(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を２以上有する基盤ＲＮＡと、
蛋白質と、前記塩基配列に非共有結合的にかつ特異的に結合するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを含む２以上の融合蛋白質と
を含んでなるＲＮＡ−蛋白質複合体であって、
前記基盤ＲＮＡが、人工のＲＮＡ配列に、前記基盤ＲＮＡとは異なるＲＮＡ由来の配列であり、天然に存在するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を導入してなるセルフフォールディングするＲＮＡである、ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項２】
前記蛋白質が蛍光蛋白質、発光蛋白質、アポトーシス誘導蛋白質、酵素、抗体から選択される機能性蛋白質である、請求項１に記載のＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項３】
前記融合蛋白質が、前記蛋白質と、前記アミノ酸配列との間にさらにリンカーを含んでなる請求項１または２に記載のＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項４】
前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、バクテリオファージλ由来のｂｏｘＢ配列であり、前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、バクテリオファージλ由来のＮペプチド配列である請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項５】
前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、ＨＩＶ由来のＲＲＥ配列であり、前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、ＨＩＶＲｅｖ蛋白質由来の配列である請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項６】
前記セルフフォールディングするＲＮＡが、ｔｙｐｅＢ ＲＮＡを含む、請求項1に記載のＲＮＡ−蛋白質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ−蛋白質複合体、およびＲＮＡ上への蛋白質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代となった現在、多くのゲノム情報が蓄積されており、我々はそれらを利用できる状況にある。また、ＤＮＡや蛋白質を網羅的に解析するＤＮＡアレイやプロテインアレイなどが普及し、医療などへの応用が望まれている。
【０００３】
ＲＮＡ構造生物学の発展により、ＲＮＡの複雑な立体構造には階層性があり、それぞれが特定の機能を有するモジュールに分割できる事が示唆されてきた。その知見に基づき、ＲＮＡのモジュールを人工的に組み合わせ新たな機能性分子を構築する「モジュラーエンジニアリング」と、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法」を併用し、高いライゲーション活性を有するリボザイム（ＤＳＬ）が創製された（非特許文献１を参照）。さらに近年、生体内のリボソームに代表されるＲＮＡ−蛋白質複合体（ＲＮＰ）の高度な機能は、その構造に基づいている事が明らかになってきた。
【０００４】
いっぽう、蛋白質が機能を発揮する場合、他の蛋白質と結合して複合体を形成していることが多い。特に、その機能を複数同時に調節しようとする時には、蛋白質間の相対位置すなわち距離や配向は厳密に制御されている。その顕著な例が、細胞内のシグナル伝達系で見られる。分裂促進因子によって活性化されるタンパクキナーゼはＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）と呼ばれている。ＭＡＰＫの完全な活性化にはトレトニンとチロシンのリン酸化が必要であるが、このリン酸化を触媒するキナーゼはＭＡＰＫＫと呼ばれており、さらにこのキナーゼもＭＡＰＫＫＫと呼ばれる酵素によってリン酸化され活性化される。活性化したＭＡＰＫは他のタンパクキナーゼや遺伝子調節蛋白質などをリン酸化し、下流にシグナルを伝える。この三つのキナーゼは足場蛋白質に結合している。足場蛋白質が無い状態では、キナーゼは自由に拡散し、ランダムあるいは非特異的な活性化で、シグナル伝達効率が低下する。足場蛋白質存在化では、基質の活性化が容易になり、特異的なシグナルカスケードを引き起こす。また、足場蛋白質の構造がアロステリックに変化し、さらにシグナル伝達が活性化されたり、足場蛋白質が細胞膜のアダプター蛋白質と結合し、部位特異的に機能したりもしている。この種の相互作用を解析するには、蛋白質間の距離や配向を調節し、制御する必要がある。
【０００５】
蛋白質を基盤上に並べる技術は、蛋白質を網羅的に解析するプロテインアレイの普及とともに必要不可欠なものとなってきた。現在では、蛋白質の末端にタグをつけプレート上の分子と結合させる方法、ガラスや特殊な膜を用いて固定する方法が一般的である。しかし、蛋白質の機能を損なわず基盤上に固定することは非常に困難である。また、思い通りの場所に並べることができたとしても、ほとんどの場合が二次元的であり、蛋白質間の相対位置を調節したような三次元的なものではない。
【０００６】
一方近年、生体内で機能する様々なノンコーディングＲＮＡが発見され、その役割に注目が集まっている。しかしながらこれらＲＮＡは生体内で多くの場合、蛋白質と複合体（ＲＮＰ）を形成している。このことから、人工ＲＮＰは、細胞機能を制御できる新しいナノブロックとして期待されている。天然に存在するＲＮＰは、比較的短い配列から構成されるＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ（ＲＮＰ  ｍｏｔｉｆ）を利用して、多くの複合体を形成していることがわかる。例えばＨＩＶ  Ｒｅｖ蛋白質は、Ｒｅｖを認識するＲＮＡモチーフと、高い親和性で相互作用している。これらＲＮＰ相互作用モチーフを効果的に抽出し、リボザイム上に配置することで、ＲＮＡ結合蛋白質存在下でのみ触媒活性をもつ、人工ＲＮＰ酵素の作成に成功した研究も存在する（非特許文献２を参照）。したがってＲＮＰは、シンセティックバイオロジー（生体分子を人工的に創り出す作業を通して生体分子や生命システムを再構築し、新しいテクノロジーを誘発する分野）研究の素材としての利用が期待されている（非特許文献３を参照）。
【非特許文献１】Ｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．；１０１（３８）：１３７５０−５，  ２００４
【非特許文献２】Ａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０，  ５４５３，  ２００１
【非特許文献３】Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３２，１，１−７  ２００７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
蛋白質を、ＲＮＡ基盤上に、蛋白質およびＲＮＡ基盤の機能及び構造を損なわずに固定する手法は、いまだに確立されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有する基盤ＲＮＡと、蛋白質と、前記塩基配列に非共有結合的にかつ特異的に結合する天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを含む融合蛋白質とを含んでなる。
本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、ＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用部位の、ＲＮＡ側の塩基配列をいう。また、本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とは、ＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用部位の、蛋白質側のアミノ酸配列をいう。
【０００９】
前記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフが天然に存在するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフであることが好ましい。
【００１０】
前記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフが試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフであることが好ましい。
【００１１】
前記基盤ＲＮＡが機能性ＲＮＡであり、前記蛋白質が機能性蛋白質であり、前記ＲＮＡ−蛋白質複合体が多機能性複合体であることが好ましい。
【００１２】
前記融合蛋白質が、前記蛋白質と、前記アミノ酸配列との間にさらにリンカーを含んでなることが好ましい。
【００１３】
前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、バクテリオファージλ由来のｂｏｘＢ配列であり、前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、バクテリオファージλ由来のＮペプチド配列であることが好ましい。
【００１４】
前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、ＨＩＶ由来のＲＲＥ配列であり、前記天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、ＨＩＶ蛋白質由来のＲＥＶ配列であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明は別の実施形態によれば、ＲＮＡ上への蛋白質の固定化方法であって、天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列との組み合わせを選択する工程と、前記アミノ酸配列を有する蛋白質とは異なる蛋白質に、前記選択する工程で選択したアミノ酸配列を結合し、融合蛋白質を調製する工程と、前記選択する工程で選択した塩基配列を導入した基盤ＲＮＡを調製する工程と、前記融合蛋白質と、前記基盤ＲＮＡとを混合する工程とを含む。
【００１６】
