(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１から６個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードする核酸。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１から６個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む、請求項１に記載のポリペプチドの生産方法。
（１）請求項２の核酸又は請求項３のＤＮＡからポリペプチドを発現させるステップ。
（２）ステップ（１）において発現されたポリペプチドを採取するステップ。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドの結晶。
【請求項６】
板状結晶である、請求項５に記載の結晶。
【請求項７】
以下の結晶データを示す、請求項５又は６に記載の結晶。
結晶系：単斜（monoclinic）
ブラベ格子：単純格子（primitive monoclinic）
空間群： Ｐ２1
格子定数：
ａ＝８３．５Å
ｂ＝２３２．０Å
ｃ＝８６．０Å
β＝１０５．５°
【請求項８】
正八面体結晶である、請求項５に記載の結晶。
【請求項９】
以下の結晶データを示す、請求項５又は８に記載の結晶。
結晶系：正方（tetragonal）
ブラベ格子：単純格子（primitive tetragonal）
空間群： Ｐ４
格子定数：
ａ＝３３６Å
ｂ＝３３６Å
ｃ＝１００Å
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドの存在下で、糖受容体基質とＤ-グルクロン酸供与体と
Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン供与体とを反応させる工程を含む、コンドロイチンの製
造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変コンドロイチン硫酸合成酵素ポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該ポリペプチドの生産方法、当該ポリペプチドの結晶等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。
Ｋ４ＣＰ：大腸菌Ｋ４株（serotype O5:K4(L):H4、ATCC 23502）に由来するコンドロイチン合成酵素
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン
ＧｌｃＵＡ：Ｄ−グルクロン酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＵＤＰ：ウリジン 5'-ジリン酸
特許文献１には、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチン硫酸合成酵素及びこれをコードするＤＮＡが開示されている。また特許文献２には、Ｋ４ＣＰの所定の領域内に１〜数個のアミノ酸の置換を有している改変酵素が開示されている。【０００３】
しかしいずれの文献にも、以下に説明する本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該ポリペプチドの結晶等については開示も示唆もない。また、Ｋ４ＣＰを改変してそのＤＮＡからの発現量を高めたり、酵素活性を高めたり、結晶化を容易にする思想についても開示や示唆はない。【０００４】
特許文献３には、プロテウス・ブルガリス由来の新規なコンドロイチン硫酸分解酵素が開示されており、その結晶も開示されている。しかし、Ｋ４ＣＰについての開示や示唆はない。【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１９９５８３号公報
【特許文献２】特開２００５−６５５６５号公報
【特許文献３】特開平１０−２６２６６０号公報
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、核酸から高発現させることができ、酵素活性も高く、結晶化が可能なコンドロイチン合成酵素のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該ポリペプチドの生産方法、当該ポリペプチドの結晶等を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、Ｋ４ＣＰにおける特定領域部分が欠失したポリペプチド及びこれをコードする核酸を取得した。そして驚くべきことに、コンドロイチン合成酵素として当該ポリペプチドを採用することにより、その核酸からの発現効率を顕著に高めることができ、その酵素活性も顕著に高めることができ、さらに当該ポリペプチドは分子が安定化しており容易に結晶化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド」という。）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【０００９】
また本発明は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードする核酸（以下、「本発明核酸」という。）を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００１０】
