(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０３μｍから０．１０μｍの平均粒径を有する微粒子及び前記微粒子表面と共有結合した抗原を含む免疫原性組成物であって、対象となるヒトまたは動物への免疫付与により、前記抗原に対して細胞性免疫応答を生産する、組成物。
【請求項２】
前記微粒子が０．０３μｍから０．０５μｍの平均粒径を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記微粒子が０．０４μｍから０．０４９μｍの平均粒径を有する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記微粒子が実質的に均一な大きさである請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記微粒子が固体コアを有する請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記微粒子がラテックス、鉄分子、金、ガラス、リン酸カルシウム、ポリスチレン、ポリリシンＧ、生分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記微粒子が前記対象となるヒトまたは動物において樹状細胞によって取り込まれることが可能な、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記樹状細胞がＤＥＣ２０５＋、ＣＤ４０＋またはＣＤ８６＋細胞である、組成物。
【請求項８】
前記抗原がペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原が病原体、組織、細胞器官または分子に由来し、下記：
花粉、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア、Ｅｌ、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｉｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳ））、ヒトＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌａｅ、およびＰ．ｍａｌａｒｉａｅ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＡＭＡ−１、ＲＥＳＡ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＬＳＡ１およびＬＳＡ３からなる群から選択されるマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種由来抗原、ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質、連鎖球菌表面タンパク質抗原、インフルエンザ核タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ表面感染タンパク質、ＴｃｐＡピリン（ｐｉｌｉｎ）サブユニット、ＶＰ１タンパク質、ＬＭＣＶ核タンパク質、リーシュマニア属の主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、ブドウ状球菌タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質、合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｃｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質、エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、ヘマグルチニン、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）表層タンパク質（Ｏｓｐ：ｏｕｔｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤリポタンパク質または３０ｋＤタンパク質（Ａｇ８５）、１０ｋＤまたは６５ｋＤタンパク質、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）クラス１表層タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスＩＥ６２およびｇｐｌ、風疹ウイルス・キャプシド・タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ Ｓ１ ａｇ、単純疱疹ウイルス・タイプＩ糖タンパク質Ｇまたはｇｐ ＤもしくはＣＰ２７、マレーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオ・ウイルス・キャプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、クラミディア・トラコマティス（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス・エンベロープＡｇ ｐｒｅ Ｓ２、ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）キャプシド、ガン遺伝子Ｅ６およびＥ７由来の乳頭腫ウイルス・ペプチド、リステリア菌表面タンパク質、水痘ウイルス・エンベロープ・タンパク質、ワクシニアウイルス・エンベロープ・タンパク質、ブルセラ菌表面タンパク質、ロタウイルスＶＰ−３、ＶＰ−４、ＶＰ−５、ＶＰ−７およびＶＰ−８、前記抗原の１種または複数の組合せ、長さにして５個以上のアミノ酸を含む前記抗原のアミノ酸サブユニットおよび前記サブユニットの１種または複数の組合せ
からなる群から選択される請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原が乳ガン抗原、肺ガン抗原、膵臓ガン抗原、結腸ガン抗原および黒色腫抗原からなる群から選択される請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原が組換えペプチドまたはタンパク質である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原との共有結合の後に、前記微粒子がグリシン、アルコール、アミンまたはアルデヒドから選択されるクエンチング剤でクエンチされる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記対象となるヒトまたは動物への免疫付与により、さらに体液性免疫応答を提供し、前記体液性免疫応答が前記抗原に対する免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭまたは免疫グロブリンＡから選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物の単回投与に続いて前記抗原に対する前記細胞性免疫応答が誘発される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞性免疫応答がＣＤ８免疫応答を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
樹状細胞による前記微粒子の取込みの後に、前記細胞性免疫応答が前記樹状細胞の増殖および／または発達および／または成熟および／または刺激により促進される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
対象である哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞による抗原の取込みを刺激するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
対象である哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞による抗原の取込みの刺激用組成物であって、０．０３μｍから０．１０μｍの平均粒径を有する有効量の微粒子及び前記微粒子表面と共有結合した抗原を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける樹状細胞による微粒子の取込みが酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）により阻害される、組成物。
【請求項１９】
前記対象に対して、経口での、吸入による、粘膜表面もしくは粘膜部を介した投与による、または皮下、皮内、筋肉内、腹膜内もしくは静脈への注入による、投与に適している、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記対象に対して、粘膜表面もしくは粘膜部を介した投与による、または皮下、皮内、筋肉内もしくは腹膜内への注入による、投与に適している、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記樹状細胞による前記抗原の取込みが前記対象における前記抗原に対する細胞性免疫応答を促進する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗原に対する細胞性免疫応答が前記組成物の単回投与に続いて誘発される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞性免疫応答がＣＤ８免疫応答を含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記樹状細胞による前記抗原の取込みが前記抗原に対する体液性免疫応答をも促進し、前記体液性免疫応答が前記抗原に対する免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭまたは免疫グロブリンＡから選択される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫原性組成物、ワクチン組成物、患者における免疫応答を誘発する方法およびこれらの組成物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の免疫系の操作は、ある種の疾病や症状を回避しまたは治療する方法として知られている。
【０００３】
免疫系が疾病をコントロールするメカニズムは、中和抗体の誘導(体液性免疫応答)および細胞性応答すなわちT細胞応答の発生を含む。後者はヘルパーT細胞(TH)および細胞毒性Tリンパ球(CTL)を含む。ウイルス感染(例えばポリオ、肝炎)の例で言えば、抗体はウイルスが細胞に感染するのを防ぐことにより保護をもたらす。抗体はまた、殺菌メカニズムを用いたりバクテリア毒素を中和することによって、バクテリア(例えば肺炎球菌、ブドウ球菌)からの保護を果たすことができる。
【０００４】
抗原からのペプチド断片がMHC IまたはMHC II(major histocompatability complex;主要組織適合性複合体クラスIまたはクラスII)として知られている分子に結合し、DC(dendritic cell;樹状細胞)またはマクロファージなどの専門のAPC(antigen presenting cell;抗原提示細胞)の表面に示されたときには、T細胞が刺激され得る。T細胞は抗原受容体を有しており、これを用いて細胞表面における抗原由来ペプチド断片の存在をモニターしている。TH細胞上の抗原受容体は、MHC II分子に結合した抗原ペプチドを認識する。これとは対照的に、CTL上の受容体はクラスI分子に対して示される抗原と反応する。
【０００５】
T細胞が病原体に感染した標的細胞またはそれが認識するエピトープを含む細胞を認識した場合、一連のイベントが生起され、刺激されたT細胞は免疫応答を増幅し、これらは最終的には、感染細胞の死をもたらす。さらに、T細胞の中には、サイトカインやリンホカインの分泌を刺激し得るものもあり、その結果、最終的には病原体の不活性化または根絶に結びつく効果を及ぼす。
【０００６】
多くのワクチンが出回っているが、多数の疾病や症状に対しより効果を有し広い範囲に効果の及ぶワクチンの製造が求められている。また、現時点でワクチンがないか効果がない感染因子(infective agent)や病原体からの保護の必要も残る。さらに、有効な単回服用ワクチン(それは、経済的理由や送達のしやすさの点で、また、患者や被治療者の服薬順守の点で特に望ましい)も求められている。
【０００７】
ほとんどのワクチンは、免疫学的に有効になるように様々なタイプの体液性応答と細胞性応答とを最適の組合せで誘導することができないという問題点を有する。例えば、抗体と細胞性応答の両者が働けばより有効と思われる場合に、抗体応答しか刺激しないワクチンもある。別の例では、対象とする感染因子からの保護を達成するためにはワクチンの多数回投与、例えば、追加刺激注射(booster shots)が必要とされる。
【０００８】
