(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール、糖酸及び糖酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の物質を核酸鎖を含む試料に添加するステップと、
前記試料中の増幅対象の核酸鎖の核酸配列のうちの一部に相補的なオリゴヌクレオチドを、プライマーとして前記核酸配列の前記一部にアニーリングさせるステップと、
前記試料中の核酸鎖を等温増幅するステップと
を含み、前記試料が、核酸の抽出及び精製処理を行なったものではない、試料中に含まれる核酸を増幅する方法。
【請求項２】
前記物質を添加するステップの前、物質を添加するステップと同時に、又は物質を添加した後に加熱するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質を添加するステップの前、物質を添加するステップと同時に、又は物質を添加した後にアルカリ溶液を添加するステップをさらに含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、血液又は口腔粘膜細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸鎖を等温増幅するステップが、プライマーをアニーリングさせるステップの後に、プライマーの３’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を等温増幅するステップである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
核酸を等温増幅するステップが、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法、ＴＲＣ法及びＭＩＴＡＮＩ法からなる群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸を等温増幅するステップが、ＬＡＭＰ法又はＭＩＴＡＮＩ法である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリフェノールが、カテキン、クロロゲン酸、タンニン酸、フラボノイド、タンニン、ルチン、ケルセチン、イソフラボン及びアントシアニンのいずれか又はそれらの混合物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
糖酸及び糖酸塩が、ペンタル酸、ヘキサル酸、グルコン酸、ヒドロキシ酸、ガラクツロン酸、マヌロン酸及びグルカリック酸のいずれか若しくはその塩又はそれらの混合物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリフェノール、糖酸及び糖酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の物質、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びポリメラーゼを含む、核酸の抽出及び精製処理を行なうことなく核酸を等温増幅するためのキット。
【請求項１１】
ＬＡＭＰ法又はＭＩＴＡＮＩ法のための請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる核酸の検出及び増幅反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中に含まれる核酸を検出及び増幅する場合には、各種の方法が知られている。例えば、プローブと検出対象の核酸とのハイブリダイゼーションの有無により、核酸を検出するハイブリダイゼーション法や、プライマーを伸長させて検出対象の核酸を増幅する方法が知られている。【０００３】
細胞中には、色素、タンパク質等の夾雑物が多く含まれており、これらの夾雑物により、プローブやプライマーの標的部位へのハイブリダイゼーションやアニーリングが阻害されたり、ＰＣＲ等の反応が阻害されたりする。したがって、生体試料中に含まれる核酸の検出及び増幅のためには、これらの方法を行なう前に、生体試料から核酸を抽出し、精製する必要がある。核酸の抽出及び精製には、細胞を溶解させ、さらにフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールによるタンパク質の除去操作を行う。あるいは、タンパク質を界面活性剤や高塩濃度で不活性化させ、プロテアーゼで分解する方法もある。【０００４】
核酸の濃縮又は塩やフェノールなどを除去するために、エタノール又はイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させる。このような数段階の遠心操作を伴う操作を行って、核酸を精製した後に、ハイブリダイゼーションや増幅を行なう。【０００５】
血液、細胞、糞便等の生体試料から抽出及び精製した核酸では、特に、生体試料中に含まれている夾雑物により、検出及び増幅が阻害されることが知られている。この阻害効果は、ウシ血清アルブミン、一本鎖ＤＮＡ結合Ｔ４遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）、ベタイン（ｂｅｔａｉｎｅ）、プロテイナーゼ阻害剤などを添加することにより、減少されることが確認されている（非特許文献１）。【０００６】
また、ＰＣＲ法の鋳型の簡易調製法として、細胞をアルカリ中で加熱し溶解後に中和して鋳型として使用するか、あるいは、細胞や組織を水と混和させ加熱したものを鋳型として、阻害をうけることなくＰＣＲによる解析を行うことのできる核酸試料が得られることも知られている（非特許文献１など）。【０００７】
ＰＣＲ法において、ＧＣ含量の高い核酸を増幅する場合には、特に困難であることが知られておりＧＣ含量の高い精製ＤＮＡを用いたＰＣＲにおいて、ＰＣＲ反応液中に多価アルコール及び／又は硫酸アンモニウムを添加することにより、ＰＣＲの増幅効率が高まることが知られている（特許文献１）。【０００８】
また、核酸増幅反応の効率を上げるために、核酸抽出のいずれかの段階で核酸を含む生体試料を酸処理して核酸増幅妨害物質を除去して、得られた抽出核酸を用いることが知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００１−３５２９８２号
【特許文献２】特開２００３−１５９０５６号
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ｄｅｃ；３８（１２）４４６３−７０
【非特許文献２】Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９８、（４）、５８８〜５９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
診断の現場では、少量の試料から目的の核酸を迅速かつ正確に検出する必要があるが、上述の通り核酸の抽出及び精製処理が必要である。しかし、これらの処理には時間と手間がかかる上に、生体試料によっては、夾雑物を完全に除去するのが困難な場合もある。また、抽出及び精製処理の条件により、核酸の回収率や夾雑物の除去程度が一定しない場合もあり、定量的な核酸の検出を行うことができないという問題があった。【００１０】
