(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物との間に相対移動がある場合、前記対象物の画像から前記対象物の１つまたは複数の特性を決定するようになされた画像化システムであって、
（ａ）前記対象物からの光を通過させ、集光光路に沿って進行するように配置された集光レンズと、
（ｂ）該集光レンズを通過した光を受光するべく配置され、それにより所定の位置に向けて導かれる画像を生成する少なくとも１つの画像レンズと、
（ｃ）前記集光レンズを通過した光を受光するべく配置され、前記対象物からの光が、一度だけ通過するように、予め決められた特性の光を異なる反射光路に沿って反射し、かつ、該予め決められた特性を持たない光を通過させる複数の光反射素子と、
（ｄ）前記各光反射素子の各々に対して１つが、前記光反射素子で反射した光および前記光反射素子を透過した光のうちの１つから前記対象物の画像を受け取るべく位置付けされ、前記対象物と前記画像化システムとの間に前記相対移動が生じている間、前記対象物の少なくとも１つの特性を表す出力信号を生成し、前記対象物の少なくとも一部からの光を時間に対して積分することによって前記出力信号を生成するように配置される複数のピクセル化検出器であって、前記少なくとも１つの特性は少なくとも１つのプローブに対応する色を含む、ピクセル化検出器と、
（ｅ）前記対象物の少なくとも１つの特性を決定するために、
１）前記各々のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記プローブの相対位置に相当する前記ピクセル化検出器上の位置において、前記対象物内の前記少なくとも１つのプローブの色の特性の光が前記ピクセル化検出器で前記対象物から受信されたかどうかを示す出力信号を生成することにより、前記対象物に適用されるプローブが、前記ピクセル化検出器からの出力信号に作用したかどうかを決定すること、
２）前記複数のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記プローブの前記相対位置での前記プローブの色の特性を示す前記出力信号におけるプローブの作用に基づいて、前記対象物の１つ又はそれ以上の特性を決定すること、
を実行することによって、前記ピクセル化検出器からの出力信号を分析するように構成されたプロセッサと
を備えることを特徴とする画像化システム。
【請求項２】
前記ピクセル化検出器の各々が、時間遅延積分検出器からなることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項３】
前記少なくとも１つの画像レンズが、前記集光レンズと前記複数の光反射素子との間の前記集光光路内に配置され、かつ、前記複数の検出器の各々と前記画像化レンズとの間の光路の長さが実質的に等しいことを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項４】
前記少なくとも１つの画像レンズと前記集光レンズが同じ光素子であることを特徴とする請求項３に記載の画像化システム。
【請求項５】
前記少なくとも１つの画像レンズが、前記複数の光反射素子の各々に対して１つの独立した画像レンズを備え、該画像レンズの各々が、前記複数の光反射素子の１つと前記複数の検出器の対応する１つとの間に配置されることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項６】
前記複数の光反射素子の各々が二色性フィルタを備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項７】
前記二色性フィルタの各々が、キューブ基板、ペリカル（ｐｅｌｌｉｃａｌ）およびプレート基板のうちの少なくとも１つからなることを特徴とする請求項６に記載の画像化システム。
【請求項８】
それぞれ前段の光反射素子と時間遅延積分検出器との間に配置され、かつ、隣接する光反射素子に対して、該光反射素子によって付与されるあらゆる非点収差が実質的に除去されるように配向された複数の補正板を備えることを特徴とする請求項２に記載の画像化システム。
【請求項９】
前記補正板の各々が、前記隣接する光反射素子が回転する軸に対して実質的に直角をなす軸の周りに回転し、前記軸の両方が前記集光光路を形成している軸に対して直角をなすことを特徴とする請求項８に記載の画像化システム。
【請求項１０】
前記予め決められた特性に、前記対象物から受光する特定の波長帯の光が含まれ、個別のピクセル化検出器の各々が、対応する反射素子によって、透過および反射の１つによって個別のピクセル化検出器の各々に向けて導かれる特定の波長帯の光を適切に集束させるように、個別のピクセル化検出器の各々が、特定の異なる波長帯の光を集束させることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項１１】
前記独立した時間遅延積分検出器の各々の量子効率が、該時間遅延積分検出器の各々に向けて光を導く特定の反射素子と結合した前記予め決められた特性に対して個別に最適化されることを特徴とする請求項２に記載の画像化システム。
【請求項１２】
前記光反射素子と対応するピクセル化検出器との間に配置された、前記対応するピクセル化検出器上に投影される前記画像に関連する開口数を制御することができる開口絞りを備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項１３】
前記対象物と前記集光レンズとの間に、前記集光光路に沿って配置された対物レンズおよび画像化スリットを備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項１４】
前記対象物を照射する入射光を提供するべく配置される光源を備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項１５】
前記光源が、明視野および励起光の少なくとも１つと共に前記対象物を照射することを特徴とする請求項１４に記載の画像化システム。
【請求項１６】
対象物を配置する基板を備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項１７】
前記個別の画像レンズの少なくとも１つが、該画像レンズの他の個別の画像レンズによって生成される第２の画像の倍率とは異なる倍率を有する第１の画像を生成するよう、少なくとも１つの前記画像レンズが、他の個別画像レンズの焦点距離とは異なる焦点距離を有することを特徴とする請求項５に記載の画像化システム。
【請求項１８】
他のピクセル化検出器が受け取る画像の倍率とは異なる倍率を有する画像を受け取る前記複数の検出器の各々が、前記他のピクセル化検出器上に投影される画像の移動との同期を維持するクロック速度でクロックされることを特徴とする請求項１７に記載の画像化システム。
【請求項１９】
前記複数の光反射素子が、それぞれ前記対象物と前記画像化システムとの間の相対移動方向に対して実質的に直角をなす方向に光を反射することを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項２０】
前記複数の光反射素子が、それぞれ前記対象物と前記画像化システムとの間の相対移動方向に実質的に整列した方向に光を反射することを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項２１】
前記対象物が流体の流れの中に流入され、前記流体の流れを概ね広く平坦な流れに導く、概ね細長い断面を有する流体通路を備えることを特徴とする請求項１に記載の画像化システム。
【請求項２２】
対象物と画像化システムとの間に相対移動がある場合に、前記対象物からの光に基づいて、前記対象物の複数の画像から移動対象物の１つまたは複数の特性を決定するための方法であって、
（ａ）前記対象物からの光を、前記対象物と前記画像化システムとの間の相対移動の方向とは異なる方向の集光光路に沿って集束させるステップと、
（ｂ）集束光を使用して前記対象物を画像化するステップと、
（ｃ）前記集光光路に沿って配置された連続する複数のポイントの各々で、予め決められた特性の光を反射するステップ、および前記予め決められた特性を持たない光を通過させるステップであって、異なる予め決められた特性の光が、連続するポイントの各々で他のポイントにおける方向とは異なる方向に反射するように、前記異なる予め決められた特性が前記複数のポイントの各々と結合しているステップであって、前記予め決められた特性は色を含む、ステップと、
（ｄ）複数のピクセル化検出器の各々を使用して、連続するポイントの各々で反射した光および連続するポイントの各々を透過した光の１つを受光するステップであって、形成された前記対象物の画像に応じて前記ピクセル化検出器の各々が出力信号を生成するステップと、
（ｅ）前記対象物の少なくとも１つの特性を決定するために、
１）前記各々のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記プローブの相対位置に相当する前記ピクセル化検出器上の位置において、前記対象物内の前記少なくとも１つのプローブの色の特性の光が前記ピクセル化検出器で前記対象物から受信されたかどうかを示す出力信号を生成することにより、前記対象物に適用されるプローブが、前記ピクセル化検出器からの出力信号に作用したかどうかを決定するステップと、
２）前記複数のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記プローブの前記相対位置での前記プローブの色の特性を示す前記出力信号におけるプローブの作用に基づいて、前記対象物の１つ又はそれ以上の特性を決定するステップと、
を実行する前記ピクセル化検出器からの出力信号を分析するステップと
を備えたことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記ピクセル化検出器の各々が、時間遅延積分検出器からなることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記画像を生成するために使用される前記複数の時間遅延積分検出器の各々と対応するレンズの間の距離を、前記距離が実質的に等しくなるように制御するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記連続する複数のポイントの各々で反射した光を、これらの反射光を検出器が受光する前に光補正するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記連続する複数のポイントの各々で反射した光を光補正するステップが、非点収差およびコマ収差を実質的に除去するステップを備えたことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記連続する複数のポイントの各々で反射した光を光補正するステップが、連続するポイントの各々で導入される非点収差のレベルを相殺するために、連続する各ポイントの後段で、等しく、かつ、相対するレベルの非点収差を付与するステップを備えたことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記連続する各ポイントの後段で、等しく、かつ、相対するレベルの非点収差を付与するステップが、連続する各ポイントの後段に配置された補正板であって、前記予め決められた特性の光を反射する連続する各ポイントに配置された素子に対して、それぞれ実質的に直角をなすように配向された補正板を利用するステップを備えたことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記異なる方向に光を反射するステップが、反射する光のスペクトル成分に基づいて特定の方向に光を反射するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
光が反射した光路に沿った連続するポイントと結合した予め決められた特性を持たない連続するポイントの各々で反射した光を減衰させるステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記光を減衰させるステップが、光が反射した前記連続するポイントと結合した前記予め決められた特性を有する光のみが前記検出器に向けて通過することができるようフィルタリングするステップを備えたことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記集束光を使用して前記対象物を画像化するステップが、連続するポイントの各々で、前記連続するポイントの各々で反射した集束光から、前記連続するポイントの各々と結合した前記複数の検出器の１つに導かれる画像が生成されるように、連続するポイントの各々に画像化レンズを使用するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの連続するポイントを選択するステップ、および他の連続するポイントで反射した光および他の連続するポイントを透過した光のうちの１つから画像を生成するために使用される倍率とは異なる倍率を使用して、選択された連続するポイントで反射した光および選択された連続するポイントを透過した光のうちの１つから画像を生成するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の検出器が、受け取る画像の倍率には無関係に、検出器上に投影される画像と同期するように、異なる倍率を有する画像を受け取る検出器と結合したクロック速度を制御するステップを備えたことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの連続するポイントで反射した光から画像を生成するために使用されるレンズと結合した開口数を制御するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記異なる方向に光を反射するステップが、反射する光のスペクトル成分に基づいて、特定の方向に光を反射するステップを備えたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に移動対象物、すなわち粒子を分析し、検出するための画像化システムに関し、より詳細には、細胞などの移動対象物の形態を決定し、分析するための画像化システム及びその方法、細胞内における蛍光インサイチュハイブリッド化（Fluorescence In-Situ Hybridization；ＦＩＳＨ）プローブの存在および組成を検出するための画像化システム及びその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞および粒子分析技術の限界により、現時点では実行不可能な多くの生物学的および医学的アプリケーションが存在している。このような生物学的アプリケーションの例として、既知の空気伝染毒素の戦場監視、および既知および未知の両毒素の存在を検出するための培養細胞の監視がある。医学的アプリケーションには、抹消血液中の珍しい細胞（すなわち、出現率の小さい細胞）の検出および分析による非侵襲出生前遺伝検査（non-invasive prenatal genetic testing）および常用癌スクリーニングがある。これらのすべてのアプリケーションには、以下の主要特性を備えた分析システムが必要である。
