(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを加水分解する工程を有することを特徴とする、下記一般式（３）で表される１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールの製造方法であって、
【化１】
0005339335.tif 000011
（式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。）
【化２】
0005339335.tif 000012
上記マンノシルエリスリトールリピッドを加水分解する工程の前に、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、上記マンノシルエリスリトールリピッドを製造する工程を有し、
上記微生物が、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）又はシュードザイマ・クラッサ（Pseudozyma crassa）であることを特徴とするマンノシルエリスリトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規マンノシルエリスリトールに関し、より詳細には微生物生産糖脂質の一種であるＭＥＬであって、分子構造中のマンノシルエリスリトール骨格が１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールであるＭＥＬの加水分解物である新規マンノシルエリスリトール及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。
【０００３】
石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）が利用されてきたが、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、界面活性剤の生産量は飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となった。しかしながら、合成界面活性剤の使用量の拡大につれて環境汚染が広がってきた。そこで、安全性が高く、環境に対する負荷を低減するために、再度生分解性の高い界面活性物質であるバイオサーファクタントが見直されはじめており、それに伴い様々な種類のバイオサーファクタントの開発が望まれている。
【０００４】
バイオサーファクタントとしては、微生物が生産する界面活性物質が代表的なものとして挙げられる。現在、上述した微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。これらのうち、糖脂質系の界面活性剤は最もよく研究され、細菌及び酵母により生産された、多くの種類の物質が報告されている。
【０００５】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。これらの諸性質から、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【０００６】
代表的な糖脂質系バイオサーファクタントの一つにマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）がある。ＭＥＬは、Ustilago nuda（ウスチラゴ  ヌーダ）とShizonella melanogramma（シゾネラ  メラノグラマ）から発見された物質である（非特許文献１及び２参照）。その後、イタコン酸生産の変異株であるCandida属酵母（特許文献１及び非特許文献３参照）、Candida antarctica（キャンデダ  アンタークチカ）（現在はPseudozyma antarctica（シュードザイマ  アンタークチカ））（非特許文献４及び５参照）、Kurtzmanomyces（クルツマノマイセス）属（非特許文献６参照）等の酵母らによっても生産されることが報告されている。現在では、長時間の連続培養・生産を行うことで３００ｇ／Ｌ以上の生産が可能となっている。
【０００７】
上記ＭＥＬが有する糖骨格には複数の不斉炭素原子が存在し、その数をｎとすると２ｎ個の光学異性体が存在する。しかし、これまで報告されてきたＭＥＬは全て、その糖骨格が以下の式（２）に示されるような４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造であった。
【０００８】
【化１】
0005339335.tif 000002
【０００９】
β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造には、もう一つ１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造（下記式（３））の異性体が想定される。
【００１０】
【化２】
0005339335.tif 000003
【００１１】
この１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬの１種を合成し、これとの比較によって従来のＭＥＬの糖骨格が上記式（２）の構造であることが証明されている（非特許文献７）。
【００１２】
生理活性を有する有機化合物にとって、その分子のキラリティーは極めて重要なポイントとなる。これまでＭＥＬは、抗菌性、抗腫瘍性、糖タンパク結合能をはじめ、様々な生理活性を有することが報告されている（非特許文献８）。さらに、ＭＥＬは極めて特異な自己集合特性を示し、それを利用したリポソーム素材、液晶化技術への展開も試みられており、分子構造の僅かな違いが自己集合体の形成に大きな影響を与えることも報告されている（非特許文献８、９）。
【００１３】
したがって、従来知られていたＭＥＬの光学異性体を大量に生産し、それらの物性比較、機能評価を行うことは、ＭＥＬの用途開発に向けて大きく貢献できるものと期待される。
【特許文献１】特公昭５７−１４５８９６号公報
【非特許文献１】アール．エイチ．ハスキンス（R. H. Haskins），ジェイ．エー．トーン（J. A. Thorn），B. Boothroyd，「カナデアン ジャーナル オブ ケミストリー（Can. J. Microbiol.）」，１巻，ｐ７４９−７５６（１９５５）．
【非特許文献２】ジー．デム（G. Deml），ティ．アンケ（T. Anke），エフ．オーバーウインカー（F. Oberwinkler），ビー．エム．ジアネッティー（B. M. Giannetti），ダブリュ．ステグリッチ（W. Steglich），「フィトケミストリー（Phytochemistry）」，１９巻，ｐ８３−８７（１９８０）．
【非特許文献３】ティ．ナカハラ（T. Nakahara），エイチ．カワサキ（H. Kawasaki），ティ．スギサワ（T. Sugisawa），ワイ．タカモリ（Y. Takamori），ティ．タブチ（T. Tabuchi），「ジャーナル オブ ファーメンテーション テクノロジー（J. Ferment.Technol.）」，（日本），日本発酵工学会，６１巻，ｐ１９−２３（１９８３）．
【非特許文献４】ディ．キタモト（D. Kitamoto），エス．アキバ（S. Akiba），シー．ヒオキ（C. Hioki），ティ．タブチ（T. Tabuchi）「アグリカリチュラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）」，（日本），日本農芸化学会，５４巻．ｐ３１−３６（１９９０）．
【非特許文献５】エイチ．エス．キム（H.-S. Kim），ビー．ディ．ユーン（B.-D. Yoon），ディ．エイチ．チョン（D.-H. Choung），エイチ．エム．オー（H.-M. Oh），ティ．カツラギ（T. Katsuragi），ワイ．タニ（Y. Tani）「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Springer-Verlag），５２巻，ｐ７１３−７２１（１９９９）．
【非特許文献６】角川（K. kakukawa），玉井（M. Tamai），今村（K. Imamura），宮本（K. Miyamoto），三好（S. Miyoshi），森永（Y. Morinaga），鈴木（O. Suzuki），宮川（T. Miyakawa）「バイオサイエンス，バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー（Biosci. Biotechnol. Biochem.）」，（日本），日本農芸化学会，６６巻，ｐ１８８−１９１（２００２）．