他のいくつかの例では、IgA、IgGおよびIgMなどの他の所望の免疫グロブリンと共にIgE生産が誘導される。免疫グロブリンはアレルギー反応に関係するので、IgEを誘導するワクチンは望ましくない。
【０００９】
IgA生産の刺激は粘膜部位または表面を通って侵入して感染する病原体に対する「最前線」防御である。したがって、IgE生産を増大せずに、高IgA分泌免疫応答を生じさせることができるワクチンも有用であろう。
【００１０】
さらに他の例を挙げると、ワクチンはAPCの刺激をもたらすが、免疫の刺激の程度は最適値以下である。例えば、樹状細胞すなわちDCは、表面分子によって互いに識別可能な一連の細胞部分集合として特徴付けられるが、この表面分子がT細胞上の受容体と結合する特異的リガンドであるものもある。従って、DCの部分集合(例えば、効率的なCD8 T細胞プライミングが可能な部分集合)を選択的に標的とするワクチンを生産することが望ましいであろう。これらのT細胞は多くの細胞内病原体およびガンに対する保護免疫に重大な役割を果たすが、誘導することが悪評高いほどに困難だからである。
【００１１】
さらに、ワクチンに関して、細胞外抗原は、ほとんどの細胞において伝統的にMHC-I処理経路に入らない。アポトーシスを起こす細胞、免疫複合体および粒子の取込みを経由するAPC中でのクラス1プロセッシングおよび提示の代替ルートが提案されているが[1]、一般に、不活化ワクチンを使用するCTL免疫の生産はありそうもない。B型肝炎表面タンパク質または酵母レトロトランスポゾン・タンパク質粒子からなる非感染性ウイルス様粒子(VLP)は、マクロファージによってMHC I提示に適したかたちに効率的に処理されin vitroでもin vivoでもCD8 CTL応答を誘導することが示されている[2、3]。VLPは、脂質含有量が乾燥重量の50%以上の多量体(multimeric)脂質含有タンパク質粒子である。
【００１２】
しかし、B型肝炎コアタンパク質粒子は免疫原ではなく脂質含有量が低い。このため、VLPはその大きさによってではなく生化学組成によって免疫原になっているのではないかとの提案がなされた。これは、抗原を脂質または洗剤を含む処方中で提示すると、恐らくは細胞膜の破損によりAPCと融合し、この結果細胞質に取り込まれるようになるという提案と矛盾しないであろう。
【００１３】
内部に抗原を封じ込めたミクロスフェアの使用については、ワクチン組成物としての可能性が検討されている。ミクロスフェアは、乳酸やグリコール酸(PLAおよびPLGA)の生分解性ポリエステルで作られる。ミクロスフェアは、そのサイズおよびポリマー組成物により分解速度をコントロールするように形成する。ミクロスフェアが分解するにつれ、封じ込められていた抗原がそこから放出され、抗原の抑制された放出をもたらして免疫応答を刺激する。これらの分子が、細胞膜と生体適合性をもつタンパク質粒子と同じように免疫細胞と接して反応する可能性は低いだろう。
【００１４】
しかし、この形態のワクチン組成物の難点として、抗原の安定性、スフェアの大きさや抗原放出の動力学といった点があり、良好な抗原性および持続的免疫性を備えたワクチンを生産し、また経済的に製造し投与できるワクチンを生産するためには、これらを全て解決する必要がある[4]。
【００１５】
米国特許第4,225,581号には、大きさに広がりのある外来粒子混合物を含む組成物が、重合体の粒子表面上に吸着された抗原を身体に送達するのに有用であると記載されている。しかし、こうしたワクチンによって送達が成功したこと、抗原性および免疫性は具体例も証明もない。特に、CD8 T細胞応答の誘導について言及はなく、MHCクラスI提示経路へのプロセッシングについてさえ言及がない。この微粒子の重合体の材料が上記のようなPLAまたはPLGAの微粒子と同様の特性を持つと予想されるであろう。
【００１６】
したがって、ワクチンの一部として投与する粒子の大きさ自体が免疫原の応答を誘導し得るかについては本発明以前には知られていなかった。
【００１７】
本発明に至る研究において、本発明者は、驚くべきことに、抗原を伴うウイルスとほぼ同じ大きさの微粒子が被治療者に強い細胞性および体液性抗体応答をもたらすという事実を見出した。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明の第1の実施形態では、ウイルスと同じ大きさの範囲にある微粒子と結合した少なくとも1つの抗原を含む免疫原の組成物を提供する。
【００１９】
免疫原組成物に関して使用する「含む」という用語は、組成物が抗原および微粒子を含むことを意味する。それは他の成分を含んでもよい。
【００２０】
「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる任意の分子、部分または実体を指す。この中には、細胞性および/または体液性免疫応答が含まれる。組成物に意図した機能によっては、1つ以上の抗原を含んでもよい。
【００２１】
抗原はペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、他のタイプの分子またはこれらのうちのいずれかの組合せでもよい。
【００２２】
抗原は、組成物に意図した目的により、病原体、組織、細胞、器官または分子に由来するものでもよいし、精製された抗原でもよいし、バクテリア、酵母または細胞培養などの適切なベクターにより生成した組替え体由来のものでもよい。病原体は、例えば任意の病原体でもよく、細胞内病原体や細胞外病原体、抗原性部分またはその一部、ＨＩＶ、インフルエンザ・ウイルス、肝炎ウイルス、マラリアなど、ウイルス、バクテリア、原生動物に由来するものでもよい。特に本発明が想定する抗原の例は以下のとおりである：花粉、Ｃ型肝炎ウイルス、（ＨＣＶ）コア、Ｅｌ、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳ））やヒトＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｉａｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅを含むＰ．ｖｉｖａｘその他のマラリア原虫種などのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種由来抗原、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＡＭＡ−１、ＲＥＳＡ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＬＳＡ１およびＬＳＡ３、ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質、連鎖球菌表面タンパク質Ａｇ、インフルエンザ核タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ表面感染タンパク質、ＴｃｐＡピリン（ｐｉｌｉｎ）サブユニット、ＶＰ１タンパク質、ＬＭＣＶ核タンパク質、リーシュマニア属の主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、ブドウ状球菌またはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質、合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｃｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質、エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、ヘマグルチニン、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）表層タンパク質（Ｏｓｐ：ｏｕｔｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤリポタンパク質または３０ｋＤタンパク質（Ａｇ８５）、１０ｋＤまたは６５ｋＤタンパク質、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）クラス１表層タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスＩＥ６２およびｇｐｌ、風疹ウイルス・キャプシド・タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ Ｓ１ ａｇ、単純疱疹ウイルス・タイプＩ糖タンパク質Ｇまたはｇｐ ＤもしくはＣＰ２７、マレーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオ・ウイルス・キャプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ６、クラミディア・トラコマティス（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス・エンベロープＡｇ ｐｒｅ Ｓ２、ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）キャプシド、ガン遺伝子Ｅ６およびＥ７由来の乳頭腫ウイルス・ペプチド、リステリア菌表面タンパク質、水痘ウイルス・エンベロープ・タンパク質、ワクシニアウイルス・エンベロープ・タンパク質、ブルセラ菌表面タンパク質、ロタウイルスＶＰ−３、ＶＰ−４、ＶＰ−５、ＶＰ−７およびＶＰ−８、前記抗原の１種または複数の組合せ、５個以上のアミノ酸を含む前記抗原のアミノ酸サブユニットまたは前記サブユニットの１種または複数の組合せ。
【００２３】
例として挙げた病原体から得られる溶解物または培養液を抗原として使用してもよい。それらが抗原性および/または免疫性をもたらす限り、そうした画分は精製、濃縮または希釈した形としてもよい。したがって、本発明によれば、患者の腫瘍溶解物や腫瘍タンパク質の特異的セット抗原を微粒子に結合することにより、患者に応じて免疫原組成物を「テーラーメードで」作成することができる。
【００２４】
抗原は任意の腫瘍タイプまたは悪性腫に由来するものでもよい。抗原がガン由来の場合、そのタイプの例としては乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、および結腸ガンおよび黒色腫が挙げられる。腫瘍から得られる特異的抗原の別の例は、黒色腫特異的抗原(例えば、MAGEシリーズ抗原)、結腸由来のガン胎児性抗原(CEA)、nm23ガン抗原および他のガン抗原、または任意の腫瘍から抽出された実際の抗原、例えば、MUC-1〜MUC-7抗原などのムチンである。組換えペプチドまたはタンパク質を単独でまたは組合せて使用してもよい。
【００２５】
抗原はさらに、上に挙げた1種または複数の抗原に基づく模倣物(mimic)またはペプチドミメティック(peptidomimetic)などの合成エピトープでもよい。
【００２６】
「結合した」という用語は、微粒子と抗原の間の結合を指す。これは吸着によるものでも、複合体形成、共有結合によるものでもよい。好ましくは、抗原は、微粒子に共有結合で結合する。さらにより好ましくは、抗原は微粒子表面に結合する。
【００２７】
微粒子という用語は小さな粒子を指す。これは、ビーズ状もしくは球状または他の適当な形とすることができる。
【００２８】
本願では、「ウイルス・サイズの粒子」(VSP)という用語は、本発明の免疫原組成物のある実施形態について説明するために使用する。用語VSPは便宜上用いられるだけであり、本発明が既知のウイルス・サイズに限定されないことが理解されるべきである。例えば、未知のウイルスと同じサイズの粒子も本発明が想定するものである。
【００２９】
本発明の微粒子は、中空であるか分子をカプセルに入れる従来技術のミクロスフェアとは異なるものとして、好ましくは、複合化または結合する抗原に安定性をもたらす固体コアを有する。抗原が粒子の表層に存在する場合、本願では便宜上これをウイルス・サイズの固体粒子(VSSP:virus sized solid particles)と呼ぶ。VSSPを作るために使用する粒子は、メーカーから入手可能で実質的に均一のサイズ(つまり規定サイズの±10%以内)である。
【００３０】
「固体コア」という用語は、実質的に固体である(つまり、粒子は中空ではない)ことを意味する。免疫原の組成物の機能を低めるものでない限り、微粒子は任意の適当な材料から構成されるものでよい。したがって、微粒子は、ラテックス、鉄分子、金(金のナノ粒子など)、ガラス、リン酸カルシウム、ポリスチレンまたはPLG(ポリリシンg)などの生分解性かつ生体適合的なポリマー材料などで作ることができる。好ましくは、微粒子はポリスチレン、PLGまたは金から構成される。最も好ましくは、微粒子はポリスチレン製である。
【００３１】
