(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｅによって仲介されるＮＫ細胞活性の阻害を予防する方法であって、
（ａ）阻害的ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターへのＨＬＡ−Ｅの結合を干渉する化合物を選択し、そして
（ｂ）阻害的ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを発現するＮＫ細胞を化合物とエクスビボで接触させる
ことを含み、阻害的ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターであり、化合物が、抗ＣＤ９４抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＨＬＡ−Ｅ抗体、及び可溶性ＨＬＡ−Ｅからなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一群のＣＤ９４＋細胞、特に天然のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびサブセットのＴ細胞を含む一群のＣＤ９４＋細胞を同定し、標的とし、そして単離する方法に関するものである。また本発明は、ＣＤ９４＋細胞に対する毒物のような機能的部分を標的とする方法にも関するものである。さらに本発明は、その方法に使われるＨＬＡ−Ｅの多量体複合体にもまた関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの白血球抗原−Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）は、極めて限定された多形の非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子である。ヒトの非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子（ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇを含む）は、古典的ＭＨＣクラスＩａ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃを含む）と相同であるが、限定された多形と低い細胞表面発現によって特徴づけられている（Ｓｈａｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８３９に総説あり）。マウスのＭＨＣクラスＩｂ分子Ｑａ−１は、ペプチド結合グルーブにおける若干の構造上の類似性および広範な組織分布をもっている点においてＨＬＡ−Ｅと若干の特性を共有している（Ｓｏｌｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４７：６７に総説あり）。
【０００３】
サイトゾル蛋白からＣＤ８＋Ｔ細胞へ誘導されたペプチドを表わす古典的なＭＨＣクラスＩ分子の機能がよく確立されているのに対して、非古典的なＭＨＣ分子の機能は、特にＨＬＡ−Ｅにおいて未知である。ＨＬＡ−Ｅは大抵の組織で転写される。われわれは最近、ＨＬＡ−Ｅが３から１１の位置において、ＭＨＣクラスＩリーダー配列から誘導されたペプチド結合部位ペプチドで結合可能であることを示した（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１１６４−１１６９）。最適の結合ペプチドはノナマーである。アラニンおよびグリシン置換を用いて、ペプチドの２と９の位置に第一のアンカー残基があり、７とそして多分３の位置に第二のアンカー残基があることが確立された。文献では、ＨＬＡ−Ｅは小胞体（ＥＲ）の中に位置しており、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＨＬＡ−ＤＭと同様に古典的ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの負荷において役割を果たしているであろう事を示唆している。ＨＬＡ−Ｅおよびヒトのβ２ミクログロブリン（β２ｍ）でトランスフェクトされたマウスの細胞も、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｆを発現するだけの７２１．２２１細胞系も、ＨＬＡ−Ｅの表面発現を示さない（Ｕｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４９：２９４５−２９５３およびＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７６：１０８３−１０９０）。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ分子の集合は、小胞体（ＥＲ）の中に現われ、そして抗原プロセシング（ＴＡＰ）と関連する輸送体を通ってのペプチドトランスロケーションを必要とする（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９６、ＨＬＡ  ａｎｄ  ＭＨＣ  ｇｅｎｅｓ，ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  Ｍ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｏｘｆｏｒｄ編集、Ｂｉｏｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｌｔｄ．；１９３−２２３に総説あり）。ヒトの細胞においては、新たに合成されたＭＨＣクラスＩ重鎖は、あとでβ２ｍの会合で移動するカルネキシンと関連している。カルネキシンの解離に続いて、クラスＩ−β２ｍヘテロダイマーは別のＥＲ存在蛋白であるカルレチクリンと安定に会合する。ＴＡＰやＭＨＣクラスＩ−カルレチクリン複合体と会合している他の分子のタパシンは、それらの間の架橋として働く。ＴＡＰとのＭＨＣクラスＩの会合はペプチド結合を促進し、そしてクラスＩ分子は放出されペプチドの安定な負荷の上に細胞表面へ輸出される。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は大きな顆粒状のリンパ球の形態をもつ毒性細胞であり、通常それらの活性によって定義される。それらは、まだ明瞭に理解されていない認識システムを用いる。しかし、腫瘍細胞系とウイルス感染細胞の認識は、標的細胞表面でのＭＫＣクラスＩの不存在によって駆動される（若干のＭＨＣクラスＩ分子は特定のＮＫレセプターと相互作用する）。ＮＫ細胞毒性は、ＦａｓとＦａｓリガンドの間の相互作用によって、または細孔形成蛋白のパーフォリンおよびセリンプロテアーゼのグランザイムＢを含む細胞内顆粒の内容の放出によって仲介される。一般に、但しこれに限定するもではないがＮＫ細胞はＣＤ３−およびＣＤ５６＋である。それらはまたＣＤ１６＋であってもよく、そして若干はＣＤ８＋でもある。ある種のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ陰性細胞を死滅させることが可能であるというＮＫ細胞類似の機能をもっている。
【０００６】
ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩと相互作用するレセプターを発現し、ＮＫ細胞仲介の細胞毒性を阻害または活性化する作用がある。免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であるキラー細胞免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）は、そのようなレセプターのグループを補完する。
【０００７】
類似の効果をもつ他のＮＫ細胞阻害レセプターは、ＮＫＧ２Ａと共有結合してＣＤ９４のヘテロダイマーとして細胞表面で発現するＣタイプのレシチンのスーパーファミリーからのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターである。ＣＤ９４はまた、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ、ＣおよびＥという４つの密接に関連した分子、ならびにＮＫＧ２ＤおよびＦという２つの更にわずかに関連した分子から成るＮＫＧ２ファミリーの他のメンバーとも会合する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡおよびＢは何れも、ＭＨＣクラスＩと相互作用してＮＫ細胞溶菌を阻害するＮＫ細胞レセプターには阻害的であり、一方ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣはＮＫ細胞トリガー機能を行なうＭＨＣクラスＩと相互作用するＮＫ細胞レセプターには促進的である。
【０００８】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ活性化レセプターは、ジスルフィド結合ホモダイマーとして発現し、トランスメンブラン領域で荷電された残基を経由してＮＫＧ２Ｃと相互作用する第三のサブユニットＤＡＰ１２を含んでいる（Ｌａｎｉｅｒ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：７０３；Ｌａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８：６９３）。ＤＡＰ１２は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ複合体の細胞表面への効率的な移動のために必要である。ＣＤ９４のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２トランスフェクタントへの連結反応は、ＤＡＰ１２のチロシンリン酸化をもたらし、これはＤＡＰ１２を経由する細胞の活性化の誘発を示唆している。
【０００９】
４つの遺伝子はＮＫＧ２糖蛋白：ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＧ２Ｄ／Ｆをコード化する（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７；Ｐｌｏｕｇａｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８３５）。ＮＫＧ２ＡおよびＢは互いにスプライスする生産物である（トランスメンブラン領域の丁度外側の１８個のアミノ酸セグメントで相違している）。ＮＫＧ２Ｃは、外部Ｃ末端領域でＮＫＧ２ＡおよびＢとは９４％という高度の相同性があり、内部およびトランスメンブラン領域を通して５６％の相同性がある。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｆがそうであるように、離れてではあるが著しく関連している（２１％の相同性）。
【００１０】
ＨＬＡ−Ｅは、細胞表面で低レベルで安定に発現することが最近に発見された。その表面での発現は、ＨＬＡ−Ｅと結合可能なリーダー配列でペプチドをもっているヒトのＭＨＣクラスＩ分子の共発現と相互関連している。これらのシグナル配列誘導ペプチドの負荷はＴＡＰおよびタパシン依存的であり、そしてＨＬＡ−Ｅ集合は古典的ＭＨＣクラスＩ集合と類似していると思われる（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：１−１０）。
【００１１】
ＨＬＡ−ＥはＮＫ細胞と結合してＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＢおよびＣのレセプターを発現することもまた見出された。大多数のＮＫ細胞はＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを発現し、そして大多数のＮＫ細胞はＨＬＡ−Ｅと結合する能力がある。ＨＬＡ−ＥもまたＴ細胞の小さいサブセットと結合してＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロダイマーを発現する。
【００１２】
