(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の生体高分子が添加されていることを特徴とする酵素センサ。
【請求項２】
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の合成高分子が添加されていることを特徴とする酵素センサ。
【請求項３】
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、電解質が添加されていることを特徴とする酵素センサ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素センサにおいて、
前記検出部には、電子伝達体として下記の一般式（１）で表される化合物、下記の一般式（２）で表される化合物及び下記の一般式（３）で表される化合物のうちの少なくとも１種類が添加されていることを特徴とする酵素センサ。
【化１】
0005131917.tif 000005
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基を表す。式中Ｍｅは、金属原子を表す。式中Ｘ−は、陰イオンを表す。）
【化２】
0005131917.tif 000006
（式中Ｍｅは、金属原子を表す。）
【化３】
0005131917.tif 000007
（式中Ｍｅは、金属原子を表す。）
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の酵素センサにおいて、
前記検出部には、電子伝達体として所定の多孔体に吸着された電子伝達体が添加されていることを特徴とする酵素センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素を利用して、試料中の検出対象物質を検出する酵素センサの研究・開発が盛んに行われている（例えば、特許文献１〜４参照）。
ところで、このような酵素センサにおいて、酵素は、様々な担体に固定された状態で利用される場合が多い。具体的には、酵素の固定化方法として、例えば、不溶性の担体に酵素（タンパク質）を結合させる担体結合法、酵素をゲルの微細な格子の中に包み込む包括固定法や半透性のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法などの包括法などが知られている。
【特許文献１】特許第３８０５４４２号公報
【特許文献２】特開２００６−１３１８９３号公報
【特許文献３】特許第２６２４２３６号公報
【特許文献４】特表２００３−５１３２３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、担体結合法では、共有結合により酵素を直接樹脂等に固定するため、酵素が簡単に脱離することはないが、固定化の操作が複雑であり、さらに、タンパク質分解酵素により酵素が分解されたり、外部環境の変化によって酵素の立体構造が変化したりするという問題がある。
また、包括固定法やマイクロカプセル法などの包括法では、ゲル格子やカプセルの構造安定性が不十分であるため、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化が生じ、酵素の活性が低下してしまう。
したがって、これらの固定化方法で固定された酵素を利用する酵素センサには、長期安定性に欠けるという問題がある。
【０００４】
本発明の課題は、長期安定性を有する酵素センサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
酵素センサにおいて、
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の生体高分子が添加されていることを特徴とする。
【０００６】
請求項２に記載の発明は、
酵素センサにおいて、
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の合成高分子が添加されていることを特徴とする。
【０００７】
請求項３に記載の発明は、
酵素センサにおいて、
酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、電解質が添加されていることを特徴とする。
【０００８】
請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素センサにおいて、
前記検出部には、電子伝達体として下記の一般式（１）で表される化合物、下記の一般式（２）で表される化合物及び下記の一般式（３）で表される化合物のうちの少なくとも１種類が添加されていることを特徴とする。
【化１】
0005131917.tif 000002
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基を表す。（式中Ｍｅは、金属原子を表す。）式中Ｘ−は、陰イオンを表す。）
【化２】
0005131917.tif 000003
（式中Ｍｅは、金属原子を表す。）
【化３】
0005131917.tif 000004
（式中Ｍｅは、金属原子を表す。）
【０００９】
請求項５に記載の発明は、
請求項１〜４の何れか一項に記載の酵素センサにおいて、
前記検出部には、電子伝達体として所定の多孔体に吸着された電子伝達体が添加されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で検出部に含有され、検出部には、分子量１０００以上の生体高分子が添加されている。
すなわち、酵素をシリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化を防止することができるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素をシリカ系メソ多孔体と共存させると、補酵素がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着して酵素の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部に分子量１０００以上の生体高分子を添加することによって、分子量１０００以上の生体高分子がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着し、補酵素のシリカ系メソ多孔体への吸着が抑制されるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で検出部に含有され、検出部には、分子量１０００以上の合成高分子が添加されている。
すなわち、酵素をシリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化を防止することができるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素をシリカ系メソ多孔体と共存させると、補酵素がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着して酵素の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部に分子量１０００以上の合成高分子を添加することによって、分子量１０００以上の合成高分子がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着し、補酵素のシリカ系メソ多孔体への吸着が抑制されるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
【００１２】
また、本発明によれば、酵素と、補酵素と、を含有する検出部を備え、酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で検出部に含有され、検出部には、電解質が添加されている。
すなわち、酵素をシリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化を防止することができるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素をシリカ系メソ多孔体と共存させると、補酵素がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着して酵素の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部に電解質を添加することによって、電解質が電離して生じるイオンがシリカ系メソ多孔体の表面に吸着し、補酵素のシリカ系メソ多孔体への吸着が抑制されるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００１４】
本発明の酵素センサ１は、例えば、気体試料又は液体試料中の検出対象物質を、その検出対象物質と選択的に反応する酵素１００を利用して、電極２０を用いて電気化学的計測法により検出するセンサである。
酵素センサ１は、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液からなる検出部１０を有しており、電極２０は検出部１０内に配置され、酵素１００は検出部１０に含有されている。
酵素センサ１においては、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に気体試料や液体試料を溶解させることによって、当該気体試料や液体試料中の検出対象物質を検出するようになっている。
【００１５】
具体的には、酵素センサ１は、例えば、図１に示すように、検出部１０と、検出部１０内に配置された作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０と、作用電極（電極２０）において発生した電流値を測定するためのポテンショスタット５０と、などを備えて構成される。
