(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物個体の口腔粘膜上皮細胞から抽出した生理活性物質であるα−アミラーゼの活性値の経時的変化に基づいて、前記生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法。
【請求項２】
前記活性値の経時的変化を示す活性変動曲線を、前記生体リズムを推定するための分子時刻表として利用する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分子時計表において、前記活性変動曲線が一日の間に示す活性極大値の数に基づいて、前記生体リズムのずれを検出する請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記生物個体について複数回作製した前記分子時計表を照合することにより、該生物個体の生体リズムのずれを検出する請求項２記載の方法。
【請求項５】
所定時刻における前記生理活性物質の活性値を、前記分子時刻表と照合することにより、前記生物個体の生体リズムのずれを検出する請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法に関する。より詳しくは、生物個体の口腔粘膜上皮細胞から抽出した生理活性物質の活性値の経時的変化に基づいて、特に概日リズムに関わる情報を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物個体の様々な生体現象は、自立的に振動する「周期的なリズム」を示すことが知られている。この周期的なリズムは「生体リズム」と呼ばれている。特に、約一日を周期とする「概日リズム（サーカディアンリズム）」は、睡眠覚醒サイクルや体温、血圧、ホルモン分泌量の日内変動などの生体現象を広く支配していると考えられている。また、心身の活動度や運動能力、薬剤感受性などについても、概日リズムの関与が明らかにされている。
【０００３】
生体リズムは、「時計遺伝子（クロックジーン）」と呼ばれる遺伝子群によって制御されている。時計遺伝子（以下、「時計分子」ともいう）は、その発現や活性、局在等を自律的に周期変動（振動）させることにより「体内時計」として機能し、他の種々の遺伝子群を制御することで、上記のような様々な生体現象を支配している。時計分子による体内時計は、体内の各細胞、組織、臓器ごとの様々なレベルで存在しており、これが同調して個体全体の生体リズムが作り出されているものと考えられる。
【０００４】
時計分子の遺伝子多型や遺伝子変異は、癌や糖尿病、血管系疾患、神経変性疾患などの発症要因となることが明らかにされている。さらに、近年、双極性障害や鬱病のような精神疾患についても、その発症要因として時計分子の遺伝子多型や変異の関与が指摘されており、時計分子の遺伝子多型や変異によって変調した体内時計を光照射によってリセットする治療方法も試みられるようになっている。
【０００５】
一方、例えば、睡眠覚醒サイクルは、体内時計による自律的な制御だけでなく、社会生活による制約も受けている。このため、日々の就寝時刻や起床時刻の変化によって、「実生活の就寝起床サイクル」と「体内時計による睡眠覚醒サイクル」との間にリズムのずれ（位相のずれ）が生じる可能性がある。このようなリズムのずれが、いわゆる「時差ぼけ」や睡眠障害、さらには上記のような精神疾患の原因ともなると考えられている。
【０００６】
「実生活の就寝起床サイクル」と「体内時計による睡眠覚醒サイクル」との間のような、いわゆる「外的時間」と「内的時間」との間に生じるずれは、生体リズムの「内的脱同調」とみなされる。この「内的脱同調」とは、体内の各臓器の体内時計が脱同調した状態と言うことができる。内的脱同調は、各臓器の体内時計の外的時間への同調のし易さ、いわば同調速度、が異なることによって生じるものと考えられる。内的脱同調が生じると、体温や血圧等の日内変動に二相性のリズムが観察されることが知られている。
【０００７】
生体リズムを利用して、薬剤治療効果の最大化を図る試みも始まっている。薬剤の標的となる分子（薬剤標的分子）や薬剤を代謝する酵素（薬物代謝酵素）の概日リズムに起因して、薬剤による治療効果も日内変動することが考えられる。そこで、薬剤ごとに最適な投薬時刻を定めて、治療効果を最大化しようとする「時間医療」という考え方が提唱されてきている。
【０００８】
また、より身近には、心身の活動度や運動能力の概日リズムを利用して、学習やトレーニングにおいて自己の能力を最大限に引き出す活動時刻や、太りにくい（又は、太りやすい）摂食時刻が検討され始めている。
【０００９】
以上のことから、体内時計による生体リズムを正確に知ることは、種々の疾患の予防、時差ぼけなどの体調不良の改善、時間医療の実現、自己能力の発揮、ダイエットなどに非常に有益と考えられる。
【００１０】