微粒子は、既知のウイルスと同じサイズ内にある。これは、微粒子が好ましくは約0.50μm未満であることを意味する。好ましくは、微粒子は、免疫応答を誘発するのに適合したサイズである。特にそれは、人間のまたは動物被験者の抗原提示細胞による取込みに適合したものである。より好ましくは、微粒子は、約0.03と0.50μmの間、好ましくは約0.03と0.15μmの間、さらに好ましくは、約0.03と0.10μmの間である。さらにより好ましくは、微粒子は約0.03と0.05μmの間であり、より好ましくは微粒子は約0.03μmと0.049μmの間であり、さらにより好ましくは微粒子は、0.03と0.04μmの間または0.04と0.049μmの間である。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用する微粒子の集合、例えば、ワクチンの1回投与分は均一のサイズである。これは、与えられた集合中の大多数の粒子が規定のサイズであることを意味する。
【００３３】
好ましくは、微粒子/抗原組成物は細胞性および/または体液性の免疫応答を誘発するのに特に適合したものである。細胞性応答は、好ましくはTH細胞、特にIFNおよびIL-4産生T細胞、CTL、特にCD8 CTLおよびB細胞の活性化、成熟または増殖からなる群から選択される。好ましくは、微粒子/抗原組成物は、抗原のMHCクラスI提示メカニズムを誘発する。これは、カヴェオール(caveole)および/またはクラスリン(clathrin)ピットが関わる従来未知のメカニズムによって開始され、実施例4および7で説明するようなRab 4非依存およびTAP依存プロセスによってさらにプロセッシングされる。体液性応答は、好ましくは、IgA、lgD、IgG、IgMおよびそのサブクラスからなる群から選択される。
【００３４】
免疫応答の増加や増幅を支援する細胞を組成物によって刺激してもよい。これらの例としては、骨髄またはリンパ(その両方)起源のDCなどのAPCおよびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞の成熟、活性化または増殖が想定されるが、T細胞、例えば、CD 40、CD 80およびCD 86と相互作用する、前記細胞に対する共同刺激的なリガンドまたは分子も同様である。
【００３５】
本発明の免疫原組成物は、抗原との接触により、またはこれに伴って引き起こされる疾病や症状の治療、予防または防止に使用することができる。例えば、組成物は、ある種のガンの治療や予防に使用することができる。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの抗原を結合した微粒子(ここで、微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである)を含むワクチン組成物を提供する。本発明の組成物はそのままでも単回投与ワクチンとして特に有用で効果があるが、多数回投与療法において使用してもよい。
【００３７】
したがって、本発明は、1つの実施形態では、少なくとも1つの抗原を結合した微粒子(ここで微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである)を含む単回投与ワクチン組成物を提供する。
【００３８】
「単回投与」は、組成物またはワクチンの1回の投与によって、体液性および/または細胞性の免疫応答を最大のレベル(「最大」とはワクチン投与を繰り返してもさらに増加させることができないレベルを意味する)に刺激ないし増強し、または組成物の受容者に保護を与えることを意味する。投与は任意の適当な手段、例えば、注入(i.m、i.p、i.v)、経口投与、吸入、あるいは粘膜表面または粘膜部を通しての投与によって行うことができる。
【００３９】
好ましくは、抗原は微粒子の表面に結合する。微粒子のサイズは、直径で約0.03と0.5μmの間、好ましくは約0.03〜0.15μm、より好ましくは約0.03〜0.10μm、さらに好ましくは0.03〜0.05μm、さらに好ましくは約0.03〜0.049μmである。さらに好ましくは0.03〜0.04μmまたは0.04μm〜0.049μmである。微粒子は、最も好ましくはポリスチレン、PLG、ガラス、リン酸カルシウムまたは金から構成される。好ましい実施形態では、本発明に従って使用する抗原はそれぞれ均一のサイズの微粒子に結合する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの抗原を結合した、ウイルスと同じ範囲の大きさの微粒子を含む、体液性免疫応答および細胞性免疫応答を開始できる単回投与ワクチン組成物を提供する。
【００４１】
細胞性応答は、好ましくはTH細胞、CTLおよびB細胞の刺激、成熟または増殖からなる群から選択される。体液性応答は、好ましくは、IgA、IgG、IgMおよびそのサブクラスからなる群から選択される。好ましくは、IgG、IgAおよび/またはIgM応答が刺激される。
【００４２】
免疫応答の開始または増幅を支援する細胞を組成物によって刺激してもよい。これらの中には骨髄またはリンパ(その両方)起源のDCなどのAPCおよびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞の成熟、活性化または増殖が想定される。
【００４３】
「含む」という用語は上記と同じ意味である。
【００４４】
微粒子という用語は上記と同じ意味である。好ましくは、微粒子は動物中の抗原提示細胞によって取り込まれるのに適合するものである。好ましくは、微粒子は0.03と0.5μmの間、好ましくは0.03と0.15μmの間である。より好ましくは微粒子は約0.03と0.10μmの間であり、より好ましくは微粒子は約0.03と約0.05μmの間である。さらに好ましくは微粒子は約0.03〜0.049μmまたは0.04μmと0.049μmである。
【００４５】
「抗原」および「結合した」という用語は上記と同じ意味である。適当なものであればどのような抗原も、ワクチン投与を意図する症状/疾病に応じて使用してもよい。
【００４６】
患者に送達される本発明のワクチン組成物の量は臨界的でなく限定されない。有効量のワクチン組成物は、好ましくは一回の服用または投与後に抗原成分に対する免疫応答を刺激する量であり、望ましくは、強い細胞性応答および体液性応答をもたらす量である。組成物の量は、患者の(患者が免疫抑制されるか免疫刺激されるかに依存して)免疫の状態、主治医または獣医の判断、また、組成物を疾病状態を防止するワクチンとして用いるのかその治療に用いるか、あるいは腫瘍の形成を防ぐワクチンとして使用するのか、既存の腫瘍の治療に用いるのかによって変えることができる。例として挙げれば、患者は、本発明の組成物を1μg〜10,000μg、より好ましくは50μg〜5,000μg、さらに好ましくは100μg〜1,000μg、さらにより好ましくは本発明の組成物100μg〜500μgを受容することができる。アジュバントは一般に必要ない。しかし、免疫付与のためにアジュバントを使用してもよい。適当なアジュバントとしては、ミョウバンやヒト投与用ワクチン技術においてよく知られた他の任意のアジュバントが含まれる。
【００４７】
本発明のワクチンは、注射によって投与してもよいし、経口ルート経由や吸入によって、あるいは粘膜表面または粘膜部位を経由して投与してもよい。1つの実施形態では、本発明のワクチンは遺伝子銃によって投与する。鉄微粒子および金微粒子は、本発明に従って使用するのであれば遺伝子銃による投与に特にふさわしい。しかし、抗原を有する他のタイプの微粒子もこの方法で投与してもよい。例えば、マラリア・ライブラリー、DNAまたはプラスミドに由来する抗原は、Smooker PMらが「Expression library immunisation protects mice against a challenge with virulent malaria.」、Vaccine、18(22):2533-2540(2000年)-その全内容が本参照によって本願に組み込まれている-に記載した手順に従って遺伝子銃によって有効に投与されることが示された。ワクチンは単回投与によるものでも、複数回投与によるものでも、あるいはプライム-ブースティング(prime-boosting)によるものでもよい。
【００４８】
さらに別の実施形態では、本発明は対象に微粒子(ここで微粒子はウイルスと同じサイズである)に結合した少なくとも1つの抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を投与することを含む対象の免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００４９】
対象は免疫応答の誘発が望まれるいずれの人間または動物でもよい。これはペットや家畜(牛、羊、馬、雌牛、ブタ、ヤギ、ラマ、鶏、ダチョウ、エミューなど)および在来および新種の動物、野獣および野生動物を含む。
【００５０】
「含む」という用語は上記と同じ意味である。
【００５１】
免疫学的に有効な量とは、好ましくは1回の投与後に対象の免疫応答を生成するのに十分な量を指す。これは上に挙げたものを含む多数の要因、および対象がヒトか動物か、その年齢、体重などによって変わる。
【００５２】
「抗原」および「結合した」という用語は上記と同じ意味である。
【００５３】
「免疫応答」という用語は、上記の細胞性応答と体液性応答を指すと共に、免疫応答を開始(mounting)するか増幅するのを支援する細胞による上記のような応答も指す。免疫応答は、特に、樹状細胞、特にDEC205+、CD40+およびCD86+細胞の増殖および/または発達(expansion)によってもたらされるものでもよい。
【００５４】
微粒子という用語は上記と同じ意味である。好ましくは、微粒子は、0.03と0.5μmの間、より好ましくは0.03と0.15μm、さらに好ましくは約0.03と0.1μmの間である。より好ましくは微粒子は約0.03と0.05μmの間であり、さらに好ましく約0.03と0.04μmの間または約0.19と0.049μmの間である。さらに好ましくは、抗原/微粒子組成物は強い細胞性および/または体液性の免疫応答を誘発するために特に適合したものである。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明は、微粒子に結合した少なくとも1種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む対象の免疫応答誘発方法であって、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および/または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約40nm〜50nmであり、最も好ましくは40〜49nmである。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、一回の投与によって抗原に対する保護免疫応答を誘発する方法であって、微粒子に結合した少なくとも1種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を一度だけ対象に投与することを含み、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および/または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約40nm〜50nmであり、最も好ましくは40〜49nmである。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、微粒子に結合した少なくとも1種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む免疫応答を誘発するために樹状細胞にin vivoで抗原を送達する方法であって、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および/または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約40nm〜50nmであり、最も好ましくは40〜49nmである。
【００５８】
また、本発明には、1種または複数の抗原を有し、大きさがウイルスと同じ範囲内である微粒子を、微粒子と抗原が結合するように接触させることを含む免疫原微粒子/抗原組成物を生産する方法が含まれる。当業者は、このような組成物を生産するために使用する技術はよく知っているであろう。
【００５９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例および図を参照して本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００６０】
