(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントを使用しない経皮抗原投与のための抗原キットであって、
Ａ）予防接種、減感作療法又は免疫療法に使用される抗原（大腸菌熱不安定性エンテロトキシンを除く）と、水性担体と、を含有して、アジュバント及びアジュバント性を有する物質を含有しない、水性抗原組成物、及び
Ｂ）抗原ならびにアジュバント及びアジュバント性を有する物質のいずれも含有せず、水分を含有する保水材及び貼付材を有するパッチ
を含む抗原キット。
【請求項２】
ワクチンとして使用される請求項１記載の抗原キット。
【請求項３】
減感作療法又は免疫療法における抗原として使用される請求項１記載の抗原キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバントを用いずに経皮的に抗原投与する抗原キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子量のタンパク抗原は、一般に正常な皮膚を通過できないことから、タンパク抗原を正常皮膚に塗布することによって生体に抗原特異的な免疫応答を引き起こすこと（経皮免疫法）は不可能と考えられてきた。ところが、近年、コレラトキシンをアジュバントとして用いる経皮免疫法が可能であることが、マウスを用いた実験で報告された（非特許文献１）。予防接種や減感作療法における副反応の多くが注射に付随するものと考えられることから、経皮免疫法による抗原投与が可能になれば、注射による従来の方法と比較して格段に安全性の向上や被接種者負担の軽減などが図られると期待される。そのため、経皮免疫法について、研究が進められてきている（特許文献１〜６、非特許文献２〜５等）。
【０００３】
これらの従来の方法においては、一般に、経皮免疫を成功させるためにはアジュバントを使用することが必須とされている。特許文献１にはアジュバントを使用していない例が記載されているが、この例においては、インタクトな皮膚ではなく、角質層を予め除去する前処理を施した皮膚に抗原が適用されている。また、特許文献２には、抗原性が高い抗原についてはアジュバントの使用は必要ではない旨の記載があるが、実際にはアジュバントを使用せずに経皮免疫を成功させた例は記載されていない。
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５０４００２
【特許文献２】特表２００３−５２３９３７
【特許文献３】特表２００４−５３６８０４
【特許文献４】特表２００４−５２９９０６
【特許文献５】特表２００４−５２５９２１
【特許文献６】特表２００２−５０４５２２
【非特許文献１】Glenn G.M. et al., Nature, vol. 391, p. 851 (1998)
【非特許文献２】Chen D.C. et al., Nature Medicine, vol. ６, no. 10, pp. 1187-90 (2000).
【非特許文献３】Hammond S.A. et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 18(5):503-526 (2001).
【非特許文献４】Godefroy S. et al., Vaccine, vol. ２１, pp. 1665-71 (2003).
【非特許文献５】Kenney R.T. et al., J. Infectious Diseases, vol. 190, pp. 774-82 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アジュバントもまた副作用を起こすことが知られており、また、ある場合には抗原の誘起する副作用を増強することも報告されている。しかし、従来の方法では、このようなアジュバントの使用に伴う弊害を避けることができない。また、従来提案されてきた経皮免疫用製剤は、抗原を含浸させた後乾燥させたドライパッチのような形態が主であり、この場合、それぞれの抗原ごとに経皮免疫用の製剤を製造する必要があり、不便である。
【０００６】
本発明は、アジュバントを使用することなく、簡便に確実に経皮的に抗原投与を行うための抗原キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ある特定の条件を採用することにより、アジュバントを用いずに簡便に免疫応答を誘起することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明によれば、
〔１〕アジュバントを使用しない経皮抗原投与のための抗原キットであって、Ａ）予防接種、減感作療法又は免疫療法に使用される抗原（大腸菌熱不安定性エンテロトキシンを除く）と、水性担体と、を含有して、アジュバント及びアジュバント性を有する物質を含有しない、水性抗原組成物、及びＢ）抗原ならびにアジュバント及びアジュバント性を有する物質のいずれも含有せず、水分を含有する保水材及び貼付材を有するパッチ、を含む抗原キット；
〔２〕ワクチンとして使用される前記〔１〕記載の抗原キット；
〔３〕減感作療法又は免疫療法における抗原として使用される前記〔１〕記載の抗原キット；
