(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩を含有することを特徴とするイノシシ科動物用抗口蹄疫ウイルス剤。
【請求項２】
イノシシ科動物がブタである請求項１記載の抗口蹄疫ウイルス剤。
【請求項３】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩を含有することを特徴とするイノシシ科動物用飼料。
【請求項４】
イノシシ科動物がブタである請求項３記載の飼料。
【請求項５】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩の有効な量を、イノシシ科動物に投与することを特徴とするイノシシ科動物の口蹄疫の処置方法。
【請求項６】
処置方法が予防または治療方法である請求項５記載の方法。
【請求項７】
イノシシ科動物がブタである請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩を含有することを特徴とするヒツジ用抗口蹄疫ウイルス剤。
【請求項９】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩を含有することを特徴とするヒツジ用飼料。
【請求項１０】
３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミドまたはその塩の有効な量を、ヒツジに投与することを特徴とするヒツジの口蹄疫の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−ピラジンカルボキサミド（以下、Ｔ−１１０５と称する。）またはその塩を含有するイノシシ科動物またはヒツジ（以下、イノシシ科動物等と称する。）用抗口蹄疫ウイルス剤、Ｔ−１１０５またはその塩を含有するイノシシ科動物等用飼料およびイノシシ科動物等の口蹄疫の予防または治療方法などの処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫は、飼育動物であるウシ、ブタおよびヒツジ等の偶蹄類動物に伝染力が強い病気の一つであり、家畜の発育障害、運動障害等を引き起こし、家畜の商品価値を急落させるヒト非感染性で家畜特異性の感染症である。口蹄疫は、世界の畜産業にとって、輸出入国のいずれの立場でも、最も警戒すべき重要な家畜伝染病に位置付けられている。
口蹄疫は、国際伝染病であり、現在もアジア、アフリカおよび南アメリカなど世界各地に広く流行している。日本においても２０００年に口蹄疫が発生した。一旦、口蹄疫が発生すると、口蹄疫ウイルスの伝染性が極めて強いため、伝播を防ぐには多大な困難を伴う。口蹄疫が一旦発生すると畜産業への打撃は極めて大きい。そのため、世界的に口蹄疫の予防および治療などの処置に多大の努力が払われている。【０００３】
口蹄疫の対策は、厳しい輸入規制、衛生管理、検疫の実施および罹患動物の屠殺であり、大流行時には国、地域レベルまたは病気発症の周辺区域において予防手段としての不活化ワクチンを用いた予防接種プログラムが実施される。しかしながら、口蹄疫は早期発見が難しく、非常に速い速度で伝播し、ワクチン接種が追いつかない。さらにウイルスは、変異が起こりやすいため、ワクチンの接種のみでは感染を完全に防ぐことができない。すなわち、現在、偶蹄目であるイノシシ科動物等に対する優れた口蹄疫の治療方法は、存在しない。
国際公開第００／１０５６９号パンフレットには、Ｔ−１１０５が優れた抗インフルエンザウイルス作用を有することが記載されている（特許文献１）。しかしながら、イノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤およびイノシシ科動物等の口蹄疫の予防または治療方法などの処置方法については具体的に開示されていない。【０００４】
【特許文献１】国際公開第００／１０５６９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
優れたイノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤およびイノシシ科動物等の口蹄疫の予防または治療方法などの処置方法が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況下、本発明者は、鋭意検討を行った結果、Ｔ−１１０５またはその塩を含有する抗口蹄疫ウイルス剤が、イノシシ科動物において強い口蹄疫治療効果を有し、イノシシ科動物の口蹄疫の治療などの処置に有用であることを見出し、本発明を完成した。
さらに、Ｔ−１１０５またはその塩を含有する抗口蹄疫ウイルス剤が、ヒツジにおいて強い口蹄疫治療効果を有し、ヒツジの口蹄疫の治療などの処置に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００７】
