(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともa) 髄外脂肪組織の試料から血管間質細胞の分画を単離し、b) ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補ったメチルセルロースを含む半固形培地で細胞を培養し、かつc) 遠心分離又はエルトリエーション法、及び免疫選択によって細胞を精製する工程からなることを特徴とする、α−アクチニン及びGATA-4因子から選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、培養されて心筋細胞に分化した細胞の調製方法。
【請求項２】
血管間質細胞が、ヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血管間質細胞の分画が、細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、遠心分離又はエルトリエーションすることによって、髄外脂肪組織の試料から単離されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
a）髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画の単離かつ精製された細胞を、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補ったメチルセルロースを含む半固形培地で培養し、b）ムスカリンのアセチルコリンレセプターのアゴニストにより反転可能に阻害される自発収縮活性を有するか又はβ−アドレナリン作動性レセプターのアゴニストにより反転可能に刺激される収縮頻度を有する細胞を選択する工程を含むことを特徴とする心筋細胞を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、髄外脂肪組織由来細胞、その調製方法、ならびに造血系の再生、特に遺伝的又は後天的な血液疾患(癌、化学療法、放射)の治療、ならびに心筋又は骨格筋の再生、特に筋障害、心筋症及び筋変性(心筋梗塞)に伴う疾患の治療のためのその用途に関する。
【０００２】  造血系再生のための既存の手段は、本質的に
-  骨髄移植、及び
-  造血組織から単離された幹細胞又は造血前駆体の移植
からなる。
これらの手段には、
-  骨髄移植は、適合性ドナーの存在に依存しており、レシピエントのリンパ球での移植の汚染に関連して、移植拒絶(移植片対宿主、つまりGvH反応)の割合が高いために、比較的効率が悪い;
-  精製された幹細胞又は造血前駆体(CD34+、Thy1+、Lin-)の移植も適合性ドナーの存在に依存しており、移植拒絶に関する不首尾を回避することができる。しかし、これらの細胞の増殖能力は限られているので、効率的な移植のために十分な量の細胞を得ることが難しい
という欠点がある。
【０００３】  骨格筋組織を再生するために、骨格筋前駆体(衛星細胞)又は骨髄の使用が長期間にわたって構想されている。しかし、これらの細胞の増殖能力は限られているので、効率的な移植のために十分な量の細胞を得ることが難しい。
心筋組織(心筋層)の再生は、骨格筋と異なって、心臓は前駆体細胞のレザバーを有しないので、ごく最近になって構想されている。心筋層を再生するために、心臓にオートロガス衛星細胞を移植することが提案されている。しかし、この方法は、これらの移植された衛星細胞が心筋細胞と同一の収縮特性を有しない骨格筋細胞に分化する限り、十分ではない。
【０００４】  この結果、種々の造血系を再生でき、心筋と骨格筋を再生できる、従来技術の手段よりも効率的で使用が簡便な新規な手段、特に細胞に対する手段が実質的に求められている。
ある非造血組織の幹細胞は、致死量を照射したマウスの造血系の全て、つまり-  造血幹細胞に特異的な、CD45マーカー以外の全幹細胞(Sca-1、c-Kit)に共通のマーカー(Jacksonら、PNAS, 1999, 96, 14482-14486),
-  又は、骨髄形態形成タンパク質型2 (BMP2)のレセプター(Pang, Blood, 2000, 95, 1106-1108)
を発現する成体マウスの骨格筋由来の筋幹細胞、及び
成体マウスの脳由来の神経幹細胞(Bjornsonら、Science, 1999, 283, 534-537)
を再生できることが最近、分かった。
【０００５】  同様に、心筋細胞を得るために、ヒトの胚細胞、骨髄間葉細胞又は内皮細胞を使用することが提案されている(Kehatら、J. Clin. Invest., 2001, 108, 407-414; Mullerら、FASEB J., 2000, 14, 2540-2548, Tomaら、Circulation, 2002, 105, 93-98; Liechtyら、 Nat. Medicine, 2000, 11, 1282-1286; Condorelliら、PNAS, 2001, 98, 10733-10738; Wangら、J. Thorac. Cardiovasc. Surg 2001, 122, 699-705; Jacksonら、J. Clin. Invest., 2001, 107, 1395-1402)。
これらの結果を説明するために、2つの仮説が提唱されている：胚細胞の全能性に近い幹細胞は、成体組織(脳、筋肉など)に存続し、種々の細胞型に分化できるであろうし、あるいはこれらの組織の他の分化された幹細胞は、極めて大きな可塑性を有し、脱分化され得るか、もしくは再プログラム化(分化転換)されるであろう。
