(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの宿主細胞不純物を含むプラスミドＤＮＡの混合物からプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記混合物に十分な塩を添加することにより２Ｍから４Ｍの範囲の塩濃度を有する溶液を調製して、疎水性相互作用媒体に対する前記少なくとも一つの宿主細胞不純物の選択的結合を可能にする工程であって、前記塩が硫酸アンモニウムまたはナトリウム塩である工程、
（ｂ）少なくとも一つの不純物が疎水性相互作用媒体と結合して複合体を形成する条件下で、前記プラスミドＤＮＡを含有する溶液を前記疎水性相互作用媒体と接触させる工程、かつ、
（ｃ）前記複合体から未結合のプラスミドＤＮＡを回収する工程
を含み、有機溶剤、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジンおよびポリビニルピロリドンの不在下で実施する方法。
【請求項２】
少なくとも一つの不純物が、ＲＮＡ、エンドトキシン、染色体ＤＮＡおよびタンパクからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの不純物がエンドトキシンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
塩が、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＳＯ42-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＮＯ3-、Ｍｇ2+、Ｌｉ+、Ｎａ+、Ｋ+およびＮＨ4+からなる群から選択されたアニオンまたはカチオンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
硫酸アンモニウムが２Ｍの濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ナトリウム塩が２Ｍの濃度の塩化ナトリウムである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
溶液のｐＨが６．８から７．４の範囲を有する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
溶液のｐＨが７．４である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡ、そして任意に少なくとも一つの宿主細胞不純物の混合物から分離する方法であって、以下の工程：
（ａ）スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡ、並びに、存在する場合には、少なくとも一つの宿主細胞不純物の混合物に、塩を添加することにより溶液を調製する工程、
（ｂ）スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡの両方が、疎水性相互作用媒体に結合して、結合第一混合物を形成する第一の条件下で疎水性相互作用媒体と溶液とを接触させる工程であって、前記第一の条件は２．５Ｍから４Ｍの濃度範囲の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記媒体を平衡化することを含む工程；
（ｃ）結合第一混合物の周りの第一の条件を第二の条件に変化させ、弛んだプラスミドＤＮＡを結合第一混合物から除去し、第二結合混合物と弛んだプラスミドＤＮＡを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第二の条件は２．３５Ｍから２．４５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第一結合混合物を洗浄することを含む工程；および
（ｄ）前記結合第二混合物の周りの第二の条件を第三の条件へと変更し、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを前記第二結合混合物から取り出し、疎水性相互作用媒体とスーパーコイル化プラスミドＤＮＡとを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第三の条件は１Ｍから２．３Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第二結合混合物を洗浄することを含む工程
を含む方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの宿主細胞不純物が、ＲＮＡ、エンドトキシン、染色体ＤＮＡおよびタンパクからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの宿主細胞不純物がエンドトキシンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
塩が、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＳＯ42-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＮＯ3-、Ｍｇ2+、Ｌｉ+、Ｎａ+、Ｋ+およびＮＨ4+からなる群から選択されたアニオンまたはカチオンを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
塩が、２．５Ｍから４Ｍの濃度範囲の硫酸アンモニウムである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
プラスミドＤＮＡからエンドトキシンを分離する方法であって、前記エンドトキシンが前記疎水性相互作用媒体と結合して複合体を形成する条件下で、１．５から４Ｍの濃度範囲のアンモニウム塩または２Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含むエンドトキシンとプラスミドＤＮＡの混合物を疎水性相互作用媒体と接触させ、かつ、前記プラスミドＤＮＡと前記複合体とを分離することを含む方法。
【請求項１６】
前記アンモニウム塩が、２Ｍの濃度で存在する硫酸アンモニウムである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物が、６．８から７．４の範囲のｐＨを有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ｐＨが７．４である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
弛んだプラスミドＤＮＡからスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを分離する方法であって、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡの両方が前記疎水性相互作用媒体と結合して結合第一混合物を形成する第一の条件下で、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡの混合物を疎水性相互作用媒体と接触させる工程であって、前記第一の条件は２．５Ｍから４Ｍの濃度範囲の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記媒体を平衡化することを含む工程；結合第一混合物の周りの第一の条件を第二の条件に変化させて、弛んだプラスミドＤＮＡを結合第一混合物から除去して、第二結合混合物と弛んだプラスミドＤＮＡを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第二の条件は２．３５Ｍから２．４５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第一結合混合物を洗浄することを含む工程；かつ、前記結合第二混合物の周りの第二の条件を第三の条件へと変更し、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを前記第二結合混合物から取り出して、疎水性相互作用媒体とスーパーコイル化プラスミドＤＮＡとを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第三の条件は１Ｍから２．３Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第二結合混合物を洗浄することを含む工程を含み、有機溶剤、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジンおよびポリビニルピロリドンの不在下で実施する方法。
【請求項２０】
前記分離した弛んだプラスミドＤＮＡ成分と前記分離したスーパーコイル化プラスミドＤＮＡとが回収および単離される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
混合物において、弛んだＤＮＡよりもスーパーコイル化ＤＮＡの量を増やす方法であって、以下の工程：
（１）スーパーコイル化ＤＮＡが疎水性相互作用媒体に優先的に結合するイオン条件下で、スーパーコイル化ＤＮＡおよび弛んだＤＮＡを含む混合物を、アルキル部を含む疎水性相互作用媒体と相互作用させる工程；
（２）弛んだＤＮＡを優先的に除くイオン条件下で、弛んだＤＮＡおよびスーパーコイル化ＤＮＡを含む疎水性相互作用媒体を処理する工程；および
（３）疎水性相互作用媒体からスーパーコイル化ＤＮＡを溶出する工程
を含み、有機溶剤、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジンおよびポリビニルピロリドンの不在下で実施する方法。
【請求項２２】
ＤＮＡを含む組成物からリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を除く方法であって、
（１）ＬＰＳがＤＮＡよりも優先的に疎水性相互作用媒体に結合するイオン条件下で、ＤＮＡおよびＬＰＳを含む混合物を、アルキル部を含む疎水性相互作用媒体と相互作用させる工程；および
（２）ＤＮＡおよびＬＰＳを含む疎水性相互作用媒体を、ＤＮＡの選択的抽出を可能にするイオン条件で処理する工程
を含む方法。
【請求項２３】
混合物において、弛んだＤＮＡよりもスーパーコイル化ＤＮＡを増やす方法であって、以下の工程：
（ａ）スーパーコイル化ＤＮＡおよび弛んだＤＮＡの混合物に、２．５Ｍから４Ｍの濃度範囲で存在する硫酸アンモニウムの塩を添加することにより溶液を調製する工程、
（ｂ）スーパーコイル化ＤＮＡおよび弛んだＤＮＡの両方が、Ｃ3からＣ10アルキル基から選択されるペンダント結合した疎水性基を備えたクロマトグラフィー支持体を含む疎水性相互作用媒体に結合して、結合第一混合物を形成する第一の条件下で疎水性相互作用媒体と溶液とを接触させる工程であって、前記第一の条件は２．５Ｍから４Ｍの濃度範囲の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記媒体を平衡化することを含む工程；
（ｃ）結合第一混合物の周りの第一の条件を第二の条件に変化させ、弛んだＤＮＡを結合第一混合物から除去し、第二結合混合物と弛んだＤＮＡを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第二の条件は２．３５Ｍから２．４５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第一結合混合物を洗浄することを含む工程；および
