(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基対227〜塩基対1831のオープンリーディングフレームを含む配列番号：8で示される配列を含むか、または上記配列と少なくとも95%同一であるか、または遺伝子コードにより上記DNA配列と縮重している配列を含むか、または上記のいずれかと相補的な配列を含み、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするDNA分子。
【請求項２】
1780〜1880塩基対を含むことを特徴とする請求項１に記載のDNA分子。
【請求項３】
1831塩基対を含むことを特徴とする請求項２に記載のDNA分子。
【請求項４】
検出可能なマーカー物質と共有結合していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のDNA分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なベクター。
【請求項６】
プロモーターに対して逆方向を向いている請求項1〜4のいずれかに記載のDNA分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なベクター。
【請求項７】
RNAがArabidopsis thalianaから単離され、逆転写酵素およびプライマー添加後に該RNAを用いて逆転写することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子を含むcDNA分子の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションし、コードされたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼを発現させることを特徴とするβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの製造法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子の配列と相補的な塩基配列を含むことを特徴とするPNA分子。
【請求項１０】
請求項9に記載のPNA分子が導入されることを特徴とする、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現が翻訳レベルでブロックされる植物または植物細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項4記載のDNA分子を試料に加え、該分子がβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子と結合することを特徴とする試料中のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子の選択方法。
【請求項１２】
該試料が植物または非脊椎動物生物体のゲノムDNAを含むことを特徴とする請求項11記載の方法。
【請求項１３】
pI値が6.0〜9.0のアイソフォームを有することを特徴とする請求項8記載の方法に従ってクローンされるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１４】
該pI値が7.50〜8.00のアイソフォームを有することを特徴とする請求項13記載の製造方法。
【請求項１５】
pI値が7.52のアイソフォームを有することを特徴とする請求項14記載の製造方法。
【請求項１６】
糖タンパク質を含む試料に請求項1〜4のいずれかに記載のDNA分子によってコードされるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼおよびUDP-キシロースを加え、キシロースがβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼによりβ1,2位で該糖タンパク質と結合することを特徴とするヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
植物または非脊椎動物における発現試験のための、または配列番号8で示される配列とホモローガスな配列であって、50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、pH7.0、1mM EDTAのストリンジェント条件下で配列番号8で示される配列とハイブリダイズする配列、を見つけるための、請求項1〜4のいずれかに記載のDNAの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、これらポリヌクレオチドを含むベクター、それぞれ該ポリヌクレオチドまたはそれから誘導されたDNAでトランスフェクションされた組換え宿主細胞、植物および昆虫、ならびにこれらの系を用いて製造された糖タンパク質に関する。
【０００２】  糖タンパク質は、炭化水素の組成物および配置が異なる生物体に特徴的な種々の複雑な炭化水素単位を有する。糖タンパク質のオリゴ糖単位は多くの働きを持っており、例えば、代謝調節に重要であり、細胞-細胞相互作用の伝達に関与し、循環中のタンパク質の循環期間を決定し、抗原抗体反応においてエピトープ認識の決め手となる。
【０００３】  糖タンパク質のグリコシル化は、小胞体(ER)中で始まり、そこで、オリゴ糖はN-グリコシド結合によりアスパラギン側鎖にかまたはO-グリコシド結合によりセリンまたはトレオニン側鎖のいずれかに結合している。N-結合オリゴ糖は、３個のマンノースと２個のN-アセチルグルコースアミン残基からなる五糖単位由来の共通コアを含む。さらに炭化水素単位を修飾するため、該タンパク質はERからゴルジ複合体に輸送される。糖タンパク質のN-結合オリゴ糖単位の構造は、その配座とそれらがプロセスされるゴルジ装置のグリコシルトランスフェラーゼの組成により決定される。
【０００４】  ある種の植物のN-グリカンのコア五糖単位は、β1,2-結合キシロースおよびα1,3-結合フコースにより置換されることが示されている(Lerougeら、1998, Plasnt Mol. Biol. 38,31-48: Rayonら、1998, J. Exp. Bot. 49,1463-1472)。七糖「MMXF3」は、植物中の主要オリゴ糖タイプを構成する（Kurosakaら、1991, J. Biol. Chem., 266,4168-4172; WilsonおよびAltmann, 1998, Glycoconj. J. 15,1055-1070)。これら構造は、それぞれ複合体N-グリカンまたはマンノース欠損もしくは切断型（トランケーテッド）N-グリカンとも呼ばれる。α-マンノシル残基はさらにGlcNAcにより置換され、これにガラクトースおよびフコースが結合してヒトルイスa-エピトープに対応する構造を生成することができよう（Meloら、1997, FEBS Lett 415,186-191; Fitchette-Laineら、1997, Plant J. 12,1411-1417)。
【０００５】  β1,2-キシロースとａ1,3-結合フコースはいずれもも哺乳動物糖タンパク質中には存在しない。β1,2-キシロースはa1,3-フコースとともに植物N-結合オリゴ糖に対する抗体のエピトープ認識に重要な役割を演じ、それによりこれらオリゴ糖に対するヒトまたは動物身体における免疫応答を誘導することがわかった（Fayeら、1993, Anal. Biochem. 209,104-108)。さらに、N-グリカンを含有するβ1,2-キシロースおよび／またはα1,3-フコースは、種々の植物および昆虫アレルゲン間の広範なアレルギー性交差反応の主な原因の一つのようであり、「交差反応炭化水素決定基」(CCD)とも呼ばれる。免疫学的交差反応がしばしば起きることにより、さらにCCDはアレルギー診断を覆い隠す。
【０００６】  植物タンパク質によりヒト身体中に誘導される免疫応答は、植物を用いて製造される組換えヒトタンパク質の医療的使用における主な問題である。この問題を回避するにはβ1,2-キシロシル化をα1,3-フコシル化とともに妨げる必要があろう。ある試験によれば、複合体グリカンの生合成における第1酵素であるN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの活性がない植物Arabidopsis thalianaの突然変異体が単離された。この突然変異体における複合体糖タンパク質の生合成は妨げられる。それにも関わらず、これら突然変異体植物はある条件下では正常に発育することができる(A. Schaewenら、1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118)。
【０００７】  他のグリコシル化工程に干渉することなくβ1,2-キシロースのオリゴ糖への伝達を特異的にブロックするには、この特異的グリコシル化を直接担う酵素、すなわちβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼを単に不活化する必要があろう。植物およびある種の非脊椎動物種、例えばSchistosoma sp. (Khooら、1997, Glycobiology 7,663-677)およびカタツムリ（例えば、Mulderら、1995, Eur. J. Biochem. 232,272-283)にのみ生じるこのトランスフェラーゼ（まだヒトまたは他の脊椎動物においてではなく）を故意に不活化して抑制し、それぞれ植物または植物細胞において生成されるヒトタンパク質がこれまでの場合のように、この免疫応答誘発エピトープをもはや含まないようにする必要があろう。
【０００８】  β1,2-キシロシルトランスフェラーゼは、UDP-キシロースから植物N-連結オリゴ糖のβ-連結マンノースにD-キシロースを伝達する。
