(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内に埋め込まれる再生用多孔質足場材であって、
培養した細胞から形成した細胞外マトリックスを脱細胞化して形成した細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなることを特徴とする再生用多孔質足場材。
【請求項２】
請求項１に記載の再生用多孔質足場材の製造方法であって、
多孔質テンプレートに細胞を播種して培養してマトリックス化して、細胞外マトリックスを形成する工程と、
前記細胞外マトリックスの脱細胞化及び前記多孔質テンプレートの除去を行い、細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなる再生用多孔質足場材を形成する工程と、を有することを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
前記細胞外マトリックスを脱細胞化した後に、前記多孔質テンプレートを除去することを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
前記細胞外マトリックスから前記多孔質テンプレートを除去した後に、脱細胞化することを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項５】
請求項２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
前記細胞外マトリックスを前記多孔質テンプレートに形成することを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項６】
請求項２から４のいずれかに記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
紫外線照射による光架橋若しくは熱架橋のいずれかの物理的架橋法、又は、ガス状若しくは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法のいずれかの方法で、前記細胞外マトリックスを架橋処理することを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
前記脱細胞化方法が、凍結・解凍を繰り返す方法、超音波処理方法、界面活性剤を添加する方法若しくは低張液に浸漬する方法のいずれか一の方法又は二以上の組み合わせであることを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【請求項８】
請求項２から７のいずれかに記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、
前記多孔質テンプレートは生体吸収性合成高分子よりなることを特徴とする再生用多孔質足場材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に埋め込まれる再生用多孔質足場材としての細胞外マトリックス由来多孔質材料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
事故や疾患によって組織や臓器が失われたり、損傷を受けたりした場合、その治療方法として、人工臓器の移植や、多孔質材料に細胞を培養し、組織・臓器を再構築して移植する組織工学的手法がある。何れの方法においても人工材料が使用されている。
従来用いられてきた足場材は、合成高分子材料、無機材料、金属材料、及びこれらの複合材料、動植物から抽出した材料を使用するしかなかった。何れにしても、足場材の骨格を形成する材料の種類は限られ、生体に対する影響を軽減する手法が確立されているとはいえないのが現状である。
【特許文献１】特開２００５−１８５５０７
【特許文献２】特開２００５−２１１４８０
【特許文献３】特開２００６−２０４５３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような実情に鑑み、材料の選択の幅を広げ、埋め込む生体に対する影響を最小限できる足場材としての細胞外マトリックス由来多孔質材料の製造方法およびその材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明１の再生用多孔質足場材は、生体内に埋め込まれる再生用多孔質足場材であって、
培養した細胞から形成した細胞外マトリックスを脱細胞化して形成した細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなることを特徴とする。
【０００５】
発明２は、発明１の再生用多孔質足場材の製造方法であって、連通多孔質テンプレートに細胞を播種して培養してマトリックス化して、細胞外マトリックスを形成する工程と、前記細胞外マトリックスの脱細胞化及び前記多孔質テンプレートの除去を行い、細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなる再生用多孔質足場材を形成する工程と、を有することを特徴とする。
【０００６】
発明３は、発明２の再生用多孔質足場材の製造方法において、前記細胞外マトリックスを脱細胞化した後に、前記多孔質テンプレートを除去することを特徴とする。
【０００７】
発明４は、発明２の再生用多孔質足場材の製造方法において、前記細胞外マトリックスから前記多孔質テンプレートを除去してから、組織化した細胞を脱細胞化することを特徴とする。
発明５は、発明２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、前記細胞外マトリックスを前記多孔質テンプレートに形成することを特徴とする。
発明６は、発明２から４のいずれかに記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、紫外線照射による光架橋若しくは熱架橋のいずれかの物理的架橋法、又は、ガス状若しくは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法のいずれかの方法で、前記細胞外マトリックスを架橋処理することを特徴とする。
発明７は、発明２に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、前記脱細胞化方法が、凍結・解凍を繰り返す方法、超音波処理方法、界面活性剤を添加する方法若しくは低張液に浸漬する方法のいずれか一の方法又は二以上の組み合わせであることを特徴とする。
【０００８】
発明８は、発明２から７のいずれかの再生用多孔質足場材の製造方法において、前記多孔質テンプレートは生体吸収性合成高分子よりなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
発明１により、本来生体内に存在した材料により足場材を形成してあるので、生体内での使用が極めて安全である。
発明２により、僅かな細胞を利用して足場材の骨格を形成することができるようになった。
このため、貴重な細胞を利用することができ、対応する生体やその再生箇所に適合しやすい材質で足場材を作ることができるようになった。
発明３、４の内、発明２では、細胞の組織化が不十分な場合でも、脱細胞化によるマトリックス化により全体を一体化させることができる。
発明４では、細胞は組織化により一体化しているのでテンプレートを除去してできた孔が脱細胞化の為の薬液の流路となって、迅速かつ効率よく脱細胞化を達成することが出来た。
また、発明８により、細胞の培養をテンプレートが阻害する問題が解決した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．実施例１〜２２で使用した骨髄由来の間葉系幹細胞、皮膚繊維芽細胞、軟骨細胞以外の細胞を使用しても、その細胞由来の同様の材料を作製できる。利用できる細胞として、胚性幹細胞、体性幹細胞と分化した体細胞があり、培養しやすい体性幹細胞と体細胞がもっとも望ましい。生体細胞には間質細胞と実質細胞があり、間質細胞を使うことが最も好ましい。体性幹細胞には間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、上皮由来幹細胞などがある。体細胞には、上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮角化細胞、骨格筋細胞、羊膜細胞、角膜細胞、粘膜細胞などがある。これらの細胞を１種類以上用いる。
２．体性幹細胞と体細胞は体の様々な部位から採取することが可能である。たとえば、間葉系幹細胞は、骨髄以外に、末梢血や脂肪組織などからも採取することができる。繊維芽細胞は皮膚や靭帯、腱などの組織から採取できる。軟骨細胞は硝子軟骨、弾性軟骨、肋軟骨と繊維軟骨から採取できる。何れの細胞も利用できるが、容易に採取でき、培養しやすく、しかも細胞外マトリックスを大量に産生する細胞が最も好ましい。