（ｄ）前記結合第二混合物の周りの第二の条件を第三の条件へと変更し、スーパーコイル化ＤＮＡを前記第二結合混合物から取り出し、疎水性相互作用媒体とスーパーコイル化ＤＮＡとを含む別個の成分を形成する工程であって、前記第三の条件は１Ｍから２．３Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む塩溶液で前記第二結合混合物を洗浄することを含む工程
を含む方法。
【請求項２４】
疎水性相互作用媒体が、ペンダント結合した疎水性基を備えたクロマトグラフィー支持体を含む、請求項１、１０、１５および１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記ペンダント結合した基が、Ｃ3からＣ10アルキル基から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
疎水性相互作用媒体が、ペンダント結合した疎水性基として、プロピル、ブチル、ヘキシル、オクチル、ノニルまたはこれらの混合物の少なくとも一つに結合したメタクリラートポリマーまたはコポリマー骨格からなる群から選択される、請求項２３、または請求項１０および１５に従属する請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
疎水性相互作用媒体が、プロピル、ブチル、ヘキシル、オクチル、ノニルまたはデシル疎水基の少なくとも一つに結合したメタクリラートポリマーまたはコポリマー骨格からなる群から選択される、請求項１に従属する請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
疎水性相互作用媒体が、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシルリガンドの少なくとも一つに結合したメタクリラートポリマーまたはコポリマー骨格である、請求項１９に従属する請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
媒体が、メタクリラートエチレングリコールコポリマー骨格または架橋結合したアガロースの少なくとも一方である、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項３０】
媒体が、１５から１００μｍの粒径のビーズ形態の樹脂である、請求項２３または２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本願は、１９９９年５月２８日に出願された米国暫定特許出願第６０／１３６７７２号の利益を請求するものであり、この全体を参照としてここに含めることとする。【０００２】  本発明は、プラスミドＤＮＡを含む水溶液から、宿主細胞不純物、例えばエンドトキシン、ＲＮＡ、タンパクおよび宿主細胞ＤＮＡの除去を含むプラスミドＤＮＡの精製方法、並びに、疎水性相互作用媒体を用いたスーパーコイル化およびニック化または弛んだプラスミドＤＮＡの混合物を含有する水溶液からスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを分離および精製する方法を提供する。また、小規模、例えば研究またはベンチスケールの、ＤＮＡ精製の改善された方法およびかかる方法に用いられる装置も提供する。本発明は、精製および／または分離されたＤＮＡ、例えばプラスミド、好ましくはスーパーコイル化ＤＮＡを提供する。
【背景技術】
【０００３】  遺伝子治療は、ヒトの疾患を治癒するための新たな治療パラダイムを与える。例えば嚢胞性繊維症、種々のタイプのガン等の、遺伝的に引き起こされた疾患の治療、および疾患に対する免疫化のためにＤＮＡを使用することは、現在広く求められている治療の有望な方法である。遺伝子産物と相互作用する、あるいはそれ自身遺伝子産物である薬剤を用いることにより疾患の表現形を変更するよりはむしろ、遺伝子治療は理論上特定の遺伝子を変更して疾患治療または処置をもたらすことができる。また、遺伝子治療は、薬剤輸送システムとしても使用されうる。これを達成するために、有益な産物（ＲＮＡ、ペプチド、タンパク等）を生じる遺伝子またはそれ自身が有益な産物である遺伝子（例えばアンチセンスＤＮＡの使用）は、個人の同種、異種または自己由来の細胞のＤＮＡまたは細胞、あるいは、後に個人にin vivo、ex vivoまたはin vitrｏで投与される宿主細胞に挿入される。例えば、血管手術中に、抗凝塊因子を形成する遺伝子が血管の細胞のＤＮＡに挿入されて、危険な血液凝固の形成を妨げることを助けることができる。多くの他の状態も、この一般的なアプローチを用いた処置に役立つ。【０００４】  遺伝子治療は、嚢胞性繊維症、心臓疾患、ガン、関節炎および他の病気を含む４０００以上の公知の遺伝疾患の多くを処置するための強力なツールであると期待される。遺伝子治療は、一般的に個人に遺伝子物質（ＤＮＡ）の輸送を必要とする。遺伝子輸送または遺伝物質の輸送は、直接的に、遺伝子含有ウイルスまたはプラスミドＤＮＡを血液または組織に投与することによって、間接的に、外来ＤＮＡを保有するように実験室で操作された細胞の導入を介して、または、当該技術分野で周知のキャリアー技術または種々のカプセル化を介して行うことができる。最近の報告では、ＤＮＡの直接的輸送も可能であろうということが示唆されている。いくつかの異なるシステムが、体性遺伝子輸送について考慮され、用いられている。例えば、ＤＮＡ（裸のまたは複合体の）、ＲＮＡウイルス（レトロウイルス）、およびＤＮＡウイルス（アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス［ＡＡＶ］、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス）を含む。【０００５】  プラスミドＤＮＡの使用のような遺伝子治療の非ウイルス方式の重要な利点は、大量に調製しやすいこと、安全性が高いこと、宿主細胞ＤＮＡに対する異種ＤＮＡの組み込みが一般的に欠如していること、および、実際に非限定的なサイズおよび数の遺伝子または遺伝子フラグメントを使用できることである。さらに、遺伝子治療におけるプラスミドＤＮＡの使用は、所望でない免疫応答を患者に引き起こし得る外来の遺伝子またはタンパクの使用を一般に含まない。さらに、プラスミドＤＮＡの使用に代わるもの、例えばウイルスベクター等は、製造が比較的高価である。【０００６】  プラスミドＤＮＡを製造するために現在用いられている方法は、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡとニック化（または弛んだ）ＤＮＡ人工物の混合物を一般的に提供し、これはプラスミドＤＮＡの最終的な応用に一般的には有用でない。本発明の方法は、スーパーコイル化およびニック化プラスミドＤＮＡの非破壊的分離を提供し、この方法はスーパー���イル化プラスミドＤＮＡの回収および使用により例示されるが、当業者はプラスミドＤＮＡの各分離された形態が、開示された方法の有益な産物であると理解するであろう。さらに、本願開示は、遺伝子治療においてスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの優れた純度の必要性を強調するが、当業者は、プラスミドＤＮＡが、遺伝子治療調製物における使用を越えて組み換え分子生物学において広く使用されること、並びに、開示された発明が、単離かつ精製されたスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの調製方法として広い利用可能性を見出すことを理解するであろう。【０００７】  現在、プラスミドＤＮＡの二つの形態の分離のための利用可能な方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような添加剤、界面活性剤およびその他の成分、例えばヘキサミンコバルト、スペルミジンおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の使用と併せて、イオン交換クロマトグラフィー（遺伝子治療用プラスミドの精製の新規、急速な方法（Bhikhabhai R. Ollivier M. and Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R&D, 75184 Uppsala, Sweeden and RPR Gencell, Rhone-Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France. Publication number: 18-1129-51; Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion exchange chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606(1998), 31-45）またはサイズ排除クロマトグラフィー（Prazeres, D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid Purification, Biotechnology Techniques Vol.11,No.6, June 1997, p417-420）を利用する。近年、添加剤としてＰＥＧを用いたスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの精製に関して、特許が付与された（Horn, et al(U.S. Patent No.5707812）。しかしながら、現在知られている方法は、スーパーコイル化およびニック化（または弛んだ）ＤＮＡの効率的かつコストのよい分離を提供することはできない。さらに、多くの公知の方法は、ＰＥＧまたはその他の添加剤を用いる不都合があり、これらは、困難であり、より時間がかかり、かつより高価な、さらなる分離、処理および品質制御方法を必要とするので、プラスミドＤＮＡの製造において望ましくない。【０００８】  プラスミドＤＮＡのスーパーコイル化および弛んだ形態の公知の分離方法の別形態は、非常に高価な、専売樹脂を利用する。これはまた、プロセッシングの際に、アセトニトリル、エタノールおよびその他の成分、例えばトリエチルアミンおよびテトラブチルアンモニウムホスファートのような溶剤を利用する。これらの方法は、一般に、溶剤の使用のために、大規模製造に適していない。さらに、これらは、出発材料中の豊富に混入した弛んだプラスミドＤＮＡがこれらの樹脂の分離能力を低減しがちなので、顕著な量の弛んだプラスミドＤＮＡを有する出発材料に適用できない（Green, A.P.ら Bio.Pharm. Vol.10, No.5, pages52-62, May 1997）。【０００９】  スーパーコイル化および弛んだＤＮＡを分離するさらなる方法は、サイズ排除クロマトグラフィーであり、サイズにおけるわずかな差に基づいてプラスミドＤＮＡの二つの形態を分離すること含む。これらのカラムは、比較的長いものになりがちであり、スケールアップの問題があり、大規模製造における実施を不可能にする。さらに、サイズ排除方法は、濃縮されたサンプル溶液を必要とし、ＤＮＡの高い粘度特性のために、プラスミドＤＮＡ溶液には不都合である。プラスミド精製のためのゲル濾過クロマトグラフィー支持体の比較（A comparison of gel filtration chroatographic supports for plasmid purification) G.N.M. Ferreira, J.M.S. Cabral and D.M.F. Prazeres, Biotechnology Techniques, Volume 11, No.6, June 1997, pp417-420参照。