(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置のための医薬の製造における、式１：
【化１】
0005253204.tif 000022
（式中、該化合物はＤ−配置である）
で示されるカルボキサミジンの塩酸塩の使用。
【請求項２】
医薬が経口投与用に製剤化される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬が、化合物の用量を患者の体重ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜患者の体重ｋｇ当たり４０ｍｇの間を含むように製剤化する、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
医薬が更にインターフェロンを含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
インターフェロンがインターフェロン−αである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
式１：
【化２】
0005253204.tif 000023
で示されるカルボキサミジンの塩酸塩、および１つ以上の医薬的に許容し得る添加物を含有する、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置のための医薬組成物であって、
該医薬組成物は固形の経口投与用製剤である、該医薬組成物。
【請求項７】
医薬組成物が経口投与用に製剤化される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が固形製剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシドアナログの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
リバビリン（１−β−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、単独療法として（呼吸器合胞体ウイルス(respiratory syncytial virus)については、例えば、非特許文献１参照）、およびインターフェロンαとの組み合わせ療法として（Ｃ型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)については、例えば、非特許文献２参照）、ウイルス疾患を処置する際の効能が実証されている、ヌクレオシドアナログである。最近報告された研究は、リバビリンのインビボ使用は、ウイルス複製の直接的な抑制によるだけでなく、Ｔ細胞が媒介する免疫を増大する能力によることができることを示している（例えば、非特許文献３〜５参照）。リバビリンのこの免疫調節効果は、ヒトおよびマウスの両方由来の活性化Ｔ細胞によって産生される１型サイトカインのレベルを測定することによって（例えば、非特許文献６参照）、および他の測定法によって、インビトロで実証され得る。リバビリンによる１型サイトカインバイアスの誘発は、マウス系のインビボにおいて機能的に重要である（例えば、非特許文献７参照）。
【０００３】
哺乳動物の免疫系は、２つの主なクラスのリンパ球：Ｂリンパ球（Ｂ細胞）お（これは、骨髄で生成する）およびＴリンパ球（Ｔ細胞）（これは、胸腺で生成する）を含む。Ｂ細胞は体液性免疫（すなわち、抗体産生）に大きく関与し、Ｔ細胞は細胞性免疫に大きく関与する。
【０００４】
Ｔ細胞は通常２つのサブクラス、ヘルパーＴ細胞および細胞毒性Ｔ細胞に分類されると考えられる。ヘルパーＴ細胞は、サイトカインと呼ばれる溶解性タンパク質メディエーター（これは、細胞性免疫に関与する）を放出することによって、他のリンパ球（これは、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージを含む）を活性化する。本明細書で使用するリンホカインは、サイトカインのサブセットである。
【０００５】
ヘルパーＴ細胞はまた、通常２つのサブクラス：１型および２型に分類されると考えられる。１型細胞はインターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生し、このものは細胞性免疫（例えば、遅延型過敏症および抗ウイルス免疫）に主に関与している。それに対して、２型細胞はインターロイキン、ＩＬ−４、Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生し、このものは主に体液性免疫反応（例えば、例えばＩｇＥおよびＩｇＧ４抗体のイソタイプのスイッチングなどのアレルゲンヘの応答）を助けるのに関与する（例えば、非特許文献８参照）。
【０００６】
本明細書で使用する用語「１型」および「２型」応答とは、それぞれ１型および２型リンパ球の誘発から得られる効果の全範囲を含むことを意味する。とりわけ、それらの応答としては、転写、翻訳、分泌および他の可能な機構による対応するサイトカインの産生の変化、対応するリンパ球の増殖の増大、およびサイトカインの産生の増大に関係する他の効果（これは、運動性の効果を含む）を含む。
【０００７】
従来の出願（例えば、特許文献１〜８参照）（これらは本明細書の一部を構成する）は、我々の最近の発見の側面に関連する。該発見は様々なヌクレオシド（このものは、本明細書において天然のヌクレオシドの誘導体およびアナログを含むと定義する）が互いに関連するリンパ球の応答の選択的なモジュレートに及ぼす効果に関係する。とりわけ、我々は１型もしくは２型の応答の一方が選択的に抑圧され得るが、他方は誘導されるかもしくは比較的に影響を受けないままであったり、１型もしくは２型の応答の一方が選択的に誘導され得るが、その他方は抑圧されるかもしくは比較的に影響を受けないままであることが分かった。我々はまた、互いに関連する１型および２型の応答を選択的にモジュレートするのに有効であるあるヌクレオシドが二峰性の効果を有する傾向があるという驚くべき事実をも発見した。とりわけ、通常比較的に高い用量では１型および２型の活性の両方を抑圧するかもしくは誘発する傾向があるヌクレオチドは、比較的に低い用量では互いに関連する１型および２型を選択的にモジュレートする傾向がある。
【０００８】
ビラミジン（Viramidine）（登録商標）（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミジン・塩酸塩）は、１０個の異なるウイルスにおいて活性であることを示し、そのことはリバビリンと比較することができる（例えば、非特許文献９〜１１参照）。加えて、リバビリンと同様にビラミジン（登録商標）はＩＭＰデヒドロゲナーゼのインヒビターである（例えば、非特許文献１２参照）。その上、予備的な毒性学の研究は、ビラミジン（登録商標）はリバビリンよりも毒性が低いことを示す（例えば、非特許文献１３参照）。また、我々の研究室での最近の研究（例えば、非特許文献１４参照（未公開の結果）））は、ビラミジン（登録商標）およびリバビリンが同様な免疫調節性質を示すことを示した。リバビリンと関係する低いバイオアベイラビリティーおよび毒性とこれらの結果を組み合わせることにより、我々が他のウイルス疾患のためのビラミジン（登録商標）を開発するだけではなく、ビラミジン（登録商標）の他の誘導体を製造し（これは、ビラミジン（登録商標）のプロドラッグの製造を含む）、それらを潜在的な抗ウイルス薬としてスクリーニングすることを促進する。
【０００９】
他のヌクレオシドアナログ化合物が互いに関連するリンパ球の応答を選択的にモジュレートするのに及ぼす影響は、これまで研究されても、または記載されてもいない。我々は、二峰性の効果、または互いに関連する１型および２型応答の選択的なモジュレートもまた、他のヌクレオシドアナログ（例えば、該化合物のプロドラッグ形態）を投与後に生じることを発見した。
