(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO. 1のアミノ酸配列において、次の条件、
（１）グルタミン残基（Ｑ）２１８はアルギニン（Ｒ）で置き換えられている、
（２）スレオニン残基（Ｔ）３０８はリシン（Ｋ）で置き換えられている、
（３）セリン残基（Ｓ）３１９はアスパラギン酸（Ｄ）で置き換えられている、のうち１つ以上を満たしているアミノ酸配列を含む改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質であって、細胞内における該改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の発現は同量の野生型ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の発現よりヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の基質（substrate）の細胞内レベルを高くする、改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項２】
前記セリン残基（Ｓ）３１９はアスパラギン酸（Ｄ）で置き換えられている、請求項１に記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項３】
SEQ ID NO. 1のアミノ酸配列においてグルタミン残基２１８はアルギニンで置き換えられたアミノ酸配列を含む請求項１又は２に記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項４】
細胞内における該改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の発現は、ナトリウムイオン（Ｎａ+）、ヨウ化物（Ｉ-）、パーテクネート（ＴｃＯ4-）、パーレネート（ＲｅＯ4-）、アスタチド（Ａｔ-）、及びこれらの組合せからなるグループから選択される基質の細胞内レベルを上昇させる請求項１〜３のいずれかに記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項５】
細胞内における該改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の発現は、ヨウ化物（Ｉ-）の細胞内レベルを上昇させる請求項１〜４のいずれかに記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項６】
癌治療、分子撮像、又はこれらの組合せにおいて使用される請求項１〜５のいずれかに記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、又はSEQ ID NO. 8の核酸配列、又は核酸配列SEQ ID NO. 17からなるプライマー及び前記野生型ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質のポリヌクレオチドをテンプレートとして使ってポリメラーゼ連鎖反応を実行することにより得られる核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
SEQ ID NO. 2の核酸配列を含む請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
試験管内の細胞内のヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の基質を増加させる方法であって、
ａ１）請求項１〜６のいずれかに記載の改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを試験管内の該細胞内に導入するステップと、
ａ２）該細胞を培養して該改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質を発現させるステップとにより導入することと、
ｂ）該細胞をヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の１つ以上の基質と接触させることとを含む方法。
【請求項１１】
前記改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の該ポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、又はSEQ ID NO. 8の核酸配列、又は核酸配列SEQ ID NO. 17からなるプライマー及び前記野生型ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質のポリヌクレオチドをテンプレートとして使ってポリメラーゼ連鎖反応を実行することにより得られる核酸配列を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2の核酸配列を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質はナトリウムイオン（Ｎａ+）、ヨウ化物（Ｉ-）、パーテクネート（ＴｃＯ4-）、パーレネート（ＲｅＯ4-）、又はアスタチド（Ａｔ-）である請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記基質はヨウ化物（Ｉ-）である請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質及びその使用、特に試験管内又は生体内で細胞内のヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の基質（substrate）を増加させるための改変ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質の使用に関する。
