(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植患者から採血された血液中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度およびその経日的変化を調べることにより、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性を予見するためのデータ、あるいは発症のリスクを推定するためのデータを提供する、ＧＶＨＤ発症可能性に関する検査方法。
【請求項２】
前記データは、血液中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度の測定値を類別処理されたものであり、その類別基準が、健常者のコントロール値から算出したMean＋2SD以内を正常範囲とし、この範囲を超える場合を異常高値とする基準であることを特徴とする、請求項1に記載の検査方法。
【請求項３】
前記データは、血液中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルで表示されることを特徴とする、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記の時系列プロファイルが区分表示されており、その区分内の時点の中には可溶性ＤＮＡＭ-１濃度に関して、直前の時点より高い値を示す時点が少なくとも２つあり、かつ、減少する変化を示す時点がない範囲として区分表示されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記移植患者が骨髄または末梢の造血幹細胞移植を受けた患者である、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
前記データは、主に同種造血幹細胞移植後の患者を対象とし、予後管理の一助として収集されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
急性移植片対宿主病を発症した患者について、ＧＶＨＤ治療の予後管理のため、またはＧＶＨＤ治療の効果を判断するための血中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルを提供することを特徴とする検査方法。
【請求項８】
少なくとも血液中の可溶性ＤＮＡＭ-１に対する抗ＤＮＡＭ-１単クローン抗体、ヒトＤＮＡＭ-1/Ｆｃキメラタンパク質およびＥＬＩＳＡ法用の器材を含み、血液中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度を測定するために前記抗ＤＮＡＭ-１単クローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を実施して、請求項３または７に記載の時系列プロファイルを作製するためのＧＶＨＤ発症可能性に関する検査用キット。
【請求項９】
ＤＮＡＭ-1の中和抗体として、抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを含むことを特徴とする、ＧＶＨＤの治療・予防用製剤。
【請求項１０】
前記抗ＤＮＡＭ-1抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の治療・予防用製剤。
【請求項１１】
前記抗ＤＮＡＭ-1抗体が、ＤＮＡＭ-1ノックアウトマウスに導入したヒトＤＮＡＭ-1遺伝子により発現されたヒト化ＤＮＡＭ-1抗体である、請求項９または１０に記載の治療・予防用製剤。
【請求項１２】
さらに少なくとも、製剤学的に許容される賦型剤、担体または安定化剤を含み、ＧＶＨＤ治療のための有効成分として他の薬効物質もまた含有してもよい、請求項９〜１１のいずれかに記載の治療・予防用製剤。
【請求項１３】
ＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者の血中ＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することによりＧＶＨＤを治療または予防するための製剤の製造において、抗ＤＮＡＭ-1抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性移植片対宿主病発症に関係するＤＮＡＭ−1レベルを移植片対宿主病予知マーカーとして検査する方法、キット、その分子標的療法に関し、詳しくは、血液検体中のＤＮＡＭ−１レベルを調べることにより、急性移植片対宿主病を発症する可能性を予見するため、またはそのリスクを評価するためのデータを提供する、移植片対宿主病予知マーカーの検査方法、キット、抗ＤＮＡＭ−1抗体を用いる分子標的療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の生体内で血液は全身に酸素を運搬したり、体内に侵入した非自己に対して攻撃して防御したりして生命維持の上で極めて重要な役割を果たしている。血液中には、赤血球、白血球および血小板という３つの血球成分が存在する。このうち白血球は主に、外部から侵入してきた非自己から生体を守るという重要な機能を持った血球であり、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球に分類される。従って白血球が減少すれば、外界から病原菌が侵入してきた場合に、これを攻撃・排除することができなくなり、易感染性を来たす。【０００３】
白血球が腫瘍化し、主に骨髄で増殖する疾患が白血病である。白血病は治療を加えない場合の経過の長さによって、慢性白血病と急性白血病とに、さらに慢性、急性ともに骨髄性とリンパ性とに分けられる。白血病が進行すれば、正常造血機能が破綻を来たすために、正常白血球の減少、貧血、血小板の減少などの異常が出現する。これに伴い、易感染性、出血傾向などの症状が顕在化する。これらの造血障害が増悪すると、生命維持そのものが困難になることにより、白血病は放置すれば致命的な疾患である。一方、腫瘍化したリンパ球がリンパ節を中心として増殖する疾患が悪性リンパ腫である。このリンパ腫はさらにＨｏｄｇｋｉｎ病と非Ｈｏｄｇｋｉｎ病とに大別され、病型によりその予後は様々であるが、致死的な経過をとるものも少なくはない。【０００４】
白血病や悪性リンパ腫などの造血器腫瘍に対して、腫瘍細胞の根絶または骨髄機能の正常化を目的として行われている治療に、造血幹細胞移植がある。造血幹細胞とは、１個の細胞から赤血球や白血球などの成熟血液細胞を作り出す能力、すなわち多分化能を有するとともに、自己複製能を持ち、すべての造血細胞の母細胞である。白血病やリンパ腫などの腫瘍細胞を根絶するために、大量の化学療法、放射線治療を行った後に、造血幹細胞を移植することにより正常造血機能を回復させることが可能である。【０００５】