Ｔ−１１０５またはその塩を含有する抗口蹄疫ウイルス剤は、イノシシ科動物等の口蹄疫の予防または治療などの処置に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、特に断らない限り、Ｔ−１１０５またはその塩において、溶媒和物および水和物が存在する場合、これらの溶媒和物および水和物も使用することができる。また、種々の形状の結晶も使用することができる。【０００９】
Ｔ−１１０５の塩としては、通常知られているヒドロキシル基における塩を挙げることができる。ヒドロキシル基における塩としては、たとえば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。上記の塩の中で、好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられ、ナトリウムとの塩が、より好ましい。【００１０】
本発明のＴ−１１０５またはその塩を含有するイノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤は、アフトウイルス属に属する口蹄疫ウイルスに対して優れた抗ウイルス作用を示す。口蹄疫ウイルスとしては、たとえば、血清型が、Ａ、ＯおよびＣのヨーロッパ型；血清型が、Ａｓｉａ１のアジア型および血清型が、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３のアフリカ型並びにそれらの亜型が挙げられる。
本発明のＴ−１１０５またはその塩を含有するイノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤は、特に、血清型が、Ａ、ＯおよびＣ並びにアジア地域で発生が認められているＡｓｉａ１に対してより優れた効果を有する。【００１１】
本発明においてイノシシ科動物とは、脊椎動物門哺乳綱偶蹄目イノシシ科の動物を意味し、具体的には、ブタおよびイノシシなどが挙げられ、特にブタが好ましい。【００１２】
Ｔ−１１０５またはその塩は、注射用蒸留水または生理食塩水等で希釈して注射剤として非経口的にイノシシ科動物等に投与してもよく、公知の製剤学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容される希釈剤、賦型剤を用い、錠剤、大型丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、乳剤、液剤、懸濁剤、プレミックス剤、シロップ剤、ペースト剤またはエアゾール剤などの動物用製剤として経口または非経口投与することができる。
Ｔ−１１０５もしくはその塩またはその動物用製剤は、必要に応じて、飼料に混合させて使用することができ、たとえば、乾草、わら類、牧草類、青刈飼料作物類、根果菜類、野草類、樹葉類およびサイレージなどの粗飼料；並びに穀類、油柏類および配合飼料などの濃厚飼料などの飼料に添加して使用することができる。また、飲料用の水などに添加して使用することもできる。
好ましい投与形態としては、筋肉注射、皮下注射および腹腔内注射などの注射剤としての投与する形態並びにＴ−１１０５を飼料に混合し、混餌経口投与する形態が挙げられる。【００１３】
本発明のイノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤およびイノシシ科動物等用飼料は、たとえば、Ｔ−１１０５またはその塩を固状または液状の担体で希釈または被覆等により安定化し、たとえば、錠剤、大型丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、乳剤、液剤、懸濁剤、プレミックス剤、シロップ剤、ペースト剤またはエアゾール剤などとするか、あるいは飼料または飲料などに直接または担体中に分散させたものを添加することにより製造することができる。固体担体としては、たとえば乳糖、ショ糖、でんぷん、小麦粉、とうもろこし粉、ふすま、大豆油粕、脱脂米糠、菜種油粕、豆腐粕、繊維素、酵母菌体、魚粉、落花生のしぼり粕、貝殻の粉および炭酸カルシウムなどが挙げられ、液状担体としては、たとえば、水、生理的食塩水および生理学的に無害な有機溶媒などが挙げられる。その他、必要に応じ、補助剤、たとえば、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、湿潤剤、濃縮剤、ゲル化剤および可溶化剤などを添加してもよい。プレミックスの形態としてもよい。さらに、防腐剤、殺菌剤、駆虫剤、抗酸化剤、着色剤、芳香剤、抗菌剤、抗生物質、酵素製剤、乳酸菌製剤、解熱剤、鎮痛剤および消炎剤などを配合してもよい。他の動物薬を配合してもよい。また、各種ビタミン類、ミネラル類およびアミノ酸類などを配合してもよい。【００１４】
