(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質溶液と、有機溶媒を含有する水溶液とを混合することにより得られる、有機溶媒の濃度が１０重量％〜２０重量％であり、発光基質の濃度が０．２９ｍｇ／ｍｌ〜０．３３ｍｇ／ｍｌである、発光基質水溶液。
【請求項２】
ルシフェラーゼの発光基質が、セレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン、およびそれらの誘導体から選ばれた１種以上である、請求項１に記載の発光基質水溶液。
【請求項３】
有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、およびエタノールから選ばれた１種以上である、請求項１に記載の発光基質水溶液。
【請求項４】
水溶液が、生理食塩水または塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液である、請求項１に記載の発光基質水溶液。
【請求項５】
有機溶媒を含有する水溶液における、有機溶媒の濃度が、有機溶媒含有水溶液に対して３〜１５重量％の範囲である、請求項１に記載の発光基質水溶液。
【請求項６】
ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質溶液と、有機溶媒を含有する水溶液とを混合し、有機溶媒の濃度が１０重量％〜２０重量％であり、発光基質の濃度が０．２９ｍｇ／ｍｌ〜０．３３ｍｇ／ｍｌである発光基質水溶液を得ることを特徴とする発光基質水溶液の製造方法。
【請求項７】
ルシフェラーゼの発光基質が、セレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン、およびそれらの誘導体から選ばれた１種以上である、請求項６に記載の発光基質水溶液の製造方法。
【請求項８】
有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、およびエタノールから選ばれた１種以上である、請求項６に記載の発光基質水溶液の製造方法。
【請求項９】
水溶液が、生理食塩水または塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液である、請求項６に記載の発光基質水溶液の製造方法。
【請求項１０】
有機溶媒を含有する水溶液における、有機溶媒の濃度が、有機溶媒含有水溶液に対して３〜１５重量％の範囲である、請求項６に記載の発光基質水溶液の製造方法。
【請求項１１】
レポーターアッセイ法において、ルシフェラーゼを生産する生物を発光させるにあたり、請求項１〜５の何れか１項に記載の発光基質水溶液を用いることを特徴とする、レポーターアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼの発光に用いる発光基質水溶液、その製造方法、それを用いたレポーターアッセイ法、および発光基質水溶液キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼは原核細胞生物である発光細菌から高等真核細胞生物であるホタルまでの発光生物において、酸素存在下で発光基質（ルシフェリン）が酸化して、光を放つ化学反応を触媒する蛋白質の総称である。発光基質としてセレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン及びその誘導体などが知られている。特にセレンテラジンを発光基質とするルシフェラーゼとして、レニラルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、オプロフォーラスルシフェラーゼ、メトリディアルシフェラーゼ、ペリフェラルシフェラーゼ、コンケシアルシフェラーゼ等が知られている。
【０００３】
このルシフェラーゼとその発光基質との発光伴う化学反応は、検査・診断薬やレポーターアッセイ法に代表される医薬原体のスクリーニング方法などに応用されている。
【非特許文献１】Ｓ．Ｂｈａｕｍｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００２）９９、３７７−３８２
【非特許文献２】Ｖｅｎｉｓｎｉｋ Ｋ．Ｍ． Ｍｏｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ（２００７）９、２６７−２７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