《関連する出願への相互参照》
本出願は、２０１０年７月２８日付で出願した台湾特許出願第０９９１２４８８１号の優先権を主張する特許出願である。
【背景技術】
【０００２】
人体内の甲状腺ホルモンの主機能は、生理機能を調節し、代謝を促進することである。例えば、甲状腺ホルモンは細胞の酸素消費量、呼吸数、体温、心拍、血流などを調節することが出来、また脂肪、タンパク質、及び炭水化物の代謝を促進することが出来る。ヨウ素（Ｉ）は甲状腺ホルモンに必須の元素である。甲状腺ホルモンは甲状腺により生成され、甲状腺の細胞膜上のヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質を介して血液中のヨウ化物イオン（Ｉ-）は甲状腺細胞に能動輸送により輸送され、甲状腺ホルモンが合成される。
【０００３】
甲状腺癌は首の部位に一般的に発生する悪性の新生物である。甲状腺癌は長い潜伏期間と速い転移速度とを有し、近年、台湾において女性に最も多い癌の１つとなっている。放射性ヨウ素療法が甲状腺癌の治療に通常使用される。ヨウ化物イオンを輸送するＮＩＳタンパク質の特異性をこの療法に適用し、放射性Ｉ‐１３１同位体を甲状腺癌細胞内に輸送して癌細胞を殺す効能を実現する。従って、放射性ヨウ素療法において、ヨウ化物イオンを甲状腺癌細胞内に輸送するＮＩＳタンパク質の機能は治療の重要な要素となっている。ＮＩＳタンパク質が十分な濃度の放射性ヨウ化物イオンを甲状腺癌細胞内に敏速に輸送できないと、癌細胞を効果的に殺して癌治療を促進することが出来ない。
【０００４】
特許文献１は野生型ＮＩＳタンパク質の正電荷数を増加させることでＩ-イオンに対する輸送機能を向上させた改変ＮＩＳタンパク質を開示する。この出願は、置換法（即ち、野生型ＮＩＳタンパク質中の中性非荷電アミノ酸または負荷電アミノ酸を正荷電アミノ酸で置換する）、又は追加法（即ち、野生型ＮＩＳタンパク質に正荷電アミノ酸を追加する）を使用して、ＮＩＳタンパク質を改変し、野生型ＮＩＳタンパク質中の正荷電アミノ酸の量を増加させることが出来ると記述している。開示された例によれば、輸送能力を向上させるために１０個の正荷電アミノ酸が野生型ＮＩＳタンパク質に追加される。
【０００５】
実際には、特許文献１が主張するようにＮＩＳタンパク質中の中性非荷電アミノ酸または負荷電アミノ酸を正荷電アミノ酸で置換して改善結果を達成することはそれほど容易ではない。また、特許文献１の開示に基づいて、意図的に多数の正荷電アミノ酸を野生型ＮＩＳタンパク質に追加して正荷電アミノ酸の数を増加させた場合、改善結果を達成するために十分な量の正荷電アミノ酸が必要であるので、ＮＩＳタンパク質の製造コストが増加する。その結果、ＮＩＳタンパク質の輸送機能を向上させるために正確で効率的な改変方法が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０００４１９１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の要望に基づいて本発明の研究が行われた。本発明の発明者はＮＩＳタンパク質のヨウ化物イオンを輸送する能力は、ＮＩＳタンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基を改変することで大きく向上しうることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの目的は、SEQ ID NO. 1のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が変えられたアミノ酸配列を含む改変ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記の改変ＮＩＳタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターとを提供することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、試験管内の細胞内のＮＩＳタンパク質の基質（substrate）を増加させる方法を提供することである。この方法は
ａ）該改変ＮＩＳタンパク質を試験管内の細胞内に導入するステップと、
ｂ）該細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させるステップとを含む。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、試験管内の細胞内のＮＩＳタンパク質の基質を増加させる方法を提供することである。この方法は
I）該改変ＮＩＳタンパク質を試験管内の細胞内に導入するステップと、
II）該細胞を動物の体内に移植するステップと、
III）該動物の体内の該細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させるステップとを含む。
【００１２】