前記固定化方法において、前記蛋白質が複数含まれている場合に、前記蛋白質間の距離及び／または配向性を三次元的に制御することが好ましい。また、前記三次元的な制御が、基盤ＲＮＡの配列及び／または骨格を変換することにより実施されることが好ましい。さらには、前記三次元的な制御が、蛍光共鳴エネルギー移動現象の観察結果に基づいて、基盤ＲＮＡの配列及び／または骨格を変換することにより実施されることが好ましい。
【００１７】
本発明はまた別の実施形態によれば、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察することによる、ＲＮＡ−蛋白質複合体の検出方法である。
【００１８】
本発明はさらにまた別の実施形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列をもつ任意の蛋白質を任意の順序で、基盤ＲＮＡ上に配置する方法である。
【００１９】
本発明はさらにまた別の実施形態によれば、前記ＲＮＡ−蛋白質複合体の、ＲＮＡの構造を制御することにより、ＲＮＡ上に固定化した蛋白質の機能や立体配置を制御する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の効果として、目的の機能及び構造をもつ人工ＲＮＡ上に目的の蛋白質を固定化したＲＮＡ−蛋白質複合体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。
本発明者らは天然のＲＮＡ−蛋白質間相互作用に着目し、これらを活用することによって、蛋白質を基盤上に並べる従来の手法では困難とされる、蛋白質およびＲＮＡ双方の機能及び構造を損なわずに３次元的にそれらの距離や配向を制御する方法を構築し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
本発明は第一実施形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有する基盤ＲＮＡと、蛋白質と、前記塩基配列に非共有結合的に、かつ特異的に結合するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを含む融合蛋白質とを含んでなる。
【００２３】
図１は、本発明のＲＮＡ−蛋白質複合体を示す概念図である。図１中、ＲＮＡ−蛋白質複合体１は、基盤ＲＮＡ２と、二つの融合蛋白質３、４とから構成されている。基盤ＲＮＡ２は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を備えている。融合蛋白質３、４は、それぞれ、蛋白質３０、４０と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列３１、４１と、リンカー３２、４２とから構成されている。
【００２４】
基盤ＲＮＡ２は、本実施形態におけるＲＮＡ−蛋白質複合体において、蛋白質を固定する足場となるＲＮＡである。基盤ＲＮＡ２は、特別な機能や構造を有さず、足場としての機能のみを有するＲＮＡでもよく、特定の性質を有することが知られている既存のＲＮＡ由来の配列を有していてもよく、人工的に合成した所望の特性を有するものでもよい。したがって、例えば、セルフフォールディングする強固な構造を有するＲＮＡでもよい。また、例えば、がん細胞表面の抗原を認識するＲＮＡなどの、特定の機能を有する機能性ＲＮＡを基盤ＲＮＡとすることもできる。本実施形態に用いることができる基盤ＲＮＡ２の具体例としては、ｔｙｐｅ−Ｅ  ＲＮＡ及び、ｔｙｐｅ−Ｂ  ＲＮＡが挙げられるが、これらには限定されない。
【００２５】
基盤ＲＮＡ２には、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を設ける。本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、天然の、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の配列として知られている塩基配列と、試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおけるＲＮＡ側の配列である塩基配列とが含まれる。
【００２６】
天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、約１０〜５０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｒｎａ／ｒｎａ．ｈｔｍｌから選択することができる。天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、基盤ＲＮＡ２とは異なるＲＮＡ由来の配列である。
【００２７】
【表１】
0005308787.tif 000002
【００２８】
【表２】
0005308787.tif 000003
【００２９】
人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフは、試験管内進化法により得ることができる。具体的には、試験管内進化法は、様々な配列多様性をもつ分子ライブラリーから、機能性ＲＮＡを選別し、その遺伝子（ＤＮＡ）を増幅、転写するといった反応を繰り返すことで、目的基質に特異的に結合するアプタマーや触媒活性をもつリボザイムを得ることができる。試験管内進化法で得られたＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフの例としては、以下の表３に記載のものを挙げることができる。また、データベースとして、アプタマーデータベース：ｈｔｔｐ：／／ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／が、具体的なモチーフ名としては、Ｂｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９結合ＲＮＡアプタマー由来のモチーフＲ９−２；  ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣが、文献としては、Ｙａｎｇ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６  ；２８１（１４）：９１３７−４４．が挙げられるが、これらには限定されない。
【００３０】
【表３】
0005308787.tif 000004
【００３１】
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を導入する基盤ＲＮＡ２上の位置は、所望の位置とすることができる。基盤ＲＮＡ２として、人工のＲＮＡ配列を用いる場合には、塩基配列２３、２４を導入する基盤ＲＮＡ２上の位置は自由に設計することができる。いっぽう、基盤ＲＮＡ２自体が特定の機能及び構造を有しており、それを保持する必要がある場合には、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を導入する位置は、ＲＮＡ２の機能構造を保持できる位置をコンピュータモデリングにより予測し、これをＲＮＡ−蛋白質相互作用の親和性を検出する実験（ＥＭＳＡ、ＳＰＲ実験など）により検証することにより決定することができる。
【００３２】
図１においては、基盤ＲＮＡ２上に、二つの異なるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を導入しているが、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列の数は、複合体を形成させたい所望の融合蛋白質の数によって決定することができる。例えば、同一の二つの融合蛋白質と基盤ＲＮＡ２との複合体を形成させる場合には、基盤ＲＮＡ２上に、同一の二つのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を導入することができる。
【００３３】
融合蛋白質３、４は、蛋白質３０、４０と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列３１、４１と、所望により、リンカー３２、４２とから構成することができる。蛋白質は、基盤ＲＮＡ２上に固定したい所望の蛋白質とすることができる。具体的には、特定の機能を有する蛋白質、蛍光、発光などの検出に利用できる蛋白質、特定の基質に特異的に結合する蛋白質、アポトーシスを誘導する蛋白質、酵素、抗体などを用いることができるが、これらには限定されない。
【００３４】
本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とは、天然の、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、蛋白質側の配列として知られているアミノ酸配列と、試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおける蛋白質側の配列であるアミノ酸配列とが含まれる。
【００３５】
天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列は、通常、約１０〜１００アミノ酸で構成されており、特定のＲＮＡ上の特定の塩基配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列は、上述の表１及び表２、及び上述のウェブサイト上で利用できるデータベースから選択することができる。人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列は、前記試験管内進化法により得られたものを用いることができる。
【００３６】
このようなＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列を選択する場合には、上記基盤ＲＮＡ２上に設けるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列との組み合わせで選択する。特定の組み合わせによってのみ、特異的な結合を生じさせることができるためである。融合蛋白質に導入する天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列は、通常、融合蛋白質を構成する蛋白質とは異なる蛋白質に由来する。
【００３７】
所望の場合には、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列と蛋白質との間に、リンカーを挿入することもできる。リンカーは、特に蛋白質と基盤ＲＮＡとの距離及び／又は配向を制御するために好ましく用いられる。具体的なリンカーとしては、当業者には既知のリンカー、例えば、へリックス構造を安定化するアラニンに富むリンカーや、蛋白質の構造をフレキシブルにするグリシンに富むリンカーを用いることができるが、これらには限定されない。具体的なリンカーの化学構造は、へリックス構造を安定化するＡＡＡＡを含む構造、蛋白質の構造をフレキシブルにするＧＧＧＧを含む構造などがある。
【００３８】
