(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセリンを資化しうる食品用酵母を、パーム油中の油脂をアルキルアルコールとエスル交換しアルキルエステルを除いて得られるグリセリンを６０〜９０重量％含む粗グリセリン画分を主炭素源として用いた培地中で連続培養することを特徴とする、酵母菌体の製造方法。
【請求項２】
前記食品用酵母が、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である、請求項１記載の酵母菌体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物油由来のグリセリンを炭素源として酵母を培養する、酵母菌体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球環境問題の解決のために、再生産可能である植物原料からの物質生産、例えば、植物油からカーボンニュートラルな軽油代替燃料としてのバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ)等、が注目を集めている。しかしながら、例えば、ＢＤＦ製造時に、油脂中のグリセリンとアルコールとをエステル交換するため、グリセリンが大量に副生成物として生成することから、これを焼却したり寒冷地の道路凍結防止剤として撒かれたりしているが、更に有利なグリセリンの活用が、大きな課題となっている。
また、通常、副成したグリセリンには、植物油由来の不純物、油脂・脂肪酸あるいは触媒等が混入しており、加熱あるいはアルカリにより容易に着色するという欠点を有しており、有効活用には、十分に精製する必要があるという問題点もあった。
【０００３】
従来より、グリセリンを資化する酵母が知られており、グリセリンを炭素源としてかかる酵母を培養し、酵母菌体あるいは酵母生産物を取得する方法が報告されている（例えば、特許文献１、等）。しかしながらこれら方法に用いられるグリセリンは精製されたものであり、また、かかるグリセリンを用いて連続培養すると、条件によっては培養液に沈殿が生じ、十分な生産性が得られないという欠点があった。
【０００４】
植物油由来のグリセリンは副生成物として生じるために安価な原材料であることから、更に有利な利用技術が求められている。
【特許文献１】特開昭４９−１１６２８４号公報、同５３−３５８０号公報、同５７−４３６８２号公報、
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、これら従来技術に鑑み、植物油由来のグリセリンを十分に精製することなく活用する、連続培養による酵母菌体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、植物油由来の粗精製したグリセリンを使用することで課題を解決できることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）グリセリンを資化しうる食品用酵母を、植物油中の油脂をアルキルアルコールとエステル交換しアルキルエステルを除いて得られるグリセリンを含む画分を主炭素源として用いた培地中で培養することを特徴とする、酵母菌体の製造方法、
（２）前記植物油がパーム油である、上記（１）記載の酵母菌体の製造方法、
（３）前記食品用酵母が、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である、上記（１）又は（２）記載の酵母菌体の製造方法、
（４）前記培養が連続培養であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の酵母菌体の製造方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、安価な粗グリセリンを用いるにもかかわらず、着色することもなく、グルコース、精製グリセリン等を炭素源として用いた場合と比較して、菌体収量あるいはＲＮＡ等の菌体内有用物質の蓄積量も多く、極めて経済的である。
