(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁した状態で含み、
脂肪由来幹細胞の細胞数と、表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の数を合計した皮膚細胞の細胞数との比が５０：１〜１：１０００である、
皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。
【請求項２】
脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含み、皮膚付属器を有する人工皮膚。
【請求項３】
皮膚移植用材料である、請求項２に記載の人工皮膚。
【請求項４】
ヒト皮膚の代替試験用である、請求項２に記載の人工皮膚。
【請求項５】
育毛剤および育毛有効成分の試験用である、請求項２に記載の人工皮膚。
【請求項６】
脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を共培養することを特徴とする、皮膚付属器を有する人工皮膚の製造方法（但し、ヒトの生体で実施される方法を除く。）。
【請求項７】
前記共培養は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁して行う、請求項６に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項８】
脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を懸濁させたコラーゲン・ゲルをヒト以外の動物の皮膚切除部位に注入することにより共培養する、請求項６または７に記載の人工皮膚の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人工皮膚およびその製造方法に関し、詳しくは、皮膚付属器を有し、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用、育毛剤および育毛有効成分の試験用として有用な人工皮膚およびその製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、人工皮膚の製造方法としては、線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに包埋して培養し、その上層に表皮角化細胞を播種することによりシャーレ内にて三次元的に培養皮膚を製造する方法が一般的に用いられている（非特許文献１）。また、シャーレ内ではなく、非ヒト動物の皮膚切開部に細胞を播種することにより培養皮膚を製造する方法についても報告されている（非特許文献２、特許文献１）。また、細胞材料として線維芽細胞と表皮角化細胞の他に毛乳頭細胞を用いて人工皮膚を製造する方法も報告されている（特許文献２）
【０００３】
【非特許文献１】分子生物学研究のための新培養細胞実験法（羊土社，ｐ１７７−１８０）
【非特許文献２】Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｙ  Ｇ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２００２，ｐ３７−ｐ３９
【特許文献１】特開２００４−３４４５０６号公報
【特許文献２】特開２００５−３０５１７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記従来の方法で製造される組織には、毛包、皮脂腺、汗腺などの皮膚付属器は存在しない。また、特開２００５−３０５１７７号公報（特許文献２）で得られる人工組織は組織付属器官様構造体を含むとされているものの、文献中の実施例の結果の細胞像において毛包細胞塊として示されている箇所は別の組織である可能性が高く、実証はなされていないと推測される。生体皮膚組織中の毛包の毛球部では間葉系細胞の周囲を上皮系細胞が取り囲む構造をしているものであるが、特開２００５−３０５１７７号の図１、２はそのような構造をとっておらず、単なる上皮細胞の塊である。また図３、４で毛包様細胞塊と呼ばれている構造物についても間葉系細胞とのコンタクトは見られない。更に、毛包原基であるならば表皮と真皮の接触面に位置するはずであるが、この構造物は表皮中に存在するため明らかに毛包ではない。従って、組織付属器を有する人工皮膚をつくる技術はこれまでに報告されていなかった。
【０００５】
このため、現在火傷などで皮膚を損傷した患者の治療に利用される人工皮膚は、「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」であったが、水分や脂質の蒸散などの機能面や皮膚の外見面から「皮膚付属器の存在する人工皮膚」を作成する技術の開発が切望されていた。すなわち、本発明の目的は、皮膚付属器の存在する人工皮膚を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者は従来からある人工皮膚形成法（非特許文献２）を参考にし、非ヒト動物の皮膚切除部位にヒト線維芽細胞及び表皮角化細胞を播種し人工皮膚を作成した。本皮膚は表面が滑らかでヒトの生体皮膚に近い外観をしており表皮及び真皮構造を有していたが、毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は有していなかった。
【０００７】
