(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清型２型の病原性ストレプトコッカス・スイスの不活化全菌体及び血清型２型の病原性ストレプトコッカス・スイス菌体からアルカリ抽出した抗原を含むことを特徴とするストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン。  
【請求項２】
不活化がホルマリンによることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。  
【請求項３】
アルカリ抽出が水酸化ナトリウム抽出であることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項４】
血清型２型の病原性ストレプトコッカス・スイスの不活化全菌体の不活化前生菌数が１０８〜１０１２の範囲から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
血清型２型の病原性ストレプトコッカス・スイスのアルカリ抽出抗原の蛋白量が少なくとも100μg/mLであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチンを豚に投与してストレプトコッカス・スイスの感染症状を軽減または感染を予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus. suis）に起因する疾患から豚を防御するためのワクチンに関わる。
【背景技術】
【０００２】
レンサ球菌属には、多くの菌種が含まれ、家畜やヒトの種々の病気の一次的ないし二次的な役割をするとされている。豚に病原性を示すレンサ球菌としては、ストレプトコッカス・スイス(S. suis)、ストレプトコッカス・ディジャラクティア(S. dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ポーシナス(S. porcinus)等が知られているが、中でもS. suisは、時に流行病的に発生することから経済的被害が大きな疾病として最も重視されている。
【０００３】
本菌は、1963年にde Moor がイギリスで豚の髄膜炎を引き起こすレンサ球菌として初めて報告し、現在では３５の血清型が存在することが明らかになっている。このうち、髄膜炎、敗血症、関節炎、心内膜炎、肺炎など、ほぼ単独感染で病気に関わり、分離頻度が高いのが血清型２型である。わが国においても、1979年に島根県で初めてS. suis 感染症が報告されて以来、栃木、静岡、三重、山形などで発生例が続き、現在では全国的にその発生が認められている。
【０００４】
現在、本病のコントロールは、飲水にアンピシリン等、飼料にペニシリンを添加することで試みられているが、疾病の極期を予測して事前に連続投与しなければならない点やコストの面を考慮すると、最良の方法とはいえない。また、本疾病に対するワクチンは、不活化全菌体とアルミニウムゲルアジュバントもしくはオイルアジュバントと組み合わせた製剤が海外で市販されている。しかし、これらの組み合わせのワクチンによる効果は完全とは言えないと報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００５】
その理由は、S. suisに多くの種類の血清型が存在することや、病原因子の分布状況や病原性に及ぼす役割について十分に検証されていないことによる。そのため、多くの研究者が本病の病原因子について報告している。例えば、莢膜多糖体(capsular polysaccaride:CPS)は、多くのグラム陽性及び陰性菌の重要な病原因子と認識されており、S. suisの場合、莢膜多糖体を欠いた同種変異株が豚に対する病原性を失ったとの報告がある（例えば、非特許文献２を参照。）。しかし、S. suisの非病原性株のほとんどが莢膜多糖体を有しており、S. suis莢膜多糖体は、病原因子として明確になっていない。また、精製した莢膜多糖体を免疫材料として試みた豚感染防御試験は、成功しなかった（例えば、非特許文献３を参照。）。
【０００６】
