(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって
前記変異型yggB遺伝子は、（ｉ）、（ｉ’）、（ｉ’’）または（ii）の変異が導入された、コリネ型細菌：
（ｉ）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域の欠失、
（ｉ’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、
（ｉ’’）配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９−５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、
または
（ii）配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１−２３、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域における１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入。
【請求項２】
前記（i’’）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列に
おいて、４２４位及び/または４３７位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である
、請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項３】
前記（ii）の変異は、フレームシフトを伴うことなく導入された、請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項４】
前記（ii）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異である
、請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項５】
前記（ii）の変異は、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列におい
て、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に１又は数アミノ酸を挿入する変異である、請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項６】
前記変異型yggB遺伝子が、下記(a)〜（n）より選ばれる変異型yggB遺伝子である請求項１〜５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：    (a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (b) 配列番号８のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (d) 配列番号２０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (f) 配列番号２２のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (h) 配列番号２４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (j) 配列番号６４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (l) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (n) 配列番号７４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【請求項７】
前記変異型yggB遺伝子の導入により、Ｌ−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項８】
さらに（i）のsymA遺伝子が不活化するように改変された、請求項１〜７のいずれか一項
に記載のコリネ型細菌。
(i) 配列番号８６の塩基番号585〜1121の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項９】
さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項１
〜８のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１０】
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
【請求項１２】
下記(a)〜（n）より選ばれる変異型yggB遺伝子：    (a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (b) 配列番号８のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (d) 配列番号２０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (f) 配列番号２２のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (h) 配列番号２４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (j) 配列番号６４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (l) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。    (m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、    (n) 配列番号７４のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵工業に関し、詳しくは、Ｌ−グルタミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられる。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００３】
コリネ型細菌の野生株は、一般的にビオチンが存在している条件ではグルタミン酸を生成しない。したがって、コリネ型細菌によるグルタミン酸生産は、ビオチン制限、界面活性剤添加、ペニシリン添加等によってグルタミン酸生成を誘導した状態で行われる（非特許文献１）。また、これらの方法を適用しなくてもビオチンが十分存在している条件でＬ−グルタミン酸を生成できる株として、界面活性剤温度感受性株（特許文献1）、ペニシリン感受性株（特許文献２）、セルレニン感受性株（特許文献３）リゾチーム感受性株（特許文献４）等が開発されている。
【０００４】
しかし、これらの手法により開発されたL-グルタミン酸生産菌は、脂肪酸合成能の低下や細胞壁合成能の低下を伴っている場合が多く、L-グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高い。したがって、これらの手法を用いてL-グルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた。
【０００５】
一方、ビオチン十分条件でＬ−グルタミン酸を生成する株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成される（特許文献５）。しかし、TCAサイクルを途中で遮断するα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった。
【０００６】
コリネ型細菌のyggB遺伝子は、エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであり（非特許文献２，３）、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが、（非特許文献４）、Ｌ−グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった。
【特許文献１】国際公開99/02692号パンフレット
【特許文献２】特開平04-088994号公報
【特許文献３】特開昭55-124492号公報
【特許文献４】国際公開00/14241号パンフレット
【特許文献５】国際公開95/34672号パンフレット
【非特許文献１】Biosci.Biotech.Biochem.,61(7),1109-1112, 1997
【非特許文献２】FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.
【非特許文献３】Mol Microbiol. 2004 Oct;54(2):420-38.
【非特許文献４】EMBO J. 1999, 18(7):1730-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造において、Ｌ−グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本研究者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、yggB遺伝子がコリネ型細菌のL-グルタミン生産に関与していることを明らかにし、yggB遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより、L-グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌。
（２）前記yggB遺伝子が、以下の(a)〜（h）のいずれかから選択されるDNAである（１）のコリネ型細菌：
(a) 配列番号５の塩基番号1437〜3035の塩基配列を含むＤＮＡ、
(b) 配列番号５の塩基番号1437〜3035の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
(c) 配列番号６１の塩基番号507〜2093の塩基配列を含むＤＮＡ、
(d) 配列番号６１の塩基番号507〜2093の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
(e) 配列番号６７の塩基番号403〜2001の塩基配列を含むＤＮＡ、
(f) 配列番号６７の塩基番号403〜2001の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
(g) 配列番号８３の塩基番号501〜2099の塩基配列を含むＤＮＡ、
(h) 配列番号８３の塩基番号501〜2099の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（３）前記yggB遺伝子が、配列番号６、６２、６８、８４、もしくは８５ら選択されるアミノ酸配列、または配列番号６、６２、６８、８４、もしくは８５から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNAである（１）のコリネ型細菌。
（４）yggB遺伝子の発現量が非改変株と比較して上昇するように改変された、（１）のコリネ型細菌。
（５）yggB遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、該遺伝子の発現量が上昇するように改変された、（４）のコリネ型細菌。
（６）変異型yggB遺伝子が導入された、（１）のコリネ型細菌。
（７）前記変異型yggB遺伝子が、配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９−５３３の配列、または配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の配列をコードする領域に変異を有する、（６）のコリネ型細菌。
（８）前記変異は、前記領域の欠失である、（７）のコリネ型細菌。
（９）前記変異は、前記領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入である、（７）のコリネ型細菌。
（１０）前記変異は、前記領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である（７）のコリネ型細菌。
（１１）前記変異型yggB遺伝子が、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、４２４位及び/または４３７位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である、（７）のコリネ型細菌。
（１２）前記変異型yggB遺伝子が、yggB遺伝子がコードするタンパク質の膜貫通領域に変異を有する遺伝子である、（６）のコリネ型細菌。
（１３）前記膜貫通領域が、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２３、２５−４７、６２−８４、８６−１０８、及び１１０−１３２からなる群から選ばれる領域である、（１２）のコリネ型細菌。
（１４）前記変異が、フレームシフトを伴うことなく導入された、（１２）のコリネ型細菌。
（１５）前記変異型yggB遺伝子が、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異を有する遺伝子である、（１２）のコリネ型細菌。
（１６）前記変異型yggB遺伝子が、配列番号６、６２、６８、８４もしくは８５のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に１又は数アミノ酸を挿入する変異を有する遺伝子である、（１２）のコリネ型細菌。
（１７）前記変異型yggB遺伝子の導入により、Ｌ−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、（６）〜（１６）のいずれかのコリネ型細菌。
（１８）さらに上記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された、（６）〜（１７）のいずれかのコリネ型細菌。
（１９）前記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子がsymA遺伝子であり、前記symA遺伝子が以下の（i）または（j）から選択されるDNAである（１８）のコリネ型細菌：
(i) 配列番号８６の塩基番号585〜1121の塩基配列を含むＤＮＡ、
(j) 配列番号８６の塩基番号585〜1121の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌内で変異型yggB遺伝子の機能を抑制するＤＮＡ。
（２０）さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、（１）〜（１９）のいずれかのコリネ型細菌。
（２１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、（１）〜（２０）のいずれかのコリネ型細菌。
（２２）（１）〜（２１）のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
（２３）下記(a)〜（p）より選ばれる変異型yggB遺伝子：
(a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(b) 配列番号８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d) 配列番号２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(f) 配列番号２２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(h) 配列番号２４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ
−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(j) 配列番号６４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(l) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(n) 配列番号７４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
（２４）変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させたコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でＬ−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
（２５）変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、in vitroでランダムに変異を導入したyggB遺伝子を導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でＬ−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
（２６）変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、転移因子を染色体上にランダムに導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でＬ−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
（２７）変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、コリネ型細菌をL−グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能な株を取得することを特徴とする方法。
（２８）前記変異型yggB遺伝子を保有する菌株が（６）〜（１６）のいずれかのコリネ型細菌である、（２４）〜（２７）のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
（２９）前記ビオチンを過剰量含む培地が、ビオチンを30μg/L以上含有する培地である、（２４）〜（２８）のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のyggB遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸を効率よく生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してＬ−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である。
