(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、
前記動物核内受容体が、ＲＸＲα核内受容体と二量体を形成する、ＲＸＲαヘテロ二量体型核内受容体であり、
前記動物核内受容体遺伝子として、ＲＸＲα核内受容体遺伝子およびＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を発現可能に含み、
前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列を含む形質転換酵母。
【請求項２】
前記ＲＮＡ不安定化配列が、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列である請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
前記ＲＸＲα核内受容体が、Ｃ末端のＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させたＲＸＲα核内受容体である請求項１または２に記載の形質転換酵母。
【請求項４】
さらに、ターミネーター配列を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子である請求項１から４のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトＳＲＣ１遺伝子である請求項５記載の形質転換酵母。
【請求項７】
前記動物核内受容体遺伝子および前記ＲＮＡ不安定化配列を常染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、
前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、
前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含む請求項１から６のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項９】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１から８のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される請求項１から９のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、請求項１から１０のいずれか一項に記載の形質転換酵母を使用することを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する請求項１１記載の分析方法。
【請求項１３】
前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、０を超え６０重量％以下の範囲である請求項１２記載の分析方法。
【請求項１４】
前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母である請求項１１から１３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１５】
前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である請求項１１から１４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１６】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）請求項１から１０のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える分析キット。
【請求項１７】
前記培地が、グルコースおよびガラクトースを含む培地である請求項１６記載の分析キット。
【請求項１８】
動物核内受容体遺伝子を含むベクターであって、
前記動物核内受容体遺伝子として、ＲＸＲα核内受容体遺伝子およびＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列を含むベクター。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ不安定化配列が、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列である請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
前記ＲＸＲα核内受容体が、Ｃ末端のＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させたＲＸＲα核内受容体である請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
さらに、ターミネーター配列を含む請求項１８から２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２２】
レポーター遺伝子を含むベクター、動物転写共役遺伝子を含むベクターおよび請求項１８から２１のいずれか一項に記載のベクターを含有するベクターセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換酵母、それを用いた分析方法および分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の化学物質の分析において、従来は機器分析が主流であったが、生物的な影響をも評価できる分析手法として核内受容体遺伝子を宿主細胞に組み込み、その発現の程度で化学物質の分析を行う手法が開発されている。宿主細胞としては、ヒト等の動物細胞および酵母が使用されている。動物細胞を用いた分析方法としては、例えば、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）遺伝子をヒト由来細胞株に組み込み、テストステロン（Ｔ）等を分析する方法がある（非特許文献１）。一方、雌化現象等で注目された環境ホルモン（内分泌撹乱物質）のエストロゲン様活性の分析方法として、ブルーギル由来のエストロゲン受容体遺伝子（特許文献１）、オオマキトカゲ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献２）、ワニ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献３）、ファットヘッドミノー由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献４）等の各種野生動物のエストロゲン受容体遺伝子を酵母に組み込み、その発現を測定するという手法が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。この他、ヒト由来エストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いてアルキルフェノール化合物のエストロゲン様活性を測定する手法が開発されている（非特許文献２）。また、例えば、ダイオキシン等のアリールハイドロカーボン類を測定するために、モルモット由来のアリールハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いた手法が開発されている（特許文献５）。これらの酵母を用いた手法では、各種核内受容体遺伝子が発現し、測定対象となるリガンド（化学物質等）が前記核内受容体に結合して複合体を形成し、この複合体がレポーター遺伝子を発現させる。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用されており、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することで、遺伝子の発現を測定している。酵母を用いた分析は、動物細胞を用いた分析方法に比べて、短時間分析が可能であり、操作の簡便性および低コスト等の利点を有する。
【０００３】
一方、ヒト核内受容体は、二量体形成後、核内受容体応答配列に結合して、標的遺伝子の転写調節を行う。ヒト核内受容体には、同じ核内受容体と二量体を形成するホモ二量体型核内受容体と、異なる核内受容体と二量体を形成するヘテロ二量体型核内受容体がある。ホモ二量体型核内受容体には、ステロイドホルモン核内受容体等の数種類があるが、ヒト核内受容体の多くは、レチノイン酸受容体α（ＲＸＲα受容体）とヘテロ二量体を形成するＲＸＲαヘテロ二量体型核内受容体である。ホモ二量体型核内受容体については、前述のレポーター遺伝子導入酵母を用いたリガンド分析手法が開発されている（特許文献６）。しかし、ヘテロ二量体型核内受容体については、形質転換酵母における分析方法が開発されていない。また、ＲＸＲαヘテロ二量体型核内受容体については、酵母ツーハイブリッド法によるリガンド分析方法が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、酵母ツーハイブリッド法は、リガンド非依存的な転写活性が生じるため、分析精度が低いという問題がある。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１９７８９０号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６０２７３号公報
【特許文献４】特開２００１−３５２９９２号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０７７号公報
【特許文献６】特開２００７−２９５８０６号公報
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２００６年、Ｖｏｌ．２２０、ｐ．９０−１０３
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７年、Ｖｏｌ．２７２、Ｎｏ．６、ｐ．３２８０−３２８８
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００３年、  Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．１、ｐ．３７−４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、ＲＸＲαヘテロ二量体型動物核内受容体リガンドを高感度で分析可能な形質転換酵母、それを用いたＲＸＲαヘテロ二量体型動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、
前記動物核内受容体が、ＲＸＲα核内受容体と二量体を形成する、ＲＸＲαヘテロ二量体型核内受容体であり、
前記動物核内受容体遺伝子として、ＲＸＲα核内受容体遺伝子およびＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を発現可能に含み、
前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列を含む。
【０００７】
本発明の分析方法は、検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、本発明の形質転換酵母を使用することを特徴とする。
【０００８】