特許文献１には、生物個体から採取した標準検体の遺伝子発現産物量測定データに基づき体内時刻を推定する方法などが開示されている。この体内時計推定方法では、遺伝子発現産物量（すなわち、ｍＲＮＡ）の発現量に基づいて、体内時計を推定するための分子時計表を作成するものである。なお、特許文献1には、具体的な採取組織（又は、細胞）及び測定対象遺伝子は記載されていない。
【００１１】
特許文献２には、ヒトの深部体温の計測値から生体リズム曲線を測定するための生体リズム曲線測定装置が記載されている。この生体リズム曲線測定装置では、外乱の影響（外部からの影響）を除去して真の生体リズム曲線を測定できるように工夫されている。なお、特許文献２には、深部体温の具体例として直腸温又は鼓膜温が挙げられており、特に直腸温が好適である旨の記載がある。
【００１２】
また、本発明に関連する発明として、特許文献３〜５には、被検者の唾液中のα−アミラーゼ活性を指標としたストレス判定方法が開示されている。このストレス判定方法は、「唾液」中のα−アミラーゼ活性を測定することにより、被験者のストレスの程度を簡便かつ容易に判定可能である。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１２１２８号
【特許文献２】特開平６−１８９９１４号公報
【特許文献３】特開２００２−１６８８６０号公報
【特許文献４】特開２００６−３４５８６９号公報
【特許文献５】特開２００６−３４５８７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特許文献１に開示される体内時計推定方法は、生物個体から採取した標準検体のｍＲＮＡの発現量に基づく方法である。特許文献1には、具体的な採取組織（又は、細胞）及び測定対象遺伝子は記載されていないが、従来、白血球中の時計遺伝子発現を調べる方法が、簡便な方法として広く採用されている。しかし、この方法では採血が不可欠となるため、被験者において肉体的苦痛が伴う。
【００１４】
さらに、測定者においても、採血した血液から白血球を分離する操作や、白血球からｍＲＮＡを抽出する操作、時計遺伝子ｍＲＮＡの発現解析などを行なう必要があり、非常に手間がかかっていた。一般に、生物検体からｍＲＮＡを抽出し、定量を行なうためには、ｍＲＮＡの分解を防止するための煩雑な操作が必要となるためである。特に、微量の生物検体を扱う場合にｍＲＮＡの分解が生じると、安定した測定結果を得ることができなくなる。
【００１５】
特許文献２に開示される生体リズム曲線測定装置は、特に直腸温を測定するものである。しかし、直腸での体温測定は、被験者に心理的あるいは肉体的苦痛を与え得るものであり、測定者においても負担感が生じ得る。
【００１６】
そこで、本発明は、生物個体の生体リズムに関わる情報を取得するための、簡便かつ低侵襲な方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題解決のため、本発明は、生物個体の口腔粘膜上皮細胞から抽出した生理活性物質、特にα−アミラーゼの活性値の経時的変化に基づいて、前記生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法を提供する。
この方法では、生理活性物質の活性値の経時的変化を示す活性変動曲線を、生体リズムを推定するための分子時刻表として利用する。
この方法では、分子時計表において、前記活性変動曲線が一日の間に示す活性極大値の数に基づいて、前記生体リズムのずれを検出することができる。
また、分子時計表を生物個体について複数回作製し、照合することにより、生物個体の生体リズムの位相のずれを検出することができる。
さらに、所定時刻における生理活性物質の活性値を、分子時刻表と照合することにより、生物個体の生体リズムの位相のずれを検出することもできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、簡便かつ低侵襲に生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
１．生理活性物質
本願発明者は、簡便かつ低侵襲に生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法を確立するため、まず、極めて低侵襲に採取可能な生体組織である口腔粘膜上皮細胞に着目した。そして、口腔粘膜上皮細胞内で発現量の日内変動を示す分子としてα−アミラーゼを同定し、その活性値が生体リズムを示すことを見出し、本願発明を完成させた。
【００２０】
すなわち、本願発明は、生物個体の口腔粘膜上皮細胞から抽出したα−アミラーゼの活性値の経時的変化に基づいて、生物個体の生体リズムに関わる情報を取得する方法である。なお、本願発明において対象とする生物個体にはヒトや、マウス・ラット・サル等の実験動物などを広く含み、特に限定されない。
【００２１】
