(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ、イネ又はトマト植物の寒冷ストレス耐性、干ばつストレス耐性又は塩ストレス耐性を高める方法であって、前記方法が、
５’から３’の転写の方向に、
植物中で機能するプロモーターと、
配列番号１を含むＯＳＩＳＡＰ１配列と
植物中で機能する転写終結配列とを含む、単離組換え植物ベクターで前記植物を形質転換して、形質転換植物を産生するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記転写終結配列がｎｏｓ終結配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって作成される遺伝子組換え植物。
【請求項６】
請求項５に記載の前記遺伝子組換え植物によって産生される種子。
【請求項７】
タバコ、イネ又はトマト植物の寒冷ストレス耐性、干ばつストレス耐性又は塩ストレス耐性を高めるための試薬であって、
５’から３’の転写の方向に、
植物中で機能するプロモーターと、
配列番号１を含むＯＳＩＳＡＰ１配列と
植物中で機能する転写終結配列とを含む単離組換え植物ベクターを含む、上記試薬。
【請求項８】
前記ベクターがプラスミドである、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓである、請求項７に記載の試薬。
【請求項１０】
前記転写終結配列がｎｏｓ終結配列である、請求項７に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネから得られた新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１及びそれに対応するタンパクの配列の同定、単離、特徴付け及び使用に関する。本発明はまた、遺伝子組換え植物系において、イネ由来のジンクフィンガー型ストレス関連タンパクをコードする新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現させて、塩、寒冷及び干ばつストレスに対する耐性を与える方法にも関する。本発明はまた、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織及び植物種子、並びにそのような植物及び植物種子を生成する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
高等植物は、固着性の生物である。この植物は、土に根を張り、過酷な環境条件から離れることができない。この植物は、寒い冬、暑く乾いた夏、これを沈める浸水、及び土の塩分並びにこれを乾燥させる干ばつに耐えている。しかし、植物は、何百万年もの間これに耐え、ストレスと戦うために進化させた一連の機構を使用して、このような条件に適応することができる。植物は、その生活環を成長しやすい月間に制限し、又はこの月間に生殖期を完了し、ストレスの多い期間を乗り切るために代謝を制限する期間に入るように進化さえした。世界人口及び世界的な公害が増大しているために、環境条件は急速に変化している。食物の必要性及び消費者の嗜好が高まるにつれて、様々なストレスが生じるために作物が自然にはそれに適応しない領域で作物を栽培することが必要となってくる。
【０００３】
ストレスは、そのすべての形で、植物の発育及び生産性に負の影響を及ぼす。植物は、塩分に対して、葉の成長を低下させ、細胞分裂及び増殖を抑制することによって応答する。根細胞の浸透ポテンシャルが低下すると、水摂取の抑制及び植物の脱水が生じる。続いて、塩が過度に蓄積すると、組織、器官及びやがては植物全体の死に至る。寒冷ストレスは、植物の成長を妨げ、細胞の自己分解及び老化をもたらし、かつ花成誘導、花粉産生、及び発芽に悪影響を及ぼす。寒冷及び乾燥ストレスは、細胞膜を損傷する。酸化ストレスの標的は、膜、タンパク及びＤＮＡである。
【０００４】
植物の発育及び生存は、環境状態の変化、すなわち温度変動、水不足、塩分、浸水、金属毒性及び機械的損傷に絶えず攻撃を受けている。この有害事象を乗り切るために、植物は、複雑な生理的かつ分子上の応答を誘導する。ストレスは一連のシグナル分子によって知覚され伝達され、この分子は最終的にストレス誘導遺伝子の調節エレメントに影響を及ぼして、転写因子、酵素、分子シャペロン、イオンチャネル、トランスポーターなど様々な種類のタンパクの合成を開始し、又はその活性を変化させる。一連の遺伝子によって制御されているこのようなカスケード事象及びその入り組んだ調節は、この好ましくない状態を乗り切るシステムの助けとなる。ある推定によると、植物はおよそ２５，０００〜５５，０００種の遺伝子を有する（Ｋａｍａｌａｙ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、１９８０、１９８４；シロイヌナズナゲノム解析計画（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）、２００１；Ｂｕｒｒ、２００２；Ｇｏｆｆら、２００２；Ｙｕら、２００２）。その多くは、すべての組織で発現している「ハウスキーピング」遺伝子であり、一方他の遺伝子は、器官特異的であり、又は環境刺激によって調節されている。植物の発育プロセス及び環境ストレスに対するその応答を理解するために、極めて重要な遺伝子の機能、及び生活環の様々な局面の間でのその調節について知ることは、絶対に必要である（Ａｕｓｕｂｅｌ、２００２；Ｒｏｎａｌｄ  ＆  Ｌｅｕｎｇ、２００２）。従来の変異遺伝学的方法及び対応する遺伝子のクローニング、並びにディファレンシャルスクリーニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、マイクロアレイ分析のような新しい手法を逆遺伝学的方法とともに使用して、このような遺伝子がクローニングされ、その機能が明らかとなってきた（Ｂｒｅｎｔ、２０００；Ｔｙａｇｉ及びＭｏｈａｎｔｙ、２０００；Ａｈａｒｏｎｉ及びＶｏｒｓｔ、２００１）。
【０００５】
イネは、最も重要な食用作物並びにモデル単子葉植物系である（Ｋｈｕｓｈ、１９９７；Ｔｙａｇｉら、１９９９；Ｃａｎｔｒｅｌｌ及びＲｅｅｖｅｓ、２００２）。しかし、増え続ける世界人口に歩調を合わせるためには、この２５年以内にコメ生産を６０％増加させるべきである。生物性及び非生物性の環境ファクターによる損失を最小にすると、純生産を向上させることを援助できるだけでなく、辺境の土地及び栽培に適さない土地でイネ栽培を拡張することもできる（Ｋｈｕｓｈ、１９９９；Ｔｙａｇｉ及びＭｏｈａｎｔｙ、２０００）。したがって、様々な非生物性ストレスに対する耐性／抵抗性を示す植物の生産が必要とされている。したがって、イネにおける機能ゲノム学は重要な研究分野であり、これにより、植物の発育及び生存に関与する新しい遺伝子の機能が明らかとなる。環境ストレス応答に関与する遺伝子の発見により、より良好な耐性／抵抗性に関する、イネ及び他の作物の遺伝子工学の新たな標的がもたらされる。したがって、イネの新規遺伝子を単離し特徴付けし、その様々な機能についてその新規遺伝子を特徴付けする必要がある。異なるスクリーニング戦略を使用して、えり抜いたインディカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．、Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ  １種）から、器官特異的に発現する、又はストレスで誘導される遺伝子を単離した。本発明では、様々な器官で発現に差があり、いくつかのストレスによって誘導されるジンクフィンガー型タンパクをコードする新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１の同定、単離、特徴付け、及び使用について説明する。本発明はまた、遺伝子組換え植物系において、イネ由来のジンクフィンガー型ストレス関連タンパクをコードする新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現させて、塩、寒冷及び干ばつストレスに対する耐性を与える方法にも関する。