(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）若しくは（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化１】
0005275315.tif 000004
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（１）若しくは（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するβ−セクレターゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有する老人性痴呆症の予防又は治療薬。
【請求項４】
請求項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型痴呆症の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）から得られる化合物、該化合物を有効成分として含有するβ−セクレターゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物から特定の薬理作用のある有用な物質待又は成分を探索して創薬に利用することが、一般に行われている。天然物からのそのような有用な物質又は成分の単離は、しばしば、発症メカニズムの解明、新たな治療薬への応用などにもつながるため、このような手法は頻繁に利用されている。この天然物として注目されているものの一つとしてキノコが挙げられる。
【０００３】
例えば、ハリタケ科のキノコであるヤマブシタケからは、神経成長因子を誘導するヘリセノン等の有用な物質が多数単離されている（例えば、特許文献１及び２、及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−７３４８６号公報
【特許文献２】特開平７−６９９６１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kawagishi, H. et al., Drugs of the Future 2008, 33(2): 149-155
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）に含まれる有用な新規化合物を単離すること、及び該化合物を利用した新たな医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）の抽出物中に新規化合物が含まれること、及びこの新規化合物がβ−セクレターゼ活性に対する優れた阻害作用を有することを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の化合物及びβ−セクレターゼ阻害剤等を提供する。
【０００９】
項１．一般式（１）若しくは（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【００１０】
【化１】
0005275315.tif 000002
【００１１】
項２．上記項１に記載の一般式（１）若しくは（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するβ−セクレターゼ阻害剤。
【００１２】
項３．上記項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有する老人性痴呆症の予防又は治療薬。
【００１３】
項４．上記項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型痴呆症の予防又は治療薬。
【００１４】
項５．上記項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有する化粧品。
【００１５】
項６．上記項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含有するアロマテラピー用キャリアーオイル。
【００１６】
項７．上記項２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤からなる食品添加剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一般式（１）及び（２）で表される化合物は新規であり、高いβ−セクレターゼ阻害活性を有する。そのため、これを有効成分として含有するβ−セクレターゼ阻害剤として有用であり、医薬品、化粧品、食品組成物等に利用することができる。本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、ヤマブシタケから抽出される成分を有効成分とするため、人体に悪影響を与えることなく、アルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆症を治療することができる。
【００１８】
本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、化粧品、アロマテラピー用キャリアーオイル、食品添加剤等として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）からの活性成分の単離操作を示す工程図である。
【図２】化合物１及び２の化学構造及び物性値を示す図である。
【図３】化合物１及び２の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを示す図である。
【図４】化合物１（イソヘリセリン）、化合物２（２−Ｎ−デエチルフェニルイソヘリセリン）、及びインパラトリンのβ−セクレターゼ活性阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、一般式（１）若しくは（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
【００２２】
【化２】
0005275315.tif 000003
【００２３】
一般式（１）で表される化合物（以下、「化合物１」ともいう）及び一般式（２）で表される化合物（以下、「化合物２」ともいう）はいずれも新規物質であり、それぞれイソヘリセリン（isohericerin）及び２−Ｎ−デエチルフェニルイソヘリセリン（2-N-deethylphenyl isohericerin）と命名した。
【００２４】
本発明における「薬学的に許容し得る塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等が挙げられる。なお、一般式（１）又は（２）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、水等の溶媒和物であってもよい。
【００２５】
化合物１及び２は、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）を溶媒で抽出することにより単離することができる。
【００２６】
本発明において用いられるヤマブシタケ（Hericium erinaceum）は、ハリタケ科（Hydnaceae）、サンゴハリタケ属（Hericium）に属するキノコである。ヤマブシタケであれば、その産地は特に限定されない。
【００２７】
ヤマブシタケは、その子実体をそのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供してもよい。また、粉末にした後更に乾燥して抽出に供したり、水中で粉砕してスラリー状にして抽出に供することもできる。また、市販されている乾燥粉末を使用することも可能である。
