(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：５’−（Ｇ）ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）Ｎ−３’で示される塩基配列からなり、
（式中、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンである。Ｘ及びＹは相互に独立した０〜７ヌクレオチド長でかつ４塩基以上の連続したグアニンを含まない任意の配列であり、Ｘ＋Ｙの長さは７または８ヌクレオチド長である。ＸＣＧＹは長さが少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含み、長さが９または１０ヌクレオチド長である。Ｐ及びＱはグアニン以外の相互に独立した１ヌクレオチドであり、Ｍは６〜８の整数であり、Ｎは０〜３の整数である。なお、ＸとＹのヌクレオチド長は必ずしも同じでなくとも良い。）
全長が１７〜２３ヌクレオチド長であり、
前記式で示される塩基配列が、配列番号６、７、１０、１５〜１７、２４、２６、２８、３０、４０、４２、４８、５０〜５２、９５及び９７からなる群より選ばれる塩基配列からなるものである、免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
全て又は一部のヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
５'−末端の連続するＧ配列のヌクレオチド残基間の少なくとも一部のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、請求項２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
３'−末端のヌクレオチド残基間の少なくとも一部のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、請求項２または３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、アレルギー疾患の治療、又は予防剤。
【請求項７】
前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である、請求項６に記載のアレルギー疾患の治療、又は予防剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む、ワクチン。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、肝炎の治療、又は予防剤。
【請求項１０】
前記肝炎がウイルス性肝炎である請求項９に記載の肝炎の治療、又は予防剤。
【請求項１１】
前記ウイルス性肝炎がＢ型あるいはＣ型肝炎である請求項１０に記載の肝炎の治療、又は予防剤。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、アレルギー疾患の治療、又は予防剤としての使用。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、ワクチンのアジュバントとしての使用。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、肝炎の治療、又は予防剤としての使用。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを、ワクチンに対するアジュバントとして利用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド及びその医薬用途に関し、詳しくは、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性が増強され、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減された新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチドを含む医薬品とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
徳永らによって特定のタイプの細菌性ＤＮＡは免疫応答を刺激することが報告されている（Yamamotoら  Jpn．J．Cancer  Res．1988  79：866-873）。免疫刺激活性に必須な細菌性ＤＮＡの主成分は、メチル化修飾を受けていないＣｐＧジヌクレオチドモチーフ（以下ＣｐＧと記す）を含む特徴的な短い配列構造である。合成したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドについても、マクロファージ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−γの産生を誘導し、ＮＫ細胞の細胞障害活性を有することが報告されている（特開平４−３５２７２４号公報）。また、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはマクロファージのみならず、樹状細胞やＢ細胞等にも作用し、細胞増殖活性、炎症性サイトカインのインターロイキン−１２（以下、ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−α（以下、ＴＮＦ−α）の産生、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）の産生を誘導することが報告されている（Klinmanら  Proc．Natl．Acad．Sci．1996  93：2879-2883）。このことから、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは細胞性免疫を誘導し、かつＴｈ１応答を誘導するため、ワクチンのアジュバントあるいはアレルギー性疾患の治療に有用であるが、一方では、ＴＮＦ−αやＩＬ−６の産生誘導により敗血症、発熱、関節痛、筋肉痛や発赤等の副作用を誘発する可能性も否定できない。【０００３】
徳永らはマウスＮＫ細胞の細胞障害活性において、６塩基パリンドロームモチーフからなるＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが強い活性を有することを見出し、５'−ＡＡＣＧＴＴ−３'（配列番号９２）、５'−ＡＧＣＧＣＴ−３'（配列番号９３）、５'−ＧＡＣＧＴＣ−３'（配列番号６１）の配列が最も強いことを報告している（Yamamotoら  J．Immunol．1992  148：4072-4076）。また、他のタイプの免疫調節オリゴヌクレオチド配列も報告されている（国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレット、国際公開第２００３／０１５７１１号パンフレット、国際公開第２００４／０５８１７９号パンフレット）。【０００４】
オリゴヌクレオチドの活性増強を目的とした研究も行われている。徳永らはＣｐＧを含む６塩基パリンドロームモチーフの外側にデオキシグアニル酸の繰り返し構造（ポリＧ配列）を挿入するとＮＫ細胞活性とＩＦＮ誘導活性が増強することを見出している（特開平４−３５２７２４号公報）。また、ＣｐＧを含む６塩基配列の外側の配列が少なからず活性に影響を及ぼすことが明らかになっている。【０００５】
その他の公知のＣｐＧ含有配列としては、Ｄ−タイプ（あるいはＡ−タイプ）及びＫ−タイプ（あるいはＢ−タイプ）の免疫刺激オリゴヌクレオチドがある（国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット）。Ｋ−タイプはＢ細胞を活性化することが知られている。Ｄ−タイプはＣｐＧを含むパリンドローム配列の外側にポリＧ配列が付加されており、樹状細胞のＩ型ＩＦＮの産生を誘導し、ヒトＮＫ細胞を活性化させる。Ｄ−タイプのＩＦＮ誘導活性については３'末端側が重要とされており、３'末端側のポリＧ配列の長さは４塩基以上必要である（国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット）。一方、炎症性サイトカインＩＬ−１２やＴＮＦ−αの産生誘導活性においても３'末端側のポリＧ配列が重要であり、その効果の発現には少なくとも４塩基以上のポリＧ配列が必要とされている（大韓民国ＫＲ２００１−０６３１５３号公報）。従って、公知の免疫刺激活性を向上させるオリゴヌクレオチドの配列、又はポリＧ配列の構造はＩＦＮ誘導と炎症性サイトカイン誘導の独立性を明らかにしていない。【０００６】
パリンドロームモチーフが５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）である免疫刺激ヌクレオチドは、１０個までの最適な長さのポリＧ配列を５'末端と３'末端に挿入することにより、従来の非修飾型（修飾型の効果は後述している）のＣｐＧ含有免疫刺激ヌクレオチドよりも強力なＩＦＮ−α誘導活性を有することが見出されている（特開２００５−２３７３２８号公報）。５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）を有する免疫刺激ヌクレオチドに高いＩＦＮ−α誘導活性をもたらすにはＧを３'末端側または５'末端側に８〜１０個置くほうがよいが、免疫制御性サイトカインであるインターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０）の産生を抑えるには５'末端側に偏在させるとよいことが開示されている（特開２００５−２３７３２８号公報）。また、炎症性サイトカインＴＮＦ−αやＩＬ−１２の誘導活性は、ＩＦＮ−α誘導活性と緩やかに相関することが報告されている。これらのことは、５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）以外のパリンドロームモチーフにおいて５'末端側へのポリＧ配列挿入の効果を明らかにしていない。また、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの炎症性サイトカイン誘導活性が減弱し、かつＩＦＮ−γとＩＦＮ−αの両方のＩＦＮ誘導活性が増強する最適なポリＧ配列の塩基数は開示されていない。【０００７】
従来のＤ−タイプＣｐＧよりも高い免疫刺激活性を有するオリゴヌクレオチドとして５'−ＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１）が見出されている（特願２００４−２８７１０２号公報）。この塩基配列の１個ないし数個の塩基が置換された誘導体についても開示されている。３個以上変換した具体的配列は開示されていないが、唯一７塩基を置換した５'−ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ−３'（配列番号５）は、３'末端のポリＧ配列が３塩基でもＩＦＮ誘導活性を有することが見出されている（国際公開第２００６／０３５９３９号パンフレット）。【０００８】
その他の活性増強を目的とした研究としては、オリゴヌクレオチドの化学修飾による安定化が知られている。天然に存在するホスホジエステルヌクレオチドは細胞内及び細胞培地中において様々な核酸分解活性によって分解されやすい。そのため、核酸分解活性の攻撃標的であるヌクレオチド間のホスホジエステル結合を置換することによる安定化、さらにその結果としての活性増加の検討が行われている。頻繁に用いられている置換方法としては、ホスホロチオエートへの置換である。Ｋｌｉｎｍａｎらの研究では、免疫刺激オリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフの外側のポリＧ配列をホスホチロオエート修飾することにより、免疫応答の誘導が増強されることを示している（国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット）。【０００９】
非メチル化ＣｐＧを含む細菌性ＤＮＡの受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーの一つＴＬＲ９であることがＴＬＲ９ノックアウトマウスを用いた研究において見出されている（Hemmiら  Nature  2000  408：740-745）。また、ヒトＴＬＲ９とマウスＴＬＲ９を活性化する最適なＣｐＧ配列は異なることが示され、種特異性の存在も明らかにされている（Bauerら  PNAS  2001  98（16）：9237-9242）。ヒトへの治療を目的とした開発においては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがヒトＴＬＲ９に高親和性を示すことが必須であるが、一方では開発段階における動物を用いた前臨床試験においてマウスなど動物に作用することも重要である。【００１０】
アレルギー性疾患の治療では現在多用されている対症療法ではなく、免疫調節型でかつ有効な根治療法が望まれている。アレルギー患者はアレルゲンに対する免疫応答がＴｈ２に偏っており、Ｔｈ１免疫応答が抑制されている。従って、Ｔｈ１免疫応答を誘導し、Ｔｈ２免疫反応を抑制する治療剤はアレルギー体質の改善に有用である。ある種の非パリンドローム配列からなるＣｐＧオリゴヌクレオチド（特開２００３−２８６１７４号公報）や６塩基パリンドローム５'−ＡＡＣＧＴＴ−３'を含むＣｐＧオリゴヌクレオチド（特表２００２−５００１５９号公報、Tigheら  J．Allergy  Clin．Immunol．2000  106：124-134）はマウス喘息モデルにおいて治療効果を有することが開示されている。しかしながら、上記の免疫刺激オリゴヌクレオチドはＴｈ１反応を誘導するのみならず、炎症性サイトカインを誘発するため、薬理作用上、有効な用量を投与した場合、好ましくない副作用が発現することが懸念される。【００１１】
アレルギー症状は肥満細胞がヒスタミン等を含む顆粒を細胞外に放出（脱顆粒）することが原因であり、この脱顆粒は肥満細胞上のＩｇＥとアレルゲンが結合した結果として、引き起こされる。近年、抗原特異的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、その免疫バランスを保持する機能において注目されている。例えば、ＴｒｅｇによるＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩを介した脱顆粒の抑制などが挙げられる（Tillら  J．Allergy  Clin．Immunol．2004  113：1025-1034）。また、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βはＩＬ−１０の産生誘導を促進することが示されている（Amanら  Blood．1996  87：4731-4736）。さらに、ＩＬ−１０はＩｇＧ４やＩｇＡ産生細胞の分化誘導を促進することから、免疫刺激ヌクレオチドによるアレルギー治療効果はＩＬ−１０の誘導もその機序の一つであると考えられている。従って、アレルギー治療に好適な免疫刺激ヌクレオチドは、ＩＦＮ−α誘導活性が増強され、ＩＬ−１０誘導活性も維持していることが望ましい。【００１２】
肝炎とは、ウイルス、アルコール、薬物、毒素及び自己免疫性などの原因で誘発された肝臓の炎症を含む症患を指す。【００１３】
肝炎ウイルスによる肝炎が大多数を占め、特にＡ，Ｂ，Ｃ型が多いが、他にもＤ，Ｅ，Ｆ，Ｇ型、及び特発性肝炎ウイルスの存在が知られている。また、上記の肝炎ウイルスはＲＮＡ型，ＤＮＡ型など多数の異なるウイルス・ファミリーの間に広がっている。【００１４】
Ｂ型ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）はそれぞれ急性及び慢性感染を引き起こす。急性肝炎は初期感染や慢性的な感染者における再発に伴って症状が現れる。一方、慢性のＣ型肝炎においては、６ヵ月以上にわたって肝臓の炎症が続き、細胞が破壊され、肝機能の低下を伴う。ＨＣＶ感染では、急性肝炎から慢性肝炎への進行の危険性が高いことも問題である。このような状況から、肝炎ウイルス感染症に対する治療の早期介入と効果の高い治療法の開発が望まれている。【００１５】
Ｃ型肝炎においては種々のインターフェロン（以下、ＩＦＮ）製剤の単独治療やＩＦＮ−α製剤とリバビリンとの併用療法が治療手段の第一選択と成っている。併用治療は、単剤治療より持続的反応が期待出来る反面、より高価で、より多くの副作用を伴う。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。このような状況から、さらなる治療薬の開発が望まれている。【００１６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの肝炎治療における効果としては、インターフェロン誘導による抗ウイルス効果の増強と、ウイルス感染細胞に対する細胞性免疫の誘導及び耐性株の出現に対する抵抗性などが挙げられる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＨＢＶあるいはＨＣＶ感染による肝炎治療用途に関しては、特表２００３−５２６６６２号公報および特表２００６−５１５２７７号公報における技術情報がある。前者はＣｐＧオリゴヌクレオチド（免疫活性化配列：ＩＳＳ）を肝炎ウイルス抗原と一緒には投与せずに治療する方法について開示している。後者はインターフェロン療法などの抗ウイルス剤が無効であった慢性Ｃ型肝炎の個体を処置する方法について開示しており、患者での有用性に関して開発番号ＣｐＧ１０１０１による臨床試験成績が２００６年欧州肝臓学会他において開示されている。しかしながら、臨床試験成績から、ＣｐＧ１０１０１の単剤治療の効果は従来の治療法と比べると極めて不十分であり、ペグ化修飾ＩＦＮ−α製剤とリバビリンとＣｐＧオリゴヌクレオチドの３剤の併用治療は、標準的な治療法であるペグ化修飾ＩＦＮ−α製剤とリバビリンの成績と比較して若干の有効性の向上は期待できるが、他の抗ウイルス剤との併用（例えばポリメラーゼやプロテアーゼなどウイルス酵素の阻害剤との併用治療）と比べて十分な治療効果が得られないことが既に明らかにされている。【００１７】
