(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールおよびその鏡像異性体、非鏡像異性体、医薬上許容される塩、またはこれらの組合せと、
これらの医薬上許容される担体および／または賦形剤とを含有する、結腸直腸癌の治療に用いられる医薬組成物であって、
前記５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールが、下記一般式（Ｉ）
【化１】
0005313971.tif 000007
（上式において、Ｒは、置換された（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）または非置換の（ｎｏｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）、炭素原子数１〜６のアルキル基（ａｌｋｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数２〜６のアルケニル基（ａｌｋｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数２〜６のアルキニル基（ａｌｋｙｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、シアノ基（ｃｙａｎｏ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数１〜５のエステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数１〜５のカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｇｒｏｕｐ）、イソオキサゾール基（ｉｓｏｘａｚｏｌｅ  ｇｒｏｕｐ）からなる群から選択される基であり、ただし、（ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｖｉｓｏ  ｔｈａｔ）Ｒがメチル基ではない（ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  −ＣＨ３）ことを条件とする）で表わされる医薬組成物。
【請求項２】
Ｒが、置換されたまたは非置換の、エチル基、プロピル基、ビニル基、アリル基、ブタジエニル基、エチニル基、プロピニル基、シアノ基、メチルエステル基、エチルエステル基、カルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒが、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＯＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、
【化２】
0005313971.tif 000008
【化３】
0005313971.tif 000009
および
【化４】
0005313971.tif 000010
からなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
経口または非経腸で投薬される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
担体は低融点ワックスであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールの有効量の範囲が、０．１ｍｇ／Ｋｇ〜５００ｍｇ／Ｋｇである、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソール（５−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ４，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）を含有する細胞周期抑制薬および結腸直腸癌細胞死滅薬に関する。ただし、５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールにおける５位の置換基はメチル基を含まない。
【背景技術】
【０００２】
２００６年に台湾衛生署によって公開された癌報告書によれば、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）は台湾地区において、最も多発する癌のトップ５に入るという。現在の臨床治療においては、治療法は手術治療、放射線治療、一般的化学療法、および遺伝子治療に限られる（Ａｓｍｉｓ  ＴＲ．ａｎｄ  Ｓａｌｔｚ  Ｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ，２００８；３７：２８７−９５，ｉｘ．；Ｄｕｒａｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２００８；１７：５９−６７；Ｋｕｗａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００８；２５：４７７−８９）。大腸癌の治療に用いられる新治療薬の開発への切実な要望が依然として存在することは明らかである。
【０００３】
牛樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）は中国伝統医学において、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、そう痒症（ｐｒｕｒｉｔｕｓ）、下痢症（ｄｉａｒｒｈｅａ）または肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）の治療に用いられている。出願人の以前の報告では、４，７−ジメトキシ５−メチル−１，３−ベンゾジオキソール（４，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｌ，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ、以下ＳＹ−１と略す）が牛樟芝の抽出物から単離されることを示している。ＳＹ−１は、ヒトＣＯＬＯ  ２０５癌細胞（ＣＯＬＯ  ２０５）の増殖反応を効果的に抑制することができる（Ｌｉｅｎ  ＨＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎａｔ  Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｃａｍ／ｎｅｐ０２０、２００９年３月１７日公開）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールの抗腫瘍活性（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）はまだ完全には理解されていない。