本発明核酸としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を例示することができる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１１】
また本発明は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む、本発明ポリペプチドの生産方法（以下、「本発明生産方法」という。）を提供する。
（１）本発明核酸からポリペプチドを発現させるステップ。
（２）ステップ（１）において発現されたポリペプチドを採取するステップ。
【００１２】
また本発明は、本発明ポリペプチドの結晶（以下、「本発明結晶」という。）を提供する。
【００１３】
本発明結晶としては、板状結晶（以下、「本発明結晶１」という。）を例示することができる。より具体的には、以下の結晶データを示す結晶を例示することができる。
結晶系：単斜（monoclinic）
ブラベ格子：単純格子（primitive monoclinic）
空間群：  Ｐ２1
格子定数：
ａ＝８３．５Å
ｂ＝２３２．０Å
ｃ＝８６．０Å
β＝１０５．５°
また本発明結晶としては、正八面体結晶（以下、「本発明結晶２」という。）を例示することができる。より具体的には、以下の結晶データを示す結晶を例示することができる。
結晶系：正方（tetragonal）
ブラベ格子：単純格子（primitive tetragonal）
空間群：  Ｐ４
格子定数：
ａ＝３３６Å
ｂ＝３３６Å
ｃ＝１００Å
【００１４】
また本発明は、本発明ポリペプチドの存在下で、糖受容体基質とＤ-グルクロン酸供与体とＮ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン供与体とを反応させる工程を含む、コンドロイチンの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｋ４ＣＰをトリプシン処理した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図(写真）である。
【図２】ΔＮ５７Ｋ４ＣＰのゲルろ過クロマトグラフィー画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図（写真）である。
【図３】本発明結晶１の光学顕微鏡像を示す図（写真）である。
【図４】本発明結晶２の光学顕微鏡像を示す図（写真）である。
【図５】ΔN57K4CPを用いて合成されたコンドロイチンの溶出パターンを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、発明を実施するための最良の形態によって本発明を詳説する。
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドは、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。【００１７】
以下、順に説明する。
（Ａ）のポリペプチドについて
（Ａ）のポリペプチドは、Ｋ４ＣＰにおけるＮ末端から５７残基分のアミノ酸が欠失したポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示す通りである。かかる配列を有するポリペプチドが取得できる限りにおいて、本ポリペプチドの製造方法も特に限定されない。例えば、本ポリペプチドは、ペプチド合成の手法により製造することもでき、公知のＫ４ＣＰにトリプシン等のプロテアーゼを作用させてＮ末端から５７残基分のアミノ酸を除去することによって製造することもでき、また、本ポリペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。より具体的な例示については、後述の実施例１及び２を参照されたい。【００１８】
本ポリペプチドは高いコンドロイチン合成酵素活性を有しており、後述する通り、容易に結晶化させることもできる。
（Ｂ）のポリペプチドについて
（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチドである。【００１９】
ポリペプチドには、それをコードする核酸の多型や変異のほか、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理・生物学的活性を示すものがあることが知られている。（Ｂ）のポリペプチドは、このように（Ａ）のポリペプチドとは構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないポリペプチドを意図するものである。
付加としては、例えば、配列番号２のアミノ末端側へのメチオニン、アラニン、グリシンから選択される１又は２以上のアミノ酸残基の付加、配列番号２のアミノ末端やカルボキシ末端側への、後述するような精製用ペプチド配列やスペーサー配列の付加などが挙げられる。
なお、（Ｂ）のうちの「配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列」は、配列番号２のアミノ末端側にＫ４ＣＰにおけるＮ末端から５７残基分のアミノ酸配列、またはその一部であって本発明ポリペプチド特有の発現効率及び結晶化特性を喪失させるようなアミノ酸配列が付加された配列は含まない。
【００２０】