【００１０】
生物学的に活性な化合物を臨床的に有用な薬物に発展させるのに解決すべき多数の障壁が存在する。多数の強力な生物学的に活性な化合物は決して臨床的に有用な薬物ではない。その理由としては、生物学的な関門（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）および腸管関門）を通過する透過性が低いことに起因するバイオアベイラビリティーの低さを含めた、望ましくない生物薬剤上の性質のためである。多数の因子が薬物のバイオアベイラビリティーに影響を及ぼすが、多数の薬物の望ましくない物理化学的な性質（例えば、電荷、親油性、水素結合能、サイズ）は薬物が生物学的な関門を通過する透過を妨害する最も一般的な因子の１つであるようである。従って、薬物の物理化学的な性質（電荷、親油性、水素結合能、サイズ）の最適化は、それら膜関門を通過する薬物の輸送を促進するための最も可能性のある一般的な方法であろう。
【００１１】
薬物の物理化学的な性質を最適化するために、１つの可能な方法はプロドラッグである（例えば、特許文献１５〜１７参照）。該用語「プロドラッグ」とは、投与後に化学的なまたは酵素学的な変換を受けて活性薬物または親薬物となり、続いて該代謝産物または親薬物が所望する薬理学的な応答を示し得るような薬物を記載するのに使用する。小有機分子中のある極性の官能性の基を一時的におよび生可逆的に誘導化することによって、該分子の薬理学的な性質を永久的に変えずに、これらの基の望ましくない物理化学的な性質（例えば、電荷、水素結合能）を「マスク」した。この方法は、プロドラッグの誘導化がカルボキシルまたはヒドロキシル官能基をエステル（これは、インビボで化学的にまたは酵素的に容易に加水分解することができる）に変換することに関係する場合に用いると非常に成功した。将来有望な方法として、該親薬物中に他の部分を導入することにより、バイオアベイラビリティー、吸収および抗ウイルス効果が増大するであろうと、我々は予想する。
【００１２】
現在のところ、未決定の機構が存在するにも関わらず、我々は多数の潜在的な利益が互いに関連する１型および２型の応答の選択的なモジュレートから得ることができることを発見した。我々は、例えば２型に関連する１型の特定のモジュレートが広範囲の病気および疾患（これは、感染、侵しゅう、腫瘍および自己免疫疾患に対する過敏症におよぶ）を処置するのに有用であり得ると結論付けた。
【００１３】
上記の疾患の多数についての最近の処置方法は有効性が限られており、有意な副作用があり、またはその両方であるので、これらの発見は特に重要である。自己免疫疾患の処置は、例えば対症療法、毒性の抗体の除去（例えば、無症筋無力症の場合）および危険な薬物（例えば、コルチコステロイド、クロロキン誘導体、抗代謝性または抗腫瘍性の薬物、並びに例えば、免疫系細胞を標的とするシクロスポリンなどの薬物）の投与に限定されることが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願番号09/426714
【特許文献２】米国特許出願番号09/291097
【特許文献３】米国特許出願番号09/291093
【特許文献４】米国特許出願番号09/471513
【特許文献５】米国特許出願番号60/164365
【特許文献６】米国特許出願番号60/164366
【特許文献７】米国特許出願番号60/172097
【特許文献８】米国特許出願番号60/175111
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Hall, C. B., McBride, J. T., Walsh, E. E., Bell, D. M., Gala, C. L., Hildreth, S., Ten Eyck, L. G., W. J. HallによるAerosolized ribavirin treatment of infants with respiratory syncytial viral infection. N. Engl. J. Med. 1983, 308, 1443-1447
【非特許文献２】Reichard, O., Norkrans, G., Fryden, A., Braconier, J-H., Sonnerborg, A., Weiland, O.によるRandomized double blind, placebo controlled trial of interferon alpha 2B with and without ribavirin for chronic hepatitis C. Lancet 1998, 351, 83-87
【非特許文献３】Hultgren, C., Milich, D. R., Weiland, O., Sallberg, M.によるThe antiviral compound ribavirin modulates the T helper Type 1/ Type 2 subset balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. J. Gen. Virol. 1998, 79, 2381-2391
【非特許文献４】Ning, Q., Brown. D., Parodo, J., Cattral, M., Fung. L., Gorczynski, R., Cole, E., Fung, L., Ding, J. W., Liu, M. F., Rotstein, O., Phillips, M., J. Levy, G.によるRibavirin inhibits viral-induced macrophage production of tumor necrosis factor, interleukin-1, procoagulant activity fgl2, prothrombinase and preserves Th1 cytokine production but inhibits Th2 cytokine response. J. Immunol. 1998, 160, 3487-3493
【非特許文献５】Martin, M., Navas. S., Quiroga, J. A., Pardo, M., Carreno, V.によるEffects of the ribavirin-inteferon alpha combination on cultured peripheral blood mononuclear cells from chronic hepatitis hepatitis C patients. Cytokine 1998, 79, 2381-2391
【非特許文献６】Tam, R. C., Pai, B., Bard, J., Lim, C., Averett, D. R., Phan, U. T., Milovanovic, T.によるRibavirin polarizes human T cell responses towards a Type 1 cytokine profile. J. Hepatol. 1999, 30, 376-382
【非特許文献７】Tam, R. C., Lim, C., Bard, J., Pai, B.によるContact hypersensitivity responses following ribavirin treatment in vivo are influenced by Type 1 cytokine polarization, regulation of IL-10 expression and costimulatory signaling, J. Immunol. 1999, 163, 3709-3717
【非特許文献８】Mosmannによる 1989, Annu Rev Immunol, 7; 145-173