【００１２】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41
, 255(1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１３】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067）
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC  13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００１４】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、こ
の登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM  BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１５】
本発明において、「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培地中または菌体内にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。コリネ型細菌の多くは後述する「L-グルタミン酸生産条件」でL-グルタミン酸を生産することができるため、「Ｌ−グルタミン酸生産能」は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよい。ただし、育種によって付与または増強された性質であってもよく、さらに後述するようにして、yggB遺伝子を用いた改変によって、Ｌ−グルタミン酸の生産能が付与されたものでもよい。
「Ｌ−グルタミン酸生産能が向上した」とは、野生株などの非改変株と比較して、Ｌ−グルタミン酸生産能が上昇したことを意味する。ここで、コリネ型細菌の野生株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、13869株、14067株、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株などが挙げられる。なお、「非改変株」としては、上記のような野生株と同程度のyggB遺伝子の発現量を示すような株、yggB遺伝子のコード領域内に変異が導入されていない株も含む。
【００１６】
育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。
【００１７】
これらの遺伝子の発現の増強は、後述のyggB遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。
【００１８】
クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、国際公開00/18935号パンフレット、特開2000-232890号公報等に記載された微生物が例示できる。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼなどが挙げられるが、この中でも特にα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株が望ましい。例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP−4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP−4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
【００２０】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、１〜２塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る。（Journal of biological Chemistry 272:8611-8617（1997））また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS（インサーションシークエンス）因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００２１】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、米国特許第6303383号参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドは、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、pHSG299(宝バイオ社製) pHSG399(宝バイオ社製)等が挙げられる。
【００２２】
変異型の目的遺伝子を宿主染色体上の目的遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。まず、温度感受性複製起点、変異型目的遺伝子、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子及びクロラムフェニコール等の薬剤耐性を示すマーカー遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。
【００２３】
ここで、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子は、染色体上からベクター部分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer,A.et al.Gene
145 (1994)69-73）。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼを搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。
【００２４】
sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出来る。バチルス・ズブチルス：sacB  GenBank Accession Number X02730  （配列番号１１）
バチルス・アミロリキュファシエンス：sacB  GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス：sacB  GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス：surB  GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス：frfA  GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス：lsxA  GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス：lsdA GenBank Accession Number L41732
【００２５】
上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能する温度（25℃）で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を温度感受性複製起点が機能しない高温（例えば３４℃）で培養し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、プラスミド上の変異型遺伝子と染色体上の目的遺伝子と組換えを起こした菌株が出現する。
【００２６】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在する目的遺伝子配列との組換えを起こし、染色体の目的遺伝子と欠失型の目的遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【００２７】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型の目的遺伝子のみを残すために、目的遺伝子領域をベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常な目的遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型目的遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型目的遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常な目的遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度（高温）で培養すると、プラスミド上の目的遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。sacBを搭載したプラスミドを用いている場合には、この時に培地にスクロースを添加することにより、プラスミドが細胞から脱落した株を効率的に選択できる。プラスミドを脱落した株より目的遺伝子に変異が残った株を選択することによって、目的遺伝子が欠失型に置換された株を取得することができる。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸に耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸に耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類に耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P- P-5020；特開昭56-1889号公報参照)ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM-P4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００２９】
本発明のコリネ型細菌は、上記のようなＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を、yggB遺伝子を用いてＬ−グルタミン酸生産能がさらに向上するように改変することによって得ることができる。あるいは、yggB遺伝子を用いて改変した後に、さらに、上述したようなＬ−グルタミン酸生産能を付与または向上させる操作を付加的に行ってもよい。
yggB遺伝子を用いた改変としては、後述のようなyggB遺伝子の発現量を増加させること、および変異型yggB遺伝子を導入することを含む。
【００３０】
（I）yggB遺伝子の発現量の増強
yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として知られ、mscSとも呼ばれるタンパク質をコードする（FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.）。
yggB遺伝子の発現量を増加させることにより、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能が非改変株に比べて向上する。すなわち、yggB遺伝子の発現量が増加するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産する。例えば、yggB遺伝子発現増強株は、親株あるいは非改変株と比べて、対糖収率でL-グルタミン酸の収率が2%以上上昇していることが好ましく、4%以上上昇していることがより好ましく、6%以上向上していることが特に好ましい。yggB遺伝子発現増強株は、非改変株と比べて、除菌体収率が向上していてもよい。除菌体収率とは、対糖収率から菌体生成に用いられた炭素収率を除いたものを意味する。
【００３１】
yggB遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、yggBのm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【００３２】
yggB遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌は、L-グルタミン酸生産条件と過剰量のビオチンを含む条件の少なくとも1つの条件で、非改変株と比べてL-グルタミン酸生産能が向上していればよい。
ここで、「L-グルタミン酸生産条件」とは炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する培地に、Ｌ−グルタミン酸生産を誘導する物質を添加したり、あるいはＬ−グルタミン酸生産を阻害する物質の培地中の量
を制限した条件を意味し、Ｌ−グルタミン酸生産を誘導するために添加する物質には、ペニシリンGやTween40等の飽和脂肪酸を含む界面活性剤が挙げられ、Ｌ−グルタミン生産を阻害するために制限する物質とはビオチンが挙げられる（アミノ酸発酵  学会出版センター  1986年）。Ｌ−グルタミン酸生産条件でのこれらの物質の培地中の添加濃度は、ビオチンは、15μg/L未満、好ましくは、10μg/L未満、さらに好ましくは、5μg/L未満であり、培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。ペニシリンの培地中の添加濃度は、0.1U/ml以上、好ましくは、0.2U/ml以上、さらに好ましくは、0.4U/ml以上であり、界面活性剤の添加濃度は、0.5g/L以上、好ましくは、1g/L以上、さらに好ましくは、2g/L以上である。
一方、「過剰量のビオチンを含む条件」とは、例えば、培地中にビオチンを30μg/L以上、好ましくは40μg/L、さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。
【００３３】
コリネ型細菌のyggB遺伝子としては、例えば、配列番号６、６２、６８、または８４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号６１の塩基配列507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号６７の塩基配列403-2001番目の配列を有する遺伝子、配列番号８３の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子などが挙げられる。配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のyggB遺伝子であり、配列番号６１の塩基配列507-2093番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバム）ATCC14967株のyggB遺伝子であり、配列番号６７の塩基配列403-2001番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株のyggB遺伝子である。配列番号８３の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank Accession No. NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号1336092-1337693にコードされており、NCgl 1221として登録されている（NP_600492. Reports  small-conductance...[gi:19552490]）。
また、コリネ型細菌の種や菌株によってyggB遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、yggB遺伝子は配列番号５の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列のバリアントであってもよい。yggB遺伝子のバリアントは、配列番号５の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列の配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、yggB遺伝子のバリアントは、yggB遺伝子ホモログ、例えばコリネ型細菌の染色体を鋳型にして例えば配列番号７５、７６の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。また、本発明の遺伝子は、コリネ型細菌のyggB遺伝子が望ましいがコリネ型細菌で機能を有する限り、他の微生物由来の遺伝子を用いてもよい。また、後述する変異型yggB遺伝子を用いてもよい。
【００３４】
yggB遺伝子は、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるものである限り、配列番号６、６２、６８または８４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。
上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙
げられる。
さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号6、６２、６８、または８４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子も含む。ここで、ホモロジーは、Karlin とAltschulによるBLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)) や PearsonによるFASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990))などによって計算することができる。これらのアルゴリズムによるホモロジー検索プログラム（BLASTN 、BLASTP など）が、NCBIなどより入手できる(//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
なお、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３５】
特に配列番号６の以下の位置のアミノ酸は置換・欠失していてもよい。コリネ型細菌に保存されるYggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８５に示し、アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をXaaで示す。
４８番目のグルタミン残基（望ましくはアルギニン残基への置換）
２７５番目のアスパラギン残基（望ましくはセリン残基への置換）
２９８番目のグルタミン酸残基（望ましくはアラニン残基への置換）