なお、本出願書類において「数個のアミノ酸」とは、コンドロイチン合成酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸残基の数を示す。例えば具体的には、２〜４０の整数、好ましくは２〜３０の整数、より好ましくは２〜２０の整数、さらに好ましくは２〜１５の整数、さらに好ましくは２〜１０の整数、さらに好ましくは２〜８の整数、さらに好ましくは２〜６の整数を示す。【００２１】
本発明ポリペプチドは、Ｋ４ＣＰにおけるＮ末端から５７残基分のアミノ酸を含まないポリペプチドである限り、配列番号２に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。【００２２】
また本ポリペプチドは、コンドロイチン合成酵素活性を有することを特徴とする。コンドロイチン合成酵素活性を有するか否かは、後述する実施例３に記載の方法にしたがって判定することができる。【００２３】
本ポリペプチドの製造方法も特に限定されず、例えば、配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列（コンドロイチン合成酵素活性を有するもの）に基づいてペプチド合成の手法により製造することもでき、また後述の方法によって変異を導入した核酸を用いて遺伝子工学的手法により製造することもできる。【００２４】
本発明ポリペプチドは、コンドロイチン合成における糖供与体基質（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）及び糖受容体基質（コンドロイチンオリゴ糖）に接触させることにより、コンドロイチン合成（コンドロイチン糖鎖の伸長反応）に用いることができる。また、後述する本発明結晶の製造原料としても用いることができる。詳細は、後述の実施例を参照されたい。【００２５】
＜２＞本発明核酸
本発明核酸は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードする核酸である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチド。
これら（Ａ）及び（Ｂ）のポリペプチドについては、前記「＜１＞本発明ポリペプチド」において説明した通りである。【００２６】
ここにいう「核酸」の語には、ＤＮＡ及びＲＮＡが包含される。したがって本発明核酸の種類は、これらのポリペプチドをコードする限りにおいてＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、なかでもＤＮＡであることが好ましい。【００２７】
なお、本発明核酸として、遺伝暗号の縮重による種々の異なった塩基配列を有する核酸が存在することは、当業者にとって容易に理解されるところである。
このような本発明核酸としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を例示することができる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００２８】
なお、本出願書類において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mM ＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。ポリペプチドがコンドロイチン合成酵素活性を有するか否かは、後述する実施例３に記載の方法にしたがって判定することができる。【００２９】
本発明核酸は、もともとは大腸菌Ｋ４株が保持している核酸をベースとして取得されたものであるが、核酸合成等によって製造されたものや、遺伝子工学的手法により製造された核酸等も当然に包含される。このように、本発明核酸の製造方法は特に限定されないが、例えば後述の実施例に記載の方法で製造することができる。【００３０】
また本発明核酸のうち、前記（Ｂ）のポリペプチドをコードする核酸や、前記（ｂ）のＤＮＡについては、以下のように製造することができる。【００３１】
前記（Ａ）のポリペプチドをコードする核酸や、前記（ｂ）のＤＮＡにおいて、これらによってコードされるポリペプチドのコンドロイチン合成酵素活性を実質的に害しないアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を起こすようなヌクレオチドの欠失、置換又は付加を導入する。ヌクレオチドの欠失、置換又は付加は、両末端に制限酵素切断末端を持ち変異点の両側を含む配列を合成し、未変異の核酸が有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることによって、核酸に導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350（1987）；Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367（1987））などの方法によっても、核酸に欠失、置換又は付加を導入することができる。このようにして欠失、置換又は付加が導入された核酸からポリペプチドを発現させ、そのポリペプチドがコンドロイチン合成酵素活性を有していれば、当該核酸が目的とする核酸であることを確認することができる。発現されたポリペプチドがコンドロイチン合成酵素活性を有するか否かは、後述する実施例３に記載の方法にしたがって判定することができる。【００３２】
本発明核酸は本発明ポリペプチドをコードしていることから、これを発現させることによって本発明ポリペプチドの生産に用いることができる。詳細は、後述の実施例を参照されたい。【００３３】
