(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記i）、ii)を含む、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃまたは糖化アルブミンの測定試薬。
i）ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ若しくは糖化アルブミンに対するプロテアーゼ、ロイコ型試薬、及びβ−シクロデキストリン類を含有する組成物
ii）糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを含有する組成物
【請求項２】
β−シクロデキストリン類が、メチルβ−シクロデキストリン若しくは２ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載の測定試薬。
【請求項３】
測定時の緩衝剤の濃度が80mM以下である請求項１または２に記載の測定試薬。
【請求項４】
プロテアーゼ反応促進剤をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項５】
β−シクロデキストリン類の濃度が０．５重量％以上である請求項１〜４のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項６】
試薬が液状であり、冷蔵で６ヶ月以上安定である請求項１〜５のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項７】
糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用するオキシダーゼがケトアミンオキシダーゼである請求項１〜６のいずれかに記載の測定試薬。
【請求項８】
試料に、請求項1〜７のいずれかに記載の測定試薬を作用させて、ロイコ型色素の発色を測定することにより、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃまたは糖化アルブミンを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ反応促進剤、及びプロテアーゼ反応促進方法に関する。また本発明は、プロテアーゼ反応促進剤を用いた試薬、測定方法に関し、さらに詳しくは、プロテアーゼ反応促進剤を用いたヘモグロビン、糖化タンパク質若しくは糖化タンパク質割合の測定用試薬、測定方法に関し、臨床検査に有用なヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ及び糖化アルブミンを正確、簡便、迅速に定量的に測定する試薬及び測定方法に関する。
さらに本発明は、シクロデキストリンを含有することを特徴とする酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤、シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含有する試薬、酵素反応の検出に使用する色素の安定化方法に関する。さらには、シクロデキストリンを用いて安定化された該色素を用いた糖化タンパク質若しくは糖化タンパク質割合測定試薬、方法に関する。
さらに本発明は、プロテアーゼ反応促進剤、及びシクロデキストリンを用いて安定化された酵素反応の検出に使用する色素を用いた糖化タンパク質若しくは糖化タンパク質割合測定試薬、方法に関し、臨床検査に有用な糖化ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ及び糖化コアルブミンを正確、簡便、迅速に定量する試薬及び測定方法に関する。
本出願は、特願２００４−２２９４９８号、及び特願２００４−２８１２２６号に基づく優先権主張して出願されたものであり、これらの出願の記載内容は本出願においてそのまま引用できる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化タンパク質の測定は非常に重要であり、中でも糖化アルブミンやヘモグロビンＡ１ｃは、臨床の現場でなくてはならない指標として多用されている。糖化アルブミンやヘモグロビンＡ１ｃの定量法としては、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、免疫法で測定されてきたが、近年、より簡便に大量検体の大量処理が可能な酵素法の開発研究が行われている（非特許文献１、２）。【０００３】
酵素法で最もよく知られている方法は、試料中の糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し生じた糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを測定する方法であるが、プロテアーゼの反応は一般的に遅く、大量のプロテアーゼを使用しても、短時間にタンパク質の分解を１００％進行させることは困難であった。また、発生した過酸化水素はパーオキシダーゼを用いて色素を発色させ定量できるが、この際、色素、特にロイコ型の色素は安定性が良くないという問題もあった。【０００４】
糖化タンパク質測定時に測定対象のタンパク質を変性させプロテアーゼの反応を促進させる添加物としてはテトラゾリウム塩（非特許文献２、特許文献１〜７）、スルホン化合物及び／又はニトロ化合物（特許文献８、９）を用いた方法が知られている。しかしテトラゾリウム塩は還元性を有する化合物、例えば糖化タンパク質やアスコルビン酸等と強く反応し呈色することから糖化タンパク質濃度の高い試料やアスコルビン酸を含む試料で異常値を示す原因になる。またスルホン化合物は酵素の阻害剤になるものが多く、特によく使用されるラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の反応停止剤となるほど強力な阻害剤である。さらにニトロ化合物は着色しており、試薬ブランクが上昇し測定精度が低下する原因となる。【０００５】
以上のとおり、現在使用されている「測定対象のタンパク質を変性させプロテアーゼの反応を促進させる添加物」は満足のいくものではなかった。
また、ロイコ型の色素を用いて測定を行っている例としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（以下、DA64と記載することがある）を添加したヘモグロビンＡ１ｃの測定（非特許文献２）があるが、試薬の安定性や保持に関する記載は一切ない。これまで液状で長期安定なロイコ型色素を含む試薬は知られていなかった。【０００６】
【特許文献１】WO 02/27012号公報
【特許文献２】WO 02/27330号公報
【特許文献３】WO 2002/027331号公報
【特許文献４】特開 2000−93199号公報
【特許文献５】特開 2001−292795号公報
【特許文献６】特開 2003−232789号公報
【特許文献７】WO 2000/210100号公報
【特許文献８】WO 2004/007760号公報
【特許文献９】WO 03/107011号公報
【非特許文献１】高妻等（Kouzuma et.al.）、「アン  エンザイマティック  メソッド  フォー  ザ  メジャーメント  オブ  グリケイティッド  アルブミン  イン  バイオロジカル  サンプル（An enzymatic method for the measurement of glycated albumin inbiological sample.）」、クリニカ  キミカ  アクタ（Clinica Chimica Acta）、２００２年、324、ｐ．６１−７１
【非特許文献２】櫻林  郁之介等（Ikunosuke Sakurabayashiet.al.）、「ニューエンザイマティック  アッセイ  フォー  グリケイティッドヘモグロビン（New enzymatic assay for glycatedhemoglobin）、クリニカル  ケミストリー（ClinicalChemistry）、２００３年、第４９巻、第２号、ｐ．２６９−２７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、従来から知られているプロテアーゼ反応促進剤よりも有用なプロテアーゼ反応促進剤を提供することにある。また、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤を提供することにある。
さらには、該プロテアーゼ反応促進剤及び／又は該安定化剤を用いて、臨床生化学検査、特にヘモグロビンＡ１ｃや糖化アルブミンの測定に有用な試薬及びそれを用いた測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記の課題を解決するために、還元性物質と作用せず、酵素活性に影響を与えにくく、着色のないプロテアーゼ反応促進剤であって、テトラゾリウム塩以外のプロテアーゼ反応促進剤について検討した。また、文献（櫻林  郁之介等、クリニカル  ケミストリー、２００３年、第４９巻、第２号、ｐ．２６９−２７４）に開示されているDA64を含むロイコ型色素を用いて同じ組成の試薬の保存安定性を調べたところ、37℃３日の保存で色素が著しく発色し、測定が困難となることを見出した。そこで、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤としては知られていない化合物について検討した。
また、該プロテアーゼ反応促進剤及び／又は該色素の安定化剤を用いることを特徴とするヘモグロビン、糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定用試薬及びそれを用いた方法、さらには、臨床生化学検査、特にヘモグロビンＡ１ｃや糖化アルブミンの測定に有用な測定用試薬及びそれを用いた測定方法について検討した。【０００９】
その結果、本発明者等は、ヘモグロビン若しくは糖化タンパク質を変性し、ヘモグロビンの色調を変化させ、かつプロテアーゼの反応を促進する化合物を選択することに着目し、還元性物質の影響を受けないもの、酵素作用を阻害しないもの、ブランクの上昇の原因にならないものを選択することに留意して鋭意検討した結果、酢酸基を含む化合物、Ｎ−アシルタウリン塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩にプロテアーゼ反応促進作用があることを見出し、さらには、これらを用いて正確にヘモグロビン若しくは糖化タンパク質、糖化タンパク質割合を測定できることを見出した。【００１０】
また、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤のスクリーニングを鋭意検討した。一般的に安定化剤として有用であることが知られている糖類や界面活性剤は安定化効果が少ないか、或いは安定化が可能であっても発色を阻害してしまう化合物が多い中で、酵素反応の検出に使用する色素の安定化効果が強く、且つ、該色素の発色反応を阻害しない化合物としてシクロデキストリンを見出した。ところで、シクロデキストリンは、化合物を包み込む包接作用によって化合物を安定に保つことが知られているが、また、一度包接された化合物はシクロデキストリン内に取り込まれたままとなる場合が多いことも知られている。本発明においては、取り込まれたままの場合は、発色反応が起こらなくなる懸念もあったが、色素、特にパーオキシダーゼの作用により発色するロイコ型の色素は、意外にも、色素が安定化され、かつ発色反応も充分に保たれることを見出した。さらに、酵素反応の検出に使用する色素はカタラーゼを共存させ、かつ緩衝剤の濃度を低くすることでさらに安定になること、また本発明の色素の安定化方法及び試薬を用いて糖化タンパク質をより高感度にまた正確に測定できることを見出した。
さらに、該プロテアーゼ反応促進剤及び／又は該色素の安定化剤を用いた臨床生化学検査、特にヘモグロビンＡ１ｃや糖化アルブミンの測定に有用な試薬及びそれを用いた測定方法を見出して本発明の完成に至った。【００１１】
すなわち、本発明は、
１）酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩のうち少なくとも１種類を含有するプロテアーゼ反応促進剤、【００１２】
２）酢酸基を含む化合物又はその塩がＮ−アシルアミノ酸又はその塩、若しくはアルキルエーテルカルボン酸又はその塩である上記１）に記載のプロテアーゼ反応促進剤、【００１３】
３）Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩が下記一般式（１）
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２      （１）
[式中、Ｒ１はアルキル基、又はアルケニル基を示し、Ｒ２はアミノ酸、又はアミノ酸誘導体中のアミノ基から水素原子を除した一価基を示す。]
で示される化合物又はその塩である上記２）に記載のプロテアーゼ反応促進剤、【００１４】
４）上記３）において、下記Ｉ）及び／又はＩＩ）であるプロテアーゼ反応促進剤、
Ｉ）Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−（但し、ｎは10〜14の整数）であるか、もしくはヘプタデス−８−エニル基である
ＩＩ）アミノ酸、又はアミノ酸誘導体がＮ−メチルアラニン若しくはサルコシンである、
５）アルキルエーテルカルボン酸又はその塩が下記一般式（２）
Ｒ３−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＯＯＭ      （２）
[式中、Ｒ３はアルキル基を示し、ｍは3〜10の整数を示し、Ｍは、水素原子、又はカルボン酸と塩を形成する金属を示す。]
で示される化合物である上記２）に記載のプロテアーゼ反応促進剤、【００１５】
６）Ｒ３がＣＨ３（ＣＨ２）Ｑ−（但し、Ｑは10又は11）である上記５）に記載のプロテアーゼ反応促進剤、
７）プロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進されたプロテアーゼ反応の結果生じる生成物を測定する方法において、プロテアーゼ反応率を１．５倍以上早くすることを特徴とするプロテアーゼ反応促進剤、【００１６】
８）上記１）〜７）いずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴とする試薬、
９）下記ｉ）〜ｉｉｉ）を含有することを特徴とする試薬、
ｉ）１）〜８）いずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤
ｉｉ）プロテアーゼ
ｉｉｉ）糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素
１０）プロテアーゼ安定化剤、及び／又は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有することを特徴とする上記８）若しくは９）に記載の試薬、
１１）試薬が液状であり、冷蔵で６ヶ月以上安定であることを特徴とする上記８）〜１０）いずれかに記載の試薬、
１２）プロテアーゼが糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを切り出すものである上記９）〜１１）記載の試薬、
１３）糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素が糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチジンに作用が高いことを特徴とする上記９）〜１２）記載の試薬、
１４）ロイコ型色素及び色素安定化剤を含むことを特徴とする上記８）〜１３）に記載の試薬、
１５）色素の安定化剤がシクロデキストリンである上記１４）記載の試薬、
１６）第一試薬にプロテアーゼ、及びヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じない糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを検出する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含むことを特徴とする上記８）〜１５）に記載の試薬、
１７）第一試薬に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬にプロテアーゼを含むことを特徴とする上記８）〜１５）に記載の試薬、
１８）第一試薬にさらにカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを含むことを特徴とする上記１６）又は１７）に記載の試薬、
１９）第一試薬と第二試薬からなるキットにおいて、プロテアーゼ及びカタラーゼを同一試薬中に含有し、かつカタラーゼの含まれていない試薬にアジ化ナトリウムを含むことを特徴とする上記８）〜１８）に記載の試薬、【００１７】
２０）上記１）〜７）いずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテアーゼ反応促進方法、
２１）上記７）に記載のプロテアーゼ反応促進剤を用い、プロテアーゼ反応率を１．５倍以上に早くすることを特徴とする上記２０）記載のプロテアーゼ反応促進方法、【００１８】
２２）上記８）〜１９）いずれかに記載の試薬を用いたヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ若しくは糖化アルブミン測定方法、
２３）同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を連続して行うことを特徴とする上記２２）記載の方法、
