(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記群の配列から選択される核酸配列を含むことを特徴とする、精製また
は単離された核酸。
a)配列番号１および配列番号３；
b)a)に定義された配列に対応する相補的配列または RNA配列。
【請求項２】
配列番号１の配列、またはこの配列に対応する相補的配列もしくは RNA配
列を含むか、あるいはこれからなることを特徴とする、請求項１記載の精製または単離された核酸。
【請求項３】
配列番号２のタンパク質をコードすることを特徴とする、精製または単離
された核酸。
【請求項４】
配列番号２の配列を含むことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２の配列からなることを特徴とする、請求項４記載のポリペプチ
ド。
【請求項６】
請求項１〜3 のいずれかに記載した核酸、または請求項４および５のいず
れかに記載したポリペプチドをコードする核酸を含む、クローニング及び／又は発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸配列中の少なくとも１５の連続した
ヌクレオチドを含む核酸の、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸配列を検出及び／又は増幅するための、プローブまたはプライマーとしての使用。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸配列の、組換えポリペプチドを製造
するための使用。
【請求項１０】
請求項７記載の細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養
し、そして組換えポリペプチドを回収することを特徴とする、組換えポリペプチドを得る方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法を用いて得られることを特徴とする、組換えポリ
ペプチド。
【請求項１２】
請求項４、５または１１のいずれかに記載のポリペプチドを選択的に結
合することを特徴とする、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１３】
下記工程を含むことを特徴とする、生物学的試料において請求項４、５
または１１のいずれかに記載のポリペプチドを検出する方法。
a)生物学的試料を請求項１２記載の抗体に接触させる、
b)抗体と生物学的試料中のポリペプチドとの間に形成される複合体を免疫反応において検出する。
【請求項１４】
下記を含むことを特徴とする、請求項１３記載の方法を行うための試薬
キット。
a)請求項１２記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
b)免疫反応に適した媒体を構成する試薬、
c)免疫反応の間に形成される抗原−抗体複合体を検出するための試薬。
【請求項１５】
配列番号１または配列番号３に対応する遺伝子の少なくとも１つの突然
変異及び／又は発現の有害な変化の存在を、患者からの生物学的試料を用いて、該遺伝子に対応する核酸配列の全部または一部を解析することにより決定することを含む、クローン病の診断及び／又は予後の評価のための、ＩＢＤ１遺伝子の解析方法であり、突然変異又は有害な変化が下記からなる群より選ばれる、前記方法：
・配列番号１の２１０７番目のヌクレオチド、または配列番号３の１６４６７番目のヌクレオチドにおけるＣからＴへの変異
・配列番号１の２７２５番目のヌクレオチド、または配列番号３の２７０５９番目のヌクレオチドにおけるＧからＣへの変異
・配列番号１の３０２２番目のヌクレオチド、または配列番号３の３４２９６番目のヌクレオチドにおけるＣの挿入。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれかの項記載の核酸配列を含むことを特徴とする、
DNAチップ。
【請求項１７】
請求項４、５もしくは１１のいずれかの項記載のポリペプチド、または
請求項１２記載の抗体を含むことを特徴とする、タンパク質チップ。
【請求項１８】
下記工程を含むことを特徴とする、生物学的試料中において請求項１〜
３のいずれかの項記載の核酸を検出及び／又は解析する方法。
a)標識された請求項１〜３のいずれかの項記載のポリヌクレオチドを接触させる、
b)該ポリヌクレオチドと生物学的試料中の核酸との間に形成されたハイブリッドを検出及び／又は解析する。
【請求項１９】
下記工程を含むことを特徴とする、生物学的試料中に請求項１〜３のい
ずれかの項記載の核酸を検出及び／又は解析する方法：
a)請求項１または２に記載の核酸から選択される、配列番号１または３の少なくとも１５の連続したヌクレオチドの断片に対応するプライマーを用いた、該生物学的試料中の核酸の増幅、
b)生物学的試料からの増幅した核酸の検出および／または定量。
【請求項２０】
２１０７番目のヌクレオチドにおいてＣからＴへの変異を有する、配列
番号１を含む精製または単離された核酸。
【請求項２１】
２７２５番目のヌクレオチドにおいてＧからＣへの変異を有する、配列
番号１を含む精製または単離された核酸。
【請求項２２】
３０２２番目のヌクレオチドにおいてＣが挿入された、配列番号１を含
む精製または単離された核酸。
【請求項２３】
７０３番目のアミノ酸がＲからＷへ置換した、配列番号２を含む単離さ
れたポリペプチド。
【請求項２４】
９０９番目のアミノ酸がＧからＲへ置換した、配列番号２を含む単離さ
れたポリペプチド。
【請求項２５】
１００８番目のアミノ酸がＬからＰへ置換した、配列番号２のアミノ酸
１〜１００８を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
下記を含む、ヒト個体においてＩＢＤ１遺伝子中の変異核酸配列の存在
または不在を決定する解析方法：
(a) ヒト個体からの生物学的試料を、１６４６７番目のヌクレオチドにおいてＣからＴへの変異を有する配列番号３、２７０５９番目のヌクレオチドにおいてＧからＣへの変異を有する配列番号３、および３４２９６番目のヌクレオチドにおいてＣの挿入を有する配列番号３からなる群より選ばれた変異核酸配列に特異的な核酸プローブと接触させること、および
(b) 該核酸プローブと該変異核酸配列との間のハイブリダイゼーションを検出することにより、該変異核酸配列の存在または不在を決定すること。
【請求項２７】
１６４６７番目のヌクレオチドにおいてＣからＴへ変異を有する配列番
号３の変異核酸配列の存在または不在を決定する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
２７０５９番目のヌクレオチドにおいてＧからＣへ変異を有する配列番
号３の変異核酸配列の存在または不在を決定する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
３４２９６番目のヌクレオチドおいてＣの挿入を有する配列番号３の変
異核酸配列の存在または不在を決定する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２種の前記変異核酸配列の存在または不在を決定する、請求
項２６記載の方法。
【請求項３１】
３種の前記変異核酸配列の存在または不在を決定する、請求項２６記載
の方法。
【請求項３２】
前記核酸プローブが検出可能な標識を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記生物学的試料がゲノムDNA である、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的試料を、前記変異核酸配列に近接する核酸配列に特異的な
一対の核酸プライマーと接触させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸プローブが少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、請求項
２６記載の方法。
【請求項３７】
ヒト個体においてクローン病を診断するための、請求項２６〜３６のい
ずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、炎症性及び／もしくは免疫性疾患およびある種の癌、特に原因不明性炎症性腸疾患に関与する遺伝子、並びにこれらの遺伝子にコードされるタンパク質に関する。本発明はまた、炎症性疾患の診断方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
原因不明性炎症性腸疾患 (IBD)は、その原因が分からない、消化管の炎症を特徴とする疾患である。炎症の位置および特性により、異なる２つの疾病分類学的実体、潰瘍性大腸炎 (UC) およびクローン病 (CD) が区別される。UCはS Wilkesにより1865年に報告され、一方、限局性回腸炎の最初の患者はクローンにより1932年に報告された。実際は、これらの病気はさらにさかのぼることができる。
【０００３】
IBDは生涯にわたり進行する慢性の疾患であり、西欧諸国においては1000人につき約１〜２人が罹患し、このことはフランスではこれらの病気の患者が60,000人〜100,000 人であることを意味する。これらの疾患は若年層にあらわれ (症例のピークは30代である) 、寛解期を挟んだ発病を経て進行し、栄養不足、子供における成長の遅滞、骨の脱鉱物質および最後に大腸癌への悪性化などの合併症をしばしば伴う。特別な治療法はない。通常の治療法は抗炎症薬、免疫抑制剤を使用し、また外科的処置を用いる。これらの治療手段はすべて、それら自身がかなり高い医原性疾患の原因である。これらすべての理由により、 IBDは大きな公衆衛生上の問題と思われる。
【０００４】
IBDの病因はこれまで不明である。この病気の発生の長期にわたる増加および一卵性双生児での不完全な一致により示されるように、環境因子がこの病気の発生に関与する。現在知られている環境危険因子は、1)タバコ (その役割はCDにおいて有害であり、UCにおいては有益である) および2)虫垂切除 (UCに対して防御的役割を有する) のみである。
【０００５】
これらの疾患をもつ人種集団および家族集団が存在することにより、ずっと以前より遺伝的素因が疑われてきた。事実、 IBDはカフカス人の集団において、特に中央ヨーロッパのユダヤ人集団においてよくみられる。家族性の形態はIBD 患者の６〜20％になる。それらはこの疾患が早期に始まった時、特によくみられる。しかしながら、これらの疾患の遺伝性を確認することを可能にしたのは双生児における研究である。実際、こられらの疾患の双生児間の一致率は、二卵性双生児よりも一卵性双生児においてより高く、これは IBD、特にCDに対する遺伝的要素を強力に裏付ける。多分 IBDは、いくつかの異なる遺伝子を含み、互いにそして環境因子と相互作用する複合遺伝性疾患であろう。従って、 IBDは多因子疾患に分類されうる。
【０００６】
IBD-罹病性 (susceptibility、罹患しやすさ) の遺伝子を証明するために２つの主要な方策が開発された。第１は、生理病理学的原因の候補である遺伝子の解析に基づく。こうして、多くの遺伝子が IBDにとって重要である可能性があるとして提案された。それらは炎症および免疫応答においてある役割を有する遺伝子であることが多い。 HLA、TAP 、TNF およびMICA遺伝子、Ｔリンパ球受容体、ICAM1 、インタロイキン1 、CCR5等が挙げられる。その他の遺伝子は、GAI2、モチリン、MRAMP 、HMLH1 などの種々の機能に関与する。実際、検討された各種候補遺伝子はいずれも、 IBDの発生に何らかの役割を果たすことはこれまで明確には証明されていない。
【０００７】
高度に多型性の遺伝的マーカーを用いた最近のヒトゲノム地図の進展により、遺伝学者が全ゲノムにわたる非標的化方法を開発することが可能となった。この方法は、逆遺伝学またはポジショナルクローニングと称され、病気に関与する遺伝子に関する仮説を立てずに、ゲノムの系統的スクリーニングによりそれらを発見しようとする。複合遺伝性疾患に最もよく使用される方法は、同じ家族内の罹患した個人の伝わり方による同一性を検討することに基づく。ゲノムに均一に (10cM毎に) 分布する非常に多数 (300 〜400)の多型マーカーについてこの値を算出する。患者間に過剰の同一性がある場合は、試験したマーカーはその疾患の罹病性 (susceptibility) に関する遺伝子を含むと考えられる領域を示す。複合遺伝子性疾患の場合は、遺伝的素因の基礎となるモデル (遺伝子の数およびそれらの各々の相対的重要性) が未知であるので、使用する統計的方法を調整しなければならないであろう。
【０００８】
本発明は IBDおよびその他の炎症性疾患に関与する遺伝子の核酸配列の証明、およびこれらの核酸配列の使用に関する。
本発明に関連して、本発明者等による予備検討によりCD罹病性の遺伝子の位置決定が既に可能となった。具体的には、本発明者等 (Hugot et al., 1996) は、CD罹病性の遺伝子は第16染色体の動原体周囲 (pericentromeric)の領域に位置する (図１) ことを示した。これは、ポジショナルクローニングにより位置決定され、文献 (Landerおよび Kruglyak, 1995)で提案された厳格な基準を満足するような、複合遺伝性疾患に対する罹病性の最初の遺伝子であった。この遺伝子は IBD1 (inflamatory bowel disease 1、炎症性腸疾患１) と命名された。それ以来、別の著者等によりその他の位置、特に第12、１、３、６および７染色体上の位置が提案された (Satsangi et al, 1996; Cho et al., 1998) 。それらは位置決定されたが、現在までこれらの IBD罹病性遺伝子のいずれも同定することはできなかった。
【０００９】
