(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材に付着している霊長類胚性幹細胞のコロニーから霊長類胚葉体を作成する方法であって、
該胚性幹細胞の付着しているコロニーを、凝集塊のまま、基材から取り外す工程、及び、
該凝集塊を、容器中、該凝集塊が該容器へ付着することを本質的に阻害する条件下でインキュベートし、胚葉体へ凝集させる工程
を含み、
該取り外し工程を、該凝集塊の凝集塊としての基材からの解離を促進する酵素の存在下で行う
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酵素がディスパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記取り外し工程を、キレート化剤の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記取り外し工程が、凝集塊を基材から機械的にかき取る工程を更に含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記取り外し工程を、トリプリン、カルシウム及びマグネシウムの存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベーション工程が、容器を攪拌する工程を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーション工程を、プラスチック製の容器中で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベーション工程を、無血清培地の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記霊長類胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、前記霊長類胚葉体がヒト胚葉体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願のクロスリファレンス
該当なし。
連邦政府委託研究に関する供述
後述する非ヒト霊長類細胞に関する本研究は、以下の機関：ＮＩＨ  ＲＲ１１５７１より与えられた合衆国政府援助による助成金により援助された。アメリカ合衆国は本発明について一定の権利を有する。本明細書に記載するヒト細胞についての研究に対して、合衆国政府資金は使用しなかった。
発明の背景
未分化霊長類胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、無限に培養することができ、かつ、身体の分化細胞を形成する可能性を維持することができる。米国特許第５，８４３，７８０号明細書、J. Thomsonら, 282, Science, 1145-1147(1989)及びJ. Thomsonら, 38, Biology, 133-165(1998)を参照のこと。これらの刊行物及び本明細書で言及するその他全ての刊行物の開示内容は、参照することにより、あたかもその内容全体が本明細書で示されているかのように本明細書に組み込まれる。
霊長類ＥＳ細胞は、ヒト組織の分化及び機能を理解するための刺激的な新規モデルを提供し、かつ、薬物の発見及び試験のための新規な戦略を提供する。更にＥＳ細胞は、ＥＳ細胞由来組織の移植に基づく新規な治療法の見込みがある。例えば、免疫無防備状態のマウスに注入されたヒト及びアカゲザルのＥＳ細胞は、全部で３つの胚性の胚葉を表す進行型分化誘導体を有する良性奇形腫を形成する。ヒトＥＳ細胞奇形腫において容易に同定される分化細胞は、平滑筋、横紋筋、骨、軟骨、消化管及び呼吸器の上皮、角質化扁平上皮、毛髪、神経上皮及び神経節を含んでいる。
ヒト及び非ヒト霊長類ＥＳ細胞株は、正常なヒトの発生及び更には異常なヒトの発生を理解するための特別に強力な新規モデルを提供する。生まれてくる子供に対する潜在的リスクのため、移植後ヒト胚の実験操作は倫理的に容認されず、その結果、ヒト胚についての機能的な研究は不足している。したがって、移植後の初期期間におけるヒト発生について知られていることは、幾つかのヒト胚の静的な組織切片及びマウスの実験発生学的研究に対する類推にほとんど完全に基づいている。
【０００２】  しかしながら、マウス及び霊長類の初期発生は有意に異なる。例えば、ヒト及びマウスの胚は、胚性ゲノム発現、胎膜及び胎盤の形成、構造及び機能並びに卵筒に代わる胚盤の形成において異なる。ヒトの発生における最初の事象は、ヒトの不妊症、妊娠喪失（pregnancy loss）及び出生異常に決定的に関連する。霊長類ＥＳ細胞は、これらのヒト初期発生事象についての理解及び発生不全の原因対する理解について新たな機会を提供する。
更に霊長類ＥＳ細胞は、特定の分化霊長類細胞の正常な機能及び病理についての興味を持つ研究者に、分化した、正倍数性の非形質転換細胞の潜在的に無制限のソースを提供する。そのような特定のＥＳ細胞由来細胞の精製された集団は、薬物発見、毒性スクリーニングに有用であり、かつ、移植用細胞のソースを提供するだろう。