が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アジュバントを使用することに伴う副作用などの弊害を起こす心配のない、極めて安全性が高く、しかも被接種者負担の少ない抗原キットが提供される。本発明による抗原投与の効果は、従来の注射による抗原投与に匹敵するものであり、従来注射によって抗原投与が行われていた予防接種、減感作療法、がんの免疫療法等に応用することができる。また、本発明においての抗原としては、一般に非常に抗原性が低いとされているものであっても充分に利用可能であるので、非常に利用範囲が広い。
【００１０】
また、本発明によれば、注射や角質層の除去などの特別な技術又は工程を要せずに誰でも簡便・容易に確実に効果を得ることができるように免疫を実施することができるので、本発明のキットを医師により処方された薬又はＯＴＣ薬として入手して用いることにより、たとえば従来は医師又は獣医師によって行われることが必要であった予防接種を、一般の個人が在宅で行うことができる。これは特に定期的に必要なペットや家畜の予防接種などにも好都合である。
【００１１】
さらに、本発明においては、抗原組成物の使用量を変えることにより、投与対象の動物種（ヒト、非ヒト動物、非ヒト哺乳類など）、年齢、体重、状態などに応じて容易に投与量を選択することができる。また、抗原含有パッチとしての抗原ごとの特別な組成を必要としないうえ、各種の抗原について適切な抗原量を含む抗原組成物を用意すれば、パッチの方は特定の抗原に限定されない汎用性のあるものを使用することができるので、製造上も有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に使用される抗原としては、抗原性（免疫原性）を有するものであれば特に制限はない。たとえば、一般的に予防接種に用いられる各種病原生物由来のタンパク（破傷風毒素及びそのトキソイド、ジフテリア毒素及びそのトキソイド、百日せき毒素及びその無毒化物、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニン、B型肝炎ウイルスのHBs抗原など）、各種のアレルゲン（スギ花粉などの花粉、ハチ毒、ダニ抗原、ハウスダストなど）、がん抗原などが挙げられる。このような抗原は、単一の抗原物質にまで精製されていてもよいが、有効性及び安全性の観点から必要と考えられる程度に精製されていれば充分である。一般に、予防接種、減感作療法又はその他の免疫療法に使用される抗原の必要量は、それぞれの抗原について公知である。あるいは動物に種々の量を投与し、血清中に産生される抗体の有無又は量を調べることにより、容易に決定することができる。
【００１３】
本発明において、抗原は、少なくとも１種の生理的に許容されうる担体（キャリア）とともに組成物を形成する。担体は、たとえば水、生理食塩水、等張性溶液、緩衝液などの水性溶液であることができる。担体は、抗原が粗精製物である場合、その精製過程から持ち込まれたものであってもよい。あるいは、抗原組成物は、公知の方法によって親水性ゲル、粉末、軟膏、懸濁剤、エキス剤、ローション剤、エアロゾール剤などの形態に製剤化されていてもよい。抗原組成物は、抗原、担体に加えて、製剤の分野において公知の他の添加剤（たとえば保存料、着色料など）を含有していてもよい。これらの各種成分及びそれらの添加量は当業者が適宜選択することができる。
本発明において使用される抗原組成物は、公知のアジュバント（アジュバント性を有する物質を含む）を含有しない。
【００１４】
本発明の第一の抗原投与方法においては、抗原組成物を皮膚に適用し、その後、適用部位を、水又は生理食塩水のような水分を含有する液体を保持した保水材で被覆する。この場合、抗原組成物は、水性液体（たとえば水を含む溶液、乳液、懸濁液など）であることが好ましいが、粉末であってもよい。本発明の第二の抗原投与方法においては、抗原組成物を保水材に担持させ、これを皮膚に接触させる。この場合、抗原組成物は、好ましくは水を含有する水性組成物、特に好ましくは水性液体である。
【００１５】
本発明において使用されるパッチは、少なくとも保水材と貼付材とを有する。保水材としては、水分を保持でき、皮膚に対して低刺激性であればよく、たとえば、ガーゼ、不織布、脱脂綿、スポンジなどが挙げられる。貼付材は、パッチを皮膚に貼付し保持することができる程度の粘着力を有するものであって、皮膚に対して低刺激性であることが必要である。貼付材は、保水材の乾燥を防ぐように、保水材の外気との接触面を覆うことができる形態及び大きさであることが好ましい。たとえば、医療用粘着テープ、絆創膏などを用いることができる。
【００１６】
したがって、本発明において使用されるパッチとしては市販のガーゼ付き絆創膏、医療用パッチなどを使用することができる。また、本発明の第一の方法に用いるパッチは、その保水材に予め水分を含有する液体を含ませておき、その状態で包装されていてもよい。
本発明において使用されるパッチは、公知の抗原及びアジュバントのいずれも含有しない。
【００１７】
