(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるタウオパチーをin vitroで検出する方法であって、
・該個体から得られたサンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程を含み、
ここで、得られた該サンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、対照個体から得られたサンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることが推論され、対照個体から得られたサンプルにおける該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標となる、
方法。
【請求項２】
個体における非タウオパチーと対比してのタウオパチーを鑑別in vitro検出する方法であって、
・該個体から得られたサンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程を含み、
ここで、得られた該サンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、非タウオパチーに罹患している個体から得られたサンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率とか、または対照個体から得られたサンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることが推論され、非タウオパチーに罹患している個体から得られたサンプル、または対照個体から得られたサンプルにおける該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標となる、
方法。
【請求項３】
該非タウオパチーが、非タウオパチー神経変性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該非タウオパチーが、血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中、および／または白血病の患者における神経毒性である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
タウオパチーが、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および／または第１７染色体関連パーキンソン病による前頭側頭痴呆である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
・該個体から得られた脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程を含み、
ここで、得られた該脳脊髄液サンプルにおけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、非タウオパチーに罹患している個体からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率とか、または対照個体からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることが推論され、非タウオパチーに罹患している個体からのＣＳＦ、または対照個体からのＣＳＦにおける該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標となる、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体ＨＴ７およびモノクローナル抗体ＡＴ２７０との免疫学的複合体を容易に形成する１５〜１００アミノ酸のホスホペプチドであって、少なくとも、
・ＨＴ７の最小エピトープ：ＰＰＧＱＫ（配列番号１）；および
・ＡＴ２７０の最小エピトープ：ＰＰＡＰＫＴ（ｐ）Ｐ（配列番号２）
を含むホスホペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法におけるホスホタウ（１８１）のレベルを測定するための組成物。
【請求項８】
該ホスホペプチドが、下記の配列：
PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE（配列番号:３）
または依然としてＨＴ７およびＡＴ２７０モノクローナル抗体に結合するという条件での変異配列を含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法におけるホスホタウ（１８１）のレベルを測定する方法における請求項７又は８に記載のホスホペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における、タウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のための請求項７又は８に記載のホスホペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法におけるホスホタウ（１８１）のレベルを測定するための検出キットの製造のための請求項７又は８に記載のホスホペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における、タウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のための検出キットの製造のための請求項７又は８に記載のホスホペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法における個体におけるタウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のための検出キットであって、少なくとも：
・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体と；
・総タウを認識する抗体と
を含む検出キット。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法における個体におけるタウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のために、ホスホタウ（１８１）のレベルを測定するための検出キットであって、少なくとも請求項７又は８に記載のホスホペプチドを含む検出キット。
【請求項１５】
少なくとも：
・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体と；
・総タウを認識する抗体と；
・請求項７又は８に記載のホスホペプチドと
を含む請求項１３又は１４に記載の検出キット。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法におけるタウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のための請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の検出キットの使用。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法におけるアルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆のin vitro検出のため、および／または血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中および／または白血病の患者における神経毒性と対比してのアルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の鑑別in vitro検出のための請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の検出キットの使用。
【請求項１８】
薬物の試験もしくはスクリーニングのための、治療上の追跡のためのデータを収集するための、および／または一定の処置の有効性の決定のためのデータを収集するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法、請求項７又は８に記載の組成物、又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の検出キットの使用。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における、総タウを認識する抗体およびホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体の使用。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における、タウオパチーのin vitro検出、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別in vitro検出のための検出キットの製造のための、総タウを認識する抗体およびホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の分野）
本発明は、タウオパチーの診断に関する。本発明は、タウオパチーの検出および／または鑑別診断のための新奇な方法を提供する。本発明は、本発明の方法における標準化に用いることができるホスホペプチドも提供する。
【０００２】（発明の背景）