【０００６】  これらの結果は、骨髄の機能不全(髄質形成不全)の治療、骨髄の腫瘍細胞(神経芽細胞腫)での汚染の治療、及び造血細胞の遺伝的異常の矯正(造血組織の遺伝的操作)に重要な因果関係を有する。これらの結果は、筋肉の機能不全(筋障害及び心筋症)及び筋肉の変性を伴う疾患(心筋梗塞)の治療にも因果関係を有する。
実際、この同一の個体から採取したオートロガスの神経組織又は筋組織を移植することによって、病気の成体個体の造血系の再生が構想される限り、幹細胞又は非造血組織前駆体の使用は、骨髄移植拒絶又は不十分なCD34細胞量に伴う問題を回避できるであろう。同様に、衛星細胞以外の幹細胞の使用は、骨髄細胞、胚細胞又は内皮細胞を移植することによって、心筋層を再生できるであろう。
【０００７】  しかし、実際上、造血系の効率的な再生及び上記の細胞由来の心筋ならびに骨格筋組織の再生は、サンプリングが技術的に難しく、利用できる組織が少量であるために、実行し難い。これらの技術的な難しさには、胚組織の使用に伴う倫理的な問題も付加される。
したがって、発明者らは、サンプリングしやすい組織から単離され、大量に入手可能な造血系及び筋組織を長期間持続して再生できる細胞を提供することを目的とした。
脂肪組織: 身体の主要貯蔵器官を占める白色脂肪組織、発熱褐色脂肪組織、及び正確な役割が知られていない髄質脂肪組織は、哺乳動物に種々の形態で存在する。
【０００８】  この脂肪組織は、2つの細胞分画からなる:- 分化した脂肪細胞からなる脂肪細胞分画: 脂肪組織細胞の30〜60％を占める未熟脂肪細胞(小さな脂肪細胞)と成熟脂肪細胞。この細胞分画は、トリグリセリドの蓄積と後期ならびに極めて後期のマーカー、例えばGPDH (グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ)の発現によって特徴付けられる、及び- 幾つかの血液細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、線維芽細胞及び脂肪細胞前駆体、特に細胞質に脂質がないことと初期マーカー、例えばコラーゲンVI (A2COL6/pOb24)とリポタンパク質リパーゼ(LPL)のα2鎖の発現によって特徴付けられる脂肪前駆細胞からなる、血管間質分画と称される非-脂肪細胞分画。
【０００９】  これらの2つの細胞分画は、Bjorntorpら(J. Lipid Res., 1978, 19, 316-324)に記載されるような方法にしたがって、密度の相違によって分離できる。
したがって、脂肪細胞の分画は、多能性幹細胞→脂肪細胞前駆体つまり脂肪前駆細胞→未熟脂肪細胞→成熟脂肪細胞のように概略的に示される。
極めて初期の前駆体、つまり脂肪細胞と筋細胞のような種々の間葉細胞型を発生できる多能性幹細胞は、同定されていない。しかし、間葉細胞系は脂肪細胞、軟骨細胞又は線維芽細胞に自発的に(奇形癌系T984)又は5-アザシチジン(10T1/2、3T3、CHEF-18)での処理後に分化できることが示されている。
【００１０】  脂肪細胞前駆体は、これらの系(クローン系1246)、マウス胚(3T3-L1、3T3-F442A、A31T、TA1)又はハムスター胚(CHEF-18)あるいは成体マウス(Ob17、HFGu、BFC-1、ST13、MS3-2A、MC 3t3-G2/PA6)からクローンされている。これらの脂肪細胞前駆体は、インビトロ又はインビボで脂肪細胞に分化できる(Ailhaudら、Annu. Rev. Nutr., 1992, 12, 207-233)。
【００１１】  さらに、先の研究(Cousinら、The FASEB Journal, 1999, 13, 305-312)では、肥満と炎症反応における脂肪細胞とマクロファージとの関係に関心をもった発明者は、脂肪前駆細胞(血管間質分画由来の一次培養、つまり3T3-L1系)がマクロファージのように食作用活性を有すること、及び単球-マクロファージに特異的なMOMA-2マーカーが脂肪前駆細胞及び脂肪細胞によっても発現されることを示した。しかし、脂肪前駆細胞がマクロファージと異なることは文献から明らかであり、従来技術を用いる限り、成熟マクロファージに特異的なF4/80 及びMac1 マーカーの存在を、これらの細胞表面で検出することはできない。
【００１２】  脂肪組織は、個体の生存のあいだ持続する再生の可能性を有しており、種々の脂肪の沈着物内に脂肪前駆細胞群を維持しながら結合している。実際、所定の沈着物に存在する脂肪細胞数は、生理学的又は生理病理学的な条件にしたがってかなりの割合で変化し得る。  この結果、ヒト又は高齢ですらある成体、齧歯動物で、分化の初期マーカー(A2COL6/pOb24、LPL、IFG-1など)を発現する脂肪前駆細胞を高い割合で含む脂肪組織の血管間質分画の細胞がインビトロで増殖でき、脂肪細胞に分化できることが示された(Ailhaudら、1992, 上記)。
【００１３】  したがって、脂肪組織の血管間質分画由来多能性幹細胞を、造血系、ならびに神経組織及び肝臓組織(国際出願WO 01/62901)又は筋肉、骨ならびに軟骨組織(Zukら、Tissue Eng., 2001, 7, 20, 211-228)の再生に使用することが提案されている。しかし、これらの書類に記載される手段は、造血活性、筋活性、神経活性又は肝臓活性を再生できる機能細胞に効率的に分化できるような幹細胞を単離できない。  意外なことに、本発明者らは、髄外脂肪組織の血管間質分画(又は血管間質細胞の分画)の細胞が、造血系ならびに心筋細胞に効率的に分化できることをここに示した; このような細胞は、哺乳動物、特に致死量を照射したマウスで造血系を再生でき、特に心臓の事象後の梗塞領域に移植すると、機能的な心臓を再生できる。
