(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、
前記凹凸パターンの２段以上の凹凸により形成される凹部が、幅２μｍ〜３，０００μｍの範囲であり、
前記２段以上の凹凸が階段状であり、
前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通する細胞培養容器。
【請求項２】
前記２段以上の凹凸は、第１の凸部と、前記第１の凸部の上に設けられ、前記第１の凸部より小さい第２の凸部とによって階段状に形成され、
前記第２の凸部が、幅１μｍ〜２，０００μｍ、高さ１μｍ〜２，０００μｍの範囲であり、前記第２の凸部の高さを前記第２の凸部の幅の１倍〜２０倍とすることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記２段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記凹凸により形成される凹部の底部に幅が１〜２０００μｍの大きさの凹みを複数有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記凹みの高さが０．１μｍ〜５０μｍであることを特徴とする請求項４記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記凹凸により形成される凹部の高さが１μｍ〜２００μｍであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項１乃至６いずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
容器素材が透明材料であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
凹凸パターンを有し、前記凹凸パターンの２段以上の凹凸により形成される凹部を有し、前記２段以上の凹凸が階段状であり、前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通する細胞培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞培養容器として、前記凹部の大きさが培養する細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍である容器を選択し、
選択した前記細胞培養容器に設けられた前記凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養する細胞培養方法。
【請求項１０】
前記細胞培養容器として、前記凹部の底部の大きさが培養する細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍である容器を選択することを特徴とする請求項９記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に大別される。アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことを意味する。生体内では、癌化した細胞（そのほか内部に異常を起こした細胞）のほとんどは、アポトーシスによって取り除かれ続けており、これにより、ほとんどの腫瘍の成長は未然に防がれていることが知られている。また、生物の発生過程では、あらかじめ決まった時期、決まった場所で細胞死が起こり（プログラムされた細胞死）、これが生物の形態変化などの原動力として働いているが、この細胞死もアポトーシスの仕組みによって起こる。例えば、オタマジャクシからカエルに変態する際に尻尾がなくなるのはアポトーシスによる。線虫では発生において起こるアポトーシスが全て記載されている。さらに免疫系でも自己抗原に反応する細胞の除去など重要な役割を果たすことが知られている。【０００３】
これに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死は、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）または壊死（えし）と呼ばれ、これと区別される。Ａｐｏｐｔｏｓｉｓの語源はギリシャ語の「ａｐｏ−（離れて）」と「ｐｔｏｓｉｓ（下降）」に由来し、「（枯れ葉などが木から）落ちる」という意味である。【０００４】
壊死（えし）は、生物の組織の一部分が死ぬことである。通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の組織が再生したり線維化したりすることで補われる。【０００５】
このような細胞を検査、試験するためには、通常、組織から単離した細胞を培養する必要がある。組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管の中で培養が行われている。この培養系の中で種々の検査が行われる。【０００６】
これらのアッセイは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果をみるものである。そのため培養に用いる培養容器も一定の均一に形成されたものが用いられる。この培養容器は、培養皿（細胞培養ディッシュ）というものが一般的に用いられる。培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または６ウェルプレート、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートがある（特許文献１）。最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状である。【０００７】
このように、現在、メディカル、バイオテクノロジー分野などで、培養試験、組織培養を目的に使用されている細胞培養ディッシュ（シャーレ）、プレートなどは、その底面の平板部分を培養面として使用されている。【０００８】
しかしながら、組織細胞の培養は、底部が平板状の培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形状となり、生体内で本来観られる形状や機能を示さなくなってしまう問題を有していた。例えば、平板状の培養皿や培養容器で脂肪細胞前駆細胞を培養し、分化誘導を行っても目的の脂肪細胞の形状に分化しないという問題を有していた。また、肝細胞ではスフェロイド状の細胞塊を形成しないという問題を有していた。【０００９】
