(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＮＡの単量体であって、
単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、
配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列の第１４３番目又は第１４７番目の位置に対応する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換えたアミノ酸配列を有し、但し、前記第１４３番目のアミノ酸残基が置換される場合、前記第１４３番目のアミノ酸残基はアルギニン又はリシンに置換され、前記１４７番目のアミノ酸残基が置換される場合、前記１４７番目のアミノ酸残基はアルギニンに置換され、かつ、
配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目及び第１４７番目からなる群より選ばれる１つの位置のアミノ酸残基が変更されたＰＣＮＡ単量体、
又は
配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目及び第１４７番目からなる群より選ばれる１つの位置のアミノ酸残基が変更され、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目及び第１４７番目以外の部位に、付加、挿入、置換及び欠失からなる群より選ばれる１〜１０個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列からなり、ＲＦＣの有無に関わらずＰＣＲ反応の際のＤＮＡ伸長を促進する活性を有するＰＣＮＡ単量体。
【請求項２】
前記第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目及び第１４７番目以外の部位に導入された変異の数が１〜５個である、請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体。
【請求項３】
配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列の、第７３番目の位置に対応する位置のアミノ酸残基をロイシンに換えた変異を含む、請求項１又は２に記載のＰＣＮＡ単量体。
【請求項４】
配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列の、第１４３番目の位置に対応する位置のアミノ酸残基をアルギニンに換えた変異を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＣＮＡ単量体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培地で培養し、当該形質転換体および／または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させることを特徴とする、ＰＣＮＡの製造方法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
【請求項９】
請求項８に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
【請求項１０】
ＰＣＲ用の試薬を備えた、請求項９に記載のＤＮＡ複製用キット。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行うことを特徴とする、ＤＮＡの複製方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、請求項１１に記載のＤＮＡの複製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ複製因子に関し、より詳しくは、ＤＮＡ複製を補助する機能に優れたＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ、増殖核抗原）に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子増幅技術とＰＣＲ法
ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を増幅する技術は、遺伝子工学技術等の発展に伴い、基礎研究から産業利用まで広く浸透してきている。初期には、特定の標的核酸配列を得るためには、酵母や大腸菌宿主内で増幅した核酸より、必要な配列を制限酵素で切り出して調製する方法が一般的であったが、マリスらのＰＣＲ法の開発と普及により、標的とする特定の核酸領域を試験管内で増幅する事が可能となった。ＰＣＲ法は専用装置や関連試薬の活発な商品化、販売と平行して、多様な研究上、産業上のアプリケーション開発が行われたため、実質的に遺伝子増幅技術のスタンタードとなった。ＤＮＡ複製の研究が進むにつれ、ＰＣＲとは原理を異とする種々の技術が考案・開発されてはいるが、操作性・コスト・品質上の観点から一般性は乏しくＰＣＲ法を一蹴するほどの技術は登場していない。【０００３】
ＰＣＲ法の評価ポイント
ＰＣＲ法の原理は細胞内でのＤＮＡ複製を最小限に模倣した形と考えられる。つまり、１）標的となる核酸鋳型の熱変性による解離、２）標的配列と相補的な１対のプライマーとの対合、３）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの鋳型相補的な伸長反応、である。これらの反応を連続的に繰り返すことにより、目的の核酸配列を指数関数的に増幅する。一般的なＰＣＲのプロトコルではｎｇオーダーの鋳型の数ｋｂの標的配列を２時間程度の反応でμｇオーダーまで増幅する事が多い。【０００４】
ＰＣＲ法には技術的制約があり、代表的には次の４点が挙げられる。１）鋳型に対する忠実性（鋳型に対応した正確な配列を増幅する性能）、２）伸長性（より長い配列を増幅する性能）、３）標的配列の増幅効率、４）反応特異性の４点である。同時にこれらはＰＣＲ技術を評価するポイントとして取り上げられる事も多い。これらの制約を克服することを目標にＰＣＲ用試薬・キットの開発が進められている。【０００５】
ＰＣＲの改善
初期のＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼとしては好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ・ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ）が一般的であった（非特許文献１）。本酵素を基本として、その後、さまざまなＰＣＲ用酵素もしくは試薬・キットが開発、販売されている。これらは、上述の技術制約ポイントについて改良される事が多く、これらの特徴をもつ試薬・キットが各メーカーより販売されている。以下にＰＣＲ法の改善の一例を紹介する。【０００６】
鋳型に対する忠実性を向上させる例としては、高忠実度型のＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ法に使用することが一般的である。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’ポリメラーゼ活性のみを有し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しないタイプのＰｏｌ  Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼである。これに対し、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼは５’→３’ポリメラーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両者を保持するα型ＤＮＡポリメラーゼである。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は校正活性として機能する。このため、このＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ反応に使用した場合、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しないＴａｑポリメラーゼと比較して増幅時の鋳型忠実度が飛躍的に向上する（非特許文献２）。【０００７】
このようなＤＮＡポリメラーゼのうち市販化されている製品の例としては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）がある。【０００８】
Ｂａｒｎｓらは、校正機能を保持するα型ＤＮＡポリメラーゼと校正機能を保持しないＰｏｌ  Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼを適切な比率で混合してＰＣＲ反応に使用すると、伸長可能な標的配列が長くなり、増幅効率も併せて向上する事を報告している（非特許文献３、特許文献１）。このような混合型ＤＮＡポリメラーゼで市販化されている製品例としては、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）、Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  Ｌｏｎｇ（ストラタジーン社）などがある。【０００９】
ＰＣＲの反応特異性の向上の一例としては、ホットスタート法が知られている。ＰＣＲ反応の非特異性は、主に鋳型ＤＮＡにプライマーが非特異的にアニーリングする事が原因で起こる事が多い。これを防ぐには高温下でＰＣＲ反応液の完全な混合を行なった直後にＰＣＲ反応を開始させるホットスタート法が効果的である。ホットスタート法には、数通りの方法が報告されているが、現在の主流は、ＤＮＡポリメラーゼと、その特異的抗体とで複合体を形成させて、低温条件では不活性型にしておき、ホットスタート時の高温条件ではじめて活性化させ、ＰＣＲ反応を行なうものである。この方法でＰＣＲ反応の特異性が高まる事が報告されている（特許文献２）。このホットスタート法に対応した製品も各遺伝子工学メーカーより販売され、一般的に利用されている。【００１０】
上述のＰＣＲ法の改善法はいずれも実用性があり製品化され、一般的に利用されているが、いずれも一長一短があり、前項に示したＰＣＲ法のすべての改善点を同時に満たすものではない。例えば、高忠実度型のα型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ  Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼと比較して伸長性に劣る事が多く、また、α型とＰｏｌ  Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼを混合するＰＣＲ法では、高忠実度型ＤＮＡポリメラーゼの忠実度には及ばない。すべてのポイントに優れたＤＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡ増幅系が待望されている。【００１１】
ＤＮＡ複製過程
一般にＤＮＡ複製開始には、まず複製起点の二本鎖構造が解かれている必要があるが、それにはＤＮＡヘリカーゼが必要である。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化される。さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃ（ＲＦＣ）がプライマーを認識して結合し、増殖核抗原（ＰＣＮＡ）をＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をする。そしてＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。連続合成では、そのまま長い新生鎖が合成されるが、不連続合成のほうでは、各Ｏｋａｚａｋｉ断片に付随するＲＮＡプライマーがヌクレアーゼで分解され、ＤＮＡ鎖に置きかえられた後ＤＮＡリガーゼが断片間を結合し、一本の新生鎖が完成する（非特許文献４および５）。【００１２】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとＲＦＣ
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＰＣＮＡ（以下、「Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ」または「ＰｆｕＰＣＮＡ」とも表記する）は、分子量２８.０ｋＤａで、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡは真核生物のＰＣＮＡと同様にホモ三量体を形成し、ポリメラーゼと相互作用して機能する事が報告されている（非特許文献６）。一方、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＲＦＣ（以下、「Ｐｆｕ−ＲＦＣ」または「ＰｆｕＲＦＣ」とも表記する）は、ＲＦＣＳとＲＦＣＬのサブユニット構造をとる。Ｐｆｕ−ＲＦＣＳのオープンリーディングフレームはインテインを１カ所コードし、成熟型Ｐｆｕ−ＲＦＣＳの分子量は３７．４ｋＤａである。Ｐｆｕ−ＲＦＣＬの分子量は５５．３ｋＤａである。プライマーエクステンション試験でＰｆｕ−ＲＦＣ、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの添加はＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長活性を著しく促進する事が報告されている（非特許文献７）。【００１３】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの構造と性質
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡは結晶構造解析が行われている（非特許文献８）。それによれば、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ三量体は，２つのサブユニットのａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ  βｓｔｒａｎｄ（βＩ１とβＤ２）間の主鎖の水素結合（Ｔ１０８−Ｋ１７８，Ｔ１１０−Ｅ１７６，Ｒ１１２−Ｅ１７４）により形成され、さらに、酸性・塩基性アミノ酸側鎖による分子間のイオン対ネットワークが三量体構造の維持に関与している。さらに，そのイオン対ネットワークに関与する残基（Ｎ末端側領域のＲ８２，Ｋ８４，Ｒ１０９とＣ末端側領域のＥ１３９，Ｄ１４３，Ｄ１４７）のうち、Ｄ１４３、Ｄ１４７を、中性アミノ酸であるアラニンに置換した変異体２種（ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ）とＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ））に関して調べた論文がある（非特許文献９）。論文には，ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ）とＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ）がゲルろ過で単量体の位置に溶出すること，結晶では三量体でなくＶ−ｓｈａｐｅｄ  ｄｉｍｅｒｓとして得られることのほか，プライマーエクステンション試験における活性測定結果の記述がある。それによると，ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ）はＰＣＮＡ単独時，ＲＦＣ併用時のどちらの場合もＤＮＡ合成促進活性を示さないが，ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ）はＲＦＣの有無に関わらずＤＮＡ合成促進活性を示し，かつＰＣＮＡ単独時の場合には野生型よりも優れた結果を示したとされている。【００１４】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡとＲＦＣ
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ（以下、「ＫＯＤ−ＰＣＮＡ」または「ＫＯＤＰＣＮＡ」とも表記する）とＫＯＤ−ＲＦＣ（以下「ＫＯＤ−ＲＦＣ」または「ＫＯＤＲＦＣ」とも表記する）はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ・ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ−１株より得られるＰＣＮＡとＲＦＣである。【００１５】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡについては非特許文献１２により報告されている。報告によればＫＯＤ−ＰＣＮＡは２４９残基を有し、計算上の分子量は２８．２ｋＤａである。先に報告のあるＰｆｕ−ＰＣＮＡも２４９残基を有し、両者のアミノ酸配列は８４．３％が一致している。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡはＰｆｕ−ＰＣＮＡと同様にＰＣＮＡに特徴的な全ての保存領域を保持しており、ＫＯＤ−ＰＣＮＡの結晶構造解析は行なわれていないものの、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとの高い相同性から推測してＰｆｕ−ＰＣＮＡ同様の形態でホモ三量体を形成する可能性が高いことが記されている。【００１６】
ＫＯＤ−ＲＦＣについては非特許文献１０により報告されている。報告によれば、ＫＯＤ−ＲＦＣは他のＲＦＣと同様にＲＦＣＬとＲＦＣＳのサブユニット構造をとる。ＲＦＣＬは分子量５７．２ｋＤａである。ＲＦＣＳ遺伝子はオープンリーディングフレーム中にインテインを１カ所コードし、成熟型ＫＯＤ−ＲＦＣＳの分子量は３７．２ｋＤａである。【００１７】
上述の２報はＫＯＤ−ＰＣＮＡ、ＫＯＤ−ＲＦＣをＫＯＤ−ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成系に添加した場合の効果に関しても報告している。報告によればプライマー伸長実験の場合はＫＯＤ−ＰＣＮＡを単独添加もしくはＫＯＤ−ＲＦＣとの共存下で伸長活性を促進し、ＰＣＲ反応系ではＫＯＤ−ＰＣＮＡ添加時には「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」が向上すると記されている。【００１８】
【特許文献１】米国特許第５，４３６，１４９号公報
【特許文献２】米国特許第５，３３８，６７１号公報
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｓ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１（１９８８）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｅ，ＪＣ  Ｂｒａｍａｎ，  ａｎｄ  ＨＨ  Ｈｏｇｒｅｆｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．    ２４，３５４６−３５５１（１９９６）
【非特許文献３】Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９１，２２１６−２２２０（１９９４）
【非特許文献４】Ｗａｇａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｔｉｌｌｍａｎ，  Ｂ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７，７２１−７５１（１９９８）
【非特許文献５】Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  Ｔ．Ａ．  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  （１９９２）
【非特許文献６】Ｃａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８１，６５９１−６５９９（１９９９）
【非特許文献７】Ｃａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，２６１４−２６２３（２００１）
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１０，１７−２３（２００１）
【非特許文献９】Ｍａｔｓｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １２，８２３−８３１（２００３）
【非特許文献１０】Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｎｏｖ；６７（１１）：２３７３−２３８０（２００３）
【非特許文献１１】Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｎｏｖ；６３（１１）：４５０４−４５１０  （１９９７）
【非特許文献１２】Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｏｃｔ；６６（１０）：２１９４−２２００  （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記のような状況の下、汎用性に優れ、使いやすいＤＮＡ増幅系を構築することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上述のＤＮＡ複製過程で利用される諸因子（以下、「アクセサリータンパク質」、「ＡＰ」とも表記する）とＤＮＡポリメラーゼで細胞内ＤＮＡ複製系を試験管内で再構築することにより、既存のＰＣＲ技術の欠点を克服する、新規なＤＮＡ増幅系を作成することを試みて来た。とりわけ、３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性を持ち、鋳型忠実度が高い超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、および細胞内ＤＮＡ複製系の諸因子（アクセサリータンパク質）のうち、ＤＮＡポリメラーゼと直接的に相互作用する可能性の高いＰＣＮＡとＲＦＣに着目し、鋭意研究を進めた。【００２１】
その結果、一方の単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、界面領域において単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、他方の単量体の界面領域内のアミノ酸残基と相互に電荷的反発を生じるアミノ酸残基で構成されるように調製することにより、ＲＦＣの有無にほとんど依存せず、伸長性、忠実性のバランス良くＤＮＡの伸長反応を促進し得る作用を備えたＰＣＮＡが得られるという知見を得、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下のＰＣＮＡ等を提供するものである。【００２２】
〔１〕ＰＣＮＡの単量体であって、
単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、かつ、
単量体のまま又は多量体を形成して、ＤＮＡ複製を促進する活性を備える、変異型ＰＣＮＡ単量体。
〔２〕前記ＰＣＮＡ単量体が、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列の場合における第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換えたアミノ酸配列を有し、
下記（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と、下記（ｉｉ）群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される、上記［１］に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。
（ｉ）第８２番目、８４番目および第１０９番目のアミノ酸残基群
（ｉｉ）第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群
〔３〕さらに、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目以外の部位に、付加、挿入、置換、および欠失からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含む、上記〔２〕に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。
〔４〕配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第７３番目のアミノ酸残基をロイシンに換えた配列を有する、上記〔３〕に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。
〔５〕前記（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上アミノ酸と（ｉｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸とが、双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸である、上記〔２〕から〔４〕のいずれか１項に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。
〔６〕配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第１４３番目のアミノ酸残基をアルギニンに換えた配列を有する、上記〔２〕から〔５〕のいずれか１項に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。
〔７〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕上記〔７〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
〔９〕上記〔８〕に記載の形質転換体を培地で培養し、当該形質転換体および／または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させることを特徴とする、変異型ＰＣＮＡの製造方法。
〔１０〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
〔１１〕上記〔１０〕に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
〔１２〕ＰＣＲ用の試薬を備えた、上記〔１１〕に記載のＤＮＡ複製用キット。
〔１３〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行うことを特徴とする、ＤＮＡの複製方法。
〔１４〕前記ＤＮＡの合成がＰＣＲである、上記〔１３〕に記載のＤＮＡの複製方法。【００２３】
