(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型HAC1遺伝子とRRBP1遺伝子を有する形質転換酵母。
【請求項２】
以下の（１）の活性型HAC1遺伝子と（２）のRRBP1遺伝子を有する、請求項１に記載の形質転換酵母。
（１）下記の（a)〜（d）から選択される活性型HAC1遺伝子：
（a）配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（b）配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUnfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（c）配列番号23に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（d）配列番号22に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の（e）〜（h）から選択されるRRBP1遺伝子：
（e）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１をコードする遺伝子
（f）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１のアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（g）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（h）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項３】
以下の（１）の活性型HAC1遺伝子と（２）のRRBP1遺伝子を有する、請求項１に記載の形質転換酵母。
（１）下記の（i）〜（l）から選択される活性型HAC1遺伝子：
（i）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子
（j）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulans の活性型HAC1タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（k）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulans の活性型HAC1タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（l）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の（e）〜（h）から選択されるRRBP1遺伝子：
（e）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１をコードする遺伝子
（f）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１のアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（g）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（h）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP１遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項４】
酵母がメタノール資化性酵母である、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項５】
メタノール資化性酵母がOgataea minutaである、請求項４に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項７】
外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、請求項１から６のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項８】
外来タンパク質が多量体タンパク質である、請求項７に記載の形質転換酵母。
【請求項９】
多量体タンパク質がヘテロ多量体である、請求項８に記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、請求項９に記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれかに記載の形質転換酵母を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
培養をProtein O-mannosyltransferase (PMT)活性を抑制する条件下で行うことを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
Protein O-mannosyltransferase (PMT)活性の抑制が、培地にPMT活性阻害剤を添加することにより行われる、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
活性型HAC1遺伝子とRRBP1遺伝子を含む酵母用発現ベクター。
【請求項１５】
活性型HAC1遺伝子が、下記の（a）から（d）のいずれかの遺伝子である、請求項１４に記載の酵母用発現ベクター。
（a）配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（b）配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUnfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（c）配列番号23に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（d）配列番号22に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項１６】
活性型HAC1遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、請求項１４に記載の酵母用発現ベクター。
【請求項１７】
YEp351GAP-II-aHAC1/p180である、請求項１４に記載の酵母用発現ベクター。
【請求項１８】
RRBP1遺伝子が、ヒト若しくはイヌ由来のRRBP1遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、請求項１４に記載の酵母用発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１４から１８のいずれかに記載の酵母用発現ベクターを導入した形質転換酵母。
【請求項２０】
活性型HAC1遺伝子を含む発現ベクター、及びRRBP1遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換酵母。
【請求項２１】
活性型HAC1遺伝子を含む発現ベクターが、下記の（a）から（d）のいずれかの遺伝子を含む発現ベクターまたはpOMexPGHy/Hac1である、請求項２０に記載の形質転換酵母。
（a）配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（b）配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUnfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（c）配列番号23に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（d）配列番号22に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２２】
活性型HAC1遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、請求項２０に記載の形質転換酵母。
【請求項２３】
RRBP1遺伝子が、ヒト若しくはイヌ由来のRRBP1遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、請求項２０に記載の形質転換酵母。
【請求項２４】
以下の工程を含む、形質転換された酵母の製造方法。
（Ａ）宿主細胞に対して、活性型HAC1遺伝子を導入する工程
（Ｂ）宿主細胞に対して、RRBP1遺伝子を導入する工程
【請求項２５】
活性型HAC1遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である、請求項２４に記載の製造方法：
（1）下記の（a）から（d）のいずれかの遺伝子
（a）配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（b）配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUnfolded Protein Response (UPR)を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（c）配列番号23に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（d）配列番号22に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（2）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子
（3）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（4）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（5）Saccharomyces cerevisiae、Trichoderma reesei、またはAspergillus nidulansの活性型HAC1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUPRを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２６】
RRBP1遺伝子が以下のいずれかの遺伝子である、請求項２４に記載の製造方法：
（1）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP1をコードする遺伝子
（2）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP1のアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表され、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（3）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP1のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列で表され、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（4）ヒト由来またはイヌ由来のRRBP1遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２７】
酵母がメタノール資化性酵母である、請求項２４から２６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２８】
メタノール資化性酵母がOgataea minutaである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項２４から２６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３０】
O型糖鎖合成を抑制する条件下で、活性型HAC1遺伝子及びRRBP1遺伝子と外来タンパク質をコードする遺伝子とを導入した形質転換酵母を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項３１】
O型糖鎖合成の抑制が、PMT遺伝子を分断することにより行われる、請求項３０に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３２】
O型糖鎖合成の抑制が、PMT活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、請求項３０に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３３】
O型糖鎖合成の抑制が、PMT遺伝子を分断し、かつ、PMT活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、請求項３０に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３４】
PMT活性阻害剤が、5-[[3,4-(1- phenylmethoxy)phenyl]methylene]-4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidineacetic acidまたは{(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-phenylethoxy)-4-(2-phenylethoxy)benzylidene]-2-thioxo-1,3-thiazolidin-3-yl}acetic acidである、請求項３２または３３に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品用途のタンパク質の遺伝子組換え技術による生産には、これまで宿主として主に動物細胞、大腸菌が用いられている。大腸菌は、目的タンパク質を低コストで生産することが可能であるが、糖鎖修飾に代表される修飾を行うことが出来ず、封入体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）中に不活化状態のタンパク質として生成するため、可溶化プロセスが必要で、複雑なタンパク質の生産には不向きである。一方、動物細胞は、目的タンパク質を活性化タンパク質として生産することができるが、細胞育種・培養に時間を要し、設備、材料費を含め、非常に高コストでの生産を余儀なくされる。
タンパク質の中でも特に抗体は古くから医薬品として利用されてきたが、ヒト以外の他起源由来のものであったため、投与された抗体自身に対する抗体が産生され、複数回の投与ができず、その利用が制限されてきた。近年、抗原結合部位以外のアミノ酸配列をヒト抗体由来の配列に置換したヒト型抗体が作製されるようになったこと、更にマウスにヒト抗体遺伝子を導入したヒト抗体生産マウスが作出されるようになったことから、抗体の医薬としての利用が急速に広まってきた。現在これらの抗体は、ハイブリドーマや抗体をコードする遺伝子を導入したＣＨＯ細胞などの培養細胞によって生産されているが、コスト、生産性、安全性などの点で問題が多い。
近年、これらの欠点を補う意味で酵母を用いて医薬品用途のタンパク質生産を行うことが検討されているが、実用化された例はほとんどない。特に、複雑な構造を有する抗体については、Ｆａｂ、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等を発現させた例（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２１３８−２１４４（２０００））はあるが、抗体全長では生産性は非常に低い（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８６７８−８６８２（１９８８））。また最近、哺乳類型のＮ結合型糖鎖を生産する酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を利用して抗体を生産させた例（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２４：２１０−２１５（２００６））が報告されるが、収率・収量については言及がない。このように、酵母での抗体の高生産は困難であるが、原因としては、酵母には十分な分泌能力がないこと、プロテアーゼによる分解などが挙げられる。
これらの問題を解決する手段の一つとして、プロテアーゼ破壊株を用いる方法が提案されており（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２６：６７１−６７７（２０００）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０：４８５−４９１（２０００）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：６２８−６３１（２００２））、発明者らもまた、プロテアーゼの一種である、プロテアーゼＡ（ＰＥＰ４）、プロテアーゼＢ（ＰＲＢ１）、ヤプシン（ＹＰＳ１）遺伝子の破壊株を用いて抗体の分解を抑制させる方法を開発している（ＷＯ２００３／０９１４３１）。一方、遺伝子導入によるタンパク質生産性向上の例として、ＢｉＰ（ＫＡＲ２）／ＰＤＩ等の小胞体上でタンパク質の３次元構造形成を助ける分子シャペロン群の一部を共発現させることによってＳｃＦｖの生産性を向上させる方法が報告されているが（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７３−７７７（１９９８））、１本鎖の抗体断片を生産しているにすぎない。
また、誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターが多く開発され、外来タンパク質の生産に利用されている。しかしながら、細胞において外来タンパク質をコードする遺伝子を強力なプロモーターを用いて高発現させた場合、またはフォールディングしにくいタンパクを生産させた場合、小胞体（ＥＲ）内でアグリゲーションを起こし、細胞内に蓄積されることがある。さらに、分泌タンパク質及び膜タンパク質は、タンパク質へ翻訳されると直ちに小胞体へ取り込まれ、一定の修飾を受けた後にゴルジ装置へ送られるが、このとき、何らかの理由で未熟な（ｕｎｆｏｌｄな）タンパク質が小胞体へ蓄積してしまうことがある。このような状態を「小胞体ストレス」と呼ぶ。小胞体ストレスの原因としては、小胞体内で起こる修飾（糖鎖、ジスルフィド結合の付加）の障害、小胞体からの輸送の低下などが挙げられる。哺乳類の細胞は、このような小胞体ストレスに対抗する手段として、「Ｕｎｆｏｌｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）」という機構を備えており、例えば、転写抑制、分子シャペロンの誘導によるフォールディング促進、変性タンパクの分解、アポトーシスによる細胞死によって、小胞体に蓄積したタンパク質を保護する。
このＵＰＲを制御する遺伝子として、動物細胞では、ＩＲＥ１α−ＸＢＰ１の系、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ−２α系、ＡＴＦ６系の系が知られている。また、酵母においては、Ｉｒｅ１ｐ−Ｈａｃ１ｐの系のみが存在することが知られており、Ｉｒｅ１ｐ−Ｈａｃ１ｐは、次のようなメカニズムでＵＰＲに関与している（図１参照）。まず、Ｉｒｅ１ｐは、通常、ＢｉＰ（抗体重鎖結合タンパク）と結合しているが、アンフォールド・タンパク質（Ｕｎｆｏｌｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＵＦＰ）が生成された場合、ＢｉＰはこのＵＦＰと結合する。ＢｉＰと解離したＩｒｅ１ｐは自己リン酸化、２量体化により活性化し、エンドヌクレアーゼ活性を発揮する。一方、ＨＡＣ１遺伝子は、通常、不活化された状態にあるが、エンドヌクレアーゼ活性を有するＩｒｅ１ｐは、ＨＡＣ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡをスプライシングし、活性型Ｈａｃ１ｐを生成する（Ｃｅｌｌ．８７：４０５−４１３（１９９６）、Ｃｅｌｌ．９０：１０３１−１０３９（１９９７）、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｎｒｎａｌ．１８：３１１９−３１３２（１９９９））。この活性型Ｈａｃ１ｐは核に移行し、転写因子として作用し、ＵＰＲと称する一連の反応、関連した糖鎖付加、タンパクフォールディング、タンパク分解（ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ＥＲＡＤ）、タンパクソーティング、脂質代謝などに関連した様々なタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進する（Ｃｅｌｌ．１０１：２４９−２５８（２０００））。
活性型Ｈａｃ１ｐを利用した外来タンパク質生産性の向上についての取組みでは、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの活性型Ｈａｃ１ｐをコードする遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入することにより異種タンパク質であるα−アミラーゼ、及び内在性タンパク質であるインベルターゼを分泌向上させた例がある（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：２０６５−２０７２（２００３））。しかしながら単一のタンパク質であるα−アミラーゼやインベルターゼは、元々分泌しやすいタンパク質として知られているものであり、生産量も２倍程度の向上しかみられない。また最近Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて、活性型ＨＡＣ１遺伝子を単独で導入した株において、抗体断片であるＦａｂを生産したという報告がある（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．９４：３５３−３６１）。しかしながら活性型ＨＡＣ１遺伝子の導入のみでは、１．３倍程度の生産性向上しか認められていない。
一方、哺乳類由来のＲＲＢＰ１（リボソーム結合タンパク１、リボソームレセプター、ｐ１８０タンパク）遺伝子を単独で酵母に導入することにより、タンパク質（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＰＴＩ）を約５倍分泌させた例（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１４６：２７３−２８４（１９９９））が知られている。ＲＲＢＰ１遺伝子は、リボソームに結合するタンパクをコードする遺伝子として当初イヌから単離された（Ｎａｔｕｒｅ．３４６：５４０−５４４（１９９０））。ＲＲＢＰ１は分子量が１８０ｋＤａでＮ末側に１０アミノ酸残基が５４回繰り返す特異な構造を持ち、この領域がリボソームと結合する。ＲＲＢＰ１は膜構造の増大、ｍＲＮＡの安定化に関与することが知られている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１３０：２９−３９（１９９５）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１５６：９９３−１００１（２００２））。しかしながら、上記のＢＰＴＩでの成功例は分子量が６５００と非常に小さいペプチドでのものであり、一般的に他の高分子量のタンパク質、更には抗体のような軽鎖、重鎖という異なったタンパク質の会合体タンパクに適応できるとは限らない。
酵母やカビでは、ＰＭＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子が酵母やカビ特有のＯ型糖鎖形成に関与することが知られている。このＰＭＴ遺伝子産物は、ＥＲ膜に局在し、分泌タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル残基にマンノースを付加する活性（以下、ＰＭＴ活性と称する）を有する。ＰＭＴにより糖鎖付加を受けたタンパクの一部はマンノプロテインとして酵母の細胞壁の主構成成分となっており、ＰＭＴ活性を極度に低減させた場合は、細胞壁が減弱化し細胞自体の生育に影響を与えることが知られている。
ＰＭＴ遺伝子に関し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＰＭＴ１，２，３，４，５，６，７の７遺伝子の存在が認められている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４２６：２９７−３０７（１９９９））。ＰＭＴ遺伝子は、ＰＭＴ１ファミリー、ＰＭＴ２ファミリー、ＰＭＴ４ファミリーの３種に分類され、ＰＭＴ１ｐとＰＭＴ２ｐはヘテロ２量体を形成し、ＰＭＴ４ｐはホモ２量体を形成し活性を発現していることが知られている。アミノ酸配列の相同性などからＰＭＴ５ｐはＰＭＴ１ｐを、ＰＭＴ３ｐはＰＭＴ２ｐを相補すると言われている。ＰＭＴ６ｐはＰＭＴ２ｐおよびＰＭＴ３ｐと相同性が高いが、どのような複合体で活性を発現しているのかは知られていない。また各々のＰＭＴタンパクには基質となるタンパクに選択性があることが知られている。