【００１４】  この結果、本発明の対象は、医薬品としての髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画である; 実際、この分画は、意外なことに、造血系を再生でき、心筋組織(心筋層)を再生することができる。  また、本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患、例えば悪性血液疾患、骨髄腫瘍、遺伝的又は後天的原因の血液疾患、又は照射もしくは化学療法後の疾患の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。  また、本発明の対象は、遺伝的又は後天的原因の筋障害及び心筋症、ならびに筋肉変性を伴う(誘導されるか又は構成的な)病理的症状、例えば心筋梗塞の治療用医薬品を製造するための該分画の使用である。
【００１５】  実際、髄外脂肪組織の血管間質分画の細胞は、単球/マクロファージ、多核好塩基球、好酸球及び好中球、血小板及び赤血球を生じる骨髄系及び/又はTリンパ球とBリンパ球を生じるリンパ球系を再生できる。これらの細胞は、収縮活性を示す機能的な心筋細胞にも分化できる。  本発明によれば、血管間質細胞の分画は、特にBjorntorpら(上記)によって記載されるプロトコルにしたがって密度の相違により単離される。
【００１６】  また、本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴とする、造血系を再生し得る単離かつ精製された細胞である。  本発明の対象は、髄外脂肪組織の血管間質細胞の分画から単離されることを特徴とする、心筋細胞に分化できる単離かつ精製された細胞でもある。
【００１７】  細胞の有利な具体例によれば、細胞は、- 髄外脂肪組織の試料を採取し、- 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、特に密度の相違により物理的に分離して、血管間質細胞の分画を単離し、かつ- 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する連続工程によって得ることができる。
【００１８】  有利には:- 物理的分離は、適当な固体支持体への付着の相違又は密度の相違(適当な勾配での遠心分離、エルトリエーション法)によって行われ、- 免疫選択は、脂肪細胞、造血又は心筋細胞前駆体によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体を用いて(ポジティブ選択)、及び/又は当業者にそれ自体公知の該前駆体にないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体を用いて(ネガティブ選択)行われる。  この具体例の有利なアレンジによれば、精製工程は、適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程によって先行される。
【００１９】  非限定的な例では、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF(幹細胞因子)、IL3及びIL6を補足したメチルセルロースを含む媒体が挙げられる。
造血系を再生可能な該細胞の別の有利な具体例によれば、それらは、脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも1つのマーカー及び/又は造血幹細胞又は前駆体用の少なくとも1つのマーカーを発現する。
心筋細胞に分化可能な該細胞の別の有利な具体例によれば、それらは、脂肪細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも1つのマーカー及び/又は心筋細胞幹細胞又は前駆体用の少なくとも1つのマーカーを発現する。
【００２０】  本発明に関連して、幹細胞と前駆体は、クローンの増殖と組織分化の性質を有する多能性細胞に相当し、これらの2つの用語は等価であると考えられる。
造血系を再生可能な細胞と心筋細胞に分化可能な細胞のこの具体例の有利なアレンジによれば、脂肪細胞前駆体用のマーカーは、A2COL6/pOb24、LPL 及びPref-1からなる群から選択される。
造血系を再生可能な細胞のこの具体例の別の有利なアレンジによれば、造血幹細胞又は前駆体用のマーカーは、CD34、CD45、Thy-1、Sca-1、CD117 及びCD38からなる群から選択される。
心筋細胞に分化可能な細胞のこの具体例のさらに別の有利なアレンジによれば、心筋細胞前駆体用のマーカーは、α-アクチニンとGATA-4因子からなる群から選択される。
【００２１】  本発明によれば造血系を再生可能な細胞は、特に少なくともA2COL6/pOb24、CD34及びCD45を発現する細胞からなる。
好ましくは、上記細胞は、ヒト由来である。
また、本発明の対象は、遺伝的に修飾された上記の細胞からなることを特徴とする、修飾細胞である。
修飾細胞の有利な具体例によれば、それらはオートロガス遺伝子について少なくとも１つの変異を含む。
本発明の目的のため、表現「遺伝子の変異」は、遺伝子について少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を意味することを意図する。
例えば、細胞のMHC遺伝子を、異種の移植を可能にするために変異することができる。
【００２２】  修飾細胞の別の具体例によれば、細胞は、異種遺伝子、特に治療上の関心がある遺伝子の少なくとも1つのコピーを含む。有利には、該遺伝子産物は、修飾細胞によって分泌される。
例えば、細胞は、インターロイキン又は血液凝固に作用する因子を発現する。
