(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１に示される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマーと、配列表における配列番号２に示される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとを備えたことを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プライマーセットを用いて、被検試料中のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）遺伝子を増幅することを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の検出方法。
【請求項３】
配列表における配列番号５に示される塩基配列又はその相補配列の少なくとも２０塩基の標識化オリゴヌクレオチド部分を備えたことを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プローブ。
【請求項４】
請求項３記載のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プローブと被検試料とを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下でインキュベートすることを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の検出方法。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプローブとして用いたとき、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）を検出しうるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コイに感染するコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の病原体を同定することのできるコイヘルペスウイルス検出用プライマーセット及びコイヘルペスウイルス検出用プローブや、これらプライマーセットやプローブを用いたコイヘルペスウイルスの検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コイヘルペスウイルス病は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に感染することによりマゴイやニシキゴイに発生する病気で、発病すると行動が緩慢になったり餌を食べなくなるが、目立った外部症状は少なく、鰓の退色やびらん（ただれ）などが見られ、幼魚から成魚までに発生し、死亡率が高いコイの病気である。  【０００３】
前記コイヘルペスウイルス病は、１９９８年５月にイスラエルにて、最初の発症の報告がなされた。その後、同じイスラエルにおいて、その年の秋と翌年の春との２度発症し、輸出用のコイを含めて約６００トンのコイが死滅した。被害総額は４００万ドルを超えるものであった。その後も世界各国（イスラエル、英国、ドイツ、オランダ、ベルギー、米国、インドネシア、台湾）で次々と発症の報告がなされた。【０００４】
わが国においても２００３年（平成１５年）１１月に農林水産省が茨城県の霞ヶ浦においてコイヘルペスウイルス病を疑うコイを確認したと発表して以来、青森、山梨、三重、岡山、宮崎と各地でコイヘルペスウイルス病の発生が報告されている。農林水産省でも感染経路の特定をはじめとして、この病気の拡散防止について努めているところである。【０００５】
自然界や養殖場でウイルスによる感染症が発生したとき、その原因となる病原体を同定することは感染症の新たな伝播の阻止あるいは予防・治療において極めて重要である。従来、魚類病原体を含めて一般細菌、ウイルス、カビ等を同定するに当たっては、その形態、生化学的性状、又は免疫学的手法を用いた生物化学的性状の観察が行われていた。最近、生化学及び分子遺伝学の発展に伴い、その病原体が有する染色体ＤＮＡやＲＮＡ、病原体構成物質や病原体の代謝物による同定・検出も可能になった。しかしながら、これらの方法は複雑な工程を多数踏まねばならず、多大な時間を費やすという問題があり、ウイルス病等のように伝播の早い疾患に十分対応できない欠点があった。【０００６】
このような事情に鑑みて、最近では各種の病原体に特異的な遺伝子を検出して病原体を同定する方法が普及している。この方法は、標的となる病原体の遺伝子から作製したＤＮＡプローブ（一本鎖ＤＮＡを標識化合物で標識したもの）が、標的となる病原体の核酸とのみハイブリダイズすることを利用するものである。さらに、目的とするＤＮＡをごく短時間で大量に増幅できる方法が開発されると、上記決定遺伝子の塩基配列のうち、両末端の一部分をプライマーとして利用することにより、被検試料（病原体を含有する生体組織）を用いてウイルス等の病原体を迅速かつ正確に検出・同定することができるようになる。【０００７】
ウイルス検出用のプライマーについては、単純ヘルペスウイルスＩ型及びII型の型特異的検出方法を提供するものであって、化学合成が可能な程度の大きさで、しかも型別の特異性が減少しない塩基配列からなるＤＮＡプライマー及びプローブを用いて、ＨＳＶＩ型又はＨＳＶII型の感染症を、高精度で、迅速に、しかも型特異的に識別することができ、その結果を診断及び治療に役立てることができる方法（例えば、特許文献１参照。）や、エイズの原因となるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を診断するために使用できる核酸であって、ＨＩＶ−１核酸の増幅及び検出にプライマー及びプローブとして使用され得るヌクレオチド配列（例えば、特許文献２参照。）や、トマト黄化葉巻病の早期診断のために、その病原ウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出させる方法（例えば、特許文献３参照。）や、ソラマメウイルトウイルスのＲＮＡ又はその塩基配列においてウラシルがチミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プライマー、及びソラマメウイルトウイルスのＲＮＡと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーを用いて、ソラマメウイルトウイルスを検出する方法（例えば、特許文献４参照。）が知られている。【０００８】
