(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、ベータ−１，３−グルカン構造、ベータ−１，４−グルカン構造及びベータ−１，６−グルカン構造の分解によって形成され、免疫機能を増進したことを特徴とする、２４．８ｋＤａ〜３２ｋＤａの分子量を有する低分子量のベータグルカンを製造する方法：
１）ベータグルカンを溶媒に溶解する工程、及び
２）工程１）の溶解物に３０〜５０ｋＧｙ吸収線量のガンマ線を照射する工程。
【請求項２】
工程２）の溶解物を追加的に乾燥する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
溶媒が、緩衝溶液、培養液、アルコール及び蒸留水からなる群から選択されたいずれか１種であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０及びセシウム（Ｃｓ）−１３７からなる群から選択されたいずれか１種の放射性同位元素から放出されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
ガンマ線が、コバルト（Ｃｏ）−６０放射性同位元素から放出されることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法によって製造された、低分子量のベータグルカン。
【請求項７】
低分子量のベータグルカンが、照射された吸収線量に比例して粘度が減少することを特徴とする、請求項６に記載の低分子量のベータグルカン。
【請求項８】
低分子量のベータグルカンが、照射された吸収線量に比例して溶解度が増加することを特徴とする、請求項６に記載の低分子量のベータグルカン。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用薬学的組成物。
【請求項１０】
低分子量のベータグルカンが、照射された吸収線量に比例して脾臓細胞のＴ細胞活性を増加させることを特徴とする、請求項９に記載の免疫増進用薬学的組成物。
【請求項１１】
低分子量のベータグルカンが、照射された吸収線量に比例して脾臓細胞のサイトカイン分泌を増加させることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫増進用薬学的組成物。
【請求項１２】
サイトカインが、ＩＦＮ−ｒまたはＩＬ−２であることを特徴とする、請求項１１に記載の免疫増進用薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、抗酸化用薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線の照射を使用した低分子量のベータグルカン（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ）を製造する方法、及びそれによって製造された低分子量のベータグルカンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
放射線の照射とは、非常に多量の放射線を物質に照射することによって化学反応が起きるようにしたり、生物の細胞を破壊したり、または細菌を死滅させる効果を利用した方法の総称である。またガンマ線の照射とは、コバルト−６０放射性同位元素から出る短波長の光であるガンマ線を食品や医療用品などにあてることであり、これにより重大な伝染病の細菌や寄生虫及び害虫を完全に死滅させることができる有益で効果的な方法が、ガンマ線照射技術である。ガンマ線は、数センチメートルのコンクリートを透過する程度の高浸透力を有した波長なので、保健医療製品を完全密封した状態で照射処理しても無菌製品を生産することができる。コバルト−６０から放出されるガンマ線は、電子のような荷電粒子に比べると、透過力が強いので液体や固体の内部まで照射するのに相応しい。医療器具の殺菌や食品照射目的には、コバルト−６０線源が使用されている。牛、豚屠畜血液血漿タンパク質パウダーにガンマ線を照射して衛生的血粉を製造する方法が提示されており（特許文献１）、またとうもろこし澱粉に一定条件のガンマ線を照射して澱粉の物理化学的性質を工程的に変化させる方法が提示されている（特許文献２）。
【０００３】
一般的に、放射線照射機は、イリジウム−１９２等の放射性同位元素をカプセルに内蔵して、それを螺旋が形成された螺旋部材（現場でピッグテール（ｐｉｇ  ｔａｉｌ）と呼ぶ）、すなわちピッグテールの一端に連結して、ピッグテールの残りの一端にコネクター（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）を連結した構成からなる放射線源アッセンブリー、該放射線源アッセンブリーを遮蔽状態で内部に保管するためのソースコンテナと、放射線源アッセンブリーと連結して放射線源アッセンブリーを移動させるための制御ケーブルアッセンブリーと、ソースコンテナに連結されて検査時に検査対象物体の位置まで放射線源アッセンブリーを案内するソースガイドチューブ装置からなっている。ソースコンテナには、放射線源の放射線を遮蔽するための放射線遮蔽物質が設置されていて、内部にＳ字形態の放射線源アッセンブリー保管部が形成されている。制御ケーブルアッセンブリーのチューブ内部とソースガイドチューブ装置のチューブ内部には、ピッグテールが回転しながら移動できるように螺旋が形成されている。制御ケーブルアッセンブリーは、チューブとギア、ハンドルなどから構成されている。前記のような放射線源アッセンブリー、ソースコンテナ、制御ケーブルアッセンブリー、ソースガイドチューブ装置の構成は、一般的な内容であるためここでは詳しく説明しない。前記のような放射線照射機の構成と動作過程は、特許文献３などを参照することにより詳細に理解できる。
【０００４】
ベータグルカン（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ）は、多糖類の一種で、人間の正常な細胞組織の免疫機能を活性化させて癌細胞の増殖と再発を抑制して、免疫細胞の機能を活発にさせるインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）及びインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）の生成を促進させる。活性ベータグルカンは、癌細胞がある体内に入って行ってサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を生産させることで、免疫細胞であるＴ細胞とＢ細胞の活動を支援して細胞組織の免疫機能を活性化することができる。
【０００５】
ベータグルカンは、微生物、きのこ類または穀類などから抽出して使用されていて、その種類も多様である。ベータグルカンを生産する微生物では、１−３結合ベータグルカンを生産するサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ４系統（特許文献４）と、１−３結合ベータグルカンを生産するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の変異株が知られている（特許文献５）。
【０００６】
多糖の一種であるグルカンは、Ｄ−グルコースのみを構成糖とするブドウ糖重合体で、連結形態によってベータ（ｂｅｔａ）あるいはアルファ（ａｌｐｈａ）型に区分される。特に、ベータグルカン（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ）は、ブドウ糖単位体がベータ（ｂｅｔａ）−グリコシド結合により１、３番位置に連結された基本骨格であり、さらに４番（１，４結合）あるいは６番（１，６結合）炭素に側鎖を有し、このような側鎖の有無によって構造的な差異とともに物理化学的性質を左右することが知られている。きのこ、酵母及び植物から分離したベータグルカンは、一般的に広く分布していて、キロ−ダルトン（ｋｉｌｏ−Ｄａｌｔｏｎｓ）からメガ−ダルトン（ｍｅｇａ−Ｄａｌｔｏｎｓ）までの分子量範囲を有している高分子量多糖類である（非特許文献１）。ベータグルカンは、ゲル化能力と水溶液での高い粘性のため、小規模の食品産業でのみ使用されている（非特許文献２）。また、ベータグルカンは、米国で次世代機能性健康食品として相当な販売量を示しており、１９８３年米国ＦＤＡが規定する一般安全基準（ＧＲＡＳ規格  ｔｉｔｌｅ  ２１，ｖｏｌ３）に記載されている。