【非特許文献９】J. T. Witkowski, R. K. Robins., G. P. Khare, R. W. SidwellによるJ. Med. Chem., 16, 935-937, 1973
【非特許文献１０】R. W. Sidwell, J. H. Huffmann, D. L. Barnard, D. Y. PifatによるAntiviral Research, 10, 193-208, 1988
【非特許文献１１】B. Gabrielsen, M. J. Phelan, L. Barthel-Rosa, C. See, J. W. Huggins, D. F. Kefauver, T. P. Monath, M. A. Ussery, G. N. Chmurny, E. M. Schubert, K. Upadhya, C. Kwong, D. A. Carter, J. A. Secrist III, J. J. Kirsi, W. M. Shannon, R. d. Sidwell, G. D. Kini, R. K. Robinsによる J. Med. Chem., 35, 3231-3238, 1992
【非特許文献１２】R. C. Willis, R. K. Robinsによる J. E. SeegmillerによるMolecular Pharmacology, 18, 287-295, 1980
【非特許文献１３】D. Y. Piflat, R. W. Sidwell, P. G. Canonicoによる Antiviral Reserch, 9, 136, 1988
【非特許文献１４】R. Tam, K. Ramasamyによる ICN Pharmaceuticcals, Inc., 1999
【非特許文献１５】H. Bundgaarによる、Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1985
【非特許文献１６】N. Bodor, L. Prokai, W. M. Wu, H. Farag, S. Jonalagadda, M. Kawamura, J. Simpkinsによる Science, 257, 1698-1700, 1992
【非特許文献１７】H. E. Taylor, K. B. Sloanによる、J. Pharma. Sci., 87, 5-20, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、新規なヌクレオシドアナログ化合物、およびその関連化合物（プロドラッグを含む）、並びにそれらの治療学的な使用および製造を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、新規なヌクレオシドアナログ化合物およびその関連化合物（プロドラッグを含む）、特に式１で示されるカルボキサミジンまたはその医薬的に許容し得る塩およびその関連化合物（プロドラッグを含む）、並びにそれらの治療学的な用途、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置におけるそれらの化合物の有用性を見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、下記に掲げる発明を提供するものである。
【００１８】
本発明の１態様において、式１：
【化１】
0005253204.tif 000002
のヌクレオシドアナログ化合物を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様において、医薬組成物は少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体と混合される、治療学的に有効な量の式Ｉのカルボキサミジンまたはその医薬的に許容し得るエステルもしくは塩を含む。
【００２０】
本発明の更に別の態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体と混合される、式１のカルボキサミジンのプロドラッグ形態またはその医薬的に許容し得るエステルもしくは塩を含む。
【００２１】
本発明の更なる態様において、式Ｉに記載の化合物は該化合物の投与に陽性に応答するいずれかの疾患を処置するのに、陽性の応答を示すいずれかの製剤およびプロトコールに従って使用する。その他に、式１の化合物は感染、侵しゅう、癌、腫瘍または他の新生生物、巨細胞動脈炎または自己免疫疾患を処置するのに使用することができると企図する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、本発明の新規な化合物またはその医薬的に許容し得るエステルもしくは塩は免疫系の態様（例えば、１型または２型の活性のモジュレートを含む）をモジュレートするのに使用することができ、有用である。本発明の新規な化合物またはその医薬的に許容し得るエステルもしくは塩を含有する医薬組成物は、感染、侵しゅう、新生生物または自己免疫疾患を処置するのに使用することもでき、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、式１の化合物の製造に関する典型的な製造スキームである。
【図２】図２は、企図する化合物および他の化合物がＳＥＢで活性化されたヒトＴ細胞における１型サイトカインの合成に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】図３は、０．６２５〜１０μＭの濃度の企図する化合物がＳＥＢで活性化されたヒトＴ細胞における１型サイトカインの合成に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】図４は、企図する化合物がＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＨＳ応答に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、ＳＥＢで活性化されたヒトＴ細胞における１型サイトカイン合成における企図する化合物および他の化合物のピーク応答およびピーク範囲を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下の用語を本明細書において使用する場合には、それらは以下に定義する通り使用する。
【００２５】
用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシドアナログ化合物」とは相互交換することができ、そしてそれらはヘテロサイクル、芳香族性ヘテロサイクルの特定の位置と、プリン（９−位）もしくはピリミジン（１−位）の天然の位置と、または該アナログの等価な位置と結合したいずれかのペントースまたは修飾したペントース部分を含む化合物を意味する。
【００２６】
用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの５’−位で置換されたリン酸エステルを意味する。
【００２７】
用語「ヘテロサイクル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を有する１価の飽和または不飽和の炭環式基を意味し、該環中、その利用できる各々の位置が場合により独立して、例えば、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、イミノ、低級アルキル、ブロモ、クロロおよび／またはシアノで置換され得る。このクラスの置換基は、プリンおよびピリミジンを含む。
【００２８】
用語「プリン」とは、窒素性の二環性ヘテロサイクルを意味する。
【００２９】
用語「ピリミジン」とは、窒素性の単環性ヘテロサイクルを意味する。
【００３０】
用語「Ｄ−ヌクレオシド」とは、Ｄ−リボース糖部分を有するヌクレオシド化合物（例えば、アデノシン）を意味する。