また、連続培養においても、なんら特殊な方法を用いなくても、精製グリセリンを用いた場合のように培養液に不溶物が析出し収量の低下を招く、ということもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる食品用酵母は、食用のものであればいずれでもよく、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母が例示され、なかでもキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｒｉｓ）が好ましい。
本発明において、これら酵母のうち、グリセリンを資化できる能力がある株が用いられる。
【０００９】
本発明で用いられる植物油由来の粗グリセリンとは、植物油中の油脂（モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド）をアルキルアルコールとエステル交換しアルキルエステルを除いたグリセリンを含む画分で、グリセリンが６０〜９０重量％、好ましくは７０〜８５重量％の粗グリセリンをいう。
粗グリセリン中のグリセリンの割合が６０重量％未満であれば、加熱によりあるいはアルカリにより着色することがあり好ましくなく、一方、９０重量％を超えると、精製に労力を要し、高価となるため好ましくない。
用いられる植物油は特に制限はないが、例えば、菜種油、大豆油、パーム油、ココナッツ油等が例示され、中でもパーム油が好ましい。
【００１０】
本発明の製造方法は、上述した粗グリセリンを主炭素源とする培地にグリセリン資化性酵母を接種、連続的に培養して、培養物から酵母菌体を採取することによって行われる。
粗グリセリンは、バッチ培養では１０％以上を添加すると増殖が遅くなるが、連続培養においては供給したグリセリンがすぐに資化されるため、２０％程度まで添加することができる。
粗グリセリン以外の培地成分としては、窒素源、無機物が含まれる。窒素源としては使用酵母の利用可能なものであればよく、硫酸アンモニウム、アンモニア水、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素などを例示することができる。これら窒素源は、一般に、０．１〜３％程度添加される。
無機物としては、リン酸一カリウム、リン酸ニカリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等が用いられる。無機物は０．１〜５％程度、金属は０．０００１〜０．１％程度、添加される。
更に、必要に応じて、ビタミンその他の生育促進物質、例えば酵母エキス、ペプトン等を添加することもできる。特に、酵母としてサッカロミセス属を用いた場合においては、酵母エキス、ペプトン等の添加効果が大きく、培養速度に大きく影響する。
【００１１】
培養は、オートクレーブ（例えば１２１℃２０分間）殺菌したグリセリンを含む培地に種母を接種し、培地中の溶存酸素を低下させない範囲で振とう培養あるいは通気攪拌培養することにより実施される。培養温度は２０〜３８℃、好ましくは２２〜３０℃である。ｐＨは３．０〜８．０、特に４．０から６．０が好ましい。
【００１２】
連続培養は、培地を供給して、供給した分を排出して培養する方法をいい、通常の通気攪拌可能な発酵槽が用いられ、２日間から２週間程度連続培養される。
培地成分の添加は、バッチ培養が終了すると同時に、ポンプで一定量の培地を連続的に供給し、培養液の排出は保持液量を一定に保つように、発酵槽の天板から挿入した配管を通して排出用のポンプで培養液を連続的に引き出すことにより行う。
培地は通常の培地殺菌と同様にオートクレーブしたものが用いられる。ｐＨは、４．０〜６．０になるようにアルカリまたはアンモニア水でコントロールする。また、培養液中の溶存酸素を保つために、必要な通気攪拌あるいは加圧を行う。
【００１３】
培養した菌体は、ろ過、遠心分離などの手段により集菌し、洗浄することにより取得することができる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
なお、実施例中のグリセリン濃度、菌体量、菌体中のＲＮＡ含有量は、以下の方法によって測定した。
（１）グリセリンの定量：ＨＰＬＣで分析した。分析条件としては、使用カラム：ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０、溶離液：純水、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、温度：８０℃、検出器：ＲＩ、注入量：５μｌで行った。
（２）菌体量：定法により絶対乾燥重量として求め、単位培養液当たりの重量として表記した。
