(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
0005124780.tif 000009
〔式中、R1はベンゼン環上に置換する水素原子を示し；R2、R4、R5、及びR7はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；R3は＝O又は＝N+(R8)(R9)・M-（式中、R8及びR9はそれぞれ独立にアルキル基を示し、M-は対イオンを示す）を示し；R6は−OH又は−N(R10)(R11)（式中、R10及びR11はそれぞれ独立にアルキル基を示す）を示し、ただしR3が＝Oである場合にはR6は−OHであり、R3が＝N+(R8)(R9)・M-である場合にはR6は−N(R10)(R11)であり；nは1から3の整数を示し；及びXは-SH又は-OHを示す〕、又は下記の一般式(II)：
【化２】
0005124780.tif 000010
〔式中、R21はベンゼン環上に置換する水素原子を示し；R22、R24、R25、及びR27はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；R23は−OH又は−N(R28)(R29)（式中、R28及びR29はそれぞれ独立にアルキル基を示す）を示し；R26は−OH又は−N(R30)(R31)（式中、R30及びR31はそれぞれ独立にアルキル基を示す）を示し、ただしR23が−OHである場合にはR26は−OHであり、R23が−N(R28)(R29)である場合にはR26は−N(R30)(R31)であり；nは1から3の整数を示し；及びYは-S-又は-O-を示す〕で表される化合物又はその塩〔ただし、
一般式(I)においてR2、R4、R5、及びR7がすべて水素原子であり、Yが-S-又は-0-であり、R3が−N(R8)(R9)であり、かつ-R6が−N(R10)(R11)であるときに、R8、R9、R10、及びR11が同時にエチル基であることはなく、
一般式(II)において、R22、R24、R25、R27がすべて水素原子であり、Yが-S-又は-O-であり、R23が−N(R28)(R29)であり、かつ-R26が−N(R30)(R31)であるときに、R28、R29、R30、及びR31が同時にエチル基であることはない〕。
【請求項２】
一般式(I)において、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、Xが-SHである請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
一般式(I)において、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、Xが-OHである請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式(I)において、R3が＝Oであり、Xが-SHである請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
一般式(I)において、R3が＝Oであり、Xが-OHである請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)であり、Yが-S-である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)であり、Yが-O-である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
一般式(II)において、R23が−OHであり、Yが-S-である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
一般式(II)において、R23が−OHであり、Yが-O-である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】
nが１である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１１】
請求項１に記載の一般式(I)又は一般式(II)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項１２】
請求項６に記載の化合物又はその塩を含む次亜塩素酸イオン測定用蛍光プローブ。
【請求項１３】
請求項５又は９に記載の化合物又はその塩を含むpH蛍光プローブ。
【請求項１４】
次亜塩素酸イオンの測定方法であって、下記の工程：
(a)請求項１に記載の一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)であり、Yが-S-である化合物又はその塩を試料と接触させる工程、及び
(b)該試料中に含まれる次亜塩素酸イオンとの反応により生じた上記一般式(I)においてR3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、Xが-SHである化合物又はその塩から生じる蛍光を測定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は次亜塩素酸イオンの選択的測定などに有用な蛍光プローブとして利用可能な新規化合物、及び該化合物を含む蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
次亜塩素酸イオンは、近年その生体内での作用が注目されている活性酸素種の一つである。好中球による殺菌作用は主に次亜塩素酸イオンによると考えられており、アズール顆粒中のミエロペルオキシダーゼにより、過酸化水素と塩化物イオンから次亜塩素酸イオンが生成することがインビトロで示されている（Klebanoff, S. J., and Clark, R. A.(1978) The Neutrophils: Function and Clinical Disorders, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, Netherlands）。また、次亜塩素酸イオンは血小板活性化因子に誘導される微小循環障害の血管内皮表面の損傷において重要な役割を果たすと考えられている（Suematsu, M., Kurose, I., Asako, H., Miura, S., and Tsuchiya, M.(1989）J. Biochem.106, 355-360)。しかしながら、次亜塩素酸イオンを完全に選択的に測定する方法、特にインビボでの測定方法が確立されていなかったため、次亜塩素酸イオンが上述の生体内での機構に直接関わっていると結論付けるのは困難であった。【０００３】
活性酸素種による各種生理活性分子などに対する障害は様々な疾病に関与すると考えられている。なかでも次亜塩素酸イオン、パーオキシナイトライト、及びヒドロキシルラジカルなどの高い酸化能を有する活性酸素種は生体に与える障害も大きいことから、これらの活性酸素種を生きている状態の生体試料で高感度に測定する手段の提供が望まれている。従来、パーオキシナイトライト及びヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種を測定できる蛍光プローブはいくつか提供されている。例えば、活性酸素種を測定する蛍光プローブとしてはDCFH (2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン)などが知られている。しかしながら、DCFHは活性酸素種の種類を識別することはできず、次亜塩素酸イオンを選択的に測定することはできない。国際公開WO 01/64664号に記載された化合物を用いて次亜塩素酸イオンを測定できることが知られているが（Setsukinai, K., et al., J. Biol. Chem., 278, pp.3170-3175, 2003）、次亜塩素酸イオンを特定するためには組み合わせの測定が必要になる場合があり、操作が煩雑であるという問題がある。
