(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１２，０００〜１４，０００であり、
（２）ゲル濾過による分子量が１０，０００〜４０，０００であり、
（３）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列は配列番号１であり、
（４）Ｎ型糖鎖であって、非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも有し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を有さない糖鎖に結合し、
（５）前記Ｎ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有する。
【請求項２】
カヤタケ属担子菌から得られた水系媒体抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーによって精製することにより得られる請求項１記載のレクチン。
【請求項３】
前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである請求項１又は請求項２記載のレクチン。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すること、を含むレクチンの製造方法。
【請求項５】
ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーの少なくとも一方により精製することを更に含む請求項４に記載のレクチンの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチン、請求項６に記載の標識レクチン又は請求項７に記載のレクチン固定化担体を用いて、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも有し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を有さない糖鎖含有物を検出することを特徴とする糖鎖検出方法。
【請求項９】
前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む請求項８に記載の糖鎖検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチンを含む、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも有し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を有さない糖鎖糖鎖含有物の有無を判定する判定薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規レクチン及びその製造方法に関し、特にキノコ抽出物由来の新規レクチン及びその製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、植物、動物のほか菌類などにも存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性（以下、適宜「特異性」ともいう）をもった物質の総称である。レクチンは、単糖のみならず糖鎖中の糖も認識するため、有用糖鎖プロファイラーとして広く用いられている。またレクチンは糖鎖に対する特異的な結合能が高いため、これを利用した目的物質の検出が可能である。目的物質の検出をより効率よく行うために、従来のレクチンとは特異性や結合能の高さなどが異なる新規なレクチンが探索され、種々見出されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、糖鎖の研究の進歩に伴って、糖鎖が生体内外で重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。例えば、ウィルス感染や癌等の各種疾患における糖鎖の役割が重要視されてきている。このため、より詳細な糖鎖研究が求められており、糖鎖の分析や癌などの診断において、特定の糖鎖を認識可能なレクチンは、有用なツールとして利用されてきている（例えば、特許文献３及び特許文献４参照）。
またＮ型糖鎖は、アスパラギンの酸アミド基に糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グルコシド結合した糖鎖群であり、高マンノース型、混成型、複合型の３種類に分類される。このような糖鎖には、例えば、ヒトα１−酸性糖タンパク質、ヒトトランスフェリン、ヒトラクトフェリン、ヒトα-フェトプロテイン、ヒト免疫イムノグロブリン等が含まれ、発生分化、癌化などの細胞状態で変化するだけでなく、種や組織などでも特異的に存在することが確認されている。
【０００４】
Ｎ型糖鎖の分岐鎖構造を決定する糖転移酵素に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素があり、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素にはそれぞれ、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素-III（GnT-III）、-IV（GnT-IV）、-V（GnT-V）、-VI（GnT-VI）等がある。これらは、図１１に示すように、それぞれ特定の分岐鎖に非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）を転移付加する働きを有することが知られている。この各種のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素によって付加された糖鎖は、さまざまな生体機能に関与している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
例えばGnT-IIIは、混成型や複合型のＮ型糖鎖上に、バイセクティングGlcNAc結合を合成する。GnT-IIIには、Ｎ型糖鎖の高分岐化の抑制があることから、肺転移等の癌転移を抑制する作用や、免疫グロブリンＧ（IgG）の活性を高める作用を有することが示唆されている。
また、GnT-IVやGnT-Vは、それぞれＮ型糖鎖の高分岐化に作用することが知られている。GnT-IVは、絨毛癌と胞状奇胎の識別に有用であり、一方、GnT-Vは、癌の転移に関与しており、その後に、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの伸張が起こることが知られている（例えば、非特許文献３及び４参照）。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６３０４３１号公報
【特許文献２】特許第２８９５９６２号公報
【特許文献３】特開２００６−１４９３９８号公報
【特許文献４】特表２００５−５１５４４０号公報
【非特許文献１】Science, 1987 May 1; 236(4801):pp.582-585.
【非特許文献２】J. Biol. Chem., Vol. 260, Issue 7, pp.3963-3969, 04, 1985
【非特許文献３】J Biol Chem. 2006 Oct 27; 281(43): pp.32122-32130., Epub 2006 Aug 28.
