(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を顕微鏡で検査するための方法であって、
該試料を照明するために空間的にコヒーレントな光を少なくとも１つの連続的な、または連続的に同調可能な波長範囲で発生し、
試料および／または所定の検査方法に応じて照明光の１つまたは複数の波長または波長範囲を選択し、
選択された波長または波長範囲の照明光で該試料を照明し、
該照明光と該試料から来る放出光とを異なる光路に分離し、
該試料から反射する検出光路内の照明光を検出前に除去し、
該放出光を検出する方法において、
該照明光の波長または波長範囲の選択を、所定の制御変数（Ｒ）が最大値をとるように、該検出光と照明光との分離、および照明光の除去と同調させ、
同調のために前記照明光の前記波長または波長範囲を所定の段階で変更し、各段階で１つまたは複数の画像を検出し、検出された画像データに基づいて前記制御変数（Ｒ）を算定し、前記制御変数（Ｒ）として、前記照明光の波長または波長範囲に応じた
（ｉ）前記検出された画像の平均輝度または前記検出された画像の平均輝度の総計、または
（ｉｉ）前記検出された画像内の２つまたはそれ以上のスペクトル範囲の平均輝度の差、または
（ｉｉｉ）前記検出された画像内の選択された２つの領域の平均輝度の差、または
（ｉＶ）前記検出された画像内の選択された２つの画像点間または第１の画像領域と背景領域としての第２の画像領域との間のコントラスト、または信号対ノイズ比
が用いられることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料を走査顕微鏡で走査することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が１つまたは複数の色素でマーキングされ、かつ該色素が放出するように前記照明光によって励起され、該放出された光を放出光として検出することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記放出光の検出される波長または波長範囲は、少なくとも部分的に前記照明光の波長範囲内に入ることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出はスペクトル分解で行われることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出すべき１つまたは複数のスペクトル範囲を各段階で相応に変更することによって、該スペクトル範囲に関して補足的な同調を行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記同調は基準試料を用いて行われることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記同調は試料自体で行われることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記同調の開始時に調整される前記照明光の波長または波長範囲は、データバンクを用いて選択されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記同調の開始時に調整される１つまたは複数の検出すべきスペクトル範囲は、データバンクを用いて選択されることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記照明光の波長または波長範囲および／または検出すべきスペクトル範囲の選択は、自動的に行われることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記照明光の波長または波長範囲および／または検出されるスペクトル範囲の選択は、ユーザによって手動的に行われることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２つの領域のうち第１の領域から、検出すべき光が放出され、前記２つの領域のうち第２の領域から、実質的な干渉光が放出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御変数（Ｒ）には、補足的に前記第１の領域からの重み付きの、かつ正規化輝度を考慮に入れることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
顕微鏡であって、
波長範囲の光を連続的に放出し、または該範囲内で同調可能な照明源（１）としてのレーザと、
照明光の波長、波長範囲、複数の波長または波長範囲を選択するための第１の選択手段（２）と、
該照明光と試料（５）から発する放出光の光路を分離するための分離手段（３）と、
該試料（５）から反射され、検出光路に達する照明光の検出を防止するための除去手段（６）と、
該放出光を検出するための検出手段（８）とを備え、前記照明源（１）、前記第１の選択手段（２）、前記分離手段（３）および前記除去手段（６）は、制御可能であり、かつそれらの波長選択特性を可変的に調整可能である顕微鏡において、
前記第１の選択手段（２）、前記分離手段（３）および前記除去手段（６）を、前記照明光の前記波長または波長範囲の段階的な変更において検出された画像から決定された制御変数（Ｒ）に基づいて前記制御変数（Ｒ）が最大値をとるように制御して、相互に同調させるための制御装置（９）を備え、
前記制御装置（９）には、検査方法および試料特性の少なくとも一つを入力し、または選択するための入力手段が設けられ、
前記制御変数（Ｒ）として前記照明光の波長または波長範囲に応じた
（ｉ）前記検出された画像の平均輝度または前記検出された画像の平均輝度の総計、または
（ｉｉ）前記検出された画像内の２つまたはそれ以上のスペクトル範囲の平均輝度の差、または
（ｉｉｉ）前記検出された画像内の選択された２つの領域の平均輝度の差、または
（ｉＶ）前記検出された画像内の選択された２つの画像点間または第１の画像領域と背景領域としての第２の画像領域との間のコントラスト、または信号対ノイズ比
が用いられることを特徴とする顕微鏡。
【請求項１６】
前記顕微鏡はレーザ走査顕微鏡として形成されることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
前記制御手段（９）は前記第１の選択手段（２）、前記分離手段（３）および前記除去手段（６）を自動的に同調させるように構成されることを特徴とする請求項１５または１６に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
前記放出光をスペクトル分解するための手段を備えることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項１９】
前記放出光が検出すべき１つまたは複数の波長範囲を選択するための第２の選択手段（７）を備えることを特徴とする請求項１８に記載の顕微鏡。
【請求項２０】
前記制御装置（９）は、前記第２の選択手段（７）を前記制御変数（Ｒ）に基づいて制御して、前記第１の選択手段（２）、前記分離手段（３）および前記除去手段（６）と同調させるように構成されることを特徴とする請求項１９に記載の顕微鏡。
【請求項２１】
前記第１の選択手段（２）は、１つまたは複数の音響光学フィルタを含むことを特徴とする請求項１５乃至２０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項２２】
前記フィルタは直列に接続され、該フィルタはそれぞれ別の波長または別の波長範囲を分離することを特徴とする請求項２１に記載の顕微鏡。
【請求項２３】
前記分離された波長または波長範囲を結合する手段を備えることを特徴とする請求項２２に記載の顕微鏡。
【請求項２４】
前記結合手段は、ダイクロイック・ビームスプリッタを含むことを特徴とする請求項２３に記載の顕微鏡。
【請求項２５】
前記第１の選択手段は１つまたは複数の可変調整可能な液晶フィルタを含むことを特徴とする請求項１５乃至２４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項２６】
前記第１の選択手段は１つまたは複数の可変調整可能なバンドパス・フィルタを含むことを特徴とする請求項１５乃至２５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項２７】
前記分離手段（３）は、前記照明光および放出光がスペクトル分解され、波長に応じて修正され、かつ偏光されるフレキシブルな３原色分解系を含むことを特徴とする請求項１５乃至２６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項２８】
