(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域を、それぞれ独立して増幅させる増幅工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の増幅物および前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、それぞれ独立して、切断部位が異なる少なくとも２種類の制限酵素で処理する切断工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の切断物および前記第２のＤＮＡ領域の切断物について、それぞれ独立して、ＤＮＡ断片長のパターンを検出する検出工程と、
前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンと、標準ＤＮＡ断片長パターンとを比較し、前記魚類被検体の魚種を識別する識別工程とを含み、
前記第１のＤＮＡ領域が、５’側に配列番号１の塩基配列を有し、３’側に配列番号２の塩基配列を有する領域であり、
前記第２のＤＮＡ領域が、５’側に配列番号２の塩基配列を有し、３’側に配列番号３の塩基配列を有する領域であり、
前記標準ＤＮＡ断片長パターンが、魚種が既知である魚類標準検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、前記増幅工程、前記切断工程および前記検出工程の実行により得られた、前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンであり、
前記２種類の制限酵素が、ＡｌｕＩまたはこれと同じ基質特異性の制限酵素と、ＨａｅIIIまたはこれと同じ基質特異性の制限酵素との組合せであることを特徴とする魚類の識別方法。
配列番号１：5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
配列番号２：5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
配列番号３：5’-AGACCGGAGTAATCCAGGT-3’
【請求項２】
前記魚類標準検体が、下記表に示す番号１〜７２番の魚類からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１記載の魚類の識別方法。
【表１Ａ】
0005205525.tif 000005
【表１Ｂ】
0005205525.tif 000006
【表１Ｃ】
0005205525.tif 000007
【請求項３】
前記第１のＤＮＡ領域において、５’末端領域が配列番号１の塩基配列であり、３’末端領域が配列番号２の塩基配列であり、
前記第２のＤＮＡ領域において、５’末端領域が配列番号２の塩基配列であり、３’末端領域が配列番号３の塩基配列である、請求項１または２記載の魚類の識別方法。
【請求項４】
前記検出工程が、電気泳動による検出工程である、請求項１から３のいずれか一項に記載の魚類の識別方法。
【請求項５】
前記魚類被検体が、魚肉、ひれ、骨、鱗、卵、精子、内臓、皮、歯および眼球からなる群から選択された少なくとも一つまたはその加工品である、請求項１から４のいずれか一項に記載の魚類の識別方法。
【請求項６】
前記魚類被検体が、ホルマリン固定化検体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の魚類の識別方法。
【請求項７】
前記増幅工程において、
前記第１領域の増幅に、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーＦ１と配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーＲ１とを使用し、
前記第２領域の増幅に、配列番号２の塩基配列からなるフォワードプライマーＦ２と配列番号５の塩基配列からなるリバースプライマーＲ２とを使用する、請求項１から６のいずれか一項に記載の魚類の識別方法。
フォワードプライマーＦ１（配列番号１）
5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
リバースプライマーＲ１（配列番号４）
5’-GATTRCGCTACCTTCGCACG-3’
フォワードプライマーＦ２（配列番号２）
5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
リバースプライマーＲ２（配列番号５）
5’-ACCTGGATTACTCCGGTCT-3'
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の識別は、従来、魚類図鑑等を用いて、魚の体型、ひれの形状、色および模様等の外観を照合することで行われていた。しかしながら、切り身、加工品および魚卵等のように、魚の外観をとどめていない検体では、識別ができないという問題があった。例えば、切り身や加工品等は、消費者保護の観点から、虚偽表示等を防止するためにも、その識別の重要性が高まっている。また、様々な環境調査または水産資源調査において、魚卵および稚魚等を採取し分析することがある。しかしながら、外観だけで魚卵および稚魚等の識別を行うことは困難であり、その識別の重要性が高まっている。
【０００３】
そこで、近年、分子生物学的手法の発達に伴い、ＤＮＡ等の核酸の分析による魚類の識別技術が開発されている。例えば、独立行政法人農林水産消費安全技術センターでは、切り身等の外観が類似している魚類の識別技術として、これらの技術を利用した方法を開発しており、ウナギ属Anguilla（ジャポニカ種、アンギラ種）、スズキ目Perciformes（タイリクスズキLateolabrax maculatus、ナイルパーチLatesniloticus）、マグロ属Thunnus（クロマグロThunnus orientalis、ミナミマグロThunnus maccoyii、メバチThunnus obesus、キハダThunnus obesus、ビンナガThunnus alalunga、コシナガThunnus  tonggol、タイセイヨウマグロThunnus atlanticus）、スズキ亜目Percoidei（マダイPagrus major、チダイEvynnis tumifrons、キダイDentex hypselosomus）、サバ属Scomber（マサバScomber japonicus、ゴマサバScomber  australasicus、タイセイヨウサバScomber scombrus）、マアジ属Trachurus（マアジTrachurus japonicus、ニシマアジTrachurus trachurus）の識別方法について、マニュアルを公開している（非特許文献１）。