(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、当該細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別するための細菌検出方法。
【請求項２】
抗体が酵素と結合した抗体である、請求項１に記載の細菌検出方法。
【請求項３】
クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、当該細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別するための細菌検出用試薬キット。
【請求項４】
抗体が酵素と結合した抗体である、請求項３に記載の細菌検出試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、最も一般的な性行為感染症（sexually transmitted disease STD)の原因微生物であるクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)に属する微生物を検出する抗体、該微生物の検出方法、該微生物の検出用試薬キット、及び該微生物検出用抗体の製造方法に関する。
本発明は、医療上、特にクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)によって惹起される典型的な STDの診断に重要である。本発明は、検体、例えば、膣の採取分泌物、尿サンプル、組織サンプル、および体液から採取された検体中に含まれる微生物クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)を検出するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】  微生物感染症の診断は通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。この中でも原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
感染症原因菌の検出は、一般に、培養・同定法（原因菌を分離、培養してその生理学的、生化学的あるいは構造的な特性に基づきこれを同定する方法）、遺伝子的診断法（原因菌の遺伝子を PCR法または特異的核酸ハイブリダイゼーションにより増幅させて、これを検出する方法）、および免疫学的方法（抗体と原因菌の抗原マーカーとの特異的反応を利用して原因菌を検出する方法）に分類される。しかしながら、培養・同定法または遺伝子的診断法を用いる場合には、結果を得るのに長時間を要する。従って、原因菌を短時間、高感度で検出することができ、迅速かつ的確に患者を処置することのできる免疫学的方法による診断法が多用される。【０００３】  従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)はヒトに特有な原因菌であり、最も一般的な性行為感染症の原因菌となる。この菌は小さな、非運動型のグラム陰性菌である。この菌により男女ともに直腸炎および結膜炎（トラコーマ−細菌由来の病名）を発症する。女性はクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)により子宮頚管炎、尿道炎、子宮内膜炎、卵管炎、肝周囲炎、LGVに感染する。卵管炎は、女性の不妊症と子宮外妊娠の最も普通の原因の１つである骨盤炎症性疾患(PID) を引き起すおそれがある(Much and Yeh 1991; Kligman, Grifo et al.1997)。また、新生児にトラコーマ（封入体性結膜炎）を発症させることもある。発展途上国の盲人の40％以上はトラコーマによるものである。【０００４】  この菌は、非常に微小の、偏性寄生生物であり、光学顕微鏡では観察し難く、宿主細胞の細胞質中で成長する。組織培養液中でのクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の成長は非常に緩慢であり、培養液中に菌を同定するまでに少なくとも３〜５日間を要する。更に、試験室での組織培養で生体外感染を起こすことは容易でない(Thomas, Evans et al.1978; Poussin, Fuentes et al.1997; Okadome, Notomi et al.1999) 。従って、迅速に病原菌として検出する診断法としては、グラム染色法と培養法などを適用することができない。【０００５】  いくつかのクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)検出用 PCR法または分子生物学的手法が最近になって開発された(US pat. No.6,010,857 Lee, Helen H. 2000; US pat. No.5,846,785 Burczak et al.1998; US pat.No.5,837,469 Harris; James M.1998  など) 。これらの方法は特異的、かつ高感度であり、検出に時間がかかる。
クラミジア(Chlamydia) 属の場合、属特異的抗原であるリポ多糖(LPS) の抗原決定基としての存在が知られており、様々な診断用キットにおいて特にクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の検出用試薬抗体に利用されている(Mearns,Richmond et al.1988; Bishop, Tullo et al.1991; Thiele, Karo et al.1992)。
更に、Petersonら(Peterson, Alexander et al.1987)、およびその他の研究者(Barsoum,Goodman et al.1989; Mohanty, Satpathy et al.1996)はクラミジア(Chlamydia) 属の主要外膜蛋白質(MOMP)に対するモノクローナル抗体を報告している。
クラミジア病原体を検出する商業的に利用可能なモノクローナル抗体および分析用キットの数はごく僅かであり、十分というには程遠い。最近になって、いくつかのクラミジア病原体の血清型が報告された。LPS またはMOMPは菌株によって異なり、一つの血清型に対する抗体がすべてをカバーするものではない (Tekgul,Aktepe et al.1992; Matthews, Pandit et al.1993; Mohanty,Satpathy et al.1996) 。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)に属する微生物を特異的、かつ高感度に迅速に検出する方法、その検出に用いる検出用抗体、検出用試薬キットを提供することを課題とする。さらに、本発明は、その検出に用いる検出用抗体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者等は、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化はきわめて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つとともに、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。
【０００８】  本発明者らは全ての微生物細胞に同一機能の分子として存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種である Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に着目した。Ribosomal Protein L7/L12蛋白質は分子量約13キロダルトンの蛋白質であり、蛋白質合成に必須のリボソーム蛋白質として存在することが知られている。クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)を含むいくつかの微生物では Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質の完全なアミノ酸配列が解明された。
【０００９】  本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらずその一部に各微生物固有の構造部分を持つことに着目し、このクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物、細菌の種特異的でかつ全ての同一菌種内の血清型について検出が可能であることを見いだした。本発明者等は、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の該蛋白質に特異的な抗体が得られること、および該抗体を用いることによりクラミジア・トラコマチス (Chlmydia trachomatis)の特異的な検出が可能であることを見出し、本発明を完成した。
