(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
筋特異的チロシンキナーゼを活性化するポリペプチドをコードする以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において５０以下のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項５】
請求項１または２記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項７】
請求項１または２に記載のＤＮＡ又は該ＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含む、神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療または予防のための医薬組成物。
【請求項８】
先天性筋無力症候群の検査方法であって、
被験者の細胞からＤＮＡを抽出する抽出手順と、
抽出された前記ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された前記塩基配列を、配列番号２に記載の塩基配列と比較する比較手順と、
解読された前記塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と相違する場合、前記被験者が先天性筋無力症候群に罹患し得ると判断する手順と、を含む検査方法（ただし、医師による判断工程を含むものは除く）。
【請求項９】
先天性筋無力症候群の検査方法であって、
被験者の細胞における配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量を検出する検出手順と、
検出された前記ＤＮＡの発現量を、健常者における配列番号２記載のＤＮＡの発現量と比較する比較手順と、
検出された前記ＤＮＡの発現量が、健常者におけるＤＮＡの発現量と有意に相違する場合、前記被験者が先天性筋無力症候群に罹患し得ると判断する手順と、を含む検査方法（ただし、医師による判断工程を含むものは除く）。
【請求項１０】
配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマー、又は、請求項６記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする先天性筋無力症候群の検査薬。
【請求項１１】
神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
請求項５記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下及び非存在下において、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは筋特異的チロシンキナーゼと結合活性を有するその断片と、筋特異的チロシンキナーゼとを接触させる手順と、
前記被検物質の存在下における前記結合活性と、前記被検物質の非存在下における前記結合活性とを比較する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１３】
神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋特異的チロシンキナーゼの活性を制御するポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含むベクター、このベクターが導入された形質転換体、ＤＮＡによりコードされるポリペプチド、このポリペプチドに結合する抗体、ＤＮＡが欠損又は変異された非ヒト形質転換動物、ＤＮＡ及び／又はポリペプチドを含む医薬組成物、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）の検査方法及び検査薬、神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動神経末端と筋が接合してなる神経筋接合部位（以下、「ＮＭＪ」とも称する）は、運動神経による、例えば神経伝達物質アセチルコリンを介した骨格筋の制御に不可欠なシナプスである。骨格筋の制御が適切に行われるためには、神経筋接合部位のシナプス後領域において、アセチルコリン受容体（以下、「ＡＣｈＲ」とも称する）が密集してなる高密度部位（以下、「クラスター」とも称する）が形成される必要がある。アセチルコリン受容体の高密度部位が正常に形成されなかった場合、先天性筋無力症候群や重症筋無力症等の神経筋伝達障害が発生することが分かっている（非特許文献１、２参照）。
【０００３】
運動神経末端は、筋特異的チロシンキナーゼであるＭｕＳＫを活性化するため、糖タンパク質アグリンを分泌することが報告されている（非特許文献３参照）。そして、アグリン依存的に起こるＭｕＳＫの活性化が、アセチルコリン受容体の高密度部位を含めたシナプス後構造を形成し、維持するために不可欠であることが報告された（非特許文献４、５参照）。【０００４】
しかし、筋が神経支配を受ける前であっても、ＡＣｈＲ高密度部位は、神経及びアグリンに非依存的に、且つ、ＭｕＳＫ依存的に、筋管の終板付近に形成されることが発見された。この発見は、発達の初期段階における筋由来の機構により、ＡＣｈＲ高密度部位が形成されることを示唆する（非特許文献６〜８参照）。【０００５】
また、アセチルコリンの産生能を失うことによって、ＡＣｈＲの密集に対する神経伝達依存的な阻害作用を排除したマウスにおいては、アグリン非依存的なＮＭＪの形成が発見されている。この発見は、アグリン以外にもＭｕＳＫの活性化因子が存在することを示唆する（非特許文献９、１０参照）。【０００６】
更に、遺伝学的研究の結果、軸索の適切な成長のみならず、ＡＣｈＲ遺伝子の正常な発現、次いで起こるＡＣｈＲの密集は、ＭｕＳＫ依存的な筋由来の機構により制御されていることも示された（非特許文献７、８参照）。【０００７】
このように、神経筋伝達障害を防止するためにはＡＣｈＲの密集が不可欠であり、このＡＣｈＲの密集には、ＭｕＳＫの活性化が必須であることが分かってきた。
【非特許文献１】Ａ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌ、Ｋ．Ｏｈｎｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｓｉｎｅ著、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」、４、３３９（２００３）
【非特許文献２】Ａ．Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、９９８、３２４（２００３）
【非特許文献３】Ｄ．Ｊ．Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｃｅｌｌ」、８５、５１３（１９９６）
【非特許文献４】Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ著、「Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、１２、１３３（１９９８）
【非特許文献５】Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ著、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」、２、７９１（２００１）
【非特許文献６】Ｔ．Ｍ．ＤｅＣｈｉａｒａ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｃｅｌｌ」、８５、５０１（１９９６）
【非特許文献７】Ｗ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｎａｔｕｒｅ」、４１０、１０５７（２００１）
【非特許文献８】Ｘ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｎｅｕｒｏｎ」、３０、３９９（２００１）
【非特許文献９】Ｔ．Ｍｉｓｇｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ」、１０２、１１０８８（２００５）
【非特許文献１０】Ｗ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．著、「Ｎｅｕｒｏｎ」、４６、５６９（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＭｕＳＫが活性化する機構は、その大部分が不明である。このため、ＭｕＳＫが活性化する機構を明らかにし、ＭｕＳＫの活性を制御できるようになることが強く望まれている。【０００９】
本発明は、ＭｕＳＫの活性を制御できるポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含むベクター、このベクターが導入された形質転換体、ＤＮＡによりコードされるポリペプチド、このポリペプチドに結合する抗体、ＤＮＡが欠損又は変異された非ヒト形質転換動物、ＤＮＡ及び／又はポリペプチドを含む医薬組成物、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）の検査方法及び検査薬、神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、様々な細胞活動（成長、生存、移動、分化等）を制御するＤｏｋファミリータンパク質（細胞内情報伝達タンパク質の一種）に属する新規なポリペプチド（以下、「Ｄｏｋ−７タンパク質」とも称する）を発見した。そして、Ｄｏｋ−７タンパク質が筋組織において高発現し、ＭｕＳＫの活性化に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は、具体的には、以下のようなものを提供する。【００１２】