検出部１０は、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液からなり、検出部１０には、例えば、酵素１００と、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０と、電子伝達体２００と、補酵素３００と、などが含有されている。
ポテンショスタット５０は、例えば、定電圧計５００ａと、電流計測器５００ｂと、などを有しており、作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０に接続されたリードと接続している。
【００１６】
（酵素）
酵素１００は、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された状態で検出部１０に含有されている。
なお、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００は、検出部１０に含有されていれば任意である。すなわち、例えば、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散させることによって、検出部１０に含有させても良いし、例えば、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を電極２０等に固定させることによって検出部１０に含有させても良いが、酵素センサ１の高感度化等の観点から、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を電極２０に固定させることによって検出部１０に含有させるのが好ましい。
【００１７】
酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０に固定する方法としては、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０に酵素１００を含む溶液を滴下するディップ法、酵素１００を含む溶液にシリカ系メソ多孔体１１０を漬侵する漬侵法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０に固定化することができる。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。
【００１８】
酵素１００は、検出対象物質と選択的に反応する酵素であれば任意であり、検出対象物質の種類によって適宜変更可能である。
具体的には、酵素１００は、例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素などの酵素（酵素タンパク質）である。
また、酵素１００は、例えば、生来の酵素分子であっても、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても良いし、所望によりそれを切断したものであっても良いし、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。
【００１９】
酸化還元酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ等を用いることができる。この他に、コレステロールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、さらにこれら酵素のミュータント等を用いることができる。
【００２０】
加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウレアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ群、ホスファターゼ群等を用いることができる。
【００２１】
転移酵素としては、例えば、各種アシル転移酵素、キナーゼ群、アミノトランスフェラーゼ群等を用いることができる。
【００２２】
異性化酵素としては、例えば、ラセマーゼ群、ホスホグリセリン酸ホスホムターゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ等を用いることができる。
【００２３】
ここで、特に好ましい酵素１００としては、例えば、各種脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が挙げられる。
【００２４】
検出部１０に含有される酵素１００は、１種類の酵素であっても、２種類以上の酵素であっても良い。
具体的には、検出部１０に含有される酵素１００は、例えば、１種類の酵素であっても、分子量及び／又はサイズ（径）が略同一の２種類以上の酵素であっても、分子量及び／又はサイズが異なる２種類以上の酵素であっても良い。また、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上である場合、酵素１００は、例えば、同種の特定物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても、異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても、同種及び／又は異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
【００２５】
また、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素は、シリカ系メソ多孔体１１０における別々の細孔の内部に固定されていても、同一の細孔の内部に固定されていても良い。
ここで、特に、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上であって、その２種類以上の酵素が異種の特定物質に作用する場合、酵素センサ１は、その異種の特定物質（２種類以上の特定物質）を同時に検出することができる。
【００２６】
（シリカ系メソ多孔体）
シリカ系メソ多孔体１１０は、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるシリカ系メソ多孔体１１０の作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
【００２７】
具体的には、シリカ系メソ多孔体１１０は、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出したりする等して界面活性剤を除去することにより作製される。これにより、シリカ系メソ多孔体１１０は、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。
【００２８】
シリカ系メソ多孔体１１０の作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、シリカ系メソ多孔体１１０の作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、シリカ系メソ多孔体１１０に、柱状の細孔が形成されることになる。
【００２９】
シリカ系メソ多孔体１１０は、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズ（細孔の径）は、固定する酵素１００のサイズ（酵素１００の径）に応じて決定される。すなわち、例えば、ミセルのサイズ（ミセルの径）が、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍となる界面活性剤を用いてシリカ系メソ多孔体１１０を作製することによって、細孔のサイズが、固定する酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍となるシリカ系メソ多孔体１１０を得ることができる。
【００３０】
シリカ系メソ多孔体１１０の形状としては、例えば、粉末状、顆粒状、シート状、バルク状、膜状等がある。
また、シリカ系メソ多孔体１１０における細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであっても良い。
【００３１】
シリカ系メソ多孔体１１０の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＫＳＷ、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
さらに、シリカ系メソ多孔体１１０の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、細孔（チャンネル）の方向が一方向に向いているという特徴を有する、例えば、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等の公知の種類を採用することができる。具体的には、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等は、例えば、円筒形のアルミナ細孔内に界面活性剤を鋳型として作製される、アルミナ細孔の方向と同一のチャンネル方向を有するメソポーラスシリカナノチャンネル集合体（一次元シリカナノチャンネルの集合体）が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体１１０である。
【００３２】
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズは、固定された酵素１００の立体構造の変化を防止可能な程度に設定されている。これによって、固定された酵素１００の立体構造を維持することができ、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００を安定化することができる。