本発明のイノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤は、口蹄疫の予防または／および治療などの処置の目的でイノシシ科動物等の家畜または動物に投与される。とりわけ、ブタに好ましく適用される。
投与量は、対象動物の年齢、体重、症状および投与経路に応じて適宜選択できるが、たとえば、動物の体重に対し、１日、1〜2000mg/kgを１回から数回に分割して投与すればよい。症状に応じ回数を増やすこともできる。また、投与期間も特に制限されないが、通常、1〜10日間の投与で十分な効果を得ることができ、間欠して投与することもできる。
【実施例】
【００１５】
次に、本発明を試験例を挙げて説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。本発明のＴ−１１０５またはその塩は、市販品の購入により入手するか、または公知の方法もしくはそれに準じた方法並びにそれらを組み合わせることにより製造することができる。なお、試験例１〜３は、独立行政法人、農業・食品産業技術総合研究機構、動物衛生研究所（東京都）で実施した。【００１６】
試験例１  in vitro 抗口蹄疫ウイルス作用
（１）口蹄疫ウイルス（O/JPN/2000株）に対するＴ−１１０５の効果を測定した。
口蹄疫ウイルス（O/JPN/2000株）をブタ由来腎臓継代細胞に約30〜100個／dishとなるように吸着（37℃、1時間）させた。ウイルス液を除去し、pH7.4に調整したMEM培地で洗浄後、Ｔ−１１０５を20μg/mLから２段階希釈した1.5％メチルセルロース加2％ウシ血清含有MEM培地を重層した。3日間培養し、0.2％クリスタルバイオレット10％中性緩衝ホルマリンにて細胞を固定後、染色し、プラーク数を数えた。薬剤非添加群のプラーク数と比較して、50％プラーク形成阻止率（IC50）を求めた。
結果は、1.6μg/mLであった。
（２）口蹄疫ウイルス（Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１）に対するＴ−１１０５の効果を測定した。
ウイルス濃度は、Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１について、各々、10TCID50、10TCID50、101.5TCID50とし、IBRS-2細胞にウイルスを吸着後（37℃、1時間）、20μg/mLから２段階希釈したＴ−１１０５を加え、48時間後に0.2％クリスタルバイオレット10％中性緩衝ホルマリンにて細胞を固定後、染色した。各濃度において4well中1well以上で細胞変性効果の阻止が認められた場合に有効と判定した。結果を表１に示す。【００１７】
【表１】
0005161078.tif 000002
【００１８】
Ｔ−１１０５は、口蹄疫ウイルスに対し、優れた効果を示した。【００１９】
試験例２（１）  Ｔ−１１０５体内動態試験（ブタ、ウシ）
ブタ（コンベンショナル、体重10kg、2頭）およびウシ（黒毛和牛、体重200kg、2頭）に1％Ｔ−１１０５配合飼料を投与量が100mg/kgとなるように経口投与した。投与後、2および8時間後に各動物の頚静脈よりヘパリンでリンスした注射筒を用いて1.5mL採血後、速やかに遠心分離（4℃、2000rpm、10分間）し、血漿250μLを1.5mLマイクロチューブに分注した。ブランク血漿を用いた検量線を基にＴ−１１０５の濃度を測定した。なお、検量線は、ブランク血漿200μLに5倍濃度のＴ−１１０５溶液50μLを加え、血漿の前処理操作と同様に実施した。血漿検体サンプルおよび検量線用血漿検体サンプル250μLにメタノール500μLを加え、攪拌し、遠心分離(10000rpm、4℃、10分間)した。上清を採取し、除タンパク処理後、減圧乾固した。残渣をHPLC移動相500μLで溶解し、遠心分離(3000rpm、10℃、10分間)し、上清を採取し、測定試料とした。測定は、以下のHPLC条件で行った。
分析カラム：Develosil ODS-MG-5 (4.6mm I.D.×250mm)、野村化学株式会社製
ガードカラム：Develosil ODS-MG-5 (4.0mm I.D.×10mm)、野村化学株式会社製
カラム温度：40℃
HPLC移動相：メタノール／1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)／蒸留水／TBA-Br
(50:50:900:1.6，v/v/v/w)
流速：1.0mL/min
検出波長：350nm
注入量：100μL
オートサンプラー温度：設定温度10℃
分析時間：約18分
