(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）に結合するヒト抗体であり、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメイン；および、さらにＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含み、ここで、前記ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５、配列番号６、及び配列番号７のアミノ酸配列から成り、そして、前記ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のアミノ酸配列から成る上記ヒト抗体。
【請求項２】
ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）及びＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）を含む抗体のエオタキシン結合ドメインとエオタキシンへの結合のために競合する、請求項１に記載のヒト抗体。
【請求項３】
ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）を含む、請求項１又は２に記載のヒト抗体。
【請求項４】
ＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項５】
ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）およびＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項６】
ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）及びＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）により形成されるエオタキシン抗原結合部位の親和性と同等か又はそれよりも高い親和性でエオタキシンを結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体であって、ここでヒト抗体の親和性、及び抗原結合部位の親和性は同じ条件下で測定される上記ヒト抗体。
【請求項７】
エオタキシンを中和する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項８】
同じ条件下で測定されたＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）及びＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）により形成されるエオタキシン抗原結合部位の力価、ヒト抗体の力価、並びに抗原結合部位の力価と同等か又はそれよりも高い力価でエオタキシンを中和する、請求項７に記載のヒト抗体。
【請求項９】
ヒト抗体がｓｃＦｖ抗体分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項１０】
抗体定常部を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項１１】
ヒト抗体が完全な抗体である、請求項１０に記載のヒト抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ４定常部を含む、請求項１０又は１１に記載のヒト抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒト抗体又は前記ヒト抗体の抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒト抗体又はその抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインの製造方法であって、上記ヒト抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインの産生条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養することを含む上記方法。
【請求項１６】
前記ヒト抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインの分離、及び／又は精製をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
医薬として許容される賦形剤、医薬として許容される担体、医薬として許容される緩衝剤、及び医薬として許容される安定化剤から成る群から選択される少なくとも１の追加成分を含む組成物への前記ヒト抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインの配合をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエオタキシンを結合するヒト抗体のエオタキシン又はエオタキシン断片への結合を含む方法であって、該方法がインビトロで行われる、方法。
【請求項１９】
配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はエオタキシン−１に対する特異的結合メンバー、とりわけヒト・エオタキシン−１に対するヒト抗体、及び特にエオタキシン−１活性を中和するものに関する。本発明の好ましい態様は、本明細書中でＣＡＴ−２１２と呼ばれるｓｃＦｖ断片の、並びに本明細書中でＣＡＴ−２１３と呼ばれるＩｇＧ４抗体の抗体ＶＨ及びＶＬドメインを利用する。より好ましい態様は、ＣＡＴ−２１２／−２１３  ＶＨ及び／又はＶＬドメインの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、特に他の抗体のフレームワーク領域内のＶＨ  ＣＤＲ３を利用する。本発明のさらなる側面は、本発明の特異的結合メンバーを含む組成物、及び治療によるヒト又は動物の体の処置法を含む、エオタキシンの阻害又は中和方法におけるそれらの使用のために提供される。
【０００２】
エオタキシン−１は、主に好酸球に発現される特異的レセプター、ＣＣＲ３に結合する化学走性誘因タンパク質である。抗エオタキシン−１抗体は好酸球増加症及び炎症部位への好酸球の動員の阻害に使用される。１の態様において、本発明は、ｓｃＦｖファージ・ディスプレイ・ライブラリーに由来した、ＣＡＴ−２１２と呼ばれるヒト抗体断片を提供する。ＣＡＴ−２１２は機能に関連した（走化作用）バイオ・アッセイにおいて６５０pMのＩＣ50でヒト・エオタキシンを強力に中和する。ＣＡＴ−２１２は１５pMのＫD を持つ高い親和性を持つ。さらなる態様において、ここで前記ＣＡＴ−２１２  ｓｃＦｖをヒトＩｇＧ４として再編成し、その抗体をＣＡＴ−２１３と呼ぶ。ＣＡＴ−２１３はＣＡＴ−２１２と同様の能力を持ち、そして走化作用アッセイにおいて７００pMのＩＣ50でヒト・エオタキシンを中和する。ＣＡＴ−２１３もオブアルブミン感作マウスにおける単核細胞走化作用を妨げる。ＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３は共にアレルギー性炎症のインビボ・モデルにおいて好酸球の増加を強力に妨げる。
【０００３】
好酸球は通常、総末梢血白血球の１〜３％の割合を占める。好酸球の著しい集積は好酸球増加症として知られる症状であり、多くの病気、例えばアレルギー性疾患、寄生生物による感染症、及び癌において引き起こされうる（Rothenburg 1998 ）。好酸球増加症は血液１ミリ四方当たり３５０超の好酸球を有する場合に分類され、そしていくつかの症例においてそのレベルは１ミリ四方当たり５０００細胞超まで上昇する。罹患した個人の末梢血における集積と同様に、好酸球は体のあらゆる組織に選択的に集積しうる。前述の好酸球増加症は好酸球の炎症誘発性作用により有害である。好酸球増加の状態、例えば喘息において、浸潤している好酸球の数と疾患の重度の間にしばしば相関関係が存在する。
【０００４】
それらが延長された期間生き延びることができる炎症部位での好酸球の集積はそれらが直に接する環境において産生されるサイトカインの組合せに依存している。好酸球は多くの毒性の炎症メディエータを含有し、それらメディエータは顆粒の中に貯蔵されている。多数のサイトカインの１以上による活性化により、好酸球は脱顆粒してカチオン性タンパク質、例えば主要な塩基タンパク質、好酸球由来の神経毒、及び好酸球性ペルオキシダーゼを含むこれらの毒素を放出する。さらに、活性化好酸球は化学走性誘因物質、脂質メディエータ、例えばロイコトリエン、及び幅広い炎症性サイトカインをも放出する。これらの物質の大部分は組織、例えば喘息における気道上皮において重大な細胞障害性作用を有する（Rothenberg, 1998 ）。
【０００５】
ケモカインは相同性の８〜１０kDa のタンパク質のグループであり（Luster, 1998）そのグループは保存されたシステイン残基の相対位置に基づいてファミリーに細分される。ケモカインは、それらが通常の発達及び恒常性、そして重要なことには炎症の間に白血球の移動のための指向性シグナルを提供するといった、血液から組織への白血球の血管外遊走の仲介に重要な役割を担う。さまざまな走化性物質、例えばロイコトリエンＢ4 、インターロイキン、及び細菌性産物が存在し、それらは組織に好酸球を動員しうるが、ケモカイン、エオタキシン−１だけが特異的に好酸球の動員を示している。
【０００６】
ヒト・エオタキシンはケモカインのβ又はＣＣ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）サブファミリーの急速に拡大しているグループのメンバーである。このグループの分子は、４つの保存されたシステインの最初の２つが隣接し、かつ２０〜７５％の配列の同一性を共有することを特徴とする。このファミリーのメンバーはエオタキシン−２（Forssmann et al., 1997; White et al, 1997 ）、エオタキシン−３（Shinkai et al, 1999 ）、単球化学走性誘因タンパク質（ＭＣＰ）−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＭＣＰ−５（Van coillie et al, 1999 ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１，ＭＩＰ−１β，ＴＡＲＣ，ＬＡＲＣ，Ｉ３０９、及びＲＡＮＴＥＳを含む。
【０００７】
エオタキシン−１は８．４kDa 、７４アミノ酸のタンパク質であり、アレルゲン免疫感作モルモットからの気管支肺胞洗浄液中に最初に検出された（Griffiths-Johnson et al, 1993; Jose et al, 1994a）。前記分子は、その皮下注入部位で好酸球の十分な集積を誘導する強力な化学走性誘因物質として最初に同定された。モルモットの遺伝子が最初にクローニングされ（Jose et al, 1994b, Rothenberg et al, 1995a）、続いてマウスの遺伝子がクローニングされた（Rothenberg et al, 1995b ）。ヒト・エオタキシン遺伝子が続いて同定され（Kitaura et al, 1996; Garcia-Zepeda et al, 1996; Ponath et al, 1996）、そしてラットの相同体はつい最近、クローニングされた（Williams et al, 1998）。ヒト・エオタキシンはマウス及びモルモット・エオタキシンと６１％の同一性を有し、そしてラット・エオタキシンと６２％の同一性を有する。そのヒト遺伝子はクロモソーム１７上に位置し、そして３のエクソンと２のイントロンを含む。前記遺伝子の５′フランキング領域は、ＡＰ−１，ＮＦＢに対する結合部位、インターフェロン・ガンマ応答エレメント、及びグルココルチコイド・レセプターを含む多数のコンセンサス調節エレメントを含み、遺伝子発現がサイトカイン並びにグルココルチコステロイドにより調節されていることを示唆している。
【０００８】
エオタキシンは、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、Ｔ−リンパ球、単球、及びマクロファージを含むさまざまな正常の細胞型により産生される（Cook et al, 1998; Ponath et al, 1996a; Li et al, 1997 ）。好酸球はエオタキシンに関して主要な効果細胞であるが、好酸球は自身でエオタキシンを生産もし、そしてそれを細胞内顆粒内に貯蔵する（Nakajima et al, 1998）。好酸球からのエオタキシンの放出は、炎症状態における好酸球の局所集積に寄与する。エオタキシン発現は多くの炎症誘発性メディエータ、例えば腫瘍壊死因子−アルファ、インターフェロン、及びインターロイキン−１により異なる細胞型から誘発される。
【０００９】
エオタキシン−２は最近クローニングされた（Forssmann et al, 1997; White et al, 1997）。それはエオタキシンと近い配列相同性を示さず、３９％のアミン酸同一性しか共有しない。しかしながら、エオタキシンと同様に、１０分の１の効果にもかかわらず好酸球及び好塩基球に対する化学走性誘因物質である。エオタキシン−３も最近同定されたが（Shinkai et al, 1999 ）、その効果はエオタキシンで観察されたそれの１０分の１と思われる。したがって、エオタキシン−３は比較的高濃度において好酸球及び好塩基球に対して走化作用を持つ（Kitaura et al, 1999 ）。
【００１０】
一般的に、ケモカイン・レセプターへのケモカインの結合において相当な冗長が存在する。典型的には、いくつかの異なるＣＣケモカインが１種類のケモカイン・レセプターに結合でき、またその逆に、１種類のＣＣケモカインがいくつかの異なるケモカイン・レセプターに結合できる。ケモカイン・レセプター、ＣＣＲ３は、エオタキシン、ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン−２、及び３を含む多くのリガンドを有する。エオタキシンがこれらのうちで最も重要であると思われる。リガンドの大部分、例えばＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ３に対して親和性が比較的低く、そのためＣＣＲ３仲介事件の誘発において特に効果的ではない。それに比べ、エオタキシンはＣＣケモカイン・レセプター３（ＣＣＲ３）に比較的高い親和性、Ｋｄ＝０．５２nMで結合する（Ponath et al, 1996a ）。さらに、エオタキシンは、ＣＣＲ３だけに結合し、そしてあらゆる他のケモカイン・レセプターに結合しない。すなわちエオタキシンはＣＣＲ３に特異的であるところでＣＣケモカインの間では独特である。
【００１１】
ヒトＣＣＲ３はクローニングされ（Combadiere et al, 1995; Daugherty et al, 1996 ）、そしてそれは３５５アミノ酸の、４１kDa の、７の膜貫通ドメインを持つタンパク質である。それはその細胞外ドメインに４のシステインを含み、そしてＧ−タンパク質を介したリン酸化の潜在的部位である細胞質内テール中に８のセリン／スレオニン残基を含む。ＣＣＲ３はＮ−連結グリコシル化の潜在的部位を持たない。ヒト・レセプターはマウス及びヒト・エオタキシンの両方を同じ親和性で結合する（Daugherty et al, 1996 ）。マウス（Gao et al, 1996 ）及びモルモット（Sabroe et al, 1998）ＣＣＲ３が続いてクローニングされ、そしてヒトＣＣＲ−３とそれぞれ６９及び６７％のアミノ酸同一性を共有する。
【００１２】
ヒトＣＣＲ−３は好酸球（Ponath et al, 1996b ）及び好塩基球（Uguccioni et al, 1997; Yamada et al, 1997 ）において主に発現される。それはＴH ２型Ｔ細胞（Sallusto et al, 1997）、中枢神経系のミクログリア細胞（He et al, 1997）、及び樹状細胞（Rubbert et al, 1998 ）でも見られる。エオタキシンは化学走性誘因物質であり、そしてＣＣＲ３発現細胞の活性化物質である。好酸球上のＣＣＲ３への結合により、エオタキシンは細胞内カルシウム動員、細胞内アクチン重合化の開始、インテグリン発現の上方調節、及び酸素ラジカル産生の誘発を引き起こす（Tenscher et al, 1996; Elsner et al, 1996）。ＣＣＲ３は、１細胞当たり４０，０００（Daugherty et al, 1996）〜４００，０００（Ponath et al, 1996b）のレセプターを持つ好酸球において特に高レベルで発現される。多くのＣＣＲ３リガンド、例えばＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４、及びＲＡＮＴＥＳもＣＣＲ３以外のケモカイン・レセプターに結合し、それによって多種多様な細胞型の化学走性誘因を仲介する。それに比べ、ＣＣＲ３に対するその高い選択性のため、エオタキシンは特に化学遊走を誘発することができ、そしてＣＣＲ３発現細胞、例えば好酸球を活性化することができる。
【００１３】
エオタキシンの効果の阻止が治療的に使用されうる一連の証拠が増えている。ウサギ又はヤギ抗体を用いたインビボにおけるいくつかの研究が存在する。その一例の研究は静中（iv）投与した抗エオタキシン抗体の効果を調べた。Gonzalo et al (1996)は２０μｇの抗エオタキシン・ウサギ・ポリクローナル抗血清ivをオブアルブミン免疫マウスに注射した。免疫に先立つ抗体投与は、気管支肺胞洗浄液中の好酸球集積の数により計算した場合、５６％まで好酸球増加を減少させた。
【００１４】
局所的に投与された抗エオタキシン抗体の効果の多くの報告も存在する。Humbles et al (1997)は、前もって 111Ｉｎ標識好酸球の注入を受けた実験未使用のモルモット（naive guinea pig）の皮内へのモルモット・エオタキシン（１０ng）とウサギ・ポリクローナル抗エオタキシン抗血清（１０μｌ）の同時注入について記載した。前記ポリクローナル抗体は局所的な好酸球集積を完全に阻止することができた。同様に、Teixeira et al (1997）は、好酸球増加症のマウス・モデルを使用し、そのマウスの４〜８時間の能動性皮内アナフィラキシー反応部位に皮内的にマウス・エオタキシン（１〜３０pmol）をウサギ・ポリクローナル抗エオタキシン抗血清と同時注入した。抗血清の５％及び２０％希釈物は、好酸球の動員をそれぞれ４５％及び９５％まで阻止した。加えて、Sanz et al (1998)は、皮内ＩＬ−４注入により内生的に産生されたエオタキシンによる好酸球集積において調べた。抗エオタキシン・ポリクローナル抗血清は、ＩＬ−４に対する応答の後期（２４〜２８時間）に５４％の阻害を示したが、しかし早期（０〜４時間）には示さなかった。
【００１５】
