(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成を阻害するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は、
4-[3-(6-クロロ-2,4-(1H,3H)キナゾリンジオン)]フェノキシイソ酪酸；
4-(2-フルオイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,5-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-エチルカルバメートフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,4-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-シクロヘキシルウレイドフェノキシイソ酪酸；
4-(2,3-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-カルボキシアルデヒドフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2-ナフチルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-メトキシフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,4-ジメトキシフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-クロロ-3-ニトロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-メチルフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,4,5-トリメトキシフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3-クロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
N-4-(ニトロフタルイミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2-チエニルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-ピリジルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,4,5-トリクロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
L-ビス-[4-(4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル)シスチン]；
4-(3,4-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソブチリルアミドメチルシクロヘキシル-4-カルボン酸；
DL-N-4-[(3,4-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソブチリル]ピペコリン酸；
4-(3,5-ジクロロフェニルウレイド)フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸；
4-(4-ヨードフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-ジメチルアミノフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2,4,6-トリクロロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2,4,6-トリメチルフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-クロロフェノキシアセトアミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-クロロ-3-ニトロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-クロロジフェニルウレア-4'-カルボン酸；
4-(3,4-ジクロロフェニルアセトアミド)フェノキシイソ酪酸；
ジフェニルウレア-4-カルボン酸；
4-(2-クロロ-4-ニトロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(ニコチニルアミド)フェノキシイソ酪酸；
4-クロロフェノキシイソ酪酸；
4-(ベンジルスルホンアミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2,5-ジクロロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
L-4-クロロベンゾイルフェニルアラニン；
2-イソプロピル-5-メチルフェノキシイソ酪酸；
4-(3,4-ジメトキシフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3-クロロ-4-フルオロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,5-ジクロロベンズアミドエチル)フェノキシイソ酪酸；
4-(フェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(フェニルウレイド-2-クロロ)フェノキシイソ酪酸；
4-(2,6-ジクロロ-4-ニトロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(3,5-ジフルオロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(N-メチル-4-クロロベンズアミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(4-ニトロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-(フェニルウレイド)フェノキシ酢酸；
4-(4-クロロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2-ヒドロキシ-4-クロロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2-ヒドロキシ-3,5-ジクロロベンゾイルカルボキサミド)フェノキシイソ酪酸；
4-(2-クロロ-5-ニトロフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-カルボキシフェノキシイソ酪酸；
4-(4-カルボキシフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
2-ウレイドフェノキシイソ酪酸；
ウレア1,3-ビス-4-フェノキシイソ酪酸；
4-(4-モルホリノスルホニルフェニルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-[(3,4-ジクロロフェニルメチル)2-クロロフェニルウレイド]フェノキシイソ酪酸；
4-(3-ピリジルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-[(3,5-ジクロロベンゾイルアミノ)メチル]フェノキシイソ酪酸；
4-(2,4-ジクロロフェナシルアミノ)フェノキシイソ酪酸；
4-(ベンジルウレイド)フェノキシイソ酪酸；
4-アセトアミド安息香酸；
2-クロロ-4-アセトアミド安息香酸；
4-アミノフェノキシイソ酪酸；
2-アセトアミドテレフタル酸；
5-クロロ-2-アセトキシ安息香酸；
2-アセトアミド-5-アセトキシ安息香酸；
2-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸；
2-(8-キノリノキシ)プロピオン酸；
N-グアニルグアニジノ-N'-4-フェノキシ酢酸；
2-(2,5-ジクロロフェノキシ)プロピオン酸；
4-ジメチルアミノ安息香酸；