数人の著者 (Rioux et al., 1998) はこの位置を複製することができなかった。しかし、これは、遺伝的不均一性がありうる複合遺伝性疾患の場合には意外なことではない。
【００１０】
同じポジショナルクローニングのアプローチにより、いくつかの免疫性および炎症性疾患、例えば硬直性脊椎炎、ブラウ症候群 (Blau's syndrome)、乾癬など、については第16染色体上の位置が提案されている (Becker et al, 1998; Tromp et al., 1996) 。そこで、これらの疾患はすべて第16染色体上に位置する同じ遺伝子 (または同じ遺伝子群) を共有しているかもしれない。
【００１１】
事実、最大の遺伝子連鎖試験は、２cMしか離れていないD16S409 またはD16S411 の領域における同じポジションに常に位置している。この結果は、非パラメトリック連鎖解析を用いるアプローチにより遺伝子位置決定に帰属されうる、かなりの大きさの信頼区間 (通常20cMより大) と矛盾する。
【００１２】
本発明者等による検討において使用した統計試験の比較により、家系による完全な同一性 (Tz2)に基づく試験は、家系による同一性の平均 (Tz) に基づくものより良好であることが示される (図１) 。かかる違いはIBD1の劣性効果により説明できる。
【００１３】
第16染色体の動原体周囲の領域にあることが知られるいくつかの遺伝子、例えばインターロイキン４受容体、CD19、CD43またはCD11、はCDに対する可能性の高い候補であるようである。しかし、予備試験の結果は、これらの遺伝子がCDに関与していることを有利に示すものではない。
【００１４】
特に、本発明はIBD1遺伝子の配列だけでなく、以下の実施例での報告にあるように実証された、 IBDの近傍に位置するためにIBD1proxと称される別の遺伝子の部分的配列にも関する。従って、そのcDNA配列がそれぞれ配列番号１および配列番号４に対応するこれらの遺伝子は、多くの炎症性及び／又は免疫性疾患および癌に関与している可能性がある。
【００１５】
IBD1およびIBD1prox遺伝子により発現されるペプチド配列は、それぞれ配列番号２および配列番号５により表される。これらの遺伝子のゲノム配列はそれぞれ配列番号３および配列番号６により表される。
【００１６】
従って、本発明の主題は、下記群の配列から選択される核酸配列を含むことを特徴とする、精製または単離された核酸である。
a)配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６；
b)配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６から選択される配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドの断片の配列；
c)最適の整列化後、a)またはb)に規定された配列と少なくとも80％の同一性割合を有する核酸配列；
d)高ストリンジェントな条件下でa)またはb)に規定された核酸配列とハイブリダイズする核酸配列；
e)a)、b)、c)またはd)に規定された配列に対応する相補的配列または RNA配列。
【００１７】
c)で規定された本発明の核酸配列は、最適の整列化後、上記a)またはb)に規定された配列と少なくとも80％、好ましくは90％、最も好ましくは98％の同一性割合を有する。
【００１８】
本明細書において区別せずに用いられる、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」なる用語は、改変されていてもいなくてもよい、一連のヌクレオチドを意味し、異常なヌクレオチドを含んでいてもいなくてもよく、そして二本鎖 DNA D、一本鎖 DNAおよび該 DNAの転写産物に対応してもよい、核酸の断片または領域を規定するのを可能にする。従って、本発明の核酸配列はPNA ( ペプチド核酸) なども含む。
【００１９】
本発明は天然の染色体環境における、すなわち天然の状態のヌクレオチド配列には関しないことは理解されるべきである。それらは、単離及び／又は精製された、すなわち、例えば複製により直接または間接に採取され、それらの環境は少なくとも部分的に改変されたものであるような、配列である。従って、化学合成により得られる核酸も含まれる。
【００２０】
本発明の目的にとって、２つの核酸またはアミノ酸配列の間の「同一性割合」なる用語は、最良の整列化後に得られる、比較すべき２つの配列間で同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味し、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の違いはランダムにその全長にわたり分布する。「最良の整列化」または「最適の整列化」は、以下のようにして決定する同一性割合が最も高い整列化を意味する。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、それらを最適に整列させた後これらの配列を比較することにより慣用の方法で行われ、この比較は配列類似性を有する局部的領域を同定し比較するために、セグメントによりまたは「比較ウインドウ」により行われる。比較のための配列の最適整列化は、手作業の他、Smith およびWaterman (1981) の局所相同性アルゴリズム、NeddlemannおよびWunsch (1970) の局所相同性アルゴリズム、Pearson およびLipman (1988) の類似性調査法、これらのアルゴリズムを用いたコンピュータープログラム (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA およびTFASTA) により行うことができる。最適の整列化を得るには、BLOSUM 62 マトリックスを有するBLAST が好ましく使用される。PAM またはPAM250マトリックスも使用できる。
【００２１】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性割合は、最適に整列化したこれらの２つの配列を比較することにより決定され、比較されるべき核酸またはアミノ酸配列は、これら２つの配列間の最適整列化のための参照配列に対して付加または欠失を多分含む。同一性割合は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較する全位置数で割り、そして得られた数を100 倍して、これら２つの配列間の同一性割合を得ることにより算出する。
【００２２】
「最適の整列化後に参照配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有する核酸配列」なる表現は、参照核酸配列と比較した場合にある種の改変、例えば特に欠失、短縮、伸長、キメラ的融合及び／又は置換 (特に点での) を有する核酸配列であり、その核酸配列が最適の整列化後に参照核酸配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有する核酸配列を意味する。それらは好ましくは、その相補的配列が本発明の配列番号１または配列番号４の配列に特異的にハイブリダイズしうる配列である。好ましくは、特異的または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２つの配列の一方と、他方に相補的な配列との間で、最適の整列化後に、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性を確実にするようなものであろう。
【００２３】
高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度の条件が、２つの相補的 DNA断片間のハイブリダイゼーションが維持されることを可能にするように選択されることを意味する。実例として、上記したポリヌクレオチド断片を規定する目的の、ハイブリダイゼーション工程のための高ストリンジェントな条件は有利には以下の通りである。
【００２４】
DNA-DNA またはDNA-RNA ハイブリダイゼーションは２つの工程において行われる：(1) ５×SSC(１×SSC は0.15M NaCl＋0.015Mクエン酸ナトリウムの溶液に相当する) 、50％ホルムアミド、７％トデシル硫酸ナトリウム (SDS)、10×デンハート溶液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子 DNAを含むリン酸塩緩衝液 (20 mM, pH 7.5)中42℃で３時間の予備ハイブリダイゼーション、(2) プローブの長さに応じた温度 (すなわち、プローブ＞100 ヌクレオチド長に対して42℃) での20時間のハイブリダイゼーション自体、次いで２×SSC ＋２％SDS 中20℃で20分間の洗浄２回、および 0.1×SSC ＋ 0.1％SDS 中20℃で20分間の洗浄１回。最後の洗浄を 0.1×SSC ＋ 0.1％SDS 中、プローブ＞100 ヌクレオチド長に対して60℃で30分間行う。規定の長さのポリヌクレオチドに対する上記高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrook et al., 1989 の教示によって、より長いまたは短いオリゴヌクレオチドに対して当業者により調整できる。
【００２５】
最適の整列化後本発明の配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有する核酸配列の中で、配列番号１または配列番号４の変異核酸配列、またはその断片、すなわち対立遺伝子性変異体、すなわち配列番号１または配列番号４の配列の個々の変異、に対応するすべての核酸配列もまた好ましい。これらの自然突然変異配列は哺乳動物、特にヒトに存在する多型、特に病的状態を引き起こすかもしれない多型に相当する。好ましくは本発明は、突然変異により配列番号１または配列番号４の正常配列によりコードされるポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列の改変を生じている変異核酸配列に関する。
【００２６】
「変異核酸配列」なる表現はまた、そのcDNAが配列番号１または配列番号４の配列を有するゲノム核酸配列のスプライス部位の突然変異及び／又は変異から生じる任意の RNAまたはcDNAも意味する。
【００２７】
本発明は好ましくは、配列番号１もしくは配列番号４の配列、その相補的配列、または配列番号１もしくは配列番号４に対応する RNA配列のいずれかを含むかまたはそれからなることを特徴とする、精製または単離された本発明の核酸配列に関する。
【００２８】
本発明核酸の配列を含むことを特徴とするプローブまたはプライマーもまた本発明の一部である。
従って、本発明はまた、特に、変異核酸配列を実証または区別すること、あるいは、そのcDNAが配列番号１または配列番号４で表される遺伝子のゲノム配列を、特に PCR法もしくは関連方法などの増幅方法を用いて同定することを可能にする、本発明のプライマーまたはプローブに関する。
【００２９】
本発明はまた、本発明の核酸配列の、ある核酸配列を検出、同定、解析または増幅するためのプローブまたはプライマーとしての使用に関する。
本発明によれば、ある核酸配列を検出、同定、解析または増幅するための方法においてプローブまたはプライマーとして使用できるポリヌクレオチドは長さが最小15塩基、好ましくは20塩基、またはさらに好ましくは25〜30塩基である。
【００３０】
本発明のプローブおよびプライマーは、検出可能な、及び／又は定量可能なシグナルを得るために、当業者に周知の方法を用いて放射性または非放射性化合物で直接または間接的に標識してもよい。
【００３１】
標識されていない本発明のポリヌクレオチド配列をプローブまたはプライマーとして直接使用することもできる。
一般的には多くの用途に使用できる配列を得るために配列を標識する。本発明のプライマーまたはプローブは放射性要素または非放射性分子で標識する。
【００３２】
使用される放射性同位体には、32P,33P,35S,3Hまたは125Iが挙げられる。非放射性の物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジオキシゲニン (dioxygenin) などのリガンド、ハプテン、染料および発光試薬 (放射発光、化学発光、生物発光、蛍光または燐光試薬など) から選ばれる。
【００３３】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、特に PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) 手法 (Rolfs et al., 1991) を用いる方法においてプライマー及び／又はプローブとして使用することができる。この手法では、増幅すべき断片の境を設けるオリゴヌクレオチドプライマー対を選ぶことが必要である。例えば、米国特許第4,683,202 号に記載の手法が例示される。増幅断片は、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、またはゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手法の後に同定し、次いで配列決定できる。増幅の特異性は、プライマーとして本発明ポリヌクレオチドの核酸配列を用い、マトリックスとしてこれらの配列を含むプラスミドあるいは誘導された増幅産物を用いて調節できる。増幅されたヌクレオチド断片は、生物学的試料中の、この増幅ヌクレオチド断片の配列に相補的な配列の標的核酸の存在を実証するために、ハイブリダイゼーション反応における試薬として使用できる。
【００３４】
本発明はまた、本発明のプライマーを用いた増幅により得ることができる核酸にも関する。