本発明の分析キットは、検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）本発明の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える。
【０００９】
本発明のベクターは、動物核内受容体遺伝子を含むベクターであって、
前記動物核内受容体遺伝子として、ＲＸＲα核内受容体遺伝子およびＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列を含む。
【００１０】
本発明のベクターセットは、レポーター遺伝子を含むベクター、動物転写共役遺伝子を含むベクターおよび本発明のベクターを含有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者等は、形質転換酵母を用いたＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体リガンドの分析方法の感度向上を目的として、一連の研究を行った。その過程で、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体の発現量に着目し、その発現量を必要最小限に留めるという着想を得た。すなわち、形質転換酵母で発現させたＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体は、リガンド非依存的に、転写活性化されるため、従来は、形質転換酵母でのヘテロ二量体型核内受容体リガンドの分析手法は実現できなかった。そこで、本発明者等は、その原因をつぎのように推察した。リガンド非依存的な転写活性化の原因の一つとして、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体の過剰発現により、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体の細胞質内保持および核内移行の制御が適切に行われないことが考えられる。また、別の原因として、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体とヘテロ二量体を形成するＲＸＲα核内受容体に起因する転写活性化等も考えられる。したがって、ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体の発現を必要最小限に留めること、およびＲＸＲα核内受容体に起因する転写活性化を抑制することが、ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体リガンドの分析方法の確立に有効であると考えた。そこで、本発明者等は、遺伝子の３′非翻訳領域に存在し、前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進するＲＮＡ不安定化配列に着目し、前記ＲＮＡ不安定化配列を形質転換酵母に組み込んだ。その結果、前記ＲＮＡ不安定化配列を組み込んだ形質転換酵母を使用すれば、ＲＸＲαへテロ二量体型動物核内受容体リガンドを高感度で分析できることを見出し、本発明に到達した。
したがって、本発明の形質転換酵母を用いれば、ＲＸＲαへテロ二量体型動物核内受容体リガンドを、簡単な操作により、低コスト、短時間かつ高感度で分析可能である。また、本発明の分析キットを用いれば、さらに簡便に、ＲＸＲαへテロ二量体型動物核内受容体リガンドの分析を実施可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の形質転換酵母において、前記ＲＮＡ不安定化配列が、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列であることが好ましい。前記発現量の調節としては、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を低減することが好ましい。
【００１３】
本発明の形質転換酵母において、前記ＲＸＲα核内受容体が、Ｃ末端のＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させたＲＸＲα核内受容体であることが好ましい。
【００１４】
本発明の形質転換酵母において、さらに、ターミネーター配列を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子であることが好ましい。
【００１６】
本発明の形質転換酵母において、前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトＳＲＣ１遺伝子であることが好ましい。
【００１７】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体遺伝子および前記ＲＮＡ不安定化配列を常染色体上に有し、前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含むことが好ましい。
【００１８】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。
【００１９】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることが好ましい。
【００２０】
本発明の形質転換酵母は、例えば、検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される。
【００２１】
本発明の分析方法において、前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有することが好ましい。グルコースを含む培地で前記形質転換酵母を培養すれば、例えば、１８時間の短時間で分析可能なレベルまで増殖させることができる。本発明の分析方法において、前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合は、特に制限されないが、例えば、０を超え６０重量％以下の範囲、好ましくは、０を超え４０重量％以下の範囲、より好ましくは、１０〜３０重量％の範囲である。
【００２２】
本発明の分析方法において、前記形質転換酵母が、グリセロール存在下で保存されていた酵母であることが好ましい。前記グリセロール存在下で保存されていた形質転換酵母は、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母であることが好ましい。
【００２３】
本発明の分析方法は、例えば、検出、定性分析または定量分析である。また、本発明において、分析は、検出、定性分析および定量分析を含む。
【００２４】
本発明の分析キットにおいて、前記培地は、グルコースおよびガラクトースを含む培地であることが好ましい。前記グルコースの重量割合は、前述のとおりである。
【００２５】
本発明のベクターにおいて、前記ＲＮＡ不安定化配列が、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するＲＮＡ不安定化配列であることが好ましい。そして、本発明のベクターにおいて、前記ＲＸＲα核内受容体が、Ｃ末端のＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させたＲＸＲα核内受容体であることが好ましい。また、本発明のベクターは、さらに、ターミネーター配列を含むことが好ましい。
【００２６】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００２７】
本発明において、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体および前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体リガンドは、特に制限されず、例えば、下記に示すＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体および前記受容体に結合可能なリガンドがあげられる。
【００２８】
（１）ＴＲα：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（２）ＴＲβ：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（３）ＲＡＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（４）ＲＡＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（５）ＲＡＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ
（６）ＰＰＡＲα：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）
（７）ＰＰＡＲδ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ（ＰＰＡＲ−ｄｅｌｔａ、ＰＰＡＲ−ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＮＵＣ１）
（８）ＰＰＡＲγ１：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  １（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ１）
（９）ＰＰＡＲγ２：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ２（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ２）
（１０）ＬＸＲβ：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ  （Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ、Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＥＲ）
（１１）ＬＸＲα：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ（Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ）
（１２）ＶＤＲ：Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（１３）ＰＸＲ−１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ−１（Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＳＸＲ−１）
（１４）ＰＸＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ−２（Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ−２、Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、ＳＸＲ−２）
（１５）ＣＡＲ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｉ３（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＭＢ６７）