本発明により、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体が見出され、開発された。この抗体は新規であり、従来公知のいかなる抗体とも異なり、上記蛋白質と特異的に反応する性質を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】  配列表において配列番号１及び２はクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12遺伝子の DNA配列及び対応するアミノ酸配列である。完全なゲノム配列が公表され (Stephens, Kalman et al.1998; Kalman,Mitchell et al.1999)、World Wide Webで入手可能である(NCBI data base, accession # AE001304 & 1AE001273)。なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基（以下、N 末）およびカルボキシル基末端（以下、C 末）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ5'末端および3'末端である。クロスマッチテストのアミノ酸配列のアミノ酸は１文字略字で表している。また、クロスマッチテストにおける「＋」の表記は、異なるアミノ酸であるが、疎水性などの性質が類縁のアミノ酸であること、「    」のブランクは性質も含めて全く異なるアミノ酸であることを示す。
また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えば Molecular Cloning, A labolatory manual, Cold Spring Harber Laboratory Press,Sambrook,J.ら (1989) を挙げることができる。
【００１１】
【表１】
0005351367.tif 000002
【００１２】  本発明において“微生物”とは、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)を意味し、特に、STD の病原性を有しクラミジア(Chlamydia ) 感染症の原因菌として診断の意義の高い微生物をいう。
本発明において、“ 微生物と特異的に反応する抗体" とは、或る種または属の微生物と特異的に反応する抗体を意味する。或る種の微生物と特異的に反応する抗体は、特に、微生物感染症の診断に有用である。
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指し、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないが Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。
【００１３】  このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、または KLH(keyhole-limpet hemocyanin) や BSA(bovine serumalbumin) といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでRibosomal  Protein L7/L12 蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。
【００１４】  また該蛋白質の全長または５残基以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸配列をGST(グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）などとフュージョン蛋白としたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。
成書(Antibodies a laboratory manual, E.Harlow et al., Cold Spring Harbor Labolatory)に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて培養した細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
【００１５】  本発明のマーカー抗原として用いることができる Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができる。
a) Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白のアミノ酸配列との類似性の少ない領域についてペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
また、既知の該遺伝子の両端部位における DNA配列をプローブとした PCR手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
【００１６】  次いで、他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子が作成され、フュージョン遺伝子は大腸菌を宿主細胞として用いて通常の遺伝子挿入法により宿主に挿入され、大量に発現せしめられる。所望の蛋白質抗原は、発現した蛋白質をアフィニティカラム法によって精製することによって、フュージョン蛋白質として用いられた蛋白質の抗体とともに、得ることができる。この場合 Ribosomal Protein L7/L12 の全長蛋白が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００１７】  b) Ribosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が菌種間で50〜60％相同であることにより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にして PCR法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を錫型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子が作成され、フュージョン遺伝子は大腸菌を宿主細胞として用いて通常の遺伝子挿入法により宿主に挿入され、大量に発現せしめられる。所望の蛋白質抗原は、発現した蛋白質をアフィニティカラム法によって精製することによって、フュージョン蛋白質として用いられた蛋白質の抗体とともに、得ることができる。この場合 Ribosomal Protein L7/L12 の全長蛋白が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００１８】  c)あるいは Ribosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する５〜30アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製する。
該抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製された Ribosomal Protein L7/L12蛋白質を取得することができる。該抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトによって破砕した微生物から所望の蛋白を取得することができる。蛋白の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製したのち作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法により Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の溶出フラクションを同定し精製画分を得ることができる。得られた精製  Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００１９】  上記の方法ａ）、ｂ）およびｃ）によって得られた、種々の微生物に特異的な本発明の抗体は、微生物に特異的な各種の診断試薬およびキットを利用する、種々の免疫学的分析法に用いることができる。例えば、この抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術である ELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉(Capture) 抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