本発明の方法においては、第一の方法及び第二の方法のいずれについても、２時間以上の間、パッチを使用して湿潤環境下で皮膚と抗原とを接触させることにより、充分な効果が得られる。一般に、抗原性が低い抗原を使用した場合であっても充分に効果を得るためには、接触時間は、好ましくは４時間以上、さらに好ましくは８時間以上である。上限は特にないが、長時間のパッチの貼付により好ましくない影響（たとえば貼付材の粘着成分によるかゆみなど）が出ない程度であればよく、たとえば４８時間以内、又は２４時間程度であることができる。
【００１８】
本発明による抗原投与は、１回行うことによりプライミング効果（２回目の免疫において抗体産生を引き起こす準備状態を生体に付与する効果）を得ることができる。しかし、抗体の産生量を充分に高くするためには２回以上繰り返して抗原投与を行うことが望ましい。抗原の投与部位は、特に限定されないが、一般には角質層が比較的薄い部位、たとえば腕の内側、腹部、耳介などに投与することが特に効果的であると考えられる。本発明の抗原投与によって得られるプライミング効果は、初回投与の部位に限らず得られるので、２回目以降の投与部位は、初回投与の部位と同じであっても異なっていてもよい。
【００１９】
例１：抗原溶液塗布と湿潤パッチによる被覆とを用いた経皮免疫応答の誘起
卵白アルブミン（ＯＶＡ）を抗原として用いて、抗原と皮膚との接触時間を変化させて、マウスに免疫応答を誘導した。
【００２０】
マウス（C57BL/6、メス、８週齢、日本エスエルシー株式会社；以下のすべての実験において同等のマウスを使用した）の腹部の毛をバリカンで刈り込み、皮膚を露出させた。２日後に以下の免疫操作を行った。麻酔したマウス５匹の腹部皮膚表面に、生理食塩水（大塚生食注、株式会社大塚製薬工場；以下すべての実験において同一の製品を用いた）に溶解した濃度２mg／mlの卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Albumin from chicken egg white, Grade VI、SIGMA社；以下すべての実験において同一の製品を用いた）溶液を５０μlずつ滴下して約１cm四方に塗り広げた。この溶液を乾燥させた後、ＯＶＡ溶液塗布部位に生理食塩水５０μlをしみ込ませたパッチ（注射用保護パッド・メディパッチ、白十字株式会社；以下すべての実験において同一の製品を用いた；水分を含む液体を含ませたパッチを本明細書において「湿潤パッチ」ということがある）を貼付してテープで固定した。これにより、マウスが皮膚の表面に塗布した抗原を経口的に摂取することが避けられるとともに、ＯＶＡ溶液塗布部位が湿潤状態に保たれた。パッチを貼付した状態で、２時間、４時間、８時間又は１６時間放置した後、パッチを取り除いて塗布部位を充分に洗浄した。
【００２１】
以上の免疫操作を２週間間隔で２回行い、２回目の免疫操作の２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２２】
結果を図１に示す。パッチの貼付時間を長くするほど、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体産生が観察される個体数が増え、産生される抗体量も増加した。パッチ貼付１６時間では、すべてのマウスにおいて有意な抗体産生が観察された。
【００２３】
したがって、少なくとも２時間以上にわたってパッチ貼付した湿潤環境下で抗原と皮膚との接触を保持することによって、アジュバントを用いなくても経皮免疫応答が誘導できることが示された。なお、この例を含むすべての実験において、抗原を適用した局所の皮膚には、肉眼的・組織学的に大きな変化は観察されなかった。
【００２４】
＜比較例＞
比較のため、従来の方法により、同様に経皮免疫を試みた。具体的には、上記と同様に処理したマウスに、生理食塩水に溶解した濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液、又は同濃度のＯＶＡ溶液にアジュバント性を有するコレラトキシン（ＣＴ）（Cholera Toxin, Vibrio cholerae, Type Inaba 569B, CALBIOCHEM社；以下すべての実験において同一の製品を用いた）を最終濃度２mg／mlとなるように加えたものを、それぞれ麻酔したマウス５匹の腹部皮膚表面に５０μlずつ滴下して約１cm四方に塗り広げた。溶液を塗布してから２時間、パッチでカバーせずに麻酔下でマウスを放置した後、溶液塗布部位を充分に洗浄した。また、別のマウス５匹には、同濃度のＯＶＡ溶液５０μlを腹部の皮内に注射した。上記の免疫操作を３週間間隔で３回行った。３回目の免疫操作をしてから２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価及び抗ＣＴ−ＩｇＧ抗体価を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２５】
