(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーをエタノールに溶解し、
該エタノール溶液にクロロホルム、酢酸エチル、およびｎ−ブタノールを加え、そして
クロロホルム、酢酸エチル、およびｎ−ブタノールに可溶な成分を除去する
ことにより得られた酸性の水溶性抽出物を有効成分として含む、抗コレステロール剤。
【請求項２】
ローヤルゼリーを精製水に溶解し、該溶液を限外ろ過により分子量１０，０００以下の画分を抽出して得られた酸性の水溶性抽出物を有効成分として含む、抗コレステロール剤。
【請求項３】
スクアレンエポキシダーゼ（ＳＥ）遺伝子の発現抑制作用を有する、請求項１または２に記載の抗コレステロール剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ローヤルゼリー（RJ）由来の成分を有効成分とする抗コレステロール剤に関する。
【０００２】
背景技術
RJは、血清コレステロールおよび脂質低下作用ならびに四塩化炭素による肝臓障害の改善作用など特に肝臓に対して多くの薬理作用を示す。
【０００３】
これまでに、RJの摂取により肝臓へのコレステロールの取込みに関与するLow density lipoprotein receptor (LDLR)の発現が上昇し、コレステロール合成に関与する酵素であるスクアレンエポキシダーゼ（SE）およびSEの転写因子であるSterol regulatory element-binding protein-1（SREB-1）の発現が低下することが明らかとなっている（Kamakura, M., Moriyama, T. and Sakaki, T. (2006) Changes in hepatic gene expression associated with the hypocholesterolaemic activity of royal jelly. J. Pharm. Pharmacol. 58, 1683-1689（非特許文献１））。SEの発現を転写レベルで抑制することは、血清中のコレステロールの低下に有用なものとなりうる。
【０００４】
しかしながら、SEの発現変動に影響を及ぼすRJ中の有効成分は全く知られておらず、RJ由来の成分を有効成分とする抗コレステロール剤についても全く知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】Kamakura, M., Moriyama, T. and Sakaki, T. (2006) Changes in hepatic gene expression associated with the hypocholesterolaemic activity of royal jelly. J. Pharm. Pharmacol. 58, 1683-1689.
【発明の概要】
【０００６】
本発明者は、今般、RJ中の特定抽出成分が、抗コレステロール作用、とりわけSE遺伝子の発現抑制作用を有することを見いだした。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】
従って、本発明は、RJ由来の成分を有効成分とする抗コレステロール剤の提供をその目的としている。
【０００８】
そして、本発明の第一の態様による抗コレステロール剤は、RJのエタノール溶液から、クロロホルム、酢酸エチル、およびｎ−ブタノール可溶性成分を除去して得られた酸性の水溶性抽出物を有効成分とするものである。
【０００９】
また、本発明の第二の態様による抗コレステロール剤は、ローヤルゼリー中の成分の内、分子量１０，０００以下でかつ酸性の水溶性抽出物を有効成分とするものである。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明による抗コレステロール剤の有効成分の由来となるRJは特に限定されず、いずれの種類のミツバチ由来のものであってもよい。
【００１１】
本発明の第一の態様において、RJを、まず、エタノール（好ましくは５０％エタノール水溶液）に溶解し、好ましくはろ過した後、クロロホルム、酢酸エチル、およびｎ−ブタノールを加えて、これら溶媒に可溶な成分を除き、水溶性成分のみの画分を得て、これを有効成分とする。また、本発明の第二の態様において、RJを、例えば精製水に溶解し、その溶液を例えば限外ろ過により分子量１０，０００以下の画分を得て、これを有効成分とする。これらの画分の液性は酸性であり、具体的にはｐＨ４以上、ｐＨ７未満を示す。
【００１２】
本発明による抗コレステロール剤は、後述する実験から明らかなようにSEの発現抑制作用を有しており、その結果血清中のコレステロールを低下させうるものと考えられる。また、本発明による抗コレステロール剤は、LDLRの発現増加作用を有さないとの特徴も有する。
