(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるトリテルペン誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗癌剤。
【化１】
0005320530.tif 000010
式中、Ｒはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または炭素数２−２４のアシル基を表す）、または＝Ｏを表す。
【化２】
0005320530.tif 000011
式中、Ｒはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または炭素数２−２４のアシル基を表す）、または＝Ｏを表す。
【化３】
0005320530.tif 000012
式中、Ｒはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または炭素数２−２４のアシル基を表す）、または＝Ｏを表す。
【請求項２】
前記トリテルペン誘導体、またはその薬学的に許容される塩が、癌細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とするものである、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記癌細胞が、白血病細胞、悪性黒色腫細胞または肺癌細胞から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のトリテルペン誘導体またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１種を有効成分として含有する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリテルペン誘導体の用途に関するものであり、詳しくは、抗癌能を有する抗癌用トリテルペン誘導体、及び該化合物を用いた医薬品、健康機能食品等の抗癌用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌治療には化学療法、外科的療法、免疫療法、放射線療法等の様々な方法があり、またこれらの組合わせが各種の癌に対して試みられており、一部の領域に限れば比較的良好な結果が得られているものの、癌治療全体を見渡せば、まだ充分満足な治療効果を奏する方法は確立されるに至っていない。
【０００３】
化学療法に用いられる薬剤も、現在までに数多く開発され、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗生物質など活発に増殖分裂する細胞の細胞分裂過程に作用して細胞傷害を与える薬剤や、また最近ではがん細胞に特徴的な分子を標的にした治療薬である分子標的薬剤などがあるが特効薬的なものはなく、依然、新たな化学療法剤が求められている。
【０００４】
トリテルペン化合物のなかではルペオール誘導体の抗癌効果に関連して転移抑制作用の報告がある（特許文献１、非特許文献１）。トリテルペン化合物の、癌細胞の増殖抑制や細胞死を機序とする抗癌作用についても検討されており、ルパン骨格の１７位の炭素における置換が抗癌活性において特に重要であることが知られている（非特許文献２）。この中でベツリン酸については以前から研究され（非特許文献３）、またベツリン酸誘導体の研究例も開示されている（特許文献２）。しかし、何れもまだ十分な効果を持つ抗癌剤として確立されたものではなく、よりヒト正常細胞への損傷が少なく、かつヒト腫瘍細胞に対し有効な物質が更に求められていた。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１５１９０２号公報
【特許文献２】特表２００６−５１７２０８号公報
【非特許文献１】”Differentiation-inducing activity of lupeol, a lupane-type triterpene from Chinese dandelion root (Hokouei-kon), on a mouse melanoma cell line”; Hata K, Ishikawa K, Hori K, KonishiT; Biol. Pharm. Bull. (2000), 23(8), pp.962-7
【非特許文献２】”Differentiation- and apoptosis-inducing activities by pentacyclic triterpenes on a mouse melanoma cell line”; Hata K, Hori K, Takahashi S; J. Nat. Prod. (2002), 65(5), pp.645-8
【非特許文献３】”Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis”; Pisha E, Chai H, Lee I S, Chagwedera T E, Fransworth N, Cordell G A, Beecher C W W, Fon H H S, Kinghorn A D, Brown D M, Wani M C, Wall M E, Hieken T J, DuptaT K D, Pezzuto J M; Nature Med. (1995), 1, pp.1046-51
【非特許文献４】”Oxyfunctionalization products of terpenoidswith dimethyldioxirane and their biological activity”, Ogawa S, Hosoi K, Ikeda N, Makino M, Fujimoto Y, Iida T; Chem. Pharm. Bull. (2007), 55(2), pp.247-250
