(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子が導入され、かつ該レポータ遺伝子を発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
レポータ遺伝子が、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉からなる群より選択される器官の組織又は細胞において発現される、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
レポータ遺伝子が、骨格筋、心筋及び平滑筋からなる群より選択される組織又は細胞において発現される、請求項１又は２記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
レポータ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｌａｃＺ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
ショウジョウバエ及び線虫を含む無脊椎動物、ゼブラフィッシュ及びメダカを含む魚類、ニワトリ及びウズラを含む鳥類、マウス、ラット、イヌ、ミニブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、マーモセット及びカニクイザルを含む哺乳動物からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列及び転写調節領域の下流にレポータ遺伝子が連結された発現カセットが導入されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
発現カセットにおいてレポータ遺伝子の上流に核移行シグナル配列が連結されている、請求項６記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
発現カセットにおいてレポータ遺伝子の下流にポリＡシグナル配列が連結されている、請求項６又は７記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物から得られ、かつレポータ遺伝子を発現することを特徴とする細胞。
【請求項１０】
脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉からなる群より選択される器官に由来する細胞である、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞である、請求項９又は１０記載の細胞。
【請求項１２】
筋芽細胞又は静止期筋衛星細胞である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
マクロファージ、線維芽細胞、グリア細胞、脂肪細胞及び血管内皮細胞からなる群より選択される細胞である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
（ａ）請求項９〜１３のいずれか１項に記載の細胞を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択するステップ
を含む、ユートロフィン遺伝子の発現を増大又は低減する薬物をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
（ｄ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択するステップ
を含む、ユートロフィン遺伝子の発現を増大又は低減する薬物をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行う、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項９〜１３のいずれか１項に記載の細胞を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ
を含む、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
（ｄ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ
を含む、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行う、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＢ）又は多発性筋炎である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）請求項１１又は１２記載の細胞を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ
を含む、筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
（ｄ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物の筋組織又は筋細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ
を含む、筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
請求項２１記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行う、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
（ｇ）選択された薬物候補を筋疾患又は筋障害の非ヒトモデル動物に投与するステップ、
（ｈ）上記薬物候補が上記非ヒトモデル動物における筋疾患又は筋障害に影響を及ぼすか否かを判定するステップ
をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
筋疾患又は筋障害が筋ジストロフィーである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）及び転写調節領域の制御下に、核移行シグナル、レポータ遺伝子及びポリＡシグナル配列からなる配列を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項２７】
ユートロフィン遺伝子の転写調節領域が配列番号１８に示す塩基配列を含む、請求項２６記載のプラスミド。
【請求項２８】
請求項２６又は２７記載のプラスミドがトランスフェクトされ、かつレポータ遺伝子を発現することを特徴とする細胞。
【請求項２９】
骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞である、請求項２８記載の細胞。
【請求項３０】
非ヒト生殖細胞又は胚性幹細胞である、請求項２８記載の細胞。
【請求項３１】
（ａ）請求項２６又は２７記載のプラスミドを用いてトランスジェニック非ヒト動物を作出するステップ、
（ｂ）作出したトランスジェニック非ヒト動物の中からレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を選抜するステップを含む、ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子を発現する非ヒト動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユートロフィン遺伝子の発現制御機構を利用してレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物及びそれに由来する細胞に関する。また本発明は、該トランスジェニック非ヒト動物及びそれに由来する細胞を用いた、ユートロフィン遺伝子の発現に影響を及ぼす薬物のスクリーニング方法、及び筋疾患又は筋障害の薬物候補のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋障害の典型例である筋ジストロフィー、とりわけジストロフィン欠損によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ染色体上の突然変異を原因として、筋細胞の細胞骨格を担うジストロフィンを欠損する重症の遺伝子性筋疾患である。この発症率は新生男児３，５００人に１人と比較的高い上に、３分の１は母体の卵細胞レベルにおける突然変異によるため遺伝相談による予防が必ずしも有効ではない。そこで、この重症で致死性の遺伝子性筋疾患に対して治療法の開発が求められている。しかし、遺伝子治療及び幹細胞移植治療に関しては免疫応答及び有効性の低さなど解決すべき問題が数多く残されている。また、薬物療法も行われているが、副作用が強いことが報告されている。そこで、比較的アプローチが容易な分子病態の解明に基づく薬物治療の開発を目指すことには十分な意義がある。
【０００３】
ＤＭＤに対する薬物開発のターゲットの一つとしてＤＭＤで欠損しているジストロフィンのホモログであるユートロフィンが注目されている（非特許文献１参照）。ユートロフィンは、ジストロフィンに構造が似ている細胞骨格タンパク質であり、筋損傷時の回復過程で筋細胞膜に発現が増加することが知られているが、正常では成熟した筋肉の筋細胞膜では発現がみられず、神経筋接合部及び筋腱接合部でのみ発現している。発生過程の筋肉や再生した筋肉では一過性に筋細胞膜にも発現することがわかっているため、ユートロフィンを過剰発現させることによりジストロフィン欠損状態を代償する可能性が示唆されており、筋ジストロフィーに対する治療効果が期待されている。しかしながら、これまでに英国Oxford大学のKay Davies教授は数万種類に及ぶ薬剤のスクリーニングを行ったと報告しているが、ユートロフィンの発現を増大する有効な薬剤は見出されていない。
【０００４】
本発明者の研究グループは、アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入の過程で、過剰な免疫応答に伴って、ユートロフィンの発現増強を生じ、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスにおける筋ジストロフィーの表現型が緩和されることを見出した（非特許文献２）。更にインターロイキン６（ＩＬ−６）の単独導入によりユートロフィンの発現増強を再現できた（非特許文献３）。しかしながら、ＩＬ−６単独投与の場合にはユートロフィンの発現増強期間が短いことや、ＩＬ−６の毒性が強いことなどから、これらを治療薬として実用化することは難しい。このアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入で使用されたコンストラクトは、ｌａｃＺ遺伝子の上流にトリ由来βアクチン遺伝子プロモータ及びサイトメガロウイルスエンハンサを付加し、下流にポリＡシグナルが付加されたものであり、ユートロフィン遺伝子を導入したものではなく、アデノウイルスベクター導入に対する生体内の免疫応答の結果、ユートロフィンが筋細胞膜にも発現することが示されたものである。