【００１０】  細菌調製物から精製され、かつ、しばしば弛んだおよびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの混合物を含むプラスミドＤＮＡ調製物は、多くの細菌宿主によって産生されるエンドトキシンが、そのプラスミドＤＮＡを受けた宿主に発熱またはセプシスのような炎症反応を引き起こすことが知られているので、ＦＤＡによって要求されるようなエンドトキシン除去を必要とする。これらのエンドトキシンは、一般的にリポポリサッカリドまたはそのフラグメントであり、これらは例えば遺伝子治療のためのプラスミドＤＮＡの発現および製造に用いられる、宿主細胞膜または高分子のような、グラム陰性菌の外膜の成分であり、かつ、宿主細胞の人工産物またはより大きな人工産物の一部としてＤＮＡ調製物中に存在する。かくして、エンドトキシンの除去は、治療または予防的使用のためのプラスミドＤＮＡの精製に重要かつ必須の工程である。【００１１】  プラスミドＤＮＡ溶液からのエンドトキシンの除去は、始めはエンドトキシンの陰性チャージ構造を用いていた；しかしながら、プラスミドＤＮＡも陰性にチャージしており、分離は通常、アニオン交換樹脂を用いて行われている。これは、両方の分子を結合し、ある条件下で、エンドトキシンを結合しつつプラスミドＤＮＡを優先的に溶出する。かかる分離は、顕著な量のエンドトキシンがプラスミドＤＮＡと共に溶出するので、部分的な除去のみをもたらし、および／または非常に僅かなプラスミドＤＮＡの回収しかできない。他の特許された方法は、界面活性剤を利用するが、これは問題を提起しうる。（エンドトキシンの消耗または除去の方法(Process for the depletion of removal of endotoxins), Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, U.S.Patent Number:5747663）。さらに、これらの樹脂の結合力は、樹脂がエンドトキシンとプラスミドＤＮＡの両方によって占められるので、１０3から１０4ＥＵ（エンドトキシンユニット）／ｍｌ樹脂のオーダーであり、例えば、通常、５００００ＥＵ／ｍｌから２０００ＥＵ／ｍｌの報告された能力に基づいて、３から８０リットルの樹脂を必要とする（Green,A.P.ら.Bio.Pharm.Vol.10, No.5, pages52-62, May 1997. Sterogene technical profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Farnsworth Cr.,Carlsbad, CA92008）。
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明は、組み合わせて、あるいは独立に使用できるプラスミドＤＮＡ分離、単離および／または精製の方法を提供する。特に、本発明は、スーパーコイル化および弛んだプラスミドＤＮＡの分離、精製および／または単離方法、並びに、エンドトキシン含有成分またはフラグメントのような宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを分離、精製および／または単離する方法を提供する。精製、分離および／または単離されたプラスミドＤＮＡ、特にスーパーコイル化プラスミドＤＮＡ組成物も、本発明により提供される。また、本発明は、プラスミドＤＮＡの研究−またはベンチ−スケール分離、単離および／または精製の方法および装置を提供する。
【００１３】  本発明は、混合物に存在する他の成分から所望のタイプのポリヌクレオチドを単離する方法を提供し、所望のタイプのポリヌクレオチドに富んだ組成物を産生する。この方法は、ポリヌクレオチドを含む混合物を疎水性相互作用媒体と接触させることにより、所望でない成分からポリヌクレオチドを分離することを含む。他の成分からポリヌクレオチドを分離すること、並びに、ポリヌクレオチドのタイプの分離は、変化するイオン条件下で、疎水性相互作用媒体に対する、ポリヌクレオチドおよび他の所望でない成分の異なる親和性によってもたらされる。かくして、本発明の方法では、ポリヌクレオチドと比べてリポポリサッカリドおよびリポプロテインに対してより優先的に結合する疎水性相互作用媒体が用いられる。かかる優先的結合は、分離処理に用いられるイオン条件の範囲にわたって生じるものである。また、本発明は、スーパーコイル化ＤＮＡおよび弛んだＤＮＡを分離する方法も含む。この方法は、スーパーコイル化ＤＮＡが弛んだＤＮＡよりも疎水性相互作用媒体に対して優先的に結合するイオン条件を利用する。
【００１４】  本発明の方法に用いられる塩濃度を記述する際に、異なる塩の等価イオン強度を用いることができると解される。また、特にエンドトキシンを除去および／または消失させる方法に関して、これらの方法を、プラスミドおよび非プラスミドＤＮＡに適用できる解釈することもできる。
【００１５】  汚染した宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを分離、単離および／または精製する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１６】  プラスミドＤＮＡおよびエンドトキシン含有成分またはフラグメントの分離、精製および／または単離の方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１７】  スーパーコイル化および弛んだプラスミドＤＮＡを分離、精製および／または単離する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１８】  精製、分離および／または単離されたプラスミドＤＮＡ、特にスーパーコイル化プラスミドＤＮＡ、の組成物も、本発明により提供される。
【００１９】  ある実施態様では、本発明は、エンドトキシンと他の宿主細胞不純物（すなわち、ＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、タンパク）とをプラスミドＤＮＡから分離する方法を提供する。この方法は、エンドトキシンと他の汚染物質とが疎水性相互作用媒体に結合して複合体を形成しする条件下で、細胞溶解物を疎水性相互作用媒体と接触させ、プラスミドＤＮＡと複合体を分離することを含む。この実施態様の方法で分離されたエンドトキシンは、グラム陰性菌由来のエンドトキシンおよびフラグメントを含み、かつ、これらのエンドトキシンおよびエンドトキシンフラグメントに結合した細胞性および亜細胞性成分を含む。疎水性相互作用媒体は、t-ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡおよびｍ−ＲＮＡを含むＲＮＡ、宿主細胞タンパクおよび染色体ＤＮＡも結合する。本発明で使用できる疎水性相互作用媒体は、樹脂、膜または他の支持媒体の形態であってもよい。
【００２０】  この実施態様の好ましい形態は、エンドトキシンを含む存在する他の汚染宿主細胞成分を含むプラスミドＤＮＡの混合物を、エンドトキシンと宿主細胞不純物が疎水性相互作用媒体に優先的に結合し維持されるような方法で、疎水性相互作用媒体を含むカラムまたはベッドマトリックスに充填することを含み、プラスミドＤＮＡは、充填処理からの流出物（フロースルー）として、または疎水性相互作用媒体に対する宿主細胞不純物およびエンドトキシンの維持を妨げないような疎水性相互作用媒体の任意的洗浄において回収される。プラスミドＤＮＡの回収後、カラムまたはベッドマトリックスを、例えばカラムまたはベッドマトリックスの周りの塩濃度を変更することによってカラムまたはベッドの疎水性相互作用条件を変更、変化または修正することにより、結合または維持された宿主細胞不純物およびエンドトキシンを溶出することによって再生できる。
【００２１】  本発明の別の実施態様は、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーのいずれかまたは両方を用いない分離方法を提供する。
【００２２】  この実施態様のある好ましい形態では、カラムまたはベッドボリュームは、疎水性相互作用カラムに汚染された不純物の選択的結合を可能にする濃度、好ましくは約２Ｍの濃度に、硫酸アンモニウム反応溶液を用いて最初に平衡化される。本発明の方法に用いられる塩は、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＳＯ42-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＮＯ3-、Ｍｇ2+、Ｌｉ+、Ｎａ+、Ｋ+およびＮＨ4+からなるがこれらに限定されない群から選択されたアニオンまたはカチオンの混合物を含む。塩の混合物も使用できる。さらに、プラスミドＤＮＡと他の汚染不純物、例えばエンドトキシン等の混合物は、好ましくは、カラムまたはベッドマトリックスと接触させる前に透析バッファーを用いて透析して、硫酸アンモニウム反応溶液における、エンドトキシンおよびプラスミドＤＮＡおよびエンドトキシンのような他の汚染不純物の疎水性を変更しうる塩および他の汚染物質を除く。この反応溶液は、好ましくは、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて、限定されないが６．８から８．５、好ましくは７．４の範囲のｐＨに緩衝化される。他のバッファーが当業者に知られており、限定されないが、例えば、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ（Ｎ−tris（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン−スルホン酸）、Tricine（Ｎ−tris（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、リン酸塩、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-bis（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、ＭＥＰＥＳ（３−Ｎ（Ｎ−モルホリノ）エチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、およびBicine（Ｎ，Ｎ−bis（２−ヒロキシエチル）グリシン）を用いることができる。
【００２３】  本発明の方法は、単離および／または精製されたプラスミドＤＮＡ、およびプラスミドＤＮＡを含む組成物を提供する。これは、実質的に低減されたエンドトキシン含量を備えるか、エンドトキシンを含まず、プラスミドＤＮＡのエンドトキシン負荷は、９５％、好ましくは９８％より多く、さらに好ましくは９９％より多く、あるいは９９．９％より多く、最も好ましくは９９．９９％から９９．９９９％まで低減される。本発明の方法は、エンドトキシンの大量の当初負荷を分離するために用いることができ、例えば、少なくとも６０００００から３百万ＥＵ／ｍｌ疎水性マトリックスの能力であることを条件に、例えば少なくとも２０００００から４０００００エンドトキシンユニット（ＥＵ）／溶液のミリリットルである。さらに、本発明の方法は、約１０未満から約２５００ＥＵ未満の範囲または約１未満から約３００ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満の範囲を含む産物プラスミドＤＮＡ組成物を提供する。または、本発明の方法は、約５０未満から約１０００未満のエンドトキシンユニット（ＥＵ）の範囲、または、約１０未満から約５０ＥＵ／ｍｇＤＮＡ未満の範囲を含む産物プラスミドＤＮＡ組成物を提供する。本発明の方法は、また、タンパク含量を０．１％（ｗ／ｗ）ＲＮＡ未満から１％（ｗ／ｗ）未満に低減し、染色体ＤＮＡを１％（ｗ／ｗ）未満に低減する。