検査・診断薬や、医薬原体のスクリーニングにおいて、ルシフェラーゼの発光は、発光強度が高く、かつ発光時間が長いことが求められている。殊に、マウスやラットなどの小動物を生体試料として使用し、被検体物質の生物学的活性を、ルシフェラーゼをレポーターとし、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用した発光によって検出するレポーターアッセイ法においては、生体試料と被検体物質とを画像化し、生体内外における動的変化を経時的に観察する必要性が高いことから、より高い発光強度、より長い発光時間が求められている。更に、生体への影響を考慮すると、少量の溶液でより多くの発光基質を注入することが望ましく、高濃度のルシフェリンを調製する必要があった。
【０００５】
レニラルシフェラーゼをレポーターとして用いマウスの全身を可視化した、非特許文献１について例示すると、レニラルシフェラーゼを生産する細胞を移植したマウスに、メタノールにて溶解した発光基質（セレンテラジン）をリン酸緩衝液にて希釈して、尾静脈注射にて注入し、麻酔した上で、得られる発光をＣＣＤカメラにて撮影するといった手法が用いられている。しかしながら、上記条件では、発光基質（セレンテラジン）溶液における発光基質の濃度は最大でも０．２ｍｇ／ｍｌ（２５℃）にしかならず、観察に必要な発光強度と発光時間が充分に達成されているとは言い難かった。
【０００６】
なお、単に発光基質水溶液における発光基質の濃度を上げるだけであれば、発光基質水溶液に含まれる有機溶剤の濃度を上げればよいが、有機溶剤濃度が高まるほど、ルシフェラーゼの発光活性や、生体試料に対する影響が高まることから、有機溶剤濃度を上げる場合であっても限度があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質水溶液と、有機溶媒を含有する水溶液とを混合することにより、最終的に得られる発光基質水溶液の有機溶剤濃度が同じであっても、より多くの発光基質が溶解可能であることを知見し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は以下の構成を有する。
（１）ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質溶液と、有機溶媒を含有する水溶液とを混合することにより得られる発光基質水溶液。
（２）ルシフェラーゼの発光基質が、セレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン、およびそれらの誘導体から選ばれた１種以上である、前記第１項に記載の発光基質水溶液。
（３）有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、およびエタノールから選ばれた１種以上である、前記第１項に記載の発光基質水溶液。
（４）水溶液が、生理食塩水または塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液である、前記第１項に記載の発光基質水溶液。
（５）有機溶媒を含有する水溶液における、有機溶媒の濃度が、有機溶媒含有水溶液に対して３〜１５重量％の範囲である、前記第１項に記載の発光基質水溶液。
（６）ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質溶液と、有機溶媒を含有する水溶液とを混合することを特徴とする発光基質水溶液の製造方法。
（７）ルシフェラーゼの発光基質が、セレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン、およびそれらの誘導体から選ばれた１種以上である、前記第６項に記載の発光基質水溶液の製造方法。
（８）有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、およびエタノールから選ばれた１種以上である、前記第６項に記載の発光基質水溶液の製造方法。
（９）水溶液が、生理食塩水または塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液である、前記第６項に記載の発光基質水溶液の製造方法。
（１０）有機溶媒を含有する水溶液における、有機溶媒の濃度が、有機溶媒含有水溶液に対して３〜１５重量％の範囲である、前記第６項に記載の発光基質水溶液の製造方法。
（１１）レポーターアッセイ法において、ルシフェラーゼを生産する生物を発光させるにあたり、前記第１項〜第５項の何れか１項に記載の発光基質水溶液を用いることを特徴とする、レポーターアッセイ法。
（１２）ルシフェラーゼの発光基質、有機溶媒、および有機溶媒を含有する水溶液から構成される発光基質水溶液キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の発光基質水溶液は発光基質濃度が高い。本発明の発光基質水溶液の製造方法は、同一の有機溶剤濃度であれば、より多くの発光基質の溶解を可能とする。本発明の発光基質水溶液は、発光基質濃度が高く、ルシフェラーゼの発光に用いた場合には、高い発光強度と長い発光時間を実現させることが可能であることから、レポーターアッセイ法に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１１】