健康な状態及び好酸球が仲介する疾患の状態におけるエオタキシンの役割をさらに理解するために、標的遺伝子の破壊を使用してエオタキシンを欠くマウスを生み出した（Rothenberg et al 1997 ）。それらのマウスを感作し、そしてオブアルブミンにより免疫した場合、好酸球の数を、野生型マウスに比べエオタキシン無発現マウスの肺からのＢＡＬ中で７０％まで減少させた（免疫後１８時間）。これは、エオタキシンが喘息モデルにおいて抗原免疫後、好酸球の動員の程度を高めることを証明している。Nakamura et al. (Am. J. Resp. & Crit. Care Med. (1999) 160 : 1952-1956）はエオタキシン・レベルと喘息の関連、及び肺機能との反比例を証明した。
【００１６】
エオタキシンｍＲＮＡは多くの組織により恒常的に産生され、そこで好酸球のホーミングによる役割を担うことが示唆されている（Rothenberg et al 1995 ）。エオタキシン無発現マウスにおいて、ひどい組織学的異常はエオタキシンの発現が知られている臓器を含めた全ての臓器で検出されなかった。同様に、白血球の表現型における変化も検出されなかった。しかしながら、総好酸球カウントは、野生型に比べて上記無発現マウスにおいて３分の１まで減少し、エオタキシンが末梢循環における好酸球の基準の数を決定する役割を担っていることも示唆された（Rothenberg et al 1997 ）。
【００１７】
本発明による特異的結合メンバーは、エオタキシンが一因となるさまざまな疾患及び病気における治療的な可能性を伴う、エオタキシンへの結合及び中和に有用である。代表的な疾患及び病気をこれ以降で明確にする。
【００１８】
１の側面において、本発明はヒト・エオタキシンに結合し、かつＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）、及び／又はＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）を含む特異的結合メンバーを提供する。
【００１９】
一般的に、ＶＨドメインはＶＬドメインと組合わされて抗体の抗原結合部位を提供するが、これ以降で明確にするとおりＶＨドメイン単独で抗原の結合に使用されうる。１の好ましい態様において、抗体の抗原結合部位をＣＡＴ−２１２  ＶＨ及びＶＬドメインの両方を含んで形成するために、ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメイン（配列番号２）をＣＡＴ−２１２  ＶＬドメイン（配列番号４）と組合わせる。他の態様において、ＣＡＴ−２１２  ＶＨドメインをＣＡＴ−２１２  ＶＬを除いたＶＬドメインと組合わせる。Ｌ鎖の乱交雑は本技術分野で十分に確立されている。
【００２０】
１以上のＣＤＲｓがＣＡＴ−２１２  ＶＨ又はＶＬドメインから選ばれ、そして好適な構造に組込まれる。これはこれ以降で明確にする。ＣＡＴ−２１２  ＶＨ  ＣＤＲ１，２、及び３をそれぞれ配列番号５，６、及び７に示す。ＣＡＴ−２１２  ＶＬ  ＣＤＲ１，２、及び３をそれぞれ配列番号８，９、及び１０に示す。ＶＨ及びＶＬドメイン、並びにＣＤＲの変異体の配列を本明細書中に示し、そしてそれを配列代替法又は変異及び配列決定により得られる、エオタキシンに対する特異的結合メンバーに利用する。上述の方法は本発明により提供されもする。
【００２１】
その配列が特に本明細書中に開示されるＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可変ドメイン・アミノ酸配列変異体を明確にされるとおり、本発明により利用しうる。特定の変異体は、１以上のアミノ酸配列の変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）を、おそらく約２０未満、約１５未満、約１０未満又は約５未満、４，３，２又は１含む。変更は、１以上の構造領域、及び／又は１以上のＣＤＲ中に作られる。
【００２２】
本発明による特異的結合メンバーは抗原への結合に関していずれかの特異的結合メンバーと競合するものであり、この両者は上記抗原に結合し、かつ特異的結合メンバー、本明細書中に開示されるＶＨ及び／又はＶＬドメイン、又は本明細書中に開示されるＶＨ  ＣＤＲ３、あるいはそれらいずれかの変異体を含む。結合要素間の競合は、例えばＥＬＩＳＡの使用及び／又は１の結合要素への特定のリポーター分子のタギングによりインビトロにおいて容易にアッセイされ、それらのアッセイは不タギング結合要素の存在を検出させ、同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。
【００２３】
よって、本発明のさらなる側面は、エオタキシンへの結合に関してＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３と競合するヒト・抗体の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。
【００２４】
エオタキシンに対する抗体であり、かつエオタキシンへの結合に関してＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３と競合しうる抗体を得るためにさまざまな方法が本技術分野で利用可能である。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は前記抗原に結合しうる１以上の特異的結合メンバーを得る方法を提供し、その方法は本発明による特異的結合メンバーのライブラリーを上記抗原と接触させ、そして上記抗原と結合しうる１以上の上記ライブラリーの特異的結合メンバーを選択することを含む。
【００２６】
上記ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面に提示され、それぞれの粒子は、その表面に提示した抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含み、あるいは、存在するならば提示されたＶＬドメインをコードする核酸をも含む。
【００２７】
上記抗原を結合することができる特異的結合メンバーの選択、そしてそのバクテリオファージ粒子上への提示に続いて、上記選択された特異的結合メンバーを提示するバクテリオファージ粒子から核酸を採取する。上述の核酸は、この後に続く、上記選択された特異的結合メンバーを提示するバクテリオファージ粒子から得られた核酸配列を有する核酸からの発現による特異的結合メンバー又は抗体ＶＨ可変ドメイン（場合により抗体ＶＬ可変ドメイン）の製造に使用される。
【００２８】
上記選択された特異的結合メンバーの抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、そのＶＨドメインを含む特異的結合メンバーとして単離された形で提供される。エオタキシンを結合する能力がさらに試験され、そしてエオタキシンへの結合に関してＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３と競合する能力もさらに試験される。エオタキシンを中和する能力はこれ以降に明確にするとおり試験される。
【００２９】
本発明による特異的結合メンバーはＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の親和性と同じにエオタキシンを結合する。
【００３０】
本発明による特異的結合メンバーはＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の力価と同じにエオタキシンを中和する。
【００３１】
さまざまな特異的結合メンバーの結合親和性及び中和力価は適当な条件下で比較される。
【００３２】
抗体配列に加え、本発明による特異的結合メンバーは、例えばペプチド又はポリペプチド、例えば折り畳みドメインの形成、あるいは抗原結合能力に加えて他の機能的特徴を分子に与える他のアミノ酸を含む。本発明の特異的結合メンバーは検出可能な標識を担持するか又は毒素又は酵素に（例えばペプチジル結合又はリンカーを介して）結合する。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は、本発明による特異的結合メンバー、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供し、さらに本発明の特異的結合メンバー、ＶＨドメイン、及び／又はＶＬドメインの製造方法を提供する、ここで上記製造方法は上記特異的結合メンバー、ＶＨドメイン、及び／又はＶＬドメインの産生を引き起こす条件下で上記核酸を発現させ、そしてそれを回収することを含む。
【００３４】
本発明による特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の体の治療方法又は診断方法、例えばヒト患者の疾患又は病気の（予防的処置を含みうる）治療方法に使用され、その治療方法は上記患者への有効量の本発明の特異的結合メンバーの投与を含む。本発明により治療されうる症状は本明細書中の他のところで明確にされるものを含む。
【００３５】
本発明のさらなる側面は、本明細書中に開示される、抗体ＶＨ可変ドメイン及び／又はＶＬ可変ドメインをコードする、一般に単離された核酸を提供する。
【００３６】
本発明の他の側面において、本明細書中に開示されたＶＨ  ＣＤＲ又はＶＬ  ＣＤＲ配列を、特に配列番号５，６及び７から選ばれるＶＨ  ＣＤＲ又は配列番号８，９、及び１０から選ばれるＶＬ  ＣＤＲ、最も好ましくはＣＡＴ−２１２  ＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号７）をコードする、一般に単離された核酸を提供する。
【００３７】
さらなる側面は本発明の核酸により形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３８】
より一層さらなる側面は抗体ＶＨ可変ドメインの製造方法を提供し、上記製造方法はコード核酸から発現を引き起こすことを含む。上述の方法は上記抗体ＶＨ可変ドメイン産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【００３９】
ＶＬ可変ドメイン、並びにＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む特異的結合メンバーの製造のための類似の方法を本発明のさらなる側面として提供する。
【００４０】
製造方法は上記産物の単離及び／又は精製のステップを含む。
【００４１】
製造方法は少なくとも１の付加成分、例えば医薬として許容される賦形剤を含む組成物への上記産物の配合を含む。
【００４２】
本発明のこれらの、そして他の側面を以下により詳細に説明する。
【００４３】
専門用語
特異的結合メンバー
これはお互いに対して結合特異性を有する分子の組合せメンバーを示す。特異的に結合する組合せメンバーは自然に誘導されるか又は完全に若しくは部分的に合成により製造される。分子の組合せの一方のメンバーは分子の組合せの他方のメンバーに特異的に結合するその表面の領域又は間隙を持ち、そしてそれ故に分子の組合せの他方のメンバーの特定の空間的及び極性の編成に相補的である。よって、対のメンバーは互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合の組合せの種類の例は抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン・レセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質である。本出願は抗原−抗体型の反応に関与する。
【００４４】
抗体
これは天然にせよ、部分的若しくは完全に合成により製造されたにせよ免疫グロブリンを示す。前記用語は、抗体結合ドメインであるか又は抗体結合ドメインに対して実質的に相同体である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質にも及ぶ。抗体の例は、免疫グロブリン・アイソタイプ及びそれらのアイソタイプのサブクラス；抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ，ｓｃＦｖ，Ｆｖ，ｄＡｂ，Ｆｄを含む断片；並びにダイアボディーである。
【００４５】
モノクローナル及び他の抗体を得、そして組換えＤＮＡ技術の手法を使用し、他の抗体又は元の抗体の特異性を維持するキメラ分子を製造することが可能である。上記手法は別の免疫グロブリンの定常部又は定常部プラス構造部への抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡの導入を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７，ＧＢ  ２１８８６３８Ａ又はＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は遺伝子変異又は他の変更の対象であり、その変異又は変更は産生される抗体の結合特異性を変化させるかどうか分からない。
【００４６】
抗体が多くの手段により修飾されうる場合、用語「抗体」は所望の特異性を持つ結合ドメインを有するあらゆる特異的結合メンバー又は物質に及ぶと解釈されるべきである。よって、この用語は天然か又は完全若しくは部分的合成かにかかわらず免疫グロブリンの結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含めた、抗体断片、誘導体、機能的同等物及び抗体の相同体に及ぶ。それ故に、免疫グロブリン結合ドメイン又は他のポリペプチドに融合した同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００４７】
完全な抗体の断片が抗原結合の機能を果しうることは示されている。結合断片の例は（ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；（ii）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（iii ）単独の抗体のＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖ断片；（iv）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989))；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（vi）２の連結したＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ′）２断片；（vii ）１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であり、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ペプチド・リンカーにより連結され、そのリンカーが抗原結合部位の形成に関係する２つのドメインをもたらす。（Bird et al, Science, 242, 423-426, 1998; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1998）；（viii）二重特異性１本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）；並びに（ix）「ダイアボディー」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）断片（WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 ）である。Ｆｖ，ｓｃＦｖ又はダイアボディー分子はＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド結合の組み込みにより安定化されている（Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996）。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）をも作製する（S.Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996）。
【００４８】
ダイアボディーはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは免疫グロブリンＬ鎖の結合領域を含む第１ドメイン、及び免疫グロブリンＨ鎖の結合領域を含む第２ドメインを含み、この２つのドメインは（例えばペプチド・リンカーにより）連結されているが、抗原結合部位の形成に互いに関与することはできない：抗原結合部位は多量体中のあるポリペプチドの第１ドメインと多量体内の他のポリペプチドの第２ドメインの関連性により形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００４９】
二重特異性抗体が使用されるべき場合、それらは従来の二重特異性抗体であり、さまざまな方法（Hollinger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechol. 4, 446-449 (1993)）、例えば化学的又はハイブリッド・ハイブリドーマから製造されるか、あるいは先に触れた二重特異性抗体断片のいずれかである。ダイアボディー及びｓｃＦｖはＦｃ領域を伴わず、抗イディオタイプ反応の作用を大きく低下させた可変ドメインだけを用いて構築される。
【００５０】
二重特異性の完全な抗体に対して二重特異性ダイアボディーは特に有用でもある、なぜならそれらは容易にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で構築されそして発現されるからである。適当な結合特異性のダイアボディー（及び他のポリペプチド、例えば抗体断片の大部分）はライブラリーからのファージ・ディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて容易に選ばれる。ダイアボディーの１のアームが、例えば抗原Ｘに対する特異性を持ち一定に保たれる場合、他のアームを変え、そして適当な特異性の抗体が選ばれるところのライブラリーが作られる。二重特異性完全抗体はｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ工学により作られる（J.B.B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996）。
【００５１】
抗原結合ドメイン
これは抗原に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全体に相補的である領域を含む抗体の一部を示す。抗原が巨大な場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し、その部分をエピトープと呼ぶ。抗原結合ドメインは１以上の抗体可変ドメインにより提供される（例えばＶＨドメインから成るいわゆるＦｄ抗体断片）。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００５２】
