(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを発現する発現ベクターを導入した心筋前駆細胞を有効成分として
含む、心筋虚血又は心筋梗塞の治療剤。
【請求項２】
心筋前駆細胞が、未分化の心筋細胞である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
心筋前駆細胞が、未分化のP19CL6細胞である、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
虚血又は梗塞を有する局所の心筋に投与される、請求項１から３の何れかに記載の治療剤
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋虚血又は心筋梗塞などの心疾患の遺伝子治療技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多能性細胞株P19CL6は、心筋の分化発達をin vitroで解析するための国際的に有効な実験システムである。この細胞は熊本大学の大久保明美博士により樹立され、その後小室一成博士と門前幸志郎博士によって心筋の研究モデルとして展開されている（Habara-Ohkubo A. Differentiation of beating cardiac muscle cells from a derivative of P19 embryonal carcinoma cells. Cell Struct Funct.†1996;21:101-110、及びMonzen K, Shiojima I, Hiroi Y, Kudoh S, Oka T, Takimoto E, Hayashi D, Hosoda T, Habara-Ohkubo A, Nakaoka T, Fujita T, Yazaki Y, Komuro I. Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4. Mol. Cell. Biol.†1999;19:7096-7105）。本発明者らは、このP19CL6由来の心筋細胞において、分化ステージに応じた自律的な活動電位、Ca、Na、K電流を観察した。【０００３】
TNNI3Kは、新生仔から成人まで心筋に特異的かつ持続的に発現されるMAPキナーゼの一つであるが、その分子の特徴は、MAPKKKであるILK(integrin-linked kinase)のアミノ酸の配列と約50％のホモロジーがある。そのアミノ酸配列は835個のアミノ酸があり、分子量は93kDである（Zhao, Yong; Meng, Xian-Min; Wei, Ying-Jie; Zhao, Xiu-Wen; Liu, Dong-Qing;Cao, Hui-Qing; Liew, Choong-Chin; Ding, Jin-Feng. Cloning andcharacterization of a novel cardiac-specific kinase that interacts specifically with cardiac troponin I. Journal of Molecular Medicine (Heidelberg, Germany) (2003), 81(5), 297-304. CODEN: JMLME8ISSN:0946-2716. CAN 139:241022 AN 2003:380646 CAPLUS３．Bibliographic Information）。このTNNI3Kは特異的に心筋トロポニンIと結合し、心筋収縮や、心機能を調節することが推測されていたがまた不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
心筋虚血、心筋梗塞などの心疾患は先進国によく見られる疾患である。欧米各国に比べると、日本では虚血性心臓疾患は少ないが、高齢者人口の増加につれて患者数は増えつづけ、３大死因の一つになっている。この心筋梗塞などの心疾患の治療、特に心機能に関与する分子や遺伝子を利用した治療法は最近よく注目され、非常に重要な課題であるが、現在の段階ではその治療法はまだ不充分であり、新規な治療法の開発が望まれている。即ち、本発明は心筋虚血又は心筋梗塞などの心疾患の治療手段を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
TNNI3Kは、心筋に特異的に発現している新規ＭＡＰキナーゼである。心筋前駆細胞において、このTNN13Kを高発現することにより心筋細胞の分化が促進されることが実証された。さらに、TNN13K高発現心筋前駆細胞をラットの梗塞心筋局所に移植すると、その心筋細胞再生の促進、梗塞面積の減少および左心室リモデリングの改善作用があることが認められた。上記の結果より、ＭＡＰキナーゼTNN13Kは、心筋虚血又は心筋梗塞など心疾患の治療ターゲットとして使用できることが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００６】
即ち、本発明によれば、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する心筋前駆細胞を有効成分として含む、心疾患治療剤が提供される。
