(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（３）配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット３と、配列番号５１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ３）との組み合わせ、
（４）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット４と、配列番号５２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ４）との組み合わせ、
（６）配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット６と、配列番号５４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ６）との組み合わせ、
（７）配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット７と、配列番号５５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ７）との組み合わせ、
（９）配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット９と、配列番号５７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ９）との組み合わせ、
（１０）配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１０と、配列番号５８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１０）との組み合わせ、
（１３）配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１３と、配列番号６１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１３）との組み合わせ、
（１４）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１４と、配列番号６２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１４）との組み合わせ、
（１５）配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１５と、配列番号６３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１５）との組み合わせ、
（１８）配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１８と、配列番号６６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１８）との組み合わせ、
（１９）配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１９と、配列番号６７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１９）との組み合わせ、
（２０）配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２０と、配列番号６８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ２０）との組み合わせ、
（２２）配列番号４３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２２と、配列番号７０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ２２）との組み合わせ、
（２３）配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２３と、配列番号７１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ２３）との組み合わせ、
（１）配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１と、配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１）との組み合わせ、
（２）配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２と、配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ２）との組み合わせ、
（５）配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット５と、配列番号５３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ５）との組み合わせ、
（８）配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット８と、配列番号５６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ８）との組み合わせ、
（１１）配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１１と、配列番号５９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１１）との組み合わせ、
（１２）配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１２と、配列番号６０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１２）との組み合わせ、
（１６）配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１６と、配列番号６４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１６）との組み合わせ、
（１７）配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１７と、配列番号６５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ１７）との組み合わせ、及び
（２１）配列番号４１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２１と、配列番号６９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体、或いは配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するその変異体（プローブ２１）との組み合わせ
からなる群から選択される２以上の前記組み合わせを含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するためのキット。
【請求項２】
（３）配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット３と、配列番号５１で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ３）との組み合わせ、
（４）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット４と、配列番号５２で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ４）との組み合わせ、
（６）配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット６と、配列番号５４で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ６）との組み合わせ、
（７）配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット７と、配列番号５５で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ７）との組み合わせ、
（９）配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット９と、配列番号５７で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ９）との組み合わせ、
（１０）配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１０と、配列番号５８で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１０）との組み合わせ、
（１３）配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１３と、配列番号６１で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１３）との組み合わせ、
（１４）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１４と、配列番号６２で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１４）との組み合わせ、
（１５）配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１５と、配列番号６３で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１５）との組み合わせ、
（１８）配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１８と、配列番号６６で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１８）との組み合わせ、
（１９）配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１９と、配列番号６７で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１９）との組み合わせ、
（２０）配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２０と、配列番号６８で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ２０）との組み合わせ、
（２２）配列番号４３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２２と、配列番号７０で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ２２）との組み合わせ、
（２３）配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２３と、配列番号７１で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ２３）との組み合わせ、
（１）配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１と、配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１）との組み合わせ、
（２）配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２と、配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ２）との組み合わせ、
（５）配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット５と、配列番号５３で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ５）との組み合わせ、
（８）配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット８と、配列番号５６で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ８）との組み合わせ、
（１１）配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１１と、配列番号５９で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１１）との組み合わせ、
（１２）配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１２と、配列番号６０で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１２）との組み合わせ、
（１６）配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１６と、配列番号６４で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１６）との組み合わせ、
（１７）配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１７と、配列番号６５で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ１７）との組み合わせ、及び
（２１）配列番号４１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２１と、配列番号６９で示される塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体、或いは配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は該プローブに対して１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されているその変異体（プローブ２１）との組み合わせ
からなる群から選択される２以上の前記組み合わせを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（３）配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット３と、配列番号５１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ３）との組み合わせ、
（４）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット４と、配列番号５２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ４）との組み合わせ、
（６）配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット６と、配列番号５４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ６）との組み合わせ、
（７）配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット７と、配列番号５５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ７）との組み合わせ、
（９）配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット９と、配列番号５７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ９）との組み合わせ、
（１０）配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１０と、配列番号５８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）との組み合わせ、