痴呆のいくつかの形態、いわゆるタウオパチー〔Goedert et al., 1998〕は、同じ病態生理学的機序、すなわち構造タンパク質であるタウの関与と関連付けられている。微小管関連タンパク質であるタウは、たとえば、アルツハイマー病に関連する、対合らせんフィラメント（ＰＨＰ）および神経原繊維タングル（neurofibrillar tangles）（ＮＦＴ）の主要なタンパク質成分である〔Brion et al., 1985；Delacourte & Defossez, 1986；Grundke-Iqbal et al., 1986；Kosik et al., 1986；Wood et al., 1986；Kondo et al., 1988〕。タウタンパク質は、異なるイソ型で存在し、うち４〜６種類は、成人の脳に見出されるが、胎児脳には、一つのイソ型のみが検出されるにすぎない。イソ型の多様性は、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって、ヒト第１７染色体上のただ一つの遺伝子から生成される〔Himmler, 1989；Goedert et al., 1989；Andreadis et al., 1992〕。
タウタンパク質の、分子クローニングから推論された限りで最も目を引く特徴は、分子のカルボキシル末端部に生じる、３１または３２アミノ酸のストレッチであって、３または４回反復されることができる。追加的な多様性は、タウ分子のＮＨ2末端部での２９または５８アミノ酸長の挿入によって生成される〔Goedertet al., 1989〕。in vivoで、タウは、タウの反復領域（２５５〜３８１）内のその微小管結合ドメインが関与する相互作用によって、ニューロンの軸索区画での微小管集成および安定性を促進する〔Lewis et al., 1988〕。正常な状況下では、成人の脳は、タウ１モルあたり２〜３モルのリン酸塩を含有する〔Selden & Pollard, 1983；Ksiezak-Reding et al., 1992〕。ラットおよびヒトで研究された限りで、正常タウの異なる部位のリン酸化は、発生状態に左右される〔Lee et al., 1991；Bramblett et al., 1993；Goedert et al., 1993〕。リン酸化の結果として生じる６０、６４および６８kDaのタウ変異体が、脳の神経原繊維タングルを示す部域で検出されている〔Delacourte et al., 1990；Goedert et al., 1992；Flament et al., 1990；Greenberg & Davies, 1990〕。これらの脳は、タウ１モルあたり６〜８モルのリン酸塩を含有する〔Ksiezak-Reding et al., 1992〕。ＰＨＰから単離されたタウ（ＰＨＰ−タウ）では、リン酸化は、いくつかの位置で発生する〔Iqbal et al., 1989；Lee et al., 1991；Hasegawa etal., 1992；Hanger et al., 1998；Buee et al., 1999〕。
【０００３】  アルツハイマー病（ＡＤ）は、タウの病理学に関連する、最も一般的な形式の一次性変性痴呆であって、４２〜７５％の罹患率を有する〔Brun, 1993；Gustafson, 1993；Ebly et al., 1994〕。前頭側頭痴呆（ＦＴＤ）は、病理学的には、ピック病、第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆、散発性ＦＴＤ、および運動ニューロン病が存在する、臨床的状態である。Mannら〔2000〕による小規模な研究によれば、ＦＴＤの３７症例中１６は、タウ免疫組織化学に基づいて、タウオパチーとして分類することができた。繊維状タウという病理学、すなわち神経原繊維タングルは、一貫してＡＤに見出されるが〔Tomlinson & Corsellis, 1984〕、ＦＴＤにも見出されることがある〔Spillantini & Geodert, 1998〕。病的なタウタンパク質は、ＡＤおよびＦＴＤにともに見出されるが〔Vermersche et al., 1995；Delacourte et al., 1996〕、脳組織についての研究は、タウの病理学は、ＡＤとＦＴＤとでは異なり、おそらくリン酸化の程度に関連することを示唆した〔Delacourte et al., 1996〕。タウの病理に関連するその他の形態の痴呆は、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底変性（ＣＢＤ）および亜急性硬化性汎脳炎を包含する。これらのタウオパチーの病理学における過剰リン酸化の役割は、現在は、充分に理解されていない。加えて、プロリン領域に集中した特異的ホスホ部位の、リン酸化の程度の正確な決定は、様々な困難に遭遇している。これらの困難のため、これらのタウオパチーを特異的に検出するための正確な方法は、依然として欠如している。
【０００４】  個体におけるタウオパチーの診断方法を提供することは、本発明の一つの目的である。
【０００５】  個体におけるアルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の診断方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【０００６】  非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【０００７】  非タウオパチー神経変性と対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【０００８】  血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中、および／または白血病の患者における神経毒性と対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【０００９】  血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中、および／または白血病の患者における神経毒性と対比しての、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の鑑別診断の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１０】  上記のとおりのインビトロ（in vitro）の方法を提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１１】  標準化に用いるためのホスホペプチドを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１２】  ホスホタウ（１８１）を検出する方法における標準化に用いるためのホスホペプチドを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１３】  上記のとおりの方法における標準化に用いるためのホスホペプチドを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１４】  上記のとおりの方法に用いるための診断キットを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１５】  タウオパチーに対する、薬物の試験もしくはスクリーニング、診断用追跡、および／または一定の処置の有効性の決定のための、ペプチド、方法、および／または診断キットを提供することは、本発明のもう一つの目的である。
【００１６】
【表１】
0005247963.tif 000002
【００１７】
【表２】
0005247963.tif 000003
【００１８】  値は、すべて、平均±ＳＤとして表されている。下記の略記を用いた；ＦＴＤ：前頭側頭痴呆、ＡＤ：アルツハイマー病、ＳＡＥ：皮質下動脈硬化性脳症、ＰＤ：パーキンソン病、Prob：蓋然性のある、Poss：可能性のある、Ｎ：個体数、Ｍ：男性、Ｆ：女性、ｙ：年齢、ＣＳＦ：脳脊髄液。
【００１９】
【表３】
0005247963.tif 000004
【００２０】  値は、すべて、平均±ＳＤとして表されている。略記：ＦＴＤ：前頭側頭痴呆、ＡＤ：アルツハイマー病、ＰＤ：パーキンソン病、ＳＡＥ：皮質下動脈硬化性脳症。
***  値は、対照についての値と比較して有意に異なる（ｐ＜０．００１）。
**   値は、対照についての値と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０１）。
*    値は、対照についての値と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００２１】（発明の詳細な説明）
本発明は、個体におけるタウオパチーを診断する方法であって、
【００２２】・該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と；
【００２３】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、対照個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程であって、対照個体における該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標である工程とを含む方法に関する。
【００２４】  本発明は、個体における非タウオパチーと対比してのタウオパチーを鑑別診断する方法であって、
