(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的及び／又は化学的反応の１つ以上の特性を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法であって：
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する；
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ）第一の関数を演算する工程、ここで当該第一の関数の演算は当該第一の関数を規定する複数のパラメーターを決定することを含む；
前記第一の関数から１つ以上のパラメーターを抽出する工程；
前記プロセッサーで、前記１つ以上の抽出されたパラメーターを使用して前記データポイントのセットを近似する第二の関数を演算する工程、ここで当該第二の関数は前記第一の関数と異なる関数形式を有する；及び
前記プロセッサーで、前記第二の関数を使用して前記生物学的及び／又は化学的反応の１つ以上の特性を決定する工程；
を有する、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上の特性が、前記増幅プロセスと関連する定量値を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のパラメーターが前記第二の関数の初期値として使用され、且つ前記第二の関数の演算が１つ以上の前記初期値を変化させることにより、前記第二の関数と前記データポイントのセットとの間のエラーを減少させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の関数が、ドリフト項を含む変形シグモイド関数である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変形シグモイド関数が：
【化１】
0005166608.tif 000022
で表され、ａ０、ａ１、ａ２、ａ３及びａ４は、前記変形シグモイド関数を前記データポイントのセットに適合させる手順の過程で決定されるパラメーターで、且つｘは、前記増幅プロセスのサイクル数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の抽出されたパラメーターが、ａ０、ａ１、ａ２及びａ３を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の生物学的及び／又は化学的反応の特性が、前記増幅プロセス中に、その時点で前記第二の関数が特定の数値を有する時間Ｃｔを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
更に：
前記データポイントのセットの部分を近似する第三の関数を演算するための前記時間Ｃｔを：
中心にＣｔが来る時間帯（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｔｉｍｅ）を定め；
当該時間帯の中のデータポイントを使用して、前記第三の関数が当該時間帯の中のデータポイントを近似するように前記第三の関数を決定する；
ことにより使用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第三の関数が六次以上の多項式である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記時間Ｃｔが、前記第二の関数の第二の微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が最大値をとる第一の時間と、前記第二の関数の第三の微分が最大値をとる第二の時間との加重平均として決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
更に：前記ベースライン部分の終点（ｅｎｄ）を前記増幅プロセスの第一の時間として選択する工程を含み、ここで、前記第一の関数の第一の導関数（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の、当該第一の時間から当該第一の導関数のピークまでの積分面積が、特定の数値の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
更に：
前記第一の関数を解析して、当該第一の関数の勾配が最大増幅勾配（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｓｌｏｐｅ）を超えるか否かを決定する工程；及び
当該第一の関数に当該最大増幅勾配を超える場所がある場合、その後当該場所を含むセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）を増幅曲線の非増幅セグメントとして扱う工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記最大増幅勾配が、ｌｎ（２．０）に当該勾配が算出される場所のデータポイントの数値を乗じたものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的及び／又は化学的反応の増幅プロセスで得られた増幅曲線のベースライン領域を決定する方法であって：
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する；
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する関数を決定する工程；
前記関数の第一の微分を演算して第一の導関数を取得する工程；
プロセッサーを使用して、ベースライン領域の終点を：
複数の各点において：
前記第一の導関数を、各点から前記第一の導関数の所定の場所まで積分して、各積分面積を取得することにより；及び
積分面積が前記ベースライン領域の終点として特定される範囲内にある点を選択することにより；
決定する工程；並びに
前記ベースライン領域の始点（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）を決定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記第一の導関数が、前記関数の第一の微分から最初のデータポイントでの第一の微分を引いたものを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択された点の積分面積が、前記最初の点から所定の場所までの前記第一の導関数の面積の既定のパーセントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
更に：
前記第一の導関数のピークを同定する工程を含み、ここで当該第一の導関数上の所定の場所が当該第一の導関数のピークである；
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記積分が、前記第一の導関数上のピークから、前記第一の導関数の始点まで実施されることにより、前記各積分面積が得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ベースライン領域の始点を決定する工程が：
１つのデータポイントが次のデータポイントに至るまでの数値の増大が所定の量を超えているか否かを判定すること；及び
所定の量を超えている場合に、当該１つのデータポイントの後にあるベースラインの始点を選択すること；
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベースライン領域の始点の決定が、当該ベースライン領域のデータポイントが閾値の中で線形の挙動を近似しない場合、当該ベースライン領域からの１つ以上のデータポイントを切り捨てる（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）ことを含み、ここで、当該ベースライン領域からの１つ以上のデータポイントの切り捨てが：
ｉ）当該ベースライン領域を、データポイントのセットの始点から当該ベースライン領域の決定された終点までの複数のデータポイントとして定める工程；
ｉｉ）当該ベースライン領域を解析して、当該ベースライン領域が、当該ベースライン領域の中のデータポイントの線形の挙動に基づいて非増幅的な挙動を呈するか否かを判定する工程；
ｉｉｉ）当該ベースライン領域が前記閾値中で線形の挙動を近似しない場合、当該ベースライン領域から１つ以上の主要なデータポイントを除去する工程；
ｉｖ）工程ｉｉ〜ｉｉｉを、ａ）当該ベースライン非増幅的な挙動を示すまで、又はｂ）工程ｉｉ〜ｉｉｉが所定の回数反復されるまで反復する工程；