α−アミラーゼは、膵液や唾液に含まれる消化酵素として知られている。また、げっ歯類を用いた実験では、唾液腺中のα−アミラーゼ量に概日リズムがみられることが報告されている（Bellavia SL, et. al. Circadian rhythm of alpha-amylase in rat parotid gland. Acta. Odontol. Latinoam. 1990; 5(1):13-23）。しかし、口腔粘膜上皮の細胞内にα−アミラーゼが発現していることはこれまで知られておらず、口腔粘膜上皮細胞内のα−アミラーゼについて生体リズムに関する検討がなされたことはない。
【００２２】
２．生理活性物質の取得
口内粘膜上皮細胞は、最も低侵襲に採取することのできる生体組織の一つであり、口内粘膜上皮細胞から得られるゲノムを用いた遺伝子型の判定等に用いられている。
【００２３】
本発明において、口内粘膜上皮細胞の採取方法としては、例えば、ブラシやスパーテル等で口腔粘膜表面から細胞を掻き取ることによって行うことができる。採取部位は、頬の裏側の粘膜が好適であり、測定のばらつきを抑えるため左右両側の粘膜から採取することが望ましい。
【００２４】
ブラシ等で採取した口内粘膜上皮細胞は、サンプルチューブ内に満たしたリン酸バッファー（PBS）などの緩衝液中でブラシ等を洗浄するようにして緩衝液中に回収することができる。この際、細胞の溶解を防止するため、緩衝液には等張液を使用する。
【００２５】
このようにして得た細胞懸濁液を遠心分離やろ過することにより、口内粘膜上皮細胞を分離する。遠心分離やろ過は、通常の方法を用いればよいが、口内粘膜上皮細胞の採取時に混入した唾液を除くため、複数回の操作を行なうことが望ましい。唾液中には唾液腺から分泌された多量のα−アミラーゼが存在しており、これが分離した細胞に混入していると、口内粘膜上皮細胞内のα−アミラーゼのみの活性を正確に測定できなくなるためである。
【００２６】
分離した細胞は、タンパク質抽出液を調製するために溶解される。細胞の溶解は、市販のタンパク質抽出試薬や界面活性剤を加えた緩衝液等を用いて行うことができる。また、細胞を懸濁した緩衝液を超音波処理するなどの物理的な細胞破砕によって溶解してもよい。この細胞溶解液を遠心分離やろ過して不溶部分を取り除くことにより、タンパク質抽出液を調製する。
【００２７】
調製したタンパク抽出液中のα−アミラーゼ活性の測定は、公知の方法を採用でき、市販の測定装置や測定キットを使用することができる。なお、具体的な測定方法は、実施例において説明する。
【００２８】
以上のように、本発明に係る方法では、採取が容易な口腔粘膜上皮細胞を用いるため、従来方法に比べ被験者の心理的・肉体的負担を極めて軽くすることができる。
【００２９】
また、ｍＲＮＡに比べて安定なタンパク質を測定対象とするため、従来方法と異なり煩雑な操作が不要で、簡便な操作で安定した測定結果を得ることが可能である。さらに、一般にｍＲＮＡの発現解析は２時間程度を要するのに比べ、α−アミラーゼ活性は後述する市販の測定装置を使用すれば数分程度で測定できるため、短時間で測定結果を得ることができる。
【００３０】
３．分子時計表
図１は、α−アミラーゼ活性の経時的変化を示す図である。図は、１日間、所定の時刻ごとに、上述の方法によって口腔粘膜上皮細胞内のα−アミラーゼ活性を測定し、活性値をプロットして得られた活性変動曲線の一例を表している。図中、横軸は時刻、縦軸は活性値を示す。本図では、一例として、0：00が最小値活性値（ｌ）、12：00が最大活性値（ｈ）として測定された場合を示した。
【００３１】
活性変動曲線は、各時刻に測定された活性値のプロットから視察によって求めることがきる。また、より正確な曲線を求めるためには、自己相関法（コレログラム）、パワースペクトル法、コサイナー法、ペリオドグラム法などの周期計算法を用いることもできる。
【００３２】
図のように、α−アミラーゼの活性値は日内変動し、概日リズムを示す。従って、α−アミラーゼ活性値の経時的変化に基づいて、被験個体の生体リズムに関する情報を得ることが可能であり、α−アミラーゼの活性変動曲線を「分子時計表」として利用することにより、被験個体の生体リズムの推定を行なうことができる。
【００３３】
すなわち、例えば、図１の活性変動曲線（以下、「分子時計表」と同義に用いる）を有することが分かっている被験個体について、所定時刻に測定された活性値がｈであったとする。この場合、図１の活性変動曲線（分子時計表）に基づけば、被験個体の概日リズム（内的時間）は12：00にあると推定できる。また、活性値がｌである場合、被験個体の概日リズム（内的時間）は0：00であり、活性値がｍである場合には、6：00又は18：00であると推定することができる。
【００３４】
また、同一の被験個体について、例えば３時間間隔で２回測定された活性値がそれぞれｐ，ｑであったとする。このとき、ｐに比べｑが高い（ｐ＜ｑ）場合には、被験個体の概日リズム（内的時間）は、活性の上昇局面である午前（0：00〜12：00）にあると推定できる。逆に、ｐに比べｑが低い（ｑ＜ｐ）場合には、午後（12：00〜24：00）にあると推定できる。さらに、ｐ及びｑの変動率（ｑ／ｐ）を求め、活性変動曲線の接線の傾きと照合することで、概日リズムにおける内的時間をより正確に推定することが可能である。
【００３５】
４．生体リズムのずれの検出
