(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
0005315691.tif 000012
［式（１）中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１は−ＮＲ３−Ｒ４−Ｒ５又は−Ｏ−Ｒ４−Ｒ５を表す。Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４は脂肪族環を含む炭素数６〜１５のアルキレン基、又は炭素数４〜８の直鎖アルキレン基を表す。Ｒ５は、ハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基又はエポキシ基を表す。ここで、Ｒ５がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、Ｒ４中に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にペンダント型に付加していてもよい。また、Ｒ５がグリシジル基の場合は、グリシジルエーテルの形でＲ４に結合する。］で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％含有する架橋重合体粒子からなり、その表面が、下記の（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化されていることを特徴とする充填剤。
（１）水
（２）活性水素基を２個以上含有するグリコール類
（３）多官能エポキシ化合物の加水分解物を含むポリオール類
【請求項２】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、多官能性モノマーから誘導される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％と、を含有する架橋重合体粒子からなる請求項１に記載の充填剤。
【請求項３】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーと多官能性モノマーとを重合して得られる架橋重合体粒子からなる請求項１又は２に記載の充填剤。
【請求項４】
下記式（２）
【化２】
0005315691.tif 000013
［式（２）中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１は−ＮＲ３−Ｒ４−Ｒ５又は−Ｏ−Ｒ４−Ｒ５を表す。Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４は脂肪族環を含む炭素数６〜１５のアルキレン基、又は炭素数４〜８の直鎖アルキレン基を表す。Ｒ５は、ハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基又はエポキシ基を表す。ここで、Ｒ５がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、Ｒ４中に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にペンダント型に付加していてもよい。また、Ｒ５がグリシジル基の場合は、グリシジルエーテルの形でＲ４に結合する。］で示される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、
下記式（３）
【化３】
0005315691.tif 000014
［式（３）中、Ｒ６、Ｒ７は各々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ８はアリール基、オキシカルボニル基又はカルバモイル基を有する２官能性の有機基を表す。］で示される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％と、を含有する架橋重合体粒子からなり、その表面が、下記の（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化されていることを特徴とする充填剤。
（１）水
（２）活性水素基を２個以上含有するグリコール類
（３）多官能エポキシ化合物の加水分解物を含むポリオール類
【請求項５】
架橋重合体粒子が、平均粒子径が５〜３００μｍの多孔性粒子である請求項１乃至４のいずれかに記載の充填剤。
【請求項６】
標準物質としてプルラン、溶離液として純水を使用した場合の排除限界分子量が、５０万〜２００万である請求項１乃至５に記載の充填剤。
【請求項７】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と架橋剤とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合して架橋重合体粒子を得、得られた架橋重合体粒子の表面を、上記（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化する請求項１乃至３のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
【請求項８】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と多官能性モノマー８０〜５ｍｏｌ％とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合する請求項７に記載の充填剤の製造方法。
【請求項９】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーが、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート、１，３−ヒドロキシアダマンタン−１−メタクリレート、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレート、１，４−ヒドロキシブチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、４−ブロモブチルメタクリレート、及び６−アミノヘキシルメタクリルアミドからなる群より選ばれる１種又は２種以上である請求項７又は８に記載の充填剤の製造方法。
【請求項１０】
多官能性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレート、１，３−アダマンタンジメタクリレート、ジビニルベンゼン、及びトリメチロールプロパントリアクリレートからなる群より選ばれる１種又は２種以上である請求項９に記載の充填剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１乃至６のいずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子の表面にイオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
上記架橋重合体粒子に含まれるエポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された請求項１１に記載のイオン交換液体クロマトグラフィーイオン交換充填剤。
【請求項１３】
上記架橋重合体粒子をエポキシ化した後、該エポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された請求項１１に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１４】
イオン交換基が、スルフォン酸基、カルボキシル基、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、及び４級アンモニウム基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１１乃至１３のいずれかに記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４のいずれかに記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤として用いるタンパク質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水溶液に溶解した物質（特にタンパク質）との吸着・脱着作用を示し、目的物質の捕集や液体クロマトグラフィー法により分離、精製する為に好適な有機化合物からなる充填剤、特に、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤に関する。より具体的には、高濃度のアルカリ水溶液に対して化学的安定性が高く、親水性に優れ、タンパク質の分離、精製に用いることができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の吸着、分離、精製に使用されるクロマトグラフィー用充填剤としては、シリカ化合物等に代表される無機系充填剤と、有機ポリマーよりなる有機系充填剤がある。有機系充填剤はスチレン、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリルアミド系に代表される合成化合物を用いる合成系充填剤とアガロース、デキストラン、マンナン等に代表される天然の多糖類を用いる天然系充填剤に大別される。【０００３】
合成系充填剤は、例えば、特許文献１乃至３に開示されているように、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートのような単官能性モノマーと多官能性モノマーの混合液を用いて、懸濁重合法等により製造され、その後、水溶性の多価アルコール等で親水化を行って基材を製造するのが一般的である。近年の合成系充填剤における親水化技術の進歩により、親水性の点では天然系と遜色無い合成系充填剤を製造する方法が見出されている。また一般には、単官能性モノマーと多官能性モノマーを用いて、懸濁重合で粒子を製造する方法のため、多官能性モノマーの添加量の調整で硬い充填剤から柔らかい充填剤まで自由に設計できる利点を有している。ただ、硬く、かつ、脆さの無い充填剤を製造したいとの観点から、合成系充填剤の場合、容易に高分子量の重合物が得られる（メタ）アクリルエステル系又は（メタ）アクリルアミド系モノマーを用いて充填剤を製造するのが一般的に行われている。しかも、粒子化後、タンパク質と相互作用するリガンドを取り付け易いとの点で、反応の基点となるグリシジル基を有した、所謂、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）モノマーを用いた充填剤が多く提案されている。【０００４】
前述のように、これら充填剤の主要用途は、液体クロマトグラフィー法によるタンパク質の分離精製である。精製されたタンパク質の主要用途として医薬品（注射用タンパク質製剤）があり、この分野では汚染物質のコンタミによる副作用のリスクを徹底的に排除することが要求されている。【０００５】
混入する可能性汚染物質としては、
（１）目的タンパク質生産工程由来の、例えば、培養液や血清等に含有する異種タンパク質、核酸、エンドトキシン、ウィルス、
（２）生産や保存に必要な添加物等の成分と精製工程で使用する器具、充填剤、分離膜、溶液等からの汚染成分、
（３）前回の精製で充填剤に吸着して溶出しなかった成分、
等が考えられる。【０００６】
充填剤はカラムに充填され、精製工程で用いられるが、初回の使用前、及び再使用前に検証された洗浄方法で必ず洗浄される。最も一般的な精製工程の装置内部の洗浄方法は、１Ｎ水酸化ナトリウムによる洗浄である。これは、タンパク質、エンドトキシン等を分解洗浄できるためである。この洗浄方法は米国食品医薬品局からの指針（ガイドライン）として推奨されており、初回及び再使用時にも有効な方法である。すなわち、使用バッチ毎にカラム装置内部を洗浄することが医薬用タンパク質精製を行うＧＭＰ施設では一般に行われている。またバッチ間隔が有る場合には、０．０１Ｎから０．１Ｎに希釈された水酸化ナトリウム水溶液を封入して装置を止めておく場合もある。更にプリオン等の異常タンパク質の除去を行うためには、より高濃度（例えば、２Ｎの濃度）の水酸化ナトリウム水溶液で洗浄することも必要である。【０００７】
ところが、ＧＭＡモノマーは高い親水性を示すエステル部位を有しているため、アルカリ性薬品との長時間の接触により、エステルの加水分解が進行し、アルコール化合物が放出されカルボン酸が生成する。放出されたアルコール化合物を洗浄により完全に除去できれば問題ないが、除去できなければ、それが汚染物質になる可能性がある。またカルボン酸の生成により、本来の充填剤性能が変化し、分離精製の再現性が失われるため純度不良が発生する。すなわち、アルカリ耐性が弱い充填剤では、単に性能劣化によって使用可能な期間が短いだけでなく、未知溶出物の発生リスクと精製操作時の溶出による汚染のリスク及び性能劣化による純度不良の発生等の課題を抱えている。【０００８】
以上のように合成系充填剤は、硬い（機械強度が高い）ため、高速・高分離に適しているとの利点を有し、親水性が高いという利点を有する一方で、更にアルカリ耐性を有した合成系充填剤の開発が期待されているのが現状である。【０００９】
【特許文献１】特公昭５８−０５８０２６号公報
【特許文献２】特開昭５３−０９０９９１号公報
【特許文献３】特開平０５−００９２３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、高速・高分離に適し、親水性に富み、なおかつ高濃度のアルカリ水溶液に耐性のある充填剤を提供することである。より詳しくは、高速・高分離に適用可能な機械強度を有し、かつタンパク質に対して非特異的吸着を引き起こさないために十分な親水性を有し、更に、高濃度のアルカリ水溶液に浸漬してもタンパク質の吸着量、保持力等の変化の小さい新規充填剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、重合性を示す（メタ）アクリロイル化合物の内、特定の構造を有した化合物をモノマーとして用いた充填剤はアルカリ耐性を有していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【００１２】
すなわち、本発明は、以下に示すとおりの、親水性に優れた新規充填剤、その製造方法、及びそれを用いたタンパク質の分離方法である。
［１］下記式（１）【００１３】
【化１】
0005315691.tif 000002
［式（１）中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１は−ＮＲ３−Ｒ４−Ｒ５又は−Ｏ−Ｒ４−Ｒ５を表す。Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４は脂肪族環を含む炭素数６〜１５のアルキレン基、又は炭素数４〜８の直鎖アルキレン基を表す。Ｒ５は、ハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基又はエポキシ基を表す。ここで、Ｒ５がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、Ｒ４中に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にペンダント型に付加していてもよい。また、Ｒ５がグリシジル基の場合は、グリシジルエーテルの形でＲ４に結合する。］で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％含有する架橋重合体粒子からなり、その表面が、下記の（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化されていることを特徴とする充填剤。
（１）水
（２）活性水素基を２個以上含有するグリコール類
（３）多官能エポキシ化合物の加水分解物を含むポリオール類
【００１４】