【００２４】  別の実施態様では、本発明は、弛んだプラスミドＤＮＡからスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを分離する方法を提供し、この方法は、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡの両方が、疎水性相互作用媒体に結合して、結合第一混合物を形成する第一の条件下で疎水性相互作用媒体とスーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび弛んだプラスミドＤＮＡの混合物とを接触させる工程；結合第一混合物の周りの第一の条件を第二の条件に変化させ、弛んだプラスミドＤＮＡを結合第一混合物から除去し、第二結合混合物と弛んだプラスミドＤＮＡを含む別個の成分を形成する工程；および、前記結合第二混合物の周りの第二の条件を第三の条件へと変更し、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを前記第二結合混合物から取り出し、疎水性相互作用媒体とスーパーコイル化プラスミドＤＮＡとを含む別個の成分を形成する工程を含む。
【００２５】  この態様の別の形態では、変化および変更は、溶出バッファーまたは溶液のｐＨ条件を、弛んだおよびスーパーコイル化形態が、異なるｐＨ条件で、塩条件を変化させてまたは変化させずに溶出できるように変化させることによって行うことができる。
【００２６】  この態様の別の形態では、変化および変更は、定組成溶離を介して実施でき、結合したプラスミドを含むカラムを通した際に、好ましくはプラスミドＤＮＡの両方の形態を溶出しうる塩濃度である同じ組成の溶液が、別個の画分に、直接的に二つの形態を別個に溶出する。
【００２７】  別の実施態様では、塩条件および／または他の条件は、プラスミドの弛んだ形態が非結合画分として回収され、スーパーコイル化形態が樹脂に結合しているように変更されうる。スーパーコイル化形態は、上記条件を用いて後で溶出できる。
【００２８】  この態様の別の形態では、変化および変更は、競合的にリガンドに結合し（“ディスプレーサー”）、結合したプラスミドＤＮＡ形態を分離成分としてマトリックスから除去する分子または分子の混合物の使用により実施することができる。
【００２９】  この態様の別の形態では、疎水性相互作用等を介して結合できる分子または分子の混合物が、プラスミドＤＮＡ溶液と混合されてもよい。これは、カラムに充填した後に置換されて、異なる形態のＤＮＡの分離をもたらす。
【００３０】  この実施態様の上記二つの変形では、共通して“置換(displacement)”および“正面(frontal)”方式のクロマトグラフィーが挙げられる。添加された分子は、産物と共溶出することができ、多くの場合、当該技術分野で公知の方法を用いて有効に分離できる。
【００３１】  置換クロマトグラフィーは、樹脂に結合した二つ以上の分子が、樹脂に対してより高い親和性を備え、連続的に置換し、かくして二つ以上の結合分子の溶出をもたらすディスプレーサー分子を用いて置換されるクロマトグラフィーの方式である。最近、ポリメチルメタクリラート、アクリル酸およびポリジメチルアミノエチルメタクリラートを含むトリブロックコポリマーからなる疎水性相互作用樹脂のディスプレーサーが同定された（Ruaan et al"Hydrophobic displacement chromatography of proteins using triblock copolymers as displacers, 1998 AIChE meetingを参照）。他のディスプレーサーは、疎水性相互作用樹脂を用いた置換クロマトグラフィー用に開発されてきた（Shukla et.al.Hydrophobic displacement chromatography of proteins in 1998 Annual AIChE meeting参照）。２−（２−ブトキシエトキシ）エタノールのようなディスプレーサーは、逆相クロマトグラフィーにおけるディスプレーサーとして使用されており、有益であろう。
【００３２】  二つの形態のプラスミドを結合させた後、上記のようなディスプレーサーを用いて、ここに記載したＨＩＣ（疎水性相互作用カラム）樹脂から連続的にスーパーコイル化および弛んだＤＮＡを置換する。
【００３３】  “正面”方式のクロマトグラフィーでは、カラムは、樹脂に対する親和性において相違するバイナリー混合物を用いて充填され、継続的にカラムに過充填することにより、一方の成分が他を置換し、二つの成分の連続的溶出をもたらす。本発明にこの方法を適用する場合、二つの形態のＤＮＡが、例えば、ＨＩＣカラムに充填され、サンプルの過充填が、弛んだ形態の置換を引き起こす置換効果をもたらし、スーパーコイル化形態から別個に回収されうる。
【００３４】  この実施態様の一つの形態では、変化および変更は、結合第一混合物を、連続的に変化する硫酸アンモニウムのような塩の濃度を備えた硫酸アンモニウム溶液のような塩溶液と混合することによる、弛んだプラスミドＤＮＡとスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの勾配溶出の連続的方法に組み合わせられる。この濃度は好ましくは、硫酸アンモニウムのような塩が約３Ｍから約１Ｍの間で変化する。弛んだプラスミドＤＮＡは、第一の溶出量に本発明のこの実施態様の形態で回収され、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡは、第二溶出量に回収される。
【００３５】  この実施態様の他の好ましい形態では、スーパーコイル化および弛んだ形態のプラスミドＤＮＡが、ＤＮＡの両形態をベッドまたはカラムの疎水性相互作用媒体に高い塩濃度、または２．５Ｍから４Ｍ、好ましくは３Ｍの硫酸アンモニウムの様な等価イオン強度で最初に結合させ、次いで、ステップ勾配または連続勾配式のいずれかで、塩濃度または等価イオン強度を約２．４５Ｍから約２．３５Ｍの硫酸アンモニウムの第一範囲に、次いで、約０Ｍ（おそらく１Ｍ）から約２．３Ｍの硫酸アンモニウムの第二範囲に変化させることにより（ステップ溶出態様）、または、約１から約３０のカラムまたはベッドボリューム、好ましくは少なくとも６のカラムまたはベッドボリュームの量にわたって、約２．５Ｍから約４Ｍの範囲から約０Ｍ（あるいは１Ｍ）から約２．３Ｍの第二範囲に硫酸アンモニウム濃度を連続的に変化させることにより（連続勾配態様）、二つの別個の形態のプラスミドＤＮＡをカラムから溶出させる。これらのいずれの形態においても、弛んだプラスミドＤＮＡは、約２．３５Ｍから約２．４５Ｍの範囲の塩（硫酸アンモニウム）濃度でカラムまたはベッド媒体から溶出するが、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡは、約０Ｍから約２．３Ｍの範囲の塩（硫酸アンモニウム）濃度でカラムまたはベッド媒体から溶出する。
【００３６】  別の実施態様において、本発明は、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを単離する方法を提供し、この方法は、
スーパーコイル化プラスミドが、非スーパーコイル化プラスミドよりも媒体に優先的に結合するイオン条件下で、疎水性相互作用媒体にスーパーコイル化プラスミドを含むサンプルを適用する工程、および
イオン条件を調節して、結合したスーパーコイル化プラスミドを前記媒体から溶出する工程
を含む。
【００３７】  他の好ましい実施態様では、本発明は、混合物において、弛んだＤＮＡよりもスーパーコイル化ＤＮＡの量を豊富にする方法を提供し、この方法は、（１）スーパーコイル化ＤＮＡが疎水性相互作用媒体に優先的に結合するようなイオン条件下で、スーパーコイル化ＤＮＡおよび弛んだＤＮＡを含む混合物を、アルキル部を含む疎水性相互作用媒体と相互作用させる工程；（２）弛んだＤＮＡを優先的に除くイオン条件下で、弛んだＤＮＡおよびスーパーコイル化ＤＮＡを含む疎水性相互作用媒体を処理する工程；および（３）疎水性相互作用媒体からスーパーコイル化ＤＮＡを溶出する工程を含む。
【００３８】  さらに好ましい態様では、本発明は、ＤＮＡを含む組成物からリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を除く方法を提供し、この方法は、（１）ＬＰＳがＤＮＡよりも優先的に疎水性相互作用媒体に結合するようなイオン条件下で、ＤＮＡおよびＬＰＳを含む混合物を、アルキル部を含む疎水性相互作用媒体と相互作用させる工程；および（２）ＤＮＡおよびＬＰＳを含む疎水性相互作用媒体を、ＤＮＡの選択的除去を可能にするイオン条件で処理する工程を含む。
【００３９】  本発明の方法は、単離および／または精製されたスーパーコイル化プラスミドＤＮＡ、およびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを含有する組成物を提供する。これは、好ましくはエンドトキシンを含まず、本発明の方法によって製造された組成物に存在するスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの量は全プラスミド量の少なくとも約５０重量％から少なくとも約９９重量％、好ましくは少なくとも約６０重量％から少なくとも約９５重量％、さらに好ましくは少なくとも約７０重量％から少なくとも約９０重量％、最も好ましくは少なくとも約７５重量％から少なくとも約８５重量％のスーパーコイル化プラスミドＤＮＡとされる。
【００４０】  重量パーセントは、ここに例示されるように、各成分の量に対応する面積を有するピークをもたらすＤＮＡ−ＮＰＲ ＨＰＬＣカラムにおけるＨＰＬＣ分離により、勾配を介して、測定される。スーパーコイル化形態のパーセントは、スーパーコイル化および弛んだプラスミドＤＮＡピークの全面積に対するスーパーコイル化ＤＮＡに対応するピーク面積のフラクションとして算出された。
【００４１】  本発明の方法で用いられる好ましい疎水性相互作用媒体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を含む。これは、例えば、メタクリラートポリマーまたはコポリマー骨格を有する、例えばメタクリラート／エチレングリコールおよび／またはメタクリラート／プロピレングリコールコポリマー（TosoHaas, Montgomeryville,PA）、および／またはアガロースまたはセファロース（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、例えば、架橋または非架橋の、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカ含有ポリマー、有機ポリマー（天然または合成）、セラミック含有またはゲルマトリックス、骨格、またはこれらと、Ｃ3からＣ10アルキル、分枝状または直鎖状、ペンダント結合(pendent)側鎖リガンドとの組合せのあらゆる組合せを含む。好ましいペンダント結合リガンドは、プロピル、ブチル、ヘキシルおよび／またはオクチルリガンドを含む。これらのリガンドは、本発明の分離、精製および／または単離方法において利用される好ましい結合相互作用を提供する。当業者であれば、疎水性相互作用樹脂が、本発明の方法でも使用できるような、これらのアルキルリガンドに加えてまたはその代わりに、リガンドを含んでもよいことを認識できる。かかるリガンドの例は、限定されないが、フェニル、オクチル、ブチル、プロピル、ネオペンチル、ヒドロキシプロピル、ベンジル、オクタデシル、ジフェニル、およびメチル、並びにこれらの置換および非置換誘導体、およびこれらの組合せを含む。本発明で使用できる適切な樹脂または媒体物質は、例えば、欧州特許第９６４０５７、欧州出願第９９１０９４４１、ＪＰ２００００３５４２３、ＪＰ９９１２７７００およびＪＰ９８１２７６６５（Kitamuraら）に記載されたものを含み、これらの全内容をここに参照として含める。