本発明の詳細な技術と好適な実施形態を、当業者が本発明の特徴を良く理解できるよう下記に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】野生型ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質（ＮＩＳ‐ｗｔ）及び変異型ＮＩＳタンパク質のヨウ素輸送機能を示す統計棒グラフである。
【図２】マウス体内のＩ‐１３１を示す生体内分子像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述したように、臨床医学では、放射性Ｉ-イオンを特異的に輸送するヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質の特性により甲状腺癌細胞を殺す放射性ヨウ素療法が甲状腺癌治療に使用されてきた。放射性ヨウ素療法は甲状腺癌細胞に対して高い特異性を有するので、効果的な甲状腺癌療法の１つになっている。しかし、この方法は甲状腺癌患者自身のＮＩＳタンパク質の輸送能力に依存している。もしＮＩＳタンパク質がＩ-イオンを効果的に輸送できないなら、治療効果は限定されるであろう。ＮＩＳタンパク質を改変して輸送能力を向上させる方法を提案する文献が存在するが、その方法はＮＩＳタンパク質を正確かつ効果的に改変することがまだ出来ない。
【００１５】
ＮＩＳタンパク質は約６５０個のアミノ酸からなる内在性膜タンパク質である（アミノ酸配列をSEQ ID NO. 1に示す）。このタンパク質は１３の膜貫通領域を有し、イオンポンプとして働き１つのヨウ化物イオン（Ｉ-）と２つのナトリウムイオン（Ｎａ+）とを甲状腺細胞内に同時に輸送する。本発明の発明者はＮＩＳタンパク質の輸送機能はＮＩＳタンパク質中のアミノ酸を改変することで向上しうることを発見した。
【００１６】
本発明は向上した輸送機能を有する改変ＮＩＳタンパク質を提供する。本発明のＮＩＳタンパク質は、その基質（substrate）を輸送する機能を向上させるよう野生型ＮＩＳタンパク質のアミノ酸配列（SEQ ID NO. 1）内の１つ以上のアミノ酸残基を変えることで作製され、従って、細胞内のＮＩＳタンパク質の基質の量を増加させるために使用できる（即ち、細胞内における本発明のＮＩＳタンパク質の発現は、同量の野生型ＮＩＳタンパク質の発現よりＮＩＳタンパク質の基質の細胞内レベルを高くする）。
【００１７】
本発明によれば、ＮＩＳタンパク質の改変は、ＮＩＳタンパク質中の正荷電又は中性非荷電アミノ酸残基を負荷電アミノ酸残基で置換してＮＩＳタンパク質中の負電荷数を増加させて輸送能力を向上させることを含む。例えば、アスパラギン酸（負荷電）を、ＮＩＳタンパク質中のセリン残基（中性非荷電）３１９を置換するために使用できる。従って、本発明では、改変ＮＩＳタンパク質はSEQ ID NO. 1のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基は負荷電アミノ酸に変えられている。
【００１８】
本発明によれば、ＮＩＳタンパク質の改変は、ＮＩＳタンパク質中の負荷電又は中性非荷電アミノ酸残基を正荷電アミノ酸残基で置換してＮＩＳタンパク質中の正電荷数を増加させて輸送機能を向上させることを含む。例えば、グルタミン残基（中性非荷電）２１８をアルギニン（正荷電）で置き換えるか、又はスレオニン残基（中性非荷電）３０８をリシン（正荷電）で置き換えることが出来る。本発明の１つの実施形態では、ＮＩＳタンパク質のグルタミン残基２１８をアルギニンで置き換える。
【００１９】
好ましくは、本発明のＮＩＳタンパク質は、SEQ ID NO. 1のアミノ酸配列において、次の条件、（１）グルタミン残基（Ｑ）２１８はアルギニン（Ｒ）で置き換えられている、（２）スレオニン残基（Ｔ）３０８はリシン（Ｋ）で置き換えられている、（３）セリン残基（Ｓ）３１９はアスパラギン酸（Ｄ）で置き換えられている、のうち１つ以上を満たしているアミノ酸配列を含む。本発明の発明者は、理論によって制限されず、上記３つのアミノ酸残基のうち任意の１つを改変することで、細胞膜上のＮＩＳタンパク質の３Ｄ構造を変えることが出来、それに応じて、その輸送機能が向上しうると考えている。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、部位特異的突然変異誘発法によりＮＩＳタンパク質中の、グルタミン残基２１８をアルギニンで置き換え（以下、NIS-Q218Rと略記する）、スレオニン残基３０８をリシンで置き換え（以下、NIS-T308Kと略記する）、及び／又はセリン残基３１９をアスパラギン酸で置き換えて（以下、NIS-S319Dと略記する）、輸送機能を大幅に向上させる。細胞内のＮＩＳタンパク質の構造に関して、上記３つのアミノ酸残基全てが細胞膜上の細胞外位置に存在する。下記の実施例に例示するように、本発明のＮＩＳタンパク質の輸送能力は、野生型ＮＩＳタンパク質（以下、NIS-wtと略記する）に比べて約２００％向上させることが出来る。
【００２１】
本発明の改変ＮＩＳタンパク質を得るために、ＮＩＳタンパク質を任意の適切な手法で改変することが出来る。例えば、本発明のＮＩＳタンパク質をアミノ酸合成機により合成することが出来る。アミノ酸合成機はアミノ酸残基２１８、３０８、及び／又は３１９の合成が実行される時、置換だけを実行する。或いは、分子生物工学により部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの組みを設計し、アミノ酸残基２１８、３０８、及び／又は３１９の核酸をコドン表を参照して改変することが出来、次に、発現が宿主細胞内で実行されて本発明のＮＩＳタンパク質が得られる。