輸血もしくは幹細胞移植後に発症する移植片対宿主病(graft-versus-host disease)は、重篤な副作用として問題視されている。造血幹細胞移植の中でも、特に同種造血幹細胞移植では、早期合併症として急性移植片対宿主病（以下、「ＧＶＨＤ」と略す）が起こることがある。急性ＧＶＨＤは、移植細胞中に存在するドナー（移植提供者）活性化Ｔ細胞が、レシピエント（患者）の白血球表面に発現する、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：human leukocyte antigen）を認識し、それを非自己とみなすことによって細胞傷害作用を持つドナーＴ細胞がレシピエント細胞を傷害することにより生じる（非特許文献１）。急性ＧＶＨＤを発症したとされる患者では、発熱、四肢・顔面・体幹の皮疹（skin rash）、ビリルビンの上昇を伴う肝臓障害、腹痛、下痢などの消化器症状が認められる。ＧＶＨＤの診断は、通常、皮膚、肝臓、大腸の生検材料の病理的検索によってなされるが、往々にして病理所見が典型的でないこともある。また病理材料の入手が困難なこともしばしばあり、実際には臨床症状によって診断するケースも少なからず経験する（非特許文献２）。【０００６】
急性ＧＶＨＤに対する初期治療として一般的にステロイド剤投与が選択される。ステロイド剤投与は、急性ＧＶＨＤには有効な治療法であるが、ステロイド投与により細菌、ウイルス感染などの重篤な副作用を合併する可能性もあり、治療開始は慎重に判断されなければならない。一方で、急性ＧＶＨＤの治療開始が遅れると致死的になるというジレンマがあり、臨床現場では急性ＧＶＨＤを如何にして診断するかということは、移植の成否に関わる重要な問題となっている。現在に至るまでに骨髄移植後の移植片対宿主病の発症を事前に予知診断する方法はない。【０００７】
急性ＧＶＨＤを診断する上で直接の判断根拠となる有用なデータの提供が要望される。対象とする同定された急性ＧＶＨＤ病態と免疫反応に関係する生理的・生化学的変化とを統計的な裏づけのもとに、一義的に結び付け得る指標の提示が臨床現場サイドからは期待される。さらに、発症可能性の予見、発症に至るリスクの推定に資することができるデータも望まれる。しかしながらそうしたデータを提供する検査方法も未だ本疾患については見当たらず、そのための検査方法の開発が待たれている。【０００８】
上記検査方法とともに、ＧＶＨＤを有効に予防、治療する方法の確立、そのために使用される医薬製剤の開発の重要性は言うまでもない。
【非特許文献１】Ferranra JL, Redddy P.,  Pathophysiology of graft-versus-host disease. Seminar in Hematology, 43: 3-10, 2006
【非特許文献２】加藤淳「造血幹細胞移植の合併症と治療 １．Graft-versus-host disease（ＧＶＨＤ）」日本内科学会雑誌, 94:67-1343, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のごとく、急性ＧＶＨＤの診断基準は、発熱や皮疹などの患者の表面的な所見に依存していることが多いことから客観性に欠けており、かつ現在の診断方法では他の疾患と峻別する鑑別が難しく、急性ＧＶＨＤに対する特異性がないのが実状である。上記状況に鑑み、本発明者は、これまでに発見したＤＮＡＭ-１と急性ＧＶＨＤとの関係について臨床検体を用いてさらに研究を進めた結果、ＤＮＡＭ-１が急性ＧＶＨＤの発症機序に関与していることを見出した。この知見に基づいて急性ＧＶＨＤに特異的な予知マーカーとしての血中ＤＮＡＭ-１の意義を確立し、その発症の予測に利用できるデータを提供する、急性ＧＶＨＤに特異的な検査方法およびキットに関する本発明、さらにはＧＶＨＤ分子標的療法、治療予防用医薬製剤に関する本発明を完成した。【００１０】
本発明は、急性ＧＶＨＤが発症する可能性を予見するためのデータまたは発症リスクを評価するためのデータを提供する、急性ＧＶＨＤ発症予測に選択的に用いられる検査方法およびキットを提供することを目的とする。【００１１】
さらに本発明はＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者のＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体を投与することによりＧＶＨＤを治療するか、予防することを特徴とする分子標的療法およびそのために使用される医薬組成物（製剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明であるＧＶＨＤ発症可能性に関する検査方法は、
移植患者から採血された血液中のＤＮＡＭ-１濃度およびその経日的変化を調べることにより、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性を予見するためのデータ、あるいは発症のリスクを推定するためのデータを提供する検査方法である。【００１３】
前記データは、血液中のＤＮＡＭ-１濃度の測定値を類別処理されたものであり、その類別基準が、健常者のコントロール値から算出したMean＋2SD以内を正常範囲とし、この範囲を超える場合を異常高値とする基準であることを特徴としている。【００１４】
また前記データは、血液中のＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルで表示されることが望ましい。【００１５】
前記の時系列プロフィルは、区分表示されており、その区分内の時点の中にはＤＮＡＭ-１濃度に関して、直前の時点より高い値を示す時点が少なくとも２つあり、かつ、減少する変化を示す時点がない範囲として区分表示されていることを特徴としている。【００１６】
前記移植患者が骨髄または末梢の造血幹細胞移植を受けた患者である。【００１７】
前記データは、主に同種造血幹細胞移植後の患者を対象とし、予後管理の一助として収集されることが望ましい。【００１８】
さらに本発明の検査方法には、急性移植片対宿主病を発症した患者について、ＧＶＨＤ治療の予後管理のため、またはＧＶＨＤ治療の効果を判断するための血中ＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルを提供することを特徴とする方法も含まれる。【００１９】
血液中のＤＮＡＭ-１濃度が、Ｔｘ25単クローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により測定されてもよい。【００２０】
本発明のキットは、少なくともＴｘ25単クローン抗体、ヒトＤＮＡＭ-1/Ｆｃキメラタンパク質およびＥＬＩＳＡ法用の器材を含み、血液中のＤＮＡＭ-１濃度を測定するためにＴｘ25単クローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を実施して、上記の時系列プロファイルを作製するためのキットである。【００２１】
本発明のＧＶＨＤの治療・予防用製剤は、ＤＮＡＭ-1の中和抗体として、抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを含むことを特徴とする。その抗ＤＮＡＭ-1抗体がモノクローナル抗体であることが望ましい。【００２２】