【００２５】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、非タウオパチーに罹患している個体で得られたホスホタウ（１８１）／総タウの比率とか、または対照個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程、非タウオパチーに罹患している個体、または対照個体における該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標である工程と
を含む方法にも関する。
【００２６】  本発明は、ＡＤに罹患している患者からのＣＳＦ、およびある種の形態のＦＴＤに罹患している患者からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率は、対照個体からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウ比と比較して有意に変化するとの知見に基づく。本発明は、さらに、ＡＤに罹患している患者からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率は、卒中に罹患している患者からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウ比と比較して有意に変化するとの知見にも基づく。タウオパチーの患者におけるホスホタウ（１８１）／総タウ比が変化することの表示は、個体におけるタウオパチーの診断、および／または非タウオパチーに罹患している個体と対比しての、タウオパチーに罹患している個体の鑑別診断のための診断試験の開発に向けての基盤を形成する。
【００２７】  「タウオパチー」は、タウの病理学に関連するあらゆる形態の痴呆である。
【００２８】  アルツハイマー病、およびある種の形態の前頭側頭痴呆（ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆）は、最も一般的な形態のタウオパチーである。したがって、本発明は、タウオパチーが、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆である、上記のいかなる方法にも関する。その他のタウオパチーは、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底変性（ＣＢＤ）および亜急性硬化性汎脳炎を包含するが、これらに限定されない。
【００２９】  特定の実施態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病を診断する方法であって、
【００３０】・該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と；
【００３１】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、対照個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較して、対照個体における該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標となることによって、該個体がアルツハイマー病に罹患していることを推論する工程と
を含む方法に関する。
【００３２】  「非タウオパチー」は、脳のタウオパチーに関連しないいかなる状態でもある。本発明の実施態様では、該非タウオパチーは、非タウオパチー神経変性である。非タウオパチー神経変性は、神経学的疾患のタウオパチーに関連しないいかなる形態でもある。非タウオパチー神経変性は、血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中、および／または白血病の患者における神経毒性を包含するが、これらに限定されない。
【００３３】  したがって、特定の実施態様では、本発明は、卒中と対比してのアルツハイマー病を個体において鑑別診断する方法であって、
【００３４】・該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と；
【００３５】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、卒中に罹患している個体で得られたホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較することによって、該個体が卒中ではなくアルツハイマー病に罹患していることを推論する工程であって、卒中に罹患している個体における該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標である工程、
を含む方法に関する。
【００３６】  ホスホタウ（１８１）は、第１８１位のトレオニンでリン酸塩を有する、すべてのタウ分子を包含する。アミノ酸配列に関する番号付けは、タウの最長のイソ型であるｈＴａｕ４０を参考にする〔Goedert et al., 1989〕。
【００３７】  総タウとは、タウのすべての形態を意味し、いかなるリン酸化状態のタウも包含する。
【００３８】  したがって、本発明は、タウオパチーの診断、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための、神経学的マーカーとして用いるためのタウおよびホスホタウ（１８１）に関する。
【００３９】  個体におけるホスホタウ（１８１）および総タウのレベルに基づけば、該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定することができる。
【００４０】  ホスホタウ（１８１）／総タウの比率は、in vivoはもとより、in vitroでも検出することができる。個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率をin vitroで検出する方法は、
【００４１】・該個体からサンプルを得る工程と；
【００４２】・該サンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と；
【００４３】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、非タウオパチーに罹患している個体からのサンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率とか、または対照個体からのサンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウ比と比較することによって、該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程であって非タウオパチーに罹患している個体、または対照個体における該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標である工程と
を含む。
【００４４】  用語「サンプル」は、生物学的材料のいかなる入手源、たとえば、ホスホタウ（１８１）タンパク質を含む体液、脳抽出物、末梢血その他いかなるサンプルも意味する。本発明の一実施態様では、ホスホタウ（１８１）／総タウの比率は、患者の体液サンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率の分析によって、in vitroで決定する。用語「体液」は、人体内に存在する、ホスホタウ（１８１）タンパク質を含む血液、リンパ、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）を包含するが、これらに限定されないすべての体液を意味する。本発明のもう一つの実施態様では、ホスホタウ（１８１）／総タウの比率は、患者から採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中で決定する。したがって、本発明は、
【００４５】・該個体から脳脊髄液サンプルを得る工程と；
【００４６】・該脳脊髄液サンプル中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と；
【００４７】・得られた該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を、非タウオパチーに罹患している個体からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウの比率とか、または対照個体からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウ比と比較することによって該個体がタウオパチーに罹患していることを推論する工程であって、非タウオパチーに罹患している個体からのＣＳＦ中のか、または対照個体からのＣＳＦ中の該比率と比較したホスホタウ（１８１）／総タウの比率の変化が指標となることによって、
を含む上記の方法に関する。
【００４８】  総タウは、抗体の使用を包含するが、これらに限定されない、公知のいかなる方法によってか、または別途、機能アッセー〔Bramblett et al., 1992〕によっても定量することができる。総タウを特異的に認識する、いかなるモノクローナルまたはポリクローナル抗体も、総タウの定量に用いてよい。正常および異常にリン酸化されたタウを認識する抗体は、Ａｌｚ５０〔Ghanbari et al., 1990〕、ＨＴ７〔Mercken et al., 1992〕、およびＡＴ１２０〔Vandermeeren et al., 1993〕を包含する。しかし、総タウを認識する、当技術に公知のその他の抗体も、用いることができる。総タウの定量のための、非常に迅速で、利用者が扱いやすい方法は、INNOTEST hTau-Ag（lnnogenetics, Gent、ベルギー国）である。