また、その他の出芽酵母のＰＭＴ遺伝子としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＭＴ１，２，４，５，６遺伝子と相同性の高い５遺伝子（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５：５４６−５６０（２００５））、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓでは少なくともＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＭＴ４遺伝子と相同性の高い遺伝子が（Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ，６：２２２−２３４（２００７））、分裂酵母のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅでは、同じくＰＭＴ１，２，４遺伝子と相同性の高い３遺伝子（ｏｍａ１，２，４）が見出されている（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：１５６−１７０（２００５））。更に本発明においてメタノール資化性酵母であるＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）においては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＭＴ１，２，４，５，６遺伝子と相同性の高い５遺伝子の存在が確認された。
またカビにおいてもＰＭＴ遺伝子は見出されている。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓではＰｍｔＡ遺伝子他２遺伝子が、またＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＭＴ２遺伝子と相同性の高いＰｍｔ１遺伝子が見出されている（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，４３：１１−１６（２００３））。
ＰＭＴ活性はペプチドの疎水的な領域に作用し、ペプチドの親水性を上げ、ＥＲ内腔でのペプチドの凝集を抑制する効果があると言われている。ところが外来タンパク質を生産した場合、ＰＭＴ活性は時として不要なＯ型糖鎖を付加し、タンパク複合体の形成不全、活性の低下等を引き起こす可能性がある。特に抗体等の多量体タンパクにとっては、その会合体形成（抗体の場合、軽鎖と重鎖の会合体形成）を阻害する可能性がある。
特許第３６３０４２４号、および特表平８−５０９８６７に、ＰＭＴ遺伝子改変によるＯ型糖鎖付加抑制による組換えタンパクの製造法が提案されているが、抗体の軽鎖・重鎖会合体形成に関する記述はない。
またＯ型糖鎖形成に関与するＰＭＴ１、ＰＭＴ２遺伝子破壊株を用いて、Ｏ型糖鎖の付加を抑制し、抗体軽鎖、重鎖分子の会合を１．５倍程度、促進する例が示されている（ＷＯ２００２／０４６４３７）。しかしながらこのデータはＲＩラベルしたアミノ酸を用いたパルス・ラベル実験の結果であり、培養プロセス全体を見た結果ではない。また、糖鎖付加抑制の程度は低く、しかも抗体の生産性については逆に低下している。
上記、ＨＡＣ１遺伝子はＵＰＲを誘導するが、ＵＰＲで誘導される遺伝子群の中には、酵母特有のＯ型糖鎖を付加するＰＭＴ遺伝子も存在することが知られている（Ｃｅｌｌ．１０１：２４９−２５８（２０００））。従ってＨＡＣ１遺伝子を導入したのみでは、抗体などの多量体タンパクを高品質で高生産することはできないと考えられる。
以上のように、酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法については、様々な方法が提示されているが、未だに実用化レベルを達成する方法はほとんど存在しない。特に抗体をはじめとする高分子量のタンパク質、会合体タンパクを効率的に生産する方法は見出されていない。一般的に細胞に遺伝子導入・遺伝子破壊等で１つの形質を導入した場合、細胞は何らかのストレスを受けるため、他の修飾が行われたり、逆の作用が生まれる場合もある。例えば、タンパク質の高発現を行った場合、ＵＰＲが活性化された状態になるが、結果的に糖鎖修飾、プロテアソームやＥＲＡＤ（ＥＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）による分解などの負の要素が働く。よって抗体のような複雑な構造をとるタンパク質の高分泌生産は、たとえば単独の遺伝子を導入するといったような、ただ１つの方法で達成されるものではなく、また従来の方法をいくつか単に組み合わせることで、必ずしも相乗的に効果が得られるものではない。
従って、本発明の課題は、酵母などの宿主細胞において、タンパク質、特には抗体などの構造が複雑なタンパク質を高分泌生産する手段を提供することにある。
【発明の開示】
【０００３】
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、メタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａにおいてタンパク質の高分泌生産に関わる遺伝子である、活性型ＨＡＣ１（小胞体ストレス時にＩｒｅ１ｐによりｍＲＮＡがスプライシングを受け、誘導される転写因子であるＨａｃ１タンパク質）遺伝子、及びＲＲＢＰ１（リボソーム結合タンパク１、リボソームレセプター、ｐ１８０タンパク）遺伝子を共発現させることにより、抗体の分泌生産性を１０倍近く向上できることを見出した。更に抗体などのヘテロ多量体の会合を阻害する、酵母特有のタンパク質へのＯ型糖鎖付加に関与するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）の活性を抑制することによって、更なる生産性の向上が実現できることを見出した。
またタンパク質の高分泌生産に関わる遺伝子である、活性型ＨＡＣ１遺伝子を発現させ、更に抗体などのヘテロ多量体の会合を阻害する、酵母特有のタンパク質へのＯ型糖鎖付加に関与するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）の活性を抑制することによって、相乗的な生産性の向上が実現できることを見出した。
本発明はかかる知見により完成されたものである（図２参照）。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を有する形質転換宿主細胞。
〔２〕以下の（１）の活性型ＨＡＣ１遺伝子と（２）のＲＲＢＰ１遺伝子を有する、〔１〕に記載の形質転換宿主細胞。
（１）下記の（ａ）〜（ｄ）から選択される活性型ＨＡＣ１遺伝子：
（ａ）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号２３に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２２に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の（ｅ）〜（ｈ）から選択されるＲＲＢＰ１遺伝子：
（ｅ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１をコードする遺伝子
（ｆ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｈ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔３〕以下の（１）の活性型ＨＡＣ１遺伝子と（２）のＲＲＢＰ１遺伝子を有する、〔１〕に記載の形質転換細胞。
（１）下記の（ｉ）〜（ｌ）から選択される活性化ＨＡＣ１遺伝子：
（ｉ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子
（ｊ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｋ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｌ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の（ｅ）〜（ｈ）から選択されるＲＲＢＰ１遺伝子：
（ｅ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１をコードする遺伝子
（ｆ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｈ）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔４〕宿主細胞が真核細胞である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
〔５〕真核細胞が酵母である、〔４〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔６〕酵母がメタノール資化性酵母である、〔５〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔７〕メタノール資化性酵母がＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａである、〔６〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔８〕酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、〔５〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔９〕外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。
〔１０〕外来タンパク質が多量体タンパク質である、〔９〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔１１〕多量体タンパク質がヘテロ多量体である、〔１０〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔１２〕ヘテロ多量体が抗体またはその機能的断片である、〔１１〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔１３〕〔９〕から〔１２〕のいずれかに記載の形質転換宿主細胞を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔１４〕培養をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことを特徴とする、〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制が、培地にＰＭＴ活性阻害剤を添加することにより行われる、〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕  メタノール資化性酵母の活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子。
〔１７〕下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかの遺伝子。
（ａ）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号２３に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２２に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔１８〕〔１７〕に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
〔１９〕ｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１である、〔１８〕に記載の発現ベクター。
〔２０〕活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を含む発現ベクター。
〔２１〕活性型ＨＡＣ１遺伝子が、〔１７〕に記載の遺伝子である、〔２０〕に記載の発現ベクター。
〔２２〕活性型ＨＡＣ１遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、〔２０〕に記載の発現ベクター。
〔２３〕ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１／ｐ１８０である、〔２０〕に記載のベクター。
〔２４〕ＲＲＢＰ１遺伝子が、ヒト若しくはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、〔２０〕に記載の発現ベクター。
〔２５〕〔１８〕から〔２４〕のいずれかに記載の発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞。
〔２６〕活性型ＨＡＣ１遺伝子を含む発現ベクター、及びＲＲＢＰ１遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞。
〔２７〕活性型ＨＡＣ１遺伝子を含む発現ベクターが〔１８〕または〔１９〕に記載の発現ベクターである、〔２６〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔２８〕活性型ＨＡＣ１遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、〔２６〕に記載の形質転換宿主細胞。
〔２９〕ＲＲＢＰ１遺伝子が、ヒト若しくはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子、またはそれらの相同遺伝子である、〔２６〕に記載の形質転換細胞。
〔３０〕以下の行程を含む、形質転換された宿主細胞の製造方法。
（Ａ）宿主細胞に対して、活性型ＨＡＣ１遺伝子を導入する行程
（Ｂ）宿主細胞に対して、ＲＲＢＰ１遺伝子を導入する行程
〔３１〕活性型ＨＡＣ１遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である、〔３０〕に記載の製造方法：
（１）〔１７〕に記載の遺伝子
（２）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子
（３）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（５）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔３２〕ＲＲＢＰ１遺伝子が以下のいずれかの遺伝子である、〔３０〕に記載の製造方法：
（１）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１をコードする遺伝子
（２）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表され、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列で表され、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔３３〕宿主細胞が真核細胞である、〔３０〕から〔３２〕のいずれかに記載した製造方法。
〔３４〕真核細胞が酵母である、〔３３〕に記載の製造方法。
〔３５〕酵母がメタノール資化性酵母である、〔３４〕に記載の製造方法。
〔３６〕メタノール資化性酵母がＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａである、〔３５〕に記載の製造方法。
〔３７〕酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、〔３４〕に記載の製造方法。
〔３８〕下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかの遺伝子。
（ａ）配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号７０に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号７０に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号６９に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔３９〕〔３８〕に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
〔４０〕ｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／ＰｐＨａｃ１である、〔３９〕に記載の発現ベクター。
〔４１〕Ｏ型糖鎖合成を抑制する条件下で、活性型ＨＡＣ１遺伝子及び／又はＲＲＢＰ１遺伝子と外来タンパク質をコードする遺伝子とを導入した形質転換細胞を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔４２〕Ｏ型糖鎖合成の抑制が、ＰＭＴ遺伝子を分断することにより行われる、〔４１〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４３〕Ｏ型糖鎖合成の抑制が、ＰＭＴ活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、〔４１〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４４〕Ｏ型糖鎖合成の抑制が、ＰＭＴ遺伝子を分断し、かつ、ＰＭＴ活性阻害剤を培地に添加することにより行われる、〔４１〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４５〕ＰＭＴ活性阻害剤が、５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄまたは｛（５Ｚ）−４−ｏｘｏ−５−［３−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）−４−（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］−２−ｔｈｉｏｘｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌ｝ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄである、〔４３〕または〔４４〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４６〕活性型ＨＡＣ１の遺伝子を導入し、ＰＭＴ遺伝子を分断した形質転換宿主細胞。
〔４７〕宿主細胞が、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａである、〔４６〕に記載の形質転換細胞。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子の取得法、及び構造を示した図である。
図２は、本発明の技術内容の概要を示した図である。
図３は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクター（ｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１）、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクター（ｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０）、ヒト抗体遺伝子発現ベクター（ｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ａｂ）の構造を示した図である。
図４は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子を導入した抗体生産酵母株の培養上清中に分泌された抗体のウエスタン解析結果を示した図である。
図５は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子を導入した抗体生産酵母株の抗体分泌量の測定結果を示したグラフである。
図６は、Ｏ型糖鎖形成が抑制された条件下で培養したＯ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子を導入した抗体生産酵母株の培養上清中に分泌された抗体のウエスタン解析結果を示した図である。
図７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１発現ベクター（ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１）、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクター（ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０）、ヒト抗体遺伝子発現ベクター（ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃ）、活性型ＨＡＣ１及びＲＲＢＰ１遺伝子共発現ベクター（ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１／ｐ１８０）を示した図である。
図８Ａは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢ１遺伝子発現ベクターを導入した抗体生産酵母株の抗体分泌生産能を比較したグラフである。図８ＢはＯ型糖鎖形成が抑制された条件で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクターを導入した抗体生産酵母株の抗体分泌生産能を比較したグラフである。図８Ｃは、ＰＭＴ阻害剤添加・無添加の条件で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクターを導入した抗体生産酵母株の抗体分泌生産能（絶対値）を比較したグラフである。
図９は、コドンを変換した合成抗体遺伝子を導入した抗体生産株での抗体の生産についてのウエスタン解析結果を示した図である。
図１０は、各酵母由来の活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。
図１１は、各酵母由来の活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した図である。
図１２は、ＰＭＴ１遺伝子またはＰＭＴ２遺伝子分断抗体生産株、および活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。
図１３は、ＰＭＴ１遺伝子またはＰＭＴ２遺伝子分断抗体生産株、および活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した図である。
図１４は、ＰＭＴ４遺伝子分断抗体生産株および活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。
図１５は、ＰＭＴ４遺伝子分断抗体生産株および活性化ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した図である。
図１６Ａは、ＰＭＴ５遺伝子またはＰＭＴ６遺伝子破壊抗体生産株の培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。図１６Ｂは、ＰＭＴ５遺伝子またはＰＭＴ６遺伝子破壊抗体生産株の分泌抗体の生産量を示した図である。
図１７は、ＰＭＴ２遺伝子またはＰＭＴ４遺伝子を分断し、かつ活性化ＨＡＣ１遺伝子導入した抗体生産株を用い、ＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を添加して培養した培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。
図１８Ａは、ＰＭＴ２遺伝子分断し、かつ活性化ＨＡＣ１遺伝子導入した抗体生産株を用い、ＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を添加して培養した培養上清の分泌抗体の生産量を示した図である。図１８Ｂは、ＰＭＴ４遺伝子分断し、かつ活性化ＨＡＣ１遺伝子導入した抗体生産株を用い、ＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を添加して培養した培養上清の分泌抗体の生産量を示した図である。
図１９は、種々のＰＭＴ阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体）を添加して培養した培養上清のウエスタン解析結果を示した図である。