具体的な、天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列との組み合わせは、例えば、塩基配列がバクテリオファージλ由来のｂｏｘＢ配列であり、アミノ酸配列が、バクテリオファージλ由来のラムダＮ配列である組み合わせ、塩基配列が、ＨＩＶ  ＲＮＡ由来のＲＲＥ配列であり、アミノ酸配列が、ＨＩＶ蛋白質由来のＲＥＶ配列である組み合わせとすることができるが、これらには限定されない。また、ＢｏｘＣ／Ｄと、Ｌ７Ａｅ由来のアミノ酸配列との組み合わせも非常に好ましい。すなわち、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））が結合する塩基配列である、５’ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ３’を基盤ＲＮＡに設け、また、これに特異的に結合するＬ７Ａｅ由来のアミノ酸配列を、所望の蛋白質に結合して融合蛋白質とすることができる。
【００３９】
具体的な、人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とアミノ酸配列との組み合わせは、  ＨＩＶ  ＲＮＡ由来のＴＡＲ配列と、試験管内進化法により取得された人工蛋白質由来のＲＳＧ−１．２  ｐｅｐｔｉｄｅ配列（ＲＮＡ．  ２００５  Ｓｅｐ；１１（９）：１３６４−７３．）、試験管内進化法により取得された人工ＲＮＡ由来のＴＡＲ  アプタマー配列と、ＨＩＶ蛋白質由来のＴａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ配列  （Ｍａｔｓｕｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  ２００３  Ｍａｙ；１１（５）：５３３−４５．）が挙げられるが、これらには限定されない。
【００４０】
前記のような基盤ＲＮＡと、融合蛋白質とは、生理的条件下、具体的には、４〜３７℃、ｐＨ６．５〜８．０付近の溶液中で混合すると、ＲＮＡ−蛋白質複合体を形成する。この結合は水素結合による安定な、かつ特異的な結合である。しかし、例えば、この溶液に、ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するペプチドを添加することによって、ペプチドの濃度依存的に簡単に結合を阻害することができるという特性をも有する。具体的なＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するペプチドの化学構造は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列を有するものとすることができる。
【００４１】
本実施形態のＲＮＡ−蛋白質複合体によれば、目的の機能及び構造をもつ人工ＲＮＡ上に目的の蛋白質を自在に配置することができる。ＲＮＡと蛋白質とは、特異的、かつ非共有結合的な結合により結合されているため、従来の共有結合的な結合と比較して、フレキシブルな結合態様による複合体とすることができる。したがって、ＲＮＡ結合モチーフをもつ任意の蛋白質を自在に交換(インストール)することができるため、ＲＮＡ−蛋白質複合体のモジュラーエンジニアリングが可能となる。また、機能性のＲＮＡと機能性の蛋白質とを複合体とすることで、多機能性のＲＮＡ−蛋白質複合体を得ることができるという利点も得られる。
【００４２】
さらに、前記ＲＮＡ−蛋白質複合体の、ＲＮＡの構造を制御することにより、ＲＮＡ上に固定化した蛋白質の機能や立体配置を制御する方法を提供することができる。すなわち、特定の物質に対して、特定の構造変化を生ずるＲＮＡを基盤ＲＮＡとすることで、特定の物質によりＲＮＡの構造を制御することによって、ＲＮＡ上に固定化した蛋白質の機能や立体配置を制御することができる。具体的にどのように基盤ＲＮＡの構造を変化させることにより、蛋白質の機能や立体配置を制御するかは、コンピュータモデリングにより決定することができる。
【００４３】
本発明は、第二実施形態によれば、ＲＮＡ上への蛋白質の固定化方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列との組み合わせを選択する工程と、前記アミノ酸配列を有する蛋白質とは異なる蛋白質に、前記選択する工程で選択したアミノ酸配列を結合し、融合蛋白質を調製する工程と、前記選択する工程で選択した塩基配列を導入した基盤ＲＮＡを調製する工程と、前記融合蛋白質と、前記基盤ＲＮＡとを混合する工程とを含む。
【００４４】
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列との組み合わせを選択する工程では、前述のデータベースを利用して、特異的な結合を生ずる塩基配列とアミノ酸配列との組み合わせを選択する。選択においては、それらの解離定数（Ｋｄ）や、結合速度（Ｋｏｎ）や解離速度（Ｋｏｆｆ）などの値を考慮することができる。
【００４５】
次の工程では、アミノ酸配列を有する蛋白質とは異なる蛋白質に、前記選択する工程で選択したアミノ酸配列を結合し、融合蛋白質を調製する。係る工程では、足場となる基盤ＲＮＡ上に固定したい所望の蛋白質の、Ｎ末端やＣ末端に選択したアミノ酸配列を共有結合により結合する。このような結合は、ペプチド合成、ＰＣＲによる遺伝子操作により達成することができる。所望の蛋白質と、選択したアミノ酸配列とは、直接結合してもよく、任意のリンカーを介して結合しても良い。
【００４６】
基盤ＲＮＡを調製する工程では、選択した塩基配列を、挿入したオリゴヌクレオチドを化学合成し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどを用いて試験管内転写することにより足場となる基盤ＲＮＡに導入することができる。
【００４７】
前記融合蛋白質と、前記基盤ＲＮＡとを混合する工程では、上記のようにして得られた融合蛋白質と、基盤ＲＮＡとを、４〜３７℃、ｐＨ６．５〜８．０付近の溶液中の条件下で混合する。ＲＮＡ−蛋白質複合体は、このように単に両者を混合することにより、簡単に形成させることができる。また、複数の種類の融合蛋白質を基盤ＲＮＡに固定させたいときには、任意の順番で融合蛋白質を添加することができる。これは、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフが特異的な結合を形成するためである。このようにして形成されたＲＮＡ−蛋白質複合体は、融合蛋白質と競合するペプチドを添加することにより、簡単に解離させることができる。
【００４８】
第二実施形態にかかる方法によれば、任意の基盤ＲＮＡに、任意の蛋白質を固定することができる。
【００４９】
本発明は、第三実施形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体の検出方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察することによる方法である。
【００５０】
蛍光共鳴エネルギー移動現象は、ドナー側の発光スペクトルとアクセプター側の吸収スペクトルに重なりがある二以上の蛍光蛋白質間において、かつ、それらの蛋白質が１ｎｍから１０ｎｍの距離範囲にあるときに観察される。したがって、本発明の第一実施形態によるＲＮＡ−蛋白質複合体において、励起波長と蛍光波長が異なる二以上の蛍光蛋白質が基盤ＲＮＡに１ｎｍから１０ｎｍの距離範囲内で結合されている場合において、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察することにより、ＲＮＡ−蛋白質複合体が、デザインした距離と配向性を有していることを確認することができる。
【００５１】
また、かかるＲＮＡ−蛋白質複合体の検出方法は、別の形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体に、該蛋白質の競合ペプチドを添加する工程と、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察することにより蛍光の消失の存在を確認する工程とを含む。かかる方法においては、蛍光共鳴エネルギー移動法により蛍光が検出されることが知られているＲＮＡ−蛋白質複合体を用いる。そして、蛋白質の競合ペプチドを添加したときに、蛍光が消失することによって、蛋白質がデザインした１ｎｍから１０ｎｍの距離範囲内で基盤ＲＮＡに結合し、競合ペプチドの添加により、蛋白質が基盤ＲＮＡから解離していることが明らかになる。
【００５２】
第三実施形態かかる方法によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体の作製において、蛋白質の固定化を確認することができる他、ＲＮＡ上に配置した、蛋白質間の距離や配向性が適切か否かを検証することができるという利点がある。
【００５３】
上記第三実施形態にかかる方法の応用として、同一の蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有し、異なる足場配列を有する複数のＲＮＡに対して、同一の蛋白質を添加してＲＮＡ−蛋白質複合体を形成させ、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察することによる、分子設計方法が挙げられる。
【００５４】
図１を参照して説明する。基盤ＲＮＡ２上に、二つの異なるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２３、２４を導入することができる。本実施形態においては、塩基配列２３と塩基配列２４との距離が異なる複数の基盤ＲＮＡを設計する。具体的には、塩基配列２３と塩基配列２４と間に存在する塩基数が異なる複数の基盤ＲＮＡを設計する。設計は、上記第一実施形態で説明したように、コンピュータモデリングで実施することができる。そして、設計した複数の基盤ＲＮＡを合成する。次に、合成した複数の基盤ＲＮＡのそれぞれに対し、異なる二つの融合蛋白質３、４を添加し、蛍光共鳴エネルギー移動現象を観察する。この測定結果により、二つの融合蛋白質３、４の分子間距離が測定され、基盤ＲＮＡ２上で、所望の最適な距離に、二つの融合蛋白質３、４を配置することが可能になる。
【００５５】
本方法によれば、溶液中の三次構造における、基盤ＲＮＡ２に特異的に結合する複数の融合蛋白質間の距離及び配向を測定することができる。これにより、溶液中での生体物質の反応場制御等が可能になり、例えば、ＲＮＡをスキャッホールドとして、リン酸化反応カスケードを担う蛋白質をＲＮＡ上に適切に配置させ、一群の蛋白質からなる化学反応をＲＮＡにより制御できるといった応用が可能となる。
【００５６】
ここでは、二つの融合蛋白質を配置する場合について説明したが、三つ以上の異なる融合蛋白質を基盤ＲＮＡ２上に配置する場合には、ＲＮＡ上の三つ以上の適切な位置に異なる三つ以上のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を導入すればよい。このようなモチーフは天然配列、または試験管内進化法により得た人工配列を自在に利用することができる。