【００３１】
用語「Ｌ−ヌクレオシド」とは、Ｌ−リボース糖部分を有するヌクレオシド化合物を意味する。
【００３２】
用語「Ｌ−配置」および「Ｄ−配置」とは、本明細書中、分子のピロロ−ピリミドン部分と結合している化合物のリボフラノシル部分の化学的な配置を記載するのに使用する。
【００３３】
用語「Ｃ−ヌクレオシド」とは、本明細書中、リボース糖部分とヘテロ環式塩基との間で形成する結合タイプを記載するのに使用する。Ｃ−ヌクレオシドにおいて、該結合はリボース糖部分のＣ−１位を起点とし、ヘテロ環式塩基の炭素と結合する。Ｃ−ヌクレオチドにおいて形成する結合は、炭素−炭素のタイプである。
【００３４】
用語「Ｎ−ヌクレオシド」とは、本明細書中、リボース糖部分とヘテロ環式塩基との間で形成する結合タイプを記載するのに使用する。Ｎ−ヌクレオシドにおいて、該結合はリボース糖部分のＣ−１位を起点とし、ヘテロ環式塩基の窒素と結合する。Ｎ−ヌクレオシドにおいて形成する結合は、炭素−窒素のタイプである。
【００３５】
用語「保護基」とは、酸素または窒素が存在する分子の他の部分の誘導化反応の間における更なる反応を防止するために、酸素または窒素に加えられる化学基を意味する。広範囲な酸素または窒素保護基が、有機合成の分野における当業者にとって知られる。
【００３６】
用語「低級アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチルまたはｎ−ヘキシルを意味する。該用語は更に、炭素数が１〜６個の環状、分枝または直鎖の基を意味する。
【００３７】
用語「アリール」とは、単環（例えば、フェニル）および２つの縮合環（例えば、ナフチル）を有する一価の不飽和の芳香族性炭素環式基を意味し、これは場合によりヒドロキシル、低級アルキル、クロロおよび／またはシアノで置換され得る。
【００３８】
用語「ヘテロサイクル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＰ）を有する一価の飽和または不飽和の炭素環式基を意味し、その各々の利用可能な位置は場合により独立して、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、イミノ、低級アルキル、ブロモ、クロロおよび／またはシアノで置換され得る。
【００３９】
用語「単環」とは、該環中に少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＰ）を有する一価の飽和の炭素環式基を意味し、それは場合により独立して、糖部分またはいずれかの他の基（例えば、ブロモ、クロロおよび／またはシアノ）で置換され得て、その結果、該単環式基は最終的に芳香族化される（例えば、チミジン）。
【００４０】
用語「免疫調節物質」および「モジュレーター」とは本明細書中で互換的に使用することができ、それらは刺激または抑圧によって正常なまたは異常な免疫系を改変することができる天然または合成産物を意味する。
【００４１】
用語「有効な量」とは、免疫機能を正常なレベルに回復したり、または感染を除くために正常なレベルを超えて免疫機能を増大させる、式（１）の化合物の量を意味する。
【００４２】
式Ｉの化合物は、多数の不斉中心を有し得る。従って、それらは光学的に活性な形態またはラセミ混合物のいずれかで製造することができる。記載したり、特許請求する本発明の範囲は、式１の化合物の個々の光学活性異性体およびそれらのラセミ混合物、並びに該化合物のラセミ体を含む。
【００４３】
用語「α」および「β」とは、図示する化学構造における不斉炭素原子上での置換基の特定の立体化学的な配置を意味する。
【００４４】
用語「エナンチオマー」とは、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体の対を意味する。エナンチオマーの１：１の比率の混合物は「ラセミ」混合物である。
【００４５】
用語「異性体」とは、同じ式を有する異なる化合物を意味する。「立体異性体」とは、原子が空間に配列する様式だけが異なる異性体である。
【００４６】
「医薬的に許容し得る塩」とは、無機および有機の酸または塩基から誘導されるいずれかの塩であり得る。
【００４７】
化合物
本発明のヌクレオシドアナログ化合物は、一般的に式:
【化２】
0005253204.tif 000003
によって記載される。該式中、該化合物の化学的な配置はＬ−配置またはＤ−配置である。企図する化合物（本明細書においては、ビラミジン（登録商標））の典型的な製造は、以下に概略する方法（実施例１を含む）および図１に示す方法に従うことができる。
【００４８】
ある医薬的な投与形態において、該化合物のプロドラッグ形態（これは、特に本発明の化合物のアシル化（例えば、アセチル化またはその他）誘導体、ピリジンエステルおよび様々な塩形態を含む）が好ましく、患者の病気の処置方法に投与することができる。当該分野の当業者は、本発明の化合物をプロドラッグ形態に容易に改変して、活性な化合物を宿主生物または患者における標的部位に容易に運搬することができる方法を認めるであろう。当該分野の当業者は、本発明の化合物を宿主生物または患者における標的部位に運搬して、該化合物の目的の効果を最大限とする際に適宜、プロドラッグ形態の有利な薬物動態学的なパラメーターをも利用する。
【００４９】
本明細書で開示する該化合物のプロドラッグ形態の製造例は、以下の通りである。ビラミジン（登録商標）の最も簡単なプロドラッグ例の１つは、ビラミジン（登録商標）のトリ−Ｏ−アセチル誘導体である。該トリ−Ｏ−アセチル誘導体を、スキーム１に示す通りに製造する。
【化３】
0005253204.tif 000004
【００５０】
ビラミジン（登録商標）の５’−レチノイル誘導体は別の簡単なプロドラッグ形態であり、このものは以下の通りに製造する。
【化４】
0005253204.tif 000005
【００５１】
ビラミジン（登録商標）の他の５’−誘導体としては、以下のスキーム３に示すものを含む。
【化５】
0005253204.tif 000006
【００５２】
これらの化合物のほとんどは、上記の通り（C. Sergheraert, C. Pierlot, A. Tartar, Y. Henin, M. LemaitreによるJ. Med. Chem., 36, 826-830, 1993）、得ることができる。
【００５３】
ビラミジン（登録商標）のクマリンベースのプロドラッグ形態の製造は、以下の通り得ることができる。
【化６】
0005253204.tif 000007
【００５４】
立体選択的なトランスポーターの関与が可能であるために、アミノ酸エステルはより良いプロドラッグ形態と考えられる。ビラミジン（登録商標）のアミノ酸誘導体を、以下に示す通りに製造することができる。
【化７】
0005253204.tif 000008
【００５５】
肝臓および胆汁系ヘの薬物の特異的な運搬として、内因性の胆汁酸輸送系は魅力的な候補である。ビラミジン（登録商標）の胆汁酸複合体の製造は、以下に示す通りに達成することができる。
【００５６】
ヌクレオチド誘導体は、別クラスのプロドラッグまたはプロドラッグ形態である。保護した５’−モノホスフェート誘導体の製造を以下に示す。該ホスフェートの負電荷を中性の置換基を用いて保護することによって、１度細胞内で対応するモノホスフェートに戻ると期待されるより親油性の誘導体を形成するであろう。
【化８】
0005253204.tif 000009
【００５７】
ヌクレオチド誘導体は、別クラスのプロドラッグまたはプロドラッグ形態である。保護した５’−モノホスフェート誘導体の製造を以下に示す。該ホスフェートの負電荷を中性の置換基を用いて保護することによって、１度細胞内で対応するモノホスフェートに戻ると期待されるより親油性の誘導体を形成するであろう。
【化９】
0005253204.tif 000010
