(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）  ＴＹＣ−１９株（受領番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５２４）。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母を用いる工程を含む脂肪酸エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルを生産する酵母、この酵母を使用する脂肪酸エステルの製造方法、及びこの方法によって製造された脂肪酸エステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料の枯渇が懸念される昨今において、国産バイオマスを代替燃料へ変換利用し、エネルギー自給率の向上を目指すための研究開発が強く求められている。そのなかで、軽油の代替燃料としては、油脂（トリグリセリド）から変換製造した脂肪酸エステル（通称：バイオディーゼル）が注目されている。国内で製造する脂肪酸エステルのほとんどは、家庭および外食産業から発生する廃食用油中のトリグリセリドを原料としており、その回収から脂肪酸エステルヘの変換製造までの技術開発が活発的に取り組まれている。
【０００３】
国内における廃食用油からの脂肪酸エステルの製造方法に関しては、大別すると、アルカリ触媒法（特許文献１）、酸触媒法（特許文献２）、リパーゼ法（特許文献３）および超臨界メタノール法（特許文献４）が挙げられる。
【特許文献１】特開平７−１９７０４７号公報
【特許文献２】特開２００４−３５９７６６号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ００／１２７４３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００４／１０８８７３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、現行の脂肪酸エステルの原料は、植物または動物由来の油脂の混合物であるが、大豆などの食用油の主要原料はほとんど輸入品であるために、エネルギー自給率の向上には寄与しない。また、廃食用油は安定供給が困難であることに加え、様々な動植物由来のトリグリセリドが混在しているために、そこから製造される脂肪酸エステルの品質の安定性の確保が困難である。そのような問題点から、現状では国内の脂肪酸エステル製造工場を合計しても年間０．５万キロリットル程度の製造量に過ぎず、これは、我が国の軽油の年間消費量（約３，０００万キロリットル）の０．０２％である。以上の背景から、エネルギー自給率の更なる向上を目指すためには、国産バイオディーゼルの低コスト、安定供給のみならず品質の安定化を図る必要があった。
【０００５】
脂肪酸エステルを効率的に製造するための新しい方法としては、短時間に増殖可能な微生物の利用が適していると考えられる。また、培養した菌体から簡単な抽出・精製法によって取得した脂肪酸エステルを輸送用燃料などとして利用するには、安全な微生物でなければならないことは言うまでもない。そのような微生物として、第一に挙げることができるのは酵母である。製パンや醸造で広く利用されている酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、菌体内に脂肪酸エステルの原料となるトリグリセリドを微量ながらも生産するが、酵母の中にはトリグリセリドを含む脂質成分を著量生産する菌種がある。これらは脂質生産性酵母と呼ばれており、代表的な酵母種としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）を挙げることができる。
【０００６】
ところが、脂肪酸エステルを生産する酵母はこれまで見出されておらず、上記の脂質生産性酵母においても、脂肪酸エステルを生産することはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、研究機関保存のカンジダ（Candida）属、シテロミセス（Citeromyces）属、クリプトコッカス属（Cryptococcus）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、デッケラ（Dekkera）属、エレモテシウム（Eremothecium）属、クリヴェロミセス（Kluyveromyces）属、コダマエア（Kodamaea）属、ラチャンセア（Lachancea）属、パチーソレン（Pachysolen）属、ピキア（Pichia）属、サターニスポラ（Saturnispora）属、ウイリオプシス（Williopsis）属およびヤロウィア（Yarrowia）属の各酵母について脂肪酸エステルの生産性を調べた。しかし、ほとんどの菌株は、脂肪酸エステルを検出できないか、検出できてもごく微量であった。
【０００８】