本発明によれば、修飾細胞は、当業者にそれ自体公知の技術にしたがって得られる； 特に、Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2000), John Wiley and Sons, Inc. New York に記載される、相同的組換え、組換えウイルス(レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノウイルス-関連ウイルス(AAV))のような組換えベクターでの感染又は組換えプラスミドでのトランスフェクションが挙げられる。組換えベクターの性質によって、対象の異種遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれるか、でなければ染色体外形態で存在する。
【００２３】  好ましくは、上記の修飾細胞は、ヒト由来である。
また、本発明の対象は、上記のヒト細胞由来の不死化細胞系である。
本発明によれば、不死化細胞系は、Greenら、Cell, 1974, 3, 127-133に記載されるように連続継代で得られる。
本発明の対象は、造血系を再生可能な(単離及び/又は修飾)細胞又は上記のこれらの細胞由来の系と、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤からなることを特徴とする、造血系の再生用医薬品である。
有利には、該医薬品は、非経口的に、好ましくは静脈内に投与される。
【００２４】  本発明の対象は、心筋細胞に分化できる(単離及び/又は修飾)細胞又は上記のこれらの細胞由来の系と、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤とからなることを特徴とする、心筋層再生用医薬品である。
有利には、該医薬品は、病変部位に局所的に投与される。
本発明の対象は、誘導されるか又は構成的な髄質の涸渇が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための、造血系、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系に分化できる細胞の使用である。
【００２５】  本発明の対象は、心筋症と心筋変性が認められる疾患の治療用医薬品を製造するための、心筋細胞に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用でもある。
また、本発明の対象は、心臓活性を調節(活性化又は阻害)できる分子をスクリーニングするための、心筋細胞に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用である。
また、本発明の対象は、造血活性を調節(活性化又は阻害)できる分子をスクリーニングするための、造血系に分化できる細胞、さもなければ上記の修飾細胞又はこれらの細胞由来の系の使用である。
【００２６】  また、本発明の対象は、少なくともa1) 髄外脂肪組織の試料を採取し、b1) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、血管間質細胞の分画を単離し、かつc1) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する工程からなることを特徴とする、上記の造血系を再生可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。  また、本発明の対象は、少なくともa2) 髄外脂肪組織の試料を採取し、b2) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、血管間質細胞の分画を単離し、かつc2) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する工程からなることを特徴とする、上記の心筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。
【００２７】  この方法の有利な具体例によれば、工程c1又はc2に先立って、適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養する追加工程が含まれる。  また、本発明の対象は、少なくともa3) 髄外脂肪組織の試料を採取し、b3) 好ましくは細胞外マトリクスをタンパク質分解酵素で消化し、物理的に分離することによって、血管間質細胞の分画を単離し、かつc3) 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地で細胞を培養し、かつd3) 物理的分離及び/又は免疫選択によって細胞を精製する工程からなることを特徴とする、骨格筋細胞に分化可能な単離かつ精製された細胞の調製法である。
【００２８】  方法の有利な具体例によれば、インビトロでの細胞の増殖について追加工程ｄ1)、d2) 又はe3) が含まれる。
有利には、物理的分離は、固体支持体への付着の相違、又は密度の相違によって行われ、免疫選択は、該細胞によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体を用いて(ポジティブ選択)及び/又は上記の該細胞にはないマーカーに特異的な少なくとも１つの抗体を用いて(ネガティブ選択)行われる。
【００２９】  有利には、本発明による単離かつ精製された細胞の得るための方法を実施するために、- 容易に入手可能な脂肪沈着物、例えば皮下脂肪沈着物から試料を採取でき(工程a1、a2又はa3)、- 特にBjorntorpら(上記)に記載のプロトコルにしたがって、血管間質細胞の分画を密度の相違によって単離し(工程b1、b2又はb3)、- 適当な成長因子及び/又はサイトカインを含む半固形培地中での細胞の培養(追加工程又は工程c3)を、ウシ胎児血清、ウシ血清、インスリン、トランスフェリン、SCF、IL3及びIL6を補充したメチルセルロースを含む培地中で行い、