従って平板状では、目的とする効率の良い細胞増殖や細胞分化が困難なため、平板状表面にサイトカインや細胞外マトリックスを固定化する方法、特殊な装置を使用する方法が試みられている（特許文献２、特許文献３）。【００１０】
しかしながら、平板状表面に細胞増殖因子や細胞外マトリックスを固定化する方法では、初期のみ効率化が上がるが、それを維持できないことや、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、さらにコストが掛かる問題がある。また、特殊な装置を使用する方法は細胞種により結果が異なり、安定した効率化が見込めないことや、大掛かりな装置を使用するため操作性が悪いこと、さらにコストが掛かる等の問題がある。【００１１】
また、細胞培養ディッシュ（シャーレ）、プレートを用いた培養試験や組織培養において、培養細胞から排出される炭酸ガスなどによるＰＨ変化は、培養細胞の活性に大きな影響を及ぼすことが知られている。このため、長期間培養においては、研究者が定期的（例えば２日ごとに）培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。更に最新の研究例では、常に新鮮な培養液を循環可能なバイオリアクターを作製し、新規な人工臓器代替モデルが提案されている。【００１２】
しかしながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織のネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）や、皮膚、消化管の粘膜上皮のような再生可能な組織の細胞死を抑制するための因子は明らかにされておらず、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。【００１３】
特に、培養が難しいとされる培養種である、ラットの心筋細胞、神経細胞、角膜細胞などは、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に分散（配置）した細胞数に対する生存率は２０〜４０％であるのが現状である。【００１４】
近年、シリコンを材料とした半導体加工技術や、フォトリソグラフ法によるＮｉ製スタンパー（原盤）を用いた成形技術の発達によって、ミリからマイクロ、更にはナノレベルの微細化が試みられている。しかしながら、これらの微細加工技術によって製造された細胞培養多ウェルプレートなどは、サンプルの微量化、集積化が可能になるものの、培養が難しいとされる細胞種に対する提案はされていない。
【特許文献１】特開平８−３２２５９３号公報
【特許文献２】特開２００３−１８９８４３公報
【特許文献３】特開２００５−１４３３４３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、従来の細胞培養容器では、細胞が薄く伸びた形状をとり，生体内で本来発現する形状や機能を示さなくなってしまい、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることが困難であるという問題があった。さらに、培養が困難な細胞種があるという問題点があった。
本発明が解決しようとする課題は、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様にかかる細胞培養容器は、凹凸パターンを有する細胞培養容器であって、前記凹凸パターンの凹凸により形成される凹部の大きさが培養細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍であるものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００１７】
本発明の第２の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹部が２段以上の凹凸により形成されることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００１８】
本発明の第３の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸により形成される凹部の底部の大きさが培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍であるものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００１９】
本発明の第４の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、少なくとも１つ以上の隣接する他の凹部と互いに連通することを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２０】
本発明の第５の態様にかかる細胞培養容器トは、上記の細胞培養容器において、前記２段以上の凹凸により形成される凹部の最下段の高さが１μｍ〜１００μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２１】
本発明の第６の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸により形成される凹部の底部に培養細胞の相当直径の０．００１〜０．９倍の大きさの凹みを複数有することを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２２】
本発明の第７の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹みの高さが０．１μｍ〜５０μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２３】
本発明の第８の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸により形成される凹部の高さが１μｍ〜２００μｍであることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２４】