また、既存のＣｐＧオリゴヌクレオチドは炎症性のサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１２やＩＬ−６の産生誘導により敗血症、発熱、関節痛、筋肉痛や発赤や予期しない副作用を誘発する可能性も否定できず、実際にマウスの肝炎モデルを用いた試験例から肝炎の症状を悪化させることが示されている（Abeら  Fukushima  J.  Med.  Sci.  2005  51：41-49）。したがって、肝炎治療に適した免疫刺激活性が向上し、かつ副作用が低減されたＣｐＧオリゴヌクレオチドの創出が望まれている。【００１８】
免疫刺激オリゴヌクレオチドの活性に依存して、投与量、投与回数を減らすことが可能となり、その結果、毒性作用が発生する可能性の低下、また、ＱＯＬを上昇させる可能性が極めて高い。
以上のことから、ヒトにおいて、上述した既存の免疫刺激配列と比較して、ＩＦＮ誘導活性が向上し、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減した配列を見出すことは、産業利用上、非常に有用であり、有益性が極めて高い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性が増強され、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減された新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド及びこの免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む医薬品とその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らはこの課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ＩＦＮ誘導活性において、ＣｐＧモチーフを含む配列の外側の５'−末端側が重要であることを見出した。すなわち、６塩基以上の連続したグアニン配列の５’末端側への挿入により、インターフェロン誘導活性がそれ以外のものよりも優れたオリゴヌクレオチドが得られることを確認した。更に検討を進めた結果、ポリＧ配列が５'−末端側には塩基数が６乃至１０の長さで挿入され、３’−末端側には塩基数が０乃至３の長さで挿入されており、かつ所定の構造的特徴を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、従来知られているＤ−タイプＣｐＧ配列からなるオリゴヌクレオチドよりもＩ型ＩＦＮ、すなわちＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βとＩＦＮ−γ誘導活性が増強されており、炎症性サイトカイン誘導活性が低減しており、更に高いＩｇＥ産生抑制活性、Ｔｈ２抑制活性、およびＴｈ１誘導活性を有することを見出した。これらに加えて、肝炎モデルマウスにおける試験の結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝炎治療効果をも有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００２１】
すなわち、本発明は、以下の各発明を提供するものである。
〔１〕  式：５’−（Ｇ）MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）N−３’で示される塩基配列からなり、
（式中、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンである。Ｘ及びＹは相互に独立した０乃至１０ヌクレオチド長でかつ４塩基以上の連続したグアニンを含まない任意の配列であり、Ｘ＋Ｙの長さは６乃至２０ヌクレオチド長である。ＸＣＧＹは長さが少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含み、長さが８乃至２２ヌクレオチド長である。Ｐ及びＱはグアニン以外の相互に独立した１ヌクレオチドであり、Ｍは６乃至１０の整数であり、Ｎは０乃至３の整数である。なお、ＸとＹのヌクレオチド長は必ずしも同じでなくとも良い。）
全長が１６乃至３７ヌクレオチド長である（但し、配列番号５記載の塩基配列（ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ）からなるものを除く。）ことを特徴とする、免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔２〕  前記Ｍが６乃至８の整数であり、かつ全長が１６乃至３５ヌクレオチド長である、〔１〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔３〕  前記ＸＣＧＹの長さが９または１０ヌクレオチド長であり、かつ全長が１７乃至２３ヌクレオチド長である、〔１〕または〔２〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔４〕  前記ＸＣＧＹがＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）、ＡＴＣＧＡＴ（配列番号６０）およびＧＡＣＧＴＣ（配列番号６１）から選ばれるいずれか一つの塩基配列を含む、〔１〕乃至〔３〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔５〕  前記ＸＣＧＹがＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）を含む、〔１〕乃至〔３〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔６〕  前記ＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）を含む免疫刺激オリゴヌクレオチドが配列番号６、７、９乃至１１及び１５乃至１８、２２、２４、２６、２８、４８、５０乃至５２、５４、９５及び９７に示される塩基配列からなる〔４〕又は〔５〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔７〕  前記ＣＧＡＴＣＧ（配列番号６０）を含む免疫刺激オリゴヌクレオチドが配列番号３０に示される塩基配列からなる〔４〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔８〕  前記ＣＧＡＴＣＧ（配列番号６１）を含む免疫刺激オリゴヌクレオチドが配列番号４０及び４２に示される塩基配列からなる〔４〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔９〕  配列番号６、７、１０及び１５乃至１７、２４、２６、２８、４８、５０乃至５２、９５および９７に示される塩基配列からなる〔４〕又は〔５〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔１０〕  全て又は一部のヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、〔１〕乃至〔９〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔１１〕  ５'−末端の連続するＧ配列のヌクレオチド残基間の少なくとも一部のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、〔１０〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔１２〕  ３'−末端のヌクレオチド残基間の少なくとも一部のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されている、〔１０〕または〔１１〕に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。
〔１３〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、医薬。
〔１４〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、アレルギー疾患の治療、又は予防剤。
〔１５〕  前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である、〔１４〕に記載のアレルギー疾患の治療、又は予防剤。
〔１６〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む、ワクチン。
〔１７〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、肝炎の治療、又は予防剤。
〔１８〕  前記肝炎がウイルス性肝炎である〔１７〕に記載の肝炎の治療、又は予防剤。
〔１９〕  前記ウイルス性肝炎がＢ型あるいはＣ型肝炎である〔１８〕に記載の肝炎の治療、又は予防剤。
〔２０〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、アレルギー疾患の治療、又は予防剤としての使用。
〔２１〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、ワクチンのアジュバントとしての使用。
〔２２〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、肝炎の治療、又は予防剤としての使用。
〔２３〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、アレルギー疾患の治療、又は予防方法。
〔２４〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを、ワクチンに対するアジュバントとして利用する方法。
〔２５〕  〔１〕乃至〔１２〕のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドの、肝炎の治療、又は予防方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明で提供される新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ誘導活性が増強され、炎症性サイトカイン誘導活性が低減され、また、高いＩｇＥ産生抑制活性、Ｔｈ２抑制活性、およびＴｈ１誘導活性を有しているなど、優れた免疫刺激活性を有するため、高い治療効果を有する。また、肝炎モデルマウスにおける試験の結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝炎治療効果をも有することも証明されている。更に、副作用の危険性が低減されているため、高用量の使用を可能である。したがって、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、従来の免疫刺激オリゴヌクレオチドと比べて短期間で高率かつ安全なワクチンアジュバントとして、アレルギー疾患および／または肝炎の治療、及び予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】図１−１は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図１−２】図１−２は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図１−３】図１−３は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図１−４】図１−４は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図１−５】図１−５は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図１−６】図１−６は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例２において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０産生量を測定した結果を示す図である。
【図３−１】図３−１は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図３−２】図３−２は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド等（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図３−３】図３−３は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６／７−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ２）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２／３−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例４において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図５−１】図５−１は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図５−２】図５−２は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図５−３】図５−３は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図５−４】図５−４は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例８において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図７−１】図７−１は、実施例９において、マウス脾細胞を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図７−２】図７−２は、実施例９において、マウス脾細胞を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧで刺激し、培養上清中のＩＬ−１０産生量を測定した結果を示す図である。
【図８−１】図８−１は、実施例１０において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＬ−１２産生量を測定した結果を示す図である。
【図８−２】図８−２は、実施例１０において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例１１において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧと公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１２において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプＣｐＧと公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドを抗ＣＤ４０抗体とＩＬ−４とともに刺激し、培養上清中のＩｇＥ産生量を測定した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例１３において、マウスを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドとスギ花粉抗原Ｃｒｙ  ｊ  １で処置し、アレルギー惹起後の血清中のＩｇＥ産生量を測定した結果を示す図である。
【図１２−１】図１２−１は、実施例１３において、マウスを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドとスギ花粉抗原Ｃｒｙ  ｊ  １で処置した後、アレルギー惹起後に摘出した脾細胞をＣｒｙ  ｊ  １で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。
【図１２−２】図１２−２は、実施例１３において、マウスを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドとスギ花粉抗原Ｃｒｙ  ｊ  １で処置した後、アレルギー惹起後に摘出した脾細胞をＣｒｙ  ｊ  １で刺激し、培養上清中のＩＬ−５産生量を測定した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例１４において、ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルにおいて本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの血清中ＡＬＴ値の上昇に及ぼす影響を評価した結果を示す図である。