この酵素は1997年にダイズミクロソームから精製された（Zengら: J. Biol. Chem., 272,31340-31347,1997)。この論文によれば、キシロース伝達のための最良のアクセプターはGlcNAc2Man3GlcNAc2-Tであるが、3-分枝上にGLcNAcを有するGlcNAc1Man3GlcNAc2もよいアクセプターである。さらに、多くの他のN-連結オリゴ糖、特に非還元末端にガラクトース単位を有するものはアクセプターとして不充分である。
【０００９】  Rayonら、(Plant Physiology, 1999,119,725-733)の論文には、アラビドプシスタンパク質が高マンノースタイプのN-グリカン、およびオリゴ糖含有キシロースおよびフコースによりN-グリコシル化されることが記載されている。TEZUKAら(Eur. J. Biochem. 203,401-413(1992))は、シカモアの懸濁培養細胞のゴルジ分画中の異なる酵素、例えばβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの活性を測定した。彼らは、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼにより内部マンノース上にキシロースが伝達されたことを証明した。さらに、彼らは、N-連結オリゴ糖含有キシロースは腹足類動物（gastropods）およびChlorophyceae由来の糖タンパク質中にもみられたが、オリゴ糖含有キシロースは植物界中に広く分布することを示した。
タンパク質の特異的抑制または不活化には、これをそれぞれ転写および翻訳工程のレベルで行うことが最良である。これには、活性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を単離し、シーケンス（配列決定）する必要がある。
【００１０】  上記のように、ダイズβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼは1997年に単離、精製された。該キシロシルトランスフェラーゼcDNAの部分のみが単離された（s. WO99/29835 A1;配列番号：6および7）が、活性タンパク質をコードする完全cDNAはこれまで単離も特徴づけもできなかった。例えばダイズのように、生物体において該キシロシルトランスフェラーゼをコードするmRNAの発生量は非常に低いため、これまで同定されていなかった該ヌクレオチド配列が該方法において大きな問題になるかもしれない。今まで、数グループが通常ダイズからのこの遺伝子の完全ヌクレオチド配列の同定を試みたが、通常の場合に有効であることが知られている従来の方法、例えばRACE-増幅(cDNA末端の急速増幅)の助けを借りて該キシロシルトランスフェラーゼmRNAに対応する完全長cDNAを生成することができなかった。この方法を用いると、未知の配列が特異的増幅プライマーの助けを借りて増幅される。5'-RACE実験が成功しなかった理由として考えられるのは、特異的PCRプライマーの不適切な選択とcDNA合成時における逆転写酵素阻害成分の存在である。
【００１１】  単離ダイズβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの１つの問題は、その溶解性と活性が界面活性剤の存在に依存することである。
きわめて低濃度のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼmRNAの問題に加えて、さらに該RNAの5'-末端の二次構造がこの領域の増幅を妨げるらしいという問題がある。これらの場合では、それ自身鋭敏な方法であるRACE増幅は、正しく、完全なキシロシルトランスフェラーゼーcDNA配列を生じない。
もちろん、該mRNAおよびそれから誘導されたcDNAは、非常に低濃度しか存在しないという事実に加え、種々の増幅の過程で非常に容易に組み換えられ、突然変異することも大いにあり得る。これらおよび他の考えられる理由により、この特異的遺伝子のクローニングと発現は今まで不可能であった。
【００１２】  本発明のある目的は、植物β1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするする全遺伝子をクローンおよびシーケンスし、この遺伝子または変化したDNA、またはそれらから誘導されたDNAを含むベクターを調製し、植物およびその細胞をこれらベクターの一つでトランスフェクションし、正常に生じるβ1,2-キシロースを含まない糖タンパク質を生成し、そのための対応する方法を提供することである。
【００１３】  さらなる目的は、β1,2-キシロースを含む同種N-グリカンまたは糖コンジュゲートをin vitroで合成することができる大量の生成組換え酵素の製造方法である。これは、植物糖タンパク質の免疫原性とアレルギー誘発性におけるβ1,2-キシロースの役割をさらに解明する助けとなろう。
【００１４】  本発明の目的は、塩基対227〜塩基対1831のオープンリーディングフレームを有する配列番号:8の配列、または上記配列と少なくとも50%ホモローガスであるかもしくはストリンジェント条件下で上記配列とハイブリダイズする配列を含むか、あるいは該遺伝子コードにより上記DNA配列と縮重した(degenerated)配列、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする配列またはそれらの相補的な配列を含むDNA分子により達成される。未だかつて記載されていないこの完全配列は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性に関する実験、分析および製造方法において特に有用である。この配列は、特にβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの不活化もしくは抑制、および該組換え酵素の過剰発現と生成に用いることができる。
【００１５】  上記のごとくダイズキシロシルトランスフェラーゼ誘導ペプチドを用いてGenBank+EMBL+DDBJ+PDBデータベースを検索することにより、有意な相同性を有する数種のポリペプチド配列（Arabidopsis(アラビドプシス)およびDrosophila(ショウジョウバエ)由来)が回収された。しかしながら、これら配列は別の方法では互いに、そして最終的に同定されたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ配列と関係がなかった。β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの候補配列の回収成功は、３つのダイズβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ誘導ペプチド配列を単一配列に適切に組み立てることによってのみ可能であった。当該分野の現状に従って本発明者らが用いたすべての検索戦略（すなわち、ペプチド配列を別個にかまたは互いに組み合わせて用いる)はβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの正しい配列の回収の成功をもたらさなかった。
【００１６】  この遺伝子の単離および精製は、DDBJ+GenBank+EMBL+PDB-データベースを用い、ダイズキシロシルトランスフェラーゼの３つの既知ペプチドに対応する配列を検索することにより達成された（特許WO99/29835 A1、配列番号：3および5）。以前にいかなるタンパク質にも割り当てられていないArabidopsis thalianaのあるDNA配列が該３つのペプチドの２つとの相同性を示すことがわかった。遺伝子発見者プログラムの助けを借りて、予測タンパク質配列をみいだし、それに従ってRT-PCRのための配列特異的プライマーを設計した。A. thaliana-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のmRNAに対応する第1鎖cDNAを生成し、次いで該第1鎖cDNAを特に設計したプライマーを用いるPCRにかけることができた。A. thalianaキシロシルトランスフェラーゼ-cDNAの生成が成功した理由は、一方ではA. thalianaのキシロシルトランスフェラーゼ-mRNAが他の植物種に比べて問題性が低く、他方ではPCRが最適に設計された遺伝子特異的プライマーを用いて行われたためであろう。
配列番号：8のオープンリーディングフレームは、534アミノ酸および理論分子量60.2kDaの、貫膜部分がおそらくIIe11とPhe29の間の領域に存在するタンパク質をコードする。配列番号:9の配列のコードされたタンパク質のpIの計算値は7.52である。
【００１７】  植物β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの活性は、該キシロシルトランスフェラーゼをUDP-キシロースおよび標識アクセプターを含む試料に加える(例えば、糖ペプチドまたは標識オリゴ糖)方法により検出され、測定される。反応時間後、結合したキシロースの量を測定する。この場合、該キシロシルトランスフェラーゼの活性は、該活性測定値が陰性コントロールの活性測定値より少なくとも10〜20%、特に少なくとも30〜50%高ければ陽性とみなす。該オリゴ糖の構造はさらにHPLCにより証明することができよう。そのようなプロトコールは従来技術である(Staudacherら、1998, Anal. Biochem. 246,96-101; Staudacherら、1991, Eur. J. Biochem. 199,745-751)。キシロースがアクセプター物質と結合するかしないかはさらに質量分析法により生成物の質量を測定することにより決定することができる。２つのDNA分子のペアリングは、試料の温度とイオン強度を選択することにより変化させることができる。ストリンジェント条件により、本発明の条件では正確でストリンジェントな結合が生じるものと理解される。例えば、DNA分子を50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、pH7.0、1mM EDTA中でハイブリダイズさせ、42℃の1% SDSで洗浄する。