【非特許文献７】ディ．クリッチ（D. Crich），エム．エー．モーラ（M. A. Mora），アール．クルツ（R. Cruz）「テトラヘドロン（Tetrahedron）」，（オランダ），エルゼビア（Elsevier），５８巻，ｐ３５−４４（２００２）．
【非特許文献８】北本  大「オレオサイエンス」，（日本），日本油化学会，３巻，ｐ６６３−６７２（２００３）．
【非特許文献９】ティ．イムラ（T. Imura），エヌ．オオタ（N. Ohta），ケー．イノウエ（K. Inoue），エヌ．ヤギ（N. Yagi），エイチ．ネギシ（H. Negishi），エイチ．ヤナギシタ（H. Yanagishita），ディ．キタモト（D. Kitamoto）「ケミストリー ア ヨーロピアン ジャーナル（Chem. Eur. J）」，（米国），ワイリー（Wiley），１２巻，ｐ２４３４−２４４０（２００６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つ糖脂質等のバイオサーファクタントについて、生産効率の向上、構造・機能バラエティの拡充が重要である。特に、ＭＥＬは、生産性、界面物性に優れるだけでなく、特異な自己集合特性と生理活性を利用した種々の用途開発が行われている。
【００１５】
しかしながら、これまで報告されている微生物由来のＭＥＬは、糖骨格が全て４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造であった。このため、構造・機能バラエティの拡充が強く求められていた。
【００１６】
また、上記非特許文献７には、１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬを化学合成して得た旨が記載されているが、これは非常に複雑な工程を経て合成されたものであり、汎用性に欠け利用し難いものであった。
【００１７】
つまり、ＭＥＬの加水分解物であるマンノシルエリスリトールについても同様の課題がある。
【００１８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来の４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬに対して、その光学異性体である１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬの加水分解物である新規マンノシルエリスリトール及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、従来の４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬ（以下、「従来型ＭＥＬ」又は「４−Ｏ−ＭＥＬ」と称する場合もある。）に対して、その光学異性体である１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有するＭＥＬ（以下、「本明細書に記載のＭＥＬ」又は「１−Ｏ−ＭＥＬ」と称する場合もある。）を生産する微生物を見出した。さらに、上記ＭＥＬを加水分解することにより、これまで単離・同定された報告の無いオリゴ糖アルコールである１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールを簡便な操作かつ大量に提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００２０】
（１）下記一般式（３）で表される１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール。
【００２１】
【化３】
0005339335.tif 000004
【００２２】
（２）下記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを加水分解する工程を有することを（１）に記載のマンノシルエリスリトールの製造方法。
【００２３】
【化４】
0005339335.tif 000005
【００２４】
（式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。）
【発明の効果】
【００２５】
本明細書に記載のＭＥＬは、従来知られていたＭＥＬの光学異性体である。分子のキラリティーの違いは生理活性や自己集合体形成能に大きな影響を及ぼすことから、従来型ＭＥＬとは界面活性に差が無いにもかかわらず、その他の諸性質において異なる挙動を示すようになる。それゆえ、本明細書に記載のＭＥＬを用いて従来のＭＥＬとの物性比較、機能評価を行うことにより、ＭＥＬの用途開発に向けて大きく貢献できる。特に、本明細書に記載のＭＥＬは、従来型ＭＥＬと異なる液晶形成能を有する。
【００２６】
また、本明細書に記載のＭＥＬの製造方法によれば、従来知られていたＭＥＬの光学異性体を大量かつ簡易に生産することができる。
【００２７】
さらに、上記ＭＥＬを加水分解することで、これまで報告例の無いオリゴ糖アルコールの１種である１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールを取得できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。
【００２９】
＜１．マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）＞
本明細書に記載のＭＥＬの理解の一助とすべく、まず従来型ＭＥＬについて概説する。
【００３０】
従来型ＭＥＬは、ＭＥＬ生産菌の培養によって得られ、その化学構造の代表例は以下の一般式（４）に示すように、４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールをその基本構造とするものである。
【００３１】
【化５】
0005339335.tif 000006
【００３２】
上記一般式（４）中、置換基Ｒは炭化水素基（アルキル基又はアルケニル基）である。上記従来型ＭＥＬは、マンノースの４位及び６位のアセチル基の有無からＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ及びＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。
【００３３】
まず、ＭＥＬ−Ａは、上記一般式（４）中、置換基Ｒ１及びＲ２がともにアセチル基である。ＭＥＬ−Ｂは、上記一般式（４）中、置換基Ｒ１がアセチル基で置換基Ｒ２は水素である。ＭＥＬ−Ｃは、上記一般式（４）中、置換基Ｒ１が水素で置換基Ｒ２はアセチル基である。ＭＥＬ−Ｄは、上記一般式（４）中、置換基Ｒ１及びＲ２がともに水素である。
【００３４】
上記ＭＥＬ−Ａ〜ＭＥＬ−Ｄにおける置換基Ｒの炭素数は、ＭＥＬ生産培地に含有させる油脂類中のトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数及び使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度により変化する。また、上記トリグリセリドが不飽和脂肪酸残基を有する場合、ＭＥＬ生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分まで資化しなければ、置換基Ｒとして不飽和脂肪酸残基を含ませることも可能である。以上の説明から明らかなように、得られる各ＭＥＬは、通常、置換基Ｒの脂肪酸残基部分が異なる化合物の混合物の形態である。
【００３５】
一方、本明細書に記載のＭＥＬは下記一般式（１）で表される構造を有し、ＭＥＬ中のエリスリトールが従来型ＭＥＬとは逆向きに導入された光学異性体であることが大きな特徴である。
【００３６】
【化６】
0005339335.tif 000007
【００３７】
なお、上記一般式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。ただし、置換基Ｒ１がともに炭素数１２の脂肪族アシル基であって、置換基Ｒ２がともにアセチル基であって、置換基Ｒ３が水素であるものを除く。これは、上記非特許文献７に開示のＭＥＬを除く意図であり、それ以外の意図はなく、本発明の権利範囲を不当に制限する限定事項ではないことを念のため付言しておく。
【００３８】
また、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１は、飽和脂肪族アシル基であっても不飽和脂肪族アシル基であってもよく、限定されるものではない。不飽和結合を有している場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数及び位置は限定されない。
【００３９】