好ましくは、前記抗ＤＮＡＭ-1抗体が、ＤＮＡＭ-1ノックアウトマウスに導入したヒトＤＮＡＭ-1遺伝子により発現されたヒト化ＤＮＡＭ-1抗体である。【００２３】
さらに本発明のＧＶＨＤの治療・予防用製剤は、少なくとも、製薬学的に許容される賦型剤、担体または安定化剤を含み、ＧＶＨＤ治療のための有効成分として他の薬効物質もまた含有してもよい。【００２４】
ＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者の血中ＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することによりＧＶＨＤを治療または予防するための製剤の製造において、抗ＤＮＡＭ-1抗体の使用も、また本発明に含まれる。【００２５】
本発明の分子標的療法は、ＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者の血中ＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することによりＧＶＨＤを治療するか、予防することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の検査方法は、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性を予見するためのデータ、あるいは発症のリスクを推定するための最も有力なデータを提供する。【００２７】
本発明の検査方法により提供されるデータは、発症可能性を判断する免疫病理学的知見に立脚しており、適切かつ便利なデータの提示態様となっている。【００２８】
本発明の検査方法により提示されるデータによりＧＶＨＤ発症可能性が事前に予知でき、ＧＶＨＤの早期治療が可能となる。急性ＧＶＨＤによる死亡率の低下、および骨髄移植成績の向上が期待できる。【００２９】
したがって本発明の検査方法は、ＧＶＨＤ発症の事前のリスク評価および早期診断、骨髄などからの造血幹細胞移植の予後管理などに使用されるデータを提供する検査方法として極めて有用である。【００３０】
本発明のＧＶＨＤの治療・予防用製剤は、ＧＶＨＤの病態に関係するＤＮＡＭ-1に特異的な中和抗体を含むため、造血幹細胞移植患者に投与することにより合併症であるＧＶＨＤを有効に予防または治療することができる。
[発明の具体的な説明]
本明細書においてＧＶＨＤとは、組織適合性抗原の異なる宿主(Host)に移入された移植片(Graft)中のリンパ球などが宿主内に生着して、宿主の組織を非自己と認識し、その組織を攻撃する病態と定義される。この場合「宿主」とは、輸血または移植を受けたレシピエント（移植患者）である。本発明は、いずれも主にヒトを対象とすることを意図し、患者がヒトである場合に好適に適用することができる。しかしながら、少なくとも免疫反応による抗体の生成が認められる非ヒト動物に対しても適用することができる。「急性」とは「慢性」に対して使用される。【００３１】
以下、本発明を検査方法、その方法を実施するためのキット、ＧＶＨＤに対するＤＮＡＭ-1分子標的療法の順で説明する。
検査方法
本発明は、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）発症可能性に関する検査方法であり、
血液中のＤＮＡＭ-１濃度およびその経日的変化を調べることにより、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性を予知するためのデータ、あるいは発症のリスクを推定するためのデータを提供することを特徴としている。【００３２】
本検査方法は、検体についての血中ＤＮＡＭ-１濃度の測定ならびに得られたデータの統計解析処理から構成される。本方法は、検体として血液から調製された血清を使用する。その血液は、急性ＧＶＨＤを発症することが懸念される輸血、幹細胞移植を受けた移植患者から採血された血液検体である。特に、骨髄または末梢の造血幹細胞移植を受けた白血病患者から採取される。移植後に急性ＧＶＨＤの発症の可能性があり、そうしたリスクを事前に予知するためである。採取部位は特に限定されない。必要な血液量は後記のＥＬＩＳＡ法を実施するのに必要な血清量を確保するだけで充分であるが、通常、１〜２mlが望ましい。採血時期および回数は医師の判断に委ねられるが、本検査の目的から複数の日時の時点で採取されることが望ましい。
・ＤＮＡＭ-１分子と急性ＧＶＨＤとの相関性
ＤＮＡＭ-1は、本発明者の一人、渋谷により発見された膜タンパク質であり（Shibuya Aら、Immunity, 1996）、ＤＮＡＭ-１（ＣＤ２２６）は、細胞傷害作用を有する活性化Ｔ細胞やＮＫ細胞などに強く発現しており、ヒト腫瘍細胞などに発現しているリガンドを認識して接着し、標的の腫瘍細胞の細胞傷害誘導に重要な役割を担うことが示唆されている（非特許文献２）。活性化Ｔ細胞においてその発現が増強されたＤＮＡＭ-1分子の一部は、細胞膜から切り離されて、血流中に可溶性ＤＮＡＭ-1として放出される。したがってレシピエントの血中に増大する可溶性ＤＮＡＭ-1分子は、ドナーの白血球細胞に由来するものである。【００３３】
急性ＧＶＨＤは、Ｔ細胞が非自己の細胞や腫瘍細胞などを攻撃する際に、その標的細胞に接着し活性化されることが転機となって発症し、このときに不可欠なシグナル伝達分子として細胞接着分子が存在する。接着分子には、同じ細胞同士を結合するカドヘリンファミリー、主に白血球に発現し細胞と細胞もしくは細胞外基質との接着に関与するインテグリンファミリー、細胞間の接着を担う免疫グロブリンファミリー、細胞の移動に関与するセレクチンファミリーやシアロムチンファミリー、細胞外基質との接着を担うリンクファミリーなどが知られている。ＤＮＡＭ-1は、免疫グロブリンファミリーに属する接着分子であるが、活性化Ｔ細胞に強く発現するこの接着分子が、急性ＧＶＨＤの発症機序に何らかの形で関与していると本発明者は提唱している。つまり、移植細胞中のドナーＴ細胞がレシピエントの白血球を非自己と見なし、両者が接着することとなるが、この接着にＤＮＡＭ-1が関与しており、標的細胞に発現しているリガンドを認識して接着する。その際、活性化シグナルを伝達して細胞傷害作用をＴ細胞に誘導する。【００３４】
実際、それを支持する研究成果が蓄積されつつある。その一つとして、後述の同種移植と自家移植との比較結果が挙げられる。これに関連して、1991年、Blazarらが、接着分子であるlymphocyte function-associated antigen 1（ＬＦＡ-1）の急性ＧＶＨＤへの関与を報告していることは興味深い。本発明者らは、ＮＫ細胞では構成的に、Ｔ細胞ではＴ細胞が抗原を認識して活性化するとＤＮＡＭ-1がＬＦＡ-１接着分子と会合すること、さらにＬＦＡ-１からのシグナルがＤＮＡＭ-1のチロシンリン酸化を引き起こし、結果的に細胞傷害活性が誘導されること、ＤＮＡＭ-1とＬＦＡ-１とが機能的にも物理的にも密接に関与していることなどを見出している（Shibuya Aら, Immunity, 1999）。