（１３）配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１３と、配列番号６１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）との組み合わせ、
（１４）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１４と、配列番号６２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）との組み合わせ、
（１５）配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１５と、配列番号６３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）との組み合わせ、
（１８）配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１８と、配列番号６６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）との組み合わせ、
（１９）配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１９と、配列番号６７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）との組み合わせ、
（２０）配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２０と、配列番号６８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）との組み合わせ、
（２２）配列番号４３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２２と、配列番号７０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）との組み合わせ、
（２３）配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２３と、配列番号７１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）との組み合わせ、
（１）配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１と、配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１）との組み合わせ、
（２）配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２と、配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ２）との組み合わせ、
（５）配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット５と、配列番号５３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ５）との組み合わせ、
（８）配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット８と、配列番号５６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ８）との組み合わせ、
（１１）配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１１と、配列番号５９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）との組み合わせ、
（１２）配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１２と、配列番号６０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）との組み合わせ、
（１６）配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１６と、配列番号６４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）との組み合わせ、
（１７）配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット１７と、配列番号６５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）との組み合わせ、及び
（２１）配列番号４１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット２１と、配列番号６９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）との組み合わせ
からなる群から選択される２以上の前記組み合わせを含む、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、及びプライマーセット４とプローブ４との組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５】
プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、プライマーセット２２とプローブ２２との組み合わせ、及びプライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
プライマーセット１とプローブ１との組み合わせ、プライマーセット２とプローブ２との組み合わせ、プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、プライマーセット５とプローブ５との組み合わせ、プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、プライマーセット８とプローブ８との組み合わせ、プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、プライマーセット１１とプローブ１１との組み合わせ、プライマーセット１２とプローブ１２との組み合わせ、プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、プライマーセット１６とプローブ１６との組み合わせ、プライマーセット１７とプローブ１７との組み合わせ、プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、プライマーセット２１とプローブ２１との組み合わせ、プライマーセット２２とプローブ２２との組み合わせ、及びプライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
ＤＮＡ増幅産物を一本鎖に単離するための手段を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記手段が磁気ビーズを含むものである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキットを用いて検体中のＨＰＶの存在又は非存在を型特異的に検出するための方法であって、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程及び増幅されたＤＮＡ産物を前記プローブを用いて検出する工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のキットを用いて検体中のＨＰＶの存在又は非存在を型特異的に検出するための方法であって、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、増幅したＤＮＡ産物を一本鎖にする工程、及び一本鎖ＤＮＡを前記プローブとハイブリダイズさせて検出する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルスを特異的に検出するためのプライマーセット及びプローブに関する。本発明はまた、これらを用いてヒトパピローマウイルスを特異的に検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は約８０００塩基対の環状２本鎖ＤＮＡをゲノムとする小型のウイルスであり、ヒト特異的に感染する。ＨＰＶについてこれまでに１００種類以上のサブタイプが報告されており、それらは疣等の皮膚病変において検出されたもの（皮膚指向性ＨＰＶ）、及び粘膜の病変において検出されたもの（粘膜指向性ＨＰＶ）に大別される。更に粘膜指向性ＨＰＶは、子宮頸癌、肛門周囲癌、陰茎癌等の癌に関与しているハイリスク型（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８等）と良性の尖圭コンジローマ等に関与しているローリスク型（ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１等）とに分類される。ＷＨＯは、世界の女性の悪性腫瘍の１１％、約４５万人にＨＰＶ感染が関わっており、世界には３億人のＨＰＶ感染キャリアが存在していると推定しており、これはＨＰＶがごくありふれたウイルスであることを示唆している。特に子宮頸癌の患者の殆どからＨＰＶが検出されている。
【０００３】
子宮頸癌は世界の女性の癌では２番目に多く、世界中では年間約２５万人、日本国においては年間約２５００人が子宮頸癌により死亡している。それゆえ、子宮頸癌の予防、診断、及び治療は女性保健において非常に重要な問題であると認識されている。幸いなことに、子宮頸癌は予防可能な癌である。その理由は、子宮頸癌の前癌病変である異形成は細胞診等によって発見可能であり、異形成は簡単な治療により完治することが出来るためである。また、異形成の開始はＨＰＶ感染に起因するものであるため、より早期かつより確実に子宮頸癌又は前癌病変を発見するためにＨＰＶ遺伝子の検査に対する重要性への認識が高まっている。
【０００４】
ＨＰＶ遺伝子検査の方法は、ＨＰＶのＤＮＡを直接検出する方法と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＨＰＶのＤＮＡを増幅してから検出する方法に大別される。
【０００５】
ＰＣＲを利用しない方法の代表は、ハイブリッドキャプチャー法である。この方法は、ＲＮＡプローブを検体中のＨＰＶのＤＮＡとハイブリダイズさせ、生成したＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを抗体を用いてイムノアッセイで検出するものである。この方法は手軽であるため現在主要なＨＰＶ遺伝子検査の方法となっている。しかし、この方法は感度が低く、またＲＮＡプローブを利用するため安定性が低く、また汚染の可能性を排除出来ないため、信頼性が低い。また、この方法は感染しているＨＰＶがハイリスク型なのかローリスク型なのかを識別するために利用されるが、そのサブタイプまで同定することは出来ない。
【０００６】
ＰＣＲを利用する方法において、増幅したＤＮＡは、制限酵素で切断した後電気泳動してバンドを検出する方法、又はＤＮＡマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせて検出する方法のいずれかにより検出される。電気泳動を利用する前者の検出方法は、通常の実験室設備により実施可能であり、経済性にも優れているとはいえ、煩雑な作業を要し、またサブタイプの同定が完全でないという欠点がある。一方プローブとのハイブリダイゼーションを利用する後者の検出方法は、検出感度が高くサブタイプ同定の特異性が高いが、迅速性・経済性の面で問題がある。
また、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅について、型特異的プライマーを用いて型特異的にＨＰＶ遺伝子を増幅する方法と、ランダムプライマー又は型非特異的プライマーを用いて型非特異的にＨＰＶ遺伝子を増幅する方法がこれまで知られている。
特許文献１及び２で開示された方法は、型特異的プライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡを増幅する。増幅されたＤＮＡは、特許文献１においてはプローブが増幅二本鎖ＤＮＡそのものであるＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションに供され、また特許文献２においては電気泳動に供され、ＨＰＶのＤＮＡの存在・非存在を検出する。これらの方法では、型特異的プライマーを用いることで高い特異性及び高い感度での増幅を達成しており、更に各プライマーを混合物として用いた場合でも特定の型のＨＰＶを特異的に検出することが出来る。
一方、特許文献３で開示された方法は、型非特異的プライマーを用いてＨＰＶのＤＮＡを増幅した後、プローブが短い一本鎖オリゴＤＮＡであるＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせることによりＨＰＶのＤＮＡを検出するものである。この方法は、共通のプライマーを使用するため合成コストや設計の容易さにおいて利点を持つ。しかしながら、短いプローブを用いてハイブリダイゼーションの特異性を高めることによりＰＣＲにおける特異性及び感度の低さをある程度克服しているとはいえ、全体としてみれば感度は低い。また、特許文献４で開示された方法は、ＨＰＶの型ごとにプライマーを作製しているとはいえ、それらのプライマー配列はほとんど同じ配列であるため、特許文献３の方法とほぼ同様のプライマー作製であると考えられる。
【０００７】
これらの状況から、複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で検出することが出来る、迅速性、簡易性及び経済性に優れた方法を開発する必要がある。
【特許文献１】特開２００４−１２１２４０
【特許文献２】特開２００６−３４５８００
【特許文献３】特表２００５−５０３１７７
【特許文献４】特表２００５−５１９６１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で検出するためのプライマーセット及びプローブを提供することを目的とする。本発明はまた、前記プライマーセット及びプローブを利用して複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、型特異的なプライマーを用いてＨＰＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせて検出することを特徴とするＨＰＶ遺伝子の検出方法に着目し鋭意検討を重ねた結果、本発明のプライマーセット及びプローブを用いることで複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で迅速かつ簡易に検出することが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]（１）配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１、
（２）配列番号３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２、
（３）配列番号５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット３、
（４）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット４、
（５）配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット５、
（６）配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット６、
（７）配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット７、
（８）配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット８、
