(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ’）：
【化１】
0005131700.tif 000011
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は共にヒドロキシル基である）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、分子シャペロン発現誘導剤。
【請求項２】
小胞体ストレスに対する細胞死抑制剤である、請求項１記載の分子シャペロン発現誘導剤。
【請求項３】
神経変性疾患予防または治療剤である、請求項1に記載の分子シャペロン発現誘導剤。
【請求項４】
神経変性疾患がアルツハイマー症、パーキンソン病または軽度認識障害である、請求項３記載の分子シャペロン発現誘導剤。
【請求項５】
分子シャペロン発現誘導剤を製造するための、下式（Ｉ’）
【化２】
0005131700.tif 000012
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は共にヒドロキシル基である）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体分子シャペロンの発現を誘導する作用を有する医薬組成物に関する。また本発明は分子シャペロン発現誘導作用に基づいて、小胞体ストレスによる細胞死を抑制するために有効な医薬組成物、または神経変性疾患の予防または治療剤として有効な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎え、アルツハイマー病などの痴呆患者数が激増している。しかし、その病態発症の分子機構は未だ明らかにされておらず、有効な治療法は見出されていないのが現状である。【０００３】
アルツハイマー病やパーキンソン病は、神経細胞の顕著な脱落を伴う進行性の神経変性疾患の代表である。アルツハイマー病（ＡＤ）の一部は遺伝子変異のある家族性ＡＤ（ＦＡＤ）であるが、大多数は家族歴のない孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である。いずれのＡＤも、脳内に沈着するアミロイド蛋白（Ａβ）からなる老人斑とタウ蛋白質の異常なリン酸化によって生じる神経原線維変化が、特徴的な病理所見である。このため、アミロイド蛋白（Ａβ）の増加がアルツハイマー病の病態に深く関わっていると考えられており（アミロイドカスケード仮説）（非特許文献１）、アルツハイマー病の治療剤として、アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）からアミロイド蛋白（Ａβ）の切り出しを抑制することによってＡβを低下させるβ/γセクレター阻害剤や、アミロイドワクチンが提案され開発が進められている（非特許文献２および３）。【０００４】
また、上記アルツハイマー病やパーキンソン病をはじめとする多くの神経変性疾患に、折り畳み異常あるいは構造異常の蛋白質（unfolded protein）が神経細胞内に凝集蓄積するという共通の病態が認められることから、近年、この異常蛋白質の蓄積（この状態を「小胞体ストレス」という）が様々な神経変性疾患の発症に関与している、という報告が相次いでなされている（非特許文献４〜９）。【０００５】
小胞体では、リボソームで合成された蛋白質が成熟するに当たり、糖鎖の付加やジスルフィド結合などの修飾を受け、折り畳まれた立体構造が形成される。小胞体で正しく折り畳まれた蛋白質はゴルジ体へと運ばれるが、折り畳みに失敗した蛋白質は正しい立体構造がとれるまで小胞体に停留される（小胞体ストレス）。小胞体ストレスが過剰な場合あるいは長時間持続する場合、細胞はアポトーシスを起こし死滅する。しかし、生体にはかかる細胞死を回避するための防御機構である小胞体ストレス応答（Unfolding Protein Response; UPR)が存在しており、細胞の生存維持に寄与している。かかる防御機構は、大まかに以下の３つに分類することができる。【０００６】
(1)小胞体関連分解機構（ER associated degraration；「ERAD」ともいう）
異常蛋白質を細胞質に排出して、ユビキチン・プロテアソーム系により分解する防御機構である。【０００７】
(2)分子シャペロン誘導機構
小胞体内に存在するシャペロン分子を転写レベルで誘導し、異常蛋白質の巻き戻しを図る機構である。異常蛋白質が蓄積したことが感知されると下流にシグナルが伝達され、分子シャペロン（「小胞体シャペロン」または「ＥＲ分子シャペロン」とも称される）が誘導される。分子シャペロンは小胞体ストレスによって発現が誘導される小胞体固有の分子（folding酵素）であり（非特許文献１０および１１）、小胞体内での新生分泌蛋白質や膜蛋白質の折り畳みに極めて重要な役割を果たしている。なお、当該分子シャペロンを誘導するセンサー或いはトランシデューサー蛋白質としてはIRE1αやATF6が知られている。【０００８】
(3)翻訳抑制機構
小胞体内に異常蛋白質が蓄積すると、翻訳開始因子（eIF2α）のリン酸化を促進して、蛋白質の翻訳を停止する機構である。この生体防御機構にはセンサー蛋白質PERKが関与していることが知られている。【０００９】
しかし、細胞があまりに過度な小胞体ストレスを受けると、上記の分子シャペロン誘導機構（小胞体ストレス応答（UPR））や小胞体関連分解機構（ERAD）でも対処しきれなくなり、様々な刺激に対して周囲の細胞との調和を乱さないために生体は積極的に自らアポトーシス（ＥＲストレス細胞死）を選択する。【００１０】
