(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗原又は抗体からなる被検出成分を検出するためのイムノクロマトグラフィー用試験具であって、
基材と、
基材上に担持されている、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部を有するクロマトグラフィー用膜担体と、
クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持されている、試料が添加される試料添加部を有する試料展開用部材と、
試料添加部よりも試料展開方向下流側でかつクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持され、被検出成分に結合可能な標識物質を保持する標識物質保持部材と、
を備え、
ヒト抗マウス抗体と反応可能な物質が、前記標識物質保持部材に保持されており、
前記ヒト抗マウス抗体と反応可能な物質が、受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２０のハイブリドーマ及び受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２１のハイブリドーマにより産生されるマウス由来モノクローナル抗体の混合物であることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験具。
【請求項２】
前記標識物質保持部材が、試料展開用部材及びクロマトグラフィー用膜担体と接触して配置されている請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
【請求項３】
前記標識物質保持部材が、クロマトグラフィー用膜担体と間隔を介して配置されている請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
【請求項４】
前記試料展開用部材が、クロマトグラフィー用膜担体と接触して配置されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー用試験具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料中の被検出成分に特異的に結合する物質を用いて被検出成分を検出する試験具として、イムノクロマトグラフィー用試験具が知られている。被検出成分の存在が疑われる試料をこの試験具の一部（試料添加部）に添加すると、試料は毛細管現象により試料添加部内を移動して、被検出成分に結合可能な標識物質を保持する標識物質保持部材に到達する。被検出成分が存在する場合は、被検出成分が標識物質と結合して複合体を形成する。さらに、毛細管現象による試料の展開に伴って、この被検出成分−標識物質の複合体がクロマトグラフィー用膜担体を移動し、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部に到達すると、この複合体が該結合物質に結合する。このことにより、判定部において標識物質−被検出成分−結合物質のサンドイッチ状の複合体が形成される。
標識物質が有色の担体粒子（着色したラテックス粒子やコロイド状金属粒子など）を含む場合、標識物質が判定部に捕捉されると判定部が発色する。この判定部の発色を観察することにより、試料中の被検出成分の検出を行うことができる。
【０００３】
このようなイムノクロマトグラフィグラフィー用試験具を用いる試験においては、試料中に含まれる、イムノクロマトグラフィー反応に影響を与える物質による擬陽性反応が問題となることがある。例えば、ヒトから採取した生体試料中には、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が含まれる場合がある。この際、ＨＡＭＡが、イムノクロマトグラフィー用試験具において、例えば結合物質として用いられているマウス由来の抗体と反応してしまう。そのため、被検出成分を含まない試料中であっても、被検出成分が存在するかのような擬陽性の結果を与えてしまう場合がある。
【０００４】
米国特許出願第２００７／００５９６８２号（特許文献１）には、ＨＡＭＡを捕捉する物質をイムノクロマトグラフィー用試験具のクロマトグラフィー用膜担体のＨＡＭＡ捕捉部に固定化して、試料中に存在するＨＡＭＡを捕捉することにより、イムノクロマトグラフィー用試験具の結果の正確性を向上させることが記載されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具では、十分にＨＡＭＡを捕捉することができない場合があった。その結果、捕捉されなかったＨＡＭＡが原因となり、誤った判定結果を与えてしまう場合があった。
