(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対
【請求項２】
プライマーが標識物質で標識された、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項２に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項１に記載のプライマー対を用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出することを特徴とする、マイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法。
【請求項５】
更に、配列番号１３９で表される塩基配列又はその相補配列から設計された１５〜４０塩基からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用いる、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
プローブが、配列番号２０４で表される塩基配列又はその相補配列である、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
下記工程を包含することを特徴とする、請求項４に記載の検出方法、
（１）請求項１に記載のプライマー対を用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（２）(１)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてマイコバクテリウム・イントラセルラーレの有無を判定する。
【請求項８】
下記のいずれかの場合に、被検試料がマイコバクテリウム・イントラセルラーレ陽性であると判定する、請求項７に記載の検出方法、
（１）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、目的とする１５５塩基対のプライマー伸長産物の画分を確認し、目的とする１５５塩基対のプライマー伸長産物が確認された場合、
（２）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、配列番号１３９で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１３９で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。
【請求項９】
プライマーが標識物質で標識されており、当該プライマー対を用いて試料中の核酸を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する、請求項４に記載の検出方法。
【請求項１０】
核酸増幅連鎖反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定する、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のプライマー対を含んでなる、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅及びその検出系を利用した、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare、以下、「M.イントラセルラーレ」と略記する場合がある。）を検出及び／又は同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非結核性抗酸菌（nontuberculous mycobacterium）は、マイコバクテリウム（Mycobacterium、以下、単にM.と略記する場合がある。）属に分類される抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌で、結核菌群及びMycobacterium leprae以外の抗酸菌の一種である。喀痰の抗酸菌塗抹検査で陽性となった症例の15〜20％は、その後の菌種同定検査で非結核性抗酸菌と診断されている。
【０００３】
非結核性抗酸菌のうち、臨床上問題となる菌種としては、M.イントラセルラーレ、Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）、Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）、Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）等が知られている。
【０００４】
その中でもよく見られるのが、M.イントラセルラーレとM.aviumである。M.イントラセルラーレとM.aviumは非常によく似ており、区別が付きにくかったことから、M.イントラセルラーレとM.aviumをあわせてMycobacterium avium complex （ＭＡＣ）と呼ばれる。非結核性抗酸菌症患者のおよそ70%はＭＡＣ感染症であり、次に多いのがM.kansasii症で、20%を占める。そして残る10%がその他の菌種による感染症である。
【０００５】
非結核性抗酸菌は一般には毒力が弱く、健常人に対しては無害であるといわれている。しかし、まれにヒトに対して感染性を示す。中でもＭＡＣは、結核後遺症（肺感染症）を引き起こしたり、ＡＩＤＳなどの易感染患者に対して日和見感染を引き起こすことが知られている。そのため、非結核性抗酸菌を迅速且つ正確に検出することは治療上、特に重要である。
【０００６】
また、非結核性抗酸菌症は近年増加傾向にあるため、結核菌と非結核性抗酸菌を短時間で鑑別する方法の開発が強く望まれている。更に、M.イントラセルラーレ及びM.aviumを核酸増幅検出法で検出・診断する方法が健康保険の適用となったことからも、その診断上の意義は大きい。
【０００７】
また、非結核性抗酸菌は、多くが抗結核薬に対して抵抗性を示す。そのため、患者に抗酸菌感染症の疑いがある場合、結核症か非結核性抗酸菌症かを鑑別診断することが、治療方針を決定するために重要である。更に、非結核性抗酸菌による病気は、その菌の種類によって治療法が夫々異なるので、その菌種を決めることも非常に重要である。しかし、非結核性抗酸菌症には特異的な臨床症状がない。そのため、臨床的所見、病理組織学的所見から結核症と非結核性抗酸菌症を鑑別し、更に非結核性抗酸菌の種類を特定することは極めて困難である。そのため、結核症か非結核性抗酸菌症かの診断は菌の同定によってなさなければならない。
【０００８】
非結核性抗酸菌症の診断のために行う一般的な菌の同定法は、喀痰塗沫検査である。しかし、この検査では、その病原菌が「抗酸菌陽性」か否かということが判るだけで、その病原菌が結核菌か非結核性抗酸菌かということは鑑別できない。そこで、通常、喀痰塗末検査で陽性だった場合は、小川培地等の培地上で菌を分離培養することによって菌の培養検査を行い、結核菌か非結核性抗酸菌かを鑑別する。そして、さらに生化学的試験を行い、菌種の同定をする。しかしながら、一般にマイコバクテリウム属は発育が遅く、例えば、菌の分離培養だけで３〜４週間を要する。そして、菌種を同定するための各種生化学的試験の結果を得るまでに、更に２〜３週間を要する。そのため、従来の基本法である、以上のような塗沫検査や培養検査を行って結核症か否かの診断結果を得るという方法は、かなり時間がかかる方法である。
【０００９】
一方、近年、遺伝子レベルで菌を検出する技術が開発されてきた。例えばポリメラーゼ連鎖反応（Polymerare Chain Reaction、ＰＣＲ）等の核酸増幅技術を利用した診断技術が、菌を検出するための有用な手段として検討されている。この方法は感度が高いので、試料中に数個の菌があれば、菌を検出できる。また、短時間（長くても４日）で検出できる（菌種を同定できる）という利点がある。しかし、通常のＰＣＲ法では、菌数は判らない。また、生菌でも死菌でも区別無く検出してしまう。更に、試料に菌があれば、菌数の多少に関わらず陽性と判定される。そのため、ＰＣＲ法では感染性の診断が不確実になる。更にまた、ＰＣＲ法には、感度が高すぎるため、偽陽性の判定が出やすい等の問題点がある。
【００１０】
ＰＣＲ法を利用したM.イントラセルラーレの検出方法としては、例えばMacSequevar遺伝子領域、M.avium 19キロダルトンタンパク質（ＭＡＶ１９ｋ）遺伝子領域、及びM.イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域の二つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの多重プライマーセットを用いて、ＭＡＣ核酸の存否を検出する方法（特許文献１）がある。しかしながら、この検出方法ではM.イントラセルラーレとM.aviumを判別することはできない。また、使用したrps1プライマー（M.イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域から設計されたプライマー）を用いたＰＣＲでは、試料がM.avium分離株の場合にも増幅産物が検出されており、M.イントラセルラーレに対する特異性に問題がある。
【００１１】
また、遺伝子挿入配列IS901の挿入部位を挟むＤＮＡ塩基配列を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の鎖長によって、トリ結核菌（M.avium）かM.イントラセルラーレかを判定する方法（特許文献２）も知られている。しかし、該プライマーを用いたＰＣＲでは、試料がトリ結核菌（M.avium）の場合でもM.イントラセルラーレの場合でもプライマー伸長産物が得られるので、この判別方法はM.イントラセルラーレに特異的な方法とはいえない。また、プライマー伸長産物の鎖長によって両者を判別するという方法は、煩雑であるし、判定者によってその判定結果が異なる場合もあり得、確実な判定方法とは言えない。
【００１２】
ＰＣＲ法以外に、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法、Strand Displacement Amplification Method）を利用する検出方法もある。例えば、特開平10−4984号（特許文献３）には、マイコバクテリアのα抗原の一部分をコードするＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の６３ヌクレオチドセグメントを標的とする方法が開示されている。この方法は、M.イントラセルラーレとM.aviumの、両方の菌が持つＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の標的配列を増幅させるプライマーを用いて、ＳＤＡ法で核酸増幅反応を行い、そして、その結果をもとにＭＡＣを検出する方法である。即ち、該方法に用いられるプライマーは、M.イントラセルラーレとM.aviumの両方を増幅させるプライマーである。しかし、この方法では、当然のことながら、試料中にM．イントラセルラーレがある場合とM.aviumがある場合の両方の場合でプライマー伸長産物が得られる。そのため、この方法でＭＡＣを検出することはできるが、M.イントラセルラーレを特異的に検出することはできない。また、ＭＡＣを検出する際であっても、偽陽性が出現する場合がある。
【００１３】
特開2001−103986号公報（特許文献４）には、ＭＡＣを検出するために用いられるプライマー、捕捉プローブ及び検出用プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドが開示されている。しかしながら、該プライマーはM．イントラセルラーレと鳥型結核菌（M.avium）の両方の菌が持つｄｎａＪ遺伝子からの４８ｂｐ標的配列を増幅する。即ち、試料中にM．イントラセルラーレが存在する場合にも、M.aviumが存在する場合にも増幅反応が起こる。従って、該プライマーを用いてＳＤＡ法を行い、補足プローブ及び検出用プローブを用いてプライマー伸長産物を検出し、その結果に基づいてＭＡＣの検出を行うことはできる。しかし、M.aviumを検出せずに、M.イントラセルラーレを特異的に検出することはできない。
【００１４】
その他、ＬＡＭＰ（Loop−Mediated Isothermal Amplification）法を利用し、M.イントラセルラーレの核酸を増幅する方法（特許文献５）等がある。しかし、ＬＡＭＰ法には増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定することができない、効率よく増幅できるＤＮＡの長さに制限がある、偽陽性が出現する、等の問題がある。
【００１５】
以上のことから、M.イントラセルラーレを特異的に且つ迅速に検出する方法を確立することが望まれている現状にあった。
【００１６】
【特許文献１】特開平11−69999号公報
【特許文献２】特許第3111213号公報
【特許文献３】特開平10−4984号公報
【特許文献４】特開2001−103986号公報
【特許文献５】特開2005−204582号公報
【非特許文献１】F.Poly et al., J. Bacteriology, 2004, 186（14）, p.4781−4795
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、診断上の偽陽性を排除した新規なM.イントラセルラーレ検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いM.イントラセルラーレの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、M.イントラセルラーレ検出用プライマー。
（３）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、M.イントラセルラーレ検出用プローブ。
（４）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び／又はプローブとして用いることを特徴とするM.イントラセルラーレの検出方法。
（５）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び／又はプローブとして含んでなる、M.イントラセルラーレ検出用試薬キット。
（６）配列番号１〜配列番号８のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号１〜配列番号８のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出に使用するプライマーおよび／又はプローブ設計への使用。
【００１９】
本発明者は、現在までに決定されたM.イントラセルラーレとその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性についての理論的検証と実験的検証を重ねた。その結果、マイクロアレイ法を用いた方法により得られたM.イントラセルラーレ由来の塩基配列の断片中に、M.イントラセルラーレの遺伝子配列の特定領域に特異的にハイブリダイズし、M.イントラセルラーレの検出に有用となる塩基配列が存在することを見出した。
【００２０】
そこで、これらの知見をもとに更に鋭意研究の結果、M.イントラセルラーレに特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列）を得、これらの塩基配列がM.イントラセルラーレの検出に有用であることを見出した。そして更にこれらの配列をもとにM.イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブを開発し、これらを用いたM.イントラセルラーレの検出方法を確立するに到った。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたM.イントラセルラーレの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、M.イントラセルラーレの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でM.イントラセルラーレの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度に且つ正確に、しかも特異的にM.イントラセルラーレの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、M.イントラセルラーレ菌体の定量を行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】候補クローン１の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図２】候補クローン２の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図３】候補クローン３の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図４】候補クローン４の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図５】候補クローン５の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図６】候補クローン６の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図７】候補クローン７の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図８】候補クローン８の塩基配列と、プライマーとして設計した塩基配列の存在位置を矢印で示す。
【図９】実施例１で得られた、プライマー02＿Fw1及びプライマー02＿Rv1を用い、M.イントラセルラーレ由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果である。
【図１０】実施例２で行ったリアルタイムＰＣＲ検出結果を示し、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明において、M.イントラセルラーレ遺伝子とは、Mycobacterium intracellulareの持つ全ゲノム配列における任意の塩基配列単位（領域）をいう。Mycobacterium intracellulareの全ゲノム配列は、まだ解読されていない。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」と略記する場合がある。）。
【００２５】
本発明に係る、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは666塩基、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは1128塩基、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは1002塩基、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは747塩基、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは618塩基、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは510塩基、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは1005塩基、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは700塩基の大きさである。
【００２６】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。好ましくは配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９〜２２又は配列番号１３９〜１４５で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３１】
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号２３〜４０又は配列番号１４６〜１５４で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３２】
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号４１〜５８又は配列番号１５５〜１６３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３３】
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号５９〜７８又は配列番号１６４〜１７３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３４】
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７９〜９２又は配列番号１７４〜１８０で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３５】
配列番号６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９３〜１０４又は配列番号１８１〜１８６で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３６】