本発明はまた、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織及び植物種子、並びにそのような植物及び植物種子を生成する方法にも関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主要な目的は、イネの様々な器官でストレスによって誘導される新規遺伝子を同定し、単離し、特徴付けかつ使用することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、配列番号１として同定されているイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡ配列を単離し、特徴付けかつ使用することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、配列番号１で示されるＯＳＩＳＡＰ１ヌクレオチド配列から、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを推定することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、様々な植物に導入するための構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でイネ由来ＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡ配列を含む植物組換えベクターを構築することである。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、前記植物組換えベクターＤＮＡで植物を形質転換して、様々な非生物性ストレスに対する高い耐性を示す遺伝子組換え植物を産生する方法を提供することである。
【００１１】
他の目的は、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡを導入することにより、タバコ及び他の植物を改変して、様々な非生物性ストレスに対する耐性を高める方法を提供することである。
【００１２】
他の目的は、タバコ及び他の植物を改変して、寒冷ストレス耐性を高める方法を提供することである。
【００１３】
他の目的は、タバコ及び他の植物を改変して、干ばつストレス耐性を高める方法を提供することである。
【００１４】
他の目的は、タバコ及び他の植物を改変して、塩ストレス耐性を高める方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、配列番号１で示される導入イネＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡ配列を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織、植物種子及びその子孫に関する。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、組換えベクターで植物ゲノムに前記ＤＮＡ断片を形質転換して、遺伝子組換え植物を産生する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、寒冷ストレス、干ばつストレス及び塩ストレスから選択されるストレスに対する耐性が高い遺伝子組換え植物を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織及び植物種子を生成する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、イネ、トマト、タバコなどの非生物性ストレス耐性植物を生成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、いくつかのストレス状態下で誘導された、イネから得られた新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１及びそれに対応する新規タンパクの配列の同定、単離、特徴付け及び使用に関する。
【００２１】
本発明の他の態様はまた、遺伝子組換え植物系において、イネ由来のジンクフィンガー型ストレス関連タンパクをコードする、配列番号１で示される新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現させて、塩、寒冷及び干ばつストレスに対する耐性を与える方法にも関する。この方法は、構成的プロモーターの制御下の新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１による植物の形質転換を使用する。このような方法の好ましい実施形態では、形質転換のどんな方法も使用することができるが、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主細胞を、構成的プロモーターの制御下でＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号１）を含む組換えベクターで形質転換し培養する。従来技術で知られている十分確立された手順に従って、この形質転換Ａ．ツメファシエンス細胞を用いて、植物細胞を形質転換する。本明細書における教示を例示する具体例として、イネの新規ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子でタバコを形質転換することに成功したことを開示する。
【００２２】
この形質転換植物は、寒冷、干ばつ、塩などの様々な非生物性ストレスに対する高い耐性を示す。
【００２３】
本発明のさらなる態様はまた、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織及び植物種子、並びにそのような植物及び植物種子を生成する方法にも関する。
【００２４】
本発明はまた、非生物性ストレスに対する耐性を与える新規ＯＳＩＳＡＰ１  ＤＮＡでイネ、トマトなどの植物を形質転換する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
したがって、本発明は、イネから得られた新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）及びそれに対応する新規タンパクの配列（配列番号２）に関し、遺伝子組換え植物系において、イネ由来のジンクフィンガー型ストレス関連タンパクをコードする、前記新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現させて、塩、寒冷及び干ばつストレス耐性を与える方法にも関する。さらに、本発明はまた、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を含むゲノムを有する遺伝子組換え植物、植物組織及び植物種子、並びにそのような植物及び植物種子を生成する方法にも関する。
【００２６】
耐性へと至るストレス知覚及びシグナル伝達には、様々な遺伝子産物の複雑な相互作用が関与する。様々なタイプのストレス、すなわち寒冷、乾燥、塩、浸水、重金属並びに損傷の後早期に誘導されるジンクフィンガー型タンパクをコードするイネ由来新規無イントロン遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１の同定、単離、特徴付け、及び使用について本明細書で説明する。この遺伝子は、ストレスホルモンのアブシジン酸によっても誘導される。遺伝子組換えタバコ中でこの遺伝子を過剰発現させると、実生の段階で塩、寒冷及び干ばつストレスに対する耐性が得られ、このことは、緑色の実生の百分率、実生の新鮮重、発育パターン及び葉緑素含有量に反映される。したがって、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）は、植物におけるストレス応答の重要な決定因子である。
【００２７】
略語についての脚注：ＯＳＩＳＡＰ１、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）亜種であるインディカ（ｉｎｄｉｃａ）のストレス関連タンパク遺伝子；ＡＢＡ、アブシジン酸；ＷＴ、野生型；ＢＡ、ベンジルアルコール；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。
【００２８】
データ寄託についての脚注：
ＯＳＩＳＡＰ１  ｃＤＮＡを受託番号ＡＦ１４０７２２でＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託し、一方、ゲノムクローンを受託番号ＡＹ１３７５９０で寄託した。
【００２９】
本文中に現れる、種々の配列の遺伝子及び括弧内に示すその受託番号を以下に示す：
ヒトＡＷＰ１（ＮＭ０１９００６）；
