(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキン活性のインビトロでの測定方法であって：
（ａ）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がパーキンによりユビキチン化される条件下で一緒にインキュベーションし、そして
（ｂ）Ｓ５ａタンパク質のユビキチン化の速度または程度を測定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
パーキン活性のモジュレーターに関するアッセイ方法であって、
（ａ）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし；
（ｂ）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を試験作用物質の存在下で（ａ）の条件下にて一緒にインキュベーションし；
（ｃ）試験作用物質の存在および不存在下でＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を比較することを含んでなり、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示し、そして試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物質がパーキン活性を阻害することを示す、上記アッセイ方法。
【請求項３】
細胞をベースとし、（ａ）工程がパーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を発現する哺乳動物細胞を提供する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）工程中で哺乳動物細胞がパーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を発現し、（ｂ）工程が（ａ）工程の細胞を試験作用物質に曝す工程を含む、ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
パーキンおよびＳ５ａがヒト由来である請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
パーキンおよびＳ５ａの少なくとも１つが細胞に対して異種である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
測定されるパーキン活性がパーキンＥ３リガーゼ活性である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００７年１月３１日に出願された特許文献１の利益を主張し、その内容は引用により全部、本明細書に編入される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）活性のアッセイ方法に関する。このアッセイ方法はパーキンソン病の処置に有用な作用物質の薬剤スクリーニングに使用することができる。本発明は、神経生物学、薬剤探索および医薬の分野における応用を見い出だす。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質のドーパミンニューロンの喪失として神経病理学的に特徴付けられる神経学的障害である。このニューロン喪失は、運動緩徐、硬直および／または振せんのような運動における変調として臨床的に現れる（非特許文献１）。ヒトの遺伝子データで、ＰＤの発生と結び付けられる遺伝子が同定された。これらの遺伝子の１つは、１群の若年発症患者のコホートを使用して染色体６に位置決定され、そしてパーキンタンパク質として特異的に同定された（非特許文献２）。パーキンタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＳ）において機能するＥ３リガーゼタンパク質である（非特許文献３）。ＵＰＳは、分解のためにタンパク質の標的化除去に関与する主要な細胞経路であり、そしてＥ３リガーゼは、細胞プロテアソーム（非特許文献４）またはリソソーム（非特許文献５）による分解のために基質を同定し、標識するために機能する。またはユビキチン化は分解せずにタンパク質機能を調節するために役立つことができる（非特許文献６）。
【０００４】
パーキンソン病を処置するための新規治療薬に対する切迫したニーズが存在する。本発明は、そのような新規治療薬を同定し、かつ／または評価するために、ならびに他の用途に有用である新規方法および材料を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／８９８，９４７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６：３３−３９
【非特許文献２】Ｋｉｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６０５−６０８
【非特許文献３】Ｓｈｉｍｕｒａ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：３０２−３０５
【非特許文献４】Ｈｅｒｅｓｈｋｏ  ａｎｄ  Ｃｉｅｎｃｈａｎｏｖｅｒ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４２５−４７９
【非特許文献５】Ｈｉｃｋｅ，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１０７−１１２
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ，２００３，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ、”Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  １７，２７３３−４０
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡単な要約
１つの観点では、本発明は２６ＳプロテアソームのＳ５ａサブユニッとのパーキン媒介型ユビキチン化が測定されるパーキン活性に関するインビトロおよび細胞に基づくアッセイ方法を提供する。このアッセイ方法は、パーキンタンパク質リガーゼ活性を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）作用物質をスクリーニングするために使用できる。
【０００８】
別の観点では、本発明はトロポニン１のパーキン媒介型ユビキチン化を測定するパーキン活性に関するインビトロおよび細胞に基づくアッセイ方法を提供する。このアッセイ方法は、パーキンタンパク質リガーゼ活性を調節する作用物質をスクリーニングするために使用できる。
【０００９】
１つの観点では、本発明は（１）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がパーキンによりユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし、そして（２）Ｓ５ａタンパク質のユビキチン化の速度または程度を測定することによりパーキン活性を測定するためのインビトロの方法を提供する。異なる観点では、この方法はＳ５ａの代わりにトロポニン１を使用して行われる。パーキンおよび／またはＳ５ａおよび／またはトロポニン１はヒト由来でよい。
【００１０】
１つの観点では、本発明は、（ａ）パーキンを発現し、そしてＳ５ａを発現する哺乳動物細胞を準備し；そして（ｂ）Ｓ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を測定することによるパーキン活性を測定するための細胞に基づく方法を提供する。このアッセイ方法はパーキン活性に及ぼす細胞の環境の効果（例えば同時に発現されるタンパク質）を比較するために使用できる。このアッセイ方法はパーキンのバリアントの活性を比較するために使用できる。パーキンおよび／またはＳ５ａは細胞に対して異種でよい。異なる観点では、この方法はＳ５ａの代わりにトロポニン１を使用して行われる。パーキンおよび／またはＳ５ａはヒト由来でよい。
【００１１】
１つの観点では、本発明はパーキン活性のモジュレーターに関するアッセイ方法を提供する。このアッセイ方法には（１）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし；（２）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を試験作用物質の存在下で（１）の条件下にてインキュベーションし；そして（３）試験作用物質の存在下でＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質の不存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含み、ここで試験作用物質の不存在でのユビキチン化に比べて、試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示し、そして試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物質がパーキン活性を阻害することを示す。異なる観点では、この方法はＳ５ａの代わりにトロポニン１を使用して行われる。パーキンおよび／またはＳ５ａおよび／またはトロポニン１はヒト由来でよい。
【００１２】
１つの観点では、本発明はパーキン活性のモジュレーターに関する細胞に基づくアッセイ方法を提供する。このアッセイ方法は（ａ）パーキンを発現し、そしてＳ５ａを発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露されない対照細胞中でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含み、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性を強化することを示し、そして試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物質がパーキン活性を阻害することを示す。異なる観点では、この方法はＳ５ａの代わりにトロポニン１を使用して行われる。
【００１３】
１つの観点では、本発明はパーキン活性の正のモジュレーターの特異性を評価するためのインビトロの方法を提供する。この方法は、（ａ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を、基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベーションし；（ｂ）Ｅ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を、パーキン活性の正のモジュレーターの存在下で（ａ）の条件下にて一緒にインキュベーションし；（ｃ）正のモジュレーターの存在および不存在下でＥ３リガーゼのリガーゼ活性を比較することを含み、ここで正のモジュレーターが存在する時のＥ３リガーゼ活性の増加は、正のモジュレーターがパーキンに対して完全には特異的でないことを示し、そして増加の不存在は、正のモジュレーターがパーキンに対して完全に特異的であることを示す。
【００１４】
１つの態様では、正のモジュレーターの存在下での基質のユビキチン化の増加は、正のモジュレーターがパーキンに対して完全には特異的ではないが、正のモジュレーターが部分的に特異的であることを示す。部分的特異性は非−パーキンＥ３に対して１００マイクロモル以下であり、そしてパーキンに対するＥＣ１０よりも少なくとも４倍高いＥＣ１０と定められる。
【００１５】