標的核酸を増幅するその他の手法を、本発明のヌクレオチド配列を有するプライマー対を用いる PCR法(PCR変法) の代わりとして有利に用いることができる。「 PCR変法」なる用語は、核酸配列の直接または間接的再生産を用いる、あるいは標識系が増幅されたすべての方法を意味する。これらの方法は当然既知である。一般的に、それらは DNAのポリメラーゼによる増幅を含み、もとの試料が RNAである場合は逆転写を予め実施しておくべきである。かかる増幅には現在、非常に多くの方法が存在し、例えば、 SDA (strand displacement amplification 、鎖置換増幅) 法 (Walker et al., 1992)、Knoh et al., (1989) により既報の TAS (transcription-based amplification system、転写に基づく増幅系) 法、Guatelli et al. (1990)により既報の3SR (self-sustained sequence replication、自立配列複製) 法、Kievitis et al. (1991)により既報のNASBA (nucleic acidsequence based amplification 、核酸配列に基づく増幅) 法、 TMA (transcription mediated amplification、転写媒介増幅) 法、Landegren et al. (1988) により既報の (ligase chain reaction 、リガーゼ連鎖反応) 法、Segev (1992)により既報の RCR (repair chain reaction 、修復連鎖反応) 法、Duck et al. (1990)により既報の CPR (cycling probe reaction、循環プローブ反応) 法およびMiele et al. (1983) により既報のQ-ベータ- レプリカーゼ増幅 (Q-beta-replicase amplification) 法がある。これらの手法のいくつかはこれまで改善されている。
【００３５】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがmRNAである場合は、生物学的試料中に含まれるmRNAからcDNAを得るために、本発明のプライマーを用いて増幅反応を行うか、または本発明のプローブを用いる検出法を実施する前に、逆転写酵素型の酵素が有利に使用される。次いで、得られるcDNAは、本発明による増幅または検出方法に用いるプライマーまたはプローブの標的として働く。
【００３６】
プローブハイブリダイゼーション手法は多くのやり方で実施できる (Matthews et al., 1988)。最も一般的方法は、各種の組織の細胞、または培養中の細胞から抽出した核酸を支持体 (ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンなど) に固定し、固定した標的核酸を規定の条件下でプローブと共にインキュベートすることからなる。ハイブリダイゼーション後、過剰のプローブを除去し、形成された雑種分子を適宜方法 (プローブに結合した放射活性、蛍光または酵素活性の測定) を用いて検出する。
【００３７】
本発明の核酸プローブの別の態様によれば、これは捕捉プローブ (capture probe)として使用できる。この場合、「捕捉プローブ」と称されるプローブは、支持体上に固定され、特異的ハイブリダイゼーションにより、試験すべき生物学的試料から得られる標的核酸を捕捉するのに使用され、次いで標的核酸を、容易に検出しうる要素で標識した「検出プローブ」と称される第２のプローブを用いて検出する。
【００３８】
従って、有利な核酸断片には、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、その構造が、標的配列とのハイブリダイゼーションにより対応する産物の発現の阻害を確実にするようなオリゴヌクレオチドが挙げられる。またた、対応する産物の発現の調節に関与するタンパク質と相互作用することにより、この発現の阻害または活性化を生じるセンスオリゴヌクレオチドも例示される。
【００３９】
いずれの場合 (センスおよびアンチセンス) も本発明のオリゴヌクレオチドをin vitroおよびin vivo で使用できる。
本発明はまた、以下から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたポリペプチドに関する。
a)配列番号２または配列番号５の配列を有するポリペプチド；
b)a)で定義した配列を有するポリペプチドの変異ポリペプチド；
c)a)のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有する、a)またはb)で定義したポリペプチドに相同的なポリペプチド；
d)a)、b)またはc)に定義したポリペプチドの少なくとも15の連続するアミノ酸の断片；
e)a)、b)またはc)に定義したポリペプチドの生物学的に活性な断片。
【００４０】
本発明の目的にとって、「ポリペプチド」なる用語はタンパク質またはペプチドを意味する。
「生物学的に活性な断片」なる表現は、それが由来するペプチド断片と、同じ生物活性、好ましくは同じ桁の範囲内 (10倍の範囲内) の活性を有する断片を意味する。そこで、実施例はIBD1タンパク質 (配列番号２) がアポトーシス現象における役割を有する可能性があることを示す。よって、IBD1タンパク質の生物学的に活性な断片は、配列番号２に由来し、かつアポトーシスにおける役割を有するポリペプチドからなる。以下の実施例は、IBD1およびIBD1proxタンパク質のペプチドドメインの機能として、これらのタンパク質に関する生物学的機能を提案し、従って、当分野の技術者が生物学的に活性な断片を同定することを可能にする。
【００４１】
好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号２の配列 (IBD1遺伝子によりコードされるタンパク質に相当) 、もしくは配列番号５の配列 (IBD1proxによりコードされるタンパク質に相当) 、または最適の整列化後に配列番号２もしくは配列番号５と少なくとも80％の同一性を有する配列からなるポリペプチドである。
【００４２】
このポリペプチドの配列は、最適の整列化後に配列番号２または配列番号５の配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有する。
【００４３】
「そのアミノ酸配列が、最適の整列化後に参照配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有するポリペプチド」なる表現は、参照ポリペプチドと比較してある種の改変、例えば、特に１または２以上の欠失及び／又は短縮、伸長、キメラ的融合及び／又は１または２以上の置換を有するポリペプチドを意味する。
【００４４】
そのアミノ酸配列が、最適の整列化後に本発明の配列番号２または配列番号５の配列、あるいはその断片と、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性割合を有するポリペプチドの中で好ましいのは、上で規定した変異核酸配列によりコードされる変異ポリペプチド、特に、そのアミノ酸配列が配列番号２または配列番号５の配列あるいはその断片と比べて少なくとも１つのアミノ酸残基の短縮、欠失、置換及び／又は付加に相当する少なくとも１つの突然変異を有するポリペプチド、より好ましくは病的状態に関連する突然変異を有する変異ポリペプチドである。
【００４５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むクローニングベクター及び／又は発現ベクターに関する。かかるベクターは、発現および、場合により宿主細胞中でのポリペプチドの分泌に必要とされる要素も含んでいてよい。かかる宿主細胞もまた本発明の主題である。
【００４６】
本発明のプロモーター及び／又は調節配列を含むことを特徴とするベクターもまた本発明の一部である。
このベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始および終止シグナル、並びに転写の調節に適当な領域も含む。それらは細胞中で安定的に保持できなければならず、場合により翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを含んでもよい。
【００４７】
これらの各種調節シグナルは、使用される細胞性宿主に関連して選択される。この趣旨で、本発明の核酸配列を、選択された宿主中で自律的に複製するベクターに挿入しても、または選択された宿主に組み込まれるベクターに挿入してもよい。
【００４８】
自律的に複製する系の中で好ましいのは、宿主細胞に応じて、プラスミドまたはウイルス型の系が使用され、ウイルスベクターとしては特にアデノウイルス (Perricaudet et al., 1992) 、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス (Epstein et al., 1992) が可能である。当分野の技術者はこれらの系のそれぞれについて使用できる技術を知っている。
【００４９】
宿主細胞の染色体への配列の組み込みが望ましい場合、例えば、プラスミドまたはウイルス型の系が使用でき、かかるウイルスは例えばレトロウイルス (Temin, 1986)またはAAV (Carter, 1993)である。
【００５０】
非ウイルスベクターの中で好ましいのは、VICAL 社により開発された手法による、裸の DNAまたは裸の RNAなどの裸のポリヌクレオチド、細菌の人工染色体 (BAC)、酵母での発現のための酵母の人工染色体 (YAC)、マウス細胞での発現のためのマウスの人工染色体 (MAC)、好ましくはヒト細胞での発現のためのヒトの人工染色体 (HAC)である。
【００５１】
かかるベクターは当分野の技術者により通常使用される方法により製造され、それより得られるクローンは、例えばリポフェクション、電気穿孔法、熱ショック、膜の化学的透過性化後の形質転換または細胞融合などの標準的方法を用いて適宜宿主に導入することができる。
【００５２】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞、特に真核細胞および原核細胞、並びにこの本発明の形質転換された細胞の１種を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物をも含む。これらの動物は、炎症性及び／又は免疫性疾患、特に消化管の炎症性疾患の病因の研究、あるいは癌の研究のためのモデルとして使用できる。
【００５３】
本発明の目的のために使用できる細胞には、細菌細胞 (Olins and Lee, 1993)、酵母細胞 (Buckholz, 1993) および動物細胞、特に哺乳動物細胞 (Edwards and Aruffo, 1993) 、殊にチャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞が挙げられる。また、例えばバキュロウイルス (Luckow, 1993) を用いる方法を使用できる昆虫細胞も挙げられる。本発明のタンパク質の発現のための好ましい細胞性宿主は COS細胞からなる。
【００５４】
本発明の動物の中では、本発明のポリペプチドを発現する齧歯類、特にマウス、ラットまたはウサギなどの動物が好ましい。
本発明の哺乳動物の中で好ましいのは、マウス、ラットまたはウサギなどの動物であり、これらの動物は配列番号２もしくは配列番号５の配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、またはその配列がこれらの動物における相同 (homologous) 遺伝子によりコードされるものが機能しないか、ノックアウトされているか、あるいは少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする動物である。
【００５５】
これらのトランスジェニック動物は、例えば、胚性幹細胞での相同的組換え、これらの幹細胞の胚への移行、生殖系列で作製されたキメラの選択およびこのキメラの成育により得られる。
【００５６】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子、またはその相同遺伝子を過発現しても、また変異が導入された該遺伝子を発現してもよい。これらのトランスジェニック動物、特にマウスは、例えば、強力で偏在する、もしくは組織型に対して選択的であるプロモーターの制御下で、またはウイルスの転写後に、この遺伝子のコピーをトランスフェクションすることにより得られる。
【００５７】
あるいは本発明のトランスジェニック動物は、LOXP/CREリコンビナーゼ系 (Rohlmann et al, 1996) またはこの遺伝子の発現を不活化するためのその他の任意の系を用いた不活化により、配列番号２もしくは配列番号５の配列のポリペプチドの１つをコードする遺伝子、またはその同種遺伝子を欠損させてもよい。
【００５８】
本発明の細胞および哺乳動物は、以下に記載する、本発明のポリペプチドを産生する方法に使用することができ、そしてまた、解析用のモデルとして使用してもよい。
【００５９】
上記形質転換された細胞または哺乳動物はまた、本発明のポリペプチドと、本発明のポリペプチドの活性に直接もしくは間接的に関与する化合物もしくはタンパク質化合物との間の相互作用を研究するためのモデルとして使用でき、これは関与する各種機構および相互作用を研究するためである。
【００６０】
それらは特に、補助因子もしくは阻害剤、特に競合阻害剤として、本発明のポリペプチド、特に本発明の配列番号２もしくは配列番号５の配列を有するタンパク質またはその変異体と相互作用する産物、あるいは本発明のポリペプチドの活性に関してアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を有する産物を選択するのに用いることができる。好ましくは、この形質転換細胞またはトランスジェニック動物は、モデル、特にこの遺伝子の異常な発現と関連する病状に対して戦うための産物を選択するためのモデルとして使用される。