マウスＡＷＰ１（ＡＪ２５１５０８）；
ＰＶＰＲ３（Ｍ７５８５６）；
ヒトＺＮＦ２１６（ＡＦ０６２３４６）；
マウスＺＮＦ２１６（ＡＦ０６２０７１）；
【００３０】
配列リスト中の配列についての簡単な記載
配列番号１  ジンクフィンガー型ストレス関連タンパクをコードするイネ由来新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１のヌクレオチド配列。
配列番号２  ＯＳＩＳＡＰ１の推定アミノ酸配列。
【００３１】
本発明は、イネから新規遺伝子及び調節エレメントを同定することを目的として始まった。最初に単離したいくつかの遺伝子から、１つの遺伝子を本研究の主な標的とした。イネから単離した新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）は、様々なストレスによって誘導され、新規ストレス関連タンパクをコードしている。
【００３２】
本発明の一実施形態では、イネの特定の器官中で、又は特定の発育段階の間で発現に差がある遺伝子を同定し単離する方法を提供する。この方向で、多面的な戦略を使用した。発現に差がある遺伝子を単離するために、リバースノーザン及びディファレンシャルスクリーニングのほかに、無作為に選択したｃＤＮＡクローンのノーザンスクリーニングを行った。実験室内で、異なる組織、すなわちイネの受粉前又は受精後の段階の花、及び７日齢の実生の根に由来する３種のｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）で構築した。根のｃＤＮＡライブラリーを低密度でＮＺＹ培地プレート上に播き、単一プラークを拾った。単一クローンを切り出した後、組換えファージクローンを、クローン化ｃＤＮＡ挿入断片を有するファージミドに転換した。ベクター骨格から挿入断片を遊離させるＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによる制限消化により、この挿入断片があることを確認した。次いで、このｃＤＮＡクローン挿入断片を放射標識プローブとして用いて、７日齢の実生の根又は苗条及び受粉前の小穂から単離した全ＲＮＡから調製したノーザンブロットにハイブリダイズさせた。標準的なプライマーで、器官特異的である、又は発現に差があることを示しているクローンの配列を決定した。ｃＤＮＡ部分配列を用いて、既知の登録配列と相同性があるかどうかＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索した。この戦略を用いて、根のｃＤＮＡライブラリーから発現に差がある３種のクローンを同定し、そのうち１つが新規ストレス関連タンパクをコードするＯＳＩＳＡＰ１であった。根及び受粉前段階の小穂で、苗条と比べて高いレベルでＯＳＩＳＡＰ１  ｍＲＮＡが検出された。本発明で、このクローンを分子レベルで詳細に特徴付けた。
【００３３】
ｃＤＮＡ配列及び推定ポリペプチドの分析
最初に、標準的なベクター特異的プライマーを用いて、ｃＤＮＡの配列決定を両端から行った。両方の鎖の配列決定を行うために、内部制限酵素部位を用いて、ｃＤＮＡをサブクローニングした。（複数の配列アラインメントを行うための）Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いてこの配列をアラインし、ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）と名付けた８４４ｂｐのアセンブリｃＤＮＡ配列が出現し（図１）、これをＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＦ１４０７２２で付託した。標準的な方法を用いて、３つすべての読み枠で、コンピュータ上で（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）ｃＤＮＡを翻訳した。メチオニンから始まる長く連続したアミノ酸配列を示したので、＋１オープンリーディングフレームを選択した。このｃＤＮＡは、１９ｂｐのポリＡ尾部を有している。ポリＡを考慮しないとき、このｃＤＮＡのＧＣ豊富度は５７．２％である。このオープンリーディングフレームは、ＵＧＡ終止コドンで終結している。このオープンリーディングフレームは、１６４アミノ酸のタンパク（配列番号２、図２）をコードし、予測分子量は１７．６ｋＤａである。ヒト及びマウスのＰＲＫ１関連タンパクＡＷＰ１（Ｄｕａｎら、２０００）、ＰＶＰＲ３（Ｓｈａｒｍａら、１９９２）、ヒト及びマウスのジンクフィンガー型タンパクＺＮＦ２１６（Ｓｃｏｔｔら、１９９８）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ユビキチン様融合タンパクＸＬＵＬＦＰ及びＡＦＵＬＦＰ（Ｌｉｎｎｅｎら、１９９３）、ホヤの後端標識（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄ  ｍａｒｋ）（ＰＥＭ６）タンパク（Ｓａｔｏｕ及びＳａｔｏｈ、１９９７）を含めて、これはいくつかのジンクフィンガー型タンパクとの相同性を示した。このすべてのタンパクは、アミノ酸１００から１６４に及ぶ、タンパクのカルボキシ末端に存在するｚｆ−ＡＮ１領域で、ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号２）との相同性を示した（図２）。
【００３４】
これは、Ｃｘ２〜４Ｃｘ９〜１２Ｃｘ２Ｃｘ４Ｃｘ２Ｈｘ５ＨｘＣ（ｘは任意のアミノ酸）の共通配列を有している。しかし、いくつかの他のアミノ酸がこのドメイン中で不変であることが判明した。保存されているシステイン及びヒスチジン残基は、単一のジンクフィンガーを形成する可能性がある。アミノ末端側には、４個のシステイン残基があり（アミノ酸２２、２６、３８、及び４１の位置、図２）、これはＯＳＩＳＡＰ１（配列番号２）、ＡＷＰ１（受託番号ＮＭ０１９００６、ＡＪ２５１５０８）及びＺＮＦ２１６（受託番号ＡＦ０６２３４６、ＡＦ０６２０７１）間で保存されている。この領域は、Ａ２０（細胞死抑制因子）様ジンクフィンガーに類似し、このジンクフィンガーはＡ２０における自己会合を媒介する（Ｄｅ  Ｖａｌｃｋら、１９９６）。ＯＳＩＳＡＰ１にはまた、ヒト転写因子ＮＦκＢのｐ６５サブユニット共通配列（Ｒｕｂｅｎら、１９９１）と長さ４０アミノ酸（５６〜９６）にわたって約５１％の同一性が認められる。この相同性は、このヒトタンパクのＣ末端側、アミノ酸３７０〜４１０に認められる。
【００３５】
ＯＳＩＳＡＰ１に類似する予測タンパクは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）やサクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）のような他の植物種で見つかっているが、その類似性は主に、保存されているジンクフィンガーによるものである。ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号２）配列は、ＰＶＰＲ３（受託番号Ｍ７５８５６）（インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）病原性関連タンパク）ジンクフィンガーと最大の相同性（７９％同一）を示した。このタンパクは、シグナル配列を含まず、おそらく可溶性細胞内タンパクである。このタンパクは、アラニン（１４．０２％）及びプロリン（１０．９８％）に富んでいる。酸性アミノ酸が１７個、塩基性アミノ酸が３４個存在し、このことにより、このタンパクは、推定ｐＩが８．６４の塩基性タンパクとなっている。このアミノ酸配列には、アミノ酸３０位に潜在的プロテインキナーゼＣリン酸化部位が、アミノ酸１３２位にＮミリストイル化部位がある（図２）。ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）は単コピー遺伝子であり、これはサザン分析によって決定した。
【００３６】
イネゲノムＤＮＡライブラリー