さらに、核酸増幅に基づく核酸の検出技術では、ごく微量の核酸の検出が可能であるため、工程が煩雑になるほどコンタミネーションによるエラーが生じやすい。したがって、夾雑物を除去するために核酸抽出及び精製処理などの工程があると、コンタミネーションの機会が高まることとなる。【００１１】
しかし、非特許文献で検討されたウシ血清アルブミン等は、用いるポリメラーゼや生体試料の種類により阻害効果が減少されない場合もあるため、広く核酸の増幅及び検出に使用できない場合がある。特に、血球中に含まれるヘム化合物は、ＰＣＲ反応において強い阻害作用があることが知られている。【００１２】
したがって、血液及び細胞等の生体試料を簡便、迅速かつ効果的に核酸検出及び／又は増幅反応に供することができる、生体試料の前処理方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、夾雑物による核酸の検出及び増幅阻害作用を減少又は抑制する物質を鋭意検討し、生体試料に添加することにより核酸の抽出及び精製工程を行うことなく簡易かつ迅速に核酸を検出及び／又は増幅できる方法を見出した。【００１４】
本発明者は、試料にポリフェノール、多価アルコール、糖酸及び糖酸塩、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の物質を試料に添加することによって、核酸の検出及び／又は増幅効率が高まることがわかった。【００１５】
すなわち、本発明は、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の物質を試料に添加するステップと、検出対象の核酸の核酸配列のうちの一部に相補的なオリゴヌクレオチドを、前記核酸配列の前記一部に相補的結合させるステップと、検出対象の核酸を検出するステップとを含む、試料中に含まれる核酸を検出及び／又は増幅する方法に関する。【００１６】
前記物質を添加するステップの前、物質を添加するステップと同時に、又は物質を添加した後に加熱するステップをさらに含んでもよく、前記物質を添加するステップの前、物質を添加するステップと同時に、又は物質を添加した後にアルカリ溶液を添加するステップをさらに含んでもよい。また、加熱するステップとアルカリ溶液によりアルカリ処理するステップの両方を行なっても良い。【００１７】
通常は、核酸の検出及び／又は増幅効率を上げるために、生体試料から予め核酸抽出及び精製処理を行うが、本発明の方法では、核酸抽出及び精製処理を行なわずに、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の物質を直接試料に添加して、核酸の検出が可能である。試料は、血液（全血、分離血液細胞を含む）又は口腔粘膜細胞から選択できる。【００１８】
オリゴヌクレオチドを相補的結合させるステップは、プローブをハイブリダイゼーションさせるステップとすることができ、プローブをハイブリダイゼーションさせた後、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、インベーダー法、パルサー法、コロニーハイブリダイゼーション法、ＬＣＲ法及びｂＤＮＡ法からなる群から選択される方法により検出対象の核酸を検出することができる。【００１９】
オリゴヌクレオチドを相補的結合させるステップは、プライマーをアニーリングさせるステップとすることができ、この場合、プライマーの３’末端から核酸鎖を伸長させることにより核酸を増幅するステップをさらに含んでもよい。核酸を増幅するステップは、等温増幅法により行なっても良い。また、核酸を増幅するステップは、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法及びＭＩＴＡＮＩ法からなる群から選択される方法により行うことができる。特に、ＬＡＭＰ法又はＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）により、核酸を増幅することができる。【００２０】
ポリフェノールは、カテキン、クロロゲン酸、タンニン酸、フラボノイド、タンニン、ルチン、ケルセチン、イソフラボン及びアントシアニンのいずれか又はそれらの混合物とすることができる。糖酸及び糖酸塩は、ペンタル酸、ヘキサル酸、グルコン酸、ヒドロキシ酸、ガラクツロン酸、マヌロン酸及びグルカリック酸のいずれか若しくはその塩又はそれらの混合物とすることができる。糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、キシリトールのいずれか又はそれらの混合物とすることができる。親水性生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの共重合体、ポリアルキレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコールのいずれか又はそれらの混合物とすることができる。多価アルコールは、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ヘキサンジオール、オクタンジオール、グリセリン、ソルビタン、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコールのいずれか又はそれらの混合物とすることができる。【００２１】
また、本発明は、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸及び糖酸塩、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の物質及びプローブを含む核酸検出のためのキットに関する。【００２２】
また、本発明は、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸及び糖酸塩、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類の物質、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びポリメラーゼを含む核酸増幅のためのキットに関する。本発明は、特に、ＬＡＭＰ法又はＭＩＴＡＮＩ法のための上記キットに関する。
【発明の効果】
【００２３】
核酸抽出及び精製処理を行なっていない試料を用いた場合でも、直接に迅速及び簡便に標的核酸の検出及び増幅を行うことができる。また、本発明の方法は、簡便であるため、コンタミネーションの機会を増やすことなく、標的核酸の検出及び／又は増幅を正確に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明では、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸及び糖酸塩、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される１種又は２種以上を、生体試料に添加することによって、夾雑物による阻害作用を受けることなく効果的に標的核酸の検出及び／又は増幅を行なうことができる。また、これらの処理に代えて、又は、これらの処理に加えて、界面活性剤を添加することによっても、夾雑物による阻害作用を受けることなく効果的に標的核酸の検出及び／又は増幅を行なうことができる。【００２５】
