(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの耐性遺伝子、テロメラーゼ遺伝子、および、1つの自殺遺伝子を有する不死化遺伝子領域、前記不死化遺伝子領域および分子内相同組換えの認識部位としての機能をフランキングする2つの配列を有し、かつ前記不死化遺伝子領域の上流に位置するフランキング配列であるLoxP部位のさらに上流と、前記不死化遺伝子領域の下流に位置するフランキング配列であるLoxP部位のさらに下流との２箇所にプロモーターを配置してなることを特徴とする細胞を可逆的に不死化するための遺伝子複合体。
【請求項２】
形質転換遺伝子をさらに含有する、請求項１に記載の遺伝子複合体。
【請求項３】
自殺遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項１または２に記載の遺伝子複合体。
【請求項４】
形質転換遺伝子が癌遺伝子、好ましくはSV40腫瘍抗原である、請求項２または３に記載の遺伝子複合体。
【請求項５】
細胞の取得方法であって、
(a)器官関連細胞を準備し、
(b)前記器官関連細胞を請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子複合体を導入することによって不死化し、
（c）前記（ｂ）の不死化細胞を増殖させ、さらに増殖した細胞の不死化を元に戻すステップを含んでなる、
ことを特徴とする細胞の取得方法。
【請求項６】
前記の器官関連細胞として多分化能性幹細胞、好ましくは骨髄間質細胞を使用することを特徴とする請求項５に記載の細胞の取得方法。
【請求項７】
不死化幹細胞を、幹細胞の器官特異的細胞への分化を助ける少なくとも1種類の分化誘導物質を添加することにより増殖させることを特徴とする請求項６に記載の細胞の取得方法。
【請求項８】
分化誘導物質がデクサメタゾン、5'-アザシチジン、トリコスタチンA、オールトランスレチノイン酸およびアンフォテリシン Bよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の細胞の取得方法。
【請求項９】
少なくとも2種類、好ましくは4種類の分化誘導物質の組合せが使用されることを特徴とする請求項８に記載の細胞の取得方法。
【請求項１０】
前記の器官関連細胞としてその器官の休止している最終分化型の親細胞を使用することを特徴とする請求項５に記載の細胞の取得方法。
【請求項１１】
前記親細胞が不死化に関して形質転換されることを特徴とする請求項１０に記載の細胞の取得方法。
【請求項１２】
良好な導入を選択するために耐性遺伝子が用いられることを特徴とする請求項５に記載の細胞の取得方法。
【請求項１３】
前記の器官関連細胞が自己細胞またはその自己細胞と同種細胞であることを特徴とする請求項５ないし１２のいずれか一項に記載の細胞の取得方法。
【請求項１４】
前記の器官関連細胞が同種細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞の取得方法。
【請求項１５】
前記同種細胞に前記の細胞を可逆的に不死化するための複合遺伝子（１）を導入し、次いで細胞を免疫調節するための遺伝子複合体（２）を導入しこれにより免疫寛容を可逆的に不死化された同種細胞で起させる前記の細胞の取得方法であって、当該免疫調節するための遺伝子複合体（２）は前記遺伝子複合体（１）領域の発現が細胞でのMHC-Ｉ分子の機能を阻害する第１の免疫調節遺伝子領域、該遺伝子領域の発現がナチュラルキラー細胞の不活性化を誘導する第２の免疫調節遺伝子領域および耐性遺伝子を含ませた遺伝子複合体であって、かつ前記の第１の免疫調節遺伝子領域がCMV遺伝子US2およびUS11;  HSV遺伝子ICP47;  CMV遺伝子US6およびUS3; アデノウイルス遺伝子E3-19KおよびE6;  HIV NEF遺伝子、ならびに細胞表面でのMHC Ｉの提示を阻害する組換え一本鎖抗体の遺伝子よりなる遺伝子群から選択される遺伝子を含有し、前記の第２の免疫調節遺伝子領域はCMV遺伝子UL18または細胞膜に固定され、ナチュラルキラー細胞を回避する組換え一本鎖抗体の遺伝子を含有する、ことを特徴とする請求項１４に記載の細胞の取得方法。
【請求項１６】
前記免疫調節が、ナチュラルキラー細胞の阻害的受容体を認識してナチュラルキラー細胞を媒介とする細胞溶解を阻害するモノクローナル抗体により引き起こされることを特徴とする請求項１５に記載の細胞の取得方法。
【請求項１７】
細胞表面でのMHC Iの提示が、β2-ミクログロブリンをコードするかTAPトランスポーターをコードする、同種細胞の少なくとも1つの遺伝子をノックアウトすることにより阻害されることを特徴とする請求項１５に記載の細胞の取得方法。
【請求項１８】
不死化が、増殖した細胞に存在する遺伝子複合体から不死化遺伝子領域を切除することにより元に戻されることを特徴とする請求項５ないし１７のいずれか一項に記載の細胞の取得方法。
【請求項１９】
前記の切除が、酵素Creリコンビナーゼを用いることにより達成されることを特徴とする請求項１８に記載の細胞の取得方法。
【請求項２０】
Creリコンビナーゼ酵素が細胞に浸透可能な組換え融合タンパク質として投与されることを特徴とする請求項１９に記載の細胞の取得方法。
【請求項２１】
前記の細胞にCreリコンビナーゼ酵素を発現する組換えウイルスを感染させることを特徴とする請求項２０に記載の細胞の取得方法。
【請求項２２】
良好な切除を選択するために自殺遺伝子が用いられることを特徴とする請求項１８ないし２１のいずれか一項に記載の細胞の取得方法。
【請求項２３】
請求項５ないし２２のいずれか一項に記載の方法により調製される細胞。
【請求項２４】
器官を再生する移植片を調製するための、請求項２３に記載の細胞の使用。
【請求項２５】
慢性疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項２３に記載の細胞の使用。
【請求項２６】
請求項２３に記載の細胞の治療上有効量を含んでなる薬剤。
【請求項２７】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の遺伝子複合体を含有するプラスミド。