［２］上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、多官能性モノマーから誘導される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％と、を含有する架橋重合体粒子からなる上記［１］に記載の充填剤。【００１５】
［３］充填剤が、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーと多官能性モノマーとを重合して得られる架橋重合体粒子からなる上記［１］又は［２]に記載の充填剤。【００１６】
［４］下記式（２）【００１７】
【化２】
0005315691.tif 000003
［式（２）中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１は−ＮＲ３−Ｒ４−Ｒ５又は−Ｏ−Ｒ４−Ｒ５を表す。Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４は脂肪族環を含む炭素数６〜１５のアルキレン基、又は炭素数４〜８の直鎖アルキレン基を表す。Ｒ５は、ハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基又はエポキシ基を表す。ここで、Ｒ５がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、Ｒ４中に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にペンダント型に付加していてもよい。また、Ｒ５がグリシジル基の場合は、グリシジルエーテルの形でＲ４に結合する。］で示される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、
下記式（３）【００１８】
【化３】
0005315691.tif 000004
［式（３）中、Ｒ６、Ｒ７は各々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ８はアリール基、オキシカルボニル基又はカルバモイル基を有する２官能性の有機基を表す。］で示される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％と、を含有する架橋重合体粒子からなり、その表面が、下記の（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化されていることを特徴とする充填剤。
（１）水
（２）活性水素基を２個以上含有するグリコール類
（３）多官能エポキシ化合物の加水分解物を含むポリオール類
【００１９】
［５］架橋重合体粒子が、平均粒子径が５〜３００μｍの多孔性粒子である［１］乃至［４］のいずれかに記載の充填剤。
［６］標準物質としてプルラン、溶離液として純水を使用した場合の排除限界分子量が、５０万〜２００万である［１］乃至［５］に記載の充填剤。
【００２０】
［７］上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と架橋剤とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合して架橋重合体粒子を得、得られた架橋重合体粒子の表面を、上記（１）〜（３）の１種以上の親水化剤によって親水化する上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
【００２１】
［８］上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と多官能性モノマー８０〜５ｍｏｌ％とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合する［７］に記載の充填剤の製造方法。
【００２２】
［９］上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーが、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート、１，３−ヒドロキシアダマンタン−１−メタクリレート、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレート、１，４−ヒドロキシブチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、４−ブロモブチルメタクリレート、及び６−アミノヘキシルメタクリルアミドからなる群より選ばれる１種又は２種以上である上記［７］又は［８］に記載の充填剤の製造方法。
【００２３】
［１０］多官能性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレート、１，３−アダマンタンジメタクリレート、ジビニルベンゼン、及びトリメチロールプロパントリアクリレートからなる群より選ばれる１種又は２種以上である上記［９］に記載の充填剤の製造方法。
【００２７】
［１１］上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子の表面にイオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【００２８】
［１２］上記架橋重合体粒子に含まれるエポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された上記［１１］に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【００２９】
［１３］上記架橋重合体粒子をエポキシ化した後、該エポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された上記［１１］に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【００３０】
［１４］イオン交換基が、スルフォン酸基、カルボキシル基、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、及び４級アンモニウム基からなる群より選ばれる少なくとも１種である上記［１１］乃至［１３］のいずれかに記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【００３１】
［１５］上記［１１］乃至［１３］に記載の充填剤をイオン交換クロマトグラフィー用充填剤として用いるタンパク質の分離方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の充填剤は、硬く、機械強度が高いために高速での使用が可能であり、高濃度のアルカリ水溶液に対する化学的安定性が高い。
また、本発明の充填剤の反応の基点に置換基を導入することで、親水性に優れた充填剤や、イオン交換基を有する充填剤を容易に調製することができ、タンパク質の分離・精製に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
まず、本発明の、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％含有する架橋重合体粒子からなることを特徴とする充填剤［以下、充填剤（１）と称する。］について説明する。【００３４】
本発明において、充填剤（１）としては、特に限定するものでないが、例えば、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、多官能性モノマーから誘導される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％を含有する架橋重合体粒子からなる充填剤が好適なものとして挙げられる。より具体的には、上記式（２）で示される繰り返し単位を２０〜９５ｍｏｌ％と、上記式（３）で示される繰り返し単位を８０〜５ｍｏｌ％を含有する架橋重合体粒子からなる充填剤が好適なものとして挙げられる。【００３５】
本発明において、充填剤（１）の製造方法としては、特に限定するものではない。たとえば、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と架橋剤とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合することにより、製造することができる。より具体的には、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー２０〜９５ｍｏｌ％と架橋剤として使用される多官能性モノマー８０〜５ｍｏｌ％とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合することにより製造することができる。【００３６】
上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーを用いた充填剤（１）の一般的な製法を以下に説明するが、製法はこれに限定されるものではない。まず予め、連続相として、例えば、蒸留水に所定の界面活性剤、更に必要に応じて無機の塩を添加し、良く攪拌して溶解させ、水溶液とする。その後、該水溶液を所定の温度まで昇温する。次に、本発明の（メタ）アクリロイル系モノマー、架橋剤として使用する多官能性モノマー、重合開始剤、更に必要があれば他のモノマー及び細孔調節の目的で添加する有機溶媒等をそれぞれ所定量取り、調整混合液を作る。そして、攪拌されている界面活性剤入り水溶液中に該調整混合液を滴下して液滴化を行うと同時に、所定の温度で重合を行い、重合体粒子を製造する。この時の重合温度について、重合開始剤が分解され、ラジカルが発生する温度であれば特に制限はない。一般に、２０℃〜８０℃、より好ましくは４０℃〜７０℃の範囲内で重合を行うとよい。【００３７】
本発明の充填剤（１）に用いられる（メタ）アクリロイル系モノマーは、上記式（１）に該当し、架橋重合体粒子化後に置換基を導入するための反応の基点を有した（メタ）アクリロイル系モノマーであれば、特に限定されるものではない。例えば、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、６−クロロヘキシル（メタ）アクリレート、４−ブロモブチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシペンチル（メタ）アクリレート、６−アミノヘキシル（メタ）アクリルアミド、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート及びそれらのジヒドロキシ基の一部又は全てがグリシジル基で置換された化合物；３，４−エポキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート及びそのジヒドロキシ基の一部又は全てがグリシジル基で置換された化合物；３，４−エポキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート及びそのジヒドロキシ基の一部又は全てがグリシジル基で置換された化合物；２，５−ビス（アミノメチル）ビシクロ〔２，２，１〕ヘプタンの片一方のアミノ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物；２，５−ビス（ヒドロキシメチル）ビシクロ〔２，２，１〕ヘプタンの片一方のヒドロキシ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物；２，６−ビス（アミノメチル）ビシクロ〔２，２，１〕ヘプタンの片一方のアミノ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物；２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ビシクロ〔２，２，１〕ヘプタンの片一方のヒドロキシ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物；１，３−ジヒドロキシアダマンタンの片一方のヒドロキ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物；１，３−ジアミノアダマンタンの片一方のアミノ基と（メタ）アクリルハライドとの反応物等が挙げられる。また、上記（メタ）アクリロイル系モノマーを単独で使用しても、混合して使用してもよい。【００３８】
本発明の充填剤（１）において、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーの割合は、全モノマー中において、通常２０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下の範囲、好ましくは３０ｍｏｌ％以上９３ｍｏｌ％以下の範囲である。この割合が好ましい理由としては、（メタ）アクリロイル系モノマーが２０ｍｏｌ％未満だと、次のような問題点があることによる。（ａ）アルカリに対する安定性が低くなる、（ｂ）生成粒子中の置換基を導入するための反応の基点が少なくなり、親水化剤で親水性を付与してもタンパク質等の分離に必要な親水性が得られない、（ｃ）９５ｍｏｌ％より割合が大きいと架橋剤として共重合する多官能性モノマーの割合が小さ過ぎ、充填剤が柔らかくなる、などである。【００３９】
本発明の充填剤（１）に用いられる多官能性モノマーとしては、特に限定するものではない。例えば、ジビニルベンゼン；炭素数が１〜４のアルキレングリコールの繰返しユニットが１〜５であるアルキレングリコール−ジ（メタ）アクリレート類；アルキレン（炭素数１〜１１）ビス（メタ）アクリレート類；アルキレン（炭素数１〜１１）ビス（メタ）アクリルアミド類等が挙げられる。上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーと共重合できるなら多官能性モノマーはこれらに限定されるものではない。更に、本発明の（メタ）アクリロイル系モノマーを合成するとき、副生してくる２官能性化合物を架橋剤として共重合する多官能性モノマーとして用いてもよい。多官能性モノマーとして具体的な化合物を例示すると、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、１，３−アダマンタンジメタクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。【００４０】
本発明の充填剤（１）において、多官能性モノマーの割合は特に限定されるものではないが、全モノマー中において、通常５ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下の範囲、好ましくは７ｍｏｌ％以上７０ｍｏｌ％以下の範囲である。この割合が好ましい理由としては、多官能性モノマーが５ｍｏｌ％未満だと充填剤に十分な硬さが得られず、高い圧力では充填剤が潰れてしまう可能性がある。また架橋剤が８０ｍｏｌ％以上になると、生成粒子中の置換基を導入するための反応の基点が少なくなり、親水化剤で親水性を付与してもタンパク質等の分離に必要な親水性が得られない。更にアルカリに対する安定性が低くなることに加え、充填剤が脆くなる場合があり、カラムへの充填作業や攪拌中等に微粒子が発生するなどの問題が起こる。【００４１】
本発明の充填剤（１）においては、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマー、上記した多官能性モノマーに加え、本発明の趣旨を逸脱しなない範囲で、それら以外の他のモノマーを使用することもできる。このような他のポリマーとしては、例えば、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、炭素数１〜３からなる直鎖状又は分岐状アルキル（メタ）アクリレート類等の（メタ）アクリレート化合物；ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、炭素数１〜３からなる直鎖状又は分岐状アルキル（メタ）アクリルアミド類等の重合性（メタ）アクリルアミド化合物；アリールアミン、アリールクロライド、アリールグリシジルエーテル等の重合性アリール化合物；ハロアルキル（炭素数１〜４）ビニルエーテル、ヒドロキシアルキル（炭素数１〜４）ビニルエーテル、ビニルアセテート等の重合性ビニル化合物等が挙げられる。併用される他のモノマーは本発明の機能を満足するなら、特に限定されるものではない。また、併用される他のモノマーは単独使用でも、混合使用でも可能である。【００４２】
