(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンナン結合レクチン（MBL）との複合体におけるMASP-２ポリペプチドの補体経路活性化活性についてのアッセイ方法であって、
（i）アッセイされるべきMBL/MASP-2複合体を含むサンプルを用意し；
（ii）0.7〜2.0Mの範囲の濃度を有する塩の溶液中で、前記のサンプルを少なくとも１つのMASP-２基質と接触させ；そして
（iii）切断されたMASP-２基質の量を検出する；
工程を含んで成る方法。
【請求項２】
更に、
（ａ）工程（i）の前記MBL/MASP-２複合体を含んで成るサンプルを、固相に適用して、結合された複合体を獲得し、
（ｂ）工程（ii）及び工程（iii）を実施し、そして
（ｃ）前記切断されたMASP-２基質の量を、工程（i）のサンプル中のMASP-２の量と関連付け、
これにより、前記サンプル中のMBL/MASP-２複合体におけるMASP-２の活性を決定する、
工程を含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相が、マンナン被膜である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのMASP-２基質が、MBL/MASP-２複合体により切断できる補体因子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのMASP-２基質が、C2、C3、C4及びC5から成る群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記切断されたMASP-２基質が、前記MASP-２基質に対して向けられた抗体により検出される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記塩が、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaI、KCl、MgI2、CaI2、NaBr、KBr、MgBr2、CaBr2、Na2S2O3、(NH4)2SO4及びNH4HCO3から成る群から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが生物学的サンプルである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記塩の濃度が1.0Ｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野：
本発明は、マンナン結合性タンパク質とも呼ばれる、マンナン−結合性レクチン（MBL）を包含する補体固定化のための生来の経路の一般的分野に関する。
【０００２】 発明の背景：
補体システムは、先天性及び適応性免疫防御の機能にとって重要な複雑に整列した酵素及び非酵素タンパク質を含んで成る（１）。最近まで、次の２種の活性化形式、すなわち抗体−抗原複合体により開始される従来の経路及び微生物の表面上の一定の構造物により開始されるもう１つの経路が知られている。補体活性化の第３の新規抗体−無関係経路が記載されている（２）。この経路は、マンナン−結合性レクチン（MBL、マンナン−結合タンパク質、NBPとして最初に記載されている；Ezekowitz，  アメリカ特許第5,270,199号を参照のこと）が炭水化物に結合する場合に開始される。
【０００３】  MBLは構造的に、補体の成分C1のC1q副成分に関連し、そしてMBLは従来の経路のC1r及びC1s成分に類似する、MASP（４）又はp100（５）と称する会合されるセリンプロテアーゼを通して補体システムを活性化すると思われる。この新規補体活性化経路は、MBLectin経路と呼ばれる。この経路にっいての推定される機構によれば、MBLは、広範囲の種類の微生物、例えば細菌、酵母、寄生原生動物及びウィルスの表面上に見出される特定の炭水化物構造体に結合し（６）、そしてその抗微生物活性は、末端の溶菌性補体経路成分（７）又は促進性ファゴサイトーシス（８）の活性化に起因する。
【０００４】  報告によれば、血漿におけるMBLのレベルが一般的に決定され得る（9，10，11）。MBL欠失は、子供（12，13）及びたぶん、成人（13，14）において種々の微生物による時折の感染に対する感受性に関連している。最近の情報は、HIV感染及びAIDSの進行に続いてのより急速な死とMBL欠失とを関連づけている（15，16）。MBLは、リウマチ様関節炎患者に高濃度で見出され、そして次に、補体を活性化する、IgG（GO）のガラクトシル形に結合する（17）。MBL欠失はまた、再発性自然流産（18）の素因、及びまた全身性エリテマトーデス（19）の進行の素因と関連している。
【０００５】  第１の臨床学的再構成試験においては、再発性感染を有するMBL−欠失幼女は、精製されたMBLによる感染により明らかに治療された（20）。MBLに関する最近の再考に関しては、文献６を参照のこと。
MBL−欠失に関連する比較的高い頻度のMBL突然変異が研究されたすべての集団に報告されている。この観察は、MBLが、ある場合、標的組織への接近を得るために、MBLを利用する一定の細胞内感染剤に対して個人をより敏感にする仮説を導いている（21）。MBLは補体システムの非常に強力な活性化剤であるので、微生物炭水化物又は内毒素を通しての不適当な活性化は損傷性炎症応答を導くことができる（10）。従って、集団の全体的な生存性は、広い個々の範囲のMBL濃度から有益であり得る。
【０００６】  MASP-1（MBP−会合セリンプロテアーゼ、MASP）は、トリプシン及びトリプシン様セリンプロテアーゼに見出されるタイプのヒスチジンループ構造を有するが、補体経路のC1r及びC1sに対して構造的に類似するセリンプロテアーゼである。19個のアミノ酸の推定上のリーダーペプチド、続いて、成熟ペプチドを形成することが推定される680個のアミノ酸残基をコードする、MASP-1コードのcDNAクローンが報告されている。
摘要は、MASP-2（22）と称する第２MASPの存在を報告している。
【０００７】発明の要約：
本発明は、マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（MASP-2）由来のアミノ酸配列（配列番号２）又はその機能的相同体を含んで成る実質的に純粋なポリペプチドの医薬組成物の生成のためへの使用に関する。
本発明は、マンナン−結合性レクチン（MBL）会合セリンプロテアーゼ（MASP-2）の単離及び特徴化に関する。MASP-2は、前に報告されたMASP（MASP-1）及び２種のC1q−会合セリンプロテアーゼ、すなわちC1r及びC1sとのいくらかの相同性を示す。MBLは単独で、補体活性化の機能的MBLectin経路を提供しない。
【０００８】  本発明者は、MASP-2をコードするcDNAをクローン化し、そして配列決定した。さらに、本発明者は、抗−HASP-2抗体を生成し、そして体液又は組織抽出物におけるMASP-2の評価についてのアッセイを構成した。さらに、本発明者は、MBL/MASP複合体の一部として、又はMBLにより会合されない遊離MASPとして存在する場合、血清又は血漿におけるMASP-2活性の決定についての定量アッセイを構成した。
【０００９】  従って、本発明の１つの観点は、実質的に純粋なマンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（MASP-2）ポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。好ましくは、MASP-2ポリペプチドは、MBLectin補体経路機能についてのインビトロアッセイ、例えば下記に記載されるアッセイシステムの１つにおける１又は複数のMASP-2機能、例えばマンナン−結合性レクチン（MBL）と会合できるその機能、セリンプロテアーゼ活性、又はMASP-2活性を保持する。本発明のいくつかのMASP-2ポリペプチド、例えば結合アッセイに使用されるそれらのポリペプチドは、アッセイにおけるそれらの存在の検出及び/又は定量化を可能ンするために、ラベルに結合され得る。適切なラベルは、シグナル（例えば、可視吸光性）を生成する酵素、蛍光団、放射性核種、等を包含する。
【００１０】  他のMASP-2ポリペプチドは、上記MASP-2活性の１つを競争的に阻害でき、そしてそれにより、MASP-2機能の評価において有用である。他のMASP-2ポリペプチドは、下記のように、抗体を生成するための有用な抗原又はハプテンである。MASP-2活性を競争的に阻害する化合物がまた特徴づけられる。好ましくは、そのような化合物は、MASP-2又はMASP-2のフラグメントのセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用する。そのような化合物は、MBLectin経路による補体活性化に対して決定的なMBL−MASP-2相互作用を競争的に阻害するMBL又はMASP-2のフラグメント、及びMASP-2による補体因子C4及びC2の触媒分解を阻害する化合物、例えばペプチドフラグメントを包含することができる。
【００１１】  本発明のこの観点に従っての特定のポリペプチドは、ａ）20Kの分子質量を有し、そして配列番号１［TPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYR］として同定される配列を含むポリペプチド；ｂ）52Kの分子質量を有し、そして配列番号１として同定される配列を含むポリペプチド；ｃ）図６（配列番号２）の完全アミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。
【００１２】  本発明のもう１つの観点は、配列番号２の配列に対して少なくとも85％同一である配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を包含する。
本発明はまた、上記マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（MASP-2）プロペプチドをコードする単離された核酸配列を特徴とする。そのような核酸配列は、核酸ベクター（例えば、発現システムにおいて組換え核酸の発現を可能にする調節核酸要素を有するそれらを包含する発現ベクター）に含まれ得る。
【００１３】  本発明はまた、MASP-2に選択的に結合する抗体を特徴とする。そのような抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体技法を包含する良く知られている技法のいずれかにより製造され得る。抗体は、MASP-2を検出するために、アッセイにおいて使用され得るよう、検出マーカーを含んで成る化合物にカップリングされ得る。
【００１４】  ポリペプチド又は抗体は、医薬組成物中に配合され、そして下記のようにして、治療剤として投与され得る。
本発明はまた、マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２（MASP-2）の検出方法を特徴とする。前記方法は、生物学的サンプルを獲得し、前記サンプルとMASP-2ポリペプチド特異的パートナーと接触せしめ、そして存在するなら、前記結合された複合体を、生物学的サンプルにおけるMASP-2の存在の表示として検出することを含んで成る。アッセイに使用される結合パートナーは抗体であり得るか、又はMASP-2についてのアッセイは補体固定活性について試験することができる。MASP-2についてのそれらのアッセイはまた、生物学的サンプルにおけるMASP-2又はMASP-2活性の定量アッセイのために使用され得る。結合パートナーの１つは、MBKに対して特異的であり得、従ってMBL/MASP-2合体の検出を可能にする。
【００１５】  MASP-2核酸発現を検出するための方法が、本発明に包含される。それらの方法は、MASP-2のすべて又はそのフラグメントをコードする核酸配列に対して、緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする核酸プローブと共にサンプルを混合することによって、MASP-2ポリペプチドをコードする配列を有するRNAを検出することを含んで成る。
【００１６】  本発明はまた、MASP-2又はMASP-2活性を欠失する患者を処理するための方法を特徴とする。これは、MASP-2ポリペプチド又はMASP-2をコードする核酸を患者に投与することによって達成される。時々、MASP-2活性を阻害することが所望されるので、本発明は、MASP-2の発現又は活性を阻害する化合物を患者に投与することによって、MASP-2の活性を阻害するための方法を包含する。MASP-2活性の阻害はまた、MASP-2アンチセンス核酸配列を投与することによって達成され得る。
【００１７】  本発明は、MASP-2をコードする核酸配列における多形現象についてのアッセイを特徴とする。サンプルにおけるMASP-2コードの核酸の存在を検出するための方法が請求されている。例として、前記方法は、緊縮条件下でMASP-2コード核酸との複合体を形成できる少なくとも１つの核酸プローブとサンプルとを混合し、そしてプローブがサンプル核酸に結合されるかどうかを決定することをを包含する。従って、本発明は、MASP-2コードの核酸を有する複合体を緊縮条件下で形成できる核酸プローブを包含する。
【００１８】  本発明は、MASP-2又はその前駆体を含んで成るポリペプチド配列での多形現象についてのアッセイを特徴とする。
MASP-2アッセイは、種々の疾病、例えば感染、炎症性患者及び再発性自然流産の患者におけるMASP-2レベル及びMASP-2活性の決定のために有用である。MASP-2は、MASP-2機能が最適状態に及ばない場合、感染の処理のために有用であり、そしてMASP-2活性の阻害は、MBLectin経路の活性により引き起こされる炎症及び悪影響の調節のために有用である。
【００１９】  “マンナン−結合性レクチン会合セリンプロテアーゼ−２”又は“MASP-2”とは、“マンナン−結合タンパク質会合セリンプロテアーゼ−２”又は“マンノース結合タンパク質会合セリンプロテアーゼ”、又は配列番号２と実質的な同一性を有するいずれかの他のポリペプチドを意味する。
【００２０】  用語“タンパク質”及び“ポリペプチド”とは、長さ又は後−翻訳修飾（例えば、解糖又はリン酸化）にもかかわらず、アミノ酸のいずれかの鎖を記載するために、本明細書において使用される。従って、用語“MASP-2ポリペプチド”は、十分な長さの天然に存在するMASP-2タンパク質、及び十分な長さの天然に存在するMASP-2ポリペプチド、又は天然に存在するタンパク質の特定のドメイン又は部分に対応する、組換え的に又は合成的に生成されたポリペプチドを包含する。この用語はまた、付加されたアミノ−末端メチオニン（原核細胞における発現のために有用である）を有する成熟MASP-2を包含する。
【００２１】  用語“精製された”とは、本明細書において使用される場合、組換えDNA技法により生成される場合、細胞材料、ウィルス材料又は培養培地を実質的に有さず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に有さない核酸又はペプチドを言及する。“単離された核酸分子”とは、生物の天然に存在するゲノムにおける配列からいずれかの手段で分離される核酸分子を意味する。従って、用語“単離された核酸分子”とは、天然に存在しない核酸分子、例えば組換えDNA技法により創造された核酸分子を包含する。
【００２２】  用語“核酸分子”とは、RNA及びDNA、例えばcDNA、ゲノムDNA及び合成（例えば、化学的に合成された）DNAを包含する。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。
本発明はまた、MASP-2ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、配列番号２をコードする配列、例えば図６に示されるcDNA配列のタンパク質のコード部分を有する核酸分子）に対して、好ましくは緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子を包含する。好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子は、400個、より好ましくは200個のヌクレオチドから成る。
【００２３】  好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子は、MASP-2により占有される活性をコードし、例えばそれらはMBLを結合し、そしてMBLectin補体経路における活性を有し、そしてセリンプロテアーゼとして作用することができる。
【００２４】  本明細書及び特許性請求の範囲を通して、３文字コード又は１文字コードが、天然のアミノ酸について使用される。L又はD形が特定されていない場合、問題のアミノ酸は天然のL形（Pure & Appl. Chem. Vol. 56 (5) pp. 595-624 (1984)を参照のこと）、又はD形を有し、その結果、形成されるペプチドは、L形、D形のアミノ酸又は混合されたL形及びD形の配列から構成され得ることが理解されるべきである。特にことわらない限り、本発明のポリペプチドのC−末端アミノ酸は遊離カルボン酸として存在し、そしてポリペプチドのN−末端アミノ酸は遊離アミノ機を含んで成ることが理解されるべきである。特にことわらない限り、アミノ酸は、天然に存在しても又はしてなくても、いずれかのアミノ酸、例えばαアミノ酸、βアミノ酸及び/又はγアミノ酸から選択され得る。従って、前記グループは次のものを含んで成るが、しかしそれらだけには限定されない：Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,Met,Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His,Alb,Nal,Sar,Orn,リシン類似体DAP及びDAPA.
