(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかのペプチド。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は２個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、癌に対する免疫誘導剤。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、キラーT細胞の誘導能が高い抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、キラーT細胞を誘導するための薬剤。
【請求項６】
以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、キラーT細胞の誘導能が高い抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は２個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーT細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを用いて誘導される、キラーT細胞。
【請求項９】
HLA分子と請求項１に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
【請求項１０】
請求項４又は６に記載の薬剤によって誘導される、請求項９に記載の抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌、膵臓癌および悪性黒色腫（メラノーマ）などのSPARCを高発現する癌の癌ワクチンとして有効な新規ペプチド、並びに当該ペプチドを含む腫瘍の治療及び／または予防のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、欧米と比較して、日本や中国などのアジア諸国で罹患率が高い。胃癌は、健康診断の普及や消化器内視鏡器具や、検査技術の進歩により、早期発見が可能となり、患者数は減少しつつある。しかしながら、依然として日本人の悪性新生物の死亡原因の第２位を占めており、未だ死亡原因に占める割合は高い。胃癌の中でもび漫性（スキルス）胃癌は、他の胃癌（腺癌）と比較して、若年者に発生し、癌の進展、転移、腹膜播種の傾向が強く、予後が不良である。スキルス胃癌は、診断時にすでに外科的切除が不能であることが多く、たとえ切除可能であっても、治療後の再発例が多いため、新たな治療法を確立することが急務である。【０００３】
我国における膵癌の死亡者数は増加する傾向にあり、2003年には21,148人が膵癌で死亡している。膵癌は現在、我国の癌による死因の6.8％を占めており、肺癌、胃癌、大腸癌、肝癌に次いで第5位である。世界人口統計データを解析して、年齢構成の異なる集団の死亡率を比較する際に用いられる年齢調整死亡率を算出してみると、2000年には100,000人あたり、男性で は 日本8.6人に対し米国7.3人、英国6.3〜7.0人、女性では日本4.9人に対し米国 5.3人、英国4.8〜5.1人と欧米と同水準になっている。
2000年の年齢調整率（世界人口による、100,000人あたり）でみると、男性では日本8.6に対して、米国7.3、英国6.3〜7.0、女性では日本4.9に対して、米国5.3、英国4.8〜5.1と欧米と同水準になっている。画像診断が進歩した現在においても、日本人の患者全体の約4割が、遠隔転移を有する進行例であり、さらに切除不能な局所進行例の状態で発見される患者も多い。1996年診断例における、膵癌患者全体の5年相対生存率は4.3％で、従来の2〜3％より増加傾向にはあるものの、依然として低い。膵癌の発生要因に関しては、喫煙、肥満、食事、飲酒、コーヒーなどの生活習慣のほか、慢性膵炎や糖尿病、遺伝要因など、さまざまな因子の関与が示唆されている。【０００４】
膵臓癌に特異的な症状はなく、症状が出た場合はすでに進行していることが多い。そのため、患者全体の5年生存率は５％以下と、診断後の予後が極めて不良である。診断の困難さによって特に先進国では、次第に癌死亡の原因疾患としての頻度が増加しつつある。現在、外科的切除を中心として、放射線治療、化学療法などによる集学的治療が行われているが、劇的な治療効果の改善はなく、新たな治療戦略の確立は急務である。【０００５】
メラノーマとは悪性黒色腫と呼ばれる皮膚がんの一種であり、浸潤および転移傾向が非常に強く、悪性度の高い癌として非常に恐れられている。皮膚を構成している細胞のなかに、メラニン色素を産生する細胞があり、これを色素細胞（メラノサイト）と呼ぶが、この細胞ががん化したものがメラノーマである。またメラノーマは、環境破壊による大気中のオゾン層の減少による、紫外線への暴露の増加により、特に白人において発生頻度が増加しつつある。
日本におけるメラノーマの発生数は人口10万人あたり1.5〜2人くらいと言われ、年間1500人〜2000人くらい発生していると推測されている。欧米では人口10万人あたり10数人以上の発生と言われ、オーストラリアでは人口10万人あたり20数人以上の発生で世界一発生数が高いと言われている。それだけに欧米やオーストラリアの人々はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。また、驚くことに外国でも日本でもメラノーマの発生は年々増加傾向が認められている。最近の調査では、日本におけるこの病気による年間死亡者数は450人前後もいる。メラノーマは何歳の人でも発生しているが、特に40歳以上になると発生が多くなり、60歳〜70歳台が最も多くなっている。小児の発生は非常に少ないが、発生しないということはなく、最近20〜30歳台の若年者の発生が多くなっている傾向がある。性別では特にどちらかに多いという傾向はなく、男女どちらにも発生する。日本人のメラノーマが発生しやすい部位は、足底（足のうら）が最も多く、約3割ぐらいを占めている。足や指の爪の部分にも多くできることが、日本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、頭など、どこの皮膚にも発生する。【０００６】