ゲノムクローンを単離して、ゲノムレベルでの構造を解明し、ＯＳＩＳＡＰ１の調節領域を特徴付けるために、イネゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。暗所で生育するイネ（Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ  １種）から単離した高分子量（約１００ｋｂ）のゲノムＤＮＡをλＤＡＳＨＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いたゲノムＤＮＡライブラリー調製に使用した。ゲノムＤＮＡ１μｇ、及び様々な濃度の４塩基認識切断型の制限酵素ＭｂｏＩでパイロット制限消化を行うと、３０分間で所望の消化量が得られた。２３〜９ｋｂの範囲でゲノムＤＮＡの最大のスメアが得られ、ＤＮＡの約３０％が非消化型である酵素濃度（０．２５Ｕ／μｌのＭｂｏＩを０．７５μｌ）を選択した。反応の規模を拡大して、大規模な制限消化を行った。ＤＮＡ約１００μｇを２５分間消化し、次いでこのＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出で精製した。消化ＤＮＡのアリコートを非消化ＤＮＡとともにアガロースゲルで分離した。λＤＡＳＨＩＩベクターとの連結に最も適した分画（９〜２３ｋｂ）を得るために、消化ＤＮＡを用いてショ糖密度勾配超遠心を行った。サイズ分画後、ＣＩＡＰ処理し精製したＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分離し、サイズが９〜２３ｋｂのＤＮＡを連結用に選択し精製した。ベクターと連結し、ファージ粒子にパッケージングした後、１次ライブラリーの力価を決定した。１次ライブラリーは、＞５×１０５ｐｆｕであることが分かった。次いで、無作為に選択したいくつかのファージクローンをＥｃｏＲＩで消化することにより、このライブラリーの平均挿入断片サイズを決定した。平均挿入断片サイズは、約１７ｋｂと算出された。
【００３７】
ＯＳＩＳＡＰ１ゲノムクローンの単離
ＯＳＩＳＡＰ１ゲノムクローンを単離するために、ＯＳＩＳＡＰ１の完全長ｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いて、λＤＡＳＨＩＩで調製したゲノムライブラリーをスクリーニングした。初回のスクリーニングで陽性クローンが２個得られた。さらに２回スクリーニングして、これを精製した。３回目でプレートに播いたプラークすべてからシグナルが得られたことから、これらが陽性であり均質であることが示唆された。
【００３８】
ゲノムクローンのサブクローニング及び配列決定
サザンハイブリダイゼーションで陽性シグナルが得られた（ＳＡＰｇ３Ｅ６と名付けた）約６．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）にクローン化し、この組換えクローンをｐＢＳＳＡＰｇ３Ｅ６と名付けた。ＯＳＩＳＡＰ１完全長ｃＤＮＡを、組換えλクローン中のＤＮＡ断片を同定するプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行うと、２．９ｋｂのＰｓｔ１断片がこのｃＤＮＡクローンとハイブリダイズすることが示された。標準的な手順を用いて、この２．９ｋｂの断片をサブクローニングし配列を決定した。その配列分析から、読み枠が中断されない、すなわちイントロンを含まないことが示唆された。複数の配列アラインメントを行うためのＣＬＵＳＴＡＬ法を用いてこの配列をアラインし、これをＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＹ１３７５９０で付託した。
【００３９】
ＯＳＩＳＡＰ１は単コピー遺伝子であり、これはサザン分析によって決定した。しかし、北京大学のゲノム学生体情報学センター（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を拠点とするインディカ米のデータベースを、ＯＳＩＳＡＰ１のコード領域で検索すると、２種のコンティグがＯＳＩＳＡＰ１とかなり相同性の高い配列を有していることが分かった。コンティグ４６６３６は、ヌクレオチドレベルで９７％の相同性を示し、このことは、これが本質的に同じ遺伝子であることを表している。その一方で、コンティグ１０３２５はヌクレオチドレベルで５９％の相同性を、推定アミノ酸レベルで６４％の相同性を示す。サザンハイブリダイゼーションで用いた厳密さの下では検出されなかった類似遺伝子を、Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ  １も有するかどうかは、依然として分かっていない。ＯＳＩＳＡＰ１のゲノムクローンのコード領域は連続的であり、イントロンを含まない。転写開始部位は、ＡＴＧの１２６ｂｐ上流のＧヌクレオチドに位置付けられた。転写開始部位の上流のゲノム領域をコンピュータ上で分析すると、ＣＲＴ／ＤＲＥ、ＡＢＲＥ、ＨＳＥ、損傷応答性エレメント、ＧＴボックス、エチレン応答性エレメントやＧＣモチーフのようなストレス応答性遺伝子発現に関与するいくつかのシス作用性エレメントが同定された（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗら、１９９９；Ｚｈｕら、２００２；Ｌｅｓｃｏｔら、２００２）。
【００４０】
ＯＳＩＳＡＰ１は発育段階で制御されている。ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子は、発現に差がある器官特異的遺伝子のスクリーニング中に実際に同定された。これは、成熟植物の幹、穂軸、及び受粉前の小穂で発現レベルが高いことが判明した。この発現レベルは、受精後の小穂で低かった。若齢植物の根は、成熟植物より転写物量が多かった。しかし、この遺伝子の転写物の量は、成熟植物の葉でより多かった。
【００４１】
ＯＳＩＳＡＰ１のストレス誘導発現。ＯＳＩＳＡＰ１は、いくつかの非生物性ストレス下で誘導される。転写物レベルは、実生の寒冷処理後１時間以内に非常に高いレベルまで増大した（図３ａ）。このレベルは、３時間後まで増大し続け、１２時間後までほとんど変わらない状態であり続け、その後低下した。寒冷で誘導される膜の硬直化は、植物による寒冷知覚における最初の事象とみなされている（Ｏｒｖａｒら、２０００；Ｓａｎｇｗａｎら、２００１）。低温で膜が硬直化する事象は、膜流動化剤として働くベンジルアルコール（ＢＡ）によって防止することもでき、膜硬直化剤のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理することにより、室温で類似の状態を作ることもできる。ＯＳＩＳＡＰ１発現に対する膜硬直化の役割を調べる目的で、ＢＡ及びＤＭＳＯの効果を検討した。９日齢の実生の葉を様々な濃度のＢＡで処理し、低温にさらした。寒冷で誘導されたＯＳＩＳＡＰ１の蓄積は、膜硬直化抑制剤によって劇的に低下した（図３ｂ）。一方、実生を膜硬直化剤のＤＭＳＯで処理すると、室温でＯＳＩＳＡＰ１の発現がかなり増加した（図３ｂ）。しかし、ＤＭＳＯの濃度が高いと、誘導は比較的少なく、これはおそらくこの化学物質の毒性によるものと考えられた。塩ストレスの場合、転写物レベルは、早くも１５分でピークに達し、１時間後に低下した（図３ｃ）。しかし、２４時間の時点でも、ｍＲＮＡレベルは対照より高かった。類似したパターンの転写物蓄積が、乾燥ストレスでも観察された（図３ｃ）。浸水ストレスの場合、異なる誘導動態が観察された（図３ｄ）。この遺伝子は、３時間以内に強く誘導されるが、その後このｍＲＮＡレベルは対照レベルまで劇的に低下した。しかし、このｍＲＮＡレベルは１２時間で再びピークに達し、３６時間まで高い状態であり続け、その後低下を示した。この遺伝子はまた、様々な重金属にも応答することが判明した（図３ｅ）。基本的に、銅、カドミウム、マンガン又は亜鉛の塩で処理すると、転写物の量が、３時間後までかなり増加し、６時間で明らかに低下した。カルシウム及びリチウムの塩は、ｍＲＮＡレベルに対してわずかな影響しか及ぼさなかった。この遺伝子は、機械的損傷にも応答した（図３ｆ）。この遺伝子は、１μＭの低い濃度でＡＢＡに応答した（図３ｇ）。ＯＳＩＳＡＰ１の発現は、１μＭのＡＢＡで実生を処理してから３０分後にピークに達した。しかし、ＡＢＡの濃度を増加させると、この転写物レベルが定常状態のまま長時間維持された。
【００４２】
生殖質特異的発現
生殖質特異的な形で、様々な非生物性ストレスに対するＯＳＩＳＡＰ１の応答を調べるために、様々な非生物性ストレスに耐性の又は感受性の系統を得た。干ばつに耐性の品種Ｔｕｌａｓｉ、干ばつ感受性のＴｒｉｇｕｎａ、塩に感受性のＪａｙａ、及び塩に耐性のＶｉｋａｓをこの研究に用いた。Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ  １は、感受性対照として維持した。実生の段階で、塩又は乾燥ストレスにこれらをさらした。評価した２つのストレスのどちらかを与えた後のＯＳＩＳＡＰ１転写物誘導レベルとこの品種（ｃｕｌｔｉｖａｒ／ｖａｒｉｅｔｙ）の耐性の間に有意な相関は引き出せなかった。しかし、評価したイネの生殖質すべてがＯＳＩＳＡＰ１を有し、この遺伝子がこのすべての場合で干ばつ及び塩ストレスの後誘導されることが判明した。