上記物質を添加することにより、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドによる核酸への相補的結合が、夾雑物による阻害作用を受けなくなる又は受けにくくなると考えられる。したがって、プローブによる標的核酸へのハイブリダイゼーション又はプライマーによる標的核酸へのアニーリングが円滑に行われる。プライマーによる標的核酸へのアニーリング効率が高まると、プライマーの３’末端からのヌクレオチド鎖の伸長効率も高まり、核酸の増幅の効率が向上する。【００２６】
上記物質の添加に加えて、加熱処理を行なっても良い。加熱処理は、上記物質の添加前、添加とほぼ同時又は添加の後に行うことができる。加熱温度は、３７℃以上、好ましくは４５℃以上、より好ましくは５５℃以上、さらに好ましくは８０℃以上とすることができる。加熱時間は、特に限定されず、極めて短時間の処理でも可能である。例えば、０．０１秒以上、又は３秒以上、好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上行うことができる。例えば、加熱条件の一つとして、９８℃で３分間の加熱を例示できるが、当業者はこの条件以外に任意の時間及び温度を設定できる。また、この加熱処理をＰＣＲ法のような加熱を伴う反応の１ステップとして行うこともできる。【００２７】
また、上記物質の添加に加えて、アルカリ処理を行なっても良い。アルカリ処理は、上記物質の添加前、添加とほぼ同時又は添加後にアルカリ溶液を試料に混合することにより行うことができる。アルカリ溶液としては、アルカリ金属水酸化物の溶液、例えば水酸化ナトリウム溶液及び水酸化カリウム溶液を例示できるが、これらに限定されない。アルカリ濃度（ＯＨ−１の濃度）は、０．１ｍＭ以上、又は１ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上とすることができる。あるいは、ｐＨ７以上、好ましくはｐＨ８以上、より好ましくはｐＨ９以上とすることができる。アルカリ濃度及びｐＨは、その後の検出または増幅ステップを阻害しない限り、任意の濃度及びｐＨで行なうことができる（例えば１０Ｍ以下）。【００２８】
さらに、加熱処理とアルカリ処理の両方を行なうことも可能である。例えば、試料に上記物質を加えて、さらにアルカリ溶液と混合した後、９８℃で３分間の熱処理を行うことができる。【００２９】
オリゴヌクレオチドは、検出対象の核酸配列の一部にハイブリダイズするプローブ又は検出対象の核酸配列の一部にアニーリングするプライマーとすることができる。プローブは、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列を有するものである。検出すべき核酸配列又はその相補鎖にハイブリダイズできる限り、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に、プローブの全塩基が相補的でなくともよい。また、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的ではない配列を、プローブの一部に有しても良い。さらに、プローブは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プローブは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。プローブは、固相表面に固定あるいは吸着した形態をとることができ、又は、遊離した状態のものを使用することができる。固定又は吸着したプローブは、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態とすることができる。【００３０】
プライマーは、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列を有するものであり、２以上のプライマーからなるプライマーセットとして用いられてもよい。検出すべき核酸配列又はその相補鎖にアニーリングできる限り、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に、プライマーの全塩基が相補的でなくてもよい。また、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に相補的ではない配列を、プライマーの一部に有しても良い。プライマーの一部に含まれる検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に相補的ではない配列としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターなどが挙げられる。さらに、プライマーは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プライマーは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。【００３１】
検出対象の核酸配列は、例えば二本鎖核酸からなる遺伝子であればセンス側の塩基配列でもアンチセンス側の塩基配列を検出してもよい。例えば、アンチセンス側の核酸配列を検出することによってその相補的であるセンス側の核酸配列（すなわち遺伝子の塩基配列）を検出することができる。検出対象の核酸は、例えば、ウイルス、細菌、原虫、多細胞生物、プラスミドまたはある種の疾患に対する前傾向又は傾向に関連する遺伝子の変異等の遺伝的条件等の核酸を含む生物に特有な核酸であり、特にＲＮＡまたはＤＮＡである。【００３２】
本発明では、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーからなる群から選択される物質を試料に添加する。添加量は、添加される物質の種類や、試料により異なるが、例えば、最終濃度として０．００１ｍＭ〜１００ｍＭである。【００３３】
添加するポリフェノールとしては、カテキン、フラバンのようなフラボノイド類、クロロゲン酸、タンニン酸のようなフェノール酸類、エラグ酸類などが例示できる。例えば、フラボノイド、カテキン、タンニン、ルチン、クロロゲン酸、ケルセチン、イソフラボン、アントシアニンなどである。また、ポリフェノール はこれらの単一種でも複数種を組み合わせて使用してもよい。なお、ポリフェノールとは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基をもつ植物成分をいう。【００３４】
多価アルコールとしては、ビスフェノールにエチレンオキサイドを付加反応させたものなどの芳香族多価アルコール 、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ヘキサンジオール、オクタンジオール、グリセリン、ソルビタン、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコールなどの脂肪族多価アルコールが例示でき、具体的には、グリセロール、ソルビトール、キシリトールなどである。なお、多価アルコールは、２個以上の水酸基を有するアルコールであり、例えば、２価〜６価アルコールである。【００３５】
糖酸としては、ペンタル酸、ヘキサル酸（グルコン酸も含む）等を使用できる。例えば、糖酸の例として、α−ヒドロキシ酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マヌロン酸、Ｄ−グルコン酸およびＤ−グルカリック酸が挙げられる。糖酸塩としては、これらの糖酸の当量のナトリウム塩が例示できる。なお、糖酸は、グルカリック酸とカルボキシル酸の総称である。【００３６】