前記マニュアルでは、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）−ＲＦＬＰ（Restriction  Fragment  Length  Polymorphism：制限酵素断片長多型解析法）を利用した識別方法が開示されている。具体的には、ミトコンドリアＤＮＡ内のチトクロームＣオキシダーゼ遺伝子または１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子等の特定領域を、ＰＣＲで増幅した後、増幅したＤＮＡを制限酵素で処理し、生成したＤＮＡ断片のサイズに基づいて、識別が行われている（非特許文献２）。
【０００４】
そして、このような核酸分析により、特定魚属および特定魚科の分類、系統類縁関係の分析、特定魚種の同定が可能になることが報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。また、前記核酸分析により、特定魚種の魚卵分析も可能であることが示されている（非特許文献６）。
【０００５】
しかし、検体には、例えば、ホルマリンで固定化された検体もあり、これについては、長期保存の点には優れるものの、前述のような核酸解析方法によって、正確な識別を行うことが困難という問題があった（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】独立行政法人 農林水産消費安全技術センター  飲食料品の品質表示確認に係る分析技術（http://www.famic.go.jp/technical_information/hinpyou/）
【非特許文献２】佐々木博己編（２００３年）、ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル、羊土社、１２１−１３３頁
【非特許文献３】向井貴彦・杉本真奈美、日本産トビハゼのミトコンドリアＤＮＡ  多型に基づく遺伝的集団構造の解析、魚類学雑誌、５３巻、１５１−１５８頁  （２００６）
【非特許文献４】秋元清治・瀬崎啓次郎・三谷勇・渡部終五、ミトコンドリア制御領域の塩基配列分析による日本周辺漁場におけるキンメダイの集団遺伝構造の解析、神水研研報第８号、８９−９７頁（２００３）
【非特許文献５】下村佳ら、フグ食中毒（疑）事例におけるミトコンドリア・シトクロムｂ遺伝子による肝残品の魚種同定、広島市衛研年報  ２４号、１１８−１１９頁  （２００５）
【非特許文献６】石黒直哉・木下泉・西田睦、ＤＮＡ分析によるヒラメ浮遊卵の識別−魚卵識別への新しいアプローチ−、平成８年度日本水産学会春季大会講演要旨集  （１９９６年）
【非特許文献７】XIA  YingZheら、Discussing  on  the  feasibility  of  large  fragments  DNA  extraction  from  formalin-fixed  fish  specimens、Shuisheng  Shengwu  Xuebao、Vol.31、No.4、Page485-491  (2007)．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、ホルマリン固定化検体等の検体の形態に関わらず、正確な識別が可能である、魚類の新たな識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の魚類の識別方法は、魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域を、それぞれ独立して増幅させる増幅工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の増幅物および前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、それぞれ独立して、切断部位が異なる少なくとも２種類の制限酵素で処理する切断工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の切断物および前記第２のＤＮＡ領域の切断物について、それぞれ独立して、ＤＮＡ断片長のパターンを検出する検出工程と、
前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンと、標準ＤＮＡ断片長パターンとを比較し、前記魚類被検体の魚種を識別する識別工程とを含み、
前記第１のＤＮＡ領域が、５’側に配列番号１の塩基配列を有し、３’側に配列番号２の塩基配列を有する領域であり、
前記第２のＤＮＡ領域が、５’側に配列番号２の塩基配列を有し、３’側に配列番号３の塩基配列を有する領域であり、
前記標準ＤＮＡ断片長パターンが、魚種が既知である魚類標準検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、前記増幅工程、前記切断工程および前記検出工程の実行により得られた、前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンであることを特徴とする。
配列番号１：5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
配列番号２：5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
配列番号３：5’-AGACCGGAGTAATCCAGGT-3’
【発明の効果】
【０００９】