（１６）ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＣＯＵＰ−ＴＦ１、ＣＯＵＰ−ＴＦα、Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−３）
（１７）ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ＣＯＵＰ−ＴＦ２、ＣＯＵＰ−ＴＦβ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＡＲＰ−１）
（１８）ＥＲＲα：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ１（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｌｐｈａ、ＥＲＲ−ａｌｐｈａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  １）
（１９）ＥＲＲβ：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ２（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ、ＥＲＲ−ｂｅｔａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ２、ＥＲＲ  ｂｅｔａ−２）
（２０）ＥＲＲγ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ＥＲＲ  ｇａｍｍａ−２）
【００２９】
これらのＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体は、分析対象となるリガンドに応じて、適宜選択すればよい。
【００３０】
つぎに、本発明において、動物転写共役因子は特に制限されない。動物転写共役因子としては、例えば、下記表１に示す８種類の転写共役因子が使用可能である。
【００３１】
【表１】
0005226353.tif 000002
【００３２】
本発明の形質転換酵母において、導入するＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体および動物転写共役因子は、分析の対象となるリガンド（化学物質）の種類により適宜決定できる。例えば、本発明の形質転換酵母は、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体として、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）等を導入した態様がある。
【００３３】
まず、ＰＸＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＰＸＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＰＸＲがある。ＰＸＲは、リガンド（プロゲステロンもしくはプロゲステロン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが応答配列（ＤＲ−３配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００３４】
前記ヒトＰＸＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＰＸＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００３５】
前記ヒトＰＸＲ遺伝子としては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｂ）のポリヌクレオチドは、下記（ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＰＸＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３６】
前記ＰＸＲ遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００３７】
ＰＸＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３８】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＤＲ−３配列は、一配列のみ組み込まれてもよく、繰り返し配列として組み込まれてもよい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３９】
つぎに、ＶＤＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＶＤＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＶＤＲがある。ＶＤＲは、リガンド（ビタミンＤ若しくはビタミンＤ様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが応答配列（ＤＲ−３配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００４０】
前記ヒトＶＤＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＶＤＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００４１】
前記ヒトＶＤＲ遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｄ）のポリヌクレオチドは、下記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＶＤＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４２】
前記ＶＤＲ遺伝子は、配列番号２の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４３】
ＶＤＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＩＢがある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４４】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＤＲ−３配列は、例えば、一配列のみ組み込まれてもよく、繰り返し配列として組み込まれてもよい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４５】
本発明の形質転換酵母には、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体とヘテロ二量体を形成するレチノイン酸Ｘ受容体α（ＲＸＲα）遺伝子を導入する。ＲＸＲαとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＲＸＲαがある。ＲＸＲαは、前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体とヘテロ二量体を形成する。前記ＲＸＲαへテロ二量体型核内受容体とそのリガンドが結合すると、前記へテロ二量体は、前記応答配列（ＤＲ−３配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００４６】
前記ヒトＲＸＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＲＸＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００４７】
前記ヒトＲＸＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｆ）のポリヌクレオチドは、下記（ｅ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＲＸＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４８】
前記ＲＸＲα遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４９】
本発明の形質転換酵母には、前記ＲＸＲα遺伝子に代えて、例えば、Ｃ末端に存在するＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させたＲＸＲα（以下、ＲＸＲαＴとする）遺伝子を導入してもよい。前記Ｈｅｌｉｘ１２領域は、ＳＲＣ１との結合の必須領域であるため、前記ＲＸＲαＴ遺伝子の導入により、ＲＸＲα核内受容体に起因するリガンド非依存的な転写活性化を抑制できる。
【００５０】
前記ＲＸＲαＴは、例えば、前記ＲＸＲαにナンセンス変異を導入して作製できる。前記ＲＸＲαＴを酵母で発現させるためには、例えば、ＲＸＲαＴ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００５１】
前記ＲＸＲαＴ遺伝子としては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｈ）のポリヌクレオチドは、下記（ｇ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｈ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＲＸＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５２】
前記動物転写共役因子である前記ヒトＳＲＣ１遺伝子としては、例えば、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｊ）のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｊ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＳＲＣ１として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５３】
本発明の形質転換酵母には、前記ＲＮＡ不安定化配列を導入する。前記ＲＮＡ不安定化配列としては、特に制限されないが、例えば、ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子の３′非翻訳領域に存在するＲＮＡ不安定化配列がある。
【００５４】
本発明の形質転換酵母において、前記ＲＮＡ不安定化配列は、例えば、前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００５５】
前記ＲＮＡ不安定化配列としては、例えば、下記（ｋ）または（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｌ）のポリヌクレオチドは、下記（ｋ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｌ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｋ）配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｌ）配列番号６に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ＲＮＡ不安定化配列として機能するポリヌクレオチド。