【非特許文献４】Biochim Biophys Acta. 1999 Oct 8; 1455(2-3): pp.287-300
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、レクチンを利用して種々の糖鎖プロファイルを行う際に、検査対象とする糖鎖に親和性を有しているとしても、異なる糖鎖に対してもある程度の親和性を示すレクチンでは、適切なプロファイルを行うことができない。現在知られているレクチンでは糖鎖に対する特異性が充分でないものがあり、特異性が高い新規なレクチンの開発に対する要請が大きくなっている。
また、Ｎ型糖鎖にも種々の種類があり、レクチンを用いてＮ型糖鎖を詳細に分析するには、選択性が高いレクチンが必要とされている。
従って本発明は、特定のＮ型糖鎖に対して高い親和性を示す新規レクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
［１］  以下の特徴を有するカヤタケ属担子菌に由来するレクチン：
（１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１２，０００〜１４，０００であり、
（２）ゲル濾過による分子量が１０，０００〜４０，０００であり、
（３）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列は配列番号１であり、
（４）Ｎ型糖鎖であって、非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも有し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）により転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を有さない糖鎖に結合し、
（５）前記Ｎ型糖鎖に対して結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有する。
【０００８】
［２］  カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーによって精製することにより得られる前記［１］記載のレクチン。
［３］  前記カヤタケ属担子菌がハイイロシメジである前記［１］又は［２］記載のレクチン。
［４］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチンの製造方法であって、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること、前記水系媒体抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを用いて精製すること、を含むレクチンの製造方法。
［５］  ガラクトース残基及びＮ−アセチルガラクトサミン残基の少なくとも一方を含有する担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーの少なくとも一方により精製することを更に含む前記［４］に記載のレクチンの製造方法。
【０００９】
［６］  前記［１］〜［３］いずれかに記載のレクチンと、標識化合物とを含む標識レクチン。
［７］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
［８］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチン、前記［６］に記載の標識レクチン又は前記［７］に記載のレクチン固定化担体を用いて、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを含む糖鎖含有物を検出することを特徴とする糖鎖検出方法。
［９］  前記糖鎖含有物を他の化合物と分別することを更に含む［８］に記載の糖鎖検出方法。
［１０］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載のレクチンを含む、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖含有物の有無を判定する判定薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定のＮ型糖鎖に対して高い特異性を示す新規レクチンを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌に由来し、上記（１）及び（２）の特徴を有するものである。カヤタケ属担子菌の子実体（キノコ）に由来するレクチンであることが好ましい。
【００１２】
本発明におけるカヤタケ属担子菌としては、ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis (Batsch:Fr.) Kummer）、アオイヌシメジ（Clitocybe odora (Bull. : Fr.) Kummer）カヤタケ（Clitocybe gibba (Pers.: Fr.) Kummer）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipes (Pers. : Fr.) Kummer）等を挙げることができ、このうちレクチンの糖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、ハイイロシメジであることが好ましい。
【００１３】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が１０，０００〜３０，０００のものであり、糖鎖認識能の高さの観点から好ましくは、１２，０００〜１４，０００である。
ＳＤＳ電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量の測定による分子量の測定は常法に従って行うことができる。
【００１４】
本発明のレクチンは、ＳＤＳ（０．５質量％）条件下での２５℃による一般的な泳動条件下では、煮沸処理を行ったものでは、１２，０００〜１４，０００の単量体として存在する。
また煮沸処理を行わないレクチンの分子量は、ゲル濾過による場合、一般的な測定条件下で、分子量推定用標準タンパクを用いて推定した結果、５，０００〜４０，０００のものであることが好ましく、１０，０００〜４０，０００のものであることが更に好ましい。
【００１５】
また、本発明のレクチンは、好ましくは、Ｎ−末端領域にAla-Asp-Gly/Val-Ile-Val-Arg/Pro-Ala-Val/Gly-Ala-Ala（配列番号１）からなるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものである。即ち本発明のレクチンは、イソレクチンであってもよく、その場合、Ｎ−末端から３残基目はＧｌｙかＶａｌであり、６残基目はＡｒｇかＰｒｏであり、８残基目はＶａｌかＧｌｙである。
【００１６】
本発明のレクチンは、特定のＮ型糖鎖に対して高い特異性を示す。また、本発明のレクチンの特異性は、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖に対して示される。このような高い特異性が示されるＮ型糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（GnT）により転移されたＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖であり、好ましくは、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンが露出している糖鎖であり、更に好ましくは、GnT-IIで転移されたＮ−アセチルガラクトサミンを少なくとも有し、且つ、GnT-IIIにより転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を含まない糖鎖である。
一方、本発明のレクチンは、その他のＮ−アセチルグルコサミン含有糖鎖には特異性を示さない。従って、Ｏ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖やキトオリゴ糖には結合しないという特異性を示す。このような特異性は、Ｎ−アセチルグルコサミン特異的であることが既知の他のレクチン、例えばコムギ胚芽レクチン（ＷＧＡ）、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、アメリカヤマゴボウ（ＰＷＭ）、バンデリアマメレクチン（ＧＳＬ−ＩＩ）には認められていない新規なものである。