糖アルコールとしては、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、キシリトールなどの糖アルコール 類が例示できる。なお、糖アルコールとは、アルコール性水酸基を有する糖質をいう。【００３７】
親水性生分解性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの共重合体）、ポリアルキレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコールおよびそれらの誘導体が例示できる。【００３８】
界面活性剤としては、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン系界面活性剤のいずれを用いることができ、高分子系のもの及び低分子系のものいずれも使用可能である。界面活性剤の例としては、純石けん分、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、しょ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩を含み、具体的にはN,N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）cholamide［BIGCHAP］、N,N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）deoxycholamide［Deoxy-BIGCHAP］、NIKKOL BL-9EX ［Polyoxyethylene（9）Lauryl Ether］、Octanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-8］、Nonanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-9］、Decanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-10］、Polyoxyethylene（8）Octylphenyl Ether ［Triton X-114］、Polyoxyethylene（9）Octylphenyl Ether ［NP-40］、Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether ［Triton X-100］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monolaurate ［Tween 20］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monopalmitate ［Tween 40］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monostearate ［Tween 60］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monooleate ［Tween 80］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Trioleate、Polyoxyethylene（23）Lauryl Ether ［Brij35］、Polyoxyethylene（20）Cethyl Ether ［Brij58］、n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside、n-Heptyl-β-D-thioglucopyranoside、n-Octyl-β-D-glucopyranoside、n-Octyl-β-D-thioglucopyranoside、n-Nonyl-β-D-thiomaltoside、IGEPAL CA-630、Digitonin、Saponin,from Soybeans、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-2-hydroxy-1-propanesulfonate ［CHAPSO］、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate ［CHAPS］、Sodium Dodecylsulfate ［SDS］、Lithium Dodecyl Sulfate ［LDS］、Lithium 3,5-Diiodosalicylate、Tris（hydroxymethyl）aminomethane Dodecyl Sulfate［Tris DS］、Sodium Cholate、N-Lauroylsarcosine、Sodium N-Dodecanoylsalcosinate、Cetyldimethylethylammonium Bromide、Cetyltrimethylammonium Bromide［CTAB］、Cetyltrimethylammonium Chloride、Guanidine Thiocyanateなどが用いられる。【００３９】
生体試料とは、動物由来及び植物由来、微生物由来の試料が挙げられるがこれらに限定されない。動物由来の試料としては、血液（全血、分離血液細胞を含む）、血清、血漿、細胞（培養細胞系を含む）、組織、体液（耳漏、鼻汁、膿、腹水、胸水、胆汁、髄液、喀痰など）、粘膜細胞（口腔粘膜細胞、胃粘膜細胞、気道粘膜細胞など）汗、羊水、排出物（尿及び糞便等）、内視鏡などによる各臓器からのブラッシング、採取液、バイオプシー試料、肺胞洗浄液などが例示できるが、これらに限定されない。植物由来の試料としては、植物体全体、培養細胞、組織、根、茎、葉、花、種子などの器官が例示できるが、これらに限定されない。微生物由来の試料としては、微生物培養物などが例示できる。また、生体試料に限らず、海水、土壌など、任意の試料に対して適用することができる。【００４０】
本発明によれば、ポリフェノール、多価アルコール、糖酸及び糖酸塩、糖アルコール及び親水性生分解性ポリマーの添加により、試料中に夾雑物が含まれる場合であっても、夾雑物によるプローブのハイブリダイゼーションの阻害や、プライマーのアニーリングの阻害が減少又は抑制されるため、効率よく検出でき、かつ、検出感度を上げることができる。【００４１】
プローブにより核酸を検出する方法としては、ＤＮＡを検出するサザンハイブリダイゼーション、ＲＮＡを検出するノザンハイブリダイゼーション、インベーダー法、パルサー法、ｂＤＮＡ法が例示できるが、これらに限定されない。【００４２】
サザンハイブリダイゼーションは、目的の配列を有するＤＮＡを検出する方法であり、一般的には、次のような手順により行われる。ＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロース電気泳動により分離する。アガロースゲル内のＤＮＡをアルカリ処理により一本鎖に変性させる。次に、ＤＮＡ断片を電気泳動後のゲルからニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンなどのメンブレンに移し、酵素や放射性同位元素により標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、プローブに相補的な配列をもったＤＮＡを検出する。【００４３】