【００２２】
ＮＩＳタンパク質はＮａ+とＩ-とを細胞外に排出する以外に、他の基質、例えばパーテクネートイオン（ＴｃＯ4-）、パーレネートイオン（ＲｅＯ4-）、アスタチドイオン（Ａｔ-）等も輸送できることはよく知られている。従って、本発明のＮＩＳタンパク質は、次のイオン：Ｎａ+、Ｉ-、ＴｃＯ4-、ＲｅＯ4-、Ａｔ-、及びこれらの組合せからなるグループから選択される基質に対して向上した輸送機能を有する。好ましくは、ＮＩＳタンパク質はＩ-イオンに対して向上した輸送機能を有する。
【００２３】
上記にように、放射性ヨウ素療法はＮＩＳタンパク質の放射性Ｉ-イオンを輸送し甲状腺癌細胞を殺して甲状腺癌を治療する能力に基づいている。本発明のＮＩＳタンパク質のＩ-イオンに対する向上した輸送機能によって、このＮＩＳタンパク質が放射性Ｉ-イオンの輸送に適用された場合、甲状腺癌に対するヨウ化物イオンの治療効果を向上させることが出来る。また、ＮＩＳタンパク質は甲状腺以外の他の組織（鼻粘膜、胃、唾液腺等）にも存在する可能性があるが、非甲状腺組織に存在するＮＩＳタンパク質の量は相対的に少ない。体内のＮＩＳタンパク質を含む他の組織に癌細胞が現れた時、本発明のＮＩＳタンパク質の向上した輸送機能をこの組織を治療するために使用でき、甲状腺組織に限定されない。
【００２４】
放射性Ｉ-イオンは癌治療に適用できるだけでなく、分子撮像にも適用できる。放射性Ｉ-イオンの放射能に基づいて、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）又はガンマ線スキャナーを体内の放射性Ｉ-イオンの活動及び状態を検出又は追跡するために使用して、癌治療のためのリアルタイム検出効果を実現できる。本発明のＮＩＳタンパク質は放射性Ｉ-イオンを癌細胞内に効果的に輸送できるので、放射性Ｉ-イオンが癌細胞を殺す過程を完全に観察することが出来る。従って、本発明のＮＩＳタンパク質は分子撮像に適用された時、特に有利である。
【００２５】
本発明は、本発明のＮＩＳタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドも提供する。このポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、又はSEQ ID NO. 8の核酸配列を含む。好ましくは、このポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2の核酸配列を含む。
【００２６】
本発明は上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。この発現ベクターを使用して宿主細胞内で発現を実行すると、本発明のＮＩＳタンパク質が生成される。従って、該発現ベクターを癌治療、分子撮像、又はこれらの組合せに適用できる。これらの用途は上記で説明されている。
【００２７】
複製可能で宿主細胞内で機能できさえすれば、任意の既知の又は販売されているベクターを本発明の発現ベクターを作製するために使用できる。例えば、原核生物を宿主細胞として使用する時、米国Stratagene社のpBluescript(登録商標) II KS (+/-)ファージミドベクター又はpUC18などのベクターを使用できる。真核生物を宿主細胞として使用する時、pcDNA3.1、pSV40/neo、又はウイルスベクターなどのベクターを使用できる。
【００２８】
本発明の改変ＮＩＳタンパク質は向上した輸送機能を有するので、細胞内のＮＩＳタンパク質の基質の量を増加させるために使用できる。従って、本発明は試験管内又は生体内で細胞内のＮＩＳタンパク質の基質の量を増加させるための方法も提供する。
【００２９】
試験管内で細胞内のＮＩＳタンパク質の基質の量を増加させるための本発明の方法は、ａ）本発明のＮＩＳタンパク質を試験管内の細胞内に導入するステップと、ｂ）この細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させるステップとを含む。生体内の細胞内のＮＩＳタンパク質の基質を増加させるための方法は、I）本発明のＮＩＳタンパク質を試験管内の細胞内に導入するステップと、II）この細胞を動物の体内に移植するステップと、III）動物の体内でこの細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させるステップとを含む。
【００３０】
本発明の方法は細胞内のＮＩＳタンパク質の基質の量を増加させることが出来る。該基質は、例えばＮａ+、Ｉ-、ＴｃＯ4-、ＲｅＯ4-、又はＡｔ-イオンであってよい。好ましくは、該方法は細胞内のＩ-イオンの量を増加させるために使用される。
【００３１】
本発明の上記方法のステップａ）又はステップI）において、本発明のＮＩＳタンパク質を試験管内の細胞内に任意の適切な手法で導入できる。例えば、これに限定されないが次のステップ、ａ１）本発明のＮＩＳタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（即ち、本発明の発現ベクター）を試験管内の細胞内に導入する、ａ２）細胞を培養してＮＩＳタンパク質を発現させる、により実行できる。
【００３２】