さらに、ＳＹ−１は、腫瘍の成長を抑制する効果はあるものの、比較的高い投与量ではじめて結腸直腸癌細胞を有効的に抑制する効果が発揮できる。このため、当該技術分野において、結腸直腸癌の治療に用いられる薬の選択肢を増やすために、結腸直腸癌を有効的に治療できる新薬への需要は差し迫っている。従来技術によるＳＹ−１以外にも、結腸直腸癌の治療に供する各種の候補薬を提供できれば、予め他の選択肢を提供することで、特定の薬品に対して薬物耐性が生じた際に、治療に用いる代替薬がないという問題を回避することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来技術における上記さまざまな欠点および需要に鑑みて、本発明は天然物から抽出された化合物の誘導体の、結腸直腸癌の治療における使用を提供することを目的とする。上記化合物は５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールであり、４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソール誘導体を含有する医薬組成物の形で提供することができる。
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールの結腸直腸癌治療用医薬品を提供し、上記５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールは下記一般式（Ｉ）を有する。
【０００７】
【化１】
0005313971.tif 000002
上式において、Ｒは、炭素原子数１〜６のアルキル基（ａｌｋｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数２〜６のアルケニル基（ａｌｋｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数２〜６のアルキニル基（ａｌｋｙｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、シアノ基（ｃｙａｎｏ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数１〜５のエステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、炭素原子数１〜５のカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｇｒｏｕｐ）、イソオキサゾール基（ｉｓｏｘａｚｏｌｅ  ｇｒｏｕｐ）からなる群から選択されるものであり、ただし（ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｖｉｓｏ  ｔｈａｔ）、Ｒはメチル基ではない（ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  −ＣＨ３）ことを条件とする。
【０００８】
上記の基は置換されたもの（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）でも非置換のもの（ｎｏｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）でもよい。より好ましくは、Ｒはエチル基、プロピル基、ビニル基、アリル基、ブタジエニル基、エチニル基、プロピニル基、シアノ基（ｃｙａｎｏ  ｇｒｏｕｐ）、メチルエステル基、エチルエステル基およびカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基またはカルボキシルプロピル基で置換されたまたは置換されていない基である。
【０００９】
好ましくは、Ｒは置換された上記官能基であり、以下を挙げることができるが、これらに限るものではない。置換された炭素原子数１〜６のアルキル基、その置換基はヒドロキシ基（−ＯＨ）、シアノ基、ニトロ基（ｎｉｔｒｏ  ｇｒｏｕｐ）、芳香基（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）またはハロゲン基（ｈａｌｏｇｅｎｙｌ）である：置換された炭素原子数２〜６のアルケニル基、その置換基はヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、芳香基またはハロゲン基である；置換された炭素原子数２〜６のアルキニル基、その置換基はヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、芳香基またはハロゲン基である。
【００１０】
Ｒは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＯＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、
【００１１】
【化２】
0005313971.tif 000003
【００１２】
【化３】
0005313971.tif 000004
および
【００１３】
【化４】
0005313971.tif 000005
からなる群から選択されたものが好ましい。
【００１４】
さらに、該５−置換４，７−ジメトキシ１，３−ベンゾジオキソールのヒト結腸直腸癌細胞の増殖作用に対する半数阻害濃度（ＩＣ50）が３７５μＭ以下であることが好ましく、２２５μＭ以下であることがより好ましく、２００μＭ以下であることがさらに好ましく、３５μＭ以下であることがまたさらに好ましい。
【００１５】
さらに、該５−置換４，７−ジメトキシ１，３−ベンゾジオキソールは、アピオール（ａｐｉｏｌｅ）、すなわち４，７−ジメトキシ５−（２−プロピレン−１−イル）−１，３−ベンゾジオキソールであることが好ましい。
【００１６】
本発明は、結腸直腸癌の治療に用いられる医薬組成物を提供し、該医薬組成物は以下のものを含有する。治療上有効量の前記いずれかの５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールおよびその鏡像異性体、非鏡像異性体、医薬上許容される塩、またはそれらの組合せ、ならびに医薬上許容されるこれらの担体および／または賦形剤。
【００１７】
上記医薬上許容される塩は、以下の医薬上許容される無機酸または有機酸との間で生成される塩類を意味する。例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酢酸、プロパン酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸を挙げることができるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明において、上記の「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、治療対象に対して治療に有効な量の化合物を投与することをいう。治療に対して有効であるとの評価は、客観的に試験もしくはマーカーなどを利用して判断し、または主観的に治療効果もしくは治療後の感覚に対する治療対象の供述に基づく。上記５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールの有効量の範囲は、０．１ｍｇ／Ｋｇから５００ｍｇ／Ｋｇであり、または１ｍｇ／Ｋｇから５０ｍｇ／Ｋｇである。有効量は投薬ルートまたは併行して使用される他の薬剤の違いによって変わることもある。