ノザンハイブリダイゼーションは、目的の配列を有するＲＮＡを検出する方法であり、一般的には、次のような手順により行われる。ＲＮＡを変性条件下でアガロース電気泳動により分離する。続いて、ＲＮＡを電気泳動後のゲルからニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンなどのメンブレンに移し、酵素や放射性同位元素により標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、プローブに相補的な配列をもったＲＮＡを検出する。【００４４】
インベーダー法は、標的ＤＮＡの一塩基ミスマッチの構造変化を特異的に認識する酵素を用いた蛍光シグナルの検出よって一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法であり、一般的には次のような手順により行われる。アレルプローブ、インベーダープローブ及びＦＲＥＴプローブと呼ばれる３種類のプローブを用意する。アレルプローブは、鋳型に特異的な配列を３’側に有し、側は鋳型の配列を無関係な配列（フラップ）を５’側に有する。アレルプローブの鋳型に特異的な３’側の配列のうちの５’末端は、ＳＮＰ部位であり、検出対象のアレルの塩基と相補的であるよう設計されている。インベーダープローブは、ＳＮＰ部位から鋳型の３’側に相補的に結合するよう設計されているが、ＳＮＰ部位に対応する塩基は任意の塩基でよい。ＦＲＥＴプローブは、３’側にフラップと相補的な配列と、５’側にヘアピン構造を形成するパリンドローム配列を持つ。ＦＲＥＴプローブの５’末端には、蛍光色素が結合し、さらにその近傍にはクエンチャーが結合している。【００４５】
これらの３種のプローブを標的ＤＮＡとハイブリッドさせて、酵素ｃｌｅａｖａｇｅを作用させる。このとき、ＳＮＰ部位に対応するアレルプローブの塩基がＳＮＰ部位の塩基に相補的に結合すると、インベーダープローブの３’末端が侵入する。この構造を酵素ｃｌｅａｖａｇｅが認識してフラップの部位でアレルプローブが切断されてフラップ部分が遊離する。遊離したフラップは、ＦＲＥＴプローブに結合する。フラップがＦＲＥＴプローブに結合すると、さらにこの構造を酵素ｃｌｅａｖａｇｅが認識して、ＦＲＥＰプローブの５’末端が切断され、クエンチャーにより消光されていた蛍光色素が遊離し、蛍光が検出されるようになる。【００４６】
パルサー法は、あらかじめ用意した相補的な３つの領域からなる２種類のＤＮＡプローブに標識を付し，それらにハイブリダイゼーションを繰り返させることで，蜂の巣のような形に結合・増幅し大きなＤＮＡの塊を作らせ，これをシグナルとなる。検出したい遺伝子にこのシグナルを結合させることで，その存在が確認できる。この方法は、ハイブリダイゼーションの過程に核酸合成酵素を必要とせず、等温で行えることから簡便であり、反応が短時間で行うことができ、ＤＮＡ及びＲＮＡのどちらも高感度に検出できる。【００４７】
ｂＤＮＡ法は、分枝鎖プローブ法又はｂＤＮＡプローブ法とも呼ばれる核酸の検出法である。プローブと核酸をハイブリダイズさせ、さらに分枝ＤＮＡとよばれる増幅分子とハイブリダイズさせ、それを検出することにより、標的核酸を検出する。【００４８】
プライマーを用いて核酸を増幅する技術には、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法、ＭＩＴＡＮＩ法などが例示できるが、これらに限定されない。これらの増幅技術は、増幅された核酸を検出することにより目的とする核酸を検出する工程をさらに含んでも良い。ＰＣＲのような温度をサイクル的に変化させることによる増幅及び等温で反応をおこさせる等温増幅法のいずれをも使用できる。例えば、等温増幅法としては、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法、ＴＲＣ法及びＭＩＴＡＮＩ法が例示できる。【００４９】
ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡに相補的な１セットのプライマーを設計し、プライマーに挟まれた領域をＤＮＡポリメラーゼにより反応容器内で増幅する技術である。ＰＣＲ法には、様々な変法があり、逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成した後にＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲ法、ＳＮＰをタイピングするための蛍光プローブであるＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより特定のアレルのみを増幅するＴａｑＭａｎＰＣＲ法など、様々な改良が当業者には公知の技術である。【００５０】
ＴＭＡ法は、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー及び３’側に標的ＲＮＡと相補的な配列と５’側にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの認識するプロモーター配列とを有するリバースプライマーを用いて、ＲＮａｓｅ活性を有するＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＲＮＡから転写産物を得て、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成することを組み合わせて、標的ＲＮＡを特異的に増幅する方法である。【００５１】
ＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー及び３’側に標的ＲＮＡと相補的な配列と５’側にＴ７ポリメラーゼの認識するプロモーター配列とを有するリバースプライマーを用いて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＲＮＡから転写産物を得て、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成することを組み合わせて、標的ＲＮＡを特異的に増幅する方法である。【００５２】
ＬＡＭＰ法は、合成されたＤＮＡの３’末端が常にループを形成し、ループ内にプライマーをアニーリングさせ、等温で標的ＤＮＡの特異的増幅を行なう方法である。【００５３】
ＩＣＡＭ法は、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨを用いて、鎖置換反応、鋳型交換反応、ニック導入反応により等温で標的とするＤＮＡの特異的増幅を行なう方法である。【００５４】
ＳＤＡ法は、制限酵素による一本鎖ニックにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより合成された鎖により置換されたＤＮＡ鎖が次の複製の鋳型となり、標的ＤＮＡの増幅を行なう方法である。【００５５】
ＭＩＴＡＮＩ（ＳＭＡＰ）法は、二種のプライマーを含んでなるプライマーセットを用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して標的核酸を合成する方法であり、本発明者が開発した方法である。プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる。第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる。【００５６】