結果を図２（パネル（Ａ）及び（Ｂ））に示す。この方法では、アジュバントとしてＣＴを同時に皮膚に塗布した場合（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）には、５匹全部について、皮内注射した群と同等の産生量の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体が血清中に観察されたが、ＯＶＡのみを皮膚に塗布した群（「ＯＶＡ」）では、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体の産生は、全く観察されなかった（図２、パネル（Ａ））。一方、抗ＣＴ−ＩｇＧ抗体の産生は、ＣＴを塗布した群でのみ認められた（図２、パネル（Ｂ））。したがって、この方法では、アジュバントとしてＣＴを同時に塗布することが、経皮免疫応答を誘導するために必須であることが確認された。
【００２６】
例２：抗原溶液を含有させたパッチを使用した経皮免疫応答の誘起
マウスの耳介に抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付することにより、マウスに抗原特異的な免疫応答を誘導することを試みた。この方法では、腹部皮膚に投与する方法とは異なり、バリカン使用時の意図しない傷口から抗原が取り込まれる可能性を避けることができる。
【００２７】
抗原溶液５０μlをしみ込ませたパッチを、麻酔したマウス５匹の耳介に貼付してテープで固定した。抗原溶液として、濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液又はこれにアジュバントとして最終濃度０.２mg／mlのＣＴを加えた溶液（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）を用いた。パッチ貼付後、２時間、４時間、８時間、１６時間又は３２時間でパッチを取り除き、耳介を洗浄した。上記の免疫操作を２週間間隔で３回行い、３回目の免疫操作の２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２８】
結果を図３に示す。この方法によっても、アジュバントを使用せずに経皮免疫応答を誘導できることが確認された。また、例１に記載した方法の場合と同様に、パッチの貼付時間を長くするほど、産生される抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体量が増加した。
【００２９】
例３：乾燥及び湿潤状態での効果の比較
抗原溶液を塗布した皮膚表面に（乾燥又は湿潤）パッチを貼付した場合と貼付しなかった場合とを比較して、経皮免疫法におけるパッチ使用の効果を検討した。
【００３０】
マウスの腹部の毛をバリカンで刈り込み、皮膚を露出させた。２日後に以下の免疫操作を行った。生理食塩水に溶解した濃度２mg／mlの卵白アルブミン（ＯＶＡ）溶液を、麻酔したマウス１５匹の腹部皮膚表面に５０μlずつ滴下して約１cm四方に塗り広げた。その後、１群５匹のマウスに以下の操作を行った：１）抗原塗布のみで放置、２）抗原塗布部位にパッチを貼付してテープで固定（乾燥パッチ）、又は３）抗原塗布部位に５０μlの生理食塩水をしみ込ませたパッチを貼付してテープで固定（湿潤パッチ）。抗原と皮膚との接触時間は１６時間とし、その後、抗原塗布部位を洗浄した。
【００３１】
上記の免疫操作を２週間間隔で３回行い、３回目の免疫操作から２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３２】
結果を図４に示す。抗原を塗布したのみの群では、ほとんど抗体産生が認められなかったのに対して、パッチを貼付した群では、有意な抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体産生が観察された。また、乾燥パッチを貼付した群に比べて湿潤パッチを貼付した群では、平均的に抗体産生量が多く、よりバラツキの少ない抗体産生が観察された。アジュバントを用いない経皮免疫法において、湿潤環境下でパッチを使用して抗原と皮膚とを接触させることが最適であることが明らかになった。
【００３３】
例４：抗原量の検討
投与する抗原量による経皮免疫の効果を調べた。
抗原溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの耳介に貼付けてテープで固定した。抗原溶液としては、濃度２mg／ml、０.２mg／ml、０.０２mg／mlのＯＶＡ溶液（１個体当りの投与抗原量としては、それぞれ１００μg、１０μg、１μgとなる）、及び各濃度のＯＶＡ溶液にアジュバントとして最終濃度０.２mg／mlのＣＴを加えた溶液（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）の計６種類を用いた。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作を２週間間隔で３回行い、３回目の免疫操作の２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３４】
結果を図５に示す。アジュバントとしてＣＴを加えた抗原溶液を投与した群の方が、より微量の抗原量によっても抗体産生が誘導される傾向があるものの、大きな違いは観察されなかった。
【００３５】
例５：抗体産生の推移
複数回の抗原の投与と抗体産生の推移との関係を検討した。