配列番号７で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１０５〜１２６又は配列番号１８７〜１９７で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３７】
配列番号８で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１２７〜１３８又は配列番号１９８〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するものが挙げられる。
【００３８】
本発明に係る、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００３９】
上記の、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとは、具体的には、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００４０】
尚、ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「50%ホルムアミド中で42〜70℃で、好ましくは60〜70℃でのハイブリダイゼーション、その後0.2〜2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中で25〜70℃で洗浄」という条件である。
【００４１】
また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜70℃の温度の条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄」という条件である。
【００４２】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの例としては、例えば、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、等が挙げられる。
【００４３】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、更に好ましくは２０塩基以上を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４５】
配列番号９〜配列番号２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
本発明に係るM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、前記した、M.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、前記した通りである。
【００４７】
尚、本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行なって得られた、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、一つ若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入或いは置換されていてもよい。一つ若しくは複数のヌクレオチドがイノシン（I）のような修飾ヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドを得る方法としては、特に限定されないが、例えば自体公知の化学合成法により調製する方法が挙げられる。この方法では、ベクター等を用いる遺伝子操作法によりオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを得る方法（クローン化法）に比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
【００４９】
例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００５０】
また、オリゴヌクレオチドの合成を業者に委託して、業者から購入しても良い。
【００５１】
本発明の目的を達成し得るオリゴヌクレオチドを探索（スクリーニング）する手段としては、FEMS Microbiology Letters 166： 63−70, 1998 あるいはSystematic and Applied Microbiology 24： 109−112, 2001などに示されているサブトラクション法、即ち標的であるゲノムＤＮＡ由来フラグメント群から区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡ由来フラグメント群と反応したものを差し引く事で、候補配列を濃縮する方法等がある。
【００５２】
また、標的であるゲノムＤＮＡ及び区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡからの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを作成するといったアプローチ、即ち任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）を利用する方法等が考えられる（特開平11−155589号公報）。
【００５３】
更に、いわゆるマイクロアレイ法と呼ばれる方法を利用することによっても、本発明の目的を達成し得るオリゴヌクレオチドを探索することができるし、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。その方法の概略は以下の通りである。
【００５４】
即ち、例えばM.イントラセルラーレゲノム由来ＤＮＡのショットガン・クローンを作成し、得られたショットガン・クローンからＤＮＡを精製する。次いで、そのシヨットガン・クローン由来の精製ＤＮＡを、ＰＣＲ等により増幅させた後、スライドガラス上に配置させてマイクロアレイを作成する。別に、標的であるM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡから蛍光標識（標識１）したＤＮＡフラグメント群を作成する。一方、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡからも蛍光標識（標識２）したＤＮＡフラグメント群を別途に作成し、対照実験を行う。即ち、標識１及び標識２の各々を同一反応系で用いる競合ハイブリダイゼーション法によって、マイクロアレイ上の配列と、標識１及び標識２との反応性（結合性）を検定する。この検定により、標的であるM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ由来フラグメント（標識１）と、より特異的に反応する配列候補群を選定できる（例えば非特許文献１等）ため、これにより目的のオリゴヌクレオチドを選別することができる。以下にマイクロアレイ法を用いた、本発明のオリゴヌクレオチドの選定方法の一例について詳説する。
【００５５】
（１）M.イントラセルラーレ由来精製ゲノムＤＮＡの調製
まず、M.イントラセルラーレ菌株を、常法（例えばオートクレーブ処理とガラスビーズ等を用いた菌体の粉砕処理）によって破砕処理した後、常法に従ってＤＮＡの抽出，精製を行えばよい。
【００５６】
（２）Whole Genome Shotgun libraryの作製
M.イントラセルラーレのWhole Genome Shotgun libraryの作製を行う方法の一例として、Venter et al., Science. 2001 Feb 16；291（5507）：1304−1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変した方法を、以下に説明する。
まず、前記（1）で得られたM.イントラセルラーレ由来精製ゲノムＤＮＡを、適当な緩衝液等で希釈した後、例えば終濃度20%のグリセロール存在下、5kPa〜9kPaの圧力下で、ネビュライザーを用いて約1〜5分間処理し、ＤＮＡの断片化処理を行う。この処理方法により、目的とする500〜1000塩基対のサイズ画分を効率よく回収する事ができる。得られた画分を市販の抽出カラムを利用して精製する。
【００５７】
その後、得られた画分（ＤＮＡ断片。目的のＤＮＡ断片を含む。）を、常法に従いライゲーションによってベクターＤＮＡに組み込んだ、組み換えＤＮＡ（M.イントラセルラーレのWhole Genome Shotgun library）を得る。
【００５８】
そのために用いられるベクターＤＮＡとしては、後で形質転換する宿主細胞が大腸菌の場合には、例えば、pBS［例えばpBSII sk＋ベクター（Stratagene社）］、pQE−TRIプラスミド （Qiagen社製）、pBluescript、pET、pGEM−3Z、pGEX等のベクターが挙げられる。用いるベクターの種類によっては、ライゲーションの前に、予めＤＮＡ断片を、ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＤＮＡ断片の末端を平滑化処理してもよい。
【００５９】
次いで、得られた組み換えＤＮＡを用いて、適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。
【００６０】
そのために用いられる宿主細胞としては例えば、大腸菌（E.coli）が挙げられ、好ましくはJM109、DH5α、TOP10等が挙げられる。この他、よりプラスミドやファージＤＮＡの導入効率の高い、Competent Cell（コンピテントセル）を用いても良い。例えば、E. coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００６１】
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326−331,1979）等により行うことができる。また、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って、形質転換を行えばよい。
【００６２】
目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された形質転換体を選別するには、例えば、形質転換のために用いたベクターの性質を利用する方法で行えばよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターを用いた場合にば、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体を培養し、得られたクローンを選択することにより、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された、形質転換体（M.イントラセルラーレのゲノム由来のWhole Genome Shotgun clone library）が容易に得られる。
（３）マイクロアレイ作製
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。
【００６３】
即ち、上記（2）で得られた形質転換体（M.イントラセルラーレのゲノム由来のWhole Genome Shotgun clone library）から常法に従いＤＮＡを精製する。精製したＤＮＡを鋳型として用い、適当なプライマー［市販のプライマーでも良い。例えばM13 Primer M1（タカラバイオ社製）及びM13 Primer RV （タカラバイオ社製）等］を用い、常法に従ってＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ増幅産物を精製する。次いで常法に従って、精製したＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ用スライドガラス上にスポットする。これにUV照射（60mJ／cm2〜300mJ／cm2、通常150mJ／cm2）を行ない、スライドガラス上にＰＣＲ増幅産物（ターゲットのM.イントラセルラーレ由来ＤＮＡを含む）を固定することにより、マイクロアレイを作製する。
【００６４】
尚、必要に応じコントロールのマイクロアレイも作製する。例えばrpsl（特許文献１）等のM.イントラセルラーレに特異的な配列のＤＮＡフラグメント、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡのフラグメント〔結核菌特有の挿入配列IS6110の部分配列（IS6110 element）、KATS2 sequence（特開平11−155589号公報）等のM.kansasiiに特異的な塩基配列のＤＮＡフラグメント、MAV19K （特許文献１）等のM.aviumに特異的な塩基配列のＤＮＡフラグメント、等や、例えば大腸ＤＮＡ等のマイコバクテリウム属菌以外の菌由来のＤＮＡ等〕を用い、夫々同様にＤＮＡの断片化からWhole genome Shotgun clone libraryを作成までの一連の処理を行い、同様にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をスライドガラス上に固定して、夫々のマイクロアレイも作製する。
【００６５】
尚、コントロールのマイクロアレイについて、あるマイクロアレイをポジティブコントロールとして設定した場合、後で行うマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションで使用するCy3標識対照用ゲノムＤＮＡには、該ポジティブコントロールの由来菌体と同じ菌体由来のゲノムＤＮＡをCy3標識したものを、用いる。例えば、M.kansasiiに特異的な塩基配列のＤＮＡフラグメントを用いてマイクロアレイを作製し、これをポジティブコントロールに設定した場合には、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションで使用するCy3標識対照用ゲノムＤＮＡの一つとして、M.kansasiiから抽出・精製したゲノムＤＮＡをCy3で標識した標識産物を用いる。
【００６６】
また、あるマイクロアレイをネガティブコントロールとして設定した場合、後で行うマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションでは、該ネガティブコントロールの由来菌体と同じ由来菌体ゲノムＤＮＡのCy3標識産物もCy5標識産物も使用しない。
【００６７】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ヘキシルアミノ−UTPを用いた間接標識法により、M.イントラセルラーレ菌株から常法により抽出・精製したゲノムＤＮＡをCy5でラベリングする。また、前記マイクロアレイのポジティブコントロールの由来菌体から抽出・精製した対照用ゲノムＤＮＡをCy3でラベリングする。例えばDeRisi研究室（www.microarrays.org）が発表したプロトコールを改変した間接標識法を例にとって説明する。この方法は、アミノ基をもつαUTP を使い、酵素伸長反応によりこれを分子内に取り込ませたＤＮＡ鎖を作成する。そしてそのアミノ基に蛍光色素（サクシニイミド体）を化学的に結合させることによってＤＮＡをラベリングしようというものである。
【００６８】
まず、出発材料（M.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ、及び対照用ゲノムＤＮＡ）を、常法に従い熱変性処理する。次いで、熱変性処理物にDTT 2μL、dATP／dCTP／dGTPの混合液、dTTP、Ha−dUTP、Klenow酵素を添加し、37℃で3時間程度の伸長反応を行う。得られた反応産物を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等を用いて完全に乾燥させる。次に、乾燥させた上記反応産物にNaHCO3 を加えて混合し、2〜3 分常温静置する。
【００６９】
別にCy3（又はCy5）をDMSO に溶かしたものを調製（Cy−dye Solution Cy3、Cy−dye Solution Cy5）する。このCy−dye Solution Cy3を、対照用ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加え、またCy−dye Solution Cy5をM.イントラセルラーレゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加え、夫々40℃で60 分程度、遮光下にインキュベートする。さらに、夫々の反応産物に4M NH2OHを加え、攪拌後に15 分程度、遮光下にインキュベートして、夫々のゲノム由来ＤＮＡの標識産物を得る。その後、得られた標識産物を、限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機で完全に乾燥させる。
【００７０】
ｉｉ）標識産物の断片化工程
前記（4）i）で得られた乾燥状態の各ゲノム由来のＤＮＡフラグメントの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris−acetate（pH8.1）、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液を調製する。該溶液に乾燥状態のゲノム由来のＤＮＡフラグメントの標識産物を懸濁混和させる。94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base のゲノム由来ＤＮＡフラグメントの標識産物を得る（Cy3標識産物、Cy5標識産物）。
【００７１】
得られたCy3標識産物とCy5標識産物を混合した後、限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等で完全に乾燥させる。
【００７２】
次いで、このマイクロチューブに、salmon sperm DNA（10mg／mL） 0.5μL、formamide  5μLを含有し、ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）で全量を40〜50μLに調整した試薬溶液（後に使用するマイクロアレイのカバーガラスが24×55mm の大きさの場合の組成である）を加え、上記で得た乾燥物を同一の溶液中で懸濁混和後、95℃で5 分程度インキュベートし、Cy3Cy5標識産物混合溶液を調製する。  
【００７３】
（５）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（アレイ上でのDNA−DNA hybridization）
前記（3）の工程で得られたマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）上に、上記（4）ii）で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液をのせ、カバーガラスをかぶせる。これをハイブリカセットにセットした後、65℃で8 時間以上、遮光下に反応させて、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC−0.1%SDS 溶液に室温で浸し、カバーグラスをはずす。1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄後、800prm で約5 分間遠心を行って乾燥させる。
【００７４】
（６）蛍光強度の測定；シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記（5）で得られたマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定する。この際、Cy3及びCy5の、２チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。蛍光シグナルの数量化は市販のＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア等を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行えば良い。
【００７５】
ハイブリダイゼーションに用いたCy5標識産物は、M.イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡを材料として標識したＤＮＡフラグメント群であり、Cy3標識産物は対照用ゲノムＤＮＡを材料として標識したＤＮＡフラグメント群である。そのため、マイクロアレイ上のあるスポットのCy3とCy5の夫々の蛍光強度を測定した結果、Cy5の蛍光の方が強く検出された場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy5標識産物、即ちM.イントラセルラーレ由来のゲノムＤＮＡの特定の配列とより強くハイブリダイズした、ということを意味し、ＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）はM.イントラセルラーレに対する特異性が高いと判断される。
一方、あるスポットについてCy5よりCy3の蛍光の方が強く検出された場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy3標識産物、即ち対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズした、ということを意味し、ＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）はM.イントラセルラーレに対する特異性が低いと判断される。また、Cy3及びCy5の蛍光の強さが同程度だった場合と、Cy3及びCy5のどちらの蛍光も検出されなかった場合にも、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、M.イントラセルラーレに対する特異性が低いと判断される。