これらの核酸検出及び核酸増幅技術は、当業者に公知であり、プローブのハイブリダイズを伴う検出及び／又はプライマーのアニーリングを伴う増幅反応によるものであれば、任意の反応に本発明の技術を適用できる。
【実施例１】
【００５７】
＜ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法における添加物による影響＞
本実施例では、生体試料として口腔粘膜細胞を使用して、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）により、又はＵＣＰ１遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＰＣＲ法により行ない、各種添加物による増幅効果の向上を調べた。ＳＭＡＰ法についてはタンニン酸を添加し、ＰＣＲ法についてはグルクロン酸ナトリウムを添加した。【００５８】
ＳＭＡＰ法のプライマーとして、下記の配列を有するプライマーセット（２Ｄ６＊４４
−Ｆ１及び２Ｄ６＊４４−ＳＲ２；それぞれ、配列番号１及び２）を用いた。また、鋳型（配列番号３）に対する各プライマー領域の位置関係は図１に示す通りである。なお、特に断りがない限り、本明細書において、プライマーの配列等は、左側を５’側、右側を３’側として記載する。【００５９】
フォワードプライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下記配列中の下線部）が鋳型にアニーリングし、伸長反応する。プライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１の５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下記配列中の下線部以外） は、プライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１からの伸長鎖上における、プライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１の３’末端塩基の１５塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。すなわち、プライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１の伸長産物は、鎖内でハイブリダイズすることによって３５ｍｅｒのループを有するステムループ構造をとり得る。【００６０】
リバースプライマー２Ｄ６＊４４−ＳＲ２の３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下記配列中の下線部）は、鋳型にアニーリングするが、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下記配列中の下線部以外）は、５’末端から８塩基目で折り返してヘアピン構造をとるように設計されている。【００６１】
フォワードプライマー２Ｄ６＊４４−Ｆ１：
ＣＧＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡ（配列番号１）
リバースプライマー２Ｄ６＊４４−ＳＲ２：
ｔｔｔａｔａｔａｔａｔａｔａａａＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＡ（配列番
号２）
ループプライマー２Ｄ６＊４４−ＬＦ４：
ＡＴＣＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＣ（配列番号４）【００６２】
２Ｄ６＊４４ＯＦ４ ：ＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＣ（配列番号５）
２Ｄ６＊４４ＯＲ４ :ＴＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧ（配列番号６）【００６３】
ＰＣＲ法のプライマーとして、下記の配列を有するプライマーセット（ＵＣＰ１  ＰＦ１及びＵＣＰ１  ＰＲ１；それぞれ、配列番号７及び８）を用いた。また、鋳型（配列番号９）に対する各プライマー領域の位置関係は図２に示す通りである。
ＵＣＰ１  ＰＦ１  ＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴ（配列番号７）
ＵＣＰ１  ＰＲ１  ＣＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＣ（配列番号８）【００６４】
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は以下の通りである。鋳型となるＤＮＡを含むサンプルは、口腔粘膜細胞を用いた。【００６５】
【表１】
0005150829.tif 000002
【００６６】
【表２】
0005150829.tif 000003
【００６７】
反応液をＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）より、６０℃で１時間反応させた。また、ＰＣＲ法のおけるサイクルは、９５℃で５分加熱した後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２度３０秒を１サイクルとして６０サイクル行った。増幅後、ＤＮＡシークエンスによって増幅産物は目的とする配列が増幅されたものであることを確認した。【００６８】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅曲線を、それぞれ図３及び図４に示す。図３から、無添加の場合よりもタンニン酸を添加した方がＳＭＡＰ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかり、図４からグルクロン酸ナトリウムを添加した方がＰＣＲ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかった。タンニン酸及びグルクロン酸ナトリウムを添加した場合、増幅が迅速に行なわれ増幅効率が高まるのは、プライマーが標的核酸にアニーリングする効率が無添加の場合に比べて高まるためと考えられる。
【実施例２】
【００６９】
＜ＳＭＡＰ法による添加物による影響＞
本実施例では、生体試料として血液を使用して、血液のアルカリ処理に界面活性剤添加することによって、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の標的核酸配列（配列番号１０）の増幅をＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）により、増幅効果の向上を調べた。【００７０】
ＳＭＡＰ法のプライマーとして、下記の配列を有するプライマーセット（ＣＹＰ２Ｃ１９-２；それぞれ、配列番号１１〜１５）を用いた。また、鋳型に対する各プライマー領域の位置関係は図５に示す通りである。【００７１】
