(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの小腸上皮由来の腸管上皮（MIE）細胞株を培養細胞として用いてインビトロでクリプトスポリジウムの感染性を評価する方法。
【請求項２】
クリプトスポリジウムのオーシストを使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞株として、ＭＩＥ株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４９７）を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
オーシストをショ糖浮遊法、及び、塩化セシウム又は臭化セシウム密度勾配法による精製により得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞株の培養培地としてＤＭＥＭを使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
原虫を培養細胞に感染させた後、２０〜２５時間後に原虫感染性を評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗スポロゾイト抗体を用いる蛍光免疫染色により原虫感染性を評価する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス腸管（ＭＩＥ）細胞を用いる原虫感染評価方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
原虫とは、一般に真核単細胞の微生物であり、寄生性で、特に病原性があるものを意味する。先進諸国では衛生状態が改善され原虫による病気は過去のものとされているが、近年、日本国内においても水道水中からこのような原虫の代表的な例であるクリプトスポリジウムが発見されることがある。
【０００３】
クリプトスポリジウム（Cryptosporidium spp.）は、胞子虫類に属する病原性の原虫のひとつである。特にクリプトスポリジウムパルバム (Cryptosporidium parvum) は病原性が高い。上水道の残留塩素などによる消毒ではオーシストを死滅させることができないため、先進諸国でもしばしば集団感染が報告される。
【０００４】
環境中では4〜6μmの大きさのオーシストを呈しており増殖することはないが、ひとたびヒト、イヌ、ネコ、等の哺乳類の体内に取り込まれると、消化器系、特に小腸に寄生して増殖する。糞便中に含まれるオーシストはヒトの場合10億個/日、大型の家畜においては100億個/日に達するといわれている。水源等が汚染され、しばしば飲料水や水道水に混入して集団的な下痢症状を発生させることがある。下痢は水様便を呈し、3l/日、回数にして数十回/日に達する。現在、特効薬は無いが、1-2週間程度で免疫ができて自然治癒するが、ＡＩＤＳ患者等では、これが原因で死に至る事もある。
【０００５】
クリプトスポリジウムのオーシスト（接合子嚢）は、代謝活性はあるものの、脱殻や感染に適している環境にあるという生化学的なシグナルを受け取るまでは、生物学的な活性が無いように見える。そのため、オーシストが生存しているか、感染性を持っているかを判別することは非常に重要である。たとえ無傷で代謝活性があるオーシストであっても感染性を持たなければ危険性はないため、公衆衛生上重要である、クリプトスポリジウムオーシストの感染性を正確、迅速、且つ、簡単に評価・確認できる手法が求められている。
【０００６】
クリプトスポリジウムのオーシストは形態だけでは感染性を判定できないことから、様々な判定方法により生存性または感染性の評価がされている。その評価方法の代表的なものとして、形態又は顕微鏡識別、in vitroでの脱殻法（Call, JL.,  Arrowood, M., Xie, LT., Hancock, K., and Tsang VC. (2001). Immunoassay for viable Cryptosporidium parvum oocysts in turbid environmental water samples. J. Parasitol., 87(1), 203-210）、生体染色法（Campbell, AT., Robertson, LJ., and Smith, HV. (1992). Viability of Cryptosporidium parvum oocysts: correlation of in vitro excystation with inclusion or exclusion of