特異性
これは、特異的結合の組合せの一方のメンバーがその特異的結合相手以外の分子へのあらゆる有意な結合も示さないであろう状況に関して使用される。前記用語は、例えば抗原結合ドメインが多数の抗原に担持される特定のエピトープに対して特異的であり、この時、抗原結合ドメインを担持する特異的結合メンバーがそのエピトープを担持するさまざまな抗原に結合しうるであろう場合にも適用される。
【００５３】
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
これは含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味で一般的に使用される、すなわち、１以上の性質又は成分の存在を許すことである。
【００５４】
分離された
これは本発明の特異的結合メンバー又はその結合メンバーをコードする核酸が本発明と合致しているであろう状態に関する。メンバー及び核酸は、それらが発見された自然環境、又はそれらが製造される（例えば細胞培養）環境、ここで上記製造がインビトロ又はインビボで実施される組換えＤＮＡ技術による場合において伴う自然に結び付けられる物質、例えば他のポリペプチド又は核酸を含まないか又は実質的に含まない。メンバー及び核酸は希釈剤又はアジュバントと一緒に配合され、そして事実上は単離されたままである−例えば上記メンバーは免疫アッセイに使用するためのマイクロタイター・プレートをコートするために使用されるゼラチン又は他の担体と普通に混合されるか、あるいは診断又は治療に使用される場合、医薬として許容される担体又は希釈剤と混合される。特異的結合メンバーは普通にか又は異種真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ若しくはＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ  ８５／１０５０３）細胞）の系によるかのいずれかでグリコシル化されるか、あるいはそれらは（例えば原核生物細胞における発現により製造された場合）グリコシル化されない。
【００５５】
「詳述したような」により、本発明の関連ＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメインがその配列が本明細書中で説明されている指定の領域と同一であるか又は非常に類似しているかのいずれかであろうことを意味する。「非常に類似した」により、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１若しくは２、あるいは３又は４の置換がＣＤＲ及び／又はＶＨ若しくはＶＬドメイン内で起こりうることが予期される。
【００５６】
本発明のＣＤＲを担持するための構造は一般的に抗体Ｈ鎖又はＬ鎖、あるいはその実質的なタンパク質であり、それらの中で上記ＣＤＲは再配列免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲに対応する位置に配置される。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は（Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987 、及び現在インターネットで利用可能なその最新のもの（http://immno.bme.nwu.edu))を参照することにより決定される。
【００５７】
好ましくは、本明細書中で詳述したようなＣＤＲアミノ酸配列がヒト可変ドメイン又はその実質的なタンパク質中のＣＤＲとして担持される。本明細書中で詳述したようなＶＨ  ＣＤＲ３配列が本発明の好ましい態様を提供し、そしてこれらのそれぞれがヒトＨ鎖可変ドメイン又はその実質的なタンパク質中のＶＨ  ＣＤＲ３として担持されることが好ましい。
【００５８】
本明細書において利用される可変ドメインはいずれかの生殖細胞系列又は再配列ヒト可変ドメインから得られるか、あるいは既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づいた合成可変ドメインである。本発明のＣＤＲ配列（例えばＣＤＲ３）は組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）の欠いた可変ドメインのレパートリー内に導入される。
【００５９】
例えば、Ｍａｒｋｓ達（Bio/Technology, 1992, 10 : 779-783）は抗体可変ドメインのレパートリーの製造方法を記載し、上記方法は、上記可変ドメイン領域の５′末端か又はその付近に対するコンセンサス・プライマーをヒトＶＨコンセンサス・プライマーによる遺伝子の第３構造領域への結合に使用してＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する。Ｍａｒｋｓ達は、どうやってこのレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ３と組合されるかをさらに記載している。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３誘導配列をＣＤＲ３を欠くＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーと混合し、そして上記の混合した完全なＶＨ又はＶＬドメインを同起源のＶＬ又はＶＨドメインと組合せて本発明の特異的結合メンバーを提供する。次に上記レパートリーを、好適な特異的結合メンバーを選択しうるように好適な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７のファージ・ディスプレイ系を用いて提示させる。レパートリーは１０4 を上回る個々のメンバーから、例えば１０6 〜１０8 又は１０10メンバーのあらゆるメンバーから成る。
【００６０】
類似の混合又は組合せ技術がＳｔｅｍｍｅｒ（Nature, 1994, 370 : 389-391 ）によっても開示され、上記Ｓｔｅｍｍｅｒはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、上記方法が抗体産生に使用されうることを観察している。
【００６１】
さらなる選択肢は、可変ドメイン全体に突然変異を引き起こすための１以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダムな突然変異誘発を用いた、本発明のＣＤＲ誘導配列を担持する新規ＶＨ又はＶＬ領域の産生である。上述の技術はＧｒａｍら（1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 : 3576-3580 ）により記載されており、Ｇｒａｍ達は変異性ＰＣＲを用いた。
【００６２】
使用されうる他の方法はＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する直接的な突然変異誘発である。上述の技術はＢａｒｂａｓら（1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 : 3809-3813 ）及びＳｃｈｉｅｒら（1996, J. Mol. Biol. 263 : 551-567）により開示されている。
【００６３】
上記技術の全てはそういうものとして本技術分野において知られ、そしてそれら自体は本発明の一部を形成しない。当業者は、本技術分野における所定の方法論を用いた、本発明の特異的結合メンバーを提供するための上述の技術を使用できる。
【００６４】
本発明のさらなる側面は、エオタキシン抗原に対して特異的な抗体の抗原結合ドメインを得るための方法を提供し、この方法は、本明細書中に示したＶＨドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入の方法により上記ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体を準備し、場合により、そうして準備された上記ＶＨドメインを１以上のＶＬドメインと組合せ、そして上記ＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬ組合せ物、並びに組合せ物を特異的結合メンバー又は抗体の抗原結合ドメインのエオタキシン抗原に対する特異性の確認のために、そして場合により好ましい特性の１以上、好ましくはエオタキシン活性中和能力について試験することを含む。上述のＶＬドメインは本明細書中で詳述したようなアミノ酸配列を有する。
【００６５】
本明細書に開示のＶＬドメインの配列変異体の１以上を利用する類似の方法を１以上のＶＨドメインと組合せる。
【００６６】
本発明のさらなる側面はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーの製造方法を提供し、上記方法は以下の：
（ａ）ＣＤＲコード領域を欠くか又は置き換えられるべきＣＤＲ３を含むかのいずれかであるＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを準備し；
（ｂ）ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供するために、上記レパートリーを本明細書中に詳述したようなアミノ酸配列をコードする供与核酸と、上記供与核酸が上記レパートリー中にＣＤＲ３領域を挿入するようなＶＨ  ＣＤＲ３のために組合せ；
（ｃ）上記産物レパートリーの核酸を発現させ；
（ｄ）エオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーを選択し；そして
（ｅ）上記特異的結合メンバー又はそれをコードする核酸を回収する、
を含む。
【００６７】
同様に、類似の方法が利用され、ここで、本発明のＶＬ  ＣＤＲ３をＣＤＲコード領域を欠くか又は置き換えられるべきＣＤＲ３を含むかのいずれかのＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組合せる。同じように、１以上又は全ての３のＣＤＲをＶＨ又はＶＬドメインのレパートリー内に移植し、次にそれを特異的結合メンバーか又はエオタキシン抗原に特異的な特異的結合メンバーかについて選別する。
【００６８】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３のＣＤＲ領域を、それらの介在性構造領域と一緒に含むであろう。好ましくは、上記部分は第１及び第４構造領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％をも含み、上記の５０％は第１構造領域のＣ末端５０％及び第４構造領域のＮ末端５０％である。さらなる可変ドメインの実質的な部分のＮ末端又はＣ末端の残基は天然の可変ドメイン領域に関連しないものである。例えば、組換えＤＮＡ技術により作り上げられる本発明の特異的結合メンバーの構築はクローニングを容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮＢ又はＣ末端残基の導入、あるいは他の操作ステップによりもたらされる。他の操作ステップは、本発明の可変ドメインを、免疫グロブリンＨ鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディーの製造において）又は以下により詳細に明記したタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に連結するためのリンカーの導入を含む。
【００６９】
本発明の好ましい側面において、ＶＨ及びＶＬドメインの１部を含む特異的結合メンバーが好ましいが、ＶＨ又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づいた単独の結合ドメインが本発明のさらなる側面を形成する。単独の免疫グロブリン・ドメイン、特にＶＨドメインは特異的な様式により標的抗原の結合が可能であることが知られている。いずれかの１本鎖特異的結合ドメインの場合において、それらのドメインはエオタキシンを結合可能な２の特異的結合メンバーの形成が可能な相補的ドメインに関する選別に使用される。
【００７０】
これはＷＯ９２／０１０４７に開示されるいわゆる階層型二重組合せ法（hierarchical dual combinatorial approach）を用いたファージ・ディスプレイ選別法により達成され、上記方法において、Ｈ又はＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーの感染に使用し、そして得られた２本鎖特異的結合メンバーを、例えばその参考文献中に記載されるものであるファージ・ディスプレイ技術により選別する。この技術も上記にＭａｒｋｓらにより開示されている。
【００７１】
本発明の特異的結合メンバーは抗体定常部又はその一部をさらに含む。例えば、ＶＬドメインはそのＣ末端でヒトＣK 又はＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖を含む抗体Ｌ鎖定常部に付着する。同じように、ＶＨドメインに基づく特異的結合メンバーは、そのＣ末端でいずれかの抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ、及びＩｇＭ、並びにあらゆるアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ４から誘導された免疫グロブリンＨ鎖の全体又は一部に付着する。ＩｇＧ４が好ましい。本発明の特異的な結合メンバーは検出可能な又は機能的な標識によりラベルされる。検出可能な標識は放射性標識、例えば 131Ｉ又は99Ｔｃを含み、これらを抗体画像化の技術分野で知られる慣例の化学反応を用いて本発明の抗体に付着させる。標識は酵素標識、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをも含む。標識は化学成分、例えばビオチンを含み、それらは特定の同系の検出可能な成分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出される。
【００７２】
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の患者、好ましくはヒトの診断法又は治療法に使用されるべく設計される。
【００７３】
したがって、本発明のさらなる側面は、提供される特異的結合メンバーの投与を含む治療方法、上記特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与のための薬剤の製造における、例えば上記特異的結合メンバーを医薬として許容される賦形剤と一緒に配合することを含む薬剤又は医薬組成物の作製方法における上述の特異的結合メンバーの使用を提供する。
【００７４】
抗エオタキシン抗体が治療的利益を提供するために使用される臨床的な適応症は、喘息、湿疹（アトピー性皮膚炎）、及び他のアトピー性疾患、例えば鼻炎、結膜炎、食物アレルギー、好酸球仲介疾患として認識されるアレルギー性大腸炎を含む。実験的証拠がアトピー患者の最も大きな原因として好酸球を支持するので、抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに対しておそらく有効であろう。さらに高い末梢好酸球をカウントする、他のアレルギー性症状、例えばアレルギー性気管支肺アスペルギルス症及び熱帯性好酸球増加症が存在し、それらは抗エオタキシン療法の対象である。
【００７５】
特に、本発明による抗エオタキシン療法は、喘息を患う多くの患者に対して明らかな利益を提供するために使用される（Mattoli et al, 1997; Ying et al, 1997; Brown et al, 1998）。英国国民の約１０％が喘息を持ち、そして最新の治療は十分に満足ゆくものではない：英国では及びウェールズでは喘息のために年間約２０００人が死亡し、そして毎年、喘息を患う人の約６％が（喘息の症状により）入院する。喘息の症状を予防、及びより重い喘息を治療の両方のための、かつて開発された治療の改良された治療に対する明らかな必要性が存在する。抗エオタキシン療法は経口的に、注入により（例えば皮下的又は緊急時は静中に）、吸入により（あらゆる望まれない効果と比較して有益な効果の概要を最適化するため）又は代わりの投与経路により与えられる。上記投与経路は、効果を最適化又は副作用を最小化するために、その疾患に対する特別の考慮により、治療の物理化学的特徴により決定される。
【００７６】
皮膚の病気は抗エオタキシンを用いた局所治療により処置されるのに最良である。病気の皮膚は多くの場合高い吸収能力を持つため、局所治療は治療のための最良の経路をよく提供し、ここで体の他の部分に望まれない効果のないことを必要とする。上記の皮膚の病気が体のかなりを覆っている場合、又はその病気が重い（おそらく他の臓器、並びに皮膚に影響を及ぼしている）場合、注入によるか又は他の有効な手段による投与が局所経路より適切である。局所注入は特定の状況下で適切である（上記の項を参照のこと）。
【００７７】
抗エオタキシン療法は病院内での使用に制限されないと考えられる。患者は上記治療を自ら施し、そして日々の投薬は複合服薬スケジュールにわたり好まれる。
【００７８】
併用治療は、有効な相乗効果を提供するために使用され、特に抗エオタキシン特異的結合メンバーと１以上の抗インターロイキン−５（ＩＬ−５）製剤との組合せが使用される。本発明による特異的結合メンバーは１以上のコルチコステロイド、特に１以上の全身性コルチコステロイドとの組合せか又は添加の状態で提供される。１以上の他の抗喘息／抗アレルギー作用物質、特に他の予防薬、例えばクロモグリケート、ロイコトリエン（レセプター）アンタゴニスト、キサンチン、及び持続型気管支拡張薬との併用治療が喘息治療のために利用される。組合せ物の同様の考えが皮膚及び他のアトピー性症状のための抗エオタキシン療法の使用のために適用される。
【００７９】
乾癬、じんましん（急性じんましん、慢性再発性じんましん、遅延型圧迫性じんましんを含む）、結節性痒疹、血疹状紅斑性発疹、天疱瘡、晩発性皮膚ポルフィリン症、持続性照射反応（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ウェルズ症候群、好酸球性蜂巣炎、薬疹、脈管炎（皮膚兆候）、紫斑病、及び他の皮膚の病気の全ての状態が本発明による抗エオタキシンにより治療されうる。これらの病気は体の大部分に及ぶ、皮膚以外の臓器を含むか、あるいは皮膚に増加した浸透性を与えない。作用部位で有効に局所的に適用されたとしても、その好ましい経路はアトピー性の適応症について示唆されたのと同じ考えから全身的（体じゅう）にである。関連した全身性徴候を伴う重度の皮膚病は、全身治療が局所治療又は局所注入よりも好ましい状況のよい例である。
