(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンおよび総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比から、皮膚の光ストレスを判定する方法であって、
局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって皮膚カテプシンを測定する、方法。
【請求項２】
皮膚カテプシンが皮膚カテプシンＬである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚カテプシンの分析方法およびそのためのキット、ならびに、皮膚の光ストレスの判定方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線露光などの光ストレスによって、皮膚の角層が肥厚し、角層の脱落が促進することが知られている。従来、皮膚における肌水分量やメラニン量の変化から、このような皮膚の光ストレスを判定することがなされていたが、定性的な評価に過ぎず、皮膚の光ストレスを定量的に評価できるものではなかった。
【０００３】
近年、光ストレスによる皮膚代謝において、皮膚カテプシンが角質の生成を担う酵素として着目されている。カテプシンは、細胞内小器官のリソソームから分泌されるプロテアーゼで、その構造や機能によりおよそ１８種類に分類される（下記の表１を参照）。
【０００４】
【表１】
0005234453.tif 000002
【０００５】
カテプシンＬは、分子量２４ｋＤａ、最適ｐＨ５．０〜６．０のシステインプロテアーゼであり、コラーゲン、アゾカゼインやヘモグロビンなどのタンパクを強力に加水分解する（たとえば、鶴大典ら、「蛋白質分解酵素Ｉ」、学会出版センター、51−55頁（非特許文献１）を参照。）。また、外傷などにより炎症を起こした皮膚や、癌細胞で増加することが知られており、細胞周期の調節因子としても働いている（たとえば、Thomas Reinheckell et al., 「The lysosomal cysteine protease cathepsin L regulates keratinocyte proliferation by control of growth factor recycling」、Journal of cell science, vol. 118(15), pp 3387−3395（非特許文献２）を参照。）。
【０００６】
皮膚が紫外線に暴露すると、刺激を受けた皮膚細胞中でカテプシンの分泌量が増え、それが引き金となって連鎖的にシグナルの伝達が行われ、最終的にアポトーシスに繋がると考えられている（たとえば、Cecilia A. Bivik et al., 「UVA/B-Induced Apoptosis in Human Melanocytes Involves Translocation of Cathepsins and Bcl-2 Family Members」、Journal of Investigative Dermatology、Vol. 126、1119−1127頁(2006)（非特許文献３）を参照。）。皮膚が紫外線に暴露すると、細胞の損傷を防ぐためにメラノサイトからのメラニンの分泌量が増加するが、もともとメラニン量の異なる人種間（黒人と白人）では、カテプシンＬ活性に差が見られるという研究報告がある（たとえば、Nannan Chen et al., 「Cathepsin L2 Levels Inversely Correlate with Skin Color, Journal of Investigative Dermatology, Vol.126, pp2345−2347(2006）（非特許文献４）を参照。）。このため、皮膚から採取された試料中における皮膚カテプシンを分析することで、皮膚の光ストレスを簡便・迅速に判定できる方法の開発が試みられている。
【０００７】
一般に、生体試料中に含まれる微量タンパクを分析する技術としては、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Asssay）法が多く用いられている。この酵素免疫測定法には、大きく分けて競合法とサンドイッチ法とがあるが、いずれも広く知られており、主に感度向上を主眼とし、標識自体の感度改良に関するものを中心とした種々の改良がなされている（たとえば特開２０００−１８０４４８号公報（特許文献１）、特開２００５−３３７９６０号公報（特許文献２）などを参照。）。
【０００８】
上述した皮膚カテプシンの分析に関しては、現在のところ、分析キットの開発・販売は実現しておらず、皮膚カテプシンの遺伝子発現解析で生体試料中の有無を定性的に判定しているのが実情である。しかしながらこのような方法では、試料の前処理を行うのに何時間も必要であるだけでなく、皮膚カテプシンの定量的な評価は難しい。
【特許文献１】特開２０００−１８０４４８号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７９６０号公報
【非特許文献１】鶴大典ら、「蛋白質分解酵素Ｉ」、学会出版センター、51−55頁
【非特許文献２】Thomas Reinheckell et al., 「The lysosomal cysteine protease cathepsin L regulates keratinocyte proliferation by control of growth factor recycling」、Journal of cell science, vol. 118(15), pp 3387−3395
