(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
長循環性非ペギレート化リポソームの製造方法であって、以下の工程、
（1） １種以上のリン脂質と、１種以上のステロールとを、溶媒又は溶媒の混合物に溶解する工程であって、前記１種以上のリン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、水素化大豆ホスファチジルコリン（HSPC）及びこれらの混合物から成る群より選択される工程、
（2） 前記溶媒又は溶媒の混合物を除去し、水性水和媒体をリン脂質及びステロールに添加するか、又は、水性水和媒体を前記溶液中の前記リン脂質及びステロールに添加し、溶媒又は溶媒の混合物を除去する工程、
を含み、
前記水性水和媒体が、硫酸アンモニウム及びスクロースから本質的になり、使用される前記水性水和媒体の量が、存在するリン脂質各ミリモルに対して10〜35mlの範囲内であって、親水性ポリマーを含まない長期循環性リポソームを形成し、前記水和したリポソーム組成物におけるリポソームが、０．０６μｍ〜０．２μｍにサイズ調整されており、そして塩酸ヒスチジンとスクロースを含むスクロース−ヒスチジン緩衝溶液を用いて、サイズ調整されたリポソーム組成物からリポソーム外硫酸アンモニウムが分離され、前記非ペギレート化リポソームが、ドキソルビシンを充填された場合であって、スイスアルビノマウスで等用量で試験した場合、非リポソーム化ドキソルビシン製剤であるADRIAMYCIN（登録商標）の血液中循環時間より少なくとも25倍長い血液中循環時間を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記水性水和媒体中の硫酸アンモニウムの濃度が、125ミリモル／リットル以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水性水和媒体中のスクロースの濃度が、０．１Ｍ〜０．５Ｍである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記スクロースの濃度が、０．２５Ｍ〜０．３Ｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スクロースの濃度が、０．２９Ｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リポソーム外水和塩が、透析緩衝溶液を使用して前記リポソーム組成物から除去される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
使用される水性水和媒体の量が、前記脂質溶液におけるリン脂質の各ミリモル当り２０〜３０ｍｌである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
使用される水性水和媒体の量が、前記脂質溶液におけるリン脂質の各ミリモル当り３０ｍｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン脂質のステロールに対するモル比が、１：0.1〜１：２である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
リン脂質のステロールに対するモル比が、１：0.7である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
更に、前記リポソームに、治療薬又は診断薬を装填する工程を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記治療薬が、抗腫瘍薬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗腫瘍薬が、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、及び塩酸エピルビシンから成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗腫瘍薬が、塩酸ドキソルビシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）であり、かつ前記ステロールが、コレステロールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソーム中に封入されるドキソルビシンの濃度が、塩酸ドキソルビシンとして表して１mM〜10mMである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ドキソルビシンの濃度が、３mM〜７mMである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドキソルビシンの濃度が、３．４５mMである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドキソルビシンの濃度が、６．９mMである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ジステアロイルホスファチジルコリン：コレステロールのモル比が、１：０．６〜１：０．８である、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
封入されたドキソルビシン（塩酸塩として）：ジステアロイルホスファチジルコリンのモル比が、１：２〜１：１５である、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
封入されたドキソルビシン（塩酸塩として）：ジステアロイルホスファチジルコリンのモル比が、１：３．５である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）水和リポソーム組成物におけるリポソームをサイズ調整し、
（ｂ）塩酸ヒスチジン及びスクロースを含有するスクロース−ヒスチジン緩衝液を使用して、サイズ調整されたリポソーム組成物から、リポソーム外硫酸アンモニウムを除去し、（ｃ）リポソーム外硫酸アンモニウムのないリポソーム組成物を、塩酸ヒスチジン及びスクロースを含有するスクロース−ヒスチジン緩衝液に溶解している少なくとも２５ｍＭの塩酸ドキソルビシンの溶液と混合して、ドキソルビシンの装填されたリポソーム組成物を得、及び
（ｄ）リポソーム外塩酸ドキソルビシンを前記リポソーム組成物から分離する、
請求項１６〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
リポソーム外硫酸アンモニウムを除去するための等張性緩衝液におけるスクロース：塩酸ヒスチジンのモル比が、29：0.1〜29：10である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記スクロースの濃度が、0.1Ｍ〜0.5Ｍである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒスチジン塩酸塩の濃度が、８mM〜12mMである、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載の方法で製造されるリポソーム。
【請求項２９】
請求項１４に記載の方法で調製された非ペギレート化ドキソルビシンリポソーム、塩酸ヒスチジン及びスクロースを含有することを特徴とする非経口投与用の長循環性非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物。
【請求項３０】
非ペギレート化塩酸ドキソルビシンリポソーム、塩酸ヒスチジン、スクロース及び硫酸アンモニウムを含有する非経口投与用の長循環性非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物であって、前記非ペギレート化ドキソルビシンリポソームが、親水性ポリマーを含まず、塩酸ドキソルビシン、コレステロール、スクロース、及びジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、水素化大豆ホスファチジルコリン（HSPC）及びその混合物からなる群より選択されるホスファチジルコリンを含み、塩酸ドキソルビシンが、０．０６μｍ〜０．１６μｍの平均粒径を有するリポソームに封入されており、そして前記非ペギレート化ドキソルビシンリポソームが、スイスアルビノマウスで等用量で試験した場合、非リポソーム化ドキソルビシン製剤であるADRIAMYCIN（登録商標）の血液中循環時間より少なくとも25倍長い血液中循環時間を有することを特徴とするリポソーム組成物。
【請求項３１】
前記ドキソルビシン（塩酸塩として）が、２mg／mlで存在し、前記ドキソルビシンのリン脂質に対するモル比が、１：3.5であり、かつ前記リン脂質のコレステロールに対する比が、１：0.7である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ドキソルビシン（塩酸塩として）が、４mg／mlで存在し、前記ドキソルビシンのリン脂質に対するモル比が、１：3.5であり、かつ前記リン脂質のコレステロールに対する比が、１：0.7である、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、診断又は治療薬を収容かつ送達するために使用可能な非経口投与用非ペギレート化(pegylated)長循環性リポソーム及びその製造に関する。
（発明の背景）
リポソームは、通常リン脂質及び／又はステロールから構成され、かつ水性区画周囲の脂質二重層を基礎とした小胞構造から成る。リポソームは、大きさ、表面電荷、及びリン脂質組成のようなその物理化学的性質で広範に変化する。
リポソームは、診断又は治療薬の可能性のある担体としてますます注目を受けている。例えば、リポソームを用いて、Gd:ジエチレントリアミン五酢酸キレート(Gd-DTPA)(例えば米国特許第6,132,763号参照)のような磁気画像処理用造影剤のような診断薬及び種々多様な新生物に対して顕著な活性を示すことが分かっているアントラサイクリン薬のような治療薬を送達している。(例えば米国特許第4,769,250号参照)。
しかし、リポソームは、その種々の血漿タンパク質との相互反応によって血液内で凝集を引き起こし、かつ網内系(RES)によって捕獲される。例えば、肝臓内のKupfer細胞又は脾臓内の固定化マクロファージは、リポソームが意図した標的に達する前にリポソームを吸収する。RESによる捕獲は、組織又は細胞を標的にしたリポソームの選択的送達を非常に困難にしている。
RESによる捕獲に加え、リポソームは血漿タンパク質と静電気的、疎水的、及びファンデルワールス相互作用を受けやすい。これら相互作用の結果、リポソームの不安定化となり、多くの場合その標的に達する前に、該小胞の循環からの急速なクリアランスにつながる。
【０００２】
また、リポソームと細胞及びタンパク質の相互作用に加え、リポソームのリン脂質と薬物の相互作用のため、特定の薬物を封入するリポソームの製造で困難が生じている。例えば、アントラサイクリンは、リン脂質小胞二重層に対して、リポソーム小胞を漏出させ、かつリン脂質小胞を不安定にする界面活性剤又は洗浄剤様効果を示した。従って、循環環境及び／又はその内容物に不安定なリポソームは、腫瘍部位に到達する前、時期尚早に抗腫瘍薬を漏出するだろう。“漏出性”リポソーム及びその結果の荒廃的毒性の結果として、科学者は、腫瘍部位に血管外遊出することができ、事実上非常に血管性である長循環性リポソームの開発を試みている。