図２０は、種々のＰＭＴ阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体）を添加して培養した培養上清の分泌抗体の生産量を示した図である。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００６年５月１６日に出願された日本国特許出願２００６−１３６９９３号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、以下の２つの構成要素より構成される。すなわち
Ａ．タンパク質高分泌生産に関する遺伝子の導入
Ｂ．酵母（およびカビ）に特有のＯ型糖鎖付加の抑制
を組み合わせることにより、タンパク質高分泌生産に関して相乗的な効果を得ることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によれば、タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター該発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞、該形質転換宿主細胞を用いるタンパク質の製造方法が提供される。
１．タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子
（１）ＨＡＣ１遺伝子
本発明において、タンパク質高分泌生産に用いる遺伝子の一つは、ＨＡＣ１遺伝子である。ＨＡＣ１遺伝子は、ゲノム上では不活性型のＨＡＣ１遺伝子として存在するが、小胞体ストレス時にＨＡＣ１遺伝子により転写されるｍＲＮＡがＩｒｅ１ｐによりスプライシングを受け、転写因子であるＨＡＣ１タンパク質（Ｈａｃ１ｐ）をコードするｍＲＮＡに変換し、翻訳されるＨａｃ１ｐがＵｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）を活性化させる。本発明においては、活性型ＨＡＣ１遺伝子はＨＡＣ１タンパク質（Ｈａｃ１ｐ）をコードする（ｍＲＮＡに相補的な）ｃＤＮＡと定義する。
従って本発明の効果をより高めるためには、活性型ＨＡＣ１遺伝子を用いることが好ましいが、不活性型ＨＡＣ１遺伝子の導入によっても、ある程度の効果を得ることができる。
以下、実際にＵＰＲを機能させるＨａｃ１ｐをコードする活性型ＨＡＣ１遺伝子について述べる。
ＨＡＣ１ｐはＮ末端より、各生物で高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン、ロイシン・ジッパー領域、更にＣ末端側のＩｒｅ１ｐによりｍＲＮＡがスプライシングされ、新たに付加される未知の活性領域により構成される。
本発明に用いる活性型ＨＡＣ１遺伝子としては、活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限はされないが、例えば、本発明において新規に取得されたＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）に由来する配列番号２３に示すアミノ酸配列、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に由来する配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、当該ＤＮＡと機能的に同等な相同ＤＮＡであってもよい。
例えば、相同ＤＮＡとしては、配列番号２３または配列番号７０に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）を活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；配列番号２３または配列番号７０に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；配列番号２２または配列番号６９に示す塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＰＲを活性化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
上記の「配列番号２３または配列番号７０に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。
上記の「配列番号２３または配列番号７０に示すアミノ酸列において１若しくは数個のアミノ酸」における「数個」の数は特には限定されないが、数個の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下程度を意味する。
また、上記の「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ、すなわち配列番号２２または配列番号６９に示す塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましく６５℃での条件をいう。
上記の変異（欠失、置換、および／または付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社製））、タカラバイオ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットなどが利用できる。
上記の「ＵＰＲを活性化させる機能」とは、ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎの蓄積に対する小胞体（ＥＲの一連の防御反応（例えば、転写抑制、分子シャペロンの誘導によるフォールディング促進、変性タンパクの分解、アポトーシスによる細胞死など）を活性化させる機能をいい、「ＵＰＲを活性化させる機能を有する」とは、該機能が、配列番号２３または配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が有する機能と実質的に同等であることをいう。
また、活性型ＨＡＣ１遺伝子はＯ．ｍｉｎｕｔａおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ以外のメタノール資化性酵母でもよく、たとえば、Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ由来の活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、他の酵母、カビなど他の生物種由来の活性型ＨＡＣ１遺伝子であってもよい。たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の活性型ＨＡＣ１タンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＰ＿１１６６２２）をコードする遺伝子（ＹＦＬ０３１Ｗ，同登録番号：Ｄ２６５０６からＩｒｅ１ｐによりスプライシングを受けたＤＮＡ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来の活性型ＨＡＣ１タンパク質（同登録番号：ＣＡＣ８８３７４）をコードする遺伝子（同登録番号：ＡＪ４１３２７２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の活性型ＨａｃＡタンパク質（同登録番号：ＣＡＣ８８３７５）をコードする遺伝子（同登録番号：ＡＪ４１３２７３）等が挙げられる。
なお、上記のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の活性型ＨＡＣ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号３９、４１、４３に、また対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４０、４２、４４に示す。
また、今回単離されたＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の活性型ＨＡＣ１遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母において初めて単離されたものであり、このことから、酵母全般、例えばメタノール資化性酵母全般においても同種の遺伝子の存在が強く示唆される。従って、これらの遺伝子もまた本発明において用いる活性型ＨＡＣ１遺伝子に包含されるものとする。
さらに、ＵＰＲを活性化する転写因子であれば、上記の活性型ＨＡＣ１遺伝子に代替して用いることが可能であり、例えば、動物細胞やその他の種由来のＨＡＣ１ホモログであるＸＢＰ−１遺伝子（ヒト由来遺伝子はＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＭ＿００５０８０に記載）がＩｒｅ１ｐによりスプライシング受け活性化された遺伝子等が挙げられる。また、ＨＡＣ１（ＸＢＰ−１）の活性化をともなうＩｒｅ１の人為的活性化も同ＵＰＲの活性化に対応するものなので、活性型ＨＡＣ１遺伝子の導入と同等であると考えられる。さらにまた、活性化されていないＨＡＣ１遺伝子そのものを強制的に発現させても前述のように活性型ＨＡＣ１の導入と同等の効果が得られる可能性を有すると考えられる。
活性型ＨＡＣ１遺伝子の取得法については、ＵＰＲを誘導した状態であれば、いかなる方法でも取得可能である。例えばフォールディングが困難なタンパク質をコードする遺伝子を高発現させた細胞、ツニカマイシン等の糖鎖修飾阻害剤、ＤＴＴ、過酸化水素水等の酸化還元剤やＵＰＲ誘導剤にて処理した細胞よりｍＲＮＡを取得し、これよりｃＤＮＡを合成することで取得することができる。またすでに開示されている配列を元に、ＤＮＡ合成機を用いてその一部または全長を合成することで取得することもできる。
（２）ＲＲＢＰ１遺伝子
本発明において、タンパク質高分泌生産に用いるもう一つの遺伝子としては、ＲＲＢＰ１遺伝子が挙げられる。ＲＲＢＰ１遺伝子は、リボソーム結合タンパク１と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子で、別名、ｈＥＳ、ＥＳ１３０、ＥＳ／１３０、ＤＫＦＺｐ５８６Ａ１４２０遺伝子とも呼ばれる。哺乳類のＲＲＢ１遺伝子はＮ末の膜貫通領域、それに引き続く塩基性アミノ酸に富んだ領域、１０アミノ酸残基より構成される５４回のリピート領域、Ｃ末側の領域より構成される。
本発明に用いるＲＲＢＰ１遺伝子としては、リボソーム結合タンパク１をコードする遺伝子であれば特に制限はされないが、例えば、ヒト由来のＲＲＢＰ１遺伝子（ＫＩＡＡ１３９８タンパクをコードする、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＡＢ０３７８１９）、イヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子（リボソーム受容体ｐ１８０をコードする、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｘ８７２２４）が挙げられる。また、上記遺伝子と機能的に同等である限り、その相同遺伝子であってもよい。ヒト由来のＲＲＢＰ１遺伝子、イヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号４５、４７に、また対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４６、４８にそれぞれ示す。
相同遺伝子としては、例えば、ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；ヒト由来またはイヌ由来のＲＲＢＰ１遺伝子の塩基配列またはそれと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリボソーム結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子遺伝子が含まれる。なお、相同性の程度、ストリンジェントな条件、変異導入法は前記と同様である。
上記相同遺伝子具体的としては、例えば、マウス（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿６２２０９７，ＸＭ＿９１３３８，ＸＭ＿９９１８８８）、ラット（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿２３０６３７）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５６７１）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１９９４３１）由来のＲＲＢＰ１遺伝子が挙げられる。
ＲＲＢＰ１遺伝子もまた、公知の一般手法によって取得することが可能である。例えばＲＲＢＰ１遺伝子を発現している細胞からｍＲＮＡを調製し、更にｃＤＮＡを合成することで得られる。
本発明において、タンパク質高分泌生産に用いる上記遺伝子や後記の高分泌発現の対象となる外来タンパク質をコードする遺伝子（以下、これらの遺伝子を「目的遺伝子」という）は、ｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する一般的な方法により取得することができる。上記の一般的な手法としては、例えば、目的遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞又は組織を、グアジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲｎａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ  ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
また、また目的遺伝子をゲノムＤＮＡから単離する場合、あるいは、プロモーター、ターミネーター領域を含む断片の単離は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、目的遺伝子を選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，３９−４４（１９７５））およびＰ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１６９−１８２（１９９１））に従って行うことができる。例えば、採取源が酵母の場合は、酵母のプロトプラストを調製して、当該プロトプラストから、通常公知のＤＮＡ抽出法、高塩濃度下での細胞残さ除去後のアルコール沈殿法、フェノールやクロロホルム抽出後のアルコール沈殿法等の常法を用いて行えばよい。
目的遺伝子の取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いた目的遺伝子の増幅には、プライマーとして２０〜３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子は塩基配列を確認した後、用いる。
一方、配列未知の目的遺伝子を含む断片の取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のクローンを選択し、当該クローンを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、またファージベクター又はコスミド等も広く用いることができる。形質転換又は形質導入を行う宿主は、上記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。
目的遺伝子断片を保持したクローンの選択は、上記遺伝子ライブラリーから、目的遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。
また目的遺伝子を化学的に全合成することもできる。例えば相補的な２対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、または一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。
遺伝子のＤＮＡ配列の決定等は通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。
２．発現ベクター
本発明のベクターは、上記の活性型ＨＡＣ１遺伝子、ＲＲＢＰ１遺伝子をそれぞれ単独で含むベクター、あるいは、活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子の両遺伝子を含むベクターが提供される。活性型ＨＡＣ１遺伝子、ＲＲＢＰ１遺伝子を宿主細胞内で発現させるために、各遺伝子を単独で含むベクターをそれぞれ用いて形質転換してもよく、また、両遺伝子を含む一つのベクターを用いて形質転換してもよい。また、同発現ベクターに外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを別に調製してもよく、別に調製した場合は、各ベクターを宿主細胞にコトランスフェクト（共導入）する。
外来タンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定はされないが、例えば、α−アミラーゼ遺伝子、α−ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、また医薬上有用な生理活性タンパク質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
本発明は特に疎水性の高いタンパク質、複合体を形成するような分泌生産が困難なタンパク質に対して有効であり、よって、上記の外来タンパク質には、多量体タンパク質、例えば、抗体またはその機能的断片であるヘテロ多量体が含まれる。
活性型ＨＡＣ１遺伝子、ＲＲＢＰ１遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子は、発現制御領域を適宜付加してタンパク質発現ユニットとして発現ベクターを構築してもよい。タンパク質発現ユニットは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、上記遺伝子、転写ターミネーター領域を有するものである。ここで使用し得るプロモーターとしては、誘導発現プロモーターであっても、構成発現プロモーターであってもよい。誘導発現プロモーターとしては、例えばメタノール資化性酵母におけるメタノール代謝に関わる、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）遺伝子プロモーター、ジヒドロキシアセトン・シンターゼ（ＤＡＳ）遺伝子プロモーター、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）遺伝子プロモーター等が挙げられる。また他の誘導プロモーターとしては銅誘導（ＣＵＰ）プロモーター等も用いることができる。構成発現プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＴＤＨ、ＧＡＰ）遺伝子、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子、エノラーゼ（ＥＮＯ）遺伝子、アクチン（ＡＣＴ）遺伝子、シトクロムｃ（ＣＹＣ）遺伝子、トレハロース合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子等のプロモーターなどが挙げられる。また転写ターミネーターは、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じまたは異なる遺伝子のものであってもよい。
外来タンパク質を高分泌生産させるためには強力なプロモーターを用いることが必要であるが、高活性なプロモーターを用いてフォールドしにくいタンパク質や、分泌されにくいタンパク質の生産を試みた場合、かえって分泌不全が起こることがある。これは、タンパク質の生産が、翻訳が行われるリボソーム、フォールディング・分泌が行われる小胞体のキャパシティを越えることにより、過剰に生産されたタンパクが細胞内で変性し、蓄積、ユビキチン化され、プロテオソームにて分解するような状況になるためである。従って、生成するタンパク質が変性しアグリゲーションを起こさない、または生産されたタンパク質が分泌能のキャパシティを越えない程度の発現量を達成できるプロモーターを適宜採択するか、あるいは活性を弱めるなどの調整を行って使用することが好ましい。多量体タンパク質の中でも、ヘテロ多量体を形成する分子は上記の影響を受けやすく、特に抗体のような分子は重鎖、軽鎖が２分子ずつ会合したヘテロ４量体であるため、適切に会合させるためには発現度は重要な因子である。また、活性型ＨＡＣ１遺伝子の発現が強すぎる場合、細胞にストレスがかかりすぎてかえって増殖を阻害することもあるので上記と同様にプロモーター活性の調整、最適化が必要である。
また、本発明の発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、酵母用発現ベクターには、Ｈｉｓ１、Ｈｉｓ２、Ｈｉｓ３、Ｈｉｓ４、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ６、Ｌｅｕ２、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２、Ａｌｇ３、Ｔｒｐ１、Ｌｙｓ２、Ａｄｅ１、Ａｄｅ２、Ｕｒａ３、Ｕｒａ５遺伝子等から選ばれる栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
また、選択マーカーとしては、上記の栄養要求性マーカーのみならず、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシンなどの薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカーなどを使用することで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
３．形質転換宿主細胞
本発明の形質転換宿主細胞は、前記１．の遺伝子を有する形質転換宿主細胞、あるいは前記２．発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞である。
形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは酵母である。酵母としては、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｉｒｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ等のメタノール資化性酵母株、あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｙａｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の酵母株が挙げられる。より具体的には、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ株としてＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ３株（Δｏｃｈ１Δｐｅｐ４Δｐｒｂ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ  Δｈｉｓ３Δ  ｌｅｕ２Δｍｅｔ１５Δ  ｕｒａ３）等を用いることができるが、これらに限定はされない。
さらに、本発明は分泌に必須であるＥＲを補強した宿主細胞を得ることを目的としているため、動物細胞やその他の細胞にも適用可能である。
本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１（１９８４））、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，１６３−１６８）、リポフェクション法等が挙げられる。
４．タンパク質の製造方法
本発明におけるタンパク質の製造は、上記の形質転換宿主細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
形質転換宿主細胞を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
形質転換宿主細胞が酵母などの微生物の場合は、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。また、培地には、選択マーカーの種類に応じ、オーレオバシジン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を適宜添加するか、あるいは、栄養要求性を相補する遺伝子（Ｌｅｕ、Ｕｒａ、Ｔｒｐ等）によって供給可能となるアミノ酸を除いてもよい。
形質転換宿主細胞の培養は、例えば酵母の場合、培地のｐＨは４〜７に調整するのが適当である。また、培養温度は１５〜３２℃、好ましくは２８℃前後である。抗体のように立体構造が複雑なタンパク質を発現する場合、細胞内でそのフォールディングをより効率的に行うために、低温で培養することが好ましい場合もある。培養時間は、２４〜１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養または連続培養等により実施することができる。