３４３番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）
３９６番目のフェニルアラニン残基（望ましくはイソロイシン残基への置換）
４３８番目のセリン残基（望ましくはグリシン残基への置換）
４４５番目のバリン残基（望ましくはアラニン残基への置換）
４５４番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）
４５７番目のプロリン残基（望ましくはセリン残基への置換）
４７４番目のセリン残基（望ましくはアスパラギン残基への置換）
５１７番目のバリン残基（望ましくは欠失）
５１８番目のグルタミン酸残基（望ましくは欠失）
５１９番目のアラニン残基（望ましくは欠失）
５２０番目のプロリン残基（望ましくは欠失）
【００３６】
上記のようなyggB遺伝子ホモログは、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号５の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号６１の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号６７の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子、または配列番号８３の塩基配列の501-2099番目の配列を有する遺伝子を改変することによって取得することができる。
また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号５の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号６１の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号６７の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子、または配列番号８３の塩基配列の501-2099番目の配列を有する遺伝子を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がコリネ型細菌に導入したときにＬ−グルタミン酸生産能を向上させるか否かは、例えば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し、上述の条件でＬ−グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめるこ
とができる。
【００３７】
またyggB遺伝子は、配列番号５の1437-3035番目の配列、配列番号６１の507-2093番目の配列、配列番号６７の403-2001番目の配列、または配列番号８３の501-2099番目の配列の相補配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコリネ型細菌に導入したときにＬ−グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００３８】
プローブとして、配列番号５の塩基番号1437-3035の塩基配列の相補配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号５の塩基番号1437-3035の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号５の塩基番号1437-3035の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。またプローブの作成には配列番号７５、７６の配列が用いられる。
なお、発現量を増強するyggB遺伝子は、後述するような変異型yggB遺伝子であってもよい。
【００３９】
yggB遺伝子の発現を増強するための方法としては、yggB遺伝子のコピー数を増加させる方法や、yggB遺伝子の発現調節領域を改変する方法や、yggB遺伝子の転写活性因子を増幅する方法や、yggB遺伝子の転写抑制因子の活性を低下する方法などが挙げられる。
【００４０】
以下、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、yggB遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001）等のマニュアルに従って実施出来る。
【００４１】
同遺伝子の発現量の増強は、yggB遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでyggB遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずyggB遺伝子は、コリネ型細菌の染色体からクローニングする。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号７５、７６に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いyggB遺伝子を増幅することが出来る。
【００４２】
PCR法により増幅されたyggB遺伝子を含む遺伝子断片は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299,
pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００４３】
上記DNAをコリネ型細菌で機能するベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベク
ターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。
【００４４】
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００４５】
yggB遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、yggB遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめyggBの増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００４６】
上記のように調製した組換えプラスミドをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）.によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
【００４７】
yggB遺伝子のコピー数を高めることは、yggB遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DNA上にyggB遺伝子を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、yggB遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。トランスポゾンでの増幅は後述に示される人工トランスポゾンでの増幅も利用できる。
【００４８】
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにyggB遺伝子を導入して、染色体上で増幅させる方法が考
えられる。例えば用いることが出来るベクターは、ｐＳＵＰ３０１（Simo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Schaefer等, Gene
145, 69〜73 (1994) ）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison, WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; US-A 5487993）、ｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993)）、ｐＥＭ１（Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516）またはｐＢＧＳ８（spratt等, 1986, Gene, 41：337〜342）等が挙げられる。yggB遺伝子を含むプラスミドベクターをコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988)）、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994)）に記載されている。
【００４９】
また、yggB遺伝子の発現を上昇させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のyggB遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、yggB遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、遺伝子の終止コドンの下流に強力なターミネーターを連結することによっても達成される。(Hamilton et al,; Journal of Bacterology171:4617-4622) 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PS2プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。ここでyggB遺伝子の発現調節領域とは、yggB遺伝子の発現量に変化を及ぼす領域を意味し、例えばyggB遺伝子の上流領域が挙げられる。ここでyggB遺伝子上流の改変に適している領域として、開始コドン以前の領域（例えば、配列番号５の開始コドン以前（塩基配列番号1436以前））の領域、望ましくは開始コドンの上流５００bpの領域、さらに望ましくは開始コドンの上流３００ｂｐの領域が挙げられる。
発現調節配列の置換は、例えば上述の温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、yggB遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５０】
＜II＞変異型yggB遺伝子の導入
yggB遺伝子を用いた改変として、コリネ型細菌への変異型yggB遺伝子の導入も挙げられる。ここで、「変異型yggB遺伝子の導入」とは、コリネ型細菌の染色体上のyggB遺伝子への変異の導入であってもよいし、変異型yggB遺伝子を含むプラスミドのコリネ型細菌への導入であってもよいし、染色体上のyggB遺伝子の変異型yggB遺伝子への置換であってもよい。
本発明において、「変異型yggB遺伝子」とは、yggB遺伝子のコード領域内の変異であって、コリネ型細菌のビオチンを過剰量含む条件下でのL-グルタミン酸生産能を向上させる機能をyggB遺伝子に付与する変異、を含むyggB遺伝子を意味する。なお、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌に導入したときに、ビオチンを過剰量含む条件下だけでなく、上述したようなL-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子であって
もよい。
「過剰量のビオチンを含む条件下でのＬ−グルタミン酸生産能が向上した」とは、本発明のコリネ型細菌を、非改変株がL-グルタミン酸を蓄積できないような濃度のビオチンを含む条件、例えば、30μg/L以上の濃度のビオチンを含む培地で培養したときに、本発明のコリネ型細菌が、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産することを意味する。
【００５１】
以下、本発明の変異型yggB遺伝子の取得方法、yggB遺伝子に変異を導入する方法について記載する。しかしながら、変異型yggB遺伝子の取得方法、yggB遺伝子に変異を導入する方法は以下の方法には限定されない。
（II-１）odhA遺伝子欠損株を利用する方法
変異型yggB遺伝子を取得する方法として、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子(sucA遺伝子)を欠損した株（以下odhA破壊株という）が利用出来ることを本発明者は発見した。odhA破壊株の構築は、上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法によって行うことが可能である。
【００５２】
本発明において、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α−ＫＤＧＨ）活性とは、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（E1o EC1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ−サクシニルトランスフェラーゼ（E2o  dihydrolipoamide-S-succinyltransferase）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3 dihydrolipoamide dehydrogenase）の3種の酵素によって触媒され、エシェリヒア・コリ等では、この3種の酵素が複合体を形成している。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase (succinyl-transferase)）、２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）とも呼ばれる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。
【００５３】
コリネ型細菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている（Microbiology 142, 3347-3354, (1996)、GenBank accession No.D84102）。odhA遺伝子の塩基配列を配列番号４３の塩基番号４４３〜４２１３に、アミノ酸配列を配列番号４４に示す。このodhA遺伝子の配列を基に、例えば、配列番号１、２に記載のようなodhA遺伝子に相補的なプライマーを設計し野生株であるATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅する。odhA遺伝子の内部断片をプラスミドに連結し、odh破壊用プラスミドを構築する。ここで用いるプラスミドとしては、コリネ型細菌用の温度感受性プラスミドや（特開平05-007491）、実施例１に記載のレバンシュークラーゼを搭載するスイサイドベクターであるpBS3が用いられる。
【００５４】
odh破壊用プラスミド電気パルス法（特開平2-207791）にて、培地中にビオチンが充分存在する条件でL-グルタミン酸を蓄積できない株、例えば野生株、C.glutamicum  ATCC13869へに導入し、染色体上のodhA遺伝子と相同組換えを起こした１回組換え株を取得する。温度感受性プラスミドを用いた場合には、プラスミドが複製出来ない温度で１回組換え株を取得する。１回組換え株であることの確認は、例えば、配列番号３、配列番号４のオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドが染色体上に導入されることによって確認出来る。
【００５５】
このようにして取得したodhA破壊株は、糖を含む培地で純化する。純化の過程でyggB遺伝子に高頻度に自然突然変異が導入される。純化した株のグルタミン酸生産能は、ビオチ
ンが過剰量含まれる培地で培養することにより確認する。例えば20mlのＬ−グルタミン酸生産フラスコ培地（グルコース30g/l,  硫酸アンモニウム  15g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1（ビタミンB1） 200μg/l, Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物（T-N全窒素）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に候補株を接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養し、糖を完全消費後、Ｌ−グルタミン酸の蓄積を確認する。L-グルタミン酸の対糖収率が50%以上を示した株について、そのyggB遺伝子の配列を決定することにより変異を特定することができる。
【００５６】
yggB変異のみを有する株を構築するためには、プラスミドによって破壊された染色体上のodhA遺伝子を野生型に復帰させればよい。odhAが欠損した株では糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば、糖を含まない培地、例えばCM2B(ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天 20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育する。従って、このodhA破壊株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導する。こうして出現した生育改善株をCM2Bプレートで純化し、その抗生物質耐性感受性とベクター残存の有無を調べれば、odhA復帰株であることが推定できる。さらにodhA遺伝子の塩基配列を決定することにより、odhA遺伝子が野生型であることを確認する。
【００５７】
また、odhA yggB二重変異株の変異型yggB遺伝子領域をＰＣＲでクローニングし、野生株に導入してもよい。二重変異株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９と配列番号１０に示す合成DNAを用いてPCRを行い変異型yggB遺伝子を増幅する。得られた増幅産物をコリネ型細菌用の温度感受性プラスミドや（特開平05-007491）、実施例１に記載のスイサイドベクターであるpBS3にクローニングし、上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法で野生型yggB遺伝子と置換することによりyggB単独変異株が構築可能である。ここで、染色体上のyggB遺伝子に変異が導入されたかどうかは、変異型yggB遺伝子の遺伝子配列を決定することにより確認することが出来る。
【００５８】
（II-２）転移因子を利用する方法