更に、ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞による死滅に対する保護を提供する。
【００１３】
更にまた、多量体ＨＬＡ−Ｅ分子はＮＫ細胞およびＴ細胞サブセットと強力に結合してＣＤ９４／ＮＫＧ２を発現することが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
最も広範な意味において本発明は、ＨＬＡ−ＥおよびＮＫ細胞及び／又はＴ細胞のサブセットの間の相互作用を使用してこれらの細胞を同定し及び／又は標的化し及び／又は単離することを提供するものであり；ならびにそのような使用のための適当な形態のＨＬＡ−Ｅを提供するものである。
【００１５】
１つの態様において本発明は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の相互作用をもたらす方法を提供するものであり、その方法は結合条件下でその細胞をＨＬＡ−Ｅと接触させることを含む。
【００１６】
従って本発明はその１つの実施態様において、検体の中のＣＤ９４／ＮＫＧ２＋ＮＫ細胞とＴ細胞の存在を同定する方法を含むものであり、その方法は検体を適当な条件下でＨＬＡ−Ｅと接触させ次いで細胞とＨＬＡ−Ｅの結合を検出することを含む。
【００１７】
他の実施態様において本発明の方法は、検体からＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞、特にＮＫ細胞とＴ細胞のサブセットを選択する方法を提供するものであり、その方法は検体を結合条件下でＨＬＡ−Ｅと接触させ次いでＨＬＡ−Ｅと結合した細胞を混合物から分離することを含む。
【００１８】
別の実施態様においては、ＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセットを死滅または不活性化する方法を提供するものであり、その方法は細胞をＨＬＡ−Ｅと結合条件下で接触させ次いで結合細胞上で標的死滅を行なうことを含む。いかなる標的死滅方法も用いることができ、例えばＮＫ細胞を結合ＨＬＡ−Ｅで検出して同定し次いでレーザー光線を用いて破壊してもよいし、またはＨＬＡ−Ｅが結合している細胞を死滅もしくは不活性化する毒性部分をＨＬＡ−Ｅに担持させてもよい。
【００１９】
更に別の実施態様において本発明は、ＨＬＡ−Ｅを標的細胞の表面で発現させることによって潜在的な標的細胞に対するＮＫ細胞活性を修飾する方法を提供するものである。この実施態様においては、細胞表面ＨＬＡ−ＥへのＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの結合は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞とＨＬＡ−Ｅ所有細胞の間の相互作用をもたらす。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡまたはＢレセプターの場合はこれは阻害的相互作用であり、その効果はＮＫ細胞による死滅からＨＬＡ−Ｅ所有細胞を保護することである。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの場合は、ＮＫ細胞促進効果があるであろう。阻害的と活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの両方を発現するＮＫ細胞の場合は、標的細胞表面でのＨＬＡ−Ｅとの相互作用の全体としての効果は阻害的である。これは阻害的レセプターが促進的レセプターを凌駕しているからである。
【００２０】
すなわち本発明は、可能性のある種々の目的のために、新規に発見されたＨＬＡ−Ｅ−ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター結合協力関係を使用することを含んでいる。本発明による方法での相互作用は、ＨＬＡ−Ｅに対するＣＤ９４／ＮＫＧ２の単なる結合であってもよい。その代わりに又はそれに加えて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞とＨＬＡ−Ｅの相互作用は、たとえば阻害効果のようなＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の活性に対する効果をもたらしてもよい。
【００２１】
別の実施態様において本発明は、本発明による方法で単離されたＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞を提供するものであり、また本発明の方法によるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞のない細胞の集団を提供するものである。
【００２２】
更に別の実施態様において本発明は、細胞のゲノムの中へ組み込まれたＨＬＡ−Ｅをコード化する核酸により細胞表面でＨＬＡ−Ｅを発現する非ヒト哺乳動物細胞を提供する。ＨＬＡ−Ｅをコード化する核酸は、それが天然には見出されないという意味で異種の核酸である。本発明はまた、そのような細胞を含む組換え動物をも提供し、その動物は体細胞および生殖細胞中にＨＬＡ−Ｅコード化核酸材料を含有するトランスジェニック動物を含み、またそのようなトランスジェニック動物から移植した受容体である動物を含む。
【００２３】
また別の観点において本発明は、化合物の生物学的活性を試験する方法を提供するものであって、その方法は
（Ｉ）細胞表面でＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを発現する細胞を提供し、
（ＩＩ）試験すべき化合物の存在下にその細胞をＨＬＡ−Ｅと接触させ、そして
（ＩＩＩ）その化合物の存在がＨＬＡ−Ｅと細胞の結合に影響を与えるかどうかを決定する
ことを含み、その方法で同定された化合物が、ＨＬＡ−ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの結合に影響する化合物であるとするものである。
【００２４】
好ましくは本発明のこの観点による方法でＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを発現する細胞はレセプターを自然に発現せず、そして最も好ましくはそれらは非ヒト細胞である。それら細胞は好ましくは安定なトランスフェクタントであり、すなわちそれら細胞はそのゲノムの中へ安定して組み込まれたＣＤ９４／ＮＫＧ２を発現する核酸材料を含むものである。
【００２５】
抗体、特にモノクローナル抗体のような化合物は、特定の所望の性質によってこの方法でスクリーニングすることができる。化合物はＨＬＡ−ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（ただしＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃではなく、逆も同じ）の間の相互作用で特異的に干渉する方法によって同定することができる。そのような特性をもつ抗体は、たとえばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ  ＮＫ細胞をＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ細胞と区別することが可能で有用である。ＨＬＡ−ＥのＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターへの結合を阻害する抗体の治療的用途、たとえば骨髄への移植もまた検討されている。マッチしたヒトのドナーを見出すことは困難であり、同種の細胞はすべてのＮＫ細胞の阻害的レセプターをもつことができるＭＨＣクラスＩリガンドを所有することはできないであろう。従って、アクチベーターレセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣとＮＫ細胞との結合を特異的にブロックする抗体は有用である。抗体の可能性のある治療的用途の他の一例は、ある種の自己免疫疾患の治療におけるものである。
【００２６】
他の観点において本発明は、２つまたはそれより多いＨＬＡ−Ｅ分子を含むＨＬＡ−Ｅの多量体を提供するものであり、該多量体はシグナル部分で標識されていてもよい非多量体ＨＬＡ−Ｅと比較すると高い結合能力をもっている。ＨＬＡ−Ｅの多量体は、二機能性または多機能性の種を生成するために、互いに結合したＨＬＡ−Ｅレセプター（すなわちＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターと結合する）の結合性質をもつ少なくとも２つのサブユニットを含んでいる。各々のサブユニットは、β２ミクログロブリンと共にＨＬＡ−Ｅの全てのまたは実質的な部分の細胞外領域、一般に少なくともα１，α２及びα３ＨＬＡ−Ｅ領域、およびペプチド結合グルーブの中の適当なペプチドを含んでいる。好ましいＨＬＡ−Ｅ多量体はテトラマーであるが、それ以外の多量体たとえばダイマー、トリマーおよび５つ、６つ、７つ等のＨＬＡ−Ｅ分子を含むものも除外されるものではない。
他の観点において本発明は、毒性剤とカップリングした組換えＨＬＡ−Ｅを提供する。この毒性剤の目的は、組換えＨＬＡ−Ｅが結合する不活性細胞を死滅させることである。それは、該目的のために充分な毒性がある。この毒性剤は好ましくは局所的効果をもっており、すなわち好ましくはＨＬＡ−Ｅが結合してない周囲の細胞に影響を与えない。好ましくは組替えＨＬＡ−Ｅは、多量体の形態である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＬＡ−ＥテトラマーはＮＫ細胞とサブセットのＴ細胞と結合することを示すものである。
【図２】ＨＬＡ−Ｅテトラマー染色は抗ＣＤ９４抗体で阻害されることを示すものである。
【図３】ＨＬＡ−Ｅは、ＮＫ細胞ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＢおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃと結合するが、ＣＤ９４またはＮＫＧ２単独とは結合しないことを示すものである。
【図４】ＨＬＡ−ＥはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの相互作用によるＮＫ細胞の阻害を仲介することを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は診断の目的に有用であり、一般には疾患のモニターのために有用である。ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞のサブ集団、またはＴ細胞のサブ集団（これらは更に抗ＣＤ８または抗ＣＤ４抗体もしくは他のＴ細胞マーカーに対する抗体またはリガンドによる共染色により同定することができる）の検出及び／又は定量は、以下のものを含む様々な条件において有用であろう。
【００２９】
（ｉ）ガン、リンパ腫、および白血病（特に大顆粒細胞白血病）
ＮＫ細胞は抗腫瘍細胞活性をもつと信じられている。治療の進行のためのマーカーまたは単純な予後は、ＮＫ細胞数および任意的にはそれらの活性状態をモニターする事によって提供することができる。これは極度に簡単な試験を提供する。ここに記載する方法は、患者から採取した検体の中のＮＫ細胞の数を決定または見積もるために用いることができる。ＮＫ様の活性（ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋）でのＮＫ細胞とＴ細胞の数は、ＮＫ細胞（たとえばＣＤ５６もしくはＣＤ１６）のマーカーに対する抗体またはＴ細胞マーカー（たとえばＣＤ３）に対する抗体の使用によって概算することができる。ＮＫ細胞の活性の状態は、活性化マーカーへの抗体による共染色で調べることができる。あるいは、ＮＫ細胞の活性化状態は、インビトロでの機能的アッセイで評価することができる。ＮＫ細胞を検体から単離し、その細胞傷害活性及び／又はサイトカイン生成能力（たとえばインターフェロン−γ及び／又はＴＮＦ−α）を直接または培養中の短時間後で評価する。
【００３０】
（ｉｉ）感染
