(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３）由来のα−ガラクトシダーゼを、ガラクトース及びグルコースを含む原料に作用させてメリビオースを製造することを含む、メリビオースの製造方法。
【請求項２】
生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が５０％以上である、請求項１に記載のメリビオースの製造方法。
【請求項３】
生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が７０％以上である、請求項１または２に記載のメリビオースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを利用することを特徴とするメリビオースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中で、ラフィノースのフラクトース部分が除去された構造を持つメリビオースは、腸内細菌叢を改善する等の機能を有することが認められ、飲食品や医薬品、香粧品等あるいは、その原料として注目を浴びている。さらにメリビオースは、制癌効果やナチュラルキラー細胞活性化作用が報告されており非常に有用なオリゴ糖であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、メリビオースは大豆オリゴ糖中に少量存在するものの工業的に供給することは困難であった。人為的には、メリビオースはラフィノースの分解によって合成されている（例えば、非特許文献１）が、原料ラフィノースが高価なため、本手法を用いた場合メリビオースを安価に供給することは不可能であった。
【０００４】
一方、α−ガラクトシダーゼを利用して、ガラクトースとグルコースからα−ガラクトオリゴ糖を製造する方法についての報告もされている（特許文献１）が、メリビオースを選択的に製造する技術は世の中にはまったく知られていなかった。また、メリビオースを合成して且つ、工業的使用に耐えうるような耐熱性を持つα−ガラクトシダーゼの知見もまったくなかった。
【０００５】
【非特許文献１】精糖技術研究会誌第３３号、３３、６４−７１、１９８４
【特許文献１】特許第３０２８２５８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、こうした状況のもとに、安価な原料であるガラクトースとグルコースを用いて、選択的にメリビオースを合成することを可能とする新規なメリビオースの製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはこれらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、メリビオースを選択的に合成可能な耐熱性α−ガラクトシダーゼを発見し、目的メリビオース以外の夾雑オリゴ糖の生成を抑制したメリビオースの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）に示すメリビオースの製造方法である。
（１）  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを、ガラクトース及びグルコースを含む原料に作用させてメリビオースを製造することを含む、メリビオースの製造方法。
（２）  α−ガラクトシダーゼが、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３）、ＡＫＣ−０１２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５４）、ＡＫＣ−０１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５５）、又はＡＫＣ−０１４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５６）、あるいはＡＫＣ−０１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３）、ＡＫＣ−０１２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５４）、ＡＫＣ−０１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５５）、又はＡＫＣ−０１４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５６）を親株として得られる変異株由来のものである、（１）に記載のメリビオースの製造方法。
（３）  生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が５０％以上である、（１）又は（２）に記載のメリビオースの製造方法。
（４）  生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が７０％以上である、（１）から（３）の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のメリビオースの製造方法によれば、安価な原料であるグルコースとガラクトースからメリビオースを選択的に製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明でいうα−ガラクトシダーゼとは、正反応としてα−ガラクトシダーゼの定義（即ち、糖鎖の非還元末端のα−ガラクトシド結合を切断する活性を有する）どおりの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う酵素のことを言う。
【００１１】
メリビオース製造に用いるα−ガラクトシダーゼは、通常行われる培養方法によって得られた微生物から得ることができる。メリビオース製造触媒であるα−ガラクトシダーゼの利用形態としては、精製酵素液や粗精製酵素液の状態でもよいが、微生物から精製せずに微生物そのもの、あるいは微生物培養液、微生物培養上清といった形態で利用することもできる。各種培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓに属する微生物に由来するものであり、メリビオースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株、ＡＫＣ−０１２株、ＡＫＣ−０１３株、ＡＫＣ−０１４株、およびＡＫＣ−０１１株、ＡＫＣ−０１２株、ＡＫＣ−０１３株、ＡＫＣ−０１４株を親株として得られる変異株が挙げられる。
【００１３】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株、 ＡＫＣ−０１２株、ＡＫＣ−０１３株、ＡＫＣ−０１４株の４株はそれぞれ平成１９年３月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。受託番号は以下の通りである。
ＡＫＣ-０１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３）
ＡＫＣ-０１２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５４）
ＡＫＣ-０１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５５）
ＡＫＣ-０１４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５６）
【００１４】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓに属する微生物を親株として得られる変異株としては、公知の変異処理を施された変異株を用いることができる。ここでいう公知の変異処理とは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓに属する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤を使用し、変異誘導処理し、それらの菌株からα-ガラクトシダーゼ活性が高い菌株を選ぶ処理のことである。変異誘導処理に用いる微生物としては、親株としてＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株, ＡＫＣ−０１２株, ＡＫＣ−０１３株, ＡＫＣ−０１４株を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のα−ガラクトシダーゼを順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、セロビオース、エルロース、有機酸、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃である。培養温度が２５℃未満あるいは８０℃より高い場合は生育性が悪く好ましくない。また、培地のｐＨは広範囲で選択可能であり、例えば３．０〜９．０が好ましい。培地のｐＨが３．０未満あるいは９．０より高い場合は生育性が悪く好ましくない。
【００１６】
本発明によれば、上記したα−ガラクトシダーゼを用いたメリビオースの製造方法が提供される。原料としては、例えばグルコース及びガラクト−スを用いることができる。原料としてグルコースとガラクト−スを利用する際には例えば、α−ガラクトシダーゼによる脱水縮合反応を利用する性質上、原料濃度は高い方が好ましいが、ガラクトース濃度が高くなりすぎるとガラクトース分子間の縮合によりグルコースとガラクトース間の脱水縮合反応が抑制されるため好ましくない。グルコース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。ガラクトース濃度は２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは、５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。