最も一般的に用いられる抗癌薬は腫瘍細胞に特異的に毒性ではなく、それらが接するすべての組織に毒性なので、その正常組織との相互作用の結果として望ましくない副作用を引き起こす。例えば、塩酸ドキソルビシンは、癌の化学療法で使用される最も一般的に用いられる細胞毒性アントラサイクリン抗生物質の１つであり、種々多様な新生物に対する活性が分かっている。塩酸ドキソルビシンは、多くの固体腫瘍及び白血病の治療で有効である。それは、特に多療法を含む乳癌の治療で有効である。塩酸ドキソルビシンは、AIDS関連カポジ肉腫のプロトコル療法である。塩酸ドキソルビシンは、卵巣、肺、精巣、前立腺、子宮頚部、頭頚部、エストロゲン肉腫及びユーイング肉腫の腫瘍に対しても顕著な活性を有する。
塩酸ドキソルビシンの通常の組成物は凍結乾燥製品又は塩酸ドキソルビシンの水溶液として入手可能である。凍結乾燥製品は、投与前に注射用水と再構成する必要がある。これら両市販製品は、静脈内投与のとき、いくつかの毒性と関係している。重度な骨髄抑制は通常、用量制限因子である。他の毒性として吐き気及び嘔吐、脱毛、粘膜炎（口内炎及び食道炎含む）及び心臓傷害性が挙げられ、塩酸ドキソルビシンの使用を制限しうる。塩酸ドキソルビシンは強力な発疱剤であり、注射部位又は皮膚が露出している部位で血管外遊出及び壊死を引き起こしうる。“ドキソルビシンフレア(flare)”は一般的でなく、注射部位の紅斑性線条の特徴がある。“ドキソルビシンフレア”は、通常約半時間で静まる。
【０００３】
塩酸ドキソルビシンの作用の機構は正確に知られてないが、多くの可能性が研究かつ記載されている。主機構は、塩酸ドキソルビシンのDNAにインターカレートする能力に関係している。DNAの統合性が有意に損なわれ、通常DNA機能の変化をもたらす。DNAとの塩酸ドキソルビシンインターカレーションのため単鎖及び二重鎖ブレーキも一般的である。塩酸ドキソルビシンの別の機構は、DNAや細胞膜損傷を誘発するフリーラジカルを生成するその能力に関係している。塩酸ドキソルビシンは、トポイソメラーゼIIをも阻害し、DNAの再生を無効にする。
塩酸ドキソルビシンの結果として生じるいくつかの毒性作用として、心臓毒性、アナフィラキシー反応、催嘔吐性、骨髄抑制、ムコシティス(muccocytis)、皮膚毒性、脱毛、及び注射部位に対する毒性が挙げられる。（Cancer Investigation, 19 (4): 424-436 (2001)）。理論では、薬物を腫瘍及び腫瘍細胞近傍に効率的に送達かつ放出する長期循環システム（遅い放出）がより有利である。従って、塩酸ドキソルビシンのような薬剤を封入して、健康又は非癌組織にその内容物を時期尚早に放出しない安定したリポソームがあれば望ましい。
【０００４】
リポソームの循環時間を増やし、ひいてはリポソームの内容物を標的組織に確実に送達する試みに取り込まれるいくつかのアプローチとして以下のことが挙げられる：シアリン酸残基コーティングを用いて細網内皮系認識からリポソームをマスクすること(米国特許第4,501,728号)；スフィンゴミエリン又は５〜20％の糖脂質を含有する飽和アシル鎖を優先的に有する天然リン脂質でリポソーム膜を堅くすること(米国特許第4,920,016号)；薬剤と、二重層と、クエン酸を含有する放出阻害緩衝液との３区画系内で伝統的リポソーム製剤より３〜80倍高い薬物対脂質比のリポソームを形成すること(米国特許第6,083,530号)；リポソームにコレステロールを取り込むこと(Alberto A. Gabizon, Cancer Investigation, 19(4) 424-436 (2001))；及びポリエチレングリコールを有するリン脂質を誘導体化すること(ペギレート化リポソーム(pegylated liposomes))(米国特許第5013556号及び第6132763号)。
【０００５】
不運なことに、上記アプローチは、リポソームの生体内循環時間を延長する可能性の限界を示すだけだった。例えば、リポソームのシアリン酸によるマスキングは、生体内リポソームの循環半減期を延長する制限された能力を有するだけだった(米国特許第4,920,016号)。これら問題を克服するため、科学者はポリエチレングリコール(PEG)のような親水性ポリマーでリポソーム表面を被覆して、リポソーム表面への種々の血漿たんぱく質の吸着を阻止した(例えば米国特許第5,013,556号、及び米国特許第5,676,971号参照)。これらペギレート化リポソームは立体的安定型リポソーム又はステルス(stealth)リポソームと呼ばれている。ペギレート化リポソームは、その内容物の放出によって生じる毒性効果をいくらか減らすようだが、不運なことに、ポリエチレングリコールの存在に起因する新たな毒性効果が現れた。例えば、ペギレート化リン脂質を含有するリポソーム製剤は、一般に“手足症候群(Hand-Foot syndrome)”として知られる皮膚毒性を招来し、結果として手のひら及び足の裏の発疹/潰瘍をもたらす(Kenneth B. Gordon, Cancer, Vol. 75(8), 1995, 2169-2173)。
【０００６】
ペギレート化リポソームの別の欠点は、リポソーム表面上の大分子(PEG)の存在がリポソームと細胞との相互作用を減らし、かつ腫瘍組織へのリポソームの入口を隠すことによって、おそらく腫瘍組織内でのリポソーム薬物の蓄積を減らしうることである(Clinical Cancer Research, (5), 1999, 3645-3652)。
従って、“手足症候群”のような有害効果を生じさせない安定した長循環性リポソーム並びにこのようなリポソーム及びそれを基礎とする組成物の製造方法が要望されている。本発明は、この要望を満たすのみならず、本発明のリポソームを投与することによる種々の状態の治療方法を提供する。
従って、本発明の主目的は、長い循環時間を有し、かつ手足症候群を生じさせないリポソームドキソルビシン組成物を開発することである。本発明の別の目的は、吐き気、嘔吐、脱毛のようなドキソルビシンの投与に伴う毒性及び他の副作用を低減することである。本発明の更に別の目的は、ドキソルビシンのような抗腫瘍薬の該組成物を担持するリポソームを開発することである。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、長循環性非ペギレート化リポソームの製造方法であって、以下の工程：
１種以上のリン脂質と、ステロールと、溶媒とを含む脂質溶液から溶媒を蒸発させることによって脂質膜を形成する工程；この脂質膜を水性水和媒体で水和する工程であって、使用する水性水和媒体の量が、前記脂質溶液中に存在するリン脂質の各ミリモルに対して10〜35mlの範囲内である工程；を含む方法を提供する。
好ましくは使用する水性水和媒体の量は、脂質溶液中のリン脂質の各ミリモルに対して30mlである。
本発明は、更に長循環性非ペギレート化サイズ調整(sized)リポソームの製造方法であって、１種以上のリン脂質とステロールを溶媒又は溶媒混合物に溶かす工程；水性水和媒体の添加によって前記脂質を水和する前又は後に、前記溶媒を除去して非ペギレート化リポソームを形成する工程（ここで、使用する前記水性水和媒体の量は、前記脂質溶液中に存在するリン脂質の各ミリモルに対して10〜35mlの範囲内である）；前記非ペギレート化リポソームを約0.06μm〜0.16μmにサイズ調整してリポソーム組成物を形成する工程；及びスクロース-ヒスチジン緩衝溶液を用いて、前記脂質組成物からリポソーム外水和塩を除去して非ペギレート化サイズ調整リポソームを形成する工程；を含む方法を提供する。
非ペギレート化リポソームの製造方法は、更に前記リポソームに治療薬又は診断薬を装填する工程を含みうる。好ましくは、治療薬は塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、及び塩酸エピルビシンのような抗腫瘍薬である。塩酸ドキソルビシンが更に好ましい。
好ましくは、ステロールに対するリン脂質のモル比は、約１：0.1〜１：２、更に好ましくは約１：0.7である。
好ましい水性水和媒体は、硫酸アンモニウムとスクロースを含み、かつ水性水和媒体中の硫酸アンモニウムの濃度は125mmols/リットル以上である。
好ましいリン脂質は、約40℃〜60℃の相転移温度を有し、最小16炭素の脂肪酸鎖を有し、かつジステアロイルホスファチジルコリン(Distearoyl phosphatidylcholine)(DSPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(Dipalmitoyl phosphatidylcholine)(DPPC)、水素化大豆ホスファチジルコリン(Hydrogenated soya phosphatidylcholine)(HSPC)及びこのようなリン脂質の誘導体から成る群より選択される。好ましいリン脂質は、ジステアリルホスファチジルコリン(DSPC)であり、好ましいステロールはコレステロールである。
【０００８】
本方法は、非ペギレート化リポソームをサイズ調整する工程をも含みうる。好ましくは0.4μm〜0.05μmの細孔サイズを有するフィルターを連続的に通す押出しによってサイズ調整する。
本発明の別の実施形態は、本明細書で述べる方法によって得られるリポソームを提供する。
本リポソームは、その製造方法で述べた比率の成分を含み、そのようにして得たリポソームの平均サイズは0.06μm〜0.16μmである。
【０００９】
本発明は、非ペギレート化ドキソルビシン非ペギレート化リポソーム、塩酸ヒスチジン、及びスクロースを含み；
前記ドキソルビシン非ペギレート化リポソームは塩酸ドキソルビシンに加え、ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール、スクロースを含み；前記リポソームは平均サイズ0.06μm〜0.160μmを有し；かつ
前記非ペギレート化ドキソルビシンリポソームは、等用量でスイスアルビノマウス(swiss albino mice)で試験した場合、ADRIAMYCINで得られる循環時間の少なくとも25倍長い血液内循環時間を有する、非経口投与用長循環性非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物をも提供する。
リポソーム内に封入される塩酸ドキソルビシン濃度は１〜10mM、好ましくは３mM〜７mM、更に好ましくは6.9mM、最も好ましくは3.45mMである。
ジステアロイルホスファチジルコリンのコレステロールに対するモル比は、１：0.6〜１：0.8、好ましくは１：0.7である。
塩酸ドキソルビシンのジステアロイルホスファチジルコリンに対するモル比は、好ましくは１：２〜１：15、更に好ましくは１：3.5である。
スクロース濃度は、好ましくは0.1Ｍ〜0.5Ｍ、更に好ましくは0.25Ｍ〜0.3Ｍである。
塩酸ヒスチジンの濃度は１mM〜100mM、好ましくは８〜12mM、更に好ましくは約10mMである。
リポソームの好ましい平均サイズは0.08μm〜0.12μmである。
典型的組成物は、塩酸ドキソルビシンが２mg/mlで存在し；かつドキソルビシンのリン脂質に対するモル比が約１：3.5であり；かつリン脂質のコレステロールに対するモル比が約１：0.7である。
別の典型的組成物は、塩酸ドキソルビシンが４mg/mlで存在し、かつドキソルビシンのリン脂質に対するモル比が約１：3.5であり、かつリン脂質のコレステロールに対するモル比が約１：0.7である。本組成物の血中循環時間(ｔ1/2)は、等用量でスイスアルビノマウスで試験した場合、ADRIAMYCINで得られる循環時間の好ましくは40倍より長い。
本発明は、本発明の組成物を投与する工程を含む、腫瘍成長の低減方法をも提供する。
本発明は、長循環性非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物の製造方法をも提供する。