【００１７】
このように本発明のレクチンは、上述した特定のＮ型糖鎖に対して高い特異性を示すものであり、他の糖鎖に対して特異性を示さない又は検出限界以下の非常に弱い結合である。このため、他の糖鎖配列が存在する環境下であっても、目的とするＮ型糖鎖のみを識別することができる。このような高い選択性を示すレクチンは、これまで知られていなかった。
【００１８】
本発明における「高い特異性」とは、４９種類以上の糖鎖の組み合わせで構成された糖鎖群の中から、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては結合性を示さないことを意味し、好ましくは１００種類以上で構成された糖鎖群の中から、特定のＮ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖のみを選択的に認識し、他の糖鎖に対しては検出限界以下の非常に弱い結合または結合性を示さないことを意味する。
【００１９】
このような高い特異性は、例えば結合定数による親和性に基づいて評価することができる。本発明のレクチンは、上記特定のＮ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖に対して、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上の親和性を示し、より好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上であり、更に好ましくは１．０×１０７Ｍ−１以上を示すことができる。この結合定数の上限は特に制限されないが、通常のレクチンの場合に示される結合定数の最大値、例えば、１．０×１０１０Ｍ−１以下の親和性を示す。また本発明のレクチンの他のＮ−アセチルグルコサミン含有糖鎖に対する親和性は低く、例えば結合定数１．０×１０４Ｍ−１以下であることが好ましい。
ここで用いられる結合定数は、例えば、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等により測定することができ、本発明の場合、以下のようにして測定したものを意味する。
【００２０】
本発明のレクチンと相互作用しないことがわかっている糖鎖（標準糖鎖）の溶出前端（Ｖ０）を基準として、検出対象の糖鎖の溶出前端（Ｖ）の遅れ（Ｖ−Ｖ０）を相互作用強度として測定する。ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０及び有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求める。
以下の基準式において、Ａは溶出に用いる物質、Ａ０は物質Ａの初濃度、Ｂは固定化リガンド、Ｖは溶出容量、Ｖ０は標準糖鎖の溶出前端容量、Ｂｔは有効リガンド量、Ｋｄは解離定数（結合定数の逆数）を意味する。本発明においては、物質Ａの初濃度は充分に小さいと考えられるため、下記の基準式（３）を採用する。
【００２１】
【数１】
0005282207.tif 000002
【００２２】
本発明のレクチンは、カヤタケ属担子菌から、公知の抽出方法、分離方法及び精製方法等を適宜組み合わせて行うことにより単離して製造することができる。
中でも、カヤタケ属担子菌から水系媒体抽出物を得ること（抽出工程）、前記水系媒体抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すること（精製工程）、を含むレクチンの製造方法により得られるレクチンであることが好ましい。
【００２３】
水系媒体としては、各種の緩衝液、水と混合しうる各種の有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。緩衝液又は有機溶媒と緩衝液の混合物を用いることが好ましい。
緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲に緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。
本発明に用いられる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも抽出効率の観点から、リン酸緩衝液等が好ましい。
緩衝液の塩濃度については、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜２０ｍＭであることがより好ましい。
また、緩衝液は各種の塩類を更に含むことができ、例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等を本発明における水系媒体として好ましく用いることができる。
【００２４】
また、有機溶媒としては水と混合しうる有機溶媒であれば特に制限なく用いることができるが、中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルを好ましく挙げることができる。有機溶媒と水又は緩衝液を混合する場合の有機溶媒の含有量としては１０質量％〜４０質量％であることが好ましい。
水系媒体とカヤタケ属担子菌とから、水系媒体抽出物を得る手法については、特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中でカヤタケ属担子菌を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また粉砕する方法としては、ミキサーやホモジナイザー等通常の粉砕方法を挙げることができる。
【００２５】
本発明における抽出工程は、水系媒体とカヤタケ属担子菌との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
従って、本発明における抽出工程は、得られるレクチンの純度の観点から、リン酸緩衝化生理食塩水中で、カヤタケ属担子菌を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。
【００２６】
抽出工程により得られた水系媒体抽出物は、次いで、精製工程において、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを用いて精製する。
イオン交換クロマトグラフィーでは、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂を使用すればよく、例えばイオン交換基としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、四級アンモニウム（ＱＡ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、スルホエチル（ＳＥ）、リン酸（Ｐ）等を使用することができ、樹脂としては、各種セルロース系、デキストラン系、アガロース系、シリカ系、合成樹脂などがあるが、精製効率と回収率の観点からジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）陰イオン交換樹脂が好ましい。
【００２７】
クロマトグラフィーに用いられる緩衝液としては、水系媒体として前述したリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を用いることができるが、緩衝液の塩濃度としては、精製効率の観点から５ｍＭ〜１０００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜２５０ｍＭであることが更に好ましい。またｐＨは精製効率の観点から、陰イオン交換樹脂を使用した場合は、ｐＨ６〜ｐＨ９に調整することが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ８．５であることがより好ましい。陽イオン交換樹脂を使用した場合はｐＨ３．５〜ｐＨ６．５に調整することが好ましく、ｐＨ４〜ｐＨ６であることがより好ましい。これらを勘案すれば、ジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）陰イオン交換クロマトグラフィー用の緩衝液としては、トリス緩衝液（塩濃度：５０ｍＭ，ｐＨ７．３）であることが好ましい。
【００２８】