前記分離手段（３）は、前記照明光および放出光が空間的に異なる領域で結像され、かつ偏光されるアクロマティックな３原色分解系を含むことを特徴とする請求項１５乃至２６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項２９】
前記除去手段（６）はスペクトル選択絞り（３２）を含むことを特徴とする請求項１５乃至２８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３０】
前記絞り（３２）は可変的に調整可能であることを特徴とする請求項２９に記載の顕微鏡。
【請求項３１】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、蛍光分光法における使用方法。
【請求項３２】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、ＦＲＥＴ実験における使用方法。
【請求項３３】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、ＦＬＩＭ実験における使用方法。
【請求項３４】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、蛍光相関分光法における使用方法。
【請求項３５】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、多光子励起の検査における使用方法。
【請求項３６】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、色素識別のための使用方法。
【請求項３７】
請求項１乃至１４に記載の工程を有する方法の、試料の操作における使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料が顕微鏡で検査され、かつ、試料を照明するために空間的にコヒーレントな光が少なくとも１つの連続的な、または連続的に同調可能な波長範囲で発生され、試料および／または所定の検査方法に応じて照明光の１つまたは複数の波長または波長範囲が選択され、選択された波長または波長範囲の照明光で試料が照明され、照明光と該試料から来る放出光とが異なる光路に分離され、試料から反射する検出光路内の照明光が検出前に除去され、かつ放出光が検出される方法に関する。本発明はさらに、試料が特に上記の方法を用いて分析される顕微鏡にも関する。本発明は空間的にコヒーレントな光を広い波長範囲に放射する光源を顕微鏡検査、特にレーザ走査技術を用いた蛍光顕微鏡検査に組み込む際の問題、およびその際に生ずる結像の問題を扱うものである。
【背景技術】
【０００２】
広帯域で放出し、または広帯域で同調可能な光源をレーザ走査顕微鏡検査に使用することは近年になってますます大きな関心を呼んでおり、その利点は波長を自由に選択できることにある。検査される試料をマーキングする色素を励起するために必要とされる異なる波長をフレキシブルに調整することが可能になる。このような広帯域の空間的にコヒーレントな光を放射する光源の使用は、例えば米国特許第６６１１６４３号明細書（特許文献１）に記載されている。この文献には、広帯域の光を発生するミクロ構造のファイバー内で放射線が結合されるレーザを光源として備えている顕微鏡構造が開示されている。もちろん、この文献には、広帯域の光を様々な検査方法に適切に使用できるようにするために、顕微鏡自体をどのように形成するかについての詳述は、なされていない。
【０００３】
広帯域の光は、ミクロ構造のファイバーを利用する代わりに特別の特性を活用しても、上記のミクロ構造ファイバーよりも制御しやすいドープされたグラスファイバを製造することができる。このような方法は、例えばタウザー（Ｔａｕｓｅｒ）外の論文、「オプティカル・レターズ（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｅｔｔｅｒｓ）」、第２９巻、５１６〜５１８ページに記載されている（非特許文献１）。
【０００４】
広帯域のレーザ照射器は、米国特許第６７９６６９９号明細書（特許文献２）にも記載されている。しかし、照射器を適応させる可能性についての一般的な指摘を除けば、そこにも、このような照射器を顕微鏡検査に適応させる具体的な技術的実施形態は記載されていない。同様に、独国特許出願公開第１０１１５５０９Ａ１号明細書（特許文献３）にもスペクトル拡張された光源と、以下ではＬＳＭと略称するレーザ走査顕微鏡との結合が極めて一般的に記載されているだけであり、そこには音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）、音響光学デフレクタ（ＡＯＤ）、音響光学ビームスプリッタ、またはＬＣＤ減衰器の使用が概略的に記載されている。
【０００５】
米国特許第６６５４１６６号明細書（特許文献４）には、スペクトル拡張がこれもミクロ構造のファイバーならびに特別のビームスプリッタで行われる照明装置によるＬＳＭの照明が記載されている。その場合、ビームスプリッタは、広帯域の光源による結像および操作の重要性に特に適応させなければならないＬＳＭ内の中央素子である。特許文献４に記載のビームスプリッタは、例えば、銀またはアルミニウムからなる広帯域の反射コーティングによっても達成可能である、偏光無依存および波長無依存の素子として構成されている。しかし、この実施形態の欠点として留意すべきことは、検出光路の著しい損失が生ずることである。特に蛍光顕微鏡検査では、この損失によって方法が失敗することがある。
【０００６】
広帯域で放出される、または広帯域で同調可能なレーザと組み合わせて、検出される光から励起光を分離する適切なフレキシブルな３原色分解光学系が必要である。可視スペクトル範囲で動作し、音響光学部品によって実現されるフレキシブルな３原色分解光学系は、例えば独国特許出願公開第１０３３９３１１Ａ１号明細書（特許文献５）に記載されているような音響光学ビームスプリッタ（ＡＯＢＳ）である。しかし、このようなＡＯＢＳは紫外線から近赤外線までのスペクトル範囲の連続的に同調可能な、または広帯域の励起には適していない。前記のスペクトル範囲用には少なくとも３つの異なる形状もしくは実施形態が必要である。狭帯域のレーザ線による励起用に構成されたこのようなＡＯＢＳには、さらに、狭いスペクトル選択幅しかなく、ひいては広帯域の光源に対してはまさに少ない効率しかない。したがって、連続スペクトルを検査方法にフレキシブルに適応させることは不可能である。スペクトルの１本または複数の不連続線しか励起のために選択できないというこのような欠点は、スペクトル分離のためにＡＯＴＦによる偏光回転を利用する３原色分解光学系にも当てはまる。
【０００７】
この欠点は、光の連続的なスペクトル分割を、また同時に該スペクトルの位置を定義可能な操作をこのスペクトル内で可能にする構成によって回避できる。このような構成は、例えば独国特許発明第１９１５１０２号明細書（特許文献６）および独国特許発明第１００１７８２５号明細書（特許文献７）で提案されている。しかし、そこに記載されている装置には、励起光路内の分割素子の前後にそれぞれ１つ、および検出光路内に１つの、３つのプリズム分光器が必要であるという決定的な欠点がある。それによって明らかに装置の複雑さと故障しやすさが高まる。その上、この装置は、ストリップ照明による並列共焦点顕微鏡に限定される。特許文献６（独国特許発明第１９１５１０２号明細書）で提案されている変形形態にはさらに、固体素子について個別の、事前に定義された波長範囲が分離され、検出されるという欠点がある。
【０００８】
したがって、上記の解決手段では、広帯域で放出され、または広帯域で同調可能な光源の潜在能力を可能性のある用途に十分に活用することができない。例えば試料をマーキングする色素が放出するように励起される照明波長を限定的にしか選択できない。先行技術の解決手段が不連続の励起線のブロックだけに限定される、検出すべきスペクトル範囲にも同じことが該当する。
【０００９】
広帯域の光源とＬＳＭとを結合し、かつＬＳＭ内で光線分離するための上記の先行技術では、その上、特に結像に関して照明波長および検出波長もしくはそれらの帯域を最適に選択するためのフレキシブルな方法を具体的にどのように見なすべきであるかの記述はなされておらず、また対応する装置も記載されていない。このような方法は、特許文献５（独国特許出願公開第１０３３９３１１Ａ１号明細書）に記載されている。この場合は、照明波長および検出波長は、試料がマーキングされる色素の特性を利用してデータバンクとの比較によって選択される。この場合、照明および検出のスペクトル範囲は、データバンクにファイルされている個々のスペクトルに基づく計算によってのみ算出される。その結果、純粋に理論的な理想であるべき調整値が得られる。その際には、測定結果に顕著な影響を及ぼすことがあるような、対象特有の多くの要因を考慮に入れることはできない。それには、例えば、例えばチエン（Ｔｓｉｅｎ）の論文、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２号（１９８９年）、２２７ページ以降に記載されているように（非特許文献２）、波長比率測定の先行技術でも既に長い間利用されているような、励起スペクトルおよび放出スペクトルの色素環境への依存性が挙げられる。別の例には、いわゆる自家蛍光の場合のように、不都合な交差励起を誘発することがある、対象中での不明な蛍光物質の発生がある。