本発明の充填剤（１）の製造時に用いられる重合開始剤としては、例えば、通常の懸濁重合で使用される有機過酸化物やアゾ系化合物等が挙げられる。上記有機過酸化物として、ブチルパーオキサイド系では、ｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルパーオキシ２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、２，５ジメチル−２，５ジ（ベンゾイルパーオキシ）ヘキサン、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシベンゾエート等が挙げられる。アミルパーオキサイド系では、ｔ−アミルパーオキシ２−エチルヘキサノエート、ｔ−アミルパーオキシｎ−オクトエート、ｔ−アミルパーオキシアセテート、ｔ−アミルパーオキシベンゾエート等が挙げられる。パーオキシカーボネート系では、ｔ−ブチルパーオキシイソプロピルカーボネート、ｔ−ブチルパーオキシ２−エチルヘキシルカーボネート、ｔ−アミルパーオキシ２−エチルヘキシルカーボネート、ジ（２−エチルヘキシル）パーオキシジカーボネート、ジ（ｓｅｃ−ブチル）パーオキシジカーボネート等が挙げられる。ジアルキルパーオキサイド系では、ジクミルパーオキサイド、２，５ジメチル２，５ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）へキサン、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ジ−ｔ−アミルパーオキサイド等が挙げられる。また、パーオキシケタール系では、１，１−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）シクロヘキサン、２，２−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）ブタン、エチル−３，３−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）ブチレート、１，１−ジ（ｔ−アミルパーオキシ）シクロへキサン等が例示できる。【００４３】
一方、アゾ系化合物として、アゾニトリル系では、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等が挙げられる。アゾアミド系では、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド］等が挙げられる。さらに、他のアゾ系化合物では、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミドオキシム）、ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）、４，４’−アゾビス（４−シアノバレリック酸）、２，２’−アゾビス（２，４，４−トリメチルペンタン）等が例示できる。ただ、（メタ）アクリロイル系モノマーを重合させられる重合開始剤であれば使用可能であり、特に上記の化合物に限定されるものではない。このような重合開始剤の添加量は、少な過ぎると重合率が低下し、モノマーが多く残存する事がある。多過ぎると、重合開始剤が重合体粒子中に残存し、タンパク質等の吸着分離に悪影響を与えることがある。したがって、通常は全モノマーに対して、０．０５重量％〜２０重量％の範囲で使用され、より好ましくは０．２重量％〜１０重量％の範囲で使用される。【００４４】
本発明において、懸濁重合に用いられる懸濁安定剤としては、連続相に溶解する界面活性剤であればよく、特に限定するものではない。例えば、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤等が挙げられ、何れも使用可能である。また、懸濁安定剤の分子量についても、特に限定されず、低分子化合物でも高分子化合物でも使用することができる。具体例としては、アニオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、高級アルコールの硫酸エステル塩、脂肪アルコールのリン酸エステル塩、アルキルアリルスルフォン酸塩、ホルマリン縮合ナフタレンスルフォン酸塩等が挙げられる。カチオン界面活性剤としては、アルキル１級アミン塩、アルキル２級アミン塩、同３級アミン塩、同４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ソルビタンアルキルエステル類、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類等が挙げられる。一方、高分子界面活性剤としては、部分ケン化ポリビニルアルコール、澱粉、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、部分ケン化ポリメタクリル酸塩等が例示される。本発明においては、これらの界面活性剤に加え、必要に応じて、無機の塩、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、硫酸アルミニウム、炭酸カルシウム、タルク等を更に添加してもよい。上記懸濁安定剤の添加量は、特に限定するものではないが、連続相に対して通常０．０１重量％〜３０重量％の範囲、好ましくは０．１重量％〜１５重量％の範囲である。【００４５】
ところで、クロマトグラフィー用の充填剤には、吸着負荷量が比較的多い多孔性充填剤と、細孔内での溶質分子の拡散による分離帯の広がりを抑制して高分離能を発現する目的で使用される非多孔性充填剤が知られている。
本発明の充填剤は、特に限定されることなく、製造方法により多孔性、非多孔性のどちらの充填剤としても製造可能である。【００４６】
多孔性充填剤の場合は、細孔径の調節が必要である。以下にその調節の一例を示すが、本発明は当該方法に限定されるものではない。ここで、細孔調節の目的で添加する有機溶媒は、用いる本発明の（メタ）アクリロイル系モノマーの量や種類、多官能性モノマーや他のモノマーとの量比、多官能性モノマーの種類や量、重合開始剤の種類や量、重合温度等の影響を受ける為に一概には決められない。一般的に、生成重合体粒子に対し膨潤性の高い有機溶媒を用いると細孔径が小さな重合体粒子を、モノマーは溶解するがポリマーは溶解しないような貧溶媒を用いると細孔径が大きな重合体粒子を製造することができる。【００４７】
細孔調節の目的で添加する有機溶媒の例として、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、デカン等の飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類等が挙げられる。なかでも、水に不溶性で、用いたモノマー及び重合開始剤を溶解する有機溶媒であれば、特にこれらに限定されるものではない。その細孔調節の目的で添加する有機溶媒の添加量は充填剤の空孔率（充填剤粒子の全容積に対する細孔容積の割合を示す）に影響を与える。空孔率は充填剤の使用目的によって異なるので、一概には決められない。一般的には、空孔率は４０％〜９０％、より好ましくは、５５％〜８０％程度の充填剤が用いられる。空孔率がこの範囲を外れると、タンパク質等水溶性の化合物を充填剤により多く吸着させたいとの目的から外れるため、機能上好ましくないとの理由による。空孔率の調節は一般的には、添加する有機溶媒の全モノマーに対する割合で決まり、有機溶媒を多く使用すれば空孔率は大きくなり、使用する有機溶媒が少なければ、空孔率は小さくなる。ただ、モノマーの反応率を変えたり、高い空孔率の重合体粒子を製造後、粒子表面を別の化合物でコーティングしたりする事で、空孔率を変える事もできるので、上記の方法に限定されるものではない。【００４８】
一方、非多孔性充填剤を製造する場合は、細孔調節である有機溶媒は添加せず、調整混合液として（メタ）アクリロイル系モノマー、多官能性モノマー及び重合開始剤を用いて製造される。しかも細孔容積が少なくかつ細孔径を小さくさせる為、多官能性モノマーの比率は、１０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下の範囲が好適となる。【００４９】
本発明の充填剤（１）の平均粒子径は、使用目的やタンパク質の精製量によって設定される為、一概には決められない。例えば、多孔性充填剤の場合は、通常３μｍ〜５００μｍ、好ましくは５μｍ〜３００μｍの範囲であればよい。一方、非多孔性充填剤の場合は、通常１．５μｍ〜６０μｍ、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲であればよい。粒径が小さすぎると、高速でタンパク質等を分離・精製する際に、充填剤入りカラム内の圧力損失が大きくなり、耐圧容器を使用する必要が生じ、設備に莫大な費用がかかることになる。また、粒径が大きくなり過ぎると水溶液中のタンパク質が粒子表面に到達するまでに時間がかかることになり、タンパク質の粒子への移動が低下する拡散問題が発生する。そのために上記の範囲が好適である。【００５０】
このようにして製造された架橋重合体粒子は細孔調節の目的で添加する有機溶媒や微量の残存モノマー等の夾雑物を含有している。そこで、例えば、アセトン、テトラハイドロフラン等の水溶性の有機溶媒で粒子を洗浄し、該夾雑物を除去後、親水化反応やイオン交換基導入等の置換基の導入を行うのが一般的である。【００５１】
次に、本発明の上記した充填剤（１）の粒子表面に親水性基が存在することを特徴とする充填剤［以下、充填剤（２）と称する。］について説明する。
本発明の充填剤（１）に用いられる架橋重合体粒子は、置換基を導入するための反応の基点となる、ハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基又はエポキシ基を有する。そのため、親水化剤を作用させることで容易に架橋重合体粒子に親水性を付与することが可能となる。ここで用いられる親水化剤は活性水素基を２つ以上含有していればよく、水；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール等に代表される、オキシエチレン基の繰返しユニットが２０以下、より好ましくは１０以下のグリコール類等；グリセリン、ソルビトール等に代表されるポリオール類等が挙げられる。その他に、多官能エポキシ化合物の加水分解物等もポリオールとして利用できる。
【００５２】
更に、親水化剤として用いる化合物において、反応前は疎水性でも、反応後に親水性を示すような化合物を親水化剤として使用することも可能である。例えば、ソルビトールポリグリシジルエーテル類、ソルビタンポリグリシジルエーテル類、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル類、グリセロールポリグリシジルエーテル類、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル等が挙げられる。このような親水化剤を用いて、架橋重合体粒子と反応を行なった後、必要があれば、残存エポキシ基と上記した活性水素基を２個以上含有している化合物とで更に反応を行ってもよい。このように水溶性を示すジヒドロキシ化合物、ポリヒドロキシ化合物又は反応後親水性を示す化合物であれば、全て親水化剤として使用できる。【００５３】
本発明において、上記式（１）で示される（メタ）アクリロイル系モノマーを用いて重合を行ない、水溶性有機溶媒で洗浄した架橋重合体粒子中には、上記したとおり、反応の基点としてハロゲン原子、アルコール性ＯＨ基、アミノ基、グリシジル基及びエポキシ基等を含有している。そこで、次にそれぞれの反応の基点について、親水化方法を示す。【００５４】
反応の基点がハロゲン原子の場合は、水溶液中でアルカリ触媒下、ハロゲン基を加水分解によりＯＨ基に変換する方法、又はアルカリ触媒下、２個以上のＯＨ基含有化合物と、所謂ウイリアムソン反応を利用して固定化する方法等が挙げられる。【００５５】
反応の基点がアルコール性ＯＨ基の場合は、アルカリ触媒下、例えば上記のエポキシ化合物との反応、更に必要があれば、残存エポキシ基と多価アルコールとの反応を行う方法が挙げられる。又はアルカリ触媒下、エピクロルヒドリンを用いてエポキシ化した後、２個以上のＯＨ基含有化合物を固定化する方法が挙げられる。【００５６】
反応の基点がアミノ基の場合は、上記のエポキシ化合物との反応、更に必要があれば、残存エポキシ基と多価アルコールとの反応を行う方法、又はエピクロルヒドリンを用いてエポキシ化後、２個以上のＯＨ基含有化合物を固定化する方法が挙げられる。【００５７】
反応の基点がグリシジル基又はエポキシ基の場合は、酸又はアルカリ触媒下、２個以上のＯＨ基含有化合物を固定化する方法が挙げられる。
このようにして得られた本発明の充填剤（２）の排除限界分子量は、標準物質としてプルラン、溶離液として純水を使用した場合、５０万〜２００万の範囲であることが好ましい。
本発明の充填剤（２）は、例えば、クロマトグラフィー用の親水性基材として使用される。【００５８】
一般的に生体高分子の分離精製を目的とするクロマトグラフィー用親水性基材では、塩濃度０．１モル／ｌ位の中性溶離液で溶出したとき、対象となる生体高分子と充填剤が何の相互作用もなく、溶出することが好ましい。すなわち、親水性基材が多孔性基材であれば、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、ＳＥＣと略す。）の原理に基づき、分子サイズの大きい分子から順に溶出し、カラム中の全溶離液量以下の溶出容量で全ての分子が溶出することが好ましい。【００５９】
本発明において、このような親水化基材の物性及び化学構造は以下のような要件を満たすことが好ましい。
親水性基材の物性は、細孔物性、機械的強度及び粒子径分布と形状でほぼ規定できる。細孔物性は細孔径分布と空孔率で大部分が規定できる。適切な細孔物性は分離目的、方法と対象高分子の分子サイズに依存する。例えば、対象が一般的な球状タンパク質（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）で、脱塩用や非多孔性充填剤用基材であれば、細孔径は排除限界分子量で５千（プルラン分子量換算）以下が好ましく、空孔率は脱塩用では、出来るだけ大きい方が好ましく、６０〜９５％が適切である。一方、非多孔性充填剤用基材では、空孔率は逆に出来るだけ小さいことが機械的強度を向上するため好ましく、２０％以下が適切である。タンパク質のＳＥＣ分離用では、排除限界分子量で５千〜５０万（プルラン分子量換算）が好ましい。また、イオン交換基、疎水性基又はアフィニティー用リガンドを基材に固定化するためには、排除限界分子量は１万〜５００万（プルラン分子量換算）、空孔率は５０〜９５％が好ましい。多孔性充填剤用基材の場合は、分離方法に拘わらず、空孔率は大きいほど、粒子径は逆に小さいほど、体積当りの分離性能は向上する。空孔率を大きくすれば充填剤は機械的強度が弱くなり、溶離液を通液するとき変形し易くなるため、空孔率は９５％以下が好ましい。特に分析目的の高性能液体クロマトグラフィー用充填剤の基材としては、８０％以下が好ましい。粒子径を小さくすれば充填カラムのカラム高さ当りの圧力損失は増加し、ますます機械的強度を高める必要が生ずる。したがって溶離液を適切な流速で通液するには、充填剤は機械的強度が高い必要があり、圧力損失を必要以上に高めないように、空孔率と粒子径を調節しなければならない。また充填剤の形状が球状でないと、カラムに充填する際に、充填剤がブリッジを形成し、隙間を生じ、最密に充填できない。そのために実用的には溶出ピーク形状が非対称になり、ピーク幅が拡大して性能の低いカラムになる。したがって、充填剤の形状は球形が好ましい。【００６０】