・血中の可溶性ＤＮＡＭ-1レベルおよびその経日的変化
上記のように、急性ＧＶＨＤに関与するとされるＤＮＡＭ-1分子の発現、動態を追求することは、急性ＧＶＨＤの診断にも有用であるが、そうしたＴ細胞を測定の対象として、ＤＮＡＭ-1分子の発現を調べることは容易ではない。ところがＤＮＡＭ-1分子は、健常者においても可溶性ＤＮＡＭ-1として血液中に存在しており、これを疾病マーカーとして検出の対象とすることは好都合であり、そうした検査方法の実用化の可能性は高い。【００３５】
本発明者の研究により、血中の可溶性ＤＮＡＭ-1が急性ＧＶＨＤの客観的かつ特異的な診断に資することができることが本発明者の研究により明らかとなった。具体的には、下記実施例に示す研究により、血中の可溶性ＤＮＡＭ-１レベルの上昇は、急性ＧＶＨＤの発症と繋がりが深いことが示されたのである。急性ＧＶＨＤ患者の血中ＤＮＡＭ-1濃度は、発症以前よりも上昇している。さらに急性ＧＶＨＤを除く、他の血液疾患などではそうした血中ＤＮＡＭ-1の増大が起こらないことも確認された。これは、血中の可溶性ＤＮＡＭ-1レベルが急性ＧＶＨＤ発症とともに特異的に変化するが、他の血液疾患においてはそのレベルは正常範囲内にあり、動かないことを示している。【００３６】
これらのことから血中のＤＮＡＭ-1分子は、急性ＧＶＨＤ発症の特異的な予知マーカーとなり得て、そのレベルの上昇傾向またはその兆しをキャッチすることができれば、発症の予知が可能となる。そのため、血中の可溶性ＤＮＡＭ-1レベルの経日的な変化を求めることは、骨髄などからの造血幹細胞移植後の予後管理として有益である。よって本発明の検査方法により提供されるデータは、主に同種造血幹細胞移植後の患者を対象とし、予後管理の一助として収集されることが望ましい。後記の実施例1で示すように、自家造血幹細胞移植よりも、幹細胞が血縁者（親または兄弟）から提供される同種造血幹細胞移植の方が、急性ＧＶＨＤを発症する可能性が極めて高いためである。このことはＨＬＡの型から自己と非自己とを厳密に識別する免疫システム本来の特性に基づく。【００３７】
本発明の検査方法において、血液中のＤＮＡＭ-１濃度を測定する方法は特に限定されない。微量の検体であっても高精度に測定できる測定方法が望まれる。一般には、ＤＮＡＭ-１分子に特異的な抗体、好ましくは単クローン抗体を使用する分析方法が高感度な手法であるために望ましく、この目的のためにはすでに確立されて各種アナライトの定量に頻用されているＥＬＩＳＡ法が好適である。従って血液中のＤＮＡＭ-１濃度が、特異性が高いＴｘ25単クローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により測定されることが好ましい。さらにＥＬＩＳＡ法を使用して迅速に測定でき、検査結果が容易に得られる方式にしたキットを使用することが望ましい。【００３８】
本発明の検査方法は、血中ＤＮＡＭ-１濃度の単なる測定検査の方法ではなく、ＧＶＨＤ発症可能性の診断に資する検査方法である。被験者からの血液検体についてＤＮＡＭ-１濃度を測定した結果、正常範囲を超える高い値が得られた場合、そのデータは当該被験者がＧＶＨＤを発症しているか、発症が疑われることを示す一傍証になり得る。しかしながら、本発明の方法はそれだけにとどまらず、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性を特異的に予見するためのデータ、あるいは発症のリスクを推定するためのデータを提供できる点に特徴があり、医師に最終的に提示される検査データの態様は、発症予知を実施するための好適な形態としている。
・検査のデータの形態
検査結果の表示方式には種々の形態があり得るが、本発明の検査方法により最終的に提示されるデータは、統計解析処理に基づき、血液中のＤＮＡＭ-１濃度の測定値を類別処理されたものであり、その類別基準が、健常者コントロール値から算出したMean＋2SD以内を正常範囲とし、この範囲を超える場合を異常高値とする基準である。“Mean＋2SD”とは、平均値＋２×標準偏差を意味し、この範囲を超える正常値は、2.5％未満の確率でしかない。血液中のＤＮＡＭ-１濃度の測定値がこの範囲内にあれば、一応、正常範囲内にあると考えられる。後述するように可溶性ＤＮＡＭ-１の正常値は、0.098 nM以下と設定している。上記正常範囲からはずれる値であれば、その逸脱程度を考慮し、急性ＧＶＨＤを発症する確率が高くなっているとして警戒すべき段階にあるか、発症を疑うことが望ましいかもしれない。【００３９】
血液中のＤＮＡＭ-１濃度の異常高値についても、それが高い値ほど、つまり正常範囲から逸脱している程度が大きいほど、一般的には将来、急性ＧＶＨＤを発症するリスクが高い傾向にあるようであるが、それだけで一義的に断定することは危険である。個人差、生理条件などに基づく変動を考慮すれば、さらに血中ＤＮＡＭ-１濃度が経時的に推移するパターンを得ることの必要性も生じる。【００４０】
従って前記データは、より客観的な判断が行えるように血液中のＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルで表示されることが望ましい。このため、骨髄などからの造血幹細胞移植を受けた患者の血中ＤＮＡＭ-１濃度が、移植後に経日的に、すなわち複数の時点で測定されることとなる。このようなプロファイルに示された血液中のＤＮＡＭ-１濃度の経日的変化から、急性ＧＶＨＤが発症する可能性について予見することができる。すなわち、血中ＤＮＡＭ-１レベルの変化のパターンから、発症に至る兆候を予知することができる。例えば、血液中のＤＮＡＭ-１が明らかに上昇する傾向が認められれば、発症リスクが高まっていると判断するのが通例である。このような判断、推定を支援するために前記の時系列プロフィルのさらに好ましい態様として、区分表示されており、その区分内の時点の中にはＤＮＡＭ-１濃度に関して、直前の時点より高い値を示す時点が少なくとも２つあり、かつ、減少する変化を示す時点がない範囲として区分表示されていることが例示される。医師が本発明の方法により提示されたデータを用いてＧＶＨＤ発症可能性を検討する際に、注目すべき個所を明示する態様とするためである。【００４１】
さらに前記の時系列プロファイルにおいて、統計解析は、当業界で利用されている各種の統計手法、検定法の中から適する方法を選択しておこなうことができる。離散的なデータの経日的変化を解析するための好適な統計解析手法を用いて、統計処理された結果の有意性の有無およびその危険率水準が示されていることが望ましい。
さらにデータの提示方法として、急性ＧＶＨＤの発症と血中ＤＮＡＭ-１濃度とを統計的な裏づけのもとに結び付ける指標を提示する方式であってもよい。一例として、血中正常値を超えると見なせる基準血中濃度として、0.098ｎMが示され、これは異常値の領域への移行可能性を示すパラメーターとして扱われる。上記のようにカットオフレベルを高くすることにより、正常段階、潜在的に発症する可能性が存在し、あるいは発症に至る過渡的段階、発症段階におけるそれぞれの判別精度が高くなる。【００４２】
