(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の角層の赤外吸収スペクトルを測定して角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）量を測定する方法であって、角層の赤外吸収スペクトルから１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ、および前記赤外吸収スペクトルから蛋白質由来の信号強度Ｂを観測する工程と、前記信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出する工程とを含み、該信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を測定する方法。
【請求項２】
前記信号強度Ａとして、１６１０〜１５８０ｃｍ-1の波数領域の信号強度Ａ１を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記信号強度Ａとして、１６１０〜１５９０ｃｍ-1の波数領域の信号強度Ａ１１を用いる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
更に、前記角層の赤外吸収スペクトルから１５９０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ１２を観測し、前記信号強度Ａ１１及び信号強度Ａ１２各々から抽出したカルボシキレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ１１’及びＡ１２’の和を前記信号強度Ａ’として用いる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
天然保湿因子ＮＭＦと蛋白質とを含む試料における蛋白質質量当たりの天然保湿因子ＮＭＦ量と、当該試料の１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域におけるカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度とから予め検量線を作成しておき、該検量線を用いて、前記信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層単位蛋白質質量当たりの天然保湿因子ＮＭＦ量を求める、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記信号強度Ａ’を抽出する工程が、カーブフィッティング法によって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記信号強度Ａ１１’及び／又はＡ１２’を抽出する工程が、カーブフィッティング法によって行われる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記信号強度Ａ’を抽出する工程が、天然保湿因子ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトルと測定対象の角層のＩＲスペクトルとの差スペクトルを求めることによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記信号強度Ｂが、１７００〜１６２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩ吸収帯および／または１５６０〜１５２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩＩ吸収帯における赤外吸収スペクトルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤外吸収スペクトルを用いて、皮膚の角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品類、皮膚洗浄料等の販売において、顧客に最も適した化粧品を推奨するために、顧客の皮膚の水分・油分・色調・形態等を店頭で測定するサービスが広く行われている。また、こういった化粧品類や皮膚洗浄料の研究開発の過程においても、肌の状態を機器計測により指標化することは、より効果の高い化粧品、皮膚洗浄料等の開発の上で必要不可欠のものとなっている。そのため、皮膚の水分・油分・色調・形態等を評価するための種々の技術開発が行われてきており、これに関係した多数の特許が今までに取得されている。
【０００３】
化粧品及び皮膚洗浄料の販売や化粧品及び皮膚洗浄料開発等において重要な肌性状の評価指標の一つとして、角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）量が知られている。ＮＭＦは、角層中の水溶性保水成分（アミノ酸類、有機酸類、無機塩類等）の総称である。皮膚は、蛋白質・脂質・ＮＭＦ等で構成されている。従来、ＮＭＦ測定法として、角層を剥離後に抽出して液体クロマトグラフで分析することが知られていた。しかし、この方法は侵襲的であり、また、その場で結果を得ることができないため、店頭での応用使用や、研究開発における多数の評価試料の測定には不向きであった。
【０００４】
液体クロマトグラフ以外の方法で角層中のＮＭＦ量の増減（相対量）を測定した例がある（例えば、非特許文献１参照）。この方法は、剥離角層の顕微ＩＲ−透過測定に基づくものであり、ＮＭＦの相対量を求めることができる。非特許文献１には、ＮＭＦを構成する化学種（アミノ酸類、ピロリドンカルボン酸、乳酸塩など）の多くがカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）を有するため、この信号強度を見積もることにより、角層中のＮＭＦ量の変化を評価できることが記載されている。このことについて、図１を参照しながら説明する。図１は、皮膚の典型的なＩＲ−ＡＴＲ（赤外減衰全反射）スペクトルである。図１に示すように、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）に関するピークとしては、１４０４ｃｍ-1付近の波数領域に、カルボキシレートアニオンの対称伸縮振動を示す信号強度が出現する。そのため、非特許文献１に記載された方法では、この１４０４ｃｍ-1付近の波数領域における信号強度を用いて測定を行っている。