（１）  筋特異的チロシンキナーゼの活性を制御するポリペプチドをコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号２記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ【００１３】
（２）  （１）記載のＤＮＡを含むベクター。【００１４】
（３）  （２）記載のベクターが導入された形質転換体。【００１５】
（４）  （１）記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。【００１６】
（５）  （３）記載の形質転換体を培養し、この形質転換体又はその培養液から合成されたポリペプチドを回収する手順を含む（４）記載のポリペプチドの製造方法。【００１７】
（６）  （４）記載のポリペプチドに結合する抗体又は抗体フラグメント。【００１８】
（７）  配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの少なくとも一部が欠損又は変異された非ヒト形質転換動物。【００１９】
（８）  （１）記載のＤＮＡ又は（４）記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。【００２０】
（９）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の検査方法であって、
被験者の細胞からＤＮＡを抽出する抽出手順と、
抽出された前記ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された前記塩基配列を、配列番号２に記載の塩基配列と比較する比較手順と、を含む検査方法。【００２１】
（１０）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の検査方法であって、
被験者の細胞における配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量を検出する検出手順と、
検出された前記ＤＮＡの発現量を、健常者における配列番号２記載のＤＮＡの発現量と比較する比較手順と、を含む検査方法。【００２２】
（１１）  配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマー、又は、（６）記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする神経筋接合部位の異常に由来する疾病の検査薬。【００２３】
（１２）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
前記ポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００２４】
（１３）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下及び非存在下において、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は筋特異的チロシンキナーゼと結合活性を有するその断片と、筋特異的チロシンキナーゼとを接触させる手順と、
前記被検物質の存在下における前記結合活性と、前記被検物質の非存在下における前記結合活性とを比較する手順と、を含むスクリーニング方法。【００２５】
（１４）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００２６】
（１５）  神経筋接合部位の異常に由来する疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
請求項７記載の非ヒト形質転換動物に被検物質を投与する手順と、
前記非ヒト形質転換動物における神経筋接合部位の異常の改善を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＤＮＡ等によれば、ＭｕＳＫの活性を制御できる。このため、これらのＤＮＡ等によれば、神経筋伝達障害を防止し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のＤＮＡの各器官における転写量を示す図である。
【図２】本発明のポリペプチドの各器官における発現量を示す図である。
【図３】本発明のポリペプチドの局在性を示す図である。
【図４】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図５】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図６】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図７】本発明のＤＮＡの導入量と、アセチルコリン受容体の密集化との関係を示す図である。
【図８】本発明のポリペプチドとアセチルコリン受容体との共密集化を示す図である。
【図９】本発明のＤＮＡの発現とアセチルコリン受容体の密集化との関係を示す図である。
【図１０】本発明のＤＮＡの強制発現により誘導されたアセチルコリン受容体の密集化の状態を示す図である。
【図１１】本発明の遺伝子のｍＲＮＡの局在性を示す図である。
【図１２】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図１３】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図１４】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図１５】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図１６】本発明のＤＮＡの強制発現により誘導されたアセチルコリン受容体の密集化の状態を示す図である。
【図１７】本発明のＤＮＡの発現抑制により変化された筋特異的チロシンキナーゼ及びその基質のリン酸化を示す図である。
【図１８】本発明のＤＮＡの発現抑制により変化されたアセチルコリン受容体の密集化の状態を示す図である。
【図１９】本発明のポリペプチド、及び、筋特異的チロシンキナーゼの、リン酸化の経時的変化を示す図である。
【図２０】本発明の遺伝子のマップである。
【図２１】本発明のＤＮＡのノックアウトの存否を示す図である。
【図２２】本発明のポリペプチドの存否を示す図である。
【図２３】本発明のＤＮＡのノックアウトにより変化された肺の状態を示す図である。
【図２４】本発明のＤＮＡのノックアウトにより変化されたアセチルコリン受容体の密集化の状態を示す図である。
【図２５】本発明のポリペプチドと筋特異的チロシンキナーゼとの相互作用を示す図である。
【図２６】本発明のポリペプチド及びその相同タンパク質のＮ末端領域を示す図である。
【００２９】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００３０】
＜ＤＮＡ＞
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。【００３１】
本発明のＤＮＡの最も好ましい態様は、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡであるが、本発明のＤＮＡには、更に、筋特異的チロシンキナーゼの活性を制御する種々の変異体やホモログが含まれる。ここで「筋特異的チロシンキナーゼの活性の制御」には、筋特異的チロシンキナーゼの活性を向上すること（つまり、活性化）、及び抑制することが含まれる。「筋特異的チロシンキナーゼの活性化」とは、筋特異的チロシンキナーゼ分子内のチロシンがリン酸化される、及び／又は、ＡＣｈＲの密集を促すことができることを指す。【００３２】
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、配列番号２記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜６０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。【００３３】
また、配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。筋特異的チロシンキナーゼを活性化する能力を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。【００３４】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。【００３５】
配列番号１記載の１〜２３０番のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し（ただし、配列番号１記載の１〜６０番のアミノ酸配列を有する）、且つ、筋特異的チロシンキナーゼの活性を制御するポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明のＤＮＡの好ましい態様の一つである。【００３６】
