(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドによりカチオン基が導入され、カチオン化度が１〜３であるカチオン化キトサンを、水溶性の有機酸を含む有機酸水溶液に溶解させてカチオン化キトサン水溶液とした後、
上記カチオン化キトサン水溶液のｐＨを７．０超、９．０以下に調整したことを特徴とする免疫アジュバント水溶液。
【請求項２】
上記カチオン化キトサンの脱アセチル化度が、３０〜１００％である請求項１に記載の免疫アジュバント水溶液。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫アジュバント水溶液に、さらにキトサンを分散して含む免疫アジュバント分散液。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の免疫アジュバント水溶液を、霧状としてヒト以外の動物の肺内に噴霧することを特徴とする免疫アジュバントの接種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応において抗原に対する抗体の産生能を向上させる効果を持つ免疫アジュバント水溶液に関し、詳しくはカチオン化キトサンを含む免疫アジュバント水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、生体が有する病気への抵抗力や治癒力であり、分子レベルで見ると、自分自身である「自己」と、外部から侵入した異物「非自己」とを識別し、「非自己」のみを速やかに処理し、そして除去するシステムである。
【０００３】
免疫には、生体に侵入する病原体を非特異的に直ちに除去する先天性免疫反応（自然免疫）と、自然免疫を突破して生体内に侵入した病原体を特異的に除去する獲得免疫反応とがある。獲得免疫反応では、生体が病原体（抗原）と特異的に相互作用する抗体を産生することで病原体に対抗する。このような病原体に感染する前に病原体に対する抵抗力（免疫）を獲得するためには、死菌や弱毒化した病原体などをワクチンとして生体に接種する必要がある。ここで、接種したワクチンによって長期間に渡り、効果的に抗体を産生するためには、抗原とともに接種し抗体産生の手助けをする免疫アジュバントの選択が非常に大きなカギとなる。
【０００４】
現在ワクチンの接種方法は、筋肉注射による接種が大半である。この方法は抗原を直接体内に導入して免疫系を刺激するものであり、血中抗体が免疫の主体となるトキソイドワクチン（破傷風など）や弱毒化した生ウイルスワクチン（麻疹など）など、成功例も多い。
【０００５】
一方、粘膜を介してワクチンを接種し、粘膜で局所的に免疫を成立させる方法は、解決すべき課題が多く開発途上にある。感染症の多くは病原体が粘膜表面に接触して粘膜から侵入するか、又はその部分で定着増菌して始まる。このような粘膜表面での感染を防ぐために、生体は粘膜局所で独自に発達した免疫システムを持っている。しかし、ワクチンを経皮接種しても粘膜局所に免疫はほとんど誘導されず、これまで粘膜を介して感染する病原体に対して効果的なワクチン治療を行うことはできなかった。
【０００６】
また、粘膜にワクチンを接種すると、免疫はその粘膜に局所的のみならず全身系の免疫をも成立させることが知られており、多くの感染症でいかに粘膜局所での免疫を成立させるかが、感染防御の決め手になると考えられている。
【０００７】
このため、粘膜を介して免疫を成立させるようなワクチン及びその接種方法の開発に期待が寄せられ、ワクチンと免疫アジュバントとの併用などについて世界中で鋭意研究されている。しかし、ワクチン接種による粘膜免疫の成立及び免疫の誘導システムに関してはまだ不明の点が多い。また、アジュバントとしての作用を有する物質として知られているものは、アルム、コレラトキシン、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、オイルアジュバント、サポニン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、ヘキサデシルアミン、アブリジン、イスコム、細胞壁骨格構成物、リポポリサッカライド、エンドトキシン及びリポソームなどに限られている。しかも、これらの中には毒性が強いものも多数含まれており、ヒトへの接種に認可の下りたものはアルムのみである。
【０００８】
上記したものの他に、近年、キチン及びキトサンが免疫アジュバントとして有用であることが示されている。キトサンは、安全性が高い天然物由来の多糖であり、工業的にはエビ、カニなどの甲殻類から得られるキチンを脱アセチル化することによって生産されている。例えば、特許文献１は、水溶性のキチンオリゴマー及びキトサンオリゴマーを注射剤により免疫アジュバントとして使用することを開示する。特許文献２は、経口接種して使用されるキチンが免疫促進剤（アジュバント）として作用することを開示する。
しかし、このようにキチン、キトサンを免疫アジュバントとして使用する場合、抗原との結合度が高くはなく、大量に接種しなければならないという問題点がある。
【０００９】
キトサン特有の性質として、製膜性、抗菌性、保水性及び凝集能などの機能が知られており、機能性高分子として各方面で実用されている。
【００１０】
例えば、特許文献３に開示する方法によれば、キトサンの加水分解によりキトサンオリゴ糖が製造され、これは医薬品、食品、化粧品分野などへ利用されている。また、医療分野においてキチン、キトサンは、特許文献４が開示するように、感染防御物質としての応用が期待されている。
【００１１】