３．細胞の種類によって、使用する培地の種類が異なる。細胞の活性を維持でき、大量の細胞外マトリックスの産生を促進する培地が最も好ましい。血清培地と無血清培地の何れも用いることができる。血清培地を用いる場合、動物（たとえば、ウシ）由来の血清と患者自身の血清を利用できるが、望ましいのは患者の血清である。
４．細胞にとっての一時的な足場材料は、生体吸収性高分子を素材とするメッシュ体やスポンジ体あるいは紐状体などの多孔質体からなるものでよい。メッシュ体は、織布又は不織布等からなるものでよい。スポンジ体は、発泡剤を利用する発泡成形法、あるいは多孔質化剤除去法等、その他公知の方法により得られる。また、紐状体は繊維状や組みヒモ等からなるものでよい。メッシュ体、スポンジ体、あるいは紐状体を形成する生体吸収性高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリリンゴ酸、ポリ−ε−カプロラクトンなどのポリエステル等が挙げられる。
５．細胞を上記の一時的な足場材料に播き、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター中で培養を行った。細胞播種に用いた細胞液の密度と播いた細胞の数は細胞が一時的な足場材料に均一に分布でき、均一な細胞外マトリックスの産生ができればよい。培養時間は十分な細胞外マトリックスを産生できればよい。通常は３０分間から２ヶ月までであり、望ましいのは３時間から４週間までである。
６．得られた細胞外マトリックスは脱細胞化や洗浄などの処理に耐え、これらの処理の後で安定な多孔質構造を保持できれば、固定化処理は必要としない。もし、これらの処理の後で安定な多孔質構造を保持することができなければ、多孔質構造を安定させる固定化が必要となる。望ましいのは固定化処理をしないほうである。
７．固定化と脱細胞化の順序はどちらでもよい。細胞を固定化した後に脱細胞化しても、脱細胞化した後に固定化してもよい。また、細胞の固定化が不要な場合もある。
８．固定化の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。細胞外マトリックスを固定化する方法として、紫外線照射による光架橋や熱架橋などの物理的架橋法、ガス状あるいは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法がある。細胞外マトリックスを損傷することがなければ、何れの固定化方法でもよい。紫外線照射による光架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、紫外線照射による光架橋により固定化する。２４０ｎｍ〜２８０ｎｍの紫外線で１０分間から２４時間照射するが、望ましいのは２５０ｎｍ〜２６０ｎｍの紫外線で３０分間から１０時間照射する。熱架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、０．０１Ｔｏｒｒから１Ｔｏｒｒまでの減圧下、１００℃から１４０度までの高温で４８時間から９６時間加熱することにより行う。９．溶液状あるいはガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法の架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなグリシジルエーテル類や、ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン１、５−ジイソシアネート、４、４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４、４、４、−トリイソシアネートのようなイソシアネート類や、メタノールやエタノールのようなアルコール類、グルコン酸カルシウムなどがあげられる。溶液状の架橋化剤での固定化は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを上記の架橋剤の溶液に３０分間から７２時間まで浸漬することにより行う。固定化温度は４℃から３７℃である。望ましいのは４℃で１時間から４８時間、あるいは、室温で３０分間から２４時間固定化する。ガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法による固定化は、上記の架橋剤をガス状にして用いることができる。脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、一定温度で一定濃度の架橋剤水溶液で飽和した架橋剤の蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。架橋温度は通常、２０℃〜４０℃に設定される。架橋に要する時間は、１〜１２時間である。
１０．脱細胞化の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。凍結・解凍を繰り返す方法、超音波処理方法、界面活性剤を添加する方法、低張液に浸漬する方法などの少なくともひとつの方法を用いるか、これらの方法を組み合わせることができる。凍結・解凍を繰り返す方法は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水（超純水）かリン酸緩衝液か低張液か高張液に浸漬して、−１０℃から−１９６℃で１０分間から１２時間まで凍結し、その後３７℃の水浴か室温で解凍し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水かリン酸緩衝液か低張液か高張液で洗浄する。この凍結・解凍のサイクルを３回から２０回まで繰り返す。
１１．細胞の一時的な足場材料を抽出除去する水溶液としては、生体吸収性高分子の骨格のみを溶かし、細胞由来の素材を溶かさないものであれば、酸性水溶液、アルカリ性水溶液あるいは中性水溶液の何れでもよい。使用される抽出液は、塩化水素、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、炭酸などの無機酸水溶液、酢酸、シュウ酸、クエン酸、コハク酸、アミノ酸、アスコルビン酸、などの有機酸水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ水溶液、塩化アンモニウム、硫酸銅、塩化鉄、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウムなどの酸性塩水溶液、酢酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムなどのアルカリ性塩水溶液、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの中性塩水溶液があげられる。望ましくはリン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムである。水溶液のモル濃度は０．０１Ｍ〜２．０Ｍであるが、好ましく０．１〜０．８Ｍである。
【実施例１】
【００１２】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に４℃で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で１０回洗浄した。洗浄後のサンプルを０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）に浸漬し、シェーカーを用いて、室温で１２時間低速振盪した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて３７℃、３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄し脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１に示す。
電顕写真より、作製した間葉系幹細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例２】
【００１３】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に４℃で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で１０回洗浄した。洗浄後のサンプルを０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）に浸漬し、シェーカーを用いて、室温で１２時間低速振盪した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて３７℃、３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図２に示す。
電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例３】
【００１４】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