本発明は，ＤＮＡ複製反応をより促進し得るように，ＰＣＮＡ単量体の界面領域のアミノ酸配列を特定したものである。本発明のＰＣＮＡは，菌主の異なる多数のＤＮＡポリメラーゼにも適用性があり，汎用性が高い。また，本発明のＰＣＮＡは，ＲＦＣを併用しない場合でも優れたＤＮＡ伸長促進活性を発揮する点において，従来に比し極めて特異な性能を発揮し得るものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、ＤＮＡの伸長反応を促進する、汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子が提供される。本発明により、伸長性および反応速度などの諸特性に優れたＤＮＡの伸長反応を行い得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＰＣＮＡの三量体を模式的に示す図である。
【図２】図２は、ＰＣＮＡ単量体が多量体を形成する場合に、単量体どうしの接合部となる界面領域において形成される単量体相互の分子間相互作用部位の一例を示す図である。
【図３】図３は、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
【図４】図４は、ＰＣＮＡ遺伝子発現プラスミドを示す図である。
【図５】図５は、ＰＣＮＡ（タンパク質）の調製フローを示す図である。
【図６】図６は、ＰＣＮＡタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図７】図７は、ＲＦＣＬ発現プラスミドを示す図である。
【図８】図８は、ＲＦＣＳｍ発現プラスミドを示す図である。
【図９】図９は、ＲＦＣ（タンパク質）の調製フローを示す図である。
【図１０】図１０は、ＲＦＣ標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（２ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（８．４ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図１３】図１３は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（１５．８ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図１４】図１４は、増幅長２ｋｂの場合における、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図１５】図１５は、増幅長８．４ｋｂの場合における、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図１６】図１６は、増幅長１５．８ｋｂの場合における、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図１７】図１７は、増幅長２ｋｂの場合における、ＥｘＴａｑに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図１８】図１８は、増幅長８．４ｋｂの場合における、ＥｘＴａｑに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図１９】図１９は、増幅長１５．８ｋｂの場合における、ＥｘＴａｑに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図２０】図２０は、増幅長２ｋｂの場合における、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図２１】図２１は、増幅長８．４ｋｂの場合における、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図２２】図２２は、増幅長２ｋｂの場合における、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図２３】図２３は、増幅長８．４ｋｂの場合における、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
【図２４】図２４は、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を示す図である。
【図２５】図２５は、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を示す図である。
【図２６】図２６は、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果を示す図である。
【図２７】図２７は、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
【図２８】図２８は、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子発現プラスミドを示す図である。
【図２９】図２９は、ＫＯＤ−ＰＣＮＡタンパク質の調製フローを示す図である。
【図３０】図３０は、ＫＯＤ−ＰＣＮＡタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３１】図３１は、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
【図３２】図３２は、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子発現プラスミドを示す図である。
【図３３】図３３は、ＫＯＤ−ＲＦＣＳｍ（成熟型ＲＦＣＳ）遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
【図３４】図３４は、ＫＯＤ−ＲＦＣＳ遺伝子発現プラスミドを示す図である。
【図３５】図３５は、ＫＯＤ−ＲＦＣタンパク質の調製フローを示す図である。
【図３６】図３６は、ＫＯＤ−ＲＦＣタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３７】図３７は、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに対するＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体及びＫＯＤ−ＲＦＣ添加効果を示す図である。
【図３８】図３８は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対するＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体及びＫＯＤ−ＲＦＣ添加効果を示す図である。
【図３９】図３９は、ＰＣＲ鋳型忠実性の測定フローを示す図である。
【図４０】図４０は、ＰＣＮＡタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図４１】図４１は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（２ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図４２】図４２は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（８．４ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図４３】図４３は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（１５．８ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図４４】図４４は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（２ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図４５】図４５は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（８．４ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【図４６】図４６は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔに対する各種ＰＣＮＡ変異体及びＲＦＣの添加効果（１５．８ｋｂ増幅の場合）を示す図である。
【符号の説明】
【００２６】
１：ＰＣＮＡ三量体
１０ａ、１０ｂ、１０ｃ：ＰＣＮＡ単量体
２０：ＰＣＮＡ単量体どうしの接合部
ＰＣＮＡ  ｇｅｎｅ：ＰＣＮＡ遺伝子ＯＲＦ
Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ：Ｔ７プロモーター
ｒｂｓ：リボソーム結合部位
Ｔ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ：Ｔ７ターミネーター
Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｏｒｉ：複製起点
ＲＦＣＬ  ｇｅｎｅ：ＲＦＣＬ遺伝子ＯＲＦ
ＲＦＣＳｍ  ｇｅｎｅ：成熟型ＲＦＣＳ遺伝子ＯＲＦ
Ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）、新遺伝子工学ハンドブック（村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第３版、１９９９年）、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第１版、１９９８年）、タンパク質実験ノート（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第２版、１９９９年）、タンパク質実験ハンドブック（竹縄忠臣編集、実験医学別冊、初版、２００３年８月１５日）、ＰＣＲ実験ノート（谷口武俊編集、羊土社、第１版、１９９７年）などの種々の実験マニュアルの記載が参照される。【００２８】
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。【００２９】
１．本発明のＰＣＮＡ
本発明のＰＣＮＡ単量体は、多量体形成に寄与する界面領域内における所定位置のアミノ酸残基を特定したものである。すなわち、本発明のＰＣＮＡ単量体は、界面領域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に反発しあうようなアミノ酸残基で構成される。ここで「分子間相互作用」とは、分子間に生じる物理的、化学的、あるいは電気的な相互作用のことであり、例えば、立体配座・立体構造などの分子の構造に起因する作用、並びにイオン結合、水素結合、疎水性相互作用など種々の分子間作用が含まれる。ＰＣＮＡ単量体が多量体を形成する場合、単量体相互の界面領域が引き合うもしくは接合するなどの分子間相互作用によって、多量体が形成される。一つの好ましい形態としては、分子間イオン対、もしくはイオン対ネットワークを形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構成される。そして、本発明のＰＣＮＡ単量体は、単量体のまま又は多量体を形成して、ＤＮＡ複製を促進する活性を備える。なお、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。【００３０】
ＤＮＡの複製反応に関与する因子の一つであるＰＣＮＡの多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し形成される。なお、本明細書において、Ｎ末端側領域とはタンパク質を一本の鎖として見たときにその中央よりＮ末端よりの部位を意味し、Ｃ末端側領域とは中央よりＣ末端よりの部位を意味する。真核細胞および古細菌において、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。図１にＰＣＮＡ三量体のモデルを図示した。図１に示すように、ＰＣＮＡ単量体１０ａ、１０ｂ、１０ｃが各末端領域において他の単量体と接合し、環構造上の多量体１を形成する。接合部２０は各単量体の末端領域が界面となり、その内部に単量体を結びつける分子間相互作用が形成される。図２に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＰＣＮＡの分子間相互作用のモデル図を示す。図２では、配列番号２に記載のアミノ酸配列（野生型Ｐｆｕ−ＰＣＮＡのアミノ酸配列）を有するＰＣＮＡについて説明する。一方の単量体１０ａのＮ末端側領域内に含まれるアミノ酸残基と、他方の単量体１０ｃのＣ末端側領域内とに含まれるアミノ酸残基とが分子間対を形成する。図２に示すように、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられる。【００３１】
これに対し、本発明では、分子間相互作用を生じる部位のアミノ酸残基の少なくとも一部が、積極的に相互に反発しあうように構成される。ここでいう「電荷的に反発しあう」とは、界面領域に含まれるアミノ酸残基の有する電荷によって反発しあうことをいう。したがって、そのような組み合わせとしては、界面に含まれるアミノ酸残基が、双方ともプラスにチャージしている分子で構成される場合、双方ともマイナスにチャージする分子で構成される場合が含まれる。より具体的には、アミノ酸残基が双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸により構成されることが好ましい。酸性アミノ酸としては、例えばアスパラギン酸（略号：ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（略号：ＧｌｕまたはＥ）などが挙げられる。また塩基性アミノ酸としては例えばリシン（略号：ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（略号：ＡｒｇまたはＲ）、ヒスチジン（略号：ＨｉｓまたはＨ）などが挙げられる。【００３２】
したがって、例えば、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列を有するＰＣＮＡをベースとした場合、本発明のＰＣＮＡを得るには、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸残基が変更される。本発明の好ましい形態としては、下記（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と、下記（ｉｉ）群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基とが、相互に電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される形態が例示される。
（ｉ）第８２番目、８４番目および第１０９番目のアミノ酸残基群
（ｉｉ）第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群
より具体的には、前記（ｉ）から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と、前記（ｉｉ）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基との組み合わせが、双方とも酸性アミノ酸どうしの組み合わせであるか、双方とも塩基性アミノ酸の組み合わせであることが好適である。すなわち、（ｉ）群および（ｉｉ）群の各群から少なくとも１つ選ばれるアミノ酸残基が、双方共にアスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選ばれる酸性アミノ酸である形態、および（ｉ）群および（ｉｉ）群の各群から少なくとも１つ選ばれるアミノ酸残基が、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選ばれる塩基性アミノ酸である形態などが好ましい例として挙げられる。【００３３】
ＤＮＡ複製を促進する活性（ＤＮＡ複製促進活性）は、元となる野生型のＰＣＮＡに比べてＤＮＡ複製が促進されることを意味する。具体的には、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列を有するＰＣＮＡ単量体又はその多量体よりもＤＮＡ複製促進活性が優れていることが、より好ましい。さらに他の具体的指標としては、下記実施例に示したＤＮＡ複製の活性測定方法に従って伸長性、反応速度などを測定した場合に、伸長性および反応速度ではＴａｑポリメラーゼに比べ同程度から１０倍以上まで活性を上昇させるＤＮＡ複製促進活性を備えることが好適である。【００３４】
また、本発明のＰＣＮＡとしては、上記の変異を含むアミノ酸配列を有するＰＣＮＡと実質的に同一のＰＣＮＡも含まれる。具体的には、本発明のＰＣＮＡとして、例えば、上記のような好ましいＤＮＡ複製促進活性を有し、かつ、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目以外の部位に、本発明の効果を阻害しない範囲において、付加、挿入、置換、および欠失からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含む変異型ＰＣＮＡが挙げられる。「数個」とは、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。このようなタンパク質においても、配列番号２又は３２に示すアミノ酸配列における（ｉ）群と（ｉｉ）群から選ばれる位置に対応するアミノ酸残基は、電荷的に反発しあうように構成される。すなわち、（ｉ）群および／または（ｉｉ）群の位置に係る所定のアミノ酸残基以外においても、その活性が著しく損なわれない範囲において他の変異が許容される。そのような変異としては例えば、アミノ酸残基のいわゆる保存的な置換も含まれ得る。なお、第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目以外の部位に、欠失、挿入、付加といった変異が導入された場合、変異導入後のアミノ酸酸残基の番号は、変異導入前のアミノ酸残基の番号とは異なることがあり得るが、多量体を形成する場合の界面内に位置し分子間相互作用を及ぼしあう上記（ｉ）および（ｉｉ）に示す位置に相当する限りにおいて、番号が前後しても本発明のＰＣＮＡに含まれる。上記変異型ＰＣＮＡのうち、特に、第７３番目のアミノ酸残基をロイシンに代えた置換のみを含むもの、またはそれに加えて他の変異を含むものは、容易に調製及び精製することができるため好ましい。【００３５】
本発明のＰＣＮＡがＤＮＡの複製反応を促進し得る作用・機序は必ずしも明確ではないが，多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有することにより，ＤＮＡの複製反応の繰り返しが円滑に行われ，その結果，ＤＮＡ複製反応をより促進するということが推測される。従来ＰＣＮＡは，単量体どうしが堅固に接合して多量体を形成することにより安定したクランプとしての役割を発揮し，ＤＮＡ複製促進因子として機能するとの考え方が主流であったが，この点において本発明は従来とは異なる知見を提供するものである。ＲＦＣを併用しない場合のＰＣＮＡの活性には，多量体の結合が堅固すぎるのは良くなく，特にＰＣＲのような複製反応の繰り返しの際には，環構造が温度上昇時に解除されるように弱められていることにより，野生型ＰＣＮＡのＲＦＣ併用時よりもさらに優れた促進活性を発揮するというものである。【００３６】
本発明の好ましいＰＣＮＡの具体例としては、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第１４３番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からアルギニンに換えた配列（Ｄ１４３Ｒ）を有するＰＣＮＡ単量体が挙げられる。第１４３番目のアミノ酸残基は（ｉｉ）群に属する。この場合、（ｉ）群に属する第８２番目、第８４番目、第１０９番目、のアミノ酸残基は順番にアルギニン、リシン、アルギニンであり、この分子間相互作用は、界面領域が通常よりも相反しあう状態を形成し得る。本形態のＰＣＮＡは、下記実施例に示されるように、ＤＮＡ複製反応の伸長性および反応速度などについてバランス良く特に優れた補助作用を発揮する。【００３７】
また、本発明は、上記本発明のＰＣＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。塩基配列はコドン表によりアミノ酸に演繹されるが、コドンの縮合により１つのアミノ酸配列は複数の塩基配列種によりコードされ得る。例えば、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号１又は３１に記載の塩基配列によりコードされる。したがって、本発明のポリヌクレオチドの一形態としては、下記（ａ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と（ｉｉ）群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発するようにアミノ酸残基が置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド【００３８】
（ａ）のような塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号１又は３１に記載の塩基配列において、上記所定位置のアミノ酸残基が対応する部位の塩基配列を改変することにより容易に作製可能である。また、アミノ酸の種類に基づく塩基配列の変換はコドン表に基づき容易に変換可能である。なお、本明細書でいうポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、さらにＤＮＡおよびＲＮＡのキメラ体、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド等が含まれる。【００３９】
また、下記（ｂ）のようなポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含み得る。
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし；
（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と（ｉｉ）群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基の組み合わせとなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し；かつ
上記所定のＤＮＡ複製促進活性を有するＰＣＮＡをコードするポリヌクレオチド【００４０】
ハイブリダイズする遺伝子を得るために用いることができるプローブは、例えば配列番号１又は３１に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。【００４１】
また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、「ストリンジェントな条件で」ハイブリダイズするポリヌクレオチドとして、上記（ｂ）のポリヌクレオチドは（ａ）のポリヌクレオチドに対し、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性（homology）を有することが好適である。なお、相同性の計算方法としては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷなどを用い得る。【００４２】
上記（ｂ）に示すポリヌクレオチドは、その塩基配列が翻訳されたアミノ酸配列を備えるタンパク質が、ＤＮＡ複製促進活性を有する。より具体的には、上記本発明のタンパク質について説明したのと同様のＤＮＡ複製促進活性を有する。【００４３】
上記本発明のポリヌクレオチドは、適当なベクターに組み込み、組換えポリヌクレオチドとして用いることができる。本明細書において組換えポリヌクレオチドとは、２種以上のポリヌクレオチド同士が連結されたハイブリッド分子のことである。本発明の組換えポリヌクレオチドの好ましい形態としては発現ベクターが挙げられる。発現ベクターは様々な形態のものが既に知られており、また市販されているものもある。本発明では組換えポリヌクレオチドの形態は、用途などに応じて適宜選択してよく、市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターを用いることができる。下記に限定されるものではないが発現ベクターに関連する具体例を示す。【００４４】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、市販品としてｐＢＴ  Ｖｅｃｔｏｒ，  ｐＴＲＧ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）など）、酵母由来プラスミド（例、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、枯草菌に好適に用いられるプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４など）などの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。【００４５】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。【００４６】
発現ベクターは、組換え操作についての扱いやすさの観点からマルチクローニングサイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選択マーカー、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）、ターミネーターなどを組み込むことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（カルベニシリン耐性遺伝子ともいわれる。以下、Ａｍｐと略称する場合がある）、カナマイシン耐性遺伝子（以下、Ｋａｍと略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、Ｔｅｔと略称する場合がある）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合ったシグナル配列を、本発明のランダムオリゴヌクレオチドまたはカセットのＮ端末側に付加する。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主細胞が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、Ｒａｓファルネシル化・シグナル配列などをそれぞれ利用できる。【００４７】
上記のように本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に導入し、本発明のＤＮＡポリメラーゼを発現する形質転換体を作製することができる。【００４８】
宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌細胞；酵母、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。【００４９】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、バイオリスティック導入（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ法）または感染等がある。【００５０】
形質転換体の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は多数に上るが、いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は液体培地でも寒天培地でもよく、その中には形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩（ＮａＣｌ）を含むＬＢ培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような誘導剤を添加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。【００５１】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００５２】
また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ、１９５、７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００５３】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７３巻、１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、ＣＯ2濃度の調節を行う。【００５４】
形質転換体に生成させた本発明のタンパク質は、必要に応じて、タンパク質精製の定法により、精製、単離することができる。以上のようにして、形質転換体を用いて、本発明のＰＣＮＡを得ることができる。【００５５】
２．本発明のＰＣＮＡを用いたＤＮＡの複製方法
本発明のＤＮＡ複製方法は、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行うことを特徴とする。ＤＮＡの合成方法としては、ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成、などが挙げられる。【００５６】
本発明のＤＮＡ複製方法としては、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が好適な形態として挙げられる。ＰＣＲにおいては、プライマーと鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡ複製を繰り返し、幾何級数的にＤＮＡを増幅させる。そのため、ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼに対するクランプとしての機能を果たすと共に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で安定した後または所定領域の増幅後には鋳型から速やかに外れることが望ましく、本発明のＰＣＮＡがこのような特性を備えているものと推察される。【００５７】
本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高い。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつＤＮＡ複製活性が増強され得る。本発明のＤＮＡ複製方法において用いるＤＮＡポリメラーゼとして好ましくは、例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、およびＰｗｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどに適用し得る。また、本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが、伸長性に劣るタイプのα型ポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。【００５８】
本発明のＤＮＡ複製方法においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから，反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。ＲＦＣ標品は一般には市販されておらず，その調製は手間を要する。ＲＦＣ標品が利用できるとしても，添加して使用する場合には，ＲＦＣ以外のＤＮＡ複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であるが，本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また，特にＰＣＲでの使用の場合には，本発明のＰＣＮＡはＲＦＣを併用しなくとも，野生型ＰＣＮＡとＲＦＣの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。【００５９】
また、ＰＣＲの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。ＰＣＲの条件としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量、ＰＣＲの反応時間、反応溶液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液のｐＨ、投入する鋳型ポリヌクレオチドの量などの種々の条件が調整される。【００６０】
３．試薬キット
本発明の試薬キットは、上記本発明のＰＣＮＡおよび必要に応じその他の試薬類を含むＤＮＡ複製用の試薬キットである。本発明のＰＣＮＡは、単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含む形態で、ＤＮＡ複製用試薬の一成分として好適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明のＰＣＮＡがＰＣＲにおいて特に好適に用い得るため、ＰＣＲ用の試薬キットとして特に好適である。【００６１】
本発明の試薬キットに備えられるＰＣＮＡはどのような形態であってもよく、精製タンパク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド、あるいはこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説明したとおりである。また、本発明のＰＣＮＡと他のＰＣＮＡを組み合わせてもよい。また、本発明のＰＣＮＡが、組換えＤＮＡまたは形質転換体の形態で提供される場合には、本発明のＰＣＮＡを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、本発明のＰＣＮＡを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般に用いられる他の成分や媒体を配合してもよい。
【実施例】
【００６２】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。【００６３】
１：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ・ＲＦＣタンパク質の調製
ＰＣＮＡ変異体タンパク質標品とＲＦＣタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子を大量発現させ、発現菌体よりタンパク質を精製することにより調製した。【００６４】
１．１：菌体入手・ゲノムＤＮＡ調製
１．１．１：Ｐｆｕ菌体入手・ゲノムＤＮＡ調製
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ３６３８株をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（英名：Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、住所：Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。ＤＳＭ３６３８株を、文献（Ｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：２５９−２６５（１９９３））に記載の方法に従って培養した。５００ｍＬの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これをバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍＬにけん濁し、１０％ＳＤＳを１ｍＬ加えた。撹拌の後、プレテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍＬのＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲｎａｓｅＡを加えて３７℃で６０分反応させた。その後、反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを回収した。【００６５】
１．２：ＰＣＮＡ遺伝子クローニング
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに登録されている塩基配列情報ＡＢ０１７４８６（配列番号１および２）を参考とし、ＰＣＲを利用したクローニング（図３）によって獲得した。以下に詳細を説明する。【００６６】
１．２．１：ＰＣＲプライマー
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子の増幅用には、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ−Ｆ、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ−Ｒを使用した。これらの配列はＰＣＮＡ遺伝子の開始メチオニンから終止コドンに相当する領域を増幅し、さらに５’側に制限酵素ＮｄｅＩ認識部位、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位が付加するように設計されている。それぞれのプライマーの配列は表１（配列番号３および４）に示した。【００６７】
【表１】
0005308027.tif 000002
【００６８】
１．２．２：鋳型ＤＮＡ
ＰＣＲの鋳型としては上記１．１．１で調製したＰｆｕゲノムＤＮＡを使用した。【００６９】
１．２．３：ＰＣＲ反応液組成
ＰＣＲ反応液は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
鋳型ＤＮＡ：  １００ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*：  １．２５Ｕ
１０ｘＥｘＴａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【００７０】
１．２．４：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【００７１】
１．２．５：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で８００ｂｐ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【００７２】
１．２．６：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。【００７３】
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【００７４】
１．２．７：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分にはＰｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し５’端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列が付加されている事が確認された。Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミドベクターをｐＵＣ／ＰＰＣと命名することとした。【００７５】
１．３：ＰＣＮＡ発現プラスミド作製
ｐＵＣ／ＰＰＣを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断しＰＣＮＡ遺伝子断片を調製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの発現ベクターを作製した。【００７６】
１．３．１：ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片調製
ｐＵＣ／ＰＰＣを以下の反応系で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【００７７】
プラスミドＤＮＡ：  ５μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【００７８】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で３０分間制限酵素切断をおこなった。反応終了後、２％アガロースゲル電気泳動を行った、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子に相当するバンド（約８００ｂｐ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【００７９】
１．３．２：ｐＥＴ−２１ａ発現ベクター
ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡ（米国ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【００８０】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【００８１】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【００８２】
１．３．３：ライゲーション反応と形質転換
上記で得たＰｆｕ−ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【００８３】
ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【００８４】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【００８５】
１．３．４：シーケンシングによる配列確認
上記組換えプラスミドにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチクローニング部位のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部分にＰｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が完全に挿入されていた。このＰｆｕ−ＰＣＮＡ遺伝子を保持するプラスミドをｐＰＰＣＮＡと呼ぶこととした（図４）。【００８６】
図４に示すように、ｐＰＰＣＮＡではｐＥＴ−２１ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、ＰＣＮＡ遺伝子ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドがＰＣＮＡ遺伝子を大量発現することが期待された。【００８７】
１．４：ＰＣＮＡ遺伝子への変異導入
より高機能なＰＣＮＡを作製する目的でＰｆｕ−ＰＣＮＡに対してアミノ酸置換を行なった。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードするコドンの塩基を置換することにより行った。表２に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。【００８８】
【表２】
0005308027.tif 000003
【００８９】
１．４．１：置換変異導入
ＰＣＮＡ遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア（表３、配列番号５〜１２）、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を利用し、同操作マニュアルに従って行った。【００９０】
【表３】
0005308027.tif 000004
【００９１】
変異導入後にはシーケンシングによりＤＮＡ配列確認し、目的部位に変異導入され、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各ＰＣＮＡ変異体設計について説明する。【００９２】
１．４．１．１：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡについての報告（非特許文献６）によれば、天然型のＰｆｕ−ＰＣＮＡを大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来の開始Ｍｅｔからの翻訳タンパク質以外に、Ｎ末端が７３残基目からスタートする約２０ｋＤａのタンパク質が副産物として生成され、７３残基目のＭｅｔをＬｅｕに遺伝子工学的手法を用いて１残基置換した場合、この約２０ｋＤａのタンパク質が生成が抑えられることが報告されている。また、このように作製されたＰｆｕ−ＰＣＮＡは、野生型ＰＣＮＡタンパク質とかわらない性質を有している事が併せて報告されている。これらの事実よりＰｆｕ＿Ｍ７３Ｌの変異を準野生型として本明細書では取り扱う。【００９３】
このＰｆｕ＿Ｍ７３Ｌの変異体をＰｆｕ−ＰＣＮＡ０１とし、変異体を作製した。Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１の作製は、鋳型プラスミドをｐＰＰＣＮＡとし変異導入用オリゴペア（Ｐｆｕ＿Ｍ７３Ｌ−ＦとＰｆｕ＿Ｍ７３Ｌ−Ｒ）を使用して行った。【００９４】
１．４．１．２：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１０
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１０はＰｆｕ−ＰＣＮＡ０１の１４３残基目のアミノ酸をＤからＡに一残基置換した変異であり、Ｍａｔｓｕｍｉｙａ（非特許文献９）により構造と性質が報告されている。報告によれば、１４３残基目のアスパラギン酸はＰｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し、三量体形成に関与するアミノ酸の一部であり、この１４３残基目のアスパラギン酸をアラニンに変換した結果、三量体形成は阻害されるもののＤＮＡポリメラーゼ活性刺激自体は維持されることが報告されている。【００９５】
このＤ１４３ＡとＭ７３Ｌの二重変異を持つＰＣＮＡ変異体をＰｆｕ−ＰＣＮＡ１０とし、作製にあたってはＰｆｕ−ＰＣＡＮＡ０１産生プラスミドを鋳型としてＰｆｕ＿Ｄ１４３Ａ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４３Ａ−Ｒの変異導入用オリゴを使用した。【００９６】
１．４．１．３：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１２
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１２は８２残基目のアミノ酸をＲからＣに一残基置換した変異であり、Ｍａｔｓｕｍｉｙａ（非特許文献９）によれば、８２残基目のアルギニンはＰｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置することが報告されている。【００９７】
このＲ８２ＣとＭ７３Ｌの二重変異を持つＰＣＮＡ変異体をＰｆｕ−ＰＣＮＡ１２とし、作製にあたってはＰｆｕ−ＰＣＡＮＡ０１産生プラスミドを鋳型としてＰｆｕ＿Ｒ８２Ｃ−ＦとＰｆｕ＿Ｒ８２Ｃ−Ｒの変異導入用オリゴを使用した。【００９８】
１．４．１．４：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１３
１４３残基目をアルギニン（塩基性アミノ酸）にかえる事で、準野生型（Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１）のアスパラギン酸（酸性アミノ酸）やＰｆｕ−ＰＣＮＡ１０のアラニン（中性アミノ酸）と電気的性質を全く変える事により、ＰＣＮＡの三量体形成能を積極的に阻害した場合のＤＮＡ複製への影響を調べる目的で作製した。具体的には、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として、Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【００９９】
１．４．１．５：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１６
三量体に形成に関連の可能性の高い２種のアミノ酸、８２残基目のアルギニンと１４３残基目のアスパラギン酸の２つのアミノ酸を同時に変異させる事での、効果を調べる目的で作製した。具体的には、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１２産生プラスミドを鋳型として、Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１００】
１．４．１．６：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７０
１４３残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として，１４３残基目のアミノ酸をリシン（塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。同じ塩基性アミノ酸でもアルギニンの側鎖のグアニジニウム基のｐＫR値は１２．４８，リシンの側鎖のブチルアンモニウム基のｐＫR値は１０．５４であり，リシンの方が塩基性が低い。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｋ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４３Ｋ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０１】
１．４．１．７：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７１
１４３残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として，１４３残基目のアミノ酸をヒスチジン（塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。ヒスチジンの側鎖のｐＫR値は６．０で，生理的ｐＨで解離する。ヒスチジンはｐＨ６．０でイミダゾール基の５０％が電荷をもつ型，残る５０％が電荷をもたない型なので，生理的ｐＨ範囲でもｐＨが高めの方では中性となる。よって置換導入するアミノ酸として，アルギニンやリシンとは異なる性質が予想される。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｈ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４３Ｈ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０２】
１．４．１．８：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７２
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与するアミノ酸の一部である１０９残基目のアルギニン（塩基性アミノ酸）をグルタミン酸（酸性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｒ１０９Ｅ−ＦとＰｆｕ＿Ｒ１０９Ｅ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０３】
１．４．１．９：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７７
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与するアミノ酸の一部である１４７残基目のアスパラギン酸（酸性アミノ酸）をアルギニン（塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｄ１４７Ｒ−ＦとＰｆｕ＿Ｄ１４７Ｒ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０４】
１．４．１．１０：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７８
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与するアミノ酸の一部である１３９残基目のグルタミン酸（酸性アミノ酸）をアラニン（中性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ａ−ＦとＰｆｕ＿Ｅ１３９Ａ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０５】
１．４．１．１１：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ７９
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与するアミノ酸の一部である１３９残基目のグルタミン酸（酸性アミノ酸）をアルギニン（塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは，Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として，Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ｒ−ＦとＰｆｕ＿Ｅ１３９Ｒ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した。【０１０６】
１．４．２：発現株の作製
以上のように取得した変異型ＰＣＮＡ発現プラスミドベクターにより大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸菌株を得た。【０１０７】
１．４．３：菌体培養と発現誘導
各変異ＰＣＮＡ発現株を１．５リットルＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて、３７℃で振とう培養を行った。対数増殖期のＯＤ600が０．３−０．５の時期に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約３時間行った。培養後の菌体は遠心分離（４℃、６，０００ｘｇ、６分）によって回収した。【０１０８】