【００２５】  本発明はまた、実質的に純粋な又は単離されたMASP-2ポリペプチド、好ましくはMASP-2の種類の機能的ドメイン又はそのフラグメントに対応するそれらのポリペプチドを特徴とする。本発明のポリペプチドは、図６に示されるアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を包含する。
本発明のポリペプチドはまた、化学的に合成され、組換え技法により合成されるか、又はそれらは、それらが精製の標準の生化学的方法に従って、天然において発現される組織から精製され得る。
【００２６】  １又は複数のMASP-2の生物学的機能又は活性を有する“機能的ポリペプチド”がまた、本発明に包含される。それらの機能又は活性は、本明細書に詳細に記載される。機能的ポリペプチドはまた、それがMASP-2又はそのフラグメント（特に、決定因子を含むフラグメント）に対して特異的に結合する抗体の生成のための抗原として作用する場合、本発明の範囲内であると思われる。
【００２７】  機能的ポリペプチドは、本明細書に開示されるそれらのポリペプチドから修飾された一次アミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、それらの修飾は、本明細書に記載されるように、保存性アミノ酸置換から成る。ポリペプチドは、それらの異化を促進するか又は遅延するよう（それらの半減期を高める）企画されたいずれかの態様で置換され得る。
【００２８】  用語“機能的相同体”及び“機能的同等物”とは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そして本発明の範囲内でお互い類似するものとして理解されるべきである。本発明のポリペプチドの機能的相同体とは、MASP-2活性又はMASP-2フラグメントの活性、例えばMASP-2の競争インヒビターとしての活性を発揮することができるいずれかのポリペプチド配列を含んで成ることを意味する。
【００２９】  本発明の機能的相同体は、上記で概略されたように、予定されたポリペプチド配列と少なくともいくらかの相同性を共有する、アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る。例えば、そのようなポリペプチドは、上記に概略されるように、予定されたポリペプチドと、少なくとも40％、例えば少なくとも約50％相同であり、例えば少なくとも60％相同であり、例えば少なくとも約70％相同であり、例えば少なくとも約75％相同であり、例えば少なくとも約80％相同であり、例えば少なくとも約85％相同であり、例えば少なくとも約90％相同であり、例えば少なくとも92％相同であり、例えば少なくとも94％相同であり、例えば少なくとも95％相同であり、例えば少なくとも96％相同であり、例えば少なくとも97％相同であり、例えば少なくとも98％相同であり、例えば少なくとも99％相同である。
【００３０】  アミノ酸配列間の相同性は、良く知られたアルゴリズム、例えばBLOSUM30,BLOSUM 40,BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62,BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85及びBLOSUM 90のいずれか１つのアルゴリズムを用いて計算され得る。
機能的相同性は、いずれか他のアミノ酸による１つのアミノ酸の少なくとも１つの置換を含んで成るアミノ配列を含んで成る。例えば、そのような置換は、保存性アミノ酸置換であるか、又は非保存性置換であり得る。
【００３１】  保存性アミノ酸置換は、予定されたアミノ酸グループ内の１つのアミノ酸の同じグループ内のもう１つのアミノ酸による置換であり、ここで予定されたグループ内のアミノ酸は、類似するか又は実質的に類似する特徴を示す。本明細書において適用されるような用語“保存性アミノ酸置換”の意味においては、１つのアミノ酸が、下記のものを有することによって特徴づけられるアミノ酸のグループ内のもう１つのアミノ酸により置換され得る：
【００３２】  ｉ）極性側鎖（Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, thr, Tyr及びCys）；
ii）非極性側鎖（Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro及びMet）；
iii）脂肪族側鎖（Gly, Ala, Val, Leu, Ile）；
iv）環状側鎖（Phe, Tyr, Trp, His, Pro）；
v）芳香族側鎖（Phe, Tyr, Trp）；
vi）酸性側鎖（Asp, Glu）：
vii）塩基性側鎖（Lys, Arg, His）；    viii）アミド側鎖（Asn, Gln）；
ix）ヒドロキシ側鎖（Ser, Thr）：
x）硫黄含有側鎖（Cys, Met）；及び
xi）モノアミノージカルボン酸又はモノアミノ−モノカルボン酸−モノアミノカルボン酸であるアミノ酸（Asp, Glu, Asn, Gln）。
【００３３】  非保存性置換は、いずれか他の置換である。機能的相同体の形成を導く非保存性置換は、例えばｉ）疎水性、例えば親水性残基、例えばArg, Lys, Trp又はAsp,又は疎水性残基により置換される親水性残基、例えば、Thr, Ser, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu又はTrpにより置換される疎水性残基（Val, Ile, Leu, Phe 又はMet）とは実質的に異なり；そして/又はポリペプチド主鎖配向に対するその効果、例えばもう１つの残基によるPro又はGlyの置換において実質的に異なり；そして/又はiii）電荷、例えば正に荷電された残基、例えばLys, His又はArgによる、負に荷電された残基、例えばGlu又はAspの置換（及び、逆もまた真である）において実質的に異なり；そして/又はiv）立体的容積、例えば大きな残基、例えばHis, Trp, Phe又はTyrのマイナーな側鎖を有する残基、例えばAla, Gly又はSerによる置換（及び、逆もまた真である）において実質的に異なる。
【００３４】  次に、本発明の機能的相同体は、１つよりも多くのそのような置換、例えば２個のアミノ酸置換、例えば３又は４個のアミノ酸置換、例えば５又は６個のアミノ酸置換、例えば７又は８個のアミノ酸置換、例えば10〜15個のアミノ酸置換、例えば15〜25個のアミノ酸置換、例えば25〜30個のアミノ酸置換、例えば30〜40個のアミノ酸置換、例えば40〜50個のアミノ酸置換、例えば50〜75個のアミノ酸置換、例えば75〜100個のアミノ酸置換、例えば100個以上のアミノ酸置換を含んで成る。
【００３５】  アミノ酸の付加又は欠失は、２〜５個のアミノ酸、例えば５〜10個のアミノ酸、例えば10〜20個のアミノ酸、例えば20〜50個のアミノ酸の付加又は欠失であり得る。しかしながら、50個よりも多くのアミノ酸の付加又は欠失、例えば50〜200個のアミノ酸の付加もまた、本発明内に包含される。
【００３６】  いずれかの変異体及びその機能的相同体を包含する本発明のポリペプチドは、１つの態様においては、５個よりも多くのアミノ酸残基、例えば10個よりも多くのアミン酸残基、例えば20個よりも多くのアミノ酸残基、例えば25個よりも多くのアミノ酸残基、例えば50個よりも多くのアミノ酸残基、例えば75個よりも多くのアミノ酸残基、例えば100個よりも多くのアミノ酸残基、例えば150個よりも多くのアミノ酸残基、例えば200個よりも多くのアミノ酸残基を含んで成ることができる。
【００３７】  追加の因子は、本明細書において使用される手段に従って、機能的に相同体を決定する場合に考慮され得る。例えば、機能的相同体は、本発明のポリペプチドに対して特異的である抗血清と会合することができる。
さらなる態様においては、本発明は、置換しているアミノ酸の値の+/-2.5以内、例えば+/-2.3以内、例えば+/-2.1以内、例えば+/-2.0以内、例えば+/-1.8以内、例えば+/-1.6以内、例えば+/-1.5以内、例えば+/-1.4以内、例えば+/-1.3以内、例えば+/-1.2以内、例えば+/-1.1以内、例えば+/-1.0以内、例えば+/-0.9以内、例えば+/-0.8以内、例えば+/-0.7以内、例えば+/-0.6以内、例えば+/-0.5以内、例えば+/-0.4以内、例えば+/-0.3以内、例えば+/-0.25以内、例えば+/-0.2以内である親水性又は水治療性指数を有する置換されたアミノ酸を含んで成る機能的同等物に関する。
【００３８】  タンパク質に対して相互作用性生物学的機能を付与することにおける親水性及び水治療性アミノ酸指数の重要性は、当業界において十分に理解されている（Kyte & Doobittle, 1982, 及びHopp. アメリカ特許第4,554,101号；それぞれ引用により本明細書に組み込まれる）。
【００３９】  本明細書において使用されるようなアミノ酸水治療性指数値は次の通りでありる：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン/シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リシン（-3.9）；及びアルギニン（-4.5）(Kyte & Doolittle, 1982)。
【００４０】  アミノ酸親水性値は次の通りである：アルギニン（+3.0）；リシン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0,+/-0.1）；グルタミン酸（+3.0），+/-0.1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5,+/-0.1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）（アメリカ特許第4,554,101号）。
【００４１】  従って、アミノ酸の置換は、１つの態様においては、それらの疎水性及び親水性値、及びアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば電荷、サイズ及び同様のものに基づいて行われ得る。種々の前述の特徴を考慮しての典型的なアミノ酸置換は、当業者に良く知られており、そして次のものを包含する：アルギニン及びリシン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；及びバリン、ロイシン及びイソロイシン。
【００４２】  本明細書に記載されるポリペプチド化合物の他に、立体的に類似する化合物は、ペプチド構造のキー部分を模倣するよう、及びそのような化合物がまた、本発明のポリペプチドと同じ態様で使用され得るよう配合され得る。これは、当業者に知られている設計及び化学的企画の技法により達成され得る。例えば、エステル化及び他のアルキル化が、テトラペプチド構造を模倣するために、例えばジ−アルギニンペプチド主鎖のアミノ末端を修飾するために使用され得る。すべてのそのような立体的に類似する構造体は、本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
【００４３】  N末端アルキル化及びC末端エステル化を有するペプチドはまた、本発明内に包含される。機能的同等物はまた、グリコシル化された及び共有又は凝集性接合体、例えばダイマー又は無関係な化学的成分を含んで成る。そのような機能的同等物は、当業界において知られている手段により、N−及びC−末端のいずれか１つ又は両者で、フラグメントに見出される基への官能価の連結により調製される。
【００４４】  従って、機能的同等物は、カルボキシル末端、アルキルアミノ、又はカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族又はアシルエステル又はアミドに結合されるフラグメント、例えばアスパラギン酸残基でのアルキルアミノへの接合体；ヒドロキシル基含有残基の0−アシル誘導体、及びアミノ末端アミノ酸又はアミノ基含有残基のN−アシル誘導体、例えばMet-Leu-Pheを有する接合体を含むことができる。アシル基の誘導体は、アルキル成分（C3〜C10の標準アルキルを包含する）（それにより、アルカノイル種を形成する）、及び炭素環式又は複素乾式化合物（それにより、アロイル種を形成する）の群から選択される。
【００４５】  本発明の範囲内の核酸配列の相同体は、類似する生物学的機能を有するRNA及び/又はタンパク質をコードし、そして
ａ）少なくとも50％同一であり、例えば少なくとも60％同一であり、例えば少なくとも70％同一であり、例えば少なくとも75％同一であり、例えば少なくとも95％同一であるか、又は
ｂ）緊縮条件下で、前記核酸配列の相補的鎖にハイブリダイズすることができる核酸配列である。
【００４６】  本明細書において使用されるような緊縮条件は、例えばSouthern E. M., 1975,J. MoI. Biol. 98: 503-517により記載されるようなサザンブロット及びハイブリダイゼーションに関して通常適用されるような緊縮性を示すであろう。そのような目的のためには、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの段階を包含することは、通常の実施である。
【００４７】  そのような段階は通常、６×SSPE、５％のDenhardt's、0.5％のSDS、50％のホルムアミド、100g/mlの変性されたサケ精巣DNAを含む溶液（42℃で18時間のインキュベーション）、次に２×SSC及び0.5％のSDSを含む洗浄液（室温で及び37℃で）、及び0.1×SSC及び0.5％のSDSを含む洗浄液（68℃で30分間のインキュベーション）を用いて、Sambrookなど., 1989, "Molecular Cloning/A LaboratoryManual", Cold Spring Harbor）（引用により本明細書に組み込まれる）により記載されるようにして、行われる。
【００４８】  核酸配列の相同体はまた、付加及び/又は欠失を包含する核酸配列を包含する。そのような付加及び/又は欠失は、内在性であり、末端で存在する。付加及び/又は欠失は、１〜５個のヌクレオチド、例えば５〜10個のヌクレオチド、例えば10〜50個のヌクレオチド、例えば50〜100個のヌクレオチド、例えば少なくとも10〜50個のヌクレオチド、例えば50〜100個のヌクレオチド、例えば少なくとも100個のヌクレオチドのものであり得る。
【００４９】  興味あるポリペプチド又は他の化合物は、それらが天然に存在する組織物とは異なり、そして本明細書に提案される少なくとも１つの使用のために適切である場合、“実質的に純粋”であると言われる。天然に存在する物質に関して、単なるわずかに変更されている調製物は、いくぶん、有用であるが、より典型的には、調製物は、興味ある化合物に関して、少なくとも10重量％（乾量）異なる。好ましくは、調製物は、興味ある化合物に関して、少なくとも60重量％、より好ましくは少なくとも75重量％、及び最も好ましくは、少なくとも90重量％異なる。純度は、いずれかの適切な標準の方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はHPLC分析により測定される。
【００５０】  ポリペプチド又は核酸分子は、それが対照のポリペプチド又は核酸分子の配列に対して、少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％及びより好ましくは少なくとも95％、98％又は99％同一である配列を有する場合、対照のポリペプチド又は核酸分子に対して、“実質的に同一”である。
【００５１】  特定のポリペプチドが定義される長さの対照ポリペプチドに対して特定の％同一性を有すると言われる場合、その％同一性は、対照ペプチドに対してである。従って、100個の長さのアミノ酸である対象ポリペプチドに対して50％同一であるペプチドは、対照ポリペプチドの50個の長さのアミノ酸に対して完全に同一である50個のアミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、その完全な長さにわたって、対照ポリペプチドに対して50％同一である100個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。もちろん、多くの他のポリペプチドが、同じ基準を満たすであろう。
【００５２】  対照配列に対して100％以下の同一性を有するポリペプチド配列の場合、非同一の位置は好ましくは（但し、必ずしも必要ではないが）、対照配列による保存性置換である。保存性置換は典型的には、次のグループによる置換を包含する：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン：リシン及びアルギニン；及びフェニルアラニン及びチロシン。
【００５３】  ポリペプチドに関しては、対照ポリペプチド配列の長さは一般的に、少なくとも16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個のアミノ酸及び最も好ましくは35個のアミノ酸、50個のアミノ酸又は100個のアミノ酸であろう。核酸に関しては、対照核酸配列の長さは一般的に、少なくとも50個、好ましくは少なくとも60個、より好ましくは少なくとも75個、及び最も好ましくは100個又は300個のヌクレオチドであろう。
【００５４】  配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）及び、そこに特定されるようなデフォールトパラメーターを用いて、測定され得る。
【００５５】  本発明の核酸分子は、挿入体の発現を測定するであろう、下記に記載されるようなベクター中に挿入され得る。前記核酸分子及びそれらがコードするポリペプチドは、診断剤又は治療剤として直接的に使用され得るか、又は治療剤又は診断剤として臨床学的に有用である抗体を生成するために使用され得る（ポリペプチドの場合、直接的に、又は核酸分子の場合、間接的に）。従って、本発明の核酸を含むベクター、それらのベクターによりトランスフェクトされた細胞、発現されるポリペプチド、及び完全なポリペプチド又はその抗原性フラグメントのいずれかに対して生成される抗体は、好ましい態様間に存在する。
【００５６】  本発明はまた、MASP-2を特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体及び構築された抗体を特徴とする。“特異的に結合する”とは、特定の抗原、例えば本発明のMASP-2ポリペプチドを認識し、そしてそれを結語するが、しかしMASP-2を含むサンプル、例えば生物学的サンプルにおける他の分子を実質的に認識も又はそれを結合もしない抗体を意味する。検出可能なマーカーを含んで成る化合物にカップリングされる抗体（又はそのフラグメント）の構造体は、化学的手段を包含するいずれかの技法、又は組換え技法により製造される構造体を包含する。本発明はまた、MASP-2又はその機能的相同体の活性を阻害できる化合物を特徴とする。
【００５７】  MASP-2の１つの活性は、補体活性化を助けることである。MASP-2のもう１つの活性は、MASP-2のセリンプロテアーゼ活性である。好ましくは、MASP-2の活性を阻害できる化合物は、MASP-2による補体活性化を阻害することができる。低い割合のMASPのみが血清におけるMBLにより会合されることを十分に理解することが重要である。従って、MASP-2活性を阻害できる化合物は、MBLを活性化しないで、MBLと会合し、そしてその結果、活性MASP-MBL複合体の血清を消耗することによって、補体活性化に対して阻害効果を発揮することができる。化合物は、MASP-2のフラグメントであり得、又はそれは、MASP-2の変異体又はそのフラグメントであり得る。さらに、化合物は抗体であり得る。
【００５８】  本発明はまた、それぞれ、MASP-2の１又は複数の機能又は活性を阻害するか又は増強できるMASP-2のアンタゴニスト及びアゴニストを特徴とする。適切なアンタゴニストは、小分子（すなわち、約500以下の分子量を有する分子）、大分子（すなわち、約500以上の分子量を有する分子）、MASP-2を結合し、そして“中和する”抗体（下記のような）、１つのタンパク質、例えばMBLに結合するために、生来の形のMASP-2と競争するポリペプチド、及びMASP-2の転写を妨げる核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子及びリボザイム）を包含することができる。MASP-2のアンタゴニストはまた、小及び大分子、及び“中和”抗体以外の抗体を包含する。