【００３０】- 細胞の精製(工程c1、c2又はd3)を、いずれかの適当な支持体での分離(付着の相違)によって、さもなければ、適当な勾配での遠心分離もしくはエルトリエーション法(密度の相違)、又は従来の免疫細胞化学技術、特に、例えばCurrent protocols in Immunology, (John E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)に記載されるようなフローサイトメトリーによるか、あるいは磁気ビーズを用いる免疫標識細胞の(ポジティブ又はネガティブな)分類技術による免疫選択によって、行う; 該細胞によって発現されるマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ポジティブ選択)及び/又は上記の細胞にはないマーカーに特異的な少なくとも1つの抗体(ネガティブ選択)は、細胞分類に用いられる;- インビトロでの細胞の増殖(工程d1、d2又はe3)は、適当な培養培地、例えば非制限的にはウシ胎児血清又は植物代用血清を含む DMEM F12 培地で行われる。
【００３１】  造血系の再生又は心筋ならびに骨格筋組織の再生のための既存の手段に比較して、上記の細胞分画と単離された細胞、またそれらの調製方法は、以下の利点を有する:
・  技術上の利点
-  サンプリングの容易性、
-  同種又は異種の移植に好ましい、採取された細胞の潜在的な増殖を伴う極めて大量の組織と細胞、
-  同種又は異種の移植に好ましい、所定培地中でのインビトロの細胞の維持、増殖又は不死化すらもの可能性、
-  1個体〜数個体の血液集団及び/又は筋組織の再生の可能性、
-  凍結した細胞の維持の可能性、
-  トランスフェクト可能な細胞、
-  治療上の関心があるタンパク質の放出に使用されうる高度な分泌能を有する細胞、
-  心筋又は骨格筋の活性もしくは造血活性を調節し得る大量の治療分子のインビトロのスクリーニングに適した細胞。
【００３２】・  経済上の利点
-  入院期間の短縮(条件づけ又は血球アフェレーシスの不要)。
・  倫理的な利点
-  比較的非侵襲性のサンプリング、
-  胚組織の不使用。
上記のほかに、本発明は、本発明の対象である方法の実施例及び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他のアレンジをも包含する。
【００３３】- 図1は、髄外脂肪組織又は骨髄細胞(対照)の血管間質細胞の注入によって得られる造血系の再生を示す。図1Aは、(x-軸に沿って)照射後10週間にわたる、(y-軸に沿って)致死量照射したマウスの生存割合を示すカプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)グラフである。非再生の照射マウスを円で示し、骨髄細胞を移植したマウスを四角で示し、血管間質細胞を移植したマウスを三角で示す。各群は、初期数10〜15匹のマウスからなる。図1Bと1Cは、それぞれ骨髄細胞(黒色)又は脂肪組織の血管間質細胞(白色)で再生した照射マウスの血小板と白血球の数を示す。結果は非照射対照の値に対する％として示し、示した値は5〜15匹のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
【００３４】- 図2は、骨髄細胞又は血管間質細胞の移植から10週間後に行った、再生したメスのマウスにおける脾臓(上のパネル)と血液(下のパネル)でのY染色体に特異的なsry遺伝子のPCRによる検出を示す。上のパネル: PCRは、脾臓DNAの50 ng (ライン1、5及び6)又は150 ng (ライン2〜4)について行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン1)又は血管間質細胞(ライン2〜4)で再生したマウスで検出される。対照のメスのマウスには、シグナルが認められない(ライン5)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる(ライン6)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。下のパネル: PCRは、50 ngの血液DNAについて行う。722 bpの産物が、オスのマウス由来の骨髄細胞(ライン5)又は血管間質細胞(ライン3-4)で再生した動物で検出される。対照のメスのマウスには、シグナルは検出されない (ライン2)。オスのマウス由来の血液試料を、陽性対照として用いる(ライン1)。分子量マーカーを、基準(MW)として示す。
【００３５】- 図3は、オスのC57Bl/6 マウスの血管間質細胞のフローサイトメトリーによる分析を示す。パネル1: 領域R1は、x-軸に沿った粒径パラメータ(FSC: 前方散在(forwards scatter))、及びy-軸に沿ったサイズパラメータ(SSC: 側方散在)の関数として、分析用に選択した細胞群に相当する。パネル 2: (y-軸に沿った)細胞のサイズの関数としての(x-軸に沿った)脂肪前駆細胞に特異的なA2COL6抗原に陽性の細胞の分布。 パネル3 及び4: 脂肪前駆細胞-特異的な抗原(A2COL6)及び造血幹細胞に特異的な2つの抗原(CD45及びCD34)に対する三重標識を示す。パネル3は、CD45+ 細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+ と(y−軸に沿った)CD34+の分布を示す。パネル4は、CD34+細胞群における(x-軸に沿った)A2COL6+ と(y-軸に沿った)CD45+の分布を示す。