１．４．４：ＰＣＮＡタンパク質精製（図５）
図５に示すように、菌体を遠心回収し（Ｓ５１）、菌体破砕（超音波破砕、Ｓ５２）、５分間煮沸し（Ｓ５３）、ポリエチレンイミン沈澱を行い（Ｓ５４）、さらに硫安沈澱を行い（Ｓ５５）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ５６、カラムとしてＨｉＴｒａｐ  Ｑを使用）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓ５７、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００を使用）という処理により標品を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、良好に精製されたことを確認した。【０１０９】
１．４．４．１：菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は２５ｍＬのバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ，  ２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，  １０％  グリセロール）またはバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、  ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、  １０％  グリセロール、  ０．５ｍＭ  ＤＴＴ）によりけん濁した。超音波処理により菌体を破砕した。【０１１０】
１．４．４．２：加熱処理
菌体破砕液を５分間煮沸した後、遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）を行い、上清を回収した。【０１１１】
１．４．４．３：ポリエチレンイミン沈澱
上清液に対しポリエチレンイミン（ＳＩＧＭＡ  Ｐ−３１４３）とＮａＣｌをそれぞれ終濃度０．２％（ｗ／ｖ）、０．５８Ｍになるように添加し、氷上で３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離（１８，５００×ｇ，２５分，４℃）して，上清を回収した。【０１１２】
１．４．４．４：硫安沈澱
上清１０ｍＬあたり硫酸アンモニウム５．６１ｇを添加し（終濃度８０％）、氷上で３０分撹拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を８０％飽和させた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファー８０ｍＬを添加して、遠心分離（３０，０００  ｘ  ｇ，  ２５分，  ４℃）により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファーＣ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解し、おなじくバッファーＣに対して透析を行った。【０１１３】
１．４．４．５：イオン交換クロマトグラフィー
透析したサンプルは、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ０１，１０，１２，１３，１６に関しては、ＦＰＬＣタンパク質精製システム（アマシャムバイオサイエンス社）を、その他のＰｆｕ−ＰＣＮＡ７０，７１，７２，７７，７８，７９に関しては、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ；アマシャムバイオサイエンス社）を実施した。溶離条件は、０．１−０．８Ｍ  ＮａＣｌ／１７．５ｍＬのリニアグラジエントとし、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。【０１１４】
１．４．４．６：ゲルろ過クロマトグラフィー
ＨｉＴｒａｐ  Ｑイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（アマシャムバイオサイエンス社）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、以降のアッセイ用標品とした。【０１１５】
得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび良好に精製されたことが確認された（図６及び図４０）。【０１１６】
１．５：Ｐｆｕ−ＲＦＣ遺伝子クローニング
ＲＦＣは２つのサブユニットＲＦＣＬとＲＦＣＳから構成されており、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓゲノム上ではタンデムに位置している。ＲＦＣタンンパク質標品の調製にあたっては、ＲＦＣＬとＲＦＣＳ遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同一宿主内に各々の発現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プラスミドの作製にあたっては非特許文献７を参照した。以下に詳細を示す。【０１１７】
１．５．１：ＲＦＣＬの遺伝子クローニングと発現プラスミド作製
Ｐｆｕ−ＲＦＣＬ遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ１４６７９２１）はＰｆｕゲノムを鋳型としたＰＣＲにより得た（塩基配列、配列番号１３；  アミノ酸配列、配列番号１４）。ＰＣＲ用プライマーとして、ＲＦＣＬ−ＦプライマーとＲＦＣＬ−Ｒプライマーを使用した（表４；配列番号１５および１６）。クローニング操作の都合上、ＲＦＣＬ−Ｆプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ認識部位、ＲＦＣＬ−Ｒプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位をそれぞれ付加した。【０１１８】
【表４】
0005308027.tif 000005
【０１１９】
ＰＣＲの鋳型としては上記１．１で調製したＰｆｕゲノムＤＮＡを使用した。【０１２０】
ＰＣＲ反応は、次の組成で行った。（５０μＬ反応系への添加量）
鋳型ＤＮＡ；１００ｎｇ
プライマー；各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ；各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*；１.２５Ｕ
１０Ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー；５μＬ
以上に滅菌蒸留水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【０１２１】
１．５．１．１：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０１２２】
１．５．１．２：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で１．４ｋｂ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０１２３】
１．５．１．３：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。【０１２４】
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０１２５】
１．５．１．４：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分にはＰｆｕ−ＲＦＣＬ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し５’端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列が付加されている事が確認された。このプラスミドをｐＵＣ１１８／ＲＦＣＬとした。【０１２６】
１．５．１．５：ＲＦＣＬ発現プラスミド作製
ｐＵＣ１１８／ＲＦＣＬを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断しＲＦＣＬ遺伝子断片を調製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、Ｐｆｕ−ＲＦＣＬの発現ベクターを作製した。【０１２７】
１．５．１．６：ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片調製
ｐＵＣ１１８／ＲＦＣＬを以下の反応系で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０１２８】
プラスミドＤＮＡ：  ５μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０１２９】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間、制限酵素切断をおこなった。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、Ｐｆｕ−ＲＦＣＬ遺伝子に相当するバンド（約１．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０１３０】
１．５．１．７：ｐＥＴ−２９ａ発現ベクター
ｐＥＴ−２９ａベクターＤＮＡ（ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０１３１】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０１３２】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２９ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０１３３】
１．５．１．８：ライゲーション反応と形質転換
上記で得たＰｆｕ−ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【０１３４】
ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【０１３５】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０１３６】
１．５．１．９：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２９ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれのプラスミドＤＮＡについてもマルチクローニング部位のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部分にＰｆｕ−ＲＦＣＬ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が完全に挿入されていた。Ｐｆｕ−ＲＦＣＬ遺伝子を保持するプラスミドをｐＲＦＣＬと呼ぶこととした（図７）。【０１３７】
図７に示すように、ｐＲＦＣＬではｐＥＴ−２９ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、ＲＦＣＬ遺伝子ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドがＲＦＣＬ遺伝子を大量発現することが期待された。【０１３８】
１．５．２：ＲＦＣＳ遺伝子のクローニングと発現プラスミド作製
Ｐｆｕ−ＲＦＣＳ遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１４６７９２２）は非特許文献７によれば、インテイン（１，５７５塩基によりコード）を１個所保持し、Ｎ端のエクステインは１７７塩基、Ｃ端のエクステインは８０４塩基にコードされていることが報告されている（終始コドンは含まず）。配列番号１７および１８にＰｆｕ−ＲＦＣＳの塩基配列およびアミノ酸配列（いずれもインテイン部分を含む）を示す。【０１３９】
ＲＦＣＳ発現ベクター作製にあたっては、まず、インテインを含むＰｆｕ−ＲＦＣＳ遺伝子全長をＰＣＲ反応を利用して増幅し、その後、インテインを除去した成熟型ＲＦＣＳ（ＲＦＣＳｍとも呼ぶ）を調製した。インテイン除去は、Ｎ端側とＣ端側のエクステインを個別にＰＣＲで増幅した後に、２種のエクステイン断片をＰＣＲ反応により融合する事により実施した。【０１４０】
１．５．２．１インテインを含むＲＦＣＳ遺伝子のＰＣＲ反応
Ｐｆｕゲノム（上記１．１で調製）、ＲＦＣＳ−Ｆ、ＲＦＣＳ−Ｒプライマー（表５；配列番号１９、２０）の組合せでＰＣＲ反応を行なった。【０１４１】
【表５】
0005308027.tif 000006
【０１４２】
ＰＣＲ反応液は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
鋳型ＤＮＡ：  １００ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*：  １．２５Ｕ
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【０１４３】
１．５．２．２：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０１４４】
１．５．２．３：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で２．６ｋｂ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０１４５】
１．５．２．４：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。【０１４６】
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０１４７】
１．５．２．５：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分はインテインを含むＲＦＣＳ遺伝子と一致した。このプラスミドをｐＵＣ／ＲＦＣＳとした。【０１４８】
１．５．２．６：エクステイン増幅用プライマー
Ｎ端側エクステイン用ＰＣＲプライマーとして、ＲＦＣＳＦ１プライマー、ＲＦＣＳＲ２プライマー（表５；配列番号２１、２３）を準備した。また、Ｃ端側エクステイン用ＰＣＲプライマーとして、ＲＦＣＳＦ２プライマー、ＲＦＣＳＲ１プライマー（表５；配列番号２２、２４）を準備した。クローニングを容易にする目的でＲＦＣＳＦ１プライマーには制限酵素ＮｄｅＩ配列、ＲＦＣＳＲ１プライマーには制限酵素ＳａｌＩ配列を５'端に付加してある。また、２種のエクステイン断片をＰＣＲ反応により融合する際に利用する相補的な配列をＲＦＣＳＦ２プライマーとＲＦＣＳＲ２プライマーに設けた。【０１４９】
２種のエクステイン増幅のためのＰＣＲ反応は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
ｐＵＣ／ＲＦＣＳ  ＤＮＡ：  ５０ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*：  １．２５Ｕ
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【０１５０】
１．５．２．７：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０１５１】
１．５．２．８：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った。ＲＦＣＳＦ１プライマーとＲＦＣＳＲ２プライマーセットのＰＣＲ産物では約１８０塩基のバンドが、ＲＦＣＳＦ２プライマーとＲＦＣＳＲ１プライマーセットのＰＣＲ産物では約８００塩基のバンドが観察された。紫外線照射下でそれぞれのバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０１５２】
１．５．２．９：ＰＣＲ融合反応
２種のエクステインＰＣＲ産物を１チューブ内で1組のプライマーセットでＰＣＲ反応に供する事で２種の断片を融合し、成熟型ＲＦＣＳをコードする遺伝子断片を得た。以下に詳細を示す。【０１５３】
２種のエクステインＰＣＲ産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
Ｎ端エクステイン断片：  ２μＬ（５０ｎｇ相当）
Ｃ端エクステイン断片：  ２μＬ（５０ｎｇ相当）
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して４４.５μＬとした。
上記を９５℃・３ｍｉｎ加熱し、３７℃まで３０分間でゆっくりと冷却した。【０１５４】
上記反応液に以下を添加する
ｄＮＴＰ：  ５μＬ（各１０ｎｍｏｌ）
ＥＸ  Ｔａｑ*：  ０.５μＬ（２.５Ｕ）
これを７２℃・１０ｍｉｎ反応させる。
（*タカラバイオ社製）【０１５５】
上記に、ＲＦＣＳＦ１プライマーとＲＦＣＳＲ１プライマーを各１０ｐｍｏｌ添加し、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０１５６】
１．５．２．１０：ＰＣＲ産物の制限酵素切断・精製
上記ＰＣＲ反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製したＤＮＡ断片は制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで二重切断した。
ＰＣＲ産物：  １μｇ相当
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＳａｌＩ：  ５ユニット
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間制限酵素切断をおこなった。反応終了後、２％アガロースゲル電気泳動を行った、２種のインテインの融合断片（成熟型ＲＦＣＳコード配列）と想定されるバンド（約１ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用し精製した。【０１５７】
１．５．２．１１：ｐＥＴ−２１ａ発現ベクターの制限酵素切断
ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡ（ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで二重切断した。【０１５８】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＳａｌＩ：  ５ユニット【０１５９】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０１６０】
１．５．２．１２：ライゲーション反応と形質転換
上記で得た２種のインテインの融合断片（成熟型ＲＦＣＳコード配列）と予測される約１ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【０１６１】
１ｋｂＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【０１６２】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０１６３】
１．５．２．１３：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチクローニング部位のＮｄｅＩとＳａｌＩ部分にインテインを除去した成熟型のＲＦＣＳｍの配列（９８４塩基）が確認された（ｐＲＦＣＳｍと命名）。【０１６４】
図８に示すように、ｐＲＦＣＳｍではｐＥＴ−２１ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、成熟型ＲＦＣＳ遺伝子ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドが成熟型ＲＦＣＳ遺伝子を大量発現することが期待された。【０１６５】
１．６：Ｐｆｕ−ＲＦＣ遺伝子発現株の作製
ｐＲＦＣＬとｐＲＦＣＳｍで大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを同時に形質転換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質転換体を選択し発現株を得た。【０１６６】
１．７：Ｐｆｕ−ＲＦＣ遺伝子発現
上記の発現株を１．５リットルＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有），３７℃にて振とう培養を行った。対数増殖期のＯＤ600が０．３−０．５の時期に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約３時間行った。培養後の菌体は遠心分離（４℃、６，０００ｘｇ、６分）によって回収した。【０１６７】
１．８：Ｐｆｕ−ＲＦＣタンパク質精製
図９に示すように、菌体を遠心回収し（Ｓ９１）、超音波破砕により菌体を破砕し（Ｓ９２）、５分間煮沸処理し（Ｓ９３）、ポリエチレンイミン沈澱を行い（Ｓ９４）、硫安沈澱を行い（Ｓ９５）、アフィニティークロマトグラフィー（Ｓ９６、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎを使用）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓ９７、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００を使用）処理にて標品を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認では、９０％以上の純度を確保できた。【０１６８】
１．８．１：菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は２５ｍＬのバッファーＢ（前出）によりけん濁した。超音波処理により菌体を破砕した。【０１６９】
１．８．２：加熱処理
菌体破砕液を５分間煮沸した後、遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）を行い、上清を回収した。【０１７０】
１．８．３：ポリエチレンイミン沈澱
上清液に対しポリエチレンイミン（ＳＩＧＭＡ  Ｐ−３１４３）を終濃度０．１８％（ｗ／ｖ）になるように添加し、氷上で３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離（18,500×g，25分，4℃）して，上清を回収した。【０１７１】
１．８．４：硫安沈澱
上清１０ｍＬあたり硫酸アンモニウム５．６１ｇを添加し（終濃度８０％）、氷上で３０分撹拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファーＣ（前出）に溶解し、おなじくバッファーＣに対して透析を行った。【０１７２】
１．８．５：アフィニティークロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルはＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して精製した。【０１７３】
溶離条件は、０．１−０．８Ｍ  ＮａＣｌ／１７．５ｍＬのリニアグラジエントとし、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。【０１７４】
１．８．６：ゲルろ過クロマトグラフィー
ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎアフィニティークロマトグラフィーでのピーク画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（前出）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アッセイ用の標品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび良好に精製されたことが確認された（図１０）。【０１７５】
２：ＰＣＮＡ変異体の評価
上記で調製した各種ＰＣＮＡ変異体のＤＮＡ増幅系への効果、とくにＰＣＲ反応系への効果を調べた。具体的にはＰＣＲ反応系にＰＣＮＡ変異体、ＲＦＣを単独もしくは併用して添加した場合、未添加の場合でＰＣＲ反応を行い、その反応産物を電気泳動に供して標的領域の増幅状態を比較することで行った。【０１７６】
２．１：各種ＰＣＮＡ変異体の評価
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡ合成酵素として市販されているＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を対象として各種ＰＣＮＡ変異体の添加効果をＰＣＲ反応の系を利用して調べた。Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｓｐ．由来の３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（ｐｒｏｏｆ  ｒｅａｄｉｎｇ活性）を有する耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼや、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。【０１７７】
２．１．１：反応液組成
アクセサリータンパク質（ＡＰとも記す）を添加する点を除いては標準的なＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては添付反応バッファー（１０ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ；組成は未公表、タカラバイオ社）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。なお鋳型ＤＮＡとしてはラムダＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ０２４５９）を使用した。【０１７８】
【表６】
0005308027.tif 000007
【０１７９】
【表７】
0005308027.tif 000008
【０１８０】
２．１．２：ＰＣＲ反応プログラム
２ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・１ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０１８１】
８．４ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・３．５ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０１８２】