本発明の第９の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、前記凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とするものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。【００２５】
本発明の第１０の態様にかかる細胞培養容器は、上記の細胞培養容器において、容器素材が透明材料であることを特徴とするものである。これにより、観察を容易に行うことができる。【００２６】
本発明の第１１の態様にかかる細胞の培養方法は、上記の細胞培養容器において、細胞培養容器に設けられた凹部に、細胞を注入して、前記細胞を培養するものである。これにより、効率よく、生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、効率よく，生体内で本来発現する形状や機能を示す細胞を効率よく増殖または／および分化させることができる細胞培養容器及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。
【図２】本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の構成を示す断面図である。
【図３】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。
【図４】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を拡大して示す平面図である。
【図５】本発明の実施の形態２にかかる細胞培養容器の構成を断面図である。
【図６】本発明の実施例１にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。
【図７】本発明の実施例２にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。
【図８】本発明の実施例３にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。
【図９】本発明の実施例４にかかる細胞培養容器の構成を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００２９】
１０  細胞培養容器、１１  第１の凸部、１２  第２の凸部、１３  凸部、１４  凹部、
１５  第１の凸部の側壁、１６  第２の凸部の側壁、１７  凹み
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
組織細胞の培養を現在、市販されている細胞培養皿（シャーレ、またはウェルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形状となる。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。【００３１】
そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。さらなる課題は、その細胞を効率良く増殖および／または分化させることである。【００３２】
本発明に係る細胞培養容器を用いた培養方法によると、微細凹凸パターンを設けることにより、生体内と同様な立体的な生育が可能であることに加え、微細凹凸により形成された立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子および／または分化誘導因子等の生理活性化物質を生体内と類似した濃度で培養できるため、生体内の細胞周囲の環境を模倣することが可能である。微細凹凸パターンは、例えば、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間が連通した連結構造を形成することにより、実現可能である。側壁を複数有することで、複数の空間を作製し、要求される用途に応じて空間の大きさを設定する。【００３３】
培養する細胞種に応じ、側壁、空間、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において適用可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間（凹部）同士が、連通するための構造を開口部とする。【００３４】
側壁によって形成される空間の寸法は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、空間が小さすぎると、その空間に細胞が入ることができなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。【００３５】
本発明者らは、鋭意研究した結果、特定のマイクロパターン形状において、細胞が産生する物質を拡散防止することによって、培養細胞の生存率を飛躍的に向上可能であることを見出し、本発明に至った。【００３６】
細胞は、その培養過程において、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチンといった物質を産生している。炭酸ガスの排出によるＰＨ変化は培養細胞において、その活性低下の要因になる反面、これらの産生物質は基質材料に使用されるなど、細胞の基質表面の接着、および分化・増殖に欠かすことのできない材料でもある。【００３７】
本発明者らは、細胞培養容器に複数のマイクロパターンを形成し、そのパターンの側壁下部で細胞を培養することにより、細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることに成功した。【００３８】
細胞の産生物質の拡散を防止し、細胞の生存率を高めることが目的であり、更に将来には、細胞培養株の生産性を高めることが期待される。したがって、本発明におけるマイクロパターンは、培養面積内における側壁下部の長さをいかに確保するかが課題となる。【００３９】
側壁間の下部の幅は、単一細胞の最小サイズが４〜５μｍであることから、例えば、２μｍ以上であることが望ましい。【００４０】
