：６６）を調製した。標的鎖上で、一つのＧ残基が、フルオレセンラベルに対してポジション０に配された。さらに下記のものを調製した。すなわち、５５ヌクレオチド長の、４個の標的オリゴヌクレオチドであって、一つは、両プローブに対して完全に相補的であるもの；２番目はプローブＹ（配列番号：６５）の下部で単一塩基ミスマッチを有するもの；３番目はプローブＺ（配列番号：６６）の下部で単一塩基ミスマッチを有するもの；４番目は、プローブＹ（配列番号：６５）とプローブＺ（配列番号：６６）のそれぞれの下部に１個ずつのミスマッチを有するものである。この２個のプローブを同時に標的にハイブリダイズさせ、蛍光モニターによる融解分析を実施例２の場合と同様にして行った。プローブＺ（配列番号：６６）（消光染料を備える）が鋳型から解離すると（Ｔｍ＝７０℃）蛍光の増加が観察され、フルオレセンラベルプローブＹ（配列番号：６５）が解離すると（Ｔｍ＝７７．５℃）、別の蛍光の増加が続いて起こった。フルオレセンラベルプローブ（図５Ａ）下部における単一塩基ミスマッチ、並びに、消光プローブ（図５Ｂ）下部における単一塩基ミスマッチのいずれも、それぞれのミスマッチに特徴的な下方へ向かうＴｍ変位によって検出された。二重ミスマッチ（すなわち、各プローブについて１個のミスマッチ）もはっきりと検出された（図５Ｂ）。
【００６７】実施例１０：消光プローブと脱消光プローブの比較
フルオレセン、ＪＯＲ、Ｃｙ５、およびＬＣＲｅｄ  ７０５の各染料を５’末端に付着させて、オリゴヌクレオチド・プローブ（２７ヌクレオチド長）を合成した。また、ポジション０と＋１に２個のＧ残基を有する、３８ヌクレオチド長の相補鎖を調製した。プローブをこの相補鎖にハイブリダイズさせ、実施例４に記載されたやり方で、プローブの解離の際の蛍光変化を測定した。ただし、この例では、励起や発光検出に適当なフィルターを使用した。蛍光強度のパーセント変化率は、フルオレセンで２８％、ＪＯＥで２０％であり、いずれもハイブリダイゼーションによって消光を示し、二重鎖解離によって脱消光を示した。また、Ｃｙ５で−１１％、ＬＣＲｅｄ  ７０５で−１２％であり、この場合はハイブリダイゼーションによって発光増強を、二重鎖解離によって消光を示した。
【００６８】実施例１１：仮想ヌクレオチドとしてフルオレセンで内部ラベルされたオリゴヌクレオチド・プローブの消光／発光増強による遺伝子型分析
第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ（Ｇ１６９１Ａ）遺伝子座（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃Ｌ３２７６４）に対する相補的なオリゴヌクレオチドを、Ｏｐｅｒｏｎ（アラメダ、カリフォルニア州）から入手し、それ以上精製せずにそのまま使用した。フルオレセン−ＯＮフォスフォラミダイト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州）を、プローブの変動性塩基に対して相補的なポジションに組み込み、また、このプローブを３’−リン酸で伸張をブロックした（図６）。従って、フルオレセンラベルは、配列ＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＦＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧ−Ｐ（配列番号：６７）の中に「仮想ヌクレオチド」として組み込まれたことになる。第Ｖ因子遺伝子座にハイブリダイズすると、フルオレセンはＧまたはＡ残基のいずれかと向き合うことになる。