fluorogenic vital dyes. Appl. Environ. Microbiol., 58, 3488-3493）、蛍光in situ ハイブリダイゼーション、マウスなどの実験動物を用いた動物感染法（Neumann, NF., Gyurek, LL., Gammie, L., Finch, GR., and Belosevic., M. (2000). Comparison of animal infectivity and nucleic acid staining for assessment of Cryptosporidium parvum   viability in water. Appl. Environ. Microbiol., 66(1), 406-412.  Neumann et al, 2000）、培養細胞を用いた培養細胞感染法（Slifko, TR., Friedman, D., Rose, JB., and Jakubowski, W. (1997). An in vitro method for detecting infectious Cryptosporidium oocysts with cell culture. Appl. Environ.  Microbiol., 63(9), 3669-3675）、mRNAの検出による生死判定（Jenkins, M., Trout, JM., Higgins, J., Dorsch, M., Veal, D., and Fayer, R. (2003). Comparison of tests for viable and infectious Cryptosporidium parvum oocysts. Parasitol. Res., 89(1), 1-5）などである。
【０００７】
これらの中でも、オーシストの感染性を評価することのできる、動物感染法と培養細胞感染法は信頼性があるとされている。特に動物感染法が最も信頼でき、‘ゴールドスタンダード’と言われているが、感染実験に対応できる動物実験施設が必要なこと、結果が出るまで日数がかかること、労働集約的であること、動物倫理上の問題などの欠点がある。それらの欠点を補うのが培養細胞を用いた感染性評価である。
【０００８】
クリプトスポリジウムのin vitro培養は、C. parvumが胎児肺細胞やMDCK（Madin-Darby canine kidney）細胞において初めて培養されて以来（Rosales et al, 1993およびCurrent et al, 1984）、現在では様々な細胞を用いてin vitro培養が行われている。また、HCT-8(ヒトアデノカルシノーマ)細胞やMDBK(ウシ腎) 細胞等の細胞株においては、life cycleの全ステージを経てオーシストを形成することが総説に記載されている(Arrowood, 2002)。
【０００９】
しかし、このような従来の培養細胞感染法では、バクテリアや夾雑物の混入を防ぎ細胞への感染効率を高めるために、細胞へ接種する前にオーシストを次亜塩素酸ナトリウム溶液処理、またはタウロコール酸やトリプシンによる脱殻処理を行い、より増殖ステージ数を増加させて計数しやすくするために最も増殖ステージ数が多くなる４８時間の培養を行うのが一般的である。しかしそれらの脱殻処理は、不活化処理能を評価するような、もともとダメージを受けている可能性のあるオーシストを用いる場合は、さらにオーシストにダメージを与えてしまう恐れがある。
【００１０】
更に、HCT-8細胞を使用いてin vitroにおいて効率良くC. parvumを培養するためには、培地成分・pH、及び培養時間等の多くの条件を設定しなければならないということも報告されている(Upton and Tilley, 1994)。
【００１１】
【非特許文献１】Rosales, MJ., Cifuentes, J., and Mascaro, C. (1993). Cryptosporidiiim parvum: culture in   MDCK cells. Exp. Parasitol., 76, 209-212.
【非特許文献２】Current, WL and Haynes, TB. (1984). Complete development of Cryptosporidium in cell culture. Science, 224(29), 603-605.
【非特許文献３】Arrowood, MJ. (2002). In Vitro Cultivation of Cryptosporidium Species. Clin. Microbiol. Rev.,  15(3), 390-400.