上記の培養物（培養液、培養菌体）から外来タンパク質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
また生産されたタンパク質を単離精製するためには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより、目的タンパク質を採取する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により目的タンパク質を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー等）、分子篩を用いたゲルろ過法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用いて単離精製すればよい。
上記の培養法、精製法は一例であって、これらに限定されるものではない。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
５．Ｏ型糖鎖の抑制方法（またはＰＭＴ活性の抑制方法）
本発明において、宿主細胞として酵母を用いる場合、上記の培養をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことがより好ましい。
哺乳類でのＯ型糖鎖の形成は、主にゴルジ体に存在するＰｅｐｔｉｄｅ  Ｏ−ＧａｌＮＡｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによってＧａｌＮＡｃが付加されることにより行われる。この糖鎖付加は、タンパク質のフォールディング後に起こる。これに対し、酵母およびカビでのＯ型糖鎖の形成は、ＰＭＴ遺伝子がコードするＰｒｏｔｅｉｎ−Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）によってタンパク質のセリンまたはトレオニン残基にマンノースが付加されることにより始まる。この付加反応をＰＭＴ活性という。このマンノース付加は、細胞中の小胞体（ＥＲ）においてタンパク質のフォールディングと並行して行われるため、哺乳類由来のタンパク質発現では本来起こらない部位に不要な糖鎖が付加されることがある。その結果、不要な修飾に起因する、会合体の形成不全、活性の低下をもたらす。
従って、培養をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性を抑制する条件下で行うことによって、不要なＯ型糖鎖形成を抑制でき、ひいては、タンパク質同士の会合を促進し、タンパク質が本来有する物性・活性を保持することが可能となる。本発明における活性型ＨＡＣ１遺伝子及び／又はＲＲＢＰ遺伝子の導入によるタンパク質の高分泌生産の効果は、ＵＰＲにより増大するＯ型糖鎖形成をＰＭＴ活性の抑制によって制御することによって、更に相乗的な効果を生むことができる。
酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加を抑制する方法としては、例えば以下の２点が考えられる。またこれらの方法を組み合わせることもできる。
（１）  酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加反応を行うＰＭＴ活性を抑制する条件下で培養及び生産を行う。
（２）  酵母およびカビに特有のＯ型糖鎖付加反応を行うＰＭＴ活性が抑制された細胞を用いる。
上記（１）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制方法は、例えば、培地にＰＭＴ活性阻害剤（ＰＭＴ阻害剤）を添加することにより行うことができる。ＰＭＴ活性阻害剤としては、例えば、ロダニン−３−酢酸誘導体（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １４，ｐ３９７５−３９７８（２００４）等を用いることができる。より具体的には、ロダニン−３−酢酸誘導体として、５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物（１ｃ）または｛（５Ｚ）−４−ｏｘｏ−５−［３−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）−４−（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］−２−ｔｈｉｏｘｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌ｝ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物（５ａ）が挙げられる。上記ＰＭＴ活性阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体）は元々、抗菌剤として検討されたものであり、タンパク質の品質および生産性の向上のために検討されたものではなく、本発明において初めてその効果が見出された。ＰＭＴは酵母細胞壁を構成するマンノプロテインの生成に重要であり、ＰＭＴ活性を低下させすぎた場合、酵母の生育に影響を与える。従って誘導発現系を用いる場合には、ＰＭＴ活性阻害剤を、細胞の増殖後、外来タンパク質遺伝子の発現時に添加することがより効果的であり、Ｏ型糖鎖修飾が抑制された質の高い目的タンパク質を最大限に生産できるであろう。
また、上記（２）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＭＴ）活性の抑制方法は、ＰＭＴ遺伝子自体を破壊、または遺伝子の発現を抑制することによっても可能である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰＭＴは、ＰＭＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｌ１９１６９）、ＰＭＴ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｌ０５１４６）、ＰＭＴ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ８３７９７）、ＰＭＴ４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ８３７９８）、ＰＭＴ５遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ９５６４４）及びＰＭＴ６遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｚ７２９８４）の少なくとも６遺伝子によってコードされており、それぞれがホモ二量体（ＰＭＴ４ｐ）やヘテロ二量体（ＰＭＴ１ｐ／ＰＭＴ２ｐ）を形成して活性を有する。また糖タンパク質により作用するＰＭＴが異なっていることが知られている。本発明においては、抗体へのＯ型糖鎖付加に関して、ＰＭＴタンパクに選択性があることを見出した。すなわち実施例に記載のようにＰＭＴ５またはＰＭＴ６遺伝子破壊株ではＯ型糖鎖付加抑制の効果はなかった。
上述のようにＰＭＴは酵母の生育にとって重要な遺伝子であり、ＰＭＴ遺伝子の破壊等、活性を消失、または極度に低下させた場合は、細胞壁が卑弱になるので、ＰＭＴ遺伝子の破壊株の利用については注意を要する。必ずしも、ＷＯ２００２／０４６４３７に示されるようにＰＭＴ遺伝子を破壊することは有効でなく、時として生育阻害により外来タンパク質の生産に悪影響を与える場合があり、目的のタンパクのＯ型糖鎖の付加修飾を最低限に抑えるような、最適なＰＭＴ活性を有するＰＭＴ遺伝子の破壊あるいは発現抑制が求められる。ＰＭＴ遺伝子を抑制する方法としては、例えばアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉを利用する方法、プロモーターを減弱化させる方法等が示される。本発明の例では、プロモーターを減弱化させる方法として、ＰＭＴ構造遺伝子部分とプロモーター領域にＤＮＡ断片を挿入し、遺伝子を分断（以下、遺伝子分断と称する場合がある。また遺伝子分断を行うためのプラスミドベクターを遺伝子分断ベクターと称する。）する方法を示している。またＰＭＴ活性は有しないがタンパクとして生成されるようなＰＭＴ遺伝子断片や活性に関与するアミノ酸残基に変異を加えた遺伝子を導入し、ＰＭＴ活性を抑制する方法（ドミナント・ネガティブ）も利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド，制限酵素，ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング，塩基配列の決定，宿主細胞の形質転換，形質転換宿主細胞の培養，得られる培養物からの酵素の採取，精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
【実施例１】
【０００６】
外来遺伝子発現プラスミドの構築
（１）Ｇ４１８耐性遺伝子をマーカーとしたＡＯＸ１遺伝子プロモーター、ターミネーターカセットとＧＡＰ遺伝子プロモーター、ターミネーターカセットからなる外来遺伝子発現タンデムベクターの構築
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のｐＯＭｅｘ３Ｇ、及びｐＯＭｅｘＧＰ１Ｕを材料に用いた。ｐＯＭｅｘ３ＧをＸｂａＩで切断し、平滑末端処理後、ＳｐｅＩリンカーを導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘ３ＧＸＳと命名した。一方、ｐＯＭｅｘＧＰ１ＵをＥｃｏＴ２２Ｉで切断し、平滑末端処理後、ＡｐａＩリンカーを導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ１ＵＴＡと命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ１ＵＴＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、平滑末端処理後単離したＧＡＰプロモーター、ターミネーターを含む約２．０ｋｂの断片を、ＡｐａＩで消化し、平滑末端処理したｐＯＭｅｘ３ＧＸＳに導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇと命名した。ｐＯＭｅｘＧＡＴ−ＧはＡＯＸ１発現カセット内にＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイト、ＧＡＰ発現カセット内にＳａｌＩ−ＡｐａＩサイトを持つ、タンデムベクターである。
（２）ＡＤＥ１遺伝子を選択マーカーとしたＧＡＰ遺伝子プロモーター及びターミネーターによる外来遺伝子発現ベクターの構築
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のｐＯＭｅｘ４Ａを材料に用いた。上記ｐＯＭｅｘＧＰ１ＵをＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、平滑末端処理後、ＢａｍＨＩリンカーを導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ２Ｕと命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ２ＵをＳａｌＩで処理し、平滑末端処理後、ＳｐｅＩリンカーを導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ３Ｕと命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ３ＵをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、ＧＡＰ発現カセットを含む約２．０ｋｂの断片を単離した。この断片を、ｐＯＭｅｘ４ＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで処理し、単離したＡＤＥ１マーカーを含む約５．０ｋｂの断片とライゲーションした。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ１Ａと命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ１ＡはＧＡＰ発現カセット内にＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトを持つ外来遺伝子発現ベクターである。
（３）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を選択マーカーとしたホスホグリセリンキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター及びターミネーターによる外来遺伝子発現ベクターの構築
Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株よりホスホグリセリンキナーゼをコードするＰＧＫ１遺伝子の取得、及びその塩基配列決定を行った。
（３−１）プローブの作成
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ００５６０）及びＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ４１７５７）由来の保存されているアミノ酸配列ＲＶＤＦＮＶＰＬＤ，ＥＧＫＥＬＰＧＶＡに対応する塩基配列のＤＮＡ縮重プライマーを以下のように合成した。
0005131666.tif 000002
プライマーＰＰＧ５（配列番号１）はアミノ酸配列ＲＶＤＦＮＶＰＬＤに対応し、プライマーＰＰＧ３（配列番号２）はアミノ酸配列ＥＧＫＥＬＰＧＶＡに対応する塩基配列の相補鎖の配列である。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰＰＧ５、ＰＰＧ３を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分）×２５サイクル］を行った。増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングした。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することで、プラスミドの挿入ＤＮＡ断片に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣ．ｍａｌｔｏｓａ由来のＰＧＫ１遺伝子のアミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するクローンを選抜した。１．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片は、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動後、回収した。
（３−２）ライブラリーの作成、及びスクリーニング
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。分離したＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロンメンブレン（アマシャム社）にトランスファーした。上記（１−３−１）で得られたＤＮＡ断片をＡｌｋＰｈｏｓ  ＤＩＲＥＣＴ（アマシャム）を用いて標識し、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｎ．，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）に従って行った。その結果、約９．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片にＰＧＫ１遺伝子が存在すると考えられた。そこでそのＤＮＡ断片をクローニングすべく、ゲノムライブラリーを作成した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａの染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動後、約９．０ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１１８とライゲーションした後、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｇｅｎｅ，１０，６３（１９８０））で大腸菌ＤＨ５α株に形質転換して、ライブラリーを作成した。約４０００クローンを前述のＤＮＡ断片をプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られた陽性クローンの中から、ＰＧＫ１遺伝子を保持したプラスミドｐＯＭＰＧＫ１を選抜した。
（３−３）塩基配列決定
プラスミドｐＯＭＰＧＫ１内のＢａｍＨＩ領域間塩基配列を、プライマーウォーキング法によって決定したところ、配列番号３に示す塩基配列を有していた。配列番号３の塩基配列には、４７６６番目から始まり、６０１６番目で終わる１２５４塩基対からなるオープンリーディングフレームが存在する。このオープンリーディングフレームから推定される配列番号４に示すアミノ酸配列とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ由来のホスホグリセリンキナーゼとの相同性を調べたところ、それぞれ７４％、８１％であった。
（３−４）ＰＧＫ１遺伝子プロモーターとターミネーターとを使った外来遺伝子発現カセットの構築
Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＧＫ１遺伝子プロモーターを含む断片とターミネーターを含む断片との間に外来遺伝子を導入する発現カセットを作製した。ＰＧＫ１遺伝子プロモーターとターミネーターとの間にＳｐｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ部位を導入するために、以下のプライマーを合成した。
0005131666.tif 000003
上記ｐＯＭＰＧＫ１を鋳型とし、プライマーＯＰＧＫ−Ｐ−Ｆ（配列番号５）とＯＰＧＫ−Ｐ−Ｒ（配列番号６）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル］、プライマーＯＰＧＫ−Ｔ−Ｆ（配列番号７）とＯＰＧＫ−Ｔ−Ｒ（配列番号８）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル］を行った。それぞれ増幅された１．５ｋｂ、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、正しい塩基配列を有するクローンを選抜した。１．５ｋｂ、１．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片はそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片及びＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片として単離した。
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のｐＯＭｅｘ５ＨのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ間に、上記１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を導入した。その後得られたプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ間に、上記１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を導入した。得られたプラスミドをｐＯＭｅｘＰＧＨｙと命名した。ｐＯＭｅｘＰＧＨｙはＰＧＫ１遺伝子発現カセット内にＳｐｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ部位を持つ外来遺伝子発現ベクターである。
【実施例２】
【０００７】
抗体遺伝子発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＦ  ａｌｐｈａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ０１１４９）の分泌シグナル（以下ａＭＦ分泌シグナル）をクローニングするため下記のプライマー合成した。
0005131666.tif 000004
前述と同じ方法で取得したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＳｐ−ａＭＦｓ−Ｆ（配列番号９）とＸｂ−ａＭＦｓ−Ｒ（配列番号１１）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒）×２０サイクル］、プライマーＳｌ−ａＭＦｓ−Ｆ（配列番号１０）とＸｂ−ａＭＦｓ−Ｒ（配列番号１１）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒）×２０サイクル］を行った。それぞれ増幅された約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認し、得られたプラスミドを、それぞれＴＯＰＯａＭＦｓＳＰとＴＯＰＯａＭＦｓＳＬと命名した。
抗体遺伝子は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００２／０９４８８０）を用いた。軽鎖、及び重鎖遺伝子の両端に制限酵素サイトを導入するため、下記のプライマーを合成した。
0005131666.tif 000005
これらＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲにて軽鎖［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分）×２０サイクル］、重鎖［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分３０秒）×２０サイクル］を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認し、得られたプラスミドをそれぞれＴＯＰＯＨｃ−ＴｒａｉｌとＴＯＰＯＬｃ−Ｔｒａｉｌと命名した。ＴＯＰＯａＭＦｓＳＬからＳａｌＩ−ＸｂａＩ消化で単離したａＭＦ分泌シグナルと、ＴＯＰＯＬｃ−ＴｒａｉｌよりＸｂａＩ−ＡｐａＩ消化で単離した抗体軽鎖を、ＳａｌＩ−ＡｐａＩで消化したｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇに３点ライゲーションで導入した。得られたプラスミドをｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ｌと命名した。次にＴＯＰＯａＭＦｓＳＰからＳｐｅＩ−ＸｂａＩ消化で単離したａＭＦ分泌シグナルと、ＴＯＰＯＨｃ−ＴｒａｉｌよりＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ消化で単離した抗体重鎖を、ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ｌに３点ライゲーションで導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ａｂと命名した（図３）。ｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ａｂは抗体重鎖と軽鎖の両発現ユニット保持した抗体発現ベクターである。
【実施例３】
【０００８】
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターの構築
活性型ＨＡＣ１遺伝子の取得は、細胞（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ２−３株）をＹＰＤ培地で２７℃にて１２時間培養後、ＵＰＲを誘導すべく培地中に１０μｇ／ｍｌとなるようツニカマイシンを添加した。ツニカマイシン添加培中にて更に１２時間培養を行い、集菌後、Ｙｅａｓｔａｒ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてｍＲＮＡを調製した。
得られたｍＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ（インビトロジェン）でＤＮａｓｅ処理した。このｍＲＮＡよりＳｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ＲＴ（インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを以下に記載のＤＮＡプライマーＨＡＣ１−１（配列番号１６）及びＨＡＣ１−１２（配列番号１７）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分）×３０サイクル］にて増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニング後、ＰＣＲで増幅された２種類の遺伝子断片由来の塩基配列を確認した（配列番号１８、１９）。