2-アミノ-4,5-ジメトキシ安息香酸；
4-スルホンアミド安息香酸；
2-アミノ-4-クロロ安息香酸；
4-ヒドロキシフェニル酪酸；
2-メチル-4-キノリンカルボン酸；
2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
6-ブロモ-2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
4-アセトアミドフェノキシ酢酸；
1-(4-クロロフェノキシブチリルアミド)-1-シクロヘキサンカルボン酸；
4-クロロフェニルアミノカルボニルイミノ二酢酸；
3-クロロ-4-ニトロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸；
メチレンビス[4,4'-(2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸)]；
N,N'-ビス(2-クロロ-4-カルボキシフェニル)ホルムアミジン；及び
N,N'-ビス(2-カルボキシフェニル)ホルムアミジン；並びにその医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項２】
老化の悪影響を遅延させるための医薬組成物であって、前記悪影響は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成であり、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は請求項1に記載の化合物の群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項３】
糖尿病由来の合併症の進行を遅延させるための医薬組成物であって、前記合併症は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成に起因し、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は請求項1に記載の化合物の群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項４】
関節リウマチ、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性またはアテローム性動脈硬化症の進行を遅延させるための医薬組成物であって、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は、
4-アセトアミド安息香酸；
2-クロロ-4-アセトアミド安息香酸；
4-アミノフェノキシイソ酪酸；
2-アセトアミドテレフタル酸；
5-クロロ-2-アセトキシ安息香酸；
2-アセトアミド-5-アセトキシ安息香酸；
2-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸；
2-(8-キノリノキシ)プロピオン酸；
N-グアニルグアニジノ-N'-4-フェノキシ酢酸；
2-(2,5-ジクロロフェノキシ)プロピオン酸；
4-ジメチルアミノ安息香酸；
2-アミノ-4,5-ジメトキシ安息香酸；
4-スルホンアミド安息香酸；
2-アミノ-4-クロロ安息香酸；
4-ヒドロキシフェニル酪酸；
2-メチル-4-キノリンカルボン酸；
2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
6-ブロモ-2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
4-アセトアミドフェノキシ酢酸；
1-(4-クロロフェノキシブチリルアミド)-1-シクロヘキサンカルボン酸；
4-クロロフェニルアミノカルボニルイミノ二酢酸；
3-クロロ-4-ニトロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸；
メチレンビス[4,4'-(2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸)]；
N,N'-ビス(2-クロロ-4-カルボキシフェニル)ホルムアミジン；及び
N,N'-ビス(2-カルボキシフェニル)ホルムアミジン；並びにその医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項５】
食品中の蛋白質の損傷を防ぐ方法であって、前記方法は前記食品と化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩の有効量を混合することを含み、前記有効量は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成を阻害し、前記化合物は請求項1に記載の化合物の群から選択される、前記方法。
【請求項６】
糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成を阻害するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は、式：
【化１】
0005209832.tif 000009
{式中、R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；
R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル(ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ)、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及び
R7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である}をもつ、前記医薬組成物。
【請求項７】
老化の悪影響を遅延させるための医薬組成物であって、前記悪影響は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成であり、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は式：
【化２】
0005209832.tif 000010
{式中、R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；
R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル(ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ)、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及び
R7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である}をもつ、前記医薬組成物。
【請求項８】
糖尿病に起因する合併症の進行を遅延させるための医薬組成物であって、前記合併症は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成に起因し、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は、式：
【化３】
0005209832.tif 000011
{式中、R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；
R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル(ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ)、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及び
R7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である}をもつ、前記医薬組成物。
【請求項９】
歯の変色を防止するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩を含み、前記化合物は、式：
【化４】
0005209832.tif 000012
