(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均細孔径が３ｎｍ〜１４ｎｍの細孔径を備え、シリカ多孔体中の金属の含有量が１〜２０質量％であるシリカ多孔体と、グルタミナーゼとから構成されており、前記金属が、ジルコニウムであると共に、前記シリカ多孔体の細孔内に前記グルタミナーゼが吸着されている耐アルカリ性グルタミナーゼ。
【請求項２】
シリカ多孔体のＸ線回折におけるｄ間隔が２ｎｍより大きい位置に少なくとも１つのピークを持つ請求項１記載の耐アルカリ性グルタミナーゼ。
【請求項３】
耐アルカリ性グルタミナーゼ中のグルタミナーゼの含有量が、２〜２０質量％である請求項１または２に記載の耐アルカリ性グルタミナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐アルカリ性グルタミナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミナーゼは、食品工業、特に蛋白質を酵素的に分解して調味食品を製造する場合に、重要な役割を果たすものとして知られている。このグルタミナーゼは、生化学的、医学的分野においても、近年特に注目されているものであり、安定な酵素剤の製造が期待されている。例えば、グルタミナーゼをグルタミンとエチルアミン誘導体の混合物に作用させることにより、Ｌ−テアニンを高い収率で得ることができる。アルカリ条件下において蛋白質を酵素的に分解できれば、食品分野などの種々の分野への応用が期待される。グルタミナーゼに耐アルカリ性を持たさせる技術開発が行われているが、そのような技術は十分に発達しているとは言い難い。
【０００３】
一方、細孔径が２〜２０ｎｍ程度の規則性細孔を有する多孔質シリカは、特にメソポーラスシリカと呼ばれ、１９９０年代にその合成が報告されて以降、吸着剤や触媒、各種担体としての利用方法が数多く提案されている（非特許文献１）。メソポーラスシリカの細孔径は、各種酵素のサイズと対応していることから、その細孔の内部に酵素を固定させるための酵素担体としての利用が期待されている。これまで、多孔質シリカの細孔内に酵素を担持させることにより、酵素に対して耐酸性、耐熱性、または異性化反応の基質特異性向上などの効果を付与する技術が開発されている（特許文献１，２）。一般に多孔質シリカは、ｐＨ８以上のアルカリ条件下の溶液中では構成成分であるシリカが溶解しやすく、細孔構造を保持できないという欠点があった。また、アルカリ条件下では、酵素が溶液中に溶解してしまい、安定的な反応を得ることができないという欠点もあった。
そのため、多孔質シリカをアルカリ条件下における反応を触媒する酵素担体として利用することは困難であった。
【特許文献１】特開２００１−１２８６７２号公報
【特許文献２】特開２００２−９５４７１号公報
【非特許文献１】福嶋喜章、セラミックス、３４巻、ｐｐ７２２−７２５、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、シリカ多孔体の細孔内にグルタミナーゼを吸着させることにより、従来にない優れた耐アルカリ性を有するグルタミナーゼを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を達成するための本発明は、次の通りである。
（１）平均細孔径が３ｎｍより大きい細孔径を備え、シリカ多孔体中の金属の含有量が１〜２０質量％であるシリカ多孔体と、グルタミナーゼとから構成される耐アルカリ性グルタミナーゼ。
（２）シリカ多孔体のＸ線回折におけるｄ間隔が２ｎｍより大きい位置に少なくとも１つのピークを持つ（１）記載の耐アルカリ性グルタミナーゼ。
（３）前記金属がジルコニウムである（１）または（２）に記載の耐アルカリ性グルタミナーゼ。
（４）耐アルカリ性グルタミナーゼ中のグルタミナーゼの含有量が２〜２０質量％である（１）〜（３）のいずれか一つに記載の耐アルカリ性グルタミナーゼ。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、従来のグルタミナーゼの耐アルカリ性を著しく向上させることが可能となり、調味食品等を製造する目的の上で極めて効率的にグルタミナーゼを作用させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明におけるシリカ多孔体とは、多孔質構造を持つケイ素酸化物を主成分とする物質を意味する。
シリカ多孔体における細孔の平均細孔径が３ｎｍ未満であると、シリカ多孔体内部へのグルタミナーゼの吸着が十分でないので好ましくない。また、平均細孔径が２０ｎｍを超えるものは、製造するのが実質的に困難である。従って、上記観点からすると、本発明における細孔の平均細孔径は、３〜２０ｎｍであり、好ましくは３〜１４ｎｍである。
本発明の平均細孔直径は、公知の窒素吸脱着により算出した。すなわち、平均細孔直径は公知のＢＪＨ法により算出した。