具体的には、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズは、例えば、固定される酵素１００（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定される酵素１００のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定される酵素１００のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、シリカ系メソ多孔体１１０における細孔の直径（中心細孔直径）は、固定される酵素１００の直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定される酵素１００の直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定される酵素１００の直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素１００の直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
ここで、酵素１００が多量体を形成する場合には、固定される酵素１００のサイズ（直径）は、多量体のサイズ（直径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００３３】
シリカ系メソ多孔体１１０の比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１０００μｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
【００３４】
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズを、固定する酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、固定する酵素１００の立体構造の維持が容易となるため、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００を安定化することができる。
【００３５】
具体的には、酵素１００として、例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素（直径：約８ｎｍ）を採用した場合、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズを、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定する。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、例えば、図２に示すように、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内壁に吸着して固定化されることになる。
【００３６】
また、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０として、例えば、図３に示すような、一次元シリカナノチャンネルの集合体が充填された膜状のものを用いる場合にも、細孔のサイズは、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定する。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔（チャンネル）の内壁に吸着して固定化されることになる。
【００３７】
（電子伝達体）
電子伝達体２００は、酵素１００と電極２０との間の電子の受け渡しを促進するためのものである。
なお、電子伝達体２００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０（反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散されたシリカ系メソ多孔体１１０、或いは、電極２０等に固定されたシリカ系メソ多孔体１１０）の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、作用電極（電極２０）に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。
【００３８】
酵素１００は、細孔のサイズが酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍程度の、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に安定的に固定されているため、生成物が直接電極２０で酸化又は還元される場合を除き、酵素分子内の活性中心が電極２０と電子移動を行うことが難しい。また、酵素１００が、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたアスペクト比の大きな細孔を有するシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定されている場合には、生成物が直接電極２０で酸化又は還元される場合においても応答が非常に遅くなる。したがって、検出部１０に、電子伝達体２００を添加するのが好ましい。
また、電極２０として酸素電極、過酸化水素電極等を利用した場合、反応が溶存酸素濃度に律速されて低濃度の試料しか測定できない、アスコルビン酸等の酸化物質の影響を受けやすく選択性が悪い等の問題が生じる。この場合にも、検出範囲の拡大、選択性の向上を目的として酵素１００とともに電子伝達体２００を使用することが効果的である。
【００３９】
ここで、ナフトキノンなどのキノン系化合物を電子伝達体として使用すると、酵素１００の活性が低下することが分かっている。これは、ナフトキノンなどのキノン系化合物が、酵素１００の活性中心に吸着するためであると考えられる。
そこで、電子伝達体２００は、例えば、ナフトキノンなどのキノン系化合物と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくい、酵素１００の活性の低下を抑制することができる活性低下抑制型の電子伝達体であるのが好ましい。
活性低下抑制型の電子伝達体としては、具体的には、例えば、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体や、所定の多孔体に吸着された電子伝達体などが挙げられる。
【００４０】
メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、具体的には、例えば、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物が挙げられる。
以下、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物を、「メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体」と呼ぶ場合がある。また、メタロセン骨格を有する電子伝達体のうち、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物以外の化合物を、「メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体」と呼ぶ場合がある。
【００４１】
ここで、特に好ましいメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、例えば、上記の一般式（１）、（２）、（３）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物が挙げられる。
上記の一般式（１）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、フェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドやフェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムヨージド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムヨージドなどのフェロセニルメチルアンモニウム塩が挙げられる。
また、上記の一般式（２）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、フェロセンカルボン酸が挙げられる。
また、上記の一般式（３）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、１−１’フェロセンジカルボン酸が挙げられる。
【００４２】
すなわち、特に好ましいメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、フェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドやフェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムヨージド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムヨージドなどのフェロセニルメチルアンモニウム塩、フェロセンカルボン酸、１−１’フェロセンジカルボン酸等が挙げられる。
【００４３】