フルオレセンモニターを伴うＰＣＲを、急速サイクル、リアルタイムＰＣＲ装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて１０  μｌ容量サンプルにて実施した。プローブを、プライマーＦＶＦ（配列番号：１９）（０．５  μＭ）とＦＶＲ（配列番号：２０）（０．２５  μＭ）とともにＰＣＲ増幅混合物に加えた。各反応は、０．１  μＭのフルオレセンラベルプローブ、各２００  μＭのｄＮＴＰ  （ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ）、５０  ｍＭトリスｐＨ８．３  （２５℃）、３  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００  μｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、０．４  ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（８８  ｎｇ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および、５０  ｎｇの精製ゲノムＤＮＡにおいて行われた。
【００６９】  既知の遺伝子型を持つゲノムＤＮＡを従来の研究（Ｌａｙ  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．，  Ｗｉｔｔｗｅｒ．Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ４３：１２，  ２２６２−２２６７，  １９９７）から得た。急速サイクルＰＣＲにおいて、９５℃における変性、５０℃における１０秒間のアニーリング、および、１℃／秒で７２℃への遷移というサイクルを４５サイクル実施し、２２２ｂｐの産物を得た。特に指定しない温度遷移速度は２０℃／秒にプログラムし、維持時間は０秒とした。ＰＣＲ後、フルオレセン蛍光を連続的に測定しながら、９５℃へ加熱、４０℃における３０秒間のアニーリング、０．１℃／秒で７５℃加熱による融解を行って自動的に融解曲線分析を実行した。
【００７０】  蛍光融解曲線分析では市販のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを用いた。ただし温度に関する蛍光の、負の導関数ではなく、正の導関数をＹ軸にプロットした。導関数の多項推定のために用いる温度間隔は８℃とし、ディジタルフィルターを用いた。
野生型のホモ接合体では、Ｆ：Ｇ対向、フルオレセン蛍光の消光、および、５８．４℃のＴｍが得られ、一方、第ＶＬｅｉｄｅｎのホモ接合体では、Ｆ：Ａ対向、蛍光増強および同様のＴｍが得られた。ヘテロ接合体では、Ｆ：ＧとＦ：Ａの両対向が得られ、蛍光は中間レベルであった。遺伝子型は、他の例の場合と同様、各対立遺伝子の特徴的Ｔｍではなく、蛍光の変化の方向によって決定される。全ての遺伝子型を相互に明瞭に区別することが可能であった。
【００７１】  仮想ヌクレオチドの別の使用例としては、配列番号：３のアナログ、すなわち、５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＮＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号：５９）によるサルモネラ菌の検出がある。ここにＮは蛍光ラベルを含む仮想ヌクレオチドである。この場合ハイブリダイゼーション時に消光が起こり、その際、前記仮想ヌクレオチドは、相補鎖の０ポジションのＧに近接設置される。
【００７２】実施例１２：Ｇ残基に蛍光ラベルを設けたオリゴヌクレオチド・プローブの脱消光による遺伝子型分析
蛍光モニター下におけるＰＣＲを実施例１１に記載したやり方で実行した。ただし下記を変更した。すなわち、第Ｖ因子遺伝子座を、５’ＡＧＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号：６８、０．５  μＭ）と５’ＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＡ（配列番号：６９、０．０６  μＭ）のプライマーを８：１モル比で用いて非対称増幅した。また、各反応液はＴａｑＳｔａｒｔ抗体を含まず、２００  ｍＭトリスｐＨ８．７（２５℃）、および、０．２  μＭのフルオレセンラベルプローブ５’ＧＧＣＧＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧ（Ｆ）（配列番号：７０）を含む。ここに下線を引いたＧはＬｅｉｄｅｎ突然変異に向き合うものである。