側壁の幅は、培養面積内における側壁下部の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、１μｍ以上とすることが望ましい。【００４１】
側壁の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、１μｍ以上であることが望ましい。【００４２】
各段の凸部の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ／幅の比は、１／１〜２０／１のなかから選択することが望ましい。【００４３】
さらに、本発明にかかる細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクターなどに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出によるＰＨ変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。【００４４】
以下に、本発明の実施の形態にかかる細胞培養容器について図を参照して説明する。【００４５】
発明の実施の形態１．
以下、本発明の実施の形態１にかかる細胞培養容器の具体的な形状について図１及び図２を用いて説明する。図１は、本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成の一例を示す平面図であり、図２は図１のＡ−Ａ'断面図である。もちろん、図１及び図２に示す構成は、本発明にかかる細胞培養容器の一例であり、図示した構成に限定されるものではない。【００４６】
細胞培養容器には、凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは２段の階段状に形成されている。従って、細胞培養容器の培養面には、２段の凸部１３が形成される。すなわち、格子状に形成された第１の凸部１１の上に直方体状の第２の凸部１２がマトリクス状に形成されている。この第１の凸部１１及び第２の凸部１２によって形成される空間が凹部１４となる。すなわち、隣接する第１の凸部１１の間の空間及び第２の凸部の間の空間が凹部１４になる。第１の凸部１１の側壁１５と隣接する第１の凸部１１の側壁との間及び第２の凸部１２の側壁１６と隣接する第２の凸部１２の側壁１６との間の空間により、細胞を培養するための凹部１４が形成される。第１の凸部１１の側壁１５及び第２の凸部１２の側壁１６は底面に対して略垂直に形成されている。従って、凹部１４は２段の凹凸を有する階段状となる。【００４７】
第１の凸部１１は、図１に示すように矩形状の凹部１４の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の凸部１２は、隣接する凹部１４の間の第１の凸部１１の上に島状に配置されている。第２の凸部１２は、矩形状の凹部１４の四辺のそれぞれに対して設けられている。なお、凹部１４の形状は矩形状に限らず、多角形状、円形状、楕円形状又はこれらの複合形状等であってもよい。【００４８】
なお、凹凸パターンを２段以上とし、凹部１４を２段以上の凹凸から形成することが好ましい。すなわち、凹部１４を２段以上の階段状としてもよい。もちろん、凹部１４は１段であってもよく、３段以上であってもよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。【００４９】
凹凸パターンの凹凸により形成される凹部１４の大きさ（幅、奥行き）は培養細胞の相当直径の１．０倍〜４０倍であることが好ましい。すなわち、隣接する凸部１３の間の間隔が培養細胞の相当直径の１．０〜４０倍であること好ましい。換言すると、凹部１４の幅が培養細胞の相当直径の１．０〜４０倍であることが好ましい。また、隣接する第１の凸部１１の側壁１５間の幅は、単一細胞の最小サイズが４〜５μｍであることから、例えば、２μｍ以上であることが望ましい。さらに、凹部１４の底部の大きさ（幅、奥行き）を培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍とすることが好ましい。すなわち、第１の凸部１１で形成される空間の幅を培養細胞の相当直径の１．５倍〜１０倍とすることが好ましい。換言すると、隣接する第１の凸部１１で形成される間の間隔を培養細胞の相当直径の１．５〜１０倍とすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。【００５０】
また、２段の凹部１４は、少なくとも１つ以上の隣接する２段の凹部１４と互いに連通することが好ましい。ここでは、第１の凸部１１の上側で隣接する２段の凹部１４が連通している。すなわち、隣接する第２の凸部１２の側壁１６間の空間で隣接する２段の凹部１４とを連通させている。具体的には、第１の凸部１１を格子状に設けて、その上に島状の第２の凸部１２を点在させる。これにより、第２の凸部１２によって空間が完全に隔てられることがなくなるため、第１の凸部１１の上の空間によって隣接する２段の凹部１４が連通する。また、凹部１４を２段以上とした場合、１段以上で形成される空間が、少なくとも隣接する凹部１４で互いに連通していることが好ましい。すなわち、２段以上の凹凸のうち少なくとも１段以上で形成される凹部が、隣接する他の凹部と互いに連通することが好ましい。この場合、最も上側の凸部を下側の凸部の上に島状に形成することによって、凹部１４を連通させることができる。凹部１４を形成する少なくとも１段の高さで、隣接する凹部１４が連通する。このように、凹凸パターンに開口部を設け、凹部を互いに連通させることが好ましい。もちろん、凹部は、１つ以上の他の凹部と連通していればよい。これにより、培養に好適な形状とすることができる。【００５１】
また、凹部１４の高さを１〜２００μｍとすることが好ましい。すなわち、第１の凸部１１の高さと第２の凸部１２の高さの和を１〜２００μｍとすることが好ましい。これにより、培養に好適な大きさとすることができる。【００５２】
また、第１の凸部１１の高さを１〜１００μｍとすることが好ましい。すなわち、階段状の凹部１４の最下段の高さを１〜１００μｍとすることが好ましい。これにより、凹部１４の底部の高さが１〜１００μｍとなり、培養に好適な大きさとすることができる。【００５３】