【００５９】  本発明はまた、MASP-2の発現を高めるか又は低めることができる（例えば、転写又は翻訳に影響を及ぼすことによって）分子を特徴とする。小分子（すなわち、約500以下の分子量を有する分子）、大分子（すなわち、約500以下の分子量を有する分子）、及びMASP-2の発現を阻害するために使用され得る核酸分子（例えば、アンチセンス及びリボザイム分子）、又はそれらの発現を増強するために使用され得る核酸分子（例えば、強いプロモーターシステムの制御下でMASP-2をコードする核酸配列を配置する発現構造体）、並びにMASP-2トランスジーンを発現するトランスジェニック動物もまた、本発明において特徴とされる。
【００６０】  本発明は、MASP-2の発現又は活性に関連する疾患を処理するための方法を包含する。従って、本発明は、MASP-2の過剰発現又は活性に関連する疾患を処理するための方法を包含する。そのような方法は、MASP-2の発現又は活性を低める化合物を投与することを包含する。本発明はまた、MASP-2の不十分な発現に関連する疾病を処理するための方法を包含する。それらの方法は、MASP-2の発現又は活性を高める化合物を投与することを包含する。
【００６１】  セリンプロテアーゼ活性を“競争的に阻害する”とは、例えば変更されたMBL又はそのフラグメントの作用が、セリンプロテアーゼ活性を活性化しないで、可逆的に又は不可逆的に、MASP-2ペプチドに結合できることを意味する。逆に言えば、MASP-2のフラグメント、例えばMASP-2のN−末端部分を包含するポリペプチドは、損なわれていないMASP-2の結合を競争的に阻害し、そして従って、MASP-2の活性化を効果的に阻害することができる。
本発明はまた、MASP-2ポリペプチドを検出するための方法を特徴とする。そのような方法は、生物学的サンプルを獲得し；MASP-2を特異的に結合する抗体と前記サンプルとを、特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして形成されるいずれかの抗体−MASP-2複合体を検出することを包含する。
【００６２】  さらに、本発明は、MASP-2の不適切な発現又は活性に関連する疾病の診断評価、分類及び予後のための方法及び組成物を包含する。例えば、本発明の核酸分子は、MASP-2の不適切な発現、又はMASP-2遺伝子における突然変異を検出するための診断用ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。そのような方法は、MASP-2発現のレベルにより細胞を分類するために使用され得る。
他方では、核酸分子は、MASP-2遺伝子における遺伝子突然変異、対立遺伝子変動及び調節欠失の同定のための診断PCR分析のためのプライマーとして使用され得る。本発明はさらに、そのような方法の実施のための診断キットを提供する。
【００６３】  本発明は、選択された化合物の存在及び不在下でMASP-2の発現又は活性を評価することによって、MASP-2の発現又は活性を調節する化合物を同定するための方法を特徴とする。選択された化合物の存在及び不在下でのMASP-2の発現又は活性のレベルの差異は、その選択された化合物がMASP-2の発現又は活性を調節できることを示す。発現は、当業者に良く知られている技法により、遺伝子発現（例えば、mRNAを測定することによって）又はタンパク質発現のレベルで評価され得る。MASP-2の活性は、機能的に、すなわち補体を活性化する化合物の能力をアッセイすることによって評価され得る。
【００６４】  好ましい方法及び材料は、本発明を例示するが、しかし限定しない下記実施例において記載される。当業者は、本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又は同等であり、そして本発明の実施又は試験に使用され得る方法及び材料を認識するであろう。
【００６５】  特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技法及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又は同等の方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が本明細書において記載される。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。さらに、材料、方法及び例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
本発明の他の特徴及び利点は、下記特定の記載から明らかであろう。
【００６６】 配列表の簡単な説明：
配列番号１：20kDのMASP-2フラグメントのアミノ酸配列。
配列番号２：シグナルペプチドを包含する十分な長さのMASP-2のアミノ酸配列：
配列番号３：シグナルペプチドを包含しない十分な長さのMASP-2のアミノ酸配列：
【００６７】 好ましい態様の記載：
MASP-2核酸分子：
本発明のMASP-2核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNAであり得、そして二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。それらの分子のフラグメントはまた、本発明の範囲内であると思われ、そして例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成され得るか、又は１又は複数の制限エンドレアーゼによる処理により生成され得る。リボ核酸（RNA）分子は、インビトロ転写により生成され得る。好ましくは、核酸分子は、長さにかかわらず、正常な生理学的条件下で可溶性であるポリペプチドをコードする。
【００６８】  本発明の核酸分子は、天然に存在する配列、又は天然に存在するそれらの配列とは異なるが、しかし遺伝子コードの宿主のために、同じポリペプチド（例えば、配列番号２のポリペプチド）をコードする配列を含むことができる。さらに、それらの核酸分子は、ポリペプチドを単にコードする配列に制限されず、そして従って、コード配列から上流又は下流に存在する非コード配列のいくつか又はすべてを含むことができる。
【００６９】  本発明の核酸分子は、合成され（例えば、ホスホラミジットに基づく合成により）、又は生物学的細胞、例えば哺乳類の細胞から得られる。従って、核酸は、ヒト、マウス、ラット、テンジュクネズミ、ウシ、羊、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、イヌ又はネコの核酸であり得る。それらのタイプの核酸内のヌクレオチドの組合せ又は修飾がまた包含される。
【００７０】  さらに、本発明の単離された核酸分子は、天然の状態において見出されないフラグメントを包含する。従って、本発明は、組換え分子、例えば核酸分子（例えば、MASP-2をコードする単離された核酸分子）が、ベクター（例えば、プラスミド又はウィルスベクター）、又は異種細胞のゲノム（又は、天然の染色体位置以外の位置での相同細胞のゲノム）中に組み込まれているそれらの分子を包含する。従って、組換え核酸分子及び使用がさらに下記に論じられる。
【００７１】  本発明の核酸分子がアンチセンス分子をコードし、又はアンチセンス分子として作用する場合、それらはMASP-2の翻訳を調節するために使用され得る。核酸発現の欠失又は調節に関係する技法は、当業者に良く知られており、そしてMASP-2活性に関連する疾患を診断し、そして/又は処理するために使用され得る。それらの核酸分子は、それらの臨床学的有用性の分野においてさらに論じられる。
【００７２】  本発明はまた、MASP-2ポリペプチドをコードする核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書に記載されるcDNA配列（配列番号３）は、他の種における相同ポリペプチドをコードする核酸、及びヒト又は他の哺乳類におけるMASP-2遺伝子のスプライス変異体を包含するそれらの核酸を同定するために使用され得る。従って、本発明は、それらの核酸分子を検出し、そして単離する方法を特徴とする。それらの方法を用いて、サンプル（例えば、核酸ライブラリー、例えばcDNA又はゲノムライブラリー）が、MASP-2−特異的プローブ（例えば、少なくとも12個の長さのヌクレオチドであるポリペプチド配列（配列番号２）をコードする、図６に示されるcDNA配列のフラグメント）と接触せしめられる。
【００７３】  プローブは、関連するポリペプチドをコードする核酸（又はその相補的配列）に対して選択的にハイブリダイズするであろう。MASP-2よりコードされるポリペプチドは他のセリンプロテアーゼに関連するので、用語“選択的にハイブリダイズする”とは、プローブが、他のセリンプロテアーゼをコードする核酸（又はその相補的配列）に対してよりも検出できるほど高い程度に、MASP-2をコードする核酸（又はその相補的配列）に結合する現象を言及するために使用される。
【００７４】  少なくとも12個（例えば、15,25,50,100又は200個）のヌクレオチドを含むことができるプローブは、いくつかの標準の方法のいずれかを用いて生成され得る（例えば、Ausubelなど., “Current Protocols In Molecular Biology, Vol.I",Green Publishing Associates, Inc., 及びJohn Wiley & Sons, Inc., NY, 1989を参照のこと）。例えば、プローブはPCR増幅方法を用いて生成され得、ここでオリゴヌクレオチドプライマーが、下記例４に記載されるように、核酸ライブラリーをスクリーンし、そしてそれにより、プローブにハイブリダイズする核酸分子（ライブラリー内の）を検出するために、プローブとして使用され得るMASP-2−特異的核酸配列（例えば、成熟MASP-2のN−末端をコードする核酸）を増幅するために使用される。
【００７５】  一本鎖核酸は、二本鎖がそれらの間で形成する場合、お互いハイブリダイズすると言われる。これは、１つの核酸が、他の配列の逆及び補体である配列を含む場合に発生する（この同じ配列が、ゲノムにおけるDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の天然の相互作用を生ぜしめ、そして“二重鎖”の配置に従う）。ハイブリダイズする領域間の完全な相補性は、二重鎖を形成するために必要とはされず；対合された塩基の数が使用されるハイブリダイゼーション条件下で二重鎖を維持するために十分であることが単に必要である。
【００７６】  典型的には、条件は、低い〜中位の緊縮性のものである。それらの条件は、完全に相補的な配列間の特定の相互作用を好むが、しかし完全には適合しない配列間でのいくらかの非特異的相互作用の発生を可能にする。ハイブリダイゼーションの後、核酸は、いくらかの非特異的相互作用により一緒に結合される二本鎖を解離するために、中位又は高い緊縮条件下で“洗浄”され得る（従って、それらの二本鎖を形成する核酸は完全には相補的ではない）。
【００７７】  当業界において知られているように、洗浄のための最適条件は、実験的に、しばしば緊縮性を徐々に高めることによって決定される。緊縮性に影響を及ぼすために変更され得るパラメーターは、主に温度及び塩濃度を包含する。一般的に、塩濃度が低く、且つ温度が高いほど、緊縮性は高い。洗浄は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度に等しいか、又は低い塩濃度を含む溶液を用いて、低い温度（例えば、室温）で開始され得る。続く洗浄は、同じ塩濃度を有する段階的に暖かな溶液を用いて行われ得る。他の手段として、塩濃度が低められ、そして温度が洗浄段階において維持され、又は塩濃度が低められ、そして温度が高められ得る。追加のパラメーターもまた変更され得る。例えば、不安定剤、例えばホルムアミドの使用が、緊縮条件を変更する。
【００７８】  核酸がハイブリダイズされる反応においては、所定のレベルの緊縮性を達成するために使用される条件は変化するであろう。お互い85％同一であるすべての核酸間での二本鎖の形成を可能にするであろう１組の条件は存在せず；ハイブリダイゼーションはまた、個々の核酸のユニーク特徴に依存する。配列の長さ、配列の組成（例えば、プリン様ヌクレオチドの含有量−対−ピリミジン様ヌクレオチドの含有量）、及び核酸のタイプ（例えば、DNA又はRNA）は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。さらなる考慮は、核酸の１つが固定されるかどうかである（例えば、フィルター上に）。
【００７９】  低い緊縮条件から高い緊縮条件への進行の例は、塩含有率がSSC（塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液；２×SSCは0.2×SSCよりも10倍、より濃縮されている）の相対的多量性として与えられる場合である。核酸は、２×SSC/0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム；界面活性剤）において42℃でハイブリダイズされ、そして次に、室温で0.2×SSC/0.1％SDS（低い緊縮性の条件のための）；42℃で0.2×SSC/0.1％SDS（中位の緊縮性の条件のための）；及び68℃で0.1×SSC（高い緊縮性の条件のための）により洗浄される。洗浄は、与えられる条件の１つのみを用いて行われ得、又は個々の条件が使用され得る（例えば、上記に列挙される順序で、それぞれ10〜15分間の洗浄）。洗浄のいずれか又はすべては反復され得る。上記に言及されたように、最適条件は変化し、そして実験的に決定され得る。
【００８０】  “緊縮条件”として考慮される第２組の条件は、ハイブリダイゼーションがChurch緩衝液（7%SDS, 0.5%NaHPO4, 1MのEDTA, 1%ウシ血清アルブミン）において50℃で行われ、そして洗浄が２×SSCにおいて50℃で行われるそれらの条件である。
検出されると、核酸分子は、多くの標準技法のいずれかにより単離され得る（例えば、Sambrookなど., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと）。
【００８１】  本発明はまた、（ａ）前述のMASP-2−関連のコード配列及び/又はそれらの補体（すなわち、“アンチセンス”配列）のいずれかを含む発現ベクター；（ｂ）コード配列の発現を方向づける調節要素（それらの例は下記に与えられる）に操作可能的に結合される前述のMASP-2−関連コード配列のいずれかを含む発現ベクター；（ｃ）MASP-2をコードする核酸配列に関係しない核酸配列、例えばレポーター又はマーカーをコードする分子を、MASP-2ポリペプチドをコードする配列の他に、含む発現ベクター；及び（ｄ）前述の発現ベクターのいずれかを含み、そしてそれにより、宿主細胞において本発明の核酸分子を発現する、遺伝子的に構築された宿主細胞を包含する。
【００８２】  組換え核酸分子は、可溶性MASP-2をコードする配列、成熟MASP-2、シグナル配列を有するMASP-2、又はMASP-2の機能的ドメイン、例えばセリンプロテアーゼドメイン、EGFドメイン、又はMBL−結合ドメインを含むことができる。十分な長さのMASP-2ポリペプチド、MASP-2のドメイン又はそのフラグメントが、下記のように、追加のポリペプチドに融合され得る。同様に、本発明の核酸分子は、MASP-2の成熟形、又は分泌を促進するポリペプチドをコードする形をコードすることができる。後者の場合、ポリペプチドは、典型的には、宿主細胞内のシグナル配列の除去により活性形に転換され得るプロタンパク質として言及される。プロタンパク質は、不活性配列の除去により、タンパク質の活性形に転換され得る。
【００８３】  上記に言及される調節要素は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：当業者に知られており、そして調節遺伝子発現を誘導するか又は他方では、調節する、誘発性又は非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び他の要素。そのような調節要素は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：サイトメガロウイルスhCMV即時初期遺伝子、SV40の初期又は後期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、ファージAの主要オペレーター及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御の領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α−接合因子のプロモーター。
【００８４】  同様に、核酸は、追加のポリペプチド配列、例えばマーカー又はレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成することができる。マーカー又はレポーター遺伝子の例は、次のものを包含する：β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（neo’，G418’）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、ヒドロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、lacZ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、緑色蛍光タンパク質（GFP）及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）。
【００８５】  本発明の実施に関連する多くの標準方法に関して、当業者は、マーカー又はレポーターの機能を付与することができる追加の配列の追加の有用な試薬を気づくであろう。一般的に、ハイブリッドポリペプチドは、第１部分及び第２部分を含み；前記第１部分はMASP-2ポリペプチドであり、そして前記第２部分は、例えば上記に記載されるレポーター又は免疫グロブリン不変領域である。
【００８６】  本発明のために使用され得る発現システムは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：本発明の核酸分子を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された微生物、例えば細菌（例えば、E. コリ及びB. サブチリス）；本発明の核酸分子を含む（好ましくは、MASP-2の核酸配列（配列番号３）を含む）組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス及びピチア）；本発明の核酸分子を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）により感染された昆虫細胞システム；組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）及びタバコモザイクウィルス（TMV））に感染された、又はMASP-2ヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）により形質転換された植物細胞システム；又は哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウィルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター及びワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構造体を有する哺乳類細胞システム（例えば、C0S, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38及びNIH3T3細胞）。