抗体を用いる微生物診断方法とは、ポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術である ELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法を利用する診断方法を意味する。
【００２０】  また、特に抗体を用いる有用な微生物診断方法として特表平7-509565号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ（OIA,Optical Immunoassay)などが高感度な診断方法として有用である。
【００２１】  また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、TritonX-100,Tween-20をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられる。界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
【００２２】  また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００２３】  クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列及び DNA配列を配列表に示す。従って、この微生物の場合は Ribosomal protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列を、配列表に「クロスマッチ」と記した類似の微生物の同種の蛋白質と比較することが可能である。相同性の低いセグメントのペプチドを合成し、これに対するポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作成することは、微生物に対する特異性を有するものの選択を省略することを可能とする。
【００２４】  特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清を Protein Aカラム等で精製しIgG 画分を取得したのち、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドに
よるアフィニティー精製を実施することが望ましい。
【００２５】  更に、当該微生物のRibosomal Protein L7/L12の DNA配列から N末端と C末端の配列に基づいて PCRプライマーが作成された。この PCRプライマーの相同性を利用して、ゲノム DNAを用いて PCR法により DNA断片を増幅させ、これを抽出し、常法によりクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)を取得することができる。クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12遺伝子の全長はこれらの断片の DNA配列情報を分析することにより知ることができる。
【００２６】  取得したクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12遺伝子は、例えば GST（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、菌体破砕液を GSTを用いたアフィニティカラムで精製することにより、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質と GSTのフュージョン蛋白質が得られる。この蛋白質をそのまま、あるいは GST部分を切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマクローンを確立し、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)菌体あるいは菌体破砕液またはクラミジア・トラコマチス
(Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
【００２７】  本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術である ELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００２８】  また本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するいわゆる捕捉(capture) 抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾していわゆる酵素標識抗体とすることにより、検出用抗体としても機能しうる。
【００２９】  以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】  クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)からの Ribosomal Protein L7/L12 遺伝子のクローニング
クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis) (ATCC VR-885ATCC から分譲、購入）をHL細胞のモノレイヤー上で培養した。クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の詳細な培養方法は Reed らおよびKuo ら (Reed,Anderson et al.1981; Kuo and Grayston 1990)の記載に従った。CO２  インキュベータ内にて37℃、５％ CO２の条件下で微生物を５日間培養した。感染した細胞を遠心分離により集め、最終的に５×10７  個/ml 前後の濃度となるようにTE Buffer  (和光純薬工業製) に懸濁した。この懸濁液約1.5ml を微量遠心チューブに移し取り10,000rpm で２分間遠心した。上澄み液を棄てた。沈殿部分を 567μl のTEバッファーに再懸濁した。さらに30μl の10％ SDSと３μl の20mg/ml ProteinaseK 溶液を加えて良く混合し、37℃で１時間インキュベートした。懸濁液を56℃で更に１時間インキュベートした。次に10％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド/0.7M NaCl溶液を80μｌ加え、よく混合したのち65℃で10分間インキュベートした。同一体積の24:1のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を700 μl 加えよく攪拌した。この溶液を微量遠心機で 12,000rpm、５分間、４℃で遠心処理したのち、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに 0.6倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振って DNAの沈殿を形成した。白い DNA沈殿をガラス棒ですくって１mlの70％エタノール（−20℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。その後チューブを10,000rpm で５分間遠心し、上清を静かに除去した。１mlの70％エタノールを追加し、混合物を更に５分間遠心した。【００３１】  再び上澄みを除去したのち沈殿を 100μｌのTEバッファーに溶解し DNA溶液を得た。このゲノム DNA溶液の濃度を Molecular Cloning, A laboratory manual,1989,Eds.Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.,Cold Spring harbor Laboratory Press の E5,Spectrophotometric Determination of the Amount of DNA or RNAに従って定量した。