（９）配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット９、
（１０）配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１０、
（１１）配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１１、
（１２）配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１２、
（１３）配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１３、
（１４）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１４、
（１５）配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１５、
（１６）配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１６、
（１７）配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１７、
（１８）配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１８、
（１９）配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１９、
（２０）配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２０、
（２１）配列番号４１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２１、
（２２）配列番号４３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２２、及び
（２３）配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２３
からなる群より選択される少なくとも１種の、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーセット。
[２]（１）配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１）、
（２）配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２）、
（３）配列番号５１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ３）、
（４）配列番号５２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ４）、
（５）配列番号５３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ５）、
（６）配列番号５４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ６）、
（７）配列番号５５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ７）、
（８）配列番号５６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ８）、
（９）配列番号５７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ９）、
（１０）配列番号５８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１０）、
（１１）配列番号５９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１１）、
（１２）配列番号６０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１２）、
（１３）配列番号６１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１３）、
（１４）配列番号６２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１４）、
（１５）配列番号６３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１５）、
（１６）配列番号６４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１６）、
（１７）配列番号６５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１７）、
（１８）配列番号６６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１８）、
（１９）配列番号６７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１９）、
（２０）配列番号６８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２０）、
（２１）配列番号６９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２１）、
（２２）配列番号７０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２２）、及び
（２３）配列番号７１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２３）
からなる群より選択される少なくとも１種の、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）検出用のプローブ。
[３]（１）プライマーセット１とプローブ１との組み合わせ、（２）プライマーセット２とプローブ２との組み合わせ、（３）プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、（４）プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、（５）プライマーセット５とプローブ５との組み合わせ、（６）プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、（７）プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、（８）プライマーセット８とプローブ８との組み合わせ、（９）プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、（１０）プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、（１１）プライマーセット１１とプローブ１１との組み合わせ、（１２）プライマーセット１２とプローブ１２との組み合わせ、（１３）プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、（１４）プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、（１５）プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、（１６）プライマーセット１６とプローブ１６との組み合わせ、（１７）プライマーセット１７とプローブ１７との組み合わせ、（１８）プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、（１９）プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、（２０）プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、（２１）プライマーセット２１とプローブ２１との組み合わせ、（２２）プライマーセット２２とプローブ２２との組み合わせ、及び（２３）プライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせ、並びに任意で（２４）プライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するためのキット。
[４]上記（１）〜（２３）の組み合わせからなる群から選択される組み合わせを２つ以上含むことを特徴とする、上記[３]に記載のキット。
[５]プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、及びプライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、並びに任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含む、上記[３]又は[４]に記載のキット。
[６]プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、プライマーセット５とプローブ５との組み合わせ、プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、及びプライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせ、並びに任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含む、上記[３]又は[４]に記載のキット。
[７]プライマーセット１とプローブ１との組み合わせ、プライマーセット２とプローブ２との組み合わせ、プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、プライマーセット５とプローブ５との組み合わせ、プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、プライマーセット８とプローブ８との組み合わせ、プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、プライマーセット１１とプローブ１１との組み合わせ、プライマーセット１２とプローブ１２との組み合わせ、プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、プライマーセット１６とプローブ１６との組み合わせ、プライマーセット１７とプローブ１７との組み合わせ、プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、プライマーセット２１とプローブ２１との組み合わせ、プライマーセット２２とプローブ２２との組み合わせ、及びプライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせ、並びに任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含む、上記[３]又は[４]に記載のキット。
[８]上記[３]〜[７]のいずれか１つに記載のキットを用いて検体中のＨＰＶの存在又は非存在を型特異的に検出するための方法であって、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程及び増幅されたＤＮＡ産物を検出する工程を含む、方法。
[９]上記[３]〜[７]のいずれか１つに記載のキットを用いて検体中のＨＰＶの存在又は非存在を型特異的に検出するための方法であって、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、増幅したＤＮＡ産物を一本鎖にする工程、及び一本鎖ＤＮＡを前記プローブとハイブリダイズさせて検出する工程を含む、方法。
[１０]上記[２]に記載のプローブ１〜２３からなる群から選択される少なくとも１種のプローブが固定化されている、ＨＰＶを検出するためのＤＮＡマイクロアレイ。
[１１]上記[２]に記載のプローブ１〜２３からなる群から選択される２以上のプローブが固定化されている、上記[１０]に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
[１２]さらに、プローブ２４が固定化されている上記[１０]又は[１１]に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で迅速かつ簡易に検出することが出来る、プライマーセット及びプローブを提供する。本発明はまた、前記プライマーセット及びプローブを利用して、複数の型のＨＰＶを高い特異性及び感度で迅速かつ簡易に検出することが出来る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ＨＰＶ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーセット、特に型特異的なプライマーセットを提供する。プライマーセットとしては、以下（１）〜（２３）に示すプライマーセットが挙げられる。
（１）配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１、
（２）配列番号３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２、
（３）配列番号５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット３、
（４）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット４、
（５）配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット５、
（６）配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット６、
（７）配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット７、
（８）配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット８、
（９）配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット９、
（１０）配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号１９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１０、
（１１）配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１１、
（１２）配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１２、
（１３）配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１３、
（１４）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１４、
（１５）配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号２９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１５、
（１６）配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１６、
（１７）配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１７、
（１８）配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１８、
（１９）配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット１９、
（２０）配列番号３９で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号３９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４０で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２０、