凸部１３の幅は、培養面積内における側壁の長さを確保するために、できるだけ狭いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、例えば、１μｍ以上とすることが望ましい。具体的には、第２の凸部１２の幅を１μｍ以上とする。換言すると、第２の凸部１２を構成する２つの側壁１６間の間隔を１μｍ以上とする。また、第１の凸部１１の幅は、第２の凸部１２以上であればよい。すなわち、第２の凸部１２が第１の凸部１１の上で、第１の凸部１１よりもはみ出ていなければよい。【００５４】
凹部１４の高さは、産生物質の拡散を抑制する観点から、例えば、１μｍ以上であることが望ましい。すなわち、第１の凸部１１と第２の凸部１２のの高さの和が１μｍ以上であることが好ましい。さらに、凹部１４の高さを２００μｍ以下とすることが好ましい。【００５５】
第２の凸部１２の幅と高さの比は、産生物質の拡散を防止する目的で、できるだけ高いことが望ましいが、工業技術的に再現可能な観点から、高さ／幅の比は、１／１〜２０／１のなかから選択することが望ましい。すなわち、第２の凸部１２の高さが第２の凸部１２の幅の１〜２０倍とすることが望ましい。さらに、第１の凸部の高さ／幅も１／１〜２０／１とすることが好ましい。これにより、精度よく細胞培養容器を生産することができる。【００５６】
さらに凹凸パターンが設けられた領域に表面処理を行うことが好ましい。すなわち、凸部１３の上面及び側面、並びに、隣接する凸部１３の間の底面に表面処理を行うことが好ましい。表面処理としては、例えば、有機材料または無機材料のコーティング処理を行うことができる。有機材料または無機材料は目的によって適宜公知の材料を選択すればよい。また、紫外線、電子線などの活性エネルギー線で処理したり、その他薬品により直接表面を改質しても良い。【００５７】
細胞培養容器上の凹凸パターンは、シリコンを材料とした半導体加工技術や、フォトリソグラフ法によるＮｉ製スタンパー（原盤）を用いた成形技術によって形成することができる。例えば、シリコンを材料とした半導体加工技術の場合、シリコン基板上にレジストを塗布し、レジストを露光、現像してレジストをパターニングする。このレジストの上からシリコンをエッチングすることによって、シリコン基板がパターニングされ、凹凸パターンが形成される。そして、レジストを剥離することにより、所望の凹凸パターンを有するシリコン製細胞培養容器が完成する。もちろん、細胞培養容器用の基板はシリコン基板に限らず、ガラス基板や樹脂基板であってもよい。このように半導体加工技術を用いることによって、精度よく凹凸パターンを形成することができる。【００５８】
また、Ｎｉスタンパを用いた成形技術の場合、まず、基板上に第１のレジスト層を塗布、露光し、さらにその上から第２のレジスト層を塗布、露光する。この第１のレジスト層及び第２のレジストを一括原像することによって基板上に凹凸パターンを形成することができる。そして、この凹凸パターンが形成された基板に導電性膜を蒸着法やスパッタリング法によって付着する。そして、導電性薄膜の上から金属をメッキにより堆積して金属構造体を形成する。金属構造体を基板から剥離することによってスタンパを形成することができる。このスタンパを用いて成形することによって、高精度の細胞培養溶液を高い生産性で製造することができる。この場合、細胞培養容器は、例えば、樹脂材料により形成される。もちろん、金属構造体を作成するための構造体をシリコン基板やガラス基板などによって形成してもよい。さらに、細胞培養容器の製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。具体的には、機械切削や、ガラスへのエッチング処理法などにより、細胞培養容器１０を製造してもよい。これによって、大面積・細胞培養株製造も可能となる。また、細胞培養容器の素材をガラスや樹脂などの透明材料とすることによって、細胞の観察を容易に行うことができる。【００５９】
上記の構造を有する細胞培養容器１０によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および／または分化させることができる。さらに、培養細胞の生存率を向上することができる。すなわち、凹部１４に細胞を注入して、培養液を供給することによって、効率よく、細胞を培養することができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。【００６０】
また、微細凹凸パターンにより形成された空間内で細胞培養を行うことで，生体内で本来発現する立体形状を示すことができ、微細凹凸の立体的区画により細胞自身が産生する細胞増殖因子や分化誘導因子等の生理活性物質の細胞周囲濃度が向上する。このため，効率よく増殖および／または分化させる細胞培養容器を提供することができ。さらに透明樹脂素材で作製することで安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。【００６１】
また、凹凸パターンを２段とする細胞培養容器は、人工臓器の代替となるバイオリアクターなどに対しても有効である。基板を重ね合わせることで、培養液を還流する空間を形成する際、培養細胞の産生物質の拡散を防止するための側壁よりも高い橋梁を、側壁と直行するように設け、培養液を側壁と直行する向きに流すことで、培養細胞からの炭酸ガスの放出によるＰＨ変化を防止し、かつ培養細胞の産生物質の拡散が可能となる。【００６２】
なお、本実施の形態では、第１の凸部１１の上に第２の凸部１２が設けられている構成について説明したが、本発明はこれに限るものではない。例えば、第１の凸部１１の上に第２の凸部１２が設けられていない構成でもよい。すなわち、高さの異なる第１の凸部と第２の凸部とが、それぞれ異なる位置に設けられていてもよい。この場合、２段以上の階段状の凸部ではなく、高さの異なる２種類以上の凸部が設けられている構成となる。【００６３】
発明の実施の形態２．
本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図３、図４及び図５を用いて説明する。図３は、本実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図４は、図３に示された点線内の構成を拡大して示す平面図である。図５は、図４のＢ−Ｂ'断面図である。なお、実施の形態１で説明した構成と同様の構成については、説明を省略する。【００６４】