0005131666.tif 000006
取得された２種類のｃＤＮＡ断片のうち、１つはゲノム配列と一致したが、もう一方は一部欠損し、短くなっており、ＵＰＲによって活性化したＩｒｅ１ｐによりスプライシングを受けたｃＤＮＡ断片であった。活性化したＨＡＣ１のｃＤＮＡを取得するため、下記のＤＮＡプライマーｓｐｅＨＡＣ１Ｆ（配列番号２０）及びｂｇｌＨＡＣ１Ｒ（配列番号２１）と上記活性化したＨＡＣ１のｃＤＮＡが存在すると考えられるｃＤＮＡプールを用いてＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒）×２０サイクル］を行った。
0005131666.tif 000007
得られた約１ｋｂ断片は活性型ＨＡＣ１遺伝子の開始コドンから終始コドンまでを含んでおり（配列番号２２）、これは３２０アミノ酸からなる活性型ＨＡＣ１ｐのアミノ酸配列に相当する（配列番号２３）。これをＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ処理し、単離後、ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ処理を施したｐＯＭｅｘＰＧＨｙに導入した。得られたベクターはｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１と命名した（図３）。このベクターは活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ユニットを保持している。
【実施例４】
【０００９】
ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクターの構築
ＲＲＢＰ１遺伝子については、かずさＤＮＡ研究所より分譲を受けたヒトＲＲＢＰ１遺伝子（ＫＩＡＡ１３９８、ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０３７８１９）を用いた。この遺伝子に両端に制限酵素サイトを導入するため、下記のＤＮＡプライマーｐ１８０  ＭＳｐ−Ｆ、ｐ１８０  ＵＢｇ−Ｒ（配列番号２４及び２５）とヒトＲＲＢＰ１遺伝子を用いてＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で５分×２０サイクル］にて増幅した。
0005131666.tif 000008
得られた約４．５ｋｂの断片をＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ処理したｐＯＭｅｘＧＰ１ＡにＢＤ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＤサイエンス）を用いて導入し、ＳｐｅＩサイトからヒトＲＲＢＰ１遺伝子の開始コドンをコードする領域を含む約５００ｂｐ、またＢａｍＨＩサイトからヒトＲＲＢＰ１遺伝子の終始コドンをコードする領域を含む約５００ｂｐの配列を決定した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０ＰＣＲと命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０ＰＣＲをＮｄｅＩ−ＡｓｃＩで消化し、ヒトＲＲＢＰ１遺伝子ＯＲＦ中１１０ｂｐから４５４１ｂｐまでを含む断片を除去した。一方、かずさＤＮＡ研究所より分譲を受けたヒトＲＲＢＰ１遺伝子をＮｄｅＩ−ＡｓｃＩで消化して得られた、ＯＲＦ中１１０ｂｐから４５４１ｂｐまでを含む断片を単離し、先のＮｄｅＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０ＰＣＲに導入した。得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０と命名した（図３）。ｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０はヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現用ベクターである。
【実施例５】
【００１０】
抗体発現酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の作成
ＮｏｔＩで消化したベクターｐＯＭｅｘＧＡＴ−Ｇ／Ａｂを用いて、エレクトロポレーションによりＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ−３株（Δｏｃｈ１Δｐｅｐ４Δｐｒｂ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１：ＷＯ２００３／０９１４３１に記載）を形質転換した。なおエレクトロポレーションの条件は、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のものを採用した。形質転換された細胞は５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天プレート培地にて選択し、培養後、ゲノムを抽出し、前述のＤＮＡプライマーＸｂ−ＫＲＥＡＥＡ−Ｈｃ（配列番号１２）とＨｃ−Ｒ−Ｂｇ（配列番号１３）を用いたＰＣＲによって重鎖の導入を、Ｘｂ−ＫＲＥＡＥＡ−Ｌｃ−Ｆ（配列番号１４）とＬｃ−Ｒ−Ａｐ（配列番号１５）を用いたＰＣＲによって軽鎖の導入を確認した。重鎖、軽鎖両遺伝子の導入が確認された株を抗体生産株Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＯ１株と命名した。
【実施例６】
【００１１】
活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１遺伝子を発現する抗体生産酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の作成
実施例５にて育種した抗体生産株Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＯ１株にＳｓｅ８７８３Ｉで消化したｐＯＭｅｘＧＰ１Ａ／ｐ１８０を上記のエレクトロポレーション法にて導入した。形質転換株はＳＤ寒天プレート培地にてＡＤＥ＋株を選択し、培養後、ゲノムを抽出し、ＲＲＢＰ１遺伝子の導入を上記のｐ１８０  ＭＳｐ−Ｆ（配列番号２４）とｐ１８０  ＵＢｇ−Ｒ（配列番号２５）を用いたＰＣＲにて確認することで取得した。得られた形質転換体をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ｒ株と命名した。同時にコントロールとしてＳｓｅ８７８３Ｉで消化したｐＯＭｅｘＧＰ１Ａを用いて形質転換し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ａ株を得た。更にＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ｒ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ａ株にＡｏｒ５１ＨＩで消化したｐＯＭｅｘＰＧＨｙ−Ｈａｃ１を上記エレクトロポレーション法によって導入した。形質転換株の活性化ＨＡＣ１遺伝子の導入は、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＹＰＤ寒天プレート培地にて選択し、培養後、ゲノムを抽出し、上記のＤＮＡプライマーｓｐｅＨＡＣ１Ｆ（配列番号２０）とｂｇｌＨＡＣ１Ｒ（配列番号２１）を用いたＰＣＲにて確認した。得られた株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨ及びＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨ株と命名した。同時にコントロールとしてＡｏｒ５１ＨＩで消化したｐＯＭｅｘＰＧＨｙをそれぞれＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ｒ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ２Ａ株に導入し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨｙ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨｙ株を得た。
【実施例７】
【００１２】
形質転換酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）による抗体の分泌確認
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨｙ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨｙ株をＢＹＰＭＧ培地［１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、１．５％メタノール、０．５％グリセロール、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）］を用いて、２８℃、４日間培養した。培養液より培養上清を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、ラベル化された抗ヒト抗体（ａｎｔｉ−ヒトＦｃ抗体、ａｎｔｉ−ヒトκ抗体）を用いてウエスタン解析を行ったところ、図４に示す通り、ＲＲＢＰ１遺伝子と活性型ＨＡＣ１遺伝子導入株は、その他の株と比較して著量の抗体を分泌した。
【実施例８】
【００１３】
形質転換酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）による分泌抗体の生産性
実施例７にて調製された培養液をＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｐｏｒｏｓ  Ａ  ５０ｕｍ  ４．６ｍｍＤ／５０ｍｍＬ、アプライドバイオシステムズ）を用いたＨＰＬＣ［分離条件、平衡化緩衝液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、溶出緩衝液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．４）、流速４ｍｌ／ｍｉｎ、検出：波長２１０ｎｍ］により、抗体生産量を測定した。スタンダードとして、動物細胞（ＣＨＯ）にて生産した抗体を用いた。ＯＤ６００＝１当たりの抗体生産性を図５に示す。ＲＲＢＰ１遺伝子のみが導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨｙ株、及び活性型ＨＡＣ１の遺伝子のみ導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨ株の抗体分泌量は、コントロール株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨｙ株と比較して、増加する傾向にあった。しかしながら、活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を共発現させたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨ株の抗体生産量は、コントロール株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨｙ株はもとより、活性型ＨＡＣ１遺伝子またはＲＲＢＰ１遺伝子を単独で導入したものより顕著に高い抗体生産量を示した。以上から、活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子の共発現は抗体の生産性に相乗効果以上の効果をもたらすことが確認できた。
【実施例９】
【００１４】
形質転換酵母株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）を用いたＯ型糖鎖形成が抑制された条件での抗体の生産
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＲＨ及びＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＫ３ＡＨｙをＢＹＰＧ培地［１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、０．５％グリセロール、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）］で２日間培養後、０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、及び５０μＭのＰＭＴ阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体：５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物１ｃ））を添加したＢＹＰＭ培地［１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、１．５％メタノール、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）］を用いて、２８℃、２日間培養した。培養液より培養上清を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、ラベル化された抗ヒト抗体（ａｎｔｉ−ヒトＦｃ抗体）を用いてウエスタン解析を行った。その結果を、図６に示す。ＰＭＴ阻害剤添加濃度は５μＭが適当で、その場合、抗体の分泌量、会合体形成率が増大した。
【実施例１０】
【００１５】
抗体遺伝子発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＦ  ａｌｐｈａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号；Ｐ０１１４９）の分泌シグナル（以下ａＭＦ分泌シグナル）と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖、及び重鎖を融合蛋白質として発現させるため、ａＭＦ分泌シグナル遺伝子と抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００１／０８３５６０）を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法によって連結した。
ａＭＦ分泌シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の重鎖用
0005131666.tif 000009
ａＭＦ分泌シグナル−抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の軽鎖用
0005131666.tif 000010
ａＭＦ分泌シグナル遺伝子領域は、Ｙ−ＤＥＲ  Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した。重鎖用として、プライマーＥｃｏＡＬＦ（配列番号２６）とＡｌｆＨ０２（配列番号２７）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＥｃｏＡＬＦ（配列番号２６）とＡｌｆＬ０２（配列番号３０）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を行い、それぞれ増幅された約０．２６ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。
抗体遺伝子領域は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体ｃＤＮＡ（ＷＯ２００１／０８３５６０）を鋳型として増幅した。重鎖用としてプライマーＡｌｆＨ０３（配列番号２８）とＡｌｆＨ０４（配列番号２９）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］を、軽鎖用として、プライマーＡｌｆＬ０３（配列番号３１）とＡｌｆＬ０４（配列番号３２）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］を行い、それぞれ増幅された約１．３５ｋｂの重鎖領域と約０．６５ｋｂの軽鎖領域の目的ＤＮＡ断片を回収した。
次に、重鎖用ａＭＦ分泌シグナル領域と約１．３５ｋｂの重鎖領域を鋳型として、プライマーＥｃｏＡＬＦ（配列番号２６）とＡｌｆＨ０４（配列番号２９）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒）×３０サイクル］を行い、増幅された約１．６ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。また、軽鎖用ａＭＦ分泌シグナル領域と約０．６５ｋｂの軽鎖領域を鋳型として、プライマーＥｃｏＡＬＦ（配列番号２６）とＡｌｆＬ０４（配列番号３２）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を行い、増幅された約０．９ｋｂの目的ＤＮＡ断片を回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、それぞれａＭＦ分泌シグナル−抗体重鎖及びａＭＦ分泌シグナルー抗体軽鎖が、ｉｎ−ｆｒａｍｅで融合している遺伝子を有していることを確認した。得られたプラスミドは、それぞれＴＯＰＯ−ａｌｆＨｃとＴＯＰＯ−ａｌｆＬｃと命名した。プライマーＥｃｏＡＬＦ（配列番号２６）に導入したＥｃｏＲＩ制限酵素部位とプライマーＡｌｆＨ０４（配列番号２９）とＡｌｆＬ０４（配列番号３２）に導入したＳａｌＩ制限酵素部位を利用して、ＴＯＰＯ−ａｌｆＨｃとＴＯＰＯ−ａｌｆＬｃから、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化でａＭＦ分泌シグナル−抗体重鎖とａＭＦ分泌シグナルー抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を回収した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて抗体重鎖と抗体軽鎖を発現させるために、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化で回収したａＭＦ分泌シグナル−抗体重鎖とａＭＦ分泌シグナル−抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５２（Ｙｅａｓｔ  ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にライゲーションした。それぞれ得られたプラスミドをＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃとＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＬｃと命名した。次に、ＧＡＰプロモーター−ターミネーターカセットの両末端にあるＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃとＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＬｃから、それぞれ、ＢａｍＨＩ−ＧＡＰプロモーター−ａＭＦ分泌シグナル−抗体重鎖−ＧＡＰターミネーター−ＢａｍＨＩ（断片１）とＢａｍＨＩ−ＧＡＰプロモーター−ａＭＦ分泌シグナル−抗体軽鎖−ＧＡＰターミネーター−ＢａｍＨＩ（断片２）をコードする遺伝子断片を回収した。断片１と断片２は、断片１または断片２を切り出した、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃまたはＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＬｃのＢａｍＨＩ部位に３断片ライゲーションで導入した。得られたベクターをＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃと命名した（図７）。制限酵素切断パターンよりＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃには、断片１と断片２が順方向にタンデムに導入されていることを確認した。ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃは、抗体重鎖と軽鎖の両発現ユニット保持した抗体発現ベクターである。
【実施例１１】
【００１６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＡＣ１前駆体ｍＲＮＡは、活性型ＩＲＥ１のＲＮａｓｅ活性によって２５２ヌクレオチドが除去され、ＨＡＣ１成熟体ｍＲＮＡとなる。このＨＡＣ１成熟体ｍＲＮＡは、Ｃ末端の１０アミノ酸残基が除去され、新たに１８アミノ酸残基が付加された活性型ＨＡＣ１に翻訳される（ＰＮＡＳ  ９７，ｐ４６６０−４６６５（２０００））。そこで、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法によって活性型ＨＡＣ１をコードする遺伝子を構築した。
0005131666.tif 000011
Ｙ−ＤＥＲ  Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）によって調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とした。プライマーＨＡＣ−Ｓａｃ−ＡＴＧ（配列番号３３）とＨＡＣ−ｉｎｔｅｒｎａｌＲ（配列番号３４）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］と、プライマーＨＡＣ−ｉｎｔｅｒｎａｌＦ（配列番号３５）とＨＡＣ−Ｓｍａ−ＳＴＯＰ（配列番号３６）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を行い、増幅された約０．６６ｋｂ（断片Ａ）と約０．０６ｋｂ（断片Ｂ）の目的ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
次に、増幅した断片Ａと断片Ｂを鋳型として、プライマーＨＡＣ−Ｓａｃ−ＡＴＧ（配列番号３３）とＨＡＣ−Ｓｍａ−ＳＴＯＰ（配列番号３６）を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６０秒）×３０サイクル］を行い、増幅された約０．７ｋｂの目的ＤＮＡ断片を取得した。回収したＤＮＡ断片は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、２３８アミノ酸残基の活性型ＨＡＣ１をコードしている遺伝子を有していることを確認した。得られたプラスミドは、ＴＯＰＯ−ａＨａｃ１と命名した。プライマーＨＡＣ−Ｓａｃ−ＡＴＧ（配列番号３３）に導入したＳａｃＩ制限酵素部位とプライマーＨＡＣ−Ｓｍａ−ＳＴＯＰ（配列番号３６）に導入したＳｍａＩ制限酵素部位を利用して、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で活性型ＨＡＣ１をコードしている遺伝子を回収した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて活性型ＨＡＣ１を発現させるために、ＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化で回収した活性型ＨＡＣ１をコードしている遺伝子を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ  ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にライゲーションした。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１と命名した（図７）。このベクターは活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ユニットを保持している。
【実施例１２】
【００１７】
ヒトＲＲＢＰ１遺伝子発現ベクターの構築
ＲＲＢＰ１遺伝子については、かずさＤＮＡ研究所より分譲を受けたヒトＲＲＢＰ１遺伝子（ＫＩＡＡ１３９８、ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０３７８１９）を用いた。この遺伝子の両端に制限酵素サイトを導入するため、以下に記載のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１８０ｋｐｎａｔｇ、Ｐ１８０ｘｂａｓｔｏｐ（配列番号３７及び３８）とヒトＲＲＢＰ１遺伝子を用いたＰＣＲ［９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６分×３０サイクル］にて増幅した。
