(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアセトアルデヒドを含有する培地でプロトテカ属微生物を培養し、２−フェニルエチルアルコールを採取することを特徴とする２−フェニルエチルアルコールの製造方法。
【請求項２】
プロトテカ属微生物が、プロトテカ  ゾフィ、プロトテカ  サーモデュリカ、プロトテカ  スタグノラ及びプロトテカ  ウイッカハミイから選ばれたいずれかの微生物である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
プロトテカ属微生物が、プロトテカ  ゾフィ JCM 9400、プロトテカ  ゾフィ  JCM9646、プロトテカ  スタグノラ  JCM9642である請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香料、精油として有用な２−フェニルエチルアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−フェニルエチルアルコールは、水に微溶でありバラ様の甘い香気を持つ無色透明な液体である。その特性から、食品香料、化粧品香料両分野において広く用いられており、非常に重要な香料化合物である。しかし、天然の２−フェニルエチルアルコールは極めて高価であることから、合成の２−フェニルエチルアルコールが市場で広く用いられ、スチレンオキシドを還元的に開環する方法が工業的製法として広く知られている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、現在、化学の各方面において環境調和型合成経路の確立が叫ばれており、微生物を用いた有用物質の生化学的合成は、環境調和型合成法として重要視されている。２−フェニルエチルアルコールの生化学的合成については、１）コリネバクテリウムに属しスチレン系化合物の分解能を有する微生物を用いたスチレンオキシドの還元的開環（特許文献１）、２）酵母を用いたＬ−フェニルアラニンからの合成（非特許文献２）、等が知られている。
【０００４】
しかしながら、前者は、出発物質であるスチレンオキシドが発がん性物質であるため、安全性の面での難点がある。また、後者は、三段階の反応工程を踏むため、操作が極めて迂遠である、生産の効率が満足のいくものではない、という問題がある。
【特許文献１】特開平７−６７６６９号公報
【非特許文献１】印藤元一著  「合成香料  化学と商品知識」化学工業日報社１９９６年
【非特許文献２】Appl Microbiol Biotechnol （２００２） ５９：１−８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微生物を用いた２−フェニルエチルアルコールの合成法について、安全かつ簡便な操作で、しかも効率よく生産する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、微生物を用いた２−フェニルエチルアルコールの合成法について検討を行った結果、基質としてフェニルアセトアルデヒドを用い、これを含有する培地でプロトテカ（Prototheca）属微生物を培養することにより、ワンポットで、効率よく２−フェニルエチルアルコールを製造することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、フェニルアセトアルデヒドを含有する培地でプロトテカ属微生物を培養し、２−フェニルエチルアルコールを採取することを特徴とする２−フェニルエチルアルコールの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本生産方法の発明によれば、安全かつ簡便な操作で、しかも効率よく２−フェニルエチルアルコールを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いられるプロトテカ属微生物としては、例えば、プロトテカ  ゾフィ（Prototheca zopfii）、プロトテカ  サーモデュリカ（Prototheca thermodurica）、プロトテカ  モリフォルミス（Prototheca moriformis）、プロトテカ  スタグノラ（Prototheca  stagnora）、プロトテカ  ウイッカハミイ（Prototheca wickerhamii）、プロトテカ  トリスポア（Prototheca trispoa）、プロトテカ  エリボトリアエ（Prototheca eriobotryae）、プロトテカ  プロトリセンシス（Prototheca protoricensis）等が挙げられ、このうち、プロトテカ  ゾフィ、プロトテカ  サーモデュリカ、プロトテカ  スタグノラ、及びプロトテカ  ウイッカハミイが好ましく、プロトテカ  ゾフィ（Prototheca zopfii）がさらに好ましい。なお、斯かる微生物は、野生株、変異株、遺伝子操作等により誘導される組み換え株のいずれでも良い。