配列が配列番号：8と少なくとも50%の相同性を有するか否かは、例えばEMBLまたはSWISSPROTデータバンクのプログラムFastDBにより決定することができる。
【００１８】  本発明のDNA分子によってコードされる組換えβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼとWO99/29835 A1に記載のダイズ由来の各酵素の間には多くの関連する違いが存在する：
1. 該組換え酵素は界面活性剤(例えば、Triton X-100)を用いることなく溶解するが、ダイズ由来酵素の溶解性は界面活性剤の存在に依存する。
2. 該組換え酵素は、界面活性剤(例えば、Triton X-100)の非存在下で完全に活性である。
3. 該組換え酵素はN-グリコシル化されているが、ダイズ由来酵素はグリコシル化されていないと記載されている。
4. A. thaliana由来酵素は、32 N-末端アミノ酸を欠く切断型としても完全な酵素活性を示す。
5. ダイズ由来酵素と対照的にA. thaliana由来酵素は広いpH-最適性を有し、pH6-8の範囲で顕著な活性を示す。
6. ダイズ酵素をコードするcDNA配列は、A. thalianaタンパク質のアミノ酸(aa)199-469のみに対応する。図11参照。
7. A. thaliana  キシロシルトランスフェラーゼをコードするcDNAは、ダイズ酵素の部分配列と比べて２つの挿入物(推定タンパク質配列のaa375-382およびaa425-429に対応する）を含む。図11参照。
8. ダイズ酵素から単離した５つのペプチド（WO99/29835 A1の図4参照）はいずれもA. thaliana由来酵素の対応領域と同一ではなかった：
ペプチド配列番号1: A. thaliana酵素のaa411-422とホモローガス。
ペプチド配列番号2: A. thaliana酵素のaa192-205とホモローガス。
ペプチド配列番号3: A. thaliana酵素のaa451-477とホモローガス。
ペプチド配列番号4: A. thaliana酵素のaa191-205とホモローガス。
ペプチド配列番号5: A. thaliana酵素のaa503-512とホモローガス(注:WO99/29835 A1に記載のcDNA配列はペプチド5のコーディング配列を含まない)。
【００１９】  したがって、本発明のDNA分子は、既知の精製酵素より驚くべき好都合な特性と効果を示す活性な組換え酵素をコードしているので特に好都合である。
好ましくは、本発明のDNA分子の配列は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。この特異的タンパク質はβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼに関連する分析、実験、および製造方法に特に有用である。
【００２０】  好ましくは、本発明のDNA分子は配列番号：8の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも95%ホモローガスである。この配列は特に活性なβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードする。相同性は、挿入および欠失を認識し、相同性計算においてこれらを考慮しないプログラムを用いて決定することが好ましい。さらに好都合な態様では、該DNA分子は1750〜1850、特に1831塩基対を含む。
【００２１】  そうするときに、上記DNA分子の１つが検出可能なマーカー物質と共有結合していると特に好都合である。マーカー（標識）物質として、あらゆる普通のマーカー、例えば蛍光、ルミネッセント、放射活性マーカー、ビオチンなどを用いることができる。このように、ハイブリダイゼーション法による固体組織試料（例えば植物由来）または液体試料中の対応DNA分子の検出、選択、および定量に適した試薬を提供する。
【００２２】  好ましくは、本発明のDNA分子には、欠失、挿入および／または置換突然変異を含む配列が含まれる。突然変異体ヌクレオチドの数は変化しやすく、１個から数個の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドまで変化する。リーディングフレームは突然変異によりシフトする。そのような「ノックアウト遺伝子」では、単に、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現が妨げられ、活性な機能的酵素の形成が妨げられることが重要である。そうするときには、酵素的に活性なタンパク質の発現が妨げられる限り突然変異の部位は変動しうる。好ましくは、C末端領域に位置する該酵素の触媒領域の突然変異。DNA配列に突然変異を挿入する方法は当業者によく知られているので、突然変異誘発の種々の可能性をここで詳細に議論する必要はない。この場合には、同時(共)突然変異誘発、および特に指向性突然変異誘発、例えば部位指向性突然変異誘発、オリゴヌクレオチド制御突然変異誘発、または制限酵素の助けによる突然変異誘発を用いてよい。
【００２３】  さらに本発明は、天然のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼDNA分子により転写される該mRNAと複合体を形成し、開裂する、上記の本発明DNA分子の配列部位と相補的な少なくとも長さ10〜15塩基対の２つの配列部位を含むリボザイムをコードするDNA分子を提供する。John M. Burkeの刊行物「Clearing the way for ribozymes」(Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997)はリボザイム機能の一般的様式に関する。リボザイムは、mRNAとの相補的塩基対化によりβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのmRNAを認識するであろう。次に、リボザイムは該酵素を翻訳する前に配列特異的に該RNAを開裂し、破壊するであろう。開裂した基質から分離した後、リボザイムは、RNA分子と反復してハイブリダイズし、特異的エンドヌクレアーゼとして作用する。一般に、該タンパク質をコードする完全なDNA配列が知られていなくても、ある種のmRNAを不活化するためにリボザイムを特に製造することができよう。リボザイムは、該mRNAに沿って徐々に移動するならば特に有効である。その場合、リボザイムがmRNA上の無リボソーム部位をみいだすことはより容易である。このため、遅（slow）リボソーム突然変異体もリボザイムのための系として適している(J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15,414-415)。
【００２４】  １つの可能な方法は、種々の形のリボザイム、すなわちミニザイムを用いることである。ミニザイムはより大きなmRNA分子を開裂させるのに特に有効である。ミニザイムは、ステム/ループIIの代わりに短いオリゴヌクレオチドリンカーを有するハンマーヘッドリボザイムである。二量体ミニザイムが特に有効である(Kuwabaraら、1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965)。
【００２５】  本発明のさらなる目的は、上記DNA分子の１つを含む生物学的に機能的なベクターに関する。宿主細胞へのトランスフェクションには増幅することができる独立ベクターが必要であり、宿主細胞、トランスフェクションメカニズム、該DNA分子の役目とサイズに応じて適切なベクターを用いることができる。多くの異なるベクターが知られており、それらを列挙することは本出願の限界を越えるので、特にベクターは当業者によく知られているため(本明細書で用いたベクター、すべての技術および用語は当業者に知られていると思われるため、Maniatisも参照)ここ以外で行う。理想的には、ベクターは低分子量であり、ベクター含有および無ベクター宿主細胞を容易に選択できるように細胞に容易に認識可能な表現型をもたらすように選択可能な遺伝子を含むべきである。DNAおよび対応する遺伝子産物を高収量で得るには、ベクターは強いプロモーター、エンハンサー、遺伝子増幅シグナル、および制御配列を含むべきである。ベクターの自律複製にはさらに複製起点が重要である。ポリアデニル化部位はmRNAの正しいプロセシングを担い、スプライスシグナルはRNAの転写を担う。ファージ、ウイルスまたはウイルス粒子をベクターとして用いる場合は、パッケージングシグナルはベクターDNAのパッケージングを制御するであろう。例えば、植物における転写では、Tiプラスミドが適切であり、昆虫細胞における転写にはバクロウイルスが、また昆虫ではトランスポゾン、例えばPエレメントが適している。
【００２６】  上記本発明ベクターを植物または植物細胞に挿入する場合、内因性β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現の翻訳後抑制は、それとホモローガスな導入遺伝子またはその部分のセンス方向への転写により達成される。このセンス技術については、さらに、刊行物、Baucombe 1996, Plant. Mol. Biol., 9: 373-382,およびBrignetiら、1998, EMBO J. 17: 6739-6746を参照。「遺伝子スプライシング」のこの戦略は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する有効な方法である。Waterhouseら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964も参照。