＜３＞本発明生産方法
本発明生産方法は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む、本発明ポリペプチドの生産方法である。
（１）本発明核酸からポリペプチドを発現させるステップ。
（２）ステップ（１）において発現されたポリペプチドを採取するステップ。【００３４】
以下、順に説明する。【００３５】
ステップ（１）は、本発明核酸からポリペプチドを発現させるステップである。本発明核酸については前記の「＜２＞本発明核酸」において説明した通りである。
本発明核酸からポリペプチドを発現させる方法は、本発明核酸から、これによってコードされるポリペプチドが生成する限りにおいて特に限定されない。例えば、本発明核酸を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製し、これを生育させることによって本発明核酸からポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターや宿主は特に限定されず、公知のもののなかから当業者が適宜選択することができる。その具体例については、後述の実施例を参照されたい。なお、ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖はもちろん、形質転換体である細胞を組み込んだ動物、昆虫等の生育を含む概念である。この生育の条件も、用いる宿主に応じて当業者が適宜選択することができる。
このステップによって発現されるポリペプチドは、本発明ポリペプチドである。【００３６】
ステップ（２）は、ステップ（１）において発現されたポリペプチド（本発明ポリペプチド）を採取するステップである。
ポリペプチドの採取の方法は、ステップ（１）におけるポリペプチドの発現態様に応じて、公知のもののなかから当業者が適宜選択することができる。【００３７】
例えば、本発明核酸を発現ベクターに挿入し、これを大腸菌等の宿主に導入して、これを培養することによって本発明ポリペプチドを発現させた場合において、ポリペプチドが培地（培養液の上清）中に分泌される形態で発現される場合には、培地を採取してこれをそのまま本発明ポリペプチドとして利用することもできる。【００３８】
またポリペプチドが、細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で発現される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって発現されたポリペプチドを抽出することができ、その抽出物を採取して、これをそのまま本発明ポリペプチドとして利用することもできる。
本発明生産方法は、前記のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む限りにおいて、他のステップを更に含んでいてもよい。【００３９】
例えば、ステップ（２）の後に、本発明ポリペプチドを精製するステップを加えることもできる。精製は、部分精製であっても完全精製であってもよく、本発明ポリペプチドの使用目的等に応じて当業者が適宜選択することができる。【００４０】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
なお、本発明ポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やポリヒスチジンなどの異種タンパク質や異種ペプチドとの融合タンパク質として発現させ、異種タンパク質や異種ペプチドに対するアフィニティカラムを利用して精製を行うこともできる。このような融合タンパク質も本発明ポリペプチドに包含される。【００４１】
本発明ポリペプチドが生産されたか否かは、生産されたポリペプチドのアミノ酸配列、作用等を分析することによって確認することができる。【００４２】
＜４＞本発明結晶
本発明結晶は、本発明ポリペプチドの結晶である。すなわち、前記（Ａ）と（Ｂ）のいずれのポリペプチドの結晶をも含む概念である。好ましい例示として、前記（Ａ）のポリペプチドの結晶を挙げることができる。
本発明結晶は、本発明ポリペプチドが結晶化したものである限りにおいて特に限定されない。またその製造方法も、ポリペプチドの結晶化に用いられる公知の手法のなかから、当業者が適宜選択することができる。本発明結晶として、単斜晶系や正方晶系の結晶が例示される。
本発明結晶としてより具体的には、例えば本発明結晶１及び本発明結晶２を例示することができる。【００４３】
本発明結晶１は、板状結晶であるものが好ましい。さらに以下の結晶データを示す結晶であるものが好ましい。
結晶系：単斜（monoclinic）
ブラベ格子：単純格子（primitive monoclinic）
空間群：  Ｐ２1
格子定数：
ａ＝８３．５Å
ｂ＝２３２．０Å
ｃ＝８６．０Å
β＝１０５．５°
本発明結晶１は、例えば、本発明ポリペプチドを含有する溶液に、終濃度１５％程度のポリエチレングリコールを添加し、室温で放置することにより製造することができる。より具体的な製造方法の例示については、後述の実施例４を参照されたい。
また本発明結晶２は、正八面体結晶であるものが好ましい。さらに以下の結晶データを示す結晶であるものが好ましい。
結晶系：正方（tetragonal）
ブラベ格子：単純格子（primitive tetragonal）
空間群：  Ｐ４
格子定数：
ａ＝３３６Å
ｂ＝３３６Å
ｃ＝１００Å