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑み開発されたものであり、その目的は、白血病、肺癌などに代表される腫瘍細胞の増殖に対し優れた抑制作用を有する抗癌物質及びこれを含有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明者等は、特定のトリテルペン誘導体が癌細胞内においてアポトーシスを誘導し、これにより極めて高い抗癌効果が奏されることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、次に示す式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される抗癌用トリテルペン誘導体、またはその薬学的に許容される塩に係わる。
【化１】
0005320530.tif 000002
式中、Rはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または任意のアシル基を表す)、または＝Ｏを表す。
【化２】
0005320530.tif 000003
式中、Rはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または任意のアシル基を表す)、または＝Ｏを表す。
【化３】
0005320530.tif 000004
式中、Rはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’(Ｒ’は水素原子または任意のアシル基を表す)、または＝Ｏを表す。
【０００９】
本発明において、前記抗癌用トリテルペン誘導体は、癌細胞の増殖を抑制及び／又は細胞死を誘導する機能を有することを特徴とするものであり、該癌細胞の細胞死誘導機能は、アポトーシスであり得る。また該癌細胞の増殖抑制は分化誘導によりもたらされても良く、その場合、細胞運動の抑制による転移・浸潤の抑制を伴ったものであり得る。
【００１０】
本発明の一態様において、前記癌細胞は、白血病細胞および肺癌細胞から選択される少なくとも１つである。
【００１１】
本発明はまた、前記抗癌用トリテルペン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗癌剤に係わる。
【００１２】
また、本発明は、前記抗癌用トリテルペン誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する健康機能食品に係わる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、白血病および肺癌などに代表される癌の治療に特に有効な抗癌用医薬品並びに健康食品の提供が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に係る抗癌用トリテルペン誘導体は、前記の式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）により表される。
【００１５】
前記の式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）において、式中、Rはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’（Ｒ’は水素原子又は任意のアシル基を表す）、または＝Ｏを表すが、Ｒ’がアシル基である場合、炭素数２〜２４のアシル基が好ましく、さらに好ましくは炭素数２〜１８のアシル基であり、例えばアセチル基、プロパノイル基、パルミトイル基、ミリストイル基等が挙げられるが、アシル基を構成する炭化水素は二重結合等の不飽和結合を含んでも、また直鎖状でも分岐鎖状であっても、あるいは芳香環を含んでいても構わない。
【００１６】
本発明のトリテルペン誘導体は例えば、ルペオールアセテート、ルペオール、またはルペノン等から、非特許文献４に開示された酸化反応および、アシル化、亜塩素酸ナトリウムによる酸化、カラム等による精製等の常法を組み合わせて用いることにより得ることができる。
【００１７】
上述したように、本発明に係る抗癌用トリテルペン誘導体およびその薬学的に許容される塩（以下において、「本発明のトリテルペン誘導体」という。）による抗癌作用は、癌細胞におけるアポトーシスが促進されることを含む機序により癌細胞の増殖が抑制されることに基づき発現するものであり、本発明による癌細胞の増殖抑制作用は、白血病、肺癌等の癌細胞に対して特に有効に作用する。また同時に本発明の抗癌作用の機序は、本発明のトリテルペン誘導体による分化誘導の結果もたらされる、細胞増殖の抑制、及び、細胞運動抑制による転移・浸潤の抑制、をも含む。
【００１８】
本発明のトリテルペン誘導体はそのまま、あるいは慣用の担体等と共に、抗癌を目的とする医療処置のための医薬として（以下、「抗癌剤」という。）、あるいは食品分野において、健康機能食品等として用いられる。
【００１９】