【０００５】
ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列は、筋の再生過程におけるユートロフィンの発現増強に重要な働きを担っていることが示されている（非特許文献４）。このＤＵＥ配列の制御下に外来遺伝子を連結してトランスジェニック動物を作出し、その動物において外来遺伝子が発現されたとの報告はない。
【０００６】
また、筋ジストロフィー治療のための薬剤のスクリーニング系の確立も望まれている。例えば、ユートロフィンの発現を増大する薬剤をスクリーニングするための方法が開発されているが、骨格筋及び心筋におけるユートロフィンの発現制御が困難であり、筋ジストロフィー治療のための薬剤のスクリーニングには有効ではなかった（非特許文献５）。
【０００７】
【非特許文献１】Jonathan M et.al. Amelioration of the dystrophic phenotype of mdx mice using a truncated utrophin transgene. Nature 第384巻第349〜353頁、1996年
【非特許文献２】Yamamoto K et al. Immune response to adenovirus-delivered antigens upregulates utrophin and results in mitigation of muscle pathology in mdx mice. Hum Gene Ther 第11巻第669〜680頁、2000年
【非特許文献３】Fujimori K et al. Interleukin-6 induces overexpression of the sarcolemmal utrophin in neonatal mdx skeletal muscle. Hum Gene Ther 第13巻第509〜518頁、2002年
【非特許文献４】Galvagni F et al. The utrophin gene Is transcriptionally up-regulated in regenerated muscle. J Biol Chem 2002; 277: 19106-13
【非特許文献５】Takahashi J et al. The utrophin promoter A drives high expression of the transgenic LacZ gene in liver, testis, colon, submandibular gland, and small intestine. J Gene Med 第7巻第237〜248頁、2005年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ユートロフィンは、ジストロフィンのホモログであり、筋肉の細胞骨格タンパク質であるため、ユートロフィンを発現増強させることによって筋疾患又は筋障害を治療又は予防できる可能性がある。そこで、ユートロフィンの発現に影響を及ぼす物質を探索するための方法及びツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列と転写調節領域の下流にレポータ遺伝子を連結した発現カセットをマウスに導入することによって、該レポータ遺伝子が骨格筋及び心筋の両方において発現されることを確認し、このマウスを利用して、ユートロフィンの発現増強に結びつく薬物、転写因子等のハイスループットスクリーニングを行うことができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１１）である。
【００１１】
（１）ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子が導入され、かつ該レポータ遺伝子を発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
上記トランスジェニック非ヒト動物において、レポータ遺伝子は、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉からなる群より選択される器官の組織又は細胞において発現される。好ましくは、レポータ遺伝子は、骨格筋、心筋及び平滑筋からなる群より選択される組織又は細胞において発現される。
上記レポータ遺伝子としては、限定されるものではないが、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｌａｃＺ）が挙げられる。
上記トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、ショウジョウバエ及び線虫を含む無脊椎動物、ゼブラフィッシュ及びメダカを含む魚類、ニワトリ及びウズラを含む鳥類、マウス、ラット、イヌ、ミニブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、マーモセット及びカニクイザルを含む哺乳動物などである。
また、上記トランスジェニック非ヒト動物は、ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列及び転写調節領域の下流にレポータ遺伝子が連結された発現カセットが導入されたものである。該発現カセットにおいては、レポータ遺伝子の上流に核移行シグナル配列が連結されていることが好ましく、及び／又はレポータ遺伝子の下流にポリＡシグナル配列が連結されていることが好ましい。
【００１２】
（２）前項（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物から得られ、かつレポータ遺伝子を発現することを特徴とする細胞。
上記細胞は、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉からなる群より選択される器官に由来するものである。好ましくは、骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞であり、より好ましくは筋芽細胞又は静止期筋衛星細胞である。また、細胞は、マクロファージ、線維芽細胞、グリア細胞、脂肪細胞及び血管内皮細胞などであってもよい。
【００１３】
（３）以下のステップを含む、ユートロフィン遺伝子の発現を増大又は低減する薬物をスクリーニングする方法：
（ａ）前項（２）に記載の細胞を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択するステップ。
【００１４】
（４）以下のステップを含む、ユートロフィン遺伝子の発現を増大又は低減する薬物をスクリーニングする方法：
（ｄ）前項（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択するステップ。
上記方法においては、前項（３）に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行うことができる。
【００１５】
（５）以下のステップを含む、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法：
（ａ）前項（２）に記載の細胞を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ。
【００１６】
（６）以下のステップを含む、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法：
（ｄ）前項（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ。
上記方法においては、前項（５）に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行うことができる。
また、前項（５）及び（６）の方法において、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害としては、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及び多発性筋炎が上げられる。
【００１７】
（７）以下のステップを含む、筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法：
（ａ）前項（２）に記載の、骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞（好ましくは筋芽細胞）を被験薬物と接触させるステップ、
（ｂ）上記細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｃ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ。
【００１８】
（８）以下のステップを含む、筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする方法：
（ｄ）前項（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験薬物を投与するステップ、
（ｅ）上記トランスジェニック非ヒト動物の筋組織又は筋細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定するステップ、
（ｆ）レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を薬物候補として選択するステップ。
上記方法においては、前項（７）に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を行った後、ステップ（ｄ）〜（ｆ）を行うことができる。
前項（７）又は（８）に記載の方法は、さらに以下のステップ：
（ｇ）選択された薬物候補を筋疾患又は筋障害の非ヒトモデル動物に投与するステップ、
（ｈ）上記薬物候補が上記非ヒトモデル動物における筋疾患又は筋障害に影響を及ぼすか否かを判定するステップ
を含むものであってもよい。
また前項（７）及び（８）に記載の方法において、筋疾患又は筋障害としては、筋ジストロフィーが挙げられる。
【００１９】
（９）ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）及び転写調節領域の制御下に、核移行シグナル、レポータ遺伝子及びポリＡシグナル配列からなる配列を含むことを特徴とするプラスミド。