本発明におけるシリカ多孔体のシリカ多孔体中の金属の含有量は、１〜２０質量％が好ましい。本発明のシリカ多孔体の金属含有量は、ＩＣＰ発光分析装置により算出した。
また、本発明におけるシリカ多孔体は、金属としてジルコニウムを含有していることが好ましい。シリカ多孔体のシリカ多孔体中のジルコニウム含有量は、耐アルカリ性の観点から１〜２０質量％が好ましく、３〜１５質量％がより好ましく、５〜１０質量％が最も好ましい。
【０００８】
シリカ多孔体へのジルコニウムの導入方法としては、特に限定されるものではないが、例えばシリカ多孔体を５０倍量の０.２Ｍ硝酸ジルコニア溶液に浸漬、撹拌後濾過し、乾燥後５８０℃で焼成することにより行うことができる
本発明におけるシリカ多孔体は、Ｘ線回折のｄ間隔が２ｎｍより大きい位置に少なくとも１つのピークを持つことが好ましい。本発明のＸ線回折パターンは、既存のＸ線回折装置であるＲＩＮＴ  ＵＬＴＩＭＡ  II、理学電機株式会社製により測定した。
本発明におけるシリカ多孔体の比表面積が１００ｍ２／ｇ未満であると、シリカ多孔体へのグルタミナーゼ担持の吸着が十分でない場合がある。また、比表面積が２０００ｍ２／ｇより大きいものは、製造するのが実質的に困難である。従って、上記観点から、本発明におけるシリカ多孔体の比表面積は、好ましくは１００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇ、より好ましくは３００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇ、最も好ましくは５００ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇである。本発明の多孔体の比表面積は、公知の窒素脱吸着により算出できる。
【０００９】
本発明におけるシリカ多孔体の製造方法としては、特に限定されるものではないが、例えば次のようにして製造できる。まず、無機原料と有機原料とを混合し、反応させることにより、有機物を鋳型としてそのまわりに無機物の骨格が形成された有機物と無機物の複合体を形成させる。次いで、得られた複合体から、有機物を除去することにより、シリカ多孔体を製造する。
無機原料は、例えば珪素含有無機物を用いることができる。そのような原料としては、例えば、層状珪酸塩、非層状珪酸塩等の珪酸塩を含む物質及び珪酸塩以外の珪素を含有する物質が挙げられる。層状珪酸塩としては、カネマイト（ＮａＨＳｉ２Ｏ５・３Ｈ２Ｏ）、ジ珪酸ナトリウム結晶（Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）、マカタイト（ＮａＨＳｉ４Ｏ９・５Ｈ２Ｏ）、アイラアイト（ＮａＨＳｉ８Ｏ１７・ＸＨ２Ｏ）、マガディアイト（Ｎａ２ＨＳｉ１４Ｏ２９・ＸＨ２Ｏ）、ケニヤアイト（Ｎａ２ＨＳｉ２０Ｏ４１・ＸＨ２Ｏ）等が挙げられ、非層状珪酸塩としては、水ガラス（珪酸ソーダ）、ガラス、無定形珪酸ナトリウム、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）シリケート、テトラエチルオルトシリケート等のシリコンアルコキシド等が挙げられる。また、珪酸塩以外の珪素を含有する物質としては、シリカ、シリカ酸化物、シリカ−金属複合酸化物などが挙げられる。これらは、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１０】
鋳型となる有機原料としては、特に限定されるものではないが、例えば界面活性剤が挙げられる。界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、非イオン型界面活性剤が好ましい。非イオン型界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン２級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレンラノリン酸誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のエーテル型のものや、ポリオキシエチレンアルキルアミン等の含窒素型のものを使用することができるが、ポリグリセリンに脂肪酸をエステル化したポリグリセリン脂肪酸エステルが好ましく使用できる。これらは単独で又は２種以上を混合して用いてもよい。
【００１１】
ポリグリセリン脂肪酸エステルはグルタミナーゼ吸着の観点から、ＨＬＢが１４.０〜１８.０であることが好ましい。ここで、ＨＬＢは分子中の親水基と親油基のバランスを表し、分子中の親水基が０％の時を０とし、１００％の時を２０として等分したものである。
無機原料と有機原料とを混合する場合、適当な溶媒を用いることができる。そのような溶媒としては、特に限定されるものではないが、水、アルコール等が挙げられる。