更に、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号２記載の塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列表の配列番号２記載の塩基配列と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００３７】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。【００３８】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより、作製できる。【００３９】
「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。【００４０】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のＤＮＡを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。【００４１】
このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。【００４２】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。【００４３】
＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、例えば、前述のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで、作製できる。即ち、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするタンパク質（ポリペプチド）を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。【００４４】
形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。【００４５】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。【００４６】
＜抗体、抗体フラグメント＞
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、上述した本発明のポリペプチドに結合する。【００４７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。また、抗体には、ウサギ等の免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト型化抗体、種々の修飾が施された抗体が含まれる。【００４８】
なお、本発明の抗体の作成方法としては、例えば、従来公知のハイブリドーマ法が挙げられる（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５  （１９７５））。【００４９】
また、本発明の抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。【００５０】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、前述のＤＮＡ及び／又はポリペプチドを有効成分として含有させることで、作製できる。【００５１】
この医薬組成物によれば、ＤＮＡ及び／又はポリペプチドを有効成分として含むので、ＭｕＳＫを活性化させ、ＡＣｈＲ高密度部位の形成を促進できる。このため、この医薬組成物は、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば先天性筋無力症候群）の治療薬もしくは予防薬として使用し得る（後述する実施例参照）。【００５２】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口（例えば、注射による筋肉への直接投与）で投与できる。投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるため、適宜選択すべきものである。【００５３】
「有効成分として含む」とは、神経筋伝達障害の治療用医薬品もしくは予防用医薬品として有効である程度に含むという意味であって、他の任意成分を含むことを除外するものではない。【００５４】
他の任意成分としては、特に限定されないが、賦形剤、希釈剤、増粘剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝材、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘調剤、溶解補助剤等の担体等が挙げられる。これらの任意成分によれば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤等の様々な形態の医薬組成物を容易に調整できる。【００５５】
＜形質転換動物＞
本発明のＤＮＡを非ヒト動物に導入、変異、又はノックアウトすることにより、非ヒト形質転換動物を作製できる。
この非ヒト形質転換動物によれば、本発明のＤＮＡが導入、変異、又はノックアウトされているから、この動物体内における遺伝子発現の態様が変化する。このため、この形質転換動物は、本発明のＤＮＡの動物体内における機能の解析手段や、この機能を調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。【００５６】
非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。【００５７】
非ヒト形質転換動物の作製方法は、例えば、次の通りである。まず、本発明のＤＮＡ、ＤＮＡの変異、又はＤＮＡと相同組換えされるＤＮＡを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する。そして、この受精卵を雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが形質転換された非ヒト形質転換動物を作製できる。【００５８】
非ヒト形質転換動物の作製は、より具体的には、例えば、次のように行うことができる。
即ち、まず、ホルモン投与により過剰排卵させた後の雌個体を、雄と交配する。次いで、交配後１日目の雌個体の卵管から受精卵を摘出し、本発明のＤＮＡ、ＤＮＡの変異、又はＤＮＡと相同組換えされるＤＮＡを含むベクターを、この受精卵にマイクロインジェクション等の方法により導入する。そして、導入後の受精卵を適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植し、新生仔を出産させる。この新生仔においてＤＮＡが形質転換されているか否かは、この新生仔の細胞から抽出したＤＮＡについて、サザン解析により確認できる。【００５９】
その他、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株において遺伝子導入及び選別を行った後、生殖系列に寄与したキメラ動物を作製し、交配することによって、非ヒト形質転換動物を作製してもよい。【００６０】
＜検査方法、検査薬＞
本発明のＤＮＡは、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）に罹患しているか否かについての検査に利用できる。
即ち、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）の検査方法は、被験者の細胞からＤＮＡを抽出する抽出手順と、；抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、；増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読する解読手順と、；解読された塩基配列を、配列番号２記載の塩基配列と比較する比較手順と；を含む。【００６１】
この検査方法によれば、先天性筋無力症候群の被疑者の有するＤｏｋ−７遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、正常者の有するＤｏｋ−７遺伝子のＤＮＡ塩基配列（配列番号２記載）と比較する。この比較の結果、被疑者の有するＤｏｋ−７遺伝子のＤＮＡ塩基配列が、正常者の有するＤｏｋ−７遺伝子のＤＮＡ塩基配列（配列番号２記載）と相違する場合、被疑者が神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）に罹患しているものと判断し得る。【００６２】
また、本発明の検査方法は、例えば、増幅手順において増幅されたＤＮＡを、筋管（例えば、野生型筋管、ＭｕＳＫ欠損筋管）等に導入し、筋特異的チロシンキナーゼが活性化されるか否かを判断する判断手順を更に備えてもよい。これにより、増幅されたＤＮＡの塩基配列と配列番号２記載の塩基配列との差異が単なる多型である場合等を排除できるので、検査精度が向上する。【００６３】
なお、この検査方法において、Ｄｏｋ−７遺伝子の他、先天性筋無力症候群に関与することが既に知られている遺伝子（コリンアセチルトランスフェラーゼ、ＡＣｈＲｓ、アセチルコリンエステラーゼ、Ｒａｐｓｙｎ、ＭｕＳＫ等）についても、併せて塩基配列を比較してもよい。これにより、先天性筋無力症候群の診断の精度が、より高まる（例えば、Ａ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｓｉｎｅ著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、５、３０８（２００５）参照）。【００６４】
別の検査方法は、被験者の細胞における配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量を検出する検出手順と、；検出されたＤＮＡの発現量を、健常者における配列番号２記載のＤＮＡの発現量と比較する比較手順と、を含む。【００６５】
