(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な配列同一性を有する核酸配列を含み、セルラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸。
【請求項２】
請求項１記載の配列を含む核酸を含む発現カセット、ベクターまたはクローニングビヒクル。
【請求項３】
請求項１記載の配列を含む核酸、又は請求項２記載の発現カセット、ベクターまたはクローニングビヒクルを含む形質転換細胞。
【請求項４】
請求項１記載の核酸を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック種子。
【請求項５】
配列番号２と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、セルラーゼ活性を有する単離または組換えポリペプチド。
【請求項６】
バイオマスを請求項５記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させることを含む、バイオマスを加工する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、エネルギー省により授与された契約番号ＤＥ−ＦＧ０３−０２ＥＲ８３３９５及びＤＥ−ＦＧ０２−０３ＥＲ８３８６５により政府の支援によってなされた。政府はこの発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、分子及び細胞生物学、並びに生化学に関する。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製する及び使用する方法を提供する。一つの態様において、本発明は、熱安定及び耐熱活性を含む、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製及び使用する方法を対象とする。本発明のポリペプチドは、多様な薬学、農業及び産業の状況で使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
セルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能な資源である。反復単位がセロビオースであるβ−１，４−グルコース単位の直鎖から構成され、これは、図５で示される構造を有するグルコース二量体である。このポリマーは、セルロースポリマーを無差別に加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びセルロースから末端セロビオース残基を除去するセロビオヒドロラーゼ（ＣＨＢ）を含む一連の酵素により分解される。セロビオース及びセロ−オリゴ糖は、β−グルコシダーゼ（ＢＧ）により加水分解されてグルコースとなる。これら３つの酵素は、全て、セルロースが完全に分解してグルコースになるのに必要である。これらの３つの酵素には、それぞれ、同じ機能を実施する異なる構造の変種が存在する。加えて、真菌及び細菌は、異なる構造の変種に加えて、同じ構造の変種の複数の形態を産生することが知られている。
【０００４】
この系を更に複雑にしているものは、幾つかの嫌気性細菌及び真菌が、酵素骨格に全て結合している複数の酵素を含む２百万ダルトンを越える分子量の多酵素複合体としてこれらの酵素を産生するという事実である。なぜそのような複雑な系の酵素がこのような単純な分子に必要なのであろうか。一部の研究者は、この複雑性は、基質の頑強な性質に起因すると考えている。セルロース鎖は、隣接する鎖の水素結合により結晶質マトリックスに充填されているミクロフィブリルを形成する。この構造は、化学的又は酵素的分解に対して高度に抵抗性がある。
ＣＢＨは、セルロースを攻撃するこれらの酵素の性質によって、この結晶質セルロースの分解において主要な酵素であると考えられる。ＣＢＨと異なり、ＥＧは、垂直の角度でセルロース鎖を攻撃する開放裂溝を有する。ＣＢＨは、活性部位を含むトンネルを介して鎖を攻撃する。現在の考え方は、セルロース鎖がトンネルの中に入り、同時に隣接する水素結合を分断するというものである。セロビオヒドロラーゼが基質にこの「足場」を確立すると、次にＥＧが入ることができ、より容易に基質を攻撃することができる。
【０００５】
既知のＣＢＨの主な欠陥は、その低い触媒活性である。一部の人々は、低活性は、加水分解のエネルギーが、水素結合を分断して酵素が基質に沿って移動できるようにする動態エネルギーに移行することが原因であると論じている。ＣＢＨは、エキソ作用酵素であり、グリコシルヒドロラーゼの９０個のファミリーのうち６個で見出される。これらには、ファミリー５、６、７、９、１０及び４８が含まれる。ファミリー５は、セルラーゼ、マンナナーゼ及びキシラナーゼが挙げられる、多くの異なる種類のグリコシルヒドロラーゼを含む。このファミリーにおける大部分のセルラーゼは、エンドグルカナーゼであるが、セロビオヒドロラーゼの例もあり、最も注目すべきは、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）からのＣｅｌＯである。ファミリー６は、エンドグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼしか含まず、エンドグルカナーゼよりもセロビオヒドロラーゼのメンバーが多い。酵素は転化機構を有し、結晶学的研究は、酵素が８個ではなく７個の平行β鎖を含むねじれたα／βバレル構造を有することを示唆する。ファミリー７の酵素は、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの両方から構成され、セロビオヒドロラーゼのほうが多く、唯一の既知のメンバーは真菌からのものである。酵素は機構を保持し、結晶構造は、β−ゼリーロール構造を示唆する。ファミリー９は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼを含み、エンドグルカナーゼが圧倒的である。しかし、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）は、エンド／エキソ−１，４−グルカナーゼを産生し、その結晶構造は、（α／α）6バレルフォールドを示唆する。この酵素は、エンド−とエキソ−グルカナーゼの両方のＣＢＨの特性を有する。ファミリー１０は、主にセロビオヒドロラーゼが記載され、残りがキシラナーゼとして記載される２つのメンバーしか含まない。ファミリー１０のセロビオヒドロラーゼ及びキシラナーゼは、メチル−ウンベリフェリルセロビオシドに対する活性を有する。ファミリー４８は、主に細菌及び嫌気性真菌セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼを含む。構造は、ファミリー９と同様の（α／α）6バレルフォールドである。