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 278, pp.3170-3175, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、次亜塩素酸イオンの選択的測定などに有用な化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式(I)で表される化合物が次亜塩素酸イオンの測定などに有用であり、特にローダミン様の化合物は弱い活性酸素種である過酸化水素と反応せず、さらに高い活性を有する活性酸素種であるヒドロキシルラジカルやパーオキシナイトライトによる蛍光増加も引き起こさないことから、この化合物を用いると次亜塩素酸イオンを極めて高選択的に測定できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。【０００６】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
【化１】
0005124780.tif 000002
〔式中、R1はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし4個の一価の置換基を示し、2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく；R2、R4、R5、及びR7はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し；R3は＝O又は＝N+(R8)(R9)・M-（式中、R8及びR9はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を示し、M-は対イオンを示す）を示し；R6は−OH又は−N(R10)(R11)（式中、R10及びR11はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を示す）を示し、ただしR3が＝Oである場合にはR6は−OHであり、R3が＝N+(R8)(R9)・M-である場合にはR6は−N(R10)(R11)であり；nは1から3の整数を示し；及びXは-SH又は-OHを示す〕、又は下記の一般式(II)：
【化２】
0005124780.tif 000003
〔式中、R21はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし4個の一価の置換基を示し、2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく；R22、R24、R25、及びR27はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示し；R23は−OH又は−N(R28)(R29)（式中、R28及びR29はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を示す）を示し；R26は−OH又は−N(R30)(R31)（式中、R30及びR31はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を示す）を示し、ただしR23が−OHである場合にはR26は−OHであり、R23が−N(R28)(R29)である場合にはR26は−N(R30)(R31)であり；nは1から3の整数を示し；及びYは-S-又は-O-を示す〕で表される化合物又はその塩
が提供される。【０００７】
好ましい態様によれば、上記一般式(I)において、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、nが1であり、Xが-SHである上記化合物又はその塩；上記一般式(I)において、R3が＝N+(CH3)2・M-であり、nが1であり、Xが-SHである上記化合物又はその塩；上記一般式(I)において、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、nが1であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩；上記一般式(I)において、R3が＝N+(CH3)2・M-であり、nが1であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩；上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、nが1であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩；上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、nが2であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩；上記一般式(II)においてR23が−N(R28)(R29)であり、nが1であり、Yが-S-である上記化合物又はその塩；上記一般式(II)においてR23が−N(CH3)2であり、nが1であり、Yが-S-である上記化合物又はその塩；上記一般式(II)においてR23が−N(R28)(R29)であり、nが1であり、Yが-O-である上記化合物又はその塩；上記一般式(II)においてR23が−N(CH3)2であり、nが1であり、Yが-O-である上記化合物又はその塩；上記一般式(II)においてR23が−OHであり、nが1であり、Yが-O-である上記化合物又はその塩；上記一般式(II)において、R23が＝Oであり、nが2であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩が提供される。【０００８】
別の観点からは、本発明により、上記一般式(I)又は一般式(II)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブが提供される。この蛍光プローブは次亜塩素酸イオン測定用プローブ又はpHプローブなどとして利用できる。特に、上記一般式(II)においてR23が−N(R28)(R29)であり、Yが-S-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブは次亜塩素酸イオンの選択的蛍光プローブとして有用である。また、上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、Xが-OHである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式(I)において、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式(II)においてR23が−OHであり、Yが-O-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブ、上記一般式(II)においてR23が−N(R28)(R29)であり、Xが-OHである上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブはpHプローブとして有用である。上記蛍光プローブの製造のための上記一般式(I)または一般式(II)で表される化合物又はその塩の使用も本発明により提供される。これらのプローブにおいてnが1または2であることが好ましい。【０００９】
さらに別の観点からは、次亜塩素酸イオンの測定方法であって、上記一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)であり、Yが-S-であるジヒドロチオフェン環構造を持つ上記化合物又はその塩を試料と接触させ、試料中の次亜塩素酸イオンとの反応によりジヒドロチオフェン環部位が酸化されて生じたキノイド型の化合物又はその塩から生じる蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により提供される上記一般式(I)又は一般式(II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオン測定のための蛍光プローブ又はpHプローブなどの蛍光プローブとして利用できる。特に、上記一般式(II)においてR23が−N(CH3)2であり、nが1であり、Yが-S-である上記化合物又はその塩を含む上記蛍光プローブは次亜塩素酸イオンに対して高い反応性を有するが、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルやパーオキシナイトライトなどの活性酸素種に対しては実質的に反応せず、次亜塩素酸イオンに対する選択的蛍光プローブとして生体試料の測定などに極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は化合物８、９、１１、１３、１９、及び２１のpH特性を示した図である。(A)はpHによる蛍光強度変化。(B)はpHによるモル吸光係数の変化。