その他の病原因子タンパクとして、ムラミダーゼ・リリースドタンパク(muramidase-released protein :MRP)及び細胞外因子(extracellular factor :EF)が報告されている。ムラミダーゼ・リリースドタンパクは、菌体をムラミダーゼ処理することで細胞壁から抽出される136-kDaのタンパク質であり、細胞外因子(EF)は、培養上清のみで検出される110-kDaのタンパク質である。これら二つのタンパク質は、病原性株に存在し、非病原性株に存在しないことから重要であると考えられてきた（例えば、特許文献１参照。）。しかし、これら２つのタンパク質を欠いた変異株が、タンパク質を有する親株と同様に豚での病原性を示した報告及びこれらのタンパク質を欠く多くの病原性分離株が、カナダでの豚の有症症例から分離されていることなどの報告から、これらのタンパク質の病原性への関与は明確とは言えない（例えば、非特許文献４を参照。）。
【０００７】
細胞壁結合44kDa蛋白については、42℃の条件下や、ウサギ免疫血清の存在下で、病原性株である親株を継代すると、細胞壁結合蛋白の44kDaのタンパク質が消失し、この44kDaタンパク質を欠いた株は、マウスの感染試験で非病原性株に変化したことが報告されている。しかし、本抗原の豚における病原性についての報告はない（例えば、非特許文献５を参照。）。
【０００８】
また、Ａ群レンサ球菌が発症を引き起こす時の病原因子と似ている60kDaのイムノグロブリンG結合蛋白(Immunoglobulin G binding protein)が、S. suisの全ての血清型２型及び全ての血清型で観察され、このタンパク質が、非病原性株と病原性株の両者に存在するという報告もある。（例えば、非特許文献６を参照。）。この他にも、S. suis血清型２型のアルブミンに対する結合活性を持つ39kDaのタンパク質も、非病原性株と病原性株の両者に観察されている（例えば、非特許文献５を参照。）。さらにフィブロネクチン／フィブリノーゲン結合タンパク質をコード化するゲノムフラグメントを修飾したクローンのワクチンへの応用の報告もある（例えば、特許文献３を参照。）。
【０００９】
莢膜多糖体とタンパク質の他にも病原因子に関係すると推測されている毒素が報告されている。sly遺伝子によってコードされ、チオールにより活性化される５４kDaの溶血ペプチドであり、コレステロール結合型細胞傷害毒素であるスイリシン(Suilysin)は、そのsly遺伝子がS. suisのほとんどの血清型に存在するものの In Vivo でのスイリシンの発現と病原性については関連性が無い。さらに、スイリシンを欠いた同種変異株3株が、豚での感染試験で全く病原性を示さなかったと報告されている。（例えば、特許文献２を参照。）。
【００１０】
国内では、本疾病に対するワクチンが平成20年1月18目に「ポーシリスSTREPSUIS」の製造販売承認が取得されたが、このワクチンも不活化全菌体とオイルアジュバントを組み合わせた製剤である。この不活化全菌体を抗原として用いたワクチンは、S. suis感染症の発症の軽減を効能または効果として承認を取得しており、感染予防や発症防止を期待することはできない。このように、S. suisの病原因子の候補と思われる様々な因子の有無は株間で多様性を示し、本病の発病機構に関して不明な点が多いため、これまで有効なワクチンは開発されていない。
【００１１】
【特許文献１】特許第２７７６６３３号公報
【特許文献２】特許第３５７８７９９号公報
【特許文献３】特表２００４−５２８８２６号公報
【非特許文献１】Staatsら Vet Res Commun. 1997;21(6):P381-407.
【非特許文献２】Kroll JSらJ. Bacteriol. 1990;172(3):P1374-9.
【非特許文献３】ElliottらJ. Hyg. 1980;85(2):P275-85.
【非特許文献４】Gottschalkら Can J Vet Res. 1998 ;62(1):P75-9.
【非特許文献５】Gottschalkら  Vet. Microbiol. 1992;30(1):P59-71.