【００２７】  さらに、本発明は、プロモーターと逆方向の、上記態様の１つのDNA分子を含む生物学的に機能的なベクターに関する。このベクターを宿主細胞にトランスフェクションする場合、「アンチセンスmRNA」は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼのmRNAと相補的であり、それと複合体を形成するものと解釈されよう。この結合は、正しいプロセシング、輸送、安定性を妨げるか、またはリボソームアニーリングを妨げることにより翻訳およびβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの正常な遺伝子発現を妨げるであろう。
【００２８】  該DNA分子の完全配列をベクターに挿入することができるかもしれないが、その部分配列もサイズが小さいためある種の目的には好都合かもしれない。アンチセンスを用いる局面では、例えば、該DNA分子は、トランスフェラーゼmRNAと結合する十分に大きなアンチセンスmRNAを形成するように十分大きいことが重要である。多くの知られた天然のアンチセンスRNA分子は約100ヌクレオチドを含むので、適切なアンチセンスRNA分子は、例えば50〜200ヌクレオチドを含む。
【００２９】  活性β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現を特に効果的に阻害するには、センス技術とアンチセンス技術を組み合せることが適切である(Waterhouseら、1998, Proc. Natl .Acad. Sci., USA, 95: 13959-13964)。
好都合には、急速にハイブリダイズするRNA分子を用いる。サイズが50ヌクレオチド以上のアンチセンスRNA分子の効率はin vitroのアニーリング速度論に依存する。すなわち、例えば急速にアニーリングするアンチセンスRNA分子は、徐々にハイブリダイズするRNA分子よりタンパク質発現の大きな阻害を示す(Wagnerら、1994, Annu. Rev. Microbiol., 48: 713-742; Rittnerら、1993, Nucl. Acids Res., 21: 1381-1387)。特に、そのような急速にハイブリダイズするアンチセンスRNA分子は多数の外部塩基(遊離末端および結合配列)、多数の構造サブドメイン(成分)、および低次のループ(Patzelら、1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68)を含む。アンチセンスRNA分子の仮説的二次構造は、例えば適切なアンチセンスRNA DNA配列を選択するためのコンピュータープログラムの助けを借りて決定してよい。
【００３０】  該DNA分子の異なる配列領域をベクターに挿入してよい。１つの可能性は、例えば、リボソームアニーリングを担う部分のみをベクターに挿入することにある。該mRNAのこの領域のブロッキングは完全な翻訳を止めるのに十分であろう。特に高効率のアンチセンス分子は、該遺伝子の5'-および3'-非翻訳領域をも生じる。
【００３１】  本発明は、２つの最後に記載のDNA分子(突然変異またはリボソーム-DNA分子)の１つを含む生物学的に機能的なベクターにも関する。ベクターに関して先に述べたことはこの場合にも適用される。
本発明によれば、逆転写を逆転写酵素およびプライマーの添加後に行うことにより植物細胞、特に葉細胞からRNAを単離する、本発明DNA分子を含むcDNAの製造方法を提供する。この方法の個々の工程は、実質的に知られたプロトコールに従って行われる。逆転写については、一方ではオリゴ(dT)プライマーの助けにより完全mRNAのcDNAを生成し、次いで、選択したプライマーによりPCRを実施するだけで、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA分子を製造することが可能である。他方で、選択したプライマーを直接逆転写に用い、短い特異的cDNAを得てよい。適切なプライマーは、例えば、該トランスフェラーゼのcDNA配列パターンに従って合成的に製造してよい。
【００３２】  さらに本発明は、本発明のDNA分子をベクター中にクローンし、次いでこれを宿主細胞または宿主にトランスフェクションし、トランスフェクションした宿主細胞の選択および増幅により活性β1,2-キシロシルトランスフェラーゼを発現する細胞系を得ることを特徴とするβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのクローニング方法に関する。該DNA分子を、例えば制限エンドヌクレアーゼの助けにより該ベクターに挿入する。ベクターについては、すでに上記したものを適用した。本方法で重要なことは効率的な宿主-ベクター系を選択することである。活性酵素を得るには真核宿主細胞が特に適している。１つの可能な方法は、昆虫細胞に該ベクターをトランスフェクションすることである。そうするには、特に昆虫ウイルス、例えばバクロウイルスなどをベクターとして用いる必要があろう。
もちろん、植物や植物細胞、ヒトもしくは他の脊椎動物細胞をトランスフェクションすることもでき、この場合、後者はそれらに外来性の酵素を発現するであろう。
【００３３】  好ましくは、本発明のベクターの少なくとも１つ、すなわち、本発明のDNA分子、突然変異体DNA分子またはリボザイムをコードするDNA分子を含むもの、または該DNA分子をプロモーターと逆方向に含むものをそれぞれ宿主細胞または植物に挿入することを特徴とする、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの生成が抑制または完全に停止した組換え宿主細胞、特に植物細胞または植物の製造方法を提供する。トランスフェクションについて先に記載したものをこの場合に適用することもできる。
【００３４】  例えば、宿主細胞として植物細胞を用いてよく、例えば、agrobacterium（アグロバクテリウム）系とTiプラスミドが好適である。アグロバクテリウム系を用いて、植物を直接トランスフェクションすることができ、アグロバクテリアは植物に根幹粒（root stem galls）を生じる。アグロバクテリアが損傷した植物に感染すると、該細菌自身は植物内に入り込まずに、環状の染色体外腫瘍-誘導Ti-プラスミドからの組換えDNA部分、いわゆるT-DNAを植物細胞に挿入する。T-DNAおよびその中に挿入されたDNA分子は、T-DNAの遺伝子を植物中で発現させるのに適した方法で該細胞の染色体DNAに組み込まれる。
【００３５】  種々の宿主系のための効率的なトランスフェクションメカニズムが多数知られている。いくつかの例としてエレクトロポーレーション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、リボソーム法がある。
次に、トランスフェクトした細胞を、例えば、ベクターが含む遺伝子の抗生物質耐性または他のマーカー遺伝子に基づいて選択する。次に、トランスフェクトした細胞系を、少量、例えばペトリ皿中、または多量、例えば発酵器中で増幅する。さらに、植物は特定の特性を有する。すなわち、植物はそれぞれ１つの(トランスフェクトした)細胞またはプロトプラストから成長し得る完全な植物を再発生させることができる。
【００３６】  用いるベクターに応じて、酵素発現が抑制または完全にブロックされるように宿主中でプロセシングされる。
欠失、挿入または置換突然変異を有するDNA分子を含むベクターをトランスフェクトする場合は、ホモローガスな組換えが生じ、突然変異体DNA分子は、突然変異にも関わらず宿主細胞のゲノム中の同一配列を認識し、「ノックアウト」遺伝子が形成されるその位置に正確に挿入されるであろう。このようにして、突然変異をβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの遺伝子に導入し、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの完全な発現を阻害することができる。上記したように、この技術を用いて突然変異が活性タンパク質の発現をブロックするのに十分であることが重要である。選択および増幅後、それぞれホモローガスな組換えの成功または突然変異の程度を決定するための更なるチェックとして遺伝子のシーケンシングを行ってよい。
【００３７】  リボザイムをコードする該DNA分子を含むベクターをトランスフェクトする場合、活性リボザイムが宿主細胞中に発現するであろう。リボザイムがβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの相補的mRNA配列と少なくとも一定の部位で複合体を形成し、この部位で開裂し、そしてこのようにして、該酵素の翻訳を阻害することができる。この宿主細胞およびそれから誘導された細胞系または所望により植物はβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼを発現しないであろう。
【００３８】  ベクターがプロモーターに対してセンスまたは逆方向に本発明のDNA分子を含む場合は、センスまたはアンチセンス-mRNAがトランスフェクトした細胞(または植物、それぞれに)中で発現するであろう。アンチセンスmRNAは、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼのmRNA配列の少なくとも部分に相補的であり、同様に該酵素の翻訳を阻害してよい。アンチセンス技術により遺伝子の発現を抑制する方法の例として、トマトの成熟過程に関与する遺伝子の発現を阻害することを記載の、Smithら、1990, Mol. Gen. Genet. 224: 477-481の刊行物が参照される。二本鎖RNA(dsRNA)が、線虫、植物、トリパノソーマ、ミバエおよびプラナリアを含む種々の生物体における配列特異的遺伝子サイレンシング(silencing)を引き起こすことが最近示され、まだ特徴づけされていないRNAトリガーは、種々の異なる植物系においてDNAのメチル化を誘導し、遺伝子機能との選択的な干渉をもたらすことが示された(概説については、Fire A., 1999, Trends Genet 15 (9): 358-363参照)。