【図２】図２は化合物２１に過酸化水素及び次亜塩素酸ナトリウム添加時の蛍光スペクトルを測定した図である。
【図３】図３は化合物２１に過酸化水素及び次亜塩素酸ナトリウム添加時の蛍光強度の時間変化を測定した図である。図中の矢印は活性酸素種の添加を示す。
【図４】図４は化合物２１及びAPFにパーオキシナイトライト添加時の蛍光強度変化を測定した図である。図中の矢印はパーオキシナイトライトの添加を示す。
【図５】図５は化合物２１及びAPFとヒドロキシルラジカルを反応させた際の蛍光スペクトルを測定した図である。
【図６】図６はブタ好中球の次亜塩素酸イオン測定を示した図である。図中の矢印（100秒）はPMA又はDMF（ネガティブコントロール）の添加を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において「一価の置換基」の種類は特に限定されず、任意の置換基を用いることができる。例えば、ハロゲン原子（本明細書において「ハロゲン原子」としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、C1-6程度の低級アルキル基（本明細書において「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれでもよく、アルキル部分を有する他の置換基の該アルキル部分についても同様である）、C1-6程度の低級ハロゲン化アルキル基、C1-6程度の低級ヒドロキシアルキル基、C1-6程度の低級アルコキシ基、水酸基、チオール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基（アミノ基はアルキル基などの置換基を1個又は2個有していてもよい）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。【００１３】
R1又はR21はベンゼン環上に置換する水素原子又は1個ないし4個の一価の置換基を示すが、2個以上の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。R1が示す置換基の置換位置は特に限定されず、ベンゼン環上の置換可能な任意の位置に置換することができる。
R3においてM-は対イオンを示し、分子の電荷を中和する個数の対イオンを意味している。対イオンの種類は特に限定されないが、例えば、塩化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸アニオン、p-トルエンスルホン酸アニオン、シュウ酸アニオン、クエン酸アニオン、酒石酸アニオンなどの有機酸アニオンなどを挙げることができる。グリシンなどのアミノ酸のカルボキシアニオンを用いてもよい。
nは1又は2であることが好ましく、1であることが特に好ましい。【００１４】
一般式(I)で表される化合物において、好ましい化合物は、R1が水素原子であり、R2、R4、R5、及びR7が水素原子、ハロゲン原子又はC1-6程度の低級アルキル基である化合物である。
特に、R2、R4、R5、及びR7をハロゲン原子で置換することによって、本発明の化合物のｐH特性を所望の特性に変化できる場合がある。
Xが-SHである場合には、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であることが好ましい。
Xが-OHである場合には、R3が＝N+(R8)(R9)・M-及びR3が＝Oであることが好ましい。
さらに好ましい化合物は、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、nが1であり、Xが-SHである化合物であり、特に好ましい化合物は、R3が＝N+(CH3)2・M-であり、nが1であり、Xが-SHである化合物である。別の好ましい化合物としては、R3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、nが1であり、Xが-OHである化合物、R3が＝Oであり、nが1であり、Xが-OHである化合物、R3が＝Oであり、nが2であり、Xが-OHである化合物、R3が＝Oであり、nが2であり、Xが-OHである化合物である。ただしR3が＝N+(R8)(R9)・M-である場合にはR6は−N(R10)(R11)であり、さらに好ましくはR6が＝N+(CH3)2・M-であり、R3が＝Oである場合にはR6は−OHである。【００１５】
一般式(II)で表される化合物において、好ましい化合物は、R21が水素原子であり、R22、R24、R25、及びR27が水素原子、ハロゲン原子又はC1-6程度の低級アルキル基である化合物である。特に、R2、R4、R5、及びR7をハロゲン原子で置換することによって、本発明の化合物のｐH特性を所望の特性に変化できる場合がある。
Yが-S-である場合には、R23が−N(R28)(R29)であることが好ましい。
Xが-O-である場合には、R23が−N(R28)(R29)及び−OHであることが好ましい。
さらに好ましい化合物は、R23が−N(R28)(R29)であり、nが1であり、Yが-S-である化合物であり、特に好ましい化合物は、R23が−N(CH3)2であり、nが1であり、Yが-S-である化合物である。別の好ましい化合物としては、R23が−N(R28)(R29)であり、nが1であり、Yが-O-である化合物、R23が−OHであり、nが1であり、Yが-O-である化合物、R23が−OHであり、nが2であり、Yが-O-である化合物である。ただしR23が−N(R28)(R29)である場合にはR26は−N(R30)(R31)であり、さらに好ましくはR26が−N (CH3)2であり、R23が＝Oである場合にはR26は−OHである。【００１６】
本発明の化合物は置換基の種類に応じて塩を形成する場合もある。塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。本発明の化合物の塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。塩の種類は特に限定されないが、例えば、塩酸塩、硫酸塩、若しくは硝酸塩などの鉱酸塩、又は酒石酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、若しくは酢酸塩などの有機酸塩などの酸付加塩、あるいはナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はメチルアミン塩若しくはトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。もっとも、塩の種類はこれらに限定されることはない。また、本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、任意の水和物又は溶媒和物も本発明の範囲に包含される。【００１７】
本発明の化合物は置換基の種類などに応じて1個又は2個以上の不斉炭素を有する場合があるが、1個又は2個以上の不斉炭素に基づく光学異性体やジアステレオ異性体などの純粋な形態の立体異性体、ラセミ体やジアステレオ異性体混合物などの立体異性体の任意の混合物なども本発明の範囲に包含される。また、一般式(I)又は一般式(II)で表される化合物が互変異性体であることは当業者に容易に理解されよう。これらの互変異性体の任意の混合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。【００１８】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、例えば、一般式(I)においてR3が＝N+(CH3)2・M-であり、nが1であり、Xが-SHである化合物と、一般式(II)においてR23が−N(CH3)2であり、nが1であり、Yが-S-である化合物とは、水溶液環境において平衡状態にあるが、生理的pHにおいてはほとんどが一般式(II)で表される閉環型の化合物として存在する。一般式(II)で表される閉環型の化合物は無蛍光性であり、一方、一般式(I)で表される開環型の化合物は蛍光性である。【００１９】
