(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸もしくはその塩、含硫還元性化合物及び界面活性剤を少なくとも含む前処理液と、鼻汁、膿、鼻腔洗浄液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、及び喀痰からなる群から選択される生体試料とを混合して、生体試料中のウイルスの抗原を測定するための測定用試料を調製する工程と、
調製された測定用試料中のウイルスの抗原をサンドイッチ酵素免疫測定法又は粒子標識イムノクロマト法によって測定する工程と、
を含む免疫学的測定方法。
【請求項２】
含硫還元性化合物が、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン、二臭化水素酸Ｓ-２アミノエチルイソチオ尿素、ハイドロサルファイト塩及び亜硫酸塩からなる群から選択される請求項１に記載の免疫学的測定方法。
【請求項３】
界面活性剤が陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両イオン性界面活性剤からなる群から選択される請求項１に記載の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、生体試料中の成分、とりわけウイルスの検出、測定に利用される検体の前処理方法を含む免疫学的測定方法に関し、いわゆる臨床検査診断に用いられる。
【０００２】
技術背景
生体試料、例えば血液、髄液、精液、唾液、尿、糞便、喀痰、鼻汁、分泌液、汗等に含まれる特定成分を検出、測定するにあたり、それら試料を前処理して、特定の成分の検出、測定を行ない易くする必要がある場合が多数ある。その方策として、種々の前処理方法が考案されている。例えば、ウイルスのコア抗原を測定するために、界面活性剤により、ウイルスの外套膜を破壊してコア蛋白質を露出させて測定する方法（特開平８−５０１３３、特開平１１−１０８９３２）が知られている。
【０００３】
またクラミジアなどの細菌に由来する可溶リポ多糖の測定には陰イオン性多糖と界面活性剤の組み合わせが開示されている（特開平９−１２７１１０）。
【０００４】
本発明の課題は生体試料中に含まれる成分、とりわけ微生物成分を検出、測定するにあたり、反応性及び反応特異性を高めるための前処理方法、前処理液或いはこれを含む測定試薬を提供することである。
【０００５】
例えば、患者から採取した喀痰または鼻汁中のインフルエンザウイルスを免疫学的に検出するためには、喀痰または鼻汁を前処理液で処理し、抗原を露出させる必要がある。このような生体試料中には、測定の妨害になる物質が多量に含まれているため、測定に悪影響を及ぼすことなく、測定目標物質の反応性を高めるための前処理が必要である。
【０００６】
発明の開示
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、被検試料中に含まれる成分を測定するための前処理液（または反応液）であって、有機酸もしくはその塩、含硫還元性化合物及び界面活性剤を少なくとも含む前処理液による処理により本発明の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、１．有機酸もしくはその塩、含硫還元性化合物及び界面活性剤を少なくとも含む前処理液と、鼻汁、膿、鼻腔洗浄液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、及び喀痰からなる群から選択される生体試料とを混合して、生体試料中のウイルスの抗原を測定するための測定用試料を調製する工程と、調製された測定用試料中のウイルスの抗原をサンドイッチ酵素免疫測定法又は粒子標識イムノクロマト法によって測定する工程と、を含む免疫学的測定方法、２．含硫還元性化合物が、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ-アセチル-Ｌ-システイン、二臭化水素酸Ｓ-２アミノエチルイソチオ尿素、ハイドロサルファイト塩及び亜硫酸塩からなる群から選択される前項１に記載の免疫学的測定方法、３．界面活性剤が陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両イオン性界面活性剤からなる群から選択される前項１に記載の免疫学的測定方法、からなる。
【０００８】
発明を実施するための最良の形態
本発明の、被検試料中に含まれる微生物の関連物質とはウイルス、リケッチャ、細菌、真菌のような微生物、またはこれら微生物由来の特定の成分が例示され、これらを免疫学的に測定する。特に抗原または抗体の測定に好適である。とりわけウイルス抗原の測定、検出に好適である。被検物質の具体例としては、例えばウイルスであれば、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、ＣＭＶ，ＺＶＺ，ＥＢＶ，ＨＨＶなど）、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ，ＨＣＶ、ＨＤＶ，ＨＧＶ）、その他カゼ症候群、消化器系疾患、中枢神経系疾患、呼吸器系疾患、出血熱等の様々な疾患の病因ウイルスが挙げられる。特にインフルエンザ抗原の測定に好適であるが、これに限らず、抗原を露出させる前処理の必要なウイルス抗原の測定に応用できる。またウイルス以外であっても、抗原を露出させる前処理の必要な細菌（黄色ブドウ球菌、大腸菌群、緑膿菌）、クラミジア等の各種微生物にも応用できる。
【０００９】
本発明の被検試料とは、生体試料または生体由来試料に含まれる成分であり、生体試料または生体由来試料とは、全血、血漿、血清、尿、髄液、精液、唾液、母乳、汗、粘液等の体液や糞便、病変部組織及びその抽出液、膿、喀痰、鼻汁、鼻腔洗浄液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液及びウイルスをはじめとする微生物培養系試料等である。これの生体試料中に含まれる特定成分を免疫学的に検出、測定するにあたり、被検体試料を予め前処理液で処理した後に測定、検出反応に供する。
【００１０】
本発明で使用する有機酸またはその塩とは、格別限定されず、例えば酢酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸の遊離酸またはその塩の中から選ばれた１種または２種以上を組み合わせて用いる。本発明において、用いる有機酸またはその塩は単独または２種以上を混合して用いる場合もある。その他の有機酸として、シュウ酸、グリコール酸、グルコン酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００１１】
本発明で使用する界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、または両イオン性界面活性剤の中から選ばれた１種または２種以上を組み合わせて用いる。用いる界面活性剤は格別限定されず、代表的な例として、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、アルキルピリジニウム塩、高級アルコール硫酸エステル塩等が挙げられる。
【００１２】
