(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈波伝播速度の降下剤であって、
ジペプチドとして、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒのジペプチドを含むことを特徴とする脈波伝播速度降下剤。
【請求項２】
米タンパク質または米原料醸造物由来タンパク質をタンパク質分解酵素で処理した処理物を含み、前記処理物が前記ジペプチドを含む、請求項１記載の脈波伝播速度降下剤。
【請求項３】
前記米原料醸造物が酒粕である、請求項２記載の脈波伝播速度降下剤。
【請求項４】
動脈硬化を治療するための動脈硬化治療剤であって、
請求項１から３のいずれか一項に記載の脈波伝播速度降下剤を含むことを特徴とする動脈硬化治療剤。
【請求項５】
動脈硬化を予防するための動脈硬化予防剤であって、
請求項１から３のいずれか一項に記載の脈波伝播速度降下剤を含むことを特徴とする動脈硬化予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈波伝播速度降下剤およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化とは、動脈が肥厚し硬化した状態をいい、一般に、血管の硬化を示す脈波伝播速度（pluse  wave  velosity：ＰＷＶ）が指標とされている。動脈硬化症は、様々な疾患を引き起こす原因となることが知られており、例えば、狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患、脳卒中、脳梗塞、脳血栓、脳出血、クモ膜下出血等の脳血管障害等との関連性が報告されている。特に、心筋に酸素を供給する役割を果たす冠動脈に動脈硬化が生じると、狭窄や閉塞が生じ、狭心症や心筋梗塞等の心血疾患を引き起こす原因となる。これらの疾患を早期に防止するためにも、動脈硬化の治療または予防は、医療において非常に重要視されている。
【０００３】
他方、医薬品には、一般的に、自然界には存在しない、人為的に設計された有機化合物が多く存在する（特許文献１参照）。しかしながら、副作用等の問題から、人体に対する安全性に優れた医薬品の提供が求められている（特許文献２および特許文献３参照）。
【特許文献１】特開2004-51639号公報
【特許文献２】特開2007-31364号公報
【特許文献３】特開2007-320956号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、動脈硬化の治療や予防に使用できる、安全性に優れる新たな薬剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の脈波伝播速度降下剤（以下、「ＰＷＶ降下剤」という）は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒからなる群から選択された少なくとも一つのジペプチドを含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明の動脈硬化治療剤または本発明の動脈硬化予防剤は、本発明のＰＷＶ降下剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒの４種類のうち少なくとも１種類のジペプチドによれば、動脈硬化の指標であるＰＷＶを降下できることを見出し、本発明に到った。このようなジペプチドを含む本発明のＰＷＶ降下剤によれば、例えば、上昇したＰＷＶを降下させたり、ＰＷＶの上昇を抑制できるため、動脈硬化の予防剤や治療剤として極めて有用である。また、本発明におけるジペプチドは、天然にも存在し、例えば、本発明者らによって、酒粕等に含まれていることが確認されている。そして、酒粕は、わが国において長年に亘り食歴があることからも、前述の各種ジペプチドの安全性は、十分に証明されているといえる。したがって、本発明のＰＷＶ降下剤や動脈硬化治療剤および予防剤は、安全に優れた薬剤として有用である。なお、本発明におけるジペプチドは、後述するように、酒粕由来のものには何ら制限されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のＰＷＶ降下剤は、前述のように、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒからなる群から選択された少なくとも一つのジペプチドを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のＰＷＶ降下剤は、前述のジペプチドを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明ＰＷＶ降下剤に含まれるジペプチドは、例えば、４種類のうちいずれか１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。また、その組み合わせも、何ら制限されない。