{式中、R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；
R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル(ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ)、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及び
R7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である}をもつ、前記医薬組成物。
【請求項１０】
食品中の蛋白質の損傷を予防する方法であって、前記方法は前記食品と化合物または前記化合物の医薬的に許容可能な塩の有効量とを混合することを含み、前記有効量は糖化反応最終生成物または蛋白質架橋の形成を阻害し、前記化合物は式：
【化５】
0005209832.tif 000013
{式中、R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；
R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル(ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ)、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及び
R7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である}をもつ、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景
本発明は、グルコース及び他の還元糖、たとえば、フルクトースまたはリボースとの反応によるタンパク質の修飾及び老化、特に後期糖化最終生成物及び架橋がしばしば形成するタンパク質の非酵素的糖化の阻害に関する。
【０００２】  血液中及び細胞内環境の還元糖の濃度が高値であると、後期糖化最終生成物（advanced glycation endproduct:AGE）として知られる糖化及び脱水縮合複合体の非酵素的形成が起きる。これらの複合体生成物は、タンパク質、脂質及びＤＮＡの遊離アミノ基に形成する（Bucala及びCerami,1992年;Bucalaら、1993年;Bucalaら、1984年）。この現象は「褐変」または「メイラード」反応と呼ばれ、食品業界によって今世紀初頭に発見された（Maillard、1916年）。生物学でも同様のプロセスが重要であるということは、グリコシル化ヘモグロビンの発見と、糖尿病患者ではその量が多いということが判明して初めて明らかになった（Rahbar、1968年；Rahbarら、1969年）。ヒト糖尿病患者及び糖尿病の動物モデルでは、これらの非酵素化反応は加速され、ヘモグロビン及びアルブミンに加えて長寿命タンパク質、たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン、チューブリン、水晶体のクリスタリン、ミエリン、ラミニン及びアクチン、並びにLDL関連脂質及びアポタンパク質の高いAGE形成及び高い糖化を引き起こす。さらに後期メイラード生成物と類似のスペクトル特性及び蛍光特性をもつ褐色色素も、高齢の個体由来の水晶体クリスタリン及びコラーゲンなどの数種の長寿命タンパク質に関連してin-vivoで見いだされた。20才代から90才代のヒト硬膜コラーゲンでは、色素が加齢と共に直線的に増加することが見いだされた。AGE修飾タンパク質は加齢と共にゆっくりと増加し、正常な組織リモデリングに寄与していると考えられる。血中糖レベルが持続的に高いため、糖尿病患者ではこれらのレベルは顕著に増加し、組織タンパク質構造及び機能の改変、AGE特異的レセプターを介する細胞応答の刺激または反応性酸素種（ROS）の発生を含む種々のメカニズムによって組織損傷を引き起こす（最近のレビューに関しては、Boelら、1995年を参照されたい）。細胞の機能においてしばしば主要な役割を果たす、影響される分子の構造的及び機能的完全性は、これらの修飾によって乱され、腎臓、眼、神経及び微小血管機能などの影響される臓器に深刻な結果をもたらす（Silbigerら、1993年；Brownleeら、1985年）。
【０００３】  AGEによる高分子の構造的変化は、加齢と共に通常の環境下で蓄積することが知られている。この蓄積は糖尿病によりひどく加速され、高血糖症と強い関連性がある。たとえば、内皮細胞下基底膜のタンパク質にAGEが形成すると、架橋形成が多数生じて、血管壁のタンパク質/タンパク質及びタンパク質/細胞相互作用においてひどい構造変化及び機能変化を引き起こす（Haitoglouら、1992年；Airaksinen、1993年）。
【０００４】  後期糖化最終生成物（AGE）の形成及び蓄積の増加は、糖尿病合併症の病因及び老化において主要な役割を果たし、これによって進行性で且つ不可逆性の分子間タンパク質架橋を引き起こすといわれている（Monnierら、1986年）。このプロセスは糖尿病によって加速され、腎症（Nicholls及びMandel、1989年）、網膜症（Hammesら、1991年）及び神経障害（Cameronら、1992年）を含むある範囲の糖尿病合併症の発生の原因になると言われてきた。特に、AGEによる腎臓への組織損傷は、腎臓の機能の漸進的低下及び末期腎臓病（ESRD）（Makitaら、1994年）、並びにESRD（Makitaら、1991年）に罹患した患者の血清における低分子量（LMW）AGEペプチド（グリコトキシン類）の蓄積（Koschinskyら、1997年）を引き起こす。これらの低分子量（LMW）−AGEは、血漿若しくは組織成分、たとえば低密度リポタンパク質（LDL）（Bucalaら、1994年）、またはコラーゲン（Miyataら、1993年）と新規架橋を迅速に形成し、組織損傷の進行及び糖尿病の死亡率を加速させる。
【０００５】  近年になって、糖尿病性腎障害の進行においてAGEが原因となっていることを示す直接的な証拠が報告された（Vlassaraら、1994年）。実際、前もって製造されたAGEを健康なラットに注入すると、糸球体肥大及びメサンギウム硬化症、マトリックスタンパク質の遺伝子発現及び成長因子の産生が誘発される（Brownleeら、1991年；Vlassaraら、1995年）。詳細な研究から、アミノグアニジン（AG）、AGE形成の阻害剤が、糸球体の組織障害を改善し、誘発的糖尿病ラットにおいて蛋白尿症を軽減させることが明らかになった（Soulis-Liparotaら、1991年；Itakuraら、1991年）。ヒトにおいては、糖尿病患者でのアミノグアニジン治療の結果として腎機能の改善に伴う低レベルのヘモグロビン（Hb）-AGEレベルの低下（Makitaら、1992年）から、糖尿病合併症の病因におけるAGEの重要性に関し、より多くの証拠が得られた（Bucala及びVlassara、1997年）。
【０００６】  世界的、特に合衆国に於いて、糖尿病合併症の治療で大きな金銭的負担を伴い、罹患率および死亡率の顕著な増加に伴って、数百万もの人々を悩ませている糖尿病の世界的な、特に米国における流行は、糖尿病合併症の予防または治療の潜在的能力をもつ薬剤を探索しそして開発するための主要なインセンティブである。糖尿病の高血糖症-誘発組織損傷のメカニズムは、これまでよく知られていなかった。しかしながら、ポリオール経路活性の増大、特異的プロテインキナーゼC（PKC）イソ形の活性化、後期糖化最終生成物の形成及び蓄積、並びに反応性酸素種（ROS）の生成の増加を含む4つの病原メカニズムが提案された（Kennedy及びLyons、1997年）。カルボキシメチルリシン（CML）、ペントシジン（pentosidine）、2種の公知のグリコキシ化（glycoxylation）生成物及びピラリンの特異的抗体を使用することによって、ESRD患者（Horieら、1997年）から得た腎臓及び糖尿病のラット水晶体（Matsumtoら、1997年）由来の種々の組織における最近の免疫組織化学研究では、腎臓及びラット水晶体の種々の病変部でこれらのAGE成分が局在し、組織タンパク質の永久的且つ不可逆的修飾を生じる主原因となるROSの生成と密接に関連するタンパク質-AGE形成を支持する多くの証拠が提供された。従って、AGE形成の阻害剤及び酸化防止剤は、糖尿病合併症の予防及び治療の有効な手段として期待できる。