組織特異的幹細胞を完全に欠く組織、例えば心臓に対して、霊長類ＥＳ細胞は、更に価値があることを証明するだろう。更に霊長類ＥＳ細胞は、新規な移植治療法の見込みを提供する。限られた数の細胞型の破壊又は機能不全により疾患、例えばパーキンソン病（ドーパミン作動性ニューロン）又は若年型糖尿病（膵臓β島細胞）が起こるとき、これらの特定の細胞型をＥＳ細胞誘導体で置換することは、潜在的に長期間の治療を提供するだろう。
これらの目的を達成するために、ＥＳ細胞を特定の細胞系統へより効率的に分化させることが望ましい。非霊長類ＥＳ細胞を神経、造血及び心臓組織へ分化させることについては、かなりの進歩があった。例えば、T. Doetschmanら, 87 J. Embry. And Exper. Morph. 27-45 (1985); G. Keller, 7 Current Op. In Cell Biol. 862-869 (1995); 米国特許第５，９１４，２６８号明細書を参照のこと。これらの例のそれぞれにおいて、ＥＳ細胞は最初に「胚葉体」（続く分化を促進する三次元のＥＳ細胞凝集体）を形成した。
しかしながら、霊長類ＥＳ細胞についての類似の実験は、マウスについての慣習的プロトコルによる胚葉体形成は失敗したことを証明した。前記の慣習的プロトコルでは、ＥＳ細胞を単一細胞へと分散し、次いで、細胞の基材への付着を防ぐ条件下で胚葉体へと凝集させるか、又は、メチルセルロース中に懸濁した単一細胞若しくはクラスターから胚葉体へと成長させることが可能である。本発明者等は、付着を防止して、霊長類ＥＳ細胞を単一細胞へ分散させた場合、当該細胞はうまく凝集せず、それゆえメチルセルロース中でクローンから成長せず、すぐに死んでしまうことを突き止めた。
それゆえ、霊長類胚葉体を製造する改良された方法及び当該方法により誘導された分化細胞に対するニーズが存在することが理解される。
【０００３】発明の要約
本発明は、基材へ付着している霊長類胚性幹細胞のコロニーから霊長類胚葉体を製造する方法を提供する。当該方法では、付着している胚性幹細胞のコロニーを凝集塊のまま（in clump）基材から取り外す（remove）。続いて、凝集塊を、容器中、当該凝集塊が当該容器に付着することを本質的に阻害する条件下でインキュベートし、胚葉体へと凝集（coalesce）させる。本出願の目的に対して、凝集塊とは２以上の幹細胞からなる集団である。好ましくは、凝集塊は、肉眼で可視するのに十分に大きい。
一つの好ましい形態において、取り外し工程は、凝集塊が、凝集塊として基材から解離（disassociation）することを促進する薬剤の存在下で行われる。純粋な化学薬品、例えばVersene（登録商標）ＥＤＴＡ二ナトリウムカルシウムキレート化剤を使用することができる。しかしながら、より好ましいのは、細胞外マトリックスに優先的に作用するプロテイナーゼ、例えばジスパーゼ（dispase）、コラゲナーゼ、カタラーゼ、ノイラミニダーゼ、パンクレアチン、膵性エラスターゼ又はトリプシン等である。トリプシンを使用する場合、トリプシンが凝集塊をも破壊することを防止するために、取り外し工程は迅速かつ比較的低い濃度下で行わなければならない。有利になるために、酵素ＥＤＴＡ混合物を使用することもできる。
別の形態において、取り外し工程は、凝集塊を、凝集塊として基材から機械的にかき取る（scraping）工程を含んでいる。
別の側面において、インキュベーション工程は、容器を攪拌すること（例えば、穏やかに揺り動かす（rocking）、振盪する又は振動させること）により、行うことができる。インキュベーション工程用の容器は、細菌非付着性グレード（non-attaching bacterial grade）の培養用プラスチックであることができ、及び／又は、インキュベーション工程は血清付着因子を欠く無血清培地の存在下で存在することができる。
別の側面において、本発明は、前記の方法を（直接的又は間接的に）使用して誘導された霊長類胚葉体を提供する。
更に別の側面において、本発明は、胚葉体から（直接的又は間接的）に誘導された分化細胞を提供する。
【０００４】  本発明にしたがうと、標準条件（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号明細書を参照のこと）下で培養した霊長類ＥＳ細胞は、異常増殖し、重層することができ、及び／又は、さもなくば基材（例えば、標準的な支持細胞層を有するプラスチック製組織培養プレート）上、凝集塊中で密接に会合する（associate）ことが許容される。次いでＥＳ細胞は、（例えば、コロニーを、ＥＳ細胞とＥＳとの付着よりも強力なＥＳ細胞コロニーの基材への付着を攻撃する酵素と共にインキュベートすることにより）凝集塊として基材から取り外される。そのような場合、酵素は、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度のディスパーゼであることができる。
代わりに、凝集塊を、マイクロピペット、細胞スクレーパー（cell scraper）等を用いて機械的にかき取ることにより凝集塊として取り外すことができる。