ここで「ＤＮＡの発現」には、転写レベル（ｍＲＮＡの発現）及び翻訳レベル（タンパク質の発現）が含まれる。【００６６】
この検査方法によれば、被験者及び健常者の間で、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量を比較する。この比較の結果、被験者におけるＤＮＡの発現量が、健常者におけるＤＮＡの発現量と有意に相違する場合、被疑者が神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）に罹患しているものと判断し得る。【００６７】
また、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）の検査薬は、配列番号２記載の塩基配列の一部又は全部を有するＤＮＡを特異的に増幅できるプライマー、又は、上述した抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含有する。【００６８】
＜治療薬の候補化合物のスクリーニング方法＞
本発明のポリペプチドは、神経筋接合部位の異常に由来する疾病（例えば、先天性筋無力症候群）の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法に利用できる。
即ち、スクリーニング方法は、上述したポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、ポリペプチドと被検物質との結合を検出する手順と、を含む。【００６９】
このスクリーニング方法によれば、ポリペプチドとの結合が検出された被検物質を、治療薬の候補化合物として特定できる。【００７０】
また、別のスクリーニング方法は、上述した被検物質の存在下及び非存在下において、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は筋特異的チロシンキナーゼと結合活性を有するその断片と、筋特異的チロシンキナーゼとを接触させる手順と；被検物質の存在下における結合活性と、被検物質の非存在下における結合活性とを比較する手順と；を含む。【００７１】
このスクリーニング方法によれば、被検物質の存在下における結合物質の結合活性が、被検物質の非存在下における結合物質の結合活性と異なることが検出された被検物質を、治療薬の候補化合物として特定できる。【００７２】
また、別のスクリーニング方法は、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、；ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含む。【００７３】
ここで「ＤＮＡの発現」には、転写レベル（ｍＲＮＡの発現）及び翻訳レベル（タンパク質の発現）が含まれる。【００７４】
このスクリーニング方法によれば、細胞内のＤＮＡ発現量の変化が検出された被検物質を、治療薬の候補化合物として特定できる。【００７５】
また、別のスクリーニング方法は、上述した非ヒト形質転換動物に被検物質を投与する手順と、；非ヒト形質転換動物における神経筋接合部位の異常の改善を検出する手順と、を含む。【００７６】
このスクリーニング方法によれば、非ヒト形質転換動物における神経筋接合部位の異常の改善が検出された被検物質を、治療薬の候補化合物として特定できる。【００７７】
以上のスクリーニング方法に用いられるスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドを備える。また、本発明は、以上のスクリーニング方法によって特定された治療薬の候補化合物も包含する。【００７８】
＜その他＞
［記録媒体］
前述したＤＮＡの塩基配列、及び、ポリペプチドのアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能記録媒体に保存されてよい。この記録媒体によれば、保存されている本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、及び、ＤＮＡの塩基配列を、コンピュータを用いてデータベース化することができる。このため、このアミノ酸配列や塩基配列を配列情報としても活用できる。【００７９】
記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能であれば、特に限定されず、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等が挙げられる。【００８０】
［網羅的解析用ツール］
本発明のＤＮＡ及びポリペプチド、並びに、これらの部分断片は、基盤上に、担体として結合させた状態で、使用することもできる。本発明のポリペプチドやＤＮＡ以外に、更に、他のポリペプチドやＤＮＡを結合させた基盤は、本発明のポリペプチドやＤＮＡを含めた網羅的な解析に使用できる。【００８１】
基盤としては、特に限定されないが、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションの検出を、例えば蛍光物質といった非放射性同位体物質を用いて行う場合、基盤として、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等を好ましく使用できる。
なお、ポリペプチドやＤＮＡの基板上への結合は、公知の方法で行うことができる。
【実施例】
【００８２】
＜実施例１＞  ｃＤＮＡの作製
まず、Ｄｏｋファミリー分子において、高度に保存されているＰＴＢドメインのアミノ酸配列（約１００アミノ酸程度から構成される）を既知のデータベース（例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＳｅａｒｃｈ）に入力し、高い相同性を示すクローンを探索した。この探索の結果得られたクローンの配列情報中の、翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンの位置情報を基に、Ｄｏｋ−７のＯＲＦ（タンパク質をコードする塩基配列領域）を推測した。そして、ＯＲＦの塩基配列情報を基に、以下に示すオリゴプライマーを設計し、常法に従いＰＣＲ法により、ヒトＤｏｋ−７のＯＲＦ領域に相当するｃＤＮＡを単離した。単離された全長ｃＤＮＡの塩基配列は、公知の方法により解読したところ、配列表の配列番号２記載の塩基配列であった。
５’−ａｔｇａｃｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｇ−３’
５’−ｔｃａａｇｇａｇｇｇｇｇｇｔｔｔａｃｃｔｔｇ−３’【００８３】
＜実施例２＞  ｃＤＮＡ挿入ベクターの作製
得られたｃＤＮＡを、哺乳動物細胞用発現ベクターである「ｐｃＤＮＡ３．１（商品名）」（クロンテック社製）、「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ（商品名）」（クロンテック社製）、「ｐＥＧＦＰ−Ｎ３  ｐｌａｓｍｉｄ」（クロンテック社製）、及び、大腸菌細胞用発現ベクターである「ｐＧＥＸ−４Ｔ−２」（アマシャムファルマシア社製）に、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを作成できる読み枠で挿入した。【００８４】
この挿入は、挿入されるベクターのマルチクローニングサイト内の制限酵素部位にあわせて制限部位を付加して設計されたプライマーを用いたＰＣＲ手順と、ＰＣＲ後の増幅産物及びベクターを制限酵素処理する手順と、制限酵素処理された増幅産物及びベクターをリガーゼ処理する手順と、リガーゼ処理後のベクターを大腸菌に形質転換する手順と、形質転換された前記大腸菌を所定期間培養し、培養後の前記大腸菌からベクターを精製する手順と、からなる周知の方法により行った。【００８５】
「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」によれば、ポリペプチドは、そのＮ末端にポリヒスチジンタグが融合され、そのＣ末端に、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグが融合された形で合成される。また、「ｐＥＧＦＰ−Ｎ３  ｐｌａｓｍｉｄ」によれば、ポリペプチドは、そのＣ末端に、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が融合された形で合成される。また、「ｐＧＥＸ−４Ｔ−２」（アマシャムファルマシア社製）によれば、ポリペプチドは、そのＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」とも称する）タグが融合された形で合成される。これらのタグやエピトープは、合成後の用途に応じ、例えば酵素処理することで、適宜除去すればよい。【００８６】
＜実施例３＞  形質転換体の作製
次のような手順で形質転換Ｃ２筋原細胞株を作製した。即ち、まず、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＣ２筋原細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を、２０ｖｏｌ％仔牛血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改良イーグル（ＤＭＥ）培地中で培養した。次いで、適宜の細胞数まで培養したＣ２筋原細胞株に、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」（インビトロジェン社製）を用いて、前述した本発明のＤＮＡを含む「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」を導入することにより、形質転換体を作製した。【００８７】
