(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基をアリル化する工程とアリル基をオスミウム酸酸化によって水酸基に変換する工程とを繰り返すことによりポリグリセロールデンドリマーを合成し、合成された前記ポリグリセロールデンドリマーを、少なくともアルミナ又は活性炭と接触させ、精製することを特徴とするポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項２】
前記アルミナと接触させてアルミナカラムクロマトグラフィーを行うか、又は、前記活性炭と接触させて活性炭カラムクロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項１記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項３】
前記アルミナと接触させてアルミナカラムクロマトグラフィーを行い、前記アルミナカラムクロマトグラフィーにおける展開溶媒を、水またはメタノールと水の混合溶媒とすることを特徴とする請求項１記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項４】
前記混合溶媒におけるメタノールの含有量を５０体積％以下とすることを特徴とする請求項３記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項５】
前記活性炭と接触させて活性炭カラムクロマトグラフィーを行い、前記活性炭カラムクロマトグラフィーにおける展開溶媒を、メタノールまたは水、あるいはこれらの混合溶媒とすることを特徴とする請求項１記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項６】
合成された前記ポリグリセロールデンドリマーを減圧処理した後、前記アルミナ又は前記活性炭と接触させることを特徴とする請求項１記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【請求項７】
前記減圧処理を、温度６０℃〜１００℃で行うことを特徴とする請求項６記載のポリグリセロールデンドリマーの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オスミウム酸酸化によって合成されたポリグリセロールデンドリマー（以下、ＰＧＤと称する。）の精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デンドリマーとは、ギリシャ語の“dendra”（樹木）を語源とするもので、規則正しく分岐した構造を有する高分子である。前記デンドリマーは、そのユニークな構造から、近年、分子エレクトロニクス、薬物キャリア等、多くの分野において研究が進められている。例えば、アミドアミン（以下、ＰＡＭＡＭと称する。）のデンドリマーが１９８５年にＴｏｍａｌｉａらによって報告され（例えば非特許文献１を参照）、その後、市販されるに至り、非常に多くの研究例が報告されるようになってきている。
【０００３】
近年では、バイオマテリアルとして生体との相互作用や体内動態が検討されるようになってきており、例えば細胞毒性に関する報告がなされている（例えば非特許文献２を参照）。さらには、ＰＡＭＡＭデンドリマー表面を生体適合性の高いポリエチレングリコール(以下、ＰＥＧと称する。)で化学修飾すること（例えば非特許文献３を参照）や、生体適合性を考慮したポリエーテル−エステルデンドリマー（例えば非特許文献４等を参照）が提案されている。
【０００４】
また、デンドリマーではないが、ハイパーブランチ型ポリグリセロール（以下、ＨｙＰＧと称する。）も注目を集めており、その製品化にまで至っている（例えば非特許文献５を参照）。最近ではＨｙＰＧにメタクリル基などの二重結合を導入し、ラジカル重合の原理に基づく３次元架橋する方法が提案され（例えば非特許文献６を参照）、その基礎的物性について検討がなされている。ただし、ＨｙＰＧはその構造が均一ではなく、分子量分布も比較的広いため、医薬品としての応用に鑑みた場合には実用化の点で懸念が残る。
【０００５】
一方、難水溶性薬物の溶解性を改善する技術としては、薬物の結晶微粒子を分散させ、水溶性高分子を噴霧・コーティングする方法（例えば特許文献１を参照）、薬物と流動化剤を混合して水溶性高分子含有水溶液を用いて造粒する方法（例えば特許文献２を参照）、親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロック共重合体を難水溶性薬物とともに有機溶媒中へ溶解し、水中油エマルジョンから有機溶媒を除去したポリマーミセルを形成する方法（例えば特許文献３を参照）、２−メタクリエオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とメタクリル酸n-ブチル（ＢＭＡ）との共重合体水溶液に可溶化させる方法（例えば特許文献４を参照）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、前述の特許文献１〜４に記載される発明では、その大部分が溶液状に難水溶性薬物を可溶化するに留まっており、生体適合性に優れたヒドロゲルを代表とする３次元架橋体のデバイス化によって可溶化からその後の放出制御に至る一連の機能を網羅できる薬物送達システムを実現することは難しいものと考えられる。とりわけ、抗ガン剤の経口投与の実現には、可溶化した抗ガン剤を小腸から効率よく吸収されるために、約２時間程度で放出する制御が必要とされているが、このような制御を特許文献１〜４に記載される発明で実現することは難しい。
【０００７】
このような状況の中、前述のデンドリマーの１種であるＰＧＤの薬物送達システムへの応用についての研究も進められている。ＰＧＤは、Ｈａｇｇらによって初めて合成されたデンドリマーであり、分子量分布が極めて小さく、均一な構造を有するという特徴を有している。既に、世代数３〜５のＰＧＤの合成法が確立され（例えば非特許文献７を参照）、そのナノサイズＰＧ構造によって難水溶性薬物であるパクリタキセル（商品名タキソール）を溶解することが知られている。例えば、ＰＧＤの場合、パクリタキセルの溶解性が製薬業界にて使用されているポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）と比較して著しく向上することが明らかとなっている（例えば非特許文献７、８を参照）。
【非特許文献１】Polym. J., 17, 117 (1985)
【非特許文献２】J. Controlled Release, 65, 133(2000)
【非特許文献３】Bioconjugate Chem., 11, 910(2000)
【非特許文献４】J. Am. Chem.Soc.123, 2905 (2001)
【非特許文献５】J. Am. Chem. Soc., 122, 2954(2000)
【非特許文献６】Biomaterials, 27, 5471 (2006)
【非特許文献７】Bioconjugate Chem., 15, 1221 (2004)
【非特許文献８】J. Controlled Release, 93, 121(2003)
【特許文献１】特開平７−２９１８５４号公報
【特許文献２】特開２００５−８２５０３号公報
【特許文献３】特開２００１−２２６２９４号公報
【特許文献４】特開２００３−１３７８１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、前述のＰＧＤは、例えばトリメチロールプロパン等の第１級水酸基をテトラブチルアンモニウムを触媒としてアリル化する工程と、アリル基をオスミウム酸酸化することによって第１級水酸基あるいは第２級水酸基へと変換する工程とを繰り返し行うことにより合成される。このような合成法により、本願発明者らは世代数４のＰＧＤ−Ｇ４．０や世代数５のＰＧＤ−Ｇ５．０の合成に成功している。
【０００９】
しかしながら、合成したＰＧＤを透析法等により精製しているにも関わらず、アミン臭を呈したり、外観上は黒褐色を呈する等、例えば医用材料として応用展開することを考えると、精製が不十分と言わざるを得ない。そのため、新たな精製法を検討する必要に迫られている。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、合成されたＰＧＤに含まれる不純物を効率的に除去することができ、医用材料等としての利用を可能とするポリグリセロールデンドリマーの精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前述の目的を達成するために、長期に亘り種々の研究を重ねてきた。その結果、ＰＧＤの精製においては、アルミナや活性炭を用いた精製が有効であるとの知見を得るに至った。