フォワードプライマーＣＹＰ２Ｃ１９＊２ＦＰは、の３’末端側にある配列（２５ｍｅｒ：下記配列中の下線部）は、鋳型にアニーリングするが、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下記配列中の下線部以外）は、５’末端から８塩基目で折り返してヘアピン構造をとるように設計されている。【００７２】
ＣＹＰ２Ｃ１９−２  ＴＰ（Ｗ）は、その３’末端側にある配列（２５ｍｅｒ：下記配列中の下線部）が鋳型にアニーリングし、伸長反応する。プライマーＣＹＰ２Ｃ１９−２ ＴＰ（Ｗ）の５’末端側にある配列（１４ｍｅｒ：下記配列中の下線部以外） は、プライマーＣＹＰ２Ｃ１９−２  ＴＰ（Ｗ）からの伸長鎖上における、プライマーＣＹＰ２Ｃ１９−２  ＴＰ（Ｗ）の３’末端塩基２４塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。すなわち、プライマーＣＹＰ２Ｃ１９−２  ＴＰ（Ｗ）の伸長産物は、鎖内でハイブリダイズすることによってループを有するステムループ構造をとり得る。【００７３】
CYP2C19-2 FP ：5' ＣＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧ 3'（配列番号１１）
CYP2C19-2 TP(W)：5' ＣＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡ 3'（配列番号１２）
CYP2C19-2 BP：5' ＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧ 3'（配列番号１３）
CYP2C19-2 OP1  ： 5' ＴＡＴＴＡＡＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴ 3'（配列番号１４）
CYP2C19-2 OP2  : 5' ＴＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴ 3'（配列番号１５）【００７４】
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は以下の通りである。鋳型となるＤＮＡを含むサンプルは、血液を用いた。【００７５】
【表３】
0005150829.tif 000004
【００７６】
ＳＭＡＰ法のサンプルのアルカリ処理及び加熱処理には、採取した血液１０μlにＴｗｅｅｎ２０を５μＬもしくは蒸留水５μl添加後攪拌したものにＮａＯＨ（５０ｍＭ）２０μＬを添加後攪拌し、９８℃で３分ほど加熱後、４℃に急冷することによって行った。【００７７】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法による増幅曲線を、それぞれ図６に示す。図６から、無添加の場合よりもＴｗｅｅｎ２０を添加した方がＳＭＡＰ法による増幅が迅速に行なわれていることが判明した。Ｔｗｅｅｎ２０を添加した場合、増幅が迅速に行なわれ増幅効率が高まるのは、プライマーが標的核酸にアニーリングする効率が無添加の場合に比べて高まるためと考えられる。
【実施例３】
【００７８】
＜ＳＭＡＰ法による核酸増幅における添加物及び加熱による影響＞
本例では、生体試料としてヒト全血を使用して、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行った。プライマーは、実施例１で用いたプライマーと同じものを用いた。反応条件等は、実施例１と同じである。【００７９】
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は、鋳型となるＤＮＡを含むサンプルに血液を用いた点と、添加物をクロロゲン酸にした点を除き、実施例１のＳＭＡＰ法に用いた試薬の組成と同じである。【００８０】
サンプルの加熱処理は採取した血液３μＬに６μＬのＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を加えたものを溶かし均一化したものに、５ｍＭのクロロゲン酸１μＬを加えた。この１０μＬの溶液を９８℃で３分間加熱した。増幅後、ＤＮＡシークエンスによって増幅産物は目的とする配列が増幅されたものであることを確認した。【００８１】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法による増幅曲線を、それぞれ図７に示す。図７から、無添加のものを加熱した場合よりもクロロゲン酸を添加したものを加熱した場合のほうが、ＳＭＡＰ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかった。クロロゲン酸を添加し、さらに加熱処理した場合、増幅が迅速に行なわれ増幅効率が高まるのは、プライマーが標的核酸にアニーリングする効率が無添加の場合に比べて高まるためと考えられる。
【実施例４】
【００８２】
＜ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による核酸増幅における添加物及びアルカリ処理による影響＞
本実施例では、生体試料として口腔粘膜細胞又は血液を使用して、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）により、又はＵＣＰ１遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＰＣＲ法により行ない、各種添加物及びアルカリ処理による増幅効果の向上を調べた。ＳＭＡＰ法についてはクロロゲン酸を添加し、ＰＣＲ法についてはグルクロン酸ナトリウムを添加した。プライマーは、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法とも、実施例１で用いたプライマーと同じものを用いた。反応条件等は、実施例１と同じである。【００８３】
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は、ＳＭＡＰ法において添加物をクロロゲン酸にした点と、ＰＣＲ法において試料を血液にして添加物をグルクロン酸ナトリウムにした点を除き、実施例１のＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法に用いた試薬の組成と同じである。【００８４】
ＰＣＲ法用のサンプルのアルカリ処理には、かき採った口腔粘膜細胞をＮａＯＨ（２５ｍＭ）１０μＬに溶かしたものに、５ｍＭのクロロゲン酸１μＬを加え室温で１５分ほど静置することによって行った。その後、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを４０μＬ加えて中和した。  ＳＭＡＰ法用のサンプルのアルカリ処理には、採取した血液３μＬとＮａＯＨ（５０ｍＭ）を６μＬ混合したものに、５ｍＭのグルクロン酸ナトリウム１μＬを加え室温で１５分ほど静置することによって行った。
増幅後、ＤＮＡシークエンスによって増幅産物は目的とする配列が増幅されたものであることを確認した。【００８５】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅曲線を、それぞれ図８及び図９に示す。図８及び図９から、無添加のものをアルカリ処理した場合よりも、クロロゲン酸又はグルクロン酸ナトリウムを添加したものをアルカリ処理した場合のほうが、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかった。クロロゲン酸又はグルクロン酸ナトリウムを添加し、さらにアルカリ処理した場合、増幅が迅速に行なわれ増幅効率が高まるのは、プライマーが標的核酸にアニーリングする効率が無添加の場合に比べて高まるためと考えられる。