【０００３】
１．測定速度が速い。
２．極めて大型のサンプルあるいは連続するサンプルを処理することができる。
３．スペクトル分解能が高く、かつ、帯域幅が広い。
４．空間解像力が良好である。
５．感度が高い。
６．測定変動が小さい。
【０００４】
出生前検査における標的細胞は、胎盤関門（placental barrier）を超えて母親の血流中に入る胎児の細胞である。癌スクリーニングでは、標的細胞が、発生期の癌腫瘍から血流中に腐肉する。この技術のこれらのいずれのアプリケーションにおいても、標的細胞は、十億個当たりに１〜５個の細胞濃度で血液中に存在している。この濃度は、典型的な２０ｍｌの血液サンプル中に約２０〜１００個の標的細胞をもたらしている。標的細胞が極端に珍しい場合、これらのアプリケーションに使用されるいかなる検出および分析システムも、濃縮サンプルの約１億個の細胞を、毎秒１０，０００細胞の最小スループットに相当する数時間以内に処理することができなければならない。細胞の処理には、全体の大きさ、核の大きさ、核の形状、および光学的濃度などの細胞形態パラメータの正確な測定、多数の蛍光マーカおよびＦＩＳＨプローブの検出および特性化、核中のＤＮＡの総量の定量化、および胎児のヘモグロビンなどの他の細胞成分の検出が含まれている。これらの処理タスクを達成するためには、システムは、細胞画像を約１ミクロンの空間解像力で収集することができなければならない。同様に、４個以上の蛍光色を弁別するためには、システムは、スペクトル分解能が高く、かつ、帯域幅が広くなければならない。プローブの中には、わずか数千個の蛍光分子で重要な細胞の特徴をラベル化しているものがあるため、極めて微弱な信号を弁別するためには、システムは、感度が高く、かつ、良好な測定の一貫性を備えていなければならない。
【０００５】
非侵襲出生前診断のための優勢な研究所プロトコルには、非核化細胞を除去するための勾配遠心分離、胎児の細胞を濃縮するための高速細胞分離、および胎児の細胞を識別し、遺伝分析するための蛍光顕微鏡検査を始めとする一連の複雑な処理ステップが使用されている。プロトコルの各ステップで胎児の細胞が少しずつ失われていくため、これらのプロトコルによっては、分析のためにもたらされる胎児細胞が極めて少なく、あるいは全くもたらされないことがしばしばである。それにも関わらず、既存の分析技術の限界により、プロトコルは簡易化されていない。胎児細胞の識別および分析は、必要な速度およびサンプル処理能力を備えた高速細胞分離装置によって、数時間以内に実施されることが理想的である。従来の細胞分離装置には、高い信頼性で胎児の細胞を識別し、かつ、診断に使用されるＦＩＳＨプローブの数および色を列挙するための、必要な画像化能力、感度、および再現性が欠けているため、この理想は、従来のシステムでは不可能である。したがって、現在のプロトコルでは、胎児の由来を確立し、遺伝診断を実施するためには、蛍光顕微鏡検査法を使用してスライド上で細胞を分離し、検査しなければならない。もたらされる胎児の細胞が少ないこと、および処理時間が長いことが相俟って、既存の技術による非侵襲胎児検査に対する臨床上のアプリケーションを阻んでいる。
【０００６】
本発明以前には、上述した有効な胎児細胞分析システム、あるいは癌分析システムのための６つの主要特性をすべて組み込んだ技術は存在していない。進歩した従来の技術を、これらのアプリケーションに適用することもできるが、依然として大きな限界が存在している。
【０００７】
Ｏｎｇらによって発行された非特許文献１に、画像化フロー細胞計算器への時間遅延積分（Time Delay and Integration；ＴＤＩ）検出器の使用が記述されている。ＴＤＩ検出器は、デバイスに向けられた放射に応答して生成される信号を、制御された方式で移動させることができる任意のピクセル化デバイスである。通常、ＴＤＩ検出器のピクセルは、行および列に配列され、デバイス上に投影された移動画像に同期して行から行へ信号が移動し、ぼやけることなく長時間の積分時間を可能にしている。Ｏｎｇらによって開示された手法は、流動している細胞に対する空間解像力および高感度の必要性に対処することによって技術を進歩させたが、この手法は、残りの主要特性には対処していない。この文献の著者は、非侵襲胎児検査に必要な速度より少なくとも１桁遅い毎秒１０細胞の動作速度および毎秒５００細胞の理論速度限界を引用している。また、システムにはスペクトル分解能がなく、レーザ散乱光および蛍光光が、画像化システムによって無差別に収集されている。
【０００８】
ごく最近開発された、特許文献１に、画像化フロー細胞計算器の代替手法が開示されている。この特許には、ビデオカメラが流動する細胞を凍結フレーム方式で検査する、フレームベース画像収集手法の使用が開示されている。この手法には、検出器の読出し速度と細胞の速度が同期するＴＤＩ検出器の場合と異なり、画像収集システムを画像エリア内に存在する細胞に同期させる必要がある。細胞をフレームベース方式で画像化する場合、ぼやけを回避するためには積分周期を極めて短くしなければならない。積分時間は、ストローブ光源あるいはシャッタ検出器と組み合わせた連続光源を使用して短縮されているが、いずれの場合においても、積分時間が短くなることによって信号対雑音比が小さくなり、延いては上記手法の感度を低下させている。また、フレームベースのカメラの場合、カメラからのデータ転送に時間がかかり、その間、画像を入手することができず、当該細胞の検出が見逃されることがある。最後に、Ｏｎｇらの特許と同様、本特許にも、広スペクトル帯域幅に対するデータ取得の備えはなく、異なる色に着色された多数の蛍光プローブおよびＦＩＳＨスポットを同時に解像するだけの十分なスペクトル分解能を備えている。
【０００９】
スペクトルの弁別については、特許文献１で対処されており、流体中に懸垂された粒子のスペクトルが、検出領域を通って流れる粒子のスペクトルとして収集されている。しかし、対象物が検出器部分で焦点外れになるため、システムにおける対象物の空間表現については、この特許には開示されていない。このシステムでは、対象物からの光が収集され、中間開口部に画像が生成されている。光は、開口を通ってスペクトル分散素子まで連続している。スペクトル分散素子は、流れの軸に沿って、光のスペクトルを分散させている。分散した光は光増幅器に印加されて増幅される。光増幅器の光信号出力が最終的にフレームベース検出器に導かれている。中間開口における画像は、スペクトル分散に先立って、物空間における光の空間分布を表している。空間分布は、光が像平面を通過し、スペクトル分散素子を通って光増幅器に伝搬するとぼやける。光増幅器部分で中間開口を再画像化するための備えがないため、結果として光増幅器部分に得られる信号分布が表しているのは光のスペクトル分布のみであり、対象物からの光の空間分布は維持されていない。空間情報の喪失により、胎児の細胞分析などのアプリケーションに対する発明の効用が制限されている。細胞内に複数の同一ＦＩＳＨスポットが存在する場合、この手法を用いてそれらのスペクトルを確認することができるが、スポットの数を正確に測定することはできない。また、この手法は、流れの軸に平行に波長スペクトルを分散させている。２つの粒子が流れの軸に沿って照射されると、その２つの粒子のスペクトルが検出器上で重複する。この問題を回避するために、上記発明には、流れの軸に沿った、極めて低い高さからの照射の使用が開示されている。低い高さからの照射により、積分時間が短縮され、光増幅器の使用が余儀なくされている。また、低い高さから照射する場合、流れの軸に沿った複数の細胞の同時画像化を回避しなければならないため、スループットが制限されている。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６４４，３８８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４２２，７１２号明細書
【非特許文献１】Ａｎａｌ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｃｙｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｌ．，９（５）：３７５−８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、提案された従来の手法の限界を解決して、改善された技法が望ましいことは明らかであろう。従来の技術が抱えるこれらの問題に対処するべく開発された新しい手法には、さらに、細胞以外の他の種類の移動対象物を分析するアプリケーションがあり、また、全く異種の技術アプリケーションに対する特定の要求に合致するべく、異なる構成で実施することができる期待がある。
【００１２】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、細胞などの移動対象物の形態を決定し、分析するための画像化システム及びその方法、細胞内における蛍光インサイチュハイブリッド化プローブの存在および組成を検出するための画像化システム及びその方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、このような目的を達成するためになされたもので、対象物との間に相対移動がある場合、前記対象物の画像から前記対象物の１つまたは複数の特性を決定するようになされた画像化システムであって、（ａ）前記対象物からの光を通過させ、集光光路に沿って進行するように配置された集光レンズと、（ｂ）該集光レンズを通過した光を受光するべく配置され、それにより所定の位置に向けて導かれる画像を生成する少なくとも１つの画像レンズと、（ｃ）前記集光レンズを通過した光を受光するべく配置され、前記対象物からの光が、一度だけ通過するように、予め決められた特性の光を異なる反射光路に沿って反射し、かつ、該予め決められた特性を持たない光を通過させる複数の光反射素子と、（ｄ）前記各光反射素子の各々に対して１つが、前記光反射素子で反射した光および前記光反射素子を透過した光のうちの１つから前記対象物の画像を受け取るべく位置付けされ、前記対象物と前記画像化システムとの間に前記相対移動が生じている間、前記対象物の少なくとも１つの特性を表す出力信号を生成し、前記対象物の少なくとも一部からの光を時間に対して積分することによって前記出力信号を生成するように配置される複数のピクセル化検出器と、（ｅ）前記対象物の少なくとも１つの特性を決定するために、１）前記各々のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の位置に相当する前記ピクセル化検出器上の位置において、前記対象物に適用されるプローブが、前記ピクセル化検出器からの出力信号を決定すること、２）前記複数のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記位置での各々の出力信号におけるプローブの作用に基づいて、前記対象物の１つ又はそれ以上の特性を決定すること、を実行することによって、前記ピクセル化検出器からの出力信号を分析するように構成されたプロセッサとを備えることを特徴とする。
【００１４】
対象物と画像化システムとの間に相対移動がある場合に、前記対象物からの光に基づいて、前記対象物の複数の画像から移動対象物の１つまたは複数の特性を決定するための方法であって、（ａ）前記対象物からの光を、前記対象物と前記画像化システムとの間の相対移動の方向とは異なる方向の集光光路に沿って集束させるステップと、（ｂ）集束光を使用して前記対象物を画像化するステップと、（ｃ）前記集光光路に沿って配置された連続する複数のポイントの各々で、予め決められた特性の光を反射するステップ、および前記予め決められた特性を持たない光を通過させるステップであって、異なる予め決められた特性の光が、連続するポイントの各々で他のポイントにおける方向とは異なる方向に反射するように、前記異なる予め決められた特性が前記複数のポイントの各々と結合しているステップと、（ｄ）複数のピクセル化検出器の各々を使用して、連続するポイントの各々で反射した光および連続するポイントの各々を透過した光の１つを受光するステップであって、形成された前記対象物の画像に応じて前記ピクセル化検出器の各々が出力信号を生成するステップと、（ｅ）前記対象物の少なくとも１つの特性を決定するために、１）前記各々のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の位置に相当する前記ピクセル化検出器上の位置において、前記対象物に適用されるプローブが、前記ピクセル化検出器からの出力信号を決定するステップと、２）前記複数のピクセル化検出器に対して、前記対象物中の前記位置での各々の出力信号におけるプローブの作用に基づいて、前記対象物の１つ又はそれ以上の特性を決定するステップと、を実行する前記ピクセル化検出器からの出力信号を分析するステップとを備えたことを特徴とする。