【００１２】
本発明のポリグリセロールデンドリマーの精製方法は、水酸基をアリル化する工程とアリル基をオスミウム酸酸化によって水酸基に変換する工程とを繰り返すことによりポリグリセロールデンドリマーを合成し、合成された前記ポリグリセロールデンドリマーを、少なくともアルミナ又は活性炭と接触させ、精製することを特徴とする。本発明は、前記アルミナと接触させてアルミナカラムクロマトグラフィーを行うか、又は、前記活性炭と接触させて活性炭カラムクロマトグラフィーを行うことを特徴とする。本発明は、前記アルミナと接触させてアルミナカラムクロマトグラフィーを行い、前記アルミナカラムクロマトグラフィーにおける展開溶媒を、水またはメタノールと水の混合溶媒とすることを特徴とする。本発明は、前記混合溶媒におけるメタノールの含有量を５０体積％以下とすることを特徴とする。本発明は、前記活性炭と接触させて活性炭カラムクロマトグラフィーを行い、前記活性炭カラムクロマトグラフィーにおける展開溶媒を、メタノールまたは水、あるいはこれらの混合溶媒とすることを特徴とする。本発明は、合成された前記ポリグリセロールデンドリマーを減圧処理した後、前記アルミナ又は前記活性炭と接触させることを特徴とする。本発明は、前記減圧処理を、温度６０℃〜１００℃で行うことを特徴とする。
【００１３】
ＰＧＤをアリル基のオスミウム酸酸化によって合成すると、アミン臭が残ったり、生成物が黒褐色を呈する等、医用材料等として応用するには問題がある。これに対して、合成後のＰＧＤをアルミナや活性炭に接触させると、不純物が効率的に吸着除去され、アミン臭が消失するとともに、着色も大幅に低減される。また、精製後のＰＧＤは、細胞のコロニー形成を阻害する細胞毒性作用がなく、実験動物に対する毒性もないことが確認されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、合成したポリグリセロールデンドリマーに含まれる不純物を効率的に除去することができ、純度の高いポリグリセロールデンドリマーを得ることが可能である。また、アミン臭が消失され着色も大幅に低減されるので、医用材料等に適したポリグリセロールデンドリマーを得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を適用したポリグリセロールデンドリマーの精製方法について説明する。
【００１６】
精製対象となるポリグリセロールデンドリマーの合成方法としては、水酸基をアリル化する工程と、アリル基をオスミウム酸酸化によって水酸基に変換する工程とを繰り返し行う方法を挙げることができる。
【００１７】
前記合成方法では、例えばトリメチロールプロパン等の第１級水酸基をテトラブチルアンモニウムを触媒としてアリル化する。テトラブチルアンモニウムを有機相と水相との相移動溶媒として用いることにより、デンドリマーのような高密度の水酸基の全てをアリル化することが可能である。
【００１８】
その後、例えばシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、オスミウム酸酸化によって第１級水酸基及び第２級水酸基へと変換する。第３級アミンの存在下でのアリル基のオスミウム酸酸化によって、９５％以上の反応率でグリコールに酸化可能である。これらの工程を繰り返すことによって、順次、高世代の（分岐数の大きい）ＰＧＤを合成することが可能である。
【００１９】
合成されるＰＧＤの具体的に例示するならば、化１に示す第３世代（デンドロン部分の分岐数３）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ３）、化２に示す第４世代（デンドロン部分の分岐数４）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ４）、化３に示す第５世代（デンドロン部分の分岐数５）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ５）等を挙げることができる。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
【化２】
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【００２２】
【化３】
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【００２３】
以上の合成方法により合成されたＰＧＤは、アミン臭があり、黒褐色を呈する。オスミウム酸酸化後には、触媒として機能したアミンやオスミウム酸（ＯｓＯ４）等が残存しているものと考えられ、これら不純物の存在が精製度を低下する要因となっているものと考えられる。
【００２４】
そこで、本願発明者は、これまでに確立されているＰＧＤ合成と核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル解析による構造解析を行い、得られたＰＧＤの精製として、従来の透析法ではなく、アルミナや活性炭を用いた精製を行い、ＰＧＤの精製法としての妥当性について検討した。その結果、合成された合成物をアルミナや活性炭と接触させることにより、従来の透析法に比べて精製度を向上することができ、例えば医用材料として応用展開する上でも十分な精製度を達成できるとの結論を得るに至った。以下、合成されたＰＧＤのアルミナ及び活性炭による精製方法について説明する。
【００２５】
先ず、アルミナ及び活性炭のいずれを用いて精製する場合にも、精製に先立って合成した生成物（ポリグリセロールデンドリマー）を減圧処理した後、前記精製を行うことが好ましい。この場合、減圧処理としては、エバポレータを用いて残存する溶媒を除去した後、生成物に例えばアセトンや精製水を加えて混合し、減圧乾燥する。減圧乾燥に際しては、例えばエバポレータを用いてアセトンや精製水等を除去した後、容器を真空トラップを介して真空ポンプに接続し、気泡が発生しなくなるまで減圧乾燥を行う。前記減圧乾燥に際しては、温度を６０℃〜１００℃に設定することが好ましい。
【００２６】
合成後の生成物には触媒として用いたオスミウム酸等が残存している。ここで、前記オスミウム酸は、その沸点が１３０℃であるため、前記温度での減圧乾燥を行うことにより、ある程度除去されるものと考えられる。
【００２７】
前記減圧処理の後、アルミナあるいは活性炭による接触処理を行う。例えばアルミナの場合、アルミナカラムクロマトグラフィーを行えばよい。アルミナカラムクロマトグラフィーは、所定の粒径のアルミナをカラムに充填し、展開溶媒に溶解した合成生成物を通液すればよい。用いるアルミナの粒径等は任意である。また、アルミナの種類も任意である。アルミナには種々のタイプがあるが、アルミナカラムとして、例えば酸化アルミニウム活性型酸性カラム、酸化アルミニウム活性型中性カラム、酸化アルミニウム活性型塩基性カラムのいずれかを使用することが可能である。
【００２８】
アルミナカラムクロマトグラフィーにおける展開溶媒としては、前記合成後の生成物を溶解し得るも溶媒が用いられ、例えば水（精製水）や水とメタノールの混合溶媒等が好適である。なお、水とメタノールの混合溶媒を用いる場合、メタノールの含有量が多くなるとＰＧＤの回収率が急激に低下することから、前記混合溶媒におけるメタノールの含有量を５０体積％以下とすることが好ましい。
【００２９】
アルミナによる接触処理としては、前記アルミナカラムクロマトグラフィーの他、バッチ式の処理も可能である。バッチ式の処理の場合、例えばアルミナを容器（フラスコ等）に入れ、ここに溶媒に溶解した合成生成物を加えて撹拌すれば良い。ただし、処理の効率を考えると、前記アルミナカラムクロマトグラフィーを採用することが好ましい。
【００３０】
活性炭を用いる場合にも、活性炭カラムクロマトグラフィーにより処理することも可能であるし、バッチ式により処理することも可能である。ただし、活性炭の場合、溶媒よりも軽くカラム内に安定して充填することが困難であることから、バッチ方式を採用することが好ましい。
【００３１】
前記活性炭を用いた場合の展開溶媒としては、水やメタノール、あるいはこれらの混合溶媒等を挙げることができる。さらには、精製水で処理した後、メタノールで洗浄することも可能である。これにより不純物の除去率を向上することが可能である。
【００３２】