また親水性基材の化学構造としては、各種充填剤を合成するための基点として修飾し易い官能基が必要である。溶質と官能基固有の相互作用を妨害すること無く固定化できるように表面にアルコール性水酸基があることが好ましい。すなわち細孔内部及び外部表面には、アルコール性水酸基やイオン化しない極性官能基が多いことが好ましい。目的の溶質と導入する官能基固有の相互作用を妨害するような官能基はないこと、また、簡単な修飾でマスキングできる範囲であることが望ましい。すなわちイオン性基や疎水性基は出来るだけ少ないことが望ましい。【００６１】
次に、本発明の充填剤（１）又は充填剤（２）の粒子表面にイオン交換基が存在することを特徴とする充填剤［以下、充填剤（３）と称する。］について説明する。
本発明の充填剤（３）が有するイオン交換基としては、特に限定するものではないが、スルフォン酸基、カルボキシル基、アミノ基、４級アンモニウム基が好適なものとして挙げられる。【００６２】
本発明において、充填剤（１）又は充填剤（２）へのイオン交換基の導入方法としては、特に限定するものではない。例えば、上記式（１）の（メタ）アクリロイルモノマーを用いて重合し、水溶性有機溶媒で洗浄した重合体粒子中に、反応の基点となるグリシジル基又はエポキシ基を有する場合、亜硫酸ソーダ又は酸性亜硫酸ソーダを用い、エポキシ基を開環させてスルフォン酸基を導入することで、カチオン交換樹脂とすることができる。また、亜硫酸ソーダ類の替わりに１級、２級又は３級アミノ基を用い、エポキシ基を開環させてアミノ基を導入すれば、アニオン交換樹脂とすることができる。【００６３】
この他に、充填剤（２）として用いられる親水化した架橋重合体粒子を使用し、エピクロルヒドリンにより、エポキシ化後亜硫酸ソーダ類又はアミン類を導入することにより、本発明の充填剤（３）が調製される。ここで用いられるアミン類としては、特に限定するものではない。例えば、アンモニア、炭素数１〜４のアルキルアミン、炭素数１〜４のジアルキルアミン、炭素数１〜４のトリアルキルアミン、ヒドロキシアルキル（炭素数１〜４）アミン、ジヒドロキシアルキル（炭素数１〜４）アミン、トリヒドロキシアルキル（炭素数１〜４）アミン、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン等が挙げられる。【００６４】
反応の基点がハロゲン原子の場合、上記したアミン類を用いて反応させれば、アニオン交換樹脂とすることができる。また、反応の基点がアミノ基の場合、そのまま、アニオン交換樹脂として使用することができる。更に必要があれば、エピクロルヒドリンを介在させて、更にアミノ基を導入してもよい。【００６５】
反応の基点がアルコール性ＯＨ基の場合、ブロモエチルスルホン酸、モノクロロ酢酸、１，３−プロパンスルトン等を用いて反応させれば、カチオン交換樹脂とすることができる。また、２−クロロエチルジエチルアミン塩酸塩、グリシジルトリメチルアンモニウムクロライド等を用いて反応させれば、アニオン交換樹脂とすることができる。さらに、エピハロヒドリンを用いて反応させれば、エポキシ基も導入することができる。
このようにして得られた本発明の充填剤（３）は、例えば、クロマトグラフィー用充填剤として、タンパク質等の生体高分子を分離精製する際に使用される。【００６６】
生体高分子の分離精製を目的とするイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、親水化基材の説明において記載したような基材に、同種のカチオン交換基又はアニオン交換基を固定化した充填剤である。このような充填剤の物性の大部分は、基材に依存する。ただし、イオン交換基を導入することにより、溶離液の塩濃度を変化させたとき、粒子の内外間で浸透圧が変化する。この作用により充填剤は、低塩濃度では膨潤し、高塩濃度で収縮する。タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーでは、塩濃度を徐々に増やして相互作用の低いタンパク質から順に溶出する方法を多用する。このとき膨潤収縮比の大きい充填剤では、カラムベッド容積が大きく変化し、充填状態が毎回変化し、再現性の良い分離にならない。膨潤収縮比の大きさは、基材マトリックス（骨格）の強さ（硬さ）とイオン交換容量により決定する。一般にイオン交換容量が大きいほど影響が大きい。したがって、基材マトリックスが膨潤収縮し難く、イオン交換容量も必要以上に大きくない方がよい。具体的には、イオン交換容量は３０〜３００ｍｅｑ／ｌが適切な範囲である。またその他の生体高分子、例えば、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）では、２００ｍｅｑ／ｌ以下が、ペプタイドやオリゴ糖などでは、５０〜５００ｍｅｑ／ｌが好ましい。【００６７】
イオン交換クロマトグラフィーの溶出方法は、一般に上述した塩濃度を徐々に増やして溶出する方法、目的の溶質がイオン交換基と結合するｐＨから反撥するｐＨへ徐々に溶離液のｐＨを変化させる方法又は両方の組合せなどがある。
その他にも再生、洗浄などではアルカリ溶液も使用するので、基材マトリックスが膨潤収縮し難い充填剤が好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により、本発明の充填剤及びその製造方法を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例１
まず、ケン化率８８％、重合度３５００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１．５ｇと１リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコールを水に溶解させた。その後、この水溶液が６０℃になるよう調節し、これを調整水溶液とした。
次に、グリシジルメタクリレート４５ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１５ｇ、クロルベンゼン６５ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．３ｇからなる調整混合液を作り、この調整混合液を６０℃の上記調整水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を６時間、６０℃で重合させた。その後、反応器を室温に冷却し、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００６９】
＜親水化基材の調製＞
得られた粒状ゲルを更に水で良く洗浄した後、この重合体２０ｇを０．５Ｎ硫酸水溶液２００ｍｌとよく混合し、これを水浴上で９０℃に加熱して、５時間反応を行い、エポキシ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、４０μｍ〜９０μｍの粒子径の粒状ゲルを取得した。このゲルを親水化基材１とする。【００７０】
＜含水率の測定＞
親水化基材１の含水率を、ケット式水分計で１２０℃、１５分間加熱した後の親水化基材１の重量減により求めた。その結果、含水率は５７．２％であった。【００７１】
＜エポキシ基の定量＞
約２ｇの親水化基材１を容量２００ｍｌの共栓付三角フラスコに投入した後、秤量した。次に、このフラスコ内に、正確に２５ｍｌの約０．２Ｍ−塩酸／ジオキサン溶液を加え、攪拌子を入れて、室温で３時間穏やかに攪拌した。次いで、このフラスコ内に、５０ｍｌのエチルアルコールと１ｍｌのフェーノルフタレイン溶液を加え、０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液で滴定して、残存塩酸量を求めた。また同時に、この約０．２Ｍ−塩酸／ジオキサン溶液中の塩酸濃度を０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液で滴定して求めた。更に、約２ｇの親水化基材１を容量２００ｍｌの共栓付三角フラスコに投入、秤量し、７５ｍｌのエチルアルコールを加え、室温で約３０分間攪拌し、フェノールフタレイン溶液を指示薬として０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液で滴定して、測定ゲル中の酸価を求めた。
このようにして得られた残存塩酸量、酸価及びゲルの含水率から乾燥ゲル１ｇ当りのエポキシ量を求めた。該親水化基材のエポキシ量は乾燥ゲル１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下であった。【００７２】
＜排除限界分子量及び空孔率の測定＞
親水化基材１のゲルスラリー水溶液を用いて内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに親水化基材１を最密充填になるように充填した。次に、ＲＩ−８０００検出器（東ソー社製）を装備したＨＬＣ−８０３Ｄ（東ソー社製）に該カラムを装着した。引き続き、標準物質に分子量４０００万のデキストラン及び各分子量のプルランを用い、０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で種々の分子量の標準物質を注入し、その溶出容量から排除限界分子量を求めた。また、デキストランとエチレングリコールの溶出容量及びカラム容積から空孔率を求めた。親水化基材１粒子の排除限界分子量は１００万、空孔率は６２％であった。【００７３】
＜アミノ化充填剤の調製＞
得られた親水化基材１を純水で洗浄し、吸引ろ過後、親水化基材１の５０ｍｌを３００ｍｌセパラブルフラスコに移し、純水２０ｍｌ、３５％水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを加え、攪拌混合した。次に、反応温度を３５〜４０℃に保ちながら、エピクロルヒドリン３３ｇ及びジエチルアミノエタノール３９ｇを４時間で滴下し、その後、更に４０℃で５時間反応を継続した。反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水、０．５Ｎ塩酸、再び純水の順によく洗浄した。この反応で得られた充填剤をアミノ化充填剤１とする。【００７４】
製造例２
グリシジルメタクリレート４９ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１１ｇ、クロルベンゼン６５ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．３ｇからなる調整混合液を用いる以外は、製造例１と同様の方法で、この調整混合液を６０℃に調節した調整水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を６時間、６０℃で重合させた。その後、反応器を室温に冷却し、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄して、粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００７５】
この粒状ゲル２５ｇ、ポリエチレングリコール（平均分子量２００）２００ｇ及びジオキサン１００ｇをよく混合し、次に三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体１ｍｌを加え、攪拌しながら、８５℃に加熱し、４時間加熱を続けた。次に、反応物を室温まで冷却し、水でよく洗浄し、水浴中で篩分級を行い、粒子径４０μｍ〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材２とする。【００７６】
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材２の物性測定をした。その結果、含水率は５５．９％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は１１０万、空孔率は６３．２％であった。
更に、製造例１に記載の方法に従って、親水化基材２にアミノ基を導入した。この反応で得られた充填剤をアミノ化充填剤２とする。【００７７】
製造例３
グリシジルメタクリレート５６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート４ｇ、クロルベンゼン６５ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．３ｇからなる調整混合液を用いる以外は、製造例１と同様の方法で、この調整混合液を６０℃に調節した調整水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を６時間、６０℃で重合させた。その後、反応器を室温に冷却し、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄して、粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００７８】
この粒状ゲル２５ｇ、ポリエチレングリコール（平均分子量２００）２００ｇ及びジオキサン１００ｇをよく混合し、次に三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体１ｍｌを加え、攪拌しながら，８５℃に加熱し、４時間加熱を続けた。次に、反応物を室温まで冷却し、水でよく洗浄し、水浴中で篩分級を行い、粒子径４０μｍ〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材３とする。【００７９】
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材３の物性測定をした。その結果、含水率は６９．４％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は１６５万、空孔率は６９．４％であった。
更に、製造例１に記載の方法に従って、親水化基材３にアミノ基を導入した。この反応で得られた充填剤をアミノ化充填剤３とする。【００８０】
製造例４
３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート６４ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１６ｇ、酢酸ブチル１４０ｇ、クロルベンゼン３１ｇ、及びｔ−ブチルパーオキシピバレート１．４ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度３５００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１０ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。引き続きかき混ぜながら、この混合物を６時間、６０℃に加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過した。この重合物を数回温水で洗浄した後、１，４−ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００８１】
この粒状ゲル５０ｇ、ポリエチレングリコール（平均分子量２００）２００ｇ及び１，４−ジオキサン２００ｇをよく混合し、次に三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体２ｍｌを加え、攪拌しながら、８５℃に加熱し４時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材４とする。【００８２】