１５．８ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・７ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０１８３】
２．１．３：電気泳動
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を、増幅した断片の大きさごとに、それぞれ図１１〜図１３（ＰＣＮＡ０１，１０，１２，１３，１６）、図４１〜４３（ＰＣＮＡ０１，１０，１３，７０，７１）及び図４４〜４６（ＰＣＮＡ１３，７２，７７，７８，７９）に示す。【０１８４】
【表８】
0005308027.tif 000009
【０１８５】
【表９】
0005308027.tif 000010
【０１８６】
２．１．４：結果１
図１１〜１３の結果について述べる。
ＰＣＮＡ０１
増幅サイズが２ｋｂ，８．４ｋｂの際は、ＲＦＣを４００ｎｇ添加した時にのみ、増幅がみられるが、その他の場合ではＰＣＮＡ０１の添加は未添加（ｎｏ  ＡＰ）の場合と比較して阻害的に働いている。これは，野生型ＰＣＮＡを使用する際には，ＲＦＣを適当量併用しなければ増幅ができないという結果であり，単独添加でＤＮＡ合成促進活性を示すプライマーエクステンション試験結果（非特許文献６および９）と異なり，ＰＣＲにおいては野生型ＰＣＮＡの単独添加は反応を明確に阻害することを示している。【０１８７】
ＰＣＮＡ１０
増幅サイズが２ｋｂ、８．４ｋｂの際は、ＲＦＣを２００ｎｇ、４００ｎｇ添加した時に増幅がみられるが、１５．８ｋｂの場合にはＲＦＣ４００ｎｇ添加時のみ増幅が観察される。増幅量はＰＣＮＡ０１の場合より優れているが、ＰＣＮＡ０１同様にＲＦＣの存在が必要で、増幅サイズによってＲＦＣの至適添加量が異なることが示唆される。【０１８８】
ＰＣＮＡ１２
増幅サイズ２ｋｂ、８．４ｋｂ、１５．８ｋｂのいずれの場合でも、ＲＦＣ添加することで増幅量が促進されることが観察された。またＲＦＣ未添加においても増幅した。ただしＰＣＲ酵素単独に比べて、若干の増幅促進しか観察されていない。【０１８９】
ＰＣＮＡ１３
増幅サイズ２ｋｂ、８．４ｋｂ、１５．８ｋｂのいずれの場合でも大量の増幅が確認され、増幅量はＲＦＣの添加量に依存しない。ＰＣＮＡ１３の添加効果にはＲＦＣを必要とせず、ＰＣＲによる増幅を顕著に促進していると考えられる。【０１９０】
ＰＣＮＡ１６
増幅サイズ２ｋｂ、８．４ｋｂ、１５．８ｋｂのいずれの場合でも増幅が確認される。ＲＦＣ未添加においても増幅したが、ＰＣＲ酵素単独と同等の増幅レベルである。またＲＦＣ添加の効果が余り観察されない。【０１９１】
５種のＰＣＮＡについてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用するＰＣＲ反応系への添加効果の確認をおこなったが、ＰＣＮＡ１３については未添加時と比較して、圧倒的に添加時の増幅効果が高く、また、ＲＦＣの添加を必要としないことが判明した。【０１９２】
２．１．５：結果２
図４１〜４３の結果について述べる。
ＰＣＮＡ０１（準野生型）
２．１．４での結果と同様に、ＲＦＣを４００ｎｇ添加した場合以外はいずれのサイズにおいても増幅が認められず、ＰＣＮＡ未添加（ｎｏ  ＡＰ）の場合と比べて阻害的に作用した。【０１９３】
ＰＣＮＡ１０（Ｄ１４３Ａ）
増幅サイズが２ｋｂの場合はＲＦＣを２００−４００ｎｇ、８．４ｋｂの場合は４００ｎｇ添加した時に明瞭な増幅がみられ、１５．８ｋｂの際はＲＦＣ４００ｎｇ添加でも増幅は認められなかった。２．１．４での結果と同様に、増幅量としてはＰＣＮＡ０１よりも優れているが、増幅にはＲＦＣの存在が必須で、増幅サイズによってＲＦＣの至適添加量が異なることが示唆された。【０１９４】
ＰＣＮＡ７１（Ｄ１４３Ｈ）
ＲＦＣ未添加では増幅が認められなかったが、増幅サイズが２ｋｂと８．４ｋｂの場合はＲＦＣ２００−４００ｎｇ、１５．８ｋｂの場合はＲＦＣを４００ｎｇ添加した場合に増幅が認められた。ＰＣＮＡ１０に比べて増幅量はさらに多くなっているものの、増幅にはＲＦＣの添加が必要であった。【０１９５】
ＰＣＮＡ７０（Ｄ１４３Ｋ）
ＲＦＣの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察された。【０１９６】
ＰＣＮＡ１３（Ｄ１４３Ｒ）
２．１．４での結果と同様に、いずれのサイズにおいてもＲＦＣに依存せずに大量の増幅が観察され、増幅レベルはＰＣＮＡ７０よりも良好であった。【０１９７】
ＰＣＮＡの１４３残基目に変異を導入した変異体４種（ＰＣＮＡ１０、１３、７０、７１）についてＰＣＲ反応系への添加効果を検証したが、ＲＦＣに依存しない促進効果を示したのはＰＣＮＡ７０（Ｄ１４３Ｋ）とＰＣＮＡ１３（Ｄ１４３Ｒ）のみで、より塩基性度の高いアルギニン残基に置換したＰＣＮＡ１３が最も強い促進効果を示した。従って、Ｄ１４３残基への変異導入によりＰＣＮＡ単独でのＰＣＲ促進効果をもたらすためには、塩基性を示すアミノ酸残基への置換が必要で、その置換した残基がＰＣＲ反応条件下（ｐＨ８．０〜）で有する正電荷が、単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引き起こすことが重要であるものと考えられる。【０１９８】
２．１．６：結果３
図４４〜４６の結果について述べる。
ＰＣＮＡ１３（Ｄ１４３Ｒ）
２．１．４、２．１．５での結果と同様に、いずれのサイズにおいてもＲＦＣに依存せずに大量の増幅が観察された。【０１９９】
ＰＣＮＡ７７（Ｄ１４７Ｒ）
ＲＦＣの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察されたが、その増幅量はＰＣＮＡ１３よりも劣っていた。【０２００】
ＰＣＮＡ７２（Ｒ１０９Ｅ）
いずれのサイズの増幅の場合でも、ＲＦＣの有無、添加量に依存せず、未添加（ｎｏ  ＡＰ）の場合と比較してほとんど変化が認められなかった。【０２０１】
ＰＣＮＡ７９（Ｅ１３９Ｒ）
いずれのサイズの増幅の場合にもＲＦＣを２００−４００ｎｇ同時添加することにより、促進効果が認められたが、増幅にはＲＦＣの存在が必須であり、ＰＣＮＡ７９の単独添加では反応を阻害した。【０２０２】
ＰＣＮＡ７８（Ｅ１３９Ａ）
いずれのサイズの増幅の場合にもＲＦＣを２００−４００ｎｇ同時添加することにより、促進効果が認められたが、増幅にはＲＦＣの存在が必須であり、ＰＣＮＡ７８の単独添加では反応を阻害した。また、ＰＣＮＡ７９との比較では、ＲＦＣを２００ｎｇ同時添加する場合には、増幅サイズにより優劣が異なったが、ＲＦＣを４００ｎｇ同時添加する場合には、その増幅量はＰＣＮＡ７９よりも劣っていた。Ｅ１３９に置換導入する場合にも、中性アミノ酸（アラニン）よりも塩基性アミノ酸（アルギニン）に置換する方が効果大と考えられる。【０２０３】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがホモ三量体を形成する際に界面に位置し、三量体形成に関与するアミノ酸のうち、４種に置換変異導入した変異体の、ＰＣＲ反応系への添加効果を検証したが、３つのタイプに分類された。単独添加では反応を阻害するが、ＲＦＣを同時添加するとＲＦＣの添加量依存的に反応が回復し、添加量によっては、未添加（ｎｏ  ＡＰ）の場合より優れた増幅が認められるというもの。単独添加、ＲＦＣ同時添加とも未添加（ｎｏ  ＡＰ）の場合とほとんど変化が認められない、反応に関与していないと推測されるもの。ＲＦＣの有無に関わらず、反応を促進するものである。ポイントは三量体の形成能にあり、イオン対ネットワークを弱める加減による現象と考えられる。すなわち、三量体構造が堅固すぎるとＲＦＣの助けがないと反応が進まない。三量体形成能が失われるとクランプとして機能できない。その中間の適度に三量体構造が弱くなった状態がＰＣＲでの酵素活性促進に重要ということだと推測される。【０２０４】
単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引き起こすことにより、ＰＣＲでの酵素活性促進に有効な三量体形成能を実現しているものと考えられる。また、熱安定性にも寄与していると推測されるイオン対ネットワークを弱めることにより、高温下で三量体が解離しやすくなるものと考えられる。ＰＣＲでの次のサイクルへの温度上昇時、あるいはサイクル最初の変性ステップの高温時に三量体が解離することにより、複製反応が繰り返されるという反応機構が推察される。【０２０５】
１１種の変異体について、ＰＣＲ反応系への添加効果の確認を行ったが、ＲＦＣに依存しない促進効果を示したのは、ＰＣＮＡ１３（Ｄ１４３Ｒ）、ＰＣＮＡ７０（Ｄ１４３Ｋ）、ＰＣＮＡ７７（Ｄ１４７Ｒ）の３種で、中でもＰＣＮＡ１３が最も強い圧倒的な増幅効果を示した。また、ＲＦＣを同時添加することにより、むしろ増幅量が減少するような傾向も見受けられた。【０２０６】
２．２：ＰＣＮＡ１３の各種ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼに対する効果
上記の結果を受けて、各種ＰＣＮＡ変異体のうち特に性質が優れているＰＣＮＡ１３について、市販の７種のＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ反応系を対象に添加効果を調べた。具体的には、２〜３種類の増幅鎖長の異なる標的配列について、伸長時間の異なるＰＣＲ反応を行ない、添加効果を確認した。【０２０７】
２．２．１：Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｓｐ．由来の３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（ｐｒｏｏｆ  ｒｅａｄｉｎｇ活性）を有する耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼである。【０２０８】
ＰＣＮＡ１３の添加を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨するＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ；組成は未公表、タカラバイオ社）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。【０２０９】
【表１０】
0005308027.tif 000011
【０２１０】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・０．５，  １，  ２ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持
８．４ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・２，  ３．５，  ５ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持
１５．８ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・２，  ５，  ６，  ７ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０２１１】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％．  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％．  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を、増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図１４〜１６に示す。【０２１２】
まとめ：
２ｋｂ増幅の場合
図１４に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）０．５ｍｉｎ、１ｍｉｎでＰＣＮＡ１３添加による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）２ｍｉｎでは反応が飽和に近い状態であるが、やはりＰＣＮＡ１３添加時の方が若干増幅量が多いことが観察される。【０２１３】
８．４ｋｂ増幅の場合
図１５に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）２ｍｉｎでは添加効果は見られないが、３．５ｍｉｎ、５ｍｉｎでは添加による促進効果が観察される。【０２１４】
１５．８ｋｂ増幅の場合
図１６に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）２ｍｉｎでは添加効果は見られないが、５ｍｉｎ、６ｍｉｎ、７ｍｉｎでは添加による促進効果が観察される。【０２１５】
２．２．２：ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑに対するＰＣＮＡ１３添加効果
ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）は、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（ｐｒｏｏｆ  ｒｅａｄｉｎｇ活性）を持つ耐熱性ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。通常のＰＣＲ条件下において、従来のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと比べて、高い増幅効率、低いエラー率で高感度のＰＣＲを実現できる。【０２１６】
ＰＣＮＡ１３の添加を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨するＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ2+ｐｌｕｓ）；組成は未公表、タカラバイオ社）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。【０２１７】
【表１１】
0005308027.tif 000012
【０２１８】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・３０ｓｅｃ，  ４０ｓｅｃ，  １ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２１９】
８．４ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・１．５ｍｉｎ，  ２ｍｉｎ，  ３ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２２０】
１５．８ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・３．５ｍｉｎ，  ４ｍｉｎ，  ５ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２２１】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図１７〜図１９に示す。【０２２２】
まとめ：
２ｋｂ増幅の場合
図１７に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）３０ｓｅｃ，  ４０ｓｅｃでＰＣＮＡ１３添加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１ｍｉｎでは添加、未添加によらず反応が飽和に達しているが、４０ｓｅｃのＰＣＮＡ１３添加時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。【０２２３】
８．４ｋｂ増幅の場合
図１８に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１．５ｍｉｎ、２ｍｉｎでＰＣＮＡ１３添加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）３ｍｉｎでは添加、未添加によらず反応が飽和に達しているが、２ｍｉｎのＰＣＮＡ１３添加時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。【０２２４】
１５．８ｋｂ増幅の場合
図１９に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）３．５ｍｉｎ、４ｍｉｎでＰＣＮＡ１３添加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）５ｍｉｎでは添加、未添加によらず反応が飽和に達しているが、４ｍｉｎのＰＣＮＡ１３添加時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。【０２２５】
２．２．３：Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果
Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社より販売されているＰＣＲ用酵素である。【０２２６】
評価に際しては、ＰＣＮＡ１３の添加を除いては標準的なＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ；２００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １００  ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，  １００  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２０  ｍＭ  ＭｇＳＯ4，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ  ８．８  ＠  ２５°Ｃ）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。【０２２７】
【表１２】
0005308027.tif 000013
【０２２８】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・５ｓｅｃ，  １５ｓｅｃ，  ３０ｓｅｃ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２２９】
８．４ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎ，  ３ｍｉｎ，  ５ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２３０】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％．  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％．  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図２０、図２１に示す。【０２３１】
まとめ：
２ｋｂ増幅の場合
図２０に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）５ｓｅｃ、１５ｓｅｃでＰＣＮＡ１３添加による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）３０ｓｅｃでは反応が飽和に近い状態であるが、やはりＰＣＮＡ１３添加時の方が若干増幅量が多いことが観察される。【０２３２】
８．４ｋｂ増幅の場合
図２１に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）１ｍｉｎ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎで添加による促進効果（増幅量、反応速度）が観察される。【０２３３】
２．２．４：Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果
Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する。【０２３４】
評価に際しては、ＰＣＮＡ１３の添加を除いては標準的なＰＣＲ反応液を組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ；２００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １００  ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，  １００  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２０  ｍＭ  ＭｇＳＯ4，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ  ８．８  ＠  ２５°Ｃ）を使用した。以下にＰＣＲ反応液組成を示す。【０２３５】
【表１３】
0005308027.tif 000014
【０２３６】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・０．５ｍｉｎ，  １ｍｉｎ，  ２ｍｉｎ，  ３ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２３７】
８．４ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・５ｍｉｎ，  ７ｍｉｎ，  ９ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２３８】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％．  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％．  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図２２および図２３に示す。【０２３９】
まとめ：
２ｋｂ増幅の場合
図２２に示すように、伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）０．５ｍｉｎ，  １ｍｉｎ，  ２ｍｉｎでＰＣＮＡ１３添加による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）３ｍｉｎでは添加、未添加によらず反応が飽和に達しているが、２ｍｉｎのＰＣＮＡ１３添加時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。【０２４０】
８．４ｋｂ増幅の場合
図２３に示すように、いずれの伸長時間（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）５ｍｉｎ、７ｍｉｎ、９ｍｉｎにおいても添加による促進効果（増幅量、反応速度）が観察される。【０２４１】
２．２．５：Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するＰＣＮＡ１３添加効果
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにＡｒｃｈａｅＭａｘｘ(R)（(R)は登録商標であることを示す）  Ｆａｃｔｏｒと呼ばれるＰＣＲ反応促進剤を添加した製品である。ＰＣＲ反応過程で副次的に産生されるｄＵＴＰはＰＣＲ反応を阻害することが知られているが、ＡｒｃｈａｅＭａｘｘ(R)  ＦａｃｔｏｒはｄＵＴＰを分解する因子であり、これを添加することでＰＣＲ反応の阻害を防止し、結果的にＰＣＲ反応効率を高めている。【０２４２】
評価に際しては、ＰＣＮＡ１３の添加を除いては標準的なＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ；２００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８.８），  １００  ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，  １００  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２０  ｍＭ  ＭｇＳＯ4，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。【０２４３】
【表１４】
0005308027.tif 000015
【０２４４】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・１０ｍｉｎ→４℃で保持【０２４５】
８．４ｋｂ増幅の場合
９２℃・２ｍｉｎ→（９２℃・１０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→６８℃・８ｍｉｎ）１０ｃｙｃｌｅｓ→（９２℃・１０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→６８℃・８ｍｉｎ＋１０ｓｅｃ／ｃｙｃｌｅ）２０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０２４６】
１５．８ｋｂ増幅の場合
９２℃・２ｍｉｎ→（９２℃・１０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→６８℃・１５ｍｉｎ）１０ｃｙｃｌｅｓ→（９２℃・１０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→６８℃・１５ｍｉｎ＋１０ｓｅｃ／ｃｙｃｌｅ）２０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０２４７】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％．  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％．  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。【０２４８】
まとめ：
図２４に示すように、いずれのサイズのＰＣＲ反応においてもＰＣＮＡ１３の添加により反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。【０２４９】
２．２．６：ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  に対するＰＣＮＡ１３添加効果
ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）は、超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ・ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性の他、強い３’→５’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（Ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ活性）を持つため、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅより約５０倍の高いＰＣＲ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを示す。市販されているＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来を主とした他の高正確性ＰＣＲ用酵素は、伸長速度が遅いものが多いが、本酵素は伸長速度が非常に速く、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの約２倍の伸長速度を有する。そのため、正確性の高いＰＣＲを短時間で行うことが可能である。【０２５０】