【００６１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドと直接または間接的に相互作用でき、及び／又はこれらのポリペプチドの発現もしくは活性を調節しうる化学的もしくは生化学的化合物をスクリーニングするための、本発明の細胞、哺乳動物またはポリペプチドの使用に関する。
【００６２】
同様に、本発明は、in vitroもしくはin vivo で本発明の核酸と相互作用しうる化合物を、本発明の核酸、細胞もしくは哺乳動物を用いてスクリーニングし、候補化合物および本発明の核酸との複合体の形成を検出する方法にも関する。
【００６３】
こうして選択された化合物もまた本発明の主題である。
本発明はまた、組換えポリペプチドの合成のための、本発明の核酸の使用にも関する。
【００６４】
それ自体本発明に含まれる、組換え体の形態の本発明のポリペプチドを製造する方法は、形質転換細胞、特に本発明の細胞または哺乳動物を、本発明の核酸配列によってコードされる組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、この組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。
【００６５】
この製造方法を用いて得ることができる組換えポリペプチドもまた本発明の一部である。
上記のようにして得られた組換えポリペプチドは、グリコシル化形態でも非グリコシル化形態でもよく、そして天然の３次構造を有しても有していなくてもよい。
【００６６】
組換えポリペプチドの配列はまた、その溶解性、特に水性溶媒中での溶解性を改善するために改変されていてもよい。
例えば、疎水性ドメインの欠如や疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸での置換などの、かかる改変は当分野の技術者には既知である。
【００６７】
これらのポリペプチドは、当分野の技術者に既知の組換えポリペプチドの製造のための技術により、上記核酸配列を用いて製造できる。この場合、使用する核酸配列は、細胞性宿主におけるその発現を可能にするシグナルの制御下に置かれる。
【００６８】
組換えポリペプチドの製造のための有効な系は、本発明のベクターおよび宿主細胞を有することが必要である。
これらの細胞は、上記ベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いでこの細胞を、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を可能にする条件下で培養することにより得ることができる。
【００６９】
組換えポリペプチドを精製するのに使用される方法は、当分野の技術者に既知である。組換えポリペプチドは、細胞溶解液またはその抽出物から、あるいは培地上清から、分画、クロマトグラフィー法、特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いた免疫アフィニティー法などを単独であるいは組み合わせて使用する方法により精製することができる。
【００７０】
本発明のポリペプチドはまた、多数の既知のペプチド合成方法の１つを用いた化学合成、例えば固相を用いる方法 (特に、Stewart et al., 1984) または部分的固相を用いる方法、断片縮合、または溶液中の通常の合成により得ることもできる。
【００７１】
化学合成により得られ、対応する非天然のアミノ酸を含んでいてよいポリペプチドもまた本発明に含まれる。
本発明のポリペプチドを特異的に認識しうることを特徴とする、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、もしくはその断片、キメラ抗体または免疫複合体 (immunoconjugate)は本発明の一部である。
【００７２】
特異的ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチド、特に遺伝的組換えまたは通常の操作によるペプチド合成により製造されたポリペプチドで免疫された動物の血清から得ることができる。
【００７３】
本発明のある種のポリペプチド、変異体またはその免疫原性断片を特異的に認識する抗体の利点が特に言及される。
配列番号２または配列番号５の配列のポリペプチドを認識しうることを特徴とする、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、もしくはその断片、キメラ抗体または免疫複合体が特に好ましい。
【００７４】
特異的モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein (1975) により既報のハイブリドーマ培養の慣用方法により得ることができる。
本発明の抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体またはFab もしくはF(ab')2 断片である。それらはまた、検出可能な及び／又は定量可能なシグナルを得るために、免疫複合体または標識抗体の形態であってもよい。
【００７５】
本発明はまた、本発明の抗体を用いることを特徴とする、本発明のポリペプチドを検出及び／又は精製する方法に関する。
本発明は、本発明方法を用いて得られることを特徴とする精製ポリペプチドも含む。
【００７６】
さらに、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は、ポリペプチドの精製のための使用に加え、生物学的試料中のこれらのポリペプチドの検出にも使用できる。
【００７７】
従って、それらは、本発明ポリペプチド、特に配列番号２もしくは配列番号５の配列のポリペプチドまたはその変異体の特定組織部分上での発現の、例えば、免疫蛍光法、金標識及び／又は酵素的免疫複合体を用いる免疫細胞化学的または免疫組織化学的解析のための手段を構成する。
【００７８】
それらは特に、生物学的試料または組織中のこれらのポリペプチドの異常な発現を証明することを可能にする。
さらに一般的には、本発明の抗体は、正常なまたは突然変異した本発明ポリペプチドの発現を観察しなければならない任意の状況において有利に使用できる。
【００７９】
従って、生物学的試料を本発明の抗体に接触させる工程、および形成される抗原−抗体複合体を証明する工程を含む、生物学的試料中の本発明のポリペプチド検出方法も本発明の主題であり、またかかる方法を実施するためのキットもそうである。かかるキットは特に以下を含む。
a)本発明のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、
b)場合により、免疫反応に適した媒体を構成するための試薬、
c)免疫反応の間に生成する抗原−抗体複合体を検出する試薬。
【００８０】
本発明の抗体はまた、IBD1遺伝子またはIBD1prox遺伝子の異常な発現がみられる場合の、ヒトにおける炎症性及び／もしくは免疫性疾患、または癌の治療に使用できる。異常な発現とは過発現または変異したタンパク質の発現を意味する。
【００８１】
これらの抗体はヒト血清から直接得ても、本発明のポリペプチドで免疫した動物から得て、次いで「ヒト化」してもよく、そのままでも、あるいは上記疾患の治療のための医薬品の製造において使用してもよい。
【００８２】
本発明の核酸配列、ポリペプチドまたは抗体を用いることを特徴とする、対立遺伝子変動性、突然変異、欠失、ヘテロ接合性の消失、または本発明遺伝子の任意の遺伝的異常を決定する方法もまた本発明の一部である。
【００８３】
本発明は事実、炎症性及び／もしくは免疫性疾患、特に IBDに関与するIBD1およびIBD1prox遺伝子の配列を提供する。本発明の方法の１つは、これらの炎症性及び／もしくは免疫性疾患の１つに対応する表現型と関連する、これらの核酸またはポリペプチド配列における突然変異を特定することである。
【００８４】
これらの突然変異は本発明の核酸および配列 (ゲノム DNA、 RNAまたはcDNA) の解析により直接検出できるだけでなく、本発明のポリペプチドを介しても可能である。特に、突然変異を有するエピトープを認識する本発明の抗体を使用することにより、「健全な」タンパク質と「病状と関連する」タンパク質との間の区別をすることができる。
【００８５】
従って、以下の実施例により実証されるように、各種炎症性及び／又は免疫性のヒト疾患におけるIBD1遺伝子の検討により、この遺伝子の配列の変異がクローン病、潰瘍性大腸炎およびブラウ (Blau) 症候群に存在することが示される。これらの配列の変異は推定されるタンパク質配列においてかなりの変化をもたらす。事実、それらは重要な機能性ドメイン中のタンパク質の非常に保存された部位上に位置するか、短縮されたタンパク質の合成を生じる。従って、これらの有害な変化はタンパク質の機能の変化をもたらし、そしてこれらの疾患の発生において原因となる影響を及ぼす可能性が極めて高い。
【００８６】
これらの突然変異がみられる様々な疾患は、IBD1遺伝子が多くの炎症性及び／又は免疫性疾患において重要である可能性があることを示唆する。この結果は、第16染色体の動原体周囲領域が、各種ヒト疾患、例えば強直性脊椎炎や乾癬性関節炎、に対する罹病性に関与する遺伝子を含むとして報告された事実と比べるべきである。従って、IBD1遺伝子は多くの炎症性及び／又は免疫性疾患において重要役割をもつことが考えられる。
【００８７】
特に、IBD1は肉芽腫性の炎症性疾患に関与しうる。ブラウ症候群およびCDは事実、この系統の一部である疾患である。従って、IBD1遺伝子における変化は同じ系統のその他の疾患 (サルコイド症、ベーチェット病など) に関しても見出されるであろう。
【００８８】
さらに、アポトーシスに至る細胞経路におけるIBD1の関与は、その発癌性の役割の可能性の問題も提起する。実際、IBD1の調節異常は癌への素因となることが予想される。この仮説は、大腸癌の素因が炎症性腸疾患に存在するという事実により裏付けられる。IBD1は癌へのこの罹病性を一部説明でき、新しい発癌性経路を明かにしうる。
【００８９】
IBD1遺伝子で観察しうる突然変異の正確な記述により、この役割が実証される炎症性または免疫性疾患の分子診断 (molecular diagnosis)の基礎をきずくことが可能となる。この遺伝子での突然変異の検索に基づくかかるアプローチは、これらの疾患の診断への寄与、そして多分、侵襲性であり高価なある種の追加検査の量を減らすことを可能にするであろう。本発明はIBD1における突然変異の検索に基づくかかる分子診断の基礎をつくるものである。
【００９０】
炎症性疾患の分子診断はまた、これらの疾患の疾病分類学的分類を改善し、特定の疾患のサブグループをその臨床的特性、病気の進行性またはある種の処置に対する応答性によりより明確に規定することを可能にする。例えば、存在する突然変異を除去すると、10％以上炎症性腸疾患を発症する現在原因不明の型の大腸炎を分類することが可能となるかもしれない。かかるアプローチはそれぞれの患者に適した初期処置を提案することを可能にするであろう。一般的に、かかるアプローチは、最後には、治療用および予防用の手段を含む、各病気の遺伝的領域に応じたその病気の個別的処置を決定しうることが望める。
【００９１】
特に、患者からの生物学的試料を用い、遺伝子に相当する核酸配列の全部または一部を解析することにより、配列番号１または配列番号４に相当する遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在及び／又は発現の有害な変化が決定されることを特徴とする、炎症性疾患または癌の診断及び／又は予後の評価の方法が好ましい。
【００９２】
この診断及び／又は予後の評価方法は、予防的に (炎症性疾患または癌の素因の研究) 、あるいは患者の臨床状態を確立及び／又は確認するのに役立たせるために用いることができる。
【００９３】
好ましくは、炎症性疾患は消化管の炎症性疾患であり、そして癌は消化管 (小腸および大腸) の癌である。
本発明の教示により、消化管の炎症性疾患と連鎖不平衡を示し、従ってこの疾患と関連する突然変異を決定することが可能となる。
【００９４】
解析は、遺伝子の全部または一部を配列決定することにより、あるいは当分野の技術者に既知のその他の方法により行える。 PCR法に基づく方法、例えば点変異を検出可能にするPCR-SSCPが特に使用できる。
【００９５】
解析はまた、配列番号１、３、４または６の配列のものに対応する、本発明のプローブを DNAチップに連結し、これらのマイクロプレート上でのハイブリダイゼーションにより行ってもよい。本発明の配列を含む DNAチップもまた本発明の主題の１つである。
【００９６】
同様に、本発明のアミノ酸配列を含むタンパク質チップもまた本発明の主題である。かかるタンパク質チップは本発明のポリペプチドと、その他のタンパク質または化合物との間の相互作用を研究することを可能にし、従って、本発明のポリペプチドと相互作用する化合物をスクリーニングするのに有用である。本発明のタンパク質チップはまた、患者の血清中の本発明のポリペプチドに対する抗体の存在を検出するのにも使用できる。本発明の抗体を含むタンパク質チップも使用できる。
【００９７】
当分野の技術者はまた、遺伝子の発現の有害な変化を研究するための方法を、例えばmRNA (特にノーザンブロッティングまたはRT-PCR実験により) を本発明のプローブを用いて検討すること、あるいは特に本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、発現されたタンパク質を検討することにより行うことができる。
【００９８】
試験される遺伝子は、好ましくは配列番号１の配列をもつ遺伝子であり、罹病性の予測を意図する炎症性疾患は消化管の疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎である。癌の検出を意図する場合は、大腸癌が好ましい。