【００１５】
本発明は、対象物の画像から対象物の１つまたは複数の特性を決定するようになされた画像化システムを対象としている。対象物と画像化システムとの間には相対運動が存在し、いずれか一方（または両方）が移動することが意図されているが、対象物が移動し、画像化システムが固定されていることが好ましい。また、以下の概要および対応する請求項のほとんどは、「１つの対象物」に関連して記載されているが、本発明が好ましくは複数の対象物との使用が意図され、とりわけ対象物の流れを画像化することに対して有用であることが明確に意図されていることについても理解すべきである。
【００１６】
本発明により、複数の検出器を利用した、視野を通って検出器に対して移動する対象物の少なくとも１つの特性を決定する方法および装置が提供される。検出器は静止していることが好ましいが、対象物と検出器との間に相対運動が存在していることがクリティカルアスペクトであり、したがって、本発明が、対象物が静止し、検出器が移動する実施形態を見越していることを理解すべきである。本発明によって提供されるデータには、高い解像力で広い帯域幅をカバーする同時空間画像およびスペクトル画像が含まれていること、また、本発明により、対象物から収集されるスペクトル情報の空間起点が提供されることに留意されたい。詳細には、複数の検出器を使用することにより、放出帯域幅による画像のひずみ、すなわち、たたみ込みの発生が確実に回避され、したがって、画像を修正するための逆たたみ込みの必要がない。スペクトル分解画像の各々に独立した検出器を提供するだけの十分な検出器が使用されている。
【００１７】
多重検出器画像化システムのいくつかの異なる実施形態が提供されている。実施形態の第１のシリーズは、個々の検出器と結合した画像化レンズを備えたシステムを対象とし、また、実施形態の第２のシリーズは、単一画像化レンズを備えたシステムを対象としている。
【００１８】
一般的に、画像化システムは、対象物から進行する光が、集光レンズを通過することによって平行になり、かつ、集光光路に沿って進行するように配置された集光レンズを備えている。集光レンズを通過した光を受光し、結像させるための少なくとも１つのレンズが配置されている。１つまたは複数のこのような画像レンズの配置は、画像化システムに使用される画像レンズが１つであるか、あるいは上で言及したように個別のレンズを個々の検出器に結合させるかどうかによって変化する。相対配置については、以下でより詳細に説明する。複数の光反射素子が、集光レンズを通過した光を受光し、予め決められた特性（predefined characteristic）を有する光を反射し、予め決められた特性を持たない光を通過させている。集光レンズを通過する光は、対象物と画像化システムとの間の相対移動方向に対して実質的に直角をなす平面に存在することが好ましい。上述したように、対象物または画像化システムあるいはその両方を、互いに相対移動させることができる。以下、簡潔にするために、この相対移動を単純に「移動」と呼ぶ。光反射素子の各々は、光を異なる方向に反射し、それぞれ、反射光を受光するべく配置された検出器を備えている。検出器の各々は、対象物の少なくとも１つの特性を表す信号を生成することができる。検出器の各々は、少なくとも１つの画像化レンズによって結像した画像を受け取るべく配置されたＴＤＩ検出器であることが好ましい。移動が生じると、画像レンズによって結像した対象物の画像が、ＴＤＩ検出器の両端間を行から行へ移動する。ＴＤＩ検出器の各々は、対象物の少なくとも一部からの光を時間に対して積分することにより、対象物の少なくとも１つの特性を表す出力信号を生成している。
【００１９】
この実施例では、集光レンズによる光の平行化により、対象物の第１のポイントから放出されるすべての光が平行光線で進行する。また、対象物の第２のポイントから放出される光も平行光線で進行するが、第１のポイントからの光に対する角度が異なっている。この方法により、対象物の空間情報が集光レンズによって集光光路中で角度情報に変換される。複数の異なる反射素子がそれぞれ特性が異なる光を反射し、それにより、異なるスペクトル成分が、複数の異なる反射素子から、好ましくは、対象物と画像化システムとの間の移動方向に対して実質的に直角をなす平面内の異なる方向に離れるように、平行化された光に作用している。この方法により、対象物の空間情報およびスペクトル情報の両方が角度情報に変換される。少なくとも１つの画像化レンズが平行化された光に作用し、様々な光角度が各検出器上の様々な位置に変換される。空間情報は、対象物の様々な位置からの光が、両方の軸に対して検出器上の様々な位置に投影されるため、システムによって保存されている。また、対象物から放出されるスペクトル成分が異なる光は、移動に対して実質的に直角をなす軸に沿って、異なる検出器に投影されることが好ましい。この方法により、対象物からの空間情報が保存され、広帯域幅をカバーするスペクトル情報が、高い分解能で同時に収集される。単一検出器を異なるスペクトル成分の各々に使用することは、各々の検出器が個々に各々の色を集束させ、それにより単一検出器システムに必要な縦色補正の制約が除去され、光学設計が単純化されることを意味している。さらに他の利点は、検出器の各々の量子効率を、その特定の色帯域に対して個別に最適化し、それによりシステムの総合感度を向上させることができることである。
【００２０】
光反射素子の各々は、予め決められた帯域幅内の光を予め決められた角度で反射するようになされた二色性フィルタすなわち二色性ミラーであることが好ましい。すべての波長が様々な角度で離れるプリズムとは異なり、予め決められた帯域幅内のすべての光が共通の角度で二色性素子に入射し、同じ角度で所与の二色性素子を離れるため、対象物を離れた光の発光スペクトルと該対象物の画像との間にたたみ込みが生じることはない。このような反射素子を使用する場合、第１のスペクトル帯域幅の光が、第１の二色性素子で予め決められた公称角度で反射する。第２のスペクトル帯域幅の光は、第１の二色性素子を通過して次の二色性素子に向かい、そこで別の予め決められた公称角度で反射する。第３のスペクトル帯域幅の光は、第１および第２の二色性素子を通過して第３の二色性素子に向かい、そこで第３の予め決められた公称角度で反射する。二色性素子は、所望の光スペクトルをカバーするべく選択され、適切なスペクトル通過帯域を備えている。二色性素子の各々の角度は、二色性素子で反射する、該二色性素子のスペクトル帯域幅に対応するスペクトル帯域幅内の光が、異なる検出器上に集束するように設定されている。
【００２１】
少なくとも１つの実施形態では、集光光路内に単一画像レンズが配置されている。検出器の位置は、検出器の各々から単一画像レンズまでの距離が実質的に等しくなるように操作されている。反射素子の各々は、画像レンズとその対応する検出器の間に配置されている。
【００２２】
他の実施形態では、検出器の各々に、反射素子とその対応する検出器の間に配置された１つの画像レンズが設けられている。画像レンズは、反射素子で反射した光が検出器に到達する前に画像レンズを通過するように配置されている。
【００２３】
さらに他の実施形態では、二色性反射素子の各々がキューブ（ｃｕｂｅ）基板であり、他の実施形態では、二色性反射素子の各々は、ペリカル（ｐｅｌｌｉｃａｌ）である。また、他の実施形態では、二色性反射素子の各々は、プレート基板である。ほとんどの実施形態において、対象物からの光が光反射素子の各々を通過するのは一度だけであることに留意されたい。
【００２４】
特に単一レンズを使用している実施形態では、光が二色性反射素子の各々を通過した後、光のひずみが大きくなる。一実施形態では、キューブ基板を使用することによって、このようなひずみが軽減され、キューブ基板の各々と結合した開口数が十分に小さく、コマ収差および非点収差が実質的に除去されている。他の実施形態では、連続する光反射素子の各々の間に補正板が配置されている。補正板の各々は、直前の光反射素子に対して、直前の光反射素子によって付与されるあらゆる非点収差が実質的に除去されるように配向されている。補正板の配向は、直前の光反射素子が反射光を複数の検出器のうちの１つに向けて導くべく回転する軸に対して実質的に直角をなしていることが好ましい。
【００２５】
個々のＴＤＩ検出器に、対応する光反射素子によってＴＤＩ検出器の各々に向けて導かれる特定の色の光を適切に集束させるためには、光を反射させ、あるいは通過させるために使用される光反射素子の予め決められた特性が色であり、また、個々のＴＤＩ検出器が、特定の色の光を個別に集束させることが好ましい。個々のＴＤＩ検出器が、そのＴＤＩ検出器に向けて導かれる特定の色に対して個々に最適化されることが最も好ましい。
【００２６】
本発明に追加光素子を組み込むことができることを理解すべきである。一実施形態は、少なくとも１つの画像レンズに隣接し、かつ、その直前に配置された開口絞りを備えている。開口絞りは、上記少なくとも１つの画像レンズに関連する開口数の制御を可能にしている。他の実施形態は、対象物と集光レンズの間の光集光光路に沿って配置された対物レンズおよび画像化スリット備えている。対象物を照射する入射光を提供するための光源が配置されている。
【００２７】
本発明におけるＴＤＩ検出器の使用により、移動軸に沿った画像化領域が拡張され、延いては積分時間が長くなっていることに留意されたい。複数の光源を画像化領域に同時に投射し、画像化領域内の対象物に入射する光の量を増やすことができる。また、拡張した画像化領域と移動軸に対するスペクトル分散軸の直交配向が相俟って、複数の対象物の同時画像化を可能にしている。この実施形態による長い積分時間および平行画像の取得が、感度が高く、かつ、矛盾のない画像化性能と高スループットの結合を可能にしている。
【００２８】
対象物からの光を提供するためのいくつかの代替方法があり、一実施形態では、対象物からの光は、対象物の非誘導放出からなっている。つまり、対象物が、放出を誘導するための光源を必要とすることなく光を放出している。他の実施形態では、対象物を照射する入射光を提供するための光源が配置されている。この実施形態では、対象物によって散乱した光の少なくとも一部が集光レンズを通過するように、対象物が入射光を散乱させ、あるいは対象物を照射している入射光が対象物を誘導し、集光レンズを通過する光を放出させている。また、対象物によって入射光の少なくとも一部が吸収され、したがって、集光レンズを通過する光には、対象物によって吸収された光の一部は含まれていない。最後に、光源からの入射光は、対象物から集光レンズに向かって反射する。使用される１つまたは複数の光源は、コヒーレント光源、非コヒーレント光源、パルス光源、および連続光源のうちの少なくとも１つを備えていることが好ましい。
【００２９】
集光レンズを通って対象物を移動させる流体の流れの中に対象物を流入させ、あるいは他の方法として、対象物をサポートに載せて運ぶことができる。あるいはサポートまたは流動媒体を利用することなく、単純に移動させることもできる。また本発明は、微視的すなわち微小対象物の画像化に限られたものではない。
【００３０】
ＴＤＩ検出器は、ＴＤＩ検出器の両端間に伝搬する信号を生成することによって、対象物の像に反応することが好ましい。典型的なＴＤＩ検出器のピクセルは行および列に配列され、行から行へ信号が伝搬しているが、本発明は、直線状ピクセル配列を使用したＴＤＩ検出器（例えば、マイクロチャネルプレートベースＴＤＩ検出器）に限定されない。ＴＤＩ検出器の両端間の信号伝搬速度は、移動の結果として得られるＴＤＩ検出器上の対象物の画像の移動に同期させることができ、あるいは移動と非同期にすることができる。
【００３１】
本発明の他の態様は、対象物を画像化するための方法を対象としたものである。これらの方法により、上で考察した画像化システムに概ね一致したステップが実施される。
【００３２】
本発明の前述の態様および付随する多くの利点については、添付の図面と共に以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に認識され、かつ、より良く理解されるであろう。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、細胞などの移動対象物の形態を決定し、分析するための画像化システム及びその方法、細胞内における蛍光インサイチュハイブリッド化プローブの存在および組成を検出するための画像化システム及びその方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明により、細胞分析および粒子分析に使用される従来技術のシステムに勝る優れた利点が提供される。これらの利点は、本発明が、光分散システムとＴＤＩ検出器に導かれる細胞および他の対象物の画像に応答して出力信号を生成するＴＤＩ検出器とを組み合わせて使用していることによるものである。複数の対象物を同時にＴＤＩ検出器上に画像化することができる。また、分析するために、各対象物の画像をスペクトル分解し、共通ＴＤＩ検出器を使用した吸収、散乱、反射あるいはプローブ放出によって対象物の特徴を弁別することができる。
【００３５】
