(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫クロマトグラフィー用ストリップを用いた歯周疾患検査又は診断のために、唾液若しくは洗口吐出液にドデシル硫酸塩又はデオキシコール酸塩を添加し、ろ過処理を行わずに測定用試料として用いることを特徴とする検査方法。
【請求項２】
予めドデシル硫酸塩又はデオキシコール酸塩を添加した免疫クロマトグラフィー用ストリップを用いた歯周疾患検査又は診断のために、唾液若しくは洗口吐出液を、ろ過処理を行わずに測定用試料として用いることを特徴とする検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫クロマトグラフィー検査用検体の処理に関するものであり、より詳しくは、歯周疾患の検査又は診断用の口腔由来検体の前処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯周疾患は、歯を支持するための組織である歯周組織における疾患の総称であり、様々なリスクが要因となる多因子性疾患であるが、そのうち必要条件として挙げられるのが、歯周病原性細菌の歯周ポケット部位への感染である。この歯周疾患は、はじめ歯肉の炎症から始まって歯周組織が崩壊し、ついには歯の脱落に至る。この様に歯周疾患は歯に重大な影響を及ぼす一方で、進行が緩慢であり痛み等がほとんどないために自覚症状がないまま悪化してしまう。そこで歯周ポケット内にどのような細菌が存在するかを調べることが、歯周疾患を早期に発見すること、及び歯周疾患のリスクを調べることに重要であると考えられている。
【０００３】
歯周病原性細菌は数多く存在することが知られているが、中でも非特許文献１に示されるように、「レッドコンプレックス」と呼ばれるポルフィロモナス  ジンジバリス、バクテロイデス  フォーサイサス、トレポネーマ  デンティコラの３菌種に感染することが、最も歯周疾患に罹るリスクが高いとされている。現在では、細菌の検出手段として、リアルタイムＰＣＲを用いる検査方法や、上記３菌種が分泌する酵素を検出し、検査する方法が実用化されている。また、実験室レベルでは、抗原抗体反応を利用したエンザイムイムノアッセイやラジオイムノアッセイ等を用いて、細菌の検査を行うこともある。
【０００４】
しかし、上記検査方法では、特定の専用装置が必要であったり、専門的知識をもって複数の複雑な検査処理を行う必要があったり、またそのために、検査を行い、その結果が得られるまでの時間が非常にかかってしまったりと、費用面においても手間の面からも、簡便に検査をすることができなかった。
【０００５】
一方、抗原抗体反応を利用する技術の一つである免疫クロマトグラフィー法は、採取した検体に含まれる細菌を抗原として、当該抗原を認識する抗体が塗布された専用ストリップに滴下することにより、当該抗原の有無や量を知ることができる方法である。この専用ストリップには、主としてニトロセルロース等の多孔質膜が利用されており、当該抗原はこの多孔質膜中を毛細管現象により移動することにより上記抗体と結合することにより検出される。そのため、操作としても検体を滴下するのみであり、抗原及び抗体を含む試料が移動して反応するまでの時間はおよそ３０分程度であることから、この免疫クロマトグラフィー法を利用すれば、検査を簡便に行うことができる。
【０００６】
しかし、歯周疾患の検査又は診断において、口腔より採取した検体、その中でも特に唾液や洗口吐出液は、その粘液性が非常に高いために上記多孔質膜中をそのまま毛細管現象によって移動させることは非常に困難である。そのため、これらの検体に対して事前に処理を行い、毛細管現象による移動を容易にさせる必要がある。これらの検体に対する処理には、化学物質による分解等がよく見られるが、その分解を過剰に行うものでは目的の抗原や抗体までをも分解してしまい、検体を検出することが不可能となる。また、上記化学物質が分子等の変性を引き起こすものであれば、正確な検体の検出を損ねることになる。よって、これらの検体に対しては適切な物質を用いて処理を行う必要がある。
【０００７】
例えば特許文献１には、免疫クロマトグラフィー法によりう蝕原因細菌（ミュータンス連鎖球菌）を測定又は同定する検査において、唾液をアルカリ処理（ＮａＯＨ）し、その後、酸処理（酒石酸／クエン酸）により中和を行い、さらにその後に非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤処理をして、唾液中のムチンやグルカンを分解させる方法が開示されている。ところがこの処理方法においては、検体処理のために複数の溶液材料を必要としており、それに伴って複数の処理ステップを実施するため、検体処理において非常に手間と時間がかかることが問題となり、さらにはコスト面からの懸念も必要となる。
【０００８】
一方、特許文献２には、免疫クロマトグラフィー法によりインフルエンザの検査を行う場合において、インフルエンザ検査用の生体から採取した検体（鼻汁、痰、咽頭ぬぐい液等）を非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン系界面活性剤）及び０．３Ｍのアルカリ金属イオン（ナトリウムイオン）を含む前処理液で処理する方法が開示されている。しかしながら、これらの技術は唾液や洗口吐出液の処理については全く開示されていない。
【特許文献１】特開２００２−３５７５９９
【特許文献２】特開２００５−２４３２３
