(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い細胞接着能を有し、キトサンから成るキトサン系フィルムの製造方法であって、
ａ）キトサンを、酸の水溶液を含む可溶化培地中に溶解するステップと、
ｂ）前記ステップａ）より得られた溶液を表面上に堆積させるステップと、
ｃ）キトサン系フィルムが形成されるよう前記表面に堆積した前記溶液を乾燥するステップと、
ｄ）前記キトサン系フィルムを（i）基剤の水溶液、（ii）５以上のｐＨを有する緩衝液、（iii）架橋剤、および（iv）それらの混合物で構成される基から選択される安定剤と接触させるステップと、
ｅ）前記ステップｄ）において得られた、安定化されたキトサン系フィルムを洗浄するステップと、
ｆ）安定化され、かつ乾燥させられたキトサン系フィルムの乾燥を、15℃乃至80℃の間の温度で、気流の存在下で行うステップと、を含むことを特徴とするキトサン系フィルムの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記キトサンの平均分子量が150,000乃至2,000,000の間であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記キトサンの平均分子量が200,000乃至500,000の間であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、前記キトサンの脱アセチル化度が65％乃至95％の間であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記キトサン派生物が、ホスホン酸基、カルボキシメチル基、メチルピロリドン基、およびそれらの混合物で構成される基より選択される１種以上の官能基を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記可溶化培地が、ｐＨが３．５以下の有機酸または無機酸の水溶液を含むことを特徴とする方法
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記酸が塩酸、酢酸、クエン酸、乳酸、およびリンゴ酸より選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記安定剤が、水酸化ナトリウム、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液またはグルタルアルデヒドの水溶液を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記安定剤が、水酸化ナトリウムおよびグルタルアルデヒドの水溶液を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記安定剤が、（i）リン酸緩衝液および炭酸緩衝液で構成される基から選択される緩衝液および（ii）グルタルアルデヒドを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記ステップｆ）における、安定化され、かつ乾燥させられたキトサン系フィルムの乾燥を、20℃乃至40℃の間の温度で、気流の存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法により得られる、高い細胞接着能を有し、キトサンから成るキトサン系フィルムは細胞接着能の活性化処理を受けていないキトサンフィルム上の細胞接着能値に対して少なくとも２５％以上に増加したエチジウム・ホモダイマー試験により決定される、細胞接着能を備えることを特徴とするキトサン系フィルム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の高い細胞接着能と、少なくとも生物活性を備える物質とを備え、キトサンから成るキトサン系フィルムを含むことを特徴とする高い細胞接着能を有する生物活性化キトサン系フィルム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の生物活性を備えるキトサン系フィルムにおいて、生物活性を備える前記物質が、ヒトまたは動物体内における生物活性を有する抗生物質、ホルモン、タンパク質、およびこれらの混合物より選択されることを特徴とする生物活性を備えるキトサン系フィルム。
【請求項１５】
請求項１４に記載の生物活性を備えるキトサン系フィルムにおいて、生物活性を有する前記物質が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）であることを特徴とする生物活性を備えるキトサン系フィルム。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生物活性を備えるキトサン系フィルムにおいて、前記ＢＭＰがヒト、天然もしくは組み換えＢＭＰ、またはこれらのダイマーもしくはヘテロダイマーであることを特徴とする生物活性を備えるキトサン系フィルム。
【請求項１７】
請求項１６に記載の生物活性を備えるキトサン系フィルムにおいて、前記ＢＭＰが、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−４、ｒｈＢＭＰ−７、それらのダイマーまたはヘテロダイマー、およびそれらの混合物より選択されることを特徴とする生物活性を備えるキトサン系フィルム。
【請求項１８】
請求項１３乃至１７のいずれかに記載の高い細胞接着能を有する生物活性化キトサン系フィルムの製造方法であって、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法に従って得られる、請求項１２に記載のキトサン系フィルムを、生物活性を有する物質と接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１３乃至１７のいずれかに記載の高い細胞接着能を有する生物活性化キトサン系フィルムの製造方法であって、生物活性物質を（i）請求項１に記載の方法の前記ステップａ）において、随意的に生分解性ポリマーと共に、酸の水溶液を含む可溶化培地中で前記キトサン溶液と接触させるか、または代替的に、（ii）請求項１に記載の方法の前記ステップｄ）において、前記安定剤と接触させた前記キトサン系フィルムと接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
支持体と、請求項１２乃至１７のいずれかに記載のキトサン系フィルムによる前記支持体の全体または部分的被覆と、を備えることを特徴とするキトサン系フィルム被覆製品。
【請求項２１】
請求項２０に記載の製品において、前記支持体が、プロテーゼおよび医療外科インプラントで構成される基から選択されることを特徴とする製品。
【請求項２２】
請求項２０に記載の製品において、前記支持体が歯科用または外傷用インプラントであって、前記キトサン系フィルムが、少なくとも一種のＢＭＰを含む生物活性化キトサンフィルムであることを特徴とする製品。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、前記支持体が、ガーゼと、組織工学において用いられる生物学的適合可能および／または生分解性ポリマーのマトリクスとから選択されることを特徴とする製品。
【請求項２４】
請求項１３乃至１７のいずれかに記載の生物活性化キトサン系フィルムの使用であって、受容器官中での生物活性を誘導するための前記フィルムで被覆した製品の製造においての使用。
【請求項２５】
請求項１３乃至１７のいずれかに記載の生物活性化キトサン系フィルムの使用であって、歯科または外傷用途のインプラントの製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  （技術分野）
本発明は、キトサン系フィルムの製造技術分野、および、医薬、食品およびバイオテクノロジー産業におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、現在まで達成されていない、医学、薬学、およびバイオテクノロジーにおける重要な用途を提供する高い細胞接着能を有するキトサンフィルムを得ることを可能にするキトサンの新たな処理方法を提案する。