ＰＧＤ合成生成物を精製する方法としては、前記アルミナによる接触処理と、活性炭による接触処理とを、それぞれ単独で行ってもよいし、組み合わせて行ってもよい。例えば、活性炭を用いたバッチ処理の後、アルミナカラムクロマトグラフィーを行ったり、逆に、アルミナカラムクロマトグラフィーの後、活性炭との接触処理を行うことも可能である。これら複合処理を行うことにより、精製度をより一層向上することが可能である。
【００３３】
以上説明したように、オスミウム酸酸化により合成したＰＧＤ合成生成物を、アルミナあるいは活性炭を用いて接触処理（例えばカラムクロマトグラフィー）を行うことにより、生成物に含まれる不純物を効率的に除去し、精製度を大幅に向上することが可能である。その結果、アミン臭がなく透明性に優れたＰＧＤを得ることが可能である。精製されたＰＧＤは、毒性もなく、医用材料として応用展開することが可能である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実際に行った実験結果を基に説明する。
【００３５】
使用した試薬類について
以下の実験で使用した試薬及び溶媒は、下記の通りである。
（１）トリス（ヒドロキシル）プロパン（Ｍｗ＝１３４．４８：和光純薬社製）
（２）テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）（Ｍｗ＝３２２．３７：和光純薬社製）
（３）５０ｗｔ％  ＮａＯＨ水溶液  （シグマ・アルドリッチ・ジャパン社製）
（４）塩化アリル（Ａｌｌｙｌ  ｃｈｏｒｉｄｅ）９８％（Ｍｗ＝７６．５２，ｄ＝０．９３２ｇ／ｍｌ）（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
（５）トルエン（脱水）（ナカライテスク社製）
（６）シリカゲル（メッシュサイズ７０−２３０ｎｍ，シグマ−アルドリッチ社製）
（７）硫酸マグネシウム（無水）（１２０．３７：関東化学社製）
（８）メタノール（Ｍｗ＝３２．０４：ナカライテスク社製）
（９）石油エーテル（ナカライテスク社製）
（１０）Ｎ−メチルモルフォリン−Ｎオキシド（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ  Ｎ−ｏｘｉｄｅ）（Ｍｗ＝１１７．１５：アルドリッチ社製）
（１１）Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（Ｍｗ＝７４．１２：ナカライテスク社製）
（１２）アセトン（Ｍｗ＝５８．０８：ナカライテスク社製）
（１３）４％オスミウム酸溶液（ＯｓＯ４）（Ｍｗ＝２５４．２３：和光純薬社製）
（１４）純水
【００３６】
実験１．ＰＧＤ−Ｇ１．０の合成及びアルミナカラムクロマトグラフィーによる精製
本実験例では、第１世代（デンドロン部分の分岐数１）のＰＧＤ（ＰＧＤ−Ｇ１．０）を合成し、その精製方法について検討した。ＰＧＤ−Ｇ１．０の合成方法は下記の通りである。
【００３７】
（ＰＧＤ−Ｇ０．５の合成）
先ず、ＰＧＤ−Ｇ０．５の合成を行った。反応式は化４に示す通りである。
【００３８】
【化４】
0005366168.tif 000005
【００３９】
トリス（ヒドロキシル）プロパン４．４７ｇ（０．０３３ｍｏｌ：水酸基として０．１ｍｏｌ）とＴＢＡＢ３．２２ｇ（０．０１ｍｏｌ）を三口フラスコに入れ、オイルバスの温度を４８℃に設定し、撹拌しながら少しずつ５０ｗｔ％ＮａＯＨ水溶液を４０ｍｌ注いだ。その後、４秒に１滴ずつ塩化アリル５０ｍｌ程度滴下した。塩化アリル５０ｍｌ（０．６１ｍｏｌ）を滴下後、トルエン１００ｍｌを反応懸濁液に入れ、さらに撹拌し続けた。撹拌後、二層に分離されたので、透明な上層のみを三角フラスコに回収した（下層は白濁した５０ｗｔ％ＮａＯＨ水溶液）。回収したトルエン溶液中に硫酸マグネシウムを約大さじ４杯を入れ、窒素を封入後、ゴム栓でキャップし、室温暗所にて一晩放置した。
【００４０】
三角フラスコ中の溶液をろ過し、なすフラスコに回収した。さらに全て入れ終わった三角フラスコに少量のトルエンを入れ、洗浄後、同様にしてろ過し、同じなすフラスコにろ液を回収した。これを三回繰り返した。回収したろ液から、エバポレーターを用いてトルエンを除去し、透明かつ液体の反応混合物を得た。この間に、１０００ｍｌシリンダーにメタノール５０ｍｌと石油エーテル４５０ｍｌを入れ、よく混合した（メタノール：石油エーテル＝１：９）。
【００４１】
ビーカーに粉末シリカゲルと上記で示した通りに調整した混合溶液を加えスラリー状とした。このとき、多量の気泡が発生するが、これは、さじ等を使ってできる限り取り除いた。スラリー状のシリカゲルをカラムに充填した。充填後、直ちに同様の溶媒（１：９）を流し、平衡化した。その後、フラスコ中の反応物をピペットを用いて静かにシリカゲルカラムの上部へ注入し、溶媒を展開した。１：９の混合溶媒を５０ｍｌ流した後、メタノールと石油エーテルの割合を１：１とした混合溶媒に取り替えカラムに注いだ。このとき、５０ｍｌ毎に新しいビーカーに回収した。
【００４２】
各ビーカーに回収した溶液をなすフラスコに入れ、エバポレーターを用いて溶媒を除去した。このとき、予め、なすフラスコの重量を測っておいた。各フラスコに回収していた液体の重量を測定し、この液体の構造解析として、１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った［ＮＭＲ装置：４００ＭＨｚＦＴ−ＮＭＲ（ＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ  ＰＬＵＳ  ４００，Ｂｕｒｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）］。このとき、ＮＭＲサンプルチューブへ約４ｃｍの高さとなるように重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を入れ、液体の方は、ミクロスパーテル一杯程度とした。１Ｈ−ＮＭＲ測定結果は下記の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝５．８５（ｍ，３Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２），５．１４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２），３．９３（ｄ，６Ｈ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２），３．３２（ｓ，６Ｈ，Ｃ（ＣＨ２）３），１．４４（ｑ，２Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２），０．８５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４３】
１Ｈ−ＮＭＲ測定結果より、目的とするＰＧＤ−Ｇ０．５に起因する全ての化学シフト値の存在を確認した。特にアリル基由来の化学シフト［５．８５ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ２）５．１４ｐｐｍ（ＣＨ＝ＣＨ２）、３．９３ｐｐｍ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）］が確認できたことは、回収した化合物にアリル基が導入されたことを示している。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値は、１分子中のプロトン数と比例するため、定量的に合成の確認の判断となる。そこで積分値を見たところ、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより５．８５ｐｐｍのＣＨ＝ＣＨ２が２．９であったことから、１分子中３Ｈであることをを確認できた。また、５．１４ｐｐｍのＣＨ＝ＣＨ２が５．７であったことからほぼ６Ｈを確認できた。さらに、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２が５．９であったことから、ほぼ６Ｈであった。これらのことから、ＰＧＤ−Ｇ０．５の理論値に近い値を得られたので、合成は成功したことが証明された。
【００４４】
（ＰＧＤ−１．０の合成）
前記ＰＧＤ−０．５を用いてＰＧＤ−１．０を合成した。反応式は化５に示す通りである。
【００４５】
【化５】
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【００４６】