ところで、哺乳類について、上記小胞体ストレス応答に関与する分子シャペロンとして、８つのグルコース調節蛋白質(GRP）、すなわちGRP78/Bip、GRP94/ERp99、ORP150/GRP170、ERp72、GRP58/ERp60/ERp61、カルレティキュリン、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）およびFKBP13が同定されている。中でもGRP78/Bipは解析が進んでいる分子シャペロンであり、ラットGRP78遺伝子については、上流域に存在するCORE領域とCCAAT配列を含むＣ１領域が転写制御に重要であることが明らかにされている（非特許文献１２〜１４）。酵母については出芽酵母のGRP78遺伝子の転写制御配列（UPRE配列：CAGNGTG）が明らかにされており（非特許文献１５）、ヒトGRP78遺伝子の上流域にも当該UPRE配列に類似した配列が存在していることも明らかになっている。【００１１】
前述するように、小胞体ストレスに対して分子シャペロン誘導機構（小胞体ストレス応答（UPR））や小胞体関連分解機構（ERAD）が有効に機能する。このため、これらのいずれかの生体防御機能を増強してやれば、過剰な小胞体ストレスに対して防御でき、小胞体ストレスによって生じる病態や疾患、ならびに神経細胞死を回避することが可能と考えられる。この観点から、従来より、特にＵＰＲに着目して分子シャペロンの発現を誘導する技術が種々提案されている。【００１２】
本発明に係る化合物（Ｉ）のうち代表的な化合物は公知の化合物である（例えば非特許文献１６）。
【非特許文献１】Hardy, J. A. & Selkoe, D. J., Science, 19, 353-356
【非特許文献２】Beher, D. & Graham, S. L., Expert. Opin. Investig. Drugs, 14, 1385-1409 (2005)
【非特許文献３】Gilman, S. et al., Neurology, 10, 1553-1562 (2005)
【非特許文献４】Kitada, T. Et al., Nature 392, 605-608 (1998).
【非特許文献５】Imai, Y. et al., Cell 105, 891-902 (2001).
【非特許文献６】Nishitoh, H. et al., Genes Dev. 16, 1345-1355 (2002).
【非特許文献７】Katayama, T et al., Nat Cell Biolog, 8, 479-485 (1999).
【非特許文献８】Katayama, T. et al., J. Biol. Chem. 276, 43446-43454 (2001)
【非特許文献９】Yasuda, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 313-318 (2002)
【非特許文献１０】Kozutsumi, Y. et al.,Nature, 332, 462-464 (1988)
【非特許文献１１】Lee, A.S., Trends Biochem. Sci., 12, 20-23 (1987)
【非特許文献１２】Resendez, E. et al., Mol. Cell. Biol., 8, 4579-4584(1988)
【非特許文献１３】Wooden, S.K.et al.,Mol. Cell. Biol., 11,5612-5623 (1991)
【非特許文献１４】Li.W.W. et al., Mol. Cell. Biol.,14, 5533-5546(1994)
【非特許文献１５】Mori. K. et al., Genes Cells, 1, 803-817 (1996)
【非特許文献１６】Journal of the Chemical Society，Perkin Transactions 2 (2002), (2), 329-336
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、小胞体ストレスに対する生体防御機構としてＵＰＲに着目して、特に神経細胞における分子シャペロンのレベルを増大する方法を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は分子シャペロンの発現を誘導する作用を有する化合物、およびこれを有効成分とする医薬組成物を提供することを目的とする。また本発明は、当該医薬組成物が有する分子シャペロン発現誘導作用に基づいて、当該医薬組成物について分子シャペロン発現誘導剤、小胞体ストレスに対する細胞死抑制剤、ならびに神経変性疾患治療剤としての新規用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねていたところ、下式で示される1-フェニル-チオシアナトアルカン-1-オン誘導体（Ｉ）を神経細胞に投与すると、分子シャペロン（GRP78/Bip）の発現量が増大し、また小胞体ストレスに対して耐性が生じることを見出し、さらに当該化合物を神経細胞に投与して分子シャペロン（GRP78/Bip）の発現量を増加させると、アミロイド前駆蛋白（APP）からアミロイド蛋白（Ａβ）の生成が阻害されてＡβ産生が抑制されることを確認した。さらに当該化合物（Ｉ）を脳室に投与しておくと、一過性虚血による脳梗塞巣の発生や伸展を抑制することができることを確認した。すなわち、本発明者らは、当該化合物（Ｉ）が分子シャペロンの発現誘導剤として機能し、蛋白質のfoldingを促進することで小胞体ストレスに対抗することを確認し、かかる知見から、当該化合物（Ｉ）が小胞体ストレスに起因して生じる各種の病態や疾患の予防または治療剤の有効成分として有用であることを確信した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。【００１５】