【図１４−１】図１４−１は、実施例１５において、ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルにおいて本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドの血清中ＡＬＴ値の上昇に及ぼす影響を比較評価した結果を示す図である。
【図１４−２】図１４−２は、実施例１５において、ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルにおいて本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドの血清中ＡＬＴ値の上昇に及ぼす影響を比較評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、式：５’−（Ｇ）MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）N−３’で示される塩基配列からなり、（式中、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンである。Ｘ及びＹは相互に独立した０乃至１０ヌクレオチド長でかつ４塩基以上の連続したグアニンを含まない任意の配列であり、Ｘ＋Ｙの長さは６乃至２０ヌクレオチド長である。ＸＣＧＹは長さが少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含み、長さが８乃至２２ヌクレオチド長である。Ｐ及びＱはグアニン以外の相互に独立した１ヌクレオチドであり、Ｍは６乃至１０の整数であり、Ｎは０乃至３の整数である。なお、ＸとＹのヌクレオチド長は必ずしも同じでなくとも良い。）、全長が１６乃至３７ヌクレオチド長である（但し、配列番号５記載の塩基配列（ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ）からなるものを除く。）ことを特徴とする。【００２５】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドを構成する塩基配列は、式：５’−（Ｇ）MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）N−３’で示される。式中の「５´−」は５´末端を、「３´−」は３´末端を示す。また、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンであり、ＸとＹは相互に独立した任意の配列及び長さからなる部分であり、ＰとＱは相互に独立した任意のヌクレオチドである。（Ｇ）Mと（Ｇ）Nは、それぞれグアニン（Ｇ）のみからなる連続する配列部分を示し、それぞれのＭとＮはグアニンの数を表す。すなわち、前記式は、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの５´末端から３´末端の塩基配列を一般化して示したものある。尚、本発明において「ＸＣＧＹ」とは、前記式中のＸ、Ｃ、Ｇ、及びＹで構成される配列部分全体を意味し、「ＰＸＣＧＹＱ」とは、前記式中のＰ、Ｘ、Ｃ、Ｇ、Ｙ、及びＱで構成される配列部分全体を意味する。また、前記式に関し「長さ」とは、各配列部分を構成するヌクレオチドの数（ヌクレオチド長）を意味する。さらに、「Ｘ＋Ｙの長さ」とは、Ｘの長さとＹの長さの合計を意味するものとする。【００２６】
前記式中、ＸとＹの長さはそれぞれ０乃至１０ヌクレオチド長の範囲である。特に、２〜６ヌクレオチド長であることが好ましい。Ｘ及びＹの配列はそれぞれ独立した任意のヌクレオチドからなるものであればよいが、４塩基以上の連続したグアニンが含まれないことが必要である。更に、Ｘ＋Ｙの長さは６乃至２０ヌクレオチド長であることが必要である。６乃至１２ヌクレオチド長が好ましく、７又は８ヌクレオチド長がより好ましく、８ヌクレオチド長が最も好ましい。なお、ＸとＹのヌクレオチド長は必ずしも同じでなくとも良い。【００２７】
前記式中、ＸＣＧＹにはパリンドローム配列が含まれることが必要である。パリンドローム配列とは、任意の２塩基の間の軸に対して左右対称に相補的な塩基から構成される塩基配列部分を意味し、回文配列とも別称されることがある。本発明においてＸＣＧＹに含まれるパリンドローム配列の長さは、８ヌクレオチド長以上であることが必要である。尚、ＸＣＧＹは８塩基以上のパリンドローム配列のみからなっていてもよいし、一部に８塩基以上のパリンドローム配列を含む限り、必ずしも完全に相補的でなくてもよい。【００２８】
ＸＣＧＹは、ＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）、ＡＴＣＧＡＴ（配列番号６０）及びＧＡＣＧＴＣ（配列番号６１）から選ばれるいずれか一つの塩基配列を含むことが好ましい。特に、ＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）を含むことが最も好ましい。これらの配列自体はパリンドローム配列であり、ＸＣＧＹに含まれるパリンドローム配列はこれらの配列を一部として含むことが好ましい。【００２９】
上記本発明におけるパリンドローム配列の例を以下に示す。ＸＣＧＹが、８塩基配列のパリンドローム配列としては、ＣＣＧＡＴＣＧＧ（配列番号６２），ＧＣＧＡＴＣＧＣ（配列番号６３），ＡＣＧＡＴＣＧＴ（配列番号６４），ＣＡＴＣＧＡＴＧ（配列番号６５），ＧＡＴＣＧＡＴＣ（配列番号６６），ＡＴＣＧＣＧＡＴ（配列番号６７），ＧＡＡＣＧＴＴＣ（配列番号６８），ＣＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号６９），ＡＧＣＧＣＧＣＴ（配列番号７０），ＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号７１），ＴＡＧＣＧＣＴＡ（配列番号７２），ＡＣＧＧＣＣＧＴ（配列番号７３），ＣＧＡＣＧＴＣＧ（配列番号７４），ＣＧＴＣＧＡＣＧ（配列番号７５）が挙げられる。このうち、ＣＣＧＡＴＣＧＧ，ＧＣＧＡＴＣＧＣ，ＡＣＧＡＴＣＧＴ，ＣＡＴＣＧＡＴＧ，ＣＧＡＣＧＴＣＧが好ましい。ＸＣＧＹが、１０塩基配列のパリンドローム配列としては、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号７６），ＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ（配列番号７７），ＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号７８），ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣ（配列番号７９）、ＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣ（配列番号８０），ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ（配列番号８１），ＣＡＧＣＧＣＧＣＴＧ（配列番号８２），ＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号８３），ＣＴＡＧＣＧＣＴＡＧ（配列番号８４），ＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ（配列番号８５），ＧＡＣＧＧＣＣＧＴＣ（配列番号８６），ＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣ（配列番号８７），ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ（配列番号８８），ＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴ（配列番号８９），ＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴ（配列番号９０）及びＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号９１）が挙げられる。このうち、ＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣ，ＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ，ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ，ＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ，ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ，ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ，ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴが好ましい。なお、パリンドローム配列は、その長さが少なくとも８ヌクレオチド長ある配列であれば必ずしもこれらの具体例に限定されない。
ＸＣＧＹの長さは８乃至２２ヌクレオチド長であり、この範囲でＸとＹのそれぞれの長さやパリンドローム配列の種類に応じて調整することができる。好ましくは、８乃至１４ヌクレオチド長が好ましく、９または１０ヌクレオチド長がより好ましく、１０ヌクレオチド長が最も好ましい。【００３０】
前記式中のＰ及びＱはグアニン以外の１ヌクレオチドである。具体的には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のいずれかである。
前記式中のＭは、６乃至１０の整数であり、６乃至８であることが好ましい。上記範囲を逸脱すると、ＩＦＮ誘導活性が不十分となるため好ましくない。また、Ｎは０乃至３の整数である。上記範囲を逸脱すると、炎症性サイトカイン誘導活性を充分に低減させることができないので好ましくない。【００３１】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの全長は、１６乃至３７ヌクレオチド長であり、前記式中のＭやＮ、ＸやＹの長さ等により異なる。前記の通りＭが６乃至８の範囲であるときは６乃至３５ヌクレオチド長である。また、ＸＣＧＹの長さが９または１０ヌクレオチド長の場合には１７乃至２３ヌクレオチド長である。
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの塩基配列の例として、好ましくは、ＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号９７：Ｍｏｄ９２），ＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧ（配列番号２８：Ｍｏｄ４６），ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２：Ｍｏｄ４３），ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＧ（配列番号２４：Ｍｏｄ４４），ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧ（配列番号２６：Ｍｏｄ４５），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号３０：Ｍｏｄ４７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ（配列番号６：Ｍｏｄ５３），ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ（配列番号７：Ｍｏｄ５４），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号９：Ｍｏｄ４０），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号１０：Ｍｏｄ５５），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号１１：Ｍｏｄ４１），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１５：Ｍｏｄ６１），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１６：Ｍｏｄ６２），ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１７：Ｍｏｄ６３），ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１８：Ｍｏｄ６４），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧ（配列番号４０：Ｍｏｄ７１）及びＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧ（配列番号４２：Ｍｏｄ７３）を挙げることができるが、必ずしもこれに限定されない。また、例えば、式：５’−（Ｇ）MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）N−３’のＭが７でＮが２である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号４３），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号４４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号４５），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号４６），ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号４７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号４８：Ｍｏｄ８４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＧ（配列番号４９），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号５０：Ｍｏｄ８５），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＧ（配列番号５１：Ｍｏｄ８３），ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号５２：Ｍｏｄ８７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＴＡＧＧ（配列番号５３），ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号１００），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号１０１）及びＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号１０２），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧ（配列番号１０５）であってもよく、さらに、Ｍが７でＮが３である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号５４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号９４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号９９）及びＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号１０７）、Ｍが８でＮが１である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号９５；Ｍｏｄ９３���，ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号９６），ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧ（配列番号１０３）及びＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧ（配列番号１０４）であってもよい。また、Ｍが８でＮが０である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣ（配列番号１０６）であってもよい。【００３２】