【００２８】
抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の無極性有機溶媒等を用いることができる。これらの中で、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エチルエーテル等が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒を混合して用いる場合、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００２９】
抽出方法については、特に限定されるものではなく、ヤマブシタケの子実体に溶媒（例えば、酢酸エチル）を加えた後、抽出物に含まれる活性成分の活性を失活させない程度に加温加熱する加熱抽出法や、超臨界抽出法等を適宜適用できる。また、一定量の溶媒にヤマブシタケを浸漬してバッチ処理する浸漬抽出法や連続的に溶媒を送り続ける連続抽出法等、公知の種々の抽出法を適用できる。
【００３０】
具体的な抽出方法の一例を挙げると、例えば、ヤマブシタケに対して、その乾燥重量の５〜１０重量倍程度、好ましくは、３〜５重量倍程度の抽出溶媒を加えて浸漬して加熱し、１〜３時間程度溶媒を還流させることにより、活性成分を抽出することができる。或いは、ヤマブシタケに対して、その乾燥重量の５〜１０重量倍程度、好ましくは、３〜５重量倍程度の抽出溶媒を加えて浸漬し、室温で１〜１４日間程度放置することにより活性成分を抽出することも可能である。勿論、溶媒の種類、溶媒量や加熱温度、加熱時間等については、活性成分を効率的に抽出できるように適宜調整すればよい。
【００３１】
上記した方法によってヤマブシタケから抽出物を得た後、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、アセトン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作によって、得られた抽出液から活性画分（化合物１及び２）を分取することができる。更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
【００３２】
なお、ヤマブシタケからの化合物１及び２の単離及び同定は、具体的には実施例１の記載に従い行うことができる。
【００３３】
このように、本発明の化合物１及び２は、天然物から単離及び精製することができるが、該化合物の製造方法はこれに限定されるものではない。公知の化学合成法をもとに該化合物を合成してもよいし、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施して製造することも可能である。
【００３４】
本発明の化合物１及び２は、下記実施例で詳述するように、強いβ−セクレターゼ阻害活性を有することから、医薬品への利用が可能である。例えば、β−セクレターゼ阻害剤として有用である。また、本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、各種用途に用いることができる。
【００３５】
例えば、本発明のβ−セクレターゼ阻害剤を医薬品として用いる場合、哺乳動物（特に、ヒト）における老人性痴呆患症の予防薬又は治療薬、特にアルツハイマー型痴呆症の予防薬又は治療薬として用いられる。
【００３６】
本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。
【００３７】
製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。
【００３８】
本発明の医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選ぶことができる。投与量の一例を挙げると、経口投与の場合、通常、成人において、有効成分量として０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ程度が適当であり、これを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。
【００３９】
また、本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、強いβ−セクレターゼ阻害活性を有することから、例えば、入浴剤、石鹸、化粧品、アロマテラピー用キャリアーオイル、香水、整髪料等の製品に加えて用いることができる。
【００４０】
本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、各製品全体に対し、通常０．００１〜１００重量％程度（好ましくは、０．１〜５重量％程度）含有していればよい。
【００４１】
本発明のβ−セクレターゼ阻害剤を含む上記の製品を用いた場合には、精油の香りによるリラクゼーション効果、リフレッシュ効果が発揮され、またストレスの多い現代社会において心身の癒し効果が発揮される。上記の製品を、高齢者、病人などが生活する環境で用いることにより、老人性痴呆症の予防・改善効果も発揮される。もちろん、使用する精油又は精油成分が有している効果、例えば、防腐効果、抗菌効果等も発揮される。
【００４２】
また、本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、食品添加剤として、例えば、清涼飲料、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）等の各種飲食品に配合することもできる。本発明のβ−セクレターゼ阻害剤は、このような人間用の飲食品に食品添加剤として配合されるだけでなく、イヌ、ネコ等のペットフードに食品添加剤として配合することも可能である。
【００４３】
食品添加剤として用いる場合には、その添加量については、特に限定的ではなく、食品の種類に応じ適宜決めればよい。一例としては、上記した抽出物の乾燥重量として、含有量が０．０００５重量％〜５０重量％程度の範囲内となるように添加すればよい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。
【００４５】
実施例１
（１）ヤマブシタケからの化合物の抽出及び単離
ヤマブシタケからの化合物の抽出及び単離は、図１に従って行った。なお、減圧濃縮は、ロータリーエバポレーターを用いた。ヤマブシタケ（まりも製薬株式会社製）（６００ｇ）を２００ｇずつ３回に分け、ソックスレー連続抽出装置を用いて抽出した。ヤマブシタケ（２００ｇ）を還流酢酸エチル（１．２リットル）で３時間連続抽出を行った。３回の溶出画分を合わせ、減圧濃縮することにより、酢酸エチル抽出物（１４ｇ）を得た。酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−酢酸エチル及びメタノール）に付すことにより４つのフラクション（以下、Ｆｒ．とする）１〜Ｆｒ．４に分画した。Ｆｒ．３（０．９ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−酢酸エチル及びメタノール）に付すことで４つのフラクション（Ｆｒ．３．１〜３．４）に分画し、さらにＦｒ．３．３を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：酢酸エチル＝４：１）で分離精製することにより、化合物１（１２０ｍｇ）を単離した。さらに、これをジエチルエーテル−ジクロロメタンで結晶化することにより、分析的に純粋な試料（８６ｍｇ）を得た。