上記プラスミドにおいて、ユートロフィン遺伝子の転写調節領域としては、例えば配列番号１８に示す塩基配列を含むものを用いることができる。
【００２０】
（１０）前項（９）に記載のプラスミドがトランスフェクトされ、かつレポータ遺伝子を発現することを特徴とする細胞。
上記細胞は、例えば骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞である。また上記細胞は、生殖細胞又は胚性幹細胞であってもよい。
【００２１】
（１１）以下のステップを含む、ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子を発現する非ヒト動物の作出方法：
（ａ）前項（９）に記載のプラスミドを用いてトランスジェニック非ヒト動物を作出するステップ、
（ｂ）作出したトランスジェニック非ヒト動物の中からレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を選抜するステップ。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ユートロフィンの発現制御機構を使用してレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物及びその細胞が提供される。該トランスジェニック非ヒト動物及びその細胞は、ユートロフィンの発現制御機構を使用するものであるため、レポータ遺伝子の発現に基づいてユートロフィン遺伝子の発現に影響を及ぼす薬物を簡便かつ効率的にスクリーニングすることが可能となる。従って、ユートロフィン遺伝子の発現に関連する疾患又は障害、さらにはユートロフィンで補うことができるジストロフィン欠損に関連する疾患又は障害（例えば筋ジストロフィー）の治療又は予防に使用可能な薬物候補をスクリーニングすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、ユートロフィン遺伝子の下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列を利用することによって、ユートロフィン遺伝子の発現制御機構により外来遺伝子をトランスジェニック動物の種々の組織及び細胞（特に筋細胞及び筋組織）において発現できるという知見に基づいている。従って、ＤＵＥ配列及びユートロフィン遺伝子転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子が導入されたトランスジェニック動物及び細胞において、該レポータ遺伝子の発現を測定することによって、ユートロフィン遺伝子の発現に影響を及ぼす条件又は薬物を同定することが可能となる。
【００２５】
１．ユートロフィン遺伝子の発現制御
（１）ユートロフィン遺伝子の転写調節領域の機能
ユートロフィンには、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉など全身の臓器で発現されるＡ−ユートロフィンと、血管内皮で発現されるＢ−ユートロフィンの２種類があり、Ａ−及びＢ−ユートロフィンの２つは異なるＮ末端配列を有する（図１（Ｂ））。骨格筋及び心筋におけるユートロフィン遺伝子発現調節機構を明らかにするため、本発明者は、Ａ−ユートロフィン遺伝子の転写調節領域に相当する上流（５．４ｋｂ）からエクソン２の翻訳開始点直前までの約１２．９ｋｂと、レポータ遺伝子として核移行シグナル（ｎｌｓ）を付加したｌａｃＺ遺伝子とを連結した発現カセット（Ｇｎｌｓマウス用発現カセット）を含むコンストラクトを得た。次に同コンストラクトを導入したトランスジェニックマウス（Ｇｎｌｓマウス）を作製し、４系統を得た。同マウスにおけるレポータ遺伝子の発現を解析したところ、肝臓、精巣、顎下腺、大腸、小腸等の組織においてｌａｃＺ遺伝子の発現がみとめられ、それらの組織では内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現していた（図３（Ａ））。また、Ｇｎｌｓマウスでは大脳、小脳においては一部の系統でｌａｃＺ遺伝子の発現が内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現していたが、心臓及び筋肉におけるｌａｃＺ遺伝子の発現は内在性Ａ−ユートロフィン遺伝子の発現を再現できなかった（図３（Ａ）；非特許文献５）。また、カルジオトキシン（ＣＴＸ）の注入により骨格筋に損傷を与え、筋再生を誘導すると内在性のユートロフィンの発現は増大したにも関わらず、ｌａｃＺ遺伝子の発現は誘導されていなかった（図８（Ａ）；非特許文献５）。このことから、Ａ−ユートロフィン遺伝子転写調節領域を含む上流塩基配列約１２．９ｋｂは、肝臓、精巣等の組織におけるユートロフィンの発現制御には十分であるが、骨格筋、心筋等の筋組織及び細胞における発現制御には十分ではないことが明らかとなっていた（比較例１；非特許文献５）。
【００２６】
（２）下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列の機能
本発明者は、骨格筋及び心筋におけるユートロフィンの発現調節機構を明らかにするために、約１２．９ｋｂの上流塩基配列に加えて下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列を用いることにより、トランスジェニックマウス（ＤＵＥマウス）の骨格筋及び心筋における発現制御が可能となることを見出した（実施例１）。
【００２７】
下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）配列は、ユートロフィン遺伝子のイントロン２内に存在するエンハンサであり（図２）、筋の再生過程におけるユートロフィンの発現増強に重要な働きを担っていることが示されている（Galvagni F et al. The utrophin gene Is transcriptionally up-regulated in regenerated muscle. J Biol Chem 2002; 277: 19106-13）。
【００２８】
ＤＵＥマウスでは、肝、精巣、顎下腺、大腸、小腸等の組織においてｌａｃＺ遺伝子のより強い発現が認められ、内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現していた（図３（Ｂ））。一方、大脳、小脳、骨格筋及び心筋においても内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現する形でｌａｃＺ遺伝子の発現が認められた（図３（Ｂ））。また、ＣＴＸの注入により骨格筋に損傷を与え、筋再生を誘導すると、ｌａｃＺ遺伝子の発現がｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で増強されたことから、ＤＵＥ配列がユートロフィンの骨格筋での発現制御に深く関わることがわかった（図８（Ｂ））。
【００２９】
従って、上述のようにＤＵＥ配列が骨格筋及び心筋におけるユートロフィン発現制御に重要であることが明らかになったことは、ユートロフィンの発現制御機構を解明する上で重要な知見であるだけでなく、ユートロフィンのＤＵＥ及び転写調節領域の制御下にてレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック動物及び細胞を用いることによって、ユートロフィンの発現増強を促す薬物を、レポータ遺伝子の発現を利用して簡便かつ効率的にスクリーニングすることが可能となる。
【００３０】
２．トランスジェニック非ヒト動物及びその細胞
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、当技術分野で公知の技術を用いて、ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子を導入することにより作製することができる。
【００３１】
トランスジェニック動物の作製においては、動物においてレポータ遺伝子をＤＵＥ配列及びユートロフィン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現させるためのベクター（核酸構築物）を使用することが好ましい。かかるベクター（核酸構築物）は、ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列、ユートロフィン遺伝子の転写調節領域、及びレポータ遺伝子を含む発現カセットを含む。
【００３２】
ベクターは、そのベクター上に存在する発現カセットを動物又は動物細胞に導入し、レポータ遺伝子を該動物又は細胞において発現することができるものであれば、線状又は環状のいずれでもよい。例えば、プラスミド、ファージミド、ウイルスに基づくベクター、人工染色体などの公知のベクター等を用いることができる。プラスミドＤＮＡとしては、細菌由来のプラスミド（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋等）、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）などをベクターとして使用することができる。ベクターは、導入対象の動物又は細胞の種類、導入方法などに応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
【００３３】
ユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列は公知であり、当技術分野で公知の方法により単離することができる。例えば、マウスユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列は、ユートロフィン遺伝子のイントロン２内に存在する１２９ｂｐからなり、例えば配列番号１に示される配列を有する（Galvagni F et al. J Biol Chem 275:3168-3172, 2000；Galvagni F et al., J Biol Chem 277:19106-13, 2002）。マウスＤＵＥ配列は、マウス骨格筋から抽出したゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリを鋳型として、配列番号２及び３に示される配列を含むプライマーＤＵＥ−Ｆ／ＤＵＥ−Ｒを用いたＰＣＲにより、ＤＵＥ配列を含む６８９ｂｐの断片を増幅することができる。また、ヒトＤＵＥ配列（Galvagni F et al., J Biol Chem 277:19106-13, 2002；配列番号１４）も報告されており、ラットＤＵＥ配列（配列番号１５）、イヌＤＵＥ配列（配列番号１６）などを、他の種のＤＵＥ配列（例えばヒトＤＵＥ配列）に基づいてホモロジー検索などにより同定することができる。ホモロジー検索は、当技術分野で公知であり、例えばＵＣＳＣ ＢＬＡＴ ＳＥＡＲＣＨ（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat）などを利用して行うことができる。
