(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）組織培養法により感染根を無菌的に取得する工程、又は（ｂ）ポット培養法により胞子を無菌的に取得する工程（１）と、
該工程（１）で取得した前記感染根又は前記胞子を、以下の（ｃ）コーンベース培地又は（ｄ）ポテトベース培地を含む寒天培地平板上で、培養温度２０℃、培養期間３〜４日間で培養する工程（２）と、を備えることを特徴とするＶＡ菌根菌の培養方法。
（ａ）組織培養法：硫酸アンモニウム０．０１７ｇ・硝酸アンモニウム０．０６ｇ・塩化カリウム０．０６ｇ・塩化カルシウム０．８ｇ・硫酸マグネシウム０．０５ｇ・塩化マンガン０．００１ｇ・酸化ほう素０．００５ｇ・硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．０００１ｇ・硫酸銅０．００１ｇ・モリブデン酸ナトリウム０．００１ｇ・硝酸コバルト０．００１ｇ・グルコース２ｇ・蒸留水１０００ｍｌからなる滅菌したｐＨ５．０の組織培養液を用いて牧草根を無菌状態で発芽発根させ、該牧草根に無菌状態で胞子を接種し感染させた感染根を取得する方法
（ｂ）ポット培養法：絶対無菌牧草と無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、培養土中に含まれる胞子から円盤状の感染粒子を選別することで胞子を無菌的に取得する方法
（ｃ）コーンベース培地：冷凍コーンを１２０℃２５分浸出しろ過したもの又はコーンスティープリカー１％溶液を一度煮沸しろ過しｐＨ５．０に補正した培地
（ｄ）ポテトベース培地：ジャガイモをミキサーで処理し、しばらく放置し上澄みをろ過し、一度煮沸してろ過したものにグルコースを加えｐＨ５．０に補正した培地
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＡ菌根菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明はＶＡ菌根菌の胞子から２つの方法で人工寒天培地平板上又は液体培養法で生菌ＶＡ菌根菌の培養法を確立し、分離菌株は株化、継代し保存も可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＶＡ菌根菌の胞子から人工培地上でＶＡ菌根菌を培養する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の（ａ）組織培養法により感染根を無菌的に取得する工程、又は（ｂ）ポット培養法により胞子を無菌的に取得する工程（１）と、
該工程（１）で取得した前記感染根又は前記胞子を、以下の（ｃ）コーンベース培地又は（ｄ）ポテトベース培地を含む寒天培地平板上で、培養温度２０℃、培養期間３〜４日間で培養する工程（２）と、を備えることを特徴とするＶＡ菌根菌の培養方法である。
（ａ）組織培養法：硫酸アンモニウム０．０１７ｇ・硝酸アンモニウム０．０６ｇ・塩化カリウム０．０６ｇ・塩化カルシウム０．８ｇ・硫酸マグネシウム０．０５ｇ・塩化マンガン０．００１ｇ・酸化ほう素０．００５ｇ・硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．０００１ｇ・硫酸銅０．００１ｇ・モリブデン酸ナトリウム０．００１ｇ・硝酸コバルト０．００１ｇ・グルコース２ｇ・蒸留水１０００ｍｌからなる滅菌したｐＨ５．０の組織培養液を用いて牧草根を無菌状態で発芽発根させ、該牧草根に無菌状態で胞子を接種し感染させた感染根を取得する方法
（ｂ）ポット培養法：絶対無菌牧草と無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、培養土中に含まれる胞子から円盤状の感染粒子を選別することで胞子を無菌的に取得する方法
（ｃ）コーンベース培地：冷凍コーンを１２０℃２５分浸出しろ過したもの又はコーンスティープリカー１％溶液を一度煮沸しろ過しｐＨ５．０に補正した培地
（ｄ）ポテトベース培地：ジャガイモをミキサーで処理し、しばらく放置し上澄みをろ過し、一度煮沸してろ過したものにグルコースを加えｐＨ５．０に補正した培地
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、無菌的に取得したＶＡ菌根菌の胞子を人工的に培養することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明はＶＡ菌根菌の培養方法であって、無菌的に胞子を取得し、これとコーンベース培地又はポテトベース培地で培養する工程を備える。以下、各工程を順次説明する。
【０００７】
（胞子の取得）
ＶＡ菌根菌の胞子を植物根から無菌的に取得する。胞子を無菌的に取得する方法としては、以下の２つの方法を例示することができる。
１．  特殊組織培養液を用いて牧草（ソルゴー等）を無菌発芽発根し、培養した牧草根に無菌胞子を接種し、感染した感染根から胞子を取得する。
２．  絶対無菌牧草（ソルゴー等）と無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、培養土中の胞子から取得する。
【０００８】
（培養）
続いて、取得した胞子をコーンベース培地又はポテトベース培地で培養して増殖させる。コーンベース培地は、例えば冷凍コーンを浸出ろ過する方法や、コーンスティープリカー溶液をろ過する方法などにより調製することができる。また、ポテトベース培地は、ジャガイモをミキサー処理して上澄みを濾過する方法で調製することができる。