【特許文献１】米国特許出願第２００７／００５９６８２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試料中に含まれる可能性があるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）によるイムノクロマトグラフィー反応への影響を低減して、従来のイムノクロマトグラフィー用試験具よりも正確な判定結果を与えることができるイムノクロマトグラフィー用試験具を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＡＭＡと反応可能な物質（以下、「ＨＡＭＡ反応物質」ということがある）を、イムノクロマトグラフィー用試験具のクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材に保持させることにより、ＨＡＭＡ反応物質と試料中のＨＡＭＡとの反応時間を充分に長くすることができることを見出した。また、上記の部材にＨＡＭＡ反応物質を保持させることにより、従来のイムノクロマトグラフィー用試験具のクロマトグラフィー用膜担体上に固定化されるＨＡＭＡ反応物質の量よりも多くのＨＡＭＡ反応物質を保持させることができるので、ＨＡＭＡによるクロマトグラフィー用膜担体上での抗原−抗体反応への影響を低減できることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
よって、本発明は、
試料中の抗原又は抗体からなる被検出成分を検出するためのイムノクロマトグラフィー用試験具であって、
基材と、
基材上に担持されている、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部を有するクロマトグラフィー用膜担体と、
クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持されている、試料が添加される試料添加部を有する試料展開用部材と、
試料添加部よりも試料展開方向下流側でかつクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持され、被検出成分に結合可能な標識物質を保持する標識物質保持部材と、
を備え、
ヒト抗マウス抗体と反応可能な物質が、前記標識物質保持部材に保持されており、
該ヒト抗マウス抗体と反応可能な物質が、受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２０のハイブリドーマ及び受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２１のハイブリドーマにより産生されるマウス由来モノクローナル抗体の混合物である
イムノクロマトグラフィー用試験具を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いることにより、試料中にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が含まれていても、ＨＡＭＡによるイムノクロマトグラフィー反応への影響を十分に低減することができる。従って、正確に試料中の被検出成分を検出することができる。このため、例えば、ウイルスや細菌等の病原体の感染を検査する場合に、擬陽性の結果を生じる可能性を低減できるので、より正確な検査結果を与えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、試料中の抗原又は抗体からなる被検出成分を検出するためのものである。
上記の試料は、ヒトから採取された生体試料及び該生体試料を前処理することにより得られるものを含む。ヒトから採取された生体試料としては、血液、血清、糞便、尿、唾液、鼻腔吸引液、スワブ、汗、涙などが挙げられる。上記の前処理としては、生体試料を適切な前処理用試薬に溶解すること、溶解して得られた溶液をフィルターでろ過することなどが挙げられる。
【００１１】
上記の被検出成分は、被検出成分に対する抗体を得ることができる物質であれば特に限定されず、細菌、原生生物や真菌などの細胞、ウイルス、タンパク質、多糖類などが挙げられる。被検出成分としては、例えば、インフルエンザウイルス（例えばＡ型、Ｂ型など）、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルス、カルシウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群の病原ウイルス（コロナウイルス）などのウイルス；マイコプラズマニューモニエ、大腸菌、スタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスニューモニエ、ストレプトコッカスピヨゲネス、マラリア原虫などの細胞；消化器系疾患、中枢神経系疾患、出血熱などの様々な疾患の病原体、これらの代謝産物；癌胎児性抗原やシフラなどの腫瘍マーカー；ホルモンなどが例示される。これらの被検出成分は、生体試料中に１種以上含まれてもよい。
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、なかでも、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス及びアデノウイルスから選択される１種以上のウイルスの検出に好適に用いることができる。
【００１２】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と反応可能な物質（ＨＡＭＡ反応物質）が、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材に保持されていることを特徴とする。ＨＡＭＡ反応物質は、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材であれば、１つの部材のみに保持されてもよいし、２つ以上の部材に保持されてもよい。