また、具体的な菌株としては、例えば、Prototheca zopfii JCM 9400、Prototheca zopfii JCM 9646、Prototheca zopfii NBRC 6998、Prototheca zopfii NBRC  7532、Prototheca zopfii NBRC 7533、Prototheca zopfii NBRC 7534、Prototheca zopfii NBRC 7535、Prototheca zopfii NBRC 7536、Prototheca thermodurica JCM 8557、Prototheca stagnora JCM 9641、Prototheca stagnora JCM 9642、Prototheca wickerhamii JCM 9643、Prototheca wickerhamii JCM 9644、Prototheca wickerhamii JCM 9645、Prototheca trispoa NBRC 6996、Prototheca eriobotryae NBRC 32449、Prototheca protoricensis IAM C‐177等が挙げられ、Prototheca zopfii JCM 9400が好ましい。これらの菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＲＩＫＥＮＢＲＣ‐ＪＣＭ）又は東京大学分子生物学研究所のＩＡＭＣＣから入手可能である。
【００１０】
本発明の微生物を培養する培地としては、本発明の微生物が増殖し得るものであればよいが、当該微生物の生育に必要な栄養源、例えば窒素源、無機物、微量栄養素、炭素源を含有せしめるのが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、アスパラギン、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキス等が挙げられる。無機物、微量栄養素としては、硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化第二鉄、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カリウム、ホウ酸、ビタミン類等が用いられる。また、炭素源としては、グルコース、スクロース、グリセリン、デキストリン、カルボキシメチルセルロース等が挙げられ、特にグルコースが好ましい。
また、上記培地には、目的物質の単離・精製の妨げにならない範囲でｎ-アルカン等の
疎水性化合物を添加してもよい。
【００１１】
培養は、好気的条件下で振盪、撹拌して行うのが好ましく、培養温度は２５〜３７℃、好ましくは２８〜３０℃、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ５〜６で、３〜７日間、好ましくは３〜５日間行なえばよい。
【００１２】
本発明において基質として用いるフェニルアセトアルデヒドは、工業的にはスチレングリコールの脱水異性化等により製造されており、Aldrich社等から入手することができる。斯かる２−フェニルエチルアルコールは、ナルシサス、ネロリ、ローズなどの花精油、グレープフルーツ、トマト、ココア、白パンなど、天然に広く存在する安全な化合物である。
【００１３】
フェニルアセトアルデヒドは、反応阻害が起こらない範囲で、一括或いは連続的に、培地に添加することができる。フェニルアセトアルデヒドは、培地中の濃度が目的物の生産性及び回収性の点から、１〜２０質量％、さらに１〜１０質量％、さらに２．０〜８．０質量％となるように添加するのが好ましい。また、培地中のフェニルアセトアルデヒド濃度を上昇させると、栄養源の不足により２−フェニルエチルアルコールの生産効率が低下するが、その際、炭素源、例えばグルコースの濃度を微生物の生育に必要に応じた濃度を含有せしめることで当該生産効率の低下を抑制することができ、２−フェニルエチルアルコールをさらに効率よく得ることができる。
フェニルアセトアルデヒドは、５０％フタル酸ジエチル溶液として流通しているが、本発明においては、これをそのまま使用することができ、また、反応に影響を与えない有機溶媒等に溶解したり、界面活性剤などに分散させて添加することもできる。
【００１４】
本発明の微生物とフェニルアセトアルデヒドとの接触は、培地に最初からフェニルアセトアルデヒドを添加しておき培養する方法、培養液にフェニルアセトアルデヒドを添加する方法の何れでもよいが、反応溶液の点から、培養液にフェニルアセトアルデヒドを添加する方法が好ましい。
また、微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに公知の方法で固定化することもできる。微生物菌体と基質とが限外ろ過膜などを介して接触する構造を持つ反応容器中で両者を反応させることもできる。
【００１５】
培養物又は接触反応混合物から、目的化合物を分離するには、培養物を遠心分離、各種溶媒による抽出等を適宜組み合わせて行えばよく、更に、クロマトグラフィー等により精製することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００１７】
実施例１