【非特許文献４】Upton, SJ. (1997). In Vitro Cultivation. In: Cryptosporidium and Cryptosporidiosis, R. Fayer (ed.), CRC Press, Boca Raton, Boston, London, New York, Washinton, D.C., pp. 181-207.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記のような従来の原虫の感染性の評価方法における問題点を解決し、特に、クリプトスポリジウムのオーシストの感染性を迅速且つ容易に評価できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、マウスの小腸上皮由来の腸管上皮（MIE）細胞株を原虫の感染性評価における培養細胞として使用することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明は以下の態様に係るものである。
［態様１］マウス腸管細胞を培養細胞として用いてインビトロで原虫感染性を評価する方法。
［態様２］原虫がクリプトスポリジウムである態様１記載の方法。
［態様３］クリプトスポリジウムのオーシストを使用する、態様１又は２記載の方法。
［態様４］マウス腸管細胞として、ＭＩＥ株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４９７）を用いる、態様１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［態様５］オーシストをショ糖浮遊法、及び、塩化セシウム又は臭化セシウム密度勾配法による精製により得る、態様１〜４のいずれか一項に記載の方法。
［態様６］マウス腸管細胞の培養培地としてＤＭＥＭを使用する、態様１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［態様７］原虫を培養細胞に感染させた後、２０〜２５時間後に原虫感染性を評価する、態様１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［態様８］抗スポロゾイト抗体を用いる蛍光免疫染色により原虫感染性を評価する、態様１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によって、従来の培養細胞感染法に比べより短時間の培養時間で、簡便で迅速にC. parvumに代表される原虫の感染性を評価できることが出来る。特に、より生体内の細胞に近い性質を有するマウス腸管細胞を培養細胞として使用することによって、従来の細胞培養系では必要とされた原虫の脱殻という煩雑な処理が不要となり、更に、生体内に近い条件で、特に一次スクリーニング系として信頼度の高い感染性評価をすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、マウス腸管細胞を培養細胞として用いてインビトロで原虫感染性を評価する方法に係る。既に記載したように、原虫とは、一般に、真核単細胞の微生物であり、寄生性で、特に病原性がある真核単細胞の微生物を意味し、代表的なものとしては、マラリア及びクリプトスポリジウム等を挙げることができる。
【００１７】
特に、クリプトスポリジウムは、世界各地で人やさまざまな種類の動物に広く感染を起こし、クリプトスポリジウム症は、衛生状態の良くない開発途上地域に住む子供がよく起こす下痢の原因になっている。
【００１８】
クリプトスポリジウムの生活環は以下の通りである。糞便に混じって体外に排出された長円形のオーシストは内部に未成熟のスポロントを含み、これが成熟して2個のスポロブラスト、ついでスポロシストとなる。最終的にスポロゾイドと呼ばれる胞子が形成され、オーシストは感染性を持つようになる。この段階のオーシストがヒトの体内に入ると、三日月型のスポロゾイドがオーシストから放出され小腸の微絨毛内に進入する。ここで円形の栄養体に成長し、核分裂を起こし8個のメロゾイドとなる。放出されたメロゾイドは他の微絨毛に感染し、無性生殖の環が形成される。一方、一部のメロゾイドは大配偶子母細胞（雌性）と小配偶子母細胞（雄性）を形成し有性生殖が起こる。小配偶子母細胞が16個のミクロガメートを放出し、これが大配偶子母細胞に到達すると接合子としてオーシストが形成される。
【００１９】
従って、オーシストの段階にある原虫の感染性を評価することが特に重要である。
【００２０】
本発明の特徴の一つは、培養細胞による感染性評価方法において、マウス腸管（ＭＩＥ）細胞を使用することである。このＭＩＥ細胞は、スポロゾイトの侵入に重要であるとされる微絨毛を形成す、培養方法によってはＭ細胞及び上皮細胞への分化にも誘導できるというユニークな細胞でもある。本発明者によって、小腸上皮細胞を宿主とするC. parvumはマウス腸管上皮（MIE）細胞に高効率で侵入し増殖すること、及び、マウス由来の細胞であるためマウス感染法とより近い結果が得られることが見出された。又、この細胞を使用することによって、従来の細胞培養系では必要とされた原虫の脱殻という煩雑な処理が不要となる。