【００９９】
本発明はまた、以下の工程を含む、検出可能な表現型に関連するIBD1遺伝子の対立遺伝子を得る方法にも関する。
a)該検出可能な表現型を発現している個体から核酸試料を得る、
b)該核酸試料を、IBD1タンパク質をコードする核酸を特異的に検出しうる試薬に接触させる、
c)IBD1タンパク質をコードする該核酸を単離する。
【０１００】
かかる方法の次に、IBD1タンパク質をコードする核酸の全部または一部を配列決定する工程を行ってもよく、これは炎症性疾患または癌への罹病性を予測することを可能にする。
【０１０１】
IBD1タンパク質をコードする核酸を特異的に検出しうる試薬は、有利には、本発明のオリゴヌクレオチドプローブであり、これは改変されてもされていなくてもよい DNA、 RNAまたはPNA からなっていてよい。この改変は、放射性または蛍光標識を含むか、あるいは塩基間の結合における改変によるものでもよい (例えば、チオリン酸エステルまたはホスホン酸メチル) 。当分野の技術者は特定の DNA配列を単離するためのプロトコルは承知している。上記方法の工程b)は、上記増幅工程であってもよい。
【０１０２】
本発明はまた、本発明のプローブを生物学的試料と接触させる工程、および、前記ポリヌクレオチドと生物学的試料の核酸との間に形成された雑種を検出及び／又は解析する工程を含む、本発明の核酸を検出及び／又は解析する方法にも関する。
【０１０３】
当分野の技術者はかかる方法を行うことができ、特に以下を含む試薬キットを使用できる。
a)プローブとして使用される、本発明のポリヌクレオチド、
b)該プローブと生物学的試料の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬、
c)該プローブと生物学的試料の核酸との間に形成される雑種を検出及び／又は分析するのに必要な試薬。
【０１０４】
これもまた本発明の主題である。
上記キットは得られる結果の質を確実にするために、陽性または陰性対照を含んでいてもよい。
【０１０５】
しかし、本発明の核酸を検出及び／又は解析するためには、当分野の技術者は本発明の配列から選択されるプライマーを用いた増幅工程を行ってもよい。
最後に、本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、ベクター、細胞もしくは抗体から選択される化合物、または本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、医薬品としての化合物、特に、配列番号１または配列番号４に相当する遺伝子の少なくとも１つの突然変異の存在と関連する炎症性及び／もしくは免疫性疾患または癌、特に消化管の炎症性疾患、殊にクローン病または潰瘍性大腸炎、の予防及び／又は治療のための医薬品としての化合物にも関する。
【０１０６】
以下の実施例は本発明の利点をより明瞭に理解することを可能にするものであり、本発明の範囲を限定するものでないことは当然である。
【０１０７】
【実施例】
【０１０８】
【実施例１】
IBD1の微細位置決定
IBD1遺伝子の同定への最初の工程は、D16S409 とD16S419 の間に位置するマーカーD16S411 (Hugot et al., 1996 および図１) をまず中心にして、対象の遺伝子領域のサイズを狭めることである。一群の接近したマーカー (高解像度遺伝子地図) を、遺伝子領域をより明確に特定するために使用し、これにより遺伝的連鎖解析が完全になり、病気に関する遺伝的連鎖不平衡を検索できる。
【０１０９】
検討はCDに罹患した少なくとも２人の親族を含む78家族−これは 119の罹患した組に対応する−に関するものであった。UCに罹患した患者を含む家族はこの検討から除いた。
【０１１０】
26のマイクロサテライト型の遺伝的多型マーカーを検討した。これらのマーカーは一緒になって、対象遺伝子領域でマーカー間の平均距離が1cM 程度の高解像度の地図を作成した。検討したマーカーの特性を表１に示す。
【０１１１】
【表１】
0005150997.tif 000002
【０１１２】
各マーカーは国際命名法と、その大部分は発見した研究所により提案された名称により列挙されている。マーカーは染色体上の順序によっている (16p から16q)。マーカー間の遺伝的距離 (Crimapプログラムを用いて実験データから算出した、Kosambi センチモルガン単位) を第２欄に示す。１番目の多型マーカーを参照点としてランダムにとる。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)に用いたオリゴヌクレオチドを第３欄に示す。
【０１１３】
これらのマイクロサテライトマーカーの遺伝子型判定 (genotyping) は蛍光プライマーを用いた自動シークエンサー方法に基づいて行った。簡単に説明すると、増幅後、蛍光ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)産物を、製造者 (Perkin Elmer) の推奨に従い自動シークエンサーのポリアクリルアミドゲル上に載せた。各個人の対立遺伝子の大きさをGenescanR および GenotyperR ソフトウェアを用いて推定した。次いで、データを家系の表現型および遺伝的データを含む統合コンピューターに保存した。次いでそれらを遺伝的連鎖解析に用いた。
【０１１４】
遺伝型判定操作の間いくつかの品質管理を行った。
−遺伝子型判定用データの独立した２回の読み、
−各電気泳動での移行の内部対照として標準 DNAの使用、
−観察された各対立遺伝子の大きさの範囲の調節、
−メンデル遺伝誤差の検索、
−マーカー間の遺伝的距離の算出 (CRIMAPプログラム) およびこの距離と文献記載のデータとの比較、
−近いマーカー間の組換えが見られたマーカーの追加の型判定。
【０１１５】
遺伝子型判定用データを複数点での非パラメトリック遺伝的連鎖法 (GENEHUNTERプログラム、バージョン1.3)により解析した。マーカーシステムの有益さは検討した領域について80％より大きかった。マーカーD16S541 、D16S3117、D16S770 およびD16S416 では試験最大値 (NPL ＝3.33；P ＝0.0004) が得られた (図２) 。
【０１１６】
これらの26の多型マーカーの型判定用データはまた、伝達不平衡 (transmission disequilibrium)を検索するためにも解析された。CDに罹患した１人または２人以上の患者のいる108 家族および76の家族２つのグループを検討した。伝達不平衡の統計的試験はSpielman et al, (1993)により報告されている。本検討では、１家族につき１人の患者を考慮に入れ、ｐ値は、検討した各マーカーで試験した対立遺伝子の数により補正した。
【０１１７】
伝達不平衡はマーカーD16S3136の対立遺伝子４および５ (それぞれ、サイズは205 および207 塩基対) で見られた (それぞれp ＝0.05およびp ＝0.01) 。
マーカーD16S3136とCDとの間の関連を示唆するこれらの結果から、D16S3136を中心とする遺伝子領域の物理的地図を作成し、そしてこの多型部位を含む大きいゲノム DNAセグメント (BAC)の配列を確立することができた。次いで、D16S3136の領域でより多数の多型マーカーを同定および解析することができ、またこの領域に存在する転写配列の決定および検討も可能となった。
【０１１８】
【実施例２】
IBD1領域の物理的マッピング
マーカーD16S3136、D16S3117、D16S770 およびD16S416 を中心としたゲノム DNA断片のコンティグ (contig) をJean Dausset財団/CEPH のヒトゲノム DNAライブラリーから作製した。染色体 DNAセグメントを、微細遺伝子マッピングに用いたある種の多型マーカー (D16S411 、D16S416 、D16S541 、D16S770 、D16S2623、D16S3035、D16S3117およびD16S3136) に基づいて同定した。マーカー配列を含むクローンを探すために、各マーカーについて、細菌人工染色体 (BAC)ライブラリーを PCR法でスクリーニングした。試験される配列が BACクローンに存在するか否かにより、Segmapソフトウェア、バージョン3.35を用いてクローンを互いの間で統合することができた。
【０１１９】
当分野の技術者に既知の方法 (Rouquier et al., 1994; Kim et al., 1996; Asakawa et al., 1997)により、対象の遺伝子領域をカバーする連続的統合 (コンティグ) を BACについて確立することができた。これを行うために、同定した BACの末端を配列決定し、次いでこれらの新しい配列データを使用して、繰り返し BACライブラリーをスクリーニングした。次いで、各スクリーニングにおいて、重複したクローンの連続体が得られるまで、１つずつ BACコンティグが進んだ。コンティグに寄与する各 BACの大きさは、バルスフィールドアガロースゲル上の移行プロフィールから推定された。
【０１２０】
このようにして、コンティグの各点で平均 5.5 BACの重複を有する、101 BAC を含み、2.5 Mbより長い全距離にわたって伸びる BACコンティグを作製した。 BACの平均サイズは 136 kb である。
【０１２１】
【実施例３】
BAC hb87b10 の配列決定
大きさ163761bpの、多型マーカーD16S3136を含むこのコンティグの BAC (hb87b10 と称する) を「ショットガン」法により配列決定した。簡単に説明すると、 BAC DNAを超音波処理により断片化した。こうして得られた DNA断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、1.5 kbより大きいサイズの断片を溶出して分析した。次いで、これらの断片を m13ファージ中にクローン化し、それ自身を電気穿孔により、コンピテントにされた細菌へ導入した。培養後、クローンの DNAを回収し、自動シークエンサーで、 m13ベクターの蛍光プライマーを用いた自動配列決定方法により配列決定した。
【０１２２】
平均サイズ600 bpの1526の異なる配列が作製され、これをPolyphredphrapR ソフトウェアを用いて互いに統合して、全 BACをカバーする配列コンティグが得られた。こうして得られた配列は、平均5.5 ゲノム当量の重複を有していた。 m13クローンライブラリー中に現れない稀少 (n ＝５) 配列ギャップを、これらのギャップの一方の側で、特異的 PCRプライマーを作製し、健全な個体のゲノム DNA由来の PCR産物を解析することにより充填した。
【０１２３】
公開の遺伝子データベース (Genbank)で入手しうる配列を有する相同の配列を探した。この 163kbの領域では既知の遺伝子は同定されなかった。いくつかの ESTを位置決定し、これは未知の遺伝子がこの配列中に含まれることを示唆した。公開の遺伝子データベース (Genbank, GDB, Unigene, dbEST) 由来のこれらの ESTは次の参照番号を有していた：AI167910, AI011720, Rn24957, Mm30219, hs132289, AA236306, hs87296, AA055131, hs151708, AA417809, AA417810, hs61309, hs116424, HUMGS01037, AA835524, hs105242, SHGC17274, hs146128, hs122983, hs87280およびhs135201。GRAIL コンピュータープログラムを用いた推定エキソンの検索により、いくつかのありうるエキソン、ポリアデニル化部位およびプロモーター配列の同定を行うことができた。
【０１２４】
【実施例４】
伝達不平衡の検討
12の二対立遺伝子性 (biallelic)多型マーカー (SNP)を約 250kbの範囲の、 BAC hb87b10を中心とする領域において同定した。これらの多型は10人程度のCDに罹患した無関係の患者の配列を解析することより得られた。配列決定は、 BACに位置する既知の ESTまたはその領域で主に行った。GRAIL コンピュータープログラムにより予測される推定エキソンも解析した。このように同定された多型マーカーの特性を表２に示す。
【０１２５】
【表２】
0005150997.tif 000003
【０１２６】
AS-PCR: 対立遺伝子特異的PCR ； LO:  オリゴヌクレオチドの連結
この検討で新たに報告された12の二対立遺伝子性多型マーカーをこの表に挙げる。そのそれぞれについて以下のことが示される。
−遺伝子座 (欄Ｉ）
−名称（欄II)
−使用した遺伝子型判定法 (欄III)
−使用可能な制限酵素 (欄IV)
−ポリメラーゼ連鎖反応または連結に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー (欄Ｖ）
−型判定の間に予測された産物の大きさ (欄VI)
CDに罹患した１人またはそれ以上の患者を含む 199家族を、これらの12の多型マーカーについて、また BAC hb87b10に位置するマーカーD16S3035およびD16S3136についても型判定した。UCに罹患した病人を含む家族は考慮に入れなかった。検討された多型の型判定のための方法は、多型の種類により異なり、以下の方法を用いる。
−多型が酵素による切断部位上にある場合にはPCR-RFLP法 (増幅、次いでPCR 産物の酵素的切断)
−多型部位に特異的なプライマーを用いる PCR法：各対立遺伝子に特異的なプライマーを用いる２つの対立遺伝子の差別的 (differential) 増幅
−オリゴライゲーション (oligoligation)試験：各対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いる差別的ライゲーション、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動