２−フェニルエチルアルコール（２−ＰＥ）の生産量をPrototheca zopfii JCM9400および既に２−ＰＥ生産の報告のある複数の菌株と比較した。用いた菌株は、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxians、Hansenula anomala、Torulopsis utilisである。各菌株を、２０ｍＬ容三角フラスコ中の４ｍＬのＧＹ培地（０．５％酵母エキス、２．０％グルコース）に接種し、２８℃で２日間往復振盪培養（１４０ｒｐｍ）した後、培養液に反応基質として５０％フェニルアセトアルデヒド／フタル酸ジエチル溶液をフェニルアセトアルデヒドの終濃度がそれぞれ２％、４％、６％となるように添加し、かつ同時にグルコースも終濃度で２％向上するように添加し、同条件での培養を継続した。基質添加後３日後の培養液に内部標準として7−ペンタデカノンを２５０μｇ添加し１ｍＬのクロロホルムおよび２ｍＬのメタノールを添加し激しく攪拌後１０分間放置した。その後さらに１ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加し攪拌後、遠心分離を行い、クロロホルム層（下層）を回収した。クロロホルムで抽出した脂溶性画分を遠心エバポレーター（ＥＹＥＬＡ社製：ＣＶＥ３１００）で濃縮しガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に供し、内部標準のピーク面積を元に２−ＰＥ生産量を算出した。結果を図１に示す。なおＧＣ分析条件は次の通りである。カラム：ＴＣ−ＷＡＸ（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、分析装置：ＧＣ−１７Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）カラム温度：１２０〜２２０℃、２℃／分昇温、注入口検出器温度：２５０℃、検出器：ＦＩＤ、キャリアガス：Ｈｅ、メイクアップガス：Ｎ2で行なった。
酵母を用いた場合は、フェニルアセトアルデヒドを４％以上添加しても生産量に伸びが見られなかったが、Prototheca zopfii JCM9400を用い、フェニルアセトアルデヒドを６％添加した場合、バッジ培養にて１０ｇ／Ｌ以上の２−フェニルエチルアルコールの生産量を示した。
なお、Ｌ−フェニルアラニンを基質として酵母を用いた流加培養の系での反応で、生産量が、１２．６g／Ｌである旨の報告があるが（文献  Biotechnol.Prog.2002,18,514-523）、バッジ培養では１０ｇ／Ｌ以上の生産量を示す反応は過去に報告がない。
【００１８】
実施例２
６％−フェニルアセトアルデヒド添加系において、プロトテカ属に属する他菌種における２−ＰＥ生産能力の確認を行なった。用いた菌種はPrototheca zopfii、Prototheca thermoduria、Prototheca stagnola、Prototheca wickerhamiiであり、対照として実施例１において用いた酵母にPichia fermentansを加え各々複数の菌株をもちいた。実施例１と同様の条件で振盪培養を開始し、培養２日目に終濃度が６％となるように５０％フェニルアセトアルデヒド／フタル酸ジエチル溶液を添加し、かつグルコース濃度も２％増大させた。添加後３日間振盪培養を継続した後、培養液を実施例１と同様に処理しＧＣに供した。各菌株での２−ＰＥ生産量を図２に示す。
いずれのプロトテカ属微生物を用いても効率よく２−フェニルエチルアルコールを得ることができた。図２から明らかなように、酵母を用いた反応との生産量の差は著しい。
【００１９】
実施例３
実施例２においてプロトテカ属の優れた２−ＰＥ生産能力が確認されたため、Prototheca zopfii JCM9400を用い、生産量の増大を試みた。実施例１と同様の条件で振盪培養を開始し、培養２日目に添加する５０％フェニルアセトアルデヒド／フタル酸ジエチル溶液とグルコースの量を変化させた。培養終了からＧＣ分析至る工程は実施例１と同様である。結果を表１に示す。添加するフェニルアセトアルデヒド（ＰＡ）量が多くなると２−ＰＥ生産へ阻害が認められるが、同時に添加するグルコース（Ｇｌｃ）量を増大させることで生産性の回復が認められ、８％−フェニルアセトアルデヒド添加系で１７ｇ／Ｌの２−ＰＥ生産量を確認した。結果を表１に示す。
培地中のフェニルアセトアルデヒド濃度を上昇させると、栄養源の不足により２−フェニルエチルアルコールの生産効率が低下するが、その際、グルコースの濃度を微生物の生育に必要に応じた濃度を含有せしめることで、当該生産効率の低下を抑えられることがわかった。
【００２０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各菌株における２−ＰＥ生産量（フェニルアセトアルデヒドの終濃度が２％、４％、６％）を示す図である（実施例１）。
【図２】各菌株における２−ＰＥ生産量を示す図である（実施例２）。
【図１】
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【図２】
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