【００７６】
そこで、例えばマイクロアレイ上で検出されたCy3／Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、例えば、散布図（スキャッタープロット）を作成する等して、結果を解析し、M.イントラセルラーレ特異配列の検出のためのスクリーニングを行う。解析においては、用いたポジティブコントロール配列のうちM.イントラセルラーレに特異的なＤＮＡのCy3／Cy5 Ratioの数値が特異性評価のための有用な基準値となる。
【００７７】
尚、マイクロアレイ上にポジティブコントロール及びネガティブコントロールがスポットされている場合には、夫々のCy3Cy5蛍光強度を測定して、その蛍光強度の傾向をみれば、蛍光スキャナー測定における１つのデータ評価基準として利用する事ができる。
【００７８】
スクリーニングを行った候補の中から、Cy3／Cy5 Ratioの数値解析の結果、有意にM.イントラセルラーレ特異的なシグナルが得られ（Cy5の蛍光強度が強い場合）、なおかつ上述のM.イントラセルラーレに特異的なポジティブコントロールのスポットに比べてRatioの数値が大きい（Cy5の蛍光強度が強い）クローンを選択する。
【００７９】
次いで、通常この分野で用いられているシークエンサー、例えばABI PRISM310キャピラリーシーケンサー（アプライドバイオ社）等の機器を利用し、常法に従い、得られた候補クローンの塩基配列決定を行えばよい。
【００８０】
尚、選択されたクローンの中から、更にM.イントラセルラーレ特異的検出のための候補配列をスクリーニングするために、例えば、リアルタイムＰＣＲ法による二次スクリーニングを行っても良い。
【００８１】
即ち、上記したCy3／Cy5 Ratioの数値解析の結果選択された候補クローンについて、塩基配列決定を行う。夫々の候補クローンについて、得られた塩基配列を基に、例えばプライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 （Whitehead Institute for Biomedical Research.）等を用いて夫々ＰＣＲ用の適当なプライマーを設計する。
【００８２】
設計されたプライマーから適当な組合せを選択し、その組合せのプライマーを用いて、M.イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡを鋳型として、常法に従いリアルタイムＰＣＲを行う。また、マイコバクテリウム属の適当な菌体由来ゲノムＤＮＡ、更に要すれば大腸菌等のマイコバクテリウム属以外の菌体由来ゲノムＤＮＡ等（対照）を鋳型として、同様にリアルタイムＰＣＲを行う。その結果、M.イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られ、その他の菌体由来ゲノムＤＮＡ（対照）を鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られなかったプライマーの組合せを選択する。そして、そのプライマーの組合せを設計した候補クローンを、最終的なM.イントラセルラーレに特異的な候補クローンとして選択すればよい。
【００８３】
本発明のM.イントラセルラーレ検出用プライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプライマーが挙げられる（以下、本発明のプライマーと記載する場合がある。）。
【００８４】
また、本発明のプライマーは、ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの中から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して使用すればよい。
【００８５】
好ましくは、プライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基の長さを有しているオリゴヌクレオチドがよい。
【００８６】
プライマーの設計方法は、プライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 （Whitehead Institute for Biomedical Research.）等を用いて設計すればよい。
【００８７】
本発明のプライマーに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明において記載したものと同じである。
【００８８】
本発明のプライマーの具体例としては、例えば配列番号９〜１３８で表される塩基配列から選ばれる配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は配列番号９〜１３８で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８９】
本発明のプライマーの好ましい具体例としては、配列番号９〜１３８で表される塩基配列から選ばれる配列を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は配列番号９〜１３８で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００９０】
より好ましいプライマーとしては、例えば配列番号９、１０、２３、２４、４１、４２、５９、６０、７９、８０、９３、９４、１０５、１０６、１２７、１２８で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号９、１０、２３、２４、４１、４２、５９、６０、７９、８０、９３、９４、１０５、１０６、１２７、１２８で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００９１】
尚、配列番号９〜２２で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９２】
配列番号２３〜４０で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号２で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９３】
配列番号４１〜５８で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号３で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９４】
配列番号５９〜７８で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号４で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９５】
配列番号７９〜９２で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号５で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９６】
配列番号９３〜１０４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号６で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９７】
配列番号１０５〜１２６で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号７で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９８】
配列番号１２７〜１３８で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号８で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【００９９】
図１に、配列番号１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号９及び配列番号１０で表される塩基配列の存在位置を、02＿Fw1 及び 02＿Rv1として、夫々矢印で示す。
【０１００】
図２に、配列番号２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号２３及び配列番号２４で表される塩基配列の存在位置を、03＿Fw1 及び 03＿Rv1として、夫々矢印で示す。
【０１０１】
図３に、配列番号３で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号４１及び配列番号４２で表される塩基配列の存在位置を、04＿Fw2 及び 04＿Rv2として、夫々矢印で示す。
【０１０２】
図４に、配列番号４で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号５９及び配列番号６０で表される塩基配列の存在位置を、06＿Fw1 及び 06＿Rv1 として、夫々矢印で示す。
【０１０３】
図５に、配列番号５で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号７９及び配列番号８０で表される塩基配列の存在位置を、10＿Fw1 及び 10＿Rv1 として、夫々矢印で示す。
【０１０４】
図６に、配列番号６で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号９３及び配列番号９４で表される塩基配列の存在位置を、13＿Fw2 及び 13＿Rv2 として、夫々矢印で示す。
【０１０５】
図７に、配列番号７で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１０５及び配列番号１０６で表される塩基配列の存在位置を、14＿Fw1 及び 14＿Rv1 として、夫々矢印で示す。
【０１０６】
図８に、配列番号８で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１２７及び配列番号１２８で表される塩基配列の存在位置を、15＿Fw2 及び 15＿Rv2 として、夫々矢印で示す。
【０１０７】
また、配列番号１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１１〜２２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１１（02＿Fw2）：415位〜434位、
配列番号１２（02＿Fw3）：91位〜110位、
配列番号１３（02＿Fw4）：272位〜290位、
配列番号１４（02＿Fw5）：245位〜264位、
配列番号１５（02＿Fw6）：41位〜61位、
配列番号１６（02＿Fw7）：423位〜442位、
配列番号１７（02＿Rv2）：563位〜582位、
配列番号１８（02＿Rv3）：294位〜313位、
配列番号１９（02＿Rv4）：447位〜466位、
配列番号２０（02＿Rv5）：373位〜392位、
配列番号２１（02＿Rv6）：175位〜194位、
配列番号２２（02＿Rv7）：641位〜659位。
【０１０８】
配列番号２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号２５〜４０で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号２５（03＿Fw2）：18位〜35位、
配列番号２６（03＿Fw3）：111位〜128位、
配列番号２７（03＿Fw4）：229位〜248位、
配列番号２８（03＿Fw5）：412位〜430位、
配列番号２９（03＿Fw6）：580位〜599位、
配列番号３０（03＿Fw7）：776位〜796位、
配列番号３１（03＿Fw8）：873位〜890位、
配列番号３２（03＿Fw9）：911位〜930位、
配列番号３３（03＿Rv2）：158位〜175位、
配列番号３４（03＿Rv3）：288位〜306位、
配列番号３５（03＿Rv4）：362位〜381位、
配列番号３６（03＿Rv5）：542位〜561位、
配列番号３７（03＿Rv6）：700位〜719位、
配列番号３８（03＿Rv7）：955位〜972位、
配列番号３９（03＿Rv8）：1040位〜1059位、
配列番号４０（03＿Rv9）：1075位〜1093位。
【０１０９】
配列番号３で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号４３〜５８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号４３（04＿Fw3）：4位〜21位、
配列番号４４（04＿Fw4）：217位〜235位、
配列番号４５（04＿Fw5）：423位〜440位、
配列番号４６（04＿Fw6）：476位〜494位、
配列番号４７（04＿Fw7）：658位〜675位、
配列番号４８（04＿Fw8）：709位〜728位、
配列番号４９（04＿Fw9）：772位〜789位、
配列番号５０（04＿Fw10）：803位〜822位、
配列番号５１（04＿Rv3）：134位〜152位、
配列番号５２（04＿Rv4）：367位〜384位、
配列番号５３（04＿Rv5）：560位〜579位、
配列番号５４（04＿Rv6）：605位〜622位、
配列番号５５（04＿Rv7）：801位〜820位、
配列番号５６（04＿Rv8）：845位〜862位、
配列番号５７（04＿Rv9）：899位〜916位、
配列番号５８（04＿Rv10）：955位〜972位。
【０１１０】
配列番号４で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号６１〜７８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号６１（06＿Fw2）：153位〜172位、
配列番号６２（06＿Fw3）：1位〜19位、
配列番号６３（06＿Fw4）：32位〜49位、
配列番号６４（06＿Fw5）：268位〜285位、
配列番号６５（06＿Fw6）：376位〜395位、
配列番号６６（06＿Fw7）：445位〜462位、
配列番号６７（06＿Fw8）：492位〜509位、
配列番号６８（06＿Fw9）：556位〜574位、
配列番号６９（06＿Fw10）：581位〜600位、
配列番号７０（06＿Rv2）：282位〜301位、
配列番号７１（06＿Rv3）：100位〜119位、
配列番号７２（06＿Rv4）：184位〜203位、
配列番号７３（06＿Rv5）：386位〜405位、
配列番号７４（06＿Rv6）：516位〜534位、
配列番号７５（06＿Rv7）：575位〜594位、
配列番号７６（06＿Rv8）：656位〜675位、
配列番号７７（06＿Rv9）：686位〜705位、
配列番号７８（06＿Rv10）：703位〜720位。
【０１１１】
また、配列番号５で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号８１〜９２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号８１（10＿Fw2）：388位〜407位、
配列番号８２（10＿Fw3）：2位〜19位、
配列番号８３（10＿Fw4）：122位〜141位、
配列番号８４（10＿Fw5）：207位〜226位、
配列番号８５（10＿Fw6）：298位〜318位、
配列番号８６（10＿Fw7）：459位〜478位、
配列番号８７（10＿Rv2）：541位〜560位、
配列番号８８（10＿Rv3）：150位〜169位、
配列番号８９（10＿Rv4）：276位〜294位、
配列番号９０（10＿Rv5）：370位〜389位、
配列番号９１（10＿Rv6）：453位〜472位、
配列番号９２（10＿Rv7）：593位〜610位。
【０１１２】
配列番号６で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号９５〜１０４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号９５（13＿Fw3）：56位〜75位、
配列番号９６（13＿Fw4）：129位〜148位、
配列番号９７（13＿Fw5）：200位〜219位、
配列番号９８（13＿Fw6）：333位〜352位、
配列番号９９（13＿Fw7）：286位〜305位、
配列番号１００（13＿Rv3）：225位〜244位、
配列番号１０１（13＿Rv4）：242位〜261位、
配列番号１０２（13＿Rv5）：325位〜343位、
配列番号１０３（13＿Rv6）：481位〜500位、
配列番号１０４（13＿Rv7）：416位〜435位。
【０１１３】
配列番号７で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１０７〜１２６で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１０７（14＿Fw3）：11位〜29位、
配列番号１０８（14＿Fw4）：73位〜92位、
配列番号１０９（14＿Fw5）：201位〜220位、
配列番号１１０（14＿Fw6）：413位〜431位、
配列番号１１１（14＿Fw7）：519位〜538位、
配列番号１１２（14＿Fw8）：657位〜674位、
配列番号１１３（14＿Fw9）：596位〜613位、
配列番号１１４（14＿Fw10）：618位〜635位、
配列番号１１５（14＿Fw11）：864位〜883位、
配列番号１１６（14＿Fw12）：806位〜824位、
配列番号１１７（14＿Rv3）：158位〜177位、
配列番号１１８（14＿Rv4）：208位〜227位、
配列番号１１９（14＿Rv5）：337位〜356位、
配列番号１２０（14＿Rv6）：548位〜565位、
配列番号１２１（14＿Rv7）：669位〜688位、
配列番号１２２（14＿Rv8）：782位〜800位、
配列番号１２３（14＿Rv9）：721位〜740位、
配列番号１２４（14＿Rv10）：755位〜773位、
配列番号１２５（14＿Rv11）：978位〜997位、
配列番号１２６（14＿Rv12）：967位〜986位。
【０１１４】
配列番号８で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１２９〜１３８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１２９（15＿Fw3）：28位〜45位、
配列番号１３０（15＿Fw4）：64位〜82位、
配列番号１３１（15＿Fw5）：131位〜148位、
配列番号１３２（15＿Fw6）：348位〜366位、
配列番号１３３（15＿Fw7）：462位〜481位、
配列番号１３４（15＿Rv3）：182位〜200位、
配列番号１３５（15＿Rv4）：197位〜215位、
配列番号１３６（15＿Rv5）：270位〜287位、
配列番号１３７（15＿Rv6）：451位〜470位、
配列番号１３８（15＿Rv7）：619位〜636位。
【０１１５】
尚、上記において、各配列番号の後の（  ）内に、本発明で命名したプライマーの名称を示す。
【０１１６】
本発明のプライマーを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法において記載した通りである。
【０１１７】
また、本発明のプライマーは、標識物質で標識されていてもよい。
【０１１８】
本発明のプライマーを標識する方法としては、この分野で通常行われているオリゴヌクレオチドの標識方法が挙げられ、標識物質毎に適宜方法を選択すればよい。
【０１１９】
本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。
【０１２０】
例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはCyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【０１２１】
本発明のプライマーを放射性同位体により標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。
【０１２２】
本発明のプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野における常法である直接標識法が挙げられる。
【０１２３】
本発明のプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野における常法の標識手法によりプライマーに取り込ませればよい。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換する方法（例えば、Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60−500717 号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。
【０１２４】
本発明のプライマーを発光物質又はビオチンで標識するには、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法に従って行えばよい。
【０１２５】
本発明のM.イントラセルラーレ検出用プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプローブが挙げられる（以下、本発明のプローブと記載する場合がある。）。