上記の性質を利用して、上記一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)（好ましくはR23が−N(CH3)2であり）、Yが-S-である化合物を次亜塩素酸イオンの選択的蛍光プローブとして用いることができる。この化合物は生理的なｐＨにおいては閉環型構造をとるため実質的に無蛍光性であり、次亜塩素酸イオンと特異的に反応して、ジヒドロチオフェン環が開環し、強蛍光性化合物を与える。この上記一般式(II)においてR23が−N(R28)(R29)（好ましくはR23が−N(CH3)2であり）、Yが-S-である化合物と次亜塩素酸イオンとの反応は、ジヒドロチオフェン環が次亜塩素酸イオンによって酸化されることで進行するため、次亜塩素酸イオンと反応して開環する化合物は一般式(I)においてXが-SHである化合物とは異なるものになり、生理的なpHで閉環することはない。また、この反応は次亜塩素酸イオンの存在下で特異的に進行し、他の活性酸素種（例えばヒドロキシルラジカルやパーオキシナイトライトなどの高い活性を有する活性酸素種又は過酸化水素などの弱い活性酸素種）の存在下では進行しない。従って、上記一般式(II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオンの測定のための選択的蛍光プローブとして使用できる。【００２０】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、(a)上記一般式(II)において、R23が−N(R28)(R29)であり、Yが-S-である化合物又はその塩を試料と接触させる工程、及び(b)該試料中の次亜塩素酸イオンとの反応により生じた上記一般式(I)においてR3が＝N+(R8)(R9)・M-であり、Xが-SHである化合物又はその塩から生じる蛍光を測定する工程を含む。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。【００２１】
また、いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、Xが-OHである化合物と一般式(II)においてR23が−OHであり、Yが-O-である化合物は、水溶液中で平衡状態にあり、プロトネーションにより蛍光性が変化する。例えば、上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、nが1であり、Xが-OHである化合物と一般式(II)においてR23が−OHであり、nが1であり、Yが-O-である化合物は、水溶液中で下記の平衡状態にあり、pH依存的に蛍光性が変化する。従って、上記一般式(I)において、R3が＝Oであり、Xが-OHである化合物と一般式(II)においてR23が−OHであり、Yが-O-である化合物はpH依存性の蛍光プローブとして利用することができる。
【化３】
0005124780.tif 000004
【００２２】
本発明の化合物から生じる蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。【００２３】
本発明の蛍光プローブは、必要に応じて、測定試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：化合物８、９、１１、及び１３の合成
＜スキーム１＞
【化４】
0005124780.tif 000005
【００２５】
(A)化合物３の合成
化合物１(2.7 g, 15 mmol)と蒸留ジクロロメタン200 mLを混合し、氷水浴上で撹拌しながらイソブテンを2時間バブルし、濃硫酸を3滴加え15時間室温で撹拌した。反応混合液を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン)で精製し、無色の針状晶を得た(19.1 g, 収率54.4%）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.31 (s, 9H), 4.50 (s, 2H), 7.11 (m, 1H), 7.31 (m, 1H), 7.50 (dd, 1H, J = 8.16, 0.93 Hz), 7.55 (m, 1H).【００２６】
(B)化合物６の合成
化合物３(0.73 g, 3 mmol)及び化合物５(0.91 g, 2 mmol)をそれぞれ20 mL, 40 mLのテトラヒドロフランに溶解し、活性化したモレキュラーシーブズ4A 1/16を加えてアルゴン雰囲気下で1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の2頸コルベンに化合物３のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上(-80℃)にて撹拌しながら1.5 mol/L t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液(4 mL, 6 mmol)を加え30分撹拌した後、化合物５のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にし2時間撹拌し、少量の水を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸ニ水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加えて溶解し、酢酸エチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧溜去して、赤橙色のオイルを得た。このオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：酢酸エチル/メタノール = 20/1)で精製して橙色の固体を得た(0.58 g, 収率78%）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.81 (s, 9H), 4.13 (s, 2H), 6.82 (dd, 2H, J = 2.01, 9.18 Hz), 6.86 (d, 2H, J = 2.01 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 9.18 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 7.14 Hz), 7.46 (td, 1H, J = 7.37, 1.41 Hz), 7.54 (m, 1H), 7.59 (d, 1H, J = 7.41 Hz). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ26.5, 59.7, 62.1, 72.5, 127.8, 129.3, 129.6, 130.7, 132.4, 137.4, 149.5.
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 373.1419 (M-H)-, calculated 373.1439 for C24H21O4 (-2.04 mmu).【００２７】
(C)化合物８の合成
化合物６(370 mg, 1 mmol)とトリフルオロ酢酸10 mLを混合し、100℃で16時間加熱還流し、氷冷下で2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液にて中性とし、飽和リン酸ニ水素ナトリウム水溶液を加えてpH4とした。この水層を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤橙色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：酢酸エチル)で精製し、赤橙色の固体を得た(220 mg, 収率70%)。
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5.13 (s, 2H), 6.39 (dd, 2H, J = 7.60, 2.40 Hz), 6.48 (d, 2H, J = 2.40 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 7.60 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 7.50 Hz), 7.2 (m, 1H), 7.2-7.4 (m, 2H). 