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的及び／又は化学的反応の基準値を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法であって：
ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットを取得する工程、ここで各データポイントが増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する；
プロセッサーを使用して、前記データポイントのセットを近似する関数を決定する工程；
前記プロセッサーを使用して、前記関数の２つ以上の異なる微分を演算する工程；
前記増幅プロセス中で各微分が最大値をとる各時間を同定する工程、ここで異なる微分における各時間が異なる；
前記プロセッサーを使用して、前記生物学的及び／又は化学的反応の基準値を、前記各時間の加重平均として算出する工程；
を有する、前記方法。
【請求項２２】
前記２つ以上の微分が、第二の微分及び第三の微分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二の微分が（１−ｐ）により加重され、且つ前記第三の微分がｐにより加重され、そしてｐが０．３〜０．７の範囲の数値をとる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
更に；
基準曲線の効率が１００％となるように加重平均の加重を設定する工程；
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
複数の指令を保存した非一時的なコンピューター可読媒体であって、当該指令が、実行されたときに、生物学的及び／又は化学的反応の増幅プロセスを表現するデータセットから当該反応の１つ以上の特性を判定するようにコンピューターシステムを制御するものであって、当該指令が請求項１に記載の方法を含む、前記媒体。
【請求項２６】
複数の指令を保存した非一時的なコンピューター可読媒体であって、当該指令が、実行されたときに、生物学的及び／又は化学的反応の増幅プロセスから得られた増幅曲線のベースライン領域を判定するようにコンピューターシステムを制御するものであって、当該指令が請求項１４に記載の方法を含む、前記媒体。
【請求項２７】
複数の指令を保存した非一時的なコンピューター可読媒体であって、当該指令が、実行されたときに、生物学的及び／又は化学的反応の増幅プロセスを表現するデータセットから当該反応の基準値を判定するようにコンピューターシステムを制御するものであって、当該指令が請求項２１に記載の方法を含む、前記媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、２００８年９月９日に出願された（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．  ００２５５８−  ０８３２００ＵＳ）、米国仮出願第６１／０９５，４１０号、表題「ＭＵＬＴＩ−ＳＴＡＧＥ，  ＲＥＧＲＥＳＳＩＯＮ−  ＢＡＳＥＤ  ＰＣＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ」の本出願（ｎｏｎ−ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に基づく優先権を主張し、その全ての内容は、本明細書中、全ての目的で、参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、全体的には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の、増幅を呈する生物学的及び／又は化学的反応で得られたデータを解析する、データ処理システム及び方法に関する。
【０００３】
多くの実験プロセスは、量の増幅を呈するものである。例えば、ＰＣＲにおいて、量は、複製されたＤＮＡ鎖の部分の数に対応し、この量は、ＰＣＲデータプロットの増幅領域において現れる増幅段階の間に、劇的に増大する。ＰＣＲデータは、典型的には、線形にドリフトするベースラインを示す領域、続いて増幅領域における指数増殖により描写される。消耗材料（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ）が枯渇すると、曲線は漸近線に変化する。増幅を呈する他の実験プロセスとして、細菌の増殖プロセスが挙げられる。
【０００４】
実験プロセスの量は、データシグナルを介して、実験装置から検出される。例えば、データは、各ウェル又はチューブ内で起こる１つ以上の反応に由来する、励起波長及び放出波長の変化をイメージングすることにより、回収され得る。当該データシグナルは、増幅の情報を決定するために解析されるデータポイントを含む。回収されたデータは、その後、典型的には、後で使用するために保存される。
【０００５】
ＰＣＲデータを使用して実施され得る解析の一例として、ベースライニングが知られている。ベースラインは、データにおけるノイズ又は設備に特異的なレベルを表すもので、増幅段階と区別される。より良好にデータの増幅領域を解析するために、しばしば、データシグナルからベースラインをドリフトする線を除去するのが望ましい。そのようなベースライニングは、ベースラインに対する実際の増幅のレベルを決定するのに好都合である。ベースラインは曲線の基礎により異なる場合があるので、幾つかの種類の解析において、この方法は、異なる曲線間で増幅レベルを比較することを可能とする。本願に全ての目的で参照により援用される米国特許公報第２００６／０２６９９４７号に、ベースライニングの一例が記載されている。
【０００６】
ＰＣＲデータを使用してしばしば行われる他の解析は、反応中の特定の標的分子の、絶対的又は相対的な、定量化を算出することである。これは、基準閾値に対応する標的シグナル閾値を設定することにより達成され得る。そして、この標的閾値に達するのに必要なサイクル数を、Ｃｔ値と称する。反応のＣｔ値を決定するための従来の方法は、しばしば、例えば原データ又は原データ中のノイズのモデリングの正確性等により限定される。
【０００７】
これらの及び他の種類の解析のための方法は存在するが、増幅システムから取得したデータは、しばしば顕著なノイズ及び他の変化する性質（ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｓｐｅｃｔ）を含み、これらは、反応の特徴の決定の効率及び正確性を妨げる。故に、増幅曲線を解析する新しい方法が必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明の態様は、ＰＣＲプロセス又は他の増幅を呈するプロセスの特性を決定するためのデータ解析システム、方法、及び機材を提供する。一つの態様において、多段階の関数の適合（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｉｔ）を使用して、決定された特性の正確性を増大することが出来る。一つの側面において、当該特性として、ベースライン、増幅プロセスの基準定量値（例えばＣｔ値）、増幅の存否、及び増幅プロセスの効率等が挙げられる。
【０００９】
一つの態様において、生物学的及び／又は化学的反応の１つ以上の特性を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法が提供される。ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットが得られる。各データポイントは、増幅プロセスの間の物質の物理量を表現する。プロセッサーは、前記データポイントのセットを近似する第一の関数を演算する。当該第一の関数から、１つ以上のパラメーターが抽出される。前記プロセッサーは、１つ以上のパラメーターを使用して、データポイントのセットを近似する第二の関数を演算する。前記生物学的及び／又は化学的反応の１つ以上の特性は、当該第二の関数を使用して決定される。
【００１０】
他の態様において、生物学的及び／又は化学的反応の増幅プロセスから得られた増幅曲線のベースライン領域を決定する方法が提供される。プロセッサーは、前記データポイントのセットを近似する関数を演算する。第一の導関数（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を得るために、前記関数の第一の微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が演算される。プロセッサーは、ベースライン領域の終点を、プロセッサーを使用して、前記第一の導関数を、各点から前記第一の導関数の所定の場所まで積分して、各積分面積を取得することにより決定する。積分面積が特定の範囲内にある点が、ベースライン領域の終点として選択される。ベースライン領域の始点（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）も決定される。