【００１０】
本発明におけるジペプチドは、例えば、後述するように天然物、その加工品、または、その醸造物等の原料から調製してもよいし、従来公知の合成方法によって合成してもよい。前記合成方法としては、例えば、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成方法や、有機化学的手法によるペプチド合成方法、遺伝子工学的手法による合成方法等があげられる。
【００１１】
前記原料からの調製方法としては、例えば、原料自体や前記原料の分解物からの精製等があげられる。前記原料の分解方法としては、特に制限されないが、例えば、酸、アルカリまたは酵素等により行うことができる。また、前記精製方法としては、例えば、吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶媒に対する溶解性の差、分子篩効果による溶出速度の差等を利用した、従来公知の分離精製方法が採用できる。また、適宜、抽出や濃縮を組み合わせることもできる。
【００１２】
前記原料としては、特に制限されず、例えば、米・豆等の穀類、肉類、海藻類、乳類等、これらの加工品や醸造物があげられる。米の加工品としては、例えば、もち、しん粉、白玉粉、みじん粉、道明寺粉、ビーフン、米麹、α米、これらをさらに加工したせんべい、ポン菓子等もあげられる。また、米原料の醸造物としては、例えば、酒、味りん、味噌、醤油等、または、これらの製造過程で発生する糠や粕等の副産物等があげられる。中でも、清酒の副産物である酒粕が好ましく、例えば、一般の酒粕や、液化酒粕等があげられる。前記液化酒粕とは、例えば、液化酵素で液化した原料米をアルコール発酵することによって製造する清酒製造において生成する酒粕である（今安  聰ら：日本農芸化学会誌、第６３号、第９７１頁、１９８９年、特開昭５９−６６８７５号）。具体例として、このような米や米加工品由来の米タンパク質、または、米原料醸造物由来のタンパク質を、タンパク質分解酵素で処理することによって、前述のジペプチドを含む処理物を得ることができる。得られた処理物は、例えば、前記ジペプチドを含む組成物として、そのまま脈波伝播速度降下剤に使用してもよいし、さらに、前記組成物から前記ジペプチドを精製して、脈波伝播速度降下剤に使用することもできる。
【００１３】
以下に、酒粕から前述のジペプチドを調製する方法の一例を示す。なお、本発明は、これには何ら制限されない。
【００１４】
まず、酒粕を煮沸処理する。煮沸処理の時間は、処理する酒粕の量に応じて適宜決定できるが、通常、５〜１５分である。
【００１５】
つぎに、煮沸処理後の酒粕を遠心分離して液体画分を除去し、得られた固体画分をタンパク質分解酵素で処理する。酵素処理は、通常、溶媒中で行われ、前記溶媒としては、例えば、水や緩衝液等があげられる。
【００１６】
タンパク質分解酵素の種類は、特に制限されないが、例えば、プロテアーゼＮアマノ（天野エンザイム株式会社；力価１５０，０００Ｕ／ｇ以上）、スミチームＡＰ（新日本化学工業株式会社;力価５０，０００Ｕ／ｇ以上）等が使用できる。これらの酵素は、１種類でもよいし、２種類以上を使用してもよい。また、複数の酵素を使用する場合、その処理順序も特に制限されず、同時に複数の酵素により処理を行ってもよいし、各酵素をそれぞれ別個に用いて処理を行ってもよい。処理温度は、例えば、使用するタンパク質分解酵素の種類に応じて適宜決定できるが、通常、４０〜６０℃であり、好ましくは５０〜６０℃である。また、処理時間は、例えば、処理する前記固体画分の量等に応じて適宜決定できるが、通常、５〜２０時間である。タンパク質分解酵素の添加量は、例えば、使用した酒粕の量等に応じて適宜決定できるが、例えば、酒粕重量に対して０．１〜１重量％が好ましく、より好ましくは０．３〜０．６重量％である。
【００１７】
そして、前記固体画分を酵素処理した後、遠心分離して液体画分を回収する。この液体画分には、前述のＶａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒが含有されている。本発明においては、前述のように、これらのジペプチドを含む液体画分をそのまま、または、濃縮もしくは粉末化して、本発明のＰＷＶ降下剤に使用してもよいし、さらに、前記ジペプチドの含有画分を精製して使用してもよい。精製は、例えば、前記液体画分を、さらに各種クロマトグラフィーに供することによって行える。前記クロマトグラフィーとしては、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）等のイオン交換クロマトグラフィー；セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）等のゲル濾過；ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＣＫ１８（資生堂製）、ＣｏｓｍｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）等の高速液体クロマトグラフィー等、従来公知のものが採用できる。