【請求項２８】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の遺伝子複合体を含有するウイルスベクター。
【請求項２９】
請求項２３に記載の細胞を含有する移植片。
【請求項３０】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の遺伝子複合体を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、例えば、器官へ移植可能な細胞を取得する方法に関する。一般的には、本発明はまた、定義された細胞群の破壊を共通して持つ変性疾患、ならびにかかる変性疾患疾患を治療するための移植片および薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  工業国では、特に年齢ピラミッドの変遷の結果として、治療が困難である、また全く治療ができない慢性変性疾患が次第に増加している。
これらの疾患としては、とりわけ、心筋疾患、神経変性疾患、骨疾患および肝臓疾患が挙げられる。
これらの疾患の重篤度、そして高齢者層での頻度の高さには、コストがかかる一方の医療と必然的な経済的に対する高いコストが伴っている。これは特に、冠血管の狭窄、慢性心筋炎、または力学的過負荷の結果として起こり得る心筋疾患について言えることである。【０００３】  一方、これらの疾患は急性心筋梗塞を誘発する可能性があり、これにより1/3のケースで致命的な経過をたどり、また、それまでにも長年の間、狭心症の発作にしばしば見舞われる。心筋梗塞は収縮心筋細胞の広範な壊死やアポトーシス破壊をもたらす。結合組織細胞の増殖および細胞外マトリックスの沈着によりこの患部が瘢痕となるが、心筋細胞は再生されない。
もう1つの重大な合併症として鬱血性心不全と呼ばれるものがあり、これは心臓肥大が原因で起こる。この肥大現象は持続的に増大する圧力に対して生理学上起こり得る初期の作用であるが、これが臨界サイズを越えると再び性能が低下する。
この臨界点の範囲を超えたさらなる拡大によって必然的に心不全が起こる。現在において考え得る心臓肥大症の唯一の治療は心臓移植である。【０００４】  心臓肥大が個々の細胞型の拡大および結合組織による収縮心筋組織の再編成によることは知られている。最終的に分化した心筋細胞は細胞分裂による再生能力を喪失してしまっており、種々の生化学および力学的刺激によってさえ心筋細胞のプログラムされた細胞死(アポトーシス)が引き起こされる。
全体としてみると、非代償性心臓肥大および心筋梗塞の双方ともが収縮心筋細胞の大きな喪失を特徴としている。【０００５】  神経変性疾患の場合、定義された細胞型の喪失によって疾患の経過を確認することもできる。よって、高齢期に最も頻度の高い神経疾患であるパーキンソン病の場合、黒質のドーパミン産生細胞の連続した減少が起こっていることから、この減少もアポトーシス細胞死が原因であると考えられる。
胎児ドーパミン作用性細胞の黒質への選択的な移植によってパーキンソン病の最も重篤な臨床症状を極めて十分に改善することができる。【０００６】  加齢に伴う骨粗鬆症、すなわち女性の進行性骨格疾患は、特に骨物質の減少を特徴とするものであり、この減少は骨形成細胞(骨芽細胞および骨細胞)の数および活性が低下した後に起こっている。
肝臓障害はアルコール暴飲もしくは慢性炎症の結果として、または代謝上の原因により、あるいは心臓血管疾患の結果として進行的に発症し、生理学上活性な肝実質細胞(肝細胞)の喪失を特徴とする。【０００７】  これに関し、ほんの一例として記載したこれらの疾患のいずれについても現在のところ治療方法がない。
心筋疾患に対して処方される薬剤は収縮性および伝導性などの心臓機能には好ましい影響を及ぼすが、喪失した心筋組織を元に戻すことは全くできない。さらに、薬剤は、例えば肝硬変後の門脈圧亢進症に関連した組織水を抜く、または骨粗鬆症による関連痛を緩和するなど、徴候的にしか作用しないことがしばしばある。【０００８】  進行心筋疾患の場合、または非代償性肝硬変の場合、臓器移植が唯一残された選択肢である。しかしながら、これはドナー臓器数の減少により制限され、さらに高額治療にも関係してくる。このことに加え、臓器移植は組織拒絶反応に関する生得的な問題にも関係する、すなわち患者は余生において免疫抑制剤による治療を強いられるということである。これに関連して起こる最も重篤な合併症はウイルス、細菌、および真菌による日和見感染症である。この感染症は往々にして死に至る経過をたどる。【０００９】  このことに加え、パーキンソン病などの神経変性疾患の場合には臓器移植という選択肢すらない。しかしながら、この疾患の一部の例では、中絶胎児脳のドーパミン作用性細胞を移植する試みによってすでにかなりよい結果が得られている。
これに関し、一例として記載した変性疾患が細胞移植により治療できるという文献ではすでに確認された適応症が記載されている。【００１０】  Kobayashiら、"Prevention of acute liver failure in rats with reversibly  immortalized human hepatocytes", Science, 第287巻, 1258-1262頁、はヒト一次肝細胞の感染に使用できるレトロウイルスベクターについて記載している。in vitroで複製した肝細胞を肝切除したラットの脾臓に注入して、細胞注入後に重要な肝機能が補われることを示すことができた。この発表で提示された方法は、移植まで、または肝臓が自然に再生するまで時間を調整することを目的としている。原則として、この発表では細胞移植を用いて臨床的に所望の効果を得ることができることが示される。【００１１】  公知の方法で使用されるレトロウイルスベクターは、2つのLoxP部位によってフランキングされる、1つの耐性遺伝子、1つの自殺遺伝子、および1つの形質転換遺伝子を有する遺伝子領域を含有する。下流のLoxP部位の後には、この第2の耐性遺伝子が翻訳されないように開始コドンが欠失したもう1つの耐性遺伝子が続いている。形質転換遺伝子、この場合にはSV40腫瘍抗原が休止肝細胞を駆動し、再び増殖させる。同時に、第1の耐性遺伝子がハイグロマイシン耐性を起こし、自殺遺伝子がガンシクロビル感受性を起こす。このように、形質転換に選択することができる。【００１２】  このように選択された細胞系の1つは明らかに不死であり、好適な培地で増殖させることができる。増殖させた後、細胞にCreリコンビナーゼを発現する複製能力のない組換えアデノウイルスを形質導入した。Creリコンビナーゼで切除する遺伝子領域はSV40 T-Ag癌遺伝子がもはや発現しないように2つのLoxP部位間に存在する。Cre-Lox系の情報については、例えば、Rajewskyら,"Conditional gene targeting", J. Clin. Invest., 第98巻, 600-603頁参照。Creリコンビナーゼでの切除の結果として分子内組換えが起こり、LoxP部位によってフランキングされる遺伝子領域の外側にこれまで存在した耐性遺伝子が開始コドンのすぐ下流に存在することになったために、ある耐性を媒介することができた。このように、この場合ではG418に対する耐性(ネオマイシン耐性遺伝子)の選択により切除の成功を確かめることができた。