本発明の魚類の識別方法によれば、例えば、ホルマリン固定化検体であっても、正確な識別が可能である。また、本発明の魚類の識別方法によれば、例えば、２種類以上の魚類標準検体を設定可能である。このため、前記非特許文献１、３〜６に記載する方法では、特定の魚種か否かを識別するのみであったが、本発明によれば、例えば、前記魚類被検体を、２種類以上、具体例として後述する７２種類またはそれ以上の種類に分類することも可能である。このため、本発明は、例えば、前述のような魚類表示の確認、生体系への影響調査等、様々な分野において、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における、配列番号１、配列番号２および配列番号３の位置関係を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域と、プライマーの位置関係の一例を示す図である。
【図４】図４は、実施例１における標準検体のバンドパターンを示す電気泳動写真である。
【図５】図５は、実施例１におけるチダイと被検体のバンドパターンを示す電気泳動写真であり、（Ａ）が、プライマー１を用いた結果であり、（Ｂ）が、プライマー２を用いた結果である。
【図６】図６は、実施例１におけるホウボウと被検体のバンドパターンを示す電気泳動写真であり、（Ａ）が、プライマー１を用いた結果であり、（Ｂ）が、プライマー２を用いた結果である。
【図７】図７は、実施例１におけるサワラと被検体のバンドパターンを示す電気泳動写真であり、（Ａ）が、プライマー１を用いた結果であり、（Ｂ）が、プライマー２を用いた結果である。
【図８】図８は、実施例１におけるタチウオと被検体のバンドパターンを示す電気泳動写真であり、（Ａ）が、プライマー１を用いた結果であり、（Ｂ）が、プライマー２を用いた結果である。
【図９】図９は、実施例２における外観からタチウオと判断した被検体と、タチウオの標準検体のバンドパターンを示す電気泳動写真であり、（Ａ）がプライマー１を用いた結果であり、（Ｂ）がプライマー２を用いた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の魚類の識別方法は、前述のように、魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域を、それぞれ独立して増幅させる増幅工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の増幅物および前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、それぞれ独立して、切断部位が異なる少なくとも２種類の制限酵素で処理する切断工程と、
前記第１のＤＮＡ領域の切断物および前記第２のＤＮＡ領域の切断物について、それぞれ独立して、ＤＮＡ断片長のパターンを検出する検出工程と、
前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンと、標準ＤＮＡ断片長パターンとを比較し、前記魚類被検体の魚種を識別する識別工程とを含む。
【００１２】
本発明は、制限酵素を用いる前記切断工程と、前記パターンを検出する前記検出工程とから、例えば、ＲＦＬＰ（Restriction  Fragment  Length  Polymorphism）による魚類の検出方法ともいえる。
【００１３】
（増幅工程）
本発明において、前記増幅工程は、前記魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域を、それぞれ独立して増幅させる増幅工程である。
【００１４】
前記魚類被検体の種類は、何ら制限されず、例えば、魚類の検体があげられ、この他に、例えば、魚類か否かが不明な生物の検体でもよい。本発明において、魚類は、脊椎動物門の上網１の魚類全般を示し、例えば、Ｉ類の無顎類、II網の板皮類、III網の軟骨魚類、IV網の棘鮫類、Ｖ網の硬骨魚類があげられる。前記魚類の生息場所は、特に制限されず、海水および淡水を問わず、海、河川、池、沼、湖等があげられる。前記検体は、例えば、魚類等の生物の組織、器官および細胞等があげられる。前記組織は、例えば、魚肉、ひれ、骨、鱗、卵、精子、内臓、皮、歯、眼球等があげられる。前記検体は、例えば、これらの加工品でもよい。また、前記検体は、例えば、固定化検体でもよく、ホルマリン、グルタルアルデヒド、エタノール等で固定化された検体でもよい。また、本発明において、前記検体は、例えば、保存等により経年劣化した検体でもよい。
【００１５】
前記増幅工程において、鋳型となるミトコンドリアＤＮＡは、例えば、従来公知の方法により調製でき、その方法は、何ら制限されない。
【００１６】
前記第１のＤＮＡ領域は、５’側に配列番号１の塩基配列を有し、３’側に配列番号２の塩基配列を有する領域である。前記第２のＤＮＡ領域は、５’側に配列番号２の塩基配列を有し、３’側に配列番号３の塩基配列を有する領域である。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における、配列番号１、配列番号２および配列番号３の位置関係を、図１に例示する。配列番号２において、Ｙは、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）を示す（以下、同様）。
配列番号１：5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
配列番号２：5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
配列番号３：5’-AGACCGGAGTAATCCAGGT-3’
【００１７】
前記第１のＤＮＡ領域は、５’側に配列番号１の塩基配列と、３’側に配列番号２の塩基配列を含む領域であればよい。前記第１のＤＮＡ領域は、好ましくは、その５’末端領域が配列番号１の塩基配列であり、その３’末端領域が配列番号２の塩基配列である。この場合、前記第１のＤＮＡ領域は、５’末端の塩基が、配列番号１の５’末端の塩基であり、３’末端の塩基が、配列番号２の３’末端の塩基である。
【００１８】
前記第１のＤＮＡ領域における５’末端領域は、例えば、配列番号１の５’末端に、さらに１塩基または数塩基の配列を有してもよいし、または、配列番号１の５’末端が１塩基または数塩基欠失した配列であってもよい。他方、前記第１のＤＮＡ領域における３’末端領域は、例えば、配列番号２の３’末端に、さらに１塩基または数塩基の配列を有してもよいし、または、配列番号２の３’末端が１塩基または数塩基欠失した配列であってもよい。１塩基または数塩基とは、例えば、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基等が例示できる。