好ましくは、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する心筋前駆細胞は、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する発現ベクターを導入した心筋前駆細胞である。
好ましくは、心筋前駆細胞は、未分化の心筋細胞である。
好ましくは、心筋前駆細胞は、未分化のP19CL6細胞である。【０００７】
好ましくは、本発明に治療剤は、心筋虚血又は心筋梗塞の治療剤である。
好ましくは、本発明の心疾患治療剤は、虚血又は梗塞を有する局所の心筋に投与される。【０００８】
本発明の別の側面によれば、心筋細胞におけるＭＡＰキナーゼTNNI3Kの発現レベルを測定することを含む、心疾患の診断方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する心筋前駆細胞を心疾患患者に投与することを含む、心疾患の治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明においては、これまでのES細胞や骨髄幹細胞を使用する場合と異なり、TNNI3K発現させた心筋前駆細胞を心筋虚血又は心筋梗塞の局所へ移植する治療を行う。また、TNNI3K発現レベルの測定を、心筋虚血又は心筋梗塞など心疾患の治療効果および予後判断の手段の一つとして使用することもできる。【００１０】
ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する心筋前駆細胞は、例えば、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する発現ベクターを心筋前駆細胞に導入することによって作製することができる。ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する発現ベクターは、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込むことによって作製することができる。ＭＡＰキナーゼTNNI3Kをコードする遺伝子は既知であり、例えば、Journal of Molecular Medicine (Heidelberg, Germany) (2003), 81(5), 297-304 (Gen Bank accession number AF116826)に記載されている。本発明で用いる発現ベクターとしては、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを心筋前駆細胞で発現させることができるものであれば特に限定されず、通常の動物細胞用の発現ベクターを用いることができる。動物細胞用の発現ベクターの具体例としては、例えば、pcDNA6、pcDM8(フナコシ)、pcDNAI/AmP(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)などを例示することができる。【００１１】
発現ベクターは通常プロモーターを有している。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００１２】
心筋前駆細胞への発現ベクターの導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。【００１３】
上記の方法により得られる、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する発現ベクターを心筋前駆細胞に導入した細胞は、通常、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現することができる。当該細胞におけるＭＡＰキナーゼTNNI3Kの発現量は、ｍＲＮＡレベルではノザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲなどの方法により確認することができ、またタンパク質レベルではウエスタンブロットなどの方法により確認することができる。【００１４】
本発明では、心筋前駆細胞は、未分化の心筋細胞であることが好ましい。未分化の心筋細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に由来する細胞を使用することができ、例えば、未分化のP19CL6細胞などを使用することができる。P19CL6細胞は、例えば、RIKEN Bioresource Center.[URL: http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/search.php]から登録番号 RCB1539（細胞の名称；P19,CL6）として入手可能である。【００１５】
本発明の心疾患治療剤は、各種の心疾患（例えば、心虚血、心筋梗塞、うっ血性心筋症、肥大型閉塞性心筋症、肥大型非閉塞性心筋症、特発性心筋症、慢性心不全など）の治療剤として安全に用いることができる。本発明の心疾患治療剤は、具体的には、例えば心筋形成剤、心臓賦活剤、拍動調節剤、心機能増強剤、心臓再生剤などとして使用することができる。【００１６】