【００３４】
また、ＤＵＥ配列は、マウス以外の動物、例えばヒト、マウス、ラット及びイヌ間で高度に保存されている。従って、マウス以外のＤＵＥ配列を用いた場合であっても、マウスＤＵＥ配列を用いた場合と同様の結果が得られることが示唆される。
【００３５】
ユートロフィン遺伝子の転写調節領域は、ユートロフィン遺伝子の転写開始点の上流配列に存在し、プロモータ配列等を含む領域である。ユートロフィン遺伝子の転写調節領域は、マウスユートロフィン遺伝子（chr 10: 12282993 - 12743312,NM 011682）、ヒトユートロフィン遺伝子（chr 6: 144654658 - 145209657, NM 007124）、ラットユートロフィン遺伝子（chr 1: 7099839 - 7614980, NM 013070）、イヌユートロフィン遺伝子（chr 1: 38951584 - 38969015, AY583531）の上流配列である。転写調節領域は、当業者であれば特定することができる。例えば、マウスにおけるユートロフィン遺伝子の転写調節領域はchr 10: 12281693-12282992と考えられている（Carina L. Dennis et al. Nucleic Acids Research 24: 1646-52, 1996）。
【００３６】
また、転写調節領域は、ユートロフィン遺伝子の上流配列に、さらにユートロフィン遺伝子のエキソン及び／又はイントロンなどを含むものであってもよい。例えばマウスユートロフィン遺伝子の転写調節領域は、プロモータを含む５’末端側（５，３８５ｂｐ）、エクソン１Ａ（４０８ｂｐ）、イントロン１（７，０１６ｂｐ）、エクソン２の始めの非翻訳領域（５９ｂｐ）を含む約１２．９ｋｂの配列（配列番号１８）を用いることができる。配列番号１８に示されるマウスユートロフィン遺伝子の転写調節領域の配列は、ＥｎｓＥｍｂｌ（http://www.ensembl.org/index.html）にEnsemble Transcript ID：ENSMUST00000076817として登録されている配列中に見出すことができる。配列番号１８において、４６９０〜４６９３番目の塩基（ｇａａａ）はＮＦＡＴ結合部位、４９４６〜４９５１番目の塩基（ｔｔｃｃｇｇ）はＮ−ｂｏｘ配列、５０３８〜５０４３番目の塩基（ｃａｇｇｔｇ）はＥ−ｂｏｘ配列、５１８８〜５１９３番目の塩基はＳｐ１、５３８６〜５７９３番目の塩基はエクソン１Ａ、１２８１０〜１２８６８番目の塩基はエクソン２の５’ＵＴＲ領域に相当する。なお、転写調節領域は、転写調節活性（プロモータ活性）を維持する限り、配列番号１８に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基の欠失、置換若しくは付加があってもよい。
【００３７】
レポータ遺伝子とは、転写調節領域の機能（例えばプロモータ、エンハンサの転写活性など）の決定に一般的に用いられている遺伝子を指し、その発現の有無又は発現量の検出が容易なものである。本発明において使用可能なレポータ遺伝子は特に限定されるものではない。例えば、蛍光タンパク質、酵素、細胞表面抗原などをコードする遺伝子が含まれる。具体的には、レポータ遺伝子としては、限定するものではないが、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｇｆｐ遺伝子、ルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子などが挙げられる。
【００３８】
またレポータ遺伝子の発現した核の同定を容易にするため、ユートロフィンの発現制御機構を利用するレポータ遺伝子には、核移行シグナルを付加することが好ましい。核移行シグナルは、細胞質で合成されたタンパク質が核内に輸送されるために必要な配列であり、当技術分野で公知である。本発明においては、例えばＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原由来の核移行シグナル（ｎｌｓ）を用いることができる（配列番号１７；Kalderon D et al. Cell 39: 499-509, 1984）。
【００３９】
さらに、導入後にレポータ遺伝子の転写時にポリＡ鎖が付加され、ｍＲＮＡが安定するようにするため、レポータ遺伝子の下流にポリＡシグナル配列を連結することが好ましい。ポリＡシグナル配列もまた当技術分野で公知であり、任意の配列を用いることができる。例えば、ウサギβグロビン遺伝子、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナル配列を用いることができる。
【００４０】
ベクターには、上記の配列に加えて、スプライシングシグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することが好ましい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４１】
ベクターに目的の配列を連結するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。また、ベクターに目的の配列を全て連結した後、そのベクターから目的の配列を含む領域を切り出して使用することも可能である。
【００４２】
対象となる動物は、動物であれば特に限定されず、例えば、無脊椎動物（ショウジョウバエ、線虫など）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカなど）、鳥類（ニワトリ、ウズラなど）、哺乳動物（マウス、ラット、イヌ、ミニブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、マーモセット、カニクイザルなど）が挙げられる。本発明においては、哺乳動物、特に実験において扱いやすいマウス、ラット等が好ましい。
【００４３】
ベクターを動物に導入するには、上記対象動物の受精卵（生殖細胞）に注入することが好ましい。その結果、ユートロフィンのＤＵＥ及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子が連結された発現カセットが受精卵の細胞に組み込まれ、その後の受精卵の分裂に伴って、全身の細胞に該発現カセットがコピーされる。
【００４４】
動物細胞へのベクターの導入方法としては、受精卵へ直接導入する方法の他に、胚性幹（ＥＳ）細胞へ導入する方法、培養細胞へ導入した細胞核を核移植により受精卵に導入する方法（核移植法）などが挙げられる。受精卵へ直接導入する方法では、ベクターのＤＮＡを、マイクロインジェクション、ウイルス感染等を利用して、受精卵に導入することができる。また、ベクターのＤＮＡを、エレクトロポレーション、リポフェクション法等によりＥＳ細胞又は他の培養細胞に導入し、選択マーカーを利用して選別した後、目的の導入細胞を得ることができる。ＥＳ細胞にベクターＤＮＡを導入する場合には、胚胎盤胞又は８細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。核移植法は、ベクターＤＮＡを任意の体細胞に導入し、ベクターＤＮＡが導入された細胞を除核した受精卵に注入し、電気刺激で細胞融合することにより行われる。受精卵を用いた場合には、それを胚胎盤胞又は８細胞期胚にまで発生させてもよい。また、胚胎盤胞又は８細胞期胚は、それをさらに一日培養して胚盤胞まで発生させてもよい。
【００４５】
その後、受精卵、又は胚胎盤胞若しくは８細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、あるいは胚盤胞を仮親の子宮に移植する。仮親を飼育出産させて、目的の発現カセットが導入された仔であるトランスジェニック動物又はキメラ動物を得る。当該動物中における所望のレポータ遺伝子の導入を確認するには、当該動物の体の一部（例えば尾部先端）を切断し、体細胞中のＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法やサザンブロット法などにより導入した配列の存在を確認する。
【００４６】
トランスジェニック動物の場合には、導入した配列の存在が確認された個体を初代とすれば、発現カセットはその仔（Ｆ１）の５０％に伝達される。すなわち、このトランスジェニック動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物（Ｆ１）が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物（Ｆ２）を得ることができる。
【００４７】
また、ＥＳ細胞を用いて得られるキメラ動物の場合には、キメラ動物を交配することにより、仔動物のいくつかは目的の発現カセットを片方の染色体にもつヘテロ接合体である。従って、これらヘテロ接合体である動物同士を交配することにより、ホモ接合体、すなわちトランスジェニック動物が得られる。
【００４８】
トランスジェニック動物は、レポータ遺伝子が導入されている限り、トランスジェニック動物同士を交配して得られる仔動物、トランスジェニック動物と他の動物を交配して得られる仔動物であってもよい。例えば、ＤＵＥ配列及び転写調節領域の制御下にレポータ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス（ＤＵＥマウス）と、公知の筋ジストロフィーモデルマウス（ｍｄｘマウス）とを交配して得られた仔動物（ＤＵＥ／ｍｄｘマウス）が挙げられる。このようなＤＵＥ／ｍｄｘマウスは、ジストロフィン欠損下でのユートロフィンの発現調節機構を検討する上で有用である。
【００４９】
トランスジェニック動物において、導入されたレポータ遺伝子の発現を確認するには、当該トランスジェニック動物の細胞由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット法、あるいは当該レポータ遺伝子の発現を検出することができる任意の方法を利用することができる。上記方法により作製されるトランスジェニック動物において、レポータ遺伝子は、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓、筋肉などの器官の組織又は細胞において発現されることになる。特に、本発明にかかるトランスジェニック動物においては、骨格筋、心筋及び平滑筋から選択される組織又は細胞においてレポータ遺伝子が発現される。
【００５０】