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 317.0809 (M-H)-, calculated 317.0814 for C20H13O4 (-0.51 mmu).【００２８】
(D)化合物４の合成
上記化合物３と同様に合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.16 (9H, s), 2.97 (t, 2H, J = 7.52 Hz), 3.56 (t, 2H, J = 7.34 Hz), 7.06 (dt, 1H, J = 10.39, 3.94 Hz), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.52 (d, 1H, J = 7.70 Hz).【００２９】
(E)化合物７の合成
上記化合物６と同様に合成した。
1H NMR (300 MHz, (CD3)2CO) δ 0.96 (s, 9H), 2.57 (dd, 2H, J = 12.8, 5.69 Hz), 3.37 (t, 2H, J = 7.06 Hz), 6.57 (d, 2H, J = 1.83 Hz), 6.62 (dd, 2H, J = 9.17, 2.20 Hz), 6.94 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 7.28 (dd, 1H, J = 7.61, 1.01 Hz), 7.46 (td, 1H, J = 7.34, 1.65 Hz), 7.55 (td, 1H, J = 7.43, 1.47 Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 7.61, 1.01 Hz).
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 387.1578 (M-H)-, calculated 387.1596 for C25H23O4 (-1.83 mmu).【００３０】
(F)化合物９の合成
上記化合物８と同様に合成した。
1H NMR (300 MHz, (CD3)2CO) δ 2.97 (t, 2H, J = 5.50 Hz), 3.81 (t, 2H, J = 5.59 Hz), 6.54 (dd, 2H, J = 8.53, 2.48 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 2.48 Hz), 6.70 (d, 2H, J = 8.53 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 8.44 Hz), 7.10-7.13 (m, 1H), 7.26-7.28 (m, 2H), 8.68 (s, 2H). 
13C NMR (75 MHz, d6DMSO)δ48.5, 72.7, 101.9, 110.7, 117.3, 125.9, 126.6, 128.1 129.3, 130.5, 135.5, 138.7, 151.8, 157.9, 206.6. 
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 331.0948 (M-H)-, calculated 331.0970 for C21H15O4 (-2.21 mmu).【００３１】
(G)化合物１０の合成
化合物６(440 mg, 1.2 mmol)をメタノール30 mLと2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液30 mLの混合溶液に溶解し、氷水浴上で撹拌しながら、75 mmol/L次亜塩素酸ナトリウム／2 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液をゆっくりと滴下し吸光光度計で494 nmのピークトップがレッドシフトしていく様子を確かめながら2.5 mmol相当の次亜塩素酸ナトリウム溶液を滴下した。反応混合物にアスコルビン酸を加え余剰の次亜塩素酸ナトリウムをスカベンジし、減圧溜去してメタノールを十分に除いた後、酢酸エチルと飽和リン酸ニ水素ナトリウム水溶液を加えて溶解した。酢酸エチルで抽出して有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して、赤橙色のオイルを得た。このオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール = 20/1)で精製して赤橙色の固体を得た(62 mg, 収率13%)。
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 409.1214 (MH)+, calculated 409.1207 for C24H22ClO4 (+0.74 mmu).【００３２】
(H)化合物１１の合成
上記化合物８と同様に合成した。
1H NMR (300MHz, (CD3)2CO) δ 5.28 (s, 2H), 6.62 (dd, 1H, J = 2.37, 8.61 Hz), 6.7-6.9 (m, 3H), 6.84 (d, 1H, J = 8.61), 6.87 (d, 1H, J = 7.14 Hz), 7.28 (dd, 1H, J = 7.45 Hz), 7.39 (td, 1H, J = 0.98, 7.45 Hz), 7.46 (d, 2H, J = 7.45 Hz).
13C NMR (75MHz, (CD3)2CO)δ72.8, 84.2, 102.9, 112.4, 113.1, 117.5, 119.3, 121.8, 124.3, 128.3, 128.9, 129.1, 130.8, 140.0, 146.4, 148.0, 151.8, 154.6, 159.1.
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 351.0415 (M-H)-, calculated 351.0424 for C20H12ClO4 (-0.51 mmu).【００３３】
(I)化合物１２の合成
化合物１０を合成する際のもう一つの主生成物として赤橙色の個体を得た(130 mg, 収率24%）。
1H NMR (300MHz, (CD3)2CO) δ 0.77 (s, 9H), 4.20 (s, 2H), 6.81 (d, 2H, J = 9.36 Hz), 7.04 (d, 2H, J = 9.36 Hz), 7.30 (d, 1H, J = 6.93 Hz), 7.6-7.5 (m, 3H).
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 441.0694 (M-H)-, calculated 441.0660 for C24H19Cl2O4 (+3.35 mmu).【００３４】
(J)化合物１３の合成
上記化合物８と同様に合成した。
1H NMR (300MHz, (CD3)2CO) δ 5.29 (s, 2H), 6.79 (d, 2H, J = 8.97 Hz) , 6.82 (d, 2H, J = 8.97 Hz), 6.92 (d, 1H, J = 7.50 Hz), 7.30 (td, 1H, J = 1.03, 7.43 Hz) 7.41 (td, 1H, J = 1.03, 7.47 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 7.50 Hz), 9.16 (s, 2H).