0005131666.tif 000012
得られた約４．７ｋｂの断片を回収し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列より、挿入断片の両末端の約６００ｂｐが目的の塩基配列を正しく含んでいることを確認した。得られたプラスミドは、ＴＯＰＯ−Ｐ１８０と命名した。次に、ＴＯＰＯ−Ｐ１８０を制限酵素ＮｄｅＩとＨｐａＩによって消化し、ＫＩＡＡ１３９８の１１０ｂｐ−４５２４ｂｐに相当する領域を含む断片を除去した。この除去領域に、ＫＩＡＡ１３９８の約４．４ｋｂのＮｄｅＩ−ＨｐａＩ断片を導入し、ＴＯＰＯ−Ｐ１８０Ｎを構築し、大腸菌ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して制限酵素ＸｂａＩ部位を脱メチル化した。プライマーＰ１８０ｋｐｎａｔｇ（配列番号３７）とＰ１８０ｘｂａｓｔｏｐ（配列番号３８）に導入したＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限酵素部位を利用して、ＲＲＢＰ１をコードしている遺伝子を含むＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片を回収した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲＲＢＰ１を発現させるために、先に回収したＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５２（Ｙｅａｓｔ  ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））に導入されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター−ターミネーターカセット中のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位にライゲーションし、得られたプラスミドをＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０と命名した。次に、ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０を制限酵素ＰｖｕＩで消化し、ＧＡＰプロモーター−ＲＲＢＰ１遺伝子−ＧＡＰターミネーターを含むＰｖｕＩ断片を回収した。このＰｖｕＩ断片を大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ３５１（Ｙｅａｓｔ  ２，ｐ１６３−１６７（１９８６））の複製必須領域、マーカー遺伝子を含むＰｖｕＩ断片と連結し、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０を構築した（図７）。このベクターはＲＲＢＰ１遺伝子発現ユニットを保持している。
【実施例１３】
【００１８】
活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１遺伝子共発現ベクターの構築
活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに一つのベクターで導入するために、活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１遺伝子共発現ベクターを構築した。実施例１１で構築したＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１を制限酵素ＨｐａＩで消化した。次に、実施例１２で構築したＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０からＧＡＰプロモーター−ＲＲＢＰ１遺伝子−ＧＡＰターミネーターを含むＢａｍＨＩ断片を回収し、両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）で平滑化し、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１のＨｐａＩ部位に導入した。得られたプラスミドをＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１／ｐ１８０と命名した（図７）。塩基配列の解析によって、導入したＧＡＰプロモーター−ＲＲＢＰ１遺伝子−ＧＡＰターミネーターを含むＢａｍＨＩ断片の挿入方向を決定した。このベクターは、活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１遺伝子の発現ユニットを保持している。
【実施例１４】
【００１９】
抗体発現酵母株、ならびに活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を発現する抗体発現酵母株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ  Δｈｉｓ３Δ  ｌｅｕ２Δｍｅｔ１５Δ  ｕｒａ３）のコンピテントセルは、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＡＲＣＨ社）によって調製した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株を、５ｍｌのＹＰＡＤ培地［０．０４％のアデニンを含むＹＰＤ培地（Ｓｉｇｍａ社）］に接種し、終夜培養（３０℃、３１０ｒｐｍ）によって得た菌体を使用した。実施例１０から実施例１３によって構築した発現ベクターは、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＡＲＣＨ社）によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株に導入し、２％の寒天を含むＳＴ寒天培地［２％のグルコース、０．０４％のアデニン、０．３ＭのＫＣｌを含みウラシルとロイシンを欠失したＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ培地（Ｓｉｇｍａ社）］上で増殖した形質転換体をそれぞれ抗体発現酵母株として選抜した。
抗体重鎖と軽鎖の発現ユニットを保持するＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃは、宿主のウラシル要求変異を相補するＵＲＡ３マーカー遺伝子を有している。一方、ＹＥｐ３５１  ＧＡＰ−ＩＩ（遺伝子が導入されていないコントロールベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１（活性型ＨＡＣ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０（ＲＲＢＰ１発現ベクター）、ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１／ｐ１８０（活性型ＨＡＣ１遺伝子及びＲＲＢＰ１共発現ベクター）は、宿主のロイシン要求変異を相補するＬＥＵ２マーカー遺伝子を有している。そこで、以下のように組み合わせて両ベクターが導入されたときのみ増殖できるように宿主に形質転換し、４種類の抗体発現酵母株を構築した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１  ＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃ（ＵＲＡ３）ＹＥｐ３５１  ＧＡＰ−ＩＩ（ＬＥＵ２）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０２  ＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃ（ＵＲＡ３）ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１（ＬＥＵ２）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０３  ＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃ（ＵＲＡ３）ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ｐ１８０（ＬＥＵ２）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０４  ＹＥｐ３５２  ＧＡＰ−ＩＩ−ａｌｆＨｃ／ａｌｆＬｃ（ＵＲＡ３）ＹＥｐ３５１ＧＡＰ−ＩＩ−ａＨＡＣ１／ｐ１８０（ＬＥＵ２）
【実施例１５】
【００２０】
形質転換酵母株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による抗体の生産性
実施例１４で作製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０３、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０４株を、ＳＴ培地を用いて３０℃、３日間培養した。この培養液を終濃度５％になるようにＹＰＡＤ培地に接種し、３０℃、３日間培養した。培養液より培養上清を調製し酵母によって分泌生産された抗体を含む試料とした。分泌生産された抗体の定量的アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行った。９６ｗｅｌｌプレートに抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の抗原であるＴＲＡＩＬレセプター蛋白質を吸着させ、酵母試料を添加し、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ特異的Ｆｃ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ社））とＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社）を使用して検出した。スタンダードは、動物細胞（ＮＳＯ）で生産した抗体を用いた。
図８Ａに示すように、ＲＲＢＰ１遺伝子のみが導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０３株は、コントロール株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１株とほとんど生産性は変わらなかった。しかしながら、活性型ＨＡＣ１遺伝子のみが導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０２株では、コントロール株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１株の約２倍の生産性を示した。さらに、活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を共発現させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０４株では、コントロール株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１株はもとより、活性型ＨＡＣ１遺伝子またはＲＲＢＰ１遺伝子を単独で導入したものより顕著に高い抗体生産量を示した（コントロールの約７倍）。活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子の共発現は抗体の生産性に相乗効果以上の効果をもたらすことが確認された。
【実施例１６】
【００２１】
形質転換酵母株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたＯ型糖鎖形成が抑制された条件での抗体の生産性
実施例１４で作製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０３、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０４株を、ＳＴ培地を用いて３０℃、３日間培養した。この培養液を終濃度５％になるように１０μＭのＰＭＴ阻害剤（ロダニン−３−酢酸誘導体：５−［［３，４−（１−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−４−ｏｘｏ−２−ｔｈｉｏｘｏ−３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物１ｃ））を初発添加したＹＰＡＤ培地に接種し、３０℃、３日間培養した。培養液より培養上清を調製し、酵母によって分泌生産された抗体を含む試料とした。実施例１５と同様に、動物細胞（ＮＳＯ）で生産した抗体をスタンダードとして使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって定量的アッセイを行った。
図８Ｂに示すように、活性型ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０２株と、ＲＲＢＰ１遺伝子が導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０３株では、明らかに、コントロール株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１株より高い生産性を示した。さらに、活性型ＨＡＣ遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子を共発現させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０４株では、コントロール株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ２Ｋ０１株はもとより、活性型ＨＡＣ１遺伝子またはＲＲＢＰ１遺伝子を単独で導入したものより顕著に高い抗体生産量を示した（コントロールの約８倍）。活性型ＨＡＣ１遺伝子とＲＲＢＰ１遺伝子の共発現による抗体生産への相乗効果は、Ｏ型糖鎖形成の抑制によってさらに効果が増大した。
【実施例１７】
【００２２】
Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａプロテアーゼＹＰＳ１遺伝子破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）の作成
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のＹＰＳ１遺伝子破壊ベクターｐＤＯＭＹＰ１をＢａｍＨＩとＣｌａＩで切断して、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＴＫ５−３株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）に電気パルス法で形質転換を行った。これらの株のＹＰＳ１遺伝子が破壊されたことを確認するために、以下のプライマーを合成した。
0005131666.tif 000013
形質転換株から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＤＹ５、ＤＹ３を用いて、ＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル）を行った。プラスミドがＹＰＳ１座に組み込まれた株からは、３．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。選抜した株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ４株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１：：ＵＲＡ３）と命名した。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ４株をＹＰＤ培地で定常期まで培養した後、５−フルオロオロチジン酸（５−ＦＯＡ）に耐性を示す株を取得した。５−ＦＯＡ耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＤＹ５、ＤＹ３を用いたＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で３分）×２５サイクル）を行った。ＵＲＡ３遺伝子が欠落した株から、１．２Ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。このΔｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ５株と命名した。
【実施例１８】
【００２３】
合成抗体遺伝子生産株（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）の作成と抗体の生産
（１）合成抗体遺伝子発現ベクターの構築
ＷＯ２００３／０９１４３１記載のｐＯＭｅｘＧＰ１ＵをＳｐｅＩ切断、平滑末端処理後、ライゲーションさせた。得られたプラスミドのＳａｌＩサイトとＥｃｏＴ２２Ｉサイトを、それぞれＳｐｅＩサイト、ＢａｍＨＩサイトへリンカーチェンジした。得られたプラスミドをｐＯＭｅｘＧＰ１ＵΔＳｐと命名した。
抗体遺伝子は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体遺伝子（ＷＯ２００２／０９４８８０）のアミノ酸配列より、Ｏ．ｍｉｎｕｔａのコドン使用頻度を考慮した遺伝子をデザインし、人工合成を行った（タカラバイオ社）。軽鎖、及び重鎖遺伝子のＮ末端には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２シグナルまたはＣｈｉｃｋｅｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅシグナルを付加し、更に両端に制限酵素サイト（５’側にＸｂａＩサイト、３’側にＢａｍＨＩサイト）の塩基配列を付加した（塩基配列番号５１、５３、５５、５７；アミノ酸配列番号５２、５４、５６、５８）。ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩで消化されたシグナルの異なる２種類の軽鎖遺伝子断片を実施例１（２）で作成されたベクターｐＯＭｅｘＧＰ１Ａへ導入し、得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＳＵＣ、ならびにｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＬｙｓと命名した。ＸｂａＩ−ＢａｍＨで消化されたシグナルの異なる２種類の重鎖遺伝子断片をベクターｐＯＭｅｘＧＰ１ＵΔＳｐのＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトへ導入し、得られたベクターをｐＯＭｅｘＧＰＵΔＳｐ／ＡｂＳＵＣならびにｐＯＭｅｘＧＰＵΔＳｐ／ＡｂＬｙｓと命名した。
ｐＯＭｅｘＰＧＨｙ（実施例１（３−４））を鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＧＫＨｙ−Ｆ（配列番号５９）とＰＧＫＨｙ−Ｒ（配列番号６０）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）×２０サイクル］にて、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を増幅した。
0005131666.tif 000014
増幅した遺伝子断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ消化したｐＯＭｅｘＰＧＨｙ導入し、挿入断片の塩基配列を決定した。得られたプラスミドを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＧＫｐＵＣ−ｐ（配列番号６１）とＰＧＫｐＵＣ−ｔ（配列番号６２）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×２０サイクル］にて、ＰＧＫプロモーター−ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子−ＰＧＫターミネーターを含む遺伝子断片を増幅した。
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増幅した遺伝子断片をＡｓｐ７１８Ｉで消化したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社）へ、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて導入し、挿入断片の塩基配列を決定した。得られたプラスミドを、ＰＧＫＨｙｇ／ｐＵＣ１１８と命名した。ｐＯＭｅｘＧＰ１ＵΔＳｐをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、ＧＡＰプロモーター−ターミネーターを含むカセットを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ消化したＰＧＫＨｙｇ／ｐＵＣ１１８へ挿入した。得られたプラスミドをＧＡＰ／ＨｙＧ／ｐＵＣ１１８と命名した。次に、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社）をＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ消化、平滑末端処理後、ライゲーションすることで、ｐＵＣ１９内部に存在するＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩの領域を除去した。このプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで消化し、ＧＡＰ／ＨｙＧ／ｐＵＣ１１８から、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化で単離した、ＧＡＰプロモーター−ターミネーターと、ＰＧＫのプロモーター−ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子−ＰＧＫターミネーターを持つ遺伝子断片を挿入した。得られたプラスミドを、ｐＯＭｅｘＨｙと命名した。
ＸｂａＩ−ＢａｍＨで消化されたＣｈｉｃｋｅｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅシグナルが付加された抗体重鎖遺伝子断片を、ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ処理を施したｐＯＭｅｘＨｙへ導入し、得られたベクターをｐＯＭｅｘＨｙ／ＡｂＬｙｓと命名した。
（２）抗体遺伝子発現酵母株の作成
ＮｏｔＩで消化した抗体発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＬｙｓとｐＯＭｅｘＧＰＵΔＳｐ／ＡｂＬｙｓを用いて、エレクトロポレーションによりＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ５株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）を形質転換した。なおエレクトロポレーションの条件は、ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のものを採用した。形質転換された細胞はＳＤ寒天プレート培地［２％グルコース、０．６７％酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ社］にて選択した。単一コロニーをＢ２ＹＰ４Ｇ培地［１．３４％酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ社）、２％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、４％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、４％グリセロール、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）］を用いて、２７℃、４日間培養した。培養液より培養上清を調製し、実施例７に記載の方法にてウエスタン解析を行い、抗体軽鎖および重鎖遺伝子が導入された抗体生産株を選択し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ１株と命名した。図９に示す通り、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ１株は、実施例５で作成したＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＯ１株と比較して、著量の抗体を分泌していた。