また、変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌はコリネ型細菌で機能する転移因子を用いてスクリーニングしてもよい。転移因子とはインサーションシーケンス（IS因子）、トランスポゾンを含む。変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子にインサーションシーケンス（IS因子）、トランスポゾンが偶然挿入されることによって取得できるものでもよいし、人工トランスポゾンを用いて、人為的に構築したものでもよい。転移因子が挿入された株は、例えばL-グルタミン酸アナログに対する感受性の低下を指標として選択することができる。L-グルタミン酸のアナログとしては、4−フルオログルタミン酸が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子含む人工トランスポゾンを用いて薬剤耐性株をランダムに選択し、耐性株のyggB遺伝子長をPCRで確認することによっても転移因子挿入株を選択できる。
【００５９】
人工トランスポゾンをコリネ型細菌に導入する方法としては、特開09-070291の方法が利用出来る。人工トランスポゾンとは、トランスポゼースの構造遺伝子、インサーションシーケンス（IS因子）の両端のインバーテッドリピート（ＩＲ）に挟まれたマーカー遺伝子のことを意味する。トランスポゼースの構造遺伝子は、人工トランスポゾンと同一のプラスミドに存在していてもよいし、別のプラスミド上に存在するものであってもよく、宿主の染色体上に存在するトランスポゾンの機能を利用してもよい。例えば、コリネ型細菌のトランスポゼースをコードする遺伝子として、以下のようなような配列が利用出来る。
【００６０】
1. NCgl0179         Cgl0182; transposase
2. NCgl0235         Cgl0238; putative transposase
3. NCgl0348         Cgl0355; putative transposase
4. NCgl0688         Cgl0718; putative transposase
5. NCgl0919         Cgl0959; transposase
6. NCgl0993         Cgl1037; transposase
7. NCgl1021         Cgl1066; transposase
8. NCgl1464         Cgl1521; putative transposase
9. NCgl1496         Cgl1557; transposase
10. NCgl1662         Cgl1733; putative transposase
11. NCgl1664         Cgl1734; transposase
12. NCgl2131         Cgl2212; transposase
13. NCgl2284         Cgl2367; transposase
14. NCgl2392         Cgl2479; putative transposase
15. NCgl2418         Cgl2504; putative transposase
16. NCgl2420         Cgl2506; putative transposase
17. NCgl2460         Cgl2548; predicted transposase
18. NCgl2542         Cgl2631; predicted transposase
19. NCgl2665         Cgl2761; putative transposase
20. NCgl2748         Cgl2845; putative transposase
21. NCgl2850         Cgl2951; predicted transposase
【００６１】
人工トランスポゾンは、適切なベクター、例えばプラスミドに搭載して宿主であるコリネホルム細菌に導入される。スクリーニングに用いる親株としては、ビオチンが過剰量含まれた条件でＬ−グルタミン酸を蓄積することが出来ない株、例えば、C.glutamicum 野生株であるATCC13869株が望ましい。人工トランスポゾンを搭載するプラスミドとしては、特に制限はないが、通常コリネホルム細菌由来のプラスミドを用いればよい。具体的には、ｐＨＭ１５１９（Agric.Biol.Chem., 48, 2901-2903 (1984)）、ｐＡＭ３３０（Agric.Biol.Chem.,48, 2901-2903 (1984)）、及びこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド等である。さら に、導入された人工トランスポゾンを効率よく染色体上で増幅させるには、上記（１）に記載したような温度感受性複製起点を有するプラスミドを用いることが好ましい（特開平５−７４９１号参照）。
人工トランスポゾンを搭載したプラスミドをコリネホルム細菌に導入する方法としては、通常よく用いられるプロトプラスト法（Gene, 39, 281-286 (1985)）、エレクトロポーレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）等の方法を用いればよい。
【００６２】
人工トランスポゾンを温度感受性プラスミドに搭載してコリネホルム細菌へ導入する場合、構築したプラスミドでコリネホルム細菌を形質転換し、プラスミドの複製が可能な２５℃で培養することにより、一細胞当り数十〜数百コピーの人工トランスポゾン搭載プラスミドを増幅させて染色体への導入を行い、その後３４℃で培養することにより余分なプラスミドを除去すればよく、この方法により効率よく染色体上での遺伝子の増幅が起こる。その他、人工トランスポゾンのみのＤＮＡ断片やコリネホルム細菌中で複製できないプラスミドベクター（例えばエシェリヒア・コリで複製するプラスミドベクター等）を用いてコリネホルム細菌の染色体に導入する方法もある。
（特開平７−１０７９７６号、Vertes,A.A., Asai,Y., Inui,M., Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)）。
【００６３】
このようにして、染色体上に人工トランスポゾンが挿入した株を、ビオチンを過剰量含むＬ−グルタミン酸生産培地で培養し、Ｌ−グルタミン酸を蓄積する株を取得する。Ｌ−グルタミン酸を蓄積する株の染色体上のyggB遺伝子の塩基配列を決定することによって、変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌を取得することが出来る。
【００６４】
（II-３）in vitroでyggB遺伝子にランダムに変異を導入する方法
また、変異型yggB遺伝子は、in vitroでランダムに変異を導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにＬ−グルタミン酸生産が可能となるクローンから選択することも出来る。スクリーニングに用いる親株としては、ビオチンが過剰量含まれた条件でＬ−グルタミン酸を蓄積することが出来ない株、例えば、C.glutamicum 野生株であるATCC13869株、ATCC13032株、ATCC14067株、C.melasecola野生株であるATCC17965が望ましい。
【００６５】
変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築する。yggB遺伝子破壊株の構築は、上述のsacB遺伝子を用いる方法と同様の方法によって行うことが可能である。例えば、yggB遺伝子のコード領域に相補的なプライマー、例えば配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、C.glutamicum ATCC１３８６９株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、yggB遺伝子のN末端側断片を調製する。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えばyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得できる。
【００６６】
得られたPCR断片はコリネ型細菌の遺伝子破壊用ベクター、例えばレバンシュークラーゼを搭載したpBS4Sに挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたyggB破壊用プラスミドをコリネ型細菌C.glutamicum ATCC13869株の染色体に挿入し、yggB欠損株を構築する。
【００６７】
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行う。まず、コリネ型細菌で複製可能なプラスミドにyggB遺伝子をクローニングする。得られたyggB増幅ベクターを変異剤を含む緩衝液、例えば500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA (pH6.0)に溶解し、75℃で６０分から９０分処理することにより変異を導入する。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02（タカラバイオ）等で脱塩した後、ATCC13869ΔyggB株に導入し、抗生物質を含む培地で形質転換体を選択する。また、対照として変異処理前のyggB増幅プラスミドについてもATCC13869ΔyggB株に導入する。出現した形質転換体を、ビオチンを過剰量含むＬ−グルタミン酸生産液体培地に接種し、しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量する。グルタミン酸は野生型のyggB増幅プラスミド導入株では殆ど増加しないが、変異処理したプラスミドを導入した株ではグルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株よりプラスミドを抽出し、そのyggB遺伝子の塩基配列を決定することで、新規な変異型yggB遺伝子が取得できる。また、またエラ−プロ−ンPCR 、DNA shuffling,
StEP−PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にyggB遺伝子に変異を導入して変異型yggB遺伝子を取得することも出来る。（Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction.）
なお、上記のような染色体上のyggB遺伝子に変異を導入する方法としては、上述の方法以外に、コリネ型細菌にＸ線や紫外線を照射する方法、またはコリネ型細菌をＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。この方法によって、変異型yggB遺伝子が導入されたかどうかは、染色体上のyggB遺伝子の塩基配列を決定することやビオチンを過剰量含む培地でＬ−グルタミン酸を生成させることによって確認出来る。
【００６８】
（II-4）L-グルタミン酸アナログ耐性株を取得する方法
変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子を有するコリネ型細菌をL−グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能なL-グルタミン酸アナログ耐性株を取得することによっても取得することができる。スクリーニングに用いる親株としては、上述のコリネ型細菌野生株が好ましいが、野生型のyggB遺伝子を有するものであれば、いずれでもよい。また野生型のyggB遺伝子を搭載したプラスミドを有するコリネ型細菌でもよい。
L-グルタミン酸アナログとしては、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、α−メチルグルタミン酸、β−ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸−γ−モノヒドロキサメ−ト、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−モノエチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−ジ−ｔ−ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ジエチルエステル、Ｄ−グルタミン酸、４−フルオログルタミン酸が挙げられ、特に４−フルオログルタミン酸アナログが使用できる。
L-グルタミン酸アナログ耐性株は以下のような手法で行う。コリネ型細菌をL-グルタミン酸アナログを添加した最小培地に接種し、24時間〜48時間後にコロニーを形成した株を取得する。培地中に含まれるL-グルタミン酸アナログの濃度は、yggB遺伝子が改変されていないコリネ型細菌が生育できず、yggB遺伝子に変異が導入されたコリネ型細菌が生育できる濃度が好ましい。より具体的には、４−フルオログルタミン酸を用いる場合は、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは5mMが好ましい。ここで、本発明のL-グルタミン酸アナログ耐性とは、最少培地に４−フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数（コロニー形成能を有する菌数）を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことを意味する。
取得できたL-グルタミン酸アナログ耐性株をビオチンを過剰量含むＬ−グルタミン酸生産液体培地に接種し、しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量する。L-グルタミン酸は野生株では殆ど増加しないが、L-グルタミン酸アナログ耐性株では、L-グルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株よりyggB遺伝子をPCRによって増幅し、そのyggB遺伝子の塩基配列を決定することで、新規な変異型yggB遺伝子が取得できる。
【００６９】
＜III＞  本発明の変異型yggB遺伝子
以下、変異型yggB遺伝子の具体例を挙げる。ただし、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で、L-グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
【００７０】
（III-１）C末端側変異
この変異は、配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９−５３３の配列、または配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば、この領域は、配列番号５の塩基配列においては、塩基番号2692-3035番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス（以下ISという）や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
【００７１】
（III-1-1） 転移因子の挿入による変異（2A-1型変異）
C末端側変異の一例として、配列番号５の２６９１番目のGの次にISが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号７に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。配列番号８においては、配列番号６の419位のバリンから下流の領域が短いISに由来する配列に置換されている。なお、配列番号７にて挿入されたISは、IS1207(Genbank accession No. X96962) 、IS719: (Genbank accession No E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型yggB遺伝子を２Ａ−１型変異と呼ぶ。２Ａ−１型変異には、配列番号６、６２、６８、８４および８５のC末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
また、上記領域に他のISが挿入されたもの、例えば上述したようなtransposaseをコードするISが挿入されたものも、本発明の範囲に含まれる。transposaseが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが、それぞれのtransposaseが認識しやすい箇所やISが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
【００７２】
（III-1-２）プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異（６６型変異、２２型変異）
またC末端側変異の一例として、配列番号６、６８、８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９−５３３の配列、または配列番号６２のアミノ酸番号４１９−５２９の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは、配列番号６の以下の位置に存在する。
４２４番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４２４番目）
４３７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４３７番目）
４５３番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４５３番目）
４５７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４５７番目）
４６２番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４６２番目）
４６９番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４６９番目）
４８４番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４８４番目）
４８９番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４８９番目）
４９７番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の４９７番目）
５１５番目のプロリン残基（配列番号６２、６８、８４、８５の５１５番目）
５２９番目のプロリン残基（配列番号６８、８４、８５の５２９番目、配列番号６２番目の５２５番目）
５３３番目のプロリン残基（配列番号６８、８４、８５の５３３番目、配列番号６２番目の５２９番目）
yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は、YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。（Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29-33、J Biol Chem. 1991 Dec 25;266(36):24287-94.）
中でも４２４番目と４３７番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。
ここで他のアミノ酸とは、プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、Lys,Glu,Thr,Val,Leu,Ile,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,Hisから選択される残基に置換すればよい。特に、424番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるAla、Gly、Val、Leu、Ileに置換されることが望ましく、中でも分岐鎖アミノ酸であるLeu、Val、Ileが望ましい。（６６型変異）424番目のプロリンをロイシンに置換する変異として、例えば、配列番号６７の1673位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型yggB遺伝子を配列番号６９に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
また、437番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr,Ser,Tyr）に置換することが望ましく、中でもSerへの置換が望ましい。（２２型変異）437番目のプロリンをセリンに置換する変異としては、例えば配列番号５の2745位のCをTに置換する変異が挙げられる。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型yggB遺伝子を配列番号７３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
【００７３】
（III-２）膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号６、６２、６８、８４、８５の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３（第１膜貫通領域）、２５〜４７（第２膜貫通領域）、６２〜８４（第３膜貫通領域）、８６〜１０８（第４膜貫通領域）、１１０〜１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。これらをコードするDNAは配列番号５の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基に該当する。本発明の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って、ここでアミノ酸配列の置換の場合は、アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく、上記数個の
置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜3個を意味する。またアミノ酸の挿入、欠失変異は、１〜数塩基のポイントミューテーションの導入や、フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入、例えば、３，６，９，１２，１５，１８、または２１塩基の挿入または欠失、好ましくは、３，６、または９塩基の欠失または挿入、より好ましくは３塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
【００７４】
例えば、以下のような変異が例として挙げられる。
（III-２−１）第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異）
この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に１又は数アミノ酸挿入された変異である。
具体例としては、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に、３アミノ酸導入されたもの、例えばCys-Ser-Leuが挿入されたものが挙げられ、この変異の例として、配列番号５の１４８０番目のGの次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【００７５】
（III-２−２）第４膜貫通領域の変異（１９型変異）
この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、１００番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン、セリン、チロシン）に置換されていることが望ましく、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異が挙げられる。
この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
【００７６】
（III-２−３）第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異、8型変異）
この変異は、配列番号６、６２、６８、８４、８５に示されるアミノ酸配列において、１１１番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であれば、いずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも分岐鎖アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン）、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン、セリン、チロシン）、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として、配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異（L30型変異）や、配列番号６１の８３７番目のGがAに置換された変異（8型変異）が挙げられる。L30型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。8型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号６３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
【００７７】
上記の「変異型yggB遺伝子」は、ビオチンが過剰量存在する条件におけるＬ−グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、上述の変異を含む機能的に均等な遺伝子、例えば、配列番号7の塩基番号1437〜2705の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号19の塩基番号1437〜3044の塩基配列を含むDNA、配列番号21の塩基番号1437〜3035の塩基配列を含むDNA、配列番号23の塩基番号1437-3035の塩基配列を含むDNA、配列番号63の塩基番号507-2093の塩基配列を含むDNA、配列番号69の塩基番号403-2001の塩基配列を含むDNA、配列番号７３の塩基番号548−2146の塩基配列を含むDNAのような変異型遺伝子と実質的に相同な遺伝子で、これらと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件のことをいう。例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件が挙げられ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７８】
変異型yggB遺伝子がコードするタンパク質としては、同タンパク質の活性がビオチンが過剰量存在する条件においてＬ−グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り、機能的に均等なタンパク質例えば、配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４から選択されるアミノ酸配列において、上記変異点のアミノ酸以外にさらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記置換は保存的置換（中性変異）が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上述したように、配列番号８５のXaaのアミノ酸が置換されてもよい。さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌で変異型yggBがコードするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
【００７９】
特に、以下のアミノ酸は配列番号８、２０、２２、２４、６４，７０，７４のアミノ酸配列において置換されていてもよい。
48位のGlu（好ましくはArgによる置換）
275位のAsp（好ましくはSerによる置換）
298位のGlu（好ましくはAlaによる置換）
343位のAla（好ましくはValによる置換）
396位のPhe（好ましくはIleによる置換）
438位のSer（好ましくはGlyによる置換）
445位のVal（好ましくはAlaによる置換）
454位のAla（好ましくはValによる置換）
457位のPro（好ましくはSerによる置換）
474位のSer（好ましくはAspによる置換）
517位のVal（好ましくは欠失）
518位のGlu（好ましくは欠失）
519位のAla（好ましくは欠失）
520位のPro（好ましくは欠失）
【００８０】
＜V＞  変異型yggB遺伝子のコリネ型細菌への導入方法
上記のような変異を有する変異型yggB遺伝子は、例えば、部位特異的変異導入法などによって得ることができる。より具体的には、yggB遺伝子の該当領域に変異を含む配列を有するPCRプライマーを用いて、該当箇所を増幅するオーバーラップエクステンションPCR法などを用いて、変異を含むyggB遺伝子を増幅してクローニングすることができる (Urban,
A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997).)。
得られた変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより本発明のコリネ型細菌を得ることができる。導入の方法としては、変異型yggB遺伝子で染色体上の野生型のyggB遺伝子を置換する方法が挙げられる。染色体上の野生型のyggB遺伝子を破壊した株に変異型yggB遺伝子を導入してもよい。なお、一回組換え株のように、野生型のyggB遺伝子を染色体上に残したまま、変異型yggB遺伝子を導入してもよく、野生型遺伝子と、変異型遺伝子が組み込まれる１コピーずつ染色体上に存在してもよい。染色体上のyggB遺伝子の置換は、例えば、上述したレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子を含む温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。
【００８１】
本発明のコリネ型細菌は、変異型yggB遺伝子を導入することにより、Ｌ−グルタミン酸アナログに対する耐性が向上したものであってもよい。本発明でＬ−グルタミン酸アナログとは、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、α−メチルグルタミン酸、β−ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸−γ−モノヒドロキサメ−ト、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−モノエチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−ジ−ｔ−ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ジエチルエステル、Ｄ−グルタミン酸、４−フルオログルタミン酸が挙げられる。Ｌ−グルタミン酸アナログに対する耐性の向上とは、最少培地に４−フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数（コロニー形成能を有する菌数）を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことをいう。具体的には、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは、5mM以上の４−フルオログルタミン酸に耐性を有することを意味する。
【００８２】
さらに上記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された細菌を用いてもよい。ここで「yggB遺伝子の機能を抑制する」とは、その遺伝子の増幅により変異型yggB遺伝子導入株のグルタミン酸生成を抑制することを意味する。変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子とは、symA遺伝子が挙げられる（supresser of yggB mutation）。symA遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank Accession
No. NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号2051306..2051845にコードされており、NCgl 1867として登録されている（NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147]）。C.glutamicum ATCC13869のsymA遺伝子を配列番号８６の塩基番号585〜1121に示す。遺伝子の不活化は、遺伝子を破壊するあるいは、発現量を低下するように改変することで達成でき、symA遺伝子の破壊や発現量を低下させるような変異の導入は、上述の酵素活性の低下と同様の方法で行うことができる。
【００８３】
また、本発明においては、yggB遺伝子を用いた改変に加えて、さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下α-KGDHと呼ぶ）の活性が低下するように改変された細菌を用いてもよい。「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」とは、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定する
ことができる。α-KGDH活性は、野生株又は親株等の非改変株に対して低下していればよいが、親株に対して約1/2以下、好ましくは1/4以下、さらに好ましくは1/10以下に低下していることが望ましく、全く活性を有しなくてもよい。
【００８４】
α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌は、上述した方法を用いて構築することが出来る。
中でもチアミンピロリン酸結合領域（配列番号43の2498番目〜2584番目の塩基によってコードされる領域（配列番号44の686Gly-714Asp））に変異を導入することが好ましい。
例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開WO95/34672号パンフレット）や、  ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＪ１２８２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１７２）株（特開平06-237779）が挙げられる。尚、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの弱化と変異型yggB遺伝子の導入は、どちらを先に行ってもよい。
【００８５】
＜３＞  本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法
上記のようにして得られるコリネ型細菌をを培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
【００８６】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００８７】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
また、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせて適当な濃度の界面活性剤、ペニシリンを加えてもよいし、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせてビオチン濃度も調節すればよい。
【００８８】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００８９】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）
【００９０】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００９１】
［実施例］
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００９２】
＜sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（A）pBS3の構築
sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築は、国際公開WO2005113745 号、WO2005113744 号の方法を参照にして行った。sacB遺伝子（配列番号１１）をバチルス・ズブチリスの染色体DNAを鋳型として配列番号13と14をプライマーとして用いて、PCRにより取得した。PCR反応は、LA taq(TaKaRa)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合49℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後BglIIとBamHIで消化し、平滑化した。この断片をpHSG299のAvaIIで消化後、平滑化した部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン（以下、Kmと略す）25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS3と命名した。pBS3の構築過程を図1に示す。