さらに、上記一般式（１）中、置換基Ｒ２のいずれか一方がアセチル基であり、他方が水素であることが好ましい。つまり、１−Ｏ−ＭＥＬであって、ＭＥＬ−Ｂ又はＭＥＬ−Ｃであることが好ましい。なかでも特に、４位が水素であって、６位がアセチル基である、すなわちＭＥＬ−Ｂであることがより好ましい。
【００４０】
例えば、ＭＥＬ−Ａ（アセチル基が２個）に比べて、ＭＥＬ−ＢまたはＭＥＬ−Ｃ（アセチル基が１個）は極性が高く、水中での自己組織化挙動が異なる。このため、形成される液晶の形態が異なり、ＭＥＬ−Ａでは幅広い濃度領域でスポンジ相（Ｌ３相）等を作るのに対して、ＭＥＬ−Ｂ又はＭＥＬ−Ｃではラメラ相（Ｌα）を作りやすい。ラメラ相は肌の角質層と非常に近い形態ですので、肌浸透性が良くなり、スキンケア素材として有用である。さらに、ＭＥＬ−Ｂは２分子膜がカプセル化したベシクル（リポソーム）を形成しやすく、カプセル内に薬剤を内包できることから、リポソーム化粧品、医薬品への応用が容易になると期待される（上記非特許文献８，９参照）。
【００４１】
なお、上記非特許文献７において合成されたＭＥＬはＡタイプであり、かつ脂肪酸鎖が２本ともＣ１２のものである。これに対して、本願発明では、ＭＥＬ−ＢやＭＥＬ−Ｃを作製することができ、また脂肪酸鎖長も多様性を持たせることができる。その結果、より異なる液晶形成能を有するＭＥＬを提供することができる（後述する図７、図８参照）。
【００４２】
なお、上記非特許文献７に記載の合成方法はあくまでＭＥＬ−Ａの合成方法のみに限定されており、ＭＥＬ−Ｂ，Ｃを合成するためには、異なる保護基の使用や異なるステップの反応を繰り返さなければならず、上記文献を参酌しても本明細書に記載のＭＥＬを合成することはできないことを念のため付言しておく。
【００４３】
また、上記一般式（１）中、置換基Ｒ３が炭素数２〜２４の脂肪族アシル基であることが好ましい。式（１）中、置換基Ｒ１及びＲ３がいずれも脂肪族アシル基であれば、トリアシルＭＥＬとなり、ジアシルＭＥＬとは異なった性質のＭＥＬを得ることができる。
【００４４】
具体的には、トリアシル体は従来のジアシル体と比べてＨＬＢ（親水−疎水バランス）が低く、より親油性の高い界面活性剤である。このため、応用用途が異なってくる。例えば、Ｗ／Ｏエマルジョンや分散剤等への利用が考えられる。また上述と同様、上記非特許文献７に記載の合成方法はあくまでジアシル体のＭＥＬ−Ａの合成方法のみに限定されており、トリアシル体の合成には根本的に異なる合成経路（異なる保護基や多段階反応）を経る必要がある。それゆえ、上記非特許文献７を参酌しても本願発明に係るＭＥＬを合成することはできない。
【００４５】
本明細書に記載のＭＥＬの分子構造は、基本的には上記一般式（１）における置換基Ｒ１の脂肪族アシル基の炭素数あるいは二重結合の有無等において異なる各化合物の混合物の形態で得られるが、これらはさらに分取ＨＰＬＣ等により精製すれば、単一のＭＥＬ化合物とすることもできる。
【００４６】
本明細書に記載のＭＥＬは、従来型ＭＥＬと同様、高い界面活性作用を有し、新たな生理活性や自己集合特性を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いることができる。さらにＭＥＬは生分解性があり、高い安全性を有する点でも非常に意義ある物質である。つまり、生分解性が高く、低毒性で環境に優しいバイオサーファクタントである。
【００４７】
さらに、従来型ＭＥＬは様々な生理活性作用を有することが報告されている。例えば、ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にＭＥＬを作用させると、顆粒系を分化させる白血病細胞細胞分化誘導作用があること。またラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にＭＥＬを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞分化誘導作用等の生理活性作用を有すること、さらに微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（X. Zhao et. al., Cancer Research,59, 482-486 (1999)）、癌細胞増殖抑制作用があること、等が報告されている。これら従来型ＭＥＬの生理作用からみて、本明細書に記載のＭＥＬにも種々の生理活性を有することが期待でき、例えば抗ガン剤等の医薬としての用途や新規化粧品材料用途が考えられる。
【００４８】
また、本明細書に記載のＭＥＬは、後述する実施例に示すように、分子のキラリティーの違いによって、従来型ＭＥＬと液晶形成能において顕著に異なる。具体的には、本明細書に記載のＭＥＬは従来型ＭＥＬと比べて非常に広い濃度領域でラメラ相を形成する能力を有しており、液晶形成能に極めて優れたバイオサーファクタントといえる。
【００４９】
なお、上述した液晶形成能の評価方法としては、従来公知の方法で確認可能であるが、例えば、液晶形成能力の簡便な比較方法として水侵入法が挙げられる。スライドガラス上にＭＥＬを塗布し、その横に蒸留水を滴下して界面に形成される液晶相を顕微鏡観察することで、液晶形成の挙動を追跡することができる。上記方法を用いることで、従来型ＭＥＬと本明細書に記載のＭＥＬ光学異性体の液晶形成能を簡便に比較することができる。
【００５０】
＜２．ＭＥＬの製造方法＞
本明細書に記載のＭＥＬの製造方法は、１−Ｏ−ＭＥＬの生産能を有する微生物を用いることを特徴としている。具体的には、例えば、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、上記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを製造するＭＥＬの製造方法である。なお、本ＭＥＬの製造方法を説明する記載においては、上記一般式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。
【００５１】
＜２−１．使用微生物＞
本明細書に記載のＭＥＬの製造方法に使用可能な微生物としては、上記シュードザイマ属に属し、ＭＥＬを生産する能力を有するもののうち、上記式（１）で表されるＭＥＬ光学異性体を生産するものであれば特に限定されるものではない。
【００５２】
上記一般式（１）のＭＥＬを生産する微生物の例としては、例えばシュードザイマ・ツクバエンシス又はシュードザイマ・クラッサ等に属する微生物が挙げられ、このうち特に、シュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物が好ましい。シュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物は、例えば２５〜３０℃で培養した場合、ＭＥＬの生産性向上効果が高く、特にシュードザイマ・ツクバエンシスＪＣＭ  １０３２４株の場合、培養温度３０℃の場合に最も良好な生産性が得られる。
【００５３】
＜２−２．使用培地及び培養方法＞
培地は、例えば、一般的な微生物又は酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、特に限定されるものではなく、特に酵母に用いられる培地が好ましい。このような培地としては、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。特に、シュードザイマ・ツクバエンシスＪＣＭ  １０３２４株を用いる場合は、培養温度を２７℃〜３３℃に設定することが好ましいという知見を得ている。上述のとおり、ＭＥＬの生産性が著しく向上するためである。
【００５４】
さらに、本明細書に記載のＭＥＬ製造方法に利用可能な微生物、特に前記シュードザイマ・ツクバエンシスＪＣＭ  １０３２４株を用いてＭＥＬを生産する場合の好適な培地組成は、以下のとおりである。
・酵母エキス；０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい。
・硝酸ナトリウム；０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．３ｇ／Ｌが特に好ましい。
・リン酸２水素カリウム；０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．３ｇ／Ｌが特に好ましい。
・硫酸マグネシウム；０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．３ｇ／Ｌが特に好ましい。
・油脂類；４０ｇ／Ｌ以上が好ましく、８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
【００５５】