【００８０】
炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、並びに好酸球性の大腸炎／腸炎／胃腸炎／シャルマン症候群が抗エオタキシン療法により効果的に治療される。好酸球はこれらの疾患を特徴づける病変中に顕著な細胞型として現れる。
【００８１】
脈管炎のいくつかの形態、特に特発性の、Ｈｕｇｕｅｓ−Ｓｔｏｒｉｎ症候群、チャーグ・ストラウス症候群、気管支中心性肉芽腫症、好酸球性肺炎（レフラー症候群）、持続性肺好酸球増加症、オーメン症候群、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、家族性好酸球増加症、及び特発性過好酸球増加症が抗エオタキシンにより治療されうる。
【００８２】
原因不明の好酸球増加症は合併症、例えば肺炎、脈管炎、大腸炎、腸炎、胃腸炎、レフラー心内膜炎、及び心臓弁線維症、並びに結合組織に影響を及ぼす症候群を生じうる。好酸球増加症は悪性疾患（特に、リンパ腫、白血病、及び胃腸の癌）、薬物療法（例えばサイトカイン注入）、並びに慢性疲労症候群にも関連する。抗エオタキシン療法はこれらの疾患の全てに使用されうる。同様に、好酸球増加・筋痛症候群、毒性オイル症候群（ｔｏｘｉｃ−ｏｉｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、好酸球増加症による広範性筋膜炎（好酸球性筋膜炎）、及び好酸球性筋炎が抗エオタキシンにより治療されうる。
【００８３】
これらの症状において抗エオタキシンによる介入が利益をもたらすので、寄生虫を原因とする好酸球の誘引は害を及ぼす効果である。病原体による好酸球誘引を含む疾患は、原生動物感染症、並びに後生動物感染症、例えばヘルミス感染症及び特に線虫感染症（例えばフィラリア症、鉤虫、回旋糸状虫症、トクソカリアシス、回虫症、及び旋毛虫症、住血線虫症［好酸球性髄膜炎］）を含む。無症状性寄生虫症は好酸球仲介疾患の固有の状態の大きな原因となる。
【００８４】
抗エオタキシン療法は好酸球以外の細胞、例えば好塩基球のＣＣＲ−３発現に影響を及ぼす。
【００８５】
本発明により、提供される組成物は個々に投与される。好ましくは、投与は「治療としての有効量」であり、これは患者に恩恵をもたらすのに十分である。上述の恩恵は、少なくとも１の症状の少なくとも１の改善である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間的経過は治療する症状の性質及び重さに依存する。治療の規定、例えば用量の決定等は一般的な開業医及び他の医師の責務である。抗体の適切な用量は当技術分野で周知である；Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Cancer 47 : 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 : 915-922を参照のこと。
【００８６】
適確な用量は、上記抗体が診断のためであるか又は治療のためであるか、治療すべき範囲の大きさと位置、上記抗体の厳密な性質（例えば抗体全体、断片又はダイアボディー）、及び上記抗体に付着されたいずれかの検出可能な標識又は他の分子の性質を含む多くの要因に依存する。典型的な抗体の用量は、全身投与については０．５mg〜１００ｇの範囲、局所投与については１０μｇ〜１mgの範囲である。典型的には、上記抗体は抗体全体、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプである。これは成人患者の単独の治療のための用量であり、上記用量は子供及び乳児に対して比例的に調整され、そして分子量に比例して他の抗体様式についても調整されうる。治療は医師の裁量で日、２週、週又は月間隔で繰り返される。
【００８７】
本発明の特異的結合メンバーは通常医薬組成物の形で投与され、その医薬組成物は上記特異的結合メンバーに加えて少なくとも１の成分を含む。
【００８８】
よって、本発明による、そして本発明により使用するための医薬組成物は、有効成分に加えて医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業者に周知の他の物質を含む。上述の物質は無毒であり、かつ有効成分の効果を妨害すべきではない。上記担体又は他の物質の正確な性質は投与経路に依存し、その投与経路は経口又は注入、例えば静中である。
【００８９】
経口投与のための医薬組成物は錠剤、カプセル、散剤又は液剤の形である。錠剤は固形の担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含む。液状医薬組成物は一般的に液状の担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油又は合成潤滑油を含む。生理的食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例えばエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールが含まれる。
【００９０】
静中注入又は患部への注入のために、上記有効成分はパイロジェンを含まず、かつ好適なpH、等張性、及び安定性を持つ、非経口で許容される水溶液の形である。当業者は、例えば等張溶媒、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が必要に応じて含まれる。
【００９１】
組成物は、治療すべき症状に依存して単独で、あるいは他の処置との組合せで同時にか又は連続してかのいずれかで投与される。他の処置は、好適な用量の鎮痛剤、例えば非ステロイド系抗炎症剤（例えばアスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン若しくはケトプロフェン）又はオピエート、例えばモルヒネ、あるいは制吐剤の投与を含む。
【００９２】
本発明は、本明細書中に提供される特異的結合メンバーのエオタキシンへの結合を引き起こす又は許すことを含む方法を提供する。記載のとおり、上述の結合は、例えば特異的結合メンバー若しくは特異的結合メンバーをコードする核酸の投与に続いてインビボで起こるか、あるいはそれは、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降又はアフィニティー・クロマトグラフィーにおいてインビトロで起こる。
【００９３】
特異的結合メンバーのエオタキシン１の結合量を測定する。計量は試験サンプル中の抗原の量に関係し、それは診断上の関心である。
【００９４】
サンプルに対する反応性はいずれか適切な手段により決定される。放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）は１つの可能性である。放射性標識抗原を標識していない抗原（上記試験サンプル）と混合し、そして上記抗体に結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、そして上記抗体に結合した放射性抗体の量を測定する。さらなる抗原、つまり、上記試験サンプル中に存在するより少ない放射活性の抗原が上記抗体に結合する。競合結合アッセイをリポーター分子に連結された抗原又はアナログを用いた非放射性抗原を用いて使用することもできる。上記リポーター分子はスペクトル的に単離された吸収又は発光の特徴を伴う蛍光色素、燐光体又はレーザー色素である。好適な蛍光色素はフルオセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサス・レッドを含む。好適な発色体色素はジアミノベンジジンを含む。
【００９５】
他のレポーターは、高分子コロイド粒子又は粒子状物質、例えば着色した磁性又は常磁性ラテックス・ビーズ、及び視覚的に観察されるか、電気的に測定されるか又は別の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生じうる生物学的又は化学的活性物質を含む。これらの分子は反応を触媒する酵素であり、その反応は、例えば色を生み出すか又は変化させ、あるいは電気的特性に変化を引き起こす。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトルの吸収又は放出を生じるような、分子的に興奮性である。それらは、バイオセンサーとの結合に使用される化学物質を含む。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン、及びアルカリ・ホスファターゼ検出系が利用される。
【００９６】
個々の抗体−リポーター複合体により生じるシグナルは（正常及び試験）サンプル中の当該抗体結合の定量化できる絶対的又は相対的データを導くために使用されうる。
【００９７】
本発明は競合アッセイによる抗原レベルの計測のために上記のとおりの特異的結合メンバーの使用、つまり競合アッセイにおいて本発明により提供される特異的結合メンバーを利用することによるサンプル中の抗原レベルの計測方法をも提供する。これは、結合していない抗原から結合した抗原の物理的分離を必要としない。物理的又は光学的変化を結合により起こすためにリポーター分子を上記特異的結合メンバーに連結することは１つの可能性である。上記リポーター分子は検出可能な、そして好ましくは計測可能なシグナルを直接的に又は間接的に発生する。リポーター分子の結合は直接的又は間接的に共有結合的、例えばペプチド結合によるか又は非共有結合的である。ペプチド結合を介した結合は、抗体とリポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え体の発現の結果として存在する。
【００９８】
本発明は、例えばバイオセンサー・システムにおいて本発明による特異的結合メンバーを利用することにより抗原レベルを直接的に計測するためにも提供される。
【００９９】
結合の測定様式は本発明の特色ではないので、当業者が彼らの選択及び一般知識により好適な様式を選ぶことができる。
【０１００】
本発明はさらに特異的結合メンバーにまで及び、この特異的結合メンバーはエオタキシンに結合するために、上記抗原を結合し、かつ本明細書中に、詳細に示したアミノ酸を持つＣＤＲ又は本明細書中に詳細に示したアミノ酸を持つＶドメインを含むいずれかの特異的結合メンバーと競合する。結合メンバー間の競合はインビトロにおいて容易にアッセイされる、例えば他の不タギング結合メンバーの存在中で検出されうる特定のリポーター分子を結合メンバーの１つにタギングすることにより、同じエピトープ又はオーバーラップするエピトープを結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。競合は例えば実施例１に記載のとおりＥＬＩＳＡを用いて測定される。
【０１０１】
競合についての試験において、上記抗原のペプチド断片、特に着目のエピトープを含むペプチドが利用される。上記エピトープ配列、それに加え１以上のアミノ酸をいずれかの末端に持つペプチドを使用する。上述のペプチドは特定の配列から「原則的に構成される」と考えられる。本発明による特異的結合メンバーは、抗原に対するそれらの結合が与えられた上記配列を伴うか又は含むペプチドにより阻害されるようなものである。これに関する試験において、配列、それに加え１以上のアミノ酸を共に含むペプチドを使用する。
【０１０２】
特定のペプチドを結合する特異的結合メンバーは上記ペプチドとのパニングにより、例えばファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離される。
【０１０３】
本発明は本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好ましい態様において、本発明は上記のとおり本発明のＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。
【０１０４】
本発明は少なくとも１の上記ポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写物又は発現カセットの形態の構築物をも提供する。
【０１０５】
本発明は１以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞をも提供する。そのためのコード核酸からの発現を含む、コードされた産物の製造方法を実行する場合、それ自身を提供するようにあらゆるＣＤＲ，ＶＨ若しくはＶＬドメイン又は特異的結合メンバーをコードする核酸は本発明の側面を形成する。発現は上記核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより都合よく達成される。発現による製造に続いて、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又は特異的結合メンバーをいずれか好適な技術を用いて単離及び／又は精製し、その後必要に応じて使用する。
【０１０６】
本発明による特異的結合メンバー、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、並びにコード核酸分子及びベクターは、実質的に純粋な状態又は相同体の形態に、例えばそれらの天然環境から単離及び／又は精製されて提供されるか、あるいは核酸の場合には所望の機能を持つポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子起源を含まないか又は実質的に含まない状態に単離及び／又は精製されて提供される。本発明による核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含み、そして全体的に又は部分的な合成物質である。本明細書中に示されるヌクレオチド配列への言及は指定配列を持つＤＮＡ分子を包含し、かつ文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ＵをＴの代わりにする指定の配列を持つＲＮＡ分子を包含する。
【０１０７】
さまざまに異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニング及び発現の系が周知である。好適な宿主細胞は細菌、哺乳動物細胞酵母、及びバキュロウイルスの系列を含む。非相同ポリペプチドの発現のために本技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、幼ハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス・メラノーマ細胞、及び多数の他の細胞を含む。一般的に、好ましい細菌宿主はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０１０８】
原核生物細胞、例えばＥ．コリにおける抗体及び抗体断片の発現は本技術分野で十分に確立されている。参考のために、例えばPlueckthun, A. Bio/Technology 9 : 545-551 (1991)を参照のこと。培養による真核生物における発現が特異的結合メンバーの製造のための選択肢として当業者に利用可能でもある、最近の総説として、例えばRef, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 : 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6 : 553-560 を参照のこと。
【０１０９】
プロモーター配列、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適当な調節配列を含む好適なベクターが選択されるか又は構築される。ベクターは必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えば「ファージ」又はファージミドである。より詳細には、例えばMolecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。例えば核酸構築物の製造、突然変異誘導、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現による核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多くの既知の技術及びプロトコールはCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。Sambrook et al. 及びAusubel et al.の開示を本明細書中に援用する。
【０１１０】
よって、本発明のさらなる側面は本明細書中に記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。よりさらなる側面は上述の核酸を宿主細胞内に導入することを含む方法を提供する。上記導入はいずれか利用可能な技術を利用する。真核生物細胞について、好適な技術は、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくは昆虫細胞のためのバキュロウイルスを用いた形質導入を含む。細胞に対して、好適な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含む。
【０１１１】
上記導入は、例えば上記遺伝子の発現のための条件下、宿主細胞を培養することにより、上記核酸からの発現の引き起こすか又は生じることがその後に続く。
【０１１２】
１の態様において、本発明の核酸は上記宿主細胞のゲノム（例えばクロモソーム）の中に組み込まれる。組み込みは、標準技術による上記ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進される。
【０１１３】
本発明は、特異的結合メンバー又は上記ポリペプチドを発現するために発現系において上記構築物を用いることを含む方法をも提供する。
【０１１４】
本発明の側面及び態様を以下の実験について言及することにより実施例としてここで説明する。
【０１１５】
【化１】
0005198704.tif 000002
【０１１６】
【化２】
0005198704.tif 000003
【０１１７】
実験的実施例一覧
実施例１：抗ヒト・エオタキシンｓｃＦｖの単離
実施例２：走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ  ３Ｇ３の中和力価
実施例３：ＣＡＴ−２１２の誘導及び配列決定
実施例４：ＣＡＴ−２１２の特異性
実施例５：走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価
実施例６：ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１２競
合アッセイ
実施例７：エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２アフィニティーの測定