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  上記の発表ではこのプロセスを可逆的不死化として記載しているが、本願発明者らの所見によれば、1つのクローンの場合には、自然変異の結果として不死細胞を誘導した可逆的形質転換である。このように、細胞のSV40 T-Agでの形質転換の場合のルールが単に「寿命の延長」をもたらし得ることであることが分かっている。これについては、例えば、ChiuおよびHarley, "Replicative senenscence and cell immortality: the role of telomeres and telomerase", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 第214巻, 99-106頁参照。ChiuおよびHarleyは、細胞の複製寿命を調節する組織時計として有用なテロメアの長さに基づいたテロメア説の概要を提示している。これらの著者はテロメラーゼ発現によりテロメアの長さが安定し、連続複製、または細胞不死化が可能になることを報告している。彼らはこの仮説に関連した治療的将来性についても記載しており、テロメラーゼ発現をin vivoまたはex vivoにおいて活性化することにより細胞の複製能力を高めることが可能かどうかを考察している。さらに、彼らは、テロメラーゼ活性が自然変異によって誘導され、数多くの腫瘍細胞に存在することを報告している。ChiuおよびHarleyの論文に基づけば、Kobayashiら(上記に引用)により報告された不死細胞系が癌遺伝子での形質転換後の自然変異の結果として起こったものと考えられる。よって、このことからKobayashiら(上記に引用)により記載された方法には再現性がなく、それゆえに商業的には通常、連続使用できないということになる。
【００１４】  ヒト一次細胞を培養すると、それらはドナーの年齢に応じてさらに20ないし60回分裂し、その後、老化期に入る。分裂ごとに起こるテロメアの喪失によって細胞分裂の停止が誘導されるが、これは細胞を癌遺伝子で形質転換することによって回避できる。この後、これらの細胞はこの最初の危機を乗り越えて分裂を続けることができる。しかしながら、分裂ごとに起こるテロメアの喪失によって遺伝子が不安定な状態に陥るため、その後のいくつかの時点で第2の危機が起こる。この第2の危機は腫瘍抗原で形質転換したほとんど全ての細胞にとって致命的なものである。しかしながら、10-6より少ない場合には自然変異の結果としてテロメラーゼの活性化が得られ、それ以降のテロメアの喪失を補うことができるということになる。このことはKobayashiら(上記に引用)の場合にも起こったに違いないが、自然不死化とよばれるものである。このテロメラーゼの活性化は再び選択的にスイッチオフすることができず、また腫瘍抗原を切除してしまった後でさえも、再び増殖の誘導を引き起こすさらなる変異の結果、これらの細胞が癌細胞に変性するかもしれないという危険が残ることにもなる。
【００１５】  それゆえに、これに関連してKobayashiら(上記に引用)により記載された方法には一連の欠点がある。第一に、この方法の成功はテロメラーゼが自然に活性化されることにある。よって、このことからこの方法には再現性がなく、それゆえに商業的には非常に限られた規模でしか使用できないことになる。第二に、テロメラーゼ活性は再び選択的にスイッチオフすることができず、腫瘍抗原を切除してしまった後でさえも細胞が癌細胞に変性する可能性があるということである。さらなる欠点としては、切除した後でさえもレトロウイルスベクターの一部が増殖した細胞において活性状態のままであり、切除の成功に向けた選択に用いられる耐性遺伝子を発現することである。しかしながら、この付加的遺伝物質はこのように処理した細胞のヒト臓器への移植に有効である。
【００１６】  Kobayashiらは最終分化型の親細胞由来の移植可能な細胞の調製に関わっているが、心臓機能を向上させる目的で自己骨髄間質細胞を心臓に移植することも知られている; Tomitaら,"Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function", Circulation, 第100巻, II247-II256頁参照。骨髄細胞を分化誘導物質5'-アザシチジンのさらなる存在下で培養した結果、骨髄細胞が心筋細胞へと分化した。
【００１７】  しかしながら、自己骨髄間質細胞の複製能力が乏しいため、このようにヒトにおいて必要な再生細胞量を複製することができない。心疾患は老人病であるため、ほとんどの自己ドナーもまた比較的高齢である。このことから考えて、患者から採取した自己骨髄細胞の場合、さらに20回の分裂は恐らく可能であろう。それゆえに、1つの細胞からは理論上、約106の細胞(左心室の0.02%未満に相当)の調製しかできないため、Tomitaら(上記に引用)により記載された方法は臨床応用には向いていない。
【００１８】  また、Makinoら、"Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro", J. Clin. Invest., 第103巻, 697-705頁、は5'-アザシチジンの添加による骨髄細胞の心筋細胞への分化に関するものである。間質細胞を4ヶ月を越える期間、頻繁に継代培養することにより不死化細胞系を得、その後、この不死化細胞系を心筋細胞への分化の開始材料として用いた。この方法にはKobayashiら(上記に引用)により記載された方法と同様に、再現性がなく、さらに臨床上許容されないという欠点がある。