また、上記微生物の培養においては、培地に炭素源を添加することが好ましい。炭素源としては油脂類、脂肪酸、脂肪酸誘導体（脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類）、あるいは合成エステルを少なくとも１種、さらには複数種混合して含有させればよく、その他の諸条件については、特に制限はなく、本発明の利用当時の技術水準に基づいて適宜選定することができる。
【００５６】
「油脂類」としては、植物油、動物油、鉱物油及びその硬化油であればよい。具体的には、アボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油（コーン油）、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、ピーナッツ油、ベニバナ油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油及びその硬化油、流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンが挙げられる。好ましくはアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、より好ましくはオリーブ油、大豆油である。
【００５７】
「脂肪酸」又は「脂肪酸誘導体」としては、高級脂肪酸由来が好ましく、例えばカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ウンデシレン酸、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、ウンデシレン酸である。
【００５８】
「合成エステル」としては、例えば、カプロン酸メチル、カプリル酸メチル、カプリン酸メチル、ラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシン酸メチル、カプロン酸エチル、カプリル酸エチル、カプリン酸エチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノレン酸エチル、ステアリン酸エチル、ウンデシン酸エチル、カプロン酸ビニル、カプリル酸ビニル、カプリン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ミリスチン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、オレイン酸ビニル、リノール酸ビニル、リノレン酸ビニル、ステアリン酸ビニル、ウンデシン酸ビニル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等が挙げられる。好ましくはラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシレン酸メチル、より好ましくはオレイン酸メチル、リノール酸メチル、ウンデシレン酸メチルである。
【００５９】
これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。
【００６０】
本明細書に記載のＭＥＬの製造方法の具体的な工程については、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びＭＥＬ生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、培地並びに培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース４０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌの組成の液体培地５ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコにａ）の培養液を接種して、３０℃で２日間培養を行う。
ｃ）マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を２０〜２００ｇ／Ｌに保持することが好ましい。
【００６１】
＜２−３．ＭＥＬの回収方法＞
ＭＥＬの回収についても従来公知の脂質の精製方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、培養終了後、当容積〜４容積倍の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質及び糖脂質成分を回収する工程を挙げることができる。その後、この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：アセトン（８０：２０）、同（７０：３０）、同（６０：４０）、同（５０：５０）、同（３０：７０）、アセトンの順で溶出させる。各溶液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、アンスロン硫酸試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得ることができる。
【００６２】
＜２−４．ＭＥＬの構造決定＞
上述したＭＥＬの製造方法により得られるＭＥＬの構造決定は、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば、シュードザイマ・ツクバエンシスＪＣＭ  １０３２４株を用いて得られたＭＥＬの構造決定手法を例にして説明すると、以下の通りである。
【００６３】
まず単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質がＭＥＬであることは、１Ｈ、１３Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ〜Ｄ）（上記一般式（４））のスペクトルとを比較することで容易に確認することができる。
【００６４】
本明細書に記載のＭＥＬが、従来型ＭＥＬの光学異性体であることは、次のように、１）糖骨格のＮＭＲ解析及び２）旋光度測定を行うことにより簡便に確認することができる。
【００６５】
１）糖骨格のＮＭＲ解析
重クロロホルム中で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、ＭＥＬの糖鎖部分のプロトンは３．３〜５．６ｐｐｍ付近に検出される。特に、グリコシド結合に関与するマンノース１’位（還元末端）のプロトンと、エリスリトール４位のプロトンはそれぞれ４．７ｐｐｍ付近と４．０ｐｐｍ付近に検出される。しかし、エリスリトールの結合向きが異なる場合、上記プロトン由来のピークがそれぞれシフトすることがＤ． Ｃｒｉｃｈらによって報告されている（上記非特許文献７参照）。そこで、従来型ＭＥＬに対して本明細書に記載のＭＥＬが、上記のピークのみシフトしたスペクトルパターンを示すことを確認する。
【００６６】
さらに、得られたＭＥＬをアルカリ（ＮａＯＣＨ３）で加水分解して得られた糖鎖（マンノシルエリスリトール；以下ＭＥと省略することがある）のＮＭＲ解析を行う。得られたＭＥＬの糖鎖と従来型ＭＥＬの糖鎖のＮＭＲスペクトルを比較することで、本明細書に記載のＭＥＬの糖鎖部分の構造が、従来型ＭＥＬ（４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造）と異なるスペクトルパターンとなることを確認できる。
【００６７】
２）旋光度測定
ＭＥＬ又はＭＥの旋光度測定を行うことで、従来型ＭＥＬと本明細書に記載のＭＥＬの分子のキラリティーを比較することができる（上記非特許文献７参照）。Ｄ． Ｃｒｉｃｈらによって報告されている、本明細書に記載のＭＥＬと糖骨格が同じ１−Ｏ−（４’，６’−ジ−Ｏ−ドデシル−２’，３’−ジ−Ｏ−ドデシル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｄ−エリスリトールの比旋光度[α]Ｄ＝−２５．９°（ｃ＝１．５）であるので、これを参考にして比較することで立体構造の違いがわかる。
【００６８】
以上の方法により、本明細書に記載の方法で得られるＭＥＬが従来型ＭＥＬとは糖骨格の立体構造が異なることが確認できる。
【００６９】
以上のように、本明細書に記載のＭＥＬの製造方法によれば、従来型ＭＥＬとはキラリティーが異なり、これまで微生物による生産の報告例の無いＭＥＬを選択的に生産することができる。上述したように、分子のキラリティーの違いは生理活性や自己集合体形成能に大きな影響を及ぼすことから、本明細書に記載のＭＥＬは、従来型ＭＥＬとは界面活性に差が無いにもかかわらず、その他の諸性質において異なる挙動を示すようになる。それゆえ、本明細書に記載のＭＥＬと従来型ＭＥＬとの物性比較は、ＭＥＬの機能評価に対する重要なファクターを示すこととなる。その結果、生理活性等の構造−物性相関に関するデータの蓄積は、医薬、食品、化粧品分野等、種々用途へのバイオサーファクタントの用途開拓の進展に大いに貢献するものである。