【０００２】  （背景技術）
キトサンは、キチン、β−１のホモポリマー、４−２−アセトアミド−Ｄ−グルコサミンの部分的脱アセチル化により得られる天然由来のポリマーであり、このうちアセトアミド−Ｄ−グルコサミンは、自然状態ではセルロースの次に最も豊富な多糖類である。
【０００３】  キチンおよびキトサンは共に、食品、医薬、およびバイオテクノロジー産業において重要かつ実際の用途を有する。これは、近年その考えられる使用に関して出願された特許を再調査し、かつ、本件に関する国際シンポジウム（Domardら、キチン科学の進歩（Advances in Chitin Sciences）、第２巻、第７ＩＣＣＣ（Euchis 97）、ジャック・アンドレ出版（Jacques Andre Publisher）（1998）；Peterら、キチン科学の進歩（Advances in Chitin Sciences）、第４巻（Euchis 99）、ポツダム大学（Universitat Potsdam）（2000））の基本的な本質を察することにより即座に理解可能である。
【０００４】  キトサンは、特に医療／医薬産業における使用を好適にする、いくつかの特性を示す。一方、キトサンは、それが供する加工に応じて、例えば多孔性マトリクス、ゲル、ヒドロゲル、スレッド、フィルム等の、多岐にわたる物理的形態を有することができる、抗真菌性および抗菌性を有する（Sanoら、J.Dental Res.、66、141−149（1987）；Ramos、V.Doctoral Thesis、Univ.Nacional del Sur、Bahia Blanca、アルゼンチン、（1999））、生物的適合性および生物分解性ポリマー（Limら、J.Biomed. Mater.Res.（Appl. Biomater.）43、282−290（1998）；Muzzarelliら、Biomaterials、14（1）、39−43（1993））である。
他方で、キトサンは、吸着により多数の物質を固定化することができる製品であり、かつ、多数の反応基が存在すれば、比較的単純な反応によって、所望の生物活性を与える物質（生物活性物質）を共有的に固定化する可能性と、またキトサンを種々の官能基で誘導体化する可能性とを提供する（WO92／09635；Muzzarelli and Zattini、 J.Biol.Macromol.8、137-143（1986）；およびMuzzarelliらCarbohydr.Polymers 11、307-320（1989））。
【０００５】  ここに挙げた文献は、例えば、前述の特性のいくつかを利用した、医療用縫合の製造、または外傷の包帯剤の成分（米国特許第6,022,556号）としての利用等、すでに開発されているいくつかの重要な用途と共に、キトサンの利用が提供する生体工学の分野における幅広い可能性を示す。
キトサンの生体内分解により、Ｄ−グルコサミンのオリゴマーが生じ、オリゴマーのその後の分解により、ヒアルロン酸の生合成経路に入ることができる製品が得られる。この作用により、この製品は骨組織および軟骨外傷の誘導修復に好適なものとなる。この種の外傷の治療に対するキトサンの効能は、文献に開示されている。
【０００６】  しかし、これまで、組織誘導修復、特に骨組織および軟骨外傷の分野の市場において利用可能なキトサン系製品またはその派生物は無かった。
その理由は、組織工学において用いられるマトリクスが持つべき特徴のひとつである、この化合物の３次元マトリクス上でのキトサンの同質細胞接着および増殖に対する適合性の欠如に見られる。（Atala and Mooney、Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds、Birkauser、ボストン（1997））。実際に、キトサンの生物医学的用途の調査を行うと、その基本的な使用は、既に述べた縫合材料および外傷用包帯剤の成分以外では、おそらくヒドロゲルの形状で結合剤として機能する充填材としての使用、またはカプセル化生体活性物質放出剤としての使用である。
【０００７】  過去20年間に及ぶ北米の特許データベース中で、キトサンが誘導再生のための支持体として用いられているものは１件のみであり、その特許においては、加工の際に、キトサンの３次元ガーゼを乳酸・グリコール酸共重合体フィルムで被覆し（米国特許第5,830,493号）、それにより、前述した、対象となる生体活性物質の固定化および吸着を行う能力を失わせることで、前述した欠点を克服している。
【０００８】  一方で、生物学的対象の化合物の吸着または結合によって、この活性化能力にフィルム形成機能が付加された場合、原則的には、組織工学において用いられるプロテーゼ、インプラント、および他のポリマーの３次元ガーゼの被覆に好適であろう材料が得られる。これにより、この活性化されたキトサンにより誘導された所望の生物活性が器官の選択領域に正確に生じるであろう。
再び、文献調査により、この分野におけるフィルム形成能力の利用に関して、欠如が示されている；留意すべきは、この材料を処理し、これにより可能な細胞接着能が減少する、透析システム（米国特許第5,885,609号）用の被覆材料としての使用のみである。
【０００９】  上述の意味におけるキトサンの使用にはおもに２つの欠点がある。一方でキトサンフィルムに対して通常用いられる安定化処理は、被覆すべき支持体の構造に悪影響を及ぼす。この意味で、キトサンは通常酸性培地中において可溶性となり、かつこのような溶液から得られたキトサンフィルムは酸性特徴を持ち続け、この場合キトサンは、キトサンイオンとして存在するということを留意すべきである。この方法で、水または緩衝化生理溶液（例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ））に接触させて形成されたフィルムは、前記溶液に酸性特徴を与え、かつ、フィルムは瞬時に完全性を失い、短時間で分解する。この現象のため、フィルムを安定化する必要があり、通常用いられる処置は、キトサンを強塩基性水溶液、通常ＮａＯＨに少なくとも１時間浸漬することからなる。この基本特徴は、組織工学において一般に用いられる、例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸等の支持体のいくつかに影響を及ぼすことができるものである。
【００１０】  その実質的使用の観点からおそらく最も重要である第２の欠点は、この目的のために処理された市販のプラスチック中に生じる細胞接着能に関して、既存のプロトコルに従って形成されたキトサンフィルム中で得られる細胞接着能と比較した場合の低細胞接着能にある。さらに、これは細胞接着能の同質性の欠如により悪化する。細胞はフィルムの特定の領域上のみで増殖し、かつ、それらの形態形成を大幅に変化させる。これは、細胞株においては通常と考えられている、メタボリズムおよび特定の特性における重要な変化を意味する。
したがって、とりわけ、医療外科および歯科診療に一般に用いられるプロテーゼまたは、ポリＬ乳酸またはポリ無水物等の細胞工学において既に用いられている生体材料のガーゼの双方に対する細胞接着能の均一性における低比率およびこの欠如が、被覆材料としてのキトサンの使用を困難にしている。
【００１１】  （発明の開示）
本発明は、良好な細胞接着能と増殖とが可能であり、さらに、生物活性を備える物質の投入により活性化され、これにより医療医薬分野における重要な用途を提供することが可能なキトサンフィルムを提供することを課題とする。
【００１２】  本発明が提供する方法は、事前に安定化され洗浄されたキトサン系フィルムに対する乾燥ステージの実行により、前記乾燥処理に供したキトサン系フィルムの細胞接着能が著しく増加したことを、発明者が観察したという事実に基づく。この処理を用いて、この目的のために処理された市販のプラスチック（例えば、ウエルプレート等）において得られる細胞接着能および増殖を上回る細胞接着能および増殖の特徴を示すキトサン系フィルムを得ることができる。また同様に、吸着または、共有的に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む生物活性を有する物質で、生物活性を維持しながら、それらを固定化することを可能にする性質を示すキトサン系フィルムを得ることができる。