【００４３】
ｐＢＩ１２１におけるＯＳＩＳＡＰ１のクローン化及びタバコの形質転換
ＯＳＩＳＡＰ１がいくつかのストレスで誘導されるので、これを使用して、モデル植物のタバコを形質転換してこの新規遺伝子の機能分析を行った。イネ新規遺伝子であるＯＳＩＳＡＰ１遺伝子をタバコ中で過剰発現させるため、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）にそのｃＤＮＡをクローン化した。このベクターは、ｇｕｓ遺伝子の発現を促進するＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを有している。ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡをクローン化するために、ｇｕｓ遺伝子を置き換えた。最初に、ｇｕｓの３’で切断するＳａｃＩでこのベクターを消化した。４種のｄＮＴＰすべての存在下で、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡの両端を平滑化した。次いで、ＢａｍＨＩでこのベクターを切断した。これにより、ベクター骨格からｇｕｓ遺伝子を遊離させた。ゲル抽出により、このベクターを精製した。一方、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを有するｐＢＫ−ＣＭＶを最初にＸｂａＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び４種すべてのｄＮＴＰで末端を埋め、次いでＢａｍＨＩで消化した。これにより、３’が平滑末端であり、５’末端がＢａｍＨＩ部位であるｃＤＮＡを遊離させた。この断片を、適合する末端を有するｐＢＩ１２１と連結させた。得られたベクターｐＢＩＳＡＰｃは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを有し、このプロモーターは、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡ発現を促進する。選択マーカーｎｐｔＩＩは、ｎｏｓプロモーターで発現が促進される。ＥｃｏＲＩで制限消化すると、ｃＤＮＡがｎｏｓの終結配列とともに遊離し、一方、ＢａｍＨＩで消化すると、この組換えクローンは直鎖化され、このことは、その部位がクローン化後に回復したことを示すものである。植物形質転換ベクターの構築物全体の図を図４に示す。
【００４４】
次いで、化学的形質転換により、この構築物をアグロバクテリウムに動員した。プラスミド単離及び制限消化により、この構築物が存在するかどうかを検出した。アグロバクテリウム中のこの構築物をタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、品種Ｘａｎｔｈｉ）に動員した。２００ｍｇ／ｌのカナマイシン存在下での再生苗条を、同じ濃度のカナマイシンを含む発根用培地に移した。根の発育後、植物を鉢に移し、培養室で維持した。
【００４５】
遺伝子組換え系統の確認及び導入遺伝子の発現
最初に、推定される形質転換体に対してｎｐｔＩＩアッセイを行って、使用した選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩの全タンパク中における活性を検出した。確認した遺伝子組換えタバコ及び非形質転換タバコを、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。８種の遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ１、ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ３８、ＳＡＰｃＬ２２、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ４４及びＳＡＰｃＬ４３）が、ｎｐｔＩＩの活性を示した。
【００４６】
また、サザン分析により、この系統に導入遺伝子が存在することを確認した（図５）。推定される形質転換体から単離したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。ｐＢＩＳＡＰｃ中で、ｃＤＮＡの５’末端及びｎｏｓ終結配列の３’末端に、この酵素の切断部位がある。ＥｃｏＲＩで消化した後、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡとｎｏｓ終結配列に相当する約１ｋｂの断片が遊離する。約１ｋｂの予想サイズに対応するバンドが、陽性対照のプラスミド並びに遺伝子組換え系統で検出された（図５に矢印で示す）が、非形質転換対照及びＳＡＰｃＬ３５では検出されず、このことからこれらにｎｐｔＩＩ活性がないことが示された。
【００４７】
選択した５種の系統にノーザン分析を行って、導入遺伝子の発現レベルを決定した（図６）。葉からＲＮＡを抽出し、放射標識プローブである全長ＯＳＩＳＡＰ１とハイブリダイズさせた。野生型タバコ由来のＲＮＡがＯＳＩＳＡＰ１プローブとハイブリダイズしなかったことにも留意されたい。
【００４８】
ＯＳＩＳＡＰ１を有する遺伝子組換えタバコ実生の寒冷、塩及び干ばつストレス耐性。ｐＢＩＳＡＰｃを有し、ＯＳＩＳＡＰ１を構成的に発現する５種の独立した遺伝子組換えタバコ系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２、ＳＡＰｃＬ９及びＳＡＰｃＬ４３）を、Ｔ１世代で塩耐性が生じるかどうか分析した。ストレス耐性の分析のため、この遺伝子組換え系統は、培地中に選択剤を入れずに発育させた。導入遺伝子を有さないカナマイシン感受性（分離世代（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）、非遺伝子組換え系統）実生の寄与については、ストレス耐性を評価する各系統で分析した実生の合計数から除外した。
【００４９】
また、ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子を有する５種の遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２、ＳＡＰｃＬ９及びＳＡＰｃＬ４３）を、Ｔ１世代で寒冷耐性が生じるかどうか分析した。表現型上、遺伝子組換え実生は、ストレスの後でより健常であった（図７ａ、ｂ）。遺伝子組換え実生の場合、３枚目又は４枚目の葉がすでに現れたが、ＷＴの場合、最初の２枚の葉しか認めることができなかった（図７ｂ）。回復１５日後の実生の新鮮重を測定すると、ストレスをかけなかった実生と比べて、ストレスをかけた遺伝子組換え実生の新鮮重の増加は６７〜９２％であったが、ＷＴの新鮮中の増加はわずか３５％であったことが明らかとなった（図７ａ）。さらに、遺伝子組換え実生の新鮮重は、低温でＷＴの実生より常に良好であった。
【００５０】
ＯＳＩＳＡＰ１過剰発現系統を干ばつストレス耐性について評価すると、８日間にわたって、ＷＴの発芽の百分率が遺伝子組換え系統と比べて非常に低かったことが明らかとなった。０．３Ｍのマンニトールにさらしてから８日目に、ＷＴでは６０％しか発芽しなかったが、２２系統以外のすべての遺伝子組換え系統では９０％以上の発芽が認められ、２２系統は発芽率６９％を示した。０．４Ｍのマンニトールに対する発芽の場合、ＷＴでは４１％しか発芽が認められなかったが、遺伝子組換え系統は発芽率６９〜９２％を示した。また、ストレスをかけた遺伝子組換え系統の新鮮重は、ＷＴと比べて非常に良好であり、このことは量的な推定にも質的にも反映されていた（図８ａ、ｂ）。
【００５１】
遺伝子組換えタバコの塩耐性に対するＯＳＩＳＡＰ１過剰発現の効果を判定するため、遺伝子組換え実生及び非形質転換（ＷＴ）実生を、材料及び方法に記載の通りに発育させた。ストレスにさらした日では、野生型（ＷＴ）と遺伝子組換え実生の新鮮重に有意差は認められなかった（表１）。移動させてから４時間後、白化はＷＴでも遺伝子組換え系統でも始まったが、これは遺伝子組換え植物で非常に少なく、ストレス後この植物はより多くの葉緑素を保持し、したがって緑色を維持していた（図９）。ストレス下での遺伝子組換え系統由来実生の新鮮重増加が非常に有意に改善したことが認められた。回復８日後、ストレスをかけたＷＴ植物の新鮮重は、ストレスをかけていない植物のレベルまで回復したが、その葉緑素の含有量は低いままであった。遺伝子組換え実生の概観は、ストレス回復から８日後でＷＴよりはるかに良好であり、これは植物生長をより早く再開した（図９ａ、ｂ）。