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材４の物性測定をした。その結果、含水率は６８．５％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は１１０万、空孔率は７４％であった。
更に、製造例１に記載の方法に従って、親水化基材４にアミノ基を導入した。この反応で得られた充填剤をアミノ化充填剤４とする。【００８３】
製造例５
３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート５８ｇ、グリシジルメタクリレート６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１６ｇ、クロルベンゼン２００ｇ、及びアゾビスイソブチルニトリル０．６ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度２４００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１５ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。引き続きかき混ぜながら、この混合物を６時間、６０℃に加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過した。重合物の表面に付着した懸濁安定剤を除去する為に重合物を数回温水で洗浄した後、１，４−ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００８４】
この粒状ゲル５０ｇ、ジエチレングリコール５０ｇ、ポリグリセリンポリグリシジルエーテル（商品名：デナコールＥＸ−５２１、ナガセ化成工業社製）５０ｇ、及び１，４−ジオキサン２００ｇをよく混合し、次に三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体２ｍｌを加え、攪拌しながら、８５℃に加熱し４時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材５とする。【００８５】
製造例１記載の方法に従って、親水化基材５の物性測定をした。その結果、含水率は７０．５％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は９０万、空孔率は７２％であった。
更に、製造例１に記載の方法に従って、親水化基材５にアミノ基を導入した。この反応で得られた充填剤をアミノ化充填剤５とする。【００８６】
製造例６
３−アダマンタンジオール１６８ｇとピリジン８０ｇをテトラヒドロフラン４００ｇに溶解した。この溶液を攪拌しながら反応温度を４０℃に保ちつつ、メタクリル酸クロライド８４ｇをこの溶液中に滴下し、２時間反応した。得られた反応液から、テトラヒドロフランを３５℃以下で減圧留去し、残留物をｎ−ヘキサンで抽出した。次に、ｎ−ヘキサン相を純水、０．１Ｍりん酸水溶液、０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、純水の順で未反応１，３−アダマンタンジオール、塩類、ピリジン、メタクリル酸を抽出除去した。最後にｎ−ヘキサン相をメタノールで抽出し、メタノール溶液を３５℃以下で減圧留去した。【００８７】
得られた生成物を、ガスクロマトグラフ分析したところ、この生成物は、３−ヒドロキシアダマンタン−１−メタクリレート１２０ｇ、１，３−アダマンタンジメタクリレート４ｇの組成であった。次に、この生成物６０ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ、トリメチロールプロパントリアクリレート１０ｇ、酢酸ブチル５０ｇ、クロルベンゼン１００ｇ、及びアゾビスイソブチルニトリル０．６ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度２４００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１０ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させ、かき混ぜながらこの混合物を６時間、６０℃に加熱して重合させた。その後、反応物を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、１，４−ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００８８】
この粒状ゲル５０ｇ、エチレングリコール２０ｇ、グリシドール３０ｇ、及び１，４−ジオキサン１５０ｇをよく混合し、次に三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体２ｍｌを加え、攪拌しながら、８５℃に加熱し４時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材６とする。【００８９】
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材６の物性測定をした。その結果、含水率は６７％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は６０万、空孔率は７０％であった。
更に製造例１に記載の方法に従って、親水化基材６にアミノ基を導入した。この反応により得られた充填剤をアミノ化充填剤６とする。【００９０】
製造例７
１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレート（日本化成社製）６４ｇ、４−ヒドロキシブチルアクリレート（日本化成社製）６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１８ｇ、クロルベンゼン２４０ｇ、及びｔ−ブチルパーオキシピバレート１．０ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度３５００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１５ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。かき混ぜながらこの混合物を６時間、６０℃に加熱して重合させた。次いで、反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、アセトンでよく洗浄し、次に水で洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００９１】
この粒状ゲル５０ｇ、ポリグリセリンポリグリシジルエーテル（商品名：デナコールＥＸ−５１２、ナガセ化成工業社製）２５ｇ、及び純水８０ｍｌをよく混合し、これに５Ｎ水酸化ナトリウム溶液３０ｍｌを４５℃にて滴下し、３時間攪拌混合した。次に反応物を室温に冷却し、０．１Ｎ塩酸及び水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材７とする。【００９２】
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材７の物性測定をした。その結果、含水率は７８％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は１５０万、空孔率は７５％であった。
更に製造例１に記載の方法に従って、親水化基材７にアミノ基を導入した。この反応により得られた充填剤をアミノ化充填剤７とする。【００９３】
製造例８
分子量３６万のポリビニルピロリドン（懸濁安定剤）５０ｇと１リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルピロリドンを水に溶解させた。その後、水溶液が６０℃になるよう調節した。次に、グリシジルメタクリレート２００ｇ、エチレングリコールジメタクリレート５０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル１．０ｇからなる混合溶液を調製し、この混合溶液を６０℃の上記水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。上記水溶液中に窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら、引き続き激しく攪拌して、この懸濁物を８時間、６０℃で重合させた。反応液を室温に冷却し、生成したゲル状重合物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００９４】
この粒状ゲル（ジオキサン含有）２００ｇを３００ｍｌのジオキサンに分散し、これに１５０ｇのエチレングリコールと５ｇの固形水酸化ナトリウムを添加し、これを水浴上で７０℃に加熱し、１６時間反応を行って、エポキシ基へのエチレングリコールの開環付加反応を行った。次いで、生成物を水、次にアセトンでよく洗浄した。その後、アセトンスラリー溶液を用いて、デカンテーション分級を行い、粒子径３〜５μｍの粒状ゲルを取得した。これを親水化基材８とする。
更に製造例１に記載の方法に従って、親水化基材８にアミノ基を導入した。この反応により得られた充填剤をアミノ化充填剤８とする。【００９５】
製造例９
分子量３６万のポリビニルピロリドン（懸濁安定剤）５０ｇと１リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行って、ポリビニルピロリドンを水に溶解させた。その後、この水溶液が６０℃になるよう調節した。次に、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート２７６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート５０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル１．０ｇからなる混合溶液を調製し、この混合溶液を６０℃の上記水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。上記水溶液に窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら、引き続き激しく攪拌して、この懸濁物を８時間、６０℃で重合させた。次いで、反応液を室温に冷却し、生成したゲル状重合物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００９６】
この粒状ゲル（ジオキサン含有）２００ｇを３００ｍｌのジオキサンに分散し、これに１５０ｇのエチレングリコールと１．５ｍｌの三弗化ホウ素エーテル錯体を室温で添加し、これを水浴上で７０℃に加熱し、４時間反応を行い、エポキシ基へのエチレングリコールの開環付加反応を行った。その後、水、次にアセトンでよく洗浄してアセトンに懸濁し、デカンテーション分級を行い、粒子径３〜５μｍの粒状ゲルを取得した。これを親水化基材９とする。
更に製造例１に記載の方法に従って、親水化基材９にアミノ基を導入した。この反応により得られた充填剤をアミノ化充填剤９とする。【００９７】
製造例１０
４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）４８ｇ、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート１６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１６ｇ、クロルベンゼン２２０ｇ、及びアゾビスイソブチルニトリル１．４ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度２４００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１０ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。かき混ぜながらこの混合物を６時間、６５℃に加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、１，４−ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【００９８】
この粒状ゲル５０ｇ、エチレングリコール１００ｇ、及び１，４−ジオキサン２００ｇをよく混合し、これに三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体２ｍｌを加え、攪拌しながら、８５℃に加熱し４時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材１０とする。
製造例１記載の方法に従って、親水化基材１０の物性測定をした。その結果、含水率は７２．５％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は１００万、空孔率は７６％であった。【００９９】
製造例１１
４−ブロモブチルメタクリレート６４ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１６ｇ、１，２−ジクロロプロパン１００ｇ、クロロベンゼン１００ｇ、及びアゾビスイソブチルニトリル１．２ｇの混合物を、ケン化率８８％、重合度２４００のポリビニルアルコール（懸濁安定剤）１５ｇを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。かき混ぜながらこの混合物を６時間、６５℃に加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、表面に付着した懸濁安定剤を除去する為に重合物を数回温水で洗浄した後、１，４−ジオキサンで洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【０１００】
この粒状ゲル５０ｇ、エチレングリコール１００ｇ、及び１，４−ジオキサン２００ｇをよく混合し、これに水酸化ナトリウム２５ｇを加え、攪拌しながら、７５℃に加熱し１０時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材１１とする。
製造例１に記載の方法に従って、親水化基材１１の物性測定をした。その結果、含水率は７０．５％、残存エポキシ量は、乾燥基材１ｇ当り０．３ｍｍｏｌ以下、排除限界分子量は８０万、空孔率は７２％であった。【０１０１】
製造例１２
１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレート（日本化成社製）３２ｇ、６−アミノヘキシルメタクリルアミド３２ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１８ｇ、イソアミルアルコール１００ｇ、クロロベンゼン１００ｇ、及びｔ−ブチルパーオキシピバレート１．５ｇの混合物を、分子量３６万のポリビニルピロリドン（懸濁安定剤）２５ｇ及びエタノールアミン１ｍｌを１リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。かき混ぜながらこの混合物を６時間、６０℃に加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、アセトンでよく洗浄し、次に水で洗浄して粒状ゲル（架橋重合体粒子）を得た。【０１０２】
この粒状ゲル５０ｇ、ポリグリセリンポリグリシジルエーテル（商品名：デナコールＥＸ−５１２、ナガセ化成工業社製）２５ｇと純水８０ｍｌをよく混合し、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液３０ｍｌを４５℃にて滴下し、３時間攪拌混合した。次に反応物を室温に冷却し、０．１Ｎ塩酸及び水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径４０〜９０μｍの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材１２とする。【０１０３】