【００１３】  従って、本発明の目的は、高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムの製造方法からなる。前記フィルムは、本発明の更なる目的を構成する。
本発明の他の目的は、高い細胞接着能を有し、生物活性を有する物質で生物活性化されたキトサン系フィルムの製造方法からなる。得られたフィルムは、本発明の更なる目的を構成する。
本発明のさらに他の目的は、例えば、歯科用または外傷用インプラント等の、全体または部分的被覆を備える、キトサン系フィルム被覆製品からなる。
本発明のさらに他の目的は、生物活性を備える物質の輸送および放出のためのビヒクルとして、高い細胞接着能を有する前記キトサン系フィルムの使用、または、高い細胞接着能を有する生物活性化キトサン系フィルムの同化におけるそれらの使用等の、前記キトサン系フィルムの用途からなる。前記生物活性化キトサン系フィルムは、同様に、その他の用途の中でも、受容器管中への生物活性の誘導、歯科または外傷用途のインプラントの骨結合の向上および／または、例えば、骨組織等の組織の再生等、多種の用途に用いることができる。
【００１４】  （発明を実施するための最良の形態）
本発明は、概して、高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムであって、生物活性化が可能なキトサン系フィルムの製造、得られたフィルムおよびその用途に関する。
【００１５】  概して、本発明により得られる高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムの製造方法は、キトサン系フィルム形成の基本ステージ、キトサン系フィルムの安定化、および安定化されたフィルムの細胞接着能活性化処理を含む。一方、キトサン系フィルムの生物活性化を、他のステージでフィルムに施される処理と同様、フィルムが形成された後、または、代替的に、例えばキトサン溶液の分解またはフィルムの安定化等の、フィルム製造工程の間のいずれかのステージで、使用すべき生物活性を備える物質の安定性および性質に応じて、生物活性を備える物質を投入することにより行ってもよい。
【００１６】  より具体的には、本発明は高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムの製造方法（以下、本発明の方法）を提供する。
ａ）キトサンを、随意に生分解性ポリマーと共に、酸の水溶液を含む可溶化培地中に溶解するステップと
ｂ）ステージａ）より得られた溶液を表面上に堆積させるステップと、
ｃ）前記表面に堆積した前記溶液を乾燥させてキトサン系フィルムを得るステップと、
ｄ）前記キトサン系フィルムを（i）基剤の水溶液、（ii）５以上のｐＨ緩衝液、（iii）架橋剤、および（iv）それらの混合物、から選択される安定剤と接触させるステップと、
ｅ）ステージｄ）において得られた安定化キトサン系フィルムを洗浄するステップと、
ｆ）安定化、かつ乾燥させたキトサン系フィルムを乾燥させるステップと、を含むフィルム製造方法。
【００１７】  本発明の方法を用いて得ることができる、高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムは、全体または部分的にキトサンからなる。キトサンは、キチンの部分的脱アセチル化により得られる天然のポリマーである。キチンは、例えば、甲殻類、菌類等の、多くの異なる資源から得ることができる。本発明において使用すべきキトサンを得るために用いられるキチンの由来は重要ではない。同様に、例えば、キトサンの生体内生物分解を好み、骨組織の再生を促すことができる、種々の官能基を生じさせるために、キトサンに対して変更を加えることができる。例を挙げると、前記官能基は、ホスホン酸基、カルボキシメチル基、メチルピロリドン基等を含む。概して、仕上げ製品がその皮膜形成能力を保持していれば、キトサンに対して任意の改良を行うことができる。特定の一実施態様において、本発明において用いられるキトサンは、ホスホン酸基、カルボキシメチル基、メチルピロリドン基、およびそれらの混合物より選択される１種以上の官能基で誘導体化されたキトサンを含む。
【００１８】  キチンの部分的脱アセチル化により得られるポリマーであるキトサンは、非常に幅広い範囲の分子量および脱アセチル化度を示す。これらのパラメータは、出発材料（キチン）上で行われる基本加水分解において用いられる具体的条件および、その由来に依存する。従って、平均分子量が150,000乃至2,000,000の間またはそれ以上で、脱アセチル化度が65％乃至95％の間またはそれ以上であるキトサンを得ることが可能である。前記キトサンは、いずれも本発明を実行するために用いることが可能であるが、例えば200,000乃至500,000の間等の、中度および低度の平均分子量、および、例えば、65％乃至95％の間等の中度および高度の脱アセチル化度を有するキトサンが好ましい。
【００１９】  生分解性ポリマーを用いる場合には、水または酸の水溶液培地中に可溶、かつ生物分解可能であるという条件下で、任意の天然または合成ポリマーとすることができる。本発明において使用可能な生分解性ポリマーの説明用の例には、ポリグリコール酸、アルギネート、カラギーナン、コラーゲン等、およびそれらの混合物が含まれる。
【００２０】  随意に生分解性ポリマーを有する、キトサン可溶化培地は、ｐＨが3.5以下の有機酸または無機酸の水溶液を含む培地である。
概して、生分解性ポリマーが適用可能な場合には、キトサンおよび生分解性ポリマーが可溶な、任意の酸を用いることができる。実例として、前記酸は塩酸、酢酸、クエン酸、乳酸、およびリンゴ酸等であってよい。特定の一実施態様において、可溶化培地は酢酸の水溶液である。
得られる水溶液中のキトサンの濃度は、キトサン中に最大5％濃度に達していれば、幅広い範囲内で異なっていてもよい（言い換えれば、キトサンフィルムの形成に通常用いられるものより高い）。
【００２１】  随意に生分解性ポリマーを有する、キトサン溶液（以下キトサン系溶液）は、目的とされる用途に適した粘度を有すべきである。この粘度は、前記キトサン系溶液を平らな表面上または複雑な表面上のどちらに適用するか、または、例えば歯科用インプラントに用いられる種類のネジ等、浸漬により物体を被覆するための培地として使用するかに応じて、幅広い範囲内で異なっていてもよい。
【００２２】  キトサン系溶液の粘度は、溶液自体に固有のいくつかの要素により決定される。一方、キトサンの濃度により、また他方で前記溶液の調製に用いられるキトサンの平均分子量により、最終的には用いられる可溶化培地により決定される。
複雑な表面上でのフィルム形成の場合は除き、概して、表面粘度は本発明の実施態様における決定的要素ではないが、この場合、溶液の同化処理中に該表面上の均一なフィルム形成を可能にするよう、このパラメータが十分高くなければならない。
【００２３】  本発明のいくつかの実施態様において、用いられるキトサンの分子量に応じて、17ｇ．ｄＬ−１乃至4ｇ．ｄＬ−１の間で変化する固有の粘度を有する50ｍＭ酢酸中1％キトサン溶液は、日常的に用いられている。
適した粘度でキトサン系溶液を調製した後、例えば、溶射、浸漬、ブラシ使用等の従来の方法を用いて、本発明により提供されるキトサン系フィルムで被覆すべき平坦面または複雑面等の表面上に、前記溶液を均一に堆積し、伸長する。
キトサン系溶液を前記表面上に堆積した後、溶媒を除去するため、例えば単純蒸発により、乾燥を行い、前記表面上にキトサン系フィルムを得る。
【００２４】  乾燥は、任意の従来の方法により行うことができる。一般的に、例えば15℃乃至80℃の間の温度等、室温からキトサンの熱分解が起こらない温度との間にある温度で、随意に気流の存在下で、重量変化が見られなくなるまで、適した時間にわたって乾燥を行うことができる。一般的に、温度を上げると、このステージの所要時間が短縮される。キトサン系フィルムが細胞の発育および増殖に関する用途のためである場合、汚染されていないフィルムを得るために、無菌室または気流を有する層流室内で作業するのが好都合である。特定の一実施態様において、キトサン系フィルムの乾燥を、20℃乃至40℃の間の温度で、気流の存在下で行う。上記の条件において、乾燥ステージは12乃至24時間の間で続けてもよい。