【００９３】
（B）pBS4Sの構築
pBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中のSmaI部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換(SmaIにより切断されない変異)によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCRで取得した。まず、pBS3を鋳型として配列番号15，16 の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子のN末端側の増幅産物を得る。一方Km耐性遺伝子のC末端側の増幅産物を得るためにpBS3を鋳型として配列番号17，18の合成DNAを鋳型としてPCRを行った。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。配列番号１６と１７は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在するSmaI部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次にSmaI部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイシン耐性遺伝子N末端側及びC末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号15，18の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたKm耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1.5分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。
【００９４】
PCR産物を常法により精製後BanIIで消化し、上記のpBS3のBanII部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4Sと命名した。pBS4Sの構築過程を図2に示す。
【実施例２】
【００９５】
＜C. glutamicum ATCC13869由来odhA変異株の構築＞
コリネ型細菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている（Microbiology 142, 3347-3354, (1996)、GenBank accession No.D84102）。公開されているodhA遺伝子の配列を基に、配列番号１、２に記載のプライマーを設計しATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅したPCR断片をBamHIで完全分解し、実施例１で構築したpBS4SのBamHI部位に挿入したプラスミドpBS4SΔsucAintを構築した（構築図は図３に記載）。
【００９６】
電気パルス法（特開平2-207791）にてC.glutamicum  ATCC13869へpBS4SΔsucAintを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）上に塗布した。31.5℃にて培養後、生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS4SΔsucAintが組み込まれた1回組換え株であることをPCRにて確認した。なお1回組換え株であることの確認は、候補株の染色体を鋳型にし、pBS4S上の特異的配列（配列番号3）と染色体上の配列（配列番号4）をプライマーにしたPCRを行うことによって、容易に確認することが出来る（非組み換え株の染色体上にはpBS4Sの配列が存在していないため、PCRによって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる）。
【００９７】
こうして取得した1回組換え株を2A-1株と名付けた。野生株ATCC13869および2A-1株を20mlのフラスコ培地（グルコース30g/l,  硫酸アンモニウム  15g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin
300μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培地中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表１に示す（OD620は101倍希釈の濁度で菌体量の指標であり、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。親株のATCC13869ではＬ−グルタミン酸を全く生成しない条件においても2A-1株ではＬ−グルタミン酸生産能を有することが確認された。
【００９８】
【表１】
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【実施例３】
【００９９】
＜２A-1由来odhA復帰株の構築＞
取得した2A-1株は、染色体上のodhA遺伝子がpBS4SΔＴ￥sucAintによって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させればodhAは野生型に復帰する。一方、odhAが欠損した株では、糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば糖を含まないCM2B(ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天 20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで、2A-1株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株2A-1R株をCM2Bプレートで純化し、そのカナマイシン感受性を調べたところ
、すべてカナマイシン感受性であり、スクロース耐性であることが明らかとなった。
【０１００】
pBS4SΔsucAintにはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子が含まれているため、pBS4SΔsucAintを有する株ではカナマイシン耐性とスクロース感受性を示し、脱落した株ではカナマイシン感受性を示し、またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から2A-1R株ではodhAが野生型に復帰していることが示唆された。さらにodhA遺伝子の配列を確認した結果、odhA遺伝子には変異がないことが確認されたことから、2A-1R株ではodhAは野生型に復帰していると結論した。2A-1R株のグルタミン酸生産能を実施例２と同様の方法で確認した。結果を表２に示す。（OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）2A-1R株のグルタミン酸蓄積は2A-1株には劣るものの野生株ATCC13869よりも遥かに高いことが示された（表２）。また、糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ、2A-1Rではグルタミン酸の分解が認められ、odhAが野生型に復帰していることが裏付けられた（図４）。
【０１０１】
【表２】
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【実施例４】
【０１０２】
＜2A-1R株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離＞
2A-1R株は、CM2Bプレート培地上においては、野生株ATCC13869とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし、最少培地（グルコース20g/l,硫酸アンモニウム  2.64g/L, KH2PO4 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, MgSO4・7H2O 0.25g/L, FeSO4・7H2O 0.01g/L, MnSO4・7H2O 0.01g/L,  CaCl2 0.01g/L, CuSO4 0.02mg/L, MOPS 40g/L, プロトカテク酸 30mg/L, VB1・HCl200μg/L, Biotin 300μg/L, 寒天 20g/L, NaOHを用いてpH6.7に調整）プレート上では野生株ATCC13869に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで、最少培地で2A-1R株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
【０１０３】
ATCC13869株の染色体DNAをSau3AIで部分分解し、シャトルベクターpVK9をBamHIで処理したものとライゲーションし、ライゲーション反応液をエタノール沈殿した後、E.coli DH5α(タカラバイオ)のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形質転換後の菌体はカナマイシン25μg/mlを含むLBプレート培地（ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 5g/l、NaCl 5g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.0に調整）に塗布し、37℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかきとり、プラスミドを抽出しATCC13869のライブラリーとした。このライブラリーを実施例３で得られた2A-1R株に電気パルス法にて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含む最少培地プレートに塗布し、コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果、配列番号５に記す断片がpVK9のBamHI部位に挿入されていたことが明らかとなった。このプラスミドをpL5kと命名した。
【０１０４】
pL5kの挿入配列と、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032
のゲノム配列（Acc.No.  NC_003450）を比較した結果、pL5kには完全長のORFとして、配列番号６に示すアミノ酸配列をもつORFのみが含まれていることが明らかとなった。ORFが膜タンパク質か否かは、インターネット上で利用可能なプログラム「SOSUI」によって予測可能である（2004/10/07 現在http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.htmlにリンクされている）。「SOSUI」でこのORFを解析した結果、５回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号６のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３、２５〜４７、６２〜８４、８６〜１０８、１１０〜１３２の領域に相当する。これらをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基配列に、膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号２５−２９、表３に示した
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
さらに公知の文献を調べた結果、このORFはYggB（NCgl 1221）として解析されているORFであることが明らかとなった（FEMS Microbiology letters 218(2003)305-309）。
【実施例５】
【０１０７】
＜2A-1R株のYggB遺伝子の変異点同定＞
2A-1R株の最少培地における生育をpL5Kが相補したことから、2A-1R株のyggB遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで、2A-1R株のyggB遺伝子の塩基配列を決定した。その結果2A-1R株ではYggB遺伝子のC末端側の領域にISが挿入されていることが明らかとなった（図5）。2A-1R株の変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に記した。このことから、2A-1R株のグルタミン酸生産能は、yggB遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお、この変異は2A-1R株のみならず2A-1株にも存在していた。odhA遺伝子に変異を導入した際に、安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで、ＩＳが挿入されたこの変異を、2A-1型変異とした。
【実施例６】
【０１０８】
＜2A-1型yggB変異株構築とL-グルタミン酸生産能評価＞
（６−１）  2A-1型変異の野生株への導入と評価（１回組換え株）
2A-1株の染色体DNAを鋳型として、配列番号９と配列番号１０に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、2A-1型変異を有するyggB遺伝子断片を増幅した。増幅産物はSacIで処理し、実施例１のpBS3のSacI部位に挿入した。2A-1型変異を有するyggB断片がクローニングされたプラスミドをpBS3yggB2Aと名付けた。
電気パルス法にてC.glutamicum  ATCC13869にpBS3yggB2Aを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS3yggB2Aが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。
得られた一回組換え株を13869-2Aとした。この株では、野生型のyggB遺伝子と変異型のyggB遺伝子の両方が発現していることとなる。
【０１０９】
取得したyggB変異導入株13869-2Aのグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表４に示す（OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A株では、ATCC13869株がＬ−グルタミン酸を生成しない条件でも、明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから、YggB遺伝子の変異により、グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【０１１０】
【表４】
0005343303.tif 000005
【０１１１】
（６−２）2A-1型変異の野生株への導入と評価（２回組換え株）
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為、13869-2A株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地（スクロース 100g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をｓ2B寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調整し、配列番号９と配列番号１０に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異を確認し、yggB遺伝子にＩＳ様配列が挿入されていた株を13869-2A-7とした。
【０１１２】
取得した13869-2A-7株のグルタミン酸生産能を、実施例2記載の方法にて確認した。その結果を表５に示す。（OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A-7株では、2A-1R株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから、ビオチン過剰量存在下でのＬ−グルタミン酸生産は、yggB遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【０１１３】
【表５】
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【実施例７】
【０１１４】
＜  A1型YggB変異株の構築と評価＞
上述のＬ−グルタミン酸生産性のodhA変異株を解析した結果、上述の2A-1変異の他にyggB遺伝子上に５種類の変異を見出した。以下、それぞれＡ１型変異、１９型変異、L30型変異、８型変異、６６型変異とし、前者３つについてはATCC13869の染色体に変異を導入
して効果を確認した。８型変異についてはATCC14067の染色体に変異を導入して効果を確認した。６６型変異に関しては、C.melassecola ATCC17965の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【０１１５】
A1型変異は、配列番号５の１４８０番目のGの次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異であり、配列番号６のアミノ酸配列の14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間にシステイン、セリン、ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【０１１６】
A1型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号30に示す合成DNAと配列番号31に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC１３８６９株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号32と配列番号33の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号９と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えばA1型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggBA1を実施例６記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、A1型に置換されていた株を選択すれば、A1型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つA1型変異株をATCC13869-A1株とした。