【０００５】
しかしながら、１４０４ｃｍ-1付近の波数領域に出現しているピークは、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）の対称伸縮振動だけではなく、主に皮脂に由来するＣ−Ｈ変角振動が重畳したものである。そのため、皮脂量が増減すると計測値が大きく変動し、正確にＮＭＦ量を測定することができないという問題があった。そのため非特許文献１では、ＩＲスペクトル測定前に試料のヘキサン洗浄を行う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Guojin  Zhang  et  al．，“Vibrational  Microspectroscopy  and  Imaging  of  Molecular  Composition  and  Structure  During  Human  Corneocyte  Maturation”，Journal  of  Investigative  Dermatology（2006）Vol．126，p．1088−1094
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、角層中のＮＭＦ量を皮脂の影響を受けることなく精度良く測定することができる、角層中のＮＭＦ測定法を提供することを目的とする。また、角層中のＮＭＦ量を非侵襲的に簡便に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
通常、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）に関する信号強度としては、カルボキシ基対称伸縮振動を示す１４０４ｃｍ-1付近の他にも、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を示す信号強度が存在する。しかしながら、図１に示すように、皮膚の角層中のＮＭＦ測定する場合には、皮膚の蛋白質に由来する１７００〜１６２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩ吸収帯および１５６０〜１５２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩＩ吸収帯に強い吸収ピークが存在するため、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を示す１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度がアミド吸収ピークの谷間に埋もれてしまい、ピークとしては観測されず、従来の方法では定量的に取り扱うことができない。
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、皮膚の角層のＩＲスペクトル中における、強い二本のアミド吸収ピークの谷間に埋もれてピークとしては観測されないカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）の信号強度を数値処理によって抽出することにより、皮脂の影響を受けずに角層中のＮＭＦ量を定量的に精度良く測定できることを見出した。本発明は、このような知見に基づきなされるに至ったものである。
【００１０】
本発明は、皮膚の角層の赤外吸収スペクトルを測定して角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）量を測定する方法であって、角層の赤外吸収スペクトルから１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ、および前記赤外吸収スペクトルから蛋白質由来の信号強度Ｂを観測する工程と、前記信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出する工程とを含み、該信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を測定する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、角層中のＮＭＦ量を正確に、迅速・簡便に測定することができる。特に、非侵襲的な測定方法において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】皮膚の典型的なＩＲ−ＡＴＲスペクトルである。
【図２】皮膚からの水抽出物のＩＲ−ＡＴＲスペクトルとモデルＮＭＦ水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルである。
【図３】１８００〜８００ｃｍ-1の波数領域における皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを２８個のガウス関数の重ね合わせでフィッティングした結果を示す図である。
【図４】ＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおける１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量との関係を示す図である。
【図５】ＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおける１６０５ｃｍ-1での信号強度と１５７４ｃｍ-1での信号強度との和と、アミドＩの信号強度との信号強度比と、単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量との関係を示す図である。
【図６】ＮＭＦとＢＳＡの混合物のＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるＮＭＦとアミドＩの信号強度比と、ＢＳＡ換算蛋白質あたりのＮＭＦ量との関係を示す図である。
