(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表される化合物又はそれらの塩。
【化１】
0005351430.tif 000016
（式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は水素である）
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を有効成分とする抗ガン剤。
【請求項３】
渦鞭毛藻であるアンフィジニウム（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＨＹＡ０２４株を培養する工程、及び培養物から請求項１に記載の化合物を回収する工程を含む、請求項１に記載の化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規マクロライド化合物、当該マクロライド化合物を有効成分とする抗ガン剤及び当該マクロライド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ガン剤と称される化合物は、その由来や化学構造を含め、極めて多岐にわたる化合物が多数開発されてきている。これは、抗ガン剤が発揮し得る副作用の存在、抗ガン剤の長期使用による薬剤耐性ガン細胞の発生、またガンの種類による薬効の相違などの理由から、常に新たな抗ガン剤の開発が現実に臨まれているからである。
【０００３】
抗ガン剤あるいはその候補化合物を提供し得る天然資源の一つに、海藻や単細胞藻類が知られている。その中でも、渦鞭毛藻が産生するアンフィジノライドと総称されるマクロライド化合物は、強力な抗腫瘍活性を有する化合物として期待されている（非特許文献１）。 しかしながら、先の理由から、依然として抗ガン剤、特に海産生物由来の抗腫瘍物質の探索ならびに開発は、常に解決すべき課題として存在している。
【非特許文献１】Ｊ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｔｅｔｅｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８６年、第２７巻、第５７５５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、渦鞭毛藻由来の優れた抗腫瘍物質を探索し、新規な抗ガン剤とそれを産生する新規渦鞭毛藻株を提供するものである。
【０００５】
本発明者らは、天然界から新規な渦鞭毛藻株を単離し、この渦鞭毛が産生する新規マクロライド化合物が腫瘍細胞増殖抑制効果を有し、抗ガン剤として利用可能であることを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００６】
１）下記一般式１、式２若しくは式３で表される化合物又はそれらの塩。
【０００７】
【化４】
0005351430.tif 000002
【０００８】
【化５】
0005351430.tif 000003
【０００９】
【化６】
0005351430.tif 000004
（式１〜３において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に水素または酸素保護基である）
【００１０】
２）１）に記載のいずれか１種以上の化合物を有効成分とする抗ガン剤。
【００１１】
３）渦鞭毛藻であるアンフィジニウム（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＨＹＡ０２４株を培養する工程、及び培養物から請求項１に記載の化合物の少なくとも一つを回収する工程を含む、請求項１に記載の化合物を製造する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマクロライド化合物はヒトの腫瘍細胞に対して優れた増殖抑制効果を有しており、新規な抗ガン剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のマクロライド化合物は、渦鞭毛藻であるアンフィジニウム（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）の新規株が産生する、抗腫瘍活性を有する化合物であり、下記式１〜式３で表される化学構造を有する。
【００１４】
【化７】
0005351430.tif 000005
【００１５】
【化８】
0005351430.tif 000006
【００１６】
【化９】
0005351430.tif 000007
（式１〜３において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に水素または酸素保護基である）
【００１７】
式１〜３の各化合物のうち、特に好ましい化合物は下記式４〜６で表される。
【００１８】
ａ）式４の化合物（式１においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は水素である化合物）
【００１９】
【化１０】
0005351430.tif 000008
【００２０】
形状：無色油状、溶解性：アルコール、クロロホルム、酢酸エチル、アセトンに可溶でヘキサン、水に不溶、分子量測定：m/z 531 (M+Na)+、1H-NMRスペクトル（600MHz、重クロロホルム中）δ 0.97 (3H, d, 6.6Hz, H3-27), 0.99 (3H, d, 6.6Hz, H3-28), 1.03 (3H, d, 6.6Hz, H3-26), 1.45 (1H, m, H-5), 1.57 (1H, m, H-5), 1.59 (1H, m, H-8), 1.66(1H, m, H-8), 1.73 (3H, brs, H3-25), 1.75 (3H, brs, H3-29), 1.86 (1H, m, H-3), 1.96 (1H, m, H-7), 1.99 (1H, m, H-3), 2.02 (1H, m, H-19), 2.05 (1H, m, 1H-19), 2.23 (1H, m, H-20), 