【００３９】  すべての系において、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現は少なくとも抑制され、好ましくは完全にブロックされる。該遺伝子発現の妨害の程度は、複合体形成の程度、ホモローガスな組換え、該ゲノム領域中の考えられる次の同時突然変異および他のプロセスに依存する。トランスフェクトした細胞のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性をチェックし、選択した。
【００４０】  さらに、上記ベクターの挿入に加え、哺乳動物タンパク質、例えばβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによりβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ発現の上記抑制をさらに増大させることができる。他の哺乳動物酵素の作用によりキシロシル化を減少させてよく、本発明のベクターおよび特に効率的な哺乳動物酵素ベクターによる活性β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現の阻害の組み合わせが特に効率的である。
【００４１】  あらゆるタイプの植物、例えば、ミドリマメ（mung bean）、タバコ植物、トマトおよび／またはジャガイモ植物をトランスフェクションに用いてよい。
【００４２】  組換え宿主細胞、特にそれぞれ植物細胞または植物を製造するための別の有利な方法は、突然変異していないホモローガスな配列の代わりに突然変異を含むDNA分子をそれぞれ宿主細胞または植物のゲノム中に挿入することからなる(Schaeferら、1997, Plant J.; 11 (6): 1195-1206)。すなわち、この方法はベクターでは機能しないが純粋なDNA分子で機能する。DNA分子は、３つの例を示すために、例えば、遺伝子衝撃、マイクロインジェクションまたはエレクトロポーレーションにより宿主中に挿入される。すでに説明したように、該DNA分子は、宿主のゲノム中のホモローガスな配列と結合し、ホモローガスな組換えおよび欠失、挿入または置換突然変異を受けることで該ゲノムを生じ、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現をそれぞれ抑制または完全にブロックすることができるであろう。
【００４３】  好ましくは、上記方法の１つにより製造された組換え植物または植物細胞がそれぞれ提供され、そのβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ生成がそれぞれ抑制または完全にブロックされる。好ましくは、それらのβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性はそれぞれ天然の植物または植物細胞のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性の50%以下、特に20%以下、特に好ましくは0%である。これら植物または植物細胞それぞれの利点は、それらが生成する糖タンパク質がいかなるβ1,2-結合キシロースも含まないかまたはほとんど含まないことである。これら植物の生成物がヒトまたは脊椎動物の身体に取り込まれてもβ1,2-キシロースエピトープによる免疫応答はみられないであろう。
【００４４】  本発明は、本発明のDNA分子の配列と相補的な塩基配列を含むPNA分子にも関する。PNA(ペプチド核酸)は、核酸塩基が偽(pseudo)-ペプチドバックボーンと結合しているDNA様配列である。一般にPNAはワトソン−クリック（Watson-Crick）塩基対化およびラセン形成により相補的DNA-、RNA-、またはPNA-オリゴマーとハイブリダイズする。該ペプチドバックボーンは酵素分解に対する強い耐性を保証する。すなわち、PNA分子は改良アンチセンス物質である。
【００４５】  ヌクレアーゼとプロテアーゼはいずれもPNA分子を攻撃することができない。相補的配列と結合する場合のPNA分子の安定性には、DNAおよびRNAポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、およびリボソームの十分な立体阻害が含まれる。Poogaらの刊行物、「Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo」(Nature Biotechnology 16: 857-861; 1998)は、一般にPNA分子、特にヒトゼラチンレセプタータイプ1 mRNAと相補的なPNA分子に関する。
【００４６】  PNA分子が上記配列を含む場合は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNAまたはDNAの部位と結合するであろうし、このようにしてこの酵素の転写を阻害することができる。PNA分子は転写も翻訳もされないので、例えば、t-Boc技術の助けにより合成的に製造されよう。
【００４７】  好都合には、本発明のDNA分子の配列に対応する塩基配列を含むPNA分子が提供される。このPNA分子はβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのmRNAまたはmRNAの部位と複合体を形成し、該酵素の翻訳が阻害される。アンチセンスRNAについて記載の同様の議論がこの場合に適用される。すなわち、例えば特に効率的な複合体形成領域はmRNAの翻訳開始領域または5'-非翻訳領域である。
本発明のさらなる目的は、転写または翻訳レベルでβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現をブロックすることを含む、本発明のPNA分子が該細胞中に挿入されることを特徴とする、植物または植物細胞、特に植物細胞の製造方法に関する。細胞にそれぞれPNA分子またはPNA分子（複数）を挿入するのにも、例えば、エレクトロポーレーションまたはマイクロインジェクションのような従来の方法を用いる。PNAオリゴマーを細胞貫通ペプチド、例えばトランスポータン(transportan)またはpAntpと結合するときは挿入が特に有効である(Poogaら、1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861)。
【００４８】  本発明は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ生成が抑制または完全にブロックされた本発明の組換え植物または植物細胞、または本発明の方法に従ってPNA分子が挿入された植物または細胞を、糖タンパク質を発現する該遺伝子でトランスフェクトし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換え糖タンパク質の製造方法を提供する。そうするには、すでに先に記載したように、所望のタンパク質の遺伝子を含むベクターをすでに先に記載したように宿主または宿主細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした植物細胞は所望のタンパク質を発現し、いかなるβ1,2-結合キシロースもほとんどまたは全く持たないであろう。すなわち、該細胞は、ヒトまたは脊椎動物の身体中で上記免疫応答を引き起こさない。この系を用いてあらゆるタンパク質を製造してよい。
【００４９】  好都合には、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの生成が抑制または完全にブロックされる組換え植物または植物細胞、またはPNA分子が本発明の方法にしたがって挿入された植物もしくは細胞を糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクションし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換えヒト糖タンパク質の製造方法を提供する。この方法により、植物(植物細胞)中で、ヒト身体に取込まれても、β1,2-結合キシロース残基に対して生じるいかなる免疫応答も引き起こさないヒトタンパク質を製造することが可能になる。そこで、食物原料として用いられる組換え糖タンパク質を製造するための植物種、例えば、バナナ、ジャガイモおよび／またはトマトを利用することができる。この植物の組織は、例えば、該組織から組換え糖タンパク質を抽出し、次いで投与するかもしくは植物組織を直接食べることによりヒト身体に取込まれる該組換え糖タンパク質を含む。
【００５０】  好ましくは、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ生成が抑制または完全にブロックされた本発明の組換え植物または植物細胞、または本発明の方法に従ってPNA分子が挿入された植物または細胞を、糖タンパク質を発現する該遺伝子でトランスフェクトし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする医療用の組換えヒト糖タンパク質の製造方法が提供される。そうするには、医療的関心があるあらゆるタンパク質を用いることができる。
【００５１】  さらに、本発明は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ-減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ1,2-結合キシロース残基の50%以下、特に20%以下、特に好ましくは0%を含む、植物系において製造された上記方法による組換え糖タンパク質に関する。もちろん、β1,2-結合キシロース残基を含まない糖タンパク質が好ましい。β1,2-結合キシロースの量は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの上記抑制の程度に依存するであろう。