【００５６】
本発明の形質転換酵母には、例えば、ターミネーター配列を導入してもよい。前記ターミネーター配列としては、特に制限されないが、例えば、酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列、酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列等がある。
【００５７】
本発明の形質転換酵母において、前記ターミネーター配列は、例えば、前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００５８】
前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列としては、例えば、下記（ｍ）または（ｎ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｎ）のポリヌクレオチドは、下記（ｍ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｎ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｍ）配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｎ）配列番号７に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ターミネーター配列として機能するポリヌクレオチド。
【００５９】
前記酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列としては、例えば、下記（ｏ）または（ｐ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｐ）のポリヌクレオチドは、下記（ｏ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｐ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｏ）配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｐ）配列番号８に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ターミネーター配列として機能するポリヌクレオチド。
【００６０】
本発明の遺伝子組換え細胞の宿主細胞は、酵母であり、好ましいのは、出芽酵母であることは、前述のとおりである。
【００６１】
前記酵母内に、前記核内受容体遺伝子を導入する方法としては、特に制限されず、従来公知の遺伝子導入方法により行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明における前記核内受容体遺伝子の導入は、そのリガンドの分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型の導入でもよい。取扱いや保存の容易性およびリガンドの分析の迅速性、正確性、簡便性からは、前述のように、宿主（酵母）染色体への遺伝子導入方法が好ましい。
【００６２】
前記酵母内に導入する前記核内受容体遺伝子は、酵母内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞（酵母）内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。本発明において、作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００６３】
前述のように、本発明において、前記核内受容体とリガンドの複合体を検出するためのレポーター遺伝子として、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用することが好ましい。前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、その上流に、前記複合体が認識して結合する応答配列（転写調節配列）と動作的に結合している。前記応答配列（転写調節配列）は、動物核内受容体遺伝子の種類により適宜決定される。前述のように、ＰＸＲおよびＶＤＲの場合の応答配列は、ＤＲ−３である。これらの応答配列（転写調節配列）およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、第１のプラスミドに組み込まれて形質転換酵母に導入されていることが好ましい。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼに限定されず、その他、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が使用できる。
【００６４】
前述のように、本発明において、転写共役因子遺伝子は、前記レポーター遺伝子を組み込んだプラスミド（第１のプラスミド）とは別のプラスミド（第２のプラスミド）に組み込んで酵母に導入することが好ましい。
【００６５】
つぎに、本発明の分析方法の一例を示す。
【００６６】
まず、所定の核内受容体遺伝子、ＲＮＡ不安定化配列、動物転写共役因子遺伝子、前記動物核内受容体応答配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換酵母を準備する。そして、この形質転換酵母のグリセロールストックを調製することが好ましい。グリセロールストックを調製するために使用する培地は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を含む培地があげられる。グリセロールストックを調製する培地組成の例を、下記表２に示す。
【００６７】
（表２）
成分                                                配合量    
ドロップアウトパウダー  （注１）                          １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、注２）    １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                        ５．０ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース）                  ２０．０ｇ
水                                                    １０００ｍＬ
（注１）ドロップアウトパウダー組成
成分                配合量              成分                  配合量  
アデニン              ２．５ｇ          Ｌ−メチオニン          １．２ｇ
Ｌ−アルギニン        １．２ｇ          Ｌ−フェニルアラニン    ３．０ｇ
Ｌ−アスパラギン酸    ６．０ｇ          Ｌ−セリン            ２２．５ｇ
Ｌ−グルタミン酸      ６．０ｇ          Ｌ−スレオニン        １２．０ｇ
Ｌ−ヒスチジン        １．２ｇ          Ｌ−チロシン            １．８ｇ
Ｌ−リジン            １．８ｇ          Ｌ−バリン              ９．０ｇ
ウラシル              １．２ｇ
（注２）窒素源：Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ＆
Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ社製）
【００６８】
前記グリセロールストックを調製するための培養は、前記のような培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、例えば、前記継続培養後の培養液を５０μＬ分取し、前記表２の培地５０００μＬ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって実施する。一方、形質転換酵母として凍結乾燥菌体を利用してグリセロールストックを調製するための培養を行う場合には、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μＬ分取し、前記と同様に前記表２に示す培地５０００μＬに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【００６９】
前記グリセロールストックを調製するための培養により、菌体が十分増殖したら、得られた培養液から１０倍濃縮グリセロールストック液を作製する。このグリセロールストック液の組成は、例えば培養液８０％、グリセロール２０％から成り、−８０℃での保存も可能である。そして、このグリセロールストック液から本培養を実施する。前記本培養に使用する培地としては、例えば、前記表２に示す培地において、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含むものを使用する。ガラクトースとグルコースの比率は、前述のとおりである。また、本培養においては、培地中に、化学物質等の被験物質を添加して行う。前記本培養の温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記本培養時間は、例えば、１０〜４８時間、好ましくは、１５〜３６時間、より好ましくは１８〜２４時間である。すなわち、前記培地にガラクトースとグルコースを添加することにより、本培養における前記形質転換酵母の増殖を促進させることができるので、短時間の本培養で、被験物質を高感度かつ高信頼性で分析可能である。また、本培養は、振とう培養でもよいし、静置培養でもよい。なお、前記被験物質が固体の場合には、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の形質転換酵母に対して毒性を示さない溶媒を用いて前記被験物質を溶解してから前記培地と混合することが好ましい。
【００７０】
つぎに、本培養後の前記形質転換酵母を、公知の手法により溶菌させる。この溶菌には、例えば、下記に示すような、Ｚバッファーに界面活性剤（サルコシル）を添加した溶菌液等が使用できる。
【００７１】
（溶菌液：Ｚバッファー）
成分                                        配合量（最終濃度）
Ｎａ２ＨＰＯ４                                      ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＳＯ４                                      ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                                            １ｍＭ
ＫＣｌ                                              １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）  ２ｍＭ