【非特許文献６】SerhirらJ. Gen Microbiol. 1993;139(12):P2953-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の課題は、発症した豚の症状を軽減するだけではなく、感染予防も可能な効果的かつ経済的ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、既に豚レンサ球菌と同じグラム陽性菌である豚丹毒菌(Erysipelothrix  rhusiopathiae)のワクチン抗原抽出方法として、アルカリ処理による67kDaの感染防御関連抗原を含む細胞表層抗原抽出方法を採用し、一定の成功を収めている。そこで、S. suisのアルカリ抽出抗原の有効性を検討したところ、不活化全菌体抗原より劣る結果しか得られなかった。しかしながら、S. suisの菌株を血清型２型とし、この不活化全菌体抗原にアルカリ抽出抗原を添加することにより、著しくワクチン効果が高まることを見出した。本発明は、これらの知見により完成したものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のワクチンを豚へ投与することにより、豚のレンサ球菌感染症を効率よく予防することが可能となった。本発明のワクチンは、養豚産業の生産性、環境衛生の改善に寄与する。さらに本発明のワクチン抗原は、調製が比較的容易であるため、生産性の向上にも寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
S. suis 血清型のなかで発病した豚から最も高頻度で分離されているのは血清型２型である。しかし、血清型２型株の全てが病原性ではなく、病原性の程度も各株間で異なっている。ワクチン製造には、病原性を有する株の使用が好ましい。本発明のワクチンには、自然発生した豚レンサ球菌感染豚から分離した豚レンサ球菌血清型２型の病原性株を採用した。この株は、自然発生した豚レンサ球菌感染豚から分離したグラム陽性球菌で、カタラーゼおよびオキシダーゼ陰性であり、Api 20 STREPまたは rapid ID 32 Strep system (API System; La Balme Les Grottes, Montalieu-Vercieu, France)によって豚レンサ球菌と決定されものであり、特異血清(Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark)を用いたスライド凝集法によって、血清型２型に陽性を示した。さらに、菌株を豚に静脈注射し、病原性を示した菌株:9334株を採用した。
【００１６】
血清型２型の病原性S. suisの培養菌液は、種菌を接種、培養した寒天培地から釣菌して液体培地に移植し、静置培養した培養菌液をさらに別途用意した液体培地に１〜２vol％の割合で接種し、３７℃で１８〜２４時間の静置培養によって得られる。培養方法は、これに限定されるものではなく、公知の培養方法が利用できる。
【００１７】
不活化全菌体抗原は、上記培養菌液を遠心処理して集菌した菌体を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で数回洗浄し、1013CFU/mLとなるようＰＢＳに浮遊させ、ホルマリンを濃度 0.2〜0.3 vol％となるように加えて不活化したものである。ホルマリン濃度は、抗原性を損なわず、S. suisの不活化が十分に行える範囲にあればよい。不活化剤は、グルタルアルデヒド又はβ-プロピオラクトンであってもよい。
【００１８】
菌体からの抗原抽出法は、処理工程の簡便さ及び価格の低さ並びに抽出後の処理の容易さから、アルカリ抽出法を採用した。アルカリ剤は、一般的な強アルカリ類ならば種類を問わないが、最も入手しやすい水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の使用が便利である。前記の本培養菌液を冷却遠心分離（12,800Ｇ）により集菌し、沈渣を0.01 mol/L のＮａＯＨ水溶液に1/50〜1/100容となるよう加える。2〜5℃で１晩撹拌後、冷却遠心にて採取した上清を中和し、ホルマリンを0.2vol％の割合で加えたものを−20〜−80℃に保存する。以後、これをＮａＯＨ抽出抗原またはＮａＯＨ抽出抗原原液という。