線維芽細胞及び、角化細胞を用いた既存の方法において皮膚付属器が形成されない理由は「既に分化の方向性が決定している細胞を用いていること」ではないかと発明者は考えた。そこで発明者は、人工皮膚の構築にあたっての未分化な細胞の利用に着目した。近年、脂肪組織に成体幹細胞が多く含まれることが発見されていること、また皮下脂肪より比較的容易に吸引脂肪液を得ることができる簡便性から、脂肪由来幹細胞を用いた「皮膚付属器の存在する人工皮膚」の形成を試みた。その結果、脂肪由来幹細胞、表皮細胞、および真皮細胞を用いることにより皮膚付属器形成能を有する人工皮膚を製造することが可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は以下の発明を提供するものである。
〔１〕  脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含む、皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。
〔２〕  脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含み、皮膚付属器を有する人工皮膚。
〔３〕  皮膚移植用材料である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔４〕  ヒト皮膚の代替試験用である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔５〕  育毛剤および育毛有効成分の試験用である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔６〕  脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を共培養することを特徴とする、皮膚付属器を有する人工皮膚の製造方法。
〔７〕  前記共培養は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁して行う、〔６〕に記載の人工皮膚の製造方法。
〔８〕  脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を懸濁させたコラーゲン・ゲルをヒト以外の動物の皮膚切除部位に注入することにより共培養する、〔６〕または〔７〕に記載の人工皮膚の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、皮膚付属器形成能を有し、人工皮膚の調製に適した培養細胞塊が提供される。また、皮膚付属器を有する人工皮膚、および皮膚付属器を有する人工皮膚を効率よく製造するための方法も提供される。
【００１０】
従って、本発明によれば、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用材料、育毛剤および育毛有効成分の試験用としての人工皮膚が提供される。更には、自身の細胞を用いて構築した皮膚付属器を有する人工皮膚を用い、育毛試験や皮膚の保湿試験を行い、自身に適した育毛剤や保湿剤などを選択できるオーダーメイド医療への応用も可能である。
【００１１】
また皮膚刺激性試験、薬剤経皮吸収性試験に現行の「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」が使われているが、より生体皮膚に近い条件の備わった人工皮膚を用いることにより現実に近い試験が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
〔培養細胞塊〕
本発明の培養細胞塊は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明における脂肪由来幹細胞とは、脂肪組織に含まれる幹細胞である。
【００１４】
幹細胞とは、多分化能を有する細胞を意味する。例えば骨組織、軟骨組織、筋肉組織などの各組織を構成する細胞への分化能をも保持するものを挙げることができる。これらの各組織を構成する細胞への分化の確認は、各種組織化学的染色法、例えば、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色、アルシアンブルー染色、ミオシン抗体染色法、ＭｙｏＤ１抗体染色などにより行うことができる。
【００１５】
脂肪組織とは、脂肪細胞により構成される生体組織の一種である。脂肪組織の生物由来は特に限定されず、ヒトのほかマウス、ラットなどの実験動物等の非ヒト動物であってもよい。また、生物の年齢、性別は特に限定されない。また、脂肪組織の部位も特に限定されないが、皮下に位置する脂肪組織（皮下脂肪）が好ましく用いられる。
【００１６】
脂肪組織の調製方法は特に限定されず、美容整形の際の脂肪吸引手術により吸引される組織片や、外科手術などの際に生体から切除される組織に含まれる切除脂肪組織から調製することができる。脂肪由来幹細胞は太い血管の周囲に存在するため脂肪吸引液よりも切除脂肪組織から多く得ることができる。一方、脂肪吸引液から幹細胞を調製したほうが、手術跡が小さく済みドナーの負担が小さい。
【００１７】