【００１９】
前記第２のＤＮＡ領域は、５’側に配列番号２の塩基配列と、３’側に配列番号３の塩基配列を含む領域であればよい。前記第２のＤＮＡ領域は、好ましくは、５’末端領域が配列番号２の塩基配列であり、３’末端領域が配列番号３の塩基配列である。この場合、前記第２のＤＮＡ領域は、５’末端の塩基は、配列番号２の５’末端の塩基であり、３’末端の塩基は、配列番号３の３’末端の塩基である。
【００２０】
前記第２のＤＮＡ領域における５’末端領域は、例えば、配列番号２の５’末端に、さらに１塩基または数塩基の配列を有してもよいし、または、配列番号２の５’末端が１塩基または数塩基欠失した配列であってもよい。他方、前記第２のＤＮＡ領域における３’末端領域は、例えば、配列番号３の３’末端に、さらに１塩基または数塩基の配列を有してもよいし、または、配列番号３の３’末端が１塩基または数塩基欠失した配列であってもよい。１塩基または数塩基とは、例えば、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基等が例示できる。
【００２１】
前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域の具体例を、図２に示す。図２は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における、配列番号１、配列番号２および配列番号３の位置関係を示す図であり、上側の矢印で示す領域が第１のＤＮＡ領域であり、下側の矢印で示す領域が前記第２のＤＮＡ領域である。
【００２２】
前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域の長さは、例えば、魚類の種類によって異なる。前記第１のＤＮＡ領域は、上限が、例えば、約１０００ｂｐであり、下限は、例えば、約３００ｂｐであり、より好ましくは、４００〜８００ｂｐである。前記第２のＤＮＡ領域は、上限が、例えば、約１０００ｂｐであり、下限は、例えば、約３００ｂｐであり、より好ましくは、４００〜８００ｂｐである。
【００２３】
前記増幅工程において、前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域を増幅する方法は、特に制限されず、例えば、プライマーを用いた増幅方法が採用できる。前記増幅方法は、特に制限されず、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等の公知の方法が採用できる。前記プライマーの配列は、特に制限されず、前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域が増幅できる配列を、適宜設定できる。
【００２４】
前記第１のＤＮＡ領域を増幅するためのプライマーは、例えば、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーＦ１と配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーＲ１とが例示できる。配列番号４において、Ｒは、グアニン（Ｇ）またはアデニン（Ａ）を示す（以下、同様）。前記Ｆ１の塩基配列は、前記第１のＤＮＡ領域における配列番号１の塩基配列と同じであり、前記Ｒ１の塩基配列は、前記第１のＤＮＡ領域における配列番号２の塩基配列に対して、相補的な塩基配列である。前記増幅工程において、前記第１のＤＮＡ領域の増幅に、前記Ｆ１とＲ１とを併用することが好ましい。前記Ｆ１と前記Ｒ１との組合せを、プライマーセット１ともいう。また、前記Ｒ１は、例えば、配列番号４において、ＲがＧであるプライマーのみを使用してもよいし、ＲがＡであるプライマーのみを使用してもよく、両者を併用してもよい。併用する場合、その割合は、特に制限されず、例えば、モル比１：１である。
フォワードプライマーＦ１（配列番号１）
5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
リバースプライマーＲ１（配列番号４）
5’-GATTRCGCTACCTTCGCACG-3’
【００２５】
前記第２のＤＮＡ領域を増幅するためのプライマーは、例えば、配列番号２の塩基配列からなるフォワードプライマーＦ２と配列番号５の塩基配列からなるリバースプライマーＲ２とが例示できる。配列番号２において、Ｙは、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）を示す（以下、同様）。前記Ｆ２の塩基配列は、前記第２のＤＮＡ領域における配列番号２の塩基配列と同じであり、前記Ｒ２の塩基配列は、前記第２のＤＮＡ領域における配列番号３の塩基配列に対して、相補的な塩基配列である。前記増幅工程において、前記第２のＤＮＡ領域の増幅に、前記Ｆ２とＲ２とを併用することが好ましい。前記Ｆ２と前記Ｒ２との組合せを、プライマーセット２ともいう。また、前記Ｆ２は、例えば、配列番号２において、ＹがＴであるプライマーのみを使用してもよいし、ＹがＣであるプライマーのみを使用してもよく、両者を併用してもよい。併用する場合、その割合は、特に制限されず、例えば、モル比１：１である。
フォワードプライマーＦ２（配列番号２）
5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
リバースプライマーＲ２（配列番号５）
5’-ACCTGGATTACTCCGGTCT-3'
【００２６】
前記プライマーセット１および前記プライマーセット２を、それぞれ独立して用いた場合、例えば、マイワシは、ミトコンドリアＤＮＡの塩基番号１４１６−２１２９の領域（７１４ｂｐ）および塩基番号２１１０−２６３８の領域（５２９ｂｐ）が増幅される。
【００２７】
前記各プライマーと前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域との位置関係の具体例を、図３に示す。図３は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における第１のＤＮＡ領域および第２のＤＮＡ領域と、Ｆ１、Ｒ１、Ｆ２およびＲ２との位置関係を示す図である。