【０００７】  老化及び糖尿病に加えて、AGEの形成は幾つかの他の病理学的状態と関連していた。IgM抗-IgG-AGEは、慢性関節リウマチ活性の臨床測定と関連するようである（Luceyら、2000年）。AGEと慢性関節リウマチとの相関関係は、北米インディアンにも存在した（Newkirkら、1998年）。AGEはアルツハイマー病の脳斑に存在し、AGEが存在するとアルツハイマー病の発生を促進することがある（Duranyら、1999年；Munchら、1998年；Munchら、1997年）。尿毒症の患者は、年齢が一緒の対照と比較して血清AGEのレベルが高かった（Odaniら、1999年；Dawnay及びMiIlar、1998年）。AGEは神経毒性とも相関していた（Kikuchiら、1999年）。AGEタンパク質は、マウスのアテローム性動脈硬化症（Sanoら、1999年）及び血液透析を受けている人でのアテローム性動脈硬化症（Takayamaら、1998年）とも関連していた。アミノグアニジンをウサギに与えた研究では、アミノグアニジン量が増加すると、大動脈中でのプラーク形成が減少し、このことは後期糖化がアテローム発生に関与しているかもしれないことを示唆しており、後期糖化の阻害剤がこのプロセスを妨害する可能性が高まっている（Panagiotopoulosら、1998年）ことを示した。N（イプシロン）−カルボキシメチルリシン（CML）、後期糖化最終生成物の著しい沈着は家族性筋萎縮性側索硬化症に罹患している人の神経膠星状ヒアリン封入体で見られるが、正常な対照サンプルでは見られない（Katoら、1999年；Shibataら、1999年）。また、喫煙が血漿低密度リポタンパク質、血管壁の構造タンパク質、及び眼の水晶体タンパク質上でのAGEの蓄積増加に関連しており、これらの作用の幾つかは多分、アテローム性動脈硬化症及び煙草利用に関連する他の疾患の原因につながるだろう（Nicholl及びBucala、1998年）。最後に、アミノグアニジンをラットに与えた研究では、この治療が進行性心臓血管及び腎臓衰弱を防御したことが示された（Liら、1996年）。
【０００８】  糖付加（glycosylation）現象のカスケードにおけるアミノグアニジンの阻害作用のメカニズムが研究されてきた。現在まで、AGE形成のAG-媒介性阻害の正確なメカニズムは完全には知られていない。幾つかの系列のin-vitro実験から対照的な結論が得られた。簡潔に言えば、高濃度の還元糖によって炭水化物カルボニルとタンパク質アミノ基との間に自然発生的な反応が起きて、
1.シフ塩基が不可逆的に形成し、その後、
2.3-デオキシグルカソン（3-DG）、非常に反応性の高いジカルボニル化合物などのAmadori縮合／脱水生成物（Katoら、1990年）、
3.不可逆的且つ反応性の非常に高い後期糖化最終生成物となる。初期Amadori生成物の例としてはケトアミン類があり、これはさらに縮合反応を受けて後期AGEを形成する。近年、多くのAGE生成物が精製され、キャラクタリゼーションされたが、それぞれin-vivoで生成したAGEのほんの少しの画分を構成しているだけであった。たとえば、ピラリン、ペントシジン、カルボキシメチル−リシン（CML）、カルボキシエチル−リシン（CEL）、クロスリン（crossline）、ピロロピリジニウム、メチルグリオキサールリシン二量体（MOLD）、Arg-Lysイミダゾール、アルギニンピリジニウム、サイペントジン（cypentodine）、ピペリジンジノンエノール及びアルキル、ホルミル、ジグリコシル−ピロールが挙げられる（Vlassara、1994年）。
【０００９】  合成ペプチド上でin-vitro形成した糖化生成物の分析では、アミノグアニジンが初期Amadori生成物の形成を阻害しないことが示された（Edelstein及びBrownlee、1992年）。BSAに形成した糖化生成物の分析でも、同様の結論に到達した（Requenaら、1993年）。いずれの実験においても、AGEの形成は、蛍光測定及びマススペクトル分析によって分析されたようにAGによって強固に阻害された。これらのマススペクトル分析では、複合体中にAGが含まれていることに対応する分子量を有するペプチド複合体を検出しなかった。NMR、質量分光法及びX-線回折を使用する詳細な機械的な研究から、アミノグアニジンがAGE前駆体3-DGと反応して3-アミノ-5-及び3-アミノ-6-置換トリアジン類を形成することが示された（Hirschら、1992年）。対照的に、水晶体タンパク質と共に標識化14C-AGを使用する他の実験では、AGはタンパク質と結合するようになり、また遊離糖の活性アルドース形と反応することも示唆している（Harding、1990年）。
【００１０】  AGE阻害剤としての他の幾つかの可能性のある薬剤候補が近年報告された。これらの研究では、in-vitro及びin-vivo評価によるアミノグアニジン（AG）の能力と比較して、AGE形成及びAGE-タンパク質架橋を阻害する薬剤の能力を評価した（Nakamuraら、1997年；Kochakianら、1996年）。この分野での最近の進展は、化合物、N-フェナシルチアゾリウムプロミド（PTB）の発見であり、この化合物はin-vitro及びin-vivoでAGE-誘導タンパク質架橋を選択的に切断する（Vasanら、1996年；Ulrich及びZhang、1997年）。不可逆的AGE-媒介性タンパク質架橋を切断する薬理学的能力によって、可能性のある治療用途が提案される。
【００１１】  高血糖-誘発架橋の長期的意義に対する初期の医薬的関与では、糖尿病の深刻な後期合併症の進行が予防されることが十分に立証されている。組織及び体液でのグルコース-媒介性架橋を完全に停止させる非毒性で且つ非常に有効な薬剤を開発することが、大いに望まれている。タンパク質に於いてAGEの形成を干渉するためにin-vitro及びin-vivoの双方に於いて研究された医薬化合物のプロトタイプは、アミノグアニジン（AG）、低分子のヒドラジン-様化合物（Brownleeら、1986年）である。しかしながら、他の多くの化合物もAGE形成に対するそのような阻害活性を持つことが見いだされた。たとえば、D-リシン（Sensiら、1993年）、デスフェリオキサミン（Takagiら、1995年）、D-ペニシラミン（McPhersonら、1988年）、チアミンピロホスフェート及びピリドキサミン（Boothら、1997年）があるが、これらはアミノグアニジンと構造的類似点を持たない。
【００１２】  AGE形成を阻害するために考えられた最初の薬剤候補としてのAGの臨床試験が進行中である（Corbettら、1992年）。多くのヒドラジン−様化合物及び非−ヒドラジン化合物が研究されてきた。これまで、AGは従来技術の他の試験化合物よりも副作用が少なく、最も有用であることが知見されてきた。他方、AGは一酸化窒素（NO）の公知の選択的阻害剤であり、酸化防止剤の作用ももつことができる（Tiltonら、1993年）。
【００１３】  AGE阻害剤として使用される多くの他の可能性のある薬剤候補が近年発見され、in-vitro及びin-vivoの双方において評価されてきた（Nakamuraら、1997年；Soulisら、1997年）。アミノグアニジン及び同様の化合物を使用する研究での成功が期待されている一方で、利用可能性とこの活性及び治療有用性の範囲を拡大させるために、さらなるAGEの阻害剤を開発する必要がいまだに存在する。
【００１４】  発明の概要
アリール及び複素環式ウレイド並びにアリール及び複素環式カルボキサミドフェノキシイソ酪酸並びに安息香酸の誘導体は、後期糖化最終生成物及び架橋の形成を頻繁に引き起こすタンパク質の非酵素的糖化を阻害することが見いだされた。他の多くのフェノキシイソ酪酸誘導体並びに以下に規定する特定の他の化合物も、タンパク質の非酵素的糖化を阻害することが見いだされた。タンパク質の非酵素的糖化及び架橋は、糖化生成物及び加齢と共に増加する長寿命タンパク質の架橋を伴う老化プロセスの一部である。このプロセスは、糖尿病と共に発生するような血中、及び細胞間環境中での高濃度の還元糖で強化される。影響された分子の構造的及び機能的完全性は、これらの修飾によって乱され、深刻な結果となることがある。本発明の化合物を使用して、非酵素的糖化及び架橋のこのプロセスを阻害し、それによって糖尿病または老化により生じた弊害を多少阻害することができる。本発明の化合物は、早期老化、慢性関節リウマチ、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性、アテローム性動脈硬化症、及び食品中のタンパク質の損傷を予防するのにも有用であり、歯の変色を防ぐことができる。