【０１１７】
ATCC13869-A1株と親株のATCC13869株を実施例２と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
A1変異を染色体上に導入した、ATCC13869-A1株は親株のATCC13869株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１１８】
【表６】
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【実施例８】
【０１１９】
＜19型YggB変異株の構築と評価＞
１９型変異は、配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異であり、配列番号６のアミノ酸配列の100番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。実施例７と同様の方法にて、１９型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号35に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC１３８６９株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号33と配列番号36の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば19型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggB19を実施例６記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、19型に置
換されていた株を選択すれば、19型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ19型変異株をATCC13869-19株とした。
【０１２０】
ATCC13869-19株と親株のATCC13869株を実施例２と同様の方法で培養を行った。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。19変異を染色体上に導入した、ATCC13869-19株は親株のATCC13869株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２１】
【表７】
0005343303.tif 000008
【実施例９】
【０１２２】
＜Ｌ３０型YggB変異株の構築＞
Ｌ３０型変異は、配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異であり、配列番号６の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
実施例７と同様の方法にて、Ｌ３０型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号37に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC１３８６９株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号38の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないＬ３０型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4 YggB-Lを実施例６記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、L30型に置換されていた株を選択し、L30型変異を有する株を構築した。このような変異を持つL30型変異株をATCC13869-L株とした。
【０１２３】
ATCC13869株と、ATCC13869-L株を実施例２と同様の方法で培養を行い、培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表８に示す。（OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。Ｌ−３０変異を導入したATCC13869-L30株は親株のATCC13869株と比べてＬ−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２４】
【表８】
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【実施例１０】
【０１２５】
＜変異型yggB遺伝子導入株のL-グルタミン酸生成条件における培養評価＞
コリネ型細菌はTween40等の脂肪酸系界面活性剤の添加や、ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで、ATCC13869株とATCC13869-19株について、Tween40添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は、20mlのフラスコ培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Tween40添加培養においては、種培養液2mlを20mlのフラスコ培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後、OD620(x101)=0.2に到達した時点で、最終濃度5g/LとなるようにTween40を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては、種培養液1mlを20mlのフラスコ培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約2.9μg/Lとなる。
Tween40添加培養およびビオチン制限培養ともに、培養開始後40時間後の培地中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表９に示す（OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はＬ−グルタミン酸の蓄積量を示す）。ATCC13869-19株では、L-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。
【０１２６】
【表９】
0005343303.tif 000010
【０１２７】
ATCC13869株、ATCC13869-L30、ATCC13869-A1株、ATCC13869-19株、プラスミドによるyggB増幅株についても、Tween40添加培養を行なった。CM-Dexプレートに一夜培養した菌体を1/6プレート分かきとり、20mlのフラスコ培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム
30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始５時間後にTween40を終濃度1g/Lとなるように添加し、培養開始から24時間後の菌体量とL-グルタミン酸の収量を分析した。その結果、表１０に示すように、ATCC13869-19, ATCC13869-L30, ATCC13869-A1株、野生型のyggB遺伝子増幅株（ATCC13869/pL5k-1）ともにL-グルタミン酸生産条件でのL-グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
【０１２８】
【表１０】
0005343303.tif 000011
【実施例１１】
【０１２９】
＜８型YggB変異株の構築＞
８型変異は、配列番号６１の837位のGがAに置換された変異であり、配列番号６２の１１１位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号６３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
実施例７と同様の方法にて、8型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号６５に示す合成DNAをプライマーとして、Brevibacterium flavumATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号６６の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、８型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB８を実施例６記載の方法と同様にATCC14067株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、８型に置換されていた株を選択し、８型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ８型変異株をATCC14067yggB8株とする。
【実施例１２】
【０１３０】
＜６６型YggB変異株の構築＞
６６型変異は、配列番号６７の1673番目のCがTに置換された変異であり、配列番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号６９に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
実施例７と同様の方法にて、66型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号７１に示す合成DNAをプライマーとして、C.melassecolaATCC17965株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号３４と配列番号７２の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号10の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば６６型yggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型YggB断片をSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB６６を実施例６記載の方法と同様にATCC17965株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、６６型に置換されていた株を選択することで、６６型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ６６型変異株をyggB66株とする。
【実施例１３】
【０１３１】
＜in vitro変異による変異型yggB遺伝子のスクリーニング＞
（１３−１）yggB欠損株の構築
変異型のyggB遺伝子をin vitroでyggBに変異をランダムに導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築した。配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC１３８６９株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得した。
【０１３２】
得られたPCR断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4ΔYggBを実施例６記載の方法でATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株の染色体DNAを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、yggB遺伝子が欠損していることを確認した。得られたyggB遺伝子欠損株をATCC13869ΔyggB株とした。
【０１３３】
（1３−2）変異型yggB遺伝子のin vitro スクリーニング
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず、プラスミドpL5kはyggB遺伝子以外の領域を若干含んでいるため、pL5kをXhoIとSalIで処理し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドpL5kXSを得た。なおSalI認識部位は、配列番号5の塩基配列上には存在しないが、pBS3のマルチクローニングサイトに存在している。得られたpL5kXS約10μgを500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA (pH6.0)に溶解し、75℃で３０分から９０分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02（タカラバイオ）で脱塩した後、実施例６記載の方法でATCC13869ΔyggB株に導入し、Km25μg/mlを含むCM2B培地で形質転換体を選択した。また、対照として変異処理前のpL5kXSについてもATCC13869ΔyggB株に導入した。出現した形質転換体を、CM2BGU2培地（実施例３記載のCM2B培地にグルコース10g/Lと15g/LのUreaを含む）2mlの液体培地に接種し、31.5℃で５時間しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量した。
表１１に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間６０分と９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中には、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが３クローンが存在していた。なお、培地中にもともと含まれていたグルタミン酸は0.16g/Lであり、ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)
のグルタミン酸蓄積量は0.31g/Lであった。
表１２に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU培地（Ureaが1.5g/Lである以外はCM2BGU2培地と同組成）にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが１クローン存在していた。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
表１１において、６０分の変異処理時間を行うことで1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-22, 表１２において、９０分の変異処理時間を行うことで0.9g/L以上のL-グルタミン酸生産能を獲得したプラスミドをpL5kXSm-27とした。ATCC13869ΔyggB/pL5kXS株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株を、実施例２記載の条件で培養し、４時間後の菌体量とL-グルタミン酸蓄積を分析した。表１３に、独立した３回の実験による平均値を示した。ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27株、ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22株では有意にL-グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき、in vitroでのランダムな変異導入によってもL-グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお、pL5kXSm-22が含むyggB遺伝子の配列は、配列番号７３に示した。（２２型変異）
22型変異は、437番目のプロリンをセリンに置換する変異であり、例えば配列番号５の2745位のCをTに置換する変異である。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っている。この変異型yggB遺伝子を配列番号７３に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
【０１３７】
【表１３】
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【０１３８】
（１３−３）変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とＬ−グルタミン酸生産確認
（１３−２）で得られた新規変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入方法は、実施例6に記載された方法でpBS4Sに変異型遺伝子を導入し、ATCC13869の染色体上の野生型のyggB遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株のATCC13869株を実施例２と同様の方法で培養を行う。培養終了後、培養液中に含まれるＬ−グルタミン酸の量を公知の方法で測定し、変異導入株がＬ-グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したyggB変異株を取得することが出来る。
【実施例１４】
【０１３９】
＜変異型yggB遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性＞
(１４−１)固体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
yggB変異によってL-グルタミン酸の生産能が向上している株では、L-グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで、yggB変異によるL-グルタミン酸のアナログとして、4-フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例４記載の最少培地に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した４−フルオログルタミン酸を終濃度7.5mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、図６上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは31.5℃で培養し、その経時変化を図６に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では、ATCC13869株が最も生育が速いのに対し、4-フルオログルタミン酸添加条件ではATCC13869株の生育が抑えられ、ATCC13869-L株およびATCC13869-A1株の方が生育が良好であることが示された。