【００２８】
前記増幅工程において、前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域は、それぞれ独立して増幅させる。具体的には、同じ魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、独立した別個の反応系において、前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域の増幅を行うことが好ましい。
【００２９】
前記増幅工程において、前記第１のＤＮＡ領域および前記第２のＤＮＡ領域の増幅は、例えば、全体の処理時間を短縮できることから、同時に、独立して行うことが好ましい。
【００３０】
（切断工程）
本発明において、前記切断工程は、前記増幅工程で得られた前記第１のＤＮＡ領域の増幅物および前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、それぞれ独立して、切断部位が異なる少なくとも２種類の制限酵素で処理する工程である。以下、前記第１のＤＮＡ領域の増幅物を、「第１の増幅物」、前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、「第２の増幅物」ともいう。
【００３１】
併用する制限酵素の数は、少なくとも２種類であればよく、例えば、２〜４種類、好ましくは、２〜３種類を併用でき、特に好ましくは２種類の併用である。前記制限酵素の種類は、特に制限されず、ＡｌｕＩ、ＨａｅIII、ＡｃｃII、ＡｃｉＩ、ＡｆａＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｎＩ、ＢｆａＩ、ＢｍｇＴ１２０Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｅＭII、ＢｓｉＹＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｒＩ、Ｃａｃ８Ｉ、Ｃｆｒ１３Ｉ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＲＩ、ＤｄｅＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＨａｐII、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＭａｅII、ＭａｅIII、ＭｂｏＩ、ＭｌｙＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＭｗｏＩ、ＮｌａIII、ＮｌａIV、ＰｌｅＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｉｍＩ、ＳｓｓＩ、ＴａｑＩ、ＴａｕＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＥ１、ＴｓｐＲＩ、Ｔｓｐ４ＣＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｔｈ１１１II、ＶｐａＫ１１ＢＩ、ＸｓｐＩおよびこれらと同じ基質特異性の制限酵素があげられる。前記制限酵素の組合せは、特に制限されず、例えば、ＡｌｕＩまたはこれと同じ基質特異性の制限酵素と、ＨａｅIIIまたはこれと同じ基質特異性の制限酵素との組合せがあげられる。本発明において、「同じ基質特異性の制限酵素」とは、同じ塩基配列を認識して、同じ切断部位を生成することを意味する。
【００３２】
前記切断工程において、前記第１の増幅物および前記第２の増幅物は、それぞれ独立して切断する。具体的には、前記増幅工程で得られた前記第１の増幅物および前記第２の増幅物を、独立した別個の反応系において、それぞれ切断することが好ましい。この際、前記第１の増幅物の切断と、前記第２の増幅物の切断は、例えば、同じ制限酵素の組合せを使用してもよいし、異なる制限酵素の組合せを使用してもよく、好ましくは、前者である。同じ制限酵素の組合せを使用することで、例えば、前記第１の増幅物の切断処理および前記第２の増幅物の切断処理を、簡便に行うことができる。
【００３３】
（検出工程）
本発明において、前記検出工程は、前記第１のＤＮＡ領域の切断物および前記第２のＤＮＡ領域の切断物について、それぞれ独立して、ＤＮＡ断片長のパターンを検出する工程である。以下、前記第１のＤＮＡ領域の切断物を、「第１の切断物」、前記第２のＤＮＡ領域の切断物を、「第２の切断物」ともいい、前記第１の切断物のＤＮＡ断片長パターンを、「第１の断片長パターン」、第２の切断物のＤＮＡ断片長パターンを、「第２の断片長パターン」ともいう。
【００３４】
前記ＤＮＡ断片長のパターンの検出方法は、特に制限されず、ＤＮＡ断片長を検出できればよく、公知の方法が採用できる。前記方法は、例えば、電気泳動法、高速液体クロマトグラフ法等の液体クロマトグラフ法、質量分析法等があげられる。前記電気泳動法は、例えば、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等があげられる。
【００３５】
前記検出工程は、例えば、具体例として、前記電気泳動による検出工程があげられる。前記検出は、例えば、まず、泳動用ゲルを用いて電気泳動を行い、つぎに、前記泳動用ゲルにおけるＤＮＡを可視化することにより行える。
【００３６】
前記電気泳動の条件は、特に制限されない。泳動用ゲルは、特に制限されず、公知のゲルが使用でき、例えば、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等があげられる。前記ポリアクリルアミドゲルにおけるゲル濃度は、特に制限されず、例えば、５〜２５ｖ/ｗ％であり、好ましくは１０〜２０ｖ/ｗ％であり、グラジエントゲルでもかまわない。前記アガロースゲルにおけるゲル濃度は、特に制限されず、例えば、１．５〜３ｖ/ｗ％であり、好ましくは２〜３ｖ/ｗ％である。
【００３７】