ＮｏｔＩで消化した抗体発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＳＵＣとｐＯＭｅｘＧＰＵ  Δ  Ｓｐ／ＡｂＳＵＣをＷＯ２００３／０９１４３１に記載のＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＴＫ５−３株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１）に導入し抗体発現株Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ１を得た。エレクトロポレーション法ならびに、株の選択方法は上記と同様の方法を用いた。
【実施例１９】
【００２４】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの活性型ｈの遺伝子の取得と発現ベクターの構築
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ活性型ＨＡＣ１遺伝子の取得は、細胞（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株）より実施例３と同様の方法で取得した。実施例３の方法にて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株よりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを以下に記載のＤＮＡプライマーＨＡＣｐ１−１（配列番号６３）及びＨＡＣｐ１−１２（配列番号６４）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分）×３０サイクル］にて増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニング後、ＰＣＲで増幅された２種類の遺伝子断片由来の塩基配列を確認した（配列番号６５、６６）。
0005131666.tif 000017
取得された２種類のｃＤＮＡ断片のうち、１つ（配列番号６５）はゲノム配列と一致したが、もう一方（配列番号６６）は一部欠損し、短くなっており、ＵＰＲによって活性化したＩｒｅ１ｐによりスプライシングを受けたｃＤＮＡ断片であった。活性化したＨＡＣ１のｃＤＮＡ全長を取得するため、下記のＤＮＡプライマーｓｐｅＨＡＣｐ１Ｆ（配列番号６７）及びｂｇｌＨＡＣｐ１Ｒ（配列番号６８）と上記活性化したＨＡＣ１のｃＤＮＡが存在すると考えられるｃＤＮＡプールを用いてＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）×２０サイクル］を行った。
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得られた約１ｋｂ断片はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子の開始コドンから終始コドンまでを含んでおり（配列番号６９）、これは３０４アミノ酸からなる活性型ＨＡＣ１ｐのアミノ酸配列に相当する（配列番号７０）。これをＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ処理し、単離後、ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ処理を施したｐＯＭｅｘＰＧＨｙ（実施例１（３−４））に導入した。得られたベクターはｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／ＰｐＨａｃ１と命名した。このベクターはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ユニットを保持している。
【実施例２０】
【００２５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターの構築
実施例１１で作成されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子を含むＴＯＰＯ−ａＨａｃ１をテンプレートとして、ＤＮＡプライマーＳｃＨＡＣ−ＸｂａＦ（配列番号７１）とＤＮＡプライマーＳｃＨＡＣ−ＢａｍＲ（配列番号７２）を用いてＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）×２０サイクル］でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子を増幅した。
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これをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ消化し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来活性型ＨＡＣ１をコードしている遺伝子を回収した。単離後、ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ処理を施したｐＯＭｅｘＰＧＨｙ（実施例１（３−４））に導入した。得られたベクターはｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／ＳｃＨａｃ１と命名した。このベクターはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ユニットを保持している。
【実施例２１】
【００２６】
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株による抗体生産
（１）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ活性型ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株の作成
実施例１８にて育種した抗体生産株Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ１株に、Ａｏｒ５１ＨＩで消化したＯ．ｍｉｎｕｔａ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／ＰｐＨａｃ１、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／ＳｃＨａｃ１を上記エレクトロポレーション法によって導入した。各形質転換株の活性型ＨＡＣ１遺伝子の導入は、ハイグロマイシンＢを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＹＰＤ寒天プレート培地にて選択し、培養後、ゲノムを抽出し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１については、実施例３記載のＤＮＡプライマーＳｐｅＨＡＣ１Ｆ（配列番号２０）とｂｇｌＨＡＣ１Ｒ（配列番号２１）を用いたＰＣＲにて確認した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子については、上記のＤＮＡプライマーｓｐｅＨＡＣｐ１Ｆ（配列番号６７）とｂｇｌＨＡＣｐ１Ｒ（配列番号６８）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子については、ＤＮＡプライマーＳｃＨＡＣ−ＸｂａＦ（配列番号７１）とＳｃＨＡＣ−ＢａｍＲ（配列番号７２）を用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）×３０サイクル］にて確認した。得られた株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｐｐＨ株及びＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株と命名した。同時にコントロールとしてＡｏｒ５１ＨＩで消化したｐＯＭｅｘＰＧＨｙをＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ１株に導入し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株を得た。
（２）ＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株による抗体の分泌確認
上記（１）で作成されたＨＡＣ１遺伝子導入抗体生産株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｐｐＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株ならびにＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株を実施例１８（２）に示した方法で培養し、非還元条件化でのウエスタン解析を行った。その結果、図１０に示す通り、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｐｐＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株は、上記（１）で作成したコントロールのＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株と比較して、抗体分子への糖鎖の付加が見られ、抗体Ｈ２Ｌ２会合体の顕著な分泌促進効果は認められなかったが、宿主と異なる種由来のＨＡＣ１遺伝子を導入しても同様の生産効果が期待できると考えられた。
（３）ＨＡＣ１遺伝子導入Ｏ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株による分泌抗体の生産性（ＴＲ−ＦＲＥＴを原理としたホモジニアス分析による定量）
１２μｌの０．９７μｇ／ｍｌ  ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）、８．３ｕｇ／ｍｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、１６．７ｕｇ／ｍｌ  Ｓｕｒｅｌｉｇｈｔ  ＡＰＣ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）、１０％ブロックエース（大日本製薬社）を含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を９６ウエル・ハーフエリアプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に加え、上記（２）にて調製された培養液を適宜、１０％ブロックエースを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈したサンプルを２μｌ入れ攪拌した。室温、暗所で１時間反応後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、蛍光を測定した。６６５ｎｍ／６１５ｎｍの値より会合抗体生産量を測定した。スタンダードとして、動物細胞（ＣＨＯ）にて生産した抗体を用いた。図１１に示す通り、活性化ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｐｐＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株にて、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株と比較して、顕著な抗体の分泌促進は認められなかったが、宿主と異なる種由来のＨＡＣ１遺伝子を導入しても同様の生産効果が期待できると考えられた。
（４）ＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を用いたＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株による抗体生産
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｐｐＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株、およびＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株を５ｍｌのＢ２ＹＰ４Ｇ培地に１白金耳、植菌し２７℃、１日間培養後、ＯＤ６００が１０になるようにＢ２ＹＰ４Ｇ培地にて希釈し、実施例９に記載のＰＭＴ阻害剤（１ｃ；原液濃度１０ｍＭ）を２μＭとなるように添加した。更に２７℃、３日間培養し、２４時間毎にＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００の１増加につき０．０４μＭづつＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を添加した。培養液より培養上清を調製し、実施例２１（３）に記載の方法にて、抗体生産量を測定した。その結果を、図１１に示す。活性化ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｏｍＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  Ｍ２ｐｐＨ株、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２ｓｃＨ株にて、ＰＭＴ阻害剤を添加して培養することで、コントロールに当たるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＡ２Ｈｙ株と比較して、抗体の分泌促進効果を認めた。
以上のように、異種のＨＡＣ１遺伝子を用いても、抗体の分泌促進効果を有することが認められた。
【実施例２２】
【００２７】
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来ＰＭＴ遺伝子の単離
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ由来ＰＭＴ１遺伝子の取得は、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＭ１−５（配列番号７３）、ＰＭ１−３（配列番号７４）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）Ｘ２５サイクル］を行った。
0005131666.tif 000020
増幅された約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングした。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを単離し、挿入断片の塩基配列（配列番号７５）を決定することで、プラスミドの挿入ＤＮＡ断片に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＭＴ１遺伝子のアミノ酸配列と高い相同性を持つアミノ酸配列（配列番号７６）をコードする塩基配列を有するクローンを選抜した。単離されたプラスミドをｐＯｍＰＭ１と命名した。
またＯ．ｍｉｎｕｔａ由来ＰＭＴ２遺伝子については、ＤＮＡプライマーＰＭ２−５（配列番号７７）、ＰＭ２−３（配列番号７８）を用い、ＰＭＴ４遺伝子については、ＤＮＡプライマーＰＭ４−５（配列番号７９）、ＰＭ４−３（配列番号８０）を用い、ＰＭＴ５遺伝子については、ＤＮＡプライマーＰＭ５−５（配列番号８１）、ＰＭ５−３（配列番号８２）を用い、ＰＭＴ６遺伝子については、ＤＮＡプライマーＰＭ６−５（配列番号８３）、ＰＭ６−３（配列番号８４）を用い、ＰＭＴ１遺伝子と同様の方法にて取得し、ＰＭＴ２遺伝子（塩基配列：配列番号８５．アミノ酸配列：配列番号８６）、ＰＭＴ４遺伝子（塩基配列：配列番号８７．アミノ酸配列：配列番号８８）、ＰＭＴ５遺伝子（塩基配列：配列番号８９、アミノ酸配列：配列番号９０）および、ＰＭＴ６遺伝子（塩基配列：配列番号９１、アミノ酸配列：配列番号９２）を含むプラスミドを、それぞれｐＯｍＰＭ２、ｐＯｍＰＭ４、ｐＯｍＰＭ５およびｐＯｍＰＭ６と命名した。
0005131666.tif 000021
0005131666.tif 000022
【実施例２３】
【００２８】
Ｏ．ｍｉｎｕｔａのＰＭＴ遺伝子分断または破壊ベクターの作成
（１）ＰＭＴ遺伝子分断ベクターの作成
（１−１）ＰＭＴ１遺伝子分断ベクターの作成
実施例２２で得られたｐＯｍＰＭ１を用いて、ＰＭＴ１遺伝子の部分配列を単離するため、以下のＤＮＡプライマーＰＭＴ１ｈＩＩＩ（配列番号９３）、ＰＭＴ１Ｋｐ（配列番号９４）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×１５サイクル］を行った。
0005131666.tif 000023
増幅された約１．６ｋｂのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し回収した。次にｐＰＩＣＺ  α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢｇｌＩＩ消化し、平滑末端処理後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを挿入、さらにＢａｍＨＩ消化し、平滑末端処理後、ＫｐｎＩリンカーを挿入した。得られたプラスミドをｐＺ−Ｈｄ−Ｋｐと命名した。ｐＺ−Ｈｄ−ＫｐをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、ゼオシン耐性遺伝子を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片を単離後、上記ＰＣＲにて増幅されたＰＭＴ１遺伝子部分配列を挿入した。挿入されたＰＭＴ１遺伝子の部分配列の塩基配列を決定した後、得られたプラスミドをｐＯｍＰＭ１ｄＺと命名した。ｐＯｍＰＭ１ｄＺはＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＰＭＴ１遺伝子の構造遺伝子（ＣＤＳ）部分とプロモーター領域を分断し、ＰＭＴ１遺伝子の転写を抑制することができる。一方、実施例１８にて作成したｐＯＭｅｘＧＰＵΔＳｐをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し、ＧＡＰプロモーターとターミネーターを含む遺伝子断片を回収後、上記ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化した、ゼオシン耐性遺伝子を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片へ挿入した。得られたプラスミドをＧＡＰ／Ｚと命名した。
（１−２）ＰＭＴ２遺伝子分断ベクターの作成
実施例２２で得られたｐＯｍＰＭ２を用いて、ＰＭＴ２遺伝子の部分配列を単離するため、以下のＤＮＡプライマーＰＭＴ２ｈＩＩＩ（配列番号９５、ＰＭＴ２Ｋｐ（配列番号９６）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×１５サイクル］を行った。
0005131666.tif 000024
増幅された約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩで消化し回収した。得られたＤＮＡ断片は、ｐＺ−Ｈｄ−ＫｐをＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ処理することで単離されたゼオシン耐性遺伝子を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片に挿入後、挿入されたＰＭＴ２遺伝子の部分配列の塩基配列を決定した。得られたプラスミドをｐＯｍＰＭ２ｄＺと命名した。ｐＯｍＰＭ２ｄＺはＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＰＭＴ２遺伝子の構造遺伝子（ＣＤＳ）部分とプロモーター領域を分断し、ＰＭＴ２遺伝子の転写を抑制することができる。
（１−３）ＰＭＴ４遺伝子分断ベクターの作成
実施例２２で得られたｐＯｍＰＭ４を用いて、ＰＭＴ４遺伝子の部分配列を単離するため、以下のＤＮＡプライマーＰＭＴ４ＦＨｄｉｎｆ（配列番号９７、ＰＭＴ４ＲＫｐｉｎｆ（配列番号９８）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）×１５サイクル］を行った。
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得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＺ−Ｈｄ−ＫｐからＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ処理によって単離された、ゼオシン耐性遺伝子を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片へ、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて導入した。挿入されたＰＭＴ４遺伝子の部分配列の塩基配列を決定した後、得られたプラスミドをｐＯｍＰＭ４ｄＺと命名した。
（２）ＰＭＴ遺伝子破壊ベクターの作成
（２−１）ＰＭＴ５遺伝子破壊ベクターの作成
ＷＯ２００３／０９１４３１に記載のＯ．ｍｉｎｕｔａのＵＲＡ３構造遺伝子の前後に約０．８ｋｂの反復配列を有する遺伝子断片を含むｐＲＯＭＵ１をＨｉｎｄＩＩＩ消化、平滑末端処理後、ＢａｍＨＩリンカーを挿入した。得られたベクターをＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ消化し、反復配列ならびにＯ．ｍｉｎｕｔａのＵＲＡ３遺伝子を含む約３．３ｋｂの断片を、ＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入した。得られたベクターをｒＵＲＡｐＢＫＳと命名した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＭＴ５ｍａｅＦ２（配列番号９９）とＰＭＴ５ｍａｅＲ（配列番号１００）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。増幅された約１．５ｂｋのＤＮＡ断片を回収し、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｒＵＲＡｐＢＫＳへＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて導入し、挿入された遺伝子断片の塩基配列を決定した。得られたベクターをＰＭＴ５Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３ｐｒｅと命名した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＭＴ５ｕｓｈｉｒｏＦ（配列番号１０１）とＰＭＴ５ｕｓｈｉｒｏＲ（配列番号１０２）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。増幅された約１．５ｂｋのＤＮＡ断片を回収し、ＮｏｔＩで消化したＰＭＴ５Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３ｐｒｅへＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて導入し、挿入された遺伝子断片の塩基配列を決定した。得られたベクターをＰＭＴ５Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３と命名した。
0005131666.tif 000026
（２−２）ＰＭＴ６遺伝子破壊ベクターの作成
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＭＴ６ｉｎｆ５’ａｒｍＦ（配列番号１０３）とＰＭＴ６ｉｎｆ５’ａｒｍＲ（配列番号１０４）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。増幅された約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＢａｍＨＩで消化したｒＵＲＡｐＢＫＳへＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて導入し、挿入された遺伝子断片の塩基配列を決定した。得られたベクターをＰＭＴ６Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３ｐｒｅと命名した。
Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１０７４６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡプライマーＰＭＴ６ｉｎｆ３’ａｒｍＦ（配列番号１０５）とＰＭＴ６ｉｎｆ３’ａｒｍＲ２（配列番号１０６）を用いて、ＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で２分）×２５サイクル］を行った。増幅された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩで消化したＰＭＴ６Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３ｐｒｅへＩｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて導入し、挿入された遺伝子断片の塩基配列を決定した。得られたベクターをＰＭＴ６Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３と命名した。