【００８７】  細菌システムいおいては、多くの発現ベクターが、発現される遺伝子生成物のために意図される使用に依存して、都合良く選択され得る。例えば、多量のそのようなタンパク質が、MASP-2ポリペプチドを含む医薬組成物の生成、又はそれらのポリペプチドに対する抗体を生ぜしめるために生成される予定である場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を方向づけることができるベクターが所望される。
【００８８】  そのようなベクターは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：E. コリ発現ベクターpUR278（Rutherなど.,EMBO J. 2:1791, 1953）、ここで挿入体のコード配列は、融合タンパク質で生成されるよう、lacZコード領域と整合してベクター中に個々に連結され得る；pINベクター（Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109, 1985; Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem 264: 5503-5509, 1989）；及び同様のもの。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現するために使用され得る。
【００８９】  一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続いて、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、クローン化された標的遺伝子生成物がGST成分から開放され得るよう、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むよう企画される。
【００９０】  昆虫システムにおいては、オートグラファ・カリホミカ（Autogarpha califomica）核ポリヒドロシスウィルス（AcNPV）が、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。このウィルスは、スポドブテラ・フルギペルダ（Spodoptera frngiperda）細胞において増殖する。挿入体のコード配列は、ウィルスの非必須領域（例えば、多面体遺伝子）中に個々にクローン化され、そしてAcNPVプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の制御下に配置され得る。
【００９１】  コード配列の好結果をもたらす挿入は、多面体遺伝子の不活性化、及び妨げられていない組換えウィルス（すなわち、多面体遺伝子によりコードされるタンパク質性コードを欠いているウィルス）の生成をもたらすであろう。次に、それらの組換えウィルスが、挿入された遺伝子が発現されるスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染するために使用される（例えば、Smithなど．，J.Virol.46: 584,1983; Smith, アメリカ特許第4,215,051号を参照のこと）。
【００９２】  哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、本発明の核酸分子は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び３分節リーダー配列に結合され得る。次に、このキメラ遺伝子が、インビトロ又はインビボ組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1又はE3）における挿入は、生存性であり、そして感染された宿主においてMASP-2遺伝子生成物を発現できる組換えウィルスをもたらすであろう（例えば、Logan and Shenk, Proc. Natl, Acad. Sci. USA81: 3655-3659, 1984を参照のこと）。特定の開始シグナルがまた、挿入された核酸分子の効果的な翻訳のために必要とされる。それらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接する配列を包含する。
【００９３】  完全な遺伝子又はcDNA、例えばそれ自体の開始コドン及び隣接する配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列の一部のみが挿入される場合、外因性翻訳制御シグナル、例えばATG開始コドンが供給されるべきである。さらに、開始コドンは、完全挿入体の翻訳を確保するために所望するコード配列の読み取り枠と接合して存在すべきである。それらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源、例えば天然及び合成起源のものであり得る。発現の効力は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等の包含により増強され得る（Bittnerなど．，Methods in Enzymol. 153: 516-544, 1987を参照のこと）。
【００９４】  さらに、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望する特定の態様で遺伝子生成物を修飾し、そしてプロセッシングする宿主細胞株が選択される。タンパク質生成物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセッシング（例えば、切断）が、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なった宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子生成物の後−翻訳プロセッシング及び修飾のための特徴的且つ特異的機構を有する、適切な細胞系又は宿主システムが、発現される外来性タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確保するために選択され得る。このためには、遺伝子生成物の主要転写、グリコシル化及びリン酸化の正しいプロセッシングのための細胞機能を有する真核宿主細胞が使用され得る。上記に列挙される哺乳細胞型は、適切な宿主細胞として作用するそれらである。
【００９５】  組換えタンパク質の長期の高収率生成に関しては、安定した発現が好ましい。例えば、上記MASP-2配列を安定して発現する細胞系が構築され得る。複数のウィルス起点を有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）、及び選択マーカーにより制御されるDNAにより形質転換され得る。外来性DNAの導入に続いて、構築された細胞は、富化された培地における１〜２日間の増殖、及び続いて、選択培地への交換を可能にされる。
【００９６】  組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そしてプラスミドのそれらの染色体への安定した組み込み、及び細胞系中にクローン化され、そして拡張され得る焦点物の形成のための増殖を可能にする。この方法は、好都合には、MASP-2を発現する細胞系を構築するために使用され得る。そのような構築された細胞系は、遺伝子生成物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価において、及び治療使用のためのMASP-2の生成のために特に有用であり得る。それらの方法はまた、実験又は治療目的のために宿主生物中に導入される細胞を修飾するために使用され得る。
【００９７】  多くの選択システムが使用され得る。例えば、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Wiglerなど．，Cell 11:223, 1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026, 1962）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyなど., Cell 22:817, 1980）遺伝子が、それぞれｔｋ-，hgprt-又はａｐｒｔ-細胞において使用され得る。
【００９８】  また、抗−代謝物耐性が、次の遺伝子のための選択に基づいて使用され得る：メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77: 3567, 1980: 0’  Hareなど．，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, 1981）；  マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan andBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 2072,1981）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Colberre-Garapinなど．，J. Mol. Biol. 150: 1,1981）；  及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreなど．，Gene 30: 147, 1984)。
【００９９】  他方では、いずれかの融合タンパク質が、発現される融合タンパク質に対する抗体を用いることによって容易に精製され得る。例えば、Janknechtなどにより記載されるシステムは、ヒト細胞系において発現される、変性されていない融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 8972-8976, 1991）。このシステムにおいては、興味ある遺伝子が、その遺伝子の読み取り枠が、６個のヒスチジン残基から成るアミノ末端標識に翻訳的に融合されるよう、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化される。組換えワクシニアウイルスにより感染された細胞化らの抽出物が、Ni2+−ニトロ酢酸−アガロ−スカラム上に負荷され、そしてヒスチジン標識されたタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液により選択的に溶出される。
【０１００】MASP-2ポリペプチド：
本発明のMASP-2ポリペプチドは、配列番号２に由来するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。さらに、本明細書に記載されるMASP-2ポリペプチドは、上記核酸分子のいずれかによりコードされるそれらであり、そしてMASP-2フラグメント、変異体、切断された形、及び融合タンパク質を包含する。それらのポリペプチドは、種々の用途、例えばMBLectin応答を調節できる他の細胞遺伝子生成物又は化合物の同定のための診断アッセイにおける試薬として、及びMBLectin経路の活性に関連する炎症及び一定の疾患（下記に記載される）の処理のために有用な医薬試験として、抗体の生成のために調製され得る。
【０１０１】  好ましいポリペプチド、例えば損なわれていないシグナル配列（配列番号２のアミノ酸１〜15から延長する）を有するポリペプチドに対応するポリペプチド、ヒトMASP-2ポリペプチドのポリペプチド（配列番号２のアミノ酸16〜686から延長する）の成熟形、及びMASP-2ポリペプチドの一部を表すポリペプチドは、実質的に純粋なMASP-2ポリペプチドである。通常の生理学的条件下で可溶性であるポリペプチドが特に好ましい。
【０１０２】  １つの態様のおいては、本発明はまた、MASP-2に対して機能的に同等であるポリペプチドを包含する。機能的同等物は、配列番号１に概略されるようなMASP-2アミノ酸配列のフラグメントのみを含んで成る。好ましい態様においては、MASP-2ポリペプチドは、下記のものから成る群から選択される：
i）配列番号１として同定される配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ii）20kDの分子質量を有する配列番号１として同定される配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
iii）配列番号２のアミン30〜444、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
【０１０３】  iv）52kDの分子質量を有する配列番号２のアミノ酸30〜444、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
v）配列番号２のアミン酸138〜296、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
vi）セリンプロテアーゼ活性を有する配列番号２に起因するアミン酸配列、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
vii）MBL補体経路機能についてのインビトロアッセイにおいてMASP-2活性を阻害できる、配列番号２に由来するアミン酸配列を含んで成るポリペプチド；
【０１０４】  viii）配列番号３のアミノ酸15〜671、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；
ix）配列番号２のアミン酸16〜296、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド；及び
x）配列番号２のアミノ酸30〜296、又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド。
【０１０５】  それらのポリペプチドは、それらが生物学的シスタムにおいてMASP-2の１又は複数の機能を実施できることにおいて、MASP-2に対して同等である。好ましいMASP-2ポリペプチドは、本明細書に記載されるMASP-2の十分に長い成熟ヒト形の活性の20％，40％，50％，75％，80％又は90％を有する。そのような比較は、一般的に、ポリペプチドの等濃度が使用され、そして比較される、生物学的活性のアッセイに基づかれる。比較はまた、得ることができる最大活性の50％に達するために必要とされるポリペプチドの量に基づかれる。
【０１０６】  機能的に同等のタンパク質は、例えば追加の、欠失された又は置換されたアミノ酸残基を含むそれらのタンパク質であり得る。置換は、関与する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づいて行われ得る。典型的には、お互いによる保存性置換を提供すると思われるアミノ酸が、本発明の要約に特定される。D−アミノ酸は、ポリペプチドの半減期を改良するために導入され得る。
【０１０７】  MASP-2（配列番号２）に対して機能的に同等であるポリペプチドは、当業者に良く知られているランダム突然変異誘発技法を用いて行われ得る（そして、得られる変異体MASP-2タンパク質が活性について試験され得る）。しかしながら、そのようなポリペプチドは、特定部位の突然変異誘発により生成されるであろう（再び、当業者に良く知られている技法を用いて）。それらのポリペプチドは、高められた機能、すなわちトMBLectin経路を活性化するより高い能力を有することができる。そのようなポリペプチドは、MBLectin経路の免疫機能の活性を増強するために使用され得る。
【０１０８】  機能的に同等のポリペプチドを企画するためには、保存される位置と可変位置との間を区別することが有用である。これは、種々の生物から得られたMASP-2cDNAの配列を一列整列することによって行われ得る。当業者は、保存されるアミノ酸残基が機能の保存のために必要であることを理解するであろう。従って、保存される残基は変更されないことが好ましい。
MASP-2コード配列内の突然変異は、選択された宿主細胞における発現のために適切であるMASP-2ペプチドを生成するために行われ得る。グリコシル化配列の導入はまた、変更された生物学的特徴を有するMASP-2ポリペプチドを生成するために使用され得る。
【０１０９】  本発明はまた、MASP-2又はその前駆体を含んで成るポリペプチド配列内の多形現象のアッセイ方法を特徴とする。これは、多くの技法により達成され得る。例えば、精製されたポリペプチドが、トリプシン消化にゆだねられ、そしてその得られるフラグメントが１又は２次元電気泳動により分析される。サンプルポリペプチドの分析からの結果が、既知の配列を用いての結果に比較される。また、分析は、１又は２次元電気泳動、続く、膜への分離されたタンパク質のトランスファー（ウェスターンブロット）による生物学的サンプル（例えば、血清又は他の体液）の分離を包含する。次に、膜が、MASP-2に対する抗体、続いてラベルされた第２抗体と反応せしめられる。染色パターンが、既知の配列又は修飾を有するサンプルを用いて得られるそのパターンと比較される。
【０１１０】  本発明のポリペプチドは、もう１つのポリペプチド、例えばマーカーポリペプチド又は融合パートナーに発現融合され得る。例えば、ポリペプチドは、細菌的に発現されたタンパク質の精製を促進するためにヘキサ−ヒスチジンに、真核細胞において発現されるタンパク質の精製を促進するために赤血球凝集素標識に融合され得る。本発明のMASP-2ポリペプチド、又はその一部がまた、変更され、その結果、それは免疫グロブリンFcドメインへの融合により長い循環半減期を有する（Caponなど．，Nature 337:525-531，1989）。同様に、高められた安定性をインビボで有する、MASP-2ポリペプチドのダイマー形が生成され得る。
【０１１１】  本発明のポリペプチドは、化学的に合成され得（例えば、Creighton,“Proteins: Structures and molecular Principles", W.H. Freeman & Co., NY, 1983）、又はたぶん、より好都合には、本明細書に記載のようにして、組換えDNA技法により生成され得る。追加の案内に関しては、当業者は、次の文献を調べる：Ausubelなど．，(前記)；Sambrookなど．，（“Molecular Cloning, A LaboratoryManual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）；  及び特に、化学的合成の例に関しては、Gait, M.J. Ed. （“Oligonucleotide Synthesis”, IRL. Press, Oxford, 1984）。
【０１１２】  本発明はまた、MASP-2活性を競争的に阻害できるポリペプチドを特徴とする。１つの観点においては、そのようなポリペプチドは、下記から成る群から選択され得る：
ｉ）配列番号２のポリペプチドのフラグメントを含んで成るポリペプチド、ここで前記ポリペプチドはMBL/MASP-2又はその機能的同等物の複合体化の競争インヒビターであり；
【０１１３】  ii）配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18又は19での１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により置換されており；
iii）配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18又は19での少なくとも２つのアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により置換されており；
iv）配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのargがもう１つのアミノ酸により置換されており；
【０１１４】  v）配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのargが小さな荷電されていないアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸により置換されており；