【００１３】
本発明による抗コレステロール剤は、有効成分をそのまま用いてもよく、また他の賦形剤、結合剤等とともに、経口または非経口投与に適した剤形とされてよい。
【００１４】
前記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、またはリン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
【実施例】
【００１５】
スクアレンエポキシダーゼ（SE）の発現抑制作用
（１）RJ50％エタノール抽出物の作成
RJ （（株）クヰンビーガーデン社製、中国浙江省産）50gに50％エタノール溶液500mLを加え、10分間攪拌し、1時間超音波処理を行なった。さらに4℃中において、遠心分離（8000rpm、10分間）後、濾紙（No.2）により濾過した。ろ液は、ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、凍結乾燥させた。この50％エタノール抽出物は、使用直前まで-4℃にて冷蔵保存した。
【００１６】
（２）肝細胞HepG2およびNMuLiを用いたSE遺伝子発現に及ぼすRJの影響
(a) HepG2細胞およびNMuLi細胞の培養および継代
HepG2細胞（ヒト肝由来癌細胞）およびNMuLi細胞（マウス肝由来細胞）（いずれも、大日本住友製薬株式会社製）は、同一の方法により培養および継代を行なった。細胞培養のための培地は、growth mediumを用いた。該growth mediumは、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM培地（500mL）を恒温槽にて37℃で温め、そこに非動化した10％子ウシ血清（MOREGATE、50mL）および100ng/mL Penicillin・Streptomycin（5mL）を添加し、作成した。子ウシ血清の非動化は、子ウシ血清を、56℃で30分間処理することにより行った。非動化後、使用時まで-20℃にて保存した。
【００１７】
前記細胞の培養は、まずセラムチューブ中の懸濁細胞（10％dimethylsulfoxideを含む前記growth medium中において、液体窒素気層下にて保存した細胞）を融解した。前記growth medium（10mL）が入った培養シャーレ（IWAKI社製、φ100mm）に融解した細胞を懸濁した。この際、細胞がシャーレ上に均等に分散するように注意しながら、シャーレを振とうした。前記細胞は37℃、5％CO2存在下にて培養した。
【００１８】
前記細胞の継代は以下のように行った。まず、培養後のシャーレ（φ100mm）中の培地を取り除き、トリプシン処理（トリプシン溶液：Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA・4Na)（GIBCO BRL））により細胞を回収した。次に、PBS(-) (Milli-Q水1L 当たりNaClを8g、KClを0.2g、Na2HPO4・12H2Oを2.9g、およびKH2PO4 を0.2g加え、溶解し、高圧蒸気滅菌し作成した。)  をシャーレ当たり4mL加え、洗いこみをした後、遠心分離（4℃、2000rpm、3分間）した。そして、その上清を除き、前記growth mediumに懸濁し、growth medium(10mL)が入ったシャーレ(φ100mm)に分散するように移した。以上の操作を一定期間ごとに行い、シャーレ上の細胞がコンフルエントにならないよう、細胞を継代した。
【００１９】
(b) 培養細胞を用いたSE遺伝子発現に及ぼすRJの影響の測定
(i) RJ50％エタノール抽出物のSEの遺伝子発現に対する影響
まず、前記growth mediumにRJ50％エタノール抽出物を0mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、および1.0mg/mLの濃度となるように添加した。さらに、各培地にcholesterol（10mg/mL）を0.2μg/mLの濃度となるように添加した。 
【００２０】
次に、コンフルエントになった細胞をトリプシン処理により回収した。そして、前記PBS(-)をシャーレ当たり4mL加え、洗いこみをした後、遠心分離（4℃、2000rpm、3分間）を行った。そして、その上清を除き、前記growth mediumに懸濁し、細胞数を計測した上で、5×105cells/mLに細胞濃度を調製し、これを各ディッシュ(φ35mm)に2mLずつ分注した。37℃、5％CO2存在下にて3〜5時間培養した後、各ディッシュ(φ35mm)の培地を除き、各濃度でRJ50％エタノール抽出物を添加した前記growth mediumを、各ディッシュ(φ35mm)に2mLずつ添加した。その後、37℃、5％CO2存在下にて24時間培養した。そして、トリプシン処理により回収し、PBS(-)を各デッシュ(φ35mm)当たり 0.5mL加え、洗いこみをした後、遠心分離(4℃、5000rpm、3分間)を行い、上清を除いて細胞を得た。