【０００７】
しかし、ベータグルカンは、人体の経口投与時に吸収される割合が相当に低い。これは、ベータグルカンが、基本的な糖単位体が架橋した（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）重合体を含む巨大な分子で成り立っているからである。ベータグルカンは、水に不溶性で抗酸化的特徴があり、経口投与時に巨大な分子量のために胃での吸収が妨げられる。このように巨大分子のベータグルカンの吸水性は、巨大な分子を消化する胃腸内部経路での特定酵素の不足のために低い。これは、分子量が大きくて、水に不溶性であるグルカン前駆体が免疫調節因子として効率的になるために、高い濃度で特定受容体に結合して、細胞内に吸収されることがうまくいかないためと考えられる。
【０００８】
また、ベータグルカンの高い粘性は、機能性食品の添加剤として難しさを有している。例えば、麦芽製造を妨害して、麦汁の分離を阻害し、ビールのろ過分離、ソース、サラダドレッシング及びアイスクリーム生産を難しくして、好ましくない沈殿物を形成する（非特許文献３）。このような食品添加剤としての使用が難しいのは、ベータグルカンの高い粘度のためである（非特許文献４）。ベータグルカンの高い粘度は、分子量及び高い濃度に関連がある（非特許文献５）。そのため、多糖類への特別な分子量の適用が求められている。
【０００９】
ベータグルカンを食品及び医薬品などに多様に使用するためには、分子量が低く、水に対する水溶性及び吸水性増加だけではなく、免疫学的反応に効率的なベータグルカンが求められている。したがって、分子量が相対的に小さくて水溶性であり、適切な受容体に最適に結合して、胃腸内壁での全体的な吸収を高めるためのベータグルカンを製造する方法が求められ、人体での免疫学的機能が向上した免疫調節因子として、低分子量のベータグルカンが求められている。
【００１０】
先行研究において高分子は、酸処理（非特許文献６）、酵素処理、物理的処理（非特許文献７）によって、ベータグルカンの分子量を減少させることができた。しかし、このような方法は、初期反応に添加物を使用し、そして副生成物（ｓｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を形成するため、より多くの精製が必要である。
【００１１】
しかし、ガンマ線照射技術は、初期反応における添加物使用及び副生成物の形成がないため、前記の方法より簡単であり、さらに環境親和的である。ガンマ線照射技術の重要な長所は、照射された物質の最終生物学的滅菌であり（非特許文献８）、生物学的商品製造のために容易に使用することができることである。高分子を低分子化させる放射線の重要な長所は、化学的反応試薬の添加とその他の温度、環境、添加物の調節のような特別な操作を必要とせずに、再現性と量的変化を促進する能力を有していることである（非特許文献９）。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ベータグルカンをさらに効果的で安全な食品添加剤として使用するために、ガンマ線照射技術を適用して、構造的な特性において短所がなく、粘性と分子量の減少、溶解度及び微生物学的安全性を改善することにある。
【００１３】
そこで、本発明者は、低分子量のベータグルカンの製造方法に関して鋭意研究し、ベータグルカン溶液にガンマ線を照射すると、ベータグルカンの分子量が減少し、高分子量のベータグルカンより放射線の照射によって得られた低分子量のベータグルカンが粘性が減少して溶解度が増加し、還元糖変化能、抗酸化性、脾臓細胞増殖能及びサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）分泌量などが増加するということを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成した。
【特許文献１】韓国特許１０−０４５８９６５号
【特許文献２】韓国特許１０−０１５６４３９号
【特許文献３】韓国特許公開番号２００３−００２９３１７号
【特許文献４】米国特許第５、５０４、０７９号
【特許文献５】米国特許第５、５０９、１９１号
【非特許文献１】１Ｈ  Ｙａｍａｄａ，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｂ．Ｓ．（Ｅｄ），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｔｈｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅ，２０００年，第４４巻、１５頁
【非特許文献２】Ｄａｗｋｉｎｓ，Ｎ．Ｌ．等，Ｆｏｏｄ  ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１９９５年，第９巻，１−７頁
【非特許文献３】Ｃａｒｒ，Ｊ．Ｍ．等，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９０年，第６７巻，２２６頁
【非特許文献４】Ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｆ．Ｈ．（Ｅｄ．），Ｏａｔｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．，１９８６年，１２１−１５２頁
【非特許文献５】Ｂｅｅｒ，Ｍ．Ｕ．等，Ｃｅｒｅａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６年，第７３巻，５８−６２頁
【非特許文献６】Ｈａｓｅｇａｗａ等，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，１９９３年，第２０（４）卷，２７９−２８３頁
【非特許文献７】Ｉｌｙｉｎａ等，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００年，第３５（６）卷，５６３−５６８頁
【非特許文献８】Ｈｕｇｏ，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｂｉｏｄｅｔ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．１９９５年，第３６（３．４）卷，１９７−２１７頁
【非特許文献９】Ｃｈａｒｌｅｓｂｙ，Ｒａｄｉａｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１９８１年，第１８（１．２）卷，５９−６６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、放射線照射を使用した低分子量のベータグルカン（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ）を製造する方法、及びそれによって製造された低分子量のベータグルカンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は放射線の照射を使用して低分子量のベータグルカンを製造する製造方法を提供する。
【００１６】
また本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを提供する。
【００１７】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
また本発明は、薬学的に有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、免疫増進方法を提供する。
【００１９】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンの免疫増進用薬学的組成物の製造のための使用を提供する。
【００２０】
また本発明は、前記低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、抗酸化用組成物を提供する。
【００２１】
さらに本発明は、薬学的に有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、抗酸化方法を提供する。
【００２２】
また本発明は、前記低分子量のベータグルカンの抗酸化用薬学的組成物の製造のための使用を提供する。