サルコシル（注３）                                  ０．２０％  
（注３）Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
【００７２】
そして、前記溶菌後の溶菌液を適量採取し、産生されたβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する。β−ガラクトシダーゼの活性は、例えば、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）やＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、その吸光度を測定すればよい。この測定において、予め、標準物質を用いて検量線を作成しておくことが好ましく、前記検量線は、被験物質の測定と同時に作成することが好ましい。さらに、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物質を適宜希釈することが好ましい。このような分析方法であれば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に分析できる。
【００７３】
本発明の分析用キットは、本発明の分析方法を簡単に実施するためのキットであって、前述のように、培地、本発明の前記形質転換酵母および発色基質（発色試薬）を含むキットである。前記発色基質（発色試薬）としては、例えば、ＯＮＰＧやＣＰＲＧ等があげられる。さらに、本発明の分析キットは、検量線作成のための標準物質等を含んでいてもよい。前記形質転換酵母は、凍結乾燥させて粉末状にしてもよい。
【００７４】
本発明のベクターは、前述の遺伝子および配列以外に、他の遺伝子または配列等を含んでいてもよい。前記他の遺伝子または配列は、特に限られず、例えば、前記調節配列が挙げられる。
【００７５】
本発明のベクターキットは、前述のベクターを含有すること以外は、特に限定されず、他のベクターを含有してもよい。
【実施例】
【００７６】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例に限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１）
本例では、下記の手順によりヒトＰＸＲ遺伝子、ヒトＲＸＲα遺伝子、ＲＮＡ不安定化配列および酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【００７８】
（１）  レポータープラスミドの作製
まず、酵母チトクロームＣ遺伝子のプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミド（ｐＹＴ−β；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０、５６８−５７４）を準備した。一方、ＰＸＲの応答配列であるＤＲ−３を含む、下記のリン酸化合成オリゴＤＮＡ（配列番号９）およびその相補鎖ＤＮＡ（配列番号１０）を作製した。作製したこれらのオリゴＤＮＡを、９４℃で１分間を１サイクルでアニーリングした。アニーリング後、ＤＲ−３が１個アニーリングしたものを精製して、前記プラスミドｐＹＴ−βのＳｐｅＩサイトに挿入した。ＤＲ−３が１個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−β−ＤＲ３×１とした。
【００７９】
（ＤＲ−３）
ＤＲ３Ｎｈ：５´−ctagcagatgaactttatgaactgttt−３´（配列番号９）
ＤＲ３Ｘｂ：５´−ctagaaacagttcataaagttcatctg−３´（配列番号１０）
【００８０】
（２）発現量調節プラスミドの作製
まず、酵母ｕｒａ３遺伝子、ｇａｌ１／ｇａｌ１０双方向性プロモーターを有するプラスミドｐＵｄｐ３を準備した。前記ｇａｌ１／ｇａｌ１０双方向性プロモーターは、プラスミドＹＥｐＬａｃから、ＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトで切り出した。プラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトに、前記酵母ｕｒａ３遺伝子を挿入後、ＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトの間に前記ｇａｌ１／ｇａｌ１０双方向性プロモーターを挿入し、前記プラスミドｐＵｄｐ３を得た。つぎに、前記プラスミドｐＵｄｐ３に、酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列を挿入したプラスミドｐＵｄｐ５を作製した。前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列は、酵母Ｗ３０３ａより抽出したゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法にて増幅した。用いたプライマー（配列番号１１および１２）およびＰＣＲの条件を以下に示す。
【００８１】
（ｃｙｃ１）
ＰｏｌＡｆＨｄ：５´−tatgtcaagcttacattcacgccctc−３´（配列番号１１）
ＰｏｌＡｒＢｓ：５´−cttctcaagctaggtcttcagtataatg−３´（配列番号１２）
【００８２】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、各プライマー各０．３μＭ、ゲノムＤＮＡ  ０．５μＬ、５％  ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００８３】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５４℃で２０秒、６８℃で３０秒のサイクルを３５サイクル実施した。
【００８４】
ＰＣＲ後、増幅した前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｂｓＩを用いて切断し、前記プラスミドｐＵｄｐ３のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＵｄｐ５とした。
【００８５】
さらに、前記プラスミドｐＵｄｐ５にＲＮＡ不安定化配列を挿入した、プラスミドｐＵｄｐ８を準備した。前記ＲＮＡ不安定化配列としては、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子の３´非翻訳領域に存在するＲＮＡ不安定化配列を用いた。前記ＲＮＡ不安定化配列を含む下記のリン酸化合成オリゴＤＮＡ（配列番号１３）およびその相補鎖ＤＮＡ（配列番号１４）を作製した。作製したこれらのオリゴＤＮＡを、９４℃で１分間を１サイクルでアニーリングした。アニーリング後、アニーリングしたオリゴＤＮＡを、ｐＵｄｐ５の前記酵母ｃｙｃ１遺伝子ターミネーター配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＵｄｐ８とした。
【００８６】
（ＲＮＡ不安定化配列）
ＨＯｕｐ：５´−agcttgtatattagtttaaaaagttgtatgtaat−３´（配列番号１３）
ＨＯｄｎ：５´−agctattacatacaactttttaaactaatataca−３´（配列番号１４）
【００８７】
図３に、前記三種類のプラスミドｐＵｄｐ３、ｐＵｄｐ５、ｐＵｄｐ８、および後述するプラスミドｐＵｄｐ４のプロモーター周辺の構造を示す。同図において、ＭＣＳは、核内受容体のｃＤＮＡを挿入するマルチクローニングサイトであり、ＣＹＣ１ｔｅｒは、前記酵母ｃｙｃ１遺伝子由来のターミネーター配列であり、ＡＤＨｔｅｒは、前記酵母ＡＤＨ遺伝子由来のターミネーター配列であり、Ｇａｌ１．１０は、前記ｇａｌ１／ｇａｌ１０双方向性プロモーターであり、ＵＲＳは、ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子由来のＲＮＡ不安定化配列である。
【００８８】
（３）  動物核内受容体発現プラスミドの作製
ヒトＰＸＲおよびＲＸＲαの各ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２から抽出したｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。用いたプライマー（配列番号１５〜１８）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００８９】
（ＰＸＲ）
ＰＸＲｆＲｂＳｐ：５´−ttccaactagtaaaacatggaggtgagacccaaag−３´（配列番号１５）
ＰＸＲｒＨｄ：５´−ccttcaagcttctcagctacctgtgatgccgaac−３´（配列番号１６）
【００９０】
（ＲＸＲα）
ＲＸＲａＲｂＫｐｎＦ：５´−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−３´（配列番号１７）
ＲＸＲａＥｃｒ：５´−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−３´（配列番号１８）
【００９１】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ  １μＬ、５％  ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９２】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５８℃で２０秒、６８℃で３分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００９３】
つぎに、増幅した各核内受容体ｃＤＮＡを、制限酵素を用いて切断した。前記プラスミドｐＵｄｐ８のｇａｌ１プロモーター下流に位置する部位に、切断したＲＸＲαのｃＤＮＡを挿入し、ｇａｌ１０プロモーター下流に位置する部位に、切断したＰＸＲのｃＤＮＡを挿入した。得られたプラスミドを、ｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαとした。なお、クローニングには大腸菌ＤＨ５α株を使用した。ｃＤＮＡおよびプラスミドの切断に用いた制限酵素を以下に示す。
【００９４】
（制限酵素）
挿入したｃＤＮＡ      ｃＤＮＡ切断用制限酵素      プラスミド切断用制限酵素  
ＰＸＲ            ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ    ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
ＲＸＲα          ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ        ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ
【００９５】
（４）  ＳＲＣ１プラスミドの作製
ＳＲＣ１ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）よりＰＣＲ法を用いて増幅した。用いたプライマー（配列番号１９および２０）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００９６】