【０１４０】
（１４−２）液体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
実施例４記載の最少培地（ただし寒天を含まない）に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した４−フルオログルタミン酸を終濃度1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM, 20mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869ΔyggB株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して31.5℃で一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、液体培地に接種し31.5℃にて振とう培養した。各菌株において、４-フルオログルタミン酸を無添加の培地でのOD660の値が１に到達した時点で培養を終了し、培養液を適当に希釈してCM-Dexプレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し、液体培養終了時の生菌数とした。４−フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を１として、４−フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図７に示した。ATCC13869-A1株およびATCC13869-L30株では、４−フルオログルタミン酸に対する感受性が低下（４フルオログルタミン酸耐性が向上）していることが明らかとなった。
これらの結果から、４-フルオログルタミン酸等、グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のyggB変異株が取得できることが示された。
【実施例１５】
【０１４１】
＜odhA弱化株での変異型yggB遺伝子導入株の作成と評価＞
【０１４２】
上記実施例9で構築したATCC13869-L30株を用いてyggB odhA二重変異株を構築し、変異型odhA遺伝子の評価を行った。
まず、ATCC13869-L株のodhA遺伝子に表１４に示す変異を導入した株を構築した。なお、表１４では、配列番号４３の塩基番号２５２８〜２５６２に相当する領域の配列を示した。また、表１５では配列番号４４のアミノ酸番号６９６〜７０７に相当する領域の配列を示した。
配列番号４５の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA8株を構築するには以下のようにすればよい。まず配列番号５３と配列番号５４に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、odhA断片を調整する。得られたodhA断片をBamHI処理して、タカラバイオ製Mutan-Super Express Kmに付属のプラスミドpKF19mのBamHI部位にクローニングした後、5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成DNAとMutan-Super Express Kmに添付されているセレクションプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR産物でsup0のE.coli例えばMV1184株を形質転換することで変異型odhA断片を含むプラスミドを構築する。次にこの断片をBamHIで切り出し、pBS4SのBamHI部位に挿入することで変異導入用プラスミドが構築できる。このプラスミドを用いて実施例１記載の方法と同様にしてATCC13869-L株を形質転換し、染色体に変異導入用プラスミドが挿入された株を取得する。次に、これらの染色体にプラスミドが挿入された株から、スクロースに耐性を示し、かつカナマイシンに感受性を示す株を分離する。さらにodhA遺伝子の配列を確認し、目的フレームシフトが導入された株を選択することによりodhA遺伝子が欠損したL30sucA8(odhA8)株が構築できる。
【０１４３】
また、以下の方法でyggB変異株を用いて、他のodhA変異株を得ることができる。
配列番号４７の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA801株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号５６の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号４９の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA805株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号５７の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号５１の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA77株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号５８の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
L30sucA8株のodhA遺伝子はフレームシフト変異であるために、αKGDH活性を有さない。しかし、L30sucA801株、L30sucA805株、L30sucA77株はodhA遺伝子に欠失があるものの、フレームシフトが起こらない変異となっており、αKGDH活性を有しているが活性は非改変株より低下している。（データは示さず）
【０１４４】
【表１４】
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【０１４５】
【表１５】
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【０１４６】
＜odhA改変株のグルタミン酸生産培養＞
これらのodhA改変株のＬ−グルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。表１４に示した株をCM-Dex寒天培地で31.5℃で一昼夜培養を行い、フラスコ培地（グルコース60g/l、硫安22.5g/l、KH2PO4  1g/l、MgSO4・7H2O  0.4g/l、FeSO4・7H2O  0.01g/l、MnSO4・4-5H2O  0.01g/l、ビタミンB1  200μg/l、大豆蛋白加水分解液0.48g/l、ビオチン300μg/l、KOHを用いてpH8.0に調整）20mlに1/6プレート分の菌体を接種し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1gを添加した後、31.5℃、速度115rpmで振とう培養を行った。培養開始19時間目のＬ−グルタミン酸蓄積を表１６に示した。odhA改変株の中には、ATCC13869-L株とほぼ同等のＬ−グルタミン酸蓄積のものも含まれていたが、sucA801, sucA805,sucA77株はsucA8株よりも高いグルタミン酸蓄積を示した。これらの結果から、yggB遺伝子の変異と共にodhA遺伝子に変異を導入することによって、さらにＬ−グルタミン酸収率が向上することを見出した。
【０１４７】
【表１６】
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【実施例１６】
【０１４８】
＜ATCC14067株およびATCC14067yggB8からのodhA弱化株の構築＞
８型変異を有するyggB変異株よりodhA欠損株を構築し、odhA欠損のみを有する株と比較培養を行なった。まず、odhAを完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号７７と配列番号７８の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号７９と配列番号８０の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号８１と配列番号８２の合成DNAを用いてPCRを行い、odhAを欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBamHIで処理した後、実施例１で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsucA47とした。
pBSΔsucA47を実施例６記載の方法と同様にATCC14067株またはATCC14067yggB8株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号７７および配列番号８０の合成DNAを用いてPCRを行い、odhA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したodhA欠損株をそれぞれATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB８株とした。
構築したATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB８株を実施例３記載の方法で培養した結果を表１７に示した。yggB8変異によってodhA変異株のL-グルタミン酸収量を向上できることが明らかとなった。
【０１４９】
【表１７】
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【実施例１７】
【０１５０】
＜2A-1R株からのsymA欠損株の構築＞
実施例３で構築した、yggBにIS挿入変異を有する２A-1R株より、symA(suppressor of ygg mutation A)遺伝子を欠損した株を構築し、2A-1R株と比較培養を行なった。ATCC13869株のNCgl1867遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８６および８７に記した。まず、symA遺伝子を完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号８８と配列番号８９の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号９０と配列番号９１の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号８８と配列番号９１の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子を欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBglIIで処理した後、実施例１で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsymAとした。
pBSΔsymAを実施例６記載の方法と同様に2A-1R株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号８８および配列番号９１の合成DNAを用いてPCRを行い、symA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したsymA欠損株を2A-1RΔsymA株とした。
構築した2A-1RΔsymA株および親株の2A-1R株を実施例３記載の方法で培養した結果を表１８に示した。symA遺伝子の欠損によって、変異型yggB遺伝子を有する株のグルタミン酸生産能を向上できることが明らかとなった。
【０１５１】
【表１８】
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【実施例１８】
【０１５２】
＜野生型yggB遺伝子増強株の構築＞
コリネ型細菌の野生型yggB遺伝子を含むプラスミドにはpL5kを用いた。pL5kは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９株の染色体DNAをSau3AIで部分分解して得られたDNA断片を、pVK9のBamHI部位に挿入して得たプラスミドである。pVK9のBamHI部位に挿入されているＤＮＡ配列を配列番号５に、yggB遺伝子のコード領域を配列番号５ の塩基番号1437-3035番目に示す。なお、pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。pL5kと同様の構成のプラスミドは、配列番号５９と配列番号６０の合成ＤＮＡをプライマーとして、ＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をBamHIで処理してpVK9のBamHI部位に挿入することによっても構築できる。
【０１５３】
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株をpL5kで、電気パルス法（特開平2-207791）にて形質転換した。形質転換後の菌体はカナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート培地（ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、NaCl 5g/l、寒天 20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整）に塗布し、31.5℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーをカナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート培地で純化し、YggB増幅株を得た。定法によりこれらの形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。こうして得られたYggB増幅株をATCC13869/pL5kとした。また対照株として、pVK9が導入された株ATCC13869/pVK9を上記と同様の方法で構築した。
【実施例１９】
【０１５４】
＜野生型yggB遺伝子増強株の評価＞
（２−１）ビオチン制限培養での効果確認
実施例１８で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ３クローン選択し、20mlの種培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、ビオチンを含まない20mlの主培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O
0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しyggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではグルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。（表１９  OD620は菌体量、GH（g/L）はグルタミン酸生産量を示す）
【０１５５】
【表１９】
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【０１５６】
（２−２）界面活性剤添加条件での効果確認
実施例１８で構築した野生型YggB増強株および対照株をそれぞれ３クローン選択し、20mlの種培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後２時間後
に、Tween40を終濃度5g/Lとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比し野生型YggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではＬ−グルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。（表２０  OD620は菌体量、GHはＬ−グルタミン酸生産量を示す。）
【０１５７】
【表２０】
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【０１５８】
（２−３）ペニシリンＧ添加培養での効果確認
実施例１８で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ３クローン選択し、20mlの種培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地（グルコース80g/l,  硫酸アンモニウム  30g/l, KH2PO4 1g/l,  MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整：オートクレーブ115℃10分）に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後２時間後に、ペニシリンＧを終濃度0.5U/mlとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しYggB導入株(ATCC13869/pL5k)ではＬ−グルタミン酸の蓄積が向上していることが示された。（表２１）
【０１５９】
【表２１】
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【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】プラスミドpBS3の構築手順を示す図。
【図２】プラスミドpBS4Sの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドpBS4sucAintの構築手順を示す図。
【図４】yggB変異導入株のL-グルタミン酸蓄積を示す図。
【図５】2A-1型変異yggB遺伝子の変異導入箇所を示す図。
【図６】変異型yggB遺伝子導入株の４-フルオログルタミン酸含有CM-Dexプレート培地における生育を示す図（写真）。
【図７】変異型yggB遺伝子導入株の４-フルオログルタミン酸(4-FG)含有液体培地における生育を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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