また、所定の多孔体に吸着された電子伝達体は、具体的には、シリカ系多孔体やカーボン多孔体などの任意の多孔体に吸着された電子伝達体である。
ここで、所定の多孔体に吸着される電子伝達体は、電子伝達体であれば任意であり、具体的には、例えば、ポリアニリンなどの導電性高分子、キノンやキノン誘導体（ナフトキノンやベンゾキノンなど）などのキノン系化合物、フェロセンやフェロセン誘導体などのフェロセン系化合物、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、などを用いることができる。
【００４４】
なお、検出部１０には、電子伝達体２００として、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物や、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物など）及び／又は所定の多孔体に吸着された電子伝達体が添加されていれば良い。
また、検出部１０に添加されるメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される所定の多孔体に吸着された電子伝達体の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００４５】
（補酵素）
補酵素３００は、酵素１００の活性の発現を触媒するためのものである。
なお、補酵素３００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０（反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散されたシリカ系メソ多孔体１１０、或いは、電極２０等に固定されたシリカ系メソ多孔体１１０）の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、作用電極（電極２０）に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。
また、補酵素３００は、例えば、補因子としての各種金属原子や金属イオン、金属錯体、各種色素など（例えば、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ３＋等）とともに検出部１０に含有されていても良い。
【００４６】
例えば、不安的中間体を経由する反応等、酵素１００のアミノ酸側鎖の触媒作用では容易に進まない反応の場合、適当な構造を有し、酵素反応の発現に関与する低分子量の有機小分子や金属イオン、金属錯体などを補因子（cofactor）として使用することが多い。補因子の中でも有機小分子や金属錯体を補酵素と呼ぶ。特に、酵素１００として、補酵素依存型酵素を用いた場合、検出部１０に補酵素３００を導入することによって、酵素反応を効率よく行わせることができる。
【００４７】
補酵素３００は、酵素１００（補酵素依存型酵素）の種類に応じて、適宜選択することができる。具体的には、補酵素３００としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、補酵素Ｉ、補酵素ＩＩ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、リポ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、ピリドキサルリン酸（ＰＡＬＰ）、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ,Coenzyme F）、ＵＤＰグルコース（ＵＤＰＧ）、補酵素Ａ、補酵素Ｑ、ビオチン、補酵素Ｂ12(コバラミン)、Ｓ−アデノシルメチオニン等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
【００４８】
ここで、ＮＡＤ＋などの補酵素３００を使用すると、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性が低下することが分かっている。これは、ＮＡＤ＋などの補酵素３００が、シリカ系メソ多孔体１１０表面のシラノール基と反応して、酵素１００の活性に影響を与えるためであると考えられる。
そこで、検出部１０に、補酵素３００を使用した際に生じる酵素１００の活性の低下を抑制するための補酵素用活性低下抑制物質を添加するのが好ましい。
補酵素用活性低下抑制物質としては、例えば、生体高分子や、合成高分子、電解質などが挙げられる。
なお、補酵素用活性低下抑制物質は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良い。
【００４９】
生体高分子は、分子量１０００以上の生体高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、セルロース、デンプンなどである。
【００５０】
また、合成高分子は、分子量１０００以上の合成高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール、デキストランなどである。
【００５１】
また、電解質は、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解して、陽イオンと陰イオンとに電離する物質であれば任意であり、具体的には、例えば、塩化カリウムなどである。
【００５２】
なお、検出部１０には、補酵素用活性低下抑制物質として、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が添加されていれば良い。
また、検出部１０に添加される分子量１０００以上の生体高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される分子量１０００以上の合成高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される電解質の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００５３】
（電極）
酵素センサ１の電極方式は、作用電極と対照電極との二極方式、作用電極と対照電極と参照電極との三極方式の何れを採用しても良い。
作用電極である電極２０としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対照電極３０としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極４０としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
【００５４】
作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０の一例として、例えば、図１に示すように、電解セルで使用する電極を挙げることができるが、これらの電極は、その大きさ、形状、構成に特に制限されるものではない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。
【００５５】
また、これらの電極は、所定の絶縁性基板上に設けることもできる。
具体的には、絶縁性基板上に、各電極を、公知の方法、例えば、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することができる。なお、各電極は、全て同一基板上に形成して一体型の酵素センサ１として作製しても良いし、複数の基板上に形成して酵素センサ１を構成しても良いし、別々の電極として作製して酵素センサ１を構成しても良い。
絶縁性基板としては、例えば、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等を用いることができる。
【００５６】
（センシング方法）
酵素センサ１によるセンシング方法としては、例えば、電気化学的計測法を用いることができる。すなわち、酸化電流又は還元電流を測定するクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法等の公知の計測法を適用することが可能である。測定方式としては、デスポーザブル方式、バッチ方式、フローインジェクション方式等、何れあっても良い。
【００５７】
また、電気化学的計測法において、色源体を酸化又は還元した色変化を検出する光検出測定法を適用することも可能である。
具体的には、例えば、グルコースセンサでは、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの２種類の酵素を固定して、酵素反応（“グルコース＋Ｏ２  ―(グルコースオキシダーゼ)→  グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２”、“Ｈ２Ｏ２＋色源体  ―(ペルオキシダーゼ)→  赤紫色素”）により生成又は消費される過酸化水素と色源体（例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとの混合物）がペルオキシダーゼを触媒として赤紫色になる色変化を検出することによって、グルコース濃度を測定することができる。
【００５８】
測定の際に酵素センサ１を取り付ける測定器本体は、例えば、データをパソコンに有線又は無線で送信できる機能を有し、リアルタイムで測定値を確認できることが好ましい。また、複数種類の酵素センサ１を取り付け可能に構成され、複数種類の酵素センサ１による検出結果を同時に計測して、データを相互比較したり検討したりできる機能を有することが望ましい。
【００５９】
以下、具体的な実施例によって本発明を説明するが、発明はこれらに限定されるものではない。実施例１では、酵素１００の活性を評価するための実験を行った。
【実施例１】
【００６０】