【００５２】  好ましくは、本発明は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ-減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ1,2-結合キシロース残基の50%以下、特に20%以下、特に好ましくは0%を含む、植物系において製造された上記方法による組換えヒト糖タンパク質に関する。
特に好ましい態様は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ-減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ1,2-結合キシロース残基の50%以下、特に20%以下、特に好ましくは0%を含む、植物系において製造された上記方法による医療用の組換えヒト糖タンパク質に関する。
【００５３】  本発明の糖タンパク質は、植物に特異的な他の結合オリゴ糖単位を含んでいてよいので、ヒト糖タンパク質の場合、それらはこれら天然の糖タンパク質と異なる。それにも関わらず、本明細書の序論部分ですでに説明したように、β1,2-結合キシロース残基はα1,3-フコース残基とともに、植物糖タンパク質に対する免疫応答もしくは交叉免疫応答の主な原因であるので、本発明の糖タンパク質によりヒト身体にわずかな免疫応答が引き起こされるか、または全く免疫応答は生じない。
【００５４】  更なる目的には、本発明の糖タンパク質を含む医薬組成物が含まれる。本発明の糖タンパク質に加え、医薬組成物はそのような組成物に一般的なさらなる添加剤を含む。これらには、各処置に適した、例えば、種々の緩衝内容物の適切な希釈剤(例えば、トリス-HCl、アセテート、ホスフェート、pHおよびイオン強度)、添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤(例えば、Tween80、Polysorbate80)、保存料(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、アジュバント、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、乳化剤、充填剤(例えば、ラクトース、マンニトール)、該タンパク質に対するポリマーの共有結合物、例えばポリエチレングリコール、重合化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸などの粒状組成物またはリポソームへの該物質の取込み、助剤および／または担体物質がある。そのような組成物は、健康状態、安定性、本発明の糖タンパク質のin vivo遊離速度およびin vivo排出速度に影響されるであろう。
【００５５】  本発明は、標識された本発明のDNA分子またはその部分配列を試料に加えβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子と結合させるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子の選択方法も提供する。ハイブリダイズしたDNA分子を検出し、定量し、選択することができる。標識DNA分子がハイブリダイズすることができる一本鎖DNAを含む試料については、試料を例えば加熱により変性させる。
１つの可能な方法は、おそらくエンドヌクレアーゼを加えた後にアガロースゲル電気泳動によりアッセイすべきDNAを分離することである。ニトロセルロース膜に移した後、本発明の標識DNA分子を混合し、次いで対応するホモローガスなDNA分子とハイブリダイズさせる(「サザンブロッティング」)。
別の可能な方法は、本発明のDNA分子の配列から誘導された特異的および／または変性プライマーを用いるPCR依存法により他の種からホモローガスな遺伝子をみつけることにある。
【００５６】  好都合には、標識された本発明のDNA分子またはその部分配列を担体マトリックス上に固定化する。DNAミクロアレイ(「遺伝子チップ」)の使用は、ホモローガスな遺伝子をみいだすか、またはホモローガスな遺伝子の発現レベルを試験するためのさらなる可能な方法である。このためには、完全なゲノム遺伝子配列、完全長cDNA配列、これら配列の部分、または部分配列のあらゆる組み合わせのいずれかを示すDNAを担体マトリックス上に固定化し、試料を担体マトリックスに加えた後にホモローガスな遺伝子を標識DNA分子とハイブリダイズさせる(例えば、Ferea T. L. & Brown, P. 0., 1999, Current Opinion in Genetics & Development 9: 715-722およびその中の引用文献参照)。
【００５７】  好ましくは、上記の本発明の方法のための試料は植物生物体のゲノムDNAを含む。この方法により、多数の植物または他の種のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在が非常に急速かつ効率的にアッセイされる。このようにして、上記方法によりこの遺伝子を含むそのような植物または他の生物体におけるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現を抑制または完全にブロックするかまたはこの遺伝子を含まない植物または他の種の個体を選択し、次いでそれらを(ヒト)糖タンパク質の生成およびトランスフェクションに用いることができる。
【００５８】  本発明は、３つの先に記載の方法に従って選択され、次いで試料から単離されたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子にも関する。これら分子はさらなるアッセイに用いることができる。それらをシーケンシングし、次いでβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼをみいだすためのDNAプローブとして用いることができる。これら標識DNA分子は、該DNA分子が単離された生物体に関して本発明のDNA分子より効率的にプローブとして生物体に機能するであろう。
【００５９】  本発明のさらなる目的は、pI値が6.0〜9.0、詳細には7.50〜8.00のアイソフォームを含む、本発明に従ってクローンされたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの製造方法に関する。タンパク質のpI値は、その正味荷電が０になるpH値であり、該タンパク質のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、および空間的構造に依存する。β1,2-キシロシルトランスフェラーゼはこの範囲のpI値を有する種々のアイソフォームを含んでいてよい。該トランスフェラーゼの種々のアイソフォームがある理由は、例えば、異なるグリコシル化があり、タンパク質分解が限られているからである。タンパク質のpI値は、当業者に知られた等電点電気泳動により決定することができる。
該酵素の主なアイソフォームの見かけの分子量は60,2kDaである。
特に、本発明の製造方法は、pI値が7.52のアイソフォームを含む。
【００６０】  本発明は、上記DNA分子によりコードされるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼおよびUDP-キシロースを炭化水素単位または糖タンパク質をそれぞれ含む試料に加え、β1,2-位のキシロースがβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼによりそれぞれ炭化水素単位または糖タンパク質と結合する、ヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質または他の糖コンジュゲートの「プランティファイド(plantified)」炭化水素単位の製造方法にも関する。β1,2-キシロシルトランスフェラーゼをクローニングするための本発明の方法により、多量の精製酵素を製造することができる。完全に活性なトランスフェラーゼを得るための適切な反応条件が提供される。
【００６１】  下記実施例および図面により本発明をより詳細に説明するが、これらはもちろん本発明を限定するものではない。詳細には、図面において、
図1は、ダイズペプチド2および3のアミノ酸配列 (特許WO99/29835;配列番号：3および5)、これらペプチドとA. thaliana配列の相同性、および４つのプライマー1-4のDNA配列を示す。
図2は、226ntの5'-非翻訳領域を含むβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのcDNA配列を示す。
図3は、上記配列から導かれたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列。
図4a、4bおよび4cは、A. thaliana β1,2-キシロシルトランスフェラーゼcDNA、あるゲノムDNAおよびあるEST配列のアラインメントを示す。
図5は、該cDNA、ゲノムDNAおよびEST配列から導かれたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図6は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、PCR-生成物およびアミノ酸残基の疎水性の概略図である。
図7は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性と陰性コントロールのそれの比較を示す。
図8aおよび8bは、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す。
図9はマススペクトルを示す。