このようにして、ユートロフィンの発現制御機構によりレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、以下に記載するようにユートロフィン遺伝子の発現に影響を及ぼす薬物のスクリーニング、筋疾患又は筋障害の治療又は予防のための薬物候補のスクリーニングにおけるツールなどとして有用である。
【００５１】
また、上述のようにして作製したトランスジェニック非ヒト動物から、ユートロフィンのＤＵＥ及び転写調節領域の制御下にてレポータ遺伝子を発現する細胞を樹立することができる。トランスジェニック動物からの細胞の樹立は、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。
【００５２】
あるいは、上記のユートロフィン遺伝子のＤＵＥ配列、ユートロフィン遺伝子の転写調節領域、及びレポータ遺伝子を含む発現カセットを含む発現ベクター（プラスミド）を動物細胞にトランスフェクトし、該細胞におけるレポータ遺伝子の発現を確認することによって、ユートロフィンのＤＵＥ及び転写調節領域の制御下にてレポータ遺伝子を発現する細胞を樹立することができる。使用する発現ベクター（プラスミド）は、レポータ遺伝子の上流に核移行シグナルを、またレポータ遺伝子の下流にポリＡシグナル配列を含むことが好ましい。発現ベクターの細胞へのトランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション等）を用いて行うことができる。
【００５３】
樹立しようとする細胞としては、ユートロフィン遺伝子の発現制御機構により遺伝子が発現される細胞であることが好ましく、例えば、脳、大腸、小腸、腎臓、肝臓、精巣、肺、顎下腺、心臓及び筋肉からなる群より選択される器官に由来する細胞が含まれる。例えば、マクロファージ、線維芽細胞、グリア細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞などがある。より好ましくは、骨格筋、心筋又は平滑筋に由来する細胞であり、具体的には筋芽細胞を樹立する。
【００５４】
例えば、筋芽細胞は、pre-plating法（T. A. Rando et al. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. JCB 1994; 125: 1275-87）を改訂した方法により筋芽細胞のみを純化し、初代培養物として確立する。
【００５５】
樹立した細胞を培養する方法は、動物細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、Ｆ１０培地に２０％ウシ胎仔血清、０．００５％ｂＦＧＦ、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、約３７℃で行う。
【００５６】
また、樹立した細胞におけるレポータ遺伝子の導入及び発現を確認するには、本明細書に記載のようにＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット法、あるいは当該レポータ遺伝子の発現を検出することができる任意の方法を利用することができる。
【００５７】
このように細胞系を樹立することにより、細胞を大量に増殖させることが可能となり、また同一条件下で被験薬物等のスクリーニングを行うことが可能となる。
【００５８】
３．スクリーニング方法
本発明は、ユートロフィンの発現制御機構によりレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック動物及び細胞を利用して、ユートロフィンの発現増大又は発現低減に関連する薬物をスクリーニングする方法を提供する。
【００５９】
すなわち、本発明に係るトランスジェニック動物に被験薬物を投与するか又は細胞を被験薬物と接触させ、該動物又は細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定することによって該被験薬物がユートロフィン遺伝子の発現制御機構に影響を及ぼすか否かを判定することができる。
【００６０】
本発明に係るユートロフィンの発現増大又は発現低減に関連する薬物のスクリーニング方法においては、まず、トランスジェニック動物に被験薬物を投与するか又は細胞を被験薬物と接触させる。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験薬物の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験薬物は、任意の物質的因子、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験薬物は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験薬物は、上記のような物質的因子に加えて、環境因子（放射線、紫外線など）であってもよい。
【００６２】
また、被験薬物としては単一の被験薬物を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験薬物の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験薬物を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００６３】
細胞を被験薬物と接触させる場合、その接触の条件は、その薬物の種類及び細胞の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、そのような接触は、細胞を被験薬物を添加した培地中で培養することにより、細胞を被験薬物を含む溶液中に浸漬することにより、又は細胞上に被験薬物を積層することにより行うことができる。また、動物に被験薬物を投与する場合には、その投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、被験薬物の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、トランスジェニック動物に被験薬物を投与する場合の投与経路は、被験薬物の種類、使用する動物の種類などに応じて、筋肉内注射、経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
【００６４】
また、被験薬物の効果は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験薬物と接触させる又は被験薬物を投与する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験薬物の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験薬物の接触又は投与期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間までの期間にわたって接触又は投与することができる。
【００６５】
さらに、複数の薬物の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験薬物を組み合わせて用いてもよい。
【００６６】
続いて、トランスジェニック動物又は細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定する。レポータ遺伝子の測定は、使用したレポータ遺伝子の種類、測定する動物の組織又は細胞の種類に応じて、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができる（例えば、「分子生物学実験プロトコールＩＩ」，西郷及び佐野訳，１９９７年，丸善株式会社を参照されたい）。
【００６７】
例えば、レポータ遺伝子として酵素タンパク質をコードする遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子等）を用いた場合には、レポータ遺伝子の発現をその酵素活性に基づいて検出することができる。例えば、酵素により検出可能な物質が検出不可能な物質に変換されるか、又はその逆に検出不可能な物質が検出可能な物質に変換される場合には、そのような物質の存在を検出することにより、レポータ遺伝子の発現を検出することができる。例えば、ｌａｃＺ遺伝子の発現は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を基質として反応させ、加水分解により生じる青色不溶物質を検出することによって、判定することができる。また、ｃａｔ遺伝子の発現は、アセチルＣｏＡとクロラムフェニコールとの反応により生じるアセチル化クロラムフェニコールを、例えば薄層クロマトグラフィーにより分離同定することによって、検出することができる。
【００６８】
また例えばレポータ遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例：緑色蛍光タンパク質をコードするｇｆｐ遺伝子、ルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子等）を用いた場合には、レポータ遺伝子の発現をその蛍光に基づいて検出することができる。例えば、レポータ遺伝子を発現する細胞は、フローサイトメーターを利用するソーティング法（ＦＡＣＳなど）を用いて、迅速に判定することが可能である。
【００６９】
あるいは、レポータ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いた反応を利用して、又はレポータ遺伝子のｍＲＮＡに対するプライマー若しくはプローブを用いた反応を利用して、レポータ遺伝子の発現を検出することが可能である。
【００７０】
レポータ遺伝子の発現を測定した後、対照のレポータ遺伝子発現と比較し、レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択する。対照としては、レポータ遺伝子が導入されていない動物又は細胞、レポータ遺伝子が導入されているが、被験薬物を投与されていない動物又は被験薬物と接触していない細胞などを用いることができる。
【００７１】
また、本発明においては、最初に、細胞を被験薬物と接触させ、該細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定して発現増強又は低減を示した被験薬物を選択し、次に、トランスジェニック動物に選択した被験薬物を投与し、該トランスジェニック動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定して発現増強又は低減を示した被験薬物を選択してもよい。
【００７２】