【００３６】-  図4は、脂肪前駆細胞系3T3-L1又は骨髄細胞(対照)の注入によって得られる造血系の再生を示す。図1Aは、(x-軸に沿って)照射から10週間にわたる、(y-軸に沿って)致死量照射したマウスの生存割合を示すカプラン-マイヤーグラフである。非-再生の照射マウスは円で示し、骨髄細胞を移植したマウスは四角で示し、3T3-L1脂肪前駆細胞系を移植したマウスは三角で示す。各群は、初期数10〜15匹のマウスからなる。図4Bと4Cは、それぞれ骨髄細胞(白色)又は3T3-L1脂肪前駆細胞系(黒色)で再生した照射マウスにおける血小板と白血球の数を示している。結果は、非照射対照の値に対する％として示し、示した値は、5〜15匹のマウスの群について得られる平均±標準偏差を示す。
【００３７】- 図5は、本発明の方法によれば、髄外脂肪組織の血管間質から単離される細胞の心筋ならびに骨格筋細胞への分化の免疫細胞化学による分析を示す。上のパネル: 分化した心筋細胞と分化した骨格筋細胞の存在は、抗-α-アクチニン抗体を用いて特異的に検出される(左パネル); 比較として、ネガティブの対照では、抗-α-アクチニン抗体の不在下では標識は認められない(右パネル)。下のパネル: 分化した骨格筋細胞の存在は、ミオシンのラピッドイソ型(rapid isoform)に対する抗体を用いて特異的に検出される(左パネル); 比較として、ネガティブの対照では、α-ミオシンのラピッドイソ型に対する抗体の不在下では標識は認められない(右パネル)。
【００３８】実施例1: 材料と方法1)  骨髄細胞の単離  骨髄細胞を6週齢のオスのC57B1/6マウスの大腿骨から単離する; 赤血球細胞を、9％の塩化アンモニウム水溶液での処理によって除き、次いで細胞を600 gで10分間遠心分離し、PBSに再懸濁して、計測し、注入する。2)  血管間質細胞(血管間質画分、つまりSVF)の単離  上記のBjorntorpらにより記載されるプロトコルにしたがって、細胞を単離する。より正確には、鼠蹊部の脂肪組織を6週齢のオスのC57Bl/6マウスから採取し、0.2% のBSAと2 mg/mlのコラゲナーゼを含むPBS緩衝液中で 45分のあいだ37℃で消化する。消化生成物を100〜25μmのろ紙で連続的に濾過し、次いで10分のあいだ800 gで遠心分離する; こうして単離した間質細胞をPBS緩衝液に再懸濁し、次いで計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。
【００３９】3)  脂肪前駆細胞系の培養  マウスの脂肪前駆細胞系3T3-L1 (ATCC基準系CL-173)を、10%の熱不活化ウシ胎児血清と2 mMのL-グルタミンを含むDMEM 培地で培養する。集密した3T3-L1細胞培養物をトリプシン処理で回収し、計測し、移植実験又は免疫分析に用いる。4)  細胞(骨髄、血管間質及び3T3-L1系)の移植  移植当日に、8〜10週齢のメスのC57Bl/6マウスを単一用量で致死的に10 Gyで照射し、次いで尾部静脈又は腹膜内の静脈内に400μl用量中の5×106〜107 個の細胞を注入する。マウスに酸性化水とオートクレーブに付した食物を与える。動物は、動物実験に関する指示にしたがって扱う。5)  血液分析  移植から4、8又は10週後に、200μlの末梢血液試料を、移植を行ったマウスの眼窩後部叢から採取し、すぐにヘパリンを含む管に移す。非照射マウスから採取した末梢血液試料をポジティブ対照として用い、非再生の照射マウスから採取した末梢血液試料をネガティブ対照として用いる。全血液細胞の計測と種々の核細胞の割合は、血液分析装置で自動的に行う。
【００４０】6)  ポリマー鎖反応(PCR)による分析  Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2000), John Wiley and Sons, Inc. New Yorkに記載される従来技術にしたがって、移植から10週間後に、造血組織(骨髄、脾臓、胸腺、肝臓)と血液の細胞から全ゲノムDNAを抽出する。DNA試料を、上記のPangらに記載されるプロトコルにしたがって、Y染色体に特異的なsry遺伝子用の各プライマー20 pmolを含む50μlの容量に増幅する。  骨髄細胞又は血管間質細胞を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子の256〜978位置に相当する722 bpのフラグメントが得られる。  3T3-L1 系を移植したマウスのDNAから、sry遺伝子に相当しないが、そのプロフィルがこれらの細胞に特異的な種々のフラグメントを得る。  各増幅系について、オスとメスのマウスから得られる試料を、それぞれポジティブ及びネガティブの対照として用いる。
【００４１】7)  免疫化学分析
実施例1.2に記載されるようにして単離した懸濁液中の細胞を、最初の抗体、0.1％BSAを含むPBS緩衝液に希釈したビオチン(Clinisciences)に結合した抗-CD34又は抗-CD45(Clinisciences)とインキュベートする。洗浄し、遠心分離した後に、上記のCurrent Protocols in Molecular Biologyに記載される従来のプロトコルにしたがって、二次抗体[フルオレセインイソチオシアネートに結合した抗-マウス免疫グロブリン(A2COL6)、テキサスレッドに結合した抗-ラット免疫グロブリン(CD45)]及びCy-クローム(chrome)に結合したストレプトアビジンそれぞれと細胞をインキュベートする。0.037%パラホルムアルデヒド含有PBS緩衝液に細胞を固定し、フローサイトメトリーで分析するか、あるいは、遠心分離によりカバースリップに固定し、蛍光顕微鏡で観察する。