本実施の形態にかかる細胞培養容器１０は実施の形態１と同様の凹凸パターンが形成されている。従って、第１の凸部１１及び第２の凸部１２の形状、寸法については、実施の形態１と同様であるため説明を省略する。さらに、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０には、実施の形態１で説明した構成に加え、凹部１４の底面に凹み１７が形成されている。すなわち、隣接する第１の凸部１１の間において、底面に凹み１７が設けられている。凹み１７は隣接する第１の凸部１１の間において、複数設けられている。従って、第１の凸部１１の側壁１５の近傍において、細胞培養容器１０の断面形状は、３段の階段状となる。凹み１７は凹部１４の底面にマトリクス状に配置されている。【００６５】
このように、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０では、細胞培養容器１０の凹部１４の底面に複数の微細な凹み１７が形成されている。凹み１７の幅は、培養細胞の相当直径以下とすることが好ましい。さらに、凹み１７の幅を、培養細胞の相当直径の０．００１〜０．９倍とすることが好ましい。また、凹み１７の深さは、０．１μｍ〜５０μｍであることが好ましい。すなわち、凹み１７によって形成される空間の大きさを培養細胞の相当直径の０．００１倍以上０．９倍以下とし、空間の高さを０．１〜５０μｍとすることが好ましい。【００６６】
また、凹凸パターンを２段あるいは３段以上としてもよい。凹凸パターンを２段構成とする場合、凹部１４を設けるための第１の凸部１１を形成する。そして、第１の凸部１１によって形成された凹部１４の底面に複数の凹み１７が配設される。【００６７】
第１の凸部１１及び第２の凸部１２は、実施の形態１と同様の形状とすることができる。すなわち、凹部１４及び凸部１３の寸法は、実施の形態１で示した範囲とすることが好ましい。凹凸パターンが設けられている領域に表面処理を行ってもよい。また、本実施の形態にかかる細胞培養容器１０は、実施の形態１で示した製造方法と同様の方法により、製造することができる。【００６８】
上記の構造を有する細胞培養容器１０によって、生体内で本来発現する形状や類似機能を示し，効率よく増殖および／または分化させることができる。さらに、安価で観察の容易な細胞培養容器を提供することができる。従って、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。【００６９】
次に本発明にかかる細胞培養容器の実施例について図６〜図９を用いて説明する。【００７０】
［実施例１］
実施例１にかかる細胞培養容器の形状について図６を用いて説明する。図６は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図６では、２段の階段状の凸部１３が一列に並んで設けられている。凸部１３のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する凸部１３の間の凹部１４は培養液が流れる凹溝となる。隣接する凹部１４は、凸部１３の外側で互いに連通している。ここで、隣接する凸部１３の間の凹部１４が細胞を培養するための培地Ｓとなる。図６に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。なお、細胞培養容器の表面上において、複数の凸部１３が配列されている方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。ここで、第１の凸部１１と第１の凸部１１の上に設けられた第２の凸部１２の奥行き方向の大きさは略一致している。【００７１】
図６に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさをｄ、第２の凸部１２の幅をｅ、第２の凸部１２の高さをｆ、隣接する第２の凸部１２間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表１に示す。
【００７２】
【表１】
0005161581.tif 000002
【００７３】
表１には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表１に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第２の凸部１２の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第１の凸部１１の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。なお、第２の凸部１２が第１の凸部１１よりも小さくなるように設定する。すなわち、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ及び幅が第２の凸部第２の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大きい値になるように設定すればよい。
【００７４】
［実施例２］
実施例２にかかる細胞培養容器の形状について図７を用いて説明する。図７は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。図７では、２段の階段状の凸部１３がマトリクス状に配列されている。すなわち、本実施例では、細胞培養容器１０が第１の凸部１１の上に、第１の凸部１１よりも小さい第２の凸部１２が配置された構成を有している。この第１の凸部１１及び第２の凸部１２からなる凸部１３がマトリクス状に配列されている。隣接する凹部１４は、第１の凸部１１の上側で互いに連通している。凸部１３と凸部１３との間の凹部１４において、細胞が培養される。すなわち、凹部１４が細胞の培地となる。図７に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。【００７５】
図７に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさをｄ、第１の凸部１１の幅をｅ、第１の凸部１１の高さをｆ、隣接する第１の凸部１１間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表２に示す。【００７６】
