(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
用量あたり２５ｐｇと同等もしくはより低い宿主細胞ＤＮＡ含量を有するインフルエンザ表面抗原ワクチンであって、かつ
ａ．細胞培養系から得られた全ウイルスを含有する流体のＤＮＡ消化酵素による処理、および
ｂ．陽イオン性洗剤を添加し、次いで表面抗原タンパク質の単離、
の一連の段階を含んで成る、
動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスからの表面抗原タンパク質の調製方法で得られる、上記ワクチン。
【請求項２】
用量あたり１０ｐｇより少ない宿主細胞ＤＮＡ含量を有する、請求項１記載のインフルエンザ表面抗原ワクチン。
【請求項３】
ａ．細胞培養系から得られた全ウイルスを含有する流体のＤＮＡ消化酵素による処理、および
ｂ．陽イオン性洗剤を添加し、次いで表面抗原タンパク質の単離、
の一連の段階を含んで成る、
動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスからの表面抗原タンパク質の調製方法。
【請求項４】
ＤＮＡ消化酵素での処理を細胞培養系でのインフルエンザウイルスの増殖中に行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
陽イオン性洗剤が、一般式
【化１】
0005258127.tif 000004
式中、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一もしくは異なり、かつ、それぞれアルキルもしくはアリールを意味し、または、Ｒ1およびＲ2は、これらが結合する窒素原子と一緒になって５もしくは６員の飽和ヘテロ環を形成し、そしてＲ3はアルキルもしくはアリールを意味し、または、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、これらが結合する窒素原始と一緒になって、窒素原子において不飽和になった５もしくは６員のヘテロ環を意味し、
Ｒ4はアルキルもしくはアリールを意味し、そして
Ｘはアニオンを意味する、
の化合物から成る、請求項３記載の方法。
【請求項６】
陽イオン性洗剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含んで成る、請求項３記載の方法。
【請求項７】
陽イオン性洗剤が非イオン性洗剤で補われる、請求項３記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザウイルスが動物細胞株で増殖される、請求項３記載の方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスがＭＤＣＫ細胞で増殖される、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術的分野】
【０００１】  本発明は、動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスからの調製により得ることのできるインフルエンザ表面抗原ワクチン、および、動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスの表面抗原タンパク質の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  インフルエンザウイルスの本体は約125nmの大きさを有し、また、それは、脂質二重層構造をもつウイルスエンベロープにより取り巻かれる核タンパク質を伴うリボ核酸（ＲＮＡ）のコアーから成る。ウイルスエンベロープの内層は主としてマトリックスタンパク質から成り、また、外層は宿主由来の脂質物質の大部分を含有する。【０００３】  いわゆる「表面タンパク質」すなわちノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）は、ウイルス本体の表面上の突起物として現われる。【０００４】  商業的に入手可能な不活性化インフルエンザワクチンの大部分は、いわゆる「スプリット・ワクチン」もしくは「サブユニット・ワクチン」である。【０００５】「スプリット・ワクチン」は、可溶化する濃度の洗剤を用いるインフルエンザウイルス全体の処理ならびにその後の洗剤およびウイルス性脂質物質の大半の除去により調製される。【０００６】インフルエンザに対する「サブユニット・ワクチン」は、「スプリット・ワクチン」と異なり、全てのウイルスタンパク質を含有するわけではない。代わりに、「サブユニット・ワクチン」は、ワクチン接種に際し、所望のウイルス中和（これゆえに保護する）抗体を誘導する原因である表面タンパク質が豊富である。【０００７】  商業的に入手可能なインフルエンザワクチンの大部分は、胚含有鶏卵で培養されたインフルエンザウイルス由来である。しかしながら、ワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの卵由来の調製はいくつかの欠点を有することが広く認識されている。すなわち、
１．こうした調製方法は卵の可変的な（微）生物学的な品質によりむしろ影響を受けやすい。【０００８】２．当該方法は、突然要求が増大する場合、すなわち重大な流行もしくは汎流行の場合、大量の適する卵の利用不可能性による論理的問題により完全に融通性を欠く。【０００９】３．かように調製されるワクチンは鶏肉および／もしくは卵のタンパク質に既知の過敏性のある人には禁忌である。【００１０】  こうした問題の解決策は、インフルエンザウイルスの組織培養由来の調製に存在するかも知れない。こうした調製方法は以下の多くの利点を有する。【００１１】１．組織培養系の細胞株は、（微）生物汚染のない十分に定義された細胞バンクシステムで入手可能であり、それによりバッチ間の一貫性が大きく改善され、かつ、より高品質の製品が得られる。【００１２】２．それは重大な流行もしくは汎流行の脅威の場合に利用可能な十分なワクチンを入手する機会を増大させうる。【００１３】３．得られるインフルエンザウイルス物質は、代替の投与経路（経口、経鼻、吸入）によりよく適することができる。【００１４】４．ＷＨＯの見解からは、この技術は毎年のワクチン組成の勧告（２月半ばから３月半ばまで）を延期することを可能にして流布する株とワクチンの合致を増大させることができる。