2.32 (1H, m, H-14), 2.41 (1H, m, H-14), 2.45 (1H, m, H-16), 2.51 (2H, m, H2-2), 3.57 (1H, brs, H-10), 3.73 (1H, m, H-9), 3.93 (1H, brd, 10.0Hz, H-6), 4.03 (1H, brs, H-4), 4.33 (1H, m, H-11), 4.78 (1H, brt, 11.4Hz, H-15), 5.27 (1H, dd, 8.0, 14.6Hz, H-17), 5.44 (1H, m, H-18), 5.45 (1H, m, H-21), 5.67 (1H, dd, H-12), 5.73 (1H, m, H-13), 5.77 (1H, brd, 10.2Hz, H-23), 6.17 (1H, dd, 10.2, 14.7Hz, H-22)、13C-NMRスペクトル（150MHz、重クロロホルム中）δ 15.2 (CH3, C-26), 17.1 (CH3, C-27), 18.2 (CH3, C-25), 20.1 (CH3, C-28), 25.9 (CH3, C-29), 30.0 (CH2, C-2), 31.1 (CH2, C-3), 33.6 (CH2, C-14), 35.4 (CH2, C-8), 35.5 (CH, C-7), 36.6 (CH2, C-5), 37.1 (CH, C-20), 40.3 (CH2, C-19), 40.4 (CH, C-16), 68.5 (CH, C-9), 71.1 (CH, C-4), 73.0 (CH, C-11), 73.6 (CH, C-6), 77.1 (CH, C-10), 78.0 (CH, C-15), 125.1 (CH, C-22), 125.1 (CH, C-23), 128.3 (CH, C-13), 130.4 (CH, C-18), 130.8 (C, C-24), 132.1 (CH, C-12), 133.2 (CH, C-17), 137.0 (CH, C-21), 174.5 (C, C-1)
【００２１】
ｂ）式５の化合物（式２においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は水素である化合物）
【００２２】
【化１１】
0005351430.tif 000009
【００２３】
溶解性：アルコール、クロロホルム、酢酸エチル、アセトンに可溶でヘキサン、水に不溶、分子量測定：m/z 559 (M+Na)+、1H-NMRスペクトル（600MHz、重クロロホルム中）δ 0.99 (3H, d, 6.8Hz, H3-31), 1.07 (3H, d, 7.0Hz, H3-27), 1.15 (3H, d, 6.8Hz, H3-28), 1.17 (3H, d, 6.8Hz, H3-26), 1.20 (3H, d, 6.8Hz, H3-25), 1.45 (1H, m, H-8), 1.59 (1H, m, H-9), 1.61 (1H, m, H-9), 1.64 (1H, m, H-8), 1.66 (1H, m, H-11), 1.82 (1H, m, H-20), 1.85 (1H, m, H-20), 1.88 (1H, m, H-11), 1.96 (1H, m, H-6), 2.05 (1H, m, H-10), 2.10 (1H, m, H-23), 2.12 (1H, m, H-19), 2.15 (1H, m, H-12), 2.23 (1H, m, H-13), 2.32 (1H, m, H-3), 2.33 (1H, m, H-2), 2.36 (2H, m, H-6 and H-15), 3.60 (1H, m, H-7), 3.65 (1H, m, H-24), 3.97 (1H, m, H-10), 4.04 (1H, m, H-12), 4.26 (1H, m, H-16), 4.91 (1H, s, H-30), 4.93 (1H, s, H-30), 5.01 (1H, s, H-29), 5.07 (1H, s, H-29), 5.30 (1H, dt, 13.3 and 5.6 Hz, H-19), 5.42 (1H, ddd, 5.5, 8.8 and 15.4 Hz, H-5), 5.52 (1H, dd, 6.9 and 15.4 Hz, H-4), 5.69 (1H, dd, 5.6 and 15.8 Hz, H-18), 5.72 (1H, dd, 5.7 and 15.8 Hz, H-17)、13C-NMRスペクトル（150MHz、重クロロホルム中）δ 14.1 (CH3, C-28), 16.3 (CH3, C-26), 16.4 (CH3, C-31), 18.4 (CH3, C-27), 20.3 (CH3, C-25), 29.4 (CH2, C-21), 31.6 (CH2, C-9), 32.0 (CH2, C-8), 32.6 (CH2, C-20), 38.0 (CH2, C-11), 39.9 (CH2, C-6), 40.4 (CH, C-3),43.6 (CH2, C-15), 43.8 (CH, C-13), 45.8 (CH, C-2), 48.9 (CH, C-23), 69.2 (CH, C-10), 69.8 (CH, C-12), 69.8 (CH, C-7), 69.9 (CH, C-24), 70.3 (CH, C-16), 73.3 (CH, C-19), 110.8 (CH2, C-30), 113.8 (CH2, C-29), 126.0 (CH, C-5), 129.4 (CH, C-17), 135.1 (CH, C-18), 137.6 (CH, C-4), 148.5 (C, C-14), 151.1 (C, C-22), 175.7 (C, C-1)
【００２４】
ｃ）式６（式３においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が水素である化合物）
【００２５】
【化１２】
0005351430.tif 000010
