(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２番目のトレオニンがイソロイシン、ロイシンまたはバリンに置換されている配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする、転移メラノーマに対するリンパ球に対して免疫原性であるペプチド。
【請求項２】
配列番号６、７または８のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２記載のペプチドまたは請求項３記載のヌクレオチドを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項５】
前記ペプチドが薬学的に許容しうる担体または希釈剤と混合していることを特徴とする請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
前記ペプチドであらかじめローディングした抗原提示細胞を含むことを特徴とする請求項４または５記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１または２記載のペプチドに対するＴ細胞レセプターまたは該Ｔ細胞レセプターを発現している細胞を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項８】
アジュバント、１または２以上のサイトカイン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８もしくはほかのＴ細胞表面抗原に対する抗体ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するヘルパーエピトープからなる群より選ばれた１または２以上の化合物も含むことを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ａ患者由来のメラノーマのサンプルから腫瘍浸潤リンパ球を単離する段階、
ｂ請求項１または２記載のペプチドと前記リンパ球を反応させる段階、
ｃ該抗原に対して結合するリンパ球を単離する段階、
を含むことを特徴とする、抗原反応性腫瘍浸潤リンパ球の産生方法。
【請求項１０】
請求項１または２記載のペプチドと検出可能なマーカーとのコンジュゲート。
【請求項１１】
検出可能なマーカーが放射性核種であることを特徴とする請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のコンジュゲートを含むことを特徴とする、請求項１記載のペプチドに対する抗体の検出用キット。
【請求項１３】
請求項１または２記載のペプチドに特異的に結合することを特徴とする腫瘍浸潤リンパ球。
【請求項１４】
請求項１３記載の腫瘍浸潤リンパ球を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１５】
請求項１または２記載のペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項１または２記載のペプチドのいずれか１または２以上を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療と診断、特にメラノーマ関連ペプチド類似体、そのエピトープ、メラノーマに対するワクチンならびにメラノーマ検出用およびワクチン接種モニタリング用の診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常組織から腫瘍組織への段階的変化の間に、腫瘍関連抗原が現れる。腫瘍関連抗原の特徴はそれらを保持する腫瘍の起源に著しく依存する。動物腫瘍に関連する抗原の存在は前世紀に記録されており、ヒトの癌の抗原的特徴は主としてモノクローナル抗体による最近の研究を通して充分に確立されている。
【０００３】
これらの抗原を単離して化学的に特徴づけようとする試みには非常な困難があり、その多くは抗原保持分子を溶液から沈殿させるのに適した試薬がないことと関係していた。
【０００４】
他の多くの刺激因子と同様に腫瘍関連抗原も、単一の防御機序だけではなく、防御機序の集合全体を（特異的なものも非特異的なものも、また体液性のものも細胞性のものも）活性化する。腫瘍増殖に対するインビボ（in vivo）での耐性における主な役割はＴリンパ球によって果たされる。これらの細胞は抗原提示細胞（APC）によってそれらに提示された腫瘍関連抗原を認識し、その認識によって活性化される。活性化と分化が起きると、これらの細胞はその腫瘍細胞を攻撃し殺す。
【０００５】
細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）は、主要組織適合複合体（MHC）クラスＩ分子の抗原結合溝に提示された長さが９〜１１アミノ酸の短いペプチド断片を認識する（Townsendら, 1986, Cell 44:959;Bjorkmanら, 1987, Nature 329:512）。これらのペプチドは通常、細胞内タンパク質プールに由来し、小胞体の内腔中でＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリン分子と会合した後、そのＭＨＣ−ペプチド複合体が細胞表面に輸送される。同じ抗原内に抗原性ペプチドと推定されるものは数多く存在するにもかかわらず、ＣＴＬによる認識のために選択されるのは数種類のペプチドに過ぎない。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ抗原はしばしば充実性腫瘍中でダウンレギュレートされる。これはすべてのクラスＩ／ＩＩ抗原に影響する場合もあるし、その一部のみに影響する場合もある。細胞傷害性Ｔリンパ球媒介性溶解のために適当な標的細胞を感作できるウイルスペプチドや細胞性ペプチドも、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現レベルが低い細胞内で産生された場合には、そうすることができないと考えられる。細胞毒感受性は、少なくともいくつかの場合には、インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子αでＭＨＣクラスＩ／ＩＩ抗原の発現レベルを高めることによって誘導することができる。
【０００７】
エピトープのＭＨＣクラスＩ結合親和力は、ペプチド−ＭＨＣ複合体の免疫原性を決定する重要なパラメーターである。抗ウイルスＣＴＬによって認識されるヒト組織適合抗原（ＨＬＡ−Ａ*０２０１）拘束性エピトープ（restrited epitopes）の分析から、数種類のペプチドがＨＬＡ−Ａ*０２０１に高い親和力で結合することが立証された。また、ＨＬＡ−Ａ*０２０１形質転換マウスを用いたモチーフ含有エピトープ候補の免疫原性分析によって、ＣＴＬ反応を誘導するにはペプチドがある閾値ＭＨＣクラスＩ親和力を持つ必要があることが明らかになった（Ressingら, 1995, J. Immunol. 154:5934;Setteら, 1994, J. Immunol. 153:5586）。ＭＨＣクラスＩ結合親和力に加えて、細胞表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性もＣＴＬエピトープの免疫原性に寄与する。したがってＭＨＣクラスＩ結合親和力とペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性は、ＣＴＬ−エピトープ型の治療用ワクチンを開発するために特定のペプチド決定基を選択する際の重要な基準である。
【０００８】
最近、いくつかの抗原が抗メラノーマＣＴＬの標的抗原として同定された。遺伝学的アプローチにより、腫瘍特異抗原ＭＡＧＥ−１および−３とメラニン細胞系特異抗原チロシナーゼが同定された（van der Bruggenら, 1991, Science 254:1643;Gauglerら, 1994, J. Exp. Med. 179:921;Brichardら, 1993, J. Exp. Med. 178:489）。
【０００９】
本出願人らによる同時係属中の特許出願（EP 0 668 350）では、ｇｐ１００メラニン細胞特異タンパク質がメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球の標的抗原であると同定された。
【００１０】
最近、さらに２つのメラニン細胞分化抗原Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１およびｇｐ７５が抗メラノーマＣＴＬの標的抗原として同定された（Coulieら, 1994, J. Exp. Med. 180:35;Kawakamiら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515;Wangら, 1995,(vol 181. 799頁, 1995)J. Exp. Med. 181:1261, 10-12）。現在では、これらの抗原に由来しＨＬＡ−Ａ*０２０１に対して様々な親和力を示す８つのＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性エピトープが特徴づけられている（Wolfelら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:759;Coxら, 1994, Science 264:716;Kawakamiら, 1995, J. Immunol. 154:3961;Bakkerら, 1995, Int. J. Cancer 62:97;Kawakamiら, 1994, J. Exp. Med. 180:347;Castelliら, 1995, J. Exp. Med. 181:363）。
【発明の概要】
【００１１】