【００２１】
(ii) 細胞からのRNAの抽出
HepG2細胞およびNMuLi細胞からのRNAの抽出は、RNA抽出キットRNAgente totalRNA Isolation system（Promega）を使用して行った。回収した前記細胞にDenaturarion Solution(200μL)を添加し、ボルテックスを用いてホモジネートした。さらに2M Sodium Acetateを20μL添加し、ボルテックスにより攪拌した後、200μL Phenol/Choloroformを加えた。再度、ボルテックスにより攪拌し、15分間氷中にて放置した後、遠心分離（4℃、15000rpm、20分間）を行った。その後、上層を除き、下層と等量のイソプロパノールを加えた。-20℃で5分間放置し、遠心分離（4℃、15000rpm、10分間）後、RNAの沈殿を得た。さらに、その沈殿を200μLの 70％エタノールを用いて濯いだ。遠心分離（15000rpm、5分間）後、沈殿をDry upし、30μL DEPC H2Oにより溶解し、Total RNA溶液を得た。Total RNAの一部を1000倍希釈し、試料のOD260nmおよびOD280nmを分光光度計により測定し、RNAおよびタンパク質の濃度を測定した。
【００２２】
(iii)SEの遺伝子発現の解析
逆転写反応
RNAからcDNAの合成は、ExScriptTMRT reagent Kit（Takara社製）を用いて行った。以下のような組成に溶液を調製し、一反応20μL当たり200ngのTotal RNAを添加し、逆転写反応（42℃で10分間、95℃で2分間）を行い、cDNAを合成した。
試薬                                     用量
5×ExScriptTMBuffer                          4.0μL
dNTP Mixture                                 1.0μL
Oligo dT Primer                              1.0μL
ExScriptTMRtase                              0.5μL
RNase Inhibitor                              0.5μL
Total RNA                                    2.0μL
RNase Feed H2O                              11.0μL
──────────────────────────
合計                                        20.0μL
【００２３】
リアルタイム（RT）-PCR反応
RT-PCRに、以下のプライマーを用いた。
Human Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): 
・GCACCGTCAAGGCTGAGAAC (Forward)
・TGGTGAAGACGCCAGTGGA (Reverse)
Human SE: 
・TTGTGATGGGAGTTCAGTACAAGGA (Forward)
・CAGCATGATTTGCTTTAAACTGTGG (Reverse)
Human HMG-CoA reductase: 
・GCCTGGCTCGAAACATCTGAA (Forward)
・CTGACCTGGACTGGAAACGGATA (Reverse)
Human LDLR: 
・CAACGGCTCAGACGAGCAAG (Forward)
・AGTCACAGACGAACTGCCGAGA (Reverse)
Human SREB-1:
・GGCTCCTGCCTACAGCTTCT (Forward)
・CAGCCAGTGGATCACCACA (Reverse)
Human SREB-2: 
・TATGGAGCAGCCTCAACGTCAG (Forward)  
・CCGTAGCGACAGTAGCAGGTCA (Reverse)
Mouse GAPDH: 
・AAATGGTGAAGGTCGGTGTG (Forward)
・TGAAGGGGTCGTTGATGG (Reverse)
Mouse SE:
・CATGGCTGAACAAATTTACCCACA (Forward)   
・CCGCAGACGACCATTCTGAG (Reverse)
【００２４】