【表２】
0005161581.tif 000003
【００７７】
表２には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表２に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第１の凸部１１の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第２の凸部１２の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。なお、第１の凸部１１が第２の凸部１２よりも小さくなるように設定する。すなわち、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ及び幅が第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ及び幅よりもそれぞれ大きい値になるように設定すればよい。【００７８】
［実施例３］
実施例３にかかる細胞培養容器の形状について図８を用いて説明する。図８は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。図８では、第１の凸部１１と第１の凸部１１よりも高い第２の凸部１２がそれぞれ異なる箇所に設けられている。すなわち、高さの異なる第１の凸部１１と第２の凸部１２とが別々に設けられている。具体的には、第２の凸部１２が細胞培養容器１０の両端にそれぞれ設けられ、その間に複数の第１の凸部１１が設けられている。第２の凸部１２は、細胞培養容器１０の端縁に沿って設けられている。細胞培養容器１０の両端に設けられた第２の凸部１２は、中央に設けられた第１の凸部１１よりも高くなっている。すなわち、第２の凸部１２が第１の凸部１１の側壁１６よりも高い橋梁となる。これにより、ＰＨの維持、細胞からの産出物質の拡散防止が可能となる。【００７９】
第１の凸部１１は、第２の凸部１２が設けられている方向に沿って１列に配列されている。そして、各々の第１の凸部１１は、第２の凸部１２が設けられている方向と直交する方向に設けられている。凸部１３のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する凸部１３の間の凹部１４は培養液が流れる凹溝となる。これにより、第２の凸部１２と直交する方向に培養液が流れる。すなわち、細胞培養容器１０の中央部を介して一端から他端へ、培養液が流れる。これにより、産出物質の拡散防止が可能となる。また、隣接する凹部１４は、第１の凸部１１の上側で互いに連通している。これにより、培養液を循環させることができる。【００８０】
図８に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器１０の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさをｄ、第１の凸部１１の幅をｅ、第１の凸部１１の高さをｆ、隣接する第１の凸部１１間の間隔をｇとする。本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表３に示す。【００８１】
【表３】
0005161581.tif 000004
【００８２】
表３には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表３に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とする。すなわち、第１の凸部１１の高さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第２の凸部１２の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第２の凸部１２の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。【００８３】
［実施例４］
実施例４にかかる細胞培養容器の形状について図９を用いて説明する。図９は、本実施例にかかる細胞培養容器の形状を示す斜視図である。本実施例では、人口臓器代替などを目的とした、バイオリアクターなど、培養液を循環させることができるモデルについて説明する。本実施例では、実施の形態２に対応する細胞培養容器１０の構成について説明する。図９に示すように、細胞培養容器１０には、第１の凸部１１によって形成される凹部１４の底面に複数の凹み１７が設けられている。【００８４】
細胞培養容器１０の両端には、それぞれ第１の凸部１１が設けられている。すなわち、２つの第１の凸部１１はそれぞれ細胞培養容器１０の端辺に沿って設けられている。そして、隣接する第１の凸部１１の間には、複数の凹み１７がマトリクス状に配列されている。第１の凸部１１は凹み１７の側壁よりも高い橋梁となる。【００８５】
図９に示すように、細胞培養容器１０の奥行き方向の大きさをＡ、細胞培養容器１０の幅をＢ、細胞培養容器１０の厚み（高さ）をＣ、凹み１７の奥行き方向の大きさをｄ、凹み１７の幅をｅ、凹み１７の高さをｆ、隣接する凹み１７の間の間隔をｇとする。ここで、本実施例にかかる細胞培養容器１０におけるＡ、Ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇの好適な値を表３に示す。【００８６】
【表４】
0005161581.tif 000005
【００８７】
表４には、細胞の培養試験に適した寸法と、培養株の製造及び組織培養に適した寸法とが記載されている。表４に示す寸法の範囲に凸部１３及び細胞培養容器１０の大きさを設定することにより、培養に好適な細胞培養容器、あるいは培養株の製造及び組織培養に適した容器を得ることができる。ここで、ｆ／ｅが１／１〜２０／１とすることが好ましい。すなわち、凹み１７の深さを幅の１倍〜２０倍とする。さらに、第１の凸部１１の奥行き方向の大きさ、幅及び高さ、並びに、隣接する第１の凸部１１の間隔もｄ〜ｇと同様の範囲に設定する。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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