【００３２】  このゲノム DNAのうち10ngを用いて PCR(polymerase chain reaction) を行った。PCR は Taqポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR001A）を用いた。５μl のバッファー、４μl のdNTP混合物、および各200pmol のオリゴヌクレオチド（配列表配列番号：３および４に示すもの）を酵素に加えた。全体の容量が50μl となるように精製水を加えた。【００３３】  この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 を用いて、95℃１分、50℃２分、72℃３分を５サイクル行ったのち、95℃１分、60℃２分、72℃３分を25サイクル行った。この PCR生成物の一部を用いて、1.5 ％アガロースゲル中にて電気泳動を実施した。エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約400bpのcDNAが増幅されていることを確認した。制限酵素BamHI およびXhoIを用いて切断後、1.5 ％アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約 400bpのバンドを切り取った。このバンドをSuprec01 (宝酒造株式会社製）で精製し、一般的なベクターであるpGEX-6P-1 (Pharmacia社製）に挿入した。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことにより GST蛋白質とのフユージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。【００３４】  具体的にはベクターpGEX-6P-1 と先の DNAとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、T4DNA リガーゼ（Invitrogen 社製）にてベクターに DNAを組み込んだ。 DNAを組み込んだベクターpGEX-6P-1 は大腸菌のワンショットコンピテントセルに遺伝子学的手法により導入し、ついで50μg/mlのアンピシリン（シグマ社）を含む半固体状の培養プレートであるＬ−ブロス寒天（宝酒造株式会社製）に接種した。プレートを37℃で12時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むＬ−ブロス培養液に接種した。37℃で８時間振とう培養・集菌後、Wizard Miniprep を用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。プラスミドは制限酵素BamHI/XhoIにて切断処理した。約 370bpの DNAを切断することによって PCR生成物の挿入を確認した。挿入された DNAの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。【００３５】  挿入 DNA断片の塩基配列の決定は、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。
シークエンスサンプルの調製はPRISM,Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 社製）を用いて行なった。先ず、9.5 μｌの反応液、4.0 μl の 0.8pmol/ μl のT7プロモータープライマー（Gibco BRL)、および 6.5μl の0.16μg/μl テンプレート DNAを0.5ml のマイクロチューブに加え、混合した。混合物を２層の 100μl 鉱油で覆ったのち、25サイクルＰＣＲ増幅処理を行った。ここで、１サイクルは、96℃での30秒間の処理、55℃での15秒間の処理、および60℃での４分間の処理からなる。生成物を４℃で５分間保持した。反応終了後、80μl の無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノールークロロホルム混合液で３回抽出した。10μl の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.2) と 300μｌ のエタノールを 100μl の水層に加え、攪拌した。その後 14,000rpm、室温で15分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を75％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μl の10mMのEDTAを含むホルムアミドに溶解して90℃で２分間で変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。
無差別に選択した５個のクローンのうち２個は PCRに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、Ribosomal Protein L7/L12の遺伝子配列と一致したＤＮＡ配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号１及び２に示すような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】
【００３６】  クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)からの Ribosomal Protein L7/L12遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をLB培地中で50ml 37℃、一昼夜培養した。500mlの２倍濃度のYT培地を37℃で１時間加熱した。１晩培養した大腸菌液50mlを 500mlの前述の培地に入れた。１時間後、 550μl の100mM イソプロピルβ-D(-)-チオガラクトピラノシド(IPTG)を導入し、４時間培養した。生成物を回収し、250ml の遠心チューブに移し、7000rpm で10分間遠心した。
上澄みを棄てて50mM Tris-HCl pH7.4 、25％ Sucroseを含む Lysisバッファー25mlずつに溶解した。
さらに10％NP-40 1.25ml、1M MgCl２ 125μl を加えてプラスチックチューブに移した。氷冷下、１分間の超音波処理を５回行った。その後、12,000rpm で15分間遠心し、上清を回収した。【００３７】  次に、PBS でコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、20mM Tris バッファー pH7.4、4.2mM MgCl２  、1mM ジチオスレイトール(DTT) を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。5mM のグルタチオンを含む50mMトリスバッフアー(pH9.6) 中で溶離処理をした。溶出画分の蛋白質含有量をピグメント結合法 (Bradford法; BioRadCo.)で決定し、主画分を取得した。
得られた精製Ribosomal Protein L7/L12/GSTフュージョン蛋白の純度は電気泳動法により確認したところ約75％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】