急速サイクルＰＣＲを、始めに９５℃で５秒間インキュベートし、その後変性（８６℃）、アニーリング（５５℃、１０秒間）、および、伸張（１℃／秒で５５℃から７２℃へ遷移）というサイクルを４５から６０サイクル実施した。これによってヒトＤＮＡサンプルから２２６ｂｐの産物を得た。ＰＣＲ後、９５℃へ加熱、６５℃への冷却、さらに０．２５℃／秒で３０℃に冷却、および、フルオレセン蛍光を連続的に測定しながら０．０５℃／秒で６５℃加熱による融解を行って融解曲線分析を実行した。別様に指示しない限り、温度遷移速度は２０℃／秒に、維持時間は０にプログラムされた。蛍光融解曲線分析は、市販のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを用いて行い、通例に従って、蛍光の、負の一次導関数を温度に対してプロットした。
【００７３】  プローブ−標的ハイブリダイゼーションにより蛍光の増加が得られた。野生型のホモ接合体の遺伝子型（Ｇ：Ｃ適合）ではＴｍは５３℃であり、さらに低い４５℃のＴｍを持つ第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎのホモ接合体の遺伝子型（Ｇ：Ｔミスマッチ）とは簡単に区別された。ヘテロ接合体の遺伝子型では、両方のＴｍ値が見られた（図７）。
【００７４】  プローブと同方向のプライマーを、対向プライマーよりも少量加えて実行される非対称ＰＣＲにおいて最善の結果が得られた。４５サイクルを行った場合、１：４のプライマー非対称で最大シグナルが得られた。６０サイクルでは１：８比が最適であった。１：８比に比べると、１：１６比では脱消光ピーク面積は６２％、１：４比では８５％、１：２比では３７％であった。このプローブシステムでは、プライマー濃度が対称的（等しい）であるとシグナルは得られなかった。
【００７５】実施例１３：消光プローブの最適化
プローブ１と標的Ｐ（表３）による融解曲線分析を実施例４と同様にして実施した。ただし、バッファーｐＨと陽イオン濃度を変更した。バッファーｐＨの作用を、１００  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭトリス溶液で、ＨＣｌにより各種ｐＨに調整した溶液で調べた（図８ａ、黒塗りひし形）。融解曲線データのピーク面積値を比べることによって相対的シグナル強度の比較が可能である。至適ｐＨは７．４−８．０であり、最高シグナルはｐＨ７．６−７．８で得られた。バッファー陽イオン濃度の作用を、様々の濃度のＫＣｌを１０  ｍＭトリスｐＨ８．３溶液に添加して調べた（図８ｂ、黒塗り丸）。シグナルは、１０または２０  ｍＭのＫＣｌ濃度ではきわめて低くかった。良好なシグナルは５０−２００  ｍＭ  ＫＣｌで観察され、最高結果は約１００  ｍＭで得られた。同様の陽イオン作用は、陽イオンを、バッファーの一部として、例えば、トリス＋およびトリシン＋と共に与えた場合にも（ただしこれらに限定されない）得られた。ＰＣＲと適合する１００  ｍＭトリスｐＨ７．８を用いると良好なシグナルを得ることができる。
【００７６】実施例１４：脱消光プローブの最適化、および、ｐＨによる消光と脱消光の互換性
セットＶ（表４）のプローブと標的を用いて、ハイブリダイゼーション時に脱消光する（シグナル強度を増す）プローブシステムについてさらに調べた。融解曲線分析を、プローブ・標的混合物を９５℃に加熱し０秒間、４０℃に冷却１５秒間、その後連続モニターしながら０．１℃／秒の勾配で９４℃加熱によって行った。