【００２３】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用健康食品を提供する。
【００２４】
また本発明は、前記低分子量のベータグルカンの免疫増進用健康食品の製造のための使用を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、アトピー予防及び改善用機能性化粧品を提供する。
【００２６】
また本発明は、有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、アトピー予防及び改善方法を提供する。
【００２７】
同時に本発明は、前記低分子量のベータグルカンのアトピー予防及び改善用機能性化粧品の製造のための使用を提供する。
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明の低分子量のベータグルカンは、下記の工程からなる製造方法によって製造される。
１）ベータグルカンを溶媒に溶解する工程、及び
２）工程１）の溶解物に放射線を照射照射する工程。
【００３０】
前記製造方法において、工程１）のベータグルカンは、微生物、きのこ類または穀類などから得ることができ、または市販されているベータグルカンを購入して使用することができる。
【００３１】
前記製造方法において、工程１）の溶媒は、蒸留水、緩衝溶液、培養液またはアルコールを使用することができるが、これらに限定されるものではなく、またこれらを２種以上組み合わせて使用しても良い。本発明の実施例では蒸留水を使用した。
【００３２】
前記製造方法において、工程２）の放射線は、放射線源にガンマ線、電子線またはＸ−線を使用することができ、ガンマ線を使用することが好ましいが（Ｄａｕｐｈｉｎ  ＪＦ等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１３１−２２０頁）、これらに限定されるものではなく、またこれらを２種以上組み合わせて使用しても良い。
【００３３】
前記ガンマ線は、コバルト（Ｃｏ）−６０、クリプトン（Ｋｒ）−８５、ストロンチウム（Ｓｒ）−９０またはセシウム（Ｃｓ）−１３７等の放射性同位元素から放出されるガンマ線を使用して照射することが好ましく、コバルト（Ｃｏ）−６０放射線同位元素から放出されることがさらに好ましいが、これらに限定されるものではなく、またこれらを２種以上組み合わせて使用しても良い。前記放射線の吸収線量は１０〜１００ｋＧｙであることが好ましく、３０〜５０ｋＧｙであることがさらに好ましいが、これに限定されない。１００ｋＧｙ以上の線量では、ベータグルカンの分子量が減少しすぎて所望する免疫活性が示されず、１０ｋＧｙ以下では分子量の減少が微小に現れるため前記のような吸収線量を設定した。
【００３４】
前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンは、分子量が１ｋＤａ〜１００ｋＤａであることが好ましく、２５〜６０ｋＤａであることがさらに好ましいが、これに限定されない。本発明の実施例では、ベータグルカンの分子量を測定した結果、ベータグルカンの非照射区の分子量は１７０ｋＤａ以上を示す一方、ベータグルカンにガンマ線の照射を１０及び３０ｋＧｙした場合、３０〜６０ｋＤａ範囲に分子量が減少し、５０ｋＧｙ以上のガンマ線の照射では、２５ｋＤａ以下の分子量のベータグルカンが得られたことを確認することで、ガンマ線の照射によって、多糖類であるベータグルカンの一定部分が分解されて低分子化されたことを確認することができた。
【００３５】
本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを提供する。
【００３６】
酵素処理は、ベータグルカンを低分子化するのに効果的であり、ベータ−１，３−グルカン及びベータ−１，４−グルカン構造は分解が容易であるが、ベータ−１，６−グルカン構造を切断することはとても難しい。しかし、放射線照射技術では、すべての構造をランダムに分解することができた。したがって、放射線の照射によって得られた低分子化されたベータグルカンは、酵素処理とは異なる分子構造を有するようになる（Ｉｌｙｉｎａ，Ａ．Ｖ．等，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００年，第３５（６）卷，５６３−５６８頁；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，Ｔ．等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６年，第６０（９）卷，１５３２−１５３４頁）。
【００３７】
本発明の実験例では、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンの粘度、溶解度及び還元糖を測定した。その結果、照射された低分子量のベータグルカンの粘度は、蒸留水に溶解した処理区への放射線の照射線量が増加するにしたがって減少し、５０ｋＧｙで顕著に減少した。このような多糖類の粘度変化は、ガンマ線照射線量に依存した多糖類分子の切断現象のためであることが知られている。また、照射された低分子量のベータグルカンの溶解度は、蒸留水に溶解した処理区への放射線の照射線量が増加するにしたがって増加し、５０ｋＧｙで著しく増加した。このようなガンマ線の照射による溶解度増加は、分子構造の破壊と変性によって低分子粒子を生成するためであることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００２年，第８２巻，１５９９−１６０５、頁）。併せて、照射されたベータグルカンの還元糖は、蒸留水に溶解した処理区への放射線の照射線量が増加するにつれて増加し、５０ｋＧｙで著しく増加した。還元糖が増加したということは、ポリマーが放射線に影響を受けて切断されたことを意味し、切断された糖の末端部位の、すなわち還元力を有した部位を測定したものである。したがって、還元糖含量の増加は、解重合反応（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）により、グルコースのような低分子量の糖が生成されたためであることが分かる。
【００３８】
前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンは、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンのすべてのベータグルカンの構造が無作為に断片化されたことを特徴とする。すなわち、酵素処理は、ベータ−１，３−グルカン及びベータ−１，４−グルカンの構造のような弱い構造は容易に分解するが、ベータ−１，６−グルカンの構造は分解するのが難しい。しかし、放射線の照射は、このようなベータ−１，６−グルカンの構造も容易に切断をすることができる。
【００３９】
本発明の実験例では、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンの含量を測定した結果、照射されたベータグルカンは、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンの含量がすべて減少した。しかし、酵素や酸処理の方法は、ベータ−１，６−ベータ−１，３−グルカン（ｂｅｔａ−１，６−ｂｅｔａ−１，３−ｇｌｕｃａｎｓ）を、効果的に加水分解することが難しいと報告されている（Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｊ．等，Ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００３年，第１８（５）卷，３５２−３５５頁）。したがって、放射線の照射によって任意的にグルカン構造が切断されたベータグルカンを得ることができるという事実を確認することができた。
【００４０】
本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用薬学的組成物を提供する。
【００４１】
また本発明は、薬学的に有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、免疫増進方法を提供する。
【００４２】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンの免疫増進用薬学的組成物の製造のための使用を提供する。
【００４３】