また、魚類のウイルス検出用プライマーに関しては、イリドウイルスのような魚類病原ウイルスを用いた、ウイルス種間で保存されているリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の中で保存性の高い領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列で設計した混合プライマーを用いて病原ウイルス遺伝子のクローニングをした後、得られたＤＮＡ中の魚病診断に適用できる特異性の高い塩基配列で混合プライマーを設計し、それを用いて魚病病原イリドウイルスを迅速に診断する方法（例えば、特許文献５参照。）が提案されている。また、ＰＣＲ法による２９２ｂｐの長さを持つＤＮＡを検出するコイヘルペスウイルスの検出方法（例えば、非特許文献１参照。）も報告されているが、検出感度及び精度の点で問題が指摘されている。【０００９】
【特許文献１】特開平５−５６８００号公報
【特許文献２】特表２００１−５１２７０１号公報
【特許文献３】特開２００４−２１５５２０号公報
【特許文献４】特開平１１−３１３６７９号公報
【特許文献５】特開平７−２８４３９９号公報
【非特許文献１】Yuasa,K. et. al. (2005) Fish Pathology 40(1):37-39.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
コイヘルペスウイルス病は致死率も高く、コイヘルペスウイルス病により、養殖コイのみならず湖沼に生息する自然界のコイにまで甚大な被害が及んでおり、より正確で迅速に検出できる方法の開発が切望されている。本発明の課題は、コイに感染するコイヘルペスウイルスをより正確で迅速に検出・同定することのできるコイヘルペスウイルス検出用プライマーセット及びコイヘルペスウイルス検出用プローブや、これらプライマーセットやプローブを用いたコイヘルペスウイルスの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、日本、アメリカ、イスラエル、インドネシアの各コイヘルペスウイルス遺伝子の全塩基配列を決定し、各コイヘルペスウイルス遺伝子レベルでの相同性が約９９％、アミノ酸レベルでの相同性が約１００％であることを確認した。次に、解明した全塩基配列のうち、コイヘルペスウイルス病原体に特異的な繰り返し配列部分に着目し、既知の真核生物やウイルスなど異なると想定される１５０から２００ｂｐ程度で、かつ塩基Ｃ及びＧの構成比率が６５％前後を超えない配列部分を探索し、日本、アメリカ、イスラエル、インドネシアの各コイヘルペスウイルス遺伝子に特異的で、よく保存されている配列番号５及び６に記載した２つの領域を選定し、かかる領域を標的としたコイヘルペスウイルス検出用プライマーセットやコイヘルペスウイルス検出用プローブを用いると、コイヘルペスウイルスをより正確で迅速に検出・同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち本発明は、（１）配列表における配列番号１に示される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマーと、配列表における配列番号２に示される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとを備えたことを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プライマーセットや、（２）上記（１）に記載のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プライマーセットを用いて、被検試料中のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）遺伝子を増幅することを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の検出方法や、（３）配列表における配列番号５に示される塩基配列又はその相補配列の少なくとも２０塩基の標識化オリゴヌクレオチド部分を備えたことを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プローブや、（４）上記（３）に記載のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プローブと被検試料とを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下でインキュベートすることを特徴とするコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の検出方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（５）配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（６）配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補的配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプローブとして用いたとき、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）を検出しうるＤＮＡに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】日本分離株（ＫＨＶ−Ｊ）、アメリカ分離株（ＫＨＶ−Ａ）、イスラエル分離株（ＫＨＶ−Ｉ）のＫＨＶゲノムの全長（ｂｐ）と予測された遺伝子数を示す図である。
【図２】日本分離株（ＫＨＶ−Ｊ）、アメリカ分離株（ＫＨＶ−Ａ）、イスラエル分離株（ＫＨＶ−Ｉ）のＫＨＶゲノムの相同性の比較結果を示す図である。