【０１２６】
本発明のプローブは、ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドから、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して使用すればよい。但し、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数を考慮して設計することが望ましい。
【０１２７】
例えば、核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザン・ハイブリダイゼーション等）等に用いるプローブとしては、１０〜７００塩基、好ましくは１００〜６００塩基、より好ましくは１００〜５００塩基、更に好ましくは２００〜５００塩基の長さを有しているものが挙げられる。
【０１２８】
例えばリアルタイムＰＣＲ増幅系（例えばTaqManTM法、Molecular Beacon法等）等に用いるプローブとしては、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、更に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有しているものが挙げられる。
【０１２９】
本発明のプローブに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明において記載したものと同じである。
【０１３０】
本発明のプローブの具体例としては、例えば、配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列の一部若しくは全部、又は配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプローブから選ばれるものが挙げられる。
【０１３１】
本発明のプローブの好ましい具体例としては、配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するもの、又は配列番号９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有するものが挙げられる。中でも配列番号１３９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するもの、又は配列番号１３９〜２０３で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有するものが挙げられる。特に好ましいものとしては、配列番号１３９、１４６、１５５、１６４、１７４、１８１、１８７、１９８で表される塩基配列から選ばれる配列を含有するもの、又は配列番号１３９、１４６、１５５、１６４、１７４、１８１、１８７、１９８で表される塩基配列から選ばれる配列に対する相補配列を含有するものが挙げられる。
【０１３２】
尚、配列番号１３９〜２０３で表される塩基配列又は配列番号１３９〜２０３で表される塩基配列に対する相補配列は、本発明のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるオリゴヌクレオチドの塩基配列である。フォワードプライマーとリバースプライマーの組合せと、それを用いたＰＣＲにより増幅される塩基配列の配列番号を表１に併せて示す。例えば、配列番号１３９で表される塩基配列は、配列番号９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅されるオリゴヌクレオチドの塩基配列であることを示す。
【０１３３】
【表１】
0005299548.tif 000002
【０１３４】
本発明のプローブを得る方法は、前記の本発明のヌクレオチドを得る方法において記載した通りである。
【０１３５】
本発明のプローブは、標識物質で標識されていてもよい。
【０１３６】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。
【０１３７】
本発明のプローブを標識するために用いられる標識物質の具体例及び標識方法は、本発明のプライマーの標識方法の説明において記載した通りである。
【０１３８】
また、後述するリアルタイムＰＣＲによる検出法において用いられる標識プローブとしては、本発明のプローブを、リアルタイムＰＣＲ法において通常用いられている標識物質で標識したものが挙げられる。例えば、5'末端がレポーター蛍光物質［カルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン（TET）等］で標識され、3'末端がクエンチャー色素［例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ），4−（（4−（dimethylamino） phenyl）azo）benzoic acid （DABCYL）等の非蛍光物質］で標識された本発明のプローブが挙げられる。
【０１３９】
後述するTaqManTMリアルタイムＰＣＲによる検出法においても、上記した標識プローブを用いることができる。
【０１４０】
本発明に係るM.イントラセルラーレの検出に用いられる試料（被検試料）としては、喀痰、血液、咽頭粘液、胃液、気管支洗浄液、経気管支採取物、胸水などの穿刺液、尿、膿等の各種臨床材料が挙げられる。また、検体から単離、培養された培養菌体、これらより単離、精製された核酸、又は核酸増幅検出系等で増幅された核酸でもよい。
【０１４１】
上記試料からＤＮＡを抽出・精製するには、検体からの抗酸菌（結核菌）のＤＮＡ抽出に用いられる常法に従って行えばよい。
【０１４２】
まず、試料中の菌体の細胞壁を破壊する必要がある。その方法としては、例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理して結核菌等の抗酸菌の膜構造を破壊する方法、菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が用いられる。
【０１４３】
喀痰を検体として用いる場合には、まず前処理として、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention、略称CDC）で推奨しているNALC （N−acetyl−L−cysteine） −NaOH法（Kent PT, Kubica GP, Pubric Health Mycobacteriology, A Guide for the Level III Laboratory, U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, Center for Disease Control, Atlanta, U.S.A., 1985年, p.31−55）による検体の均質化を行うことが望ましい。
【０１４４】
菌体の細胞壁を破壊した後、この分野で一般的なＤＮＡの調製法（フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法等  Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol., 1990, Mar；28（3）, 495−503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim−van Dillen PM, van der Noordaa J）、イソプロパノールを用いて沈殿させる方法等によりＤＮＡの抽出及び精製を行えばよい。
【０１４５】
検体から単離、培養された培養菌体を、M.イントラセルラーレを検出する試料として用いる場合を例にとって示すと、次の通りである。
【０１４６】
例えば小川培地上のコロニーを採取し、滅菌蒸留水に懸濁、遠心分離して菌体を集めた後、蒸留水に再懸濁し、オートクレーブ処理した後、菌体の粉砕処理（ガラスビーズによる物理的破砕等）を経て、さらに遠心分離して上清を回収する。得られた上清からＤＮＡを抽出・精製すればよい。
【０１４７】
ＤＮＡの抽出・精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよいし、この分野における常法（例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、エタノールやイソプロパノール等を用いて沈殿させる方法等）に従って行ってもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic−tip等を用いてＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。
【０１４８】
本発明に係るM.イントラセルラーレの検出方法としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び／又はプローブとして用いる方法（本発明のプライマー及び／又はプローブを用いる方法）が挙げられる。
【０１４９】
例えば、
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法、
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。
【０１５０】
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法
該方法において（Ａ）の、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う方法としては、例えば、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅反応［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（特開昭60−281号公報）、ＬＡＭＰ（Loop−mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000）、ICANTM（Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids）法（臨床病理, 51（11）, 1061−1067, 2003, Nov）、LCR（ligase chain reaction）法（特開平4−211399号）、SDA（strand displacement amplification）法（特開平8−19394号）］を行ってプライマー伸長させる方法が挙げられる。これによりM.イントラセルラーレの塩基配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長産物を測定することにより、M.イントラセルラーレを検出することができる。
【０１５１】
上記の核酸増幅反応を行う方法の中でも、ＰＣＲ法が最も一般的な方法として挙げられ、ＰＣＲ法の例としては、例えばリアルタイム増幅検出系（例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照）を用いることができる。また、リアルタイム増幅検出系による検出系の例として、例えばリアルタイムＰＣＲ検出法が挙げられる。
【０１５２】
リアルタイムＰＣＲ検出法の例としては、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe−ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）等が挙げられる。
【０１５３】
ＰＣＲ等の核酸増幅反応において用いられる本発明のプライマーの具体例は、前記した通りである。
【０１５４】
また、核酸増幅反応に用いられる、好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、前記表１で示される組合せが挙げられる。
【０１５５】
その中でも好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、例えば下記のものが挙げられる。
【０１５６】
（１）フォワードプライマーが配列番号９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１５７】
（２）フォワードプライマーが配列番号２３で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号２４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１５８】
（３）フォワードプライマーが配列番号４１で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号４２で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１５９】
（４）フォワードプライマーが配列番号５９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号６０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１６０】
（５）フォワードプライマーが配列番号７９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号８０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１６１】
（６）フォワードプライマーが配列番号９３で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号９４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１６２】
（７）フォワードプライマーが配列番号１０５で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１０６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ、
【０１６３】
（８）フォワードプライマーが配列番号１２７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号１２８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ。
【０１６４】
上記プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常この分野で用いられているものを用いればよく、その条件、手法等は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、ＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。
【０１６５】
核酸増幅反応で得られたプライマー伸長産物を検出する方法は、通常この分野で行われている常法で良く、限定されるものではない。
【０１６６】
例えばインターカレーター法、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe−ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）、核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法等、様々な検出法が挙げられる。
【０１６７】
これらのうち、一般によく用いられる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１６８】
（Ａ−１）インターカレーター法、
（Ａ−２）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法、
（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、
（Ａ−４）標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法。
【０１６９】
以下に、夫々の方法について説明する。
（Ａ−１）インターカレーター法
公知のインターカレーターを利用してリアルタイムＰＣＲを行う、通常のインターカレーター法が利用できる。
【０１７０】
例えば、本発明のプライマーと、インターカレーターを用い、通常のインターカレーター法を利用したリアルタイムＰＣＲを行う方法が挙げられる。
【０１７１】
即ち、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を発する試薬であり、励起光を照射すると蛍光を発する。ＰＣＲによって増幅を繰り返してＤＮＡが増えると、インターカレーターがそのＤＮＡに取り込まれるので、プライマー伸長産物の生成量に比例して、ＤＮＡに取り込まれていくため、インターカレーターに由来する蛍光強度を検出することにより、プライマー伸長産物の量を知ることができる。
【０１７２】
但しインターカレーターは全ての二本鎖ＤＮＡに結合するので、得られた蛍光強度の測定結果を基に、必要に応じ、融解曲線分析を行う。即ち、ＰＣＲ後にＰＣＲ反応液の温度を徐々に上げながら、インターカレーター由来の蛍光強度を測定する。最初はＰＣＲ増幅産物は二本鎖を形成しているので蛍光を発しているが、ＰＣＲ反応液の温度がある一定の温度に達すると一本鎖に解離するので、インターカレーター由来の蛍光は急激に低下する。この時の温度が融解温度（Ｔｍ値）であり、プライマー伸長産物の配列に固有の値である。そのピークが、目的とする特異産物のピークか、又は非特異産物のピークかについては、このＴｍ値から判定することができる。
【０１７３】
このインターカレーター法は、リアルタイムＰＣＲの後に電気泳動を行う必要がないので、臨床検査の分野等において、迅速に判定を行う必要がある場合には、有効な方法である。
【０１７４】
本発明に用いられるインターカレーターとしては、通常この分野で用いられているインターカレーターであれば、何でも用いることができるが、例えばSYBRTM Green I （Molecular Probe社商品名）、エチジウムブロマイド、フルオレン等がある。
【０１７５】
本発明に係る「インターカレーター法を利用したM.イントラセルラーレの検出方法」の例を説明すると、以下の通りである。
【０１７６】
本発明のプライマーと、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）を用い、M.イントラセルラーレを検出する試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲを行う。そして前記した温度を上げる方法で、プライマー伸長産物に対してインターカレーションするインターカレーター（SYBRTM Green I）由来の蛍光量を測定する。
【０１７７】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光量の１次微分（変化量）をとり、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行うことによって、ピークの検出を行い、単一のピークが得られた場合に、被検試料はM．イントラセルラーレ陽性（即ち、M.イントラセルラーレ菌、又はその遺伝子が存在する。以下同じ。）と判定される。
【０１７８】
又は、精製ＤＮＡ試料溶液の希釈系列を調製し、各希釈系列毎に、上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行う。次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光量の１次微分（変化量）をとり、融解曲線を作成して、増幅産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行う。
【０１７９】
この場合のM．イントラセルラーレの検出方法としては、融解曲線解析で各希釈系列に対する各プライマー伸長産物について、同一のＴｍ値のピークが検出された場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性と判定すればよい。
【０１８０】
また、インターカレーター法を利用した方法で得られた測定値をもとに、リアルタイムＰＣＲにおいて行われる情報に従って、検量線を作成することもできるので、その検量線を用いて試料中にあるM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。
検量線の作成方法及びそれを用いたM.イントラセルラーレの定量方法は後記する。
【０１８１】
本発明に係るインターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ検出法によるM.イントラセルラーレの検出方法の一例として、前記した「プライマー02＿Fw1」と「プライマー02＿Rv1」を用いて、M.イントラセルラーレを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。
【０１８２】
まず、公知の方法により、M.イントラセルラーレを検出する試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。
【０１８３】
別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（02＿Fw1）、及び配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（02＿Rv1）を合成する。
【０１８４】
上記で合成した02＿Fw1をフォワードプライマーとして、02＿Rv1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。