２４）ヘモグロビンの測定及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を同一波長で行うことを特徴とする上記２３）に記載の方法、
２５）副波長を設定し測定波長から差し引くことを特徴とする上記２４）に記載の方法、
２６）へモグロビンＡ１ｃのβ鎖Ｎ端の糖化ペプチドを特異的に測定することを特徴とする上記２２）〜２５）に記載の方法、
２７）ヘモグロビンＡ１ｃ測定時に溶血液、ヘモグロビン溶液もしくはヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドをキャリブレーターとして測定しその検量線から定量値を計算することを特徴とする上記２２）〜２６）記載の方法、
２８）同一反応槽中でアルブミンの測定及び糖化アルブミンの測定を連続して行うことを特徴とする上記２２）記載の方法、
２９）アルブミンの測定及び糖化アルブミンの測定を同一波長で行うことを特徴とする上記２８）に記載の方法、
に関する。【００１９】
また、既知濃度の糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリンから選ばれたいずれかの合成ペプチドをキャリブレーターとして、これを用いた測定値を元に試料中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度を算出したのち、さらに同時に／又は別に測定した総ヘモグロビン濃度で除すことによりヘモグロビンＡ１ｃ値(%)として算出することを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃ値(%)の算出方法に関する。【００２０】
また別の態様として、本発明は、特に血液試料中のヘモグロビン、糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合を酵素を用いて正確、簡便、迅速、安価に定量する目的において有用なプロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ反応促進方法、該プロテアーゼ反応促進剤を含有する試薬、及びヘモグロビン、糖化タンパク質若しくは糖化タンパク質割合を測定する方法に関する。具体的には、同一反応槽を用いて連続して糖化タンパク質を測定する方法に用いる試薬に、上記１）に記載のプロテアーゼ反応促進剤を追加した試薬、及び該試薬を用いた測定方法に関する。さらに詳細には、糖化タンパク質割合の測定は通常はタンパク質の測定と糖化タンパク質の測定を別々に行い割合換算するが、本発明者等は別途、これらを同一反応槽で連続して測定する方法を開発している（特開2001−204495号公報等を参照）。該方法と本件発明のプロテアーゼ反応促進剤とを組み合わせれば、より早く、正確に測定することが可能になるが、この組み合わせ等も本件発明である。【００２１】
また、本発明は、
３０）酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤であって、シクロデキストリンを含有することを特徴とする色素の安定化剤、
３１）シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン類であることを特徴とする上記３０）に記載の安定化剤、
３２）β−シクロデキストリン類が、メチル−β−シクロデキストリンもしくは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする上記３１）に記載の安定化剤、
３３）酵素反応の検出に使用する色素が、パーオキシダーゼの作用により発色する色素であることを特徴とする上記３０）から３２）いずれかに記載の安定化剤、
３４）パーオキシダーゼの作用により発色する色素が、ロイコ型色素であることを特徴とする上記３３）に記載の安定化剤、【００２２】
３５）上記３０）から３４）いずれかに記載の安定化剤、及び酵素反応の検出に使用する色素を含有する試薬、
３６）カタラーゼを含有することを特徴とする上記３５）に記載の試薬、
３７）測定時の緩衝剤濃度が80mM以下であることを特徴とする上記３５）又は３６）に記載の試薬、
３８）プロテアーゼを含有することを特徴とする上記３５）から３７）いずれかに記載の試薬、
３９）プロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴とする上記３８）記載の試薬、
４０）測定時のシクロデキストリンの濃度が0.5重量％以上であることを特徴とする上記３５）から３９）いずれかに記載の試薬、
４１）試薬が液状であり、冷蔵で６ヶ月以上安定であることを特徴とする上記３５）から４０）いずれかに記載の試薬、【００２３】
４２）上記３０）から３４）記載の安定化剤を用いることを特徴とする酵素反応の検出に使用する色素の安定化方法、【００２４】
４３）上記３５）から４１）記載の試薬を用いることを特徴とする糖化タンパク質若しくは糖化タンパク質割合の測定方法、
４４）糖化タンパク質が糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン、又はヘモグロビンＡ１ｃであり、糖化タンパク質割合が糖化アルブミン値、糖化ヘモグロビン値、又はヘモグロビンＡ１ｃ値であることを特徴とする上記４３）記載の方法、
４５）酵素反応の検出に使用する色素を安定化させるための、シクロデキストリンの使用、【００２５】
４６）上記３５）から４１）いずれかに記載の試薬を製造するための、シクロデキストリンの使用、
に関する。  【００２６】
さらに、本発明は、酵素反応の検出に使用する色素の安定化方法及び該色素を安定化した試薬、さらにそれを用いた特に血液試料中の糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合を正確、簡便、迅速、安価に定量する試薬、及び測定方法に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のプロテアーゼ反応促進剤を含む試薬は、糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定試薬に添加することで、該測定を正確、簡便、迅速に行える効果を有し、該効果によって、測定用試薬を大量、安価に提供する事を可能とする効果を有する。
また、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤を提供することで、該色素の安定化方法、該色素を含有する流通時の保存安定性に優れた試薬、さらにそれを用いた糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定方法及び測定用試薬を提供する事が可能になる。
本発明のプロテアーゼ反応促進剤、及び酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤を含む試薬は、臨床検査に有用なヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ及び糖化アルブミンを正確、簡便、迅速に定量的に測定する、流通時の保存安定性に優れた試薬を提供する事が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
発明の構成及び好ましい形態について、以下更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるプロテアーゼ反応促進剤としてはプロテアーゼ反応を促進し、かつ還元性物質の影響を受けず、同時に使用する酵素の活性を阻害せず、ブランクの原因にならないものであればいかなるものでも使用できるが、例えばアニオン界面活性剤が好ましく、中でも酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタウリン又はその塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩がさらに好ましい。少なくとも１種類の本発明に使用しうるプロテアーゼ反応促進剤を含有する組成物を、プロテアーゼ反応促進用試薬として用いることができる。【００２９】
酢酸基を含む化合物又はその塩としては、Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤が好ましく、Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩がより好ましく、Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩が特に好ましい。また別の態様として、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩が大変に好ましい場合もある。尚、酢酸基を含む化合物は、カルボン酸フリーであり、その塩は、カルボン酸と塩を形成する金属イオンとの塩であれば何でもよい。【００３０】
本発明に使用しうるＮ−アシルアミノ酸又はその塩としては下記一般式（１）
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２      （１）
[式中、Ｒ１はアルキル基、又はアルケニル基を示し、Ｒ２はアミノ酸、又はアミノ酸誘導体中のアミノ基から水素原子を除した一価基を示す。]
で示される化合物又はその塩が好ましい。【００３１】
Ｒ１はアルキル基、もしくはアルケニル基である。Ｒ１が示すアルキル基としては、直鎖状、又は分枝状の炭素数１１〜１５のアルキル基が好ましく、直鎖状の炭素数１１〜１５のアルキル基、すなわち、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−（但し、ｎは10〜14の整数）が特に好ましく、中でも直鎖状の炭素数１１のアルキル基（ＣＨ３（ＣＨ２）１０−；ウンデシル基）（ＣＨ３（ＣＨ２）１０−ＣＯ−基としてラウロイル基）が最も好ましい。Ｒ１が示すアルケニル基としては、直鎖状、又は分枝状の炭素数１１〜１５のアルケニル基が好ましく、直鎖状の炭素数１７、又は１９のアルケニル基がより好ましく、直鎖状の炭素数１７のアルケニル基が特に好ましい。二重結合の数としては、２、又は１が好ましく、１が特に好ましい。つまり、Ｃ１７Ｈ３１−、又はＣ１７Ｈ３３−基が好ましく、Ｃ１７Ｈ３３−基が特に好ましい。二重結合の位置としては、少なくとも８位に二重結合があることが好ましい。Ｒ１が示すアルケニル基の具体例としては、オレイン酸からカルボン酸を除した基（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７−；ヘプタデス−８−エニル基）、リノール酸からカルボン酸を除した基（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７−；ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基）等が挙げられる。【００３２】
Ｒ１としては、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−（但し、ｎは10〜14の整数）もしくはヘプタデス−８−エニル基が好ましく、ヘプタデス−８−エニル基が特に好ましい。また別の態様としては、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−（但し、ｎは10〜14の整数）が好ましい場合もあり、中でもＣＨ３（ＣＨ２）１０−が特に好ましい。【００３３】
Ｒ２はアミノ酸、又はアミノ酸誘導体中のアミノ基から水素原子を除した一価基である。該アミノ基から水素原子を除した一価基部分が、一般式（１）中の−ＣＯ−とペプチド結合を形成する。アミノ酸、又はアミノ酸誘導体としては、アミノ基とカルボン酸基を有する化合物であれば何でもよいが、標準アミノ酸、又はその誘導体が好ましい。標準アミノ酸としては非極性側鎖アミノ酸が好ましく、具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンが好ましく、グリシン、アラニン、又はバリンがより好ましく、グリシン、又はアラニンが最も好ましい。
標準アミノ酸の誘導体としては、標準アミノ酸のＮ−アルキル置換体が好ましく、具体的には、Ｎ−メチル置換体が好ましい。また、標準アミノ酸の誘導体としては、Ｎ−メチルアラニン若しくはサルコシンが好ましく、サルコシンが特に好ましい。また、別の態様としてはＮ−メチルアラニンが好ましい場合もある。【００３４】
一般式（１）が示す化合物としてはフリー体、又はその塩が好ましい。塩を形成する金属としては、カルボン酸と塩を形成する金属であれば何でもよいが、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、又はセシウムが挙げられる。塩を形成する金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、又はカルシウムが好ましく、ナトリウム、又はカリウムがより好ましく、ナトリウムが特に好ましい。また、別の態様としてはカリウムが好ましい場合もある。一般式（１）で示される化合物としては、フリー体も好ましい。【００３５】
一般式（１）で示される化合物としては、具体的にはココイルサルコシンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウロイルサルコシンカリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム、オレオイルサルコシン、又はラウロイルメチルアラニンナトリウム等が好適な例として挙げられ、ココイルサルコシンナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム、又はラウロイルメチルアラニンナトリウムがさらに好ましい例として挙げられ、ラウロイルメチルアラニンナトリウムが最も好ましい例として挙げられる。
一般式（１）で示される化合物は、公知の方法で合成することができ、例えば、市販で入手可能な長鎖脂肪酸Ｒ１−ＣＯＯＨ（Ｒ１は前記と同義）と、市販で入手可能なアミノ酸Ｒ２−Ｈ（Ｒ２は前記と同義）とを公知のペプチド化条件下で反応させて得ることができる。また、一般式（１）で示される化合物は、市販品を使用することもでき、例えば、日光ケミカル社などから入手して使用することができる。これらを、必要に応じてカルボン酸フリー化、又は金属との塩化を行って使用することもできる。【００３６】
また、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩としては下記一般式（２）
Ｒ３−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＯＯＭ      （２）
[式中、Ｒ３はアルキル基を示し、ｍは3〜10の整数を示し、Ｍは、水素原子、又はカルボン酸と塩を形成する金属を示す。]
で示される化合物が好ましい。【００３７】
Ｒ３はアルキル基である。Ｒ３が示すアルキル基としては、直鎖状、又は分枝状の炭素数１１〜１２のアルキル基が好ましく、直鎖状の炭素数１１〜１２のアルキル基、すなわち、ＣＨ３（ＣＨ２）Ｑ−（但し、Ｑは10又は11）が特に好ましい。
Ｒ３としては、ＣＨ３（ＣＨ２）10−が好ましい。さらに別の態様としてはＣＨ３（ＣＨ２）11−が好ましい場合もある。
ｍは３〜１０の整数である。ｍとしては、３〜１０が好ましく、３、６、１０が好ましく、６、１０がより好ましく、６が特に好ましい。また、別の態様としては１０である場合も好ましい。【００３８】
Ｍは、水素原子、又はカルボン酸と塩を形成する金属を示す。塩を形成する金属としては、カルボン酸と塩を形成する金属であれば何でもよいが、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、又はセシウムが挙げられる。Ｍとしては、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、又はカルシウムが好ましく、水素原子、ナトリウム、又はカリウムがより好ましく、ナトリウムが特に好ましい。また、水素原子が好ましい場合もある。別の態様としてはカリウムが好ましい場合もある。【００３９】
一般式（２）で示される化合物としては、具体的にはポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（６）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレン（７）トリデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（４．５）ラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、又はポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸等が好適な例として挙げられ、ポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（６）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、又はポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸が特に好ましい例として挙げられる。
一般式（２）で示される化合物は公知の方法で合成することができ、例えば、市販で入手可能なＲ３−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−１−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ（Ｒ３、ｍは前記と同義）と、市販で入手可能なハロ酢酸誘導体Ｘ−ＣＨ２ＣＯＯＭ（Ｍは前記と同義、Ｘは臭素原子、又は塩素原子を示す）とを公知のエーテル化条件下で反応させて得ることができる。また、一般式（２）で示される化合物は市販品を使用することもでき、例えば、日光ケミカル社などから入手して使用することができる。これらを、必要に応じてカルボン酸フリー化、又は金属との塩化を行って使用することもできる。【００４０】