【００４２】  疎水性相互作用媒体は、カラムまたはベッドリアクターに収容または充填されてもよいビーズの形態であってもよく、また、架橋した多孔性媒体であってもよい。ビーズ媒体のサイズは、２．５μｍから１００μｍ以上までの範囲とすることができる。ビーズ媒体のサイズは、好ましくは直径が約３０から約１１０μｍの範囲、例えば約３５から約１００μｍの直径、または３５から９０μｍの直径である。疎水性相互作用媒体は、セルロースまたはセルロース誘導体骨格、ポリエーテルスルホン、ポリスルホンおよびこれらの誘導体および／または濾過および分離技術で公知の他の物質のような膜の形態で存在し、プラスチックを含み、マイクロタイタープレートおよびペトリまたは細胞培養皿および容器を含む。
【００４３】  “Streamline”(Amersham Pharmacia biotech)カラムに使用されるビーズは、通常、種々の密度を備えたより大きなサイズであり、これらに限定されないがAmersham Pharmacia Biotech, Biosepra Incを含む種々の製造者によって製造され、これでは、浄化された溶解物はこれらの“引き延ばされたベッド(expanded bed)”カラムを通して流されて、疎水性相互作用リガンドを含むビーズに対する結合を介して汚染物質を除去する。
【００４４】  より小さいビーズサイズは、通常、ＨＰＬＣを含む高性能分離において用いられる。これでは、この発明は、プラスミドＤＮＡおよび／または異なる形態のＤＮＡを定量的に分析する方法を提供するために利用される。
【００４５】  この発明における使用の目的のためのビーズは、特に、プラスミドＤＮＡの二つの形態の分離は、プラスミドＤＮＡは一般的にあまりに大きくて、細孔を占めることができないので、多孔性である必要がなく、かくして、さらなる収容力を与える。しかしながら、汚染物質結合の目的で、ＲＮＡ、タンパク、エンドトキシンおよびＤＮＡフラグメントのような汚染分子が細孔のサイズ以下であるので、細孔は収容力を有効に増大させることができる。この場合、多孔性が機能し、かくして、多孔性樹脂は有益である。
【００４６】  本発明の方法は、好ましくは、有機溶媒、添加剤または界面活性剤、例えばグリコール、ポリエチレングリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジンまたはポリビニルピロリドンを必要としない。これらは、後に、遺伝子治療等で使用する前に産物であるスーパーコイル化プラスミドＤＮＡから分離する必要がある。
【００４７】  本発明の方法は、スーパーコイル化プラスミド、弛んだプラスミドＤＮＡおよびエンドトキシンのような細胞性汚染物の疎水性の差を利用する。
【００４８】  ここに記載した方法は、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡ、コスミドおよびファージミドベクターを精製および単離するために使用できる。これらのベクターおよびプラスミドＤＮＡは、あらゆる起源から精製することができる。さらに、エンドトキシン、ＲＮＡ、タンパクおよび染色体ＤＮＡを含む汚染物の同様の混合物がこれらの調製物に存在しうるので、酵母および哺乳動物細胞に存在するコスミドおよびプラスミドＤＮＡも精製できる。また、これらの起源からプラスミドおよびコスミドＤＮＡのスーパーコイル化形態を得る必要性もあり、かくして、ここに記載されている方法は、これらの応用の多くにおいてＤＮＡを精製することに使用できる。
【００４９】  “疎水性相互作用媒体”とは、（ａ）支持体部と（ｂ）当該支持体部に直接的または間接的に結合された疎水性部とを含む物質である。支持体部および疎水性部の例は、ここに記載されており、また、当該技術分野において公知である。疎水性部は、ここに記載された分離方法に使用される優先的結合のベースを提供する。“疎水性相互作用媒体”の種々の例は、当該技術分野において知られており、ここに記載されている。ここで用いられる別の用語も、疎水性相互作用媒体を示し、その例は、“樹脂”、“マトリックス”、“カラム”、“媒体”、“ビーズ”そして“疎水性相互作用リガンド”である。
【００５０】  “ＤＮＡ”とは、限定されないが、プラスミド（スーパーコイル化および／または弛んだまたはニック化）、コスミドまたは人工染色体を含む。
【００５１】  “ニック化(nicked)”または“弛んだ(relaxed)”ＤＮＡとは、スーパーコイル化していないＤＮＡを意味する。“スーパーコイル化(supercoiled)”ＤＮＡとは、当該技術分野において周知の用語である。
【００５２】  “汚染不純物(contaminating impurity)”とは、それからＤＮＡを分離または単離することが望まれるあらゆる物質である。汚染不純物は、限定されないが、宿主細胞タンパク、エンドトキシン、宿主細胞ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。何が汚染不純物と考えられるかは、本発明の方法が実施される状況に依存すると理解される。“汚染不純物”は、宿主細胞誘導物であっても、そうでなくてもよい。すなわち、宿主細胞不純物であっても、そうでなくてもよい。
【００５３】  第一成分（ＤＮＡ等）の“単離(isolating)”または“精製(purifying)”とは、始めに第一成分が一緒に見出される別の成分からの第一成分の豊富化を意味する。所望および／または得られる精製の程度を以下に記載する。好ましくは、本発明の方法は、約５倍の豊富化、好ましくは約１０倍の豊富化、好ましくは約２０倍の豊富化、好ましくは約５０倍の豊富化、好ましくは約１００倍の豊富化、好ましくは約２００倍の豊富化、好ましくは約５００倍の豊富化、好ましくは約１０００倍の豊富化をもたらす。あるいは、精製の程度は、別の成分に関して、あるいは結果的な調製物に関して、第一成分のパーセントとして表現される。かかるパーセントの例は、ここに与えられている。
【００５４】  成分の“優先的(preferential)”または“選択的(selective)”結合または除去（取り出し）とは、所定の条件について、別の成分よりも大きな程度で、第一成分が結合または除去（取り出し）されることを意味する。
【００５５】  当業者に知られているように、“除去（または、取り出し）（removal）”または“結合(binding)”は、必須に、あるいは好適にさえ、完全な、または１００％の除去または結合を意味しない。
【００５６】  “水性(aqueous)”溶液は、一般的に、水をベースとする溶液（すなわち、主要溶媒が水である）を示す。これは、溶剤が１００％水であってもなくてもよい。
【００５７】  組み換え細菌細胞に産生されたプラスミドＤＮＡの単離は、細胞の溶解および細胞破片の除去を含み、これは、種々の方法を介して達成できる。最終的な溶液は、通常、他の汚染物のなかで極めて高い量のエンドトキシンを含む、プラスミドＤＮＡを含む。本発明の方法は、第一段階として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、顕著な量の重要汚染物、例えばＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパクおよびエンドトキシンを除去する。ここで、プラスミドＤＮＡは結合せずに流れる。本発明の方法は、細菌溶解により得られた混合溶液を、ｐＨ範囲が６．８から８．５、好ましくはｐＨが６．８から７．４の、好ましくは２Ｍ硫酸アンモニウムを含み、任意に１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファーに任意に透析すること、および、この任意に透析した溶液を、好ましくは、予め、ｐＨ範囲が６．８から８．５（好ましくは６．８から７．４）の、２Ｍ硫酸アンモニウム、そして任意に１０ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーで平衡化した、プロピル、ブチル、オクチルまたはヘキシルリガンドのいずれかまたは混合物のような疎水性相互作用リガンドを有するクロマトグラフィー支持体を含む収容型クロマトグラフィーカラムを通して流すことを含む。フロースルー溶液は、通常、硫酸アンモニウムのような塩の約２Ｍの濃度であり、優勢に、２％未満の汚染物を含むプラスミドＤＮＡ（スーパーコイル化および弛んだものの混合物）を含む。上流の工程のバリエーションに依存して、スーパーコイル化ＤＮＡのパーセントは、５０から９５重量％、通常約７５から８５％、あるいは８０から８５％の範囲とすることができ、混合物からのプラスミドＤＮＡの弛んだ形態の除去を含む、さらなる精製を必要とする。
【００５８】  本発明の方法は、エンドトキシンレベルが特定のレベルより低い、すなわち、通常＜１０ＥＵ／ｍｇプラスミドＤＮＡである、精製されたプラスミドＤＮＡを製造することを可能にする。本発明のエンドトキシン除去方法は、大規模または小規模生産に適しており、治療および研究用グレードの物質の経済的な製造を可能にする。これらの方法は、ここに記載される、疎水性樹脂に対するエンドトキシンの選択的結合を利用し、大規模生産では、使用された樹脂のミリリットル当たり１ミリオンユニットを越える収容力を有する。
【００５９】  慣例的に利用できるエンドトキシン除去の方法は、低い収容力を有し（１０００から５００００ＥＵ／樹脂のミリリットル）、および／または低いプラスミドＤＮＡ回収をもたらし、および／または化学的成分および／または方法の使用を含み、治療用グレードの物質の調製には容易には使用できない（米国特許第５７４７６６３）。本発明のエンドトキシン除去方法は、エンドトキシン−およびプラスミドＤＮＡ−含有溶液を、エンドトキシンをプラスミドＤＮＡよりも顕著により疎水性として、エンドトキシンの、ブチル、オクチル、および／またはヘキシル基のような疎水性相互作用リガンドを含む樹脂に対する結合または優先的相互作用および分離をプラスミドＤＮＡよりも確実にする、約２Ｍの濃度の硫酸アンモニウムまたは塩化ナトリウムのような塩に懸濁することを含む。使用される塩濃度は、好ましくは、ＲＮＡ、タンパクおよびエンドトキシンに結合するように最適化することができる。エンドトキシンが、ここに記載した疎水性相互作用リガンドに対して優れた親和性を有するので、より低い塩濃度でも、エンドトキシン結合のみを提供するには十分である。
【００６０】  エンドトキシン除去のこの方法の魅力的な特徴は、簡単かつ＞９５％のプラスミドＤＮＡの回収率に加えて、約１００００００ＥＵ／ｍｌ樹脂、エンドトキシンに対する樹脂の大きな収容力である。例えば、５００ｍｇのプラスミドと１０ミリオンＥＵのエンドトキシンとを含有するプラスミドＤＮＡ溶液は１０ｍｌの樹脂を用いて精製できるが、一方、かかるアニオン交換樹脂における貧弱な回収率という不都合を伴って、少なくとも１０００から４０００ｍｌのアニオン交換樹脂が、プラスミドＤＮＡとエンドトキシンを結合するために求められている。それゆえ本発明の方法は、１００から４００倍の樹脂のコストを節約することができ、さらにカラムコストを節約し、産物の回収率を増やすことができる。商業的に入手可能なＤＮＡ Ｅｔｏｘ樹脂は、本発明の方法で用いられている樹脂よりも現在少なくとも８倍高価である。エンドトキシン除去に使用できる専売的化学を利用した他の商業的樹脂（PolyFlo-PureSyn Inc.,87 Great Valley Pkwy Malvern, PA 19355）は、５から１０倍高価であり、溶剤とイオン対形成化学物質の使用を必要とする。