現在、メラノーマの治療法として外科療法、化学療法および放射線療法が実施されている。しかし、これらの治療法の適応外の転移癌や難治性癌に対する緩和的な治療法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより癌の増殖を抑制する免疫療法が注目され、実際に一部の患者では功を奏している。【０００７】
一方、近年の分子生物学及び腫瘍免疫学の発展により、細胞傷害性（キラー）T細胞およびヘルパーT細胞が、癌細胞あるいは抗原提示細胞の表面にHLA分子を介して提示される、癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が分解されてできたペプチドを認識して、癌細胞を破壊する免疫反応を示すことが明らかとなった。さらに、このような癌を攻撃する免疫反応を刺激する、腫瘍抗原蛋白質及び、それらに由来するペプチドが多数同定されてきており、抗原特異的な腫瘍免疫療法の臨床応用が進められている。【０００８】
HLAクラスI分子は、身体のすべての有核細胞の表面に発現しており、細胞質や核で産生される蛋白質が、細胞内で分解されて出来たペプチドを結合して、細胞表面に発現する。正常な細胞の表面には、正常な自己の蛋白質に由来するペプチドがHLAクラスI分子に結合しており、これを免疫系のT細胞が識別して破壊することはない。一方、癌細胞は癌になる過程で、正常細胞には、ほとんど発現していないか、あるいはごく僅かしか発現していない蛋白質を大量に発現することがある。このような癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が細胞質内で分解されて出来たペプチドが、HLAクラスI分子に結合して癌細胞の表面に発現すると、キラーT細胞がこれを認識して癌細胞のみを破壊する。また、このような癌特異抗原やペプチドを個体に投与することにより、正常細胞には危害を加えることなく、癌細胞を破壊して癌の増殖を抑制することができる。これを、癌特異抗原を用いた癌免疫療法と呼ぶ。またHLAクラスII分子は、主に抗原提示細胞の表面に発現しており、抗原提示細胞が細胞外から取り込んで、細胞内で分解されて出来た癌特異抗原由来のペプチドを結合して細胞表面に発現する。これを認識したヘルパーT細胞は、活性化され他の免疫担当細胞を活性化する種々のサイトカインを産生することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導あるいは増強する。【０００９】
そこで、これらの癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に有害事象を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、他の治療が行えない、どんな末期の癌患者にでも使用できる治療法になりうると期待される。また、あらかじめ、このような癌を発生するリスクが高いヒトに対して、癌特異抗原およびぺプチドをワクチンとして投与することにより、癌の発生を予防できる可能性がある。【００１０】
本発明者らは先に、胃癌組織および正常組織における、ゲノムワイドの23,040種の遺伝子の発現をｃＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。その結果、びまん性浸潤性胃癌の患者20例中11例で、正常胃粘膜と比較して胃癌組織において５倍以上（平均13万倍）高発現する遺伝子として、Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) を同定した。（図１）SPARC遺伝子は、正常な脂肪組織、乳腺、卵巣、脊髄、精巣、子宮、胎盤などに軽度の発現を認めたが、正常胃粘膜と比較して、いずれも5倍以下の低い発現であった（図２）。【００１１】
SPARCは、びまん性浸潤性胃癌に高発現しているだけでなく、膵臓癌やメラノーマにも高発現していることが、他の研究者により既に報告されている。さらに発明者らは、メラノーマ患者の血清中には、SPARCが分泌されており、特にメラノーマの早期発見に有用な腫瘍マーカーとなりうることを見出している（特願2004-303688；及び Clinical Cancer Research 11: 8079-8088, 2005）。【００１２】
SPARCは286個のアミノ酸からなる43KDの酸性の分泌蛋白質で、システインに富み、細胞分裂期には核に移行する。またSPARCは、細胞外基質蛋白と細胞との相互作用を調節することにより、細胞の増殖を調節することにも関与する蛋白質である。骨芽細胞や血小板、創傷部位などに発現していることより、組織の修復と再構築に関与していると考えられている。さらに、メラノーマや骨肉腫などの癌、および腫瘍の間質細胞にも高発現すること、ならびにSPARCの発現が腫瘍の予後、浸潤あるいは転移と相関することが報告されている。【００１３】
【非特許文献１】Ikuta Y ら、Clinical Cancer Research 11: 8079-8088, 2005.