次いで、型判定用データを伝達不平衡試験を用いて解析した (GENEHUNTERソフトウェア、バージョン２の TDTコンピュータープログラム) 。数人の罹患した親族を含む家族について、１人の患者のみを解析のために考慮した。事実、もし数人の血縁関係のある患者を考慮すると、統計計算においてデータの非独立性の問題を生じ、試験値の膨張を生じ得る。解析に用いた患者は、自動無作為化操作を用いて各家族内でロットで引き抜かれた。この無作為化により、得られる統計試験の値は検討した家族のグループからのただ１つの可能なサンプルを表した。解析をこの１つの可能なサンプルに限定しないように、かつ得られる結果の有効性をより明瞭に理解するために、各試験において約100 の無作為サンプルを得て解析した。
【０１２７】
マーカーは別々に検討し、次いでその染色体セグメント上での順序により分類した (KIAA0849ex9(遺伝子座１) 、hb27G11F (遺伝子座２) 、Ctg22Ex1 (遺伝子座３) 、SNP1 (遺伝子座４) 、ctg2931-3ac/ola(遺伝子座５) 、ctg2931-5ag/ola(遺伝子座６) 、SNP3-2931(遺伝子座７) 、Ctg25Ex1 (遺伝子座８) 、CTG35ExA (遺伝子座９) 、ctg35ExC (遺伝子10) 、d16s3136 (遺伝子11) 、hb133D1f (遺伝子12) 、D16S3035 (遺伝子座13) 、ADCY7int7(遺伝子14)(表２) 。従って、２、３および４の連続したマーカーを含むハプロタイプも同じ手法( 各家族について１人の患者を取り出す、100 の無作為サンプル) を用いて解析した。
【０１２８】
試験した各サンプルにつき、少なくとも10の親染色体に保持される遺伝子型 (またはハプロタイプ) のみが考慮された。従って、平均して 250の異なる試験を各サンプルにつき行った。次いで、各有意な閾値に対して陽性であると期待される試験数を推定することおよびこの分布を観察される分布と比較することができた。健常人については、試験の分布は無作為基準で期待されるものと違いはない (χ2 ＝2.85、ddl ＝４、ｐ＝0.58) 。一方、患者の場合は陽性試験が過剰であり、これは検討領域中の伝達不平衡を反映している。
【０１２９】
別々に考慮された各多型マーカーについての、または最も強い伝達不平衡を示すハプロタイプについての伝達不平衡試験の結果は、次のマーカーおよび疾患が連鎖不平衡であることを示した：Ctg22Ex1 (遺伝子座３) 、SNP1 (遺伝子座４) 、ctg2931-5ag/ola(遺伝子座６) 、SNP3-2931(遺伝子座７) 、Ctg25Ex1 (遺伝子座８) 、ctg35ExC (遺伝子10) 。これらのマーカーは約50kbの範囲にわたる (hb87b10 の配列上の74736 〜124285位) 。
【０１３０】
クローン病と最も強く関連しているハプロタイプもそれ自身この領域にわたる。従って、大部分の無作為サンプルにとって、伝達試験 (transmission test)は、以下のマーカーを結合しているハプロタイプに対して陽性 (ｐ＜０．０１）であった。
−遺伝子座５−６、遺伝子６−７、遺伝子座７−８、遺伝子座８−９、遺伝子座９−10、遺伝子10-11
−遺伝子座５−６−７、遺伝子６−７−８、遺伝子座７−８−９、遺伝子座８−９−10、遺伝子９−10-11
−遺伝子座５−６−７−８、遺伝子６−７−８−９、遺伝子座７−８−９−10
罹病率の最もリスクが高いハプロタイプは遺伝子座７〜10により規定される。これはハプロタイプ1-2-1-2(表２) である。
【０１３１】
試験したマーカーは予想通り、互いに連鎖不平衡である。
より最近では、2000年６月に発行された (Martin et al., 2000) Pedigree Disequilibrium (家系不平衡) 試験が、 TDTコンピュータープログラムを用いて得られた結果の意味をより明確に理解するために用いられた。この新しい統計学は、実際、ある家族における患者および健常人の両方から得られる情報をすべて利用することを可能にし、各家族に対して統計全体における各親族の重要性と釣り合うことを可能にする。 PDT試験に対応し、クローン病に罹患した１人またはそれ以上の親族をもつ 235の家族の拡大されたグループから得られたｐ値は表３に示される。この新しい解析法により、 BAC hb87b10の領域は実際クローン病に関連することが確認される。
【０１３２】
【表３】
0005150997.tif 000004
【０１３３】
【実施例５】
IBD1遺伝子の同定
BAC hb87b10に存在する公開された ESTグループ (Unigene 参照番号：Hs135201, Hs87280, Hs122983, Hs146128, Hs105242, Hs116424, Hs61309, Hs151708, Hs87296 およびHs132289) をより完全な相補的DNA (cDNA)の配列の検索のために検討した。IBD1proxについては、公開のライブラリーで入手可能なクローンを配列決定し、配列を互いに統合した。IBD1については、末梢血の相補的 DNAライブラリー (Stratageneヒト血cDNAλzapexpress ref 938202)を製造者の提案する方法によって既知の ESTから作製した PCR産物でスクリーニングした。次に、こうして同定されたcDNAを、示されたcDNAが得られるまで、cDNAライブラリーなどをさらにスクリーニングするために使用した。
【０１３４】
EST hs135201 (UniGene)により、利用しうる遺伝子データベース (Genbank)にないcDNAの同定が可能となった。従って、これは新規なヒト遺伝子に対応する。cDNAおよびゲノム DNAの配列の比較により、この遺伝子は11のエキソンと10のイントロンからなることが分かった。同定したcDNAの5'に位置する、追加のエキソンがGrail プログラムでの配列解析により予測される。これらのエキソンはCARD4/NOD1遺伝子の第１のエキソンと非常に相同性である。同定されたエキソンすべてと推定の追加のエキソンを考慮すると、この新規な遺伝子はCARD4/NOD1と非常に近いゲノム構造を有するようである。さらに、転写開始部位は第１の推定エキソンの上流に現れる。これらのすべての理由により、推定エキソンはこの新規遺伝子に寄与していると考えられた。従って、添付書類 (配列番号１) に示したcDNAは、同定した配列全部に加え、コンピューターモデリングにより予測された配列を含み、この相補的DNA は予測されたコーディング配列の最初の ATGコドンでランダムに開始する。従って、これに基づき、この遺伝子は12のエキソンと11のイントロンを含むであろう。この遺伝子のイントロン−エキソン構造は配列番号３に報告されている。
【０１３５】
ヌクレオチド配列から推定されるタンパク質配列は 1041 のアミノ酸を含む( 配列番号２) 。この配列は生物学データベース (Genpept, pir, swissprot)のいずれにも見出されない。
【０１３６】
これまで、上記推定エキソンを確認することはできなかった。従って、IBD1遺伝子は事実上、11のエキソンと10のイントロンのみを含み、1013のアミノ酸 (即ち、最初に決定されたよりも28アミノ酸少ない) のタンパク質をコードする。
【０１３７】
推定タンパク質配列の検討により、この遺伝子は３つの異なる機能性ドメインを含むことが示される (図３) 。
−アポトーシスおよびNFkappa B 経路の活性化を調節するタンパク質間の相互作用に関わることが知られているCARDドメイン (Caspase Recruitment Domain、カスパーゼ加入ドメイン) 。このCARDドメインにより、この新規なタンパク質をCARDタンパク質ファミリーに分類することが可能となる。このファミリーの最も知られたメンバーはCED4, APAF1 およびRICKである。
−ATP-認識部位およびマグネシウム結合部位を含む NBDドメイン (Nucleotide-Binding Domain 、ヌクレオチド結合ドメイン) 。従って、このタンパク質は多分キナーゼ活性を有するはずである。
−その他の既報のタンパク質ドメインとの類似性により、タンパク質間の相互作用に関与すると推測される LRRドメイン (Leucine-Rich Domain 、ロイシンに富むドメイン) 。
【０１３８】
さらに、このタンパク質の LRRドメインにより、このタンパク質が細胞内シグナリングに関与し、植物にも動物にも存在するタンパク質のファミリーに入ることが可能となった。
【０１３９】
この新規な遺伝子と、これまで同定された公開のデータベースで利用可能な遺伝子とを比較すると、この遺伝子がCARD4/NOD1 (Bertin et al., 1999; Inohara et al., 1999)と非常に相同性であることが分かる。この相同性は相補的 DNAの配列、遺伝子のイントロン−エキソン構造およびタンパク質配列に関する。２つの相補的 DNAの配列同一性は58％である。類似性はイントロン−エキソン構造のレベルでもみられる。タンパク質レベルでの配列の相同性は40％のオーダーである。
【０１４０】
この新規遺伝子とCARD4/NOD1との間の類似性は、IBD1タンパク質は、CARD4/NOD1と同じく、アポトーシスおよびNF-kapp B (Bertin wt al., 1999; Inohara et al., 1999) 活性化の調節に関与していることを示唆する。細胞のアポトーシスおよびNF-kappa Bの活性化の調節は免疫反応において必須の細胞内シグナリング経路である。具体的には、これらのシグナル伝達経路は、細胞−細胞相互作用および炎症の各種メディエーター (サイトカイン) に対する細胞応答に関与する TNF (Tumor Necrosis Factor 、腫瘍壊死因子) 受容体ファミリーのタンパク質のエフェクター経路である。従って、この新規遺伝子は一般的に炎症性反応において重要である可能性がある。
【０１４１】
いくつかの立証が、クローン病におけるNF-kb の細菌誘導性の脱制御 (deregulation) を支持している。まず、マウスにおける IBDの自然発生的罹病性は、 LRRドメインを介して LPSに結合しており (Poltorak et al., 1998 およびSundberg et al, 1994) 、NF-kB ファミリーのアクチベーターの一員であることが知られている分子、Tlr4における突然変異と関連していた。第２に、抗生物質での治療はCDに罹患した患者において一時的改善を生じるが、これは腸内細菌がクローン病の病因としての役割を果たしているという仮説 (McKay, 1999)を支持する。第３に、NF-kB は炎症性腸疾患において中枢的役割を果たし、クローン病では基底膜単核細胞において活性化される (Schreiber et al., 1998) 。第４に、クローン病の治療はNF-kB 阻害剤として知られているスルファサラジンおよびグルココルチコイドの使用に基づく (Auphan et al., 1995 およびWahl et al., 1998)。
【０１４２】
さらにより最近、IBD1候補遺伝子がCED4/APAF1スーパーファミリーの一員であるNOD2に非常に似たタンパク質コードすることが示された (Ogura et al., 2000) 。IBD1およびNOD2のヌクレオチドおよびタンパク質配列は実際、２つの既報の配列の開始の小部分で異なるのみである。さらに、Nod2およびIBD1の組織発現は重なり得る。従って、これらの２つの遺伝子 (タンパク質) は同一であると考えられる。Nod2の LRRドメインは細菌のリポ多糖類 (LPS)に対する結合活性を有し (Inohara et al., 2000) 、そしてその欠失はNFkB経路を刺激することが実証された。この結果は本発明のデータを確認するものである。
【０１４３】
次いで、IBD1の組織発現をノーザンブロッティングにより検討した。ほとんどのヒト組織において4.5 kbの転写物がみられた。転写物の大きさはcDNAにより予測された大きささと一致する。この4.5 kbの添加物は小腸および大腸では極めて少ないようである。一方、これは白血球細胞では非常に強く発現される。これは、クローン病が循環している免疫細胞と関連する疾患である可能性があることを示唆する、移植での臨床データと合致する。事実、腸移植はクローン病における移植物での再発を防止しないが、一方骨髄移植はこの病気の進行に対しよい影響を与える。
【０１４４】
また、データは選択的スプライシングに注意を向けさせる。これは炎症性疾患の進行においてある役割を果たしうる突然変異の発生の可能性において、重要な要素であると判明するかもしれない。
【０１４５】
IBD1遺伝子のプロモーターは現在正確には同定されていない。しかし、非常に多くの遺伝子との類似性により、このプロモーターは少なくとも一部、この遺伝子のすぐ上流、その5'部分に存在すると考えるのが合理的である。この遺伝子領域は、 EST (HUMGS01037, AA835524, hs.105242, SHGC17274, hs.146128, hs.122983, hs.87280) の存在により証明されるように、転写される配列を含む。これらの配列を含むATCCクローンを実験室で配列決定および解析し、選択的スプライシングを伴うかもしれないエキソンおよびイントロンの構成を実証できた。これらのデータは別の遺伝子 (IBD1の近傍にあることからIBD1proxと命名された) の存在を示唆する。IBD1proxの相補的 DNAの部分的配列を記載する (配列番号４) 。これは配列番号６上のイントロン−エキソン構造である。
【０１４６】
