(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖結合量が少なくかつ均一であるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物中で、以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の５′側に以下の（Ｃ）〜（Ｈ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合された融合ＤＮＡを発現させる工程を含むこと、及び前記微生物が、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｓ−２）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１）であることを特徴とする方法： 
（Ａ）配列番号８で示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号８で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号９で示されるアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列；
（Ｈ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んだ状態で７５〜９０ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
グルコースを基質とする酵素として、請求項２に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の微生物を利用した、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨとも記載する）の生産方法に関し、特に、血糖自己測定用のバイオセンサに使用するのに好適なＦＡＤ−ＧＤＨの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握して治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるバイオセンサは、一般的に、絶縁体基板上に、測定電極、対電極及び検知電極からなる電極層を形成し、これらの電極基板上に、グルコースを基質とする酵素と電子受容体を含む試薬層を形成してなる。このバイオセンサの血糖値の測定は、バイオセンサに血液を添加して、試薬層中のグルコースを基質とする酵素を血液中のグルコースと反応させて、電子を生成させ、この電子による電子受容体の還元及び酸化から生じる電流値に基づいて血液中のグルコース濃度（血糖値）を求めることによって行われる。
【０００３】
このバイオセンサで使用されるグルコースを基質とする酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから、血糖自己測定用のバイオセンサにおいて古くから利用されている。グルコースオキシダーゼを利用した血糖自己測定用のバイオセンサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで血液中のグルコース濃度の測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））といったグルコースデヒドロゲナーゼの使用が提案されている。これらの酵素は溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、安定性が乏しいという欠点や補酵素の添加が必要で測定が煩雑になるという欠点がある。一方、後者のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
これらの欠点を有さないグルコースデヒドロゲナーゼとして、特許文献１には、アスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）の使用が提案されている。この酵素は、基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で上述のグルコースデヒドロゲナーゼより優位である。また、この酵素は、５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率を示し、熱安定性についても優れている。特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列が開示されており、特許文献３には、アスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列に改変を加えて熱安定性を向上させたＦＡＤ−ＧＤＨが開示されている。この特許文献３のＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス属にセルフクローニングして糖鎖結合型にすることによって、熱安定性をさらに高めることができることが本発明者らによって判明している。
【０００６】
しかしながら、この糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨを血糖自己測定用のバイオセンサに使用すると、正常に作動しない場合があった。そこで本発明者らがその原因を追求したところ、このＦＡＤ−ＧＤＨには多数の糖鎖が結合しており、この糖鎖が試薬溶液の粘度を著しく増加させ、溶解を妨げるため、バイオセンサが正常に作動しなくなることが判明した。実際、本発明者らの調査によれば、特許文献３のＦＡＤ−ＧＤＨをアスペルギルス属にセルフクローニングして糖鎖結合型とした場合、酵素粉末あたりの糖鎖結合量は約４０％程度であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約８０ｋＤａから１２０ｋＤａであり、糖鎖結合量が多い上に変動が大きかった。
【０００７】
従って、血糖自己測定用のバイオセンサに使用する糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨとしては、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるものが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開２００４／０５８９５８号公報
【特許文献２】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献３】特開２００８−１７８３８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、血糖自己測定用のバイオセンサに好適な、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる目的を達成するために鋭意検討した結果、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属に分類される微生物を宿主として使用し、この微生物に、特許文献３に記載されている改変型アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を導入してこの微生物中でこの遺伝子を発現させると、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨが生産されることを見出した。
【００１１】
また、本発明者らは、この微生物を宿主としてアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる場合、遺伝子のコドンユーセージをこの微生物に合わせて最適化することが、封入体を形成せずに酵素活性を維持したままのＦＡＤ−ＧＤＨを培養液中に高レベルで分泌生産させるために必要であることを見出した。また、遺伝子配列本体に付加される分泌シグナルペプチド配列を最適化することにより、宿主細胞外へのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌生産性がさらに飛躍的に向上されることを見出した。
【００１２】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（４）から構成されるものである。
（１）糖鎖結合量が少なくかつ均一であるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物中で、以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の５′側に以下の（Ｃ）〜（Ｈ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合された融合ＤＮＡを発現させる工程を含むことを特徴とする方法： 
（Ａ）配列番号８で示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号８で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号９で示されるアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列；
（Ｈ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列。