【００２５】  予め得られたキトサン系フィルムは、その強い酸性特徴のため、即時に使用することはできない。前述した通り、水またはリン酸緩衝液等の緩衝化生理溶液に接触させた前記フィルムは、瞬時に分解する。この理由で、使用前にフィルムを安定化することが必要である。
予め形成されたキトサン系フィルムを安定化するため、前記フィルムを（ａ）基剤の水溶液または5以上のｐＨ緩衝液等の中和剤、（ｂ）架橋剤、または（ｃ）それらの混合物とすることができる安定剤と接触させる。
【００２６】  キトサンフィルムを安定化するのに通常用いられる手順は、フィルム（または物体またはそれにより被覆された表面）を、概ね１Ｍ ＮａＯＨの強塩基性溶液中に最低１時間、時には24時間にわたって、浸漬することからなる。しかし、前述した通り、前記処置はフィルム被覆された支持体の安定性に悪影響を及ぼす。この処理の効果により、これはまさにその目的であるが、キトサンイオン上に存在する電荷の全体中和が生じ、従ってフィルムとフィルム被覆支持体との間の相互作用に強い還元が起こる。
【００２７】  前述した安定化プロトコルを用いることも可能であるが、本発明において、基本処理にあまり厳しくない条件を用いて、使用される基剤（ＮａＯＨ）の濃度とそれに曝露する時間を、共に短縮するのが好適である。特定の実施態様において、使用される0.5Ｍ ＮａＯＨ水溶液中における浸漬時間は、30乃至40分間の間である。
代替的に、キトサンフィルムの電荷を中和するために、5以上のｐＨ緩衝液により提供されるものなど、例えば、炭酸緩衝液およびリン酸緩衝液等の、他の緩衝化培地を用いることが可能である。
【００２８】  形成されたキトサン系フィルムを安定化する他の方法は、フィルム中に存在するキトサンの鎖間の、二機能試薬等の、架橋剤による架橋を含む。特定の実施態様において、使用される架橋剤は、一般的に用いられる二機能試薬である、グルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドは、ＮａＯＨにより提供される培地等の、強アルカリ培地、あるいは、炭酸緩衝液およびリン酸緩衝液等により提供される培地等の緩衝化培地と共に用いることができる。これらの場合において、フィルムの安定化はキトサン鎖の架橋に伴う電荷の中和と同時に達成される。
【００２９】  上記に関連して、予め得られたキトサン系フィルムの安定化において、特定の実施態様において、中性に近いｐＨ値の、0.1乃至1Ｍの間、好ましくは0.25Ｍのモル濃度のリン酸緩衝液を用いることが可能である。グルタルアルデヒドを、最大0.1％、好ましくは0.05％未満、より好ましくは0.025％未満の濃度で、架橋剤として用いることができる。双方の安定化効果の組み合わせ、例えば、0.5Ｍの濃度のＮａＯＨと、0.025％の濃度のグルタルアルデヒドとを用いた同時処理等も用いられている。他の特定の実施態様において、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液等の緩衝液、およびグルタルアルデヒドを含む安定剤が用いられた。
【００３０】  他の薬剤への曝露の時間は変動可能であり、30乃至45分間の曝露が好適であるが、より長い時間も可能である。
キトサン系フィルムを安定化した後、その目的のために用いた安定剤を排出して、かつ使用した安定剤の残りを除去するため、前記フィルム用に与えられた生物学的使用に適合可能である十分な量のＰＢＳまたは他の任意の培地で数回洗浄する。
【００３１】  このように安定化されたフィルムも、全表面にわたって均一かつ均質の細胞接着能を、依然として生じることができない。実施例１に示す通り、万一、洗浄後、出来上がった接着細胞株のシーディングを行う場合、前述した方法（図１）によると、存在するＤＮＡ量の試験は、シーディングされた細胞のおよそ3分の1のみがフィルムに接着することを示す。この接着性は均質ではなく、代わりに接着した細胞を伴わず、フィルムの特定の領域に、その表面の大部分で起こる（図２）。さらに、これら接着細胞中に生じた細胞増殖は、フィルムの全表面にわたる拡大を生じる傾向はなく、むしろ接着の初期点の周辺に集中し（図２）、細胞構築を変性し、これら細胞株の繊維芽細胞の典型的な形態を変化させる（図３）。この事実は、組織誘導再生のための前記キトサン系フィルムの使用を実質上不可能にする。
【００３２】  前記の細胞接着能は、キトサンの由来、使用されたキトサン製造方法、使用されたキトサンの平均分子量、時間および条件、または安定化前のキトサンフィルムの保存等に応じて、非常に可変的である。種々の前述の変量に明らかな相関性はなく、フィルムへの均質な細胞接着は、最初に述べた通り、非常に可変的な結果を得る。
【００３３】  キトサン系フィルムの長期保存期間（時に数ヶ月）は、（用いたキトサンの分子量の影響を除去し、薄層の重量も除去した）直ちに形成および使用された同じフィルムと比較して細胞接着に好都合に影響すると見られ、接着性に対してわずかな影響を有する構造的変化が僅かであることを示す。
それでもなお、この現象の不規則な性質は、細胞結合および増殖の能力に関して、キトサンフィルムの挙動を均質化する処置を構築する必要性を示し、これにより、キトサンのいわゆる「活性化」が存在する。この目的のため、安定化されたフィルムの細胞接着能の活性化処理からなる、本発明の方法の以下のステージを行う。
【００３４】  本発明の開発の間、驚くべきことに、少なくとも、既に安定化されたキトサン系フィルムの第２乾燥、およびその初期形成で用いられたものと同条件下での洗浄が、細胞接着性に関して、キトサンフィルムの挙動を均質化することが分かった。これにより、（菌株の生存性を示す）酵素活性の段階と、これらの後者中に得られる量と同等のＤＮＡ量を伴う、市販の菌株のボトル中同細胞が示す密度と類似したシーディング後の細胞密度を得る。細胞増殖は均質であり、シーディングされた株の典型的な微視的細胞形態を維持する。
【００３５】  概して、任意の従来方法により、例えば15℃乃至80℃の間の温度等、室温からキトサンの熱分解が起こらない温度との間にある温度で、随意に気流の存在下で、適した時間にわたって乾燥を行うことができる。乾燥は重量変化が見られなくなるまで行う。特定の実施態様において、キトサン系フィルムの乾燥を、20℃乃至40℃の間の温度で、気流の存在下で行う。上記の条件において、恒量は通常12乃至24時間で達成される。
【００３６】  本発明の方法により得られたキトサン系フィルムは、高い細胞接着能を有する。細胞接着フィルムの能力は、種々の試験により測定することができる。例として、前記細胞接着能は、端的に、Ｃ２Ｃ１２細胞をキトサン系フィルム被覆ウェルまたは被覆されていないウエル（プラスチック）中に培養すること、細胞を溶解すること、エチジウム・ホモダイマーを添加すること、培養すること、530ｎｍでの励起後に645ｎｍで放射された蛍光強度を読み取ることを含む「エチジウム・ホモダイマー試験」［前記試験用のプロトコルが書かれた実施例１を参照］と呼ばれる試験により、例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞等の、任意の接着細胞株を用いて測定してもよい。この説明で用いられた意味において、「高い細胞接着能を有するキトサン系フィルム」という表現は、前記キトサン系フィルムが通常の状態にある、つまり、前もって細胞接着能を活性化するためのいかなる特殊処理も受けていない、同フィルムよりも高い細胞接着能を有するという事実を意味する。例として、本発明の細胞接着能の活性化処理は、キトサン系フィルムに、前記処理により活性化された、エチジウム・ホモダイマー試験により測定される細胞接着能であって、活性化の前記処理を受けていないキトサンフィルム上の前記エチジウム・ホモダイマー試験により決定される細胞接着能値に対して少なくとも25％、好ましくは少なくとも50％以上増加した細胞接着能を与える。
【００３７】  本発明の方法によって得ることができる、高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムは、この発明のさらなる目的を構成する。
細胞接着能を備えるキトサン系フィルムを、細胞への接着および細胞の発育のために用いることができる。そのためには、前記フィルム上の細胞増殖を促す能力を有する物質を固定化することが有用である。