ステップａ１）において、発現ベクターを既知のトランスフェクション法により細胞内に導入することが出来る。例えば、ＰＥＧ原形体法、化学法、電気穿孔法、遺伝子銃移入等を使用できる。１つの実施形態では、電気穿孔法を形質転換に使用する。このプロセスでは、細胞を電流で刺激した時、細胞膜の透過性が突然増加し、異種の遺伝子（例えば、発現ベクター）が細胞内に入るのを可能にする。電気穿孔法は操作が容易で簡単であるので有利であり、様々な種類の細胞に適しており、かつ形質転換の成功率が高い。
【００３３】
ステップａ１）において、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、又はSEQ ID NO. 8の核酸配列を含む。好ましくは、このポリヌクレオチドはSEQ ID NO. 2の核酸配列を含む。
【００３４】
ステップａ２）において、該細胞を培養して本発明のＮＩＳタンパク質を発現させる。次に、ＮＩＳタンパク質は、輸送機能を実行する細胞生理機構により細胞膜へ輸送される。次に、本発明のＮＩＳタンパク質は該細胞内に導入される。
【００３５】
本発明のＮＩＳタンパク質が試験管内の細胞内に導入された後、ステップｂ）を実行して、該細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させる。或いは、生体内で細胞内のＮＩＳタンパク質の基質を増加させたい場合は、ステップII）を実行して、先ず該細胞を動物の体内に移植する。次に、ステップIII）を実行して、動物の体内で該細胞をＮＩＳタンパク質の１つ以上の基質と接触させる。ステップII）では、任意の適切な方法を使用して該細胞を動物の体内に移植することが出来る。例えば、腹腔内注射、静脈注射等を細胞接種に使用できる。
【００３６】
ステップｂ）又はステップIII）において、任意の適切な方法を使用して該細胞を基質と接触させることが出来る。例えば、該細胞を含む培地に基質を単に加える、又は細胞移植された動物が基質を取り込むことで、該細胞を基質と接触させることが出来る。向上した輸送機能を有するＮＩＳタンパク質が該細胞の細胞膜上に存在するので、基質は該細胞内に容易に輸送され該細胞内の該基質の量を増加させることが出来る。
【００３７】
本発明の方法は、試験管内又は生体内で細胞内のＩ-イオンの量を増加させることが出来るので、試験管内又は生体内分子撮像に適用できる。例えば、本発明の方法は、試験管内又は生体内細胞又は組織試験に適用できる。放射性Ｉ-イオンと単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）又はγ放射スキャナーとを使用して細胞又は組織内の放射性Ｉ-イオンの活動及び状態を検出又は追跡することで、試験管内又は生体内分子撮像を実行できる。
【００３８】
以下、本発明を下記の実施例を用いて更に例示する。しかし、下記の実施例は例示するためだけに提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３９】
変異型ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質の調製
実験Ａ：一本鎖ファージミドＤＮＡの調製
プラスミド、pBluescript(登録商標) II KS(+)-5’hNIS（野生型ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質（ＮＩＳ‐ｗｔ）のポリヌクレオチド）を含む大腸菌（CJ236、米国New England BioLabs社から購入）を１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む培地（１リットル当りトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、及び塩化ナトリウム１０ｇを含む）に入れ、培養器内で３７℃で振とう培養した。次の日、ブロスを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（米国Sigma-Aldrich）と１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールとを含む2xYT培地（１リットル当りトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、及び塩化ナトリウム５ｇを含む）に加えた。ブロスのO.D.600値が０．３に達するまで、該細菌を培養器内で３７℃で振とう培養した。次に、M13KO7ヘルパーファージ（米国New England BioLabs社から購入）を該ブロスに加え、培養器内で３７℃で１時間振とう培養し、次に７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを該ブロスに加え、培養器内で３７℃で６時間振とう培養した。該ブロスを遠心分離管に入れ、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を収集し、別の遠心分離管に入れ、再び遠心分離した。上澄み液を収集し、１０Ｕ／μＬのDNase I（デオキシリボヌクレアーゼI)と１０μｇ／ｍＬのRNase Aとを加えた。この混合物を３７℃で１５分間反応させ、次に１／４体積のファージ沈降液（２０％PEG-8000、３．７５Ｍ酢酸アンモニウム）を混合物に加えた。この混合物を氷の上に３０分間置き、１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
【００４０】