脂肪由来幹細胞は、脂肪組織から調製することができる。例えば脂肪吸引液からの脂肪由来幹細胞の調製は、以下のようにして行うことができる。脂肪吸引液に１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２などの培地を添加して希釈することによりコラゲナーゼ活性を中和する。その後、遠心して上清を除去し、除去後得られるペレットに上記の培地を加えて再懸濁した後、更に遠心して上清を除去する。同様の洗浄操作をもう一度繰り返す。この洗浄操作により非接着性の赤血球細胞を除き、脂肪由来幹細胞を得ることができる。また、こうして得られた幹細胞は抗生物質／抗菌剤および１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養することができる。
【００１８】
一方、上述の方法と同様にコラゲナーゼ活性を中和した後の遠心操作後に、最上部に浮遊した細胞を採取し、新生仔牛血清を１０％含むＤＭＥＭまたはＦ１２培地を利用した天井培養に供しても、脂肪由来幹細胞を得ることができる。
本方法は既に報告されている方法（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｌｏｃｕｌａｒ  ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｊｉｍｅ  Ｓｕｇｉｈａｒａ，１９８７, ｖｏｌ２８，ｐ１０３８−１０４５、日本再生医療学会雑誌，２００６，ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１，加野浩一郎  他、など。）であり、広く脂肪細胞研究者に用いられている方法である。
【００１９】
皮膚は、表皮および真皮と皮膚付属器とから構成される。表皮ケラチノサイト（表皮角化細胞）とは表皮を構成する主たる細胞であり、線維芽細胞とは真皮を構成する主たる細胞である。
【００２０】
上記表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の生物由来は特に限定されず、ヒトでなくともマウス、ラットなど実験動物等の非ヒト動物であってもよい。
【００２１】
表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の調製方法は特に限定されず、例えば形成外科、皮膚科、外科手術等の余剰皮膚などの皮膚切除片から初代培養して用いてもよく、またそれぞれの細胞を純化して用いてもよい。さらに、継代培養して増殖させたものを使用することも出来る。継代培養する場合には、６０〜８０％コンフルエント未満で継代する。また６回以上の継代培養は、細胞の毛包誘導能が低下するため好ましくない。表皮ケラチノサイトを調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば０．２５％トリプシン中で４℃、２４時間処理した後に遠心操作を行うことにより表皮からケラチノサイトを分離することが出来る。分離した表皮ケラチノサイトは無血清・低カルシウム濃度を特徴とするＫＧＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）、もしくは市販のＨｕｍｅｄｉａ  ＫＧ２培地（ＴＯＹＯＢＯ）等を用いて３７℃、５％ＣＯ２の存在下で培養して調製することができる。また、線維芽細胞を調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば培養シャーレに固定後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を静かに加え、３７℃、５％ＣＯ２の存在下でインキュベートをする。培養開始4日から7日目頃より皮膚片の周囲より線維芽細胞が増殖することが確認でき、こうして線維芽細胞を調製することができる。
【００２２】
本発明の培養細胞塊は、上述した脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、皮膚付属器形成能を害しない範囲でその他の細胞を含むものであってもよい。
【００２３】
本発明の培養細胞塊は、上記の脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、その調製方法は特に限定されない。例えば、これらの細胞を適当な培地、例えばコラーゲン・ゲルなどの上に播種して調製され得る。ここでコラーゲン・ゲルとは、コラーゲンを主成分とするゲル状の物質を意味する。コラーゲンはＩ〜ＶＩＩＩ型まで様々なタイプがあるが、コラーゲンＩもしくはコラーゲンＩＶがこのましい。コラーゲン・ゲルとしては、組織培養用などのコラーゲンの市販品（例えば、新田ゼラチン社製のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩＰ、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩＡなど）を用いることができる。
【００２４】
本発明の培養細胞塊は、皮膚付属器形成能を有する。すなわち、例えば培養細胞塊を生体に移植することなどにより、将来的に皮膚付属器を形成する能力を有していればよく、皮膚付属器が形成されていなくともよい。ここで皮膚付属器とは、皮膚を構成する表皮層と真皮層に付属している器官を意味し、毛包、汗腺、皮脂腺、爪などを挙げることができる。これらの皮膚付属器は、水分や皮脂を分泌して皮膚に潤いを与える、体温を調節する、外部から皮膚を保護するといった役割を担う。本発明の培養細胞塊は、上記皮膚付属器のうち毛包、汗腺、および皮脂腺の形成能を有することが好ましい。
【００２５】
〔人工皮膚〕