さらに、高い細胞接着能を有するキトサン系フィルムを、生物活性を備える物質のビヒクルとして用いることができ、これにより、生物活性を備える物質を固着または固定化し、かつ、随意に、それらを目的の箇所へ放出する。
したがって、本発明は、本発明の方法に従って得ることができる前記キトサンフィルムと少なくとも生物活性の物質とを備える、高い細胞接着能を有する生物学的に活性化されたキトサンフィルムを提供する。
【００３８】  生物活性を備える物質として、例えばヒトまたは動物体内等の受容器宮中で生物活性を発揮することが可能な、天然、合成または組み換え由来の任意の物質を用いることができる。例として、生物活性を有する前記物質は、抗生物質、ホルモン、タンパク質等とすることができる。特定の実施態様において、生物活性を有する前記物質は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に属するタンパク質である。例えばヒト、天然もしくは組み換えＢＭＰ、または、これらのダイマーもしくはヘテロダイマー等、例えばヒト組み換えＢＭＰ（ｒｈＢＭＰ）等である。特定の実施態様において、前記ｒｈＢＭＰは、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−４、ｒｈＢＭＰ−７、それらのダイマーまたはヘテロダイマー、およびそれらの混合物より選択される。
【００３９】  高い細胞接着能を有する、生物学的に活性化されたキトサンフィルムは、本発明の方法に従って得ることができる、高い細胞接着能を有するキトサンフィルムを、生物活性を有する前記物質と接触させる処置により得ることができる。
代替的に、生物活性を有する前記物質を、本発明の方法のステージａ）において、随意に生分解性ポリマーと共に、酸の水溶液を含む可溶化培地中で、前記キトサン溶液と接触させるか、または代替的に、本発明の方法のステージｄ）において、安定剤と接触させたキトサン系フィルムと接触させることを含む処理を用いて、高い細胞接着能を有する、生物学的に活性化されたキトサンフィルムを得ることができる。
【００４０】  安定化され、洗浄され、かつ乾燥させられたキトサン系フィルムの生物活性化処理は、受容器宮中に所望の生物活性を誘導するために、前記フィルムを生物学的に活性化する目的を有する。前記誘導は、生物活性を有する前記物質のキトサン系フィルムを固定化することによって達成される。生物活性を有する前記物質のキトサン系フィルムへの固着または固定化を、フィルム上への前記物質の直接吸着か、または、グルタルアルデヒドと共にタンパク質中に存在する反応基間の相互作用等の、フィルム上への前記物質の共有固定化のいずれかにより達成してもよい。
【００４１】  実施例３は、キトサンフィルム上に吸着または共有して固定化されたｒｈＢＭＰ−２により生じた細胞株Ｃ２Ｃ１２上のアルカリホスファターゼ活性の誘導を説明する。この誘導は、市販のプラスチック上にシーディングされ、全試験時間にわたって培養培地中に存在する用量である、溶液中の同じ用量のｒｈＢＭＰ−２で処理した、前記細胞株中に得られたものと比較しても遜色がない。前記実施例３（表Ｖ参照）に見られる通り、生物活性という観点から、キトサンとｒｈ−ＢＭＰ−２間の相乗効果があると見られる。
【００４２】  本発明はまた、支持体と、高い細胞接着能を有し、随意に生物活性化されたキトサンフィルムによる前記支持体の全体または部分的被覆とを備える、キトサン系フィルムで被覆された物体または製品も提供する。特定の実施態様において、前記被覆された物体または製品は、例えば歯科用または外傷用インプラント等の、プロテーゼまたは医療−外科用インプラントであり、前記キトサン系フィルムは、少なくとも、ＢＭＰを含む、生物学的に活性化されたキトサンフィルムである。他の特定の実施態様において、前記支持体は、ガーゼと、組織工学において用いられる生適合性および／または生分解性ポリマーのマトリクスとから選択される。
【００４３】  他の側面において、本発明は、受容器官中への生物活性の誘導、骨組織の増強および／または再生が所望される受容器官の全体または部分的領域における歯科または外傷用に用いられるインプラントの骨結合の向上において、本発明により得られる、高い細胞接着能を有する生物学的に活性化されたキトサン系のフィルムの使用に関する。
より具体的には、本発明はまた、歯科または外傷用途のインプラントの同化における、本発明により得られた高い細胞接着能を有する、生物学的に活性化されたキトサンフィルムの使用に関する。
【００４４】  また本発明は、本発明により得られる、高い細胞接着能を有する生物活性化されたキトサン系フィルムを備える支持体を、前記生物活性を要する前記受容器宮中にインプラントすることを含む、受容器宮中に生物活性を誘導する方法を提供する。
また本発明は、前記インプラントの骨結合を向上する必要がある前記受容器宮中に、本発明により得られる、高い細胞接着能を有する、生物活性化されたキトサンのフィルムで被覆されたインプラントを埋め込むことを含む受容器官における歯科用または外傷用インプラントの骨結合を向上するための方法であって、前記インプラントの骨結合を向上する必要がある前記受容器宮中の、生物活性を有する物質がＢＭＰであることを特徴とする方法を提供する。
【００４５】  また本発明は、骨組織の再生を要する受容器宮中に、本発明により得られる、高い細胞接着能を有する生物学的に活性化されたキトサンフィルムで被覆された骨生成のマトリクスをインプラントすることを含む、受容器宮中の骨組織の再生方法であって、生物活性を有する前記物質がＢＭＰであることを特徴とする方法を提供する。
【００４６】  先に詳細に述べた通り、本発明の結果として、我々が関連する技術分野においては初めて、良好な細胞接着能および細胞増殖を可能にし、且つ、さらに、生物活性を有する物質の投入により活性化することが可能なキトサン系フィルムを得ることができる。前記キトサン系フィルムは、被覆すべき対象物またはインプラントの形状に完全に適合可能なホスト器官から得た細胞が接着することのできる、生物学的適合可能および生分解性フィルムを構成する。
【００４７】  ヒト組織工学においてしばしば用いられる３次元多孔質マトリクスの場合、支持体の機械的性質を活かす複合体の形成を可能にし、且つ、フィルムの形態であるためマトリクスの体内に形成された孔をキトサンは閉塞しないため、周辺細胞の貫入および発育のために維持されるべき適した多孔率を可能にする。同時に、外側表面および内側表面の双方上に、すべての材料中に生じる生物活性を伴う細胞接着能は、所望な生物学的効果が、内部に向かう貫入を通してではなく、マトリクスの本体全体に同時に生じるのを可能にする。用いられる活性剤は最初の瞬間から利用可能であり、支持体の全体に影響を及ぼす。
【００４８】  本発明により提供される新しいキトサン系フィルムのこれら特殊な特徴は、前記材料のキトサン系フィルムによる被覆と、ダイマーまたはヘテロダイマー形態の、天然もしくは組み換え由来のＢＭＰ等の、骨増殖促進要素の投入によるその活性化を用いて、キトサン系フィルムを医療外科措置に一般に用いられるインプラントおよびプロテーゼに特に適したものとする。
【００４９】  同様に、本発明のキトサン系フィルムは、被覆ガーゼまたは、組織工学において一般的に用いられる生適合性および／または生分解性ポリマーに基づき、生物活性を有するＢＭＰおよび／または他の物質の投入により活性化された、本発明により提供されたキトサン系フィルムによるその全体および部分的被覆により、骨組織および軟骨外傷の修復にも特に有用である。
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、その範囲を限定すると考えるべきではない。
【００５０】  実施例１
細胞接着用非活性化キトサンフィルム上の細胞株増殖
本実施例は、本発明の方法に従って調製されたキトサンフィルムにより得られた細胞接着のレベルを示すためのものである。
1％キトサン溶液を50ｍＭ酢酸中に調製する。0.45μｍを通して予め濾過した後、0.22μｍを通す濾過により溶液を殺菌する。
【００５１】  この溶液の200μｌを、市販のプラスチックのコントロールの役割を果たすよう自由なものをいくらか残して、48−ウエルプレートのウエルに堆積する。