前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンは、脾臓細胞のＴ細胞活性を増加させることを特徴とする。本発明の実験例では、試験管内及び生体内においてベータグルカンによるＴ細胞活性への効果を測定した結果、照射されたベータグルカンによるＴ細胞活性の変化は、蒸留水に溶解した処理区への放射線の照射線量が増加するにつれて増加し、特に、５０ｋＧｙの放射線量で照射されたベータグルカンが、Ｔ細胞活性を著しく増加することを確認した。
【００４４】
前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンは、脾臓細胞のサイトカインの分泌を増加させることを特徴とする。本発明の実験例では、試験管内及び生体内においてベータグルカンによるサイトカイン分泌能への効果を測定した結果、照射されたベータグルカンにより、Ｔｈ１から分泌されるサイトカインであるＩＦＮ−ｒ及びＩＬ−２は、ベータグルカンへのガンマ線の照射が増加するにつれて、有意的にサイトカイン分泌が増加することを確認することができた。
【００４５】
ゆえに、本発明による放射線が照射された低分子量のベータグルカンが、優れた免疫調節機能を有するという事実が分かった。
【００４６】
本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、抗酸化用組成物を提供する。
【００４７】
また本発明は、薬学的に有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、抗酸化方法を提供する。
【００４８】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンの抗酸化用薬学的組成物の製造のための使用を提供する。
【００４９】
前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンは、ＤＰＰＨラジカル消去能力が増加することを特徴とする。本発明の実験例では、ＤＰＰＨラジカル消去能力を測定した結果、照射されたベータグルカンのＤＰＰＨラジカル消去能力が高く示され、照射線量が増加するにつれて有意的に増加した。
【００５０】
本発明の前記低分子量のベータグルカンを医薬品に使用する場合、 同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上を追加して含むことができる。
【００５１】
前記低分子量のベータグルカンは、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００５２】
すなわち、本発明の低分子量のベータグルカンは、実際の臨床投与時に経口及び非経口の様々な剤形で投与することができ、製剤化する場合には普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の低分子量のベータグルカンに少なくとも１種以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、一般的に使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤ではプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐薬の基材では、硬化油脂（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００５３】
低分子量のベータグルカンの投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様であり、一日投与量は、低分子量のベータグルカンの量を基準に、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは３０〜８６ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは５０〜６０ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜６回投与することができる。
【００５４】
本発明の低分子量のベータグルカンは、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００５５】
本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを有効成分として含む、免疫増進用健康食品を提供する。
【００５６】
また本発明は、前記低分子量のベータグルカンの免疫増進用健康食品の製造のための使用を提供する。
【００５７】
本発明の前記低分子量のベータグルカンを食品添加物に使用する場合、前記低分子量のベータグルカンをそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康または治療的処置）によって相応しく決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時に本発明の組成物は、原料に対して１５重量部以下、好ましくは１０重量部以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするまたは健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でもよく、安全性面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００５８】
前記食品の種類には、特別な制限がない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的な意味での健康食品をすべて含む。
【００５９】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり一般的に約０．０１〜０．０４ｇであり、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００６０】
前記の他に本発明の低分子量のベータグルカンは、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ぺクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の低分子量のベータグルカンは、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、本発明の低分子量のベータグルカン１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００６１】
本発明は、前記製造方法によって製造された低分子量のベータグルカンを有効成分として含むアトピー予防及び改善用機能性化粧品を提供する。
【００６２】
また本発明は、有効な量の前記低分子量のベータグルカンを個体に投与する工程を含む、アトピー予防及び改善方法を提供する。
【００６３】
さらに本発明は、前記低分子量のベータグルカンのアトピー予防及び改善用機能性化粧品の製造のための使用を提供する。
【００６４】
ベータグルカンは、免疫機能増進作用を通じて皮膚炎症緩和、補湿作用効果を示してアトピー疾患の予防及び改善効果がある（ｐｉｌｌａｉ，Ｒ．等，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２００５年，第４９９巻，１２７８−１２７９頁）。本発明は、巨大分子であるベータグルカンを低分子量に製造して、経皮での吸収率が増大するので、アトピー疾患の予防及び改善用機能性化粧品として有用に使用することができる。
【００６５】
本発明の前記低分子量のベータグルカンを化粧品に使用する場合、前記低分子量のベータグルカンを有効成分として含んで製造される化粧品は、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態で製造することができる。乳化剤形の化粧品では、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどがあり、可溶化剤形の化粧品では柔軟化粧水がある。
【００６６】