実施例８：ＣＡＴ−２１２への結合に関するマウス・エオタキシンの競合
実施例９：カルシウム流動アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価
実施例１０：ヒト鼻腔ポリープに対するＣＡＴ−２１２の免疫応答性
実施例１１：ＩｇＧ４様式（ＣＡＴ−２１３）へのＣＡＴ−２１２の変換
実施例１２：走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価
実施例１３：ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１３
競合アッセイ
実施例１４：アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるＣＡＴ−２１２及
びＣＡＴ−２１３の効果
実施例１５：Ｌ１．２  ＣＣＲ−３をトランスフェクトした細胞：アカゲザル
及びマウス・エオタキシンを用いたエオタキシン仲介走化作用ア
ッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価
実施例１６：ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおける
ＣＡＴ−２１３の中和力価
実施例１７：エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるＣＡＴ−２１
３の中和力価
実施例１
抗ヒト・エオタキシンｓｃＦｖの単離
ｓｃＦｖ抗体レパートリー
扁桃腺、骨髄、及び末梢血から単離されたＢ−リンパ球から誘導し、そしてファージミド・ベクター内にクローニングした巨大１本鎖Ｆｖヒト抗体ライブラリー（Vaughan et al, 1996 ）を選択に使用した。このｓｃＦｖレパートリーを個々の組換え体が約１．３×１０10持つように計算する。このレパートリーからの抗体は、固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるｓｃＦｖ精製を可能にするためのＣ末端範囲の６ヒスチジン、及びモノクローナル抗ｃ−ｍｙｃ抗体、９Ｅ１０を用いた一般的な検出システムを提供するためのｃ−ｍｙｃから誘導された短い配列をも組み込む。
【０１１８】
ｓｃＦｖの選択
ヒト・エオタキシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を１０μｇ／mlでイムノチューブ（Ｎｕｎｃ；Ｍａｘｉｓｏｒｂ）上に直接的にか、あるいはＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイター・プレート（Ｎｕｎｃ）上にコートしたジサクシンイミド・スベレート活性化ＢＳＡに結合させてコートした。選択の第１段階のために、１０12力価単位のライブラリー・ファージを使用した。上記ｓｃＦｖライブラリー選択の第３段階を標準的なパニング・プロトコール（Vaughan et al, 1996 ）に引き続き実施した。選択の段階２及び３からの個々のクローンを取り出し、そしてファージＥＬＩＳＡにより選別した。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡのためのファージの取り出し
選択の段階２及び３からの個々のコロニーを、１００μｇ／mlのアンピシリン及び２％グルコースを追加した２ＴＹ培地（２ＴＹＡＧ）を１ウェル当たり１００μｌ含む９６ウェル・プレートに接種した。プレートを振とうしながら３７℃で４時間培養した。１０のＭＯＩまでＭ１３Ｋ０７ヘルパー・ファージを各ウェルに加え、そしてそのプレートを３７℃でさらに１時間インキュベートした。上記プレートをベンチトップ遠心分離機により２０００rpm で１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、１００μｇ／mlのアンピシリン及び５０μｇ／mlのカナマイシンを追加した２ＴＹ（２ＴＹＡＫ）１００μｌ中に再懸濁し、そして振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。プレートを２０００rpm で１０分間遠心分離し、各ウェルから１００μｌのファージを含有する上清を９６ウェルプレートに回収した。上記のファージをブロックするために、２０μｌの１８％マーベル・ブロッキング溶液含有６×ＰＢＳ（６ＭＰＢＳ）を各ウェルに加え、そして室温で１時間インキュベートした。上記ファージはすぐにＥＬＩＳＡに使用できる状態である。
【０１２０】
ファージＥＬＩＳＡ
可塑性９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ）をＰＢＳ中０．５μｇ／mlヒト・エオタキシン又は対照としてＰＢＳのみにより４０℃で一晩コートした。コート後、上記溶液を各ウェルから除去し、そして上記プレートを３％マーベル含有ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）により室温で１時間ブロッキングした。そのプレートをＰＢＳにより３回洗浄し、次に５０μｌの事前にブロックしたファージを各ウェルに加えた。上記プレートを室温で１時間静置したままインキュベートした。そのプレートを室温で０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）の３回交換、続いてＰＢＳの３回交換により洗浄した。
【０１２１】
各ウェルに、ＭＰＢＳ中に５０００分の１希釈での抗遺伝子VIII−ＨＲＰ複合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５０μｌを加え、そしてそのプレートを室温で１時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴにより３回、続いてＰＢＳにより３回洗浄した。次に５０μｌの３，３′，５，５′−テトラメチル・ベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）基質を各ウェルに加え、そして室温で３０分間、あるいは発色するまでインキュベートした。上記反応を２５μｌの０．５Ｍ  Ｈ2 ＳＯ4 の添加により停止させた。発生されたシグナルをマイクロタイター・プレート・リーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ３５５０）を用いて４５０nmでの吸収（Ａ450 ）を読み取ることで計測した。
【０１２２】
抗エオタキシンｓｃＦｖ
たった４種類の異なるｓｃＦｖがファージＥＬＩＳＡにより同定されたことによりエオタキシン特異的ｓｃＦｖの単離が非常に困難であることがわかった。同じｓｃＦｖライブラリーを他の抗原に対して選択した場合、より多くのｓｃＦｖが典型的には同定される。さらなる特徴を示すことに関して同定されたコロニーを３Ｇ３と称し、そしてこのクローンはＥＬＩＳＡにおいてＰＢＳで見られたそれの５〜１０倍超のヒト・エオタキシンでのシグナルを常に示した。
【０１２３】
実施例２
走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ  ３Ｇ３の中和力価
背景
上記抗エオタキシンｓｃＦｖ  ３Ｇ３の中和力価をインビトロ走化作用アッセイを用いて測定した。
【０１２４】
インビボにおいて阻害が望まれるＣＣＲ３発現細胞の化学遊走を誘発することがエオタキシンの能力であるため上記走化作用アッセイは特にインビトロにおける力価アッセイに関係する。上記アッセイはＣＣＲ３レセプターを発現する細胞が走化作用によりエオタキシン・グラジエントに向かって移動する原理に働きかける。ここに詳述した上記方法はPanath et al, 1996a による記載に基づく。簡単に言うと、エオタキシンを、適当なバッファー中の試験抗体と一緒にトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の下部ウェルに入れた。ＣＣＲ３レセプターを発現するトランスフェクト細胞を上記トランスウェルの上部チャンバーに入れた。上記の２のチャンバーを３μＭの孔径を持つポリエステル膜によって隔てた。ＣＣＲ３リガンド、例えばエオタキシンに反応した細胞だけがその孔を通って遊走する。定められたインキュベーション期間の後、下部チャンバーまで遊走した細胞の数をカウントし、そしてこの数は上記上部チャンバーに入れたケモカインの化学遊走誘発活性の指標である。それ故に、この化学遊走誘発活性の阻害がこのアッセイにより評価されうる。
【０１２５】
ＣＣＲ３細胞の維持
Ｌ１．２細胞をヒトＣＣＲ３レセプターによりトランスフェクトし、その表面にＣＣＲ３を発現する安定な細胞株を製造した。上記細胞を１０％熱不活化ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２％  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１０Ｕペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｇ／mlストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、２５０μｇ／mlカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）、及び４００μｇ／mlゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）中で維持した。上記アッセイで使用するために上記細胞を１〜２×１０6 ／mlの間に保った。ＣＣＲ３発現を上方調節するための上記細胞のＮＯ刺激を上記走化作用アッセイのために必要とした。５０ng／mlのエオタキシンに対する反応を慎重に観察した、なぜなら遊走細胞数は、おそらくＣＣＲ３発現レベルの変化により、細胞の維代数にともない減少するからである。典型的には下部チャンバーまで遊走した上記細胞の１０％サンプルを続いてフローサイトメトリーにより計測した。５０ng／mlのエオタキシンは典型的には８，０００〜１０，０００細胞の走化作用を誘発することがわかった（これは上記１０％値である；すなわち合計で８０，０００〜１００，０００細胞が下部チャンバーまで遊走した）。
【０１２６】
走化作用アッセイ
走化作用アッセイのバッファーは、１％エオタキシン不含ＢＳＡ（Ｂａｙｅｒ  Ｐｅｎｔｅｘ）、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）を含む。（二重で）抗体の試験溶液をアッセイ・バッファー中に所望の濃度まで希釈した。ＩＭＡＣ−精製（次項を参照のこと）ｓｃＦｖ  ３Ｇ３について、典型的な希釈の範囲は１００μｇ／ml〜１μｇ／mlであった。ヒト・エオタキシン（Ａｌｂａ  Ｃｈｅｍ）を適当な試験ｓｃＦｖと混合する時に５０ng／mlの終濃度まで加えた。全てのサンプルを室温で３０分間インキュベートした。ＣＣＲ３  Ｌ１．２細胞をＨｅｒａｅｕｓ  Ｓｅｐａｔｅｃｈ  １．０ベンチトップ遠心機により１，２００rpm で５分間遠心分離し、その培地を吸引により除去し、そしてその細胞を２５mlのＰＢＳ中に再懸濁した。上記細胞を次に再び遠心分離し、そしてその細胞ペレットを１０7 細胞／mlにアッセイ・バッファー中に再懸濁した。試験溶液（ウェル当たり０．６ml）をトランスウェル・プレートの下部チャンバー内に入れた。トランスウェルを上記試験溶液上に入れ、そして１００μｌの細胞（合計１０6 細胞）を各トランスウェルの上部チャンバー内に入れた。インキュベーションを５％  ＣＯ2 下、３７℃で４時間行った。上記トランスウェルを取り除く前にそのプレートを軽くたたいて膜の下側に付着した全ての細胞を取り外した。下部チャンバーまで遊走した細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーターを用いてカウントした。サンプルを培地流速を用いて６０秒間それぞれカウントした。上記試験抗体に起因する走化作用の阻害率を次に測定した。
【０１２７】
ｓｃＦｖの精製
走化作用アッセイにおいて３Ｇ３  ｓｃＦｖの力価を測定するために、ｓｃＦｖをＩＭＡＣによりまず下処理した。２ＴＹＡＧ（５ml）に３Ｇ３のシングル・コロニーを接種し、そして振とうしながら３０℃で一晩育成した。この一晩培養した物を次に１００μｇ／mlアンピシリン及び０．１％グルコース含有２ＴＹ  ５００mlへの接種に使用し、そして１．０のＡ600 に達するまで振とうしながら３０℃で育成した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１mMまで加え、そして上記培養物を３０℃でさらに３．５時間育成した。
【０１２８】
細胞を５，０００rpm での遠心分離により採取し、そして１０mlのＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５mM  ＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖；氷冷）中に再懸濁した。さらに１５mlのＴＥＳの１：５希釈物（水による）を加え、そしてその細胞懸濁液を回転輪上、４０℃で３０分間インキュベートした。これは浸透圧衝撃を引き起こし、そして上記ｓｃＦｖを含むペリプラズム抽出物を生じた。残留細胞及び破片を、４０℃で２０分間９，０００rpm での遠心分離によりペレット化した。その上清を新しい試験管に移し、そして５０μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ2 を加えた。次に、バッファー（５０mM  リン酸ナトリウム、pH８、３００mM  ＮａＣｌ）により事前に洗浄された２mlのＮｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ）をプロテアーゼ阻害剤錠（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と一緒にペリプラズミック抽出物に加えた。上記配合物を回転させながら４０℃で一晩インキュベートした。上記Ｎｉ−ＮＴＡを５分間２，０００rpm での遠心分離によりペレット化し、そしてその上清を吸引した。アガロース・ビーズを５０mlの洗浄バッファーにより３回洗浄し、各洗浄の間にはそのアガロース・ビーズを集めるために遠心分離した。１０mlの洗浄バッファーを最後の洗浄の後に加え、そして上記スラリーをポリプレップ・カラム（ＢｉｏＲａｄ）に添加した。２mlの溶出液（５０mM  ＮａＰｉ、pH８、３００mM  ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール）を排水したアガロースに加え、そしてその溶出液を集めた。ＩＭＡＣ精製ｓｃＦｖを製造者の指示によるＮａｐ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用によりＰＢＳにバッファーに変換した。Ａ280 を読み取り、そしてそのタンパク質濃度を、１mg／mlタンパク質＝Ａ280 １．４の分子減衰係数を用いて測定した。精製ｓｃＦｖを−７０℃で５００μｌアリコートの状態で保存した。
【０１２９】
結果
走化作用アッセイにおける精製ｓｃＦｖ  ３Ｇ３についての代表的なデータを図１に示す。ｓｃＦｖ  ３Ｇ３に関してＩＣ50は８００nMである。結果として、この抗体は低〜中程度の力価である。
【０１３０】
実施例３
ＣＡＴ−２１２の誘導及び配列決定
ｓｃＦｖ  ３Ｇ３の低〜中程度の力価は、この抗体をあらゆる治療的適用に関して比較的不適当な候補物質にしている。
【０１３１】
ＣＡＴ−２１２と呼ばれるさらなるｓｃＦｖ抗体をいろいろな技術を用いて得、そしてそのＤＮＡ配列を決定した。
【０１３２】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡを、ベクター特異的プライマー、ｐＵＣ１９逆及びｆｄｔｅｔｓｅｑ（Vaughan et al, 1996 ）を用いて２ＴＹＡＧアガロース・プレート上の個々のコロニーからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅条件は３０サイクルについては９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間、続いて７２℃で最後の１０分間伸長を含む。そのＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて５０μｌ  Ｈ2 Ｏの終量まで精製した。２〜５μｌの各挿入調製物を、Ｔａｑ色素−ターミネータ・サイクル・シークエンシング・システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた配列決定のための鋳型として使用した。プライマー（Osbourn et al, 1996 ）、ｇｅｎｅ３ｌｅａｄｅｒ，ＰＣＲＨＬｉｎｋを上記ｓｃＦｖのＶH の配列決定のために使用し、そしてＰＣＲＬＬｉｎｋ及びｍｙｃｓｅｑ１０を上記ｓｃＦｖのＶL の配列決定のために使用した。
【０１３３】
ＣＡＴ−２１２  ＶH 及ＶL のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１及び３に示す。ＣＡＴ−２１２  ＶH 及びＶL の誘導されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び４に示す。
【０１３４】
抗体の個々のＶH 及びＶL セグメントをＶ−ＢＡＳＥ（Tomlinson et al, 1995 ）により既知のヒト生殖細胞系列の配列に整列し、そして最も近い生殖細胞系列を同定した。ＣＡＴ−２１２のＨ鎖について最も近い生殖細胞系列をＶH ３ファミリーの１つであるＤＰ４９と同定した。上記ＣＡＴ−２１２  ＶH は上記ＤＰ４９生殖細胞系列とたった６の変更しかなく、これらの２がＣＤＲ２内に存在する。ＣＡＴ−２１２のＬ鎖について最も近い生殖細胞系列をＶK １ファミリーの１つであるＤＰK ５と同定した。上記ＣＡＴ−２１２  ＶL は上記ＤＰK ５生殖細胞系列とたった２の変更しかなく、両方ともＣＤＲ内に存在する。ＣＡＴ−２１２の配列全体又はその誘導体（例えばＣＡＴ−２１３）は、生殖細胞系列と合計でたった８の変更しかなく、その４はＣＤＲ内に存在する。これは、これらのヒト抗体が患者の処置に使用される場合に免疫原性のあらゆる可能性のある危険をより最小化するはずである。
【０１３５】
実施例４
ＣＡＴ−２１２の特異性
ＣＡＴ−２１２の特異性を調べるために２種類の技術：ファージＥＬＩＳＡ及びウエスタン・ブロッティングを使用した。
【０１３６】
ファージＥＬＩＳＡ
ＣＡＴ−２１２の特異性を測定するために、ファージＥＬＩＳＡを、ヒト及びマウス・エオタキシン、並びに関連の及び関連のないヒト抗原のパネル；ＭＩＰ−１α，ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−５，ＩＬ−１８，ＩＬ−１２，ＲＡＮＴＥＳ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＮＦα、そしてＰＢＳに対して実施した。