以下、この活性変動曲線の変化によって、被験個体の生体リズムのずれを検出する方法について説明する。
【００３６】
活性変動曲線は、その最大値（又は最小値）、最大値（又は最小値）の観察時刻、最大値から最小値（又は最小値から最大値）への傾き等によって形状を特徴付けることができる。本発明では、この活性変動曲線の形状を「位相」というものとする。また、活性変動曲線（分子時計表）により特定される被験個体の概日リズムの形状についても「位相」という。
【００３７】
具体的には、図１に示した活性変動曲線（分子時計表）では、最小値ｌ、最大値ｈ、最小値の観察時刻（外的時間）0：00、最大値の観察時刻12：00によって特徴付けられる形状、すなわち「位相」を有している。
【００３８】
（4-1）二相性リズムの検出による方法
まず、分子時計表を用いて、活性変動曲線が一日の間に示す活性極大値の数に基づき、生体リズムのずれを検出する方法について説明する。
【００３９】
既に説明したように、生体リズムにおける「内的時間」と「外的時間」との間に生じるずれは、「内的脱同調」とみなされる。そして、この内的脱同調が生じると、体温や血圧等の日内変動に二相性のリズムが観察されることが分かっている。従って、この二相性のリズムを検出することによって、内的脱同調、すなわち生体リズムのずれ、を検出することが可能となる。
【００４０】
本発明者らは、実施例において詳述するように、体温や血圧等と同様に、α−アミラーゼ活性の日内変動においても、内的脱同調の指標となり得る多相性のリズムが検出できることを見出した。
【００４１】
図２は、典型的な二相性リズムを示すα−アミラーゼの活性変動曲線の位相を示す図である。図は、図１に示した活性変動曲線を有する被験個体において、内的脱同調が生じた場合の活性変動曲線の一例を表している。
【００４２】
図１において、被験個体の位相は、一つの極大値（最大値）ｈと、その観察時刻（外的時間）12：00によって特徴付けられていた。これに対して、図２における被検個体の位相は、２つの極大値ｈ１とｈ２が出現している。すなわち、図２に示した活性変動曲線は、一日の間に、12：00の極大値ｈ１、18：00の極大値ｈ２の２つの活性極大値を伴う二相性リズムとして観察されている。
【００４３】
このような複数の活性極大値は、各臓器の体内時計の外的時間への同調速度が異なることによって、個体全体の生体リズムが一時的に脱同調することによって出現するものと考えられる。
【００４４】
従って、分子時計表を用いて、活性変動曲線が一日の間に示す活性極大値の数が２以上であるか否かに基づいて、生体リズムのずれとその程度を検出することが可能である。なお、活性極大値の数は２つに限られず、活性極大値を３以上伴う多相性リズムが観察される場合もある。
【００４５】
ここで、図２に示した12：00の極大値ｈ１の観察時刻（外的時間）12：00は、図１に示した当初の活性変動曲線における最大値ｈの観察時刻と原則的に一致する。被験個体の生体リズムに内的脱同調が生じると、この最大値ｈの観察時刻12：00とは異なる時刻（図２では18：00）に新たな極大値ｈ２が観察される。そして、活性極大値の観察時刻（上記の例では12：00と18：00）の間隔が長いほど、内的脱同調の程度が大きいとみなすことができる。
【００４６】
さらに、極大値ｈ１及び極大値ｈ２の大きさは、被験個体に生じた内的脱同調の程度に依存して変化する。これらの大きさは、被験個体に生じた内的脱同調が次第に修正され、個体全体の生体リズムが徐々に同調していくにつれ、次第に大きさが変化する。すなわち、例えば、生体リズムが内的脱同調前のリズムに回復していく際には、観察時刻18：00に出現した極大値ｈ２は徐々に消失する。
【００４７】
また、生体リズムが内的脱同調後のリズムに同調していく場合には、逆に、観察時刻12：00の元々の極大値ｈ１が徐々に消失し、18：00の極大値ｈ２が次第に大きくなる。
【００４８】
従って、図２に示した活性変動曲線における極大値ｈ２の大きさ、より好適には極大値ｈ１と極大値ｈ２との振幅比（ｈ２／ｈ１）、に基づけは、生体リズムのずれの程度を知ることができる。この場合、振幅比（ｈ２／ｈ１）が１に近く、極大値ｈ１と極大値ｈ２がほぼ等しい場合が最も内的脱同調の程度が大きいものと判断される。
【００４９】
このように、分子時計表を用い、活性変動曲線が一日の間に示す二以上の活性極大値の観察時刻の間隔や、その大きさ及び振幅比に基づいて、生体リズムのずれの程度や、ずれからの回復具合を判定することが可能である。活性変動曲線が３以上の極大値を有する多相性リズムとして観察された場合には、それぞれの極大値の大きさや振幅比に基づいて判定を行うことができる。
【００５０】
（4-2）複数回作成した分子時計表の照合による方法
次に、被験個体について複数回作製した分子時計表を照合することにより、生体リズムのずれを検出する方法について説明する。
【００５１】