まず、医薬用途に係る本発明の抗癌剤について説明する。本発明の抗癌剤は、例えば、経口投与、非経口投与することができ、非経口投与としては、注射、経皮投与、直腸投与、眼内投与等により投与され得、これらの投与経路に応じて、適切な薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤等と組み合わされ製剤化することができる。経口投与に適した剤型としては、特に限定されるものではないが、固体、半固体、液体等の状態のものが含まれ、具体的には、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等を挙げることができる。本発明の抗癌剤の投与量は、投与形態、投与経路、対象とする疫病の程度や段階等に応じて適宜設定、調節することができるが、通常は、活性成分として、一日当たり質量で約０．０００１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．００１〜５００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１００ｍｇであり、一回投与量として０．０１ｍｇ、０．２ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００ｍｇ等が設定されるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の抗癌剤を錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、懸濁剤等に製剤化する手段としては、公知の製剤化方法を用いることができ、本発明のトリテルペン誘導体を賦形剤、潤滑剤等と混合し、更に必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、浸潤剤、保存剤等と混合することにより行うことができる。これらの添加成分の具体例としては、でん粉、乳糖のような糖類、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ゼラチン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。
【００２１】
注射による投与としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内等に投与することができ、かかる投与方法において用いられる注射用製剤の製剤化方法としては、通常用いられる方法を用いることができる。具体的には、本発明のトリテルペン誘導体を、植物性油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、プロピレングリコールのような水性又は非水性の溶媒中に溶解又は懸濁し、あるいは乳化させ、更に必要により、可溶化剤、浸透圧調節剤、乳化剤、安定剤及び保存料のような従来用いられている添加剤と共に製剤化することができる。
【００２２】
経皮投与としては、対象となる皮膚の状態等に応じて軟膏剤、乳化剤、パスタ剤、ハップ剤、リニメント剤、ローション剤、懸濁剤等として投与することができ、かかる投与方法において用いられる経皮投与用製剤の製剤化方法としては、通常用いられる方法を用いることができる。例えば、軟膏剤は、本発明のトリテルペン誘導体を公知の方法によりワセリン、パラフィン等の疎水性基材、又は親水ワセリン、ポリエチレングリコール等の親水性基材と練り合わせることにより製剤化することができる。
【００２３】
直腸投与としては、例えば坐薬として投与することができ、坐薬の製剤化方法としては、通常用いられる方法が用いられ得る。具体的には、本発明のトリテルペン誘導体を、体温で融解するが室温では固化しているカカオバター、カーボンワックス、ポリエチレングリコール等の賦形剤と混合し、成形することにより、製剤化することができる。
【００２４】
次に、健康機能食品として用いられる本発明の抗癌用組成物について説明する。
本発明のトリテルペン誘導体は、いわゆる健康機能食品への用途としても有用であり、例えば、菓子、清涼飲料等の飲料、野菜又は果実加工品、畜肉製品、調味料等として広く適用可能である。その形態としては、特に限定されるものではなく、例えば粉末、固形、溶液等であり得る。上述したような食品類に本発明のトリテルペン誘導体を配合する場合には、本発明のトリテルペン誘導体をルペオール等の原料から化学合成された化学物質として配合する場合のほか、本発明のトリテルペン誘導体を含有する植物等やその加工品として、あるいは適当な溶媒によるそれらの抽出物、また更にその抽出物を適当な方法により分画したものとして配合することができる。かかる健康機能食品中への本発明のトリテルペン誘導体の配合量としては、目的や製品形態等に応じて適宜設定することができる。一般的には、ドリンク剤等の溶液又は懸濁液等の場合、例えば、３０ｍｌ中、活性成分として０．００１〜１００ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．１〜５ｍｇである。また、タブレット等粉末固形製品の場合は、例えば、３００ｍｇ中、活性成分として０．００１〜５０ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．１〜２ｍｇである。
【００２５】
本発明のトリテルペン誘導体を健康機能食品として利用する場合、甘味料、酸味料、保存料、香料、着色料、賦形剤、安定剤、湿潤剤、吸収促進剤、ｐH調整剤等の種々の添加成分を配合することができる。これら添加成分の具体例としては、キノコ抽出液、人参抽出液のような各種食品抽出エキス溶液、キノコ抽出物、人参抽出物のような各種食品抽出エキス、ハチミツ、環状オリゴ糖、還元麦芽糖、トレハロース、乳糖、ショ糖脂肪酸エステル等を挙げることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
[分化とアポトーシス誘導活性]