本発明の人工皮膚は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むことを特徴とし、皮膚付属器を有するものである。
【００２６】
脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の培養細胞塊の説明欄において前述した通りである。これらの細胞のうち、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の人工皮膚の使用目的に応じて自家の細胞（被験者の細胞）または市販の細胞を用いることができる。例えば、人工皮膚の使用目的が薬剤刺激性試験、経皮吸収性試験の場合には、自家の細胞を使用する必要はなく、メーカーより販売されている線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを購入して用いることができる。
【００２７】
本発明の人工皮膚は、各種用途に用いることができ、例えば外科手術、美容形成手術などの際の皮膚移植用材料として用いることができる。また、経皮薬、化粧品などの薬効性試験、安全性試験などの際のヒト皮膚の代替試験用に用いることができる。本発明の人工皮膚は、毛包などの皮膚付属器官を有することから、特に育毛剤や、育毛有効成分の薬効性試験、安全性試験などの試験用に好ましく用いることができる。
【００２８】
〔人工皮膚の製造方法〕
上記本発明の人工皮膚の製造方法は特に限定されないが、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを共培養して調製される。
【００２９】
共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁して行うことが望ましい。コラーゲン・ゲルについては、前記した本発明の培養細胞塊の項で既に述べたとおりである。コラーゲン・ゲルに対し、懸濁させる脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトの量は、各細胞の継代数や形質などの諸条件により適宜調整すべきであり、細胞数や細胞比を数値範囲として限定することは困難である。一例を挙げると、コラーゲン・ゲル混合溶液１００μｌに対し脂肪由来幹細胞、皮膚細胞（線維芽細胞と表皮ケラチノサイト）の細胞数合計で５．０×１０４〜１．０×１０８であり、好ましくは５．０×１０５〜１．０×１０７の範囲で定めることができる。また脂肪由来幹細胞と皮膚細胞の細胞比も、目安としては５０：１〜１：１０００で混合することが好ましく、特に１０：１〜１：１００で混合することが好ましく、中でも１：１〜１：１００で懸濁（混合）することが最も好ましい。尚、コラーゲン・ゲル混合溶液に細胞を懸濁する際には氷上にて行い、ゲルを泡立てないように静かに混合する。
【００３０】
上記共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。特に脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁させた状態で動物（好ましくは、非ヒト動物（ヒト以外の動物））の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。これにより、非ヒト動物の皮膚切除部位に人工皮膚が形成される。
【００３１】
非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモットなどの実験動物等を用いることができる。非ヒト動物の中でも免疫不全非ヒト動物が好ましい。また、非ヒト動物の皮膚組織であれば特に切除する部位は限定されないが、例えばラット等の実験動物の場合には処置の容易さから背部の皮膚組織が好ましい。
【００３２】
脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位において共培養する際には、表面の乾燥を防ぎ異物の混入を防ぐために蓋付の小型培養チャンバーを皮膚切除部位に固定してなされることが好ましい。チャンバーは、湿度を保てる構造のものであり、動物が足で触れたり口で舐めることができないようになっており、床敷きなどの異物が混入しないようなものであればよく、移植用の細胞を保持する空隙部分と、移植用の細胞導入口および皮膚組織への開口部とを有する構造のものを用いることができる。例えば、皮膚組織への開口部周辺につば状の突出部を有するチャンバーは、皮膚組織中につば部分を挿入してチャンバーを固定することができるので好ましく用いられる。チャンバーの材質は特に制限されるものではなく、例えばポリプロピレン、シリコン製のものが使用できる。チャンバーの大きさも特に制限されるものではない。
【００３３】
体表面へのチャンバーの固定の例を挙げると以下の通りである。移植対象の動物の皮膚をチャンバーのサイズに合わせて切除し、周囲の皮膚表面をつまみ、皮膚下にチャンバーのつばを挿入し、チャンバーの周辺部の皮膚を縫合または医療用クリップ、医療用接着剤を用いてチャンバーを固定することができる。
【００３４】
チャンバーを用いて細胞を播種する際、面積当たりの細胞数が少ないと人工皮膚中の毛包構造の形成に不十分であり、反対に面積当たりの細胞数が多すぎても細胞死が起きたり、チャンバー内でのケラチノサイトの正常な角化を妨げてしまうため好ましくない。チャンバーの大きさは非ヒト動物の体の大きさにより様々なものを用いることが出来るため特に規定されないが、大きすぎると皮膚切除部位への固定が困難である。従って、作成したい人工皮膚の大きさに合わせてチャンバーと非ヒト動物を選択することが好ましい。チャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により自然に脱離するが、固定の度合いが強く自然に脱離されない場合は固定に用いた器具を外すことによりチャンバーを脱離させても良い。