下記実施例において具体的に示される通り、配列表の配列番号６、７、９乃至１１及び１５乃至１８、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４２、４８、５０乃至５２、５４、９５及び９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、前記式において、ＰＸＣＧＹＱの条件を満たすがその他の条件を満たさないＤ−タイプＣｐＧ配列よりもＩＦＮ誘導活性が増強され、炎症性サイトカイン誘導活性が低減することが確認されている。すなわち、ＩＦＮ誘導活性においては、オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフを含むパリンドローム配列が必須であるが、ＩＦＮ誘導活性の増強と炎症性サイトカイン誘導活性の低減においては、その外側に挿入するポリＧ配列の塩基数が重要である。従って、本発明の最も重要な部分は、ポリＧ配列と特定のパリンドローム配列との組み合わせではなく、最適なポリＧ配列の挿入様式である。また、上記列挙したオリゴヌクレオチドのうち、配列番号６、７、１０及び１５乃至１７、２４、２６、２８、４８及び５０乃至５２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、中でも、配列番号６、７、１０、２８、４８及び５０乃至５２のオリゴヌクレオチドは、強いインターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性を有しており、特に好ましい。【００３３】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合、各ヌクレオチドのリボース糖部、塩基部のうちの全て又は一部が化学修飾されていてもよい。ただし、ＸＣＧＹのＣのメチル化は免疫刺激活性が消失するので好ましくない。このような修飾された本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの好適な実施形態としては、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合におけるリン酸基の酸素原子の置換及び／又は修飾であり、例えばホスホロチオエート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、メチルフォスフォネート（Ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びフォスフォラミデート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を挙げることができる。ホスホロチオエート修飾は、５'−末端のポリＧ配列（前記式中の（Ｇ）M）の一部又は全てのヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合においてなされていることが好ましい。５'−末端のポリＧ配列については、該配列を構成するすべての塩基間又は最末端のホスホジエステル結合においてホスホロチエート修飾がなされていることが好ましい。３'−末端のポリＧ配列については、最末端の塩基を除く一部又は全ての塩基間のホスホジエステル結合においてホスホロチオエート修飾がなされていることが好ましい。また、上記一般式におけるＮ＝０又は１のオリゴヌクレオチドはグアニン以外の３’−末端側のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されていてもよい。さらには、５’−末端のポリＧ配列と３’−末端側の最末端のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されていることが好ましい。さらに、免疫刺激活性を有する限りにおいては、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン（前記式中の中央部のＣ）においてメチル化以外の化学修飾がされていてもよい。【００３４】
ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドの分解は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼにより媒介される。ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されることによりこれらのヌクレアーゼに対して抵抗性を獲得することが知られている。一部のヌクレオチド残基間が修飾されているオリゴヌクレオチドとしては、例えば、５'及び３'末端のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドやポリＧ配列のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドがあり、エキソヌクレアーゼに耐性を有する。また、全てのヌクレオチド残基間がホスホロチオエート修飾されているオリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに抵抗性を有する。ヌクレアーゼ耐性のＣｐＧオリゴヌクレオチドは安定であり、例えば、標的受容体に作用する時間の延長や一定の濃度を維持する結果、増強された免疫刺激活性を示す。【００３５】
なお、上記の本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、上述した塩基配列に関する要件を満たしていれば、免疫刺激活性、具体的には増強されたＩＦＮ誘導活性と低減された炎症性サイトカイン誘導活性を有する限り、核酸以外の分子が結合されていてもよい。【００３６】
本発明において、免疫刺激オリゴヌクレオチドが免疫刺激活性を有するとは、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性が増強され、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減されることを意味する。ここで、炎症性サイトカインとはインターロイキン−１２（以下、ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−α（以下、ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）およびインターロイキン−１β（以下、ＩＬ−1β）を意味する。炎症性とは、組織における発熱の誘導や細胞の浸潤及び活性化を引き起こす性質を言う。一方、免疫抑制性とは上記の炎症反応を抑制するような機能あるいは性質を有することを表す。インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−1０）は、免疫抑制性サイトカインの一つであり、機能的に炎症性サイトカインとは異なる。ＩＦＮ誘導活性或いは炎症性サイトカイン誘導活性とは、例えば、ヒトにおいては平均的な反応性を有するヒト検体の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、マウスにおいては骨髄由来樹状細胞あるいは脾細胞あるいはＣｐＧ配列を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドに感受性の単球系細胞株Ｊ７７４やＲＡＷ２６４．７からの各サイトカイン産生を誘導する作用のことを示す。本発明においては、ヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣ）における免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの産生誘導を指標とした活性として示すことができる。また、マウス脾細胞における免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の産生誘導を指標とした活性として示すことができる。更に、マウス樹状細胞及びＪ７７４細胞株において免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によりインターロイキン−１２ｐ４０（以下ＩＬ−１２ｐ４０）及びＴＮＦ−αの産生誘導を指標とした活性として示すこともできる。また、本発明において、いくつかの免疫刺激オリゴヌクレオチド配列の活性を比較する際に用いる、増強されたＩＦＮ誘導活性とは、上記細胞を免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激した場合に他よりも低濃度において多量のＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γを誘導することを表わす。一方、低減された炎症性サイトカイン誘導活性とは、上記細胞を免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激した場合に他よりも少量のＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αを誘導することをいう。【００３７】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−αのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法を以下に示す。ヒト血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７を用いた密度勾配遠心を２０００ｒｐｍ，室温で２５分間行い、ＰＢＭＣを単離する。単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり４．０×１０６個の細胞が含まれるように調製後、丸底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり４．０×１０５個の細胞を播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドの存在下で２４時間、または７日間刺激し、それぞれ培養上清を回収する。ＩＦＮαとＩＦＮγの産生量は、それぞれ２４時間と７日間の刺激後の培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて定量する。【００３８】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣからのＩＬ−１２及びＴＮＦ−αのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法を以下に示す。ヒト血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７を用いた密度勾配遠心を２０００ｒｐｍ，室温で２５分間行い、ＰＢＭＣを単離する。単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり２．０×１０６個の細胞が含まれるように調製後、平底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２．０×１０５個の細胞を播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドの存在下で８時間、または２４時間刺激し、それぞれ培養上清を回収する。ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの産生量は、それぞれ８時間と２４時間の刺激後の培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて定量する。【００３９】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドによるマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生誘導の有無を確認する手段として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験が挙げられる。具体的方法を以下に示す。オス１０−２５週齢のＣＬ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０／ＦＣＳ  １０％の入ったシャーレに移す。擦り付きスライドガラス２枚を用いて脾臓をすり潰し、セルストレイナーで漉しながら丸底遠沈管に移す。１０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心し、上清を捨てて、５ｍＬの溶血バッファー（０．８３％  ＮＨ4Ｃｌと１７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６５を９対１で混合して調製する）を加え、ピペッティング操作で細胞塊をほぐして懸濁する。５分間室温でインキュベーションしたのち、５ｍＬの培養液を加えて転倒混和し、１０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心する。上清を捨てて、１０ｍＬの培養液を加え、ピペッティング操作で細胞塊をほぐして懸濁した。洗浄操作を２回繰り返したのちに、培養液で再懸濁して、トリパンブルーを用いて細胞数をカウントして、１ｍＬあたりの生細胞数が４×１０6となるように調製する。丸底の９６穴プレートに１ウェルあたり４．０×１０5個の細胞となるように播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドを添加して３日間刺激する。刺激終了後、培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量する。【００４０】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドによるマウスＪ７７４細胞からのＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−α産生誘導の有無を確認する手段として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験が挙げられる。Ｊ７７４細胞株は培養液（ＲＰＭＩ１６４０，ＦＣＳ  １０％，５０μＭ  ２−ＭＥ）で１ｍＬあたりに１×１０6個となるように調整する。平底９６穴マルチプレートに１ウェルあたり１．０×１０5個の細胞となるように播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドを添加して４時間あるいは８時間あるいは４８時間刺激する。刺激終了後、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量する。【００４１】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド又は従来の技術及び核酸合成装置で合成できる。これらの合成方法は酵素的方法、化学的方法、本発明の配列より長い配列の分解を含むが、必ずしもこれに限定されるものではない。また、修飾されたオリゴヌクレオチドも従来の技術において合成される。例えば、オリゴヌクレオチドホスホルアミデートを硫黄で処理することにより、ホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチドが得られるが、必ずしもこれに限定されるものではない。これらのオリゴヌクレオチドの合成技術、修飾技術は本明細中に引用されている特許文献、非特許文献においても用いられており、その他にも多数の報告が確認される公知の技術である。【００４２】
上記した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、医薬としての使用を目的としたオリゴヌクレオチド複合体の形態にあってもよい。複合体とは、該免疫刺激オリゴヌクレオチドと他の物質（例えば、サイトカイン類やペプチド、タンパクあるいは非タンパク質からなる抗原が含まれる）との混合物及び結合体、該免疫刺激オリゴヌクレオチドを取り込ませたコロイド分散系あるいは脂質ベース系を使用してもよい。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロクロスフェア、ビーズがあげられる。また、脂質ベース系としては、例えば、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが選択されてもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。好適な実施形態としては、上記の複合体が免疫刺激オリゴヌクレオチドを埋封したリポソームである。埋封とは、リポソームの脂質膜表面との結合、脂質膜中への取り込み、あるいはリポソームの内腔への取り込みを指し示す。また、リポソームは特定の機能分子、例えば、モノクロナール抗体、糖、糖脂質、若しくはタンパク質により、修飾、若しくは結合されていてもよい。【００４３】
リポソームを構成する脂質としては、リポソームを構成するために知られている任意の常用の脂質を単独で又は複数組合せて使用することができる。例えば、天然物、例えば卵黄、大豆、又はその他の動植物から得られる脂質、これらの脂質を水素添加によって不飽和度を低下したものを使用することができる。具体的には、例えば、ステロール類（例えばコレステロール）、ホスファチジルエタノールアミン類（例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルコリン類（例えばジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルセリン類（例えばジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン）、ホスファチジン酸類（例えばジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸）、スフィンゴミエリン類やカルジオリピン等があげられるが、必ずしもこれに限定されない。【００４４】
リポソームの作製は公知の方法を用いる。ボルテックス法及び超音波法が一般的であるが、そのほかにエタノール注入法、エーテル法、メカノケミカル法、加温法、脂質溶解法及び逆相蒸発法などが適用でき、これらを組合せて使用することもできる。例えば、ボルテックス法及び超音波法においては、所定の脂質を有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、クロロホルム又はこれらの混合物、例えばメタノールとクロロホルムとの混合物に溶解した後、該有機溶剤を蒸発除去することにより脂質の薄層を得る。この際、上記した脂質を様々な組み合わせ、濃度比率で有機溶剤に溶解することにより、多様なリポソームを製造することが可能である。次に、この脂質の薄層に水性媒体を加えてボルテックス処理又は超音波処理することによりリポソームが形成される。この際に、上記水性媒体にリポソーム内へ埋封する物質を混入、例えば溶解又は懸濁させておくことにより、物質をリポソームに埋封することができる。水性媒体に溶解する埋封物質の濃度は、特に限定はされないが、タンパク質においては０．００３７５〜３７５ｍｇ／ｍＬ、免疫刺激オリゴヌクレオチドにおいては０．５μｇ〜５０００μｇ／ｍＬであることが好ましい。また、一般的にはリポソーム粒子径としては０．０１〜１０μｍの範囲内であることが好ましい。【００４５】