ｈＳＲＣ１ｂｇＦ：５´−tggaactcaagatttgaccatatc−３´（配列番号１９）
ｈＳＲＣ１ｘｈＲ：５´−gagcattcctctagtctgtagtc−３´（配列番号２０）
【００９７】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ  １μＬ、５％  ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９８】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００９９】
増幅したＳＲＣ−１  ｃＤＮＡを精製し、さらに以下のプライマー（配列番号２１および２２）を用いたＰＣＲ法にてｃＤＮＡに制限酵素サイトを付加した。増幅したｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕベクターのｇａｌ１プロモーター下流に挿入した。本プラスミドＤＮＡをｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１とした。
【０１００】
ＳＲＣ−１ｅＦｂｇ２：５´−caaagaagatctcccaggtgtgaag−３´（配列番号２１）
ＳＲＣ−１ｅＲｘｈ２：５´−agggccctcgagactctagtctgtag−３´（配列番号２２）
【０１０１】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）  １μＬ、５％  ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【０１０２】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを２０サイクル実施した。
【０１０３】
（５）  形質転換酵母の作製
まず、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株に、塩化リチウム法にて、前記ｐＹＴ−β−ＤＲ３×１プラスミド  ＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地にロイシンを１００ｍｇ添加したものである。
【０１０４】
つぎに、前記形質転換酵母に、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１プラスミド  ＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地である。
【０１０５】
さらに、前記ｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαを、制限酵素ＥｃｏＲＶで処理して直鎖状とし、以下のように前記形質転換酵母へ導入し、染色体への組込みを行った。
【０１０６】
まず、前記形質転換酵母を、３０℃で濁度（Ａｂｓ６６０ｎｍ、以下、ＯＤ６６０とする）が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（０．１Ｍ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ６６０＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状の前記の各ｐＡＵＲ１０１ベクター  ５μｇと、キャリアーＤＮＡ（商品名：ＳＡＬＭＯＮ  ＴＥＳＴＥＳ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇ（合計２０μＬ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍＬにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μＬ添加し、緩やかに混合した。
【０１０７】
つぎに、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍＬのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、オーレオバシディンＡ（ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ、０．５ｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μＬずつ塗布して培養した。そして、オーレオバシディンＡ耐性株をＧａｌ１プロモーターとＰＸＲのｃＤＮＡ領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。以上の操作により、ｐＹＴ−β−ＤＲ３×１およびｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１ＤＮＡをプラスミドとして保持し、ゲノム中よりヒトＲＸＲαおよびＰＸＲを発現する形質転換酵母を作製した。
【０１０８】
（６）ＰＸＲのｍＲＮＡ量の測定
本例の形質転換酵母について、ＰＸＲのｍＲＮＡ量を測定した。
【０１０９】
（形質転換酵母の前培養）
まず、本例の形質転換酵母を、下記組成の前培養用の培地にて１８時間前培養を行った。培養の結果、濁度（Ａｂｓ５９５ｎｍ）が１．０程度に形質転換酵母が増殖した。
【０１１０】
（前培養用培地の組成）
成分                                                      配合量    
ドロップアウトパウダー（前記注１）                            １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、前記注２）    １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                            ５．０ｇ
グルコース                                                  ２０．０ｇ
水                                                            １Ｌ
【０１１１】
（形質転換酵母の本培養）
つぎに、９６穴プレートを用い、１ウェルあたり以下の構成で、リガンド溶液、前培養した菌体液および本培養用培地を混合し、３０℃で１８時間、静置培養を行った。
【０１１２】
リガンド溶液：１０ｍＭ  ＤＭＳＯに溶解したリファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、ＲＩＦ）１μＬ
菌体液（Ｏ．Ｄ．１〜１．５）：５μＬ
本培養用培地：下記組成の培地１００μＬ
【０１１３】
（本培養用培地の組成）
成分                                                      配合量    
ドロップアウトパウダー（前記注１）                            １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、前記注２）    １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                            ５．０ｇ
グルコース                                                    ２．０ｇ
ガラクトース                                                １８．０ｇ
水                                                            １Ｌ
【０１１４】
（ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成）
さらに、前記本培養後の形質転換酵母を、遠心して集菌後、ソルビトールバッファー（１Ｍ  ソルビトール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、３０℃で３０分振とうした。振とうした菌体は、再度遠心して集菌後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出した。前記トータルＲＮＡの抽出操作は、キット添付の操作書に従って行った。抽出したトータルＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡの合成は、以下の条件で行った。
【０１１５】
（ＰＣＲ条件：反応液  ５×ＳＳＩＩバッファー）
５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２０ｕｎｉｔ、２．５μＭ  ｏｌｉｇｏ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、タカラバイオ社製）または  ｒａｎｄｏｍ  ６ｍｅｒ（Ｒｄ６、タカラバイオ社製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００ｕｎｉｔ、２μｇ  ｙｅａｓｔ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを反応液２０μＬ中に含む。
【０１１６】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
２５℃で１０分、５０℃で３０分、５５℃で３０分の条件で反応させた。
【０１１７】
ｃＤＮＡ合成後、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｖ２．０（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。用いたプライマー（配列番号２３および２４）リアルタイムＰＣＲの条件を以下に示す。
【０１１８】
ｈＰＸＲ１００８ＲＴｆ：  ５′−tgaggaggagtatgtgctgatgc−３′（配列番号２３）
ＰＸＲｒＨｄ２：  ５′−ttctcagctacctgtgatgccgaac−３′（配列番号２４）
【０１１９】
（ＰＣＲ条件：反応液組成）
１×ＣＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、プライマー各０．５μＭ、１μＬ  ｃＤＮＡ（またはスタンダードとしてプラスミドＤＮＡ）を反応液２５μＬ中に含む。
【０１２０】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０分のサイクルを４５サイクル実施した。
【０１２１】
（リアルタイムＰＣＲによる測定）
ｍＲＮＡ定量における検量線作成用のスタンダードとして、プラスミドｐＵｄｐ３ＰＸＲ／ＲＸＲαを作製した。前記プラスミドｐＵｄｐ３ＰＸＲ／ＲＸＲαは、前記プラスミドｐＵｄｐ８に代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ３を用いたこと以外は、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαと同様にして作製した。前記プラスミドｐＵｄｐ３ＰＸＲ／ＲＸＲα  ＤＮＡは、１ｐｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。得られたｃＤＮＡサンプルおよび前記スタンダードについて、同時に、リアルタイムＰＣＲによる測定を行った。