プレートを、層流室内で気流の存在下で一晩かけて30℃の温度で乾燥させる。乾燥後、ウエルを、30乃至45分の間の一定時間、以下の安定剤のいくつかの400μｌで3重に処理する。（i）0.5 Ｍ ＮａＯＨ；0.25 Ｍ リン酸塩；（ii）0.025％グルタルアルデヒド；および（iii）0.5 Ｍ ＮａＯＨの溶液および0.025％グルタルアルデヒドを用いる。
処理時間が経過した後、培地を排出し、洗浄の間培地を、フィルムを有するプレートに10分間接触させたまま、プレートを4回にわたって、ＰＢＳ400μｌで洗浄する。
【００５２】  最後に、ＰＢＳを排出し、200μｌの細胞菌株培地（高グルコースＤＭＥＭ、およびペニシリン／ストレプトマイシン）を加え、且つ、10,000細胞／ｃｍ２濃度のＣ２Ｃ１２またはＲＯＳ細胞でウエルをシーディングする。最後に培地を、さらに200μｌの菌株培地で仕上げ、且つ、ウエルをＣＯ２のオーブン中で、37度で培養する。翌日、培地を排出し、異なるウエルに関連試験を行う。
得られた結果を、各々の条件のブランクに相当する値を減じた後、細胞株Ｃ２Ｃ１２を表Iに、および細胞株ＲＯＳを表IIに示す。全ての場合において、別に指示がなければ、ブランケット中の値はそれぞれの場合に得られた値の間の百分率と、参照用に用いた従来のウエルプレート（プラスチック）で得られた相当する値を示す。
【００５３】
【表１】
0005366350.tif 000002
【００５４】
【表２】
0005366350.tif 000003
【００５５】  異なる試験を行うためのプロトコルは以下の通りである。
カルセインＡＭ：培地を排出し、プレートを200μｌのＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを排出し、（カルセインＡＭ（4ｍＭ）の10μｌストックと10ｍｌのＰＢＳとの混合物より得られた）ウエルごとに100μｌのカルセインＡＭ溶液を加える。プレートを１時間室温で、暗所にて培養し、且つ490ｎｍでの励起に続いて、530ｎｍで放射される蛍光強度を読み取る。
【００５６】 エチジウム・ホモダイマー：カルセインＡＭを排出し、70％メタノールを加えることにより細胞を殺す。細胞の死後、メタノールを排出し、ウエル毎に100μｌのエチジウム・ホモダイマーを（ＰＢＳ10ｍｌにエチジウム・ホモダイマー（2ｍＭ）のストック溶液20μｌを追加することにより得られた）ウエル毎に加える。30分間の培養の後、530ｎｍでの励起に続いて645ｎｍで放射される蛍光強度を読み取る。
【００５７】 ＭＴＴ：ＰＢＳ3ｍｌ中のＭＴＴ15ｍｇの再構成により形成された40μｌ（ウエル中に存在する量の10分の1）の溶液を、菌株培地に加える。その混合物を、2時間にわたりＣＯ２のオーブン中で、37度で培養する。可溶化溶液（基本的にイソプロパノール中のトリトンＸ−100）の等しい量を2時間後にそれぞれのウエルに加え、形成されたホルマザンの結晶を繰返しピペットで取ることにより溶解した後、このトライアルキットのサプライヤー（シグマケミカル社）により提供されたプロトコルに従って、光学濃度を570ｎｍおよび690ｎｍで読み取る。
【００５８】  一方、Ｃ２Ｃ１２およびＲＯＳの菌株細胞の逆光学顕微鏡（対物：10ｘおよび接眼：10ｘ、計100ｘ）の観察は、シーディングされた細胞のおよそ3分の1のみが、説明した方法に従って形成されたフィルムに接着し、且つ、接着性は均質ではなく、フィルムの特定の領域において生じ、接着した細胞のない表面が大部分存在することを示した。さらに、これら接着性細胞における細胞増殖は、フィルム全体にわたる拡大につながる傾向にはなく、むしろ、接着の初期点の周辺に集中し（図２）、細胞構築を変性し、これら細胞株の繊維芽細胞の典型的な形態を変化させる（図３）。この事実は、組織誘導再生のために前記キトサン系フィルムを実際に使用することを不可能にする。従って、本実施例において説明したプロトコルに従って得られ、且つ安定化されたキトサンフィルムは、表面全体にわたって均一および均質な細胞接着を示すことはできない。
【００５９】  実施例２
細胞接着用活性化キトサンフィルム上の細胞株増殖
実施例１において説明された手順に、忠実に従う。
ＰＢＳで洗浄した後、培地を排出し、気流の存在下で、30乃至35℃でフィルムの第２乾燥を行う。
乾燥後、菌株培地200μｌ（ＤＭＥＭ高グルコース）を加え、細胞を実施例１と同じ濃度でシーディングし、ウエルを更なる培地200μｌで仕上げる。最後に、プレートをＣＯ２のオーブン中で、37度で培養する。翌日、既に説明したプロトコルに従って、実施例１で説明したものと同じ分析を行う。得られた細胞株Ｃ２Ｃ１２の結果を表IIIに、およびＲＯＳの結果を表IVに示す。
【００６０】
【表３】
0005366350.tif 000004
【００６１】
【表４】
0005366350.tif 000005
【００６２】  表IIIおよびIVに示された値を比較すると、細胞接着能の活性化処理を供したキトサンフィルム上で分析された細胞株の増殖は、前記細胞接着能の活性化処理を受けていないキトサンフィルム上で得られたものより、はるかに大きい。
【００６３】  同様に、種々の安定化処理および細胞接着能の活性化処理を供したキトサンフィルム上の、Ｃ２Ｃ１２およびＲＯＳの菌株細胞の反光学微視（100ｘ）の観察は、シーディングされた細胞が説明した方法に従って形成されたフィルムに十分に接着し、且つ、接着性細胞における細胞増殖は、フィルム全体にわたる拡がりにつながる傾向にあり、細胞構築を変性しないことを示した（図４乃至６）。この事実は、組織誘導再生のために前記キトサン系フィルムを実際に使用することを可能にする。従って、本実施例において説明したプロトコルに従って得られ、安定化され、且つ、その細胞接着能という観点で活性化されたキトサンフィルムは、表面全体にわたって均一および均質な細胞接着を示すことができる。
【００６４】  実施例３
ｒｈＢＭＰ−２によるキトサンフィルムの活性化
40μｌのｒｈＢＭＰ−２（酢酸50ｍＭ中に1ｍｇ／ｍｌの濃度で）で形成された溶液を、第２乾燥の後、実施例２で説明したプロトコルに従って調製されたフィルム上に堆積する。続いてＰＢＳ160μｌを用いた希釈を行う。ウエルは一晩4℃に保たれ、次に翌日、タンパク質を有する培地を排出する。次に、実施例１または２で説明したプロトコルに従って、20,000細胞／ｃｍ３の初期細胞密度で、ウエルをＣ２Ｃ１２でシーディングする。
【００６５】  シーディング後、キトサンフィルム上にシーディングされた細胞にはｒｈＢＭＰ−２の追加をせずに、濃度1ｍｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２を40μｌだけプラスチックコントロールウエルに加える。
３日目、菌株培地を排出し、等量の新たな培地と交換して、コントロール細胞上にｒｈＢＭＰ−２を新たに追加する。試験の間中、キトサンフィルム上にシーディングされた細胞にｒｈＢＭＰ−２の追加はせず、従って、生じた活性は、細胞シーディングに先立ってフィルムに吸着したｒｈＢＭＰ−２により行われるべきである。
【００６６】  表Vには、ｒｈＢＭＰ−２により誘導されたアルカリホスファターゼ活性に対して得られた結果が示されている。
この試験の実行に続くプロトコルは、以下の通りである。菌株培地を排出し、１回200μｌのＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを排出し、ウエル毎に100μｌの溶菌溶液（0.1％、50ｍＭトリス塩酸 ｐＨ6.8および10ｍＭ Ｍｇｃｌ２のトリトンＸ−100）を加える。溶液を、−80℃に３回冷凍／解凍する。最後に、使用直前の37度への予めの加熱および調製を伴い、この溶菌溶液をそれぞれのウエルより排出し、150μｌの１：１アルカリホスファターゼ溶液および基質を加える（シグマケミカル社）。溶液を、10分間37度で培養し、ウエル毎に150μｌの0.5 Ｍ ＮａＯＨを添加した後10分後に反応が終了した。最後に、ＯＤを405ｎｍで読み取る。
【００６７】
【表５】
0005366350.tif 000006
【００６８】  実施例４
インプラントネジの被覆