【００４２】8)  造血器官の分化
短期の造血始原細胞(short-term hematopoietic progenitor)又は前駆体を、実施例1.4に記載されるプロトコルにしたがって致死量照射し、次いで移植したメスのC57 Bl/6マウスの造血組織を用いて分析する。
長期の造血始原細胞又は前駆体を、実施例1.4に記載されるプロトコルにしたがって4 Gyの非致死量を照射し、次いで移植したSCIDマウスの造血組織を用いて分析する。
a)  リンパ系
胸腺リンパ球(リンパ球前駆体)を、Current Protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and Son Inc, Library of Congress, USA)に記載の従来技術にしたがって移植したメスのマウスの胸腺から精製する。次いで、全ゲノム DNAを胸腺リンパ球から抽出し、実施例1.6に記載されるように増幅する。
【００４３】b)  骨髄系
移植したマウス由来の骨髄及び脾臓細胞の抽出物を、Current Protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and Son Inc, Library of Congress, USA)に記載される従来技術を用いて調製し、次いで製造者の指示に従って、1% メチルセルロース、15%ウシ胎児血清、1% ウシ血清、10μg/mlヒトインシュリン、200μg/mlトランスフェリン、10-4 M メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、50 ng/ml 組換えマウスSCF、10 ng/ml 組換えマウスIL3及び10 ng/ml組換えヒトIL6を含む培地(培地METHOCULTTM GF M3534, STEM CELL TECHNOLOGIES INC),に細胞を播種する。
【００４４】9)  筋肉の分化  実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を、上記のメチルセルロースベースの半固形培地で培養する(実施例1.8)。  心筋細胞と骨格筋細胞を、製造者の指示に従って特異的な抗体(クローンEA-53, SIGMA)を用いて顕示されるα-アクチニンの発現で検出する。  骨格筋細胞は、製造者の指示にしたがって特異的な抗体(クローンMY-32, SIGMA)を用いて顕示されるミオシンイソ型(ラピッドイソ型)の重鎖の発現によって特異的に検出される。
【００４５】  また、心筋細胞は、ムスカリンのアセチルコリンレセプター(それぞれそれぞれカルバミルコリンとアトロピン)又はβ-アドレナリン作動性レセプター(それぞれイソプロテレノール及びプロプラノロール)のアゴニストもしくはアンタゴニストの存在又は不在下の自発収縮活性によって検出される。
より正確には、カルバミルコリン(2 μM)、アトロピン(10μM)、イソプロテレノール(10μM)又はプロプラノロール(40μM)を含む1 mlのDMEM培地を、メチルセルロースベースの培地に加える。分子の拡散に必要な5分間のインキュベート後、過剰量の緩衝液を除き、細胞の収縮を、1分間顕微鏡下で計測する。
【００４６】実施例2: 致死量を照射したメスのマウスにおける、骨髄細胞(対照)又は血管間質細胞由来の造血系の再生  レシピエントのマウスを照射し、次いで実施例1に記載のプロトコルにしたがって、血管間質細胞、さもなければ骨髄細胞(対照)を用いて腹膜内に移植する。1)  照射動物の生存  図1Aは、造血系の長期持続再生を評価するための、照射から10週間後に分析した動物の生存を示す。認められた結果は、照射から3週間以内に非再生マウスが死亡することを示している。他方、血管間質細胞あるいは骨髄細胞で移植した動物のうち40%の生存が認められる。致死量の照射は内因性造血前駆体の大部分を排除するので、認められた結果は、再生した動物の生存が移植細胞に関連していることを示している。
【００４７】2)  造血系の分析  図1Bと1Cは、非照射対照の値に関連する％として示される、種々の造血系の再生を示している。  非再生マウスでは、血小板数は、1週間で急速に551×103個の血小板/μlの初期値から145±6×103個の血小板/μlの値に低下する。他方、血管間質細胞又は骨髄細胞で移植したマウスでは、血小板数は徐々に増して、4週間で有意な値に達し、10週では対照の値にほとんど等しい(図1C)。 血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球は、照射から1週間後にはほぼ検出できず、7週間後には、対照と同一の値に戻る。
【００４８】  図1Bと1Cは、血小板と白血球の数の回復が、骨髄細胞で再生したマウスでより迅速であることも示している。  白血球群の分析は、骨髄細胞又は血管間質細胞で再生したマウスでは、白血球、単球及び顆粒球の割合が非照射の対照マウスの割合に等しいことを示している。  したがって、これらの結果は、血管間質細胞の腹膜内注入によって、致死量を照射したマウスを生きながらえさせることができ、等しい数の骨髄細胞で認められるものに匹敵する効率で、但し、数週間の遅延を伴って、骨髄とリンパ系を再生できることを立証している。
【００４９】3)  レシピエントのマウスにおける移植細胞の立証
造血組織における注入細胞由来のオスの細胞の存在と再生したメスのマウスの血液を、Y染色体に特異的なsry遺伝子用プライマーを用いてPCRにより分析した。
非再生マウスの群又は対照のメスのマウスの群では、オスの細胞は検出されない。