前記ＤＮＡの可視化は、特に制限されず、核酸染色剤を使用する方法があげられる。前記核酸染色剤は、特に制限されず、ＤＮＡの二本鎖間に挿入されるインターカレーターがあげられる。前記インターカレーターは、例えば、紫外線照射により蛍光を発する物質が好ましく、特に、ＤＮＡの二本鎖間に挿入された状態で、その蛍光強度が増加するものが好ましい。前記インターカレーターとしては、例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）等が使用できる。前記インターカレーターを使用した場合、例えば、前記インターカレーターの存在下、泳動後の泳動用ゲルに紫外線を照射して現れる蛍光バンドにより、可視化することできる。前記核酸染色剤の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸染色剤を含む泳動用ゲルを使用して、ＤＮＡの二本鎖間に挿入させてもよいし、前記核酸染色剤含有液に、泳動後の泳動用ゲルを浸漬することで、ＤＮＡの二本鎖間に挿入させてもよい。
【００３８】
前記ＤＮＡ断片長のパターンの検出は、例えば、前記ＤＮＡを可視化した状態の前記泳動用ゲルについて、目視で行ってもよいし、画像化して行ってもよい。また、本発明において、前記ＤＮＡ断片長のパターンの検出は、例えば、各断片のＲｆ（移動度）で表わすことにより行ってもよい。
【００３９】
（識別工程）
本発明において、前記識別工程は、前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンと、標準ＤＮＡ断片長パターンとを比較し、前記魚類被検体の魚種を識別する識別工程である。
【００４０】
前記標準ＤＮＡ断片長パターンは、魚種が既知である魚類標準検体由来のミトコンドリアＤＮＡに関する、前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンおよび第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンである。以下、前記魚類標準検体由来のミトコンドリアＤＮＡに関し、前記第１のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンを、「第１の標準断片長パターン」、前記第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンを、「第２の標準断片長パターン」ともいう。
【００４１】
前記第１の標準断片長パターンおよび前記第２の標準断片長パターンは、前述した、前記増幅工程、前記切断工程および前記検出工程の実行により得られたＤＮＡ断片長パターンである。具体的には、前記魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡに対して行われたのと同じ前記増幅工程、前記切断工程および前記検出工程により得られたＤＮＡ断片長パターンである。
【００４２】
前記魚類被検体と前記魚類標準検体について、それぞれの前記増幅工程は、例えば、同じプライマーを使用することが好ましく、温度および時間、反応液組成等の増幅反応条件が同じであることが、より好ましい。
【００４３】
前記魚類被検体と前記魚類標準検体について、それぞれの前記制限酵素による切断工程は、例えば、同じ制限酵素を使用することが好ましく、温度および時間、反応液組成等の酵素反応条件が同じであることが、より好ましい。
【００４４】
前記魚類被検体と前記魚類標準検体について、前記ＤＮＡ断片長のパターンの検出方法は、同じであることが望ましい。ゲル電気泳動法で行う場合は、ゲルの種類およびゲル濃度が同じ泳動ゲルを使用し、電流および時間等の泳動条件も同じであることが好ましい。
【００４５】
前記魚類標準検体は、例えば、下記表に示す番号１〜７２番の魚類があげられる。なお、以下の種類は例示であって、本発明は、これらの魚種に限定されるものではない。前記魚類標準検体の数は、特に制限されず、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
【表１Ａ】
0005205525.tif 000002
【表１Ｂ】
0005205525.tif 000003
【表１Ｃ】
0005205525.tif 000004
【００４６】
前記魚類標準検体の種類は、特に制限されず、前述の魚類検体と同様に、組織、器官および細胞等があげられる。前記組織は、例えば、魚肉、ひれ、骨、鱗、卵、精子、内蔵、皮、歯、眼球等があげられる。前記検体は、例えば、これらの加工品でもよい。また、前記検体は、例えば、ホルマリン固定化検体でもよい。
【００４７】
前記増幅工程において、鋳型となるミトコンドリアＤＮＡは、例えば、従来公知の方法により調製でき、その方法は、何ら制限されない。
【００４８】
前記被検体に関する前記第１のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第１の標準ＤＮＡ断片長パターンとの比較、前記被検体に関する前記第２のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第２の標準ＤＮＡ断片長パターンとの比較について、その方法は、特に制限されない。前記比較は、例えば、前記泳動ゲルについて目視してもよいし、前記泳動ゲルの画像について比較してもよいし、前記泳動ゲルから求めた移動度により比較してもよい。
【００４９】
本発明においては、例えば、前記魚類標準検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、前記第１の標準断片長パターンおよび前記第２の標準断片長パターンを、予め準備しておくことが好ましい。具体的には、例えば、画像化して、画像として保存しておく、または、各断片の移動度を求めておくこと等が好ましい。これによって、例えば、前記第１および第２の標準断片長パターンを、被検体を識別する度に準備することが不要となる。この場合、例えば、前記被検体についての前記増幅工程、前記切断工程および前記検出工程を、前記標準検体と同じ条件で行うことが好ましい。前記被検体と前記標準検体とを同条件で処理することによって、例えば、識別の度に前記標準断片長パターンの検出が不要となり、かつ、識別の信頼性も十分に確保できる。
【００５０】