さらに、キトサンの用途を拡大するため、各種キトサン誘導体が製造されている。中でも、カチオン化キトサン誘導体は、特許文献５が開示するように水溶性が高く、特許文献６が開示するように、免疫賦活剤としての応用も模索されている。
【特許文献１】特公平７−４７５４６号公報
【特許文献２】特開昭５５−４３０４１号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８９公報
【特許文献４】特開平９−３０１８０７号公報
【特許文献５】特公平６−４９７２５号公報
【特許文献６】特表２００２−５４００７７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、上述した従来技術の問題点を解決し、生体への安全性が高く、目的部位に局所的に免疫を誘導できる免疫アジュバント水溶液、免疫アジュバント分散液及びその接種方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的は以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドによりカチオン基が導入され、カチオン化度が１〜３であるカチオン化キトサンを、水溶性の有機酸を含む有機酸水溶液に溶解させてカチオン化キトサン水溶液とした後、上記カチオン化キトサン水溶液のｐＨを７．０超、９．０以下に調整したことを特徴とする免疫アジュバント水溶液を提供する。
【００１４】
本発明の免疫アジュバント水溶液においては、カチオン化キトサンは、カチオン化キトサンの脱アセチル化度が３０〜１００％であることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、上記免疫アジュバント水溶液に、さらにキトサンを分散して含む免疫アジュバント分散液、及び、上記免疫アジュバント水溶液を、霧状としてヒト以外の動物の肺内に噴霧することを特徴とする免疫アジュバントの接種方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体への安全性が高く、主に全身系免疫に関与するＩｇＧのみならず、粘膜などで感染防御に関わり、抗ウイルス作用を有する分泌型ＩｇＡの産生能にも優れた免疫アジュバント水溶液、免疫アジュバント分散液及び当該免疫アジュバントの接種方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明中において「部」又は「％」とあるのは、特に断りのない限り質量基準である。
まず、本発明の免疫アジュバントを構成するカチオン化キトサンについて説明する。
【００１９】
本発明で使用するカチオン化キトサンは、天然物からキチンを得て、それを脱アセチル化してキトサンを得、このキトサンをカチオン化したものである。上記キチンは、カニ・エビなど甲殻類の外骨格をはじめとして、イカ、オキアミ及び昆虫並びにキノコなどの菌類などから得られるものであり、その起源は特に限定されることなく、本発明に使用することができる。
【００２０】
キチンは、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成単位とする天然高分子である。一方、キトサンは、キチンの脱アセチル化物であり、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（グルコサミン）を構成単位とする塩基性多糖類である。キトサンは、既に工業的に生産されており、種々のグレードのものを入手することができる。本発明に使用するキトサンは、起源及び製法に特別な制限はなく、従来より工業生産されているキトサンを使用することができる。
【００２１】
本発明のカチオン化キトサンの製造方法には特に制限はないが、
（１）上記キトサンに３級アミノ基又は４級アンモニウム基或いはその両方（以下「カチオン基」という）を持つ化合物を用いて、カチオン基をキトサンに導入する方法；又は、
（２）アルキル化剤を用いてキトサンのアミノ基をアルキル化し、該アミノ基をカチオン化する方法；を好適に使用することができる。
【００２２】
上記（１）の方法に使用できる、カチオン基を持つ化合物としては、例えば、２−クロロエチルジエチルアミン又はその塩酸塩、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルジエチルアミン、２，３−エポキシプロピルジメチルアミン、トリメチル−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。一方、（２）の方法に使用するアルキル化剤としては、例えば、ヨウ化メチル及びヨウ化エチルなどを挙げることができる。
【００２３】
本発明におけるカチオン化キトサンのカチオン化度は、以下の式１により定義される。
（式１）カチオン化度＝キトサンに導入されたカチオン基の数÷原料キトサンを構成するグルコサミン残基の数
上記カチオン化度はキトサン及びカチオン化キトサンのコロイド当量値から、以下の式２により求めることができる。
（式２）カチオン化度＝ｐＨ９でのカチオン化キトサンのコロイド当量値÷（ｐＨ３でのカチオン化キトサンのコロイド当量値−ｐＨ９でのカチオン化キトサンのコロイド当量値）
なお、ｐＨ３では全アミノ基及び４級アンモニウム基のコロイド当量値を求めることができ、ｐＨ９では４級アンモニウム基のコロイド当量値を求めることができる。
【００２４】