特異性アッセイ方法の１つの態様では、パーキンの基質はＳ５ａである。１つの態様では、パーキンの基質はトロポニン１である。非パーキンＥ３リガーゼタンパク質はＲＩＮＧ  Ｅ３リガーゼでよい。非パーキンＥ３リガーゼタンパク質は、Ｍｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰからなる群から選択されることができる。
【００１６】
幾つかの態様では、特異性が決定される正のモジュレーターは、（ａ）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし；（ｂ）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を試験作用物質の存在下で（ａ）の条件下にて一緒にインキュベーションし；（ｃ）試験作用物質の存在および不存在下でＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を比較することを含んでなり、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示すアッセイ方法で同定される。幾つかの態様では、工程（ａ）および（ｂ）の前に、パーキンタンパク質は、パーキン活性を試験作用物質の不存在下での４０〜７０％までに下げる熱的条件下にて試験作用物質の存在下でインキュベーションされる。
【００１７】
幾つかの態様では、特異性が決定される正のモジュレーターは、（ａ）パーキンを発現し、そしてＳ５ａを発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露されない対照細胞中でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含んでなり、ここで試験作用物質の存在下でＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示すアッセイ方法で同定される。
【００１８】
幾つかの態様では、特異性が決定される正のモジュレーターは、（ａ）パーキンを発現し、そしてトロポニン１を発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でトロポニン１のユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露されない対照細胞中でのトロポニン１のユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含んでなり、ここで試験作用物質の存在下でＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示すアッセイ方法で同定される。幾つかの態様では、特異性が決定される正のモジュレーターは、（ａ）パーキンを発現し、そしてトロポニン１を発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でトロポニン１のユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露されない対照細胞中で
のトロポニン１のユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含んでなり、ここで試験作用物質の存在下でトロポニン１のユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性の正のモジュレーターであることを示すアッセイ方法で同定される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】インビトロでのパーキンの自己ユビキチン化（ａｕｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）が、ｐＨ８．０に比べてｐＨ８．８で行われた時に強化されたことを示すウエスタンブロットである。図１Ａは抗パーキン抗体で染色した反応生成物のウエスタンブロットを表す。図１Ｂはビオチン化−ユビキチンについて染色した反応生成物を示すウエスタンブロットを表す。
【図２】パーキンＥ３リガーゼ活性によるＳ５ａのユビキチン化を示すウエスタンブロットである。
【図３】パーキンＥ３リガーゼ活性によるトロポニンのユビキチン化を示すウエスタンブロットである。
【図４】パーキンおよびｍｄｍ２Ｅ３リガーゼ活性に及ぼす化合物の効果を、基質としてＳ５ａを使用して示すグラフである。化合物はパーキン活性を２．８ｕＭのＥＣ５０で増加させたが、ｍｄｍ２のＥ３リガーゼ活性を上げず、または阻害しなかった。
【００２０】
発明の詳細な説明
遺伝データは、ヒトにおいてパーキンタンパク質の喪失が、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失と、最終的にはパーキンソン病（「ＰＤ」）をもたらすことを確立した。パーキンタンパク質は、Ｅ１ユビキチン活性化酵素およびＥ２ユビキチン結合酵素と一緒に作動するＥ３（ユビキチン）リガーゼタンパク質である。Ｅ１酵素は、結合するためにＡＴＰを使用してユビキチンを活性化し、そしてそれをＥ２酵素に移す。パーキンはＥ２と相互作用し、そしてユビキチンをタンパク質基質上のリシンのε−アミノ基に移す。基質へのユビキチン部分の連続的付加でポリユビキチン鎖が生じる。パーキン活性は、ユビキチンの基質または「標的タンパク質」への転移の速度もしくは程度を測定することによりアッセイ方法できる。
【００２１】
既知のパーキン基質には、アルファ−シヌクレインおよびパーキンタンパク質自体（自己ユビキチン化）を含む。ここで今、Ｓ５ａ（２６Ｓプロテアソームのサブユニット）およびトロポニン１（「トロポニン」）がパーキンリガーゼの基質となり得ることが見いだされた。
【００２２】
この知見に一部基づき、パーキン活性はＳ５ａまたはトロポニンのユビキチン化の速度もしくは程度を測定することによりアッセイ方法することができる。パーキンリガーゼ活性のアッセイ方法は、ＰＤおよび他の神経学的疾患の処置に使用するための薬剤候補をスクリーニングし、そして評価するために価値がある。またアッセイ方法は生物学的サンプル中のパーキンの存在を検出し、組換え体の完全性または精製したパーキンタンパク質を評価し、修飾した、またはバリアントパーキンタンパク質のリガーゼ活性を評価し、そしてパーキンリガーゼ活性のモジュレーターをスクリーニングするために有用である。そのようなモジュレーターは治療薬として医薬に、および医学的研究に応用を有する。
【００２３】
またアッセイ方法はパーキンタンパク質に対するパーキンのモジュレーターの特異性を決定するために（一般的にＥ３リガーゼのモジュレーターとは対照的に）も提供される。
【００２４】
Ｉ．パーキンリガーゼ活性のインビトロアッセイ方法
１つの観点では、本発明は（１）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし、そして（２）Ｓ５ａタンパク質のユビキチン化の速度または程度を測定することによりパーキン活性
を測定するためのインビトロの方法を提供する。
【００２５】
１つの観点では本発明は、（１）パーキンタンパク質およびトロポニンタンパク質を、トロポニンタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし、そして（２）トロポニンタンパク質のユビキチン化の速度または程度を測定することによりパーキン活性を測定するためのインビトロの方法を提供する。
【００２６】
パーキンおよび他のＥ３リガーゼによりユビキチン化を測定するための多くのアッセイ方法が知られている。本開示により導かれる（Ｓ５ａがパーキン基質である教示を含む）当業者は、そのようなアッセイ方法をパーキンによるＳ５ａのユビキチン化を測定するために適合させることができるだろう。例えばパーキンおよびＳ５ａを組み合わせ、そしてＥ１（例えばＵＢＡ１［Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５５３８６］）、Ｅ２（例えばＵｂｃＨ７）、Ｍｇ−ＡＴＰ、ユビキチンおよび適切なバッファーの存在下でインキュベーションし、そしてユビキチンがＳ５ａへ結合する速度または程度を測定することができる。本明細書で使用する「インキュベーションする」とは、成分を合わせ、そして通常は室温もしくは生理学的温度で酵素反応（１もしくは複数）が起こるようにする標準的意味を有する。パーキンにより基質タンパク質がユビキチン化される条件下で、パーキン（または他のＥ３リガーゼ）とＳ５ａ（または他のパーキン基質）とを一緒にインキュベーションすることは、Ｅ３および基質がユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＡＴＰを含んでなるバッファー溶液中で合わせられ、そしてユビキチンの基質への転移を生じるための温度よび時間でインキュベーションされることを意味する。そのような条件は科学文献中に広く記載されている。例示的アッセイ方法条件を限定ではなく具体的説明のために以下に記載する。
【００２７】
Ｓ５ａ（または他のパーキン基質）のユビキチン化の速度または程度は、様々な方法で測定できる。Ｓ５ａのユビキチン化を測定するための１つの方法には、ユビキチン化反応、反応混合物から電気泳動によるタンパク質の分離、分離したタンパク質のウエスタンブロッティング、ウエスタンブロットの抗−Ｓ５ａ抗体によるプロービングおよびユビキチンのＳ５ａ基質への付加を反映するＳ５ａの移動性の変化の検出を行うことが関与する（実施例２を参照されたい）。しかしユビキチン化を測定する任意の方法を使用でき、それには免疫学に基づくアッセイ方法（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク、引用により本明細書に編入）、質量分析法、電磁気スペクトル分光法、クロマトグラフィー法、検出可能に標識されたユビキチンを使用したユビキチン化および当業者には明白な他の取り組みがある。
【００２８】
本発明の実施には多くのインビトロアッセイ方法形式を使用することができる。例えばアッセイ方法成分は溶液状であることができ、あるいは１もしく複数を固定化してもよい。例えば１つの取り組みでは、エピトープタグ付Ｓ５ａが、マイクロウェルもしくはビーズのような支持体上のタグを介して固定化される。パーキンおよび他の試薬を含むユビキチン化反応混合物がウェルに加えられ、そしてユビキチン化反応が起こる。生じたユビキチン化Ｓ５ａ（“ｕＳ５ａ”）のレベルは、免疫学的方法（例えば検出可能に標識された抗−ユビキチンもしくは抗−Ｓ５ａ抗体の複合体への結合）、他の結合法（例えば反応にビオチン化ユビキチンを使用し、そしてアビジン−連結プローブを使用してｕＳ５ａを検出する）、あるいは検出可能に標識されたユビキチンをアッセイ方法に使用して測定される。
【００２９】
具体的説明のために、１つのアッセイ方法ではＳ５ａが表面上（マイクロウェルプレート、球状ビーズ、磁気ビーズ；等）に固定化され、そしてパーキン、Ｅ１、Ｅ２、ユビキチンおよびＡＴＰを含むリガーゼ反応ミックスとインキュベーションされる。１つの態様
では、Ｓ５ａが９６ウェルもしくは３８６プレート（例えばイムロン：Ｉｍｍｕｌｏｎ、ウォールサム、マサチューセッツ州；Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ライフテクノロジーズ：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスルーエ、ドイツ；等）のウェルに固定化される。ユビキチン化を妨害しないＳ５ａの固定化法を使用することができる。例えばＳ５ａは、抗体がＳ５ａエピトープを認識する抗体結合系を使用して固定化することができる。あるいは抗体はＳ５ａタンパク質に融合したエピトープタグを認識することができる。１つの取り組みでは、固定化には非抗体媒介型の相互作用が関与する。例えば１つの取り組みでは、Ｎ−末端６ｘＨｉｓタグを含むＳ５ａが、ニッケル被覆アッセイ方法プレートを使用して固定化される。１つの取り組みでは、ビオチン化成分がアビジンとの相互作用を介して固定化される。