抗原溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの耳介に貼付してテープで固定した。抗原溶液としては、濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液、及び同濃度のＯＶＡ溶液にアジュバントとして最終濃度０.２mg／mlのＣＴを加えたもの（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）を用いた。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作を２週間間隔で３回行い、初回免疫後６週間まで毎週採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３６】
結果を図６に示す。ＯＶＡのみの群（「ＯＶＡ」）及びＣＴを加えた群（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）の両方について、抗体産生はほぼ同様な推移を示した。ＣＴを加えた群の方がやや抗体産生量が多かったが、ほとんど有意ではなかった。
【００３７】
例６：血清中の抗体の長期間にわたる消長
血清中に誘導された抗原特異的ＩｇＧ抗体の長期間にわたる消長を検討した。
抗原溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの耳介に貼付けてテープで固定した。抗原溶液としては、濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液又は同濃度のＯＶＡ溶液にアジュバントとして最終濃度０.２mg／mlのＣＴを加えたもの（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）を用いた。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作を２週間間隔で３回繰り返した。初回免疫後４週間、６週間及び２４週間で採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３８】
結果を図７に示す。ＯＶＡのみの群（「ＯＶＡ」）及びＣＴを加えた群（「ＯＶＡ＋ＣＴ」）の両方について、最終免疫後２０週間まで、血清中に誘導された抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体は、ほとんど減少すること無く推移した。ＣＴを加えた群の方がやや抗体産生量が多かったが、大きな違いは見られなかった。
【００３９】
例７：プライミング効果の保持期間の検討
初回免疫によるプライミング効果が保持される期間について検討を行った。
濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの耳介に貼付けてテープで固定した。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作をしてから２週間後、４週間後、６週間後、１４週間後に同じ免疫操作を繰り返した。２回目の免疫操作の２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４０】
結果を図８に示す。初回免疫のみによる特異的な抗体産生の誘導はほとんど見られなかったが、初回免疫によるプライミング効果は、少なくとも免疫後１４週間まで保持されていた。
【００４１】
例８：プライミング効果の伝達
初回免疫によるプライミング効果が、抗原を投与した部位とは異なる皮膚部位にも伝達されるかどうかを検討した。
【００４２】
濃度２mg／mlのＯＶＡ溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの左の耳介に貼付してテープで固定した。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作をしてから２週間後に同様の免疫操作を、初回免疫と同じ左の耳介又は初回免疫とは反対側の右の耳介で行った。対照としてＯＶＡ溶液の代わりに生理食塩水を用いた実験も並行して行った。２回目の免疫操作の２週間後に採血して血清を分離した。血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４３】
結果を図９に示す。２回目の免疫操作を１回目とは反対側の耳介に対して行った場合にも有意な抗体産生が観察された（「Left: OVA Left: OVA」及び「Left: OVA Right: OVA」）。したがって、経皮免疫の効果は、免疫操作をした部位とは異なる皮膚部位にも伝達されることが確かめられた。
【００４４】
例９：破傷風トキソイドを用いた経皮免疫
抗原溶液５０μlをしみ込ませたパッチをマウスの耳介に貼付けてテープで固定した。抗原溶液として濃度２００Lf／mlの破傷風トキソイド（Ｔｔｄ）（財団法人化学及び血清療法研究所より入手した）溶液又は同濃度のＴｔｄ溶液にアジュバントとして最終濃度０.２mg／mlのＣＴを加えたもの（「Ｔｔｄ＋ＣＴ」）を用いた。パッチを貼付してから２０時間後にパッチを取り除いて、耳介を洗浄した。上記の免疫操作を２週間間隔で３回繰り返し、初回免疫後６週間まで２週間間隔で採血して血清を分離した。血清中の抗Ｔｔｄ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４５】