【０１２２】
（７）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、リガンドへの応答性を測定した。
【０１２３】
（形質転換酵母の培養）
本例の形質転換酵母は、前述と同様に、前培養および本培養を行った。
【０１２４】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
前記本培養の後、各ウェルから培養液を５μＬずつ採取し、新たな９６穴プレートの各ウェルに移し、下記組成の測定試薬を１００μＬ加えた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、ｏ−ニトロフェノールの生成量から算出するため、４０５ｎｍにおける反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。分析結果は、４０５ｎｍの吸光度／６２０ｎｍの吸光度の比を算出し、リガンド非添加（溶媒である１０ｍＭ  ＤＭＳＯのみを添加）での値を１とした誘導率で示した。
【０１２５】
（測定試薬の組成）
成分                                                配合量（最終濃度）
Ｎａ２ＨＰＯ４（注４）                                        ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＳＯ４（注４）                                        ４０ｍＭ
ＭｇＳＯ４                                                    １ｍＭ
ＫＣｌ                                                      １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）            ２ｍＭ
サルコシル（前記注３）                                        ０．４０ｗ／ｖ％
ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）  １ｍｇ／ｍＬ
（注４）Ｎａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＳＯ４を混合後、ｐＨ７．５に調整
【０１２６】
（比較例１−１）
（１）レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１２７】
（２）発現量調整プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列および前記ＲＮＡ不安定化配列を含まない、前記プラスミドｐＵｄｐ３を用いた。前記プラスミドｐＵｄｐ３は、実施例１と同様に作製した。
【０１２８】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ３ＰＸＲ／ＲＸＲαを用いた。
【０１２９】
（４）ＳＲＣ１プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、ＳＲＣ１プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１３０】
（５）形質転換酵母の作製
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ３ＰＸＲ／ＲＸＲαを用いたこと以外は、実施例１と同様に作製した。
【０１３１】
（６）ＰＸＲのｍＲＮＡ量の測定
本例の形質転換酵母における、ＰＸＲのｍＲＮＡ量測定は、実施例１と同様にして行った。
【０１３２】
（７）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、実施例１と同様に、リガンド応答性を測定した。
【０１３３】
（比較例１−２）
（１）レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１３４】
（２）発現量調整プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記ＲＮＡ不安定化配列を含まず、かつ前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列に代えて、酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列を挿入した、プラスミドｐＵｄｐ４を用いた。前記酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列の挿入は、以下のように行った。
【０１３５】
前記酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列の増幅は、用いたプライマー以外は、前記酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列と同様にして行った。以下に、用いたプライマー（配列番号２５および２６）を示す。増幅させた前記酵母ＡＤＨ遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｆｌＩを用いて切断し、前記ｐＵｄｐ３のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
【０１３６】
（ＡＤＨ）
ｓｃＡＤＨ３ＵＴＲｆＥｃ：５´−ctaaataagcgaattccttatgatttatg−３´（配列番号２５）
ｓｃＡＤＨ３ＵＴＲｒＭｆ：５´−tgcaggcaattgctcggcatgccggtag−３´（配列番号２６）
【０１３７】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記プラスミドｐＵｄｐ８に代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ４を用いたこと以外は、実施例１と同様にして作製した。前記プラスミドｐＵｄｐ４を用いて作製した本例の動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドｐＵｄｐ４ＰＸＲ／ＲＸＲαとした。
【０１３８】
（４）ＳＲＣ１プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、ＳＲＣ１プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１３９】
（５）形質転換酵母の作製
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ４ＰＸＲ／ＲＸＲαを用いたこと以外は、実施例１と同様に作製した。
【０１４０】
（６）ＰＸＲのｍＲＮＡ量の測定
本例の形質転換酵母において、ＰＸＲのｍＲＮＡ量測定は、実施例１と同様にして行った。
【０１４１】
（７）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、実施例１と同様に、リガンドへの応答性を測定した。
【０１４２】
（比較例１−３）
（１）レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１４３】
（２）発現量調整プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記ＲＮＡ不安定化配列を含まない、前記プラスミドｐＵｄｐ５を用いた。前記プラスミドｐＵｄｐ５は、実施例１と同様に作製した。
【０１４４】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記プラスミドｐＵｄｐ８に代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ５を用いたこと以外は、実施例１と同様にして作製した。前記プラスミドｐＵｄｐ５を用いて作製した本例の動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドｐＵｄｐ５ＰＸＲ／ＲＸＲαとした。
【０１４５】
（４）ＳＲＣ１プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、ＳＲＣ１プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１４６】
（５）形質転換酵母の作製
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ５ＰＸＲ／ＲＸＲαを用いたこと以外は、実施例１と同様に作製した。
【０１４７】
（６）ＰＸＲのｍＲＮＡ量の測定
本例の形質転換酵母において、ＰＸＲのｍＲＮＡ量測定は、実施例１と同様にして行った。
【０１４８】
（７）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、実施例１と同様に、リガンド応答性を測定した。
【０１４９】
前記実施例１および前記比較例１−１〜１−３で作製した形質転換酵母について、ＰＸＲのｍＲＮＡ量を測定した結果を、下記表３に示す。
【０１５０】
【表３】
0005226353.tif 000003
【０１５１】
前記表３に示すように、Ｒｄ６を用いてｃＤＮＡを作製した場合、実施例１のｍＲＮＡ量は、比較例１−１〜１−３の約１／７０〜１／１７０であった。また、ｏｌｉｇｏ−ｄＴを用いてｃＤＮＡを作製した場合、実施例１のｍＲＮＡ量は、比較例１−１〜１−３の約１／４〜１／８５であった。すなわち、ＲＮＡ不安定化配列を有する実施例１において、ＰＸＲのｍＲＮＡ量が著しく低いことが示された。また、Ｒｄ６を用いてｃＤＮＡを作製した場合、比較例１−１〜１−３間のｍＲＮＡ量に大きな差異はなかった。しかし、ｏｌｉｇｏ−ｄＴを用いてｃＤＮＡを作製した場合、酵母ｃｙｃ１遺伝子のターミネーター配列を持つ比較例１−３が、他の比較例に比べて特に高い値を示した。前記Ｒｄ６プライマーは、ランダム配列を有するプライマーであり、前記ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーは、ポリＡ  ｔａｉｌを持つｍＲＮＡの逆転写反応用プライマーである。すなわち、ターミネーター配列の有無および種類等により、ポリＡが付加されたＰＸＲのｍＲＮＡ量が異なることが示された。
【０１５２】
前記実施例１および前記比較例１−１〜１−３で作製した形質転換酵母について、リガンドへの応答性を測定した結果を、下記表４に示す。
【０１５３】
【表４】
0005226353.tif 000004
【０１５４】
前記表４に示すように、実施例１では、リファンピシンに応答して、β−ガラクトシダーゼが誘導された。実施例１の前記誘導率は、約４倍であった。それに対し、比較例１−１〜１−３では、β−ガラクトシダーゼの誘導は認められなかった。また、リガンド非添加時（陰性対照）におけるβ−ガラクトシダーゼの発現量が、実施例１では低いのに対し、比較例１−１〜１−３では、リガンド添加時の値に近い高値を示した。
【０１５５】
（実施例２）
（１）レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１５６】