【００３０】
反応成分を加える前に、表面はタンパク質、特にＥ１のプレートへの非特異的結合を減らすためにブロッキング溶液で処理することができる。ブロッキング剤にはＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ピアス  ケミカル社：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）；ＳｙｎＢｌｏｃｋ（セロテック：Ｓｅｒｏｔｅｃ、ローリー、ノースカロライナ州）；ＳｅａＢｌｏｃｋ（カルビオケム：ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、ダームスタット、ドイツ）；金属キレートブロック（ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）；１％カゼイン；１〜５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；グルタチオン；およびこれらの様々な組み合わせを含む。ブロッキング工程後、ウェルはＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋウォッシュ（ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）またはリガーゼバッファーウォッシュ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄できる。１つの態様では、Ｉｍｍｕｌｏｎ９６または３８４ウェルプレートは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の１％カゼインでブロッキングされ、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／４ｍＭ  ＤＴＴを使用して洗浄される。
【００３１】
ブロッキング工程後、Ｅ１（ユビキチン−活性化酵素）、Ｅ２（ユビキチン結合酵素）、ＡＴＰ−Ｍｇおよびユビキチン（通常は標識したユビキチン）を含むリガーゼ反応ミックスを、固定化パーキン（パーキンＥ３リガーゼ）および基質（例えばＳ５ａもしくはトロポニン）と合わせる。場合によりＥ１はエピトープにタグが付けられる（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼもしくはＨｉｓ６を用いて）。反応成分は任意の望ましい順序で加えられる。ＡＴＰは反応を開始するために所望により最後に加えられる。
【００３２】
例示的な反応ミックスは：
・パーキンタンパク質（例えば０．０１〜１０ｕｇ）
・５００ｎＭ  １：１  ビオチン：ユビキチン
・２〜６ｎＭ  ＧＳＴ−Ｅ１
・３００ｎＭ  Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
・Ｓ５ａ（２００ｎＭ）
・１０ｍＭ  ＭｇＡＴＰ
・５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．８
反応成分、典型的にはＡＴＰは陰性対照のような特定のサンプルからは除くことができる。１つの態様では、アッセイ方法は９６または３８４ウェルプレート形式で行われる。プレートはある期間（例えば室温で６０分間、または３７℃で１０〜９０分間）、インキュベーションされる。プレートは可溶性試薬を除去するために洗浄され、そしてユビキチンの存在または量（すなわちユビキチン化Ｓ５ａのユビキチン成分）が測定される。洗浄溶液は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌでよい。
【００３３】
ユビキチン化Ｓ５ａの検出法は、使用する標識またはタグに依存する。例えばプレートアッセイ方法では、蛍光タグを付けたユビキチンが蛍光プレートリーダーを使用して直接検出でき、ビオチンタグを付したユビキチンは標識したストレプトアビジンを使用して検
出でき（例えばストレプトアビジン−ＨＲＰもしくは１：５０００のＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ［ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州］）、そしてエピトープタグを付したユビキチンは抗−タグ抗体を使用したイムノアッセイ方法で検出できる。
【００３４】
別の取り組みでは、ユビキチン化アッセイ方法を溶液中で行い、そして溶液（またはアリコート）を捕捉プレートに移すことができる。例となる反応では、反応成分を５０マイクロリットル容量とし、そしてアッセイ方法を３７℃で１０〜９０分間（例えば６０分間）行う。アッセイ方法の終わり、および／またはアッセイ方法の種々の時点で、反応ミックスまたはそのアリコートを、Ｓ５ａに結合する固定化部分（例えば抗−Ｓ５ａ抗体、またはＨｉｓ−タグ付きＳ５ａにはニッケル）、あるいはユビキチンに結合する固定化部分（例えば抗−ユビキチン抗体、Ｈｉｓ−タグ付きユビキチンにはニッケル、またはエピトープタグ付きユビキチンには抗−エピトープタグまたは抗体）を含む捕捉プレート（例えば９６もしくは３８４ウェルプレート）に移す。本発明で使用するタンパク質を標識するための一般的なエピトープタグには、ＦＬＡＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）、Ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチンおよびその他がある。
【００３５】
アッセイ方法は特定の終点でＳ５ａの単位質量あたりの総ユビキチン化を測定するために（ユビキチン化の「程度」）、かつ／またはＳ５ａ分子のポリユビキチン化を程度を測定するために（すなわちユビキチン鎖の長さ）設計することができる。アッセイ方法は様々な時点でのユビキチン化を測定して（例えば実施例２を参照にされたい）、単位時間あたりの（ユビキチン化の「速度」）、または変動する条件下のユビキチン化のレベルを決定するために設計することができる。
【００３６】
上記のように、代替的態様ではアッセイ方法にＳ５ａの代わりにトロポニンが使用される。例となる反応ミックスは：
・パーキンタンパク質（例えば０．０１〜１０ｕｇ）
・５００ｎＭ  １：１  ビオチン：ユビキチン
・２〜６ｎＭ  ＧＳＴ−Ｅ１
・３００ｎＭ  Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
・トロポニン１（２００ｎＭ）
・１０ｍＭ  ＭｇＡＴＰ
・５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．８
【００３７】
一般に本発明のインビトロアッセイ方法には、パーキン、Ｓ５ａ、Ｅ１（例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ２）、Ｅ２（例えばＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ８、ＵｂｃＨ１３）、Ｍｇ−ＡＴＰおよびユビキチンをバッファー溶液中に含む。アッセイ方法成分は当該技術分野で知られている方法、または以下に記載する方法を使用して作成でき、あるいは購入してもよい。例えば精製したユビキチン経路の酵素はボストン  バイオケム社（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ）から得ることができる（８４０  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｄｒｉｖｅ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州０２１３９）。また、Ｗｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９：４８９−９８を参照にされたい。トロポニンは購入することができる（例えばアブカム：Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。限定ではなく具体的説明のために、アッセイ方法成分をさらに以下に記載する。パーキン、トロポニン、Ｓ５ａ、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチンは精製され、かつ／または組換え体であることができ、そしてヒト、哺乳動物、マウスもしくは他の真核生物起源であり得る。様々なアッセイ方法の中には、反応成分が同種（例えばヒトのパーキン、Ｓ５ａ、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチン、またはマウスのパーキン、Ｓ５ａ、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチン）に由来する。
【００３８】
ａ）パーキン
アッセイ方法で使用するパーキンタンパク質は、ほとんどがヒトのパーキンと実質的に同じ配列を有する。ヒトのパーキンタンパク質の例示的配列は、ＮＣＢＩ寄託番号ＢＡＡ２５７５１で見いだされる。あるいはヒト以外の哺乳動物（例えばマウス）のパーキンタンパク質を使用してもよい。マウスのパーキンタンパク質に関する例示的配列は、ＮＣＢＩ寄託番号ＡＡＩ１３２０５で見いだされる。パーキンタンパク質は典型的には科学文献に広く記載されている方法を使用して組換え発現により得られる。パーキンは真核細胞培養で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で（例えばＵＳ２００７／０２１２６７９号明細書を参照にされたい）、または当該技術分野で知られている他のタンパク質発現系で生産され得る。読者の便宜のため、パーキン配列を配列番号２および４として提供する。あるいはこのアッセイ方法で使用するパーキンは、１もしくは複数の残基の置換、挿入または欠失により配列番号２または配列番号４から派生するバリアントであることができるが（マウスまたはヒトのパーキンを使用する場合）、少なくとも幾らかのリガーゼ活性を保持する。幾つかの変更体では、野生型とは異なる活性を有するパーキンバリアントを使用できる（例えば１６７位でセリンの代わりにアスパラギンを有するバリアント；２１２位でシステインの代わりにチロシンを有するバリアント；２４０位でトレオニンの代わりにメチオニンを有するバリアント；２７５位でアルギニンの代わりにトリプトファンを有するバリアント；２８９位でシステインの代わりにグリシンを有するバリアント；４３７位でプロリンの代わりにロイシンを有するバリアント）。場合により、細胞または微生物中で発現した時、野生型パーキンとは異なる表現型を与えるバリアントが使用される。さらにごく僅かなリガーゼ活性を保持するパーキンフラグメントを使用することができる。
【００３９】
パーキンは融合タンパク質として発現でき、そして例えばエピトープタグを含んで精製および／またはマイクロタイターウェルのような基質への結合を促進することができる。パーキンは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の細菌中で組換え的に発現され、そして公開された特許出願であるＵＳ２００７／０２１２６７９号明細書に記載されているように精製され得る。この精製法にはアルギニンを含有する溶液中でタンパク質がリフォールディングされる透析工程を含む。
【００４０】