ＨＡＭＡは、マウスの免疫グロブリン（マウス抗体）を特異的に認識する、ヒトが有する抗体である。ＨＡＭＡは、以前にマウス抗体に曝露されたヒトや、マウスモノクローナル抗体を用いた医薬品による治療を受けたヒトなどが有している場合が多い。本明細書において、ＨＡＭＡは、マウス抗体と反応可能な、ヒトが有する抗体であれば特に限定されず、例えばウサギ抗体、イヌ抗体などのその他の哺乳動物の抗体と交差反応可能なヒト由来の抗体であってもよい。
【００１３】
上記のＨＡＭＡ反応物質は、ＨＡＭＡと反応可能な物質であれば特に限定されないが、マウス抗体、及びそのフラグメント（例えばＦｃフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントなど）のような抗体を含むことが好ましい。
ＨＡＭＡ反応物質は、より好ましくは、受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２０(微生物の識別の表示  ＨＢ２−２３５０)のハイブリドーマ若しくは受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２１(微生物の識別の表示  ＨＢ３−３５４)のハイブリドーマ（ともに、２００７年９月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託された）により産生されるマウス由来モノクローナル抗体、又は「モノクロ用非特異除去剤」（バイオリンク社製）である。
ＨＡＭＡ反応物質は、１種類を単独で用いても良いし、２種類以上を混合して用いても良い。特に、上述の受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２０及び受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２１のハイブリドーマより産生されるマウス由来モノクローナル抗体を混合した、ＨＡＭＡ反応物質が好ましい。
【００１４】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、上記のＨＡＭＡ反応物質が、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材に保持される。
上記のクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置される部材は、試料展開用部材、標識物質保持部材、又は試料展開用部材でもなく標識物質保持部材でもない第２試料展開用部材であり得る。
【００１５】
本発明のように、ＨＡＭＡ反応物質を、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材に保持させることにより、ＨＡＭＡ反応物質をクロマトグラフィー用膜担体に固定化するよりも、多くの量のＨＡＭＡ反応物質を保持させることができる。また、ＨＡＭＡ反応物質をクロマトグラフィー用膜担体に固定化するよりも、試料中に存在するＨＡＭＡとＨＡＭＡ反応物質との反応時間を長くすることができる。従って、イムノクロマトグラフィー反応へのＨＡＭＡの影響を低減することができる。
【００１６】
本明細書において、「試料展開方向上流側」及び「試料展開方向下流側」とは、イムノクロマトグラフィー用試験具の長手方向について、試料を添加する側を上流側、試料が展開していく（流れていく）側を下流側として考えた場合の相対的な方向を意味する。
また、本明細書において、例えば「クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持されている」試料展開用部材とは、クロマトグラフィー用膜担体の試料展開方向上流側の端を含んで、試料展開方向上流側のいずれかの位置に試料展開用部材の少なくとも一部分が存在することを意味する。
【００１７】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の試料展開用部材は、試料が添加される試料添加部を有し、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持される。
上記の試料展開用部材は、レーヨン、グラスファイバー、セルロースファイバーなどの材質のものを用いることができる。
上記の試料添加部は、試料が添加される部分であり、試料展開用部材の試料展開方向上流側の部分に位置することが好ましい。
【００１８】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の標識物質保持部材は、被検出成分に結合可能な標識物質を保持し、試料添加部よりも試料展開方向下流側でかつクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持される。
上記の標識物質保持部材は、グラスファイバー、セルロースファイバー、プラスチック(例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなど)ファイバーなどの材質のものを用いることができる。標識保持部材は、試料展開用部材と接触して配置されていることが好ましい。
【００１９】