図1:パネルA-マクロファージによる異なる大きさの粒子の差異的取込みを樹状細胞の場合と比較して示したグラフである。0.02、0.1または1ミクロンのサイズの蛍光性ビーズを1細胞当たり1000個、C57BL/B6マウスから得た培養腹膜浸出物マクロファージまたは骨髄由来樹状細胞と一夜インキュベートし、蛍光を発する細胞のパーセンテージをFACSCanによって評価した。3つの同様の実験のうちの1つを示してある。ビーズ濃度を10倍にして使用して、ビーズまたはBalb/c由来の抗原提示細胞による3時間パルスを行った場合でもビーズサイズの差異による同様の取込みにおける差異が得られた。パネルB-ウイルス・サイズ粒子は、in vivoではリンパ節細胞に優先的に見出される。LEFT C57BL/B6マウスの足の裏に、異なる大きさ(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1および2ミクロン)の0.1%蛍光性ビーズ溶液50μlを皮内接種し、滲出膝下リンパ節を10日後に取り出し、ビーズを取り込んだ細胞のパーセンテージをFACScanによって評価した。データは、3回の試料における蛍光性の細胞+/-標準誤差(SE)の平均パーセンテージとして示す。0.04および0.1ミクロンの粒子サイズは他のいずれのサイズの粒子よりも有意に高い取込みを示した(p>0.001)。0.1または1ミクロンのビーズのみを使用した同様の実験では、接種後3、6または9日に回収したリンパ節中、0.1ミクロンのビーズ取込みが、1ミクロンビーズの取込みを有意に上回っていた。パネルCおよびD-ウイルス・サイズの粒子は、リンパ節NLDC145+(DEC205+としても知られている)(パネルC)およびF4/80+(パネルD)細胞によって優先的に取り込まれる。蛍光性粒子を取り込んだリンパ節細胞をFACScan分析によって調べ、樹状細胞マーカーNLDC145/DEC205またはマクロファージ/単球マーカーF4/80の同時発現量を評価した。データは、ビーズ取込みにより蛍光性になったNLDC145+またはF4/80+細胞のパーセンテージを示す。
【００６１】
図2:パネルA-異なる大きさのビーズに結合したOVAによって免疫されたIFNγ産生CD8およびCD4 T細胞の誘導。C57BL/B6マウスを、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1または2ミクロン・サイズのビーズと結合したOVA100μgによって2度(10日の間隔)皮内に免疫し、追加刺激免疫の10日後に脾臓T細胞活性をIFNγELISPOTによって評価した。応答は、H-2Kb制限CD8 T細胞エピトープSIINFEKLまたは全OVAに対して測定した。OVAに対する反応性の評価の場合には、分析前に磁気ビーズ(Dynabeads)によって脾臓細胞をCD8 T細胞から除き、OVA応答性CD4 T細胞の定量を行った。SIINFEKLは2.5μg/mlで、OVAは25μg/mlで使用した。3回の同様の実験のうちの1回の結果を示す。1群当たり2匹のマウスがそれぞれの大きさのビーズで免疫された。ELISPOT培養を2回行い、試験した細胞100万個の当たりのスポット形成単位(SFU)の平均値を示す。標準偏差(SD)は常に平均値の20%未満であった。パネルB-SIINFEKLに応じた細胞傷害活性を有するT細胞とIFNγ分泌T細胞とのELISPOTによる相関。C57BL/B6マウスを大きさの異なるビーズ-OVAで免疫し、SIINFEKLに対する応答性を上記IFNγELISPOTによって評価した。さらに、細胞傷害活性を有するSIINFEKL特異的T細胞の数を制限的稀釈分析(limiting dilution analysis)により平行して測定した。クロム付与EL4細胞を単独でまたはSIINFEKL2.5μg/mlであらかじめパルス処理したものを標的として使用した。得られたデータは、これら2種の分析結果の間に強い相関(R二乗=0.9254)が存在することを示している。2回の同様の実験のうちの一方を示す。パネルC-異なる大きさのビーズに結合したOVAによる免疫によって誘導された抗体産生。パネルAに記載したマウスから血清を回収し、血清希釈物についてOVA特異的IgG応答性をELISAによって試験した。0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1または2ミクロンの大きさのOVAビーズ免疫を与えたマウスを個体ごとにプロットする。同様な2回の実験のうちの一方を示す。
【００６２】
図3:最適なT細胞応答を誘導するのに必要な抗原のビーズへの共有結合。パネルA-ビーズ結合OVAのみがMHCクラスI制限T細胞応答を説明する。C57BL/B6マウスを、事前透析を行わず(対照)または300Kd排除膜によってPBSに対して透析した後(透析)、0.04ミクロンのビーズに共有結合的に結合したOVAで免疫した。皮内免疫10日後にINFγ産生脾臓SIINFEKL特異的CD8 T細胞の誘導をELISPOTによって評価した。グループ当たり4匹のマウスについて複製ウェル中のELISPOTによって評価した平均+/-SEを示す。PANEL B-ビーズおよび可溶のOVAを同時投与した場合は最適のMHCクラスI制限T細胞応答を誘導するのには十分ではない。C57BL/B6マウスを、0.1ミクロンのビーズに共有結合させたOVA(ビーズ結合OVA)、または注射に先立って混合したOVA(ビーズ/OVA混合物)で免疫した。皮内免疫10日後にINFγ産生脾臓SIINFEKL特異的CD8 T細胞の誘導をELISPOTによって評価した。グループ当たり2匹のマウスについて複製ウェル中のELISPOTによって評価した平均T細胞前駆体頻度を示す。
【００６３】
図4:ウイルス・サイズ・ビーズ-OVAによる単回免疫はMHCクラスI制限T細胞を長期間持続的に高レベルに誘導するのに十分である。パネルA-C57BL/B6マウスを、ビーズ-OVA(0.1ミクロン)で、1、2または3回、14日の間隔をあけて皮内免疫し、それぞれの場合について最後の免疫の10日後にSIINFEKLに対するこれらのIFNγ応答をELISPOTによって調べた。1群当たり3匹のマウスが免疫になった。また、データは、各マウスにおける2回の分析結果の平均値を示す。同様な2回の実験のうちの一方を示す。パネルB-マウスをビーズ-OVA(0.1ミクロン)で一度免疫し、12日または82日後にSIINFEKLまたはOVAに対するINFγ応答をELISPOTによって試験した。図2と同様に測定したOVAに対する抗体レベルは82日目でも維持された。
【００６４】
図5:皮内免疫後に滲出リンパ節中においてビーズを取り込んだ細胞によるCD40発現の評価。未処理のC57BL/6マウス(左)または蛍光性の0.04μmフルオビーズ(fluo-beads)で足の裏の皮内に免疫されたマウス(右)から、注射48時間後に膝下のLN細胞を切除し、これらのマーカーに特異的な抗体に結合したPEで染色することによりCD40発現について分析した。FL-1=FITC陽性細胞(ビーズ+)およびFL-2=PE陽性細胞(マーカー+)。バックグラウンドの染色は無視できた(<1%)。左のパネルは、免疫していない動物から得た膝下LN細胞を表わし、右のパネルは、VSP-OVA免疫動物から得た同じタイプの細胞を表わす。
【００６５】
図6:0.1μmOVAビーズに応じたマウスの未熟および成熟DC増殖の誘導。C57BL/6マウスの後脚の脛骨および大腿骨から抽出した骨髄細胞からDCを得てGM-CSFおよびIL-4を加えて培養した。培養5日後に、細胞を1.25×106細胞/1.25mlの実験条件に分け、1000ビーズ/細胞の割合でビーズ結合OVA(0.1μm)をパルス処理した。パルス処理4日目に、適当な培地にLPSおよびTNFaを添加した。細胞のインキュベートを一夜続け、翌日、増殖チミジン分析をセット・アップし、一夜インキュベートした。各値は3回の平均±SD(パルス処理しないDCと実験群間でp<0.00001。対のないt-検定(unpaired t-test))を表わす。
【００６６】
図7:in vivoにおいて0.04μm粒子を取り込んだAPC表現型の同定(1μm粒子と比較)。0.04または1μmのフルオビーズ(fluobeads)-OVA50μlをC57/B6マウスの足の裏に注入した。48時間後に活性化と抗原提示細胞系の細胞マーカーを有するビーズ陽性細胞の同時染色を行うために膝下の滲出LNを分析した。3-14マウス/マーカーについて平均+/- SEを示す。0.04および1μmフルオビーズ+細胞は、DEC205、F4/80、CD40、CD80およびCD86の有意に異なる発現を有していた(p<0.05)。
【００６７】
図８Ａ：ＤＣによるウイルス・サイズ粒子取込みのメカニズム。骨髄由来の培養ＤＣを、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）［０（黒）、５（白）、１０μＭ（灰色）］、アミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（ＡＭＬ））［０（黒）、１（白）、３μＭ（灰色）］またはサイトカラシンＤ（ＣＤＤ）［０（黒）、０．２５（白）、０．５μｇ／ｍｌ（灰色）］と共に３０分間および０．０４μｍ０ＶＡ−蛍光性粒子を加えてさらに３時間インキュベートした。カヴェオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）、クラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）被覆ピット形成または食細胞運動の選択的な阻害は、１０μＭ ＰＭＡ、３ｍＭアミロライドおよび０．５μｇ／ｍｌＣＣＤについてそれぞれ１４、１５で報告されている。ＰＭＡとＡＭＬを共に使用する場合、ＰＭＡは１０μＭで一定とし、ＡＭＬは１（白）または３ｍＭ（灰色）加えた。蛍光を示す細胞数をＦＡＣＳｃａｎによって評価した。データは３回行った培養の平均＋／− ＳＤとして示す。
【００６８】
図8B:取込みメカニズムの確認。DCを、何も加えず、あるいはCDD1μg/ml、フィリピン(filipin:FIL)1μg/mlまたは塩化アンモニウム(AC)40mMと共に30分間、および0.04μmまたは1μmの蛍光性ビーズを加えてさらに3時間インキュベートした。カヴェオラ(caveolae)またはクラスリン(clathrin)被覆ピット形成の選択的な阻害は、1μg/mlフィリピンおよび40mM塩化アンモニウムについてそれぞれ14〜17、29で報告されている。蛍光を示す細胞数をFACScanによって評価した。データは3回行った培養の平均+/- SDとして示す。
【００６９】
図9:可溶OVAおよび1um-OVAビーズは0.05um-OVAビーズに匹敵する保護を誘導しない。C57/B6マウスを、0.05umまたは1umビーズに結合したOVA、可溶OVAで皮内(ID)に免疫するかまたは処理せず、次いで上記と同様に抗原に曝した。データは、各群8匹の10日目における個々の腫瘍サイズとして示す。2回行った同様の実験のうちの1回を示す。0.05um-OVAビーズ群と他の群のそれぞれの間の腫瘍発生率の差は有意なものであった:未処理(naive)に対しP=0.0001;可溶に対しp=0.0007;1umビーズ-OVAに対してp=0.0035。
【００７０】
図10:ウイルス・サイズ粒子は、初期エンドソームと同時局在しない(左)。骨髄由来DCを0.1ミクロンのビーズ-OVA(500ビーズ/細胞)と共に一夜インキュベートし、遊離ビーズを除くために穏やかに洗浄し、ガラス・スライド上にスピン・アウトして共焦点顕微鏡用に調製した。次いで、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、トリトンで浸透可能とし、初期エンドソーム・マーカーRab4の存在を、ビオチン結合モノクローナル抗体を用いて染色し、次いでストレプトアビジン-アレクサ(Alexa)で染色した。非結合0.04および0.1ミクロン・ビーズでも同様の結果を観察した。3回行った実験のうちの1回を示す。蛍光性0.1ミクロン・ビーズは、ビーズと共に30分または3時間インキュベートしたDCを使用したRab4染色では同様に同時局在を示さなかった。(右)マウスを、0.1ミクロンのビーズ-OVAを用いて後肢の足の裏に皮内注射し、48時間後、滲出膝下リンパ節を切除して上記と同様に共焦点分析を行った。Rab4マーカーおよびOVA結合または非結合0.1ミクロンまたは0.04ミクロンのビーズについて同時局在は全く観察されなかった。3回行った実験のうちの1回を示す。対照的に、1ミクロン・サイズの蛍光性ビーズで免疫した陽性コントロール・マウスでは同時局在が確認された。
【００７１】
図11:腫瘍からの保護。パネルA-C57/B6マウスを、OVA-VSSPで1回皮内(ID)免疫するか(免疫)、処理せず(未処理)、30日後に皮下注入によって5×106EG7(腫瘍細胞)でチャレンジした。腫瘍はカリパスを用いて測定した。1群当たり10匹の動物に対して個々の腫瘍成長曲線を示す。パネルB-上記と同様に腫瘍を誘導し、腫瘍成長8日目(免疫の日を0日目とする)に、6匹の動物を処理せず(未処理)、またはOVA-VSSPで皮内(ID)免疫した(免疫)。免疫後3〜13日目の個々の成長曲線を示す。
【００７２】
図12:VSSP免疫後に致死性マラリアの抗原投与を受けたマウスの存命。VSSP-OVA、VSSP溶解物または溶解物のみを100μgで皮内に1度免疫したC57/B6マウスを、500,000個の致死性マラリア原虫(Plasmodium yoelii)17XL感染C57/B6赤血球でチャレンジした。存命を毎日監視した。1群当たり5匹の動物が抗原に曝され、6回の代表的な実験のうちの1回を示す。同様の実験では、未処理マウスは2週間後に40%の存命率を示した(8/20匹のマウス)。溶解物は、標準のプロトコルを使用して、P.yoelii 17XL感染した赤血球の凍結解凍を繰り返し、超遠心分離し、VSPに結合させて生成した。