【非特許文献１】Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ ＳＳら、「歯肉縁下プラークにおける細菌複合体（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎ ｓｕｂｇｉｎｇｉｖａｌ ｐｌａｑｕｅ）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・ペリオドントロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．）、第２５巻、第１３４〜１４４頁（１９９８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、う蝕原因細菌の検査において唾液を処理する方法は知られていたが、複数の材料や処理行為を必要とする等簡便なものではなかった。その一方でインフルエンザの検査において生体由来検体を処理する方法はあったが、唾液や洗口吐出液ではなく、また歯周疾患の検査又は診断を特定するものではなかった。
【００１０】
そこで本発明が解決すべき課題は、免疫クロマトグラフィー法により口腔由来検体を用いて歯周疾患の検査又は診断を行う際に、より正確かつ簡便に検査を行なう為に必要な上記口腔由来検体の処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、口腔由来検体の処理につき鋭意検討を重ねた結果、上記口腔由来検体について、陰イオン性界面活性剤、好適にはドデシル硫酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを用いて検体処理を行うことにより、正確かつ簡便に歯周疾患の検査又は診断を行なえることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、口腔由来検体に係る検体処理方法を提供するものであり、免疫クロマトグラフィー法による歯周疾患検査又は診断用の口腔由来検体について、陰イオン性界面活性剤を用いることを特徴とした検体の処理方法である。
【００１３】
また、上記検体の処理方法においては、上記陰イオン性系界面活性剤が、ドデシル硫酸塩又はデオキシコール酸塩であることが好適である。
【発明の効果】
【００１４】
以上詳述したように、免疫クロマトグラフィーにより歯周疾患の検査又は診断を行う場合について、ドデシル硫酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを用いて口腔由来検体の処理を行うことにより、免疫クロマトグラフィー用ストリップに目詰まりを発生させることなく、正確かつ簡便に歯周疾患の検査又は診断を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、測定の対象となる検体は、口腔内由来のものであればよく、特に限定されないが、好ましくは、唾液、洗口吐出液、歯肉溝浸出液又はプラーク等が挙げられる。
【００１６】
これらの検体を採取する方法は特に制限されず、公知の方法を採用することができる。例えば唾液であれば、ガムベースやパラフィンワックス等の咀嚼により得られる刺激唾液や、安静時の無刺激唾液、スワブや吸水紙を用いて唾液を吸着する方法で採取することができるが、検体の採取が短時間ででき、検体の処理が容易となる刺激唾液が最も望ましい。また、洗口吐出液は、水や生理食塩水又は緩衝液等を口に含んだ後、口をよく動かして漱ぎを行なっても、口に含むのみですぐに吐き出してもよい。プラークに関しては、スケーラーや歯ブラシで掻き取ったものを水や生理食塩水又は緩衝液等に懸濁したものや、ブラッシング後に洗口した水や生理食塩水又は緩衝液等が挙げられる。
【００１７】
本発明の検体の処理方法に用いられる陰イオン性界面活性剤は、特に限定されないが、アルキル硫酸エステル塩（ドデシル硫酸ナトリウム等）、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム等）や、ラウリルスルホコハク酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。本発明においては、特にアルキル硫酸エステル塩や胆汁酸塩が良いが、中でもドデシル硫酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムが最も適している。
【００１８】
上記の陰イオン性界面活性剤は、検体の処理に使用する際には、０．００１〜０．１％の濃度になるように添加することができる。
【００１９】
本発明の検体の処理方法には、上記の陰イオン性界面活性剤の他、一般的に当業者が使用しうる成分を含ませて用いることができる。具体的には、反応に至適なｐＨに保持しうる緩衝液を構成する成分や、その他有機酸や無機酸、金属塩等を含ませることができる。緩衝液としては、リン酸や、ホウ酸、トリス緩衝液といったものが挙げられる。ｐＨは、特に制限されないが、中性程度（ｐＨ５．０〜９．０）が好ましい。有機酸としては、具体的には酒石酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、酢酸、ギ酸等があり、無機酸としては硫酸、塩酸、硝酸、亜硝酸等が挙げられる。また、金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩等が挙げられる。
【００２０】
