(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させるための調製物であって、デフィブロチド、および造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１の造血因子を活性成分として含有し、前記造血因子が顆粒球コロニーの成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）である、前記調製物。
【請求項２】
水性溶液であることを特徴とする、請求項１記載の調製物。
【請求項３】
一方が造血前駆細胞を動員する能力を有する造血因子を含有し、他方がデフィブロチドを含有する、２つの異なる、別々に投与され得る調製物によって構成される、請求項１記載の調製物。
【請求項４】
哺乳類の末梢血中の幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させるために、同時に、別々にまたは逐次使用するための組み合わされた調製物として、デフィブロチド、および造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１の造血因子を含有する調製物であって、前記造血因子がＧ−ＣＳＦである、前記調製物。
【請求項５】
通常の賦形剤および／またはコアジュバントをさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の調製物。
【請求項６】
哺乳類の末梢血中の幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させることができる調製物の製造のために、デフィブロチドを、造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１の造血因子と組み合わせて使用する方法であって、前記造血因子がＧ−ＣＳＦである、前記方法。
【請求項７】
哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させるための調製物であって、デフィブロチド、および造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１の造血因子を含有し、静脈内に投与されるものであり、前記造血因子がＧ−ＣＳＦである、前記調製物。
【請求項８】
Ｇ−ＣＳＦが５〜２４μｇ／ｋｇの用量で投与され、デフィブロチドが５〜１５ｍｇ／ｋｇ／時の用量で投与されることを特徴とする、請求項７記載の調製物。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドが２〜７日間投与されることを特徴とする、請求項８記載の調製物。
【請求項１０】
哺乳類がヒトであることを特徴とする、請求項７記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および前駆細胞の量を増加させることができる新規調製物に関する。該調製物は、デフィブロチド（defibrotide）を、造血前駆細胞を動員（以下、可動化ともいう）する能力を有する少なくとも１の造血因子、好ましくはＧ−ＣＳＦと組み合わせて含むことを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】  哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および造血前駆細胞の増加された量を得ることの可能性は、長年、鋭意研究活動の主題であった。幹細胞および／または造血前駆細胞の有用性は実際、循環する造血前駆細胞の自己移植、循環する造血前駆細胞の同種移植などの分野、および循環する造血細胞の遺伝子治療のためのプログラムにおいて特に重要である。【０００３】  幹細胞および前駆細胞は、誕生後、ほとんど排他的に骨髄に位置しているが、にもかかわらず、それらは移動性を示す。すなわち、生理学的条件下では、骨髄の空洞を通って移動し、循環する。そのプロセスは、通常「可動化（mobilisation）」として知られ、種々の処理、例えばサイトカインおよび特に顆粒球コロニーの成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）の投与によって哺乳類において増幅され得る。「ホーミング（homing）」として知られる逆のプロセスは、例えば、造血細胞の移植後の照射された被移植体において生じる。