【００７３】
図13:抗原OVAについて前述したのと同様に抗原nm23を0.05μビーズ(VSP)に結合し、100μg/マウスの割合でマウスに皮内注射し、10日後のIFNガンマ活性を免疫された動物の脾臓についてELISPOTによって評価した。データidは、100万個の脾臓細胞についてnm23に応答する細胞の前駆体発生率をスポット形成単位(SFU/百万個)±平均値の標準偏差(SID)として示した。3匹のマウス(m1〜m3)の個々の応答を示す。
【００７４】
図14:ガン抗原nm23またはOVAを、標準プロトコルによりVSPに結合し100μg/マウスの割合で皮内注射した。10日後に、IL4分泌細胞の誘導をELISPOTによって評価した。データは、それぞれ免疫した3匹の個体マウスについてのSFU/100万+/-SDとして示す。
【００７５】
図15A:OVAに結合した0.05μmビーズ(VSP-OVA)で1度皮内免疫したマウス血清中のOVAへの抗体応答性および非免疫対照群(Aグループ)と比較した90日後のELISAによるその評価(Bグループ)。
【００７６】
図15B:図15Aのマウスと同じ血清について、2匹の未処理マウス(A2とA3)および3匹のVSP-OVAマウス(B2、3および5)中のOVA特異的IgE抗体の存在をELISAにより試験した。
【００７７】
図16:パネルA-単回免疫による長期持続性抗体応答の誘導。C57/B6マウスを、0.04μmビーズに結合したOVAで1度免疫し、その血清を異なる時点で採取した。OVA特異的IgG ELISAにおける4匹の動物各群の血清の405nmの+/- SE光学密度平均値を示す。未処理血清をネガティブ・コントロールとして示す。2回行った同様の実験のうちの1回を示す。全lgおよび非IgAまたIgMについても同様のELISA結果が検出された(図示していない)。OVAだけは、PBS免疫動物に対してIgG応答を誘導せず、完全フロイント・アジュバント(CFA)中のOVAは、単回投与0.05μmビーズ-OVA(図示していない)より対数的に高いIgG応答を誘導した。パネルB-0.04μmビーズ-OVAによる1度の免疫によるIFNγ産生T細胞の長期持続的高レベル誘導。C57/B6マウスを、0.04μmビーズ結合OVA(黒または格子縞模様の縦棒)、PBA中可溶OVA(白い棒)または0.04μmビーズと混合したOVA(灰色の縦棒)で1度皮内免疫した。10日後(黒、白、灰色の縦棒)または12か月後(格子縞模様の縦棒)にIFNγELISPOTによってSIINFEKL応答的な脾臓T細胞前駆体発生率を評価した。1群当たり4匹のマウスを試験し、2回行った同様の実験のうちの1回を示す。各群について100万個の細胞当たりのスポット形成単位(SFU)の平均値+/-標準偏差(SE)を示す。10分の1の抗原(10μg VSP-OVA)を使用した同様の実験において、1度の免疫が102+/-56のSIINFKL特異的脾臓細胞(100万個当たり;n=4)を誘導した。標準的なクロム放出試験でも、1度の免疫後10日目に細胞傷害性T細胞応答が観察された(E:T比=20:1における3/3動物についての特異的溶解は50%を超過。図示していない)。
【００７８】
図17:プライム/ブースト。C57/B6動物を未処理(処理なし)とするか、またはMUC1由来ペプチドcp13-32の100ugを完全フロイント・アジュバント中KLH70Ougと結合したもの(cp13)、マンナンに結合した組換えMUC1-GST融合タンパク質(MFP)または0.1um VSPと結合したMUC1-GST融合タンパク質(VSP)で皮内に1度プライムした。14日後に動物を、100万のMUC1タンパク質発現感染性ワクシニアウイルスで追加刺激し、10日後にcp13-32中エピトープに対する応答性をIFNgELISPOTによって評価した。示すデータは、2〜3匹の動物/群についての100万個の脾臓細胞当たりのIFNg産生細胞数の平均値+/-SEである。
【００７９】
図18:ポリスチレンとガラスの0.05umVSP-OVA粒子の比較。前述のもの(PS)と同様に、ポリスチレン0.05μmビーズをOVAに結合し、同じ方法でOVAを結合したガラス・ビーズ(G1)と比較した。さらに、ガラス・ビーズについて様々な化学処理を比較した。簡単に言えば、ガラス・ビーズを秤量し、固形分2.5%のPBS溶液に懸濁し2度洗浄した。小型遠心器(microfuge)中5分間の遠心分離によってPBSを除いた。ビーズ小球をph 7.4の8%グルタルアルデヒドPBS溶液に再懸濁し、室温で穏やかに一夜混合した。次いでビーズをPBSで3回洗浄し、PBSに再懸濁し、ml当たり500μgのタンパク質を加え5時間穏やかに混合した。次いで、ビーズをペレットとし、ペレットをo.5Mエタノールアミンに再懸濁することにより反応を停止し30分間混合した。次いで、ビーズをPBSで洗浄し、免疫(G2)のために使用した。ポリスチレン(PS)またはガラス(G1またはG2)VSP-OVAを100ug/マウスの量で皮内に免疫し10日後にELISPOTによって脾臓からSIINFEKL特異的IFNg分泌T細胞を定量した。データは1群当たり3匹の動物について個々の平均値+/-SEを示す。
【００８０】
図19:ビーズ結合および免疫性のモード。50mM MESバッファー(ph 6.0)に2mg/ml溶解させたオボアルブミンをポリスチレンカルボキシ変性0.05μmビーズ(固形分2%)と15分間混合した。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジアミドを各調製物に4mg/ml(pH 6.5)加え、室温で2時間インキュベートした。標準(グリシン)は、7mg/mlグリシンまたは1Mエタノールアミン(アミン)20μl(pH 7.4)、または1Mアミノアセタルデヒドジメチルアセタール(アルデヒド)20μl(pH 8.0)、または1Mエチレンジアミン(アルコール)20μl(pH 7.4)でクエンチした。調製物をおよそ16時間室温でインキュベートした。調製物はすべて、4℃のPBSで一夜透析した。アルデヒド調製物は、1MHCLの20μlでさらにクエンチし4時間インキュベートし、40℃のPBSで一夜透析した。2〜3匹のC57/B6マウスを、これらのVSSP-OVA粒子の各100ugで皮内免疫し、CD8 T細胞エピトープSIINFEKLへのIFNg ELISPOTによって脾臓中で評価した。結果を各動物の100万脾臓細胞当たりのSFUの平均値+/-SEとして示す。
【００８１】
【実施例】
実施例1:使用した材料および方法
マウスおよび免疫:6週齢から8週齢のC57BL/6およびBALB/cマウスをWalter and Eliza Hallから購入した。マウスは抗原結合ビーズ100μlを後肢の足の裏に皮内(ID)免疫した。
【００８２】
試薬:特に断らない限り、抗原オボアルブミン(OVA(等級III))および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジアミド(EDAC)を含む試薬はすべてSigmaから購入した。FACScanおよび共焦点分析用のモノクローナル抗体は、タンパク質Gカラム(Pharmacia)を用いて実験室でハイブリドーマ・ラインから取り出すか、またはPharmigenから購入した。FITC結合フルオスフェアおよびカルボキシル化フルオスフェア0.02〜2μはMolecular Probesから、また、非蛍光性カルボキシル化ミクロスフェアはおよびPolysciencesから購入した。次のマーカーに対する略語を使用した:MHCII、MHCI、CD11c、CD11b、F4/80、NLD-145、CD8alpha、CD40、CD80およびCD86。共焦点分析で使用する抗Rab4モノクローナル抗体はラッセル博士(Peter McCallum Research Institute)から頂いた。
【００８３】
抗原提示細胞:樹状細胞は、以前に公表された方法[5]に小さな修正を加え骨髄単球から調製した。簡単に言えば、細胞を媒体を用いて骨穴から洗い流すことにより後肢の脛骨および長骨から収穫し、次いで赤血球を溶解させた。細胞は、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)、4mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン硫酸塩および100μM β-メルカプトエタノールを添加したRPMI(CSL、AUST)中1X106細胞/mlをプレート塗布し、1000単位/mlGM-CSFおよび0.2ng/mlのIL-4を加えた。10ml培養物を37℃の高湿度CO2インキュベーター内に置いた100mm直径のペトリ皿中で5〜6日間成長させた。チオグリコレートを腹腔内注射してから3日後にマクロファージをマウス腹腔内(IP)から取り出し、記載されているように3日間培養して接着細胞分画を増やした[6]。
【００８４】
ビーズ抗原結合はメーカー指示に従って行った。簡単に言えば、OVAを0.05M MESバッファーpH 6.0中2.0mg/mlに希釈し体積比1:1で固形分2%(体積)のビーズと混合した、混合物を15分間穏やかに揺り動かし、次いで、4mg/ml EDACを加えた。混合物のpHは希NaOHで6.5に調節し、混合物は2〜3時間穏やかに揺り動かした。反応は、最終濃度100mMのグリシンで停止させた。30分間混合した後、調製物を冷PBS中で一夜透析した。調製物は直ちに使用したか、または後の使用のために0.01%のアジ化物を加えて4℃で貯蔵した。
【００８５】
細胞傷害性分析:これは記載されているようにして行った[3]。簡単に言えば、37℃の高湿度CO2インキュベーター内に置いた2mlのウェル・プレート中、ペプチド抗原10μg/mlを10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)、4mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン硫酸塩および100μM β-メルカプトエタノールを添加したRPMI(CSL、AUST)培地を用い2.5×106/mlの条件で7日間脾臓細胞を培養することにより細胞傷害性分析用のエフェクター細胞を生成した。3日目にインターロイキン2(10U/ml、組換えヒトIL2、リンフォカルト(Lymphocult)HT、Biotest、英国)を加えた。標的は51Crを付与したEL4細胞であり、単独でまたは予め10μg/ml SIINFEKLLペプチドもしくはオボアルブミン変形EL4細胞系で1時間プレパルス処理した。特に断らない限り分析は20:1のエフェクター:標的比で2回行った。自然溶解(培地のみ)および最大溶解(5%トリトンを用いた)はすべての標的に対して4回セット・アップした。4時間後に上清を収穫した。溶解率(%Lysis)は100×((実験放出-自然放出)/(最大放出-自然放出))として計算した。特異的溶解率(%SL)はペプチドによる%Lysis-ペプチドによらない%Lysisとして計算した。
【００８６】
細胞傷害性T細胞前駆体(CTLp)分析:CTLp分析は、以前に記述されるように行った[7]。CTLp発生率は、少なくとも6個のエフェクター細胞数(1×103-1.28×105)について、32のレプリケートの最小値から決定した。細胞はU-底マイクロタイター・トレーにおいて、5×105マイトマイシンC処理共通遺伝子(syngeneric)脾臓細胞と共に、10%のウシ胎児血清、5μM SIINFEKLまたはOVAおよび10U/ml rhIL-2を添加したDMEM中で培養した。7日後、各マイクロカルチャーを、104 51 Cr標識したEL4またはEG7を標的として含む100μl標的細胞懸濁液で培地100mlを替えることにより細胞傷害性を分析した。各ウェルにおいて51Cr放出が刺激剤のみと培養した104のエフェクターから、またはペプチドのみまたはrIL2のみを備えた刺激剤細胞からのアイソトープ放出量の平均値を標準偏差の3倍上回った場合、細胞傷害性が存在すると考えられた。線形の関係(0.987≦r2≦1)が、応答者細胞の数(線形スケール)と陰性ウェル発生率(対数スケール)の間に存在した。CTLp発生率は37%陰性ウェルを生成するのに必要な応答者細胞投与量の逆数として決定した[8、9]。CTLp発生率分析は、3回実行した。また、個々の発生率は平均値と20%以上は異ならなかった。
【００８７】
ELISPOT IFNγ分析:これは記載されているのと同様にして実行した[3]。簡単に言えば、新たに分離した5×106/mlの脾臓細胞100μlを、抗ネズミIFNγmAb(R4)(EACC)でプレコートした混合酢酸塩プレート(MAHAミリポア)上で18時間所定の刺激をしながらインキュベートした。各条件について2重のウェルをセット・アップした。使用する培地は上記のように成分を添加したRPMI1640(CSL)であった。一夜インキュベートした後、細胞を洗浄し、別のビオチン結合抗ネズミIFNγ(XMG.21-ビオチン、Pharmigen、CA、USA)mAbプレートでインキュベートし、エクストラビジン(extravidin)アルカリフォスファターゼ(A-AP)を1μg/ml(シグマ)で結合した。アルカリフォスファターゼ活性のスポットは比色定量のAP検知キット(Biorad、ヘラクレス、CA(アメリカ))を使用して検出し、また解剖顕微鏡を利用して数えた。データは、100万個の細胞当たりのスポット形成単位(SFU)として示される。SIINFEKL-ペプチドは2.5のμg/mlで利用した。