その結果、レポータ遺伝子の発現を増大する被験薬物は、ユートロフィン遺伝子の発現を増大する薬物と同定される。また、レポータ遺伝子の発現を低減する被験薬物は、ユートロフィン遺伝子の発現を低減する薬物と同定される。
【００７３】
また別の態様において、本発明に係るトランスジェニック動物に被験薬物を投与するか又は細胞を被験薬物と接触させ、該動物又は該細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定することによって、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物候補を同定することができる。あるいは、本発明に係るトランスジェニック動物に被験薬物を投与するか、又はその骨格筋、心筋若しくは平滑筋由来の細胞を被験薬物と接触させ、該動物の筋組織若しくは筋細胞、又は該細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定することによって、筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補を同定することができる。
【００７４】
本発明に係る薬物候補のスクリーニング方法においては、まず、トランスジェニック動物に被験薬物を投与するか又は骨格筋、心筋若しくは平滑筋由来の細胞を被験薬物と接触させる。骨格筋、心筋若しくは平滑筋由来の細胞は、当技術分野で公知の方法により調製することができる。そのような細胞としては、例えば筋芽細胞を用いることが好ましい。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法の対象となる薬物（被験薬物）の種類は特に限定されず、例えば上述したような薬物を用いることができる。また、動物への被験薬物の投与、細胞と被験薬物の接触も、上述と同様に適宜選択することが可能である。
【００７６】
一実施形態において、薬物候補により治療又は予防対象となる疾患又は障害は、ユートロフィン遺伝子の発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害である。例えば、ユートロフィン遺伝子の発現増大に関連する疾患又は障害としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及び多発性筋炎などが挙げられる。一方、ユートロフィン遺伝子の発現低減に関連する疾患又は障害としては既知のものは存在しないが今後研究が進むにつれてスクリーニングの対象となる疾患又は障害がみつかる可能性がある。
【００７７】
また別の実施形態において、薬物候補により治療又は予防対象となる疾患又は障害は、筋疾患又は筋障害である。筋疾患又は筋障害としては、筋変性を起因とする疾患又は障害、例えば筋ジストロフィー、具体的にはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などが挙げられる。
【００７８】
細胞又はトランスジェニック動物におけるレポータ遺伝子の発現の測定は、上述の通り実施することができる。動物におけるレポータ遺伝子の発現の測定において、発現を測定する対象となる組織は、どの組織におけるユートロフィン遺伝子の発現に関連する疾患又は障害の薬物候補をスクリーニングしようとするかの目的に応じて異なる。例えば、腎臓、肝臓などの臓器におけるユートロフィン発現に関連する疾患又は障害の薬物候補をスクリーニングする場合には、当該臓器におけるレポータ遺伝子の発現を測定する。また、ユートロフィンによりジストロフィン欠損を補って筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物候補をスクリーニングする場合には、筋組織又は筋細胞、例えば骨格筋、心筋又は平滑筋におけるレポータ遺伝子の発現を測定する。
【００７９】
レポータ遺伝子の発現を測定した後、対照のレポータ遺伝子発現と比較し、レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物を選択する。対照としては、レポータ遺伝子が導入されていない動物又は細胞、レポータ遺伝子が導入されているが、被験薬物を投与されていない動物又は被験薬物と接触していない細胞などを用いることができる。
【００８０】
その結果、レポータ遺伝子の発現を増大又は低減する被験薬物は、薬物候補として選択することができる。例えば、ユートロフィンによりジストロフィン欠損を補うことを目的とした薬物候補のスクリーニングの場合には、レポータ遺伝子の発現を増大する被験薬物を薬物候補として選択する。
【００８１】
また、薬物候補のスクリーニングは、一次スクリーニングとして、細胞を被験薬物と接触させ、該細胞におけるレポータ遺伝子の発現を測定して発現増強又は低減を示した被験薬物を選択し、次に二次スクリーニングとして、トランスジェニック動物に選択した被験薬物を投与し、該トランスジェニック動物におけるレポータ遺伝子の発現を測定して発現増強又は低減を示した被験薬物を薬物候補として選択してもよい。
【００８２】
さらに、上記薬物候補のスクリーニングにおいては、さらに、選択された薬物候補を、疾患又は障害のモデル動物に投与して、薬物候補がモデル動物における疾患又は障害に影響を及ぼすか否かを判定してもよい。モデル動物は、目的とする疾患又は障害の要因（遺伝的素因など）を有するか又は少なくとも１つの症状を示すものであれば特に限定されるものではない。例えば、筋疾患又は筋障害のモデル動物としては、筋ジストロフィーのモデルマウス（ｍｄｘマウス：Sicinski, P. et al., Science 244:1578-1580, 1989）、筋ジストロフィーのモデルイヌ（ｃ−ｘｍｄイヌ：Komegay, J.N. et al., Muscle Nerve 11:1056-1064, 1988；ＣＸＭＤＪイヌ：Shimatsu Y et al., Exp Anim. 52:93-7. 2003、Shimatsu Y et al., Acta Myol. 24:145-54. 2005）などを用いることができる。
【００８３】
薬物候補がモデル動物における疾患又は障害に影響を及ぼすか否かの判定は、モデル動物の疾患又は障害の種類、要因、症状などにより異なるが、当業者であれば、その疾患又は障害に及ぼす影響を適宜判定することができる。例えば、筋疾患又は筋障害に及ぼす影響を判定する場合には、筋力、血清クレアチンキナーゼ値の測定、単離骨格筋の張力測定、組織学的な筋最大直径及び中心核線維の頻度の計測、並びにユートロフィン抗体を用いた免疫組織学的染色などを行うことができる。
【００８４】
上述のようにして、疾患又は障害の改善が認められる場合の薬物候補は、当該疾患又は障害の治療又は予防のための医薬の候補として選択することができる。
【００８５】
以上から、本発明に係るトランスジェニック動物又は細胞を用いることにより、ユートロフィンの発現増大又は発現低減に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための薬物、あるいは筋疾患又は筋障害を治療又は予防するための薬物を見出し、さらには医薬又は治療法の効果を確認することが可能となる。
【００８６】
以下、本説明を実施例によりさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８７】
[比較例１]
下流ユートロフィンエンハンサ（ＤＵＥ）を含まない発現カセットを用いてトランスジェニックマウス（Ｇｎｌｓ）を作製した。
【００８８】
（１）Ｇｎｌｓマウスの作製
マウスＡ−ユートロフィンの５’末端を含むゲノム配列（約１２．９ｋｂ）は１２９Ｓｖマウス遺伝子ライブラリーから得た。このクローン約１２．９ｋｂは、マウスＡ−ユートロフィン遺伝子（ｃｈｒ１０：１２２８２９９３（ＮＭ ０１１６８２））のプロモータを含む５’末端側（５，３８５ｂｐ）、エクソン１Ａ（４０８ｂｐ）、イントロン１（７，０１６ｂｐ）、エクソン２の始めの非翻訳領域（５９ｂｐ）を含む（配列番号１８；図２における「ユートロフィン遺伝子の５’末端配列」に相当する）。このフラグメント（約１２．９ｋｂ）にレポータ遺伝子として核移行シグナル（ｎｌｓ）とｌａｃＺ遺伝子を連結し、３’末端にウサギβグロビンポリＡを付随させて、トランスジーン発現カセット（図２におけるＧｎｌｓマウス用発現カセット）を構築した。この発現カセットを含むＤＮＡフラグメントはアガロースゲルからＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用いて分離し精製した。このＤＮＡフラグメントをマイクロインジェクションによってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵に注入し、偽妊娠マウスの卵管に移植して、仔マウスを得た。
【００８９】
仔マウスの尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロッティングを行った。具体的には、ゲノムＤＮＡをプロテイナーゼＫ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）及びプロナーゼＥ（１ｍｇ／ｍｌ）消化により溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を用いて単離した。続いてゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham Biosciences）に転写した。ｌａｃＺ遺伝子の３０７２ｂｐのＤＮＡ断片をサザンプローブとして３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識し、上記膜と６５℃にて一晩かけてハイブリダイズさせた。続いて膜を、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの洗浄、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの洗浄により６５℃にて十分に洗浄し、ＢＡＳ２５００（Fuji Film）により分析した。その結果、ＬａｃＺを発現しているマウスをトランスジェニックＦ０マウス（Ｇｎｌｓマウス）として選択した。
【００９０】
（２）β−ガラクトシダーゼの発現
Ｇｎｌｓマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現を確認するため、逆転写酵素−ポリメラーゼ増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、組織学的分析及び免疫組織学的分析を行った。
【００９１】