【図３】本発明のＫＨＶ検出用プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図４】本発明のＫＨＶ病病原体検出用プライマーを用い、ＫＨＶゲノムの量（６種類）に対するＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図５】本発明のＫＨＶ病病原体検出用プライマーを用い、ＫＨＶに感染した３匹のコイの鰓のＤＮＡに対するＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プライマーセットとしては、配列表における配列番号１に示される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマーと、配列表における配列番号２に示される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとを備えたプライマーセット、あるいは、配列表における配列番号３に示される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマーと、配列表における配列番号４に示される塩基配列の少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーとを備えたプライマーセットであれば特に制限されず、これらコイヘルペスウイルス検出用プライマーセットを用いて、被検試料中のコイヘルペスウイルス遺伝子を増幅することにより、コイヘルペスウイルスを検出することができる。【００１６】
上記少なくとも１０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡプライマーや第２のＤＮＡプライマーとしては、１０〜５０塩基のオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチド部分、中でも２０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有するプライマーが好ましいが、プライマーの長さとしては、ＰＣＲによる増幅するＤＮＡにおいて１塩基以上離れておればよい。【００１７】
また、本発明のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）検出用プローブとしては、配列表における配列番号５に示される塩基配列（コイヘルペスウイルスのゲノム７６８９−７８７８あるいは２８０５２７−２８０７１６の１９０ｂｐ部分）又はその相補配列の少なくとも１０塩基、好ましくは２０塩基以上の標識化オリゴヌクレオチド部分を備えたプローブ、あるいは、配列表における配列番号６に示される塩基配列（コイヘルペスウイルスのゲノム１５９９６−１６１６０あるいは２８８８３４−２８８９９８の１６５ｂｐ部分）又はその相補配列の少なくとも１０塩基、好ましくは２０塩基以上の標識化オリゴヌクレオチド部分を備えたプローブを有するものであれば特に制限されず、これらコイヘルペスウイルス検出用プローブと被検試料とを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下でインキュベートすることにより、コイヘルペスウイルスを常法により検出することができる。【００１８】
上記被検試料としては、コイヘルペスウイルスを含有している疑いのある試料であれば特に制限されず、例えば、コイのエラ、表皮、肝臓、腎臓などの組織や血液から常法により抽出したＤＮＡ抽出液を具体的に例示することができる。【００１９】
本発明のコイヘルペスウイルス検出用プライマーセットを用いる本発明のコイヘルペスウイルスの検出方法は、被検試料中のコイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡの増幅工程と、コイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡ検出工程とからなる。遺伝子ＤＮＡの増幅工程では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ループメディエイティッド・アイソサーマル・アンプリフィケーション法（ＬＡＭＰ）、アイソサーマル・アンド・キメリック・プライマーイニシエイテッド・アンプリフィケーション法（ＩＣＡＮ）などを用いることができる。【００２０】
例えば、ＰＣＲ法を利用すると、微量のＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増幅することができる（Science, 239:487-491, 1988）。ＰＣＲでは、増幅させるＤＮＡ領域を挟んでセンス鎖に対するプライマー（以下、第１プライマーということがある）及びアンチセンス鎖に対するプライマー（以下、第２プライマーということがある）の２種のＤＮＡプライマーを用いて、被検試料中のコイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡを増幅することができる。上記第１プライマーや第２プライマーのそれぞれを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例えば、ビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。【００２１】
ＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅工程では、第１プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることが好ましい。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。【００２２】
本発明のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び被検試料を含む混合液を用いてＰＣＲを行う場合の増幅条件としては、例えば、ＤＮＡの変性（約９０〜９５℃で、約１０秒〜約２分間）、１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング（約３７〜７０℃で、約３０秒〜約３分間）、及びＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成（約６５〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）を好適に挙げることができ、この増幅サイクルを１０〜６０回、特に２０〜４０回繰り返すことが好ましい。最終サイクルにおいては、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合成が完全に行われるようにすることが好ましい。被検試料中にコイヘルペスウイルスが存在する場合には、増幅サイクル終了後に、コイヘルペスウイルス由来のＤＮＡが大量に合成されることになり、このＤＮＡを次のＤＮＡ検出工程によって検出する。【００２３】
