(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点蛍光走査型顕微鏡法において、１つの光源（３）の１つの照射ビーム経路（２）およびさらに別の光源（５）の少なくとも１つのさらに別の照射ビーム経路（４）を有し、
前記１つの照射ビーム経路（２）と前記さらに別の照射ビーム経路（４）が、少なくとも試料領域において互いに部分的に重なり合うことができるような試料（１）を照射する装置であって、
少なくとも１つの光学素子（７）が前記さらに別の照射ビーム経路（４）に配置され、前記試料領域における前記照射ビーム経路（２，４）の光の照射パターンが環状照射パターンを有するように、前記光学素子（７）が光の位相若しくは光の振幅を変化させる、と共に、
前記さらに別の光源（５）からの光が当たり、該光を発散光学系（１２）の方向に反射するビームスプリッタキューブ（１１）と、
前記発散光学系（１２）の方向に反射された前記さらに別の照射ビーム経路（４）の光が、前記光学素子を通過した後に当たるミラー（１３）
とを具え、
該ミラー（１３）は、該ミラー（１３）に入射した光を、前記光学素子、発散光学系（１２）及び前記ビームスプリッタキューブ（１１）を通過して第１のビームスプリッタ（６）に達するように反射し、
該第１のビームスプリッタ（６）で、前記さらに別の照射ビーム経路（４）が前記１つの光源（３）の照射ビーム経路（２）と結合し、
該第１のビームスプリッタ（６）の光は、検出ビーム経路（２１）中に配置される第２のビームスプリッタ（２２）および走査装置（１６）を経て前記試料（１）に照射され、
前記検出ビーム経路（２１）は、前記第２のビームスプリッタ（２２）によって、前記１つの照射ビーム経路（２）と前記さらに別の照射ビーム経路（４）から分離されることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好ましくは共焦点蛍光走査型顕微鏡法において、１つの光源の１つの照射ビーム経路およびさらに別の光源の少なくとも１つのさらに別の照射ビーム経路を有し、照射ビーム経路が互いに少なくとも部分的に重なり合うことができる試料照射装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
国際公開第９５  ２１  ３９３号により、特に共焦点蛍光走査型顕微鏡法に関して、一般的なタイプの装置が既知である。この装置において、試料点の横解像度を向上させるために、試料点は励起光ビームを用いて照射され、その結果、励起光によって作用される蛍光分子が励起状態に達する。さらに、試料点は、適切な波長の誘導光ビームを用いて照射され、その結果、励起状態にある蛍光分子を誘導放出のプロセスによって基底状態に戻らせることができる。このような関係において、励起光ビームおよび誘導光ビームは、その強度分布または照射パターンが試料領域において、互いに部分的に重なり合うように配置される。オーバーラップ領域にある蛍光分子は、励起光ビームによる励起直後に、誘導放出によって基底状態に達するため、蛍光は、誘導ビームの照射パターンまたは２つの照射パターンのオーバーラップ領域に位置するのではなく、励起ビームの照射パターンに位置する蛍光分子からのみ検出される。誘導放出光および反射誘導光は、光学フィルタによって走査型顕微鏡の検出ビーム経路からフィルタリングされるため、励起ビームの照射パターンの領域から２つの照射パターンのオーバーラップ領域を除いた蛍光のみが検出される。このような縮小により、回折限界画像の限界より小さいサイズまで蛍光放射に寄与する試料領域を縮小させることができるため、解像度が向上する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述した既知の一般的な装置において、励起光ビームおよび誘導光ビームの調整は、２つの光ビームが空間的に明確に定義された方法で互いにそろえなければならないため、問題をはらんでいる。このような配置にするため、個別の光学素子は、手動またはモータを備えた方法で位置調整がなされる。このような位置調整は、特に長期の安定性を備える必要があるため、設計に相当の費用が必要となる。温度変化によって、光学的な配置全体の長手方向の膨張もまた、補償されなければならない。形成される誘導光ビームの照射パターンの形状に応じて、複数の光学素子を使用する必要がある可能性があり、このことは不都合なことに調整の自由度を増大させる。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、その配置が簡素であり、各誘導ビーム経路用の光学素子の数を削減することができるような試料照射装置を構成および開発することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、請求項１に記載の装置によって実現される。