本発明の組成物は新規であり、今までに報告されていない。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、安定した長時間性非ペギレート化リポソーム、及びその製造を提供する。ペギレート化リポソームは、ポリエチレングリコール(PEG)で被覆したリポソームである。このリポソームの表面は数千のPEGの鎖、“ペギレート化(pegylation)”と呼ばれるプロセスで装飾されている。PEG鎖は、リポソームの表面を“毛髪状”にし、これはリポソームの血液タンパク質の表面への早い吸着を妨げる。この早い吸着がリポソームの血液からの早い除去を加速する。対照的に、ペギレート化リポソームは保護され、ずっとおそい速度で血液から除去される。PEGなしで作ったリポソームに比し、ペギレート化リポソームは、より安定かつ細網内皮系(RES)の細胞によって広範囲に取り込まれず、循環内にある間に、封入されている物質又は薬物を漏出する傾向が低い。例えば、ドキソルビシンを封入するPEG-リポソームの薬物速度論は、長循環性半減期、遅い血漿クリアランス、及び非ペギレート化リポソームドキソルビシン又はフリーなドキソルビシンと比較して減少した量の分布を特徴とする。長循環と、腫瘍脈管構造の中を通って血管外遊出するペギレート化リポソームの能力は、特に高い血管原性の腫瘍内での薬物蓄積が増強するため、高確率の強い腫瘍応答を有する、腫瘍組織内でのドキソルビシンの局在化をもたらす。また、ペギレート化リポソームの伝統的リポソームを越えた高い安定性の結果、感受性器官の組織内での薬物のアベイラビリティを減らし、それによって毒性や吐き気、嘔吐、及び脱毛のような他の副作用の低減となる。しかし、“手足症候群”として知られる、皮膚の発疹又は潰瘍が手のひらと足の裏に観察される重篤な副作用がペギレート化リポソームの臨床使用から生じることが報告されている(Kenneth B. Gordon, Cancer, Vol. 75(8), 1995, 2169-2173)。ペギレート化リポソームによる別の欠点は、リポソーム表面上の大分子(PEG)の存在がリポソームと細胞の相互作用を減らし、腫瘍組織へのリポソームの入口を隠し、それによって、おそらく腫瘍組織内でのリポソーム薬物の蓄積を減らしうることである。
【００１１】
本発明の方法は、長循環半減期を有するペギレート化リポソームの安定性と、低減した上記毒性を示す安定した長循環性の低毒性非ペギレート化リポソームを提供する。しかし、本発明のリポソームはPEGの使用を必要とせずに上記結果を達成するので、本発明のリポソームは“手足症候群”を引き起こさない。
本発明の方法では、脂質の水和は、脂質を溶かすために用いる溶媒の蒸発前に行うことができ、或いは溶媒の蒸発後に行ってもよい。本発明に好適な溶媒は、リン脂質を溶解できる有機溶媒である。当該技術の当業者は、リポソームの製造で常用され、かつ適切な溶媒を識別する。典型的な好適溶媒として、限定するものではないが、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、メタノール、アセトンが挙げられる。
脂質の水和を溶媒の蒸発後に行う場合、クロロホルム、塩化メチレンのような溶媒が好ましい溶媒である。
脂質の水和を溶媒の蒸発前に行う場合、エタノール、メタノール、アセトンのような水混和性溶媒が好ましい溶媒である。
水和を溶媒の蒸発後に行う場合、本方法は、１種以上のリン脂質と、ステロールと、溶媒又は溶媒混合物とを含む脂質溶液から溶媒を蒸発させることによって脂質膜を形成する工程を含む。
溶媒の蒸発は、限定するものではないが、溶液上に不活性ガス流を通すこと、加熱すること、真空、又は真空下加熱することによる蒸発のようないずれの蒸発法によっても達成することができる。一般的に、回転式エバポレーターフラスコを利用する。
【００１２】
水和を溶媒の蒸発前に行う場合、本方法は、溶媒を含有する水性リポソーム懸濁液からの溶媒の蒸発を含む。溶媒の蒸発は、限定するものではないが、溶液上に不活性ガス流を通すこと、加熱すること、真空、又は真空下加熱することによる蒸発のようないずれの蒸発法によっても達成することができる。一般に、回転式エバポレーターフラスコを利用する。溶媒又は溶媒混合物を蒸発させた後、水性懸濁液形態内にはリポソームのみが残る。
【００１３】
本発明では、リポソームを調製するために好適ないずれのリン脂質も使用しうる。好適なリン脂質として、リポソーム膜の浸透性を減らす傾向のあるものが挙げられる。長い脂肪酸鎖を有するリン脂質を含有するリポソームがより好適であり、より短い脂肪酸鎖を有するリン脂質で構成されるリポソームより薬剤のより遅い放出をもたらす。脂肪酸の炭素鎖長が増すにつれ、相転移温度も上昇する。より高い相転移温度のリン脂質で構成されるリポソームは、より低い相転移温度のリン脂質で構成されるリポソームより遅くその内容物を放出する。より高い相転移温度は、リン脂質膜が半透性なので、リポソームの内側から血流中への内容物の遅い放出を可能にする。膜の浸透性と安定性に影響する他のリン脂質特性として飽和及び荷電の度合が挙げられる。
好ましくは、本発明のリポソームは中性脂質を含有する。好ましくは、中性脂質は40℃〜65℃、更に好ましくは約50℃〜54℃の相転移温度を有する。好ましいリン脂質は、少なくとも16炭素の脂肪酸鎖を有する。
本発明の好適なリン脂質として、限定するものではないが、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、又はジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)又はこのようなリン脂質の誘導体が挙げられる。ホスファチジルコリンは好ましい中性脂質である。好ましいリン脂質は、一般的にジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)として知られる1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリンである。DSPCの分子量は790であり、分子式Ｃ44Ｈ88ＮＯ8Ｐを有する。
【００１４】
ステロール類をリン脂質と一緒にリポソーム中に組み入れて、リポソーム膜の堅さと浸透性を変える。典型的なステロールはコレステロール及びその誘導体又は類似体である。コレステロールはリポソーム膜の堅さを増し、かつ浸透性を減らす傾向がある。コレステロールは両親媒性分子であり、その水性表面に配向したヒドロキシル基でリン脂質膜内にそれ自体を挿入する。リポソーム膜に最適な浸透性を与えるが、膜の堅さも維持する濃度でコレステロールを組み入れる。リン脂質対コレステロール比の選択は、内容物のリポソームからの溶解速度を画定する。本発明のリポソームは１：0.1〜１：２の範囲のリン脂質のステロールに対するモル比を有する。好ましくは、範囲は１：0.5〜１：1.5である。ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)がリン脂質で、かつコレステロールがステロールの場合、好ましいリン脂質のステロールに対するモル比は、１：0.6〜１：0.8である。好ましモル比は約１：0.7である。
溶媒又は溶媒混合物は真空下で蒸発させる。水和を溶媒の除去後に行う方法では、形成された脂質膜を水性水和媒体で水和してリポソームを形成する。撹拌しながら或いはミキシング下で水性水和媒体を加えて脂質膜を水和してリポソームを形成する。当業者は、利用に好適な水性水和媒体を認識している。好ましい水性水和媒体は、後に種々の薬剤をリポソーム内に装填するときに補助するためのプロセスで化学的勾配を確立するために利用しうるように緩衝液／塩を含有する。典型的な水性水和媒体として、限定するものではないが、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムが挙げられる。好ましい水性水和媒体は、硫酸アンモニウムを含む。また、水性水和媒体は、限定するものではないが、スクロース、塩化ナトリウム、デキストロース、又はマンニトールのような等浸透圧薬を含む。等浸透圧薬は、該溶液の他成分及びリポソーム自体と非反応性であることが好ましい。スクロースが最も反応性が低いので、等浸透圧薬は好ましくはスクロースである。水性水和媒体が硫酸アンモニウムを含む場合、好ましくは等浸透圧薬はスクロースである。スクロースはリポソーム膜を保護かつ堅くするときに役立ち、またリポソーム組成物の等張性を維持するためにも役立つ。
【００１５】
水性水和媒体の量は、従来のリポソーム及びペギレート化リポソーム製造で使用する水和媒体の量に比べて制御／低減される。水性水和媒体の量を減らすことによって、リン脂質が一緒により密接に詰まり、結果としてより厚いリポソーム膜又は“シェル”となる。より厚い“シェル”は、PEGを必要とせず、リポソーム内容物の安定した長循環性の遅い放出と低減した毒性を与える。使用する水和媒体の量が少ないほど、より密接にリン脂質が一緒に詰まり、かつより厚いシェルになる。“制御／低減”とは、本発明で使用する水性水和媒体の量が、以前に知られ又は一般に認められている水性水和媒体の量より少ないことを意味する。好ましく低減した量の水和媒体(すなわち、リン脂質各ミリモルに対して30ml)と好ましい濃度のコレステロールを使用すると、結果のリポソーム組成物は堅いリン脂質二重層を有するだろう。
この水和量の低減は、脂質溶液中に存在するリン脂質の１モル当たりに使用する緩衝液の量の比率の点から見ることもできる。本発明では、使用する水性水和媒体の量は、脂質溶液中に存在するリン脂質各ミリモルに対して10〜35mlの範囲内である。好ましくは、水性水和媒体の量は、脂質溶液中に存在するリン脂質各ミリモルに対して20〜30mlである。更に好ましくは、水性水和媒体の量は、脂質溶液中に存在するリン脂質各ミリモルに対して30mlである。
【００１６】
リポソームは、適切にサイズ調整する。当業者は、リポソームサイズ調整の適切な方法を認識している。加圧下均質化は該方法の１つである。別の好適な方法は、細孔サイズのフィルターを介してリポソームを押し出して所望のリポソームサイズと適合させることを含む。本発明のリポソームは密接に詰まった膜を有するので、サイズ調整は従来のリポソームによるより難しい傾向がある。従って、好ましくは細孔サイズをだんだん小さくする一連のフィルターを通してサイズ調整する。例えば、水和後、リポソームをまず0.40μmの細孔サイズに通した後、引き続き約0.05μmのより小さい細孔サイズのフィルターに通す。結果のリポソームは、0.06μm〜0.2μmの平均サイズ範囲を有する。好ましい平均サイズ範囲は0.08μm〜0.12μmである。
水和媒体中のリポソーム外塩をリポソームから除去又は洗浄する。透析媒体を用いる透析は、リポソーム外水和媒体塩を除去する典型的な方法である。透析では、いずれの適切な緩衝溶液も使用しうる。リポソーム組成物中に存在するリポソーム外塩の除去は、リポソーム膜を横断して内側から外側への化学的勾配を生じさせ、この勾配は後にリポソームの装填で必要とされる。リポソーム外塩を除去するための他の好適手段として限外濾過又はカラムクロマトグラフィーが挙げられる。
本発明のリポソームは、治療薬又は診断薬の長循環性の遅延放出送達機構を与える。いずれの既知の方法を用いても所望の治療薬又は診断薬をリポソームに装填することができる。典型的な方法として、脂質膜の水和前に脂質膜に薬剤を加えること、pH勾配によって、又は化学的勾配によって薬剤を直接水和媒体中に組み入れることが挙げられる。好ましい方法は、化学的勾配を用いて薬剤を装填することを含む。活性薬装填プロセスでリポソームを装填する場合、リン脂質の相転移温度より高いか又は等しい温度でブランクリポソーム懸濁液と薬物溶液を混合する。
【００１７】