無機原料と有機原料の混合方法は、特に限定されるものではないが、界面活性剤を酸性溶液に溶解させた後、この溶液に塩基性物質と無機原料を添加し、２０℃〜６０℃で３時間〜２４時間混合することが好ましい。無機原料と界面活性剤の混合比（重量比）は特に限定されるものではないが、無機原料：界面活性剤＝１：０.５〜１：２が好ましい。無機原料と塩基性物質の混合比（質量比）は、特に限定されるものではないが、無機原料：塩基性物質＝１００：０.１〜１００：１０が好ましい。
【００１２】
酸性溶液を調製するための酸性物質は特に限定されるものではなく、無機酸または有機酸を用いることができる。例えば、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、蟻酸、酢酸、硝酸、硫酸、燐酸等が例示できる。
無機原料と有機原料を撹拌し反応させる際のｐＨ条件は、酸性条件であれば特に限定されるものではないが、ｐＨ３以下が好ましい。
有機物と無機物の複合体から有機物を除去する方法としては、複合体を濾取し、水等により洗浄、乾燥した後、４００℃〜６００℃で焼成する方法、有機溶媒等により抽出する方法などが挙げられる。
【００１３】
本発明の耐アルカリ性グルタミナーゼは、シリカ多孔体とグルタミナーゼとから構成される。シリカ多孔体中のグルタミナーゼは、２質量％〜２０質量％が好ましく、３質量％〜２０質量％がより好ましく、５質量％〜１０質量％が最も好ましい。
シリカ多孔体に対するグルタミナーゼの吸着は、グルタミナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌを２０ｍｇのシリカ多孔体に添加後、４℃で１日混合攪拌することにより行うことができる。
調製されたシリカ多孔体＝グルタミナーゼ複合体は、遠心分離により未吸着のグルタミナーゼと分離される。
グルタミナーゼ吸着率は、下記式１に示すように、添加グルタミナーゼ量とシリカ多孔体に吸着したグルタミナーゼから算出することができる。
【００１４】
【数１】
0005234452.tif 000002
【００１５】
本発明の耐アルカリ性グルタミナーゼのグルタミナーゼ活性は、既存のキット（例えば、ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社））によって測定できる。すなわち、耐アルカリ性グルタミナーゼを３７±０.２℃の恒温水槽に５分間放置した後、あらかじめ３７±０.２℃に保持した２％グルタミン酸１０ｍｌを添加し、試験管ミキサーで激しく攪拌する。３７±０.２℃の恒温水槽で正確に１０分間放置した後、０.７５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌してから、直ちに氷水につける。５分間放置した後、氷水から取り出し、０.７５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する（反応側の試験液）。
【００１６】
別に５０ｍｌ容のプラチューブ（ファルコンチューブ）に０.７５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する。３７±０.２℃の恒温水槽中に５分間放置した後、２％グルタミン溶液１０ｍｌを加えて、試験管ミキサーで激しく攪拌してから、氷水につける。５分間放置した後、氷水中から取り出し、０.７５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え、試験管ミキサーで激しく攪拌する（ブランク側の試験液）。
ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社）の発色液３ｍｌを分注した試験管（反応側）、試験液（ブランク側）、グルタミン酸標準液（１００μｇ／ｍｌ）及び水を２００μＬずつ別々に加えて振り混ぜ、２５〜３０分間放置した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定する。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
製造例１
ＨＬＢ１５.０のポリグリセリン脂肪酸エステル及び１Ｎ塩酸２００ｍｌを混合し、完全にポリグリセリン脂肪酸エステルを溶解させた後、ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）９ｇ及びデカン２０ｍｌを添加した。密封系にてこの溶液（ｐＨ３以下）を２５℃で１２時間攪拌後、生じた沈殿物を濾過にて回収した。その後、イオン交換水にて水洗・濾過を３回繰り返し、エタノールにて洗浄・濾過後、この固形物を５０℃で２時間乾燥させ、さらに５５０℃で６時間焼成を行って、シリカ多孔体１.８ｇを得た。
このシリカ多孔体１ｇを５０倍量の０.２Ｍ硝酸ジルコニア溶液０.０５Lに１時間浸漬し、室温で２時間撹拌後濾過した。得られた固形物を乾燥後、５８０℃で６時間焼成し、ジルコニウムを含有するシリカ多孔体Ａを０.９ｇ得た。
【００１８】