また、次のような手順で形質転換２９３Ｔ細胞株を作製した。即ち、まず、ヒト培養細胞（非筋肉細胞）である２９３Ｔ細胞株を、１０ｖｏｌ％ＦＢＳを添加したＤＭＥ培地中で培養した。次いで、適宜の細胞数まで培養した２９３Ｔ細胞株に、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」（インビトロジェン社製）を用いて、上述したＤＮＡを含む「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」を導入することにより、形質転換体を作製した。【００８８】
また、次のような手順で形質転換大腸菌を作製した。即ち、まず、ＬＢ培地内で、適宜の菌体濃度になるまで培養した大腸菌に、周知のヒートショック法により、上述したＤＮＡを含む「ｐＧＥＸ−４Ｔ−２」を導入し、形質転換体を作製した。【００８９】
＜実施例４＞  ポリペプチドの作製
次のような手順で、本発明のポリペプチドを作製した。即ち、まず、上述した形質転換大腸菌を、ＬＢ培地内で適宜の菌体濃度になるまで培養し、培養後の菌体を遠心分離により集めた。次に、集めた菌体を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波により細胞壁を破砕した。次に、破砕物を遠心分離し、目的のタンパク質を含有する膜画分を得た。そして、この膜画分を界面活性剤「トリトンＸ−１００」を用いて可溶化して得た粗溶液から、常法に従いグルタチオンセファロース（アマシャムファルマシア社）を用いて、目的のタンパク質を単離、精製した。【００９０】
＜実施例５＞  抗体の作製
上述の方法により作製された、ヒトＤｏｋ−７ポリペプチド断片（配列表の配列番号１記載の２１４番〜２９１番のアミノ酸配列を含む）とグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質を、抗原として、ウサギ及びラットの各々に注射投与することで、抗Ｄｏｋ−７抗血清を得た。この抗血清は、ウェスタン解析の結果から、ヒト、マウス、ラット由来Ｄｏｋ−７タンパク質を認識したが、トラフグ由来Ｄｏｋ−７タンパク質は認識しないことが分かった（図示はしていない）。【００９１】
＜実施例６＞  Ｄｏｋ−７遺伝子の解析
（Ａ）Ｄｏｋ−７遺伝子のｍＲＮＡ局在性について
Ｄｏｋ−７遺伝子のｍＲＮＡの概略的局在性を解析するため、ヒトの脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢白血球（この順に、図１中の１〜１２に各々対応する）の各々から抽出したＲＮＡブロット（「ヒトマルチティッシュブロット」（クロンテック社製）を使用した）を被検体として、常法に従いノーザン解析を行った。この結果を図１に示す。【００９２】
図１に示されるように、ヒトＤｏｋ−７遺伝子の転写活性は、心臓及び骨格筋においてのみ検出された。なお、図１下側は、β−アクチンの解析結果（対照区）を示す。【００９３】
（Ｂ）Ｄｏｋ−７タンパク質の局在性について
Ｄｏｋ−７タンパク質の概略的局在性を解析するため、マウスの心筋（ＣＭ）、大腿筋（ＴＭ）、肝臓（Ｌｖ）、脾臓（Ｓｐ）、横隔膜筋（ＤＭ）の各々から抽出したタンパク質を被検体として、常法に従いウェスタン解析を行った。なお、ウェスタン解析に使用した抗体は、抗Ｄｏｋ−７抗血清、及び、抗β−アクチン抗体「Ｉ−１９」（サンタクルス社製）であった。この結果を図２に示す。【００９４】
図２に示されるように、マウスＤｏｋ−７タンパク質は、心筋と、骨格筋（大腿筋及び横隔膜筋）とにおいてのみ検出された。なお、図２下側は、β−アクチンの解析結果（対照区）を示す。【００９５】
次に、Ｄｏｋ−７タンパク質の細胞レベルでの局在性を解析するため、常法に従い、坐骨神経切除の前後におけるマウス腓腹筋の、筋神経筋接合部位のシナプス後領域周辺における免疫染色を行った。なお、免疫染色に使用した抗体は、抗Ｄｏｋ−７抗血清、抗シナプトフィシン抗体「ＳＶＰ３８」（サンタクルス社製）であった。【００９６】
シナプトフィシン（ＳＹＮ）は、シナプス前小胞の構成成分であり、シナプス前領域等の位置を示す対照区である。バンガロトキシン（Ｂｔｘ）は、ＡＣｈＲの位置を示す対照区である。この結果を図３に示す。図３左側は坐骨神経切除前の組織を用いた場合の結果を、図３右側は坐骨神経切除の１週間後の組織を用いた場合の結果を示す。なお、Ｄｏｋ−７及びＢｔｘ各図を混合した図は図示していないが、図３左側及び右側における各図は、同一切片の同一視野における図である。また、図３中のバーは２０μｍに対応する。【００９７】
図３に示されるように、シナプトフィシンは坐骨神経切除後には消失していたのに対し、Ｄｏｋ−７タンパク質はＡＣｈＲと共局在し、且つ、この共局在は神経切除の前後を通じて保持されていた。【００９８】
以上の結果から、Ｄｏｋ−７は、神経ではなく筋肉で発現されるタンパク質であり、神経筋接合部位のシナプス後領域において、ＡＣｈＲに関連する機能を有することが示唆された。【００９９】
＜実施例７＞  Ｄｏｋ−７タンパク質の機能解析
Ｄｏｋファミリーに属するタンパク質の分子内に存在するＰＴＢドメインは、リン酸化チロシンキナーゼと相互作用する例が報告されている（Ｆ．Ｃｏｎｇ，Ｂ．Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｐ．Ｇｏｆｆ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９，８３１４（１９９９）；Ｊ．Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５４，３４５（２００１）；Ｒ．Ｊ．Ｃｒｏｗｄｅｒ，Ｈ．Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｍ．Ｙａｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｊｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４２０７２（２００４）等参照）。更に、ＭｕＳＫ分子内のＮＰＸＹの４アミノ酸（配列表の配列番号１記載の５５０〜５５３番）から構成されるＰＴＢドメインターゲットモチーフは、ＭｕＳＫ活性化に必須であると報告されている（Ｈ．Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｊ．Ｇｌａｓｓ，Ｇ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，＆Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４６，１１３３（１９９９）；Ｒ．Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，６７（２０００）；Ｒ．Ｈｅｒｂｓｔ，Ｅ．Ａｖｅｔｉｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，５４４９（２００２）等参照）。そこで、Ｄｏｋ−７タンパク質とＭｕＳＫとの相互作用を通じて、Ｄｏｋ−７タンパク質の機能解析を行った。【０１００】
（Ａ）非筋肉細胞
２９３Ｔ細胞株に、ヒトＤｏｋ−７、ｍｙｃタグに融合された、野生型（以下、「ＷＴ」とも称する）マウスＭｕＳＫ又はキナーゼ不活性型変異ＭｕＳＫ（以下、「ＭｕＳＫ−ＫＡ」とも称する）の各々のＤＮＡが挿入されたベクターを、上述の方法により導入し、形質転換２９３Ｔ細胞株を作製した。なお、野生型（ＷＴ）マウスＭｕＳＫのＤＮＡは、特異的に結合するプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により作製し、作製したＤＮＡを、所望のアミノ酸配列の読み枠になるように、上述の方法に従い「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」に挿入した。ＭｕＳＫ−ＫＡのＤＮＡは、配列番号３記載のアミノ酸配列における６０８番のリジンをアラニンに置換したアミノ酸配列をコードするよう、野生型（ＷＴ）マウスＭｕＳＫのＤＮＡに変異を加えることで作製した。この変異は、周知の変異工学的手法で行った。【０１０１】
各々の形質転換された２９３Ｔ細胞を、１０ｖｏｌ％ＦＢＳを添加したＤＭＥ培地中で、所定の細胞数になるまで培養した後、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）に溶解させることで、全細胞可溶物（ＷＣＬ）を得た。次いで、この全細胞可溶物に対して、常法に従い、抗ｍｙｃタグ抗体（αｍｙｃ）を用いた免疫沈降を行い、免疫沈降物（ＩＰ：αｍｙｃ）を得た。【０１０２】
各形質転換体から得られた、全細胞可溶物及び免疫沈降物の各々について、ウェスタン解析を行った。なお、ウェスタン解析に使用した、Ｄｏｋ−７抗体（ＩＢ：αＤｏｋ−７）は、上述の手順で得られたＤｏｋ−７タンパク質で免疫したマウス血清から精製されたポリクローナル抗体であった。また、抗リン酸化チロシン抗体（ＩＢ：αＰＹ）は「４Ｇ１０」（アップステートバイオロジー社製）、抗ｍｙｃタグ抗体（ＩＢ：αｍｙｃ）は「９Ｂ１１」（セルシグナリング社製）であった。この結果を図４に示す。図４の上側は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１０３】