溶離液としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）陰イオン交換クロマトグラフィー用の緩衝液としては、トリス緩衝液（塩濃度：５０ｍＭ，ｐＨ７．３）とし、塩濃度０ｍＭ〜１０００ｍＭで塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出または塩化ナトリウム濃度の段階的溶出のいずれかが挙げられる。
上記水系媒体抽出物を例えば陰イオン交換クロマトグラフィーに供した場合には、本発明のレクチンは、非吸着画分に含まれる。
【００２９】
本発明の製造方法では、イオン交換クロマトグラフィーに加えて、疎水性クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーの少なくとも一方を用いた精製を行ってもよい。
【００３０】
疎水性クロマトグラフィーに用いられる充填剤としては特に制限はなく、例えば疎水性基としては、エチル、ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、フェニル、ω−アミノエチル、ω−アミノブチル、ω−アミノヘキシル、ω−アミノオクチル、ω−アミノデシル等を使用することができ、樹脂としては、各種セルロース系、デキストラン系、アガロース系、シリカ系、合成樹脂などを挙げることができるが、精製効率の観点から、ブチル−トヨパール等が好ましい。
溶離液としては、タンパク質（レクチン）を分画することができれば特に制限はなく、硫酸アンモニウムや酢酸等を挙げることができる。溶出方法としては、例えば、硫酸アンモニウム１．５Ｍからの濃度勾配による溶出または段階的溶出のいずれかが挙げられる。
【００３１】
疎水性クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーの前後のいずれであってもよいが、精製工程の観点からイオン交換クロマトグラフィーの後に行うことが好ましい。
上記水系媒体抽出物を疎水性クロマトグラフィーに供した場合には、ＯＤ２８０の吸光度で特定される２つの独立したピークが認められ、本発明のレクチンは、硫酸アンモニウム濃度０．６Ｍ〜０．０５Ｍの濃度勾配による溶出される画分に含まれる。
【００３２】
本発明のレクチンは、ガラクトース非親和性であるので、ガラクトース結合性レクチンの排除を目的として、ガラクトース残基を含む担体を充填剤としたカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを用いることが好ましい。これにより、水系媒体抽出物中のレクチンは、このカラムへの非吸着画分として特定することができる。
【００３３】
本発明のレクチンは、ガラクトース非親和性であるので、ガラクトース残基を有するアフィニティークロマトグラフィーとしては、非吸着画分として特定することができ、溶出液としては、ガラクトース残基を有する糖類を含有さない溶液であれば、特に制限なく用いることができる。特に、カラムの平衡化に使用した緩衝液でそのまま溶出することが好ましく、操作の簡便性の観点からリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が特に好ましい。
【００３４】
また、本発明の製造方法では、各精製工程によって得られた溶出液を再度用いて、各種のクロマトグラフィーを繰り返し行ってもよく、更に他のクロマトグラフィーによる追加精製を行ってもよい。
このような他のクロマトグラフィーとしては、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００３５】
レクチンの製造方法は、各精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含むことができる。これにより、レクチンを高い純度で単離することができる。
透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。
【００３６】
本発明のレクチンは、従来公知のレクチンとは物理化学的性質、及び、糖鎖への結合特異性などの生化学的性質が異なる新規のレクチンである。特に各種のＮ型糖鎖を含む糖鎖を高い選択性で識別することができるので、これらの糖鎖を検出することを目的とした検査試薬、免疫調節剤、糖質の分離分析用特異的吸着剤等として用いることができる。
【００３７】
本発明の標識レクチンは、前記レクチンと標識化合物とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。標識化合物としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができる。
標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は常法によりレクチンと結合することができる。
【００３８】
本発明のレクチン固定化担体は、前記レクチンと支持担体とを少なくとも含む。支持担体を構成する材料としては、特に制限はなく、例えば、無機材料、有機材料、及びこれらの複合材料を挙げることができる。無機材料としては、金属、半導体、金属酸化物等の金属化合物、セラミックス、ガラス、シリカ等を挙げることができる。また、有機材料としては、ゴム、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン等のポリビニルポリマー類、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ゼラチン等のポリアミド類、セルロース、アガー、アガロース、デキストラン、スターチ等の多糖類等を挙げることができ、糖鎖の分別効率の観点から、アガロース等が好ましい。
また支持担体の構造としては、特に制限はなく、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造等を挙げることができる。
【００３９】
レクチンは前記支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。固定化するレクチンの量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせることができる。
活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。
【００４０】
糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ９．０であり、ＮａＣｌ含量が０Ｍ〜０．５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２含量が０ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０ｍＭ〜５ｍＭの緩衝液である。
アフィニティカラムの洗浄後、溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭ〜２００ｍＭ濃度である。
【００４１】
本発明の糖鎖検出方法は、前記レクチン、前記標識レクチン又は前記レクチン固定化担体を用いて、上述したような特定のＮ型糖鎖を含む糖鎖含有物を検出することを特徴とするものである。本発明のレクチンは特定のＮ型糖鎖を高い特異性で認識するため、上述したＮ型糖鎖を含有する糖鎖含有物を高い精度で検出することができる。ここで糖鎖含有物には、ペプチド鎖、多糖類、糖脂質、糖タンパク質、細胞、細胞断片等が含まれる。なお本発明の検出方法は、前記レクチン又は前記標識レクチンを用いて、対象とする特定のＮ型糖鎖含有物を検出すること（以下、「検出工程」という）を行うものであれば、レクチンを用いて糖鎖を検出する通常の検出方法に含まれる他の工程を含んでもよい。
【００４２】
レクチンが結合した糖鎖含有物の検出は、例えば、標識化合物によってレクチンを予め標識化することで容易に行うことができる。中でも、感度と検出の容易さから、標識化合物を予めレクチンに結合してレクチンを標識化しておき、標識化合物を検出することによって行うことが好ましい。
標識レクチンの検出手段は、用いられた標識化合物に応じて適宜選択される。例えば、吸光度測定、発光強度測定、蛍光強度測定、目視等により行うことができ、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）法等を好ましく用いることができる。
【００４３】
