(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの合成方法であって、縮合反応条件下で式（１）の化合物と式（２）の化合物とを液体反応溶媒中で反応させ、式（３）の化合物を得ることを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成方法。
【化１】
0005253578.tif 000013
（式中、Ｒ1はジメトキシトリチル基、ＲＮＡまたはＤＮＡであり；Ｒ2、Ｒ3はそれぞれ立体障害型シリル系保護基であり；Ｒ4はハロゲン元素であり；Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオンであり；Ｂ1、Ｂ2はそれぞれＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基である。）
【請求項２】
前記縮合反応条件が、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールおよび／または１−（２−メシチレンスルホニル）−１，２，４−トリアゾールを縮合剤にし、前記反応溶媒としてピリジンを用い、式（１）の化合物１モルに対して、式（２）の化合物の使用量が０．８〜３モルであり、該縮合剤の使用量が２〜５モルであり、該反応溶媒が５〜５０リットルであり、反応温度が１０〜５０℃であり、反応時間が０．５〜１０時間であることを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項３】
Ｒ2とＲ3が、それぞれｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基からなる群より選択され、Ｒ4が塩素または臭素であり、前記トリアルキルアンモニウムイオンの各アルキル基の炭素数が１〜６個であり、前記アシル基がベンゾイル、イソブチリル、アセチルからなる群より選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項４】
式（１）または式（３）において、−ＣＨ2−Ｎ3がオルト位に位置し、式（２）または式（３）において、Ｒ4がオルト位に位置する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項５】
式（１）の化合物が、縮合反応条件下で式（４）の化合物と式（５）の化合物とを反応させてから、５’位にあるＲ5保護基を脱離することにより得られる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【化２】
0005253578.tif 000014
（式中、Ｒ2は立体障害型シリル系保護基であり；Ｒ5はジメトキシトリチル基であり；Ｒ6はハロゲン元素であり；Ｂ1はＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基からなる群より選択される。）
【請求項６】
前記縮合反応条件は、Ｎ−メチルイミダゾールを補助剤にし、ジクロロメタン、ピリジンからなる群より選択される少なくとも１種を反応溶媒として用い、式（４）の化合物１モルに対して、式（５）の化合物の使用量が１〜５モルであり、該補助剤の使用量が１．８〜３．５モルであり、該反応溶媒の使用量が２０〜２００リットルであり、反応温度が−１０℃〜１０℃であり、反応時間が５〜１００時間であることを含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項７】
式（５）の化合物の合成方法が、
ステップ（１）：過酸化ベンゾイルの存在下で、式（９）の化合物とＮ−ハロゲンコハク酸イミドとを反応させ、式（１０）の化合物を得るステップ
ステップ（２）：式（１０）の化合物とアルカリ金属アジドとを反応させ、式（１１）の化合物を得るステップ、および、
ステップ（３）：式（１１）の化合物を加水分解して、アシル化して式（５）の化合物を得るステップ、
を含む、請求項５または請求項６に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【化３】
0005253578.tif 000015
式中、Ｒ9はハロゲン元素であり、Ｒ10は炭素数１〜４のアルキル基である。
【請求項８】
前記ステップ（１）において、反応溶媒が、テトラクロロメタン、トリクロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタンからなる群よる選択される少なくとも１種であり、式（９）の化合物１モルに対して、Ｎ−ハロゲンコハク酸イミドの使用量が１〜３モルであり、過酸化ベンゾイルの使用量が０．０１〜０．１モルであり、反応溶媒の使用量が５〜２０リットルであり、反応温度が８０〜１２０℃であり、反応時間が０．５〜６時間であり、
前記ステップ（２）において、反応溶媒が、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドからなる群よる選択される少なくとも１種であり、式（１０）の化合物１モルに対して、アルカリ金属アジドの使用量が１〜３モルであり、反応溶媒の使用量が３〜１０リットルであり、反応温度が０〜８０℃であり、反応時間が２〜３０時間であり、
前記ステップ（３）において、前記加水分解は式（１１）の化合物と、アルカリ金属水酸化物のアルコール水溶液との混合溶液との反応を含み、式（１１）の化合物１モルに対して、アルカリ金属水酸化物の使用量が５〜１００モルであり、反応温度が０〜５０℃であり、反応時間が０．１〜２時間であり、前記アルコール水溶液との混合溶液におけるアルカリ金属水酸化物の濃度が５〜１０重量％である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項９】
式（２）の化合物が、触媒の存在下で、式（６）の化合物、式（７）の化合物とトリアルキルアミンとを反応溶媒の中で反応させことにより得られ、
該触媒が、１，２，４−トリアゾール、トリエチルアミン、ピリジンからなる群より選択される少なくとも１種であり、
該反応溶媒はジクロロメタン、ジオキサシクロヘキサン、テトラヒドロフランからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【化４】
0005253578.tif 000016
（式中、Ｒ1はジメトキシトリチル基、ＲＮＡまたはＤＮＡであり；Ｒ3は立体障害型シリル系保護基であり；Ｒ4、Ｒ7およびＲ8はそれぞれハロゲン元素であり；Ｂ2はＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基である。）
【請求項１０】
反応温度が、−１０℃〜１０℃であり、反応時間が０．５〜１０時間であり、式（６）の化合物１モルに対して、式（７）の化合物の使用量は１〜５モルであり、前記トリアルキルアミンの使用量は１〜５０モルであり、前記触媒の使用量は２〜１０モルである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドの基本構造ユニットはヌクレオチドであり、ヌクレオチドは塩基、ペントースとリン酸から構成される。ヌクレオチドは、ＲＮＡ（リボ核酸）とＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に分類できるが、この２種類のヌクレオチドは基本化学構造が同じで、含有するペントースのみが異なる。ＲＮＡのペントースはＤ−リボースであり、ＤＮＡのペントースはＤ−２−デオキシリボースである。塩基としては、一般的に、グアニン、アデニン等のプリン塩基、シトシン、チミン、ウラシル等のピリミジン塩基等を含む。
【０００３】
現在広く使用されているオリゴヌクレオチドの化学合成方法は、固相合成法であり、ホスホラミダイトトリエステル法とも言う。例えば、「生化学（上）（王鏡岩ら編著、第３版、高等教育出版社）５２０〜５２１ページ」に固相合成に関する記載を参照することができる。全ての反応は大きくない固相カラムの中で行う。設計した通りに反応を行うようにするため、まず活性化しようとするヌクレオチドの特定する遊離の基を保護（ブロック）する。５’−ＯＨ基は、ＤＭＴ（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル、又はジメトキシトリチル）基により保護され、塩基中のアミノ基はベンゾイル基により保護される。３’−ＯＨ基は、アミノ亜リン酸化合物を用いて活性化させる。１個目のヌクレオチドの３’−ＯＨ基は、固相（樹脂）と結合する。亜リン酸トリエステルは、その５’−ＯＨ基と活性化されたモノマー（ヌクレオチド）との間に形成される。活性化されたモノマーの５’−ＯＨ基と塩基のアミノ基は保護されているために反応には関わらない。第２ステップの反応において、亜リン酸トリエステルは、ヨウ素酸化によりリン酸エステルに転換する。第３ステップの反応において、トリクロロ酢酸を加えて成長鎖の５’−ＯＨ基の保護基ＤＭＴを脱離する。ＤＮＡ鎖は、もう一つのヌクレオチドユニットにより伸長されて、次の鎖の伸長反応に投入できる。事前に決めたシーケンス制御に従って、ＤＮＡ断片の合成を完了させ、ベンゼンチオールにより５’−ＯＨ上の保護基ＤＭＴを脱離して、濃アンモニア水で処理することによってＤＮＡ断片を固相から切り出し、それから濃アンモニア水を用いて加熱条件下で塩基上の保護基を脱離して、最後に濃アンモニア水を取り除いて、真空下で蒸発させて、所定のものを得る。
【０００４】
上に述べた固相合成の全工程は固相カラム中で行うために、固相カラムの量が制限されて、この方法の合成規模が小さく、収率が低く、大量合成の要求に満足できない。核酸の研究の進展に伴い、科学研究に用いるオリゴマーＲＮＡは迅速的に増加するし、ＲＮＡを臨床上に応用することもますます増えているため、ＲＮＡを大規模に合成できる方法は非常に意義がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来のオリゴヌクレオチドの化学合成方法において合成規模が小さい欠点を克服し、オリゴヌクレオチドを大規模に合成できる合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成方法を提供する。この方法は、縮合反応条件下で式（１）の化合物と式（２）の化合物とを液体反応溶媒中で反応させ、式（３）の化合物を得ることを含む。
【０００７】
【化１】
0005253578.tif 000002
【０００８】
式中、Ｒ1はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル基）、ＲＮＡまたはＤＮＡであり；Ｒ2、Ｒ3はそれぞれ立体障害型シリル系保護基であり；Ｒ4はハロゲン元素であり；Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオンであり；Ｂ1、Ｂ2はそれぞれＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、適宜な保護基を用いて保護しようとする官能基を保護し、式（１）の化合物（ＯＨ−成分）にある連結しようとする５’末端のヒドロキシル基と式（２）の化合物（Ｐ−成分）にある連結しようとする３’末端のリン酸塩とを遊離にして、液体反応溶媒中で縮合反応を行い、ＯＨ−成分とＰ−成分とを連結し、新たなＤＮＡまたは短鎖ＲＮＡが得られる。必要に応じて、このステップが完了してから、得られたＤＮＡまたは短鎖ＲＮＡの５’末端の保護基を脱離して、新しい式（２）の化合物と縮合反応を再度行い、より長い鎖を有するものを得、このような工程を繰り返して、最後に全ての保護基を脱離して、所定の長さのオリゴヌクレオチドを得る。もしくは、新たに得られたＤＮＡまたは短鎖ＲＮＡの３’末端にある保護基を脱離してから、３’末端のヒドロキシル基をリン酸エステル化して新たなＰ−成分を得て（反応式IIIに示されているような反応）、新しい式（３）の化合物と縮合反応を再度行い、より長い鎖のものを得、このような工程を繰り返して、最後に全ての保護基を脱離して、所定のオリゴヌクレオチドを合成できる。本発明の方法は、固相カラムを使用する必要がなく、液体反応溶媒中で実施できて、オリゴヌクレオチドを大規模に合成することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の提供するオリゴヌクレオチドの合成方法は、縮合反応条件下で式（１）の化合物と式（２）の化合物とを液体反応溶媒中で反応させ、式（３）の化合物を得ることを含む。
【００１１】
【化２】
0005253578.tif 000003
【００１２】
式中、Ｒ1はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル基）、ＲＮＡまたはＤＮＡであり；Ｒ2、Ｒ3はそれぞれ立体障害型シリル系保護基であり；Ｒ4はハロゲン元素であり；Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオンであり；Ｂ1、Ｂ2はそれぞれＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基である。
【００１３】
このステップは反応式Ｉに示すことができる。
【００１４】
【化３】
0005253578.tif 000004
【００１５】
前記縮合反応条件としては、以下の縮合剤、反応溶媒、反応温度、反応時間等を含むことができる。
前記縮合剤としては、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、１−（２−メシチレンスルホニル）−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＩ）からなる群より選択される少なくとも１種を用いることができる。
ＭＳＮＴの構造式を式（８）に示す。
【００１６】
【化４】
0005253578.tif 000005
【００１７】
前記反応溶媒としてはピリジンを用いることができる。
【００１８】
式（１）の化合物１モルに対して、式（２）の化合物の使用量は通常０．８〜３モル、好ましくは１〜２モル、より好ましくは１〜１．３モルである。縮合剤の使用量は通常２〜５モル、好ましくは２．５〜３モルである。反応溶媒の使用量は通常５〜５０リットル、好ましくは５〜２０リットルである。
反応式Ｉに示されている反応温度は通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜３５℃である。反応時間は通常０．５〜１０時間、好ましくは１〜５時間である。
【００１９】
式（１）、式（２）、及び式（３）において、前記立体障害型シリル系保護基としては、立体障害と保護性能を有するシリル系基であれば、いかなる種類のものも用いることができるが、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基からなる群より選択されるものが好ましく、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基がより好ましい。
【００２０】
前記ハロゲン元素としては、フッ素、塩素、臭素とヨウ素からなる群より選択することができるが、塩素または臭素が好ましく、塩素がより好ましい。
【００２１】