【００５７】
このように、第一実施形態から第三実施形態に具体的に説明した本発明によれば、ＲＮＡ結合モチーフをもつ蛋白質が、自在に入れ替え可能である、すなわちインストールできるという特長を有する。このようなＲＮＰのモジュール性を利用することにより、様々な応用が可能となる。例えば、本発明にかかるＲＮＡ−蛋白質複合体を用いてセンシング、スイッチ、機能性分子として利用することもできる。さらには、ＲＮＡの配列を制御することによって、自律的に立体構造を構築させ、その立体構造上に含まれる蛋白質結合ＲＮＡモチーフを、目的とする蛋白質のポリペプチドと相互作用させることによって、（複数の）蛋白質の機能を損なわずに距離および配向を制御して固定化させる方法を実現することができる。
【００５８】
以下の実施例において、モジュラーエンジニアリングを利用した機能性人工ＲＮＡ−蛋白質複合体の作製の方法を示す。本手法は、天然のＲＮＡ−蛋白質間相互作用を活用し、コンピュータモデリングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの人工ＲＮＡ−蛋白質複合体の設計に基づき、蛋白質機能構造を損なわずに３次元的に基盤ＲＮＡ上に融合蛋白質を固定化し、その距離や配向を制御する技術である。以下に、具体的な実験例を挙げて説明する。
【実施例１】
【００５９】
［コンピュータモデリングによるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体の設計］
【００６０】
ＲＮＡ−蛋白質複合体の分子設計は分子モデリングソフトウェア、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ１．７（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて下記の通り行った。まず、ＮＭＲ解析によりＲＮＡとの複合体の構造が解明されている２つのアルギニンリッチモチーフ、バクテリオファージλＮ（ＩＤ：１ＱＦＱ）とＨＩＶ  Ｒｅｖ（ＩＤ：１ＥＴＧ）の両ペプチドの構造をＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）から取得し、結合に必要な領域であるλＮの１−１９残基、ＨＩＶ  Ｒｅｖの３４−５０残基（配列番号２）を表示させた。次に、λＮペプチドのＣ末端に蛍光蛋白質であるＹＦＰ（ＩＤ：２ＹＦＰ）を、ＨＩＶ  ＲｅｖペプチドのＮ末端に同じく蛍光蛋白質であるＣＦＰ（ＩＤ：１ＯＸＦ）を、アラニンを４つリンカーとして付加することで結合させ、融合させた。また、後述するがλＮの結合力を向上させるためにλＮのＮ末端４残基Ｍ−Ｄ−Ａ−ＱをＧ−Ｎ−Ａ−Ｒに置換した（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ；  Ｊ．ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．  ２００２，  １２４，  １０９６６−１０９６７）（配列番号１）。また、ＨＩＶ  ＲｅｖのＣ末端には、αヘリックスの形成能を向上させ、結合力を増加させるため、アラニンを４つ付加させてある（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ；  Ｃｅｌｌ．１９９３，７３，１０３１−１０４０）。こうして図２（Ａ）（Ｂ）に示す二つの融合蛋白質を作製した。
【００６１】
次に、λＮおよびＨＩＶ  Ｒｅｖが結合するＲＮＡはそれぞれｂｏｘＢおよびＲＲＥであるが、コンピュータモデリング上で２つの蛍光蛋白質ＹＦＰおよびＣＦＰの発色団の距離が近接する（５．３５ｎｍ）ようにシミュレーションを行った。その結果、ｂｏｘＢの配列とＲＲＥの配列からループ部分を除いた４４−５２，６６−７６塩基の部分の配列を余分な塩基対を介さずに直接隣接させたときが最も近接したので直接結合させた。また、基盤ＲＮＡの二次構造を安定させるためＲＲＥのｂｏｘ  Ｂに隣接していない側に３塩基対付加した。また、ＲＮＡ作製の際、プライマー伸長法の副産物の生成を抑制するため末端を非ワトソンクリック塩基対のＧ−Ｕペアとし、３’末端にＵを２個付加した。こうして完成させた基盤ＲＮＡをｔｙｐｅＥ  ＲＮＡとした（図３（Ａ））。このようにして本手法のモデルとなるｔｙｐｅＥ  ＲＮＰを作製した（図４）。
【実施例２】
【００６２】
［人工ＲＮＡ−蛋白質複合体の作製］
［ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡ及びその変異体の作製］
Ｔｙｐｅ  Ｅ  ＲＮＡ（配列番号３）は、Ｔ７プロモーターを含むセンス側のプライマーとそれとハイブリダイズするアンチセンス側のプライマーの２本（配列番号４、５）を、グラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、ハイブリダイズ、伸張させた。１００μＬ反応液には、各１００μＭ  ＤＮＡプライマー  ２μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを８μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  １０×バッファー  １０μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ製）０．５μＬが混合してあり、９４℃  １分、６３℃  ３０秒、７２℃  １分を１０サイクルで行った。反応後、フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、２０μＬの超純水に溶解し、転写の鋳型として用いた。後述するＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）に用いる際に３２Ｐで放射性標識する場合には、反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  スペルミジン，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１．２５ｍＭ  ＡＴＰ，１．２５ｍＭ  ＣＴＰ，１．２５ｍＭ  ＵＴＰ，０．２５ｍＭ  ＧＴＰ，［３２Ｐ−α］ＧＴＰ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製），２０Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ製），Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ条件下、３７℃、３時間から一晩で行った。ＦＲＥＴ測定に用いる際に放射性標識しない場合には、同じ鋳型ＤＮＡを用いて、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いて、転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型ＤＮＡ  ８μＬ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合した全２０μＬを３７℃で２時間から一晩反応させた。
【００６３】
反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１５分インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。反応液に、１１５μＬの超純水と１５μＬ  酢酸アンモニウムストップ溶液を加え、さらにフェノール処理、ジエチルエーテル抽出、エタノール沈殿を行い精製した。放射性標識したＲＮＡもしていないＲＮＡもエタノール沈殿後、変性色素２０μＬ（８０％ホルムアミド，０．１７％ＸＣ，０．２７％ＢＰＢ）に溶解させ、１０％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのゲルを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０））を加え、３７℃、一晩溶出を行った。溶出したＲＮＡは再びフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行って精製した。
【００６４】
また、基盤ＲＮＡとしてｔｙｐｅＥ  ＲＮＡに加え、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に変異を導入した変異体も作製した。すなわち、ｂｏｘＢもしくはＲＲＥに変異を導入することにより、λＮもしくはＲｅｖの結合を阻害した変異体ｍｕｔ−ｂｏｘＢ  ＲＮＡ（配列番号６）（図３（Ｂ））およびｍｕｔ−ＲＲＥ  ＲＮＡ（配列番号９）（図３（Ｃ））、ｂｏｘＢとＲＲＥの両者に変異を導入することによりλＮとＲｅｖの両者の結合を阻害したｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ＲＮＡ（ＤＭ  ＲＮＡ）  （配列番号１２）（図３（Ｄ））、以上三種類の変異体をＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの作製のときと同様にＴ７プロモーターを含むセンス側のプライマーとそれとハイブリダイズするアンチセンス側のプライマーの２本（配列番号７、８、１０，１１、１３，１４）を、グラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、ハイブリダイズ、伸張させて作製し、以下の実験にコントロールとして用いた。図３中、ｍｕｔは、変異を含む配列を示す。
【００６５】
［融合蛋白質の作製］
初めにλＮ遺伝子とＨＩＶ  Ｒｅｖ遺伝子を、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ−３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にＲａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いて連結した。このプラスミドをそれぞれＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで切断し、同じ制限酵素で切断したＹＦＰ遺伝子とＣＦＰ遺伝子をそれぞれ連結することによりｐλＮ−ＹＦＰ及びｐＣＦＰ−Ｒｅｖを得た。ここで、ＣＦＰもしくはＹＦＰ遺伝子は、ｐＥＣＦＰもしくはｐＥＹＦＰプラスミド（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ製）からＰＣＲで増幅した。また、ｐＮ−ＹＦＰおよびｐＣＦＰ−ＲｅｖプラスミドはＣ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ×６）が挿入されている。なお、ＣＦＰとＲｅｖならびにＮとＹＦＰを融合する際、両蛋白質の間にリンカー部位グリシン、トレオニンが導入されている。これは、発現ベクターに制限酵素部位を導入するためであり、リンカー部位の塩基配列は制限酵素ＫｐｎＩの切断部位を含んでいるからである。続いて、リンカーのアミノ酸配列をアラニン４残基に変更した方法について述べる。まず、適切な塩基配列を持つプライマー（配列番号２８、２９、３１、３２）を用いてＰＣＲを行い、改変したリンカーを連結させたλＮ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ後、λＮ遺伝子はＸｂａＩとＫｐｎＩを用いて、Ｒｅｖ遺伝子はＫｐｎＩとＢａｍＨＩを用いて切断し、それぞれを同じ制限酵素で切断したｐＮ−ＹＦＰまたはｐＣＦＰ−Ｒｅｖに連結して発現ベクターを得た（配列番号２７、３０）。