0005131666.tif 000027
【実施例２４】
【００２９】
ＰＭＴ遺伝子が分断または破壊されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株の作成と評価
（１）ＰＭＴ遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株の作成
実施例１８にて育種した抗体生産株Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ１株に、実施例２３にて作成されたＰＭＴ遺伝子分断ベクターについて、ＰＭＴ１遺伝子分断ベクターについてはＰｓｔＩ、ＰＭＴ２遺伝子分断ベクターについてはＸｈｏＩ、ＰＭＴ４遺伝子分断ベクターについてはＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、上記エレクトロポレーション法によって導入した。形質転換株のＰＭＴ遺伝子の分断の確認は、Ｚｅｏｃｉｎｅを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＹＰＤ寒天プレート培地にて選択し、培養後、ゲノムを抽出し、ＰＭＴ１遺伝子については、Ｚｅｏ１（配列番号１０７）とＰＭＴ１ｚｅｏ１（配列番号１０９）の組み合わせと、Ｚｅｏ２（配列番号１０８）とＰＭＴ１ｚｅｏ２（配列番号１１０）の組み合わせのＤＮＡプライマー、ＰＭＴ２遺伝子については、Ｚｅｏ１（配列番号１０７）とＰＭＴ２ｚｅｏ１（配列番号１１１）の組み合わせと、Ｚｅｏ２（配列番号１０８）とＰＭＴ２ｚｅｏ２（配列番号１１２）の組み合わせのＤＮＡプライマー、ＰＭＴ４遺伝子については、Ｚｅｏ１（配列番号１０７）とＰＭＴ４ＰＣＲ３’ａｒｍＦ（配列番号１１３）の組み合わせと、Ｚｅｏ２（配列番号１０８）とＰＭＴ４ＰＣＲ５’ａｒｍＲ３（配列番号１１４）の組み合わせのＤＮＡプライマー用いたＰＣＲ［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）×３０サイクル］にて分断ベクター導入による各ＰＭＴ遺伝子の分断を確認した。
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得られた株をそれぞれ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ１株（ＰＭＴ１遺伝子分断）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ２株（ＰＭＴ２遺伝子分断）及びＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株（ＰＭＴ４遺伝子分断）と命名した。同時にコントロールとしてＳｓｅ８３８７Ｉ消化したＧＡＰ／ＺをＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ１株に導入し、Ｚｅｏｃｉｎｅ耐性株を選択することでＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｚ株を得た。
（２）ＰＭＴ遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株による分泌抗体の生産性
上記（１）で作成された各ＰＭＴ遺伝子分断抗体生産株を実施例１８（２）に示した方法で培養し、ウエスタン解析を行った。その結果、図１２および図１４に示す通り、ＰＭＴ１遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ１株、ＰＭＴ２遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ２株、およびＰＭＴ４遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株では、上記（１）で作成したＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｚ株と比較して、抗体会合体分泌量の若干の増加を確認した（図１２：レーン３、レーン６、図１４：レーン３）。
（３）ＰＭＴ遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株による分泌抗体の生産性（ＴＲ−ＦＲＥＴを原理としたホモジニアス分析による定量）
実施例２１（３）に記載の方法にて、上記（２）にて調製された培養液中の抗体生産量を測定した。スタンダードとして、動物細胞（ＣＨＯ）にて生産した抗体を用いた。図１３および図１５に示す通り、ＰＭＴ１遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ１株、ＰＭＴ２遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ２株、およびＰＭＴ４遺伝子が分断されたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株では、上記（１）で作成したＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｚ株と比較して、抗体会合体分泌量の若干の増加を確認した（図１３：ＹＹ２Ｐ１、ＹＹ２Ｐ２、図１５：ＹＹ２Ｐ４）。
（４）ＰＭＴ５ならびにＰＭＴ６破壊株の作成と評価
（４−１）Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＰＭＴ５遺伝子破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５）の作成
実施例２３（２−１）にて作成したＰＭＴ５遺伝子破壊ベクターＰＭＴ５Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３をＨｉｎｄＩＩＩで消化後、実施例１７にて作成した、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ５株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１）へ、電気パルス法にて形質転換を行った。これらの株のＰＭＴ５遺伝子が破壊されたことを確認するために、以下のプライマーを合成した。
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形質転換株から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーｇＰＭＴ５−５（配列番号１１５）とｇＰＭＴ５−２（配列番号１１６）を用いて、ＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル）を行った。プラスミドがＰＭＴ５座に組み込まれた株からは、４．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。同様に、形質転換株から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーｇＰＭＴ５−３（配列番号１１７）とｇＰＭＴ５−４（配列番号１１８）を用いて、ＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル）を行った。プラスミドがＰＭＴ５座に組み込まれた株からは、４．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。選抜した株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ６株（Δｏｃ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１Δｐｍｔ５：：ＵＲＡ３）と命名した。
（４−２）Ｏ．ｍｉｎｕｔａＰＭＴ６遺伝子破壊株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６）の作成
実施例２３（２−２）にて作成したＰＭＴ６遺伝子破壊ベクターＰＭＴ６Ｋ／Ｏ／ｒＵＲＡ３をＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで消化後、実施例１７にて作成した、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ５株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１）へ、電気パルス法にて形質転換を行った。これらの株のＰＭＴ６遺伝子が破壊されたことを確認するために、以下のプライマーを合成した。
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形質転換株から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰＭＴ６  ＰＣＲ３’ａｒｍＦ（配列番号１１９）とＰＭＴ６  ＰＣＲ３’ａｒｍＲ（配列番号１２０）を用いて、ＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル）を行った。プラスミドがＰＭＴ６座に組み込まれた株からは、５．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。同様に、形質転換株から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰＭＴ６  ＰＣＲ５’ａｒｍＦ（配列番号１２１）とＰＭＴ６  ＰＣＲ５’ａｒｍＲ（配列番号１２２）を用いて、ＰＣＲ（（９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分）×２５サイクル）を行った。プラスミドがＰＭＴ６座に組み込まれた株からは、６．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が検出された。選抜した株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ７株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１Δｐｍｔ６：：ＵＲＡ３）と命名した。
（５）ＰＭＴ５ならびにＰＭＴ６遺伝子が破壊されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株の作成
ＮｏｔＩで消化した抗体発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＬｙｓ（実施例１８（１）で作成）とＳｓｅ８３８７Ｉで消化した抗体発現ベクターｐＯＭｅｘＨｙ／ＡｂＬｙｓ（実施例１８（１）で作成）を用いて、エレクトロポレーションによりＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ６株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ５：：ｒＵＲＡ３）ならびにＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ７株（Δｏｃｈ１Δｙｐｓ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｐｍｔ６：：ｒＵＲＡ３）を形質転換した。形質転換された細胞はハイグロマイシンＢが５０μｇ／ｍｌとなるよう添加されたＳＤ寒天プレート培地（２％グルコース、０．６７％酵母ニトロゲンベース〔Ｄｉｆｃｏ社〕）にて選択した。単一コロニーをＢ２ＹＰ４Ｇ培地［１．３４％酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ社）、２％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、４％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、４％グリセロール、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）］を用いて、２７℃、４日間培養した。培養液より培養上清を調製し、実施例７に記載の方法にてウエスタン解析を行い、抗体軽鎖および重鎖遺伝子が導入された抗体生産株を選択した。得られた株はそれぞれ、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ５株（ＰＭＴ５遺伝子破壊株）ならびＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ６株（ＰＭＴ６遺伝子破壊株）と命名した。一方、コントロールとして、ＮｏｔＩで消化した抗体発現ベクターｐＯＭｅｘＧＰＡ／ＡｂＬｙｓとＳｓｅ８３８７Ｉで消化したｐＯＭｅｘＨｙ／ＡｂＬｙｓをエレクトロポレーションによって、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＫ４株（Δｏｃｈ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１Δｙｐｓ１：：ｒＵＲＡ３）へ導入し、上記の方法と同様に抗体発現株を作成、選択した。得られた株は、Ｏ．ｍｉｕｔａ  Ａｃｏｎ株と命名した。
（６）ＰＭＴ５ならびにＰＭＴ６遺伝子が破壊されたＯ．ｍｉｎｕｔａ抗体生産株による分泌抗体の生産性
ＰＭＴ５遺伝子破壊株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ５株、ＰＭＴ６遺伝子破壊株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ６株、ならびにＯ．ｍｉｎｕｔａ  Ａｃｏｎ株を実施例１８（２）に示した方法で培養し、非還元ウエスタン解析を行った。また培養液を実施例２１（３）に記載の方法にて、抗体生産量を測定した。スタンダードとして、動物細胞（ＣＨＯ）にて生産した抗体を用いた。その結果、図１６に示すとおり、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ５株、ならびにＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＡＰ６株とコントロールに当たるＯ．ｍｉｎｕｔａ  Ａｃｏｎ株とで抗体の会合体の生産性に大差はなかった。
【実施例２５】
【００３０】
ＰＭＴ遺伝子が分断され、かつＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株の作成と評価
（１）ＰＭＴ遺伝子が分断され、かつＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株の作成
実施例２４（１）で作成された、Ｏ．ｍｉｎｕｔａＹＹ２Ｐ２株（ＰＭＴ２遺伝子分断株）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株（ＰＭＴ４遺伝子分断株）、およびＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｚ株（コントロール株）に、実施例３にて作成されたＯ．ｍｉｎｕｔａ由来活性型ＨＡＣ１遺伝子発現ベクターｐＯＭｅｘＰＧＨｙ／Ｈａｃ１をＡｏｒ５１ＨＩで消化し、上記エレクトロポレーション法によって導入した。形質転換株の活性化ＨＡＣ１遺伝子の導入は、ハイグロマイシンＢを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＹＰＤ寒天プレート培地にて選択し、培養後、ゲノムを抽出し、活性型ＨＡＣ１遺伝子の導入を、実施例６の方法に従い、ＰＣＲにて確認した。得られた株をＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ２ｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子導入ＰＭＴ２遺伝子分断株）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ４ｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子導入ＰＭＴ４遺伝子分断株）、およびＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子導入コントロール株）と命名した。同時にコントロールとしてＡｏｒ５１ＨＩで消化したｐＯＭｅｘＰＧＨｙをＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｚ株に導入し、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺＨｙ株（ベクター導入コントロール株）を得た。
（２）ＰＭＴ遺伝子が分断され、かつＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株による分泌抗体の生産性
上記（１）で作成された、ＨＡＣ１遺伝子が導入された各ＰＭＴ遺伝子分断抗体生産株を実施例１８（２）に示した方法で培養し、ウエスタン解析を行った。その結果、図１２および図１４に示す。ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＰＭＴ２遺伝子分断株である、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ２ｏｍＨ株は、ＨＡＣ１遺伝子単独導入株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺｏｍＨ株ならびに、ＰＭＴ２分断株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ２株と比較して、著量の抗体を分泌していた（図１２：レーン７）。また、ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＰＭＴ４遺伝子分断株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ４ｏｍＨ株は、ＨＡＣ１遺伝子単独導入株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺｏｍＨ株ならびに、ＰＭＴ４分断株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株と比較して、著量の抗体を分泌していた（図１４：レーン６）。
また培養液を実施例８および実施例２１（３）に記載の方法にて、抗体生産量を測定した。スタンダードとして、動物細胞（ＣＨＯ）にて生産した抗体を用いた。その結果、図１３および図１５に示す。ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＰＭＴ２遺伝子分断株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ２ｏｍＨ株は、コントロールにあたるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子単独導入株）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ２株（ＰＭＴ２遺伝子分断株）および、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺＨｙ株（ベクター導入コントロール株）と比較して、著量の会合抗体を分泌していた（図１３：Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ２ｏｍＨ株）。また、ＨＡＣ１遺伝子が導入されたＰＭＴ４遺伝子分断株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ４ｏｍＨ株は、コントロールにあたるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子単独導入株）、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ２Ｐ４株（ＰＭＴ４遺伝子分断株）および、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３ＺＨｙ株（ベクター導入コントロール株）と比較して、著量の会合抗体を分泌していた（図１５：Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ４ｏｍＨ株）。
【実施例２６】
【００３１】
ＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を用いたＰＭＴ遺伝子が分断され、かつＨＡＣ１遺伝子が導入されたＯ．ｍｉｎｕｔａ株による抗体生産
上記実施例２５（１）で作成された、ＨＡＣ１遺伝子が導入された各ＰＭＴ遺伝子分断抗体生産株を５ｍｌのＢ２ＹＰ４Ｇ培地に１白金耳、植菌し２７℃、１日間培養後、ＯＤ６００が１０になるようにＢ２ＹＰ４Ｇ培地にて希釈し、実施例９に記載のＰＭＴ阻害剤（１ｃ；原液濃度０．１、０．５、２．５、１０ｍＭ）を０．０１６、０．０８、０．４、２．０μＭとなるように添加した。更に２７℃、３日間培養し、２４時間毎にＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００の１増加につき０．０００３２、０．００１６、０．００８、０．０４μＭづつＰＭＴ阻害剤（１ｃ）を添加した。培養液より培養上清を調製し、実施例１８（２）に示した方法でウエスタン解析を行った。その結果を、図１７に示す。更に実施例２１（３）に記載の方法にて、分泌抗体の生産性を定量した。その結果を、図１８に示す。Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ２ｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子導入ＰＭＴ２遺伝子分断株）では、ＰＭＴ阻害剤濃度をＯＤ６００の１増加につき、０．００８μＭ程度添加（原液濃度２．５ｍＭ）した場合に最も抗体の生産性が高く、Ｏ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ３Ｐ４ｏｍＨ株（ＨＡＣ１遺伝子導入ＰＭＴ４遺伝子分断株）ではＰＭＴ阻害剤をＯＤ６００の１増加につき０．０４μＭ程度添加（原液濃度１０ｍＭ）した場合が最も抗体の生産性が高かった。ＰＭＴ遺伝子の発現抑制とＰＭＴ阻害剤の併用で、糖鎖付加が強力に抑制されていると考えられる。ＨＡＣ１導入株の糖鎖付加を抑制するには、ＰＭＴ遺伝子の発現抑制とＰＭＴ阻害剤の併用によるＰＭＴタンパク質の活性阻害により、会合体抗体のさらなる高生産が期待できる。
【実施例２７】
【００３２】
ＰＭＴ阻害剤（５ａ）の評価
抗体遺伝子導入株であるＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＹＹ１株を５ｍｌのＢ２ＹＰ４Ｇ培地に１白金耳、植菌し２７℃、１日間培養後、ＯＤ６００が１０になるようにＢ２ＹＰ４Ｇ培地にて希釈し、実施例９に記載のＰＭＴ阻害剤（１ｃ）とは異なったＰＭＴ阻害剤（｛（５Ｚ）−４−ｏｘｏ−５−［３−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）−４−（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］−２−ｔｈｉｏｘｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−３−ｙｌ｝ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐ３９７５，（２００４）中の化合物５ａ））を１μＭとなるよう添加した。更に２７℃、３日間培養し、２４時間毎にＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００の１増加につき０．０２μＭづつ添加した。培養液より培養上清を調製し、実施例１８（２）に示した方法でウエスタン解析、及び実施例２１（３）に記載の方法にて、分泌抗体の生産性を定量した。その結果を図１９及び図２０に示す。抗体会合体の生産性は、新たに検討したＰＭＴ阻害剤（５ａ）を添加することによっても、増加する傾向にあり、実施例９に記載のＰＭＴ阻害剤（１ｃ）と同等の効果を持つと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、通常のタンパク質のみならず、抗体などの構造が複雑なタンパク質をも酵母において高分泌生産することが可能となる。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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