しかし、可動化およびホーミングの機構はまだなおはっきりしない（C.F. Craddockら、「ＶＬＡ４インテグリンに対する抗体が、霊長類およびマウスにおいて長期にわたる再集団化（repopulating）細胞を可動化し、サイトカイン誘発される可動化を増大させる」, Blood, Vol.90, n.12, 1997, pp.4779-4788；F. Prosperら、「末梢血前駆細胞の可動化およびホーミングは、α４β１インテグリン発現および機能の可逆的下方調節に関係する」, J. Clin. Invest., Vol.101, n.11, 1998, pp.2456-2467；M. Vermeulenら、「マウスの造血幹および前駆細胞のホーミングおよび可動化における付着分子の役割」, Blood, Vol.92, n.3, 1998, pp.894-900）。【０００４】  Ｇ−ＣＳＦ（ＣＡＳ登録番号１４３０１１−２−７／Merck Index, 1996, 第4558頁）は、顆粒球の前駆細胞の増殖および分化に欠くことのできない造血成長因子である。それは、種々の細胞、例えば単球、線維芽細胞および内皮細胞による特異的な刺激に応答して通常産生される１８〜２２ｋＤａの糖蛋白である。用語「デフィブロチド」（ＣＡＳ登録番号８３７１２−６０−１）は通常、動物および／または植物組織からの抽出（米国特許第３，７７０，７２０号および米国特許第３，８９９，４８１号）によって得られるポリデオキシリボヌクレオチドを定義する。このポリデオキシリボヌクレオチドは通常、アルカリ金属、一般にはナトリウムの塩の形で使用される。デフィブロチドは、主として、その抗トロンビン活性（米国特許第３，８２９，５６７号）に関して使用されるが、異なる用途、例えば急性腎不全の治療（米国特許第４，６９４，１３４号）および急性心筋虚血の治療（米国特許第４，６９３，９９５号）においても使用され得る。【０００５】最後に、米国特許第４，９８５，５５２号および米国特許第５，２２３，６０９号は、デフィブロチドの製造法を記載している。該方法は、一定かつ十分定義された物理化学的特性を有し、かつ望ましくない副作用を何ら示さない物質を得ることを可能にする。【０００６】  本発明の目的のために、用語「デフィブロチド」は、したがって、動物および／または植物組織、特に哺乳類の臓器からの抽出によって得られるオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを意味するものとして理解されるべきである。好ましくは、デフィブロチドは、上記した特許��記載された方法にしたがって製造される。したがって、上記特許は、本明細書の一体としての部分とみなされるべきである。さらにより好ましくは、デフィブロチドは、米国特許第４，９８５，５５２号および米国特許第５，２２３，６０９号に記載された方法にしたがって製造される。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  驚いたことに、デフィブロチドを、造血前駆細胞を可動化する能力を有する造血因子と組み合わせておよび／または一時的に極めて接近させて投与することにより、幹細胞および造血前駆細胞の高められた可動化を得ることができることが今分かった。
【０００８】  実施例から分かるように、デフィブロチドを、造血前駆細胞を可動化する能力を有する造血因子と組み合わせておよび／または一時的に極めて接近させて投与することは、造血因子のみの投与によって得られ得るものよりもはるかに高い可動化レベルの獲得を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、したがって、哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させるための調製物であって、デフィブロチドを、造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１の造血因子、好ましくはＧ−ＣＳＦと組み合わせて、「活性剤」として含有する調製物によって表される。その好ましい実施態様では、この調製物は、注入可能な水性溶液によって構成される。あるいは、その調製物は、一方がデフィブロチドを含有し、他方が造血前駆細胞を動員する能力を有する造血因子を含有する２つの異なる溶液によって構成され得る。本発明に従う調製物は、したがって、哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させるために、上記の活性素を同時に、別々にまたは逐次使用するための組み合わされた調製物として形成される。
【００１０】  本発明の第二の目的は、哺乳類、好ましくはヒトの末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させることができる調製物の製造のために、デフィブロチドを、造血前駆細胞を可動化する能力を有する少なくとも１の造血因子と組み合わせて使用する方法によって表される。