【特許文献１】特願2004-303688
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、びまん性浸潤性胃癌、膵臓癌およびメラノーマなどのSPARCを高発現する腫瘍の治療法として実施されている外科療法、化学療法および放射線療法では治療が難しい、転移癌や難治性癌に対する緩和的な治療法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより癌の増殖を抑制する免疫療法を行うための手段を開発することを解決すべき課題とする。即ち、本発明は、癌患者に有害事象を伴うことなく、上記の癌に対する強い免疫反応を誘導することができる、癌特異的に高発現するSPARC蛋白質由来のペプチドを同定して、当該ペプチドを腫瘍の免疫療法に応用することを解決すべき課題とする。本発明は、腫瘍に反応性を示すヒト・キラーT細胞、およびヘルパーT細胞を誘導することができるSPARC蛋白質由来のペプチドを同定し、SPARCを高発現する多様な癌の患者を対象として、腫瘍の免疫療法を可能にする手段を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、びまん性浸潤性胃癌のcDNA マイクロアレイ解析により、びまん性浸潤性胃癌に高発現する遺伝子SPARCを同定した。SPARCの発現は、一部の正常組織にも観察されるが、癌部と比較すると著しく低い。SPARC特異的なキラーT細胞による抗腫瘍免疫の誘導の有無を検討するために、結合するペプチドのアミノ酸配列に関する特徴が、日本人で最も頻度が高いHLA-A24と同一である、マウスKd分子を発現するBALB/cマウスを利用した。つまり、95％の相同性を有するヒトとマウスのSPARCについて、両者においてアミノ酸配列が共通しているペプチドで、ヒトのHLA-A24およびマウスKdに共通した結合モチーフを持つものを合成した。それらのペプチドの混合物を負荷した骨髄由来樹状細胞を、BALB/cマウス(Kd発現)に免疫することにより、ペプチド特異的かつSPARC発現癌細胞を破壊するキラーT細胞が誘導されるか否かを検討した。さらに、同様の免疫方法による前処置を受けたマウスにおいて、移植したマウスSPARC発現癌細胞の増殖が抑制され、生存期間が延長するか否か検討した。なお、ペプチドを免疫したマウスに、自己免疫現象の発生にともなって観察されるような有害事象が、出現するか否についても検討した。その結果、配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドは、SPARC発現癌細胞を破壊するキラーT細胞を誘導することができ、さらに、これらのペプチドを免疫したマウスにおいては、移植したマウスSPARC発現癌細胞の増殖が抑制され、生存期間が延長されることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【００１６】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  以下の何れかのペプチド。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーT細胞の誘導能を有するペプチド。【００１７】
（２）  （１）に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、癌に対する免疫誘導剤。
（３）  （１）に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
（４）  （１）に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、腫瘍反応性T細胞の誘導能が高い抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
（５）  （１）に記載のペプチドを少なくとも１種類以上を含む、腫瘍反応性T細胞を誘導するための薬剤。【００１８】
（６）  以下の何れかのペプチドをコードする遺伝子を含む、腫瘍反応性T細胞の誘導能が高い抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーT細胞の誘導能を有するペプチド。【００１９】
（７）  （１）に記載のペプチドに対する抗体。
（８）  （１）に記載のペプチドを用いて誘導される、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団。【００２０】
（９）  HLA分子と（１）に記載のペプチドとの複合体を提示する抗原提示細胞。
（１０）  （４）又は（６）に記載の薬剤によって誘導される、（９）に記載の抗原提示細胞。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１）本発明のペプチド及びそれを含む癌に対する免疫誘導剤
本発明のペプチドは、以下の何れかのペプチドである。
（Ａ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーＴ細胞、の誘導能を有するペプチド。【００２２】
本明細書で言う細胞傷害性T細胞の誘導能を有するペプチドとは、キラーＴ細胞を刺激するＴ細胞誘導活性を有するペプチドを意味する。【００２３】
本発明のペプチドの入手・製造方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、遺伝子組み換え技術により作製した、組み換えペプチドの何れでもよい。【００２４】
化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って、本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して、本発明のペプチドを合成することもできる。【００２５】