製造例１記載の方法に従って、該親水化基材の物性測定をした。その結果、含水率は７８％、排除限界分子量は１２０万、空孔率は７４％であった。
更に製造例１に記載の方法に従って、親水化基材１２にアミノ基を導入した。この反応により得られた充填剤をアミノ化充填剤１２とする。【０１０４】
製造例１３
製造例４で得られた親水化基材４を純水で洗浄し、吸引ろ過後、親水化基材４の５０ｍｌを３００ｍｌセパラブルフラスコに移し、純水３０ｍｌ、１，３−プロパンスルトン２０ｇをこれに加え、攪拌混合した。反応温度を３５〜４５℃に保ちながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液１５ｇをこれに滴下し、滴下後更に４０℃で３時間反応を継続した。反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水でよく洗浄した。この反応で得られた充填剤をスルフォン化充填剤１３とする。【０１０５】
製造例１４
製造例４で得られた親水化基材４を純水で洗浄し、吸引ろ過後、５０ｍｌを３００ｍｌセパラブルフラスコに移し、純水２５ｍｌ、モノクロロ酢酸ナトリウム２５ｇをこれに加え、攪拌混合した。反応温度を４５〜５５℃に保ちながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液６０ｇをこれに滴下し、滴下後更に５０℃で４時間反応を継続した。反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水でよく洗浄した。この反応で得られた充填剤をカルボキシメチル化充填剤１４とする。【０１０６】
製造例１５
製造例４で得られた親水化基材４を純水で洗浄し、吸引ろ過後、５０ｍｌを３００ｍｌセパラブルフラスコに移し、純水２５ｍｌ、７０％グリシジルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液４０ｇを加え、攪拌混合した。反応温度を３０〜３５℃に保ちながら、４８％水酸化ナトリウム水溶液２ｇをこれに投入し、滴下後更に３５℃で２４時間反応を継続した。反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水、０．５Ｎ塩酸、再び純水の順によく洗浄した。この反応で得られた充填剤を４級アンモニウム化充填剤１５とする。【０１０７】
製造例１６
製造例１３に記載の方法に従って、製造例２で得られた親水化基材２にスルフォン基を導入した。この反応で得られた充填剤をスルフォン化充填剤１６とする。【０１０８】
製造例１７
製造例１４に記載の方法に従って、製造例２で得られた親水化基材２にカルボキシメチル基を導入した。この反応で得られた充填剤をカルボキシメチル化充填剤１７とする。【０１０９】
製造例１８
製造例１５に記載の方法に従って、製造例２で得られた親水化基材２に４級アンモニウム基を導入した。この反応で得られた充填剤を４級アンモニウム化充填剤１８とする。【０１１０】
以上の製造例で調製した、粒状ゲル（架橋重合体粒子）、親水化基材、充填剤をそれぞれ表１〜表３に併せて示す。【０１１１】
【表１】
0005315691.tif 000005
【０１１２】
【表２】
0005315691.tif 000006
【０１１３】
【表３】
0005315691.tif 000007
【０１１４】
実施例１
製造例４で得られた親水化基材４の親水性と耐アルカリ性を２５℃±２℃に調節した部屋で評価した。
親水性評価は、タンパク質溶液を充填カラム及び空カラムに注入し、一定量の溶出液を採取し、溶出液の２８０ｎｍ紫外吸光度を測定比較する方法で回収率を測定する方法で行なった。つまり、基材が疎水性を有していれば、タンパク質は基材に疎水吸着されて回収率が低下し、逆に、基材の親水性が高ければ、回収率が高くなることを利用する方法で各々のカラムについて機能を比較した。なお、本実施例においてタンパク質としては、オボアルブミン（卵白）、α‐キモトリプシノーゲンＡ（ウシ）、ミオグロビン（ウマ）及びリゾチーム（卵）（以上、シグマアルドリッチジャパン社製）、チトクロームＣ（ウマ）（和光純薬工業社製）を用いた。【０１１５】
具体的には、親水化基材４からなる充填剤を内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填して充填カラムとした。溶離液として、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．８）と０．２Ｍ硫酸ナトリウムの含有溶液を用い１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流し、同溶離液に２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した上記タンパク質を０．１ｍｌ注入し、注入後４分目から溶出液２０ｍｌを採取した。一方、空カラムとしては、タンパク質溶液の分散を防ぐ目的で、内径１０．７ｍｍ長さ７５ｍｍのステンレスカラムを用い、上記と同様にして注入後２分から溶出液２０ｍｌを採取した。空カラムから採取されたタンパク質の吸光度を１００％とする相対比較で各々のタンパク質の回収率を求めた。
その結果、いずれのタンパク質も９５％以上の回収率を示し、親水化基材４は親水性が高い事を確認した。【０１１６】
次に、耐アルカリ性の評価は、水酸化ナトリウム水溶液浸漬によるカルボキシル基生成量の比較により行った。すなわち、純水でよく洗浄した後、親水化基材４を、内径２０ｍｍの底部グラスフィルター付きのクロマトグラフ管を用いて１０ｍｌずつ測り取り、８０ｍｌ蓋付きサンプルビン２個にそれぞれ移した。一方のサンプルビンには、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌを、他方には純水６０ｍｌをそれぞれ加え、密栓し、それぞれのスラリー液を混合した後、２５℃にて４週間静置保管した。保管後のそれぞれの親水化基材４の全量を０．５ＮのＨＣｌ溶液で良く洗浄し、引き続き、純水で良く洗浄した後、カルボキシル基量を０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液による滴定により測定した。これら親水化基材のカルボキシル基量の差より、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液浸漬による加水分解で生成したカルボキシル基量を算出した。
その結果、親水化基材４のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり８．３ミリ等量であった。【０１１７】
実施例２
製造例５で得られた親水化基材５の親水性と耐アルカリ性を評価した。
すなわち、親水性の評価は、実施例１に記載の方法に従って行った。その結果、タンパク質の回収率は何れも９５％であり、親水化基材５は親水性が高い事を確認した。
また、耐アルカリ性の評価は、実施例１に記載の方法に従い、親水化基材５を４週間アルカリ水溶液に浸漬することにより行なった。浸漬後の基材の耐アルカリ性を実施例１に記載の方法で評価したところ、親水化基材５のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり１０．５ミリ等量であった。【０１１８】
実施例３
製造例６で得られた親水化基材６の親水性と耐アルカリ性を実施例１に記載の方法に従って評価した。
その結果、タンパク質の回収率は何れも９５％であり、親水化基材６は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材６のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり１２．４ミリ等量であった。【０１１９】
実施例４
製造例７で得られた親水化基材７の親水性と耐アルカリ性を実施例１に記載の方法に従って評価した。
その結果、タンパク質の回収率は何れも９５％であり、親水化基材６は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材７のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり１０．６ミリ等量であった。【０１２０】
実施例５
製造例４で得られたアミノ化充填剤４のイオン交換容量を以下に示す方法で測定した。すなわち、実施例１に記載した要領で、アミノ化充填剤４を１０ｍｌ測り取り、これを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、純水の順でよく洗浄し、０．１Ｎ塩酸による滴定により、測定した。その結果、アミノ化充填剤４のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり４５ミリ等量であった。【０１２１】
次に、アミノ化充填剤４の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。すなわち、水酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しの当該アミノ化充填剤に対する牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す。）の結合量、及び酸性タンパク質の一定溶出条件での溶出容量を測定した。ここで、水酸化ナトリウム水溶液浸漬の条件は、浸漬期間を１２週間とする以外は、実施例１における親水化基材の耐アルカリ性評価と同じ条件で行った。【０１２２】
＜ＢＳＡ結合量の測定＞
純水でよく洗浄後、アミノ化充填剤４を内径１０ｍｍの底部グラスフィルター付きのクロマトグラフ管を用いて正確に３ｍｌ測り取った。その後、アミノ化充填剤４の１０倍容量の、５０ｍＭトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、該アミノ化充填剤を３回洗浄した後、５０ｍｌメスフラスコに移した。ＢＳＡの含有濃度が２０ｍｇ／ｍｌの上記トリスアミノメタン緩衝液１０ｍｌを加え、１０分間混合してＢＳＡを吸着させた。その後、この懸濁液を濾紙でろ過して、アミノ化充填剤４を除き、残存ＢＳＡ溶液を得た。【０１２３】
引き続き、紫外分光光度計でこの残存ＢＳＡ溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。予め、紫外分光光度計を用いて、既知濃度のＢＳＡ溶液と２８０ｎｍでの吸光度の関係を求めた相関図により、残存ＢＳＡ量を求めた。そして、添加した２００ｍｇのＢＳＡ量と残存ＢＳＡ量との差をＢＳＡ結合量とした。【０１２４】
その結果、純水に浸漬したアミノ化充填剤４のＢＳＡ結合量は２９．５ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤４のＢＳＡ結合量は２６．５ｍｇ／ｍｌであった。それらの差、すなわちアルカリによるＢＳＡ結合量の低下は３．０ｍｇ／ｍｌと非常に小さい事を確認した。【０１２５】
＜酸性タンパク質の溶出容量の測定＞
アミノ化充填剤４を内径７．５ｍｍ、長さ７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、初期緩衝液に、５０ｍＭトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、１ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク質含有試料を０．０５ｍｌ注入して、カラムにタンパク質を吸着させた。その後、最終緩衝液が、５０ｍＭトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）であり、さらには０．５Ｍ塩化ナトリウム含有溶液になるよう、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで６０分間のリニアグラジエント溶出を行った。溶出タンパク質の検出は、２５±２℃、紫外線吸収検出器ＵＶ８０２０（東ソー（株）製、検出波長は２８０ｎｍ）を用いて行った。試料としては、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す。）及び大豆トリプシンインヒビター（以下、ＳＴＩと略す。）を用いた。そして、リニアグラジエント開始から種々のタンパク質のピークトップが溶出するまでの溶離液の溶出量を測定し、これを溶出容量とした。【０１２６】
その結果、純水に浸漬したアミノ化充填剤４のＯＶＡの溶出容量は１６．２ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２８．０ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤４のＯＶＡの溶出容量は１５．３ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２７．０ｍｌであった。すなわち、アルカリによってＯＶＡで０．９ｍｌ、ＳＴＩで１．０ｍｌ溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、該アミノ化充填剤をアルカリ水溶液に浸漬しても溶出容量の変化は小さい事、換言すれば、タンパク質の保持力はほとんど変化しない事を確認した。【０１２７】
＜アミノ化充填剤の硬さの評価＞
アミノ化充填剤４の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤４（体積平均粒子径：７４μｍ、標準偏差：１３．４μｍ）を内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填した。定流量ポンプ（最大流速１０ｍｌ／ｍｉｎ）で０から１０ｍｌ／ｍｉｎで純水を通液し、最大４００ｋＰａまで測定可能なブルドン管式圧力計を用い、各流速での圧力損失を測定した。次に、このアミノ化充填剤４をカラムより抜出し、空カラム及び送液システムの同一流速での圧力損失を測定し、充填剤ベッドの正味の圧力損失を算出した。
その結果、最大流速１０ｍｌ／ｍｉｎ（線流速６６７ｃｍ／ｈｒ）まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は７８ｋＰａであった。【０１２８】
実施例６
製造例５で得られたアミノ化充填剤５のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤５のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり８５ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤５の耐アルカリ性及び硬さの評価を、実施例５に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。【０１２９】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤５のＢＳＡ結合量は３７．４ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤のＢＳＡ結合量は３５．９ｍｇ／ｍｌであった。その差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は１．５ｍｇ／ｍｌと非常に小さい事を確認した。【０１３０】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤５のＯＶＡの溶出容量は１７．２ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２５．２ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤５のＯＶＡの溶出容量は１６．８ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２４．８ｍｌであった。すなわちアルカリによってＯＶＡで０．４ｍｌ、ＳＴＩで０．４ｍｌ溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤５をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力はほとんど変化しない事を確認した。【０１３１】