【００１９】  上記のことから考えて、本発明の目的は、例えば組織を局所的に再生するのに使用できる免疫学的にコスト効率の良い方法および臨床上無害な細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】  本発明によれば、この目的は細胞を取得する方法であって、以下の、器官関連細胞を準備し、器官関連細胞を不死化し、不死化細胞を増殖させ、さらに増殖した細胞の不死化を元に戻すステップを含んでなる方法により達成される。これに関して、器官関連細胞は多分化能性幹細胞、好ましくは骨髄間質細胞またはその器官の休止している最終分化型親細胞である。
【００２１】  可逆的に不死化した結果として、このように調製した細胞は臨床上無害である。さらに、この細胞は無制限に得ることができる。
多分化能性幹細胞を器官関連細胞として使用する場合には、不死化幹細胞を、幹細胞の器官特異的細胞への分化を助ける少なくとも1種類の分化誘導物質のさらなる存在下で増殖させる。
また、休止最終分化親細胞を使用する場合には、これらの細胞を、それらが確実に増殖できるよう不死化に関してさらに形質転換する。
【００２２】  このように調製した細胞は、例えば心筋梗塞部分への移植を行うのに使用でき、それによって同時にかつ実質的に鬱血性心不全および続発性致命的心筋梗塞の危険性を少なくすることができる。この方法は、骨および軟骨外傷関連、および慢性骨変性症(骨粗鬆症)関連に使用できる再生骨細胞および軟骨細胞の獲得にも好適である。また、この方法を用いて肝臓再生用の肝実質細胞およびパーキンソン病治療用のドーパミン作用性細胞を調製することができる。
【００２３】  本発明の方法によれば、生体外での組織の調製を目的として、いかなる所望量の一次細胞でも産生することができる。新規方法によって産生させた内皮細胞または平滑筋細胞を、心臓または静脈弁の調製を目的として用いてマトリックス、好ましくは例えばコラーゲンまたはフィブロネクチンから作製したバイオマトリックスにコロニーを形成させることができる。
例えば、筋細胞、好ましくは心筋細胞、ならびに骨細胞を調製する場合には、不死化幹細胞を増殖させる際にデクサメタゾン、5'-アザシチジン、トリコスタチンA、オールトランスレチノイン酸およびアンフォテリシンBの群から選択される分化誘導物質を加えることが好ましい。この点については、増殖に関連して少なくとも2種類、好ましくは4種類のこれらの分化誘導物質を使用することが特に好ましい。
【００２４】  幹細胞の心筋細胞への分化は5'-アザシチジンの添加により誘導されるが、少なくとも1種類のさらなる分化誘導物質の添加によって分化を増進することができる。本願発明者らの所見によれば、相乗作用する5'-アザシチジンとトリコスタチンAとの組合せはこの点において特に好適である。この分化はオールトランスレチノイン酸およびアンフォテリシンBをさらに添加することによりさらに最適なものとなり得る。
【００２５】  数種類の分化誘導物質の組合せから得られる相乗作用のほか、本発明者らが5'-アザシチジンに存在することを見出した変異誘発効力が実質的に低下するまたは完全に破壊してしまうというさらなる利点もある。
以上のことから、このようにして幹細胞から得られた心筋細胞は臨床用途において安全に使用することが可能である。
可逆的不死化幹細胞は分化誘導物質であるデクサメタゾンの添加によって骨細胞および軟骨細胞に分化する。この場合においても、分化誘導物質である5'-アザシチジン、トリコスタチンA、オールトランスレチノイン酸およびアンフォテリシンBの添加によって相乗作用を得ることができる。
【００２６】  分化誘導物質であるデクサメタゾンに関しては、CongetおよびMinguell,"Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells", J. Cell. Physiol., 第181巻, 67-73頁で、デクサメタゾンでの処理により間質細胞から骨形成細胞が得られることがすでに報告されているという事実も挙げておく。
これに関して使用できる器官関連細胞は自己細胞または同種細胞のいずれかである。
【００２７】  自己細胞の有利な点は免疫寛容にあるが、同種細胞にはほぼいつでも無制限に利用できるという利点がある。しかしながら、同種細胞でも本発明によれば、免疫寛容が起こり、宿主対移植片反応(HVGR)が減少することになる。
従って、患者の治療を目的として同種細胞から調製した移植可能な細胞を最初に使用することができるが、同時に患者由来の自己細胞からさらなる移植可能な細胞が調製される。十分な自己移植可能細胞が入手できる場合、移植されて免疫寛容によっていずれの問題も起こすことがないのはこれらの細胞だけである。
【００２８】  本発明によれば、少なくとも1つの耐性遺伝子、1つの不死化遺伝子および、好ましくは1つの自殺遺伝子を有する不死化遺伝子領域、その遺伝子領域にフランキングし、かつ分子内相同組換えの認識部位として機能する2つの配列、ならびにその遺伝子領域の上流に位置する少なくとも1つのプロモーターを含有する遺伝子複合体が細胞を可逆的に不死化するために使用される。
この遺伝子複合体を器官関連細胞に導入する場合、まず良好な導入を選択するため耐性遺伝子を用いることができる。
【００２９】  不死化遺伝子(好ましくはテロメラーゼ遺伝子である)が存在する結果、増殖中のテロメア喪失が回避される、すなわち、器官関連細胞が増殖可能な幹細胞である場合には、細胞が無制限に複製できるということになる。
また、使用する器官関連細胞が最終分化親細胞である場合には、遺伝子複合体は1つの形質転換遺伝子(好ましくは癌遺伝子であるSV40腫瘍抗原である)をさらに含有する。このように、移植可能細胞を調製するために休止細胞を不死化してそれらを使用することが可能である。
【００３０】  増殖させた後、分子内相同組換えによって耐性遺伝子、不死化遺伝子および自殺遺伝子を含有する遺伝子領域を遺伝子複合体から切除し、不死化を確実に破壊する。その結果として、このように調製した細胞を移植した後にそれらが癌細胞へと変性する危険性は通常の場合以下となる。