（２）微生物が、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｓ−２）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１）であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）（１）または（２）に記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んだ状態で７５〜９０ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
（４）グルコースを基質とする酵素として、（３）に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法は、アスペルギルス属の微生物由来の糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージを最適化し、この微生物とは全く異なる特定の微生物中で、特定の分泌シグナルペプチドと結合された状態で発現させるので、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを宿主細胞外へ効率的に分泌生産することができる。かかるＦＡＤ−ＧＤＨは、熱安定性に優れかつ試薬溶液に容易に溶解するため、血糖自己測定用のバイオセンサに使用するのに好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２用の発現ベクターｐＣｓＵＸの模式図である。
【図２】図２は、各ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子発現コントラクト導入形質転換体のＦＡＤ−ＧＤＨ生産性を示す。
【図３】図３は、組換えＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性試験の結果を示す。
【図４】図４は、組換えＦＡＤ−ＧＤＨのｐＨ安定性試験の結果を示す。
【図５】図５は、組換えＦＡＤ−ＧＤＨの分子量試験の結果を示す。
【図６】図６は、組換えＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖分解試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、アスペルギルス属の微生物由来の糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージを最適化し、この微生物とは全く異なる特定の微生物中で、特定の分泌シグナルペプチドと結合された状態で発現させることにより、本来の宿主微生物中で発現させたＦＡＤ−ＧＤＨと比べて糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に得ることを特徴とするものである。
【００１６】
具体的には、本発明の方法では、遺伝子発現の宿主微生物として、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属の微生物を使用する。好ましくは、クリプトコッカス属の微生物の中でも、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株という特定の菌株を使用する。この菌株は、独立行政法人酒類総合研究所において単離された酵母であり、αアミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼなどの酵素を大量に生産することが確認されている。なお、この菌株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（現在の名称は、製品評価技術基盤機構）  特許生物寄託センターに１９９５年９月５日にＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５として国内寄託し、２００８年４月２５日にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託に移管済である。
【００１７】
本発明の方法において、クリプトコッカス属の微生物を遺伝子発現の宿主微生物として使用することにより糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨが得られる理由は未だ明確ではないが、クリプトコッカス属の微生物に特有の糖鎖合成及び結合システムが存在するためであると考えられる。
【００１８】
本発明の方法では、宿主微生物中で発現させる糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子は、（Ａ）配列番号８の塩基配列で表わされるものである。この塩基配列は、特許文献３に記載のアスペルギルス属由来の改変型遺伝子の塩基配列そのものではなく、宿主のクリプトコッカス属の微生物中での発現に適するようにそのコドンユーセージが最適化されている。改変型遺伝子の塩基配列をクリプトコッカス属の微生物中にそのまま導入して発現させても、発現産物は封入体を形成してしまい、不活性なＦＡＤ−ＧＤＨしか得られない。本発明の方法によれば、発現させる遺伝子のコドンユーセージを宿主微生物のコドンユーセージに合わせて最適化することにより、封入体を形成させずに酵素活性を維持したままＦＡＤ−ＧＤＨを分泌生産させることができる。
【００１９】
配列番号８のコドンユーセージは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２の発現に最適化されたものであり、その塩基配列のコドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率は９２．６％である。一方、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２で発現が確認されている、αアミラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼの塩基配列のコドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率はそれぞれ、８１．５％、８１．３％、８０．０％であり、コドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率は非常に高い傾向がある。これらのことから、配列番号８はクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２中での発現に適するだけでなく、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２と類似のコドンユーセージを有する他のクリプトコッカス属の微生物（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓなど）中での発現にも適すると予測される。なお、宿主微生物のコドンユーセージは、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から提供される情報を用いることで予測することが可能である。
【００２０】
また、本発明の方法では、（Ａ）配列番号８で示される塩基配列の代わりに、（Ｂ）配列番号８で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列も使用できる。この（Ｂ）の塩基配列は、（Ａ）の塩基配列の均等の範囲の塩基配列である。これは、酵素タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として酵素タンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等の酵素タンパク質であることが多いからである。（Ｂ）の塩基配列は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号８に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。
【００２１】
本発明の方法では、（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表されるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子は、タンパク質の発現効率及び発現成功率を高めるため、タンパク質のＮ末満に分泌シグナルペプチドを結合させた状態で発現させる。一般的に、分泌タンパク質のＮ末端には、分泌シグナルペプチドが存在しており、この既存の分泌シグナルペプチドを高効率な分泌シグナルペプチドと置換することで、これら分泌タンパク質の発現効率及び発現成功率を上げることができることが報告されているからである。
【００２２】