【００４９】  ホスホタウ（１８１）は、抗体の使用を包含するが、これらに限定されない、公知のいかなる方法によっても定量することができる。好適実施態様では、ホスホタウ（１８１）は、少なくとも下記の工程：
【００５０】・患者からサンプルを得る工程と；
【００５１】・該サンプルを、抗原−抗体複合体を生成するのに適する条件下で、ホスホタウ（１８１）を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させる工程と；
【００５２】・該サンプルとの該抗体の免疫学的結合を検出する工程と
を含む免疫アッセーによって定量する。
【００５３】  はるかに好適な実施態様では、ホスホタウ（１８１）は、下記の工程：
【００５４】・患者からサンプルを得る工程と；
【００５５】・該サンプルを、抗原−抗体複合体を生成するのに適する条件下で、ホスホタウ（１８１）を特異的に認識するモノクローナル抗体（一次抗体すなわち捕捉抗体）と接触させる工程と；
【００５６】・該抗原−抗体複合体を、抗原−抗体複合体を生成するのに適する条件下で、ホスホタウ（１８１）を特異的に認識するモノクローナル抗体（二次抗体すなわち検出抗体）と接触させる工程と；
【００５７】・該抗原−抗体複合体を、該二次抗体による特異的タグ付け、またはそれとのカップリングのいずれかのための、当業者には公知である可能ないかなるマーカーとも接触させる工程と；
【００５８】・標準化の目的で、おそらくは、該抗体を、両抗体と反応する精製されたホスホタウタンパク質またはホスホペプチドと接触させる工程と
を含む、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって定量することができる。
【００５９】  好都合には、二次抗体自体が、マーカーとの直接または間接カップリングのためのマーカーもしくは基を有する。
【００６０】  本発明に用いられる限りで、表現「認識する」、「反応する」、「免疫学的結合」または「抗原−抗体複合体を生成する」は、抗原と抗体との結合が、該抗体および抗原の免疫学的特性に留意するすべての条件下で生じることと解されるものとする。
【００６１】  本発明に用いられる限りで、表現「特異的に認識する」は、該抗体が、ホスホタウ（１８１）とは免疫学的複合体を形成できるが、トレオニン１８１でのリン酸化を欠くタウ分子とは形成できないことと解されるものとする。
【００６２】  ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する、いかなるモノクローナル抗体も、ホスホタウ（１８１）の定量のための該方法に用いることができる。ホスホタウ（１８１）の定量に用いるのに好適なモノクローナル抗体は、ＡＴ２７０（WO95/17429のもとに刊行された国際特許願）である。しかし、ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する、当技術に公知のその他の抗体も用いることができる。
【００６３】  標準化の目的で、トレオニン１８１でリン酸化されたタウタンパク質またはペプチドを用いることができる。これは、脳からの抽出、またはin vitroでの正常タウのリン酸化のような、いかなる方法によっても得ることができる。プロリン領域に集中された特異的ホスホ部位のリン酸化の程度を正確に決定することは困難であるため、本発明の実施態様では、合成ホスホペプチドを標準化のために用いる。該合成ホスホペプチドは、免疫アッセーに用いられた抗体と免疫学的複合体を形成することができなければならない。
【００６４】  したがって、本発明は、モノクローナル抗体によって認識される少なくとも二つのエピトープを含み、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおいて、該モノクローナル抗体との免疫学的複合体を容易に形成する、ホスホペプチドにも関する。以前の研究は、ペプチドは、一定のモノクローナル抗体に対するエピトープを含むが、該モノクローナル抗体は、必ずしも該ペプチドを認識しないことを示していた〔DeLeys et al., 1996〕。本発明者らは、該エピトープを認識するモノクローナル抗体との免疫学的複合体を実際に形成できるような、二つのエピトープを有するホスホペプチドを画定することができた。加えて、本発明者らは、該ホスホペプチドが、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおいて、それらを認識するモノクローナル抗体との免疫学的複合体を形成できるような、二つのエピトープをともに画定することができた。
【００６５】  用語「ペプチド」は、アミノ酸（ａａ）の重合体を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。本発明の一実施態様では、該ホスホペプチドの長さは、１５〜１００アミノ酸である。本発明の好適実施態様では、該ホスホペプチドは、２０〜５０アミノ酸を含む。本発明のもう一つの好適実施態様では、該ホスホペプチドは、３０〜４０アミノ酸を含む。
【００６６】  本発明のペプチドは、Houbenweyl（1974）、およびAtherton & Shepard（1989）が記載したとおりの、古典的化学合成のような、当技術に公知のいかなる方法によっても、実施例の項に記載されたような、商業的に入手できるいかなる方法によっても、またはSambrookら（1989）が記載したような組換えＤＮＡ手法によっても生成することができる。
【００６７】  ホスホペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸にリン酸塩を有するペプチドである。本発明のホスホペプチドの使用は、本発明者らが、特定のホスホイソ型とのホスホペプチドの関係を決定し、特定のホスホ部位のリン酸化の程度を査定するのを可能にした（例１、１．５を参照されたい）。本発明のホスホペプチドの使用は、タウの特定の分子形態を標準化された方法で定量するのを可能にすることになる。
【００６８】  リン酸化されたペプチドは、公知のいかなる方法によって製造することもできる。それらは、たとえば、ジ−tert−ブチルジイソプロピルジイソプロピルホスホアミダイトとの反応、および保護されていないセリンおよびトレオニン残基のtert−ブチルヒドロペルオキシドによる酸化によって、集成後に製造することができる。また、ペプチド合成の際に、リン酸化されたアミノ酸を組み込むことによって製造することもできる。最近では、集成後リン酸化なしにホスホペプチドを直接合成するための、新たなリン酸化セリン誘導体（Ｎ−α−Fmoc−Ｏ−ベンジル−Ｌ−ホスホセリン）が商業的に入手できる（Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121）。
【００６９】  好適実施態様では、本発明は、モノクローナル抗体ＨＴ７およびモノクローナル抗体ＡＴ２７０との免疫学的複合体を容易に形成するホスホペプチドであって、少なくとも、
【００７０】・ＨＴ７の最小エピトープ：ＰＰＧＱＫ（配列番号１）；および
【００７１】・ＡＴ２７０の最小エピトープ：ＰＰＡＰＫＴ（ｐ）Ｐ（配列番号２）
を含むホスホペプチドに関する。
【００７２】  はるかに好適な実施態様では、本発明は、下記の配列：
【００７３】      PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE（配列番号：３）
【００７４】〔式中、「（ｐ）」は、トレオニンがリン酸化されていることを意味する〕、
または依然としてＨＴ７およびＡＴ２７０モノクローナル抗体に結合する条件での変異配列を含む、上記のとおりのホスホペプチドに関する。用語「変異配列」は、配列番号：３で表されるペプチドの、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換もしく欠失による、ＨＴ７およびＡＴ２７０モノクローナル抗体を依然として認識する、いかなる変種もしくはフラグメントも意味する。この用語は、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化、脂肪酸などによる修飾のような、ペプチドの翻訳後修飾を具体的に意味せず、かつ除外もしない。この定義に包含されるのは、たとえば、アミノ酸の１種類またはそれ以上の類似体（非天然アミノ酸を包含する）を含むペプチド、置換された連関を有するペプチド、突然変異させたその改作、システイン残基の間にジスルフィド結合を有するペプチド、ビオチニル化されたペプチドはもとより、当技術に公知のその他の修飾である。
【００７５】  本発明は、さらに、該ホスホペプチドを、ホスホタウ（１８１）のレベルを測定する方法に用いる用途に関する。
【００７６】  本発明は、さらに、非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断の方法に、該ホスホペプチドを用いる用途に関する。
【００７７】  本発明は、さらに、アルツハイマー病を診断する方法に、該ホスホペプチドを用いる用途に関する。
【００７８】  本発明は、さらに、卒中と対比してのアルツハイマー病の鑑別診断の方法に、該ホスホペプチドを用いる用途に関する。