13C NMR (75MHz, (CD3)2CO)δ73.0, 84.4, 108.5, 113.0, 118.9, 121.9, 124.3, 128.1, 129.1, 129.2, 140.0, 145.9, 147.7, 154.8.
HRMS (ESI-Tof): Found 385.0019 (M-H)-, calculated 385.0034 for C20H11Cl2O4 (-1.56 mmu).【００３５】
例２：化合物１７の合成
＜スキーム２＞
【化５】
0005124780.tif 000006
【００３６】
(K)化合物１５の合成
化合物１４ (2.50 g, 10.0 mmol)、t-ブチルメルカプタン(1.35 g, 15.0 mmol)、炭酸セシウム(3.30g, 10.0 mmol）、ジメチルホルムアミド30 mLを混合し15時間室温で撹拌した。反応混合液をn-ヘキサンに希釈し0.1 mol/L ナトリウムリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：n-ヘキサン)で精製して無色の液体を得た（1.96 g, 収率 75.7%）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.39 (s, 9H), 3.89 (s, 2H), 7.08 (td, 1H, J = 7.66, 1.71 Hz), 7.25 (td, 1H, J = 7.47, 1.22 Hz), 7.44 (dd, 1H, J = 7.61, 1.74 Hz), 7.53 (dd, 1H, J = 8.07, 1.28 Hz).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 30.8, 33.5, 43.2, 124.4, 127.5, 128.4, 131.0, 132.9, 137.9.【００３７】
(L)化合物１６の合成
化合物１５ (0.38 g, 1.5 mmol), 化合物５(0.46 g, 1.0 mmol)をそれぞれ20mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性化したモレキュラーシーブズ4A 1/16を加えてアルゴン雰囲気下で1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の2頸コルベンに化合物１５のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上(-80℃)にて撹拌しながら1.5 mol/L t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液(1.3 mL, 2 mmol)を加え10 分撹拌した後、化合物５のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にて30分撹拌し、少量の塩酸を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸ニ水素ナトリウム水溶液, 酢酸エチルを加えて溶解し、酢酸エチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤色の固体得た。この固体をシリカゲルカラムにチャージして、酢酸エチルで洗浄後メタノールで溶出し、メタノール画分を減圧溜去後、リン酸ニ水素ナトリウム水溶液、酢酸エチルを加えて溶解し酢酸エチルで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤色の固体を得た(0.40 mg、定量的)。
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 1.05 (s, 9H), 3.58 (s, 2H), 6.58 (d, 2H, J = 1.65 Hz), 6.61 (dd, 2H, J = 9.26, 2.11 Hz), 6.95 (d, 2H, J = 8.99 Hz), 7.33 (dd, 1H, J = 7.34, 1.56 Hz), 7.51 (td, 1H, J = 7.38, 1.53 Hz), 7.58 (td, 1H, J=7.47, 1.59 Hz), 7.66 (dd, 1H, J = 7.61, 1.38 Hz).
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 389.1197 (M-H)-, calculated 389.1211 for C24H21O3S (-1.46 mmu).【００３８】
(M)化合物１７の合成
化合物１６ (220 mg, 0.56 mmol), トリフルオロ酢酸10 mLを混合し、100℃で16時間加熱還流し、減圧溜去してトリフルオロ酢酸を除き、2 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液に溶解して酢酸エチルで水相を洗浄し、水相をODSシリカゲルカラムにチャージして超純水で溶出して得た画分を塩酸で中和してpH7とし、析出した黄色の固体を濾取して、黄色の固体を得た(122 mg、収率 65%)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 4.49 (s, 2H), 6.43 (s, 2H), 6.45 (dd, 2H, J =7.98, 1.93 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 7.52 Hz), 6.77 (m, 2H), 7.20 (td, 1H,J=7.38, 0.76 Hz), 7.29 (td, 1H, J=7.52, 1.16 Hz), 7.43 (d, 1H, J=7.52 Hz), 9.73 (s, 2H).
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 333.0577 (M-H)-, calculated 333.0585 for C20H13O3S (-0.86 mmu).【００３９】
例３：化合物１９の合成
＜スキーム３＞
【化６】
0005124780.tif 000007
【００４０】
(N)化合物１９の合成
化合物３ (0.49 g, 2 mmol)と化合物１８ (0.28 g, 1 mmol)をそれぞれ25 mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性化したモレキュラーシーブズ4A 1/16を加えてアルゴン雰囲気下で1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の2頸コルベンに化合物３のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上(-80℃)にて撹拌しながら1.5 mol/L t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液(1.5 mL, 2.3 mmol)を加え30 min撹拌した後、化合物１８のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にし2時間撹拌し、酢酸3mLを加えた。反応混合物を減圧溜去して酢酸エチルを加えて溶解し、2 mol/L 塩酸で抽出した。水層を水酸化ナトリウム水溶液で中和してpH7にし、ジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧溜去して紫色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル）で精製して減圧溜去し、紫色の固体を得た(4.8 mg, 収率1.3%)。
1H NMR (300 MHz, (CD3)2CO) δ 2.96 (s, 12H), 5.21 (s, 2H), 6.43 (d, 2H, J = 2.38 Hz), 6.47 (d, 2H, J = 8.62, 2.57 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 8.62), 6.80 (d, 1H, 7.52 Hz), 7.25 (t, 1H, J = 7.15 Hz), 7.36 (td, 1H, J = 7.34, 0.98 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 7.52 Hz).