【００５２】
様々なストレスに対する形質転換植物の分析は、寒冷、干ばつ、塩ストレスなど様々なストレス条件下で、形質転換植物が非形質転換対照と比べて良好な生長及び生存率を示すことを明らかに示すものである。
【００５３】
植物の分子生物学についての研究、並びに代謝経路の変化及びストレスに関する遺伝子操作を、タバコやシロイヌナズナなどのモデル植物で試験し、次いで他の重要な作物でも同様の表現型が生じることが示された数多くの例が存在する。本発明者らは、寒冷、干ばつ及び塩ストレスに対する高い耐性を与える新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１でイネ及びトマトを形質転換した（Ｍｏｈａｎｔｙら、１９９９及びＪａｎｉら、２００２）。その結果は、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）が、非形質転換対照と比べて高いストレス耐性及び生長上の利点を与えることを示している。
【００５４】
様々な非生物性ストレスにさらした後、多数の遺伝子が誘導される（Ｓｅｋｉら、２００１）。この遺伝子は、植物にストレス耐性を与えるように様々な方法で機能する（Ｉｎｇｒａｍ及びＢａｒｔｅｌｓ、１９９６；Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、１９９９；Ｈａｓｅｇａｗａら、２０００ｂ；Ｚｈｕ、２００２）。この遺伝子の発現パターンは、そのシステムの必要によって左右される。すなわち、ストレス応答初期の間に必要な遺伝子は、ストレス後すぐに誘導されるが、恒常期及び回復期の間に必要なものは遅く誘導される。Ｋａｗａｓａｋｉら（２００１）は、対照的なイネの品種のＰｏｋｋａｌｉ（塩耐性）とＩＲ２４（塩感受性）で、塩ストレス後の遺伝子発現プロフィルを比較した。塩に対する応答を、即時（１５分以内）、初期（１時間）、初期回復期（３〜６時間）、及びストレス補償期（２４時間以降）に分け、各区分に上方制御遺伝子又は下方制御遺伝子が８〜１０種あった。ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子（配列番号１）はストレスにさらされてから１５分以内に高レベルに誘導されるので、この状況では、ＯＳＩＳＡＰ１は即時応答の区分に入る。そのタンパク産物（配列番号２）は、ストレス後非常に初期に必要となる可能性がある。このような早い遺伝子発現誘導は、乾燥及び塩によるＲＤ２９の誘導（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ及びＳｈｉｎｏｚａｋｉ、１９９３、１９９４）、乾燥によるＣＯＲ４７及びＥＲＤ１０の誘導（Ｗｅｌｉｎら、１９９４；Ｋｉｙｏｓｕｅら、１９９４）、ＯＳＬＥＡ３の場合の塩による誘導（Ｍｏｏｎｓら、１９９７）、並びに乾燥、塩又はＡＢＡによるＲＤ２２の誘導（Ａｂｅら、１９９７）でも観察されている。ＯＳＩＳＡＰ１タンパク（配列番号２）は、哺乳動物タンパクＡ２０（Ｏｐｉｐａｒｉら、１９９０）と相同性がある。Ａ２０のジンクフィンガードメインは、二量体化に必要であり（Ｄｅ  Ｖａｌｃｋら、１９９６）、ＮＦ−κＢが媒介する遺伝子発現を阻害することにより、ＴＮＦが誘導するアポトーシスを阻害する（Ｃｏｏｐｅｒら、１９９６；Ｈｅｙｎｉｎｃｋら、１９９９ａ、ｂ；Ｂｅｙａｅｒｔら、２０００；Ｌａｄｅｍａｎｎら、２００１）。Ａ２０タンパクのジンクフィンガードメインは、その阻害活性を発揮するのに十分であり、他の細胞タンパクとの結合とは無関係であることが判明した（Ｄｅ  Ｖａｌｃｋら、１９９７；Ｌａｄｅｍａｎｎら、２００１）。培養細胞中でのＡ２０の過剰発現で、又はＡ２０のＣ末端のジンクフィンガードメインの過剰発現でも、ＮＦ−κＢの活性が下方制御されることも示されている（Ｓｏｎｇら、１９９６；Ｅｖａｎｓら、２００１）。高塩度のストレスにより、細胞分裂の阻害及び細胞死の促進が生じ（Ｈａｓｅｇａｗａら、２０００）、一方、冷却ストレスにより、萎凋、組織の白化及び電解質漏出が生じる（Ｔｏｋｕｈｉｓａ及びＢｒｏｗｓｅ、１９９９）。このすべてによって、最終的には細胞死が生じるはずである。
【００５５】
ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子の過剰発現は、遺伝子組換え植物の白化及び細胞死を回避する助けとなり得る。ストレスを受けたこの植物は、ストレスに関係する損傷がより軽度であり、より速やかに回復することができる。したがって、２つのシステムが異なり、その２つの間に共通するのはジンクフィンガーモチーフだけであるが、ＯＳＩＳＡＰ１及びＡ２０は、過剰発現させると同様の効果がある。タンパクＯＳＩＳＡＰ１はまた、その第２のＣ末端ジンクフィンガードメインがＡＮ−１型のジンクフィンガータンパクと高い相同性を示す。このタンパクであるＰＥＭ６、ＺＮＦ２１６、ＸＬＵＬＦＰ及びＰＶＰＲ３は、その機能が明確ではない。いくつかの親水性ポリペプチドが、寒冷に順応する間に誘導され、煮沸後でも可溶性のままである（Ｈｕｇｈｅｓ及びＤｕｎｎ、１９９６；Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、１９９８）。このポリペプチドは、凍結に関係する脱水の有害な作用を緩和することにより、凍結耐性に寄与すると推測されている。塩ストレス並びに寒冷ストレスも、細胞レベルで脱水を引き起こす（Ｈａｓｅｇａｗａら、２０００）。ＯＳＩＳＡＰ１タンパクは親水性であり、この性質も、遺伝子組換え植物の塩及び寒冷耐性の増大に寄与している可能性がある。本研究で示したように、他のいくつかの遺伝子の過剰発現が実生にストレス耐性をもたらすことが以前から分かっている（Ｐｒａｎｄｌら、１９９８；Ｓａｉｊｏら、２０００；Ｋｉｍ  ＣＫら、２００１；Ｐｉａｏら、２００１；Ｓｕｎら、２００１；Ｔａｍｍｉｎｅｎら、２００１）。
【００５６】
最後に、本発明により、イネ由来の新規ジンクフィンガー型タンパクの遺伝子が同定され、特徴付けられ、他の作物にストレス耐性を作り出すのに使用することができる、塩、干ばつ及び寒冷耐性の新規決定因子が解明された。このタンパクが他のストレスでも機能する可能性があり、これはその発現が誘導されることによって示されることも見落とさなかった。
【００５７】
以下の実施例は、例示の目的だけで記載するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきでない。
【実施例】
【００５８】
植物材料及び処理
以前の記載の通りに（Ｇｒｏｖｅｒら、１９９９）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、インディカ亜種、Ｐｕｓａ  Ｂａｓｍａｔｉ  １種）種子を処理し、栽培した。栽培７日後、水に浸した綿を含む１００ｍｌビーカーに実生を移し、一方他の処理では、所望の溶質を含む水を使用した。塩化ナトリウムを終濃度２００μＭになるまで加えた。ＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯ中に溶解させて、１０ｍＭのストックを作成し、これをさらに水で希釈した。約１ｃｍ間隔で葉端に切れ込みを入れて、実生に損傷を与えた。寒冷ショックでは、実生を５±１℃で維持した。ティッシュペーパー上で植物を乾燥させ、乾燥したティッシュペーパー中にこれをラップで包んだ状態を所望の時間維持することによって乾燥刺激を行った。１００ｍｌビーカーで栽培中の実生を２Ｌガラスビーカー中の水に浸水させ、その状態を維持した。５、１０及び１５ｍＭのベンジルアルコール（ＢＡ）で、９日齢の実生の切れ込みを入れた葉を２５℃で３時間処理し、次いでこの処理を５±１℃で４８時間継続した（Ｓａｎｇｗａｎら、２００１）。ＤＭＳＯによる処理では、実生の切れ込みを入れた葉を２、４及び６％のＤＭＳＯの存在下で２５℃で維持した。
【００５９】
ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子のクローン化及び配列分析