【００２６】
形状：無色固体、溶解性：クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、エタノール、メタノールに可溶で水、ヘキサンに不溶、分子量測定：m/z 663 (M+Na)+、1H-NMRスペクトル（600MHz、重クロロホルム中）δ0.84 (3H, d, 6.8 Hz, H3-34), 0.90 (3H, t, 6.6 Hz, H3-31), 0.97 (3H, d, 6.8 Hz, H3-33), 1.28 (3H, d, 6.8 Hz, H3-32), 1.28 (2H, m, H2-30), 1.33 ~ 1.48 (6H, m, H-11, H-12, H-15, H-28, and H2-29), 1.52 (1H, m, H-18), 1.60 ~ 1.75 (7H, m, H2-6, H-11, H-12, H-15, H-18, and H-29), 2.02 (1H, m, H-14), 2.08 (1H, m, H-19), 2.35 (1H, ,m, H-19), 2.51 (1H, m, H-26), 3.23 (1H, m, H-2), 3.44 (1H, m, H-17), 3.58 (1H, m, H-8), 3.71 (1H, m, H-10), 3.82 (1H, m, H-9), 4.10 (1H, m, H-13), 4.10 (1H, m, H-7), 4.13 (1H, m, H-27), 4.29 (1H, m, H-24), 4.42 (1H, m, H-5), 5.00 (1H, m H-25), 5.59 (1H, dd, 4.0 and 15.8 Hz, H-23), 5.61 (1H, dd, 3.4 and 15.4 Hz, H-4), 5.74 (1H, m H-20), 5.81 (1H, m, H-3), 6.09 (1H, dd, 10.3 and 15.8 Hz, H-21), 6.17 (1H, dd, 10.3 and 15.8 Hz, H-21)
【００２７】
本発明のマクロライド化合物を産生する渦鞭毛藻は、沖縄県西表島の海水からそれぞれ単離された、アンフィジニウム（（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＨＹＡ０２４株と同定される、新規の渦鞭毛藻であることが明らかとなった。本発明の渦鞭毛藻ＨＹＡ０２４株は、高知大学海洋コア総合研究センターにて保管されている。
【００２８】
本発明のマクロライド化合物は、渦鞭毛藻ＨＹＡ０２４株を適当な条件下で培養することで製造することができる。培養条件の例としては、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌した海水に下記表１に示す組成を有する海水補強栄養剤を１％の濃度で添加し、さらに３ｍM ＮａＨＣＯ３をpH７．３〜８．５になるように添加し、孔径０．２２μｍのフィルターを用いてろ過滅菌を行って調製される培養液に渦鞭毛藻ＨＹＡ０２４株を接種し、２５℃、培養期間中、明期時間１６時間、暗期時間８時間の周期で３０００ルクスの光を当てながら、１４日間程度静置培養すればよい。
【００２９】
【表１】
0005351430.tif 000011
【００３０】
ただし、これらの培地組成や培養温度等の培養条件は限定的なものではなく、適宜調節ないし選択することができることはいうまでもない。
【００３１】
培養物中に生産蓄積されたマクロライド化合物を回収するには、あらかじめ遠心分離あるいは濾過などで分離して得られた培養藻体に対して、当該マクロライド化合物の理化学的性質を考慮して、代謝産物を採取するのに通常用いられる分離、精製の手段を適宜利用すればよい。例えば、培養藻体に対してメタノール等の溶剤、好ましくはメタノール／トルエン（３：１）で抽出操作を行い、得られる抽出液（トルエン画分）からマクロライド化合物をさらにジクロロメタン等の有機溶剤で抽出したり、カラムクロマトグラフィーによってマクロライド化合物を吸着、溶出させたりすればよい。さらに必要に応じてさらに精製操作を行って、所望の純度を有するマクロライド化合物として回収し、製造することが出来る。クロマトグラフィーで用いられる担体としては慣用の無機及び有機の担体、例えばシリカゲル、ポリビニル樹脂、ポリスチレン樹脂などが利用される。
【００３２】
本発明のマクロライド化合物は、例えば医薬品分野等の抗ガン剤として有用である。本発明の化合物は、単独で用いてもよいし、又は一般に製剤上許容される無機または有機の一種、あるいは数種のベヒクル、坦体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、光沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、芳香剤、着色剤等と共に混和、製剤化してもよい。
【００３３】
製剤の剤型は投与経路あるいは投与計画等によって適宜決定すればよい。投与形態は、経口投与、経腸投与、非経口投与もしくは局所投与等が挙げられ、非経口投与としては、例えば、注射剤として静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与とすることができる。また従来公知の技術を用いて顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤等の剤型に製剤化することができる。散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤を製造する際には、コーンスターチ、ゼラチン、デキストリン等の結合剤、カオリン、炭酸カルシウム、微晶性セルロース等の賦形剤、デンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤、タルク等の光沢剤、乳糖、ショ糖等の甘味剤等を、本発明のマクロライド化合物と共に配合することができる。また、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤等の液体製剤を製造する際には、水や植物油等の一般的に用いられる不活性な希釈剤の他、湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、着色剤、防腐剤、安定剤等を本発明のマクロライド化合物と共に配合することができる。