【００３５】
非ヒト動物の皮膚切除部位に形成された人工皮膚は、そのままヒト皮膚の代替試験用、特に育毛剤や育毛有効成分の試験用に用いることができる。また、皮膚移植用材料として、動物から組織を採取してヒトなど他の個体に移植することも可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。尚、実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００３７】
実施例１〜３および比較例１〜３
［脂肪由来幹細胞の調製］調製例１
３２歳、ＢＭＩ値２２ｋｇ／ｍ２の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を２００ｃｃ吸引した。ＰＢＳバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、０．０７５％コラゲナーゼ中にて３７℃、３０分間インキュベートした。ここに１０％  ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ１５０μｍのメッシュを用いてろ過した。このろ液を１２００×ｇにて１０分間遠心後、上清を除き、ペレットを１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。これを再び１２００×ｇにて１０分間遠心し、上清を除いた。得られたペレットを１０％  ＦＢＳ、１％  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＤＭＥＭに再懸濁し、６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種して３７℃、５％ＣＯ２存在下にて一晩培養した。翌日、ＰＢＳバッファーを用いてプレートを洗浄することにより非接着性の赤血球細胞を除いた。こうして得られた細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  ｓｔａｉｎ，Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎ，Ｍｙｏｓｉｎ抗体染色、ＭｙｏＤ１抗体染色により確認）。
【００３８】
［線維芽細胞の調製］
ヒト皮膚の線維芽細胞は以下に示す一般的な手法により調製した。無菌的手法により得たヒト皮膚片（形成外科・皮膚科・外科手術での余剰皮膚など）を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて１．５〜２ｃｍ角の小片とした。この皮膚小片を培養シャーレに固定し、培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を静かに加え、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始した。培地交換は週に２回行った。培養開始３日〜７日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。細胞は６０〜８０％コンフルエントで回収した。
【００３９】
［表皮ケラチノサイトの調製］
ヒト皮膚の表皮ケラチノサイトは以下に示す一般的な手法により調製した。無菌的手法により得たヒト皮膚片を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて１〜２ｃｍ角の小片とした。これらは１０００Ｕ／ｍＬディスパーゼ中にて４℃、２４時間処理した。その後、ＤＭＥＭ培地に浸して軽く洗浄し、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。こうして得られた表皮を０．１％トリプシン溶液１０ｍＬ中にて３７℃、３分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。トリプシンインヒビターを２ｍｇ含有するＤＭＥＭ培地１０ｍＬ加え、遠心により細胞を回収後、ＫＧＭ培地を用いて細胞を播種した。インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始し、培地交換は２日に１回行った。こうして培養した表皮ケラチノサイトは６０〜８０％コンフルエントで回収した。
【００４０】
［細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製］
新田ゼラチン社製のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩＰを用いて添付のプロトコルを参考にコラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および表皮ケラチノサイトを、コラーゲン・ゲル混合溶液１００μｌに対し、表１に示した細胞数になるように細胞を懸濁した。これらの作業は氷上で行った。また、本試験で用いた脂肪由来幹細胞は人工皮膚中でその局在を検出できるようにＱｔｒａｃｋｅｒ  ５２５  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)を用いてＱ−ｄｏｔ５２５標識したものを用いた。