被検出成分に結合可能な標識物質は、被検出成分に結合可能な抗体又は抗原が標識されたものが好ましい。該抗原又は抗体を標識する標識成分としては、例えば寒天、アガロース、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセルロースエステル類、ゼラチン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの天然又は合成の樹脂及びその誘導体、ガラス(例えば活性化ガラス)、シリカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アルミナ、硫酸バリウムなどの無機材料からなる粒子を色素分子、蛍光分子又は磁気粒子などで標識して得られる粒子、赤血球、金などの金属コロイドを挙げることができる。なかでも、色素分子、蛍光分子又は磁気粒子を有するラテックス粒子及び金コロイドが好ましい。
【００２０】
上記の被検出成分に結合可能な標識物質は、被検出成分の種類に応じて２種以上であってもよい。
【００２１】
上記の標識物質保持部材は、試料が適切に展開されたか否かを確認するための、対照用標識物質をさらに保持することが好ましい。対照用標識物質は、試料中の成分に対して実質的に反応性を有さないものが好ましい。該対照用標識物質は、以下に記載する対照用標識物質に結合可能な物質と対として用いることができる。すなわち、対照用標識物質、及び対照用標識物質に結合可能な物質は、２つの特異的に結合可能な物質の組み合わせであり、これらのうち、いずれを対照用標識物質として用いてもよい。このような特異的に結合可能な２つの物質の組み合わせとしては、ハプテンとそれに結合可能なタンパク質、例えばストレプトアビジン又はアビジンとビオチン、２，４−ジニトロフェノール又はジゴキシンとタンパク質（例えばアルブミン、カゼイン、フィブリノゲンなど）などが挙げられる。
【００２２】
上記の対照用標識物質の標識としては、上記の標識物質と同様の標識を用いることができる。対照用標識物質は、標識物質と同じ標識成分で標識されていてもよいし、異なる標識成分で標識されてもよい。
【００２３】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の基材は、通常のイムノクロマトグラフィー用試験具の基材として用いられるものであれば特に限定されず、プラスチック、紙、ガラスなどの材質のものを用いることができる。該基材は、クロマトグラフィー用膜担体、試料展開用部材、標識物質保持部材などを配置するために、表面に粘着性を有することが好ましい。
【００２４】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具のクロマトグラフィー用膜担体は、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部を有する。
上記のクロマトグラフィー用膜担体は、静電作用、疎水相互作用のような物理的作用によりタンパク質と結合できかつ毛管現象により試料を展開できる材質のものを用いることができる。該材質のものとしては、ニトロセルロース、ナイロン（例えば、カルボキシル基やアルキル基を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテートなどが挙げられる。
【００２５】
クロマトグラフィー用膜担体の判定部に固定化される結合物質は、被検出成分に結合可能な物質であればよく、被検出成分に特異的に結合可能な抗体又は抗原が好ましい。該結合物質は、上記の標識物質が被検出成分に結合する部位とは異なる部位で被検出成分に結合するものがより好ましい。
上記のクロマトグラフィー用膜担体は、被検出成分の種類に応じて判定部を１つだけ備えてもよいし、２つ以上備えてもよい。２つ以上備える場合は、それぞれの判定部に異なる種類の被検出成分に結合可能な結合物質が固定化される。
【００２６】
上記のクロマトグラフィー用膜担体は、試料が適切に展開されたか否かを確認するための、対照用標識物質に結合可能な物質が固定化された対照部を有することが好ましい。
上記の対照用標識物質に結合可能な物質は、対照用標識物質について上述したとおりである。
【００２７】
上記の判定部及び対照部は、ライン状、円状、方形状などであってよい。
【００２８】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、上記のクロマトグラフィー用膜担体、試料展開用部材、及び標識物質保持部材の他に、吸収部材を備えることができる。吸収部材は、セルロース、グラスファイバーなどの材質のものを用いることができる。該吸収部材は、クロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向下流側の位置に、クロマトグラフィー用膜担体と接触させて配置することが好ましい。このような位置に吸収部材を有することにより、試料の展開速度を速くすることができる。
【００２９】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の形態の例を、図１に示す。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示されるイムノクロマトグラフィー用試験具は、試料展開用部材１と、標識物質保持部材２と、クロマトグラフィー用膜担体３と、吸収部材４と、基材５を有している。（ｄ）に示されるイムノクロマトグラフィー用試験具は、試料展開用部材１と、標識物質保持部材２と、クロマトグラフィー用膜担体３と、吸収部材４と、基材５と、第２試料展開用部材６を有している。