【００１１】
更なる他の態様において、生物学的及び／又は化学的反応の基準値を、当該反応の増幅プロセスを表現するデータセットから決定する方法が提供される。ベースライン部分及び増殖部分を有する曲線を形成するデータポイントのセットが得られる。プロセッサーは、前記データポイントのセットを近似する関数を決定する。プロセッサーは、前記データポイントのセットを近似する関数を決定する。前記プロセッサーは、前記関数の２つ以上の微分を演算する。前記増幅プロセスにおいて、各微分が最大値をとる各時間が同定される。前記生物学的及び／又は化学的反応の基準値は、前記各時間の加重平均として算出される。
【００１２】
一つの態様において、回収されたデータの勾配又は当該データを近似する関数が閾値を越える勾配を有するか否かをチェックすることにより、当該データ中の増幅を表現するデータが、ジャンプ又は他のエラーを表現するデータから区別され得る。他の態様において、ドリフト項を含む変形シグモイド関数が、前記増幅プロセスを表すデータを近似するのに使用され得る。
【００１３】
本発明の他の態様は、本明細書中に記載される方法に関連する、システム及びコンピューターで読取り可能な媒体に関する。
【００１４】
本発明の本質及び長所は、以下の詳細な記載及び付属の図面を参照にして、より良く理解を得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＣＲ増幅曲線の例を示す。
【００１６】
【図２】増幅プロセスから測定された原データの例を示す。
【００１７】
【図３】本発明の態様に係る、増幅反応から得たデータポイントを解析する方法を描写するフロー図を示す。
【００１８】
【図４】実際の増幅に対してジャンプしているデータ曲線の例を示す。
【００１９】
【図５】本発明の態様に係る、データ曲線のセグメントが増幅を示すか否かを決定する方法を描写するフロー図を示す。
【００２０】
【図６】本発明の態様に係る、増幅曲線のベースライン領域を決定する方法を描写するフロー図を示す。
【００２１】
【図７】本発明の態様に係るベースライニングの方法から得られた増幅データ及び曲線のプロットを示す。
【００２２】
【図８】本発明の態様を使用してベースライニングした多くのＰＣＲ曲線の例を示す。
【００２３】
【図９】本発明の方法に係る、増幅反応の特性を決定するために、多段階の関数の適合を実施することにより、増幅曲線を解析する方法を描写するフロー図を示す。
【００２４】
【図１０】本発明の態様に係る、変形シグモイド関数とＰＣＲデータとの間の適合を示す。
【００２５】
【図１１】本発明の態様に係る、ＰＣＲ曲線の様々な最大の微分の演算を例示する。
【００２６】
【図１２】本発明の態様に係る、Ｃｔ値を決定するために、複数回の関数の適合を実施することにより、増幅曲線を解析する方法を描写するフロー図を示す。
【００２７】
【図１３】本発明の態様に係る、リアルタイムＰＣＲデータを処理するシステムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、例えば増幅反応の異なる特性の数を決定するために、増幅反応の結果を処理及び解析する技術を提供する。ＰＣＲ増幅プロセスで得たデータを解析するのに様々な態様が特に有用であって、当該データとして、ベースライン、定量値（例えばＣｔ値）、及び異なる領域の当該データの関数形式に由来する挙動等が挙げられる。しかしながら、本発明の教示は、ノイズを含み得るデータセット又は曲線、そして特に細菌の増殖プロセス等の、増殖（増幅）を呈すると推定される他の特定の曲線の処理に適用することも当然に可能である。
【００２９】
Ｉ．  増幅曲線
増幅（増殖）曲線は、一定時間中でいずれの時に量が増大したかを示す。そのような曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）から得られる。典型的なＰＣＲ増殖曲線のデータは、二次元的なプロットで表現でき、例えば、ｘ軸にサイクル数をとり、ｙ軸に累積の増殖の指標をとる。典型的には、前記累積の増殖の指標は、蛍光マーカーに由来する蛍光強度の数値である。使用される具体的なラベル及び／又は検出スキームに依存して、他の指標も使用され得る。例として、発光強度、生物発光強度、燐光強度、電荷移動、電圧、電流、力、エネルギー、温度、粘性、光散乱、放射線強度、反射率、透過率及び吸光度が挙げられる。サイクルの例として、時間、プロセスサイクル、単位操作サイクル（ｕｎｉｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）及び生殖サイクル等が挙げられる。
【００３０】
図１は、ＰＣＲ曲線１００を示し、ここでは、典型的なＰＣＲプロセスについて、サイクル数１２０に対する強度の数値１１０がプロットされている。数値１１０は関心のある任意の物理量であってもよく、そしてサイクル数は、プロセス中の時間又は工程の数に関連する任意の単位であり得る。そのような増幅曲線は、典型的には、線形部分（領域）１３０、これに増殖（増幅）部分１４０、更に漸近部分１５０が続く。図１を参照されたい。また、下方にカーブするデータ等の追加の種類の挙動も存在し得る。増殖部分は指数的、シグモイド的、高次多項式的、又は他の種類のロジスティック関数、又は増殖を表現するロジスティック曲線を有する。
【００３１】
関与する実験プロセスを理解するために、増殖部分１４０の位置及び形状を同定することが重要である。例えば、ＰＣＲプロセスにおいて、増幅の開始を同定するのが望ましく、それは、ベースライン部分（線形部分１３０）の終点１６０に起こる。加えて、増殖部分１４０の形状の解析は、しばしば、「ベースライニング」、あるいはＰＣＲ曲線１００から線形部分１３０を差し引く工程を含む。
【００３２】
図２は、増幅を表すリアルタイムＰＣＲ曲線２００を図示する。まず、当該データは、領域２３０で線形の挙動を示す。そして、その後のサイクルで、領域２４０において、増幅が認められる。図２を図１と比較すると、リアルタイムＰＣＲ曲線中にしばしば存在するノイズ及び他の変動性が、本来の反応の重要な特性を決定するための任意のデータ解析を、図１に示すより理想的なモデルよりも一層困難にする可能性があることは明白である。
【００３３】
前記曲線は、多くの異なる目的で解析され得る。幾つかの目的は、本明細書中に記載される。
【００３４】
ＩＩ．  増幅曲線の解析の概要
図３は、本発明の態様に係る増幅反応から得たデータポイントを解析する方法を描写するフロー図を示す。図３の工程の多くは、一つの態様の具体的な要請に依存して任意である。加えて、図３に示されている様々な工程の多くは、他の工程から独立して実施され得る。例えば、図１２に記載のベースライン解析は、いずれかのＣｔの決定から独立して実施される。図３の工程の幾つかを実施する具体的な方法は、他の図に関連して後述する。
【００３５】
工程３１０において、増幅を引き起こす生物学的又は化学的反応の原データを、解析のために取得する。態様によっては、前記原データは、前記反応から取得した光の様々な波長を表す。一つの態様において、前記データは、前記反応の各サイクルの後に測定される光の強度である。例えばサイクルあたりの蛍光値のセットの形の前記原データは、解析されるために、メモリーに書き込まれ得る。
【００３６】
工程３２０において、これらの光の波長は、更なる解析を実施する前のそれらの色に従って分離され得る。一つの態様において、ウェル毎に補正された色分離マトリックスが生産され、これは機器較正データから得ることができる。当該マトリックスは、ウェルに充填される色素に特異的に依存し得る。一つの側面において、逆マトリックス又は特異値分解等のマトリックス演算が使用されて、前記原データから色分離データが算出される。色分離データは、色素、工程番号及びウェルインデックスによりそれぞれ同定される、曲線のセットとしてアウトプットされ得る。色分離データは、曲線のセットとしてアウトプットされ、それぞれが、色素、工程番号及びウェルインデックスにより同定される。増幅曲線は、各色、並びに各ウェル試料及び工程に対して存在する。これらのアウトプット曲線は、使用者に提示される前にベースラインが差し引かれる場合もある。
【００３７】
工程３３０において、色分離原データは、当該データが本来の反応において増幅が起こったことを示すものであるか否かを判定するために解析される。増幅が起こったか否かを判定するのに、様々な解析が実施され得る。曲線が短すぎる場合、曲線中のデータの値の標準偏差が十分に小さい場合、曲線中のデータポイントの関数の適合が負の勾配を有する場合、及びデータとその線形の適合との間の差が、点の数と比較して充分な回数のサインを切り替える場合等が、非増幅と判定されるものの例として挙げられる。全ての目的で参照により援用される米国特許出願第２００６／０２７１３０８号は、増幅を表すデータから線形データを区別するために、データが統計的に線形の挙動を表すか否かを判定する方法を開示している。態様によっては、データが増幅の発生を示すか否かを判定するために、最大増幅勾配結合解析（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｓｌｏｐｅ  ｂｏｕｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が実施され、これは下記で詳述する。