本発明を使用して、光の散乱、反射、吸収、蛍光、燐光、ルミネセンス等を含む光信号を測定することにより、細胞および他の対象物の形態学的特性、測光特性およびスペクトル特性を決定することができる。形態学パラメータには、核面積、周界、構成すなわち空間周波数成分、重心位置、形状（すなわち円形、楕円、バーベル形等）、体積、および任意のこれらのパラメータの比率が含まれている。また、本発明を使用して、細胞の細胞形質のための同様のパラメータを決定することもできる。本発明による測光測定により、核光学濃度、細胞形質光学濃度、背景光学濃度、および任意のこれらの値の比率が決定される。本発明を使用して画像化される対象物は、蛍光または燐光を誘導することによって発光する対象物であっても、あるいは誘導を必要とすることなく光を発生する対象物のいずれであっても良い。いずれの場合においても対象物からの光が本発明によるＴＤＩ検出器上で画像化され、放出された光の存在および大きさ、１つまたは複数の光信号が発生する、細胞または他の対象物中の離散位置の数、信号源の相対配置、および対象物中の各位置から放出される光の色（波長または波長帯）が決定される。
【００３６】
本発明を備えた画像化システムの最初のアプリケーションは、画像化システムを通って流れる流体中に流入される細胞の、上述した１つまたは複数のパラメータを決定するための細胞分析装置としての使用が考えられるが、本発明を使用して他の移動対象物を画像化することもできることを理解すべきである。
【００３７】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。  
＜第１実施形態＞
図１〜図３は、本発明による画像化システムの第１実施形態を示す図で、画像化システム２０を通って流れる流体流２２によって運ばれる細胞などの移動対象物の画像生成と共に略図で示したものである。図１では、流体流２２に対象物２４（細胞などであるが、代替としては微粒子）が流入され、対象物を、画像化システムを通して運んでいる。図１の流体流の方向は、図面用紙に向かう（あるいは図面用紙から出てくる）方向であり、図２および図３では、流れの方向は、図の左側の矢印で示すように上から下に向かう方向である。対象物２４からの光３０は、光を集光し、無限遠でほぼ集束する集光光３４を生成する集光レンズ３２ａおよび３２ｂを通過している。つまり、集光レンズ３２ｂからの集光光の光線は概ね平行である。集光光３４は、光を分散させ、分散光３８を生成するプリズム３６に入っている。分散光は、次に、光４２をＴＤＩ検出器４４上に集束させる画像化レンズ４０ａおよび４０ｂに入っている。
【００３８】
図２から明らかなように、対象物２４の画像化を常に示していると仮定すると、対象物が流体流２２と共に移動すると、位置２６および位置２８の両方に対象物が示されることになる。その結果、対象物２４の画像が、図２の右側に示すように、検出器上の２つの離散空間位置２６’および２８’に生成される。あるいは、図２が単一の瞬間を示している場合、位置２６および２８は、検出器上の位置２６’および２８’に同時に画像化された２つの個別対象物の位置を表している。
【００３９】
画像化システム２０および本明細書において示す他のすべての画像化システムに関しては、図２に示すレンズおよび他の光素子が、比較的単純な形態でのみ示されていることを理解されたい。したがって、集光レンズは、集光レンズ３２ａおよび３２ｂのみを備えた複合レンズとして示されている。当分野の技術者には理解されるように、より単純であれ、あるいはより複雑であれ、異なる設計のレンズ素子を使用して画像化システムを構築し、所望の光学性能を提供することができる。画像化システムに使用される実際のレンズまたは光学素子は、画像化システムが使用される画像化アプリケーションの個々のタイプによって様々である。
【００４０】
本発明の実施形態の各々に対して、画像化する対象物と画像化システムとの間に相対移動が存在することを理解されたい。ほとんどの実施形態では、画像化システムを移動させるより対象物を移動させる方が好都合であるが、実施形態の中には、対象物を静止した状態に維持し、画像化システムを対象物に対して移動させることを意図した実施形態もある。他の代替として、画像化システムおよび対象物の両方を、異なる方向に、あるいは異なる速度で移動させることもできる。
【００４１】
本発明の様々な実施形態に使用されるＴＤＩ検出器は、以下で説明するように、専用ピクセル読出しアルゴリズムを使用した長方形電荷結合素子（ＣＣＤ）を備えていることが好ましい。非ＴＤＩ  ＣＣＤアレイは、カメラの二次元画像化に広く使用されている。標準ＣＣＤアレイでは、ピクセルに入射する光子が、ピクセル中にトラップされる電荷を生成している。各ピクセルからの光子電荷が、電荷をピクセルからピクセルへシフトさせることによって検出器アレイから読み出される。検出器アレイから読み出された電荷は、次に出力コンデンサにもたらされ、電荷に比例した電圧が生成される。ピクセルの読出しと読出しの間にコンデンサが放電し、チップ上のすべてのピクセルに対する処理が繰り返される。読出しの間は、未だ読出しが完了していないピクセル中の電荷生成を防止するために、あらゆる露光からアレイを遮蔽しなければならない。
【００４２】
ＣＣＤアレイを備えたあるタイプのＴＤＩ検出器４４では、ピクセルが読み出されている間、ＣＣＤアレイは露光された状態を維持している。読出しは、一度に１行ずつ、アレイの上から下へ向かって実施される。第１の行が読み出されると、読出しが完了したばかりの行の方向に、１ピクセルだけ残りの行がシフトされる。アレイ上に画像化される対象物が、ピクセルの移動に同期して移動すると、対象物からの光が、画像がぼやけることなく、ＴＤＩ検出器の総読出し周期の期間に渡って積分される。ＴＤＩ検出器によって生成される信号の強度は、ＴＤＩの行数に比例した積分期間に伴って直線的に増加するが、雑音は、積分期間の平方根でしか増加しないため、行数の平方根だけ信号対雑音比が総合的に増加する。本発明での使用に適したＴＤＩ検出器の１つは、Ｄａｌｓａ社のＴｙｐｕ  ＩＬ−Ｅ２イメージセンサであるが、代替として他の等価物またはさらに優れた画像センサを使用することもできる。Ｄａｌｓａのイメージセンサは、９６段すなわち９６行を有しており、それぞれ５１２個のピクセルを備えている。本発明には、行および列の構成が異なる他のタイプのイメージセンサ、あるいはピクセルが非直線状に配列された他のタイプのイメージセンサを使用することもできる。Ｄａｌｓａセンサの感度および信号対雑音比は、それぞれ標準ＣＣＤアレイの約９６倍および１０倍である。また、ＴＤＩ検出に関連する積分時間が長いため、時間的かつ空間的な照度変動が平均化され、測定の一貫性が向上している。
【００４３】
流体の流れを使用し、対象物を、画像化システムを通して運んでいる画像化システム２０および本発明の他の実施形態では、フロースルークベットすなわちジェット（図示せず）に、分析する細胞あるいは他の対象物が含まれている。流体の速度および細胞濃度は、ＴＤＩ検出器のピクセル読出し速度に整合させるために、システムを通してサンプル溶液をドライブするシリンジポンプ、ガス圧力、または他のポンプ方式（図示せず）を使用して制御されているが、必要に応じてＴＤＩ検出器の読出し速度を選択的に制御し、それによりサンプル溶液の移動に整合させることができることを理解すべきである。
【００４４】
様々な光学倍率を使用して、ＴＤＩ検出器の感光領域（ピクセル）上に画像化される対象物の所望の解像力を達成することができる。ほとんどの実施形態では、光学倍率の範囲が１：１から５０：１の間であり、対象物の画像が形成されるＴＤＩ検出器上の感光領域の数に対して、また、当然のことではあるが、画像化する対象物の実際のサイズ、および対象物の画像化システムからの距離に応じて実質的な範囲を提供することが意図されている。本発明には、細胞および他の微視的対象物の分析から、星のような対象物の画像化に至るアプリケーションを有することが意図されている。
【００４５】
本発明がＣＣＤタイプのＴＤＩ検出器に限定されないことを強調しておく。本発明のＴＤＩ検出器には、相補性金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）および多重チャネルプレート画像化デバイスなどの他のタイプのＴＤＩ検出器を使用することも可能である。デバイスに向けられた放射に応答して生成される信号を、制御された方式でデバイスを通して移動させることができる任意のピクセル化デバイス（すなわち多数の感光領域を有するデバイス）が、本発明のＴＤＩ検出器としての使用に適していることを理解することが重要である。通常、信号は、デバイス上に投影される移動画像に同期して移動し、それによりぼやけの原因になることなく、画像を積分する時間を長くしているが、所望の効果を達成する必要に応じて、信号の移動を放射画像の移動に対して選択的に非同期化させることもできる。
【００４６】
＜第２実施形態＞
図４は、本発明の第２実施形態である画像化システムを示す図で、多くの点で画像化システム２０と類似しているが、この第２実施形態の画像化システム４５は、外部光のＴＤＩ検出器４４への到達を実質的に防止するスリット５２を備えた共焦点実施形態である。画像化システム４５では、対象物２４からの光４６は、対物レンズ４８によってスリット５２上に集束する。図４に示すように、スリット５２は十分に狭く、対物レンズ４８によってスリット上に集束しない光によるスリットの通過を阻止している。スリットを通過した光３０’は、画像化システム２０に関連して上で考察したように、集光レンズ３２によって集光される。集光光３４は、プリズム３６によってスペクトル分散し、同じく上述したように、画像化レンズ４０によってＴＤＩ検出器４４上で結像する。対象物２４からの光以外の光によるＴＤＩ検出器４４への到達を排除することにより、ＴＤＩ検出器４４は、対象物の実際の画像にのみ対応する、既に排除済みの外部光による影響を受けていない出力信号を生成することができる。この方法によって排除されない場合、ＴＤＩ検出器４４に到達する周辺光によって、ＴＤＩ検出器からの出力信号に「雑音」が生成されることになる。
【００４７】
画像化システム２０および４５の各々の図には、光源が示されていないことに留意されたい。この最初の２つの実施形態は、対象物が発光体である場合、すなわち対象物が光を発生する場合、対象物の画像を生成するための個別の光源を必要としないことを明確にするために、この２つの実施形態の最も一般的な形態で示したものである。しかしながら本発明のアプリケーションの多くは、画像化する対象物に入射する光を提供する１つまたは複数の光源を使用する必要がある。光源の位置によって入射光と対象物の相互作用が実質的に影響され、延いてはＴＤＩ検出器上の画像から得られる情報が影響される。
【００４８】
図５には、対象物２４に入射する光を提供するために使用することができる複数の様々な光源の位置が示されているが、光源を図５に示す位置以外の他の多くの位置に配置することができることを理解されたい。使用される１つまたは複数の光源の各々の位置は、画像化する対象物およびＴＤＩ検出器によって生成される信号から引き出す対象物のデータによって様々である。例えば、図５に示すように、光源６０ａまたは６０ｂを使用することにより、対象物２４に入射し、対象物から集光レンズ３２の光軸に沿って散乱する光５８が提供される。集光レンズ３２の光軸は、光源６０ａまたは６０ｂのいずれかから対象物２４に入射する光の方向に対して約９０°の角度をなしている。
【００４９】
一方、光源６２は、光源６２から放出された光５８が、対象物に向かって概ね集光レンズ３２の光軸に整列した方向を進行するように配置されている。したがって、ＴＤＩ検出器４４上に形成される画像には、対象物２４によって吸収される光は含まれていない。したがって、光源６２を使用して対象物を照射することにより、対象物の光吸収特性を決定することができる。
【００５０】
光源６４は、集光レンズ３２の光軸から約３０〜４５°外れた光路に沿って対象物に導かれる光で対象物２４を照射するべく配置されている。この光５８は、対象物２４に入射すると対象物２４で反射（散乱）し、反射すなわち散乱した光がＴＤＩ検出器４４上に結像する。より直接的な反射光は、外部光源６６によって提供されている。外部光源６６は、外部光源６６の光５８が部分反射表面６８に向かって導かれるように配置されている。部分反射表面６８は、光の一部が集光レンズ３２を通して対象物２４上に反射するように配置されている。対象物に到達した光は対象物で反射し、集光レンズ３２の光軸に沿って戻り、少なくともその一部が部分反射表面６８を通過し、それによりＴＤＩ検出器４４上に対象物の画像が形成される。他の方法としては、部分反射表面６８の位置に、部分反射表面６８の代わりに二色性ミラーを使用して外部光源６６からの光を導き、対象物２４からの蛍光あるいは他の誘導放出を励起することもできる。この場合、対象物２４からの放出の少なくとも一部が集光レンズ３２によって集光され、二色性ミラーを通過してスペクトルが分散し、ＴＤＩ検出器によって検出される。
【００５１】
対象物に入射する光を使用して対象物を画像化する以外に、光源を使用して、対象物による光の放出を誘導することもできる。例えば、細胞内に挿入されたＦＩＳＨプローブは、光で励起されると蛍光を発し、励起されたあらゆるＦＩＳＨプローブから、ＴＤＩ検出器４４上で結像する、対応する特性発光スペクトルを生成する。図５では、光源６０ａ、６０ｂ、６４または６６を代替として使用して、対象物２４のＦＩＳＨプローブを励起させ、それによりＴＤＩ検出器４４は、ＦＩＳＨプローブによって生成されるＦＩＳＨスポットを、プリズム３６によって提供される対象物からの光のスペクトル分散の結果として、ＴＤＩ検出器上の異なる位置に画像化することができる。ＴＤＩ検出器表面におけるこれらのＦＩＳＨスポットの配置は、ＦＩＳＨスポットの発光スペクトルおよびＦＩＳＨスポットの対象物中の位置によって決まる。本発明によるＴＤＩ検出器上へのＦＩＳＨスポットの画像生成に関連したＦＩＳＦプローブの使用については、以下でさらに詳細に説明する。
【００５２】