本発明に使用しうるＮ−アシルタウリン又はその塩としては、Ｎ−ココイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ−パルミトイルメチルタウリンナトリウム、又はＮ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム等が挙げられ、Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム、又はＮ−ステアロイルメチルタウリンナトリウムが特に好適な例として挙げられるが、Ｎ−アシルタウリン又はその塩であればいかなる化合物を用いてもよく、フリーのＮ−アシルタウリンを用いてもよい。
本発明に使用しうるＮ−アシルタウリン又はその塩は公知の方法で合成することができ、例えば、市販で入手可能なタウリンを市販で入手可能なアシル化剤と反応させて得ることができる。また、本発明に使用しうるＮ−アシルタウリン又はその塩は市販品を使用することもでき、例えば、日光ケミカル社などから入手して使用することができる。これらを、必要に応じてカルボン酸フリー化、又は金属との塩化を行って使用することもできる。【００４１】
また、本発明に使用しうるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩としてはポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（３）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム、又はポリオキシエチレン（４）ノニルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられ、ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、又はポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸トリエタノールアミンが特に好適な例として挙げられるが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩であればいかなる化合物を用いてもよく、フリーのポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸を用いてもよい。
本発明に使用しうるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩は市販品を使用することができ、例えば、日光ケミカル社などから入手して使用することができる。【００４２】
結局、本発明のプロテアーゼ反応促進剤としては、具体的には、ココイルサルコシンナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルアラニンナトリウム、ポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（６）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸、Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム、ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、又はポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸トリエタノールアミンが好ましく、ラウロイルメチルアラニンナトリウム、ポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（６）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸、Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム、Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム、ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、又はポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸トリエタノールアミンがより好ましく、ラウロイルメチルアラニンナトリウムが最も好ましい。【００４３】
これらのプロテアーゼ反応促進剤の使用濃度としては、プロテアーゼのタンパク質への作用が大きくなる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えば通常下限は0.01％以上、好ましくは0.05％以上であり、最も好ましくは0.1％以上であり、上限は50％以下であり、好ましくは40％以下であり、最も好ましくは30％以下である。【００４４】
また、本発明のプロテアーゼ反応促進剤としてはプロテアーゼ反応率を１．２５倍以上に速くするものであれば良いが、ヘモグロビンＡ１ｃの測定に用いる場合は、好ましくは１．５倍以上であり、より好ましくは２倍以上でありもっとも好ましくは２．５倍以上である。糖化アルブミンの測定に用いる場合にはプロテアーゼが作用しやすいことから、１．５倍以上の速度が得られれば良い。【００４５】
プロテアーゼ反応促進度の確認は実施例１の方法を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃ値の高い試料と低い試料の吸光度差が反応促進剤無添加の場合（コントロール）の何倍になるかを計算すると良い。ちなみにコントロールは無添加若しくは反応促進効果の認められない糖類、たとえばソルビトールを反応促進剤の代わりに添加した試験溶液を用いると良い。アルブミンに対するプロテアーゼ反応促進剤のスクリーニングを行う場合には試料を糖化アルブミン値の高い試料と低い試料に置き換えて行えばよい。【００４６】
また、本発明におけるプロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進されたプロテアーゼ反応の結果生じる物質とは糖化アミノ酸、糖化ペプチド、アミノ酸、ペプチド等のことであり、好ましくは糖化アミノ酸、糖化ペプチドであり、プロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進されたプロテアーゼ反応の結果生じる生成物を測定する方法とは、たとえばヘモグロビンＡ１ｃ及び糖化アルブミンを測定する方法が挙げられるが、その他の測定方法に使用しても良い。【００４７】
本発明に使用しうるプロテアーゼとしては、糖化タンパク質に有効に作用し、かつ当該タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば動物、植物由来のプロテアーゼ、バチルス(Bacillus)属、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾパス(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、リソバクター(Lysobacter)、グリフォラ(Glifila)、酵母(Yeast)、トリチラチウム(Tritirachium)、サーマス(Thermus)、シュードモナス(Pseudomonus)、アクロモバクター(Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が好適な例として挙げられる。バチルス(Bacillus)属の微生物由来のプロテアーゼとしては例えばズブチリシンやメタロプロテアーゼ等が好適な例として挙げられる。【００４８】
また測定対象である糖化タンパク質が糖化アルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きい為より好ましく、バチルス属由来プロテアーゼ、たとえばズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ−VIII、−IX、−X、−XV、−XXIV、−XXVII、−タイプXXXI（以上シグマ社製）、サーモリシン(Thermolysin)、ナガーゼ(Nagarse)（以上和光純薬社製）、オリエンターゼ−90N、−10NL、−22BF、−Y、−5BL、ヌクレイシン（以上阪急バイオインダストリー社製）、プロレザー、プロテアーゼ−N、−NL、−S「アマノ」（以上天野製薬社製）、GODO−BNP、−BAP（以上合同酒清社精製）、プロチン−A、−P、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ（以上大和化成社製）、トヨチームNEP（東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム−FM、ノボラン（以上ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン−NBS、−SA（以上洛東化成工業社製）、アルカリプロテアーゼ  GL440、オプティクリーン−M375プラス、−L1000、−ALP440（以上協和発酵社製）、ビオプラーゼALP−30、SP−4FG、XL−416F、AL−15FG（以上ナガセ生化学工業社製）、アロアーゼAP−10、プロテアーゼYB、（以上ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ−N、−7089、ベロンW（以上樋口商会社製）、キラザイム  P−1（ロシュ社製）等が特に好ましく、ズブチリシン、ナガーゼ、プロテアーゼ−タイプ−XXVII、又はキラザイム  P−1が最も好ましい。【００４９】
また測定対象である糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃである場合には、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属、リゾバクター(Lysobacter)属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きい為に好ましく、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがより好ましく、リゾバクター属由来のプロテアーゼがより好ましい態様もある。糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを切り出すバチルス属、又はリゾバクター(Lysobacter)属由来のプロテアーゼがさらに好ましく、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)、バチルス・サーモリティカス・ロッコー(Bacillus thermoproteolyticus Rokko) もしくはリゾバクターエンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes)由来のプロテアーゼが最も好ましい。なお、好ましい具体的なプロテアーゼとしては、例えばバチルス・サーモリティカス・ロッコー(Bacillus thermoproteolyticus Rokko)由来のサーモリシン、サモアーゼ(大和化成社製)、トヨチームNEP（東洋紡績社製）、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)由来であるプロテアーゼ（Bacillus sp.  ASP-842  FERM  BP-08641）、リゾバクターエンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes)（Lysobacter
enzymogenes  YK366  FERM  BP−10010）由来のプロテアーゼ等が挙げられ、サーモリシン、リゾバクターエンザイモゲネス由来のプロテアーゼが好ましく、サーモリシンが特に好ましい。また、リゾバクターエンザイモゲネス由来のプロテアーゼが特に好ましい別の態様もある。【００５０】
なお、本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定はカゼイン−フォリン法を用いて測定した。また、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを切り出す酵素基質特異性はWO  2004/104203号公報、若しくは2003-344052号公報に記されている方法を用いて確認することができる。たとえばWO  2004/104203号公報記載の確認方法としては例えばヘモグロビンのα鎖Ｎ末端及びβ鎖Ｎ末端５残基の糖化ペプチドを用いて、β鎖Ｎ末端の糖化ペプチド、たとえば糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニンのみが生成され、糖化バリルロイシン、糖化バリルロイシルセリン、糖化バリルロイシルセリルプロリンを生じないプロテアーゼであれば良い。また、たとえば2003-344052号公報に記されている確認方法としては、糖化バリルヒスチジルパラニトロアニリド及び糖化バリルロイシルパラニトロアニリドを用いて、糖化バリルヒスチジルパラニトロアニリドのみからパラニトロアニリンを遊離するものであれば良い。【００５１】
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、糖化タンパク質から生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化タンパク質が測定できる酵素であれば如何なるものを用いてもよいが、好ましくは、αアミノ基が糖化されたアミノ酸及び／又はαアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素、εアミノ基が糖化されたアミノ酸及び／又はεアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素等が挙げられる。酵素の種類としてはデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ及びキナーゼ等があるが、広く研究されているオキシダーゼが好ましい。【００５２】
εアミノ基が糖化されたアミノ酸及び／又はεアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、カンジダ（Candida）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のオキシダーゼ等が挙げられる。【００５３】
さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可能な酵素の例としては、遺伝子組み換え型ケトアミンオキシダーゼ（KAOD；旭化成ファーマ社製；Clinica Chimica Acta、２００２年、324、ｐ．６１−７１に記載）及び加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型KAOD（KAOD−V；旭化成ファーマ社製；WO 02/27330号公報に記載のFOD遺伝子を含有する形質転換微生物JM109・pcmFOD5(FERM BP−7848)が生産するKAOD）が挙げられる。尚、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性は文献（Clinia Chimica Acta、２００２年、324、ｐ．６１−７１）記載の方法で測定した。【００５４】
またαアミノ基が糖化されたアミノ酸及び／又はαアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の例としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）由来のオキシダーゼ、前記遺伝子組み換え型ケトアミンオキシダーゼ（KAOD；旭化成ファーマ社製；Clinica Chimica Acta、２００２年、324、ｐ．６１−７１に記載）及びヘモグロビンＡ１ｃ測定時に有用な糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチジンに作用が高いステフィリウム属、ネオコスモスポラ属、アカエトミウム属、カエトミウム属、コニオカエタ属、コニオカエチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属由来の酵素が挙げられる。【００５５】