【００２１】
このマウス腸管細胞の一例として、東北大学大学院農学研究科・農学部応用生命科学講座 動物機能科学講座機能形態学研究室より譲渡され、茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成２０年２月１日付けで寄託されている、ＭＩＥ（Murine Intestinal Epitheliocyte）株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４９７）を挙げることができる。当業者に公知の他の任意の方法・手段で調製したマウス腸管細胞を用いることも可能である。
【００２２】
本発明方法において、原虫を含む又は原虫を含む可能性のある検体試料から感染の妨げとなる夾雑物又はバクテリアを除去等するために、原虫を培養細胞に感染させる前処理として、当業者に公知の任意の方法、例えば、ショ糖浮遊法、及び、塩化セシウム又は臭化セシウム密度勾配法によりオーシストを精製して使用することが好ましい。又、上記検体試料は、原虫感染性を評価する目的等に応じて、飲料水、水道水、並びに食物等の飲食に供するもの、又は、環境中のその他の任意の場所から採取することが可能である。
【００２３】
又、マウス腸管細胞の培養に用いる培地として特に制限はないが、迅速且つ高感度の評価を行うにはダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）が好適な培地の一例である。通常、１０％程度のウシ胎児血清（FBS）が含有させることが好ましい。その他、当業者に公知のビタミン類、ペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質、グルコース等の糖類、HEPES等の緩衝液、及びインスリン等の培地補助成分を適宜含有させることが出来る。
【００２４】
原虫の感染性は、原虫を培養細胞に感染させた後、適当な時間、例えば、２０〜２５時間の経過後に評価する。尚、原虫による感染前及び感染後のマウス腸管細胞の培養に関するその他の条件（例えば、培養装置、培養温度、雰囲気等）は、当業者が適宜選択して設定することが出来る。
【００２５】
原虫の感染性（増殖ステージ）の評価は、走査型電子顕微鏡、微分干渉顕微鏡、及び蛍光免疫染色等の当業者に公知の任意の方法・手段を用いた増殖ステージ数の計数などによって行うことが可能である。操作の簡便さ及びコスト等の点からは、蛍光免疫染色を用いる方法が好ましい。該蛍光免疫染色には、フルオロセインチオシアネート等の適当な蛍光色素で標識された抗スポロゾイト抗体を用いる。このような標識抗体は市販品として容易に入手することが出来る。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例をあげて本発明を更に詳しく説明する。以下の実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではなく、当業者であれば、本明細書の特許請求の範囲に記載された範囲であれば、それらの任意の変形、修飾、及び応用等も本発明に属するものであることは明白である。
【００２７】
供試原虫
本発明者が継代維持しているC. parvum HNJ-1株（1989年31歳女性の下痢便より分離され、大阪市立大学井関基弘教授がマウスを用いて継代していたものを、本発明者が分与を受けた。凍結保存などが困難なため、生きたマウスを用いて継代されている。）を実験に用いた。感染の妨げとなる夾雑物をできるだけ取り除くため、以下に示すショ糖浮遊法（表１）によりオーシストを粗精製し、塩化セシウム密度勾配法（表２）（Upton, 1997）を用いて純度の高いオーシストを得た。精製したオーシストの数は、ビュルケルチュルク血球計算盤で計数した。
【００２８】
【表１】
0005299945.tif 000002
【００２９】
【表２】
0005299945.tif 000003
【００３０】
細胞培養および感染
以下の表３のように培養、継代したＭＩＥ（Murine Intestinal Epitheliocyte）株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４９７）を0.1×105cells/cm2ずつ8wellチャンバースライド（Nunc; 154534）に播種し、90％コンフルエントになるまで培養した。不活化処理を行ったオーシストはすべて1.0×105oocysts/wellずつ接種した。培地はすべてDMEM（10% FBS, 0.2% P.S.）を用い、培養はオーシスト接種後24h行った。
【００３１】
【表３】
0005299945.tif 000004
【００３２】
加熱によるオーシストの不活化