そこで、生乳から分離した１００株以上の酵母について調べたところ、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）と同定された１株ＴＹＣ−１９（ＮＩＴＥ ＡＰ−５２４）において、脂肪酸エステルを著量生産していることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
したがって、本発明は、下記のとおりである。
１．脂肪酸エステルを培養培地当たり１０μｇ/ｍｌ以上生産することを特徴とするクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する酵母、
２．酵母が、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）である上記１に記載の酵母、
３．クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）  ＴＹＣ−１９株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５２４）、
４．上記１〜３に記載の酵母を用いて製造された脂肪酸エステル、
５．上記１〜３に記載の酵母を用いる工程を含む脂肪酸エステルの製造方法、
６．上記１〜３に記載の酵母から製造された脂肪酸エステルを含む燃料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の脂肪酸エステル生産性酵母を、糖質を含む国産のバイオマスで培養し、脂肪酸エステルを発酵生産することにより、低コストかつ効率的に脂肪酸エステルを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でいう酵母は、脂肪酸エステルを生産することができる、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する酵母をいう。好ましくは、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）に分類される酵母であり、特に好ましくは、クリプトコッカス・カルバタス  ＴＹＣ−１９株である。なおこの菌株は、２００８年３月１２日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５２４として、寄託されている。また、脂肪酸エステルの種類も特に限定されず、種々の脂肪酸エステルを含有していてもよい。例えば、オレイン酸メチルエステルなどが該当する。
【００１２】
本発明の脂肪酸エステルの製造方法は、クリプトコッカス・カルバタス  ＴＹＣ−１９株を用いることを特徴とする。この菌株の培養方法は、酵母の培養に適したものであれば、従来公知の任意の方法を用いることができる。また、本発明の菌株の培養液からの脂肪酸エステルの製造方法としては、従来公知の任意の抽出方法を用いることができ、場合により、従来公知の任意の脂肪酸エステルの精製方法を用いることもできる。
【００１３】
本発明の脂肪酸エステルの製造方法により得られた脂肪酸エステルを、軽油の代替燃料に利用することができる。脂肪酸エステルは、上述したように、軽油の代替燃料として利用できることから、１００％純度の脂肪酸エステルまたは軽油との混合利用により、輸送用燃料として利用することができる。
【実施例１】
【００１４】
本発明の詳細を以下の実施例によって説明する。ただし、本発明はそれらの実施例によっては何ら限定されるものではない。
【００１５】
国内産生乳から分離した酵母クリプトコッカス・カルバタス  ＴＹＣ−１９を一白金耳かきとり、試験管（直径１．８ｃｍ，長さ１８ｃｍ）中のＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）１ｍｌに接種して種培養を行った。菌体の増殖後、種培養液４００μｌを２００ｍｌ三角フラスコ中のビート廃糖蜜培地（ビート廃糖蜜５％、酵母エキス１％）またはチーズホエー培地（ホエーパウダー３．５％、酵母エキス１％）４０ｍｌに移植して、３０℃、２４時間、振盪（１８０ｒｐｍ）培養を行った。菌体が増殖して白濁した培養液を遠心分離にかけ、集めた菌体に１９ｍｌのクロロホルム−メタノール−蒸留水（５：１０：４，ｖ／ｖ）を加え、３分間超音波処理して菌体を懸濁させた。この菌体懸濁液に５ｍｌのクロロホルムおよび５ｍｌの蒸留水を加えた後、遠心分離により得た下層を、濃縮乾固して得た全脂質を試料１とした。
【００１６】
また、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保有するクリプトコッカス・カルバタスの標準株ＮＢＲＣ１１５９、アメリカンタイプカルチャーコレクションが保有するクリプトコッカス・カルバタスＡＴＣＣ２０５０８およびＡＴＣＣ２０５０９、およびオランダ微生物株保存センターが保有するクリプトコッカス・カルバタスＣＢＳ２１７６、ＣＢＳ２７４４、ＣＢＳ２７５４、ＣＢＳ２７５５、ＣＢＳ２８２９、ＣＢＳ４２６０、ＣＢＳ５１６２、ＣＢＳ５１６３、ＣＢＳ５３２４およびＣＢＳ８７７０を、同様の方法にて処理し、全脂質を得、比較試料１から１３とした。