遠心分離後、上澄み液を取除き、トリス緩衝液を使用して沈澱物を溶かした。次にフェノール／クロロホルムで沈澱物を数回抽出した。上澄み液を収集し、アルコール沈澱で一本鎖ファージミドＤＮＡを沈澱させた。最後に、一本鎖ファージミドＤＮＡを水で溶かした。
【００４１】
実験Ｂ：部位特異的突然変異誘発
ＮＩＳタンパク質の細胞膜外に位置する中性（非荷電）非高度保存アミノ酸を選択し、このＮＩＳタンパク質のアミノ酸の配座と重要な機能部位とに基づいて部位特異的突然変異誘発法で変異ＮＩＳタンパク質を調製した。
【００４２】
先ず、実験Ａにおいて調製した一本鎖ファージミドＤＮＡ（１μＬ）と、SEQ ID NO. 9の核酸配列を含むプライマー（１．２５μＬ）と、１０倍アニーリング緩衝液（１μＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、及び２０ｍＭのＭｇＣｌ2を含む）とを２次脱イオン水（６．７５μＬ）に加え、試験管内で混合した。次に鉱油を加え、水の蒸発を防いだ。この混合物を水中で９９℃で５分間加熱し、次に１分当り１℃の割合で徐々に３０℃まで冷却して一本鎖ファージミドＤＮＡと該プライマーとをアニールした。次にこの混合物を氷の上で冷却した。
【００４３】
次に合成緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４遺伝子３２タンパク質（米国Invitrogen社から購入）を該試験管に加え、該試験管を氷の上に５分間置き、次にこの混合物を２５℃で５分間反応させ、最後に３７℃で９０分間反応させてＰＣＲを実行した。反応完了後、得られた生成物をフェノール／クロロホルムで数回抽出し、次にアルコールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを水で溶かし、電気穿孔法により大腸菌ＮＭ５２２（Stratagene社から購入）内に導入した。大腸菌ＮＭ５２２のブロスをアンピシリンを含む培養皿に塗布し、培養器内で３７℃で１６〜２４時間培養した。選別を実行し、変異ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｙ８１Ｄ（ＮＩＳタンパク質のチロシン残基（Ｙ）８１がアスパラギン酸（Ｄ）で置換された）のポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを含む大腸菌ＮＭ５２２を得た。
【００４４】
大腸菌ＮＭ５２２の１つのコロニーを選択し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（１リットル当りトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、及び塩化ナトリウム１０ｇを含む）に入れ、培養器内で３７℃で２４時間振とう培養した。この細菌のプラスミドＤＮＡを抽出し制限酵素で切断し、部位特異的突然変異誘発の結果をＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。上記実験方法はKunkel, 1985, ”Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”, Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 82: 488-492を参照した。この文献を本明細書に援用する。
【００４５】
上記手順を、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、又はSEQ ID NO. 17の核酸配列を含むプライマーを使用して繰り返し、変異ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｙ８１Ｒ、ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ２２１Ｒ、ＮＩＳ‐Ｓ２４０Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｄ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｋ、ＮＩＳ‐Ｌ３１５Ｄ、又はＮＩＳ‐Ｓ３１９Ｄのポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを含む大腸菌ＮＭ５２２を作製した。本実験の部位特異的突然変異誘発に使用したプライマー配列を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0005234846.tif 000002
【実施例２】
【００４７】
ヨウ素輸送試験
SuperFect（QIAGEN社から購入）を使用して、実施例１で得た変異ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｙ８１Ｄのポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを人肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣから購入）に輸送し、この変異ＮＩＳタンパク質を発現させた。２４時間後、１０．２μＣｉ（マイクロキュリー）／ｍＬのヨウ素１２５（Ｉ‐１２５）を含む１ｍＬのＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）を細胞培地に加えた。培養器内で３７℃で１時間培養した後、細胞を収集し、Cobra II 自動ガンマ計数器（独国Packard BioScience)を使用してＩ‐１２５の放射能を測定しＮＩＳタンパク質のヨウ素輸送能力を求めた。