本アッセイ方法に適するパーキン形は、一般に同じモル量の野生型ヒトパーキンのリガーゼ活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、多くの場合は少なくとも８０％、そしてたいていは少なくとも９０％を保持する。リガーゼ活性を保持するパーキンフラグメントを使用できる。典型的にはそのようなフラグメントは、自然に存在するパーキン配列の少なくとも２００個の連続する残基、そして多くの場合は少なくとも４００個の連続する残基を含んでなる。幾つかの態様では、本発明で使用するパーキンのバリアントは自然に存在するパーキンの形態と少なくとも９０％の配列同一性、時に少なくとも９５％の配列同一性、そして多くの場合は少なくとも９８％の配列同一性を共有する。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に並べることにより決定できる。タンパク質はマニュアルで、またはデフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムのようなコンピューター実行型のアルゴリズムを使用して並べることができる。
【００４１】
ｂ）Ｓ５ａ
Ｓ５ａはパーキンの基質である。Ｓ５ａはマルチユビキチン−結合タンパク質であり、ポリ−ユビキチン鎖にそのユビキチン相互作用モチーフを介して結合する。Ｓ５ａはＦｅｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、「ヒト２６Ｓプロテアーゼのマルチユビキチン鎖結合サブユニットのモレキュラークローニングおよび発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ２６Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８１（１−２），１４３−１４８；Ｃｏｕ
ｘ  ｅｔ  ａｌ．，「２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの構造および機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０Ｓ  ａｎｄ  ２６Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，８０１−８４７（１９９６）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４８（３）：７２７−３９；ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒ，１９９６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６０２０−２８；Ｋａｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：８９３；およびＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５４６１に記載されている。ヒトＳ５ａの配列は、ＮＣＩタンパク質データベース中で寄託番号ＮＰ ００２８０１を有する。
【００４２】
Ｓ５ａ基質はアッセイ方法に使用するために修飾され得る。例えばＳ５ａは融合タンパク質として発現されることができ、そして例えばＧＳＴもしくはＨｉｓ６のようなエピトープタグを含むことができる。ＧＳＴ−タグ付きＳ５ａはバイオモル社（ＢｉｏＭｏｌ，Ｉｎｃ．）（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）から購入できる。Ｈｉｓ６−タグ付きＳ５ａはＷａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１７６７−７７に記載されているように調製できる。パーキンによりユビキチン化され得る能力を保持する、典型的には自然に存在するＳ５ａ配列の少なくとも２００個の連続する残基、多くの場合は少なくとも３００個の連続する残基、多くの場合は少なくとも３５０個の連続する残基、時に少なくとも３７０個の連続する残基を含んでなる短縮形もしくはフラグメントを使用できる。幾つかの態様では、自然に存在するヒトのタンパク質（ＮＰ ００２８０１）と少なくとも９０％の配列同一性、時に少なくとも９５％の配列同一性、そして多くの場合は少なくとも９８％の配列同一性を有するＳ５ａのバリアントが使用される。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に並べることにより決定することができる。タンパク質はマニュアルで、またはデフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムのようなコンピューター実行型ノアルゴリズムを使用して並べることができる。
【００４３】
ｃ）トロポニン１
トロポニン１はパーキンの基質であり、そして以下に記載するリガーゼ特異性アッセイ方法を含む本発明のアッセイ方法に使用できる。ヒトのトロポニン１は配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ ０００３５４）を有するが、任意の哺乳動物由来の形態を使用できる。トロポニン１がパーキンの基質として使用される場合、タンパク質はアッセイ方法に使用するために修飾してもよい。例えばトロポニン１は融合タンパク質として発現されることができ、そして例えばＧＳＴもしくはＨｉｓ６のようなエピトープタグを含むことができる。トロポニン１は市販されており、または周知のプロトコールを使用して調製できる。パーキンによりユビキチン化される能力を保持する、典型的には自然に存在するトロポニン配列の少なくとも１５０個の連続する残基、多くの場合は少なくとも１８０個の連続する残基、多くの場合は少なくとも２００個の連続する残基、時に少なくとも２０５個の連続する残基を含んでなるトロポニン１の短縮形もしくはフラグメントを使用できる。幾つかの態様では、自然に存在するヒトのタンパク質（ＮＣＩタンパク質データベース寄託番号ＮＰ ０００３５４）と少なくとも９０％の配列同一性、時に少なくとも９５％の配列同一性、そして多くの場合は少なくとも９８％の配列同一性を有するトロポニン１のバリアントが使用される。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に並べることにより決定することができる。タンパク質はマニュアルで、またはデフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムのようなコンピューター実行型のアルゴリズムを使用して並べることができる。
【００４４】
ｄ）セプチン４
セプチン４（“Ｓｅｐｔ４”）はパーキンの基質であり、そして以下に記載するリガーゼ特異性アッセイ方法を含む本発明のアッセイ方法に使用できる。Ｓｅｐｔ４は細胞分裂
で機能をもつ保存されたタンパク質ファミリーのメンバーである。セプチン４の３種のスプライスバリアントが今日までに同定された：Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ ００４５６５）、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（“ＡＲＴＳ”としても知られている）（ＮＰ
５３６３４０）およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３（ＮＰ ５３６３４１）。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３は、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１がＮ末端にさらに２１個のアミノ酸を含むことを除いて同じ配列を有する。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）はバリアント１および３と残基１〜２４７については配列同一性を共有し、そしてアミノ酸２４７〜２７４については配列に多様性がある（Ｌａｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２：９１５−２０を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）。またＣｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、「遺伝的局所性偶発的ニューロパシー：圧迫麻痺に罹り易い遺伝的ニューロパシーおよび遺伝的神経痛性筋萎縮症（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｆｏｃａｌ，ｅｐｉｓｏｄｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｐａｌｓｉｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｅｕｒａｌｇｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）」、Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．８（１−２）：１５９−７４；Ｓｐｉｌｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６「ここに挙るセプチン：細胞内の機能および組織を調和させる新規ポリマー（Ｈｅｒｅ  ｃｏｍｅ  ｔｈｅ  ｓｅｐｔｉｎｓ：ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１９（Ｐｔ  １）：４−１０；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４「セプチン遺伝子ファミリーの病理生物学（Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｐｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ）」、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０４（４）：４８９−５０５を参照にされたい；各々、引用により本明細書に編入する。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ３はパーキンの基質であることが示された（データは示さず）。引用により本明細書に編入する同時係属出願である６０／９３９，３３５号明細書を参照にされたい。
【００４５】
本発明のアッセイ方法では、Ｓｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ３でよい。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ１でよい。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ２でよい。アイソフォームのバリアント、フラグメントおよび混合物も使用できる。Ｓｅｐｔ４のアイソフォーム１およびアイソフォーム３は、ただアミノ末端の２１アミノ酸残基が異なるだけで、パーキンとの等価の相互作用を有すると考えられる。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）はアミノ末端１〜２４７残基に相同性を有する。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２はユビキチン化され、そして神経細胞からの共免疫沈降実験ではＳｅｐｔ４ｖａｒ２およびパーキンが互いに相互作用することが示された。
【００４６】