チタンネジ（図７）を、50ｍＭ酢酸中の1％キトサンの溶液に浸漬する。溶液を次に排出し、ネジの常時回転を保ちつつ、気流の存在下で乾燥させ、これによりフィルムは表面全てに均一に伸長する（図８）。
【００６９】  フィルム形成の後、実施例２で述べた手順の１つに従って処理し、実施例３で述べた手順に従って活性化する。次に、マドリッド大学（Universidad Complutense of Madrid（UCM））の畜産学部により提供された、体重2.5ｋｇのニュージーランド産のウサギの脛骨の平部の内面の近位第３部にネジをインプラントする。３週間後、ウサギを解剖して、接着がコントロール中（被覆されていないチタンネジ）より安定していることを観察する。ネジを抜くために、20乃至60ニュートンの力が必要である。
【００７０】  実施例５
細胞菌株の全タンパク質含有量の測定
この試験は、培養時間（日数）に対する細胞菌株の総タンパク質含量をブラッドフォード法により測定するために行う。この試験において、吸収度の値は細胞菌株のタンパク質含有量を示し、従って、フィルムに接着した細胞の数を示す。参照として用いられた従来のウエルプレート（プラスチック）を用いて得られた値を、本発明により得られた細胞接着能の活性化処理を受けず、種々の安定化処理で安定化されたキトサンフィルムを用いて得られた値（実施例５．１）および本発明により得られた細胞接着能の活性化処理を供した、種々の安定化処理で安定化されたキトサンフィルムを用いて得られた値（実施例５．２）と比較する。
【００７１】  ５．１細胞接着能活性化をしないキトサンフィルム
この試験を行うために、48個のウエルのプレート7個（コースター）を以下の通り調製した。プレートはそれぞれ、実施例１に述べた方法により得られた、種々の処理［処理１：リン酸緩衝液；処理２：ＮａＯＨ；処理３：グルタルアルデヒドおよびＮａＯＨ；および処理４：グルタルアルデヒド］により安定化された、細胞接着能の活性化処理を受けていない、種々のキトサンフィルム（1ｃｍ３）を３重に含むいくつかのウエルを有した。フィルムは有するが細胞を持たないウエル、フィルムを持たないウエル、細胞を持たないウエル、および細胞を有するウエルをコントロールおよびブランクとして用いた。
【００７２】  次に200μｌの細胞菌株培地（高グルコースＤＭＥＭ、およびペニシリン／ストレプトマイシン）をそれぞれのウエルに加える。ウエルは、10,000細胞／ｃｍ２の密度で、Ｃ２Ｃ１２またはＲＯＳ細胞でシーディングした。それぞれのウエルを、さらに200μｌの菌株培地で仕上げ、且つ、一定期間中（１乃至７日）、ＣＯ２のオーブン中で37度で培養する。
【００７３】  細胞菌株の総タンパク質をブラッドフォード法により測定する試験を以下の方法を用いて行う。試験当日、最初に、菌株培地を排出し、次に、ウエルを400μｌのＰＢＳで洗浄（2回）して、培地中に存在し、且つ試験を妨害し得たタンパク質の残りを除去する。800μｌの蒸留水またはMilliQと共に、ウエル毎に200μｌのブラッドフォード試薬（BioRad）を加える。プレートを、30分間暗室で、室温にて培養し、吸収度を595ｎｍで読み散る。
【００７４】  得られた結果を、各々の条件のブランクに相当する値を減じた後、図９に示す。図９において、得られた値の不規則性を理解することができ、期待されるとおり、（菌株培地の変化およびそれに続く、接着していない細胞の排出と同時に）細胞接着能が第４日目より存在しない、またはほとんど存在しない種々のキトサンフィルムよりもプラスチックに対してより効果的に細胞が接着した点に気付く。これは、第４日目から後に測定された接着性の値における大幅な減少により示されている。
【００７５】  ５．２細胞接着能の活性化を有するキトサンフィルム
実施例５．１で述べた手順を正確に反復し、しかし前記実施例で用いられたキトサンフィルムを、種々の処理［処理１：リン酸緩衝液；処理２：ＮａＯＨ；処理３：グルタルアルデヒドおよびＮａＯＨ；および処理４：グルタルアルデヒド］により安定化された、実施例２で得た本発明の細胞接着能の活性化処理を供したキトサンフィルムに交換した。
【００７６】  得られた結果を、各々の条件のブランクに相当する値を減じた後、図１０に示す。図１０において、細胞が第４日目以降においても、プラスチックのものより同様または大きいレベルでこの場合に用いられたキトサンフィルムに対して接着したことが理解することができる。
図９および１０における値を比較すると、細胞接着能の活性化処理に供したキトサンフィルム上で検定された接着能および細胞株の増殖は、細胞接着能の前記活性化処理を供していないキトサンフィルム上にえられたものよりも、はるかに大きいことが分かる。
【００７７】  実施例６
ｒｈＢＭＰ−２の吸着
ウエル中に所望の量のタンパク質（5−400μｇのｒｈＢＭＰ−２）を得るためのｒｈＢＭＰ−２（酢酸50ｍＭ中に1ｍｇ／ｍｌの濃度で）の溶液の適した量を、48ウエルプレートのウエル上に1ｃｍ３の部分に堆積した、実施例２に述べたプロトコルに従って調製されたフィルムに加え、ウエルに加えられたタンパク質溶液の量が200μｌ未満の場合、ＰＢＳを用いて体積を200μｌにする。次に、プレートを覆い、冷室内で4℃で一晩保持する。翌日、タンパク質溶液をウエルより排出し（上澄み）、且つ、上澄み中の全タンパク質含有量をブラッドフォード法により測定する（実施例５）。タンパク質のストック溶液にて得られる値の差異を計算することにより、キトサン上に吸着したタンパク質の量が得られる。
ＮａＯＨ、またはグルタルアルデヒドで安定化され、且つ、本発明により得られた細胞接着能の活性化処理に供したキトサンフィルムによるｒｈＢＭＰ−２の吸着結果を、図１１および１２に示す。それぞれの図において、エラー・バーは、いくつかの実験の平均に相当する。
【００７８】  実施例７
時間経過に伴うｒｈＢＭＰ−２によるキトサンの活性化
この試験は、ｒｈＢＭＰ−２を用いた、時間経過に伴うキトサンフィルムの活性化能力を評価するために行った。そのため、（50ｎＭ酢酸中に1ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＢＭＰ−２溶液からの）10μｇのｒｈＢＭＰ−２を、48ウエルプレートのウエル中に堆積した、実施例２に述べたプロトコルに従って調製されたフィルムに加える。フィルムで被覆されていないウエルを、コントロールとして用いた。
【００７９】  プレートを一晩4℃に保ち、翌日、タンパク質を有する培地を排出する。次に、実施例１または２で述べたプロトコルに従って、菌株培地を加え、10,000細胞／ｃｍ３の初期細胞密度で、Ｃ２Ｃ１２によるシーディングを行う。
シーディングの後、キトサンフィルム上にシーディングされた細胞に対して更なるｒｈＢＭＰ−２の追加をせず、10μｌのｒｈＢＭＰ−２をプラスチックコントロールウエルに加える。
【００８０】  第４日目に、菌株培地を排出し、コントロール細胞に新たにｒｈＢＭＰ−２の追加を行いつつ、初期培地と等しい量に変化させる。全試験の時間にわたって、キトサンフィルム上にシーディングされた細胞に対していかなるｒｈＢＭＰ−２の追加も行わなず、これにより、生じた活性は、細胞シーディングに先立ってフィルム上に吸着されたｒｈＢＭＰ−２により行われるべきである。
【００８１】  図１３は、異なる日における、ウエル中の全ｒｈＢＭＰ−２により誘導されたアルカリホスファターゼ活性（実施例３に述べた試験のプロトコル参照）の得られた結果を示す。得られた結果は、種々の処理［処理１：リン酸緩衝液；処理２：ＮａＯＨ；処理３：グルタルアルデヒドおよびＮａＯＨ；および処理４：グルタルアルデヒド］により安定化され、且つ、本発明により与えられる細胞接着能の活性化処理を供した、キトサンフィルムに結合した、ｒｈＢＭＰ−２が、試験対象の時間にわたって、活性のままであることを示す。
【００８２】  実施例８
インプラントを抜くために必要なトルクの測定
実施例４で述べた手順に続いて、種々の処理［処理１：リン酸緩衝液；処理２：ＮａＯＨ；処理３：グルタルアルデヒドおよびＮａＯＨ；および処理４：グルタルアルデヒド］により安定化されたキトサンフィルムで被覆したチタン製ネジを調製する。ネジ上にフィルムが形成された後、細胞接着能は、実施例３で述べた手順に従うｒｈＢＭＰ−２の吸着により生物学的に活性化される。被覆されていないチタン製ネジをコントロールとして用いた。