【特許文献１】米国特許第６６１１６４３号明細書
【特許文献２】米国特許第６７９６６９９号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第１０１１５５０９Ａ１号明細書
【特許文献４】米国特許第６６５４１６６号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０３３９３１１Ａ１号明細書
【特許文献６】独国特許発明第１９１５１０２号明細書
【特許文献７】独国特許発明第１００１７８２５号明細書
【非特許文献１】タウザー（Ｔａｕｓｅｒ）外、オプティカル・レターズ（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２９巻、５１６〜５１８ページ
【非特許文献２】チエン（Ｔｓｉｅｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２号（１９８９年）、２２７ページ以降
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、試料を照明するために空間的にコヒーレントな光が少なくとも１つの連続的な、または連続的に同調可能な波長範囲で発生される上記の方法および顕微鏡を、そのような対象特有の要因がより良く考慮されるように改良することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的は冒頭に記載の種類の方法において、照明光の波長または波長範囲の選択が、所定の制御変数Ｒが最大値をとるように検出光と照明光との分離、および照明光の除去と同調されることによって達成される。この場合には、ユーザにとって最適な結像が達成される。すなわち、結像に関して同調が最適化される。
【００１２】
最も簡単な場合は、例えば試料から来る光の輝度が制御変数として利用される。これは従来の反射光顕微鏡では、例えば試料の吸収、放出、および反射の状態に依存する。この特性はさらに、試料がどの波長で照射されるかに依存する。しかし、試料は走査顕微鏡によって検査されることが好ましい。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、試料は１つまたは複数の色素でマーキングされる。その後、色素は照明光によって放出するように励起され、放出された光が放出光として検出される。その際に、照明と検出との前述の最適化された同調は、放出光の検出される波長または波長範囲が少なくとも部分的に照明光の波長範囲内に入る場合、すなわち、例えば放出光のみならず照明光も視覚スペクトル内の互いに重複する範囲から発する場合に特に極めて重要である。
【００１４】
有利には同調のために照明光の波長または波長範囲が所定の段階で変更される。各段階で１つまたは複数の画像が検出され、引き続き一般には登録された画像データに基づいて制御変数が算定される。各段階で検出光および照明光の分離、ならびに照明光の除去も適応化されるので、結局は制御変数Ｒについて波長または例えば波長部分範囲の平均波長にも依存する曲線が生ずる。例えば画像の平均輝度、選択された２つの画素間のコントラスト、または信号／ノイズ比のような様々な制御変数が考えられ、これらの数値は最大化される。
【００１５】
本発明の有利な実施形態では検出もスペクトル分解で行われる。好ましくは検出すべきスペクトル範囲も同調に含まれ、各段階で照明光に関連してこのスペクトル範囲も変更される。検出すべきスペクトル範囲の最適な同調は、異なる色素の波長に応じた交差励起が生ずる場合に特に有利である。パラメータ相互の最適な同調は、有利には、実際の試料と基本的に同一の基準試料で、すなわち同じ色素でマーキングされ、その化学環境が実際の試料と同じ試料で実施される。あるいは、漂白作用が従属的な役割を果たす限り、すなわち像面内の平均色素濃度が同調中にほぼ一定に留まっている限りは、同調が試料自体で行われてもよい。同調は、後の結像にとって重要な対象の切片内で実施されることもできる。最適な同調に必要な時間にわたって静的な試料の場合は、この最適化の枠内で得られる画像を信号／ノイズ比（ＳＮＲ）を改善するための画像平均化のために利用することができる。
【００１６】
迅速な同調のためには、特に初期設定、すなわち、顕微鏡の構成部品の対応する調整と関連する波長もしくは波長範囲、ならびに場合によっては検出スペクトル範囲の初期調整が決定的に重要である。その際、有利には同調の開始時に調整される照明光の波長または波長範囲がデータバンクを用いて選択される。場合によっては、検出されるスペクトル範囲も事前にデータバンクを用いて選択される。さらに好ましくは、データバンクには、場合によっては溶剤に依存するこの色素の励起スペクトルおよび放出スペクトルがファイルされる。
【００１７】
本発明の有利な実施形態では、照明光の波長または波長範囲、ならびに場合によっては放出光のスペクトル範囲の選択が全自動で行われ、通常はユーザが初期設定を設定することが好ましい。これは計器自体で行うこともでき、または顕微鏡が制御されるシステムに色素の種類を認識させて、それに基づいてシステムがデータバンクから適切な初期設定を選択できるようにしてもよい。このようなデータを利用できない場合は、ユーザが照明光および放出光の波長または波長範囲を手動的に選択することも有意義である。
【００１８】
最も簡単な場合、例えば試料が単一の色素のみでマーキングされ、試料から反射するレーザ光線の輝度だけが問題である場合は、好ましくは照明光の波長または波長範囲に応じて検出された画像の平均輝度の総和が制御変数Ｒとして利用される。したがって、最適な同調もしくは制御変数Ｒの最大値の算定のための各々の最適化段階で少なくとも１つの画像が撮影される。あるいは、複数の初期設定もテストされ、そのためには最適化段階ごとに２つ以上の画像を撮影する必要がある。各画像ごとに、その平均輝度が算出されて総計される。
【００１９】
しかし、制御変数のこのような簡単な選択ができない場合もある。それは例えば、励起を最適化する際に波長に応じてさらなる色素の交差励起が生ずる場合である。放出光がスペクトル分解されて検出され、付加的に励起される色素の放出スペクトルが判明すれば、スペクトル分離を行うことができる。その場合は、制御変数として照明光の波長または波長範囲に応じて検出された画像内の、通常は様々な画像領域からの２つまたはそれ以上のスペクトル範囲の平均輝度の差が用いられるのが好ましい。
【００２０】
前記の例ではスペクトルのスペクトル分離はコンピュータによって行われる。付加的な色素が１つしかない場合は、２つのスペクトル範囲内の平均輝度を算定するだけで充分である。第１のスペクトル範囲は、結像される色素の最大放出値のあたりに定められる。その場合は、平均輝度として例えばＩＳの値が生ずる。第２のスペクトル範囲としてほぼ付加的な色素の放出が当たる範囲が選択され、そこで平均輝度ＩＣが算定される。制御変数をＲとすると、この場合はＲ＝ＩＳ−ＩＣとなる。この場合は放出光についてのスペクトル範囲の変更もしくは最適化は行われてはならず、範囲は一定に保たれる。所望の信号と少なくとも２つのチャネル内の交差励起信号とのスペクトル分離が問題なく可能である場合は、広範囲のスペクトル分解はまったく省くことができる。
【００２１】
方法の別の実施形態では、制御変数として照明光の波長または波長範囲に応じた画像内の選択された２つの領域の平均輝度の差が用いられる。これは特に、上記の例のようなスペクトル分離が不可能な場合に実施される。その場合、第１の領域は、例えば所望の信号を含む領域として定義される。画像内の第２の領域は、いわゆる背景領域として定義される。後者の場合、干渉光、すなわち上記の例では交差励起によって優位に放出される輝度が検出され、一方、第１の領域では大部分が所望の輝度の検出に由来する。双方の輝度は例えば蛍光信号であってもよい。その場合、制御変数Ｒは第１の領域と第２の領域との輝度差Ｒ＝Ｉ１−Ｉ２となる。より簡明に表示するために、制御変数を双方の輝度の総和で除算することによってさらに正規化することができる。補足として制御変数に第１の領域からの重み付きの、かつ正規化された輝度ｗ＊Ｉ１／Ｉ１ｍａｘを付加的に考慮に入れることが好ましい。ただしｗは選択可能な重み係数である。このようにして、最適な同調に際して所望の輝度に関連してさらに信号／ノイズ比を考慮に入れることができる。