【実施例５】
【００８６】
＜ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による核酸増幅における添加物及びアルカリと加熱処理による影響＞
本実施例では、生体試料として口腔粘膜細胞又は血液を使用して、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＳＭＡＰ法（ＭＩＴＡＮＩ法）により、又はＵＣＰ１遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＰＣＲ法により行ない、各種添加物、アルカリ処理及び加熱処理による増幅効果の向上を調べた。ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法ともにカテキンを添加した。プライマーは、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法とも、実施例１で用いたプライマーと同じものを用いた。反応条件等は、実施例１と同じである。
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は、添加物をカテキンにした点と、ＰＣＲ法ではサンプルに血液を用いた点を除き、実施例１の試薬の組成と同じである。【００８７】
ＰＣＲ法のサンプルのアルカリ処理及び加熱処理には、かき採った口腔粘膜細胞を１０μＬのＮａＯＨ（２５ｍＭ）に溶かしたものに、１０ｍＭのカテキン１μＬを加え９８℃で３分ほど加熱することによって行った。その後、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを４０μＬ加えて中和した。
ＳＭＡＰ法のサンプルのアルカリ処理及び加熱処理には、採取した血液３μＬとＮａＯＨ（５０ｍＭ）６μＬを混合したものに、１０ｍＭのカテキン１μＬを加え、９８℃で３分ほど加熱することによって行った。
増幅後、ＤＮＡシークエンスによって増幅産物は目的とする配列が増幅されたものであることを確認した。【００８８】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅曲線を、それぞれ図１０及び図１１に示す。図１０及び図１１から、無添加のものをアルカリ処理及び加熱処理した場合よりも、カテキンを添加したものをアルカリ処理及び加熱処理した場合のほうが、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかった。カテキンを添加し、さらにアルカリ・加熱処理した場合、増幅が迅速に行なわれ増幅効率が高まるのは、プライマーが標的核酸にアニーリングする効率が無添加の場合に比べて高まるためと考えられる。
【実施例６】
【００８９】
＜ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による核酸増幅における添加物及びアルカリと加熱による影響＞
本実施例では、生体試料として口腔粘膜細胞又は血液を使用して、その中に含まれるヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＳＭＡＰ法により、又はＵＣＰ１遺伝子中の標的核酸配列の増幅をＰＣＲ法により行ない、各種添加物及びアルカリ処理による増幅効果の向上を調べた。ＳＭＡＰ法についてはカテキン又はポリエチレングリコールを添加し、ＰＣＲ法についてはカテキンを添加した。プライマーは、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法とも、実施例１で用いたプライマーと同じものを用いた。反応条件等は、実施例１と同じであるが、本実施例においては、各試料について３回実験を行った。【００９０】
２５μＬの反応液を調製した。反応液の組成は、添加物をカテキンにした点と、ＰＣＲ法ではサンプルに血液を用いた点を除き、実施例５の試薬の組成と同じである。増幅後、ＤＮＡシークエンスによって増幅産物は目的とする配列が増幅されたものであることを確認した。【００９１】
リアルタイムＰＣＲ  ＭＸ３０００Ｐによって得られたＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅曲線を、それぞれ図１２〜１５に示す。図１２は、口腔粘膜細胞を試料として、カテキンを添加して、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の標的核酸配列をＳＭＡＰ法により増幅したものであり、図１３は血液を試料として、ポリエチレングリコールを添加して、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を増幅したものであり、図１４は、血液を試料として、カテキンを添加して、ＵＣＰ１遺伝子をＰＣＲ法により増幅したものであり、図１５は、口腔粘膜細胞を試料として、カテキンを添加して、ＵＣＰ１遺伝子をＰＣＲ法により増幅したものである。【００９２】
図１２〜１５から、無添加の場合に比べ、カテキン又はポリエチレングリコールを添加した場合のほうが、ＳＭＡＰ法及びＰＣＲ法による増幅が迅速に行なわれていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＳＭＡＰ法で用いられたプライマーと鋳型の位置関係を示す図である。
【図２】ＰＣＲ法で用いられたプライマーと鋳型の位置関係を示す図である。
【図３】実施例１のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図４】実施例１のＰＣＲ法による結果を示すグラフである。
【図５】実施例２のＳＭＡＰ法で用いられたプライマーと鋳型の位置関係を示す図である。
【図６】実施例２のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図７】実施例３のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図８】実施例４のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図９】実施例４のＰＣＲ法による結果を示すグラフである。
【図１０】実施例５のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図１１】実施例５のＰＣＲ法による結果を示すグラフである。
【図１２】実施例６のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図１３】実施例６のＳＭＡＰ法による結果を示すグラフである。
【図１４】実施例６のＰＣＲ法による結果を示すグラフである。
【図１５】実施例６のＰＣＲ法による結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005150829.tif 000016
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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