【図７】前腕皮膚を市販食器用洗剤で洗浄・乾燥した前後の、皮膚ＩＲ−ＡＴＲスペクトルである。
【図８】ＮＭＦを含む皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルとＮＭＦを含まない皮膚ＢのＩＲ−ＡＴＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法では、皮膚の角層の赤外吸収スペクトルを測定する。測定は、皮膚から角層を採取して赤外吸収スペクトルを測定する方法（侵襲法）や、皮膚から直接赤外吸収スペクトルを測定する方法（非侵襲法）等が挙げられるが、直接肌の状態を測定できる非侵襲法が好ましい。非侵襲法としては、光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲ測定法乃至ＩＲ−ＡＴＲ測定法などが挙げられるが、本発明はこれに限定されない。ＩＲ−ＡＴＲ測定は、例えば、ＰＩＲ光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲプローブ（システムズエンジニアリング社製）を用いて行うことができる。
【００１４】
本発明では、角層の赤外吸収スペクトルから１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ、および前記赤外吸収スペクトルから蛋白質由来の信号強度Ｂを観測する工程と、前記信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出する工程とを含む。
【００１５】
１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における赤外吸収は、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基を表す。）の逆対称伸縮振動の情報を含むものである。より詳細には、１６１０〜１５８０cm-1に出現するのは主にアミノ酸類のカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動で、１５９０〜１５７０cm-1に出現するのは主に有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動である。しかし、カルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動の情報は、蛋白質由来の強い二本の吸収ピーク（アミドＩおよびアミドＩＩ）の谷間に存在するために、角層のＩＲスペクトル中ではピークとしては観測されない。このため、通常の方法では定量的に取り扱うことができず、これまでこの１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収をＮＭＦ量の測定に使用することは容易に想到し得なかった。これに対して、本発明では、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出することで、油脂成分の影響をほとんど受けないＮＭＦ情報を得ることができる。
ここで、本発明における「有機酸類」とは各層中にＮＭＦとして存在するものであれば特に制限はなく、例えば、乳酸塩、クエン酸塩、ピロリドンカルボン酸等が挙げられる。
【００１６】
本発明を更に詳細に説明する。
第一の実施態様として、上記波数領域のうち、１６１０〜１５８０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１を観測し、これを用いてカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出することにより角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を精度よく測定することが出来ることができる。そして、上記波数領域のうち、１６１０〜１５９０cm-1の波数領域の信号強度Ａ１１を用いると、より精度よく測定することができる。
また第二の実施態様として、１６１０〜１５９０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１１と１５９０〜１５７０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１２を観測する。信号強度Ａ１１及び信号強度Ａ１２各々から抽出したカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ１１’及びＡ１２’の和を信号強度Ａ’とする。当該信号強度Ａ’を用いることによって、アミノ酸類のカルボキシレートアニオン由来の逆対称伸縮運動の信号と共に有機酸類のカルボキシレートアニオン由来の逆対称伸縮振動の信号強度を観測することができる。そのため、更に高い精度でＮＭＦ量を測定することが可能となる。
【００１７】
本発明において観測される信号強度Ｂは、蛋白質由来の吸収帯における赤外吸収スペクトルであればいかなるものを使用してもよいが、アミドＩ吸収帯（１７００〜１６２０ｃｍ-1の波数領域）および／またはアミドＩＩ吸収帯（１５６０〜１５２０ｃｍ-1の波数領域）由来の吸収信号を使用することが好ましい。
【００１８】
本発明では、皮膚のＩＲスペクトル中のカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動の信号強度を数値処理によって算出する。逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）を抽出する手段としては特に限定されないが、カーブフィッティング法、差スペクトル法、スペクトル合成法を好ましく適用することができる。
【００１９】
（１）カーブフィッティング法