前記トリアルキルアンモニウムイオンのアルキル基は、それぞれ同一でも異なってもよい。各アルキル基の炭素数としては１〜６個のものが挙げられるが、好ましくは１〜４個である。より好ましいアルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルとｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００２２】
Ｂ1、Ｂ2のアシル基としては、炭素数２〜２０個のアシル基が挙げられるが、ベンゾイル、イソブチリル、アセチルが好ましい。
【００２３】
式（１）または式（３）において、−ＣＨ2−Ｎ3の位置は、オルト位、メタ位、パラ位からなる群より選択されるが、好ましくはオルト位である。
式（２）または式（３）において、Ｒ4の位置は、オルト位、メタ位、パラ位からなる群より選択されるが、好ましくはオルト位である。
【００２４】
反応式Ｉの反応が完了した後、反応を終止して、生成物を分離してもよい。
反応の終止方法としては、反応溶液とトリエチルアミン炭酸水素塩（ＴＥＡＢ）水溶液とを混合し、攪拌しながら１０〜９０分間保持する方法が挙げられる。トリエチルアミン炭酸水素塩水溶液の濃度としては０．１〜１モル／リットル、トリエチルアミン炭酸水素塩水溶液と前記反応溶媒との容積比としては０．０２〜０．５とすればよい。
【００２５】
前記分離の方法としては、終止反応後の反応溶液とジクロロメタンとを混合する工程、トリエチルアミン炭酸水素塩水溶液を加えて洗浄する工程、有機層を乾燥して、ろ過し、濃縮し、常圧カラムにより分離し、生成物を得る工程を含むことが可能である。ジクロロメタンと前記反応溶媒との容積比としては２〜２０、トリエチルアミン炭酸水素塩水溶液の濃度としては０．０５〜０．５モル／リットルとすればよい。前記洗浄の回数は１回もしくは複数回であり、洗浄用のトリエチルアミン炭酸水素塩水溶液の総容積と前記反応溶媒の容積との比としては２〜２０とすればよい。前記乾燥、ろ過、濃縮、常圧カラム分離の操作方法は当業者間ではよく知られており、詳細についてはここでは省略する。
【００２６】
必要に応じて、反応式Ｉの反応が完了した後、得られたＤＮＡまたは短鎖ＲＮＡの５’末端の保護基を脱離して（式IIに示されたような第２ステップ反応）、新たな式（２）の化合物と縮合反応を行い、より長い鎖が得られる。このような複数ステップ反応を繰り返して行い、最後に全ての保護基を脱離して、所定の鎖を有するオリゴヌクレオチドを得ることができる。もしくは、新たに得られたＤＮＡまたは短鎖ＲＮＡの３’末端にある保護基を脱離してから、３’末端のヒドロキシル基をリン酸エステル化して新たなＰ−成分が得られ（反応式IIIに示されているような反応）、新たな式（３）の化合物と縮合反応を再度行い、より長い鎖のものが得られる。このような複数ステップ反応を繰り返して、最後に全ての保護基を脱離して、所定合成のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００２７】
本発明の方法によれば、式（１）の化合物は反応式IIに示された反応により合成できる。即ち、縮合反応条件下で式（４）の化合物と式（５）の化合物とを反応させ、５’位にあるＲ5保護基を脱離する。
【００２８】
【化５】
0005253578.tif 000006
【００２９】
式（４）と式（５）において、Ｒ2は立体障害型シリル系保護基であり、種々の立体障害と保護性能を有するシリル系基であり、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基からなる群より選択され、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。
Ｒ5はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル基）、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
Ｒ6はハロゲン元素である。前記ハロゲン元素としては、フッ素、塩素、臭素とヨウ素からなる群より選択され、好ましくは塩素または臭素であり、より好ましくは塩素である。
Ｂ1はＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基からなる群から選択される。前記アシル基としては、炭素数２〜２０個のアシル基が用いられ、好ましくはベンゾイル、イソブチリル、アセチルである。
【００３０】
式（１）または式（４）において、−ＣＨ2−Ｎ3の位置は、オルト位、メタ位、パラ位からなる群より選択され、好ましくはオルト位である。
【００３１】
反応式IIにおいて、前記縮合反応条件としては、Ｎ−メチルイミダゾールを補助剤にし、反応溶媒はジクロロメタン、ピリジンからなる群より選択される少なくとも１種であることなどを含むことができる。
【００３２】
式（４）の化合物１モルに対して、式（５）の化合物の使用量は通常１〜３モル、好ましくは１．５〜３モルである。前記補助剤の使用量は通常１〜８モル、好ましくは２〜３．５モルである。反応溶媒の使用量は通常２０〜２００リットル、好ましくは３０〜１５０リットルである。
反応温度としては、通常−１０℃〜１０℃であり、氷浴を用いることが好ましい。反応時間としては、通常５〜１００時間、好ましくは１０〜６０時間である。
【００３３】
反応式IIの反応が完了した後、反応を終止して、縮合反応生成物を分離してもよい。
反応の終止方法としては、反応溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とを１〜２０分間混合する方法が挙げられる。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と前記反応溶媒との容積比としては１〜１０とすればよい。
【００３４】
前記分離の方法としては、終止反応後の反応溶液の有機層と水層を分ける工程、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて有機層を洗浄する工程、全ての有機層を乾燥して、ろ過し、濃縮し、常圧カラムにより分離する工程を含む方法が挙げられ、これらの工程を経て、生成物が得られる。
前記洗浄の回数は、１回でも複数回でもよく、洗浄用の炭酸水素ナトリウム水溶液の総容積と前記反応溶媒の容積との比としては１〜２０とすればよい。前記乾燥、ろ過、濃縮、常圧カラム分離の操作方法は、当業者間では知られており、詳細についてはここでは省略する。
【００３５】
５’位のＲ5保護基を脱離する方法としては、攪拌しながら縮合反応生成物とギ酸をクロロホルムの中、１０〜５０℃で５〜６０分間反応させ、反応後有機層とギ酸層とを直接に分層し、ギ酸層はジクロロメタンを用いて抽出し、全ての有機層を乾燥して、ろ過し、濃縮し、常圧カラムにより分離する工程を含む方法が挙げられ、これらの工程を経て、生成物が得られる。
前記抽出の回数は、１回もしくは複数回でもよく、抽出用のジクロロメタンの総容積とギ酸の容積との比としては１〜２０とすればよい。前記乾燥、ろ過、濃縮、常圧カラム分離の操作方法は、当業者間ではよく知られており、詳細についてはここでは省略する。ギ酸の使用量としては、前記縮合反応生成物１モルに対して１０〜５０リットル用いればよい。
【００３６】
５’位のＲ5保護基を脱離する方法としては、攪拌しながら縮合反応生成物とパラトルエンスルホン酸１％、トリクロロ酢酸３〜５％、トリフルオロ酢酸３〜５％のジクロロメタン溶液とを１〜６０分間反応させる方法が挙げられる。ここで、前記有機酸の当量数は反応計量数の５〜２０倍である。その後、反応後飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、有機層を分離し、有機層を乾燥して、ろ過し、濃縮し、常圧カラムにより分離する工程を含むことで、生成物が得られる。前記乾燥、ろ過、濃縮、常圧カラム分離の操作方法は、当業者間では知られており、詳細についてはここでは省略する。
【００３７】
３’位にある保護基を脱離する方法としては、攪拌しながら縮合反応生成物とトリフェニルホスフィンまたはメチルジフェニルホスフィンとを水１０％のジオキサシクロヘキサンの中、１０〜５０℃で一夜反応させ、反応後溶媒を蒸留で除去して、常圧カラムにより分離する方法が挙げられ、これにより生成物が得られる。縮合反応生成物１モルに対してトリフェニルホスフィンまたはメチルジフェニルホスフィンの使用量としては３〜５モルとすればよく、ジオキサシクロヘキサンの使用量は５０〜１５０リットルとすればよい。前記蒸留、常圧カラム分離の操作方法は、当業者間ではよく知られており、詳細についてはここでは省略する。
【００３８】
式（５）の化合物の合成方法は、以下に示されているステップを含むことができる。
ステップ（１）：過酸化ベンゾイルの存在下で、式（９）の化合物とＮ−ハロゲンコハク酸イミドとを反応させ、式（１０）の化合物を得る；
ステップ（２）：式（１０）の化合物とアルカリ金属アジドとを反応させ、式（１１）の化合物を得る；
ステップ（３）：式（１１）の化合物を加水分解して、アシル化して式（５）の化合物を得る。
【００３９】
【化６】
0005253578.tif 000007
【００４０】
式中、Ｒ9はハロゲン元素であり、Ｒ10は炭素数が１〜４のアルキル基である。
【００４１】
上記ステップ（１）において、反応溶媒はテトラクロロメタン、トリクロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタンからなる群より選択される少なくとも１種とすることができる。式（９）の化合物１モルに対して、Ｎ−ハロゲンコハク酸イミドの使用量は通常１〜３モル、好ましくは１〜１．２モルであり、過酸化ベンゾイルの使用量は通常０．０１〜０．１モル、好ましくは０．１〜０．２モルであり、反応溶媒の使用量は通常５〜２０リットル、好ましくは６〜１０リットルであり、反応温度は通常８０〜１２０℃、好ましくは９０〜１１０℃であり、反応時間は通常０．５〜６時間、好ましくは１〜３時間である。
【００４２】
上記ステップ（２）において、反応溶媒はエタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドからなる群より選択される少なくとも１種とすることができる。式（１０）の化合物１モルに対して、アルカリ金属アジドの使用量は通常１〜３モル、好ましくは１．５〜２モルであり、反応溶媒の使用量は通常３〜１０リットル、好ましくは６〜８リットルであり、反応温度は通常０〜８０℃、好ましくは２５〜３５℃であり、反応時間は２〜３０時間である。
【００４３】
上記ステップ（３）において、前記加水分解は式（１１）の化合物と、アルカリ金属水酸化物のアルコール水溶液との混合溶液（容積比＝１：１）との反応を含んでもよい。式（１０）の化合物１モルに対して、アルカリ金属水酸化物の使用量は通常５〜１００モル、好ましくは１０〜２０モルであり、反応温度は通常０〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃であり、反応時間は通常０．１〜２時間、好ましくは０．２５〜１時間である。前記アルコールー水混合溶液におけるアルカリ金属水酸化物の濃度は５〜１０重量％としてもよい。
【００４４】
式（２）の化合物は、反応式IIIに示された反応により合成できる。即ち、触媒の存在で式（６）の化合物、式（７）の化合物とトリアルキルアミンとを反応溶媒の中で反応させことにより得られる。
【００４５】
【化７】
0005253578.tif 000008
【００４６】
前記触媒は１，２，４−トリアゾール、トリエチルアミン、ピリジンからなる群より選択される少なくとも１種である。
前記反応溶媒は、ジクロロメタン、ジオキサシクロヘキサン、テトラヒドロフランからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００４７】
式（６）、式（７）において、Ｒ1はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル基）、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
Ｒ3は立体障害型シリル系保護基であり、種々の立体障害と保護性能を有するシリル系基が用いられ、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基からなる群より選択され、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。
Ｒ4、Ｒ7とＲ8はそれぞれハロゲン元素である。前記ハロゲン元素としては、フッ素、塩素、臭素とヨウ素からなる群より選択され、好ましくは塩素または臭素であり、より好ましくは塩素である。
Ｂ2はＮ−アシル基で誘導されたグアニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたアデニン基、Ｎ−アシル基で誘導されたシトシン基、Ｎ−アシル基で誘導されたチミン基またはＮ−アシル基で誘導されたウラシル基からなる群より選択される。前記アシル基としては、炭素数２〜１０個のアシル基であり、好ましくはベンゾイル、イソブチリル、アセチルである。
【００４８】
式（３）または式（７）において、Ｒ4の位置は、オルト位、メタ位、パラ位からなる群より選択され、好ましくはオルト位である。
【００４９】
反応式IIIに示されている反応の反応条件としては、反応温度は、通常−１０℃〜１０℃、好ましくは氷浴が用いられる。反応は２つステップに分けて行われ、第１ステップの反応時間は、通常０．５〜１０時間、好ましくは１〜３時間である。
【００５０】
式（６）の化合物１モルに対して、式（７）の化合物の使用量は通常１〜５モル、好ましくは１．５〜３モルであり、トリアルキルアミンの使用量は通常１〜５０モル、好ましくは３〜２０モルであり、触媒の使用量は通常２〜１０モル、好ましくは２〜６モルであり、前記反応溶媒の使用量は通常５〜２００リットル、好ましくは１０〜１００リットルである。
【００５１】
第１ステップの反応が完了後、反応溶液とトリエチルアミン炭酸水素塩の水溶液とを混合し、攪拌しながら１０〜９０分間保持してもよい。トリエチルアミン炭酸水素塩の水溶液の濃度は０．１〜１モル／リットルであり、トリエチルアミン炭酸水素塩の水溶液と前記反応溶媒との容積比は０．２〜２である。それから有機層と水層とを分けて、トリエチルアミン炭酸水素塩の水溶液を用いて有機層を洗浄し、全ての有機層を乾燥して、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して、生成物が得られる。洗浄用のトリエチルアミン炭酸水素塩水溶液の濃度は０．１〜１モル／リットルであり、洗浄は１回または複数回であってもよい。洗浄用のトリエチルアミン炭酸水素塩水溶液と前記反応溶媒との容積比は０．５〜５としてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実験例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
実施例に用いる原材料およびその入手方法を以下に示す。