上記本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、各種用途の医薬の有効成分として用いることができる。実施形態の一つの好適な適応症としては、アレルギー疾患があげられる。アレルギー疾患とは、花粉、ダニ、犬や猫などの動物、食物、ハウスダストなどに由来する抗原物質を起因とし、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、喘息などの炎症を症状とする疾患である。さらに好適な実施形態としては、上記アレルギー疾患のうち、特に花粉アレルギー症の治療、又は予防剤の有効成分としての用途を挙げることができる。花粉アレルギーとは特にスギ花粉由来の蛋白を抗原とするアレルギーが一般的であるが、抗原がヒノキ、シラカバ、ハンノキ、ブタクサ、ヨモギ、カモガヤなどの他の花粉由来物質であっても良い。【００４６】
例えば、スギ花粉抗原で感作したマウスの脾細胞をスギ花粉抗原で刺激すると通常は抗原特異的なＴｈ２応答の指標となるＩＬ−５やＩＬ−４の産生が誘導され、Ｔｈ１応答の指標となるＩＦＮ−γの産生誘導は確認できないが、スギ花粉抗原と本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで同時に刺激するとＩＦＮ−γが効果的に誘導されることを確認できる。また、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドをマウスに処置した後に、抗原とアラムの混合液でＴｈ２反応を惹起すると、血清中の抗原特異的なＩｇＥの産生は抑制され、抗原特異的なＩｇＧ２ａが増加することが確認できる。この試験方法は感作及び治療用に処置する抗原に喘息誘発抗原を用いた場合、喘息の治療効果を確認できる。
従って、上記本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは各種アレルギーに対して高い治療、予防効果を示す。【００４７】
上記本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、単剤での使用や、上記したアレルゲンとともに用いて減感作療法の治療剤としての使用も可能である。【００４８】
さらに、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはヒト細胞のＩｇＥ産生を抑制する作用を有する。かかる作用を確認するための手段として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｇＥ産生の抑制活性を評価する試験の具体的方法を以下に示す。上記した方法によりヒト血液から単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり４．０×１０６個の細胞が含まれるように調製した後、平底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり４．０×１０５個の細胞を播き、ヒトＩＬ−４と抗ＣＤ４０抗体とともに免疫刺激オリゴヌクレオチドを添加して１４日間刺激し、培養上清を回収する。ＩｇＥの産生量はＥＬＩＳＡ法にて定量する。【００４９】
上記発明の実施形態の一つの好適な適応症としては、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む、ワクチンであっても良い。ワクチンの使用可能な疾患は感染症及びアレルギー症である。感染症とはウィルス、細菌、真菌、及び原虫等を原因として発症する疾患であるが、必ずしもこれに限定されるものではない。通常、ワクチンとは、患者に投与し、活性な免疫を生成する、感染性因子、感染因子のある部分、または動植物由来の因子を含む抗原性懸濁液または溶液をいう。ワクチンを構成する抗原性部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、核酸のどれであっても良い。好ましい実施形態としては、特に限定はされないが、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと上記ワクチンの混合液である。また、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと上記ワクチンの抗原性部分との複合体であってもよい。【００５０】
さらに、実施形態の一つの好適な適応症は、肝炎、具体的には免疫系の活性化を伴う肝炎、非ウイルス性の肝炎及び／又はウイルス性肝炎であって、さらに好ましくはＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染によるＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎である。
本明細書のＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の症状には、急性および慢性の肝炎を成因とする症状が含まれる。ウイルス性肝炎の臨床症状は、黄疸、腹痛、倦怠感、吐き気、及び嘔吐、並びに肝炎に関係する臨床的／検査所見、肝酵素レベルの上昇（例えば、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)、及び／又は乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)）、ビリルビンの上昇、ＨＣＶウイルス血症または抗原レベル、門脈圧亢進症および食欲不振等の上昇を含むが必ずしもこれに限定されない。【００５１】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎の治療効果は、上記した臨床症状（例として黄疸、倦怠感、腹痛）、肝炎関連の検査所見（例として血中肝酵素レベル）、ウイルス増幅および複製、あるいはウイルスの量（力価）を指標として評価しうる。すなわち、本発明による治療を行わなかった個体と比較し、本発明による免疫刺激オリゴヌクレオチドを用いて治療をした個体は、Ｂ型肝炎及び／Ｃ型肝炎の臨床症状の消失、寛解、改善あるいは症状の程度の軽減、さらには罹患期間の短縮が期待できる。肝炎関連の検査所見やウイルス複製およびウイルス量についても治療効果として反映されうる。ウイルス力価の減少は、感染部位又は個体からのウイルスの排除を含む。【００５２】
評価の方法としては、症状の検出、臨床検査による肝機能の計測、肝生検、肝門脈圧の直接的又は間接的計測、及びウイルス粒子、ウイルス核酸またはウイルス抗原力価の計測、そして抗ウイルス抗体の検出及び計測を含む本技術分野で知られるいずれかの手段が選択されうる。腹痛及び倦怠感等の自覚的な身体的症状は症状の有無により判定し、黄疸は定性ベース、ビリルビンの血中又は血清中レベルの計測により定量化する。肝炎に関する検査所見、例えば、血液あるいは血清中の肝酵素はＡＳＴ及びＡＬＴ量は、血液学的、血液生化学的及び組織学的試験により計測する。血液又は血清サンプル中のウイルス力価は当該技術領域における周知の方法、例えばウイルス粒子の定量化（例えば分離及び可視化によるか又はＤＮａｓｅ抵抗性粒子のアッセイ）、血液又は血清サンプル中のウイルス抗原の検出（ＥＬＩＳＡ法による抗原量の定量化）、血液又は血清サンプル中の抗ウイルス抗体の検出、又はウイルス核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）の検出（ＨＣＶ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅あるいはウイルス特異的プローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により計測する。肝組織生検においても上記方法で評価可能である。【００５３】
上記発明の治療剤の治療対象は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。ヒト以外の脊椎動物は、例としてイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラットまたはマウスがあるが、必ずしもこれに限定されない。【００５４】
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の可能性のある個体（例としては身体的症状のない場合やＨＣＶキャリアーである母体内の胎児）、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の認められた個体、上記したＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎の臨床症状を伴う個体（例えば、慢性肝炎や初期感染あるいは慢性感染後の再発等による急性肝炎を含む）に投与されうる。ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染あるいはその症状の程度により、免疫刺激オリゴヌクレオチドの投与はさまざまな回数でなされる。また、免疫刺激オリゴヌクレオチドを用いた治療は、インターフェロン療法等の治療（およびその効果）が不十分であった個体あるいは不成功に終わった個体にも用いられうる。さらに、免疫刺激オリゴヌクレオチドは単回又は複数回投与されうる。【００５５】
このようなアレルギー疾患あるいは肝炎の予防・治療剤として用いる場合、投与経路は、特に限定されないが、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、患部組織への注入、経口投与、経鼻投与、経眼投与等、経咽頭投与、経肺投与、経皮投与、舌下投与などが好ましい。また、投与量は、患者の症状、治療目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、成人１日当り、オリゴヌクレオチド量として、０．１ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、好ましくは１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ程度である。アジュバントとして使用する場合の投与量も、投与目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、上記と同程度の投与量でよい。また、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、通常、採用される剤形を製剤する周知の製剤方法により製剤される。
またこれらの免疫刺激オリゴヌクレオチドは、アレルギー疾患の治療、若しくは予防剤、ワクチンのアジュバント又は肝炎の治療、若しくは予防剤としての使用し、アレルギー疾患の治療、若しくは予防方法、ワクチンに対するアジュバントとして利用する方法又は肝炎の治療、若しくは予防方法としても使用できる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を詳細に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の説明文中で使用されている免疫刺激オリゴヌクレオチドの配列の略号及び特性は、配列表に記載されている。また、実施例中に記載されている公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドの配列、略号及び特性は表１に示した。【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例１：ヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激オリゴヌクレオチドのＩＦＮ誘導活性に必須な５'末端側ポリＧ配列の塩基数の比較
種々の塩基数からなるポリＧ配列を挿入したＣｐＧオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＦＮ誘導活性に必須な長さについて検討した。徳永らが示しているパリンドローム配列ＣＧＡＴＣＧ（特開平４−３５２７２４号公報の配列４９及び配列１５）を含むパリンドローム配列ＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡの外側の両末端あるいは５’末端側のみにホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列を含むオリゴヌクレオチドを挿入した免疫誘導オリゴヌクレオチド２０種を構築した（配列番号１〜２０）。なお、Ｍｏｄ２（配列番号１）およびＭｏｄ３３（配列番号５）については国際公開２００６／０３５９３９パンフレットにおいて、ＩＦＮ誘導活性を有することが示されている。そしてこれらの配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ産生の誘導活性を有するものをスクリーニングした（図１−１〜図１−６、表２）。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ誘導活性の評価は、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法として示した手順及び条件に従い、それぞれ２４時間刺激及び７日間刺激した培養上清中の産生量をもとに評価した。【００５９】
【表２】
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【００６０】
表２に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）における値である。図及び表中の配列中の小文字はホスホロチオエート修飾塩基を表わす。【００６１】
図１−１及び図１−２は、Ｍｏｄ２（配列番号１：レーン２）、Ｍｏｄ５２（配列番号２：レーン３）、Ｍｏｄ５１（配列番号３：レーン４）、Ｍｏｄ４２（配列番号４：レーン５）、Ｍｏｄ５３（配列番号６：レーン６）、Ｍｏｄ５４（配列番号７：レーン７）、Ｍｏｄ５６（配列番号８：レーン８）、Ｍｏｄ４０（配列番号９：レーン９）、及びＭｏｄ５５（配列番号１０：レーン１０）の、オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量、及び同濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−γ産生量の結果をそれぞれ示す。ＩＦＮ−α誘導活性（表２及び図１−１）に関し、３’末端にポリＧ配列が３塩基（Ｎ＝３）ある群（図１−１、レーン３〜７）では、５’末端にポリＧ配列が６塩基以上（Ｍは７以上）持つものの活性が高かった（レーン６および７）。また３’末端にポリＧ配列が２塩基（Ｎ＝２）ある群（レーン８〜１０）では、５’末端にポリＧ配列を６塩基以上持つものの活性が高かった（レーン９、１０）。さらに、典型的なＤ−タイプＣｐＧ配列の構造（Ｍ＝２／Ｎ＝６、レーン２）を有するＭｏｄ２と比較して、Ｍｏｄ５２（Ｍ＝３／Ｎ＝３、レーン３）、Ｍｏｄ５１（Ｍ＝４／Ｎ＝３、レーン４）及びＭｏｄ４２（Ｍ＝５／Ｎ＝３、レーン５）の活性は減弱あるいは完全に消失することから、Ｍｏｄ２のポリＧ配列中４乃至６の数塩基を変換した配列を設計するだけでは必ずしも増強されたＩＦＮ−α誘導活性を有するオリゴヌクレオチドが得られるわけではないことが判明した。ＩＦＮ−γ誘導活性（図１−２）についても、Ｍｏｄ５６（配列番号８、Ｍ＝５／Ｎ＝２、レーン８）を除き、同様の傾向であった。特に、Ｍｏｄ５３（Ｍ＝７／Ｎ＝３、レーン６）、Ｍｏｄ５４（Ｍ＝８／Ｎ＝３、レーン７）とＭｏｄ５５（Ｍ＝７／Ｎ＝２、レーン１０）のＩＦＮ−γ誘導活性は、３’末端のポリＧ配列の長さが６塩基であるＭｏｄ２よりも有意に向上した（ｔ検定：Ｐ＜０．０１）。この結果は、オリゴヌクレオチドのＩＦＮ誘導活性は５’末端側に依存し、少なくとも６塩基以上の長さのポリＧ配列が必要であることを示している。【００６２】
次に、５’末端のポリＧ配列の長さとＩＦＮ誘導活性との関連について明らかにするため、２０塩基までのポリＧ配列を５’末端に挿入したオリゴヌクレオチドについてＩＦＮ誘導活性を評価した（図１−３及び図１−４）。図１−３及び図１−４には、Ｍｏｄ２（レーン１）、Ｍｏｄ６１（配列番号１５：レーン２）、Ｍｏｄ６２（配列番号１６：レーン３）、Ｍｏｄ６３（配列番号１７：レーン４）、Ｍｏｄ６４（配列番号１８：レーン５）、Ｍｏｄ６５（配列番号１９：レーン６）、及びＭｏｄ６６（配列番号２０：レーン７）の、オリゴヌクレオチドの濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量とＩＦＮ−γ産生量をそれぞれ示す。その結果、濃度３００ｎＭにおいて、８塩基までのポリＧ配列を持つもののＩＦＮ−α誘導活性は有意に向上し(図１−３、Ｍ＝６〜８／ｎ＝０、レーン２〜４)、塩基数１０のポリＧ配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ＝１０／Ｎ＝０）はＭｏｄ２を若干上回る活性を示した(図１−３、レーン５)。一方、１２塩基以上（Ｍ＝１２  ｏｒ  ２０／Ｎ＝０）では殆ど活性が消失した(レーン６、７)。また、ＩＦＮ−γ誘導活性は、ＩＦＮ−α誘導活性と同様の傾向であったが、ポリＧ配列が１２塩基以上でも従来のＤ−タイプＣｐＧ配列のＭｏｄ２と同程度の活性であった（図１−４、レーン１、６、７）。【００６３】