評価に際しては、ＰＣＮＡ１３の添加を除いては標準的なＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＃１；１．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ６０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，  １００ｍＭ  ＫＣｌ，  １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  ０．０１％ＢＳＡもしくは１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＃２；１．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８，  ６０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，  １００ｍＭ  ＫＣｌ，  １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  ０．０１％ＢＳＡ）を使用した。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。【０２５１】
【表１５】
0005308027.tif 000016
【０２５２】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・１０ｓｅｃ→６８℃・１２ｓｅｃ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・３ｍｉｎ→４℃で保持【０２５３】
８．４ｋｂ，  １５．８ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・１０ｓｅｃ→６８℃・２ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・３ｍｉｎ→４℃で保持【０２５４】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。【０２５５】
まとめ：
図２５に示すように、いずれのサイズのＰＣＲ反応においてもＰＣＮＡ１３の添加により反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。【０２５６】
２．２．７：Ｐｗｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  に対するＰＣＮＡ１３添加効果
Ｐｗｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）は、好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｗｏｅｓｅｉ株由来のＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性の他、強い３’→５’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（Ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ活性）を持つため、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅより高いＰＣＲ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを示す。そのため、正確性の高いＰＣＲを短時間で行うことが可能である。【０２５７】
評価に際しては、ＰＣＮＡ１３の添加を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨するＰＣＲ反応液の組成とし、バッファーとしては製品添付反応バッファー（１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８５，  ５０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，  ２５０ｍＭ  ＫＣｌ，  ２０ｍＭ  ＭｇＳＯ4）を使用した。以下にＰＣＲ反応液組成を示す。【０２５８】
【表１６】
0005308027.tif 000017
【０２５９】
ＰＣＲ反応プログラム：
２ｋｂ増幅の場合
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・１０ｓｅｃ→６８℃・３０ｓｅｃもしくは１ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・３ｍｉｎ→４℃で保持【０２６０】
８．４ｋｂ増幅の場合
９５℃・２ｍｉｎ→（９５℃・３０ｓｅｃ→６０℃・３０ｓｅｃ→７２℃・２ｍｉｎもしくは４ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃・３ｍｉｎ→４℃で保持【０２６１】
電気泳動：
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対してＸ１０ローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、ＰＣＲ反応液の１０μＬ相当量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。【０２６２】
まとめ：
図２６に示すように、いずれのサイズのＰＣＲ反応、伸長時間においてもＰＣＮＡ１３の添加により反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。【０２６３】
以上の実施例に示したように，ＰＣＮＡ１３は代表的な市販の７種のＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼに対して優れた伸長促進活性を発揮することが証明された。また，使用したＰＣＮＡ１３は，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰＣＮＡの変異改良体であるが，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼだけでなく，菌種の異なるＤＮＡポリメラーゼに対しても有効であることが示された。【０２６４】
３：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ・ＲＦＣタンパク質の調製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ変異体タンパク質標品とＲＦＣタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子を大量発現させ、発現菌体よりタンパク質を精製することにより調製した。【０２６５】
３．１：菌体入手・ゲノムＤＮＡ調製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株はＪＣＭ（ＪＡＰＡＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ）より１０ｍＬの培養液として入手した（ＪＣＭ  ＮＯ．１２，３８０）。この培養液を６，０００ｘｇ，１５ｍｉｎ，４℃で遠心し菌体を回収した。回収した菌体は１ｍＬのＴＢＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）にけん濁、洗浄し、１５，０００ｘｇ，５ｍｉｎ，４℃の遠心操作にて回収した。【０２６６】
沈殿物を１００μＬの溶菌バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ・ｐＨ８．０，０．５％  ＳＤＳ）に溶解し、５０℃にて３時間のインキュベーション反応を行なった。その後、この反応液に１００μＬフェノール／クロロホルム溶液を添加した。さらにこの溶液を１５，０００ｘｇ，５ｍｉｎ，室温にて遠心分離操作を行い、上清約１００μＬを回収した。この上清溶液をＭａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅキット（東洋紡）を利用し、同操作マニュアルに従いゲノムＤＮＡを回収した。【０２６７】
３．２：ＫＯＤ−ＰＣＮＡの調製
３．２．１：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子クローニング
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＢＤ１８２８２８（配列番号３１および配列番号３２）を参考とし、ＰＣＲを利用したクローニング（図２７）によって獲得した。以下に詳細を説明する。【０２６８】
３．２．１．１：ＰＣＲプライマー
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子の増幅用には、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ−Ｆ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ−Ｒを使用した。このプライマーセットはＰＣＮＡ遺伝子の開始メチオニンから終止コドンに相当する領域を増幅し、さらに５’側に制限酵素ＮｄｅＩ認識部位、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位が付加するように設計されている。それぞれのプライマーの配列は表１７（配列番号３３および３４）に示した。【０２６９】
【表１７】
0005308027.tif 000018
【０２７０】
３．２．１．２：ＰＣＲ反応液組成
ＰＣＲ反応液は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
鋳型ＤＮＡ*：  １００ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ**：  １．２５Ｕ
１０ｘＥｘＴａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*鋳型ＤＮＡ：３．１で調製したゲノムＤＮＡ、**ＥＸ  Ｔａｑ：タカラバイオ社製）【０２７１】
３．２．１．３：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０２７２】
３．２．１．４：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で７５０ｂｐ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０２７３】
３．２．１．５：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０２７４】
３．２．１．６：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分にはＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し５’端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列が付加されている事が確認された。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミドベクターをｐＵＣ／ＫＰＣと命名することとした。【０２７５】
３．２．２：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子発現プラスミド構築
ｐＵＣ／ＫＰＣを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断しＰＣＮＡ遺伝子断片を調製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡの発現ベクターを作製した。【０２７６】
３．２．２．１：ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片調製
ｐＵＣ／ＫＰＣを以下の反応系で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０２７７】
プラスミドＤＮＡ：  ５μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０２７８】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間制限酵素切断を行なった。反応終了後、２％アガロースゲル電気泳動を行った、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子に相当するバンド（約７５０ｂｐ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０２７９】
３．２．２．２：ｐＥＴ−２１ａ発現ベクター
ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡ（米国ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０２８０】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０２８１】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０２８２】
３．２．２．３：ライゲーション反応と形質転換
上記で得たＫＯＤ−ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【０２８３】
ＰＣＮＡ  ＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【０２８４】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０２８５】
３．２．２．４：シーケンシングによる配列確認
上記組換えプラスミドにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチクローニング部位のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部分にＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子のオープンリーディングフレームが完全に挿入されていた。このＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子を保持するプラスミドをｐＫＰＣＮＡと呼ぶこととした（図２８）。【０２８６】
図２８に示すように、ｐＫＰＣＮＡではｐＥＴ−２１ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、ＰＣＮＡ遺伝子ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドがＰＣＮＡ遺伝子を大量発現することが期待された。【０２８７】
３．２．３：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ遺伝子への変異導入
より高機能なＰＣＮＡを作製する目的でＫＯＤ−ＰＣＮＡに対してアミノ酸置換を行なった。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードする塩基を置換することにより行った。表１８に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。【０２８８】
【表１８】
0005308027.tif 000019
【０２８９】
３．２．３．１：置換変異導入
ＰＣＮＡ遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア（表１９、配列番号３５〜３８）、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を利用し、同操作マニュアルに従って行った。【０２９０】
【表１９】
0005308027.tif 000020
【０２９１】
変異導入後にはシーケンシングによりＤＮＡ配列を確認し、目的部位に変異が導入され、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各ＰＣＮＡ変異体設計について説明する。【０２９２】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｒｉｏｓｕｓのＰＣＮＡについての報告（非特許文献６）によれば、野生型のＰｆｕ−ＰＣＮＡを大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来の開始Ｍｅｔからの翻訳タンパク質以外に、Ｎ末端が７３残基目から翻訳が開始される約２０ｋＤａのタンパク質が副産物として生成され、目的タンパク質生産の効率を落とすことが報告されている。この約２０ｋＤａのタンパク質は７３残基目のＭｅｔをＬｅｕに１残基置換した場合、生成が抑えられ、作製されたＰｆｕ−ＰＣＮＡは、野生型ＰＣＮＡタンパク質とかわらない性質を有している事が併せて報告されている。ＫＯＤ−ＰＣＮＡとＰｆｕ−ＰＣＮＡはいずれも全長が２４９アミノ酸残基で、完全一致するアミノ酸は８４．３％、さらに性質が類似するアミノ酸を加味すると非常に高い相同性を有する。このような状況を踏まえて、ＫＯＤ−ＰＣＮＡについて７３残基目のＭｅｔをＬｅｕに１残基置換したＫＯＤ−ＰＣＮＡのＭ７３Ｌの変異を準野生型として本明細書では取り扱う。【０２９３】
このＫＯＤ＿Ｍ７３Ｌの変異体をＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１と命名し、変異体を作製した。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１の作製は、鋳型プラスミドをｐＫＰＣＮＡとし変異導入用オリゴペア（ＫＯＤ＿Ｍ７３Ｌ−ＦとＫＯＤ＿Ｍ７３Ｌ−Ｒ）を使用して行った（表１９参照、配列３５、配列３６）。【０２９４】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１３
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｒｉｏｓｕｓのＰＣＮＡの場合、１４３残基目のアミノ酸残基は単量体どうしが三量体を形成する際に、イオンペアネットワーク形成に関わる事が知られている（非特許文献９）。我々のグループは、上記実施例１〜２の通り、この位置のアミノ酸残基の電気的性質を逆にかえた変異型ＰＣＮＡがＤＮＡ合成に際しＤＮＡポリメラーゼの反応を飛躍的に促進することを発見している。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓの場合、この位置に相当するアミノ酸は野生型ではグルタミン酸（酸性アミノ酸）であるが、これをアルギニン（塩基性アミノ酸）へ置換することによりこの部位のアミノ酸の電気的な性質を全くかえる事が可能である。ＤＮＡ合成時に添加した場合の影響を調べる目的でこの変異体を作製した。具体的には、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１産生プラスミドを鋳型として、ＫＯＤ＿Ｅ１４３Ｒ−ＦとＫＯＤ＿Ｅ１４３Ｒ−Ｒの変異導入用オリゴを使用して作製した（表１９、配列３７、３８）。【０２９５】
３．２．３．２：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ発現株の作製
以上のように取得した変異型ＰＣＮＡ発現プラスミドベクターにより大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸菌株を得た。【０２９６】
３．２．４：ＫＯＤ−ＰＣＮＡタンパク質精製
図２９に示すように、菌体を遠心回収し（Ｓ２９１）、菌体破砕（超音波破砕、Ｓ２９２）、５分間煮沸し（Ｓ２９３）、ポリエチレンイミン沈澱を行い（Ｓ２９４）、さらに硫安沈澱を行い（Ｓ２９５）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ２９６、カラムとしてＨｉＴｒａｐ  Ｑを使用）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓ２９７、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００を使用）という処理により標品を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認ではいずれの標品についても９０％以上の純度を確保できている。【０２９７】
３．２．４．１：菌体培養とＫＯＤ−ＰＣＮＡ発現誘導
各変異ＰＣＮＡ発現株を１．５リットルＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて、３７℃で振とう培養を行った。対数増殖期のＯＤ600が０．３−０．５の時期に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約３時間行った。培養後の菌体は遠心分離（４℃、６，０００ｘｇ、６分）によって回収した。【０２９８】
３．２．４．２：菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は２５ｍＬのバッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、  ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、  １０％  グリセロール、  ０．５ｍＭ  ＤＴＴ）によりけん濁した。超音波処理により菌体を破砕した。【０２９９】
３．２．４．３：加熱処理
菌体破砕液を５分間煮沸した後、遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）を行い、上清を回収した。【０３００】
３．２．４．４：ポリエチレンイミン沈澱
上清液に対しポリエチレンイミン（ＳＩＧＭＡ  Ｐ−３１４３）とＮａＣｌをそれぞれ終濃度０．２％（ｗ／ｖ）、０．５８Ｍになるように添加し、氷上で３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離（１８，５００×ｇ，２５分，４℃）して，上清を回収した。【０３０１】
３．２．４．５：硫安沈澱
上清１０ｍＬあたり硫酸アンモニウム５．６１ｇを添加し（終濃度８０％）、氷上で３０分撹拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を８０％飽和させた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファー８０ｍＬを添加して、遠心分離（３０，０００  ｘ  ｇ，  ２５分，  ４℃）により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファーＣ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解し、おなじくバッファーＣに対して透析を行った。【０３０２】
３．２．４．６：イオン交換クロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ；アマシャムバイオサイエンス社）を実施した。溶離条件は、０．１−０．８Ｍ  ＮａＣｌ／１７．５ｍＬのリニアグラジエントとし、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとし、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１とＫＯＤ−ＰＣＮＡ１３のピーク画分を得た。【０３０３】
３．２．４．７：ゲルろ過クロマトグラフィー
ＨｉＴｒａｐ  Ｑイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（アマシャムバイオサイエンス社）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、以降のアッセイ用標品とした。【０３０４】
得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび良好に精製されたことが確認された（図３０）。【０３０５】
３．３：ＫＯＤ−ＲＦＣの調製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤのＲＦＣは２つのサブユニットＲＦＣＬとＲＦＣＳから構成されており、ゲノム上ではタンデムに位置している。ＲＦＣタンンパク質標品の調製にあたっては、ＲＦＣＬとＲＦＣＳ遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同一宿主内に各々の発現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プラスミドの作製にあたっては非特許文献１０を参照した。以下に詳細を示す。【０３０６】
３．３．１：ＫＯＤ−ＲＦＣＬの遺伝子クローニングと発現プラスミド構築（図３１）
ＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ；１８２，８３０）はＫＯＤゲノムを鋳型としたＰＣＲにより得た（配列番号３９）。【０３０７】
３．３．１．１：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲ用プライマーとして、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ−ＦプライマーとＫＯＤ−ＲＦＣＬ−Ｒプライマーを使用した（表２０；配列番号４０および４１）。クローニング操作の都合上、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ−Ｆプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ認識部位、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ−Ｒプライマーには制限酵素ＸｈｏＩ認識部位をそれぞれ付加した。【０３０８】
【表２０】
0005308027.tif 000021
【０３０９】
３．３．１．２：ＰＣＲ反応液組成
ＰＣＲの鋳型としては上記３．１で調製したＫＯＤゲノムＤＮＡを使用した。
ＰＣＲ反応は、次の組成で行った。（５０μＬ反応系への添加量）
鋳型ＤＮＡ；１００ｎｇ
プライマー；各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ；各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*；１．２５Ｕ