第１ヌクレオチド（Ａ）：式（６）に示された化合物であり、保護されたアデニンオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ2はＮ−ベンゾイルアデニンであり、Ｒ1はＤＭＴｒであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第２ヌクレオチド（Ａ）：式（４）に示された化合物であり、保護されたアデニンオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ1はＮ−ベンゾイルアデニンであり、Ｒ5はＤＭＴｒであり、Ｒ2はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第３ヌクレオチド（Ｃ）：式（６）に示された化合物であり、保護されたシトシンオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ2はＮ−ベンゾイルアシトシンであり、Ｒ1はＤＭＴｒであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第４ヌクレオチド（Ｇ）：式（４）に示された化合物であり、保護されたグアニンオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ1はＮ−ベンゾイルアグアニンであり、Ｒ5はＤＭＴｒであり、Ｒ2はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第５ヌクレオチド（Ｇ）：式（６）に示された化合物であり、保護されたグアニンオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ2はＮ−ベンゾイルアグアニンであり、Ｒ1はＤＭＴｒであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第６ヌクレオチド（Ｕ）：式（４）に示された化合物であり、保護されたウラシルオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ1はウラシルであり、Ｒ5はＤＭＴｒであり、Ｒ2はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
第７ヌクレオチド（Ｕ）：式（６）に示された化合物であり、保護されたウラシルオリゴヌクレオチド。式中、Ｂ2はウラシルであり、Ｒ1はＤＭＴｒであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）より購入する。
トリエチルアミン：天津市北方天医試薬工場より購入する。
１，２，４−トリアゾール：アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）より購入する。
２−クロロフェニルジクロロホスファイト：式（７）の化合物。式中、Ｒ4、Ｒ7とＲ8はいずれも塩素であり、Ｒ4はメタ位である。アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）より購入する。
２−アジドメチルベンゾイルクロライド：式（５）の化合物。式中、Ｒ6は塩素であり、Ｒ4はメタ位である。合成実施例６で合成する。
ＭＳＮＴ：式（８）の化合物。シグマ  アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）より購入する。
【００５４】
合成実施例１
本合成実施例は、式（３）化合物の原料、即ち式（２）化合物（Ｐ−成分）を合成する。
２５０ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（２．７６ｇ、４０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１０．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加えて、ジクロロメタン（１５ｍｌ）で溶解させる。氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（４．９１ｇ、２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１０ｍｌを滴下して、それから第１ヌクレオチド（７．８７ｇ、１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液３５ｍｌを滴下する。氷浴下で２．５時間攪拌後、１Ｍ濃度のＴＥＡＢ（３５ｍｌ）を加えて、さらに０．５時間攪拌する。１Ｍ濃度のＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回抽出する。全ての有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーターで溶媒を除去して生成物（１０．７８ｇ、収率１００％）を得る。31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１Ｍ）δ−６．０９．ＥＳＩ−ＭＳ，Ｍ-９７６．２９２６。この収率は、第１ヌクレオチドより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００５５】
合成実施例２
本合成実施例は、式（３）化合物の原料、即ち式（１）化合物（ＯＨ−成分）を合成する。
２５０ｍｌの丸底フラスコに、Ｎ−イミダゾール（２．０８ｇ、２５ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１５ｍｌ）を加える。氷浴下で２−アジドメチルベンゾイルクロライド（４．１８ｇ、２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１５ｍｌを滴下して、それから第２ヌクレオチド（７．８７ｇ、１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液４０ｍｌを滴下して、氷浴下で反応を４０時間保持する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を加えて反応を終止する。分液後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ×２）で２回洗浄する。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（８．２１ｇ、収率８６．８％）を得る。この収率は、第２ヌクレオチドより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
上で得た生成物（８．２１ｇ、８．６７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１７０ｍｌ）に溶解させ、高速攪拌下（攪拌速度：５００〜１０００回転数／分）で、ギ酸（１７０ｍｌ）を加えて、室温で３０分間反応する。直接分液し、ギ酸層をジクロロメタン（１７０ｍｌ×３）で３回抽出し、合併後、水（１７０ｍｌ×３）で３回、０．１Ｍ濃度のＴＥＡＢ（１７０ｍｌ×１）で１回洗浄する。全ての有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（４．７８ｇ、収率８５．５％）を得る。この収率は、第２ヌクレオチドより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００Ｍ）δ（−０．３２，３Ｈ，１ＣＨ3），（−０．００，３Ｈ，１ＣＨ3），（−０．７７，９Ｈ，３ＣＨ3），１．８９（ｓ，１Ｈ），４．０１−４．２８（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ2），４．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），５．４２−５．４６（ｔ，１Ｈ），５．８８，５．９０（ｄ，１Ｈ），６．０９，６．１２（ｄ，１Ｈ），６．２６（ｄ，１Ｈ），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．５８−７．７９（ｍ，５Ｈ），８．１６−８．３１（ｍ，４Ｈ），８．９８（ｓ，１Ｈ），９．２２（ｓ，１Ｈ），ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｎａ）+６６７．２４１９。
【００５６】
合成実施例３
第１ヌクレオチドの代わりに第３ヌクレオチドを用いて、合成実施例１と同様な方法で合成する。
【００５７】
合成実施例４
第２ヌクレオチドの代わりに第４ヌクレオチドを用いて、合成実施例２と同様な方法で合成する。
【００５８】
合成実施例５
第１ヌクレオチドの代わりに第５ヌクレオチドを用いて、合成実施例１と同様な方法で合成する。
【００５９】
合成実施例６
第１ヌクレオチドの代わりに第７ヌクレオチドを用いて、合成実施例１と同様な方法で合成する。
【００６０】
合成実施例７
第２ヌクレオチドの代わりに第６ヌクレオチドを用いて、合成実施例２と同様な方法で合成する。
【００６１】
合成実施例８
第２ヌクレオチドの代わりに第３ヌクレオチドを用いて、合成実施例２と同様な方法で合成する。
【００６２】
合成実施例９
本合成実施例は式（５）の化合物を合成する。
（１）還流冷却装置を装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに、化合物１（１０．０ｇ）を加えてから、塩化チオニル（８０ｍｌ）を加えて、加熱還流して、９０℃で攪拌しながら５時間反応する。還流冷却装置を蒸留装置に換えて、溶媒である塩化チオニルを蒸留で除去する。冷却後、メタノール（６０ｍｌ）を加えて、室温で攪拌しながらトリエチルアミン（１５ｍｌ）を滴下する。滴下後、室温でさらに３０分間攪拌反応する。エバポレーターで過量のメタノールとトリエチルアミンを除去して、酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄する。エステル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した後、化合物２（９．７ｇ、収率８８．２％）を得る。
【００６３】
【化８】
0005253578.tif 000009
【００６４】
（２）２５０ｍｌの丸底フラスコに、化合物２（１．５０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、テトラクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解後、ＮＢＳ（１．９８ｇ、１１ｍｍｏｌ）とＢＰＯ（０．４８ｇ、０．２ｍｍｏｌ）とを加えて、１．５時間加熱還流して反応する。ろ過して浮いた不溶物を除去してから、溶媒を蒸留で除去して、化合物３を得る。反応は定量的である。
【００６５】
【化９】
0005253578.tif 000010
【００６６】
（３）２５ｍｌの丸底フラスコに、化合物３（９１６ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を加え、エタノール（２０ｍｌ）に溶解後、アジ化ナトリウム（５２０ｍｇ、８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２１時間攪拌して反応する。エバポレーターでエタノールを除去してから、酢酸エチルを加えて溶解させ、水、飽和食塩水で順次に洗浄する。有機層はエバポレーターで溶媒を除去した後、５％の水酸化ナトリウム溶液（メタノール／水（容積比）＝１／１）（４０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、エバポレーターでメタノールを除去する。２．５Ｍ濃度の塩酸を用いてＰＨ値を約１になるように調製し、ジクロロメタンで４回抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去し、化合物５を得る。シクロヘキサンより化合物５を再結晶し、白色結晶を得る。
化合物５の核磁気共鳴分光法分析結果：
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００Ｍ）４．８９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2）、７．４３−７．４７（ｔ，１Ｈ）、７．５４−７．５６（ｄ，１Ｈ）、７．６１−７．６４（ｔ，１Ｈ）、８．１８−８．２０（ｄ，１Ｈ）。
元素分析結果：
計算値；Ｃ：５４．２４，Ｈ：３，９８，Ｎ：２３．７２。
実測値；Ｃ：５３．８０，Ｈ：３．９９，Ｎ：２３．９２。
【００６７】
【化１０】
0005253578.tif 000011
【００６８】
（４）１００ｍｌの丸底フラスコに、化合物５（１．０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）を加え、トリクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解して、塩化チオニル（２．０２ｇ、１６．９５ｍｍｏｌ）を加えて、５時間加熱還流する。反応後、エバポレーターで溶媒を除去する。トルエン（３ｍｌ×３回）との共沸で過量の塩化チオニルを取り出し、化合物６を得る。得られた化合物は、デシケータ内に保管しておく。
【００６９】
【化１１】
0005253578.tif 000012
【００７０】
実施例１
本実施例はオリゴヌクレオチドを合成する。
合成ターゲット：全て保護されたＲＮＡ
DMTr[CGAAAGAACG]AZMB
備考：［  ］は３’末端と５’末端を除いて全て保護されているＲＮＡである。ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、５’末端の保護基である。ＡＺＭＢは２−アジドメチルベンゾイル基であり、３’末端の保護基である。
【００７１】
（１）DMTr[CpG]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例４の生成物（５９８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）と合成実施例３の生成物（１．１９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計７４５ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で３時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（６０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３回）で３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（８３１ｍｇ、収率５６．４％）を得る。この収率は、合成実施例４より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７２】
（２）OH[CpG]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（１）で得たDMTr[CpG]AZMB（８００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をトリクロホルム（７．５ｍｌ）に溶解し、高速攪拌しながらギ酸（７．５ｍｌ）を添加し、室温で３０分間攪拌し反応する。直接分液し、ギ酸層をジクロロメタン（５ｍｌ×３）で３回抽出し、合併後、水（５ｍｌ×３）で３回、０．１Ｍ濃度のＴＥＡＢ（１０ｍｌ×１）で１回洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（５００ｍｇ、収率７９．１％）を得る。この収率は、DMTr[CpG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７３】