化学的勾配を用いて、薬剤の量を容易に調節することができ、一旦薬剤をリポソームの内側に装填すると、リポソーム外媒体への漏出は最少である。更に、水和工程で緩衝液／塩を含有する水和媒体を使用する場合、該勾配を生じさせると、上述したようなリポソーム外水和媒体塩を除去後非常に便利になる。リポソーム装填で役立つ化学的勾配を生じさせるために使用しうるこのような典型的水和媒体の１つは、硫酸アンモニウムを含む。しかし、塩化ナトリウムで等張性にされている硫酸アンモニウム溶液による水和は(米国特許第5,316,771参照)、貯蔵時に漏出するリポソームをもたらす。リポソーム組成物のフリーな薬物含量は、貯蔵時に増え、ひいては毒性を増す。それゆえリポソーム膜を強くする必要がある。そこで、本発明は、該溶液の他成分及び水和媒体中のリポソーム自体と非反応性である等浸透圧薬の併用を提供する。好ましくは等浸透圧薬はスクロースである。スクロースの使用はリポソーム膜を保護することが分かった。スクロースは、リポソーム膜を保護し、堅くするときに役立ち、かつリポソーム組成物の等張性を維持するためにも役立つ。凍結乾燥前、脱水するためトレハロース、スクロース、マルトースのような糖類を用いてにリポソーム膜を保護している(米国特許第4,880,635号)。
【００１８】
従って、本発明は、より堅く、かつその中に封入した薬剤を貯蔵時に漏出しないリポソームを与える水和媒体として硫酸アンモニウムと共にスクロースを使用することを規定する。水和媒体にスクロースを添加すると、スクロースがリポソーム膜の内面と外面に残り、リポソーム膜の両面を堅くし、それによって薬物の漏出を減らす。水和媒体中のスクロースの濃度は、0.1Ｍ〜0.5Ｍであることが好ましい。0.25Ｍ〜0.3Ｍの濃度が好ましい。
水和媒体中の硫酸アンモニウムの濃度は、リポソームからの薬物漏出で重要な役割を演じる。水和のため又はリポソーム形成のために使用するときはいつでも125mM未満の濃度の硫酸アンモニウム溶液は貯蔵時の薬物漏出を示した。従って、好ましい製造方法では、水和媒体中の硫酸アンモニウムの濃度は125mMより高く、順次、貯蔵時の漏出が低減したリポソーム組成物を生成する。従って、好ましい方法では、硫酸アンモニウム溶液の濃度は、125ミリモル/リットル以上であり、かつ水和媒体はスクロースを含む。
透析を行うと、それはリポソーム外塩、すなわち硫酸アンモニウムを除去するが、リポソーム内硫酸アンモニウム塩を除去しないので、リポソーム膜を横断する内側から外側への化学的勾配を生じさせる。
【００１９】
薬物をリポソーム内に装填するためと、結果のリポソーム組成物を薬物の所望濃度に希釈するための両方で使用可能な多くの好適な緩衝溶液がある。リポソームは、約6.0〜8.0のほぼ中性のpHで安定なリン脂質を主に含むので、リポソームを装填及び希釈するために使用する緩衝溶液も中性pHを有するべきである。また、理想的には、緩衝溶液は非経口製剤に適さなければならない。薬物をリポソーム内に装填するため及びリポソーム組成物の希釈のために本発明で好適な、非経口製剤で最も一般的に用いられる緩衝溶液のいくつかは、グリシン、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、及びヒスチジン緩衝液である。中性範囲のpHで最も安定しているので、ヒスチジン緩衝溶液が好ましい。好ましくは、緩衝溶液は、29：0.1〜29：10、更に好ましくは約29：１のモル比でスクロースと塩酸ヒスチジンを含む。スクロースの使用は、リポソーム膜を保護及び堅くするときに役立ち、かつリポソーム組成物の等張性の維持でも役立つ。
リポソームに装填後、いずれの取り込まれない薬剤も除去する。好適な方法として、限定するものではないが、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析、微細孔スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー樹脂(DOWEX)による処理とその後のろ過が挙げられる。DOWEX処理は、その使用しやすさのため好ましい方法である。透析を使用する場合、好ましくはリポソーム外水和媒体塩を除去するときに上述したのと同様に行う。
【００２０】
上述したように、水性水和媒体の量を制御又は低減することによって、結果のリポソームは単位体積当たりのリン脂質含量が増加する。リン脂質含量の増加はリポソームの安定性を高め、浸透性を減じ、ひいてはいずれの取込み薬剤の放出も遅くする。
本発明のリポソーム内に装填するために好適な薬剤は、イオン性基を有する水溶性の両親媒性化合物である。両親媒性薬剤は親水性と親油性の両特性を示し、治療薬又は診断薬でよい。治療薬はいずれの所望の薬剤でもよく、抗腫瘍薬を含む。
抗腫瘍薬は、癌細胞の成長と伝播を阻止し、殺し、又は遮断する薬物である。多くの好適な抗腫瘍薬があり、そのいくつかとして、アルトレタミン(Altretamine)；アスパラギナーゼ；BCG；硫酸ブレオマイシン；ブスルファン；カルボプラチン；カルマスチン(Carmustine)；クロランブシル；シスプラチン-シス-白金、シス-ジアミン-ジクロロ白金；クラドリビン(Cladribine)、2-クロロデオキシアデノシン；シクロホスファミド；シタラビン-シトシンアラビノシド；ダカルバジンイミダゾールカルボキサミド；ダクチノマイシン；ダウノルビシン-ダウノマイシン、塩酸ダウノルビシン；デキサメタゾン；ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン；エピルビシン；エトポシド-エピポドフィロトキシン；フロクスリジン(Floxuridine)；フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルタミド(Flutamide)；フルダラビン(Fludarabine)；ゴセレリン；ヒドロキシウレア；イダルビシン HCL；イホスファミド-イソホスファミド；インターフェロンα；インターフェロンα2a；インターフェロンα2b；インターフェロンαn3；イリノテカン；ロイコボリンカルシウム；ロイプロライド(Leuprolide)；レバミゾール；ロムスチン；メゲステロール(megestrol)；メルファラン-L-フェニルアラニンマスタード、L-サルコリジン(L-sarcolysin)；塩酸メルファラン(Melphalan)；メクロレタミン、窒素マスタード；メチルプレドニゾロン、メトトレキセート-アメトプテリン、マイトマイシン-マイトマイシン-C；ミトキサントロン；メルカプトプリン、パクリタキセル；プリカマイシン(Plicamycin)-ミトラマイシン；プレドニゾン；プロカルバジン；ストレプトゾシン-ストレプトゾトシン；タモキシフェン；6-チオグアニン；チオテパ-トリエチレンチオホスホラミド；ビンブラスチン；ビンクリスチン；又は酒石酸ビノレルビン(vinorelbine tartrate)が挙げられる。この発明の好ましい抗腫瘍薬として、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、及び塩酸エピルビシンが挙げられる。
【００２１】
本発明は、リポソームに診断薬を装填することも提供する。診断薬として、限定するものではないが、MRI(磁気共鳴画像法)の際クリアな写真を与えるために使用されるMRI造影剤(常磁性剤とも呼ばれる)が挙げられる。MRIは、磁気とコンピューターを用いて体内の特定領域の画像又は“写真”を生成する特種な診断手順である。ｘ線と異なり、MRIは電離放射線を含まない。典型的MRI診断薬として、ガドジアミド(Gadodiamide)；ガドペンテテート(Gadopentetate)；ガドテリドール(Gadoteridol)；ガドベルセタミド(Gadoversetamide)、Gd：ジエチレントリアミンペンタセディン酸キレート(Gd-DTPA)(米国特許第6,132,763号)が挙げられる。
【００２２】
リポソームに装薬し、未封入治療／診断薬を除去したら、リポソーム組成物を非経口投与に適するようにする滅菌のため無菌ろ過することができる。理想的に、フィルターは少なくとも0.2μmフィルターである。次に、リポソーム組成物を脱発熱原の滅菌バルク容器内にろ過する。引き続き滅菌組成物をガラスバイアルのような脱発熱原のより小さい滅菌容器内に無菌的に詰める。窒素のような不活性ガスでパージして容器のヘッドスペースの空気を除去し、容器を封止する。“非経口投与に適する”とは、該組成物が無菌、等張性かつ細菌性内毒素が制御されていることを意味する。
本発明は、安定した長循環性の低毒性非ペギレート化リポソームをも提供する。本リポソームは、好ましくは本明細書で述べる方法で製造される。この発明のリポソームは、等用量でスイスアルビノマウスで試験した場合、従来の非リポソーム製剤(ADRIAMYCIN)より少なくとも25倍長い血液循環半減期を有する長循環性非ペギレート化リポソームである。好ましい血液循環半減期は、ADRIAMYCINで得られる半減期より約40倍長い。
【００２３】
本明細書の非ペギレート化リポソームは、リン脂質とコレステロールで構成される。リン脂質のコレステロールに対する許容しうる比率は上述し、好ましくは約１：0.1〜１：２のモル比である。リン脂質のステロールに対する好ましいモル比は約１：0.7である。ホスファチジルコリンが好ましいリン脂質であり、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)が特に好ましい。
本非ペギレート化リポソームに診断又は治療薬を装填することができる。このような薬剤は周知であり、かつ上述した。本発明の非ペギレート化リポソームは、好ましくは上述したような化学的勾配を用いて装填される。本発明の好ましい非ペギレート化リポソームを塩酸ドキソルビシンで装填し、上述した方法で調製する。一実施形態では、上述した活性装填手順で塩酸ドキソルビシンを装填するとき、装填前に薬物を適切な緩衝溶液（上述したような）に溶かして少なくとも25mMの濃度を得る。活性装填プロセスが硫酸アンモニウム勾配に関係する場合、硫酸アンモニウムが塩酸ドキソルビシンと反応して硫酸ドキソルビシンを形成する。硫酸ドキソルビシンは不溶性であり、装填後リポソームの内側に残る。いかなる取り込まれない又はフリーな薬物も装填リポソームから除去したら、水性緩衝溶液で薬物装填リポソームを希釈して所望薬物濃度を達成する。使用する好ましい緩衝溶液は、前述したようなスクロース-ヒスチジン緩衝溶液である。
【００２４】
典型的な非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物は、２mg/mlの塩酸ドキソルビシンを含有する。別の典型的な非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物は、４mg/mlの塩酸ドキソルビシンを含有する。本発明の方法を使用する場合、最終的な所望組成物で望まれる濃度の２倍の濃度で非ペギレート化リポソーム中にドキソルビシンを装填しうる。そして、装填リポソームを適切な緩衝溶液（上述したような）で希釈して、リポソーム組成物１ml当たりのドキソルビシンの所望濃度を達成することができる。希釈時、リポソームが懸濁している外部媒体は希釈されるが、リポソーム内の薬物は未希釈のままである。
好ましい実施形態では、塩酸ドキソルビシンのリン脂質に対するモル比は約１：２〜約１：15である。好ましいモル比は、約１：3.5である。
【００２５】
本発明は、非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物をも提供する。本組成物は、技術的に周知の適切な薬学的に許容しうる担体中に上述したような非ペギレート化リポソームを含む。リポソームに塩酸ドキソルビシンが装填されている。本組成物は、非経口投与に好適であり、かつ長循環性である。
一実施形態は、非経口投与用長循環性非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物を提供する。本リポソーム組成物は、薬学的に許容しうる担体中に非ペギレート化リポソームを含む。好適な薬学的に許容しうる担体は技術的に周知である。好ましい医薬組成物では、塩酸ドキソルビシンの濃度は、１mM〜10mMで変化し、更に好ましくは約6.9mM、最も好ましくは約3.45mMである。リン脂質のモル濃度は、非経口組成物の10mM〜15mMで変化する。更に好ましい含量は約12.15mMである。
【００２６】