本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、該ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。【００２６】
発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、ペプチドをコードする遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また、本発明のペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれでもよく、また宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた公知の手法により行えばよい。【００２７】
本発明においては、上記のようにして作製した形質転換体を培養し、培養物中に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物より本発明のペプチドを採取することにより、組み換えペプチドを単離することができる。【００２８】
形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えばよい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のペプチドを単離精製するには、通常のペプチドの単離、精製法を用いればよい。【００２９】
本明細書における「１又は数個のアミノ酸」とは、一般的には１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜８個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸（例えば、１個、２個又は３個のアミノ酸）を意味する。【００３０】
なお、配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１から３の何れかに記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者であれば適宜製造又は入手することができる。即ち、配列番号１から３の何れかに示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、細胞傷害性T細胞の誘導能を有するペプチドは、上記の化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。【００３１】
上記した本発明のペプチドは、後記実施例にも示す通り、癌に対する免疫を誘導することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む、癌に対する免疫誘導剤が提供される。【００３２】
本発明の癌に対する免疫誘導剤は、インビトロ、エクソビボ又はインビボ、好ましくはエクソビボで用いることにより、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができ、これにより癌に対する免疫を付与することができる。【００３３】
(２)本発明の抗体
本発明は、上記した本発明のペプチドの一部もしくは全部をエピトープ（抗原）として認識する抗体、並びに当該ペプチドを用いて、エクソビボあるいはインビトロ刺激により誘導されたキラーＴ細胞にも関する。一般的には、キラーT細胞の方が抗体よりも強い抗腫瘍活性を示すことが知られている。【００３４】
本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は定法により行なうことができる。【００３５】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物又は鳥類を免疫感作し、該哺乳動物又は鳥類から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等の哺乳動物又は鳥類を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適当なアジュバントを含む緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の、通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。【００３６】
免疫感作した哺乳動物又は鳥類を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら、例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物又は鳥類から血液を採取して、該血液（ポリクローナル抗血清）を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、本発明のペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。【００３７】
一方、モノクローナル抗体はハイブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合により、ハイブリドーマを得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。【００３８】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明のペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を動物の皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合してハイブリドーマを作製することができる。【００３９】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明のペプチドを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行うことにより、本発明のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。【００４０】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。【００４１】