【０１８５】
即ち、プライマー02＿Fw1と、プライマー02＿Rv1を各50〜2000nM、インターカレーター［例えばSYBRTM Green I （Molecular Probe社商品名）］を原液の約5000〜100000倍希釈、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2% TritonX−100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位／mLのポリメラーゼ（例えばTaq DNA ポリメラーゼ）を含有する10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。該ＰＣＲ用反応液に、M.イントラセルラーレを検出する試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を加え、ＰＣＲ用試料とする。このＰＣＲ用試料を９６穴反応プレートのウェルに入れ、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にプライマー伸長産物に対してインターカレーションするインターカレーター（例えばSYBRTM Green I）由来の蛍光量を測定する。
【０１８６】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光量の一次微分（変化量）をとり、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行い、単一のピークが得られた場合に、被検試料はM．イントラセルラーレ陽性と判定される。
【０１８７】
又は、精製ＤＮＡ試料溶液の希釈系列を調製し、各希釈系列毎に、上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行う。次いで横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光量の１次微分（変化量）をとり、融解曲線を作成して、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、検出ピークの解析を行う。
【０１８８】
この場合のM.イントラセルラーレの検出方法としては、融解曲線解析で各希釈系列に対する各プライマー伸長産物について、同一のＴｍ値のピークが検出された場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性と判定される。
【０１８９】
また、対照として、M.イントラセルラーレ以外のマイコバクテリウム属菌由来ＤＮＡを常法により抽出・精製し、これを鋳型として用いる以外は、上記と同様の方法にしてリアルタイムＰＣＲを行い、同様にSYBRTM Green Iの蛍光量を測定し、融解曲線解析を行ってもよい。この場合は、試料中にM.イントラセルラーレ由来の配列がないので、融解曲線解析でピークは出現しないはずである。M.イントラセルラーレの有無の判定をより確実にするためには、上記した対照実験を一緒に行うことが望ましい。
【０１９０】
更に、検量線を作成することによって、試料中のM．イントラセルラーレのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることができる。また、その数はM．イントラセルラーレの数に比例するので、試料（被検試料）中のM．イントラセルラーレの数も知ることができる。
（Ａ−２）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（TaqManTMプローブ法）
TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法は、5'末端を例えばFAM等の蛍光色素（レポーター）で、3'末端を例えばTAMRA等のクエンチャー色素で標識した標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法で、目的の微量なＤＮＡを高感度且つ定量的に検出することができる方法である（例えば米国特許第5,538,848号の記載参照）。
【０１９１】
具体的には、配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部又は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の5'末端がレポーター蛍光色素で標識され、3'末端がクエンチャー色素で標識されたものを標識プローブとして用いて、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、該標識プローブから遊離された標識物質の標識を検出する方法である。
【０１９２】
TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法の原理は以下の通りである。
【０１９３】
この方法には、5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光標識プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光標識プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングする方法であり、これにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【０１９４】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出系に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーには、本発明のプライマーが用いられる。好ましいプライマーとしては、前記したＰＣＲ法等の核酸増幅反応において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも前記した通りである。
【０１９５】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出系に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、前記した本発明のプローブであればよい。実際には、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せでリアルタイムＰＣＲを行った場合に得られると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を含有するプローブ、又は更にその配列から設計される塩基配列を含有するプローブが用いられる。例えば、02＿Fw1（配列番号９で表される塩基配列を持つ）と02＿Rv1（配列番号１０で表される塩基配列を持つ）の二つのプライマーの組み合わせを用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合に用いられるプローブは、そのリアルタイムＰＣＲで増幅されると予想される配列番号１３９の塩基配列を含有するヌクレオチドか、配列番号１３９の塩基配列から設計される配列（例えば配列番号２０４で表される配列）を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１９６】
標識プローブの５’末端を標識するレポーター蛍光物質としてはカルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、Cy5、VIC等が挙げられるが、中でもFAMがよく用いられる。３’末端を標識するクエンチャー色素としては、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（例えばBHQ2），4−（（4−（dimethylamino） phenyl）azo）benzoic acid （DABCYL）等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもTAMRAがよく用いられる。
【０１９７】
リアルタイムＰＣＲ検出系に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、リアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、リアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。
【０１９８】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出系によるM.イントラセルラーレの検出方法の一例を説明すると、以下の通りである。
【０１９９】
まず、公知の方法（例えば前記した方法）に従い、M.イントラセルラーレを検出する試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（02＿Fw1）、及び配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（02＿Rv1）を合成する。
【０２００】
また、02＿Fw1及び02＿Rv1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅されると予想される配列番号１３８の塩基配列から、プローブとして利用するための配列（例えば配列番号２０４で表される配列）を設計し、この塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、３’末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。
【０２０１】
上記で調製した02＿Fw1をフォワードプライマーとして、02＿Rv1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。
【０２０２】
即ち、各0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマー02＿Fw1及びプライマー02＿Rv1、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl2 、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2% TritonX−100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位／mLのTaq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを含有する10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。このＰＣＲ用反応液20μLに精製ＤＮＡ試料1ngを加え、ＰＣＲ用試料を得る。このＰＣＲ用試料を９６穴反応プレートのウェルに入れ、適当なリアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光量を測定する。
【０２０３】
この場合のM.イントラセルラーレ検出方法としては、レポーター色素の蛍光が測定された場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性と判定される。
【０２０４】
また、リアルタイムＰＣＲ法では、検量線を作成することができるので、試料中のM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はM.イントラセルラーレの数に比例するので、試料（被検試料）中のM.イントラセルラーレの数も知ることができる。
【０２０５】
検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知のM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を調製する。次いで各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いて上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、レポーター色素の蛍光量を測定する。各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対する、測定した蛍光量の測定値（Rn、ｙ軸）をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、蛍光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の増幅曲線が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。
【０２０６】
インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行って、得られた測定値を基に同様に検量線を作成することができる。例えば、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対するインターカレーター由来の蛍光量の測定値（Rn、ｙ軸）をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、上記と同じ方法でCt値を得、リアルタイムＰＣＲに用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。
【０２０７】
試料中のM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、先ずM.イントラセルラーレを検出する試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。
【０２０８】
（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法
この方法としては、例えば
「下記工程
（i）配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（ii）上記（i）で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてM.イントラセルラーレの有無を判定する、
を包含することを特徴とするM.イントラセルラーレの検出方法」が挙げられる。
【０２０９】
電気泳動を行い、その結果に基づいて、M.イントラセルラーレの有無を判定する方法としては、例えば
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法、
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法
等が挙げられる。
【０２１０】
核酸増幅反応の具体例は、前記した通りである。
【０２１１】
電気泳動法の条件、操作方法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。
【０２１２】
以下に、（Ａ−３−１）及び（Ａ−３−２）の方法について説明する。
【０２１３】
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法
例えば、まず本発明のプライマーから、適当なフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを選択し、それを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う。次いで、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、核酸増幅反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せから、増幅されるであろうプライマー伸長産物の大きさ（塩基対数）を予測しておき、得られた電気泳動画分が予測された大きさのプライマー伸長産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた電気泳動画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、そのプライマー伸長産物の特徴的大きさ（塩基対数）により確認する等の方法が挙げられる。
【０２１４】
（Ａ−３−１）の方法による具体的な判定方法としては、例えば前記した表１に記載されたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、そのプライマーの組合せで増幅されると予想される、表１に記載の配列番号で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド、又はその塩基対数の大きさの画分が確認された場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性と判定する方法が挙げられる。
【０２１５】
これらの方法の中のより好ましい方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。
（１）配列番号９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１５５塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１３９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２１６】
（２）配列番号２３で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１５９塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１４６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２１７】
（３）配列番号４１で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４２で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１７９塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１５５で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２１８】
（４）配列番号５９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１５７塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１６４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２１９】
（５）配列番号７９で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８０で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１６０塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１７４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２０】
（６）配列番号９３で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９４で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１７２塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１８１で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２１】
（７）配列番号１０５で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１８１塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１８７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２２】
（８）配列番号１２７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１５２塩基対のオリゴヌクレオチド画分又は配列番号１９８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。
【０２２３】
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法
例えば核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物について、電気泳動を行う。得られた電気泳動画分について、本発明のプローブを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行う。該標識プローブの標識を検出することによって、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料は、M．イントラセルラーレ陽性と判定する方法が挙げられる。
【０２２４】
用いられるプローブ及びプローブを標識する標識物質の具体例、並びにプローブの標識方法は、前記した通りである。
【０２２５】