これに関連したフランキング配列は好ましくはLoxP部位であり、分子内組換えにはCreリコンビナーゼが用いられる。これに関連して増殖させた細胞の不死化はいずれかの所望の時点において、Creリコンビナーゼを発現する、例えば、組換えウイルス(例えば、組換えアデノウイルス)で細胞を感染させる、またはCreリコンビナーゼを細胞に浸透可能な組換え融合タンパク質(例えば、voyagerタンパク質VP22との融合タンパク質)として投与することにより元に戻すことができる。
【００３１】  これに関連して自殺遺伝子が切除の成功に向けた選択に用いられる。自殺遺伝子は好ましくは単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子である。不死化遺伝子領域を切除した後、導入した遺伝子複合体から自殺遺伝子も除去した。これによりこれらの細胞はもはやガンシクロビル感受性でないことになる。しかしながら、ガンシクロビル感受性は切除が行われなかった細胞になお存在し、そのため、これらの細胞が死滅することになる。
【００３２】  これに関連して記載された方法の重大な利点は、不死化を元に戻した後に遺伝子複合体が発現可能な遺伝子を全く含まないという事実にある。すなわち、これらの細胞の移植が臨床的見地から完全に無害であるということである。
器官特異的細胞として同種細胞を用いる場合、遺伝子複合体をこれらの細胞に導入することにより免疫寛容が同種細胞で起こる。これに関連して細胞を免疫調節するための遺伝子複合体は該遺伝子領域の発現が細胞でのMHC I分子の機能を阻害する第1の免疫調節遺伝子領域、および該遺伝子領域の発現がナチュラルキラー細胞(NK細胞)の不活性化を誘導する第2の免疫調節遺伝子領域を含んでなる。
免疫調節するための遺伝子複合体は良好な導入の選択に用いられる1つの耐性遺伝子をさらに含んでなる。
【００３３】  これに関連した第1の免疫調節遺伝子領域は、CMV遺伝子US2およびUS11; HSV遺伝子ICP47; CMV遺伝子US6およびUS3; アデノウイルス遺伝子E3-19KおよびE6; HIV NEF遺伝子、ならびに細胞表面でのMHC Iの提示を阻害する組換え一本鎖抗体の遺伝子: 群から選択される1つの遺伝子を含有する。
本発明によれば、第2の免疫調節遺伝子領域は、CMV遺伝子UL18または細胞膜に固定され、ナチュラルキラー細胞を回避する組換え一本鎖抗体の1つの遺伝子を含有する。
【００３４】  このようにして達成された免疫調節を用いて不死化した同種器官特異的細胞で免疫寛容を誘導する。この免疫寛容によって同種受容者への危険性なく細胞を移植できるようになる。
免疫寛容は第一に、細胞表面でのMHC Iの提示を阻害することにより達成される。これにより受容者の細胞傷害性Tリンパ球が外来ドナー細胞を溶解しなくなる。これに関連してCMV遺伝子US2およびUS11を発現させることによりMHC I分子が細胞表面に存在しないようにする。
【００３５】  MillerおよびSedmak、"Viral effects on antigen processing", Curr. Opin. Immunol. 第11巻, 94-99頁では、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)のこれらの遺伝子産物が細胞内MHC I分子の大量分解を引き起こすことを示すことができた。
細胞でのMHC I提示を低下させる、または完全に阻害することによってナチュラルキラー細胞の活性化が起こることから、CMV遺伝子UL18の発現によりこれらのナチュラルキラー細胞の活性は阻害される。
【００３６】  また、別のウイルス遺伝子、例えば、HSV遺伝子ICP47、CMV遺伝子US6およびUS3、アデノウイルス遺伝子E3-19KおよびE6、またはHIV NEF遺伝子を用いた場合でもMHC Iの不活性化はもたらされる。さらに、MHC I構成部分、例えば、β-2-ミクログロブリン遺伝子を直接ノックアウトすることも可能である。細胞表面でのMHC Iの提示を阻害する組換え一本鎖抗体を細胞内発現させることもさらに可能である。
【００３７】  また、ナチュラルキラー細胞の阻害的受容体を認識して、NK細胞を媒介とする細胞溶解を阻害するモノクローナル抗体を用いてナチュラルキラー細胞を不活性化することもできる。本発明によれば、このモノクローナル抗体は組換え一本鎖抗体として同種ドナー細胞膜に固定されることから、NK細胞の攻撃を回避できる。
また、この新規な方法を用いて、また要すれば、新規な遺伝子複合体を用いて作製した細胞も同様に本発明の対象の1つとなる。本発明によれば、これらの細胞は器官を再生する移植片の調製または慢性疾患を治療する薬剤の製造に用いることができる。
【００３８】  この背景に対し、本発明はまた、本発明に従って作製した細胞の治療上有効量を含んでなる薬剤、およびこれらの細胞を含有する移植片にも関する。
本発明は器官を再生するための細胞の使用に関する。
さらに、本発明はプラスミド、ウイルスベクター、または可逆的不死化に向けた遺伝子複合体および／または細胞の免疫調節に向けた遺伝子複合体を含んでなるキットに関する。
【００３９】  本発明のプラスミドおよび／または本発明のウイルスベクターは遺伝子複合体を器官特異的細胞に導入するのに用いられ、これらの細胞を適当に形質転換するおよび免疫調節作用を及ぼすことで不死化する。
遺伝子複合体のほか、本発明のキットは必要とされるその他の物質および／または材料、例えば、Creリコンビナーゼをコードする組換えアデノウイルスを含有してもよい。
【００４０】  さらに、キットを用いて同種または自己ドナー細胞を可逆的に不死化し、増殖させた後、器官再生を目的としてこれを移植する。
その他の利点については説明および／または添付の図面で確認できる。
上記の特徴および以下でさらに説明される特徴は、本発明の範囲を離れることなく、示された各々の場合の組合せに限らずその他の組合せでも、またはそれら単独でも使用できることが分かるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４１】  以下、実施形態および添付の図面により本発明を説明する。
実施例1：器官関連細胞の準備