本発明の心疾患治療剤は、公知の方法に従い、ＭＡＰキナーゼTNNI3Kを高発現する心筋前駆細胞を細胞懸濁液とすることにより作製することができる。このようにして得られる心疾患治療剤は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対してカテーテルで挿入するか、直接心臓へ注射するか、静脈に注射するか、又は静脈点滴により投与することができる。【００１７】
投与量、投与回数は本発明の効果が得られる限り特に限定されない。投与量については、投与１回当たりの細胞数として、成人一人当たり一般的には、１０4〜１０8細胞程度、好ましくは、１０5〜１０7細胞程度とすることができる。投与回数は１回以上であれば、任意の回数だけ投与することができ、一般的には１〜１０回、好ましくは１〜５回程度である。
【実施例】
【００１８】
（Ａ）実験方法
（１）多能性P19CL6細胞を用い心筋細胞への分化を誘導するモデル
未分化のP19CL6細胞をバクテリアカルチャディッシュにhand dropで入れ、１％ディメティルスルフォキシドの存在下で培養した。４日間程度培養した後、２日毎に培地を交換して、さらに培養した。このように培養している細胞はマスを形成して、自律的に拍動する現象が表れる。具体的には、４×105細胞を60mmバクテリアカルチャディッシュにhand dropで入れ(１％ディメティルスルフォキシドの存在下)、接着培養で自律的な拍動をする心筋細胞集団を形成させ、自律拍動の出現時間、頻度を観察した。【００１９】
（２）TNNI3K遺伝子のトランスフェクション
新規MAPキナーゼであるTNNI3K分子の遺伝子pcDNA6-FLAG/TNNI3Kを導入して、TNNI3K高発現の細胞株を下記の方法により作製した。エレクトロポレーション法(electropoie 2000、Invitrogen)を利用して、TNNI3Kの遺伝子pcDNA6-FLAG/TNNI3KをP19CL6細胞へ導入し、blasticidin(Invitrogen)（500μg/ml）抵抗性のTNNI3K高発現のステイブル細胞株を作製した。ウエスタンプロット法を用い、未分化細胞と分化成熟した細胞(16日目)のTNNI3K細胞群とflag-only細胞群でTNNI3Kの発現レベルを確認し、TNNI3Kを高発現する細胞群を取得した。【００２０】
（３）拍動心筋細胞集団数と拍動発生の時間の観察
カルチャディッシュに見られた拍動心筋細胞集団数と拍動発生時間、拍動頻度を観察し、flag-onlyとTNNI3K高発現細胞群とを比較した。
シングル心筋細胞の自発拍動は、EPC-７パッチクランプアンプ（List Electronic）を用いてホールセルパッチクランプ法により観察した。パッチ電極はPB-7プラー（Narishige Corp.LTD）により作製し、２〜６ＭΩの抵抗を有していた。電圧−クランプパルスの発生およびデータ取得は、pCLAMソスフトウエア（Axon Instrument）を備えたＰＣコンピューターにより制御して分析した。記録は３Ｈｚでフィルターにかけた。全細胞漏出及び電流は、Ｐ／４操作法を用いてオンラインで差し引いた。カレントクランプ技術を用い、分化期間の心筋細胞の自発活動電位を室温下で記録した。【００２１】
（４）拍動心筋細胞の形態学検査
α-アクチニン抗体で免疫染色した陽性細胞の形態や細胞の量を観察した。また、α-アクチニン蛋白の発現をウエスタンブロッティングにより比較した(α-アクチニンの発現は、心筋細胞への分化の１指標となる)。具体的には以下の通り行った。【００２２】
形態学検査のために、心起源の分化細胞を、α−アクチニンに対するモノクローナル抗体（Sigma）で染色し共焦点顕微鏡で解析した。即ち、細胞を回収し、３５ｍｍディッシュ中でアセトン／メタノール（１：１）で２分間固定し、洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１５分間ブロッキングした。それから一次抗体（０．２％Triton X-100/PBSで希釈した抗−α−アクチニン抗体）を１時間添加し、次に、０．２％BSA/PBSで希釈した二次抗体（FITC標識ヤギ抗マウスＩｇＧ）を添加した。洗浄及び２．５％ＤＡＢＣＯ／８０％グリセロールで固定した後、共焦点顕微鏡（Fluoview, FV300, オリンパス）を用いて共焦点顕微鏡写真を取得して分析した。【００２３】
ウエスタンブロッティングは以下の通り行った。タンパク質を、flag-only群及びTNNI3K高発現群の各分化段階の心筋細胞から調製した。細胞を採取し、２４時間培養し、回収し、溶解した。それからタンパク質を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で２時間かけて分離し、エレクトロブロットにより３時間かけてニトロセルロース膜に移した。膜をスキムミルクで一晩ブロッキングし、洗浄し、抗−ｐｃＤＮＡ−flag／TNNI3K（ニワトリ抗ヒト、１：１０００）又は抗−α−アクチニン（ウサギ抗マウス、１：８００）、又は抗-Bax（ウサギ抗マウス、１：５００）と一緒にインキュベートした。次いで、膜を洗浄し、ＨＲＰ−標識二次抗体（１：３０００〜５０００）と一緒に室温で１時間インキュベートした。特異的タンパク質をＥＣＬ（Amersham）で検出した。【００２４】