本発明の検出方法では、検出された糖鎖含有物を他の物質と分別すること（分別工程）を更に含んでもよい。このような分別方法は、前記レクチン又はレクチン固定化担体を用いて行うことが好ましい。前記レクチンは前記Ｎ型糖鎖に対して高い特異性で結合できることから、これらの糖鎖含有物を高い精度で他の物質から分別することができる。
【００４４】
レクチンが結合する糖鎖含有物の分別は、例えば、上述したようなレクチンを固定化した担体を用いることによって容易に行うことができる。糖鎖化合物の分別方法は、レクチンを固定化した担体に応じて適宜選択され、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂ／Ｆ分離（bound/free分離）等により行えばよい。
なお、分別工程は必ずしも検出工程と別個独立した工程でなくてもよく、検出することと分別することとが同時に行われても、連続して行われてもよい。
【００４５】
本発明の糖鎖検出方法では、糖鎖検出感度、糖鎖分別効率の観点から、本発明のレクチンとこのレクチンにより認識される糖鎖との相互作用強度が、他の糖鎖との相互作用強度の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましく、１０００倍以上であることが更に好ましい。レクチンと糖鎖との相互作用強度は、例えば、赤血球凝集反応阻害試験、溶出までの時間の比較、結合量（重さ）等、通常、この用途に用いられる比較可能な測定法であれば、特に制限されず用いることができる。
【００４６】
なお、本発明のレクチンの製造方法及び糖鎖検出方法における糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、表面プラズモン共鳴装置、電気泳動等も、周知の方法で使用することができる。
【００４７】
本発明の判定薬は、前記レクチンを含み、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを含む糖鎖含有物の有無を判定するものである。本発明のレクチンは、上述したように特定のＮ型糖鎖を高い精度で認識することができるので、本判定薬を用いることによって、この特定のＮ型糖鎖が試料中の微量であっても確実に判定することができる。
【００４８】
例えば、転移性ガンでは、６種類のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ：図１１参照）の作用によって構成される糖鎖の組み合わせにより転移の傾向が異なっていることから、転移性ガンに関連する試料であるか否かの判定に利用することができる。また、糖タンパク質糖鎖合成障害疾患に関連する試料であるか否かの判定に利用することができる。従って、本発明の判定薬を用いることによって、糖タンパク質糖鎖合成に障害がある又は転移性ガンの可能性がある試料を早期に特定することができる。
また、被検体の血液等、液体試料や、基板上にスポットされて固定化された乾燥試料に対して本発明のレクチンを接触させること及び、この接触により前記レクチンに結合し得る物質を検出すること含む検出方法も、本発明に含まれる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００５０】
［実施例１］
（１）レクチンＣＮＡ−IIIの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体粉末（日本きのこ研究所製）０．５ｍｇに、２０ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０  ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１  ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした
Ｃカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１０×１００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約２６ｍｌ）にて回収し、ラクトース非結合性レクチン画分を得た。吸着分は、その後、０．１Ｍのラクトース溶液を溶出液として用いて２５℃、０．５ｍｌ／分の条件下で溶出して回収した（ラクトース結合性レクチン画分）。ラクトース非結合性レクチン画分ついては、回収後、微量透析装置（ＴＯＭＹ社製  ＭＤ−００３−５０、分画分子量３５００）でイオン交換クロマトグラフィーの溶離液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３）に４℃３時間透析を行い、濃縮した。
レクチンを含有する各画分は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）及び後述する赤血球凝集活性を測定することによって同定した。
【００５１】
（２）イオン交換クロマトグラフィー
上記（１）で得られたラクトース非結合性レクチン画分を、陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；１７−０７０９−０１）を使用し、溶離液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．３）及び溶離液Ｂ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ／Ａ）、溶出０〜１４ｍｉｎ（Ｂ−ｃｏｎｃ，０−１００％）、１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、室温にてクロマトグラフィーを行い、分取した。レクチン含有画分の特定は、ＯＤ２８０ｎｍの吸光度及び後述する赤血球凝集活性を測定することによって同定した。
ラクトース非結合性レクチン画分は、陰イオン交換樹脂非吸着画分と吸着成分画分が含まれていることがわかった。
【００５２】
（３）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
９６ウェルタイタープレートの一レーンにＰＢＳを各２５μｌ入れ、ウェルに、レクチン溶液又は各クロマトグラフィーにおける回収画分を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。赤血球凝集活性は、凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とした。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
上記（２）で得られた陰イオン交換樹脂非吸着画分は赤血球凝集力価(力価)２５６を示し、陰イオン交換樹脂吸着画分は力価１６を示した。
【００５３】
（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
上記（２）により得られたレクチン含有画分を、電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液、分子量マーカーは共に１μｌ使用し、製品プロトコール及び常法に従って泳動を行い、相対移動度から分子量を推定したところ、陰イオン交換樹脂非吸着画分には、分子量１２，０００〜２８，０００に複数のバンドが確認された。
次いで、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５４】
（５）疎水性クロマトグラフィー
クロマトグラフィーの溶離液Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）とＤ：０Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）を調製した。また、カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製φ１６×２００ｍｍ）にＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴＯＳＯＨ社製）を１０ｍｌ充填した。