【００２２】
本発明はさらに、波長範囲の光を連続的に放出し、または該範囲内で同調可能な照明源としてのレーザと、照明光の波長、波長部分範囲、複数の波長または波長範囲を選択するための第１の選択手段と、照明光と試料から発する放出光の光路を分離するための分離手段と、試料から反射され、検出光路に達する照明光の検出を防止するための除去手段と、さらに放出光を検出するための検出手段とを含む顕微鏡に関するものである。その際、照明源、第１の選択手段、分離手段および除去手段は制御可能であり、かつそれらの波長選択特性は可変的に調整可能である。このような顕微鏡では上記の目的は、第１の選択手段、分離手段および除去手段を制御変数Ｒに基づいてこの制御変数が最大値をとるように制御し、相互に同調させるための制御装置が備えられることによって達成される。その際、顕微鏡はレーザ走査顕微鏡であることが好ましく、その理由はこのように構成された顕微鏡を制御装置によって異なる検査方法および検査条件に最適に適応させることができるからである。
【００２３】
好ましくは、このような顕微鏡には検査方法および／または試料特性を入力し、または選択するための入力手段が備えられる。それには例えば試料をマーキングするための、または単光子または多光子法のような蛍光物質を励起するための特別な方法を使用できるか否かを判定するための色素を含めることができる。後者の場合は例えば、例えばパルス継続時間およびパルス繰返し率などのレーザのパルス・パラメータに作用を及ぼすために最適化に関する照明光の補足的な制御が有利になることがある。
【００２４】
制御装置は、好ましくは第１の選択手段、分離手段および除去手段を自動的に同調させるように構成されている。初期設定を入力した後、例えば制御装置によって初期波長部分範囲が自動的に調整され、それに適応して分離手段と除去手段との光透過性が調節される。次の段階で、この工程が別の波長もしくは別の波長部分範囲について繰り返される。引き続いて、制御装置では各設定用の算定された制御変数の比較に基づく評価、ならびにそれに続くこの制御変数の最大値もしくは最適値の算定が行われる。その後、この最適な設定に調整される。
【００２５】
顕微鏡の別の有利な実施形態では、放出光をスペクトル分解する手段が備えられる。それによって例えば、複数の色素によってマーキングされた試料から来る光が色素に応じて別個に分解される。その際に、放出光が検出される１つまたは複数の波長範囲を選択するための第２の選択手段を備えることが好ましい。特に、照明光の波長範囲が放出光の波長範囲と重なる場合はこのような選択が必要である。
【００２６】
制御装置が第２の選択手段を制御変数に基づいて制御して、第１の選択手段、分離手段および除去手段と同調させるように構成されることが好ましい。第２の選択手段を除去手段と組み合わせ、またはこれに組み込むことも可能である。このようにして、波長範囲は励起光のみならず放出光についてもそれらの位置、幅および輝度に関して互いに最適に同調されることができる。
【００２７】
第１の選択手段には１つまたは複数の音響光学フィルタ、特に音響光学同調フィルタ（ＡＯＴＦ）または音響光学同調モジュレータ（ＡＯＭ）が備えられることが好ましい。ＡＯＭ技術に対するＡＯＴＦの利点は特に、２つ以上の波長もしくはスペクトル範囲を広帯域のスペクトルから第１次回折での分割を介して同時に選択可能であることにある。それは色素として色素依存のスペクトル幅での励起が可能である、ひいては利用可能な広帯域のレーザ光源のレーザ性能をより良好に活用できるという重要な特性があるためである。したがって、上記のような励起の最適な同調に関して、スペクトル幅に関してもフレキシビリティができるだけ高いことが有利である。先行技術によるＡＯＴＦは極めて狭いスペクトル幅、もしくは幅が０．５乃至２ｎｍの高いスペクトル鮮鋭度を有している。他の場合は同じ特性で、例えば４９０ｎｍの平均波長の場合にスペクトル幅が２５乃至３０ｎｍで、６７０ｎｍの平均波長での場合にスペクトル幅が６０乃至６５ｎｍのような、より広いスペクトル幅を実現するような前記ＡＯＴＦの技術的実施形態も考えられる。ＡＯＴＦのスペクトル窓の幅は基本的に変更不能なシステム特性である。
【００２８】
先行技術によるＡＯＭはそれぞれ調整された音響光学周波数において、ＡＯＴＦよりも広いスペクトル幅を実現している。スペクトル幅は例えば近赤外線範囲では約２０ｎｍであり、約４９０ｎｍ乃至６４０ｎｍの範囲では約２０乃至４０ｎｍである。ＡＯＭは約１５０ｎｍを超える可視範囲では同調可能であり、したがってこの範囲は２５０ｎｍ超で同調可能なＡＯＴＦの場合よりもやや狭い。
【００２９】
したがって、より広い１つのスペクトル範囲、またはより狭い複数のスペクトル範囲を選択できるようにするため、フィルタ、すなわちＡＯＭおよび／またはＡＯＴＦは直列に接続されることが好ましく、その際に各ＡＯＭおよび／またはＡＯＴＦは別の波長または別の波長範囲を分離する。そこで好ましくは、分離された波長または波長範囲を結合する手段が備えられる。それには例えば、好ましくはロングパス、ショートパスまたはバンドパス・フィルタとして実施されるダイクロイック・ビームスプリッタを使用できる。照明源が、極めて短いパルスを送出し、このパルスが非線形の試料交換作用のために物面で使用されるレーザである場合は、個々の素子内のガラス経路が連続する大きいガラス経路であるため（この場合、材料として例えばＴｅＯ２またはＳｉＯ２が問題になる）、先行技術で格子区間またはプリズム区間として実現可能な拡散補償が必要である。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態では、第１の選択手段には１つまたは複数の可変調整可能な液晶フィルタが備えられる。電気光学的な機能メカニズムに基づくこのような同調可能な液晶フィルタによっても照明光のスペクトル選択が可能である。この液晶フィルタには例えばいわゆる液晶可同調フィルタ（ＬＣＴＦ）が挙げられる。ＬＣＴＦでは、４００乃至７２０ｎｍ、６５０乃至１１００ｎｍ、８５０乃至１８００ｎｍおよび１２００乃至２４５０ｎｍのスペクトル範囲用の実施形態が知られている。光線が透過するそれぞれの窓の半価幅はＡＯＴＦおよびＡＯＭの場合と同様にシステム全体で一定であり、最初に挙げたスペクトル範囲については４００ｎｍの下限波長では１０ｎｍの範囲にあり、また約７００ｎｍの上限波長では４５ｎｍである。約５０Ｈｚの切換え周波数によって透過範囲の迅速な交換が可能であり、その際に一時に１つの範囲だけを選択できる。
【００３１】
さらに一般に格子、プリズムもしくは単色分光器に基づく構成も考えられる。顕微鏡の別の構成では、第１の選択手段には１つまたは複数の可変調整可能なバンドパス・フィルタが備えられる。このような同調可能なバンドパス・フィルタは、例えば独国特許出願公開第１９８３５０７０Ａ１号明細書に記載されているようなロングパスおよびショートパス・フィルタの形態の、対応する微細に段階付けした干渉フィルタに基づいて構想することができる。それによって大きい波長範囲をカバーすることができるだけではなく、補足的にそれぞれの帯域通過の幅をも可変状態に保つことができる。１０ｎｍという個々のロングパス・フィルタもしくはショートパス・フィルタの最小の段階付けは先行技術に対応するものである。これに対応して、結果として生ずる帯域通過の半価幅もこの大きさにある。上記の電子光学または音響光学フィルタ素子のような半価幅と波長との固定的な結合はなされないので、スペクトル幅の意図的な影響が可能である。このようなバンドパス・フィルタはもちろん、上記のような別の構成部品との組合せでも使用できる。これは輝度も変調する必要がある場合に有利であるが、それはバンドパス・フィルタでは不可能だからである。
【００３２】
輝度変調のための別の手段は簡単なグレーフィルタの他に、個別に段階付けされて回転可能なホイールに配置されているにせよ、連続フィルタとして連続しているにせよ、線形偏光フィルタまたは偏光ビームスプリッタと組み合わせたλ／２プレートの形態のアクロマティックな遅延プレートに基づく偏光減衰器もある。アクロマティックな遅延プレートは可視スペクトル範囲内では約２５０ｎｍのスペクトル範囲を、また近赤外線範囲では約５００ｎｍをカバーできる。別の可能性としては簡単な液晶フィルタを使用することがある。このような装置はスペクトル選択の前または後に接続されることが有効である。輝度変調の別の可能性としては、例えばファラディ回転子におけるような磁気光学効果、または例えばいわゆるポッケル・セルにおけるような電気光学効果を介した偏光回転に基づく部品を使用することがある。もちろん、許容されるならば、レーザ源の直接変調も可能である。