ＮＫ細胞数は、ウイルスまたはそれ以外で感染中は変化し得る。そしてそれらの数を知ることはたとえばＨＩＶに感染した患者において大きな価値がある。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染におけるＮＫ細胞数のモニターは特に重要であろう。ＣＭＶはその蛋白の中に、ＨＬＡ−Ｅ発現に影響を与え得る配列をもっている。さらに詳しくは、これらのＣＭＶ配列は、ウイルス宿主細胞中のＨＬＡ−Ｅの細胞表面発現を誘発する。
【００３１】
（ｉｉｉ）妊娠
胎児の拒絶反応の予防における胎盤中のＮＫ細胞の役割は重要である。本発明は、胎盤中のＮＫ細胞をモニターする手段を提供する。
【００３２】
（ｉｖ）移植
ＮＫ細胞は、骨髄移植後の移植拒絶反応および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関与しているであろう。ＮＫ細胞をモニターすることは、患者の管理において価値があろう。
【００３３】
（ｖ）免疫不全症
ＨＬＡ−Ｅの診断的使用は、正常なＮＫ細胞レベルよりも低いかまたは高い、本態性または後天的な新しい免疫不全症症候群の検出まで広げることができる。若干の治療はＮＫ細胞に毒性的であるか促進的であろう。
【００３４】
（ｖｉ）自己免疫疾患
たとえば全身的エリテマトーデス、糖尿病、甲状腺疾患、白斑、関節リュウマチ、などの自己免疫疾患におけるＮＫ細胞のモニターは有用であろう。
【００３５】
（ｖｉｉ）追跡治療
本発明はまた、ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋ＮＫ細胞のアップまたはダウンレギュレーションをもたらし得る治療の二次的効果のモニターをも可能とする。
【００３６】
ＮＫ細胞は上記の疾患や状態の例において特異的に参照されたが、ＨＬＡ−Ｅで認識されるレセプターを発現するＴ細胞サブセットのモニターもまた包含される。
【００３７】
本発明はまた一連の治療的応用をもっている。以下にそれを例示する。
【００３８】
（ｉ）ＮＫレベルの向上
本発明は、ＨＬＡ−Ｅ結合ＮＫ細胞またはＴ細胞を混合細胞集団から選択する方法を提供する。選択された細胞はインビトロで拡大されそして患者に戻される。そのような処置は、これらの細胞の生長不全が予後不良と関連しているような幾つかの重篤な感染やガンにおいて効果的であろう。
【００３９】
（ｉｉ）ＮＫ細胞の除去
本発明は、たとえば移植においてドナー骨髄として用いられるべき骨髄からのＨＬＡ−Ｅ結合ＮＫ細胞とＴ細胞の除去のための方法や手段を提供する。他の技術を用いる骨髄のＴ細胞除去は既知であり効果的である。毒素とカップリングしたＨＬＡ−ＥもまたインビボでＨＬＡ−Ｅ結合細胞を破壊するために用いることができる。
【００４０】
（ｉｉｉ）細胞表面でのＨＬＡ−Ｅの発現
本発明は、細胞表面へＨＬＡ−Ｅを提供することによるＮＫ細胞活性の阻害または刺激のための方法や手段を提供する。ＮＫ細胞は移植の拒絶反応において役割を果たしている。したがってＨＬＡ−Ｅが異種移植片臓器や組織での細胞表面で発現することを確かめることによって、拒絶反応の可能性が減少されるであろうし、また拒絶反応も避けることができるであろう。
【００４１】
本発明によるＨＬＡ−Ｅの多量体は、種々の可能性のある形態をとることができる。ＨＬＡ−Ｅ分子は、リンカー分子を経由して交互に会合することができる。それとは別にまたはそれに加えて、ＨＬＡ−Ｅ分子は、たとえばリポソームのような膜分子の如き大きなものに付着させることができる。適当なリンカー分子は、たとえばアビジン、ストレプタビジンおよびエクストラビジンのような多価付着分子（それらの各々はビオチンに対して４つの結合部位をもっている）を包含する。すなわち、ビオチン化したＨＬＡ−Ｅ分子は、４つまでのＨＬＡ−Ｅ結合部位をもつＨＬＡ−Ｅの多量体複合体の中へ形成することができる。得られた複合体におけるＨＬＡ−Ｅ分子の数は、複合体を作るのに用いたリンカー分子や、またそれ以外のビオチン化した分子たとえばビオチン化したシグナル部分あるいは毒性部分の存在や不存在に依存するであろう。好ましい複合体はトリマーまたはトリマーのＨＬＡ−Ｅ複合体である。
【００４２】
ＨＬＡ−Ｅのダイマーまたは多量体を作製するのに適当な他の架橋技術はたとえば、ダイマーを製造するための抗体架橋、ならびにフルロゲニック（ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ）化合物のような架橋剤その他の化学的架橋剤を用いる技術を含む。
【００４３】
ここで詳細に記載するものは、組換えＨＬＡ−Ｅ重鎖（α１、α２およびα３領域）をビオチン化し、そしてβ２ｍ分子およびＨＬＡ−Ｂからの合成リーダーペプチドでインビトロにおいてＨＬＡ−Ｅ重鎖を再生して複合体を構成することによるＨＬＡ−Ｅテトラマーの製法である。ここに記載の方法においてビオチン化部位は、ＨＬＡ−Ｅ重鎖のＣ末端の中へ組換えられており、そして組換えＨＬＡ−Ｅ分子は適当なビオチン化酵素という手段でビオチン化される。次いで、この場合のエクストラビジンでは、多価のリンカー分子が加えられる。このテトラマー化方法の変法も考えられる。たとえばβ２ｍは、その７つのリジン残基において化学的にビオチン化することができ、そのうち４つは複合体をつくるのに適切な位置にある。
【００４４】
どんな形態のＨＬＡ−Ｅが用いられても、ＨＬＡ−Ｅペプチドグルーブでの結合のための適当なペプチドが必要であろう。表１と２は、ＭＨＣクラスＩリーダー配列の３から１１までの残基で見出される可能性のあるペプチドの例を示す。これらの表は、それらのうちのどれがＨＬＡ−Ｅとインビトロで結合することが分かるかを示すものである。ＨＬＡ−Ｅと結合するこれ例外のペプチドもまた用いられる。その例は、ＭＨＣクラスＩリーダー配列ペプチドと同じかまたは異なるであろうウイルス蛋白からのペプチドである。通常ノナマーペプチドはＨＬＡ−Ｅと結合するのに最適の大きさであるが、それよりも僅かに短いかまたは僅かに長いペプチド、たとえば片方または両方の末端の１つまたは２つの残基もまた作用することが可能である。ＨＬＡ−Ｅと結合する合成ペプチドを同定する適当なアッセイはＢｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１１６４−１１６９に記載されている。
【００４５】
ＨＬＡ−Ｅの標識化は、いかなる適当な方法により行なってもよい。ここでは、テトラマー複合体を製造するために、エクストラビジンを経由してフィコエリスリンで標識化したテトラマーＨＬＡ−Ｅについて記載する。種々のこれ以外のシグナル部分が、ＨＬＡ−Ｅモノマーまたは多量体の種々の可能性のある部位で用いることができ、そしてＨＬＡ−Ｅは多量体化の途中またはその後で標識化することができる。蛋白を標識化するために普通に使用される有用なシグナル部分は、放射性（たとえば３２−Ｐ、３３−Ｐまたは３５−Ｓ）、蛍光性（たとえばＦＩＴＣ）および酵素性（たとえばセイヨウワサビのペルオキシダーゼ）の標識を含む。これらの及びその他の検出可能な標識が、本発明において用いられる。
【００４６】
本発明においては、ＨＬＡ−Ｅはまた担体と結合して提供される。このように固定化されたＨＬＡ−Ｅは捕捉の目的、すなわちＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞を捕捉し分離するために特に有用である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞を含有し、または含有していると思われる混合物を、結合条件下で固定化ＨＬＡ−Ｅと接触させ、そして非結合物を除去する。ついでＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞を回収する。適当な固体の担体の例としては、たとえばビーズ、ウエル、チューブおよびプレートの形状の担体物または粒子が含まれるがこれに限定されるものではない。ＨＬＡ−Ｅは当業者によく知られている種々の手段で固定化することができ、適当なリンカー分子によって担体に付着することができる。
【００４７】
本発明によれば、ＨＬＡ−Ｅはまた毒性部分のようなエフェクター剤に付着して提供され、その目的はインビトロまたはインビボでの細胞の混合集団におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の標的的な除去であり得る。この毒性部分は好ましくは、ＨＬＡ−Ｅが結合している細胞を選択的に死滅させる毒素である。適当な毒素は、植物（たとえばリシンやアブリン）もしくは細菌（たとえばジフテリア毒素、シュードモナスの菌体外毒素）のような天然の材料から誘導することができ、または合成品もしくは天然に存在する毒素の合成種であってもよい。１つの特定の例において毒素は、ＨＬＡ−Ｅと毒素の間のジスルフィド結合を誘導するリンカー分子によってＨＬＡ−Ｅとカップリングしている（Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９１，４８２−４９５；Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，１３１：２２１−２３７）。チオエーテルや他の関連化合物を、非還元結合を形成するために使うことができる。別の例においては、組換え融合蛋白を作り出すために毒素をコード化する遺伝子をリガンドをコード化する遺伝子にスプライシングすることによって、ＨＬＡ−Ｅ分子との融合蛋白として毒素を発現することができる（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，６１：３３１−３５４）。そのような融合はまた、毒素とＨＬＡ−Ｅのテトラマーのまたは多量体の複合体の創製を可能とするビオチン化部位をも含む。
【００４８】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞に対する毒素を検出し、分離し、標的とするのに用いるためにここに記載のＨＬＡ−Ｅは、一般に可溶性のＨＬＡ−Ｅ分子である。ここで「可溶性」という用語は、細胞表面レセプターに関する分野において通常使用されるような意味で用いている。細胞表面レセプターの可溶性形態は通常、トランスメンブラン領域の除去によって天然の形態から誘導される。この蛋白は細胞質のおよびトランスメンブランの領域の両方を除去してトランケートされるか、または残っている細胞質領域の一部分もしくは全部でトランスメンブラン領域のみを除去してもよい。大切なことは、レセプターの所望の細胞外機能が残っていることであり、これは今の場合はＨＬＡ−Ｅ結合領域のＣＤ９４／ＮＫＧ２−結合能力である。野生型のＨＬＡ−Ｅは、蛋白分解的な分解で、または遺伝子的に作製しトランケートした若しくは部分的に除去した形態を発現して、所望の形態を得るために修飾することができる。
【００４９】
一方では、細胞の表面に存在する本発明で用いられるＨＬＡ−Ｅは、好ましくは、但し必須ではないけれども、トランスメンブラン領域を含むＨＬＡ−Ｅの膜結合形態である。それは細胞質領域を持ってもよく、また持たなくてもよい。通常は表面でＨＬＡ−Ｅを発現しない細胞の表面において発現するようなＨＬＡ−Ｅを得るためには、グルーブを結合したＨＬＡ−Ｅペプチドで結合するペプチドを提供することが必要である。このペプチドは、ＨＬＡ−Ｅ発現を許容するＨＬＡリーダー配列から誘導され得るか、またはＨＬＡ−Ｅと結合しそして発現を誘発するペプチドを発現するような別の源から誘導することができる。そのような別の源は、ＨＬＡ−Ｅと結合しその発現を誘発するペプチドをコード化することでＮＫ細胞仲介の細胞毒性を逃れるウイルスを包含する。たとえばヒトのサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ＨＬＡ−Ｅと結合可能なペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）をもつところのＵＬ４０（受理番号ｐ１６７８０）として知られている蛋白をコード化する（表１参照）。
【００５０】