メラニン細胞分化抗原ｇｐ１００およびＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に由来する２つのＨＬＡ−Ａ*０２０１提示エピトープの免疫原性を改善する試みとして、ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合親和力を向上させるために、それらエピトープ内でのアミノ酸置換が行われた。
【００１２】
驚くべきことに、これらのエピトープ類似体は元のエピトープからみて改善された免疫原性を持つことを見出した。さらに本発明では、それらのエピトープ類似体が、天然エピトープを内因的にプロセシングし提示する標的細胞との交差反応性を示すペプチド特異的ＣＴＬを誘導させることを立証する。
【００１３】
改善された免疫原性を持つ本発明のこれらエピトープ類似体の使用は、慢性ウイルス性疾患および癌に関してＣＴＬ−エピトープ型ワクチンの開発に貢献しうる。
【００１４】
より詳細に述べると、ＭＨＣクラスＩ親和力とペプチド−ＭＨＣ複合体安定性はＭＨＣクラスＩ提示エピトープの免疫原性を決定する重要なパラメーターであるから、２つのメラニン細胞分化抗原由来エピトープのＨＬＡ−Ａ*０２０１結合能を、Ｔ細胞レセプター（TCR）との相互作用に影響を及ぼすことなく、向上させうるかどうかを検討する。アラニン置換体を使ってＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープとｇｐ１００  １５４−１６２エピトープを詳細に分析したところ、４番目から７番目まで（Melan-A/MART-1 27-35）または５番目から７番目まで（gp100 154-162）のアミノ酸がＴＣＲ認識にとって決定的な残基であることが明らかになった。これらのデータは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子のＸ線結晶学による研究（Saperら, 1991, J. Mol. Biol. 219:277;Latronら, 1992, Science 257:964）と一致して、ＭＨＣ分子の外側に向って配向しているこのペプチドの４番目と５番目のより自由な残基が突出したＴＣＲ接触部位としての役割を持つことを含意している。ＨＬＡ−Ａ*０２０１についてはＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープとｇｐ１００  １５４−１６２エピトープの６番目と７番目のアミノ酸がＭＨＣペプチド結合溝中の二次ポケットと相互作用するだけでなく、ＴＣＲ相互作用にとっても決定的な残基であることが立証されている（Ruppertら, 1993, Cell 74:929;Madden ら, 1993, Cell 75:693）。
【００１５】
驚くべきことに、ｇｐ１００  １５４−１６４エピトープの８番目のアラニン置換ＫＴＷＧＱＹＷＡＶは増大したＨＬＡ−Ａ*０２０１親和力を示すペプチドをもたらした。さらにこのエピトープ類似体は、天然エピトープと比較して１０倍低い濃度で、ｇｐ１００反応性ＣＴＬによって認識された。これらのデータは、非アンカー位置におけるアミノ酸置換が増大したＭＨＣクラスＩ親和力とＴ細胞認識をもたらしうることを立証している。
【００１６】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合モチーフに対してＶ、Ｌ、ＭまたはＩによるＮ末端アンカー置換を行なうことにより、ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対して改善された親和力を持つエピトープ類似体であって、野生型エピトープ反応性ＣＴＬによってなお認識されるものを、両エピトープについて同定することを試みた。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープについては、ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対して同等（Ｍ）もしくは改善された（Ｖ、ＬおよびＩ）親和力を持つエピトープ類似体が得られた。しかしＮ末端アンカー置換はいずれも、Ｔ細胞反応性の減少を引き起こした。このエピトープの場合は、明らかに、Ｎ末端アンカー残基がペプチドの中心にある側鎖の位置ぎめに影響を及ぼし、それによってＴＣＲ相互作用が排除される。最近、同様の観察結果がインフルエンザＡマトリックスタンパク質のＨＬＡ−Ｂ*３５０１拘束性エピトープに関して記述されている（Dongら, 1996, Eur. J. Immunol. 26:335）。このペプチドの２番目のセリン残基をより一般的なＨＬＡ−Ｂ*３５０１Ｎ末端アンカーであるプロリンに置換すると、ＨＬＡ−Ｂ*３５０１への結合はかなり増強されたが、このエピトープ類似体は天然エピトープと反応するＣＴＬによって認識されなかった。さらにこのペプチドはペプチドアンタゴニストとしてふるまうことが、ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩ提示ペプチドの両方のＴ細胞認識について立証された（Dongら, 1996, Eur. J. Immunol. 26:335;De Magistrisら, 1992, Cell 68:625;Klenermanら, 1994, Nature 369:403）。これらの発見はアンカー残基置換がＭＨＣクラスＩ結合に影響を及ぼすだけでなく、ある場合にはペプチド−ＭＨＣ複合体のコンフォメーション変化をももたらし、それがＴＣＲとの相互作用の変化につながりうることを例証するものである。
【００１７】
しかしｇｐ１００  １５４−１６２エピトープの場合は、アラニン置換類似体ＫＴＷＧＱＹＷＡＶの他にも、改善されたＨＬＡ−Ａ*０２０１親和力を持ち、しかも野生型エピトープと比較して１０倍低い濃度で抗ｇｐ１００  ＣＴＬによって認識される３つのアンカー置換類似体ＫＶＷＧＱＹＷＱＶ、ＫＬＷＧＱＹＷＱＶおよびＫＩＷＧＱＹＷＱＶが得られた。ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスを用いたインビボでの免疫実験により、これらのエピトープ類似体は免疫原性であって、エピトープ類似体と天然エピトープの両方と反応するマウスＣＴＬの誘導をもたらすことが立証された。これらのエピトープ類似体の免疫原性は予想されるものであった。というのは、これらのエピトープ類似体と天然エピトープのペプチド−ＭＨＣ複合体安定性はどちらも同等に高かったからである。
【００１８】
ドナー由来のＰＢＬを用いたインビトロ（in vitro）でのＣＴＬ誘導実験により、内因的に野生型エピトープを提示する腫瘍細胞との交差反応性を示すエピトープ類似体特異的ＣＴＬを獲得しうることが立証された。健康なドナーのＴ細胞レパートリー（repertoire）は、野生型エピトープと反応するＴリンパ球の他に、明らかにｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体と反応するＴ細胞をも含有する。種々のｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体および野生型ｇｐ１００  １５４−１６２と反応するクローン化ＣＴＬのＴＣＲ利用法を分析すれば、野生型エピトープに対するＣＴＬ活性を誘導するのに使用できるＴ細胞レパートリーのスペクトルに関して有益な情報が得られるだろう。癌の免疫療法については、エピトープ類似体を用いて抗原性腫瘍エピトープに対するＴ細胞レパートリー中の多様な特異性を活性化することにより、患者が免疫時に抗腫瘍反応をうまく開始する可能性を増大させることができる。また野生型エピトープに対する耐性が観察される場合でも、修飾エピトープなら免疫反応を引き出すことができるかもしれない。
【００１９】
免疫療法のプロトコルに「改善された」エピトープを使用すれば、生体内の抗原提示細胞の細胞表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体の量が増大し、抗原特異的ＣＴＬの初回刺激が強化されるだろう。癌免疫療法におけるそれらの可能性とは別に、改善された免疫原性を持つエピトープ類似体の使用は、慢性ウイルス疾患に関するＣＴＬ−エピトープ型ワクチンの開発にも寄与しうる。
【００２０】
したがって本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列（ただし、２番目または８番目のアミノ酸が置換されている）の少なくとも一部分からなることを特徴とする、転移メラノーマに対するリンパ球に対して免疫原性であるペプチドである。
【００２１】
本発明の好ましい態様は２番目のトレオニンがイソロイシン、ロイシンまたはバリンで置換されているペプチドである。
【００２２】
本発明のもう１つの好ましい態様は８番目のグルタミンがアラニンで置換されているペプチドである。
【００２３】
本発明のとくに好ましい態様は配列番号２〜８のアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチドである。
【００２４】
「ペプチド」という用語はアミノ酸の分子鎖を指し、その生成物の特定の長さを指すものではなく、また必要であれば、たとえばマンノシル化、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化などによってインビボまたはインビトロで修飾されてもよい。したがってとりわけポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、このペプチドの定義に包含される。またペプチドは（キメラ）タンパク質の一部であってもよいし、そのペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列（の一部）であってもよい。
【００２５】