カーブフィッティング法は、皮膚の角層のＩＲスペクトルを、適切な関数の重ね合わせで表現し、各信号成分の寄与を定量的に見積もる方法である。カーブフィッティング法を用いることにより、各成分の吸収バンドを分離し、各々の吸収バンドの正確な位置や面積を計算することができる。カーブフィッティング法に用いられる関数形としては、ガウス関数、ローレンツ関数、フォークト関数等が挙げられる。皮膚は蛋白質・脂質・ＮＭＦ等で構成されており、そのＩＲスペクトルはきわめて複雑であるが、適切な関数（例えばガウス関数）の重ね合わせで、そのスペクトル形状を良く表現することが可能である。
実際にカーブフィッティングを行うには、市販の数値解析ソフトを使用してもよいし、専用ソフトを作成してもよい。
市販ソフトとしては、例えばＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ６．０（株式会社ヒューリンクス）やＯｒｉｇｉｎ８．０（株式会社ライトストーン）が利用できる。例えば分光学の分野で現在広く普及しているＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ６．０では、回帰分析  （カーブフィッティングと同じ）用の組み込み回帰関数として、線形、多項式、サイン、指数、二重指数、ガウス、ローレンツ、ヒルの微分方程式、シグモイド、ログノーマル、ガウス  ２Ｄ  （２次元ガウスピーク）、多項式  ２Ｄ  （２次元多項式）が用意されている。解析したいＩＲスペクトルをＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ６．０に読み込み、スペクトル形状を最も良く表現できる波数位置に任意の関数（例えばガウス関数）を必要な個数だけ配置し、固定するパラメーター（例えばピーク位置やピーク幅等）と、可変とするパラメーター（例えばピーク高さ）を指定する。その後に回帰分析機能を実行すれば、関数の重ね合わせにより合成したスペクトルと、実測のＩＲスペクトルの各データ点における、二乗誤差の総和が最小になる可変パラメーター値群を本ソフトは出力してくれる。
専用ソフトを作成する場合は、例えば代表的なプログラミング言語であるＶｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ６．０やＶｉｓｕａｌ  Ｃ＋＋上で作成することができる。解析したいＩＲスペクトル形状を、上記市販ソフトの場合と同様に、ガウス関数のような非線形関数の重ね合わせで最小二乗近似するソフトを記述することになる。最小二乗近似法としては、例えば最小二乗Ｔａｙｌｏｒ微分補正法を用いることで、関数の重ね合わせにより合成したスペクトルと、実測のＩＲスペクトルの各データ点における二乗誤差の総和が最小になる可変パラメーター値群を算出することができる。最小二乗Ｔａｙｌｏｒ微分補正法のプログラミング方法については、以下の書籍を参考にすれば実行することができる。
「科学計測のための波形データ処理」，南  著，ＣＱ出版社
「最小二乗法による実験データ解析」，中川，小柳  著，東京大学出版会
“Numerical  Recipes  in  C”  by  H．w．Press，S．A．Teukolsky，W．T．Vetterling，and  B．P．Flannery，Cambrige  University  Press（１９８８）
邦訳：「Ｃ言語による数値計算のレシピ」、技術評論社
上述のように市販ソフト、あるいは作成した専用ソフトを用いることにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける各々の吸収バンドの、正確な面積を計算することができる。このようにして得られた各吸収バンド面積のうち、蛋白質由来の吸収バンドの面積を蛋白質由来の信号強度Ｂとし、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動由来の吸収バンドの面積をカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とすることができる。
【００２０】
（２）差スペクトル法
差スペクトル法は、測定対象の角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含む皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）から、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含まない皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）を差し引くことにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける、ＮＭＦの信号強度を見積もる方法である。角層中のＮＭＦを除去する方法としては、例えば、皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの混合溶媒等）を接触させた後に水に接触させることにより行うことが挙げられる。
スペクトルの差し引きを行う前に、差し引きに用いる２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）の吸光度表示での信号強度を、ＮＭＦの影響を受けない吸収ピークの強度を基準に規格化しておくことが必要である。ＮＭＦの影響を受けない吸収ピークとしては蛋白質に特徴的な吸収が好ましく、その中でも特に特徴的な吸収であるアミドＩまたはアミドＩＩの吸収ピーク強度を基準とするのが最も好ましい。
例えばアミドＩを基準とする場合であれば、例えば１８００ｃｍ-1〜１６００ｃｍ-1における最大値と最小値が、それぞれ１．５および０になるように、差し引きに用いる２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）の吸光度を規格化し、その後に差分スペクトル（測定対象の角層の規格化後のスペクトル―ＮＭＦを除去した角層の規格化後のスペクトル）の算出を行うことになる。差分の算出は一般的なＩＲスペクトルの解析ソフト（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のＯＭＮＩＣソフトウェア）の機能により求めることができる。