使用する器官関連細胞は増殖に関連してさらに器官特異的細胞へと分化させることが必要な多分化能性幹細胞、またはすでに分化させた所与の器官の親細胞であってよい。
【００４２】  さらに、所定の患者由来の自己細胞とドナー由来の同種細胞とを区別する必要がある。自己細胞はさらなる免疫調節処置を行わずに使用できるが、同種細胞は免疫調節遺伝子で安定的にトランスフェクトする。同種細胞の利点はこれらの細胞を大量に準備でき、数多くの受容者にすぐに使用できることであるが、さらに免疫調節処置(実施例2を参照)により宿主対移植片反応(HVGR)の危険性もかなり低くなる。自己細胞の利点はHVGRの危険性がないことである。
【００４３】  使用する幹細胞は骨髄間質細胞である。これらの細胞は骨芽細胞、筋芽細胞、含脂肪細胞、およびその他の細胞型へと分化させることができる。病院では、骨髄を通常、同種骨髄移植の外科的条件下で得る。しかしながら、この接合に必要とされるのは造血幹細胞だけであり、本発明の目的とする間質幹細胞が副産物として得られる。
また、間質幹細胞は末梢血からも単離することができる。
【００４４】  このようにして得られる幹細胞を通常の細胞培養ディッシュに植え付け、10%ウシ胎児血清およびペニシリン、ストレプトマイシンまたはアンフォテリシンBなどの抗生物質を含有するαMEMまたはIDEM培地で培養する。
実施例2：不死化、形質転換および免疫調節
このようにして得た器官関連細胞を可逆的に不死化するには、同時に最終分化型の親細胞が形質転換される必要がある。同種器官関連細胞の場合にはさらに免疫調節も必要となる。
【００４５】  器官関連細胞を可逆的に不死化するには図1に示す遺伝子複合体を使用する。また、同種ドナー細胞を免疫調節するには図2に示す遺伝子複合体を使用する。
両方の遺伝子複合体はともにプラスミドトランスフェクションまたはウイルス形質導入によって器官関連標的細胞に導入することができる。各々の耐性遺伝子が遺伝子複合体の良好な導入の選択に用いられる。
図1に示す遺伝子複合体の耐性遺伝子は、例えば、G418耐性を媒介するネオマイシン遺伝子である。図2の遺伝子複合体の耐性遺伝子は、例えば、ハイグロマイシン耐性を媒介するハイグロ遺伝子である。
【００４６】  図1の遺伝子複合体は形質転換遺伝子としてSV40大型腫瘍抗原を、さらに不死化遺伝子としてテロメラーゼ遺伝子を含有する。これに関連して、形質転換遺伝子は休止している最終分化型の親細胞に必要とされるだけであり、テロメラーゼをコードする不死化遺伝子は幹細胞の増殖に十分なものである。
さらに、図1に示す遺伝子複合体は自殺遺伝子、すなわちガンシクロビル感受性を媒介するチミジンキナーゼ遺伝子を含有する。
【００４７】  自殺遺伝子TK、形質転換遺伝子SV40T-Ag、およびテロメラーゼ遺伝子TELO、さらに第1の耐性遺伝子resistを含んでなる不死化遺伝子領域に2つのLoxP部位がフランキングする。バクテリオファージP1酵素Creリコンビナーゼを用いて２つの同一LoxP配列において相同組換えを達成することができる。LoxP部位は、8塩基対非パリンドローム配列を媒介とする2つの13塩基対逆位反復配列で構成される34塩基対DNA配列である。2つのLoxP部位が直線DNA分子において同じ方向に配置されると、Creリコンビナーゼによって分子内組換えが達成され、これによって2つのLoxP部位間に存在する配列が切除される。分解により切除されたDNAが平衡状態から除かれるため、これは非常に特異的であり、かつ非常に有効である。
【００４８】  遺伝子融合、IRES(内部リボソーム侵入部位)を用いる内部翻訳、または内部タンパク質分解(prot)によりタンデム型遺伝子の発現を達成することができる。最後に述べた可能性としては、プロテアーゼ(それ自身をcis切断することから、個々の遺伝子の機能を識別する)を遺伝子間に置く。FMDV(口蹄疫ウイルス)2Aプロテアーゼを内部プロテアーゼとして使用することができる。
図1に示す遺伝子複合体を実施例1に記載した器官関連細胞にうまく導入した後、これらの細胞を随意に増殖させることが可能である。器官関連細胞が多分化能性幹細胞である場合には、以下の実施例3に記載するように幹細胞の器官特異的細胞への分化を助ける少なくとも1種類の分化誘導物質のさらなる存在下で増殖を起こす。
【００４９】  また、器官関連細胞がドナーから得た同種細胞である場合には、免疫寛容を得るため、図1に示す遺伝子複合体とともに図2に示す遺伝子複合体を導入する必要がある。
CMV遺伝子US2およびUS11を発現させることによりMHC I分子が器官関連細胞の細胞表面に存在しないようにすることでこれが起こる。MHC Iの提示を低下させるまたは完全に阻害する一方、他方では細胞傷害性Tリンパ球が外来ドナー細胞を溶解しなくなり、このことからさらにナチュラルキラー細胞が自動的に活性化されることになる。
【００５０】  本発明によれば、ナチュラルキラー細胞の活性化はCMV遺伝子UL18の発現による機構によって阻害されるが、この機構についてはまだ正確には分かっていない。
図1および2では、pAがポリ(アデニル化)シグナル、promがプロモーターを示している。resist2はresistとは異なる耐性遺伝子である。
また、MHC Iは、別のウイルス遺伝子、例えば、HSV遺伝子ICP47、CMV遺伝子US6およびUS3、アデノウイルス遺伝子E3-19KおよびE6またはHIV NEF遺伝子を用いて、β-2-ミクログロブリン遺伝子などのMHC I構成部分を直接ノックアウトすることにより、または細胞表面でのMHC Iの提示を阻害する組換え一本鎖抗体を細胞内発現させることにより不活性化することもできる。
【００５１】  また、ナチュラルキラー細胞の阻害的受容体を認識して、ナチュラルキラー細胞を媒介とする細胞溶解を阻害するモノクローナル抗体を用いてナチュラルキラー細胞を阻害することもできる。このモノクローナル抗体は組換え一本鎖抗体として同種ドナー細胞膜に固定されることから、ナチュラルキラー細胞の攻撃を回避できる。
膜局在一本鎖抗体の調製については、Einfeldら、"Construction of a pseudoreceptor that mediates transduction by adenoviruses expressing a ligand in fiber or penton base", J. Virol., 第73巻, 9130-9136頁に記載されている。