もちろん、本発明ペプチドの断片と同様に機能的誘導体も本発明に包含される。機能的誘導体には、全配列中の１または２以上のアミノ酸が異なり、欠失、置換、逆位または付加を持つペプチドが含まれるものとする。生物活性および免疫学的活性を本質的に変化させないと予想できるアミノ酸置換は記述されている。関係するアミノ酸間でのアミノ酸置換または進化の過程で頻繁に起ってきた置換は、とりわけＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Dayhof. M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., ワシントンD.C., 1978, vol. 5, suppl. 3を参照）。この情報に基いてＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、相同なポリペプチド間の機能的類似性を決定する迅速かつ高感度なタンパク質比較法を開発した（Science 227, 1435-1441, 1985）。
【００２６】
また、ｇｐ１００（またはＭｅｌａｎ）に由来するその他のペプチド類似体であって、腫瘍浸潤リンパ球による標的細胞溶解を誘導しうるものも、これらペプチドの機能的誘導体であるものとする。
【００２７】
さらに、それらペプチドの付加塩、それらペプチドのアミド（特にＣ末端アミド）、エステル（特にＣ末端エステル）およびＮ−アシル誘導体（特にＮ末端アシル誘導体とＮ−アセチル誘導体）も、それらペプチドの機能的誘導体であるものとする。
【００２８】
本発明のペプチドは合成的に、組換えＤＮＡ技術によって、また該ペプチドのアミノ酸配列がウイルスＤＮＡの一部であるＤＮＡ配列によってコードされる場合はウイルスによって産生されうる。合成ペプチドの製造法は当該技術分野でよく知られている。
【００２９】
有機化学的ペプチド合成法には、均一相での、またはいわゆる固相を使った、縮合反応による必要なアミノ酸のカップリングが含まれると考えられる。この縮合反応は次のように行なうことができる：
ａ）遊離のカルボキシル基と保護されたその他の反応性基とを持つ化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離のアミノ基と保護されたその他の反応性基とを持つ化合物（アミノ酸、ペプチド）の、縮合剤存在下での縮合反応；  ｂ）活性化されたカルボキシル基と遊離のまたは保護されたその他の反応基とを持つ化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離のアミノ基と遊離のまたは保護されたその他の反応性基とを持つ化合物（アミノ酸、ペプチド）の縮合反応。
【００３０】
カルボキシル基の活性化は、とりわけ、カルボキシル基を酸ハライド、アジド、無水物、イミダゾリド、あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性エステルに変換することによって起こりうる。
【００３１】
前記縮合反応の最も一般的な方法は、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １−３（Gross, E. およびMeienhofer, J.編）１９７９，  １９８０，  １９８１（Academic Press社）に記述されているようなカルボジイミド法、アジド法、混成無水物法ならびに活性エステルを用いる方法である。
【００３２】
組換えＤＮＡ技術によるペプチドの製造は既知の一般法であるが、これには多くの可能性があり、そのすべてがいくらか異なる結果につながる。発現させようとするポリペプチドはＤＮＡ配列によって（より正確に述べると核酸配列によって）コードされる。
【００３３】
本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸配列も本発明の一部である。
【００３４】
本発明のペプチドをコードする配列は、好ましくは配列番号２〜８に示す配列である。
【００３５】
当該技術分野ではよく知られているように、遺伝コードは縮重しているので、同じアミノ酸をコードする別のコドンを与えるような塩基の置換をあるコドン内で行なうことができる。例えばアミノ酸であるグルタミン酸のコドンはＧＡＴでありＧＡＡでもある。したがって配列番号１〜８に示すようなアミノ酸配列を持つポリペプチドの発現には、そのような代替的コドン組成を持つ派生的な核酸配列を利用することができ、したがって異なる核酸配列を見出しうる。
【００３６】
本明細書において「ヌクレオチド配列」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、リボ核酸（RNA）配列とデオキシリボ核酸（DNA）配列の両方を示す。原則としてこの用語は分子の一次構造を指す。したがってこの用語は二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡとそれらの修飾体を包含する。
【００３７】
前記ペプチド類似体の免疫原性断片であるペプチドも本発明の一部である。
【００３８】
免疫原性断片は免疫原反応を誘導する能力を保っている断片、すなわちその断片を特異的に認識する抗体を惹起できるか、またはその断片によって活性化されたＴリンパ球を発見できるものである。もう１つの可能性はＤＮＡワクチンである。
【００３９】
前述のように腫瘍関連抗原の免疫原作用はＴ細胞活性化機序によってしばしば誘発されることが知られている（Townsendら, 1989, H., Ann. Rev. Immunol. 7, 601-624）。Ｔ細胞レセプター（TCR）依存的かつＭＨＣ拘束的にメラノーマ細胞を認識する細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）は、腫瘍保持患者から単離されている（Knuthら, 1992, Cancer surveys. 39-52）。もう一つのメラニン細胞特異抗原であるチロシナーゼ由来のペプチドは、あるＣＴＬクローンによって認識されることが示されている（Brichardら, 1993, J. Exp. Med., 178, 489-495）。
【００４０】
ＭＨＣ分子によるＴ細胞の活性化には、その短い断片（例えば８〜１２ｍｅｒｓ）がＴリンパ球に対して提示される抗原のプロセシングが必要であることがわかっている。
【００４１】
本発明のペプチドは無関係な配列（すなわち自然界ではそれらが結合していない配列）と隣接していることが好ましい。なぜなら、そのような隣接配列は、おそらくはＡＰＣによるより良いプロセシングと提示により、これらペプチドの免疫原性を高めることがわかっているからである。
【００４２】
前記のペプチドまたは一連のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列は、本発明のもう一つの部分を構成する。
【００４３】
組換えＤＮＡ技術によるペプチドの産生にこれらの配列を使用すること（これについては後に詳しく例証する）に続いて、本発明のペプチドに関して配列表に開示した配列情報は診断目的にも使用できる。
【００４４】
例えばそれぞれＵＳＰ  ４，６８３，２０２とＥＰ  ３２９，８２２に記述されているようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や核酸配列に基いた増幅法（NASBA;nucleic acid sequence based amplification）などの核酸増幅技術によってｇｐ１００またはｇｐ１００様タンパク質を検出するための診断試験の基礎として、これらの配列からプライマーを得ることができる。
【００４５】
これらのヌクレオチド配列は、本発明のペプチドを組換えＤＮＡ技術で産生するために使用できる。そのためには、そのヌクレオチド配列が、適当な宿主細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションするために使用できるクローニングビヒクル（vehicle）中に含まれていなければならない。
【００４６】
核酸配列のクローニングには、広範な種々の宿主細胞とクローニングビヒクルの組み合せを有効に使用することができる。例えば有用なクローニングビヒクルとしては染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば様々な既知の細菌プラスミドや、より広い宿主域を持つｐＢＲ３２２などのプラスミド、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、バクテリオファージ（例えばラムダ−ｇｔ−Ｗｅｓ、シャロン２８およびＭ１３系ファージ）、プラスミドとファージまたはウイルスＤＮＡ（例えばＳＶ４０、アデノウイルスまたはポリオーマウイルスＤＮＡ）の組み合せに由来するベクターなどを挙げることができる（Rodriquezら, 1988, 編, Vectors, Butterworths;Lenstraら, 1990, Arch. Virol., 110, 1-24）。
【００４７】
有用な宿主としては、細菌宿主、酵母とその他の菌類、植物または動物宿主、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、メラノーマ細胞、樹状細胞、サル細胞およびその他の宿主を包含してよい。
【００４８】
ペプチドの発現に使用されるビヒクルは、さらにそのペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたコントロール配列を含むだろう。そのようなコントロール配列は一般にプロモーター配列と、発現レベルをレギュレートおよび／またはエンハンスさせる配列からなる。さらに複製起点および／または優性選択マーカーも、そのようなビヒクルには存在することが多い。もちろんコントロール配列とその他の配列は、選択した宿主細胞に依存して変動しうる。
【００４９】
宿主細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションする技術は当該技術分野でよく知られている（例えばManiatisら, 1982/1989, Molecular cloning: A laboratory Manual,コールドスプリングハーバー研究所）。