このようにして得られた差分スペクトルにおける、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域に出現する各信号の強度を、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とし、規格化後の２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）のいずれかにおける蛋白質由来の吸収バンドの面積を蛋白質由来の信号強度Ｂすることができる。
【００２１】
（３）スペクトル合成法
スペクトル合成法は、測定対象の角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含む皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）を、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含まない皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）と、ＮＭＦのＩＲスペクトルの重ね合わせで近似することにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける、ＮＭＦの信号強度を見積もる方法である。角層中のＮＭＦを除去する方法としては、例えば、皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの混合溶媒等）を接触させた後に水に接触させることにより行うことが挙げられる。このとき抽出された水溶液の乾固物のＩＲ−ＡＴＲスペクトル、あるいは水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルより水の信号を差し引いた差スペクトルを、ＮＭＦのＩＲスペクトルとみなすことができる。あるいは角層のＮＭＦ組成を模した組成を有す混合物（アミノ酸、有機酸等で構成）のＩＲ−ＡＴＲスペクトル、あるいは本モデルＮＭＦの水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルより水の信号を差し引いた差スペクトルを、ＮＭＦのＩＲスペクトルとみなすことができる。
このようにして得られた、測定対象の角層のＩＲスペクトルを、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトルとＮＭＦのＩＲスペクトルで合成・近似することになる。
ここで
測定対象の角層のＩＲスペクトル＝α×（ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル）＋β×（ＮＭＦのＩＲスペクトル）
とし、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を含む波数領域において、測定対象の角層のＩＲスペクトルを最も良く表現するαとβの組み合わせを求めることになる。計算に適した波数領域としてはアミドＩ、アミドＩＩ、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号を含む１８００〜１４５０ｃｍ-1を有していることが好ましい。
最適なα、βの算出法としては、上述のような市販の数値解析ソフトを使用してもよいが、一般的な表計算ソフト（例えばマイクロソフト社のエクセル）のソルバー機能を用いても簡単に算出することができる。この場合、α、βの関数として得られる合成スペクトルと測定対象の角層のＩＲスペクトルとの間で、各波数データ点ごとに差分値を算出する。そして、この差分値の二乗値を全データ点で積分した値が最小値を示すように、ソルバー機能を用いてα、βを最適化すればよい。このようにして得られたパラメーターβをカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とし、パラメーターαを蛋白質由来の信号強度Ｂすることができる。
【００２２】
本発明において、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）を抽出した後、信号強度Ａ’と前記の観測された蛋白質由来の信号強度Ｂとの比から、角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を測定する。このとき、角層中におけるＮＭＦの絶対量を精度良く測定するために、ＮＭＦと蛋白質とを含む試料における蛋白質質量当たりのＮＭＦ量と、当該試料の１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域におけるカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度とから作成した検量線を用いて、前記信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層単位蛋白質質量当たりの天然保湿因子ＮＭＦ量を求めることが好ましい。
【００２３】
検量線の作成法としては、例えば、以下の（１）又は（２）に示す方法が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
（１）採取した皮膚角層を用いた検量線の作成法
ヒト皮膚のＩＲ−ＡＴＲ測定を行った後に、該皮膚より角層を採取し、該角層中のＮＭＦ量（アミノ酸類、及び乳酸塩、ピロリドンカルボン酸等の有機酸類）および蛋白質量を液体クロマトグラフ等により測定して、両者の比から蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を求める。次いで、上記ヒト皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるカルボキシレートアニオンの信号強度（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）と蛋白質の信号強度との比と、蛋白質質量あたりのＮＭＦ量との関係の検量線を得る。