ＤＮＡ検出工程としては、ゲル電気泳動法及びエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザンブロットハイブリッド法、又はジデオキシ法による塩基配列決定法、放射性標識法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。サザンブロットハイブリッド法、又はin situハイブリッド法
を行う場合には、放射性プローブ、非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ又は化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法を利用する場合には、蛍光標識を使用したＤＮＡオートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用いることができる。【００２４】
上記増幅工程で用いる第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせとしては、配列番号１に示される塩基配列（ａｃａｇｔｇｔｃｃｇａｃｔｔｇｔｇｃｇａ）からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｆということがある）と配列番号２に示される塩基配列（ｔｇｇｔｇｃｃｃａｃａｔｇｔｇｃｇｔｔｇ）からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｒということがある）との組み合わせ（以下、ＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマーセットということがある）や、配列番号３に示される塩基配列（ｇａｃａｃｔｇａａｃａｔｇａａｃａｃｔｇ）からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＫＨＶ−ＧＴ−Ｆということがある）と配列番号４に示される塩基配列（ｇａａｔｃｃａｔｃｃｃｃａｔｃａｃｃｃｇ）からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＫＨＶ−ＧＴ−Ｒということがある）との組み合わせ（以下、ＫＨＶ−ＧＴプライマーセットということがある）を好適に例示することができ、これらの組み合わせのいずれか１種を単独で用いるか、又は２種を同時に用いることもできる。【００２５】
上記ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｆは、コイヘルペスウイルスのゲノム７６８９−７７０８あるいは２８０５２７−２８０５４６に存在し、ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｒは、コイヘルペスウイルスのゲノム７８５９−７８７８あるいは２８０６９７−２８０７１６に存在する配列の相補鎖であり、これらＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマーセットを用いると、配列番号５に示される１９０ｂｐの塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。また、上記ＫＨＶ−ＧＴ−Ｆは、コイヘルペスウイルスのゲノム１５９９６−１６０１５あるいは２８８８３４−２８８８５３に存在し、ＫＨＶ−ＧＴ−Ｒは、コイヘルペスウイルスのゲノム１６１４１−１６１６０あるいは２８８９７９−２８８９９８に存在する配列の相補鎖であり、これらＫＨＶ−ＧＴプライマーセットを用いると、配列番号６に示される１６５ｂｐの塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。これらＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマーセットやＫＨＶ−ＧＴプライマーセットを用いると、コイヘルペスウイルスのゲノム７６８９−７８７８あるいは２８０５２７−２８０７１６の１９０ｂｐ部分やゲノム１５９９６−１６１６０あるいは２８８８３４−２８８９９８の１６５ｂｐ部分を、短時間の内に特異的に大量に増幅することができるので、被検試料中におけるコイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡの存在を特異的に検出することができる。【００２６】
本発明の第１プライマーや第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によって調製することができる。【００２７】
本発明のコイヘルペスウイルス検出用プローブを用いる本発明のコイヘルペスウイルスの検出方法は、被検試料中のコイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡに標識化されている本発明のコイヘルペスウイルス検出用プローブをハイブリダイズさせ、プローブに結合されている標識物質を検出することにより行うことができ、被検試料として、コイヘルペスウイルスを含有している疑いのある試料から常法により抽出したＤＮＡ抽出液をそのまま使用することもできるが、ＰＣＲ法により増幅されたコイヘルペスウイルス遺伝子ＤＮＡを使用することもできる。【００２８】
上記標識物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位体、ビオチン、アビジン等を挙げることができ、具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５
Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を例示することができる。【００２９】