図９はバッファーｐＨが、シグナル強度とシグナル変化の方向に及ぼす影響を示す。この図では、バッファーは、５００  μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１００  ｍＭトリスである。ｐＨが８よりもアルカリになると、プローブはハイブリダイゼーション時に脱消光する。一方、ｐＨが８よりも酸性になると、プローブはハイブリダイゼーション時に消光する。言い換えると、消光または脱消光は必ずしも全てプローブの性質によるものではなく、プローブ／温度結合によるものでもなく、バッファー条件（陽イオン濃度やｐＨ）にも依存する。このことはさらに図８ａでも示される（白抜きひし形と白抜き三角）。この図では、蛍光を、それぞれ、１０  ｍＭのトリス・バッファーおよび１０  ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール・バッファーを用い７．２−９．０および８．７−１０．７のｐＨ範囲で、１６０  ｍＭのＫＣｌの存在下に調べた。脱消光シグナルはｐＨ８．０−１０．７で得られ、最高結果はｐＨ８．６以上で見られた。ｐＨ８．０周辺ではシグナルはほとんど見られず、さらに酸性のｐＨでは僅かな消光が認められた。２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパノールから成るバッファー液はまた、本用途に有用な基本的バッファー液用としても使用された。
【００７７】  図８ｂ（白抜き丸）は陽イオンの脱消光シグナルに対する作用を示す。シグナルは１０−２０  ｍＭ  ＫＣｌではきわめて低いが、５０−３２０  ｍＭ  ＫＣｌでは強く、最良の結果は８０−１６０  ｍＭ  ＫＣｌで得られた。同様の陽イオン作用が、Ｌｉ＋，Ｎａ＋，Ｃｓ＋、テトラメチルアンモニウム＋イオンでも、あるいは、陽イオンを、バッファーの一部として、例えば、トリス＋およびトリシン＋と共に与えた場合にも（ただしこれらに限定されない）得られた。ＰＣＲと適合し、かつ、実施例１２でも用いた２００  ｍＭトリスｐＨ８．７−８．８を用いると良好なシグナルが得られた。グリセロールやテトラペンチルアンモニウム＋のような化合物は脱消光シグナルを抑制した。
【００７８】実施例１５：融解ピーク面積の、ＰＣＲアニーリング温度に関連した、プローブＴｍに対する依存性
様々のＴｍを有する単一ラベルプローブを用いて、プローブ・標的融解時に見られる、プローブＴｍ、ＰＣＲアニーリング温度、および、蛍光強度変化の間の関係を調べた。前述の実施例と同様、シグナル強度は、融解曲線データから得られるピーク面積比によって評価した。いずれも５’−フルオレセンでラベルされ、３’リン酸末端を有する、下記の６個のプローブを、ヘモクロマトーシスに関達するＧ８４５Ａ多形性領域（Ｇｅｎｂａｎｋ、アクセス＃Ｚ９２９１０）と相補的となるように設計した。
プローブ−ａ（２１ヌクレオチド長）：
プローブＨＣＹＰ２＋１個の３’Ｃ残基
プローブ−ｂ（２１ヌクレオチド長）：
プローブ−ａと同じ、ただし４塩基が３’方向に変位
プローブ−ｃ（１７ヌクレオチド長）：
プローブ−ａと同じ、ただし３’末端の４塩基を除去・平滑化
プローブ−ｄ（１７ヌクレオチド長）：
プローブ−ｂと同じ、ただし３’末端の４塩基を除去・平滑化
プローブ−ｅ（１３ヌクレオチド長）：
プローブ−ｃと同じ、ただし３’末端の４塩基を除去・平滑化
プローブ−ｆ（１３ヌクレオチド長）：
プローブ−ｄと同じ、ただし３’末端の４塩基を除去・平滑化
非対称増幅を、０．０６２５  μＭのプライマーＨＣＹＲと、０．５  μＭのプライマー５’ＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡ（配列番号：７１）により、実施例８の反応混合液をＴａｑＳｔａｒｔ抗体（８８  ｎｇ）と併用して実行した。９４℃０秒、６０℃１０秒、および、５℃／秒で７２℃へ加熱するＰＣＲサイクルを５０サイクル実施し、次に、最終的に９４℃へ加熱、３５℃へ冷却１０秒間保持、および、連続蛍光測定をしながら勾配０．１℃／秒で８０℃への加熱を行った。各融解曲線導関数についてピーク面積を求め、同じプローブで、ＰＣＲ無しの合成鋳型から得たピーク面積によって正規化した。プローブ−ｃのピーク面積を１００とした時の、プローブ−ａとプローブ−ｂの相対的ピーク面積を求めた。プローブ−ｄのピーク面積を１００とした時のプローブ−ｂとプローブ−ｆの相対的ピーク面積比を求めた。ピーク面積値を、プローブのＴｍに対してプロットした（図１０）。最大ハイブリダイゼーションシグナルは、プローブＴｍがＰＣＲアニーリング温度よりも約５℃下回る時に観察された。サイクル毎に蛍光をモニターする必要のない実施態様では、プローブＴｍが、ＰＣＲのアニーリング温度よりも０−１０℃、もっとも好ましくは約５℃低くなるようにプローブ長を調節するのが好ましい。多くの場合プライマーＴｍはＰＣＲのアニーリング温度付近にあるから、至適プローブＴｍもプライマーＴｍよりも約５℃低くなる。