キトサンは水に不溶であり、ほとんどの希酸には可溶であることが知られている。原料キトサンをカチオン化することにより、親水性を高め、その水溶性を向上させることができる。カチオン化キトサンのカチオン化度が０．１未満では、カチオン性、親水性共にキトサン本来の性質と同程度であり、免疫アジュバントとして使用したときに十分な効果が得られない。したがって、本発明の免疫アジュバントに用いるカチオン化キトサンのカチオン化度は、０．１以上であることが好ましい。カチオン化度が約１以上となると、酸を用いずに水に溶解することができ、本発明の免疫アジュバントとしてより好ましい形態の一つである。なお、カチオン化度が３を超えても、免疫アジュバントとしての効果は向上しないため、製造工程上のコスト面で非効率である。
【００２５】
前記（１）のカチオン基の導入方法の例として、キトサン８部を７０％含水イソプロピルアルコール１４０部中に分散させ、次いでこの分散液に、２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド１３部を加えて、６５〜７０℃で２４時間撹拌しながら反応させる方法を挙げることができ、この反応後にカチオン化キトサンを得ることができる。
【００２６】
この例において、原料キトサンの脱アセチル化度、分子量、イソプロピルアルコールなどの反応溶媒の含水率、キトサンとカチオン化基を有する化合物（例：２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド）との当量比、反応時間、反応温度などを変えることにより、カチオン化度を調整することができる。
【００２７】
前記（２）の方法により、本発明の免疫アジュバントに適するカチオン化度が０．１〜３であるカチオン化キトサンを得るためには、原料キトサンを構成するピラノース環１個（１モル）当たり０．３モル以上１０モル以下のアルキル化剤を加えて反応するとよい。
【００２８】
本発明の免疫アジュバントに使用するカチオン化キトサンの脱アセチル化度に特別な制限はなく、用途に応じて最適な条件を適宜選択することができるが、脱アセチル化度が３０％未満では、得られるカチオン化キトサンのカチオン性及び親水性が不十分であり、通常、脱アセチル化度３０％以上が好ましい。カチオン化キトサンのカチオン性及び親水性の点から、脱アセチル化度は、６０％〜１００％であることがより好ましく、さらに好ましくは８０％〜１００％である。
【００２９】
（脱アセチル化度測定方法）
上記キトサンの脱アセチル化度は、コロイド滴定を行い、その滴定量から算出することができる。具体的には、指示薬にトルイジンブルー溶液を用い、ポリビニル硫酸カリウム水溶液でコロイド滴定することにより、キトサン分子中の遊離アミノ基を定量し、キトサンの脱アセチル化度を求める。以下に脱アセチル化度測定方法の一例を示す。
【００３０】
１．滴定試験
０．５％酢酸水溶液にキトサン純分濃度が０．５％となるようにキトサンを添加し、キトサンを攪拌、溶解して１００ｇの０．５％キトサン／０．５％酢酸水溶液を調製する。次にこの溶液１０ｇとイオン交換水９０ｇを攪拌混合して、０．０５％のキトサン溶液を調製する。さらにこの０．０５％キトサン溶液１０ｇにイオン交換水５０ｍｌ、トルイジンブルー溶液約０．２ｍｌを添加して試料溶液を調製し、ポリビニル硫酸カリウム溶液（Ｎ／４００ＰＶＳＫ）にて滴定する。滴定速度は２ｍｌ／分〜５ｍｌ／分とし、試料溶液が青から赤紫色に変色後、３０秒間以上保持する点を終点の滴定量とする。
なお、キトサン純分とは、原料キトサン試料中のキトサンの質量を意味し、具体的には、キトサン試料を１０５℃、２時間乾燥して求められる固形分質量である。
【００３１】
２．空試験
上記滴定試験に使用した０．５％キトサン／０．５％酢酸水溶液の代わりに、イオン交換水を使用し、同様の滴定試験を行う。
【００３２】
３．アセチル化度の計算
Ｘ＝１／４００×１６１×ｆ×（Ｖ−Ｂ）／１０００
＝０．４０２５×ｆ×（Ｖ−Ｂ）／１０００
Ｙ＝０．５／１００−Ｘ
Ｘ：キトサン中の遊離アミノ基質量
（グルコサミン残基質量に相当）
Ｙ：キトサン中の結合アミノ基質量
（Ｎ−アセチルグルコサミン残基質量に相当）
ｆ：Ｎ／４００ＰＶＳＫの力価
Ｖ：試料溶液の滴定量（ｍｌ）
Ｂ：空試験滴定量（ｍｌ）
脱アセチル化度（％）
＝（遊離アミノ基）／｛（遊離アミノ基）＋（結合アミノ基）｝×１００
＝（Ｘ／１６１）／（Ｘ／１６１＋Ｙ／２０３）×１００
なお、１６１はグルコサミン残基の分子量、２０３はＮ−アセチルグルコサミン残基の分子量である。
【００３３】
本発明の免疫アジュバントに含まれるカチオン化キトサンの原料キトサンは、１％酢酸水溶液に、当該原料キトサンを１％となるように溶解させたときに、当該水溶液の粘度が１ｍＰａ・ｓ〜１０，０００ｍＰａ・ｓとなるものが好ましい。上記粘度が１ｍＰａ・ｓ未満となる原料キトサンは、低分子化のためのコストがかさみ、製造コスト上不利である。一方、粘度が１０，０００ｍＰａ・ｓを超えるとカチオン化キトサン水溶液としたときに粘度が高くなりすぎ、水溶液中のカチオン化キトサンの濃度を低くしなければならず、また、接種方法も限定されるため、好ましくない。
【００３４】
なお、上記キトサン水溶液の粘度は、例えば、１％酢酸水溶液にキトサン純分濃度が１％となるようにキトサンを溶解させ、この溶液を、恒温槽にて２０℃に保ちながらＢ型回転粘度計を用いて粘度測定を行うことにより、決定することができる。
【００３５】
本発明の免疫アジュバントは、前記したように水に対する溶解度が高いので、水に溶かして免疫アジュバント水溶液として使用することができる。
当該免疫アジュバント水溶液におけるカチオン化キトサンの含有量は、全質量中０．１〜２０％を占める量であることが好ましく、１〜５％含有することがより好ましい。カチオン化キトサンの量が０．１％未満では、免疫応答を促進するという免疫アジュバントとしての効果が十分には得られず、一方、添加量が２０％を超えるとカチオン化キトサン水溶液が流動性を失い、接種に不便であり好ましくない。
【００３６】