【００７９】  個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率をin vitroで検出する方法は、該個体のタウオパチーに対する、薬物の試験もしくはスクリーニングに、治療上の追跡に、および／または一定の治療の効果を評価するのに用いることもできる。
【００８０】  個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率の初期in vivo検出の方法は、該個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率を決定する工程と、それを、健康な対照個体におけるホスホタウ（１８１）／総タウの比率と比較する工程とを含む。一実施態様では、ホスホタウ（１８１）および総タウは、in vivo造影によって定量することができる。ホスホタウ（１８１）および総タウは、Arbitら（1995）、Tamadaら（1995）、Wakabayashiら（1995）、Huangら（1996）Sandrockら（1996）、Marianiら（1997）が記載した脳造影法を包含するが、これらに限定されない、非侵襲的方法によって、in situで定量することができる。これらのin vivo造影法は、それぞれ特異的に、ホスホタウ（１８１）を認識するか、または総タウを認識する、標識化された抗体を用いることによって、ホスホタウ（１８１）および総タウの定位および定量を許し得る。
【００８１】  ホスホタウ（１８１）および総タウは、該個体のタウオパチーに対する、薬物の試験もしくはスクリーニングに、治療上の追跡に、および／または一定の治療の効果を評価するためのin vivo造影用マーカーとして用いることもできる。
【００８２】  本発明は、さらに、ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する少なくとも１種類の抗体を含む、個体におけるタウオパチーの診断、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための診断キットに関する。
【００８３】  もう一つの実施態様では、本発明は、上記のとおりの診断キットであって、少なくとも：
【００８４】・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体と；
【００８５】・タウを認識する抗体と
を含む診断キットに関する。
【００８６】  もう一つの実施態様では、本発明は、本発明による少なくとも１種類のホスホペプチドを含む、上記のとおりの診断キットに関する。
【００８７】  もう一つの実施態様では、本発明は、上記のとおりの診断キットであって、少なくとも：
【００８８】・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体と；
【００８９】・本発明によるホスホペプチドと
を含む診断キットに関する。
【００９０】  もう一つの実施態様では、本発明は、上記のとおりの診断キットであって、少なくとも：
【００９１】・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識する抗体と；
【００９２】・タウを認識する抗体と；
【００９３】・本発明によるホスホペプチドと
を含む診断キットに関する。
【００９４】  個体におけるタウオパチーを診断するのに好適なキットは、免疫アッセイに基づき、
【００９５】・ホスホタウ（１８１）のエピトープとの免疫学的複合体を形成する、モノクローナル抗体（一次抗体）と；
【００９６】・ホスホタウ（１８１）を特異的に認識するモノクローナル抗体（二次抗体）と；
【００９７】・該二次抗体による特異的タグ付け、またはそれとのカップリングのいずれかのためのマーカーと；
【００９８】・一次抗体と試験サンプル、二次抗体と試験サンプル、および／または結合した二次抗体とマーカーとの免疫学的反応を実施するのに適する緩衝液と；
【００９９】・本発明によるホスホペプチドと
を含む。
【０１００】  本発明は、タウオパチーの診断、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断のための請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の診断キットの使用に関する。
【０１０１】  本発明は、さらに、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の診断に用いるための上記の診断キットの使用に関する。
【０１０２】  本発明は、さらに、血管性痴呆、クロイツフェルト−ヤコブ病、卒中、および／または白血病の患者における神経毒性と対比してのアルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭痴呆、および／または第１７染色体連関パーキンソン病による前頭側頭痴呆の鑑別診断に用いるための上記の診断キットの使用に関する。
【０１０３】  本発明は、タウオパチーの診断用、および／または非タウオパチーと対比してのタウオパチーの鑑別診断用の診断キットの製造のための、神経学的マーカーとして用いるための総タウおよびホスホタウ（１８１）の使用にも関する。
【０１０４】  本発明は、タウオパチーに対する、薬物の試験もしくはスクリーニング、治療上の追跡、および／または一定の治療の有効性の決定に用いるための本発明のホスホペプチド、方法および／または診断キットの使用にも関する。
【０１０５】  本明細書、および付記されたクレームの全体を通じて、文脈から別途要求されない限り、単語「含む」、ならびに「含み」および「含んで」のような変化形は、記述された完全体もしくは工程、または記述された完全体もしくは工程の群の包含を意味するが、その他のいかなる完全体もしくは工程、または完全体もしくは工程の群の除外も意味しないと解されることになる。
【０１０６】  本明細書におけるいかなる先行技術の参照も、該先行技術が、オーストラリア国における常識的な一般的知識の一部を形成することの承認、またはそのいかなる形態の示唆でもなく、かつそれとしても解してはならない。
【０１０７】  ここで、本発明を、特に好都合な実施態様を説明する下記の実施例を参照して、例示する。しかし、これらの実施例は、例示的であり、いかなる方法でも本発明を限定するとして解することはできない。
【実施例】
【０１０８】例１：標準化に用いるためのホスホペプチドの設計
１．１：タウおよびタウ由来ペプチドの合成
２種類のＰＣＲプライマー〔出発メチオニンコドン−
CATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGG（−１〜３４）（配列番号：４）
を含むプライマー、および停止コドン：
CCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC（配列番号：５）
の周囲の逆プライマー〕を用いて、ヒトのタウからの最小形態をＰLに基づく発現系（Innogenetics, Gent、ベルギー国）内に増幅した。ＰＣＲ産物の配列は、配列決定によって確認した。変化は、コドン中の第三塩基対でのみ観察されたにすぎない：Pro182でＣＡＡに代えてＣＡＧ、Ala227でＧＣＡに代えてＧＣＧ、およびAsn251でＡＡＴに代えてＡＡＣ。アミノ酸配列に関するすべての番号付けは、最長のタウイソ型：hTau40を参照する〔Goedert et al., 1989〕。SacII部位（アミノ酸第１５４〜１５５位）およびPstI部位（第２４２〜２４３位）に充填することによるフレームシフト突然変異種の構成に基づいて、欠失突然変異種を作成した。【０１０９】  自動化ペプチド合成は、Millipore 9050という合成装置で、通常は、Ｎ末端でビオチニル化されたペプチドとして、実施した。サンドウィッチＥＬＩＳＡのためのペプチドAc- PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE-NH2（第１５４〜１８７位）（配列番号：３）の大規模合成は、自社で、Neosystems（Strasbourg、フランス国）によって合成した。品質管理は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）（純度＞９９％）、質量分析計による分析（平均ＭＷ＝３，４５４．８）、およびアミノ酸分析（正味ペプチド含量＝８４．３％）を含む。【０１１０】  エピトープマッピングのために、誘導体化されたピン（Multiple Peptide Systems, San Diego, CA92121）または紙上で、手動でペプチドを合成した。紙上で合成されたペプチドについては、ジメチルアミノピリジンの存在下で、Fmoc−β−アラニンの対称無水物（９−フルオレニルメトキシカルボニル−β−アラニン）を用いて、紙を誘導体化した。Fmoc基を除去した後、第二のβ−アラニン残基を、ＴＢＴＵ〔＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１′，３，３′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート〕による活性化後に加えた。次いで、ペプチドを、スポットとして手動で合成した。【０１１１】  リン酸化されたペプチドは、ジ−tert−ブチルジイソプロピルジイソプロピルホスホロアミダイトとの集成後反応、および保護されていないセリンおよびトレオニン残基のtert−ブチルヒドロペルオキシドによる酸化によって製造した。最近では、集成後リン酸化なしにホスホペプチドを直接合成するための、新たなリン酸化セリン誘導体（Ｎ−α−Fmoc−Ｏ−ベンジル−Ｌ−ホスホセリン）が商業的に入手できる（Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121）。固体の支持体から剥離した後に、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、ペプチドおよびホスホペプチドを精製した。ペプチドの品質は、質量分析によって確認した。【０１１２】１．２：免疫アッセイ