検体の処理方法は、通常の方法に従えば良く、液状の検体を処理する際には、上記陰イオン性界面活性剤を含む液体等を検体に加え、転倒混和や、振とう、撹拌等により、その液体等と検体とが混合されればよい。また、唾液をスワブや吸水紙を用いて採取した場合は、上記陰イオン性界面活性剤を含む液体等に当該吸水体を浸し、混和した後、その液体等と検体とを吸水体より搾り取ることにより処理を行うことができる。また、免疫クロマトグラフィー上の、抗原検出部位よりも上流の部位に設置する部材、例えば、サンプルパッドや、ニトロセルロースメンブレンの抗原検出部位より上流の部分に直接、あらかじめ上記陰イオン性界面活性剤を含む液体等を含浸させることで、免疫クロマトグラフィー上で検体の移動と同時に処理を行うことも可能である。処理時間は特に制限されないが、処理後２時間以内が望ましく、処理後すぐに検査等を行うことも可能である。反応温度は室温であれば問題なく、５℃〜３５℃で反応すれば良い。
【００２１】
さらに本発明により、上記陰イオン性界面活性剤を含む検体等を構成部材の一つとして、当該処理方法により口腔由来検体を処理することを特徴とする歯周疾患検査又は診断用の免疫クロマトグラフィー用検査キットを提供することもできる。
【実施例】
【００２２】
本発明の理解のために、以下に実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
試験例１  唾液検体における陰イオン性界面活性剤の効果
本試験例は、検体として唾液を用いた際の陰イオン性界面活性剤の効果について確認することを目的に行なった。
【００２４】
コロイド粒形が４０ｎｍの市販の金コロイド溶液（ＢＢＩ社）０．１ｍＬに、５０ｍＭリン酸緩衝液を０．９ｍＬ添加し、ｐＨを９．０に調製した。一方、本発明に係るポルフィロモナス  ジンジバリス（以下、「Ｐｇ」とする。）を特異的に認識するモノクローナル抗体は、「単クローン抗体実験マニュアル」（富山朔二・安藤民衛編，講談社発行参照）等に示されたような細胞融合によるハイブリドーマの樹立に基づいて、常法により作製し、得られた抗Ｐｇモノクローナル抗体を、蒸留水を用いて６０μｇ／ｍＬに調製した。金コロイド懸濁液に抗Ｐｇモノクローナル抗体溶液を１００μＬ添加し、撹拌後１０分間静置した。次いで、１％ＰＥＧ２００００  ５５μＬと１０％  ＢＳＡ  １１０μＬを添加し、１０℃  １００００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、上清を除去した。次いで１％  ＢＳＡと０．１％  ＰＥＧ２００００、０．１％  アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（以下、「金コロイド保存バッファー」とする。）５００μＬで再懸濁し、再度１０℃  １００００ｒｐｍで１５分間遠心処理した。再び上清を除去した後、金コロイド保存バッファーを１００μＬ加え、懸濁し、金コロイド標識抗体とした。
【００２５】
図１に示したような、ニトロセルロースメンブレン（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ｍｅｍｂｌａｎｅ，ＨＦ１２０，２５ｍｍ×５ｍｍ）からなる展開メンブレン３上の検出部（テストライン）４及び抗原抗体反応確認部（コントロールライン）５に、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬの抗Ｐｇモノクローナル抗体と０．２５ｍｇ／ｍＬの市販の抗マウスＩｇＧポリクローナル抗（ＳＩＧＭＡ社）体を直線状に塗布し、５０℃で３０分間インキュベートした。当該抗体固定化メンブレンを、０．５%ＢＳＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に３０分間含浸し、次に０．５%スクロース及び０．０５%  コール酸ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に６０分間含浸後、抗体固相化メンブレンを取り出し、室温で一晩放置し乾燥した。
【００２６】
金コロイド標識抗体１０μＬに蒸留水１０μＬと、５％スクロース及び０．０５%  ＰＥＧ２００００を含む２０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液２０μＬを混合したものを、グラスファイバー（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、８ｍｍ×５ｍｍ）に２５μＬ塗布し、一晩真空乾燥してコンジュゲートパッド２とした。
【００２７】
作製した抗体固相化メンブレン３及びコンジュゲートパッド２と、サンプルパッド１（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１８ｍｍ×５ｍｍ）及び吸収パッド６（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、２０ｍｍ×５ｍｍ）を支持台紙７（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、６０ｍｍ×５ｍｍ）上に図１のように貼り合わせ、免疫クロマトグラフィー用ストリップとした。
【００２８】
１０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、０．９％  ＮａＣｌを含有する溶液（ｐH７．４）に、ドデシル硫酸ナトリウムを０．０５％になるように加え、これを検体処理液とした（実施例１）。さらに、上記ドデシル硫酸ナトリウムに換えて、デオキシコール酸ナトリウムを加えたものを使用し（実施例２）、その他としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を加えたものを使用した（比較例１〜３）。また、上記ドデシル硫酸ナトリウムを加えなかったものも使用した（比較例４）。