【００３８】
増幅が起こらなかった場合、態様によっては、データの更なる解析を行わない場合もある。増幅が起こった場合は、態様によっては、方法３００が続いて行われ得る。
【００３９】
工程３４０において、ベースライン解析が行われる。ベースラインは、一般に、増幅プロセスに関係しない作用に関連するものである。例えば、オフセット、ドリフト、ノイズ、又は他のアーティファクトが強度シグナル中に存在する場合があり、それらは、本来の増幅プロセスの結果ではない。前記ベースライン解析は、様々な方法で実行され得る。態様によっては、前記ベースライン解析は、特定の信頼レベル内のベースラインの終点を決定するための原データの関数の近似（適合）から、確率分布関数を作成することにより実施される。このベースライン解析は、本開示の中でより詳しく検討される。一つの態様において、前記原データの関数の近似として、シグモイド関数が使用され得る。
【００４０】
工程３５０において、前記原データに密接に合致する関数の近似を作成することにより、関数の適合が実施される。態様によっては、工程３４０で得られる関数の適合が、工程３５０の適合として使用される場合もある。他の態様において、新しい関数の適合が実施され、これは、過去の関数の適合に基づくものの場合もある。そのような多段階の適合は、下記で詳述する。態様によっては、前記関数の近似として、変形シグモイド関数が使用される。
【００４１】
工程３６０で、態様によっては、Ｃｔ値の決定のために、工程３５０で得た関数の近似を使用する。上記で議論したように、増幅曲線において、Ｃｔ値は、前記反応における特定の標的分子の、絶対的な、又は相対的な意味での定量を計算するために使用され得る。態様によっては、前記Ｃｔ値は、前記関数の近似の２つの微分の加重平均を使用して決定される。
【００４２】
態様によっては、工程３３０の結果が非増幅を示す場合、方法３００において、ベースライン領域の終点が最終サイクルとなり、及び／又はＣｔ値が前記曲線とその平均値が交差する角度となる。
【００４３】
ＩＩＩ．  増幅の存否の判定
上記工程３３０において記載したように、データが増幅反応を表すか否かに関して、解析が行われ得る。一つの態様において、最大増幅勾配結合解析が実施される。
【００４４】
多くの場合、測定の間に機械に接触し、又は動作不良が生じることにより、データのジャンプが生じる。この場合、前記データは、増幅を表すように見えるが実際はエラーのアーティファクトである鮮明なジャンプを炙り出すことが出来る。このような挙動を炙り出す曲線の極端な例を、図４に挙げる。図４において、ＲＦＵは相対蛍光強度を意味し、そしてサイクルは、ＰＣＲ反応又は増幅型の挙動を示すいずれかのプロセスの増幅のサイクルを意味する。態様によっては、実際の増幅と、エラーに起因するデータのジャンプ等のいずれかのアーティファクトとを峻別するために、実際の増幅の最大許容勾配（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｌｌｏｗｅｄ  ｓｌｏｐｅ）を使用する。
【００４５】
図５は、本発明の一つの態様に係る、データ曲線のセグメントが増幅を示すか否かを決定する方法５００を描写するフロー図である。様々な態様において、方法５００は、ベースライニングの前に、ベースライニングの後に、又はベースライニング手順の部分として実施され得る。例えば、前記曲線のベースラインの始点から終点までの部分が、増幅挙動を同定するために；そして、増幅挙動が存在するか否かを同定するために解析され、その後に方法５００が実行される場合もある。
【００４６】
工程５１０において、増幅を呈する生物学的又は化学的反応から抽出されたデータが、解析の為に取得される。態様によっては、前記データは、色分離され得る。取得されたデータは、典型的には、ベースライン部分及び増殖部分を有する。
【００４７】
工程５２０において、前記データの関数の近似を取得するために、前記データを使用しての関数の適合が実施される。この関数の近似は、態様によっては、本来の反応の様々な特徴を決定するために使用され得る。態様によっては、シグモイド関数が、関数の近似のために使用される。他の態様において、関数の適合は、前記データの一部分のためだけに実施され得る。
【００４８】
工程５３０において、関数の近似の解析は、関数の適合の勾配が最大増幅勾配結合（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｌｏｐｅ  ｂｏｕｎｄ；ＭＡＳＢ）を超えるか否かを判定するために実施される。当該関数の適合の勾配の解析は、データ曲線のあらゆる点において実施される場合もある。
【００４９】
工程５４０において、勾配が最大増幅勾配を超える場所（セグメント等）において、前記データは、非増幅とみなされ得る。一つの態様において、方法５００の解析が全ての可能な増幅領域を抜き取った場合、当該データ曲線は、非増幅と分類され得る。他の態様において、増幅領域が前記ジャンプの後に存在する場合、ベースライン領域の始点は、当該ジャンプの直後に設定され得る。
【００５０】
前記最大勾配の導出における一つの態様を、以下に記載する。一つの側面において、下記等式は、実際の増幅曲線の勾配が、理想的な、純粋に指数関数的な、定常的な最大効率の増幅曲線の勾配により、上方が境界される（ｂｏｕｎｄｅｄ  ａｂｏｖｅ）ことを示す。
【００５１】
増幅を検討する。ここで、ｙｎはベースライニングされたデータを表し、そしてはＥＮはＮサイクルでの増幅効率を表す。
【化１】
0005166608.tif 000002
【００５２】
前記挙動は指数関数的であるから、微分は、ｌｎ空間（ｌｎは自然対数）における差により近似され得る。結果として、当該微分は、以下のように記載される。
【化２】
0005166608.tif 000003
【００５３】
平均値の定理を使用して、以下のように表すこともできる。
【化３】
0005166608.tif 000004
ここで、Ｎは、Ｎ＝Ｎ＊、及びＮ＜Ｎ＊＜Ｎ＋１のいずれかの数値と評価される。
【００５４】
前記ベースライニングされたデータの自然対数と前記平均値の定理との差から導き出された等式を組み合わせて：
【化４】
0005166608.tif 000005
が得られ、ここで、ｙ及びＥは、連続関数としてどこに定めてもよい。当該等式の右辺及び左辺は、異なる数値、Ｎ及びＮ＊と評価されると留意されたい。Ｅ（Ｎ）＜１であるため、当該等式の右辺は、ｌｎ（２）により厳密に上方が境界される。
【００５５】
右辺はＮとは独立しているため、＊は無くともよい。その結果、以下のようになる。
【化５】
0005166608.tif 000006
【００５６】
その結果、次の式が得られる。
【化６】
0005166608.tif 000007
【００５７】
この式は、前記データに対する関数の適合（例えば回帰関数の適合）について、この不等式が満たされるか否かを判定する試験として評価され得る。当該不等式が満たされる場合、そのデータは増幅を表すものと推定される。当該不等式が満たされない場合、そのデータはアーティファクトを含むものであって、相応に処理され得る。例えば、この試験は、収集したＰＣＲデータが増幅を含む反応を表すか否かを判定するために使用される、最初の試験の一部分として使用され得る。他の態様において、他の目的でもこの解析が使用され得る。
【００５８】
ＩＶ．  ベースライニング
図６は、本発明の一つの態様に係る増幅曲線のベースライン領域を決定する方法を描写するフロー図である。方法６００のグラフは、図７に示される。
【００５９】
工程６１０において、前記データに対する関数の近似（適合）が取得される。態様によっては、当該関数の適合において、純粋なシグモイド関数が使用され得る。シグモイドは、回収されたデータにより定められる曲線に対する関数の近似を提供する。原データ７０１及びその関数の近似７０２を、図７に示す。
【００６０】
工程６２０において、前記関数の適合の第一の微分Ｆ’が決定される。第一の微分は、様々な方法で決定され得て、実施された関数の適合の種類に依存し得る。
【００６１】
工程６３０において、前記曲線の始点の微分値であるＦ’（０）は、当該導関数がベースライニングされるように、前記曲線自体から差し引かれ得る。ベースライニングされた第一の導関数の一例を、７０３に示す。
【００６２】