【００５０】
当該ペプチドの情報に次いで、そのペプチドが結合するとわかっているＭＨＣ分子の情報を保持するベクターで宿主細胞をコトランスフォーメーションまたはコトランスフェクションすれば、きわめて実用的である。そのＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ２．１、ＨＬＡ−Ａ１もしくはＨＬＡ−Ａ３．１またはメラノーマ患者中に存在することがわかっているその他任意のＨＬＡ対立形質であることが好ましい。メラノーマ細胞がメラノーマ患者に由来するＨＬＡ−Ａ２．１拘束性の細胞障害性Ｔ細胞クローンによって認識される抗原を持つことは確証されている（Anichiniら, 1993, J. Exp. Med., 177, 989-998）ので、ＨＬＡ−Ａ２．１はとりわけ好ましい。
【００５１】
本発明ペプチドの発現にとりわけ適した宿主細胞はネズミＥＬ４およびＰ８．１５細胞である。該ペプチドの発現にはヒトＢＬＭ細胞（Katanoら, 1984, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 108, 197）がとりわけ適している。なぜならこの細胞は既にＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２．１を発現できるからである。
【００５２】
本発明のペプチドはメラノーマ治療用のワクチンに使用できる。
【００５３】
このワクチンは、免疫原として有効量の活性ペプチドに加えて、薬学的に許容しうる担体または希釈剤をも含有してもよい。
【００５４】
本発明のペプチド（特にオリゴペプチド）の免疫原性は架橋するか、または免疫原性担体分子（すなわち患者の免疫学的反応を独立して誘起する特性を持つ巨大分子であって、そこに本発明のペプチドを共有結合できるもの）あるいはタンパク質の一部であっても結合することによってエンハンスすることができる。
【００５５】
担体分子への共有結合は当該技術分野でよく知られる方法を使って行なうことができ、その的確な選択は使用する担体分子の性質よって決まるだろう。免疫原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のペプチドは、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドなどを使って結合できる。
【００５６】
このような結合剤は別個の担体分子を使用することなくペプチド同士を架橋するためにも使用できる。そのような架橋によるポリペプチドまたはペプチド集合体への変換も免疫原性を増大させうる。
【００５７】
本発明で有用な薬学的に許容しうる担体または希釈剤の例には、ＳＰＧＡなどの安定化剤、炭水化物（例えばマンノース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストランなど）、アルブミンやカゼインなどのタンパク質、ウシ血清や脱脂乳などのタンパク質含有剤および緩衝液（例えばリン酸緩衝液）を含む。
【００５８】
任意に、アジュバント活性を持つ１または２以上の化合物をワクチンに加えてもよい。好適なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油乳剤（例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）やＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標）のもの）、サポニン、ビタミンＥ可溶化物などである。
【００５９】
樹状細胞は、抗原の取り込みに使用されて抗原プロセシングを促進するマンノースレセプターを発現するプロフェッショナル（professional）なＡＰＣである。
【００６０】
本発明のワクチンはとりわけ静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に投与することができる。
【００６１】
投与すべき有益な有効量は患者の年齢と体重およびそのワクチンの投与法に依存して変化するだろう。
【００６２】
当該ワクチンはＴ細胞応答を特異的に獲得するために使用できるが、ワクチン接種後にＢ細胞応答が誘発される可能性もある。その場合は、そのＢ細胞応答がそのワクチンのペプチドに対する抗体の形成をもたらし、その抗体は抗原産生のソースすなわち腫瘍細胞に向けられることになる。このようにして腫瘍細胞が両免疫系の応答によって攻撃されるので、これは有利な特徴である。
【００６３】
当該ワクチンが抗原提示細胞（APC）によってＭＨＣ分子中に提示されるようなペプチドを含んでなる場合、両免疫系はさらにより効果的に誘発されるだろう。抗原提示は、本発明ペプチドの一つがローディングされた単球、マクロファージ、指状突起細胞、ランゲルハンス細胞、そしてとりわけ樹状細胞を用いることによって、またはペプチドを含むタンパク質またはマンノシル化されたタンパク質をローディングすることによって達成できる。ＡＰＣのローディングは本発明ペプチドをＡＰＣ内またはＡＰＣの近傍へ導くことによって達成できるが、ＡＰＣに完全なｇｐ１００抗原をプロセシングさせることがより好ましい。この方法により、インビボの状況をもっともリアルに模倣した提示が達成される。さらに、その細胞によって使用されるＭＨＣはそのエピトープを提示するのに適したタイプのものである。
【００６４】
ＡＰＣをエピトープの提示に使用することの総合的な利点は、この点で、使用されるＡＰＣ細胞の選択である。タイプの異なるＡＰＣから、刺激性ＡＰＣと阻害性ＡＰＣがあることがわかっている。
【００６５】
好ましいものは、同時刺激性（co-stimulating）分子を持つことを特徴とするいわゆる「プロフェッショナル」抗原提示細胞であって、抗原提示の過程に重要な役割を持つ、記載の細胞タイプである。そのような同時刺激性分子は、例えばＢ７、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＴＬＡ−４または耐熱性抗原（Schwartz, 1992, Cell 71, 1065-1068）などである。
【００６６】
やはり抗原提示細胞として作用しうることが示されている線維芽細胞は、これらの同時刺激性分子を持たない。
【００６７】
メラニン細胞ペプチド類似体の情報を保有するクローニングビヒクルで既にトランスフェクションされた細胞を使用して、その細胞をＭＨＣクラスＩ分子のヌクレオチド配列（例えばＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ａ１またはＨＬＡ  Ａ３．１をコードする配列）を含むクローニングビヒクルでコトランスフェクションすることもできる。これらの細胞は抗原提示細胞として作用し、その表面に発現されたＭＨＣクラスＩ分子中にペプチド類似体を提示するだろう。その細胞が前述の同時刺激性分子（具体的にはＢ７（Ｂ７．１、Ｂ７．２）、ＣＤ４０）の１つまたは同様の機能を持つ分子（例えば細胞系にトランスフェクションされたサイトカイン）を発現しうる場合、この提示はエンハンスされると考えられる。この発現は、その細胞をそのような同時刺激性分子をコードする配列情報を持つ第三のクローニングビヒクルでトランスフォーメーションまたはトランスフェクションした結果であってもよいが、その細胞がすでに同時刺激性分子産生能を持っていてもよい。
【００６８】
目的の発現産物の他にも、発現されてその細胞の目的の免疫原反応に負の影響を及ぼしうる数多くの要素を保有するこれらの細胞を伴うワクチンの代わりに、ペプチドがローディングされたＭＨＣ分子を露出させるリポソームであって、例えばそこにリンフォカインを充填したもので、ワクチンを構成させることもできる。そのようなリポソームは免疫学的Ｔ細胞反応を誘発するだろう。
【００６９】
インビボと同じ方法でペプチドを提示することによって、エンハンスされたＴ細胞応答が誘発されるだろう。さらに、比較的大きな抗原提示細胞の天然のアジュバント作用によって、Ｂ細胞応答も誘発される。このＢ細胞応答はとりわけ、そのペプチド−ＭＨＣ複合体に対する抗体の生成をもたらすだろう。この複合体は特に、患者中でｇｐ１００のエピトープが天然に提示されることが示されている場であってそれゆえＴ細胞応答を誘発することができる腫瘍細胞中に認められる。本発明のペプチドを既に提示しているＡＰＣのワクチン接種によって拡大されるのは、この自然に起っている現象である。拡大によって、拡大されたＴ細胞応答が誘発されるばかりでなく、ＭＨＣ−ペプチド複合体に対する抗体をもたらすＢ細胞応答も開始されるだろう。
【００７０】
本発明のワクチンは、ワクチン接種後にＴ細胞応答とＢ細胞応答の両方の開始と維持に増強作用を持つ数多くの化合物によって強化することができる。
【００７１】
ワクチンへのサイトカイン類の添加は、そのようにしてＴ細胞応答をエンハンスするだろう。好適なサイトカインは、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７またはＩＬ−１２などのインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、腫瘍壊死因子、ＩＦＮ−などのインターフェロン類、ケモカインなどである。
【００７２】
同様に、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２７およびＣＤ２８などのＴ細胞表面抗原に対する抗体も免疫原反応をエンハンスするだろう。
【００７３】
またＣＤ４+ヘルパー細胞またはＣＤ８+キラー細胞を刺激するためのヘルパーエピトープの添加も免疫原反応を強化する。また、例えば熱ショック由来タンパク質やコレラ毒素などといった他の抗原に由来するヘルパーエピトープも使用できる。
【００７４】