【００３０】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の好ましい態様において、標識物質保持部材は、試料展開用部材及びクロマトグラフィー用膜担体と接触して配置される。このような態様の例としては、例えば図１の（ａ）及び（ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の別の好ましい態様において、標識物質保持部材は、クロマトグラフィー用膜担体と間隔を介して配置される。このような態様の例としては、例えば図１の（ｂ）及び（ｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。
上記の間隔は、イムノクロマトグラフィー用試験具の大きさ、検出される被検出成分の種類などに応じて、適宜選択できる。
【００３２】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具のさらに別の好ましい態様において、試料展開用部材は、クロマトグラフィー用膜担体と接触して配置される。このような態様の例としては、例えば図１の（ｂ）及び（ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、試料添加部よりも試料展開方向下流側でかつクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側の位置で基材上に担持される第２試料展開用部材をさらに備えることが好ましい。該第２試料展開用部材は、標識物質保持部材よりも試料展開方向上流側の位置に配置されてもよいし、下流側の位置に配置されてもよい。また、第２試料展開用部材は、２つ以上存在することもできる。
【００３４】
上記の第２試料展開用部材が備えられる場合、上記のＨＡＭＡ反応物質は、試料展開用部材、第２試料展開用部材及び標識物質保持部材から選択される少なくとも１つに保持されることが好ましい。
上記の第２試料展開用部材は、上記の試料展開用部材と同様の材質のものを用いることができる。
【００３５】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、従来公知のイムノクロマトグラフィー用試験具の製造方法において、ＨＡＭＡ反応物質をクロマトグラフィー用膜担体よりも試料展開方向上流側に配置された部材に保持させる工程を追加することにより製造できる。
例えば、ＨＡＭＡ反応物質が標識物質保持部材に保持される場合、標識物質及び任意に対照用標識物質を含む緩衝液に標識物質保持部材を含浸させるか又は該緩衝液を標識保持部材に添加して乾燥させる工程において、該緩衝液にＨＡＭＡ反応物質をさらに加えることにより、ＨＡＭＡ反応物質を標識物質保持部材に保持させることができる。
また、ＨＡＭＡ反応物質が試料展開用部材又は任意の第２試料展開用部材に保持される場合、ＨＡＭＡ反応物質を含む緩衝液に試料展開用部材又は第２試料展開用部材を含浸させるか又は該緩衝液を試料展開用部材又は第２試料展開用部材に添加して乾燥させる工程を行うことにより、ＨＡＭＡ反応物質を試料展開用部材又は任意の第２試料展開用部材に保持させることができる。
【００３６】
上記のようにして作製した標識物質保持部材、試料展開用部材又は第２試料展開用部材を、従来公知の方法により作製したその他の構成要素、例えば基材、クロマトグラフィー用膜担体、標識物質保持部材又は試料展開用部材、任意の第２試料展開用部材及び任意の吸収部材とともに組み立て、裁断することにより、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を製造できる。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
市販のインフルエンザウイルス検出用のイムノクロマトグラフィー用試験具（ポクテムインフルエンザＡ／Ｂ、シスメックス社）の標識物質保持部材に、ＨＡＭＡ反応物質として受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２０及び受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４２１で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生されるマウス由来モノクローナル抗体を保持させて、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を調製した。
すなわち、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂの標識物質保持部材の調製を、以下のようにして行った。
【００３８】
抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を感作した青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）１０５０μｇを、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））３９５０μＬに懸濁し、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。