１０Ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー；５μＬ
以上に滅菌蒸留水を添加して５０μＬとした。
（＊タカラバイオ社製）【０３１０】
３．３．１．３：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０３１１】
３．３．１．４：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で１．５ｋｂ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０３１２】
３．３．１．５：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。【０３１３】
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０３１４】
３．３．１．６：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分にはＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し５’端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列が付加されている事が確認された。このプラスミドをｐＵＣ１１８／ＫＲＦＣＬとした。【０３１５】
３．３．１．７：ＫＯＤ−ＲＦＣＬ発現プラスミド作製
ｐＵＣ１１８／ＫＲＦＣＬを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断しＲＦＣＬ遺伝子断片を調製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、ＫＯＤ−ＲＦＣＬの発現ベクターを作製した。【０３１６】
３．３．１．８：ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片調製
ｐＵＣ１１８／ＫＲＦＣＬを以下の反応系で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０３１７】
プラスミドＤＮＡ：  ５μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０３１８】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間、制限酵素切断をおこなった。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子に相当するバンド（約１．５ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０３１９】
３．３．１．９：ｐＥＴ−２９ａ発現ベクター
ｐＥＴ−２９ａベクターＤＮＡ（ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重切断した。【０３２０】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＸｈｏＩ：  ５ユニット【０３２１】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２９ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０３２２】
３．３．１．１０：ライゲーション反応と形質転換
上記で得たＫＯＤ−ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【０３２３】
ＲＦＣＬ  ＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２９ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【０３２４】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（３０μｇ／ｍＬカナマイシン）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０３２５】
３．３．１．１１：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２９ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれのプラスミドＤＮＡについてもマルチクローニング部位のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部分にＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が完全に挿入されていた。ＫＯＤ−ＲＦＣＬ遺伝子を保持するプラスミドをｐＫＲＦＣＬと呼ぶこととした（図３２）。【０３２６】
図３２に示すように、ｐＫＲＦＣＬではｐＥＴ−２９ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、ＲＦＣＬ遺伝子のオープンリーディングフレーム、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドがＲＦＣＬ遺伝子を大量発現することが期待された。【０３２７】
３．３．２：ＫＯＤ−ＲＦＣＳの遺伝子クローニングと発現プラスミド構築
非特許文献１０によれば、ＫＯＤ−ＲＦＣＳ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＩＤ：ＢＤ１８２，８２９）は全長２，６０１塩基によってコードされ、インテインを１個所保持し、Ｎ端のエクステインは１７７塩基、Ｃ端のエクステインは８０４塩基にコードされていることが報告されている（終始コドンは含まず）。配列表の配列番号４２にＫＯＤ−ＲＦＣＳの塩基配列（インテイン部分を除去した成熟型配列）を示す。【０３２８】
図３３に示したようにＲＦＣＳ発現ベクター作製にあたっては、まず、インテインを含むＫＯＤ−ＲＦＣＳ遺伝子の全長をＰＣＲ反応を利用してクローニングし（Ｓ３３１〜Ｓ３３４）、その後、２種のエクステイン断片を個別にＰＣＲ反応により増幅した後（Ｓ３３５〜３３６）、インテインを除去し、２種のエクステインを結合した成熟型ＲＦＣＳ（ＲＦＣＳｍとも呼ぶ）を調製し、発現ベクターへ組み込んだ（Ｓ３３７〜Ｓ３３９）。【０３２９】
３．３．２．１：インテインを含むＲＦＣＳ遺伝子全長のクローニング
３．３．２．１．１：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲプライマーはＫＯＤ−ＲＦＣＳ−Ｆ、ＫＯＤ−ＲＦＣＳ−Ｒプライマー（表２１；配列番号４３及び４４）を使用した。【０３３０】
【表２１】
0005308027.tif 000022
【０３３１】
３．３．２．１．２：ＰＣＲ反応組成
ＰＣＲの鋳型としては上記３．１で調製したＫＯＤゲノムＤＮＡを使用した。
ＰＣＲ反応液は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
鋳型ＤＮＡ：  １００ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*：  １．２５Ｕ
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【０３３２】
３．３．２．１．３：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０３３３】
３．３．２．１．４：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った後、紫外線照射下で２．６ｋｂ付近のバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０３３４】
３．３．２．１．５：ＰＣＲ産物のサブクローニング
精製したＰＣＲ産物はｐＵＣ１１８−ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（いずれもタカラバイオ社）を利用して操作マニュアルに準じてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物で大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ／ｍＬ含有）上に播種し３７℃で一晩静置培養して、ＰＣＲ産物を保持する大腸菌クローンを得た。【０３３５】
寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０３３６】
３．３．２．１．６：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＵＣ１１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識部位に挿入されたＤＮＡ配列を調べた。その結果、挿入部分はＲＦＣＳ遺伝子の２種のエクステインの塩基配列を完全に含んでいた。このプラスミドをｐＵＣ／ＫＲＦＣＳとした。【０３３７】
３．３．２．２：エクステイン結合操作（インテイン除去操作）
３．３．２．２．１：エクステイン結合用プライマー
Ｎ端側エクステイン用ＰＣＲプライマーとして、ＲＦＣＳ−Ｎｄｅ−Ｆプライマー、ＲＦＣＳ−Ｅｘ１−Ｒプライマー（表２２；配列番号４５及び４８）を準備した。また、Ｃ端側エクステイン用ＰＣＲプライマーとして、ＲＦＣＳ−Ｅｘ２−Ｆプライマー、ＲＦＣＳ−Ｓａｌ−Ｒプライマー（表２２；配列番号４７及び４６）を準備した。クローニングを容易にする目的でＲＦＣＳ−Ｎｄｅ−Ｆプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ配列、ＲＦＣＳ−Ｓａｌ−Ｒプライマーには制限酵素ＳａｌＩ配列を５’端に付加してある。また、２種のエクステイン断片をＰＣＲ反応により融合する際に利用する相補的な配列をＲＦＣＳ−Ｅｘ１−ＲプライマーとＲＦＣＳ−Ｅｘ２−Ｆプライマーに設けた。【０３３８】
【表２２】
0005308027.tif 000023
【０３３９】
３．３．２．２．２：ＰＣＲ反応液組成
２種のエクステイン増幅のためのＰＣＲ反応は、次の組成で行った。（５０μＬ反応液系への添加量）
ｐＵＣ／ＫＲＦＣＳ  ＤＮＡ：  ５０ｎｇ
プライマー：  各１０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ：  各１０ｎｍｏｌ
ＥＸ  Ｔａｑ*：  １．２５Ｕ
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して５０μＬとした。
（*タカラバイオ社製）【０３４０】
３．３．２．２．３：ＰＣＲ反応条件
上記で調製した反応液をＰＣＲ装置を使用して、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０３４１】
３．３．２．２．４：ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ反応産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行った。ＲＦＣＳ−Ｎｄｅ−Ｆプライマー、ＲＦＣＳ−Ｅｘ１−ＲプライマーセットのＰＣＲ産物では約１８０塩基のバンドが、ＲＦＣＳ−Ｅｘ２−Ｆプライマー、ＲＦＣＳ−Ｓａｌ−ＲプライマーセットのＰＣＲ産物では約８００塩基のバンドが観察された。紫外線照射下でそれぞれのバンドを含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＰＣＲ産物の精製を行った。【０３４２】
３．３．２．２．５：ＰＣＲ融合反応
２種のエクステインＰＣＲ産物を１チューブ内で１組のプライマーセットでＰＣＲ反応に供する事で２種の断片を融合し、成熟型ＲＦＣＳをコードする遺伝子断片を得た。以下に詳細を示す。【０３４３】
２種のエクステインＰＣＲ産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
Ｎ端エクステイン断片：  ２μＬ（５０ｎｇ相当）
Ｃ端エクステイン断片：  ２μＬ（５０ｎｇ相当）
１０ｘ  ＥＸ  Ｔａｑバッファー：  ５μＬ
以上に滅菌水を添加して４４．５μＬとした。
上記を９５℃・３ｍｉｎ加熱し、３７℃まで３０分間でゆっくりと冷却した。【０３４４】
上記反応液に以下を添加する
ｄＮＴＰ：  ５μＬ（各１０ｎｍｏｌ）
ＥＸ  Ｔａｑ*：  ０．５μＬ（２．５Ｕ）
これを７２℃・１０ｍｉｎ反応させる。
（*タカラバイオ社製）【０３４５】
上記に、ＲＦＣＳ−Ｎｄｅ−ＦプライマーとＲＦＣＳ−Ｓａｌ−Ｒプライマーを各１０ｐｍｏｌ添加し、９５℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを３０サイクル繰り返すプログラムでＰＣＲ反応を行った。【０３４６】
３．３．２．２．６：ＰＣＲ産物の制限酵素切断・精製
上記ＰＣＲ反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製したＤＮＡ断片は制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで二重切断した。
ＰＣＲ産物：  １μｇ相当
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＳａｌＩ：  ５ユニット
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間制限酵素切断をおこなった。反応終了後、２％アガロースゲル電気泳動を行った、２種のインテインの融合断片（成熟型ＲＦＣＳをコードする配列）と想定されるバンド（約１ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用し精製した。【０３４７】
３．３．２．２．７：ｐＥＴ−２１ａ発現ベクターの制限酵素切断
ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡ（ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで二重切断した。【０３４８】
プラスミドＤＮＡ：  ２μｇ
１０Ｘ制限酵素バッファー：  ５μＬ
制限酵素ＮｄｅＩ：  ５ユニット
制限酵素ＳａｌＩ：  ５ユニット【０３４９】
以上に滅菌水を添加し５０μＬとし、３７℃で２時間静置した。反応終了後、１％アガロースゲル電気泳動を行った、ｐＥＴ−２１ａベクターＤＮＡの直線フォームに相当するバンド（約５．４ｋｂ付近）を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従いゲルからｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片の精製を行った。【０３５０】
３．３．２．２．８：ライゲーション反応と形質転換
上記で得た２種のインテインの融合断片（成熟型ＲＦＣＳコード配列）と予測される約１ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖ２（タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。【０３５１】
１ｋｂＤＮＡ断片：  １００ｎｇ
ｐＥＴ−２１ａ  ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間反応した。【０３５２】
このライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）上に播種し３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーのうち３個をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）３ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０３５３】
３．３．２．２．９：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミドＤＮＡにつき、ＤＮＡシーケンサーを使用してプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａに挿入されたＤＮＡ配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチクローニング部位のＮｄｅＩとＳａｌＩ部分に２種のエクステインが結合した（インテインを除去した）成熟型のＲＦＣＳｍの配列（９８４塩基）が確認された（ｐＫＲＦＣＳｍと命名）。【０３５４】
図３４に示すように、ｐＫＲＦＣＳｍではｐＥＴ−２１ａが保持するＴ７プロモーターからｒｂｓ（リボソーム結合部位）、成熟型ＲＦＣＳ遺伝子のオープンリーディングフレーム、Ｔ７ターミネーターの順に並んでいる事が確認された。本プラスミドが成熟型ＲＦＣＳ遺伝子を大量発現することが期待された。【０３５５】
３．３．３：ＫＯＤ−ＲＦＣ発現株の作製
ｐＫＲＦＣＬとｐＫＲＦＣＳｍで大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを同時に形質転換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質転換体を選択し発現株を得た。【０３５６】
３．３．４：ＫＯＤ−ＲＦＣタンパク質精製
図３５に示すように、菌体を遠心回収し（Ｓ３５１）、菌体破砕（超音波破砕、Ｓ３５２）、５分間煮沸し（Ｓ３５３）、ポリエチレンイミン沈澱を行い（Ｓ３５４）、さらに硫安沈澱を行い（Ｓ３５５）、アフィニティークロマトグラフィー（Ｓ３５６、カラムとしてＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰを使用）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓ３５７、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００を使用）という処理により標品を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認ではいずれの標品についても９０％以上の純度を確保できている。【０３５７】
３．３．４．１：菌体培養と発現誘導
上記の発現株を１．５リットルＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬカナマイシン含有），３７℃にて振とう培養を行った。対数増殖期のＯＤ600が０．３−０．５の時期に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約３時間行った。培養後の菌体は遠心分離（４℃、６，０００ｘｇ、６分）によって回収した。【０３５８】
３．３．４．２：菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は２５ｍＬのバッファーＢ（前出）によりけん濁した。これを超音波処理により菌体を破砕した。【０３５９】
３．３．４．３：加熱処理
菌体破砕液を５分間煮沸した後、遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）を行い、上清を回収した。【０３６０】
３．３．４．４：ポリエチレンイミン沈澱
上清液に対しポリエチレンイミン（ＳＩＧＭＡ  Ｐ−３１４３）を終濃度０．１８％（ｗ／ｖ）になるように添加し、氷上で３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離（１８，５００×ｇ，２５分，４℃）して，上清を回収した。【０３６１】
３．３．４．５：硫安沈澱
上清１０ｍＬあたり硫酸アンモニウム５．６１ｇを添加し（終濃度８０％）、氷上で３０分撹拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離（１８，５００ｘｇ，  ４℃，  ２５分）により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファーＣ（前出）に溶解し、おなじくバッファーＣに対して透析を行った。【０３６２】
３．３．４．６：アフィニティークロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルはＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して精製した。【０３６３】
溶離条件は、０．１−０．８Ｍ  ＮａＣｌ／１７．５ｍＬのリニアグラジエントとし、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとし、ピーク画分を得た。【０３６４】
３．３．４．７：ゲルろ過クロマトグラフィー
ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎアフィニティークロマトグラフィーでのピーク画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（前出）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アッセイ用の標品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび良好に精製されたことが確認された（図３６）。【０３６５】
４：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の評価
上記で調製したＰＣＮＡ変異体のＤＮＡ増幅系への効果、とくにＰＣＲ反応系への効果を調べた。具体的にはＰＣＲ反応系にＰＣＮＡ変異体、ＲＦＣを単独もしくは併用して添加した場合、未添加の場合でＰＣＲ反応を行い、その反応産物を電気泳動に供して標的領域の増幅状態を比較することで行った。ＰＣＲ反応に使用するポリメラーゼとしては市販されている２種のＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーセ、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用した。【０３６６】
４．１：ＫＯＤ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに対するＫＯＤ−ＰＣＮＡの添加効果
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ−１株由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼ活性の他に、強い３’→５’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（Ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ活性）を持つ、いわゆるアルファ型ＤＮＡポリメラーゼである。３’→５’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を保持するため、一般的に使用されているＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅより高いＰＣＲ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを示す。また、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来を主とした他のアルファ型の高正確性ＰＣＲ用酵素は、伸長速度が遅いものが多いが、本酵素は伸長速度が非常に速いことが報告されている（非特許文献１１）。【０３６７】
４．１．１：鋳型ＤＮＡと反応プライマー
鋳型ＤＮＡとしてはラムダＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ０２４５９）を使用した。ＰＣＲ増幅の標的配列としてはラムダＤＮＡの２３，１１９番より２５，１４２番の配列とした。この時使用したＰＣＲプライマー配列は表８に記載してあるが、別途表２３に示した。【０３６８】
【表２３】
0005308027.tif 000024
【０３６９】
４．１．２：反応液組成
反応液の組成を表２４及び２５に示した。【０３７０】
【表２４】
0005308027.tif 000025
【０３７１】
【表２５】
0005308027.tif 000026
【０３７２】
４．１．３：ＰＣＲプログラム
上記反応液を以下のＰＣＲプログラムにて反応させた。
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・１５ｓｅｃ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０３７３】
４．１．４：電気泳動
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、５０μＬ反応液のうち１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を、図３７に示す。【０３７４】
４．１．５：結果
結果を図３７に示した。この実験条件ではＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼのみでも良好な伸長増幅が確認できる（レーン１）。準野生型ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１を添加した場合に反応阻害が観察されるが（レーン２），ＲＦＣの添加量を増加すると阻害が回復し未添加の場合と同程度の伸長増幅が観察される（レーン３、４）。一方、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１３を添加した場合、ＫＯＤ−ＲＦＣの添加に依存しない良好な伸長増幅が観察され、この効果はしかもアクセサリー蛋白質未添加の場合やＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１にＫＯＤ−ＲＦＣを添加した場合よりすぐれていた。【０３７５】
４．２：Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに対するＫＯＤ−ＰＣＮＡの添加効果
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡ合成酵素として市販されているＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を対象として各種ＰＣＮＡ変異体の添加効果をＰＣＲ反応の系を利用して調べた。Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｓｐ．由来の３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性（ｐｒｏｏｆ  ｒｅａｄｉｎｇ活性）を有する耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼや、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。【０３７６】
４．２．１：鋳型ＤＮＡと反応プライマー