また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。【００４２】
（３）キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団
本発明はまた、本発明のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団に関する。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を、本発明のペプチドでインビトロ刺激すると、腫瘍反応性を示す活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は、癌の養子免疫療法に有効に用いることができる。また本発明のペプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞に、インビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原ペプチド発現樹状細胞を投与することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導することができる。【００４３】
好ましくは、本発明のペプチドと、免疫賦活剤とを用いてエクソビボあるいはインビトロ刺激により、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができる。ここで用いる免疫賦活剤としては、細胞増殖因子又はサイトカインなどが挙げられる。【００４４】
上記のようにして得られたキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を体内に移入することにより、腫瘍を抑制することができ、癌を予防及び／又は治療することが可能である。【００４５】
また、本発明のペプチドを用いることにより、上記した通り腫瘍の増殖を抑制することができるキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。従って、本発明によれば、腫瘍反応性T細胞と本発明のペプチドを含む細胞培養液が提供される。この細胞培養液を用いることにより、腫瘍を抑制することができるキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。さらに、本発明によれば、上記の細胞培養液、及び細胞培養容器を含む、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養キットも提供される。【００４６】
（４）本発明の腫瘍の治療及び／または予防のための医薬（癌ワクチン）
本発明のペプチドは、癌細胞特異的キラーＴ細胞を誘導することができるので、癌の治療、予防剤として期待できる。例えば、本発明のペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、この組換えＤＮＡで形質転換されたBCG菌の細菌、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡをゲノムに組み込まれたワクシニアウイルス等のウイルスは、ヒト癌の治療・予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ワクチンの投与量及び投与法は通常の種痘やＢＣＧワクチンと同様である。【００４７】
即ち、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（そのまま、あるいは発現ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡの形）、当該ＤＮＡを含む組換えウイルス若しくは組換え細菌はそのままあるいはアジュバントに分散した状態で、癌ワクチンとしてヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明のペプチドも同様に、アジュバンドと分散した状態で癌ワクチンとして投与することができる。【００４８】
本発明で用いることができるアジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用することが好ましい。【００４９】
本明細書で言う癌の種類は特に限定されず、具体例としては、胃癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、皮膚癌、骨肉腫、褐色細胞腫、頭頸部癌、脳腫瘍、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、又は軟部組織肉腫などが挙げられ、上記の中でも、胃癌（特に、びまん性浸潤性胃癌）、膵臓癌、又はメラノーマ（悪性黒色腫）などのようなSPARCを高発現する癌を挙げることができる。【００５０】
本発明のペプチドは、Ｔ細胞エピトープとして癌細胞に特異的なキラーT細胞、あるいはヘルパーT細胞を誘導することができるので、ヒト癌の予防・治療剤として有用である。また、本発明の抗体も、癌抗原であるSPARCの活性を阻害することができるものであれば、ヒト癌の予防・治療剤として有用である。実際の使用法としては、本発明のペプチドあるいは抗体をそのまま、又は医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤ととともに、必要に応じて下記の補助剤も加えて、注射剤として投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等を挙げることができる。【００５１】