３日間培養後、培養した細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、４℃で０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、リン酸緩衝液で１０回洗浄した。その後、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，  ５ｍＭＥＤＴＡ）に漬け、室温でシェーカーで低速度で１２時間振動した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌｔｏ１０ｍＭＭｇＣｌ２）で３７℃で３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図３に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例４】
【００１５】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例２
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，  ５ｍＭＥＤＴＡ）に漬け、室温でシェーカーで低速度で１２時間振動した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡ−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を３７℃で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で１２時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図４に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例５】
【００１６】
間葉系幹細胞由来材料のスポンジ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のスポンジ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養し、７日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡスポンジ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸（７５：２５）との共重合体ＰＬＧＡをクロロホルムに溶かし、１５（ｗ／ｖ）％の溶液を調製した。ＰＬＧＡのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が１５０μｍ〜２５０μｍの塩化ナトリウムの粒子（ＰＬＧＡ重量の９倍）を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、４８時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム／ＰＬＧＡ円柱体を蒸留水に浸し、２時間ごとに蒸留水を交換しながら、４日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が１５０μｍ〜２５０μｍで空隙率が９０％のＰＬＧＡスポンジ体を得た。本ＰＬＧＡスポンジ円柱体を空気中で２４時間乾燥した後、さらに真空状態で１２時間乾燥した。その後、ＰＬＧＡスポンジ円柱体を切断して０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡスポンジ体の片面に１．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡスポンジ体を裏返して、裏面にも１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、４℃で０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、リン酸緩衝液で１０回洗浄した。その後、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，  ５ｍＭＥＤＴＡ）に漬け、室温でシェーカーで低速度で１２時間振動した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌｔｏ１０ｍＭＭｇＣｌ２）で３７℃で３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡ−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で７日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄して、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で１２時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図５に示す
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例６】
【００１７】
皮膚繊維芽細胞由来材料のスポンジ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のスポンジ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養し、７日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡスポンジ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸（７５：２５）との共重合体ＰＬＧＡをクロロホルムに溶かし、１５（ｗ／ｖ）％の溶液を調製した。ＰＬＧＡのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が１５０μｍ〜２５０μｍの塩化ナトリウムの粒子（ＰＬＧＡ重量の９倍）を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、４８時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム／ＰＬＧＡ円柱体を蒸留水に浸し、２時間ごとに蒸留水を交換しながら、４日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が１５０μｍ〜２５０μｍで空隙率が９０％のＰＬＧＡスポンジ体を得た。本ＰＬＧＡスポンジ円柱体を空気中で２４時間乾燥した後、さらに真空状態で１２時間乾燥した。その後、ＰＬＧＡスポンジ円柱体を切断して０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡスポンジ体の片面に１．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡスポンジ体を裏返して、裏面にも１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、４℃で０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、リン酸緩衝液で１０回洗浄した。その後、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，  ５ｍＭＥＤＴＡ）に漬け、室温でシェーカーで低速度で１２時間振動した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌｔｏ１０ｍＭＭｇＣｌ２）で３７℃で３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡ−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で７日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄して、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で１２時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、繊維芽細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図６に示す。
電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例７】
【００１８】
軟骨細胞由来材料のスポンジ型多孔質体の作製例１