また、ヘモグロビンＡ１ｃ測定時に有用な糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチジンに作用が高い糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素のより好ましい例としては、ステフィリウム・エスピー菌株、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）；ＩＦＯ７５９０菌株、WO  2004/104203記載のネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）４７４菌株、アカエトミウム・エスピー菌株、カエトミウム・エスピー、コニオカエタ・エスピー菌株又はコニオカエチジウム・サボリＡＴＣＣ菌株、アルスリニウム・エスピーＴＯ６、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ３１９５０、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ６６２０、アルスリニウム・ジャポニカムＮＢＲＣ３１０９８、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７、ピレノケータ・ゲンチアニコラＭＡＦＦ４２５５３１、ピレノケータ・テレストリスＮＢＲＣ３０９２９、レプトスフェリア・ノドラム（分生子世代名フォーマ・ヘンネレルギー）ＮＢＲＣ７４８０、レプトスフェリア・ドリオラムＪＣＭ２７４２、レプトスフェリア・マクランス（分生子世代名フォーマ・リンガム）ＭＡＦＦ７２６５２８、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２、プレオスポラ・ベタエ（分生子世代名フォーマ・ベタエ）ＮＢＲＣ５９１８、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（Curvulalia clavata  FERM  BP-10009）などの菌株由来の酵素が挙げられ、特に好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）；ＩＦＯ７５９０菌株、WO  2004/104203記載のネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）４７４菌株、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（Curvulalia clavata  FERM  BP-10009）由来の酵素が挙げられ、最も好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）；ＩＦＯ７５９０菌株由来の酵素が挙げられる。また、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（Curvulalia clavata  FERM  BP-10009）由来の酵素が最も好ましい別の態様もある。なお基質特異性の確認は基質に糖化バリルヒスチジン及び糖化バリルロイシンを用いてその作用を確認すればよい。【００５６】
本発明に使用しうるプロテアーゼの安定化剤としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いてもよく、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であれば好ましい。【００５７】
好ましいプロテアーゼの安定化剤の例としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、カルシウム、食塩、第四級アンモニウム塩及び第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤が挙げられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、グリセリン等が挙げられ、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。【００５８】
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であればいかなる濃度で用いてもよく、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度としては、例えばDMSOを安定化剤として添加する場合には、下限濃度は5%以上、好ましくは10%以上であり、上限の濃度は50%以下、好ましくは40%以下の濃度で添加すればよい。【００５９】
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いてもよく、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば好ましい。【００６０】
好ましい糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、マグネシウム、カルシウム、硫安、アミノ酸、ザルコシンが挙げられる。糖アルコールの例としては、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が挙げられる。また、アミノ酸としては全てのアミノ酸に強い安定化効果があるが、特に標準アミノ酸が好ましく、中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸、アラニン、バリン、グリシン、リジン等が挙げられる。【００６１】
また、これらの糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性低下を抑える濃度であればいかなる濃度で用いてもよく、特に試薬を液体の状態で保存中において糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度としては、例えばソルビトールを安定化剤として添加する場合には、下限濃度は0.1%以上、好ましくは0.2%以上であり上限の濃度は30%以下、好ましくは20%以下の濃度で添加すればよい。【００６２】
本発明における、試薬の安定性は、例えば以下のように判定することができる。液状試薬を、冷蔵（2〜10℃）保存、好ましくは4℃で、６ヶ月保存する（あるいは、37℃、４日間保存の条件を代用してもよい）。この保存後の試薬と、保存前の試薬を用いて、濃度既知の糖化アルブミンあるいはヘモグロビンＡ１ｃ（あるいは糖化ヘモグロビン）をキャリブレーターとして測定し、血清若しくは溶血液（溶血処理した血液）を試料として測定し、保存前の試薬と保存後の試薬で濃度を比較する。その差異が少ない方が好ましく、差異がないことが大変に好ましい。【００６３】
本発明のプロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテアーゼ反応促進方法は、大変に有用である。【００６４】
本発明に使用しうる酵素反応の検出に使用する色素としては、例えば、補酵素、テトラゾリウム塩、トリンダー試薬、ロイコ型試薬等が挙げられるが、補酵素、トリンダー試薬、ロイコ型試薬が好ましく、トリンダー試薬、ロイコ型試薬等のパーオキシダーゼの作用により発色する色素がさらに好ましく、ロイコ型試薬が特に好ましい。
例えばデヒドロゲナーゼを用いて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する場合には、ＮＡＤ（Nicotinamide adenine dinucleotide）等の補酵素、若しくはニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２H−テトラゾリウム：WST-1、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２H−テトラゾリウム：WST-3、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２H−テトラゾリウム：WSR-8（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩を用いることが出来る。【００６５】
また例えばオキシダーゼを用いて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する場合には、はオキシダーゼの作用の結果生じた過酸化水素をパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリン(4-AA)若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、或いは、ロイコ型試薬を用いることができる。【００６６】
トリンダー型試薬の水素供与体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、N−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム１水（HALPS）、N−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリンナトリウム1水（TOPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム1水（MAOS）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム1水（HDAPS）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（HDAOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム1水（DAPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（DAOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム（ALPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンナトリウム1水（ADPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンナトリウム2水（ADOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（TOOS）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン２ナトリウム（TODB；以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。【００６７】
本発明に使用しうるロイコ型色素としては、いかなる色素を用いても良いが、たとえば入手が容易なＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（DA64）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（DA67）；以上和光純薬社製等）２，２’−アミノビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸（ABTS）、ビス−（４−ジエチルアミノフェニル）−２−スルフォフェニルメタン（BSPM）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（BCMA）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（MCDP）；以上和光純薬社製、ｏ−トリジン、３，３’−ジアミノベンジジン・4HCｌ（DAB）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（HPPA）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ−３−スルフォフェニル）トリジン・2Na・4H２O（SAT-3）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（TMBZ）、Ｎ−（３−スルフォプロピル）−３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・Na（TMBZ-PS）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン・6Na（TPM-PS）（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。【００６８】
本発明に使用しうる色素の安定化剤としては、色素の安定性を向上させるものであればいかなる物質を用いても良いが、好ましくはシクロデキストリンである。シクロデキストリンは酵素反応の検出に使用する色素の安定化効果が得られるシクロデキストリンであればいかなるものを用いても良い。たとえばα−シクロデキストリン類、β−シクロデキストリン類、γ−シクロデキストリン類が挙げられるが、β−シクロデキストリン類、γ−シクロデキストリン類が好ましく、β−シクロデキストリン類が特に好ましい。α−シクロデキストリン類としては、α−シクロデキストリンが挙げられる。γ−シクロデキストリン類としては、γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンが挙げられ、γ−シクロデキストリンが好ましいが、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンが好ましい場合もある。β−シクロデキストリン類としては、β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、モノアミノ−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンが挙げられるが、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンが好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。また、メチル−β−シクロデキストリンが大変に好ましい場合もある。
結局、シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、モノアミノ−β−シクロデキストリン（以上シグマ社等から入手可能）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンもしくはメチル−β−シクロデキストリン（以上日本食品加工株式会社等から入手可能）が好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンがより好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。また、メチル−β−シクロデキストリンが大変に好ましい場合もある。【００６９】
該シクロデキストリンを酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤として使用することができる。又、酵素反応の検出に使用する色素を安定化させるためにシクロデキストリンを使用することができる。さらには、酵素反応の検出に使用する色素の安定化試薬を製造するためにシクロデキストリンを使用することができる。
酵素反応の検出に使用する色素の使用濃度としては、試薬保存中に発色が十分に保たれる濃度であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で冷蔵保存中に発色が十分に保たれる濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、たとえばDA67を用いた場合には1μＭ以上、好ましくは2μＭ以上であり、上限は100mM以下、好ましくは50mM以下である。
シクロデキストリンの使用濃度としては、試薬保存中に酵素反応の検出に使用する色素の劣化を抑える濃度であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に色素の劣化を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えばメチル−β−シクロデキストリンを安定化剤として添加する場合には、下限濃度は0.5%以上、好ましくは1.0%以上であり上限の濃度は50%以下、好ましくは40%以下の濃度で添加すればよい。また色素とシクロデキストリンの重量比として好ましい比を示すと、下限としては、該色素：シクロデキストリン＝１：０．０１以上、好ましくは１：０．０４以上であり、上限としては、１：５００万以下、好ましくは１：３３０００００以下が好ましい。【００７０】
本発明に使用しうる好ましい緩衝剤の具体的な例としては、グッドの緩衝剤が好ましく、例えば、３−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）、２−ヒドロキシ−３−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(ACES)、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ADA）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（BES）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis-Tris）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（CAPS）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（CHES）、３−[Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、２−モルフィリノエタンスルホン酸（MES）、３−モルフィリノプロパンスルホン酸（MOPS）、２−ヒドロキシ−３−モルフィリノプロパンスルホン酸（MOPSO）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸（PIPES）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（POPSO）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（TAPS）、２−ハイドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（TAPSO）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（TES）、Ｎ−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]グリシン（Tricine）、及びトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ACES）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ADA）等を用いた緩衝剤、又はホウ酸、アンモニア、グリシン、炭酸、酢酸、リン酸、ジエタノールアミン、ｐ−フェノールスルホン酸、２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール、カコジル酸、クエン酸、マレイン酸、ベロナール及び３，３−ジメチルグルタル酸等が挙げられる。