本発明ペプチドに対する反応性腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の使用は、本発明のもう一つの部分を構成する。この方法での第一段階は患者から試料を採取することである。これは通常、局部麻酔下に腫瘍沈着物を切除することによって行われる。次にこの標本中に存在するＴＩＬを既知の方法に従って４〜８週間培養増殖する（Topalianら, 1987, J. Immunol. Meth. 102, 127-141）。次いでこの培養期間中にＴＩＬを本発明ペプチドまたはｇｐ１００タンパク質との反応性について調べる。抗原を認識するＴＩＬを単離し、さらに培養する。
【００７５】
この方法によって得られる反応性腫瘍浸潤リンパ球も本発明の一部を構成する。ｇｐ１００およびそのエピトープと特異的に反応するそのようなＴＩＬ細胞系の一例（ＴＩＬ１２００と呼ぶ）を発見した。このＴＩＬ１２００細胞系はＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２．１をも発現する。さらに、この細胞系によるＴＣＲα／β、ＣＤ３およびＣＤ８の発現も立証されている。さらにＴＩＬ１２００はＨＬＡ−Ａ２．１とｇｐ１００の両方を発現するトランスフェクタントを認識する。
【００７６】
このＴＩＬ１２００と、ｇｐ１００を認識するその他のＴＩＬはメラノーマ患者の治療に適している。そのような治療のためには、ＴＩＬを前述のように培養し、それを静脈内注入により患者に戻す。治療の成功は腫瘍保有宿主の全身照射またはシクロホスファミドによる治療による予備治療によっておよびインターロイキン−２の同時投与によって増強することができる（Rosenbergら， 1986, Science 223, 1318-1321）。
【００７７】
患者に注入によって戻されるＴＩＬは好ましくは自家ＴＩＬ（すなわち患者自身の腫瘍に由来するもの）であるが、アロゲンのＴＩＬの注入も考えられる。
【００７８】
前述の方法によって得られるＴＩＬのもう１つの利用法はインビボの診断への使用である。ＴＩＬを例えば111Ｉｎ（Fisherら, 1989, J. Clin. Oncol. 7, 250-261）または他の任意の適当な診断マーカーでラベルすれば、それらはメラノーマ患者中の腫瘍沈着の同定に適するようになる。
【００７９】
本発明ペプチドまたはｇｐ１００タンパク質に対する反応性ＣＴＬによって発現されるＴ細胞レセプター（TCR）は、本発明のもう一つの部分を構成する。当該術分野ではよく知られているようにＴＣＲはＣＴＬの特異性を決定する。したがってＴＣＲ（とりわけその可変領域）をコードするｃＤＮＡを単離し、Ｔ細胞に導入することにより、抗腫瘍活性を任意のＴ細胞に移入させることができる。とくに、そのようなＴＣＲを自家Ｔ細胞に導入した後、そのＴ細胞を増殖すれば、自家患者への養子移入に好適な多数のＣＴＬが得られる。
【００８０】
また、このＴ細胞レセプターを保有する細胞をワクチン接種に使用することもできる。
【００８１】
ワクチンは、本発明のペプチドを発現する能力を持つメラノーマ細胞から構成させることもできる。これらの細胞はＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ（ｇｐ１００に対するもの）などの特異的抗体を使って患者から単離できるが、天然のｇｐ１００産生細胞であるかもしくは本発明のペプチドを産生するように遺伝子操作されている培養メラノーマ細胞系からそれらのメラノーマ細胞を作ることもできる。これらの細胞は照射によって非腫瘍原性にし、患者に注入する（戻す）ことができる。これらメラノーマ細胞の免疫学的作用を増強するには、リンフォカイン、好ましくはインターロイキン−２（IL-2）または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を産生するように、それらを遺伝的に改変することが好ましい。ペプチド+／ｇｐ１００+メラノーマ細胞を、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦの産生をコードする配列を持つクローニングビヒクルでトランスフェクションすることができる。
【００８２】
そのようなワクチンの患者への注入により、ＣＴＬの生成が刺激されるだろう。
【００８３】
同様の効果を持つもう１つのタイプのワクチン接種は、純粋なＤＮＡ、例えば本発明のペプチド（相同体および非相同体（キメラタンパク質）または反復体）をコードするＤＮＡ配列を持つベクターまたはベクターウイルスのＤＮＡを用いるワクチン接種である。注射すると、その抗原またはペプチドを発現する細胞に、そのウイルスが感染またはそのＤＮＡが形質転換されるだろう。
【００８４】
本発明のペプチドに対する抗体も本発明の一部である。
【００８５】
これらのペプチドに対する単一特異性抗体は、Ｈａｌｌらの方法（1984 , Nature 311, 379-387）の変法により、複特異性（polyspecific）抗血清からアフィニティー精製法で得ることができる。複特異性抗血清は標準的な免疫法に従ってウサギを免疫することによって得ることができる。
【００８６】
本明細書にいう単一特異性抗体とは、関連する抗原に対して同種の結合特性を持つ単一の抗体種または複数の抗体種と定義される。本明細書にいう同種の結合とは、その抗体種が本発明のリガンド結合ドメインに結合できることを指す。
【００８７】
これらの抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、ヒト化モノクローナル抗体であることがより好ましい。
【００８８】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られている方法により、近交系マウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）を適当なタンパク質で免疫することによって調製できる（Koehler, G.およびMilstein C., 1975, Nature 256, 495-497）。次いでダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）などの適当な細胞培養培地中のヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン中で生育することによりハイブリドーマ細胞を選択する。抗体産生ハイブリドーマを好ましくはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天法（1973, Tissue Culture Methods and Applications, KruseおよびPaterson編, Academic Press）を使ってクローン化する。分離したコロニーを適当な培養培地が入った培養用培養プレートの各ウェルに移す。抗体産生細胞は、適当な免疫原を使ったスクリーニングによって同定される。免疫原陽性ハイブリドーマ細胞は当技術分野で知られる技術で維持される。特異的抗モノクローナル抗体は、そのハイブリドーマをインビトロで培養するか、当該技術分野で知られる手法によりハイブリドーマを注射した後、マウスで腹水を調製することによって産生される。
【００８９】
ヒト化抗体を使用することが好ましい。ＣＤＲ移植法などの抗体ヒト化法が知られている（Jonesら, 1986, Nature 321, 522-525）。本発明のポリペプチドと反応する抗体に対する抗原反応を避けるためにもう１つ考えられることは、ヒト抗体またはその断片もしくは誘導体の使用である。
【００９０】
ヒト抗体は単離したＢリンパ球のインビトロの刺激によって産生できる。またヒト抗体は、本発明リガンド結合ドメインの少なくとも１つで免疫したヒトから収集された（不死化）Ｂリンパ球から単離することもできる。
【００９１】
前述の抗体はメラノーマ患者の受動ワクチン接種に使用できる。この種のワクチンに好ましいタイプの抗体は、ＭＨＣ分子と結合して提示された前述のペプチドに対する抗体である。この種の抗体を生産するには、ＡＰＣによって提示されたペプチドの免疫化が必要である。そのような免疫化は前述のように行なうことができる。また、ペプチド−ＭＨＣ複合体に対するヒト抗体を、該ペプチドの１つをローディングしたＡＰＣからなるワクチンで処置された患者から単離することもできる。
【００９２】
本発明ワクチンの１つによる処置後に形成される抗体は、該ワクチン接種のモニタリングにも使用できる。そのような方法のためには、その患者の血清を入手し、ワクチン接種に使ったペプチドに対する抗体を検出する。この検出操作から抗体価を知ることにより、追加ワクチン接種の必要があるかどうかを判断することができる。
【００９３】
血清中の該抗体の特異的検出は、ラベルされたペプチドによって達成できる。ラベルはインビトロの診断の分野で知られている診断マーカーならどれでもよいが、最も好ましいもの（また広く使用されているもの）は酵素、色素、金属および放射性核種（例えば67Ｇａ、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、123Ｉ、125Ｉまたは131Ｉ）である。
【００９４】
放射性診断マーカーは本発明のペプチドに直接結合するか、そのペプチドに直接またはリンカーもしくはスペーサー分子を介して結合されたキレート成分によって結合することができる。放射性核種をペプチドまたはペプチド様構造に結合する技術は、（腫瘍）診断薬の分野では、インビボ試験とインビトロ試験の両方で使用されるラベルされた抗体の数多くの応用例から既に知られている。
【００９５】
ペプチドの直接ラベルは、例えば１バイアル法（one-vial method;Haismaら, 1986, J. Nucl. med. 27, 1890）に記述されているように行なうことができる。リンカーまたはスペーサー分子を使用してまたは使用せずに、キレート団を介してペプチドをラベルする一般的方法は、例えばＵＳＰ４，４７２，５０９とＵＳＰ４，４８５，０８６に記述されている。ＤＴＰＡの二環式無水物を用いるキレート団はＨｎａｔｏｗｉｃｈら（1983, J. Immunol. Meth. 65, 147-157）に開示されている。ジアミ ドジメルカプチド化合物による結合はＥＰ１８８，２５６に開示されている。