【非特許文献３】Cecilia A. Bivik et al., 「UVA/B-Induced Apoptosis in Human Melanocytes Involves Translocation of Cathepsins and Bcl-2 Family Members」、Journal of Investigative Dermatology、Vol. 126、1119−1127頁(2006)
【非特許文献４】Nannan Chen et al., 「Cathepsin L2 Levels Inversely Correlate with Skin Color, Journal of Investigative Dermatology, Vol.126, pp2345−2347(2006）
【非特許文献５】橋本ら、「テトラブロモフェノールを用いる尿タンパク質の吸光光度定量及び目視定量」、分析化学、Vol.54、No.9、2005、783-788頁
【非特許文献６】Welss T et al., 「Hurpin is a selective inhibitor of lysosomal cathepsin L and protects keratinocytes from ultraviolet-induced apoptosis」、Biochemistry 42(24)、2003、7381−7389頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、皮膚から採取された試料中における皮膚カテプシンを簡便・迅速に定量分析できる方法およびそのためのキットを提供することである。
【００１０】
また本発明は、皮膚から採取された試料から、皮膚の光ストレスのレベルを簡便・迅速に判定できる方法およびそのためのキットを提供することもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンを、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって分析する方法であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の皮膚カテプシンの分析方法において、皮膚カテプシンは皮膚カテプシンＬであることが好ましい。
【００１３】
本発明は、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンおよび総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比から皮膚の光ストレスを判定する方法（以下、「第１の判定方法」と呼称する。）についても提供する。
【００１４】
本発明の第１の判定方法においては、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって皮膚カテプシンを測定することが好ましい。
【００１５】
また本発明の第１の判定方法において、皮膚カテプシンは皮膚カテプシンＬであることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシン、皮膚カテプシン阻害物質および総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比、総タンパク質に対する皮膚カテプシン阻害物質の比および皮膚カテプシン阻害物質に対する皮膚カテプシンの比から皮膚の光ストレスを判定する方法（以下、「第２の判定方法」と呼称する。）についても提供する。
【００１７】
本発明の第２の判定方法においては、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって皮膚カテプシンおよび皮膚カテプシン阻害物質を測定することが好ましい。
【００１８】
また本発明の第２の判定方法において、皮膚カテプシンは皮膚カテプシンＬであることが好ましい。
【００１９】
本発明は、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された検出部とが形成された、皮膚カテプシン分析用キット（以下、「第１のキット」と呼称する。）についても提供する。
【００２０】
また本発明は、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された第１の検出部と、酸塩基指示薬を含む第２の検出部とが形成された、皮膚の光ストレス判定用キット（以下、「第２のキット」と呼称する。）についても提供する。
【００２１】
本発明はさらに、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された第１の検出部と、酸塩基指示薬を含む第２の検出部と、皮膚カテプシン阻害物質の抗体が予め固定された第３の検出部とが形成された、皮膚の光ストレス判定用キット（以下、「第３のキット」と呼称する。）についても提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の皮膚カテプシンの分析方法およびそのためのキット（第１のキット）によれば、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって、特異性の高い免疫測定法で皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを分子認識して、簡便・迅速に定量分析することが可能となる。このような方法およびキットは、皮膚の光ストレスのレベルの簡便・迅速な判定に有用である。