IBD1proxに対応するcDNAの翻訳により、ホメオボックスを含むタンパク質が得られる。しかし、この遺伝子のいくつかのcDNAの解析では選択的スプライシングの存在が示唆される。可能な選択的スプライシングの１つによれば、IBD1proxはアノニマス EST HUMGS01037 に対応し、その RNAは未分化系列よりも分化した白血球系列においてより強く発現される。
【０１４７】
従って、この遺伝子が炎症および細胞分化においてある役割を有する可能性がある。よって、それ自身もまた IBDの罹病性に対するよい候補であると考えられる。CDと、IBD1proxのコーディング配列上に位置する多型ctg35ExCとの間の関連は、この多型がタンパク質レベルで何らの配列変化も生じないにもかかわらず、この仮説を支持する。
【０１４８】
最後に、より最近、クローン病に罹患し、IBD1遺伝子に何の突然変異も含まない家族での遺伝的連鎖の存在それ自身も、IBD1proxがIBD1に加え、この病気の遺伝的素因においてある役割を有していることを示唆している。
【０１４９】
IBD1とIBD1proxとの間の機能的関係は現在確立されていない。しかし、この２つの遺伝子がかなり近接していることはそれらの間の相互作用を反映するかもしれない。この場合、これらの遺伝子の「頭−尾」の位置関係は、それらが共通または互いに依存する調節方法を有するかもしれないことを示唆する。
【０１５０】
【実施例６】
炎症性疾患におけるIBD1遺伝子突然変異の同定
炎症性疾患におけるIBD1の役割を確認するために、この遺伝子のコーディング配列およびイントロン−エキソン結合部を、無関係の70人、即ち、CDに罹患した50人の患者、UCに罹患した10人の患者、ブラウ症候群に罹患した１人の患者および健常人９人において、エキソン２からエキソン12まで配列決定した。検討した患者はほとんどが家族性型のこの病気であり、伝達不平衡研究により明かになった罹病性ハプロタイプの保持者であることが多い。
【０１５１】
こうして、この血縁関係のない70人のグループにおいて24の変異配列を同定した (表３) 。
報告される突然変異の命名は、1041のアミノ酸を含むタンパク質の最初の配列に関する。より最近提案された命名法は、最初の配列から28のアミノ酸を除くことによって容易に推定でき、従って、1013アミノ酸を含むタンパク質に対応する (実施例５参照) 。
【０１５２】
【表４】
0005150997.tif 000005
【０１５３】
各エキソンに見られるサイレント突然変異以外の突然変異を記載する。それらはペプチド鎖における変異により示されている。検討した各突然変異および各表現型について、突然変異が見られた回数を試験した染色体の数に関連させて示す。
【０１５４】
機能的な変異配列はエキソン１〜３ (タンパク質のCARDドメインに対応) においては同定されなかった。エキソン７および12もまた配列の変異を示さなかった。ある種の変異は、既に同定され、伝達不平衡検討で型判定された多型に相当する、すなわち、
−Snp3-2931:  ヌクレオチド変異 T805C、タンパク質変異 S269P
−ctg2931-5ag/ola:ヌクレオチド変異 T1380C ( サイレント)
−ctg2931-5ac/ola:  ヌクレオチド変異 T1746G(サイレント)
−SNP1: ヌクレオチド変異 C2107T 、タンパク質変異 R703W
いくつかの変異配列はサイレントであり (G417A, C537G, C1284A, C1287T,T1380C, T1764G およびC2928T) 、タンパク質配列の変化は何らもたらさない。それらはここではこれ以上検討しなかった。
【０１５５】
16の非サイレント配列変異については、タンパク質配列変異が43/50 CDにおいて見られ、健常者対照では5/9 であり、また6/10 UC であった。１または２以上の配列変異の存在は、CD表現型と関連するようであった。いくつかの配列変異はCDに罹患した同じ個人においてしばしば存在し、これはCDに対する遺伝子の時による劣性効果を示唆する。これに反し、UCに罹患した患者または健常人の対照では複合ヘテロ接合体またはホモ接合体は見られなかった。
【０１５６】
いくつかの非サイレント変異がUCまたはCDに罹患した患者および健常人の両方に存在した。それらはエキソン２、４および９に位置する変異S269P, N290S, R703W およびV956I であった。従って、これらの配列変異に対して可能な機能的役割を選択する前にさらなる情報が必要なようである。
【０１５７】
V956I は保存的 (conservative) 配列変異 (脂肪族アミノ酸) である。
配列変異S269P はヌクレオチド結合ドメインの最初におけるアミノ酸の種類の変化 (イムノ酸 (immuno acid)へヒドロキシル化) に相当する。この配列変異およびCDは伝達不平衡にある。事実それは多型Snp3である (上記参照) 。
【０１５８】
R703W はアミノ酸の種類の改変をもたらす (塩基性の代わりに芳香族) 。この改変は、IBD1とCARD4/NOD1の間の保存領域である、 NBDおよび LRRドメインの間の中間領域に生じる。これは従って、この多型には機能的役割が推測される。この配列変異 (多型部位Snp1に対応) はCDに罹患した患者にランダムな場合よりも多い頻度で伝達され (上記参照) 、このことはこの多型がCDと関連していることを確かにする。健常人にこの突然変異体が存在することは、慢性炎症性腸疾患などの複合遺伝病について予測されるように突然変異の不完全な浸透を反映する。
【０１５９】
R703W のすぐ隣に位置する変異R704C はCDおよびUCの両方において同定できた。それはまた、それ自身、同じタンパク質領域でのタンパク質の非保存的 (nonconservative)変異 (塩基性アミノ酸の代わりに硫黄含有アミノ酸) に対応し、このことはR703W に対すると同じ程度に重要なR704C に対する機能的効果を示唆する。
【０１６０】
その他の配列変異はCD、UCまたはブラウ症候群に特異的である
逆に、いくつかの配列変異は稀であり、１人または数人の患者に存在する (A613T, R704C, E844K, N853S, M864V, A919D) 。それらは常に、ロンシンに富む領域の、これらの領域内で重要な位置にタンパク質の非保存的改変を生じる変異である。これらの各種要素は、これらの変異が機能的役割を有することを示唆する。
【０１６１】
配列変異 (G909R および L1008P * ) は極めて多くのクローン病で見出され (それぞれ7/50および16/50)、一方それらは対照またはUCに罹患した人において検出されない。
【０１６２】
コドン1008のグアノシンの欠失／挿入は、最後の LRRのαヘリックスの３番目のロイシンをプロリン (終止コドンが続く) に変化させる結果となる (L1008P* ) 。従って、この配列変異はタンパク質の重要な改変を生じさせる：タンパク質の大きさの減少 (短縮 LRRドメインを有するタンパク質) および高度に保存されたアミノ酸 (ロイシン) の変化。この配列変化は、この突然変異を有する16家族での伝達不平衡の検討 (p ＝0.008)により立証されたように、CDと関連している。
【０１６３】
突然変異G909R は６番目の LRRモチーフの最後のアミノ酸に生じる。それは脂肪族アミノ酸を塩基性アミノ酸で置換するものである。この変異は、ロイシンに富むモチーフ (IBD1およびNOD1/CARD4の両方について) の末端位置におけるアミノ酸の通常中性または極性の性質、およびIBD1およびNOD1/CARD4タンパク質のアミノ酸の保存された性質を考慮すると重要である可能性がある。
【０１６４】
ブラウ症候群では、検討した家族の患者 (ｎ＝２）は、エキソン４に位置し、タンパク質の NBDドメインに対応する特定の配列変異 (L470F)を保持していた。この系列では、この配列変異はブラウ症候群に特異的であった。
【０１６５】
UCでは、健常人に見出されなかったいくつかの配列変異も同定された。突然変異を有する病人の割合は、IBD1とUC間のあまり強く確立されていない連鎖と、後者の疾患のおそらく低い遺伝性を考慮して予測されるように、CDに関するよりも小さい。配列変異はCDに対しておよびUCに対して共通である (R703W, R704C) 。逆に、その他はUCに対して特異的であるようであった (V794M)。この観察により、CDとUCは、少なくとも一部同じ遺伝的素因を共有する疾患であることが確認できる。これは IBDに対する疾病分類学の基礎を築く。
【０１６６】
このように、IBD1遺伝子の配列変異の検討により、かなり可能性のある機能的効果 (例えば、短縮タンパク質) を有し、クローン病、UCおよびブラウ症候群と関連するいくつかの変異を同定することが可能となった。
【０１６７】
この遺伝子のプロモーターは現在決定されていない。しかし、多分、この遺伝子の上流の5'領域に位置するであろう。この仮説によれば、この領域に見出された配列変異は機能的効果を有するかもしれない。これは、CDとある種の多型遺伝子座 (ctg35ExCまたはCtg25Ex1など) との間の非常に強力な関連を説明できる。
【０１６８】
従って、本発明はヒトにおいてCARDドメインを含有する遺伝子ファミリーにおける突然変異を最初に記載するものである。各種の炎症性疾患におけるこれらの突然変異の頻度は、IBD1遺伝子が正常および病的な炎症過程において必須の役割を果たすことを示す。本発明は、正常および病的な炎症過程の生理病理学の分野での理解および研究の新規な方法を提供する。その結果、IBD1により制御されるエフェクター経路を調節し、炎症性疾患の治療および一般的炎症過程の調節に有用な新規な薬剤分子の開発を考えることが可能になる。
【０１６９】
【実施例７】
クローン病の罹病性の生物学的診断のための基礎
より最近、クローン病に罹患した 457人の独立した患者、潰瘍性大腸炎に罹患した 159人の独立した患者および対照となる健常な 137人を、突然変異の検索において検討した。この検討により、これまで報告された突然変異を確認し、そして図４に報告される追加の突然変異を同定することができた。次いで、主要な突然変異を、クローン病に罹患した 235家族において遺伝子型の判定を行った。このより最近の研究は、参照として、より短いタンパク質配列 (1013アミノ酸、実施例５参照) を用いて報告されるが、従来の突然変異の命名は、アミノ酸の位置を示す数に28足すことによりこれから容易に推定される。
【０１７０】
５つの最もよくみられる突然変異の中で、保存的突然変異V981I ( 以前はV956I)は炎症性腸疾患の１つまたはその他とはあまり関連しておらず、従って、この疾患に重要な役割を果たしているようにはみえない。
【０１７１】
変異S241P(以前はS269P)はその他の主要な突然変異と連鎖不平衡にあり、それ自身は、炎症性腸疾患の罹病性において重要な役割を果たしているようではない (データは示さず) 。
【０１７２】
逆に、その他の３つの突然変異、R675W(以前はR703W)、G881R(以前はG909R)および980fs(以前はL1008P* ) はクローン病と顕著に関連するが、潰瘍性大腸炎とは関連しない (下記参照) 。 LRR中の、またはその中程度近傍での、３つのよくみられる突然変異の位置は、多分、変異したタンパク質によるNFkBの負の調節における欠損を介する、このタンパク質ドメインが関与する作用機構を非常に有利に説明する。その他の突然変異はもっと稀である (図４) 。これらの累積突然変異はクローン病に罹患した人では17％存在するのに対し、健常人および潰瘍性大腸炎に罹患した人ではそれぞれ４％および５％である。非常に多数の稀少突然変異も LRRに存在する。
【０１７３】
クローン病において最もよくある３つの多型の家族内検討により、この３つはすべてこの疾患に関与していることが示される (表５) 。予想通り、非常に有害であると考えられる突然変異については、最も強く関連している多型は短縮性の突然変異である。これら３つの突然変異の１つより多くを有する染色体を 235家族において同定することができなかったので、これらの３つの多型は独立して、クローン病と関連している。これらの関連の独立性は、IBD1遺伝子はクローン病の遺伝的素因に明らかに関与しているという仮説をかなり支持する。
【０１７４】
【表５】
0005150997.tif 000006
【０１７５】
患者−対照検討により、この関連が確認される (表６) 。それらは、クローン病に最もよくある突然変異は潰瘍性大腸炎ではあまりみられないことを示す。
【０１７６】
【表６】
0005150997.tif 000007
【０１７７】
これらの突然変異の用量−効果の検討により、ホモ接合体または複合ヘテロ接合体の状態で突然変異を有する人は、これらの突然変異をもたないかヘテロ接合体の状態である人よりこの疾患を発症する危険が非常に大きいことが示される (表７) 。
【０１７８】
【表７】
0005150997.tif 000008
【０１７９】
集団全体では、0.001 というクローン病の危険率を参照として採用し、突然変異がHardy-Weinberg平衡にあることが推定された。
上記検討により、以前の予備的データが確認され、IBD1変異を検討することによる、クローン病の生物学的診断の詳細な基礎が提供される。事実、この検討は、
1)混血のカフカス人集団においては0.001 より大きい頻度の突然変異を明かにし、
2)観察された突然変異の頻度を決定し、クローン病に関連する３つの主要突然変異を決定することを可能にする。従って、この検討により、疾患性の変異の検索のために遺伝子を検討するための方策を決定できる：即ち、まず３つの主要な突然変異を型判定し、第２に最後の７エキソンの突然変異を検索し、第３に、その他の配列変異を検索する。
3)これらの突然変異をその位置および性質を指摘することにより検索するための実用的様式を明かにする。事実、次いで、当分野の技術者がその個人的専門技術により型判定および配列決定方法を発展させることは容易である。特に、 PCR、次いで酵素的切断および電気泳動、dHPCL 、DGGEまたはSSCPによる移行プロフィールの検討、オリゴライゲーション、微細配列決定などにより、３つの主要な突然変異の遺伝子型を判定する可能性が挙げられる。