【００４６】
また、Ｆｒ．４（４．７ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−アセトン及びメタノール）に付すことで３つのフラクション（Ｆｒ．４．１〜４．３）に分画し、さらにＦｒ．４．３をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ジクロロメタン−アセトン及びメタノール）に付すことで４つのフラクション（Ｆｒ．４．３．１〜４．３．４）に分画した。さらに、Ｆｒ．４．３．２を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：アセトン＝３：２）で分離精製することにより、化合物２（７４ｍｇ）を単離した。さらに、これをヘキサン−アセトンで結晶化することにより、分析的に純粋な試料（３６ｍｇ）を得た。
【００４７】
（２）化合物１及び２の構造決定
化合物１及び２の構造を決定する目的で、ＨＲ−ＥＩ−ＭＳ、ＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。
【００４８】
ＨＲ−ＥＩ−ＭＳの測定には、日本電子株式会社製JEOL the Tandem MS station JMS-700を使用した。
【００４９】
ＩＲ（赤外線吸収）スペルトルの測定には、日本分光株式会社製のJASCO FT/IR-470 plus Fourier transform infrared spectrometerを使用した。
【００５０】
ＮＭＲスペクトルの測定には、JEOL ECA-500(500 MHz, 1H; 125 MHz, 13C)spectrometerを使用した。化合物１はＣＤＣｌ３中で、化合物２はＤＭＳＯ−ｄ６中で測定した。
【００５１】
化合物１及び２の化学構造及び物性を図２に示す。
【００５２】
化合物１は、ＨＲ−ＥＩ−ＭＳの測定から分子式Ｃ２７Ｈ３３ＮＯ３を示した。また、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの解析のため、二次元ＮＭＲを測定してプロトンと炭素との間の相関を調べたところ、すべてのシグナルの帰属が明らかとなった（１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを図３に示す）。化合物１のＮＭＲデータは、既知化合物のヘリセリン(Kimura Y., et ai., Agric. Biol. Chem. 55 p.2673-2674(1991))のそれと類似しており、異性体であることが示唆された。二次元ＮＭＲにおける遠隔１Ｈ−１３Ｃ異核間の相関（ＨＭＢＣ）を詳細に検討したところ、Ｈ３とＣ１、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ７ａとの間に、また、Ｈ７とＣ１、Ｃ３ａ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７ａとの間に相関が観測されたことから、ヘリセリンとはイソインドリノン骨格のカルボニルの位置異性体であることが判明した。
【００５３】
これらの結果から、化合物１は、(E)-5-(3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イル)-4-ヒドロキシ-6-メトキシ-2-フェニルエチルイソインドリン-1-オン（(E)-5-(3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl)-4-hydroxy-6-methoxy-2-phenylethylisoindolin-1-one）（イソヘリセリン；isohericerinと命名した）と決定した。
【００５４】
化合物２は、ＨＲ−ＥＩ−ＭＳの測定から分子式Ｃ１９Ｈ２５ＮＯ３を示した。二次元ＮＭＲ測定から得られた１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを図３に示す。化合物２は、図３のＮＭＲデータから明らかなように、化合物１からフェニルエチル基の欠落した化合物であることが判明した。また、インドリノン骨格のカルボニルの位置を確認するため、ＨＭＢＣ相関を調べたところ、化合物１と全く同様のプロトンと炭素との間の相関が観測されたことから、化合物２は、(E)-5-(3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イル)-4-ヒドロキシ-6-メトキイソインドリン-1-オン（(E)-5-(3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl)-4-hydroxy-6-methoxyisoindolin-1-one）（２−Ｎ−デエチルフェニルイソヘリセリン；2-N-deethylphenyl isohericerinと命名した）と決定した。
【００５５】
実施例２（β−セクレターゼ阻害活性試験）
β−セクレターゼ阻害活性を、PanVera社から購入したＢＡＣＥ１（組換えヒトＢＡＣＥ１）アッセイキットを用いて評価した。評価試験は、メーカーが作製したキットの取扱説明書の記載を改変した方法（Jeon S.Y., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13: 3905-3908 (2003)）に従って行った。以下、簡単に説明する。
【００５６】
１０μＬのＢＡＣＥ１（１．０Ｕ／ｍｌ）、１０μＬの基質（５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム中の７５０ｎＭ  Ｒｈ-ＥＶＮＬＤＡＥＦＫ-Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、及び１０μＬの試料溶液（試料を３０％ＤＭＳＯに溶かした溶液）を混合して試験試料とした。また、上記試料溶液の替わりに１０μＬのアッセイバッファー（３０％ＤＭＳＯ含有、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を加えたものをコントロールとした。これらを暗所において室温で６０分間インキュベーションした後に、５５０ｎｍの波長の光を照射して励起させ、５９０ｎｍの波長における発光強度を測定した。
【００５７】
β−セクレターゼ活性の阻害パーセントを以下の式；
セクレターゼ活性(％)＝［１−｛（Ｓ−Ｓ０）／（Ｃ−Ｃ０）｝］×１００
（式中、Ｃは６０分間のインキュベーション後のコントロール（酵素、バッファー、及び基質）の発光強度を示し、Ｃ０は０時におけるコントロールの発光強度を示し、Ｓはインキュベーション後の試験試料（酵素、試料溶液、及び基質）の発光強度を示し、Ｓ０は０時における試料の発光強度を示す）に従って計算した。全データは、３回の試験結果の平均である。ポジティブコントロールとしてインペラトリン（imperatorin）を用いた（Marumoto S. and Miyazawa M. Phytother. Res. 24: 510-513 (2010)）。結果を図４に示す。
【００５８】
図４の結果から、化合物１（イソヘリセリン）及び化合物２（２−Ｎ−デエチルフェニルイソヘリセリン）の５０％阻害濃度であるＩＣ５０値は、それぞれ７９・１μＭ及び６１．７μＭであることがわかった。
【図１】
0005275315.tif 000005
【図２】
0005275315.tif 000006
【図３】
0005275315.tif 000007
【図４】
0005275315.tif 000008