精製したＰＧＤ−Ｇ０．５（４．５９ｇ）（Ｍｗ＝２６０、０．０１７４ｍｏｌ、アリル基０．０５２２ｍｏｌ）を予め重量測定した２００ｍｌなすフラスコに入れ、ＮＭＯ６．７３ｇ（０．０５７４ｍｏｌ）、アセトン２６ｍｌ、精製水２６ｍｌ、及びｔｅｒｔ−ブタノール（イソプロパノール）４．７５ｍｌを入れ、よく混合した。ここに４ｗｔ％ＯｓＯ４０．９５ｍｌをメスピペットを用いてゆっくり溶液に入れ、一晩撹拌し続けた。その後、エバポレーター（温度５０℃）を用いて、アセトン、水等を除去し、さらに続けて、気泡が発生しなくなるまで減圧乾燥した。ここで減圧乾燥は、反応物の入ったナスフラスコを、真空トラップを介して直接真空ポンプに接続し、オイルバス（温度約８０℃）に浸して行った。
【００４７】
回収した液体の重量を測定し、この液体の構造解析として１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った（ＮＭＲ装置：４００ＭＨｚＦＴ−ＮＭＲ（ＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ  ＰＬＵＳ  ４００，  Ｂｕｒｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。このとき、ＮＭＲサンプルチューブへ約４ｃｍの重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を入れ、試料の重量は、ミクロスパーテル一杯程度とした。１Ｈ−ＮＭＲ測定結果は下記の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ＝４．８７（ｓ，ＯＨ），３．７５（ｍ，３Ｈ，ＣＨＯＨ），３．５８−３．４１（ｍ，１２Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ，Ｃ（ＣＨ２）３），１．４４（ｑ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），０．８９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ測定結果より、目的とするＰＧＤ−Ｇ１．０に起因する化学シフト値の存在を確認した。特に、グリセロール由来の化学シフト［４．８７ｐｐｍ（ＯＨ）、３．７５ｐｐｍ（ＣＨＯＨ）］が確認できたことは、回収した化合物に水酸基が導入されたことを示している。さらに、ＰＧＤ−Ｇ０．５で観察されたアリル基のピークが消失していたので、オスミウム酸酸化が確かに進行していたことを示している。
【００４９】
また、重メタノールを溶媒にした場合、水酸基のピークが４．８−４．９ｐｐｍ付近に検出されることが経験則から知られている。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて４．８７ｐｐｍに確認されたことから、水酸基が導入されたことが考えられる。積分値を見たところ、３．７５ｐｐｍのＣＨＯＨが３．００であったことから、３Ｈを確認することができた。すなわち、１分子中にＣＨＯＨが３つ導入されていることを示しており、このことから明らかにＰＧＤ−Ｇ１．０である。
【００５０】
（ＰＧＤ−Ｇ１．０精製法の検討）
得られたＰＧＤ−Ｇ１．０を４つのサンプルに分け、それぞれのサンプルの重量を測定した（カラム前重量）。その上で、各サンプル１ｇ当り１０ｍｌの水、メタノール、もしくはこれらの混合溶媒（それぞれの組成は表１に示した通り）に溶解した。そして、これら溶液１０μｌをマイクロピペットを用いてとり、１ｍｌの各溶媒に希釈し（１００倍希釈）、１９０ｎｍ−５００ｎｍの紫外・可視スペクトルを測定した（紫外・可視分光装置：Ｊａｓｃｏ  Ｖ−５５０）。
【００５１】
上記各サンプル溶液を一晩室温にて放置し（なすフラスコ中、パラフィルムにて封印）、アルミナカラムに各サンプル溶液と同様の組成の展開溶媒を用いて通した。得られた溶液をエバポレータにて減圧濃縮し、その後、凍結乾燥した。乾燥後、各サンプルの重量を測定した（カラム後重量）。その上で、カラム精製前と同様に、紫外・可視スペクトルを測定した。
【００５２】
表１にＰＧＤ−Ｇ１．０のカラム精製前後の重量及び収率を示した。このとき収率は以下の式から算出した。
収率（％）＝［カラム精製後に得られたＰＧＤ−Ｇ１．０の重量（ｇ）／カラム精製前のＰＧＤ−Ｇ１．０の重量（ｇ）］×１００
【００５３】
【表１】
0005366168.tif 000007
【００５４】
Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨが１：１及び１：０の時、収率は８０％以上であったが、０：１及び１：２の時はそれぞれ２９％、あるいは５６％であった。すなわち、ＭｅＯＨの割合が高い場合、回収率は６０％を下回った。このことから、ＰＧＤのＭｅＯＨに対する溶解性が水よりも低いとも予想されるが、定性的にはＭｅＯＨ、水ともに溶解したことから、これら２つの溶媒への溶解性の違いについては判断し難い。しかしながら、水とＭｅＯＨでは回収率に極端な差があったので、その原因を考察することとした。
【００５５】
先ず、回収率とＭｅＯＨ濃度の関係を図１に示した。図１より、ＭｅＯＨの割合が０から５０％までの間では、回収率は８４％〜８８％にまで少しずつ上昇したが、５０％を超えると回収率が極端に減少していることが見受けられた。
【００５６】
この理由として考えられる要因の一つとして、次のような事項を挙げることができる。すなわち、アルミナカラム精製において、何らかの赤褐色不純物が吸着されていたので、不純物とアルミナの間には、何らかの分子間相互作用が働き、これにより不純物が取り除かれＰＧＤが回収されたものと考えられる。したがって、ＭｅＯＨ含有量の増大によって回収率が低下したことは、不純物のみならず、デンドリマーも吸着されたものと考えられる。
【００５７】
ここで、それぞれの分子間相互作用の強さを考えてみた。水が１００％の場合、ＰＧＤとアルミナとの分子間相互作用が低く、結果的に８４％であった。さらに、ＭｅＯＨを５０％（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：１）とすると、収率は８８％であったため、５０％のＭｅＯＨは、ＰＧＤとアルミナとの相互作用には、影響を与えていなく、むしろＰＧＤを溶出し易くしているものと考えられる。さらに、ＭｅＯＨ含有量を増大させて５０％以上とすると、回収率が６０％を下回ったことから、アルミナとデンドリマーの分子間相互作用がＭｅＯＨによって増強されていると考えられる。このためアルミナカラム内にＰＧＤが残存していることが考えられる。以上のことから、回収率の観点からすると、アルミナカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：１のときが最適と考えられる。
【００５８】
しかしながら、回収率のみでは不純物の除去を定量的に判断できないため、表１の各サンプル溶液をＵＶ／ＶＩＳスペクトル測定し、精製度の定量化が可能かどうか検討した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルの結果を図２〜図５に示す。なお、図２〜図５において、線ａは精製前のＵＶ／ＶＩＳスペクトル、線ｂは精製後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【００５９】
図２を例にとると、精製前には２１６．５ｎｍ（ピーク１）及び２７２．５ｎｍ（ピーク２）の二つのピークが確認された。しかし、精製後には、これら二つのピークが減少し、特に２７２．５ｎｍのピークは、消失する傾向にあった。このような傾向は、他のサンプルでも同様であった（図３〜図５）。そこで、これら精製前の二つのピークが不純物に由来しているものと仮定し、それぞれのピーク値から、精製率を以下の式に基づいて算出した。算出結果について、表２〜表５に示す。
精製率（％）＝［１−｛Ａｂｓ（精製後）／Ａｂｓ（精製前）｝］×１００
【００６０】
【表２】
0005366168.tif 000008
【００６１】
【表３】
0005366168.tif 000009
【００６２】
【表４】
0005366168.tif 000010
【００６３】
【表５】
0005366168.tif 000011
【００６４】
ここで、精製度の指標として、これらのピークが適切かどうかを考察した。具体的にはピーク１とピーク２のどちらを基準にするかについて考えた。表２〜表５の結果から、ピーク２から算出した精製度は、いずれも９０％以上であった。この結果を踏まえると、精製後の回収デンドリマーにおいても見られた薄い赤褐色は、ピーク２によるものとは考えにくい。オスミウム酸酸化後は、触媒として機能したＮＭＯとＯｓＯ４が残存していると考えられるので（ＰＧＤの水酸基は水由来である）、アルミナカラムに黒色の不純物が吸着されていることを考慮すると、ＯｓＯ４に由来するピークがピーク２であると推察される。一方で、ピーク１について見ると、サンプル１（表２）では７９％であったのに対し、サンプル４（表４）においては５４％であり、しかも赤褐色がサンプル２よりも濃く、光の透過を目視で確認することが難しいレベルであった。これらのことから、精製度に深く関係しているのは、ピーク２では無く、ピーク１であるとする方が適切であると推測される。従って、精製度の良否はピーク１を基準として定めることにした。