本発明の方法で使用できる分泌シグナルペプチドとして、配列番号９〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ｃ）〜（Ｈ）を挙げることができる。これらのアミノ酸配列のうち、配列番号９で示される（Ｃ）のアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼが生産するＦＡＤ−ＧＤＨに由来する分泌シグナルペプチド配列である。配列番号１０〜１２で示される（Ｄ）〜（Ｆ）のアミノ酸配列は、いずれもクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産する酸性キシラナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列であり、配列番号１０は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから３７番目のアミノ酸までとした配列（Ｘｓ１）であり、配列番号１１は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから２３番目のアミノ酸までとした配列（Ｘｓ２）であり、配列番号１２は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから１７アミノ酸までとした配列（Ｘｓ３）である。配列番号１３で示される（Ｇ）のアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産するα―アミラーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ａｓ）である。配列番号１４で示される（Ｈ）のアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産するクチナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ｃｓ）である。
【００２３】
以下の実施例で示すように、これらの分泌シグナルペプチド配列はいずれも、極めて高効率であり、これらを用いることにより、クリプトコッカス属の微生物の細胞外へのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌生産効率を飛躍的に増大させることができる。
【００２４】
これらの分泌シグナルペプチドをタンパク質のＮ末端に結合された状態で発現させるためには、上述の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列の５′側にこれらの分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列（（Ｃ）〜（Ｈ）のアミノ酸配列）のいずれかをコードする塩基配列が結合された融合ＤＮＡを宿主微生物中で発現させればよい。
【００２５】
本発明の方法において宿主として使用することができる微生物であるクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２は、各種難分解性酵素を分泌生産することが確認されており、生でんぷん分解性のα―アミラーゼや酸性キシラナーゼ、生分解性プラスチックを分解するクチナーゼなどの酵素を分泌生産する。しかしながら、これらの分泌タンパク質の有する分泌シグナルペプチドは、従来から分泌タンパク質に見出されており、最も高効率な分泌シグナルペプチドかどうかは不明であった。また、分泌シグナルペプチドの配列を予測するコンピュータプログラムが提供されており、これらのコンピュータプログラムを用いることで、アミノ酸配列情報から分泌タンパク質に含まれる分泌シグナルペプチドの配列の存在を予測することが可能であるが、これらのコンピュータプログラムにより各分泌シグナルペプチドの能力を推測することは現在のところ困難である。すなわち、予測された分泌シグナルペプチドが、実際に、分泌タンパク質等のタンパク質の発現に利用可能であるか否か、さらにこれらタンパク質の大量生産に利用できる、より高効率なものであるか否かは予測することができない。さらに、予測される分泌シグナルペプチドの種類によっては、切断部位が数箇所に及ぶ場合もあり、分泌シグナル配列の最適な長さに関しても、予測することは困難である。本発明の方法で使用する上述の分泌シグナルペプチドは、単にコンピュータプログラムによって予測されたものではなく、本発明者らの繰り返しの実験によってその有効性を認められたものである。
【００２６】
次に、本発明の方法の具体的な工程について説明する。本発明の方法は、クリプトコッカス属の微生物中で、上記融合ＤＮＡ（ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子＋分泌シグナルペプチド配列）を発現させる工程を含む。この工程は、具体的には、常法に従って融合ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、次にこの組換え発現ベクターをクリプトコッカス属の微生物に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を適当な条件下で培養することによって行うことができる。
【００２７】
本発明の方法で使用する発現ベクターとしては、特に限定するものではないが、従来公知のベクター、例えば大腸菌のベクターが挙げられる。大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。好ましくは、ベクターＤＮＡは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、発現ターミネーターＤＮＡ配列を含み、より好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、キシラナーゼプロモーター、キシラナーゼターミネーターを含む。
【００２８】
発現ベクターと宿主微生物の組み合わせとしては、特に限定するものではないが、例えば遺伝子を組み込む宿主由来の栄養要求性マーカー遺伝子または薬剤耐性マーカー遺伝子と、遺伝子を組み込む宿主由来の発現プロモーターＤＮＡ配列と、遺伝子を組み込む宿主由来のターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、栄養要求性変異宿主または薬剤感受性宿主との組み合わせが挙げられる。最も好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子と、キシラナーゼプロモーターＤＮＡ配列と、キシラナーゼターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２との組み合わせが挙げられる。
【００２９】
宿主微生物の細胞に組換え発現ベクターを導入する方法としては、特に限定するものではないが、エレクトロポレーションなどの方法が挙げられる。
【００３０】
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。なお、培養に先立って、高ＦＡＤ−ＧＤＨ生産細胞株を予め選抜しておくことが有利である。
【００３１】
培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスや大豆蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。
【００３２】
その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３３】
培養温度は、菌が発育してＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２の場合、通常は２０〜２５℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６０〜１２０時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育してＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０〜９．０程度である。
【００３４】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、上記形質転換体を培養して得られる菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従って、予め、濾過、遠心分離などにより、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質含有溶液と菌体とを分離した後に利用することもできる。
【００３５】
あるいは、このようにして得られたＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質含有溶液からＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を精製して利用してもよい。精製方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の処理を挙げることができる。
【００３６】
本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する。
（ｉ）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を示す。
（ｉｉ）分子量：糖鎖を含んだ状態で７５〜９０ｋＤａである。
（ｉｉｉ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．５〜７．５である。
（ｉｖ）熱安定性：５０℃１５分間の熱処理後に９０％以上の残存活性を有する。
【００３７】