逆転写反応で合成したcDNAを滅菌したMilliQ水により5倍希釈を5段階行い、希釈溶液のRT-PCRを実施し、各サンプルについて検量線を作成して、細胞中のmRNA量を定量化した。RT-PCR用の96穴プレート（Applied Biosystems社製）に下記の組成の溶液を18μL/wellで分注した。その後、各2μL/wellのcDNA希釈液を入れ、混合した。cDNAを鋳型として以下の条件にてABI PRISM 7500 (Applied Biosystems社製) を用いてRT-PCRを行い、肝細胞中の目的因子のmRNA発現量を定量した。
【００２５】
＜反応液＞                   １反応分       45反応分    
SYBR Premix Ex Taq              10μL        450μL
Primer Forward 50μM          0.08μL        3.6μL
Primer Reverse 50μM          0.08μL        3.6μL
DyeII                         0.40μL         18μL
滅菌MilliQ水                  7.44μL      334.8μL
─────────────────────────────
合計                            18μL        810μL          
【００２６】
PCR条件
まず、cDNAを95℃で10秒間変性し、次に95℃で5秒間アニーリングを行い、その後60℃で35秒間伸長反応を行う。これを40サイクル繰り返す。その後、さらに95℃で15秒間、60℃で60秒間、そして95℃で15秒間処理し、ＰＣＲ反応を終了させた。
【００２７】
(c)細胞毒性評価（MTT法）
RJ水抽出画およびRJ50％エタノール抽出物を種々の濃度（0mg/mL、0.033mg/mL、0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、および1.0mg/mL）により、前記growth mediumに添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度により添加した。
【００２８】
96穴プレート（IWAKI社製）にHepG2細胞およびNMuLi細胞をそれぞれ1×104cells/well（100μL/well）の密度でまき、37℃、5％CO2存在下にて3〜6時間培養後、抽出物添加培地に交換した。さらに24時間培養後、MTT溶液（5mL/mL MTT /PBS(-)溶液）を10μL加え、そして4時間培養を行なった。その後、100μLイソプロパノール/塩酸溶液（0.04M塩酸/イソプロパノール溶液）を加え、ホルマザンを完全に溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて、560nmにおける吸光度を測定した。
【００２９】
RJ50%エタノール抽出物は、マウス由来の肝細胞NMuLi細胞およびヒト由来肝細胞HepG2細胞におけるSEのｍRNAの発現を濃度依存的に阻害した（図１および図２）。更に、同抽出物のMTTアッセイによる細胞毒性を評価した結果、RJ50％エタノール抽出物は培養24時間においてNMuLi細胞およびHepG2細胞の生存率に影響を及ぼしていなかった（図１および図２）。これらの結果は、RJ50%エタノール抽出物中にSEの発現抑制を示す成分が存在していることを示す。
【００３０】
（３）有機溶媒を用いた分画
有機溶媒を用いたRJの成分分画は下記図３のように行った。まず、200mgのRJ50％エタノール抽出物を秤量し、水を5mL添加し、さらにクロロホルムを5mL添加した。ボルテックスにより試料を溶解した後、遠心分離（4℃、15000rpm、3分間）を行なった。H2O層を移し、再度クロロホルムを5mL添加し、攪拌後遠心分離を行い、2回分の分離溶液層を合わせ、クロロホルム層とした。次に、H2O層に酢酸エチル5mLを添加し、ボルテックスにより攪拌の後、遠心分離(4℃、15000rpm、3分間)を行った。H2O層に再度酢酸エチル5mLを添加し、攪拌後遠心分離を行い、クロロホルム層と同様に1回目と2回目の層を合わせ、酢酸エチル層とした。次に、H2O層に水飽和n-ブタノール5mL添加し、ボルテックスにより攪拌後、4℃、15000rpm、3分間遠心分離(4℃、15000rpm、3分間)を行なった。H2O層に再度水飽和n-ブタノール5mLを添加し、攪拌後遠心分離を行い、前述同様、2回分の層を合わせ、水飽和n-ブタノール層とした。得られた有機溶媒分離溶液は減圧下において溶媒を除去後、凍結乾燥を行なった。H2O層は凍結乾燥にかけた。