投与量は成人１人当たり、本発明のペプチドあるいは抗体を例えば、１回当たり0.01mg〜100mgの範囲になるように投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加えて顆粒にしたものでもよい。【００５２】
本発明の薬剤に添加することができる腫瘍反応性Ｔ細胞誘導活性を高めるための補助剤としては、ムラミルジペプチド(MDP) ほかのＢＣＧ菌などの菌体成分、Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. vol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-21、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いることもできる。また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦなどのＴ細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等、ならびにNKT細胞を活性化するαガラクトシルセラミドやToll様レセプターに結合して自然免疫系を活性化するCpG、リポ多糖（ＬＰＳ）なども補助剤として用いることができる。【００５３】
また、HLA-A24陽性患者から採取した細胞または、HLA-A24陽性の他人（アロ）由来の細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者の血管内に投与し、患者の体内で効果的にキラーT細胞を誘導することもできる。また、患者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより、試験管内でキラーT細胞を誘導した後に患者血管内に戻すこともできる。このような細胞移入による治療は既に癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られた方法である。【００５４】
本発明のペプチドを体内に注入することにより、腫瘍反応性T細胞を誘導し、その結果、抗腫瘍効果が期待できる。また、リンパ球をエクソビボあるいはインビトロで本発明のペプチドで刺激すると活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞を患部に注入することによる養子免疫療法に有効に用いることができる。【００５５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
［実施例１］
（１）cDNAマイクロアレイ解析
摘出した、び漫性浸潤性胃癌患者の癌部と非癌部組織をLaser capture microdissectionにより分別して切り出し、各組織よりRNAを抽出した。これらのRNAより、逆転写反応によりcDNAを合成する際に、癌部cDNAをCy5で非癌部cDNAをCy3で蛍光標識した後に混合し、ターゲットDNAとした。プローブcDNAをアレイしたスライドガラス上でハイブリダイゼーションを行った後、非特異的な結合を洗浄し取り除き、CCDカメラあるいは蛍光スキャナーを用いてハイブリダイゼーション後の蛍光画像を取込み、疑似カラー(Cy5:赤、Cy3:緑)をつけて表示するとともに、それぞれの蛍光強度の比(R/G)を計算し、遺伝子発現プロファイルとして示した。さらに、び漫性浸潤性胃癌患者20例の癌部と非癌部における23,040種類の遺伝子の発現を比較検討することにより、多くの症例で、癌部/非癌部の発現の比が5以上の遺伝子を１５種類選び出した（図1）。【００５７】
次に各遺伝子について29臓器（胎生期の4臓器を含む）の正常組織における23,040種類の遺伝子の発現プロファイルを解析して、正常臓器では発現が低い遺伝子を選び出した。今回われわれが腫瘍抗原として選定したSPARCは、び漫性浸潤性胃癌患者20例中11例で癌部/非癌部の発現の比が5以上（平均133,359倍）で、一部の正常組織にも発現しているが、癌部と比較するとその発現は著しく低かった（図２）。【００５８】
［実施例２］
（２）ヒトHLA-A24およびマウスKd拘束性SPARCペプチドレパートリーの選択
95％の相同性を有するヒトとマウスのSPARCにおいて、アミノ酸配列が共通しているペプチド部分の中から以下のペプチドを選んだ。ヒトHLA-A24およびマウスKd分子に共に強く結合するペプチドに、共通して観察されるアミノ酸配列に関する既知の情報をもとに、SPARC分子の全アミノ酸配列について探索し、両分子に結合親和性が高いと推定されるペプチドのレパートリーを、コンピュータープログラムを利用して選択した。その結果、候補ペプチドとして４種類を決定した(表１)。【００５９】
【表１】
0005150849.tif 000002
【００６０】
SPARC Kd-1：配列番号１
SPARC Kd-3：配列番号２
SPARC Kd-4：配列番号３【００６１】
（３）樹状細胞 (DC) ワクチン
BALB/c骨髄由来の骨髄細胞からGM-CSFを用いて、骨髄細胞由来の樹状細胞 (BM-DC)を誘導した。誘導法に関しては、先に報告した方法(Nakatsura,TらClin Cancer Res 10, 8630-8640, 2004)を用いた。このようにして得られたBM-DCに、上記で決定したペプチド４種類の混合物と10μMの濃度で2時間培養した後、一匹あたり5×105の個数を腹腔内に投与した。1週間の間隔をおいて2回同様に投与しマウスを免疫した後、マウスの脾細胞を回収してキラーT細胞の検出に用いた。CD8+T細胞由来のキラーT細胞の誘導を厳密に検討するために、脾臓の採取後に脾細胞からMACS ビーズを用いてCD4+T細胞を取り除いたものを用いた。【００６２】
キラーT細胞が認識するSPARCペプチドの決定に用いたプロトコールを以下に示す。（免疫マウスからの脾細胞回収日をDay 0とする）