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のスポンジ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、７日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡスポンジ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸（７５：２５）との共重合体ＰＬＧＡをクロロホルムに溶かし、１５（ｗ／ｖ）％の溶液を調製した。ＰＬＧＡのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が１５０μｍ〜２５０μｍの塩化ナトリウムの粒子（ＰＬＧＡ重量の９倍）を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、４８時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム／ＰＬＧＡ円柱体を蒸留水に浸し、２時間ごとに蒸留水を交換しながら、４日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が１５０μｍ〜２５０μｍで空隙率が９０％のＰＬＧＡスポンジ体を得た。本ＰＬＧＡスポンジ円柱体を空気中で２４時間乾燥した後、さらに真空状態で１２時間乾燥した。その後、ＰＬＧＡスポンジ円柱体を切断して０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡスポンジ体の片面に１．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡスポンジ体を裏返して、裏面にも１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、４℃で０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、リン酸緩衝液で１０回洗浄した。その後、０．１％のトリトンＸ−１００を含有する低張液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，  ５ｍＭＥＤＴＡ）に漬け、室温でシェーカーで低速度で１２時間振動した。リン酸緩衝液で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅと１０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌｔｏ１０ｍＭＭｇＣｌ２）で３７℃で３時間処理した。その後、リン酸緩衝液で１０回洗浄して、脱細胞化した。
ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡ−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で７日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄して、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で１２時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、繊維芽細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体の外観を図７に示す。繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図８に示す。電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例８】
【００１９】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例２
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化し、細胞の固定化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に４℃で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で１０回洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図９に示す。
電顕写真より、作製した間葉系幹細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例９】
【００２０】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例３
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化し、細胞の固定化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、２０ｍＭ水溶性カルボジイミドと１０ｍＭハイドロキシスクシンイミドを含有する２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に室温で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４で洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１０】
【００２１】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例２
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に４℃で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で１０回洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥した。得られた皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１０に示す。
電顕写真より、作製した皮膚繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例１１】
【００２２】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例３
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、２０ｍＭ水溶性カルボジイミドと１０ｍＭハイドロキシスクシンイミドを含有する２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に室温で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４で洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１２】
【００２３】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例３
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを０．１％のグルタルアルデヒド水溶液に４℃で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、０．１Ｍのグリシン水溶液に３時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で１０回洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１１に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例１３】
【００２４】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例４
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、２０ｍＭ水溶性カルボジイミドと１０ｍＭハイドロキシスクシンイミドを含有する２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に室温で２４時間浸漬することにより、細胞を固定化した。１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４で洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１４】
【００２５】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例４
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１５】
【００２６】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例５
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１２に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例１６】