工程６４０において、例えば、点が増幅（増殖）領域の中にある確率を定める分布等の、確率分布関数が作成される。このようにして、増幅領域の始点が決定されることにより、ベースライン領域の終点が計算され得る。
【００６３】
一つの態様において、前記確率分布関数は、非斜交平行領域（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｈａｔｃｈｅｄ  ａｒｅａ）７０８中の、第一の導関数の下の面積に関する。前記導関数のピーク以後の領域は、領域７０５に図示されるように、切り離される。故に、領域７０５は、ベースライン解析の一つの態様において、使用されない。前記導関数の始点から前記導関数のピーク７０４（変曲点で生じる）までの領域が、更なる解析に使用される。ベースライニングされた導関数は、その後、（例えば正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）として）その曲線の下に規定される領域により分割されて、所定の点が増幅領域内にあるか否かの確率分布として解釈され得る新しい関数が得られる。当該確率分布関数は、本来の曲線の変曲点で最大値（１００％）をとり、そして当該曲線の始点で、０％に向かって単調に減少する。
【００６４】
工程６５０において、増幅領域の始点において、信頼レベルが選択される。態様によっては、前記信頼レベルは、ベースライニングされた導関数の下の面積の大きさ（パーセンテージ等）に関連する。例えば、ベースライン領域の始点は、積分面積が相対的に小さい位置に発生するものとして解釈され得る。そのような点は、増幅領域中に存在する確率が低い（例えば３〜０％）ことにより、その点がもはやベースライン領域中に無いと考えられるときに発生する。
【００６５】
一つの態様において、ある点が増幅領域の中にある確率は、増幅領域の始点の信頼レベルが１００％付近となるように、逆に（例えば１００％から差し引く）記述される場合もある。一つの態様において、実際の問題として、信頼レベルの数値は、９０％〜９７％となるのが望ましい。１００％の数値は、実際は、その点が曲線全体の始まりに近くなり得るため、増幅領域の始点としてサイクル数が低すぎる。９０％未満の数値は、その点が増幅領域の中にある可能性が極めて高くなり得るため、数値が高すぎる。
【００６６】
工程６６０において、ベースラインの終点は、信頼レベルが到達する点により決定される。一つの態様において、所望の信頼レベル内で増幅領域の始点（ベースライン領域の終点）を決定するために、確率分布関数を、７０６に示すように、ピーク７０４から当該関数の始まりに向かい、当該面積が選択された信頼レベル（例えば分数サイクル値（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）ｘ）と合致するまで積分する。図７において、この点は、７０７と記される。ピーク７０４から点７０７までの確率分布関数の下の面積は、選択された信頼レベルと等しい。
【００６７】
他の態様において、前記曲線は、始点から、信頼レベルが例えば３％〜１０％と解釈され得るところに達するまで積分され得る。この数値を１００％から差し引いたものが、信頼レベルが選択された（例えば１００％付近）方法に合わせるために使用される。
【００６８】
この点７０７は、増幅が発生したことが予想される領域の信頼できる境界として使用される。このサイクル値は、ベースラインの終点として解釈され得る。
【００６９】
工程６７０において、ベースラインの終点が決定された後、ベースラインの始点が決定され得る。一つの態様において、前記曲線の始点からベースラインの終点までの部分（抽出された部分）が解析されて、ベースラインの始点が決定される。当該抽出された部分が十分に線形である場合、ベースラインの始点が、前記曲線の始点に設定される。
【００７０】
一つの側面において、十分な線形性（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）は、データポイントが線に適合し得る尺度として測定される。例えば、最小二乗適合（ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ  ｆｉｔ）において、適合した線からのデータポイントの標準偏差は、線形性の尺度として使用され得る。線形挙動からのエラーは、線形性が存在するか否かを決定するために、閾値と比較され得る。
【００７１】
十分に線形な領域は、非増幅的な領域として扱われ得る。一つの態様において、第一のサイクルがベースライン領域から除かれることにより、装置の安定性のようなＰＣＲプロセスの開始に共通する問題が排除される。
【００７２】
前記曲線の抽出された部分が十分に線形でない場合、ベースラインの始点を決定するために、追加の解析が実行され得る。一つの態様において、当該追加の解析は、一つの態様において、当該追加の解析は、前記曲線の抽出された部分の末端（ｌｅａｄｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）を、末端の領域が非増幅領域に達するまで、又は所定の繰り返しの最大回数に達するまで、繰り返し除去又は切り取ることからなる。ベースラインの始点がジャンプの位置の直後に設定されるように、ベースライン領域内にジャンプが存在するか否かを決定するために、上記で開示した最大勾配解析が、追加で繰り返し使用され得る。
【００７３】
以下は、このベースライニング方法の態様のより詳細な数学的記載である。
【００７４】
第一の工程は、前記原データに、関数の適合を行うことである。当該関数の適合の関する第一の工程は、前記データをモデル化するのに使用されるべき関数の近似を選択することである。一つの態様において、シグモイド関数が、この目的に使用される。
【００７５】
次に、選択された前記データの関数の近似に使用される初期回帰（適合）パラメーターのセットを定める必要がある。下で使用される回帰パラメーターは：ａ０、ａ１、ａ２、ａ３ある。下記パラメーターのセットは、様々なデータセットにおいて良好に動作することが実験的に判定された１組のパラメーターの例である。ここで、ｙ＝ＲＦＵ、ｘ＝サイクルであって、これらのパラメーターは、以下のように利用され得る：ａ０＝ｙ［１］；ａ１＝ｙ．Ｍａｘ−ｙ．Ｍｉｎ；ａ２＝ｘ．Ｌｅｎｇｔｈ／２；ａ３＝１．０
【００７６】
これらの回帰パラメーターを使用するシグモイド回帰関数の例として、以下のものが挙げられる。
【化７】
0005166608.tif 000008
【００７７】
この回帰関数を使用して、前記関数の第一の微分が、以下のように計算され：
【化８】
0005166608.tif 000009
そして、第二の微分が、以下のように計算される。
【化９】
0005166608.tif 000010
第一の微分は、第二の微分の方程式が０となるｘの値で最大となる。
【００７８】
ある点が増幅領域中にある確率は、以下のように計算される。
【化１０】
0005166608.tif 000011
【００７９】
非斜交平行領域において、出願人らは、変曲点Ｉから左に積分することにより、増幅領域の開始部にある信頼度９５％の境界μを探す。
【化１１】
0005166608.tif 000012
【００８０】
Ｐに上記式を代入すると、以下のようになる。
【化１２】
0005166608.tif 000013
【００８１】
この式に前記純粋なシグモイドを代入して、以下の式が得られる。
【化１３】
0005166608.tif 000014
【００８２】
次に、以下の式を反復する（ｉｔｅｒａｔｅ）ことにより、ベースラインの始点を決定する。
【化１４】
0005166608.tif 000015
これらの関数は、それがベースライン領域の所望の終点に収束するまで反復される。
【００８３】
図８は、上記ベースライニング方法の有効性を示す。図８において、多くのノイズを含むデータセット等の多くの異なるデータセットが、上記方法を使用して、効率的にベースライニングされる。明らかに認められるように、増幅の前の線形領域は、曲線を差し引いた場合、線形の領域が、グラフのｘ軸（サイクル）に対して平行となるものとして同定されていた。
【００８４】
Ｖ．  多段階の関数の適合
上記に述べたように、増幅反応から得られるデータ値の関数の近似は、ベースライニング及びＣｔ値の同定等の、複数のプロセスにおいて使用され得る。使用されていた一つの関数の式は、式１／（１＋ｅ４）のシグモイド関数である。しかしながら、そのような関数の式は、増幅反応の物理的特性を誤認する可能性がある。故に、態様によっては、ドリフト項を使用する変形シグモイド関数（下記）が使用され、これは、様々な浮動するベースラインや、シグモイド関数が誤認する可能性がある他の特性を考慮している。
【００８５】