図５に示す光源の各々は、所望する画像化システムのアプリケーションに応じて、コヒーレント光、非コヒーレント光、広帯域光または狭帯域光のいずれかの光５８を発生している。したがって、狭帯域光源を必要としないアプリケーションに対しては、タングステンフィラメント光源を使用することができる。ＦＩＳＨプローブからの蛍光放出を誘導するようなアプリケーションの場合は、対象物によって散乱した光から、その対象物のスペクトル分解無ひずみ画像を生成することもできるため、狭帯域レーザ光であることが好ましい。この散乱光画像は、すべてのＦＩＳＨスポットの発光スペクトルが、レーザ光の波長以外の異なる波長である限り、ＴＤＩ検出器４４上に生成されるＦＩＳＨスポットから個別に解像することができる。光源は、持続波（ＣＷ）タイプあるいはパルスタイプのいずれであっても良い。パルスタイプの照射源を使用する場合、ＴＤＩ検出に関連する積分期間が長いため、複数のパルスからの信号を積分することができる。また、光をＴＤＩ検出器に同期してパルス化する必要が無い。
【００５３】
本発明においては、パルスレーザにより、光源としてＣＷレーザに勝る、小型、高効率、高信頼性、および多数の波長を同時に引き渡す能力を含むいくつかの利点が提供される。パルスレーザのもう１つの利点は、細胞内に使用される蛍光プローブの蛍光励起の飽和レベルを達成するその能力である。蛍光飽和は、蛍光分子に遭遇する光子の数が、その吸収能力を超えた場合に生じる。パルスレーザによって提供される飽和励起は、パルス間の励起強度の変化が蛍光放出強度に及ぼす影響が小さいため、非飽和ＣＷレーザ励起より本質的に雑音が少ない。
【００５４】
上述した画像化システムのプリズム３６は、いずれも細胞からの光信号をＴＤＩ検出器のピクセル上にスペクトル分散させることができるため、回折格子に置き換えることができる。スペクトル分散を使用することにより、細胞すなわち他の対象物からの有用なデータが提供されるばかりでなく、測定雑音が低減される。光源の波長と蛍光プローブの発光スペクトルが異なる場合、集光系中に散乱する光源からの光は、蛍光信号から空間的に隔離される。光源の波長と蛍光プローブの発光スペクトルがオーバラップする場合は、光源の波長の光が当たるＴＤＩ検出器のピクセルが、残りの蛍光信号が当たるピクセルから隔離される。また、蛍光信号を複数のピクセル上に分散させることにより、画像化システムの総合ダイナミックレンジが広がる。
【００５５】
＜第３実施形態＞
図６は、本発明の画像化システムの第３実施形態を示す図で、第１の好ましい実施形態の立体構造７０である。この構造により、対象物を２つの異なる方向から画像化し、単一方向から見た場合にオーバラップすることになる特徴を弁別することができる。第３の好ましい実施形態は、顕微鏡スライドなどの移動基板上の対象物に使用することもできるが、細胞を含有したＦＩＳＨプローブなど、溶液中の多重成分対象物の分析に特に有用である。このようなプローブは、細胞の三次元核中のいたるところに点光源として出現する。場合によっては複数のＦＩＳＨプローブが、画像化システムの光軸に沿って、オーバラップした形で出現することもある。このような場合、ＦＩＳＨプローブの１つが他のＦＩＳＨプローブを妨害するため、細胞内に存在しているプローブの数を正確に測定することは困難である。プローブの数を正確に測定することは、ダウン症候群として知られているトリソミー２１などの遺伝異常を決定する場合の重要な要素である。単一透視系は、対象物を光軸に沿って「パンスルー（panning through）」させることによってこの問題に対処し、対象物中に複数の像平面を得ている。この方法は有効ではあるが、複数の画像を収集するためには相当な時間を必要とし、流動する細胞に容易に適用することは不可能である。図６に示す立体画像化システム７０は、画像化システム２０に関連して、上述したように、２つのＴＤＩ検出器４４ａおよび４４ｂ、および関連する光素子を備えている。
【００５６】
２つのＴＤＩ検出器の集光レンズ３２の光軸を、例えば、９０°の間隔を隔てて配置することにより、複数のＦＩＳＨプローブから、少なくとも一方のＴＤＩ検出器４４ａまたは４４ｂ上に画像化されたＦＩＳＨスポットを個別に解像することができる。複数のＦＩＳＨプローブが、一方の検出器上に生成された画像に対してオーバラップしている場合、それらのＦＩＳＨプローブは、もう一方のＴＤＩ検出器上に生成されたスペクトル分散画像中で個別に解像される。また、２つのＴＤＩ検出器を、「立体すなわち三次元構成」と呼ぶことができる画像化システム７０に使用することにより、相対ＴＤＩ読出し速度、軸配向、傾き、焦点面位置および倍率などのパラメータを含むシステムの各レグを柔軟に構成することができる。複数の細胞または他の対象物を、各検出器上に垂直方向に同時に画像化することができる。ＴＤＩ上の信号に同期して対象物が移動するため、画像のぼやけを防止するためのゲートすなわちシャッタは不要である。既に言及したように、本発明は、パルスを粒子の視野中への到達に一致させるためのタイミングを取るトリガ機構を必要とすることなく、パルス光源またはＣＷ光源を使用することができる。パルス光源を使用する場合、ＴＤＩ検出器と結合した移動軸に沿った視野が広くなるため、移動中の細胞すなわち対象物に、その縦断中に複数のパルスを照射することができる。フレームベースの画像化装置とは対照的に、ＴＤＩシステムは、複数のパルスからの信号を積分した、対象物のぼやけのない単一画像を生成することができる。ＣＷ光源を使用する場合、シャッタが開いているごく僅かな微小セグメントの時間とは対照的に、対象物が視野を通って縦断する全期間に渡って、対象物が発生する信号を収集することができる。したがって、本発明においては、検出器上に収集され、画像化される信号の量が、従来技術によるフレームベースの画像化システムより実質的に多くなっている。したがって、本発明は、優れた信号対雑音比で、極めて高いスループット率で動作することができる。
【００５７】
また、図６には、図に示す画像化システムに関連する様々な目的に有用な、複数の例示的光源位置が示されている。ＴＤＩ検出器４４ａに関しては、光源６２が、ＴＤＩ検出器上に生成される画像から対象物の吸収特性を決定することができる方向から、対象物２４の照射を提供している。同時に、光源６２によって提供される、対象物２４で散乱する光を使用して、ＴＤＩ検出器４４ｂ上に散乱画像およびスペクトル分散画像を生成することができる。光源７４を使用して、ＴＤＩ検出器４４ａおよび４４ｂの両方に、スペクトル分散画像および散乱画像を生成することができる。光源６２および７２の波長が異なり、かつ、各々の集光レンズ３２の光軸に整列した光源からの波長を阻止するための適当なフィルタを備えている場合、この２つの光源を使用して、対象物で散乱する光を生成することができる。例えば、光源７２が、対象物２４で散乱し、かつ、ＴＤＩ検出器４４ａに向かって導かれる波長Ａの光を発生すると仮定する。光源６２が発生する波長Ｂを阻止するフィルタ（図示せず）を備えることにより、波長Ｂの光がＴＤＩ検出器４４ａ上に生成される画像に直接影響を及ぼすことはない。同様に、光源６２が発生する、対象物２４からＴＤＩ検出器４４ｂ上に散乱する光の画像化を妨害することがないよう、適当なフィルタ（図示せず）を使用して、光源７２からの光を阻止することができる。
【００５８】
また、図６に示されている外部光源６６を使用して、部分反射器６８と共にＴＤＩ検出器４４ａ上に画像を生成することができる。光源６４を使用して、ＴＤＩ検出器４４ａ上に画像を生成する反射光を発生させることができる。外部光源６６からの散乱光は、ＴＤＩ検出器４４に向けて導かれる。所望する特定のアプリケーションおよび対象物に関する情報に応じた画像化を達成するために必要な、対象物への入射光の提供に適したこれらの光源の位置および他の可能位置については、当分野の技術者には明らかであろう。
【００５９】
＜画像化スライドまたはスライドによって移送される対象物＞
次に、図７を参照すると、画像化システム８０が示されている。画像化システム８０は、スライド８２上の対象物２４を画像化するために使用される点を除き、画像化システム２０に類似している。対象物２４は、図７に示すように、画像化システムに対して移動するスライド８２によってサポートされている。別法としては、スライド８２が画像化する対象物であっても良い。反射した入射光を使用して対象物が画像化されるため、対象物は半導体ウェハであっても紙であっても良く、あるいは他の興味のある対象物であっても良い。
【００６０】
スライド８２あるいはスライド８２によってサポートされた対象物２４のいずれかに入射する光を提供するために、複数の異なる位置の１つに配置された光源が使用される。例示的光源６２、６４および６６は、本発明に有用な光源が配置される位置をいくつか示したものである。いずれかの光源から放出される光５８は、コヒーレント光であっても非コヒーレント光であっても、あるいはパルスまたはＣＷのいずれであっても良い。光５８は、光源６２からスライド８２を通して（スライドが透明である場合）導かれ、あるいは光源６４または６６が使用される場合は、対象物またはスライドで反射する。既に言及したように、外部光源６６は、部分反射表面６８と共に対象物を照射している。
【００６１】
＜第４実施形態＞
図８Ａおよび図８Ｂは、本発明の画像化システムの第４実施形態を示す図で、ＴＤＩ検出器４４上に対象物２４の散乱パターン画像を生成する画像化システム９０の２つの異なる図を示したものである。上に挙げた実施形態の場合と同様、対象物２４からの光３０は、集光レンズ３２ａおよび３２ｂを通過し、集光光３４が円筒レンズ９２上に導かれている。円筒レンズ９２は、概ね円筒レンズ９２の中心軸９６に整列したラインに沿って、光９４をＴＤＩ検出器４４上に集束させている。図８Ｂに中心軸９６が示されているが、対象物２４が画像化システムを通って移動する方向に対して直角をなしていることは明らかであろう。対象物２４が図８Ａに示す配置に対して下へ向かって移動すると、円筒レンズ９２のＴＤＩ検出器４４上の焦点が上に向かって移動する。したがって、円筒レンズ９２は、ＴＤＩ検出器４４の感光領域、すなわちピクセルの１つまたは複数の行に沿って、対象物の画像を分布している。
【００６２】
＜第５実施形態＞
図９は、本発明の画像化システムの第５実施形態を示す図で、ＴＤＩ検出器４４上に対象物２４の散乱パターン画像およびスペクトル分散画像の両方を形成する画像化システム１００が示されている。画像化システム１００では、対象物２４からの光３０は、二色性フィルタ１０２に向けて導かれる無限遠集束光３４を生成する集光レンズ３２ａおよび３２ｂを通過している。二色性フィルタ１０２は、対象物２４に入射する特定の波長の光、例えば光源（図示せず）の波長の光を反射している。他のすべての波長の光は、回折格子１１２に向かって二色性フィルタ１０２を透過する。回折格子１１２は、二色性フィルタ１０２を透過した、典型的には対象物２４のＦＩＳＨプローブの蛍光によって生成された光をスペクトル分散させ、それにより異なるＦＩＳＨプローブの数に対応する複数のＦＩＳＨスポットおよび画像化する対象物がＴＤＩ検出器４４上に形成される。
【００６３】
二色性フィルタ１０２で反射した光１０４は、円筒レンズ１０６を透過し、ラインに沿って、散乱パターン画像としてＴＤＩ検出器上の領域１１０中に集束する。二色性フィルタ１０２で反射する波長とは異なる波長を有する、対象物２４のＦＩＳＨスポットまたは他のアスペクトのスペクトル分散画像が、画像化レンズ１１４ａおよび１１４ｂによる光１１６として、ＴＤＩ検出器の領域１１８上に結像される。したがって、散乱パターン画像およびスペクトル分散画像に対応する信号の両方が、ＴＤＩ検出器４４によって生成される。
【００６４】
＜第６実施形態＞
図１０は、本発明の画像化システムの第６実施形態を示す図で、第２のＴＤＩ検出器４４ｂに向かって異なる方向に角度が付けられた二色性フィルタ１０２’が使用されているため、前述の第５の実施形態とは若干異なる画像化システム１２０である。この実施形態では、光１０８’で示される分散パターン画像は、円筒レンズ１０６’によって生成されている。画像化システム１００の場合と全く同様に、二色性フィルタ１０２’を透過した光がＴＤＩ検出器４４ａ上に集束する。画像化システムの異なる側に配置された２つの個別ＴＤＩ検出器が使用されている以外は、画像化システム１２０の動作は、画像化システム１００の動作と実質的に同じであるが、第３の好ましい実施形態の場合と全く同様に２つの個別ＴＤＩ検出器が使用されているため、相対ＴＤＩ読出し速度、軸配向、傾き、焦点面位置および倍率などのパラメータを含むシステムの各レグを柔軟に構成することができる。また、必要に応じて、画像化システム１００を単一ＴＤＩ検出器の代わりに２つの個別ＴＤＩ検出器を備えた構造にすることができることに留意されたい。
【００６５】
＜ＴＤＩ検出器上のスペクトル分散画像の処理＞
細胞分析に使用する場合、本発明により、ＦＩＳＨプローブが細胞内で空間的に接近して配置されている場合であっても、ＴＤＩ検出器上のＦＩＳＨスポットの解像に実質的なユーティリティが提供される。本発明を使用してスペクトル画像化を実施する場合、対象物中の光の空間分布がその光のスペクトル分布でたたみ込まれ、ＴＤＩ検出器に対象物の画像が生成される。このたたみ込みにより、光のスペクトル帯域幅に応じて、分散軸に沿ったぼやけが生じる。スペクトル帯域幅が狭い場合、システムのスペクトル分解能によるぼやけは小さいか、あるいはまったくぼやけることはない。本発明では、物空間の空間解像力が約１ミクロンで、ピクセル当たり約３ｎｍのスペクトル分解能であることが意図されているが、空間解像力およびスペクトル分解能は、特定のアプリケーションの要求に合致させるべく調整することができる。
【００６６】