（３）ＲＮＡ含有量：シュミット・タンホイザー・シュナイダーの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６年１６４巻７４７頁）によりＲＮＡを抽出後、ＲＮＡ量を求め、これを菌体乾燥重量あたりの百分率で表記した。
【００１５】
試験例１
キャンディダ・ユティリス  ＡＴＣＣ９２２６を、予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む試験管で種母培養した。
５００ｍｌ容の三角フラスコに培地を３０ｍｌ仕込み、オートクレーブ殺菌した後、種母培養液を０．３〜１％植菌し、３０℃で約２４時間、３００ｒｐｍで振とう培養した（バッチ培養）。培地組成は、パーム油由来粗グリセリン（ＳＵＭＩ  ＡＳＩＨ社製、輸入販売元中央化成（株）、グリセリン含量８３％）０．６％（グリセリン純分として０．５％相当）、尿素０．０５％、硫酸アンモニウム０．０１７％、リン酸一カリウム０．５％、リン酸二カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．００５％、硫酸鉄４．３ｐｐｍ、硫酸マンガン４．３ｐｐｍ、硫酸亜鉛４．３ｐｐｍ、硫酸銅０．４３ｐｐｍを用い、ｐＨは５．５に調整した。なお、尿素は別殺菌後別添加した。
結果を表１に示す。
表１に示すように、炭素源として粗グリセリンを使用すると、グリセリンに対する菌体収率が５９％と、高い菌体生産性を示した。
【００１６】
【表１】
0005366070.tif 000002
【００１７】
比較試験例１
試験例１において、粗グリセリンに換えて精製グリセリン（ＭＵＳＩＭ  ＭＡＳ社製、輸入販売元中央化成(株)、グリセリン含量９９．９％）０．５％を用いた以外は試験例１と同様に実施した。
結果を表２に示す。
表２から、対液のＲＮＡ生産性と対グリセリン菌体収率は粗グリセリンの方が精製グリセリンよりも高いことがわかる。
【００１８】
【表２】
0005366070.tif 000003
【００１９】
比較試験例２
試験例１において、粗グリセリンに換えてグルコース０．５％を用いた以外は試験例１と同様に実施した。
結果を表３に示す。
表３から、対液のＲＮＡ生産性は粗グリセリンと同程度であるが、対糖菌体収率は粗グリセリンの方がグルコースに比べて極めて高いことがわかる。
【００２０】
【表３】
0005366070.tif 000004
【００２１】
試験例２
試験例１において、キャンディダ・ユティリス  ＡＴＣＣ９２２６に換えて、キャンディダ・ユティリス  ＡＴＣＣ９９５０を用いた以外は試験例１と同様に実施した。
結果を表４に示す。
表４からわかるように、菌体収率、対液のＲＮＡ生成量ともに高い値を示した。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
比較試験例３
試験例２において、粗グリセリンに換えて精製グリセリン（ＭＵＳＩＭ  ＭＡＳ社製、輸入販売元中央化成(株)、グリセリン含量９９．９％）０．５％を用いた以外は試験例２と同様に実施した。
結果を表５に示す。
表５から、菌体収率はやや高いが、ＲＮＡの生産性は粗グリセリンに比べて劣ることがわかる。
【００２４】
【表５】
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【００２５】
比較試験例４
試験例２において、粗グリセリンに換えてグルコース０．５％を用いた以外は試験例２と同様に実施した。
結果を表６に示す。
表６から、粗グリセリンの方がグルコースよりも対液の菌体生産性やＲＮＡ生産性が高い傾向であることがわかる。
【００２６】
【表６】
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【００２７】
試験例３
サッカロミセス・セレビシエ（「ダイヤイーストＹＳＴ」協和発酵フーズ（株）製）を、予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む試験管で種母培養した。
５００ｍｌ容の三角フラスコに培地を３０ｍｌ仕込み、オートクレーブ殺菌した後、種母培養液を０．３〜１％植菌し、３０℃で約４８時間、３００ｒｐｍで振とう培養した（バッチ培養）。培地組成は、パーム油由来粗グリセリン（ＳＵＭＩ  ＡＳＩＨ社製、輸入販売元中央化成（株）、グリセリン含量８３％）２．４％（グリセリン純分として２．０％相当）、ポリペプトン２％、酵母エキス１％を用いた。