（２１）配列番号４１で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４２で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２１、
（２２）配列番号４３で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２２、及び
（２３）配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット２３。
【００１３】
プライマーセット１における、「配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー」及び「配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー」とは、それぞれ「配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」及び「配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」と同義であり、以下、便宜上、それぞれ「配列番号１のプライマー」及び「配列番号２のプライマー」とも称する。
「配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、上記配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってＨＰＶ６遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅させることのできる機能を有する。以下、当該変異体を、便宜上、「配列番号１のプライマーの変異体」とも称する。同様に「配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、上記配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってＨＰＶ６遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅させることのできる機能を有する。以下、便宜上、「配列番号２のプライマーの変異体」とも称する。「変異体」は、プライマーとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている。
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望するＨＰＶ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーとしての機能を有する変異体を得るための条件を適宜決定することができる。
【００１４】
プライマーセット１は、「配列番号１のプライマー」又は「配列番号１のプライマーの変異体」と「配列番号２のプライマー」又は「配列番号２のプライマーの変異体」とから構成され、好ましくは「配列番号１のプライマー」と「配列番号２のプライマー」から構成される。
【００１５】
プライマーセット１と同様にしてプライマーセット２〜２３における各プライマーを定義付けることができる。すなわち、
プライマーセット２は「配列番号３のプライマー」又は「配列番号３のプライマーの変異体」と「配列番号４のプライマー」又は「配列番号４のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３のプライマー」と「配列番号４のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ１１遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット３は「配列番号５のプライマー」又は「配列番号５のプライマーの変異体」と「配列番号６のプライマー」又は「配列番号６のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号５のプライマー」と「配列番号６のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ１６遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット４は「配列番号７のプライマー」又は「配列番号７のプライマーの変異体」と「配列番号８のプライマー」又は「配列番号８のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号７のプライマー」と「配列番号８のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ１８遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット５は「配列番号９のプライマー」又は「配列番号９のプライマーの変異体」と「配列番号１０のプライマー」又は「配列番号１０のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号９のプライマー」と「配列番号１０のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３０遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット６は「配列番号１１のプライマー」又は「配列番号１１のプライマーの変異体」と「配列番号１２のプライマー」又は「配列番号１２のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号１１のプライマー」と「配列番号１２のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３１遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット７は「配列番号１３のプライマー」又は「配列番号１３のプライマーの変異体」と「配列番号１４のプライマー」又は「配列番号１４のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号１３のプライマー」と「配列番号１４のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３３遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット８は「配列番号１５のプライマー」又は「配列番号１５のプライマーの変異体」と「配列番号１６のプライマー」又は「配列番号１６のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号１５のプライマー」と「配列番号１６のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３４遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット９は「配列番号１７のプライマー」又は「配列番号１７のプライマーの変異体」と「配列番号１８のプライマー」又は「配列番号１８のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号１７のプライマー」と「配列番号１８のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３５遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１０は「配列番号１９のプライマー」又は「配列番号１９のプライマーの変異体」と「配列番号２０のプライマー」又は「配列番号２０のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号１９のプライマー」と「配列番号２０のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ３９遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１１は「配列番号２１のプライマー」又は「配列番号２１のプライマーの変異体」と「配列番号２２のプライマー」又は「配列番号２２のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号２１のプライマー」と「配列番号２２のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ４０遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１２は「配列番号２３のプライマー」又は「配列番号２３のプライマーの変異体」と「配列番号２４のプライマー」又は「配列番号２４のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号２３のプライマー」と「配列番号２４のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ４２遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１３は「配列番号２５のプライマー」又は「配列番号２５のプライマーの変異体」と「配列番号２６のプライマー」又は「配列番号２６のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号２５のプライマー」と「配列番号２６のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ４５遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１４は「配列番号２７のプライマー」又は「配列番号２７のプライマーの変異体」と「配列番号２８のプライマー」又は「配列番号２８のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号２７のプライマー」と「配列番号２８のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５１遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１５は「配列番号２９のプライマー」又は「配列番号２９のプライマーの変異体」と「配列番号３０のプライマー」又は「配列番号３０のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号２９のプライマー」と「配列番号３０のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５２遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１６は「配列番号３１のプライマー」又は「配列番号３１のプライマーの変異体」と「配列番号３２のプライマー」又は「配列番号３２のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３１のプライマー」と「配列番号３２のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５３遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１７は「配列番号３３のプライマー」又は「配列番号３３のプライマーの変異体」と「配列番号３４のプライマー」又は「配列番号３４のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３３のプライマー」と「配列番号３４のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５４遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１８は「配列番号３５のプライマー」又は「配列番号３５のプライマーの変異体」と「配列番号３６のプライマー」又は「配列番号３６のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３５のプライマー」と「配列番号３６のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５６遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット１９は「配列番号３７のプライマー」又は「配列番号３７のプライマーの変異体」と「配列番号３８のプライマー」又は「配列番号３８のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３７のプライマー」と「配列番号３８のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５８遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット２０は「配列番号３９のプライマー」又は「配列番号３９のプライマーの変異体」と「配列番号４０のプライマー」又は「配列番号４０のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号３９のプライマー」と「配列番号４０のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ５９遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット２１は「配列番号４１のプライマー」又は「配列番号４１のプライマーの変異体」と「配列番号４２のプライマー」又は「配列番号４２のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号４１のプライマー」と「配列番号４２のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ６１遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット２２は「配列番号４３のプライマー」又は「配列番号４３のプライマーの変異体」と「配列番号４４のプライマー」又は「配列番号４４のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号４３のプライマー」と「配列番号４４のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ６６遺伝子の特定の領域を増幅することができ、
プライマーセット２３は「配列番号４５のプライマー」又は「配列番号４５のプライマーの変異体」と「配列番号４６のプライマー」又は「配列番号４６のプライマーの変異体」とから、好ましくは「配列番号４５のプライマー」と「配列番号４６のプライマー」とから構成され、ＨＰＶ６８遺伝子の特定の領域を増幅することができる。
【００１６】
各プライマーセットの一例を表１に示す。なお、後述するように、本発明では、内部標準として利用されるＧ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）遺伝子を増幅するためのプライマーセットを任意で用いることができる。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子を増幅するためのプライマーセット（プライマーセット２４）は、配列番号４７で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマー又は配列番号４８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなる。
【００１７】
【表１−１】
0005302519.tif 000002
【００１８】
【表１−２】
0005302519.tif 000003
【００１９】
なお、上記表１において、各プライマーが結合する、各ウイルスタイプ及びＧ３ＰＤＨのゲノム上の位置（ｎｔ）は、表２に示す各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）登録番号の遺伝子配列における位置である。
【００２０】
【表２】
0005302519.tif 000004
【００２１】