Fayer（1994）に従って加熱処理を行った。Fayerの加熱試験では、45℃, 5minの加熱ではオーシストを不活化できず、72.4℃, 2minの加熱でオーシストの不活化に成功していた。精製したオーシストをイオン交換水で遠心洗浄（9,100 rpm, 3 min）し、イオン交換水に懸濁して1.0×106oocysts/mlに調製する。200μlのPCRチューブにオーシスト懸濁液を100μlずつ分注し、サーマルサイクラーにて45℃, 5minまたは72.4℃，2min加熱した。加熱後すぐに氷中で冷却し、1.5ml  チューブにオーシスト懸濁液を移し、DMEM（10% FBS, 0.2% P.S.）で2回遠心洗浄（10,000 rpm, 10min, 4℃）を行った。その後、沈査をDMEM（10% FBS, 0.2% P.S.）に懸濁し、感染に用いた。
【００３３】
高純度・高溶解オゾン水によるクリプトスポリジウムの不活化
オゾン曝露の流れは以下の表４に示した通りである。オゾン発生装置は、natures社より供与された実験機を用いた。
オゾンへの曝露条件は、以下の通り行った（鈴木, 修論；2007）。精製・浄化後のC. parvumオーシスト1.0×107個に20 ppm中温オゾン水50 mlを30分間反応させた系と、1.0×106オーシストを含む500 μl C. parvumオーシスト懸濁液に、等量の20 ppmオゾン水を30分間反応させた系（終濃度 10 ppm）をオゾン暴露区として用いた。しかし、オゾン水のくみ取りから曝露までの間に、オゾンの損失が考えられるため、曝露実験時は常にHACH社のオゾン検出試薬（0.5-1.5 mg/l）でオゾン濃度を測定した。検出試薬の測定限界に合わせ、オゾン水をイオン交換（DI）水で20倍に希釈し、検出試薬を用いた。オゾン水の温度を反応性の高い中温（25℃程度）にするため、オゾン水を60℃の高温水で急速に加熱した。またそれぞれのオゾン濃度における暴露時間は30minとし、反応終了後にオゾンの反応停止剤として0.1 M チオ硫酸ナトリウム溶液を100 μl添加し、反応を停止させた（表４）。Controlとして、1.0×106個のC. parvumオーシストを含む50 mlオーシスト懸濁液に、100μlの0.1 M チオ硫酸ナトリウムを添加した実験区を設定し、1.0×105-1.0×10-1oocysts/wellとなるよう段階希釈してMIE細胞に接種した。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
蛍光免疫染色
感染24hの培養上清をアスピレート後、未脱殻オーシストや殻のオーシスト壁を取り除くため、細胞表面を0.01% Tween-20/PBSにて2回洗浄し、100% ice coldメタノールにて-20℃で10min固定した。培養上清をアスピレート後、細胞表面を0.01% Tween-20/PBSにて2回洗浄し、1% BSA/0.002% Tween-20/TBSを添加して室温にて1hブロッキングし、Dilution/Blockingバッファーで20倍に希釈した抗スポロゾイト一次抗体(Fluorescein isothiocyanate: FITC-rabeled rat anti-sporozoite Polyclonal antidoby; Waterborne)を滴下して遮光下、室温で1hインキュベートした。その後PBS(-)にて2回洗浄して非結合抗体を洗い流し、Mounting Medium（Waterborne）を滴下してカバーガラスをのせてマニキュアで封入し、蛍光顕微鏡にて各サンプルの増殖ステージ数を計数した。
【００３６】
結果
1. 加熱によるクリプトスポリジウムの不活化
それぞれのサンプルについて、増殖ステージ数が非常に多いサンプルでは顕微鏡の倍率400倍による計数が不可能であったため、1000倍にて計数した。45℃, 5minで加熱したサンプルは、25視野合計の増殖ステージ数は平均149.75であった（×1000）（図１）。また、72.4℃, 2minで加熱したサンプルにおいては、増殖ステージは確認されなかった（図２）。コントロールは、1ウェルあたり1.0×105オーシストを接種した場合平均354.75（×1000）、1.0×104オーシストの場合平均92.25（×1000）、1.0×103オーシストの場合平均42（×400）、1.0×102オーシストの場合平均9.25（×400）、1.0×101オーシストの場合平均1.5（×400）、1.0×100オーシストの場合平均0.5（×400）、1.0×10-1オーシストの場合平均0.5（×400）であった（表５、表６）。そのため、45℃, 5minで加熱したサンプルにおける感染性のあるオーシスト数は1.0×104オーシスト以上であり、72.4℃, 2minで加熱したサンプルにおいては、1オーシスト未満であることが示唆された。尚、マウス感染法と比較した結果を表７に示す。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