【００１９】
本発明の５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールは、医薬品組成物中の活性成分であり、経口または非経腸方式によって投薬でき、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、腹膜内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、直腸（ｒｅｃｔａｌ）および局部（ｔｏｐｉｃａｌ）経由の投薬経路を含む。
【００２０】
経口投薬に関しては、本発明の５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールは、従来の抗悪性腫瘍薬（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）および／または細胞成長抑制薬（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と併せて使用し、例えば錠剤（ｔａｂｌｅｔ）またはカプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）、パウダー（ｐｏｗｄｅｒ）、分散可能な粒子（ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、扁平状カプセル（ｃａｃｈｅｔ）、水溶液または懸濁液の形で投薬することができる。錠剤で経口投与する場合によく使われる担体は、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、コーンスターチ（ｃｏｒｎ  ｓｔａｒｃｈ）、炭酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、タルク（ｔａｌｃ）および糖である。潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）として、例えばステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）がある。カプセルの形で経口投与する場合、効果的な担体は、ラクトース、コーンスターチ、炭酸マグネシウム、タルクおよび糖である。懸濁水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）による経口投与時には、担体は乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）および／または懸濁液とすることができる。このほか、経口投与時にはさらに甘味料（ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ）および／または香味料（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇｓ）を含有することができる。
【００２１】
筋肉内、腹膜内、皮下および静脈内を経由する投薬に関しては、よく使用される剤形は活性成分の無菌溶液形式であり、緩衝液によってｐＨ値が調整される。
【００２２】
静脈内経由投薬に関してよく使用される剤形は、活性成分を含む溶質の全体濃度を制御して得られる等浸透圧溶液である。
【００２３】
直腸投薬に関しては、よく使用される剤形は座剤である。前もって低融点ワックス（例えば脂肪酸、グリセリンまたはヤシ油の混合物）を溶解させ、次に活性成分を均等攪拌などの方法によって、該低融点ワックス中に分散させ、次いで低融点ワックスと活性成分とが均等に混合された混合物を適当なサイズの型に流し入れ、冷却して固体成型する。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、他の結腸直腸癌の治療に好適に使用されるあらゆる既知の方法または組成物と組み合わせて使用することができる。
【００２５】
本発明は、上記５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールを含有する細胞周期抑制薬を提供する。
【００２６】
本発明は、上記５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールを含有する結腸直腸癌細胞死滅薬を提供する。
【００２７】
本発明における５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールは、細胞のタイプに対して特異性を有することが証明されており、結腸直腸癌細胞を死滅させるものの、正常なヒト細胞を死滅させることはない。したがって結腸直腸病変細胞の増殖作用に有効に対抗し、結腸直腸癌の治療に用いることができる。本発明の５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールおよびその医薬組成物は、結腸直腸癌細胞の増殖作用に対して、比較的低い半数阻害濃度を有する。これは、従来技術と比べて比較的低い投与量で癌細胞の成長を有効に抑制する効果を実現することを示しており、結腸直腸癌細胞死滅薬またはその他の結腸直腸癌治療薬のコンビナトリアル・ケミストリー・データバンクの参考になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ヒト結腸直腸線癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）（ＣＯＬＯ  ２０５）がＳＹ−１誘導体によって２４時間処理された後、細胞生長が抑制される様子を示すグラフである。
【図１Ｂ】ヒト結腸直腸線癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）（ＣＯＬＯ  ２０５）がＳＹ−１誘導体によって４８時間処理された後、細胞生長が抑制される様子を示すグラフである。
【図１Ｃ】ヒト結腸直腸線癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）（ＣＯＬＯ  ２０５）がＳＹ−１誘導体によって７２時間処理された後、細胞生長が抑制される様子を示すグラフである。
【図２】正常なヒト細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）（ＦＨＣ細胞）が異なる濃度のＳＹ−１誘導体によって異なる時間処理された後、細胞生長が抑制される様子を示すグラフである。