【００６１】  本発明の方法は、より低い性質の出発物質（すなわち、弛んだおよびスーパーコイル化ＤＮＡの混合物からなる出発物質）から９０％より多くのスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを含む高い量のプラスミドＤＮＡを提供する。さらに、本発明の方法は、遺伝子治療のためのプラスミドＤＮＡの製造に通常使用される大規模処理に利用できる。本発明の方法は、通常、質の低減をもたらす、すなわちプラスミドＤＮＡの弛んだ／ニック化形態の生成をもたらすバリエーションとは独立に、高い品質のプラスミドＤＮＡの信頼できる製造を可能にする。これらのバリエーションは、プラスミドＤＮＡを製造するバクテリアの増殖およびその後の単離および精製工程に生じうる。
【００６２】  本発明の、スーパーコイル化および弛んだプラスミドＤＮＡを分離する方法、および、プラスミドＤＮＡとエンドトキシンを分離する方法は、例えば、Ｃ4からＣ10アルキル、分枝状または直鎖状、リガンドを含み、かつ、好ましくはブチルまたはヘキシルリガンドを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に対して、プラスミドＤＮＡの形態およびエンドトキシンが異なる結合特異性を示すことを見出したことに基づく。これらのリガンドは、本発明の分離、精製および／または単離方法に利用される優先的結合相互作用を与える。当業者であれば、疎水性樹脂が、これらのアルキルリガンドに加えて、またはこれらに変えて、本発明の方法で使用することができる、リガンドを含んでもよいことを理解できるであろう。かかるリガンドの例も上述されている。以下の非限定的な例は、本発明の方法を例示する。以下の一般的な方法を用いることができる。
【００６３】  遺伝子治療の応用のためのプラスミドを、適切な宿主細菌、例えば大腸菌(Escherchia coli)から、培養(fermentation)後に抽出した。開示された発明の以下の例では、プラスミドpE1A-K2を含むE.coli STBL-2が用いられた。プラスミドpE1-A-K2は、アデノウイルスタイプ５の抑制遺伝子を含み、選択マーカーとしてカナマイシン遺伝子を含むｐＵＣプラスミド誘導体である。培養は、無機塩、例えばカリウム一塩基ホスファート(potassium mono basic phosphate)、ナトリウム二塩基ホスファート(sodium dibasic phosphate)、硫酸アンモニウムおよび硫酸マグネシウムを含む適切な酵母抽出物／グルコース培地において、ｐＨ６．５から７．８、好ましくは７．０、３７℃の温度において、好気的に行われる。エアレーションは、培地のボリューム当たり空気が１ボリュームにセットされ、攪拌が８００ｒｐｍにセットされる。グルコースが培地から消費されるまで細胞をこの方式で増殖させ、発酵槽のＤＯをグルコース供給と攪拌によって調節する。この供給物は、グルコースの濃縮溶液（１６０ｇ／Ｌ）および酵母エキス（８０ｇ／Ｌ）および塩（１・５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、ＭｇＳＯ4、リン酸バッファー中に１．５ｇ／Ｌ）を含む。培養完了後、この細胞を、遠心し、または、ウルトラまたはマイクロ濾過膜を通して濾過することによって回収し、ｐＨ７．４のＴＥ（以下参照）バッファーを用いて洗浄する。細胞を、優しく攪拌しながら、０．１５Ｎから０．２ＮのＮａＯＨおよび１％ドデシル硫酸ナトリウムの同量の溶液（ｐＨ１１．５から１３）と懸濁液とを接触させることによって溶解する。アルカリ性溶液を、酢酸カリウム溶液を用いて中和する。この物質を、遠心分離または一連の深さのフィルターに懸濁液を通過させることにより浄化する。プラスミド溶液を、限外濾過膜により濃縮し、ｐＨ７でＴＥバッファーに対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション濃縮水は、ここに記載された媒体に直接適用することができる。
【００６４】  溶解物のプラスミドＤＮＡ含量は、一般的には、全核酸の２％未満であり、内容物の大半は、ＲＮＡまたは染色体ＤＮＡである。さらに、溶解物は、エンドトキシンおよび細胞性タンパクで汚染（混入）されている。
【００６５】  また、本発明は、単離または精製されたＤＮＡの小規模、研究用規模またはベンチスケールの生産の方法、並びにこの方法で使用される装置カラムおよび分離器も提供する。当業者であれば、プラスミドＤＮＡの小規模製造が、大規模製造と比較して別の問題を持ち込むことを理解するであろう。特に、小規模分離は、出発物質において大きな比率を占める汚染ＲＮＡの分離を必要とし、上述したように、大規模出発物質におけるプラスミド−ＲＮＡ比は約２％（ｗｔ／ｗｔ）であるが、小規模の比率は約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）である。さらに、小規模サンプルの培養ボリュームは、大規模分離においては約５Ｌから約１０００Ｌであるのに対し、一般的に約２ｍＬから約２Ｌである。本発明の小規模分離は、約１から約２０ｍｌ、通常は約１０ｍｌから約１５ｍｌの範囲の反応器またはカラムベッドボリュームを用いて、約１００μｇから約１ｍｇのプラスミドを含む。それゆえ、本発明は、エンドトキシン、ＲＮＡおよび弛んだＤＮＡのような不純物から、単離および／または精製されたＤＮＡ、好ましくはスーパーコイル化ＤＮＡを効率的に小規模で製造することを可能にする。
【００６６】  種々の方法が例示に用いられているが、当業者であれば、別の調製方法および出発物質を本発明において使用できることを理解できるであろう。
【実施例】
【００６７】実施例１：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するエンドトキシンの除去（スモールスケール）
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、濾過法を通じて精製した。これを通じて使用された全てのバッファーは、0.2μmフィルターを通じて濾過され、エンドトキシンのためのサンプルをポリスチレンサンプルチューブに貯蔵した。【００６８】  ダイアフィルトレーション残余物(〜400ml)をTE pH7.4(50mM Tris、10mM EDTA、HClでpH7.4に調節)内に透析し、実験のために使用した。サンプルを2Mにするために必要とされる硫酸アンモニウム(AS)を、100mlのTEプラス2M AS、pH7.4バッファーに加え、部分的に溶解した。この溶液を透析サンプルに加え、最終容量を575mlとし、その475mlを実験のために使用した。【００６９】  2.6cmの直径、15cmのベッド長、約75mlのベッド容量を有するブチル650Sカラム(TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomerville, PA 18936社製のButyl 650S樹脂)をパックし、2M ASを含むTEバッファー、pH7.4で平衡化した。サンプルを、5ml/分の流速で乗せた。フロースルーを回収し、サンプルを分析のために採取した（DNA濃度、アガロースゲル、およびエンドトキシンアッセイ）。エンドトキシンアッセイをスパイクで実施し、サンプルを適切に希釈し、許容可能だと考慮される範囲でPPC(Positive Product Control)回収物を得た。BW出版物No. P50-650U-5, Kinetic-QCL Test Kit Manualに記載されたBio Whittaker Kinetic-QCL Chromogenic LALアッセイを使用して、エンドトキシン濃度を測定した。サンプルの搭載に引き続き、2M硫酸アンモニウムを含むTEをカラムを通じて流し、回収し、サンプル化した。次いでカラムをTEバッファー、pH7.4、USP精製水で洗浄し、0.5N水酸化ナトリウムで清浄化し、>15容量のUSP精製水でリンスした。エンドトキシンは、表１に示されるようにこれらの洗浄物のそれぞれで存在した。この顕著なエンドトキシン除去効率に加えて、十分量のRNA、タンパク質、及びDNA断片が除去され、サンプルは顕著に精製された。【００７０】
【表１】
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樹脂のml当たりのエンドトキシン容量                  ３百万EU/ml
サンプル中のエンドトキシンの減少                    99.992%【００７１】実施例２：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するエンドトキシンの除去（ラージスケール）
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、濾過法を通じて精製した。【００７２】  ダイアフィルトレーション残余物(〜650ml)をTE pH7.4(50mM Tris、10mM EDTA、HClでpH7.4に調節）内に透析し、実験のために使用した。サンプルを2Mにするために必要とされる硫酸アンモニウムを、1200mlのTEプラス2M AS、pH7.4バッファーに加え、部分的に溶解した。この溶液の容量を、1300mlまでにした。この溶液を透析サンプルに加え、最終容量を1950mlとし、HClを使用してpHを7.4に調節した。【００７３】  5cmの直径、15cmのベッド長、約275mlのベッド容量を有するブチル650Sカラムをパックし、2M ASを含むTEバッファー、pH7.4で平衡化した。サンプルを、20ml/分の流速で乗せた。フロースルーを回収し、サンプルを分析のために採取した（上述の通りDNA濃度、アガロースゲル、およびエンドトキシンアッセイ）。サンプルの搭載に引き続き、2M硫酸アンモニウムを含むTEをカラムを通じて流し、回収し、サンプル化した。次いでカラムをTEバッファー、pH7.4、USP精製水で洗浄し、0.5N水酸化ナトリウムで清浄化し、>15容量のUSP精製水でリンスした。エンドトキシンは、表２に示されるようにこれらの洗浄物のそれぞれで存在した。この顕著なエンドトキシン除去効率に加えて、十分量のRNA、タンパク質、及びDNA断片が除去され、サンプルは顕著に精製された。【００７４】
【表２】
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樹脂のml当たりのエンドトキシン容量                  ６４万EU/ml
サンプル中のエンドトキシンの減少                    99.993%【００７５】実施例３：ヘキシル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するエンドトキシンの除去（スモールスケール）
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、濾過法を通じて精製した。上清を20mMリン酸カリウムバッファー(6.8のpHを得るような割合で20mMリン酸カリウム二塩基酸と組み合わせた20mMリン酸カリウム一塩基酸溶液）、pH6.8内に透析し、サンプルを2Mにするために必要とされる硫酸アンモニウムを、20mlの2M ASを含むKPB(20mMリン酸カリウムバッファー)、pH6.8バッファーに加え、溶解した。この溶液を5mlの透析サンプルに加え、最終容量を25mlとし、pHを6.8に調節した。【００７６】  1.6cmの直径、4cmのベッド長、約8mlのベッド容量を有するヘキシル650S(TosoHaas)カラムをパックし、2M ASを含むKPB、pH6.8で平衡化した。サンプルを、2ml/分の流速で乗せた。フロースルーを回収し、サンプルを分析のために採取した（DNA濃度、アガロースゲル、およびエンドトキシンアッセイ、上記参照）。サンプルの搭載に引き続き、2M硫酸アンモニウムを含むKPBをカラムを通じて流し、回収し、サンプル化した。次いでカラムをKPB、pH6.8、USP精製水で洗浄し、0.5N水酸化ナトリウムで清浄化し、>15容量のUSP精製水でリンスした。エンドトキシンは、表３に示されるようにこれらの洗浄物のそれぞれで存在した。この顕著なエンドトキシン除去効率に加えて、十分量のRNA、タンパク質、及びDNA断片が除去され、サンプルは顕著に精製された。【００７７】