【００８３】  次に、マドリッド大学（Universidad Complutense of Madrid（UCM））の畜産学部により提供された、体重2.5ｋｇのニュージーランド産のウサギの脛骨の平部の内面の近位第３部に、キトサンフィルムで被覆したネジをインプラントし、コントロールネジを同ウサギのもう１つの脛骨の平部にインプラントした。インプラントは、従来の方法を用いて行う。ウサギは、動作にいかなる制限も受けずに保たれ、指示された期間（５乃至７週間）後、ウサギを解剖して、ネジを抜くために必要なトルクの測定により、インプラントの骨結合を評価する。
【００８４】  得られた結果を、図１４に示す。図１４において、結果は、コントロール（被覆されていないチタンネジ）中よりもキトサンフィルムで被覆されたネジの場合により安定した接着を示す。さらに、市販のネジ、Osseotite（登録商標）およびTiUnite（登録商標）（Nobel Pharma）（Gottlobら、Applied Osteointegration Research、2000によるデータ）に得られるトルク値を比較として挙げる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  細胞の丸い外観を観察することができることから、細胞が懸濁液中にあることを示している、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供していない、ＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例１）を含んだウエルにシーディングした細胞株Ｃ２Ｃ１２の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図２】  細胞の集団が総状花序の形態で見られることから、異常増殖パターンを示している、図１の後の段階にある、すなわち培地を交換してフィルムに接着していない細胞を取り出した後の、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供していない、ＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例１）を含んだウエルにシーディングした細胞株Ｃ２Ｃ１２の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図３】  フィルムに接着することで、前記細胞の形態が変化したことが見られることから、成長の異常パターン及び細胞構築の変更を示す、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供していない、グルタルアルデヒド及びＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例１）を含んだウエルにシーディングした細胞株Ｃ２Ｃ１２の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図４】  フィルムの全面が、集合に至るまでは単層形態の細胞で完全に覆われていることが分かる、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供した、ＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例２）を含んだウエルにシーディングした細胞株Ｃ２Ｃ１２の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図５】  細胞でまだ覆われていないフィルムの部分が分かる、図４に示す段階の前の、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供した、ＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例２）を含んだウエルにシーディングした細胞株Ｃ２Ｃ１２の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図６】  フィルムの全面が、集合に至るまでは単層形態の細胞で完全に覆われていることが分かる、本発明に従う細胞接着能の活性化処理に供した、ＮａＯＨで安定化したキトサンフィルム（実施例２）を含んだウエルにシーディングした細胞株ＲＯＳ 17/2.8の逆光学顕微鏡（100ｘ）により得られた写真である。
【図７】  ネジの機械化の筋が分かる、キトサンフィルムで被覆する前の、実験動物へのインプラント実験に用いたチタンネジの一部の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により得られた写真（100ｘ）である。
【図８】  ＮａＯＨで安定化し、この発明により得られる細胞接着能の活性化処理に供したキトサンフィルムで被覆した、実験動物へのインプラント実験に用いたチタンネジの一部の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により得られた写真（100ｘ）である。
【図９】  吸収率の値は、ブラッドフォード法を用いて測定された各例の細胞株のタンパク質含量を示しており、間接的にフィルムに接着した細胞の量を示しており、対照として用いる従来のウエルプレート（プラスチック）を用いて得られた値を、本発明により得られる細胞接着能の活性化処理に供していない、種々の安定化法を用いて安定化したキトサンフィルムを用いて得られた値と比較し、接種時間（日）に対する細胞株の総タンパク質含量を示す棒グラフである。
【図１０】  吸収率の値は、ブラッドフォード法を用いて測定された各例の細胞株のタンパク質含量を示しており、間接的にフィルムに接着した細胞の量を示しており、対照として用いる従来のウエルプレート（プラスチック）を用いて得られた値を、種々の安定化法を用いて安定化した後、この発明により得られる細胞接着能を活性化する処理に供したキトサンフィルムを用いて得られた値と比較し、接種時間（日）に対する細胞株の総タンパク質含量を示す棒グラフである。
【図１１】  添加したタンパク質の量に対する、ＮａＯＨを用いて安定化し、この発明により得られる細胞接着能の活性化処理に供したキトサンフィルムにより吸収されるｒｈＢＭＰ−２の割合を示す棒グラフである。
【図１２】  添加したタンパク質の量に対する、グルタルアルデヒドを用いて安定化し、この発明により得られる細胞接着能の活性化処理に供したキトサンフィルムにより吸収されるｒｈＢＭＰ−２の割合を示す棒グラフである。
【図１３】  異なる日におけるウエル中の総アルカリホスファターゼ／タンパク質活性を示す棒グラフであり、得られた結果は、種々の処理により安定化され、この発明により得られる細胞接着能の活性化に供せられたキトサンフィルムに結合したｒｈＢＭＰ−２が依然として活性であることを示しており、得られた値は、対照として用いられた従来のウエルプレート（プラスチック）を用いて得られた結果と比較されている。処理１：リン酸緩衝液を用いて安定化。処理２：ＮａＯＨを用いて安定化。処理３：グルタルアルデヒド及びＮａＯＨを用いて安定化。処理４：グルタルアルデヒドを用いて安定化。
【図１４】  種々の時間でウサギの頚骨の平らな部分に事前に埋め込まれたインプラントを外すのに必要なトルクまたは偶力を示す棒グラフであり、この発明により得られ、種々の処理（ＮａＯＨ：処理２、グルタルアルデヒド及びＮａＯＨ：処理３、グルタルアルデヒド：処理４）により安定化され、この発明により得られる細胞接着能の活性化処理に供せられ、ｒｈＢＭＰ−２を用いて生物学的に活性化されたキトサンフィルムで被覆したチタンネジを用いて得られた値は、コントロール（未被覆チタンネジ）を用いて得られた結果と比較されており、および、さらに比較のため、市販のネジOsseotite（登録商標）（Nobel Pharma）を用いて得られた値を含む（データはGottlobら、Applied Osteointegration Research、2000年、1：25乃至27から得た）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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