【００１５】 発明の詳細な説明
後期糖化最終生成物（AGE）に対する種々の有機化合物の阻害効果を調査するために様々な種類の有機化合物をスクリーニングする際に、本出願人は、試験したフェニルウレイド置換フェノキシプロピオン酸誘導体の殆どが阻害作用をもち、これらの化合物の幾つかはアミノグアニジンの同一阻害濃度よりもずっと低濃度でAGE-形成の強力な阻害剤であることを知見した。
【００１６】  本発明において使用した化合物及びそれらの有用な組成物は、初期糖化生成物の非常に活性なカルボニル中間体と反応することができるので、初期生成物を予防を阻害して、タンパク質の架橋及びタンパク質の老化を導く後期糖化最終生成物のより後期の形成が起こらないようにする。
【００１７】  本発明で想定する他の有用な点は、早期老化の予防及び食品中のタンパク質の損傷の予防である。本発明の薬剤は、歯の変色予防などの口腔衛生分野でも有用である。
【００１８】 化合物
本発明の化合物は、アリール及び複素環式ウレイド並びにアリール及び複素環式カルボキサミドフェノキシイソ酪酸の誘導体として集合的に定義される（Rahbarら、1999年）。本発明の化合物を包含する一般式を図１に示す。これらの化合物は、酸素に対するヘモグロビンの親和性を低下させ、ヘモグロビン-酸素-解離曲線を右側にシフトさせることによって、ヘモグロビンの酸素親和性の修飾に対するその効果について本来開発されてきた一連の化合物の一部である（Rahbarら、1987年；Lalezariら、1988年；Lalezari及びLalezari、1989年；米国特許第5，268,500号；米国特許第5,292,935号；米国特許第5,093,367号；米国特許第4,921，997号）。
【００１９】  本発明の代表的な化合物が図5〜10のLR1からLR92として示されており、これらをタンパク質糖化及びAGE-形成に対する可能性のある阻害効果に関してスクリーニングした。本明細書の目的に関し、これらの構造に対して割り当てた名前は以下の通りである。
LR1 4〔3-（6-クロロ-2,4-（1H,3H）キナゾリンジオン）〕フェノキシイソ酪酸、MW＝374.5；
LR2 4-（2-フルオイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝289;
LR3（8G5）＊  4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝383；
LR4（8p）  4-（4-エチルカルバメートフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝401；
LR5（8G4）  4-（3,4-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝383；
LR6 4-シクロヘキシルウレイドフェノキシイソ酪酸、MW＝318；
LR7 4-（2,3-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝383；
LR8（8nf）  4-（4-カルボキシアルデヒドフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝328；
LR9 4-（2-ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝341；
LR10（8cl）  4-（4-メトキシフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝344；
LR11  （8c2）  4-（3,4-ジメトキシフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝374；
LR12 （8k）  4-（4-クロロ-3-ニトロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝393.5；
LR13 （8b1）  4-（4-メチルフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝328；
LR14 （8c3）  4-（3,4,5-トリメトキシフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝404；
LR15 4-（3-クロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝348.5；
LR16 N-4-（ニトロフタルイミド）フェノキシイソ酪酸、、MW＝378；
LR17 4-（2-チエニルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝305；
LR18 4-（4-ピリジルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝300；
LR19 4-（3,4,5-トリクロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝417.5；
LR20 L-ビス−〔4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン〕、MW＝871；
LR21 4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリルアミドメチルシクロヘキシル-4-カルボン酸、MW＝522；
LR22 DL-N-4-〔（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル〕ピペコリン酸、MW＝494；
LR23 4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸、MW＝508；
LR24 4-（4-ヨードフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝440；
LR25 4-（4-ジメチルアミノフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝345；
LR26 4-（2,4,6-トリクロロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝417.5；
LR27 4-（2,4,6-トリメチルフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝356；
LR28 4-（4-クロロフェノキシアセトアミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝363.5；
LR29 4-（4-クロロ-3-ニトロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝406.5；
LR30 4-クロロジフェニルウレア-4´-カルボン酸、MW＝290.5；
LR31 4-（3,4-ジクロロフェニルアセトアミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝382；
LR32 ジフェニルウレア-4-カルボン酸、MW＝240；
LR33 4-（2-クロロ-4-ニトロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝393.5；
LR34 4-（ニコチニルアミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝300；
LR35 4-クロロフェノキシイソ酪酸、MW＝208.5；
LR36 4-（ベンジルスルホンアミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝349；