このうち、特に注目すべきは、その分子量である。従来の特許文献３のアスペルギルス属の微生物中で発現されたＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、糖鎖を含んだ状態で約８０〜１２０ｋＤａであるので、本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、従来のものと比べて糖鎖結合量が著しく少なくかつ均一である。従って、本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、このような酵素化学的特徴を活かして、血糖自己測定用バイオセンサに好適に使用することができる。
【００３８】
上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する形質転換体の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
【００３９】
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素を指す。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満の酵素を指す。
【００４０】
本発明において、ＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
【００４１】
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定法
＜反応試薬＞
下記のＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
・  ５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
・  ６．８ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
・  １Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
【００４２】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＡＤ−ＧＤＨ溶液の代わりにＦＡＤ−ＧＤＨを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から以下の式（Ｉ）に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義される。
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ−ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝・・・（Ｉ）
【００４３】
なお、式（Ｉ）中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
１．ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の発現
特許文献３に記載のアスペルギルス属由来の改変型遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号１に示す。
【００４６】
配列番号１に示される７番目から７２番目の塩基配列は、アスペルギルス属由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする塩基配列であると予測される。クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．において組換え生産されたアスペルギルス属由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質は、本分泌シグナル配列が除去された成熟型の配列と予測される。成熟型として分泌されるアスペルギルス属由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質をコードする塩基配列を配列番号８に示す。
【００４７】
次に、配列番号２のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｆ及び配列番号３のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｒをプライマーとして用いて、配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子全長配列をＰＣＲにより増幅し、増幅された配列（ＡＯＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ））をＭｌｕＩ処理した。
【００４８】
一方、Ｘｙｌプロモーター、Ｘｙｌターミネーター、及びＵＲＡ５遺伝子を含むｐＣｓＵＸプラスミド（５．９ｋｂｐ）をＭｌｕＩ処理し、Ｘｙｌプロモーターの直ぐ下流を一箇所切断したのち、脱リン酸化処理した。処理後のプラスミドにＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））を構築した。
【００４９】
次に、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、遺伝子配列に変異を加えた。具体的には、組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号４のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ＿Ｇ１６３Ｒ＿Ｆと配列番号５のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ＿Ｇ１６３Ｒ＿Ｒをプライマーとして用いて、１６３位のアミノ酸をＧからＲに置換し、次に、配列番号６のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ＿Ｖ５５１Ｃ＿Ｆと配列番号７のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ＿Ｖ５５１Ｃ＿Ｒをプライマーとして用いて、５５１位のＶをＣに置換することにより、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））を構築した。なお、ここで増幅された配列は、配列番号８の配列の５´側に、配列番号９に示す分泌シグナルペプチド配列が付与されたものに相当する。
【００５０】
なお、図１に示すｐＣｓＵＸプラスミドはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２に由来する酸性キシラナーゼプロモーター（Ｘｙｌ−ｐｒｏ）、酸性キシラナーゼターミネーター（Ｘｙｌ−ｔｅｒ）、及びｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子（ＵＲＡ５）を市販のｐＵＣ１９ベクターに常法により連結して組換え体ＤＮＡを作製し、この組換え体ＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを常法に従い形質転換することで取得することができる。形質転換体はアンピシリン耐性により選択できる。
【００５１】
次に、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、分泌シグナルペプチド配列を配列番号９以外のものに置換した。具体的には、組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１６のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｓ）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１０に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１７のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）−Ｘｙｌ２−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１１に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２ＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１８のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）−Ｘｙｌ３−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１２に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２Ｘｓ３ＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１９のＡｍｙｌａｓｅ（ｓｓ）−Ｘｙｌ２−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１３に示す「Ａｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２ＡｓＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；及び組換えプラスミドｐＣｓＵＸＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号２０のＣｕｔｉｎａｓｅ（ｓｓ）−Ｘｙｌ２−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１４に示す「Ｃｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２ＣｓＡＯｍＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））をそれぞれ作製した。