【００６５】
ピーク１を指標とした場合、最も精製度が高かったサンプルは、サンプル１（表２）であることから、アルミナカラム精製に最も適した溶媒は、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨの割合が１：１のときであると判断した。
【００６６】
以上のことを総合して考えると、ＰＧＤ−Ｇ１．０の精製においては、回収率、精製度の両方におけるデータより、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨの割合が１：１であるときが最適であることが判明した。
【００６７】
実験２．ＰＧＤ−Ｇ３．０の合成及びアルミナカラムクロマトグラフィーによる精製
（ＰＧＤ−Ｇ３．０の合成）
本実験例では、第３世代（デンドロン部分の分岐数３）のＰＧＤ（ＰＧＤ−Ｇ３．０）を合成し、その精製方法について検討した。
【００６８】
ＰＧＤ−Ｇ３．０は、ＰＧＤ−Ｇ１．０を原料に、実験１と同様の過程を繰り返し、ＰＧＤ−Ｇ１．０→ＰＧＤ−Ｇ１．５→ＰＧＤ−Ｇ２．０→ＰＧＤ−Ｇ２．５→ＰＧＤ−Ｇ３．０の順に合成した。各過程の反応式は化６〜化９に示す通りである。
【００６９】
【化６】
0005366168.tif 000012
【００７０】
【化７】
0005366168.tif 000013
【００７１】
【化８】
0005366168.tif 000014
【００７２】
【化９】
0005366168.tif 000015
【００７３】
合成したＰＧＤ−Ｇ３．０の１Ｈ−ＮＭＲ測定結果は下記の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ＝４．８７（ｓ，ＯＨ），３．７７−３．４９（ｍ，１０５ＯＨ），３．３４（ｓ，６Ｈ，Ｃ（ＣＨ２）３），１．４３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），０．８９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）
【００７４】
１Ｈ−ＮＭＲ測定により目的とするＧ３．０に起因する化学シフト値の存在を確認した。特に、水酸基由来の化学シフト［４．８７ｐｐｍ（ＯＨ）］が確認できたことは、回収した化合物に水酸基が導入されたことを示している。また、アリル基のピークが消失しており、水酸基に起因するシフトが４．８７ｐｐｍに確認されたことから、水酸基が導入されたことが証明された。また、積分値を見たところ、３．３４ｐｐｍのＣ（ＣＨ２）３が、６．４０であり、理論値から０．４０ズレてはいるが、６Ｈを確認することができた。以上のことから、合成された物質は明らかにＰＧＤ−Ｇ３．０であると言える。
【００７５】
（ＰＧＤ−Ｇ３．０精製法の検討）
ＰＧＤ−Ｇ１．０の場合と同様に、ＰＧＤ−Ｇ３．０を５つのサンプルに分け、それぞれのサンプルの重量を測定した（カラム前重量）。その上で、各サンプル１ｇ当り１０ｍｌの水、メタノール、もしくはこれらの混合溶媒（それぞれの組成は表６に示した通り）に溶解した。その後のアルミナカラム精製、紫外・可視スペクトル測定は、ＰＧＤ−Ｇ１．０の場合と同様である。表６にＰＧＤ−Ｇ３．０のカラム精製前後の重量及び収率を示した。
【００７６】
【表６】
0005366168.tif 000016
【００７７】
Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：０の時、回収率は７６％であったが、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：１、１：２、２：１の時はそれぞれ５９％、３８％、４８％であった。またＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝０：１においては、１．８％であった。回収率とＭｅＯＨ濃度の関係を図６に示した。ＭｅＯＨ含有率の増大に伴って、回収率が低下する傾向にあった。このことから、ＰＧＤ−Ｇ３．０のＭｅＯＨに対する溶解性が水よりも低いとも予想されるが、定性的にはＭｅＯＨ、水ともに溶解したことから、これら２つの溶媒への溶解性の違いについては判断し難い。しかしながら、水とＭｅＯＨでは回収率に極端な差があったので、その原因を考察することとした。
【００７８】
回収率とＭｅＯＨ濃度の関係を図６に示した。図６より、ＭｅＯＨの割合が０から３３．３％までの間では、回収率は７６％〜４８％に減少しているが、３３．３％から５０％の間では、４８％〜５９％と少し上昇した。さらに、５０％を超えてからは、回収率が極端に減少していることが見受けられたＰＧＤ−Ｇ１．０の場合と同様に、アルミナカラムに何らかの黒褐色の不純物が吸着されていたので、ＯｓＯ４と思われる不純物が取り除かれたＰＧＤ−Ｇ３．０が回収されたと考えられる。したがって、ＭｅＯＨ含有量の増大によって回収率が低下したことは、不純物のみならず、ＰＧＤ−Ｇ３．０も吸着されたことによるものと考えられる。
【００７９】
ここで、それぞれの混合溶媒について分子間相互作用の強さを考えてみた。水が１００％の場合、デンドリマーとアルミナとの分子間相互作用が弱く、結果的に７６％であった。さらに、ＭｅＯＨを３３．３％（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝２：１）とすると、回収率は４８％であったため、水が１００％のときより回収率が落ちていることから、ＭｅＯＨによってアルミナとＰＧＤ−Ｇ３．０の分子間相互作用が増強されていると考えられる。また、ＭｅＯＨを５０％（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：１）にすると回収率は、５９％に上がった。これは、何らかの影響で一時的に分子間相互作用が弱まったことによるものと考えられるが、単なる誤差とも受け取ることができる。ＭｅＯＨ含有量を増大させ５０％以上とすると、回収率が段階的に減少し、６６．６％の時には回収率が３８％、１００％のときでは１．８％であった。
【００８０】
以上のことから、回収率の観点からすると、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨが１：０のときが最適と考えられる。ただ、この結果は、ＰＧＤ−Ｇ１．０の時とは異なるものである。先ず、一番の大きな違いは、ＭｅＯＨによる回収率の差である。ＰＧＤ−Ｇ１．０の時には２９％回収できていたものが、ＰＧＤ−Ｇ３．０では僅か１．８％にまで減少した。これから推測されることは、ＰＧＤ−Ｇ３．０では、デンドリマーの性質が変化し、ＰＧＤ−Ｇ１．０と比較して、アルミナとデンドリマーの分子間相互作用がＭｅＯＨによって増強されていると考えられ、これにより回収率が下がったものと考えられる。
【００８１】
しかしながら、回収率のみでは不純物の除去を定量的に判断できないため、表６の各サンプル溶液をＵＶ／ＶＩＳスペクトル測定し、精製度の定量化が可能かどうか検討した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルの結果を図７〜図１０に示す。なお、サンプル６については、回収率が低く、解析に必要十分量が得られなかったため、解析を行わなかった。
【００８２】
図７（サンプル５）を例にとると、精製前には２０３ｎｍ付近にピーク（ピーク１）が確認された。これに対して、精製後にはピークが減少していることがわかる。そこで、ＰＧＤ−Ｇ１．０において定めた通り、精製前の一番高いピーク値を用い、精製率を以下の式から算出した。算出結果について、表７〜表１０に示す。
精製率（％）＝［１−｛Ａｂｓ（精製後）／Ａｂｓ（精製前）｝］×１００
【００８３】
【表７】
0005366168.tif 000017
【００８４】
【表８】
0005366168.tif 000018
【００８５】
【表９】
0005366168.tif 000019
【００８６】
【表１０】
0005366168.tif 000020
【００８７】