その一例を示すと、次の通りである。即ち、前記した表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、ＰＣＲに用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せで増幅されると予測される、表１に記載の配列番号の塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを調製しておく。電気泳動画分の該標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料はM．イントラセルラーレ陽性である、と判定する方法、が挙げられる。
【０２２６】
これらの方法の好ましい具体例としては、例えば、下記の方法が挙げられる。
（１）配列番号９で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について、配列番号１３９で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２７】
（２）配列番号２３で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２４で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１４６で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２８】
（３）配列番号４１で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４２で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１５５で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２２９】
（４）配列番号５９で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６０で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１６４で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２３０】
（５）配列番号７９で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８０で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１７４で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２３１】
（６）配列番号９３で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９４で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１８１で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２３２】
（７）配列番号１０５で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０６で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１８７で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法、
【０２３３】
（８）配列番号１２７で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２８で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について配列番号１９８で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。
【０２３４】
（Ａ−３）の方法による、本発明のM.イントラセルラーレの検出方法の詳細を、例えば02＿Fw1をフォワードプライマーとして用い、02＿Rv1をリバースプライマーとして用いたＰＣＲ、及び電気泳動を行った後、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物画分を確認する方法によって検出する場合（上記の（Ａ−３−１）の（１）の方法）を例に挙げて説明すると、以下の通りである。
【０２３５】
まず、公知の方法（例えば前記した方法）に従い、M.イントラセルラーレの有無を検出する試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。別に、前記した方法で、本発明に係るヌクレオチドから、ＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホアミダイト法にて、02＿Fw1（配列番号９で表される配列を持つオリゴヌクレオチド）及び02＿Fw1（配列番号１０で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド）を合成する。
【０２３６】
各0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマー02＿Fw1及びプライマー02＿Rv1、1.0〜4.0mM MgCl2 、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、夫々0.1〜0.6mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及び10〜80単位／mLのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris−HCl（pH8.9）緩衝液を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。
【０２３７】
ＰＣＲ用反応液に精製ＤＮＡ試料を添加したものをＰＣＲ用試料として用い、ＤＮＡサーマルサイクラーにて、20〜40回ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ後の反応液を、１.５％アガロースゲル電気泳動する。次いでエチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。また、分子量マーカーも反応液と同時に電気泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出する。フォワードプライマーとして02＿Fw1、及びリバースプライマーとして02＿Rv1を用いたＰＣＲでは、M.イントラセルラーレの塩基配列中の155塩基対のＤＮＡ断片（配列番号１３９で表される塩基配列を持つ。）が複製されると予測される。そこで、155塩基対の大きさの蛍光バンドが確認された場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性と判定すればよい。
【０２３８】
また本発明は、核酸増幅工程において、ＲＮＡ転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第2650159号）、３ＳＲ（self−sustained sequence replication）法（特公平7−114718号）、ＴＡＳ（transcription based amplification system）法（特表平2−500565号：国際公開WO88／10315号）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）法（特開平11−46778号）などが挙げられるが、中でも逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させる。）を利用する一定温度核酸増幅法が測定系の自動化には適する。
【０２３９】
（Ａ−４）標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法、
本発明のプライマーを前記した方法で標識した標識プライマーを用い、被検試料中の核酸を鋳型として用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を検出・測定し、標識を検出できた場合には、その被検試料M.イントラセルラーレ陽性である、と判定する方法が挙げられる。この方法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、前記のＰＣＲ法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも前記した通りである。
【０２４０】
上記方法の場合、核酸増幅反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定し、標識を検出できた場合に、被検試料はM.イントラセルラーレ陽性であると判定すればよい。
【０２４１】
遊離の標識プライマーを除く方法としては、核酸増幅反応反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長産物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。
【０２４２】
また、核酸増幅反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長産物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。
【０２４３】
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法
更に、本発明のM．イントラセルラーレの検出方法として、配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を標識物質で標識したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。
【０２４４】
具体的には、例えば下記のような方法が挙げられる。
（Ｂ−１）本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合させたものを捕捉プローブとして用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のM.イントラセルラーレ由来の核酸を固相上に固定化させる検出法（例えば、特開昭62−265999号の記載参照）。この場合、本発明のオリゴヌクレオチドあるいは固相担体が、標識物質で標識されていてもよい。
（Ｂ−２）標識されていない（B−1）の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとM.イントラセルラーレ由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特開昭58−40099号の記載参照）を行う方法。
（Ｂ−３）ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のM.イントラセルラーレ由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法。
【０２４５】
尚、本発明のM.イントラセルラーレの検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０２４６】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。
【０２４７】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。
【０２４８】
本発明に係るM.イントラセルラーレ検出用試薬キットとしては、「配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）又は／及びプローブ（本発明のプローブ）として含んでなるM.イントラセルラーレ検出用試薬キット。」が挙げられる。プライマーは標識物質で標識されたものであってもよい。その標識物質の具体例は前記した通りである。
【０２４９】
上記キットを構成する本発明のプライマー及び本発明のプローブの具体例は、前記した「本発明のプライマー」、「本発明のプローブ」についての説明に記載した通りである。
【０２５０】
本発明のプライマーは標識物質で標識されたものであってもよい。その標識物質の具体例は前記した通りである。
【０２５１】
本発明のプライマーを含んでなるキットには、フォワードプライマーとリバースプライマーの一組のプライマーを含む組成も含まれる。その好ましい実施態様としては、前記表１に記載のプライマーの組合せを含む組成が挙げられる。
【０２５２】
例えば下記のものが挙げられる。
（１）（a）配列番号９で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号９で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号１０で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１０で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５３】
（２）（a）配列番号２３で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号２３で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号２４で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号２４で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５４】
（３）（a）配列番号４１で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号４１で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号４２で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号４２で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５５】
（４）（a）配列番号５９で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号５９で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号６０で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号６０で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５６】
（５）（a）配列番号７９で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号７９で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号８０で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号８０で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５７】
（６）（a）配列番号９３で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号９３で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号９４で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号９４で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５８】
（７）（a）配列番号１０５で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１０５で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号１０６で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１０６で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２５９】
（８）（a）配列番号１２７で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１２７で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）配列番号１２８で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１２８で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.イントラセルラーレ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
【０２６０】
上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして含んでいてもよい。
【０２６１】
更に、「本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして含んでなるM.イントラセルラーレ検出用試薬キット。」が挙げられる。該プローブは標識物質で標識されたものであってもよい。
【０２６２】
これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は前記した通りである。
【０２６３】
尚、本発明のM.イントラセルラーレの検出用試薬キットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０２６４】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。
【０２６５】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。
【０２６６】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【０２６７】
尚、実施例で用いられる細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
【実施例】
【０２６８】
実験例１．M.イントラセルラーレゲノム由来のクローンの選択
（１）ＤＮＡ試料の調製
まず、小川培地上で培養したM.イントラセルラーレ（ATCC13950）のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した後、菌体の粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）を経て、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、（株）キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic−tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行った。
【０２６９】
得られた精製ゲノムＤＮＡ断片を、最終400ng／μL（10mM Tris−HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、M．イントラセルラーレ由来ＤＮＡ試料として用いた。
【０２７０】
また、ポジティブコントロール用に、rps1（配列番号２０５で表される配列のＤＮＡフラグメント、M.イントラセルラーレに特異的な配列、特許文献１に記載）、IS6110 element（配列番号２０６で表される配列のＤＮＡフラグメント、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌）が持つ配列）、M.kansasiiのKATS2 sequence（配列番号２０７で表される配列のＤＮＡフラグメント、M.kansasiiに特異的な配列、特開平11−155589号公報）、ネガティブコントロールとしてM.aviumのMAV19K（配列番号２０８で表される配列のＤＮＡフラグメント、M.aviumに特異的な配列、特開平11−06999号公報に記載）及び大腸菌のＤＮＡの抽出方法の常法に従いＤＮＡを抽出，精製した大腸菌由来のＤＮＡ、を用いて夫々同様にＤＮＡ試料を調製し、同様に以下の処理を行った。
【０２７１】
（２）Whole Genome Shotgun libraryの作製
上記（1）で得られたM．イントラセルラーレ由来ＤＮＡ試料24μgを材料として用い、以下の方法（Science. 2001 Feb 16；291（5507）：1304−1351 Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変）で、Whole Genome Shotgun libraryの作製を行った。
【０２７２】
まず、終濃度20%のグリセロール存在下で、5kPa〜9kPaの圧力下、ネビュライザー（インビトロジェン社製）を用いて約10分間処理して、M．イントラセルラーレ由来ＤＮＡ試料を断片化した。この処理方法により、目的とする500〜1000塩基対のサイズ画分を効率よく回収する事ができた。得られた画分を（株）キアゲン製の抽出カラムを利用して精製した。
【０２７３】