13C NMR (75 MHz, (CD3)2CO)δ40.5, 72.1, 99.1, 109.4, 114.5, 121.6, 124.4, 128.5, 128.8, 130.4, 152.3, 152.6.
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 373.1879 (MH)+, calculated 373.1916 for C24H25N2O2 (-3.67 mmu).【００４１】
例４：化合物２１の合成
＜スキーム４＞
【化７】
0005124780.tif 000008
【００４２】
(O)化合物２０の合成
化合物１５ (0.59 g, 2.4 mmol)と化合物１８ (0.28 g, 0.60 mmol)をそれぞれ10 mLの蒸留テトラヒドロフランに溶解し、活性化したモレキュラーシーブズ4A 1/16を加えてアルゴン雰囲気下で1時間乾燥した。よく乾燥したアルゴン雰囲気下の2頸コルベンに化合物１５のテトラヒドロフラン溶液をシリンジにて移し、ドライアイス/アセトン浴上(-80℃)にて撹拌しながら1.5 mol/L t-ブチルリチウムn-ペンタン溶液(2 mL, 3 mmol)を加え10分撹拌した後、化合物１８のテトラヒドロフラン溶液を加えドライアイス/アセトン浴から外して室温にし30分撹拌し、少量の塩酸を加えた。反応混合物を減圧溜去して飽和リン酸ニ水素ナトリウム水溶液とジクロロメタンを加えて溶解し、ジクロロメタンで抽出して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧溜去して赤紫色の固体得た。この固体をクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム→酢酸エチル→ジクロロメタン/メタノール＝20/1）で精製し、減圧溜去して赤紫色の固体を得た(48 mg, 収率17%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 0.94 (s, 9H), 3.32 (s, 12H), 3.35 (s, 2H), 6.81 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.91 (dd, 2H, J = 9.4, 2.5 Hz), 7.10 (dd, 1H, J = 7.8, 1.0 Hz), 7.14 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.39 (td, 1H, J = 7.4, 1.3 Hz), 7.47 (dd, 1H, J = 7.7, 1.3 Hz), 7.53 (td, 1H, J = 7.5, 1.2 Hz). 
13C NMR (75MHz, CDCl3)δ 30.1, 30.8, 41.0, 43.0, 96.5, 113.7, 114.2, 127.3, 129.3, 130.3, 130.7, 131.4, 131.7, 136.4, 157.1, 157.3, 157.4.
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 445.2291 (M-Cl)+, calculated 445.2314 for C28H33N2OS (-2.27 mmu).【００４３】
(P)化合物２１の合成
化合物２０(48 mg, 0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸10 mLを混合し、100℃で16時間加熱還流した。氷冷下で2 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液で中性にし、更に食塩を添加して飽和させ、この水層を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧溜去して紫色の固体を得た。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：酢酸エチル)で精製し減圧溜去して、紫色の固体を得た(24 mg, 収率62%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.94 (s, 12H), 4.50 (s, 2H), 6.36 (d, 2H, J = 2.6 Hz), 6.40 (dd, 2H, J = 8.6, 2.6 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 8.6), 6.92 (d, 1H, 7.2 Hz), 7.18  (t, 1H, J = 6.9 Hz), 7.2-7.3 (m, 1H), 7.35 (d, 1H, J = 7.5 Hz).
HRMS (ESI-Tof) m/z Found 389.1685 (MH)+, calculated 389.1688 for C24H25N2OS (-0.22 mmu).【００４４】
例５：化合物８、９、１１、１３、１９、及び２１のpH特性
各化合物のpH特性を調べた。それぞれ下記の化合物濃度、共溶媒 (ジメチルホルムアミド(DMF))濃度となるように (化合物濃度 / DMF濃度)、各化合物のDMFストック溶液を任意のpHの0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液中に希釈した。
化合物８: 0.2 μmol/L / 0.1%, 化合物９: 5 μmol/L / 0.5%, 化合物１１: 5 μmol/L / 0.5%, 化合物１３: 5 μmol/L / 0.5%, 化合物１９: 1.25 μmol/L / 1%, 化合物２１: 1 μmol/L / 1%
これらの蛍光強度及びモル吸光係数を測定した結果を図１に示す。pH依存的に蛍光性の変化が見られたことから、これらの化合物はpHプローブとして機能することが示された。【００４５】
例６：化合物２１の蛍光特性