【００４１】
［ヌードマウスへの細胞播種］
ポリプロピレン製の内径１０ｍｍのつば付き円筒の上部に蓋を付着したチャンバーＡを用いた（図４）。ヌードマウスの背部皮膚から直径１２ｍｍの円状に皮膚を切除し、切除部位にチャンバーを設置し、それぞれ医療用クリップを用いて固定した。チャンバーＡの蓋１には１８ゲージの注射針を用いて穴を開け、細胞液の注入口２とした。チャンバーＡの注入口２から、表１に示した細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を１ｍｌサイズのシリンジと２４Ｇサイズの注射針（ともにテルモ社製）を用いて１００μｌずつ注入した。細胞注入に用いたチャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により、設置から７日後に自然に外れた。
【００４２】
［形成した人工皮膚における皮膚付属器の有無の確認］
細胞播種２８日後に播種部位を切除し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、ＨＥ染色により組織学的検討を行った。その結果、脂肪由来幹細胞を播種した実施例１（図１）、実施例２（図５）、実施例３（図６）では細胞移植部位に毛包、皮脂腺が形成されていることが確認できた。また形成された毛包にはＱ−ｄｏｔ標識された細胞が検出されたことから、脂肪由来幹細胞が毛包細胞に分化したことが確認できた（実施例１の例：図２）。一方、脂肪由来幹細胞を播種していないほかは実施例１と同じように行った例を比較例１に示した。また、線維芽細胞を使用しない例を比較例２に、表皮ケラチノサイトを使用しない例を比較例３に示した。比較例１では細胞移植部位に毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は確認できなかった（図３）ほか、比較例２、３においても、皮膚付属器はほとんど形成されなかった。
【００４３】
従って、人工皮膚中に皮膚付属器を形成させるには脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および皮膚ケラチノサイトを共に培養することが必須であることを発見した。
【００４４】
【表１】
0005340564.tif 000002
【００４５】
実施例４
前述の実施例１〜実施例３、及び比較例１〜比較例３に示した脂肪由来幹細胞は前記調整例１で調製しているが、他の方法で調製した脂肪由来幹細胞についても同様の皮膚付属器形成能を有するかどうかについて検討した。
【００４６】
［脂肪由来幹細胞の調製］調製例２
上記調製例１の方法以外にも脂肪吸引液、または脂肪組織の酵素処理液から得られる成熟脂肪細胞を用いて幹細胞を得ることが出来、以下に方法を示した。４３歳、ＢＭＩ値２５ｋｇ／ｍ２の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を２００ｃｃ吸引した。ＰＢＳバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、０．０７５％コラゲナーゼ中にて３７℃、３０分間インキュベートした。ここに１０％  ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ１５０μｍのメッシュを用いてろ過後、１２００×ｇにて１０分間遠心した。遠心操作により最上部に浮遊した細胞をパスツールピペットで丁寧に採取し、ＰＢＳバッファーに再懸濁した。同様に再び遠心洗浄し、浮遊する細胞をパスツールピペットで採取した。こうして得た浮遊細胞を以下に示す天井培養に用いた。天井培養とは液中で浮遊するために通常の接着培養が困難である細胞を、培養液を満たしたフラスコに植え込むことにより天井面に付着させ培養する方法である。培養フラスコに新生仔牛血清を１０％添加したＦ１２培地を満たし、フラスコを立てたまま調製した浮遊細胞を入れ、栓をし、フラスコの底面を上にして３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１０日間培養した。顕微鏡下にて細胞が天井面へ接着していることを確認した後、培地を除き、新生仔牛血清を１０％添加したＦ１２培地を加えフラスコの天地を静かに逆にして通常のフラスコ培養としてさらに７日間培養した。こうして得られた接着細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  ｓｔａｉｎ，Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎ，Ｍｙｏｓｉｎ抗体染色、ＭｙｏＤ１抗体染色により確認）。
【００４７】
上述の調製例２で調製した脂肪由来幹細胞（細胞数：１．５×１０５ｃｅｌｌｓ）と皮膚細胞（線維芽細胞の細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓ、表皮ケラチノサイトの細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓ）の細胞比を１：１０、全細胞数合計を１６５００００ｃｅｌｌｓとしたほかは、実施例１と同様にして作成した人工皮膚を図７に示した。毛包、皮脂腺、汗腺といった皮膚付属器の形成が確認でき、皮膚組織切片長１０ｍｍあたりの毛包数は１０本以上であった。
【００４８】
実施例５〜実施例８（育毛有効成分試験）