相応しい化粧品の剤形では例えば、溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）、非イオン型の小滴分散剤の形態、クリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシーラーステックの形態で提供することができる。また、泡沫（ｆｏａｍ）の形態または圧縮された推進剤をさらに含んだエアゾール組成物の形態でも製造することができる。
【００６７】
また、前記化粧品は、本発明の低分子量のベータグルカンに追加で脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封止剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮蔽剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小滴または化粧品に通常的に使用される任意の他の成分のような化粧品学分野で通常的に使用される補助剤を含むことができる。
【発明の効果】
【００６８】
本発明によるガンマ線の照射による低分子量のベータグルカンは、粘度が減少して水溶性が増加する物理的特性と抗酸化活性、脾臓細胞増殖とサイトカインの分泌能が増加するなどの優れた生物学的特性によって、食品、医薬品及び化粧品素材として有用に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
以下、本発明を実施例、実験例及び製剤例によって詳細に説明する。
【００７０】
但し、下記実施例、実験例及び製剤例は、本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が実施例、実験例及び製剤例によって限定されるものではない。
【００７１】
＜実施例＞ガンマ線の照射による低分子量のベータグルカンの製造
本発明で使用されたベータグルカンは、エースバイオテック（ＡＣＥ  ＢＩＯＴＥＣＨ；韓国）から購入した。ベータグルカン試料は、白パウダー形態でポリサッカライドの含量は、９７．２％であり、ベータグルカンの含量は８０％以上である。蒸留水にベータグルカンを１０％濃度（ｗ／ｖ）で溶解して実験に使用した。
【００７２】
多様な濃度に製造されたベータグルカン試料は、韓国原子力研究院井邑放射線科学研究所のコバルト−６０放射線の照射装置（ｃｏｂａｌｔ−６０  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）から照射された。線源の大きさは、約１００ｋＣｉであり、線量率は時間当り１０ｋＧｙだった。吸収線量の確認は、５ｍｍ直径アラニン線量計（ｄｉａｍｅｔｅｒ  ａｌａｎｉｎｅ  ｄｏｓｉｍｅｔｅｒｓ）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，ドイツ）で行い、線量測定（Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）システムは、国際原子力機関（ＩＡＥＡ）の規格に準用して標準化した後に使用し、適用された照射線量は、室温で０、１０、３０及び５０ｋＧｙで照射した。
【００７３】
＜実験例１＞分子量測定
ガンマ線の照射後ベータグルカンの分子量測定は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＰＣ）を使用して測定した。ＧＰＣは、ウォーターズ５１５ポンプ（Ｗａｔｅｒｓ  ５１５  ｐｕｍｐ）、２×ＰＬａｑａｇｅｌ  ＯＨ混合した（７．８×３００ｍｍ）カラム、ウォーターズ２４１０屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１０  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）のウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＧＰＣシステム装備を使用した。試料は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に希釈した後、１００μｌを投与した。カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）は、１．０ｍｌ／分の流速で４０℃で作動した。分子量分布は、０．１％ｗ／ｗの濃度で多様なデキストランを使用して較正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した。分子量計算のための分析は、ミレニアム（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）３．０５．０１を使用した。
【００７４】
図１は、ガンマ線の照射によるベータグルカンの分子量を示したものである。非照射されたベータグルカンの分子量は、１７８，０３５Ｄａである。一方、１０、３０、５０ｋＧｙでガンマ線照射されたベータグルカンの分子量は、それぞれ６１，９６２Ｄａ、３２，００４Ｄａ、２４，８２２Ｄａに分子量が減少した。事前に調査した研究報告書によると、ベータグルカンの分子量が１００ｋＤａ以上なら高分子で、５０ｋＤａ以下ならば低分子であると知られている（Ｂｏｈｎ，Ｊ．Ａ．等，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．，１９９５年，第２８（１）卷，３−１４頁）。ガンマ線によるこのような変化は、グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）の破壊によって分子の作用基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）中で変化が起きるからであると判断され、グリコシド結合の分裂によって起きる分子量の大きな減少は、低分子量の糖を形成すると報告されている（Ｓｏｋｈｅｙ，Ａ．Ｓ．等，Ｆｏｏｄ  Ｓｔｒｕｃｔ．１９８３年，第１２巻，３９７−４１０頁）。
【００７５】
＜実験例２＞粘度測定
ガンマ線照射されたベータグルカンの粘度は、Ｓ２１番スピンドルを使用して１８０ｒｐｍでブルックフィールド粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）（ＤＶ−ＩＩ＋ｐｒｏ，Ｂｒｏｏｋ−ｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ，米国）で測定した。粘度は、室温で測定した。
【００７６】
図２は、ガンマ線照射されたベータグルカンの粘度を示した。照射線量が増加するにつれてベータグルカン溶液の粘度は減少する傾向を見せた。非照射されたベータグルカン溶液の粘度は、１９１．９３（ｃｐ）で示され、１０及び３０ｋＧｙでガンマ線照射されたベータグルカン溶液の粘度は、１３５．５（ｃｐ）及び７５．８１（ｃｐ）に減少し、５０ｋＧｙで照射したベータグルカンの粘度は、４３．９（ｃｐ）に粘度が減少した。
【００７７】
＜実験例３＞溶解度測定
ガンマ線照射されたベータグルカンの水溶性は、ベータグルカン溶液を凍結乾燥して凍結乾燥されたベータグルカン試料を２０分間蒸留水に溶解した後、３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄み液を得る。その次に、分離した上澄み液を２時間１００℃で乾燥した後、乾燥した試料の重さを測定した。
【００７８】
溶解度（％）＝｛（お皿＋溶解後乾燥した試料）−お皿｝／凍結乾燥された試料×１００
【００７９】
図３は、ガンマ線照射されたベータグルカンの溶解度を示した。非照射されたベータグルカンの溶解度は、５１．２３％と示され、１０及び３０ｋＧｙの低い線量でガンマ線照射されたベータグルカンは、５５．７６％及び７５．８１％に溶解度が増加した。５０ｋＧｙで照射したベータグルカンの溶解度は８１．７２％であり、非照射区と比べた時、溶解度が最も大きく増加したことが示された。
【００８０】
＜実験例４＞還元糖測定
還元糖は、３，５−ジニトロサリチル酸（３、５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＮＳＡ）方法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．１９５９年）によって測定した。試料１ｍｌを１５ｍｌの試験管に移してＤＮＳＡ試薬（ジニトロサリチル酸０．５ｇ、水酸化ナトリウム８ｇ、ロッシェル塩１５０ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解）２ｍｌを添加した。その混合溶液を５秒間混合して、９０℃で１０分間反応させた後、冷却した。試料の還元糖数値は、スペクトロフォトメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＵＶ−１６０１  ＰＣ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏ．，東京，日本）を使用して５５０ｎｍで測定した。