前記識別工程においては、前記被検体に関する前記第１のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第１の標準ＤＮＡ断片長パターンとが同一であり、且つ、前記被検体に関する前記第２のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第２の標準ＤＮＡ断片長パターンとが同一である場合に、前記被検体は、前記標準検体と同種であると識別できる。また、前記識別工程においては、前記被検体に関する前記第１のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第１の標準ＤＮＡ断片長パターン、および、前記被検体に関する前記第２のＤＮＡ断片長パターンと、前記標準検体に関する前記第２の標準ＤＮＡ断片長パターン、いずれか一方または両方が同一ではない場合、前記被検体は、前記標準検体と同種ではなく、異種の魚類であると識別できる。また、前述の表１Ａ〜１Ｃに示す被検体のいずれにも該当しない場合には、前記７２種類の魚類のいずれにも該当しない魚類であると識別できる。
【実施例】
【００５１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【００５２】
［実施例１］
（１）標準検体の調製
前記表１Ａ〜１Ｃに示す魚種が明らかな７２種類の魚肉から、商品名Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のプロトコルに従って、ＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡは、トリス−ＥＤＴＡバッファー（ＴＥ：ｐＨ８．０）に溶解した。これをＰＣＲの標準サンプルとした。
【００５３】
（２）ＰＣＲ
前記第１のＤＮＡ領域を増幅するためのプライマーセット１と、前記第２のＤＮＡ領域を増幅するためのプライマーセット２を準備した。下記リバースプライマーＲ１は、ＲがグアニンＧであるプライマーと、ＲがアデニンＡであるプライマーとを、モル比１：１で混合したものを使用した。下記フォワードプライマーＦ２は、ＹがチミンＴであるプライマーと、ＹがシトシンＣであるプライマーとを、モル比１：１で混合したものを使用した。
（プライマーセット１）
フォワードプライマーＦ１（配列番号１）
5’-CCCGTCTCTGTGGCAAAAGA-3’
リバースプライマーＲ１（配列番号４）
5’-GATTRCGCTACCTTCGCACG-3’
（プライマーセット２）
フォワードプライマーＦ２（配列番号２）
5’-CGTGCGAAGGTAGCGYAATC-3’
リバースプライマーＲ２（配列番号５）
5’-ACCTGGATTACTCCGGTCT-3'
【００５４】
前記プライマーセット１を含むＰＣＲ反応液１および前記プライマーセット２を含むＰＣＲ反応液２を調製し、ＰＣＲを行った。前記反応液１および前記反応液２は、まず、商品名ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績社製）０．５μｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ  フォワードプライマー０．５μｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ  リバースプライマー０．５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ５μｌ、滅菌水３３．５μｌのプレミックス溶液を調製し、さらに、前記サンプル５μｌを加えて、合計５０μｌとした。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒反応させた後、５７℃で２秒、７４℃で３０秒の反応を１サイクルとして、合計３５サイクル行った。
【００５５】
（３）制限酵素処理
ＰＣＲ反応後、前記ＰＣＲ反応液を、商品名ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、前記キットのＥＢ緩衝液５μｌに溶解した。そして、前記溶液について、ＵＶ吸収によりＤＮＡ濃度を測定し、５０ｎｇ／μｌの濃度に調整し、増幅ＤＮＡ溶液とした。前記増幅ＤＮＡ溶液のうち２μｌ（ＤＮＡ：１００ｎｇ）を制限酵素処理した。制限酵素処理は、ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIによるダブルダイジェストとし、その反応液における酵素量は、ＡｌｕＩ  １ｕｎｉｔおよびＨａｅIII  １ｕｎｉｔとし、反応温度３７℃、終夜反応とした。
【００５６】
（４）電気泳動処理
制限酵素処理後の反応液について、アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。前記ゲルは、商品名Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｐ（登録商標）Ａｃｅ  １０−２０％グラジエントゲル（１７ウェルゲル、和光純薬工業社製）を使用した。泳動液は、トリスグリシン緩衝液（０．２５ｍｏｌ／Ｌトリスヒドロキシアミノメタン、１．９２ｍｏｌ／Ｌグリシン、ｐＨ８．３）を使用した。泳動時の電流は、２０ｍＡ、泳動時間は、６０分とした。そして、泳動後の前記ゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色し、ＵＶライトを照射して、電気泳動パターンを写真により画像化した。
【００５７】
これらの結果の一部を、図４の写真に示す。図４は、前記標準検体に関する電気泳動写真であり、（Ａ）は、前記プライマーセット１を用いた結果であり、（Ｂ）は、前記プライマーセット２を用いた結果である。図４において、Ｍは、１００ｂｐラダーマーカーである。７２種類の標準検体のバンドパターンを比較した結果、全て異なるパターンを示していた。このことから、被検体が、いずれかの標準検体と同じバンドパターンを示した場合、いずれか一種類の標準検体のみと対応し、他の標準検体と重複することがないことが確認できた。なお、図４は、一部の結果を示すが、前記表１Ａ〜１Ｃに示す７２種類全ての魚類について、異なるバンドパターンが得られることを確認した。
【００５８】
（５）被検体の調製