【図３】アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞中Ｇ０／Ｇ１段階の停滞に対する投与量依存効果を示す図である。これは、フローサイトメトリー分析によって得られ、サブＧ１、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ段階の細胞のパーセンテージはＭｕｌｔｉｃｙｃｌｅ分析ソフトによって測定され、各グループは３つのサンプルを有し、その値は平均値±ＳＥで表示され、対照群に対して*Ｐ＜０．０５である。
【図４】アピオールの、細胞周期調整蛋白質の発現に対する効果を示すグラフである。
【図５Ａ】アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシスに対する時間と投与量の依存性反応を示し、同調化されたＣＯＬＯ  ２０５細胞が１０％ＦＣＳによって１５、３６および４８時間処理された後、細胞周期各段階における群分布の様子を示す図である。
【図５Ｂ】アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシスに対する時間と投与量の依存性反応を示し、同調化されたＣＯＬＯ  ２０５細胞が１０％ＦＣＳによって１５、３６および４８時間処理された後、細胞周期各段階における群分布の様子を示す図である。
【図５Ｃ】アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシスに対する時間と投与量の依存性反応を示し、同調化されたＣＯＬＯ  ２０５細胞が１０％ＦＣＳによって１５、３６および４８時間処理された後、細胞周期各段階における群分布の様子を示す図である。
【図５Ｄ】アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシスに対する時間と投与量の依存性反応を示し、同調化されたＣＯＬＯ  ２０５細胞が１０％ＦＣＳによって１５、３６および４８時間処理された後、細胞周期各段階における群分布の様子を示す図である。
【図５Ｅ】アピオールの処理がＣＯＬＯ  ２０５細胞のカスパーゼおよびｂａｘ／ｂｃｌ−２比率に及ぼす影響を示す図である。
【図６】アピオールによる処理がＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシス調整蛋白質に及ぼす影響を示す図である。
【図７】ヒトＣＯＬＯ  ２０５細胞中において、アピオールが細胞周期停滞を誘発する情報を伝達する経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
スクリーニングおよび最適化によって結腸直腸癌細胞の増殖作用を抑制できる新規活性化合物を得るために、出願人は１０種類の４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールの一連の誘導体の、ヒト結腸直腸癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）（ＣＯＬＯ  ２０５）に対するインビトロでの抑制活性について評価を行った。これらの誘導体は牛樟芝から単離されたリード化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＳＹ−１）を基礎としている。この１０種類の化合物の構造と活性との関係を分析することによって、５位のアルキル基の鎖の長さが重要であり、置換基がアリル基であるアピオールが最も優れた抑制活性を示すことが判明した。本発明は、ＳＹ−１の類似物であるアピオールが、ＣＯＬＯ  ２０５細胞の増殖作用（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を抑制することができるが、正常なヒト結腸表皮細胞（ＦＨＣ）の増殖作用を影響しないことを証明した。アピオール（７５〜２２５μＭ）によって誘発されるＧ０／Ｇ１細胞周期の停滞（Ｇ０／Ｇ１  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）は、ｐ５３、ｐ２１およびｐ２７のレベル（ｌｅｖｅｌ）増加およびシクロスポリンＤ１のレベル低減と明らかな関係を有することが分かった。一方、ＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシスに関しては、アピオール処理（＞１５０μＭ）によって切断されるカスパーゼ−３、−８、−９およびｂａｘ／ｂｃｌ−２比が顕著に増加し、ＤＮＡ断片化作用の分析およびフローサイトメトリー分析におけるサブＧ１ピーク（Ｓｕｂ−Ｇ１  ｐｅａｋ）の分析から、ＤＮＡ断片化の発生を導くことが分かる。これらの結果は、ＳＹ−１がヒト結腸直腸癌細胞の成長を抑制できることを証明し、中でも特にアピオールは顕著な効果が見られる。
【００３０】
本発明における５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソールおよびその鏡像異性体、非鏡像異性体、薬学上許容される塩は、牛樟芝などの天然物中から既知のあらゆる抽出技術によって得られ、または４，７−ジメトキシ−５−メチル−１，３−ベンゾジオキソールを元に既知の化学的手段を用いて合成することで得ることができる。
【００３１】
下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの実施例はあくまでも説明に供するものであって、本発明に対する実施上の制限と解するべきでないことを明確にすべきである。
【実施例】
【００３２】
実験材料と実験方法
１．化合物と試薬
下記実施例中において使用される５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソール（５−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ４，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅｓ、すなわちＳＹ−１誘導体であり、表１に示される化合物１〜９）はオーストリアのＡｕｒｏｒａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．から購入した。アピオール（ａｐｉｏｌｅ）は友和貿易株式有限会社（Ｕｎｉ−ｏｎｗａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（台湾）から購入した。これらの化合物の構造はＮＭＲスペクトルによって同定した。
【００３３】
２．細胞の培養