図10は、逆層HPLCによるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す。
図11は、ダイズから精製したβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と本出願のcDNAから誘導した推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６２】実施例1:
RT-PCRおよびcDNAクローニング
RT-PCRにより推定β1,2-キシロシルトランスフェラーゼcDNA増幅用プライマーを以下のごとく設計した。２つのダイズペプチド(配列番号：1および2、特許WO99/29835 A1の図4の配列番号：3および5に対応するが、C末端アミノ酸LGが配列番号：5から省略された)(図1参照)を用いるDDBJデータベースのBLASTP検索は、相同性80%以上のArabidopsis thaliana ゲノムDNA配列(Acc. Nr. AB015479)から導かれたあるタンパク質配列を示した(配列番号：3)。プライマー3(配列番号：4)および4(配列番号：5)はダイズペプチド2および3とホモローガスなA. thaliana配列に基づいた。BCM Search LauncherのGene-Finderを用いる該ホモローガスなゲノムDNA配列の分析により１つの推定タンパク質を得た。プライマー1(配列番号：6)は、該推定タンパク質の出発コドンを含むように設計したが、プライマー2 (配列番号：7)は該推定タンパク質の終止コドンを含む。
【００６３】  完全RNAは、TRIzol試薬 (Life Technologies)を用い、Arabidopsis thalianavar Columbiaの若葉から単離された。該RNAをDNアーゼ (Promega、RQ1 RNアーゼ不含DNアーゼ)で処理して微量のゲノムDNAを除去した。第1鎖cDNAを、オリゴ(dT)プライマー(Sigma)およびAMV逆転写酵素(Promega)を用い、42℃で総RNA 1μgから合成した。
【００６４】  第1鎖cDNAを、センスおよびアンチセンスプライマーの異なる組み合わせを用いるPCRにかけた(図6に示す)。プライマー3およびプライマー4の生成物は長さ174bp(P1)のDNA断片であり、プライマー1およびプライマー2の生成物は1605bp(P2)DNA断片であり、プライマー1およびプライマー4の生成物は長さ1525bp(P3)のDNA断片であり、また、プライマー3およびプライマー4は254bp(P4)のDNAを生成した。推定オープンリーディングフレームを増幅するためにプライマー1およびプライマー2を用いた。PCR反応物は、総量50μL中に各プライマー0.2μmol、0.05mM dNTPs、2mM MgSO4、20mMトリスHCl(pH8.2、25℃), 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X100、ヌクレアーゼ不含BSA 5μg、およびPromegaのPfu DNAポリメラーゼ2.5単位を含んだ。94℃、2分間の第1変性工程後、92℃で1分間、53℃で40秒間、および72℃で3分間および30秒間を30サイクル実施した。最後の伸張工程を72℃で8分間実施した。PCR生成物をSmaI線状化、脱リン酸化puc19ベクターにサブクローンし、次いでシーケンシングした。サブクローンした断片の配列をジデソキシヌクレオチド法(ABI PRISM Dye Termination Cycle Sequencing Ready Reaction KitおよびABI PRISM 310 Genetic分析器(Perkin Elmer))により得た。RT-PCRの結果、３つのわずかに異なるcDNA配列が観察された。理論pI値が7,52であり、分子量が60,2kDAの534アミノ酸のタンパク質をコードするサイズ1605bp(xt-Ath6、配列番号：8)のcDNA 6の配列（図3参照）は、２つのイントロンを除去した後にゲノムクローンから誘導されたヌクレオチド配列(xt-Athgen. seq)と同一である。cDNA 9は、cDNA 6と比べて4塩基対の変化を示すがcDNA 16はcDNA 6と比べて6塩基対の変化を示す(図4a、4bおよび4cに示す)。したがって、cDNA 9から誘導したアミノ酸配列は、cDNA 6から誘導したアミノ酸配列(配列番号：8)と比べて２つの変化を含み、cDNA 16のアミノ酸配列は、４つの変化した残基を示す（図5に示す）。
【００６５】  図3は、β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ(xt-Ath6;配列番号：8)のcDNA由来アミノ酸配列(配列番号：9)を示す。アスパラギン-結合グリコシル化の潜在的部位はAsn51、Asn301およびAsn479である。
【００６６】  図4a，4bおよび4cは、A. thaliana cDNA 6 (xt-Ath6;配列番号：8)、A. thaliana cDNA 9 (xt-Ath9)、A. thaliana cDNA 16 (xt-Ath16)、２つのイントロン(xt-Athgen)除去後のA. thaliana ゲノムDNA配列、およびA. thaliana EST配列(xtAthEST)からのβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼヌクレオチド配列のアラインメントを示す。点線はコンセンサス配列を表し、断続線はギャップを表す。ゲノム配列 (xt-Athgen; Acc. No. AB015479、ゲノムDNAの58185-58187位に開始コドン、60214-60216位に終止コドン)は、スプライス部位予測サーバーNetPlantGeneを用い、２つの推定イントロン(イントロン1：ゲノムDNAの58881〜59116位、イントロン2:ゲノムDNAの59268〜59458位）を除去することにより生じる。A. thaliana EST配列 (xt-AthEST; Acc. No. AI994524)は、BLASTNを用いるデータベース検索の結果である。
【００６７】  図5は、A. thaliana cDNA 6 (xt-Ath6; 配列番号：9)、A. thaliana cDNA 9 (xt-Ath9)、A. thaliana cDNA 16 (xt-Ath16)、A. thaliana ゲノム配列 (xt-Athgen)、およびA. thaliana EST配列 (xt-AthEST)から誘導したβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼからのアミノ酸配列のアライソメントを示す。点線はコンセンサス配列を表し、断続線はギャップを表す。
【００６８】  図6に、略図的予測β1,2-キシロシルトランスフェラーゼタンパク質(先端)およびコードされたタンパク質のProtScaleを用いる誘導疎水性指数(底部)を示し、陽性疎水性指数は疎水性の増加を意味する。４つの上記PCR生成物(P1-P4)のサイズをcDNAに関して示す。「C」は該トランスフェラーゼの仮定細胞質領域をコードし、「T」は仮定貫膜領域を、また「G」は仮定ゴルジ腔触媒領域をコードする。「TMpred」(EMBnet)によるタンパク質配列の分析によりIle11〜Phe29の仮定貫膜領域を得た。おそらく該酵素のC末端領域は触媒領域を含むので、ゴルジ装置の腔中を指すべきである。これによれば、このトランスフェラーゼは、糖タンパク質の生合成に関与する今までに分析されたすべてのグリコシルトランスフェラーゼのようなタイプII貫膜タンパク質であるようである(Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277)。灰色領域は、２つのペプチドの位置を示し、六角形は潜在的N-グリコシル化部位を示す。NCBIを介してアクセスできるデータバンクのBLAST検索は、他の１つの植物配列とのみ高い相同性を示した(ハイブリッドアスペン、Acc. No. AI62640)。
【００６９】実施例2:
昆虫細胞における組換えβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼの発現
細胞質および貫膜領域を含む推定β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの完全なコーディング領域を、BamHIおよびEcoRI消化によりpuc19 ベクターから取り出し、BamHI/EcoRI消化、脱リン酸化バクロウイルストランスファーベクター pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA)にサブクローンした。正しいクローニングを、pVL1393順（方向）プライマー5'AACCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3' (配列番号：10)およびpVL1393逆（方向）プライマー5'-GTCGGGTTTAACATTACGGATTTC-3' (配列番号：11)を用いてシーケンシングすることにより確認した。ホモローガスな組換えを保証するため、トランスファーベクター1μgを、Lipofectin (Life Technologies)を製造業者のプロトコールに従って用い、IPL-41培地中の1 x 106 Sf-9細胞に線状Baculo-GoldウイルスDNA (PharMingen, San Diego, CA) 200ngを共トランスフェクションした。27℃で5日間インキュベーションした後、種々の容量の組換えウイルス上清を用いてSf-21昆虫細胞を感染させた。細胞を5%加熱不活化ウシ胎児血清添加IPL-41培地中で、27℃、4日間インキュベーションし、次いで回収し、リン酸緩衝生理食塩水溶液で2回洗浄した。細胞を下記緩衝液に再懸濁し、ホモゲナイズし(1ml/107細胞)、氷上で30分間インキュベーションした：100mM MES緩衝液、pH7.0、1% Triton X-100、1mM DTT、1mM PMSF、5μg/mlロイペプチン(Sigma)、5μｇ/ml E-64 (Serva)。