【００６６】
そうして得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。得られたコロニーに、インサートが含まれるか調べるために、以下の手順でコロニーダイレクトＰＣＲを行った。反応液２０μＬには、各１０μＭ  プライマー  １μＬ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．６μＬ、１０×ｔａｑ  バッファー  ２μＬ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ製）０．１μＬが混合してあり、９４℃  １分、６０℃  １分、７２℃  １分を３０サイクルで行った。反応後、２％アガロース電気泳動で、インサートを確認したコロニーを用いて、発現を行った。
【００６７】
１％グルコース、５０μｇ／μＬアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振蕩培養した。続いて培養液５００μＬを１％グルコース、５０μｇ／μＬ  アンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍＬに植え継いだ。Ｏ．Ｄ．５５０が０．４〜０．６になるまで３７℃で振蕩培養し、その後、発現誘導するために１ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、２５℃で８時間振蕩培養した。遠心分離で菌体を回収し、ソニケーションバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、超音波処理を行い、菌体を破砕した。なお、超音波処理は、氷上で冷却後、１５秒間超音波を当てる、という操作を６回繰り返した。遠心分離により、上清を回収し、ヒスチジンタグが付いた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて次のように精製した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムにヒスチジンタグで吸着した融合蛋白質を洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）３ｍＬで３回洗浄した。その後溶出バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、各５０ｍＭ，１００ｍＭ，２００ｍＭ，３００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）各１ｍＬ×２回で段階的に溶出させた。確認はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。続いて、マイクロコンＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて、蛋白質の濃縮及び３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）でバッファーの置換を行った。精製したタンパク質は、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）バッファーで適当な濃度に溶解し、−８０℃で保存した。また、蛋白質の濃度はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。
【実施例３】
【００６８】
［ＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）によるＲＮＡ−蛋白質複合体形成の確認］
反応は最終濃度が２０ｎＭ  ＲＮＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１Ｕ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０〜２０００ｎＭ蛋白質となるよう、以下の条件で行った。まず３２Ｐで標識した１００ｎＭ  ＲＮＡ  ４μＬを９０℃  ５分で変性した後、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５Ｕ／μＬ  ｔＲＮＡ、５０％グリセロール）４μＬ、超純水を加えた後、蛋白質と混合し、全量を２０μＬとした。混合後、反応溶液を氷上で１５分間放置した。色素（０．２５％  ＢＰＢ、０．２５％  ＸＣ、３０％  グリセロール）を１μＬ加え、４℃の冷蔵庫の中で、１０％  非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を３〜４時間行った。試料の拡散を防ぐために、初めの１５分は、４００Ｖで泳動し、その後３００Ｖに切り替えた。ゲルの放射線量の強さをＢｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＡＳ２５００；富士写真フィルム製）で解析した。結果、ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡにおいて設計通り基盤ＲＮＡ上に融合蛋白質が２つ結合していることを示唆する結果が得られた（図５（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）、及び図６）。
【実施例４】
【００６９】
［ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー移動）測定によるＲＮＡ−蛋白質複合体設計の評価］
［ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡ及びＤＭ  ＲＮＡでのＦＲＥＴ測定］
反応は最終濃度が１００ｎＭ  ＲＮＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１Ｕ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、５００ｎＭ蛋白質となるよう、以下の条件で行った。ＲＮＡ以外の試料は、氷上放置し冷やして用いた。１μＭ  ＲＮＡ  ２１μＬを９０℃  ５分で変性させ、超純水６３μＬと、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５Ｕ／μＬ  ｔＲＮＡ）を４２μＬ加え、よく混合した後、卓上遠心機でスピンダウンした。続いて２．５μＭ  各蛋白質を４２μＬ混合し全量を２１０μＬとして卓上遠心機でスピンダウンした後、遮光したサンプルケースに入れ、室温で３０分放置した。
【００７０】
反応後、試料をゲルローディング用チップ（２００μＬ）で１００μＬ採取し、０．５ｍｍ×０．５ｍｍの石英セルに空気に注意しながら静かに入れ、蛍光分光器ＦＰ−６５００（日本分光）を用いて、次のような条件で蛍光測定を行った。測定条件は、測定モードＥｍｉｓｓｉｏｎ、励起バンド幅  ５ｎｍ、蛍光バンド幅  ５ｎｍ、レスポンス０．２ｓｅｃ、感度  Ｍｅｄｉｕｍ、測定範囲４００−６００ｎｍ、データ取込間隔  ０．１ｎｍ、励起波長  ４３３．０ｎｍ、走査速度  ２００ｎｍ／ｍｉｎ、繰返し回数  １回。温度調節器は感度が下がるため、用いなかった。石英セルの洗浄は、アスピレーターを使って超純水で三回行った。測定は少なくとも２回以上行った。ＦＲＥＴの評価は、スペクトルデータの定性的結果を得るため、ＣＦＰの放出波長のマイナーピークである５０４ｎｍで規定化を行い、その相対的比較を行った。また、５２７ｎｍの蛍光強度と４７５ｎｍの蛍光強度の比をＦＲＥＴ  ｖａｌｕｅの指標として用い、解析を行った。結果、ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡにおいてｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡでは見られなかった４７５ｎｍの蛍光強度が減少し、５２７ｎｍの蛍光強度が増加するというＦＲＥＴ特有の現象が見られた（図７）。これは設計通りに基盤ＲＮＡ上に２つの蛋白質が機能を損なわずに結合できていることを示唆するものである。
【００７１】
さらに、ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡ及びｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡにおいてＲＮＡ濃度を０〜３００ｎＭまで変化させ、ＦＲＥＴ効率への影響を調べた。結果、ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡにおいて図８のようにある濃度まではＦＲＥＴ効率が濃度依存的に上昇していくが、ある濃度を越えると減少していく結果が得られた。これはある程度の濃度までは基盤ＲＮＡ上に２つの融合蛋白質が結合した複合体の割合が増加していく結果を示唆するが、さらに基盤ＲＮＡを増やすと片方の融合蛋白質のみが結合した複合体の割合が上昇していく、などの理由でＦＲＥＴ効率の減少に影響していると見られる。
【００７２】
［ペプチドによるＦＲＥＴ競合実験］
λＮ−ＹＦＰ、ＣＦＰ−Ｒｅｖ両融合蛋白質の代わりに、λＮペプチド及びＲｅｖペプチドを用いて結合のＦＲＥＴ競合実験を行った。手順は上記と同様である。結果、１００ｎＭ  ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡに対し、５μＭまたは１０μＭのペプチドにより、ＦＲＥＴ強度の減少が確認された（図９、１０）。このことは、配列特異的に基盤ＲＮＡ上に２つの融合蛋白質が結合しているという結果であり、上記の実験結果を裏付けるものである。
【実施例５】
【００７３】
［ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡへの本手法の適用及びその評価］
［ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡの設計］