（１）シリカ系メソ多孔体１１０の合成
まず、シリカ系メソ多孔体１１０の合成を行った。
具体的には、水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合した後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＤＴＭＡ−Ｃｌ）８０ｇを７０℃の水１Ｌに添加し、完全透明液になってから、トリイソピルベンゼン７０ｍＬを更に添加し、ホモミキサーで３０分間激しく攪拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に５分間攪拌した。これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間攪拌した。これを吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返した。これを４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃の電気炉で６時間焼成することにより、白色粉末状のシリカ系メソ多孔体１１０を得た。
この白色粉末の構造を粉末Ｘ線回折装置（理学ＲＡＤ−Ｂ装置）を用いて測定し、細孔径や表面積及び細孔総容積を窒素吸着装置を用いて測定した結果、白色粉末が平均細孔直径約８．２ｎｍの２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するメソポーラスシリカ多孔体の粉末であることを確認した。得られたシリカ系メソ多孔体１１０を、以下「大口径ＦＳＭ」という場合もある。
【００６１】
（２）酵素１００の固定化
次に、シリカ系メソ多孔体１１０に酵素１００を固定した。ここで、酵素１００として、ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた。
具体的には、大口径ＦＳＭの粉末５０ｍｇと、ホルムアルデヒド脱水素酵素の濃度が４．２ｍｇ／ｍＬのホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬと、を混合し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で２４時間緩やかに攪拌した。その後、この混合液を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離して固形分を回収して、脱イオン水５ｍＬによる洗浄と、同上の条件での遠心分離とを３回繰り返した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素を大口径ＦＳＭに固定化した。得られた物質、すなわち、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定された大口径ＦＳＭを、以下「ＦＤＨ固定化ＦＳＭ」という場合もある。
さらに、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて大口径ＦＳＭに対するホルムアルデヒド脱水素酵素の吸着量を測定したところ、大口径ＦＳＭに対する吸着量は１３２ｍｇ／ｇであった。
【００６２】
（３）酵素１００の活性試験
次に、酵素１００の活性を測定した。
ここで、ホルムアルデヒド脱水素酵素が、補酵素（ＮＡＤ＋）の存在下で、基質であるホルムアルデヒドをギ酸に酸化する反応（ＨＣＨＯ  ＋  ＮＡＤ＋  ＋  ３Ｈ２Ｏ  ―（ホルムアルデヒド脱水素酵素）→  ＨＣＯＯ−  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  ２Ｈ３Ｏ＋）を利用して、酵素１００の活性を測定した。すなわち、ＮＡＤ＋（酸化型）の還元により生じるＮＡＤＨ（還元型）に特徴的な波長３４０ｎｍ（ε340＝６２２２Ｍ−１ｃｍ−１）を選び、その吸光度の変化から、生成したＮＡＤＨ濃度を求めることによって、酵素１００の活性を測定した。
【００６３】
（３−１）固定化酵素の活性
まず、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性を測定した。
具体的には、リン酸緩衝液２．５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを０．６４ｍｇ加えて分散させ、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。比較のために、遊離酵素（遊離ホルムアルデヒド脱水素酵素）に対しても同様の測定を行った。なお、測定に使用した、大口径ＦＳＭに固定された酵素１００と、遊離酵素と、の酵素量は同一に設定した。その結果を図４に示す。
【００６４】
図４においては、横軸に反応時間、縦軸に３４０ｎｍの吸光度を示す。実線は大口径ＦＳＭに固定された酵素１００（固定化酵素）、破線は遊離酵素を示す。
【００６５】
図４によれば、大口径ＦＳＭに固定された酵素１００は、遊離酵素と同程度に反応が進行することが分かった。
これにより、大口径ＦＳＭの細孔の内部に固定された酵素１００が変性せずに活性を維持していることが分かった。
【００６６】
（３−２）固定化酵素の活性の経時変化
次に、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
【００６７】
具体的には、まず、試料[１]〜[４]を作成した。
【００６８】
試料[１]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００６９】
試料[２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００７０】
試料[３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００７１】
試料[４]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋と１．３ｍｇのナフトキノンとを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００７２】
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、３日後、７日後、９日後、１３日後、１６日後及び２２日後に同様の測定を行った。その結果を図５に示す。
【００７３】
図５においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[１]の結果、三角プロット（△）は試料[２]の結果、四角プロット（□）は試料[３]の結果、菱型プロット（◇）は試料[４]の結果を示す。
【００７４】
図５によれば、試料[１]、すなわち、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００は、２０日後も８０％以上の酵素活性を保つことが分かった。
これにより、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定することによって、酵素１００の活性の低下を抑制できることが分かった。
【００７５】
また、図５によれば、ＮＡＤ＋を添加した試料（試料[２]）は、ＮＡＤ＋を添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。
これは、ＮＡＤ＋が、大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応して、酵素活性に影響を与えているためと考えられる。
【００７６】
また、図５によれば、ナフトキノンを添加した試料（試料[３]）は、ナフトキノンを添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。さらに、ナフトキノンを添加した試料（試料[３]）は、ＮＡＤ＋を添加した試料（試料[２]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。
これは、ナフトキノンが、ＦＤＨ固定化ＦＳＭ中の酵素１００の活性中心に吸着して、活性を阻害しているためと考えられる。
【００７７】
また、図５によれば、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加した試料（試料[４]）は、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。さらに、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加した試料（試料[４]）は、ＮＡＤ＋のみを添加した試料（試料[２]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きく、ナフトキノンのみを添加した試料（試料[３]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが小さいことが分かった。
これは、酵素１００の活性中心付近のＮＡＤ＋の存在によって、酵素１００の活性中心へのナフトキノンの吸着が抑制されたためと考えられる。
【００７８】
（３−３）ＮＡＤ＋及び補酵素用活性低下抑制物質の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、ＮＡＤ＋及び補酵素用活性低下抑制物質（電解質、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定化された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
【００７９】
具体的には、まず、試料[５]〜[７]を作成した。また、比較のために試料[８]を作成した。
【００８０】