（５）ホールセルパッチクランプ法による酵素(コラゲンナーゼ)で単離したシングル心筋細胞を用いた実験
自発活動電位を記録し、その活動電位のアドレナリン受容体作用薬であるエピネフリンに対する感受性を観察した。【００２５】
また、Fura-2/AMを負荷したシングル心筋細胞を用い、細胞内Ca2+濃度に対するカフェイン、リアノジンあるいはhigh-K+溶液の効果を検討した。細胞内Ca2+濃度の測定のために、シングル心筋細胞をコラゲンナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）で単離し、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたマウントカバースリップディッシュ（３５ｍｍ径）の上に置き、３．５μＭ fura-2/AM（同仁化学）と一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を培地で４回洗浄した。マイクロ蛍光強度測定を、室温で生理食塩水（140mM NaCl, 5mM KCl, 1.5mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Hepes, 10mMグルコース, pH7.4）中で行った。細胞を画像プロセッサーシステム（ACOUScosmos, 浜松フォトニクス）を用いて３４０ｎｍ／３８０ｎｍ画像の比率を集め、分析ＭＯディスクに保存した。さらに、高Ｋ+溶液（142mM）、カフェイン（10mM)又はリアノジン（２．６μＭ）の存在下におけるＣａ2+応答も調べた。【００２６】
（６）TNNI3Kと心筋細胞の発生と成熟期のアポトーシス抑制との関係の検討
細胞は、45℃で90分熱処理し、その後培養し、annexin-V抗体で染色し、FACScan法でannexin-Vポジティブ細胞のパーセンテージを計算した。
また、ウエスタンプロット法を用いてBax蛋白の発現を解析した。即ち、UVを２０秒間照射し、２４時間培養した後、細胞を収集、溶解し、ウエスタンプロットした。【００２７】
（７）ラット心臓の冠状動脈の前降支(the left anterior descending coronary artery LAD)の結紮法による心筋梗塞モデルに対するTNNI3Kの効果
ラット（雄Spague-Dawleyラット）（体重２７５〜３２０ｇ，８〜１０週齢）の冠状動脈の前降支を結紮して、心筋梗塞モデルを作成した。ラットを以下の３群に分けた：（ｉ）培地のみ投与（ｎ＝９）、（ii）P19CL6の心筋内投与（ｎ＝５）、及び（iii）TNNI3Kを高発現するP19CL6細胞（ｎ＝７）投与。心筋梗塞局所にTNNI3Kを高発現するP19CL6由来の分化初期(４日目)の心筋細胞（４×１０6細胞／部位、×６個所）を移植した後、心筋梗塞サイズ(梗塞心筋の厚さ、梗塞心筋の厚さと非梗塞心筋の厚さの比率、左心室直径、拡張指数)、及び心筋細胞の細胞死(ネクローシス、アポトーシス)の状況を観察した。培地のみ、又はTNNI3Kを導入してないP19CL6由来の分化初期(４日目)の心筋細胞を移植した後の心臓の場合と結果を比較した。【００２８】
（Ｂ）結果
（１）TNNI3Kは心筋細胞の発生初期に拍動細胞群の形成とその拍動頻度の増加を促進する（図１Ａ）
本実験結果より、P19CL6細胞由来の心筋細胞の拍動は一番早い場合は、分化誘導の開始後６日目にみられ、15日目以後はほとんどのマスの拍動がみられた。flag-only細胞及びTNNI3K高発現細胞の両方において、拍動心筋細胞集団が形成されるが、TNNI3K高発現細胞では、その心筋細胞集団数がflag-onlyより多かった。その拍動頻度の平均値はflag-onlyの場合では約70回/分である(71.3±36.1、n=135マス)。TNNI3K高発現細胞由来心筋細胞の場合は、その拍動頻度が平均約90回/分であり(88.9±52.7、n=138マス)、flag-onlyより有意に増加した（図１Ａ）。【００２９】
（２）TNNI3Kはシングル心筋細胞の自発活動電位のエピネフリンに対する感受性は強くなる
シングル心筋細胞の自発活動電位の拍動頻度はエピネフリン濃度(10-8、10-7、10-6M)に依存的に増加した。TNNI3Kは心筋細胞のエピネフリンの低濃度投与に対する感受性を著しく高めた。この結果から、TNNI3Kは、心筋細胞の発生分化初期において交感神経などの自律神経調節の発達を促進することが示される（図１Ｂ）。【００３０】
（３）TNNI3Kは、α-アクチニン抗体で免疫染色した陽性細胞の数とα-アクチニン蛋白の発現レベルを増加する
TNNI3Kとflag-onlyを比べると、前駆細胞の分化により形成された心筋細胞の大きさおよびその形態については差がなかったが、α-アクチニン抗体で免疫染色した陽性細胞の数とα-アクチニン蛋白の発現レベルではTNNI3K高発現細胞がflag-onlyの方より有意に増加した（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）。【００３１】
（４）TNNI3KはP19CL6由来の心筋細胞の分化初期において、アポトーシスの発生を有意に抑制する