【００２３】
また本発明の皮膚の光ストレスの判定方法（第１の判定方法、第２の判定方法のいずれもを含む）によれば、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンおよび総タンパク質、または、皮膚カテプシン、皮膚カテプシン阻害物質および総タンパク質を測定し、それぞれの比率を算出することで、皮膚の光ストレスのレベルを迅速に有意に判定することができる。また、これらの方法を行うためのキット（第２のキット、第３のキットのいずれもを含む）によれば、皮膚カテプシンおよび総タンパク質、または、皮膚カテプシン、皮膚カテプシン阻害物質および総タンパク質を１つの試験紙上にドライケミストリーで構成することで、低廉なディスポーザブル・テストストリップを実現できるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
＜皮膚カテプシンの分析方法およびそのためのキット＞
本発明の皮膚カテプシンの分析方法は、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンを、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって分析することを特徴とする。このような本発明の皮膚カテプシンの分析方法によれば、皮膚から採取された試料中における皮膚カテプシンを簡便・迅速に定量分析することができる。
【００２５】
本発明の分析方法において分析の対象となる皮膚カテプシンは、ヒトの皮膚に存在する、光ストレスによる皮膚代謝において角質の生成を担う酵素であり、上述した表１に示したように、皮膚カテプシンＬ、皮膚カテプシンＡ、皮膚カテプシンＢ、皮膚カテプシンＣ、皮膚カテプシンＤ、皮膚カテプシンＥ、皮膚カテプシンＦ、皮膚カテプシンＧ、皮膚カテプシンＨ、皮膚カテプシンＫ、皮膚カテプシンＬ１、皮膚カテプシンＬ２、皮膚カテプシンＯ、皮膚カテプシンＲ、皮膚カテプシンＳ、皮膚カテプシンＴ、皮膚カテプシンＷ、皮膚カテプシンＸなどの種類が知られている。本発明の分析方法では、これらのうちのどの種類の皮膚カテプシンを分析の対象とするものであってもよいが、皮膚から最も高い濃度で採取することができることから、皮膚カテプシンＬを分析の対象とすることが好ましい。
【００２６】
本発明の分析方法において分析に供する皮膚カテプシンを含む試料は、ヒトの皮膚、特にはヒトの皮膚の角質から採取されたものを用いる。試料を採取するヒトの身体の部位は、たとえば腕、顔、手、首などの皮膚が露出している部位であれば特に制限はされないが、最も露出時間が長く、光ストレスを受けやすいことから、腕または顔が好ましい。また試料の採取方法についても特に制限されないが、たとえば粘着層を有するパッド（好適な具体例としてはＤ−Ｓｑｕａｍｅ  Ｄ１００（Ｃｕｄｅｒｍ社製）（直径２２ｍｍ×厚み０．１ｍｍ程度）など）を、上述したようなヒトの身体の部位の皮膚に貼着した後、これを剥離することで、粘着層への付着物を回収することで採取することができる。なお、採取された試料をイムノクロマトグラフィによって分析するに際しては、当該試料を抽出液に溶解させた液体試料を調製する。この抽出液としては、たとえば、酢酸緩衝液中にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含有させた、下記の表２に示す組成（１００ｍＬあたり）を有するものが好適に用いられる。表２に示す例の酢酸緩衝液では、濃度を低濃度（たとえば４ｍＭ）にすることで、その後の濃縮処理による影響を受けにくくしている。また、表２に示す例の酢酸緩衝液は、ｐＨを皮膚カテプシンＬの最適ｐＨである５にしている。
【００２７】
【表２】
0005234453.tif 000003
【００２８】
本発明の分析方法においては、特異性の高い免疫測定法で、試料中に含まれる皮膚カテプシンを分子認識し、局在プラズモン共鳴により試料中に含まれる皮膚カテプシンの検出感度を増加（増感）させるため、たとえば金コロイド、銀コロイドなどの希金属粒子などが用いられる。これらの中でも、化学的安定性の理由から、金コロイドが好ましい。金コロイドは、市販の製品を好適に用いることができ、具体例としては、ＯＤ520＝１２のイムノクロマト用金コロイド原液（ＷＲＧＨ１、（株）ワインレッドケミカル製）などが挙げられる。
【００２９】
金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴によるイムノクロマトグラフィは、具体的には、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートを予め作製し、これをまず、試料（液体試料）中の皮膚カテプシンと抗原抗体反応により結合させ、次に、この皮膚カテプシン−コンジュゲートの結合体を、コンジュゲートの抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体とさらに抗原抗体反応により結合させてトラップし、トラップした結合体を定量分析することで行うことができる。ここで、本発明の皮膚カテプシンの分析方法において、コンジュゲートに用いられる抗体、ならびに、当該コンジュゲートの抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体は、それぞれ市販の製品を好適に用いることができる。
【００３０】