幾つかの実験では、Ｓｅｐｔ４の短縮形を本発明の方法で使用できる。例えば以下の実験的実施例で示されるように、Ｎ末端から最高１１７個のアミノ酸を欠いているＳｅｐｔ４バリアントは、パーキンによりユビキチン化されるそれらの能力を保持し、そして本発明のアッセイ方法で使用することができる。幾つかの態様では、Ｓｅｐｔ４の他のバリアント、例えば挿入、欠失もしくは置換により異なるＳｅｐｔ４バリアントを使用して本発明の方法を実施することができる。有用なバリアントはパーキンユビキチン化基質となる特性を保持し、これは当該技術分野で知られ、そして本明細書に記載するアッセイ方法を使用して試験することができる。本発明で使用できるＳｅｐｔ４の他のバリアントには、Ｓｅｐｔ４タンパク質と９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有するバリアントを含む。当業者は２つのタンパク質配列を最適に並べることにより、バリアントが共有する元のタンパク質との相同性を容易に決定することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムのようなアライメントプログラムは、２つのタンパク質を最適に並べるために使用できるプログラムの例である。
【００４７】
ｅ）ユビキチン、ユビキチン−活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン−キャリアータンパク質（Ｅ２）
ユビキチン、ユビキチン−活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン−キャリアータンパク質は市販されており、または日常的な組換え法を使用して作成することができる。ユビキチンは例えばボストンバイオケム社から市販されている（８４０  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｄｒｉｖｅ、ケンブリッジ、ＭＡ０２１３９）。ビオチン化ユビキチンは１ｍＭの２９．２ｕｌを使用して５０ｕｇのビオチン−ユビキチン（ＵＢ−５６０、ボストンバイオケム）に再懸濁し、約１７％ビオチン化された約１．１７ｍＭの３０ｕｌのユビキチンを得ることにより調製することができる。ユビキチンにタグが付される場合（例えばエピトープタグ）、タグはユビキチンのＮ末端に融合されるか、またはそうでなければユビキチン化を妨害しないように付される。
【００４８】
ｆ）抗体
パーキン、Ｓ５ａおよびユビキチンに対する抗体は市販されている（例えばＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，４６２０  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  ６００、ゴールデン、コロラド州８０４０３）か、または日常的な方法を使用して作成できる。アッセイ方法の幾つかの変形では、エピトープにタグを付けたタンパク質はタグを認識する抗体を使用して認識される。
【００４９】
アッセイ方法法の選択を上に記載したが、ｕＳ５ａを作成し、そして検出するための多くの可能な取り組みがあり、そして上記アッセイ方法の多くの変形を同定することは当業者の通常の十分に可能な技術範囲内であると認識される。
【００５０】
ＩＩ．パーキンリガーゼ活性のモジュレーターのインビトロスクリーニング
上に注記したように、本発明のアッセイ方法はパーキンタンパク質活性のモジュレーター、特に正のモジュレーターのスクリーニングに応用を提供する。特定のメカニズムに結び付けられることは望まないが、正のモジュレーターはパーキンアゴニスト（これはパーキンリガーゼ活性を上げる）、またはパーキンタンパク質の安定化物（これは変性条件の存在下でのパーキン構造を維持する）であることができる。パーキンタンパク質を安定化する化学シャペロンのような化合物は、パーキンソン病の処置に有力な作用物質である。１つの態様では、候補の作用物質がパーキンソン病を処置するために有用であるかどうかを決定するためにインビトロアッセイ方法が使用され、これは化合物の存在下での精製した（または部分精製した）パーキンタンパク質のＳ５ａユビキチン化活性を測定し、そして化合物の存在下でのパーキンタンパク質のユビキチン化活性を、化合物の不存在下での精製したパーキンタンパク質のユビキチン化活性と比較することを含むことができる。ユビキチン化活性を上げる作用物質の能力は、パーキンソン病の処置に有用である作用物質およびさらなる試験の候補を示す。
【００５１】
反応成分は任意の順序で合わせてよい。試験作用物質は、ライゲーション反応の開始（例えばＡＴＰの付加）の前に加えてもよく、またはライゲーション反応が始まった後に加えてもよい。
【００５２】
このように、本発明の１つの観点では、パーキン活性のモジュレーターに関するアッセイ方法を提供する。このアッセイ方法には（１）パーキンタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化され得る条件下で一緒にインキュベーションし；（２）パーキンタンパク質、Ｓ５ａタンパク質および試験作用物質を（１）の条件下にて一緒にインキュベーションし；（３）試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質の不存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含むことができ、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性を強化し、そして試験作用物質の
存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物質がパーキン活性を阻害することを示す。通常、反応は試験作用物質の存在および不存在下で並行して行われる。しかし対照反応を異なる時期に行うことも可能である。例えば１つの変法ではアッセイ方法には（１）パーキンタンパク質、Ｓ５ａタンパク質および試験作用物質を、パーキンタンパク質がＳ５ａをユビキチン化できる条件下で一緒にインキュベーションし、そして（２）試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質の不存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度（例えば予め測定された値）と比較することを含み、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性を強化することを示し、そして試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物質がパーキン活性を阻害することを示す。またアッセイ方法は、多数の作用物質を同じ反応、バッチで、または組み合わせてアッセイ方法することが可能である。
【００５３】
幾つかの変形では、パーキンはリガーゼアッセイ方法の開始前に熱で破壊される。熱変性アッセイ方法では、パーキン活性の正のモジュレーターである作用物質（パーキンのアゴニストもしくは安定化剤）が同定される。パーキンは熱的な不安定化条件（すなわち天然のパーキンタンパク質のリガーゼ活性を少なくとも４０％、通常は対照の約４０％〜７０％まで下げるのに十分高い温度）で、作用物質（１もしくは複数）の存在もしくは不存在下でインキュベーションされ、そして次いでパーキンリガーゼ活性が測定される。パーキン構造を保存する（パーキン安定化剤）またはパーキンの酵素的活性のアゴニストとして作用する作用物質の両方が、試験作用物質が含まれる場合に、より高いユビキチン化のレベルにより同定される（安定化剤に関しては最大１００％まで）。熱変性アッセイ方法は、同時係属出願第６０／０２５，２３１号明細書に記載されている（これは引用により本明細書に編入する）。
【００５４】
パーキンの不安定化に関する条件は、通常、４５〜６０℃の範囲の温度でのインキュベーション、および３０分から３時間の範囲のインキュベーション温度を含む。例となる熱不安定化条件は、５７℃で９０分である。他の例となる熱不安定化条件は、６０℃で１５０分である。１つの態様では、パーキン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および試験作用物質（１０μＭ）を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．８、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（場合により０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ−１２７を含む）中でインキュベーションする。
【００５５】
パーキン活性を調節（阻害または増加）させる能力についてスクリーニングすることができる作用物質の種類に特定の限定はない。種々のクラスの試験作用物質を使用できる。例えば多数の天然および合成の化合物のライブラリーを使用できる（ＮＣＩ公開合成化合物コレクションライブラリー（Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ベセスダ、メリーランド州；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７３に記載されている化学的に合成されたライブラリー；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２−１１４２６；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１６１４−１６１８；およびＳａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１７０８−１１７１２を参照にされたい）。１つの態様では、作用物質は１０００未満、多くの場合は５００未満の分子量をもつ分子のような低分子である。好ましくは作用物質は血液−脳関門を通過でき、または血液−脳関門を通過できるように修飾され得る。１つの態様では、「化学シャペロン」は、パーキンを安定化でき（すなわち過剰に発現された場合でも、パーキンの活性
なコンフォメーションを維持する）、またはミスフォールドしたパーキンバリアントの正しいフォールディングを誘導する作用物質である。
【００５６】
本明細書で使用するように、「パーキンソン病を処置するために有用な作用物質」または「パーキンソン病を処置するための候補化合物」とは、他の化合物よりもパーキンソン病の患者に治療的または予防的利益を表す見込みが高いと同定される化合物、すなわち薬剤候補を指すと理解される。薬剤探査に精通している人は、薬剤候補が患者に投与される前にさらなる試験（例えば動物でのインビボ試験）を受けることができると理解している。また、ヒトへの投与が認可された作用物質は、薬剤候補の誘導体または化学的に修飾された形でよいと理解している。
【００５７】
ＩＩＩ．リガーゼの特異性スクリーニング
パーキン媒介型のＳ５ａのユビキチン化を上げると同定された作用物質（今後、時に「パーキンの正のモジュレーター」と呼ぶ）は、Ｓ５ａがパーキンの基質となる上記スクリーニングアッセイ方法を使用して同定できる。追加のスクリーニング工程を使用して、本発明の方法を使用して同定された任意のパーキンの正のモジュレーターの特異性を特性決定することができる。「特異性」とは、正のモジュレーターが試験した複数のＥ３リガーゼのアゴニストもしくは安定化物質ではないが、パーキンを排他的に調節するか、またはそれが他のＥ３リガーゼを調節するよりも効果的に調節することを意味する。
【００５８】
また本明細書で開示する特異性のスクリーニングは、上記方法を使用して元々同定されたパーキンの正のモジュレーターの特異性を評価するためにも使用できる（パーキンの基質としてＳ５ａを使用して）。また本明細書に開示する特異性のスクリーニングは、他の方法（例えばＳ５ａ以外のパーキンの基質、例えば限定するわけではないがトロポニン１およびセプチン４を使用したスクリーニング）により同定されたモジュレーターの特異性を特性決定するためにも使用できる。