図３は、活性変動曲線の位相の変化を示す図である。図３（Ａ）中、点線で示す活性変動曲線は図１に示した曲線であり（以下、「分子時計表１」ともいう）、実線は同一被験個体について、異なる測定日に図１と同様の測定を行って得た活性変動曲線（以下、「分子時計表２」ともいう）の一例を表している。図中、横軸は時刻、縦軸はα−アミラーゼ活性値を示す。
【００５２】
分子時計表１は、最小値（ｌ）の観察時刻（外的時間）を0：00、最大値（ｌ）の観察時刻を12：00とする位相を有しているのに対して、分子時計表２では、最小値（ｌ）の観察時刻が6：00、最大値（ｌ）の観察時刻が18：00となり、位相が変化している。
【００５３】
これは、分子時計表１の作製時点と分子時計表２の作製時点とで、被験個体の活性変動曲線の位相にずれが生じたとみることができる。具体的には、分子時計表２の作製時点における被験個体の生体リズム（内的時間）は、分子時計表１の作製時点から６時間遅れた（又は１８時間進んだ）ことになる。
【００５４】
このように、同一被験個体について複数回分子時計表を作製し、これらを互いに照合することによって、被験個体の生体リズムの位相のずれを検出することができる。
【００５５】
（4-3）所定時刻の活性値を分子時計表と照合する方法
続いて、所定時刻における生理活性物質の活性値を、分子時刻表と照合することにより、生体リズムのずれを検出する方法について説明する。
【００５６】
図３（Ｂ）は、図３（Ａ）において、分子時計表１（図１も参照）を点線から実線に、分子時計表２を実線から点線に換えて示した図である。
【００５７】
先に説明したように、図１の活性変動曲線（分子時計表）を有することが分かっている被験個体について、所定時刻に測定された活性値がｍであった場合、分子時計表１に基づいて、被験個体の概日リズム（内的時間）は6：00又は18：00と推定できる。
【００５８】
ここで、同一被験個体について、異なる測定日の6：00（外的時間）に測定を行って得た活性値がｍからｌに変化していたと仮定する（図３（Ｂ）中、丸印参照）。この場合、被験個体の概日リズム（内的時間）は６時間遅れて（又は１８時間進んで）、分子時計表２で示される概日リズムに変化したと推定することができる。
【００５９】
このように、所定時刻における活性値を、予め作製した分時計表と照合することよって、より簡便に被験個体の生体リズムの位相のずれを検出することも可能である。
【００６０】
以上の通り、本発明に係る方法によれば、α−アミラーゼの活性値の経時的変化を示す活性変動曲線を分子時刻表として利用することで、各被験個体に固有の生体リズムを推定し、生体リズムの位相のずれを検出することが可能である。
【００６１】
実施例では、口内粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼ活性の具体的な測定データを示し、α-アミラーゼ活性値が概日リズムを示すこと、及びこの概日リズムが起床時刻によって影響を受けて位相にずれを生じ得ることについて説明する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
＜α−アミラーゼの同定＞
実施例１では、口腔粘膜上皮細胞内において概日リズムを示すタンパク質の同定を行なった。
【００６３】
成人男性（３２歳）から口腔粘膜上皮細胞を採取した。採取は、10:00，13:00，16:00，19:00，22:00，1:00，4:00，7:00の８回行い、市販の口腔粘膜上皮採取用ブラシ（Medical Packaging Corporation：CYB-1）を使用して行なった。口腔粘膜上皮細胞の採取後、チューブ内に満たしたＰＢＳでブラシを洗浄し、ＰＢＳ中に細胞を回収した。この細胞懸濁液を遠心分離（3,000rpm，30sec）し、分離した口腔粘膜上皮細胞をタンパク質抽出用バッファー（PIERCE Biotechnology社：RIPA Buffer）で溶解し、再度遠心分離（3,000rp
m，30sec）を行なってタンパク質抽出液を調製した。
【００６４】
得られたタンパク質抽出液について、定法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。図４は、電気泳動後のアクリルアミドゲルを、クマシー(CBB)染色して得られたタンパク質の染色像である。図中、レーン１及び１４は分子量マーカーである（図中左に分子量を示す）。レーン２−１３は、上記の各時刻において採取した口腔粘膜上皮細胞から抽出したタンパク質である。図中、矢印で示す約50kDaのタンパク質（以下、「目的タンパク質」という）に関して発現量の日内変動が認められる。
【００６５】
図５は、目的タンパク質の各時刻における発現量を示す図である。発現量は、図４に示した染色像において目的タンパク質のバンドをデンシトメトリーにより定量し、各サンプルにおける総タンパク質量で標準化を行なった値を、1:00を１とした相対値で示した（10:00，13:00，16:00，19:00：n=6，22:00，1:00，4:00，7:00：n=3）。
【００６６】