上記（２）で得られた陰イオン交換樹脂非吸着画分を含む７ｍｌの溶離液Ｃを、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ常温にてカラムに供し、通過液はフラクションコレクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；ＦＲＡＣ−１００）で試験管に５ｍｌずつ回収した。次いで、Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）を１００分流した後、Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）１００％からＤ：０Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）  濃度勾配（濃度  Ｃ：１００−０％，１０１−６００分）で流した。通過液はフラクションコレクターで試験管に５ｍｌずつ回収した。
クロマトグラフィー回収液のＯＤ２８０を上記と同様の条件で測定し、また、赤血球凝集活性の測定を上記と同様に行った。
同じく、上記と同様の方法で、クロマトグラフィー回収液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。上記赤血球凝集活性を示したレクチン含有画分では、分子量約１２，０００に単一のバンドを確認したため、これをＣＮＡ−IIIと決定した。
【００５５】
［実施例２］
（１）レクチンＣＮＡ−IIIの精製
ハイイロシメジ（Clitocybe nebularis）子実体（福島県で採取）４００ｇを凍結乾燥（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して、ハイイロシメジ子実体凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末２０ｇに、２００ｍｌの０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳを加えて、振とう機（ＣＳ−４５０  ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で７℃、２時間振とうした。次いで、遠心機（ＣＦ−５１  ＨＩＴＡＣＨＩ社製）で１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした
カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１６×２００ｍｍ）にラクトース−アガロース（Ｊ−オイルミルズ社製）を２５ｍｌ充填し、ＰＢＳで平衡化した後に、上記で得られた粗抽出液を供した。非吸着分をＰＢＳ（約１００ｍｌ）にて回収し、ラクトース非結合性レクチン画分を得た。
画分を回収した回収液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：６−８，０００（平面幅１４．６ｍｍ）に入れ、１００倍量の蒸留水による７℃での透析を３回行った。
次いで、実施例１と同様にして、レクチン含有画分を以下に記載のとおり更に精製した。
【００５６】
（２）イオン交換クロマトグラフィー
上記（１）で得られた非吸着画分を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）（溶離液Ａ）に溶解して試料とし、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）に供した。なお試料溶液Ｂは、０．５ＭのＮａＣｌ／Ａとして調製した。
カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ１６×２００ｍｍ）にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を５０ｍｌ充填した。ラクトース非結合性レクチン画分（溶離液Ａに溶解）５０ｍｌを、１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で４℃にてカラムに流した。通過液はフラクションコレクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；ＦＲＡＣ−１００）で試験管に１５ｍｌずつ回収し、２００ｍｌの溶離液Ａをカラムに供し、通過液をフラクションコレクターで試験管に１５ｍｌずつ回収し、非吸着画分としてを得た。
次いで、２００ｍｌの溶離液Ｂをカラムに供し、通過液はフラクションコレクターで試験管に１５ｍｌずつ回収した。レクチン含有画分は、回収液のＯＤ２８０での吸光度に基づいて特定した。得られた非吸着画分を回収し、回収液を透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：６−８，０００（平面幅１４．６ｍｍ）に入れ、１００倍量の蒸留水×３回、７℃で透析した。透析後、非吸着画分を回収し、凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して粉末を得た。
【００５７】
（３）疎水性クロマトグラフィー
クロマトグラフィーの溶離液Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）とＤ：０Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）を調製した。また、カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製φ１６×２００ｍｍ）にＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴＯＳＯＨ社製）を１０ｍｌ充填した。
上記（２）で得られた非吸着画分を含む７ｍｌの溶離液Ｃを、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ常温にてカラムに供し、通過液はフラクションコレクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；ＦＲＡＣ−１００）で試験管に５ｍｌずつ回収した。次いで、Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）を１００分流した後、Ｃ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）１００％からＤ：０Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．６）  濃度勾配（濃度  Ｃ：１００−０％，１０１−６００分）で流した。通過液はフラクションコレクターで試験管に５ｍｌずつ回収した。クロマトグラフィー回収液のＯＤ２８０を上記と同様の条件で測定し、また、赤血球凝集活性の測定を上記と同様に行った。赤血球凝集活性に基づき、硫酸アンモニウム濃度０．６Ｍ〜０．１Ｍでの回収液をレクチン含有画分と特定した。この画分を回収し、回収液を透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：６−８，０００（平面幅１４．６ｍｍ）に入れ、１００倍量の蒸留水×３回、７℃で透析した。透析後回収し、凍結乾燥機（ＦＤ−５Ｎ、ＥＹＥＬＡ社製）で凍結乾燥して精製量を測定した。精製できたＣＮＡ−ＩＩＩは１７．７ｍｇであった。更にウサギ赤血球凝集活性を測定したところ、力価５１２（１mg/ml)、および、最小凝集濃度０．６５（μｇ／ｍｌ）であった。
【００５８】
（４）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
上記（３）で得られたでレクチンＣＮＡ−IIIに対して、煮沸処理を行ったもの（試料Ａ）で、前述したものと同様にしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。結果を図１に示す。なお図１においてレーン１は試料Ａ、Ｍはマーカーを示す。
その結果、試料Ａの場合には１２，０００にバンドを確認することができた（図１参照）。
（５）ゲルろ過による分子量測定
上記のようにして得られたレクチンＣＮＡ−IIIについて、標準用試料Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量：80,000）、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（分子量：67,000）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量：47,000）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ  （分子量：29,000）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｂ（分子量：13,700）を用いて、常法に従って分子量を推定したところ、約１３，０００であった。