Day -21  (1) BALB/cマウスの骨髄細胞にGM-CSFを加え、骨髄由来の樹状細胞（以下BM-DC）の誘導を開始する。
Day -14  (2) 誘導したBM-DCに４種類のSPARCペプチドの混合物を添加し、2時間後に1匹あたり5×105 個を腹腔内に投与する。
(1)(2)を1週毎2回繰り返す。
Day 0  免疫したBALB/cマウスの脾細胞を回収し、再びBM-DCに、それぞれのSPARCペプチドを添加して2時間たったものと共培養した後に6日間培養した。
Day 6  SPARCペプチドを特異的に認識するキラーT細胞を検出するために、Cr放出試験を行った。キラーT細胞により傷害されるターゲット腫瘍細胞としてT2Kd細胞、RL male 1細胞株、Meth A細胞株およびBALB/3T3細胞株を設定した。【００６３】
（４）Cr放出試験によるSPARC特異的キラーT細胞による腫瘍細胞傷害の検討
誘導したSPARC特異的キラーT細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を、以下のようにして検討した。T2Kd細胞はTAP遺伝子の発現を欠損するマウスT2細胞株に、Kd遺伝子を導入した細胞株である。TAP欠損により外部から添加したペプチドがMHCクラスI分子に結合する性質を持つ場合にのみ、当該MHCクラスI分子とペプチドの複合体が細胞表面に発現する。RL male 1細胞株は、BALB/cマウス由来のT細胞性白血病細胞である。両細胞ともにSPARCを発現していない。いっぽう、Meth AとBALB/3T3細胞株は、BALB/cマウス由来の繊維肉腫細胞株および繊維芽細胞細胞株でSPARCを発現している。これらの細胞株を放射性クロミウム(Cr)で標識した後に、上記のキラーT細胞と４時間培養した後に培養上清を回収して、死細胞から放出された放射性Crの量を定量して細胞傷害活性を検出した。【００６４】
その結果、SPARCを発現していないT2Kd細胞およびRL male 1に対する細胞傷害は観察されなかったが、SPARC Kdペプチド1、3および4を負荷することにより、細胞表面に当該SPARC KdペプチドとKd分子の複合体を発現したT2Kd細胞、SPARCを自然発現しているMeth AおよびBALB/3T3に対して、特異的に細胞傷害活性が観察された(図３)。【００６５】
［実施例３］
（５）SPARCペプチドの免疫によるBALB/cマウスにおける抗腫瘍免疫の誘導
（方法）
BM-DCを10μMのSPARC Kd -1,3,4 混合ペプチドと2時間培養した後に、一匹あたり5×105個を腹腔内に投与した。1週間の間隔をおいて、同様にペプチド負荷BM-DCを投与してマウスを合計２回免疫した７日後に、マウスSPARCを高発現するマウス繊維肉腫細胞株Meth A（１×１０6）を皮下に移植し、腫瘍の増殖とマウスの生存期間を検討した。【００６６】
（結果）
結果を図４に示す。SPARCペプチドパルスBM-DCの予防的投与は、皮下移植したMeth Aに対する増殖抑制効果、およびマウスの生存期間の延長を誘導できた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
HLA-A24（A＊2402）は日本人の約６０％が所有する、最も頻度が高いHLAクラスＩ対立遺伝子である。HLAクラスＩ分子に対応する、BALB/cマウスのKd 分子に結合するペプチドのアミノ酸配列は、ヒトのHLA-A24に結合するペプチドのそれと非常に良く類似している。したがって、BALB/cマウスにペプチドを免疫した際に、ペプチドがKd分子に結合して、キラーＴ細胞を誘導し、これが当該ペプチドとKd分子の複合体を発現する癌細胞を破壊する場合には、当該ペプチドはHLA-A24に結合して、同様に癌細胞を破壊するヒト・キラーＴ細胞、を誘導できることが明らかになっている。従って、本発明で提示するペプチドは、HLA-A24を所有する、びまん性浸潤性胃癌、膵臓癌およびメラノーマ患者の免疫療法に応用することが可能であり、これらの癌の増殖や進展を抑制することにより、患者のQOLを改善することができると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、びまん性浸潤性胃癌の患者20例のｃＤＮＡマイクロアレイ解析により同定した、正常胃粘膜と比較して胃癌組織において高発現する、ベスト１５の遺伝子について、個々の症例における発現の程度を示したものである。この中より、以下に示す正常組織のｃＤＮＡマイクロアレイ解析結果を含めて考慮し、癌部に特異的に高発現するSecreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)を、びまん性浸潤性胃癌における最も理想的な癌特異抗原として選定した。
【図２】図２は、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、25種類の成人の主要臓器および４種類の胎生期の臓器におけるSPARCの発現を解析したものである。SPARC遺伝子の発現は、一部の正常組織にも観察されるが、癌部と比較すると発現の程度は著しく低かった。
【図３】図３は、BALB/cマウスにおいて、マウスKd 拘束性SPARC Kd -1, Kd -3,あるいはKd -4エピトープペプチドを用いて誘導したCTLによる、SPARC陽性腫瘍細胞の傷害を示す。
【図４】図４は、SPARC Kd -1, Kd -3およびKd -4ペプチドを混合して負荷した、骨髄樹状細胞（BM-DC）のBALB/cマウスへの前投与による、皮下移植されたMeth A癌細胞の増殖抑制と生存期間の延長を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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