試料[５]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、電解質（１２ｍｇの塩化カリウム）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００８１】
試料[６]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００８２】
試料[７]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の合成高分子（２０ｍｇのデキストラン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００８３】
試料[８]は、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成し、そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、作成したアミノ基修飾ＦＳＭを加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
具体的には、上記作成した大口径ＦＳＭ５０ｍｇに、３−ＡＰＴＥＳを２ｍＬ、エタノールを１８ｍＬ添加して緩やかに３時間攪拌し、大口径ＦＳＭ表面のシラノール基にアミノ基を修飾した。次いで、脱水エタノールで洗浄し、４５℃で一晩乾燥させ、アミノ基修飾ＦＳＭを作成した。そして、作成したアミノ基修飾ＦＳＭの粉末と、ホルムアルデヒド脱水素酵素の濃度が４．２ｍｇ／ｍＬのホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬと、を混合し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で２４時間緩やかに攪拌した。その後、この混合液を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離して固形分を回収して、脱イオン水５ｍＬによる洗浄と、同上の条件での遠心分離とを３回繰り返した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成した。
【００８４】
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、７日後、１０日後、２１日後及び３４日後に同様の測定を行った。その結果を図６に示す。
【００８５】
図６においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[５]の結果、三角プロット（△）は試料[６]の結果、四角プロット（□）は試料[７]の結果、菱型プロット（◇）は試料[８]の結果を示す。
【００８６】
図６によれば、分子量１０００以上の生体高分子（ウシ血清アルブミン）を添加した試料（試料[６]）では、測定の期間中、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が生じないことが分かった。
また、図６によれば、電解質（塩化カリウム）を添加した試料（試料[５]）や分子量１０００以上の合成高分子（デキストラン）を添加した試料（試料[７]）では、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が抑制されることが分かった。
これにより、電解質の電離により生じる陽イオンや分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子が、大口径ＦＳＭ表面に吸着して、ＮＡＤ＋が大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応するのを抑制し、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が抑制されることが分かった。中でも、分子量１０００以上の生体高分子（ウシ血清アルブミン）は、ＮＡＤ＋が大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応するのを好適に抑制できることが分かった。
【００８７】
（３−４）活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物や、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物など）、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
【００８８】
具体的には、まず、試料[９]〜[１３]、[１５]、[１６]を作成した。また、比較のために試料[１４]、[１７]、[１８]を作成した。
【００８９】
試料[９]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．２ｍｇのフェロセンカルボン酸）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９０】
試料[１０]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．１ｍｇのヒドロキシメチルフェロセン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９１】
試料[１１]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．２ｍｇのジメチルアミノメチルフェロセン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９２】
試料[１２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．７ｍｇのη-ベンゼンヘキサフルオロフォスファート）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９３】
試料[１３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．７ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９４】
試料[１４]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、電子伝達体として金属錯体（３．５ｍｇのルテニウムレッド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９５】
試料[１５]は、所定の多孔体（１０ｍｇのモレキュラーシーブ（孔径：１ｎｍ））に、電子伝達体としてキノン系化合物（１．３ｍｇのナフトキノン）を吸着させ、遠心分離によりキノンで着色された残留物を抽出することによって、ナフトキノン吸着モレキュラーシーブを作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、作成したナフトキノン吸着モレキュラーシーブを全て添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９６】
試料[１６]は、所定の多孔体（８．０ｍｇのカーボン多孔体）に、電子伝達体として導電性高分子（２．０ｍｇのポリアニリン）を吸着させることによって、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、作成したポリアリニン吸着カーボン多孔体を全て添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９７】
試料[１７]は、試料[８]と同様にしてホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成し、そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、作成したアミノ基修飾ＦＳＭを加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９８】
試料[１８]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【００９９】
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、７日後、１０日後、２１日後及び３４日後に同様の測定を行った。その結果を図７に示す。
【０１００】
図７においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。白丸プロット（○）は試料[９]の結果、白三角プロット（△）は試料[１０]の結果、白四角プロット（□）は試料[１１]の結果、白菱型プロット（◇）は試料[１２]の結果、白逆三角プロット（▽）は試料[１３]の結果、黒丸プロット（●）は試料[１４]の結果、黒三角プロット（▲）は試料[１５]の結果、黒四角プロット（■）は試料[１６]の結果、黒菱型プロット（◆）は試料[１７]の結果、黒逆三角プロット（▼）は試料[１８]の結果を示す。
【０１０１】
図７によれば、電子伝達体２００として所定の多孔体に吸着された電子伝達体（キノン系化合物）を添加した試料、すなわち、ナフトキノン吸着モレキュラーシーブを添加した試料（試料[１５]）や、電子伝達体２００として所定の多孔体に吸着された電子伝達体（導電性高分子）を添加した試料、すなわち、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を添加した試料（試料[１６]）では、酵素活性の低下が抑制され、試料[１６]は、３０日後も９０％程度の酵素活性が保たれ、試料[１５]は、３０日後も８０％程度の酵素活性が保たれることが分かった。