【００５９】
［実施例３］
実施例２で得られたレクチンＣＮＡ−IIIについて、以下のような評価を行った。
（１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
レクチンＣＮＡ−III  １０μｇを、ＴＡ（０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとＣＮＡ−IIIのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてＡｕｔｏｆｌｅｘ（ブルカーダルトニクス社製）を用い、ＬＰモードでＣＮＡ−IIIの分子量を測定した。その結果、ＣＮＡ−IIIの分子量は１１，４３４であった。
【００６０】
（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列
ＣＮＡ−IIIのＮ−末端領域のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーとしてＰＰＳＱ−２１（島津製作所社製）を用いて解析したところ、下記アミノ酸配列（配列番号１）であることが分かった。
【００６１】
（３）温度安定性
５００μｇのＣＮＡ−IIIを生理食塩水１ｍｌに溶解し、各試験温度で３０分間インキュベートした。直ちに氷冷し１０分後に上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図２に示した。
図２から、本発明のレクチンは４℃〜５０℃まで比較的安定であり、６０℃以上の温度では活性がさがることが分かった。
【００６２】
（４）ｐＨ安定性
５０μｇのＣＮＡ−IIIを生理食塩水１ｍｌに溶解し、これを試験管に分取した。等量の下記の各ｐＨ緩衝液をそれぞれ加え、４℃にて２４時間インキュベートした後、上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図３に示した。図３から、本発明のレクチンＣＮＡ−IIIはｐＨ２からｐＨ１１の間で安定であった。
−ｐＨ緩衝液−
ｐＨ２．０  ：  ２０ｍＭ  塩化カリウム塩酸緩衝液
ｐＨ３．０  ：  ２０ｍＭ  塩化カリウム−塩酸緩衝液
ｐＨ４．０  ：  ２０ｍＭ  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０  ：  ２０ｍＭ  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０  ：  ２０ｍＭ  リン酸緩衝液
ｐＨ７．０  ：  ２０ｍＭ  リン酸緩衝液
ｐＨ８．０  ：  ２０ｍＭ  トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)緩衝液
ｐＨ９．０  ：  ２０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１０．０  ：  ２０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
ｐＨ１１．０  ：  ２０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
なお、各緩衝液は０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含む。
【００６３】
（５）ウサギ赤血球凝集活性試験
ウサギ保存血液（日本バイオテスト社製）を遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、血漿及び白血球および不純物を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、２％ウサギ赤血球液とした。
【００６４】
ａ）赤血球凝集活性の測定
９６ウェルタイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに、レクチン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られた２％ウサギ赤血球液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性として表１に示した。また、赤血球が凝集するレクチンの最大希釈倍率を求め、最小凝集濃度を算出した。
【００６５】
ｂ）ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験
ウサギ赤血球凝集活性試験において、ウサギ保存血液の代わりにヒツジ保存血液（日本バイオテスト社製）、ブタ保存血液（日本バイオテスト社製）、ヒト保存血液（Biotest社製）を用いた以外は同様にして、ヒツジ、ブタ、ヒト赤血球凝集活性試験を行った。結果を表１に示した。
【００６６】
【表１】
0005282207.tif 000003
【００６７】
（６）ウサギ赤血球凝集阻害試験
表２及び表３の３２種の糖タンパク質および糖を適量秤量し、ＰＢＳを添加し、表２及び表３記載の濃度に調製した。上記（実施例２）で得られたＣＮＡ−IIIのウサギ赤血球凝集活性を測定し、赤血球が凝集する最低希釈倍率が２〜４倍になるようこれらをＰＢＳで希釈した。次いで９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルにＰＢＳを２５μｌずつ入れ、これにレクチン溶液を５０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。このウェルにそれぞれ、上記で希釈した試料を２５μｌずつ添加し、室温で６０分間放置後、４％ウサギ赤血球液を２５μｌずつ添加し、室温で１時間放置後、凝集阻害の有無を確認した。結果を下記表２及び表３に示した。
【００６８】
【表２】
0005282207.tif 000004
【００６９】
【表３】
0005282207.tif 000005
【００７０】
上記表２および３の結果から、ＣＮＡ−IIIはフェツイン、アシアロフェツイン、チログロブリンで阻害が強くみられたが、他の糖タンパクや糖による阻害はみられなかった。
【００７１】
［実施例４］
（７）特異性試験（糖鎖の検出）
（ａ）オリゴ糖の準備
実施例に使用したピリジルアミノ化（ＰＡ−）オリゴ糖を、図４及び図５に示す。
ＰＡ糖鎖は、タカラバイオ社、生化学バイオビジネス社ならびに増田化学工業社などから購入した。もしくは、未標識の糖鎖や糖鎖を酵素消化して得た糖鎖等をＧｌｙｃｏＴＡＧ（登録商標、タカラバイオ社製）でピリジルアミノ化した。
その他の標識化糖鎖は、図６に示す。パラニトロフェニル（ｐＮＰ−）糖鎖およびフルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ−）糖鎖は生化学バイオビジネス社、東京化成社、シグマ社、トロント・リサーチ・ケミカル社、カルビオケム社、大塚化学工業社から購入したものを使用した。
【００７２】
（ｂ）レクチンカラムの調製
０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）中にレクチンを溶解し、ＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）へその製造者マニュアルに従って結合させた。０．８％ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、ＴＢＳ緩衝液）中にレクチン−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ×１０ｍｍ，３１．４μｌ）に充填した。
【００７３】
（ｃ）フロンタルアフィニティクロマトグラフィー
ＦＡＣ自動分析装置（FAC-1、（株）島津製作所製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ−１装置に接続した。流速およびカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎおよび２５℃に保った。前記ＴＢＳ緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ〜４ｍｌ）のＰＡ−糖鎖（３．７５ｎＭ又は７．５ｎＭ）およびｐＮＰ−糖鎖およびＦｍｏｃ−糖鎖（１μＭ）を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。