次に、タカラバイオ社製のＤＮＡ Blunting Kitを用い、T4 DNA Polymeraseの5'→3'polymerase活性と3'→5'exonuclease活性を利用して、得られたＤＮＡ断片の末端を平滑化した。このＤＮＡ断片と、平滑末端処理済みpBSII sk＋ベクター（Stratagene社）とでライゲーション反応を行い、ＤＮＡ断片をpBSII sk＋ベクター（ampｒ）に組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。
【０２７４】
タカラバイオ社製E. coli JM109 Competent Cellsを用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えＤＮＡを用いてE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行った。得られた形質転換体を100μg／mLのアンピシリン、0.2 mM IPTG、40μg／mL X−Galを含むLB−寒天培地にプレート培養した。白色コロニーをピックアップし、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組み換えＤＮＡが導入された、形質転換体のlibrary（M．イントラセルラーレのゲノム由来のWhole Genome Shotgun clone library）を得た。
【０２７５】
（３）マイクロアレイ作製
上記（2）で得られた形質転換体のlibrary（M．イントラセルラーレのゲノム由来のWhole Genome Shotgun clone library）を用い、下記の方法でＰＣＲを行って、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。
【０２７６】
まず、各１μMのプライマーM13 Primer M1（タカラバイオ社製）及びプライマーM13 Primer RV（タカラバイオ社製）、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg／mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X−100（トリトンX−100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（（株）ニッポン・ジーン製）40単位／mL を含有する10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。
【０２７７】
上記（２）で得られた形質転換体（M．イントラセルラーレのゲノム由来のWhole Genome Shotgun clone）のそれぞれから、常法に従いＤＮＡを精製した。この精製したＤＮＡ（テンプレートとなる）をＰＣＲ用反応液20μLに懸濁添加したものを調製し、ＰＣＲ用試料とした。このＰＣＲ用試料を用い、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクル ＰＣＲを行った。
【０２７８】
ＰＣＲ反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。
【０２７９】
得られたＰＣＲ増幅産物を精製後、固定化Buffer（終濃度3x SSC）と混合した。
【０２８０】
スポットされるＰＣＲ産物の終濃度が300ng／μLとなるように調整し、装置内の湿度を55%に設定したタイピング用装置（GTMAS Stamp II； 日本レーザ電子社製）を使用し、スライドガラス（CMT GAPS−II； Corning社製）上に、上記で得られたＰＣＲ産物をスポットした（スポット径150−250μm）。スポットが終了したスライドガラスをUVクロスリンカー（UV Stratalinker1800； Stratagene社製）に移し、150mJ／cm2のUV照射を行なって、ＰＣＲ増幅産物（目的のＤＮＡ）をスライドガラス上に固定化し、マイクロアレイ（M．イントラセルラーレゲノム由来ＤＮＡのWhoule Genome Shotgun clone libraryを材料としたマイクロアレイ、合計1100クローン）を作製した。
【０２８１】
前記（1）で得られたポジティブコントロール用ＤＮＡ試料（rps1、IS6110 element、KATS2 sequence）、及びネガティブコントロール用ＤＮＡ試料（MAV19K、大腸菌由来ＤＮＡ）についても、同様に前記（2）のWhole Genome Shotgun libraryの作製及び上記（3）のマイクロアレイの作製を行い、スライドガラス上に夫々のマイクロアレイを作製した。
【０２８２】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識とマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）を利用し、標的ゲノムＤＮＡフラグメントの蛍光色素標識を行った。
まず、M.intracellulare（ATCC16950）から常法により抽出・精製したゲノムＤＮＡ 2μgに、製品中のrandom primer solution 20μLを混合した後、熱変性（９５℃、5分間）処理を行い、サンプル溶液を得た。別に、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌、日本細菌学会から供与された。）、及びM.kansasii（ATCC12478）から常法により夫々ゲノムＤＮＡを抽出・精製し（対照用ゲノムＤＮＡ）、各々についても同様に処理を行い、サンプル溶液を得た。
【０２８３】
次いで、得られたサンプル溶液夫々に、0.1M DTT 2μL、dATP／dCTP／dGTP（各5ｍM）の混合液 2μL、2.5ｍM dTTP 0.8μL、5ｍM Ha−dUTP 1.6μL、Klenow酵素（40U／μL） 1μLを添加し、total volume＝50μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、37℃で3時間の伸長反応を行った。マイクロコンYM−30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5mL チューブにセットし、上記で得られた反応産物をカラムにのせ、14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機（CentriVap concentrator； LABCONCO社製）で完全に乾燥させた。
【０２８４】
乾燥させた上記反応産物に、50ｍM NaHCO3 を10μL 加え混合し、2〜3 分常温で静置した（以下、「反応産物溶液」と称する。）。
【０２８５】
別に、１mg のCy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社）又はCy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を105μL のDMSO に溶かしたものを調製した（Cy−dye Solution Cy3、Cy−dye Solution Cy5）。このCy−dye Solution Cy3 10μL を対照用ゲノムＤＮＡフラグメント（M. bovis由来、M.kansasii由来）を用いて得られたサンプル溶液夫々に加え、40℃で60 分インキュベート（遮光）を行った。また、Cy−dye Solution Cy5 10μL をM．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記サンプル溶液に加え、40℃で60 分インキュベート（遮光）を行った。
【０２８６】
さらに、インキュベート後の、夫々の上記反応産物溶液に、4M NH2OH（使う直前に調製する）を10μL 加え、攪拌後、15 分インキュベート（遮光）を行い、夫々の標識産物、即ちM. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡをCy3で標識した標識産物、M.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡをCy3で標識した標識産物、及びM.イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡをCy5で標識した標識産物を得た。
【０２８７】
マイクロコンYM−30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5mL チューブにセットし、上記で得られた各ゲノムＤＮＡの標識産物をカラムにのせ、14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機（CentriVap concentrator； LABCONCO社製）で完全に乾燥させた。
【０２８８】
iｉ）標識産物の断片化工程
上記（4） i）で得られた乾燥状態のゲノムＤＮＡの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris−acetate（pH8.1）、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、ゲノムＤＮＡの標識産物を断片化した生成物を得た。
【０２８９】
尚、BcaBEST DNA Polymerase（タカラバイオ社製）及びrBst DNA Polymerase（EPICENTRE社製）を用いてラベル化効率（base／dye）を調べた結果、Cy3標識の実験結果ではM. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡ、M.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡともに、約20塩基にdye 1分子が取り込まれていることを確認している。また、Cy5標識の実験結果では、M．イントラセルラーレゲノムＤＮＡの約10塩基にdye 1分子が取り込まれていることを確認している。
【０２９０】
得られたCy3標識産物溶液及びCy5標識産物溶液を混合し、マイクロコンYM−10（ミリポア社製）の限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機（CentriVap concentrator； LABCONCO社製）で完全に乾燥させた。次いで、マイクロチューブに以下の試薬を加え、懸濁混和して標識産物を溶解させ、M. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物とM.イントラセルラーレゲノム由来ＤＮＡのCy5標識産物のCy3Cy5標識産物混合溶液と、M.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物とM.イントラセルラーレゲノム由来ＤＮＡのCy5標識産物のCy3Cy5標識産物混合溶液を得た。
【０２９１】
ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）；40μL
salmon sperm DNA（10mg／mL）            ；0.5μL
formamide                               ；5μL
Total 40〜50μL
得られたCy3Cy5標識産物混合溶液を、95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。
【０２９２】
iii）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
前記（3）の工程により、M．イントラセルラーレのWhole Genome shotgun clone、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして用いるDNAフラグメントの各々のスポットを同一のスライドガラス上に集積したマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）が作製される。
上記（4）ii）で得られたCy3Cy5標識産物混合溶液をマイクロアレイ上にのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいたものの上にのせて密閉し、遮光下に65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップをカバーガラスごと2×SSC−0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でＤＮＡチップを静かに揺らしてカバーグラスをはずした。次いで1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにＤＮＡチップをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。
【０２９３】
（５）蛍光強度の測定：シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナー（Protein Array Scanner；日本レーザ電子社製）を用いて、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）上の蛍光強度を測定した。この際、Cy3標識産物とCy5標識産物を用いた競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、２チャンネル、即ち2ch（Cy3、Cy5）での蛍光検出データを得た。
【０２９４】
蛍光シグナルの数量化は日立ソフト社製のDNASISTM−Array（ＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア）を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行った。また、信頼性限界ラインを定め、それ以下の領域のデータは扱わない事で正規化され信頼性のある蛍光強度比を求めた。
【０２９５】
マイクロアレイチップ上には、M.イントラセルラーレの菌体由来のＤＮＡ、ポジティブコントロール（rps1：M.イントラセルラーレに特異的な配列のＤＮＡフラグメント、IS6110 element：M. bovisに特異的な配列のＤＮＡフラグメント、KATS2 sequence：M.kansasiiに特異的な配列のＤＮＡフラグメント）及びネガティブコントロール（MAV19K：M.Aviumに特異的な配列のＤＮＡフラグメント、大腸菌由来ゲノムＤＮＡの断片）がスポットされている。
【０２９６】
まず、M. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物とM．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡのCy5標識産物の混合物を用いてマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションを行い、蛍光強度を測定して、Cy3／Cy5の蛍光強度比（Ratio）を求めた。即ち、あるマイクロアレイ上のスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ増幅産物）は、Cy5標識産物、即ちM．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。他方、あるマイクロアレイ上のスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片は、M．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡに対する特異性が弱く、Cy3標識産物、即ちM. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。この方法で、マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出し、蛍光強度が高く、且つCy3に対するCy5の蛍光強度比が高いスポットの上位５０スポットを選択した。
【０２９７】
同じマイクロアレイについて、M.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物とM．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡのCy5標識産物の混合物を用いて同様にマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション、蛍光強度の測定及び蛍光強度比を測定した。この場合は、あるスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ増幅産物）は、Cy5標識産物、即ちM.イントラセルラーレゲノム由来ＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。他方、あるスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片は、M．イントラセルラーレ由来ゲノムＤＮＡに対する特異性が弱く、Cy3標識産物、即ちM.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出し、蛍光強度が高く、且つCy3に対するCy5の蛍光強度比が高いスポットの上位５０スポットを選択した。
【０２９８】
M. bovis由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物を用いた場合に選択された上位５０スポットと、M.kansasii由来の対照用ゲノムＤＮＡのCy3標識産物を用いた場合に選択された上位５０スポットを比較し、両方の場合に共通するスポットで、rps1（M.イントラセルラーレに特異的な配列）のスポットよりも更に強いCy5の蛍光が検出されたスポット１６個を選択した。このスポットは、M. bovisよりも、M.kansasiiよりも、更にrps1よりもM.イントラセルラーレに対する特異性が高いと判断された。そこで、この１６クローンを先ず一次候補クローンとして選定した。
【０２９９】
（６）一次候補クローンの塩基配列決定
次に、選択された一次候補の１６クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。
【０３００】
即ち、Big Dye Terminatorキット（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、製品プロトコールに従い以下の手順でシークエンス解析を行った。
【０３０１】
一次候補ＤＮＡ（一次候補クローン）      ；2μL（100ng）
M13 Primer M1              ；1μL（5pmoL）
premix                       ；8μL
【０３０２】
上記の混合物に、総volume＝20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。
【０３０３】
96℃ 2 min → （96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min）×25 →4℃
【０３０４】
得られたシークエンス反応産物をQIAGEN社製ゲルろ過カラムで精製後、MJ Research社製のシークエンサー（BaseStation）を用い、機器付属の手順書に従い候補配列すべてのシークエンス（塩基配列）解読を完了した。
【０３０５】
得られた結果をデータベース（NCBI BLAST及びCHEMICAL ABSTRACT）で検索した結果、M.イントラセルラーレがゲノム配列未解読の生物種であるにも起因するが、データベース上では一次候補の１６クローン全てが、未登録の新規な配列であった。
【０３０６】
（７）二次候補クローンの選択
１）ＰＣＲプライマーの合成
まず、決定された一次候補１６クローンのシークエンスの解析結果に基づき、夫々の一次候補クローンについて、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3（Whitehead Institute for Biomedical Research.）を用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列を設計し、更にその結果を基にＰＣＲに使用可能と推測されるフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを設計した。
【０３０７】
ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。
【０３０８】
次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、合成オリゴヌクレオチドを精製した。
【０３０９】
２）プローブの作製
夫々の一次候補クローン毎に設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いたＰＣＲで増幅されると予測される塩基配列から、プローブとして利用するための配列を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、３’末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。
【０３１０】
３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