vi）配列番号３として同定される配列又はその機能的同等物を含んで成るポリペプチド、ここで位置１４でのargがgly及びalaから成る群から選択されたアミノ酸により置換されており；
vii）MASP-2又はその機能的相同体と会合できるマンナン−結合性レクチン（MBL）のフラグメントを含んで成るポリペプチド；及び
viii）MASP-2を選択的に結合する抗体。
【０１１５】  本発明はまた、MASP-2（及びそれをコードする遺伝子）と相互作用し、そしてそれにより、MASP-2の機能を変更するポリペプチドを特徴とする。相互作用するポリペプチドは、当業者に知られている方法を用いて同定され得る。１つの適切な方法は、タンパク質相互作用をインビボで検出する“２−ハイブリッドシステム”である（Chlenなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578, 1991）。この方法を実施するためのキットは、Clontech（Palo Alto, CA）から入手できる。
【０１１６】抗−MASP-2抗体：
ヒトMASP-2ポリペプチド（又は免疫原性フラグメント又は類似体）が本発明において有用な抗体を生ぜしめるために使用され得；そのようなポリペプチドは組換え方法により生成され得るか、又は合成され得る（例えば、“Solid Phase Peptide Synthesis”，  前記；Ausubelなど．，前記を参照のこと）。一般的に、ポリペプチドは、Ausubelなど．，前記に記載されるように、キャリヤータンパク質、例えばKLHにカップリングされ、アジュバントと共に混合され、そして宿主哺乳類中に注入され得る。また、前記キャリヤーはPPDであり得る。抗体は、ペプチド抗原親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。
【０１１７】  特に、種々の宿主動物が、MASP-2タンパク質又はポリペプチドによる注入により免疫化され得る。宿主動物は、ウサギ、マウス、テンジュクネズミ、ラット及び鶏を包含する。免疫学的応答を高めるために使用され得る種々のアジュバントは、宿主種に依存し、そしてフロイントアジュバント（完全及び不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック  ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールを包含する。実質的に有用なヒトアジュバントは、BCG（Bacille Calmette‐Guerin）及びコリネバクテリウム・パルビウム（Corynebacterium purvum）を包含する。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清に含まれる抗体分子の異種集団である。
【０１１８】  従って、本発明内の抗体は、ポリクローナル抗体及び、さらに、モノクローナル抗体、ヒト適合された又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、及びFab発現ライブラリーを用いて生成される分子、及びファージ表示技法により生成される抗体又はフラグメントを包含する。
特定の抗原に対する抗体の相同集団であるモノクローナル抗体は、上記MASP-2タンパク質及び標準のハイブリドーマ技法を用いて調製され得る（例えば、Kohlenなど．，Nature 256: 495, 1975: Kohlerなど., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976; Kohlerなど., Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976; Hammerlingなど., “Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma”, Elsevier, NY, 1981; Ausubel など.，前記を参照のこと）。
【０１１９】  特に、モノクローナル抗体は、Kohlerなど.,Nature 256: 495, 1975及びアメリカ特許第4,376,110号に記載のように、培養物における連続細胞系による抗体分子の生成を提供するいずれかの技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Kosborなど., Immunology Today 4:72, 1983; Coleなど．，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026, 1983）：及びEBV−ハイブリドーマ技法（Coleなど．，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983）により得られる。
【０１２０】  そのような抗体は、IgG，IgM，IgE，IgA，IgD及びそれらのいずれかのサブクラスを包含するいずれかの免疫グロブリンクラスのものであり得る。（鶏の場合、免疫グロブリンクラスはまた、IgYでもあり得る。）本発明のmAbを生成するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養され得る。インビボで高い力価のmAbを生成する能力が、これを現在好ましい生成方法にするが、しかしいくつかの場合、すなわち腹水からの標準の免疫グロブリンの存在が所望されない場合、又は論理的考慮に関与する場合、インビトロ生成が、生存動物中への癌細胞の導入を回避するために好ましいであろう。
【０１２１】  生成されると、ポリクローナル、モノクローナル又はファージ由来の抗体が、Ausubelなど．，前記に記載のように、標準の方法によるウェスターンプロット又は免疫沈殿分析により、特定のMASP-2認識について試験される。MASP-2を特異的に認識し、そしてそれに結合する抗体が本発明において有用である。例えば、そのような抗体は、動物により生成されるMASP-2のレベルをモニターするために（例えば、MASP-2の量又は非細胞位置を決定するために）、イムノアッセイにおいて使用され得る。また、抗体は、下記に論じられるように、MASP-2インヒビターとして使用され得る。
【０１２２】  好ましくは、本発明の抗体は、高く保存される領域外に存在し、そして基準、例えば高い頻度の荷電された残基により、たぶん抗原性であると思われるMASP-2タンパク質のフラグメントを用いて生成される。１つの特定の例においては、そのようなフラグメントは、PCRの標準技法により生成され、そして次に、pGEX発現ベクター中にクローン化される（Ausubelなど．，前記）。融合タンパク質は、E．コリにおいて発現され、そしてAusubelなど．，前記に記載のように、グルタチオンアガロース親和性マトリックスを用いて精製される。
【０１２３】  いくつかの場合、抗血清の低親和性又は特異性の可能性ある問題を最少にすることが所望される。そのような情況下で、２又は３個の融合体が個々のタンパク質のために生成され得、そして個々の融合体が少なくとも２匹のウサギ中に注射され得る。抗血清が、連続した、好ましくは少なくとも３回の追加免疫注射により生ぜしめられ得る。
抗血清がまた、組換えMASP-2タンパク質又は対照タンパク質、例えばグルココルチコイド受容体、CAT又はルシフェラーゼを免疫沈殿するその能力について調べられる。
【０１２４】  抗体は例えば、診断アッセイの一部として、生物学的サンプルにおけるMASP-2の検出に使用され得る。抗体はまた、MASP-2の発現又は局在化に対する候補体化合物の効果を測定するために、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。さらに、そのような抗体は、患者へのそれらの導入の前、正常な及び／又は構築されたMASP-2発現細胞を評価するために、記載される遺伝子治療技法に使用され得る。そのような抗体はさらに、異常MASP-2活性を阻害する方法に使用され得る。
【０１２５】  さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより“キメラ抗体”（Morrisonなど．，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1984; Neubergenなど．，Nature, 312; 604, 1984; Takedaなど．，Nature, 314: 452, 1984）の生成のために開発された技法が、使用され得る。キメラ抗体は、１つの分子であり、ここで異なった動物種、例えばネズミmAb由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン不変領域を有するそれらの種から、異なった部分が誘導される。
【０１２６】  他方では、一本鎖抗体の生成について記載される技法（アメリカ特許第4,946,778号、第4,946,778号及び第4,704,692号）は、MASP-2タンパク質又はポリペプチドに対する一本鎖抗体を生成するために適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を通してFv領域のH及びL鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドをもたらすことにより形成される。
【０１２７】  特定のエピトープを認識し、そしてそれを結合する抗体フラグメントは、既知技法により生成され得る。例えば、そのようなフラグメントは、次のものを包含するが、但しそれだけには限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(ab’)2フラグメント、及びF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFabフラグメント。他方では、Fab発現ライブラリーが、所望する特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの急速且つ容易な同定を可能にするために構成され得る（Huseなど., Science, 246: 1275, 1989）。
【０１２８】  MASP-2に対する抗体は、当業者は良く知られている技法を用いて、MASP-2の一部に類似する抗−イディオタイプ抗体を生成するために使用され得る（例えば、Greenspanなど., FASEB J. 7: 437, 1993; Nissinoff, J. immunol. 147: 2429, 1991を参照のこと）。例えば、MASP-2に結合し、そしてMASP-2のリガンドの結合を競争的に阻害する抗体は、MASP-2のリガンド結合ドメインに類似し、そして従って、MASP-2、例えばMBLのリガンドを中和する抗−イディオタイプを生成するために使用され得る。そのような中和抗−イディオタイプ抗体又はそのような抗−イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントが治療レジメに使用され得る。
【０１２９】  抗体は、当業界において知られている方法によりヒト適合化され得る。例えば、所望する結合特異性を有するモノクローナル抗体は商業的にヒト適合化され得る（Scotgene, Scotiand: Oxford Molecular, Palo Alto, CA）。十分なヒト抗体、例えばトランスジェニック動物において発現されるそれらの抗体はまた、本発明の特徴である（Greenなど., Nature Genetics 7: 13-21, 1994; また、アメリカ特許第5,545,806号及び第5,569,825号を参照のこと；それらの両者は引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】  抗−MASP-2抗体が使用される、本明細書に記載される方法は、下記障害の症状を示す患者を診断するために、臨床学的設定に便利に使用され得る、少なくとも１つの特異的MASP-2ヌクレオチド配列又は本明細書に記載される抗体試薬を含んで成る、予備包装された診断キットを用いて行われ得る。
【０１３１】MASP-2の定量アッセイ：
単なる例として、定量アッセイが、体液又は器官（生検）抽出物におけるMASP-2の濃度の評価のために考案され得る。そのようなアッセイは、液相又は固相であり得る。例は競争性及び非競争性ELISAである。後者の例として、マイクロタイターウェルが、抗−MASP-2抗体により被覆され、サンプルと共にインキュベートされ、そしてMASP-2の存在が酵素ラベルされた抗体、続いて着色された化合物を沈殿する基質により可視化される。他方では、ラベル、例えばユウロピウムが使用され、そして検出が時間分解された蛍光分析法の使用により行われる。
【０１３２】  単独で又はMBL/MASP複合体の一部として、MASP-2の機能的活性のアッセイがいくつかの方法により行われ得る。MBL/MASP-2合体についての試験の例として、試験サンプルがマンナン−被覆されたマイクロウェル上に適用され、そしてC4がC4-分解活性を評価するために添加され、又はC3が生成されるC3コンバーターゼのC3の分解活性を評価するために添加される。MBL/MASP複合体の一部として存在しないMASP-2のアッセイが同様に行われるが、しかしMBLが、マンナン−被覆されたウェルへのこの添加の前、マイクロウェル又はサンプルのいずれかに添加される。MBLの添加の前、サンプルはMBL及びMBL/MASP-1及びMBL/MASP-2複合体を、ビーズ結合される固相マンナンによる処理により、又は固相抗−MBL抗体により、又は前記複合体を沈殿するが、しかし上清液にMASP-2を残す適切な濃度の沈殿剤、例えばPEGによる処理により消耗される。アッセイは、従来の補体活性化経路及び他の補体活性化経路からの妨害を最少にするか又は排除する条件下で行われる。
【０１３３】  MASP-2の活性又はMASP-2を排除するアッセイが、個人、特に感染又は炎症性疾患を有するそれらの個人からのサンプルにおける診断及び処理目的のために使用され得る。
【０１３４】治療のためのMASP-2：
特許請求の範囲において特定される成分の治療使用は、MASP-2における構成的又は一時的欠失が個人を１又は複数の感染に対して敏感に対する情況下で、又は個人が確立された感染を中和できない情況下で適用され得る。特異、本発明は、感染の処理のための薬剤の調製のためへのMASP-2の使用に関する。好ましくは、MASP-2欠失の個人がMASP-2により処理されたとしても、又は血清における正常MASP-2活性を有する個人も処理され得る。
【０１３５】  本発明のさらなる態様においては、MASP-2は、低MBL血清レベルを有する個人における感染の処理のための薬剤の調製のために使用され得る。そのような態様においては、医薬組成物は好ましくは、さらに、少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（MBL）サブユニット、又は前記少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（MBL）サブユニットを含んで成る少なくとも１つのマンナン−結合性レクチン（MBL）オリゴマーを含んで成る。他方では、MASP-2及びMBLは、キットの一部として投与され得る。
【０１３６】  好ましくは、本発明のMBLオリゴマーは、MBLのテトラマー、ペンタマー及び／又はヘキサマーから成るオリゴマー群から選択される。MBLは、組換え的に生成されるか、又は精製された天然に存在するMBLであり得る。例えば、MBLは、引用により本明細書に組み込まれる特許出願PCT/DK00/00246号又はPCT/DK00/00247号に開示されるMBL種のいずれかであり得る。本発明の低MBL血清レベルは好ましくは、500ng/ml以下のMBL血清レベル、より好ましくは100ng/ml以下のMBL血清レベル、さらにより好ましくは50ng/ml位かのMBL血清レベルである。
【０１３７】  また、MASP-2は、投与されるMBLのために利用できる十分な量のMASP-2を確保するために、血清MBLレベルとは無関係にMBL処理を受ける個人にも投与され得る。
MASP-2又はMBL/MASP複合体は、個人の免疫防御を改良するために、静脈内注入により投与され得る。
【０１３８】  本発明者は、MASP-2がMBL/MASP複合体の強力な抗菌活性のために必要とされ、そして従って、遺伝的に決定されるか又は獲得されたMASP-2の欠失が、感染に対する個人の耐性及び確立された感染を攻撃する能力を不生にするであろうと信じている。天然の又は組換えMASP-2による再構成は、そのような情況下での有用な処理療法である。組換えMASP-2は、活性を調節するために、完全な分子の形、分子の一部、又は他の構造体にいずれかの手段により結合される完全な分子又はその一部の形で存在することができる。組換え生成物は、そのようなことが所望される場合、増強された活性又は低められた活性を得るために、天然の分子と構造的同一であるか、又はわずかに変性され得る。
【０１３９】  天然の又は組換えMBLによる再構成治療は、受容体がMBL/MASP活性の発現のための十分なMASP-2を有することを必要とする。従って、MASP-2は、患者が不十分なMASP-2活性を有する場合、治療用調製物に含まれるべきである。
MASP-2は好ましくは、50ng/ml〜100μg/ml、好ましくは100ng/ml〜800μg/ml、より好ましくは500ng/ml〜500μg/ml、さらにより好ましくは750ng/ml〜250μg/ml、さらにより好ましくは１μg/ml〜100μg/ml、さらにより好ましくは２μg/ml、最も好ましくは２μg/ml〜10μg/mlの処理されるべき個人の血清におけるMASP-2の濃度をもたらす用量で投与される。
本発明の医薬組成物により処理され得る感染は、いずれかの感染剤による感染であり得る。例えば、感染は、微生物種により引き起こされ得る。
【０１４０】  微生物種は菌類；酵母、細菌又は寄生体であり得る。
本発明の細胞は、次のものから成る群から選択され得る：アクロモバクター・キシロソキシダン（Achrombacter xylosoxidans）、A. カルコアセチカス（A. calcoaceticus）、好ましくはA. アニトラタス（A. anitratus）、A. ハエマリチカス（A. haemlyticus）、A. アルカリゲネス（A. alcaligenes）、及びA. イオフィ（A. iwoffii）、アクチノマイセス・イスラエリ（Actinomyces israelii）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Aeromones hydrophilia）、アルカリゲネス（Alcaligenes）種、好ましくはA. フェエカリス（A. faecalis）、A. オドランス（A. odorans）及びA. デニトリフィカンス（A. denitrificans）、アリゾナ・ヒンスハウィ（Arizona hinshawii）、
【０１４１】  バチラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、B. セレウス（B. cereus）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragllis）、B. メラニノゲニカス（B. melaninogenicus）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドリフェリ（Borrelia burgdorfeni）、B. レキュレンチス（B. recurrentis）、ブルセラ（Brusella）種、好ましくはB. アボルタス（B. abortus）、B. スイス（B. suis）、B. メリテンシス（B. melitensis）及びB. カニス（B. canis）、カリマトバクテリム・グラヌロマチス（Calymmatobacterium granulomatis）、カムピロバクター・フェタス ssp. インテスチナリス（Campylobacter fetus ssp. Intestinalis）、