【００５２】  モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを第一のステップで調製する；例えば、Immunobiologies [Immunobiology] 、 第三版、 Janewayら、 Current Biology Limited & Churchill Livingstone & Garland Publishing Inc., 1997参照。ハイブリドーマは免疫化マウスの脾臓由来の死滅抗体産生細胞と不死骨髄腫細胞との融合物である。
この融合細胞は両方の親細胞の特性、すなわち、抗体産生能力と不死性を備えている。ハイブリドーマ細胞を特別選抜培地(HAT培地)で増殖させ、目的とする抗体の発現について確認する。
【００５３】  次のステップはモノクローナル抗体の軽および重鎖可変部をコードする遺伝子断片のクローニングである。抗原の認識に重要な遺伝子配列をこれらの可変部のコンセンサスプライマーを用いてPCRにより増幅させる。約15個のアミノ酸をコードするショートリンカーによって、可変部軽鎖の遺伝子配列と重鎖の遺伝子配列とを融合させる。これによって一本鎖Fv(可変フラグメント)と呼ばれるものが得られる。
【００５４】  細胞で発現させる際には、別のシグナル配列およびアンカー配列を用いて、本発明で使用する膜局在一本鎖抗体を作製することで、かかる一本鎖抗体を細胞膜に挿入することができる。
しかしながら、本発明の抗体は、Einfeldらにより記載されるように、直線血球凝集素エピトープを認識しないで、ナチュラルキラー細胞のエピトープを認識することで、NKが媒介する細胞溶解を阻害する。この一本鎖抗体の遺伝子をUL18CMV遺伝子の代わりに図2に示す遺伝子複合体に含めることができる。
【００５５】  本発明によれば、一本鎖抗体が細胞内エピトープを認識することによりMHC I分子の構成または移動を阻害するよう「細胞内発現抗体」という意味でもそれらを使用できる。かかる抗体の遺伝子は図2に示す遺伝子複合体に存在してもよく、例えばCMV遺伝子US2およびUS11と置き換えることができる。
これらの一本鎖抗体は群: TAPトランスポーター(抗TAPIおよび抗TAPII)、β2-ミクログロブリン、カルネキシン、カルレティキュリンおよびタパシンに対して向けられた抗体から選択される。1種類以上のこれらの細胞内一本鎖抗体の発現および活性により、MHC I分子を同種細胞表面に存在させないようにし、細胞傷害性Tリンパ球による細胞溶解を回避する。
【００５６】  MHC I構成部分の直接ノックアウトは、トランスジェニックマウスを調製するための胎児幹細胞に関して最初に記載された方法に基づいている。遺伝子の「ノックアウト」の概説については、Koch-Brandt, "Gentransfer Prinzipien - Experimente - Anwendung bei Saugern" [Principles of gene transfer - experiments - use in mammals], Thieme Verlag, 1993、ならびにSedivyおよびDutriaux,"Gene targeting and somatic cell genetics - a rebirth or a coming of age?", Trends. Genet., 第15巻, 88-90頁に見出せる。
【００５７】  この方法では、ノックアウトしょうとする遺伝子と相同である領域をこの相同領域内に1つの耐性遺伝子と相同領域外に1つの自殺遺伝子を有するプラスミドにクローニングする。次いで、このプラスミドをまれな場合であるが、標的遺伝子に組み込まれている相同領域を有するある細胞にトランスフェクトする。
相同領域内に存在する耐性遺伝子により組込みに関する選択が可能となる一方、またこれにより関連する対立遺伝子の標的遺伝子の発現が阻害される。自殺遺伝子は相同領域外に存在しているため、この遺伝子は相同組換えではなく、人為的な遺伝子操作による組換えに関連して、付随的にしか組み込まれることはない。
【００５８】  自殺遺伝子は自殺遺伝子の人為的な遺伝子操作による組換えが起こった細胞の選択に用いられる。それゆえ、この方法はある遺伝子;本発明の場合では、例えば、MHC I複合体に絶対必要な部分であるβ2-ミクログロブリンに対するヒト遺伝子、の2つの対立遺伝子の一方を最初にノックアウトするのに用いられる。よって、β2-ミクログロブリンの発現をさせないことで、細胞表面にMHC I分子が完全に存在しなくなり、さらにこのことにより細胞傷害性Tリンパ球が媒介する細胞溶解を防ぐこととなる。
【００５９】  同様に、第2の対立遺伝子をノックアウトするために、第2の耐性遺伝子を用いて同じ戦略をとる必要がある。この遺伝子は同一相同配列によって第2の対立遺伝子に組み込むことができる。ここでは、2つの耐性遺伝子と自殺遺伝子がこの成果を得るための選択に用いられる。
β2-ミクログロブリンノックアウトマウスの調製については、KollerおよびSmithies, "Inactivating the beta 2-microglobulin locus in mouse embryonic stem cells by homologous recombination", PNAS, 第86巻, 8932-8935頁によりすでに記載されている。器官関連同種細胞を調製することを目的とした、細胞傷害性Tリンパ球に耐性であるヒト細胞およびかかる細胞の使用について示された文献はない。
【００６０】  また、MHC I複合体構成部分のノックアウトと同様に、上記のアプローチを用いてTAPトランスポーターの一方または両方の遺伝子をノックアウトすることもできる。これによっても同様に、細胞表面にMHC I分子が存在しなくなる。TAPIをノックアウトしたマウスもまた報告されている、Beharら,"Susceptibility of mice deficient in CD1D or TAP1 to infection with Mycobacterium tuberculosis", J. Exp. Med., 第189巻, 1973-1980頁参照。