本組成物は、更にジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール、塩酸ヒスチジン、及びスクロースを含む。好ましくは本リポソームは0.06μm〜0.16μmの平均サイズを有する。
好ましくは塩酸ドキソルビシン含量は１〜10mMであり、更に好ましくは塩酸ドキソルビシン含量は3.45mMである。
本発明の組成物では、ジステアロイルホスファチジルコリンのコレステロールに対するモル比は１：0.6〜１：0.8であり、好ましくは１：0.7である。
本発明の組成物では、塩酸ドキソルビシンのジステアロイルホスファチジルコリンに対するモル比は１：２〜１：10であり、好ましくは１：２〜１：８、更に好ましくは１：3.5である。
スクロース含量は0.1Ｍ〜0.5Ｍ、更に好ましくは0.25Ｍ〜0.3Ｍである。
本発明の組成物では、塩酸ヒスチジンの含量は１mM〜100mM、好ましくは８〜12mM、更に好ましくは10mMである。
本発明の組成物では、リポソームは0.08μm〜0.12μmの平均サイズを有する。
本発明の一実施形態では、塩酸ドキソルビシンは４mg/mlで存在し、ドキソルビシンのDSPCに対するモル比は１：3.5であり、かつDSPCのコレステロールに対するモル比は１：0.7である。
本発明の更に別の実施形態では、塩酸ドキソルビシンは２mg/mlで存在し、ドキソルビシンのDSPCに対するモル比は１：3.5であり、かつDSPCのコレステロールに対するモル比は１：0.7である。
本組成物中のドキソルビシンリポソームは、好ましくは等用量でスイスアルビノマウスで試験した場合、ADRIAMYCINの40倍を超える長さの血液中循環半減期(ｔ1/2)を有する。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物を投与することによって腫瘍成長を低減する方法を提供する。この方法は、治療的に有効な量の本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物を投与する工程を含む。非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物は持続性循環時間を有し、毒性の低減を示し、かつ“手足症候群”問題を呈しないので、非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物は腫瘍成長を低減するための実行可能な治療を与える。熟練家は、本明細書で提示するデータのみならず投与量、投与時間、及び投与経路の一般的知識を用いて、本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームで、塩酸ドキソルビシンによる治療に感受性の腫瘍を有する個体を治療することができる。２mg/ml及び４mg/ml塩酸ドキソルビシン強度の本発明の組成物が腫瘍成長の低減の治療で有用である。
【００２８】
本発明は、これら組成物中と同比率の成分を有する組成物の製造方法をも提供する。
本方法は、以下の工程、
（ａ）ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)とコレステロールを単溶媒又は溶媒混合物に溶かす工程；
（ｂ）硫酸アンモニウムとスクロースを含み、DSPCの各ミリモル当たり10ml〜35mlの範囲の量の水性水和媒体を添加して脂質を水和する前又は後に前記溶媒を除去する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の最後に得られるリポソーム組成物中のリポソームを約0.060μm〜0.16μmにサイズ調整する工程；
（ｄ）塩酸ヒスチジンとスクロースを含むスクロース-ヒスチジン緩衝溶液を用いて、工程（ｃ）でサイズ調整したリポソーム組成物からリポソーム外硫酸アンモニウムを除去する工程；
（ｅ）前記スクロース-ヒスチジン緩衝溶液に塩酸ドキソルビシンを溶かして、少なくとも25mMの塩酸ドキソルビシン濃度の溶液を得る工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られる塩酸ドキソルビシン溶液と、工程（ｄ）の最後に得られるリポソーム組成物とを混合して塩酸ドキソルビシン装填リポソーム組成物を得る工程；
（ｇ）接線流ろ過、カラムクロマトグラフィー又は微細孔スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーを基礎とする樹脂のような樹脂による処理のようないずれかの方法によって前記リポソーム組成物からリポソーム外塩酸ドキソルビシンを除去する工程；
（ｈ）工程（ｇ）の最後に得られるリポソーム組成物の体積を前記スクロース-ヒスチジン緩衝溶液で補って、必要濃度の塩酸ドキソルビシンを有するリポソーム組成物を得る工程；
（ｉ）前記リポソーム組成物を、滅菌0.2μの滅菌グレードフィルターを通して無菌的に滅菌容器内にろ過し、前記リポソームドキソルビシン組成物を得る工程；
を含む。
水性水和媒体中の硫酸アンモニウムの濃度は、125mM以上である。
【００２９】
本発明の塩酸ドキソルビシン含有非ペギレート化リポソームは、従来の塩酸ドキソルビシン製剤(ADRIAMYCIN)及びペギレート化リポソーム塩酸ドキソルビシン製剤(CAELYX)に比べて低い毒性効果を示した。下表１は、マウスにおける急性毒性と薬物速度論研究の結果を提供する。実施例IIで述べるパラメーターで製造されるような本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームを市販のペギレート化リポソームドキソルビシン製剤、CAELYX及びADRIAMYCINと比較した。本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームのLD50は、CAELYX及びADRIAMYCINのLD50より高く、本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームが低毒性を有することを実証している。
【００３０】
【表１】
0005355842.tif 000002
略号：MTD＝最大耐量；Cmax＝血漿中で達成される最大濃度；Tmax＝血漿中の薬物の最大濃度を達成するためにかかる時間；Kel＝排出定数；T1/2＝血漿中の薬物濃度が50％まで減少するために必要な時間；AUC＝“濃度”対“時間”曲線下の面積；Vd＝分布量；Cl＝薬物のクリアランス速度
【００３１】
本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームをマウスに移植したMCF-7ヒト乳腫瘍に使用した。結果を下表２に与える。腫瘍重量の差と効率をT/C％（試験対対照パーセンテージ）で測定する。この研究（実施例VI）では、CAELYXを用いたT/Cの最高比率は12mg/kgで-78かつ６mg/kgで-34.7であり、本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームを用いた場合、最高比率は12mg/kgで-93.4かつ６mg/kgで-89.43である。これら結果は、本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物が、現在市販されているペギレート化リポソーム製剤、CAELYXより腫瘍重量を効率的に減らすと考えられる。
【００３２】
【表２】
0005355842.tif 000003
【００３３】
本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームのL1210マウス白血病細胞に対する抗腫瘍活性を試験した。結果を下表３に与える。この試験（実施例VI）の結果は、本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソーム組成物がペギレート化リポソーム（CAELYX）ほど有効であることを示す。
【００３４】
【表３】
0005355842.tif 000004
T/C％：試験対対照パーセンテージ
【００３５】
上記表１〜３の結果は、本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物が低毒性プロファイルとより長い循環時間を有することを実証し、かつMCF-7及びL121腫瘍モデルに対する生体内の抗腫瘍活性の効率を立証した。
以下、当業者が更に完全にこの発明を理解できるように、実施例を示し、この発明のリポソーム製剤の製法、特徴づけ、及び動物モデルでの生体内化学療法適用について述べる。これら実施例は、説明の目的のためだけに提示され、いかなる場合にも本発明を限定することを意図しない。
【００３６】
（実施例）
これら実施例の塩酸ドキソルビシンは、米国薬局方仕様書に従う非経口グレードのものである。これら実施例で用いたリン脂質は非経口グレードのものである。これら実施例で用いたコレステロールは米国薬局方仕様書に従っている。これら実施例で用いた水は、注射用水仕様書に従う非経口グレードである。これら実施例で用いた他のすべての添加剤は非経口グレードのものである。全処理は、制御した環境の領域内で行った。
本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン製剤との比較評価のためBen Venue Laboratories, USA製のCAELYX(ペギレート化リポソームドキソルビシン製剤)と、Pharmacia & Upjohn, USA製のADRIAMYCIN(従来の非リポソームドキソルビシン製剤)を動物研究で使用した。“従来の非リポソームドキソルビシン組成物”とも称するADRIAMYCINは、注射用の凍結乾燥無菌粉末であり、各バイアルは塩酸ドキソルビシン10mg、ラクトース50mg、メチルヒドロキシベンゾエート1mgを含有する。使用前に、パックで提供される5mlの注射用水で凍結乾燥粉末を再構成する。
血液検査のため、細胞カウンター(Sysmex Automated Hematology Analyzer-KX-21)を使用した。
【００３７】
実施例Ｉ：塩酸ドキソルビシン含有リポソーム組成物の製造方法
脂質膜形成：回転式エバポレーターフラスコ内、DSPC(1.565g)とコレステロール(0.521g)を交互にクロロホルム(40ml)に溶かした。それらを清澄溶液が生成するまで混合した。フラスコを回転式エバポレーターに連結し、水浴温度を60℃に調整した。真空下溶媒を蒸発させてフラスコの壁面に脂質の薄膜を形成した。真空を解放後、窒素をフラスコ内に通しながらフラスコを約５分間回転させ、いずれの残存溶媒をも乾かした。
水和：フラスコ内の脂質膜を60mlの硫酸アンモニウム含有水性水和媒体で水和した。水和媒体は、10.0gmのスクロースと、2.04gmの硫酸アンモニウムと、100mlの水から成る。脂質膜と水和媒体を含有するフラスコを65〜68℃に維持した水浴上で30分間回転させてリポソームを形成した。
押出しによるリポソームのサイズ減小：上記で得たリポソーム懸濁液を、0.4μm〜0.05μmの細孔サイズを有するフィルターを通して連続的に押し出すことによってサイズ調整する。
硫酸アンモニウム勾配の発生：サイズ調整したリポソームの懸濁液をスクロース-ヒスチジン溶液に対して透析してリポソーム外硫酸アンモニウムを除去することによって化学的勾配を生じさせた。透析のため300KDカセットで取り付けた接線流ろ過システムを使用した。硫酸アンモニウムの非存在はネセラー(Nesseler)薬で調べた。
透析及び薬物装填(後述)で用いるスクロース-ヒスチジン緩衝溶液は以下のとおりである：170.0gmのスクロース、3.40gmのヒスチジンHCl、1.7リットルの水、pHを6.0〜6.5に調整するために十分な量の水酸化ナトリウム。