７日齢イネ実生の根由来のｃＤＮＡライブラリーを、λＺＡＰ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）で調製した。このライブラリーから無作為にクローンを選択し、製造業者の説明書の通りに、単一クローンを切り出して組換えｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクターを得た。このクローンを放射標識プローブとして用いて、イネ植物の様々な部分から単離した全ＲＮＡとハイブリダイズさせた。様々な器官で発現に差があるいくつかのクローンを同定し、さらに特徴付けた。
【００６０】
標準的なプライマーを用いて、そのうちの１つであるＯＳＩＳＡＰ１の配列を両端から決定した。完全長配列を得るために、ＳａｃＩ又はＰｓｔＩでｃＤＮＡを消化し、これを再び連結させ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にサブクローニングした。標準的なプライマーを用い、標準的な方法を用いて、サブクローンの配列を決定した。
【００６１】
ＯＳＩＳＡＰ１ゲノムクローンを単離するために、ＭｂｏＩで消化したゲノムＤＮＡを用いて、イネゲノムＤＮＡライブラリーをλＤＡＳＨＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）で調製した。そのｃＤＮＡを使用して放射活性プローブを作成し、このライブラリーをスクリーニングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。陽性プラークを３回スクリーニングして精製し、この遺伝子を含む、組換えファージクローン由来の５．５ｋｂのサブクローン断片の配列を決定した。翻訳開始部位を含むように設計されたプライマーを使用したプライマー伸長法による分析で、転写開始部位を決定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【００６２】
プラスミドＤＮＡの単離、制限消化、ＤＮＡの連結、ＰＣＲ、アガロースゲル及びアクリルアミドゲル電気泳動、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換及び培養、並びに種々のＤＮＡ断片の配列決定は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載の標準的な手順に従って実施した。ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡ（配列番号１）は、８４４ｂｐであり、１９ｂｐのポリＡ尾部を含み、予測分子量が１７．６ｋＤａである１６４アミノ酸（配列番号２）のタンパクをコードしている。
【００６３】
ＲＮＡブロット分析
Ｌｏｇｅｍａｎｎら（１９８７）による方法を少し改変して、ＲＮＡ抽出を行った。全ＲＮＡ２０μｇを用いて、Ｇｒｏｖｅｒら（１９９９）に従ってノーザン分析を実施したα−３２Ｐ  ｄＡＴＰで標識したＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡをプローブとして用いた。オートラジオグラフィーによって、ハイブリダイゼーションを検出した。同一サンプルに由来する、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡのバンドを、全ＲＮＡの量及び質に関する対照として使用した。
【００６４】
植物での構成的発現のための植物形質転換ベクターの構築
イネＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）をタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、品種Ｘａｎｔｈｉ）で過剰発現させるため、ｇｕｓ遺伝子と置き換えることで、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）にそのｃＤＮＡをクローン化した。最初に、ｇｕｓの３’で切断するＳａｃＩでこのベクターを消化した。４種のｄＮＴＰすべての存在下で、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡの両端を平滑化した。次いでこのベクターをＢａｍＨＩで切断して、ベクター骨格からｇｕｓ遺伝子を遊離させた。ゲル抽出により、このベクターを精製した。一方、ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）のｃＤＮＡを有するｐＢＫ−ＣＭＶを最初にＸｂａＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び４種すべてのｄＮＴＰでそのＤＮＡの末端を埋め、次いでＢａｍＨＩで消化した。これにより、３’が平滑末端であり、５’末端がＢａｍＨＩ部位であるｃＤＮＡを遊離させた。この断片を、適合する末端を有するｐＢＩ１２１と連結させた。得られたベクターｐＢＩＳＡＰｃは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを有し、このプロモーターは、ＯＳＩＳＡＰ１遺伝子（配列番号１）の発現を促進するが、このベクターを図４に示す。この植物選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子であった。次いで、化学的形質転換により、この構築物をアグロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に動員した。
【００６５】
植物の形質転換
標準的なプロトコルの通りに（Ｇｅｌｖｉｎら、１９９４）、アグロバクテリウムが媒介する、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、品種Ｘａｎｔｈｉ）の形質転換を実施した。２００ｍｇ／ｌのカナマイシン存在下での再生苗条を、同じ濃度のカナマイシンを含む発根用培地に移した。根の発育後、植物を鉢に移し、培養室で維持した。最初に、推定される形質転換体に対してｎｐｔＩＩアッセイを行って、使用した選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩの全タンパク中における活性を検出した。様々な系統で導入遺伝子が組み込まれ、発現していることを、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いて、それぞれサザン分析（図５）及びノーザン分析（図６）によって確認した。サザン分析及びノーザン分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載の標準的な手順に従って実施した。ＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現している遺伝子組換え系統を、Ｔ２世代まで繁殖させた。
【００６６】
同様に、新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１を用いたイネの形質転換を、標準的なプロトコルを用いて実施した。標準的なプロトコルを用いて、この遺伝子を過剰発現しているトマト植物を得た。
【００６７】
塩、寒冷及び干ばつストレス耐性に関する遺伝子組換え系統の分析
層流フード下で、微小遠心管内で絶えず撹拌しながら、野生型及び遺伝子組換えタバコのＴ１の種子の表面を７０％エタノールで３０秒間滅菌した。この処理の後、ピペットを用いてエタノールを除去した。この種子をＴｗｅｅｎ  ２０を１滴含む２％（体積／体積）次亜塩素酸ナトリウム溶液に沈め、微小遠心管を軽くたたいてときどき撹拌しながら５分間置き、続いてオートクレーブしたＭｉｌｌｉ−Ｑ水で少なくとも６回洗浄した。ショ糖及び有機成分を含まない、半分の濃度のＭＳ培地（ＭＳＨ）で、１６時間／８時間の明／暗周期で２５±１℃に維持した培養室内で１６日間実生を栽培し、各ラックを白色蛍光管（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｃｈａｍｐｉｏｎ、４０Ｗ／５４）３本、及び黄色蛍光管（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｔｒｕｌｉｇｈｔ、３６Ｗ／８２）１本から供給される光（５０〜１００μモルｍ−２秒−１）で照らした。１６日齢の実生を新鮮なＭＳＨに移し、ストレス処理を与えるまでさらに５日間栽培した。
【００６８】