【００９６】
例示のため、次に説明する添付の図面を参照して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】アラニン置換エピトープの標的細胞感作。（Ａ）クロム標識Ｔ２標的細胞を様々な量の表示したアラニン置換エピトープ類似体と共に１時間前培養した。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５反応性ＴＩＬ１２３５リンパ球をエフェクター／標的比２０で添加した。（Ｂ）アラニン置換ｇｐ１００  １５４−１６２類似体の標的細胞感作を、エフェクター／標的比２０のｇｐ１００反応性ＴＩＬ１２００リンパ球を使って分析した。
【図２】Ｎ末端アンカー置換エピトープの標的細胞感作。クロム放出実験を図１と同様に行なった。（Ａ）Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５反応性ＴＩＬ１２３５リンパ球を使って、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５類似体による標的細胞感作を分析した。（Ｂ）ｇｐ１００  １５４−１６２反応性ＴＩＬ１２００リンパ球を使って、ｇｐ１００  １５４−１６２類似体による標的細胞感作を評価した。
【図３】ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおけるｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体の免疫原性。ペプチドなし、１０ｍＭ野生型ｇｐ１００  １５４−１６２または１０ｍＭのマウスの免疫に使用したエピトープ類似体と共に前培養したクロムでラベルされたジャーカットＡ２／Ｋb標的細胞を用いて、免疫マウスから得たバルクＣＴＬをその溶解活性について試験した。各ペプチドについて、反応するマウスのバルクＣＴＬの平均特異溶解率を示す。標準偏差が平均値の１５％を超えることはなかった。２回の実験のうち代表的な１実験を示す。
【図４】インビトロで誘導したエピトープ類似体特異的ＣＴＬ培養物のペプチド特異的反応性。クロムでラベルされたＨＬＡ−Ａ*０２０１+Ｔ２標的細胞を、１０ｍＭの関連ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合ペプチド、１０ｍＭ野生型ｇｐ１００  １５４−１６２または１０ｍＭのＣＴＬ誘導に使用したエピトープ類似体と共に前培養した。種々のＣＴＬ培養物を２０：１のエフェクター：標的比で添加した。２回の実験のうち代表的な１実験を示す。
【図５】エピトープ類似体によって誘導したＣＴＬ培養物は、野生型エピトープを内因的に提示するメラノーマ細胞を溶解する。クロムでラベルされたＨＬＡ−Ａ２．１+ＢＬＭおよびＭｅｌ  ６２４メラノーマ細胞を標的細胞として使用した。ＢＬＭ細胞はｇｐ１００の発現を欠く。種々のＣＴＬ培養物を２０：１のエフェクター：標的比で添加した。２回の実験のうち代表的な１実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
材料と方法
細胞培養
ＨＬＡ−Ａ*０２０１+メラノーマ系ＢＬＭは以前に記述されているように培養した（Bakkerら, 1994, J. Exp. Med. 179:1005）。ＴＩＬ１２００リンパ球とＴＩＬ１２３５リンパ球は以前に報告されているように培養した（Kawakamiら, 1992, J. Immunol. 148:638）。Ｔ２細胞（Salterら, 1985, Immunogenetics, 21:235）とＨＬＡ−Ａ*０２０１+Ｂリンパ芽球様ＪＹ細胞は、５％ＦＣＳ（BioWhittaker, ベルギー・ヴェルヴィエ）を補足したＩｓｃｏｖｅ培地（Gibco, 英国スコットランド・ペーズリー）で維持した。ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbキメラ分子を発現するジャーカットＡ*０２０１／Ｋb細胞（Irwinら, 1989, J. Exp. Med. 170:1091）は０．８ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ，英国スコットランド・ペーズリー）を補足した５％ＦＳＣを含むＩｓｃｏｖｅ培地で培養した。
【００９９】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１+リンパ球
健康な白人ボランティアは、モノクローナル抗体ＢＢ７．２（Parhamら, 1981, Hum. Immunol. 3:277）およびＭＡ２．１（Parhamら, 1978, Nature 276:397）を用いてフローサイトメトリーにより、ＨＬＡ−Ａ２表現型に分類された。ドナーに白血球除去血輸血を行い、ＰＢＭＣをフィコール／ハイパック密度勾配遠心分離法によって単離した。それらの細胞は４×１０7ＰＢＭＣずつ低温保存した。
【０１００】
形質転換マウス
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスを使用した（動物業者は米国インディアナポリスのHarlan Sprague Dawley社）。マウスを清潔な慣用の条件下に飼育した。この形質転換マウスは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１α１およびα２ドメインは無傷のまま、重鎖のα３ドメインが対応するネズミＨ−２Ｋbドメインで置換されているＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbキメラ遺伝子の産物を発現する（Virielloら, 1991, J. Exp. Med. 173:1007）。これにより、ネズミＣＤ８+Ｔリンパ球上のネズミＣＤ８分子は、ハイブリッドＭＨＣクラスＩ分子の同系α３ドメインと相互作用することができる。
【０１０１】
ペプチド
ＣＴＬの誘導とクロム放出アッセイのために、ＡＢＩＭＥＤマルチプルシンセサイザー（multiple synthesizer）を使ってＦｍｏｃペプチド化学により、遊離のカルボキシ末端を持つペプチドを合成した。分析用ＨＰＬＣによれば、ペプチドはいずれも９０％を超える純度を持っていた。ペプチドはＤＭＳＯに溶解して、−２０℃で保存した。
【０１０２】
Ｔ２細胞でのＨＬＡ−Ａ*０２０１アップレギュレーション
Ｔ２細胞でのペプチド誘導性ＨＬＡ−Ａ*０２０１アップレギュレーションは以前に記述されているように行なった（Nijmanら, 1993, Eur. J. Immunol. 23:1215）。簡単に述べると、ペプチドをＤＭＳＯ原液から種々の濃度に希釈し（最終ＤＭＳＯ濃度０．５％）、１０5個のＴ２細胞と共に体積１００ｍｌの無血清Ｉｓｃｏｖｅ培地中、３ｍｇ／ｍｌヒトβ２−ミクログロブリン（Sigma, ミズーリ州セントルイス）の存在下に３７℃、５％ＣＯ2で１４時間インキュベートした。Ｔ２細胞の細胞表面におけるＨＬＡ−Ａ*０２０１分子の安定化は、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体ＢＢ７．２（Parhamら, 1981, Hum. Immunol. 3:277）を用いてフローサイトメトリーで分析した。蛍光指数（Fluorescence Index）は（実験平均蛍光÷バックグラウンド平均蛍光）−１、として表す。背景平均蛍光値はＴ２細胞を同等濃度のＨＬＡ−Ａ*０２０１非結合ペプチドと共にインキュベートすることによって得た。
【０１０３】
競合用ＨＬＡ−Ａ*０２０１ペプチド結合アッセイ
ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチド結合は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１+ＪＹ細胞を用いて、以前に記述されているように分析した（van der Burgら, 1995, Hum. Immunol. 44:189）。簡単に述べると、マイルドに酸処理されたＪＹ細胞を１５０ｎＭフルオレセイン（FL）でラベルされた基準ペプチド（FLPSDC(-FL)FPSV）および数濃度の競合ペプチドと共に、１．０ｍｇ／ｍｌβ2−ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）の存在下にインキュベートした。次に、それらの細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって分析した。競合ペプチドの不在下で得た平均蛍光（ＭＦ）を最大結合とみなし０％とした。また基準ペプチドなしで得たＭＦを１００％阻害とした。結合阻害百分率は次式を使って計算した：（１−（ＭＦ  １５０ｎＭ基準および競合ペプチド−ＭＦ基準ペプチドなし）÷（ＭＦ  １５０ｎＭ基準ペプチド−ＭＦ基準ペプチドなし））×１００％。競合ペプチドの結合能を、ＦＬでラベルされた基準ペプチドの結合を５０％阻害するのに必要な濃度（IC50）として表わす。
【０１０４】
３７℃におけるＭＨＣ−ペプチド複合体安定性の測定
ＭＨＣ−ペプチド複合体安定性の測定を行なった。ＭＨＣクラスＩ分子のデノボ合成を停止するために、ＨＬＡ−Ａ*０２０１+ホモ接合ＪＹ細胞を１０-4Ｍエメチン（Sigma, 米国セントルイス）で、３７℃で１時間処理した。次にそれらの細胞にマイルドに酸処理を施し、次いで２００ｍＭのペプチドを室温で１時間ローディングした。その後、遊離のペプチドを除去するために細胞を２回洗浄し、３７℃で０、２、４および６時間インキュベートした。次にその細胞をモノクローナル抗体ＢＢ７．２（Parhamら, 1981, Hum. Immunol. 3:277）を用いて染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１０５】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおけるＣＴＬ誘導