本発明の免疫アジュバント水溶液は、そのｐＨが４．５〜９．０であることが好ましい。ｐＨが４．５より低いと生物に悪影響を与えるという点で問題があり、９．０を超えるとカチオン化キトサンが析出するという問題があり好ましくない。
【００３７】
ｐＨの調整に使用する物質は、特に制限されず、当業者に周知の物質を使用することができる。ｐＨ調製に使用するアルカリ物質としては、アルカリ金属の水酸化物又は炭酸塩、アンモニア及びアミン類があり、具体的には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ−エチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−メチルプロパノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパノールアミン及びアミノメチルプロパノールなどを挙げることができる。特に好ましいものは、水酸化ナトリウム及びアンモニアである。
【００３８】
また、本発明の免疫アジュバント水溶液は、水溶性の有機酸をさらに含んでもよい。本発明の免疫アジュバント水溶液が水溶性の有機酸をさらに含むことにより、カチオン化キトサンの不溶解分が減少し、カチオン化キトサンの使用量を減らすことができるという利点がある。当該有機酸は水溶性であれば特に制限されず、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、タウリン、ピロリドンカルボン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ヒドロキシマロン酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、安息香酸、サリチル酸、アミノ安息香酸、フタル酸、けい皮酸及びビタミンＣなどを挙げることができる。
本発明の免疫アジュバント水溶液が有機酸を含む場合、カチオン化キトサン１００部に対し有機酸は３００部以下であることが好ましい。
【００３９】
本発明の免疫アジュバント水溶液は、水溶性の無機酸を含んでもよく、このような無機酸の例として、塩酸、リン酸、硝酸及び硫酸などを挙げることができる。
【００４０】
また、本発明の免疫アジュバント水溶液は、水に不溶のキトサンをさらに含む分散液であってもよい。キトサンを含むことにより、その接種部位によっては、アジュバント残存量が増加し、免疫促進効果が持続するという効果を生ずるため好ましい。
【００４１】
本発明の免疫アジュバント水溶液は、当業者に周知の種々の接種方法により接種することができるが、当該水溶液を霧状として粘膜に噴霧することにより、より適切なアジュバント効果を発揮することができる。接種部位にも特に制限はないが、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内及び直腸内に接種することが好ましく、肺内に接種することが最も好ましい。本発明の免疫アジュバント水溶液を、経鼻接種及び経口接種する場合、カチオン化キトサンの濃度は０．５〜５％が好ましい。また、経肺接種の場合、０．１〜３％が好ましい。
【００４２】
本発明の免疫アジュバント、その水溶液及び分散液を接種できる動物は、特に制限されず、例として、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜類、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、鳥などの愛玩動物、ペット類、魚類、海洋生物並びにマウス、サル及びヒトを挙げることができる。
【００４３】
抗体産生能の高い免疫アジュバントの条件としては、まず目的の抗原物質と結合しやすいことが必要である。また、細胞内に取り込まれやすいこと、および、細胞内で長期間にわたって抗原物質を徐放することが必要である。本発明の免疫アジュバントの作用機序は不明であるが、このような条件を満たしているために、少ないワクチン接種量で長期間免疫効果を発揮することができるものと考えられる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
（マウスへのＯＶＡ抗原の免疫）
カニ殻より調製した脱アセチル化度８７％のキトサンフレーク１部に２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド１部及び精製水１部を混合後、６５℃にて２４時間加熱し、カチオン化度１．１のカチオン化キトサンを得た。このカチオン化キトサンを含水イソプロピルアルコールで洗浄後、乾燥して固形カチオン化キトサンを得、これを以下の実験に使用した。なお、カチオン化度はキトサン及びカチオン化キトサンのコロイド当量値より算出した。
【００４６】
固形カチオン化キトサンを４％クエン酸溶液に溶解し、不溶解分を濾過して２％カチオン化キトサン水溶液を得た。次いで、当該２％カチオン化キトサン水溶液５部に対して０．２５％ＯＶＡ（卵白由来アルブミン）／１×ＰＢＳ溶液２部を加え、塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調製し、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を得た。
【００４７】
当該混合液７μＬを、ジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経鼻接種した。この経鼻接種の日から１週間ごとに計３回、上記混合液７μＬを経鼻接種した。この３回目の経鼻接種の日を第０週としてその後、週に一度、以下の要領で血液、便及び膣洗浄液を得た。また、ブースター効果を確認するために、上記３回目の経鼻接種の日から２〜３ヶ月の後、同様に４回目の経鼻接種を行った。