【００１７】
本発明のα−ガラクトシダーゼを用いてメリビオースを製造する際の反応温度は、１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応温度が１０℃未満である場合、反応速度が極めて小さく、９０℃を超える温度領域では酵素活性の失活が早く大量の酵素を要するため好ましくない。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ３．０〜７．５、さらに好ましくは３．５〜６．０である。反応ｐＨが２．０未満、あるいは１０．０より大きい場合、酵素の失活が著しく早くなるため好ましくない。反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜３００時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
【００１８】
本発明においては、生成オリゴ糖中のメリビオース含有率を５０％以上に向上することができ、好ましい条件では７０％以上、より好ましい条件では８０％以上に、さらに好ましい条件では９０％以上に向上することができる。メリビオース含有率が低い場合、生成物からのメリビオースの精製が著しく困難となるだけでなく、基質であるグルコースあるいはガラクトースの無駄な消費も重大な問題となる。
【００１９】
本発明において得られる生成オリゴ糖中のメリビオース含有率は以下の方法により測定される。
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法] 
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を２０倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度％（ｗ／ｖ）を算出した。また、反応停止後の糖合成液を２倍希釈して、ＨＰＬＣ分析を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Ｃａｒｂｐａｃ  ＰＡ１カラム（ダイオネクス社製）を用い、カラム温度３５℃、流量１ｍＬ／ｍｉｎ．で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を利用し、０−２０分、２０−４０分、４０−４５分の各々の段階で水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液の比率が４９／５０／１、３０／５０／２０、０／１００／０となるようなグラジエント条件で行った。ＨＰＬＣ分析には、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＣＬＧガードカラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＣ１０１１カラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０カラム（昭和電工社製）を連結して使用し、カラム温度８０℃、流量０．６ｍＬ／ｍｉｎ．、ＲＩ検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率（％）はメリビオース蓄積濃度／全二糖蓄積濃度×１００により算出した。
【００２０】
[α−ガラクトシダーゼ活性の測定方法]
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、２．６７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５０μＬに適宜調整した酵素液１５０μＬを混合し、４０℃で１０分間程度反応させた後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液１ｍＬに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長４２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度のｐ−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして評価する。
α−ガラクトシダーゼの熱安定性は各温度条件下に一定時間さらした後に、α―ガラクトシダーゼ活性を測定することにより評価することができる。
【００２１】
本発明の方法により製造されるメリビオースを精製、分離する方法としては、一般的に用いられている精製処理方法を利用することができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってラフィノースを分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらのメリビオースの精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。
【００２２】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (ＤＩＦＣＯ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ａ(表.１参照) １００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。
【００２４】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始２８３時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析した結果を図１に、ＨＰＬＣ分析した結果を図２に示した。メリビオース糖蓄積濃度は２．９％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は７０．７％であった。
【００２５】
実施例２
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５３：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (ＤＩＦＣＯ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ａ(表１参照) １００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。
【００２６】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース５０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始１８時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析し、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率を算出した。メリビオース糖蓄積濃度は１．５％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は８５．８％であった。
【００２７】
実施例３
実施例１に記載の方法で得られるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株の菌体を１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）に懸濁して、４℃および５０℃で２時間インキュベートを行い、それぞれα−ガラクトシダーゼ活性測定を行った。活性測定は、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）に溶解させた２.６７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド４５０μＬに、各温度でインキュベートした菌液１５０μＬを混合し、４０℃で１０分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、４℃および５０℃でインキュベートした菌液の活性を算出した。４℃でインキュベートした菌体活性を１００とすると、５０℃でインキュベートした菌体の活性は９７という高い値を示した。
【００２８】
比較例１
Ｇｒｅｅｎ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて実施例３に記載した方法で、熱安定性試験を行ったと。実施例３と同様に、４℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性を１００とすると、５０℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性は５０であった。
【００２９】
【表１】
0005275640.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明を用いることにより、安価な基質を原料として用いて、煩雑な酵素精製工程を行わずに、選択的にメリビオースを製造できるメリビオースの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株を用いた糖合成反応（実施例１）の反応液をイオンクロマト分析したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図２】図２は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ  ＡＫＣ−０１１株を用いた糖合成反応（実施例１）の反応液をＨＰＬＣ分析したリテンションタイム０〜４５分の結果を示す。
【図１】
0005275640.tif 000003
【図２】
0005275640.tif 000004