【００３１】
最終的に水抽出画分173.4mg、クロロホルム抽出画分64.5mg、酢酸エチル抽出画分3.8mg、およびn-ブタノール抽出画分16.3mgを得た。その後分離溶液抽出画分は、使用直前まで-4℃にて冷蔵保存した。
【００３２】
培養細胞を用いたSE発現抑制活性に対する有機溶媒抽出画分の影響
クロロホルム抽出画分、酢酸エチル抽出画分、水飽和n-ブタノール抽出画分、および水抽出画分をgrowth mediumに0mg/mL、0.3mg/mL、および1.0mg/mLの濃度となるよう添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度で添加した。
【００３３】
培養細胞を用いたSEの遺伝子発現の解析は、前述と同様の方法で実施した。
【００３４】
その結果、クロロホルム画分(CHCl3）、酢酸エチル画分(酢エチ)、およびブタノール画分(BuOH)はHepG2細胞のSEの発現に対して影響を及ぼさなかった（図４）。しかし、水抽出画分(H2O)は濃度依存的にSEの発現抑制活性を示した（図４）。また、同水抽出画分は、24時間の培養期間内において細胞毒性は示していなかった（図５）。したがって、前記水抽出画分は、コレステロール合成に関与するSEの発現を転写レベルで抑制するため、血清中のコレステロール低下に有用である。
【００３５】
肝細胞のmRNA発現に対する水抽出画分の影響
水抽出画分をgrowth mediumに0mg/mL、0.3mg/mL、および1.0mg/mLの濃度で添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度で添加した。
【００３６】
前述のRT-PCR反応において、GAPDHおよびSEに加え、HMG-CoA reductase、LDLR、SREB-1、およびSREB-2の遺伝子発現の解析を前述と同様の方法で実施した。
【００３７】
更に、水抽出画分の肝細胞中の種々の因子のmRNAの発現に対する影響について検討した。
【００３８】
その結果、水抽出画分は、コレステロール合成の律速酵素であるHMG−CoAリダクターゼの発現には影響を与えなかった（図６）。また、マイクロアレイ解析で、RJの摂取により発現の増加が見られたLDLRについても、水抽出画分はLDLRの遺伝子発現に影響を及ぼしていなかった（図６）。一方、水抽出画分は、転写因子であるSREB-2の遺伝子発現には影響を及ぼさず、SREB-1の遺伝子発現を濃度依存的に阻害していた（図６）。これらの結果から、水抽出画分にはLDLRの発現増加に関与する成分は含まれずSEの発現抑制に関与する成分のみが含まれていることが明らかとなった。さらに、そのSEの発現抑制は、コレステロール代謝や脂質代謝に関与する転写因子のうち、SREB-2ではなくSREB-1の遺伝子発現の抑制を介して行われていることも明らかとなった。
【００３９】
培養細胞を用いたSE遺伝子発現に及ぼすRJの影響
H2O抽出エキス(RJ水抽出画分)、RJ上清画分(RJを精製水に溶解して10％の濃度にし、その上清を凍結乾燥してサンプルを作成)、RJ  UF10000画分(10％RJ水溶液を分子量１０，０００の限外ろ過膜（UF）で処理したろ液（分子量１０，０００以下の成分）)を作成し、さらにそれらを培地に添加（0.5mg/mL）して培養肝細胞（HepG2）を培養し、24時間後の肝細胞からTotal RNAを抽出し、SEの遺伝子発現の変化をリアルタイムPCR(Applied Biosystems社製)により定量した。なお、前記H2O抽出エキスをpHメーター(Horiba社製)により測定した結果、pH4.51であった。
【００４０】
結果、下記図７に示されたように、H2O抽出エキス、RJ上清画分、およびRJ  UF10000画分のそれぞれにおいてSEの遺伝子発現の抑制効果を示した。したがって、本願発明の抗コレステロール剤の有効成分は、分子量１０，０００以下でかつ酸性の水溶性物質であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、RJエタノール抽出物のNMuLiに対するSE発現抑制作用を表す。
【図２】図２は、RJエタノール抽出物のHepG2に対するSE発現抑制作用を表す。
【図３】図３は、有機溶媒を用いたRJの成分分画を表す。
【図４】図４は、各種抽出画分のSE発現抑制活性を表す。
【図５】図５は、水抽出画分の細胞毒性を表す。
【図６】図６は、肝細胞のmRNA発現に対する水抽出画分の影響を表す。
【図７】図７は、SE遺伝子発現に対する影響を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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