検量線を作成し、ピーク面積より血漿検体サンプル中の各個体のＴ−１１０５の濃度を求め、その平均値を算出した。【００２０】
試験例２（２）  Ｔ−１１０５体内動態試験（ヒツジ）
ヒツジ（コリデール種、体重63kgおよび67kg、2頭）に1％Ｔ−１１０５配合飼料を投与量が100mg/kgとなるように経口投与した。投与後、2および8時間後に各個体の頚静脈よりヘパリンでリンスした注射筒を用いて1.5mL採血後、速やかに遠心分離（4℃、2000rpm、10分間）し、血漿250μLを1.5mLマイクロチューブに分注した。血漿検体サンプルにメタノール500μLを加え、攪拌し、遠心分離(10000rpm、4℃、10分間)した。上清を採取し、除タンパク処理後、減圧乾固した。残渣をHPLC移動相500μLで溶解し、遠心分離(3000rpm、10℃、10分間)し、上清を採取し、測定試料とした。測定は、試験例２（１）と同様の条件で行った。
標準液で検量線を作成し、ピーク面積より血漿検体サンプル中の各個体のＴ−１１０５の濃度を求め、その平均値を算出した。【００２１】
試験例２（１）および（２）の結果を表２に示す。【００２２】
【表２】
0005161078.tif 000003
Ｔ−１１０５は、ブタおよびヒツジにおいて高い血中濃度を維持し、優れた体内動態を示した。【００２３】
試験例３  混餌投与有効性試験
Ｔ−１１０５の口蹄疫に対する治療効果は、ブタ全身感染モデルを用いて評価した。
ブタ（コンベンショナル、体重10kg、投与群２頭（ブタ番号１および２）、非投与群２頭（ブタ番号３および４））に口蹄疫ウイルス106TCID50を前肢蹄球部に接種し、感染を惹起した。
Ｔ−１１０５は、ウイルス接種1時間前に200mg/kgを投与し、以後、1日2回（400mg/kg/day）、6.5日間、経口混餌投与を行った。臨床症状の推移をウイルス接種後８日まで観察した。また、血漿および鼻汁拭い液中のウイルス量の経過をウイルス接種後３日まで測定した。
臨床症状の推移を表３、血漿中ウイルス量の結果を表４、鼻腔スワブ中ウイルス量の結果を表５に示す。【００２４】
【表３】
0005161078.tif 000004
−：異常なし、＋：跛行、++：起立不能【００２５】
Ｔ−１１０５非投与群は、ウイルス接種後２日目以降、跛行・起立困難となり、足に水疱が形成されたのに対し、Ｔ−１１０５投与群は、外見的な変化は、全く見られなかった。【００２６】
【表４】
0005161078.tif 000005
【００２７】
Ｔ−１１０５非投与群の血漿中ウイルス量は、急激に増加したが、Ｔ−１１０５投与群の血漿中ウイルス量は、検出限界以下であった。
Ｔ−１１０５は、ブタ全身感染モデルにおいて、優れた治療効果を示した。【００２８】
【表５】
0005161078.tif 000006
【００２９】
Ｔ−１１０５非投与群の鼻腔スワブ中ウイルス量は、増加したが、Ｔ−１１０５投与群の鼻腔スワブ中ウイルス量は、ほとんど増加しなかった。
Ｔ−１１０５は、ブタ全身感染モデルにおいて、優れた治療効果を示した。【００３０】
さらに、Ｔ−１１０５投与群のブタには、投与期間中、毒性と考えられる所見は、発現しなかった。【００３１】
試験例４  細胞毒性作用
96穴プレート(ＩＷＡＫＩ社製)に所定の濃度のＴ−１１０５を含有させた培養液を100μL／穴で添加した。ついで、Vero細胞を2×104個/mLに培養液で調製し、100μL／穴で蒔き込み、37℃、5％炭酸ガスの条件下で4日間培養した。培養終了時にＸＴＴ法［たとえば、キャンサー・リサーチ(CANCER RESEARCH)、第48巻、p.4827−4833(1988年)など］により、生細胞数を測定した。
Ｔ−１１０５の50％細胞増殖抑制濃度(IC50)は、250μg/mL以上であった。【００３２】
上記の結果から明らかなように、Ｔ−１１０５は、安全性が高く、かつ、イノシシ科動物等用抗口蹄疫ウイルス剤として口蹄疫ウイルスによって引き起こされる口蹄疫の治療に有効である。【００３３】
製剤例１  錠剤
Ｔ−１１０５ 10gを乳糖4.4g、結晶セルロース4.4g、カルボキシメチルスターチナトリウム1.0gおよびステアリン酸マグネシウム0.20gと混合し、1錠あたり200mgとなるように混合末を打錠し、1錠中にＴ−１１０５ 100mgを含有する錠剤を得た。【００３４】
製剤例２（配合飼料）
Ｔ−１１０５ 30gをブタ用の市販飼料（ＪＡ全農製）2970gと混合し、１％Ｔ−１１０５配合飼料3000gを得た。配合飼料中でＴ−１１０５は、24時間分解されず、安定であった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
Ｔ−１１０５またはその塩を含有する抗口蹄疫ウイルス剤は、イノシシ科動物等の口蹄疫の予防または治療などの処置に有用である。