＜１．本発明に用いられる材料＞
本発明に用いられる発光基質は、ルシフェラーゼの発光基質であれば特に限定されるものではない。具体的には、セレンテラジン、ホタルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、渦鞭毛ルシフェリン、オキアミルシフェリン、およびそれらの誘導体などが挙げられる。本発明においては、それらから選ばれた１種を用いても良く、２種以上を使用しても良い。本発明においては、セレンテラジンが好ましく用いられる。
【００１２】
本発明に用いられる有機溶媒は、ルシフェラーゼの発光基質を溶解することができれば特に限定されない。具体的には、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール等が挙げられる。発光基質がセレンテラジンである場合には、セレンテラジンの溶解度の高さの点から、ジメチルスルホキシドおよびメタノールが好ましく用いられる。
【００１３】
本発明に用いられる水溶液は、通常生体試料への注入に用いられる水溶液であれば特に限定されない。具体的には、生理食塩水、グルコース溶液、リン酸緩衝液、塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液などが好ましく用いられる。本発明においては、生理食塩水および塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液が特に好ましく使用することができる。本発明に緩衝液を用いる場合、緩衝液は弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するものであることが好ましい。
なお、本発明においては、水溶液が単なる水である場合であっても、本発明の効果が得られる。この単なる水は、Ｃａイオンを含まないか、含んでいたとしてもＣａの含有量は本発明の効果を損なわない程度の微量であることが好ましい。
【００１４】
＜２．発光基質水溶液の製造方法＞
本発明の発光基質水溶液（以下「第３溶液」と言うことがある）の製造方法は、ルシフェラーゼの発光基質を有機溶媒に溶解した発光基質溶液（以下「第１溶液」と言うことがある）と、有機溶媒を含有する水溶液（以下「第２溶液」と言うことがある）とを混合することを特徴とする。
第１溶液における発光基質の濃度は、発光基質の溶解度を満たすものであれば特に限定されない。第１溶液の調製の際、多量の有機溶媒で発光基質を溶解すると、第３溶液に含まれる有機溶媒の最終濃度が高まる。第３溶液が生体試料内に注入されるような場合、有機溶媒濃度が低い方が、生体試料が受ける有機溶媒の影響が少ない傾向にある。このような点を考慮すると、第１溶液における当該発光基質の濃度は、１〜８ｍｇ／ｍｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜６ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００１５】
第２溶液における有機溶媒の濃度は、第１溶液を加えた際に発光基質が析出せず、且つ第３水溶液の有機溶媒濃度が２０重量％を超えなければ、特に限定されない。具体的には３〜１５重量％の範囲である。
【００１６】
なお、第１溶液に使用する有機溶媒と、第２溶液に使用する有機溶媒の種類は、同じであっても違っていても良いが、本発明においては、同じであることが好ましい。
【００１７】
第３溶液における有機溶媒の濃度は特に限定されるものではない。溶媒濃度が高いほど、より多くの発光基質を第３溶液に溶解させることが可能である。一方、溶媒濃度が低いほど、生体試料に注入した際の、有機溶媒の影響が少なくなり、検査、診断、スクリーニングの精度が高くなる傾向がある。こういった点に鑑みると、第３溶液における有機溶媒の濃度は、１０〜２０重量％以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明においては、発光基質と有機溶媒と水溶液の組み合わせは特に限定されるものではない。本発明において好ましい組み合わせとしては、セレンテラジン、ジメチルスルホキシド、および生理食塩水の組み合わせ、セレンテラジン、ジメチルスルホキシド、および塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液の組み合わせ、セレンテラジン、メタノール、および生理食塩水の組み合わせを挙げることが出来る。
【００１９】
＜３．本発明発光基質溶液の用途＞
本発明の発光基質水溶液の用途は特に限定されるものではないが、本発明の発光基質水溶液は、発光基質濃度が高く、ルシフェラーゼの発光に用いた場合には、高い発光強度と長い発光時間を実現させることが可能であることから、レポーターアッセイ法に好適に使用することができる。
【００２０】