式中、Ｒ１は、例えばＣＨ３Ｃ（Ｏ）Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−；（ＣＨ３）２ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−；（ＣＨ３）３ＣＣ（Ｏ）Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−；（ＣＨ３）３ＣＣ（Ｏ）ＯＣＨ２−；Ｃ６Ｈ５Ｃ（Ｏ）Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２またはＨＯＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２−などである。
【００５８】
アミノ酸ホスホルアミデートは、以下の通り製造することができる、別クラスのプロドラッグである。
【化１０】
0005253204.tif 000011
【００５９】
モノホスフェートプロドラッグの他の誘導体を以下に示す。
【化１１】
0005253204.tif 000012
【００６０】
ビラミジン（登録商標）のサリチル酸ベースのプロドラッグを、以下のスキームによって得ることができる。
【化１２】
0005253204.tif 000013
【００６１】
ヌクレオシド５’−ジまたはトリ−ホスフェートのプロドラッグは、それらが代謝的な経路をより迂回するであろうと言う理由で、より関心が持たれる。
【００６２】
以下に、潜在的なヌクレオチド親油性のプロドラッグを示し、このものは以下に示す通りに製造する。
【化１３】
0005253204.tif 000014
【００６３】
別クラスのビラミジン（登録商標）の潜在的なホスフェートを、以下に示す。
【化１４】
0005253204.tif 000015
【００６４】
他の可能なプロドラッグとしては、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３９３４２、ＷＯ９８／３９３４３、ＷＯ９８／３９３４４およびＷＯ９８／４５０１６に示される群の可能な組み合わせを含む。
【００６５】
ビラミジン（登録商標）のプロドラッグは、該親分子の糖部分を改良することによるだけでなく、アミジン官能基を誘導化することによっても得ることができた。アミジン基を改変することによって製造することができるいくつかのクラスのプロドラッグを、以下に示す。
【化１５】
0005253204.tif 000016
【化１６】
0005253204.tif 000017
【００６６】
用途
式Ｉに記載の化合物を用いて、広範囲な病気、実際には１つ以上の該化合物の投与に陽性に反応するいずれかの病気を処置することを企図する。その他に、本発明の化合物を用いて、感染、侵しゅう、癌、腫瘍または自己免疫疾患を処置することができると特に企図する。本発明の化合物を用いて、患者の特定の器官（例えば、肝臓または心臓）における病気または疾患を標的とすることができると更に企図する。
【００６７】
本発明の化合物を用いて処置することを企図する感染としては、例えば呼吸器合成体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペス１型および２型、陰部疱疹、ヘルペス性角膜炎、ヘルペス性脳炎、帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザＡ型ウイルス、ハンターンウイルス（出血熱）、ヒトパピローマウイルス、麻疹および真菌を含む。
【００６８】
本発明の化合物を用いて処置することを企図する侵しゅうとしては、例えば原虫の侵しゅう、並びにぜん虫および他の寄生虫の侵しゅうを含む。
【００６９】
処置することを企図する癌または腫瘍としてはウイルスが原因のものを含み、その効果としてはウイルスに感染した細胞の新生生物状態への癌化を抑制すること、癌化した細胞から他の正常な細胞ヘのウイルスの蔓延を抑制すること、および／またはウイルスにより癌化した細胞の増殖を抑止することを含み得る。
【００７０】
処置することを企図する自己免疫疾患および他の疾患としては、例えば関節炎、かん鮮、腸疾患、若年性糖尿病、ループス、多発性硬化症、痛風、痛風性関節炎、リウマチ性関節炎、移植の拒絶反応、巨細胞関節炎、アレルギーおよび喘息を含む。
【００７１】
本発明に記載する化合物の更なる他の企図する使用としては、それ自身、治療剤として有用であるかまたは他の目的に有用である、他のヌクレオシドアナログまたは他のヌクレオチドアナログの化学的な製造における中間体としての使用を含む。
【００７２】
更に別の態様においては、哺乳動物の処置法は治療学的におよび／または予防学的に有効な量の本発明の化合物を含有する医薬物を投与することを含む。本態様において、該効果は哺乳動物の免疫系のある部分のモジュレートに関連し得て、特に互いに関連する１型および２型のリンホカインのモジュレートに関連し得る。１型および２型のリンホカインのモジュレートが生じる場合に、該モジュレートとしては１型および２型の両方の抑圧を含めることができ、１型リンホカインの刺激または２型の応答と比べた１型の応答の増加がより好ましい。
【００７３】
本発明の記載の化合物をいずれかの適当な医薬製剤として、且ついずれかの適当なプロトコール下、インビボ、インビトロまたはエキソビボで投与することを企図する。従って、投与は経口、非経口（例えば、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射もしくは注入方法によることを含む）、吸入スプレー、直腸、局所などによって、通常の非毒性の医薬的に許容し得る担体、補助剤およびビヒクルを含有する単位用量形態で投与することができる。
【００７４】
例えば、本発明の化合物を医薬的に許容し得る担体と一緒に混合して製剤化することができると企図する。例えば、本発明の化合物を薬理学的に許容し得る塩として経口投与することができる。本発明の化合物のほとんどは水溶性であるので、それらは生理学的なサリン溶液（これは、例えばｐＨを約７．２〜７．５にまで緩衝化する）として静脈内投与することができる。通常の緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸水素塩またはクエン酸塩）を本目的に使用することができる。当然に、当該分野の当業者は本明細書の教示内で製剤化を改良して、本発明の組成物が不安定になったりまたはそれらの治療学的な活性を損なったりすることなく、ある投与経路のための多数の製剤を得ることができる。特に、本発明の化合物を水または他のビヒクルについてより可溶にするという改良は、当該分野でよく知られている小さな改良（例えば、塩の形成、エステル化など）によって容易に達成することができる。患者において有益な効果を最大とするために本発明の化合物の薬物動態学を管理する目的で、ある化合物の投与経路および投与レジメを改良することは、当該分野の通常の知識の範囲内である。
【００７５】
加えて、上記の感染または病気の処置のために、本発明の化合物を単独で、または他の薬物と組み合わせて投与することができる。本発明に記載の組み合わせ療法は、本発明の化合物またはその官能性誘導体の少なくとも１つ、および他の医薬的に活性な成分の１つを投与することを含む。該活性成分および医薬的に活性な薬物を別々にまたは一緒に投与することができ、別々に投与する場合には、これらは同時にまたはいずれかの順序で別々に投与することができる。活性成分および医薬的に活性な薬物の量、並びに投与の相対的なタイミングを選んで、所望する組み合わせ療法の効果を得る。該組み合わせ療法は、本発明のある化合物、その生理学的な官能性誘導体および本明細書に下記する薬物の１つを投与することを含む。
【００７６】