【００８１】
図４は、ガンマ線照射されたベータグルカンの還元糖を測定した。ベータグルカン還元糖のＲ２値が０．９３８３の時、非照射区ベータグルカンの還元糖は０．９１７％である一方、１０及び３０ｋＧｙの低い線量でガンマ線照射されたベータグルカンでは、それぞれ１．１２８％及び１．９７３％に還元糖が増加した。５０ｋＧｙで照射したベータグルカンの溶解度は、非照射区と低いガンマ線照射区とを比較した時、２．１７３％で最も大きく増加した。
【００８２】
＜実験例５＞ベータグルカン構造変化
ガンマ線照射されたベータグルカンは、濃縮された塩酸（３７％，１０Ｎ）に溶解した後、１００℃で２時間１．３Ｎ  ＨＣｌで加水分解した。酸加水分解したベータグルカンは、ベータ−Ｄ−グルコース分析キット（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｉｍｔ．から購入）を使用して、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンの含量を測定した。
【００８３】
表１は、放射線の照射によって低分子化されたベータグルカンにおけるベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンの含量を示した。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
表１に見られるように、放射線の照射によって得られた低分子量のベータグルカンは、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，４−グルカン及びベータ−１，６−グルカンの含量がすべて減少した。したがって、放射線の照射によって任意的にグルカン構造を切断したベータグルカンを得られる事実を確認することができた。
【００８６】
＜実験例６＞ガンマ線照射された低分子量のベータグルカンの試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）Ｔ細胞活性測定
脾臓細胞増殖能力は、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｒｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）によって測定した。ＰＢＳを使用して５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解したＭＴＴ溶液は、２４時間培養された脾臓細胞に３０μｌを入れて３７℃のインキュベーターで２時間反応をさせた後、遠心分離した。上澄み液を除去して、１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ）を入れて細胞を溶解させた後、３７℃のインキュベーターに５分間放置して、マイクロプレートエリサリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）を使用して５９５ｎｍで吸光度を測定した。
【００８７】
図５では、ガンマ線の照射によるベータグルカンのＴ細胞活性を示した。マウスの脾臓細胞のＴ細胞活性は、脾臓細胞を非照射区と照射されたベータグルカンで処理した後、２４時間培養後、ＭＴＴ分析によって測定した。非照射のベータグルカンより、本発明の照射されたベータグルカンとともに培養した脾臓細胞中のＴ細胞活性が、大きく増加することを観察することができた。０、１０、３０及び５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンで処理したマウスの脾臓細胞Ｔ細胞活性値は、それぞれ１０９、１１６、１２２及び１２７％であることが確認でき、５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンで処理された脾臓細胞のＴ細胞活性が、非照射区と比較した時に、最も高い活性数値であることが確認できた。
【００８８】
＜実験例７＞ガンマ線照射された低分子量のベータグルカンの試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）サイトカイン分泌能測定
サイトカイン分析のために脾臓細胞の単一細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）は、ウェル当たり１×１０６細胞（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の濃度で９６−ウェル組織培養プレート（ｗｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｐｌａｔｅｓ）に置いた。使用した培地は、最終濃度ウェル当たり１×１０６細胞に１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培養液を使用し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。細胞は、０〜２．５μｇ／ｍｌ濃度のベータグルカンで処理し、２４時間培養後に採取した。分析に使用する前まで−７０℃に保管した。
【００８９】
本発明では、試験管内システム（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ）でＴｈ１から分泌されるサイトカインを用いて、非照射区と照射されたベータグルカンの免疫機能検査を試みた。Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ及びＴｈ１）とナチュラルキラー細胞（ＮＫ  ｃｅｌｌｓ）は、インターフェロン−ガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ，ＩＦＮ−ｒ）を分泌する。この主要機能は、捕食細胞の活性因子である。Ｔｈ１から分泌されるサイトカインの変化は、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ抗体、及びＢＤ  ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用するＥＬＩＳＡ方法によって測定した。図６では、非照射区と照射されたベータグルカンの刺激により脾臓細胞から分泌されるサイトカインであるＴｈ１細胞のＩＦＮ−ｒを測定した。Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインであるＩＦＮ−ｒは、非照射区ベータグルカンと比較した時、ガンマ線照射線量が増加するにつれてＩＦＮ−ｒの分泌量が増加することを確認でき、３０、５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンが、０、１０ｋＧｙで照射されたベータグルカンより、サイトカインの分泌量がさらに高く示されることを確認した。
【００９０】
図７では、非照射区と照射されたベータグルカンの刺激による、脾臓細胞から分泌するサイトカインであるＴｈ１細胞のＩＬ−２を測定した。ＩＦＮ−ｒと同様にＴｈ１細胞から分泌するサイトカインであるＩＬ−２は、非照射区ベータグルカンと比較した時、ガンマ線照射線量が増加するにつれてＩＦＮ−ｒの分泌量が顕著に増加することを確認することができ、３０、５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンが、０、１０ｋＧｙで照射されたベータグルカンより、サイトカインの分泌量がさらに高く示されることを確認することができた。
【００９１】
＜実験例８＞ガンマ線照射された低分子量のベータグルカンの試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＤＰＰＨ（２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｙｌ）ラジカル消去能力測定