また、本発明における金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴によるイムノクロマトグラフィに用いるイムノクロマト試験紙は、具体的には、以下の手順にて好適に作製することができる。まず、ＯＤ520＝１２のイムノクロマト用金コロイド原液（ＷＲＧＨ１、（株）ワインレッドケミカル製）５００μＬをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．２、２０ｍＭ）５００μＬに加えて２倍希釈し、金コロイド溶液（ＯＤ520＝６）を調製する。この金コロイド溶液１ｍＬに、シリコナイズドチューブ（１．５ｍＬ）中で、皮膚カテプシンＬの抗体（抗カテプシンＬ抗体）溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ａｎｔｉ  Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、型番：ＭＡＢ９５２、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  Ｉｎｃ．製）１００μＬを攪拌しながら加え、４℃で２０分間静置する。その後、カゼインナトリウムを２．５％含んだ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．８）１２３μＬを攪拌しながら加え、再び４℃で２０分間静置する。これを、１４，０００×ｇ、１０℃で１５分間遠心分離する。遠心分離後の上清を除去し、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を１％含んだ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．２）（以下、ＢＳＡ溶液とする）を１ｍＬ加えて懸濁する。再びこれを１４，０００×ｇ、１０℃で１５分間遠心分離し、遠心分離後の上清を除去してＤ（＋）−トレハロース二水和物を５％含んだＢＳＡ溶液２６７μＬを加える。これを金コロイド標識抗体溶液とする。この金コロイド標識抗体溶液に、グラスファイバーパッド（５×５×０．４１ｍｍ3、ＧＦＣＰ１０３０００、ミリポア社製）を浸し、室温で３０分間乾燥させてコンジュゲートパッドを作製する。
【００３１】
次に、ストリップ状にカットしたニトロセルロース膜（５０×５×０．２４ｍｍ3、ＨＦ１２００４ＸＳＳ、ミリポア社製）を作製し、端から２０ｍｍの位置に抗カテプシンＬ抗体（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ａｎｔｉ  Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、型番：ＭＡＢ９５２、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  Ｉｎｃ．製）をライン状に２μＬ塗布する。これを室温で３０分間乾燥させ、次に、カゼインナトリウムを１％含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）をガラスシャーレに満たし、ニトロセルロース膜を入れて５０ｒｐｍで３０分間振盪する。その後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を満たしたガラスシャーレにニトロセルロース膜を浸して３０分間振盪し、洗浄を行う。洗浄終了後、ニトロセルロース膜の表面の水分をキムワイプで吸い取り、室温で３０分間乾燥する。ニトロセルロース膜上に、コンジュゲートパッド、サンプルパッド（５×１０×０．８３ｍｍ3、ＣＦＳＰ２０３０００、ミリポア社製）、吸収パッド（５×５×０．８３ｍｍ3、ＣＦＳＰ２０３０００、ミリポア社製）を重ね、粘着テープで固定することで、イムノクロマト試験紙が好適に作製できる。
【００３２】
ここで、図１は、本発明の好ましい一例の皮膚カテプシンの分析用キット（第１のキット）１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は液体試料８を注入する前の状態、図１（ｂ）は液体試料８を注入した後の状態をそれぞれ模式的に示している。本発明は、上述した本発明の皮膚カテプシンの分析方法に特に有用なキット（第１のキット）であって、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された検出部とが形成された皮膚カテプシン分析用キットについても提供するものである。図１には、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板２上に、液体試料８を滴下するための試料パッド３と、皮膚カテプシンの抗体１３と金コロイド１２とのコンジュゲート１１が予め含浸されたコンジュゲートパッド４と、コンジュゲート１１に用いた抗体１３とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体１４が予め固定された検出部５とが形成された例の本発明の第１のキットを示している。このような本発明の第１のキットにより、金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴によるイムノクロマトグラフィによって、特異性の高い免疫測定法で、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを分子認識して、簡便・迅速に定量分析を行うことができる、低廉なディスポーザブル・テストストリップが提供される。
【００３３】