すなわち本発明は下記の態様を有する：
項１．  式（Ｉ）：【００１６】
【化１】
0005131700.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、低級アルキル基または低級アルコキシ基；Ａｌｋは低級アルキレン鎖；Ｘは酸素原子または硫黄原子を意味する）
で示される化合物（1-フェニル-チオシアナトアルカン-1-オン誘導体）もしくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、医薬組成物。【００１８】
項２．  式（Ｉ’）：【００１９】
【化２】
0005131700.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は共にヒドロキシル基またはフッ素原子であるか、またはＲ１’が塩素原子であり、Ｒ２’が水素原子である）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、項１に記載の医薬組成物。【００２１】
項３．分子シャペロン発現誘導剤である、項１または２記載の医薬組成物。【００２２】
項４．小胞体ストレスに対する細胞死抑制剤である、項１または２記載の医薬組成物。【００２３】
項５．神経変性疾患予防または治療剤である、項1または２に記載の医薬組成物。【００２４】
項６．神経変性疾患がアルツハイマー症、パーキンソン病、または軽度認識障害である、項５記載の医薬組成物。【００２５】
項７．項１または２に記載する医薬組成物を被験者に投与する工程を有する、神経変性疾患の予防または治療方法。【００２６】
項８．神経変性疾患がアルツハイマー症、パーキンソン病、または軽度認識障害である、項７に記載する予防または治療方法。【００２７】
項９．神経変性疾患の予防または治療剤を製造するための、下式（Ｉ）【００２８】
【化３】
0005131700.tif 000004
【００２９】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、低級アルキル基または低級アルコキシ基；Ａｌｋは低級アルキレン鎖；Ｘは酸素原子または硫黄原子を意味する）
で示される化合物（1-フェニル-チオシアナトアルカン-1-オン誘導体）もしくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物の使用。【００３０】
項１０．上記の化合物（1-フェニル-チオシアナトアルカン-1-オン誘導体）が、下式（Ｉ’）：【００３１】
【化４】
0005131700.tif 000005
【００３２】
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は共にヒドロキシル基またはフッ素原子であるか、またはＲ１’が塩素原子であり、Ｒ２’が水素原子である）
で示される化合物である、項９に記載する使用。
【発明の効果】
【００３３】
本発明が提供する1-フェニル-チオシアナトアルカン-1-オン誘導体（Ｉ）およびこれを有効成分とする医薬組成物は、小胞体ストレス応答（UPR）に関与する分子シャペロンの発現を誘導する作用を有しているため、過剰な小胞体ストレスによって生じる病態や疾患の予防および治療に有効に使用することができる。すなわち、本発明によれば、過剰な小胞体ストレスによって生じる各種神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、軽度認識障害、脳卒中、糖尿病性神経症、緑内障など）を有効に予防または治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明が提供する医薬組成物は、下式（Ｉ）：【００３５】
【化５】
0005131700.tif 000006
【００３６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、低級アルキル基または低級アルコキシ基；Ａｌｋは低級アルキレン鎖；Ｘは酸素原子または硫黄原子を意味する）
で示される化合物または製薬上許容される塩を有効成分とするものである。【００３７】
式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２で定義されるハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、ヨウ素原子および臭素原子を挙げることができる。好ましくは塩素原子およびフッ素原子である。また低級アルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を挙げることができる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒ−ブチル基、ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、２−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１−メチル−２−エチルプロピル基などを挙げることができる。好ましくは炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖状のアルキル基であり、より好ましくはメチル基である。また低級アルコキシル基としては、炭素数１〜６のものを挙げることができ、具体的にはメトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、第二級ブトキシル基および第三級ブトキシル基等を挙げることができる。好ましくはメトキシル基である。なお、Ｒ１およびＲ２は、互いに同一であっても、またそれぞれ異なるものであってもよい。【００３８】