【０１３７】
ＣＡＴ−２１２ファージミドを含む個々のＥ．コリ・コロニーを５mlの２ＹＴＡＧに接種し、そして振とうしながら３７℃で４時間インキュベートした。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパー・ファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０のＭＯＩまで各試験管に加え、そして３７℃で最初の３０分間は静置して、そして最後の３０分間は緩やかに振とうして、１時間インキュベートした。細胞を３，５００rpm で１０分間遠心分離することでペレットにし、そしてその上清を捨てた。細胞を５mlの２ＴＹＡＫ中に再懸濁し、そして振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、上記細胞を３，５００rpm で１０分間遠心分離することでペレットにした。そのファージ含有上清（５ml）を新しい試験管に丁寧に移し、１mlの６ＭＰＢＳを加え、そして室温で１時間インキュベートしてＥＬＩＳＡの前に上記ファージを前もってブロックした。
【０１３８】
さまざまな抗原のコート濃度及び供給者を表１に示す。ＥＬＩＳＡを原則的に実施例１に記載のとおり実施した。その結果を図９に示す。ＣＡＴ−２１２はヒト・エオタキシンに特異的であり、かつ試験したあらゆる関連のない又は関連のヒト抗原と交差反応しない。バックグラウンドを越えるごくわずかなシグナルがマウス・エオタキシンにおいて見られた。これはＣＡＴ−２１２がヒト・エオタキシンに比べて比較的弱いながらも、マウス・エオタキシンを認識することを示す。ヒト又はマウス以外のいずれかの種については市販のエオタキシンを入手できなかった。
【０１３９】
ウエスタン・ブロッティング
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＰＨＡＳＴシステム及び１０〜１５％ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて実施した。エオタキシン及びヒトＭＣＰ−１（４００ng）のサンプルを分子量マーカーと同時に上記ゲル上で泳動した。電気泳動を実施し、次にタンパク質を拡散によりイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に転写した。その膜をＭＰＢＳとの１時間のインキュベーションによりブロックし、次にＭＰＢＳ中の１０μｇ／ml  ＩＭＡＣ精製ＣＡＴ２１２  ｓｃＦｖ又は関連性のないｓｃＦｖにより振とうしながら室温で１時間プローブした。これに続き、上記の膜をＰＢＳＴ中で（３×２分間）洗浄し、次に１μｇ／mlのビオチン化抗ｍｙｃタグ抗体（９Ｅ１０）と一緒に１時間インキュベートした。洗浄を待ってから、最後の洗浄の前にそのブロットを１μｇ／mlのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と一緒に１時間インキュベートした。そのブロットを製造業者の指示に従いＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中に入れ、そしてＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ）に焼き付けた。
【０１４０】
予測した分子量の明確なバンドが観察された一方で、上記ＭＣＰ−１のレーンにはバンドが検出されなかったので、ＣＡＴ−２１２  ｓｃＦｖはヒト・エオタキシンと特異的に反応した。対照である同濃度の関連性のないｓｃＦｖはエオタキシン又はＭＣＰ−１のいずれとも反応しなかった。
【０１４１】
実施例５：エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価
ＣＡＴ−２１２（及びＣＡＴ−２１３、実施例１２を参照のこと）の力価を、実施例２に記載のとおり、走化作用アッセイにより試験した。試験に先立ち、単量体ｓｃＦｖをＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーにより調製した。
【０１４２】
単量体ｓｃＦｖの調製
単量体ｓｃＦｖをＰｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣシステムのセファデックス７５カラムでのＩＭＡＣ精製材料のゲルろ過により調製した。上記カラムを０．５ml／分でＰＢＳを流し込み、そして５００μｌのサンプルを添加した。精製単量体ｓｃＦｖを含む画分を集めた。ｓｃＦｖの濃度を集めたピーク画分のＡ280 nmを読み取ることにより測定した。
【０１４３】
ＣＡＴ−２１２  ＦＰＬＣ精製ｓｃＦｖに関して（アッセイ・バッファーによる）典型的な希釈の範囲は１μｇ／ml〜０．００１μｇ／mlであった。
【０１４４】
結果
結果を図３に示す（３の測定の平均値）。ＣＡＴ−２１２はＣＣＲ３トランスフェクトＬ１．２細胞のエオタキシン仲介走化作用を６５０±８３pMのＩＣ50で阻害した。したがって、３Ｇ３になされた修飾は、このｓｃＦｖ抗体の力価において１０００倍超の向上をもたらした。ＣＡＴ−２１２は高い力価の抗エオタキシン中和抗体である。
【０１４５】
実施例６
ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１２競合アッセイ
序文
好適なポリスチレン・マイクロタイター・プレートに受動的に固定化された場合、ＣＡＴ−２１２は、その解離定数（ＫD ）により定められる濃度依存様式でのエオタキシンの結合を示した。 125ヨウ素標識エオタキシンからのβ放射は、それが燐光体浸透マイクロタイター・プレート（Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標））と相互作用する時に検出可能な光シグナル（シンチレーション）を生み出す。射程の短かいこの放射は上記の得られたシグナルがわずかな非結合物質からの寄与を伴う結合抗原に起因することを裏付ける。この技術をエオタキシン−ＣＡＴ−２１２相互作用のＫD 、及び競合阻害によるＣＡＴ−２１２とＣＡＴ−２１３（実施例１３を参照のこと）超製物の相対親和性を測定するために使用した。
【０１４６】
アッセイ・プロトコール
Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）（ＮＥＷ  ＳＭＰ２００；９６ウェル）のウェルを０．０５Ｍカーボネート−ビカーボネート・バッファー（Ｓｉｇｍａ）中に希釈した４０nMのＩＭＡＣ精製ＣＡＴ−２１２（調製方法については第２項を参照のこと）１００μｌによりコートした。そのプレートをシールし、そして４℃で４時間インキュベートし、次にそれを逆さにすることで空にし、そして１５０μｌの１％マーベル含有ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）により４℃で一晩ブロックした。使用直前に、前記プレートを逆さにすることで空にし、そしてＰＢＳにより３回洗浄し、次に水気を取った。
【０１４７】
上記アッセイ・バッファーは０．５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）から成っていた。試験サンプルをバッファー中で３倍希釈し、二重の１１の流度を得た。５０μｌの希釈した試験サンプルをウェルに加え、続いて５０μｌの３０pM［ 125Ｉ］エオタキシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えた。そのプレートをシールし、そして室温で１〜２時間インキュベートした。そのプレートをＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーション・カウンターによりカウントした（ウェルをそれぞれ２分間カウントした）。
【０１４８】
データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ）を使用して４−パラメーター・ロジスティック方程式を用いて明白なＩＣ50値を得た。Ｙ＝下限＋（上限−下限）／（１＋１０＾（（Ｌｏｇ  ＩＣ５０−Ｘ）×丘の傾き））
Ｘ＝濃度の対数、ＹはＣＰＭである。
【０１４９】
結果
図４はアッセイの結果を示し、このアッセイにおいて非標識ＣＡＴ−２１２を［ 125Ｉ］エオタキシンのｆｌａｓｈ  ｐｌａｔｅ（商標）にコートしたＣＡＴ−２１２への結合に対する競合のために使用した。ＣＡＴ−２１２はこのアッセイ（４の測定の平均値）において４２．５pMのＩＣ50を示す。
【０１５０】
実施例７
エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２親和性の測定
アッセイ・プロトコール
実施例６に記載のとおりＦｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）をＣＡＴ−２１２によりコートし、そして試薬を調製した。アッセイ・バッファー中、［ 125Ｉ］エオタキシンの連続的な２倍希釈物＋／−１００倍超の非標識エオタキシンを調製し、そして二重で１００μｌのサンプルをそのコート・プレートに加えた。上記サンプルをシールし、室温で２時間インキュベートし、そしてカウントした。
【０１５１】
上記データを、式：Ｙ＝（ＢMAX ×［Ｌ］）／（ＫD ＋［Ｌ］）によるＫＥＬＬ  ｆｏｒ  ｗｉｎｄｏｗｓソフトウェア・パッケージ（Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて非線形曲線の当てはめにより分析した。
【０１５２】
上記の式において、［Ｌ］は遊離リガンド濃度であり、ＫD は親和性であり、かつＢMAX は最大結合部位濃度である。
【０１５３】
次に上記データを、そのリガンドが相同体集団の結合部位に結合している時に傾き＝−１／ＫD 及びＢMAX のＸ断片を持つ直線を呈する、結合／遊離の比対結合のスキャッチャード・プロット（図５）の使用により視覚化する。
【０１５４】
結果
上記スキャッチャード・プロット（図５）より、ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンについての親和性を１４６pMと評価した。
【０１５５】
実施例８
ＣＡＴ−２１２への結合に対するマウス・エオタキシン競合
序文
ＣＡＴ−２１２／ＣＡＴ−２１３のインビボ活性を扱うために、２種類の方法を利用した（実施例１４を参照のこと）：
（１）マウス・モデルにおける好酸球増加症に対するヒト・エオタキシンの注入による効果
（２）マウス・モデルにおける好酸球増加症に対する内生的エオタキシンの産生誘導による効果。
【０１５６】
第２の方法のために、ＣＡＴ−２１２／ＣＡＴ−２１３がマウス・エオタキシンを認識するかどうか決定することがまず必要であった。
【０１５７】
アッセイ・プロトコール
Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）を実施例６に記載のとおり準備した。アッセイ・バッファー中、非標識ヒトエオタキシンとマウス・エオタキシンの１１の連結的に３倍希釈し、そして３０pMの評価濃度で調製された 125Ｉ−エオタキシンと混合し、そして１００μｌを二重でウェルに加えた。そのプレートをシールし、そして室温で２時間インキュベートして、カウントし、そしてそのデータを実施例６に記載のとおり処理した。
【０１５８】
結果
マウス・エオタキシンへ結合するＣＡＴ−２１２についてのＩＣ50の評価は２９６nM（２の測定の平均値）である。そのデータを表６に示す。したがって、ＣＡＴ−２１２はマウス・エオタキシンを認識する。
【０１５９】
実施例９
カルシウム流動アッセイにおけるＣＡＴ−２１２の中和力価
序文
この機能的アッセイは、レセプターがそのリガンドに結合され、そして活性化された時に引き起こされる細胞内Ｃａ2+の上昇を計測するために設計される。この場合、ＣＣＲ３によりトランスフェクトされた細胞にＣａ2+感受性蛍光色素（ｆｌｕｏ−３ＡＭ）を加え、そして蛍光発光をＦＬＩＰＲを用いて経時的に観察した。ＦＬＩＰＲにより、各ウェル中の蛍光発光の計測を計画した間隔（１又は５秒毎）で実施し、そして試薬を各ウェルに同様に加えた。上記ＣＣＲ３レセプター結合エオタキシンにより誘導された細胞内Ｃａ2+濃度の上昇が計測され、そしてそれは蛍光発光の増加に比例する。ＣＡＴ−２１２のエオタキシンへの結合、そしてその中和を原因とするこの反応の阻害を定量化しうる。
【０１６０】
アッセイ・プロトコール
この実験に先立ち、２４時間、０．５μｇ／ml酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む通常培地を添加することによりＣＣＲ３細胞を活性化し、ＣＣＲ３発現を増加させることによりエオタキシンに対する応答の程度を増加させた。活性化ＣＣＲ３細胞をＰＲＭＩ  １６４０により２度洗浄し、次に新たに調製した２μＭ  ｆｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０３％プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、及び０．１％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中に４×１０6 細胞／mlで再懸濁した。次にその細胞を３７℃で４５分間インキュベートした。これに続き、それらをＲＰＭＩ  １６４０により１度洗浄し、そしてＦＬＩＰＲバッファー（１２５mM塩化ナトリウム、５mM塩化カリウム、１mM塩化マグネシウム、１．５mM塩化カルシウム、２５mM  Ｈｅｐｅｓ、５mMグルコース、及び０．１％  ＦＣＳ、pH７．４）により２度洗浄した。最終的にそれらを１×１０6 ／mlでＦＬＩＰＲバッファー中に再懸濁し、そして１００μｌを透明な底の９６ウェルのブロックした壁を持つプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移して１ウェル当たり１×１０5 細胞を得た。次にそのプレートを１０００rpm で５分間遠心分離し、均一で、比較的密度の高い、単層の細胞を得た。
【０１６１】
ＣＡＴ−２１２の希釈系列を終濃度の６倍で準備し（最終的に２００nM〜１．６nM）、そして等量の６０nMエオタキシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と一緒に室温で１０分間プレ・インキュベートした。全ての処置物を少なくとも二重で、９６ウェル・ポリスチレン・プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中にＦＬＩＰＲバッファーを用いて１００μｌの終量に調製した。上記細胞に接触するエオタキシンの終濃度は１０nMであった。
【０１６２】
上記ｆｌｕｏ−３添加細胞を含むプレートをＦＬＩＰＲに設置し、そして蛍光発光を最初の６０秒間に関しては１秒毎、その後終了まで５秒間隔の様式で読み取った。上記実験を室温で実施した。この実験のために、５０μｌの各処置物を１０秒の合間の後に全てのウェルに加えた。
【０１６３】
結果
この実験の結果を図７に示した。ＣＡＴ−２１２が、エオタキシンがＣＣＲ３細胞上のそのレセプターに結合することにより生じるＣａ2+流動の用量依存的阻害を示すことが考えられうる。図８は、このデータに関して５nMの概算のＩＣ50値を与える「上記曲線以下の面積」を示す。
【０１６４】
実施例１０
ヒト鼻腔ポリープに対するＣＡＴ−２１２の免疫応答性
序文
ヒト鼻腔ポリープは好酸球の浸潤により特徴づけられる炎症性組織である。エオタキシン発現は、鼻腔ポリープ中で上方調節されているとして立証されており、そしてエオタキシン・タンパク質は抗エオタキシン抗体を用いた免疫細胞化学により検出される（Ponath et al., 1996a )。したがって、ＣＡＴ−２１２をヒト鼻腔ポリープの切片を用いて免疫応答性について審査した。
【０１６５】
ＩＣＣのための組織の準備
ヒト鼻腔ポリープ組織サンプルを手術サンプルから得た。組織を５mm3 のぶつ切りに切断し、そして最適な切断組織化合物（ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ）の滴下を用いてコルク片の上に取り付けた。上記組織を冷凍するために、２０mlのイソプロパノールを液体窒素浴中で冷却し、そして上記の取り付けた組織を３０秒間浸した。次に凍結組織をクライオチューブに移し、そしてさらに３０秒間液体窒素中に浸した。組織ブロックを−７０℃で冷凍保存した。切片を切断するために、ＯＣＴ化合物をクライオスタット・チャック（ｃｒｙｏｓｔａｔ  ｃｈｕｃｋ）に適用し、そして上記凍結組織をはめ込んだ。次に上記チャック及び組織を液体窒素中で３０秒間急激に冷凍した。次にその組織をクライオスタット上に取り付け、そして各ヒト組織の５ミクロン凍結切片を顕微鏡用スライドの上に切断した。
【０１６６】
ＩＣＣのためのファージ抗体の準備
ファージ抗体クローンを実施例１に記載のとおり取り出した。ファージ含有上清をＩＣＣで使用する前に１％  ＢＳＡにより前もってブロックした。
【０１６７】
プロトコール
ヒト組織切片を環境温度で１５分間アセトン中に浸漬することにより固定し、風乾し、次にＰＢＳＴにより３回、（合計）１０分間洗浄した。試験ｓｃＦｖをＰＢＳＴ中に希釈し、そして上記切片に室温で２時間適用した。スライドをＰＢＳＴにより３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ中に１／１００に希釈したマウス９Ｅ１０抗体と一緒にインキュベートした。切片をＰＢＳＴにより３回洗浄し、そして供給されたＥｎＶｉｓｉｏｎ抗マウス・ペルオキシダーゼ重合体（ＤＡＫＯ  Ｋ４００６）中で３０分間インキュベートした。切片を再度ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、そして３−アミノ−９−エチル−カルバゾール・ペルオキシダーゼ基質（ＡＥＣ；Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。ＡＥＣ基質を、原液（ジメチルホルムアミド中に溶解された２．４mg／mlのＡＥＣ）を２０mM酢酸ナトリウム・バッファー、pH５．２中に１：１０に希釈し、そして０．１５％（ｖ／ｖ）の過酸化水素を加えることにより調製した。１００μｌのＡＥＣ基質溶液を各切片に加え、そして５〜１０分間インキュベートした、続いて０．１％  Ｔｗｅｅｎ含有生水により洗浄して発色を止めた。その後上記スライドを＜５秒間ヘマトキシリン（ＤＡＫＯ  Ｓ２０２０）により対比染色し、次に水により３回洗浄した。次に洗浄した切断を水性マウントによりコートし、そしてガラス・カバー片を適用した。
【０１６８】
結果