本願の請求項１に記載の試料照射装置は、共焦点蛍光走査型顕微鏡法において、１つの光源（３）の１つの照射ビーム経路（２）およびさらに別の光源（５）の少なくとも１つのさらに別の照射ビーム経路（４）を有し、前記１つの照射ビーム経路（２）と前記さらに別の照射ビーム経路（４）が、少なくとも試料領域において互いに部分的に重なり合うことができるような試料（１）を照射する装置であって、少なくとも１つの光学素子（７）が前記さらに別の照射ビーム経路（４）に配置され、前記試料領域における前記照射ビーム経路（２，４）の光の照射パターンが環状照射パターンを有するように、前記光学素子（７）が光の位相若しくは光の振幅を変化させることと、を特徴としている。
【０００６】
【発明の実施の形態】
図１は、共焦点走査型蛍光顕微鏡法に関して、試料１を照射する装置を示している。走査型蛍光顕微鏡は、試料１の点状蛍光励起を形成する光源３の照射ビーム経路２を有する。さらに別の光源５のさらに別の照射ビーム経路４は、明確に定義された試料領域において蛍光分子の誘導放出を形成する。照射ビーム経路２，４は、互いに重なり合うことができる。２つの照射ビーム経路２，４は、ビームスプリッタ６によって結合される。
【０００７】
本発明によれば、照射ビーム経路４の光を変性する光学素子７は、照射ビーム経路４中に配置される。素子７の光学特性は、試料領域における照射ビーム経路４の照射パターンが形状を変形させるように影響を及ぼしたり変化させたりすることができる。
【０００８】
光学素子７は、対物レンズ８の焦点面に共役なフーリエ平面に配置される。
【０００９】
光学素子７は、光の位相および振幅を変化させ、光透過素子として具体化される。
【００１０】
光学素子７は、ピクセルごとに入射光の位相をλ／２遅延するＬＣＤ素子である。したがって、個別の空間周波数は、ＬＣＤ素子の励起関数として、λ／２位相遅延させることができ、さらに、振幅に関して減衰させることができる。光学素子７によるさらに別の照射ビーム経路４の位相または振幅を変化させた結果、試料領域におけるさらに別の照射ビーム経路４の照射パターンの形状を変形させる。
【００１１】
図２は、本発明による装置のさらなる実施形態を示している。ここでは、光学素子は、さらに別の照射ビーム経路４における個別の素子として配置される変形可能なミラー９として具体化される。変形可能なミラー９は、ピエゾアクチュエータ１０によって調整されることができる。
【００１２】
図３は、図２の別報として、本発明による装置の実施形態を示している。光源５からの光は、ビームスプリッタキューブ１１に当り、概略的に示されている発散光学系１２の方向に反射される。ＬＣＤ素子として具体化された光学素子７を通過した後、さらに別の照射ビーム経路４の光はミラー１３に当る。ミラー１３は、光学素子７、発散光学系１２およびビームスプリッタキューブ１１を通過した光をビームスプリッタ６に反射する。ビームスプリッタ６で、さらに別の照射ビーム経路４は、光源３の照射ビーム経路２と結合される。
【００１３】
この実施形態において、素子７の光学特性の変性は、定義可能な事象と同期されることができる。光学素子７は、同期手段１４（点線で示す）を介して、パルスレーザ光源５およびレーザ光源３に接続される。パルスレーザ５のパルス列の関数として、光学素子７を作動することができる。光学素子７は、同期手段１５（点線で示す）を介して走査装置１６に接続される。これにより、走査装置１６を光学素子７と同期することができる。光学素子７は、同期手段１７（点線で示す）を介して検出器１８に同様の方法で接続される。
【００１４】
図１〜図３において、光学素子７は、さらに別の照射ビーム経路４全体に作用する。図１〜図３において照射ビーム経路２の励起用ピンホール１９および検出ビーム経路２１の検出用ピンホール２０を示す。照射ビーム経路２，４は、ビームスプリッタ２２によって検出ビーム経路２１から分離される。
【００１５】
最後に、上述した例示の実施形態は、特許請求された教示を示すために過ぎず、それら例示の実施形態に限定するものではないことを特に留意されたい。
【００１６】
本発明によって第一に認識されることは、光学素子がその光学特性の点において影響を及ぼすことができるまたは変性することができるという事実によって、光学素子の調整を簡素化することができる。素子の光学特性が変性されると、素子は対応する照射ビーム経路および試料領域の照射パターンの光を変性する。その結果、その照射ビーム経路の照射パターンは、その形状および／またはその３次元位置に関して、もう１つの照射ビーム経路の照射パターンに対して変性させることができるため、互いに照射ビーム経路を調整することができる。
【００１７】