式（Ｉ）において、Ａｌｋで定義される低級アルキレン鎖としては炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアルキレン鎖を挙げることができる。具体的には、メチレン鎖、エチレン鎖、プロピレン鎖、ブチレン鎖、エチルメチレン鎖などを挙げることができる。好ましくはメチレン鎖である。【００３９】
式（Ｉ）において、Ｘは酸素原子および硫黄原子のいずれでもよいが、好ましくは酸素原子である。【００４０】
式（Ｉ）において、ベンゼン環に結合する下式：【００４１】
【化６】
0005131700.tif 000007
【００４２】
（式中、AlkおよびXは前記と同じ）
で示される基の位置は特に制限されないが、好ましくはＲ１基またはＲ２基に対してパラの位置である。より好ましくはＲ１基に対してパラの位置である。【００４３】
式（Ｉ）において、Ａｌｋとして好ましくはメチレン鎖であり、この場合、好ましくはＸが酸素原子、Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、ハロゲン原子（好ましくは塩素原子またはフッ素原子）、ヒドロキシル基、および水素原子である。かかる化合物として、具体的には下式（Ｉ’）で示される3位および／または4位に置換基を有するα−チオシアナトアセトフェノン化合物を挙げることができる。【００４４】
式（Ｉ’）：【００４５】
【化７】
0005131700.tif 000008
【００４６】
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は共にヒドロキシル基またはフッ素原子であるか、またはＲ１’が塩素原子であり、Ｒ２’が水素原子である）
なお、当該化合物には、具体的にはＲ１’およびＲ２’が共にヒドロキシル基である1-(3,4-ジヒドロキシ-フェニル)-2-チオシアナト−エタノン（分子量：209.22）；Ｒ１’およびＲ２’が共にフッ素原子である1-(3,4-ジフルオロ-フェニル)-2-チオシアナト−エタノン（分子量：213.20）；およびＲ１’が塩素原子でＲ２’が水素原子である1-(4-クロロ-フェニル)-2-チオシアナト−エタノン（分子量：211.67）が含まれる。好ましくはＲ１’およびＲ２’が共にヒドロキシル基である1-(3,4-ジヒドロキシ-フェニル)-2-チオシアナト−エタノン（以下、これを「BIX」ともいう）である。【００４７】
上記化合物（Ｉ）のうち代表的な化合物は非特許文献１６等に記載の公知の化合物であり、公知の方法で製造することができる。特に下式（Ｉ’）で示されるα−チオシアナトアセトフェノン化合物は、商業的に入手可能である〔例えば、Maybrige(英国)、Chemstep（仏）など〕。【００４８】
また、これらの化合物は、以下のような方法により合成することも可能である。【００４９】
【化８】
0005131700.tif 000009
【００５０】
(図中、Yはハロゲン、メタンスルホニルオキシ、パラトルエンスルホニルオキシ等の脱離基を表し、ZSCNはチオシアン酸の金属またはアンモニウム塩を表す。また、Ｒ１、Ｒ２、Ａｌｋ，およびＸは前記の通りである。)
具体的には、公知の方法により調製される化合物aとチオシアン酸塩（ZSCN）をトルエン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等の溶媒中、-20℃〜200℃好ましくは0℃〜100℃で0.5時間から24時間、好ましくは1時間から10時間反応させることにより化合物（Ｉ）を得ることができる。なお、水酸基等の置換基が反応の障害となる場合には、必要な段階で予め保護し、チオシアン酸塩との反応後にその保護基を除去すれば良い。【００５１】
これらの化合物は、遊離または塩の形態を有するもののいずれであってもよい。ここで塩としては、通常、製薬上許容される塩、たとえば無機塩基または有機塩基との塩を挙げることができる。無機塩基としては、たとえば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウムやアンモニウム等を挙げることができる。有機塩基としては、たとえば、エタノールアミン等の第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン等を挙げることができる。【００５２】
また上記の化合物は、遊離物またはその塩が、溶媒和してなるものであってもよい。なお、ここで溶媒和物には水和物が含まれる。【００５３】
上記化合物（Ｉ）は、分子シャペロン遺伝子の発現を誘導する作用を有する（実験例１参照）。ここで分子シャペロン遺伝子とは、小胞体内腔に局在し、分泌蛋白質や膜蛋白質の小胞体内での折り畳みに重要な役割を担っている分子シャペロンの遺伝子をいう。例えばORP150遺伝子（Ikeda, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Common., 230, 94-99 (1997) ）、GRP94遺伝子（Maki. R.G.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5658-5662 (1990)）、GRP78遺伝子（Ting J. and Lee, A.S. DNA, 7, 275-286 (1988)）、カルレティキュリン遺伝子（Rokeach, LA.et al., J. Immunol.147, 3031-3039 (1991)）、ERp72遺伝子、GRP58遺伝子、PDI遺伝子、FKBP13遺伝子などを挙げることができる。好ましくは、神経細胞で高発現しているGRP78遺伝子、ORP150遺伝子、GRP94遺伝子である。【００５４】