ＣＯＬＯ  ２０５（ｐ５３−野生型）細胞株は、ヒト結腸線癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＣＣＬ−２２２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，アメリカ）から分離されたものである。この細胞株を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。ＦＨＣ（ＣＲＬ−１８３１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，アメリカ）は、正常なヒト胚胎結腸粘膜長期表皮細胞培養物（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ＫＭ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｒａ  ＤＰ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１９８４；２０：８５９−６８）である。培養物は湿潤５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベータ中において培養した。
【００３４】
３．細胞生存率アッセイ（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）
培養細胞に対する化合物の増殖抑制効果は、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミドアッセイ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ａｓｓａｙ，ＭＴＴ  ａｓｓａｙ］によるものである。各ウェル２×１０4細胞（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で２４ウェル培養プレート（２４−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）中で培養し、一晩放置した後、異なる濃度の化合物で処理した。２４、４８および７２時間のインキュベーション後、２ｍｇ・ｍＬ-1のＭＴＴ溶液［リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ），ｐＨ７．４に調整］３０μＬを各ウェル中に入れ、培地プレートをさらに３時間インキュベートする。インキュベートによって、緩やかに吸収され、各ウェルから培地を取り除き、２００μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で置き換えた。各ウェルの吸収値を酵素結合免疫吸着分析器（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によって波長５５０ｎｍで測定した。
【００３５】
４．フローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
異なる濃度のアピオールでＣＯＬＯ  ２０５細胞を処理した後、それぞれ異なる時間経過後にトリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）によって吸収し、ろ過後にＰＢＳで二回洗浄し、４℃の７０％アルコール中で２４時間以上かけて固定させた。固定された細胞をろ過後にＰＢＳで再度洗浄し、ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＲＮａｓｅ（２  Ｕ  ｍＬ−１）で３０分間処理した後、ヨウ化プロピジウム試薬（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）［３．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および２０ｍｇのｍｌ−１ヨウ化プロピジウム］で処理した。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリー測定器（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって測定した。細胞周期の各段階にある細胞のパーセンテージをソフトウェア（例えば、Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ  ３２ｂｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって分析した。
【００３６】
５．免疫ブロット法分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＣＯＬＯ  ２０５細胞株を異なる濃度のアピオールでそれぞれ異なる時間（ｄｕｒａｔｉｏｎ）で処理した後、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％  ＮＰ−４０、１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ、５０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ抑制カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）および１ｍＭ  ＰＭＳＦ］に溶解し、得られた細胞溶解液（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を免疫ブロット法分析に用いた（Ｌｉｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００７；２８２：２７７６−８４）。処理された細胞から得られた蛋白質抽出物（各レーンに１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、特定抗体によって検出し、β−アクチンの含有量によって蛋白質負荷量（ｌｏａｄｉｎｇ）を修正する。免疫検出（ｉｍｍｕｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）は適当に希釈された特定抗体を使用して、４℃で終夜行った。一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１：１００と１：１０００の比で希釈した。上記一次抗体は、抗サイクリンＤ１（ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１）と抗ｐ２７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗アクチン（ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗切断カスパーゼ−３、−８、−９（ａｎｔｉ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３，−８，−９）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗ｐ２１、抗ｐ５３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）および抗ｂａｘと抗ｂｃｌ−２（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）を含む。