本発明のプライマーは、各ＨＰＶ遺伝子との特異性が高くなるよう（１００％の相補性）、他の型のＨＰＶと相同性の高い配列を有さないよう、及びＴｍ値がプライマーセット間で近くなるように設計されているため、これらを混合して１つの試験管内でマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、試料中に存在する特定の型のＨＰＶ遺伝子を特異的に増幅することが可能である。
【００２２】
各プライマーの変異体の配列は、表１に記載される各プライマーの情報に基づいて設計することができる。具体的には、配列番号１のプライマーの変異体は、配列番号２のプライマー（又は配列番号２のプライマーの変異体）とのＰＣＲ反応によって、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのＰＣＲ反応によって得られるＰＣＲ産物と同一の、或いは相同性の高いＰＣＲ産物を得ることができるように設計される。相同性の高さは、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。配列番号１のプライマーの５’末端は、ＨＰＶ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０９２９３２）ゲノム上７２５１位に結合するが、±５０位、好ましくは±２０位、特に好ましくは±１０位に結合するようなプライマーも配列番号１のプライマーの変異体として本発明の範疇である。
【００２３】
相同性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、相同性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、相同性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。
【００２４】
本発明のプライマーセットの各ヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製  Ｍｏｄｅｌ  ３９４）を用いて化学的に合成することが出来る。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において良く知られる他の方法のいずれかを用いて合成しても良い。
【００２５】
本発明は、前記ＰＣＲ増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブも提供する。該プローブは、各ＰＣＲ増幅産物の塩基配列に含まれる一本鎖ＤＮＡであり、センス鎖ＤＮＡ又はアンチセンス鎖ＤＮＡのいずれであっても良い。具体的には、以下（１）〜（２３）に示すプローブが挙げられる。
（１）配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号４９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１）、
（２）配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２）、
（３）配列番号５１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ３）、
（４）配列番号５２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ４）、
（５）配列番号５３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５３で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ５）、
（６）配列番号５４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５４で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ６）、
（７）配列番号５５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ７）、
（８）配列番号５６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５６で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ８）、
（９）配列番号５７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５７で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ９）、
（１０）配列番号５８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５８で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１０）、
（１１）配列番号５９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号５９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号５９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１１）、
（１２）配列番号６０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１２）、
（１３）配列番号６１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１３）、
（１４）配列番号６２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１４）、
（１５）配列番号６３で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６３で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１５）、
（１６）配列番号６４で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６４で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６４で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１６）、
（１７）配列番号６５で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６５で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１７）、
（１８）配列番号６６で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６６で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６６で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１８）、
（１９）配列番号６７で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６７で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６７で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ１９）、
（２０）配列番号６８で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６８で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６８で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２０）、
（２１）配列番号６９で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号６９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号６９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２１）、
（２２）配列番号７０で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号７０で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７０で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２２）、及び
（２３）配列番号７１で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号７１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ又は配列番号７１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体（プローブ２３）。
【００２６】
プローブ１における、「配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ」とは、「配列番号４９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」と同義である。以下、便宜上、「配列番号４９のプローブ」とも称する。
「配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体」とは、上記配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号４９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプローブとしての機能、すなわちＨＰＶ６遺伝子の特定の領域を検出することのできる機能を有する。以下、当該変異体を、便宜上、「配列番号４９のプローブの変異体」とも称する。「変異体」は、プローブとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている。
「配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ」とは、「配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」と同義である。以下、便宜上、「配列番号４９と相補的なプローブ」とも称する。
「配列番号４９で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体」とは、上記配列番号４９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号４９で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプローブとしての機能、すなわちＨＰＶ６遺伝子の特定の領域を検出することのできる機能を有する。以下、当該変異体を、便宜上、「配列番号４９と相補的なプローブの変異体」とも称する。「変異体」は、プローブとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている。
【００２７】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望するＨＰＶ遺伝子検出用のプローブとしての機能を有する変異体を得るための条件を適宜決定することができる。
【００２８】
プローブ１は、「配列番号４９のプローブ」、「配列番号４９のプローブの変異体」、「配列番号４９と相補的なプローブ」、又は「配列番号４９と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号４９のプローブ」又は「配列番号４９と相補的なプローブ」である。
プローブ１と同様にしてプローブ２〜２３を定義付けることができる。すなわち、
プローブ２は、「配列番号５０のプローブ」、「配列番号５０のプローブの変異体」、「配列番号５０と相補的なプローブ」、又は「配列番号５０と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５０のプローブ」又は「配列番号５０と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ１１遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ３は、「配列番号５１のプローブ」、「配列番号５１のプローブの変異体」、「配列番号５１と相補的なプローブ」、又は「配列番号５１と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５１のプローブ」又は「配列番号５１と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ１６遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ４は、「配列番号５２のプローブ」、「配列番号５２のプローブの変異体」、「配列番号５２と相補的なプローブ」、又は「配列番号５２と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５２のプローブ」又は「配列番号５２と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ１８遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ５は、「配列番号５３のプローブ」、「配列番号５３のプローブの変異体」、「配列番号５３と相補的なプローブ」、又は「配列番号５３と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５３のプローブ」又は「配列番号５３と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３０遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ６は、「配列番号５４のプローブ」、「配列番号５４のプローブの変異体」、「配列番号５４と相補的なプローブ」、又は「配列番号５４と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５４のプローブ」又は「配列番号５４と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３１遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ７は、「配列番号５５のプローブ」、「配列番号５５のプローブの変異体」、「配列番号５５と相補的なプローブ」、又は「配列番号５５と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５５のプローブ」又は「配列番号５５と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３３遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ８は、「配列番号５６のプローブ」、「配列番号５６のプローブの変異体」、「配列番号５６と相補的なプローブ」、又は「配列番号５６と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５６のプローブ」又は「配列番号５６と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３４遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ９は、「配列番号５７のプローブ」、「配列番号５７のプローブの変異体」、「配列番号５７と相補的なプローブ」、又は「配列番号５７と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５７のプローブ」又は「配列番号５７と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３５遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１０は、「配列番号５８のプローブ」、「配列番号５８のプローブの変異体」、「配列番号５８と相補的なプローブ」、又は「配列番号５８と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５８のプローブ」又は「配列番号５８と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ３９遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１１は、「配列番号５９のプローブ」、「配列番号５９のプローブの変異体」、「配列番号５９と相補的なプローブ」、又は「配列番号５９と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号５９のプローブ」又は「配列番号５９と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ４０遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１２は、「配列番号６０のプローブ」、「配列番号６０のプローブの変異体」、「配列番号６０と相補的なプローブ」、又は「配列番号６０と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６０のプローブ」又は「配列番号６０と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ４２遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１３は、「配列番号６１のプローブ」、「配列番号６１のプローブの変異体」、「配列番号６１と相補的なプローブ」、又は「配列番号６１と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６１のプローブ」又は「配列番号６１と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ４５遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１４は、「配列番号６２のプローブ」、「配列番号６２のプローブの変異体」、「配列番号６２と相補的なプローブ」、又は「配列番号６２と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６２のプローブ」又は「配列番号６２と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５１遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１５は、「配列番号６３のプローブ」、「配列番号６３のプローブの変異体」、「配列番号６３と相補的なプローブ」、又は「配列番号６３と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６３のプローブ」又は「配列番号６３と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５２遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１６は、「配列番号６４のプローブ」、「配列番号６４のプローブの変異体」、「配列番号６４と相補的なプローブ」、又は「配列番号６４と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６４のプローブ」又は「配列番号６４と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５３遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１７は、「配列番号６５のプローブ」、「配列番号６５のプローブの変異体」、「配列番号６５と相補的なプローブ」、又は「配列番号６５と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６５のプローブ」又は「配列番号６５と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５４遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１８は、「配列番号６６のプローブ」、「配列番号６６のプローブの変異体」、「配列番号６６と相補的なプローブ」、又は「配列番号６６と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６６のプローブ」又は「配列番号６６と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５６遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ１９は、「配列番号６７のプローブ」、「配列番号６７のプローブの変異体」、「配列番号６７と相補的なプローブ」、又は「配列番号６７と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６７のプローブ」又は「配列番号６７と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５８遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ２０は、「配列番号６８のプローブ」、「配列番号６８のプローブの変異体」、「配列番号６８と相補的なプローブ」、又は「配列番号６８と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６８のプローブ」又は「配列番号６８と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ５９遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ２１は、「配列番号６９のプローブ」、「配列番号６９のプローブの変異体」、「配列番号６９と相補的なプローブ」、又は「配列番号６９と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号６９のプローブ」又は「配列番号６９と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ６１遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ２２は、「配列番号７０のプローブ」、「配列番号７０のプローブの変異体」、「配列番号７０と相補的なプローブ」、又は「配列番号７０と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号７０のプローブ」又は「配列番号７０と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ６６遺伝子の特定の領域を検出することができ、
プローブ２３は、「配列番号７１のプローブ」、「配列番号７１のプローブの変異体」、「配列番号７１と相補的なプローブ」、又は「配列番号７１と相補的なプローブの変異体」のいずれかであり、好ましくは「配列番号７１のプローブ」又は「配列番号７１と相補的なプローブ」であり、ＨＰＶ６８遺伝子の特定の領域を検出することができる。
【００２９】
各プローブの一例（プローブがセンス鎖ＤＮＡの場合）を表３に示す。なお、後述するように、本発明では、内部標準として利用されるＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するためのプローブを任意で用いることができる。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子を検出するためのプローブ（プローブ２４）は、配列番号７２で示される塩基配列からなるプローブ又は配列番号７２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体、或いは配列番号７２で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ又は配列番号７２で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプローブとしての機能を有するその変異体である。
各プローブの塩基配列、Ｔｍ値、サイズ、及びゲノム上の位置を表３に示す。
【００３０】
【表３−１】
0005302519.tif 000005
【００３１】
【表３−２】
0005302519.tif 000006
【００３２】
位置（ｎｔ）は、センス鎖ＤＮＡであるプローブの、各ウイルスタイプ及びＧ３ＰＤＨのゲノム上の位置（５’→３’）を示している。なお、位置は、表２に示す各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号の遺伝子配列における位置で示している。
【００３３】
該プローブは、長さが６９〜７１ｂｐと比較的短く、かつ、他の型のＨＰＶと相同性の高い配列を有さないように設計されているため、各ＰＣＲ増幅産物と非常に高い特異性でハイブリダイズする。例えば、ＰＣＲ増幅産物を各ＨＰＶに特異的なプローブが支持体上に固定されている検出用ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせることにより、試料中における各ＨＰＶの存在又は非存在を検出することが出来る。
【００３４】
各プローブの変異体の配列は、表３に記載される各プローブの情報に基づいて設計することができる。具体的には、配列番号４９のプローブの変異体は、ＨＰＶ６のゲノム上７５１９位〜７５８８位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る程度に相同性の高いオリゴヌクレオチドとなるように設計される。相同性の高さは、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。配列番号４９のプローブは、ＨＰＶ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０９２９３２）ゲノム上７５１９位〜７５８８位領域に相当するが、ＨＰＶ６遺伝子を特異的に検出することができる場合には、５’末端側及び３’末端側のいずれも±５０位、好ましくは±２０位、特に好ましくは±１０位変動してもよい。
プローブがアンチセンス鎖ＤＮＡの場合は、表３に記載される各ＨＰＶ遺伝子特異的配列に相補的な配列に基づいて、所望するＨＰＶ型特異的なプローブを設計することができる。
【００３５】
相同性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、相同性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、相同性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。
【００３６】
該プローブの各ヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製  Ｍｏｄｅｌ  ３９４）を用いて化学的に合成することが出来る。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において良く知られる他の方法のいずれかを用いて合成しても良い。
【００３７】
本発明の一つの側面として、ＨＰＶの型特異的なプライマーセットとプローブとの組み合わせを１種類以上、好ましくは２種類以上含有する、ＨＰＶ検出用のキットが提供される。該キットを用いたＨＰＶの検出は、型特異的なプライマーセットを用いて対応する型のＨＰＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅すること、及び各増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてＨＰＶの存在を検出すること、を含む。本発明のプライマーセットはそれぞれのＴｍ値が近似するように設計されており、従って、特に複数のプライマーセットを混合して用いるマルチプレックスＰＣＲ反応を行なうのに好適である。
【００３８】
プライマーセット１〜２３によって得られるＰＣＲ増幅産物は、それぞれプローブ１〜２３によって型特異的に検出される。例えばプライマーセット１を用いた場合にはそのＰＣＲ増幅産物の検出にはプローブ１が用いられる。
【００３９】
本発明のキットを用いたＨＰＶの検出のために、試料中のＤＮＡが抽出され、該ＤＮＡが前記プライマーセットを用いたＰＣＲに付される。試料としては、ＨＰＶに感染していると疑われる被験者から得られた組織試料、生検、スメア等を用いることが出来る。更に、採取した細胞から密度勾配遠心操作により、通常ＨＰＶが感染する子宮頸部扁平上皮細胞を濃縮して用いることも出来る。或いは、培養細胞、例えばＨｅＬａ細胞等を用いても良い。本発明に従ってＨＰＶ遺伝子の存在を検出することが有用であると考えられる対象疾病には、疣、上皮内新生物、皮膚癌、口腔・口咽頭癌、性器新生物、子宮頸癌、コンジローム、乳頭種等が含まれる。
【００４０】
試料からＤＮＡを抽出する方法は当該技術分野において良く知られており、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出や、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる抽出により行うことが出来る。或いは、カラムキット（ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ（登録商標）  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔ  Ｇｅｎｔｒａ）による抽出を行っても良い。
【００４１】
このようにして試料から抽出されたＤＮＡをテンプレートとして、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、各型のＨＰＶ遺伝子を増幅する。ＰＣＲの方法自体は、当該技術分野において周知であり（Saiki et al.,Science,239,487-491,1988）、センス鎖にハイブリダイズするプライマー（リバースプライマー）とアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（フォワードプライマー）とを用い、これらのプライマー、鋳型ＤＮＡ（即ち、ＨＰＶ遺伝子）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、アニーリング、伸長、変性の工程から成るサイクルを２０回ないし４０回程度繰り返すことにより行うことができる。本発明のキットを用いたＨＰＶ検出において、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ）、Ｚ−Ｔａｑ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｍ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるポリメラーゼ等を用いることが出来る。プライマーのＴｍ値に基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当該技術分野において良く知られており、当業者は、プライマーの長さやＧＣ含量、目的とする特異性や感度、用いるポリメラーゼの特性等に基づいて、最適な条件を選択することが出来る。例えば、下記の実施例においては、９５℃で４分間、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で７分間でＰＣＲを実施した。また、所定の検出感度を達成し、かつ、ウイルスの型による検出感度のばらつきが少なくなるように、ＰＣＲ溶液に含めるプライマーの量を適宜調節することが出来る。
【００４２】