上記ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの評価と同様の鋳型ＤＮＡ、プライマーを使用した。【０３７７】
４．２．２：反応液組成
反応液の組成を表２６及び２７に示した。
【表２６】
0005308027.tif 000027
【０３７８】
【表２７】
0005308027.tif 000028
【０３７９】
４．２．３：ＰＣＲプログラム
上記反応液を以下のＰＣＲプログラムにて反応さた。
９４℃・１ｍｉｎ→（９８℃・５ｓｅｃ→６８℃・１．５ｍｉｎ）３０ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持。【０３８０】
４．２．４：電気泳動
ＰＣＲ反応終了後、５０μＬのＰＣＲ反応溶液に対して１０ｘローディングバッファー（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％、  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ０．４％、  Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ０．４％）を５μＬ添加、混合した後、５０μＬ反応液のうち１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動マーカーとしてラムダ／ＳｔｙＩマーカー（東洋紡社）を使用した。結果を、図３８に示す。【０３８１】
４．２．５：結果
結果を図３８に示した。この実験条件ではＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのみでも伸長増幅が確認できる（レーン１）。準野生型ＫＯＤ−ＰＣＮＡ０１を添加した場合に反応阻害が観察されバンドが確認できないが（レーン２），ＲＦＣの添加量を増加すると阻害が回復し未添加の場合と同程度の伸長増幅が観察される（レーン３、４）。一方、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１３を添加した場合は、ＫＯＤ−ＲＦＣ未添加時でも良好な伸長増幅が観察され、この効果は他の４種の条件よりも優れた伸長増幅を示した（レーン５）。【０３８２】
４．３：まとめ
上述の実験よりＫＯＤ−ＰＣＮＡ１３は代表的な２種のＰＣＲ酵素に対してＰＣＲ反応を促進する事が分かった。またこの反応はＲＦＣを必要としないだけでなく、野生型とＲＦＣを同時添加した場合よりも促進活性が優れていた。以上の結果から，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰＣＮＡだけでなく，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡでも同様の変異導入により優れた効果が得られることが証明された。本発明のＰＣＮＡ単量体の界面領域のアミノ酸残基の特定は，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰＣＮＡにだけ限定して有効なものではなく，同様の構造的背景を持つＰＣＮＡに応用できる発明であることが示された。【０３８３】
５．Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１３添加反応時の忠実性測定
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１３をＰＣＲ反応に添加した際の鋳型忠実性に与える影響について、市販の高忠実度型ＰＣＲ酵素であるＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製、以下、単に「Ｐｙｒｏｂｅｓｔ」と略記することがある。）を対象として検討した。ＰｙｒｏｂｅｓｔはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼで、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、これがプルーフリーディング活性として機能している。【０３８４】
忠実性はＰＣＲ産物のシーケンスを調べ、鋳型シーケンスと比較することにより求めた。概略を図３９に示した。まず、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独もしくはＰｆｕ−ＰＣＮＡ１３を添加してＰＣＲ反応を行い（Ｓ５１１）、増幅されたＤＮＡ断片の末端を平滑化・リン酸化し（Ｓ５１２）、この断片をプラスミドベクターにクローニングし（Ｓ５１３），大腸菌に導入しコロニーを単離、プラスミドを抽出する（Ｓ５１４，Ｓ５１５）。各プラスミドの挿入配列の一部（５００ｂｐ）をＤＮＡシーケンサーで調べ（Ｓ５１６）、結果を鋳型シーケンスと比較し、エラー発生頻度を調べた（Ｓ５１７）。【０３８５】
５．１：ＰＣＲ反応
５．１．１：ＰＣＲ酵素とＰｆｕ−ＰＣＮＡ１３の組合せ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独でＰＣＲ反応を実施した場合とＰｙｒｏｂｅｓｔにＰｆｕ−ＰＣＮＡ１３を添加してＰＣＲ反応を実施した場合について調査した。これらに対する対照の目的でＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製、以下、単に「Ｔａｑ」と略記することがある。）単独でのＰＣＲ反応についても調査した。Ｔａｑは一般的に利用されるＰｏｌＩ型のＰＣＲ酵素であるが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、同活性を保持するα型ＰＣＲ酵素と比較して忠実性は低いとされている。【０３８６】
５．１．２：鋳型・標的領域
ＰＣＲ反応の鋳型として、ラムダＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ０２４５９）を用い、７種の領域を調査対象とした。各領域のラムダＤＮＡ上の位置、サイズ、各領域を増幅するために用いたプライマーの組み合わせを表２８に、また各プライマー配列は表２９に示した。【０３８７】
【表２８】
0005308027.tif 000029
【０３８８】
【表２９】
0005308027.tif 000030
【０３８９】
５．１．３：ＰＣＲ反応液組成
ＰＣＲ反応液は一般的なＰＣＲ反応液組成とした（表３０）。ＰＣＲ酵素としてＰｙｒｏｂｅｓｔを使用する際には、添付バッファーである１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（組成未公表）を、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑを使用する際には添付バッファーである１０ｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．３），５００ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を使用した。Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１３添加時の終濃度は０．６ｎｇ／μＬ（０．３μＬ）とし、未添加の場合は滅菌水を同体積（０．３μＬ）添加した。【０３９０】
【表３０】
0005308027.tif 000031
【０３９１】
５．１．４：ＰＣＲプログラム
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独の場合
（９８℃・１０ｓｅｃ→６８℃・２．５ｍｉｎ）３０Ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ＋Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ１３の場合
（９８℃・１０ｓｅｃ→６８℃・１．５ｍｉｎ）３０Ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持
Ｔａｑ単独の場合
（９４℃・３０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１．５ｍｉｎ）３０Ｃｙｃｌｅｓ→４℃で保持【０３９２】
５．２：ＰＣＲ産物の末端平滑化反応・精製
上記ＰＣＲ反応により得られた各ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供しエチジウムブロマイド染色を行った後、目的サイズのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに従いゲル中のＤＮＡ断片の精製を行った。精製したＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（タカラバイオ社製）を利用し、同キットマニュアルに従い、末端平滑化・リン酸化反応に供した。【０３９３】
５．３：ＰＣＲ産物のクローニングベクターへの挿入
末端平滑化・リン酸化処理したＤＮＡ断片（５０ｎｇ）と制限酵素ＨｉｎｃＩＩ切断ＢＡＰ処理済みＤＮＡ（ｐＵＣ１１８  Ｈｉｎｃ  ＩＩ／ＢＡＰ・タカラバイオ社製）（５０ｎｇ）を以下の通りライゲーション反応に供した。
末端平滑化・リン酸化処理済ＤＮＡ断片：  ５０ｎｇ
ｐＵＣ１１８  Ｈｉｎｃ  ＩＩ／ＢＡＰ：  ５０ｎｇ
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ２  酵素液：  ５μＬ
以上に滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で６０分間反応した。【０３９４】
５．４：大腸菌コロニー単離・プラスミド抽出
上記ライゲーション産物（３μＬ）により１００μＬ大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（タカラバイオ社）を形質転換し、大腸菌液をＬＢ寒天プレート（１００μｇ/ｍＬアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ＧＡＬ各４０μｇ/ｍＬ含有）上に播種し、３７℃で一晩静置培養した。寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーをＴＢ液体培地（１００μｇ/ｍＬアンピシリン含有）１．５ｍＬ、３７℃にて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。【０３９５】
５．５：挿入配列のシーケンス
抽出したプラスミドを鋳型とし，ＤＮＡシーケンサーを使用してＤＮＡ配列を解析した。【０３９６】
挿入されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ増幅断片）のうちの５００ｂｐの配列を解析対象とした。【０３９７】
５．６：オリジナル配列と比較
結果を表３１に示した。表中の各用語は以下の通りである。
「フラグメントＩＤ」；ＰＣＲ反応標的領域の識別番号。
「Ｅｎｚｙｍｅ，ＡＰ」；ＰＣＲ反応時の酵素とＰｆｕ−ＰＣＮＡ１３の組合せ。
「ラムダＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」；７種のＰＣＲ増幅断片のうち解析対象となった塩基配列の位置を示す。
「Ｓａｍｐｌｅ」；シークエンス解析対象となったプラスミド数（すなわち、ＰＣＲ増幅断片数）を表す。
「Ｂａｓｅ」；シークエンス解析の対象となった塩基数。
「ＮＤ」；シークエンシングデータのノイズ等で解読不可能であった塩基数。
「Ａｌｌ」；「ＮＤ」以外の解読可能であった総塩基数。
「Ｅｒｒｏｒ」；総塩基数のうち複製エラーが確認された塩基数。
「Ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓ」；解読できた総塩基数「Ａｌｌ」に対する、複製エラーが確認された塩基数「Ｅｒｒｏｒ」の割合。【０３９８】
【表３１】
0005308027.tif 000032
【０３９９】
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独の場合、５９２サンプルを解析したところ、総計２９５，９０１ｂａｓｅｓに対して複製エラーは4ｂａｓｅｓという結果（Ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓは７４ｋｂあたり１ｂａｓｅ）が得られた。ＰｙｒｏｂｅｓｔにＰｆｕ−ＰＣＮＡ１３を添加した場合，４８９サンプルを解析したところ、総計２４４,３５１ｂａｓｅｓに対して複製エラーは５ｂａｓｅｓという結果が得られた（Ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓは４９ｋｂあたり１ｂａｓｅ）。Ｔａｑの場合，５３８サンプルを解析したところ，総計２６８,８５６ｂａｓｅｓに対して複製エラーは１２０ｂａｓｅｓという結果（Ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓは２．２ｋｂに１ｂａｓｅ）が得られた。【０４００】
上記の３種の試験群で比較すると，Ｔａｑに比べて，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ+ＰＣＮＡ１３添加の２種はＥｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓが１桁低く，両グループ間の複製忠実度に明確な差があることが観察された。【０４０１】
一方，後者の２種の反応（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独とＰｙｒｏｂｅｓｔ＋ＰＣＮＡ１３添加）の間での比較に関しては，Ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅｓに１．５倍の差はあるものの，複製エラー数が４（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ単独）と５（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ＋ＰＣＮＡ１３添加）であり，有意な差は検出されなかった。このデータからは，ＰＣＮＡ１３の添加により忠実度に明確な差が生じるかは不明だが，その差は小さく，少なくとも極端に悪化することはないと考えられる。図１４から図１６の実施例に示すとおり，高忠実度型ＰＣＲ酵素であるＰｙｒｏｂｅｓｔの伸長能を飛躍的に向上させる一方で，忠実度面でもＰｏｌ  Ｉ型ＰＣＲ酵素であるＴａｑよりもはるかに良いレベルを維持していることは確かであり，本発明のＰＣＮＡの優秀性が証明された。
【産業上の利用可能性】
【０４０２】
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０４０３】
配列番号１：  Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ
配列番号２：  Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ
配列番号３：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ−Ｆ
配列番号４：  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ−Ｒ
配列番号５：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｍ７３Ｌ−Ｆ
配列番号６：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｍ７３Ｌ−Ｒ
配列番号７：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ａ−Ｆ
配列番号８：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ａ−Ｒ
配列番号９：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｒ８２Ｃ−Ｆ
配列番号１０：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｒ８２Ｃ−Ｒ
配列番号１１：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−Ｆ
配列番号１２：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｒ−Ｒ
配列番号１３：  Ｐｆｕ−ＲＦＣＬ
配列番号１４：  Ｐｆｕ−ＲＦＣＬ
配列番号１５：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＬ−Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１６：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＬ−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１７：  Ｐｆｕ−ＲＦＣＳ
配列番号１８：  Ｐｆｕ−ＲＦＣＳ
配列番号１９：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２０：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２１：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳＦ１  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２２：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳＦ２  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２３：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳＲ２  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２４：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳＲ１  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２５：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｆ０２
配列番号２６：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｆ１１
配列番号２７：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｆ２４
配列番号２８：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｒ０３
配列番号２９：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｒ１４
配列番号３０：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｒ１６
配列番号３１：  ＫＯＤ−ＰＣＮＡ
配列番号３２：  ＫＯＤ−ＰＣＮＡ
配列番号３３：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＰＣＮＡ−Ｆ
配列番号３４：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＰＣＮＡ−Ｒ
配列番号３５：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ＿Ｍ７３Ｌ−Ｆ
配列番号３６：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ＿Ｍ７３Ｌ−Ｒ
配列番号３７：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ＿Ｅ１４３Ｒ−Ｆ
配列番号３８：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ＿Ｅ１４３Ｒ−Ｒ
配列番号３９：  ＫＯＤ−ＲＦＣＬ
配列番号４０：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＲＦＣＬ−Ｆ
配列番号４１：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＲＦＣＬ−Ｒ
配列番号４２：  ＫＯＤ−ＲＦＣＳ
配列番号４３：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＲＦＣＳ−Ｆ
配列番号４４：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＫＯＤ−ＲＦＣＳ−Ｒ
配列番号４５：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｎｄｅ−Ｆ
配列番号４６：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｓａｌ−Ｒ
配列番号４７：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｅｘ２−Ｆ
配列番号４８：  ｐｒｉｍｅｒ：  ＲＦＣＳ−Ｅｘ１−Ｒ
配列番号４９：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ０９
配列番号５０：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ１４
配列番号５１：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ１６
配列番号５２：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ１９
配列番号５３：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ２３
配列番号５４：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ２５
配列番号５５：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ０４
配列番号５６：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ１１
配列番号５７：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ１５
配列番号５８：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ１７
配列番号５９：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ２１
配列番号６０：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ２５
配列番号６１：  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ２７
配列番号６２：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｋ−Ｆ
配列番号６３：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｋ−Ｒ
配列番号６４：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｈ−Ｆ
配列番号６５：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４３Ｈ−Ｒ
配列番号６６：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｒ１０９Ｅ−Ｆ
配列番号６７：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｒ１０９Ｅ−Ｒ
配列番号６８：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４７Ｒ−Ｆ
配列番号６９：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｄ１４７Ｒ−Ｒ
配列番号７０：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ａ−Ｆ
配列番号７１：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ａ−Ｒ
配列番号７２：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ｒ−Ｆ
配列番号７３：  ｐｒｉｍｅｒ：  Ｐｆｕ＿Ｅ１３９Ｒ−Ｒ
【図１】
0005308027.tif 000033
【図２】
0005308027.tif 000034
【図３】
0005308027.tif 000035
【図４】
0005308027.tif 000036
【図５】
0005308027.tif 000037
【図６】
0005308027.tif 000038
【図７】
0005308027.tif 000039
【図８】
0005308027.tif 000040
【図９】
0005308027.tif 000041
【図１０】
0005308027.tif 000042
【図１２】
0005308027.tif 000043
【図１３】
0005308027.tif 000044
【図１４】
0005308027.tif 000045
【図１５】
0005308027.tif 000046
【図１７】
0005308027.tif 000047
【図２０】
0005308027.tif 000048
【図２２】
0005308027.tif 000049
【図２３】
0005308027.tif 000050
【図２６】
0005308027.tif 000051
【図２７】
0005308027.tif 000052
【図２８】
0005308027.tif 000053
【図２９】
0005308027.tif 000054
【図３０】
0005308027.tif 000055
【図３１】
0005308027.tif 000056
【図３２】
0005308027.tif 000057
【図３３】
0005308027.tif 000058
【図３４】
0005308027.tif 000059
【図３５】
0005308027.tif 000060
【図３６】
0005308027.tif 000061
【図３７】
0005308027.tif 000062
【図３８】
0005308027.tif 000063
【図３９】
0005308027.tif 000064
【図４０】
0005308027.tif 000065
【図４１】
0005308027.tif 000066
【図４２】
0005308027.tif 000067
【図４３】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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