抗体の単離および特徴付けの詳細は、ＡＴ１２０〔Vandermeerem, et al., 1993b〕、ＨＴ７〔Mercken et al., 1992〕、ＢＴ２〔Vandermeeren, et al., 1993a〕およびＡＴ２７０〔Goedert et al., 1994〕について記載されている。ペプチド−抗体相互作用を捕捉アッセーによって定量するために、ストレプトアビジン（Roche Diagnostics, Brussels、ベルギー国）を、５０mM炭酸緩衝液、pH９．５中で５μg/mlで終夜被覆した。ブロックした後、ビオチニル化ペプチドを加え、タウ抗体によって検出した。セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングさせた第二の抗体を用いて、免疫反応を定量した。【０１１３】  INNOTESTホスホタウ（１８１Ｐ）の研究版を、下記のとおり設計した：ＨＴ７被覆免疫プレートを、サンプルまたは標準７５μlとともに、同時にビオチニル化ＡＴ２７０とともに４℃で終夜温置した。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識化したストレプトアビジン（RDI, Flanders, NJ、米国）を３０分間加えた。反応は、０．９ＮのＨ2ＳＯ4５０μlの添加によって停止した。【０１１４】  総タウは、INNOTEST hTau-Agを用いて測定し、標準として用いた組換えタウについての４１，０６５の計算分子量を用いて、pg/mlをにpM変換した。【０１１５】１．３：タウ抗体のマッピング
組換えタウを認識するタウ抗体を、完全なタウ分子上でマッピングするために、PstIおよびSacII部位に基づいて、欠失突然変異体を構築した。試験した抗体、すなわちＨＴ７、ＡＴ１２０、ＢＴ２およびタウ１は、すべて、プロリンに富む領域に位置する（hTau40上で第１５４〜２４２位、データは示さず）。エピトープをさらに明確にするために、小さい重複ペプチドを合成した。第一工程では、８個のアミノ酸が重複する、９アミノ酸長の４８のペプチドを、ピン上に合成した。配列は、１５５〜２０８位にわたった。ＡＴ１２０、ＨＴ７、ＢＴ２およびタウ１を試験した。５種類の抗体中４種類をマッピングすることができ、ＨＴ７の最小エピトープは、ＰＰＧＱＫ（第１５９〜１６３位）（配列番号：１）であったが、ＢＴ２およびタウ１の反応性は、識別不能であった：ＤＲＳＧＹＳ（第１９３〜１９８位）（配列番号：６）（図１ａ）。ＡＴ１２０は、これらのペプチド上でマッピングできなかったため、第２０６〜２３２位からの配列を網羅する、新たな１セットのペプチドを紙上に合成した。１２アミノ酸長の、１１アミノ酸と重複する合計１６のペプチドが、この領域を網羅するのに必要とされた。ＡＴ１２０の最小エピトープは、配列ＰＰＴＲＥＰＫ（第２１８〜２２４位）（配列番号：７）（図１ｂ）によって規定される。【０１１６】１．４：ＡＴ２７０の特異性
ホスホ依存性抗体であるＡＴ２７０の特異性を、タウの２２のリン酸化部位を網羅する合成ホスホペプチドに対して確認した。これらのペプチドの配列を、表１に要約する。これらの部位のうち１２個所に対応する非リン酸化ペプチドを、並行して分析した（図２）。ＡＴ２７０のみが、ホスホ−Thr１８１および／またはホスホ−Thr１７５を含むホスホペプチドと反応した。これらのペプチドを、捕捉アッセーで滴定し終えたとき、ＡＴ２７０は、ホスホ−Thr１８１のそれと比較して、ホスホ−Thr１７５を含むペプチドとモルベースで１８倍、反応性が乏しかった（結果は示さず）。最後に、第１６６〜１９６位の領域を網羅する、１５アミノ酸長のビオチニル化リン酸化ペプチドを用いて、最小エピトープを画定した。免疫反応性ペプチドを図１ｃに示し、ＡＴ２７０の最小エピトープは、ＰＰＡＰＫＴ（ｐ）Ｐ（第１７６〜１８２位）（配列番号：２）であった。【０１１７】１．５：ホスホペプチドの設計、およびリン酸化の程度の決定
このペプチドの情報を用いて、第１５４〜１８７位を網羅するホスホペプチドを合成した。この配列は、ＨＴ７（第１５９〜１６３位）およびＡＴ２７０（第１７６〜１８２位）のエピトープ、ならびにＨＴ７エピトープに対するＮ末端、およびＡＴ２７０に対するＣ末端の追加の５アミノ酸を網羅する。このホスホペプチドの正確な濃度を、アミノ酸分析を用いて決定した〔Blennow et al., 1995〕。この濃度に基づくと、ペルオキシダーゼに基づくＥＬＩＳＡの測定範囲は、精密プロファイリングを用いて５〜３００pMであった。アッセー内およびアッセー間の変動係数は、１０％未満であった。【０１１８】  どのようにリン酸化の程度がホスホタウ（１８１）および総タウの絶対レベルに関連するかを決定するために、異なる５種類のＰＨＦ−タウプレパラートを、それぞれのアッセーで同時に定量した。ＰＨＦ−タウは、Goedertら（1992）に従い、ＰＨＦ−タウを脳抽出物上清から選択的に沈降させるために１％Ｎ−ラウロイルサルコシナートを用いて、調製した。ＡＤ患者の側頭皮質（ＰＨＦ−Ａ〜Ｄ）または海馬（ＰＨＦ−Ｅ）からの組織を、Born-Bunge脳バンク（Dr. P. Cras, Antwerp、ベルギー国）から入手した。【０１１９】  図３に示したとおり、ホスホ−Thr１８１のリン酸化の程度は、ＰＨＦ−タウプレパラート間で異なった。最高のホスホタウレベルを有するＰＨＦ−タウプレパラートが、１００％に近いリン酸化の程度を有すると仮定すると、ホスホタウ（１８１）／総タウ比は、リン酸化の程度の少なくとも３．３倍の過大評価となる。にもかかわらず、ホスホタウ（１８１）／総タウの比率が、リン酸化の程度を過大評価することを斟酌すると、ＣＳＦ−タウからのタウ中のThr１８１のリン酸化の状態は、多くとも５９±１８％（1.952／3.3）であって、正常な条件下での脳由来タウについてのThr１８１のリン酸化状態〔２０〜３０％；Watanabe et al., 1993；Matsuo et al., 1994〕と密接に一致する。【０１２０】例２：アルツハイマー病、前頭側頭痴呆および／または血管性痴呆の患者でホスホタウ（１８１）を決定するアッセーにおける、標準化のためのホスホペプチドの使用
２．１：患者
研究に含めたのは、ＦＴＤの患者１８名（年齢範囲：４８〜７７歳）、ＡＤの患者６０名（年齢範囲：可能性がある６８〜８８歳、蓋然性があるのは５８〜９０歳）、皮質下動脈硬化性脳症の患者１７名（ＳＡＥ：血管性痴呆の推定される一形態）（年齢範囲：６７〜８４歳）、ＰＤの患者１５各（年齢範囲：５９〜８２歳）、および対照１７名（年齢範囲：６８〜８０歳）であった。彼らの特徴を、表２に要約する。【０１２１】  研究に含まれた患者は、すべて、ＦＴＤ、ＡＤ、ＳＡＥ、ＰＤの臨床的診断を受けさせ、痴呆またはＰＤの患者についての予測的長期研究から、連続的に補充した。臨床的診断を確定し、ＣＳＦのサンプリングを実施した。次いで、Institute of Clinical Neuroscience, Sahlgrenska University Hospital, Moelndal、スウェーデン国で神経化学的分析を実施した。精神的疾患の診断および統計マニュアル〔Association AP, 1987〕または生化学的基準に従って、特定されない痴呆（たとえば混合痴呆）、重い精神医学的疾病（たとえば精神分裂病）の病歴、慢性アルコール中毒、明確な非退行性神経学的疾病（たとえば正常圧水頭症）、重い頭部損傷の病歴、重いＣＮＳ内感染、全身性疾病（たとえば悪性腫瘍）、および痴呆の二次的原因（たとえば甲状腺機能低下症）を有する患者は、除外した。大規模な脳梗塞および／または多数の空隙を有する患者も除外した。含まれた患者は、すべて、病歴、身体的、神経学的および精神医学的検査、血液のスクリーニング検査室用試験（痴呆のその他の原因、たとえば甲状腺機能低下症を除外するのに妥当な検査室用試験）ＣＳＦの定型的分析（たとえば細胞学）、ＥＣＧ、胸部Ｘ線、ＥＥＧ、脳のコンピュータ化断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴造影（ＭＲＩ）、単一光子放射コンピュータ化断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または133キセノン吸入手法〔Cortexplorer；Risberg & Gustafson, 1983〕を用いた局所的脳血流（ＣＢＦ）の調査を包含する、臨床的調査を受けた。【０１２２】  ＦＴＤは、前記のとおり〔Sjoegren et al., 1997〕、Lund/Manchester基準〔Brun et al., 1994〕に従って診断した。ＦＴＤ患者は、いずれも、梗塞の徴候が皆無であり、数人のＦＴＤ患者に白質の軽い変化が見出されたにすぎない。【０１２３】  「蓋然的ＡＤ」の診断は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡの基準〔McKhann et al., 1984〕に従って、除外によってなされた。ＡＤ患者を、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡの基準によって定義されるとおり、蓋然ＡＤの１群、および可能ＡＤの１群に区分した。