しかしながら、既定のパラメーターと共に使用される場合、当該高分解能（ｈｉｇｈｅｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の関数は、良好な関数の適合を提供するのに安定性を欠く可能性がある。例えば、上記で議論した変形シグモイド関数のような高分解能の関数は、しばしば、関数を形成するための最初の開始パラメーターに対し、低分解能の関数よりも大幅に敏感である。その結果、これらの高分解能の関数への既定のパラメーターの使用は、良好な結果を生じない場合がある。言い換えると、前記高分解能の関数は、既定の開始パラメーターが使用される場合、前記データの関数の近似と前記データ自体との間のエラーを効率的に減少させられない場合がある。
【００８６】
いずれかの回帰関数に存在するエラーは、例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズム等の、アルゴリズムを使用して最小化することが出来る。このアルゴリズムは、エラー、即ち適合する関数と実際のデータとの間の差を最小化する。当該差は、下記等式により測定され：
【化１５】
0005166608.tif 000016
ここでＰは、適切な適合が達成されるまで変化させられるべき回帰パラメーターのベクトルである。伝統的に、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎ法及びＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｄｅｓｃｅｎｔ法の組合せであって、これにより、前記アルゴリズムは、エラーの性質に依存して、計算の過程でいずれの方法を使用するべきかを調節する。
【００８７】
前記変形シグモイド関数形式が使用される場合、最小化アルゴリズムを用いて収束を行うのは困難な場合がある。よって、一つの態様において、前記変形シグモイド関数形式用のパラメーター（シード値（ｓｅｅｄ  ｖａｌｕｅ））を得るために、第一のシグモイド関数の適合が行われる。他の態様において、前記変形シグモイド関数の適合は、他の関数の適合からシード値を得ずに計算され得る。
【００８８】
図９は、本発明の態様に係る、増幅反応の特性を決定するために、多段階の関数の適合を実施することによる、増幅曲線を解析する方法を描写するフロー図である。示されているように、方法９００は、３つの関数の適合の段階を使用するが、他の態様において、より多く、又はより少ない解析の段階が使用され得る。シグモイド及び変形シグモイド関数を使用する実施例が提供されるが、多段階の関数の適合は、他の関数形式を使用する場合もある。
【００８９】
下記の記載において、「低分解能」及び「高分解能」という用語は、関数の適合の順番を意味し、高分解能の適合は、低分解能の適合の後に行われる。これらの用語は、前記データの関数の近似が本来の原データを描写（ｍａｐ）する正確性の度合に対応し得るものでもある。故に、前記解析の各段階は、それ以前の解析の段階を積み重ねて、前記データの正確な近似を形成する。
【００９０】
工程９１０において、前記増幅反応から、データを取得する。このデータを、本明細書中に記載されるような、任意の適切な形式であり得る。
【００９１】
工程９２０において、前記増幅データの第一の関数の適合が決定される。当該第一の関数の適合は、低分解能である。例えば、前記データ曲線は、純粋なシグモイド関数により適合され得る。シグモイドモデル等の低分解能の関数は、典型的には、変形シグモイド回帰関数等のより高分解能の関数よりも、初期のシードパラメーターに対して感受性が低い。その結果、純粋なシグモイド関数は、既定の初期パラメーターを使用して、良好に動作する。
【００９２】
一つの態様において、この関数は、高分解能の関数が有効でないいずれかの解析を実施するのに使用され得る。この第一の関数の適合を使用して行われ得る解析は、例えばベースライン解析である。
【００９３】
工程９３０において、前記多段階解析の次の段階のためのシードパラメーターを作り出すために、低分解能解析が使用され得る。一つの態様において、前記シードパラメーターは、高分解能関数のパラメーターの初期値である。
【００９４】
工程９４０において、第二の関数の適合は、より高分解能の適合（例えば回帰関数）を得るために、前記シードパラメーターを使用する。一つの側面において、低分解能の関数から得たシードパラメーターを使用することにより、より高分解能の適合における良好な初期値を得ることが出来る。初期値が良好であれば、適合の方法（例えば上記のもの）の収束は、より容易かつより確実に達成できる。
【００９５】
多段階の関数の適合の実施は、取得された最後の関数の適合にロバスト性をもたらす場合もある。ロバスト性の重要な尺度は、本来の反応の特性の決定の反復可能性である。高分解能の関数は、本来の反応のＣｔ値等のパラメーターを計算するのに使用され得る。前記反復可能性は、反復におけるＣｔの標準偏差を使用して測定され得る。ロバスト回帰エンジン（ｒｏｂｕｓｔ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅ）も、より確実に収束して、より小さいＣｔ標準偏差を提供する。ここで、収束は、実際のデータへの適合のエラーが十分に小さいか否かにより測定される。
【００９６】
工程９５０において、第二の関数の適合を使用して、前記増幅反応のＣｔ値が決定される。一つの態様において、Ｃｔ値は、前記第二の関数の適合（例えば変形シグモイド関数）が閾値と交差する位置のサイクル数として決定される。他の態様において、前記関数の近似（適合）の微分の加重平均が、Ｃｔ値として使用される。
【００９７】
工程９６０において、工程９５０で得られたＣｔ値により定められる領域内で、第三の関数の適合が実施される。例えば、前記第二の関数の近似から計算されるＣｔ値が、前記増幅反応を包含する領域の重心（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）を定めるのに使用され得る。そして、前記第三の関数の適合が、この領域内のデータポイントの近似として形成される。一つの態様において、前記重心により定められる領域の幅は、当該重心と増殖（増幅）領域の始点との間のサイクル幅の２倍である。
【００９８】
一つの態様において、この第三の関数の適合は、増幅領域に対してのみ行われる。増幅曲線の大域的挙動（ｇｌｏｂａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）における変動性のためである。この変動性は、空間的整合の問題（ｓｐａｔｉａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｓｓｕｅ）等の要素による、装置のバイアスの可能性を反映するものである。前記第二の関数の適合は大域的であってもよく、かつ増幅曲線全体の全体的な挙動を反映するものであるから、このバイアスは、第二の回帰から算出されたＣｔ値に反映され得る。この効果を減少させるために、非常に高分解能の回帰が、増幅領域のみを包含する帯（ｗｉｎｄｏｗ）において実行され得る。これは、曲線の先端、及び曲線の末端等の、化学においてしばしば劣化及び整合の問題が生じる部分に反映される変動性を排除する。
【００９９】
態様によっては、前記第三の関数の適合は、多項式回帰であってもよい。一つの態様において、６次多項式関数の適合が、増幅領域に適用される。多項式の次数は、当該多項式の最高次の項の指数の値と同じである。
【０１００】
工程９７０において、更に、より高度な正確性でＣｔ値等の特性を決定するために、第三の関数の適合が使用される。このような、高分解能の回帰関数の開始パラメーターを得るために低分解能の回帰を使用するプロセスは、必要に応じて、多くの回数繰り返されても良い。各繰り返しにおいて、その前の回帰関数を使用して、更に高分解能の回帰関数のシード値が決定される。もし、何らかの理由で、第一の回帰関数から得られたシードパラメーターを使用して、高分解能の関数を形成できない場合、先験的に（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）、開始パラメーターの事前予測（ａ  ｐｒｉｏｒｉ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）が代わりに使用され得る。
【０１０１】
一つの態様において、第二の関数の適合に使用される高分解能の関数の近似は、以下の変形シグモイド関数である。
【化１６】
0005166608.tif 000017
【０１０２】
この等式において、
【化１７】
0005166608.tif 000018
は、標準的なシグモイド関数からの改変である、様々に変動するベースラインを表す、内的線形ドリフト項（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｄｒｉｆｔ  ｔｅｒｍ）である。この項は、前記データの関数の近似とデータ自体との間の適合を、増幅データに見られる実際の挙動をより良好に表現することによる、多数の標準偏差により、改善する。
【０１０３】