これにより、キノン系化合物や導電性高分子などの電子伝達体を所定の多孔体に吸着させることによって、キノン系化合物や導電性高分子などの電子伝達体が酵素１００の活性中心に吸着しにくくなり、酵素活性の低下が抑制されることが分かった。
【０１０２】
また、図７によれば、フェロセン系化合物の中でも、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（すなわち、フェロセンカルボン酸を添加した試料（試料[９]）、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミドを添加した試料（試料[１３]））では、酵素活性の低下が抑制されることが分かった。特に、試料[１３]は、２０日後も７０％程度の酵素活性が保たれ、試料[９]は、２０日後も５０％程度の酵素活性が保たれることが分かった。
これにより、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体は、ナフサキノンなどのキノン系化合物と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくく、酵素活性の低下を引き起こしにくいことが分かった。
一方、フェロセン系化合物の中でも、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体を添加した試料（すなわち、ヒドロキシメチルフェロセンを添加した試料（試料[１０]）、ジメチルアミノメチルフェロセンを添加した試料（試料[１１]）、η-ベンゼンヘキサフルオロフォスファートを添加した試料（試料[１２]））では、酵素活性の低下を引き起こし、長期安定性は見込めないことが分かった。
【０１０３】
（３−５）ＮＡＤ＋、補酵素用活性低下抑制物質及び活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、ＮＡＤ＋、補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）及び活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
【０１０４】
具体的には、まず、試料[１９]〜[２２]を作成した。また、比較のために試料[２３]を作成した。
【０１０５】
試料[１９]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．２ｍｇのフェロセンカルボン酸）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【０１０６】
試料[２０]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．７ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【０１０７】
試料[２１]は、所定の多孔体（８．０ｍｇのカーボン多孔体）に、電子伝達体として導電性高分子（２．０ｍｇのポリアニリン）を吸着させることによって、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）と作成したポリアリニン吸着カーボン多孔体の全てとを添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【０１０８】
試料[２２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の合成高分子（２０ｍｇのポリエチレングリコール）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．８ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【０１０９】
試料[２３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
【０１１０】
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、６日後、１５日後、２２日後及び２８日後に同様の測定を行った。その結果を図８に示す。
【０１１１】
図８においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[１９]の結果、三角プロット（△）は試料[２０]の結果、四角プロット（□）は試料[２１]の結果、菱型プロット（◇）は試料[２２]の結果、逆三角プロット（▽）は試料[２３]の結果を示す。
【０１１２】
図８によれば、補酵素用活性低下抑制物質及び活性低下抑制型の電子伝達体を添加していない試料（試料[２３]）と比較して、補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）及び活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加した試料、すなわち、分子量１０００以上の生体高分子及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（試料[１９]、[２０]）、分子量１０００以上の生体高分子及び所定の多孔体に吸着された電子伝達体を添加した試料（試料[２１]）、分子量１０００以上の合成高分子及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（試料[２２]）では、酵素活性の低下が抑制され、２０日後も９０％以上の酵素活性が保たれることが分かった。
【０１１３】
以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、電子伝達体２００と、を含有する検出部１０を備え、検出部１０内には、作用電極（電極２０）が配置され、電子伝達体２００は、所定の多孔体に吸着された電子伝達体である。
したがって、電子伝達体を所定の多孔体に吸着させることによって、この電子伝達体が酵素１００の活性中心に吸着するのを抑制できるため、電子伝達体２００を使用した場合であっても、また、電子伝達体２００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
ここで、所定の多孔体に吸着された電子伝達体は、酵素センサ１の高感度化等の観点から、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０とともに電極２０近傍に固定させることによって、検出部１０に含有させるのが好ましい。具体的には、例えば、電子伝達体が吸着している多孔体と、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０と、を混合したり積層したりして、電極２０に固定するのが好ましい。固定化の方法は任意であり、例えば、ナイロンメッシュ及びＯリングを用いてこれらを電極２０上に密着固定する方法であっても良いし、公知の固定化方法であっても良い。
【０１１４】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、電子伝達体２００と、を含有する検出部１０を備え、検出部１０内には、作用電極（電極２０）が配置され、電子伝達体２００は、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物）である。
したがって、側鎖として４級アンモニウム塩基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（１）で表される化合物）や、側鎖としてカルボシキル基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物）は、キノン系化合物などの電子伝達体と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくいため、電子伝達体２００を使用した場合であっても、また、電子伝達体２００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
【０１１５】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、補酵素３００と、を含有する検出部１０を備え、酵素１００は、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された状態で検出部１０に含有され、検出部１０には、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が添加されている。
すなわち、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素１００の立体構造の変化を防止することができるため、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素３００をシリカ系メソ多孔体１１０と共存させると、補酵素３００がシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着して酵素１００の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部１０に補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質）を添加することによって、検出部１０に分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が電離して生じるイオンがシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着し、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着が抑制されるため、補酵素用活性低下抑制物質を添加することによって、補酵素３００を使用した場合であっても、また、補酵素３００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