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  にもかかわらず、インフルエンザウイルスの組織培養に関してもまた重大な問題が存続する。なぜなら、連続細胞系からの遺伝子物質がワクチンに存在し続けうるからである。
【００１６】  こうした問題は、気付かれない場合には、規制当局が安全性の理由のためにこうしたインフルエンザワクチンの市場販売許可の要求を拒絶することにつながりうる危険を提出する。例えば、米国食品医薬品局は、ヒトでの使用のためのバイオテクノロジー製品が１用量あたり100pgより多くの宿主細胞ＤＮＡを含有しないことを要求する。
【００１７】  従って、本発明は、安全でありかつ許容できない量の有害な遺伝子物質を含有せず、また、規制当局により設定される必要条件に合致するワクチンの目的のためのインフルエンザウイルス表面抗原の調製法を提供する。しかしながら、100pg/用量よりかなり低い宿主細胞ＤＮＡ含量をもつインフルエンザウイルスワクチンを調製することが望ましいと考えられ、また驚くことに達成可能であった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】  従って、本発明は、動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスからの調製により得ることができ、かつ用量あたり25pgと同等もしくはより低い宿主細胞ＤＮＡ含量を有する、インフルエンザ表面抗原ワクチンに関する。
【００１９】  特定の態様では、本発明は
ａ．細胞培養系から得られた全ウイルスを含有する流体のＤＮＡ消化酵素による処理、および
ｂ．陽イオン性洗剤を添加し、次いで表面抗原タンパク質の単離、
の一連の段階を含んで成る、動物細胞培養系で増殖されたインフルエンザウイルスからのそうした低ＤＮＡインフルエンザワクチンを調製するのに有用な表面抗原タンパク質の調製方法を提供する。
【００２０】  本発明の方法は、ヒトインフルエンザ、ブタインフルエンザ、ウマインフルエンザおよびトリインフルエンザに典型的なウイルスのような多様なインフルエンザウイルス株を含有するワクチンの調製の間に応用されうる。
【００２１】  本発明の動物細胞培養系は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のような一次細胞、もしくはマディン・ダービー(Madin Darby)イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびベロ(Vero)細胞のような連続細胞株のいずれかを含有しうる。
【００２２】  ＤＮＡ消化酵素を用いる全ウイルス含有流体の処理は、場合によっては細胞培養およびウイルス増殖の過程の間にすでに醗酵槽中で直接実施してもよい。
【００２３】  ＤＮＡ消化酵素の適する例は、ＤＮアーゼ（例えばＥＣ３．１．２１およびＥＣ３．１．２２に分類される）ならびにヌクレアーゼ（例えばＥＣ３．１．３０およびＥＣ３．１．３１に分類される）である。
【００２４】  本発明の適する陽イオン性洗剤は、主として一般式
【００２５】
【化２】
0005258127.tif 000002
【００２６】式中、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一もしくは異なり、かつ、それぞれアルキルもしくはアリールを意味し、
または、Ｒ1およびＲ2は、これらが結合する窒素原子と一緒になって５もしくは６員の飽和ヘテロ環を形成し、
そしてＲ3はアルキルもしくはアリールを意味し、
または、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、これらが結合する窒素原始と一緒になって、窒素原子において不飽和となった５もしくは６員のヘテロ環を意味し、
Ｒ4はアルキルもしくはアリールを意味し、そして
Ｘは陰イオンを意味する、
の化合物から成る。
【００２７】  こうした陽イオン性洗剤の例は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃ．Ｔ．Ａ．Ｂ．）のようなセチルトリメチルアンモニウム塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩である。リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＭＡもまた適する洗剤である。
【００２８】  場合によっては、これらの陽イオン性洗剤は、トゥイーン(Tween)のような非イオン性洗剤で補われ得る。
【００２９】  洗剤処理段階の後の表面抗原タンパク質の単離は、例えば
１．例えば遠心分離もしくは超遠心分離による表面抗原タンパク質からのＲＮＰ粒子（体）の分離、ならびに
２．例えば、適する樹脂（アンバーライト(Amberlite)ＸＡＤ−４のような）との洗剤の疎水性相互作用および／もしくは限外（透析）濾過による、表面抗原タンパク質からの洗剤の除去
の段階を含んでよい。
【００３０】  驚くべきことに、本発明の方法は、動物細胞由来のＤＮＡのその含量の極めて低い製品を生じる。25pg/用量程度低いおよび多くの場合には10pg/用量程度低いＤＮＡ濃度さえ容易に達成可能である。
【００３１】  当該表面抗原タンパク質は、例えば緩衝液（例えばＰＢＳ）を添加することおよび／もしくは他のインフルエンザウイルス血清型からの抗原と混合することにより、インフルエンザワクチンを調製するよう処理されうる。