【００２７】
間葉系幹細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例６
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社より購入）を、増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で継代培養を２回行った。この間葉系幹細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）によって剥離・回収し、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。その後、さらに２５ｍＭＮＨ４ＯＨ水溶液で１０分間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１７】
【００２８】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例４
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例１８】
【００２９】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例５
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１３に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例１９】
【００３０】
皮膚繊維芽細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例６
生体吸収性高分子である乳酸／グリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したＭｅｄｉｕｍ  １０６Ｓ  （２％ウシ胎児血清を添加した）培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１回継代培養した。１回継代培養した皮膚繊維芽細胞を０．０２５％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファー剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に、１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。その後、さらに２５ｍＭＮＨ４ＯＨ水溶液で１０分間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例２０】
【００３１】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例５
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で１０回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした０．１％のトリトンＸ−１００を含有する高張液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１．５ＭＫＣｌ）に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で３時間低速振盪した。１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で３時間洗浄した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３時間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
【実施例２１】
【００３２】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例６
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
これを−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。電顕写真を図１４に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
【実施例２２】
【００３３】
軟骨細胞由来材料のメッシュ型多孔質体の作製例７
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、３日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、ＰＬＧＡメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Ｃａｍｂｒｅｘ  （Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．）社から購入したヒト関節軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン及び５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡメッシュ体に１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６時間培養した後、ＰＬＧＡメッシュ体を裏返して、裏面にも１．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞を播種し、上記の培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。−８０℃で３時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で毎回１０分間で３回洗浄した。この凍結−解凍を６回繰り返した。その後、さらに２５ｍＭＮＨ４ＯＨ水溶液で１０分間洗浄した。
その後、ＰＬＧＡと細胞の複合体を０．５Ｍのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、ＰＬＧＡと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で４８時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で２０回洗浄し、前記ＰＬＧＡを除去した。
溶出後の残留物を−８０℃で４時間凍結し、真空減圧下（０．２  Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
【００３４】
上記各実施例の特徴を表１にまとめた。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率６５倍）
【図２】実施例２のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率８０倍）
【図３】実施例３のメッシュ型多孔質体１の走査電子顕微鏡像（拡大率９０倍）
【図４】実施例４のメッシュ型多孔質体２の走査電子顕微鏡像（拡大率７０倍）
【図５】実施例５のスポンジ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率５００倍）
【図６】実施例６のスポンジ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率５００倍）
【図７】実施例７のスポンジ型多孔質体の外観写真
【図８】実施例７のスポンジ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率５００倍）
【図９】実施例８のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１２０倍）
【図１０】実施例１０のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１２０倍）
【図１１】実施例１２のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１２０倍）
【図１２】実施例１５のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１６０倍）
【図１３】実施例１８のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１２０倍）
【図１４】実施例２１のメッシュ型多孔質体の走査電子顕微鏡像（拡大率１２０倍）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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