【００８８】
統計分析:各群で保護されたマウスの数をEpiInfoバージョン5.0パッケージのStatcalcプログラム中のχ２検定を使用して比較した。免疫性の研究では、ELISPOTおよびクロム放出応答を、Microsofエクセル・バージョン5.0aパッケージを用いたスチューデント検定を使用して群間で比較した。線形回帰分析を用いて、ウインドウズ版統計プログラム・パッケージ用SPSSを使用して免疫性と保護の間の相関性を評価した。
【００８９】
樹状細胞とマクロファージによるビーズ取込み:スライドガラス上で培養した3日齢マクロファージおよび5日齢樹状細胞培養物に5分から24時間までの間、異なるサイズの蛍光マイクロビーズを与えた。次いで、培養物を洗浄して遊離ビーズを除き、FACScanまたは共焦点分析のために調製した。
【００９０】
ビーズをin vivoで取り込む細胞の分析:滲出リンパ節と脾臓を免疫後12時間から12日以内の様々な時間間隔でビーズ免疫マウスから回収した。細胞を回収後および赤血球を溶解し洗浄後、FACscanまたは共焦点分析のために調製した。
【００９１】
細胞表面マーカー染色およびフロー・サイトメトリー:表面染色については、5×105細胞を、表面マーカーF4/80およびNLD-145、CDへのPE標識MoAbと共にインキュベートした。直接抗体に付けられないないときは、細胞を2回の洗浄後、第1の抗体に特異的な別のPE標識抗体と共にインキュベートした。第2の抗体が加えられた種の未処理血清は第2の抗体を用いたインキュベートの前にブロッキング・ステップで使用した。2回の洗浄後、細胞をPBS/0.2%パラホルムアルデヒドで洗浄し、FACScanフロー・サイトメーター(Becton-Dickinson)およびCellQuestソフトウェアで分析した。光散乱ゲートを設けて死細胞および非リンパ細胞を除外した。ビーズで免疫されているが何らの表面マーカーでも染色されていないものおよび表面マーカーに対するPE標識抗体で染色された未処理マウス由来の細胞を、FITCとPE放射スペクトルの間の重なりに対する補償量を決定するために使用した。
【００９２】
細菌に取り込まれたFITC標識ビーズの共焦点顕微鏡分析:2重の蛍光発生および伝達検知部を備えたOlympus製の走査共焦点顕微鏡をクリプトン・アルゴン・レーザー光源と共に使用し、様々なサイズの蛍光化ビーズがマクロファージまたは樹状細胞の貪食によって取り込まれたかどうか判断した。食細胞運動を決定するために0.5〜1.0ミクロン間のステップ・サイズで試料を通して連続する部分を得、Optiscanアナライザーで分析した。細胞は、フルオレセインとアレクサ(Alexa)594に対しそれぞれ488nmおよび568nmで起動され、530nmおよび610nmの帯域フィルターによってそれぞれ検出した。データ獲得の全プロセスにわたって、レーザー力は飽和レベル以下に維持し、利得およびオフセット・パラメーターは個々の実験内で維持した。
【００９３】
ELISA分析:OVAに対する抗体反応はELISAを使用して測定した。ポリ塩化ビニル・マイクロタイター・プレートをOVA(10μng/ml、0.2M NaHCO3バッファー、pH 9.6)で4℃で一夜覆った。プレートをPBS/0.05%Tween20で4回およびPBSで4回洗浄し、次いで、2%ウシ血清アルブミンで非特異的結合を室温1時間でブロックした。上記のように洗浄した後、マウス血清の連続稀釈液を加えて室温でさらに1時間インキュベートした。非免疫マウス血清をネガティブ・コントロールとして使用した。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIg(Selinus、AUS)および色原体基質2(2"-アジノ-ジ(3-エチルベンズチアゾリン)スルホネート(Amersham、英国)を用いて結合抗体を検出した。EL 312eマイクロプレート・リーダを使用して405nm吸収を記録した。
【００９４】
実施例2:in vitroおよびin vivoでの抗原提示細胞によるVSSPの優先的取込み
マクロファージ/単球由来細胞を用いた多数の研究が、粒子サイズに依存する食細胞運動を示しており、その最適の取込みサイズは直径1ミクロンである[10、11]。取込みは樹状細胞中で観察されたが、粒子サイズは包括的には試験されていなかった。本発明者はタンパク質で覆ったウイルス・サイズ(0.03-0.1μm)の粒子が樹状細胞またはマクロファージによって効率的に取り込まれるか否かを確証することに特に興味を持っていた。図1aはチオグリコレートが腹膜浸出物マクロファージが1μmおよび0.1μm両方のフルオレセイン標識粒子(fluo-ビーズ)を内部に取り込むことを示している。これに対し、骨髄由来の未熟な樹状細胞は、0.1μmサイズのfluo-ビーズを優先的に取り込むことが見出された。共焦点顕微鏡を使用して粒子が細胞内(図示していない)にあることを確認した。このin vitroでのデータは、in vivoでウイルス・サイズの固体粒子(VSSP)が抗原提示細胞によって優先的に取り込まれることを示唆した。蛍光性ポリスチレンタンパク質を、一連のサイズ(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1および2μm)の粒子に結合させ、C57BL/B6マウスの足の裏に皮内注射し、10日後にFACScan分析のために滲出膝下リンパ節から回収した。0.04〜0.1μmサイズの粒子は、リンパ節細胞によって優先的に取り込まれていた(図1b)。同様の結果は、非結合粒子と共に、粒子注入後1、3、6および10日目にリンパ節細胞を分析して得られた。VSSPは、マクロファージ表面マーカーおよび樹状細胞表面マーカー(図1b)の両方を発現する抗原提示細胞によって効率的に取り込まれた。骨髄由来樹状細胞もin vitroでさらにVSSPを取り込んだ。予想通り、これらの細胞は主に脊髄性の表現型であった[12]。
【００９５】
実施例3:抗体および細胞傷害性およびIFNγ分泌T細胞のVSSPプライム高前駆体発生率
In vivoでの樹状細胞による効率的なVSSP取込みは、標的抗原の送達のためにこれを使用することおよび新規なワクチンとして可能性を示唆した。C57/BLマウスを、オボアルブミン(OVA)被覆を施した0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1または2μmの粒子で免疫し、15日後に追加刺激し、10日後に血清または脾臓細胞を回収した。図2aは、MHCクラスI制限SIINFEKLエピトープに対して0.04μmサイズの粒子を使用して達成されたIFN-γ分泌CD8 T細胞誘導が最適の誘導となることを示す。CD4 T細胞のOVAへの応答は、0.04〜1ミクロンを変動するOVAを結合した粒子を備えた同様の前駆体発生率でも見出された。IINFEKLに対する細胞傷害性T細胞もVSSPで誘導され、IFNγ分泌T細胞前駆体発生率と相関している(R2=0.92)(図2b)。意外にも、0.04μm粒子で免疫し、次いで1μm粒子で免疫したマウスでは、OVA特異的IgGも最も高い前駆体発生率が見出された(図2c)。同様の免疫性結果はフルオレセインを含まないVSSPの使用でも見つかった。したがって、多くの免疫原およびアジュバントが細胞性または体液性応答の一方を優先的に促進するのとは対照的にVSSPは、両者をハイ・レベルで誘導することができた。
【００９６】
図2に示される結果は、結合後に残余の可溶抗原を除去せずに、同じ合計量の抗原を注入することに基づいている。図3aは、可溶抗原が透析または超遠心分離によって除去した後でも同様のT細胞応答が0.04ミクロンのVSSPで得られたことを示す。したがって、観察されたT細胞応答に対し可溶抗原からの重要な貢献はなかった。これは、結合しているOVAと結合していないOVAとVSSP混合物との比較によってさらに支持された。図3bは、共有結合したVSSPのみがSIINFEKL特異的T細胞を高レベルで誘導したことを示す。したがって、VSSPが共有結合的に付着することが、in vivoでOVAをクラスI提示経路へと導きクラスI制限T細胞を誘導するのに必要であった。より大きな粒子と比較して小さな粒子では結合するタンパク質の量が多くなり、それによりVSSP免疫性が高くなるという議論も可能であろう。しかし、実際はそうではなかった。理由は以下の通りである。1)0.04μmおよび0.02μmにサイズのピークがあるビーズでは免疫応答をほとんど誘導しなかった(図2)。2)0.04〜0.1ミクロンのVSSPは、抗原結合のレベルと無関係に1μm粒子より一貫して免疫原性が高かった。(3)1μm粒子の免疫濃度を100倍(1mg/マウス)まで増加させVSSP濃度以上としてもVSSPに結合した抗原の濃度範囲に見合う免疫原性の増強は得られなかった。および4)免疫において様々なサイズのビーズ上の結合タンパク質の量を等しくしても、あるいは、様々なサイズのビーズ数を同数としても、VSSPが一連の濃度範囲(全OVA 0.5〜1000ug、結合OVA 0.5〜50ug、動物1匹当たりのビーズ103〜108)で一貫して、より大きな粒子より高い免疫原性を示した。
【００９７】
実施例4:粒子の取込みおよびプロセッシングの新規経路
外来抗原の消化に由来したペプチドはクラスII MHCプロセッシング経路を通って、逆流(regurgitate)するか、引き続いて、細胞表面で空のクラスIMHC分子に結合することが示唆されている[1、10]。クラスI提示のこの代替メカニズムは、TAP(抗原処理に関連したトランスポーター)によって仲介される小胞体(ER)への輸送からは独立している。B型肝炎表面タンパク質VLPは、TAP独立したメカニズム[2]によってマクロファージ中クラスI提示のためにプロセッシングを受ける。本発明者は、OVAを結合したVSSPを用いてTAPノックアウトC57/BLマウスを免疫にした。TAP-KO動物中ではSIINFEKLまたはOVAに対してはバックグラウンド・レベル以上のT細胞応答を検知することができず、VSSPのクラスI提示プロセッシングが示唆されたが、対照的に、TAP依存性であった。外来抗原のTAPの依存性クラスI提示メカニズムは、1μm粒子上に吸着されたタンパク質について、細胞質へ抗原の細胞内取込み(endocytic)小胞の「漏れやすさ」に基づき偶発的に抗原を細胞質に放出するものと記述されている[1、10]。食細胞運動によって取り込まれたこうした大きな粒子の処理は、Rab4アダプタータンパク質を発現するリゾソームとの初期の結合ステップを含んでいる[13]。本発明者は、VSSPがこの経路を経由しているかのどうか決定するために共焦点顕微鏡を使用した。図4は、皮内のVSSP投与の24時間後、小胞を含むRab4およびVSSPフルオビーズが培養中の骨髄由来樹状細胞にも、in vivoのリンパ節細胞においても同時局在しなかったことを示す。したがって,、VSSPは、Rab4独立かつTAP依存性であるという点において、VLPやこれより大きな粒子が使用するプロセッシング経路のいずれとも異なる経路を使用するのであろう。このメカニズムについては、実施例7でさらに調査した。
【００９８】
実施例5:VSSPはin vivoおよびin vitroで抗原提示細胞の発達を誘導する。
C57BL/6マウスを処理しないか(未処理)、蛍光性0.1μmフルオビーズで足の裏を皮内免疫した。膝下のリンパ節(LN)を注射48時間後に切除し、このマーカーに特異的な抗体と結合したPEで染色することによりCD40発現を分析した。
【００９９】
結果(図5)は、0.04、0.05および0.1μmポリスチレン・ビーズが、単独でもOVAに結合しても、皮内免疫後に滲出膝下リンパ節から回収される細胞総数を4倍まで増加することができたことを示している。さらに、それらは、NLDC145+(樹状細胞マーカー)の割合を1.5倍に増加させたがF4/80+(単級/マクロファージ・マーカー)細胞の割合は増加させなかった。また、それらは、活性化分子CD40およびCD86を発現するリンパ節細胞の割合を1.5倍以上に高めた。図5は、免疫後にFACScanによって観察されたCD40+細胞の増加(33%〜63%)の例を示す。さらに、それは、これらの細胞の多くが0.04μmビーズを取り込んだことを示す(このケースでは、我々は、蛍光性の緑の核を備えた0.04μmビーズを使用した)。
【０１００】
0.04、0.05μmおよび0.1のポリスチレン・ビーズは単独でもOVAに結合しても、マウス骨髄からin vitroで精製された樹状細胞を増殖まで誘導することができた。未熟であって、成熟に至らない(LPSとTNF-alphaによる活性化の後に)樹状細胞はVSSPのこの活性化効果を受けやすかった(図6)。
【０１０１】