図１１は、ピクセル当たり約１０ｎｍのスペクトル分解能および約０．５ミクロンの空間解像力を備えた本発明を示した図である。図１１には、さらに、同一発光スペクトルを有する２つのＦＩＳＨプローブ１４４ａおよび１４４ｂが配置された核１４２を有する細胞１４０を画像化するための本発明の使用方法が示されている。図１１では、ＦＩＳＨプローブ１４４ａおよび１４４ｂの発光スペクトル１４６の幅は約１０ｎｍであり、「量子ドット」または狭帯域蛍光染料で生成される。狭帯域幅スペクトルの光たたみ込みにより、ＦＩＳＨスポット１４８ａおよび１４８ｂのぼやけが最小になり、それらをＴＤＩ検出器４４上で容易に解像することができる。
【００６７】
図１２では、異なる発光スペクトルを有するＦＩＳＨプローブ１５４および１５６が配置された核１５２を有する細胞１５０が示されている。ＦＩＳＨプローブは、異なる発光スペクトルが異なるＤＮＡ列に対応するように設計されている。ＦＩＳＨプローブ１５４および１５６の発光スペクトルの各々は、波長帯１５８および１６０で示すように比較的狭く、したがって、図１１の場合と同様、ＦＩＳＨスポット１６２および１６４のぼやけが最小になっている。また、波長をＴＤＩ検出器４４上の横方向位置にマップする本発明によるスペクトル分散により、細胞内のＦＩＳＨプローブ１５４および１５６が極めて近接しているにも関わらず、ＦＩＳＨスポット１６２および１６４の比較的広い物理変位が提供される。合わせて考察すると、図１１および図１２には、本発明による同一または異なる色のＦＩＳＨプローブの弁別方法が示されており、それにより多数の遺伝的特徴を同時に列挙することができる。本発明が、一度に１０個以上の異なる色のプローブが細胞内に存在する、胎児の細胞分析の要求に打ってつけであることは、当分野の技術者には理解されよう。また、本発明が、ＦＩＳＨプローブを使用した胎児の細胞分析に限定されないことについても、当分野の技術者には理解されよう。
【００６８】
図１３および図１４は、同じくスペクトル帯域幅の広い光と共に本発明を使用することができることを示したものである。この場合、追加信号処理ステップが実行され、広発光スペクトルによる横方向のぼやけが補正されている。図１３には、核１４２を有する細胞１４０が示されている。核には、共通の発行スペクトルを有するＦＩＳＨプローブ１７０ａおよび１７０ｂが配置されている。ＦＩＳＨプローブ１７０ａおよび１７０ｂは、比較的広い発光スペクトル１７２を生成することによって特性化されている。本発明によって提供されるスペクトル分散によって光学的にたたみ込まれると、ＦＩＳＨスポット１７４ａおよび１７４ｂがＴＤＩ検出器４４上に生成されるが、ＦＩＳＨスポットの発光スペクトルが比較的広いため、ＴＤＩ検出器４４の両端間でその画像が横方向にぼやける。ＦＩＳＨスポット１７４ａおよび１７４ｂの分離をより鮮明に解像するために、既知のＦＩＳＨ発光スペクトルを使用して、ＴＤＩ検出器４４によって生成される信号に対する逆たたみ込みが実行され、それにより正確なＦＩＳＨスポット表現１７８ａおよび１７８ｂがディスプレイ１７６上に生成されている。逆たたみ込みステップにより、ＦＩＳＨスポットの数を列挙する能力が強化されている。
【００６９】
図１４は、細胞１５０の核１５２中に配置されたＦＩＳＨプローブ１８０と１８２の間の対応関係を示した図である。ＦＩＳＨプローブ１８０および１８２は、図に示すように、それぞれ比較的広い帯域の発光スペクトル１８４および１８６を生成することによって特性化されている。スペクトル分散したＦＩＳＨプローブによって放出される蛍光の光たたみ込みにより、ＴＤＩ検出器４４上にＦＩＳＨスポット１８８および１９０が生成される。この場合も、ＴＤＩ検出器４４によって生成される信号を使用した既知の発光スペクトルに対する逆たたみ込みにより、ディスプレイ１７６上に示す、ＦＩＳＨスポット１９２および１９４の対応画像が回復されている。この場合も、波長をＴＤＩ検出器４４上の横方向位置にマップする本発明によるスペクトル分散により、細胞内のＦＩＳＨプローブ１８０および１８２が極めて近接しているにも関わらず、ＦＩＳＨスポット１９２および１９４の比較的広い物理変位が提供される。この方法により、比較的広く、かつ、異なる発光スペクトルを有するＦＩＳＨプローブによって生成されたこれらのＦＩＳＨスポット画像を解像することができる。
【００７０】
図１５は、ＴＤＩ検出器４４によって生成される信号を分析し、上で説明した逆たたみ込みステップを実行するためのシステム２３０を示した図である。図１５では、ＴＤＩ検出器４４の信号は、アナログ／ディジタル（Ａ−Ｄ）変換器２３４に必要なレベルを達成するべく、ＴＤＩ検出器４４からの信号をバッファし、かつ、増幅する増幅器２３２に印加されている。このＡ−Ｄ変換器は、増幅器２３２からのアナログ信号をディジタル信号に変換し、ＴＤＩラインバッファ２３６に入力している。ＴＤＩラインバッファ２３６は、ディジタル信号がＣＰＵ２３８によって処理されるまでの間、ディジタル信号を一時的に保存している。上述した逆たたみ込みを実行するために、ＴＤＩラインバッファ２３６に保存されている信号を使用して、使用されているＦＩＳＨプローブの発光スペクトルに対する逆たたみ込みを実行することができるよう、既知の発光スペクトルが、ＦＩＳＨプローブ毎にスペクトルバッファ２４０にロードされる。ＣＰＵ２３８は、逆たたみ込みおよび他の分析手順を実行するべくプログラムされた高速プロセッサであり、画像化された対象物の所望の特性、すなわちパラメータの識別を可能にしている。ＣＰＵ２３８の出力は、画像を表示するかあるいは後の分析用として記録することができる画像ラインバッファ２４２に一時的に保存される。
【００７１】
図１６は、本発明による、雄細胞２００および雌細胞２０８を識別し、かつ、それらに対応する散乱画像２１２および２２０を生成するための実用的なアプリケーションを示した図である。雄細胞２００には、黄色蛍光染料で着色された核２０２が含まれている。また、ＦＩＳＨプローブ２０４は、核中のＸ染色体の存在を示す橙色蛍光放出を提供し、一方、ＦＩＳＨプローブ２０６は、Ｙ染色体の存在を示す蛍光放出を提供している。グリーンレーザの光が照射された雄細胞２００からの蛍光放出をスペクトル分解することにより、画像化される光の波長を関数として分離された一連の画像がＴＤＩ検出器４４上にもたらされる。細胞に入射するレーザ光の波長帯は極端に狭いため、レーザの散乱によって生成される雄細胞２００の画像２１２に対するスペクトル分解処理によるたたみ込みはごく僅かである。細胞２００およびその核２０２のグリーンレーザ散乱画像２１２がＴＤＩ検出器の左側に出現し、核２０２が放出する黄色蛍光に対応する蛍光スポット２１４が、ＴＤＩ検出器上の次の何列かの列に出現している。また、ＦＩＳＨプローブ２０４および２０６が放出する蛍光の異なる波長を関数としたＦＩＳＨスポット２１６および２１８が、検出器上の間隔を隔てた位置に出現しているが、それらの各々の発光スペクトルの幅により、ＴＤＩ検出器４４の数列に渡って僅かにぼやけている。ＴＤＩ検出器によって生成される信号を分析することにより、ＸおよびＹ染色体に反応したＦＩＳＨプローブが検出され、それにより使用者は、ＸおよびＹの両方の染色体が細胞に含まれているため、その細胞２００が雄の細胞であることを決定することができる。同様に、スペクトル分解された雌細胞２０８にも、同じく核２１０の特性黄色蛍光が含まれているが、雄細胞の場合とは異なり、ＦＩＳＨプローブ２０４に対応する、２つのＸ染色体の存在を示す２つのＦＩＳＨスポット２１６が含まれている。ＴＤＩ検出器４４も雄細胞２００および雌細胞２０８の空間位置を区別しているため、両細胞が図１６の左側の矢印で示す方向に画像化システムを通過する際に、これらの細胞に対する対応スペクトル分解を個別に容易に解像することができる。この場合も、ＴＤＩ検出器４４によって生成される信号に逆たたみ込みを適用することにより、図に示す対応ＦＩＳＨスポットがより良好に解像されることに留意されたい。
【００７２】
＜無ひずみスペクトル分散システム＞
本発明は、画像からの発光ペクトルに対する逆たたみ込みの必要を排除するために、画像を形成する光の発光スペクトルで画像をたたみ込むことのないスペクトル分散フィルタアセンブリを備えることができる。図１７は、本発明の第７の好ましい実施形態を示した図で、５色スタックウェッジスペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を使用したこのような無ひずみスペクトル分散システム２５０に対応している。この第７の実施形態は、スペクトル分散プリズム素子３６（図〜図３）がスペクトル分散フィルタアセンブリ２５２に置き換えられている点を除き、図１〜図３に示す実施形態に実質的に類似している。スペクトル分散フィルタアセンブリは、光を帯域幅が異なる複数の光ビームに分割している。したがって、生成された各光ビームは、それぞれ異なる公称角度で導かれ、それぞれＴＤＩ検出器４４の異なる領域を照射している。スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２によって生成される各帯域幅間の公称角度分離は、物空間内の画像化システムの視野角度を超過しており、それにより検出器上での様々な帯域幅の視野画像のオーバラップを防止している。
【００７３】
スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２は、赤色二色性フィルタＲ、橙色二色性フィルタＯ、黄色二色性フィルタＹ、緑色二色性フィルタＧおよび青色二色性フィルタＢを含む複数の二色性スタックウェッジフィルタからなっている。赤色二色性フィルタＲは、集光光３４の光路内に配置され、集光レンズ３２ａおよび３２ｂの光軸２５３に対して約４４．０°の角度で配向されている。赤色波長以上、すなわち＞６４０ｎｍの光が赤色二色性フィルタＲの表面で、垂直光軸２５７から反時計方向に測定した公称角度１°で反射する。図１８は、赤色二色性フィルタＲの典型的なスペクトル反射率特性Ｒ’を、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２に使用されている他の二色性フィルタに対応する典型的なスペクトル反射率特性と共にプロットした図である。図１８では、Ｏ’は、橙色二色性フィルタＯのスペクトル反射率特性を表している。また、Ｙ’は、黄色二色性フィルタＹのスペクトル反射率特性を表しており、以下同様である。赤色二色性フィルタＲで反射した光は、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を離れ、ＴＤＩ検出器４４の赤色光を受光する領域に光を結像させる画像化レンズ４０ａおよび４０ｂを通過する。赤色光を受光する領域は、図１７に示すように、ＴＤＩ検出器の右端に向かって配置されている。
【００７４】
橙色二色性フィルタＯは、赤色二色性フィルタＲの後方に若干距離を隔てて配置され、光軸２５３に対して４４．５°の角度で配向されている。橙色波長以上、すなわち＞６１０ｎｍの光が橙色二色性フィルタＯで、垂直光軸２５７に対して０．５°の公称角度で反射する。６４０ｎｍより長い波長からなる集光光３４の一部が、赤色二色性フィルタＲで既に反射しているため、橙色二色性フィルタＯの表面で反射した光は、６１０ｎｍと６４０ｎｍの間の橙色に着色された領域を有効に帯域通過する。この光は、垂直光軸２５７から０．５°の公称角度で進行し、同じく、図１７に示すように、ＴＤＩ検出器４４の右側に向かって、ＴＤＩ検出器の中央領域と赤色光を受光する領域の間に配置された、橙色光を受光する領域に照射するようになされた画像化レンズ４０ａおよび４０ｂによって結像する。
【００７５】
黄色二色性フィルタＹは、橙色二色性フィルタＯの後方に若干距離を隔てて配置され、光軸２５３に対して４５°の角度で配向されている。黄色波長、すなわち５６０ｎｍ以上の波長の光が黄色二色性フィルタＹで、垂直光軸２５７に対して０．０°の公称角度で反射する。黄色二色性フィルタＹで反射した光の波長は、５６０ｎｍと６１０ｎｍの間の黄色領域を有効に帯域通過し、ＴＤＩ検出器４４の中央へ向かって、黄色光を受光する領域に照射するようになされた、垂直光軸２５７の近傍の画像化レンズ４０ａおよび４０ｂによって結像する。
【００７６】
二色性フィルタＧおよびＢも、二色性フィルタＲ、ＯおよびＹと同様の方法で、緑色光波長帯および青色光波長帯が、ＴＤＩ検出器４４のそれぞれ緑色光および青色光を受光する領域上に結像するように構成され、かつ、配向されている。緑色光および青色光を受光する領域は、ＴＤＩ検出器の左側に向かって配置されている。二色性フィルタを予め決められた異なる角度で積み重ねることにより、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２が集合的に機能し、光スペクトルの定義済波長帯内の光が、ＴＤＩ検出器４４の予め決められた領域上に集束する。スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２に使用するフィルタに、図１８に関連して上で説明したスペクトル特性とは異なるスペクトル特性を持たせることができることは、当分野の技術者には理解されよう。また、所望の分散特性を達成するためのスペクトル特性は任意であり、二色性以外のフィルタを使用することもできる。
【００７７】
上述した二色性フィルタのウェッジ形状により、フィルタをほぼ接触した状態で、あるいは接触した状態で配置し、また、場合によっては接合して一体にすることによってスペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を形成することができる。二色性フィルタの基板中に製造されたウェッジ形状の角度により、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を容易に組み立てることができ、隣接する二色性フィルタの間にウェッジ形基板が挟まれたモノリシック構造を形成することができる。フィルタを互いに接触させるか、あるいは接合して一体にする場合、フィルタのスペクトル性能を決定している材料の組成は、接触していない材料の組成とは異なる組成にすることができる。平らな非ウェッジ形基板を使用して、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を製造することができることは、当分野の技術者には理解されよう。その場合、機械的なフィルタ取り付けなど、他の手段を使用してフィルタ間の角度関係を維持することができる。