まず、３週令のトランスジェニックマウスを安楽死させ、各組織（大脳、小脳、骨格筋、心筋、小腸、大腸、精巣、肝臓、顎下腺、腎臓、肺、横隔膜）を採取し、液体窒素で凍結した。これらの凍結組織から、ＴＲＩｓｏｌ試薬（Invitrogen Life Technologies）を用いて総ＲＮＡを単離した。この総ＲＮＡを、ＲＮＡ１μｇ当たり１ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Invitrogen Life Technologies）を用いて室温にて１５分処理し、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加してＤＮａｓｅＩを不活化した後、６５℃にて１０分加熱した。この総ＲＮＡ３．５μｇを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＴＭ（Invitrogen Life Technologies）により逆転写反応を行った。ユートロフィンエキソン１Ａセンスプライマー（5'-GGCGTTTCCAATCGGGTGTC-3'；配列番号１０）及びｌａｃＺ遺伝子アンチセンスプライマー（5'-CGTTCTGCCCATCATCAGGC-3'；配列番号１１）を用いて、９５℃にて１分の変性、５９℃にて３０秒のアニーリング、７２℃にて１分の伸長からなるサイクルを３５回行って、ＰＣＲを実施した。対照として、ハウスキーピング遺伝子である１８Ｓ ｒＲＮＡの発現レベルについても調べた。
【００９２】
結果を図３（Ａ）に示す。このＧｎｌｓマウスは、肝臓、精巣等の組織においてｌａｃＺ遺伝子の発現が認められ、その発現は内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現していたが、心臓及び筋肉における発現は内在性Ａ−ユートロフィンの発現を再現することはできなかった（Takahashi J et al. The utrophin promoter A drives high expression of the transgenic LacZ gene in liver, testis, colon, submandibular gland, and small intestine. J Gene Med 2005; 7: 237-248）。また、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ；Wako Chemicals）を用いた組織化学的分析、ユートロフィンに対する抗体を用いた免疫組織化学分析によっても、同様の結果が得られた（データは示さない）。
【実施例１】
【００９３】
本実施例においては、ＤＵＥを含む発現カセットを用いてトランスジェニックマウス（ＤＵＥマウス）を作製した。
（１）ＤＵＥマウスの作製
図４に示すような手順で、マウスユートロフィン遺伝子イントロン２に存在するエンハンサ１２９ｂｐ（下流ユートロフィンエンハンサ：ＤＵＥ）（Galvagni F et al. The utrophin gene is transcriptionally up-regulated in regenerated muscle. J Biol Chem 2002; 277: 19106-13）を、比較例１に記載のＧｎｌｓマウス用発現カセットの上流に挿入し、新たな発現カセット（図２におけるＤＵＥマウス用発現カセット）を構築した。この発現カセットを用いてトランスジェニックマウス（ＤＵＥマウス）を作製した。
【００９４】
簡単に説明すると、マウス骨格筋よりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＤＵＥ−Ｆ／ＤＵＥ−Ｒ（表１、配列番号２及び３）を用いて、ＰＣＲ法によりＤＵＥ配列を増幅した後、電気泳動でＤＵＥ配列を含む６８９ｂｐのバンドを確認した。この増幅した６８９ｂｐのＰＣＲ産物をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製し、ベクターｐＣＲ２．１（３．９ｋｂ、Invitrogen製）に挿入した（図４（Ａ））。同クローンのうちＤＵＥを含む２１９ｂｐのフラグメントを増幅するために、制限酵素ＮｏｔＩを５’側に付加したプライマー（ＤＵＥ−Ｆ−ＮｏｔＩ）（表１、配列番号４）と制限酵素ＥａｇＩを５’側に付加したプライマー（ＤＵＥ−Ｒ−ＥａｇＩ）（表１、配列番号５）を作製し、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を行い、電気泳動により同２１９ｂｐの配列と付加した制限酵素サイトの配列を含む２３２ｂｐのバンドを確認した。同２３２ｂｐのＰＣＲ産物をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製し、再びベクターｐＣＲ２．１（３．９ｋｂ）に挿入して、コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）に形質転換した。ブルーホワイトセレクションにより白色コロニーをピックアップし、アンピシリン含有ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）を用いて培養し、ミニプレップ法でプラスミドを精製した。同プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、電気泳動にて２３２ｂｐのフラグメントが組み込まれているコロニーを選択した後、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ法で同プラスミドを精製した。このプラスミドを制限酵素ＥａｇＩで切断後、電気泳動によりＤＵＥ配列を含む線状のＤＮＡのバンドを確認した後、制限酵素ＮｏｔＩにより切断し、電気泳動してゲルからＤＵＥ配列を含む２１９ｂｐのＤＮＡフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製した（図４（Ｂ））。
【表１】
0005250810.tif 000002
【００９５】
次に、ＤＵＥ配列をＧｎｌｓマウス用発現カセットの上流に挿入してＤＵＥマウスを作製するため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋にＧｎｌｓトランスジーン発現カセットが組み込まれているプラスミド（Ｇｎｌｓマウス用発現カセット）をＮｏｔＩで切断し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）処理した後、ＤＵＥ配列を含むフラグメントを挿入した（図４（Ｃ））。このＤＵＥ配列を含むフラグメントを挿入したプラスミドをコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）に形質導入した。大腸菌のコロニーをピックアップしてアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ミニプレップ法でプラスミドを精製し、Ｔ３（２０ｍｅｒ）プライマーとＤＵＥ−ｉｎＲプライマー（表１、配列番号６及び７）を用いて２３５ｂｐのＰＣＲ産物の有無から、ＤＵＥ配列が組み込まれているプラスミドを選択した（図４（Ｄ））。
【００９６】
続いて、ＤＵＥ配列を含むフラグメントが挿入されているプラスミドをアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ法によりプラスミドを精製して、塩基配列を確認した後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによりＧｎｌｓマウス用発現カセットの５’側にＤＵＥ配列を付加したフラグメント（図２におけるＤＵＥマウス用発現カセット）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋から切断した（図４（Ｅ））。このフラグメントをＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製し、マイクロインジェクションによりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス受精卵に注入し、２匹のＦ０マウス（ＤＵＥマウス）を得た。Ｆ０マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ仔マウスを得た。仔マウスの尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＬａｃＺ−Ｆ／ＬａｃＺ−Ｒ（表１、配列番号８及び９）を用いてＰＣＲ法を行うことによりトランスジーン陽性マウスを選択した。同世代のトランスジェニックマウス、またはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの交配を繰り返してラインを確立した。
【００９７】
（２）β−ガラクトシダーゼの発現
得られたＤＵＥマウスを用いて、β−ガラクトシダーゼの発現を確認した。最初に、ｍＲＮＡレベルでの発現を確認するため、比較例１の（２）に記載のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーは、ｌａｃＺセンス１プライマー（5’-CGACATTGCCGTAAGTGAAG-3’；配列番号１２）及びｌａｃＺアンチセンス１プライマー（5’-ATCGCCATTTGACCACTACC-3’；配列番号１３)を使用して、９５℃にて５分変性後、９５℃にて３０秒の変性、６０℃にて３０秒のアニーリング、７２℃にて１分の伸長からなるサイクルを３０回行った後、７２℃にて７分の伸長反応をし、４℃にて保存した。
【００９８】
その結果を図３（Ｂ）に示す。ＤＵＥマウスにおいては、肝、精巣、顎下腺、大腸、小腸等の組織においてｌａｃＺ遺伝子のより強い発現が認められ、また大脳、小脳、骨格筋及び心筋においても内在性のＡ−ユートロフィンの発現を再現する形でｌａｃＺ遺伝子の発現が認められた。
【００９９】
また、ＤＵＥマウスから組織（大脳、小脳、顎下腺、肝臓、小腸、大腸、精巣、前脛骨（ＴＡ）筋、心臓）を採取し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結した。凍結切片（１０μｍ）をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色し、また５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ；Wako Chemicals）を用いた染色を行った。
【０１００】