続いて、目的タンパク質について、ペプチド・マス・フィンガープント解析によるタンパク質同定を行なった。目的タンパク質のバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、トリプシンによるIn-Gel消化を行なった後、ゲルからペプチド断片を抽出した。得られたペプチド断片を、質量分析計（TOF-MS：Applied Biosystems：oMALDI-Qq-TOF MS/MS QSTAR Pulsar i）によって解析し、MASCOT(Matrix Science)を用いて、NCBInr(Taxonomy human)と照合することにより、タンパク質を同定した。結果、目的タンパク質はα-アミラーゼ
と同定された。
【００６７】
以上、実施例１の結果から、口腔粘膜上皮細胞内において概日リズムを示すタンパク質として、α-アミラーゼが同定できた。
【００６８】
（実施例２）
＜口腔粘膜上皮細胞におけるα-アミラーゼの発現確認＞
実施例２では、口腔粘膜上皮細胞でα-アミラーゼが発現していることを確認するための実験を行なった。
【００６９】
実施例１と同様の方法で分離した口腔粘膜上皮細胞から、市販のTotal RNA抽出精製キット（AgilentTechnologies）を用いてＲＮＡを抽出し、定法に従ってRT-PCRを行なった。使用したプライマーの配列を、「表１」に示す。
【００７０】
【表１】
0005320864.tif 000002
【００７１】
図６は、RT-PCRにより増幅されたＤＮＡ断片の泳動像（染色像）を示す図である。図中、レーン１はＤＮＡサイズマーカーである。レーン２はネガティブコントロール）、レーン３は口腔粘膜上皮細胞である。
【００７２】
図に示すように、レーン３において、約150bpsのＤＮＡ断片（図中矢印）の増幅が確認され、口腔粘膜上皮細胞にα-アミラーゼｍＲＮＡが発現していることが確認された。
【００７３】
次に、タンパク質レベルでのα-アミラーゼの発現を確認するため、以下の実験を行なった。
【００７４】
実施例１と同様の方法で、口腔粘膜上皮細胞の採取後、ブラシをチューブ内に満たしたＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液について、α-アミラーゼの活性値を測定した。測定は、Salivary α-Amylase Assay Kit (Salmetrics社)を用いて行なった。
【００７５】
図７は、α-アミラーゼの活性値を示す図である。図中、「ＰＢＳ」は上記の細胞懸濁液で測定された活性値（約20U/ml）を示す。この細胞懸濁液では、口腔粘膜上皮細胞は溶解されていないため、測定される活性値は、口腔粘膜上皮細胞の採取時にブラシに付着して混入した唾液中に含まれるα-アミラーゼに由来するものと考えられる。なお、図中、「Saliva」は、ＰＢＳで２０倍に希釈した唾液のα-アミラーゼ活性を示している。
【００７６】
図中、「ＰＢＳ＋TritonX100」及び「ＰＢＳ＋Sonic」は、上記の細胞懸濁液中の口腔粘膜上皮細胞を溶解した場合に測定された活性値を示す。「ＰＢＳ＋TritonX100」では、細胞懸濁液に界面活性剤（TritonX100）を加えて細胞を溶解させた。また、「ＰＢＳ＋Sonic」では、細胞懸濁液を超音波処理することによって細胞を溶解させた。
【００７７】
「ＰＢＳ＋TritonX100」及び「ＰＢＳ＋Sonic」で測定された活性値は、それぞれ約50U/ml，65U/mlであり、口腔粘膜上皮細胞を溶解しない場合（「ＰＢＳ」参照）に測定された活性値よりも高かった。
【００７８】
このことは、「ＰＢＳ＋TritonX100」及び「ＰＢＳ＋Sonic」では、細胞を溶解したことで、混入した唾液中に含まれるα-アミラーゼに加え、口腔粘膜上皮細胞内から溶出されたα-アミラーゼの活性が測定されたことを示唆するものであり、口腔粘膜上皮細胞内にα-アミラーゼタンパク質が発現していることを示している。
【００７９】
以上、実施例２の結果から、口腔粘膜上皮細胞内において、α-アミラーゼがｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで発現していることが確認された。
【００８０】
（実施例３）
＜α-アミラーゼ活性の概日リズムの検討＞
実施例３では、口腔粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼについて、活性値の日内変動を検索し、α-アミラーゼ活性の概日リズムについて検討を行った。
【００８１】
（１）8:00起床の被験者Ａ（男性，32歳）を対象に、1:00, 4:00, 7:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00において口内粘膜上皮細胞の採取を行い、500μLのPBSに懸濁した。
（２）遠心分離（3000rpm, 30sec）により細胞を沈殿させ、上清のPBSを廃棄した。分離した細胞は、次の工程まで凍結下で保存した。
（３）細胞に、100mM Na-PO4(pH6.0), 100mM NaCl, 0.1% Triton X-100を30μL加え、細胞を溶解した。再度遠心分離（3000rpm, 30sec）を行い、得られた上清をタンパク抽出液