実施例3：増殖および分化
すでに最終分化している不死化親細胞を通常培地で増殖させる（さらに測定する必要はない）。
【００６１】  しかし、不死化細胞が骨髄間質幹細胞である場合、分化誘導物質を添加してそれらを器官特異的部位に分化させる必要がある。
例えば、間質幹細胞を5'-アザシチジンで処理することによりそれらを心筋芽細胞へと分化させることが可能である(Makinoら,上記に引用)。心筋細胞へと発達する可能性を有する幹細胞を5'-アザシチジンで処理することで、脱メチル化の結果として分化プロセスが誘導される。これに関しては、プロモーターがまだ知られていない必須の心筋細胞分化遺伝子により活性化される可能性が高い。
【００６２】  しかし、本発明者らの見解によれば、5'-アザシチジンには変異誘発性がある。この理由には、幹細胞の心筋細胞への分化が、本発明によれば、少なくとも１種類のさらなる分化誘導物質の添加により増進することがある。この目的にはトリコスタチンA(TSA)が提案される。TSAはヒストン脱アセチル化を阻害する。このヒストン脱アセチル化はCpGメチル化の転写抑制に関わっている。
CpG島、すなわちいくつかのCpGジヌクレオチドを含有する領域はプロモーターに多く認められる。メチル化によってCpGを多く含有するプロモーターの活性を実質的に阻害することができる。例えば、アザ基が5の位置に存在することから細胞プロセスの結果としてのメチル化はこの位置では起こらないため、5'-アザシチジンが細胞を複製するDNAに組み込まれる場合にこれが起こる。
【００６３】  よって、腫瘍細胞ですでに示されたように、5'-アザシチジンとTSAとの組合せによって相乗的な作用が得られる(Cameronら, "Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer", Nat. Gehet., 第21巻, 103-107頁参照)。
本発明によれば、この相乗作用が幹細胞の心筋細胞への分化に用いられる。この分化はオールトランスレチノイン酸およびアンフォテリシンBをさらに添加することによりさらに最適なものとなる。レチノイン酸は筋芽細胞系H9C2において骨格筋表現型よりも心筋表現型を選択する分化誘導物質である(Menardら、"Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells",J. Biol. Chem., 第274巻, 29063-29070頁参照)。
【００６４】  また、アンフォテリシンBは心筋細胞への分化に有利な効果を示し得る(Phinneyら、"Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variation in yield, growth, and differentiation", J. Cell. Biochem., 第72巻, 570-585頁参照)。
数種類の分化誘導物質の組合せを使用する利点は、これにより5'-アザシチジンの変異誘発効力を実質的に低下させるまたは完全に破壊してしまうという相乗効果が得られることである。このことは幹細胞により誘導された心筋細胞のその後の臨床使用にかなり重要なことである。
【００６５】  分化誘導物質デクサメタゾン(Congetら、上記に引用)を単独でまたは上記4種類の分化誘導物質との組合せで使用する場合には幹細胞を骨細胞および軟骨細胞へと分化することが可能である。
実施例4：不死化の逆転
実施例3で記載したように増殖させ、要すればさらに分化させた細胞をその後移植できるようにするためには、移植細胞が腫瘍細胞に変性しないように不死化を再び無効にする必要がある。
【００６６】  これは図1に示す遺伝子複合体から2つのLoxP部位間の遺伝子領域を切除する酵素Creリコンビナーゼを用いることにより達成される。またこれはCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルス(Ad-Prom-Cre)で細胞を感染させることによっても行うことができる。このように、不死化はいずれかの所望の時点において元に戻すことができる。
プロモーターが相同組換えされた図1に示す遺伝子複合体に残存することから、切除されたDNA配列にはそれらが欠けているため、増殖細胞では発現させることができない。また、ポリ(アデニル化)シグナルがプロモーターにフランキングしていることから、細胞DNAに組み込まれるプロモーターではcis位にあるいずれの隣接細胞配列も活性化することができない。
【００６７】  しかし、さらなる安全な手段として、TK自殺遺伝子もまた図1に示す遺伝子複合体に組み込まれる。図1に示すその細胞の遺伝子複合体がなお無傷である細胞はチミジンキナーゼを発現し、さらにガンシクロビルを添加することにより選択的に死滅し得る。
Ad-Prom-Creで細胞を感染させる代替法として、Creリコンビナーゼ酵素を融合タンパク質、例えば組換えCre-VP22として投与してもよい。細胞に浸透可能なこの融合タンパク質は細胞培養培地に添加され、voyagerタンパク質VP22を含む融合物のため、増殖細胞に拡散する。
実施例5：移植
実施例4で記載したように不死化を元に戻した後、さらに好適な品質制御を行い、その後、通常の技術を用いて、例えば、注射器でそれらを器官に注入することにより細胞を損傷器官に移植する。不死化によりどんな所望の量であっても材料が入手可能であるため、これを繰り返して行うことができる。
【００６８】  不死化を行わない場合、1つの幹細胞から約5×108ないし1×109細胞、高齢者のドナーなら1×106細胞しか誘導できない。再生にはこれでは少なすぎる。さらに、自己移植の場合、患者は細胞が増殖し、必要数の細胞が得られるまで待機しなければならない。これに対し、移植が同種のものである場合には、所望の数の細胞がいつでも得られる。
特に必要である場合には、まず同種移植を行い、その後続けて自己移植に転換することが好適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  細胞を可逆的に不死化する遺伝子複合体の図解。
【図２】  細胞を免疫調節する遺伝子複合体の図解。
【図１】
0005313425.tif 000002
【図２】
0005313425.tif 000003