【００４８】
血液：ジエチルエーテルで麻酔後、尾静脈から採血した。
便：各個体を樹脂製ケージ中に数分間放置し、便をエッペンドルフチューブに回収した。
膣洗浄液：１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）５０μＬを膣中でピペッティングした。この作業を２回行い、膣洗浄液を得た。
【００４９】
（サンプルの調製）
上記手順により得た血液、便及び膣洗浄液を以下のように処理し、抗体価測定のためのサンプルを調製した。
血清サンプル：上記血液を室温にて、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、その上清を再度同じ条件で遠心分離して得た上清を血清サンプルとした。当該サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
便サンプル：上記便を４℃にて１％ＢＳＡ中に分散し、この分散液を４℃にて、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離して、その上清を便サンプルとした。当該サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
膣洗浄液サンプル：上記膣洗浄液を室温にて、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、その上清を膣洗浄液サンプルとした。当該サンプルは使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
【００５０】
ＥＬＩＳＡ法を用いて、各サンプルについてＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価を測定した。当該測定は以下の手順で行った。
（ＩｇＧ抗体価の測定）
ＯＶＡ抗原（生化学工業株式会社製）をコーティングバッファー（精製水１ＬにＮａ2ＣＯ3：１．６ｇ、ＮａＨＣＯ3：２．８２ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．０）で５μｇ／ｍＬとなるように調製し、この溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Costar3690 A/2、コーニング社）に１穴あたり５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して、抗原を吸着（コーティング）させた。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
【００５１】
上記コーティング終了後、コーティングバッファーを廃棄し、次いでＥＬＩＳＡプレートにブロッキングバッファー（精製水１Ｌに１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ、アルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：１０ｇ、ＮａＮ3：１ｇを含む）を１穴あたり１００μＬずつ分注し、１時間放置した。
ＥＬＩＳＡプレートとは別にＵ底プレートを用意し、上記各サンプルを２6〜２15倍に希釈した１０段階の２倍希釈系列を調製した。希釈にはブロッキングバッファーを用い、最終希釈測定法（エンド・ポイント・ダイリューション法）を行った。
【００５２】
上記ブロッキング終了後、ＥＬＩＳＡプレートからブロッキングバッファーを廃棄し、Ｕ底プレートで調製したサンプルを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
なお、陽性コントロールとしては、単クローン抗体抗鶏卵アルブミン（MONOCLONAL ANTI-CHICKEN EGG ALBUMIN CLONE OVA）（ＳＩＧＭＡ社）を１万〜５１２万倍に希釈した１０段階の２倍希釈系列を用いた。また、陰性コントロールとしては、ＯＶＡ抗原を免疫していないマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで希釈して調製した２6〜２15の１０段階の２倍希釈系列を用いた。
【００５３】
インキュベート終了後サンプル液を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機（バイオテック社製、MODEL MW-96F）を用いて、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５４】
２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）で１，０００倍希釈し、これを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５５】
３次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）で２，０００倍に希釈し、これを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５６】