【００３９】
抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体を感作した青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）１０５０μｇを、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））３９５０μＬに懸濁し、抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。
【００４０】
ストレプトアビジンを感作した赤色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．１９μｍ）１１５０μｇを、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））３８５０μＬに懸濁し、ストレプトアビジン感作ラテックス粒子を調製した。
【００４１】
ＨＡＭＡ反応物質用緩衝液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））１ｍＬに、上記の２種類のハイブリドーマから産生されるマウス由来モノクローナル抗体を、それぞれ１．７５ｍｇ／ｍLとなるように溶解し、ＨＡＭＡ反応物質溶液を調製した。
【００４２】
上記のようにして調製した、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子３６００μＬ、抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子３６００μＬ、ストレプトアビジン感作ラテックス粒子２００μＬ及びＨＡＭＡ反応物質溶液８００μＬを混合し、ＨＡＭＡ反応物質を含有する混合ラテックス８２００μＬを得た。
【００４３】
得られたＨＡＭＡ反応物質を含有する混合ラテックス８３２μＬを、グラスファイバー製パッド（３００ｍｍ×５ｍｍ×０．２８ｍｍ）に加え、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部材を調製した。
【００４４】
このようにして調製した標識物質保持部材を、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂの基材、クロマトグラフィー用膜担体、及び試料展開用部材とともに組み立てて、裁断して、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を得た。
なお、このイムノクロマトグラフィー用試験具は、１テストストリップ当たり１０μｇのＨＡＭＡ反応物質を保持していた。
【００４５】
また、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂは、図１の（ａ）のような構造を有する試験具であり、被検出成分に結合可能な結合物質としてインフルエンザウイルスＡ型に対するマウスモノクローナル抗体及びインフルエンザウイルスＢ型に対するマウスモノクローナル抗体、並びに対照用標識物質に結合可能な物質としてビオチンＢＳＡが、クロマトグラフィー膜担体上の判定部及び対照部にそれぞれ固定化されている。
【００４６】
比較例１
比較例１として、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂを用いた。
【００４７】
比較例２
比較例２として、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂのクロマトグラフィー用膜担体の第１判定部７Ａ（図２参照）に、実施例１で用いたものと同じＨＡＭＡ反応物質を固定化したものを用いた。
【００４８】
以下に、比較例２のクロマトグラフィー用膜担体の調製方法を、図２を用いて説明する。
図２は、クロマトグラフィー用膜担体の平面図である。図２に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー用膜担体７は、第１判定部７Ａ、第２判定部７Ｂ及び対照部７Ｃを有している。
【００４９】
比較例２のクロマトグラフィー用膜担体では、第１判定部７Ａ、第２判定部７Ｂ及び対照部７Ｃに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて、以下の溶液を塗布した。
第１判定部７Ａ：
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記のＨＡＭＡ反応物質に含まれる２種類のマウス由来モノクローナル抗体が、それぞれ１．７５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した溶液。
第２判定部７Ｂ：
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体の溶液。
対照部７Ｃ：
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したビオチンＢＳＡの溶液。