さらに、３’末端のポリＧ配列の塩基数とＩＦＮ誘導活性との関連について評価した。図１−５及び図１−６には、Ｍｏｄ２（レーン２）、Ｍｏｄ５０（配列番号１４：レーン３）、Ｍｏｄ４９（配列番号１３：レーン４）、Ｍｏｄ４０（レーン５）、Ｍｏｄ４１（配列番号１１：レーン６）の、オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量と、同濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−γ産生量とを、それぞれ示す。５’末端のポリＧ配列の長さを２塩基（Ｍｏｄ２：Ｍ＝２／Ｎ＝６、レーン２）から６塩基（Ｍｏｄ５０：Ｍ＝６／Ｎ＝６、レーン３）にするとＭｏｄ５５（Ｍ＝７／Ｎ＝２、図１−１及び図１−２のレーン１０参照）と同程度にＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの産生量は増加した（表２、図１−５及び１−６）。５’末端側に６塩基のポリＧ配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ＝６／Ｎ＝０〜６）のＩＦＮ−α誘導活性は、３’末端側のポリＧ配列の長さにも依存する傾向を示したが、完全に消失することなく、Ｍｏｄ２を超えていた（図１−５、レーン３〜６）。また、各オリゴヌクレオチドの濃度３００ｎＭにおけるＩＦＮ−γ誘導活性は、いずれもＭｏｄ２を超えていた（図１−６、レーン２〜６）。
以上の結果から、５'末端側のポリＧ配列の塩基数（Ｍ）が６乃至１０、好ましくは６乃至８である場合、３'末端側にポリＧ配列が全くないオリゴヌクレオチド（Ｍ＝６〜８／Ｎ＝０）であっても、前記式中のＰＸＣＧＹＱ部分が同一である従来のＤ−タイプＣｐＧ配列よりも増強されたＩＦＮ誘導活性を有することを確認した。【００６４】
実施例２：マウスＪ７７４細胞における免疫刺激オリゴヌクレオチドの炎症性サイトカイン誘導活性に必須な３'末端側ポリＧ配列の塩基数の比較
５'末端側に長さが６塩基のポリＧ配列を挿入した免疫刺激オリゴヌクレオチドについて、前述したマウスＪ７７４細胞のＩＬ−１２ｐ４０産生誘導の有無を確認する手段としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験を行った。すなわち、Ｊ７７４細胞株を各オリゴヌクレオチドで４８時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカインＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ４０）の産生量を評価した。その結果、（Ｍｏｄ５０（レーン２）、Ｍｏｄ４９（配列番号１３：レーン３）、Ｍｏｄ４８（配列番号１２：レーン４）、Ｍｏｄ３３（配列番号５：レーン５）、Ｍｏｄ４０（レーン６）、Ｍｏｄ４１（レーン７））の、それぞれの終濃度３００ｎＭにおけるＩＬ−１２ｐ４０の産生は、３'末端側のポリＧ配列の塩基数が４以上（Ｍ＝６／Ｎ＝４〜６：レーン２〜４）で誘導されたが、３塩基以下（Ｍ＝６／Ｎ＝０〜３：レーン５〜７）では全く活性が認められなかった（図２）。【００６５】
以上の結果から、３'末端側のポリＧ配列が３塩基以下のオリゴヌクレオチドは、５'末端側に６塩基のポリＧ配列が挿入されていても炎症性サイトカイン誘導活性が低減あるいは消失することを確認した。【００６６】
実施例３：パリンドロームモチーフとしてＣＧＡＴＣＧ、ＡＴＣＧＡＴ及びＧＡＣＧＴＣを有する配列を含む、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド等及びＤ−タイプＣｐＧオリゴヌクレオチドの、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ産生誘導効果の比較
式：５’−（Ｇ）MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）N−３’のＰがＴ（チミン）、ＱがＡ（アデニン）であり、ＸＣＧＹが１０塩基である６種のパリンドロームモチーフに、それぞれポリＧ配列が５'末端側に６塩基と３'末端側に３塩基を挿入した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３、Ｍ＝６／Ｎ＝３）、及びポリＧ配列が５'末端側に２塩基で３'末端側に６塩基挿入したＤ−タイプＣｐＧ配列（Ｄ−ｔｙｐｅ  ＣｐＧ：  Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６、Ｍ＝２／Ｎ＝６）を合成し、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性を評価した。それぞれのオリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフは、配列表、図３−１、及び３−２、及び３−３中で示されており、Ｍｏｄ２９（配列番号２１）及びＭｏｄ４３（配列番号２２）はレーン１のＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ、Ｍｏｄ３７（配列番号２３）及びＭｏｄ４４（配列番号２４）はレーン２のＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ、Ｍｏｄ３８（配列番号２５）及びＭｏｄ４５（配列番号２６）はレーン３のＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ、Ｍｏｄ３９（配列番号２７）及びＭｏｄ４６（配列番号２８）はレーン４のＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ、Ｄ１９（配列番号２９）及びＭｏｄ４７（配列番号３０）はレーン５のＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣである。尚、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。【００６７】
濃度１００ｎＭにおけるＤ−タイプＣｐＧと本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドなどの活性を測定した結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（図３−１、Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）は、評価した全てのパリンドロームモチーフにおいてＤ−タイプＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）よりもＩＦＮ−αの誘導活性が亢進し、Ｄ−タイプＣｐＧの１．４〜７４．５倍の範囲で増強された。また、上記オリゴヌクレオチドの濃度１００ｎＭにおけるＩＦＮ−γ産生誘導活性についても、ＩＦＮ−αと同様な傾向を示した（図３−２）。【００６８】
さらに、前記式中のＰがＡ（アデニン）、ＱがＣ（シトシン）あるいはＴ（チミン）であり、８塩基のパリンドロームモチーフＣＧＡＣＧＴＣＧを含む、２種の本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＤ−タイプＣｐＧのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性を評価した。その結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのＭｏｄ７１（配列番号４０、Ｍ＝７／Ｎ＝２）とＭｏｄ７３（配列番号４２、Ｍ＝６／Ｎ＝２）は、濃度３００ｎＭにおいて、それぞれのＤ−タイプＣｐＧ配列であるＭｏｄ７０（配列番号３９、Ｍ＝３／Ｎ＝６）とＭｏｄ７２（配列番号４１、Ｍ＝２／Ｎ＝６）よりも活性が顕著に増強された（図３−３）。【００６９】
これらの結果は、本発明の新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドの有するポリＧ配列の挿入様式が特定のパリンドローム構造に非依存的にＩＦＮ誘導活性を増強することを示している。【００７０】
実施例４：パリンドロームモチーフとしてＣＧＡＴＣＧを有する本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α産生誘導効果
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの最適な配列について検討した。Ｍ＝７且つＮ＝２であり、ＸＣＧＹがＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣである本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのＰとＱについて、さらに検討した。ＰがＡ（アデニン）かつＱがＴ（チミン）のオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８３，配列番号５１）、ＰがＴかつＱがＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８４，配列番号４８）、ＰとＱがともにＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８５，配列番号５０）、ＰがＣかつＱがＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８７，配列番号５２）を合成した。実施例３において見出した、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの中でも特に強いＩＦＮ誘導活性を有するＭｏｄ４６とこれらのオリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性について比較評価した。尚、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。
その結果、オリゴヌクレオチドの濃度１００ｎＭにおいて、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８４、Ｍｏｄ８５およびＭｏｄ８７はＭｏｄ４６と同程度のＩＦＮ−α誘導活性を示した（図４）。この結果は、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのＰとＱが、Ｇ以外の塩基、すなわちＡ、Ｔ及びＣのいずれでも良く、互いに相補的なヌクレオチドでなくても強いＩＦＮ−α誘導活性を有することを示している。【００７１】
実施例５：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の比較
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと特開２００５−２３７３２８号公報において強いＩＦＮ−α誘導活性を有する配列として示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３（配列番号９８）のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性を比較した。
Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３と最近似な配列を有し、ホスホロチオエート修飾していない本発明の免疫刺激オリゴオリゴヌクレオチドであるＭｏｄ９２（配列番号９７）及びＭｏｄ９３（配列番号９５）を合成し、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性を比較した（表３及び表４）。尚、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。
その結果、Ｍｏｄ９２及びＭｏｄ９３はＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３及びＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１に比べて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した。【００７２】
【表３】
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【００７３】
表３に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。【００７４】
【表４】
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【００７５】
表４に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。【００７６】
以上の結果から、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート修飾されていなくても強いＩＦＮ−α誘導活性を有していることが確認された。また、一般式におけるＰとＱが、Ｇ以外の塩基であることの重要性が示された。従って、ＧＡＣＧＡＴＣＧなどの優れたＩＦＮ−α誘導活性を示すパリンドローム配列とポリＧ配列の間に少なくとも１塩基のヌクレオチドを挿入することによってさらにＩＦＮ−α誘導活性が向上することが示された。【００７７】
実施例６：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３のヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２誘導活性の比較
実施例５において用いた本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ９３と特開２００５−２３７３２８号公報で示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１のヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２誘導活性を比較した。尚、測定は前述したＰＢＭＣからのＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法に沿って行った。
その結果、本発明のＭｏｄ９３はＩＬ−１２の産生を全く誘導せず、むしろ刺激しなかった対照と比べて抑制する傾向を示した（表５）。一方、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１は弱いながらＩＬ−１２産生の増加を認めた。従って本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはヒトにおいても炎症性サイトカインの誘導活性が低いことが示された。【００７８】
【表５】
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【００７９】
表５に表示されたＩＬ−１２産生量は無刺激（ｎｏ  ＣｐＧ−ＯＤＮ）或いは免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が３００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。【００８０】
免疫刺激オリゴヌクレオチドの単独刺激ではヒト末梢血細胞からの顕著なＩＬ−１２産生が認められなかったので、強力な炎症反応の誘導因子であるエンドトキシンのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とともに刺激してＩＬ−１２産生に及ぼす影響を評価した。すなわち、前記した方法に従って単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり２．０×１０6個の細胞が含まれるように調製後、丸底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２．０×１０5個の細胞を播き、ＬＰＳと免疫刺激オリゴヌクレオチドの共存下で２４時間処置して培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＩＬ−１２の産生量を定量した。免疫刺激オリゴヌクレオチドはＭｏｄ９２、Ｍｏｄ９３、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３を用いた。その結果、いずれの免疫刺激オリゴヌクレオチドにおいてもＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）刺激で誘導されるＩＬ−１２産生を増強しなかった。むしろ、その産生を抑制する効果が認められ、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ９３が最も強い阻害活性を示した（表６）。【００８１】
【表６】
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【００８２】
表６に表示されたＩＬ−１２産生量はＬＰＳ存在下の無刺激（ｎｏ  ＣｐＧ−ＯＤＮ）あるいは免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。【００８３】
以上の結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはヒトにおいて炎症性サイトカイン誘導活性が公知の配列よりも少なく、かつ抗炎症作用を有することを確認した。【００８４】