さらに好ましい緩衝剤の例としては、ｐＨ中性付近に緩衝作用をもつ緩衝剤、例えばEPPS、HEPES、HEPPSO、ACES、ADA、BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、DIPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricine、Tris、ACES、ADA、ホウ酸、アンモニア、グリシン、リン酸、ジエタノールアミン、ｐ−フェノールスルホン酸、２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール、カコジル酸、クエン酸、マレイン酸、ベロナール及び３，３−ジメチルグルタル酸等であり、最も好ましくは３，３−ジメチルグルタル酸である。【００７１】
本発明の酵素反応の検出に使用する色素が安定化された状態で含有されている試薬としては、少なくとも本発明の酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤及び酵素反応の検出に使用する色素を含有する試薬であれば何ら限定されない。【００７２】
また、上記本発明の試薬に対して、さらにカタラーゼを共存させることも大変に好ましい。カタラーゼを共存させる意味は保存中に生じる過酸化水素を消去し保存中の色素の発色を極力抑えることにある。本発明に使用しうるカタラーゼとしてはカタラーゼ活性をもつ酵素であればいかなるものを用いても良いが、例えばアスペルギルス・ニガー由来の酵素、牛肝由来の酵素が好ましく、アスペルギルス・ニガー由来の酵素が特に好ましい。また、牛肝由来の酵素が特に好ましい場合もある。尚、アスペルギルス・ニガー由来の酵素、牛肝由来の酵素はシグマ社などから入手可能である。【００７３】
本発明に使用しうるヘモグロビン測定用試薬、及び測定方法としては本発明のプロテアーゼ反応促進剤を用いてヘモグロビンを測定する試薬及び測定方法であればいかなる試薬及び測定方法を用いてもよいが、前記酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩を含有する試薬及び該試薬を用いた測定方法が好ましく、酢酸基を含む化合物又はその塩として前記Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩、若しくはアルキルエーテルカルボン酸又はその塩を含有する試薬及び該試薬を用いた測定方法が特に好ましい。これらのプロテアーゼ反応促進剤の使用濃度としては、ヘモグロビンが測定できる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えば通常下限は0.01％以上、好ましくは0.05％以上であり、最も好ましくは0.1％以上であり、上限は50％以下であり、好ましくは40％以下であり、最も好ましくは30％以下である。【００７４】
本発明に使用しうるヘモグロビン測定の操作としては前記ヘモグロビン定量試薬に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、反応開始後一定時間後のヘモグロビンの色調（吸光度）を測定すればよい。ヘモグロビンの色調としては例えば200nm〜1000nm、好ましくは280nm〜800nmの吸光度を測定すればよい。この場合、既知濃度のヘモグロビンを用いて測定した場合の吸光度変化と比較すれば被検液中のヘモグロビンの量を求めることができる。【００７５】
本発明に使用しうる糖化タンパク質測定用試薬としては本発明のプロテアーゼ反応促進剤及び／又は本発明のシクロデキストリンに代表される酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤を用いて糖化タンパク質を測定する試薬であればいかなる試薬を用いてもよいが、前述のプロテアーゼ、及び糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含む試薬が好ましい。プロテアーゼと、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素は同一溶液に処方されてもよいが、プロテアーゼを含むプロテアーゼ試薬、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含む検出試薬から成る試薬を用いることが好ましく、プロテアーゼ反応促進剤はどちらに処方されてもよいが、プロテアーゼが糖化タンパク質に作用する時に若しくは前もってプロテアーゼ反応促進剤が存在すればよい。また、プロテアーゼを含有する試薬にプロテアーゼ安定化剤を、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含有する試薬に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を添加するとより好ましい。
なお、酵素反応の検出に使用する色素、及び本発明のシクロデキストリンに代表される酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤と、カタラーゼを共存させ、パーオキシダーゼは別の試薬に添加し測定時に混合されるようにするとより好ましい。これは色素とパーオキシダーゼが共存すると、保存中に反応が進み発色してしまう可能性があるからである。【００７６】
具体的な本発明に使用しうるプロテアーゼ試薬としては、タンパク質分解反応が効率よく進行するようにpH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ安定化剤を有効な濃度になるように適宜調製して添加すればよい。
本発明に使用しうる緩衝剤としては、酵素反応の検出に使用する色素の安定性に影響を与えない緩衝剤であればいかなる緩衝剤を用いても良いが、具体例は前述した通りである。その使用濃度は、測定時の緩衝剤濃度として設定することが重要であり、測定時の緩衝剤濃度の上限が80mM以下、さらに好ましくは50mM以下であり、またその下限は0.1mM以上好ましくは1mM以上であれば良い。
例えばタンパク質がアルブミンであり測定対象が糖化アルブミンである場合において、プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いる場合にはpHが7〜10付近でタンパク質分解活性が強いため、反応のｐHは7〜10を選択することが好ましい。【００７７】
また、例えばタンパク質がヘモグロビンであり測定対象が糖化ヘモグロビンもしくはヘモグロビンＡ１ｃである場合において、前記トヨチームNEP（東洋紡績社製）を用いる場合には、タンパク質分解活性がpH6.0〜9.0付近で強いことから、反応のｐＨはpH6.0〜9.0を選択することが好ましい。【００７８】
プロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中のタンパク質を十分に分解し得る濃度で有ればよく、下限は10U/ml以上、好ましくは100U/ml以上であり、最も好ましくは500U/mlであり、上限は1.0×106U/ml以下であり、好ましくは5.0×10５U/ml以下であり、最も好ましくは3.0×10５U/ml以下である。【００７９】
プロテアーゼ反応促進剤は本発明のプロテアーゼ反応促進剤であればいかなるものを用いてもよい。使用濃度としては、タンパク質を効果的に変性させプロテアーゼのタンパク質への作用が大きくなる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えば通常下限は0.01％以上、好ましくは0.05％以上であり、最も好ましくは0.1％以上であり、上限は50％以下であり、好ましくは40％以下であり、最も好ましくは30％以下である。【００８０】
プロテアーゼの安定化剤としての使用濃度としては、液状状態の冷蔵保存で６ヶ月安定な試薬性能を示す濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えばジメチルスルホキシドを用いた場合には、通常下限は1%以上、好ましくは5%以上であり、上限は60％以下、好ましくは50％以下である。【００８１】
カタラーゼの使用濃度としては、酵素反応の検出に使用する色素が不安定になる過酸化水素等を消去できる濃度であればいかなる濃度を用いても良いが、例えば通常下限は0.1U/ml以上、好ましくは1U/ml以上であり、最も好ましくは2U/ml以上であり、上限は3000U/ml以下であり、好ましくは1500U/ml以下であり、最も好ましくは1500U/mlである。【００８２】
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含有する測定試薬の組成については、使用する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の至適pHを考慮し反応が効率よく進行するようにpHを選択し、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素量を決定すればよい。次いでパーオキシダーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤及びプロテアーゼ試薬にカタラーゼを用いた場合にはその作用を止めるアジ化ナトリウム等のアザイドを添加すれば良い。
例えばタンパク質がアルブミンであり測定対象が糖化アルブミンである場合において、例えば前記のKAOD若しくはKAOD−V（旭化成ファーマ社製）を使用する場合、最大活性の50%
以上の活性を示す領域がpH6.5〜10と広いので、反応のpHは6.5〜10を選択することが好ましい。また、例えばタンパク質がヘモグロビンであり測定対象が糖化ヘモグロビンもしくはヘモグロビンＡ１ｃである場合において、例えば前記のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来KAODを使用する場合、最大活性の50%以上の活性を示す領域がpH6.0〜10と広いので、反応のpHは6.0〜10を選択することが好ましい。【００８３】
糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の使用濃度としては、糖化タンパク質が測定できる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、通常下限は0.5U/ml以上、好ましくは１U/ml以上であり、上限は1000U/ml以下、好ましくは500U/ml以下である。
パーオキシダーゼ使用濃度としては、測定系より生じた過酸化水素が測定できる濃度であればいかなる濃度を用いても良いが、通常下限は0.01U/ml以上、好ましくは0.1U/ml以上であり、上限は100U/ml以下、好ましくは50U/ml以下である。
糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては、液状状態の冷蔵保存で６ヶ月安定な試薬性能を示す濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えばソルビトールを用いた場合には、通常下限は0.1%以上、好ましくは1%以上であり、上限は30％以下、好ましくは20％以下である。【００８４】
カタラーゼ反応を止める目的でアザイドを使用する場合のアザイドとしては、カタラーゼ活性が十分にとまる濃度であればいかなる濃度を用いてもよい。たとえばアジ化ナトリウムを用いる場合の使用濃度としては、通常下限は0.01%以上好ましくは0.05%以上であり、上限は10％以下、好ましくは5％以下である。【００８５】
本発明に基づく糖化タンパク質の測定方法において、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を用いる場合に、その作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素としてＮＡＤを用いて生成される変化の量として還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である340nm付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、若しくは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、2−(4−Lodophenyl)−3−(4−nitrophenyl)−5−(2,4−disulfophenyl)−2H−tetrazolium, monosodium
salt (WST−1)、2−(4−Lodophenyl)−3−(2,4−dinitrophenyl)−5−(2,4−disulfophenyl)−2H−tetrazolium, monosodium
salt (WST−3;以上同仁化学研究所社製)に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量してもよく、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量又は反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばケトアミンオキシダーゼを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。【００８６】
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により定量してもよく、また電気化学的手法によって定量してもよく、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を定量してもよい。【００８７】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリン（4−AA）若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（DA64）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（DA67）；以上和光純薬社製等）等を用いることが出来る。【００８８】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極の材料としては、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来るが、さらにオキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定してもよい。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定してもよい。
さらに本発明の測定方法、試薬において、プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、加えてその反応前後若しくは同時に他のエンドプロテアーゼ、又は他のエキソプロテアーゼを作用させてもよい。【００８９】
また本発明に基づく糖化タンパク質を測定する酵素反応試薬の組成には、例えば界面活性剤、塩類や防腐剤などを適宜選択して添加してもよい。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリビニルアルコール、等の0.01〜10%、好適には0.05〜5%、各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10%、好適には0.05〜1%を適宜添加すればよい。各種防腐剤としては、プロクリン（SUPELCO社製）の0.01〜10%、好適には0.02〜5%を適宜添加してもよい。【００９０】
本発明に使用しうる糖化タンパク質の測定方法としては、前記本発明の糖化タンパク質測定する酵素反応試薬の組成物に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後一定時間後の2点間の数分ないし数十分間、例えば3分後と4分後の1分間、又は3分後から8分後の5分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接又は間接的に前記の方法で測定すればよく、エンドポイントアッセイの場合には検出反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すればよい。この場合既知濃度の糖化タンパク質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化タンパク質の量を求めることができる。