とした。
（４）タンパク抽出液のタンパク質濃度をBCA Protein Assay Kit (PIERCE Biotechnology社)を用いて測定し、各時刻のサンプルのタンパク質濃度を1mg/mLに揃えた。
（５）タンパク質濃度調整後のタンパク抽出液25μLを、ニプロ社ココロメーター用チップに滴下し、ココロメーターを用いてα-アミラーゼ活性を測定した。
なお、被験者Ａは、1：00の口腔粘膜上皮細胞の採取後に就寝し、4：00，7：00の測定の際には、口腔粘膜上皮細胞の採取のため一端起床した後、次の採取時刻まで再度睡眠をとった。
【００８２】
結果を図８に示す。図中、横軸は時刻、縦軸はα-アミラーゼの活性値を示す。
【００８３】
起床（8：00）後、最初の測定である9：00には、α-アミラーゼ活性値は約12U/mlであった。13：00，16：00では約20U/ml に上昇し、19：00に最大値約25U/mlを示した。その後、22：00，1：00ではそれぞれ約22U/ml，約19U/ml に減少し、4：00，7：00では、9：00の時点と同程度（約12U/ml）で推移した。
【００８４】
このことから、α-アミラーゼ活性値が日内変動を示し、この日内変動が起床時刻前後を最小値とし、夕刻19：00を最大値とする概日リズムを示すことが明らかとなった。
【００８５】
図９には、比較のため、唾液中のα-アミラーゼの活性値を測定した結果を示す。図中、横軸は時刻、縦軸はα-アミラーゼの活性値を示す。
【００８６】
図８に示した口腔粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼと異なり、唾液中のα-アミラーゼの活性値には概日リズムがみられていない。これは、唾液腺から分泌されるα-アミラーゼ量は、ストレスに鋭敏に反応することが知られており（先に挙げた特許文献３〜５参照）、測定の際のストレスによってα-アミラーゼ量が変動したことが要因の１つと考えられた。
【００８７】
（実施例４）
＜α-アミラーゼ活性の概日リズムの検討２＞
実施例４では、実施例３と同一の被験者Ａを対象に、起床時刻を8：00から6：00に変更し、口腔粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼ活性の概日リズムについて検討を行った。なお、就寝時刻は0:00の口腔粘膜上皮細胞採取の後である。
（１）6:00起床の被験者Ａ（男性，32歳）を対象に、0:00, 3:00, 6:00, 9:00, 12:00, 15:00, 18:00, 21:00において口内粘膜上皮細胞の採取を行い、500μLのPBSに懸濁した。
（２）遠心分離（3000rpm, 30sec）により細胞を沈殿させ、上清のPBSを廃棄した。同様の操作を再度行なった。分離した細胞は、次の工程まで凍結下で保存した。
（３）細胞に、20mM Tris-Cl(pH 7.0), 150mM NaCl, 1% Sucrose Monolaurateを30μL加え、細胞を溶解した。再度遠心分離（3000rpm, 30sec）を行い、得られた上清をタンパク質抽出液とした。
（４）吸光度（280nm）により、タンパク質抽出液のタンパク質濃度を測定した。
（５）Salivary α-Amylase Assay Kit (Salmetrics社)を用いて、タンパク抽出液のα-アミラーゼ活性を測定した。手順は、キット添付のプロトコールに従った。
【００８８】
結果を図１０に示す。図中、横軸は時刻、縦軸は活性値を示す。なお、活性値は、上記（５）で測定された活性値を、（４）で算出したタンパク質量で標準化して示した。
【００８９】
起床時刻を6：00に変更した場合、α-アミラーゼ活性の概日リズムは、15：00に最大値（約3.5U/mg）を示し、8：00起床の場合（図８参照）に比べて、最大値が測定された時刻が４時間早くなった。これは、起床時刻を変更したことによって、被験者の生体リズムにずれが生じたことを示唆している。
【００９０】
以上、実施例３及び４の結果から、口内粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼ活性が概日リズムを示し、さらにこの概日リズムが起床時刻の影響を受けて変化し得ることが示された。
【００９１】
（実施例５）
実施例５では、４人の被験者を対象に、以下のスケジュールに従って、生体リズム（睡眠覚醒リズム）を後方に10時間シフトさせ、人為的な内的脱同調（時差ぼけ）状態を生じさせた。
【００９２】
（１）第１日目：17:30から4時間おきに口腔粘膜上皮細胞を回収した。就寝時刻23：30。採材開始時刻17:30から、以降4時間おきに口腔粘膜上皮細胞の採取を行った。
（２）第２日目：起床時刻7：30。起床後は、翌日第３日目9：30まで睡眠をとらず、睡眠覚醒リズムをシフトさせた。起床時刻前、1:30, 5:30のサンプリングは一時的に起床して行った。以下、睡眠時間帯にあたるサンプリングについては、同様に一時的に起床して行った。