薬物装填：リポソーム製剤に装填し、かつ４mg/mlの塩酸ドキソルビシン濃度を有する薬物装填リポソームを得るため、丸底フラスコ内、スクロース-ヒスチジン緩衝溶液(上述した)中の15mg/mlのドキソルビシンHCl溶液を調製した。上記のサイズ調整し、かつ透析したリポソームを丸底フラスコにゆっくり加え、65℃で１時間混合した。この薬物装填リポソームをDOWEXと30分間混合し、取り込まれない薬物を除去した。スクロース-ヒスチジン緩衝溶液で薬物装填リポソームを２mg/mlに希釈してから、無菌0.22μm膜フィルターで無菌的にろ過した。ろ過したリポソームドキソルビシン組成物を脱発熱原の滅菌ガラスバイアル中に無菌的に詰め、窒素のカバー下テフロン（登録商標）コートゴム栓で封止した。
【００３８】
実施例II：ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物、非リポソームドキソルビシン組成物、及び本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物のLD50比較
以下のリポソームドキソルビシン組成物を調製した。
各mlの組成物は以下の成分を有する
DSPC                −    9.55mg
コレステロール      −    3.15mg
塩酸ドキソルビシン  −    2.01mg
スクロース          −    95mg
塩酸ヒスチジン      −    2mg
実施例Ｉと同一手順で組成物を調製した。塩酸ドキソルビシン(216mg)を14mlのスクロース-ヒスチジン緩衝溶液に溶かし、サイズ調整した40mlのリポソームに加え、１時間混合した。結果の薬物装填リポソーム分散系をDOWEXカラムに通し、取り込まれない薬物を除去した。
【００３９】
DOWEXカラムを通した後に得られた生成物は、以下の特性を有した。
生成物分析
総ドキソルビシンHCl量                3.98mg/ml
取り込まれたドキソルビシンHCl量      3.94mg/ml
ヒスチジン緩衝液で２mg/mlの濃度に希釈後の上記生成物を以下のパラメーターについて分析した：
外観                      ：赤色半透明液
pH                        ：6.1
粒子サイズ                ：平均粒子サイズ0.093μm
DSPC含量                  ：9.55mg/ml
コレステロール含量        ：3.15mg/ml
ドキソルビシンHCl含量     ：2.01mg/ml
スクロース含量            ：9.35％w/v
ヒスチジンHCl含量         ：ポジティブ
細菌性内毒素              ：2.2EU未満/mg塩酸ドキソルビシン
無菌状態                  ：無菌
【００４０】
この組成物をマウスでの急性毒性研究に供した。
“ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”(CAELYX)、“従来の非リポソームドキソルビシン組成物”(ADRIAMYCIN)、及び本発明の“非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”のLD50比較。
使用動物                  ：どちらかの性のスイスアルビノマウス
動物の体重範囲            ：20〜22gm
群数                      ：３
群毎の動物数              ：10
動物を３群に分け、各群10匹の動物で構成した。群１は実施例IIの組成物を受け、群２はCAELYXを受け、群３はADRIAMYCINを受けた。
すべての動物は静脈内経路による注射を受けた。動物に投与する前、薬物溶液を適宜デキストロース(5%w/v)溶液で希釈した。動物を14日間観察した。臨床毒性及び死亡率について動物を観察した。
研究した種々のドキソルビシン製剤のLD50値を表１に示した。
市販の従来製剤(ADRIAMYCIN)のLD50は10.29mg/kgであるが、LD50用量が16.13mg/kgであることが分かった。市販のペギレート化リポソーム製剤CAELYXのLD50は13.5mg/kgだった。これら結果は、本発明の非ペギレート化リポソームが他のドキソルビシン製剤及びペギレート化リポソームドキソルビシン製剤に比べて低毒性を有することを示している。
【００４１】
実施例III：本発明の“非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”の“ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”(CAELYX)及び、“従来の非リポソームドキソルビシン組成物”(ADRIAMYCIN)との、亜急性毒性の比較。
使用動物                  ：どちらかの性のスイスアルビノマウス
群数                      ：11
群毎の動物数              ：８
動物の体重範囲            ：19〜23gms
投与経路                  ：静脈内
動物11群に分け、各群８匹の動物から成る。群１はデキストロース５％注射を受け、群２は本発明のブランクリポソーム(薬物装填前)を受け、群３、群４及び群５は、異なる用量で実施例IIの組成物を受け、群６、群７及び群８は、異なる用量でCAELYXを受け、群９、群10及び群11は、異なる用量でADRIAMYCINを受けた。用量を下表４に示す。
【００４２】
【表４】
0005355842.tif 000005
【００４３】
全群が14日間選択日に静脈内経路で注射を受けた。動物に投与する前、製剤を適宜デキストロース(5%w/v)溶液で希釈した。以下のことについて動物を14日間の研究期間中観察した。
→  死亡率
→  臨床徴候及び症候
→  体重
→  食物消費
→  器官質量
【００４４】
結果
死亡率：すべての製剤について14日間にわたって死亡率を記録した。
【表５】
0005355842.tif 000006
【００４５】
臨床徴候：研究期間中、すべてのドキソルビシン処置群で尾皮膚の脱落及び脱毛が観察された。尾皮膚の脱落は５回の注射後の動物で観察された。すべてのドキソルビシン処置動物で用量依存性脱毛が観察された。表６は、この研究の期間中の脱毛を示す。
【表６】
0005355842.tif 000007
# 起毛(毛の起立)が処置12の日に８匹の動物のうち１匹で観察された。
+  ８匹の動物のうち１匹が脱毛を示した。
+ + ８匹の動物のうち２匹が脱毛を示した。
+ + +  ８匹の動物のうち３匹が脱毛を示した。
+ + + +  ８匹の動物のうち４匹が脱毛を示した。
【００４６】
体重：日１、日４、日７及び日14に動物の体重を記録した。２mg/kgと３mg/kgの用量ですべての薬物処置群で体重の減少が観察された。減量は対照と有意に異なった。ブランクリポソームを受ける動物の体重はデキストロース群に匹敵した。
食物消費：４〜14日の時期からドキソルビシン処置動物は一般的に食物消費の減少を示した。
器官重量：生存動物の器官を収集かつ秤量した。全動物の平均器官重量はすべての薬物処置群で類似していることが分かった。
【００４７】
実施例IV：“本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”と“ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”(CAELYX)及び“従来の非リポソームドキソルビシン組成物”(ADRIAMYCIN)のマウスにおける薬物速度論の評価。
使用動物                  ：どちらかの性のスイスアルビノマウス
群数                      ：３
群毎の動物数              ：48
動物の体重                ：25〜30gm
薬物速度論研究の用量      ：10mg/kg
時点                      ：５分、30分、１時間、２時間、５時間、
10時間、15時間、20時間
各時点のマウス数          ：６匹
投与経路                  ：静脈内
【００４８】
収集後の血液試料を4000rpmで20分間遠心分離し、血漿を分離し、分析するまで-20℃で凍結した。凍結血漿を解凍して分析に用いた。
１mlのアセトニトリルを100μLの血漿に加え、10分間ボルテックスし、3250rpmで10分間遠心分離した。上清を取り除き、それに0.5mlの飽和ZnSO4溶液を加えた。結果溶液を５分間ボルテックスしてから10分間3250rpm速度で遠心分離した。上部の有機層を取り除き、酸素フリー窒素ガス下60℃で乾燥させた。得られた残留物を200μLのZnSO4含有溶媒Ａで再構成した。この溶液100μLをHPLCカラムに注入した。
装置                  ：Shimadzu Liquid Chromatograph LC-10ATVP
カラム                ：C8 Thermoquest hypersil MOS (250×4.6mm,5μ)
カラム温度            ：周囲温度
移動相                ：溶媒Ａ：酸性水(pH 2.5、60％過塩素酸で調整)＆
テトラヒドロフラン(80：１，v/v)
溶媒Ｂ：アセトニトリル
溶媒Ａ：溶媒Ｂ(40：60)
流速                  ：1ml/分
検出器                ：蛍光検出器(RF-10 AXL Shimadzu；Ex 460nm及びEm 550nM)
実験時間              ：15分
（統計解析）
３つの製剤間の比較にスチューデント式ｔ-テストを用いた。
結果は表１に要約した。
【００４９】
実施例Ｖ：本発明の“非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”と“従来の非リポソームドキソルビシン組成物”(ADRIAMYCIN)のイヌにおける亜急性毒性の比較。
使用動物                  ：イヌ
群数                      ：３
群毎の動物数              ：３
動物の体重                ：10〜20kgs
用量及び投与              ：20分間にわたって１mg/kg静脈内注入
投与は４用量について１週間に１回(すなわち７日後)
薬理学的評価：
→  毒性の臨床徴候
→  体重
→  血行動態パラメーター
→  血液学
→  生化学パラメーター
【００５０】
【表７】
0005355842.tif 000008
【００５１】
体重：
ADRIAMYCIN処置群は体重の減少を示したが、対照及び実施例IIの組成物処置群は体重の減少を示さなかった。
【表８】
0005355842.tif 000009
【００５２】
研究した血液学パラメーター：
→  RBC
→  全WBC及び差次的WBC
→  ヘモグロビン
→  ヘマトクリット
→  平均血球量
→  血小板
研究したすべての上記パラメーターは全群で正常の範囲内だった。
生化学パラメーター−クレアチンホスホキナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼレベルの上昇がADRIAMYCIN処置群で見られたが、対照及び実施例IIの組成物では有意な変化は観察されなかった。
肝機能試験(LFT)−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ及び総ビリルビンレベルの上昇がADRIAMYCIN処置群で見られたが、対照及び実施例IIの組成物では有意な変化は観察されなかった。
腎機能試験(KFT)−血液尿素窒素(BUN)及びクレアチニンの増加がADRIAMYCIN処置群で観察されたが、対照は増加を示さなかった。実施例IIの組成物で措置した動物群は、BUN及びクレアチニンの両レベルの上昇を示したが、ADRIAMYCIN処置群より有意でなかった。