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物に対して、対応する型特異的にＨＰＶを検出することができる本発明のプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーションは、例えば、標識プローブやマイクロアレイを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの診断は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離したＤＮＡを各型特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する（ＤＮＡ増幅産物）。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ＤＮＡとする。この標識ＤＮＡをマイクロアレイに接触させ、マイクロアレイにあらかじめ固定化されているプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、０．２ｍｌ若しくは１．５ｍｌプラスチックチューブに分注して標識ＤＮＡ水溶液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、５〜１００μｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、０．５〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はポリエチレン２０ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
複数のＤＮＡ増幅産物を同時にプローブ生体高分子とハイブリダイズさせるための方法としては、例えば特許第３８６０１７４号で開示された方法を用いることができる。
【００４３】
本発明は、プローブ１〜２３からなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは２又はそれ以上が固定化されている、ＨＰＶを検出するためのＤＮＡマイクロアレイを提供する。該ＤＮＡマイクロアレイは任意で内部標準としてプローブ２４を固定化していてもよい。
【００４４】
マイクロアレイの作製方法としては、支持体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを支持体表面に固定する方法とが知られている。本発明のマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができるが、簡便には後者である。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Fodor, S.P.A. Science 251:767, 1991）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、表面処理した支持体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、イオン結合又は共有結合させる（例えば、Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した支持体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996）。また、ポリ−Ｌ−リジン又はアミノプロピルシランをコーティングしたガラス表面を支持体として用いることもできる。支持体としては、例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコンチップ等が挙げられる。また、プローブの固定は、当該技術分野で利用される任意の方法に従ってなされ得るが、通常、スポッター等を用いて支持体上にＤＮＡを固定すれば良い。
【００４５】
本発明のキットを用いてＨＰＶを検出するためにＤＮＡマイクロアレイを用いる場合には、ハイブリダイゼーションに供する前に増幅ＤＮＡ産物を予め標識しておくことが好ましく、増幅時に標識を行うことが特に好ましい。該標識方法としては、ＰＣＲ増幅産物を作製する際、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の基質となるＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）と標識付きデオキシヌクレオチド(例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）をそれぞれ調製して、各ｄＮＴＰの終濃度を揃えることで、作製される増幅産物中に標識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法、及び予め標識されたプライマーを用いてＰＣＲ反応を行いＤＮＡを標識する方法の二つを挙げることが出来る。
【００４６】
標識物質としては、蛍光物質又はビオチンのいずれか一つを含んでいることが、検出感度及び標識の簡便さの点から好ましい。好ましい蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ等が挙げられ、特に好ましい蛍光物質はＣｙ３である。ビオチン及びジゴキシゲニンの場合は、各種ビオチン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。蛍光標識して利用される各種蛍光物質は、かかる蛍光物質に由来する蛍光強度を観測する光学的検出手段を利用することで、高感度の検出を可能とする。また、前記標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出法も、酵素活性は、各種発色反応を利用するものとすることで、光学的検出手段の利用が可能であり、高感度の検出を可能とする。該光学的検出手段としては、共焦点、非共焦点レーザースキャナー又はＣＣＤスキャナーを用いて蛍光強度値を読み取れば良い。
【００４７】
増幅産物をＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせるに当たって、二本鎖ＤＮＡ産物をＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション反応に供しても良いし、ハイブリダイゼーション反応前に増幅二本鎖ＤＮＡ産物から一本鎖ＤＮＡを単離する工程を加えても良いが、検出感度の観点から、一本鎖ＤＮＡに単離する工程を加えることが好ましい。
【００４８】
二本鎖ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡの単離の方法は特に限定されないが、例えば、特開２００６−２３０３４２で開示された方法を挙げることが出来る。即ち、以下の手順に従って一本鎖ＤＮＡは単離される。検出しない側のタグ鎖を合成するためのプライマーの５’端にビオチンを標識しておく。増幅後、ビオチンをストレプトアビジンが固定化されている磁気ビーズと結合させ、増幅ＤＮＡ産物−磁気ビーズの複合体を形成させる。複合体にＮａＯＨ水溶液などのアルカリ溶液を加えて反応させることにより、増幅ＤＮＡ産物の二本鎖を一本鎖に乖離させる。その後、磁気ビーズをマグネットに吸着させることにより、ビオチン標識されていないプライマーにより伸長した一本鎖ＤＮＡのみを選択的に単離することが出来る。なお、磁気ビーズを用いてアンチセンス鎖ＤＮＡを単離する工程の概要を図１に示した。図１記載の工程において、５’末端をビオチン修飾したフォワードプライマーの代わりに、５’末端をビオチン修飾したリバースプライマーを用いれば、磁気ビーズを用いたセンス鎖ＤＮＡの単離も同様になされ得る。
【００４９】
ＨＰＶ遺伝子検査は、臨床サンプルを用いた検査であるため、実験的な精度管理が非常に重要である。そのために、内部標準となる遺伝子（内部標準遺伝子）を設定することが望ましい。本明細書において内部標準遺伝子とは、検体由来のＤＮＡと共にマルチプレックスＰＣＲに供され、該増幅産物を認識するプローブとハイブリダイズさせて検出することにより、偽の負の反応を検出するために利用される遺伝子を言う。この目的のために、細胞内での発現量が比較的多く、またその変動が少ない、ハウスキーピング遺伝子が利用されることが多い。具体的には、例えば、Ｇ３ＰＤＨ、β−アクチン等が挙げられる。
本発明のキットは内部標準としてＧ３ＰＤＨを採用しており、Ｇ３ＰＤＨ用のプライマーセット（プライマーセット２４）とプローブ（プローブ２４）との組み合わせを任意で含む（上記表１及び表３を参照）。該プライマーセットとプローブとの組み合わせは、様々な型のＨＰＶ遺伝子に対する増幅反応若しくはハイブリダイゼーション反応と同時かつ同じ効率で増幅若しくはハイブリダイズするように設計されている。
【００５０】
一つの実施態様において、本発明のキットは、前記２４種類のプライマーセットとプローブとの組み合わせのうち、プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、及び任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含有する。この場合、該キットは、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の検出を可能とするが、これらのＨＰＶサブタイプは、子宮頸癌の発症について特にハイリスクである。
【００５１】
別の実施態様において、本発明のキットは、前記２４種類のプライマーセットとプローブとの組み合わせのうち、プライマーセット３とプローブ３との組み合わせ、プライマーセット４とプローブ４との組み合わせ、プライマーセット５とプローブ５との組み合わせ、プライマーセット６とプローブ６との組み合わせ、プライマーセット７とプローブ７との組み合わせ、プライマーセット９とプローブ９との組み合わせ、プライマーセット１０とプローブ１０との組み合わせ、プライマーセット１３とプローブ１３との組み合わせ、プライマーセット１４とプローブ１４との組み合わせ、プライマーセット１５とプローブ１５との組み合わせ、プライマーセット１８とプローブ１８との組み合わせ、プライマーセット１９とプローブ１９との組み合わせ、プライマーセット２０とプローブ２０との組み合わせ、プライマーセット２３とプローブ２３との組み合わせ、及び任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含有する。この場合、該キットは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８の検出を可能とするが、これらのＨＰＶサブタイプは、子宮頸癌の発症についてハイリスク群に分類される。
【００５２】
更なる実施態様において、本発明のキットは、ＨＰＶを検出するための前記２３種類のプライマーセットとプローブとの組み合わせの全て、及び任意でプライマーセット２４とプローブ２４との組み合わせを含有する。
【００５３】
本発明のキットは、前記各プライマーセットとプローブとの組み合わせ以外に、以下の試薬全て、又はそれらの任意の組み合わせ、及びその他の試薬を含有し得る：緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ポジティブコントロールＨＰＶ  ＤＮＡ、非ＨＰＶ  ＤＮＡ、内部標準Ｇ３ＰＤＨ  ＤＮＡ、ｄＮＴＰ、蛍光色素標識塩基（例、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）、及びストレプトアビジンが固定されている磁気ビーズ。
【００５４】
本発明の別の側面として、上述した本発明のキットを用いて検体中のＨＰＶの存在又は非存在を型特異的に検出するための方法が提供される。該方法は、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程及び増幅されたＤＮＡ産物を検出する工程を含む。
【００５５】
別の実施態様において、該方法は、検体中から抽出したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、増幅したＤＮＡ産物を一本鎖にする工程、及び一本鎖ＤＮＡを前記プローブとハイブリダイズさせて検出する工程を含む。各工程における実際の手順は、特に限定されないが、キットの説明において記述した方法を適宜用いることが好ましい。
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００５７】
本実施例で用いる、各試薬（緩衝液、酵素、溶液、化合物等）は、特に指定のない限り、当分野で通常用いられているものであり、商業的に入手可能であるか、以前に報告されたようにして調製することができる。
【００５８】
実施例１  プライマーの設計及び特異性の確認
ＨＰＶ及び内部標準として用いるＧ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）の遺伝子配列は公共データベースから入手した。本発明において用いた２４種類の遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、表２に示されている。
【００５９】
各遺伝子の配列に基づいて、以下の基準を満たすプライマーセットを設計した：融解温度（Ｔｍ）が６０〜７０℃の範囲内（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄを用いた場合。Ｎａ＋  Ｃｏｎｃ．：５０ｍＭ）であること；増幅産物の長さが１００〜５００ｂｐの範囲内であること；ＧＣ含量が５０〜６０％の範囲内であること；他の種類のＨＰＶと相同性の高い配列を有しないこと；分子内で二次構造を形成しないこと；及び、プライマー同士がハイブリダイズしないこと。このようにして、各ＨＰＶ及びＧ３ＰＤＨに特異的なプライマーセットを設計した。
【００６０】
表１に示されるプライマーセットの配列に基づいて、ＤＮＡ合成機によりオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。
【００６１】
ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６６及びＨＰＶ６８をコードするＤＮＡをそれぞれプラスミドｐＵＣ１８内に導入して、２３種類のテンプレート用のプラスミドを作製した。
【００６２】
次に、２３種類のＨＰＶテンプレート用のプラスミド及びＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔリンパ腫）由来のゲノムの各ＤＮＡに対し、上述した通り作製した各々のプライマーセットを用いて、個々にＰＣＲ反応を行った。反応液の組成は以下の通りである：
【００６３】
【表４】
0005302519.tif 000007
【００６４】
用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりである：９５℃で４分間、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で７分間の後に４℃で保存。得られた増幅ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により分離した。いずれのプライマーセットについても、予測される長さの増幅産物が得られ、非特異的なハイブリダイズに起因する夾雑増幅物がないことを確認した。
【００６５】
次に、２４種類のプライマーセットの混合物を用いて、２３種類のＨＰＶテンプレート用のプラスミド及びＪｕｒｋａｔ細胞から抽出したゲノムを各々、ＰＣＲ反応に用いた。なお、各プライマーセットの増幅効率がほぼ同程度となるように濃度を２パターンに分けて混合した。反応液の組成は以下のとおりであった。
【００６６】
【表５】
0005302519.tif 000008
【００６７】
用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりであった：９５℃で４分間、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で７分間の後に４℃で保存。得られた増幅ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により分離した結果を図２に記載した。いずれのテンプレートについても、予測される長さの増幅産物が得られたことから、プライマーを混合した場合においても非特異的なハイブリダイズに起因する夾雑増幅物がないことを確認した。
【００６８】
実施例２  プローブの設計