化合物（Ｉ）の分子シャペロンの発現誘導作用は、分子シャペロン遺伝子の転写物（ｍRNA）または遺伝子産物（蛋白質）の量に基づいて評価することができる。具体的には、ノーザンブロッティングやウエスタンブロッティングなどの通常の方法により、化合物（Ｉ）で処理した細胞（好ましくは、神経細胞）中の分子シャペロン遺伝子の転写物（ｍRNA）または遺伝子産物（蛋白質）の量が、未処理の細胞よりも増大していることをもって、当該化合物の分子シャペロンの発現誘導作用を評価することができる。【００５５】
ゆえに化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、分子シャペロン発現誘導剤として有効に使用することができる。この場合、医薬組成物中に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、当該医薬組成物が分子シャペロンの発現誘導作用を有する限りいかなる量であってもよく、例えば０．１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは１〜６０重量％、さらに好ましくは３〜４０重量％である。【００５６】
さらに化合物（Ｉ）は、分子シャペロンの発現誘導作用に基づいて、蛋白質をfoldingし、小胞体内への異常蛋白質の蓄積を抑制して小胞体ストレスを緩和することができ、その結果、小胞体ストレスによる細胞死を抑制、または小胞体ストレスに対する耐性を増強することができる（実験例２参照）。かかる化合物（Ｉ）の小胞体ストレスに対する細胞死抑制作用は、化合物（Ｉ）の存在下で細胞に小胞体ストレス誘発剤を作用させた場合の生存細胞の割合を、化合物（Ｉ）非存在下で細胞に小胞体ストレス誘発剤を作用させた場合の生存細胞の割合と比較することによって評価することができる。なお、小胞体ストレス誘発剤としては、蛋白質のＮ−グリコシル化を阻害するツニカマイシン（tunicamycin：Tm）、カルシウム貯蔵を枯渇させるカルシウムイオノフォアA23187、およびカルシウムATPaseを阻害するタプシガーギン（thapsigargin：Tg）が知られている。この場合、化合物（Ｉ）の作用による生存細胞の増加（死細胞の抑制）に基づいて、当該化合物（Ｉ）の小胞体ストレスに対する細胞死抑制作用を評価することができる。【００５７】
ゆえに化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、小胞体ストレスに対する細胞死抑制剤、または小胞体ストレスに対する耐性増強剤として有効に使用することができる。この場合、医薬組成物中に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、当該医薬組成物が小胞体ストレスに対して細胞死抑制作用、または耐性増強作用を有する限りいかなる量であってもよく、例えば０．１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは１〜６０重量％、さらに好ましくは３〜４０重量％である。【００５８】
さらに化合物（Ｉ）は、分子シャペロンの発現誘導作用に基づいて、小胞体ストレスを緩和するとともに、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症や進展に関わるアミロイド蛋白Ａβの生成を抑制することができる（実験例３参照）。【００５９】
かかる化合物（Ｉ）のＡβ生成抑制作用は、アミロイド前駆蛋白（APP）を発現しえる細胞に化合物（Ｉ）を作用させて、当該細胞中のアミロイド蛋白Ａβの割合を、化合物（Ｉ）を作用させない場合と比較することによって評価することができる。この場合、化合物（Ｉ）の作用によるＡβ生成量の低下に基づいて、当該化合物（Ｉ）についてＡβ生成抑制作用を評価することができる。また、実験例３に示すように化合物（Ｉ）のＡβ生成抑制作用は、ＡβをＡＰＰから切り出す酵素（γセクレターゼ）が作用する部位からＡＰＰを移動させることに基づく。従って、上記Ａβ生成量の低下にかえて、ＡＰＰ（mature型）の低下若しくは修飾ＡＰＰ（immature型）の増加を指標としてＡβ生成抑制作用を評価することもできる。【００６０】
ゆえに化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、神経変性疾患の予防または治療剤として有効に使用することができる。この場合、医薬組成物中に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、当該医薬組成物が分子シャペロンの発現誘導作用、好ましくは分子シャペロンの発現誘導作用に基づいて、小胞体ストレスに対して細胞死抑制作用及び／またはＡβ生成抑制作用を有する限り、いかなる量であってもよく、例えば０．１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは１〜６０重量％、さらに好ましくは３〜４０重量％である。【００６１】
なお、本発明が対象とする神経変性疾患には、その発症に小胞体ストレスまたは小胞体ストレスによる細胞死が関わる疾患が含まれる。例えばアルツハイマー病、軽度認識障害（MCI）、パーキンソン病、脳卒中（脳梗塞）、ポリグルタミン病、プリオン病、糖尿病、緑内障等を挙げることができる。好ましくは、アルツハイマー病、軽度認識障害（MCI）、パーキンソン病である。【００６２】