なお、補酵素用活性低下抑制物質をシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着させることによって、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着を抑制したが、例えば、適切な官能基等でシリカ系メソ多孔体１１０の表面を修飾する等して、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着を抑制するようにしても良い。
【０１１６】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、シリカ系メソ多孔体１１０と、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００と、を備え、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズが、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍に設定されている。
したがって、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に、酵素１００をしっかりと固定することができるとともに、酵素１００を高い自由度をもって固定することができるため、酵素１００の立体構造の変化が防止され、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
また、シリカ系メソ多孔体１１０は多孔質であり、比表面積が非常に大きい。したがって、シリカ系メソ多孔体１１０を担体として用いると、シリカ系メソ多孔体１１０よりも比表面積が小さい担体を用いる場合と比較して、より大きな吸着量でより高濃度に酵素１００を固定することができる。さらに、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に酵素１００をしっかりと固定することで、酵素１００は適度に分散された状態に維持されるため、酵素１００が凝集を起こして失活する等を避けることができる。すなわち、細孔のサイズが、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているシリカ系メソ多孔体１１０を担体として用いることで、より大きな吸着量でより高濃度に酵素１００を固定することができるとともに、酵素１００が凝集を起こして失活する等を避けることができるため、優れた感度を有する酵素センサ１を提供することができる。
また、酵素１００は、適度に分散された状態に固定されることになるため、物質の透過拡散性が良好となり、酵素反応が効率的に進行する。
【０１１７】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、シリカ系メソ多孔体１１０が、検出対象物質の濃縮作用を有するため、気相又は液相中の微量な検出対象物質を極めて高感度に検出することができる。また、電子伝達体２００を利用することにより、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性中心と電極２０との間の電子移動が媒介・促進され、高感度で高速な応答を得ることが可能となる。これらの作用により、電気化学的計測による極めて高速且つ高感度な検出対象物質の検出が可能となり、高速且つ高感度で、長寿命な、安定性に優れた酵素センサ１を構成することができる。
【０１１８】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、気相又は液相中の微量な検出対象物質を極めて高感度に検出することにより、特定の匂い、又は、ガスを検出するためのセンサとして使用することができる。また、液相中での特定の味を検出するためのセンサや、バイオリアクター中で特定物質の生成及び／又は生成量を検出するために用いることもできる。
【０１１９】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、測定に際しては、参照電極４０に対する作用電極（電極２０）の電圧を特定の電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、検出対象物質を高感度かつ選択的に測定することができる。特に、電子伝達体２００を利用することにより、この設定電圧を下げることができ、選択性を向上することが可能となる。
【０１２０】
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、検出対象物質によって分子識別素子としての酵素１００の種類を変えることが必要である。例えば、酵素１００として、検出対象物質（測定対象）がグルコースの場合にはグルコースオキシターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを、測定対象がエタノールの場合にはアルコールオキシターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼを、測定対象がホルムアルデヒドの場合にはホルムアルデヒドオキシターゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを、測定対象が総コレステロールの場合にはコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物等を用いることができる。
【０１２１】
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【０１２２】
酵素センサ１にポテンショスタット５０を含むよう構成したが、これに限ることはなく、酵素センサ１とポテンショスタット５０とは別体であっても良い。
【０１２３】
酵素センサ１による電気化学的計測は、一つの基板上に形成した二極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０）又は三極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０と参照電極４０）の電極を用いても良いし、独立した各電極（作用電極（電極２０）、対照電極３０、参照電極４０）を組み合わせて用いても良い。
【０１２４】
二極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０）又は三極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０と参照電極４０）の各電極を、所定の絶縁性基板上に形成した場合、例えば、この絶縁性基板上における電極２０が形成された領域を含む領域（以下、「分析領域」という。）上に所定の電解液を滴下して、この分析領域上を検出部１０としても良いし、例えば、分析領域上に所定の電解液で満たされた液相室を設けて、この分析領域上（液相室内）を検出部１０としても良い。
【０１２５】
酵素１００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解された遊離酵素の状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０以外の担体に固定された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、電極２０等に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明の酵素センサの一例を示す模式図である。
【図２】細孔の内部に酵素が固定されたシリカ系メソ多孔体の第１の例を模式的に示す図である。
【図３】細孔の内部に酵素が固定されたシリカ系メソ多孔体の第２の例を模式的に示す図である。
【図４】シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された酵素活性を測定して得た結果である。
【図５】シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された酵素の活性の経時変化を測定して得た結果である。
【図６】ＮＡＤ＋及び補酵素用活性低下抑制物質の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定化された酵素の活性の経時変化を測定して得た結果である。
【図７】活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された酵素の活性の経時変化を測定して得た結果である。
【図８】ＮＡＤ＋、補酵素用活性低下抑制物質及び活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された酵素の活性の経時変化を測定して得た結果である。
【符号の説明】
【０１２７】
１  酵素センサ
１０  検出部
１００  酵素
１１０  シリカ系メソ多孔体
２００  電子伝達体
３００  補酵素
【図１】
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【図４】
0005131917.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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