インプットベクトル（ｘ、ｙ）における既定の初期回帰パラメーターシード値は、以下のものであり得る：
ａＯ＝パラメーター［０］＝ｙ［１］；ａ１＝パラメーター［１］＝ｙ．Ｍａｘ−ｙ．Ｍｉｎ；ａ２＝パラメーター［２］＝ｘ．Ｌｅｎｇｔｈ／２；ａ３＝パラメーター［３］＝１．０；ａ４＝パラメーター［４］＝ｙ．Ｍｅａｎ−ｙ［１］
【０１０４】
しかしながら、上記のように、これらの既定値は、正確な増幅データモデルを形成し得ない。この場合、これらの変数に使用される値は、純粋なシグモイド関数の適合から得られたものである場合があり、工程９２０で取得され得る。例えば、ａ０〜ａ３の値は、シグモイド関数の適合の最後の値から直接取られ得る。一つの側面において、前記シードは、関数形式が類似するため、この方法で決定される場合がある。
【０１０５】
ｘに関する第一及び第二の微分は、以下のようになる：
【化１８】
0005166608.tif 000019
第一の微分は、第二の微分が０となるｘの値で最大となる。
【０１０６】
ｘに関する第三の微分は、以下のようになる：
【化１９】
0005166608.tif 000020
第二の微分は、第三の微分が０となる適切なｘの値の位置で最大となる。
【０１０７】
ｘに関する第四の微分は、以下のようになる：
【化２０】
0005166608.tif 000021
第三の微分は、第四の微分が０となる適切なｘの値の位置で最大となる。当該微分が最大となる位置を同定することにより、一つの態様において、この情報は、Ｃｔ値を決定するのに使用され得る。
【０１０８】
図１０は、原データに対して適合する、高分解能変形シグモイド回帰関数の例を示す。２つの線が互いに殆ど見分けがつかないほどに接近しているので、この適合は、この例において、大域的に優れている。
【０１０９】
ＶＩ．  Ｃｔ値の計算＿＿加重最大微分（ＷＥＩＧＨＴＥＤ  ＭＡＸＩＭＵＭ  ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥ）法
増幅を行う反応のＣｔ値を選択することが可能な方法は、数多く存在する。それぞれの方法は、何がしかの長所及び短所を有する。Ｃｔ値は、関数の適合を行う、各単一の段階の後に、又は複数の段階の後に、決定され得る。
【０１１０】
Ｃｔ値は、曲線上の点を表し、他の曲線上の点と幾つかの特性において類似する端数を含み得る（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）サイクル数である。様々な態様において、Ｃｔ値は、強度シグナルがある目標の閾値に到達したときの、ある増幅数値が達成されたときの、ある濃度数値が達成されたときの、ある微分値又は微分の組合せの値の最大値が達成されたときの、又は曲線のある数値又は当該曲線の形状を表現する他の特性が達成されたときの、端数を含み得るサイクル数であり得る。
【０１１１】
Ｃｔ値は、異なる未知の開始量（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）を表現する異なる曲線の間の増幅の相対レベルを比較し、又は既知の絶対的又は相対的な量の標準と比較することが出来る。前者は相対定量として知られ、一方後者は絶対定量として知られる。
【０１１２】
本発明の一つの態様において、Ｃｔ値は、前記増幅曲線に対する関数の近似の第二の誘導体の最大値におけるサイクル数（端数を含んでもよい）として選択される。この数値は、Ｃｔ値の優れた評価法をもたらすが、Ｃｔ値が過剰に高くなる可能性がある。また、効率の値が過剰に高くなる可能性もある。
【０１１３】
他の態様において、Ｃｔ値は、前記増幅曲線に対する関数の近似の第三の微分が最大となる位置におけるサイクル数（端数を含んでもよい）として選択される。この方法は、第二の微分が最大となる位置の約２サイクル前の優れたＣｔ値を得られる。また、この方法は、優れていないが良好な効率の値を得られる。しかしながら、第三の微分の位置におけるＣｔ値の評価法は、許容されるものではあるが、第二の微分の位置におけるＣｔ値の評価法程良好ではない。
【０１１４】
図１１は、変形シグモイド関数によりモデル化された増幅曲線を示すための、最大の第一、第二及び第三の微分の例を示す。微分が最大となる値は、次に次数の高い微分の０の点に位置する。０点１１０１及び１１０３は、第一の微分が最大となる位置を見出すのに使用され；０点１１０２は、第二の微分が最大となる位置を見出すのに使用され；そして０点１１０４は、第三の微分が最大となる位置を見出すのに使用され得る。
【０１１５】
一つの目標は、いずれの場合も最良となる前記２つの間の妥協点を見つけることである。これは、当該２つの微分の加重平均としてＣｔ値を計算することにより達成され得る。一つの態様において、加重平均において、第ｎ及び第ｎ＋１の微分値が使用される。微分が最大となる値は、反復又はＮｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎアルゴリズム等の技術を使用して計算され得る。
【０１１６】
前記加重平均で使用される加重パラメーターは、基準の数を満たすように調製され得る。一つの態様において、前記加重パラメーターは、既知の良好な、効率加重パラメーター校正ファイルにおいて、標準曲線の効率が１００％となるように設定される。この場合、参照ファイルとしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの線形性が使用されるが、充分な適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ）を有するとみなされる任意のデータでも足りる。他の態様において、前記曲線の末尾に変動への感受性を最小にする加重パラメーターが設定される場合もあるが、その部分では増幅が蛍光又は装置の変動のいずれによるものであるかを正確に表現しない点が問題となり得る。
【０１１７】
態様によっては、前記第二の微分が最大となる位置及び第三の微分が最大となる位置の加重平均が、Ｃｔ値を決定するのに使用され、この加重因子は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ線形性参照ファイルに応じて選択される。式は以下のようになる。
ＣｔＳｅｌｅｃｔｉｏｎＶａｌｕｅ  ＝  （１．０  −  ｐ）  ＊  Ｍａｘ２ｎｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＸＬｏｃａｔｉｏｎ  ＋  ｐ  ＊  Ｍａｘ３ｒｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＸＬｏｃａｔｉｏｎ
一つの態様において、前記加重値ｐは、典型的には、０．３〜０．７の範囲内である。例えば、一つの態様では、加重値として０．６５を使用する。
【０１１８】
何らかの理由により第ｎ及び第ｎ＋１の微分の加重平均が計算できない場合、Ｃｔ値は、他の方法を使用して決定されてもよい。例えば、前記曲線は、帯の内側で解析され得る。また、前記曲線は、一つの結果が得られるまで切り詰められる場合もある。増幅が早期に生じる場合、この解析は、開始後を推定すること（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｎｇ  ｐａｓｔ  ｔｈｅ  ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）により実施され得る。前記データが後期に増幅を示す場合、この解析は、前記曲線の終端の後の曲線を推定することにより実施され得て、そして再計算が試みられ得る。
【０１１９】
上記のいずれも妥当なＣｔ値をもたらさない場合、前記システムは、単一の閾値の解析方法に使用されるアプローチに戻され得る。米国特許出願ＵＳ２００６／０２６９９４７及びＵＳ２００６／０２７１３０８を参照されたい。これらの参照のいずれも、全ての目的で本明細書中に参照により援用される。上記のいずれも妥当なＣｔ値をもたらさない場合、低分解能の方法で、信頼性に劣るＣｔ値が計算され得る。
【０１２０】
上記方法９００に記載したように、微分の平均の使用等により、最初のＣｔ値が決定された後、当該Ｃｔ値を使用して、高分解能の関数の適合のための領域を定める。この高分解能の関数の適合（例えば高次多項式回帰関数）を使用して、微分の平均を用いたＣｔ値の更なる改善を行い得る。このプロセスは、上記のように、増幅領域の周囲の帯を定める。Ｃｔの決定をこの増幅帯に制限することにより、当該曲線の始部及び終部で見られる変動性の解析への影響を低減させられる。その結果、より正確なＣｔ値を決定できる。この場合の加重値は、装置のバイアスによる変動を最小にするように調整される。
【０１２１】