塩ストレスでは、２５０ｍＭのＮａＣｌの、ショ糖を含まない半分濃度ＭＳ溶液に浸した８層のティッシュペーパー上に、実生を無菌的に移した。蒸発を防ぐために、このペトリ皿を密封した。上記で示した培養室条件下でこれを４日間栽培した。続いて、滅菌ティッシュペーパーを過剰の水で浸した滅菌蒸留水中でこれを簡単に洗浄し、ショ糖を含まない半分濃度ＭＳ培地にこれを戻した。回復のための培養室条件下で、これを栽培した。ＷＴ（非形質転換対照）及び遺伝子組換え系統の緑色の実生の百分率及び新鮮重を、塩ストレスから８日後に測定した。
【００６９】
寒冷処理では、８±１℃に維持した寒冷チャンバーに２１日齢の実生が入っているペトリ皿を移し、１５日間置いた。次いで、回復のための培養室条件にこの皿を戻した。ＷＴ（非形質転換対照）及び遺伝子組換え系統の新鮮重を、寒冷ストレス後１５日間回復させた後に測定した。実験はすべて２回より多く反復し、２回の実験のデータをその差とともに示す。
【００７０】
干ばつストレスでは、種子を０．３Ｍ及び０．４Ｍのマンニトールで発芽させ、８日間にわたって観察記録を行った。ＷＴ（非形質転換対照）及び遺伝子組換え系統の相対的新鮮重増加を、０．３Ｍ及び０．４Ｍのマンニトールで発芽させてから８日後に測定した。
【００７１】
参考文献
0005253710.tif 000002
0005253710.tif 000003
0005253710.tif 000004
0005253710.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】イネ由来の新規遺伝子ＯＳＩＳＡＰ１（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）及び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。終止コドンには、星印を付けている。Ａ２０型ジンクフィンガーの形成に関与する、このタンパクのＮ末端で保存されているシステイン残基、並びにＡＮ−１型ジンクフィンガーのＣ末端のシステイン及びヒスチジン残基を太字体で示す。推定Ｎミリストイル化及びＰＫＣリン酸化部位を下線で示す。
【図３ａ】イネ実生に寒冷ストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｂ】イネ実生に膜流動性の化学修飾物質によるストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｃ】イネ実生に塩及び乾燥ストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｄ】イネ実生に浸水ストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｅ】イネ実生に重金属によるストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｆ】イネ実生に機械的損傷によるストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図３ｇ】イネ実生にアブシジン酸（ＡＢＡ）によるストレスをかけた後のＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現パターンを示す図である。すべての場合のノーザンハイブリダイゼーションで、ＯＳＩＳＡＰ１のｃＤＮＡを放射標識プローブとして用いた。泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すため、下段のパネルで、エチジウムブロマイド染色したｒＲＮＡを示す。
【図４】１．８７ｋｂのｇｕｓ断片を置き換えて構築物ｐＢＩＳＰＡｃを生成することにより、ベクターｐＢＩ１２１にクローン化されたＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡを示す図である。構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用して、ＯＳＩＳＡＰ１のＤＮＡの発現を促進させた。この構築物はまた、植物の選択に使用したｎｐｔＩＩ断片をも含む。これは、植物組換えベクターｐＢＩＳＰＡｃの概略図であり、正しい縮尺を示すものではない。
【図５】推定される形質転換体のサザン分析を示す図である。  野生型及び推定される形質転換体由来のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、１．２％アガロースゲルで分離した（左側のパネル）。ＯＳＩＳＡＰ１の放射標識完全長ＤＮＡでサザンハイブリダイゼーションを行った後、オートラジオグラムを得た。ＵＴ及びＵＤで示したレーンは、非形質転換野生型及び非消化ＤＮＡをそれぞれ表している。ＥｃｏＲＩで消化したｐＢＩＳＡＰｃ２５ｎｇを陽性対照として使用した。矢印は、予想したサイズ（約１ｋｂ）のハイブリダイズした断片を示している。
【図６】ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現する、様々な遺伝子組換えタバコ系統でのＯＳＩＳＡＰ１の発現レベルの決定を表す図である。様々な遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）由来の全ＲＮＡ１０μｇを用いて、ノーザン分析を行った。ＵＴは、非形質転換タバコ対照である。下段のパネルは、泳動量及びＲＮＡの質が同じであることを示すためのリボゾームＲＮＡの顕著なバンドを示す。
【図７ａ】野生型（ＷＴ）及びＯＳＩＳＡＰ１過剰発現遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）由来のタバコ実生に対する寒冷ストレスの影響を示す図である。２１日齢の実生を８±１℃で１５日間栽培し、培養室条件に移した。寒冷ストレスから回復させてから１５日後に、寒冷ストレスをかけた実生の新鮮重を記録した。ストレスをかけなかった同齢の実生の新鮮重も記録し、これを対照とした。各バーの上部に２回の実験の絶対差を示す。
【図７ｂ】野生型（ＷＴ）及びＯＳＩＳＡＰ１過剰発現遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）由来のタバコ実生に対する寒冷ストレスの影響を示す図である。２１日齢の非形質転換型（ＷＴ）及びＯＳＩＳＡＰ１過剰発現系統の実生を８±１℃で１５日間寒冷ストレスをかけ、次いで回復用のＭＳＨに戻した。回復させてから１５日後、ＷＴ及び５種の遺伝子組換え系統の代表的な実生の写真を撮影した。
【図８ａ】野生型（ＷＴ）及びＯＳＩＳＡＰ１過剰発現遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）由来のタバコ実生に対する脱水ストレスの影響を示す図である。０．３Ｍ又は０．４Ｍのマンニトールで発芽させた８日齢の実生の相対的な新鮮重を示す。新鮮重は、ストレスをかけなかった実生の新鮮重と比較して示す。２回の実験の絶対差を示す。
【図８ｂ】野生型（ＷＴ）及びＯＳＩＳＡＰ１過剰発現遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）由来のタバコ実生に対する脱水ストレスの影響を示す図である。０．３Ｍ（上段のパネル）及び０．４Ｍ（下段のパネル）のマンニトールで発芽させてから８日後に撮影した、ＷＴ及び５種の遺伝子組換え系統の代表的な実生を示す。
【図９ａ】野生型（ＷＴ）、及びＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現する遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）のＴ１子孫由来のタバコ実生に対する塩ストレスの影響を示す図である。２１日齢の実生を２５０ｍＭのＮａＣｌ中で４日間塩ストレスをかけ、次いで回復用のＭＳＨに戻した。回復させてから８日後、緑色を保持しているＷＴ及び遺伝子組換え系統の実生をカウントした。各バーの上部に２回の実験の絶対差を示す。
【図９ｂ】野生型（ＷＴ）、及びＯＳＩＳＡＰ１を過剰発現する遺伝子組換え系統（ＳＡＰｃＬ８、ＳＡＰｃＬ９、ＳＡＰｃＬ１１、ＳＡＰｃＬ２２及びＳＡＰｃＬ４３）のＴ１子孫由来のタバコ実生に対する塩ストレスの影響を示す図である。２１日齢の実生を２５０ｍＭのＮａＣｌで４日間塩ストレスをかけ、次いで回復用のＭＳＨに戻した。回復させてから８日後、ＷＴ及び５種の遺伝子組換え系統の代表的な実生の写真を撮影した。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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