【表６】
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【００３９】
2. 高純度・高溶解オゾン水によるクリプトスポリジウムの不活化
10ppm オゾン水に30min暴露したサンプルの25視野における増殖ステージ数は平均267.25（×1000）、20ppm オゾン水に30min暴露したサンプルの増殖ステージ数は平均22.5（×400）であった（図３、図４）。コントロールと比較すると、10ppm オゾン水に30min暴露したサンプルの感染性のあるオーシスト数は1.0×104オーシスト以上であり、20ppm オゾン水に30min暴露したサンプルにおいては100オーシスト以上1000オーシスト未満であったと考えられる。これより、不活化率はそれぞれ0-1 log10, 2-3 log10であり、1.5mlチューブ内という小さな反応系で行った10ppmオゾン水による処理はC. parvumオーシストを十分に不活化できていなかった。尚、マウス感染法と比較した結果を表７に示す。
【００４０】
【表７】
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【００４１】
考察
本実施例では、オーシストの精製には最もバクテリアや夾雑物の混入が少ない塩化セシウム密度勾配遠心法を用い、不活化試験後のオーシストを特別な滅菌または脱殻処理を行わずに直接培養細胞に播種した。また、通常は脱殻したオーシストの殻や、未脱殻のオーシストを取り除くために培養開始後90minまたは2hで感染細胞の洗浄を行うが、本実験ではそのような行程を省いて行った。完全にオーシストを不活化できる条件（72℃, 2min）で不活化したオーシストをMIE細胞に接種した実験において抗体反応が得られなかったことから、免疫染色直前の洗浄のみでも完全に脱殻したオーシストの殻や未脱殻のオーシストを除去できると考えられた。さらに、本実施例で用いたMIE細胞はC. parvumの細胞侵入性または増殖率が図１及び図２のコントロールに見られるように非常に高く、培養時間24hでも正常なオーシスト10個ですべてのウェルにおいて増殖ステージを確認できた（表６）。各不活化処理における不活化率は、加熱処理45℃, 5minにおいて0-1 log10、72.4℃, 2minにおいて5 log10以上であり（図１及び図２）、オゾン水処理10ppm, 30minにおいて0-1 log10、20ppm, 30minにおいて2-3 log10であった（図３及び図４）。よって、特別な脱殻処理を行わず、培養時間24hでも、ゴールドスタンダードである動物感染法（マウス感染法）と類似した不活化結果を得られることが示唆された（表７）。以上より、MIE細胞感染法は、表８に示すように、従来の培養細胞感染法に比べより簡便で迅速にC. parvumの感染性を評価できることが示された。
【００４２】
【表８】
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【００４３】
参考文献
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Call, JL.,  Arrowood, M., Xie, LT., Hancock, K., and Tsang VC. (2001). Immunoassay for viable Cryptosporidium parvum oocysts in turbid environmental water samples. J. Parasitol., 87(1), 203-210.
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【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によって、クリプトスポリジウムオーシストの感染性を正確、迅速、且つ、簡単に評価する方法が提供され、クリプトスポリジウム等の原虫感染防止等により公衆衛生面に多大に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】45℃, 5min加熱処理したオーシストを接種したときの計25視野における           増殖ステージ数（n=4）を示す。
【図２】72℃, 2min加熱処理したオーシストを接種したときの計25視野における増殖ステージ数（n=4）を示す。
【図３】オゾン10ppm（23.5℃）, 30min暴露したオーシストを接種したときの計25視野における増殖ステージ数（n=4）を示す。
【図４】オゾン20ppm（23.5℃）, 30min暴露したオーシストを接種したときの計25視野における増殖ステージ数（n=4）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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