式１に記載のモジュレートと組み合わせて有効であると企図される、他の薬物または活性成分としては、例えば抗ウイルス薬（例えば、インターフェロン、これはインターフェロンαおよびγ、リバビリン、アシクロビル（acyclovir）およびＡＺＴ（登録商標）；抗真菌剤薬（例えば、トルナフテート（tolnaftate）、フンギゾン（Fungizone）（登録商標）、ロトミリン（Lotrimin）（登録商標）、ミセレックス（Mycelex）（登録商標）、ナイスタチンおよびアンフォテラシン（Amphoteracin）を含むが、これらに限定されない）；駆虫薬（例えば、ミンテゾール（MIntezol）（登録商標）、ニクロシド（Nicloside）（登録商標）、ベルモックス（Vermox）（登録商標）およびフラギル（Flagyl）（登録商標））；腸剤（例えば、イモジウム（Immodium）（登録商標）、ロモチル（Lomotil）（登録商標）およびファジメ（Phazyme）（登録商標））；抗腫瘍薬（例えば、インターフェロンαおよびγ、アドリアミシン（Adriamycin）（登録商標）、サイトキサン（Cytoxan）（登録商標）、イムラン（Imuran）（登録商標）、メトトレキセート、ミトラシン（Mithracin）（登録商標）、チアゾフリン（Tiazofurin）（登録商標）、タキソール（Taxol）（登録商標））；皮膚科学用の薬物（例えば、アクロベート（Aclovete）（登録商標）、シクロコルト（Cyclocort）（登録商標）、デノレックス（Denorex）（登録商標）、フロロン（Florone）（登録商標）、オキソラレン（Oxsoralen）（登録商標）、コールタールおよびサリチル酸）；偏頭痛用製剤（例えば、エルゴタミン化合物）；上記以外のステロイドおよび免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ディプロソン（Diprosone）（登録商標）、ヒドロコルチゾン、フロロン（Floron）（登録商標）、リデックス（LIdex）（登録商標）、トピコルト（Topicort）およびバリソン（Valison）を含む）；代謝薬（例えば、インスリン）および上記の分類にうまく適合し得ない他の薬物）（例えば、サイトカイン（例えば、IL2, IL4, IL6, IL8, IL10およびIL12）を含む））を挙げられる。特に好ましい主な薬物は、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換のグアノシンアナログ、２，３−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、インターフェロン（例えば、ＩαＢ−インターフェロン）、ツカレゾール（tucaresol）、レバミゾール（levamisole）、イソプリノシンおよびシクロリグナンス（cyclolignans）である。
【００７７】
それらの更なる治療学的な薬物としては、例えば免疫系のモジュレートまたは関連する病気に有効である薬物（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換のグアノシンアナログ、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、インターフェロン（例えば、α−インターフェロン）、ツカレゾール、レバミゾール、イソプリノシンおよびシクロリグナンス）を含む。本発明に記載のある化合物は、この目的の効果のために共投与される他の化合物の代謝または失活などを低下させることによって、本発明に記載のある薬物の生物学的な活性を増大させるのに有効であり得る。
【００７８】
用量について、当該分野の当業者は治療学的に有効な量が処置する感染もしくは病気、その激しさ、使用する処置レジメ、使用する薬物の薬物動態学、並びに処置する患者（動物またはヒト）に応じて変わるであろうと認めるであろう。様々な別の用量（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ以上の用量を含む）もまた適当であると企図する。処置の成功は式１の化合物の比較的に低い血中濃度でいくつかのウイルス感染について得ることができるが、他のウイルス感染は比較的に高い用量を必要とし得るとも更に企図する。しかしながら、適当なレジメは、少量を投与し、次いで副作用が過剰に有害となるかまたは目的の効果が得られるまでその量を増加させることによって展開されるであろうと企図する。
【００７９】
活性化合物の投与は、連続（静脈内点滴）から１日当たり数回の経口投与（例えば、Ｑ．Ｉ．Ｄ．）にまで多岐にわたることができ、例えば経口、局所、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（これは、透過増大薬を含むことができる）、頬側および坐薬の投与、並びに他の投与形態を含むことができる。
【００８０】
本発明の医薬組成物を製造するために、本発明の化合物の１つ以上の治療学的に有効な量を通常の医薬の混合方法に従って、医薬的に許容し得る担体と密に混合して、用量を得ることが好ましい。担体は投与（例えば、経口または非経口）に望ましい製剤の形態に応じた広範囲な形態をとることができる。経口投与形態の医薬組成物を製造する場合には、通常の医薬的な媒質のいずれかを使用することができる。従って、液体の経口製剤（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤）の場合には、安定な担体および添加物（例えば、水、グリコール、油、アルコール、芳香剤、保存剤、着色剤など）を使用することができる。固体の経口製剤（例えば、散剤、錠剤、カプセル剤）の場合、および固体の製剤（例えば、坐剤）の場合には、適当な担体および添加物（例えば、デンプン、糖担体（例えば、デキストロース、マンニトール、ラクトース）を含む）および関連する担体、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを使用することができる。望むならば、錠剤またはカプセル剤を、標準的な方法によって腸溶性としたりまたは持続的な放出とすることができる。
【００８１】
非経口製剤の場合には、担体は分散を助ける成分を含めた他の成分を含むことができるが、通常は減菌した水または塩化ナトリウム水溶液を含むであろう。当然に、減菌した水を使用して減菌のまま保存する場合には、該組成物および担体もまた減菌でなければいけない。適当な担体、懸濁化剤などを使用することができる場合には、注入可能な懸濁剤をも製造することができる。
【実施例】
【００８２】
（製造例）
３−シアノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール（７）の製造
３−シアノ−１，２，４−トリアゾール（１８．８ｇ、２００ｍｍｏｌ）（６）、１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース（６３．６６ｇ、２００ｍｍｏｌ）およびビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート（１ｇ）の混合物を、ＲＢフラスコ（５００ｍＬ）に置いた。該フラスコを、１６５〜１７５℃で予め加熱した油浴中に置き、水流アスピレーター減圧下で２５分間撹拌した。置き換えられた酢酸をアスピレーターとＲＢフラスコの間に置いた氷冷トラップに集めた。該フラスコを該油浴から取り出し、冷却させた。該フラスコの温度が約６０〜７０℃に達すると、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１５０ｍＬ）を入れ、ＥｔＯＡｃ中に抽出させた。該水相をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を用いて再び抽出した。該ＥｔＯＡｃ抽出液を合わせて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）を用いて洗浄した。該有機抽出液を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、ろ過し、該ろ液を蒸発させて乾固させた。残渣をエーテル（１００ｍＬ）に溶解させて、このものを０℃で１２時間冷却させることにより、無色の結晶を得た。該固体をろ過し、最少量の冷ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、固体のＮａＯＨを用いて高真空下で乾燥した。収量は５６．４ｇ（８０％）であった。