これらのデータは、サイズが0.04〜0.1μmの粒子(VSSP)が、樹状細胞を含む抗原提示細胞、特にCD40とCD86などの共同刺激的な分子に対する効果を発現する細胞を刺激して増殖発達させる、これまで知られていなかった能力を疑いなく有することを示唆する。これは、なぜそれらがそれほどかくも強力かを説明する。さらに、それは、それら化学的に結合しない場合であっても、抗原に対する反応についてもVSSPがアジュバント効果(下記の実施例14を参照)を有するメカニズムを示唆する。
【０１０２】
実施例6:注射後迅速にVSSPを取り込んだ細胞の表現型の展開
足の裏に皮内注射した際にどの細胞がVSSPを急速に取り込むか(したがって、その後の免疫活性化に寄与している可能性があるか)についてさらに評価するために、滲出膝下リンパ節を切除した。次いで、蛍光性のコアを備えた0.04μmVSSP-OVAを取り込んだ細胞の表現型をFACScanによって分析し、同一の粒子ではあるがサイズが1μmの粒子と比較した。図7は、0.04μmビーズ+または1μmビーズ+の割合が、個々の表現型のマーカーとして現れていることを示す。0.04μmビーズを取り込む細胞はほとんどNLDC145+、CD40+およびCD86+であった。さらに、より多くのCD11c+、CD4+およびCD8+細胞が、1μmビーズ+より0.04μmビーズ+であった。0.04μmビーズを取り込んだ細胞のこの高度に活性化されたDC表現型はさらに、なぜ我々が観察した免疫応答、特にCD8 T細胞応答がかくも有力かを説明するであろう。
【０１０３】
実施例7:微粒子の取込みおよびプロセッシング
樹状細胞(DC)による0.04μmビーズ-OVA取込みのメカニズムを検討するため、骨髄由来DCを、食細胞運動(サイトカラシンD、CDD)抑制剤;クラスリン・ピット抑制剤(アミロライド(amiloride、AML))またはカヴェオール仲介吸収抑制剤(ホルボール・ミリスチン酸酢酸塩、PMA)と共にインキュベートした[14、15]。DCを、所定の濃度で30分間、PMA、AML、CDD、フィリピン(FIL)または塩化アンモニウム(AM)(すべてSigma社から入手)を用いた培養を3重に行った。さらに3時間後、OVA蛍光0.04μmビーズを加え、FACScanによって定量した。
【０１０４】
PMAおよびAMLは両者ともDCによる0.04μmビーズ-OVA取込みを減少させた。しかし、CCDはどのような阻害作用も引き起こさなかった(図8a)。PMAとAMILによる阻害は付加的(additive)であった(図8a)。このことは、クラスリン・ピットおよびカヴェオールが両方ともVSSP取込みに関係することを示唆している。
【０１０５】
受容体仲介エンドサイトーシスに必要なNa+-H+交換を阻害することによりアミロライドは作用を及ぼす[14]。発明者はさらに、細胞質ゾル酸性化を妨害することによりクラスリン・ピットの組立てを阻害する塩化アンモニウム[14]を用いて試験した。塩化アンモニウムは、0.04μmサイズのビーズの取込みを阻害したが1μmサイズではそのような効果を示しておらず(図8b)、クラスリン・ピットの役割がVSSP取込みに関与していることを裏付ける。カヴェオールはDCにおいてウイルス粒子取込みに新しいメカニズムを仲介していることが示唆されている[15]。本発明者はPMAの使用がカヴェオールがDCにおいてVSSP取込みに関係していることを示唆するものと結論する(図8a)。これを確認するために、発明者は、カヴェオールの別の阻害剤であるフィリピンを使用した。フィリピンはコレステロールの分離によって作用を及ぼし、PMAはカヴェオール吸収を規制するリン酸化イベントに影響する[14、15、16、17]。PMAと同様にフィリピンは、1μmビーズ取込みではなく0.04μm取込みをブロックして発明者の仮説を確認した(図8b)。
【０１０６】
カヴェオールとクラスリン・ピットは核内性(endosomal)であり、リソソーム・コンパートメントへ分子を輸送することができる[14、16]。あるいは、カヴェオールは、抗原を直接細胞質ゾル[17]に送達して、MHCクラスIの提示のために、細胞質のプロセッシングおよびTAP依存性の小胞体内への輸送に結びついている可能性もある[1、18]。
【０１０７】
これらの結果は、実施例4において示したものと共に、本発明に従って示された抗原プロセッシング用の新規経路を示す。本発明の免疫原の組成物は、カヴェオールおよび/またはクラスリン・ピット(抗原はその後にRab4独立でTAP依存性のMHCクラスI提示経路によって処理される)経由で抗原提示細胞によって取り込まれるように見える。この観察結果は、カヴェオールのTAP依存性の抗原処理経路およびそのCD8細胞誘導能力は、これまでに報告されていなかったという点において新規である。
【０１０８】
100,000個のOVAを発現する腫瘍細胞(EL4)を用いた皮下の抗原投与からマウスを保護する能力について、50nm(すなわち、0.05μm)(VSSP)OVA結合粒子をOVA単独と直接に、または、1000nm(つまり1μm)OVA結合粒子と比較した。マウスはすべて上記のいずれか100μgで1度皮内免疫し(または処理なし=未処理)、次いで、30日後に腫瘍で抗原投与した。図9aは、VSSP-OVAは完全にOVA発現腫瘍の成長を防いだが、OVA単独または1000nmビーズでは保護に有意な効果がなかったことを示す。
【０１０９】
実施例9:単回VSSP免疫が高レベルの免疫を誘導し、腫瘍抗原投与に対し保護する。
OVA結合VSSPを用いた皮内免疫でIFNγ産生および細胞傷害性SIINFEKL特異的T細胞を誘導した(図10aおよび1aまたは1b)。追加的な免疫は応答性を増加させなかった(図10aおよび10c)。免疫82日後でも高い前駆体発生率でT細胞を維持することができる(図10d)。抗体応答も同様に維持された(図16)。単回VSSP免疫によって達成されたCD8 T細胞前駆体発生率レベルはVLP粒子の単回または多数回投与で観察される値よりも高く、高度に効率的な異種起源のプライム/追加刺激療法のみがこれに匹敵した[1、2、3、19、20]。高いINFγ産生および細胞傷害性T細胞前駆体発生率は、多くの細胞内病原体およびガンからの保護に関係している[21、22、23]。本発明者は、OVA結合VSSPの単価回皮内投与によりC57/BLマウスを免疫にし、次に、EG7腫瘍細胞系(これは細胞質のOVAを発現し、細胞傷害性SIINFEKL特異的T細胞のin vitroでの標的である)でそれらに抗原投与した。結果は、VSSPで免疫にしたマウスが、完全に腫瘍の抗原投与から保護されたことを示す。一方、未処理の対照ではすべて腫瘍が成長した。さらに、図2cで観察したのと同様に、抗原結合VSSPの単回投与に引き続いて抗体レベルも増加した。
【０１１０】
VSSPワクチン例のさらなる検討
以下の実施例10〜13は、VSSPが様々な抗原と共に使用することができ、INF産生およびIL4産生T細胞の両方を含む広い免疫を誘導することを公式に実証する。単回投与後、IgGは高レベルであるが、アレルギーと関わるIgE抗体は潜在的な量でしか誘導されない。
【０１１１】
VSSPの治療における有効性はさらに2つのモデルで示される。1)確立している腫瘍の100%の除去(実施例10参照)および2)ワクチンの単回投与後の致死マラリアからの保護(実施例11参照)。様々な疾病に対する単回投与ワクチンを開発するために、これらは、VSSPを極めて有力で柔軟なワクチン・プロトコルとしてさらに確認する。さらに、これらの発見に基づけば、ガンの予防および治療のためにもVSSPが使用できると発明者は信じる。
【０１１２】
実施例10:確立した腫瘍の除去
本発明者は、ビーズ-OVAを用いた1度の免疫で、その後にOVAを発現する腫瘍による抗原投与に対して完全な保護がなされることを観察した。
【０１１３】
C57/B6マウスを、100μgビーズ(0.05μm)-OVAで1度(皮内)免疫するか、または処理しないまま放置した(未処理)。30日後に、マウスは5×106EG7腫瘍細胞系で抗原投与した。免疫後3〜13日目に腫瘍サイズをカリパスを用いて測定した。退縮状態を検討するため、マウスにEG7細胞を与え、8日後に同様の腫瘍サイズ分布のグループに分けた。1群は未処理のままとし、他方は3日後(つまり腫瘍細胞系投与後の11日目)にビーズ-OVAで免疫した。
【０１１４】
発明者は、腫瘍に罹患しているマウスを1度免疫するだけで、確立した腫瘍を治癒できることを以下に示す。腫瘍は1度の注射後2週以内に免疫したマウスから除かれた。この治療効果は、どのようなガンワクチンと比べても非常に特殊なことであり、このワクチン・ビヒクルを治療用ワクチンの開発において非常に有用なものとしている(図11B)。
【０１１５】
ムチン-1またはMuc1は乳ガンに伴う抗原である。VSSP-Muc1タンパク質で1度免疫した場合でも、さらに乳ガン抗原を発現する腫瘍細胞系で抗原投与したマウスにおいて腫瘍の形成が阻止された(図11A参照)。
【０１１６】
実施例11:マラリアからの保護
本発明者は、直径0.05μmのポリスチレン・ビーズがマウスにおいてマラリアからの保護を誘導するためのビヒクルとして使用できることを実証する。マラリア原虫(Plasmodium yoelii)からの溶解物を赤血球を感染させ、ビーズに結合してマウスの免疫に使用し、次いで、このマウスを致死量の寄生生物で抗原投与した。
【０１１７】
P.yoelli 17XLに50%の赤血球感染率(parasitaemia)で感染したC57BL/6マウスから血液を採取した。800gで15分間遠心分離した後に赤血球(RBC)を回収し、冷凍-解凍を3回繰り返した上、超音波で処理した(溶解物)。溶解物は上記のような0.05μm粒子に結合させた。ビーズ-溶解物、ビーズ-OVAまたは溶解物のみを皮内注射した。2週間後、免疫したC57BL/6マウスまたは未処理C57BLマウスを腹膜内注射により、1,000,000個のP.yoelli 17XL感染RBCで抗原投与した。
【０１１８】
動物はすべて抗原投与を生き残ったが、溶解物のみ(ビーズ結合なしで)免疫した動物の60%は、感染を抑えることができず死んだ(図12)。これは単回投与ワクチンで血液段階マラリアからの保護を実現した最初の例である。単回投与ワクチンは、マラリアや第3世界において広範囲に見られる他の伝染病に対して、ワクチンの投与および分配を単純化し広い人口をカバーできるので特に魅力的である。
【０１１９】
実施例12:細胞の免疫
1)ガン抗原nm23などのOVA以外の抗原を結合した直径0.05μmのポリスチレン・ビーズも、IFNガンマ分泌T細胞の高レベルの誘導によって証拠づけられるように強い細胞免疫を誘導する(図13)。
2)細胞免疫を誘導するのと同様に、ビーズ-OVAまたはビーズ-nm23は、IL4を高レベルで誘導する(図14)。このリンホカインは、他の抗体の産生を促進するが、これは、なぜ細胞性免疫(これはINNガンマを要求する)と同様に良好な抗体誘導も観察されたかを説明していると言えるだろう。
【０１２０】
実施例13:抗体免疫
1)OVAに結合した直径0.05μmのポリスチレン・ビーズは、1度の皮内(ID)注射後にIgG抗体を高い滴定濃度で誘導した(図15A)。
2)高いIgGレベルにもかかわらず、検知できるIgEレベルはない。したがって、このワクチンは(アレルギーに関係するため)潜在的に有害なIgE応答を誘導する危険を有しないことが公式に実証された(図15B)。
【０１２１】
実施例14:様々な投与ルートおよびIgGおよびIgA抗体の誘導
ワクチンのヒトへの有用な投与ルートを決定する目的で、上記と同様な皮内経由の他、OVA結合VSSP(100μg/マウス)を、マウス腹膜内、皮下、鼻内、また直腸内に投与した。1群当たり3〜4匹のマウスを1度の免疫の30日後に試験した。ELISPOT分析(1/50,000〜1/2,000脾臓細胞)によって、皮内と同様にすべてのルートでSIINFEKLまたはOVAに対してIFNgを分泌するT細胞が誘導された。意外にも、皮内注射を用いたこれまでの観察結果ではIgGが高レベルで誘導される反面IgAはほとんどないか全く誘導されなかったのに対して、これらの他のルートによるVSSP-OVAは血清IgA応答を誘導し、直腸内と、鼻内ルートでは検知できるIgGが誘導されなかった(滴定濃度<1/100)(表1)。したがって、直腸内、腹膜内、鼻内または皮下ルートによるVSSPは、粘膜の伝染病(例えば、肺、子宮頚部または腸内)などのIgAが保護機能を果たす場合にも疾病への保護免疫を誘導するために使用することができる。
【表１】
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【０１２２】
2回投与による異常に高いIgG応答:
VSSP-OVAで2度免疫(100μg/マウス;14日を隔てて)で驚くほど高い血清lgの生成が得られ、ELISAによって評価したIgG抗体滴定濃度は1/500,000を超えていた。乳ガン抗原nm23およびマラリア抗原MSP4/5をVSSPに結合して2度免疫した後、特異的IgG抗体についても同様の結果が得られた。
【０１２３】
実施例15:長期持続的応答