フォスファターゼ用発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＫＰＬ社）の１粒を発色基質用緩衝液（精製水１Ｌにジエタノールアミン：０．９７ｍＬ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．１ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．８）５ｍＬに溶解して発色液を調製し、この発色液を１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後反応停止液として１Ｎ  ＮａＯＨを１穴あたり５０μＬずつ分注して反応を止め、波長４０５ｎｍ及び６３０ｎｍ（主波長４０５ｎｍ、副波長６３０ｎｍ）で各穴の吸光度を測定した。なお、吸光度の測定には、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダー  Multiskan EX（Thermo Labsystems社）を使用した。
【００５７】
吸光度の測定値から、陰性コントロールの吸光度平均値とその標準偏差（ＳＤ）を求めた。次いで、サンプルの吸光度を希釈率に対してプロットし標準曲線を作成し、陰性コントロールの吸光度平均値＋２ＳＤの標準曲線との交点を求め、この交点の２の乗数をＩｇＧ抗体価として得た。３回目の経鼻接種の日を第０週として、経鼻接種の日からの時間経過に対してプロットした血清サンプルのＩｇＧ抗体価を図１中に◆で示す。
【００５８】
（ＩｇＡ抗体価の測定）
ＯＶＡ抗原（生化学工業株式会社製）をコーティングバッファー（精製水１ＬにＮａ2ＣＯ3：１．６ｇ、ＮａＨＣＯ3：２．８２ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．０）で５μｇ／ｍＬに調製し、この溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（SUMILON ELISAプレートＳ  MS-8496F、住友ベークライト株式会社）に１穴あたり１００μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して、抗原を吸着させた。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
【００５９】
上記コーティング終了後、コーティングバッファーを廃棄し、次いで当該ＥＬＩＳＡプレートにブロッキングバッファー（精製水１Ｌに１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ、アルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：１０ｇ、ＮａＮ3：１ｇを含む）を１穴あたり２００μＬずつ分注し、１時間放置した。
【００６０】
ＥＬＩＳＡプレートとは別にＵ底プレートを用意し、各サンプルについて５倍及び１０倍の希釈液を調製した。希釈にはブロッキングバッファーを使用した。
【００６１】
インキュベーション終了後、ＥＬＩＳＡプレートからブロッキングバッファーを廃棄し、Ｕ底プレートで調製した希釈サンプルを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートの際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
なお、陽性コントロールとしては、コレラ毒素（以下、ＣＴと略す）−ＯＶＡ混合液（１×ＰＢＳ緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＴ溶液１部に対して０．２５％ＯＶＡ水溶液２部を加え、ピペッティングにより十分に混合して調製したもの）を多量に接種してＩｇＡ抗体を産生させたマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで５倍及び１０倍希釈したものを用いた。また陰性コントロールとしては、ＯＶＡ抗原を免疫していないマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで５倍及び１０倍希釈したものを用いた。
【００６２】
インキュベーション終了後サンプル液を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機（バイオテック社、ＭＷ−９６Ｆ）を用いて、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６３】
２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡ（ＫＰＬ社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）で１，０００倍希釈し、これを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベーション終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり４００μＬずつ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６４】
３次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）で２，０００倍に希釈し、これを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、ＥＬＩＳＡプレートから溶液を廃棄し、次いで洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween２０）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６５】