分化した５日目の細胞を45℃90分処置後、annexin-V抗体で染色し、annexin-Vポジティブ細胞のパーセンテージ数を調べた。その結果、TNNI3K高発現細胞では、flag-onlyよりannexin-Vポジティブ細胞が少ないことが認められた（図３Ｂ）。
Baxの発現の解析。細胞をUVで20秒間照射し、その後、24時間培養し、Baxの発現レベルをウエスタンプロット法で解析した。その結果、flag-only群と比べ、TNNI3K高発現細胞では分化初期のBax蛋白発現量は有意に減少した（図３Ｃ）。【００３２】
（５）P19CL6細胞由来の心筋細胞における細胞内Ca2+応答に対するTNNI3Kの効果
Fura-2/AMを負荷したP19CL6細胞由来の心筋細胞において、細胞内Ca2+濃度に対するカフェイン、リアノジンあるいはhigh-K+溶液の効果を検討した。細胞内Ca2+ストアからのリリーズを促進する薬物、カフェイン10mM、あるいはリアノジン2.6μMで誘導されるCa2+濃度の上昇はflag-only群よりTNNI3K高発現群で強かったが、high-K+溶液投与で細胞膜に存在しているCa2+チャンネルを活性化させる場合では両群ともほぼ同じ程度の細胞内Ca2+濃度の持続的増加を誘発した（図４）。【００３３】
（６）TNNI3Kはin vivo実験で心筋梗塞モデルの左心室-リモデリングを改善する
SDラットの心筋梗塞モデルにおけるin vivo実験では、梗塞局所心筋に、分化初期のTNNI3K高発現P19CL6細胞を注入すると、P19CL6脂肪のみの注入より、梗塞心臓の左心室-リモデリングの改善が促進された（図５）。
また、分化初期のTNNI3K高発現P19CL6細胞を注入した場合には、P19CL6細胞のみより、心筋梗塞サイズの縮小とともに、梗塞局所のアポトーシスの抑制が認められた(図５)
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明では、TNNI3K遺伝子を導入することによりTNNI3K蛋白レベルを高め、病態心筋の再生や機能回復を図り、心筋症、心機能不全に対する新たな治療戦略を提供することができる。即ち、ＭＡＰキナーゼTNNI3K高発現の心筋前駆細胞を心筋虚血又は心筋梗塞の局所へ移植することにより、心筋細胞再生を促進でき、梗塞面積を減少でき、さらに左心室リモデリングを改善することができる。本発明の技術は、操作方法が簡単で、特異性が高く、治療効果も大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、TNNI3K過剰発現細胞における自発拍動を示す。図Ａは、P19CL6由来心臓マスにおける自発拍動を示す。ａ：６０ｍｍ培養ウエル中の自発拍動マスの発生数。最初の拍動マスの発生時をこの図に示す。ｂ：拍動マスの発生数。拍動マスの数を顕微鏡下で計算した。ｃ及びｄ：拍動マスの平均頻度。図Ｂは、エピネフリンに対する自発作用力の応答を示す。自発作用力をホール細胞パッチクランプ法でシングル心筋細胞で記録し、エピネフリンへの応答を調べた。ａ：flag-onlyの細胞の代表例。ｂ：TNNI3K発現細胞の代表例。ｃ：EP1で刺激された拍動数の増加の用量依存性
【図２】図２は、シングル心筋細胞における免疫組織分析を示す。Ａ：Flag-only群及びTNNI3K群における分化終期（１６日目）におけるシングル心筋細胞の代表写真。Ｂ：α−アクチニン陽性細胞の数。アクチニン陽性細胞の数は、Flag-only群及びTNNI3K群の両方において、培養日数に依存して増加した。Ｃ：α−アクチニンの発現についてのウエスタンブロットの結果。各レーンの下段の表示は分化の日数を示す。
【図３】図３は、TNNI3K過剰発現による心筋発生中のアポトーシスの阻害を示す。Ａ：心筋細胞の発生に対する最初の培養細胞数の変化の影響。最初の細胞数を変化させて、flag-only群とTNNI3K群における心筋細胞のマス形成を調べた。Ｂ：FACScanでの測定によるアネキシン−Ｖ陽性細胞の割合。下段のグラフは、分化中（左のグラフ）及び未分化（右のグラフ）の細胞のアポトーシス細胞の割合を時間経過を示す。Ｃ：心筋細胞におけるＢａｘタンパク質の発現を示す。
【図４】図４は、TNNI3KがP19CL6由来の心筋細胞において細胞内カルシウム応答を高める効果を示す。Ａ．カフェイン、リアノジン、high-Kの投与による細胞内カルシウム濃度の一過性上昇。Ｂ．Flag-only群とTNNI3Kにおける細胞内カルシウム応答のまとめ。
【図５】図５は、インビボにおける心筋梗塞に対するTNNI3Kを高発現するP19CL6細胞の心筋内注入の効果を示す。Ａ：心臓切片の写真。Ｂ：水平に切断した心臓の写真。Ｃ：心筋梗塞（ＭＩ）のある領域とない領域における心室の壁厚の比率、ＭＩ厚さ（心筋梗塞領域の心室の壁厚、培地群）、及びＬＶ径（左心室径）。ＭＩ：心筋梗塞、ＭＩ＋Ｐ：心筋梗塞＋P19CL6細胞の注入、ＭＩ＋Ｐ＋Ｔ：心筋梗塞＋TNNI3Kを高発現する分化P19CL6細胞の注入。Ｄ：ラット心筋から得た切片のＨＥ染色（心筋梗塞後１４日目）。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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