また、凍結切片（６μｍ）をスライドにのせ、乾燥させた後、アセトン中で−２０℃にて６分かけて固定した。ヒト・ユートロフィン（ＵＴ−２）の１７６８〜２０７８番のアミノ酸を認識するウサギポリクローナル抗体（Imamura M. et al., Proc Nal Acad Sci USA 95:6139-6144, 1998）を用いて免疫組織化学分析を行った。一次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Molecular Probes）を用いて検出した。核はヨウ化ＴＯＴＯ−３（Molecular Probes）で染色した。神経筋接合部（ＮＭＪ）はＡｌｅｘａ５９４で標識したαブンガロトキシン（α−ＢＴＸ）（Molecular Probes）で染色した。シグナルは、レーザー走査共焦点画像化システム（ＴＣＳＳＰＴＭ、Leica）を用いて写真に記録した。
【０１０１】
これらの結果を図５及び６に示す。図５において、記号は、Ｖ＝終末肝細静脈、Ｓｉ＝洞様毛細血管、Ｈ＝肝細胞、ＳＴ＝精細管、Ｌ＝ライディヒ細胞、Ｓ＝セルトリ細胞、Ｃ＝精管（capillary）、ＣＭ＝内輪筋層、Ｇ＝杯細胞、ＬＭ＝外縦筋層、ＳＤ＝線条導管、Ｓｃ＝漿液分泌細胞、ＳＡ＝漿液腺房、Ｖｉ＝柔毛、Ｃｒ＝腺窩、Ｐ＝パーネト細胞、ＭＭ＝筋粘膜を表す。また図６において、記号は、ＣＰ＝脈絡叢、ＰＭ＝脳軟膜、ＣＣ＝大脳皮質、Ｎ＝ニューロン、ＭＬ＝分子層、ＧＬ＝顆粒層、Ｐ＝プルキンエ細胞、ＩＤ＝介在板（intercalated disk）、ＮＭＪ＝神経筋接合部を表す。この結果からも、ＤＵＥマウスにおいては、肝、精巣、顎下腺、大腸、小腸等の組織においてβ−ガラクトシダーゼのより強い発現が認められ、また大脳、小脳、骨格筋及び心筋においてもβ−ガラクトシダーゼの発現が認められた。
【０１０２】
（３）筋肉再生時のβ−ガラクトシダーゼ発現
ＤＵＥマウスに筋肉変性を生じさせるため、５週令のＤＵＥマウスの右側前脛骨（ＴＡ）筋に２９ゲージ針を用いてタイワンコブラ（Naja naja atra）毒のカルジオトキシン（ＣＴＸ；生理食塩水中１０μＭ、Wako Chemicals）を注射した。ＣＴＸの濃度は、Couteaux R. et al.（Biol Cell 62:171-182, 1988）に従って測定した。ＣＴＸを注射したＤＵＥマウスをＣＴＸ注射の１〜７日後に安楽死させた。ＣＴＸを注射したＴＡ筋及び注射していない対側のＴＡ筋を採取し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結した。凍結切片（１０μｍ）をＸ−Ｇａｌ染色した。同時に、凍結切片（６μｍ）をＵＴ−２とＡｌｅｘａ５９４標識α−ＢＴＸで染色した。また、これらの凍結切片から総ＲＮＡを単離し、ｌａｃＺセンス１プライマー（配列番号１２）及びｌａｃＺアンチセンス１プライマー（配列番号１３）を用いてｌａｃＺ遺伝子を増幅した。
【０１０３】
その結果を図７及び８に示す。この結果から、ＣＴＸの注入により骨格筋に損傷を与え、筋再生を誘導すると、β−ガラクトシダーゼの発現がｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で増強されることが明らかとなった。よって、ＤＵＥ配列がユートロフィンの骨格筋での発現制御に深く関わることがわかった。
【０１０４】
（４）ｍｄｘマウスとの交配によるβ−ガラクトシダーゼの発現
ユートロフィンはｍｄｘマウスの筋細胞膜で発現が増加することが知られている。ＤＵＥ配列を含む発現カセットが導入されたｍｄｘマウスを得るために、オスのＤＵＥマウスとメスのｍｄｘホモマウスを交配させて仔マウス（オス）を得た。ジストロフィンを完全に欠損している同仔マウス（ＤＵＥ／ｍｄｘマウス）からゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法及びサザンブロット法により導入した発現カセットの存在を確認した。ＤＵＥ／ｍｄｘマウスを使用するとジストロフィン欠損下でのユートロフィンの発現調節機構を検討することができる。２週齢のＤＵＥ／ｍｄｘマウスを安楽死させ前頸骨筋（ＴＡ筋）、腓腹筋（ＧＡ筋）、心臓、横隔膜を採取し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結した。凍結切片（１０μｍ）をＸ−Ｇａｌ染色した。同時に、凍結切片（６μｍ）をＵＴ−２とＡｌｅｘａ５９４標識α−ＢＴＸで染色した。また、これらの凍結切片から総ＲＮＡを単離し、ｌａｃＺセンス１プライマー（配列番号１２）及びｌａｃＺアンチセンス１プライマー（配列番号１３）を用いてｌａｃＺ遺伝子を増幅した。
【０１０５】
この結果、ジストロフィン欠損下ではβ−ガラクトシダーゼの発現がｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で増強していた。筋ジストロフィー患者やｍｄｘマウスのようにジストロフィンが欠損している状態では、内在性のユートロフィンは神経筋接合部及び筋腱接合部だけでなく筋細胞膜にも発現している。そのため、ジストロフィンが欠損しているＤＵＥ／ｍｄｘマウスにおいてもトランスジーンとして導入したβ−ガラクトシダーゼのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの発現が増加していたと考えられる。しかもβ−ガラクトシダーゼの発現が神経筋接合部及び筋腱接合部だけでなく筋細胞膜にもみられた。すなわち、β−ガラクトシダーゼの発現量及び発現部位が内在性のユートロフィンの動向を再現できたといえる。従ってＤＵＥマウスを用いたレポータ遺伝子の発現を指標とする薬物スクリーニングはユートロフィンの発現増強を目指す筋ジストロフィーの治療法開発に有用であることが示唆された。
【実施例２】
【０１０６】
本実施例では、実施例１で作製したＤＵＥトランスジェニックマウスから、pre-plating法（T. A. Rando et al. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. JCB 1994; 125: 1275-87）を改訂した方法により筋芽細胞の一次培養物を以下のように樹立した。
【０１０７】
ＤＵＥマウスから得られた骨格筋を細切した後、０．２％２型コラゲナーゼ溶液中で３７℃、３０分間、撹拌処理した。その後、１８Ｇの注射針に数回通して組織片を粉砕して、さらに１５分間コラゲナーゼ処理した。４℃の２％血清含有ＰＢＳを加えてコラゲナーゼの働きを止め、１００μｍフィルター次いで４０μｍフィルターに通し、フィルター濾過液を１，５００ｒｐｍ、５分間遠心した。赤血球を除くためにペレットになった細胞に低張処理液（０．８３％ＮＨ４Ｃｌと０．１７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６５）を９：１の割合で混合）を加え、１分間軽く振盪した。２％血清含有ＰＢＳを加え平衡化し、再び１，５００ｒｐｍ、５分間遠心を行って細胞を回収し、増殖培地に懸濁した。懸濁した細胞をコーティング無しの培養皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度で２時間培養後、未付着細胞を含む上清を回収し、１型コラーゲンでコーティングした培養皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度で一晩培養した。翌日未付着細胞を含む上清を回収し、１型コラーゲンでコーティングした培養皿に移して培養を続けた。増殖培地は、最初は１日毎に、後は２〜３日毎に交換した（Uezumi A et. al. Functional heterogeneity of side population cells in skeletal muscle.  BBRC 2006; 341: 864-873）。細胞がコンフルエントに達した際には継代し、１００回以上分裂を続けている細胞を株化したものとみなした。株化した細胞をごく低い密度で播種して生じた単一細胞に由来すると思われるコロニーを単離する。この操作を２〜３回繰り返し行いクローン化した（colony isolation method）。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、ユートロフィンの発現制御機構を使用してレポータ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物及びその細胞が提供される。該トランスジェニック非ヒト動物及びその細胞は、ユートロフィンの発現制御機構を使用するものであるため、レポータ遺伝子の発現に基づいてユートロフィン遺伝子の発現に影響を及ぼす薬物又は薬物を簡便かつ効率的にスクリーニングすることが可能となる。従って、ユートロフィン遺伝子の発現に関連する疾患又は障害、さらにはユートロフィンで補うことができるジストロフィン欠損に関連する疾患又は障害（例えば筋ジストロフィー）の治療又は予防に使用可能な薬物候補をスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Ａ−ユートロフィン及びＢ−ユートロフィン遺伝子のゲノム上の構造（Ａ）、並びにＡ−ユートロフィン及びＢ−ユートロフィンタンパク質の構造及びその発現部位（Ｂ）を示す。
【図２】Ｇｎｌｓマウス用発現カセット及びＤＵＥマウス用発現カセットの構造を示す。
【図３】Ｇｎｌｓマウス（Ａ）及びＤＵＥマウス（Ｂ）の各組織におけるｌａｃＺ遺伝子の発現を示す。
【図４】ＤＵＥマウス用発現カセットを構築するための手順を示す。
【図５】ＤＵＥマウスの各組織におけるβ−ガラクトシダーゼ及びユートロフィンの発現を示す。
【図６】ＤＵＥマウスの各組織におけるβ−ガラクトシダーゼ及びユートロフィンの発現を示す。
【図７】カルジオトキシン投与後のＤＵＥマウスの骨格筋組織におけるβ−ガラクトシダーゼ及びユートロフィンの発現を示す。
【図８】カルジオトキシン投与後のＧｎｌｓマウス（Ａ）及びＤＵＥマウス（Ａ）の骨格筋組織におけるｌａｃＺ遺伝子の発現を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１：マウス下流ユートロフィンエンハンサ
配列番号２〜１３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１４：ヒト下流ユートロフィンエンハンサ
配列番号１５：ラット下流ユートロフィンエンハンサ
配列番号１６：イヌ下流ユートロフィンエンハンサ
配列番号１７：ＳＶ４０ウイルス 核移行シグナル
【図１】
0005250810.tif 000003
【図２】
0005250810.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
0005250810.tif 000007
【図６】
0005250810.tif 000008
【図７】
0005250810.tif 000009
【図８】
0005250810.tif 000010
【配列表】
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