フォスファターゼ用発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＫＰＬ社）の１粒を発色基質用緩衝液（精製水１Ｌにジエタノールアミン：０．９７ｍＬ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．１ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．８）５ｍＬに溶解して発色液を調製し、この発色液を１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、反応停止液として１Ｎ  ＮａＯＨを１穴あたり５０μＬずつ分注して反応を止め、波長４０５ｎｍ及び６３０ｎｍで各穴の吸光度を測定した。なお、吸光度の測定には、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダー  Multiskan EX（Thermo Labsystems社）を使用した。
５倍及び１０倍希釈したサンプルの吸光度の各平均値をＩｇＡ抗体価として得た。３回目の経鼻接種の日を第０週として、経鼻接種の日からの時間経過に対してプロットした血清サンプルのＩｇＡ抗体価を図２中に◆で示す。
【００６６】
［比較例１］
実施例１で用いたカチオン化キトサン水溶液に代えて、粘膜免疫アジュバントとして定評のあるコレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例１と同様の実験を行った。すなわち、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を実施例１と同様にして調製し、当該混合液３μＬを、実施例１と同様にジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経鼻接種し、血液、便及び膣洗浄液を得てサンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。
【００６７】
実施例１と同様にして得た血清サンプルのＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価を、それぞれ図１及び図２中に△で示す。
【００６８】
図１及び図２から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。この血清サンプルについての結果と同様に、便サンプル、膣洗浄液サンプルについても、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。
【００６９】
［実施例２］
実施例１と同様にして調製したカチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液７μＬを、ジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス(Polymeric immunoglobulin receptor knockout mice)５匹に経鼻接種し、実施例１と同様の手順及び方法で血液を得て血清サンプルを調製した。ＩｇＡ抗体価の測定において血清サンプルを１００倍及び２００倍に希釈して用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。ＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図３及び図４中に◆で示す。
【００７０】
［比較例２］
実施例２で用いたカチオン化キトサン水溶液に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例２と同様の実験を行った。すなわち、比較例１と同様にして調製したＣＴ−ＯＶＡ混合液３μＬを、実施例２と同様にジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に経鼻接種し、実施例２と同様の手順及び方法で血液を得て血清サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。ＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図３及び図４中に△で示す。
【００７１】
図３及び図４から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。
【００７２】
［実施例３］
実施例１と同様にして調製した２％カチオン化キトサン水溶液５部に対して、０．２５％ＯＶＡ水溶液２部及び１×ＰＢＳ溶液を１８部加え、ピペッティングにより十分に混合し、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を得た。当該混合液２５μＬを、５ｍｇ／ｍＬネンブタール（マウス体重１ｇ当たり、約０．０１ｍＬ使用）腹腔内注射で麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経肺接種した。なお、肺への接種の噴霧器としてはPENNCENTURY社製、モデル１Ａ−１Ｃを使用した。
【００７３】
この経肺接種の日から１週間ごと計３回、同様に上記混合液の経肺接種を行った。この３回目の経肺接種の日を第０週として、その後、実施例１と同様の手順及び方法により、週に一度、血液、便及び膣洗浄液を得てサンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。また、ブースター効果を確認するために、上記３回目の経肺接種の日から２〜３ヶ月の後、同様に４回目の経肺接種を行った。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図５及び図６中に◆で示す。