本発明で使用する還元性物質は、含硫還元性化合物であり、単独または２種以上を混合して用いる場合もある。代表的な還元剤として、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−Ｌシステイン、二臭化水素酸Ｓ−２アミノエチルイソチオ尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ハイドロサルファイト塩、亜硫酸塩等の含硫還元性物質が挙げられる。
【００１３】
これらによる前処理にあたってその使用量は、被検体試料液中での濃度として規定される。有機酸類の添加量は総量として最低５ｍＭ以上、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜１００ｍＭである。１００ｍＭ以上を添加しても格別の処理効果は期待出来ないが利用を制限するものではない。界面活性剤類の添加量は総量として、０．０１Ｗ／Ｖ％以上、好ましくは０．０５Ｗ／Ｖ％以上で、上限は５Ｗ／Ｖ％、好ましくは１Ｗ／Ｖ％、より好ましくは０．１２５Ｗ／Ｖ％である。０．１２５Ｗ／Ｖ％以上を添加しても格別の処理効果は期待出来ないが利用を制限するものではない。還元剤類の添加量は総量として最低０．５ｍＭ以上、好ましくは１〜５００ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭである。１０ｍＭ以上を添加しても格別の処理効果は期待出来ないが利用を制限するものではない。
【００１４】
本発明の具体的な実施態様の例として、界面活性剤として非イオン性界面活性剤の１種であるポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（商品名、ＮＰ−４０）を０．０１〜５Ｗ／Ｖ％、より好適には０．０５〜１．０Ｗ／Ｖ％、還元剤として２−メルカプトエチルアミン 塩酸塩の１〜１００ｍＭ、より好適には１０〜５０ｍＭ、有機酸としてクエン酸を１０〜５００ｍＭ、より好適には５０〜１００ｍＭを用い、その溶液のｐＨを５〜７、より好適には６付近に調整した溶液を前処理液として使用する。
【００１５】
本発明の被験試料は、例えばその前処理液の１００μＬとインフルエンザウイルスを含む患者の鼻汁２０μＬを混合し前処理をしたのち、免疫化学測定法、例えば、抗インフルエンザモノクロナール抗体を用いるサンドイッチ酵素免疫測定法、或いは着色ラテックス粒子で抗インフルエンザモノクロナール抗体を標識した、粒子標識イムノクロマト法等によって測定する。
【００１６】
実施例
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１）
種々の界面活性剤を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝６．０に加えて、前処理液とした。その前処理液１００μＬとインフルエンザ培養ウイルスを混合して室温で１０分間前処理した後、抗インフルエンザウイルスモノクロナール抗体を用いる酵素免疫測定法でウイルス抗原を測定した。その結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0005198710.tif 000002
【００１９】
以上の結果、調査した全ての界面活性剤において少なくとも０．０６〜０．５Ｗ／Ｖ％の濃度範囲において、酵素免疫法での測定シグナルが強められることが判り、前処理の効果が明らかになった。
【００２０】
（実施例２）
種々の還元剤を０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液に添加すること以外は、実施例１と同様に操作して還元剤の効果を調べた。その結果を表２に示した。
【００２１】
【表２】
0005198710.tif 000003
【００２２】
以上の結果還元剤を添加することにより、より大きい吸光度が観測され、前処理効果が大きいことが判った。
【００２３】
（実施例３）
種々の有機酸を０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０及び２０ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を含む２０ｍＭリン酸緩衝液に添加すること以外は、実施例１と同様に操作して有機酸の効果を調べた。その結果を表３に示した。
【００２４】
【表３】
0005198710.tif 000004
【００２５】
以上の結果より有機酸を添加することにより、より大きいシグナルが得られ、前処理効果が高くなることが示された。
【００２６】
（実施例４）
０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝６．０溶液（０．１％ＯＮＰ／ＮａＰＢ）、０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝６．０溶液に１０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインを加えた溶液（ＮＰ４０＋ＮＡＣ／ＮａＰＢ）、０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ＝６．０に１０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインを加えた溶液（ＮＰ４０＋ＮＡＣ／Ｃｉｔｒａｔｅ）および０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ＝６．０に１０ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を加えた溶液（ＮＰ４０＋ＭＥＡ／Ｃｉｔｒａｔｅ）の各前処理液を調製して、インフルエンザ患者の鼻汁または咽頭ぬぐい液（Ｎｏ．５ｘ２、Ｎｏ．１０，Ｎｏ．１９，Ｎｏ．２０、Ｎｏ．３１）、培養ウイルス抗原（ＮＩＢＳＣ社製）および市販インフルエンザ抗原（Ａ／Ｔｅｘａｓ１／７７ Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）の各試料を前処理して、抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法でインフルエンザ抗原を測定した。その結果を表４に示した。
【００２７】
【表４】
0005198710.tif 000005
【００２８】
以上の結果より、０．１Ｗ／Ｖ％のノニデットＰ−４０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝６．０溶液（０．１％ＮＰ／ＮａＰＢ）前処理液及び還元剤ＮＡＣを加えた前処理液に比べて、有機酸を添加した前処理液で処理した試料は、何れも大きいシグナルが得られ、より前処理効果が大きいことが判った。
【００２９】
発明の効果
被検試料中に含まれる成分を測定するための前処理液（または反応液）であって、少なくとも有機酸もしくはその塩を含む前処理液、特に界面活性剤、還元性物質から選ばれた少なくとも１種と有機酸もしくはその塩を含む検体前処理液による処理により、生体試料中に含まれる成分、とりわけ微生物成分を検出、測定するにあたり、反応性及び反応特異性を高めることに成功した。