現在、生物学分野や医学分野の研究において、細胞等の生体試料の生物学的活性を、ルシフェラーゼをレポーターとして、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用した発光によって検出する技術（レポーターアッセイ法）が広く利用されている。さらに、レポーターアッセイ法と高感度発光検出装置とを併用する方法であれば、生細胞あるいはマウスやラットなどの小動物を生体試料とした個体レベルにおいて、種々の生物学的活性を可視化することができるので、より効率的な医療用薬剤の研究、開発が可能となる。本発明の発光基質水溶液は、このレポーターアッセイ法と高感度発光検出装置とを併用する方法において特に好ましく使用することができる。
【００２１】
本出願におけるもう１つの発明は、発光基質水溶液キットである。本発明の発光基質水溶液キットは、ルシフェラーゼの発光基質、有機溶媒、および水溶液、もしくは有機溶媒を含有する水溶液から構成されるが、本発明の効果を損なわない限り、それら以外の成分を含むものであってもよい。
【００２２】
本発明の発光基質水溶液キットの組成は特に限定されるものではないが、キットを用いて得られる発光基質水溶液の組成が、前述の発光基質水溶液の製造方法において述べた有機溶媒濃度、発光基質濃度の範囲になるようなものであることが好ましい。
【００２３】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りがない限り「重量％」を意味する。
【実施例】
【００２４】
実施例１
２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬社製）に、１００μｇのセレンテラジン（チッソ社製）を加えて溶解した。このセレンテラジンのＤＭＳＯ溶液を、１０μｌのＤＭＳＯを加えた１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（シグマ社製）２８０μｌに加え、発光基質水溶液を調整した。この発光基質水溶液のセレンテラジンの溶解性等を表１に示した。
【００２５】
実施例２
２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬社製）に、１００μｇのセレンテラジン（チッソ社製）を加えて溶解した。このセレンテラジンのＤＭＳＯ溶液を、１０μｌのＤＭＳＯを含有する生理食塩水（大塚製薬製）２８０μｌに加え、この発光基質水溶液のセレンテラジンの溶解性等を表１に示した。
【００２６】
実施例３
７０μｌのメタノール（和光純薬社製）に、２００μｇのセレンテラジン（チッソ社製）を加えて溶解した。このセレンテラジンのメタノール溶液を、７０μｌのメタノールを含有する生理食塩水（大塚製薬製）６３０μｌに加え、発光基質水溶液を調整した。この発光基質水溶液のセレンテラジンの溶解性等を表１に示した。
【００２７】
比較例１
３０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬社製）に、１００μｇのセレンテラジン（チッソ社製）を加えて溶解した。このセレンテラジンのＤＭＳＯ溶液を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（シグマ社製）２７０μｌに加え、発光基質水溶液を調整した。この発光基質水溶液のセレンテラジンの溶解性等を表１に示した。
【００２８】
比較例２
１４０μｌのメタノール（和光純薬社製）に、２００μｇのセレンテラジン（チッソ社製）を加えて溶解した。このセレンテラジンのメタノール溶液を、生理食塩水（大塚製薬製）５６０μｌに加え、発光基質水溶液を調整した。この発光基質水溶液のセレンテラジンの溶解性等を表１に示した。
【００２９】
【表１】
0005320730.tif 000002
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液
【００３０】
比較例１のように、あらかじめＤＭＳＯを加えない水溶液では、セレンテラジンは溶解せず懸濁した。実施例１、２では、ＤＭＳＯで５ｍｇ／ｍｌのセレンテラジン溶液を作製し、混合する水溶液中にあらかじめ３．６重量％のＤＭＳＯを加えたところ、セレンテラジンは溶解した。これにより、従来では溶解しなかったセレンテラジンの濃度で水溶液が作製できることが示された。
【００３１】
比較例２のように、あらかじめメタノールを加えない水溶液では、セレンテラジンは溶解せず懸濁した。実施例３では、メタノールで２．９ｍｇ／ｍｌのセレンテラジン溶液を作製し、混合する水溶液中にあらかじめ１２．５重量％のメタノールを加えたところ、セレンテラジンは溶解した。これにより、従来では溶解しなかったセレンテラジンの濃度で水溶液が作製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の発光基質水溶液は、ルシフェラーゼの発光に用いることができ、特に、ルシフェラーゼの発光を利用したレポーターアッセイ法に好適に使用することができる。