本発明の医薬組成物は、通常、分子シャペロン発現誘導に対して有効量の、ひいては小胞体ストレスによる細胞死の抑制および／またはＡβ生成抑制に有効量の化合物（Ｉ）に加えて、製薬上許容される担体または添加剤を配合して調製される。【００６３】
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。【００６４】
好ましくは経口投与および静脈内投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。【００６５】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【００６６】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製用の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。【００６７】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択するここができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【００６８】
本発明の医薬組成物にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【００６９】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。【００７０】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。【００７１】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。【００７２】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。【００７３】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。【００７４】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。【００７５】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。【００７６】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。【００７７】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。【００７８】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。【００７９】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。【００８０】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。【００８１】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。【００８２】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。【００８３】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。【００８４】
本発明の医薬組成物を、分子シャペロン発現誘導剤、小胞体ストレスに対する細胞死抑制剤、または神経変性疾患予防・治療剤として用いる場合、その経口投与量として、化合物（Ｉ）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇである。静脈内投与をする場合、化合物（Ｉ）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。【００８５】
なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。【００８６】
また本発明は、上記本発明の医薬組成物を被験者に投与することによって、当該被験者について神経変性疾患を予防し、また治療する方法に関する。
ここで対象とする神経変性疾患は、前述するように、その発症に小胞体ストレスまたは小胞体ストレスによる細胞死が関わる疾患が含まれる。具体的には、アルツハイマー病、軽度認識障害（MCI）、パーキンソン病、脳卒中（脳梗塞）、ポリグルタミン病、プリオン病、糖尿病、緑内障等を挙げることができる。好ましくは、アルツハイマー病、軽度認識障害（MCI）、パーキンソン病である。【００８７】
また本発明が対象とする被験者には、上記の神経変性疾患に罹患した患者のほか、神経変性疾患に罹患する可能性のある患者も含まれる。なお、神経変性疾患は、環境因子、薬剤、遺伝および加齢などが原因とされている。このため、汚染水、汚染された大気または農薬などにさらされている人（患者）、麻薬による中毒患者、医薬による副作用障害を発症している患者、ならびに遺伝性の患者なども  上記神経変性疾患に罹患する可能性のある患者に含まれる。  【００８８】