本発明によるガンマ線が照射されたベータグルカンのラジカル消去能力は、アマロウィクズ（Ａｍａｒｏｗｉｃｚ）などの方法で測定した（Ａｍａｒｏｗｉｃｚ，Ｒ．等，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４年，第８４巻，４，５５１−５６２頁）。
【００９２】
図８では、ガンマ線照射されたベータグルカンの抗酸化効果を示した。ガンマ線の照射処理されたベータグルカンのＤＰＰＨラジカル消去能力は、処理されたベータグルカンのすべての濃度で非照射区ベータグルカンより高く示され、この実験結果より、ガンマ線照射線量が増加するにつれて抗酸化能力は有意的に増加したことを確認することができた。
【００９３】
＜実験例９＞ガンマ線照射された低分子量のベータグルカンの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）Ｔ細胞活性測定
本発明でＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜７週）は、オリエント社（Ｏｒｉｅｎｔ  Ｉｎｃ．）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ソウル，韓国）から購入した。マウスは、２２±２℃の室内温度と１２時間間隔で夜と昼が変化する飼育場のポリカーボネートケージ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｃａｇｅ）で飼育し、飼料と水を自由に与えながら飼育した。動物は、非照射区（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、０ｋＧｙ、１０ｋＧｙ、３０ｋＧｙ、５０ｋＧｙで処理された５グループに分類して、７日間５０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で経口投与して実験を進めた。マウスの脾臓を分離した後、脾臓細胞を分析する前にＲＰＭＩ培養液中に直ちに維持させた。本発明での動物実験は、国内農林部の「動物保護法令（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｃｔ）」にしたがって行った。
【００９４】
脾臓リンパ球（Ｓｐｌｅｅｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）は、マウスの脾臓（ｆｅｍａｌｅ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ）から一般的な分裂方法で獲得した。脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターでＲＰＭＩ−１６４０培養液と１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンとともに維持させた。
【００９５】
図９では、非照射区と照射されたベータグルカンを投与したマウスの脾臓細胞活性を測定した。本発明では、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で脾臓細胞の免疫調節を調べるために、マウスの脾臓細胞活性測定は、非照射区と照射されたベータグルカンを７日間投与したマウスの脾臓細胞を２４時間培養後、ＭＴＴ分析で細胞活性を測定した。非照射区と照射されたベータグルカンを投与したマウスの脾臓細胞活性は、非照射区と比較した時、活性が高いことを確認することができた。１０ｋＧｙで照射されたベータグルカンを投与したマウスの脾臓細胞活性数値は１２８．５％であり、３０及び５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンを投与したマウスの脾臓細胞活性数値は１３９．３％及び１８３．８％と大きく増加したことを確認した。
【００９６】
＜実験例１０＞ガンマ線照射された低分子量のベータグルカンの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）サイトカイン分泌能測定
本発明では、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で非照射区と照射されたベータグルカンの免疫刺激機能を調べるために実験を進めた。Ｔｈ１から分泌されるサイトカインは、ＥＬＩＳＡ方法によって測定した。図１０と図１１では、非照射区と照射されたベータグルカンの刺激による脾臓細胞から分泌されるサイトカインであるＴｈ１細胞のＩＦＮ−ｒ及びＩＬ−２を測定した。
【００９７】
Ｔｈ１から分泌されるサイトカインであるＩＦＮ−ｒ及びＩＬ−２は、ベータグルカンへのガンマ線の照射が増加するにつれて、有意的にサイトカイン分泌が増加することを確認することができた。７日間５０ｋＧｙで照射されたベータグルカンを投与したマウスのサイトカイン分泌量は、対照区と１０、３０ｋＧｙで照射されたベータグルカンを投与したマウスと比較して、最も多い量のサイトカインを分泌した。
【００９８】
下記に本発明の低分子量のベータグルカンのための製剤例を例示する。
【００９９】
＜製剤例１＞：薬学的製剤の製造
【０１００】
１．散剤の製造
低分子量のベータグルカン                      ２ｇ
乳糖                                          １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【０１０１】
２．錠剤の製造
低分子量のベータグルカン                  １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                          １００ｍｇ
乳糖                                      １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【０１０２】
３．カプセル剤の製造
低分子量のベータグルカン                  １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                          １００ｍｇ
乳糖                                      １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１０３】
４．丸薬の製造
低分子量のベータグルカン                    １ｇ
乳糖                                    １．５ｇ
グリセリン                                  １ｇ
キシリトール                            ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸当たり４ｇになるように製造した。
【０１０４】
５．顆粒の製造
低分子量のベータグルカン                １５０ｍｇ
大豆抽出物                                ５０ｍｇ
ブドウ糖                                ２００ｍｇ
澱粉                                    ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加し、６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包みに充填した。
【０１０５】
＜製剤例２＞：食品の製造
本発明の低分子量のベータグルカンを含む食品を、次のように製造した。
【０１０６】
１．料理用薬味の製造
本発明の低分子量のベータグルカン２０〜９５重量部で、健康増進用料理用薬味を製造した。
【０１０７】
２．小麦粉食品の製造
本発明の低分子量のベータグルカン０．５〜５．０重量部を小麦粉に添加して、その混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【０１０８】