【０１４２】  カムピロバクター・フェタス ssp. ジュジュニ（Campylobacter fetus SSp. Jejuni）、クラミジア（chlamydia）種、好ましくはC. プシタシ（C. psitaci）及びC.トラコマチス（C. trachomatis）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium riolaceum）、シトロバクター（Citrobacter）種、好ましくはC. フレウンジ（C. freundii）及びC. ジベルサス（C. diversus）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、C. ペルフリンゲンス（C. perfringens）、C. ジフィシレ（C. difficile）、C. テタニ（C. tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）、C. ウレセランス（C. ulcerans）、C. ハエモリチカム（C. haemolyticum）及びC. シュードツベルキュロシス（C. pseudotuberculosis）、
【０１４３】  コキシエラ・ブメチ（Coxiella bumetii）、エトワルドシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、エンテロバクター（Enterobacter）、好ましくはE. クロアカエ（E. cloacae）、E. アエロゲネス（E. aerogenes）、E. ハフンラエ（E. hafnlae）（また、ハフニア・アルビイ（Habnia alvei）とも称する）、及びE. アグロメランス（E. agglomerans）、エリスルペロスリックス・リヒュスロパチアエ（Eryslpelothrix rhuslopathiae）、エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalls）、
【０１４４】  ハエモフィラス・デュクレイ（Haemophillus ducreyi）、H. インフルエンザエ（H. influenzae）、ヘリコバクター（Helicobacter）種、クレブシエラ（Klebsiella）種、好ましくはK. プネウモニアエ（K. pneumouiae）、K. オザエナエ（K. ozaenae）、K. リノヌクレロマチス（K. rhinoscleromatis）、レジオネラ（Legionella）種、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、モラキセラ（Moraxella）種、好ましくはM. ラキュナタ（M. lacunata）及びM. オスロエンシス（M. osloensis）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、M. レプラエ（M. leprae）、M.ツベルキロシス（M. tuberculosis）、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、好ましくはM. プネウモニアエ（M. pneumoniae）、
【０１４５】  ネイセリア・ブノルホエアエ（Neisseria gonorrhoeae）、N. メニンギチジス（N. meningitidis）、１カルジア（Nocardia）種、好ましくはN. アステロイデネ（N. asteroidae）及びN. ブラシリエンシス（N. brasiliensis）、パステルレリア・ハエモリチカ（Pasterurelia haemolytica）、P. ムルトシダ（P. multocida）、ペプトコーカス・マグナス（Peptococcus magnus）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、プネウモコシ（Pnumococci）、プロテウス（Proteus）種、好ましくはP.ミラビリス（P. mirabilis）、P. バルガリス（P. vulgaris）、P. レチゲリ（P. rettgeri）及びP. モルガニ（P. morganii）（また、それぞれ、プロビデンシア・レトゲリ（Providencia rettgeri）及びモルガネラ・モルガニル（Morganella morganil）とも呼ばれる）、
【０１４６】  プロビデンシア（Providencia）種、好ましくはP. アルカリファシエンス（P. alcalifaciens）、プロビデンシア（Providencia）種、好ましくはP. アルカリファシエンス（P. alcalifaciens）、P. スツアルチ（P. stuartii）及びP. レトゲリ（P. rettgeri）（また、プロテウス・レトゲリ（Proteus rettgeri）とも称する）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、P. マレイ（P. mallei）、P. シュードマレイ（P. pseudomallei）、リケツシア（Rickettsia）、ロカリマイア・ヘンセラエ（Rochalimaia henselae）、サルモネラ（Salmonella）種、好ましくはS. エンテリジス（S. enteridis）、S. チピ（S. typhi）及びS. デルビイ（S. derby）、及び最も好ましくは、サルモネラDT104型のサルモネラ種、セラチア（Serratia）種、S. マルセスセンス（S. marcescens）、シゲラ、
【０１４７】  シセンテリアエ（Shigella dysenteriae）、S. フレクシネリ（S. flexneri）、S. ボイジ（S. boydii）及びS. ソネイ（S. sonnei）、スピリラム・ミノル（Spirillum minor）、スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、S. エピデルミジス（S. epidermidis）、S. サプロフィチカス（S. saprophyticus）、ストレプトバシラス・モニリホルミス（Streptobacillus moniliformis）、ストレプトコーカス（Streptococcus）、好ましくはS. ファエカリス（S. faecalis）、S. ファエシウム（S. faecium）、及びS. デュランス（S. durans）、ストレプトコーカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalectiae）、S. プネウモニアエ（S. pnoeumoniae）、S. ピロゲネス（S. pyogenes）、
【０１４８】  トレポネマ・カラテウム（Treponema carateum）、トレポネアム・パリダム（Treponeam pallidum）、T. ペルテニュ（T. pertenue）、好ましくはT. パリダム（T. pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrlo cholerae）、V. バラハエモリチカス（V. parahaemolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）及びY. ペスチス（Y. pestis）。
【０１４９】  本発明の寄生体は、次のものから成る群から選択され得る：マラリア（Malaria）（プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）、P. ビバックス（P. vivax）、P. マラリアエ（P. malariae））、スキストソメス（Schistosomes）、トリパノソメス（Trypanosomes）、レルシマネア（Lelshmania）、フィラリアル・レマトデス（Filaria nematodes）、トリコモニアシス（Trichomoniasis）、サルコスポリジアシス（Sarcosporidiasis）、タエニア（Taenia）（T. サギナタ（T. saginata）、T. ソリウム（T. solium））、レイスマニア（Leishmania）、トキソプラスマ・ゴンジ（Toxoplasma gondii）、トリキネロシス（Trichinelosis）（トリキネラ・スピラリス（Trichinella spiralis））又はコシジオシス（Coccidiosis）（エイメリア（Eimeria）種）。
【０１５０】  菌類は、クリプトコーカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）、カルジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ススペルギラス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）及びコシジオイドマイコシス（Coccidioidomycosis）から成る群から選択され得る。
１つの好ましい態様においては、細菌種は、少なくとも１つの抗生物質薬剤に対して耐性であり得る。例えば、細菌種は、多耐性であり得る。１つの例においては、細菌種は病原性である。
本発明のもう１つの態様においては、感染は、ウィルスによる感染であるウィルス感染である。
【０１５１】  本発明のウィルスは、下記のものから成る群から選択され得る：アデノ関連ウィルス、アデノウィルス、鳥類感染性気管支炎ウィルス、バキュロウィルス、水痘、コロナウィルス、サイトメガロウィルス、ジステンパーウィルス、腸ウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ネコ白血病ウィルス、フラビウィルス、口蹄疫ウィルス、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、E型肝炎ウィルス、疱疹ウィルス、単純庖疹ウィルス、インフルエンザウィルス、HIV-1、HIV-2、HTLV1、A及びB型インフルエンザウィルス、Kunjinウィルス、ラッサ熱ウィルス、LCMV（リンパ球脈絡髄膜炎ウィルス）、レンチウィルス、麻疹ウィルス、メンゴウィルス、モルビルウィルス、ミクソウィルス、
【０１５２】  乳頭種ウィルス、パロウィルス、パラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、パルボウィルス、Pokoウィルス、ポリオウィルス、ポリオマー腫瘍ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、狂犬病ウィルス、レオウィルス、RSウィルス、レトロウィルス、ライノウィルス、牛疫ウィルス、ロタウィルス、Semliki森林ウィルス、センダイウィルス、シミアンウィルス４０、シンドビスウィルス、SV5、ダニ媒介脳炎ウィルス、トガウィルス（風疹、黄熱病、デング熱）、ワクシニアウィルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス及び水癌性口炎ウィルス。
【０１５３】  １つの好ましい態様においては、ウィルスは、レトロウィルス、例えばヒト免疫欠損ウィルスである。
MASP-2についてのアッセイ：
MASP-2（又はMASP-2インヒビター）による治療は通常、患者からの血清又は血漿におけるMASP-2の推定により進められるべきである。そのようなアッセイの例は、下記に記載される。
【０１５４】MASP-2抗原についてのアッセイ：
MASP-2タンパク質は便利には、標準の免疫学的方法の１つを用いて、抗原として推定される。
単なる例として、MASP-2の定量TRIFMA（時間分解された免疫蛍光アッセイ）を、１）１μgの抗−C'MASP-2抗体によるマイクロタイターウェルの被膜；２）Tween-20による阻止；３）試験サンプル、例えば希釈された血漿又は血清サンプルの適用；４）Eu−ラベルされた抗−N' MASP-2抗体の適用；５）増強溶液（Wallac Ltd）の適用；６）時間分解された蛍光計上でのEuの読み取りにより構成した。
【０１５５】  （ELISAによる評価は、同様にして、例えば段階４においてビオチン−ラベルされた抗−N'MASP-2；段階５においてアルカリホスファターゼーラベルされたアビジンを用いることにより；６）基質の適用；及び７）色彩の強度を読み取り行われ得る。）個々の段階の間で、プレートは室温でインキュベートされ、そして洗浄された（但し、段階６と７との間は除く）。検量線が、任意には、1ml当たり１単位のMASP-2を含むと言われる、プールされた正常血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。この第１段階のMASP-2アッセイに使用される抗体は、合成ペプチドに対して生ぜしめられ、そして生来のMASP-2とは良好には反応されなかった。従って、サンプルが、煮沸水浴上で５分間、SDSにより前処理され、そしてSDSが、アッセイの前、非イオン性界面活性剤（Triton X-100）により中和された。アッセイのさらなる進行は、生来のMASP-2と反応する抗体を使用し、SDS処理を不必要にする。
【０１５６】  アッセイは、天然の又は組換えMASP-2又はその一部と反応する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体又は組換え抗体を用いて、同様にして構成され得る。
損なわれていないMASP-2と又は活性化生成物と選択的に反応する抗体の使用を通して、又は分子の種々の部分に対する抗体の組合せを通して、アッセイは、MBLectin経路のインビボ活性化の評価のために構成され得る。それらのアッセイは、この経路の活性化により引き起こされる炎症の決定のために有用であろう。
MBL/MASP合体のMASP-2活性についてのアッセイ：
【０１５７】  MASP-2は、補体システムを活性化するその能力により評価され得る。C4がMASP-2により分解され得る場合、活性チオールエステルが露出され、そしてC4が求核基近くに共有結合されるようになる。従って、C4bの実質的な部分が、被覆されたプラスチック壁に結合されるようになり、そして抗−C4抗体により検出され得る。従って、単独で、又はMBL/MASP合体の一部のMASP-2の機能的活性のアッセイは、いくつかの方法により行われ得る。C4を分解するMBL/MASP-2の活性は、MASP-2を検出するための次の方法によりアッセイされ、ここでMASP-2活性についてのアッセイを含んで成る前記方法は、
【０１５８】  −結合されたMBLを獲得する固相に、予定された量のMBLを含んで成るサンプルを適用し；
−前記結合されたMBLに予定された量のMASP-2を適用し；
−前記複合体に少なくとも１つの補体因子を適用し；
−分解された補体因子の量を検出し；
−前記MASP-2の量と前記分解された補体因子の量とを相関し；そして
−MASP-2の活性を決定するか；又は
【０１５９】  −結合された複合体を獲得する固相に、予定された量のMBL/MASP-2複合体を含んで成るサンプルを適用し；
−前記複合体に少なくとも１つの補体因子を適用し；
−分解された補体因子の量を検出し；
−前記MASP-2の量と前記分解された補体因子の量とを相関し；そして
−MASP-2の活性を決定する段階を含んで成る。
【０１６０】  MASP-2活性についての定量的TRIFMAが、１）100μlの緩衝液中、１/μgのマンナンによりマイクロタイターウェルを被覆し；２）Tween-20により阻止し；３）試験サンプル、例えば希釈された血漿又は血清サンプルを適用し；４）５μg/mlでの精製された補体因子C4を適用し；５）37℃で１時間インキュベートし；６）Eu−ラベルされた抗−C4抗体を適用し；７）増強溶液を適用し；そして８）時間分解された蛍光計によりEuを読み取ることによって構成された。（ELISAによる評価は、同様にして、例えば段階６においてビオチン−ラベルされた抗−Ｃ４を適用し；７）アルカリホスファターゼーラベルされたアビジンを適用し；８）基質を適用し；そして９）色彩強度を読み取ることによって行われ得る。）
【０１６１】  個々の段階の間で、プレートは室温でインキュベートされ、そして洗浄され、但し段階７と８との間は除く。検量線は、任意には、1ml当たり１単位のMBL/MASP-2活性を含むと言われる、１つの選択された正常血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。アッセイは、従来の又は他の補体活性化経路によるC4の活性化を妨げる条件下で行われる。C4の活性化は、セリンプロテアーゼインヒビターベンズアミジンにより完全に阻害された。従来の補体経路の活性化は好ましくは、アッセイの産物を減じるために阻害される。
【０１６２】  好ましくは、阻害は高いイオン強度でアッセイを行うことによって行われ、ここで塩濃度は、0.2M以上、例えば2.5M以上、例えば0.3M〜10M、例えば0.5M〜5M、例えば0.7M〜2M、例えば0.9M〜2M、例えば1.0M以上である。使用される塩は、アッセイのために適切ないずれか１又は複数の塩、例えばNaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaI，KCl，MgI2，CaI2，NaBr，KBr，MgBr2，CaBr2，Na2S2O3，(NH4)2SO4及びNH4HCO3から選択された塩であり得る。従来の経路の阻害は好ましくは、MBL/MASP複合体を妨げないが、しかしC1qrs複合体を破壊する。
【０１６３】  他の経路の阻害は、アッセイを行う前、サンプルを、少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも20倍又はそれ以上に希釈することによって行われ得る。
【０１６４】遊離MASP-2活性の評価についてのアッセイ：
MBL−欠失個人からのサンプルにおけるMASP-2活性の評価は、MASP−フリ−BMLにより被覆されたウェル上で行われる。MBLを有する個人からのサンプルにおける遊離MASPの評価が、まず、セファロース−結合されたマンナンと共にインキュベートすることによって（10倍に希釈された血漿又は血清300μlのビーズと共にインキュベートされる）、MBL/MASP-1及びMBL/MASP-2複合体を除去し、そして次に、上清液を分析することによって行われる。
【０１６５】  TRIFMAホルメートにおいて行われるアッセイは次の通りにして進行する：１）100μlの緩衝液中、１μlのマンナンによりマイクロタイターウェルを被覆し；２）Tween-20により阻止し；３）100ng/mlのMASP−フリーMBLと共に、緩衝液中、1000倍希釈度でのサンプルをインキュベートし、そしてウェル当たり100μlの混合物を適用し；４）4℃で一晩インキュベートし；４）洗浄し、そして５μg/mｌでの精製された補体因子C4を適用し；５）37℃で１時間インキュベートし；６）Eu−ラベルされた抗−C4抗体を適用し；７）増強溶液を適用し；そして８）時間分解された蛍光分析法によりEuを読み取る。
【０１６６】  （ELISAによる評価が、同様にして、例えば段階６においてビオチン−ラベルされた抗−C4を適用し；７）アルカリホスファターゼ−ラベルされたアビジンを適用し；８）基質を適用し；そして９）色彩強度を読み取ることによって行われ得る。）検量線が、任意には、1ml当たり１単位のMASP-2活性を含むと言われる、１つの選択されたMBL−欠失血漿の希釈溶液を用いて構成され得る。アッセイは、従来の又は他の補体活性化経路によりC4の活性化を妨げる条件下で行われる（上記を参照のこと）。
【０１６７】MASP-2活性の阻害：
MASP-2の生物学的活性のインヒビターが、MASP-2の補体活性化活性及び炎症活性を制御するために使用され得る。そのようなインヒビターは、C2又はC4の標的構造を表す基質類似体であり得る。インヒビターは、天然の又は修飾されたペプチド、又はMASP-2の活性を競争的に又は非競争的に阻害するいずれかの有機分子のものであり得る。インヒビターは、短い又は長い時間、循環にとどまるよう変性され、そして注射により又は経口的に与えられるよう構成され得る。インヒビターは、化学的又は酵素的方法により、天然の又は組換えMASP-2から生成されるMASP-2のフラグメントであり得る。インヒビターは、天然に存在する短形のMASP-2であり得る。インヒビターは、可溶性形で存在するか、又は固相にカップリングされ得る。固相は、体外血液又は血漿流動装置に使用される適合表面であり得る。