【０００６】
道路車両用の燃料において、あまり高価でなく再生可能な供給源の必要性が存在する。新たな燃料供給源は、燃焼後に無害な最終生成物を生じるのであれば、より魅力的である。エタノールは、石油系燃料に対して魅力的な代替案を提供し、デンプン又はリグノセルロース由来の単糖の発酵により得ることができる。しかし、現在の経済状況は、高い生成価格のため、エタノールの広範な使用を後押ししない。価格を減少することを目的とする研究の一つの領域は、リグノセルロースから発酵可能な糖を生成するのに使用できる酵素の技術的な効力を高めることである。供給原料をより効率的に消化する酵素を開発することは、換言するとエタノール生成費用を減少することになる。より効率的な方法は、米国の外国の油に対する依存度を減少し、その依存性に関連しうる価格変動を減少する。バイオエタノールのようなによりきれいな燃料を輸送に使用することは、部分的には地球温暖化の原因であると考えられているＣＯ2の純放出を減少することもできる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ（ベータ−グルコシダーゼ）、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。一つの態様において、本発明の酵素は、基質加水分解の方法を改善するために増加した触媒速度を有する。触媒速度のこの増加した効率は、産業用途に有用でありうる糖の生成効率の増加をもたらし、例えば、そのように生成された糖は、エタノール生成のために微生物により使用することができる。一つの特徴において、本発明は、高活性（例えば、増加した触媒速度）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及び／ベータ−グルコシダーゼを提供する。本発明は、酵素費用の減少した、例えばバイオマスをエタノール処理する費用が減少した本発明の酵素を使用する（例えば、バイオマスをエタノールにする）産業用途を提供する。したがって、本発明は、あらゆるバイオマスから、バイオエタノールを生成する、及びバイオエタノールを含む燃料が挙げられるバイオエタノール含有組成物を生成する効率的な方法を提供する。
【０００８】
一つの特徴において、本発明の酵素は、例えば内部エンド−β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する、グルカナーゼ、例えばエンドグルカナーゼ活性を有する。一つの特徴において、前記エンドグルカナーゼ活性（例えば、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ活性）は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）における１，４−及び／又はβ−１，３−ベータ−Ｄ−グリコシド結合の加水分解、穀類ベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカン及びセルロース部分を含有する他の植物材料のような混合ベータ−１，３−グルカンにおける、リケニン、ベータ−１，４−結合の加水分解を含む。
【０００９】
一つの特徴において、本発明の酵素は、エンドグルカナーゼ（例えば、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４；エンド−ベータ−１，３（１）−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．６；エンド−ベータ−１，３−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．３９）活性を有し、セルロース及びグルカンにおいて内部β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルコシド結合を加水分解して、より小さい分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを生成することができる。本発明は、本発明のこれらの酵素を使用して、より小さい分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを生成する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明の酵素を使用して、グルカン、例えば、１，４−β−及び／又は１，３−グリコシド結合Ｄ−グルコピラノースから形成される多糖を生成する。一つの態様において、本発明のエンドグルカナーゼは、食品産業における例えばベーキング、並びに果実及び野菜加工、農業廃棄物の分解、動物飼料の製造、パルプ及び紙の生産、織物の製造、並びに家庭用及び産業用洗浄剤のために使用される。一つの特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、微生物により、例えば真菌及び／又は細菌により産生される。
【００１０】
一つの特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、穀類の主要な非デンプン多糖であるベータ−グルカン（β−グルカン）を加水分解するために使用される。多糖のグルカン含有量は、多様な成長条件に応じて著しく変わり得る。多糖の物理化学的特性は、粘性溶液を生じるか又は酸化条件下ではゲルも生じるような特性である。加えて、グルカンは高度な水結合能力を有する。これらの特徴は、全て、醸造、ベーキング、動物栄養を含む幾つかの産業において問題を提示する。醸造用途では、グルカンの存在は、麦芽汁濾過性及び濁り形成の問題をもたらす。ベーキング用途（特に、クッキー及びビスケット）では、グルカンは、機械加工が困難でビスケットのサイズを減らす粘着性の生地を作り出す可能性がある。したがって、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、β−グルカン含有組成物中のβ−グルカンの量を減少することに使用され、例えば、本発明の酵素は、溶液又はゲルの粘度を減少する処理において、組成物、例えばβ−グルカン含有組成物の水結合能力を減少する処理において、醸造処理において（例えば、麦芽汁濾過性を増加し、濁り形成を減少するため）、例えばクッキー、パン、ビスケットなどを作る生地の粘着性を減少する処理において使用される。