【０１２４】  ＳＡＥについての診断基準は、下記のすべてであった：（ａ）精神的劣化（主として、非狭窄−情動疾患、および前頭認識機能不全；（ｂ）歩行障害（運動失調および／または運動機能不全）；（ｃ）病巣性の神経学的徴候；（ｄ）高血圧および糖尿病のような血管性危険因子、または全身性血管病の存在；（ｅ）ＭＲＩまたはＣＴでの、二側散在性の皮質下−傍室深白質変化（＞２mm）、小窩性梗塞、拡大した心室系、および１個所を越える皮質梗塞の不在。基準は、他の研究者〔Bennett et al., 1990〕が示唆したものと矛盾しなかった。ＳＡＥ患者のうち１５名は、皮質梗塞が皆無であり；残余の４名は、１個所の皮質梗塞があった。【０１２５】  ＰＤの診断は、LangstronおよびKoller〔1991a, b〕による勧告に従ってなされた。ＰＤ患者��、すべて、運動緩慢、硬直および静止時振戦という三つの特徴のうち少なくとも二つを示し、すべてのＰＤ患者が、Ｌ−ドーパ投与に応答性であった。痴呆の何らかの徴候を示したＰＤ患者は、皆無であり、すべて、２７以上のミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）〔Folstein et al., 1975〕の評点を有した。【０１２６】  臨床診断は、すべて、生化学的分析の結果を知らない内科医が実施し、その逆もなされた。患者のうち、その時点で痴呆を（たとえばコリンエステラーゼ阻害剤によって）治療していたものは皆無であった。【０１２７】  痴呆を有する患者では、ＭＭＳＥ〔Folstein et al., 1997〕を用いて、痴呆の程度を評価した。【０１２８】  正常な対照、およびＰＤの患者は、潜在的マーカーの感度および特異性の分析に含めた。【０１２９】  対照群は、精神医学的または神経学的疾患、悪性疾患または全身性障害（たとえばリウマチ様関節炎、伝染病）の病歴、症状もしくは徴候のない個体からなった。ＭＭＳＥを用いて、その認識状態を評価し、２８未満の評点のものは、除外した。【０１３０】  Goeteborg、Lund/MalmoeおよびLinkoeping大学（スウェーデン国）の倫理委員会が、研究を承認した。患者（またはその最近縁の親類）および対照は、すべて、ヘルシンキ宣言の条項に従って実施される研究に参加するための、告知された同意を与えた。【０１３１】２．２：ＣＳＦ分析
すべての患者および対照に対して、腰椎穿刺をＬ３／Ｌ４またはＬ４／Ｌ５間空で実施した。最初のＣＳＦ１２mlを、ポリプロピレン管に捕集し、静かに混合して、勾配効果〔Blennow et al., 1993〕を回避した。同時に、血清サンプルを採取した。１μlあたり５００を越える赤血球を有するＣＳＦは、すべて、排除した。ＣＳＦおよび血清サンプルを、２，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、細胞その他の不溶性物質を除去した。次いで、アリコートを、生化学分析まで−８０℃で貯蔵した。【０１３２】  血清およびＣＳＦアルブミンの定量的決定を、比濁分析によって、Behring Nephelometer Analyzer（Behringwerke AG, Marburg、ドイツ国）を用いて実施した。ＣＳＦ／血清アルブミン比〔Tibbling et al., 1977〕を、〔ＣＳＦアルブミン（mg/L）／血清アルブミン（g/L）〕として算出し、血液脳関門（ＢＢＢ）機能の尺度として用いた。【０１３３】  ＣＳＦ−タウを、以前に詳述した〔Vandermeeren, et al., 1993b；Blennow et al., 1995〕とおり、総タウ（正常タウおよびＰＨＦ−タウの双方）を測定するよう構成した、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（INNOTEST hTau-Ag：Innogenetics, Gent、ベルギー国）を用いて決定した。【０１３４】  ホスホタウ（１８１）のレベルを、上記のとおり、INNOTESTホスホタウ（１８１Ｐ）によって決定した。【０１３５】２．３：統計的解析
すべての変数は、正規分布し、そのため、影響変数（ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−ホスホタウ）に関する群比較には、パラメトリック統計学を用いた。完全要因多重分散分析を、それぞれ、従属変数としてＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−ホスホタウを、共変量として年齢、持続期間、および痴呆の重篤度を、因子として診断カテゴリー（蓋然および可能ＡＤ、ＦＴＤ、ＰＤ、ＳＡＥ、および正常な加齢）を用いて実施した。変動に寄与しない因子は、解析から除外し、再演算を実施した。事後比較は、不等ｎについてのターキーの事後検定を用いて実施した。【０１３６】  平均年齢は、可能ＡＤと比較したＰＤ（ｐ＜０．００１）および蓋然ＡＤ（ｐ＜０．０５）で有意に低かった。蓋然ＡＤの患者は、可能ＡＤの患者より有意に痴呆性であった（ｐ＜０．０５）。ＣＳＦ／血清アルブミン比（痴呆群についてのみ）および性別に関しては、いかなる患者群または対照群間にも差が見出されなかった（表２）。【０１３７】２．４：痴呆、パーキンソン病、および正常な加齢におけるＣＳＦ−総タウおよびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）
ＣＳＦ−タウは、蓋然ＡＤおよび可能ＡＤで、ＦＴＤ（ｐ＜０．００１）、ＰＤ（ｐ＜０．００１）、ＳＡＥ（ｐ＜０．００１）および対照（ｐ＜０．００１）と比較して、またＦＴＤで、ＳＡＥ（ｐ＜０．０１）と比較して有意に増加した（表３；図４）。【０１３８】  ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）は、蓋然ＡＤで、ＦＴＤ（ｐ＜０．００１）、ＰＤ（ｐ＜０．００１）、ＳＡＥ（ｐ＜０．００１）および対照（ｐ＜０．００７９）と比較して、また可能ＡＤで、ＦＴＤ（ｐ＜０．００１）およびＳＡＥ（ｐ＜０．００１）と比較して有意に増加したが、対照と比較して増加しなかった。さらに、ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）は、対照と比較して、ＦＴＤ（ｐ＜０．０００１）およびＳＡＥ（ｐ＜０．０００１）でも有意に減少した（表３；図５）。【０１３９】  ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）を、それぞれ、すべての診断群で相関させた（蓋然および可能ＡＤ：ｒ＝０．８６、ｐ＜０．００１；ＦＴＤ：ｒ＝０．６６、ｐ＜０．０１；ＳＡＥ：ｒ＝０．５８、ｐ＜０．０５；ＰＤ：ｒ＝０．６２、ｐ＜０．０５；対照：ｒ＝０．６５、ｐ＜０．０１；図６）。【０１４０】  ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）／ＣＳＦ−総タウ比を算出し、蓋然ＡＤ（ｐ＜０．００１；１．１６±０．２４）、可能ＡＤ（ｐ＜０．００１；１．１０±０．２０）およびＦＴＤ（ｐ＜０．００１；０．８８±０．３４）で、対照（全３群についてｐ＜０．００１；１．９５±０．６０）、ＰＤ（全３群についてｐ＜０．００１；１．９２±０．４２）およびＳＡＥ（全３群についてｐ＜０．００１；１．９６±１．０８）と比較して、有意に減少していることが見出された。【０１４１】例３：急性虚血性卒中の患者と比較してのアルツハイマー病の患者におけるＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）およびＣＳＦ−総タウレベルの決定
３．１：患者
ＣＳＦ−総タウおよびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）を、急性虚血性の患者２２名（男子１６名、女子６名、平均年齢±ＳＤ：６５．７±９．２歳）からの長期的ＣＳＦサンプルで検査した。患者は、すべて、以前に記載されたとおり〔Tarkowski et al., 1999〕、標準化された方法で評価した。可能なときは、ＣＳＦサンプルを、５回の機会に捕集した：入来から０〜１日（ｎ＝９）、２〜３日（ｎ＝１８）、７〜９日（ｎ＝２２）、３週（ｎ＝２１）、および３〜５ヶ月（ｎ＝２１）。【０１４２】  また、蓋然ＡＤの患者５４名（男子２５名、女子２９名、平均年齢±ＳＤ：７３．３±７．４歳）、および健康な対照１７名（男子４名、女子１３名、平均年齢±ＳＤ：６８．６±７．５歳）を調べた。平均年齢は、対照群よりＡＤで有意に（ｐ＜０．０５）に高かった。「蓋然ＡＤ」の診断は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡの基準〔McKhann et al., 1984〕に従って、除外によって下した。臨床的評価および診断手順は、別途詳述されている〔Andreasen et al., 1998, 1999〕。痴呆の程度は、ＭＭＳＥ〔Folstein, 1975〕を用いて評価し、ＡＤ群で２３．８±４．４であった。対照群は、精神医学的または神経学的疾患、悪性疾患または全身性障害の病歴、症状もしくは徴候のない個体からなった。２８未満のＭＭＳＥ評点の個体は、除外した。臨床診断は、すべて、生化学的分析の結果を知らずに実施され、その逆もなされた。【０１４３】  卒中の患者を、発作の約１ヶ月後に、以前に詳述されたとおり〔Tarkowski et al., 1999〕、コンピュータ化断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴造影（ＭＲＩ）によって検査した。大きさ（cm2で表す）をＣＴによって、また体積（mlで表す）をＭＲＴによって決定した。【０１４４】  ３またはそれ以上の群間の比較には、Kruskal-Wallis試験を、また有意ならば、２群間の比較にMann-WhitneyのＵ検定を用いた。補正には、Spearman相関係数を用いた。【０１４５】  GoeteborgおよびUmea大学の倫理委員会が、研究を承認した。患者（またはその最近縁の親類）および対照は、すべて、ヘルシンキ宣言の条項に従って実施される研究に参加するための、告知された同意を与えた。【０１４６】３．２：ＣＳＦ分析