すなわち非ヒト哺乳動物細胞の表面でのＨＬＡ−Ｅ発現はたとえば、その細胞をＨＬＡ−ＥならびにＨＬＡ−Ｅと結合可能なリーダー配列ペプチドをもつ別のＨＬＡクラスＩをコード化する核酸で共トランスフェクトすることによって達成することができる。別法としてその細胞は、ＨＣＭＶのＵＬ４０やＨＬＡ−Ｅをコード化する核酸で共トランスフェクトすることもできる。われわれは、ＵＬ４０でトランスフェクトしたときは、細胞内でＨＬＡ−Ｅを発現する細胞は、細胞表面でＨＬＡ−Ｅを発現すべく誘発されることを示した。細胞を２つの異なった配列で共トランスフェクトするかわりに、その細胞を両方の配列を含む単一ベクターで、あるいは更に好ましくはペプチドでＨＬＡ−Ｅの融合蛋白をコード化するキメラの核酸でトランスフェクトすることができる。このキメラ核酸は、たとえばＨＬＡ−Ｅをコード化する組換え核酸であってもよく、そこでＨＬＡ−Ｂ８のリーダー配列はＨＬＡ−Ｅのリーダー配列と置き換えられる。別の例において核酸は、充分な長さのリンカーを経由してペプチドと結合するＨＬＡ−Ｅをコード化して、そのペプチドをペプチド結合のグルーブに位置させ、また一方ではＨＬＡ−Ｅ分子に共有結合的に付着させたままとする。この例においてペプチドは、切断除去されたリーダー配列の一部分ではなく、細胞表面において発現する成熟したＨＬＡ−Ｅ分子へ結合する。有利には、このペプチドはＨＬＡ−ＥのＮ末端（α−１領域）を経由してＨＬＡ−Ｅ重鎖と結合している。そのようなＭＨＣ−結合ペプチドは、刊行された文献（たとえばＭｏｔｔｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９５，１８１：４９３−５０２を参照）に記載されている。更にはＨＬＡ−Ｅ重鎖およびβ２ｍを融合蛋白として発現することも有利である。そのような融合は文献（たとえばＴｏｓｈｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１９９６，９３：２３６を参照）に記載されている。すなわちＨＬＡ−Ｅペプチド分子は、単一コード化配列から発現することができる。
【００５１】
別の種の中へ移植されるべき器官や組織の中の細胞表面でのＨＬＡ−Ｅの提供のために、適当なトランスジェニックな動物を生産することができる。トランスジェニックなブタやラットやマウスのようなトランスジェニック動物の創製技術は、当業界でよく知られている。本発明の目的のために、ＨＬＡ−Ｅや受容体生物内でペプチドと結合する適当なＨＬＡ−Ｅを発現する核酸材料を、発生の適当な初期段階で生物体の細胞内へ導入する。次いで、細胞の表面でＨＬＡ−Ｅを発現する個々の動物を選択する。これら動物からの器官や組織は、移植のための異種個体の材料を提供する。
【００５２】
異種個体細胞におけるＨＬＡ−Ｅの欠如は、ＮＫ細胞仲介の溶菌にたいして感受性にさせる。何故ならばそれらのＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトのキラー細胞阻害レセプターによって認識されないからである。これはブタの内皮細胞上でのＨＬＡ−Ｃｗ０３０１の発現を誘発することから明白であり、それはＨＬＡ−Ｃｗ０３０１と結合する阻害的ＮＫレセプターを発現するＮＫ細胞で仲介される異種個体の細胞毒性からブタの細胞を保護する（Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１５９：３６５５）。ＮＫ細胞が、異種移植片に対する細胞免疫応答において役割を果たしているという証拠がある（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１３：３３９およびＢａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９６，１７：３７９に総説がある）。内皮は、血管化異種移植片と受容体免疫系のあいだの接触の最初の部位である。ヒトのＮＫ細胞は血管内皮に付着して異種個体の器官の中へ浸透することが示され（Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３，５６：７８５；Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，１４１：７１）、またＮＫ細胞はブタの内皮細胞を直接的に活性化することが示されている（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９６，６１：７６３）。インビトロでの異種個体のヒトの抗ブタ細胞毒性はポリクローナルＮＫ集団から重要なＭＨＣ非限定的貢献を含んでいることが観察されている（Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，１４１：７１；Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３，５５：２９４；Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９６，３：１８８）。ＨＬＡ−Ｃｗ３を認識する免疫スーパーファミリーＣＤ１５８からのキラー細胞阻害レセプターを発現するトランスジェニックマウスは、同系のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｃｗ３対立遺伝子を発現するＨ−２ミスマッチ骨髄移植片の拒絶反応を防ぐこともまた示されている（Ｃａｍｂｉａｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１９９７，９４（１５）：８０８８−９２）。すなわちＨＬＡ−Ｅトランスジェニック動物は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現するヒトのＮＫ細胞による攻撃する傾向がないような器官を提供するのに用いることができる。
【００５３】
異種個体の移植はまた、移植物の生存を改善する目的のために、他のメカニズム及び／又は試薬をも含む。とくに免疫抑制剤が用いられる。免疫抑制剤は移植治療においてふつうに用いられる。
【００５４】
最近、異種移植片の源として提案されている一次的動物種はブタおよびヒヒ（そしてウシもまた可能）である。現在検討中の特定の治療例は次のようである。
−  ブタ胎児のニューロン組織の移植によるパーキンソン病の治療、
−  カプセル化したブタの膵臓島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ）の移植または浸透による糖尿病の治療、
−  ブタの全肝臓を通しての浸透または移植による肝不全の治療
（Ｄｅａｃｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３：３５０；Ｔｉｂｅｌｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１９９４，２６：７６２：Ｃｒａｍｅｒ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．，１９９５，２７：８０を参照）
【００５５】
トランスメンブラン及び／又は細胞質領域の欠如、または多量体のために要求されるビオチン化部位の存在、といった特別の態様に加えて、本発明で用いられる組換えＨＬＡ−Ｅは天然のＨＬＡ−Ｅと違ったものにするような別の態様をもつことができる事は明白であろう。たとえば組換えＨＬＡ−Ｅは、天然のＨＬＡ−Ｅと比べて削除物、挿入物または変化残基をもつことができ、それは本発明で用いられるように、高められた結合能力または改善された安定性のような改良された性質をもたらす。４℃を越える及び／又は室温を越える及び／又は約３７℃といった高い温度での改善された安定性をもつＨＬＡ−Ｅは、特に重要である。
【００５６】
ここで述べたような組換え形態のＨＬＡ−Ｅはまた、インビボでの用途のための適当な処方で提供される。そのような処方は、医薬的に許容される希釈剤または担体を含む。
【００５７】
ＨＬＡ−Ｅそれ自体は極めてわずかの多形ももっている。ＨＬＡ−Ｅの２つの異なる対立遺伝子の配列は、以下のデータベース位置で見出すことができる。すなわち、Ｍ２００２２におけるＥ＊０１０１；およびＭ３２５０７におけるＥ＊０１０３１（１０７の位置におけるグリシン残基）。
【００５８】
以下に、その原理が本発明の分離、同定または標的死滅方法に付加的に応用されるであろうところの若干の公知技術を説明する。
【００５９】
若干の公知の分離方法は、ＨＬＡ−Ｅを用いるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の分離または単離における使用のために使用されるであろう。たとえばＴ細胞集団は、抗体で被覆したプレートを用いて単離することができる。この抗体は、特定の細胞表面マーカーに特異的なものである。細胞の分離は、陰性選択プロセスまたは陽性選択プロセスであってよい（Ｗｙｓｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９７８，ＰＮＡＳ，７５：２８４０−２８４８）。ＨＬＡ−Ｅ被覆プレートは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の分離のために使用することができる。
【００６０】
Ｔ細胞のサブ集団の免疫磁気精製法もまた、陰性もしくは陽性選択プロセスにおける磁気ビーズ上に被覆した適当な抗体を用いて行なうことができる（Ｆｕｎｄｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５５−６１）。ＨＬＡ−Ｅで被覆したビーズは同様にしてＣＤ９４／ＮＫＧ２＋ＮＫおよびＴ細胞の選択のために使用することができる。
【００６１】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）技術もまた用いることができる。蛍光標識細胞のセルソーティングはフローサイトメトリーを用いて、特定の細胞内および細胞表面の発現をモニターしそして細胞集団をソートするものである（Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，９：３０９−３１５）。
【００６２】
混合細胞集団におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の選択的削除または標的的死滅のために用いることのできる技術は、抗体／補体−仲介の細胞毒性を含む。補体に固定した抗体を用いて、抗体で認識されるマーカーを発現する細胞を補体の存在下に溶菌することができる（Ｂｉａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ，１９７０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：７０２−７２０）。たとえば抗ＨＬＡ−Ｅ抗体は、ＨＬＡ−Ｅの結合している細胞を選択的に破壊するのに用いることができる。
【００６３】
【表１】
0005268828.tif 000002
【００６４】
［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（配列番号）：１−１１］
【実施例】
【００６５】
例１
ＨＬＡ−Ｅ多量体複合体の構成
ＨＬＡ−Ｅテトラマー複合体を、インビトロで組換えＨＬＡ−Ｅとβ２ｍ分子をＨＬＡ−Ｂ＊０８０１のシグナル配列の３−１１残基から誘導した合成ペプチド（ＶＭＡＰＲＴＶＬＬ）で再生することで構成した。ビオチン化部位をＨＬＡ−Ｅ重鎖のＣ末端でつくり、ＨＬＡ−Ｅ／β２ｍ／ペプチド複合体を大腸菌ＢｉｒＡ酵素を用いて酵素的にビオチン化させ、そしてフィコエリスリン（ＰＥ）−標識エクストラビジンと複合させてテトラマー複合体を作った。ＨＬＡ−Ａと−Ｂテトラマー複合体は、インビトロで末梢血液からの抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターと特異的に結合するのに大変効率的であることが証明された（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９４−９６）。
【００６６】
方法
ＨＬＡ−Ｅは、ＨＬＡ−Ｅ＊０１０１ホモ接合体個体の単核細胞から抽出したプライマーのＣＯＯ７およびＣＯＯ６でＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。Ｎ末端ヌクレオチド配列は、プライマーＣＯ１７およびＣＯＯ６を用いるＰＣＲ変異誘発によって同義語的に変化して、大腸菌のｐＧＭＴ７ベクターからの蛋白発現を最適化する。ＨＬＡ−Ｅの細胞外部分（１−２７６残基）をコードする配列は、プライマーＣＯ１７とＣＯ２３を用いて増幅され、そしてｐＧＭＴ７誘導体の中へ再クローン化されて、ＨＬＡ−Ｅ重鎖の３’末端のフレーム中のＢｉｒＡ認識とビオチン化部位を含むところのプラスミドＣＯＣＯ９２の発現をもたらす。プライマーは次のようである。