【００３４】
注射剤等の非経口投与製剤の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、レシチン等が挙げられる。
【００３５】
本発明のマクロライド化合物の臨床投与量は、経口投与により用いる場合には、成人一人に対し概ね０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇであるが、年齢、病状、症状、他の薬物等の同時投与の有無により、適宜増減することがさらに好ましい。
【実施例】
【００３６】
実施例１
１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌した海水に前記表１に示す組成を有する海水補強栄養剤を１％の濃度で添加し、さらに３ｍM ＮａＨＣＯ３をｐＨ７．３〜８．５になるように添加し、孔径０．２２μmのフィルターを用いてろ過滅菌を行って調製される培養液に、渦鞭毛藻ＨＹＡ０２４株を接種し、２５℃、培養期間中、明期時間１６時間、暗期時間８時間の周期で３０００ルクスの光を当てながら、１４日間静置培養した。
【００３７】
遠心分離操作で回収し渦鞭毛藻を凍結乾燥し、凍結乾燥物１５．３ｇに５００ｍＬのメタノール／トルエン（３：１）を加えて撹拌（３回）後、５００ｍＬの水を加え、さらに５００ｍＬのトルエンで３回抽出した。全トルエン画分（２ｇ）をシリカゲルカラム（溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）にかけ、さらにＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（溶出液アセトニトリル：水＝７：３）、ＮＨ２−ＳｉＯ２カラム（溶出液ヘキサン：アセトン＝２：１）次いでＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８カラム（ＹＭＣ社製、溶出液：アセトニトリル／水＝６０：４０、流速：２ｍＬ／分、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）で精製し、６種類のマクロライド化合物と想定される化合物を分離、回収した。
【００３８】
得られた６種の化合物について、高分解能エレクトロスプレー質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）により分子量を確認し、さらにＮＭＲ（核磁気共鳴）を中心としたスペクトルデータ測定を行って、６種の化合物の化学構造式を式４、式５及び式６と決定した。
【００３９】
【化１３】
0005351430.tif 000012
【００４０】
高分解能エレクトロスプレー質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）（m/z 531.3298 （[M+Na]+））
分子量（C29H48O7Na、計算値531.3297）
【００４１】
【化１４】
0005351430.tif 000013
【００４２】
高分解能エレクトロスプレー質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）（m/z 559.3626 （[M+Na]+））
分子量（C31H52O7Na、計算値559.3611）
【００４３】
【化１５】
0005351430.tif 000014
【００４４】
高分解能エレクトロスプレー質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）（m/z 663.3728 （[M+Na]+））
分子量（C34H56O11Na、計算値663.3720）
【００４５】
実施例２
１０％仔牛血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社）及び１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）（以下、培養液とする）に、ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞株（ＤＧ−７５、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２６７５）、又はヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−８６）を１×１０５／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液５０μlを９６ウエルマイクロプレートに添加した後、上記培養液を４９μｌ加え、全量を９９μｌとした。ＤＭＳＯに溶解した式（４）〜式（６）で表される化合物、５−ＦＵ（Ｗａｋｏ社）（いずれも０．０００１〜１０μｇ／ｍＬ）をウェルに１μｌずつ添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％、７２時間培養した。培養後、各ウェルにＷａｋｏ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｗａｋｏ社）を１０μｌ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）にて測定した吸光度から増殖阻害率を次式より算出し、増殖阻害率が５０％を示す培養液中の化合物濃度をＩＣ５０値として算出した。
阻害率（％）＝（１−（サンプル／ブランク））×１００
【００４６】
表２に各新規マクロライド化合物及び既存抗ガン剤のＩＣ５０値（単位μｇ／ｍＬ）を示す。
【００４７】
【表２】
0005351430.tif 000015
【００４８】
これらの結果から、新規マクロライド化合物が高い抗腫瘍活性を有する優れた抗ガン剤となることが示された。