【００５２】
２．クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２への形質転換
組換え宿主にはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．  Ｕ−５株を使用した。本菌株は、形質転換体の選択のために、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２を自然変異によりウラシル要求性にしたものであり、ｐＣｓＵＸ２プラスミドと共に独立行政法人酒類総合研究所において取得されたものである。なお、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２からのウラシル要求性株の取得は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２にＵＶを照射し、５−フルオロオロト酸を含む培地で培養し、生き残った株を選抜することにより容易に行うことができる。
【００５３】
形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９２  Ｍａｒ；６０（３）：１１０１−８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．  Ｕ−５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、２．９６Ａｂｓであった。次に、この培養液６．７５ｍｌを２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に植菌し、２５℃、１８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、０．９４Ａｂｓであった。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化したプラスミド１０μｇ（〜５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；  Ｖ＝０．４７ｋＶで行った。通電後の液中に６００μｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ−ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％  −ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。
【００５４】
形質転換で得られた形質転換体については、配列番号１５のＡＯＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号３のｒｃＡＯＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡績社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、遺伝子が導入された菌株に関して、次の３．で培養を行った。
【００５５】
３．ＦＡＤ−ＧＤＨ活性の確認
２．で取得した形質転換体を、３ｍｌ液体培地（０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、１．０％グルコース）で２５℃、２３０ｒｐｍ、４８時間培養し、前培養液とした。前培養液０．０３ｍｌを３ｍｌ液体培地（酵母エキス２％、キシロース５％）に植え継ぎ、２５℃、２３０ｒｐｍ、７２時間培養し、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を確認した。
【００５６】
数個の菌株に関して培養液上清中のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した結果を、図２に示す。図２には、得られた数個の形質転換体のうち、最も生産性の高かった菌株のＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定値を示している。
【００５７】
図２に示すとおり、コドンユーセージを最適化した遺伝子を導入し、分泌シグナルペプチド配列としてアスペルギルス・オリゼのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列（配列番号９）を使用した菌株（図２のＵＸＡＯｍ）では、約３４．６Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。本結果から、アスペルギルス・オリゼのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２においても有効に機能することが確認された。
【００５８】
さらに、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１（配列番号１０）に変更したもの（図２のＵＸＸｓ１ＡＯｍ）では、最大約４２．０Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２（配列番号１１）に変更したもの（図２のＵＸＸｓ２ＡＯｍ）では、最大約８５．７Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３（配列番号１２）に変更したもの（図２のＵＸＸｓ３ＡＯｍ）では、最大約４４．５Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列（配列番号１３）に変更したもの（図２のＵＸＡｓＡＯｍ）では、最大約２１．２Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＣｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列（配列番号１４）に変更したもの（図２のＵＸＣｓＡＯｍ）では、最大約３６．０Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。
以上の結果から、上述する６つの分泌シグナルペプチド配列を用いることにより、ＦＡＤ−ＧＤＨをクリプトコッカス属の微生物の細胞外に効率的に分泌生産することが可能である。
【００５９】
４．ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質の取得
３．でＦＡＤ−ＧＤＨ活性が最も高かったＵＸＸｓ２ＡＯｍ株形質転換体を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、培地（５％酵母エキス、５％キシロース、）で２５℃、６８時間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を採取し、以下の実験で粗酵素溶液として用いた。
【００６０】
５．酵素の精製
上記の粗酵素溶液から、以下のステップ（１）〜（３）により、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を単離精製した。
【００６１】
（１）濃縮・脱塩
粗酵素溶液を分画分子量３００００の限界濾過膜で濃縮し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
【００６２】
（２）Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）による精製
活性画分を、６０％硫酸アンモニウム飽和（ｐＨ６．０）になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。６０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化させたＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。活性画分を分画分子量１００００の限界濾過膜で濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に置換した。
（３）ＤＥＡＥセファロース（ＧＥヘルスケア社製）による精製
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化させたＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗカラムに粗酵素濃縮液を通液して、透過活性画分を回収した。精製酵素の比活性は、約４００Ｕ／ｍｇであり、酵素の精製倍率は、粗精製酵素の約２０倍であった。
【００６３】
６．ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質の特性評価