表７〜表１０を見ると、ＭｅＯＨの割合が５０％以上であると、精製率が６０％を超えている。これに対して、ＭｅＯＨの割合が５０％以下であると、５０％を下回っている。このことから、不純物を取り除く場合には、ＭｅＯＨの割合を増やすことで精製率を向上することができるものと推測される。しかしながら、この場合においても７０％を超える精製率は得られていない。ＰＧＤ−Ｇ１．０の精製においては、８０％近くの精製率を得られることができていることを考えると、ＰＧＤ−Ｇ１．０とＰＧＤ−Ｇ３．０のデンドリマーは、全く性質の異なった物質であると考えられる。これらのことから、回収率を重視した場合は、溶媒は蒸留水のみが妥当であると考えられる。
【００８８】
ＰＧＤ精製後に含有されているオスミウム酸は、沸点が１３０℃であるため、減圧乾燥を高温で行うことにより除去できるものと考えられる。したがって、長時間減圧乾燥を行うことで、ＰＧＤから発するアミン臭が無くなることが期待されたが、実際には、アルミナカラム精製後にアミン臭が消失していた。したがって、アルミナカラムによるＰＧＤの精製は、オスミウム酸の精製に有効であると考えられる。
【００８９】
実験３．種々のタイプのアルミナカラムを用いたＰＧＤ−Ｇ１．０精製の検討
ＰＧＤ−Ｇ１．０（６３ｍｇ）に水とメタノール（１：１）の混合溶媒６３０ｍｌを加え、１ｗｔ％の溶液を調製した。そして、これら溶液について１９０ｎｍ−５００ｎｍの紫外・可視スペクトルを測定した（紫外・可視分光装置：Ｊａｓｃｏ  Ｖ−５５０）。その後、２１０ｍｌずつに３等分し、これら溶液を酸化アルミニウム活性型酸性カラム、酸化アルミニウム活性型中性カラム、酸化アルミニウム活性型塩基性性カラムにそれぞれ通液した。得られた溶液をエバポレータにて減圧濃縮し、その後、凍結乾燥した。乾燥後、各サンプルの重量を測定した（カラム後重量）。その上で、カラム精製前と同様に、紫外・可視スペクトルを測定した。
【００９０】
カラム精製前後における溶液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを図１１に示した。図１１から明らかなように、酸化アルミニウム活性型酸性カラムを通すと、大幅に強度が減少した。この吸収極大は、溶液中に混入しているＮ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシド（ＮＭＯ）である可能性が強いことから、プロトン化されたアルミナとＮＭＯ中の酸素原子上の不対電子対が静電的相互作用している可能性が考えられる。表１１に、２０４nm及び２７０nmの吸収極大から算出した精製率及び収率を示した。
【００９１】
【表１１】
0005366168.tif 000021
【００９２】
実験４．活性炭を用いたＰＧＤ−Ｇ１．０精製の検討
ＰＧＤ−Ｇ１．０（１．６２ｇ）にＭｅＯＨを加えて最終的に５０ｗｔ％となるようにした。この溶液について１９０ｎｍ−５００ｎｍの紫外・可視スペクトルを測定した（紫外・可視分光装置：Ｊａｓｃｏ  Ｖ−５５０）。この溶液に適当量の活性炭を加えて一晩撹拌後、ろ過し、得られたろ液を回収した。回収した溶液をエバポレータにて減圧濃縮し、その後、凍結乾燥した。乾燥後、各サンプルの重量を測定した（精製後重量）。その上で、精製前と同様に、紫外・可視スペクトルを測定した。同様にして、精製水を用いて活性炭処理し［ＰＧＤ−Ｇ１．０（１．７４ｇ）を使用］、精製水でろ過後、さらにＭｅＯＨでろ過を行い、活性炭を用いた精製における溶媒の違いについて検討した。
【００９３】
（溶媒としてＭｅＯＨを用いた場合）
活性炭を用いた精製により、１．０９ｇのＰＧＤ−Ｇ１．０が得られた。これから、回収率は６７％と算出された。カラム精製前後における溶液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを図１２に示す。図１２から、精製前には２１０ｎｍ及び２６６．５ｎｍの二つのピークが確認された。しかしながら、精製後には、これら二つのピークが減少し、特に２６６．５ｎｍのピークは消失する傾向にあった。そこで、これら精製前の二つのピークが不純物に由来しているものと仮定し、それぞれのピーク値から精製率を算出した。算出結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】
0005366168.tif 000022
【００９５】
（精製水を用いて処理した後、ＭｅＯＨで洗浄した場合）
活性炭を用いた精製により、０．５０ｇのＰＧＤ−Ｇ１．０が得られた。これから、回収率は２９％と算出された。精製前後における溶液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを図１３に示す。図１３から、精製前には２１０ｎｍ及び２６６．５ｎｍの二つのピークが確認された。しかしながら、精製後には、これら二つのピークが減少し、特に２６６．５ｎｍのピークは消失する傾向にあった。そこで、これら精製前の二つのピークが不純物に由来しているものと仮定し、それぞれのピーク値から精製率を同様に算出した。算出結果を表１３に示す。
【００９６】
【表１３】
0005366168.tif 000023
【００９７】
（検討結果）
以上のスペクトルの吸収極大値の強度を縦軸に、使用した溶媒を横軸にして、活性炭処理前後の強度変化を棒グラフにした（図１４）。ＮＭＯ由来と考えられている２００ｎｍ−２１０ｎｍの吸収ピーク強度からは、明らかに精製水に溶解後、メタノール溶出する方が除去率が高かった。オスミウム酸由来と考えられる２６６．５ｎｍのピーク強度においても同様であった。これらのことは、ＮＭＯやオスミウム酸は水への溶解性が高く、活性炭へは吸着されないためであると考えられる。そして、その後のＭｅＯＨによる活性炭からのＰＧＤ−Ｇ１．０の溶出によって、精製率が１００％近くなったものと推察される。しかしながら、完全に近かった精製率であったにも関わらず、回収率は２９％と低かった。このことは、ＭｅＯＨによる溶出が不十分であったか、もしくは、最初の精製水による洗浄操作によってＰＧＤ−Ｇ１．０が既に不純物と一緒に溶出されていた可能性も考えられる。
【００９８】
実験５．精製したＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０を用いた細胞毒性試験
アルミナカラムで精製したＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の安全性を調べるため、チャイニーズ・ハムスター肺由来のＶ７９細胞を用いるコロニー形成法による細胞毒性試験を実施した。ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の精製は、実験２に準じてアルミナカラムを用いて行い、展開溶媒は水とした。
【００９９】
なお、本試験は、「医療用具の製造（輸入）承認申請に必要な生物学的安全性試験の基本的考え方について」（平成15年2月13日、医薬審発第0213001号）、「Biological Evaluation of Medical Devices - Part 1: Evaluation and Testing」（ISO 10993-1,August 1, 2003）、「生物学的安全性試験の基本的考え方に関する参考資料について」（平成15年3月19日、医療機器審査No. 36、以下、医療機器審査No. 36と記す）および「Biological Evaluation of Medical Devices - Part 5: Tests for In Vitro Cytotoxicity」（ISO 10993-5, May 15, 1999）に準拠して実施した。
【０１００】
（被験物質）
被験物質であるＰＧＤ−Ｇ３．０（成分：ポリグリセロールデンドリマー  第３世代、分子量：１，６９０、純度：９５％以上）及びＰＧＤ−Ｇ４．０（成分：ポリグリセロールデンドリマー  第４世代、分子量：３，５００、純度：９５％以上）は、いずれも若干褐色、水あめ状の粘性体であり、使用時まで室温にて保管した。
【０１０１】
（陽性対照物質）
細胞の感度および実験条件の精度を確認するためＺＤＢＣ（zinc di-n-butyldithiocarbamate：和光純薬工業社製）を陽性対照物質として用いた。陽性対照物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業社製）に溶解して希釈した。
【０１０２】
（細胞）
Ｖ７９細胞はＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。入手した時点で５代のものを、さらに１４代まで継代して凍結保存（マイコプラズマ陰性）した。これを解凍後９代で試験に用いた。培養は、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％含むＭＥＭ１０培地を用い、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内で培養した。試験には６ウェルプレート（ウェル直径：３５ｍｍ）を用いた。また、６ウェルプレートの蓋および側面に処理条件を示す記号または数値を記して識別した。１用量あたり３ウェル用いた。