【００１１】  最後に、本発明の更なる目的は、哺乳類の末梢血中の循環における幹細胞および／または造血前駆細胞の量を増加させる方法によって表され、該方法は、デフィブロチを、造血前駆細胞を可動化する能力を有する少なくとも１の造血因子と組み合わせてまたは一時的に接近させて哺乳類に投与することを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  本発明をもたらした実験を行うにあたって使用された造血因子は、Ｇ−ＣＳＦである。しかし、Ｇ−ＣＳＦ以外であるにもかかわらず造血前駆細胞を可動化する能力を有する造血因子、例えば顆粒球およびマクロファージコロニーの成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、「Ｆｌｔ３リガンド」（ＦＬ）、「幹細胞因子」（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、および当業者に明らかな他の造血因子によって同様の結果が得られ得ることは除外されるべきでない。
【００１３】  この最初の実験段階においてＧ−ＣＳＦと組み合わせて使用されたデフィブロチドは、Prociclideの商標でCrinos Spaによって現在市販され、そして米国特許第４，９８５，５５２号および米国特許第５，２２３，６０９号に記載の方法にしたがって製造されたデフィブロチドであった。
【００１４】  ２つの活性成分の投与方法に関しては、それは、本発明の目的のために限定的ではない。すなわち、デフィブロチド、および造血前駆細胞を可動化する能力を有する造血因子は、その技術分野において公知の方法および薬量学にしたがって哺乳類（および特にヒト）に投与され得る。一般には、経口、筋肉内、腹腔内、皮下または静脈内投与され、最後の方法が好ましい。
【００１５】  ２つの活性成分は、同時にまたは順次投与することもできる。すなわち、第一の場合では、両方の活性成分を含み、その技術分野において公知の通常の賦形剤および／またはコアジュバントが所望により添加されている単一の調製物によって２つの活性成分が投与される。あるいは、２つの活性成分が、順次、すなわち、一方が造血前駆細胞を可動化する能力を有する造血因子、好ましくはＧ−ＣＳＦを含み、他方がデフィブロチドを含む２つの異なる調製物によって投与され得る。
【００１６】  一般に、Ｇ−ＣＳＦは、５〜２４μｇ／ｋｇの用量で皮下投与され、ＤＥＦは５〜１５ｍｇ／ｋｇ／時の用量で２〜７日間、連続注入によって投与される。
【００１７】  純粋に本発明の非限定的例示としてみなされるべき添付の実施例から明らかなように、最も一般的な実験哺乳類モデルとしてのマウス、およびサルに、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドを一緒に投与すると、Ｇ−ＣＳＦのみの投与によって得られ得るよりもはるかに高い可動化レベルを得ることができるとともに、高いレベルの可動化が望ましい全ての治療分野のための明らかな利点を有する。
【実施例】
【００１８】実施例１
本実施例は、マウスの血液中に存在する白血球（ＷＢＣ）の量に対するＧ−ＣＳＦおよび／またはデフィブロチド（ＤＥＦ）の投与の効果を評価するために行われた。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２５ｇ体重）に、Ｇ−ＣＳＦ（５μｇ／マウス／日）、ＤＥＦ（１ｍｇ／マウス／日）、またはＧ−ＣＳＦ（５μｇ／マウス／日）と増加する用量のＤＥＦ（１、１０、１５ｍｇ／マウス／日）との組み合わせを腹腔内（ＩＰ）注入した。Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＤＥＦを投与しなかった対照マウスに、マウス血清アルブミンの塩類（saline）溶液（０．１％に緩衝化）（ＰＢＳ／ＭＳＡ）をＩＰ注入によって投与した。マウスを５日間処置し、処置の３または５日後、あるいは処理を中止して３日後に屠殺した。この実験の結果を図１に示す。マウスの各群を、以下の記号を使用して表した。Ｇ−ＣＳＦ（■）（ｎ＝２４）、ＤＥＦ１（○）（ｎ＝３）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＤＥＦ１（◆）（ｎ＝１３）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＤＥＦ１０（▲）（ｎ＝６）、Ｇ−ＣＳＦ＋ＤＥＦ１５（●）（ｎ＝２３）。対照マウスのＰＢＳ／ＭＳＡ中の平均白血球数は２．８７±０．２ｘ１０6／ｍｌ血液であった。データを、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。【００１９】実施例２
実施例１のマウスの血液１ｍｌに対する、全コロニーを形成する細胞（ＣＦＣ）の可動化動力学。対照マウスのＰＢＳ／ＭＳＡ中の平均ＣＦＣ数は３９±１２／ｍｌ血液であった。データを図２に示し、各時点での各動物のサンプルに関して２つの培養物から誘導された平均±ＳＥＭとして表す。【００２０】実施例３