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウス３匹の各群に、Ｈ−２  Ｉ−Ａb拘束性ＨＢＶコア抗原由来Ｔヘルパーエピトープ（１２８−１４０；配列ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）（Milichら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:1620）１４０ｍｇの存在下にＩＦＡ中に乳化したペプチド１００ｍｇを尾静脈の根元に皮下注射した。１１日後、マウスを犠牲にし、脾細胞（１０ｍｌ中３０×１０6細胞）をペプチドローディングした同系照射ＬＰＳ刺激Ｂ細胞リンパ芽球（比４：１）により試験管内で再刺激した。培養第６日に、バルク応答細胞集団をその特異的溶解活性について試験した。
【０１０６】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１+ドナー由来ＣＴＬのインビトロ誘導
樹状細胞は、融解したＰＢＭＣを使用して、以前に記述されているように（Bakkerら, 1995, Cancer Res. 55:5330）Ｒｏｍａｎｉらの手法（Romaniら, 1994, J. Exp. Med. 180:83）に従って生成した。培養開始前に、樹状細胞に５０ｍＭのペプチドをローディングした。自家ＣＤ８+濃縮応答Ｔリンパ球は、融解したＰＢＭＣを２時間付着させた後、ＣＤ４+Ｔ細胞の非接着画分を抗ＣＤ４モノクローナル抗体ＲＩＶ−７（Leerlingら, 1990, Dev. Biol. Stand. 71:191）とヒツジ抗マウスＩｇＧ被覆磁性ビーズ（Dynal, スウェーデン・オスロ）とを使って部分的に枯渇させることによって調製した。刺激開始時に、２×１０5個のペプチドローディングされたＤＣと２×１０6個の応答細胞を、５％プールヒトＡＢ＋血清、１０3Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−６（Sandoz, スイス・バーゼル）および５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２を含むＩｓｃｏｖｅ培地２ｍｌが入った２４ウェル組織培養プレート（Costar, オランダ・バートホーエフドルプ）の各ウェルで共培養した。
【０１０７】
第８日と第１５日に、ペプチドをパルスした樹状細胞を刺激細胞として使用することにより、応答細胞集団を再刺激した。それぞれ最終濃度１０Ｕ／ｍｌと５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Cetus Corp., カリフォルニア州エメリービル）とＩＬ−７（Genzyme, マサチューセッツ州 ケンブリッジ）を含む培地で、各培養を増殖させた。その１週間後に、付着ペプチドパルスＰＢＭＣを使って既に記述されているように各培養物を再刺激した（Bakkerら, 1995, Cancer Res. 55:5330）。少なくとも４回の再刺激後に、応答細胞集団をその特異的溶解活性について調べた。
【０１０８】
クロム放出アッセイ
クロム放出アッセイは以前に記述されているように行なった（Bakkerら, 1994, J. Exp. Med. 179:1005）。簡単に述べると、１０6個の標的細胞を１００ｍＣｉ  Ｎａ351ＣｒＯ4（Amersham, 英国バッキンガムシア）と共に１時間インキュベートした。次に様々な量のエフェクター細胞を、Ｕ底微量定量プレート（Costar, オランダ・バートホエフドルプ）のウェル３つずつに入れた標的細胞に、１５０ｍｌの最終体積で加えた。ペプチド認識アッセイでは、標的細胞を１００ｍｌの体積中で様々な濃度のペプチドと３７℃で３０分または６０分あらかじめインキュベートした後、エフェクター細胞を加えた。５時間のインキュベーション後、上清の一部を収集し、その放射活性含有量を測定した。３つ一組のウェルの平均特異的溶解百分率は、次式を使って計算した。特異的溶解（％）＝（（実験放出−自発的放出）÷（最大放出−自発的放出））×１００。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：
Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープとｇｐ１００  １５４−１６２エピトープに関するＨＬＡ−Ａ*０２０１結合および／またはＴＣＲ相互作用に関与するアミノ酸残基の同定
Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープとｇｐ１００  １５４−１６２エピトープは、転移メラノーマに由来するＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＴＩＬ系を用いて同定された。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１+標的細胞上に提示された場合にＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１特異的ＴＩＬ１２３５系を誘発できる名目（nominal）エピトープであることがわかった（Kawakamiら, 1994, J. Exp. Med. 180:347）。ｇｐ１００アミノ酸１５５−１６１付近に位置する８ｍｅｒｓから１１ｍｅｒｓまでの一群のペプチドのなかから、我々は９ｍｅｒｓである１５４−１６２が、ｇｐ１００反応性ＴＩＬ１２００系による溶解に関してＨＬＡ−Ａ*０２０１+標的細胞を最も効率よく感作するペプチドであると同定した（Bakkerら, 1995, Int. J. Cancer 62:97）。現在では、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５  ９ｍｅｒｓとｇｐ１００  １５４−１６２  ９ｍｅｒｓはＨＬＡ−Ａ*０２０１+メラノーマ細胞の細胞表面から溶離され、タンデム質量分析法によって同定されており、このことは、それらが実際にＨＬＡ−Ａ*０２０１中に内因的に提示される名目エピトープであることを示している。ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合および／またはＴＣＲ相互作用に関与する両エピトープ中のアミノ酸残基を同定するために、本来のアミノ酸がアラニン残基で置換されているエピトープ類似体を合成した。アラニン残基が野生型エピトープ中に存在する場合は、それらをアミノ酸であるグリシンに置換した。プロセシング欠損細胞系Ｔ２を用いる間接結合アッセイ法により、それら置換ペプチドをＨＬＡ−Ａ*０２０１への結合について評価した（Nijmanら, 1993, Eur. J. Immunol. 23:1215）。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ中の置換はいずれも、Ｔ２細胞の細胞表面でＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を安定化する能力のほとんど完全な喪失をもたらした（表Ｉ）。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５類似体をμＭ濃度でＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬによる溶解に関するＨＬＡ−Ａ*０２０１+標的細胞の感作に使用した場合、このエピトープの４番目から７番目までの位置におけるアラニン置換について、我々は標的細胞溶解の減少を観察した（表Ｉ）。また、２番目の位置におけるグリシン置換はＣＴＬ反応性の減少をもたらした。したがってＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープ中のこれらの位置にあるアミノ酸はＴＣＲ相互作用に関与すると考えられる。
【０１１０】
ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープの場合、エピトープ類似体のＨＬＡ−Ａ*０２０１親和力の減少は、３番目と９番目の位置でのアラニン置換のみに観測された（表Ｉ）。Ｔ細胞認識に関しては、このエピトープの５番目、６番目および７番目の位置におけるアラニン置換は許されず、このことは、これらの位置にあるアミノ酸がＴＣＲに関してこのエピトープ内の決定的な接触残基であることを示している。
【０１１１】
次に、μＭ濃度で反応性を誘導したエピトープ類似体を滴定することにより、関連するＣＴＬによる溶解に関してＴ２標的細胞を感作するそれらの相対能力を評価した（図１）。エピトープ類似体はいずれの場合もその感作能が野生型エピトープと比較して同等もしくは劣っていた。ただし、ｇｐ１００  １５４−１６２の８番目の位置におけるアラニン置換は例外であって、驚くべきことに、このペプチドは１０倍低い濃度でさえｇｐ１００反応性ＣＴＬによる標的細胞の溶解を誘導することができた。
【０１１２】
実施例２：
ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープとＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープにおけるＮ末端アンカー残基置換はどちらもＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する親和力の改善をもたらす
Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２７−３５エピトープとｇｐ１００  １５４−１６２エピトープは共に通常でないＮ末端アンカー残基を持つので、我々はこれらの残基を一般的なＨＬＡ−Ａ*０２０１アンカー残基Ｖ、Ｌ、ＩまたはＭに置換した（Drijfhoutら, 1995, Hum. Immunol. 43:1）。次いで我々はそれらのペプチドを、ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合と、関連するＣＴＬによる溶解に関して標的細胞を感作するそれらの能力について試験した。メチオニン置換を除いて、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ中のアンカー残基置換はすべてＨＬＡ−Ａ*０２０１への結合の有意な改善をもたらした（表II）。これらのペプチドを１ｍＭの濃度でローディングしたＨＬＡ−Ａ*０２０１-標的細胞は、メチオニン置換エピトープ以外は、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１反応性ＣＴＬによって認識された（表II）。メチオニン置換ペプチドは野生型エピトープと同等なレベルでＨＬＡ*０２０１に結合したが、ＣＴＬ活性を誘導することはできなかった。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１アンカー置換ペプチドを用いた滴定実験により、これらのエピトープ類似体はＴＩＬ１２３５による溶解に関して標的細胞を感作する点で野生型よりも劣ることが明らかになった（図２）。
【０１１３】
Ｔ２アッセイ法を用いた場合、メチオニン置換エピトープを除くｇｐ１００  １５４−１６２アンカー置換ペプチドはすべて野生型エピトープと同等なＨＬＡ−Ａ*０２０１結合を示した（表II）。興味深いことに、これらのペプチドは、野生型ペプチドと比較して１０倍低い濃度で標的細胞上にローディングされた場合も、ＴＩＬ１２００によって認識され（図２）、一方、メチオニン置換ペプチドは何も相違を示さなかった。これらの発見は、天然エピトープ内のアミノ酸置換がＴ細胞認識の改善をもたらしうることを立証している。
【０１１４】
実施例３：
ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体による改善された標的細胞感作はＨＬＡ−Ａ*０２０１への増大した親和力と相関する
置換されたｇｐ１００  １５４−１６２エピトープの強化されたＣＴＬ認識をＨＬＡ−Ａ*０２０１親和力の改善に帰することができるかどうかを評価するために、ここでは、それらペプチドのＨＬＡ−Ａ*０２０１結合能を、ラベルされた基準ペプチドと問題のペプチドとの競争に基く、より高感度な細胞結合型ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合アッセイ法を使って調べた（van der Burgら, 1995, Hum. Immunol. 44:189）。このアッセイ法で得たＨＬＡ−Ａ*０２０１結合親和力から、野生型と比較して１０倍低い濃度でＴＩＬ１２００による溶解に関して標的細胞を感作できるペプチドはすべて、ＨＬＡ−Ａ*０２０１により高い親和力で結合していることが明らかになった（表III）。Ｎ末端アンカー置換に加えて、Ｃ末端アンカー位置に隣接する極性残基の疎水性残基への置換も、見かけ上ＴＣＲ認識に影響を及ぼすことなく、ＨＬＡ−Ａ*０２０１親和力が改善されたエピトープ類似体をもたらした（KTWGQYWAV）。ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体解離速度の測定によって、試験したエピトープ類似体が野生型と比較して少なくとも同等に安定であることが明らかになった（表III）。試験したペプチドはすべて４時間を超えるＤＴ50（複合体の５０％が減衰するのに必要な時間）を示した。３時間以上のＤＴ50値を持つペプチドはＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウス中で免疫原性だった。総合するとこれらのデータは、ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体が野生型ｇｐ１００  １５４−１６２と比較して類似するまたは増大した免疫原性を持ちうることを示している。
【０１１５】
実施例４：
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおけるｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体の免疫原性
ＭＨＣクラスＩ結合親和力と解離速度を測定したｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体の生体内での免疫原性を決定するため、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにｇｐ１００  １５４−１６２野生型エピトープ、エピトープ類似体ＫＴＷＧＱＹＷＡＶ、ＫＶＷＧＱＹＷＱＶ、ＫＬＷＧＱＹＷＱＶまたはＫＩＷＧＱＹＷＱＶ、もしくはコントロールのペプチド（ＨＢＶコア１８−２７；ＦＬＰＳＤＤＦＰＳＶ）をワクチン接種した。これらの形質転換マウスの作出（Vitielloら, 1991, J. Exp. Med. 173:1007）とそのインビボ免疫原性分析への使用は以前に記述されている（Ressingら, 1995, J. Immuno. 154:5943;Setteら, 1994, J. Immunol. 153:5586）。図３に示すように、ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体ＫＴＷＧＱＹＷＡＶ、ＫＶＷＧＱＹＷＱＶおよびＫＬＷＧＱＹＷＱＶはきわめて効率よくＣＴＬ応答を誘導した。それより程度は低いが、エピトープ類似体ＫＩＷＧＱＹＷＱＶと野生型ｇｐ１００  １５４−１６２もＣＴＬ応答を誘発できた。ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体をワクチン接種したマウスに由来するバルクＣＴＬは、ワクチン接種に使用したペプチドと野生型エピトープをローディングしたジャーカットＡ*０２０１／Ｋb細胞をどちらも特異的に溶解した。興味深いことに、エピトープ類似体に対して生じたＣＴＬバルク培養物はすべて、野生型エピトープをパルスした標的細胞を、ワクチン接種に使用したエピトープ類似体をパルスした標的細胞と比較して同等かそれ以上に認識した。このように、試験したｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体はすべて、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウス中で免疫原性であり、天然のｇｐ１００  １５４−１６２エピトープとの交差反応性を示すＣＴＬを誘導した。
【０１１６】
実施例５：
内因的にＨＬＡ−Ａ*０２０１に提示された野生型ｇｐ１００  １５４−１６２との交差反応性を示すｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体特異的ヒトＣＴＬのインビトロ誘導
次に我々は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１+の健康なドナーのＴ細胞レパートリー内にｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体を認識できるＴ前駆細胞が存在するかどうかを評価するためのインビトロＣＴＬ誘導アッセイを行なった。これを達成するため、我々は、過去に記述されているように、ペプチドローディングされた樹状細胞の自家応答Ｔリンパ球との共培養を開始した（Bakkerら, 1995, Cancer Res. 55:5330）。数回の再刺激後、応答Ｔ細胞を細胞障害活性について試験した（図４）。ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体ＫＴＷＧＱＹＷＡＶ、ＫＶＷＧＱＹＷＱＶ、ＫＬＷＧＱＹＷＱＶおよびＫＩＷＧＱＹＷＱＶに対して生じたバルクＣＴＬ集団はすべて、ＣＴＬ誘導に使用したペプチドと共にインキュベートしたＨＬＡ−Ａ*０２０１+Ｔ２標的細胞を効率よく溶解した。無関係なペプチドの存在下では低いバックグラウンド溶解だけが観測された。またこれらのｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体反応性ＣＴＬは、野生型ｇｐ１００  １５４−１６２と共にインキュベートしたＴ２標的細胞をも効率良く溶解した。これらのＣＴＬ応答細胞集団が内因的にプロセシングされ提示された野生型エピトープをも認識しうるかどうかという問題と取り組むために、我々はＨＬＡ−Ａ*０２０１+メラノーマ細胞系ＢＬＭとＭｅｌ  ６２４を標的として用いるクロム放出実験を行なった。ＢＬＭ細胞はタンパク質レベルでもｍＲＮＡレベルでもｇｐ１００抗原の発現を失っている（Ademaら, 1993, Am. J. Pathol. 143:1579）。図５に示すように、ペプチド誘導ＣＴＬ培養物はいずれも抗原発現性Ｍｅｌ  ６２４細胞を溶解したが、抗原陰性のＢＬＭ細胞に対する溶解は観察されないか、バックグラウンド溶解しか観察されなかった。さらに、抗ｇｐ１００  １５４−１６２類似体ＣＴＬによって放出されるＴＮＦから、これらＣＴＬの内因的に提示された野生型ｇｐ１００  １５４−１６２との反応性が立証された（未公表のデータ）。これらのデータは、ｇｐ１００  １５４−１６２エピトープ類似体をローディングした樹状細胞を用いて誘導されたこれら４種類のＣＴＬ培養物がすべて、ＨＬＡ−Ａ*０２０１+Ｍｅｌ  ６２４細胞によって内因的にプロセシングされ提示された天然のｇｐ１００  １５４−１６２エピトープを認識したことを示している。
【０１１７】
【表１】
0005198354.tif 000002
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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