図４に示されるように、Ｄｏｋ−７を２９３Ｔ細胞内で強制発現させると、野生型（ＷＴ）ＭｕＳＫのチロシンリン酸化は強く促進されたが、キナーゼ不活性型変異体であるＭｕＳＫ−ＫＡのチロシンリン酸化の促進は検出されなかった。【０１０４】
同様の手順で、トラフグＤｏｋ−７（Ｆ７）、及び、ヒトＤｏｋ−１〜７の各々が導入された形質転換２９３Ｔ細胞株を用いて、ウェスタン解析を行った。なお、トラフグＤｏｋ−７、ヒトＤｏｋ−１〜６の各々のＤＮＡは、各々に特異的に結合するプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により作製し、作製したＤＮＡを、所望のアミノ酸配列の読み枠になるように、上述の方法に従い「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」に挿入した。この結果を図５に示す。図５の上側は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１０５】
図５に示されるように、トラフグＤｏｋ−７タンパク質は、ヒトＤｏｋ−７タンパク質と同様に、ＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進できた。この結果から、Ｄｏｋ−７の性質は脊椎動物に共通することが示唆された。一方、ヒトＤｏｋ−１〜６のタンパク質については、いずれもＭｕＳＫのチロシンリン酸化を検出できなかった。
従って、Ｄｏｋ−７は、脊椎動物一般に保存された、ＭｕＳＫの特異的活性化物質であることが示唆された。【０１０６】
（Ｂ−１）筋管
上述の手順で得た、ヒトＤｏｋ−７が形質転換されたヒトＣ２筋原細胞を飽和細胞密度にまで増殖させ、２ｖｏｌ％馬血清を添加したＤＭＥ培地中で５〜７日間培養し、筋管（Ｃ２筋管）に分化させた。【０１０７】
このＣ２筋管を、２ｖｏｌ％ウマ血清を添加したＤＭＥ培地中で、所定の細胞数になるまで培養した後、アルカリ可溶化液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．５、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦ、１％  デオキシコール酸ナトリウム、１％  トリトン−Ｘ１００）に溶解させることで、全細胞可溶物（ＷＣＬ）を得た。次いで、この全細胞可溶物に対して、常法に従い、抗ＭｕＳＫ抗体「Ｎ−１９」及び「Ｃ−１９」（いずれも、サンタクルス社製）を用いた免疫沈降、もしくは、Ｂｔｘを用いたＡＣｈＲ複合体のプルダウンを行い、各々の沈降物を得た。
【０１０８】
Ｃ２筋管から得られた全細胞可溶物（ＷＣＬ）、及び、この全細胞可溶物に対して、免疫沈降を行って得られた免疫沈降物（ＩＰ：αＭｕＳＫ）、Ｂｔｘによるプルダウンを行って得られた単離物（ＢＰ）の各々について、ウェスタン解析を行った。なお、ウェスタン解析に使用した、抗リン酸化チロシン抗体（ＩＢ：αＰＹ）は「４Ｇ１０」（アップステートバイオロジー社製）、抗ＭｕＳＫ抗体（ＩＢ：αＭｕＳＫ）は「ＡＦ５６２」（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、抗チロシンリン酸化ＡＣｈＲβ１抗体は「Ｔｙｒ−３９０」（サンタクルス社製）、抗ＡＣｈＲα１抗体は「Ｃ−１８」（サンタクルス社製）、Ｄｏｋ−７抗体は上述の抗血清（ＩＢ：αＤｏｋ−７）、αチューブリン抗体（ＩＢ：αチューブリン）は「ＤＭ１Ａ」（シグマ社製）、であった。この結果を図６に示す。なお、図６左側は、挿入配列のない「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」をＣ２筋原細胞に導入した場合における結果を示す対照区である。【０１０９】
図６に示されるように、Ｄｏｋ−７を筋管内で過剰発現させると、内在性ＭｕＳＫのチロシンリン酸化が促進され、その基質であるＡＣｈＲβ１のチロシンリン酸化も促進された。【０１１０】
（Ｂ−２）Ｄｏｋ−７とＡＣｈＲとの関係
様々な量のＤｏｋ−７含有プラスミドを形質導入したＣ２筋管におけるＡＣｈＲの密集状態を次の手順により調べた。即ち、まず、筋管を、１ｎｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ５９４結合Ｂｔｘと１時間反応させた後、洗浄し、３．７％ＰＦＡを混合したＰＢＳで固定した。固定化した筋管の画像は、「ＤＦＣ３５０ＦＸ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ」（ライカ社製）を接続した「ＤＭ６０００Ｂ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」（ライカ社製）により収集した。対物４０倍の１０フィールドを無作為に選択し、ＡＣｈＲクラスター（直径５μｍ以上）数を計測した。この結果を図７に示す。
図７に示されるように、Ｄｏｋ−７の強制発現によってＡＣｈＲクラスターが誘導され、ＡＣｈＲクラスター数は、Ｄｏｋ−７含有プラスミドの注入量に相関していた。
【０１１１】
次に、ＥＧＦＰに融合されたＤｏｋ−７を筋管内で強制発現させた際の局在性を、ＡＣｈＲと併せて、共焦点顕微鏡観察によって調査した。この結果を図８に示す。なお、ＡＣｈＲ及びＤｏｋ−７各図を混合した図は図示していないが、各図は同一切片の同一視野における図である。なお、図８におけるバーは、２０μｍを示す。
図８に示されるように、強制発現されたＤｏｋ−７はＡＣｈＲとともにクラスターを形成していた。この結果は、図３に見られる結果とも一致する。【０１１２】
なお、ＡＣｈＲは、ＭｕＳＫの活性化によって、筋管内でＭｕＳＫとともにクラスターを形成することも知られている（Ｋｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｔ．，Ｍｉｓｇｅｌｄ，Ｔ．，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６４，１０７７−１０８７（２００４）、Ｓａｎｄｅｒ，Ａ．，Ｈｅｓｓｅｒ，Ｂ．Ａ．＆Ｗｉｔｚｅｍａｎｎ，Ｖ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５，１２８７−１２９６（２００１）参照）。【０１１３】
（Ｂ−３）ＡＣｈＲの密集
上述のヒトＤｏｋ−７が導入されたＣ２筋管、及び、挿入配列のない「ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ」が導入されたＣ２筋管（対照区）における、ＡＣｈＲの密集状態を上述した手順により観察した。この結果の一部を図９に示す。図９中のバーは２００μｍを示す。【０１１４】
図９に示されるように、ヒトＤｏｋ−７が形質転換されたＣ２筋管には、対照区に比べて、はるかに多いＡＣｈＲの密集が観察された。また、図示はしないが、ヒトＤｏｋ−１〜６が形質転換されたＣ２筋管には、対照区と比べて、ＡＣｈＲの密集についての有意な差は観察されなかった。【０１１５】
ＡＣｈＲβサブユニットのチロシンリン酸化は、ＭｕＳＫの活性化に伴って起こることが報告されている（例えば、Ｃ．Ｆｕｈｒｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｒ．Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｚ．Ｗ．Ｈａｌｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，４９５１（１９９７）参照）。この報告を踏まえれば、図６及び図９に示す結果から、Ｄｏｋ−７タンパク質は、ＭｕＳＫの活性化を介して、ＡＣｈＲβ１のチロシンリン酸化を促進し、ＡＣｈＲの密集を促進できることが示唆された。
【０１１６】
次に、分化の過程で、Ｃ２筋原細胞に対して、上述した形質転換Ｃ２筋管、及び、１０ｎｇ／ｍｌの神経性アグリンで７日間処理したＣ２筋原細胞について、より詳細な観察を行った。この結果を図１０に示す。図１０中のバーは４０μｍを示す。【０１１７】
図１０に示されるように、外来遺伝子であるＤｏｋ−７により誘導されたＡＣｈＲ密集部位は、高度に分岐化された複雑構造を有していた。また、Ｄｏｋ−７により誘導されたＡＣｈＲ密集部位は、アグリンにより誘導された密集部位、もしくは、自発的に形成された密集部位に比べ、大きかった。なお、観察された密集部位の複雑構造は、インビトロ及びインビボで観察が報告された分化後のプレッチェル様ＡＣｈＲ密集構造（例えば、Ｔ．Ｔ．Ｋｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｍｉｓｇｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６４，１０７７（２００４）参照）に似ていた。【０１１８】
＜実施例８＞  Ｄｏｋ−７ｍＲＮＡの生体内局在
Ｄｏｋ−７遺伝子のｍＲＮＡの生体内局在をより細かく解析するため、Ｃ５７ＢＬ／６由来のマウス胚から得られた横隔膜筋を被検体として、以下のような手順で、インサイチュハイブリダイゼーション解析を行った。【０１１９】
マウス胚から得られた横隔膜筋をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、プロテイナーゼＫで処理し、更に、マウスＤｏｋ−７のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたアンチセンス又はセンスリボプローブによって、プローブした。これらのプローブは、マウスＤｏｋ−７ｃＤＮＡ（ＡＢ２２０９１９）のヌクレオチド１−９９９に対応するものである。インサイチュハイブリダイゼーションを常法に従って行い、アルカリフォスファターゼ抱合抗ＤＩＧ抗体によって検出されたシグナルをＮＢＴ及びＢＣＩＰによって現像した。撮影は、カメラ「ＤＰ−７０」（オリンパス社製）が取り付けられた立体顕微鏡「ＭＺ１６」（ライカ社製）を用いて行った。この結果を図１１に示す。なお、図１１中のバーは、５００μｍを示す。【０１２０】