【００３８】  クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12の蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫については、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のGST フュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質抗原 100μg を 200μl の PBSに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを 200μl 加え混合した。エマルジョン化したのち 200μl を腹腔内に注射した。同じエマルジョン化抗原を２週間後、４週間後、および６週間後に腹腔内に注射した。２倍濃度のエマルジョン化抗原を10週間後および14週間後に腹腔内に注射した。最終の免疫化終了の３日後に脾臓を摘出し、細胞融合した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞 10８個に対し骨髄腫細胞２×10７  個をガラスチューブに取り良く混合したのち1500rpm で５分間遠心し上澄みを棄た。その後細胞をよく混合した。【００３９】  細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、NS-1系の細胞株を用い10％の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養し、細胞融合の２週間前から0.13mMのアザグアニン、0.5 μg/mlのMC-210、10％の牛胎児血清を含む RPMI1640 培地で１週間培養後、さらに10％の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で１週間培養したものを用いた。【００４０】  37℃に保持したRPMI 1640 培養液50mlを混合細胞試料に加え、1,500rpmで遠心分離した。上澄み液を除去後、37℃に保持した50％ポリエチレングリコール1mlを加え、１分間攪拌した。37℃に保持したRPMI 1640 培養液10mlを加え、混合液を殺菌したピペットで約５分間吸引・排出する事により激しく攪拌した。５分間1,000rpmで遠心分離し、上澄み液を除去したのち、細胞濃度が５×10６/mlとなるように30ml HAT培養液を加えた。この混合物を均一になるまで攪拌し、0.1mlずつを96穴の培養プレートに注ぎ、37℃、７％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。ＨＡＴ培地を、第１日、第１週、および第２週にそれぞれ0.1ml ずつ加え、ELISA 法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。【００４１】  0.05％のアジ化ソーダ含む PBS中に溶解したRibosomal Protein L7/L12/GST蛋白および GST蛋白をそれぞれ10μg/ml濃度で希釈した液を 100μl ずつ96穴プレートに別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液(PBS中） 200μl 添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液 (0.02% Tween20,PBS)で洗浄した。これに融合細胞の培養液 100mlを加え、室温にて２時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した。次いで、濃度 50ng/mlのペルオキシダーゼでラベルしたgoat anti-mouse IgG 抗体溶液 100μl を加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB 溶液(KPL社製）を 100μl ずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで１N の硫酸 100μl を加えて反応を停止し、450nm の吸光度を測定した。【００４２】  この結果、GST フュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質にのみ反応しGST には反応しない陽性ウェルが見いだされ Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し24穴プラスティックプレート中、HAT 培地で培養した。
培養した融合培地を細胞数が約20個/ml になるようにHT培地で希釈し50μl を、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞10６  個と96穴培養プレート中で混合した。混合後、７％ CO２条件下、37℃で２週間培養した。
培養上澄み中の抗体活性を前述のELISA 法にて同様に検定し、Ribosomal Protein L7/L12蛋白との反応陽性の細胞を回収した。さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマCTRB-1〜5 の計５クローンを取得した。
【実施例４】
【００４３】  クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質を検出するモノクローナル抗体の選択
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的には、RPMI 1640 培地 (10％ FCS入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に0.5ml のプリスタンを腹腔内に注射したBalb/Cマウスの腹腔内に５×10６  個(PBS中）注射した。３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
得られた抗体を含む溶液をProtein A カラム(5ml bed, Pharmacia 製）に吸収させ、３倍量の PBSで洗浄した。次いで、クエン酸バッファー(pH3) で溶出した。抗体画分を回収し、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を取得した。この５株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてELISA 法により評価した。
モノクローナル抗体の評価にはサンドウィッチ分析法を用いた。作成されたモノクローナル抗体をペルオキシダーゼに結合せしめることにより検出用の抗体として用いた。【００４４】  酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ(SigmaグレードVI) を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用し Analytical Bio-chemistry132(1983), 68-73 に述べられている方法に従って行った。ELISA 反応においては市販の抗クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)ポリクローナル抗体(Biodesign社、ウサギ）を10μg/ml濃度で希釈した液を 100μl ずつ96穴プレートに別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液(PBS中） 200μl 添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液 (0.02％ Tween20,PBS) で洗浄した。これに各微生物の培養液に濃度 0.3％となる量の Triton X-100 を加え、常温で５分間抽出することにより得られた抗原溶液 100μl を加え、室温で２時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度５μg/mlのペルオキシダーゼ標識抗 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質抗体溶液 100μl を加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB 溶液(KPL社製）を 100μl ずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで１N の硫酸 100μl を加えて反応を停止した。450nm の吸光度を測定した。【００４５】  酵素標識抗体としてハイブリドーマCTRB-1由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の全ての株を10６  個/ml の感度で検出すると同時に他の Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniaeおよびNeisseria  meningitides 等の微生物について10８  個/ mlの高濃度でも反応性を示さずRibosomal Protein L7/L12蛋白に対するモノクローナル抗体を用いることでクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。この抗体はAMCT-1と名付けられた。表２はAMCT-1を用いた結果のみを示す。別の微生物と交差反応を示す他の抗体を使用した結果はここで言及しない。【００４６】
【表２】