３．スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明の低分子量のベータグルカン０．１〜５．０重量部をスープ及び肉汁に添加して、健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【０１０９】
４．牛挽肉（ｇｒｏｕｎｄ  ｂｅｅｆ）の製造
本発明の低分子量のベータグルカン１０重量部を牛挽肉に添加して、健康増進用牛挽肉を製造した。
【０１１０】
５．乳製品（ｄａｉｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明の低分子量のベータグルカン５〜１０重量部を牛乳に添加し、該牛乳を使用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１１１】
６．禅食の製造
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末にして製造した。
【０１１２】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末にして製造した。
【０１１３】
本発明の低分子量のベータグルカンを真空濃縮器で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１１４】
前記で製造した穀物類、種実類及び低分子量のベータグルカンの乾燥粉末を、次の割合で配合して製造した。
【０１１５】
穀物類（玄米３０重量部、ハト麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
低分子量のベータグルカンの乾燥粉末（３重量部）、
霊芝（０．５重量部）、
地黄（０．５重量部）。
【０１１６】
＜製剤例３＞：飲料の製造
【０１１７】
１．健康飲料の製造
低分子量のベータグルカン                １０００ｍｇ
クエン酸                                １０００ｍｇ
オリゴ糖                                  １００ｇ
梅の実濃縮液                                  ２ｇ
タウリン                                      １ｇ
精製水を加えて全体                      ９００ｍｌ
通常の健康飲料製造方法によって前記の成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱して、できた溶液をろ過して滅菌した２ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管して、本発明の健康飲料組成物製造に使用した。
【０１１８】
前記組成比は、比較的嗜好飲料に相応しい成分を好ましい実施例で混合組成したが、需要者の階層、需要者の国、使用用途など地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変形実施してもかまわない。
【０１１９】
２．野菜ジュースの製造
本発明の低分子量のベータグルカン５ｇを、トマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。
【０１２０】
３．果物ジュースの製造
本発明の低分子量のベータグルカン１ｇを、リンゴまたはブドウジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。
【０１２１】
＜製剤例４＞：低分子量のベータグルカンを使用した化粧品の製造
本発明の低分子量のベータグルカンを有効成分として含む免疫強化用機能性化粧品を製造することができる。本発明者等は、低分子量のベータグルカンを含む免疫強化用機能性化粧品として、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどの乳化剤形の化粧品及び柔軟化粧水などの可溶化剤形の化粧品を製造した。
【０１２２】
＜１−１＞乳化剤形の化粧品製造
表２に記載した組成で乳化剤形の化粧品を製造した。製造方法は下記のとおりである。
【０１２３】
１）１ないし９の原料を混合した混合物を６５〜７０℃で加熱した。
２）１０の原料を前記工程１）の混合物に投入した。
３）１１ないし１３の原料の混合物を６５〜７０℃で加熱して完全に溶解させた。
４）前記工程３）を経ながら、前記２）の混合物を徐々に添加して８，０００ｒｐｍで２〜３分間乳化させた。
５）１４の原料を少量の水に溶解させた後、前記工程４）の混合物に添加して２分間さらに乳化させた。
６）１５ないし１７の原料をそれぞれ計量した後、前記工程５）の混合物に入れて３０秒間さらに乳化させた。
７）前記工程６）の混合物を乳化後、脱気過程を経て２５〜３５℃に冷却させることにより乳化剤形の化粧品を製造した。
【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
＜１−２＞可溶化剤形の化粧品製造
表３に記載した組成で可溶化剤形の化粧品を製造した。製造方法は下記のとおりである。
【０１２６】
１）２ないし６の原料を１の原料（精製水）に入れてミキサーを使用して溶解させた。
２）８ないし１１の原料を７の原料（アルコール）に入れて完全溶解させた。
３）前記工程２）の混合物を前記工程１）の混合物に徐々に添加しながら可溶化させた。
【０１２７】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明によるガンマ線の照射による低分子量のベータグルカンは、粘度が減少して水溶性が増加する物理的特性と抗酸化活性、脾臓細胞増殖とサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌能が増加するなどの優秀な生物学的特性により、食品、医薬品及び化粧品素材として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ガンマ線の照射によるベータグルカンの分子量減少を示したグラフである。
【図２】ガンマ線の照射によるベータグルカンの粘度減少を示したグラフである。
【図３】ガンマ線の照射によるベータグルカンの溶解度増加を示したグラフである。
【図４】ガンマ線の照射によるベータグルカンの還元糖変化の増加を示したグラフである。
【図５】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞のＴ細胞活性増加（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を示したグラフである。
【図６】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞からのＩＮＦ−ｒ分泌能の増加（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を示したグラフである。
【図７】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞からのＩＬ−２分泌能の増加（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を示したグラフである。
【図８】ガンマ線照射されたベータグルカンの２，２−ジフェニル−１−ピクリル−ヒドラジル（２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｙｌ、ＤＰＰＨ）ラジカル消去能力の増加を示したグラフである。
【図９】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞のＴ細胞活性増加（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を示したグラフである。
【図１０】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞からのＩＮＦ−ｒ分泌能の増加（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を示したグラフである。
【図１１】ガンマ線照射されたベータグルカンによる脾臓細胞からのＩＬ−２分泌能の増加（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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