【００１８】
本発明のＰＷＶ降下剤は、前述のジペプチドを有効成分として含んでいればよいが、さらに、例えば、薬学的に許容可能な添加物等を含んでいても良い。前記添加物としては、例えば、後述する剤形に応じて、賦形剤、ｐＨ調整剤、保存剤、等張剤等が選択できる。
【００１９】
また、本発明のＰＷＶ降下剤は、前記ジペプチドとして、前記ジペプチドの精製品を含んでもよいし、例えば、ジペプチドを含有する、米タンパク質や米原料醸造物由来タンパク質のタンパク質分解酵素処理物を含んでもよい。本発明のＰＷＶ降下剤における前記ジペプチドの含有量（ジペプチドの総量）は、特に制限されないが、例えば、一日の摂取量が、０．１〜１．０ｍｇとなるように設定されていることが好ましく、より好ましくは０．３〜０．７ｍｇである。
【００２０】
本発明ＰＷＶ降下剤の形態は、特に制限されず、例えば、溶液状、固形状、粉末状、溶媒に分散させた状態であってもよい。具体的な剤形としては、例えば、投与方法に応じて、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）、注射剤等があげられる。これらの各剤形に応じて、例えば、適した添加剤や基材等を使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従って製造できる。
【００２１】
本発明の動脈硬化治療剤または本発明の動脈硬化予防剤は、前述のように、本発明のＰＷＶ降下剤を含むことを特徴とする。本発明の動脈硬化治療剤および動脈硬化予防剤は、本発明のＰＷＶ降下剤を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。なお、その形態等については、前述と同様である。
【００２２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。
【実施例１】
【００２３】
（ペプチド画分の調製）
以下の製造方法により、酒粕から、前述のジペプチドを含有するペプチド画分を調製した。まず、酒粕６０ｇ（固形分５８．４％）を１０分間沸騰させた後、１２０００ｒｐｍ、１５分間の条件下で遠心分離した。得られた沈殿物４２ｇを１８０ｍｌの水に分散させ、この分散液にプロテアーゼＮアマノ（商品名、天野エンザイム株式会社製）２１０ｍｇを添加して、５０℃で６時間処理した。続いて、前記分散液に、さらにスミチームＡＰ（商品名、新日本化学工業株式会社製）２５０ｍｇを添加して、６０℃で１６時間処理した。得られた酵素処理液を、１２０００ｒｐｍ、１５分間の条件下で遠心分離し、得られた上清を、孔径０．４５μｍおよび０．２２μｍのメンブレンフィルター（東洋濾紙株式会社製）を用いてろ過した。ろ液を凍結乾燥し、得られた粉末をペプチド画分とした。
【００２４】
前記ペプチド画分に含まれる４種類のジペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に、その結果を下記表１に示す。なお、下記表１において、総ペプチド量とは、前記４種類のジペプチド（Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ）を含む分子量３，０００以下のペプチドの総量である。
【００２５】
標準ピーク面積の測定
（１）ペプチド標準液の調製
各種ペプチド（Ｖａｌ−Ｔｙｒ；シグマ社製、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ；国産化学社製）をそれぞれ１０ｍｇ量り取り、水または塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、１ｍＬに定容した。各種ジペプチドを含有する４種類の溶液を、ペプチド標準溶液とした。
（２）内部標準液（ＩＳ）の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（シグマ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍＬで完全に溶解させ、内部標準液とした。
（３）標準液の調製
前記各種ペプチド標準液と前記内部標準液とを、各種ジペプチドがそれぞれ０．０１ｍｇ／ｍｌ、前記内部標準物質が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合した。この４種類の混合液を標準液とした。
（４）ピーク面積の測定
前記４種類の標準液について、それぞれ下記条件でＬＣ／ＭＳ分析を行い、各ジペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters  Alliance  2695-2996-ZQ4000