単純にＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を繋いだだけのｔｙｐｅＥ  ＲＮＡだけでなく、以前我々の研究室で取得したＤＳＬリボザイムのＲＮＡ骨格に用いたセルフフォールディングするｔｙｐｅＢ  ＲＮＡ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１０，５２７−５３４，２００２）を基盤ＲＮＡとするＲＮＡ−蛋白質複合体も設計した。設計はｔｙｐｅＥ  ＲＮＡのときと同様にＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ１．７（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を使用して以下のように行った。まず、ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡの設計のときと同様に、上部の構造安定化モジュールとして、テトラヒメナ・グループＩイントロンのＧＡＡＡテトラループ−１１ｎｔレセプター相互作用構造をＰＤＢから取得し（ＩＤ：１ＧＩＤ）、下部の構造安定化モジュールとして、テトラヒメナ・グループＩイントロンのＰ４−Ｊ６／７部分のベーストリプル構造をＰＤＢから取得した（ＩＤ：１ＧＲＺ）。
【００７４】
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列の導入場所として、１１ｎｔレセプターの上部、１１ｎｔレセプターとＴｒｉｐｌｅ  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（ＴＨＳ）の間の部分を選択し、そこへそれぞれｂｏｘＢ−λＮ、ＲＲＥ−ＲｅｖのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を導入した。コンピュータモデリング上で２つの蛍光蛋白質ＹＦＰおよびＣＦＰの発色団の距離が近接する（５．３９  ｎｍ）ようにシミュレーションを行った。それぞれに蛍光蛋白質ＹＦＰとＣＦＰを融合させたのもｔｙｐｅＥのときと同様である。さらに、これらのモジュール間を繋ぐ際に、モチーフの導入による設計上の構造の歪みを解消するため、ステムの中に２つのｋｉｎｋを含み、直線的なヘリックス構造を取らずに少しカーブしたような構造を取ることがＸ線構造解析から知られている［Ｕ（ＵＡ）６Ａ］２を用いることにした（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｏｌ．２０９，４５９−４７４，１９８９）（ＩＤ：１ＲＮＡ）。また、ステムの末端を繋ぐループは、ＵＵＣＧテトラループ構造をＰＤＢより取得し（ＩＤ：１Ｆ７Ｙ）、望みの塩基配列に置換させたものを用いた（図１１（ａ）（ｂ））。こうして、コンピューター上でｔｙｐｅＢ  ＲＮＡ−蛋白質複合体の設計を行った（図１１（ｃ））。
【００７５】
また、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡが期待通りに三次相互作用に依存してコンパクトな構造になるか調べるため以下の実験に使用する３つの変異体であるＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１（図１２（Ｂ））、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ＋１（図１２（Ｃ））、Ｍｕｔ  １１ｎｔＲ  ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ）（図１２（Ａ））を作製した。Ｔｙｐｅ  Ｂ  ＲＮＡ−１とＴｙｐｅ  Ｂ  ＲＮＡ＋１は、デザインの正確性から１塩基程度のズレは生じる可能性があると考え、１１ｎｔレセプターのＧＡＡＡテトラループに対する相対位置が１塩基対分だけ上下にズレている変異体である。また、Ｍｕｔ  １１  ｎｔＲ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ＲＮＡは、１１ｎｔレセプター部分を単純なステム構造に置換することにより、ＧＡＡＡテトラループとの相互作用を破壊した変異体である。
【００７６】
［ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡの作製］
ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ（配列番号１５）に関しては、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ  ｆｗ（配列番号１６）プライマーとＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ  ｒｅｖプライマー（配列番号１７）の２本を、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて、ハイブリダイズ、伸張させた。反応には、各１００μＭ  ＤＮＡプライマー  ２μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを８μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  １０×バッファー  １０μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ  ｔａｑ、ＴＡＫＡＲＡ製）０．５μＬを使用した。以上の条件で、９４℃  １分、６０℃  ３０秒、７２℃  １分を１５サイクルの反応を行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断させ、再びフェノール処理、エタノール沈殿を行い、ＬＭＰアガロース電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し精製した。Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断させたｐＵＣ１１８ベクターにクローニングした。Ｔｙｐｅ  Ｂ  ＲＮＡの変異体であるＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１（配列番号１８）、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ＋１（配列番号２１）、ｍｕｔ  １１ｎｔＲ  ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ（配列番号２４）に関しては、ｐＴｙｐｅＢ  ＲＮＡプラスミドを鋳型とし、５’末端にＢｓａＩに認識、切断される制限酵素部位を導入したプライマー（配列番号１９、２０、２２、２３、２５、２６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応バッファー（５０μＬ）の組成は、各１０μＭ  ＤＮＡプライマー２．５μＬ、２ｍＭｄＮＴＰを８μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μＬ、ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ  １０×バッファー  ５μＬ、鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  ｔａｑ、ＴＡＫＡＲＡ）０．５μＬであった。この時、ＬＡ  ｔａｑを用いたのは、ＡＵリッチな配列を含むため、二次構造形成による伸張反応の阻害を防ぐためである。以上の条件で、９４℃  ３０秒、５８℃  ３０秒、７２℃  ４分を２５サイクルの反応を行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、ＬＭＰアガロース電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し精製した。その後ＢｓａＩで処理し、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）により自己環化させ、プラスミドを再構築した。
【００７７】
これらのプラスミドの配列確認は、Ｂｃａ  ＢＥＳＴＴＭ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用い、ダイデオキシ法によって行った。シークエンス反応は、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトの両端に位置するプライマーであるＭ１３、Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅを用いた。反応後の試料をエタノール沈殿により回収し、ＡＬＦ  ｅｘｐｒｅｓｓＩＩ（Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）により挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡやその１１ｎｔレセプター変異体に関しては、プラスミドに組み込む際に、５’末端にＴ７プロモーター配列を付加していたため、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し直鎖状にしたものを鋳型ＤＮＡとして用いてＴｙｐｅＥ  ＲＮＡと同様に転写反応を行った。エタノール沈殿後、変性色素２０μＬ（８０％ホルムアミド，０．１７％ＸＣ，０．２７％ＢＰＢ）に溶解させ、５％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのゲルを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０））を加え、３７℃、一晩溶出を行った。溶出したＲＮＡは再びフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行って精製した。
【００７８】
［ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡ及びその変異体の構造の確認］