なお発症可能性の予知、すなわち発症する可能性に関わるリスクの推定に用いられるデータは、上記の血中ＤＮＡＭ-１濃度の経日的変化が有力な手がかりを与えるために好適であるが、予知もしくは推定の確度を上げるため必要であれば他の病態指標の変化もまた併用されてもよい。例えば移植後に頻発する様々なウイルス、細菌、真菌などの感染によって急性ＧＶＨＤに典型的な諸症状が同様に生起することもある。こうしたケースと峻別するためには上記の併用が必要とされるであろう。また検査結果の表示方式は、必ずしも上掲のものだけに限定されることはなく、表示の形式も含めて本発明の目的に合致する限り、種々の修飾、変更が可能である。
発症の予見可能性と発症リスク推定
急性ＧＶＨＤを発症する可能性を予知する、あるいは発症のリスクを推定するとは、ＧＶＨＤに発症しておらず、明確な自覚症状として表れていないか、それに近い状態であっても、それに至る免疫的、代謝的、生理的な諸変化が潜在的に生じているか、それが進行しており、いずれ発症に至る可能性を、好ましくは確率的に見積もることである。このような発症可能性の予見、リスク評価は予防医学上極めて意義がある。すなわち予後の予測と経過観察からは特に意義がある。そうした行為は、診断の一側面を構成する。「診断」とは、医師の行なう医療行為のうち、患者の症状、各種の検査結果に基づいて、疾患に罹患しているか、さらに治療のために患者の病態、病型、病期を決定することである。そうした診断行為に含まれる、発症する可能性を予知するか、あるいは発症のリスクを推定するために最も有用なデータを、本発明の検査方法は提供することができる。上記の態様および表示を有するデータは、モニタリング・マーカーとしての血中ＤＮＡＭ-１が、特異的に急性ＧＶＨＤ発症に関わることを示す免疫系の病理知見に立脚しており、かつ統計的裏づけを有するために急性ＧＶＨＤの発症予知に一義的に用い得るデータである。【００４３】
発症リスクの推定は、実際には医師により本発明の検査方法により提供されたデータに加えて、他の臨床データ、被験者個々の事情（年齢、性別、既往歴、生活習慣など）を総合的に勘案してなされるであろう。そうした判断に基づく予測は、一層信頼度を増すこととなる。【００４４】
急性ＧＶＨＤを発症する可能性が高いと判定された患者は、発症時に適切な治療を直ちに受けられるように予後観察下におかれる。これにより発症に至った場合にもＧＶＨＤの早期治療が可能となる。
本発明の検査方法により提供されるデータは、急性ＧＶＨＤの特異的疾患予知マーカーとして有用性があることにとどまらず、急性ＧＶＨＤを発症し、適切な治療がなされた後の寛解に至るまでの予後管理においても意義がある。これは急性ＧＶＨＤの発症を予知し、さらには予防する立場からすれば、ある意味でレトロスペクティブとなる。上記のように血液中のＤＮＡＭ-１濃度が、急性ＧＶＨＤの特異的な疾患予知マーカーとして見なせるほどに特徴的に変化することを考えれば、血中ＤＮＡＭ-１濃度およびその変動に関するデータは、治療後の推移を示すモニタリング・マーカーとして、あるいは治療効果を判断するための臨床データといった利用態様もあってもよい。したがって本発明の検査方法には、急性移植片対宿主病を発症した患者について、治療の予後管理のため、または治療の効果を判断するための血中ＤＮＡＭ-１濃度の時系列プロファイルを提供することを特徴とする検査方法も含まれる。
キット
本発明のキットは、
少なくともＴｘ25単クローン抗体、ヒトＤＮＡＭ-1/Ｆｃキメラタンパク質およびＥＬＩＳＡ法用の器材を含み、血液中のＤＮＡＭ-１濃度を測定するためにＴｘ25単クローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を実施して、上記の時系列プロファイルを作製するためのキットである。【００４５】
本発明に係るキットは、上記検査方法を実施するために必要とされる各種器材または資材、試薬を含み、具体的には、ＥＬＩＳＡ法を実施するための上記抗体類、ＥＬＩＳＡ用試薬、および血清中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度を定量するための試薬類を含むものである。これらの試薬の中には、各種酵素類、検量線作成用の標準物質、緩衝液、洗浄液なども含まれる。キット要素として、さらに多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。本キットを用いて測定する対象の検体は、血清であることが好ましい。
本発明による検査方法のハイスループットな態様として、上記キットの中に、マイクロリアクタ形態のもの、具体的にはチップ形状の器材を含んでもよい。このような構成では、検体の分析を（半）自動的に行うチップから送られる信号についての数値化されたものを取り込み、ファイルを作成し、コンピュータ上の所定のディレクトリに保存する形態を採用するシステムが好ましい。これにより数値データを統計的に処理して、発症可能性を推定することができるデータを提供される。そのためのデータ処理は、必要な補正、正規化を経て、統計的解析を可能とする好適なソフトウェアを使用して行われる。このようなデータ処理のためのシステム構築は、当業者であれば既存の技術、方式、手順を利用して行なうことができる。
ＤＮＡＭ-1中和抗体およびそのＧＶＨＤ治療への利用
さらに本発明は、ＤＮＡＭ-1の中和抗体として、抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを含むことを特徴とするＧＶＨＤの治療・予防用製剤（または医薬組成物）ならびにＧＶＨＤの分子標的療法を提供する。好ましくは、その有効成分である抗ＤＮＡＭ-1抗体がモノクローナル抗体である、治療・予防用製剤である。
・ＤＮＡＭ−１に対する分子標的療法
急性ＧＶＨＤの発症時に可溶性ＤＮＡＭ−１が高値をとることから、可溶性または膜型のＤＮＡＭ−１が急性ＧＶＨＤの病態に何らかの関与をしていると言っても差し支えなく、ＤＮＡＭ−１が急性ＧＶＨＤの予防ならびに治療の分子標的となりうる可能性が考えられた。本発明者はＧＶＨＤの治療・予防の方法および治療・予防用医薬組成物を開発するために、マウスＧＶＨＤモデルを作製して、ＤＮＡＭ−１に対する分子標的療法の研究を進めた。具体的にはＤＮＡＭ−１のマウス相同遺伝子を世界に先駆けてクローニングし（Tahara-Hanaoka, et al, Biochem Biophys Res Commun, 2005）、ノックアウトマウスを樹立するとともに、マウスＤＮＡＭ−１に対する中和抗体を作製した（Tahara-Hanaoka, et al, Blood, 2006）。【００４６】
上記マウスＤＮＡＭ−１に対する中和抗体を用いる研究を行なった結果、下記実施例４に記載されるように、急性ＧＶＨＤではアロ抗原特異的免疫応答やこれに伴う炎症反応に関与する免疫細胞が活性化し、可溶性ＤＮＡＭ−１が分泌されていること、可溶性または膜型のＤＮＡＭ−１が急性ＧＶＨＤの病態に何らかの関与をしている可能性が強く示唆され、同時に、急性ＧＶＨＤが抗ＤＮＡＭ−１抗体の投与によって予防、治療できることが示された。【００４７】