1 ml の B16 2F2 細胞(細胞数1 x 105個) を種々の濃度のトリテルペン存在下で3日間培養し、メラニン含有量と生細胞数を文献（Hata K, Hori K, Takahashi S (2002) Differentiation- and apoptosis-inducing activities of pentacyclictriterpenes on a mouse melanoma cell line. J Nat Prod 65: 645-649）の記述に従い測定した。メラニン生合成に関するED50値を、メラニン生成量増加の用量依存性に関する実験結果から求めた。また細胞増殖を50%抑制する濃度を表すIC50値を測定した。細胞のアポトーシスはヘキスト33258色素を用いて蛍光顕微鏡下で検出した。
【００２８】
【化４】
0005320530.tif 000005
【化５】
0005320530.tif 000006
【化６】
0005320530.tif 000007
【００２９】
[結果]
6つのトリテルペン化合物1-6(但し化合物1, 2および3はそれぞれ式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される化合物においてＲ’（Ｒはα−Ｈ，β−Ｏ−Ｒ’）がアセチル基である化合物であり、また化合物4, 5および6はそれぞれ式（ＩＶ）、式（Ｖ）および式（ＶＩ）で表される化合物)について、上述の方法を用い、B16 2F2細胞の分化の指標の一つであるメラニン生成と、細胞増殖に対する効果を評価した。結果は表1に要約した。
【００３０】
【表１】
0005320530.tif 000008
【００３１】
化合物1-6のメラニン合成量増加調節に関するED50値は3.4から7.2μMの範囲であった。この結果はこれらの化合物における構造の違いはメラニン生成活性にほとんど影響しないことを示している。即ち、化合物1-3は化合物4-6と同程度によくB16 2F2細胞の分化を誘導した。また化合物1-3は、化合物4-6に比べ、より低濃度でB16 2F2細胞の増殖を阻害した。
【００３２】
これらの化合物の細胞毒性がアポトーシス誘導によるものかどうか調べた。B16 2F2細胞を化合物5, 2, または3(何れも終濃度10μM)で処理した後(但しコントロールとして非処理のサンプルを用意)、細胞核をヘキスト33258色素で染色した。その結果、化合物2と3で処理したB16 2F2細胞では核の凝集と断片化が観察されたが、非処理と化合物5処理の細胞ではそれらは観察されなかった(図1)。
【００３３】
（実施例２）
[選択的細胞毒性]
いくつかのタイプのヒト由来癌細胞に対する、化合物5及び1-3の選択的細胞毒性特性を調べ、その結果を下記表2にまとめた。
【００３４】
【表２】
0005320530.tif 000009
【００３５】
化合物5は9種のヒト由来癌細胞（白血病[２種]、肺腺癌、メラノーマ、子宮頸癌、肝癌、結腸腺癌、乳腺腺癌、骨肉腫と正常線維芽細胞のそれぞれに由来する細胞）の増殖にほとんど影響しなかった。化合物1-3は2種の白血病由来細胞と1種の肺腺癌由来細胞に対し顕著な増殖阻害効果を示したが、他の癌細胞及び正常線維芽細胞由来のWI38細胞には効果が微弱又は無効であった。
【００３６】
（実施例３）
［化合物2のヒト白血病細胞株（HL60）及びヒト肺癌細胞株（Lu99）に対するアポトーシス誘導］
C-29位にカルボニル基を有する化合物によるこれら腫瘍細胞の選択毒性がアポトーシスによるものか否かを検討した（図2）。無処理、あるいは 10 mMの化合物 5で処理した白血病細胞株（HL60）はアポトーシスを誘導されなかった（aおよび b）。化合物 5の C-29位にアルデヒド基が付加した化合物2は同(濃度で HL60細胞に対して、アポトーシスの特長である核の分断、凝集を誘導した（c）。さらに、化合物2は 10 mMの濃度でヒト肺癌細胞株（Lu99）に対してアポトーシスを誘導した（f）。
【００３７】
（実施例４）
本発明に係る注射剤用抗癌剤は、例えば、以下の手段により調製することができる。
【００３８】
成分 配合量
本発明のトリテルペン誘導体 １０ ｍｇ
ポリオキシエチレン水素化ひまし油６０ ４００ ｍｇ
エタノール １ｍLとするのに必要な量
常法により本発明のトリテルペン誘導体及びポリオキシエチレン水素化ひまし油６０をエタノールに溶解させ、上記成分組成からなる溶液を調整する。得られる溶液は、適量の生理食塩水で希釈して、静脈内注入により投与することができる。
【００３９】
（実施例５）
本発明に係る健康機能食品（タブレット）は、例えば、以下の成分組成において製造することができる。
【００４０】
本発明のトリテルペン誘導体 ０．５ｍｇ
還元麦芽糖 ８７．８ ｍｇ
トレハロース ４１．２ ｍｇ
乳糖 １６．５ ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル ６．２ ｍｇ
デキストリン １４７．８ ｍｇ
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ルペオール誘導体のB16 2F2細胞に対するアポトーシス誘導を示す蛍光顕微鏡写真。B16 2F2細胞を未処理(a)または10μMの化合物5(b), 2(c), 3(d)で48時間処理したのち、アポトーシスを起こした細胞をヘキスト33258色素による染色で検出した。
【図２】ルペオール誘導体のHL60細胞(a-c)及びLu99細胞(d-f)に対するアポトーシス誘導を示す蛍光顕微鏡写真。細胞を未処理(a, d)、10μMの化合物5(b, c)及び化合物2(c, f)で48時間処理したのち、アポトーシスを起こした細胞をヘキスト33258色素による染色で検出した。
【図１】
0005320530.tif 000013
【図２】
0005320530.tif 000014