(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１で示される甘草素リキリチゲニンを必須成分とする人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）成長抑制剤。
［化１］
0005275241.tif 000010
【請求項２】
前記甘草素リキリチゲニンが１０μｇ／ｍｌでのヒト肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）に対する抑制作用が１×１０―５モル／リットルのヒト肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）に対するアドリアマイシンの抑制作用と同等である請求項１記載の人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）成長抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然植物甘草中の活性物質甘草リキリチゲニン（以下、Ｌ−ｇｅｎｉｎと略称する）を必須成分とするガン細胞成長抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘草は漢方薬品の一成分または食品の添加成分として広く使用されており、近年、甘草中の各種成分について系統立てた研究が行われているが、甘草中の抗がん活性成分の研究については未だ不十分である。現在、甘草中の三テルペン類化合物とフラボン類化合物は抗腫瘍の主要な活性成分と考えられており、その内、三テルペン類化合物、特に甘草グリシリジン、甘草グリシリジン酸の抗腫瘍研究は比較的多く行われている。他方、甘草フラボン類化合物については甘草フラボン類化合物混合物に抗がん作用、抗突然変異と抗酸化作用があることが発表されている（傅乃武らは研究）に過ぎない。他方、甘草中のフラバノン類単量体に属する化合物リキリチゲニンについては、抗ウイルス作用、例えばＨＩＶ感染治療やＣ型肝炎ウイルスに対して有効であることが発表されている（Ｃｒａｎｃｅらの研究）が、抗腫瘍作用およびそのメカニズムについては検討されていない。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明者らは、甘草中のフラバノン類単量体：リキリチゲニン（甘草素ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）とリクイリチン（ｌｉｑｕｉｒｉ）に対して、鋭意研究を重ね、リキリチゲニンが人体外の腫瘍細胞実験により人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）に対し、がん細胞の成長を著しく抑制する作用があることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明は、式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人ガン細胞成長抑制剤にある。
【化１】
0005275241.tif 000002
【発明の効果】
【０００５】
式１で示されるリキリチゲニンは以下の有意量の投与により、人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）らの成長作用を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（実施例１）
式１で示されるリキリチゲニンについて以下の実験結果を得た。
一．細胞株及び選別方法
細胞株：人肺がん細胞Ａ５４９
人低分化胃腺がん細胞  ＢＧＣ−８２３
人肝臓がん細胞ＳＭＭＣ−７７２１
人早幼粒細胞白血病細胞ＨＬ−６０
方法：
１．指数成長期状態が良好な細胞１瓶、０．２５％のトリポシン消化液を入れるこ
とで消化された貼壁細胞を剥離させる、数２〜４×１０4 ／ｍＬを計り、細胞懸液
を作成する。
２．細胞懸液を９６個孔のプレートと１８０個孔のプレートに其々摂取し、低温の
ＣＯ・５２・の培養器に置き、２４時間培養する。
３．液を換え、実験しようとする薬物を２０／孔に入れて、７２時間に培養する。
４．ＭＴＴを９６個孔のプレートに２０／孔に入れ、培養器の中で４時間を培養す
る。
５．上の清液を吸い去り、ＤＭＳＯを１５０／孔に入れ、プレートに５分間揺れ振
動させる。
６．酸素連鎖性免疫吸着測定器を用いて、波長５７０ｎｍのとこ其々孔の吸光値を
測定し、細胞の抑制率を計算する。
細胞の抑制率％＝陰性対象組ＯＤ値−実験物組ＯＤ値  ×１００％
陰性対象組ＯＤ値
〔表１〕
0005275241.tif 000003
〔表２〕
0005275241.tif 000004
〔表３〕
0005275241.tif 000005
〔表４〕
0005275241.tif 000006
表４．の結果は甘草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度２５０μmol/L 、５
００μmo/Lの時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ５４．８％、５８．１％で
あることを示している。
［表５］
0005275241.tif 000007
表５．の結果は甘草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度２５０μmol/L 、５
００μmol/L の時，肝臓ガン細胞に対する抑制率はそれぞれ４２．０％、８９．９
％であることを示している。
〔表６〕
0005275241.tif 000008
表６．の結果は甘草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度１２５μmol/L 、５
００μmol/L の時，結腸ガン細胞に対する抑制率はそれぞれ５７．６％、９１．９
％であることを示している。
以上の表２を見ると、甘草リキリチゲニン(liquiritigenine) は特に肝臓がん細胞
(SMMC7721)に著しい抑制作用を示している。その抑制作用は甘草三テルペン類の単
量体（モノマー）グリシリジン酸よりずっと高く、表３のアドレアマイシン以上で