腰椎穿刺をＬ３／Ｌ４またはＬ４／Ｌ５間空で実施した。最初のＣＳＦ１２mlを、ポリプロピレン管に捕集し、静かに混合して、場合による勾配効果を回避した〔Blennow, 1993〕。１μlあたり５００を越える赤血球を有する、ＣＳＦサンプルを排除した。ＣＳＦサンプルを、２，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、細胞その他の不溶性物質を除去し、次いで、生化学分析まで−８０℃で貯蔵した。【０１４７】  ＣＳＦ−タウのレベルを、以前に詳述した〔Vandermeeren, et al., 1993b；Blennow et al., 1995〕とおり、総タウ（正常タウおよびＰＨＦ−タウの双方）を測定するよう構成した、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（INNOTEST hTau-Ag：Innogenetics, Gent、ベルギー国）を用いて決定した。ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）のレベルを、上記のとおり、INNOTESTホスホタウ（１８１Ｐ）によって決定した。【０１４８】３．３：アルツハイマー病の患者、および卒中の患者におけるＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）およびＣＳＦ−総タウ
卒中患者では、ＣＳＦ−総タウは、急性発作の２〜３日後に（２４．４±７．４pM；ｐ＝０．００２）、０〜１日（平均年齢±ＳＤ：５．４±１．２pM）と比較して顕著な増加を示し、７〜９日（２４．１±４．３pM；ｐ＜０．０００１）、および３週間後（２５．０±４．１pM；ｐ＜０．０００１）には上昇したままであり、次いで、３〜５ヶ月後（８．５±１．２pM；ｐ＝０．３５）に正常レベルに復帰した（図８）。基線で採取したＣＳＦサンプルによる患者９名についての、ＣＳＦ−総タウについての個々の値を図９に示す。【０１４９】  対照的に、ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）では、基線（平均±ＳＥＭ：９．１±３．１pM）と、２〜３日（１０．９±１．０pM）、７〜９日（１３．０±２．１pM）、３週間（１１．５±２．０pM）または３〜５ヶ月（１０．６±２．０pM）との間に有意差はなかった（図８）。基線で採取したＣＳＦサンプルによる患者９名についての、ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）についての個々の値を図９に示す。【０１５０】  ＣＳＦ−総タウは、蓋然ＡＤ（平均±ＳＤ：１４．４±５．５pM）では、対照（８．３±２．８pM）（ｐ＜０．０００１）と比較して有意に増加した。ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）も、蓋然ＡＤ（２０．５±６．５pM）では、対照（１５．９±５．７pM）（ｐ＜０．０５）と比較して有意に増加した。【０１５１】  ＣＳＦ−総タウおよびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）には、ＡＤ群（ｒ＝０．９３、ｐ＜０．０００１）および対照群（ｒ＝０．７２、ｐ＜０．０１）で正の相関関係がある（図１０）。卒中群では、この相関関係は、０〜１日（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１）および３ヶ月後（ｒ＝０．８０）の方が、２〜３日（ｒ＝０．５４）、７〜９日（ｒ＝０．５８）、特に３週間後（ｒ＝０．１５）より強かった。【０１５２】  図１０から、アルツハイマー病患者についてのＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）／ＣＳＦ−総タウの比率の間には、卒中患者と比較して差があることは、明らかである。アルツハイマー病患者（ｙ＝０．８２±４．３９、ｒ＝０．９０、ｐ＜０．０００１）、および卒中患者（ｙ＝０．１７±８．０９、ｒ＝０．４１５、ｐ＜０．０００１）から得られた値についての回帰分析は、有意な差（ｐ＜０．００１）を示した。【０１５３】  ＣＴによって測定した限りでの梗塞の大きさと、ＣＳＦ−総タウの最高レベルとの間には、正の相関関係があった（ｒ＝０．７２；ｐ＜０．０１）が、ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）との相関は、有意ではなかった（ｒ＝０．３４９）。ＭＲＩによって測定した限りでの梗塞の体積と、ＣＳＦ−総タウの最大値と間にも、正の相関関係があった（ｒ＝０．６６；ｐ＜０．０５）が、ＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）との相関関係は、有意ではなかった（ｒ＝０．５９）。【０１５４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  重複する合成ペプチド上のタウ抗体、ＨＴ７、タウ１、ＢＴ２、ＡＴ１２０およびＡＴ２７０の精密マッピングを示す図である。免疫反応性ペプチドのみを示す。Ａ：ピン上で合成されたペプチド上のマッピング。８アミノ酸が重複する４８のノナペプチドを用いて、１５５〜２０８のタウ領域を網羅した。Ｂ：紙上でのペプチド合成。１２アミノ酸長の重複する１６ペプチドが、領域２０２〜２３２のＡＴ１２０エピトープを画定する。Ｃ：領域１６６〜１９６を網羅するビオチニル化ホスホペプチド（リン酸化されたトレオニンを示す）上のＡＴ２７０抗体のマッピング。
【図２】  合成ホスホペプチドのスクリーニングによって画定された限りでの、ホスホ−Thr１８１に対するＡＴ２７０の特異性を示すグラフである。１μg/mlの濃度のストレプトアビジンで被覆したプレート上に、ビオチニル化ホスホペプチドを捕捉した。ＡＴ２７０は、ペルオキシダーゼとカップリングさせた二次抗体を介して検出した。ペプチドの配列を、表１に示す。
【図３】  ＨＴ７−ＡＴ２７０アッセーによって決定したホスホタウレベルと、総タウレベル（ＡＴ２７０−（ＨＴ７−ＢＴ２）アッセイ）との関係を示すグラフである。いくつかのＰＨＦ−タウプレパラートを異なる希釈で検定した。数字は、ＰＨＦ−夕ウプレパラートの約０．５のＯＤ450に相当する希釈からの、異なる２枚のプレート上で二重に検定したとおりの生のデータを示す。グラフ上の棒は、標準偏差である。ＰＨＦ−Ａ〜Ｄは、アルツハイマー病の脳の前頭側頭皮質に由来し、ＰＨＦ−Ｅは、海馬領域から調製した。
【図４】  前頭側頭痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病および皮質下動脈硬化性脳症におけるＣＳＦ−総タウの散乱プロットを示すグラフである。
【図５】  前頭側頭痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病および皮質下動脈硬化性脳症におけるＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）の散乱プロットを示すグラフである。
【図６】  ＣＳＦ−総タウとＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）との、研究でのすべての個体を包含する相関関係のプロットを示すグラフである。
【図７】  前頭側頭痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病および皮質下動脈硬化性脳症の患者からのＣＳＦ中のホスホタウ（１８１）／総タウ比の散乱プロットを示すグラフである。
【図８】  急性卒中後の異なる時点でのＣＳＦ−総タウ（左）およびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）（右）を示すグラフである。柱は平均値であり、棒はＳＤである。異なる時点でのサンプル数：０〜１日：ｎ＝９、２〜３日：ｎ＝１８、７〜９日：ｎ＝２２、３週：ｎ＝２１、３〜５月：ｎ＝２１。０〜１日と比較した有意度；ＣＳＦ−タウについては、２〜３日：ｐ＝０．００２、７〜９日：ｐ＜０．０００１、３週：ｐ＜０．０００１、３〜５月：ｐ＝０．０３５、ＣＳＦ−ホスホタウについては、０〜１日と比較していかなる時点でも有意差はなかった。
【図９】  １日目にＣＳＦサンプルを採取した患者９名についての、異なる時点でのＣＳＦ−総タウ（左）およびＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）（右）の個々の値を示すグラフである。
【図１０】  アルツハイマー病の患者（ｎ＝５４）、および対照（ｎ＝１７）（左）、ならびに急性卒中の患者（ｎ＝２２、サンプル数＝９１）（右）におけるＣＳＦ−総タウとＣＳＦ−ホスホタウ（１８１）との相関関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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