実施例１で言及したマウスの末梢血の１０5バッフィコート細胞に対する全ＣＦＣ（ＣＦＵ−ＧＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘ＋ＨＰＰ−ＣＦＣ）の頻度における変化。対照マウスのＰＢＳ／ＭＳＡ中の平均ＣＦＣ数は３．５±１であった。データを図３に示し、各時点での各動物のサンプルに関して２つの培養物から誘導された平均±ＳＥＭとして表す。【００２１】実施例４
実施例１のマウスの５日間処置した後の血液１ｍｌに対する全ＣＦＣ（ＣＦＵ−ＧＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘ＋ＨＰＰ−ＣＦＣ）。データを図４に示し、各動物のサンプルに関して２つの培養物から誘導された平均±ＳＥＭとして表す。【００２２】実施例５
実施例１で言及したマウスの末梢血の１０5バッフィコート細胞に対する全ＣＦＣ（ＣＦＵ−ＧＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘ＋ＨＰＰ−ＣＦＣ）の頻度。データを図５に示し、各動物のサンプルに関して２つの培養物から誘導された平均±ＳＥＭとして表す。【００２３】実施例６
本実験は、サルの末梢血中の循環における造血前駆細胞／幹細胞（高増殖潜在能−コロニー刺激細胞、すなわちＨＰＰ−ＣＦＣ）の量に対するＧ−ＣＳＦおよび／またはＤＥＦの投与の効果を評価するために行われた。研究は、健康な４〜６歳の、血液学および臨床化学に関して正常な値を示したアカゲザルにおいて行われた。Ｇ−ＣＳＦは、２サイクルに関して、１００μｇ／ｋｇで５日間皮下投与された。ＤＥＦは、第２サイクルの５日間に連続注入系によって１５ｍｇ／ｋｇ／時で投与された。出血、Ｇ−ＣＳＦの投与および薬物バッグの取替えのために動物を麻酔した。この実験の結果を図６に示す。これから明らかなように、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドを組み合わせた投与は、サルにおいて、Ｇ−ＣＳＦのみの投与によって得られ得るよりも約８倍高いＨＰＰ−ＣＦＣ可動化を可能にする。【００２４】結論
図１に示すデータから容易に明らかであるように、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドを組み合わせた投与は、マウス血液中の循環における白血球の量において実質的な増加を生じる。特に記すべきことは、デフィブロチドのみの投与は、循環における白血球の量に対して正の影響を有しないということである。従って、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドの組み合わせは、白血球の数の増加の、用量に依存する驚くべき効果を生じる。この効果は、互いに独立した２つの効果の単なる和ではない。【００２５】  図２〜５は、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドを組み合わせた投与によって、Ｇ−ＣＳＦのみの投与によって得られ得るよりも１０〜１００倍高い可動化レベルがマウスにおいて得られ得ることを明らかに示す。最後に、図６は、Ｇ−ＣＳＦおよびデフィブロチドを組み合わせた投与によって、Ｇ−ＣＳＦのみの投与によって得られ得るよりも約８倍高い幹細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）可動化がサルにおいて可能であることを確証する。２つの活性成分を組み合わせた効果は、用量に依存する。なぜならば、可動化のレベルが、投与されたデフィブロチドの量に比例して増加するからである。最も高い可動化ピークは、全ての場合において、投与の約第５日目に達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】  図１は、マウスの血液に存在する白血球（ＷＢＣ）の量に対するＧ−ＣＳＦおよび／またはデフィブロチド（ＤＥＦ）の投与の効果を示すグラフである。
【図２】  図２は、マウスの血液１ｍｌに対する、全コロニーを形成する細胞（ＣＦＣ）の可動化動力学を示すグラフである。
【図３】  図３は、マウスの末梢血の１０5バッフィコート細胞に対する全ＣＦＣの頻度における変化を示すグラフである。
【図４】  図４は、マウスの５日間処置した後の血液１ｍｌに対する全ＣＦＣレベルを示すグラフである。
【図５】  図５は、マウスの末梢血の１０5バッフィコート細胞に対する全ＣＦＣの頻度を示すグラフである。
【図６】  図６は、サルの末梢血中の循環における造血前駆細胞／幹細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）の量に対するＧ−ＣＳＦおよび／またはＤＥＦの投与の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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