【００２９】
健常者にガムベースを５分間咀嚼させ、分泌された刺激唾液を採取した。上記刺激唾液は、リアルタイムＰＣＲ法によりＰｇ細菌数が測定機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）の検出限界以下であることを確認し、その後、上記刺激唾液に１０００分の１量の濃度既知のＰｇ懸濁液を添加し、１０７個／ｍＬとしたものを陽性検体とし、上記刺激唾液そのままのものを陰性検体とした。それぞれの検体２０μLを、上記検体処理液１８０μLに添加し、転倒混和して測定用試料とした。
【００３０】
上記免疫クロマトグラフィー用ストリップに、測定用試料である陽性検体又は陰性検体を１００μＬ滴下し、測定用試料の移動を３０分間確認した。各測定用試料の滴下後、コンジュゲートパッドに含浸された金コロイド標識抗体（赤紫色）の移動を目視で確認し、金コロイド標識抗体の移動が見られなかったものについて、目詰まりが発生するものとした。
【表１】
0005124211.tif 000002
【００３１】
上記のように目詰まりを確認した後、目詰まりが発生しなかった検体処理液を用いて上記免疫クロマトグラフィー用ストリップにおける検体の検出を調べた。具体的には上記と同様に、測定用試料である陽性検体又は陰性検体を１００μＬ滴下し、Ｐｇの検出を３０分間調べた。上記測定用試料の滴下後、Ｐｇ検出部（テストライン）及び抗原抗体反応確認部（コントロールライン）について目視で判定を行い、反応が確認できた場合を「＋」とし、反応が確認できなかった場合を「−」とした。
【００３２】
その結果は表２の通りであり、ドデシル硫酸ナトリウムを検体処理液とした場合及びデオキシコール酸ナトリウムを検体処理液とした場合は、陽性検体は「＋」と判定され、陰性検体は「−」と判定された。一方、その他の検体処理液については、全て陰性検体が「＋」と判定され、正確にＰｇの判定を行うことができなかった。なお、コントロールラインはいずれも「＋」と判定され、抗原抗体反応が行われていることは確認できた。
【表２】
0005124211.tif 000003
【００３３】
試験例２  洗口吐出液検体における陰イオン性界面活性剤の効果
本試験例は、検体として洗口吐出液を用いた際の界面活性剤の効果について確認することを目的に行なった。
【００３４】
試験例１に従って、免疫クロマトグラフィー用ストリップを作製した。
【００３５】
１０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、０．９％  ＮａＣｌを含有する溶液（ｐH７．４）に、ドデシル硫酸ナトリウムを０．０５％になるように加え、これを検体処理液とした（実施例３）。さらに、上記ドデシル硫酸ナトリウムに換えて、デオキシコール酸ナトリウムを加えたものを使用し（実施例４）、その他としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を加えたものを使用した（比較例５〜７）。また、上記ドデシル硫酸ナトリウムを加えなかったものも使用した（比較例８）。
【００３６】
健常者に１５ｍＬの滅菌蒸留水で１０秒間洗口させ、吐き出したものを洗口吐出液として採取した。上記洗口吐出液は、リアルタイムＰＣＲ法によりＰｇ細菌数が測定機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）の検出限界以下であることを確認し、その後、上記洗口吐出液に１０００分の１量の濃度既知のＰｇ懸濁液を添加し、１０７個／ｍＬとなるように調製したものを陽性検体とし、上記洗口吐出液そのままのものを陰性検体とした。それぞれの検体１８０μＬに、上記検体処理液２０μＬを添加し、転倒混和して測定用試料とした。
【００３７】
試験例１と同様に、上記免疫クロマトグラフィー用ストリップに、測定用試料である陽性検体又は陰性検体を１００μＬ滴下し、測定用試料の移動を３０分間確認した。各測定用試料の滴下後、コンジュゲートパッドに含浸された金コロイド標識抗体（赤紫色）の移動を目視で確認し、金コロイド標識抗体の移動が見られなかったものについて、目詰まりが発生するものとした。
【表３】
0005124211.tif 000004
【００３８】
その結果は表４の通りであり、試験例１と同様にドデシル硫酸ナトリウムを検体処理液とした場合及びデオキシコール酸ナトリウムを検体処理液とした場合は、陽性検体は「＋」と判定され、陰性検体は「−」と判定された。一方、その他の検体処理液については、全て陰性検体が「＋」と判定され、正確にＰｇの判定を行うことができなかった。なお、コントロールラインはいずれも「＋」と判定され、抗原抗体反応が行われていることは確認できた。
【表４】
0005124211.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】免疫クロマトグラフィー用ストリップの概略を示す図である。
【符号の説明】
【００４０】
１  サンプルパッド
２  コンジュゲートパッド
３  ニトロセルロースメンブレン
４  テストライン
５  コントロールライン
６  吸収パッド
７  支持台紙
【図１】
0005124211.tif 000006