【０１０３】
（細胞毒性試験）
被験物質は水に溶解するので、被験物質に用いる溶媒は日局注射用水とし、最高処理濃度を生理的限界用量である５ｍｇ／ｍＬとした。日局注射用水を媒体として用いることから、培地に対する被験物質の添加量を１０ｖｏｌ％とし、最終処理濃度の１０倍濃度の試験液を調製し、溶媒を用いて公比２で希釈し１０段階の濃度（試験液：０．０９７７、０．１９５、０．３９１、０．７８１、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０  ｍｇ／ｍＬ）を設定した。
【０１０４】
Ｖ７９細胞を０．２５％トリプシンを用いて単離した後、細胞濃度１０３個／ｍＬの懸濁液とし、この細胞懸濁液０．１ｍＬ（１００個）を２ｍＬのＭＥＭ１０培地の入っている６ウェルプレート（ウェル直径：３５ｍｍ）に分注した。播種翌日、ウェル内の培地を除き、新鮮なＭＥＭ１０培地１．８ｍＬを加えた後、日局注射用水（陰性対照）及び段階希釈した試験液を、それぞれ培地に２００μＬずつ添加し（溶媒濃度１０ｖｏｌ％）、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）で６日間培養した。
【０１０５】
培養終了後、培地を除き、メタノールで固定し、１０ｖｏｌ％ギムザ液で染色した。ウェルあたりのコロニー数（５０個以上の細胞からなるものを１個とした。）を多目的高速画像解析装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．：ＰＣＡ−１１、システムサイエンス社製）で計測し、陰性対照群と比較して各処理群の相対コロニー形成率を算出し、ＩＣ５０値を求めた。また、コロニー形成能（陰性対照群のコロニー数／１００）を算出した。
【０１０６】
（陽性対照物質を用いた細胞毒性試験）
前述の細胞毒性試験と同様の方法によりＶ７９細胞を播種した。翌日、各ウェルより培地を除き、新鮮なＭＥＭ１０培地２ｍＬを加えた後、最終処理濃度（１．０、２．０、３．０、４．０、５．０μｇ／ｍＬ）の２００倍になるように調製したＺＤＢＣ溶液またはＤＭＳＯ（陰性対照）を１０μＬずつ培地に添加し（溶媒濃度０．５ｖｏｌ％）、６日間培養した。以下、細胞毒性試験と同様の方法により、陰性対照群に対する各処理群の相対コロニー形成率を算出し、ＩＣ５０値を求めた。
【０１０７】
（評価）
細胞毒性試験については、１）陰性対照群でのコロニー形成能が良好（０．８以上）であること、２）陽性対照物質（ＺＤＢＣ）のＩＣ５０値が１〜５μｇ／ｍＬの範囲内であること、を満たしていることを確認した。
【０１０８】
（試験結果）
表１４に、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０のＶ７９細胞におけるコロニー形成試験の結果を示す。また、表１５に、陽性対照物質のＶ７９細胞におけるコロニー形成試験の結果を示す。さらに、図１５に、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の濃度とコロニー形成率の関係を示す。図１５は、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０のＶ７９細胞におけるコロニー形成に対する影響を示すものであり、Ｖ７９細胞をウエルに１００個播腫し、翌日、種々の濃度のＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０を添加して６日間培養を続けた後に、固定、染色してコロニー形成率を求めた。
【０１０９】
【表１４】
0005366168.tif 000024
【０１１０】
【表１５】
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【０１１１】
表１４や図１５から明らかなように、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０は、いずれの濃度においてもＶ７９細胞のコロニー形成を阻害しなかった。陰性対照群でのコロニー形成能は１．０２であり、良好であった。また、陽性対照物質を用いた試験におけるＺＤＢＣのＩＣ５０値は、１．７μｇ／ｍＬであった（表１５参照）。陰性対照群におけるコロニー形成能及び陽性対照物質を用いた試験で得られたＩＣ５０値は、「評価」の項に示した基準を満たすものであったことから、本実験は被験物質の細胞毒性作用を適正に評価していると考えられる。
【０１１２】
以上の結果から、今回行った試験条件下において、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０には、Ｖ７９細胞のコロニー形成を阻害する細胞毒性作用はないことが示された。
【０１１３】
実験６．精製したＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０のラットを用いた単回静脈内投与毒性試験
アルミナカラムで精製したＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の安全性を調べるため、ラットにおける静脈内投与による単回毒性試験を実施した。ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の精製は、実験２に準じてアルミナカラムを用いて行い、展開溶媒は水とした。
【０１１４】
（試験ガイドライン）
本試験は、「医薬品毒性試験法ガイドライン［１］単回投与毒性試験」（平成５年８月１０日、薬新薬第８８号）を参考にして実施した。
【０１１５】
（被験物質）
被験物質であるＰＧＤ−Ｇ３．０（成分：ポリグリセロールデンドリマー  第３世代、分子量：１，６９０、純度：９５％以上）及びＰＧＤ−Ｇ４．０（成分：ポリグリセロールデンドリマー  第４世代、分子量：３，５００、純度：９５％以上）は、いずれも若干褐色、水あめ状の粘性体であり、使用時まで室温にて保管した。
【０１１６】
（使用動物と飼育方法）
４週齢のSprague-Dawley (SD)系［Crl:CD（SD）］雄ラット（日本チャールス・リバー社、厚木飼育センター）を購入し、搬入した。搬入した動物は検疫と飼育環境への馴化を兼ね、入荷日も含めて６日間飼育した。検疫・馴化期間中１日１回、動物の一般状態を観察したがいずれの動物にも異常が認められなかったため、検疫終了時の測定体重をもとに体重別層化無作為抽出法により３匹ずつの６群に群分けし、１８匹を試験に使用した。
【０１１７】
動物は、許容温度２１．０℃〜２５．０℃、許容湿度４０．０％〜７５．０％、換気回数約１５回／時、照明１２時間（７〜１９時点灯）に設定された飼育室で金属製金網床ケージ（２２０ｗ×２７０ｄ×１９０ｈ：単位ｍｍ）に１匹ずつ収容して飼育し、固型飼料（ＣＥ−２、日本クレア社製）と水道水を自由に摂取させて飼育した。試験に使用した動物はフェルトペンで尾に個体番号を標識し識別し、また識別の補助として、試験番号、性別及び動物番号を記入したカードを飼育ケージに掛けた。検疫期間中は飼育ケージに入荷動物番号を標識した。
【０１１８】
（投与検体の調製）
ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０の投与に際しては、生理食塩液（光製薬株式会社製）で２００ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを生理食塩液で段階１０倍希釈して２０ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過して使用した。なお、生理食塩液の生体への影響についてはこれまでのデータから無視できるものと判断し、溶媒投与群は設定しなかった。
【０１１９】
（投与方法）
被験物質の毒性に関わる検討はこれまで行われていなかった。また、被験物質は粘稠であり、高濃度では静脈内投与は難しいものと考えられた。これらの事柄から、上限を１０００ｍｇ／ｋｇとし、公比１０で投与量を設定し、およその毒性を調べた。
【０１２０】
直前に測定した体重を基に個体別に投与液量を算出し、ステンレス製注射針（２５Ｇ）を用いて単回静脈内投与した。投与容量は体重（ｋｇ）あたり５ｍＬとし、約１分間で投与した。投与は１０時２９分〜１１時５９分の間に行った。群、投与物質、投与用量、投与容量および動物番号は表１６の通りとした。