デザインしたＴｙｐｅＢ  ＲＮＡとこれらの変異体を用い、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＴｙｐｅＢ  ＲＮＡが期待される構造を取りうるかどうか検討した。非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うと、非変性ゲル中でのＲＮＡの移動度はそのＲＮＡの大きさや形で決まるため、長さが同じ程度のＲＮＡ分子を泳動した場合、よりコンパクトな立体構造を取る分子ほど泳動度が大きくなる。そのため、ＲＮＡ立体構造のコンパクトさを相対的に比較するために有効な手段である。また、ＧＡＡＡテトラループ−１１ｎｔレセプターはマグネシウムイオン濃度依存的に相互作用が強くなることが知られていることから、マグネシウムイオン濃度を０ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭと変化させて非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。以下具体的な手順を示す。超純水５μＬに３２Ｐで標識したＲＮＡ１μＬ（２００００ｃｐｍ）を加え、８０℃，５ｍｉｎ加熱して変性させた。室温まで冷却させた後、１０×緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ（ｐＨ７．５），任意濃度の１０倍のＭｇ（ＯＡｃ）２）を０．５μＬ加え、３０℃，３０ｍｉｎかけてＲＮＡをフォールディングさせた。１μＬの色素マーカー（１８％グリセリン，０．５％  ＸＣ）を加え、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルは５％ポリアクリルアミド（３９：１）を用いて作製し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ（ｐＨ７．５），任意濃度のＭｇ（ＯＡｃ）２を含むバッファーを使用して２００Ｖ  ３分でサンプルをゲル中に素早く泳動させ、発熱を防ぐために７５Ｖで４〜７時間泳動した。Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含まない場合にはゲル、緩衝液の両方に最終濃度が０．１ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加した。また、長時間の泳動により上下の泳動層のバッファー組成に違いが出るのを防ぐために、ペリスタポンプを用いてバッファーを循環させた。ゲルの放射線量の強さをＢｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＡＳ２５００；富士写真フィルム製）で解析した。
【００７９】
結果、マグネシウムイオン濃度が０ｍＭでは、移動度に差はほとんど見られなかったのに対し、マグネシウムイオンを含んだ非変性ゲルでは、ＲＮＡ相互作用を破壊したｍｕｔ  １１ｎｔＲ  ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡに比べ、その他のＲＮＡの移動度が大きくなった（図１３（ａ）（ｂ）（ｃ）、図１４）。これは、ＲＮＡの三次元的な相互作用を意味する。ループ−レセプターの相対位置の変化の影響を見てみると、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１とＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ＋１がほぼ同程度の移動度を示したのに対し、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１は少し移動度が小さかった。このことは、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１が他の二種類のＲＮＡと比べてループ−レセプター相互作用が弱いことを示している。以上の結果より、デザインしたＲＮＡは期待通りに三次相互作用に依存してコンパクトな構造になることが示された。
【００８０】
［ＥＭＳＡによるｔｙｐｅＢ  ＲＮＡ−蛋白質複合体形成の確認］
ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡのときと全く同様の手順で行った。結果、ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡにおいても設計通り基盤ＲＮＡ上に融合蛋白質が２つ結合していることを示唆する結果が得られた（図１５（ａ）（ｂ）、図１６）。
【００８１】
［ＦＲＥＴ測定によるｔｙｐｅＢ  ＲＮＡ−蛋白質複合体設計の評価］
ｔｙｐｅＥ  ＲＮＡのときと全く同様の手順で行った。結果、ｔｙｐｅＢ  ＲＮＡにおいても４７５ｎｍの蛍光強度が減少し、５２７ｎｍの蛍光強度が増加するというＦＲＥＴ特有の現象が見られた（図１７、図１８）。以上のことから、基盤ＲＮＡとして単純にＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を並べただけの構造のみならず、設計したセルフフォールディングするＲＮＡの目的の位置にＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を入れ、蛋白質を結合させる事にも成功した。
【実施例６】
【００８２】
［ＲＮＡ及び融合蛋白質の調製］
実施例１と同様にして、図３（Ａ）に示すｔｙｐｅ−Ｅ  ＲＮＡ（配列番号３  ｇｇｃｃｕｇｇｇｃｇ  ｃａｇｃｃｃｕｇａａ  ｇａａｇｇｇｃｕｇａ  ｃｇｇｕａｃａｇｇｃ  ｕｕｕ）、及び図３（Ｄ）に示すｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ＲＮＡ（ＤＭ  ＲＮＡ）  （配列番号１２）を作製した。また、同様にして、図１９（ａ）に示す、ｔｙｐｅ−Ｅ−２  ＲＮＡ（配列番号３３  ｇｇｃｃｕｇｇｇｃｇ  ｃａｃｃｕｇａａ  ｇａａｇｇｕｇａ  ｃｇｇｕａｃａｇｇｃ  ｕｕｕ）、図１９（ｂ）に示す、ｔｙｐｅ−Ｅ−３  ＲＮＡ（配列番号３４  ｇｇｃｃｕｇｇｇｃｇ  ｃａｃｕｇａａ  ｇａａｇｕｇａ  ｃｇｇｕａｃａｇｇｃ  ｕｕｕ）、図１９（ｃ）に示す、ｔｙｐｅ−Ｅ−４  ＲＮＡ（配列番号３５  ｇｇｃｃｕｇｇｇｃｇ  ｃａｕｇａａ  ｇａａｕｇａ  ｃｇｇｕａｃａｇｇｃ  ｕｕｕ）を作製した。
実施例１と同様にして、図２（Ａ）（Ｂ）に示す二つの融合蛋白質を作製した。得られた蛋白質（Ａ）λ−ＹＦＰの配列を、配列番号３６に、得られた蛋白質（Ｂ）ＣＦＰ−ＲＥＶの配列を配列番号３７に示す。
【００８３】
［コンピュータモデリングによる機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体］
実施例１と同様の方法で、ｔｙｐｅ−Ｅ  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−２  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−３  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−４  ＲＮＡのそれぞれと、融合蛋白質との複合体のモデリングを行った。この結果を、図２０、２１、２２に、それぞれ示す。モデリングの結果、ｔｙｐｅ−Ｅ  ＲＮＡに二つの融合蛋白質を結合させたときの両融合蛋白質間の発色団間の距離は、約５．７ｎｍであった。なお、発色団間の距離とは、ＣＦＰ蛋白質の６６番目のアミノ酸残基であるチロシンと、ＹＦＰ蛋白質の６６番目のアミノ酸残基であるトリプトファンとの距離をいう。図２０に示すモデリングの結果、ｔｙｐｅ−Ｅ−２  ＲＮＡに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約４．６ｎｍであった。図２１に示すモデリングの結果、ｔｙｐｅ−Ｅ−３  ＲＮＡに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約３．１ｎｍであった。図２２に示すモデリングの結果、ｔｙｐｅ−Ｅ−４  ＲＮＡに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約１．９ｍｍであった。なお、図２２において、実際には、λ−ＹＦＰは、ＲＮＡに結合していないことが、ゲルシフトアッセイによる実験（図示せず）により確認された。
【００８４】
［ＦＥＲＴアッセイ］
上記５種類のＲＮＡと、二つの融合蛋白質との複合体、及びＲＮＡを加えない融合蛋白質のみの系のＦＥＲＴ測定を、実施例４と同様の方法により行った。具体的には、反応は最終濃度が１００ｎＭ  ＲＮＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１Ｕ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、５００ｎＭ蛋白質となるよう、以下の条件で行った。ＲＮＡ以外の試料は、氷上放置し冷やして用いた。１μＭ  ＲＮＡ  ２１μＬを９０℃  ５分で変性させ、超純水６３μＬと、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５Ｕ／μＬ  ｔＲＮＡ）を４２μＬ加え、よく混合した後、卓上遠心機でスピンダウンした。続いて２．５μＭ  各蛋白質を４２μＬ混合し全量を２１０μＬとして卓上遠心機でスピンダウンした後、遮光したサンプルケースに入れ、室温で３０分放置した。反応後、試料をゲルローディング用チップ（２００μＬ）で１００μＬ採取し、０．５ｍｍ×０．５ｍｍの石英セルに空気に注意しながら静かに入れ、蛍光分光器ＦＰ−６５００（日本分光）を用いて、次のような条件で蛍光測定を行った。測定条件は、測定モードＥｍｉｓｓｉｏｎ、励起バンド幅  ５ｎｍ、蛍光バンド幅  ５ｎｍ、レスポンス０．２ｓｅｃ、感度  Ｍｅｄｉｕｍ、測定範囲４００−６００ｎｍ、データ取込間隔  ０．１ｎｍ、励起波長  ４３３．０ｎｍ、走査速度  ２００ｎｍ／ｍｉｎ、繰返し回数  １回。温度調節器は感度が下がるため、用いなかった。石英セルの洗浄は、アスピレーターを使って超純水で三回行った。測定は少なくとも２回以上行った。ＦＲＥＴの評価は、スペクトルデータの定性的結果を得るため、ＣＦＰの放出波長のマイナーピークである５０４ｎｍで規定化を行い、その相対的比較を行った。また、５２７ｎｍの蛍光強度と４７５ｎｍの蛍光強度の比をＦＲＥＴ  ｖａｌｕｅの指標として用い、解析を行った。
【００８５】
結果を、図２４、２５に示す。グラフが示すように、ｔｙｐｅ−Ｅ  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−２  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−３  ＲＮＡの順にＦＲＥＴ強度が上昇したことがわかる。これは、蛍光蛋白質間の発色団の距離が短い程ＦＲＥＴ効率が高くなることに起因する。いっぽう、ＲＮＡを添加しなかった系、ＤＭ  ＲＮＡ、ｔｙｐｅ−Ｅ−４  ＲＮＡは、いずれも低いＦＲＥＴ強度を示すことがわかった。この結果から、ＤＭ  ＲＮＡ及びｔｙｐｅ−Ｅ−４  ＲＮＡでは、二種の融合蛋白質がＲＮＡに結合していないことが示唆される。