【００７９】  プローブがアニーリング温度よりも高いＴｍを持つ場合に見られるシグナル強度の減少は、ＰＣＲ中のプローブの加水分解か、プローブによるポリメラーゼ伸張の阻止によるＰＣＲ効率の低下のいずれかによるものと考えられる。至適Ｔｍよりも低いＴｍを持つプローブに観察されるシグナル強度の減少は、冷却時産物鎖がアニールすることによりプローブのための結合部位が少なくなるためか、または、一本鎖の中に二次構造の形成されるためと考えられる。
【００８０】  これまで好ましい実施態様を参照しながら本発明を詳細に説明してきたけれども、前記請求項に記述され定義される本発明の精神と技術的範囲内においてなお数々の変種および修正が存在することを理解しなければならない。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、表１に示す３組のプローブと標的における蛍光測定データを示す。セットＡ（実線）、セットＢ（点線）、セットＣ（一点鎖線）。
【図２】  図２は、図１に示したデータのｄＦ／ｄＴプロットであり、融解曲線を融解ピークに変換したものである。
【図３】  図３は、サイクル数対蛍光消光相対値のプロット図である。
【図４】  図４ＡとＢは、第Ｖ因子遺伝子に対する融解曲線データのプロット図である。図４Ａは蛍光対温度を示し、図４Ｂは一次導関数ｄＦ／ｄＴ対温度を示す。
【図５】  図５ＡとＢは、多重プローブによる突然変異分析における融解曲線を示す。図５Ａは、両プローブ共ミスマッチ無し、対、フルオレセン・プローブ存在下でミスマッチの場合を示し、図５Ｂは、両プローブ共ミスマッチ無し、対、消光プローブ存在下におけるミスマッチ、または、両プローブ存在下におけるミスマッチの場合を示す。
【図６】  図６は、内部ラベルされたフルオレセン・プローブによる、第ＶＬｅｉｄｅｎ（Ｇ１６９１Ａ）の、斉一リアルタイム遺伝子型分析の結果を示す。この図では融解曲線を、蛍光の一次導関数プロットとして表す。野生型ホモ接合（実線）、突然変異ホモ接合（鎖線）、ヘテロ遺伝子型（点線）の曲線が示されている。
【図７】  図７は、フルオレセン脱消光プローブによる、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ遺伝子型分析を示す。野性型ホモ接合、突然変異ホモ接合、ヘテロ遺伝子型、および、ネガティブ・コントロールに関する融解曲線が、負の一次導関数として表されている。
【図８】  図８ａと８ｂは、融解曲線から得られたピーク面積、対、バッファーｐＨ（図８ａ）、または、バッファーの陽イオン濃度（８ｂ）のプロット図である。消光プローブによるデータ（黒塗り印）と、脱消光プローブによるデータ（白抜き印）はそれぞれ下記のバッファー条件下に得られたものである。１０  ｍＭトリスと１００−１６０  ｍＭ  ＫＣｌ（四角）、１０  ｍＭトリスｐＨ８．３−８．８（丸）、および、１０  ｍＭ  ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、１６０  ｍＭ  ＫＣｌ（三角）。
【図９】  図９は脱消光プローブにおける融解曲線データのプロット図であり、蛍光変化のレベルと方向がバッファーのｐＨによって影響されることを示す。バッファーのｐＨ７．２、ｐＨ７．７、ｐＨ８．２、ｐＨ８．８における曲線が示されている。
【図１０】  図１０は、融解ピーク面積対プローブＴｍのプロット図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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