結果を表７に示す。
【００２８】
比較試験例５
試験例３において、粗グリセリンに換えて精製グリセリン（ＭＵＳＩＭ  ＭＡＳ社製、輸入販売元中央化成(株)、グリセリン含量９９．９％）２．０％を用いた以外は試験例３と同様に実施した。
結果を表７に示す。
【００２９】
試験例４
試験例３において、サッカロミセス・セレビシエ（「ダイヤイーストＹＳＴ」協和発酵フーズ（株）製）に代えて、サッカロミセス・セレビシエ（「オリエンタルイースト」オリエンタル酵母工業（株）製）を用いた以外は試験例３と同様に実施した。
結果を表７に示す。
【００３０】
比較試験例６
試験例４において、粗グリセリンに換えて精製グリセリン（ＭＵＳＩＭ  ＭＡＳ社製、輸入販売元中央化成(株)、グリセリン含量９９．９％）２．０％を用いた以外は試験例４と同様に実施した。
結果を表７に示す。
【００３１】
試験例５
試験例３において、サッカロミセス・セレビシエ（「ダイヤイーストＹＳＴ」協和発酵フーズ（株）製）に代えて、サッカロミセス・セレビシエ（「カネカイースト」（株）カネカ製）を用いた以外は試験例３と同様に実施した。
結果を表７に示す。
【００３２】
比較試験例７
試験例５において、粗グリセリンに換えて精製グリセリン（ＭＵＳＩＭ  ＭＡＳ社製、輸入販売元中央化成(株)、グリセリン含量９９．９％）２．０％を用いた以外は試験例５と同様に実施した。
結果を表７に示す。
【００３３】
【表７】
0005366070.tif 000008
【００３４】
表７から、パン酵母であるサッカロミセス・セレビシエ３種類の培養ではいずれも、粗グリセリンの方が精製グリセリンよりも、対グリセリン菌体収率、対液ＲＮＡ生産量、ＲＮＡ含有量が高いことがわかる。
【００３５】
実施例１
キャンディダ・ユティリス  ＡＴＣＣ９２２６を３０ｍｌ容試験管にＹＰＤ培地６ｍｌを入れて滅菌した培地に植菌し、２４℃、２４時間、３００ｒｐｍで振とう培養（試験管振とう機、いわしや製）し、さらに８０ｍｌ容試験管にＹＰＤ培地を１５ｍｌ入れて滅菌した培地３本に前述培養液を０．３ｍｌずつ植菌し、２４℃、２４時間振とう培養した。
合計４５ｍｌの種母を５Ｌ容発酵槽に予め仕込んでおいた培地に植菌し、約２９時間バッチ培養を行った。培地組成の炭素源は試験例１で使用した粗グリセリンを純分として６％になるように添加した。他の培地成分として、リン酸一アンモニウム０．４５１％、硫酸アンモニウム０．２４２％、硫酸マグネシウム０．１２％、塩化カリウム０．２０５％、硫酸鉄２６ｐｐｍ、硫酸マンガン２６ｐｐｍ、硫酸亜鉛２６ｐｐｍ、硫酸銅２．６ｐｐｍを用いた。培養条件は、張り込み液量２Ｌ、ｐＨ４．０（９Ｎ−アンモニア水でｐＨをコントロール）、培養温度２３℃、通気量１ｖｖｍ、攪拌６５０ｒｐｍ、内圧０．０５Ｍｐで行った。培地供給はマイクロチューブポンプ（ＭＰＥ型、ＥＹＥＬＡ製）で連続的に培地を供給し、排出管から同様にマイクロチューブポンプで連続的に培養液を抜き出し、保持液が一定になるようにコントロールした。発酵槽内に残存するグリセリン量は定期的にサンプリングを行い、ＨＰＬＣで分析した。グリセリン濃度がほぼ０．５±０．２ｇ／ｌ前後になるように供給液量をコントロールした。連続培養は３日間行った。
結果を表８に示した。
【００３６】
【表８】
0005366070.tif 000009
【００３７】
比較例１
実施例１において、粗グリセリンの代わりに比較試験例１で使用した精製グリセリンを用いた以外は実施例１と同様に連続培養を行った。
バッチ培養終了時には、対グリセリン菌体収率は５３．３％であったが、連続培養１日目の途中から菌体増殖の阻害が起こり、残存グリセリン濃度が上昇して、連続培養の維持が出来ず、培養を中止した。この時、通液培地には不溶物が発生しており、この影響で何らかの阻害が起きたものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上述べてきた通り、本発明によると、ＢＤＦ製造時に副成する植物油由来のグリセリンを、粗グリセリンの状態で用いることで、着色もなく、グルコースあるいは精製グリセリンを用いたよりも菌体収率あるいはＲＮＡ等の菌体内有用物質の蓄積量も多い、工業的に有利な、連続培養による酵母菌体の製造方法が提供される。