【００２４】
（２）モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いた検量線の作成法
アルブミンのようなモデル蛋白質とモデルＮＭＦ（アミノ酸類、及び乳酸塩、ピロリドンカルボン酸等の有機酸類単品又はこれら２種以上の組合せの混合物）との混合物を調製し、該混合物のモデル蛋白質とモデルＮＭＦとの混合比と、該混合物のＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるカルボキシレートアニオンの信号強度（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）と蛋白質の信号強度との比の関係の検量線を得る。
【００２５】
本発明によれば、角層中のＮＭＦ量を正確に、迅速・簡便に測定することができる。特に、非侵襲的な測定方法において有用である。本発明の方法は、化粧品、皮膚洗浄料等の販売における店頭でのＮＭＦ測定や、化粧品、皮膚洗浄料等の研究開発における多数の評価試料のＮＭＦ測定などに好ましく応用することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
本実施例においては、ＩＲ測定を以下の装置構成にて行った。
（１）ＦＴＩＲ（Ｎｉｃｏｌｅｔ３８０、商品名、サーモサイエンティフィック社製）
（２）光ファイバカップリングユニット（ＦｉｂｅｒＭａｔｅ、商品名、システムズエンジニアリング社製）
（３）ＰＩＲ光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲプローブ（システムズエンジニアリング社製）
（４）装置制御・データ処理用コンピュータ
【００２８】
参考例
皮膚のＩＲスペクトルにおける１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収がＮＭＦに由来するものであることを確認するために、以下の測定を行った。
１）皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルとの１：１混合溶媒、体積比）を３０分接触させる。
２）有機溶媒を除去後、皮膚を乾燥させる。
３）該有機溶媒処理部に、水を３０分間接触させる。
４）水抽出液を乾燥・濃縮し、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定する。
【００２９】
さらに、下記表１に示す組成を持つモデルＮＭＦ水溶液を調製し、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。
【００３０】
【表１】
0005250441.tif 000002
【００３１】
皮膚からの水抽出物のＩＲ−ＡＴＲスペクトル及びモデルＮＭＦ水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを図２に示す。水抽出物のスペクトルの特徴として以下のことが言える。
１）脂質に特徴的な鋭いアルキル鎖のＣＨ伸縮振動（２９００ｃｍ-1付近に出現）のピークが存在しない。
２）蛋白質に特徴的なアミドＩ（１６５０ｃｍ-1付近）とアミドＩＩ（１５４０ｃｍ-1付近）の二本の組み合わせのピークが存在しない。
３）アミノ酸や有機酸に特徴的なカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動（１６００ｃｍ-1付近）とカルボキシレートアニオン対称伸縮振動（１４０５ｃｍ-1付近）が出現している。
４）ＣＨ伸縮振動（２９００ｃｍ−１付近に出現）の強度に比較して、ＣＨ変角振動（１４００ｃｍ-1付近に出現）の強度が強いことが、鎖状アルキル骨格由来でないＣＨ基の存在を示唆している。
皮膚角層の主要構成成分が、蛋白質、ＮＭＦ、脂質であることを考慮すると、本水抽出物は主としてＮＭＦで構成されていることが強く支持される。実際に上記特徴は、モデルＮＭＦ水溶液のスペクトルの特徴とも一致しており、皮膚のＩＲスペクトルにおける１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収がＮＭＦに由来するものであることが確認できた。
【００３２】
実施例１
（１）皮膚の角層の赤外吸収スペクトルの測定
前記の構成の装置を用いて、ヒトの前腕皮膚のＩＲ測定を行った。通常ＩＲ−ＡＴＲ測定の分析深さは１μｍ程度であり、これは一般的なヒト皮膚の角層（約１５μｍ）よりも十分に浅い。そのため本装置構成で得られる皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルは、角層のＩＲ−ＡＴＲスペクトルとみなすことができる。
【００３３】
（２）カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度の抽出
得られたＩＲスペクトルにおいて、１６１０〜１５８０ｃｍ-1の波数領域における信号強度及び１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａから、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度をカーブフィッティング法によって抽出した。２８個のガウス関数のピーク位置を下記表２に示した位置にそれぞれ固定した後に、ピーク幅を皮膚スペクトル形状に合わせて適宜調整し、その後ピーク高さのみを可変パラメータとして、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルに対して、最小二乗法によりフィッティングした。図３に、１８００〜８００ｃｍ-1の波数領域における皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを２８個のガウス関数の重ね合わせでフィッティングした結果を示す。
【００３４】
【表２】
0005250441.tif 000003
【００３５】
（３）蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度の算出