（３）DMTr[AA]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例２の生成物（１．３９ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）と合成実施例１の生成物（３．０３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２２ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．８０ｇ、６．０５ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢを添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（３．０８ｇ、収率８７．９％）を得る。この収率は、合成実施例２より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７４】
（４）OH[AA]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（３）で得たDMTr[AA]AZMB（３．０８ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を１％濃度の４−トルエンスルホニルクロリド溶液（１００ｍｌ）に溶解し、室温で３０分間攪拌し反応する。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和して有機層を分液し、ジクロロメタンで水層を２回抽出し、有機層を合併する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（２．４５ｇ、収率９８．８％）を得る。この収率は、DMTr[AA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７５】
（５）DMTr[GAA]AZMB
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（４）で得たOH[AA]AZMB（２．４５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）と合成実施例５の生成物（２．３９ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１９ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．５６ｇ、５．２６ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（２ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（２００ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（４．０６８ｇ、収率９６．０％）を得る。この収率は、OH[AA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７６】
（６）OH[GAA]AZMBの合成
２５０ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（５）で得たDMTr[GAA]AZMB（４．０６８ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）をトリクロホルム（５０ｍｌ）に溶解し、高速攪拌しながらギ酸（５０ｍｌ）を添加し、室温で３０分間攪拌し反応する。直接分液し、ギ酸層をジクロロメタンで３回抽出し、合併後、水で３回、０．１Ｍ濃度のＴＥＡＢで１回洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（２．６６ｇ、収率７５．６％）を得る。この収率は、DMTr[GAA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００７７】
（７）DMTr[AGAA]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（６）で得た生成物OH[GAA]AZMB（１．４８ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）と合成実施例１の生成物（１．０８ｇ、１．００ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（８ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計６３２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１．５ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（５００ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して粗生成物（２．２１ｇ）を得る。
【００７８】
（８）DMTr[AGAA]OHの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（７）で得たDMTr[AGAA]AZMB（２．２１ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）をジオキサシクロヘキサンと水の混合溶媒（比率：９／１）（２．６ｇ）を加えて溶解し、トリフェニルホスフィン（７９６ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間攪拌する。エバポレーターで溶媒を除去した後、常圧カラム分離して粗生成物（２．１ｇ）を得る。
【００７９】
（９）DMTr[AGAA]PO-の合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（４２０ｍｇ、６．０８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（７６８ｍｇ、７．６０ｍｍｏｌ）とを加え、ジクロロメタン（７ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（５６０ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍｌ）を滴下し、さらにステップ（８）で得たDMTr[AGAA]OH（２．１ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２．５ｍｌ）を滴下し、氷塩浴で２．５時間攪拌する。ＴＥＡＢ（３ｍｌ）を添加して反応を終止する。０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（１．３１ｇ）を得る。ステップ（７）〜（９）の総収率は５６．７％である。
【００８０】
（１０）DMTr[CGAA]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（６）で得た生成物OH[GAA]AZMB（１．１２ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）と合成実施例３の生成物（７４６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（６ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計４８２ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１．５ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（６０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して粗生成物（１．６３ｇ）を得る。
【００８１】
（１１）DMTr[CGAA]OHの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（１０）で得たDMTr[CGAA]AZMB（１．６０ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）をジオキサシクロヘキサンと水の混合溶媒（比率：９／１）（１．６ｇ）を加えて溶解し、トリフェニルホスフィン（５９５ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間攪拌する。エバポレーターで溶媒を除去した後、常圧カラム分離して粗生成物（１．５ｇ）を得る。
【００８２】
（１２）DMTr[CGAA]PO-の合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（３１５ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５７６ｍｇ、５．７０ｍｍｏｌ）とを加え、ジクロロメタン（５ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（４２０ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２ｍｌ）を滴下し、さらにステップ（１１）で得たDMTr[CGAA]OH（１．５ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２ｍｌ）を滴下し、氷塩浴で２．５時間攪拌する。ＴＥＡＢ（１．５ｍｌ）を添加して反応を終止する。０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（１．１２ｇ）を得る。ステップ（１０）〜（１２）の総収率は６１．９％である。
【００８３】
（１３）DMTr[AGAACG]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（２）で得た生成物OH[GCG]AZMB（４８０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）と合成実施例９で得た生成物DMTr[AGAA]PO-（１．２０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（８ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（３３３ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で２．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（６０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（１．２１ｇ、収率７３．４％）を得る。
【００８４】
（１４）DMTr[AGAACG]OHの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（１３）で得たDMTr[AGAACG]AZMB（１．２１ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をトリクロホルム（１０ｍｌ）に溶解し、高速攪拌しながらギ酸（１０ｍｌ）を添加し、室温で３０分間攪拌し反応する。直接分液し、ギ酸層をジクロロメタンで３回抽出し、合併後、水で３回、０．１Ｍ濃度のＴＥＡＢで１回洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（８６３ｍｇ、収率７８．６％）を得る。
【００８５】
（１５）DMTr[CGAAAGAACG]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、ステップ（１４）で得たOH[AGAACG]AZMB（８４０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）とステップ（１２）で得た生成物DMTr[CGAA]PO-（７８６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１８４ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して０．５時間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（６０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（１．２０ｇ、収率８２．４％）を得る。ＭＡＩＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）−ＴＯＦ  ＭＳ（飛行時間型質量分析法）：６５６０．７８７。
【００８６】
実施例２
本実施例はオリゴヌクレオチドを合成する。
合成ターゲット：5'-CGAAAGAACG-3'
【００８７】
（１）４−ニトロベンズアルデヒドオキシム（４６ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）とテトラメチルグアニジン（３２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）とをジオキサシクロヘキサンと水との混合溶液（０．６ｍｌ）に溶解し、均一に混合後、実施例１で得たDMTr[CGAAAGAACG]AZMB（１３ｍｇ、２μｍｏｌ）を添加し、室温で３０時間反応する。このステップはホスフィンにある保護基を脱離する工程である。
【００８８】
（２）上記ステップ（１）で得た反応液は、４０℃で真空遠心乾燥を行った後、２５〜２８％濃度の濃アンモニア水（５ｍｌ）を加え、５０℃で１２時間反応する。このステップは塩基と３’末端の保護基を脱離する工程である。
【００８９】
（３）上記ステップ（２）で得た反応液は、４０℃で真空遠心乾燥を行った後、８０％濃度の酢酸（１ｍｌ）を加え、室温で３０分間反応して、再度遠心乾燥を行い、残留物を水（２ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｍｌ）で洗浄して、−８０℃での真空冷凍乾燥により粉末を得る。このステップは５’末端の保護基を脱離する工程である。
【００９０】
（４）上記ステップ（３）で得た冷凍乾燥粉末を１Ｍ濃度のフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン溶液（１ｍｌ）に溶解し、３７℃で一夜反応させる。このステップは２’末端の保護基を脱離する工程である。反応完了した反応液に同容積の水でクエンチングし、４０℃で真空遠心乾燥を行いテトラヒドロフランを除去し、残留物はsephadexG25カラムにより脱塩し、波長２６０ｎｍの紫外光を吸収する生成物を収集し、保護基を脱離したオリゴヌクレオチド5'-CGAAAGAACG-3'の水溶液を得る。−８０℃での真空冷凍乾燥により白色粉末を得る。ＭＡＩＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：３２３３．６７。
【００９１】
実施例３
本実施例はオリゴヌクレオチドを合成する。
合成ターゲット：保護されたＲＮＡ
DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMB、およびDMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB
【００９２】
（１）OH[CG]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例３の生成物（４．４３３ｇ、４．２ｍｍｏｌ）と合成実施例４の生成物（２．１９４ｇ、３．５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（３０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（２．９１１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌する。０．１ＭのＴＥＡＢ（４ｍｌ）を添加して１０分間攪拌して反応を終止する。エバポレーターで溶媒を除去した後、得たものをジクロロメタン（５０ｍｌ）に入れ、０．１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、５%濃度の HYPERLINK "http://jp.exportpages.com/product/1025501275/1.htm" シュウ酸でｐＨ３に調整し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ過液５０ｍｌを得る。そのろ過液を２５０ｍｌの丸底フラスコに移し、６％濃度のトリフルオロ酢酸（５０ｍｌ）をゆっくり添加し、室温で５分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加え、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（２０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７８％）を得る。この収率は、合成実施例４より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９３】
（２）OH[GG]AZMBの合成
合成実施例５の生成物（４．４７１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、合成実施例４の生成物（２．１９４ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（２０ｍｌ）と０．１ＭのＴＥＡＢ（３ｍｌ）を使用する以外は、上記ステップ（１）と同様な方法でOH[GG]AZMBを合成する。生成物の収率が６７．１％である。この収率は、合成実施例４より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９４】
（３）OH[AU]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例１の生成物（４．５３４ｇ、４．２ｍｍｏｌ）と合成実施例７の生成物（１．８１１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．９１１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して１０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（４５ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（４５ｍｌ）をゆっくり添加し、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で５分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加え、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（２０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率８１．１％）を得る。この収率は、合成実施例７より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９５】
（４）OH[UU]AZMBの合成
２５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（１０．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）と合成実施例７の生成物（４．５３ｇ、８．７５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（４５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計７．２８ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（５０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（１００ｍｌ）をゆっくり加える。室温で５分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（５０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７３％）を得る。この収率は、合成実施例７より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９６】
（５）OH[CA]AZMBの合成
５００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例３の生成物（３１．６６ｇ、３０ｍｍｏｌ）と合成実施例２の生成物（１６．１２ｇ、２５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２０．７９ｇ、７０ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１００ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（６００ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（３７０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（３７０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で５分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７２％）を得る。この収率は、合成実施例２より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９７】
（６）OH[CC]AZMBの合成
合成実施例３の生成物（１２．２５ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）、合成実施例８の生成物（６．０ｇ、９．６７ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（５０ｍｌ）とＭＳＮＴ（８．０１ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（４）と同様な方法でOH[CC]AZMBを合成する。生成物の収率は８３％である。この収率は、合成実施例８より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９８】
（７）OH[GC]AZMBの合成
２５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（１８．４７ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）と合成実施例８の生成物（９．０ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（７２ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１２．０ｇ、４０．６ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（８０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（１５０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で１０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（１２０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６３．８％）を得る。この収率は、合成実施例８より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【００９９】
（８）OH[UG]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（５．１４ｇ、５．４ｍｍｏｌ）と合成実施例４の生成物（２．８２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（３０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計３．７４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（４５ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（４５０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で５分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（３００ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７８％）を得る。この収率は、合成実施例４より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１００】
（９）DMTr[GG]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（７．６４ｇ、７．２ｍｍｏｌ）と合成実施例４の生成物（３．７６ｇ、６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（３５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計５．０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で２．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（２００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率８１％）を得る。この収率は、合成実施例４より計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０１】
（１０）DMTr[UGC]AZMBの合成
２５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（７．６７ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（７）で得たOH[GC]AZMB（７．７７ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（４０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計５．１３ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で３.５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７３％）を得る。この収率は、OH[GC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０２】
（１１）DMTr[UCA]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（８．６７ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（５）で得たOH[CA]AZMB（８．９５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（５０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計５．８２ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７７％）を得る。この収率は、OH[CA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０３】
（１２）DMTr[ACG]AZMBの合成
合成実施例１の生成物（２．６７ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、上記ステップ（１）で得たOH[CG]AZMB（２．４０ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１５ｍｌ）とＭＳＮＴ（１．５８ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（１１）と同様な方法でDMTr[ACG]AZMBを合成する。生成物の収率が７８％である。この収率は、OH[CG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０４】
（１３）DMTr[GUU]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（４．３０ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）と上記ステップ（４）で得たOH[UU]AZMB（３．１５、３．０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．５０ｇ、８．４０ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で２．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（３０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７９％）を得る。この収率は、OH[UU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０５】