当該被験者に対する上記医薬組成物の投与方法は、前述するように特に制限はなく、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与および静脈内投与である。その投与量としては、経口投与の場合は、化合物（Ｉ）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇを、また静脈内投与の場合は、化合物（Ｉ）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような割合を挙げることができる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実験例により説明するが、本発明は、かかる実験例に限定されるものではない。また、以下の実験例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Willey-Interscience）等に記載された方法を用いた。【００９０】
また、下記の実験例では、化合物（Ｉ）の代表的例として、1-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-thiocyanato-ethanone（BIX）を用いた。【００９１】
実験例１
下記に説明するように、神経芽細胞腫SK-N-SH細胞に1〜50μMの1-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-thiocyanato-ethanone（BIX）を６時間暴露させて、分子シャペロン誘導の有無をノーザンブロッティングで測定した。【００９２】
（１）トランスフェクション
SK-N-SH細胞を、24穴プレート中で80%コンフルエンスになるまで成長させ、次いでLipofectamine 2000試薬（Invitrogen社）を用いて、GRP78/Bipプロモーターの制御下にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を有するレポータープラスミド（0.2μg）をトランスフェクションした。また。対照として、SV40エンハンサーとプロモーターの制御下にRenillaルシフェラーゼ遺伝子を有する対照プラスミドpRL-SV40（0.02μg）（Promega社）を用いて、SK-N-SH細胞をトランスフェクションした（対照細胞）。12時間後、各SK-N-SH細胞を1〜50μMのBIX、または300ｎMのthapsigargin（Tg）（小胞体ストレス誘発剤）（対照）で6時間処理した。【００９３】
（２）RNA単離および半定量的RT-PCR分析
上記各SK-N-SH細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、遠心分離して回収した。全RNAをRNeasy kit（Qiagen K.K.社）を用いて、そのマニュアルに従って細胞から単離した。RNA濃度を波長260nmの分光光度計で測定した。1.0％変性アガロースゲルに展開後、Immobilon-NY＋メンブラン（Millopore社製）に転写した。ランダムプライマーDNA標識キット（TaKaRA社製）を用いてGRP78/ Bip cDNAから作成した32P-標識ｃDNAプローブをハイブリダイズさせ、2xSSC、0.1% SDSおよび0.1xSSC、0.1% SDSで洗浄後、IPプレート（富士フイルム）上で曝露させて、BAS1800システム（富士フイルム）で分析した。【００９４】
結果を図１に示す。図１から、BIXは濃度依存的に分子シャペロン遺伝子の発現を誘導する作用を有することがわかる。【００９５】
実験例２
神経芽細胞腫SK-N-SH細胞を5μM のBIX存在下で12時間培養し、次いでこれを、小胞体ストレス誘発剤であるツニカマイシン（Tm）を0.5μg/mlの割合で含む新鮮培地に移し、さらに12〜48時間培養し、SK-N-SH細胞の生存数を測定した。なお、生存細胞数の測定は、Hoechst33258染色によりアポトーシスを起こした細胞を染色し、生存細胞と区別することで行った。具体的には、所定時間（12, 28, 36および48時間）培養した細胞を、４％のパラホルムアルデヒドに4℃で30分間処理した後、PBSで5分間洗浄し、100μMのHoechst33258（和光純薬工業製）を含むPBSで20分間処理することによってアポトーシスを起こした細胞を染色し、Hoechst33258により染め出される核が断片化したアポトーシス細胞の数から生存細胞数を算出した。対照実験として、SK-N-SH細胞をBIXの非存在下で12時間培養したものについても同様に、小胞体ストレス誘発剤（Tm）処理して、SK-N-SH細胞の生存数を測定した。【００９６】
結果を図２に示す。図中、BIX→TmはBIX処理群（BIX存在下で培養した後、Tm存在下で培養）の結果を、またNormal→TmはBIX非処理群（BIX非存在下での培養後、Tm存在下で培養）（対照群）の結果を示す。なお、結果（図２）は、対照群の12時間Tm処理時の生存細胞数を１とした場合の各生存細胞数の割合（細胞生存率）として示す。図２からわかるように、28、36および48時間と、時間が経過するにつれて、BIX処理群の細胞生存率は非処理群（対照群）よりも上昇した（細胞死の抑制）。このことから、BIXは、細胞に小胞体ストレスに対する抵抗性を与え、小胞体ストレスによる細胞死を抑制する作用を有することがわかる。【００９７】
実験例３