【００１９】
不活化全菌体とＮａＯＨ抽出抗原の混合は、不活化全菌体（108〜1012CFU/mL）に対しＮａＯＨ抽出抗原を蛋白量100μg/mL以上になるよう添加すればよい。これらの数値は実施例２，３の実験成績に基づいて決定されたものである。
【００２０】
本発明のワクチンは、感染防御効果を高めるためにアジュバントを添加できる。アジュバンドとしては、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、ムラミルジペプチド、カリウムミョウバン、サポニン、鉱物油又は植物油等を用いることができる。
【００２１】
本発明ワクチンの投与法は、注射法である。３週齢の豚の頚部筋肉内に本発明ワクチン１mL をそれぞれ２週間隔に２回注射することにより、豚レンサ球菌感染症の発症から豚を防御することが可能である。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。
【実施例１】
【００２３】
(1) 菌体の培養
S. suis 9334株を製造用寒天培地（ポアメディア羊血液寒天培地／栄研化学）に接種し、37℃で24時間培養する。発育した集落5〜10個を釣菌して製造用液体培地（BRAIN HEART INFUSION PORCINE: 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に移植し、37℃で18〜24時間静置培養したものを元培養菌液とした。次に、製造用培地（BRAIN HEART INFUSION PORCINE）に元培養菌液を1〜2 vol％ の割合で接種し、37℃で18〜24時間静置培養し、菌数が1012.5以上に達したものを本培養菌液とした。
【００２４】
(2) 不活化全菌体抗原液の調製
本培養菌液にホルマリン(ホルムアルデヒド)を0.2 vol％加え、37℃、48時間感作した。感作後、菌数を108または1012CFU/mLとなるようＰＢＳで適宜調整し、実施例２に供した。
【００２５】
(3) 抽出抗原液の調製
本培養菌液を冷却遠心分離（12,800Ｇ）により集菌し、沈渣を0.01 mol/L ＮａＯＨ水溶液を用いて本培養菌液量の1/50〜1/100になるように浮遊した。この浮遊液を2〜5℃で１晩撹拌後、冷却遠心（12,800Ｇ）して採取した上清を抽出抗原液とした。抽出抗原液に塩酸を加えてpHを7.0に調整後、ホルマリンを0.2vol％の割合で添加し、さらに 37℃で１晩感作後、原液として-20℃の条件下で保存した。原液の蛋白量は800μg/mLであった。高濃度抽出抗原液は、別途、増量した沈渣を0.05 mol/L ＮａＯＨ水溶液に浮遊し、2〜5℃で２晩撹拌して求めた。各上清の蛋白量をそれぞれ100および4000μg/mLに調整し実施例３に供した。
【実施例２】
【００２６】
抗原量の異なる不活化全菌体抗原を用いた豚感染防御試験
実施例１で調製した２種の不活化全菌体ワクチンを用いて豚感染防御試験を実施し、その効果を比較した。免疫方法は以下の通りである。約３週齢のＳＰＦ豚１５頭を３グループに分け、試験群１の５頭には1012CFU/mL の不活化全菌体ワクチンを 1mL 頸部に筋肉注射し、２週間後さらに 1mL を注射した。同様に試験グループ２の豚５頭に108CFU/mL の不活化全菌体ワクチンを各 1mL ２回注射し、残り５頭はコントーロールとした。攻撃試験として、最終免疫２週間後、全頭にS. suis２型病原株を109CFU/0.5mL 静脈注射した。攻撃後の２週間、発熱、跛行の有無を観察し、採血した血中の菌数を測定した。攻撃後１４日目に生残した供試豚を剖検し、採材した主要臓器及び関節液から回収された攻撃菌数を測定した。各試験成績は下記の基準で数値化又はスコア化した。結果を表１に示す。  抗原量の異なる両ワクチンは、S. suis感染症の特徴的な臨床症状（発熱、跛行）及び菌血症を軽減させたが、発症を完全に抑えることはできず、両ワクチンのワクチン効果に有意差は認められなかった。
【００２７】
【表１】
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転機：豚レンサ球菌の感染による死亡数もしくは倫理上の安楽死数。
発熱：生残した供試豚で41℃以上の発熱した回数をスコア（−〜3＋）で示した。