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【実施例５】
【００４７】  Ribosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis) Ribosomal Protein L7/L12蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得
実施例１に記載の方法により取得したクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis) Ribosomal Protein L7/L12蛋白質またはTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として使用した。 100μg の抗原を含む生理食塩水約 1.2mlをフロイントアジュバント1.5ml とともに乳化した。エマルジョンを SPF日本白色ウサギに皮下注射してウサギを免疫化した。２週間おきに５〜６回免疫し、抗体価を確認した。
抗体価の確認はELISA 法により実施した。0.05％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質を10μg/ml濃度に希釈した液を 100μl ずつ96穴プレートに分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液(PBS中） 200μl 添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液 (0.02％  Tween 20,PBS) で洗浄した。正常のウサギ血清および免疫化したウサギの抗血清を希釈して得られた溶液 100μl を加え、室温にて２時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度 50ng/mlのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG 抗体溶液 100μl を加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液  を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。OPD 溶液(Sigma社製）を 100μｌ  ずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで１N の硫酸 100μｌ  を加えて反応を停止した。492nm の吸光度を測定した。【００４８】  抗体価上昇を確認後、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、37℃で１時間放置後、４℃で一晩静置した。その後3000rpm 5 分間遠心し、上清を回収した。得られた抗血清は４℃で保存した。
クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。HiTrap NHS活性化カラム(1ml, Pharmacia 社製）を用いた。カラムを1mM HCI で置換後直ちにRibosomal Protein L7/L12蛋白質の PBS溶液(1mg/ml)を加えた。カラムを30分間静置後、ブロッキング試薬を加え、PBS で平衡化した。
このクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。この抗血清を PBSで５倍に希釈し、0.45μm のフィルターを通した後、流速0.5ml/min でクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後0.1MグリシンpH2.1 でカラムから溶出し、直ちに1M Tris-HCl pH9.0 で中和した後、抗体価測定法と同様のELISA 法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。【００４９】  このようにして得られたポリクローナル抗体は特表平7-509565号公報に記載されている OIA法により評価した。
精製した抗体は OIA法の捕捉(capture) 抗体として使用した。また検出(detect)抗体としては実施例４に記載したAMCT-1モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ(SigmaグレードVI) を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸 N−ヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalytical Bio-chemistry132(1983), 68-73に述べられている方法に従って行った。
OIA 反応においては0.05％アジ化ナトリウムを含む PBS中の精製ポリクローナル抗体を10μg/ml濃度に0.1M HEPES pH8.0で希釈した液を50μl ずつシリコンウエハー上に添加し室温で30分反応させた後、蒸留水で洗浄し、サッカロース及びアルカリ処理カゼインを含むコーティング溶液でコーティング後、使用した。【００５０】  上記操作で得られた各微生物の培養液に濃度 0.5％となる量の TritonX-100を加え常温で５分間抽出することにより得られた抗原溶液15μｌを上記シリコンウェハー上に添加し、室温で10分間反応させた。次いで、20μg/mlペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を15μｌ加え、10分間反応させた。蒸留水で洗浄後、TMB 溶液（KPL 社製）を15μｌずつ加え、混合物を室温にて５分間反応させた。生成物を蒸留水で洗浄し、酵素反応により生成した青色を肉眼で観察した。
この結果、表３に示すように、精製ポリクローナル抗体APCT-1を捕捉抗体として用いることにより、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)を 108 bacteria/mlの感度で検知できること、および他の微生物の反応性は検知できないことが明らかである。
このようにしてクラミジア・トラコマチス (Chiamydia trachomatis)のRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムにより、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)に特異的に反応するポリクローナル抗体を取得したことを確認した。【００５１】
【表３】
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【発明の効果】
【００５２】  本発明によると微生物の進化の過程で機能的に保持された細胞内分子に対する抗体を用いて特定の種の微生物を特異的に検出できるだけでなく、同一種内の全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を用い、クラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の検出を精度良く行うことができる。
また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行なうことができる。
【００５３】引用文献
（１）米国特許
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No.5,846,785; Burczak,et al.,1998 「MOMP遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドおよびクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の検出法」
No.5,837,469; Harris; James M.1998「増殖によるクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)の分析およびクラミジア・トラコマチス (Chlamydia trachomatis)核酸の検出」
（２）その他の特許文献
特表平7-509565
（３）その他の文献
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【００５４】
【配列表】
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