【表３】
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樹脂のml当たりのエンドトキシン容量                  ３．７百万EU/ml
サンプル中のエンドトキシンの減少                    99.999%【００７８】実施例４：オクチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するエンドトキシンの除去（スモールスケール）
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、上述の濾過法を通じて精製した。上清を実験のために使用した。サンプルを2Mにするために必要とされる硫酸アンモニウムを、20mlのTEプラス2M AS、pH7.4バッファーに加え、溶解した。この溶液を10mlの透析サンプルに加え、最終容量を25mlとし、pHを7.4に調節した。【００７９】  1.0cmの直径、10cmのベッド長、約8mlのベッド容量を有するOctyl Sepharose4 Fast Flowカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)をパックし、2M ASを含むTE、pH7.4で平衡化した。サンプルを、2ml/分の流速で乗せた。フロースルーを回収し、サンプルを分析のために採取した（DNA濃度、アガロースゲル、およびエンドトキシンアッセイ）。サンプルの搭載に引き続き、2M硫酸アンモニウムを含むTEをカラムを通じて流し、回収し、サンプル化した。次いでカラムをTE、pH7.4、USP精製水で洗浄し、0.5N水酸化ナトリウムで清浄化し、>15容量のUSP精製水でリンスした。エンドトキシンは、表４に示されるようにこれらの洗浄物のそれぞれで存在した。【００８０】
【表４】
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樹脂のml当たりのエンドトキシン容量                  ７．４１百万EU/ml
サンプル中のエンドトキシンの減少                    99.996%【００８１】実施例５：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー−勾配溶出を使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドDNAの分離
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、上述の濾過法を通じて精製した。エンドトキシン、RNA、タンパク質、染色体DNA等のような主要な混在物を除去するためのプラスミドＤＮＡのグロス精製を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して実施し、そこで2M硫酸アンモニウムの濃度で、プラスミドDNAはカラムをフロースルーし、混在物はカラムに結合する（上記参照）。【００８２】  プラスミドDNAを含むフロースルーを透析し、いずれかのさらなる精製を提供しないアニオン交換(Bio Sepra)カラムで処理した。Qアニオン交換カラム及びダイアフィルトレーションを通じた処理は、ブチルカラムでの分離を達成するために必要ではない。Qアニオン交換カラムからの溶出物を、30kD再生産セルロース膜(0.1m2, Millipore Corporation)を使用してダイア濾過した。透析物質を、固体の硫酸アンモニウムを使用して3M硫酸アンモニウムに調節した。【００８３】  2.6cmの直径、約15cmのベッド長のブチル(Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas)カラムを、15-20ml/分の流速でパックした。カラムをTris-EDTAバッファーpH7.4中の3M硫酸アンモニウムで平衡化した。サンプルを、5ml/分の流速で乗せた。プラスミドは3M硫酸アンモニウムでカラムに結合した。カラムを2-3カラム容量のバッファー中の3M硫酸アンモニウムで洗浄した。次いでカラムを、６ベッド容量で3Mから1Mの硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出した。勾配溶出の間で、二つのピークが生じ、第一のピークはプラスミドDNAの弛んだ形態を含み、第二のピークはプラスミドDNAのスーパーコイル化形態を含むことが、フラクションのアガロースゲルで明らかとなった（図４Ａ）。クロマトグラムは図４Ｂに示されている。その結果を、二つの形態のパーセンテージを測定するために使用されるHPLCアッセイによりさらに確認した（表５）。【００８４】  アッセイの感度の制限内で、開始材料は50-60%のスーパーコイル化形態のみを含むのに対して、第二のピークは85%のスーパーコイル化形態を含むことが確認された。少なくとも90%の開始材料中のスーパーコイル化プラスミドDNAが回収された。ピークの感度限界は、15cmのカラム長でさえ分離を効果的にするのに十分であった。これは、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドの効果的な分離を示す。この優れた分離に加えて、残余量のRNA、タンパク質、及びエンドトキシンが除去され、遺伝子治療に対する特異的条件に適合する産物が生じた。【００８５】
【表５】
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【００８６】実施例６：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー−勾配溶出ロングカラムを使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドDNAの分離
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、上述の濾過法を通じて精製した。エンドトキシン、RNA、タンパク質、染色体DNA等のような主要な混在物を除去するためのプラスミドDNAのグロス精製を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して実施し、そこで2M硫酸アンモニウムの濃度で、プラスミドDNAはカラムをフロースルーし、混在物はカラムに結合する（上記参照）。プラスミドDNAを含むフロースルーを透析し、いずれかのさらなる精製を提供しないアニオン交換(Bio Sepra)カラムで処理した。Qアニオン交換カラムからの溶出物を、30kD再生産セルロース膜を使用してダイア濾過した。透析物質を、実施例５で上述のように、固体の硫酸アンモニウムを使用して3M硫酸アンモニウムに調節した。【００８７】  2.6cmの直径、約30cmのベッド長のブチル(Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas)カラムを、15-20ml/分の流速でパックした。カラムをTris-EDTAバッファーpH7.4中の3M硫酸アンモニウムで平衡化した。サンプルを、5ml/分の流速で乗せた。プラスミドは3M硫酸アンモニウムでカラムに結合した。カラムを2-3カラム容量で3M硫酸アンモニウムバッファー溶液で洗浄した。次いでカラムを、６ベッド容量で3Mから1Mの硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出した。勾配溶出の間で、二つのピークが生じ、第一のピークはプラスミドDNAの弛んだ形態を含み、第二のピークはプラスミドDNAのスーパーコイル化形態を含むことが、フラクションのアガロースゲルで明らかとなった（図５Ａ）。クロマトグラムは図５Ｂに示されている。その結果を、二つの形態のパーセンテージを測定するために使用されるHPLCアッセイによりさらに確認した（表６）。【００８８】  アッセイの感度の制限内で、開始材料は50%のスーパーコイル化形態のみを含むのに対して、第二のピークは90%のスーパーコイル化形態を含むことが確認された。ピークのベースラインの感度限界が、より長いカラムで得られた。この実施例は、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドの効果的な分離を示す。この優れた分離に加えて、残余量のRNA、タンパク質、及びエンドトキシンが除去され、遺伝子治療に対する特異的条件に適合する産物が生じた。【００８９】
【表６】
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【００９０】実施例７：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー−段階溶出ロングカラムを使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドDNAの分離
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、上述の濾過法を通じて精製した。エンドトキシン、RNA、タンパク質、染色体DNA等のような主要な混在物を除去するためのプラスミドＤＮＡのグロス精製を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して実施し、そこで2M硫酸アンモニウムの濃度で、プラスミドDNAはカラムをフロースルーし、混在物はカラムに結合する（上記実施例１参照）。フロースルー及び洗浄物をプールし、接線フロー濾過を使用して30kD超濾過膜を使用して濃縮した。濃縮したプラスミドDNAを、固体の硫酸アンモニウムを使用して3M硫酸アンモニウムに調節した。【００９１】  1cmの直径、約30cmのベッド長のブチル(Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas)カラムを、6ml/分の流速でパックした。カラムをTris-EDTAバッファーpH7.4中の3M硫酸アンモニウムで平衡化した。サンプルを、2ml/分の流速で乗せた。プラスミドは3M硫酸アンモニウムでカラムに結合した。カラムを2-3カラム容量で3M硫酸アンモニウムバッファー溶液で洗浄した。次いでカラムを、2-3カラム容量を使用して、各種の濃度の硫酸アンモニウム−2.8M、2.7M、2.6M、2.55M、2.5M、2.4M、1Mで溶出した。ピークを、2.4M及び1Mの溶出物で観察した。ピークのアガロースゲル電気泳動が、図６Ａに示されている。ゲルは、スーパーコイル化及び弛んだ形態の明らかな分離を示す。2.4Mの溶出物は弛んだ形態を含み、1Mの溶出物はスーパーコイル化DNAを含む。クロマトグラムは図６Ｂに示されている。その結果を、二つの形態のパーセンテージを測定するために使用されるHPLCアッセイによりさらに確認した（表７）。【００９２】  アッセイの感度の制限内で、開始材料は62%のスーパーコイル化形態のみを含むのに対して、第二のピークは93%のスーパーコイル化形態を含むことが確認された。これらの結果を後の実験によって確認し、2.3M及び2.2Mの溶出物は感度原型を提供せず、2.4Mの溶出物は弛んだ形態の有意な除去を繰り返し提供し、それによって1M溶出物中のスーパーコイル化形態が富化された。段階溶出を使用して達成された分離は、ラージスケールの分離で有意であり、それは段階溶出を使用してより迅速に実施される。この実施例は、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階溶出を使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドの効果的な分離を示す。この優れた分離に加えて、残余量のRNA、タンパク質、及びエンドトキシンが除去され、遺伝子治療に対する特異的条件に適合する産物が生じた。【００９３】