本発明の測定方法に使用しうるキャリブレーターとしては前記既知濃度のタンパク質のほかに既知濃度の糖化アミノ酸、又は糖化ペプチドを用いても良い。糖化アミノ酸、又は糖化ペプチドの例としては、市販の合成ペプチドを用いればよいが、ヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合には糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン等を用いることが出来る。キャリブレーター中のペプチドの濃度は試料より生じるペプチドの濃度が十分に測定できる濃度であれば良い。【００９１】
本発明に使用しうる糖化タンパク質割合測定用試薬の組成物としては、前記糖化タンパク質測定用試薬の組成物に、別途若しくは同時にタンパク質を測定する組成を追加すればよい。例えばタンパク質が糖化アルブミンであれば、別途アルブミンを、またタンパク質が糖化ヘモグロビン若しくはヘモグロビンＡ１ｃである場合には別途ヘモグロビンを測定すればよい。アルブミンやヘモグロビンの測定は公知の方法を用いて行えばよい。【００９２】
別途アルブミンを測定する組成物としては公知のアルブミンを測定する方法であれば如何なる方法を用いてもよい。このような方法には、例えばブロムクレゾールグリーン（以下BCGと略す。）、ブロムクレゾールパープル（以下BCPと略す。）、ブロモフェノールブルー（以下BPBと略す。）、メチルオレンジ（以下MOと略す。）、又は２−（４’−ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸（以下HABAと略す。）等のアルブミン特異的な色素を用いる方法等が挙げられる。さらにまた、対象となるタンパク質がヘモグロビンである場合には、公知のヘモグロビンを測定する方法であれば如何なる方法を用いてもよい。このような方法には、例えばメトへモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、緑色発色団形成法又はオキシヘモグロビン法等が挙げられる。緑色発色団形成法とは、緑色発色団形成試薬とヘモグロビンを反応せしめ、安定な生成物（緑色発色団）を形成する方法であり、緑色発色団は英国特許公開第 2052056号に記述されるアルカリ性ヘマチン D−575と同様な吸収スペクトルを有する。【００９３】
本発明に使用しうる同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を連続しておこなう方法としては、本発明のプロテアーゼ反応促進剤が含有されている試薬を用いるものであればいかなる方法を用いてもよいが、具体的な方法としては、プロテアーゼ反応促進剤を含む第１反応試薬に試料を添加し、一定時間後、例えば３分若しくは５分後等にヘモグロビンに特有な吸収例えば220nm〜900nm、好ましくは280nm〜800nmの吸光度を測定し、続いてケトアミンオキシダーゼを含有する第２反応試薬を添加し、一定時間後、例えば３分若しくは５分後等に発色色素の吸収極大付近の吸光度を測定すればよい。この場合プロテアーゼは第１反応試薬、第２反応試薬どちらに含まれていてもよい。また、別途ヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度が既知の試料の吸光度と比較することでヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度に変換が可能である。通常ヘモグロビンＡ１ｃ値は総ヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の割合で表現されることから、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を総ヘモグロビン濃度で除し、割合換算すればよい。【００９４】
さらに本発明の同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を連続しておこなうことを特徴とする方法としては同一波長を用いてヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃを測定し、別途試料由来のにごり等の影響を差し引く目的で副波長を測定し、測定波長から差し引くことが好ましい。測定波長としてはいかなる波長を用いてもよいが、発色色素の吸収極大付近が好ましく、例えば前記DA67を用いる場合には500nm〜700nmで測定が可能であり、好ましくは550nm〜660nmであり、副波長としては600nm〜800nm、好ましくは650nm〜750nmを用いて測定が可能である。【００９５】
本発明の試薬は液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できるが、好ましい剤形は液状品である。
本発明の測定対象となる試料としては、少なくともヘモグロビン若しくは糖化タンパク質を含有する被検液であれば如何なるものを用いてもよいが、好ましい被検液としては血液成分、例えば血清、血漿、血球、全血若しくは分離された赤血球等が挙げられる。また分離された赤血球や糖化ヘモグロビンをあらかじめプロテアーゼにより断片化したプロテアーゼ処理液（溶血液）も好ましい被検液として用いることができる。尚赤血球の分離は公知の遠心分離法によって、例えば3000回転３分程度で分離することが可能である。また分離した血球の溶血方法としては蒸留水で溶血させれば十分である。【００９６】
本発明の糖化タンパク質測定試薬及び方法における測定対象である糖化タンパク質としては、例えば糖化アルブミン又はヘモグロビンＡ１ｃ（糖化ヘモグロビンを含んでもよい）が挙げられるが、測定対象となる糖化タンパク質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化タンパク質を測定してもよい。【００９７】
試料中に目的とする糖化タンパク質、たとえばヘモグロビンＡ１ｃ若しくは糖化アルブミン以外にあらかじめ糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが含まれ測定に影響を与える場合、たとえば高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者の試料を測定する場合若しくはヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合に、分子内に大量の糖化アミノ酸が存在し酵素の特異性のみでは目的とするβ鎖Ｎ末端の糖化を特異的に測定できない場合にはこれらの目的外の成分を消去して測定する必要がある。
消去反応は糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を用いて行えばよく、たとえば前記あらかじめ糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが含まれ測定に影響を与える場合には、第一試薬に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬に含むプロテアーゼを含む試薬を用いればよい。【００９８】
第一試薬に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬に含むプロテアーゼを含む試薬の処方については前記の消去反応を含まない試薬のプロテアーゼ試薬、及び糖化アミノ酸測定試薬を用いることが出来るが、第一試薬、第二試薬の混合比率が１：１ではなく、例えば１：３、１：４又は１：５などである場合は、混合時に各成分が有効に働く濃度になるように適宜調整すればよい。つまり第一試薬、第二試薬の混合比が１：４の場合、第一試薬に処方する成分は５／４の濃度範囲に、第二試薬に処方する成分は前記の濃度範囲の５倍の濃度範囲にすればよい。
また、第一試薬にプロテアーゼ、及びヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じない糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含有し、第二試薬に第二試薬にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを検出する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含有する試薬処方については、前記の消去反応を含まない試薬のプロテアーゼ試薬にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じない糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を0.5〜1000U/ml、好ましくは1.0〜500U/ml添加したもの、及び糖化アミノ酸測定試薬を用いることが出来るが、第一試薬、第二試薬の混合比率が１：１ではなく、例えば１：３、１：４又は１：５などである場合は、混合時に各成分が有効に働く濃度になるように適宜調整すればよい。つまり第一試薬、第二試薬の混合比が１：４の場合、第一試薬に処方する成分は５／４の濃度範囲に、第二試薬に処方する成分は前記の濃度範囲の５倍の濃度範囲にすればよい。【００９９】
さらに、消去反応で生じた過酸化水素は検出反応に悪影響を及ぼすことから第一試薬にカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを処方し分解すればよい。カタラーゼは1〜2000U/ml、好ましくは5〜1000U/mlで処方すればよく、これ以外の量処方しても良い。アジ化ナトリウムは第二試薬中に0.001〜0.1％好ましくは0.02〜0.09％処方すれば良い。またパーオキシダーゼは0.1〜100U/ml、好ましくは0.2〜50U/ml処方すればよいがこれ以外の量処方しても良い。
【実施例】
【０１００】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
［実施例１］プロテアーゼ反応促進剤のスクリーニング
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
4000U/ml  中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）
1.5mM      CaCl2(和光純)
＋        試験サンプル
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
30U/ml    KAOD（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来；旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）
80U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
80μM    DA−67（和光純薬社製）
試験サンプルとしては以下のものをそれぞれ独立して用いた。尚（  ）内の濃度はR１
中の最終濃度を示す。【０１０１】
Tween−20(1%)、Brij35(1%)、TritonX−100(1%)、デオキシコール酸(1%)、イミノ２酢酸(IDA；1mM)、ZnSO4(0.1mM)、AlCl3(0.1mM)、フェロシアン化カリウム(0.01mM)、ソルビトール(5%)、グルコース(5%)、亜硝酸ナトリウム（2mM）、ジメチルスルホキシド（10％）、Adenosine 5'−triphosphate(ＡＴＰ；2mM)、nicotinamide adenine dinucleotide(ＮＡＤ；2mM)、flavin adenine dinucleotide(ＦＡＤ；2mM)、 (以上和光純薬社製)、ココイルサルコシンナトリウム（サルコシネートCN−30；1%）、ミリストイルサルコシンナトリウム（サルコシネートMN；1%）、パルミトイルサルコシンナトリウム（サルコシネートPN；1%）、ラウロイルメチルアラニンナトリウム（アラニネートLN−30；1%）、ポリオキシエチレン（３）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム（ECTD−3NEX；1%）、ポリオキシエチレン（６）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム（ECTD−6NEX；1%）ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル酢酸（AKYPO−RLM100；1%）、ラウリルリン酸（ホステンHLP；1%）、Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム（LMT；1%）、Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム（SMT；1%）ラウリル硫酸ナトリウム（SLS；1％）、ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン（SBL−2T−36；1%）、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン（SBL−4T；1%）、ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン（SBL-203-27；1%）、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン（AM−301；1%）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（１５）グリセリル（TMGS−15；1%）、3−[(3−Cholamidopropyl)  dimethyl−ammonio]propanesulfonic
acid (CHAPS;1%)、（以上日光ケミカル社製）、WST−3(2mM：同仁化学研究所社製)
＜操作方法＞
37度にインキュベートされたR−1;180μlにHbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS
HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製、30倍希釈品）20μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR−2;45μlを添加した。R−2添加前及び添加5分後の660nmの吸光度を測定した。表１に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評価結果を示した。表１中に示したＡＨ−ＡＬは、１次キャリブレーターのレベル４（9.88％）から得られた吸光度ＡＨから、１次キャリブレーターのレベル２（5.38％）から得られた吸光度ＡＬを差し引いた差である。ここでＡＨ−ＡＬが大きければプロテアーゼ反応促進効果があると判定できる。特に、ＡＨ−ＡＬが２０以上の場合には優れた促進効果がある。
表１に示すようにＮ−アシルアミノ酸であるサルコシネートCN−30、サルコシネートMN、サルコシネートPN、アラニネートLN−30、アルキルエーテルカルボン酸であるECTD−3NEX、ECTD−6NEX、AKYPO−RLM100、Ｎ−アシルタウリン酸であるLMT、SMT、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩であるSBL−2T−36、SBL−4T、SBL−203−27に効果が見られた。【０１０２】
このことから酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であり、酢酸基を含む化合物又はその塩としてはＮ−アシルアミノ酸又はその塩、若しくはアルキルエーテルカルボン酸又はその塩にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であった。
Ｎ−アシルアミノ酸又はその塩としては下記一般式（１）
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２      （１）
[式中、Ｒ１はアルキル基、又はアルケニル基を示し、Ｒ２はアミノ酸、又はアミノ酸誘導体中のアミノ基から水素原子を除した一価基を示す。]
で示される化合物又はその塩にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であり、中でも、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−（但し、ｎは10〜14の整数）もしくはヘプタデス−８−エニル基である、及び／又は、Ｒ２が標準アミノ酸、Ｎ−メチルアラニン若しくはサルコシンである、化合物が好ましいことが明らかとなった。
アルキルエーテルカルボン酸又はその塩としては下記一般式（２）
Ｒ３−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＯＯＭ      （２）
[式中、Ｒ３はアルキル基を示し、ｍは3〜10の整数を示し、Ｍは、水素原子、又はカルボン酸と塩を形成する金属を示す。]
で示される化合物にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であり、中でも、Ｒ３がＣＨ３（ＣＨ２）Ｑ−（但し、Ｑは10又は11）である化合物が好ましいことが明らかとなった。尚、DA67のかわりにTPM-PSを用いても結果はほぼ同じであった。また、糖の添加はプロテアーゼ反応を促進しないが、ソルビトールの添加をコントロールとするとコントロールの吸光度変化は6.5mAbsでありＮ−アシルアミノ酸、アルキルエーテルカルボン酸、Ｎ−アシルタウリン酸、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩では約4.3倍の反応促進効果が確認された。尚10mAbs以上の吸光度変化が得られれば測定は可能であるが、その場合は反応促進効果が1.5倍と計算され、1.5倍以上の反応促進効果が得られれば良いと考えられる。【０１０３】