ヒト鼻腔ポリープの３０μｇ／mlでのＣＡＴ−２１２染色切片は、５０μｇ／mlでの陽性対照抗エオタキシン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について見られたものと同等の様式である。同じ濃度でも対照だけか又は関連性のないｓｃＦｖと一緒の上記基質による検出可能な染色は存在しなかった。ＣＡＴ−２１２は、被覆する上皮組織、並びに鼻腔ポリープのストロマ中に位置する細長くなった単核細胞及び内皮細胞における特異的な細胞質染色を示した。これは、鼻腔ポリープにおいて抗エオタキシン抗体により得られた公表されたＩＣＣ特徴（Ponath et al., 1996a）と一致する。その染色がエオタキシンに対して特異的であるか確認するために、競合ＩＣＣを行った、ここで４０μｇ／mlのＣＡＴ−２１２を、上記鼻腔ポリープ切片に添加する前に１３３μｇ／ml、６６０μｇ／ml、及び１．３３mg／mlエオタキシンに前もって結合させた。ＣＡＴ−２１２単独では上記のとおり良好な染色が得られた。ＣＡＴ−２１２をエオタキシンに前もって結合させた場合、それらは、１．３３mg／mlエオタキシンでは全ての特異的染色が実質的に消滅する状態の鼻腔ポリープへの結合の用量依存阻害であった。
【０１６９】
実施例１１
ＩｇＧ４様式（ＣＡＴ−２１３）へのＣＡＴ−２１２の変換
序文
上記ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−２１２）の完全な抗体（ＩｇＧ４；ＣＡＴ−２１３）様式への変換に使用されるベクターは以下のとおりであった：ｐＧａｍｍａ４（ＶH 発現ベクター）及びｐＭＲ１５．１（ＶL 発現ベクター）。これらのベクターの両方をＬｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得た。
【０１７０】
プロトコール
使用した全てのプライマーを表３に配列番号について言及する。上記ＶH ＤＮＡ及びＶL ＤＮＡをそれぞれオリゴヌクレオチドｐ１１３／ｐ１３２及びｐ１０９ａ／ｐ１１０ｂを用いてまず増幅した。全ての上記ＰＣＲ反応はその校正能力のためにＰｗｏＩポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＰＣＲ条件は９４℃、３０秒間；５０℃、３０秒間；７２℃、６０秒間の２５サイクルとした。ＶH 及びＶL の両方についてのシグナル配列をそれぞれｐ１０／ｐ１３２及びｐ１１／ｐ１１０ｂを用いて増幅することにより加えた。ＤＮＡのＶH 及びＶL 断片をそれらの受容ベクターと平行してそれぞれＨｉｎｄIII ，ＡｐａＩ及びＢｓｔＢＩ，ＢｓｉＷＩを用いて消化した。次に断片を一緒に連結し、よって個々のプラスミドを構築した。両プラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、そして一緒に連結して最終構築物を形成した。全ての制限消化及び連結をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの酵素を使用し、その業者により推奨されるバッファーを用いて実施した。
【０１７１】
上記ベクターの形質転換のために、エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（ＤＨ５α）を使用した。エレクトロポレーションを０．２cmギャップ・エレクトロポレーション・キュベットで行ない、そのキュベットの中で５μｌの連結ＤＮＡを１００μｌのＥ．コリに加えた。上記細胞に２００Ωで２．５kVのシングル・パルスを与え、続いて振とうインキュベーターにより３７℃で２ＴＹ中、２０分間の回復期間を与えた。アリコートを２ＴＹＡＧアガロース平板培地上に移し、そして３７℃で一晩インキュベートした。翌日、そのコロニーを採取し、Ｔａｑポリメラーゼと適当なプライマーを用いたＰＣＲにより選別した。
【０１７２】
正しいサイズの挿入物を有するクローンを１００mlの２ＴＹ（１００μｇ／mlアンピシリン含有）中、振とうインキュベーターにより３７℃で一晩育成した。その細胞を３，０００ｇで１５分間の遠心分離により採取し、そしてＱＩＡＧＥＮ  ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用してそのプラスミドＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡ濃度を、Ａ260 nmの１＝５０μｇ／mlと仮定し分光光度法で測定した。上記最終構築物をプライマーｐ２４，ｐ３４、並びにｐ３６及びｐ３７を用いて配列決定し、正確な配列を確認した。
【０１７３】
３６プレート・トランスフェクションをＮＳＯ細胞において、ｇｓシステム（Ｌｏｎｚａ）を使用したエレクトロポレーション（２５０Ｖ）により、選択可能なマーカーとしてグルタミン合成酵素遺伝子を用いて実施した。野生型ＮＳＯ細胞を２mMグルタミンを伴う１０％透析ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で育成した。６×１０7 ＮＳＯ細胞を、ＰｖｕＩにより直鎖にした３００μｇのＤＮＡによりトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、その細胞をグルタミンを含むＤＭＥＭ中に再懸濁し、そして３６×９６ウェル・プレート（５０μｌ／ウェル）に移し、そして５％  ＣＯ2 中、３７℃でインキュベートした。翌日、１５０μｌ／ウェルの選択培地（グルタミン不含ＤＭＥＭ）を加えた。約３週間後、そのコロニーを陰性対照として関連性のない抗体を用いたＥＬＩＳＡ（以下を参照のこと）により選別した。＞２０μｇ／ml生産する全てのコロニーを２４ウェルプレートで増殖させ、次に二重でＴ２５フラスコで増殖させた。一方のフラスコを飽和まで育成し、そして他方を冷凍した。４Ｂ７と称する第１の細胞株（クローンでない）を血清不含培地に適合させ、そしてプロテインＡを用いた精製のために２Ｌの容量まで増殖させた。
【０１７４】
ＩｇＧ発現を検出するための選別ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４，Ｄｙｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各ウェルを１００μｌの５０mM重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム・バッファー、pH９．６中、１μｇ／mlヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈａｒｌａｎ）により４℃で一晩コートした。プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ／０．０５）により３回洗浄した。ＣＡＴ−２１３をＰＢＳＴ／０．０５中で希釈し、２倍希釈系列をそのプレートの中に作り出した。そのプレートを室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴ／０．０５により３回洗浄した。ＰＢＳＴ／０．０５中に希釈した１：５０００  ＨＲＲ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈａｒｌａｎ）１００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳＴ／０．０５により３回洗浄した。これに続き、１００μｌの新たに調製したＨＲＰ基質バッファー（使用直前に加える５μｌ  Ｈ2 Ｏ2 ／５０mlバッファーを含有する２４mMクエン酸、５２mMリン酸水素ナトリウム、pH５．２中、０．４mg／ml  ｏ−フェニレンジアミン）を各ウェルに加えた。５〜１０分後、上記反応を５０μｌの１２．５％硫酸の添加により止めた。Ａ490 を計測した。
【０１７５】
最初に上記選別ＥＬＩＳＡにおいて強いシグナルによって示された大量のＩｇＧを発現する上記細胞株を増殖のために選んだ。これはその９６ウェル・プレートからＴ７５フラスコまでの増殖を伴った。次にこの細胞株を、時間ごとに血清を半分に減らす（血清の開始割合は１０％である）連続的な希釈を含め無血清培地（Ｌｏｎｚａ  ＮＭ２）に適合させた。一旦無血清培地に適合すれば、次に上記細胞株を１５０mlフラスコ中で飽和状態まで育成し、そして１０％未満の細胞生存で採取した。その上清を遠心分離により清澄にし、次に０．２２μｍフィルターを通してろ過した。上記抗体をその上清からプロテインＡアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０１７６】
抗エオタキシン特異的なＩｇＧを検出するための結合アッセイ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４，Ｄｙｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各ウェルを、１００μｌの５０mM重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム・バッファー、pH９．６中、０．５μｇ／mlエオタキシン（Ａｌｂａｃｈｅｍ）により４℃で一晩コートした。このプロトコールの残りの部分は選別アッセイと同じである（先の項を参照のこと）。関連性のない対照抗体を含めて結果を図９に示す。
【０１７７】
実施例１２
エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価
アッセイ・プロトコール
ＣＡＴ−２１３の力価を原則的に実施例２に記載のとおり走化作用アッセイで試験した。試験に先立ち、ＣＡＴ−２１３をプロテインＡアフィニティー・カラム（実施例１１のとおり）を用いて上記上清から精製した。プロテインＡ精製ＣＡＴ−２１３についての典型的な希釈範囲は、アッセイ・バッファー中、１００nM〜０．０３nMであった。
【０１７８】
結果
このアッセイの結果を図３に示す。ＣＡＴ−２１３はＣＣＲ３トランスフェクトＬ１．２細胞のエオタキシン仲介走化作用を７００＋３５０pMのＩＣ50で阻害した。この力価はこのアッセイにおいてＣＡＴ−２１２について見られたものに類似している。
【０１７９】
実施例１３
ＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンに関するＣＡＴ−２１３競合アッセイ
アッセイ・プロトコール
上記Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アッセイを原則的に実施例６に記載のとおり実施した。Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）を４０nMのＣＡＴ−２１２によりコートした。ＣＡＴ−２１２，ＣＡＴ−２１３、及びエオタキシンをアッセイ・バッファー中に希釈し、そして５０μｌをウェルに加え、続いて５０μｌの６０pM［ 125Ｉ］エオタキシンを加えた。
【０１８０】
結果
このアッセイにおいてＣＡＴ−２１３のＩＣ50は５９．３pM（４の測定の平均、図４）である。これは上記ＣＡＴ−２１２のｓｃＦｖについて得られた値に類似している。
【０１８１】
実施例１４
アレルギー性炎症のインビボ・モデルにおけるＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３の効果
アレルギー性炎症の空気嚢モデルを好酸球増加症を研究するために好都合なモデルとして選んだ。デキサメサゾン（ステロイド系抗炎症薬）はこのモデルにおいて空気嚢への好酸球の動員の阻止することが示されている（Das et al., 1997を参照のこと）。他の抗エオタキシン抗体は、（すでに先に議論された）インビボ・モデルの範囲で好酸球の動員を阻止することがすでに示されている、上記モデルにおいて、好酸球増加症をオブアルブミン感作動物におけるエオタキシンの局所投与により刺激したか、あるいはオブアルブミン（抗原）免疫により誘発した。
【０１８２】
ＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の効果をオブアルブミン感作マウスにおける空気嚢モデルで調べた、ここで好酸球増加症を空気嚢内（ｉ．ｐｏ．）投与された組換えヒト・エオタキシン又はオブアルブミンのいずれかにより誘発した。
【０１８３】
方法
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１７〜２１ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｕ．Ｋ．又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒにより供給された）をＢａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ）で小動物柵ユニットの中に収容した。マウスを１ケージに３匹収容し、そのケージは１２時間の昼／夜サイクル（午前７時に点灯）である。動物を実験前の少なくとも２週間その動物小屋に馴化させ、そして飼料と水を自由摂取させた。
【０１８４】
感作をDas et al., 1997により報告されたとおり実施した。簡単に言うと、マウスを１日目と８日目に１００ｇの水酸化アルミニウム・ゲル中オブアルブミン（３．３mg水酸化アルミニウム含有０．４mlの生理食塩水；再水和ゲル）の皮下（ｓ．ｃ．）注入によりオブアルブミンに対して感作した。１の空気嚢をDas et al., 1997によりすでに報告されている方法で上記マウスの背中に形成した。９日目、マウスをイソルレンにより麻酔し、そして２．５mlの無菌空気（０．２５μｍろ過）を各マウスの背中に皮下注入した。１２日目、マウスにさらに２．５mlの無菌空気を注入して上記空気嚢を再び膨らませた。１５日目、マウスをエオタキシン又はオブアルブミンのいずれかにより免疫した。
【０１８５】
ヒト・エオタキシン免疫手順
実験に先立ち、ｉ．ｐｏ．投与されたヒト組換えエオタキシン（Ａｌｂａｃｈｅｍ）がオブアルブミン感作マウスにおいて好酸球増加症を再現しうることを明らかにした。ヒト・エオタキシン投与の３０分前、組換えマウスＩＬ−５（ＩＬ−５；１００pmol  kg-1）を静中（ｉ．ｖ．）注入して好酸球の循環プールを増加させた（Collins et al., 1995を参照のこと）。６時間後、ヒト・エオタキシン（１μｇ、０．５ml  ｉ．ｐｏ．）は生理食塩水（０．５ml  ｉ．ｐｏ．）に比べ上記空気嚢への好酸球動員の明らかな増加を引き起こした（エオタキシン５．３±１．１、生理食塩水１．２±０．３好酸球×１０5 ；ｎ＝６、Ｐ＜０．０１マンホイットニー検定）。さらなる実験において、１００pmol  kg-1のＩＬ−５（ｉ．ｖ．）、並びに１μｇのヒト・エオタキシン（ｉ．ｐｏ．）を使用し、そしてエオタキシン投与後６時間に計測を行った。生理的食塩水によってのみ処理された対照群をも基礎細胞流入を得るために全ての実験の中に含んだ（シャム免疫群）。
【０１８６】
オブアルブミン免疫手順
オブアルブミンの免疫用量をオブアルブミン感作マウスにおける試験的な実験の系から決定した。最初の実験において、１００μｇでなく１及び１０μｇのオブアルブミン（０．５ml、ｉ．ｐｏ．）が２４時間後に溶媒処理動物（０．５mlの生理食塩水、ｉ．ｐｏ．）に比べて顕著な好酸球動員を引き起こすことを示した。１０μｇのオブアルブミンが最も再現性のある応答を生じたので（オブアルブミン６．４±１．１、生理食塩水１．４６±０．２３好酸球×１０5 ；ｎ＝６、Ｐ＜０．０１、ダネット検定による分散分析）、この用量をこれ以降経時的実験に使用した。この実験において、マウスは生理的食塩水又は１０μｇのオブアルブミンのいずれかを受け（ｉ．ｐｏ．）、そして細胞流入を免疫後２〜７２時間の間評価した。６時間の時点を、好酸球（並びに細胞合計）の上記空気嚢への流入がこの時に最大となったとして選んだ（オブアルブミン５．４±１．４、生理食塩水１．１±０．２好酸球×１０5 ；ｎ＝５〜６）。全てのこれに続く実験において、１０μｇのオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）を投与し、そして６時間で計測を行った。生理食塩水のみで免疫した対照群をも基礎細胞流入を得るために全ての実験に含んだ（シャム免疫群）。さらに、オブアルブミン感作動物において、オブアルブミン免疫（１０μｇ  ｉ．ｐｏ．）を受けてマウス・エオタキシン・レベルを高めることを示した（生理食塩水対照９３±１２、オブアルブミン免疫３５３９±３７２pg  ml-1；ｎ＝８〜９、Ｐ＜０．００１、マンホイットニー検定）。
【０１８７】
薬剤投与
全身的なＩｇＧ抗体処理（ＣＡＴ−２１３，ＣＡＴ−００１（無ＩｇＧ処理）又は抗マウス・エオタキシンＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））をヒト・エオタキシン又はオブアルブミンの投与３０分前に静中により行った。ＣＡＴ−２１２，ＣＡＴ−１７１（無ｓｃＦｖ対照）又はＣＡＴ−２１３により局所的な空気嚢内処理をヒト・エオタキシン又はオブアルブミンの投与と同時に行った。溶媒対照群を全ての抗体実験に含め、そしてこれらのマウスはＰＢＳの投与を受けた。全ての静中注入を１００μｌの容量で尾静脈を介して行ない、そして全てのｉ．ｐｏ．注入を０．５mlの総量で行った。
【０１８８】
結果の定量化
マウスを、ＣＯ2 窒息、あるいは血漿サンプルを必要とする場合には過剰量のペントバルビタール・ナトリウムに続けて心臓穿刺することにより洗浄前に屠殺した。その空気嚢を５Ｕml-1ヘパリン含有氷冷ＰＢＳ（１ml；カルシウム又はマグネシウム不含；Ｓｉｇｍａ）により洗浄し、そして氷中に保存した。洗浄液のアリコート（１０μｌ）を総細胞の評価（高速読み取り、使い捨て細胞カウンター、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ）のために取り出し、そして１００，０００細胞を含むさらなるサンプルをサイトスピン調製のために取り出した。残った洗浄液を１０００ｇで５分間遠心分離し、次にその上清をアリコートにし、そして−７０℃で保存した。上記の細胞ペレットを再懸濁し、そしてサイトスピンを調製し、風乾し、そして示差的に細胞をカウントするためにライト染色（Ｗｒｉｇｈｔｓ  ｓｔａｉｎ）により染色した。ある場合に、上記洗浄上清をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりエオタキシンについてアッセイした。
【０１８９】
示される全ての結果は平均±ＳＥである。細胞流入データを空気嚢当たりの細胞数として表すか、あるいは薬剤処理について、好酸球流入の阻害％として表した。好酸球流入の阻害％を以下の方程式を用いて各処理群について細胞数データから計算した：
【０１９０】
【数１】
0005198704.tif 000004
【０１９１】
次に各処理群について平均±ＳＥを計算した。
【０１９２】
大部分の生データをダンネットによる分散分析により統計学的に分析した。ステューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定をも使用した。全ての統計学的分析をＩｎｓｔａｔソフトウェアを用いて実施し、そしてＰ＜０．０５の時、平均値の間の差を有意と解釈した。
【０１９３】
結果