本発明者が抗ＤＮＡＭ−１モノクローナル抗体を２０クローン以上作製した中で、中和抗体はTX４２の１クローンのみであった。このことに示されるように、急性ＧＶＨＤにおいて、ＤＮＡＭ−１に対する中和抗体の作製は容易ではない。さらに特筆すべきこととしてTX４２抗体は、生体内でＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害活性）によるＤＮＡＭ−１発現細胞を減少させないで、抗ＤＮＡＭ−１の機能のみを消失させる抗体である。多くの抗体はＡＤＣＣを誘導し、その分子を発現する細胞自体を減少させ、免疫能の低下などの副作用を起こしやすい。この点からも本発明の予防・治療方法のための抗ＤＮＡＭ−１抗体として、TX４２抗体のような上記特性を有する中和抗体は優れている。【００４８】
このことに基づき、本発明の別の態様として、ＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者の血中ＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することによりＧＶＨＤを治療するか、予防することを特徴とする分子標的療法が提案される。ここで、「中和抗体」とは、標的分子であるＤＮＡＭ-1に特異的に結合するとともに、さらに生体内でＤＮＡＭ-1の生物学的活性（とりわけＧＶＨＤの発症または病態に関係する生理作用）を抑制もしくは喪失させ得る活性を有する抗体分子を言う。おそらくＤＮＡＭ-1が過剰に存在する状況で、該中和抗体は移植細胞中のドナーＴ細胞とレシピエントの白血球との接着に関与するＤＮＡＭ-1に特異的に結合してその作用を妨げる結果、細胞傷害作用をＴ細胞に誘導されることが阻止されるのであろう。上記検査の結果に基づいて血中ＤＮＡＭ-1が上昇する段階に、抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することにより、ＧＶＨＤの発症を未然に阻止したり、早期治療も可能となる。
・ＧＶＨＤの治療・予防用製剤
本発明のＧＶＨＤの治療・予防用製剤（または医薬組成物）は、ＤＮＡＭ-1の中和抗体として、抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを含むことを特徴とする。抗ＤＮＡＭ-1抗体は、公知技術を利用することにより種々のタイプのものを作製できる。本発明製剤をヒトに適用する場合には以下の態様が好ましい。すなわち前記抗ＤＮＡＭ-1抗体が、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスとして、ＤＮＡＭ-1ノックアウトマウスに導入したヒトＤＮＡＭ-1遺伝子により発現されたヒト化ＤＮＡＭ-1抗体である。あるいはマウス、ウサギ、ニワトリといった異種動物とのキメラタイプの抗体であってもよい。免疫反応性である抗体は、上記のＤＮＡＭ-1と特異的に免疫反応するものが好ましく、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれでもよい。特に抗原特異性、抗原親和性、中和活性および交叉反応性などの性質上、モノクローナル抗体であることが望ましい。患者に投与した抗体が異種タンパク質として認識され、それに対する免疫応答を生じさせてしまう副作用を回避するために、抗体のヒト化技術、ヒト型抗体、モノクローナル抗体の作製技術などを用いるが、確立され公知となった技術を利用してもよい。例えばＴｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３），８０, ７３０８−７３１２; Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（１９８３），４（３）, ７２−７９に記載されるような技術を用いて、キメラ抗体、ヒト化モノクローナル抗体を作製することも可能である。また、抗体の作製は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）などの既存抗体生産系を利用してもよい。【００４９】
作製された上記の抗体は、中和抗体としての能力を有する限りにおいて適切な修飾、改変（断片化、ポリペプチドなどとの複合化、アミノ酸残基の修飾など）を必要に応じて施すことができる。分子の安定化、活性の増強、血中半減期の調整などを目的として得られたこれらの変形体を抗体のアナログとする。なお、これらの抗体は、上記検査方法に使用される抗体としても使用可能である。
さらに本発明の治療・予防用製剤は少なくとも、製剤学的に許容される賦型剤、担体または安定化剤を含み、ＧＶＨＤ治療のための有効成分として他の薬効物質を含有してもよい。他の薬効物質として、これまでのＧＶＨＤ治療法において使用されてきた医薬物質、例えばステロイド類、免疫抑制剤などが挙げられる。あるいは、ＤＮＡＭ-1遺伝子の過剰な発現を抑制することができる物質でもよい。製薬学的に許容される添加物質として、製剤業界で従来使用されてきた各種物質の他に、さらにマクロファージ活性化因子などのエフェクター、抗ＤＮＡＭ-1抗体の安定化もしくはターゲティング性を向上させる物質、抗体の血中半減期を改善する物質であってもよい。医薬上寛容される担体および賦形剤は当業者に公知であり、例えば、塩、糖およびその他の浸透圧調節剤、緩衝剤、酸、塩基およびその他のpH調節剤、粘度改良剤、着色剤などを含んでもよい。【００５０】
抗体医薬である上記製剤の剤型は限定されず、例えば凍結乾燥剤、粉末製剤、ｐＨを調整された緩衝液による溶液製剤、注射用マイクロカプセル剤などとして提供される。例えば注射剤としての製剤には必要とされる、または望ましい賦形剤および／または添加剤と一緒に、注射可能または注入可能な懸濁液または分散液を調製するために、生体適合性の、または生理学的に許容される液体担体（好ましくは水性のキャリヤー）に添加することができる。これらの付加的な添加成分は、当業界慣行の製薬技術に基づいて添加される。例えば生理食塩水あるいは市販注射用蒸留水といった、製薬学的に許容され得る非毒性担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
本発明の別の態様としてＧＶＨＤを発症している患者または発症する可能性のある移植患者の血中ＤＮＡＭ-1を標的分子として、その中和抗体である抗ＤＮＡＭ-1抗体もしくはそのアナログを投与することによりＧＶＨＤを治療または予防するための製剤の製造において、抗ＤＮＡＭ-1抗体を使用する方法が含まれる。
・用法