図１１に示されるように、アンチセンスリボプローブは、終板領域を含む横隔膜の中央領域に特異的に結合し、この終板領域にセンスリボプローブは結合していなかった。従って、マウスＤｏｋ−７のｍＲＮＡは、終板領域を含む横隔膜の中央領域に特異的に発現していることが示唆された。
【０１２１】
＜実施例９＞  Ｄｏｋ−７の変異株解析
Ｄｏｋ−７の変異株、ＭｕＳＫの変異株を用いて、Ｄｏｋ−７タンパク質によるＭｕＳＫのチロシンリン酸化に必須な部位の決定を試みた。【０１２２】
（Ａ）ＭｕＳＫについて
ＰＴＢドメインのターゲットモチーフであることが報告されているＭｕＳＫのアミノ酸配列（ＮＰＸＹ）に変異を有する変異型ＭｕＳＫ（ＮＡ、ＹＦ）、チロシンキナーゼ不活化変異型ＭｕＳＫ（ＫＡ）を発現するＤＮＡを、常法に従って、点変異導入法により作製した。そして、これらのＤＮＡ、及び、野生型Ｄｏｋ−７を発現するＤＮＡ、を各々発現する形質転換２９３Ｔ細胞株を、上述の方法と同様の手順により、作製した。ここで、ＮＡは配列番号３記載のアミノ酸配列５５０番のアスパラギンをアラニンに置換した変異型で、ＹＦは配列番号３記載のアミノ酸配列５５３番のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異型で、ＫＡは配列番号３記載のアミノ酸配列６０８番のリジンをアラニンに置換した変異型である。なお、ＭｕＳＫ及びその変異体にはｍｙｃタグが融合されている。【０１２３】
各々の形質転換細胞株から得られた全細胞可溶液（ＷＣＬ）に対して、抗ｍｙｃタグ抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降物（ＩＰ：αｍｙｃ）を得た。そして、この全細胞可溶液及び免疫沈降物について、ウェスタン解析を行った。使用した抗体は、上述の抗体と同じ抗体であった。この結果を図１２に示す。なお、図１２の上側は、野生型ＭｕＳＫ、ＮＡ変異体、ＹＦ変異体に関するＰＴＢドメインターゲットモチーフを含む周辺のペプチド配列を示す。また、図１２の中央部は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１２４】
図１２に示されるように、２９３Ｔ細胞においては、野生型ＭｕＳＫ（ＷＴ）はＤｏｋ−７と結合し共沈降したことが確認された。一方、ＹＦ、ＮＡのいずれも、Ｄｏｋ−７と結合し共沈降したことは確認されなかった。この結果から、ＮＰＸＹを含むＰＴＢドメインのターゲットモチーフが、Ｄｏｋ−７とＭｕＳＫとの結合に関与することが示唆された。更に、２９３Ｔ細胞においては、ＹＦ、ＮＡはいずれも、Ｄｏｋ−７により誘導されるＭｕＳＫのチロシンリン酸化を妨害することはないことも示唆された。【０１２５】
（Ｂ）Ｄｏｋ−７について
まず、野生型ヒトＤｏｋ−７（ＷＴ）、野生型ヒトＤｏｋ−７のうちＮ末端側に存在するＰＨドメイン（配列番号１記載のアミノ酸配列の８〜１０７番）の一部を欠損させた変異型Ｄｏｋ−７（ΔＮ）、野生型ヒトＤｏｋ−７のうちＣ末端側領域を欠損させた変異型Ｄｏｋ−７（ΔＣ）、を各々発現し、且つＭｕＳＫを強制発現する形質転換２９３Ｔ細胞株を、上述の方法と同様の手順により、作製した。ここで、ΔＮは配列番号１記載のアミノ酸配列６１〜５０４番にまで削除した変異型で、ΔＣは配列番号１記載のアミノ酸配列１〜２３０番にまで削除した変異型である。なお、Ｄｏｋ−７及びその変異体にはＦＬＡＧタグが融合され、ＭｕＳＫにはｍｙｃタグが融合されている。【０１２６】
そして、各々の形質転換細胞株から得られた全細胞可溶液について、ウェスタン解析を行った。ウェスタン解析に用いた、抗ｍｙｃタグ抗体（ＩＢ：αｍｙｃ）、抗ＦＬＡＧタグ抗体（ＩＢ：αＦＬＡＧ）、抗リン酸化チロシン抗体（ＩＢ：αＰＹ）は、総て、上述したものと同じものであった。この結果を図１３に示す。図１３の上側は各Ｄｏｋ−７の構造概略図である（詳細は図２６参照）。また、図１３の中央部は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１２７】
図１３に示されるように、ＭｕＳＫのチロシンリン酸化は、野生型ヒトＤｏｋ−７及びΔＣについては確認されたが、ＰＨドメインを欠損したΔＮについては確認されなかった。この結果により、ＰＨドメインが、ＭｕＳＫのチロシンリン酸化に必須であることが示唆された。【０１２８】
次に、ヒトＤｏｋ−７のＰＴＢドメイン内のアミノ酸配列（配列番号１記載のアミノ酸配列の１０９〜２０４番）中の１５８、１５９、１７４番のアルギニンがアラニンに置換された変異型Ｄｏｋ−７（ＲＡ）のＤＮＡを、常法に従って、点変異導入法により作製した。このＲＡ、野生型ヒトＤｏｋ−７（ＷＴ）を各々発現し、且つＭｕＳＫを強制発現する形質転換２９３Ｔ細胞株を、上述と同様の手順で、作製した。ここでも、ＭｕＳＫにはｍｙｃタグが融合されている。【０１２９】
そして、各々の形質転換細胞株から得られた全細胞可溶液（ＷＣＬ）に対して免疫沈降を行い、得られた免疫沈降物（ＩＰ：αｍｙｃ）についてウェスタン解析を行った。使用した抗体は、上述の抗体と同じ抗体であった。この結果を図１４に示す。図１４の上側は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１３０】
図１４に示されるように、野生型ヒトＤｏｋ−７はＭｕＳＫと結合し共沈降したのに対し、ＰＴＢドメインに変異を有するＲＡはＭｕＳＫと結合し共沈降したことは確認されなかった。この結果から、ＰＴＢドメインが、Ｄｏｋ−７とＭｕＳＫとの結合に関与することが示唆された。【０１３１】
一方、Ｄｏｋ−７のＲＡがＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進することから、少なくとも２９３Ｔ細胞内では、Ｄｏｋ−７のＰＴＢドメインがＭｕＳＫのチロシンリン酸化の誘導に重要ではないことが示唆された。【０１３２】
更に、同様の解析を、分化開始３日後及び６日後における各Ｃ２筋管（Ｄｏｋ−７のＷＴ、△Ｃ、ＲＡの各々が既に遺伝子導入されている）から得られた全細胞抽出液（ＷＣＬ）、及び、この全細胞抽出液に対して免疫沈降を行って得られた免疫沈降物（ＩＰ：αＭｕＳＫ）について行った。この結果を図１５に示す。なお、分化開始３日後ではわずかなＣ２筋管しか形成されておらず、分化開始６日後では分化が完了していた。
また、分化開始７日後の各Ｃ２筋管のＡＣｈＲクラスター数を、上述の通りの手順で、計測した。この結果を図１６に示す。【０１３３】
図１５に示されるように、分化開始３日後及び６日後において、野生型Ｄｏｋ−７タンパク質は、内在性ＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進できた。一方、ＲＡ、ΔＣについては、分化開始３日後（分化の途中）では内在性ＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進できたが、分化開始６日後（分化完了後）では内在性ＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進しなかった。【０１３４】
また、図１６に示されるように、野生型Ｄｏｋ−７タンパク質は、ＡＣｈＲクラスター数を増加した。一方、ＲＡ、ΔＣについては、分化後のＣ２筋管におけるＡＣｈＲクラスター数の増加は、ほとんど見られなかった。【０１３５】
これらの結果から、ＰＴＢドメイン及びＣ末端領域は、分化後のＣ２筋管におけるＭｕＳＫの活性化、ＡＣｈＲの密集に必要であることが示唆された。また、図１３に示されるＤｏｋ−７のΔＮについては分化後のＣ２筋管においてもＭｕＳＫのチロシンリン酸化を促進せず、ＡＣｈＲの密集を誘導しなかった（図示せず）。一般に、ＰＨドメインはタンパク質の膜局在に関与することが知られていることから、ＭｕＳＫのチロシンリン酸化に関して、Ｄｏｋ−７の膜局在が重要な役割を果たしていることが示唆された。
【０１３６】
以上の結果をまとめると、筋管への分化の過程で、ＭｕＳＫの活性化に対する細胞内阻害要素が強化される機構が推測される。【０１３７】
＜実施例１０＞  逆遺伝学的解析
（Ａ）アグリンとの関係
Ｄｏｋ−７の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ（ｓｉＤ−７）及び、対照区に用いたｓｉＲＮＡ（対照区）の塩基配列は以下の通りであった（いずれも、キアゲン社製）。
ｓｉＤ−７：  ５’−ＣＡＣＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＧＡ−３’
対照区：      ５’−ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ−３’【０１３８】
そして、このｓｉＲＮＡをＣ２筋原細胞に導入し、分化させることにより、Ｄｏｋ−７発現が抑制された形質転換筋管を作製した。なお、この形質転換の方法は、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」の代わりに「Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ｓｉＲＮＡ  ｒｅａｇｅｎｔ」（ロシュ社製）を使用したことを除き、上述の方法と同様の手順で行った。【０１３９】