本発明の第１のキット１に用いられる基板２は、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成される。このような基板２を形成する材料としては、たとえば上述したようなストリップ状にカットしたニトロセルロース膜、セルロース膜などが好適に用いられるが、これに限定されるものではない。また、ポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ガラスなどで形成されたベース基板上に、ニトロセルロース膜が形成されて、基板２が実現されていてもよい。
【００３４】
試料パッド３は、液体試料８を注入した際に、当該液体試料８中に含まれる、分析対象である皮膚カテプシンが当該試料パッド３を通過し、基板２に到達するように構成される。より精度の高い競合反応を行うことができるようになる観点からは、試料パッド３は、皮膚から採取された液体試料８中に含まれる分子量が比較的大きい夾雑物（たとえばムチン、ペクリル、リゾチームなど）をろ過または吸着により除去し得るような材料で形成されることが好ましい。このような分子量が比較的大きい夾雑物をろ過または吸着し得るような試料パッド３の形成材料としては、たとえば、ガラス繊維、セルロースなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。なお、図１に示す例では、試料パッド３をコンジュゲートパッド４とは別に設けた例を示しているが、コンジュゲートパッド４に液体試料を直接注入して、コンジュゲートパッド４が試料パッドを兼ねるように構成されていても勿論よい。
【００３５】
コンジュゲートパッド４には、上述した金コロイド１２と皮膚カテプシンの抗体１３とのコンジュゲート１１が予め含浸されている。ここで、図２（ａ）は、本発明の第１のキット１のコンジュゲートパッド４における抗原抗体反応、図２（ｂ）は、本発明の第１のキット１の検出部５における抗原抗体反応を模式的に示す図である。図１（ｂ）に示したように、上述した試料パッド３に液体試料８が注入された場合、液体試料８はまずコンジュゲートパッド４に移動し、コンジュゲートパッド４中に予め含浸されていた金コロイド１２と皮膚カテプシンの抗体１３とのコンジュゲート１１が液体試料８に溶け込む。これによって、図２（ａ）に示すように、コンジュゲートパッド４において、皮膚カテプシン９とコンジュゲート１１の抗体１３とが抗原抗体反応し、皮膚カテプシン９とコンジュゲート１１との結合体が形成される。このようなコンジュゲートパッド４を形成する材料としては、試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料が同様に好適に用いることができる。なお、コンジュゲート１１をコンジュゲートパッド４に予め含浸させておく方法としては、従来公知の適宜の方法を適用でき、特に制限されないが、たとえば上述したような方法が好適である。
【００３６】
本発明の第１のキット１における検出部５には、上述したようにコンジュゲート１１に用いられた皮膚カテプシンの抗体１３とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体１４が予め固定されている。抗体１４は、たとえば共有結合、イオン結合、配位結合、ファンデルワールス力などの化学的な結合による固定、コーティングなどの被膜形成などの従来公知の適宜の手法を用いて、検出部５に固定することができる。上述したようにコンジュゲートパッド４における抗原抗体反応で形成された皮膚カテプシン９とコンジュゲート１１との結合体は、毛細管現象によって水平方向に概ね沿って検出部５まで移動し、検出部５において、図２（ｂ）に示すように、抗体１４と抗原抗体反応を起こし、検出部５にトラップされる。
【００３７】
図３は、図１に示した例の本発明のキット１の検出部５における皮膚カテプシン量の測定を模式的に示す図であり、図３（ａ）は斜視図、図３（ｂ）は断面図である。上述したように皮膚カテプシン９とコンジュゲート１１との結合体は、毛細管現象によって水平方向に概ね沿って検出部５まで移動し、検出部５に予め固定されていた抗体１４にトラップされる。このトラップされた皮膚カテプシン９とコンジュゲート１１と抗体１４との結合体について、図３に示すような発光素子２１、受光素子２２を備え、さらに化学反応、発色濃度の安定化のための温度制御機構２３が内蔵された光学式測定器を用いて、皮膚カテプシンを定量的に分析する。すなわち、検出部５にトラップされた結合体に、発光素子２１から光を照射し、その反射光を受光素子２２にて受光して結合体中における金コロイドの濃度測定を行うことで、トラップされた皮膚カテプシンを定量的に分析することができる。
【００３８】
なお、本発明の第１のキット１は、通常、検出部５に関し、試料パッド３とは反対側の基板２の端部に吸収パッド１０が設けられる。この吸収パッド１０は、毛細管現象によって水平方向に概ね沿って移動し、検出部５を通過した後の液体試料を吸収するためのものであり、上述した試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料にて形成された吸収パッド１０を好適に用いることができる。
【００３９】
＜皮膚の光ストレスの判定方法（第１の判定方法）およびそのためのキット＞