前記表２中のピーク番号３、４、５の面積和（アミドＩ吸収帯の信号に相当）を蛋白質
の信号強度とした。また、前記表２中のピーク番号６の面積（アミノ酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動および有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動の一部に相当）、または前記表２中のピーク番号６とピーク番号７の面積の合計（アミノ酸類および有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動に相当）をＮＭＦの信号強度とした。図３における両者の比から、蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度を算出した。
【００３６】
（４）皮膚角層を用いた検量線の作成
（４−１）１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和と、アミドＩの信号強度との信号強度比の算出  別途、検量線を作成するために、以下の測定試料についてＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。
＜測定試料＞ヒト（０歳〜４０代の合計５３名）の腹部、大腿部、臀部、腰部の皮膚
＜測定条件＞光ファイバ型ＩＲプローブを皮膚に約１０秒間押し当てて２０００〜５００ｃｍ-1の波数領域のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。
各測定試料について、得られたＩＲスペクトルについて前記カーブフィッティング法を適用し、１６０５ｃｍ-1（前記表２中のピーク番号６）の信号強度とアミドＩ吸収帯（前記表２中のピーク番号３、４、５）の信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩ吸収帯の信号強度との信号強度比とをそれぞれ求めた。
【００３７】
（４−２）単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量の算出
各測定試料について、上記ＩＲ−ＡＴＲスペクトルの測定後に、同測定部位の角層をＰＰＳ（ポリフェニレンサルファイド）テープを用いて採取した。
角層を剥離したテープの一部を溶媒（メタノールと水との混合溶媒、体積比１：１）に浸漬させ、抽出液を液体クロマトグラフで測定し、アミノ酸、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸とこれらの総量（ＮＭＦ量）を求めた。また、角層を剥離したテープの残りの部分を溶媒（硫酸ドデシルナトリウムを含んだ塩酸水溶液）に浸漬させ、水酸化ナトリウム水溶液で中和した後にビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により抽出液を呈色させて吸光度を測定し、角層内の蛋白質の質量を求めた。
測定したＮＭＦ量を、測定した蛋白質の質量で除すことにより、単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出した。
【００３８】
（４−３）検量線の作成
各測定試料について、上記（４−１）項で求めた１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、上記（４−２）項で求めた単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量とをプロットして、検量線を作成した。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、ＮＭＦ量との間に良好な線形性があることがわかった。したがって、図４の検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、角層中の単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
【００３９】
また、各測定試料について、上記（４−１）項で求めた１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比と、上記（４−２）項で求めた単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量とをプロットして、検量線を作成した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比と、ＮＭＦ量との間に良好な線形性があることがわかった。したがって、図５検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、角層中の単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
【００４０】
（５）モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いた検量線の作成
さらに別途、モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いて検量線を作成した。角層を構成する主要な蛋白質はケラチン、フィラグリン、インボルクリン等であるので、モデル蛋白質としてはこれらの混合物を用いることが最も好ましい。しかしこれらの蛋白質の標品はきわめて高価であり、標品の混合物を検量線作成に用いることは現実的ではない。そこで代替の角層モデル蛋白質として、安価に入手可能な牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。ＢＳＡも角層蛋白質と同様に、アミドＩおよびアミドＩＩの強い吸収帯を示すため、ＢＳＡとモデルＮＭＦ混合物を用いれば、ＢＳＡ換算での検量線を得ることができる。
【００４１】