【００４８】
上記手順を、実施例１で調製した変異ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｙ８１Ｒ、ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ２２１Ｒ、ＮＩＳ‐Ｓ２４０Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｄ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｋ、ＮＩＳ‐Ｌ３１５Ｄ、又はＮＩＳ‐Ｓ３１９Ｄのポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを使用して繰り返した。結果を図１と表２に示す。
【００４９】
【表２】
0005234846.tif 000003
＊ P<0.05、野生型ＮＩＳタンパク質と比較して有意差がある。
【００５０】
図１と表２から分かるように、野生型ＮＩＳタンパク質と比較すると、変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｋ、及びＮＩＳ‐Ｓ３１９ＤはＩ-イオンを輸送する有意により高い能力を示した。ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒが最も高い輸送能力を有する。従って、本試験は、野生型ＮＩＳタンパク質の細胞外アミノ酸を改変することで得られるＮＩＳタンパク質は向上した輸送機能を有することを示した。
【００５１】
また、本試験は、野生型ＮＩＳタンパク質内の中性又は負荷電アミノ酸を正荷電アミノ酸で置き換えてＮＩＳタンパク質の輸送機能を向上させることはそれほど簡単ではなく（例えば、ＮＩＳ‐Ｙ８１Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ２２１Ｒ、及びＮＩＳ‐Ｓ２４０Ｒの試験結果に示されている）、ＮＩＳタンパク質の輸送機能を向上させる効果を得るために、ＮＩＳタンパク質のアミノ酸配列の特定の位置に対して置換えを行わなければならないことを示した。一方、ＮＩＳ‐Ｓ３１９Ｄの試験結果は、中性（非荷電）アミノ酸を負荷電アミノ酸で置き換える（即ち、ＮＩＳタンパク質の負電荷の数を増加させる）ことでも、ＮＩＳタンパク質の輸送機能を向上させうることを示した。
【実施例３】
【００５２】
ヨウ素輸送運動試験
SuperFectを使用して、変異型ＮＩＳタンパク質（ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｋ、又はＮＩＳ‐Ｓ３１９Ｄ）のポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを人肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２に輸送し、このＮＩＳタンパク質を発現させた。２４時間後、該細胞を６．２５μＭ（０．３９０６２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、１２．５μＭ（０．７８１２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、２５μＭ（１．５６２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、５０μＭ（３．１２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、１００μＭ（６．２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、２００μＭ（１２．５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、４００μＭ（２５μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、８００μＭ（５０μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）、又は１６００μＭ（１００μＣｉ／ｍＬのＩ‐１２５を含む）のヨウ化ナトリウムを含む培地に入れた。４分間培養した後、ＨｅｐＧ２細胞を収集し、Cobra II 自動ガンマ計数器を使用してＩ‐１２５の放射能を測定した。得られた値を下記の式に入力して、Ｖmax値とＫm値をLineweaver-Burkプロットにより計算した。
ｖ＝Ｖmax×[Ｉ]／（Ｋm＋[Ｉ]）＋０．０１５６×[Ｉ]＋２．４５８８
ヨウ化ナトリウムを加えてない野生型ＮＩＳタンパク質を含むＨｅｐＧ２細胞からの値（０．０１５６×[Ｉ]＋２．４５８８）をバックグラウンド値として使用した。結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
0005234846.tif 000004
【００５４】