魚種が未知である魚卵３６個を、それぞれ、１０％ホルマリンで固定し、ホルマリン固定化検体を調製した。前記ホルマリン固定化抗体を、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄してホルマリンを除去した後、さらに、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、前記標準検体と同様にして、ＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡは、共沈剤（商品名エタ沈メイト（ニッポンジーン製））を使用し、エタノール沈殿により濃縮を行った。これをＰＣＲの被検体サンプルとして使用した以外は、前記（２）、（３）および（４）と同様にして、ＰＣＲ、制限酵素処理および電気泳動を行った。
【００５９】
そして、前記プライマーセット１を用いた前記標準検体の電気泳動写真と前記被検体の電気泳動写真とについて、バンドパターンを比較し、前記プライマーセット２を用いた前記標準検体の電気泳動写真と前記被検体の電気泳動写真とについて、バンドパターンを比較した。その結果、前記被検体について、前記プライマーセット１を用いたバンドパターンおよび前記プライマーセット２を用いたバンドパターンが、完全に一致したものを、その標準検体と同種であると識別した。その結果、９個がチダイ、７個がホウボウ、１個がサワラ、６個がタチウオであると識別できた。
【００６０】
これらの結果の一部を、図５〜図８に示す。図５は、標準検体チダイおよび被検体１の電気泳動写真であり、図６が、標準検体ホウボウおよび被検体２の電気泳動写真であり、図７が、標準検体サワラおよび被検体３の電気泳動写真であり、図８が、標準検体タチウオおよび被検体４の電気泳動写真である。各図において、上側の２つのレーンが、プライマーセット１を用いた結果であり、下側の２つのレーンが、プライマーセット２を用いた結果である。各図に示すように、各被検体のバンドパターンは、それぞれ、プライマーセット１を用いた結果およびプライマーセット２を用いた結果のいずれについても、完全に標準検体のバンドパターンと一致していた。
【００６１】
［実施例２］
本実施例において、すでに外観から魚類が判別されている被検体について、本発明の方法による魚類の識別を行い、本発明の方法による判別の信頼性を確認した。
【００６２】
外観からタチウオと判断された魚個体について、その魚肉、皮、ひれ、眼球、内蔵（卵巣）およびホルマリン固定した内蔵（卵巣）を準備し、商品名Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のプロトコルに従って、ＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡは、トリス‐ＥＤＴＡバッファー（ＴＥ：ｐＨ８．０）に溶解した。これをＰＣＲの被検体サンプルとした。
【００６３】
そして、前記実施例１と同じ条件で、ＰＣＲ、制限酵素処理および電気泳動を行った。なお、電気泳動の際、前記実施例１において調製したタチウオの魚肉から得た標準検体を、共に泳動した。
【００６４】
これらの結果を、図９の写真に示す。図９は、前記実施例１におけるタチウオの標準検体と、前記外観からタチウオと判別した被検体の電気泳動写真であり、（Ａ）は、ＰＣＲにおいてプライマーセット１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＰＣＲにおいてプライマーセット２を用いた結果である。図９（Ａ）および（Ｂ）において、レーンＭは、マーカー、レーン１は、タチウオの標準検体（魚肉）、レーン２〜７は、タチウオの被検体であり、順番に、魚肉、皮、ひれ、眼球、内蔵（卵巣）、ホルマリンで固定した内蔵（卵巣）の結果である。
【００６５】
まず、図９（Ａ）および（Ｂ）のいずれにおいても、レーン１「タチウオの標準検体（魚肉）」と、レーン２「外観からタチウオと判別した被検体（魚肉）」とは、全く同じバンドパターンを示した。この結果から、本発明によれば、バンドパターンから確実に魚類を判別できることがわかり、本発明の信頼性を確認できた。また、図９（Ａ）のレーン２〜７、図９（Ｂ）のレーン２〜７は、それぞれ、全く同じバンドパターンを示した。この結果から、分析する魚の部位、ならびに、固定化検体か否かにかかわらず、識別が可能であることがわかった。特に、ホルマリンで固定化した検体についても同一のバンドパターンを示したことから、本発明は、検体の種類に影響されることなく、様々な検体に適用できるため、極めて有用な方法であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように、本発明の魚類の識別方法によれば、例えば、ホルマリン固定化検体であっても、正確な識別が可能である。また、本発明の魚類の識別方法によれば、例えば、２種類以上の魚類標準検体を設定可能である。このため、前記非特許文献１、３〜６に記載する方法では、特定の魚種か否かを識別するのみであったが、本発明によれば、例えば、前記魚類被検体を、２種類以上、具体例として前述の７２種類またはそれ以上の種類に分類することも可能である。このため、本発明は、例えば、前述のような魚類表示の確認、生体系への影響調査等、様々な分野において、有用である。
【要約】      （修正有）【課題】ホルマリン固定化検体等の検体の形態に関わらず、正確な識別が可能である、魚類の新たな識別方法を提供する。【解決手段】魚類被検体由来のミトコンドリアＤＮＡについて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における第１ＤＮＡ領域および第２ＤＮＡ領域を、それぞれ独立して増幅させる増幅工程、前記第１および前記第２のＤＮＡ領域の増幅物を、それぞれ独立して２種類の制限酵素で処理する切断工程、前記第１および前記第２のＤＮＡ領域の切断物について、それぞれ独立して、ＤＮＡ断片長のパターンを検出する検出工程、前記第１および第２のＤＮＡ領域のＤＮＡ断片長パターンと標準ＤＮＡ断片長パターンとを比較し、前記魚類被検体の魚種を識別する識別工程を実行する。【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005205525.tif 000015
【図９】
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【配列表】
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