エオタキシンｉ．ｐｏ．により処理したマウスにおけるＣＡＴ−２１２又はＣＡＴ−２１３の効果
ＣＡＴ−２１２（０．０００５，０．００５、＆  ０．０５mg  kg-1  ｉ．ｐｏ．）は、ＩＬ−５処理オブアルブミン感作マウスにおいてヒト・エオタキシン（１ｇ；ｉ．ｐｏ．）により引き起こされた好酸球増加症を有意して減じた（それぞれ３２，７９、及び９５％阻害；ｎ＝８）（図１０）。ＣＡＴ−１７１効果をもたない対照ｓｃＦｖ（０．０５ｇ  kg-1  ｉ．ｐｏ．）は好酸球動員に効果がなかった（−５±１５％阻害；ｎ＝８）。
【０１９４】
ヒト・エオタキシン（１μｇ、ｉ．ｐｏ．）と同時にｉ．ｐｏ．投与したＣＡＴ−２１３（０．００１，０．０１，０．１，＆  １mg  kg-1、ｎ＝７〜８）は、好酸球増加症の用量相関阻害能力を生じた（図１０）。
【０１９５】
全てのＣＡＴ−２１３用量が有効であり、そして９４％の最大阻害を１μｇ  kg-1でのＣＡＴ−２１３により観察した。ＣＡＴ−００１、１μｇ  kg-1は細胞流入にわずかに効果があった（７±１％阻害、ｎ＝８）。
【０１９６】
ヒト・エオタキシン（１μｇ）のｉ．ｐｏ．注入３０分前にｉ．ｖ．投与したＣＡＴ−２１３（０．０１，０．１，１，＆  １０mg  kg-1）は、ＩＬ−５処理オブアルブミン感作マウスにおいて好酸球動員の有意な用量依存的阻害（それぞれ、４６，７３，７９，＆  ９１％、ｎ＝８）を生じた（図１０）。ＣＡＴ−００１対照ＩｇＧ４（１０mg  kg-1）は好酸球動員に有意に影響しなかった（８±１％阻害、ｎ＝８）。
【０１９７】
よって、ＣＡＴ−２１３の空気嚢内投与は、インビボにおいて好酸球増加を抑制するその能力においてＣＡＴ−２１２と等しい効力を持つ（ＣＡＴ−２１３及びＣＡＴ−２１２の両者についてのＥＤ90は約１×１０-9mols  kg-1である）。ＣＡＴ−２１３及びＣＡＴ−２１２はヒト・エオタキシンの中和によりインビボにおける好酸球増加を妨げる；これらの抗体は、インビトロにおける走化作用アッセイ（実施例１２を参照のこと）において比較した時にヒト・エオタキシンに対して類似の中和力価を持つことがすでに示されている。ＣＡＴ−２１３もｉ．ｖ．投与の後に好酸球動員を抑制する（ＣＡＴ−２１２はｉ．ｖ．で試験しなかった）。しかしながら、ＣＡＴ−２１３は、局所的に与えられた時に好酸球増加を減少させる、ヒト・エオタキシンのより強力な阻害剤である（ｉ．ｐｏ．投与のＣＡＴ−２１３はｉ．ｖ．投与に比べて約１０倍強力である；図１０）。
【０１９８】
オブアルブミンｉ．ｐｏ．処理動物におけるＣＡＴ−２１３の効果
ＣＡＴ−２１３（０．０１，０．１，１，＆  １０mg  kg-1、ｎ＝７〜８）ｉ．ｐｏ．は用量依存的にオブアルブミンにより増加した好酸球動員を阻害した。ＣＡＴ−２１３とオブアルブミンを同時に投与した。０．１mg  kg-1及び１０mg  kg-1のＣＡＴ−２１３はそれぞれ６０％及び９７％阻害を生じた。ＣＡＴ−２１３  ｉ．ｐｏ．はその空気嚢への単核細胞流入をも阻害したが、しかし好中球動員には顕著に影響しなかった（表２）。ＣＡＴ−００１、１０mg  kg-1  ｉ．ｐｏ．は細胞流入にわずかに効果があった（好酸球流入の阻害は−２０±１８％であった、ｎ＝８）。
【０１９９】
ｉ．ｖ．投与したＣＡＴ−２１３はオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）により誘発した好酸球動員を有意に阻害した。オブアルブミンの３０分前に与えたＣＡＴ−２１３（０．０１，０．１，１，＆  １０mg  kg-1  ｉ．ｖ．、ｎ＝８）は６時間目で好酸球増加を阻止した。１及び１０mg  kg-1は、それぞれ５６及び８５％までの好酸球動員の有意な阻害を生じた。０．０１及び０．１mg  kg-1のＣＡＴ−２１３、並びに１０mg  kg-1のＣＡＴ−００１（効果のない抗体対照）は不活性であった（図１９；ＣＡＴ−００１阻害１４±１４％、ｎ＝８）。（ＣＡＴ−００１でなく）ＣＡＴ−２１３  ｉ．ｖ．はその空気嚢へのオブアルブミン誘発好中球及び単核細胞動員の用量依存的阻害を生じた（表２）。
【０２００】
同様に、上述のデータは、ＣＡＴ−２１３を空気嚢に局所的に与えた時、好酸球増加のより強力な阻害物質であることの兆候を示している（ｉ．ｖ．投与よりも約１０倍強力である；図１９）。しかしながら、ＣＡＴ−２１３の局所（ｉ．ｐｏ．）投与ではなく全身（ｉ．ｖ．）投与は好中球流入を阻止する能力を持つ。ＣＡＴ−２１３の全身及び局所投与は共に単核細胞の走化作用を阻害しうる。
【０２０１】
別個の実験において、抗マウス・エオタキシンＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の全身（ｉ．ｖ．）投与の効果をオブアルブミン（ｉ．ｐｏ．）免疫マウスにおいて調べ、比較データを提供した。抗マウス・エオタキシン（０．０５、０．５，＆  ５mg  kg-1、ｎ＝７〜８）は好酸球動員の用量依存的阻害を生じた（それぞれ、１４，３７，＆  ６７％）。よって、ＣＡＴ−２１３及び抗マウス・エオタキシンＩｇＧ２Ａは、応答の程度及び力価の両方において好酸球走化作用に対して類似の阻害を生じた（図１９）。
【０２０２】
まとめ
まとめれば、上記ヒト抗エオタキシン抗体、ＣＡＴ−２１２（ｓｃＦｖ）、及びＣＡＴ−２１３（ＩｇＧ４）はアレルギー性炎症のインビボ・モデルにおいて好酸球増加を強力に阻止する。ＣＡＴ−２１３は、局所的及び全身的のいずれで与えられた場合でも有効である。ＣＡＴ−２１３の全身的投与は好中球、並びに単核細胞の走化作用を阻止する付加的な作用を持つ。これらのデータは、インビボでのエオタキシンへの生物学的応答の阻止におけるＣＡＴ−２１３及びＣＡＴ−２１２の作用と一致する。
【０２０３】
実施例１５
Ｌ１．２  ＣＣＲ−３トランスフェクト細胞を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価：アカゲザル及びマウス・エオタキシン
アカゲザル及びマウス・エオタキシンを中和するＣＡＴ−２１３の能力を原則的に実施例２に記載のとおりの走化作用アッセイにより評価した。
【０２０４】
アッセイ・プロトコール
従ったアッセイ・プロトコールは実施例２について記載されたものと原則的に同じであった。走化作用をアカゲザル・エオタキシン又はマウス・エオタキシンのいずれかにより高めた。アカゲザル（１２５ng／ml）又はマウス（５０ng／ml）エオタキシンをトランスウェル培養システムの下部チャンバー中でインキュベートし、その後、それぞれ１×１０6 又は２×１０6 のＬ１．２−ＣＣＲ３細胞を上記トランスウェルの上部チャンバーに加えた。遊走細胞をＦＡＣＳ分析により定量化し、そして１分間速い流速でカウントした。
【０２０５】
結果
ＣＡＴ−２１３は、Ｌ１．２−ＣＣＲ３細胞のアカゲザル、及びマウス・エオタキシン仲介走化作用を阻害し、それぞれ３．０３×１０-7Ｍ（１．０１×１０-7、９．０１×１０-7Ｍ）及び２．６３×１０-6Ｍ（１．３０×１０-6、５．３４×１０-6Ｍ）の幾何平均ＩＣ50及び９５％信頼区間値を有する（図１２）。上記データはそれぞれ三重及び二重で実施された少なくとも３の実験を表す。
【０２０６】
実施例１６
ヒト好酸球を用いたエオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価
走化作用アッセイは、エオタキシンのＣＣＲ３発現細胞の化学遊走を誘発する能力を評価するためインビトロ・アッセイ系と関連がある。この場合、上記ＣＣＲ３発現細胞が血液から直接得られたヒト好酸球であるためこれらの実験では生理学的関連性が増加している。
【０２０７】
好酸球の調製
好酸球を、アレルギー性疾患の症状を持たないアトピーの、喘息を持たない患者のヘパリン化末梢血から単離した。血液を１／５量のデキストラン溶液（生理食塩水中、６％ｗ／ｖ）と混合し、そして赤血球を室温で４５分間沈殿させた。上記赤血球除去血漿をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）上に重ね、そして８００ｇ、２０℃で２５分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離した。
【０２０８】
顆粒球ペレットの残留赤血球を２回の低張溶解により除去し、その後好中酸を抗ＣＤ１６コート超常磁性マイクロビーズ（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；３×１０6 顆粒球当たり２μｌのビーズ）と一緒に０℃で３０分間インキュベートすることにより標識した。次に上記細胞を強磁場中で１０mlスチール・ウール・カラムに流し、そして標識されていない細胞をカラムの４倍量の氷冷標識バッファー（ＰＢＳ、２×１０-3Ｍ  ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）により抽出した。その抽出細胞は常に＞９５％好酸球であった。
【０２０９】
アッセイ・プロトコール
好酸球を１×１０-2Ｍ  ＨＥＰＥＳ及び０．３％ｗ／ｖ  ＢＳＡを添加したＨＢＳＳ中に再懸濁し、そして走化作用アッセイに使用する前に３７℃／５％  ＣＯ2 で少なくとも４５分間インキュベートした。サンプル（培地又は１×１０-8Ｍヒト・エオタキシン、プラス又はマイナスＣＡＴ−２１３又はＣＡＴ−００１（対照抗体））を４８ウェル・マイクロ走化作用・チャンバーの下部ウェルに加えた。
【０２１０】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）不含ポリカーボネート膜フィルター（８μｍポアサイズ）を下部ウェルと上部ウェルの間に配置し、そしてそのチャンバーを３７℃／５％  ＣＯ2 で３０分間インキュベートした。次に細胞をその上部ウェルに加え、そしてそのチャンバーを３７℃／５％  ＣＯ2 でさらに６０分間インキュベートした。この期間終了後、遊走しなかった細胞を上記フィルターの上面からはがした；上記フィルターを乾燥させ、メタノールにより固定し、そしてＭａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａを用いて染色した。遊走細胞を各サンプルについて５倍の高倍率（×４００）視野中でカウントした。
【０２１１】
結果
三重のポイントで実施した３の別個の実験の結果を図１３（平均±ＳＥＭ）に示す。ＣＡＴ−２１３は、ヒト好酸球のエオタキシン仲介走化作用を１．５３×１０-9Ｍ（３．０９×１０-11 、７．５４×１０-8Ｍ）の幾何平均ＩＣ50及び９５％信頼区間で阻害した。ＣＡＴ−００１（対照抗体）は走化作用に影響しなかった。したがって、ＣＡＴ−２１３はヒト好酸球のエオタキシン誘発走化作用を中和する。
【０２１２】
実施例１７
エオタキシン仲介好酸球形状変化アッセイにおけるＣＡＴ−２１３の中和力価  形状変化は走化作用において必須の過程であり、そして将来的な遊走応答の徴候と考えられる。好酸球がエオタキシン勾配への応答により血液循環から組織へ移動するために、細胞骨格成分の再組織化が起こらなくてはならない。この再組織化は細胞形態学における特有の変化を伴い、これは前方散乱（ＦＳＣ）への変化としてフローサイトメーターにおいて可視化される。この実施例において使用したアッセイはSabroe et al (1999）により記載された方法を使用する。
【０２１３】
アッセイ・プロトコール
以下のとおりに得られた顆粒球調製物を用いて実験を実施した。末梢血をＥＤＴＡ（１０mlの血液当たり１５０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）を含むシリンジ内に採取し、そして１０mlの血液当たり１mlの、０．９％生理食塩水中６％デキストラン−Ｔ５００の追加により赤血球を沈殿させた。沈殿を室温で４０分間起こした。次にその赤血球除去血漿を不連続７０％〜８０％パーコール勾酸上に重ね、そして１１３７ｇ、室温で２０分間遠心分離して顆粒球から単核細胞を分離した。得られた顆粒球層をＰＢＳにより洗浄し、次に３０６ｇ、室温で５分間遠心分離してペレットにした。次にその細胞ペレットを形状変化バッファー（ＰＢＳ、１×１０-3Ｍ  ＣａＣｌ2 、１×１０-3Ｍ  ＭｇＣｌ2 、１×１０-2Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１×１０-2Ｍグルコース、０．１％  ＢＳＡ、pH７．３）中に再懸濁した。次に細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２１４】
３×１０-9Ｍエオタキシン又はバッファー、プラス又はマイナスＣＡＴ−２１３又はＣＡＴ−００１（対照）を３００μｌの容量でポリプロピレン・フローサイトメーター用試験管に加えた。（１００μｌで）５×１０5 細胞を各試験管に加えた。次に試験管を３７℃で７分間すみやかにインキュベートし、その後氷冷浴に移した。最後に２５μｌのＣｅｌｌｆｉｘバッファー（１０×）を加え、そして個々の試験管をフローサイトメーターで読み取った。好酸球をＦＬ２チャンネルを用いてそれらの自己蛍光により同定した。次にＦＳＣを評価した。
【０２１５】
結果
このアッセイの結果を図１４に示す。ＣＡＴ−２１３はヒト・エオタキシンによりヒト好酸球に惹起した形状変化を阻害し、７．１４×１０-10 Ｍ（２．０７×１０-10 、２．４４×１０-9Ｍ）の幾何平均ＩＣ50及び９５％信頼区間を持つ。データを、別個の提供者からの細胞を用いた二重のポイントにより実施した５の実験からの平均±ＳＥＭとして表す。
【０２１６】
【化３】
0005198704.tif 000005
【０２１７】
【化４】
0005198704.tif 000006
【０２１８】
【化５】
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【０２１９】
【表１】
0005198704.tif 000008
【０２２０】
【表２】
0005198704.tif 000009
【０２２１】
【表３】
0005198704.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】  上記エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるｓｃＦｖ  ３Ｇ３の中和力価を示す。データは２の独立実験の標準誤差範囲を伴う平均を表す。最大走化作用は５０ng／mlヒト・エオタキシンに対する応答において下部チャンバーへ遊走した細胞数である。ｓｃＦｖ  ３Ｇ３に関するＩＣ50は８００nMである。
【図２】  試験した他の関連する又は関連しない抗原のいずれについてもバックグラウンド（ＰＢＳ）を越えるシグナルを持たないＣＡＴ−２１２の特異性ＥＬＩＳＡを示す。弱いシグナルがマウス・エオタキシンに対して観察された。
【図３】  エオタキシン仲介走化作用アッセイにおけるＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３の中和力価を示す。
【図４】  競合アッセイにおけるＣＡＴ−２１２のＩＣ50を説明する。
【図５】  エオタキシンに対するＣＡＴ−２１２の親和性の決定に使用したＣＡＴ−２１２に結合するエオタキシンのスキャッチャード・プロットを示す。
【図６】  ＣＡＴ−２１２への結合に対するマウス・エオタキシンの競合を説明する。
【図７】  エオタキシンにより誘発した細胞内Ｃａ2+濃度の上昇のＣＡＴ−２１２による中和を示す。１０nMエオタキシン＋／−  ＣＡＴ−２１２（ＣＡＴ−２１２の濃度は警告文中に示した）の追加に対する応答における蛍光発光の変化をＦＬＩＰＲにより経時的に計測した。対照はバッファーのみの追加である。Ａｂだけの追加では蛍光発光は有意に変化しない。エオタキシンについて三重のウェル、そして各抗体濃度について二重のウェルの平均を示す。
【図８】  １２ｓ〜１００ｓまでのデータについて計算した、カルシウム流動アッセイにおけるＣＡＴ−２１２に関するデータの曲線下の面積を示す。Ｙ軸上の孤立したポイントはエオタキシンのみである。エオタキシンについて三重のウェル、そして各抗体濃度について二重のウェルの平均及び標準偏差を示す。
【図９】  ＣＡＴ−２１３のヒト・エオタキシンへの結合特異性を証明する。
【図１０】  ＩＬ−５により処理したオブアルブミン感作マウスの空気嚢へのヒト・エオタキシン誘発好酸球動員に対するＣＡＴ−２１２及びＣＡＴ−２１３の効果を示す。ＣＡＴ−２１２をｉ．ｐｏ．投与したのに対してＣＡＴ−２１３を別々の実験においてｉ．ｐｏ．及びｉ．ｖ．の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的な細胞カウント・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施により統計的に評価した。 *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１はヒト・エオタキシン免疫ＰＢＳ対照動物（＝０％阻害；ｎ＝７〜８）との比較による。各ポイントは平均値を表し、そしてその垂直なバーはＳＥを示す。空気嚢に局所的に投与されたＣＡＴ−２１３又はＣＡＴ−２１２は好酸球増加の用量相関阻害を引き起こした。全身的に与えられたＣＡＴ−２１３は好酸球の走化作用をも有意に阻害した。
【図１１】  オブアルブミン感作マウスの空気嚢へのオブアルブミン誘発好酸球動員に対するＣＡＴ−２１３の効果を説明する。別々の実験においてＣＡＴ−２１３をｉ．ｐｏ．及びｉ．ｖ．の両方で投与した。抗体処理の効果を、示差的な細胞カウント・データを用いてダンネット検定による一元配置分散分析の実施により統計的に評価した。 *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１はオブアルブミン免疫ＰＢＳ対照動物（＝０％阻害；ｎ＝７〜８）との比較による。各ポイントは平均値を表し、そしてその垂直なバーはＳＥを示す。上記空気嚢に局所的に投与されたか又は全身的に与えられたＣＡＴ−２１３は好酸球増加の強力な用量相関阻害を引き起こした。好酸球動員に対する抗マウス。エオタキシンＩｇＧ２Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｍＡｂ）のｉ．ｖ．投与の効果を比較のために示す。
【図１２】  Ｌ１．２−ＣＣＲ３細胞のアカゲザル・エオタキシン及びマウス・エオタキシン誘発走化作用に対するＣＡＴ−２１３の効果を説明する。データは、それぞれ三重又は二重で実験した少なくとも３の実験からの平均±ＳＥＭで表す。
【図１３】  ヒト末梢好酸球のヒト・エオタキシン誘発走化作用のＣＡＴ−２１３による中和を示す。データは、三重のポイントで実施した３の実験からの平均±ＳＥＭで表す。
【図１４】  ＣＡＴ−２１３がヒト好酸球のエオタキシン仲介形状変化を阻害したことを示す。ＣＡＴ−００１（対照抗体）は不活性であった。データは、二重のポイントで実施した５の実験からの平均±ＳＥＭで表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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