２３種類のＨＰＶ及びＧ３ＰＤＨの各ＰＣＲ増幅領域内に、以下の基準を満たすプローブ（センス鎖ＤＮＡ）を設計した：融解温度（Ｔｍ）が７２〜７８℃の範囲内（ＧＣ％  ｍｅｔｈｏｄを用いた場合。Ｎａ＋  Ｃｏｎｃ．：５０ｍＭ）であること；プローブの長さが６９〜７１ｂｐの範囲内であること；ＧＣ含量が４５〜５５％の範囲内であること；他の型のＨＰＶと相同性の高い配列を有しないこと；及び、分子内で二次構造を形成しないこと。このようにして、各ＨＰＶ及びＧ３ＰＤＨに特異的なプローブを設計した（表３）。
【００６９】
表３に示されるプローブの配列に基づいて、ＤＮＡ合成機によりオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。
【００７０】
実施例３  ＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例２で合成した２４種類のプローブ各々について、表６のように混合し、接触又は非接触型の市販スポッター（ＳｐｏｔＡｒｒａｙ又はＰｉｅｚｏｒｒａｙ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）にてポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたガラス基板に、図３に示す配置で各プローブについて２箇所ずつスポッティングを行い、検出用ＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００７１】
【表６】
0005302519.tif 000009
【００７２】
実施例４  ＨＰＶの増幅及び検出
（１）ＨＰＶ及びＧ３ＰＤＨの増幅・標識
２４種類のプライマーセットの混合物（プライマーミックス）を用いて、２３種類のＨＰＶテンプレート用のプラスミド及びＪｕｒｋａｔ細胞から抽出したゲノムに対して各々、表７に示す反応液の組成でＰＣＲ反応を行った。２４種類のプライマーセットは、各プライマーセットの増幅効率がほぼ同程度となるように濃度を２パターンに分けて混合した。なお、ＰＣＲ反応液にはＨＰＶ感染の有無をＤＮＡマイクロアレイ上で蛍光強度として検出するために、蛍光色素標識塩基（Ｃｙ３−ｄＵＴＰ：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を一緒に加えた。
【００７３】
【表７】
0005302519.tif 000010
【００７４】
用いたＰＣＲの反応条件は次の通りである：９５℃で４分間、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で７分間の後に４℃で保存。
以上により、Ｃｙ３標識された増幅ＤＮＡ産物を得た。
【００７５】
ＰＣＲ反応後、市販ＰＣＲ精製カラムを用いて反応に用いられなかった余分な酵素、蛍光色素標識塩基、プライマーの除去を行い、Ｃｙ３標識された増幅ＤＮＡ産物を精製した。
【００７６】
（２）ＤＮＡマイクロアレイを用いたＨＰＶの検出
精製されたＣｙ３標識増幅ＤＮＡ産物を、表８に記載したハイブリダイゼーション溶液と混和し、９５℃で２分間加熱変性、次に氷上で３分間静置した後、８μＬをＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションに用いた。
【００７７】
【表８】
0005302519.tif 000011
【００７８】
ハイブリダイゼーション反応は、特許第３８６０１７４号で開示された方法を用いて、６５℃の恒温槽で１時間行った。
【００７９】
ハイブリダイゼーション反応後は、ＤＮＡマイクロアレイを２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液で各５分間洗浄し、次に０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスを行い、窒素ガスエアーガン又はスライド遠心機を用いて乾燥させた。
【００８０】
これを市販マイクロアレイスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ：Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いてスキャンを行った。波長５３２ｎｍにおけるスポットの蛍光強度値及びスポット周縁のバックグランド値から検出可否を判定した。
【００８１】
いずれのテンプレートについても、非特異的なハイブリダイズに起因する蛍光スポットは検出されず、ＨＰＶの型特異的に蛍光スポットを検出出来ることを確認した。
【００８２】
実施例５  磁気ビーズを用いた一本鎖ＤＮＡの単離工程を追加したＨＰＶの検出（図１参照）
実施例１で設計した各プライマーセットのうちプライマーＦのみ、５’末端にビオチンを付加したものを新たに作製した。実際の合成は、受託ＤＮＡ合成メーカーに発注し、汎用のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成された。これを用いて実施例４の（１）に記載しているＨＰＶ及びＧ３ＰＤＨの増幅・標識工程を同様に行い、Ｃｙ３標識増幅ＤＮＡ産物を得た。
【００８３】
次に、１．５ｍＬチューブ内でＣｙ３標識増幅ＤＮＡ産物の溶液をストレプトアビジンが固定化されている磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）と１５分間反応させ、増幅ＤＮＡ産物−磁気ビーズの複合体を形成させた。反応液の組成は以下のとおりである：
【００８４】
【表９】
0005302519.tif 000012
【００８５】
その後、マグネットに複合体を吸着させながら反応液を完全に除去した。次にマグネットを外し、複合体に１０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨ（アルカリ）溶液を加えて１０分間反応させることにより、増幅ＤＮＡ産物の二本鎖を一本鎖に乖離させた。その後、再度マグネットにより表１のプライマーＦによりＰＣＲ反応で伸長したセンス鎖の（一本鎖）ＤＮＡのみを吸着させ、アルカリ溶液を採取することによりプライマーＲによりＰＣＲ反応で伸長したアンチセンス鎖ＤＮＡのみを選択的に単離した。単離したアンチセンス鎖の（一本鎖）ＤＮＡに３Ｍ酢酸Ｎａを１μＬ加えて中和した後、氷上で５分間静置した。
【００８６】
次に、単離したアンチセンス鎖（一本鎖）ＤＮＡを、実施例４の（２）に記載したＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション反応に用いた。なお、表８に記載した反応組成のＣｙ３標識された増幅ＤＮＡ産物をアンチセンス鎖（一本鎖）ＤＮＡに置き換える以外は、すべて実施例４の（２）と同様に行った。
【００８７】
スキャン画像を図４に記載する。いずれのテンプレートについても、非特異的なハイブリダイズに起因する蛍光スポットは検出されず、ＨＰＶの型特異的に蛍光スポットを検出出来ることを確認した。さらに、磁気ビーズを用いた一本鎖ＤＮＡの単離工程を追加したことで実施例４の場合に比べて、いずれのテンプレートについてもより高感度に検出できることが確認できた（図５）。
【００８８】
以上の結果より、本発明のプライマーセット及びプローブ、並びに本発明のＨＰＶの検出方法を利用することにより、ＨＰＶを高い特異性及び感度で検出出来ることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１：ＨＰＶ６遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２：ＨＰＶ６遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３：ＨＰＶ１１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４：ＨＰＶ１１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号５：ＨＰＶ１６遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号６：ＨＰＶ１６遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号７：ＨＰＶ１８遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号８：ＨＰＶ１８遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号９：ＨＰＶ３０遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１０：ＨＰＶ３０遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１１：ＨＰＶ３１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１２：ＨＰＶ３１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１３：ＨＰＶ３３遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１４：ＨＰＶ３３遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１５：ＨＰＶ３４遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１６：ＨＰＶ３４遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１７：ＨＰＶ３５遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１８：ＨＰＶ３５遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１９：ＨＰＶ３９遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２０：ＨＰＶ３９遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号２１：ＨＰＶ４０遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２２：ＨＰＶ４０遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号２３：ＨＰＶ４２遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２４：ＨＰＶ４２遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号２５：ＨＰＶ４５遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２６：ＨＰＶ４５遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号２７：ＨＰＶ５１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号２８：ＨＰＶ５１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号２９：ＨＰＶ５２遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号３０：ＨＰＶ５２遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３１：ＨＰＶ５３遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号３２：ＨＰＶ５３遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３３：ＨＰＶ５４遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号３４：ＨＰＶ５４遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３５：ＨＰＶ５６遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号３６：ＨＰＶ５６遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３７：ＨＰＶ５８遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号３８：ＨＰＶ５８遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号３９：ＨＰＶ５９遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４０：ＨＰＶ５９遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号４１：ＨＰＶ６１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４２：ＨＰＶ６１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号４３：ＨＰＶ６６遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４４：ＨＰＶ６６遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号４５：ＨＰＶ６８遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４６：ＨＰＶ６８遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号４７：Ｇ３ＰＤＨ遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号４８：Ｇ３ＰＤＨ遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号４９：ＨＰＶ６遺伝子検出用プローブ
配列番号５０：ＨＰＶ１１遺伝子検出用プローブ
配列番号５１：ＨＰＶ１６遺伝子検出用プローブ
配列番号５２：ＨＰＶ１８遺伝子検出用プローブ
配列番号５３：ＨＰＶ３０遺伝子検出用プローブ
配列番号５４：ＨＰＶ３１遺伝子検出用プローブ
配列番号５５：ＨＰＶ３３遺伝子検出用プローブ
配列番号５６：ＨＰＶ３４遺伝子検出用プローブ
配列番号５７：ＨＰＶ３５遺伝子検出用プローブ
配列番号５８：ＨＰＶ３９遺伝子検出用プローブ
配列番号５９：ＨＰＶ４０遺伝子検出用プローブ
配列番号６０：ＨＰＶ４２遺伝子検出用プローブ
配列番号６１：ＨＰＶ４５遺伝子検出用プローブ
配列番号６２：ＨＰＶ５１遺伝子検出用プローブ
配列番号６３：ＨＰＶ５２遺伝子検出用プローブ
配列番号６４：ＨＰＶ５３遺伝子検出用プローブ
配列番号６５：ＨＰＶ５４遺伝子検出用プローブ
配列番号６６：ＨＰＶ５６遺伝子検出用プローブ
配列番号６７：ＨＰＶ５８遺伝子検出用プローブ
配列番号６８：ＨＰＶ５９遺伝子検出用プローブ
配列番号６９：ＨＰＶ６１遺伝子検出用プローブ
配列番号７０：ＨＰＶ６６遺伝子検出用プローブ
配列番号７１：ＨＰＶ６８遺伝子検出用プローブ
配列番号７２：Ｇ３ＰＤＨ遺伝子検出用プローブ
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】磁気ビーズを用いた一本鎖ＤＮＡの単離工程（アンチセンス鎖ＤＮＡを単離する場合）の概念図である。
【図２】増幅ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図３】作製したＤＮＡマイクロアレイ上のスポット配置を示す図である。
【図４】単離した標識一本鎖ＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションの結果を検出したスキャン画像を示す図である。
【図５】磁気ビーズを用いた一本鎖ＤＮＡの単離工程を行わない場合と行う場合との間の、ＨＰＶ検出感度の違いを示す図である。
【図１】
0005302519.tif 000013
【図２】
0005302519.tif 000014
【図３】
0005302519.tif 000015
【図４】
0005302519.tif 000016
【図５】
0005302519.tif 000017
【配列表】
0005302519000001.app