【００１７】
＜ＴＬＣによる確認と結果＞
上記試料１、比較試料１〜１３を少量のクロロホルム−メタノール（２：１，ｖ／ｖ）に溶解し、へキサン−ジエチルエーテル（９５：５，ｖ／ｖ）を展開溶媒として、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけた。そして、２５％硫酸を噴霧、加熱後に出現するスポットの様子を観察した。さらに比較試料１４として市販の脂肪酸エステル標品（オレイン酸メチルエステル）を加えた。図１にその結果を示す。
【００１８】
図１に示したように、ビート廃糖蜜培地による培養で、比較試料１４の市販の脂肪酸エステル標品と同じ位置にスポットが顕著に観察された菌株は、試料１（ＴＹＣ−１９）のみであり、比較試料８（ＣＢＳ２８２９）においては僅かに検出されるものの、その他の比較試料では検出されなかった。一方、チーズホエー培地による培養で、脂肪酸エステルが顕著に観察された菌株は、同様に試料１のみであり、その他の比較試料では極微量しか検出されなかった。したがって、本発明のクリプトコッカス・カルバタス  ＴＹＣ−１９は、培養培地の相違に関わらず安定的かつ高濃度に脂肪酸エステルを生産していることがわかる。
【００１９】
＜脂肪酸エステルの生産量の算出＞
さらに、この菌体の脂肪酸エステルの生産量の算出結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0005366113.tif 000002
【００２１】
画像解析装置によってスポットの画像を取り込み、スポットの強度から培養培地当たりの生産量を算出した。これらの結果から、本発明のクリプトコッカス・カルバタス  ＴＹＣ−１９は、脂肪酸エステルを培養培地当たり１０μｇ/ｍｌ以上生産していることが分かった。
【００２２】
＜脂肪酸エステルの組成の分析＞
さらに、この菌体が生産した脂肪酸エステルの組成の算出結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
0005366113.tif 000003
【００２４】
ビート廃糖蜜培地およびチーズホエー培地による培養で調製した試料１をＴＬＣにかけた後、脂肪酸エステルのスポット部分をかきとって、少量のへキサンによってシリカゲルから脂肪酸エステルを溶出させた。溶出した脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィーで分析することによって、脂肪酸エステルの分子種の分離とそれらのピーク面積から脂肪酸エステルの組成を算出した。これらの結果から、本発明のクリプトコッカス・カルバタスＴＹＣ−１９が生産する主要な脂肪酸エステルは、オレイン酸メチルエステルが４０％以上、リノール酸メチルエステルが４５％以上であることが分かった。
【実施例２】
【００２５】
本発明の「脂肪酸エステルの製造方法」は、「分離工程」と「精製工程」を含むことができる。
【００２６】
「分離工程」では、脂肪酸エステルを生産するクリプトコッカス・カルバタス菌体から脂肪酸エステルを分離する。まず、菌体から脂肪酸エステルを分離するために、酵母菌体の増殖を行う。微量の酵母菌体を液体培地に接種し、２５〜３０℃で２４時間、１５０〜２２０ｒｐｍで振盪培養すると、菌体が増殖して白濁する。次に、液体培地上の白濁した菌体を遠心分離によって集め、培養直後の生菌体中の全脂質成分を有機溶媒で抽出する。そして、抽出溶液を濃縮、乾燥することにより、脂肪酸エステルを得ることができる。
【００２７】
「精製ステップ」では、前記分離工程で分離された粗脂肪酸エステルを精製する。精製工程は、脂肪酸エステル（種々の脂肪酸エステルを含む）として精製するものであってもよいし、脂肪酸エステルのうち単一の成分を精製するものであってもよい。分離工程で得られた粗脂肪酸エステルを少量の溶媒に溶解し、シリカゲルクルマトグラフィーを行うことによって、脂肪酸エステル画分のみを容易に分離することができる。また、シリカゲルクロマトグラフィーを繰り返すことにより、さらに細かく成分を分離精製することとしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、大豆や菜種などの油糧作物から脂肪酸エステルを製造するのではなく、大量かつ安定的に供給可能なビート廃糖蜜やチーズホエーを用いる発酵生産法という手段を使用し、工業的に安価に脂肪酸エステルを得ることができる。他面では、砂糖およびチーズ製造時に多量に副生するビート廃糖蜜およびチーズホエーについて、産業上有用かつ高度な新規用途を図り、付加価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＴＬＣによる確認と結果を示す。
【図１】
0005366113.tif 000004