＜アミノ化充填剤の硬さ＞
アミノ化充填剤５の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤５（体積平均粒子径：７２μｍ、標準偏差：１４．１μｍ）を内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例５に記載の方法と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速１０ｍｌ／ｍｉｎ（線流速６６７ｃｍ／ｈｒ）まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は８０ｋＰａであった。【０１３２】
実施例７
製造例６で得られたアミノ化充填剤６のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤６のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり７０ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤６の耐アルカリ性、及び硬さの評価を、実施例５に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。【０１３３】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤６のＢＳＡ結合量は２６．１ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤６のＢＳＡ結合量は２４．７ｍｇ／ｍｌであった。その差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は１．４ｍｇ／ｍｌと非常に小さい事を確認した。【０１３４】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤６のＯＶＡの溶出容量は１７．９ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２６．３ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤６のＯＶＡの溶出容量は１７．０ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２４．９ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤６はＯＶＡで０．９ｍｌ、ＳＴＩで１．４ｍｌ溶出容量が減少することが判った。つまり、アミノ化充填剤６をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力はほとんど変化しない事を確認した。【０１３５】
＜アミノ化充填剤の硬さ＞
アミノ化充填剤６の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤６（体積平均粒子径：７６μｍ、標準偏差：１３．１μｍ）を内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例５に記載の方法と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速１０ｍｌ／ｍｉｎ（線流速６６７ｃｍ／ｈｒ）まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は７５ｋＰａであった。【０１３６】
実施例８
製造例７で得られたアミノ化充填剤７のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤７のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり１２５ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤７の耐アルカリ性、及び硬さの評価を、実施例５に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。【０１３７】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤７のＢＳＡ結合量は２６．２ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤７のＢＳＡ結合量は２５．２ｍｇ／ｍｌであった。その差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は１．０ｍｇ／ｍｌと非常に小さい事を確認した。【０１３８】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤７のＯＶＡの溶出容量は１７．６ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２８．２ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤７のＯＶＡの溶出容量は１６．８ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２７．４ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤７はＯＶＡで０．８ｍｌ、ＳＴＩで０．８ｍｌ溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤７をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力はほとんど変化しない事を確認した。【０１３９】
＜アミノ化充填剤の硬さ＞
アミノ化充填剤７の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤７（体積平均粒子径：７４μｍ、標準偏差：１３．１μｍ）を内径１０．７ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例５に記載の方法と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速１０ｍｌ／ｍｉｎ（線流速６６７ｃｍ／ｈｒ）まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流速の圧力損失は７７ｋＰａであった。【０１４０】
実施例９
製造例９で得られたアミノ化充填剤９の耐アルカリ性の評価を、水酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しの当該アミノ化充填剤に対する、酸性タンパク質の一定溶出条件での溶出容量測定によって行った。水酸化ナトリウム水溶液浸漬の条件は、実施例５と同じ条件で行なった。【０１４１】
＜酸性タンパク質の溶出容量の測定＞
アミノ化充填剤９を内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍのステンレスカラムに充填し、初期緩衝液に、５０ｍＭトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、１ｍｇ／ｍｌ濃度のタンパク質含有試料を０．０２ｍｌ注入して、カラムにタンパク質を吸着させた。その後、最終緩衝液が、５０ｍＭトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）であり、さらには０．５Ｍ塩化ナトリウム含有溶液になるよう、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで３０分間のリニアグラジエント溶出を行った。溶出タンパク質の検出は、２５±２℃、紫外線吸収検出器ＵＶ８０２０（東ソー社製、検出波長は２８０ｎｍ）を用いて行った。試料としてはＯＶＡ及びＳＴＩを用いた。そして、リニアグラジエント開始から種々のタンパク質のピークトップが溶出するまでの溶離液の溶出量を測定し、これを溶出容量とした。【０１４２】
その結果、純水で洗浄したアミノ化充填剤９のＯＶＡの溶出容量は６．５ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は１３．５ｍｌであった。一方、水酸化ナトリウム溶液に１２週間浸漬したアミノ化充填剤９を純水で良く洗浄した、洗浄後の当該アミノ化充填剤のＯＶＡの溶出容量は６．３ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は１３．２ｍｌであった。水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤９は、ＯＶＡで０．２ｍｌ、ＳＴＩで０．３ｍｌ溶出容量が減少した。この変化量は、誤差の範囲に近く、アミノ化充填剤９をアルカリ水溶液に浸漬しても溶出容量はほとんど変化しない結果であった。【０１４３】
比較例１
製造例１で得られた親水化基材１の耐アルカリ性を、実施例１に記載の方法に従って評価した。親水化基材１のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり１２５ミリ等量であった。【０１４４】
比較例２
製造例２で得られた親水化基材２の耐アルカリ性を、実施例１に記載の方法に従って評価した。親水化基材２のカルボキシル基生成量は、充填剤１リットル当たり１３７ミリ等量であった。【０１４５】
比較例３
製造例１で得られたアミノ化充填剤１のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤１のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり１２８ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤１の耐アルカリ性を、実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１４６】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤１のＢＳＡ結合量は３５．６ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤１のＢＳＡ結合量は０．６ｍｇ／ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬することにより、アミノ化充填剤１の吸着量がマイナス３５．０ｍｇ／ｍｌもの大幅な低下を来たした事を確認した。【０１４７】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤１のＯＶＡの溶出容量は１７．８ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２５．９ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤１のＯＶＡの溶出容量は４．６ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は７．８ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤１はＯＶＡでマイナス１３．２ｍｌ、ＳＴＩでマイナス１８．１ｍｌと大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤１をアルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。【０１４８】
比較例４
製造例２で得られたアミノ化充填剤２のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤２のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり１１９ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤２の耐アルカリ性を、実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１４９】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤２のＢＳＡ結合量は３３．９ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤２のＢＳＡ結合量は１．０ｍｇ／ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬することにより、アミノ化充填剤２の吸着量がマイナス３２．９ｍｇ／ｍｌもの大幅な低下を来たした事を確認した。【０１５０】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤２のＯＶＡの溶出容量は１６．６ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２２．３ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤２のＯＶＡの溶出容量は４．９ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は８．４ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤２はＯＶＡでマイナス１１．７ｍｌ、ＳＴＩでマイナス１３．９ｍｌと大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤２をアルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。【０１５１】
比較例５
製造例３で得られたアミノ化充填剤３のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤３のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり１０６ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤の耐アルカリ性、及び硬さを、実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１５２】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤３のＢＳＡ結合量は３０．７ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤３のＢＳＡ結合量は０．７ｍｇ／ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤３の吸着量がマイナス３０．０ｍｇ／ｍｌもの大幅な低下を来たした事を確認した。【０１５３】
＜アミノ化充填剤の硬さ＞
アミノ化充填剤３の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤３（体積平均粒子径：７６μｍ、標準偏差：１２．１μｍ）を内径１０．７ｍｍ長さ１５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例５に記載の方法と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果流速が６ｍｌ／ｍｉｎ（線流速４００ｃｍ／ｈｒ）を越えると流速と圧力損失の関係は直線からずれ始め、圧力の上昇が激しくなった。そして、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速では圧力損失の影響が大きく、流せない状態であった。【０１５４】