【００６７】
ＣＯＯ６  ｇｔｇｇｇｃｔａａｇｃｔｔａｃｇｇｃｔｔｃｃａｔｃｔｃａｇｇｇｔｇａｃｇｇｇｃｔｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］
ＣＯＯ７  ｃｔａｃｇｇｇｃａｔａｔｇｇｔａｇａｔｇｇａａｃｃｃｔｃｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｃｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３］
ＣＯ１７  ｃｃｇｔａｃｃｔｃｇａｇｃａｔａｔｇｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｔｔｔａａａａｔａｔｔｔｔｃａｔａｃｔｔｃｔｇｔａｔｃｔａｇａｃｃｃｇｇｃｃｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４］
ＣＯ２３  ｔｇｇｔｇｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｔｃｃａｔｃｔｃａｇｇｇｔｇａｃｇｇｇｃｔｃｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５］
【００６８】
ＨＬＡ−Ｅテトラマー複合体は、本質的には既述のようにして製造される（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。簡単に言えば、ＨＬＡ−Ｅとβ２ｍ蛋白は大腸菌株の、それぞれＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＸＡ９０で過剰発現され、封入体から精製され、尿素溶液の中へ溶解され、ついでＨＬＡ−Ｂ＊０８０１リーダー配列（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からの合成ペプチド（ＶＭＡＰＲＴＶＬＬ）によりインビトロでの希釈によって再生される。ＨＬＡ−Ｅ重鎖／β２ｍ／ペプチド複合体はＢｉｒＡ酵素でビオチン化され、ＦＰＬＣおよびＭｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィーで精製され、ついでエクストラビジンＰＥ（Ｓｉｇｍａ）と４：１のモル比で複合体とする。
【００６９】
例２
ＨＬＡ−Ｅテトラマーの結合
９種の正常のドナーからの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、例１に記載のようにして製造したＨＬＡ−Ｅテトラマーで染色し、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）溶菌サイクルＢＭＬＦ１  ２５９−２６７ペプチドエピトープ（Ｓｔｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．ｅｄ．１８５：１６０５−１７）で再生したＨＬＡ−Ａ２テトラマーで観察される染色と比較した。高い頻度のリンパ系細胞をＨＬＡ−Ｅテトラマーで染色し（２から１１％の範囲）（図１Ａ）、一方ではＨＬＡ−Ａ２テトラマーは一般にＥＢＶ−血清反応陽性のドナー（図１Ｃ）中で０から０．８％のリンパ球で染色する。リンパ球結合ＨＬＡ−Ｅテトラマー上で電子的ゲートを設定することにより、大部分はＮＫ細胞（典型的には４０から８０％のＣＤ３−、ＣＤ５６＋）であるが、著しいサブセットはＴ細胞であり（典型的には１５から５０％のＣＤ３＋）であり、そのうちの若干はまたＣＤ５６を発現する（図１Ｂ）ことを観察した。リンパ球結合ＨＬＡ−Ｅテトラマーの約２％はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして約５％はＣＤ１９＋Ｂ細胞であったが、これらのものはＨＬＡ−Ａ２テトラマーによる類似の染色の故に非特異的結合を表わす（データは示してない）。ＨＬＡ−Ａ２テトラマーはＣＤ５６＋細胞と結合しないが、ＥＢＶ−血清反応陽性ドナーにおいては、ＥＢＶ特異的なＣＤ３＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞と結合し（図１Ｄ）、特定のＴ細胞レセプターをもつＴ細胞のためのＨＭＣ−テトラマー複合体の特異性についてのこれまでの研究を確認するものである（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。
【００７０】
Ｃタイプのレシチンスーパーファミリーに属するＮＫ細胞レセプター（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２４３３−３７）（図２Ａ）であるＣＤ９４に対する抗体ＨＰ３Ｄ９（Ａｒａｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：３２３８−４７）の存在下にＰＢＭＣとテトラマーを培養したときに、ＨＬＡ−Ｅテトラマー染色を中止した。抗体ＨＰ３Ｄ９を希釈するにつれ、ＨＬＡ−Ｅテトラマー染色は回復した（データは示してない）。多くのよく特性化されたＣＤ９４＋ＮＫクローンをＨＬＡ−Ｅテトラマーで染色することにより、そしてまた別の抗ＣＤ９４ｍＡｂ（ＤＸ２２）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１６３−１７２）がＨＬＡ−Ｅテトラマー結合を完全に阻害する（図２Ｂ、データは示してない）ことを示すことにより、ＨＬＡ−ＥとＣＤ９４のあいだの相互作用もまた確認された。ＣＤ９４＋ＮＫクローン上のＨＬＡ−Ａ２テトラマーによる染色は見られなかった（データは示してない）。
【００７１】
ＨＬＡ−Ｅと相互作用するＮＫレセプターをさらに特性化するために、これらレセプターでトランスフェクトしたＰ８１５および２９３Ｔ細胞を染色した。ＣＤ９４単独またはＮＫＧ２Ｂ単独で安定にトランスフェクトしたＰ８１５にはＨＬＡ−Ｅテトラマーの染色は観察されず（図３Ａ）、またＣＤ９４またはＮＫＧ２Ａ単独で一時的にトランスフェクトした２９３Ｔでも同様であった（データは示してない）。これとは対照的にＨＬＡ−Ｅテトラマーは、ＣＤ９４とＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４とＮＫＧ２Ｂ、またはＣＤ９４とＮＫＧ２Ｃで共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞と結合した（図３Ｂ）。これらのトランスフェクタントにおけるヘテロダイマーの発現を、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＢおよびＮＫＧ２Ｃヘテロダイマーと反応するポリクローナルウサギ血清を用いてモニターした（Ｌａｚｅｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４５）。この結果は、阻害的レセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫクローンまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃで安定にトランスフェクトしたマウスの前−Ｂ  Ｂａ／Ｆｅ細胞を用いて確認した（図２Ｂ、ただしデータは示してない）。テトラマーを作るのに使った組換えＨＬＡ−Ｅが大腸菌内に生産されるので、ＨＬＡ−Ｅ上の炭水化物は結合には必要でない。ＣＤ９４およびＮＫＧ２蛋白の両方がＣタイプのレシチンスーパーファミリーのメンバーであると仮定すれば、これは極めて驚くべきことである。炭水化物残基は、結合の親和性を増大させる相互作用の追加的な点を形成する。
【００７２】
ＫＩＲ２ＤＬ１（ＮＫＡＴ１もしくはｐ５８）、ＫＩＲ２ＤＬ３（ＮＫＡＴ２もしくはｐ５８）、ＫＩＲ３ＤＬ１（ＮＫＡＴ３もしくはｐ７０）、ＫＩＲ３ＤＬ２（ＮＫＡＴ４もしくはｐ７０／１４０）、ＫＩＲ２ＤＳ２（ＮＫＡＴ５もしくはｐ５０）、ＫＩＲ２ＤＬ２（ＮＫＡＴ６もしくはｐ５８）、またはＫＩＲ２ＤＳ４（ＮＫＡＴ８もしくはｐ５０）でトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞上ではＨＬＡ−Ｅテトラマーでの染色は観察されなかったので、ＨＬＡ−Ｅは他のキラー細胞阻害細胞レセプター（ＫＩＲ）と相互作用をしないことをわれわれは示した（Ｌａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５：１４５−１５４）。更には、これらのＫＩＲレセプター、すなわちＥＢ６（抗ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＧＬ１８３（抗ＫＩＲ２ＤＬ３、−ＫＩＲ２ＤＳ２、−ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＤＸ９（抗ＫＩＲ３ＤＬ１）、または５．１３３（抗ＫＩＲ３ＤＬ１、−ＫＩＲ３ＤＬ２）の何れに対する抗体によっても、ＨＬＡ−ＥテトラマーによるＰＢＭＣの染色はブロックされなかった（データは示してない）。すなわち、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターはＨＬＡ−Ｅ認識のための唯一および特異的なレセプターと思われる。
【００７３】
われわれは以前に、ＨＬＡ−ＥはマウスのＱａ−１分子と同じく（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｃｅｌｌ，７９：６４９−６５８；ＤｅＣｌｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１８３−２１９１；Ｃｏｔｔｅｒｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２１２３−２１３２）インビトロでＭＨＣクラスＩ分子からのシグナル配列誘導ペプチドと結合することができると報告し（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）、そして最近は、ＨＬＡ−Ｅ細胞表面発現はそのようなペプチドの結合によって制御されることを示した（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。殆どのＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子はＨＬＡ−Ｅと結合するリーダーペプチド３−１１をもっており、一方ではＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子はわずか三分の一しかもっていない。残りのＢ対立遺伝子は、メチオニンの代わりにペプチドの２の位置でスレオニンをもっている。第一のアンカー残基におけるこの置換は、既に述べた（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）（表２）インビトロの結合アッセイで測定したようにＨＬＡ−Ｅと結合するペプチドを分離させる。ＨＬＡ−Ｅと結合できるリーダーペプチドをもつＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ陰性７２１．２２１細胞へのトランスフェクションは、７２１．２２１細胞の細胞表面での内因性のＨＬＡ−Ｅの発現を生じさせる。リーダー配列ペプチドが結合能力をもたないときは、細胞表面でのそのようなＨＬＡ−Ｅのアップレギュレーションは観察されなかった。
【００７４】