【表１】
0005131955.tif 000002
【０１０４】
［実施例２］プロテアーゼ反応促進剤を含有する試薬
＜試薬＞
ヘモグロビン測定試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
１％        サルコシネートMN
0.05％      アジ化ナトリウム
上記試薬において、サルコシネートMNを用いる代わりに、AKYPO-RLM100、SMT、又はSBL-2Z-36を用いた試薬も別途調製した。【０１０５】
［実施例３］プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼを含有する試薬
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
4000U/ml    中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製；トヨチームNEP）
1.5mM      CaCl2(和光純薬社製)
1％          アラニネートLN−30
0.05%      アジ化ナトリウム
本試薬のプロテアーゼの特異性は糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン及び糖化バリルロイシルセリルプロリルアラニンを用いて確認し、ヘモグロビンβ鎖Ｎ端に特異性が高く、α鎖Ｎ端には実質的に作用しないことが明らかであった。さらにバチルス・サーモリティカス・ロッコー(Bacillus thermoproteolyticus Rokko)由来のサーモリシン、サモアーゼ(大和化成社製)、バチルス・エスピー(Bacillus
sp.  ASP-842  FERM  BP-08641)由来であるプロテアーゼ、リゾバクターエンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes  YK366  FERM  BP−10010）由来のプロテアーゼについても同様の基質特異性が確認され、中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製；トヨチームNEP）の代わりに処方できることが確認された。【０１０６】
［実施例４］プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び／又は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬（ＨｂＡ１ｃ用）
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM        トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
4000U/ml    中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）
1.5mM      CaCl2(和光純薬社製)
1％          アラニネートLN−30
6％          DMSO
0.05%        アジ化ナトリウム
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
２−１）R−2−A
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
60U/ml    KAOD（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来；旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）若しくはWO  2004/104203
記載のネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora 
vasinfecta）４７４菌株由来
160U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
10％        ソルビトール
0.1%        アジ化ナトリウム
２−２）R−2−B
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
160μM      DA−67（和光純薬社製）【０１０７】
［実施例５］プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び／又は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬（ＨｂＡ１ｃ用）
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
4000U/ml    中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）
1.5mM      CaCl2(和光純薬社製)
1％          アラニネートLN−30
6％          DMSO
0.05%      アジ化ナトリウム
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
60U/ml    KAOD（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来；旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）若しくはWO  2004/104203
記載のネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora 
vasinfecta）４７４菌株由来
160U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
10％        ソルビトール
0.1%        アジ化ナトリウム
160μM      DA−67（和光純薬社製）
2％          ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
（日本食品加工株式会社製）【０１０８】
［実施例６］第一試薬にプロテアーゼ及びヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じない糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを検出する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含む試薬。
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
4000U/ml    中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）
1.5mM      CaCl2(和光純薬社製)
1％          アラニネートLN−30
6％          DMSO
0.05%      アジ化ナトリウム
10U/ml      KAOD（旭化成ファーマ社製）
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
60U/ml    KAOD（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来；旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）
160U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
10％        ソルビトール
0.1%        アジ化ナトリウム
160μM      DA−67（和光純薬社製）
2％          ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
（日本食品加工株式会社製）【０１０９】
［実施例７］第一試薬に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬に含むプロテアーゼを含む試薬。
＜試薬＞
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM    トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
12U/ml    KAOD（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来；旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）
32U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
6％        ソルビトール
0.05%      アジ化ナトリウム
32μM      DA−67（和光純薬社製）
2％        ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
（日本食品加工株式会社製）
1％        アラニネートLN−30
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬    
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
20000U/ml  中性プロテアーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）
1.5mM      CaCl2(和光純薬社製)
30％        DMSO
0.05%      アジ化ナトリウム【０１１０】
［実施例８］プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び／又は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬（ＧＡ用）
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
8mM        4−AA
10％        DMSO
１0000U/ml  Bacillus licheniformis由来プロテアーゼ（シグマ社製）
(DEAE−セファロース樹脂で精製、脱塩したものを使用)
0.001675%  BCP（和光純薬社製）
0.05%      アジ化ナトリウム
0.5%        Tween20
（±１％    アラニネートLN−30）
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
50mM      トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
5％          ソルビトール
20U/ml      KAOD（旭化成ファーマ社製）
5U/ml        パーオキシダーゼ(シグマ社製)
10mM    N−Ethyl−N−(2−hydroxy−3−sulfopropyl)−3−metylaniline.sodium
salt, dihydride (TOOS；同仁化学研究所)
0.05%      アジ化ナトリウム【０１１１】
［実施例９］ヘモグロビンの測定と試薬の安定性
実施例２の試薬を用いてヘモグロビン濃度が既知の標準品を測定した。
＜ヘモグロビン測定試薬の反応手順＞
自動分析計（日立7170S型自動分析計；日立製作所）を用いて測定を行った。試料20μlに試薬180μlに添加して660nmの吸光度変化を測定した。対照に水をおき５分後の吸光度差を計算した。試料はヘモグロビン標準品を５段階希釈したものを用いた。【０１１２】
結果を図１に示す。図１に示すように本発明におけるプロテアーゼ反応促進剤（サルコシネートMN、AKYPO−RLM100、SMT、SBL−2Z−36）を用いてヘモグロビンの定量が可能であった。またサルコシネートMNをプロテアーゼ反応促進剤として使用した試薬の37℃、4日間の保存試験を行った。ヘモグロビン標準品5.5g/dlをキャリブレーターとしてHbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製  レベル１  ヘモグロビン濃度135g/L）を30倍希釈して測定したところ、ヘモグロビンの測定値は保存試験前（54mAbs 、4.5g/L）であり、保存試験後（50mAbs 、4.6g/L）であった。これらの結果より本試薬は冷蔵で６ヶ月以上安定であると推定された。【０１１３】
［実施例１０］ヘモグロビンＡ１ｃの測定、ヘモグロビンＡ１ｃ割合の計算
実施例４、５の試薬を用いて試料を測定した。
＜試料＞
１）HbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製）30倍希釈品
２）１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2  30倍希釈品  ９容に  乳ビ（２０００度；干渉チェック；シスメックス社製）１容を添加した乳ビ混入ヘモグロビン
＜R−2試薬の調製＞  実施例４の試薬はR−2−A試薬、R−2−B試薬を使用前に１：１で混合し使用した。実施例５の試薬はそのまま使用した。
＜ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬の反応手順＞
自動分析計（日立7170S型自動分析計；日立製作所）を用いて測定を行った。試料20μlに試薬R−1 180μlに添加し、３７℃に保温し主波長660nm、副波長700nmの吸光度変化を測定した。５分後、試薬R−2 45μlに添加し、３７℃に保温し主波長660nm、副波長700nmの吸光度変化を測定した。また、測定値はHbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS
HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製  レベル１；ヘモグロビン濃度135g/L、HbA1c値4.04%とレベル５；ヘモグロビン濃度132g/L、HbA1c値12.63%）をキャリブレーターとして使用し値を換算した。ヘモグロビンの定量はR2試薬添加直前の測光で行い、HbA1cの定量はR2添加後5分後の測光より計算した。
ヘモグロビン及びHbA1cの検量線を図２、及び図３に示す。HbA1c濃度はHbA1c測定用実試料標準物質のHbA1c％とHbA1c濃度より算出した。図２より明らかなように本発明におけるプロテアーゼ反応促進剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの定量が可能であった。また図３より明らかなようにさらにヘモグロビンの定量も同時に定量が可能であった。これらのことから本発明を用いて同一反応槽中でヘモグロビン及びHbA1cを連続して測定できることが明白であった。【０１１４】
また、乳ビ混入ヘモグロビンの測定では副波長を差し引かない場合には試料とR−1が混合された時点での計算された吸光度が高く、１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2のレベル１、HbA1c値4.04%を５回測定した場合の再現性はCV値３．５％であり、一方副波長を差し引いた場合には再現性１．５％と正確性が向上していた。このことからヘモグロビン及びHbA1cを同一波長で測定し、副波長を差し引くことにより正確にHbA1cが測定できることが明らかである。また、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来（旭化成ファーマ社製、特開2004-275013号公報に製法記載）及びWO  2004/104203記載のネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Neocosmospora
vasinfecta）４７４菌株由来のケトアミンオキシダーゼでは同じ結果が示された。【０１１５】
さらに本試薬R−1及びR−2−Aを液体状態で37℃４日間保存し安定性を評価した。なお実施例４の試薬はR−2−Bは冷蔵にて保存し、R−2−AとR−2−Bは使用直前に混合した。測定の結果、１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2のレベル３（ヘモグロビン濃度145g/L、HbA1c値7.32%）の３０倍希釈品のヘモグロビン定量値は保存試験前（実施例４の試薬58mAbs、4.8g/L、実施例５の試薬55mAbs、4.8g/L）であり、保存試験後（実施例４の試薬56mAbs、4.7g/L、実施例５の試薬5４mAbs、4.7g/L）であった。またHbA1cの計算値は保存試験前（実施例４の試薬7.5%、実施例５の試薬7.6%）であり、保存試験後（実施例４の試薬7.6%、実施例５の試薬7.5%）であった。また冷蔵保存３ヶ月のデーターでは測定値に差は見られなかった。これらの結果より実施例４の試薬のR−1、R−2−A、及び実施例５の試薬は冷蔵で６ヶ月以上安定であると推定された。一般的にロイコ型の色素は反応性が高い半面不安定であり実施例４の試薬ではその他の成分と分離して保存する必要があったが、シクロデキストリンの添加により色素が安定化され、その他の成分と同じ容器に処方することが可能であることが明白であった。