本発明の医薬製剤は、ＧＶＨＤの治療または予防いずれの場合にも注射剤または点滴注入剤として、具体的には血管内投与、静脈内投与により患者に投与される。その至適投与量と濃度、投与経路、時期、処方に関しては、上記ＧＶＨＤ治療・予防法に関連して通例、症状、患者側の条件などを勘案して医師により個々に設定される。投与量は、患者の諸条件、投与目的（治療のためであるか、予防目的のためであるかによる）または該医薬製剤に含有される活性成分（前記抗体、薬効物質など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μg〜1000mg、好ましくは10μg〜500mgの範囲で投与することができる。注射剤の場合、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ELISA法によるＤＮＡＭ-１濃度測定用の検量線を示す。検量線（Ａ）は、ＤＮＡＭ-１濃度、0.015625 nmolから2 nmolまでの測定値により、また検量線（Ｂ）は、0.015625 nmolから0.5 nmolまでの測定値に基づいて作成した。縦軸は可溶性（soluble）ＤＮＡＭ-１濃度を、横軸はOD405nm値を示す。
【図２】図２は、様々な血液疾患の初発時の血中可溶性ＤＮＡＭ-１濃度を示す。図中の血液疾患は、本文に記載されたものである。“Control”は、標準であり、その範囲を正常範囲(normal range)として表している。
【図３】図３は、同種移植（allogeneic transplantation）と自家移植（autologous transplantation）における血中可溶性ＤＮＡＭ-１濃度を示す。
【００５２】
ピーク値を比較し、●プロットは、臨床診断により急性ＧＶＨＤとされた検体を示し、■プロットは、臨床診断により急性ＧＶＨＤの疑いありとされた検体を示す。
【図４】図４は、急性ＧＶＨＤ発症の有無と、可溶性ＤＮＡＭ-１濃度との関係を示す。同種移植のうち、急性ＧＶＨＤを発症した例と発症しなかった症例における可溶性ＤＮＡＭ-１濃度のピーク値を比較した。上側の点線は、0.0983であり、下側の点線は−0.0375である。
【図５】図５は、血中ＤＮＡＭ-１濃度の経日的な変化におけるパターンの異なる例を、３名の被験者の測定結果から示す。マイナスの値は、ＥＬＩＳＡ法におけるデータ処理（ブランクを差し引く）から発生する。
【図６−１】図６−１は、非血縁者から提供された同種骨髄造血幹細胞の移植患者で、急性ＧＶＨＤを発症した患者、２名（ＹＵ、ＮＫ）の治療後における血中ＤＮＡＭ-１濃度の変化を示す。図中、“PSL”および“ mPSL”はメチルプレドニゾロン、“Alp”は血清中アルカリホスファターゼ、“Pulse”はパルス療法、“MMF”はミコフェノール酸モフェチルである。マイナスの値は、ＥＬＩＳＡ法において、ブランクを差し引くデータ処理から発生する。
【図６−２】図６−２は、非血縁者から提供された同種造血幹細胞移植患者（ＹＭ）について、急性ＧＶＨＤ発症前、発症、治療後の各フェーズにおける血中ＤＮＡＭ-１濃度の変化を示す。図中の表示、記号などは図６−１と同様である。
【図７】図７は、ＧＶＨＤ誘導モデルにおけるＤＮＡＭ-1の関与を実験的に示すグラフである。1.0 Gyの放射線を照射されたC57BL6マウスにBALB/C（野生型またはＫＯ型）からの骨髄が移植された。“ＫＯ”はノックアウトを意味する。
【図８】図８は、ＧＶＨＤ誘導モデルにおける抗ＤＮＡＭ-1抗体の効果を示すグラフである。予め亜致死量（0.4 Gy）の放射線を照射したBALB/CとC57BL/6とのF1マウスに、BALB/Cマウスの脾臓細胞を移植することにより誘導した急性ＧＶＨＤのマウスモデルにおいて、あらかじめ抗ＤＮＡＭ−１抗体中和（TX４２）を投与したレシピエントマウスに対して移植が行なわれた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
[実施例]
以下の実施例中で用いる使用材料の入手源、試薬類の濃度、使用量、処理時間、処理温度などの数値的条件、処理方法などは、この発明の範囲内の好適例にすぎない。したがってこれらの実施例は、本発明を限定する意味で解されるべきではない。
【実施例１】
【００５４】
血液疾患と可溶性ＤＮＡＭ-1の相関性
ＤＮＡＭ-１が急性ＧＶＨＤの発症に関与しているか、さらに様々な血液疾患の初発時にＤＮＡＭ-１が上昇しているかを血中の可溶性ＤＮＡＭ-１レベルを測定することにより調べた。血清中の可溶性ＤＮＡＭ-１の濃度を測定するためにはＥＬＩＳＡ法を用いた。
・対象および検体
総数３９名（ＧＶＨＤを発症した移植患者18名および発症しなかった移植患者21名）から測定のための臨床検体を採取した。内訳は、2001年11月以降に筑波大学附属病院で造血幹細胞移植を受けた患者血清を、患者の同意を得て−70℃にて保存したものを今回の研究対象とした。移植ドナーの血清を健常コントロールとして使用した。
・試薬および抗体
Ｔｘ25ハイブリドーマは、本発明者の一人が開発した細胞系である（非特許文献ＸＸを参照）。Ｔｘ25ハイブリドーマを、ＢＡＬＢ/ｃＡ-ｎｕ、雌性マウス（6週齢）の腹腔内に接種し、腹水を採取した後に、Amersham Bioscience社(ウプサラ、スウェーデン)から購入したMAbTrapキットを用いて、Ｔｘ25単クローン抗体を精製した。【００５５】
組換えヒトＤＮＡＭ-1/Ｆｃキメラタンパク質およびビオチン化抗ヒトＤＮＡＭ-1多クローン抗体を、R&D System社(ミネアポリス、MN)から、またExtrAvidinペルオキシダーゼ（マウスExtrAvidinペルオキシダーゼ染色キットを含む）およびFast o-phenylenediamine dihydrochloride(OPD)タブレットをSIGMA-ALDRICH社(セントルイス、MO)から購入した。【００５６】
緩衝液として、PBSは、1000 ml 中にNaCl 8000mg、 KCl 200mg、 NaHPO4 1150mg、 KH2PO4 200mgのものを、T-PBSはPBS 1000mlに Tween 20(R) 500μg  添加したものを使用した。
・ＥＬＩＳＡ法
ELISA用96穴（12行×8列）平底マイクロプレート（DYNEX TECHNOLOGIES社、  Chanitilly, VA）に、PBSで8μg/mlに希釈したＴｘ25抗体を、100μl/ウェル加えて、4℃にて、一晩、コーティングした後、PBSで5分間×3回洗浄し、1％BSA/PBSにて1時間、室温にてブロッキングを行った。その後、PBSで3分間×2回洗浄し、１列目には0.05％Tween20添加PBS（T-PBS）で2nmから8段階希釈系列を作ったヒトＤＮＡＭ-1/Ｆｃキメラタンパク質をスタンダードとして100μl/ウェル加え、2列目以降には患者血清を100μl/ウェル加えて4時間室温で静置した。その後、T-PBSで10分間×3回洗浄し、T-PBSで0.6μg/mlに希釈したビオチン化抗ヒトＤＮＡＭ-１抗体を100μl/ウェル加えて1時間、室温に静置した。その後、T-PBSで10分間×3回洗浄し、T-PBSで250倍に希釈したExtrAvidinペルオキシダーゼを100μl/ウェル加えて30分間、室温で静置し、次いでT-PBSで10分間×3回洗浄した。その後、発色剤としてOPDを用いて、ペルオキシダーゼの酵素活性をOD405nmにて測定した。【００５７】
上記8段階希釈系列を作ったＤＮＡＭ-１のうち、実際の患者血清中の可溶性濃度を反映すると考えられた0.0156nmから0.5nmまでの測定値より検量線を作成し（図１）、これを用いて血清中の可溶性ＤＮＡＭ-１の濃度を決定した。