5 μmol/Lの化合物２１の0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH7.4：共溶媒として0.5％DMFを含む）に過酸化水素を終濃度が1 mmol/L、100 mmol/Lとなるように、及び次亜塩素酸ナトリウムを終濃度が2.5 μmol/Lとなるようにそれぞれ添加し、励起波長550 nmにおける蛍光スペクトルを測定した。結果を図２に示す。高濃度の過酸化水素を添加しても蛍光スペクトルに変化は見られなかったが、次亜塩素酸ナトリウム添加すると、580 nmの蛍光強度が増加し蛍光スペクトルに大きな変化が見られた。また、過酸化水素及び次亜塩素酸イオンを添加しなかった溶液においては、蛍光強度が全く増加しなかった。【００４６】
例７：化合物２１と次亜塩素酸イオン及び過酸化水素との反応
5 μmol/Lの化合物２１の0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH7.4：共溶媒として0.5％DMFを含む）に、25℃で、過酸化水素を終濃度が1 mmol/L、100 mmol/Lとなるように、及び次亜塩素酸ナトリウムを終濃度が2.5 μmol/Lとなるようにそれぞれ添加し、励起波長550 nm、蛍光波長580 nmにおける蛍光強度の時間変化をそれぞれ測定した。結果を図３に示す。高濃度の過酸化水素を添加しても蛍光強度に変化は見られなかったが、次亜塩素酸ナトリウム添加すると、蛍光強度の増加が見られた。【００４７】
例８：化合物２１とパーオキシナイトライトとの反応
1 μmol/Lの化合物２１の0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH7.4：共溶媒として1％DMFを含む）に、25℃で、励起波長550 nm、蛍光波長580 nmにて蛍光強度の時間変化測定を開始した。矢印が示す時間にパーオキシナイトライトを終濃度が1 μmol/Lとなるように添加し、さらに同量のパーオキシナイトライトを一回、10倍量のパーオキシナイトライトを一回、矢印の時間に追加して添加している。また、次亜塩素酸イオン及びパーオキシナイトライトと反応して蛍光強度が増加することが知られているAPF（J. Biol. Chem., 278, 3170-3175 (2003)）をポジティブコントロールとして測定した。APFを用いた測定は、1 μmol/LのAPF溶液を用い、測定励起波長、蛍光波長のみそれぞれ490 nm、515 nmに変更した以外は化合物２１と同様にして、パーオキシナイトライトを最初の矢印の一回のみ終濃度が1 μmol/Lとなるように添加した。結果を図４に示す。APFはパーオキシナイトライト添加により蛍光上昇が見られたが、化合物２１ではパーオキシナイトライトによる蛍光上昇は見られなかった。【００４８】
例９：化合物２１とヒドロキシルラジカルの反応
3 μmol/Lの化合物２１の0.1 mol/Lナトリウムリン酸緩衝液（pH7.4：共溶媒として1％DMFを含む）に終濃度1 μmol/Lとなるように過酸化水素を添加した。25℃で激しく撹拌しているところに、塩化鉄（II）溶液をそれぞれ終濃度が1 μmol/L、2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/Lとなるように添加してヒドロキシルラジカルを発生させ、励起波長550 nmにおける蛍光スペクトルを測定した。また、ポジティブコントロールとしてAPFを用いて比較した。APFを用いた測定は、3 μmol/LのAPF溶液を用い、測定励起波長、蛍光波長のみそれぞれ490 nm、515 nmに変更した以外は化合物２１と同様にして、塩化鉄（II）溶液を4 μmol/Lとなるように添加して行った。結果を図５に示す。APFは塩化鉄（II）溶液添加によって発生するヒドロキシルラジカルと反応して蛍光強度が増加したが、化合物２１では塩化鉄（II）溶液添加前後で蛍光スペクトルの変化は見られなかった。
例６から９の結果より、化合物２１は光による自動酸化もなく、また過酸化水素、パーオキシナイトライト、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種とは反応せず、次亜塩素酸イオンを選択的に測定するプローブとして機能することが示された。【００４９】
例１０：ブタ好中球の次亜塩素酸イオンの測定
PMA (Phorbol myristate acetate)刺激によってブタ好中球で生成される次亜塩素酸イオンの測定に化合物２１を適用した。Wakeyama, H. らの方法（ Biochem. J. 205 (1982), 593-601）に従って精製したブタ好中球を、Krebs-Ringer リン酸緩衝液（114 mmol/L 塩化ナトリウム、4.6 mmol/L 塩化カリウム、2.4 mmol/L 硫酸マグネシウム、1.0 mmol/L 塩化カルシウム、15 mmmol/L リン酸二水素ナトリウム/リン酸水素二ナトリウム、pH 7.4）に懸濁して1×106 cell/mLとした。この細胞懸濁液に化合物２１を濃度が1 μmol/Lとなるように添加し（この時点で細胞懸濁液は共溶媒としてDMFを0.1%含む）、37℃で蛍光強度測定を開始した（励起波長550 nm、蛍光波長580 nm）。100秒後にPMAのDMF溶液をPMA濃度が2 ng/mLとなるように添加して、更に37℃で蛍光測定を続けた（この時点で細胞懸濁液は共溶媒としてDMFを0.2%含む）。また、100秒後にDMFのみを細胞懸濁液のDMF濃度が0.2%となるように添加し、コントロールとして測定した。結果を図６に示す。DMF添加だけでは蛍光強度が増加せず、PMAを添加した場合のみ蛍光強度が著しく増加した。このことから、化合物２１はPMA刺激によって好中球が産生する次亜塩素酸イオンを検出可能であり、次亜塩素酸イオンを測定する蛍光プローブとして機能することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により提供される上記一般式(I)又は一般式(II)で表される化合物又はその塩は次亜塩素酸イオン測定のための蛍光プローブ又はpHプローブなどの蛍光プローブとして利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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