（２）発現量調整プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１５７】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドとしては、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαの、ＲＸＲαのＣ末端のＨｅｌｉｘ１２を欠失させたプラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴを用いた。前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴは、以下のように作製した。
【０１５８】
まず、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、前記ｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに含まれるＲＸＲ  ｃＤＮＡの４４３番目のコドンにナンセンス変異を導入し、ＲＸＲαのＣ末端に存在するＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させた。用いたプライマー（配列番号２７および２８）および反応条件を以下に示す。
【０１５９】
ＲＸＲ４４３Ｆ：  ５′−cttcttcaagctcatcgggtagacacccat−３′（配列番号２７）
ＲＸＲ４４３Ｒ：  ５′−ggtgtcaatgggtgtctacccgatgagctt−３′（配列番号２８）
【０１６０】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、３μＬ  Ｑｕｉｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐｆｕ  ｕｌｔｒａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １０ｕｎｉｔ（以上Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、０．２５μＭ  各プライマー、１０ｎｇ  プラスミドＤＮＡを反応液５０μＬ中に含む。
【０１６１】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で７分のサイクルを１８サイクル実施した。
【０１６２】
ＰＣＲ後、制限酵素ＤｐｎＩで鋳型プラスミドＤＮＡを消化し、大腸菌に形質転換した。得られたプラスミドＤＮＡをｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴとした。
【０１６３】
（４）ＳＲＣ１プラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、ＳＲＣ１プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１６４】
（５）形質転換酵母の作製
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴを用いたこと以外は、実施例１と同様に作製した。
【０１６５】
（６）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、以下のようにしてリガンド応答性を測定した。
【０１６６】
（形質転換酵母の培養）
本例の形質転換酵母は、実施例１と同様にして、前培養を行った。
【０１６７】
本例の形質転換酵母の本培養は、リファンピシンおよび９−ｃｉｓレチノイン酸をリガンド溶液として用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。なお、前記リファンピシンは、１０ｍＭ  ＤＭＳＯに溶解させ、下記表５に示すように、異なる１０濃度の溶液を調製した。また、前記９−ｃｉｓレチノイン酸は、１０ｍＭ  ＤＭＳＯに溶解させ、下記表６に示すように、異なる５濃度の溶液を調製した。
【０１６８】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
本例の形質転換酵母は、実施例１と同様にしてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。前記測定の結果を、下記表５、表６および図１に示す。表５は、前記リファンピシンをリガンドとして用いた測定結果であり、表６は、前記９−ｃｉｓレチノイン酸をリガンドとして用いた測定結果である。図１において、横軸は、各リガンドの濃度（μＭ）であり、縦軸は、リガンド非添加での値を１とした誘導率である。
【０１６９】
【表５】
0005226353.tif 000005
【０１７０】
【表６】
0005226353.tif 000006
【０１７１】
前記表５、６および図１に示すように、本例の形質転換酵母において、リファンピシンによるβ−ガラクトシダーゼの誘導率は、約４倍であった。それに対し、本例の形質転換酵母において、９−ｃｉｓレチノイン酸による誘導は、全く見られなかった。すなわち、本例の形質転換酵母は、ＲＸＲαのリガンドには反応せず、ＰＸＲのリガンドのみに反応することが示された。
【０１７２】
（実施例３）
（１）レポータープラスミドの作製
本実施例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１７３】
（２）発現量調整プラスミドの作製
本実施例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１７４】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
本実施例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記核内受容体遺伝子ＰＸＲに代えて、核内受容体遺伝子ＶＤＲを発現可能に導入したこと以外は、実施例２と同様に作製した。本実施例における前記動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドｐＵｄｐ８ＶＤＲ／ＲＸＲαＴとした。前記プラスミドｐＵｄｐ８ＶＤＲ／ＲＸＲαＴは、前記ヒトＶＤＲの増幅および導入時に用いたプライマーおよび制限酵素以外は、実施例２と同様に作製した。以下に、前記用いたプライマー（配列番号２９および３０）および制限酵素を示す。
【０１７５】
（プライマー）
ＶＤＲｆＸｂ：５´−ctccttctagaatggaggcaatggcggccagcac−３´（配列番号２９）
ＶＤＲｒＳｐ：５´−gctgtactagtcaggagatctcattgccaaacac−３´（配列番号３０）
【０１７６】
（制限酵素）
挿入したｃＤＮＡ      ｃＤＮＡ切断用制限酵素      プラスミド切断用制限酵素  
ＶＤＲ              ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ              ＸｂａＩ
【０１７７】
（４）ＳＲＣ１プラスミドの作製
本実施例の形質転換酵母において、ＳＲＣ１プラスミドは、実施例１と同様に作製した。
【０１７８】
（５）形質転換酵母の作製
本実施例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに代えて、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＶＤＲ／ＲＸＲαＴを用いたこと以外は、実施例１と同様に作製した。
【０１７９】
（６）リガンド応答性の測定
本例の形質転換酵母について、以下のようにしてリガンド応答性を測定した。
【０１８０】
（形質転換酵母の培養）
本例の形質転換酵母は、実施例１と同様にして、前培養を行った。
【０１８１】
本例の形質転換酵母の本培養は、リガンド溶液として、活性型ビタミンＤ３（１,２５−ＯＨ  ＶＤ３）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。なお、前記活性型ビタミンＤ３は、１０ｍＭ  ＤＭＳＯに溶解させ、下記表７に示すように、異なる９濃度の溶液を調製した。
【０１８２】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
本例の形質転換酵母は、実施例１と同様に、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。前記測定の結果を、下記表７および図２に示す。図２において、横軸は、活性型ビタミンＤ３の濃度（μＭ）であり、縦軸は、リガンド非添加での値を１とした誘導率である。
【０１８３】
【表７】
0005226353.tif 000007
【０１８４】
前記表７および図２に示すように、本例の形質転換酵母では、活性型ビタミンＤ３により、β−ガラクトシダーゼが誘導された。本例の形質転換酵母において、前記誘導率は、最大約２０倍であった。
【０１８５】
これらの結果から、本発明の形質転換酵母を用いることにより、ＲＸＲα核内受容体とヘテロ二量体を形成する核内受容体のリガンドを、高感度で分析できる。また、前記核内受容体発現プラスミドｐＵｄｐ８は、ＰＸＲだけでなく、本実施例のＶＤＲのように、ＲＸＲαとヘテロ二量体を形成する他の核内受容体にも、利用可能である。さらに、例えば、前記非特許文献３の図１（２）のグラフ（ｊ）において、酵母ツーハイブリッド法を用いた、活性型ビタミンＤ３誘導によるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果が示されているが、同法は、本発明の前記実施例３と比べ、活性を示す最低濃度が約１０倍大きく、測定感度が低い。このことから、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、前記酵母ツーハイブリッド法と比べ、高い測定感度を有するといえる。しかも、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、操作が簡単であり、短時間で分析ができ、低コストであるという利点もある。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
以上のように、本発明の形質転換酵母を用いれば、高検出感度でＲＸＲα核内受容体とヘテロ二量体を形成する核内受容体のリガンドの分析が可能となる。したがって、本発明の分析方法は、化学物質やタンパク質等のリガンドの分析の分野において有用な方法であり、その用途は制限されず広い。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、本発明の実施例２におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例３におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例および比較例の形質転換酵母に含まれる、核内受容体発現プラスミドのプロモーター周辺の構造図である。図３（Ａ）は、比較例１−１（ｐＵｄｐ３）、図３（Ｂ）は、比較例１−２（ｐＵｄｐ４）、図３（Ｃ）は、比較例１−３（ｐＵｄｐ５）、図３（Ｄ）は、実施例１（ｐＵｄｐ８）に含まれる核内受容体発現プラスミドの前記構造図である。
【図１】
0005226353.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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