【００３３】
色素を励起する照明光を放出光線から分離するために、特にレーザ走査顕微鏡を使用する蛍光顕微鏡検査ではいわゆる３原色分離光学系（ＨＦＴ）が使用される。その場合、このような３原色分離光学系は機能に応じて３つの入力および出力、いわゆるポートを備えている。第１のポートでレーザ源の光は３原色分離光学系に到達する。この光は第２のポートでＨＦＴから出て、試料へと向けられる。第２のポートは同時に、試料から来る光のための入力、特に試料との交換作用によって発生する蛍光光のための入力としての役割も果たす。この光はＨＦＴ内でレーザ光とスペクトル分離され、第３のポートを経て検出器に向けられる。
【００３４】
分離手段には照明光および放出光がスペクトル分解され、波長に応じて修正され、偏光されるフレキシブルな３原色分離光学系が備えられることが好ましい。波長に応じた修正によって、励起光と放出光とを効率よく分離し、適正なポートに送ることが可能になる。その際に、例えば独国特許発明第１９５１０１０２号明細書、独国特許発明第１００１７８２５号明細書、および独国特許発明第１９８４２２８８号明細書に記載されているように、波長に応じて機械的素子によって例えば光路を制御できる。別の可能性としては、例えば液晶に基づくいわゆる空間光モデュレータ（ＳＬＭ）を用いて光の偏光を制御することがある。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、分離手段には照明光および放出光が空間的に異なる領域で結像され、偏光されるアクロマティックな３原色分離光学系が備えられる。この場合は前述のフレキシブルな３原色分離光学系とは異なり、スペクトル帯域がフレキシブルに調整されるのではなく、励起と検出との分離は広帯域で行われる。レーザ走査顕微鏡による蛍光顕微鏡検査では、この分離は励起光と蛍光との様々な空間干渉度に基づいて行われる。励起光は空間的にコヒーレントなので、この光は限定された構造でひとみ内に形成されることができる。これに対して空間的にインコヒーレントな蛍光光はひとみ全体を満たす。励起光が適宜に形成され、ＨＦＴ内で適切に反射または透過された構造を援用すれば、このようにして励起光を波長に依存することなく完全に試料に送り、また蛍光光をわずかな損失で検出器に送ることができる。
【００３６】
例えば照明光の波長が検出すべきスペクトル範囲内に入るので、前記の素子を用いた照明光と放出光の完全な分離ができない場合は、このような光が検出器に到達することを防止する除去手段を備えることが好ましい。除去手段には好ましくは可変的に調整可能なスペクトル選択絞りを備えることが好ましい。このような絞りは例えば独国特許発明第１０３４００２０号明細書に記載されている。
【００３７】
好ましくは上記の方法および顕微鏡を蛍光分光法または蛍光相関分光法に使用し、ＦＲＥＴおよびＦＬＩＭ分析で、多光子励起の検査で、色素識別で、また一般的に試料の操作で使用することができる。もちろん、このように列挙した例がすべてではなく、その他の用途、特に生物医学上のおよび当業者にはよく知られている使用法が考えられる。
【００３８】
次に本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
図１には検出波長範囲が固定している場合に励起波長を最適化するための方法の流れ図が示されている。ユーザは最適化を開始するためのシステムの基本設定を自ら行うこともでき、または試料内にある色素を入力して、放出スペクトルおよび検出スペクトルがファイルされたデータバンクを利用することもできる。後者の場合は、データバンク情報に基づいてシステムの基本設定が自動的に行われる。ステップ幅、励起帯域および検出帯域のようなその他の最適化パラメータがシステムによって自動調整される。最適化を開始する前に、ユーザによるこの調整の制御と処理が可能であるが必ずしも必要ではない。ここに示した蛍光顕微鏡による測定の例では、基準試料または検査される試料自体で行われる最適化の枠内で、励起波長λは所定のステップ幅の枠内で変更される。あるいは、波長範囲を変更することもでき、また複数の波長範囲の変更も可能である。調整された波長に応じて、この例では次に分離手段および除去手段が適応化され、試料から反射する光の検出が行われる。その際に、好ましくは、完全な画像またはｚ方向の画像のファイルが保存されるが、検出は試料内の個々のポイントについてだけでしか行うことができない。いずれの場合も、検出された信号は制御変数Ｒに変換される。例えば、Ｒは保存されたすべての画像の平均輝度の総和であると定義することができる。このように算定された制御変数Ｒについて次に、この段階で算定された値が先行段階での制御変数Ｒの値より大きいか否かの比較が行われる。そうではない場合は、次の励起波長のための設定の調整が行われ、改めて制御変数Ｒが算定される。制御変数Ｒがこれまでに算定された制御変数Ｒの値と比較して最大である場合は、調整された設定は記憶され、そこで初めて次の波長が調整される。励起波長のこのような変更の終了時に、システムが、制御変数Ｒの最大値に合わせて調整され記憶された調整値に対応するように設定される。
【００４０】
図２ａおよび２ｂには、複数の色素の波長に応じた交差励起が生ずる場合の励起の最適化における制御変数の算定が示されている。このような場合は信号もしくは輝度を直接分離することは不可能である。したがって、基本的に所望の蛍光が検出される第１の画像領域、ならびに優先的に交差励起によって放出される蛍光が検出される背景領域としての第２の画像領域が定義される。２つの領域からの平均信号もしくは輝度は波長に応じて図２ａに示されている。ステップ幅はここでは５ｎｍである。
【００４１】
この場合に可能な制御変数として、例えば背景領域からの平均信号Ｓ２に対する第１の画像領域からの信号Ｓ１のコントラストが問題になる。
【００４２】
【数１】
0005189277.tif 000002
この制御変数は図２ｂに示されている。
【００４３】
信号／ノイズ比も考慮に入れるために、コントラストはさらに付加的に第１の画像領域の重み付きの正規化された信号値で補完できる。
【００４４】
【数２】
0005189277.tif 000003
図２ｂには重みｗ＝１の場合の制御変数Ｒｂが示されている。最適値として第１近似で実際に調整された波長λでの制御変数値が用いられるが、測定値に対して補間がなされることが好ましい。この場合は、実際に調整された値と密接した、それぞれ補間された最適な励起波長が得られる。
【００４５】
図３には図１よりも拡大された方法の流れ図が示されており、この図では補足的に各波長段階で検出帯域もしくは検出波長の状態が最適化されている。これは、例えば様々な放出フィルタの導入に関連する分離手段の調整によって行うことができる。このようにして、各励起波長ごとに検出向けに最適化された制御変数Ｒｄが得られる。最適化の終了時に、図１に示された方法と同様に、例えば補間によって制御変数Ｒの最大値が算定され、それに応じてシステムが設定される。
【００４６】
図４には本発明による顕微鏡の基本概略図が示されている。左側には波長範囲の光を連続的に放出し、またはこの範囲で同調可能なレーザを含む照明源１がある。照明源１から光が放射され、第１の選択手段２に偏光される。ここで照明光の１つの波長または波長範囲、複数の波長または波長範囲の選択が行われる。先送りのために選択された波長または波長範囲は分離手段３に偏光される。これは照明光と試料５から来る検出光の光路を分離する役割を果たす。矢印は光線の方向を示している。選択された波長範囲の光は結像モジュール４を介して試料５に偏光される。試料５が蛍光色素によってマーキングされると、照明光が吸収される。励起された色素は別の波長の光を放出し、これは分離手段３に反射される。分離手段３によって放出波長の光の他に、例えば試料から反射された照明光の一部をも含む放出光が除去手段６に向けられ、そこで照明光のこの部分が除去される。そこで放出光は第２の選択手段７に偏光され、そこで放出光が検出される１つまたは複数の波長範囲が選択される。除去手段６と第２の選択手段７とは単一の部品として実施されてもよい。第２の選択手段７から光は最終的に、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラを含むことができる検出手段８に到達する。検出値を用いてコンピュータで生成された画像が記憶される。本発明による顕微鏡はさらに、照明手段１、第１の選択手段２、分離手段３、除去手段６、第２の選択手段７、ならびに検出手段８と接続された制御装置９をも含んでいる。制御装置９によって、個々の構成部品が制御され、また前述のように互いに最適に同調される。その際にアルゴリズムはハードウェア回路を介して、または適宜のプログラムを介して、または双方の組合せを介して実行することができる。手動による同調された制御も可能である。