また、初回免疫後６週間の血清について、毒素中和活性との相関性が高いと言われているＫＰＡ法（人工合成粒子を担体とした間接凝集反応）による抗体価の測定を行った。さらに、最終免疫３週間後に破傷風毒素の半数致死量の１０倍量を大腿部皮下に投与して、その２日後にマウスの生死を観察した。
【００４６】
結果を図１０及び表１に示す。ＥＬＩＳＡ法による測定（図１０）では、アジュバントとしてＣＴを加えた群に比べると若干劣るものの、Ｔｔｄ単独で経皮免疫した群においても、有意な抗Ｔｔｄ−ＩｇＧ抗体産生が観察された。ＫＰＡ法による抗体価の測定によっても、アジュバント添加群ではアジュバント非添加群に比べて、４倍程度高い血清抗体価を示した（表１）。しかし、アジュバントを用いないで免疫したマウスについても、破傷風毒素攻撃に対して１００％が無症状で生き残った。このことから、本発明のアジュバントを使用しない経皮免疫法の充分な有効性が確認された。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
例１０：抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付する方法と抗原塗布後の皮膚に湿潤パッチを貼付する方法との比較
１０匹のマウスの腹部の毛をバリカンで刈り込んで皮膚を露出させた。２日後にマウスを麻酔して５匹ずつの２群に分けた。一方の群のマウスには、濃度２．０mg／mlの卵白アルブミン（ＯＶＡ）溶液５０μlを浸染したパッチを、露出した腹部の正常皮膚に貼付した。もう一方の群のマウスには、濃度２．０mg／mlのＯＶＡ溶液５０μlを露出した腹部の正常皮膚に滴下して約１cm２に塗り広げて乾燥させた後に、同部位に生理食塩水５０μlを浸染したパッチを貼付した。両群とも１８時間後にパッチを取り除き、抗原投与部位を充分に洗浄した。以上の免疫操作を２週間間隔で３回行った。最終免疫の２週間後に採血して、血清中の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４９】
結果を図１１に示す。抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付する方法よりも、抗原塗布後の皮膚に湿潤パッチを貼付する方法の方が有意に抗ＯＶＡ−ＩｇＧ産生量が多く、効果が高かった。したがって、抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付する方法でも充分に経皮免疫の効果が得られるが、抗原塗布後の皮膚に湿潤パッチを貼付する方法の方がさらに有利であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、抗原溶液塗布後、湿潤パッチを貼付して種々の時間で経皮免疫を行ったマウスにおける個体別の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価を示す図である。
【図２】図２は、抗原溶液塗布後、パッチを貼付せずに経皮免疫したマウス、及び皮内注射により免疫したマウスの個体別の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ（パネルＡ）及び抗ＣＴ−ＩｇＧ（パネルＢ）抗体価を示す図である。「ＯＶＡ」＝卵白アルブミン、「ＯＶＡ＋ＣＴ」＝卵白アルブミン＋コレラトキシン（以下も同じ）を表す。
【図３】図３は、抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付して経皮免疫を行ったマウスの抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価を示す図である。
【図４】図４は、抗原溶液塗布後のパッチ使用の効果を、マウス個体別の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価によって示す図である。
【図５】図５は、種々の量の抗原を含む溶液をしみ込ませたパッチを貼付して経皮免疫を行ったマウスの個体別の抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価を示す図である。
【図６】図６は、複数回の抗原投与と抗体産生の推移との関係を示す図である。矢印は抗原投与した時点を示す。
【図７】図７は、より長期間にわたる抗原投与と抗体産生の推移との関係を示す図である。矢印は抗原投与した時点を示す。
【図８】図８は、初回免疫によるプライミング効果の保持をマウス個体別に示す図である。
【図９】図９は、プライミング効果の伝達を示す図である。
【図１０】図１０は、破傷風トキソイドを抗原として用いた場合の経皮免疫の効果を示す図である。
【図１１】図１１は、抗原溶液をしみ込ませたパッチを貼付した場合と抗原溶液塗布後に湿潤パッチを貼付した場合との効果を比較する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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