表３は野生型ＮＩＳタンパク質のＶmax値と比べて変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、ＮＩＳ‐Ｔ３０８Ｋ、及びＮＩＳ‐Ｓ３１９ＤのＶmax値は明らかに高く、変異型ＮＩＳタンパク質はＩ-イオンを輸送する能力がより高いことを示した。また、ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒが最も高い輸送能力を示した。従って、本試験は本発明のＮＩＳタンパク質は向上した輸送機能を実際に有することを示した。ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒを下記の試験に使用した。
【実施例４】
【００５５】
動物試験‐生体内Ｉ-イオン輸送試験
SuperFectを使用して、変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒ、又は野生型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐ｗｔのポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを人肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２に輸送し、このＮＩＳタンパク質を発現させた。２４時間後、該細胞（８．４×１０4個の細胞）をBalb/cマウス（国立研究所動物センターから購入）の腹腔に腹腔内注射で注射した。先ず、マウスに１５０μｇ／ｋｇ体重のプリスタン（増感剤；Sigma-Aldrich社から購入）を２週間注射してマウスの免疫力を低下させた。接種から３日後、マウスに２０Ｃｉ／ｋｇ体重のＩ‐１３１を与え、２日後、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を使用して生体内撮像の能力評価を行い、マウス体内に残る残留Ｉ‐１３１の量を測定し、更に変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒのマウス体内でＩ‐１３１を吸収／輸送する能力を求めた。生体内撮像の能力評価の結果を図２と表４に示す。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
図２と表４から、野生型ＮＩＳタンパク質を接種したマウスと比較すると、変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒを接種したマウスでは、Ｉ‐１３１の放射能はかなり高かったことが分かる。この結果は、本発明のＮＩＳタンパク質はマウス体内で細胞がＩ‐１３１を保持し放射性ヨウ素の量を増加させるのを可能にしうることを示す。従って、本発明のＮＩＳタンパク質を癌治療又は分子撮像に使用できる。
【実施例５】
【００５８】
動物試験‐細胞毒性試験
実施例４において変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒまたは野生型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐ｗｔを接種したマウスを９日間飼育した後、屠殺した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）液を使用してマウスの腹腔を洗浄し、腹部すすぎ液（腫瘍細胞を含む）を収集した。Cobra II 自動ガンマ計数器を使用して腹部すすぎ液内のＩ‐１３１の放射能強度を測定し、腫瘍細胞を殺すＩ‐１３１の能力を向上させる変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒの効果を観察した。上記のプロセスにおいて、腫瘍細胞に輸送されなかったＩ‐１３１はマウス体外へ排泄された。従って、放射能が減少したことは、腫瘍細胞の数が減少し、本ＮＩＳタンパク質は腫瘍細胞を殺すＩ‐１３１の能力を向上させるより高い能力を有していたことを示す。結果を表５に示す。
【００５９】
【表５】
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* cpm、1分当りのカウント数／８．４×１０4個の細胞
【００６０】
表５は変異型ＮＩＳタンパク質ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒを接種したマウスの腹部すすぎ液内の放射能は、野生型ＮＩＳタンパク質を接種したマウスのそれより明らかに低く、ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒタンパク質は腫瘍細胞に対するＩ‐１３１の細胞毒性力を向上させたことを示す。従って、ＮＩＳ‐Ｑ２１８Ｒは、マウス体内で腫瘍細胞によるＩ‐１３１の吸収を増加させることで、腫瘍細胞を殺すＩ‐１３１の効果を増大させることが出来る。
【００６１】
この実施例は、本発明のＮＩＳタンパク質を放射性ヨウ素療法に適用することで、癌細胞の放射性ヨウ化物イオン吸収能力を向上させ癌細胞に対する細胞毒効果を増大させうることを証明している。
【００６２】
上記の実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明の原理と効果を例示するために提供されている。当業者は上記の開示に基づいて本発明の原理と思想から逸脱することなく様々な変更と置換えを想到する可能性がある。従って、本発明の範囲は下記の請求項により実質的に定義される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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