【００４７】
図５には様々な波長、ならびに様々な波長範囲の光を生成する照明源１が例示されている。システムの基本は、増幅システムの直接的な放出によってパルスされる１．５６μｍの、またパルスのスペクトル幅が約５０ｎｍ、パルス長の範囲が１００ｆｓまたはそれ未満のレーザ光線を発するエルビウム・ファイバ・レーザ１０である。その場合、この光線の周波数は、例えば拡散シフトされ、ドープされたグラスファイバまたは非線形結晶（また、その組合せ）でのコンティニウム光発生によって変換されることができる。この方法は、例えばエフ  タウザー外（Ｆ．Ｔａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）により２００４年３月１日公刊のＯｐｔ．Ｌｅｔ．、第２９巻、第５号に記載されている。エルビウム・ファイバ・レーザ１０の光線によって非線形周波数増倍法を用いて波長が７８０ｎｍおよび３９０ｎｍの光を直接発生することができる。非線形コンティニウム光発生によって補足的に９００ｎｍ乃至２０００ｎｍの範囲で同調可能なパルス長が約１００ｆｓの光線を発生することができる。それによって、さらに、これも非線形周波数増倍法によって同調範囲を可視範囲にシフトすることができる。したがって、原理上、補足的に４５０ｎｍ乃至１０００ｎｍのスペクトル範囲がカバーされる。
【００４８】
４５０ｎｍ乃至９００ｎｍのスペクトル範囲ではレーザ・パルスのスペクトル幅は、短波の部分範囲での約１０ｎｍと長波の部分範囲での４５ｎｍの範囲にある。このようにして、３９０ｎｍもしくは２２５ｎｍ乃至２０００ｎｍの範囲のレーザ光線を供給する単一の光源が得られる。この範囲内での同調が同時に可能な場合は、様々な波長範囲を同時に利用できる。第１の選択手段２を用いて、１つの波長範囲または複数の波長範囲を外部からも分割可能である。このことは使用時には、同時に利用可能な複数のレーザ線向けに構成された実験で、画像撮影の際に、例えばチタン・サファイア系の場合のようにレーザを周期的に同調させる必要がないという利点がある。
【００４９】
ここで、重要な例として選び出される生物医学的用途の枠内でＬＳＭを使用する場合、本質的なコントラストのメカニズムは蛍光である。蛍光色素は、励起のために使用されるレーザ光線が同調されなければならない特有の励起メカニズムを有している。その際、レーザ放出と試料５内にある色素の励起スペクトルとが完全に、または部分的に重なると蛍光信号が発生される。すなわち、レーザ光源の光子が試料５から吸収される。ほとんどの場合、蛍光色素の放出スペクトルは励起スペクトルに対して吸収時のエネルギー損失によって長波スペクトル範囲へとシフトされる。しかし、２つのスペクトル間のこのいわゆるストークス・シフトは極めてわずかであることが多いので、簡単な手段では検出の際にスペクトルの完全な分離を達成することはできず、励起スペクトルと放出スペクトルとが部分的に重複することが多い。その結果、不要で、検出サイドで除去することが困難な迷光が生じないようにするため、可視スペクトル範囲では試料に到達するレーザ光線を正確に選択することが必要である。
【００５０】
図６には２色の着色の場合の、関与する色素の重複する励起スペクトルと放出スペクトルの関係が示されている。第１の色素のスペクトルは点線で示され、第２の色素のスペクトルは２点鎖線で示されている。両方の場合とも励起スペクトルと放出スペクトルとは重なるので、実験の明確な解析は、それぞれのスペクトルが正確に判明していて、励起と検出との同時的な同調がなされた場合にのみ成功する。したがって、広帯域で放出され、または同調可能な光源は、励起の帯域が広帯域であるにもかかわらず迷光が検出されない場合だけ有効に使用できる。図６には２つの色素にとって最適化された励起もしくは検出のための波長範囲がそれぞれ異なる斜線で長方形として示されている。したがって実験では励起のために使用されるレーザ光の大部分ができるだけ完全に除去されなければならない。そのために上記の照明源１との関連でさらに別の構成部品が必要である。
【００５１】
１つの部品は特に音響光学フィルタの使用が適している第１の選択手段２によって実現される。それには上記のＡＯＴＦおよびＡＯＭが挙げられる。ＡＯＴＦのスペクトル窓の幅は、波長範囲に応じてレーザ光線のスペクトル幅よりも約３０％乃至５０％広いので、この場合はレーザのほぼ全エネルギーを利用することが常に可能である。広帯域で放出されるレーザと組み合わせて、ＡＯＴＦは特に、選択された窓の外側のスペクトル範囲がＡＯＴＦによって効果的に除去されるという意味でスペクトル選択に適している。これは補足的に限界周波数が約５００ｋＨｚの高速スイッチとして機能し、レーザ光線のエネルギーを準連続的に変調もしくは調整することができる。
【００５２】
図７にはスペクトル窓の幅の変更がどのようにして達成されるかが示されている。広帯域で同調可能なレーザの場合、レーザと広帯域のＡＯＴＦの中心周波数が互いにシフトされる。レーザのスペクトルは図７では波長に応じた同形の輝度分布として実線で示されており、ＡＯＴＦの通過範囲は点線で示されている。中心周波数と符合する２つのスペクトルの最大値の上の２つの矢印はスペクトルの相互がシフト可能であることを意味している。双方の中心周波数を相互にシフトさせると、スペクトルの一部だけが、ここでは陰影線で示された２つのスペクトル分布の重複領域を通され、利用される。別の可能性として、例えば微細に段階付けした干渉フィルタを使用した可変バンドパス・フィルタのような補足的な素子との組合せがある。さらには、広帯域と狭帯域のＡＯＴＦとを１つのアセンブリに組み込むことによって、選択されたスペクトル範囲の幅を音響光学技術の特性の枠内で、また光源のスペクトル輝度を考慮に入れたそれぞれのＡＯＴＦの選択によって選択可能にすることも考えられる。
【００５３】
他方ではＡＯＭは調整された音響光学周波数に関してＡＯＴＦよりも広いスペクトル幅を有しており、これは近赤外線範囲では約２０ｎｍであり、可視範囲では２０ｎｍと４０ｎｍとの間にある。その同調可能範囲は近赤外線範囲では約４００乃至５００ｎｍであり、可視スペクトル範囲では最大１５０ｎｍである。したがって、同調可能範囲は可視スペクトル範囲で約２５０ｎｍであるＡＯＴＦの場合よりもやや狭い。したがって、例えば４５０乃至７００ｎｍのスペクトル範囲でＡＯＭを介してスペクトル選択および輝度変調を行うために、複数のＡＯＭを直列に配列することが有利である。
【００５４】
図８には３つのＡＯＭ１１、１２、１３のこのような直列配列が示されている。これらは、ＡＯＭ１１、１２、１３が照射方向に（図では左から右に）並んでいる場合、スペクトルの次第に長くなる波長部分が選択され、それぞれ先行するＡＯＭ１１もしくは１２の回折しない０次回折が後続のＡＯＭ１２もしくは１３内に入るように構成されている。ＡＯＭ１１、１２、１３を通って光軸から離れる回折次数は、ミラー１４およびダイクロイック・スプリッタ１５、１６を介して統合され、再び平行に光路内に結合され、これに対して非回折次数はビーム・トラップ１７によって吸収される。図示して例では、ＡＯＭ１１は例えば４５０乃至４９０ｎｍの範囲を偏光し、ＡＯＭ１２は４９０乃至６４０ｎｍの波長範囲を偏光し、ＡＯＭ１３は６４０乃至７００ｎｍの範囲を偏光する。
【００５５】
分離手段３を用いて、励起光線は放出光線から分離される。ＬＳＭの場合は通常はいわゆる３原色分離光学系（ＨＦＴ）が使用される。このようなＨＦＴは励起スペクトルと検出スペクトルとを分離し、そのため機能に応じて３つの入力および出力、いわゆるポートを備えている。第１のポートＰ１を介してレーザ源の光は効率的に試料に向けられる。第２のポートＰ２を介して試料と照明光との交換作用によって発生する蛍光光がレーザ光からスペクトル分離される。最後に第３のポートＰ３を介して蛍光光は効率的に検出器に向けられる。
【００５６】
図９ａおよび１０ａにはこれらのポートＰ１、Ｐ２およびＰ３が同様に示されている。２つの図面はこのようなＨＦＴの可能な構成を平面図で示しており、対応する側面図が図９ｂもしくは１０ｂに示されている。２つの場合ともこれは励起および検出向けのスペクトル帯域の選択に際してフレキシブルないわゆる可変３原色分離光学系である。励起光および試料から放出される蛍光光は、それぞれスペクトル分解され、その後、備えられたポートＰ２またはＰ３を経てＨＦＴを出るように、波長に応じて特性が修正される。図９ａおよび９ｂに示された可変ＨＦＴの変化形態では励起光と放出光とは幾何的に分離される。照明光は、まずビームスプリッタ１８に当たり、妨害されずにこれを通過する。プリズム１９で光はスペクトル分割される。光は、ミラー２０および２１を経てスイッチ素子２２へと偏光され、このスイッチ素子２２は個々に制御可能な複数のミラーを有するミラー・アレイであってよい。ミラーは、波長に応じて光源から来る光線を別の偏光ミラー２３、プリズム１９、および別のビームスプリッタ２４を経て試料またはビーム・トラップ２５へと向ける。