【００７４】
ＰＡ糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
４９種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、図７に示すとおり、ＣＮＡ−IIIは、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖のみ、結合である溶出の遅れが確認できた。
【００７５】
さらに、糖鎖群を増やし、ＰＡ糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−Ｍ３、番号００３）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定する同様の実験をおこなった。
また、ｐＮＰ-糖鎖糖鎖はＵＶ吸収強度（検出波長 ２８０ｎｍ）、および、Ｆｍｏｃ−糖鎖はＵＶ吸収強度（検出波長 ２７４ｎｍ）でモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−αＧａｌＮＡｃ、番号１００９）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
【００７６】
ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ−Ｖ０および有効リガンド量（Ｂｔ）から糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求めた。
【００７７】
【数２】
0005282207.tif 000006
【００７８】
フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ−）標識１ＧＮ２ＧＮ−７ＮＣ（アシアロアガラクトＮ型二本鎖糖鎖：ＮＧＡ２）（番号３００１)を０μＭ〜１μＭになるようＴＢＳ緩衝液で作製した。上記同様分析を行い、各濃度における相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−αＧａｌＮＡｃ、番号１００９）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定し、結合定数（Ｋａ）および有効リガンド量（Ｂｔ）を求めた。その結果、結合定数（Ｋａ）＝１．８２×１０６Ｍ−１および有効リガンド量（Ｂｔ）＝０．０１９ｎｍｏｌであった。結合した糖鎖の相互作用強度および結合定数を算出した。結果を表４及び表５と図８に示す。
【００７９】
１５２種類で構成された糖鎖群で特異性を評価した結果、表４及び表５と図８に示すとおり、ＣＮＡ−IIIは、Ｎ型糖鎖であって、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖（番号１０１、１０３、１０５、１０７、２０１、２０２、３０６、３１２、４０４、３００１）に結合性を示した。Ｏ型糖鎖（番号１１０３、１１０４、１１０５）やキトオリゴ糖（番号９０６、９０７、１２０７）には結合せず、またＮ−アセチルグルコサミン（番号１００９、１０１０）のみでも結合しないことがわかった。
【００８０】
以上の内容を図９下段に示した分岐鎖マップを用いて更に説明する。
図９は糖鎖を結合定数の大きい順に配列している。このマップは、各Ｎ型糖鎖が有するＮ−アセチルグルコサミン分岐鎖をヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（GnT-I〜VI）に適用される命名法に基づいて類別したものである。例えば、ある糖鎖のＶのマス目がストライプのボックスで埋まっていれば、その糖鎖はGnT-V酵素により合成されるGlcNAcを有することを意味している。
図９の分岐鎖マップを見ると、ＣＮＡ−IIIは、分岐II、すなわち、GnT-IIにより転移されたＮ−アセチルグルコサミンを有するＮ型糖鎖１０１、１０３、１０５、１０７、２０１、２０２、３０６、３１２、４０４を認識する。しかし、分岐III、すなわち、GnT-IIIにより転移されたＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を有すると結合できない。また、GnT-IIにより転移されたＮ−アセチルグルコサミンのみを有するＮ型糖鎖には結合できるが、GnT-Iにより転移されたＮ−アセチルグルコサミンのみでは結合できないことがわかった。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
［比較例］
バンデリアマメレクチン-II（ＧＳＬ−II）もＣＮＡ−IIIと同様に特異性を解析した。
ＰＡ糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍおよび蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ−ラクトース）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。１００種類以上で構成された糖鎖群で特異性を評価し、相互作用強度を算出した。ｐＮＰ-糖鎖はＵＶ吸収強度（検出波長２８０ｎｍ）でモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ｐＮＰ−Ｆｕｃ、番号１０１１）に対する前端溶出液の差：Ｖ−Ｖ０〕を測定した。
結果を図１０に示す。また図１０において上段はＣＮＡ−IIIの特異性を示し、下段はＧＳＬ−IIの特異性を示す。
図１０に示されるように、ＧＳＬ−IIは、番号１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、９０６、９０７に結合した。
また、ＧｌｃＮＡｃαおよびβ（番号１００９、１０１０）とＯ型糖鎖（番号１００４や１００５、１００６）、キトオリゴ糖（番号１２０７）にも結合することがわかった。
【００８４】
このように本発明のレクチンは、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンが露出した糖鎖に高い親和性を有し、他のＮ−アセチルグルコサミン含有糖鎖には特異性を示さないことは明らかである。従って、本発明の新規レクチンは、このような特定のＮ型糖鎖を精度高く検出することに利用可能である。また、現在市販されているＮ−アセチルグルコサミン特異的レクチンよりも結合が非常に強いことが特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIの温度安定性を示す図である。
【図３】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ＰＡ−）を示す図である。
【図５】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ｐＮＰ−あるいはＦｍｏｃ−）を示す他の図である。
【図６】本発明の糖鎖特異的結合性の測定の用いられたオリゴ糖（ｐＮＰ−あるいはＦｍｏｃ−）を示す他の図である。
【図７】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【図８】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す概念図である。
【図９】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIの糖鎖特異的結合性の測定結果を示す分岐鎖マップ。
【図１０】本発明の実施例にかかるレクチンＣＮＡ−IIIの糖鎖特異的結合性（上段）とバンデリアマメレクチン-II（ＧＳＬ−II）の糖鎖特異的結合性（下段）の測定結果比較を示す概念図である
【図１１】Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の作用を説明する図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図７】
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【図１１】
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【配列表】
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