実施例７：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＭ２６、Ｍ２７、Ｍ２６−ＧＳ、Ｍ２７−ＧＳ、Ｉ１、２００６、２３９５、１０１８、Ｃ２７４、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＤ１９のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の比較
ＫＲ２００１−００６３１５３（大韓民国公開特許）において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｍ２６（配列番号３７）及びＭ２７（配列番号３８）とそれぞれのポリＧ配列のヌクレオチド間をホスホロチオエート修飾したＭ２６−ＧＳおよびＭ２７−ＧＳと、実施例１及び３において見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ５５およびＭｏｄ４６のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した。尚、本実施例５におけるヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。その結果、オリゴヌクレオチド濃度１００ｎＭにおいて、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは他のオリゴヌクレオチドに比べて著しく高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図５−１）。【００８５】
次に、特開２００５−２３７３２８号公報において強いＩＦＮ−α誘導活性を有する代表的な配列として示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）と実施例１及び３において見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ５３、Ｍｏｄ５４、Ｍｏｄ５５、Ｍｏｄ６１、Ｍｏｄ６２、Ｍｏｄ４５、Ｍｏｄ４６、Ｍｏｄ７１及びＭｏｄ７３のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの方が濃度１μＭにおいて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図５−２）。【００８６】
また、特表平１０−５０６２６５号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｉ１と、実施例３において見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６と、Ｍｏｄ４６と同一のパリンドローム配列を有するＤ−タイプＣｐＧのＭｏｄ３９と、Ｍｏｄ３３のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは濃度３０ｎＭにおいて著しく高いＩＦＮ−α誘導活性を示したのに対し、他のオリゴヌクレオチドはほとんど活性を示さなかった（図５−３）。【００８７】
さらに、国際公開第００／６１１５１号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（Ｄ１９）、特表２００１−５０３２６７号公報及び国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（２００６）、国際公開第０３／０１５７１１号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（２３９５）、特表２００２−５１７１５６号公報及び特表２００２−５００１５９号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列（１０１８）及び国際公開第０４／０５８１７９号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（Ｃ２７４）と本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６（配列番号２８）のヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−α誘導活性を比較した。その結果、オリゴヌクレオチド濃度１００ｎＭにおいて、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドが最も強いＩＦＮ−α誘導活性を有することを確認した（図５−４）。【００８８】
以上の結果、公知のＣｐＧ配列を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドよりも、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの方が高いＩＦＮ−α誘導活性を示すことが明らかとなった。【００８９】
実施例８：ポリＧ配列とパリンドローム配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣを有する、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８５、Ｍｏｄ８７と公知ＣｐＧオリゴヌクレオチドＧ１０、Ｇ３−６、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１、Ｇ１−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ９及び２３３２のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性の比較
パリンドローム配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣの外側にポリＧ配列が挿入された公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、特開２００５−２３７３２８号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）及びＧ１−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ９（配列番号５５）、国際公開第２００５／０１４１１０号パンフレットにおいて開示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ１０（配列番号５６）及びＧ３−６（配列番号５７）と、特表２００３−５１０２９０号公報において示されているオリゴヌクレオチド２３３２（配列番号５８）がある。そこで、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８５及びＭｏｄ８７と上記公知ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した。尚、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。その結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの方が、オリゴヌクレオチド濃度３０ｎＭにおいて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図６）。【００９０】
実施例９：免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ２、Ｍｏｄ３３、Ｍｏｄ３９及びＭｏｄ４６のマウス脾細胞におけるサイトカイン産生誘導活性の比較
Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のマウス脾細胞を用いて実施例１および３で見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ４６と、Ｍｏｄ３３、Ｄ−タイプＣｐＧであるＭｏｄ３９及びＭｏｄ２との間で、サイトカイン誘導活性を比較評価した。【００９１】
濃度１００ｎＭにおけるＤ−タイプＣｐＧと本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０誘導活性を測定した。測定は、前述したマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生誘導の有無を確認する具体的手段として挙げた手順及び条件に従って行った。その結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ４６のＩＦＮ−γ誘導活性はパリンドロームモチーフが同一のＤ−タイプＣｐＧであるＭｏｄ３９より増強し、Ｍｏｄ３３よりも大きく上回っていた（図７−１）。一方、Ｍｏｄ３３とＭｏｄ４６のＩＬ−１０誘導活性は、それぞれ、Ｍｏｄ２やＭｏｄ３９の誘導活性とほぼ同等であった（図７−２）。免疫刺激オリゴヌクレオチドによる免疫制御性サイトカインＩＬ−１０の誘導については炎症性サイトカインの誘導メカニズムと異なる可能性が示唆された。【００９２】
以上の結果は、本発明の新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドが、ＩＬ−１０誘導活性を維持した状態でパリンドロームモチーフ非依存的なＩＦＮ誘導活性を増強することを示している。また、免疫刺激活性はＣｐＧ配列によって種特異性があるが、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは種差に影響されず、ＩＦＮ誘導活性を増強させる普遍的な構造であることを確認した。【００９３】
実施例１０：本発明の新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドの、Ｊ７７４細胞株における炎症性サイトカイン産生誘導活性の低減
実施例３で見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドなどによる炎症性サイトカイン産生の誘導活性についてパリンドロームモチーフが同一のＤ−タイプＣｐＧと比較評価した。それぞれのオリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフは、配列表及び図８−１及び８−２中で示されており、Ｍｏｄ３７及びＭｏｄ４４はレーン１のＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ、Ｍｏｄ３８及びＭｏｄ４５はレーン２のＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ、Ｍｏｄ３９及びＭｏｄ４６はレーン３のＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣである。尚、評価は、前述したマウスＪ７７４細胞におけるＩＬ−１２とＴＮＦ−αの誘導活性を評価する試験として挙げた手順及び条件に従って行った。その結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ４４、Ｍｏｄ４５及びＭｏｄ４６は、それぞれの同一のパリンドローム配列を有するＤ−タイプＣｐＧのＭｏｄ３７、Ｍｏｄ３８及びＭｏｄ３９と比べて、濃度３００ｎＭにおいて、ＩＬ−１２（図８−１）とＴＮＦ−α（図８−２）の誘導活性がどちらも顕著に抑制された。【００９４】
以上の結果、本発明で見出したポリＧ配列の挿入様式を有する新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドは同一のパリンドロームモチーフからなる従来のＤ−タイプＣｐＧよりも低減された炎症性サイトカイン誘導活性を示した。【００９５】
実施例１１：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドと２００６、２３９５、１０１８及びＣ２７４のＪ７７４細胞株におけるＴＮＦ−α誘導活性の比較
実施例８で見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６と公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドのＴＮＦ−α誘導活性を評価した。Ｊ７７４細胞株にそれぞれの免疫刺激オリゴヌクレオチドを（最終濃度３００ｎＭ）あるいは陽性対照のリポポリサッカライド（ＬＰＳ：最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）で８時間刺激処置して培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した。その他の手順及び条件は実施例１０と同様とした。その結果、実施例４において示されているオリゴヌクレオチド配列２００６（配列番号３１）、２３９５（配列番号３２）、１０１８（配列番号３３）、Ｃ２７４（配列番号３４）及びＭｏｄ３９とＬＰＳと比べて、Ｍｏｄ４６は減弱されたＴＮＦ−α誘導活性を示した（図９）。このことから、実施例２及び６で示される結果も考慮すると、３'末端のポリＧ配列の塩基数が３塩基以下である本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは炎症性サイトカインの誘導活性が減弱することが示された。【００９６】
実施例１２：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７とＭｏｄ３９と１０１８のヒトＰＢＭＣにおけるＩｇＥ産生抑制活性の比較
実施例８で見出した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７と公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドのヒトＩｇＥ産生抑制活性を、前述したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｇＥ産生の抑制活性を評価する試験の具体的方法として示した手順及び条件に従い、１４日間刺激した培養上清中の産生量をもとに評価した。すなわち、ＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり４．０×１０６個の細胞が含まれるように調製した後、平底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり４．０×１０５個の細胞を播き、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−４と０．２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体とともに免疫刺激オリゴヌクレオチドを最終濃度が３０あるいは１００ｎＭとなるように添加した後、１４日間刺激して培養上清中のＩｇＥ産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した（図１０）。
その結果、ＩＬ−４と抗ＣＤ４０抗体で誘導されるＩｇＥ産生に関し、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ８７（図１０のレーン５）は、国際公開２００６／０３５９３９パンフレットにおいて示されているＭｏｄ２（図１０のレーン３）及びＭｏｄ３９（レーン４）、特表２００２−５００１５９号公報において示されている１０１８（レーン６）や国際公開第０３／０１５７１１号パンフレットにおいて示されている２３９５（レーン７）と比べ、ＩｇＥ産生量が低かった。【００９７】
以上の結果、公知のＣｐＧ配列を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドよりも、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドの方が高いＩｇＥ産生抑制活性を有しており、ヒトのアレルギー治療に有効である可能性が示された。【００９８】
実施例１３：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのアレルギーモデル動物におけるＩｇＥ産生抑制効果の確認
実施例１２で顕著なヒトＩｇＥ抑制活性を示した本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７のアレルギー治療効果について、アレルゲンに特異的なＴｈ２反応をマウスに惹起したときに誘導される血清中のＩｇＥ量を指標に評価した。アレルゲンはスギ花粉症のアレルゲンの一つとして知られる、スギ花粉抗原Ｃｒｙ  ｊ  １を用いた。Ｃｒｙ  ｊ  １の精製は公知の方法（Ｈ．Ｙａｓｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｅｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７１，７７−８６，Ｍ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），４５，３０９−３１２）に準じて行った。特表２００２−５１７１５６号公報においてアレルギー治療効果を高める手段として抗原と免疫刺激オリゴヌクレオチドを近接化する方法が開示されている。具体的には共有結合やリポソーム等のマイクロカプセルを用いた方法があり、国際公開第２００６／０３５９３９号パンフレットにおいてＭｏｄ２とＣｒｙ  ｊ  １を封入したリポソーム複合体がアレルゲンに暴露された時に誘導されるマウスの血中ＩｇＥを抑制することが報告されている。このＩｇＥ抑制効果については公知のＣｐＧ配列を有するオリゴヌクレオチドと比べて強いことが確認されている。そこで、リポソームによる近接化技術を用いてＭｏｄ８７とＭｏｄ２のアレルギー治療効果を上記の試験方法により評価した。【００９９】