SY5Y/APPsw(SY5Y細胞にスエーデン型変異を持つAPPをトランスフェクトし、parmanent cell lineとしたもの)を、0〜10μg/mlのBIXの存在下で８時間培養した。次いでこれをPBSで洗浄し、Nonidet P-40 lysis 緩衝液（1% Nonidet P-40, 20mM HEPES pH7.6, 100mM NaCl, 3mM MgCl2, 5mMジチオスレイトール, 0.1% protease inhibitor cocktail（Sigma））中に添加して溶菌した。細胞溶解物を、氷上で3回5秒間超音波処理し、5分間15000rpmで遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、SDSサンプル緩衝液中で5分間ボイルした。蛋白質量が当量になるように10-15%のSDS-PAGEの各レーンに供し、電気泳動後、PVDF膜に転写して、第１抗体〔抗-APP抗体（Chemicon, Temecula, CA, USA）,抗-Aβantibodies,4G8 and 6E10（Signet Pathology Systems Inc., Dedham, MA, USA）〕を用いてイムノブロットした。次いで膜をTBS/Tween-20で洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ結合第２抗体（ECLキットの抗ラット/マウス抗体）（Sigma）とインキュベートした。対応するバンドをNitro Blue Tetrazolium (Sigma)と5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate（Roche）を用いて検出した。なお、抗-KDEL抗体はGRP78/Bipを認識する酵素である。【００９８】
結果を図３に示す。この図からわかるように、分子シャペロン（Bip）はBIXによって濃度依存的に発現誘導が増大され、またそれに伴って分泌Ａβ量（アミロイド蛋白）が減少することが観察された。また、アミロイド蛋白の前駆体であるＡＰＰは、BIXの濃度が上昇するに従って、mature型が減りimmature型が増えることが観察された。このことから、BIXは、分子シャペロン（Bip）を誘導することでＡＰＰをimmature化し、これによってＡＰＰがγセクレターゼによる切断に対して耐性化し、ＡＰＰの切断によるＡβ産生および分泌が抑制されているものと考えられる。【００９９】
実験例４ 
マウス（20-27g、雄、DDYマウス）（SLCより入手）の脳室内に、10%のDMSOに溶解したBIX（５または20μg／2μ１）を投与した後、片側中大脳動脈(MCA)を栓子にて閉塞し、低酸素条件とすることで人為的に小胞体ストレスを引き起こした。なお、BIXの脳室内への投与は、脳図譜に基づき頭蓋骨を介して針を挿入することにより行った。【０１００】
閉塞処置後24時間後に、マウスの挙動から神経学的障害の程度を下記の基準に従ってスコア化して評価することができる。
＜神経学的障害の程度＞
０（正常）：神経学的障害が認められない
１（軽度）：右前足に伸展障害がある
２（中度）：対側部位にサークリング（circling）がある（旋回行動）
３（重度）：歩行不能または立ち直り反射が消失。【０１０１】
次いで、断頭して脳をとりだし、前脳を嗅脳から2mm間隔に５分割した（図４のＡ参照）。各切片を2%の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色し、梗塞部位を同定して、デジタルカメラを用いて画像として記録し、Image Jを用いて梗塞領域（面積、容積）の割合を定量した。【０１０２】
また、脳浮腫の割合を下式に従って算出することもできる。【０１０３】
【数１】
0005131700.tif 000010
【０１０４】
なお、対照として、脳室内へのBIX（5μg／2μ１または20μg／2μ１）の投与に代えて、等量のDMSOを投与して、上記と同様にして試験を行った。【０１０５】
TTC染色の結果を図４Ｂに示す。図４Ｂ中、向かって右側がBIX投与群の結果、向かって左側がBIX非投与群（対照群）の結果である。脳の白い領域は梗塞が生じている部位である。各切片毎の梗塞領域の面積を図５Ａに、マウス嗅脳から6mm部位の切片における梗塞領域の容積を図５Ｂに示す。【０１０６】
図５ＡおよびＢからわかるように、BIX 20μg投与群で、マウス嗅脳から6mm部位で梗塞領域の有意な減少が認められた。またBIX 5μg投与群でも梗塞領域の減少が認められた。【０１０７】
以上のことから、BIXで代表される化合物（Ｉ）は、分子シャペロンの発現誘導作用を有し、それに伴って小胞体ストレスによる細胞死を抑制する作用、およびアミロイド蛋白（Ａβ）の生成を抑制する作用を有することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】1-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-thiocyanato-ethanone（BIX）による分子シャペロン（GRP78/Bip）の発現誘導を示す結果である（実験例１）
【図２】小胞体ストレス誘発剤（Tm）によって誘発される細胞死に対するBIXの抑制作用を示す結果である（実験例２）
【図３】BIXのアミロイド蛋白（Ａβ）生成抑制作用を示す結果である（実験例３）
【図４】実験例４において、Ａは前脳の切断様式を示す図であり、Ｂは切断した脳切片をＴＴＣ染色した結果を示す図である。
【図５】Ａは各脳切片の梗塞領域の面積を、Ｂは嗅脳から6mm部位の切片における梗塞領域の容積を、各々BIX（5、20μg）投与した場合と、未投与（control）の場合で対比した結果を示す。
【図１】
0005131700.tif 000013
【図２】
0005131700.tif 000014
【図３】
0005131700.tif 000015
【図４】
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【図５】
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