別に、M.イントラセルラーレから、常法に従いゲノムＤＮＡ試料を調製した。また、対照としてEscherichia coli、及び１８菌種のマイコバクテリウム属細菌（M.tuberculosis、M.kansasii、M.marinum、M.simiae、M.scrofulaceum、M.gordonae、M.szulgai、M.avium、M.gastri、M.xenopi、M.nonchromogenicum、M.terrae、M.triviale、M.fortuitum、M.chelonei、M.abscessus、M.peregrinum）から、常法に従いＤＮＡ試料（対照用）を調製した。得られたＤＮＡ試料について、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、既知の各菌体のゲノムＤＮＡ量と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μLのゲノムＤＮＡが得られた。
【０３１１】
次いで10mM Tris−HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー／μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。
【０３１２】
４）リアルタイムＰＣＲ
上記１）で調製したフォワードプライマーとリバースプライマーを用い、下記の通りリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３１３】
即ち、一次候補クローンひとつから設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマー各１μM、195nMの上記（2）で調製した蛍光標識プローブ、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg／mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX−100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（（株）ニッポン・ジーン製）40単位／mL を含有する10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とした。
【０３１４】
反応液20μLに各希釈系列のＤＮＡ試料１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを９６穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光量を測定した。尚、蛍光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。
【０３１５】
尚、ひとつの一次候補クローン毎に、それぞれその塩基配列を本に設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、M.イントラセルラーレ由来ＤＮＡ試料、マイコバクテリウム属菌体由来ＤＮＡ試料１８種、及び大腸菌ＤＮＡ由来試料を夫々鋳型として９６穴反応プレートを用いて、夫々のリアルタイムＰＣＲを一度に行った。
【０３１６】
５）二次スクリーニング
上記４）で得られたリアルタイムＰＣＲの結果から、M.イントラセルラーレのゲノム由来ＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られ、その他の菌体由来ゲノムＤＮＡ（対照）を鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られなかったプライマーの組合せを選択した。そして、そのプライマーの組合せを設計した候補クローンを、最終的なM.イントラセルラーレに特異的な候補クローンとして選択した。
【０３１７】
選択された候補クローンは、以下の８クローンである。尚、特に記載しない限り、以下、一次スクリーニングで選択された候補クローンを「一次候補クローン」と呼び、二次スクリーニングで最終的に選択された候補クローンを、単に「候補クローンと」呼ぶ。）
・候補クローン１：配列番号１で表されるヌクレオチド配列を持つ６６７塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン２：配列番号２で表されるヌクレオチド配列を持つ１１２９塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン３：配列番号３で表されるヌクレオチド配列を持つ１００３塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン４：配列番号４で表されるヌクレオチド配列を持つ７４８塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン５：配列番号５で表されるヌクレオチド配列を持つ６１９塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン６：配列番号６で表されるヌクレオチド配列を持つ５１１塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン７：配列番号７で表されるヌクレオチド配列を持つ１００６塩基のオリゴヌクレオチド
・候補クローン８：配列番号８で表されるヌクレオチド配列を持つ７０２塩基のオリゴヌクレオチド
【０３１８】
実施例１．候補クローンのM.イントラセルラーレ特異性評価
実験例１で得られた候補８クローンについてＰＣＲ増幅系を利用した評価実験を実施し、これらの候補クローンが、遺伝子増幅検出系を用いたM.イントラセルラーレの特異的検出系に利用できるかどうかを調べた。
（１）ＰＣＲプライマーの合成
まず、決定された候補クローン１のシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3（Whitehead Institute for Biomedical Research.）を用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列、即ち「５’−GTTCAGCAGATCGTCGTAGG−３’」（配列番号９）及び「５’−CTCTTGACGAGGCAAAACAT−３’」（配列番号１０）のオリゴヌクレオチドを設計した。以下、配列番号９で表される塩基配列のプライマーを「02＿Fw1」、配列番号１０で表される塩基配列のプライマーを「02＿Rv1」という。
【０３１９】
次いで、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、合成オリゴヌクレオチドを精製した。
【０３２０】
（２）試料の調製
Escherichia coli （E. coli、大腸菌）（ATCC11775）、及び１８種のマイコバクテリウム属細菌、即ちMycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）（TMC102［H37Rv］）、M.イントラセルラーレ（ATCC13950）、Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム.カンサシ）（ATCC12478）、Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）（ATCC927）、Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）（ATCC25275）、Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）（ATCC19981）、Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）（ATCC14470）、Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）（ATCC35799）、Mycobacterium avium（マイコバクテリウム・アビウム）（ATCC25291）、Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）（ATCC15754）、Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）（ATCC19250）、Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）（ATCC19530）、Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）（ATCC15755）、Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）（ATCC23292）、Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）（ATCC6841）、Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）（ATCC35752）、Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）（ATCC19977）、Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）（ATCC14467）を用い、下記の方法でＤＮＡを抽出・精製し、ＤＮＡ試料を得た。
【０３２１】
まず、Mycobacterium tuberculosisは、Mycos Research, LLCから精製ゲノムＤＮＡを入手し、それを精製ＤＮＡとして用いた。
【０３２２】
それ以外の細菌については、American Type Culture Collection （ATCC）から菌株を入手し、下記の方法でＤＮＡを抽出・精製した。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
【０３２３】
すなわち、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌については、まず、小川培地上のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した。次いで菌体を粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）した後、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、（株）キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic−tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行った。
【０３２４】
また、大腸菌については、大腸菌のＤＮＡ抽出方法の常法に従い、ＤＮＡを抽出、精製した。
【０３２５】
得られたマイコバクテリウム属菌それぞれの精製ＤＮＡを、最終１ng／μL（10mM Tris−HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。
【０３２６】
得られた大腸菌の精製ＤＮＡを、最終１ng／μL（10mM Tris−HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。
【０３２７】
（３）ＰＣＲ
候補クローンの塩基配列（配列番号１）をもとに、上記（1）で設計、合成したプライマー02＿Fw1及び02＿Rv1を用い、下記の通りＰＣＲを行った。尚、候補クローン１の塩基配列上の、各プライマー02＿Fw1及びプライマー02＿Rv1の持つ塩基配列の存在位置は図１に示した通りである。
【０３２８】
１）ＰＣＲ用反応液の調製
上記（1）で得られたプライマー02＿Fw1及びプライマー02＿Rv1を各300nM、発色試薬としてSYBRTM Green I （Molecular Probe社商品名）を原液の30倍希釈、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg／mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX−100、dATP、dCTP、dGTP、dTTPを各0.2mM、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位／mL を含有する10mM Tris−HCl（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。
【０３２９】
２）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲにおける増幅ターゲットとなる鋳型ＤＮＡとして、上記（2）で調製したマイコバクテリウム属細菌由来又は大腸菌由来のＤＮＡ試料を用い、以下の方法で、インターカレーション法での定量モニタリングによる検討評価を行った。
【０３３０】
まず、上記（3）1）で調製したＰＣＲ用反応液２０μＬに、前記（2）で調製したＤＮＡ試料１μＬ（１ng）を添加してＰＣＲ用試料とした。このＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM  ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を４０サイクル繰り返し、増幅産物に対してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光量を測定した。
【０３３１】
（４）融解曲線解析
各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光量の１次微分（変化量）をとり、融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
【０３３２】
（５）結果
各ＤＮＡ試料について得られた融解曲線解析の結果を１つのグラフにまとめて、図９に示す。
【０３３３】
図９の結果から明らかな如く、本発明のプライマー02＿Fw1、及びプライマー02＿Rv1を用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、M.イントラセルラーレ由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき（図９：M.intraccellulare）、陽性と判定できた。
【０３３４】
これに対し、図９から明らかな如く、M.イントラセルラーレ以外のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、該当する蛍光シグナルが確認できず（図９：other species）、すべて陰性と判定できた。
【０３３５】
更に、図９から明らかな如く、M.イントラセルラーレ由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合の融解曲線解析の結果、単一の明瞭なピークが得られたことから、行った検出系は、M.イントラセルラーレに極めて特異性の高い、検出方法であることが分かる。
【０３３６】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、M．イントラセルラーレを特異的に検出することが出来ることが判る。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたM.イントラセルラーレの検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。
【０３３７】
実施例２．候補クローンのM.イントラセルラーレの検出感度の検定
（１）M.イントラセルラーレ検出用ＰＣＲプライマーの合成
実施例１（1）と同じ機器を用い、同様の操作でプライマー02＿Fw1、及びプライマー02＿Rv1を合成した。
【０３３８】
（２）M.イントラセルラーレ検出用プローブの作製
02＿Fw1及び02＿Rv1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅されると予測される配列番号１３９の塩基配列（155塩基）から、プローブとして利用するための配列「５’−ATACGTGCCCAGAAGCTCTACCGAGAT−３’」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号２０４。この配列を持つオリゴヌクレオチドプローブを、以下、INT０２＿F1R1＿FAMTAMと記載する。）。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。
【０３３９】
（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実験例１（1）で調製したM.イントラセルラーレから得られたM.イントラセルラーレ由来ＤＮＡ試料について、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、既知のM.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡ量と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μLのゲノムＤＮＡが得られた。
【０３４０】
次いで10mM Tris−HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー／μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。
【０３４１】
（４）リアルタイムＰＣＲ
上記（1）で調製した02＿Fw1をフォワードプライマーとして、02＿Rv1をリバースプライマーとして用い、下記の通りリアルタイムＰＣＲを行った。
【０３４２】
即ち、各１μMのプライマー02＿Fw1、及びプライマー02＿Rv1、195nMの上記（2）で調製した蛍光標識プローブINT０２＿F1R1＿FAMTAM、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg／mL BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX−100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（（株）ニッポン・ジーン製）40単位／mL を含有する10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、反応液とした。
【０３４３】
反応液20μLに各希釈系列のＤＮＡ試料１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを９６穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光量を測定した。尚、蛍光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。
【０３４４】
（５）結果
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、検量線を作成した。
【０３４５】
即ち、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の蛍光量（Rn、ｙ軸）をプロットした増幅曲線を作成した。次いで、蛍光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図１０に示す。
【０３４６】
ｙ＝−３.８２５ｘ＋３８.７８
Ｒ２＝０.９９６
以上のことより、リアルタイムＰＣＲで発光が検出されたことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、その増幅領域となる配列から標識プローブを設計し、リアルタイムＰＣＲを行う事でM.イントラセルラーレが検出できることが判った。
【０３４７】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、M.イントラセルラーレの定量が可能であることが判った。更に、図１０より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、M.イントラセルラーレのゲノムＤＮＡが初期量として２コピー存在する条件でもM.イントラセルラーレの検出が可能である事がわかる。
【０３４８】
更に、リアルタイムＰＣＲ法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、M.イントラセルラーレの検出に有効である。
【産業上の利用可能性】
【０３４９】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたM.イントラセルラーレの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、M.イントラセルラーレの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でM.イントラセルラーレの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度にM.イントラセルラーレの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、M.イントラセルラーレ菌体の定量も行うこともできるという効果を奏する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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