【００７８】
前述の構成以外に、帯域外信号に必要な除去量に応じて、各光ビーム中の不要な信号をさらに減衰させるための検出器フィルタアセンブリ２５４を、任意選択で無ひずみスペクトル分散システム２５０に備えることができる。図１９は、上述した５色帯域に対応する例示的検出器フィルタ２５４の構造を示した図で、図１９に示すように、すべて隣り合わせて配置された、青色スペクトル領域２５６、緑色スペクトル領域２５８、黄色スペクトル領域２６０、橙色スペクトル領域２６２および赤色スペクトル領域２６４を備えている。図２０Ａ〜図２０Ｅは、それぞれ青色、緑色、黄色、橙色および赤色の各スペクトル領域すなわち波長帯に対応するスペクトル特性を示したものである。図１９に示す検出フィルタアセンブリは、個々のフィルタを共通基板上に隣合せ配列で接合して構築されたものであり、あるいは当分野の技術者に良く知られている他の手段によって構築されたものである。また、フィルタをＴＤＩ検出器４４の直前に置く代わりに、代替として中間像平面に配置することもできることは、当分野の技術者には理解されよう。
【００７９】
図１７に示す実施形態では、光は、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を励起する前に、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２中の二色性フィルタの各々を２回通過している。この条件により、帯域外信号がさらに減衰するが、帯域内信号も減衰する。図２１は、本発明の第８の実施形態を示した図で、反射した後の光は、他の二色性フィルタを通過していない。この実施形態では、赤色キューブフィルタ２６６、黄色キューブフィルタ２６８、緑色キューブフィルタ２７０および青色キューブフィルタ２７２を備えた複数のキューブ二色性フィルタが、光が２度以上いかなるキューブフィルタも通過しないことを保証するために、十分に間隔を隔てて配置されている。図１７に示す実施形態の場合と同様、キューブ二色性フィルタは、定義済帯域幅内の光を、ＴＤＩ検出器２７４上の個別領域に結像させるべく、適切な角度で配向されている。光がキューブ二色性フィルタ２６６、２６８、２７０および２７２の各々で反射すると、画像化レンズ４０ａおよび４０ｂに向けて導かれ、光の異なる帯域幅部分が、ＴＤＩ検出器２７４の受光表面上に形成された、それぞれ対応する赤色光、黄色光、緑色光および青色光を受光するセグメントすなわち領域に集束する。必要に応じて、検出器フィルタアセンブリ２５４（ただし橙色スペクトル領域を除く）に類似した構造の任意選択検出器フィルタアセンブリ２７６を使用して、帯域外信号の除去を強化することができる。キューブフィルタの代わりに、間隔を隔てて配置された個別プレートすなわちペリカル素子を、このアプリケーションに使用することができることは、当分野の技術者には理解されよう。図２１に示す第８の実施形態では、レンズ４０ａおよび４０ｂに対するクリア開口の要求を最小化するためには、画像化レンズ４０ａおよび４０ｂは、複数のキューブフィルタから十分に離れた位置に配置しなければならない。ページに対して直角をなす平面内のクリア開口が、レンズと複数のキューブフィルタとの間の距離の増加と共に大きくなることは、当分野の技術者には理解されよう。したがって、レンズ４０ａおよび４０ｂの配置は、両方の平面内のクリア開口に適切に適応するべく選択しなければならない。
【００８０】
第７および第８の好ましい実施形態についての前述の説明は、４色系および５色系の使用を示したものである。より広いスペクトル領域、あるいはより狭いスペクトル領域、もしくは所与のスペクトル領域内における異なる通過帯域をカバーするシステムを構築するために、フィルタの数がもっと多い、あるいはもっと少ないスペクトル分散素子を、これらの構成に使用することができることについては、当分野の技術者には理解されよう。同様に、使用する二色性フィルタおよび／または帯域通過フィルタの数およびスペクトル特性を適切に選択することにより、本発明によるスペクトル分解能が向上し、あるいは低下することについても、当分野の技術者には理解されよう。また、所与の帯域幅の光をＴＤＩ検出器上の任意の所望ポイントに導くべく、フィルタの角度すなわち配向を調整することができることは、当分野の技術者には理解されよう。さらに波長が増加する順に、あるいは波長が減少する順に光を集束させる必要はない。例えば、蛍光画像化アプリケーションの場合、励起波長および放出波長に対応しているフィルタが、システムの光軸に対して配向されている角度を変更することにより、これらの波長間のより空間的な分離をＴＤＩ検出器上に生成することができる。最後に、角度、位置、偏光、位相または他の光学特性を含む非スペクトル特性に基づいて集光光を分散させることができることは、当分野の技術者には明らかであろう。
【００８１】
既に上述した実施形態の場合と同様、第７および第８の好ましい実施形態の多くのアプリケーションには、画像化する対象物に入射する光を提供するために使用する１つまたは複数の光源が必要である。したがって図５〜図７に示し、かつ、上述した様々な位置に配置された様々な光源を使用して、これらの実施形態の各々によって生成される画像の品質を向上させることができる。これらの実施形態の説明を簡潔にし、分かり易くするために、図１７および図２１には光源が省略されているが、上述した実施形態に関連した光源の使用についての説明を基に、これらの実施形態におけるこのような光源の使用法については、当分野の技術者には認識されよう。
【００８２】
図２２は、無ひずみスペクトル分散システム２５０を使用した場合の複数の細胞２００の画像に対応する、ＴＤＩ検出器４４上の画像分布を示した図である。図２２と図１６を比較すると明らかなように、結果として得られるＴＤＩ検出器上の画像は、多くの点で類似しているが、無ひずみスペクトル分散システムを使用した場合、図２２から分かるように、発光スペクトルと対象物のたたみ込みによって生じる画像の広がりはない。たたみ込みに代わって、各二色性フィルタの予め決められた帯域幅内のすべての波長が、フィルタで同じ公称角度で反射するため、その通過帯域内の画像成分が検出器上で位置ひずみを生じることはない。また、図２２には物空間の流れに対して直角をなす視野角度が示されている。この特定の構成では、物空間における視野角度は、＋／−０．２５°未満である。視野角度をもっと大きくし、あるいはもっと小さくすることができることは、当分野の技術者には理解されよう。例えば、スライド上のより広い領域に渡る細胞、あるいは広い平坦な流れの中の細胞を画像化するために視野角度を大きくした分だけ、使用されている色の数に比例して検出器における視野角度が大きくなる。含有フローセル３０６が組み込まれた図２５に示すように、市販されているフローセルを使用して、容易に広い平坦な流れを生成することができることは、当分野の技術者には理解されよう。フローセル３０６は、流れおよび光軸の両方に対して直角をなす軸に沿った細長い断面を有している。広い平坦な流れの生成については、特許文献２を含む多くの参照文献の中で考察されている。フローセル３０６を使用することにより、広い平坦な流れが得られる。広い平坦な流れを提供するためのフローセル３０６または他の手段が組み込まれた実施形態では、このような広い平坦な流れに流入されるあらゆる対象物を画像化し、かつ、その画像を検出器で捕捉することができるだけの十分な大きさの視野角度であることが好ましい。したがって、流量の幅が広くなると、対象物が視野を通過する際に、その流量中のすべての対象物を確実に画像化するためには、上記幅の増加に比例して視野角度も大きくしなければならない。
【００８３】
図２２は、３つの細胞２８０、２８２および２８４が視野を通過する場合の、検出器上に投影される画像を示した図である。細胞２８０、２８２および２８４の光散乱画像は、青色領域として示されている検出器の左側に出現している。緑色蛍光染料で着色された細胞核２０２の画像は、検出器の緑色領域に出現している。また、細胞内の性染色体を分析するために、３つの異なる色に着色された遺伝プローブ２０４、２０５および２０６が使用されている。プローブ２０４は、橙色蛍光染料でＸ染色体を着色し、プローブ２０５は、黄色蛍光染料でＹ染色体を着色している。また、プローブ２０６は、雌細胞内の不活性Ｘ染色体を赤色蛍光染料で着色している。細胞２８２は、図２２に示すように、検出器上に画像化されている。細胞２８２からのプローブ２０４の画像２８６は、検出器の橙色領域に出現している。同様に、プローブ２０５の画像２８８は、検出器の黄色領域に出現している。検出器上の信号が、検出器上におけるこれらの画像の存在および位置を決定するために処理され、細胞２８２が雄細胞であることが決定される。同様に、検出器の橙色領域に画像２９０および２９２を生成し、かつ、検出器の赤色領域に画像２９４および２９６を生成するプローブ２０４および２０６を含んだ細胞２８０および２８４は、これらの細胞がそれぞれ雌であることを示している。
【００８４】
＜無ひずみスペクトル分散システムの多重ＴＤＩ検出器実施形態＞
図２５、図２６および図２８は、スペクトル分散および画像化のための多重検出器を利用した、本発明の代替実施形態を示した図である。スペクトル分解は、概ね上で説明した二色性フィルタを使用して実施されているが、図２５に示すように、スペクトル領域の各々に独立した画像化レンズおよび検出器が使用されている。対象物に対する無限空間に二色性フィルタ３０１〜３０５が配置され、光収差を最小化するべく、対象物からの光をスペクトル分解させている。各二色性フィルタの後段に、個別の画像化レンズ３１１〜３１５が使用され、対応する検出器３２１〜３２５上に対象物の画像を形成している。この構成の場合、各検出器のピクセルの数は、上述した実施形態の場合より少なく、そのため、高ピクセルライン速度でこの実施形態を動作させることができる。検出器の各々に投影される画像は、図１７に示す検出器のゾーンの１つに示すように出現する。スペクトルの赤色部分の光を受光するようになされた検出器上の画像は、図１７の最も右側のゾーンに出現する画像と同じように出現する。
【００８５】
対象物からの光は、一度しか二色性フィルタの各々を通過しないため、図２５、図２６および図２８に示す実施形態は、光効率の点で他の実施形態に勝る利点を有している。多重検出器実施形態の他の利点は、個々の検出器が個々の色を個別に集束させるため、縦方向の色補正の制約が除去され、光学設計が簡略化されることである。さらに他の利点は、各検出器の量子効率を、その特定の色帯域に対して個々に最適化することができることである。検出器に利用される半導体材料をドーピングすることによって、このような最適化が達成されることについては、当分野の技術者には容易に認識されよう。図２５に示すように、複数の画像化レンズを使用する場合、１つまたは複数のレンズ（レンズ３１１で実例化されているように）の焦点距離を他のレンズとは異なる焦点距離にし、それにより差動倍率を使用して同時に画像を収集することができる。この場合、検出器３２１のクロックレートが、同期を維持するために焦点距離に比例して速くなるため、チャネルの１つをより大きい倍率で使用して明視野画像を収集し、それにより形態の詳細をより正確に分析する場合に有用であることが期待される。また、図２５に示す構成により、光開口絞り３３０の配置によって示すように、開口数をチャネルに独立して制御することができる。フローセル３０６の特性により、図２５に示す物体平面３４８ａが、他の図に示す物体平面３４８より広いことに留意されたい。上述したように、フローセル３０６により、画像の各々が十分な大きさの視野角度をカバーしている限り、物体平面３４８ａを同時に通過する複数の対象物が同時に画像化される、広く平坦な流れを得ることができる。本発明による画像化システムを、このような広く平坦な流れと共に使用する場合、生成される画像が実質的にすべての物体平面を囲い込むように、視野角度を物体平面（物体平面３４８ａなど）の大きさに整合させなければならない。物体平面は、使用する流体通路の周囲によって形成されることに留意されたい。
【００８６】
図２６は、多重検出器手法の他の実施形態を示した図である。図２５に示す実施形態に類似しているが、図２６に示す実施形態には、検出器上に画像を投影するために必要な画像化レンズの数が少なくなる利点がある。図２６に示す実施形態では、二色性フィルタ３４５〜３４７の前段に画像レンズ３４０が配置されている。集光レンズ３２および画像レンズ３４０の機能を単一素子で実行することができることは、当分野の技術者には理解されよう。検出器３４１〜３４４は、光路に沿った適切な位置に配置され、各検出器の表面に物体平面３４８を結像している。検出器３４１〜３４３は、二色性フィルタ３４５、３４６および３４７で反射する対象物からの光の光路に沿って配置され、検出器３４４は、二色性フィルタ３４７を透過する対象物からの光の光路に沿って配置されている。二色性フィルタは、対象物の画像に対する集束空間に配置され、したがって、各フィルタは、その設計に応じて、各下流側検出器の画像中に、非点収差、コマ収差、球面収差および色収差を付与している。後続する各フィルタによって、これらの収差の各々の多くが累進的に追加される。本発明の典型的な実施態様では、フィルタ空間における開口数（すなわち屈折率と照射半円錐角の正弦の積）は、約０．０３である。したがって、キューブ基板を二色性フィルタに使用する場合、コマ収差および非点収差は無視することができ、また、球面収差は実質的に除去され、０．１５波高未満である。縦方向色収差は、検出器をそれらの各色帯域に対する最良焦点面に移動させることによって効果的に相殺される。また、二色性フィルタの基板に、優れた理論的光学性能を備えたペリクル（ｐｅｌｌｉｃｌｅ）をキューブの代わりに使用することもできる。