跛行：生残した供試豚で認めた関節炎による跛行の程度及び跛行の認められた日数を平均してスコア（−〜3＋）で示した。
血中菌数：観察期間中に採血した血液から回収された攻撃菌菌数（CFU/mL)を合計してスコア（−〜3＋）で示した。
臓器菌数：剖検により採取した主要臓器から回収された攻撃菌菌数（CFU/mL)を合計してスコア（−〜3＋）で示した。
関節    ：剖検により採取した関節液から攻撃菌が回収された頭数。
【実施例３】
【００２８】
免疫投与回数の異なる不活化全菌体抗原を用いた豚感染防御試験
S. suisの不活化全菌体ワクチンの免疫投与数を増やした場合、ワクチン効果が高くなるかを検討した。実施例１で調製した不活化全菌体ワクチン（不活化前生菌数：108 CFU/mL）を２回（２週間隔）または１０回（３または４日間隔）免疫投与し、感染防御試験を実施した。攻撃試験及び臨床観察の方法は実施例２と同じである。表２に結果を示す。この結果、投与回数を５倍に増やしてもワクチン効果に有意差が生じないことが明らかになった。以上の結果から、不活化全菌体ワクチンの抗原を増量しても、あるいは投与回数を増やしても、確実に予防効果のあるワクチンは得られないことが示唆された。
【００２９】
【表２】
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【実施例４】
【００３０】
抗原量の異なるＮａＯＨ抽出抗原を用いた豚感染防御試験
実施例１で調製した蛋白量の異なる２種のＮａＯＨ抽出抗原ワクチンを用いて、豚感染防御試験を試みた。群５に蛋白量4000μg/mLのＮａＯＨ抽出抗原、群６に蛋白量 100μg/mLのＮａＯＨ抽出抗原をそれぞれ投与した。投与回数、接種方法、攻撃方法および観察方法は実施例２に準ずる。結果を表３に示す。ＮａＯＨ抽出抗原のワクチン効果は、不活化全菌体より劣るものの、特徴的な臨床症状（発熱、関節炎による跛行）及び菌血症を軽減させていた。また、抗原量の多寡による有意差は認められなかった。
【００３１】
【表３】
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【実施例５】
【００３２】
免疫投与回数の異なるＮａＯＨ抽出抗原を用いた豚感染防御試験
実施例１で調製した蛋白量 100μg/mL のＮａＯＨ抽出抗原ワクチンを用いて、投与回数とワクチン効果の関係を検討した。投与方法、攻撃方法および観察方法は、実施例３に準ずる。結果は、表４に示したように、投与回数を５倍にしても、ワクチン効果に有意差は認められなかった。
以上、実施例２〜５により、S. suisの不活化全菌体抗原においてもＮａＯＨ抽出抗原においても単味では、予防効果のある実用的なワクチンが得られないことが明らかになった。
【００３３】
【表４】
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【実施例６】
【００３４】
不活化全菌体とＮａＯＨ抽出抗原との混合ワクチンの調製
実施例１で調製した不活化抗原原液とＮａＯＨ抽出抗原原液を用いて、不活化全菌体とＮａＯＨ抽出抗原との混合ワクチンを調製した。実施例２，４の結果から、どちらも抗原量とワクチン効果に有意差のないことが示めされたため、不活化抗原の抗原量は 108CFU/mL また抽出抗原の抗原量は蛋白濃度で100μg/mL とした。
【実施例７】
【００３５】
本発明のワクチンを用いた豚感染防御試験
実施例６で調製した混合ワクチンを、実施例２の全菌体抗原単味及び実施例４のＮａＯＨ抽出抗原単味と共にそれぞれ５頭のＳＰＦ豚へ２週間隔２回投与し、ワクチン効果を比較した。免疫材料は、実施例６で調製した混合ワクチンを群９に、実施例１で調製した不活化全菌体抗原(108CFU/mL)を群１０に、実施例１で調製したＮａＯＨ抽出抗原（蛋白量 100μg/mL）を群１１にそれぞれ使用した。攻撃方法及び観察方法は、実施例２〜５と同じである。結果を表５に示す。その結果、本発明のワクチンは、特徴的な臨床症状である発熱を予防し、関節炎による跛行を軽減させること及び菌血症を予防できることが明らかになった。
【００３６】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のワクチンは、豚レンサ球菌感染症の予防が可能であり、養豚業における経済的損失を軽減することができる。