【００５０】  他方、sry遺伝子に特異的な722 bpの産物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマウス由来の骨髄細胞を注入したマウスの血液に極めて大量に存在する(図2)。同一サイズの生成物は、造血組織(骨髄、胸腺、脾臓)とオスのマウス由来の血管間質細胞の移植から10週間後のメスのマウスの血液にも認められる(図2)。  したがって、図2に示す結果は、血管間質の幾つかの細胞が、腹膜腔から造血部位への移動能、増殖能及び循環血液細胞への分化能を有し、この結果、致死量を照射したマウスで機能的な造血を再生できることを示している。
【００５１】4)  造血分化分析  sry遺伝子は、オスのマウス由来の脂肪組織の血管間質細胞を移植したメスのマウス由来の精製胸腺細胞(リンパ球前駆体)で検出され、これらの細胞が、リンパ系への分化に潜在性を有していることを示している。  sry遺伝子を含む骨髄細胞のクローンは、骨髄細胞と脂肪組織の血管間質細胞を移植したマウス(C57 Bl/6 及びSCID)の脾臓細胞から得られる; 非致死量を照射したSCIDマウスでは、sry遺伝子を含む造血系クローン数は著しく高い。これらの結果は、脂肪組織の血管間質細胞が骨髄系に分化できる造血始原細胞を含むことを示している。  この一連の結果は、脂肪組織の血管間質が、照射マウスでリンパ系に分化しうる短期及び長期の造血始原細胞と機能的な造血を再生し得る骨髄造血系を含むことを示している。
【００５２】実施例3: 血管間質細胞の表現型分析 血管間質が異種細胞群からなる限り、フローサイトメトリーの免疫標識実験を行って、造血活性を有する血管間質細胞を同定する。  図3は、血管間質細胞群の35.3±3.6%が脂肪前駆細胞に特異的なマーカーであるA2COL6抗原を発現することを示している(パネル2)。造血幹細胞に特異的な2個の抗原を用いると、免疫標識実験は、細胞の35.8±6%と30.6%±3.1%が、それぞれCD34とCD45にポジティブであることを示し、脂肪組織から単離される血管間質細胞が種々の造血系(骨髄系及びリンパ系)細胞に分化しうる造血幹細胞の意外な源であることを立証している。  補足的な三重標識実験は、A2COL6-ポジティブな細胞の大部分がCD34 及び CD45抗原も発現していることを示しており(図3: パネル3及び4)、脂肪前駆細胞が造血前駆体であると考えられることを立証している。この三重標識は、3T3-L1脂肪前駆体系を用いても得られた。
【００５３】実施例4: 致死量を照射したメスのマウスにおける、3T3-L1 脂肪前駆細胞系細胞由来の造血系の再生
レシピエントのマウスを照射し、実施例1に記載のプロトコルにしたがって、3T3-L1 脂肪前駆細胞系の細胞を用いて静脈内又は腹膜内に移植した。
予備実験は、おそらくは腹膜腔から造血中心への細胞の移動が遅いために、細胞を腹膜内に注入すると移植の効率が低くなることを示している。
したがって、静脈内注入の結果を図4に示す。
図4Aは、致死量の照射から10週間後に、骨髄細胞を移植したマウスの80%が依然として生存しているが、3T3-L1細胞を移植したマウスはわずか50%が照射を免れていることを示している。
【００５４】  移植したマウスの2群についての血液細胞数は、照射から4週間以内の血小板と白血球数の部分的な回復を示している(図4B及び4C)。10週間目で、血小板数は、移植したマウスの2群について非照射対照の血小板数に等しい値に達する(図4B)。他方、10週目で、骨髄細胞で再生したマウスは、非照射対照のそれらに等しい値に再度達するが、白血球数は3T3-L1細胞で再生したマウスでは対照の値の50%を越えない。
白血球群の分析は、3T3-L1細胞で再生したマウスでは、リンパ球、単球及び顆粒球の割合が非照射対照マウスのそれらと同等であることを示している。
したがって、これらの結果は、骨髄細胞に匹敵して、より効率的で、非照射対照に匹敵する値で骨髄及びリンパ系を再生でき、照射から8週間後に3T3-L1系が造血系を部分的に再生できることを示している。
【００５５】実施例5: 心筋細胞と骨格筋細胞への脂肪組織の血管間質細胞のインビトロの分化  実施例1.2に記載されるようにして単離した血管間質細胞を培養し、実施例1.9に記載する条件下で分析する。  これらの条件下、心筋と骨格筋の収縮細胞への細胞の分化によって、細胞の増殖を観察する。  図5は、α-アクチニンの発現によって特徴付けられる心筋細胞と骨格筋細胞の存在を示す。それは、ミオシンイソ型の重鎖の発現による骨格筋細胞の特異的な検出も示している。  下記の表１は、心筋細胞に特異的な細胞の自発的な収縮活性、またカルバミルコリン(ムスカリンアセチルコリンレセプター)での収縮阻害及びアトロピン(同一レセプターのアンタゴニスト)の添加によるその作用の反転を示している。値は、3回の独立した測定の平均に相当する。
【００５６】
【表１】
0005258138.tif 000002
【００５７】  表２は、イソプロテレノール(β-アドレナリン作動性レセプターのアゴニスト)での収縮頻度の刺激とプロプラノロール(同一レセプターのアンタゴニスト)の添加によるその作用の反転を示す。値は、3回の独立した測定の平均に相当する。
【００５８】
【表２】
0005258138.tif 000003
【００５９】  上記から明らかなように、本発明は、例示的に記載したにすぎない実施方法、製造及び適用にいかなる方法でも限定されない; 逆に、本発明は、本発明の関連又は範囲から逸脱しないで当業者が行い得る全ての変形を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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