【００５９】
以下の実施例３に示すように、Ｓ５ａは数種のＥ３リガーゼの基質である。本発明はパーキン以外のＥ３リガーゼによるＳ５ａのライゲーションに及ぼす、パーキン活性の正のモジュレーターが評価される、特異性を決定するためのインビトロの方法を提供する。１つの態様では、このアッセイ方法には（１）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質、およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベーションし；（２）Ｅ３タンパク質およびＳ５ａタンパク質を、パーキンの正のモジュレーターの存在下で（１）の条件下にて一緒にインキュベーションし；（３）パーキンの正のモジュレーターの存在でのＳ５ａのユビキチン化の速度または程度を、パーキンの正のモジュレーターの不存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度または程度と比較することを含み、ここでパーキン活性のモジュレーターの存在下でのＳ５ａユビキチン化の相対的増加は、パーキン活性のモジュレーターが非パーキンＥ３リガーゼ活性の活性を正に調節する（例えば非−パーキンＥ３リガーゼのアゴニストである）ことを示す。パーキンのＳ５ａユビキチン化を調節するが、Ｓ５ａの非−パーキンＥ３ユビキチン化を検出可能に調節しないパーキン活性のモジュレーターは、特異的なパーキンの正の調節活性を有すると同定される。通常、試験は数種の濃度のモジュレーターを使用して行われる。用量依存的曲線は、当該技術分野で周知な方法を使用して作成できる。典型的には、連続的な２倍もしくは３倍の希釈が使用される。通常、試験濃度は１００マイクロモルから５０ピコモルの範囲内である。以下の実施例４を参照にされたい。またアッセイ方法は種々のパーキン基質、例えばトロポニン１、またはＥ１、Ｅ２および上に記載した他の反応成分の存在下でユビキチン化され得る他のパーキン基質を使用しても行うことができる。
【００６０】
Ｓ５ａの非パーキンＥ３ユビキチン化も調節するが、パーキン活性を調節するほど効果的ではないパーキンの正のモジュレーターは、パーキンに部分的に特異的であるパーキン
の正のモジュレーター活性を有すると同定される。この内容において、「それほど効果的ではない（ｌｅｓｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ）」とは、１０％までパーキン活性を上げるために必要な化合物の量（濃度）（“ＥＣ１０”）が、パーキンよりも非パーキンＥ３で高いことを意味する。このアッセイ方法では、１００％は化合物の不存在下でＥ３リガーゼの完全な活性（すなわち弱められたり、変性されたりしていない）の全活性と定める。非パーキンＥ３に関するＥＣ１０が１００マイクロモル以下ならば、パーキンよりも２倍より大きい非パーキンＥ３に関するＥＣ１０は、部分的特異性を表す。好ましくはＥＣ１０は少なくとも５倍、１０倍、２０倍、または１００倍高い。このようにパーキン活性を１マイクロモルの濃度で１００％から１１０％に上げ、そして２５マイクロモル濃度で１００％から１１０％に上げる化合物は、部分的特異性を表す。このアッセイ方法の幾つかの変形では、パーキンおよび非パーキンＥ３が部分的に弱められ、そして完全に活性なリガーゼの１００％の活性よりも低い活性を有する可能性がある。そのような例では、弱められたパーキン活性を１マイクロモルの濃度で５０％から６０％へ上げる化合物、および弱められた非パーキン活性を２５マイクロモルの濃度で５５％から６５％へ上げる化合物が、部分的特異性を表す。非パーキンＥ３（１もしくは複数）に関するＥＣ１０が１００マイクロモルより大きく、そしてパーキンに対するＥＣ１０よりも少なくとも４倍高い場合、化合物はパーキンに完全に特異的であると考えられる。
【００６１】
非パーキンＥ３のリガーゼ活性に関するアッセイ方法条件は、結果が比較されるパーキンアッセイ方法で使用される条件と必ずとは限らないが同じでよい。例えば修飾は、最適な反応条件またはコファクターで、種々のＥ３間の差異を説明するように作成できる。例えばＥ３がＭｄｍ２またはＭｕｒｆ１である場合、Ｅ２タンパク質はＵｂｃＨ５でよく、一方、対応するパーキンアッセイ方法では、好適なＥ２タンパク質はＵｂｃＨ７でよい。特異性はアッセイ方法の反応条件および／または非パーキンＥ３リガーゼ（１もしくは複数）に関して報告できる。例えば実施例４に記載する実験では、試験する化合物はＭｄｍ２に比してパーキンに特異的である。
【００６２】
熱的な不安定化アッセイ方法が使用される場合、変性の条件は異なるＥ３リガーゼで変動するが、実施例に記載するように測定することができる。以下に示すように、Ｅ３  Ｅ６ＡＰは４１℃で１時間のプレインキュベーション後に、その活性の５０％を失うようであった。Ｅ３  Ｍｕｒｆ１は６０℃で１時間のプレインキュベーション後に、その活性の５０％を失うようであった。所定のＥ３リガーゼに関して、活性を４０〜７０％まで下げる熱的変性条件を決定することは、この開示により導かれる熟練者の技術の範囲内である。
【００６３】
パーキンの基質をユビキチン化できる任意の哺乳動物のＥ３リガーゼを、その基質を使用する特異性のアッセイ方法に使用できる。例えば実施例４に示すように、ＣＨＩＰ、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１、Ｅ６ＡＰ、Ｍｄｍ２およびＳｉａｈ２はＳ５ａをユビキチン化できる。ＣＨＩＰ（Ｈｓｐ７０−相互作用タンパク質のカルボキシル末端）は、熱ショックタンパク質と相互作用するテトラトリコペプチド反復含有タンパク質であり、そしてシャペロン機能を負に調節する（例えばＢａｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４５３５−４５；Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：９３−９６を参照にされたい）。Ｎｅｄｄ４（神経前駆体細胞が発現した発生的にダウンレギュレートされたタンパク質４）は、Ｎ末端にＣ２ドメイン、タンパク質中央に２から４つのＷＷドメインおよびＣ末端に触媒的ＨＥＣＴドメインを有するＥ３ユビキチンリガーゼのファミリー中の原型タンパク質である（例えばＩｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：１９７２−１９８４を参照にされたい）。Ｍｕｒｆ１（筋肉特異的ＲＩＮＧフィンガータンパク質１）は、筋肉の萎縮の発生に重要なタンパク質である（例えばＡｔｔａｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１７３−１８６を参照にされたい）。
Ｍｄｍ２（ｐ５３結合タンパク質Ｍｄｍ２）は、ｐ５３腫瘍サプレッサートランス活性化ドメインに結合する発癌タンパク質である（Ｋｕｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３）。Ｅ６ＡＰ（ヒト乳頭腫ウイルスＥ６−随伴タンパク質）は、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６発癌タンパク質とｐ５３との相互作用を媒介する（Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５−７８４を参照にされたい）。Ｓｉａｈ２（Ｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ２）は、低酸素に対する細胞応答の調節に結び付けられた（例えばＮａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｅｌｌ  １１７：９４１−９５２）。他の哺乳動物のＥ３リガーゼは、医学文献を参照にすることにより当業者により容易に同定される。限定するのではなく、具体的な例として、Ｅ３ユビキチンリガーゼアトロフィン（ａｔｒｏｐｈｉｎ）−相互作用タンパク質４（ＡＩＰ４）；ＥＤＤ（またはＨＹＤ）；Ｓｍｕｒｆ２；アトロギン（ａｔｒｏｇｉｎ）−１／ＭＡＦｂｘ；ＲＮＦ８；ｃ−ＩＡＰ１；ＳＣｆ−Ｃｄｃ４；Ｈｅｒｃ４；ｇｐ７８；ＲＩＮＣＫ；Ｐｉｒｈ２；Ｐｈｒ１；Ｔｒｉａｄ１；ＲＮＦ１２５／ＴＲＡＣ−１；Ｕｆｄ２ｐ；リガンド−オブ−Ｎｕｍｂタンパク質Ｘ１；Ｃｕｌｌｉｎ４Ｂ；ＨＲＤ−１；ＤＤＢ２；ＢＲＣＡ１  ＲＩＮＧ；ｃ−Ｃｂ１；ＨＡＣＥ１：ＲＮＦ５；Ｓｋｐ２；ｍｉｎｄ  ｂｏｍｂ１；およびＨｕｗｅｌがある。
【００６４】
幾つかの態様では、非パーキンＥ３はＲＩＮＧファミリーのメンバーである。幾つかの態様では、Ｅ３リガーゼはＭｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰから選択される。１つの態様ではＥ３リガーゼはＭｕｒｆ１またはＥ６ＡＰである。１つの態様では、Ｅ３リガーゼはＭｕｒｆ１である。幾つかの変更態様では、特異性アッセイ方法はＳ５ａ以外のパーキン基質、例えばトロポニン１を使用する。
【００６５】
ＩＶ．パーキンリガーゼ活性の細胞に基づくアッセイ方法
１つの観点では、本発明は（ａ）パーキンを発現し、そしてＳ５ａを発現する哺乳動物細胞を準備し；そして（ｂ）Ｓ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を測定することにより、パーキン活性を測定するための細胞に基づく方法を提供する。関連する観点では、本発明は（ａ）パーキンを発現し、そしてトロポニン１を発現する哺乳動物細胞を準備し；そして（ｂ）トロポニン１のユビキチン化の速度もしくは程度を測定することにより、パーキン活性を測定するための細胞に基づく方法を提供する。このアッセイ方法は細胞の環境（例えば同時に発現されるタンパク質）がパーキン活性に及ぼす効果を比較し、パーキンバリアントの活性を比較するために、薬剤スクリーニングアッセイ方法に、および他の用途に使用することができる。
【００６６】
パーキンおよびＳ５ａまたはトロポニンを発現する細胞は、そのタンパク質の１つまたは両方を自然に発現する細胞であることができる。様々な細胞を使用でき、それらにはＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ−２２６６）、ＣＯＳ細胞（ＣＲＬ−１６５１）；ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−６１）または他の哺乳動物細胞株を含む。１つの態様では、細胞は内因性のＳ５ａおよび内因性のパーキンを発現する。あるいはタンパク質の一方または両方が細胞に対して外因性であり、そして組換え的に発現され得る。細胞は安定に、または一時的にトランスフェクトされ得る。好ましくは細胞は多数のアッセイ方法を通して一貫性があるような安定なトタンスフェクタントである。１つの態様では、細胞は内因性のＳ５ａおよび外因性のパーキンを発現する。１つの態様では、細胞は内因性のパーキンおよび外因性のＳ５ａを発現する。幾つかの態様では、細胞が１つの種に由来するものであり、そしてパーキンおよび／またはＳ５ａは外因性であり、そして別の種に由来する。例えばパーキンおよびＳ５ａはヒトに由来し、そして細胞はヒト以外の哺乳動物に由来することができる。
【００６７】
また細胞は、マウスまたはラットの神経細胞培養物のような初代培養物でよい。マウス
の皮質性培養物をＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｃ５６ＢＬ／６ＷＴまたは他のマウスから調製することができる。ヒトのタンパク質を発現するトランジェニックマウスを使用できる。ラットの腹側中脳（ＲＶＭ）培養物は、Ｅ１５Ｗｉｓｔａｒラットまたは他のラットから調製できる。
【００６８】