なお、実験例１及び比較例１のクロマトグラフィー用膜担体では、第１判定部７Ａに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体の溶液が塗布されている。
それぞれの溶液を塗布したクロマトグラフィー用膜担体を、５０℃で３０分間乾燥させた。
【００５０】
乾燥後のクロマトグラフィー用膜担体７をブロッキング液（ＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃、１２０分間乾燥させ、比較例２のクロマトグラフィー用膜担体を調製した。
【００５１】
得られた比較例２のクロマトグラフィー用膜担体を、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂの基材、標識物質保持部材、及び試料展開用部材とともに組み立てて、裁断して、比較例２のイムノクロマトグラフィー用試験具を得た。
【００５２】
なお、得られた比較例２のイムノクロマトグラフィー用試験具は、１テストストリップ当たり４．１μｇのＨＡＭＡ反応物質がクロマトグラフィー膜担体上に固定化された。この量より多い量のＨＡＭＡ反応物質を固定化しようとすると、クロマトグラフィー膜担体の表面にＨＡＭＡ反応物質が析出することがわかった。よって、クロマトグラフィー用膜担体上に固定化できるＨＡＭＡ反応物質の量は、試験具の品質を考慮すると、実施例１のイムノクロマトグラフィー用試験具に保持されるＨＡＭＡ反応物質の量よりもかなり少なくなると考えられる。
【００５３】
実験例１
抗マウスＩｇＧ（MBL303G Anti-Mouse IgG (Goat)、Lot No. 130）を、以下に示す希釈用緩衝液  で表１に示す濃度に希釈した。これを試料とし、実施例１、比較例１及び２のイムノクロマトグラフィー用試験具の試料添加部に、試料２００μＬを添加した。１５分経過後に、判定部の発色強度を目視により判定した。
この判定は、ＢｉｏＤｏｔ社のＴＳＲ３０００メンブレンストリップリーダーで測定した判定部のラインの強度が０．０１５以上０．０３未満のものを１＋、０．０３以上０．０８未満のものを２＋、０．０８以上のものを３＋となるような目視判定見本を作製し、試験具に現れたライン強度を該目視判定見本と比較することにより行った。また、１＋の目視判定見本よりも弱く発色したラインを、＋ｗと判定した。
また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、抗マウスＩｇＧを含まない希釈用緩衝液を用いた。
なお、希釈用緩衝液の組成を以下に示す。
＜希釈用緩衝液＞
リン酸１ナトリウム・２Ｈ2Ｏ    ７８ｇ
塩化ナトリウム                 ４５ｇ
アジ化ナトリウム               ２．５ｇ
ウシアルブミン                 ５０ｇ
４Ｎ水酸化ナトリウム           ８７．５ｍＬ
超純水                         ５Ｌ
＊１Ｎ水酸化ナトリウム及び１Ｎ塩酸を用いてｐＨ７．０に調整
【００５４】
結果を、表１に示す。ここで、「Ａ」の欄は、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体が固定化された、第１判定部の判定結果を示す。一方、「Ｂ」の欄は、抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体が固定化された、第２判定部の判定結果を示す。なお、「−」は目視では判定部の着色が確認できなかったことを示す。
また、比較例２では、上述のように第１判定部にＨＡＭＡ反応物質を固定化した。従って、比較例２では、第２判定部の判定結果である、「Ｂ」の欄のみが記載されている。
なお、表には示さないが、全ての実験において、対照部の着色を確認した。すなわち、適切に試料の展開が行われたことを確認した。
【００５５】
【表１】
0005340575.tif 000002
【００５６】
表１の結果から、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂ（比較例１）の判定部（第１及び第２判定部）は、試料中にインフルエンザウイルスが含有されていないにもかかわらず、抗マウスＩｇＧの存在により、擬陽性の結果を示していることがわかる。
また、ＨＡＭＡ反応物質をクロマトグラフィー用膜担体上に固定化した比較例２のイムノクロマトグラフィー試験具を用いた場合でも、この擬陽性の結果を回避できていない。
これに対して、本発明の実施例１のイムノクロマトグラフィー用試験具では、抗マウスＩｇＧの濃度が１６８μｇ／ｍＬであった場合に、わずかに擬陽性の結果が見られるものの、比較例１及び２の試験具に比べて、より正確な結果を提供できることがわかる。
【００５７】
実施例２
実施例１のポクテムインフルエンザＡ／Ｂの代わりに、ポクテムＳインフルエンザ（シスメックス社）の標識物質保持部材に実施例１で用いたものと同じＨＡＭＡ反応物質を保持させて、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を調製した。
ポクテムＳインフルエンザは、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂと同様に、被検出成分に結合可能な結合物質としてインフルエンザウイルスＡ型に対するマウスモノクローナル抗体及びインフルエンザウイルスＢ型に対するマウスモノクローナル抗体、並びに対照用標識物質に結合可能な物質としてビオチンＢＳＡが、クロマトグラフィー膜担体上のそれぞれ判定部及び対照部に固定化されているが、図１（ｂ）のような構造を有する。