二次抗体は、過酸化酵素と複合したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｏｒ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）およびアルカリ性脱リン酸化酵素と複合したヤギ抗マウス抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含み、１：５０００で希釈して室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬ検出試薬（ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＶＤＦメンブレン（ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）上に転移させた免疫活性を有する蛋白質（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚｅ）する。
【００３７】
６．ＤＮＡ断片化作用の分析（ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
異なる処理が施されたＣＯＬＯ  ２０５細胞を使用し、ＤＮＡ断片化作用の分析によって細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を測定した（Ｈｏ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ，１９９６；１６：２０−３１）。ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を抽出し、２％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）で電気泳動を行った。ＤＮＡは臭化エチジウム染色（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって可視化した。
【００３８】
７．統計
すべての数値は、平均値±標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＥ）の方式で示された。有意性の比較は（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって行った。有意性はＰ＜０．０５を境界としている。
【実施例１】
【００３９】
５−置換４，７−ジメトキシ−１，３−ベンゾジオキソール誘導体のヒト結腸線癌細胞に対する細胞毒性活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）
本実施例では１０種類のＳＹ−１誘導体の抗増殖効果（ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）について分析し、ＣＯＬＯ  ２０５細胞を異なる濃度の各化合物（３７．５〜２２５μＭ）で異なる時間（２４、４８および７２時間）処理した後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミドジメトキシを使用して「実験材料と実験方法」に記載された「３．細胞生存率アッセイ」を用いて、各化合物の細胞毒性活性を測定した。
【００４０】
各化合物のＣＯＬＯ  ２０５細胞中における抗増殖活性を図１Ａ〜１Ｃに示した。その結果から、５位の官能基が脂肪族置換基（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）であるもの（化合物４、５およびアピオール）は、極性アルカン官能基であるもの（化合物１〜３）に比べ、比較的高い抗増殖効果を有することが分かった。化合物１、２、３、４、５および６のＩＣ50値（ＩＣ50  ｖａｌｕｅ）は、測定の結果それぞれ５９．４μ  Ｍ、１５２．３μＭ、１４８．５μＭ、７２．１μＭ、１１０．９μＭおよび６６．７μ  Ｍであった。しかし、５位が比較的バルキーな置換基（ｂｕｌｋｉｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）であるもの（化合物７、８および９）は、非常に弱い抑制効果を示した（＞２２５μＭ）。
【００４１】
結果は図１Ａ〜１Ｃに示される通りであるが、ＣＯＬＯ  ２０５  細胞に対して最も潜在能力のあるのはアピオール（ａｐｉｏｌｅ）であり、ＩＣ50値は４８時間および７２時間に明らかに＜３７．５μＭ（図１Ｂおよび１Ｃ）となった。ＳＹ−１誘導体の側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）は２−プロペニル基（２−ｐｒｏｐｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）（アピオール）およびｎ−プロピル基（ｎ−ｐｒｏｐｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ）（化合物５）であるが、アピオールのＣＯＬＯ  ２０５細胞に対する抗増殖活性はプロピル基を有するものの３倍以上であった。
【００４２】
また、ＳＹ−１誘導体のＣＯＬＯ  ２０５癌細胞増殖に対する抑制作用が細胞タイプに対して特異性（ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）があるかを調べるために、正常なヒト結腸表皮細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）（ＦＨＣ）を異なる投与量のアピオール（図２で示すもの）で異なる時間処理し、「実験材料と実験方法」に記載した細胞生存率分析によって各化合物の細胞毒性活性を測定した。
【００４３】
図２に示すように、アピオールの細胞毒性活性は正常なヒト細胞株においては観察されていない。そのため、下記実施例ではアピオールを代表として、本発明について例を挙げて説明する。
【００４４】
【表１】
0005313971.tif 000006
【実施例２】
【００４５】
ＳＹ−１誘導体によって誘導されるヒト結腸線癌細胞の細胞周期停滞（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）