【数１】
0005253204.tif 000018
元素分析（Ｃ１４Ｈ１６Ｎ４Ｏ７（３５２．３０）として計算）；理論値：Ｃ  ４７．３３、Ｈ  ４．５８、Ｎ  １５．９０；実測値：Ｃ  ４７．７０、Ｈ  ４．６３、Ｎ  １６．０１。
【００８３】
１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミジン（ビラミジン（登録商標））・塩酸塩（８）
（７）（１４．０８ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（２．１４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）および無水アンモニア（１５０ｍｌ）の混合物を、スチール製のボンベ中、８５℃で１８時間加熱した。該スチール製ボンベを冷却し、開封し、該内容物を蒸発させて乾固させた。残渣をＭｅＣＮ−ＥｔＯＨから結晶化させて、（８）（１０．６ｇ、９５％）を得た。
【数２】
0005253204.tif 000019
元素分析（Ｃ８Ｈ１４ＣｌＮ５Ｏ４（２７９．６８）として計算）；理論値：Ｃ  ３４．３５、Ｈ  ５．０５、Ｎ  ２５．０４、Ｃｌ  １２．６９；実測値：Ｃ  ３４．３９、Ｈ  ５．１０、Ｎ  ２５．１４、Ｃｌ  １２．７１。
【００８４】
別法として、該製造を以下の通り、商業的に入手可能なリバビリン（登録商標）から進めることができる。
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（９）
１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバビリン（登録商標）（２８．４ｇ、１１６．４ｍｍｏｌ）（５）の無水酢酸（２００ｍL）およびピリジン（５０ｍL)の懸濁液を、室温で終夜撹拌した。得られた透明溶液を真空下で濃縮して、透明な発泡体（４３．１ｇ、定量）を得た。この発泡体をＴＬＣ上で均質とし、更に精製することなく次の工程に直接的に使用した。少量をフラッシュクロマトグラフィー精製を行なうことにより、分析用の試料を得た。
【数３】
0005253204.tif 000020
元素分析（Ｃ１０Ｈ１８Ｎ４Ｏ８として計算）Ｃ、Ｈ、Ｎ。
【００８５】
３−シアノ−２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール（１０）
（９）（４３．１ｇ、１１６．４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５００ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（２４４ｍＬ）を加え、該混合物を氷−塩浴下で０℃まで冷却した。オキシ塩化リン（３０．７ｍＬ、３３０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下し、該溶液を室温まで昇温させた。該混合物を室温で１時間撹拌した後、ＴＬＣ（ヘキサン／アセトン（３：１））は出発物質の完全な消失を示した。該褐色の反応混合物を真空下で濃縮して乾固させて、残渣をクロロホルム（５００ｍＬ）に溶解させた。該有機溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×２００ｍＬ）を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥して真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（２０％アセトンのヘキサン溶液を使用）を行って、アモルファス状固体の純粋な（１０）（３３．１４ｇ、リバビリンからの８１％）を得た。この固体は標準的な試料のすべての面で一致した。
【数４】
0005253204.tif 000021
【００８６】
１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミジン・塩酸塩（８）
（１０）（４．０ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）のメタノール（１００ｍＬ）の懸濁液に、メトキシナトリウム（１２ｍＬ）（１モル）のメタノール溶液を加え、該混合物を室温で終夜撹拌した。該溶液をメタノールで洗浄したDowex H＋樹脂を用いてｐＨが４にまで酸性とし、該樹脂をろ過し、該ろ液を真空下で濃縮して乾固させた。該残渣を最少量のメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、耐圧ボトルに移した。塩化アンモニウム（０．６１ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）および乾燥アンモニアガス（７５ｍＬ）を用いて０℃で飽和としたエタノール溶液を加えて、該ボトルを封し、該溶液を室温で終夜撹拌させた。該溶液を真空下で濃縮して乾固させて、得られた残渣をアセトニトリル／エタノールから結晶化して、結晶性の固体の（８）（２．９５ｇ、９３％）を得た。この試料は標準的な試料の全ての面で一致した。
【００８７】
（薬理試験）
ビラミジン（登録商標）（１．３９ｍｇ／ｍＬ）はＴ−リンパ球（活性化されたものが好ましい）中での１型サイトカインの発現および産生を増大させると、特に企図する。様々な実験からの結果を図２〜５に示す。図２は、５μＭのビラミジン（これは、式１に記載の化合物である）、リバビリンおよびレボビリンがＳＥＢで活性化されたヒトＴ細胞（ｎ＝５ドナー）における１型サイトカインの製造に及ぼす影響を示す。この場合に、ビラミジンはトリアゾールを用いるコントロールの場合と比べて、１型応答の明確な増加を示す。図３は、用量が０．６２５〜１０μＭの範囲のビラミジンがＳＥＢ（黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で活性化されたヒトＴ細胞における１型サイトカイン産生に及ぼす用量応答性効果の図面である（データは４つの個体のドナーによるものである）。ビラミジンの接触過敏症（ＣＨＳ）アッセイにおける１型応答の増加のインビボ効果を、図４において明確に示す。図５はビラミジンおよびレボビリン／リバビリンのピーク応答でのヌクレオシドの濃度と、応答のピーク領域との間の比較を示す（該図面中、ｙ軸はある実験における応答者の数を示す）。
【００８８】
ヒトＴ−細胞の調製およびインビトロでの活性化
末梢血液単核細胞を健康なドナーまたはリウマチ関節炎の患者から、密度勾配遠心分離、続いてLymphokwik（One Lambda, Canoga Park CA）を用いたＴ細胞の濃縮によって単離した。混入している単球をプラスチックに粘着させることによって除いた。精製したＴ細胞は、＞９９％のＣＤ２＋、＜１％のＨＬＡ−ＤＲ＋および＜５％のＣＤ２５＋であり、このものをＲＰＭＩ−ＡＰ５（ＲＰＭＩ−１６０媒質、これは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨが７．４）、５％の自己血漿、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．０５％の２−メルカプトエタノールを含有する）中で保存した。
【００８９】