【０００９】
コーンベース培地又はポテトベース培地は、いずれも平板培地又は培養液とすることができる。また、平板培地とする場合は、寒天平板培地とすることが好ましい。培地のｐＨとしては５．０が好ましく、また培養温度としては２０℃が好ましい。培養期間としては３〜４日間が好ましい。寒天培地平板上で培養した場合、ＶＡ菌根菌は通常１〜２種の集落を形成する。
【００１０】
本発明のおけるＶＡ菌根菌としては、Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ（ギガスポラ・マルガリータ）及びＧｌｏｍｕｓ  ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ（グロムス・エチュニカタム）を挙げることができる。また、植物根としては、牧草（ソルゴー等）を挙げることができる。
【実施例】
【００１１】
特殊組織培養液、コーンベース培地及びポテトベース培地の調整及び各種の滅菌方法は次のようにして行った。
【００１２】
＜特殊組織培養液＞
硫酸アンモニウム０．０１７ｇ・硝酸アンモニウム０．０６ｇ・塩化カリウム０．０６ｇ・塩化カルシウム０．８ｇ・硫酸マグネシウム０．０５ｇ・塩化マンガン０．００１ｇ・酸化ほう素０．００５ｇ・硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．０００１ｇ・硫酸銅０．００１ｇ・モリブデン酸ナトリウム０．００１ｇ・硝酸コバルト０．００１ｇ・グルコース２ｇ・蒸留水１０００ｍｌ  ｐＨ５．０
【００１３】
＜コーンベース培地＞
冷凍コーン１００ｇを１０００ｍｌの割合に加え１２０℃２５分浸出しろ過したもの又はコーンスティープリカー（Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｅ）１％溶液を一度煮沸しろ過しｐＨ５．０に補正した。
【００１４】
＜ポテトベース培地＞
ジャガイモ１００ｇをミキサーで処理し１０００ｍｌとし、しばらく放置し上澄みをろ過し、一度煮沸してろ過したものにグルコース１０ｇを加えｐＨ５．０に補正した。
【００１５】
胞子及び牧草（ソルゴー等）は適当な濃度の殺菌剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム溶液、過酸化水素などの適当な殺菌剤を用いて滅菌し、特殊組織培養液は無菌ろ過法、培地類は１２０℃１５分間、その他の培養土、器具及び器財はいずれも１２０℃３０分間滅菌を行った。
【００１６】
以下の２つの実施例はいずれも自然光線下で実施した。
【００１７】
（２）実施例２
絶対無菌牧草（ソルゴー等）とＶＡ菌根菌の無菌胞子を植え込み隔離ポット栽培し、経時的培養土中の胞子の発芽状態を調べたが、極めて複雑過程をとり約１ヶ月後には胞子、幼若胞子と円盤状の仮称感染粒子が確認され、この仮称感染粒子は適当な時期を見計らいながら上記の寒天培地平板上に培養すると同様に本菌の集落が形成された。尚、仮称感染粒子以外に同時分離される胞子及び幼若胞子は全く発育しなかった。
【００１８】
本菌は２つの方法（実施例１，２）で分離し、その際ポテトベース寒天培地平板上又はコーンベース寒天培地平板上に２〜３種の集落を形成することがある。これについて細菌学的、並びに生化学的諸性状を検討した結果、Ｓｍｏｏｔｈ（スムース）・Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔ（インターメデート）・Ｒｏａｇｈ（ラフ）及びＭｕｃｏｉｄ（ムコイド）のＭｕｔａｔｉｏｎａｌｐｈａｓｅ（変異相）が存在することを確認した。変異相によって形成される集落も異なりＳｍｏｏｔｈの場合ポテトベース寒天培地平板上には盛り上がった多型の集落を形成し、培地深部に菌糸が深入する。コーンベース寒天培地平板上での集落は菌糸の深部深入と同時に寒天培地平板上に長い菌糸が伸長する。突然変異率はやや高く、Ｒ（ラフ）・Ｍ（ムコイド）株は変異誘起物質を含む勾配寒天培地平板法等によってｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ（誘発変異）によってＳ（スムース）が出現する。
【００１９】
以上２法（実施例１，２）で分離したＶＡ菌根菌をＴＣ−１Ｎｏ１（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ）・ＴＣ−１  ２Ｎｏ２０（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ  ｍａｒｇａｒｉｔａ）及びＴＣ−７Ｎｏ２（Ｇｌｏｍｕｓ  ｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ）株と命名した。本菌株の保存は胞子の保存菌株の維持のような植物栽培による必要はなくＮＩＨ（ＵＳＡ）処方の凍結保存液に菌体を浮游させ凍結すれば長期にわたり保存は可能である。
【００２０】
ＴＣ−１Ｎｏ１及びＴＣ−７Ｎｏ２株は例えばポテトベース培養液又はコーンベース培養液に２０℃〜２５℃で４〜５日間培養すると、菌体はフロック状に沈降する。菌体の純粋実験を行って確認したのち、例えば滅菌パーライト、フヨーライトその他の保持剤に保持させ、適度の湿度を保ち、更に保持剤で混和希釈する。従って共生率も自由に変えることができる。