LR37 4-（2,5-ジクロロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝396；
LR38 L-4-クロロベンゾイルフェニルアラニン、MW＝303.5；
LR39 2-イソプロピル-5-メチルフェノキシイソ酪酸、MW＝236；
LR40 4-（3,4-ジメトキシフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝374；
LR41 4-（3-クロロ-4-フルオロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝393.5；
LR42 4-（3,5-ジクロロベンズアミドエチル）フェノキシイソ酪酸、MW＝384；
LR43 4-（フェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝314；
LR44 4-（フェニルウレイド-2-クロロ）フェノキシイソ酪酸、348.5；
LR45 4-（2,6-ジクロロ-4-ニトロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝406.5；
LR46 4-（3,5-ジフルオロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝350；
LR47 4-（N-メチル-4-クロロベンズアミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝347.5；
LR48 4-（4-ニトロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝359；
LR49 4-（フェニルウレイド）フェノキシ酢酸、MW＝286；
LR50 4-（4-クロロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝351.5；
LR51 4-（2-ヒドロキシ-4-クロロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝377.5；
LR52 4-（2-ヒドロキシ-3,5-ジクロロベンゾイルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸、MW＝412；
LR53 4-（2-クロロ-5-ニトロフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝393.5；
LR54 4-カルボキシフェノキシイソ酪酸、MW＝224；
LR55 4-（4-カルボキシフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝358；
LR56 4-ウレイドフェノキシイソ酪酸、MW＝236；
LR57 ウレア1,3-ビス-4-フェノキシイソ酪酸、MW＝416；
LR58 4-（4-モルホリノスルホニルフェニルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝463；
LR59 4-〔（3,4-ジクロロフェニルメチル）2-クロロフェニルウレイド〕フェノキシイソ酪酸、MW＝507.5；
LR60 4-（3-ピリジルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝315；
LR61 4-〔（3,5-ジクロロベンゾイルアミノ）メチル〕フェノキシイソ酪酸、MW＝382；
LR62 4-（2,4-ジクロロフェナシルアミノ）フェノキシイソ酪酸、MW＝382；
LR63 4-（ベンジルウレイド）フェノキシイソ酪酸、MW＝328；
LR64 4-アセトアミド安息香酸；
LR65 2-クロロ-4-アセトアミド安息香酸；
LR66 4-アミノフェノキシイソ酪酸；
LR67 4-アセトキシ安息香酸；
LR68 4-ヒドロキシ安息香酸；
LR69 2-アセトアミドテレフタル酸；
LR70 5-クロロ-2-アセトキシ安息香酸；
LR71 2-アセトアミド-5-アセトキシ安息香酸；
LR72 2-アセトキシ-5-ヒドロキシ安息香酸；
LR73 2-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸；
LR74 2-（8-キノリノキシ）プロピオン酸；
LR75 4-アミノベンゾイルグリシン；
LR76 N-グアニルグアニジノ-N´-4-フェノキシ酢酸；
LR77 2-（2,5-ジクロロフェノキシ）プロピオン酸；
LR78 4-ジメチルアミノ安息香酸；
LR79 2-アミノ-4,5-ジメトキシ安息香酸；
LR80 4-スルホンアミド安息香酸；
LR81 2-アミノ-4-クロロ安息香酸；
LR82 4-ヒドロキシフェニル酪酸；
LR83 2-メチル-4-キノリンカルボン酸；
LR84 2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
LR85 6-ブロモ-2-メチル-3,4-キノリンジカルボン酸；
LR86 4-アセトアミドフェノキシ酢酸；
LR87 1-（4-クロロフェノキシブチリルアミド）-1-シクロヘキサンカルボン酸；
LR88 4-クロロフェニルアミノカルボニルイミノ二酢酸；
LR89 3-クロロ-4-ニトロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸；
LR90 メチレンビス〔4,4´-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）〕；
LR91 N,N´-ビス（2-クロロ-4-カルボキシフェニル）ホルムアミジン；
LR92 N,N´-ビス（2-カルボキシフェニル）ホルムアミジン。
＊かっこ内の記号はLalenzari及びLalenzari（1989年）から引用した。
【００２０】  上記リストには92個の化合物があるが、この多くの化合物は互いに非常に似ており、一緒に分類することができる。たとえば、化合物正LR1及びLR16はいずれも、環式ウレイドフェノキシイソ酪酸であり；化合物LR2、LR9、LR17、LR20、LR28、LR29、LR31、LR34、LR37、LR38、LR42、LR47、LR50、LR51、LR52、LR61及びLR62は、アミドフェノキシイソ酪酸であり；化合物LR3〜LR8、LR10〜LR15、LR19、LR21〜LR27、LR30、LR32、LR33、LR40、LR41、LR43、LR44、LR46、LR48、LR49、LR53、LR55、LR58〜LR60、LR63、LR89及びLR90はアリールウレイドフェノキシイソ酪酸であり；化合物LR35、LR39、LR54、LR56、LR57、LR66、LR74、LR76、LR77、LR82、LR86及びLR87は、クロフィブリン酸誘導体であり；化合物LR91及びLR92はホルムイミド誘導体であり；並びに化合物LR64、LR65、LR67〜LR75、LR78及びLR83〜LR85はアリールカルボン酸誘導体である。
【００２１】  上記化合物は、標的タンパク質上における後期糖化最終生成物の形成及び得られたタンパク質架橋を阻害することができる。本発明の原理は、後-糖化段階、即ち蛍光発色団の形成を阻害する試薬を使用することであり、その発色団の存在は糖尿病及び老化に関連していて、糖尿病及び老化の不都合な後遺症の原因となる。理想的な試薬は、上記発色団の形成、タンパク質の関連する架橋及び、たとえば動脈及び腎臓などで発生する他のタンパク質上のタンパク質のトラッピングを防止する。本発明の化合物は、ヒトを含む哺乳類に投与し、タンパク質糖化及び架橋（タンパク質の老化）を防止または減少させることができる。本発明の化合物は、それぞれの薬剤の活性に応じて種々の投薬量で一回の量または個々の量で経口的に適用することができる。さらに、本発明の化合物は非経口的または直腸的に投与することができる。本発明の化合物、本発明の種々のアッセイ方法の背後の理論的根拠、及びそれらの使用を、以下の実施例によって説明する。
【実施例１】
【００２２】 実施例1
ヘモロビン-δ-グルコノラクトン（δ-Glu）アッセイ