【００７４】
［比較例３］
実施例３で用いたカチオン化キトサン水溶液に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例３と同様の実験を行った。すなわち、１×ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＴ溶液１部に０．２５％ＯＶＡ溶液２部を加え、さらに１×ＰＢＳを２２部加えて希釈し、ピペッティングにより十分に混合した。このＣＴ−ＯＶＡ混合液２５μＬを実施例３と同様に６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経肺接種した。その後、実施例３と同様の手順及び方法で経肺接種、サンプル調製をし、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図５及び図６に△で示す。
【００７５】
図５及び図６から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。この血清サンプルについての結果と同様に、便サンプル及び膣洗浄液サンプルについても、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。
【００７６】
［実施例４］
実施例３と同様の手順及び方法でカチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を調製した。当該混合液２５μＬを、５ｍｇ／ｍＬネンブタール（マウス体重１ｇ当たり、約０．０１ｍＬ使用）腹腔内注射で麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に経肺接種した。なお、肺への接種は実施例３と同様に行った。
【００７７】
実施例３と同様の手順及び方法により、この経肺接種の日から１週間ごとに計３回、上記混合液の経肺接種を行った。この３回目の経肺接種の日を第０週として、その後、実施例３と同様の手順及び方法により、週に一度血液を得て血清サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。また、ブースター効果を確認するために、３回目の経肺接種の日から２〜３ヶ月の後、４回目の経肺接種を行った。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図７及び図８中に◆で示す。
【００７８】
［比較例４］
実施例４で用いたカチオン化キトサン水溶液に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例４と同様の実験を行った。すなわち、比較例３と同様にして調製したＣＴ−ＯＶＡ混合液２５μＬを実施例４と同様にネンブタールで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に計４回経肺接種した。実施例４と同様の手順及び方法により、週に一度、血清サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図７及び図８中に△で示す。
【００７９】
図７及び図８から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、カチオン化キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。
【００８０】
全ての実施例において、ＯＶＡの免疫アジュバントとしてコレラ毒素を使用した比較例よりも、カチオン化キトサンを使用した実施例の方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。また、図中１４週目の抗体価が高まっていることから４回目の免疫を行うことにより、急激に抗体産生能が高まるブースター効果が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によれば、生体への安全性が高く、全身系免疫に関わるＩｇＧのみならず、粘膜などで局所的に感染防御に関わり、抗ウイルス作用を有する分泌型ＩｇＡの産生能に優れた免疫アジュバント水溶液、免疫アジュバント分散液及び当該免疫アジュバントの接種方法が提供される。本発明の免疫アジュバント水溶液、免疫アジュバント分散液を本発明の接種方法で粘膜に接種することにより、接種部位に局所的に免疫を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図２】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図３】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図４】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図５】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図６】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図７】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図８】カチオン化キトサンとＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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