上記５．で単離した、クリプトコッカスを宿主として組換え生産したアスペルギルス・オリゼ由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ（以下、クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨと称する）の精製酵素の特性を評価した。また、対照として、アスペルギルス・オリゼを宿主として組換え生産した、特許文献３に記載のアスペルギルス・オリゼ由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ（以下、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨと称する）の精製酵素についても同様に特性を評価した。
【００６４】
（１）熱安定性
各精製酵素を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１００Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、２０℃〜６５℃の温度で１５分間処理し、残存活性を算出した。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ及びクリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨはいずれも５０℃まで９０％以上の活性を維持していた。
【００６５】
（２）ｐＨ安定性
各精製酵素を、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜５．５）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、１００ｍＭＰＩＰＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５−７．５）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）、で２０Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、２５℃で１６時間処理し、残存活性を算出した。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ及びクリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨはいずれもｐＨ３．５〜７．５の範囲で９０％以上の活性を維持していた。
【００６６】
（３）分子量
Ｎｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各精製酵素の分子量を求めた。結果を図５に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  Ｓｈａｒｐ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）
レーン２：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ）
レーン３：クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
レーン４：アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
レーン５：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ）
レーン６：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  Ｓｈａｒｐ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）
【００６７】
また、脱糖鎖酵素（Ｒｏｃｈｅ社製、ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｈ）を用いて各精製酵素を脱糖鎖処理し、同様に電気泳動により、糖鎖除去後の分子量を求めた。結果を図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｍａｒｋ１２）
レーン２：クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
レーン３：脱糖鎖処理後のクリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
レーン４：アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
レーン５：脱糖鎖処理後のアスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ精製酵素。
【００６８】
図５からわかるように、クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、７５ｋＤａ〜９０ｋＤａであり、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量（８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ）と比較して均一である。
【００６９】
さらに図６のレーン２と３の対比からわかるように、クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを脱糖鎖処理することによりその分子量は６０ｋＤａになったことから、クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖は１５ｋＤａ〜３０ｋＤａと均一であることが予測され、タンパク質あたりの糖鎖結合量は平均して２０％程度であると推定される。また、図６のレーン４と５の対比からわかるように、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを脱糖鎖処理することによりその分子量は同じく６０ｋＤａになったことから、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖は約２０ｋＤａ〜６０ｋＤａと不均一であることが予測され、タンパク質あたりの糖鎖結合量は平均して４０％程度であると推定される。
【００７０】
（４）糖鎖結合量
凍結乾燥されたアスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ及びクリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを使用して、フェノール硫酸法により、酵素タンパク質あたりの糖鎖結合量を測定した。凍結乾燥したＦＡＤ―ＧＤＨ粉末をイオン交換水で０．２ｇ／Ｌに溶解し、ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液を調製した。次に、このＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．５ｍｌと、５％（ｗ／ｖ）フェノール溶液０．５ｍｌと、９７％硫酸２．５ｍｌを混合し、室温に冷却した後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。０−２００ｍｇ／ＬのＤ−マンノース標準液で検量線を作成し、酵素粉末重量あたりの糖鎖結合量を測定した。その結果、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖結合量は４０％であるのに対し、クリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの糖鎖結合量は１８％であった。
【００７１】
以上の結果から、本実施例により得られたクリプトコッカス組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型ＦＡＤ−ＧＤＨとほぼ同等の特性を有し、しかも糖鎖結合量が少なくかつ均一であることが判明した。
【００７２】
なお、本実施例では分泌シグナルペプチドとして配列番号１１のものを使用しているが、分泌シグナルペプチドはＦＡＤ−ＧＤＨのタンパク質発現効率及び発現成功率に関与し、発現されたタンパク質への糖鎖結合には関与しないので、分泌シグナルペプチドを配列番号１１以外のものに置換しても、クリプトコッカス属の微生物を宿主として使用する限り、本実施例と同様に糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨが得られると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、アスペルギルス・オリゼ由来の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨと同等の特性を有し、しかも糖鎖結合量が少なくかつ均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に組換え生産することができる。従って、本発明は、血糖自己測定バイオセンサ用の試薬として好適なＦＡＤ−ＧＤＨを生産するために極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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