【表７】
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【００９４】実施例８：ヘキシル疎水性相互作用クロマトグラフィー−勾配溶出ロングカラムを使用する、スーパーコイル化及び弛んだ形態のプラスミドＤＮＡの分離
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、上述の濾過法を通じて精製した。エンドトキシン、RNA、タンパク質、染色体DNA等のような主要な混在物を除去するためのプラスミドDNAのグロス精製を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して実施し、そこで2M硫酸アンモニウムの濃度で、プラスミドDNAはカラムをフロースルーし、混在物はカラムに結合する（例えば上記実施例１参照）。プラスミドDNAを含むフロースルーを透析し、いずれかのさらなる精製を提供しないアニオン交換カラムで処理した。Qカラムからの溶出物を、30kD再生産セルロース膜を使用してダイア濾過した。透析物質を、実施例５で上述のように、固体の硫酸アンモニウムを使用して3M硫酸アンモニウムに調節した（上記参照）。【００９５】  1cmの直径、約30cmのベッド長のヘキシル(Toyopearl Hexyl 650C - TosoHaas)カラムを、5ml/分の流速でパックした。カラムをTris-EDTAバッファーpH7.4中の3M硫酸アンモニウムで平衡化した。サンプルを、2ml/分の流速で乗せた。プラスミドは3M硫酸アンモニウムでカラムに結合した。カラムを2-3カラム容量で3M硫酸アンモニウムバッファー溶液で洗浄した。次いでカラムを、６ベッド容量で3Mから1Mの硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出した。勾配溶出の間で、二つのピークが生じ、第一のピークは主にプラスミドDNAの弛んだ形態を含み、第二のピークは主にプラスミドDNAのスーパーコイル化形態を含むことが、フラクションのアガロースゲルで明らかとなった（図７Ａ）。【００９６】  クロマトグラムは図７Ｂに示されている。質的に、第二のピークは、アガロースゲル電気泳動に基づいて、開始材料より顕著に高い割合のスーパーコイル化プラスミドを含んだ。Butylの35:mと比較して、Hexylの100:mのビーズサイズという事実を考慮して、ピークの優れた感度限界が得られた。【００９７】実施例９：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するエンドトキシンの除去（塩化ナトリウム使用）
プラスミドpE1A-K2を有する大腸菌細胞を生育し、化学的方法を使用して溶解し、濾過法を通じて精製した。上清を実験のために使用した。サンプルをアニオン交換カラム(Q Hyper D - BIOSEPRA Inc.)を通じて精製した。カラムからの2M塩化ナトリウム溶出物を、この実験のために使用した。サンプルは、2M NaClを含む50mM Tris 10mM EDTA pH7.4バッファーに存在した。直径1cm、長さ20cm、約10mlの容量を有するブチルHICカラム(Butyl 650S樹脂を使用 - TosoHaas)をパックし、2M塩化ナトリウムを含むTEで平衡化した。サンプルを2mI/分の流速で乗せた。フロースルーを回収し、サンプルを分析のために採取した（DNA濃度、アガロースゲル、エンドトキシンアッセイ）。サンプルの搭載に引き続き、2M硫酸アンモニウムを含むTEをカラムを通じて流し、回収してサンプル化した。その後カラムをTE pH7.4で洗浄した。【００９８】
【表８】
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樹脂のml当たりのエンドトキシン容量                  １５４０EU/ml
サンプル中のエンドトキシンの減少                    98%【００９９】実施例１０：ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する、スモールスケールプラスミド精製
Qiagen's Miniprepキットとして一般的に周知である商業的に入手可能なキットを使用して、スモールスケールプラスミドDNA精製を実施する。ここに記載された方法を、商業的なキットに対するいくつかの利点を提供するためにプラスミドDNAの精製のために使用できる。以下のサンプルは、スモールスケールでのプラスミドDNAの精製のための、本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用を説明する。【０１００】  精製のための開始材料は、標準法を通じて得られた。特に、約4.65Kbのプラスミドを有する大腸菌細胞を、３７℃で100μg/mlのアンピシリンを含むLuria Brothで生育させた。細胞を2.7のODで回収した。細胞を遠心分離を通じて培地から回収した。その後細胞ペレットを、50mM Tris-HCl、10mM EDTA pH8.0に再懸濁した。等量の200mM NaOH、1%SDS溶液を加え、十分に混合し、室温で５分インキュベートした。この工程は細胞の溶解を引き起こし、プラスミドDNAを含む細胞内容物を放出させる。3.1M酢酸カリウム(pH5.5)より成る中和溶液を、等量（元々の）で加え、十分に混合した。中和溶解物を、チーズクロス及びフィルターを通じて濾過し、沈降物を除去した。透明な溶解物を、70%イソプロパノール(3mlの透明な溶解物当たり2.1mlのイソプロパノールを加える)で沈降させた。沈降物を遠心分離を通じて分離し、ペレットを70%エタノールで洗浄し、乾燥して10mM TriS-HCl、0.1mM EDTAバッファー、pH8.0に溶解した。沈降物を使用まで−２０℃で凍結し、精製実験の開始材料として使用した。【０１０１】  20mlのベッド容量、10cmのベッド長を有するブチル650Sカラムを、1.6cmの直径のカラム(Pharmacia XK16/20)にパックし、50mM Tris-HCl、10mM EDTA(TE)バッファー、pH7.4中の2.2M硫酸アンモニウム(AS)で平衡化した。搭載のためのサンプルを2.2Mの最終濃度で固体の硫酸アンモニウムを加えることによって調製した。サンプルをTris-EDTA、pH7.4中の2.2M ASで10mlに希釈した。【０１０２】  精製条件は、プラスミドDNAがフロースルーに回収され、混在物が樹脂に結合するようにデザインした。【０１０３】  サンプルを2ml/分で乗せ、フロースルーを回収した。カラムをTEバッファー中の2.2M ASの35mlで洗浄し、洗浄物１(10ml)、洗浄物２(14.5ml)及び洗浄物３分画(10ml)として回収した。ピークは洗浄の間で生じた。カラムを、TEバッファー、pH7.4中の1M ASの55mlで溶出し、1M洗浄物１(10ml)及び1M洗浄物２(45ml)として回収した。ピークは1M AS溶出の間で生じた。カラムを50mlのUSP-精製水で溶出した。ピークが生じた。以下の表は、上述の分画のそれぞれで存在する全核酸を示す。濃度は、260nmでの吸光度に基づいて計算された(Conc. (μg/ml)=A260*50)。【０１０４】
【表９】
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【０１０５】  サンプルのアガロースゲル電気泳動を実施した。図８は、ゲルの写真コピーを示す。ゲルの写真は、洗浄物分画（レーン３，４，５）においてプラスミドDNAを示す。ロードサンプル（レーン２）とは対照的に、視覚化可能なRNAは洗浄物分画では見られない。溶出物分画は、レーン６及び７に示されるようにRNAを含む。洗浄物プールにおけるエンドトキシンを、Kinetic QCLエンドトキシンアッセイを使用して測定した。エンドトキシンは、0.005EU/mlであるこのアッセイの感度レベルでサンプル中で検出されなかった。プラスミドの収率は、100mlの培養物から733μgであり、それは商業的なキットで入手可能なものと同様である。【０１０６】  ここ及び以下で引用される参考文献の全内容は、参考として完全に取り込まれる。
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】  スーパーコイル化および弛んだプラスミドDNAを分離する例示的方法を実施することに関する種々の工程の流れ図を示す。
【図２】  例示方法で用いられる、結合したリガンド化学を備えた種々の疎水性相互作用支持体の概念図である。
【図３】  プラスミドＤＮＡからエンドトキシンを分離する例示的方法を実施することに関する種々の工程の流れ図を示す。
【図４】  （内部）は、SYBR GOLDで染色した実施例５（ブチルＨＩＣ）からのアガロースゲルのスキャンイメージを示し、レーン１はスーパーコイル化ＤＮＡラダーを含み、レーン２および３はピーク１からのサンプルを含み（弛んだもの）、レーン３−５はピーク２（スーパーコイル化）からのサンプルを含む。（レーンは左から右に番号付けされている。）分量に対する吸収の実施例５からのクロマトグラムは、弛んだ（ピーク１）とスーパーコイル化ＤＮＡ（ピーク２）の分離を示す。
【図５】  （内部）は、SYBR GOLDで染色した実施例６（ブチルＨＩＣ）からのアガロースゲルのスキャンイメージを示し、レーン１はマーカーを含み、レーン２および３はピーク１からのサンプルを含み（弛んだもの）、レーン４−６はピーク２（スーパーコイル化形態）からのフラクションを含む。（レーンは左から右に番号付けされている。）実施例６からのクロマトグラムは、弛んだ（ピーク１）とスーパーコイル化ＤＮＡ（ピーク２）形態の分離を示す。
【図６】  （内部）は、実施例７からのアガロースゲルのスキャンイメージを示し、レーン１はマーカーを含み、レーン２および３はカラムに添加された物質を含み、レーン４は人工産物ピークの物質を含み、レーン５は２．４Ｍ AS Elutionの物質を含み、かつ、レーン６は、1M AS Elutionの物質を含む（レーンは左から右に番号付けされている）。クロマトグラムはプラスミドＤＮＡの弛んだおよびスーパーコイル化形態の分離を示す。ここで、人工産物ピークは、広い最初の（左）ピークであり、右に、それぞれ弛んだおよびスーパーコイル化ピークが続いている。
【図７】  （内部）は、実施例８（ヘキシルＨＩＣ）からのアガロースゲルのスキャンイメージを示し、レーン１はマーカーを含み、レーン２−４はピーク１の物質を含み（弛んだもの）、レーン５および６はピーク２（スーパーコイル化形態）からのフラクションを含む。（レーンは左から右に番号付けされている。）このクロマトグラムは、スーパーコイル化形態から弛んだものを分離することを示す。
【図８】  実施例９のSYBR GOLD染色したサンプルのアガロースゲル電気泳動のスキャンイメージを示し、レーン１はマーカーを含み、レーン２はカラムに充填された物質を含み、レーン３、４および５は、それぞれウォッシュ１、２および３を含み、レーン６は１Ｍ溶出物を含み、かつ、レーン７は水溶出物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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