次いで、本質的に無傷のコロニーを、非付着条件下（好ましくは、培養皿の連続的な揺動、細菌非接着性グレードの培養用プラスチック、及び／又は、血清付着因子を欠く無血清培地の存在下での連続培養）でインキュベートする。次いで、コロニーは、急速に凝集して密集した胚葉体になることができる。その後、胚葉体は、持続的な懸濁液中、又は、基材へ再付着した後に分化することが許容される。そのような胚葉体を使用して、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の分化した誘導体を誘導するか、又はその他の所望の細胞系統を得ることができる。
霊長類胚性幹細胞株から霊長類胚葉体を形成する効率的な方法を提供することが、本発明の利点である。本発明の別の利点は、その他の霊長類細胞型への分化に適した霊長類胚葉体を提供することである。本発明のその他の特徴及び利点は、以下の明細書及び請求の範囲の記載を検討した後に明らかになるだろう。
【０００５】好ましい態様の詳細な説明
胚葉体の形成
霊長類胚性幹細胞（例えば、アカゲザル又はヒト。米国特許第５，８４３，７８０号明細書、J. Thomsonら, 282, Science 1145-1147 (1998)）を、有糸分裂的に不活性化された（３０００ｒａｄ  ｇ−照射）マウス胚線維芽細胞中で培養し、０．１％ゼラチンと共に一晩インキュベートすることにより既に処理された組織培養用プラスチック上、５×１０4細胞／ｃｍ2に調製した（E. Robertson, Embryo-derived Stem Cell Lines. In : Teratocarcinomas And Embryonic Stem Cells : A Practical Approach IRL Press : Washington, D.C., 71-112 (1987)）。培養培地は、７９％のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１リットル当たり４５００ｍｇのグルコース。ピルビン酸ナトリウムなし。）、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％非必須アミノ酸ストック（GIBCO）から構成される。
時間をかけて、、コロニーに凝集塊を形成させることができる。次いでＥＳ細胞コロニーを、ＥＳ細胞を凝集塊の状態に維持する物理的又は化学的方法を使用して、組織培養プレートから取り外すことができる。
ディスパーゼ又はコラゲナーゼを用いたＥＳ細胞コロニーの培養プレートからの取り外しのために、培養培地をＥＳ細胞から除去する。ディスパーゼ（ＥＳ培養培地中、１０ｍｇ／ｍｌ）又はコラゲナーゼ（ＤＭＥＭ又はその他の基本培地中の１ｍｇ／ｍｌ溶液）を、培養プレートに添加する。培養プレートを１０〜１５分間、インキュベーターへ戻す。
ディスパーゼ処理後、コロニーを、培養皿へ洗い落とす又は穏やかな攪拌により組織培養プレートから離すことができる。コラゲナーゼ処理の後、５ｍｌガラスピペットを用いて、細胞を培養皿からこすり落とすことができる。幾つかのコロニーの解離が起こるが、これは細胞を個別化するのには不十分である。細胞を組織培養プレートから化学的に取り外した後、細胞懸濁液を穏やかに５分間遠心分離し、上清を取り除いて廃棄し、細胞をすすぎ、血清を有する又は有しない培養培地中に再懸濁する。
【０００６】  細胞の機械的取り外しは、引いた（pulled）ガラスピペットを用いて細胞を培養プレートからこすり落とすことにより達成する。細胞凝集塊は、遠心分離することなしに、新鮮組織培養培地中に、直ちに再懸濁することができる。
コロニーが組織培養プレートから取り外されると、ＥＳ細胞を、更なる胚葉体形成の期間中、懸濁状態に維持しなければならない。このことは、例えば、細胞懸濁液を、穏やかにかつ連続的に揺動することにより達成することができる。細胞懸濁液を、６ウェルの組織培養皿のウェルへ分取し、シールされた加湿隔離チャンバー内部に置き、５％ＣＯ2、５％Ｏ2及び９０％Ｎ2で満たし、ロッカー（rocker）（Red Rocker, Hoefer Scientific Instruments）に置く。ロッカーは、３７℃に維持したインキュベーター内部に収容される。培養プレートは、少なくとも４８時間から１４日間の間、連続的に揺動することができる。
２日毎に、揺動装置からプレートを取り出し、培養培地を取り除き、新鮮培養培地を細胞へ添加する。次いで、培養皿を揺動装置へ戻す。細胞を揺動なしに懸濁液培養皿（Nunc）中で培養するとき、又は、付着因子を提供する血清の不存在下で培養するとき、細胞は、懸濁液中に残存するだろう。全ての細胞は、３７℃、加湿、制御された気体雰囲気（５％ＣＯ2、５％Ｏ2及び９０％Ｎ2又は空気中の５％ＣＯ2）中で培養しなければならない。
培養を１１日間まで懸濁液中で維持した後、機械的又は化学的手段により胚葉体を分配（dispense）し、ＥＳ培地中、ゼラチンで処理した組織培養用プレート又はマトリックスへの再付着を許容することができる。
移動し、プレーティングされた胚葉体は、平らな単層を形成し、これは、２日毎に培地を置き換えることにより維持することができる。
【０００７】胚葉体及び分化細胞の分析