以前の研究（Ｌｉｅｎ  ＨＭ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，上記と同じ；Ｈｏ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００５；４３：１４８３−９５）において、ＣＯＬＯ  ２０５細胞は完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）に置き換えて１５時間（１５ｈ）後に、化合物で処理された群別のＧ０／Ｇ１細胞群は、対照群に対して最大の差異を示す。このため、本実施例においては、この時間（１５ｈ）を選んでアピオールによる細胞周期停滞の投与量依存効果について調べた。本実施例は「実験材料と実験方法」に記載した「４．フローサイトメトリー分析」の分析によって異なる投薬量のアピオールで処理したＣＯＬＯ  ２０５細胞の、細胞周期の各段階における細胞のパーセンテージを示している。上記の「５．免疫ブロット分析」によって、ｐ２１、ｐ２７およびｐ５３およびサイクリンＤ１で処理したＣＯＬＯ  ２０５の細胞内における発現状況が分かった。
【００４６】
図３に示すように、アピオールはＧ０／Ｇ１停滞に対して投与量依存効果（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を有し、中でも顕著なＧ０／Ｇ１停滞（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｇ０／Ｇ１  ａｒｒｅｓｔ）はアピオール（＞７５μＭ）で処理されたＣＯＬＯ  ２０５細胞中において誘発され、その効果は投与量依存性である。
【００４７】
以前の研究で、サイクリン依存性のキナーゼ阻害剤（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＣＤＫｉ）、例えばｐ２１およびｐ２７は抗癌薬（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ）によってＧ０／Ｇ１において停滞するヒト結腸癌細胞中において上向きに調節される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）（Ｌｉｅｎ  ＨＭ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，同上書；Ｈｏ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，同上書；Ｗｕ  ＣＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２；１８０：２２−３５）ことが明らかになっている。本実施例においては、細胞周期調整蛋白質（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現に対する、アピオールの効果について分析したが、その結果は図４に示す通りで、上記アピオール（＜１５０μＭ）中に暴露され１５時間経過したＣＯＬＯ  ２０５細胞において、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３およびサイクリンＤ１の発現が誘発された。
【実施例３】
【００４８】
ＳＹ−１誘導体によるヒト結腸線癌細胞のカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）の活性化
本実施例ではさらに、ＣＯＬＯ  ２０５細胞がアピオール中に暴露されて３６〜４８時間経過した後のアポトーシスの状況について分析し、「実験材料と実験方法」に記載した「３．フローサイトメトリー分析」、「４．免疫ブロット分析」および「５．ＤＮＡ断片化作用分析」によって実施した。
【００４９】
まず、アピオールの細胞周期調節の時間と投与量の依存効果を、上記実施例を参照してフローサイトメトリー方式の細胞測定分析によって測定した。その結果は図５Ａ〜５Ｄに示す通りで、高投与量のアピオール（１５０、２２５μＭ）は、３６および４８時間に顕著なサブＧ１ピーク（ｓｕｂ−Ｇ１  ｐｅａｋ）群を増大させる。
【００５０】
次に、従来技術で、アポトーシスの発生に活性化カスパーゼ（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ＮＡ  ａｎｄ  Ｌａｚｅｂｎｉｋ  Ｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８；２８１：１３１２−６；ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ  ＷＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３；７５：８１７−２５）が必要であることが示されている。したがって、出願人はさらに免疫ブロット分析によって、アピオールで処理した後のＣＯＬＯ  ２０５細胞中のカスパーゼ活性化およびｂａｘ／ｂｃｌ−２比に対する関与の状況（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を測定し、その際に異なる投与量のアピオールで処理したＣＯＬＯ  ２０５細胞の蛋白質抽出物［各レーン（ｌａｎｅ）において１００μｇ］をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し特定抗体によって検出し、さらにβ−アクチンによって蛋白質負荷量を校正した。
【００５１】
図５Ｅに示す通り、アピオール（１５０または２２５μＭ、３６時間経過）はＣＯＬＯ  ２０５アポトーシスを誘発し、それに伴ってｂａｘ／ｂｃｌ−２比の増加およびカスパーゼ−３、−８、−９の切断作用が生じる。
【００５２】
次に、出願人は、ＤＮＡ断片化作用の分析により、アピオールで処理したＣＯＬＯ  ２０５細胞のアポトーシス状況を調べた。アピオールで３６時間処理した後のＣＯＬＯ  ２０５細胞中においてのみ、ＤＮＡ断片化作用が観察された（＞７５μＭ）。ＤＮＡ断片化作用は確かに高投与量のアピオール（１５０μＭ）によって誘発されることが分かり、図６に示す通りである。
【００５３】
以上のことから、例えばアピオールなどのＳＹ−１誘導体は、確かに細胞タイプに特異的にヒト結腸線癌細胞のアポトーシスを誘発し、したがって結腸直腸癌の化学療法に用いることが可能である。
【図３】
0005313971.tif 000011
【図５Ａ】
0005313971.tif 000012
【図５Ｂ】
0005313971.tif 000013
【図５Ｃ】
0005313971.tif 000014
【図５Ｄ】
0005313971.tif 000015
【図７】
0005313971.tif 000016
【図１Ａ】
0005313971.tif 000017
【図１Ｂ】
0005313971.tif 000018
【図１Ｃ】
0005313971.tif 000019
【図２】
0005313971.tif 000020
【図４】
0005313971.tif 000021
【図５Ｅ】
0005313971.tif 000022
【図６】
0005313971.tif 000023