得られたシリカ多孔体Ａの細孔径分布をＢＥＬ社窒素吸着装置（ＢＥＬｓｏｒｐ II）で測定し、ＢＪＨ法により平均細孔径を求めたところ、平均細孔径は１０.６ｎｍであった。また、得られたシリカ多孔体Ａのジルコニウム含有量をＩＣＰ発光分析装置にて測定したところ、ジルコニウム金属での含有量は３.０％であった。
得られたシリカ多孔体Ａは、Ｘ線回折のｄ間隔が２ｎｍより大きい位置に１つのピークを有した。
得られたシリカ多孔体Ａの比表面積を窒素脱吸着により算出したところ５２３ｍ２／ｇであった。
【００１９】
比較品の製造例１
製造例１で得られたシリカ多孔体Ａの０.５ｇを５０倍量の０.２Ｍ硝酸アルミニウム溶液０.０２５Ｌに１時間浸漬し、室温で２時間撹拌後濾過した。得られた固形物を乾燥後、５８０℃で６時間焼成し、アルミを含有するシリカ多孔体Ｂを０.４ｇ得た。
得られたシリカ多孔体Ｂの細孔径分布をＢＥＬ社窒素吸着装置（ＢＥＬｓｏｒｐ II）で測定し、ＢＪＨ法により平均細孔径を求めたところ、平均細孔経は１０.６ｎｍであった。
【００２０】
得られたシリカ多孔体Ｂのアルミニウム含有量をＩＣＰ発光分析装置にて測定したところ、アルミニウム金属での含有量は０.３％であった。また、得られたシリカ多孔体ＢのＸ線回折パターンを測定したころ、ｄ間隔が２ｎｍより大きい位置に１つのピークを有した。
得られたシリカ多孔体の比表面積を窒素脱吸着により算出したところ５０８ｍ２／ｇであった。
【００２１】
実施例１
製造例１で得られたシリカ多孔体Ａの５０ｍｇに、１.０ｍｇ／ｍｌのグルタミナーゼと０.０１Ｍエチルアミン溶液を５ｍｌ添加し、４℃で２４時間攪拌し、本発明の耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１を得た。このとき使用したグルタミナーゼ溶液について、反応後の上澄み液を同仁化学の蛋白定量キットによりＣＢＢ法を用いてタンパク質濃度を測定した。得られた耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１中のグルタミナーゼ含有量を式１より求めたところ、７.４質量％であった。
【００２２】
比較例１
シリカ多孔体Ａに代えて、比較品の製造例１で得られたシリカ多孔体Ｂを用いた以外は実施例１と同様の方法でグルタミナーゼ多孔体混合物Ｂ１を得た。このとき使用したグルタミナーゼ溶液について、反応後の上澄み液を同仁化学の蛋白定量キットによりＣＢＢ法を用いてタンパク質濃度を測定した。得られたグルタミナーゼＢ１中のグルタミナーゼ含有量を式１より求めたところ、８.２質量％であった。
【００２３】
試験例１
実施例１で得られた耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１、および比較例１で得られたグルタミナーゼＢ１について、それぞれ５０ｍｇにｐＨ１０の０.０２Ｍ Ｌ−グルタミン／０.１２Ｍエチルアミン塩酸塩溶液１０ｍｌを添加し、４℃で２０時間撹拌した。遠心分離後、固形分を回収し、酵素活性を元のグルタミナーゼの酵素活性を１００とした時の酵素活性で算出した。結果を表１に示した。
【００２４】
【表１】
0005234452.tif 000003
【００２５】
試験例２
実施例１で得られた耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１および比較例１で得られたグルタミナーゼＢ１について、それぞれ０.０５ｇにｐＨ１０の０.０２Ｍ Ｌ−グルタミン／０.１２Ｍエチルアミン塩酸塩溶液１０ｍｌを添加し、４℃で２０時間撹拌・反応させた。その後、耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１およびグルタミナーゼＢ１を遠心分離により上層の反応溶液を除去し、沈殿した耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１およびグルタミナーゼＢ１を回収した（１回合成）。回収した耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１およびグルタミナーゼＢ１にそれぞれｐＨ１０の０.０２Ｍ Ｌ−グルタミン／０.１２Ｍエチルアミン塩酸塩溶液１０ｍｌを添加し、４℃で２０時間撹拌・反応させた後、遠心分離により沈殿した耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１およびグルタミナーゼＢ１を回収する同様の操作を計６回繰り返した。回収した耐アルカリ性グルタミナーゼＡ１およびグルタミナーゼＢ１において、１回、３回および６回合成後の酵素活性を元の酵素活性を１００とした時の酵素活性で算出した。結果を表２に示した。
【００２６】
【表２】
0005234452.tif 000004
【００２７】
このように本実施形態によれば、従来のグルタミナーゼの耐アルカリ性を著しく向上させた耐アルカリ性グルタミナーゼを提供することができた。この耐アルカリ性グルタミナーゼを用いることにより、調味食品等を製造する目的の上で、極めて効率的にグルタミナーゼを作用させることが可能となる。