【００５３】
実施例VI：ヌードマウスに移植したL1210マウス白血病及びMCF-7ヒト乳腫瘍に対する“本発明の非ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”と“ペギレート化リポソームドキソルビシン組成物”(CAELYX)の抗腫瘍活性の評価
投与製剤：上記ドキソルビシンの両製剤を無菌の通常の食塩水(0.9％)で１mg/mlに希釈した。体重を基準とした種々の試験群に適量の薬物溶液を投与し、動物は表９及び10に示されるように薬物を受けた。
両モデルで６週齢のメスのNCrヌード(nu/nu)マウスを使用した。
Guide for Care and Use of Laboratory Animals(ILAR publication, 1996, National Academy Press)で特定されているようなポリカーボネートマイクロアイソレーターケージに動物を収容した。50％の新鮮な空気で部屋をよく換気した(１時間毎に10回以上空気変え)。12時間明るい／12時間暗いの光周期を維持した。室温を18〜26℃で維持した。
腫瘍接種前少なくとも３日間、研究動物を順応させた。
一般的説明：L1210マウス白血病及びMCF-7ヒト乳腫瘍モデルで、食塩水を受ける対照群に対して上記の両リポソーム製剤をそれぞれ２種の濃度で試験した。
【００５４】
L1210モデル
腫瘍細胞：ATCCからL1210マウス白血病細胞系を得、標準的インビトロ細胞拡張法で増殖させた。細胞を適切な補充及び10％ウシ胎児血清(FBS)を有する培地内で成長させた。35 T-225フラスコ内で80〜90％集密に培養を成長させた。細胞を遠心分離で収集し、ペレット化細胞を血清フリーRPMI内で106生細胞/mlに再懸濁させた。25G針で0.1mlの細胞懸濁液を動物に注射した。
群及び投与量：各群は５匹の動物から成る。106腫瘍細胞/マウスでマウスに腹腔内接種した。表９に示される用量で日１、５及び９に両リポソーム製剤を静脈内投与した。措置後30日間動物を観察し、死亡率を記録した。
【００５５】
【表９】
0005355842.tif 000010
【００５６】
毎日動物を調べ、毎週２回秤量し、体重を記録した。研究期間中のいずれの死亡率も記録した。
各処置群の平均生存率を食塩水を受けた対照の生存率と比較して両リポソーム製剤の抗腫瘍活性を評価した。結果は、以下のように計算するT/C比によって表した。
T/C％＝（試験群の平均生存時間／対照群の平均生存時間）×100
T/C≧125％を有意な活性とみなす。
L1210マウス白血病モデルに対する抗腫瘍活性の結果は表３に与えられている。
死亡率は、第１注射(日１)後15〜26日の範囲だった。食塩水を受けた対照群の平均生存時間は16.5日だった。両薬物処置群は平均生存時間(T/C％)で同様の差を示し、実施例IIの組成物がL1210腫瘍モデルに対してCAELYX程度の効き目があることを示している。
【００５７】
MCF-7モデル：
腫瘍細胞：ATTCからMCF-7ヒト乳腫瘍細胞系を得、標準的インビトロ細胞拡張法で増殖させた。細胞を適切な補充及び10％FBSを有する培地内で成長させた。35 T-225フラスコ内で80〜90％集密に培養を成長させた。細胞を遠心分離で収集した。細胞を血清フリーRPMI内で107生細胞/mlに再懸濁させた。25G針で0.1mlの細胞懸濁液を動物に注射した。
群及び投与量：各群は５匹の動物から成る。接種５日前にエストロゲンペレットをマウスに移植した。107腫瘍細胞/マウスでマウスに皮下接種した。腫瘍が30〜100mm3の大きさに達するまで腫瘍を成長させた。適切な大きさに達したら(接種後５日目)、表10に示されるように日１、５及び９に試験物品を静脈内投与した。措置開始後30日まで毎週２回キャリパーで腫瘍サイズを測定した。
【００５８】
【表１０】
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【００５９】
毎日動物を調べ、毎週２回秤量し、体重を記録した。１週間に２回キャリパーで個々マウスの腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍寸法(mm×mm)から扁長楕円体の体積についての式：Ｌ×Ｗ2／２を用いて概算の腫瘍質量(mg)を計算した。式中、Ｌは２測定の長い方である。
処置群の腫瘍質量の変化を食塩水を受けた対照の変化と比較して両リポソーム製剤の抗腫瘍活性を評価した。
腫瘍質量の変化は、最終評価日(処置後30日)の群平均腫瘍質量から腫瘍細胞の接種５日後の群平均腫瘍質量を引いて腫瘍質量の変化を計算した。
υWt＝Wt最終−Wt初期
すべての試験群のT/C比を以下のように計算した：    
T/C％＝（υWt試験／試験のWt初期）×100
T/C≦20は、中程度の活性を示すために必要とみなす。T/C≦10％は、有意な活性とみなす。
抗腫瘍活性MCF-7ヒト乳腫瘍モデルに対する抗腫瘍活性は表２に示されている。
【００６０】
【表１１】
0005355842.tif 000012
【００６１】
対照群の腫瘍は、研究期間中第26日に最大116.4mgに達するまで成長し続けたが、処置マウスは、研究期間中有意に退行した。12mg/kgの実施例IIの組成物を受ける群では腫瘍が完全に消失し、実施例IIの組成物がMCF-7ヒト乳腫瘍に有効であることを示した。
表11に示されるように、種々の群で数匹の早期死亡が起こった。しかし、死亡の原因は腫瘍に無関係と思われた。最も大きい腫瘍を有する食塩水対照群で死亡がなかった。死亡動物の数匹は壊死し、それらすべてが肥厚した異常な膀胱を有することが分かった。研究の最後に、肥厚膀胱を有するマウスと同様に多くのマウスを安楽死させた。肥厚化膀胱の１つの組織病理学的検査によって、腫瘍転移の証拠がないことが明らかになった。エストロゲン化し、腫瘍移植したヌードマウスの早過ぎる死は、尿生殖器疾患の徴候による。
【００６２】
実施例VII：A121ヒト卵巣腫瘍を有する無胸腺マウスにおける本発明のドキソルビシンリポソームの最大耐量(MTD)の決定及び治療効率の評価
A121ヒト卵巣腫瘍を有する無胸腺マウスにおける本発明のドキソルビシンリポソームの最大耐量(MTD)の決定及び治療効率の評価は、従来の非リポソーム製剤(ADRIAMYCIN)及びペギレート化リポソーム製剤(CAELYX)と比較して行った。
ヌード無胸腺Ncr-nu/nuマウス[４マウス/群(対照群中10)]にトロカール移植片を介してA121卵巣腫瘍を皮下移植した。この実験では全部で46匹の動物を用いた。全部で46匹の動物を実験で利用した。等用量のADRIAMYCIN、CAELYX及び実施例IIの組成物を静脈内で評価した。腫瘍移植後５及び12日に、マウスの尾静脈を介して薬物を静脈内投与した。
全治療群が良い抗腫瘍効力を示した。
投与スケジュールを以下に示す。
対照マウス：対照マウスは何ら処置を受けなかった。
ADRIAMYCIN
12mg/kg（６mg/kg×２注射）
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
36mg/kg（18mg/kg×２注射）
CAELYX
12mg/kg（６mg/kg×２注射）
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
36mg/kg（18mg/kg×２注射）
実施例IIの組成物
12mg/kg（６mg/kg×２注射）
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
36mg/kg（18mg/kg×２注射）
フリー薬物の最高用量36mg/kg(18mg/kg×２ADRIAMYCIN)を受けたすべてのマウスと、中間用量の24mg/kgを受けた４匹のマウスの３匹が薬物毒性の結果として死亡した。従って、ADRIAMYCINの最大耐量は24mg/kg未満である。
マウスはCAELYXと実施例IIの組成物の両方に耐えた。マウスは36mg/kgで両製剤に良く耐えた。しかし、CAELYXは実施例IIの組成物より高い毒性を引き起こすようであり、高用量(36mg/kg)受けるマウスのより大きい減量を生じさせた。
この研究は、実施例IIの組成物が市販のペギレート化リポソーム製剤(CAELYX)及び従来の非リポソーム製剤(ADRIAMYCIN)より良く耐えられることを実証する。
【００６３】
実施例VIII：多剤耐性のPgpポジティブヒト結腸DLD1腫瘍異種移植片で移植したヌード無胸腺マウスにおける本発明のリポソームドキソルビシン組成物の効力を評価すること
多剤耐性(Pgp＋)DLD1ヒト結腸腫瘍を皮下移植したヌード無胸腺マウスにおける効力研究に実施例IIの組成物と共にCAELYX及びADRIAMYCINを供した。
動物、ヌード無胸腺マウス、４マウス/群(対照群中10)にトロカール移植片を介してヒトDLD-1結腸腫瘍を皮下移植した。
対照マウス：無処置
ADRIAMYCIN
12mg/kg（６mg/kg×２注射）
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
CAELYX
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
36mg/kg（18mg/kg×２注射）
48mg/kg（24mg/kg×２注射）
実施例IIの組成物
24mg/kg（12mg/kg×２注射）
36mg/kg（18mg/kg×２注射）
48mg/kg（24mg/kg×２注射）
実験に全部で42匹の動物を利用した。
【００６４】
結果：
投与後実施例VIIで36mg/kgのフリー薬物投与後に観察された毒性に基づき、この研究ではADRIAMYCINの投与量を12及び24mg/kgに少なくした。対照的に、CAELYXと実施例IIの組成物の投与量を48mg/kgに増やして、それぞれのMTDでのフリー薬物によるその効力と毒性を比較した。すべての薬剤は、多剤耐性のPgpポジティブヒト結腸腫瘍異種移植片で皮下腫瘍移植後５及び12日に尾静脈を介してヌード無胸腺マウスに静脈内投与した。
全措置群は腫瘍効力を示した。
しかし、どちらかのリポソーム製剤を受けたマウスが有意に高い抗腫瘍効力を示した。等価のフリー薬物用量(24mg/kg)では、フリー薬物によって10日の平均腫瘍成長遅延が観察されたが、日40に、すべてのリポソーム製剤投与マウスは600nm3未満の腫瘍を有していた。CAELYX又は実施例IIの組成物のどちらも36mg/kgの投与量で毒性の証拠はなかった。
最高用量(48mg/kg)では、両リポソーム薬物製剤(24mg/kg×２、CAELYX又は実施例IIの組成物)マウスが薬物毒性の結果として15％を超える減量を示し、かつ当該各群の４匹のうち１匹の動物が早期(日17、19)に死亡した。従って、両リポソーム製剤のMTDは同様であり、48mg/kg未満であると思われた。
【００６５】
ADRIAMYCINとは対照的に、２種のリポソーム製剤[CAELYX−(ペギレート化ドキソルビシン)及び実施例IIの組成物(非ペギレート化ドキソルビシン)]は、ヌード無胸腺マウスでのPgpポジティブの多剤耐性ヒトDLD1結腸腫瘍の皮下移植に対して有意な抗腫瘍効力を示した。24mg/kgの等用量では、両リポソーム製剤はフリー薬物に比し、高い効力を示した。更に、両リポソーム製剤は、フリー薬物に比べて低毒性を示し、多くの薬物の投与を許容した。ADRIAMYCINのMTDはリポソーム製剤のMTDの約半分であると思われる。36mg/kgのリポソーム薬物用量は良く耐えられた。
【００６６】
実施例IX〜XIII：
実施例IX〜XIIIの組成物及びプロセスを下表12に示す。
【表１２】
0005355842.tif 000013
【００６７】
手順：実施例X、XI及びXIIでは実施例Ｉの手順に従った。