・種々の血液疾患についての結果
健常者コントロールの測定値から、“mean+2SD”（平均値＋２×標準偏差）を算出し、これを“正常範囲（normal range）”として、これを超える場合に「異常高値」とした。従って、可溶性ＤＮＡＭ-１の正常値は、0.098 nM以下である。【００５８】
図２に示すように、キャッスル病（Castleman’s disease）においては、1検体のみが正常範囲を大きく逸脱したが、ＡＬＬ（acute lymphocytic leukemia; 急性リンパ性白血病）、ＡＭＬ（acute myelogenous leukemia; 急性骨髄性白血病）、ＮＨＬ（non-Hodgkin lymphoma; 非ホジキンリンパ腫；“diffuse large B”  ；“follicular”  ；“mantle cell” ）、ＨＤ（hodgkin disease; ホジキン病）、ＭＭ（multiple myeloma; 多発性骨髄腫）、ＩＴＰ（immune thrombocytopenic purpura; 特発性血小板減少性紫斑病）においては、いずれの患者からの血清中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度は、すべて正常範囲内に分布していた。
・急性ＧＶＨＤについての結果
移植後に急性ＧＶＨＤが発症する可能性がある同種移植（allogeneic transplantation）の後と、自家移植（autologous transplantation）の後の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度を測定した。自家移植では、患者自身の骨髄または末梢造血幹細胞を凍結保存しておいて、それを移植に用いるために、急性ＧＶＨＤが起こらないと想定される。【００５９】
その結果、図３に示されるように、自家移植後の血清では90％が正常範囲内にあるのに対して、同種移植後の血清では45.7％が正常範囲よりも高濃度であった。【００６０】
以上の結果から、多くの血液疾患初発時においては、血中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度は上昇しておらず、これに対して急性ＧＶＨＤにおいて血中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度が特異的に上昇することが示された。レシピエント細胞をドナーＴ細胞が傷害する際に、何らかの形でＤＮＡＭ-１の関与が想定される。同種移植後に可溶性ＤＮＡＭ-１が高値を示した症例のうち、85.7%で急性ＧＶＨＤを発症していた。【００６１】
そこで同種移植において、急性ＧＶＨＤを発症した検体と発症しなかった検体とを比較すると、図４に示すように血中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度に関して、急性ＧＶＨＤを発症しなかった検体では、80％が正常範囲内にあるのに対して、発症した検体では、58.1％が正常範囲よりも高濃度であった。
このことから、血中の可溶性ＤＮＡＭ-１濃度が正常範囲より高い値を示す場合には、急性ＧＶＨＤを発症しているか、発症に近いか、それに至る可能性があるとして差し支えないことがわかった。
【実施例２】
【００６２】
データ表示例
血中ＤＮＡＭ-１濃度の経日的な変化におけるパターンの異なる例を、３名の患者の測定結果から図５に示す。患者ＹＴおよびＴＯのグラフでは、ＤＮＡＭ-１濃度に関して、直前の時点より高い値を示す時点が少なくとも２つあり、かつ、減少する変化を示す時点がない範囲として区分表示がなされている。ＫＭのパターンでは、そうした区分表示ができない。
【実施例３】
【００６３】
急性ＧＶＨＤ発症患者の治療後における血中ＤＮＡＭ-１濃度の変化
急性ＧＶＨＤを発症した造血幹細胞移植患者において、治療を開始した後の血中ＤＮＡＭ-１濃度の経日的な変化も調べた。すなわち急性ＧＶＨＤの発症を診断し、治療を開始した日を“Ｄａｙ０”として、その後の血中ＤＮＡＭ-１濃度を追跡した。血中ＤＮＡＭ-１濃度は、実施例１のＥＬＩＳＡ法により測定した。２名の急性ＧＶＨＤ発症患者について、追跡期間における血中ＤＮＡＭ-１濃度の経日的な変化を図６−１に示す。また図６−２では、造血幹細胞移植後において血中ＤＮＡＭ-１濃度の変化から急性ＧＶＨＤ発症可能性についての明確な予知に至らず、その後発症し治療した移植患者ケースを示す。いずれの図にも症状知見を併せて表示している。これらの図に表された結果から、治療開始後の血中ＤＮＡＭ-１濃度およびその後の寛解までの推移は、治療後の推移を示すモニタリング・マーカーとして、あるいは治療効果を判断するための臨床データとなり得ることが示された。【００６４】
血中ＤＮＡＭ-１濃度の類別、ＤＮＡＭ-１濃度の経日変化データの統計解析に基づくＤＮＡＭ-１指標を用いて、急性ＧＶＨＤの発症に至るわずかな兆候を捉えることを可能とした本発明は、患者に対し個別に適切な治療・投薬計画を立てる上で極めて有用な技術である。
【実施例４】
【００６５】
マウスＧＶＨＤモデルにおけるＤＮＡＭ−１に対する分子標的療法
ＤＮＡＭ−１のマウス相同遺伝子をクローニングして（Tahara-Hanaokaら, Biochem Biophys Res Commun, 2005）、ノックアウトマウスを樹立するとともに（未発表）、マウスＤＮＡＭ−１に対する中和抗体を作製した（Tahara-Hanaokaら, Blood, 2006）。【００６６】
この抗体の中和活性を実証するために、まずBALB/Cマウスをドナーとし、C57BL/6マウス（1.0 Gy量の放射線を照射されている）をレシピエントとした同種骨髄移植で急性ＧＶＨＤモデルを作製した。このマウスＧＶＨＤモデルにおいて、ＤＮＡＭ−１ノックアウトマウス（BALB/Cバックグラウンド）の骨髄細胞を移植細胞として用いると、その移植を受けたC57BL/6マウスにおいては急性ＧＶＨＤの発症が著明に抑制された（図７）。【００６７】
次に、亜致死量（0.4Gy）の放射線を照射したBALB/CとC57BL/6とのF1マウスに、BALB/Cマウスの脾臓細胞を移植し誘導した急性ＧＶＨＤのマウスモデルにおいて、あらかじめ抗ＤＮＡＭ−１抗体中和（TX４２）を投与したレシピエントマウスに対して移植すると、急性ＧＶＨＤの発症が著明に抑制された（図８）。【００６８】
これらの結果より、急性ＧＶＨＤではアロ抗原特異的免疫応答やこれに伴う炎症反応に関与する免疫細胞が活性化し、可溶性ＤＮＡＭ−１が分泌されていること、可溶性あるいは膜型のＤＮＡＭ−１が急性ＧＶＨＤの病態に何らかの関与をしている可能性が強く示唆された。同時に、急性ＧＶＨＤが抗ＤＮＡＭ−１抗体（TX４２）の投与によって予防、治療できることが可能であることも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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