本発明結晶２は、例えば、本発明ポリペプチドを含有する溶液に、終濃度４Ｍ程度のギ酸ナトリウムを添加し、室温で放置することにより製造することができる。より具体的な製造方法の例示については、後述の実施例５を参照されたい。【００４４】
本発明結晶は、本発明ポリペプチドを極めて高純度なかたちで提供することができる。例えば、本発明結晶を水溶性の溶媒で再溶解して、これを本発明ポリペプチドとしてコンドロイチン合成等に用いることができる。【００４５】
＜５＞本発明のコンドロイチンの製造方法
本発明のコンドロイチンの製造方法は、本発明のポリペプチドの存在下で、糖受容体基質とD-グルクロン酸供与体（ＧｌｃＵＡ）とＮ-アセチル-D-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）供与体とを反応させる工程を含む、コンドロイチンの製造方法である。
ここで、ＧｌｃＵＡ供与体としてはヌクレオシドジリン酸−ＧｌｃＵＡが好ましく、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが特に好ましい。また、ＧａｌＮＡｃ供与体としてはヌクレオシドジリン酸−ＧａｌＮＡｃが好ましく、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが特に好ましい。
これらの糖受容体基質としては、コンドロイチンを用いることが好ましく、なかでもコンドロイチン４糖やコンドロイチン６糖などのコンドロイチンオリゴ糖を用いることが好ましい。  上記反応によりコンドロイチンを生成し、例えばカラムクロマトグラフィーなどによって得られたコンドロイチンを精製することによって精製コンドロイチンを得ることができる。
本発明のコンドロイチンの製造方法は、得られるコンドロイチンの分子量によって限定されるものではないが、後述する実施例に記載のように例えば数十万以上の高分子量のコンドロイチンを製造することも可能である。【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００４７】
野生型Ｋ４ＣＰのトリプシン処理による、本発明ポリペプチド（ΔＮ５７Ｋ４ＣＰ）の製造
発現ベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ３（アマシャム  バイオサイエンス株式会社製；配列番号５に塩基配列を開示した。）における、ＢａｍＨＩサイト（配列番号５における塩基番号９３０〜９３５）とＥｃｏＲＩサイト（配列番号５における塩基番号９３８〜９４３）との間に、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（野生型Ｋ４ＣＰをコードしている。）を挿入した。配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡは、特許文献１に記載の方法で調製した（特許文献１の実施例２における「インサート」が、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡに相当する。）。【００４８】
これを大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’（Invitrogen社製）にトランスフォーメーションし、以後、特許文献１の実施例２に記載された方法と同様にして、ポリペプチドを発現させた。
ｐＧＥＸ４Ｔ３を用いて発現されたポリペプチドは、ＧＳＴ（glutathione S-transferase）との融合ポリペプチドとなっていることから、発現されたポリペプチドを、グルタチオンセファロース  ４Ｂ（Glutathione Sepharose 4B；  ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用いてアフィニティー精製した。
精製されたポリペプチドをトロンビンで処理することによって、ＧＳＴ部分を除去した。トロンビンによる処理は、ポリペプチド１３μｇに対して１単位のトロンビンを添加して、４℃で一晩インキュベートすることにより行った。
トロンビン処理後、ゲルろ過（Sephacryl-S200；アマシャム  バイオサイエンス株式会社製）によって、ＧＳＴ部分を含有しないＫ４ＣＰ（配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。）を得た。【００４９】
これを終濃度１０ｎｇ／ｍｌのトリプシンで２０℃、１５分間処理した。処理前及び処理後の溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に付し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果を図１に示す。図１中、「Ｍ」は分子量マーカー、「−」はトリプシン処理前の溶液を、「＋」はトリプシン処理後の溶液をそれぞれ示す。【００５０】
図１に示される通り、トリプシン処理後の溶液では、トリプシンによってわずかに低分子化されたバンド（図１中の黒三角印）が検出された。この低分子化されたバンドについてＮ末端アミノ酸配列を解析した結果、このバンドはＫ４ＣＰのＮ末端から５７残基分のアミノ酸が除去されたものであることが判明した。したがって、この低分子化されたバンドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが示された。以下、このポリペプチドを「ΔＮ５７Ｋ４ＣＰ」という。
【実施例２】
【００５１】