【００８７】
二色性フィルタ３４５〜３４７にプレート基板を使用する場合、優勢な収差は非点収差である。非点収差は、二色性プレートフィルタを通して透過波面に付与されるが、図２７に示すように、厚さ、入射角およびガラスの種類がほぼ同じ透明補正板３６０を挿入することによって効果的に相殺される。しかし、補正板３６０は、二色性フィルタ３６１に対して軸Ｚの周りに９０°回転させなければならない。補正板３６０および二色性フィルタ３６１により、等しく、かつ、相対する量の非点収差が透過波面に付与され、それにより非点収差が互いに相殺される。したがって、検出器３４２を照射する光には非点収差は存在しない。この構成により、若干の残留コマ収差が残されるが、光学性能は、回折限界に極めて近くなっている。光の伝搬に対して、その厚さ、材料および／または角度を調整することにより、補正板を多くの代替位置に配置することができることは、当分野の技術者には理解されよう。追加対物レンズ４８およびスリット５２を使用して、任意の無ひずみスペクトル分散実施形態を構築し、図２６に示すような共焦点ストップ構造を形成することができる。図２８は、複数の画像化レンズを使用した、図２５と類似した実施形態を示したものであるが、検出器のほとんどが、二色性フィルタの透過光路に沿って配置されている。いずれの多重検出器実施形態も、図２６および図２８の両方に示すように、二色性フィルタを透過した光、二色性フィルタで反射した光、あるいは透過と反射を組み合わせた光を検出器が受光するように構築されている。
【００８８】
＜広視野分解画像＞
図２４に示すようなセグメントＴＤＩ検出器３００を使用することにより、本発明を使用して広視野を画像化し、スループットを向上させることができる。この方法により、広い平坦な流れの中、または顕微鏡スライドおよびマイクロプレート上に見出される細胞または他の対象物を隣り合わせて配向することができる。この構成により、対象物が一列配向で整列している場合に可能な数より多くの対象物を同時に画像化することができる。
【００８９】
図２３は、広い視野を容易に画像化することができる本発明の一実施形態を示した図である。図２３では、基板７３は、二色性素子２５２によって提供されるスペクトル分解の軸に概ね平行すなわち整列した方向に移動している。レーザまたは他のタイプの照明源を備えた任意選択の外部イルミネータ６０ａを使用して、基板７３上で移送される対象物を照射することができる。また、基板と画像化システムとの間には、両矢印で示す方向に相対移動が存在している。任意選択でもう１つのイルミネータ６０ｂを備え、反射表面７７で反射した光を使用して、基板上の対象物の明視野照明を提供することもできる。レンズ７１を通過した基板７３上の対象物からの光は、反射表面６９で反射し、二色性（または部分反射）ミラー６７を通過して、レンズ５７によってスリット５５に集束する。集光レンズ３２は、スリットからの光を平行にし、二色性素子２５２上に導いている。二色性素子２５２は、レンズ４０を通過する光を検出器４４の様々な領域上に個々に分散させている。
【００９０】
セグメント検出器３００（図２４）は、図２３に示す検出器４４に使用され、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２は、画像が検出器４４の両端間を移動する方向に平行な軸に沿って光を分解するべく配向されている。上述したように、図２３に示す基板７３の視野は、明視野イルミネータ６０ｂを使用して、あるいはイルミネータ６０ａによる外部照明を使用して、明視野中で照射されている。いずれの場合においても、照射された視野は、光学系によって画像化されると、検出器３００のセグメントの１つとサイズが同じになる。
【００９１】
既に説明したように、スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２を使用する場合、光は、帯域幅が異なる複数の光ビームに分割される。したがって、生成された光ビームの各々は、それぞれ異なる公称角度で導かれ、それぞれ検出器３００の異なるセグメントを照射する。スペクトル分散フィルタアセンブリ２５２によって生成される各帯域幅間の公称角度分離は、物空間内の画像化システムの視野角度を超過しており、それにより検出器上での様々な帯域幅の視野画像のオーバラップを防止している。したがって、検出器セグメントの各々は、同じ視野を見ているが、それぞれ異なるスペクトル帯域幅からなる光を見ている。スリット５５は、意図する視野以外からのあらゆる迷光を除去し、それらがシステムを通過して検出器３００の不適切なゾーンを照射することを防止するために設けられている。
【００９２】
図に示す実施形態では、セグメント化された検出器３００は、４つのセグメントすなわちゾーン３０２ａ〜３０２ｄからなり、それぞれ異なる特性の光を受光している。検出器は、入射する画像に対応する電荷が、セグメントの両端間を移動する画像に一致して、そのセグメントの両端間を流れるように、これらのゾーンにセグメント化されている。この電荷がセグメントから読み出され、隣接する、異なる特性の光が画像化されているセグメントすなわちゾーンに入ることは許容されない。任意選択で、各ゾーンによって受け取られた画像に対応する電荷が、ゾーンの長さに対して積分され、ゾーンに設けられているタップから読み出される。また、任意選択で、各ゾーンから電荷を読み出す速度を個別に制御することができる。要約すると、本発明のこの最後の実施形態により、複数の特性の光を同時に収集し、かつ分析することができるように、検出器上に広い視野が画像化され、分析される。
【００９３】
以上、本発明について、本発明を実践する好ましい形態に関連して説明したが、特許請求の範囲に記載の各請求項の技術的範囲内において、多くの変更を加えることができることは、当分野の技術者には理解されよう。したがって、本発明の範囲は、以上の説明に何ら制限されることはなく、特許請求の範囲の各請求項を参照することによってのみ決定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】粒子が図面用紙中に流れ込むものとして画かれた流体流によって運ばれる、本発明の第１実施形態の平面図である。
【図２】図１に示す第１実施形態の側面図である。
【図３】図１の第１実施形態の等角図である。
【図４】外部光の空間フィルタリングに使用されるスリットを備えた共焦点実施形態の等角図である。
【図５】光源の様々な位置を第１の実施形態と共に示す等角図である。
【図６】ＦＩＳＨプローブ間の干渉を回避するべく、粒子からの光をモニタするための画像化素子の第２のセットおよびＴＤＩ検出器を備えた、第１実施形態の代替および光源の代替位置を示す図である。
【図７】対象物が集光レンズを通過して移動するスライドによってサポートされるか、あるいは集光レンズを通過して移動するスライドを備えた実施形態の等角図であって、光源の様々な位置を示す図である。
【図８Ａ】ＴＤＩ検出器上に散乱パターンを生成するために使用される、図７の実施形態の代替の平面図である。
【図８Ｂ】ＴＤＩ検出器上に散乱パターンを生成するために使用される、図７の実施形態の代替の側面図である。
【図９】散乱パターン画像を形成する光および対象物からのスペクトル分散光が、ＴＤＩ検出器の個別部分に画像化されるさらに他の実施形態の平面図である。
【図１０】散乱パターン画像を形成する光および対象物からのスペクトル分散光が、２つの異なるＴＤＩ検出器によって画像化されるさらに他の実施形態の平面図である。
【図１１】細胞内の２つのＦＩＳＨプローブを解像するための、本発明による狭ＦＩＳＨ発光スペクトルの光たたみ込みを示す概略図である。
【図１２】ＴＤＩ検出器上のＦＩＳＨプローブの画像を解像するための、異なる２色の狭ＦＩＳＨ発光スペクトルの光たたみ込みを示す概略図である。
【図１３】ＦＩＳＨ発光スペクトルがより広い場合に、単一色の２つのＦＩＳＨプローブの画像を解像するために、本発明によって如何にして逆たたみ込みが提供されるかを示す概略図である。
【図１４】ＦＩＳＨプローブの画像を解像するための、比較的広い２色ＦＩＳＨスペクトルの逆たたみ込みを示す概略図である。
【図１５】本発明によるＴＤＩ検出器によって生成される信号を処理するために使用される画像化システムのブロック図である。
【図１６】細胞が雄からのものであるか、雌からのものであるかを決定するための本発明の使用方法を示す概略図である。
【図１７】光をスペクトル分離させるために使用される複数の二色性スタックフィルタを備えた、スペクトル分散素子を使用した代替実施形態の平面図である。
【図１８】図１７に示す実施形態に使用される二色性フィルタのいくつかの典型的な通過帯域をＸ−Ｙプロットしたグラフを示す図である。
【図１９】帯域外の光をさらに抑制するために、図１７の実施形態のＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリを示す概略図である。
【図２０Ａ】ＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリのフィルタセグメントの対応する通過帯域に対する透過率対波長をＸ−Ｙプロットしたグラフを示す図である。
【図２０Ｂ】ＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリのフィルタセグメントの対応する通過帯域に対する透過率対波長をＸ−Ｙプロットした他のグラフを示す図である。
【図２０Ｃ】ＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリのフィルタセグメントの対応する通過帯域に対する透過率対波長をＸ−Ｙプロットしたグラフを示す図である。
【図２０Ｄ】ＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリのフィルタセグメントの対応する通過帯域に対する透過率対波長をＸ−Ｙプロットした他のグラフを示す図である。
【図２０Ｅ】ＴＤＩ検出器の前段に任意選択で置かれる検出フィルタアセンブリのフィルタセグメントの対応する通過帯域に対する透過率対波長をＸ−Ｙプロットした他のグラフを示す図である。
【図２１】スペクトル分散フィルタシステムが、スペクトル分散効果を生成するために様々な角度で配向された複数の二色性キューブフィルタを備えた、図１７の構成の他の実施形態の平面図である。
【図２２】図１７のスペクトル分散フィルタシステムを使用する場合に、ＴＤＩ検出器上に投影される画像の例示的セットを示す図である。
【図２３】スペクトル分解が対象物を運んでいる基板の移動方向に概ね平行な軸に沿って発生する、さらに他の実施形態の略等角図である。
【図２４】複数の異なるスペクトル構成の光の検出および画像化に使用されるスペクトルセグメント検出器の略平面図である。
【図２５】各スペクトル分解画像のための個別ＴＤＩ検出器および個別画像化レンズを使用した代替実施形態の等角図である。
【図２６】個別ＴＤＩ検出器を使用し、スペクトル分解素子の前に共通画像化レンズが置かれた代替実施形態の等角図である。
【図２７】収束空間に配置されたプレートビームスプリッタによって誘導される非点収差を補正するために追加された補正板を示す等角図である。
【図２８】スペクトル分解素子を透過した光およびスペクトル分解素子で反射した光の両方を受光する個別ＴＤＩ検出器を使用した代替実施形態の等角図である。
【符号の説明】
【００９５】
２０，４５，７０，９０，１００，１２０  画像化システム
２２  流体流
２４  対象物
３２ａ，３２ｂ  集光レンズ
３６  プリズム
４０ａ，４０ｂ，１１４ａ，１１４ｂ，３１１〜３１５  画像化レンズ
４４，４４ａ，４４ｂ  ＴＤＩ検出器
５２  スリット
６０ａ，６０ｂ，６２，６４，７２，７４  光源
６６  外部光源
６８  部分反射器
９２，１０６，１０６’  円筒レンズ
１０２，１０２’，３０１〜３０５，３４５〜３４７，３６１  二色性フィルタ
１１２  回折格子
３２１〜３２５，３４１〜３４４  検出器
３４０  画像レンズ
３６０  補正板
【図１】
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【図２】
0005160158.tif 000003
【図３】
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【図４】
0005160158.tif 000005
【図５】
0005160158.tif 000006
【図６】
0005160158.tif 000007
【図７】
0005160158.tif 000008
【図８Ａ】
0005160158.tif 000009
【図８Ｂ】
0005160158.tif 000010
【図９】
0005160158.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
0005160158.tif 000013
【図１２】
0005160158.tif 000014
【図１３】
0005160158.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005160158.tif 000020
【図１９】
0005160158.tif 000021
【図２０Ａ】
0005160158.tif 000022
【図２０Ｂ】
0005160158.tif 000023
【図２０Ｃ】
0005160158.tif 000024
【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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