好都合なことに、調整に匹敵する方式で、素子の光学特性の変性によって、装置の温度ドリフトを補償することができるため、明確に定義された最適な照射および検出状態が常に存在する。理想的には、光学特性を変性することができる素子を使用することによって、物理的に複雑な調整およびドリフト補償装置の必要がないようにすることができ、それによって（特に好都合な方式で）光ビーム経路を簡素にし、さらに製作コストを削減する。
【００１８】
光学特性を変性することができる光学素子はまた、ビームに対応する影響または変性を与えることによって、複数の個別の光学素子と同様の効果を実現することができるため、光学素子の数を削減することができる。
【００１９】
光学素子は、さらに別の照射ビーム経路に配置されることが好ましい。したがって、光学素子はさらに別の照射ビーム経路にのみ作用するため、それによって、試料領域においてさらに別の照射ビーム経路の照射パターンの形状が変性される。これに関連して、さらに別の照射ビーム経路は、誘導光ビームとして使用されてもよい。
【００２０】
光学素子はまた、照射ビーム経路および／または検出ビーム経路に配置されてもよい。それによって、試料領域における照射ビーム経路の照射パターンの形状および検出器によって検出可能な試料領域の検出パターンの形状が変形される。照射ビーム経路および検出ビーム経路における複数の光学素子を結合した配置も考えられる。これは、たとえば試料領域におけるさらに別の照射ビーム経路の照射パターン用にさらに別の照射ビーム経路に配置される光学素子を用いて、非対称な形状を形成することができ、試料領域における照射ビーム経路の照射パターン用に照射ビーム経路にさらに別の光学素子を配置する結果、さらに別の照射パターンを鏡像対称に形成することができる。この方法は、異方性または六角形のピクセルパターンを用いて試料を走査するために使用されてもよい。
【００２１】
特に好ましい実施形態において、光学素子は、対物レンズの焦点面と共役なフーリエ平面に配置される。その結果、フーリエ光学の原理に基づき、光学素子の対応する構成に関して、すべての空間周波数は、同一または異なるように作用されることができる。
【００２２】
光学素子は、それに関連するビーム経路において光通過素子または反射素子として具体化されてもよい。
【００２３】
素子の光学特性の変性のために、素子は、適応性のある光学構成要素として具体化される。同様の方法または局所的に異なる方法で、光ビーム全体に作用させることができる。
【００２４】
具体的には、光学素子は液晶表示装置（ＬＣＤ）として具体化されてもよい。
ＬＣＤ素子の適切な作動によって、ピクセル単位で、入射光の位相の遅延および／または入射光の振幅の縮小を実現することができる。ＬＣＤ素子におけるそれぞれの個別ピクセルを直接制御することができるため、特に好都合な方式において、この配置はきわめて柔軟性に富み、使用中に素子の光学特性を変性することもできる。
【００２５】
さらなる実施形態において、光学素子はカラーＬＣＤとして具体化される。これは、特に、異なる波長の光が進行しているビーム経路にカラーＬＣＤ素子を配置する場合に、きわめて好都合である。カラーＬＣＤ素子を適切に設置することによって、カラーLCD 素子はピクセルごとの色選択方式において、複数の波長のうちの１つの光に作用することができる。
【００２６】
きわめて一般的に言えば、光学素子は、マイクロメカニカルシステムとして具体化されてもよい。特に、光学素子は、ディジタルマイクロミラー（ＤＭＤ）またはグレーティングライトバルブ（ＧＬＶ）として具体化されてもよい。このような光学素子はまた、ピクセルごとに作動させることもできるため、対応するビーム経路の個別の領域から反射させたり個別の領域に影響を及ぼすことができる。別法として、変形可能なミラーを光学素子として使用してもよい。変形可能なミラーの個別の領域をその面形状に関して変形することができるため、対応するビーム経路の照射パターンまたは検出パターンはその形状を変形する。
【００２７】
特に好都合な方式において、光学素子の光学特性の変性は、定義可能な事象と同期させることができる。たとえば、光学素子は、光源の強度変調またはパルス列と同期させてもよい。好都合なことに、走査型顕微鏡の走査装置を光学素子と同期させることは、特定の照射点において横方向または軸方向の依存を示しうる走査型顕微鏡において使用される光学系の横方向または長手方向の色の誤差を補償するために作用する。信号発生を最適化するために、素子の光学特性の変性と検出器素子との同期も行われることができる。
【００２８】
光学素子は、ビーム経路の全体または一部に作用することができる。光学素子が相互に作用するビーム経路の断面より大きくなるような寸法に形成されることが好ましいため、光学素子は照射ビーム経路全体に作用する。しかし、別法として、逆の場合、言い換えれば、ビーム経路の断面が光学素子の寸法より大きい場合も考えられる。