あることがわかる。 
【０００７】
（製造例）
本発明のリキリチゲニン（式１）は甘草から直接抽出して生成することができる
が、式１で示されるリキリチゲニンはイソリキリチゲニンをイソメラーゼの作用で閉環し
て酸素複素環を形成して製造することができる。なお、イソリキリチゲニンは次のようにして合成することができる。
1、合成の工程条件の選択
（1）簡単にイソリキリチゲニン（isoliquiritigenin）合成するには、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）と原料とし、ルイス塩基（Lewis base）の触媒作用の情況下、縮合反応（condensation reaction）でワンステップ合成できる。その化学反応式は：
【化２】
0005275241.tif 000009
2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）のmol比は1:1.5〜1:3であり、好ましくは1:1.8〜1:2である。
（2）溶剤の選択
2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）を溶解可能な有機溶剤を選んで使用することができる。低級アルコール、例えば、イソプロピルアルコール（isopropyl alcohol）、N−ブチルアルコール（n-butyl alcohol）、イソプロピルエーテル（isopropyl ether）、N,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide）、ジメチルスルフォキシド（dimethyl sulphoxide）、ジオキサン（dioxane）、エチレングリコールモノメチルエーテル（ethylene glycol monomethyl ether）、エチレングリコールジメチルエーテル（ethylene glycol dimethyl ether）等の溶剤。イソプロピルアルコール（isopropyl alcohol）、N−ブチルアルコール（n-butyl alcohol）、ジオキサン（dioxane）などが好ましい。
（3）触媒剤の選択
比較的に強いアルカリ性試薬を用いて触媒反応をしなければならず、ナトリウム・アルコキシド（ｓｏｄｉｕｍａｌｋｏｘｉｄｅ）、水酸化アルカリ或は水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｉｄｅ）などを使用できる。好ましくは低級アルコールのナトリウム塩を使用する。
（４）反応時間及び温度
同じ温度下、反応時間が比較的に長いほうが生産率の向上に有利である。反応温度は８０〜１５０℃であり、反応時間は２４〜３６時間である。
（５）抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の選択
反応に使用される原料は何れもフェノール類（ｐｈｅｎｏｌｓ）であって、アルカリ性の環境下で酸化及び変質し易く、窒素ガスを入れると同時に反応系に抗酸化剤をいれなければならない。常用される抗酸化剤にはブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、その他の抗酸化剤が使用できる。
２、汚染除去工程の選択
（１）脱色剤の選択
活性炭、活性白土、シリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）、活性酸化マグネシウム或は活性酸化アルミニウムを使用して脱色することができる。活性炭の脱色効果がもっとも優れている。
（２）再結晶（ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）溶剤の選択
イソリキリチゲニンとその異性体の甘草グリシリジンが混在しているので、混合溶剤を用いて再結晶汚染除去を行う必要がある。その中、常用する混合溶剤には、ベンゼン−エチルアセテート（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）、クロロホルム−エチルアセテート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）、ベンゼン−メチルアルコールなどがあり、その中で、体積比はベンゼンとクロロホルムが１００、エチルアセテート、メチルアルコール或はエチルアルコールは６〜１０である。なお、ベンゼン−エチルアセテートの効果がもっとも良い。
具体的実施方式
窒素ガスが通る四口フラスコにおいて、１４０ｍｌのＮ−ブチルアルコール、ジヒドロキシベンズアルデヒド２０ｇを加え、室温下で金属ナトリウムのシート４．０ｇ、１ｇの抗酸化剤を加え、ゆっくり攪拌しながら水浴させ、全部溶解するまで加熱する。１０５℃まで上昇すると、１５ｇの２，４−ジヒドロキシアセトフェノンをゆっくり８０ｍｌのＮ−ブチルアルコール溶液に一滴ずつ加え、激しく攪拌し、この温度下で２８時間反応させた後冷却する。
氷水浴に１８％の塩酸を中性になるまで加える。反応液は二層に分かれる。有機相を取って活性炭で脱色させ、遠心し、有機層を洗浄液が薄くなるまで水洗いする。減圧して溶剤を回収し、乾燥させると１６．５ｇのサーモンピンク色のイソリキリチゲニンの粗品を得た。それはイソリキリチゲニンと甘草グリシリジンの混合物である。
ベンゼン：エチルアセテートの体積比が１００：８０のベンゼン−エチルアセテートの混合溶剤２００ｇを製造し、粗品のイソリキリチゲニンと甘草グリシリジンの混合物をこの溶液の中で加熱溶解させ、熱いうちにその中の不溶物を濾過し、温度を下げてイソリキリチゲニンを析出させ、濾過した後、ベンゼンだけで充分に洗浄し、乾燥させて８．２ｇ（０．０３ｍｏｌ）の黄色のイソリキリチゲニンを得る。そのＨＰＬＣ分析含有量≧９６％であり、その紫外、赤外、核磁気共鳴、マススペクトル分析は標準商品と同じであった。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明に係るリキリチゲニンはそのまま又は付形剤とともに、液体、錠剤、顆粒、ゼリー等の形態で提供することもできるし、あるいは食品添加物として飲料、各種食品に添加され、所定の抗がん効果を発揮することができる。