４３歳女性の頭部皮膚片（外科手術での余剰皮膚、１．０ｃｍ×３．０ｃｍの大きさ）を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて０．３ｃｍ幅の短冊状にカットした。これらの皮膚片は１０００Ｕ／ｍＬディスパーゼ中にて４℃、２４時間処理した。その後、ＤＭＥＭ培地に浸して軽く洗浄した後、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。表皮は表皮角化細胞の培養に、真皮は線維芽細胞の培養に供した。
【００４９】
表皮角化細胞の調製法を以下に示した。表皮を０．１％トリプシン溶液１０ｍＬ中にて３７℃、３分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。トリプシンインヒビターを２ｍｇ含有するＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え、遠心により細胞を回収後、ＫＧＭ培地を用いて細胞を播種した。インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始し、培地交換は２日に１回行った。こうして培養した表皮ケラチノサイトは６０〜８０％コンフルエントで回収した。
【００５０】
線維芽細胞の調製法を以下に示した。真皮をメスを用いて１ｃｍ幅にカットし、この小片を培養シャーレに接着させた。ここに培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を静かに加え、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始した。培地交換は週に２回行った。培養開始３日〜７日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。細胞は６０〜８０％コンフルエントで回収した。
【００５１】
こうして得られた表皮ケラチノサイトと線維芽細胞を上述の調製例２で得られた脂肪由来幹細胞と混合して、細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製は、細胞数、細胞比を表２の実施例５〜実施例８に記載した通りとしたほかは、実施例１と同様とした。このようにして調製した細胞混合液に何も添加しないで（実施例５）、或いは細胞混合液に既に育毛効果の知られているタンパクであるｅｐｈｒｉｎ−Ａ３（実施例６）、ｓｈｈ（実施例７）、ＥＧＦ（実施例８）を、それぞれ表２に示す量加えてヌードマウスの皮膚切除部位に播種し、育毛促進効果が得られるか検討した。ヌードマウスへの細胞播種、形成した人工皮膚における皮膚付属器有無の確認については実施例１と同様にして行った。
【００５２】
各タンパク質を添加して培養した場合と、無添加の場合とで、毛包などの皮膚付属器の分化の程度を比較した。その結果、各タンパク質のいずれを添加した場合にも、無添加の場合と比較して毛包が形成され、組織において毛が生えたことが肉眼でも明らかであり、育毛効果も確認できた。中でもｅｐｈｒｉｎ−Ａ３を加えた場合（実施例６：図９）と無添加の場合（実施例５：図８）との間の毛包数の増加および育毛効果は、他のタンパク質の場合と比べて顕著であった。つまり評価した本人に適した育毛有効成分はｅｐｈｒｉｎ−Ａ３であることが分かった。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
このことから、本発明人工皮膚は育毛剤および育毛有効成分の試験に使用することができることが明らかとなった。すなわち、育毛試験をしたい本人の皮膚細胞から調製した人工皮膚を試験に用いることができるため、本人に合った育毛剤や育毛有効成分を選択することが可能となる。従って、従来の動物試験による育毛評価よりも個人に合った育毛評価が出来る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、実施例１において形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図２】図２は、実施例１において形成した人工皮膚中の毛包における、脂肪由来幹細胞部分の断面図である。
【図３】図３は、比較例１のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図４】図４は、移植用チャンバーの一例を示す斜視図である。
【図５】図５は、実施例２のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図６】図６は、実施例３のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図７】図７は、実施例４のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図８】図８は、実施例５のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【図９】図９は、実施例６のチャンバーにおいて形成した人工皮膚の組織切片の断面図である。
【符号の説明】
【００５６】
Ａ  チャンバー
１  蓋
２  注入口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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