このように、二つの融合蛋白質とこれが特異的に結合する配列を有するＲＮＡとのＲＮＡ−蛋白質複合体と、ＦＲＥＴ測定を用いることにより、ＲＮＡ上に目的の複数の蛋白質を、距離と配向性を制御して自在に配置させる技術が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の活用例として、この技術は、目的の機能構造をもつ人工ＲＮＡを分子デザインにより創出し、そのＲＮＡ上に目的の蛋白質を自在にインストールできるため、ＲＮＡ−蛋白質複合体の機能変換や、目的・用途に合わせてＲＮＡ−蛋白質間相互作用を複数導入し、多機能性アプタマーなどの新規分子を作製する事ができる可能性がある。ＲＮＡと蛋白質は化学的に安定な物質であり、またグラム単位での合成が可能な他の有機材料と同等の実用的な材料であるため、シンセティックバイオロジーとして医療、環境への応用のほか、さらにはナノテクノロジーの機能性新材料としてエレクトロニクス、イメージングなどへの新たな材料を提供することも可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の一実施形態によるＲＮＡ−蛋白質複合体を示す模式図である。
【図２】図２Ａは、ＹＦＰを有する融合蛋白質を表す模式図であり、図２Ｂは、ＣＦＰを有する融合蛋白質を表す模式図である。
【図３】図３Ａは、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの二次構造を表す模式図であり、図３Ｂは、ｍｕｔａｎｔ  ｂｏｘＢ  ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの二次構造を表す模式図であり、図３Ｃは、ｍｕｔａｎｔ  ＲＲＥ  ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの二次構造を表す模式図であり、図３Ｄは、ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  （ＤＭ）  ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの二次構造を表す模式図である。
【図４】コンピュータモデリングによるＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの設計図である。
【図５】図５Ａは、λＮ−ＹＦＰとＴｙｐｅＥ  ＲＮＡの結合力が弱いことを表し、図５Ｂは、λＮ−ＹＦＰにアミノ酸置換を施したＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰがＴｙｐｅＥ  ＲＮＡと相互作用する結合力が強いことを表し、図５Ｃは、ＣＦＰ−ＲｅｖがＴｙｐｅＥ  ＲＮＡと相互作用する結合力が強いことを表す図である。
【図６】図６は、ＥＭＳＡによるＴｙｐｅＥ  ＲＮＡとその変異体融合蛋白質の結合の確認を示す。
【図７】図７は、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡとその変異体のＦＲＥＴ測定の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡとその変異体のＲＮＡ濃度によるＦＲＥＴ効率の変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ペプチドによる競合阻害実験の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ペプチドによる競合阻害実験の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１（ａ）は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの設計方法の概略を示す図であり、図１１（ｂ）は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの塩基配列と二次構造を示す図であり、図１１（ｃ）は、コンピュータモデリングによるＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの設計図である。
【図１２】図１２（ａ）は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ、図１２（ｂ）は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの１１ｎｔレセプターのＧＡＡＡテトラループに対する相対位置が１塩基対分だけ下にずれている変異体であるＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１、図１２（ｃ）は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの１１ｎｔレセプターのＧＡＡＡテトラループに対する相対位置が１塩基対分だけ上にずれている変異体であるＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ＋１をそれぞれ示す模式図である。
【図１３】図１３は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ−１、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ＋１がセルフフォールディングできるのに対し、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡの構造安定化部位に変異を導入したｍｕｔａｎｔ１１ｎＲは、セルフフォールディングできないことを示す図である。
【図１４】図１４は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ及びその変異体の構造設計とＲＮＡ３次相互作用の確認を示す図である。
【図１５】図１５は、ＥＭＳＡによる、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ及びその変異体と、融合蛋白質の結合の確認を示す図である。
【図１６】図１６は、ＥＭＳＡによる、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ及びその変異体と、融合蛋白質の結合の確認を示す図である。
【図１７】図１７は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡとその変異体のＦＲＥＴ測定の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ＴｙｐｅＢ  ＲＮＡ上に配置されたＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰとＣＦＰ−Ｒｅｖは、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡ上に配置されたＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰとＣＦＰ−Ｒｅｖ  と同等のＦＲＥＴ効率を有することを示すグラフである。
【図１９】図１９Ａは、ＴｙｐｅＥ−２  ＲＮＡの二次構造を表す模式図であり、図１９Ｂは、ＴｙｐｅＥ−３  ＲＮＡの二次構造を表す模式図であり、図１９Ｃは、ＴｙｐｅＥ−４  ＲＮＡの二次構造を表す模式図である。
【図２０】図２０は、ＴｙｐｅＥ−２  ＲＮＡ上に配置されたＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰとＣＦＰ−Ｒｅｖのモデリング図である。図中の数字は、発色団間距離を表す。
【図２１】図２１は、ＴｙｐｅＥ−３  ＲＮＡ上に配置されたＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰとＣＦＰ−Ｒｅｖのモデリング図である。図中の数字は、発色団間距離を表す。
【図２２】図２２は、ＴｙｐｅＥ−４  ＲＮＡ上に配置されたＧＮＡＲ−λＮ−ＹＦＰとＣＦＰ−Ｒｅｖのモデリング図である。図中の数字は、発色団間距離を表す。
【図２３】図２３は、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡと、蛋白質の結合を阻害する変異体（ＤＭ  ＲＮＡ）、及びＴｙｐｅＥ  ＲＮＡのＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフの距離を近接させたＲＮＡ（Ｅ−２，Ｅ−３，Ｅ−４）のＦＲＥＴ測定の結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＴｙｐｅＥ  ＲＮＡと蛋白質の結合を阻害する変異体（ＤＭ  ＲＮＡ）、及びＴｙｐｅＥ  ＲＮＡのＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフの距離を近接させたＲＮＡ（Ｅ−２，Ｅ−３，Ｅ−４）のＦＲＥＴ効率を比較して示すグラフである。
【符号の説明】
【００８８】
１    ＲＮＡ−蛋白質複合体
２    基盤ＲＮＡ
２３  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
２４  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
３    融合蛋白質
３１  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列
３２  リンカー
４    融合蛋白質
４１  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列
４２  リンカー
【図１】
0005308787.tif 000005
【図２】
0005308787.tif 000006
【図３】
0005308787.tif 000007
【図７】
0005308787.tif 000008
【図８】
0005308787.tif 000009
【図９】
0005308787.tif 000010
【図１０】
0005308787.tif 000011
【図１２】
0005308787.tif 000012
【図１４】
0005308787.tif 000013
【図１７】
0005308787.tif 000014
【図１８】
0005308787.tif 000015
【図１９】
0005308787.tif 000016
【図２３】
0005308787.tif 000017
【図２４】
0005308787.tif 000018
【図４】
0005308787.tif 000019
【図５】
0005308787.tif 000020
【図６】
0005308787.tif 000021
【図１１】
0005308787.tif 000022
【図１３】
0005308787.tif 000023
【図１５】
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【図１６】
0005308787.tif 000025
【図２０】
0005308787.tif 000026
【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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