本発明はまた、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンおよび総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比から皮膚の光ストレスを判定する方法（第１の判定方法）についても提供する。本発明の第１の判定方法によれば、皮膚カテプシンおよび総タンパク質を測定し、その比率を算出することで、皮膚の光ストレスのレベルを迅速に有意に判定することができる。ここで、「総タンパク質」とは、皮膚から採取された試料中におけるタンパク質の総量を指し、この総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比率が低い場合には、急性ストレスが低いと判定することができ、逆に、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比率が高い場合には、急性ストレスが高いと判定することができる（総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比率と急性ストレスとの相関関係については、たとえば非特許文献３などを参照）。
【００４０】
なお、本発明の第１の判定方法において、試料の採取は本発明の皮膚カテプシンの分析方法において上述したのと同様の手法にて行うことができ、また、測定する皮膚カテプシンの種類も同様の理由から皮膚カテプシンＬが好ましい。また本発明の第１の判定方法において、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを測定する方法は、特に制限されるものではなく、局在プラズモン共鳴を用いた免疫クロマトグラフィ、マイクロ電気泳動、表面プラズモン共鳴などの適宜の手法を用いることができるが、簡便性、迅速性の観点からは、上述した本発明の皮膚カテプシンの分析方法と同様に、金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴による免疫クロマトグラフィを利用することが、好ましい。
【００４１】
また本発明の第１の判定方法において、皮膚から採取した試料中に含まれる総タンパク質を測定する方法としては、特に制限されないが、たとえば、橋本ら、「テトラブロモフェノールを用いる尿タンパク質の吸光光度定量及び目視定量」、分析化学、Vol.54、No.9、2005、783-788頁（非特許文献５）に記載されたような、酸塩基指示薬を利用する方法が好適に採用できる。たとえば、酸塩基指示薬の１つであるテトラブロモフェノールブルー（Ｃ19Ｈ10Ｂｒ4Ｏ5Ｓ、ＴＢＰＢ、分子量：６６９．９６）は、水溶液中でＨ2ＴＢＰＢ、ＨＴＢＰＢ-、もしくはＴＢＰＢ2-として存在する。非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下では、次式（Ａ）の状態でミセル内に溶解する。次に、この酸塩基指示薬にタンパク質を加えると、次式（Ｂ）の反応が起こる。このような反応によって、酸塩基指示薬は、タンパク質濃度に応じて、黄色から深緑色に変化するため、この色の変化を観察することで、皮膚から採取した試料中に含まれる総タンパク質を定量的に分析することが可能となる。
【００４２】
ＨＴＢＰＮＢ-＋xＴｒｉｔｏｎＸ−１００
→（ＨＴＢＰＢ-・xＴｒｉｔｏｎＸ−１００）m    （Ａ）
y（ＨＴＢＰＢ-・xＴｒｉｔｏｎＸ−１００）m＋Ｐｒｏｔｅｉｎ
→〔y（ＨＴＢＰＢ-・xＴｒｉｔｏｎＸ−１００・Ｐｒｏｔｅｉｎ）m    （Ｂ）
（上記式（Ａ）、（Ｂ）において、ｘはＨＴＢＰＢ-  １ｍｏｌを取り込むＴｒｉｔｏｎＸ−１００のモル数、ｙはＰｒｏｔｅｉｎ  １ｍｏｌと反応するＨＴＢＰＢ-のモル数、ｍはミセルを表す。）
ここで、図４は、本発明の好ましい一例の皮膚の光ストレスの判定用キット（第２のキット）５１を模式的に示す斜視図であり、図４（ａ）は外観図、図４（ｂ）は図４（ａ）の状態からハウジング５２を取り除いた上体を示す図である。本発明は、上述した本発明の第１の判定方法を好適に行い得るキットであって、図４に示すように、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板５５上に、液体試料５４を滴下するための試料パッド５３と、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッド５６と、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された第１の検出部５７と、酸塩基指示薬を含む第２の検出部５８とが形成されたキット５１についても提供する。このような本発明の第２のキットにより、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって、特異性の高い免疫測定法で、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを分子認識して定量分析を行うとともに、当該試料中の総タンパク質についても同時に測定し、皮膚の光ストレスを簡便・迅速に判定することができる、低廉なディスポーザブル・テストストリップが提供される。
【００４３】
本発明の第２のキット５１において、基板５５、試料パッド５３、コンジュゲートパッド５６および第１の検出部５７は、本発明の第１のキット１において上述した基板２、試料パッド３、コンジュゲートパッド４および検出部５についてそれぞれ上述したとおりであり、コンジュゲートパッド５６に用いる金コロイド、皮膚カテプシンの抗体、検出部５７に用いる皮膚カテプシンの抗体もそれぞれ同様である。本発明の第２のキット５１では、図４に示すように、基板５５の中央付近に液体試料５４を注入するための試料パッド５３が設けられ、基板５５の約半分には、上述したコンジュゲートパッド５６および第１の検出部５７が形成され、液体試料中の皮膚カテプシンを定量的に分析できるように構成されているとともに、基板５５の残りの約半分には、酸塩基指示薬を含む第２の検出部５８が形成され、液体試料中の総タンパク質を同時に測定できるように構成されていることを特徴とする。