ヘモグロビン（HbA1C）における初期糖化生成物（Amadori）形成の評価を、阻害剤化合物の存在下及び非存在下においてグルコースの酸化形と一緒に赤血球を培養することによって実施し、その後試験物質と対照における（HbA1C）を評価した（Rahbar及びNadler、1999年）。この試験はLindsayら（1997年）による近年の報告に基づくものである。δ-Glu、グルコースの酸化類似体は、赤血球内でヘモグロビンと迅速に反応することができ、培養後数時間以内でHbA1Cレベルが顕著に増加する。対照的に、グルコースが同等の反応を起こすには数週間必要である。本出願人はこの知見を利用して、ヘモグロビンの初期段階糖化（Amadori生成物）を測定するアッセイ方法及び、HbA1C形成を阻害するための阻害剤の能力を評価するためのアッセイを考案した。簡潔に言えば、新鮮な血液をカリウム−EDTAに採取し、血液200μLと、リン酸緩衝化-塩類溶液（PBS）、pH7.4単独、50ミリモル/Lδ-Gluを含有するPBS（Sigma）、または50ミリモル/Lδ-Glu＋1ミリモルL阻害剤を含有するPBSのいずれかの40μ/Lとを混合することにより、採取30分以内で培養用に製造した。37℃で5時間インキュベーションした後、存在する糖化ヘモグロビンの割合を測定した。専用のイオン交換HPLC系（BIORAD DIAMAT）を使用して、糖化Hb（HbA1C）の割合を測定した。血液サンプルを三重分析した。本発明の化合物によるHbA1C形成の阻害率％を、以下の式：
（（B-C）/（B-A））×100
〔式中、Aは、δ-Gluで処理していないベースライン対照試験管中のHbA1C濃度であり、Bは、δ-Gluで培養した血液中のHbA1C濃度であり、Cは、δ-Glu及び本発明の阻害剤化合物の両方で処理した試験管中のHbA1C量である〕に従って計算した。【００２３】  本発明の化合物1ミリモル/Lを使用して正常なボランティアからのδ-Glu処理全血を使用する（HbA1C）形成量を、選択化合物に関して図2A〜Bに示す。全92種類のLR化合物に関して、HbA1C形成の阻害割合として計算した結果を表1に示す。
図2A〜Bは1回のアッセイの結果を示し、表1に示されている結果は3回の測定の平均である。【００２４】  上記実験は、この種の薬物療法が、初期糖化生成物の形成、後期糖化最終生成物形成における前期段階に関連する病状を軽減させるのに効果があることを示唆している。【００２５】実施例2
BSA-グルコースアッセイ
この試験を使用して、BSAの蛍光のグルコース-媒介性発生を阻害するための本発明の阻害剤の能力を評価した（Ikedaら、1996年）。NaN3 0.2 g/Lを含有する1.5 Mリン酸塩緩衝液pH 7.4中のSigmaから入手した50 mg/mL及び800 mMグルコース（144 mg/mL）からのBSA（画分V）を、種々の濃度の本発明の化合物の存在下または非存在下において、37℃で7日間、無菌条件下で培養した。培養7日後、それぞれのサンプルを、特異的な蛍光の発生（励起、370 nm；放出、440 nm）に関して測定した。試験サンプル対対照におけるAGE形成の阻害率％を、各阻害剤化合物に関して計算した。アミノグアニジン（50 mM）を正の対照として使用した。【００２６】  図3A〜Bは、本発明の試験化合物の選択に関して、本発明の新規阻害剤1ミリモル/L対アミノグアニジン50ミリモル/Lの阻害効果を示す。図3A〜Bに示されているデータは1回の測定由来である。92種類の化合物のそれぞれに関して3回の測定を平均した結果を表1に示す。【００２７】
【表１】
0005209832.tif 000002
【００２８】
【表２】
0005209832.tif 000003
【００２９】
【表３】
0005209832.tif 000004
実施例3
N-アセチル-グリシル-リシンメチルエステル（G.K.ペプチド）-リボースアッセイ
本発明の新規阻害剤化合物による後期糖化生成物（AGE）及びAGE-阻害の評価を、試薬の存在下または非存在下で、リボース中のG.K.ペプチドの培養により試験し、続いてその特異的な蛍光の測定により糖化及びAGE形成の間に生成した発色団を測定した。リボースの存在下でN-アセチルグリシル-リシンエステルの架橋を阻害するため本発明の化合物の能力を評価するのに使用するNagarajら（1996年）の方法は、以下の通りであった。
貯蔵溶液：
NaN3 0.2 g/Lを含有する0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4；
0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4中のGKペプチド（Sigma）80 mg/mL；
0.5 Mリン酸塩緩衝液中のリボース800 mM（120 mg/mL）。【００３０】  ３種類の貯蔵溶液の等容積（0.1 mL）を一緒に混合し、0.2ミクロン濾紙（Corning）で濾過し、37℃で24時間、無菌条件下で培養した。本発明の阻害剤化合物を添加して、1ミリモル/Lの終濃度にした。培養期間の終了時に、それらの特異的蛍光（励起、340 nm；放出、420 nm）を分析した。種々の濃度の阻害剤による阻害率％を、上記の如く計算した。正の対照としてアミノグアニジンを50 mMで使用した。【００３１】  図4A〜Bは、G.K.ペプチド-リボースアッセイを使用して、これらの別個の測定でタンパク質-AGEの特異的な蛍光を遮蔽する本発明の選択化合物の阻害作用を示す。全92種類の化合物に関する結果を表1に示す。図4A〜Bは、一回のアッセイの結果を示すが、表1のデータは、それぞれの化合物の3回のアッセイの平均した結果である。上記2回の実験（実施例2及び3）から得られた結果は、この種の薬物治療が、後期糖化生成物の形成及びタンパク質架橋に関連する病原性を減少させるのに効果があることを示唆している。【００３２】 実施例4
リゾチーム-グルコースまたはフルクトース架橋アッセイ
Taneda及びMonnier（1994年）に従ったリゾチーム-グルコースまたはフルクトース架橋アッセイは、AGE-誘発架橋及びAGE-タンパク質形成に対する化合物の阻害作用を評価するために実施されたin-vitroアッセイである。0.2 g/L NaN3を含有する0.2 Mリン酸ナトリウムpH 7.4中の卵白リゾチーム（Sigma）及びグルコースまたはフルクトースを、種々の試験化合物と混合し、試験化合物1ミリモル/L、100 mg/mL卵白リゾチーム、及び200 mMグルコースまたは100 mMフルクトースの終濃度を得た。全てのサンプルを、37℃で7日間、無菌条件下で培養した。7日後、それぞれのサンプルを、AGE-誘導架橋及びAGE-形成の測定に関して分析した。還元性条件下で20％SDS-PAGEゲルにアリコートを適用し、クーマシーブルーで染色した。【００３３】 実施例5
ELISAアッセイ
特別なELISA方法（Al-abedら、1999年）を使用して、ラット尾-腱-コラーゲンコーティング化96ウェルプレート（Collaborative Resarch製Biocoatマイクロタイタープレート）に対して糖化-BSA（AGE-BSA）の架橋を阻害するために研究された化合物の能力を評価した。ラット尾-腱-コラーゲンコーティング化96ウェルプレートに対するAGE-BSAの架橋を、所望の濃度の試験化合物を使用した場合と使用しない場合において実施した。次いで、ウェルを洗浄することによって、非架橋AGE-BSAを除去した。次いで尾-腱-コラーゲンコーティング化プレートに架橋したAGE-BSAを、AGE-RNアーゼに対して発生したポリクローナル抗体によって定量化した。このアッセイにおける正の結果から、本発明の阻害剤がコラーゲンと架橋するAGE-BSAの量を減少させ得ることが示される。正の対照としてアミノグアニジンを使用した。【００３４】  5種類の代表的な化合物を使用した結果を、図11A〜Bに示す。5種類の化合物（LR33、LR41、LR20、LR23及びLR62）は、種々のAGE-タンパク質架橋の強力な阻害剤のうちの数種類である。対照の阻害率％は、1ミリモル/LにおいてLR33に関しては61％であり、LR41に関しては27.4％であり、50 mMのアミノグアニジンに関しては45.5％と計算された。【００３５】 実施例6
リボヌクレアーゼ-リボース蛍光-阻害及び架橋-阻害アッセイ