【００５７】
機械的素子のスイッチによって光路を制御する代わりに、ＨＦＴを偏光光学式に形成することもできる。このような構成は図１０ａおよび１０ｂに示されている。前述の例の簡単なビームスプリッタの代わりに、この場合は偏光ビームスプリッタ２６および２７が使用される。スイッチ素子２８は、この場合は方向転換の役割を果たすのではなく、偏光回転の役割を果たし、例えば波長に応じた遅延プレートとして機能する液晶セルとして形成されることができる。
【００５８】
除去手段６によって、励起のために使用されるレーザ光が検出器に到達することが防止される。その際に、いわゆる放出フィルタが使用され、その実施形態もしくは形状は後続の検出器に応じて異なる。
【００５９】
可能な構成の１つは図１１に示すように励起のために使用される光が意図的にブロックされるスペクトル選択絞りを使用することである。３原色分割光学系から来る光は、まず格子２９を介してスペクトル分解され、ミラー３０を介してライン検出器３１の前に配置されている絞りアレイ３２へと向けられる。絞りアレイ３２の個々の絞りは、例えばビーム・トラップとして形成することが可能であり、好ましくはライン検出器３１への光路を選択的に開放または遮断するように電子的に制御可能である。それによって補足的に複数のスペクトル帯域を同時に検出する可能性が開かれる。
【００６０】
単一検出器を有する検出の場合も、絞りアレイによるスペクトル選択的な遮断が達成可能である。大規模集積検出器が使用されない場合は、そのためにスペクトル分割された光線を再び検出前に集結させなければならない。これは例えば４ｆ構成と組み合わせた少なくとも１つの別の拡散素子を使用して行うことができる。このような構成の例が図１２に示されている。ＨＦＴから来る光は、まず格子３１に当たり、そこでスペクトル分解され、レンズ３４に結像される。個々の光線は、次に絞りアレイ３２に並行に当たり、そこで波長に応じて通過または遮断される。図示した例では、上の光線が遮断され、一方、２つの別の光線は通過することができる。その焦点距離もレンズ３４と同様にｆであるレンズ３５によって光線は格子３６に結像され、そこで光線は再び共通の光線に統合され、除去手段６を離れて単一検出器へと向けられる。格子の代わりにプリズムを使用することもできる。
【００６１】
図１３で使用される構成は、図１２に示されている構成よりもやや簡単であり、ブロックする素子の前に共焦点フィルタリングが行われる場合、検出時にスペクトル部分の正確な重複が生じないことに基づいている。スペクトル分解され、透過される部分はレンズ３７から直に検出器８に結像される。絞りアレイを使用する代わりに、励起スペクトルの遮断に必要なスペクトル内の判明している位置にモータによって移動される、例えば幅が可変の移動可能なスリット、または簡単なエッジとして実施可能な単一の絞りを使用することもできる。
【００６２】
絞りアレイ３２が第２の選択手段７の機能をも果たし、検出されるスペクトル範囲の選択に使用できるものの、前記の変化形態の場合には補足的に第２の選択手段も必要である。これは除去手段６の前または後ろに配置することができ、第１の選択手段２と類似した構成部品からなるものでよい。そこで、例えば同調可能なバンドパス・フィルタが単チャネル検出器用の放出フィルタとしても適している。その際に、通過範囲は対応するチャネル内で検出される蛍光色素の放出スペクトルへと最適化される。
【００６３】
以下では上記の構成部品の適宜の組合せによって、広帯域で放出され、または広帯域で同調可能なＬＳＭ内のレーザ光源の実用的な利用のために必要な機能を果たす構成を示す。
【００６４】
図１４は選択可能なスペクトル幅を有する複数線励起が可能な構成を示している。広帯域で同調可能な、もしくは放出されるレーザを含む照明源１から切換え可能なミラー３８を用いて光を別のミラー３９を介して選択的に狭帯域のＡＯＴＦ４０または広帯域のＡＯＴＦ４１に向けることができる。これに対応して、概略的に示された透過スペクトルによって示されるように、蛍光励起のために使用される光の所望のスペクトル幅が選択可能である。広帯域のＡＯＴＦ４１を使用する場合は、好ましくはパルス式レーザ光の帯域幅はカットされないので、試料内での多光子処理が可能になる。切換え可能なミラー３８は、好ましくは５０：５０の分割比で選択的に固定ニュートラル・スプリッタとしても実施可能である。２つのチャンネルからの光線部分を再び統合するために、同類のミラー４３が使用される。双方の光路の統合は偏光光学スプリッタの使用によっても可能である。上記の機能を実現する別の可能性は、切換え可能なスペクトル幅を有する音響光学素子を使用することである。この場合は光線の分割および統合はなされない。それぞれのＡＯＴＦ４０、４１の０次回折の、利用されない光線部分はそれぞれビーム・トラップ４２に向けられる。他方では、選択された光線は、可変的、またはアクロマティックな３原色分離光学系を含む分離手段３に当たる。試料５との交換作用の後に発生する蛍光信号は、同調可能なバンドパス・フィルタとして構成される放出フィルタを形成し、除去手段６の機能をも果たす第２の選択手段７を介して単一検出器４４に向けられる。この構成によってＡＯＴＦ４０、４１の可能性の枠内で少なくとも２つのスペクトル範囲を選択することができ、同時に迅速なトグルならびに輝度変調もしくは輝度減衰を行うことが可能になる。
【００６５】
図１５には、可変的に調整可能なスペクトル幅を有する複数線励起のための構成が示されている。照明源１から来るレーザ光線は方向転換のための光学素子の圧電駆動に基づく光ファイバ・スイッチ４５を介して真直ぐに通過するか、または９０°方向転換される。その際、スイッチは４５０乃至７００ｎｍ、７８０乃至８５０ｎｍ、または１２６０乃至１６５０ｎｍの波長範囲用に構成できる。切換え時間はミリ秒の範囲にあるので、２つの光路間の迅速な往復切換えが可能であり、補足的に光線をビーム・トラップ４６に向けることができる。双方の光路内ではそれぞれ異なる構成が可能な可変バンドパス４７、４８を使用できるので、可変幅を有する２つのスペクトル範囲を広帯域のレーザ光線から選択することが可能である。光ファイバ・スイッチ４５は１つの切換え機能しか実施できないので、輝度変調もしくは輝度減衰の機能はそれぞれ、例えばフィルタホイール４９、５０のような後続の構成素子によって果たされる。光ファイバ・スイッチ４５の代わりに、高速切換え可能なミラー３８を使用することもでき、または波長範囲が定まっている場合にロングパス、またはショートパスとして実施可能な固定ダイクロイック・スプリッタを使用することもできる。選択された光線は切換え可能なミラー４３によって再び１本の光線として統合される。切換え可能なミラー４３の代わりに、ダイクロイック・ビームスプリッタ、ニュートラル・スプリッタ、または偏光光学スプリッタを使用することもできる。そこで、光線は同調可能な、またはアクロマティックなＨＦＴを予め含むことができる分離手段３に当たる。試料５との交換作用後に発生される蛍光信号はライン検出器３１を介して検出される。除去手段６と第２の選択手段７とは単一のスペクトル感知絞りアレイ３２によって実現される。
【００６６】
最後に図１６には単光子励起および多光子励起の選択、または組合せが可能な構成が示されており、これは試料５が操作される検査方法に特に有利である。照明源１から２つの広帯域の、または広帯域で同調可能なスペクトル範囲を同時に利用できる。それには、例えば図５に示されている照明装置が適している。図示した例では、可視範囲では４５０ｎｍ乃至７００ｎｍの波長範囲を、また近赤外線範囲では８００乃至１３００ｎｍの波長範囲を利用できる。少なくとも近赤外線範囲の光線はフェムト秒パルスの形態である。双方の波長範囲ともまず分離される光路内で実験要件に同調させることができる。その際、可視スペクトル範囲では波長選択は好ましくは狭帯域のＡＯＴＦ５１によって行われる。近赤外線範囲では波長部分範囲は好ましくはＡＯＭ５２によって選択される。ＡＯＭ５２はＡＯＴＦと比較してフェムト秒パルスのスペクトル帯域幅をカットしないという利点を備えている。近赤外線範囲内の光線によって多光子励起の他に、もしくは多光子励起を用いて試料５の取扱いも可能であり、その際に可視スペクトル範囲はまず単光子励起時の通常の画像撮影の役割を果たす。
【００６７】