実施例IXでは、0.4μ〜0.2μの膜を通して押し出して0.15μm〜0.25μmの範囲の平均サイズを得ることによってリポソームのサイズを小さくすることを除き、実施例Ｉの手順に従った。
実施例XIIIでは、水和の量を２倍にすることをを除き、実施例IIの手順に従った。
【００６８】
【表１３】
0005355842.tif 000014
【００６９】
実施例XIV：スクロースのないリポソームドキソルビシン組成物
脂質膜形成：回転式エバポレーターフラスコ内、ジステアロイルホスファチジルコリン(1.565g)とコレステロール(0.521g)を交互にクロロホルム(40ml)に溶かした。清澄な溶液が生成するまでそれらを混ぜ合わせた。フラスコを回転式エバポレーターに連結し、水浴温度を60℃に調整した。真空下溶媒を蒸発させてフラスコの壁に脂質の薄膜を形成した。真空を解放後、窒素を通しながらフラスコを約５分間回転させていずれの残存溶媒をも乾かした。
水和：フラスコ内の脂質膜を、60mlの硫酸アンモニウム含有水性水和媒体で水和した。水和媒体は10.0gmのスクロース、2.04gmの硫酸アンモニウム、及び100mlの水から成る。脂質膜と水和媒体を含有するフラスコを65〜68℃に維持した水浴上で30分間回転させてブランクリポソームを形成した。
押出しによるブランクリポソームのサイズ減少：0.4μm〜0.05μmの細孔サイズを有するフィルターを連続的に通して押し出すことによって、上記から得たリポソーム懸濁液をサイズ調整した。
透析：サイズ調整したリポソームの懸濁液をpH6.5の0.2％w/v塩酸ヒスチジン溶液に対して透析した。透析には接線流ろ過システムを使用した。リポソーム外硫酸アンモニウムが除去されるまで透析を続けた。リポソーム外媒体中の硫酸アンモニウムの非存在はNesseler試薬で確認した。
薬物装填：丸底フラスコ内、14mlの塩酸ヒスチジン緩衝溶液(上述した)に216mgの塩酸ドキソルビシンを溶かすことによって、15mg/mlのドキソルビシンHCl溶液を調製した。上記のサイズ調整し、かつ透析したリポソームの測定量(40ml)を丸底フラスコにゆっくり加え、65℃で１時間混合した。
この薬物装填リポソームをDOWEXで処理して、取り込まれない薬物を除去した。
DOWEXによる処理の前後に得た組成物の試料を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で塩酸ドキソルビシン含量について分析した。結果は以下のとおりである。
総ドキソルビシンHCl含量(DOWEX処理前)                4.02mg/ml
取り込まれたドキソルビシンHCl含量(DOWEX処理後)      4mg/ml
【００７０】
フリー薬物除去後の塩酸ドキソルビシン装填リポソームを、塩酸ヒスチジンとスクロースの溶液(上述した)で２mg/mlの塩酸ドキソルビシン濃度に希釈した。このようにして得たリポソーム組成物を滅菌0.22μm膜フィルターを用いて脱発熱原滅菌容器内に無菌的にろ過し、以下のパラメーターについて分析した。
外観                        ：赤色半透明液
pH                          ：6.3
粒子サイズ                  ：平均粒子サイズ0.097μm
ドキソルビシンHCl含量       ：2.05mg/ml
細菌性内毒素                ：2.2EU未満/mg塩酸ドキソルビシン
無菌度                      ：無菌
この実施例で得た組成物について安定性研究を行い、考察を表14に与えた。
【００７１】
実施例XV：120mMの硫酸アンモニウム溶液を有するリポソームドキソルビシン組成物の製造方法
脂質膜形成：回転式エバポレーターフラスコ内、ジステアロイルホスファチジルコリン(1.565g)とコレステロール(0.521g)を交互にクロロホルム(40ml)に溶かした。清澄な溶液が生成するまでそれらを混ぜ合わせた。フラスコを回転式エバポレーターに連結し、水浴温度を60℃に調整した。真空下溶媒を蒸発させてフラスコの壁に脂質の薄膜を形成した。真空を解放後、窒素を通しながらフラスコを約５分間回転させていずれの残存溶媒をも乾かした。
水和：フラスコ内の脂質膜を60mlの水性水和媒体で水和した。水和媒体は、水中、スクロース10%w/v、硫酸アンモニウム1.58%w/vから成る。脂質膜と水和媒体を含有するフラスコを65〜68℃に維持した水浴上で30分間回転させてブランクリポソームを形成した。
押出しによるブランクリポソームのサイズ減少：0.4μm〜0.05μmの細孔サイズを有するフィルターを連続的に通して押し出すことによって、上記から得たリポソーム懸濁液をサイズ調整した。
透析：サイズ調整したリポソームの懸濁液をスクロース-ヒスチジン緩衝溶液に対して透析した。透析には接線流ろ過システムを使用した。リポソーム外硫酸アンモニウムが除去されるまで透析を続けた。リポソーム外媒体中の硫酸アンモニウムの非存在はNesseler試薬で確認した。透析及び薬物装填(後述)で用いた塩酸ヒスチジン溶液は以下のとおりだった：170.0gmのスクロース、3.40gmのヒスチジンHCl、1.7リットルの水、及びpHを6.0〜6.5に調整するために十分な量の水酸化ナトリウム。
薬物装填：丸底フラスコ内、14mlの塩酸ヒスチジン緩衝溶液(上述した)に216mgの塩酸ドキソルビシンを溶かすことによって、15mg/mlのドキソルビシンHCl溶液を調製した。上記のサイズ調整し、かつ透析したリポソームの測定量(40ml)を丸底フラスコにゆっくり加え、65℃で１時間混合した。
この薬物装填リポソームをDOWEXで処理して、取り込まれない薬物を除去した。
DOWEXによる処理の前後に得た組成物の試料を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で塩酸ドキソルビシン含量について分析した。結果は以下のとおりである。
総ドキソルビシンHCl含量(DOWEX処理前)                4.11mg/ml
取り込まれたドキソルビシンHCl含量(DOWEX処理後)      4.10mg/ml
【００７２】
フリー薬物除去後の塩酸ドキソルビシン装填リポソームを、塩酸ヒスチジンとスクロースの溶液(上述した)で２mg/mlの塩酸ドキソルビシン濃度に希釈した。このようにして得たリポソーム組成物を滅菌0.22μm膜フィルターを用いて脱発熱原滅菌容器内に無菌的にろ過し、以下のパラメーターについて分析した。
外観                        ：赤色半透明液
pH                          ：6.35
粒子サイズ                  ：平均粒子サイズ0.09μm
ドキソルビシンHCl含量       ：2.03mg/ml
細菌性内毒素                ：2.2EU未満/mg塩酸ドキソルビシン
無菌度                      ：無菌
この実施例で得た組成物について安定性研究を行い、考察を表14に与えた。
【００７３】
実施例XVI：実施例XIV、実施例XVの組成物と本発明の組成物(実施例II)を加速温度(25度)における短期安定性研究に供した。
ドキソルビシン含量の結果は表14に与えた。
【表１４】
0005355842.tif 000015
【００７４】
この実施例は、取り込まれたドキソルビシンの漏出を減らすためにスクロースの存在が必須であり、かつ水性媒体中の硫酸アンモニウム濃度が重要であることを示す。120mMの濃度は取り込まれたドキソルビシンの漏出につながるので不十分である。しかし、スクロースと、155mMの濃度の硫酸アンモニウムを含有する実施例IIの組成物は、研究期間中、取り込まれたドキソルビシンを漏出しなかった。
【００７５】
実施例XVII：水和後溶媒除去法によるリポソームドキソルビシン組成物の調製
ジステアロイルホスファチジルコリン(1.565g)とコレステロール(0.521g)を交互にエタノール(42ml)に溶かし、加圧下、絶えず撹拌している水性水和媒体中に汲み上げた。水性水和媒体は、水中、スクロース10%w/v、硫酸アンモニウム2.04%w/vから成る。この溶媒エタノール含有脂質溶液を回転式エバポレーターフラスコに移した。フラスコを回転式エバポレーターに連結し、水浴温度を60℃に調整した。真空下エタノールを除去した。
押出しによるブランクリポソームのサイズ減少：0.4μm〜0.05μmの細孔サイズを有するフィルターを連続的に通して押し出すことによって、上記から得たリポソーム懸濁液をサイズ調整した。
透析：サイズ調整したリポソームの懸濁液をヒスチジン緩衝溶液に対して透析した。透析には接線流ろ過システムを使用した。リポソーム外硫酸アンモニウムが除去されるまで透析を続けた。リポソーム外媒体中の硫酸アンモニウムの非存在はNesseler試薬で確認した。透析及び薬物装填(後述)で用いた塩酸ヒスチジン溶液は以下のとおりだった：170.0gmのスクロース、3.40gmのヒスチジンHCl、1.7リットルの水、及びpHを6.0〜6.5に調整するために十分な量の水酸化ナトリウム。
薬物装填：丸底フラスコ内、14mlの塩酸ヒスチジン緩衝溶液(上述した)に216mgの塩酸ドキソルビシンを溶かすことによって、15mg/mlのドキソルビシンHCl溶液を調製した。上記のサイズ調整し、かつ透析したリポソームの測定量(40ml)を丸底フラスコにゆっくり加え、65℃で１時間混合した。
この薬物装填リポソームをDOWEXで処理して、取り込まれない薬物を除去した。
フリー薬物除去後の塩酸ドキソルビシン装填リポソームを、塩酸ヒスチジンとスクロースの溶液(上述した)で２mg/mlの塩酸ドキソルビシン濃度に希釈した。このようにして得たリポソーム組成物を滅菌0.22μm膜フィルターを用いて脱発熱原滅菌容器内に無菌的にろ過した。
実施した毒物学的及び効力研究の概要は以下のとおりである。
実施例II−本発明の塩酸ドキソルビシン含有非ペギレート化長循環性リポソームは、非リポソーム塩酸ドキソルビシン製剤(ADRIAMYCIN)及びペギレート化リポソーム塩酸ドキソルビシン製剤(CAELYX)に比べて低い毒性作用を示した。本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームのLD50は、CAELYX及びADRIAMYCINより高く、本発明の非ペギレート化ドキソルビシンリポソームが低毒性を有することを実証している。
実施例III−亜急性毒性研究では、CAELYXと実施例IIの組成物の両者で同パターンの毒性が観察されたが、ADRIAMYCINは毒性を示した。
実施例IV−薬物速度論研究では、実施例IIの組成物とCAELYXが類似の血漿半減期を示した。全血液量と薬物分布の見掛け量はほぼ等しく、正常組織による低いリポソーム摂取を示しており、CAELYXと同様だった。ADRIAMYCINはより早いクリアランスと高量の薬物分布を示し、正常組織内でのフリードキソルビシンの摂取を暗示している。
実施例Ｖ−イヌの毒性研究では、実施例IIの組成物がADRIAMYCINより良く耐えられることが分かった。
実施例VI−L1210マウス白血病及びMCF-7ヒト乳腫瘍の腫瘍モデルでは、実施例IIの組成物が効力があることが分かった。
実施例VII−腫瘍移植マウス内における実施例IIの組成物の最大耐量がADRIAMYCINよりずっと高いことが分かった。
実施例VIII−多剤耐性のPgpポジティブヒト結腸DLD1腫瘍異種移植片で移植したヌード無胸腺マウスで実施例IIの組成物が有効であることが分かった。
【００７６】
上記実施例は、本発明の組成物が腫瘍成長を低減するために非常に有用であることを明白に立証する。これは、治療的に有効な量の本発明の非ペギレート化塩酸ドキソルビシンリポソームを非経口的に投与することを包含する。非ペギレート化塩酸ドキソルビシンリポソームは、長期の循環時間を有し、低減した毒性を示し、かつ“手足症候群”問題をもたらさないので、それらは腫瘍成長の低減に有用である。