【００３２】  場合によっては、表面抗原の濃縮がさらなるワクチン調製に必要とされる。
【実施例】
【００３３】実施例１
Ａ．ウイルスの増殖
１．抗原タイプＢ／ヤマガタ(Yamagata)のインフルエンザウイルスを、種ウイルスを細胞とともに35℃で２日間インキュベーションすることにより、醗酵槽中でマディン・ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）で増殖させる。【００３４】２．次いで、醗酵槽の液体のｐＨを、希水酸化ナトリウムの添加により8.0に上昇させ、そしてベンゾン(Benzon)ヌクレアーゼを１リットルあたり1000単位（１μg）の最終濃度まで添加する。【００３５】３．インキュベーションを35℃でさらに４時間進行させる。【００３６】Ｂ．ウイルスの単離
１．液体を、公称孔径0.5ミクロンのデプスフィルター(depth filter)で濾過して細胞の破片を除去する。【００３７】２．その後、インフルエンザウイルスを、300,000の分子量カットオフのメンブレンを使用する超遠心分離により濃縮かつ精製する。【００３８】３．ショ糖を30％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで濃縮物に添加し、その後、ホルムアルデヒドを0.015％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加する。この混合物を２〜８℃で72時間攪拌する。【００３９】４．次いで、ウイルス濃縮物を、リン酸緩衝生理的食塩水で５倍に希釈し、そしてアミコン  セルファイン  サルフェート(Amicon cellufine Sulphate)を含有するアフィニティーカラムに負荷する。リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄することにより不純物を除去した後、ウイルスを、リン酸緩衝生理的食塩水中1.5Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出する。溶出した液を、300,000の分子量カットオフのメンブレンを使用する超遠心分離により濃縮かつ脱塩する。【００４０】Ｃ．サブユニットの単離
１．非イオン性洗剤トゥイーン(Tween)８０を300μg/mlの最終濃度まで添加し、そして、臭化セチルトリメチルアンモニウムを750μg/mlの最終濃度まで添加する。この混合物を４℃で３時間攪拌し、その後、ＲＮＰ粒子を遠心分離により表面抗原タンパク質から分離する。【００４１】２．上清を〜８℃でアンバーライトＸＡＤ−４とともに攪拌して洗剤を除去する。アンバーライトを濾過により除去し、そして濾液をその後、0.22μmフィルターでの通過により濾過滅菌にかける。【００４２】上の過程を通じ、サンプルの宿主細胞ＤＮＡ含量を、32Ｐ標識されたイヌＤＮＡプローブを使用するスロットブロットハイブリダイゼーションに基づく確認された試験に従い分析した。【００４３】多様な段階後に実行されたＤＮＡアッセイの結果が以下の表に与えられる（この表で、ＩＶＶ用量あたりのＤＮＡ量が50μgのＨＡあたりのピコグラムで表される）。【００４４】
【表１】
0005258127.tif 000003
【００４５】実施例２
増殖、精製、不活性化およびウイルス切断が実施例１でのように遂げられる。【００４６】増殖培地のｐＨを使用する（段階Ａ１）ウイルス増殖（段階Ａ２およびＡ３）の後半の時間の間の発酵槽液のベンゾンヌクレアーゼ処理は、ＤＮＡ除去に関して同様の結果を生じる。【００４７】より高濃度で必要とされるとは言え、ＤＮアーゼＩは、宿主細胞ＤＮＡの除去において同様に有効である（段階Ａ１〜Ａ３の間）。同様の結果が他のエンドヌクレアーゼを使用して得られることができる。【００４８】実施例３
当該方法が、細胞破片の除去（段階Ｂ１）が遠心分離により遂げられることを除き、実施例１もしくは２でのように遂げられる。【００４９】実施例４
当該方法が、ウイルスが、例えばリン酸緩衝生理的食塩水でのショ糖濃度勾配を使用する連続的フローゾーン遠心分離(continuous flow zonal centrifuge)例えばエレクトロヌクレオニクス(Electro-Nucleonics)（モデルＲＫ）で遠心分離することにより発酵槽液から濃縮かつ精製される（段階Ｂ２）ことを除き、実施例１、２もしくは３でのように遂げられる。【００５０】実施例５
当該方法が、段階Ｃ１の臭化セチルトリメチルアンモニウム溶液の添加が、臭化セチルピリジニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化メチルベンゼトニウム、塩化デカメトニウムもしくは臭化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムの溶液の添加により置き換えられることを除き、実施例１ないし４でのように遂げられる。宿主細胞ＤＮＡの除去に関して同様の結果が得られる。【００５１】実施例６
当該方法が、ショ糖の添加がアフィニティーカラムクロマトグラフィー後に実行され、また、ホルムアルデヒドが120時間、最大0.05％（ｗ／ｖ）まで添加されることを除き、実施例１で記述されるように遂げられる。【００５２】実施例７
実施例１、２、３、４および６の方法を、同様に株Ｂ／ハービン(Harbin)、Ｂ／パナマ(Panama)、Ａ／テキサス(Texas)（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／台湾(Taiwan)（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ヨハネスブルグ(Johannesburg)（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／武漢(Wuhan)（Ｈ３Ｎ２）のインフルエンザウイルスから低ＤＮＡワクチンを調製するのに成功して応用した。