また、実施例４、及び５の試薬はプロテアーゼとして糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼを、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに作用する酵素として糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチジンに作用が高いことを特徴とする酵素を用いているがJDS HbA1c Lot2のレベル３の定量値が表示値と一致していることから、正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定していることが明白である。【０１１６】
［実施例１１］消去系を組み込んだ試薬の性能
＜試薬＞
実施例６、７の試薬を用いた。
＜試料＞
HbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS
HbA1c Lot2 レベル３（HbA1c値7.32%）福祉・医療技術振興会製）30倍希釈品、9容に糖化アミノ酸１容を添加して試料とした。またコントロールとしては、糖化アミノ酸の代わりに蒸留水を添加したものを用いた。添加する糖化アミノ酸濃度としては、糖化−Ｚ−リジン水溶液（ＦＺＬ）  2mM、糖化−バリン水溶液（ＦＶ）2mM（糖化アミノ酸はハシバらの方法により合成、精製した。Hashiba
H、J.Agric.Food Chem.24：70、1976）を用いた。
＜反応手順＞
実施例１０と同じ手順で試料を測定した。
測定の結果、１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2のレベル３（HbA1c値7.32%）ののHbA1c定量値は、実施例６の試薬を用いた場合コントロール、FZL添加、FV添加の順に7.2、7.3、7.1%であり、実施例７の試薬は7.3、7.4、7.1%であり消去反応が行われ、正確な値が測定されていることが確認された。
［実施例１２］糖化アルブミンの測定、糖化アルブミン割合の計算及び試薬の安定性
＜糖化アルブミン測定試薬の反応手順＞
実施例５の試薬を使用した。37度にインキュベートされたR−1;240μlにコントロール血清H（株式会社BML社製；用法に基づき調製し５段階に蒸留水で希釈した。）8μlを添加し、主波長546nm（副波長700nm）の吸光度を測定した。37℃で反応を開始し、正確に5分後にR−2;80μlを添加した。R−2添加前及び添加5分後の吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いた△A0を算出した。値の換算はルシカGA用キャリブレーター（旭化成ファーマ社製）を同時に測定し吸光度を比較して行った。アルブミンの測定は試料添加直後からR−2添加直前の吸光度を引いた吸光度差より求めた。糖化アルブミンの測定はR−2添加５分後の吸光度よりR−2添加直前の吸光度を引いた吸光度差より求めた。【０１１７】
プロテアーゼ反応促進（アラニネートLN−30）を含まない場合、プロテアーゼの反応は遅く、コントロール血清（株式会社BML社製；希釈なし）のGA測定の感度は32mAbsであり、含んだ場合（48mAbs）の66％であった。反応率は１．５倍に加速されていた。
また、５段階希釈した管理血清の測定値を図４に示す。図４から分かるように本試薬を用いて同一反応槽中、同一波長でアルブミン、糖化アルブミンを定量し、糖化アルブミン値（％）を良好に測定することが出来た。【０１１８】
さらに本試薬を液体状態で37℃４日間保存した結果、コントロール血清（株式会社BML社製；希釈なし）を測定したところ、GA測定の感度は48mAbs、アルブミンの測定感度60mAbs、GA値44.8%であり、保存後はGA測定の感度は46mAbs、アルブミンの測定感度61mAbs GA値44.5%であった。これらの結果より本試薬は冷蔵で６ヶ月以上安定であると推定された。【０１１９】
［実施例１３］酵素反応の検出に使用する色素安定化剤のスクリーニング
＜試薬＞
１）R−1  色素含有試薬
200mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
200μM  ＤＡ64、ＤＡ67もしくは0.04％のMBTH（和光純薬社製）
＋試験サンプル
２）R−2  パーオキシダーゼ含有試薬
200mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml  パーオキシダーゼ(シグマ社製)
0.04%  TOOS（和光純薬社製；ただしR-1にMBTHを用いた場合にのみ添加）
試験サンプルとしては以下のものを用いた。尚（  ）内の濃度はR１中の最終濃度を示す。
Tween-20(1%)、Brij35(1%)、TritonX-100(1%)、デオキシコール酸(1%)、イミノ２酢酸(IDA；1mM)、ZnSO4(0.1mM)、AlCl3(0.1mM)、フェロシアン化カリウム(フェロシアン化K；0.01mM)、ソルビトール(5%)、グルコース(5%)、亜硝酸ナトリウム（2ｍM）、ジメチルスルホキシド（DMSO；10％） (以上和光純薬社製)、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(2HPβCD；0.5%、2%、5%)、メチル−β−シクロデキストリン(MβCD；0.5%、2%、5%)（以上、日本食品加工株式会社製）
＜操作方法＞
37℃にインキュベートされたR-1;500μlとR-2;500μlを混合し、37℃-２分加温し吸光度を測定し（A0）、10μlの過酸化水素500μMもしくは蒸留水を添加した。37℃に加温し過酸化水素添加後正確に５分後に吸光度を測定し（A1）を測定し、吸光度変化ΔA（A1-A0）を計算した。吸光度は色素にDA64を用いた場合には750nm、DA67を用いた場合には660nm、４-AA-TOOSを用いた場合には570nmを測定した。
測定は試薬調製直後、試薬を37℃で２日、９日保存して蒸留水を測定した場合のブランク及び過酸化水素の感度を測定した。
表２−１、及び表２−２にブランクと酵素反応の検出に使用する色素の保存の関係を示す。表２−１、及び表２−２から判るように金属塩及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリンにブランクを抑える効果が確認された。また過酸化水素500μMを測定した場合の該色素と金属塩及び該色素とシクロデキストリン濃度と保存の関係を表３に示す。金属塩は表２−２よりブランク上昇は認められなかったが、表３より過酸化水素の感度そのものが出なくなっていた。また、表３よりシクロデキストリン0.5％以上の濃度で該色素の安定化効果が認められた。【０１２０】
【表２−１】
0005131955.tif 000003
【０１２１】
【表２−２】
0005131955.tif 000004
【０１２２】
【表３】
0005131955.tif 000005
【０１２３】
［実施例１４］シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬に及ぼすカタラーゼ添加効果
＜試薬＞
１）R−1  色素含有試薬
200mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
200μM  ＤＡ67（和光純薬社製）
2％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製）  
±500U/ml  カタラーゼ（和光純薬社製）
２）R−2  パーオキシダーゼ含有試薬
200mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10U/ml  パーオキシダーゼ(シグマ社製)
0.05％  アジ化ナトリウム（和光純薬社製）
＜操作方法＞
実施例１３に同じ。測定は試薬調製直後、試薬を37℃で２日、９日
保存して蒸留水を測定した場合のブランク及び過酸化水素の感度を測定した。結果は表４に示す。表４から判るようにカタラーゼの添加により保存時のブランクが有意に低下し、酵素反応の検出に使用する色素の安定性も上昇した。【０１２４】
【表４】
0005131955.tif 000006
【０１２５】
［実施例１５］シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬に及ぼす緩衝剤濃度の効果
＜試薬＞
１）R−1  色素含有試薬
50mM、80mM、100mM、200mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10μＭ  DA67（和光純薬社製）
2％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製）
4000U/ml  トヨチームNEP（東洋紡績社製）
500U/ml  カタラーゼ（和光純薬社製）
1％  サルコシネートLN（日光ケミカルズ社製）
２）R−2  パーオキシダーゼ含有試薬
50mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
78U/ml  パーオキシダーゼ(シグマ社製)
26U/ml  カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来KAOD（旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）
0.05％  アジ化ナトリウム（和光純薬社製）
＜操作方法＞
自動分析計（日立7170S型自動分析計；日立製作所）を用いて測定を行った。試料20μlに試薬R-1  180μlに添加し、37℃に保温し主波長660nm、副波長700nmの吸光度変化を測定した。５分後、試薬R-2  45μlに添加し、37℃に保温し主波長660nm、副波長700nmの吸光度変化を測定した。また、試料にはHbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS
HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製  レベル１；135g/L-4.04%とレベル５；132g/L-12.63%）の30倍希釈品を用いた。
測定は試薬調製直後、試薬を37℃で２日、４日、６日保存してレベル５の感度−レベル１の感度を計算した。
結果は表５に示す。表５から判るように緩衝剤の濃度80mM以下で、有意に酵素反応の検出に使用する色素の安定性が上昇した。【０１２６】
【表５】
0005131955.tif 000007
【０１２７】
［実施例１６］シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬（HbA1c用）
＜試薬＞
１）R−1  色素含有試薬
50mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
10μＭ  DA67（和光純薬社製）
2％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製）
4000U/ml  トヨチームNEP（東洋紡績社製）
500U/ml  カタラーゼ（和光純薬社製）
1％  サルコシネートLN（日光ケミカルズ社製）
２）R−2  パーオキシダーゼ含有試薬
50mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
78U/ml  パーオキシダーゼ(シグマ社製)
26U/ml  カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来KAOD（旭化成ファーマ社製、
特開2004-275013号公報に製法記載）
0.05％  アジ化ナトリウム（和光純薬社製）【０１２８】
［実施例１７］シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬（ＧＡ用）
１）R−1  タンパク質分解試薬
50mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.0
10μＭ  DA67（和光純薬社製）
2％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製）
10％  DMSO
１0000U/ml  Bacillus licheniformis由来プロテアーゼ（シグマ社製）
(DEAE-セファロース樹脂で精製、脱塩したものを使用)
500U/ml   カタラーゼ（和光純薬社製）
２）R−2  糖化アミノ酸検出試薬
50mM  トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
5％  ソルビトール
20U/ml  KAOD（旭化成ファーマ社製）
5U/ml  パーオキシダーゼ(シグマ社製)
0.05%  アジ化ナトリウム【０１２９】
［実施例１８］ヘモグロビンA1cの測定、ヘモグロビンＡ１ｃ割合の計算及び試薬の安定性実施例１６の試薬を用いて試料を測定した。
＜試料＞
１）HbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製）30倍希釈品
＜ヘモグロビンA1c測定試薬の反応手順＞
自動分析計（日立7170S型自動分析計；日立製作所）を用いて測定を行った。試料20μlに試薬R-1 180μlに添加し、37℃に保温した。試料添加５分後、試薬R-2 45μlに添加し、37℃に５分間保温した。吸光度の測定はR-2試薬添加直前（A1）及び添加５分後（A2）に主波長660nm、副波長700nmを測定した。また、測定値はHbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2 福祉・医療技術振興会製  レベル１；ヘモグロビン濃度135g/L、HbA1c値4.04%とレベル５；ヘモグロビン濃度132g/L、HbA1c値12.63%）をキャリブレーターとして使用し値を換算した。ヘモグロビンの定量はA1で行い、HbA1cの定量はA2-A1より計算した。
ヘモグロビン及びHbA1cの検量線を図５及び図６に示す。図５、図６より明らかなように本発明における酵素反応の検出に使用する色素の安定化方法を用いてヘモグロビンA1c、及びヘモグロビンの定量が可能であった。ヘモグロビンA1c、及びヘモグロビンの定量が可能であることからヘモグロビンA1ｃ割合の計算が可能であることは明白である。
さらに本試薬を液体状態で37℃４日間保存した結果、１次キャリブレーター  JDS HbA1c Lot2のレベル３（ヘモグロビン濃度145g/L、HbA1c値 7.32%）の３０倍希釈品のヘモグロビン定量値は保存試験前（40mAbs 、4.8g/L）であり、保存試験後（38mAbs 、4.7g/L）であった。またHbA1cの計算値は保存試験前（7.2%）であり、保存試験後（7.3%）であった。また冷蔵保存３ヶ月のデータでは測定値に差は見られなかった。これらの結果より本試薬は冷蔵で６ヶ月以上安定であると推定された。【０１３０】
［実施例１９］グリコアルブミンの測定、グリコアルブミン割合の計算及び試薬の安定性
＜グリコアルブミン測定試薬の反応手順＞
実施例１７の試薬を使用した。37度にインキュベートされたR-1;240μlにコントロール血清H（株式会社BML社製；用法に基づき調製し５段階に蒸留水で希釈した。）8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前及び添加5分後の吸光度、主波長660nm、副波長700nmを測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いた△A0を算出した。値の換算はルシカGA用キャリブレーター（旭化成ファーマ社製）を同時に測定し吸光度を比較して行った。アルブミンの測定はアクアオートカイノス  ＡＬＢ試薬（カイノス社製）を用いて試薬の用法容量に従い測定を行った。５段階希釈した管理血清の測定値を図７に示す。図７から分かるように本試薬を用いてアルブミン、グリコアルブミンを定量し、グリコアルブミン値（％）を良好に測定することが出来た。
さらに本試薬を液体状態で37℃４日間保存した結果、コントロール血清L（株式会社BML社製；希釈なし）を測定したところ、GA測定の感度は150mAb、GA値18.3%であり、保存後はGA測定の感度は146mAb、GA値18.2%であった。これらの結果より本試薬は冷蔵で６ヶ月以上安定であると推定された。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明における測定用試薬及び測定方法は臨床検査に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】本発明の実施例９に基づくヘモグロビンの測定結果である。
【図２】本発明の実施例１０に基づくヘモグロビンＡ１ｃの測定結果である。
【図３】本発明の実施例１０に基づくヘモグロビンの測定結果である。
【図４】本発明の実施例１２に基づく糖化アルブミンの測定結果である。
【図５】本発明の実施例１８に基づくヘモグロビンA1cの検量線である。
【図６】本発明の実施例１８に基づくヘモグロビンの検量線である。
【図７】本発明の実施例１９に基づくグリコアルブミンの測定結果である。  図中、クローズド□はアルブミン濃度を示し、クローズド菱形はグリコアルブミン濃度を示し、クローズド△はグリコアルブミン値を示す。
【図１】
0005131955.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005131955.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
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