【００５８】
比較例３
比較例３として、ポクテムＳインフルエンザを用いた。
【００５９】
実験例２
実施例１及び２、並びに比較例１及び３のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いて、患者から採取した試料について試験した。
試料は、ポクテムインフルエンザＡ／Ｂ又はポクテムＳインフルエンザの添付文書に従って、患者から採取した生体試料（鼻腔吸引液、鼻腔拭い液又は咽頭拭い液）を付属の検体抽出試薬で処理することにより調製した。
得られた試料約２００μＬを、実施例１及び２、並びに比較例１及び３のイムノクロマトグラフィー用試験具の試料添加部に添加し、実験例１と同様にして、判定部のライン強度の判定を行った。ライン強度が＋ｗ以上のものを、インフルエンザウイルス陽性と判定した。
【００６０】
対照実験として、同じ生体試料について、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によりインフルエンザウイルス抗原の検出を行った。
イムノクロマトグラフィー用試験具又はＲＴ−ＰＣＲにより陽性と判定された試料の数を、表２の「Ａ」（インフルエンザウイルスＡ型について陽性）、「Ｂ」（インフルエンザウイルスＢ型について陽性）又は「Ａ／Ｂ」（インフルエンザＡ型及びＢ型ともに陽性）の欄に示す。また、表２の「−」の欄は、陰性と判定された試料の数を示す。
【００６１】
【表２】
0005340575.tif 000003
【００６２】
表２の結果から、ＲＴ−ＰＣＲによるとインフルエンザウイルスが存在しないと判定されるが、従来のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いた場合には陽性であると判定される試料（表２（Ａ）（Ｃ）の網掛けのカラム）が存在するが、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いると、このような試料であっても、ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致して、陰性と判定できることがわかる。すなわち、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いることにより、擬陽性の発生率が低減されたことがわかる。
【００６３】
実施例３
実施例２で用いたＨＡＭＡ反応物質に代えて、ＨＡＭＡ反応物質として市販の非特異吸収抗体（バイオリンク社、モノクロ用非特異除去剤、Lot. 061002）を用いて、本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具を調製した。
１テストストリップ当たりに保持されたＨＡＭＡ反応物質の量は、７．２μｇであった。
【００６４】
実験例３
実施例３及び比較例３のイムノクロマトグラフィー用試験具を用いて、ＨＡＭＡ血清（ヒト抗マウス抗体を含有する血清）を試料としてライン強度の判定を行った。
ＨＡＭＡ血清として、以下のものを用いた。
ＨＡＭＡ血清１：BioReclamation（国際バイオ社製）BRH22942
ＨＡＭＡ血清２：BioReclamation（国際バイオ社製）BRH40929
ＨＡＭＡ血清３：BioReclamation（国際バイオ社製）BRH40930
ＨＡＭＡ血清４：BioReclamation（国際バイオ社製）BRH40932
【００６５】
上記のＨＡＭＡ血清１５０μＬを、ポクテムＳインフルエンザに付属の検体抽出試薬８００μＬと混合して調製した試料約２００μＬを、各イムノクロマトグラフィー用試験具の試料添加部に添加し、１０分後に実験例１と同様にしてライン強度の判定を行った。
また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、検体抽出試薬２００μＬを用いた。
結果を、表３に示す。なお、「−」は目視では判定部の着色が確認できなかったことを示す。なお、表には示さないが、全ての実験において、対照部の着色を確認した。すなわち、適切に試料の展開が行われたことを確認した。
【００６６】
【表３】
0005340575.tif 000004
【００６７】
表３の結果から、ＨＡＭＡ反応物質として市販の非特異吸収抗体を用いた本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、従来のイムノクロマトグラフィー用試験具に比べて、擬陽性の発生率を低減できたことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具の形態の例を示す。
【図２】比較例のクロマトグラフィー用膜担体の平面図を示す。
【符号の説明】
【００６９】
１    試料展開用部材
２    標識物質保持部材
３    クロマトグラフィー用膜担体
４    吸収部材
５    基材
６    第２試料展開用部材
７    クロマトグラフィー用膜担体
７Ａ  第１判定部
７Ｂ  第２判定部
７Ｃ  対照部
【図１】
0005340575.tif 000005
【図２】
0005340575.tif 000006