遺伝子工学的手法による、本発明ポリペプチド（ΔＮ５７Ｋ４ＣＰ）の製造
前記の発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ３における、ＢａｍＨ１サイト（配列番号５における塩基番号９３０〜９３５）とＥｃｏＲＩサイト（配列番号５における塩基番号９３８〜９４３）との間に、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ（ΔＮ５７Ｋ４ＣＰをコードしている。）を挿入した。配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡはＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によって調製した。【００５２】
これをエレクトロポレーションにより大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’（Invitrogen社製）に導入し、終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンナトリウムを添加した２×ＹＴ培地中、３０℃で培養した。培養液中の菌体濃度（ＯＤ６００；６００ｎｍにおける吸光度）が０．６〜１になった段階で、培養液中に終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ（isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside）を添加し、３０℃で一晩培養した。培養終了後、その菌体破細液上清をグルタチオンセファロース  ４Ｂ（Glutathione Sepharose 4B；  ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用いてアフィニティー精製した。
精製されたポリペプチドをトロンビンで処理することによって、ＧＳＴ部分を除去した。トロンビンによる処理は、実施例１と同様に行った。【００５３】
トロンビン処理後、実施例１と同様にゲルろ過し、ＧＳＴ部分を含有しないΔＮ５７Ｋ４ＣＰ（配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。）を得た。ゲルろ過の溶出画分（７つの画分）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果を図２に示す。図２中、「Ｍ」は分子量マーカーを示す。【００５４】
図２より、遺伝子工学的手法によってもΔＮ５７Ｋ４ＣＰを製造できることが示された。
なお、本実施例において発現されたΔＮ５７Ｋ４ＣＰの発現量は、実施例１において発現されたＫ４ＣＰの発現量の約１０倍であった。
【実施例３】
【００５５】
酵素活性の測定
前記実施例２で製造したΔＮ５７Ｋ４ＣＰと、特許文献１の実施例２に記載の方法で製造したＫ４ＣＰ（配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端に、Ｈｉｓタグを含むペプチドが結合している）の両方について、コンドロイチン合成酵素活性を測定した。測定の方法は次の通りである。【００５６】
酵素活性を測定するポリペプチド（２．０μｇ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、コンドロイチン６糖（０．１ｎｍｏｌ；生化学工業株式会社）、ＵＤＰ−［3Ｈ］ＧａｌＮＡｃ（０．１μＣｉ、３ｎｍｏｌ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（３ｎｍｏｌ）を含有する反応溶液（５０μｌ）を、３０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の反応溶液を１００℃で１分間加熱処理して、酵素反応を停止させた。その後、この溶液をSuperdex Peptide HR10/30カラム（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）にアプライし、０．２Ｍ  ＮａＣｌを溶離液として用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。コンドロイチン６糖以上の画分を回収し、酵素反応によって取り込まれた［3Ｈ］ＧａｌＮＡｃの放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
その結果、ΔＮ５７Ｋ４ＣＰは、Ｋ４ＣＰの活性に比して、２．０６倍のコンドロイチン合成酵素活性（比活性；ポリペプチド重量あたり）を示した。
【実施例４】
【００５７】
本発明結晶１の製造
実施例２で得られたΔＮ５７Ｋ４ＣＰを２０ｍｇ／ｍｌ含有する溶液（溶媒組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＵＤＰ及び５ｍＭ  ＭｎＣｌ2）を調製し、これにポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０；Hampton Research社）及びＮａＣｌを、それぞれ終濃度１５％及び０．２Ｍとなるように添加して、室温で放置した。その結果、ΔＮ５７Ｋ４ＣＰの結晶が生成した。この結晶の光学顕微鏡像を図３に示す。図３に示される通り、この結晶は板状結晶であった。この結晶についてＸ線結晶解析を行い、以下の結晶データを得た。
結晶系：単斜（monoclinic）