Ｃｔ値を使用して増幅曲線を比較するとき、既知の標準が存在するのであれば、それらのＣｔ値に対する公知の標準的な開始値に関して、標準曲線として知られるグラフが作成される場合がある。標準がなくとも、多数倍希釈セットを使用して標準曲線を定める場合もある。そして、対数線形グラフを使用して、未知の試料のＣｔ値を推定することにより、前記曲線を定めるのに、絶対的な標準と多数倍の未知の物のいずれが使用されたかに依存して、それらの絶対的又は相対的な開始量を決定する。この対数線形グラフの勾配は、効率を計算するのに使用され得る。この効率は、ＰＣＴ増幅の間に、解離、アニーリング、及び伸長からなるフルサイクルが、ＤＮＡ粒子の数を倍にする平均の確率を意味し得る。各サイクルで完全な倍増が起こらないため一般に、この効率は１未満であるのが望ましいが、あるいは望ましくない追加の産物が生産されることにより、効率は１を超える場合もある。
【０１２２】
ＶＩＩ．  組み合わせた方法
図１２は、本発明の態様に係る、複数の関数の適合を実施することにより増幅曲線を解析してＣｔ値を決定する方法を示すフロー図である。図１２の各工程は、本開示で既にかなり詳細に記載したものである。図１２の多くの工程は、一つの態様の具体的な要求に依存して選択的である。加えて、工程１２に概観される様々な工程の多くは、他の工程から独立して実施され得る。例えば、図１２に記載のベースライン解析は、Ｃｔ決定工程がいずれのものであるかに依存せずに実施され得る。
【０１２３】
工程１２１０において、増幅を呈する生物学的又は化学的反応から原データを、解析のために取得する。態様によっては、前記原データは、色分離データであってもよい。態様によっては、当該色分離データは、当該データが増幅を表すか否かを決定するために解析され得る。本発明の態様によっては、この決定を行うために、前記最大増幅勾配結合解析が実施される。
【０１２４】
工程１２２０において、前記原データを使用して第一の関数の適合が実施されることにより、当該データの第一の関数の近似が得られる。この関数の近似は、態様によっては、本来の反応の様々な特性を判定するのに使用され得る。態様によっては、第一の関数の適合として、シグモイド関数が使用され得る。
【０１２５】
工程１２３０において、ベースライン解析が実施される。本発明の態様によっては、前記本来のデータの関数の近似として、シグモイド関数が使用され得る。一つの態様において、当該ベースライン解析は、工程６００の態様を使用する。
【０１２６】
工程１２４０において、第二の関数の適合が行われ、前記データの第二の関数の近似が作成される。前記第一の関数の近似は、当該第二の関数の近似のパラメーターの幾つかを作成するのに使用され得る。態様によっては、当該第二の関数の近似は、上記のように、変形シグモイド関数を使用する。
【０１２７】
工程１２５０において、前記第二の関数の近似を使用して、Ｃｔ値を決定する。態様によっては、当該Ｃｔ値は、前記第二の関数の近似の２つ以上の微分が最大値となるサイクル数の加重平均を使用して決定される。例えば、第二の微分が最大となる値及び第三の微分が最大となる値におけるサイクル数の加重平均が使用されてもよい。
【０１２８】
工程１２６０において、第三の関数の適合を使用して、前記データの第三の関数の近似を作成する。一つの態様において、前記工程１２５０において決定されたＣｔ値を使用して、工程１２６０の関数の適合を行う数値の範囲を定める。
【０１２９】
工程１２７０において、前記第三の関数の近似は、新しいＣｔ値を決定するために使用され得る。態様によっては、この新しいＣｔ値は、前記第三の関数の近似の２つ異常の微分が最大値をとるサイクル数の加重平均を使用して決定される場合もある。
【０１３０】
工程１２２０、１２４０及び１２６０の如き多段階の関数の適合は、必要に応じて、多くの回数反復されてもよい。
【０１３１】
ＶＩＩＩ．  システムの例
図１３は、本発明の一つの態様に係るシステム１３００を示す。このシステムは、見ての通り、サンプルホルダー１３１０に、最近又はＤＮＡ等のサンプル１３０５を含む。前記サンプルからの蛍光強度の数値等の物理特性１３１５は、デテクター１３２０により検出される。ノイズ成分を含むシグナル１３２５が、デテクター１３２０から論理システム１３３０に送られる。シグナル１３２５からのデータは、ローカルメモリー１３３５又は外部メモリー１３４０又は保存装置１３４５に保存され得る。一つの態様において、アナログ／デジタルコンバーターは、アナログシグナルをデジタル形態に変換する。
【０１３２】
論理システム１３３０は、コンピューターシステムの、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサー等であって、又はそれらを備える。また、当該システムは、ディスプレイ（モニター、ＬＥＤディスプレイ等）、及び使用者入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタン等）を備え、又はそれらと組み合わされる。論理システム１３３０及び他の構成は、単独のシステム、又はネットワーク接続されたコンピューターシステムの部分であってもよく、又は、それらは、サーマルサイクラー装置に直接取り付けられ、又は組み込まれてもよい。また、論理システム１３３０は、プロセッサー１３５０中で実行される最適化ソフトウエアを備えてもよい。
【０１３３】
本発明の特定の側面の特定の詳細は、本発明の態様の精神及び範囲から逸脱することなく、任意の適切な方法で組み合わされてもよい。しかしながら、本発明の他の態様は、それぞれ個別の側面に関する特定の態様に、又はこれらの個別の側面の特定の組合せに関する場合もある。
【０１３４】
上記本発明は、モジュラーとして、あるいは統合された方法で、ハードウエア及び／又はコンピューターソフトウエアを使用して、制御論理の形態で実施され得る。本明細書中に提供される開示及び教示に基づき、当業者は、ハードウエア、並びにハードウエア及びソフトウエアの組合せを使用して、本発明を実施する他の手段及び／又は方法を知得及び認識し得る。
【０１３５】
本願に記載のソフトウエアコンポーネント及び関数のいずれかは、例えば公知の又はオブジェクト指向の技術を使用し、例えばＪａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋又はＰｅｒｌ等の適切ないずれかのコンピューター言語で表される、プロセッサーにより実行されるソフトウエアコードとして実現され得る。当該ソフトウエアコードは、保存及び／又は伝達用のコンピューターで読取り可能な媒体上に、一連の指令又はコマンドとして保存され得て、適切な媒体として、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、ハードドライブ若しくはフロッピー（登録商標）ディスク等の磁気媒体、又はコンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタルバーサタイルディスク）等の光学媒体、フラッシュメモリー等が挙げられる。前記コンピューターで読取り可能な媒体は、そのような保存又は伝達装置の任意の組合せであってもよい。
【０１３６】
また、そのようなプログラムは、インターネット等の、様々なプロトコルに従う、有線、光学、及び／又は無線ネットワークを介して伝達されるように適応させたキャリア信号を使用してエンコード及び伝達されてもよい。本発明の態様に係るコンピューターで読取り可能な媒体は、そのようなプログラムを用いてエンコードされたデータ信号を使用して形成され得る。前記プログラムコードでエンコードされたコンピューターで読取り可能な媒体は、取り付け可能な装置に搭載される場合があり、他の装置から個別に提供（例えばインターネットダウンロード）される場合もある。コンピューター読取り可能な媒体は、単一のコンピュータープログラム製品（例えばハードドライブ又はコンピューターシステム全体）上又は内部に設置されてもよく、一つのシステム又はネットワーク内の異なるコンピュータープログラム製品上又は内部に存在してもよい。コンピューターシステムとして、使用者に本明細書中に記載の結果のいずれかを提供するための、モニター、プリンター、又は他の適切なディスプレイが挙げられる。
【０１３７】
上記本発明の例示的態様の記載は、例示及び記述を目的として提供したものである。これは、包括的である（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ）ことを意図するものではなく、又は本発明を、記載されているままの形式に限定することを意図するものでもなく、そして、上記教示を参照して、多くの改変及び変更が可能である。上記態様は、本発明の原理及びその実際の応用を最も良く説明し、それにより、他の当業者が、具体的な使用の意図に適合するように、様々な改変を加えて、様々な態様において本発明を最適に使用することができるように、選択及び記載されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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