【００４４】
ここで、第２の検出部５８には、たとえば、上述した酸塩基指示薬の１つであるテトラブロモフェノールブルーを利用した総タンパク試験紙が設置される。この総タンパク試験紙は、たとえば、まず、（１）テトラブロモフェノールブルーをエタノールに溶解し、７４μＭとしたＴＢＰＢ溶液、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を水に溶解した１％界面活性剤溶液、０．５Ｍの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を調製した後、（２）ＴＢＰＢ溶液：界面活性剤溶液：緩衝液＝５：１：５の割合で混合して指示薬を調整した後、（３）指示薬をろ紙に含浸し、温度１５℃、湿度１５％で２０分間乾燥させることで好適に作製することができる。
【００４５】
＜皮膚の光ストレスの判定方法（第２の判定方法）およびそのためのキット＞
本発明はさらに、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシン、皮膚カテプシン阻害物質および総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比、総タンパク質に対する皮膚カテプシン阻害物質の比および皮膚カテプシン阻害物質に対する皮膚カテプシンの比から皮膚の光ストレスを判定する方法（第２の判定方法）についても提供する。本発明の第２の判定方法によれば、皮膚カテプシン、皮膚カテプシン阻害物質および総タンパク質を測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシンの比率、総タンパク質に対する皮膚カテプシン阻害物質の比率および皮膚カテプシン阻害物質に対する皮膚カテプシンの比率をそれぞれ算出することで、以下の表３に示す相関関係から、急性ストレスについてだけでなく、慢性ストレスについても迅速に有意に判定することができる。なお、下記表３に示す相関関係については、たとえばWelss T et al., 「Hurpin is a selective inhibitor of lysosomal cathepsin L and protects keratinocytes from ultraviolet-induced apoptosis」、Biochemistry 42(24)、2003、7381−7389頁（非特許文献６）などを参照できる。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
本発明の第２の判定方法においても、試料の採取は本発明の皮膚カテプシンの分析方法において上述したのと同様の手法にて行うことができ、また、測定する皮膚カテプシンの種類も同様の理由から皮膚カテプシンＬが好ましい。また本発明の第２の判定方法においても、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを測定する方法は、特に制限されるものではなく、局在プラズモン共鳴を用いた免疫クロマトグラフィ、マイクロ電気泳動、表面プラズモン共鳴などの適宜の手法を用いることができるが、簡便性、迅速性の観点からは、上述した本発明の皮膚カテプシンの分析方法と同様に、金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴による免疫クロマトグラフィを利用することが好ましい。また、本発明の第２の判定方法でも、皮膚から採取された試料中の総タンパク質を測定する方法については特に制限されないが、上述した本発明の第１の判定方法と同様に、酸塩基指示薬を利用する方法が好適である。
【００４８】
本発明の第２の判定方法によれば、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシン阻害物質についても測定し、総タンパク質に対する皮膚カテプシン阻害物質の比および皮膚カテプシン阻害物質に対する皮膚カテプシンの比も判定材料とする。ここで、上述した非特許文献６には、皮膚カテプシンＬ（ＣａｔＬ）は、皮膚のアポトーシスを進める酵素であるが、一方で、紫外線刺激によって引き起こされるアポトーシスの結果生じる皮膚の角質化は、Ｈｕｒｐｉｎ（ｈｅａｄｐｉｎ、ＰＩ１３もしくはｓｅｒｐｉｎ）という阻害物質（ｉｎｈｉｂｉｔＣａｔＬ）により防止されることが指摘されている。すなわち、紫外線による皮膚細胞のダメージの程度により、ＣａｔＬとｉｎｈｉｂｉｔＣａｔＬの分泌バランスが変わり、その結果、皮膚細胞のアポトーシスが調節されている可能性が示唆されている。したがって、被験者の皮膚に引き起こされた光ストレスが、急性的なものか慢性的なものかは、皮膚カテプシン／カテプシン阻害物質比を求めることで、より正確に判断できる可能性がある。
【００４９】
本発明の第２の判定方法において、測定の対象となる皮膚カテプシン阻害物質としては特に制限されず、Ｈｕｒｐｉｎなどが挙げられる。
【００５０】
皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシン阻害物質は、たとえば、金コロイドを用いた局在プラズモン共鳴による免疫クロマトグラフィ、マイクロ電気泳動、表面プラズモン共鳴などの適宜の手法を用いて測定することができ、その測定方法は特に制限されないが、簡便性、迅速性の観点からは、皮膚から採取した試料中に含まれる皮膚カテプシンを測定する場合と同様に、免疫クロマトグラフィを利用することが好ましい。この場合、皮膚カテプシン阻害物質の抗体は、市販品を好適に用いることができる（具体例は上述）。
【００５１】
本発明はさらに、上述した本発明の第２の判定方法を好適に行い得るキットであって、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、液体試料を滴下するための試料パッドと、皮膚カテプシンの抗体と金コロイドとのコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コンジュゲートに用いた抗体とは異なる部位を認識する皮膚カテプシンの抗体が予め固定された第１の検出部と、酸塩基指示薬を含む第２の検出部と、皮膚カテプシン阻害物質の抗体が予め固定された第３の検出部とが形成されたキット（第３のキット）についても提供する。このような本発明の第３のキットによっても、局在プラズモン共鳴を用いたイムノクロマトグラフィによって、特異性の高い免疫測定法で、皮膚から採取された試料中の皮膚カテプシンを分子認識して定量分析を行うとともに、当該試料中の総タンパク質および皮膚カテプシン阻害物質についても同時に測定し、皮膚の光ストレスを簡便・迅速に判定することができる、低廉なディスポーザブル・テストストリップが提供される。
【００５２】
本発明の第３のキットにおいて、基板、試料パッド、コンジュゲートパッド、第１の検出部および第２の検出部は、本発明の第２のキット５１において上述した基板、試料パッド、コンジュゲートパッドおよび第１の検出部、第２の検出部についてそれぞれ上述したとおりであり、コンジュゲートパッドに用いる金コロイド、皮膚カテプシンの抗体、第１の検出部に用いる皮膚カテプシンの抗体、第２の検出部に用いる総タンパク試験紙などももそれぞれ同様である。本発明の第３のキットは、たとえば、基板の中央付近に液体試料を注入するための試料パッドが設けられ、基板は、試料パッドを中心に概ね３つの領域に分けられ、その約３分の１の部分には、上述したコンジュゲートパッドおよび第１の検出部が形成され、液体試料中の皮膚カテプシンを定量的に分析できるように構成され、また約３分の１の部分には、上述した総タンパク試験紙が設けられた第２の検出部が形成され、液体試料中の総タンパク質を定量的に分析できるように構成されているとともに、さらに、残る約３分の１の部分には、第３の検出部が形成され、液体試料中の皮膚カテプシン阻害物質を定量的に分析できるように構成されている。
【００５３】
ここで、第３の検出部には、たとえば、皮膚カテプシン阻害物質（好適には、上述したＨｕｒｐｉｎ）の抗体が予め固定されている。抗体は、たとえば共有結合、イオン結合、配位結合、ファンデルワールス力などの化学的な結合による固定、コーティングなどの被膜形成などの従来公知の適宜の手法を用いて、第３の検出部に固定することができる。
【００５４】
今回開示された実施の形態は全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内で全ての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
皮膚カテプシンは、光ストレスによる皮膚代謝において、角質の生成を担う酵素であり、ヒトの角質に含まれる皮膚カテプシンの簡便・迅速な分析が実現されれば、皮膚の光ストレスの定量評価に有用である。また、本技術は、皮膚カテプシンだけでなく他の皮膚酵素の迅速分析にも寄与すると考えられ、化粧品・医療分野での応用範囲は広い。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の好ましい一例の皮膚カテプシンの分析用キット（第１のキット）１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は液体試料８を注入する前の状態、図１（ｂ）は液体試料８を注入した後の状態をそれぞれ模式的に示している。
【図２】図２（ａ）は、本発明の第１のキット１のコンジュゲートパッド４における抗原抗体反応、図２（ｂ）は、本発明の第１のキット１の検出部５における抗原抗体反応を模式的に示す図である。
【図３】図１に示した例の本発明のキット１の検出部５における皮膚カテプシン量の測定を模式的に示す図であり、図３（ａ）は斜視図、図３（ｂ）は断面図である。
【図４】本発明の好ましい一例の皮膚の光ストレスの判定用キット（第２のキット）５１を模式的に示す斜視図であり、図５（ａ）は外観図、図５（ｂ）は図５（ａ）の状態からハウジング５２を取り除いた上体を示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
１  キット、２  基板、３  試料パッド、４  コンジュゲートパッド、５  検出部、８  液体試料、９  皮膚カテプシン、１０  吸収パッド、１１  コンジュゲート、１２  金コロイド、１３  皮膚カテプシンの抗体、１４  皮膚カテプシンの抗体、２１  発光素子、２２  受光素子、５１  キット、５２  ハウジング、５３  試料パッド、５４  液体試料、５５  基板、５６  コンジュゲートパッド、５７  第１の検出部、５８  第２の検出部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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