組換えパーキンを発現している細胞を使用する場合、パーキンは発現ベクターを使用して発現することができる。１つの態様では、発現ベクターは野生型パーキンをコードする。例えばヒトのパーキンに関するｃＤＮＡ（ＮＭ００４５６２）は、本アッセイ方法で使用するためにベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位中に挿入することができる。他の態様では、パーキン変異体をコードする発現ベクターが使用される。米国特許公開第２００７０２１２６７９号明細書に記載されるように、ある種のパーキン変異体の発現はプロテアソーム機能の抑制をもたらす。例となるパーキン変異体には、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９Ｇ、Ｐ４３７Ｌがあり、好ましくはＲ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹまたはＣ２８９Ｇが使用される。パーキン変異体を使用するアッセイ方法は、野生型パーキンを使用するアッセイ方法の代わりとして、またはそれと組み合わせて使用できる。幾つかの態様では、パーキンおよび／またはＳ５ａタンパク質はバリアントおよび／または融合タンパク質である。
【００６９】
組換え発現の方法は知られている。発現ベクター、一過性のトランスフェクションのための方法、および本発明の実行のために適当な細胞培養の方法は、当該技術分野において周知であり、そして本明細書ではごく簡単に記述する。周知のように、発現ベクターは、典型的にはコーディング配列（例えば、パーキンの）に操作可能に連結された真核生物の発現制御要素を含む組み換えポリヌクレオチド構築物である。発現制御要素は、プロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含むことができる。発現ベクターは、典型的には、エピソームか、または宿主染色体ＤＮＡの組み込み部分のいずれかとして宿主生物において複製可能である。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）；ｐＥＡＫ（エッジバイオシステムズ：Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）およびその他（２００５を通じて補遺されたようなＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨークを参照にされたい）を含む。通常は、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能にするための選別マーカー、例えばアンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。トランスフェクションおよび細胞の培養に関する方法も周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ；およびＡｕｓｕｂｅｌ，１９８９、同上を参照にされたい。
【００７０】
Ｖ．パーキンリガーゼ活性のモジュレーターの細胞に基づくスクリーニング
本発明の細胞に基づくアッセイ方法は、パーキンソン病を処置する候補化合物を同定するために、パーキンタンパク質活性のモジュレーターのスクリーニングに有用である。１つの観点では、パーキン活性に及ぼす作用物質の効果が、（ａ）パーキンを発現し、そしてＳ５ａを発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露しない対照細胞中でのＳ５ａのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含む細胞に基づくアッセイ方法で評価することができ、ここで試験作用物質の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性を強化すること
を示し、そして試験作用物の存在下でのＳ５ａのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物がパーキン活性を阻害することを示す。関連する観点では、パーキン活性に及ぼす作用物質の効果が、（ａ）パーキンを発現し、そしてトロポニンを発現する哺乳動物細胞を準備し；（ｂ）細胞を試験作用物質に対して暴露し；（ｃ）試験作用物質の存在下でのトロポニンのユビキチン化の速度もしくは程度を、試験作用物質に暴露しない対照細胞中でのトロポニンのユビキチン化の速度もしくは程度と比較することを含む細胞に基づくアッセイ方法で評価することができ、ここで試験作用物質の存在下でのトロポニンのユビキチン化の相対的増加は、試験作用物質がパーキン活性を強化することを示し、そして試験作用物の存在下でのトロポニンのユビキチン化の相対的減少は、試験作用物がパーキン活性を阻害することを示す。
【００７１】
細胞は、作用物質を細胞培養基に加えることにより試験作用物質に暴露することができる。１つの取り組みでは、Ｓ５ａを発現する細胞はパーキンをコードする発現構築物でトランスフェクトされる。細胞は１〜１０日間、好ましくは２〜５日間（例えば３日間）培養され、次いで試験作用物に暴露される。暴露期間は変動し得るが、通常、１〜２４時間、好ましくは４〜１６時間である。同様に様々な濃度の作用物質を試験できる。この濃度は作用物質の性質に応じて変えることができるが、典型的には１ｎＭ〜５ｕＭの範囲内であると思われる。典型的には、数種の異なる濃度の試験作用物質が、ゼロ濃度の対照と共にアッセイ方法される（例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭ）。
【００７２】
本発明の１つの実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、６ウェル細胞培養プレートの培養ウェル（例えば、各ウェル直径約３０ｍｍ）中で７５％密度まで増殖される。細胞は、１ウェル当たり約２．５ｕｇのプラスミドを用いて上記のパーキン発現ベクターでトランスフェクトされ、そして細胞は試験作用物質による分析前に約３日間（例えば、２〜５日）培養される。
【００７３】
ＶＩ．化合物および使用法
１つの観点では、本発明は上記方法により同定されるパーキン活性の正のモジュレーターを提供する。作用物質は１０００未満、しばしば５００未満の分子量を持つ分子のような低分子でよい。１つの態様では、作用物質はパーキンを安定化できる（すなわちたとえ過剰に発現された場合でも、パーキンを活性なコンフォメーションに維持する）「化学シャペロン」であるか、またはミスフォールドしたパーキンバリアントの正しいフォールディングを誘導する。本発明はさらに、治療に有効な量の化合物を投与することにより、パーキンソン病と診断された個体の処置法を提供する。さらに本発明は予防に有効な量の化合物を投与することにより、パーキンソン病を発症する危険が平均より高いと決定された個体の処置法を提供する。
【実施例】
【００７４】
ＶＩＩ．実施例
実施例１：パーキンの自己ユビキチン化アッセイ方法
図１に示すように、インビトロのパーキン自己ユビキチン化は、ｐＨ８．０に比べてｐＨ８．８で強化された。自己ユビキチン化アッセイ方法は以下の反応条件を使用して行った：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝８．０または８．８
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
２００ｕＭ  Ｅ１（ＵＢＡ１）
２ｍＭ  Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
１０ｕｇ  パーキン
２００ｕＭ  ユビキチン
１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ
【００７５】
反応は、０、３０および６０分に取り出したアリコートを用いて３７℃で進行させた。アッセイ方法混合物の１５μｌアリコートは、１２％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、そしてウエスタンブロットのためにポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移した。膜は２時間、５％ＢＳＡまたは５％無脂肪ミルクを加えたＴｒｉｓ−緩衝化生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中でブロッキングし、次いで室温で１時間、抗−Ｓ５ａ抗体（バイオモル社：ＢｉｏＭｏｌ，Ｉｎｃ．；プリマスミーティング、ペンシルバニア州）と共に、３％ＢＳＡまたは５％無脂肪ミルクを加えたＴＢＳＴ中でインキュベーションした（室温で１時間）。ＴＢＳＴは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。膜は４ｘ１５分、室温のＴＢＳＴで洗浄した。次いで膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗−マウスＩｇＧと室温で１時間インキュベーションした。膜は４Ｘ１５分、室温のＴＢＳＴで洗浄し、次いでアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＥＣＬプラス化学発光試薬（アマシャムバイオサイエンス）中で２分間、製造元の指示に従いインキュベーションした。次いでＰＶＤＦは時間の長さを変えてフィルムに暴露して、図１のデータを得た。このアッセイ方法では、パーキンはＵＳ２００７／０２１２６７９に記載されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換えにより生産され、そして精製された。
【００７６】
図１Ａは、抗−パーキン抗体により染色した反応生成物のウエスタンブロットを表す。１つの矢印は単量体パーキンを示す。二重の矢印はユビキチン化パーキンのラダーを示す。ｐＨ８．８で行った時、ラダーは３０分で有意により強い（ｒｏｂｕｓｔ）。図１Ｂはビオチン化ユビキチンについて染色した反応生成物のウエスタンブロットを表す。１つの矢印は単量体パーキンを示す。二重の矢印はユビキチン化パーキンのラダーを示す。ｐＨ８．８で行った時、ビオチン−ユビキチンシグナルにより視覚化されるように、ラダーは３０分で有意により強い。
【００７７】
実施例２．Ｓ５ａはパーキン基質である
Ｓ５ａはパーキンＥ３リガーゼの基質であることが見い出された。Ｓ５ａを加えた、または加えなかった標準反応中のパーキンタンパク質を用いた実験の結果は、図２に示す。Ｓ５ａは精製を容易にするために、アミノ末端Ｈｉｓ６エピトープタグを包含した。アッセイ方法は以下の反応条件を使用して行った：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝８．８；
５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
２００ｕＭ  Ｅ１；
２ｍＭ  Ｅ２；
１０ｕｇ  パーキン（組換え体）
２００ｕＭ  ユビキチン；
Ｍｇ−ＡＴＰ  １ｍＭ
＋／−２００ｎＭ  Ｓ５ａ
【００７８】
反応は、実施例１に記載したように０、３０および６０分に取り出した時点で行い、電気泳動にかけ、そしてウエスタンブロットに供した。ブロットは抗−Ｓ５ａ抗体で染色した（図２）。図では、１つの矢印は単量体Ｓ５ａを示す；二重の矢印はユビキチン化Ｓ５ａを示す。０分では、より高分子量形のＳ５ａは無い。より高分子量形のＳ５ａは３０分で出現し、そして６０分で増加する（図上の二重頭矢印を参照にされたい）。
【００７９】
これらのデータは、パーキンタンパク質、Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ＡＴＰ、Ｓ５ａおよびユビキチンのみを含有する精製した反応混合物中、ユビキチンはＳ５ａタンパク質へ時間依存的様式で移されることを明らかに示す。試験管には他のユビキチンリガーゼは無く、そ