阻害的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現するＮＫ細胞が、ある種のＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃまたは−Ｇ対立遺伝子でトランスフェクトした７２１．２２１細胞を死滅させずに、中和した抗ＣＤ９４または抗クラスＩ抗体の存在下にこれらのトランスフェクタントを溶菌することが可能であることは既に示されている（Ｐｈｉｌｌｐｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１６３−１７２；Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：２４８７−２４９２；Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２８：３１９９−３２０３）。表面発現をもたらすＨＬＡ−Ｅに結合可能なＨＬＡクラスＩリーダー配列ペプチドの存在と、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害レセプターの特異性のあいだの顕著な相関関係は、表２に示されている。トランスフェクションによって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫクローンによる死滅から７２１．２２１細胞を防御するＭＫＣクラスＩ対立遺伝子のすべては、ＨＬＡ−Ｅと結合可能なペプチドをもっている。同様にして、これらのクローンに対して防御能力のないＨＬＡ対立遺伝子のすべてはＨＬＡ−Ｅ結合リーダーペプチドを欠如している。ＨＬＡ−ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのあいだの物理的相互作用の直接の証拠と共にこれらの結果は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターによる阻害は、広い範囲のＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ分子よりもむしろＨＬＡ−Ｅの認識によって仲介されることを示している。これを更に支持するものとして、ヒトのＴ細胞リンパ親和性ウイルスＨＴＬＶ１（Ｇａｒｂｏｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８４：１３４−１４１）のタックスペプチドエピトープの周囲で再生されるＨＬＡ−Ａ２テトラマーは、ＨＬＡ−Ａ２がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫクローンに対して保護効果を有しＨＬＡ−Ａ２標的細胞保護は抗ＣＤ９４または抗クラスＩ抗体の存在下で逆となるという事実にもかかわらず、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡトランスフェクタントまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター発現ＮＫ細胞とは結合しない。われわれはさらに、クラスＩ分子とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのあいだの相互作用を阻害する抗クラスＩ抗体ＤＸ１７もまたＨＬＡ−Ｅを認識することを免疫沈殿によって確認した。
【００７５】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫクローンによる７２１．２２１標的細胞の認識は、主に栄養芽層細胞で発現する別の非古典的クラスＩ分子であるＨＬＡ−Ｇのトランスフェクションによって阻害されないことが最近に示されている（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１０７２−１０７５；Ｐｅｒｅｚ  Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５７３６−５７４３；Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：１８７５−１８８０）。しかしながらＨＬＡ−Ｇもまた、著しいレベルのＨＬＡ−Ｅを発現するＨＬＡ−Ｅおよび７２１．２２１−Ｇトランスフェクタントと結合可能なリーダー配列ペプチドをもっている。同様にして、Ｒｅｙｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９７（Ｎａｔｕｒｅ，３８６：５１４−５１７）はヒトのサイトメガロウイルスはＭＨＣクラスＩと同様に、多分ＣＤ９４レセプターを含むＮＫ細胞溶菌から７２１．２２１細胞を保護できるウイルス蛋白（ＵＬ１８）をコード化する旨を最近に報告している。これらの観察が７２１．２２１中の外因性ＨＬＡ−Ｅ分子へのＨＬＡ−ＧまたはＵＬ１８リーダーペプチドの結合によって説明できるか否かは研究中である。
【００７６】
ＨＬＡ−Ｅはまた、ＮＫ細胞トランスフェクタントで細胞傷害活性を活性化することが示されたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃとも結合し（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３６０３−３６０９）、これはＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ阻害ＮＫ細胞レセプターとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ刺激ＮＫ細胞レセプターの両者を経由するＮＫ細胞仲介細胞傷害を規制することに関わっている事を示している。われわれの現在の結果は、非古典的クラスＩ分子ＨＬＡ−Ｅの新規な役割を示し、そしてその卓越したレセプターを同定するものである。シグナル配列誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ｅの強力な優位性が単にＨＬＡ−Ｅの発現を許容するのかどうか、またはそれがＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターによる認識に必須かどうかについては、まだ決定されていない。
【００７７】
【表２】
0005268828.tif 000003
［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：はそれぞれ１（４）、２、３、４（４）、５、７（４）、８（２）］
＊  結果はＰｈｉｌｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９６により発表
†  ペプチド結合アッセイは、インビトロで行なわれた。結果は、ＨＬＡ−Ｅに結合する百分率として示した光学密度の比率で表わした（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）
‡  ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｇ陰性．２２１細胞は、短いリーダー配列を有しておりＨＬＡ−Ｅと結合可能な適当なペプチドを欠如しているようなＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｆを表わす
§  ＨＬＡ−Ｅと結合可能なリーダー配列ペプチドの存在は、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を認識する抗体ＤＴ９を用いＨＬＡ−Ａまたは−Ｂによりトランスフェクトされた．２２１および．２２１細胞で測定されたＨＬＡ−Ｅ表面発現をアップレギュレートする。
【００７８】
例２のための図の説明
【００７９】
図１：ＨＬＡ−ＥテトラマーはＮＫ細胞とサブセットのＴ細胞と結合する
【００８０】
（Ａ）ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１から３−１１のリーダー配列ペプチド残基の周囲に再生されたＨＬＡ−Ｅテトラマー、または（Ｃ）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）溶菌サイクルＢＭＬＦ１  ２５９−２６７ペプチドエピトープの周囲に再生されたＨＬＡ−Ａ２テトラマー（Ｓｔｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）を用いての正常ＥＢＶ血清反応陽性ドナーＶＢからのゲート制御末梢血液リンパ球でのフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＨＬＡ−Ｅテトラマーまたは（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２テトラマー結合リンパ球のフェノタイプは、指示したしたような三色染色で更に研究した。各々の象限における百分率は、右上の十字で表わす。ＣＤ３−、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団全体の中で１０．３％の細胞がＨＬＡ−Ｅテトラマーと結合し、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団全体の中で２．２％の細胞がＨＬＡ−Ｅテトラマーと結合した。これとは対照的に、０．２％未満のＣＤ３−、ＣＤ５６＋細胞がＨＬＡ−Ａ２と結合し、また１％のＣＤ３＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２テトラマーと結合した。
【００８１】
図２：ＨＬＡ−Ｅテトラマー染色は抗ＣＤ９４抗体で阻害される
【００８２】
（Ａ）正常のドナーＳＲＪからの末梢血液リンパ球を、抗ＣＤ９４抗体ＨＰ３Ｄ９（Ａｒａｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）（腹水の５０倍希釈液）ついでＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（Ｓｉｇｍａ）；ＨＬＡ−Ｅテトラマー−ＰＥ単独；またはＨＬＡ−Ｅテトラマー染色を阻害するＨＰ３Ｄ９（１／５０）の存在下でのＨＬＡ−Ｅテトラマー−ＰＥで染色した。
【００８３】
（Ｂ）ＮＫレセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するがＫＩＲ分子を発現しないＮＫ細胞系ＮＫＬ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｅｘｐ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２４：４０６−４１５）を、抗ＣＤ９４抗体ＤＸ２２（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）（１ｍｇ）、次いでＰＥ抗マウスＩｇＧ；ＨＬＡ−Ｅテトラマー−ＰＥ；またはＨＬＡ−Ｅテトラマー染色を阻害するＤＸ２２抗体１ｍｇの存在下でのＨＬＡ−Ｅテトラマーで−ＰＥ染色した。各々の象限での百分率を右上に示した。ＨＩＬＶ１タックスペプチド（Ｇａｒｂｏｃｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）の周囲で再生されたＨＬＡ−Ａ２テトラマーはＮＫＬと結合しなかった（データは示してない）。
【００８４】
図３：ＨＬＡ−Ｅは、ＮＫ細胞ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＢおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃと結合するが、ＣＤ９４またはＮＫＧ２単独とは結合しない
【００８５】