【００７０】
さらにいえば、本明細書に記載のＭＥＬは、一見すると化学的な合成手法を用いても理論上では合成可能であるようにみえる。しかしながら、化学合成により合成する場合、極めて特殊な合成技術と多段階に渡る複雑な保護・脱保護反応が必要である。また、そもそもキラリティーを完全に制御することは著しく困難であるため、現実的には化学的に合成することは極めて困難であるといえる。これに対して、本明細書に示すような微生物生産法では精巧な生合成経路を経由するため、位置・立体構造が完全に制御された特殊構造を維持し、かつ一段階のステップのみで製造する方法を提供できるため、極めて有効な手段と成り得る。
【００７１】
＜２−５．１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールの同定＞
上記一般式（２）に示される４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール（以下、４−Ｏ−ＭＥと省略することがある。）は、これまでに従来型ＭＥＬ（４−Ｏ−ＭＥＬ）のアルカリ加水分解によって合成され、その構造解析結果が報告されている公知のオリゴ糖アルコールである。また、キャンディダ属酵母を用いたグルコースを原料とする発酵生産方法も報告されており（特開昭６３−６３３９０、T. Kobayashiら, Argic. Biol. Chem. Vol.51, pp.1715-1716 (1987)）、化粧品、医薬品の成分としての有効性が期待されている。
【００７２】
しかし、上述のように、本明細書に記載のＭＥＬをアルカリ加水分解することで得られる糖鎖は、上記一般式（３）に示される１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール（以下、１−Ｏ−ＭＥと省略することがある。）であり、Ｄ． Ｃｒｉｃｈらによってその構造は想定されている（上記非特許文献７参照）ものの、製造例及び単離・同定に関する報告例は皆無である。
【００７３】
単糖類、多糖類によらず、糖鎖には多数の不斉炭素原子が存在し、立体構造の違いによって多種多様に分類されており、それぞれ特定の機能を有する。特に糖鎖の立体構造の違いは特異な生体分子認識機構の中枢を担っていることから、分子のキラリティーの違いは生理活性に大きな影響を及ぼすものと考えられ、本発明によって得られる１−Ｏ−ＭＥには、従来の４−Ｏ−ＭＥとは異なる生理機能の発現が期待される。特に、糖アルコールは低甘味、低エネルギー性、非う蝕性等の特徴を利用して食品分野に広く利用されるほか、保湿性等を利用して化粧品分野でも需要が高く、新たな構造、キラリティーを有する素材を提供できれば、その利用価値は極めて高い。
【００７４】
なお、本発明には以下の発明が含まれていてもよい。
【００７５】
（１）上記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッド。
（式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。ただし、置換基Ｒ１がともに炭素数１２の脂肪族アシル基であって、置換基Ｒ２がともにアセチル基であって、置換基Ｒ３が水素であるものを除く。）
（２）上記一般式（１）中、置換基Ｒ２のいずれか一方がアセチル基であり、他方が水素である（１）に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
【００７６】
（３）上記一般式（１）中、置換基Ｒ３が炭素数２〜２４の脂肪族アシル基である（１）又は（２）に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
【００７７】
（４）微生物により生産されたものである（１）〜（３）のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
【００７８】
（５）シュードザイマ（Pseudozyma）属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、上記一般式（１）で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを製造するマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
（式（１）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、置換基Ｒ２は同一でも異なっていてもよく水素又はアセチル基を表す。また、置換基Ｒ３は水素又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。）
（６）上記微生物が、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）又はシュードザイマ・クラッサ（Pseudozyma crassa）である（５）に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【００７９】
上記発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様及び以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神及び添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００８１】
〔実施例１：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養〕
ａ）保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を、 グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し３０℃で振とう培養を行い、次いで、ｂ）得られた菌体培養液１ｍＬを所定量の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌの組成の液体培地２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で振とう培養を行った。
上記ａ）とｂ）の各培養により得られた菌体培養液を使用して、以下の試験を行った。
【００８２】
〔実施例２：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の糖脂質生産能の確認〕
ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を７日間行って培養液を採取し、これを用いてPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株のバイオサーファクタントの生産を薄層クロマトグラフィーで確認した。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア水＝６５：１５：２を用い、指示薬には糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン硫酸試薬を用いた。ＭＥＬの標準として、Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株を大豆油添加培地で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた。ＭＥＬ標準における、ＭＥＬ−Ａ〜Ｄはそれぞれ上記一般式（４）に表される化合物を示す。
【００８３】
その結果を図１に示す。同図によれば、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株は、ＭＥＬ−Ｂと思われる糖脂質を生産していることがわかった。
【００８４】
〔実施例３：ＭＥＬ生産用培地で同リピッドの生産〕
Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を７日間行った。その後培養液を採取し、培養液中の酢酸エチル可溶成分を精製後、生産されたＭＥＬを高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例として大豆油を炭素源として培養したPseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株の培養液を、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【００８５】