してＳ５ａは自身をユビキチン化できないので、示される活性はＳ５ａと相互作用し、そしてユビキチンをＳ５ａへ移すことができるパーキンタンパク質による可能性のみである。
【００８０】
実施例３．トロポニン１はパーキン基質である
トロポニンを基質として使用した標準的反応で、パーキンタンパク質を使用した実験の結果を図３に示す。このアッセイ方法は以下の反応条件を使用して行った：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝８．８；
５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
５０ｎＭ  Ｅ１；
５０ｕＭ  Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
パーキン（以下参照）
２００ｎＭ  ユビキチン；
１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ
２００ｎＭ  トロポニン
【００８１】
図に示すように、２種のパーキン調製物を使用した：Ｈｉｓ６タグ付きパーキン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびＧＳＴタグ付きパーキン（０．０３ｍｇ／ｍｌ）。反応は０、３０および６０分に取り出した時点で行い、電気泳動にかけ、そしてウエスタンブロットに供した。ブロットは抗−トロポニン１抗体（アビカム：ＡｂＣａｍ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ８２８８）で染色した。０分で、より高分子量形のトロポニンは無い。より高分子量形のユビキチン化トロポニンは３０分で出現し、そして６０分で増加する。
【００８２】
実施例４．選択性スクリーニングのための代用Ｅ３リガーゼ
パーキンＥ３リガーゼ活性を阻害または強化する作用物質（今後、時に「パーキンモジュレーター」と呼ぶ）は、Ｓ５ａがパーキン基質であるアッセイ方法を使用して同定することができる。本明細書に開示する追加のスクリーニング法を使用して、パーキン−Ｓ５ａ相互作用に関するパーキンモジュレーターの特異性を確認することができる。
【００８３】
Ｅ３リガーゼはユビキチン化酵素の最大のファミリーを表し、現在、数百の推定配列が同定されている。Ｅ３リガーゼの構造および作用機構に基づきグループ分けされた３つのＥ３ファミリーがある：（１）Ｅ６ＡＰカルボキシ末端に相同的（ＨＥＣＴ）（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｅ６ＡＰ  Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、（２）真に興味深い新規遺伝子（Ｒｅａｌｌｙ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅ）（ＲＩＮＧ）および（３）ＵＦＤ２相同体（Ｕ−ｂｏｘ）。本発明のアッセイ方法は例えばＲＩＮＧ  Ｅ３、Ｕ−ｂｏｘ  Ｅ３またはＨＥＣＴ  Ｅ３であることができる。パーキンはＲＩＮＧファミリーのメンバーであるので、化合物のスクリーニングには代用のリガーゼとして別のＲＩＮＧファミリーＥ３を利用することが最も価値があるだろう。しかしＥ３リガーゼは歴史的に発現が難しい。したがって我々はＳ５ａをユビキチン化する能力について試験するために、各ファミリーからＥ３リガーゼを選択した。第２のスクリーニングに使用するために理想的なＥ３リガーゼは十分に発現し、パーキンに使用されるユビキチン化アッセイ方法で使用する反応条件下で高い活性を有し、そして熱変性アッセイ方法でパーキンを破壊するために使用するものと類似の条件下で熱変性することができる。パーキンは４５〜６０℃の変性温度を有することが見いだされた。特異性のスクリーニングに理想的なＥ３リガーゼは、パーキンのスクリーニングに開発された熱ストレスアッセイ方法で使用するために、４５〜６０℃の範囲の熱的変性温度を有する。
【００８４】
我々は６種のＥ３リガーゼ（ＣＨＩＰ、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１、Ｍｄｍ２、Ｅ６ＡＰおよびＳｉａｈ２）を下記のように発現させ、そして精製した（Ｂ章）。Ｓｉａｈ２を除
いて、すべてのＥ３リガーゼが高い活性でＳ５ａをユビキチン化することができた。Ｓｉａｈ２は大変低い活性でＳ５ａをユビキチン化した。以下のＣ章を参照にされたい。
【００８５】
次いで我々はＥ３リガーゼが４℃から６０℃の温度範囲でプレインキュベーションされた後に、Ｓ５ａをユビキチン化する能力について試験した。熱的変性温度は、ＣＨＩＰおよびＳｉａｈ２を除いてすべてのＥ３について評価した。以下のＣ章を参照にされたい。約５０％の活性が失われた温度を、試験した各Ｅ３について表１に列挙する。
【００８６】
【表１】
0005329434.tif 000002
【００８７】
これらの実験に基づき、我々はＮｅｄｄ４、Ｅ６ＡＰおよびＭｕｒｆ１がすべて良好な発現、精製およびＳ５ａに対する活性を示すと結論付けた。ＣＨＩＰは良く発現し、そしてＳ５ａに対して合理的な活性を有したが、それほど純粋なサンプルではなかった。Ｓｉａｈ２は良く発現そして精製されたが、Ｓ５ａに対して大変低い活性を示した。Ｎｅｄｄ４、Ｅ６ＡＰ，Ｍｕｒｆ１およびＭｄｍ２の熱的変性特性を評価した。Ｎｅｄｄ４は４℃より高い温度でプレインキュベーションした時に、いかなる活性も示さず、そしてＭｄｍ２は６０℃でプレインキュベーションした後でも完全な活性を有した。Ｅ６ＡＰは４１℃で熱的変性を示し、そしてＭｕｒｆ１は６０℃で熱的変性を示す。
【００８８】
これらすべての結果を考慮して、熱変性に基づく特異性のスクリーニングに使用するために、最も有望な２種のＥ３リガーゼはＥ６ＡＰおよびＭｕｒｆ１であった。Ｍｕｒｆ１はパーキンのようにＲＩＮＧ  Ｅ３であるので、Ｍｕｒｆ１がリガーゼの第２スクリーニングに特に良く適している。
【００８９】
Ａ．Ｅ３リガーゼの発現および精製
Ｅ３リガーゼのＧＳＴ融合物をコードする発現プラスミドは、ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換され、そしてアンピシリン耐性に基づき選択された。細胞は選択培地で一晩生育させ、そして翌朝、１：１０倍に希釈した。ＯＤ６００により測定した時、細胞密度が対数増殖期に達した時、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。発現は温度および時間で異なり、そして以下の表２に列挙する。またＥ３タンパク質を精製するために使用したアフィニティカラムの種類、およびタンパク質を透析した最終的なバッファーも与
える。
【００９０】
【表２】
0005329434.tif 000003
【００９１】
発現および精製はＰＡＧＥによりクマーシー染色を使用してモニタリングして、目的タンパク質を含有する溶出画分を同定した。
【００９２】
Ｂ．基質としてＳ５ａを使用する能力
各Ｅ３リガーゼに関して、基質としてＳ５ａを使用したユビキチン化アッセイ方法を行った。簡単に説明すると、ユビキチン化反応物は５０ｎＭ  Ｅ１、１ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、５μＭ  ＵｂｃＨ７、０．２ｍｇ／ｍＬ  Ｅ３、２００ｎＭ  ユビキチンおよび２００ｎＭ  Ｓ５ａを含んだ。ユビキチン化反応は３７℃で１時間インキュベーションし、そしてサンプルを０、３０’および６０’に取った。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、イモビロン（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）に移し、そしてＳ５ａに対するモノクローナル抗体（バイオモル：ＢｉｏＭｏｌ）を使用してウエスタンブロッティングした。
【００９３】
Ｃ．Ｅ３リガーゼの熱変性
Ｅ３リガーゼの熱変性特性を特性決定するために、Ｅ３を４℃〜６０℃の温度範囲で９０分間、プレインキュベーションした（Ｍｄｍ２およびＮｅｄｄ４は４、３７、４５、５０および６０℃で；Ｍｕｒｆ１は４、３７、５０、６０、７０および８０℃で；Ｅ６ＡＰは３７、３９、４１、４３および４５℃で）。９０分で、５０ｎＭ  Ｅ１、１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、５μＭ  ＵｂｃＨ７（Ｍｄｍ２およびＭｕｒｆ１にはＵｂｃＨ５ａ）、２００ｎＭユビキチンおよび２００ｎＭ  Ｓ５ａを含有するプレミックスを作成した。プレミックスを０．２ｍｇ／ｍＬのＥ３リガーゼに加え、そして３７℃で６０分間インキュベーションした。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、そしてＳ５ａに対するモノクローナル抗体（バイオモル）を使用してウエスタンブロッティングにより評価した。
【００９４】
パーキンはその活性の約５０％を４５℃から５０℃の間で失い、これは以前の実験と一致する。Ｍｄｍ２は６０℃でプレインキュベーションした後でも活性を保持するようである。Ｎｅｄｄ４は試験した条件下で４℃を除く任意の温度でプレインキュベーションした後に活性を失うようであった。Ｅ６ＡＰは４１℃でのプレインキュベーション後にその活
性の５０％を失うようであるので、Ｅ６ＡＰが熱変性を受けるさらに特異的な温度を決定するために、我々はこの実験を３７℃〜４５℃の温度範囲を使用して繰り返した。Ｍｕｒｆ１は６０℃でその活性の５０％を失うようであった。
【００９５】
実施例４．リガーゼの選択性スクリーニング
パーキンＥ３リガーゼ活性を阻害または強化する作用物質（今後、時に「正のモジュレーター」と呼ぶ）は、Ｓ５ａがパーキンの基質であるアッセイ方法を使用して同定することができる。本明細書に開示するさらなるスクリーニング法を使用して、パーキン−Ｓ５ａの相互作用に関する正のモジュレーターの特異性を確認することができる。パーキンによるＳ５ａのユビキチン化を調節するが、異なるＥ３リガーゼによるＳ５ａのユビキチン化は調節しない作用物質は、パーキンに特異的な調節活性を有すると同定される。
【００９６】
図４では、パーキン活性の正のモジュレーター（ＧＳＴ−パーキン  ＰＳ／ＵｂｃＨ７を使用してＥＣ５０＝２．８ｕＭ）が、Ｅ３リガーゼＭｄｍ２に及ぼすその効果を試験する実験を表す。ＧＳＴ−Ｍｄｍ２は１００ｎＭのＵｂｃＨ５ａを含む０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で１，５３６ウェル形式で使用した。図に示すように、パーキン活性の正のモジュレーターはＭｄｍ２の活性を上げず、正のモジュレーターがパーキンに特異性を有することが示された。
【００９７】
本明細書に引用するすべての刊行物および特許明細書（特許、公開された特許出願および未公開特許出願）は、そのような各刊行物もしくは明細書が具体的および個別に参照により本明細書に編入されることが示されているように、参照により本明細書に編入する。刊行物および特許明細書の引用は、いずれかのそのような明細書が先行技術に関していることの是認を意図せず、またそれが同明細書の内容または期日に関するいかなる是認をも構成しない。本発明は今、記述された説明および実施例により記載してきたが、当業者は、本発明が種々の実施態様で実行でき、そして前述の説明および実施例が具体的に説明することを目的とし、以下を特許請求の範囲を限定するものではないことを認識するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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