【００７０】実施例３
β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性のアッセイ
細胞乳剤のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性をアッセイした。陰性コントロールを同数の非感染細胞を用いて実施した。アッセイ混合物は、総容量20μl中に、乳化細胞13μl、アクセプター基質として2nmolダブシル化GnGnヘキサペプチドまたはGnGn-ピリジルアミン(図8a)、ドナー基質として1mM UDP-キシロース、10mM ATP、20mM MnCl2、ならびにN-アセチルヘキソサミニダーゼによる生成物の分解を防ぐために1mM 2-アセトアミド-1,2-ジデオキシ-ノジリマイシンを含んだ。試料を37℃で1時間インキュベーションし、MALDI-TOF質量分析法により分析した。
【００７１】  図7は、組換えβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼおよび陰性コントロールの酵素活性の測定値を示す。灰色のバーはGnGn ヘキサペプチドを基質に用いた時の活性を示し、黒色のバーはGnGn-ピリジルアミンを基質に用いたことを示す。共トランスフェクションした細胞の酵素活性は陰性コントロールより30倍高かった。
β1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアクセプター基質の構造を図8aに示し、仮定生成物を図8bに示す（ここで、Rはピリジルアミンまたはダブシル化ヘキサペプチド残基を表す）。
【００７２】実施例４
キシロシルトランスフェラーゼ生成物の質量分析
質量分析は動的抽出 (遅延(late)抽出と同義)を可能にするDYNAMO (BioAnalysis, SantaFe, NM)、MALDITOF MSを用いて行った。2タイプの試料マトリックス調製物を用いた。ダブシル化グリコペプチドを5%ギ酸に溶解し、部分標本を標的に適用し、空気乾燥し、および1%α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸で被った。ピリジルアミノ化グリカンを水で希釈し、標的に適用し、空気乾燥した。2% 2.5-ジヒドロキシ安息香酸を添加後、試料を急速に減圧乾燥した。
【００７３】  図9は、これら試料のマススペクトルを示し、(A)は陰性コントロールであり、主なピーク(S)は、ダブシル-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3) Asn-Arg-Thr基質を示し、理論[M+H]+値は2262.3である。この基質は、(S*)のダブシル基のAzo機能の崩壊により形成されたより小さなイオンおよびナトリウム付加生成物としても出現する。m/z = 2424.4のピークは、該基質の不完全な脱ガラクトシル化を示す。マススペクトル(B)は、37℃で1時間インキュベーション後の組換えβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼを含む試料を示す。[M+H]+値が2393.4の主要ピーク(P)はキシロシル化生成物を示す。
【００７４】実施例５
キシロシルトランスフェラーゼ生成物のHPLC分析
キシロシルトランスフェラーゼアッセイはGnGn-ピリジルアミン10 nmolをアクセプター基質として用いる以外は実施例3に記載のごとく行った。4時間インキュベーションした後、試料をMALDI-TOF質量分析および逆相HPLCの両方で分析して生成物の構造を確認した。基質nGn-PAのわずか前方に溶出する推定生成物ピークを回収した。MALDI-TOF MSにより生成物の質量は1550.9と決定され、これはGnGnX-PAの結果とよく一致する。ウシ腎臓由来のβ-N-アセチルグルコミニダーゼ(酵素25mU含有50mMクエン酸ナトリウム緩衝液中、37℃20時間)で消化すると、グリカンがほぼMMの保持(時間)で溶出された。これはMM-PAおよびMMX-PAの保持時間に関する公表データと一致する(Wilson & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15,1055-1070)。選択した条件下(酵素50mUと共に37℃で20時間)でタチナタマメ由来のα-マンノシダーゼでさらに消化すると２つの新しいピークが出現した。α1,3-結合マンノースはα1,6-結合マンノースよりマンノシダーゼにかなりより感受性であるから、該ピークをOOXおよびMOX（溶出順に）割り当てる。特に、酸でデフコシル化することによりブロメラインから調製したMOX-ピリジルアミンは、キシロシルトランスフェラーゼ生成物から誘導した推定MOXと共溶出された。α-1,3-結合マンノース残基の除去による溶出時間のかなり高度なシフトはβ-マンノースがキシロースで置換されていることを強く示唆する(Wilson & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070; Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15,79-82)。
【００７５】  図10は、逆相HPLCによるキシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す。(A)トランスフェラーゼインキュベーション混合物、(B)単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物、(C)β-N-アセチルグルコサミニダーゼで消化後の単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物、(D)さらにα−マンノシダーゼで消化後の単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物。ピークの割り当ては以下の通りである。1、GnGn-PA； 2、GnGnX-PA； 3、MMX-PA ; 4、MOX-PA; 5、OOX-PAA; 6、MO-PA (単離生成物中の微量の基質由来)。N-グリカン構造の略号については、Wilson I. B. H.およびAltmann, F., 1998, Glycoconj. J. 15,1055-1077参照。
【００７６】  図11は、WO99/29835 Alの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、精製ダイズ酵素のアミノ酸配列が本発明のcDNAから誘導した配列のアミノ酸199-469のみに対応することを示す。さらに、本発明のcDNAから誘導した推定アミノ酸配列は精製ダイズ酵素の配列と比べて２つの挿入物(予測配列のaa375-382およびaa425-429に対応)を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ダイズペプチド2および3のアミノ酸配列 (特許WO99/29835;配列番号：3および5)、これらペプチドとA. thaliana配列の相同性、および４つのプライマー1-4のDNA配列を示す図である。
【図２】  226ntの5'-非翻訳領域を含むβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのcDNA配列を示す図である。
【図３】  上記配列から導かれたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４ａ】  A. thaliana β1,2-キシロシルトランスフェラーゼcDNA、あるゲノムDNAおよびあるEST配列のアラインメントを示す図である。
【図４ｂ】  A. thaliana β1,2-キシロシルトランスフェラーゼcDNA、あるゲノムDNAおよびあるEST配列のアラインメントを示す図である。
【図４ｃ】  A. thaliana β1,2-キシロシルトランスフェラーゼcDNA、あるゲノムDNAおよびあるEST配列のアラインメントを示す図である。
【図５】  該cDNA、ゲノムDNAおよびEST配列から導かれたβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図６】  β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、PCR-生成物およびアミノ酸残基の疎水性の概略図である。
【図７】  β1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞のβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性を陰性コントロールと比較した図である。
【図８ａ】  β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す図である。
【図８ｂ】  β1,2-キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す図である。
【図９】  マススペクトルを示す図である。
【図１０】  逆層HPLCによるβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す図である。
【図１１】  ダイズから精製したβ1,2-キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と本出願のcDNAから誘導した推定アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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