その結果を図２に示す。図２によれば、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を培養すると、ＭＥＬ−Ｂと同じ保持時間にピークが確認できる糖脂質を得られることがわかる。
【００８６】
〔実施例４：Pseudozyma crassa CBS 9959株の培養とＭＥＬ生産能の確認〕
実施例１に記載の方法に対し、Pseudozyma crassa CBS 9959株を用い、温度は２５℃に設定して同様に培養を行った。ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を７日間行った後の培養液を採取し、これを用いて実施例２に記載の方法と同様に、Pseudozyma crassa CBS 9959株のバイオサーファクタントの生産を薄層クロマトグラフィーで確認した。
【００８７】
その結果を図３に示す。これによれば、Pseudozyma crassa CBS 9959株は、既知のＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ〜Ｃ）よりも少しずつＲｆ値の低い糖脂質を生産していることがわかった。
【００８８】
〔実施例５：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬの構造解析〕
まず、糖骨格のＮＭＲ解析を行った。実施例２で得られた糖脂質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた既知の分離方法で単離・精製し、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒として１Ｈ−ＮＭＲ解析を行った。比較対象として、Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株を培養して生産し、単離・精製した従来型ＭＥＬ−Ｂについても同様に測定した。
【００８９】
結果を図４に示す。同図に示すように、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する糖脂質はＭＥＬ−Ｂであることがわかった。また、マンノース１’位（図中、Ｈ−１’）が４．７３ｐｐｍから４．７６ｐｐｍへと低磁場シフトし、さらに従来型ＭＥＬでは大きく２つに分かれるエリスリトール４位プロトン（３．８ｐｐｍ、４．０ｐｐｍ）も、大きくシフトして１つにまとまる（３．９ｐｐｍ）様子が確認された。これはＤ． Ｃｒｉｃｈらによって報告されている非特許文献７の記述と全く一致しており、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産したＭＥＬ由来のエリスリトールが従来型ＭＥＬとは逆向きに結合していることを証明するものである。
【００９０】
＜１−Ｏ−ＭＥの合成と構造解析＞
さらに、より詳細な糖骨格構造の比較を行うため、アルカリ加水分解によって側鎖脂肪酸を開裂することで、糖鎖（マンノシルエリスリトール；ＭＥ）の合成を行った。実施例６で得られたＭＥＬ（６８０ｍｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド（２０ｍｇ）を添加して、室温で１時間撹拌した。反応終了後、陽イオン交換樹脂（ダウエックスＨフォーム；１ｇ）を加えてさらに１５分撹拌し、ろ過によって樹脂を除去後、エバポレーターによってメタノールを除去した。得られた残渣に少量の水（１ ｍＬ）と酢酸エチル（１０ ｍＬ）を加え、反応によって開裂した脂肪酸及び酢酸を酢酸エチル相に抽出して除去した。糖鎖が含まれる水相について、９０％エタノール水溶液中で再結晶操作を行うことにより糖鎖（マンノシルエリスリトール；ＭＥ）を回収した。上記操作によって、本反応では糖鎖の結晶は得られず、無色透明、油状の化合物が沈殿として得られた（２５７ｍｇ）。
【００９１】
一方、実施例１においてＭＥＬ標品として用いたPseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株を培養することで得られる従来型ＭＥＬについても、同様の操作で糖鎖を回収した。本操作によって従来型ＭＥＬから合成した糖鎖（４−Ｏ−ＭＥ）は白色針状結晶として得られた（２２４ｍｇ）。
【００９２】
得られた各ＭＥについて、重水（Ｄ２Ｏ）を溶媒として１Ｈ、１３Ｃ−、各種二次元ＮＭＲ解析を行った。
【００９３】
その結果、図５に示すように、エリスリトール４位プロトンのみピークのシフトが見られた（Ｈ−４ａ：３．８５ｐｐｍ→３．８９ｐｐｍ、Ｈ−４ｂ：４．１２ｐｐｍ→４．０ｐｐｍ）。M. Kurzらは、従来型ＭＥＬと同じ構造であるウスチリピッドから調製した４−Ｏ−β−マンノピラノシル−Ｄ−エリスリトール（文献中では１−Ｏ−βマンノピラノシル−Ｌ−エリスリトールと記載）の詳細な構造解析を行っており（J. Antibiot., 56, 91-101 (2003)）、ここで従来型ＭＥの４位プロトンの化学シフトが、Ｈ−４ａ：３．７６ｐｐｍ、Ｈ−４ｂ：４．０９ｐｐｍと記載している。このように公知の文献においても、従来型ＭＥ（及びＭＥＬ）は、エリスリトール４位プロトンが大きく２つに分かれることが提示されており、本明細書に記載のＭＥＬが、エリスリトールが逆向きに結合した１−Ｏ−β−マンノピラノシル−Ｄ−エリスリトールを糖骨格構造に有する従来型ＭＥＬとは光学異性体の関係にある新規ＭＥＬであることが示された。それぞれの化学シフトをまとめて表１に示す。
【００９４】
【表１】
0005339335.tif 000008
【００９５】
＜１−Ｏ−ＭＥの旋光度測定＞
次いで、上記ＭＥについて、旋光度測定を行った。Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株それぞれを培養して得られたＭＥＬから、上記に従ってアルカリ加水分解によりＭＥを合成し、蒸留水に溶解して１％水溶液を作成した。各水溶液について、旋光計（日本分光デジタル旋光計ＤＩＰ ３７０型）を用いて旋光度測定を行い、各ＭＥの比旋光度を求めた。
【００９６】
その結果、Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）由来のＭＥの比旋光度は[α]Ｄ＝−３５．２°であり、一方Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株由来のＭＥの比旋光度は[α]Ｄ＝−３９．６°となった。すなわち各菌株から生産されたＭＥＬの糖骨格（ＭＥ）のキラリティーが異なることが示され、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬは従来型のＭＥＬとは糖骨格の立体構造が異なる光学異性体となっていることが証明された。
【００９７】
＜１−Ｏ−ＭＥの状態観察＞
Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）由来の従来型ＭＥは、上記の合成、回収操作（９０％エタノール中での再結晶操作）によって白色針状結晶として得られた。融点測定の結果、融点は１５６．９℃であることが確認された。一方、本発明のPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株由来のＭＥは、上述の再結晶操作によって結晶が得られず、無色透明、油状の化合物として得られた。得られた油状ＭＥは、凍結乾燥や不溶溶媒（アルコール類、アセトンなど）中への再沈殿操作によっても粉末状の化合物として回収することができず、その結果、融点測定を行うことができなかった。
【００９８】
以上のように、両者の間で分子の立体構造が異なり、結晶性が異なることが示された。本発明の１−Ｏ−ＭＥは、上記のように従来型４−Ｏ−ＭＥに比べ高い吸湿性を有することが推測され、これは保湿・湿潤剤としてスキンケア等の化粧品用途に利用する際非常に有利である。
【００９９】
以上の結果から、実施例２で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬはＭＥＬ−Ｂであり、さらに従来型ＭＥＬ−Ｂとは光学異性体の関係にある１−（６’−アセチル−２’、３’−ジ−Ｏ−アルカ（ケ）ノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールであることが確認された。
【０１００】
〔実施例６：Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産するＭＥＬの構造解析〕
実施例４で得られたPseudozyma crassa CBS 9959株が生産する糖脂質についても、実施例５と同様にして単離・精製を行い、３種類の糖脂質について全て１Ｈ−ＮＭＲ解析を行い、従来型ＭＥＬ−Ａ〜Ｃと比較した。
【０１０１】