(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器、Waters社製)
カラム：Imtakt  UK-C18  75×4.6mm（Imtakt社製）
移動相：Ａ液：０．０５％  ＨＣＯＯＨ／水
Ｂ液：アセトニトリル（０−２５％／０−７．５分、１００％／７．５−８．５分）
注入量：１０μＬ
流速：１ｍＬ/分
カラム温度：３５℃
検出条件：ＵＶ１９０−３００ｎｍ
ＭＳ  エレクトロスプレーイオン（ESI）法  positive  ＳＩＲモード
【００２６】
ペプチド画分の測定
得られた前記ペプチド画分１０ｍｇを純水1ｍＬに溶解し、ペプチド画分液を調製した。前記ペプチド画分液と前記内部標準液とを、ペプチド画分粉末が０．００２ｇ／ｍｌ、内部標準物質が０．１ｍｇ／ｍＬとなるように混合して、試料液を調製した。この試料液について、前記標準液と同様にしてＬＣ／ＭＳ分析を行い、各ジペプチドのＭＳピーク面積を測定した。そして、得られた各ジペプチドのＭＳピーク面積より、下記式にしたがって、前記ペプチド画分における各ジペプチドの含有量を算出した。
ペプチド画分のジペプチド含有量（ｍｇ/g）＝Ａ×｛（Ｂ／Ｃ）／（Ｄ／Ｅ）｝／Ｆ
Ａ：標準液のジペプチド濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｂ：試料液のジペプチドピーク面積
Ｃ：試料液のＩＳピーク面積
Ｄ：標準液のジペプチドピーク面積
Ｅ：標準液のＩＳピーク面積
Ｆ：試料液のペプチド画分濃度（ｇ／ｍｌ）
【００２７】
【表１】
0005305666.tif 000002
【００２８】
（ＰＷＶ測定）
前記ペプチド画分を含有するカプセル状のＰＷＶ降下剤を調製して、被検者に経口投与し、経時的なＰＷＶの変移を確認した。なお、試験は、プラセボを用いた一重盲検査比較試験とした。
【００２９】
ＰＷＶ降下剤は、１日の投与量が前記総ペプチド量６００ｍｇとなるように設定した。具体的には、前記ペプチド画分１０００ｍｇ（総ペプチド量６００ｍｇ）を茶透明のハードカプセル６カプセルに分注して、１日分のＰＷＶ降下剤とした。他方、前記ペプチド画分に代えて、デキストリンと色素との配合物を、重量および外観が前記ＰＷＶ降下剤と見分けがつかないように、同様の茶透明のハードカプセルに分注して、プラセボを調製した。なお、同様に６カプセルを１日分のプラセボとした。
【００３０】
被験者は、株式会社ファンケルおよび民間ボランティア募集機関において募集した有償ボランティアの成人男女３８名とした。なお、これらの被検者には、二次性高血圧症、降圧薬の服用患者、医師により糖尿病の診断を受けている者、妊娠・授乳中の者、その他重度の疾患を抱えている者は含まれていない。
【００３１】
前記被検者を、ランダム割付表を用いて無作為に２群に分けた。一方の群１９名（男性１１名、女性８名）には前記ＰＷＶ降下剤を投与し（以下、「ＰＷＶ降下剤群」という）、他方の群１９名（男性１０名、女性９名)には前記プラセボを投与した（以下、「プラセボ群」という）。前記ＰＷＶ降下剤群および前記プラセボ群には、それぞれ１日１回夕食後に６カプセルを１２週間毎日投与した。
【００３２】
ＰＷＶ測定は、投与開始０週、４週、８週、１２週の計４回実施した。前記測定の時間帯は、午前９時から午前１１時の間とし、朝食を食べていない空腹状態の被験者を、座った状態で１０分以上安静にさせた後、血圧脈波検査装置（商品名ｆｏｒｍ  ＰＷＶ/ＡＢＩ、型番ＢＰ−２０３ＲＰＥ  ＩＩ、オムロンコーリン社)を用いて行った。
【００３３】
測定結果を下記表２に示す。各投与期間における測定値は、平均値±標準偏差（Ａｖｅ±ＳＤ）で示した。
【００３４】
さらに、ＰＷＶ降下剤群およびプラセボ群のそれぞれについて、投与前（０週）のＰＷＶ値と、各投与期間（投与開始４週、８週および１２週）のＰＷＶ値とについて、対応のあるｔ−検定を行い、各投与期間の比較を行った。なお、前記検定の有意水準は、両側５％とした。
【００３５】
【表２】
0005305666.tif 000003
【００３６】
前記表に示すように、ＰＷＶ降下剤群では、投与期間に経過に伴って、ＰＷＶ値が減少した。特に、投与開始後１２週において、投与開始前（０週）と比較して、ＰＷＶ値の有意な低下が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上のように、本発明のＰＷＶ降下剤によれば、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＴｒｐおよびＩｌｅ−Ｔｙｒの４種類のうち少なくとも１種類のジペプチドを含むことによって、動脈硬化の指標であるＰＷＶを降下できる。このため、本発明のＰＷＶ降下剤は、例えば、動脈硬化の予防剤や治療剤としても極めて有用である。