【０１２１】
【表１６】
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【０１２２】
（観察と検査）
投与日を観察第１日として第１５日まで毎日、死亡の有無を確認した。一般状態の観察を、投与日（観察第１日）は投与前に１回、投与後は約１時間継続的に観察し、その後は約１時間毎に投与後６時間まで全例の一般状態を観察した。観察第２日以降は、毎日１回の頻度で一般状態を観察した。体重は、投与直前、観察第２、４、８、１１、１５日及び死亡動物発見時に測定した。観察第１５日には全例をペントバルビタール麻酔下で放血致死させて剖検し、器官・組織の肉眼的観察を実施した。器官重量は測定しなかった。これらのうち、各群の１例（動物番号１、４、７、１０、１４及び１６）及び死亡動物（動物番号１１及び１２）の主要器官・組織〔脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓及び与部位（尾）〕を０．１Ｍリン酸緩衝１０％ホルマリン溶液に固定保存した。この内、ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、死亡した２例（動物番号１１及び１２）の脳、心、肺および腎臓についてはヘマトキシリン・エオジン標本を作製し、病理組織学検査を実施した。
【０１２３】
（データの解析）
体重の平均値及び標準偏差を算出した。
【０１２４】
（試験成績）
ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０単回静脈内投与後の雄ラットの生存数を表１７に、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０単回静脈内投与後の雄ラットの一般状態所見を表１８に、ＰＧＤ−Ｇ３．０単回静脈内投与後の雄ラットの体重推移を表１９に、ＰＧＤ−Ｇ４．０単回静脈内投与後の雄ラットの体重推移を表２０に、ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０単回静脈内投与後の雄ラットの部検所見を表２１に、ＰＧＤ−Ｇ４．０１０００ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与後に死亡した雄ラットの病理組織学検査所見を表２２にそれぞれ示す。
【０１２５】
【表１７】
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【０１２６】
【表１８】
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【０１２７】
【表１９】
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【０１２８】
【表２０】
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【０１２９】
【表２１】
0005366168.tif 000031
【０１３０】
【表２２】
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【０１３１】
ａ．死亡と一般状態
ＰＧＤ−Ｇ３．０を１０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した全例で、１４日間の観察期間中に死亡例及び一般状態の異常は観察されなかった（表１７及び表１８参照）。一方、ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した３例中の２例（動物番号１１及び１２）が投与直後（投与終了から３分以内）に死亡したが、残りの１例（動物番号１０）は試験終了時（観察第１５日）まで生存した。また、ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した６例に死亡例は認められなかった（表１７参照）。死亡した２例では死亡に至るまでの間に明らかな一般状態の異常は認められなかった（表１８参照）。
【０１３２】
ｂ．体重
ＰＧＤ−Ｇ３．０を投与した全例では、観察終了日までの体重増加は順調であった（表１９参照）。また、ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した全例、さらに１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、観察終了日まで生存した１例においても体重増加は概ね順調であった（表２０参照）。
【０１３３】
ｃ．部検
ＰＧＤ−Ｇ３．０を投与した動物ではいずれの器官・組織にも異常所見は認められなかった。ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、死亡した２例（動物番号１１及び１２）では肺の退縮不全、及び暗赤色化、腎臓の皮髄境界部の暗赤色化が認められた。ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した全例、さらに、１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、観察終了日まで生存した１例では剖検時に明らかな異常は認められなかった（表２１参照）。
【０１３４】
ｄ．病理組織学検査
ＰＧＤ−Ｇ４．０を１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、死亡した２例（動物番号１１及び１２）のヘマトキシリン・エオジン標本を作製し、病理組織学検査を実施した。いずれの例でも、肺の水腫、肺胞腔への泡沫細胞の集簇が観察された。また、腎臓では皮質に好塩基性尿細管および被膜下に限局性の嚢胞が認められた。しかし、これらの組織の変化の程度は、いずれもごく軽度であった（表２２参照）。
【０１３５】
以上の結果から、ＰＧＤ−Ｇ３．０単回静脈内投与は、本試験での最高用量である１０００ｍｇ／ｋｇまでは毒性を示さないものと判断した。一方、ＰＧＤ−Ｇ４．０は、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量では明らかな毒性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】アルミナカラムを用いてＰＧＤ−Ｇ１．０を精製した場合におけるメタノール濃度と収率の関係を示す特性図である。
【図２】サンプル１における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図３】サンプル２における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図４】サンプル３における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図５】サンプル４における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図６】アルミナカラムを用いてＰＧＤ−Ｇ３．０を精製した場合におけるメタノール濃度と収率の関係を示す特性図である。
【図７】サンプル５における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図８】サンプル７における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図９】サンプル８における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図１０】サンプル９における精製前後のＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図１１】アルミナカラムのタイプの相違によるＵＶ／ＶＩＳスペクトルの相違を示す特性図である。
【図１２】溶媒としてメタノールを用い活性炭と接触させて精製した場合の精製前後におけるＵＶ／ＶＩＳスペクトルを示す特性図である。
【図１３】溶媒として精製水を用い活性炭と接触させて精製した後にメタノールで洗浄した場合の精製前後におけるＵＶ／ＶＩＳスペクトルを示す特性図である。
【図１４】活性炭処理前後の吸収極大値の強度変化を示す特性図である。
【図１５】ＰＧＤ−Ｇ３．０及びＰＧＤ−Ｇ４．０のＶ７９細胞におけるコロニー形成に対する影響を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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