（Ａ）Ｐ８１５細胞は、ヒトのＣＤ９４  ｃＤＮＡ（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）またはＮＫＧ２Ｂ  ｃＤＮＡ（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７−２０）を含有するｐＢＪ−ネオベクターで安定にトランスフェクトされた。細胞は、ＰＥ−コントロールマウスＩｇＧ１（ｃＭＩｇＧ１）もしくはＩｇＧ２ｂ（ｃＭＩｇＧ２ｂ）、抗ＣＤ９４抗体ＤＸ２２−ＰＥ、抗ＮＫＧ２ＡおよびＢ抗体ＤＸ２０−ＰＥ、またはＨＬＡ−Ｅテトラマー−ＰＥで染色された。Ｐ８１５トランスフェクタントは、ＨＬＡ−Ｅテトラマーでも、またＨＬＡ−Ａ２  ＨＴＬＶ１タックスペプチドテトラマーでも染色されなかった。（Ｂ）ＣＤ９４で安定にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、およびＮＫＧ２Ｃで一時的にトランスフェクトされた（Ｌａｚｅｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。ウサギの前免疫血清（ｃＲＩｇＧ）の５００倍希釈またはウサギの抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロダイマー血清（抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２）の５００倍希釈を用い、ついでＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧまたはＨＬＡ−Ｅテトラマー−ＰＥによってフローサイトメトリー染色が行なわれた。ＨＬＡ−Ａ２−ＨＴＬＶ１タックスペプチドテトラマーによる染色は観察されなかった。対照のプラスミドで共トランスフェクトした２９３Ｔ−ＣＤ９４細胞の染色は、ＨＬＡ−Ｅまたはウサギの抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２血清によっては染色されなかった（データは示されていない）。
【００８６】
例３
ＮＫ細胞クローンに対する保護とＨＬＡ−Ｅ発現を可能とするＨＬＡ−Ｅ結合リーダー配列での細胞のトランスフェクション
【００８７】
方法
ヒトのＮＫ細胞クローンを確立し、文献記載のようにして培養した（Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１３２１−１３３６）。細胞毒性試験を文献記載のようにして行なった（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１６３−１７２）。ＨＬＡ−ＧのリーダーセグメントならびにＨＬＡ−Ｂ＊５８０１の細胞外、トランスメンブラン、および細胞質領域キメラのｃＤＮＡを含有するキメラのｃＤＮＡを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲによって作製した。すなわちセンスプライマー１，５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＣＧＡ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６］；アンチセンスプライマー１，５’−ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７］；センスプライマー２，５’−ＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］；およびアンチセンスプライマー２，５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９］。
【００８８】
テンプレートとして野生型のＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡをプライマーセット１と共に用い、そしてテンプレートとして野生型のＨＬＡ−Ｂ＊５８０１  ｃＤＮＡをプライマーセット２と共に用いてＰＣＲを行なった。これらのＰＣＲ反応からの生成物を混合し、そしてセンスプライマー１およびアンチセンスプライマー２と共に次の反応にテンプレートとして使った。生成物をＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＪネオベクターのなかへ連結させた。
【００８９】
ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ならびにマウスＣＤ８０（またはＢ７−１）の細胞外、トランスメンブランおよび細胞質領域のリーダーセグメントを含有するキメラｃＤＮＡを、つぎのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲによって生成させた。すなわちセンスプライマー３，５’−ＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］；アンチセンスプライマー３，５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＣ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１］；センスプライマー４，５’−ＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＡＧ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２］およびアンチセンスプライマー４，５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＴ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３］。
【００９０】
テンプレートとして野生型のマウスＣＤ８０  ｃＤＮＡをプライマーセット３と共に用い、テンプレートとして野生型のＨＬＡ−Ｂ＊０７０２  ｃＤＮＡをプライマーセット４と共に用いてＰＣＲを行なった。これらのＰＣＲ反応からの生成物を混合し、そしてセンスプライマー４およびアンチセンスプライマー３と共に次の反応にテンプレートとして使った。生成物をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＪネオベクターの中へ連結させた。ＰＣＲ生成物は配列決定によって確認した。７２１．２２１Ｂ−リンパ芽球細胞を野生型でキメラのｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして文献記載のようにして選択した（Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）。
【００９１】
結果
ＨＬＡ−Ｅの表面発現を誘導するＨＬＡ−Ｅ結合リーダーペプチドの存在がＣＤ９４／ＮＫＧＴ２Ａ＋ＮＫ細胞クローンに対する保護を提供するのに充分かどうかを決定するために、キメラ相補的ＤＮＡ（ＧＬＳ−Ｂ＊５８０１）を作製した。それは、ＨＬＡ−Ｇのリーダーセグメント（それからペプチドがＨＬＡ−Ｅを結合可能である；表２参照）ならびにＨＬＡ−Ｂ＊５８０１の細胞外、トランスメンブランおよび細胞質領域（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターでの認識に関連しないＨＬＡ分子；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１６３−１７２）を含有している。安定な７２１．２２１細胞系トランスフェクタントを選択し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現するＮＫ細胞クローンによる溶菌に対しての受動性について分析した。図４ａに示すように、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現するＮＫ細胞クローンは、野生型ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１でトランスフェクトした７２１．２２１細胞と同じように、トランスフェクトされてない７２１．２２１細胞を効果的に死滅させた。しかしながらＮＫ細胞で仲介された溶菌に対する保護はキメラＧＬＳ−Ｂ＊５８０１分子の発現で付与されたが、ＣＤ９４またはＨＬＡクラスＩ分子に対する抗体の存在下では逆となる。ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（ただしＨＬＡ−Ｅと結合可能なペプチドと共に；表２）のリーダーセグメントならびにマウスＣＤ８０の細胞外、トランスメンブランおよび細胞質領域を含有するキメラｃＤＮＡ（Ｂ７ＬＳ−ｍＣＤ８０）を、７２１．２２１細胞の中へトランスフェクトしＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞クローンでの溶菌について試験した。ＣＤ８０は、活性化したＢおよびＴ細胞ならびにマクロファージで発現する接着細胞表面分子である。この実験でＣＤ８０は、ＭＨＣクラスＩ分子のリーダー配列のみがＨＬＡ−Ｅのアップレギュレートと保護効果の誘発に必要なことを示すために、無関係の対照分子として用いられる。Ｂ７ＬＳ−ｍＣＤ８０分子を発現する７２１．２１１細胞の溶菌は少なかったが野生型のＣＤ８０を発現する細胞ではそうではなく、そして保護は対照抗体ではなくて抗ＣＤ９４によって逆となった（図４ｂ）。これらの結果は、ＨＬＡ−Ｅ結合リーダーペプチド単独が、阻害的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａタイプのレセプターを発現するＮＫ細胞クローンによる溶菌から７２１．２２１細胞を保護するのに充分である。
【００９２】
これらの結果は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのリガンドとしてのＨＬＡ−Ｅの更なる確認を提供する。
【００９３】
例３の図面の説明
【００９４】
図４：ＨＬＡ−ＥはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの相互作用によるＮＫ細胞の阻害を仲介する
【００９５】
（Ａ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現する代表的なＮＫ細胞クローンによる、ＨＬＡ−Ｇリーダー配列を含むＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、ＨＬＡ−Ｇまたはキメラ分子（ＧＬＳ−Ｂ＊５８０１）、ならびにＨＬＡ−Ｂ＊５８０１の細胞外、トランスメンブランおよび細胞質領域を発現する７２１．２２１細胞の溶菌。５μｇ  ｍｌ−１の対照免疫グロブリン（ｃｌｇ）、抗ＣＤ９４（ＤＸ２２）または抗ＨＬＡクラスＩ（ＤＸ１７）の存在下に、０．５：１のエフェクターと標的の比率でアッセイを行なった。（Ｂ）マウスのＣＤ８０またはＨＬＡ−Ｂ＊０７０２リーダー配列を含むキメラ分子（Ｂ７ＬＳ−ｍＣＤ８０）ならびにＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを発現する２つの代表的なＮＫ細胞クローンによるマウスの細胞外、トランスメンブランおよび細胞質領域を発現する７２１．２２１細胞の溶菌。１０μｇ  ｍｌ−１の対照免疫グロブリン（ｃｌｇ）または抗ＣＤ９４（ＤＸ２２）の存在下で１：１のエフェクター対標的の比率で行なった。
【００９６】
例４
蛍光活性化細胞ソーティングによるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋の単離
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ドナーからヘパリン含有のチューブ内へ取出した静脈血から得た。簡単に言えば血液検体を、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０で１：１に希釈し、そして希釈血液の１０ｍｌを５ｍｌのフィコール−ハイパック勾配においた。１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、界面のＰＢＭＣを注意深く除去し、ＲＰＭＩで２回洗った。最初の遠心分離は２０００ｒｐｍで１０分間行い、次に１２００ｒｐｍで１０分間行なって殆どの血小板を除去した。次いでＰＢＭＣをＲＰＭＩ内で希釈し、処理中は無菌培地に保持した。
【００９７】