（１４）DMTr[GUG]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（４．２９ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）と上記ステップ（８）で得たOH[UG]AZMB（３．６０、３．１１ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．５９ｇ、８．７１ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で３．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６７％）を得る。この収率は、OH[UG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０６】
（１５）OH[ACC]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例１の生成物（５．６２ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（６）で得たOH[CC]AZMB（５．４ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２２ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計３．５９ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で３時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（１００ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（８０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率５２％）を得る。この収率は、OH[CC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０７】
（１６）OH[GCA]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（４．００ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）と上記ステップ（５）で得たOH[CA]AZMB（４．２ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．７３ｇ、９．１８ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で３時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（３５ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（２５ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６８％）を得る。この収率は、OH[CA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０８】
（１７）OH[UCC]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（３．５９ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）と上記ステップ（６）で得たOH[CC]AZMB（２．４２ｇ、２．９０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．４１ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（３０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６４．１％）を得る。この収率は、OH[CC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１０９】
（１８）OH[ACG]AZMBの合成
上記ステップ（１２）で得たDMTr[ACG]AZMBをジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で１０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（１５ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（２．０ｇ、収率５５％）を得る。この収率は、OH[CG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１０】
（１９）OH[GAU]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例５の生成物（３．８２ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）と上記ステップ（３）で得たOH[AU]AZMB（３．３０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２．３３ｇ、７．８４ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（５ｍｌ）を添加して３０分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（３０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６３％）を得る。この収率は、OH[AU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１１】
（２０）OH[AGG]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例１の生成物（３．３０ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（２）で得たOH[GG]AZMB（２．９８ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．９６ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で２．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（２０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率６９％）を得る。この収率は、OH[GG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１２】
（２１）OH[AACC]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例１の生成物（３．２４ｇ、３．００ｍｍｏｌ）と上記ステップ（１５）で得たOH[ACC]AZMB（４．３１ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．８７ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で３時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して反応生成物を得る。その反応生成物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸（５０ｍｌ）をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を３％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（４０ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率５０％）を得る。この収率は、OH[ACC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１３】
（２２）DMTr[CGCA]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例３の生成物（３．０４ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）と上記ステップ（１６）で得たOH[GCA]AZMB（４．２５ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．８４ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で３．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（５０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７６％）を得る。この収率は、OH[GCA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１４】
（２３）DMTr[UUCC]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、合成実施例６の生成物（２．４３ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）と上記ステップ（１７）で得たOH[UCC]AZMB（３．５０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計１．６３ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、室温で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加して２０分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ×３）で３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率７８％）を得る。この収率は、OH[UCC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１５】
（２４）DMTr[GG]OHの合成
５００ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（９）で得たDMTr[GG]AZMB（７．５５ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５．０４ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）とを加え、ジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（２４０ｍｌ）を加えて溶解し、室温で８時間攪拌反応する。溶媒除去後、分取精製装置のフラッシュクロマトグラフィー（テレダイン・イスコ社（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．）のＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ／ＴＳ）を用いて分離し、トリフェニルホスフィンオキシドを含有した３’保護基脱離の粗生成物を得て、乾燥しておく。
【０１１６】
（２５）DMTr[GG]PO-の合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（１．５０ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（３．５８ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）とを加え、無水ジクロロメタン（１６．６ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（２．１７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（８．８ｍｌ）溶液を滴下し、１時間攪拌してから、氷浴を氷塩浴に切り替え、温度を−１０℃〜−５℃に制御し、さらに前記ステップ（２４）で得たDMTr[GG]OHの無水ジクロロメタン（１３．３ｍｌ）溶液を滴下し、氷塩浴で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（２０ｍｌ）を添加し、０．５時間攪拌して反応を終止する。分液で有機層を得て、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率：６０％）を得る。この収率は、DMTr[GG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１７】
（２６）DMTr[UCA]OHの合成
前記ステップ（１１）で得たDMTr[UCA]AZMB（１１．３ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（４．９６ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[UCA]OHを合成する。
【０１１８】
（２７）DMTr[UCA]PO-の合成
無水ジクロロメタン（１９．５ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（１．７７ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（４．２１ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（２．５６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１０．５ｍｌ）溶液、および前記ステップ（２６）で得たDMTr[UCA]OHの無水ジクロロメタン（１５．６ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[UCA]PO-を合成する（収率：７９％）。この収率は、DMTr[UCA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１１９】
（２８）DMTr[UGC]OHの合成
前記ステップ（１０）で得たDMTr[UGC]AZMB（１０．６ｇ、４．４２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（４．６３ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[UGC]OHを合成する。
【０１２０】
（２９）DMTr[UGC]PO-の合成
無水ジクロロメタン（１９．４ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（１．７６ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（４．１８ｇ、４１．４ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（２．５４ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１０．４ｍｌ）溶液、および前記ステップ（２８）で得たDMTr[UGC]OHの無水ジクロロメタン（１５．５ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[UGC]PO-を合成する（収率：７１％）。この収率は、DMTr[UGC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１２１】