前記表１に示す組成を持つモデルＮＭＦを調製し、次いで、ＢＳＡとモデルＮＭＦとの混合水溶液を、混合比（質量％）を様々に変更して調製した。これらの混合水溶液について、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルの測定後、水のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを差し引いた後に、前述のカーブフィッティング解析を行い、１６０５ｃｍ-1（前記表２中のピーク番号６）の信号強度とアミドＩ吸収帯（前記表２中のピーク番号３、４、５）の信号強度との信号強度比を算出した。
【００４２】
各測定試料について、上記で求めた１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、モデルＮＭＦとＢＳＡとの混合質量比（単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量）とをプロットして、検量線を作成した。結果を図６に示す。
図６から明らかなように、１６０５ｃｍ-1の信号強度とモデルＮＭＦ量との間に良好な直線関係があることがわかった。したがって、図６の検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
【００４３】
（６）角層中のＮＭＦ量の測定
上述のようにして、ヒトの前腕皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した後、カーブフィッティング法を適用して１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比を、それぞれ算出した。その後、前述の１６０５ｃｍ-1の信号強度または１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和に基づく検量線（（４）で得られた角層単位蛋白質質量当たりのＮＭＦ量の算出用検量線、並びに（５）で得られたＢＳＡ換算蛋白質質量当たりのＮＭＦ量の算出用検量線）を用いて、角層中のＮＭＦ量を測定した。
また、同様にして、前記前腕皮膚を市販食器用洗剤で洗浄・乾燥した後のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定し、角層中のＮＭＦ量を測定した。
１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比を用いて算出したＮＭＦ量の結果を表３に、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比を用いて算出したＮＭＦ量の結果を表４に示す。また洗浄処理前後の皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを図７に示す。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
表３及び表４の結果から明らかなように、食器用洗剤を皮膚に接触させることで、角層表層のＮＭＦ量が低下することが定量的に測定できた。また表３及び表４の角層内蛋白質質量あたりのＮＭＦ質量はほぼ同様の結果を示しており、１６０５ｃｍ-1の信号強度を用いても、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和を用いても、それぞれの検量線に従って同様のＮＭＦ量を測定することができることがわかった。したがって、本発明の方法によれば、日常のＮＭＦ量の変動を敏感に把握できることがわかった。このような評価は、食器用洗剤や皮膚洗浄料の皮膚へのマイルド性の評価等に、非常に有用である。
【００４７】
実施例２
実施例１におけるカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度の抽出について、カーブフィッティング法を下記の差スペクトル法に代えたこと以外は実施例１と同様にして角層中のＮＭＦ量の測定を行ったところ、実施例１と同様に、皮膚の角層中のＮＭＦ量を相対的に定量測定できることがわかった。
【００４８】
（差スペクトル法）
ＮＭＦを含む皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、ＮＭＦを含まない皮膚ＢのＩＲ−ＡＴＲスペクトルを差し引くことにより、皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるＮＭＦの信号強度を算出した。
ＮＭＦを含まない皮膚の調製は以下のように行った。
１）皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの１：１混合溶媒）を３０分接触させる。
２）有機溶媒を除去後、皮膚を乾燥させる。
３）該有機溶媒処理部に、水を３０分間接触させる。
４）水を除去後、皮膚を乾燥させる。
以上の処理により、角層表層部のＮＭＦを完全に取り除くことができる。
処理前の皮膚である皮膚ＡおよびＮＭＦを含まないよう調製した（処理１）〜４）を施した）皮膚である皮膚Ｂのスペクトルを図８に示す。皮膚Ａおよび皮膚Ｂのスペクトル中の、アミドＩのピーク強度が一致するように皮膚Ｂのスペクトル強度に対して定数を乗じ、その後、皮膚Ａのスペクトルより皮膚Ｂの強度補正後のスペクトルを差し引くことにより、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にピークを持つＮＭＦの信号を得た。この差スペクトル中の１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にピークを持つＮＭＦの信号強度と、皮膚Ｂの強度補正後のスペクトルの蛋白質の信号強度（例えばアミドＩ）の強度比を算出することで、皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおける、蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度を算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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