【０１６８】  微生物炭水化物又は内因性オリゴ糖は、MBL/MASP複合体の所望しない活性化を誘発し、損傷性炎症応答をもたらすことができる。この病理生理学的活性は、MASP-2活性のインヒビター、例えばPefablocの投与により低められ得る。また他の酵素インヒビター（PMSF，ベンズアミジン、等）が、MASP-2活性についてTRIFMAにおいてアッセイされる場合、効果的であることがわかっている。明らかに、インビボ使用のためのインヒビターを企画する場合、毒性が主な考慮であり、そして高い特異性のインヒビターが広い反応性のインヒビターよりも低い毒性であると思われる。特異的インヒビターは、補体因子C4又はC2分子上の標的構造体を表す、ペプチド、ペプチド類似体又はペプチド誘導体を用いて生成され得る。
【０１６９】  もう１つのタイプのインヒビターは、MASP-2の活性部位又はMASP-2上の他の構造体に対する抗体（又は抗体のフラグメント）に基づかれ、従ってMASP-2の活性を阻害する。MASP-2に対する抗体は、好ましくは、上記で論じられた抗体である。インヒビターはまた、MASP-1によりもたらされるが、MASP-2の活性化の阻害に向けられ、すなわちMASP-2上のMASP-1のための標的構造体がこのタイプの適切なインヒビターである。もう１つのタイプのインヒビターは、MBLへのMASP-2の結合を妨げ、そしてそれにより、MASP-2の活性化を妨げる。MASP-2のN−末端の20kDaフラグメントが、このタイプの適切なインヒビターである。より特定には、MBLへのMASP-2の結合を仲介するポリペプチド鎖の正確な部分を特定し、そして合成ペプチド又は類似する構造体をインヒビターとして使用することができる。インヒビターは、L−アミノ酸によりD−アミノ酸を置換され得る。
【０１７０】  また、インヒビターは、選択分子として、MASP-2又はそのフラグメントを用いて、SELEX（指数的増強によるリガンドの組織的進展）により単離されたRNA又は一本鎖DNAであり得る。MASP-2のリーダー配列は本出願の他の部分に示されている。
さらに、MASP-2のインヒビターは、セリンプロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニンである。
MASP-2活性は、MASP-1の作用、又はMASP-1の活性を刺激するいずれか他の物質を通してのプロ酵素形のMASP-2の活性化されたMASP-2への転換により制御され得る。
【０１７１】実施例
例１．MASP-2の同定
カルシウム依存性態様で炭水化物に結合する、ヒト血漿タンパク質及びタンパク質複合体（すなわち、レクチン及び会合タンパク質）を、マンナン−及びN−アセチルグルコサミン−誘導体化されたセファロースビーズでの親和性クロマトグラフィーにより精製した。EDTA及び酵素インヒビターを含む緩衝液により希釈された、プールされたCPD−血漿（2.5L）を、セファロース2B CL及びマンナン−セファロールに通した。トロンビンインヒビターPPACK（D−フェニルアラニン−プロイル−アルギニル−クロロメチルケトン）及びCaCl2を添加した。そのプールを、セファロース2B−CL及びマンナン−セファロースに通して、そしてマンナン−セファロースにカルシウム依存的に結合するタンパク質を、EDTA服務緩衝液により溶出した。溶出液を再石灰化し、GlcNAc−セファロースカラムに通し、上記のように溶出し、20mlのレクチン調製物を得た。
【０１７２】  このタンパク質調製物を、SDS−PAGEにより、及びPVDF−膜上にブロットすることにより分析した。ウシレクチン調製物（25）に対して生ぜしめられた鶏抗体いよるブロットの進展は、52kDaのMrを有するタンパク質、及び32kDaでのMBLを表した。52kDaのバンドを、NH2−末端アミノ酸配列分析にゆだねた。配列は、前に記載されたMASP（MASP-1）の配列との類似性を示した。19個のNH2−末端アミノ酸を表す合成ペプチドに対して生ぜしめられた抗体（抗−N’ MASP-2抗血清）は、52kDaの分子、及び20kDaに対する移動度を有する分子を認識した（図１、レーン１）。非還元条件下で、76kDaのポリペプチドを、抗−N’−MASP-2抗血清を用いて検出し、鎖内ジスルフィド結合の存在を示した。20kDaのポリペプチドは、52kDaのポリペプチドと同じNH2−末端配列を有することが見出され、そして後者の切断された形を、たぶん表す。直接的に決定されたアミノ酸配列（NH2−末端、及び内部ペプチドのそれらの末端）が図６に示される。
【０１７３】  非還元条件下での第１の寸法及び還元条件下で第２の寸法を有する２寸法SDS−PAGEは、76kDaのMrを有するジスルフィド結合されたタンパク質の一部である52kDaのポリペプチドを示した。前記タンパク質の残りの部分をたぶん表す、31kDaのポリペプチド（図１、レーン３）はまた、タンパク質のCOOH−末端部分における配列を表す合成ペプチドに対して生ぜしめられた抗血清（抗−C’ MASP-2）により、76kDaのタンパク質の一部として認識された（cDNA配列決定技法により測定された；下記を参照のこと）。非還元条件下で抗−N’ MASP-2抗体に関して見出される76kDaのバンドもまた、抗−C’ MASP-2抗体により認識された（図１、レーン４）。
【０１７４】  図１ｂは、非還元条件下での第１の寸法を包含する、２寸法でのSDS−PAGEを示す。レーンを切断し、ジチオトレイトール（DTT）を含むサンプル緩衝液においてインキュベートし、もう１つのSDS−PAGEゲル上に置き、そして電気泳動の後、ゲルをブロットし、そしてブロットを抗−N’ MASP-2抗体により進行せしめた。分子量マーカーの位置が示される。
【０１７５】例２．マンナン−結合性レクチンに会合したセリンプロテアーゼに対する抗体の調整
BCG（Bacillus Calmette Guerinワクチン）により感作された動物を、C. Koch，The State Serum Institute, Copenhagenに従って、PPD（ツベルクリン精製されたタンパク質誘導体）に結合された合成ペプチドにより免疫化した。抗−N’  MASP-1、抗−C’  MASP-1及び抗−N’ MASP-2と称する抗体は、それぞれ、MASP-1の最初の19個のアミノ酸残基、MASP-1の最後の19個のアミノ酸残基、及びMASP-2の最初の19個のアミノ酸残基に対応するペプチドにより免疫化されたウサギからであった。鶏抗−C’ MASP-2抗体は、MASP-2のC末端部分における配列を表す２種のペプチド（残基505〜523及び538〜556）の混合物により免疫化された鶏からであった。すべてのペプチドは、カップリングのための追加のC末端システムを有した。抗体及び標準鶏IgGを、卵黄から精製した（26）。
【０１７６】  モノクローナル抗−MBL抗体、IgG1−κ（クロン131−1）及び対照IgG1−κ（クローンMOPC21）を、プロテインA親和性クロマトグラフィーにより精製した。F(ab’)2ウサギ抗−ヒトC4及びF(ab’)2ウサギ抗−ヒトC1qを、ウサギ抗−ヒトC4及びウサギ抗−ヒトC1qのペプシン消化により生成した（DAKO, Glostrup, Denmark）。ウェスターンブロットの染色に関しては、抗体を１μg/mlで使用した。結合された鶏抗体を、ウサギ抗−鶏IgG、続いてペルオキシダーゼ−ラベルされたヤギ抗−ウサギIgG、及び増強された化学ルミネセンス技法を用いての進行により可視化した。結合されたマウス及びウサギ抗体を、それぞれペルオキシダーゼ−ラベルされたウサギ抗−マウスIgG及びペルオキシダーゼ−ラベルされたヤギ抗−ウサギIgGにより可視化した。
【０１７７】例３．52kDa及び20kDaのポリペプチドのアミノ酸配列決定
レクチン調製物を濃縮し、SDS−PAGEにゆだね、そしてPVDF膜にトランスファーした。２つのストリップを、抗−ビオチンレクチン抗体により進行せしめた（25）。ブロットの残りを、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。全クーマシー染色されたタンパク質の約5％を表すことが判断されている、免疫染色された52kDaのバンドに対応するバンドを、切断し、そしてApplied Biosystemsタンパク質配列決定機上での配列決定にゆだねた。
【０１７８】  抗−N’ MASP-2抗体の生成の後、類似するウェスターンブロットを、抗−N−MASP-2抗体を用いて行った。この抗体により可視化された、52kDa及び20kDaのバンドのタンパク質のNH2−末端を配列決定した。ペプチドを、もう１つのブロットからの２種のバンドにおけるタンパク質のトリプシン消化により調製し、逆相クロマトグラフィーにより分別し、そして主要ピークにおけるペプチドを配列決定にゆだねた。
【０１７９】例４．MASP-2のクローニング及び配列決定
肝臓は、C1r，C1s及びMASP-1の合成の一次部位である。従って、肝臓からのRNAを、得られたペプチド配列から推定されるプライマーによるRT−PCRのための鋳型として使用した。cDNAの第１鎖合成を、First-Strand cDNA Synthesis Kit (Phamacia)を用いて、1.3μｇのヒト肝臓RNAにより行った。PCRを、それぞれ、アミノ酸配列EYANDQER及びKPFTGFEAから誘導された変性センス及びアンチセンスプライマーを用いて、このcDNAに対して行った。PCRプログラムを次の通りに行った：50℃でのアニーリング（１サイクル）；55℃でのアニーリング（１サイクル）；及び60℃でのアニーリング（33サイクル）。得られる300bpのPCR生成物を、TA−クローニングキット（Invitrogen）を用いてE．コリプラスミドpCRII中にクローン化し、そして挿入体のヌクレオチド配列を決定した。
【０１８０】  得られる300bpのRT−PCR生成物のヌクレオチド配列は、プライマーが誘導されたペプチドの配列を確かめる推定されるアミノ酸配列を有する読み取り枠（ORF）を含んだ。このプラスミドの挿入体を、放射性ラベルし、そして市販のヒト肝臓ライブラリー（Stratagene）における合計８×105個のクローンをスクリーニングするためのプローブとして使用した。16個のクローニングがハイブリダイズし、そして４個の最長のもの（phl-1，2，3及び4）を完全に配列決定した。配列分析は、すべてのクローンが同じ新規のヒトmRNAの逆転写物を表すことを示した。
【０１８１】  最長のクローンphl-4は、36bpの5’未翻訳領域で開始する2475bp、続いて2061bpのORF、及びポリ−A末端で終る378bpの3’未翻訳領域を含んで成る。phl-4のヌクレオチド配列は、翻訳されたアミノ酸配列と共に図６に示される。配列は、EMBLヌクレオチド配列データベースに寄託された（受託番号第Y09926号）。phl-1及びphl-2の配列は、phl-4と全体的には一致するが、phl-3のヌクレオチド配列は、２種の位置でのphl-4，ヌクレオチド位置1147でのトランスバージョン（GからT）及び位置1515でのトランジッション（からT）で、phl-4とは異なる。最初の変化が、TyrによるAsp356の置換を誘導する。すべてのクローンは単一のドナーから単離されたRNAから転写された肝臓ライブラリーから単離されるので、観察される差異は、MASP-2遺伝子における多形現象を表すことができ、又はライブラリーの構成の間、創造される誤差のためである。
【０１８２】  NH2−末端及びすべての配列決定されたペプチドのアミノ酸配列は、クローンphl-4から推定される配列において同一であった。ORFは、15個の残基のシグナルペプチドを包含する、686個のアミノ酸のポリペプチド鎖をコードする。シグナルペプチドを排除すると、計算されるMrは74,153であり、これはSES-PAGE上で観察される76kDaと一致し（図１）、等電点は5.43であり、そしてモル消衰係数は113,640である(すなわち、1mg/mlでのOD280nm＝1.54）。MASP-1に比較して、その配列は、N−連結されたグルコシル化のための部位を含まない。セリンプロテアーゼにおいて活性中心のために必須である３個のアミノ酸残基（His 468，Asp 517及びser 618）が存在する。
【０１８３】例５．MASP-1、C1rびC1sとのMASP-2の比較
cDNA配列から推定されるアミノ酸配列は、MASP-1、C1r及びC1sのそれらの配列と相同である（図２）。注目すべきは、ドメイン機構は、１つの（1r/C1s−様ドメイン、１つの上皮成長因子−様（EGF−様）ドメイン、続いて第２のC1r/C1s−様ドメイン、２種の補体制御タンパク質（CCP）ドメイン及びセリンプロテアーゼドメインを特徴とするそれらの４種のタンパク質に共有する。上皮成長因子−様ドメインにおけるカルシウム結合モチーフに関与するキー残基は、得られる配列、並びにMASP-1，C1r及びC1sに存在する。さらに、活性部位セリンの６個の残基の前の基質特異性関連残基は、すべての４種のタンパク質におけるアスパラギン酸である。
【０１８４】  MASP-1、C1r及びC1sはすべて、残基Argと、第２CCPドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間に位置するIleとの間のペプチド結合の分解により活性化される。得られるポリペプチド鎖（最大のものは“H鎖”として言及され、そして最小のものは“L鎖”として言及される）は、ジスルフィド結合により一緒に維持される。類似性によれば、本発明者の結果は、還元条件下でのSDS−PAGEの後、MASP-2のN−末端に対する抗体により認識される52kDaのポリペプチドが、MASP-2のH鎖であり、ところがMASP-2の−C末端に対する抗体により認識される31kDaのポリペプチドがL鎖であることを示す。図２において見出されるように、Arg及びIleは、第２のCCPドメインとプロテアーゼドメインとの間の予測される位置でMASP-2に存在する。
【０１８５】  前記４種のタンパク質間での同一性及び類似性を、図２における一列整列に基づいて研究した。6の偏りを突然変異データマトリックス（250PAMS）の個々の頃に付加し、そして６の分解ペナルティーを使用した。すべての４種の種における同一の残基は、星印により示される。C1r/C1s−様ドメイン、EGF−様ドメイン及びCCPドメインの開始は、配列上に示されている。一列整列されたシステインは濃く示されている。H鎖及びL鎖を生成する、Arg残基とIle残基との間の可能性ある分解部位は、セリンプロテアーゼドメインが開始する部位と同一である。
【０１８６】  セリンプロテアーゼにおける活性中心のために必須である３個のアミノ酸残基（His 468, Asp 517及びSer 618）は、（◇）により示される。MASP-1のヒスチジン−ループにおけるシステインは、（▽）により示される。ペプチドのアミノ酸配列決定により得られる配列は下線が引かれている。タンパク質間の同一性（図２）は、すべて、39％〜45％であり、そして機能的関連性の手掛かりを与えない。タンパク質間での類似する性質の残基及び同一の残基を考慮しての類似性（図３ｂ）は、39％〜52％であり、そして最小の類似性はMASP-1とC1sとの間であり（39％）、そして最高の類似性はMASP-1とC1rとの間（52％）、及びMASP-2とMASP-2との間（52％）である。
【０１８７】  MASP-2は、C1r（46％）及びC1s（47％）との類似性を示す。相対的同一性は機能的関連性に関して手掛かりを与えないが、C1sとMASP-2との間の類似性評点は、C1sとMASP-1との評点よりも有意に高く、そしてMASP-1は、C1sに対してよりもC1rに対してより類似し、このことは、C1sと同じようにMASP-2がC2及びC4分解酵素であることを示唆する。配列のいくつかの特徴は、MASP-2、C1r及びCIsがMASP-2前駆体からの遺伝子重複及び分岐により進化したことを示唆する。MASP-1配列のみが、トリプシン−様セリンプロセアーゼの特徴であるヒスチジンループを含む（27）。
【０１８８】  活性部位セリンは、ほとんどのセリンプロテアーゼにおけるように、MASP-1におけるTCNコドン（Nは、A，T，G又はCである）によりコードされ、そしてMASP-2、C1r及びC1sにおいては、それはAGYコドン（ここで、YはT又はCである）によりコードされる。MASP-1を包含する、ほとんどのセリンプロテアーゼにおいては、プロリン残基が、活性部位セリンから下流の第３位置で見出され、そして異なったアミノ酸がMASP-2，C1s及びC1rに見出される（MASP-2及びC1sにおけるアラニン、C1rにおけるバリン）。それらの類似性に基づいて、MASP-2の触媒ドメインがC1r及びC1sにおけるように単一のエキソンによりコードされ、そしてMASP-1を包含する（28）ほとんど他のセリンプロテアーゼが分解したエキソンを有することを予測できる。
【０１８９】例６．MBL/MASP複合体
上記レクチン調製物を、モノクローナル抗−MBL抗体により被覆されたマイクロ夕イターウェルにおいて、又は負の対照として、同じサブクラスの非特異的モノクローナル免疫グロブリンにより被覆されたウェルにおいてインキュベートした。抗体により捕獲されたタンパク質を溶出し、そしてSDS−PAGE／ウェスターンブロットにより分析した。その結果（図３a）は、結合MBLの他に、抗−MBL抗体がMASP-1及びMASP-2の両者を捕獲することを示す。マイクロタイターウェルを、モノクローナル抗−MBL又は対照モノクローナルネズミIgG1により被覆し、２種の異なったレクチン調製物（a及びｂ）のいずれか１つと共にインキュベートし、そして結合されたタンパク質を溶出し、そして還元条件下でのSDS−PAGE、及びウェスターンブロットにより分析した。
【０１９０】  ブロットaを、抗−MBL抗体により、ブロットbを抗−C’ MASP-1抗体により、そしてブロットCを、抗−N’ MASP-2抗体により進行せしめた。レーン１は分別されなかったレクチン調製物aを表す。レーン３及び４は、抗−MBL抗体により被覆され、そしてレクチン調製物ｂ及びaと共にそれぞれインキュベートされたウェルからの溶出物を表し、そしてレーン２及び５は、標準IgGにより被覆され、そしてレクチン調製物ｂ及びaと共にそれぞれインキュベートされたウェルからの溶出物を表す。
【０１９１】  Superose 6B CL上でのレクチン調製物のゲル透過クロマトグラフィー（GPC）からの画分を、MBL、MASP-1及びMASP-2について分析した（図３a）。レクチン調製物を、カルシウム含有緩衝液におけるSuperose 6カラム上でのGPCにゆだねた。MBLは750kDaのMrに対応する体積（Ve）での主要ピーク及び350kDaに対応する位置での小さなピークにおいて溶出された。パネルAは、モノクローナル抗−MBL抗体を用いてのウェスターンブロットによる画分の分析の結果を示す。
【０１９２】  約60kDaでのバンドはすべてのMBL調製物において見られ、そして試験される抗−MBL抗体（モノクローナル及びポリクローナル）により認識され、そして従って、たぶん、32kDaのポリペプチド鎖の非還元性ダイマーを表す。パネルBは、抗−N’ MASP-2抗体（32kDaの上方バンドを展開する）、続いて、抗−C’ MASP-1抗体（31kDaの下方バンドを展開する）を用いての同じ分析を示す。純粋に技術的な理由のために、20kDaの切断されたMASP-2がこの図に見られず、ここでブロットは抗−MASP-2及び抗−MASP-1とのインキュベーション間で部分的に切除されている。クロマトグラム上の矢印は、空隙率（１）及び次のマーカータンパク質IgMのための溶出位置（２）、C1q（３）、チログロブリン（４）、IgG（５）及び血清アルブミン（６）を示す。
【０１９３】  MASP-1及びMASP-2は、主として高分子量MBLと共に同時溶出する。pH6でのMBL調製物のクロマトグラフィー処理は、MASP-1又はMASP-2がMBLにより会合されなかったことを示した。Tanなど．，（1996, Biochem. J. 319： 329-332）を参照のこと。
【０１９４】例７．補体活性化
従来の補体活性化経路及びMBL−開始される経路は、C4及び。C2の酵素活性化を通してのC3転換複合体C4b2bの生成を包含する。C1複合体（C1qr2s2）においては、この特定のプロテアーゼ活性は、C1rによる酵素の活性化の後、C1sにより示される。C4の活性化に基づいて、反応性チオールエステルが暴露され、そしてC4bがアミノ又はヒドロキシル基近くに共有結合する。