ブラベ格子：単純格子（primitive monoclinic）
空間群：  Ｐ２1
格子定数：
ａ＝８３．５Å
ｂ＝２３２．０Å
ｃ＝８６．０Å
β＝１０５．５°
【実施例５】
【００５８】
本発明結晶２の製造
実施例２で得られたΔＮ５７Ｋ４ＣＰを２０ｍｇ／ｍｌ含有する溶液（溶媒組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＵＤＰ及び５ｍＭ  ＭｎＣｌ2）を調製し、これにギ酸ナトリウム及びジチオトレイトールを、それぞれ終濃度４Ｍ及び２０ｍＭとなるように添加して、室温で放置した。その結果、ΔＮ５７Ｋ４ＣＰの結晶が生成した。この結晶の光学顕微鏡像を図４に示す。図４に示される通り、この結晶は正八面体結晶であった。この結晶についてＸ線結晶解析を行い、以下の結晶データを得た。
結晶系：正方（tetragonal）
ブラベ格子：単純格子（primitive tetragonal）
空間群：  Ｐ４
格子定数：
ａ＝３３６Å
ｂ＝３３６Å
ｃ＝１００Å
なお、配列番号４で示されるＫ４ＣＰ（Ｎ末端から５７残基分のアミノ酸が除去されていないもの）について種々の方法で結晶化を試みたが、結晶化することはできなかった。
【実施例６】
【００５９】
実施例２で製造したΔN57K4CP（２０μｇ）を用いてＵＤＰ−［3Ｈ］ＧａｌＮａｃ（０．１μＣｉ，３０ｎｍｏｌ）、及びＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（３０ｎｍｏｌ）並びにコンドロイチン６糖（［Ａ］１ｎｍｏｌ，［Ｂ］０．１ｎｍｏｌ，［Ｃ］０．０１ｎｍｏｌ）をそれぞれ含有する反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２，  ０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ2，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １００μｌ）を３０℃で７２時間インキュベートした。反応液を加熱処理後、直列につないだSephacryl S500 HR10/30カラムとSuperose 6 HR10/30 カラム（ともにGEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて１分あたり０．５ｍｌの流速でゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出画分の［3Ｈ］放射活性を測定して、合成されたコンドロイチンの溶出パターンを解析した（図５）。
ヒアルロン酸標準品を用いて分子量の検量線を作成し、その検量線から溶出された合成コンドロイチンの平均分子量を求めると［Ａ］が約１６ｋＤａ，［Ｂ］が約２１６ｋＤａ，［Ｃ］が約６８５ｋＤａであった。
【実施例７】
【００６０】
実施例２で製造したΔN57K4CP（２００μｇ）を用いて、放射活性を持たないＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（３００ｎｍｏｌ）、及びＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（３００ｎｍｏｌ）並びにコンドロイチン６糖（［Ａ］１０ｎｍｏｌ，［Ｂ］１ｎｍｏｌ，［Ｃ］０．１ｎｍｏｌ）をそれぞれ含有する実施例６と同様な反応溶液（１００μｌ）をインキュベートして酵素反応を行った。加熱処理した反応液をFast Desalting カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、高分子溶出画分をＣ１８セプパック（ウォーターズ社）に通した後、凍結乾燥した。得られた合成コンドロイチンの平均分子量を多角度光散乱計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で測定した結果（表１）、［Ａ］が３４．７ｋＤａ，［Ｂ］が１５７ｋＤａ，［Ｃ］が３４４ｋＤａであった。【００６１】
【表１】
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表中、「D/A」は、コンドロイチン６糖に対する糖ヌクレオチド供与体基質のモル濃度比を示す。反応は３０℃で７２時間行った。【００６２】
実施例６，７の結果から、ΔN57K4CPを使用することにより高分子量のコンドロイチンが効率よく得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明ポリペプチドは、野生型Ｋ４ＣＰに比して核酸から極めて効率よく発現させることができ、その酵素活性も野生型Ｋ４ＣＰに比して高く、しかも結晶化が容易であることから、例えばコンドロイチンの効率よく安価な生産ツール等として利用することができ、極めて有用である。また、本発明ポリペプチドを使用することにより高分子量のコンドロイチンを効率よく得ることができる。本発明核酸は、このような本発明ポリペプチドの効率よく安価な生産ツールとして利用することができ、極めて有用である。本発明生産方法は、本発明ポリペプチドの効率的な生産に利用することができ、極めて有用である。本発明結晶は、このような本発明ポリペプチドを極めて高純度なかたちで提供するものであり、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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