その結果、図６に示すように、Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産する３種類の糖脂質は、ＭＥＬ−Ａ〜Ｃにそれぞれ対応し、さらに従来型ＭＥＬでは大きく２つに分かれるエリスリトール４位プロトンピークが、シフトして１つにまとまっていることが確認された。したがってPseudozyma crassa CBS 9959株は、従来型ＭＥＬとはエリスリトールが逆向きに結合したＭＥＬ−Ａ〜Ｃそれぞれの光学異性体を生産することが証明された。
【０１０２】
〔実施例７：液晶形成能の比較〕
実施例２で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬと、Pseudozyma antarctica KM-34（ＦＥＲＭＰ−２０７３０）株が生産する従来型ＭＥＬについて、水侵入法による液晶形成能の比較を行った。その結果、図７及び図８に示すように、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株由来のＭＥＬは、従来型ＭＥＬと比べて非常に広い濃度領域でラメラ相を形成する能力を有しており、液晶形成能に極めて優れたバイオサーファクタントであることが示された。
【０１０３】
〔実施例８：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養によるトリアシルＭＥＬの生産〕
０．２ｍｌのP.tsukubaensisフローズンストックを２０ｍｌのＹＭ種培地／５００ｍｌ容坂口フラスコに植菌し、２６℃、１８０ｒｐｍ、１晩培養させ、種種菌とした。０．２ｍｌの種種菌を再度、２０ｍｌのＹＭ種培地／５００ｍｌ容坂口フラスコに植菌し、２６℃、１８０ｒｐｍ、１晩培養させ、種菌とした。２０ｍｌの種菌を２ＬのＹＭ培地／５Ｌ Ｊａｒに植菌し、２６℃  ３００ｒｐｍ（１／４ＶＶＭ、０．５Ｌ ａｉｒ／ｍｉｎ）で８日間培養した。培養液を７，９００ｒｐｍ  ６０ｍｉｎ  ４℃で遠心し、菌体（ＭＥＬ−Ｂを含む）と上清に分離した。菌体画分にそれぞれ８０ｍｌの酢酸エチルを加え、菌体が十分懸濁するように上下に攪拌した後、７，９００ｒｐｍ  ３０ｍｉｎ  ４℃で遠心した。得られた上清に等量の飽和食塩水を加え攪拌し酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層に無水硫酸Naを適量加え、３０分間精置させた後、エバポレートし糖脂質を得た。
【０１０４】
〔実施例９：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリアシルＭＥＬのＮＭＲ解析〕
実施例８で得られた糖脂質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた既知の分離方法で単離・精製し、ＭＥＬ−Ｂ  ５０ｇおよびトリアシルＭＥＬ−Ｂ  １．５ｇを得た。トリアシルＭＥＬ−Ｂ画分について重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）を溶媒として１H−ＮＭＲ分析を行い実施例５と同様の方法で解析を行った。その結果を図９に示す。同図に示すように、P. tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリアシルＭＥＬ−Ｂについてもエリスリトールが従来型ＭＥＬとは逆向きに結合していることが確認された。
【０１０５】
比較対象として、Pseudozyma hubeiensisを培養して生産し、上記と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、ＭＥＬ−Ｃ  ４５ｇ、トリアシルＭＥＬ−Ｃ  １．３ｇを単離・精製した。このトリアシルＭＥＬ−Cについても同様に重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）を溶媒として１H−ＮＭＲ分析を行った。その結果、図１０に示すように、Pseudozyma hubeiensisが産生したＭＥＬ−Ｃは、エリスリトールが従来型ＭＥＬと同じ向きで結合していることを確認した。
【０１０６】
〔実施例１０：Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬ−Ｂの脂質ドメイン解析〕
Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬ−Ｂを、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分離した後、マススペクトロメトリーにより質量分析を行い（ＬＣ−ＭＳ分析）、脂質ドメインの脂肪酸構造を確認した。その結果、図１１に示すように、マンノースの一方の水酸基には炭素数８の脂肪酸が付加しており、もう一方には１０から１４の脂肪酸が付加していることが確認された。
【０１０７】
比較対象として、Pseudozyma hubeiensisを培養して生産し、単離・精製したトリアシルＭＥＬ−Cについても同様にＬＣ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１２に示すように、マンノースの一方の水酸基には炭素数６の脂肪酸が主に付加しており、もう一方には８から１６の脂肪酸が付加していることが確認された。
【０１０８】
なお、ＨＰＬＣの分析条件は以下の通り。ＨＰＬＣ装置：Agilent100、カラム：Imtakt  Cadenza  ＣＤ−Ｃ１８  ２×１５０ｍｍ、移動相：Ａ  ０．１%ギ酸、Ｂ  アセトニトリル、０分（５０%Ｂ）−２０分（９８%Ｂ）−３０分（９８%Ｂ）、流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、注入量：３μｌ。ＭＳ条件は以下の通り。ＭＳ装置：BRUKER  DALTONICS esquire  3000  Plus、イオン化法：ＥＳＩ  ポジティブ。
【０１０９】
〔実施例１１：ＭＥＬの構造解析〕
さらに、各種ＮＭＲ（1H、13C、1H-1H COSY、HMQC、HMBC）測定を行い、ＭＥＬの構造を詳細に解析した。構造解析を簡便にするため、炭素源として大豆油の代わりにオレイン酸とグルコースを４０ｇ／Ｌずつ添加し、残りの条件は実施例４と同様の方法で生産し、実施例５と同様にして単離・精製したP. crassaが生産するＭＥＬ−Ａを用いた。1H-NMRスペクトル及び1H-1H COSYスペクトルを図１３、図１４にそれぞれ示す。
【０１１０】
図１４のCOSYスペクトルにおいて、ａ−ｂ−ｃの相関が明確に示された。ｃはHMBCスペクトル測定結果より２’−位に結合しているエステルであることが確認され、このことから２’−位の脂肪酸エステルがＣ４のブタノイル基であることが示された。また、２．１ｐｐｍ付近に３本のピークが検出され、それぞれが２’、４’、６’−位に結合しているアセチル基由来のピークであることも確認された。
【０１１１】
上記をまとめると、P. crassaが生産するＭＥＬ−Ａは図１３中に示した構造式の通り、従来型ＭＥＬとはエリスリトールが逆向きに結合し、２’−位にアセチル基、またはブタノイル基、３’−位に脂肪酸エステル基が結合した構造のＭＥＬであることが確認された。また、ピークの積分値より、２’−位にアセチル基を有するＭＥＬとブタノイル基を有するＭＥＬの比率は約６０：４０であることが示された。
【０１１２】
続いて、得られたＭＥＬの側鎖脂肪酸組成の分析を以下の手順で行った。ＭＥＬ約１０ｍｇを蓋付試験管に秤取し、５％塩酸メタノール試薬１ｍＬを加え、８０℃で加熱することで脂肪酸部の加水分解を行った。２時間後、水１ｍＬを加えて反応を停止させ、ヘキサン１ｍＬを添加することで、反応によって生成した脂肪酸メチルエステルをヘキサン相に抽出した。このようにして得られた脂肪酸メチルエステルを含むヘキサン相をＧＣ／ＭＳ分析に掛けることで、ＭＥＬに結合している脂肪酸鎖の組成分析を行った。結果を表２に示す。なお、本分析では脂肪酸鎖がＣ６以上のものしか検出されない。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
分析の結果、上記で得られたＭＥＬは、Ｃ１４の脂肪酸が主成分であり、全体の約６５％、次いでＣ１６の脂肪酸が約２４％であった。２’−位には本測定で検出できないＣ２またはＣ４のエステルのみが結合していることから、上記の脂肪酸組成はそのまま３’−位に結合している脂肪酸組成比に一致すると考えられる。
【０１１５】
さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定によって、上記ＭＥＬの分子量測定を行った。ＭＥＬ−ＡのＭＳスペクトルを図１５に示す。ＭＳ分析の結果より、擬似分子イオン[M+Na]+ (z/m) 641.8または669.9が検出された。前者はＣ１４：１脂肪酸とアセチル基、後者はＣ１４：１脂肪酸とブタノイル基、またはＣ１６：１脂肪酸とアセチル基が結合したＭＥＬ−Ａであると推測される。