この形質転換筋管及び野生型筋管をそれぞれ、神経性アグリン（Ａｇ）１０ｎｇ／ｍｌで１５分間処理した後又は無処理の細胞可溶物に対して免疫沈降を行って得られた免疫沈降物（ＩＰ：αＭｕＳＫ、ＩＰ：αＤｏｋ−７）、Ｂｔｘを用いたプルダウンを行って得られた単離物（ＢＰ）の各々について、ウェスタン解析を行った。使用した抗体は、上述した抗体と同じ抗体であった。リン酸化チロシン抗体の検出は、検出時間を１０秒間、１分間として行った。この結果を図１７に示す。【０１４０】
また、神経性アグリン（Ａｇ）１０ｎｇ／ｍｌで１２時間処理を行った後、又は、無処理の各筋管におけるＡＣｈＲクラスター数を計測した。この結果を図１８に示す。【０１４１】
また、Ｃ２筋管を神経性アグリン１０ｎｇ／ｍｌで３０分間処理した際の、ＭｕＳＫ及びＤｏｋ−７のチロシンリン酸化の経時的変化（処理開始後１分、５分、１０分、３０分）を、各々の抗体による免疫沈降物（ＩＰ：αＭｕＳＫ、ＩＰ：αＤｏｋ−７）をウェスタン解析することにより調べた。この結果を図１９に示す。【０１４２】
図１７に示されるように、ｓｉＤ−７により内在性Ｄｏｋ−７の発現が抑制されると、アグリンの非存在下におけるＭｕＳＫ及びＡＣｈＲβ１のチロシンリン酸化が妨げられた。同様に、アグリンに依存的な、ＭｕＳＫ活性化、ＡＣｈＲβ１のリン酸化も妨げられた。【０１４３】
また、図１８に示されるように、ｓｉＤ−７により内在性Ｄｏｋ−７の発現が抑制されると、アグリン依存的及び非依存的なＡＣｈＲの密集がともに妨げられた。【０１４４】
ちなみに、アグリンによるＡＣｈＲの密集化にＭｕＳＫが不可欠であることは、既知の事実である（Ｈ．Ｚｈｏｕ、Ｄ．Ｊ．Ｇｌａｓｓ、Ｇ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｅｓ著、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１４６、１１３３（１９９９）、  Ｒ．Ｈｅｒｂｓｔ、  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ著、「ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ」、１９、６７（２０００）参照）。【０１４５】
これらの結果から、Ｄｏｋ−７は、筋管におけるＭｕＳＫの活性化及びＭｕＳＫに依存したＡＣｈＲの密集化に必須の役割を果たしていることが分かった。【０１４６】
なお、図１９に示されるように、アグリン刺激を施したＣ２筋管細胞において、内在性ＭｕＳＫのチロシンリン酸化、及び、内在性Ｄｏｋ−７のチロシンリン酸化は、同様の経時的変化をたどっていた。このため、上述した結果にかかわらず、Ｄｏｋ−７がＭｕＳＫの関与するシグナル伝達経路の下流における役割を果たしている可能性は、否定できないことが示唆された。【０１４７】
＜実施例１１＞  逆遺伝学的解析（個体レベル）
（Ａ）ノックアウトマウスの作製
マウスｄｏｋ−７遺伝子座を含むバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンは、ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒより入手した（図２０上段）。組換えベクターは、ｄｏｋ−７遺伝子の第１、第２エキソン（各エキソンは、番号１〜７で表される）をネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子で置換し、このネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＡがｄｏｋ−７遺伝子ＤＮＡの５’断片（１．８ｋｂ）及び３’断片（７．３ｋｂ）に隣接するように、構築した（図２０中段）。このコンストラクトを直線化して、１２９／Ｏｌａ由来の胚性幹細胞にエレクトロポレートし、３つのホモ組換体を同定した。キメラの雄をＣ５７ＢＬ／６雌と交配し、キメラ生殖系列ひいてはヘテロ接合体を得た。図２０において、ＢはＢｇｌＩＩ制限部位、ＸはＸｈｏＩ制限部位を表し、ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を表す。【０１４８】
組換えベクターが挿入されたことを確認するために、野生型マウス、ヘテロマウス、ヌルマウスの各々の尾からＤＮＡを精製し、このＤＮＡにＢｇｌＩＩによる制限処理を施した後、図２０上段に示される配列に対応するプローブを用い、常法に従ってサザン解析を行った。この結果を図２１に示す。
【０１４９】
図２１に示されるように、野生型マウス及びヘテロマウスにおいては、７．６ｋｂにバンドが検出されたのに対して、ヌルマウスには、このバンドが検出されなかった。更に、野生型マウスにおいては検出されなかった３．５ｋｂのバンドがヘテロマウス及びヌルマウスにおいて検出された。以上の結果から、ヌルマウスにおいては、組換えベクターによってエキソン１及び２が相同組換えされ、ヌル対立遺伝子となっていることが確認された。【０１５０】
更に、野生型マウス及びヌルマウスの各々の筋肉抽出液を試料とし、エキソン６及び７の部分に対応するペプチドを検出可能な抗Ｄｏｋ−７抗体を用いたウェスタン解析を行った。この結果を図２２に示す。【０１５１】
図２２に示されるように、野生型マウスではＤｏｋ−７と予想されるバンドが検出されたのに対して、ヌルマウスでは何のバンドも検出されなかった。従って、ヌルマウスにおいては、Ｄｏｋ−７タンパク質が合成されていないことが確認された。【０１５２】
（Ｂ）呼吸について
同腹仔である野生型マウス及びヘテロマウスは正常な状態を示したのに対して、Ｄｏｋ−７ヌルマウスは、誕生時において動けず、生後すぐに死亡した。また、ヌルマウスには呼吸不全が予想されたため、ヌルマウスの肺を、ヘマトキシリン・エオシン染色した後、観察した。この結果を図２３に示す。【０１５３】
図２３に示されるように、肺胞のエアサックが野生型マウスでは広がっていたのに対して、ヌルマウスでは広がっていなかった。この結果から、ヌルマウスにおける呼吸不全が確認された。【０１５４】
（Ｃ）ＮＭＪについて
野生型マウス及びヌルマウスの各々の胚（１４．５日胚、１８．５日胚）から、横隔膜筋を調整し、この横隔膜筋に、抗ニューロフィラメント染色及びＢｔｘ染色を行うことで、神経及びＡＣｈＲをそれぞれ可視化した。可視化された横隔膜筋を観察した結果を図２４に示す。なお、図２４中のバーは１００μｍを示す。【０１５５】
図２４に示されるように、ヌルマウスの１４．５日胚及び１８．５日胚の双方において、横隔膜筋の終板領域にはＡＣｈＲクラスターが検出されなかった。一般に、１４．５日胚では神経／アグリンに非依存的に発生期ＡＣｈＲクラスターが形成され、１８．５日胚では神経／アグリンに依存的にＡＣｈＲが密集化することから、いずれのタイプのＭｕＳＫ依存的シナプス後特化にもＤｏｋ−７が必要であることが示唆される。更に、ヌルマウス１８．５日胚において、運動神経幹から延びる軸索側枝は、横隔膜の終板領域において異常に長く、神経幹近傍で終結しなかった。
【０１５６】
これらの異常性は、ＭｕＳＫ欠損マウスにおいて見られる異常性と区別できないことから、Ｄｏｋ−７は、神経筋シナプス形成というＭｕＳＫ依存的生体プロセスにおいて、必須の役割をインビボで果たしていることが示唆される。【０１５７】
＜実施例１２＞  Ｄｏｋ−７と先天性筋無力症候群との関係
先天性筋無力症候群は、ＡＣｈＲを含めたシナプス後構造に影響を与える遺伝的変化と関連することが報告されている（前述の非特許文献１、２参照）。そして、先天性筋無力症候群の原因となった遺伝的変化の一例として、ＭｕＳＫ遺伝子の点変異が報告されている（例えば、Ｆ．Ｃｈｅｖｅｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３，３２２９（２００４）参照）。この報告された点変異によれば、変異型ＭｕＳＫ遺伝子は、無発現対立遺伝子と、ＭｕＳＫ−ＶＭと、からなる。そこで、Ｄｏｋ−７とＭｕＳＫ−ＶＭとの相互作用について調査することとした。【０１５８】
ＭｕＳＫ−ＶＭ（ｍｙｃタグ標識）及びヒトＤｏｋ−７を、上述の方法で、２９３Ｔ細胞に導入し、形質転換２９３Ｔ細胞を作製した。次いで、この形質転換２９３Ｔ細胞から得られた全細胞可溶物（ＷＣＬ）と、この全細胞可溶物に対して免疫沈降を行って得られた免疫沈降物（ＩＰ：αｍｙｃ）とについて、ウェスタン解析を行った。使用した抗体は、上述した抗体と同じ抗体であった。この結果を図２５に示す。図２５の上側は、この解析に用いた各２９３Ｔ細胞に導入されているＤＮＡの組み合わせを示す。【０１５９】
図２５に示されるように、Ｄｏｋ−７を強制発現する形質転換２９３Ｔ細胞においては、野生型ＭｕＳＫタンパク質（ＷＴ）が野生型Ｄｏｋ−７タンパク質と結合するのに対して、変異型ＭｕＳＫタンパク質（ＶＭ）は野生型Ｄｏｋ−７タンパク質とほとんど結合しなかった。【０１６０】
以上の結果をまとめると、先天性筋無力症候群の機構として、次のような機構を推測できる。即ち、ＭｕＳＫ及び／又はＤｏｋ−７における遺伝的変化により、ＭｕＳＫとＤｏｋ−７との相互作用が減少する。この結果、筋管内におけるＡＣｈＲの密集化が阻害されるために、先天性筋無力症候群の症状が表れる。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
Ｄｏｋ−７遺伝子ＤＮＡ内における変異により先天性筋無力症候群に罹患している患者に対して、本発明のポリペプチド及び／又はＤＮＡを投与することにより、ＭｕＳＫのチロシンリン酸化、ＡＣｈＲβ１のリン酸化を介してＡＣｈＲの密集化が促進され、結果として先天性筋無力症候群を治療又は予防し得る。また、本発明のＤＮＡ塩基配列を決定することにより、先天性筋無力症候群を検査できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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