ウシ膵臓リボヌクレアーゼA（RNアーゼA）は、タンパク質糖化及びAGE形成、並びにAGE-形成の速度論を研究するためのモデルタンパク質として広く使用されてきた（Khalifahら、1996年）。RNアーゼAは、糖化の間に沈澱しないという利点をもつのに対し、リゾチームはリボース及びグルコースとともに糖化の間に沈澱し易い。【００３６】  RNアーゼ-リボースアッセイでは、アミノグアニジンと比較して、阻害剤の存在下または非存在下におけるAGE-形成の結果として発生した蛍光を測定する。このアッセイは、SDS-PAGEにより示されたような二量体及び三量体の形成及びタンパク質-架橋に対する化合物の阻害作用を検出するのにも使用される。【００３７】  このアッセイの連続型及び中断型（Nagarajら、1996年）のいずれもが、うまく実施できた。しかしながら、中断法の方が本出願人の意図するようにうまくできた。ウシRNアーゼAタイプI-A（Sigma）を本出願人のアッセイ全体にわたって使用した。【００３８】  連続法に関しては、RNアーゼ、1 mg/mLをリボース（0.2 M）と一緒に、37℃、暗所で7日間、0.02％アジ化ナトリウムを含有する0.4 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5中で培養した。有望な阻害剤を、培養期間の開始時に反応物に添加した。全ての溶液は、0.2ミクロン濾紙（Corning）を通して濾過することにより滅菌条件下で調製した。培養終了時、サンプルをその蛍光（励起、330 nm；放出、400nm）に関して分析した。種々の濃度の阻害剤によるAGE-形成の阻害率％を、上記の如く計算した。【００３９】  中断RNアーゼ-リボースアッセイは、以下のようにして実施した：RNアーゼ、10 mg/mLを、阻害剤化合物の非存在下、0.02％アジ化ナトリウムを含有する0.4 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5中、37℃で24時間、リボース（0.5 M）と一緒に培養した。次いで、0.4 Mリン酸塩緩衝液中で反応物を1：100に希釈し、次いで試験阻害剤を所望の濃度で反応物に添加することによって、糖化を中断させた。反応物を0.2ミクロン濾紙を通して濾過し、さらに4日間、37℃で暗所で培養した。培養期間終了時、サンプルを上記の如くその蛍光に関して分析し、阻害率％を計算した。【００４０】  試験化合物の阻害効果を検出するには、培養期間の終了時に、RNアーゼ架橋及び二量体-三量体形成を阻害する阻害作用を、上記の如くSDS-PAGE法により分析した。中断糖化アッセイの場合には、サンプルはCentricon 10（Amicon）を使用して濃縮し、次いでゲルに適用した。【００４１】  上記実施例は、この種の薬剤療法が、非酵素的糖化生成物（初期及び後期生成物）並びにタンパク質-タンパク質架橋の形成に関連する病状を軽減させるのに有用であることを示唆している。本発明の化合物は、糖尿病合併症を予防するために第2/3相臨床試験中のアミノグアニジンと比較してin-vitroでAGE-形成に関し10〜40倍も強力な阻害剤であることが見いだされた。先の研究から、これらの化合物は非毒性であることが示された。これらの化合物は、1回の量または個々の量でそれぞれの薬剤の活性に応じ種々の投薬量で経口的に投与することができる。さらに、本発明の化合物は非経口的または直腸的に投与することができる。【００４２】  本発明の好ましい態様の詳細を参照として本願明細書で開示してきたが、本発明の開示は限定的というよりもむしろ例示的なものであり、本発明の趣旨及び付記請���の範囲内で当業者は種々の変形を考えつくであろう。【００４３】
【化６】
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【００４４】
【化７】
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【００４５】
【化８】
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【００４６】
【化９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、本発明のアリール及び複素環式ウレイド並びにアリール及び複素環式カルボキサミドフェノキシイソ酪酸の全てではないが、多くを包含する一般式を示す。R1、R2、R3及びR4は、同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル、アリール、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及び1〜6個の炭素原子のアルコキシからなる群から独立して選択され；R5及びR6は同一または異なっていてもよく、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、アラルキル（ここで前記アルキル部分は1〜6個の炭素原子を持つ）、3〜7個の炭素原子のシクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され；及びR7は、水素または、1〜6個の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基である。
【図２】図2A-Bは、δ-Gluと一緒に、5時間（図2A）または16時間（図2B）培養した全血における種々の阻害剤化合物の効果を示す。グラフの棒は、得られたHbAlcレベルを表す。50 mMでアミノグアニジンを使用した以外には、阻害剤は1 mM終濃度で使用した。図2Aに関しては、グラフの棒は、A：ベースライン対照、血液とPBSとを含有するがδ-Gluは含有しない；B：δ-Glu処理血液を含有するが阻害剤を含まない；C：血液＋δ-Glu＋アミノグアニジンを含有する；D〜L：これらは、血液＋δ-Gluと、それぞれLR26、LR28、LR29、LR33、LR36、LR41、LR45、LR49及びLR69とを含有する。図2Bに関しては、グラフの棒は、A：ベースライン対照、血液とPBSとを含有するがδ-Gluは含有しない；B：δ-Glu処理血液を含有するが阻害剤を含まない；C：血液＋δ-Glu＋アミノグアニジンを含有する；D〜L：これらは、血液＋δ-Gluと、それぞれLR66、LR67、LR71、LR79、LR80、LR81、LR85、LR88及びLR92とを含有する。全てのサンプルは同一濃度の血液及びδ-Gluを含有する。
【図３】図3A-Bは、BSA-グルコースアッセイのデータを示し、50 mMアミノグアニジンと比較した阻害剤1 mMによるAGE形成の阻害率を示す。図3Aに関しては、グラフの棒は、A：アミノグアニジン；B：LR26、C：LR28、D：LR29、E：LR33、F：LR36、G：LR41、H：LR45、I：LR49及びJ：LR62である。図3Bに関しては、グラフの棒は、A：アミノグアニジン；B：LR66、C：LR67、D：LR71、E：LR79、F：LR80、G：LR81、H：LR85、I：LR88及びJ：LR92である。
【図４】図4A-Bは、G.K-リボースアッセイのデータを表し、50 mMアミノグアニジンと比較した阻害剤1 mMによるAGE形成の阻害率を示す。図4Aに関しては、グラフの棒は、A：アミノグアニジン；B：LR26、C：LR28、D：LR29、E：LR33、F：LR36、G：LR41、H：LR45、I：LR49及びJ：LR62である。図4Bに関しては、グラフの棒は、A：アミノグアニジン；B：LR66、C：LR67、D：LR71、E：LR79、F：LR80、G：LR81、H：LR85、I：LR88及びJ：LR92である。
【図５】図5は、LR1〜LR14の構造を示す。
【図６】図6は、LR15〜LR28の構造を示す。
【図７】図7は、LR29〜LR42の構造を示す。
【図８】図8は、LR43〜LR56の構造を示す。
【図９】図9は、LR57〜LR73の構造を示す。
【図１０】図10は、LR74〜LR92の構造を示す。
【図１１】図11A-Bは、AGE-BSAを用いるコラーゲンの架橋の阻害を測定する特異的ELISAアッセイを使用する代表的な化合物の阻害効果における免疫化学的方法の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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