（３）第３日目：就寝時刻9：30。起床時刻17：30。
（４）第４日目〜第８日目：就寝時刻9：30、起床時刻17：30の睡眠覚醒リズムを維持し続けた。
（５）実施例４と同様にして、採取した口腔粘膜上皮細胞内のα-アミラーゼ活性を測定した。
【００９３】
結果を図１１に示す。図中、横軸は時刻、縦軸はα-アミラーゼの活性値を示す。図中、上段には、各日の睡眠時間帯を黒塗りで、起床時間帯を白塗りで表すことにより、実験スケジュールを示した。
【００９４】
睡眠覚醒リズムをシフトさせる前である第２日目と第３日目の就寝時刻（9：30）前では、9：30にα-アミラーゼ活性の極大値が測定されている（図中、符号「ｐ１」参照）。このとき、α-アミラーゼ活性の概日リズムは一相性となっている。
【００９５】
その後、睡眠覚醒リズムをシフトさせた後の第４日目以降では、21：30に新たな活性極大値の出現が確認される（符号「ｐ２」参照）。α-アミラーゼ活性の概日リズムは、二相性のリズムに変化している。
【００９６】
この結果は、α-アミラーゼ活性の概日リズムが示す多相性のリズムを検出することで、睡眠覚醒リズムのシフトにより被験者に生じた内的脱同調（時差ぼけ）を検出し得ることを示している。
【００９７】
図１２は、睡眠覚醒リズムのシフト後に二相性の極大値が観察された時刻である9:30と21:30の時点における、第２日目から第７日目までのα-アミラーゼ活性値を示す図である。
【００９８】
睡眠覚醒リズムをシフトさせる前である第２日目においては、9:30の時点におけるα-アミラーゼ活性値は、21:30の時点における活性値に比べて十分に大きい。
【００９９】
これに対して、睡眠覚醒リズムをシフトさせた第４日目以降では、9:30の時点におけるα-アミラーゼ活性値が徐々に低下し、逆に、21:30の時点における活性値が次第に上昇している。これは、睡眠覚醒リズムのシフトによって被験者に生じた内的脱同調が徐々に回復し、被験者の生体リズムがシフト後の就寝時刻9：30、起床時刻17：30の睡眠覚醒リズムに次第に同調してきていることを示すものである。
【０１００】
従って、この結果から、9:30と21:30に観察される二相性の活性極大値の大きさ又は振幅比に基づけば、被験者の内的脱同調、すなわち生体リズムのずれの程度や、ずれからの回復具合を判定できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明に係る方法によれば、α−アミラーゼの活性値の経時的変化を示す活性変動曲線を分子時刻表として利用することで、各被験個体に固有の生体リズムを簡便かつ低侵襲に推定することができる。従って、各個人が自身に固有の生体リズムを知り、最適な投薬時刻や活動時刻、摂食時刻を設定することが可能となり、時間医療の実現や、自己能力の発揮、ダイエットに役立てることができる。
【０１０２】
さらに、本発明に係る方法により、生体リズムのずれを検出すれば、生体リズムのずれを原因とする種々の疾患の予防や、時差ぼけなどの体調不良の改善に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】α−アミラーゼ活性の経時的変化の一例を示す図である。
【図２】典型的な二相性リズムを示すα−アミラーゼの活性変動曲線の位相を示す図である。
【図３】α−アミラーゼの活性変動曲線の位相の変化を示す図である。
【図４】口腔粘膜上皮細胞から抽出したタンパク質の染色像である。
【図５】目的タンパク質の各時刻における発現量を示す図である。
【図６】α−アミラーゼのRT-PCRの結果を示す図である。
【図７】口腔粘膜上皮の細胞懸濁液及び細胞溶解液のα-アミラーゼ活性を示す図である。
【図８】実施例３におけるα-アミラーゼ活性の測定結果（8：00起床）を示す図である。
【図９】唾液中のα-アミラーゼ活性を示す図である。
【図１０】実施例４におけるα-アミラーゼ活性の測定結果（6：00起床）を示す図である。
【図１１】実施例５におけるα-アミラーゼ活性の測定結果（内的脱同調状態）を示す図である。
【図１２】第２日目から第７日目までの9:30と21:30の時点におけるα-アミラーゼ活性値を示す図である。
【図１】
0005320864.tif 000003
【図２】
0005320864.tif 000004
【図３】
0005320864.tif 000005
【図４】
0005320864.tif 000006
【図５】
0005320864.tif 000007
【図６】
0005320864.tif 000008
【図７】
0005320864.tif 000009
【図８】
0005320864.tif 000010
【図９】
0005320864.tif 000011
【図１０】
0005320864.tif 000012
【図１１】
0005320864.tif 000013
【図１２】
0005320864.tif 000014
【配列表】
0005320864000001.app