比較例６
製造例８で得られたアミノ化充填剤８の耐アルカリ性の評価を、実施例９に記載の酸性タンパク質の溶出容量測定法に従って行った。その結果は以下の通りであった。【０１５５】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水で洗浄したアミノ化充填剤８のＯＶＡの溶出容量は７．５ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は１５．８ｍｌであった。一方、水酸化ナトリウム溶液に１２週間浸漬したアミノ化充填剤８のＯＶＡの溶出容量は２．５ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は４．４ｍｌであった。水酸化ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤８はＯＶＡでマイナス５．０ｍｌ、ＳＴＩでマイナス１１．４ｍｌ溶出容量が少なくなり、殆ど保持されなくなる事が判った。【０１５６】
実施例１０
製造例１０で得られた親水化基材１０の親水性と耐アルカリ性を、実施例１に記載の方法に従って評価した。その結果、タンパク質の回収率は何れも９５％以上であり、親水化基材１０は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材１０のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり２５．５ミリ等量であった。【０１５７】
実施例１１
製造例１１で得られた親水化基材１１の親水性と耐アルカリ性を、実施例１に記載の方法に従って評価した。その結果、タンパク質の回収率は何れも９５％以上であり、親水化基材１１は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材１１のカルボキシル基生成量は、基材１リットル当たり２８．０ミリ等量であった。【０１５８】
実施例１２
製造例１２で得られたアミノ化充填剤１２のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤１２のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり７５ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤の耐アルカリ性を実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１５９】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤１２のＢＳＡ結合量は３４．８ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤１２のＢＳＡ結合量は２９．０ｍｇ／ｍｌであった。その差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は５．８ｍｇ／ｍｌと小さい事を確認した。【０１６０】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬したアミノ化充填剤１２のＯＶＡの溶出容量は１８．２ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２７．２ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤１２のＯＶＡの溶出容量は１６．４ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２４．８ｍｌであった。すなわちアルカリによってＯＶＡで１．８ｍｌ、ＳＴＩで２．６ｍｌ溶出容量が減少することが判った。つまり、アミノ化充填剤１２をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力変化は少ない事を確認した。【０１６１】
実施例１３
製造例１５で得られた４級アンモニウム化充填剤１５のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、４級アンモニウム化充填剤１５のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり９５ミリ等量であった。また、４級アンモニウム化充填剤１５の耐アルカリ性を実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１６２】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬した４級アンモニウム化充填剤１５のＢＳＡ結合量は４３．５ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬した４級アンモニウム化充填剤１５のＢＳＡ結合量は３７．４ｍｇ／ｍｌであった。その差、すなわち、アルカリによるタンパク質結合量の低下は６．１ｍｇ／ｍｌと小さい事を確認した。【０１６３】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬した４級アンモニウム化充填剤１５のＯＶＡの溶出容量は２０．４ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は３１．０ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬した４級アンモニウム化充填剤１５のＯＶＡの溶出容量は１８．４ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は２８．１ｍｌであった。すなわち、アルカリによってＯＶＡで１．８ｍｌ、ＳＴＩで２．６ｍｌ溶出容量が減少することが判った。つまり、４級アンモニウム化充填剤１５をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力変化は少ない事を確認した。【０１６４】
実施例１４
製造例１３で得られたスルフォン化充填剤１３のイオン交換容量を以下に示す方法で測定した。すなわち、実施例１に記載した要領で、スルフォン化充填剤１３を１０ｍｌ測り取り、これを１Ｎ塩酸、純水の順によく洗浄し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液による滴定で測定した。その結果、スルフォン化充填剤１３のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり９０．０ミリ等量（ｐＨ７．０）であった。【０１６５】
次に、スルフォン化充填剤１３の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。すなわち、水酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しのスルフォン化充填剤１３のイオン交換容量を、ｐＨ３．５及び８．５においてそれぞれ測定し、ｐＨ３．５とｐＨ８．５間のイオン交換容量差により、耐アルカリ性を評価した。つまり、（メタ）クロイル系モノマー重合体からなる充填剤では、スルフォン酸基はｐＨ３．５以下でほぼイオン化するが、カルボン酸基はｐＨ３．５以上でないとイオン化せず、ｐＨ３．５以上でイオン化を始め８．５までにほぼ完全にイオン化する。したがって、ｐＨ３．５と８．５間のイオン交換容量差の変化からエステル加水分解で生じるカルボン酸量が測定できる。また、ｐＨ３．５のイオン交換容量変化でスルフォン酸基の放出量が測定できる。なお、水酸化ナトリウム水溶液浸漬の条件は、浸漬期間は１２週間とする以外は、実施例１の親水化基材における耐アルカリ性の評価方法と同じ条件とした。【０１６６】
その結果、純水に浸漬したスルフォン化充填剤１３の、ｐＨ３．５及び８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ８６．２ミリ等量と９０．５ミリ等量であった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したスルフォン化充填剤１３では、ｐＨ３．５及び８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ８５．８ミリ等量と９０．８ミリ等量であった。したがって、スルフォン酸基の放出量及びカルボン酸生成量はそれぞれ０．４ミリ等量と５．０ミリ等量と非常に少なく、スルフォン化充填剤１３が安定である事が確認された。【０１６７】
実施例１５
製造例１４で得られたカルボキシメチル化充填剤１４のイオン交換容量を、実施例１４に記載の方法に従って測定した。その結果、カルボキシメチル化充填剤１４のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり６４．５ミリ等量（ｐＨ８．５）であった。【０１６８】
次に、該カルボキシメチル化充填剤の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。すなわち、水酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しのカルボキシメチル化充填剤のｐＨ８．５におけるイオン交換容量の変化で測定した。但し、この方法では、カルボキシメチル基を含有するエステル基の加水分解によりカルボン酸が生成するため、充填剤のアルカリ耐性を正確には測定できないと考えられるが、他に適当な方法がないため、この方法で評価することとする。なお、水酸化ナトリウム水溶液浸漬の条件は、浸漬期間を１２週間とする以外は、実施例１の親水化基材における耐アルカリ性評価と同じ条件とした。【０１６９】
その結果、純水に浸漬したカルボキシメチル化充填剤１４のｐＨ８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量は６４．５ミリ等量であった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したカルボキシメチル化充填剤１４では、６４．５ミリ等量であった。すなわち、イオン交換容量には全く変化が無かった。【０１７０】
比較例７
製造例１８で得られた４級アンモニウム化充填剤１８のイオン交換容量を、実施例５に記載の方法に従って測定した。その結果、４級アンモニウム化充填剤１８のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり１２９ミリ等量であった。また、４級アンモニウム化充填剤１８の耐アルカリ性を実施例５に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。【０１７１】
＜ＢＳＡ結合量＞
純水に浸漬した４級アンモニウム化充填剤１８のＢＳＡ結合量は３８．８ｍｇ／ｍｌ、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬した４級アンモニウム化充填剤１８のＢＳＡ結合量は１．４ｍｇ／ｍｌであった。１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬した４級アンモニウム化充填剤１８の吸着量は、マイナス３７．４ｍｇ／ｍｌもの大幅な低下を来たした事を確認した。【０１７２】
＜酸性タンパク質の溶出容量＞
純水に浸漬した４級アンモニウム化充填剤１８のＯＶＡの溶出容量は２１．８ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は３３．２ｍｌであった。一方、１２週間水酸化ナトリウムに浸漬した４級アンモニウム化充填剤１８のＯＶＡの溶出容量は５．６ｍｌ、ＳＴＩの溶出容量は１０．２ｍｌであった。すなわちアルカリによってＯＶＡでマイナス１６．２ｍｌ、ＳＴＩでマイナス２３．０ｍｌと大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、４級アンモニウム化充填剤１８をアルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。【０１７３】
比較例８
製造例１６で得られたスルフォン化充填剤１６のイオン交換容量を、実施例１４に記載の方法に従って測定した。その結果、スルフォン化充填剤１６のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり９５．４ミリ等量（ｐＨ７．０）であった。【０１７４】
次に、実施例１４に記載の方法に従ってスルフォン化充填剤１６の耐アルカリ性を評価した。その結果、純水に浸漬したスルフォン化充填剤１６の、ｐＨ３．５及び８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ９１．２ミリ等量と９６．４ミリ等量であった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したスルフォン化充填剤１６では、ｐＨ３．５及び８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ５８．６ミリ等量と１０２．８ミリ等量であった。したがって、スルフォン酸基の放出量及びカルボン酸生成量はそれぞれ３２．６ミリ等量と４４．２ミリ等量であり、多くのエステル加水分解が起こりスルフォン酸基を含有するアルコールが放出された事が確認された。【０１７５】
比較例９
製造例１７で得られたカルボキシメチル化充填剤１７のイオン交換容量を、実施例１４に記載の方法に従って測定した。その結果、カルボキシメチル化充填剤１７のイオン交換容量は、充填剤１リットル当たり６８．８ミリ等量（ｐＨ８．５）であった。【０１７６】
次に、カルボキシメチル化充填剤１７の耐アルカリ性を実施例１５に記載の方法に従って評価した。なお、水酸化ナトリウム水溶液浸漬の条件は、浸漬期間を１２週間とする以外は、実施例１における親水化基材の耐アルカリ性の評価方法と同じ条件とした。【０１７７】
その結果、純水に浸漬したカルボキシメチル化充填剤１７のｐＨ８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量は６８．８ミリ等量であった。一方、１２週間水酸化ナトリウム溶液に浸漬したカルボキシメチル化充填剤１７では、ｐＨ８．５における充填剤１リットル当たりのイオン交換容量は９６．４ミリ等量であった。すなわち、イオン交換容量は２７．６ミリ等量増加していた。この増加はカルボキシメチル基を含有しないエステル基の加水分解で新たにカルボン酸が生成したためであり、エステル基の加水分解が進行している事を示している。【０１７８】
以上の実施例、比較例の結果をそれぞれ表４〜表７に併せて示す。【０１７９】
【表４】
0005315691.tif 000008
【０１８０】
【表５】
0005315691.tif 000009
【０１８１】
【表６】
0005315691.tif 000010
【０１８２】
【表７】
0005315691.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
高速・高分離に適用可能な機械強度を有し、かつタンパク質に対して非特異的吸着を引き起こさないために十分な親水性を有し、更に、高濃度のアルカリ水溶液に浸漬してもタンパク質の吸着量、保持力等の変化の小さい新規充填剤が提供される。これらは水溶液に溶解した物質（特にタンパク質）との吸着・脱着作用を示し、目的物質の捕集や液体クロマトグラフィー法に利用できる。
なお、２００５年６月９日に出願された日本特許出願２００５−１６９１１１号の明細書、特許請求の範囲、及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。