本発明者等は、プレーティング後７日目まで、免疫蛍光抗体染色を用いて、神経表現型の細胞の存在を確認した。細胞を、３０％メタノール／１０％酢酸中で固定し、その後、抗体と共にインキュベートした。使用した抗体は以下の通りであった。ウサギ抗ウシＧＦＡＰ（DAKO）、抗Ｆｏｒｓｅ−１（Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗ウシＭＡＰ−２（Roche）、抗ヒトＮＣＡＭ／ＣＤ５６（DAKO）及び抗−０１（ウィスコンシン大学のS.-C. Zhang氏より提供）。抗ＧＦＡＰを除く全ての一次抗体はマウスモノクローナルである。二次抗体である、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ及びビオチンコンジュゲートヤギ抗ウサギ及びＡＭＣＡコンジュゲートストレプトアビジンは、Jackson ImmunoResearchから購入した。
Ｆｏｒｓｅ−１抗体は、ヒト及びげっ歯類の胚性ＣＮＳ中の神経細胞付着分子に結合する脳特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるホスファカン（phosphacan）を認識する（K. Allendorferら, 6, Mol. And Cell. Neuro. 381-395(1995); S. Toleら, 15, J. Neuro. 957-969(1995)）。０１抗体は、胚性マウス脳培養物において３日目からプロオリゴデンドログリア（pro-oligodendrocytes）を同定する（M. Schachnerら, 83, Dev. Biol. 328-338(1981); I. Sommerら, 83, Dev. Biol. 311-327(1981)）。
プレーティング後３日目以内に、Ｆｏｒｓｅ−１及び０１により染色された神経前駆体が観察された。Ｆｏｒｓｅ−１抗体は、多数の円形細胞を染色した。一方、多数の突起を有する非常に低密度な平板細胞は、抗−０１抗体により染色された。
神経細胞及びグリアが、プレーティング後３日目後に、神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）／ＣＤ５６（図３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）（図３）、βＩＩＩ−チューブリン及びグリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の陽性染色により検出された。ＮＣＡＭは、神経上皮内の細胞−細胞相互作用において重要であると考えられている細胞付着分子である（B. Cunninghamら, 236, Science 799-806(1987); J. Ritzら, 42, Adv. Immuno. 181-211(1988)）。ＭＡＰ−２は、脳の微小管構築において重要な役割を果たす。βＩＩＩ−チューブリンは神経細胞特異的マーカーであり、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）はアストロサイトのマーカーである。
【０００８】細胞系列への分化
胚葉体は、種々の所望の細胞系列へ分化することができる。例えば、マウスについて使用される技術（M. Wilesら, 111, Development 259-267(1991)）に類似する技術を用いて、胚葉体を使用して造血細胞を誘導することができるだろう。この点について、２ｉ．ｕ．／ｍｌのエリスロポエチン又はＩＬ３の存在下、血清含有倍中に胚葉体をプレーティングすることができるだろう。
心臓細胞系列を所望する場合、T. Doetschmanら, 87, J. Embry. Exper. Morph. 27-45(1985)に類似の技術を使用することができるだろう。胚葉体を、血清含有培地中、添加物なしにプレーティングすることができる。
神経細胞系列を発生させるために、胚葉体を、２０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子＋２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子の存在下でプレーティングすることができる。これは、B. Reynoldsら, 255, Science 5052(1992)に記載される技術に類似するものである。
したがって、本発明は、霊長類ＥＳ細胞から霊長類胚葉体を作製する効率的な方法を提供するものである。前記の実施例は、げっ歯類及びヒトの胚性幹細胞（並びにこれらの胚葉体を経て誘導された神経細胞）に焦点を合わせたものであるが、本明細書に記載される技術は、霊長類胚性幹細胞及びその他の細胞型に対して広く使えるものであるべきである。本明細書では凝集塊の取り外しに関する特定の技術について検討しているが、本発明はこれらの技術に限定されるものではない。凝集塊中の細胞を基材から取り外すその他の技術も使われるべきである。
したがって、本発明は、本明細書に記載される特定の態様に限定されるものではない。特許請求の範囲が、本発明の完全な範囲を判断するために向けられるべきである。
産業上の利用可能性
本発明は、研究、医学目的及び細胞系列への分化に適したヒト及びその他の霊長類の胚葉体の供給を提供する。