本発明のＤＮＡとしては、配列番号５又は６に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号５又は６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプローブとして用いたとき、コイヘルペスウイルスを検出しうるＤＮＡや、配列番号５又は６に示される塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプローブとして用いたとき、コイヘルペスウイルスを検出しうるＤＮＡであれば特に制限されるものでなく、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。【００３０】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号５又は６に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（以後"モレキュラークローニング第３版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。【００３１】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００３２】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。【００３３】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示したＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマーセットやＫＨＶ−ＧＴプライマーセットを調製し、それらを用いて、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。実験方法については別段で記載するもの以外は、モレキュラークローニング第３版に記載の方法に準じて行った。また、下記の用語については略号を使用した。
ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液：０．７Ｍ ＮａＣｌを含有する１０％セチルトリメチルアンモニウム蓚酸溶液、トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリス塩酸：トリスヒドロキシメチルアミノメタンを含有し、塩酸でｐＨを調整したもの、ＳＤＳ：ドデシル硫化ナトリウム、ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸、ＴＢＥ緩衝液：０．０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍ硼酸、０．００２Ｍ ＥＤＴＡを含有する液体、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＴＥ：１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する溶液、ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸、ｄＣＴＰ：デオキシシトシン三リン酸、ｄＧＴＰ：デオキシグアニン三リン酸、ｄＴＴＰ：デオキシチミン三リン酸、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル。
【実施例１】
【００３５】
日本、アメリカ及びイスラエルでコイより分離されたＫＨＶ、すなわち日本分離株（ＤＤＢＪアクセッション番号；ＡＰ００８９８４）、アメリカ分離株（ＤＤＢＪアクセッション番号；ＤＱ６５７９４８）及びイスラエル分離株（ＤＤＢＪアクセッション番号；ＤＱ１７７３４６）の全ゲノム配列を決定した。図１にこれらＫＨＶゲノムの全長（ｂｐ）と予測された遺伝子数を示し、図２にこれらＫＨＶゲノムの相同性の比較結果を示す。これらＫＨＶゲノム配列より下記の２セットのＰＣＲプライマーを作製した。また、各プライマーの日本分離株（ＫＨＶ−Ｊ）のゲノムにおける位置を示す。【００３６】
１．ＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマー
ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｆ：５’−ａｃａｇｔｇｔｃｃｇａｃｔｔｇｔｇｃｇａ−３’
（ゲノムの位置：７６８９−７７０８，２８０５２７−２８０５４６）
ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｒ：５’−ｔｇｇｔｇｃｃｃａｃａｔｇｔｇｃｇｔｔｇ−３’
（ゲノムの位置：７８５９−７８７８，２８０６９７−２８０７１６）【００３７】
ＫＨＶ−ＴＮＦＲプライマーにより下記の配列１９０ｂｐが増幅される。下線はプライマー配列を示した。
５’−ＡＣＡＧＴＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡＣＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡ−３’【００３８】
２．ＫＨＶ−ＧＴプライマー
ＫＨＶ−ＧＴ−Ｆ：５’−ｇａｃａｃｔｇａａｃａｔｇａａｃａｃｔｇ−３’  
（ゲノムの位置：１５９９６−１６０１５，２８８８３４−２８８８５３）
ＫＨＶ−ＧＴ−Ｒ：５’−ｇａａｔｃｃａｔｃｃｃｃａｔｃａｃｃｃｇ−３’  
（ゲノムの位置：１６１４１−１６１６０，２８８９７９−２８８９９８）【００３９】
ＫＨＶ−ＧＴプライマーにより下記の配列１６５ｂｐが増幅される。下線はプライマー配列を示した。
５’−ＧＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡＴＡＧＣＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＣ−３’【００４０】
ＫＨＶのゲノムＤＮＡ抽出はモレキュラークローニング第３版に従い行った。抽出したＤＮＡはＴＥバッファーにて透析し用いた。  
【実施例２】
【００４１】
ＫＨＶゲノムの位置７６８９から７７０８番目に存在する配列である前記ＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｆを上流プライマーとし、同じく７８５９から７８７８番目に存在する配列の相補鎖であるＫＨＶ−ＴＮＦＲ−Ｒを下流プライマーとし、ＫＨＶゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により目的ＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡの塩基配列を確認した。増幅にはタカラ社製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び酵素に添付されてくる１０倍濃度反応液及び１０倍濃度ｄＮＴＰ溶液を１倍濃度になるように用いた。反応液は５０マイクロリットルになるように調整した。この溶液を自動温度調節機にかけ、上記のＰＣＲプライマーを用い、ＫＨＶゲノムを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとし、３０サイクル行った。【００４２】