サイトカインタンパクのレベルの測定のために、Ｔ−細胞（１ｍＬの容量中に１×１０６細胞）を、０．５μｇのイオノマイシンを加えた１０ｎｇのＰＭＡ（これらは共にCalbiochem, La Jolla, CA製）を加えることによって活性化し、加湿したインキュベーター（０〜２０μＭのヌクレオシドの存在下、３７℃、５％ＣＯ２下で）中の２４ウェルプレートで４８時間までインキュベートした。活性化の後、細胞由来のサイトカインの産生について上清を分析した。増殖および生存度の研究において、上記のプロトコールを、９６ウェルプレートフォーマット（これは、０．２ｍＬの容量中、０．２×１０６の細胞を使用し、２ｎｇのＰＭＡおよび０．１μｇのイオノマイシンを用いて活性化）に改変した。別実験では、２ｍＬ中、５×１０６のＴ細胞を１μｇのイオノマイシンを加えた２０ｎｇのＰＭＡを用いて活性化した。あるいは、文献の方法に従って細胞をＳＥＢを用いてインビトロで活性化することができる。ここで、６〜２４時間インキュベートした後に、全ＲＮＡをＴ細胞から単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析して様々なサイトカインおよび炎症性メディエーターのｍＲＮＡレベルを測定した。また、別実験において、ヒトＴ細胞を更に精製して（Stem Cell Technologies, Vancouver, BC製の細胞濃縮試薬を使用）、ＣＤ４＋（RosetteSepヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離試薬を用いてＣＤ８＋は＜１％）、およびＣＤ８＋（RosetteSepヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離試薬を用いてＣＤ４＋は＜１％）のＴ細胞サブセットの純粋な個体群を得た。その後に、ｍＬ当たり１×１０６細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンを用いて、全Ｔ細胞実験の通りに活性化した。
【００９０】
細胞外サイトカインの分析
適当に希釈後、ＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−４およびＩＬ−５（Biosource International, Camarillo, CA）に特異的なＥＬＩＳＡキットを用いて、細胞上清中のヒトサイトカインのレベルを測定した。マウスのサイトカインのレベルを、マウスのＩＦＮｇおよびＩＬ−４に特異的なＥＬＩＳＡキット（R and D Systems, Minneapolis, MN）を用いて測定した。すべてのＥＬＩＳＡの結果をｐｇ／ｍＬで表わした。いくつかのデータを、活性化コントロールの％で示し、未処置の活性化したＴ細胞のサイトカインのレベルに対する、試験ヌクレオシドの存在下での活性化したＴ細胞サイトカインのレベルの比率×１００％として算出した。試験ヌクレオシドによるサイトカインレベルでのゼロ効果は、活性化コントロール値（１００％）のパーセントとして示す。あるいは、データを活性化したコントロールからのパーセントの変化（［（試験のｐｇ／ｍＬ−活性化したコントロールのｐｇ／ｍＬ）／活性化したコントロールのｐｇ／ｍＬ］×１００％）として示す。試験ヌクレオシドがサイトカインレベルに及ぼすゼロ効果は、０％であろう。
【００９１】
接触過敏症（ＣＨＳ）
接触性アレルゲンであるＤＮＦＢとの反応性を、上記（Ishii, N., K. Takahashi, H, Nakajima, S. Tanaka, P. W. Askenase.による, 1994. DNFB contact sensitivity (CS) in Balb/c and C3H/3He mice. J. Invest. Dermatol. 102: 321）の通り、測定した。要するに、未処置のマウスのせん毛した腹部上ヘアセトン：オリーブ油（４：１）中の０．３％のＤＮＦＢ（２０μＬ）を適用することによって、マウスを感作した。ＣＨＳの最適な誘発として、マウスを感作の５日後に各耳の両側に０．１２％のＤＮＦＢ（２０μＬ）を用いてチャレンジした。未感作のマウスについてもチャレンジし、各実験のコントロールとして使用した。２４時間後、耳の厚さを測定し、チャレンジ前の値からチャレンジ後の値を引くことによってＤＮＦＢヘの応答を評価した。提示する通り、７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンを用量がＰＢＳ（０．３ｍｇ／ｋｇ）（５０μＬ）中に６．２μｇで、またはＰＢＳ（０．６ｍｇ／ｋｇ）（１００μＬ）中に１２．４μｇで、ＤＮＦＢを用いたチャレンジ時に腹膜内注射によって投与した。これらの用量の７−β−Ｄ−リボフラノシル−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミジンは、予備的な最適化実験において最大効果を示した。最終的な耳の厚さの測定後に、マウスを中枢の脱臼によって犠牲にし、腋／外側の腋のリンパ節を取り出した。単離したリンパ節細胞からの全細胞ＲＮＡの単離後に、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析を行って、マウスのＩＦＮｇ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルを追跡した。
【００９２】
更なる実験
免疫応答は１型応答へ変化することが好ましいと、通常企図する。結論として、本発明の化合物はウイルス疾患（１型応答が減少したりまたは抑圧される、ウイルス感染が好ましい）の処置において特に有用であると企図する。免疫応答をモジュレートする際の有効性を確認するために、様々な実験を行なった。企図する化合物を用いて行なったいくつかの実験の典型的な概要を以下に示す。
【００９３】
インビトロ：ビラミジンは、ＬＬＣ−ＭＫ２（アカゲザルの腎臓細胞）のプンタ  トロ（Punta Toro）ウイルス感染を抑制した。ここで、８ｍｇ／ｍＬ（Adames菌株の場合）で、および１２ｍｇ／ｍＬ（Balliet菌株の場合）で、ＥＣ５０であった。３２０ｍｇ／ｍＬで、ＣＧ５０であった（１．０〜１．２のウイルス評点）。
【００９４】
インビボ：ビラミジンを皮下または経口投与することにより、ＰＴＶを皮下注射した場合（Adames菌株）には、１００％の生存（Ｃ５７ＢＬ／６マウス／ｇｐ）が得られた。
【００９５】
ＰＴＶによる感染後の２４時間では、インビボでの最少限に有効な皮下用量である３２ｍｇ／ｋｇのリバビリンおよびビラミジンを、１日に２回、５日間皮下的に与えることにより、９６ｍｇ／ｋｇであった。ＰＴＶによる感染後の２４時間では、インビボでの最少限に有効な経口用量である２０ｍｇ／ｋｇのリバビリンおよびビラミジンを、１日に２回、５日間経口的に与えることにより、４０ｍｇ／ｋｇであった。
【００９６】
通常、本発明に記載の最も好ましい使用は、活性化合物が非標的宿主細胞に対して比較的に細胞毒性ではなく、標的に対して比較的により活性である使用である。この点で、Ｌ−ヌクレオシドはＤ−ヌクレオシドよりも増大した安定性を有し得るので有利でもあり、この為により良い薬物動態力学を得ることができる。Ｌ−ヌクレオシドは酵素によって認識されることがなく、従ってより長い半減期を有するので、この結果を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明の新規なヌクレオシドアナログ化合物およびその関連化合物（プロドラッグを含む）、特に式１で示されるカルボキサミジンまたはその医薬的に許容し得る塩およびその関連化合物（プロドラッグを含む）は、治療学的な用途、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置において有用であり、工業的利用価値が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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