【０１１６】
以上のＮＭＲ測定、脂肪酸組成分析、分子量測定の結果をまとめると、P. crassaが生産するＭＥＬ−Ａの主成分は、下記一般式（５）に示す１−（２’、４’、６’−トリアセチル−３’−Ｏ−アルカ（ケ）ノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトール、または一般式（６）に示す１−（４’、６’−ジアセチル−２’−Ｏ−ブタノイル−３’−Ｏ−アルカ（ケ）ノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールに示される構造であり（３’−位のアルカノイル基は、上記脂肪酸組成分析結果の通り、Ｃ１４、Ｃ１６、またはＣ１８の飽和または不飽和脂肪酸エステル）と考えられる。また同様に、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃはそれぞれ上記の構造から４’−位または６’−位のアセチル基が外れた構造であることが確認された。これらの構造のＭＥＬは全てこれまで報告例の無い化合物であり、一般的な化学合成法では極めて合成困難な化合物である。
【０１１７】
【化７】
0005339335.tif 000010
【０１１８】
〔実施例１２：４−Ｏ−ＭＥと１−Ｏ−ＭＥの肌の保湿効果〕
４−Ｏ−ＭＥ及び１−Ｏ−ＭＥの分子のキラリティーの違いによる肌の保湿効果を評価するために、上記糖質を含む水溶液を肌に塗布し、肌の導電性を測定することで保水力の比較を行った。実施例５の方法で合成した４−Ｏ−ＭＥ及び１−Ｏ−ＭＥの１％水溶液及び純水を調製し、前腕内側皮膚に１０μＬ／ｃｍ２塗布した。SANWA Digital Multimeterを用いて塗布後すぐ、１０分後、３０分後、６０分後の塗布部１ｃｍ間の導電性（電気抵抗）を測定することで比較を行った。評価は６サンプルの平均とした。電気抵抗の経時変化を図１６に記す。
【０１１９】
図１６に示すように、水、１％４−Ｏ−ＭＥ水溶液を塗布した場合、時間経過に伴って抵抗値が大きく上昇し、乾燥肌の状態に近づいた。一方、１％１−Ｏ−ＭＥ水溶液を塗布した場合は、初期の抵抗値の上昇は他のサンプルと大差なかったものの、時間経過によっても抵抗値は緩やかな上昇となり、３０分後、６０分後で抵抗値の差は拡がり、肌の保水量に差が出たことを示した。すなわち、１−Ｏ−ＭＥは、４−Ｏ−ＭＥと比較して保水能力に優れていることが示された。
【０１２０】
エリスリトールの結合向きが異なることで、水酸基の配向が異なり、より水を分子内または分子間で保持する能力が高まっていることが推測される。実施例５でも述べたように、１−Ｏ−ＭＥは結晶の吸水性が高く、水を保持しやすい状態にあることが裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本明細書に記載のＭＥＬは、従来型ＭＥＬに対してエリスリトールがマンノースに逆向きにエーテル結合したキラリティーの全く異なる構造をしており、液晶形成挙動をはじめ、自己集合特性が従来のものとは大きく異なる。これらの物性の違いによって、従来型には見られない新たな生理活性の発現が期待されることから、従来型ＭＥＬと同様に、洗浄剤用途、食品工業、化学工業、環境分野等への幅広い利用はもちろん、特に医薬、化粧品産業等での用途拡大に多大に貢献できると考えられるものと期待される。
【０１２２】
また、本発明に係るＭＥは従来型ＭＥに対してエリスリトールがマンノースに逆向きにエーテル結合したキラリティーの全く異なる構造をしていることで、従来型ＭＥと比べて生理機能が大きく異なる。それゆえ、結晶性の違い、保水力の違いを利用して、医薬、化粧品産業、食品工業、化学工業等で機能性の基幹物質としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】実施例２におけるPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養物についての薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】実施例３における、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養物についての高速液体クロマトグラフィーの分析結果を示す図である。
【図３】実施例４における、Pseudozyma crassa CBS 9959株の培養物についての薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】実施例５で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及びPseudozyma antarctica KM-34（FERMP-20730）株が生産するＭＥＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける、糖骨格部分の拡大図（３．４〜５．７ｐｐｍ）である。
【図５】実施例５で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及びPseudozyma antarctica KM-34（FERMP-20730）株が生産するＭＥＬを出発物質として合成した、マンノシルエリスリトールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける、糖骨格部分の拡大図（３．３〜４．２ｐｐｍ）である。
【図６】実施例６で得られたPseudozyma crassa CBS 9959株が生産するＭＥＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける、糖骨格部分の拡大図（３．４〜５．７ｐｐｍ）である。
【図７】実施例７において、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及びPseudozyma antarctica KM-34（FERMP-20730）株が生産するＭＥＬに関し、水侵入法によって液晶形成能について偏光顕微鏡観察を行った結果を示す図である。
【図８】実施例７において、Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株、及びPseudozyma antarctica KM-34（FERMP-20730）株が生産するＭＥＬに関し、水侵入法によって液晶形成能について位相差顕微鏡観察を行った結果を示す図である。
【図９】実施例８、実施例９で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリアシルＭＥＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと糖骨格部分の拡大図（３．４〜５．７ｐｐｍ）である。
【図１０】実施例９で得られたPseudozyma hubeiensisが生産するトリアシルＭＥＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと糖骨格部分の拡大図（３．０〜５．７ｐｐｍ）である。
【図１１】実施例８、実施例９で得られたPseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するＭＥＬのＨＰＬＣ（ＯＤＳ）−ＭＳ分析による脂質ドメイン解析結果を示す図である。
【図１２】実施例９で得られたPseudozyma hubeiensisが生産するトリアシルＭＥＬのＨＰＬＣ（ＯＤＳ）−ＭＳ分析による脂質ドメイン解析結果である。
【図１３】実施例６で得られたPseudozyma crassa CBS 9959株が生産するＭＥＬ−Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】実施例６で得られたPseudozyma crassa CBS 9959株が生産するＭＥＬ−Ａの１Ｈ−１Ｈ COSYスペクトルにおける、脂質部分の拡大図（０．７〜２．５ｐｐｍ）である。
【図１５】実施例６で得られたPseudozyma crassa CBS 9959株が生産するＭＥＬ−Ａの分子量測定を行ったMALDI-TOF/MSスペクトルを示す図である。
【図１６】実施例１２において、サンプル塗布後の肌の保水量を比較するために肌表面の電気抵抗の経時変化を追ったグラフを示す図である。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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