ＰＣＲ反応終了後、０．８％アガロースゲルを用い、ＴＢＥ緩衝液中にて８０ｍＡで１時間の電気泳動を行うことにより、増幅されたＤＮＡ断片の分子量を測定した。この増幅ＤＮＡ断片の検出及び分子量は、市販の１００ｂｐラダーに対する相対移動度として測定した。ＤＮＡ断片の検出は、アガロースゲルを臭化エチジウム（１μｇ／ｍＬ）含有ＴＢＥ緩衝液中で染色した後、紫外線照射過下における蛍光を観察することにより行った。【００４３】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は前述した耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いたジデオキシ法で決定した。その結果は配列表の配列番号５に記載のとおり、塩基配列の長さが１９０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【実施例３】
【００４４】
ＫＨＶ病病原体ゲノムの位置１５９９６から１６０１５番目に存在する配列であるＫＨＶ−ＧＴ−Ｆを上流プライマーとし、同じく１６１４１から１６１６０番目に存在する配列の相補鎖であるＫＨＶ−ＧＴ−Ｒを下流プライマーとし、ＫＨＶ病病原体の種を決定する遺伝子をＰＣＲ法により増幅して、得られたＤＮＡの塩基配列を決定した。以下、実施例１と同様の操作を行い配列表の配列番号６に記載した塩基配列の長さが１６５ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【実施例４】
【００４５】
実施例２及び３で得られた二種類のＤＮＡ断片の塩基配列について、ＫＨＶゲノムの構成塩基配列の１部に合致しているかどうかをコンピューター解析ソフト（ＳＤＣソフトウェア）にて比較した。同時に遺伝子配列に関するデータベース(http://www.ncbi.nih.gov/index.html)にアクセスし、これらの塩基配列と同じ部分を持つ真核生物及びウイルスが存在するか否かについてもコンピューター解析ソフト（ＳＤＣソフトウェア）にて比較解析した。【００４６】
その結果、得られたＤＮＡ断片の塩基配列はいずれもＫＨＶゲノム中に存在することが確認され、データベースでの検索結果でも、これらのＤＮＡ断片と同じ塩基配列部分を有する真核生物及びウイルスは存在しないことがわかった。以上のことから、得られた１９０ｂｐ及び１６５ｂｐの長さを持つ二種類のＤＮＡ断片はいずれもＫＨＶを特異的に検出するＤＮＡ配列であるといえる。  
【実施例５】
【００４７】
実施例２及び３で使用したプライマー、並びに既報のＫＨＶ検出用プライマーを使用して、日本（Ｊ）、アメリカ（Ａ）、イスラエル（Ｉｓ）、及びインドネシア（Ｉｎ）で分離されたＫＨＶゲノムを鋳型としたＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ領域を増幅ができるか否かを検討した。ＰＣＲ用の試薬の調整、試験条件及び電気泳動条件は全て実施例２と同様とした。既報のＫＨＶ検出用プライマーとしては、前記非特許文献１のTable １のCorrected Sph 1-5 primer setを用いた。【００４８】
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を図１に示した。実施例２及び３で使用したプライマーは、いずれも既存プライマーと同様に分離地域の異なる全てのＫＨＶについて、電気泳動上でそれぞれ求める分子量部分に明瞭なＤＮＡバンドを形成してそれらのゲノムの存在を示した。
【実施例６】
【００４９】
実施例２及び実施例３で使用したプライマー、並びに既報のＫＨＶ検出用プライマーを使用して、日本で分離されたＫＨＶゲノムに対してＰＣＲを行い、それぞれのプライマーセットによるＫＨＶの検出感度を比較した。それぞれのＰＣＲは実施例２と同様にして実施したが、ＫＨＶゲノムついては、それぞれの反応液に混合するＫＨＶゲノムＤＮＡの量を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ及び１ｐｇの６種類を調整し、ＰＣＲによる種決定遺伝子の増幅を試みた。【００５０】
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真を図２に示した。実施例２及び３で使用したプライマーは、いずれも既存プライマーと同様に電気泳動上でそれぞれ求める分子量部分に明瞭なＤＮＡバンドを形成したが、既報プライマーではＫＨＶゲノムが１００ｐｇの量以下では検出できなくなったのに対し、本発明におけるプライマーのいずれも、ＫＨＶゲノム１０ｐｇでＰＣＲ増幅ＤＮＡによる明瞭なバンドを出現させた。すなわち、本発明で得られたプライマーは、いずれも既報プライマーの１００倍のＫＨＶゲノムの検出感度を有し、ＫＨＶ病の診断技術を飛躍的に向上させるものであることが明らかとなった。
【実施例７】
【００５１】
実施例２及び実施例３で使用したプライマー、並びに既報のＫＨＶ検出用プライマーを使用して、ＫＨＶに感染した３匹のコイの鰓から抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行い、それぞれのプライマーセットによるＫＨＶの検出を行った。また、コントロールには日本で分離されたＫＨＶゲノムＤＮＡを用いた。それぞれのＰＣＲは実施例２と同様にして実施した。コイの鰓からのＤＮＡの抽出は、「魚類のＤＮＡ―分子遺伝学的アプローチ」２章  遺伝子の解析法（廣野育生）；株式会社恒星社厚生閣（1997年6月10日発行）に記載された方法により行った。【００５２】
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を図５に示した。実施例２及び３で使用したプライマーでは、いずれも電気泳動上でＫＨＶ特異的な明瞭なＤＮＡバンドが形成され、非特異的ＤＮＡバンドは形成されなかった。これに対して、既報プライマーでは、ＫＨＶに感染した３匹のコイの鰓のＤＮＡにおいて、ＫＨＶ特異的なＤＮＡバンドに加え、非特異的ＤＮＡバンドが形成されていた。すなわち、本発明で得られたプライマーは、いずれも既報プライマーに比べて、ＫＨＶゲノムの優れた検出精度を有し、ＫＨＶ病の診断技術を飛躍的に向上させるものであることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のコイヘルペスウイルス検出用プライマーセットやコイヘルペスウイルス検出用プローブを使用することにより、コイヘルペスウイルス遺伝子を高感度・高精度かつ迅速に検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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