VSSP-OVAに対する応答は驚くほど持続的であった。図16は、1度の皮内免疫(100μg/マウス)の1年後でも、強いIgGOVA特異的抗体を示すELISA(パネルA)およびSIINFEKLに対するCD8 T細胞応答を示すIFNg ELISPOT(パネルB)が存在することを示す。さらにパネルBは、最適の免疫原性を得るためには固体粒子に抗原が共有結合しなければならないことを示す。
【０１２４】
実施例16:異種起源のプライム-ブースト
プライミングを行わなかったもの、完全フロイント・アジュバント(CFA)中のMUC1由来のペプチドcp13-32(cp13)、マンナン結合MUC1(組換えMUC1-GST融合タンパク質)(M-FP)または0.1μm VSSP-MUC1(組換えMUC1-GST融合タンパク質)(VSSP)によってプライミングを行った動物の応答をブースト(追加刺激)するために牛痘-MUC1を使用した。図17は、VSSP-MUC1でプライムされた牛痘-MUC1ブースト群では、MUC1のペプチド13〜32領域に対する応答が、牛痘MUC1を単独で(無/V、VSSP/Vと比較)受け取った動物と比較して増強されたことを示す。したがって、VSSP抗原は異種起源のプライム-ブースト・プロトコルで使用するに適しているであろう。
【０１２５】
実施例17:VSSP用固体コアの材料組成
0.04-0.05μmサイズの固体コアVSSPが免疫原性の主要な決定要素であるという発明者の仮説からはポリスチレン以外の材料で作られた粒子も、このサイズ範囲内であれば高度に免疫原性を示すであろうと予測される。したがって、発明者は、ポリスチレン(PS)またはガラス(G1またはG2)で作られており、同じ化学的操作(G1)またはグルタルアルデヒド(G2)を使用してOVAに結合させた0.05μm粒子を用いて皮内に1度免疫したマウスの免疫原性を比較した。図18は、ポリスチレンまたはガラスで作られたVSSPが同様に高度に免疫原性であり、SIINFEKLに対するIFNg産生T細胞の前駆体発生率を高レベルで誘導することを示す(ELISPOTによる)。したがって、タンパク質結合用のVSSPの固体コアはポリスチレンによるばかりでなくガラスでも提供することができ、他の材料、例えば、PLGも固体コアとして機能を有することが予想される。
【０１２６】
実施例18:VSSPへの抗原の結合
0.05μm粒子と混合した抗原は抗原単独よりも高い免疫原性を示すが、共有結合による結合が最適の免疫原性に必要なことを結果が示している。したがって、VSSPに抗原を結合させるために使用する化学的操作が理論上免疫原性の決定要素となり得る。特に、粒子の全面的な帯電は、特異的血清または他の内在的なタンパク質との相互作用を促進することができた。これらは、その結果として、理論上樹状細胞による取込みを促進し、高い免疫原性を誘導することができる。このために試験するために、マウスを、表面帯電量が異なる50nm(つまり0.05μm)の粒子で免疫した。OVA-VSSPはカルボン酸塩で修飾したナノ粒子を使用しているため全体として負電荷を有しており、グリシンを備えたOVAとの結合後には活性化されたカルボン酸基がクエンチされる(グリシン、図19)。また、エタノールアミンとの反応をクエンチすることにより、結合後の電荷はOVAの純電荷を除いて中和することができる(アルコール、図19)。エチレンジアミンでクエンチすることによって、正電荷が導入される(アミン、図19)。アミノアセタルデヒドジメチルアセタールでクエンチすることによって、潜在的に有用なアルデヒド基を導入することができる(アルデヒド、図19)。結合プロトコルにおけるこれら3種の修飾はすべて免疫原性が高い粒子となるが、アミンとアルコールによる修飾はグリシンに匹敵し、アルデヒドはわずかに免疫原性が低くなる。したがって、粒子への反対の電荷の導入が同様の免疫性をもたらすと共に血清タンパク質の非特異性の吸着による限りではほとんどあり得ない程高い免疫性である。さらに、結合操作に若干の代替的修正を加えれば、免疫原性を減少させることなく電荷を変化させることができる。
【０１２７】
考察
上記の結果を考慮すれば、本発明の組成物は、様々な伝染病、ガンまたは他の疾病に適用が可能なワクチンまたはワクチン戦略をさらに改善ないし最適化する方法を提供する。
【０１２８】
VSSPの最適のサイズは、ほとんどの既知のウイルス(30〜150nm)のそれと一致する。従って、それはVSSPの使用が生物学上重要であると推測してもよいように思われる。上記の観察から、発明者は、VSSPのサイズ範囲の粒子に完全に反応するように、免疫系が適応し得ると信じる。本発明の前には、免疫応答の刺激はウイルスのサイズ範囲内の免疫の刺激物のサイズに大きく依存し、特に他の病原体(例えば、バクテリア、菌類)由来のエピトープは相当に大きいということは知られていなかったし理解されていなかった。実際に、この経路を通って誘発される標的抗原は、驚くほど広く(免疫応答の両腕である細胞性免疫と体液性免疫の両者を含む)かつ強い応答(長く持続的な高いエフェクターT細胞前駆体発生率を迅速に誘導する)は、免疫系がウイルスのサイズの粒子に完全に反応するために適応していることを示唆している。HepB表面タンパク質または酵母レトロトランスポゾン・タンパク質(Ty)で構成されたVIP(つまり粒子に結合されない純粋な抗原)を利用する従来の研究も単回免疫投与によって導入される広く長く持続的な免疫を示していたが、VSSPに比べれば、その応答はまだ10〜100倍も低かった[1、2、3、19、20]。しかし、サイズ以外の要素、例えば、その脂質やマンナン成分、または膜結合タンパク質なども、VLPがクラスI制限T細胞応答を誘導するの能力の原因と考えられていた[1]。理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者は、in vivoにおけるVSSPによる樹状細胞などの抗原提示細胞への効率的に標的とする組合せは、その後にタンパク質分解による潜在的な遅い抗原放出が続き、特に強力な免疫原性を生成したのではないかとも考えている。
【０１２９】
新規ワクチンとしてのVSSPの使用は、OVAモデルにおいてガン細胞による抗原投与を引き続いて行った場合、これからの保護を果たす単回免疫投与の能力により実証された。本発明者は、乳ガンで発現する抗原であるムチン-1(MUC-1)に対する広く強い免疫原性および保護も観察した。それらの動物研究で利用した皮内投与ルートは、人間にも容易に実施することができる。VSSPは、このようにヒトのワクチン開発のために特に魅力的で単純な戦略を提示し、特に、体液性免疫と細胞性免疫の両者が保護生成に参加する、マラリア、ガンおよびウイルス性疾病、顕著には、AIDSおよび肝炎[10、12、21、25-28]などの疾病に対して有効である。また、組換え抗原をクラスI提示経路の標的とすることにより、多数のエピトープに対するT細胞応答誘導の可能性を提示し、したがって、MHCの様々な標的ヒト集団におけるそうしたワクチンの使用にも及び得るであろう。
【０１３０】
現在、CTLの有効な刺激のためのDCのプライミングは、DCのex vivoでのパルス処理によっているが、これは高価で、物流的にも困難である。本発明は、効率的にDCにin vivoで抗原を送達し、これに続けて抗原特異的CD8 T細胞の多数の誘導および免疫保護をもたらす代替法を提供する。0.04-0.05μmの狭いサイズ範囲内のVSSPがCD8 T細胞を誘導する能力は非常に高いが、これはMHC1処理経路および/またはAPC機能の直接刺激を標的として、APCによる、または有力な部分集合による効率的な取込みの結果であり得る。VSSIPの取込みは、他のサイズと比較して、リンパ節中で増強されると判明し、また、この増強は粒子陽性DEC205+細胞、すなわちDCマーカーの発生率が増加することによる。DCは強力なAPCであり、CD40およびCD86の発現はさらに効率的なCD8T細胞プライミングの有能な部分集合を特徴づける。これらのマーカーは、VSSP+細胞中に高い割合で見つかった。したがって、in vivoにおけるこの有力なDC部分集合におけるVSSPの取込みおよび選択的な局在化は、発明による微粒子の免疫原性を説明する。
【０１３１】
本発明のVSSPの他の利点には、多数のルートを経由しての投与に続きIgA生産を含む免疫応答を誘導する能力およびプライム-ブースト・ワクチン戦略に適している点が含まれる。
【０１３２】
さらなる研究は、VSSPにユニークな免疫応答を誘発させる生理学的メカニズムを決定するためにVSSPを使用することを含むであろう。
【０１３３】
ここに記載した本発明については、他の様々な実施形態が、本発明の基礎となる中心的概念から外れることなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。
【０１３４】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】  マクロファージによる異なるサイズの粒子の差異的取込みを樹状細胞の場合と比較して示したグラフである。
【図２】  異なるサイズのビーズに結合したOVAによって免疫されたIFNγ産生CD8およびCD4 T細胞の誘導(パネルA)、SIINFEKLに応じた細胞傷害活性を有するT細胞とIFNγ分泌T細胞とのELISPOTによる相関(パネルB)および異なるサイズのビーズに結合したOVAによる免疫によって誘導された抗体産生(パネルC)を示すグラフである。
【図３】  最適なT細胞応答を誘導するのに必要な結合が抗原のビーズへの共有結合であることを示すグラフである。
【図４】  C57BL/B6マウスをビーズ-OVA(0.1ミクロン)で間隔をあけて皮内免疫した場合についてSIINFEKLに対するこれらのIFNγ応答をELISPOTによって調べた結果(パネルA)およびマウスをビーズ-OVA(0.1ミクロン)で免疫しSIINFEKLまたはOVAに対するINFγ応答をELISPOTによって調べた結果(パネルB)を示すグラフである。
【図５】  皮内免疫後にビーズを取り込んだ滲出リンパ節中細胞によるCD40発現を示すグラフである。
【図６】  0.1μmOVAビーズに応じたマウスの未熟および成熟DC増殖の誘導を示すグラフである。
【図７】  in vivoにおいて0.04μm粒子を取り込んだAPC表現型の同定を示すグラフである。
【図８Ａ】  DCによるウイルス・サイズ粒子取込みのメカニズムを示すグラフである。
【図８Ｂ】  図8Aの結果を再確認したグラフである。
【図９】  可溶OVAおよび1μm-OVAビーズおよび0.05μm-OVAビーズの保護効果を示すグラフである。
【図１０】  細胞の共焦点顕微鏡写真像である。
【図１１】  C57/B6マウスを、OVA-VSSPで1回皮内(ID)免疫するか(免疫)、処理せず(未処理)、5×106EG7(腫瘍細胞)を皮下注入30日後に抗原投与した結果を示すグラフである。
【図１２】  VSSP免疫後に致死性マラリアの抗原投与を受けたマウスの存命結果を示すグラフである。
【図１３】  抗原nm23を0.05μビーズに結合し(VSP)、100μg/マウスの割合でマウスに皮内注射し、10日後のIFNガンマ活性を免疫された動物の脾臓についてELISPOTによって評価した結果を示すグラフである。
【図１４】  ガン抗原nm23またはOVAを、標準プロトコルによりVSPに結合し100μg/マウスの割合で皮内注射し、10日後に、IL4分泌細胞の誘導をELISPOTによって評価した結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】  OVAに結合した0.05μmビーズ(VSP-OVA)で1度皮内免疫したマウス血清中のOVAへの抗体応答性および非免疫対照群(Aグループ)と比較した90日後のELISAによるその評価(Bグループ)を示すグラフである。
【図１５Ｂ】  図15Aのマウスと同じ血清について、2頭の未処理マウス(A2とA3)および3頭のVSP-OVAマウス(B2、3および5)中のOVA特異的IgE抗体の存在をELISAにより試験した結果を示すグラフである。
【図１６】  単回免疫による長期持続性抗体応答の誘導を示すグラフ(パネルA)および0.04μmビーズ-OVAによる1度の免疫によるIFNγ産生T細胞の長期持続的高レベル誘導を示すグラフ(パネルB)である。
【図１７】  C57/B6動物を未処理(処理なし)とするか、またはMUC1由来ペプチドcp13-32の100μgを完全フロイント・アジュバント中KLH70Ougと結合したもの(cp13)、マンナンに結合した組換えMUC1-GST融合タンパク質(MFP)または0.1um VSPと結合したMUC1-GST融合タンパク質(VSP)で皮内に1度プライムし、次いで追加刺激した結果を示すグラフである。
【図１８】  ポリスチレンとガラスの0.05umVSP-OVA粒子の比較を示すグラフである。
【図１９】  C57/B6マウスをVSSP-OVA粒子で皮内免疫し、CD8 T細胞エピトープSIINFEKLへのIFNg ELISPOTによって脾臓中で評価した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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