4)この拡大し変化した集団では同じ染色体上に見られない最もよくある突然変異の独立性を実証する。この情報により、２倍量の遺伝子内変異の保持者として複合ヘテロ接合体 (２つの突然変異を有する) である人を確実に分類できる。
5)大部分の突然変異は潰瘍性大腸炎のリスクに全くあるいは小さな影響を及ぼすだけであることを実証する。この結果から、この２つの疾患の間の差別的診断において臨床医科の助けとなることを予想できる。実際、約10％の患者において炎症性腸疾患は生物学的、放射線医学的および内視鏡的検査にもかかわらず、未分類のままである。
6)最もよくみられる遺伝子型に対して病気の相対的および絶対的リスクを明かにする。この結果は、リスクのある集団、特に患者の親族において予防的監視および介入のアプローチにおいて有用である可能性のある、予測的診断の基礎を築く。
7)IBD1遺伝子の用量−効果の存在を実証し、クローン病の遺伝的素因が一部劣性であることを確認する。従って、遺伝相談および家族内前臨床診断のための基礎を築くことができる。
【０１８０】
最後に、 NBDドメインの追加の突然変異がブラウ症候群を有する第２の家族において単離されたことに注意すべきである。２つの異なる家族での２つの事象が稀であることは、この遺伝子がブラウ症候群および一般的肉芽腫性疾患に関与していることを確認するのに十分である。
【０１８１】
これらのデータはすべて、日常的実施において実施者にとって直接応用でき、有用である診断手段を提供する。
IBD1のプロモーター領域に位置し、その部分的配列が本発明に開示されているIBD1prox遺伝子もまた、免疫系の成熟細胞の差別的発現により示唆されるように、それ自身、細胞アポトーシスおよび炎症性過程の調節において重要な役割を有しているかもしれない。ここで報告された、多型マーカーctg35ExC (この遺伝子の転写される領域に位置する) とクローン病との間の強い関連もこの仮説を非常に強く支持する。
【０１８２】
炎症性腸疾患は、これまで罹病性遺伝子が確実には同定されていなかった複合遺伝病である。本発明は、ポジショナルクローニング (または逆遺伝学) のアプローチを用いて、クローン病の罹病性に対する最初の遺伝子を同定することを可能にした。これは、複合遺伝病に対するかかるアプローチを用いて得られた最初の遺伝子位置決定であり、少なくとも複合遺伝病のある種の患者でその有用性および実施可能性を実証する。
【０１８３】
本発明はまた、配列番号２および配列番号５から選択されたタンパク質の少なくとも 200のアミノ酸の連続断片を含むポリペプチドをコードすることを特徴とする、精製または単離された核酸に関する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第16染色体の動原体周囲領域におけるクローン病のための非パラメトリックの遺伝的連鎖試験 (Hugot et al., 1996による) 。第16染色体の動原体周囲領域のマーカーの家系による同一性に基づく複数点での連鎖解析。マーカー間の遺伝的距離はCRIMAPプログラムを用いて推定された。ロッドスコア (MAPMAKER/SIBS)を左側の図に示す。２つの仮確率試験を開発し、右側の図に示した。１番目 (Tz) は平均の試験に類似している。２番目 (Tz2)は２つの対立遺伝子を共有する罹患した組の割合の試験に類似する。
【図２】  複数点の非パラメトリックの遺伝的連鎖解析。クローン病に罹患した数人の親族をもつ78家族を、第16染色体の動原体周囲領域の26の多型マーカーについて遺伝子型決定した。各マーカーの位置は矢で表した。マーカーの順序およびそれらの間の距離はCrimapソフトウェアを用いた実験データの解析による。曲線の下の矢は発表された最初の研究 (Hugot et al., 1996) に用いられたマーカー SPN、D16S409 およびD16S416 を示す。図の上部にある矢は、遺伝的連鎖試験の最大に位置するマーカーD16S3136、D16S541 、D16S3117、D16S416 およびD16S770 に相当する。型判定用データはGenehunterソフトウェア、バージョン1.3 の複数点の非パラメトリック分析プログラムを用いて解析した。最大 NLSスコアは3.33 (p ＝0.0004) であった。
【図３】  IBD1によりコードされるタンパク質の図式的表示。IBD1によりコードされるタンパク質は水平に表示する。構成する各種ドメインは各ドメインの開始と終止に対応するアミノ酸参照番号を付した図の上に示される。タンパク質はCARDドメイン、ヌクレオチド結合ドメイン (NBD)およびロイシンに富むモチーフ (LRR)からなる。
【図４】  CDに関連する３つの変異体におけるIBD1/NOD2 タンパク質の図式的表示。
A:IBD1候補遺伝子のcDNA配列から推定して作製した翻訳物はNOD2 (Ogura et al., 2000) のものと同じである。このポリペプチドは２つのCARDドメイン (CAspase Recruitment Domain) 、ヌクレオチド結合ドメイン (NBD)、27アミノ酸の10回の繰り返しおよびロイシンに富むモチーフ (LRR)を含む。 NBDのモチーフＡ(Pループ) のATP/GTP 結合部位の共通配列は黒丸で示す。CDと関連する３つの主な変異体によりコードされる配列の変化はSNP 8 (R675W) 、SNP 12 (G881R)およびSNP 13 (フレームシフト 980) である。このフレームシフトは980 位でロイシンコドンをプロリンコドンに変化させ、直ちに終結コドンが続く。
B: 457人のCD患者、 159人のUC患者および罹患しておらず血縁関係のない 103人におけるNOD2の稀少ミスセンス変異体。稀少ミスセンス変異体の位置は３つのグループに対して示される。左の目盛りは検討中のグループで同定された変異体の数を示し、右の目盛りは突然変異の頻度を計る。多型V928I の対立遺伝子頻度は３つのグループであまり異ならず (0.92：0.08) 、対応する遺伝子型はHardy-Weinberg平衡にある。
参考文献
Auphan et al. (1995), Science 270, 286-90.
Asakawa et al. (1997), Gene, 191, 69.
Becker et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9979.
Bertin et al. (1999), J. Biol. Chem., 274, 12955.
Buckholz (1993), Curr. Op. Biotechnology 4, 538.
Carter, (1993), Curr. Op. Biotechnology 3, 533.
Cho et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 7502.
Duck et al. (1990), Biotechniques, 9, 142.
Edwards and Aruffo (1993), Curr. Op. Biotechnology, 4, 558.
Epstein (1992), Medecine/Sciences, 8, 902.
Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874.
Hugot et al. (1996), Nature, 379, 821.
Inohara et al. (1999), J. Biol. Chem., 274, 14560.
Inohara et al. (2000), J. Biol. Chem.
Kievitis et al. (1991), J. Virol. Methods, 35, 273.
Kim et al. (1996), Genomics, 34, 213.
Kohler and Milstein (1975), Nature, 256, 495.
Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173.
Landegren et al. (1988), Science 241, 1077.
Lander and Kruglyak (1995), Nat. Genet., 11, 241.
Luckow (1993), Curr. Op. Biotechnology 4, 564.
Martin et al. (2000), Am. J. Hum. Genet. 67: 146-54.
Matthews et al. (1988), Anal. Biochem., 169, 1-25.
Mckay (1999), Gastroenterol. 13, 509-516.
Miele et al. (1983), J. Mol. Biol., 171, 281.
Neddleman and Wunsch (1970), J, Mol. Biol. 48: 443.
Ogura et al. (2000), J, Biol. Chem.
Olins and Lee (1993), Curr. Op. Biotechnology 4: 520.
Perricaudet et al. (1992), La Recherche 23: 471.
Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444.
Poltorak et al. (1998), Sciences 282, 2085-8.
Rioux et al. (1998), Gastroenterology, 115: 1062.
Rohlmann et al. (1996), Nature Biotech. 14: 1562.
Rolfs, A. et al. (1991), Berlin: Springer-Verlag.
Rouquier et al. (1994), Anal. Biochem. 217, 205.
Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.
Satsangi et al. (1996), Nat. Genet., 14: 199.
Schreiber et al. (1998), Gut 42, 477-84.
Segev (1992), Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205.
Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2: 482.
Steward and Yound (1984), Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem.
Company, Rockford, 111, 2nd ed. (1984).
Spielman et al. (1993), Am. J. Hum. Genet., 52, 506.
Sundberg et al. (1994), Gastroenterology, 107, 1726-35.
Temin (1986), Retrovirus vectors for gene transfer.  In Kucherlapati R., ed.  Gene Transfer, New York, Plenum Press, 149-187.
Tromp et al. (1996), Am. J. Hum.  Genet., 59: 1097.
Wahl et al. (1998), B. J. Clin. Invest. 101, 1163-74.
Walker (1992), Nucleic Acids Res. 20: 1691.
【配列表】
0005150997.tif 000009
0005150997.tif 000010
0005150997.tif 000011
0005150997.tif 000012
0005150997.tif 000013
0005150997.tif 000014
0005150997.tif 000015
0005150997.tif 000016
0005150997.tif 000017
0005150997.tif 000018
0005150997.tif 000019
0005150997.tif 000020
0005150997.tif 000021
0005150997.tif 000022
0005150997.tif 000023
0005150997.tif 000024
0005150997.tif 000025
0005150997.tif 000026
0005150997.tif 000027
0005150997.tif 000028
0005150997.tif 000029
0005150997.tif 000030
0005150997.tif 000031
0005150997.tif 000032
0005150997.tif 000033
0005150997.tif 000034
0005150997.tif 000035
0005150997.tif 000036
0005150997.tif 000037
0005150997.tif 000038
0005150997.tif 000039
0005150997.tif 000040
0005150997.tif 000041
0005150997.tif 000042
0005150997.tif 000043
0005150997.tif 000044
0005150997.tif 000045
0005150997.tif 000046
0005150997.tif 000047
【図１】
0005150997.tif 000048
【図２】
0005150997.tif 000049
【図３】
0005150997.tif 000050
【図４】
0005150997.tif 000051