（３０）DMTr[GUU]OHの合成
前記ステップ（１３）で得たDMTr[GUU]AZMB（５．４１ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．４７ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）とジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（１２０ｍｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[GUU]OHを合成する。
【０１２２】
（３１）DMTr[GUU]PO-の合成
無水ジクロロメタン（９．８ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（８９１ｍｇ、１３．１ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（２．１２ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（２．５４ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（５．２ｍｌ）溶液、および前記ステップ（３０）で得たDMTr[GUU]OHの無水ジクロロメタン（７．９ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[UGC]PO-を合成する（収率：６４％）。この収率は、DMTr[GUU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１２３】
（３２）DMTr[GUG]OHの合成
前記ステップ（１４）で得たDMTr[GUG]AZMB（４．４０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１．９２ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）とジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（９００ｍｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[GUG]OHを合成する。
【０１２４】
（３３）DMTr[GUG]PO-の合成
無水ジクロロメタン（６．８ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（６２２ｍｇ、９．１５ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（１．４８ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（８９８ｍｇ、３．６６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（３．６ｍｌ）溶液、および前記ステップ（３２）で得たDMTr[GUG]OHの無水ジクロロメタン（５．５ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[UGC]PO-を合成する（収率：６４％）。この収率は、DMTr[GUG]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１２５】
（３４）DMTr[CGCA]OHの合成
前記ステップ（２２）で得たDMTr[CGCA]AZMB（４．７７ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１．７４ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[CGCA]OHを合成する。
【０１２６】
（３５）DMTr[CGCA]PO-の合成
無水ジクロロメタン（１０．０ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（６０４ｍｇ、８．８８ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（１．６２ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（８７３ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（３．５ｍｌ）溶液、および前記ステップ（３４）で得たDMTr[CGCA]OHの無水ジクロロメタン（５．４ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[CGCA]PO-を合成する（収率：６４％）。この収率は、DMTr[CGCA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１２７】
（３６）DMTr[UUCC]OHの合成
前記ステップ（２３）で得たDMTr[UUCC]AZMB（３．８５ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１．２５ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）とジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（６０ｍｌ）を使用する以外は、上記ステップ（２４）と同様な方法でDMTr[UUCC]OHを合成する。
【０１２８】
（３７）DMTr[UUCC]PO-の合成
無水ジクロロメタン（９．８ｍｌ）に溶解した１，２，４−トリアゾール（８９１ｍｇ、１３．１ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（２．１２ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルジクロロホスファイト（１．２９ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（５．２ｍｌ）溶液、および前記ステップ（３６）で得たDMTr[UUCC]OHの無水ジクロロメタン（５．５ｍｌ）溶液を使用する以外は、上記ステップ（２５）と同様な方法でDMTr[UUCC]PO-を合成する（収率：８６％）。この収率は、DMTr[UUCC]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１２９】
（３８）DMTr[GGAACC]AZMBの合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（２５）で得たDMTr[GG]PO-（２．７４ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）と上記ステップ（２１）で得たHO[AACC]AZMB（２．７０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計０．８７３ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で３時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（１００ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率４８％）を得る。
【０１３０】
（３９）DMTr[UCACA]AZMBの合成
上記ステップ（２７）で得たDMTr[UCA]PO-（４．８４ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、上記ステップ（５）で得たHO[CA]AZMB（２．０１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１５ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計１．３１ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[UCACA]PO-を合成する（収率：６６％）。
【０１３１】
（４０）DMTr[UCAACG]AZMBの合成
上記ステップ（２７）で得たDMTr[UCA]PO-（４．５６ｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、上記ステップ（２０）で得たHO[ACG]AZMB（２．７０ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１５ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計１．１７ｇ、３．９５ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[UCAACG]AZMBを合成する（収率：６０％）。
【０１３２】
（４１）DMTr[CGCAUU]AZMBの合成
上記ステップ（３５）で得たDMTr[CGCA]PO-（３．２０ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、上記ステップ（４）で得たHO[UU]AZMB（１．０５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１０ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計８３２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[CGCAUU]AZMBを合成する（収率：８７％）。
【０１３３】
（４２）DMTr[UGCGC]AZMBの合成
上記ステップ（２９）で得たDMTr[UGC]PO-（７．００ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）、上記ステップ（７）で得たHO[GC]AZMB（３．１０ｇ、２・４６ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（２５ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計２．０５ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[UGCGC]AZMBを合成する（収率：７８％）。
【０１３４】
（４３）DMTr[GUUGAU]AZMBの合成
上記ステップ（３１）で得たDMTr[GUU]PO-（３．２０ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、上記ステップ（１９）で得たHO[GAU]AZMB（２．３０ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１２ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計１．０６ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[GUUGAU]AZMBを合成する（収率：７４％）。
【０１３５】
（４４）DMTr[GUGAGG]AZMBの合成
上記ステップ（３３）で得たDMTr[GUG]PO-（２．６０ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、上記ステップ（１８）で得たHO[AGG]AZMB（１．９０ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１０ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計８３２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[GUGAGG]AZMBを合成する（収率：７４％）。
【０１３６】
（４５）DMTr[UUCCUU]AZMBの合成
上記ステップ（３７）で得たDMTr[UUCC]PO-（２．８０ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、上記ステップ（４）で得たHO[UU]AZMB（０．９４ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１０ｍｌ）およびＭＳＮＴ（計７４８ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（３８）と同様な方法でDMTr[UUCCUU]AZMBを合成する（収率：８２％）。
【０１３７】
（４６）HO[UCACA]AZMBの合成
上記ステップ（３９）で得たDMTr[UCACA]AZMB（３．８０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を４％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（１５ｍｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率８４％）を得る。
【０１３８】
（４７）HO[CGCAUU]AZMBの合成
上記ステップ（４１）で得たDMTr[CGCAUU]AZMB（３．８０ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（４６）と同様な方法でHO[CGCAUU]AZMBを合成する（収率：５８％）。
【０１３９】
（４８）HO[GUUGAU]AZMBの合成
上記ステップ（４３）で得たDMTr[GUUGAU]AZMB（３．５０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（４６）と同様な方法でHO[GUUGAU]AZMBを合成する（収率：５８％）。
【０１４０】
（４９）HO[UUCCUU]AZMBの合成
上記ステップ（４５）で得たDMTr[UUCCUU]AZMB（２．９０ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（４６）と同様な方法でHO[UUCCUU]AZMBを合成する（収率：８７％）。
【０１４１】