ＨＬＡ−Ｅテトラマーの結合はフローサイトメトリーでモニターし、そして細胞をソーティングした。ＰＢＭＣ（５×１０６）を３７℃で１５分間培養し、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）で標識した１２μｌのＨＬＡ−Ｅテトラマーと共に４℃で１５分間培養した。次に、ＦＩＴＣで標識したＣＤ３モノクローナル抗体をさらに１５分間４℃で加えた。次いで細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ上でソーティングした。これは蛍光放射を測定し、静電的振れ（電子的細胞ソーティング）による明白な細胞集団を分離するものである。ＨＬＡ−Ｅテトラマーで染色した単一細胞や細胞サブセットを、無菌の９６ウエルの平板の中へ採取し、培地に入れる。ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＨＬＡ−Ｅ  ｔｅｔ＋）およびＴ細胞（ＣＤ３＋、ＨＬＡ−Ｅ  ｔｅｔ＋）は、照射フィーダー細胞（ＰＢＭＣおよびＪＹ  ＢＣＬ）、０．１μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび、それぞれ１００Ｕ／ｍｌまたは１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下でイッセル（Ｙｓｓｅｌ）の培地（Ｙｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７２：２１９９）中で生長させた。この方法で処理した自己細胞は、患者に再注射するのに適している。ＦＡＣＳ技術もまた定量の目的のための細胞計数に用いることができる。
【００９８】
ＮＫ細胞やクローンを培養するのに適した方法は、Ｌｉｔｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９３，１７８：１３２１−１３３６に記載されている。Ｔ細胞の維持方法はＤｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．，１９９８，８（７），４１３およびＮｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：４８４−４８７に記載されている。
【００９９】
例５
ＨＬＡ−Ｅで被覆したビーズを用いるＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の単離
ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを発現する細胞を、ＨＬＡ−Ｅ−ストレプタビジン被覆のダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で単離した。ダイナビーズＭ−２８０ストレプタビジンは、ストレプタビジンで被覆された磁気ビーズである。可溶性のＨＬＡ−Ｅを、ＨＬＡ−Ｅ重鎖のＣ末端でＢｉｒＡ酵素のビオチン化部位で処理しβ２マイクログロブリン、および若干のＨＬＡ分子のシグナル配列の３−１１残基からの合成ペプチドで再生した（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：７９５に記載されている）。これらのＨＬＡ−Ｅモノマーは、ＢｉｒＡ酵素を使ってビオチン化され、そして標準のプロトコールを用いてダイナビーズＭ−２８０と複合させた。ビオチン化したＨＬＡ−Ｅは、二方向性の混合（２μｇのＨＬＡ−Ｅ／１０７ダイナビーズ）で３０分間４℃でＰＢＳ−洗浄ダイナビーズＭ２８０で培養した。これらのビーズを、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）磁気粒子濃縮機（ＭＰＣ）内のチューブへ入れて採取し、上澄み液を除去した。ビーズを同様の方法で５回洗浄した。次いでＨＬＡ−Ｅ被覆Ｍ−２８０ダイナビーズを、単離したＰＢＭＣ（例３記載のようにして得たもの）（１０７ビーズ／ｍｌ）と混合し、緩やかに攪拌しながら４℃で２０分間培養した。チューブをダイナルＭＰＣに入れ、２分間放置した。上澄み液を除去し、ビーズに付着した細胞を５回洗浄した。次いで細胞を、例３に記載のようにして生長させた。
【０１００】
注：ＨＬＡ−Ｅのレセプターを発現する細胞のＰＢＭＣを除くために、上澄み液を保存しビーズを廃棄した。
【０１０１】
例６
ＮＫ細胞の標的死滅
組換えビオチン化ＨＬＡ−Ｅを、例１に記載のようにして作製した。ビオチン化したＨＬＡ−Ｅと、酵素パーフォリンのようなビオチン化毒性剤との３：１のモル比の混合物をエクストラビジンと結合して、毒性剤と結合した多量体ＨＬＡ−Ｅを製造した。ヒトのドナーからのＰＢＭＣ検体を標準的技術によって製造しＨＬＡ−Ｅ試薬と接触させたところ、検体に存在するＣＤ９４／ＮＫＧ２＋細胞の死滅をもたらした。ＣＤ９４／ＮＫＧ２陰性細胞は回収した。
【０１０２】
例７
異種移植
ＨＬＡ−Ｅのリーダー配列をＨＬＡ−Ｂ８のリーダー配列で置き換えたＨＬＡ−Ｅを発現する組換えＤＮＡを作製した。このキメラｃＤＮＡは、ＨＬＡ−Ｂのリーダー配列ならびにＨＬＡ−Ｅの細胞外（α１、α２とα３）、トランスメンブランおよび細胞質領域を含んでいる。これは、次のオリゴヌクレオチドプライマーを使って製造した。
【０１０３】
センスプライマーＡ：
５’−ＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４］
アンチセンスプライマーＢ：
５’−ＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５］
センスプライマーＣ：
５’−ＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣ−３’［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６］
【０１０４】
テンプレートとしてＨＬＡ−ＥのｃＤＮＡを用いプライマーＡおよびＢでＰＣＲを行なった。次いでこのＰＣＲからの生成物を、プライマーＢおよびＣとの引き続いての反応のためのテンプレートとして用いた。最終生成物を、ＥｃｏＲ１とＸｂａＩで消化し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３の中へ結合させた。
【０１０５】
次いでトランスジェニックな動物を次のようにして作製した。メスを過剰排卵させ、受精オスとかけ合わせ、そして翌日に屠殺した。２つの生殖核をもつ接合体を回収し、生殖核の１つを、ＨＬＡ−Ｅ−ＨＬＡ−Ｂリーダー配列構築を発現するＤＮＡでマイクロインジェクションした。生存している胚を偽妊娠している里親のメスの中へ再移植し、新生児からのＤＮＡ検体について外来遺伝子（ＨＬＡ−Ｅ構築）の存在を評価する。これらの技術の詳細は文献に記載がある（たとえばＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｍ．ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｘ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｐ．７４７−８０２）およびＳｅｃｔｉｏｎ  ＸＩ：  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ｐ．８０３−９３２））。
【０１０６】
例８
哺乳動物細胞へのＣＤ９４およびＮＫＧ２の安定なトランスフェクション
マウスの細胞（Ｐ８１５、Ｌ細胞）を、ＣＤ９４  ｃＤＮＡおよびＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２ＣとＤＡＰ１２を含有する哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（ネオマイシン耐性遺伝子）で、電気穿孔法または燐酸カルシウム沈澱法のそれぞれにより連続してトランスフェクトした。ＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｃ  ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ヒグロベクター（ヒグロマイシン耐性遺伝子を含有）の中へクローニングし、そしてＤＡＰ１２発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ゼオ（ゼオマイシン耐性）の中へクローニングした。Ｐ８１５細胞を５００μＦ、０．２５ボルトで電気穿孔し、そして２日後に選択物（Ｇ４１８とヒグロマイシンとゼオマイシン）を添加した。高いレベルのレセプターを発現する細胞を、フローサイトメトリーでソートした。Ｌ細胞を燐酸カルシウムＤＮＡ沈澱によってトランスフェクトし、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびゼオマイシンの存在下で選択した。トランスフェクタントを限定希釈によってクローニングし、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの細胞表面発現を特定の抗体を使ってモニターした。
【０１０７】
安定なトランスフェクタントは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２へのＨＬＡ−Ｅの結合を阻止する抗体租の他のものを同定するのに有用である。阻害的なＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター（たとえばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）または促進的なＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター（たとえばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ）と結合するＨＬＡ−Ｅを特異的に阻止するものは、２つの異なるトランスフェクタントを用いる結合アッセイを行なうことにより同定することができる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２へのＨＬＡ−Ｅの結合を阻止する公知の抗体の一覧を以下に掲げる。
【０１０８】
ＨＬＡ−ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターのあいだの相互作用をブロックする抗体：
１．抗ＨＬＡ−Ｅ：３Ｄ１２（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：４９５１）
２．抗ＣＤ９４：
ＨＰ３Ｄ９（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５７７９）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎにより商業化されている
ＨＰ−３Ｂ１（Ａｒａｍｂｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３２３８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈにより商業化されている
Ｘ１Ａ８５（Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２４８７）
ＤＸ２２２（Ｐｈｉｌｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１６３）ＤＮＡＸ
３．抗ＮＫＧ２Ａ
Ｚ１９９（Ｃａｒｒｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５６３）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈにより商業化されている
Ｚ２７０（Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：２４８７）
【０１０９】
この例に記載した技術はまた、ここに記載したようなＨＬＡ−Ｅをコード化する核酸でネズミのＬ細胞のような哺乳動物の細胞をトランスフェクトするためにも用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１は、ＭＨＣリーダー配列から生成されるペプチドの配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜２６は、プライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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