【０１９５】  MASP-2及びMASP-2、並びにC1r及びC1sのC4活性化能力を比較した。これは、SDS−PAGE、続いてウェスターンブロットにより、C1調製物及びMBL/MASP調製物を分解することによって達成された。ブロットを、37℃でのヒト血清とのインキュベーション、続く抗−C4抗体を用いての折出したＣ4bの検出により、C4転換活性について試験した。
【０１９６】  C1を、IgG−カップリングされたセファロースビーズを４℃でヒト血清と共にインキュベートすることにより精製した。ビーズを洗浄し、そしてC1r及びC1sの活性化のために37℃で30分間、インキュベートした。ビーズを非還元性サンプル緩衝液に懸濁し、そして煮沸しないで、SDS−PAGE、続いて、SDSの存在下でのブロットにゆだねた。類似するブロットは、酵素インヒビターの存在下で生成されたMBL調製物から製造された（The State Serum Institute, Copenhagen）。
【０１９７】  ブロットのストリップを、Biorex70上での分別によりC1qを消耗された、1.1％（v/v）のヒトMBL−欠失血清と共に37℃で30分間インキュベートした。ブロットを、ビオチニル化されたF(ab’)2抗−C4抗体、続いてペルオキシダーゼ−ラベルされたストレプタビジン及び発光試薬により展開した。同目的のブロットを、血清とのインキュベーションの間、存在するセリンプロテアーゼインヒビター（アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド）により処理した。他のストリップを抗体により直接的に展開した。
【０１９８】  図４の結果は、C4がMASP-2バンドに対応する位置で折出し、そしてC4析出はMASP-1に応答する位置で観察されなかったことを示す。MASP-1は、それがそれぞれ約30kDa及び70kDaで２つのバンドとして出現する（示されていない）還元条件下で、SDS−PAGEにより示されるような活性化された状態で存在した。観察されるC4活性化及び析出はセリンプロテアーゼインヒビターにより阻害された（図４）。C4を活性化する活性は、MBL/MASPが精製方法を通して添加される酵素インヒビターの存在下で調製される場合、検出され得なかったことがまた観察された。C1の調製物を同様にして分析し、そして酵素インヒビターにより阻害されるC4析出が、使用される技法により分離されない、C1r及びC1sに対応する位置で観察された。
【０１９９】  図４は、C1s及びMASP-2によるC4の活性化を示すウェルターンブロットの表示である。パネルAは、非還元条件下で、及び電気泳動の前、サンプルを加熱しないで分離されたC1のウェスターンブロットを示す。レーン１を抗−C1s抗体により展開した。レーン２を、ヒト血清、続いて抗−C4抗体と共にインキュベートした。レーン３はレーン２と同じであったが、但し血清とのインキュベーションの間、セリンプロテアーゼインヒビターが存在した。
【０２００】  パネルBは、Aにおけるようにして分離されたMBL調製物のウェスターンブロットを示す。レーン１は抗−N’ MASP-1により、レーン２は抗−N’ MASP-2により展開された。レーン３を、ヒト血清、次に抗−C4と共に37℃でインキュベートした。レーン４においては、ブロットを、セリンプロテアーゼインヒビターと共にプレインキュベートし、そして血清とのインキュバーションはまた、インヒビターの存在下で行われた。MASP-1は、グリコシル化のために（17）、MASP-2よりも高いMr、及び９個の長いアミノ酸のポリペプチドを示す。
【０２０１】  本発明の結果は、内在性免疫系のMBLectin経路を通しての補体活性化と補体活性化の従来の経路を通してのその活性化との間での類似性を強調する（図５）。従来の経路を通しての活性化は脊椎動物においてのみ見出される特定の免疫応答に関連し、そしてMBLectin経路及び他の経路は、外来性生物の内因性認識に依存し、そして従って、たぶん特定の免疫系の進化を実際より早くする。すべての経路は、微生物表面に共有結合し、そして補体のエフェクター機能を仲介する、中心補体C3のC3bへの活性化に集中する。
【０２０２】  従来の及びMBLectin経路においては、開始分子複合体は、リガンドとの反応に基づいて、２種の会合されるセリンプロテアーゼ（それぞれ、MASP-1及びMASP-2、又はC1r及びC1s）を活性化する、オリゴマーリガンド−結合成分（それぞれ、MBL又はC1q）から構成される。
【０２０３】参考文献
１）Law, S.K.A. & Reid, k B. M. Complement, 2, ed. (Ed. Male, D.)1-88(In Focus. IRL. Press, Oxford, 1996).
２）Ikeda, K, Sannoh, T., Kawasaki, N., Kawasaki, T. & Yamashina, I.Serum Lectin with known structure activates complement through the classical pathway. J. Bio. Chem. 262, 7451-7454 (1987).
３）Kawasaki, T., Etoh, R. & Yamashina, I. Isolation and characterization of a mannan-binding protein from rabbit liver. Biochem. Res. Commun,81, 1018-1024 (1978).
４）Matsushita, M. & Fujita, T. 4) Activation of the classical complement pathway bay mannose-binding protein in association with a novel C1s-like serine protease J. Exp. Med. 176. 1497-1502 (1992).
５）Ji, Y-H. など., Activation of the C4 and C2 components of complement by a proteinase in serum bactericidal factor, Ra reactive factor J. Immunol. 150, 571-578 (1993).
【０２０４】  ６）Turner, M.W. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the Innate immune system. Immunol. Today, 17, 532-540 (1996).
７）Kawasaki, N., Kawasaki, T. & Yamashina, I. A serum lectin( mannan-binding protein) has complement-dependent bactericidal activity. J. Biochem. 106, 483-489 (1989).
８）Kuhlman, M., Joiner, K. & Ezekowitz, R.A.B. The human mannose-binding protein functions as an opsonin. J. EXP. Med. 169, 1733-1745 (1989).
９）Sumiya, M. など. Molecular basis of opsonic defect in Immundeficient children Lancet 337, 1569-1570 (1991).
10）Lipscombs, R.J. など., High frequancies in African and non-Africanpopulations of independent mutations in the mannose binding protein gene. Hum. Mol. Genet. 1. 709-715 (1992).
【０２０５】  11）Madsen H.O. など., A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein.Immunogenetlcs 40, 37-44 (1994).
12）Super, M., Thiel, S., Lu, J., Levinsky, R.J. & Tumer, M.W. Association of low levels of mamman-binding protein with a cornmon defect of opsonisation. Lancet ii, 1236-1239 (1989).
13）Garred, P., Madsen, H.O., Hofmann, B. & Svejgaard, A. increased frequency of homozygosity of abnormal mannan-binding-protein alleles in patients with suspected immunodeficiency. Lancet 346, 941-943 (1995).
14）Summerfield, J.A. など. Mannose binding protein gene mutaions associated with unusual and severe infections in adults. Lancet 345, 888-889(1995).
15）Nielsen, S.L., Andersen, P.L., Koch, C., Jensenius, J.C. & Thiel. S. Thelevel of the serum opsonin, mannan-binding protein in HIV-1 antibody-positive patients. Clin. Exp. Immunol. 100, 219-222 (1995).
【０２０６】  16）Gerred, P., Madsen, H.O., Balslev, U., Hofmann, B., Pedersen, C., Gerstoft, J. and Svejgaard, A. Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to variant alleles of mannose-blnding lectin,Lancet 349, 236-240 (1997).
17）Malhotra, R. Wormald, M.R., Rudd, P.M., Fischer, P.B., Dwek, R.A.and Sim, R.B. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthrltis can activate complement via the mannose-binding protein. NatureMed. 1, 237-243 (1995).
18）Kilpatrick, D.C., Bevan, B.H. and Liston, W.A. Association betweenmannan-binding protein deficiency and recurrent miscarriage. Mol. Hum.Reprod. 1, 2501-2505( 1995).
19）Davies, E.J., Snowden, N., Hillarby, M.C., Carthy, D. Grennan, D.M., Thomson, W．and Ollier, W.E.R. Mannose-blnding protein gene polymorphism in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 38, 110-114 (1995).
20）Jensenius, J.C. Mannan-binding lectin(MBD) : From investigations on fish and chickens to substitution therapy in an infant with severe infections. Immunology, 86, Suppl. 1, 100, abstract (1995).
【０２０７】  21）Gerred, P., Madsen, H.O., Kurtzhals, J.A., など. Diallelic polymrphism may explain varlations of blood concentrations of mannan-binding in Eskimos but not in black Africans, Eur. J. Immunogenet. 19. 403-412 (1992).
22）Thiel, S., Jensen, T.V., Laursen, S.B., Willis, A. and Jensenius, J.C. Identification of a new mannan-binding protein associated serine protease (MASP-2). Immunology 86, Suppl. 1,101 (1995).
23）Thiel, S., Jensen, T.V., Laursen, S.B., Willis, A., Reld, K.B.M., Hansen, S. and Jensenius, J.C. Identification of a new mannan-binding lectin associated serine proteas (MASP-2). Mol. Immunol., 33, Suppl. 1, 91 (1996).
24）Jensen, T.V., Stover, C., Poulsen, K., Lausen, S.B., Eggieton., P.,Reid, K.B.M., Wills, A., Schwaeble, W., Lu, J., Holmskov, U., Jensenius, J.C. and Thiel, S. Cloning of cDNA encoding a human MASP-like protein (MASDP-2). Mol. Immunol., 33, Suppl. 1, 81 (1996).
25）Baatrup, G., Thiel, S., lsager, H., Svehag, S.E. & Jensenius, J.C.Demonstration in human plasma of a lectin activity analogous to that ofbovlne conglutinin, Scand. J. Immunol. 26, 355-361 (1987).
【０２０８】  26）Jensenius, J.C., Andersen, I., Hau, J., Crone, M. & Koch, C. Eggs;conveniently packaged antibodies, Methods for purification of yolk IgG.J. Immunol. Methods 46, 63-66 (1981).
27）Sato, T., Endo, Y., Matsushita, M. & Fujita, T. Molecular charactarization of a novel serine protease involved in activation of the complement system by mannose-binding protein. Int. Immunol. 6, 665-669 (1994).
28）Endo. Y., Sato, T., Matsushita, M. & Fujita, T. Exon structure ofthe gene encoding the human mannose-binding protein-associated serine protease light chain: comparison with complement C1r and C1s genes. Int.Immunol. 9, 1355-1358 (1996).
29）Tan, S.M., Chung, M.C.M., Kon, O.L., Thiel, S. Lee, S.H. & Lu, J.Improvements on the purification of mannan-binding lectin and demonstration of its Ca2+-independent association with a C1s-like serine protease. Biochem. J. 319, 329-332 (1996).
30）Barton, G, J. Protein multiple sequence alignment and flexible patten matching. Methods Enzymol. 403-428 (1990).
【０２０９】  31）Takada, F., Takayama, Y., Hatsuse, H. & Kawakami, m. A new memberof C1s family of complement proteins found in a bactericidal factor, Ra-reactive factor, in human serum. Biochem. Biophys. Res, Comm. 196, 1003-1009 (1993).
32）Journat, A. & Tosi, M. Cloning and sequencing of full-length cDNAencoding the precurson of human complement component C1r, Biochem. J. 240, 783-787 (1986).
33）Lytus, S.P., Kurachi, K., Sakariassen, K. S. & Davie, E.W. Nucleotide sequence of cDNA coding for human complement C1r. Biochemistry 25, 4855-4863 (1986).
34）Mackinnon, C.M., Carter, P.E., Smyth, S.J., Dunbar, B. & Fothergill, J.E. Molecular cloning of cDNA for human complement component C1s. The complete amino acid sequence. Eur. J. Biochem .169, 547-553 (1987).
35）Tosl, M., Duponchel, C., Meo, T. & Julier, C. Complete cDNA sequence of human complement C1s and close physical linkage of the homologousgenes C1s and C1r. Bio-chemistry 26, 8516-8524 (1987).
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1a−1bは、糖親和性クロマトグラフィーにより精製されたヒト血漿タンパク質のウェスターンブロットを示す。
【図２】  図２は、MASP-2（クローンphl-4）、MASP-1（17，22）、C1r（23，24）及びC1s（25，26）のアミノ酸配列の配列一列整列を示す。
【図３】  図3a-3bは、MBL、MASP-1及びMASP-2間で形成される分子複合体を示す結果を示す。
【図４】  図4a-4bは、C1s及びMASP-2によるC4の活性化を示すウェルターンブロットを示す。
【図５】  図５は、補体活性化の３種の経路を示す。
【図６】  図６は、MASP-2のcDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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