Ｃｒｙ  ｊ  １と免疫刺激オリゴヌクレオチドを封入したリポソーム複合体の調製は以下の通りに行った。なお、陰性対照として免疫刺激オリゴヌクレオチドを封入しないＣｒｙ  ｊ  １封入リポソーム複合体を調製した。コレステロールとジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）をモル比で１：１で混合し、クロロホルム：メタノール（＝２：１）液に溶解し、ナシフラスコ内で脂質フィルムを作製した。次に脂質フィルムに３．７５ｍｇ／ｍｌのＣｒｙ  ｊ  １あるいはＣｒｙ  ｊ  １と１０〜２０μＭの免疫刺激オリゴヌクレオチドの混合液を加え、４０℃にて攪拌し、リポソームを作製した。Ｍｏｄ８７の封入量は１条件（１ｘＭｏｄ８７）であり、Ｍｏｄ２についてはＭｏｄ８７と同濃度（１ｘＭｏｄ２）および３倍濃度（３ｘＭｏｄ２）の２条件で作製した。これらのリポソームを整粒装置のエクストルーダーを用いて、１μｍのフィルターに０．２〜１ＭＰａの範囲で加圧しながら５回整粒を行った。次にリポソーム液を遠心回法にて収後、ＰＢＳ（−）で３回懸濁、遠心、上清除去することでリポソームの外側のＣｒｙ  ｊ  １および免疫刺激オリゴヌクレオチドを除去した。得られたリポソームの分析は、コレステロール量、Ｃｒｙ  ｊ  １、免疫刺激オリゴヌクレオチドの測定をそれぞれ市販のキット、コレステロールＥテストワコー（和光純薬、４３９−１７５０１）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｏｗｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、２３２４０)、ＯｌｉＧｒｅｅｎ  ｓｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏ−１１４９２）を用いて行った。リポソーム液のＣｒｙ  ｊ  １が１μｇあたりの１ｘＭｏｄ８７、１ｘＭｏｄ２および３ｘＭｏｄ２の量はそれぞれ４．７５１、５．４２５、及び１６．８６７ｎｇであった。【０１００】
以下の実施例で示すリポソーム複合体の略記については以下の通りである。「Ｃｒｙ  ｊ  １＋１ｘ  Ｍｏｄ２／Ｌ」とは、Ｃｒｙ  ｊ  １と１ｘＭｏｄ２の条件で封入したリポソーム複合体であり、「Ｃｒｙ  ｊ  １＋  ３ｘＭｏｄ２／Ｌ」とは、Ｃｒｙ  ｊ  １と３ｘＭｏｄ２の条件で封入したリポソーム複合体であり、「Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ」とは、Ｃｒｙ  ｊ  １と１ｘＭｏｄ８７の条件で封入したリポソーム複合体である。「１ｘの場合」とは、Ｃｒｙ  ｊ  １が１μｇあたりに免疫刺激オリゴヌクレオチドを約５ｎｇ含んでいることを示している。「３ｘの場合」とは、Ｃｒｙ  ｊ  １が１μｇあたりに免疫刺激オリゴヌクレオチドを１ｘの３倍量の約１５ｎｇ含んでいることを示している。また、「Ｃｒｙ  ｊ  １／Ｌ」とはＣｒｙｊ  １のみをリポソームに封入したものある。また、「Ｃｒｙ  ｊ  １」とはリポソームに封入せずにＣｒｙｊ  １を直接投与したことを示す。【０１０１】
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）に各被検物質を１週間間隔で被検物質投与開始週を０Ｗとして０，１及び２Ｗの３回皮内投与（ｉ．ｄ．）をした。被検物質は、Ｃｒｙ  ｊ  １、Ｃｒｙ  ｊ  １／Ｌ、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ２／Ｌ、Ｃｒｙ  ｊ  １＋３ｘ  Ｍｏｄ２／Ｌ及びＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌを、Ｃｒｙ  ｊ  １蛋白量が１μｇ／１００μＬとなるようにＰＢＳで調製して、一回に１００μＬずつ投与した。最後の被検物質処置から１週間後（３Ｗ）と２週間後（４Ｗ）の２回に渡り、Ｃｒｙ  ｊ  １及びアラムの混合液を各個体に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）してＴｈ２反応の惹起を行った。６Ｗに眼底採血を行い、血液は遠心操作後、血清として−２０℃にて凍結保存した。得られた血清はＴｈ２反応の指標である血清中総ＩｇＥ量の測定用のサンプルとして使用した。また、最後の採血後、各個体から脾臓を摘出した後、各個体の脾臓を摘出してホモジネートし、本明細書中、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生誘導の有無を確認する具体的手段中に記載されている調製方法に従って脾細胞を調製した（ＲＰＭＩ１６４０培地，１０％ウシ胎児血清）。各個体の脾細胞懸濁液は、丸底の９６穴マルチプレートに１ウェルあたり４×１０5細胞となるように播き、Ｃｒｙ  ｊ  １存在下（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）で、ＣＯ2インキュベータ内にて７２時間の培養を行い、培養上清を回収した。回収した培養上清中のＩＬ−５（Ｔｈ２反応指標）とＩＦＮ−γ（Ｔｈ１反応指標）をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１０２】
６Ｗの血清中のＩｇＥ量を測定した結果、Ｃｒｙ  ｊ  １処置群のＩｇＥ量は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群よりも２倍以上高い値を示した。また、ＩｇＥ量はＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ処置群が最も低く、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  ３ｘＭｏｄ２／Ｌ、Ｃｒｙ  ｊ  １／Ｌ、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ２／Ｌの順で低い値を示した（図１１）。Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ２／Ｌ投与群とＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ投与群の２群間で統計処理（ｔ検定）を行った結果、ＩｇＥ産生量は有意（Ｐ＜０．０５）にＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌの方が低かった。【０１０３】
次に、被検物質を処置したマウスのＴｈ２反応またはＴｈ１反応の誘導を確認するために、マウスから脾臓を摘出し、Ｃｒｙ  ｊ  １刺激によって培養上清中に誘導される脾細胞のＩＬ−５（Ｔｈ２反応指標）及びＩＦＮ−γの産生量を測定した（図１２−１）。Ｔｈ１反応の指標であるＩＦＮ−γの産生量を測定した結果、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ（１４３２４．６２  ｐｇ±７４４４．０７）処置群が最も高く、次いでＣｒｙ  ｊ  １＋  ３ｘＭｏｄ２／Ｌ（３４７５．３０  ｐｇ±９０７．５６）とＣｒｙ  ｊ  １／Ｌ（１７８２．０２  ｐｇ±８４９．２３）の順で産生量が増加していた。また、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌと同じ免疫刺激オリゴヌクレオチド量を投与したにもかかわらず、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  ３ｘＭｏｄ２／Ｌ処置群では殆ど産生が認められなかった。【０１０４】
次に、ＩＬ−５の産生量を測定した。その結果、Ｃｒｙ  ｊ  １／Ｌは全くＩＬ−５の産生を抑制しなかったが、免疫刺激オリゴヌクレオチドを添加することにより顕著に減少した。Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ投与群の抑制活性が最も強かった。ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＣｒｙ  ｊ  １を内封したリポソーム複合体のＩＬ−５抑制活性はＩＦＮ−γ誘導活性と逆相関し、ＩｇＥ産生抑制活性とよく相関していた。また、Ｃｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ２／Ｌ投与群とＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌ投与群の２群間で統計処理（ｔ検定）を行った結果、ＩＬ−５産生量は有意（Ｐ＜０．０５）にＣｒｙ  ｊ  １＋  １ｘＭｏｄ８７／Ｌの方が低かった。（図１２−２）。【０１０５】
これらのことから、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとアレルゲンを封入したリポソームは、アレルゲンに暴露された時のＴｈ２反応及びＩｇＥ産生を、公知の免疫刺激ヌクレオチドとアレルゲンのリポソーム内封アレルゲンの技術と比較してより強力に抑制する効果を有し、Ｔｈ１誘導活性を強力に誘導することが判明した。【０１０６】
以上の結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは動物を用いたアレルギーモデルにおいて公知のＤ−タイプＣｐＧオリゴヌクレオチドよりもＩｇＥ産生抑制活性、Ｔｈ２抑制活性とＴｈ１誘導活性が向上しており、かつ低用量で効果的な治療効果を有することから、アレルギー疾患をもつ患者に投与された場合、アレルギー疾患の治療、又は予防剤として有用であることが示された。【０１０７】
実施例１４：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのマウスにおける肝炎治療効果
マウスの肝炎モデルとして一般的に利用されているコンカナヴァリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝炎モデルを用いて本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗炎症効果について評価した。ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルは、急激な炎症反応の惹起による肝炎を発症し、免疫反応の活性化を伴う肝炎モデルとして用いられている。尚、ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルにおいてＣｐＧオリゴヌクレオチドを評価した試験（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００５）５１，４１−４９）においてＫ−タイプＣｐＧである１６６８（配列番号１０８）が逆に肝炎の症状を悪化させた結果を示した公知例がある。また、ＣｐＧを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドがＣｏｎＡ誘発肝炎モデルにおいて肝炎のマーカーとなるＡＬＴ値の上昇を抑制したという報告例は開示されていない。【０１０８】
ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルの調製と血清中ＡＬＴ値の測定は、以下のようにして行った。
５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）を用いた。ＣｏｎＡを投与するマウスは、投与前日の夕方からＣｏｎＡ投与完了まで絶食とし、ＣｏｎＡ投与終了後に給餌を再開した。ＣｏｎＡを投与しない群をＮａｉｖｅ群とした。免疫刺激オリゴヌクレオチドはＣｏｎＡを投与する３，６，２４時間前に１回行った。免疫刺激オリゴヌクレオチドはＰＢＳ（−）で濃度１０μｇ／ｍＬに調整した後、１００μＬずつマウスの尾静脈内に注射した。一匹あたり１μｇを投与した。ＣｏｎＡは溶媒に生理食塩水を用いて濃度４ｍｇ／ｍｌに調整した後、１００μＬずつマウスの尾静脈内へ投与した。一匹あたり０．４ｍｇを投与した。ＣｏｎＡ投与から２４時間後に採血し、得られた血液を１００００ｒｐｍ、５分間４℃にて遠心分離し、血清を得た。血清中のＡＬＴ値はフジドライケム（ＤＲＩ−ＣＨＥＭ  ５５００Ｖ、富士フィルム）で測定した。【０１０９】
ＣｏｎＡ誘発肝炎マウスモデルの炎症惹起から２４時間後の血清中ＡＬＴ値の上昇を評価した結果（図１３）、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ８７（配列番号５２）は処置時間に依存して血清中ＡＬＴ値の上昇を抑制した（図１３、レーン３〜５）。３時間前処置からＡＬＴ値上昇を抑制する傾向が認められ（レーン５）、２４時間前処置は血清中ＡＬＴ値が有意に低く（レーン３）、ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるＡＬＴ値（レーン２）の２８．５％（ｔ検定：ｐ＜０．０５）であった。【０１１０】
以上の結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝炎治療効果を有することを確認した。【０１１１】
実施例１５：本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７と２３９５、１０１８およびＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１のマウスにおける肝炎治療効果の比較
Ｃ型慢性肝炎への適用の臨床試験中のＣｐＧ１０１０１と同一配列であり、国際公開第０３／０１５７１１号パンフレットおよび特表２００６−５１５２７７号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列（２３９５、配列番号３２）、特表２００３−５２６６６２号公報で示されているオリゴヌクレオチド配列（１０１８、配列番号３３）、および特開２００５−２３７３２８号公報において強いＩＦＮ−α誘導活性を有する代表的な配列として示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）と、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７（配列番号５２）とについて、マウスＣｏｎＡ誘発肝炎モデルを用いた肝炎治療効果を比較した。【０１１２】
実施例１４に示されている方法に従って、免疫刺激オリゴヌクレオチドの肝炎治療効果を血清中ＡＬＴ値の上昇の抑制を指標に評価した。まず、Ｍｏｄ８７と２３９５の肝炎治療効果を比較評価した。免疫刺激オリゴヌクレオチド１μｇをＣｏｎＡ投与の６時間前にマウスに処置し、ＣｏｎＡによる炎症惹起から２４時間後に採血して血清中のＡＬＴ値を測定した。その結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７（図１４−１、レーン３）は有意にＡＬＴ値の上昇の抑制をした（ｔ検定：ｐ＜０．０５）が、２３９５（レーン４）は全く効果がなかった。【０１１３】
次に、Ｍｏｄ８７と１０１８およびＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１の肝炎治療効果を比較評価した。免疫刺激オリゴヌクレオチド１μｇをＣｏｎＡ投与の２４時間前にマウスに処置し、ＣｏｎＡによる炎症惹起から２４時間後に採血して血清中のＡＬＴ値を測定した。その結果、ＡＬＴ値の上昇は本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７（図１４−２、レーン３）が最も強く抑制し、次いで１０１８（図１４−２、レーン４）とＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（図１４−２、レーン５）の順に抑制効果があった。Ｍｏｄ８７と１０１８はそれぞれＡＬＴ値上昇を有意に抑制した（ｔ検定、Ｍｏｄ８７：ｐ＜０．０１，１０１８：ｐ＜０．０５）が、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１は有意な抑制が認められなかった。
従って、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはＣｐＧを含有する公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドよりも強い肝炎治療効果を示すことを確認した。【０１１４】
実施例６におけるヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの比較試験から、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは近似配列よりもＩＬ−１２の産生を抑制する活性が強いことが示されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗炎症作用とマウスの肝炎治療効果は相関する可能性が示めされた。【０１１５】
以上の結果、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、優れたインターフェロン誘導活性かつ低減された炎症性サイトカイン誘導活性を有することに加え、肝炎治療作用を有することが示され、Ｃ型肝炎の患者に投与された場合、Ｃ型肝炎の治療、又は予防剤として有用であることが確認された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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