（５０）DMTr[GGAACC]PO-の合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（３８）で得たDMTr[GGAACC]AZMB（２．２０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５２４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）とを加え、ジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（２５ｍｌ）を加えて溶解し、室温で１８時間攪拌反応する。エバポレーターで溶媒を除去した後、分取精製装置のフラッシュクロマトグラフィー（テレダイン・イスコ社（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．）のＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ／ＴＳ）１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を用いて分離し、トリフェニルホスフィンオキシドを含有した３’保護基脱離の粗生成物を得て、乾燥しておく。
１００ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（１７０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（４５４ｍｇ、４．５０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ジクロロメタン（１．５ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（２４６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１．０ｍｌ）溶液を滴下し、１時間攪拌してから、氷浴を氷塩浴に切り替え、温度を−１０℃〜−５℃に制御し、さらに上のステップで得たDMTr[GGAACC]OHの無水ジクロロメタン溶液を滴下し、氷塩浴で４時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ）を添加し、０．５時間攪拌して反応を終止する。分液で有機層を得て、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（二つステップの総収率：５４％）を得る。
【０１４２】
（５１）DMTr[UCAACG]PO-の合成
上記ステップ（４０）で得たDMTr[UCAACG]AZMB（３．６０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（５０）と同様な方法でDMTr[UCAACG]PO-を合成する（二つステップの総収率：６６％）。
【０１４３】
（５２）DMTr[UGCGC]PO-の合成
上記ステップ（４２）で得たDMTr[UGCGC]AZMB（６．４０ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（５０）と同様な方法でDMTr[UGCGC]PO-を合成する（二つステップの総収率：７０％）。
【０１４４】
（５３）DMTr[GUGAGG]PO-の合成
上記ステップ（４４）で得たDMTr[GUGAGG]AZMB（３．００ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を使用する以外は、上記ステップ（５０）と同様な方法でDMTr[GUGAGG]PO-を合成する（二つステップの総収率：４１％）。
【０１４５】
（５４）DMTr[GGAACCUCACA]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５０）で得たDMTr[GGAACC]PO-（１．２ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）と上記ステップ（４６）で得たHO[UCACA]AZMB（０．８５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２０８ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。ジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（１．４０ｇ、収率７１％）を得る。
【０１４６】
（５５）DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５２）で得たDMTr[UGCGC]PO-（２．５２ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と上記ステップ（４８）で得たHO[GUUGAU]AZMB（２．５ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（８ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計５００ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率４９％）を得る。
【０１４７】
（５６）DMTr[UCAACGCGCAUU]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５１）で得たDMTr[UCAACG]PO-（２．４３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（４７）で得たHO[CGCAUU]AZMB（１．８５ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（８ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計４２４ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物を得て、後続の反応ステップに用いる。
【０１４８】
（５７）DMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMBの合成
５０ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５３）で得たDMTr[GUGAGG]PO-（１．４０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（４９）で得たHO[UUCCUU]AZMB（１．２４ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（６ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計２４９ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物を得て、後続の反応ステップに用いる。
【０１４９】
（５８）HO[UCAACGCGCAUU]AZMBの合成
上記ステップ（５６）で得たDMTr[UCAACGCGCAUU]AZMBをジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を４％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率５３％）を得る。この収率は、HO[CGCAUU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１５０】
（５９）HO[GUGAGGUUCCUU]AZMBの合成
上記ステップ（５７）で得たDMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMBをジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、攪拌しながら６％濃度のトリフルオロ酢酸をゆっくり加え、最終系においてトリフルオロ酢酸の濃度を４％にする。室温で３０分間攪拌してから、飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液を加えて中和し、分液により有機層を得る。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率５４％）を得る。この収率は、HO[UUCCUU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１５１】
（６０）DMTr[GGAACCUCACA]PO-の合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５４）で得たDMTr[GGAACCUCACA]AZMB（１．４０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（２００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）とを加え、ジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（１０ｍｌ）を加えて溶解し、室温で２８時間攪拌反応する。エバポレーターで溶媒を除去した後、分取精製装置のフラッシュクロマトグラフィーを用いて分離し、トリフェニルホスフィンオキシドを含有した３’保護基脱離の粗生成物（１．２ｇ）を得て、乾燥しておく。
２５ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（６５ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（１６２ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ジクロロメタン（０．５ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（９８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（０．５ｍｌ）溶液を滴下し、１時間攪拌してから、氷浴を氷塩浴に切り替え、温度を−１０℃〜−５℃に制御し、さらに上述のステップで得たDMTr[GGAACCUCACA]OHの無水ジクロロメタン溶液を滴下し、氷塩浴で５．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（３ｍｌ）を添加し、１時間攪拌して反応を終止する。分液で有機層を得て、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率：４３％）を得る。この収率は、DMTr[GGAACCUCACA]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１５２】
（６１）DMTr[UGCGCGUUGAU]PO-の合成
１００ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（５５）で得たDMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB（１．９５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（３５０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）とを加え、ジオキサシクロヘキサン／水（容積比＝９／１）（１０ｍｌ）を加えて溶解し、室温で２８時間攪拌反応する。エバポレーターで溶媒を除去した後、分取精製装置のフラッシュクロマトグラフィーを用いて分離し、トリフェニルホスフィンオキシドを含有した３’保護基脱離の粗生成物（１．４５ｇ）を得て、乾燥しておく。
１００ｍｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（９０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）と再蒸留のトリエチルアミン（２２４ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）とを加え、無水ジクロロメタン（１．０ｍｌ）で溶解し、氷浴下で２−クロロフェニルジクロロホスファイト（１３７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（０．５ｍｌ）溶液を滴下し、１時間攪拌してから、氷浴を氷塩浴に切り替え、温度を−１０℃〜−５℃に制御し、さらに上のステップで得たDMTr[UGCGCGUUGAU]OHの無水ジクロロメタン溶液を滴下し、氷塩浴で５．５時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（３ｍｌ）を添加し、１時間攪拌して反応を終止する。分液で有機層を得て、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物（収率：３４．４％）を得る。この収率は、DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMBより計算した理論収量に対して、実際に得た生成物の重量比率である。
【０１５３】
（６２）DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（６０）で得たDMTr[GGAACCUCACA]PO-（５６０ｍｇ、７０ｍｍｏｌ）と上記ステップ（５８）で得たHO[UCAACGCGCAUU]AZMB（５００ｍｇ、７０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１．５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計６２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物を得る（収率：９６％）。
【０１５４】
（６３）DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMBの合成
２５ｍｌの丸底フラスコに、上記ステップ（６１）で得たDMTr[UGCGCGUUGAU]PO-（５６０ｍｇ、７９μｍｏｌ）と上記ステップ（５９）で得たHO[GUGAGGUUCCUU]AZMB（６００ｍｇ、７９μｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１．５ｍｌ）を加えて溶解し、ＭＳＮＴ（計７０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加し、室温で８時間攪拌する。１ＭのＴＥＡＢ（１ｍｌ）を添加して２５分間攪拌して反応を終止する。反応液をジクロロメタン（約５０ｍｌ）に入れ、１ＭのＴＥＡＢで３回洗浄し、分液で得た有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、常圧カラム分離して生成物を得る（収率：８８％）。
【０１５５】
実施例４
本実施例はオリゴヌクレオチドを合成する。
合成ターゲット：
5'-GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU-3'、および5’-UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU-3’
DMTr[CGAAAGAACG]AZMBの代わりに、DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMBまたはDMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMBを用いて、実施例２と同様な方法で保護基を脱離する。
測定により、合成されたオリゴヌクレオチドの配列は設計された配列と一致する。