【００２９】
光学素子によって、照射ビーム経路および／またはさらに別の照射ビーム経路の照射パターンは、定義された方式で形成されることもできる。特に、トーラスが対物レンズの焦点面に位置し、照射ビーム経路の照射パターンに対して対称に配置される場合には、さらに別の照射ビーム経路の環状照射パターンは、横解像度を増大させるため、非常に好都合であると思われる。２つの照射パターンの重なり領域において励起される蛍光分子による誘導放出は、それに励起されるため、適切な検出の場合には、照射パターンの領域からオーバーラップ領域を除いた蛍光のみを検出することができる。さらに、照射ビーム経路に配置される光学素子は、実質的に、樽、平行六面体、立方体または球の形状であるような照射パターンを形成してもよい。最後に、特定の照射パターンの形状は、たとえば最大ＳＮ比を備えた最大解像度を目的とする場合など用途の境界条件に適応させる必要がある。
【００３０】
特に好都合な方式において、さらに別の照射ビーム経路の照射パターンは、照射ビーム経路の照射パターンに対する構成と相補性があるため、すべての空間的な方向において、解像度の向上が可能となる。
【００３１】
すべての空間的な方向において等方性である照射パターンは、この方式で得られた試料の像が、すべての空間的な方向において同一の解像度および等距離のピクセルサイズであるため、特に定量分析の場合にきわめて好都合である。
【００３２】
ＳＮ比を最大にするため、照射パターンが少なくとも大部分は一様な強度分布に構成されるように準備がされる。その結果、同一の強度を備えた蛍光発光するために、照射パターンの光によって作用される蛍光分子が励起され、その誘導放出がさらに別の照射パターンによって励起される蛍光分子は、同一の遷移確率を備えた基底状態に達する。このため、照射パターンの強度分布が、エッジで急に減少するように準備され、測定される領域と誘導される領域との間に最も著しい可能な遷移を生じる。
【００３３】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明の試料照射装置では、少なくとも１つの光学素子が照射ビーム経路の少なくとも一方に配置され光を変性することと、試料領域における照射ビーム経路の照射パターンが形状を変形するように前記素子の光学特性が影響を受けるまたは変性されることとを特徴としているから、光学素子の調整を簡素化することができる。すなわち、素子の光学特性が変性されると、素子は対応する照射ビーム経路および試料領域の照射パターンの光を変性する。その結果、その照射ビーム経路の照射パターンは、その形状および／またはその３次元位置に関して、もう１つの照射ビーム経路の照射パターンに対して変性させることができるため、互いに照射ビーム経路を調整することができる。
【００３４】
好都合なことに、調整に匹敵する方式で、素子の光学特性の変性によって、装置の温度ドリフトを補償することができるため、明確に定義された最適な照射および検出状態が常に存在する。理想的には、光学特性を変性することができる素子を使用することによって、物理的に複雑な調整およびドリフト補償装置の必要がないようにすることができ、それによって（特に好都合な方式で）光ビーム経路を簡素にし、さらに製作コストを削減することができる。
【００３５】
光学特性を変性することができる光学素子はまた、ビームに対応する影響または変性を与えることによって、複数の個別の光学素子と同様の効果を実現することができるため、光学素子の数を削減することができる。
【００３６】
したがってこの発明により、その配置が簡素であり、各誘導ビーム経路用の光学素子の数を削減することができるような試料照射装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による第１の実施態様を概略的に示している。
【図２】図２は、さらなる実施態様を概略的に示している。
【図３】図３は、さらなる実施態様を概略的に示している。
【符号の説明】
１  試料、  ２  照射ビーム経路、  ３  光源、  ４  照射ビーム経路、  ５  光源、  ６  ビームスプリッタ、  ７  光学素子、  ８  対物レンズ、  ９  変形可能なミラー、  １０  ピエゾアクチュエータ、  １１  ビームスプリッタキューブ、  １２  発散光学系、  １３  ミラー、  １４  同期手段、  １５  同期手段、  １６  走査装置、  １７  同期手段、  １８  検出器、  １９  励起用ピンホール、  ２０  検出用ピンホール、  ２１  検出ビーム経路、  ２２  ビームスプリッタ
【図１】
0005114762.tif 000002
【図２】
0005114762.tif 000003
【図３】
0005114762.tif 000004