可視スペクトル範囲内の光線もパルスの形態である場合は、さらに光路を別の分岐によって拡張することも考えられるが、それは図１６には図示されていない。この分岐では補足的な周波数増倍によって波長範囲が２２５乃至３５０ｎｍの光線が発生される。このようにして、例えばいわゆるケージ解除のような、特に効率的な所定の操作を実施可能な紫外線範囲の光線が得られる。最適にはこの周波数変換はＡＯＴＦを用いたスペクトル選択の後に行われるので、既に選択された光線だけが増倍される。すべての光路内に、先行技術から知られているように拡散補償装置５３を備えることができる。それによってそれぞれのレーザ光線のパルス長を制御することができる。選択されるスペクトル範囲用に分離された２つの光路があるので、２つの光線はビーム統合器５４によって再び統合される。このビーム統合器５４は先行技術によりダイクロイック・スプリッタ層をベースにして実現可能である。
【００６８】
図１６に示された構成を図１４に示された構成と組み合わせて、一方では前記の２つの波長範囲を利用できるようにすると共に、他方では４５０乃至７００ｎｍのスペクトル範囲で補足的に、レーザ光のエネルギーおよびスペクトルの構造、ならびに時間構造が得られる前述の利点を備えた広帯域のＡＯＴＦを使用するオプションが生ずるようにすることも可能である。
【００６９】
前述の方法および構成によって、レーザ走査顕微鏡を利用する場合は様々な生物医学的用途が考えられ、そのためには励起波長または波長範囲のもしくは検出すべき波長または波長範囲の最適化が重要な役割を果たす。
【００７０】
励起波長の最適化にとって特に興味深い用途はいわゆる蛍光共振エネルギー転換実験（ＦＲＥＴ実験）である。このような実験では、ドナー色素の放出波長がアクセプタ色素の励起波長とある範囲で重複する色素の組合せだけを使用できる。しかし、高いコストの制御の場合でもアーチファクトを排除することができず、またその結果、対応して得られる有意義な結果が少ないので、双方の色素とドナー色素の励起波長との交差励起はできるだけ避けるべきである。しかし最適な励起波の選択、すなわちドナー色素にとってできるだけ効率的であるがアクセプタなしで励起することは、対応して測定精度が高まり、ひいては検査される構造の情報をより精密なものにすることができるので極めて有利である。その上、励起波長を自由に選択できることで２つ以上の隣接するラインによる励起、および撮影された蛍光画像の対応するコンピュータ評価から交差励起とＦＲＥＴの分離を達成する可能性が開ける。
【００７１】
励起波の最適化を利用できる別の方法はいわゆる蛍光寿命画像顕微鏡法（ＦＬＩＭ）である。この場合は励起状態の色素の寿命が生体細胞内で測定され、その寿命はナノ秒の範囲にある。その際に寿命は試料の局部環境に決定的に左右される。寿命および局部環境への依存度を正確に調査するには、交差励起を回避した効率的な励起が不可欠である。このような測定をＦＲＥＴ実験と組み合わせることもできる。
【００７２】
広帯域で放出され、または広帯域で同調可能なレーザの使用による励起波長の最適化が重要な役割を果たす別の用途は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）である。それはＬＳＭによって捉えられる共焦点容積内の分子の化合特性を調査可能である極めて高感度の方法である。有意義な自動相関信号にとって、また良好な交差相関信号にとってさらに重要なことは、励起波長を色素に良好に同調させることである。この同調によって、「最大励起」という判断基準ではなく「最小のクロストーク」という判断基準で選択された適切な色素を使用することが可能になる。クロストークの最小化、すなわち短波色素のスペクトル派生物による長波色素の励起を最小限にすることによって、測定される事象が変質することがないので相関信号のより正確な評価が可能になる。同調可能であることによってさらに、それぞれの用例に適したさらに別の色素が開発される。少なくとも２つの色素で動作する交差相関は特に重要である。
【００７３】
本発明は特有のスペクトル情報を用いて色素を識別する際にも利点をもたらす。励起波長を自由に選択することで、色素の信号を識別するために２つ以上の個別波長での信号の輝度差を評価することができる場合が多い。その際に個別波長を同時に利用することが有利であるが、その理由はそうしないと、生体試料の場合に使用できるようにするためには、レーザを別の波長に同調させるための期間が長すぎるからである。波長は短い周期で交互に切換えられるので、ほとんど遅延なく蛍光信号を識別することができる。その際の方法の選択可能性は波長を自由選択によって生じ、それによって試料内にある色素全体を考慮に入れた特に特徴的な痕跡を利用できる。
【００７４】
７００乃至１０００ｎｍの範囲の多光子励起を利用して、この方法は直接検出、いわゆるノンデスキャン検出にも使用できるので、組織薄片、組織標本または動物全体のような強く散乱する試料の場合にも使用できる。それによって例えば、ミリ秒範囲の必要な時間分解能を有する信号を取得し、引き続き同時にスペクトル分離ができるので、組織片内のイオン濃度の複雑な測定への道が開かれる。その際の測定速度はもはやレーザを同調する速度に左右されず、スキャナの速度によってのみ左右される。
【００７５】
本発明による方法および本発明による構成は試料の取扱いにも有利に適している。それは通常は精密な漂白、例えばケージ解除、光子変換、または光子活性化のような光化学的修正、または物理的破壊のような目的をもったフッ化クロムの励起であると理解される。ケージ解除には例えば紫外線範囲の波長ならびに近赤外線範囲の波長が用いられる。一方、画像撮影は可視範囲で行われる。既に処理中から手順を辿ることができるように、この場合もできるだけ同時に作業することが望ましい。使用される波長の最適化によって、ケージ解除も信号発生のために色素励起もより効率的に行うことができ、ひいては結像が最適化され、また試料の負荷を最小限にすることができる。
【００７６】
ここに記載した用途は例として選択されたものに過ぎない。本発明による方法は、本明細書では明示しないがユーザにとっては自明な他の検査方法にも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】固定検出波長範囲での方法の流れ図。
【図２ａ】試料の様々な領域からの２つの信号の信号強度を示すグラフ。
【図２ｂ】可能な２つの制御変数の曲線を示すグラフ。
【図３】可変検出波長範囲での方法の流れ図。
【図４】顕微鏡の基本概略図。
【図５】複数の波長もしくは波長範囲を有する照明光を発生するための照明源の概略図。
【図６】２つの色素でマーキングされた試料用の照明光および放出光の波長範囲の最適な調整を示すグラフ。
【図７】照明光スペクトルとＡＯＴＦのスペクトル通過範囲との同調による波長選択を示すグラフ。
【図８】複数のＡＯＭの直列接続を示す概略図。
【図９ａ】幾何的な光分離を行う可変３原色分離光学系の概略平面図。
【図９ｂ】上記の可変３原色分離光学系の概略側面図。
【図１０ａ】偏光光学的光分離を行う可変３原色分離光学系の概略平面図。
【図１０ｂ】上記の可変３原色分離光学系の概略側面図。
【図１１】検出前に照明光のスペクトル選択および除去を行うための除去手段の概略図。
【図１２】スペクトル選択のための第２の変化形態。
【図１３】スペクトル選択のための第３の変化形態。
【図１４】選択可能なスペクトル幅を有する複数線励起のための構成の概略図。
【図１５】可変的に調整可能なスペクトル幅を有する複数線励起のための別の構成の概略図。
【図１６】同調可能な単光子励起と多光子励起とを組み合わせる構成の概略図。
【符号の説明】
【００７８】
１…照明源、２…第１の選択手段、３…分離手段、４…結像モジュール、５…試料、６…除去手段、７…第２の選択手段、８…検出手段、９…制御装置、１０…エルビウム・ファイバ・レーザ、１１、１２、１３…ＡＯＭ、１４…ミラー、１５、１６…ダイクロイック・スプリッタ、１７…ビーム・トラップ、１８…ビームスプリッタ、１９…プリズム、２０、２１…偏光ミラー、２２…スイッチ素子、２３…偏光ミラー、２４…ビームスプリッタ、２５…ビーム・トラップ、２６、２７…ビームスプリッタ、２８…スイッチ素子、２９…格子、３０…ミラー、３１…ライン検出器、３２…絞りアレイ、３３…格子、３４、３５…レンズ、３６…格子、３７…レンズ、３８…切換え可能なミラー、３９…ミラー、４０…狭帯域のＡＯＴＦ、４１…広帯域のＡＯＴＦ、４２…ビーム・トラップ、４３…切換え可能なミラー、４４…単一検出器、４５…光ファイバ・スイッチ、４６…ビーム・トラップ、４７、４８…可変バンドパス、４９、５０…フィルタホイール、５１…狭帯域のＡＯＴＦ、５２…ＡＯＭ、５３…拡散補償装置、５４…ビーム統合器、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３…ＨＦＴのポート、Ｒ…制御変数、Ｓ…信号。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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