加えて、炭水化物（例えば、β−グルカン）は、焼成品の急速な再水和に関連し、新鮮さの消失及び保存寿命の低減をもたらす。したがって、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、あらゆる炭水化物含有食物、飼料又は飲料、例えばβ−グルカン含有食物、飼料又は飲料の新鮮さの保持、新鮮さの増加、又は新鮮さの消失速度の低減、及び保存寿命の増加のために使用される。
【００１１】
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、例えば穀物食での（例えば、反芻動物のような動物又はヒト）における消化管の内容物の粘度を減少するために使用される。したがって、別の特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、食物又は飼料の消化率及び動物（例えば、ヒト又は家畜）の成長率に肯定的な影響を与えるために使用され、一つの特徴では、より高い飼料転換効率を生じるために使用される。穀物食餌を用いる単胃動物の飼料用途では、ベータ−グルカンは、消化管内容物の粘度に対する寄与要因であり、それによって飼料の消化率及び動物の成長率に悪影響を与える。反芻動物では、これらのベータ−グルカンは、繊維摂取の実質的な構成要素を表し、グルカンのより完全な消化は、より高い飼料転換効率を促進する。したがって、本発明は、本発明のエンドグルカナーゼを含む動物飼料及び食物を提供し、一つの特徴において、これらの酵素は、動物の消化官、例えば胃及び／又は腸において活性である。
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、あらゆる植物材料で見出されるものを含む、セルロース又はあらゆるベータ−１，４−結合グルカン含有合成若しくは天然材料を消化するために使用される。本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、例えば、木材加工、パルプ及び／若しくは紙産業において、織物産業において、及び家庭用及び産業用洗浄剤において、並びに／又はバイオマス廃棄物加工において、セルロースを消化するために、商業用の酵素として使用される。
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、医薬組成物、食物、飼料、薬剤、栄養補助食品）を提供する。これらの組成物は、多様な形態、例えば、錠剤、ゲル剤、丸剤、インプラント、液剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又は任意の形態のカプセル化形態として配合することができる。
【００１２】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３及び配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）を含む本発明の例示的な核酸に、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む単離又は組換え核酸を提供し、別の特徴では、これらの核酸は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするか、又は本発明のポリペプチドに特異的に結合できる抗体を生成することができるポリペプチドをコードするか、或いはこれらの核酸は、セルラーゼコード核酸を同定若しくは単離するプローブとして、又はセルラーゼ発現核酸の発現を阻害するために使用できる（これらの態様は、全て「本発明の核酸」と呼ばれる）。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。
【００１３】
本発明の核酸には、また、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４及び配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）に記載の配列及びその部分配列を有するポリペプチド並びにその変種を含む、本発明の例示的な酵素をコードする単離又は組換え核酸が含まれる。一つの態様において、ペプチドは、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００１４】
一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供し、これらは混合培養物に由来する点において共通の新規性を有する。本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３及び配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）の本発明の例示的な核酸に、少なくとも約５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する配列を含む、混合培養物から単離されるセルロース分解酵素コード核酸を提供する。
【００１５】
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、例えば、本発明の例示的なポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１及び配列表も参照すること）を含む、本発明の例示的なポリヌクレオチド配列（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）及びそれらによりコードされるポリペプチドを含む、セルラーゼ酵素−、例えばエンドグルカナーゼ酵素−、セロビオヒドロラーゼ酵素−及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素−コード核酸を提供し、これらは共通の供給源、例えば環境供給源に由来する点において共通の新規性を有する。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ酵素−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ酵素−、セロビオヒドロラーゼ酵素−及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素−コード核酸も提供し、これらは環境供給源、例えば混合環境供給源に由来する点において共通の新規性を有する。 
一つの特徴において、上記配列比較アルゴリズムは、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．２アルゴリズムであり、フィルタリング設定は、blastall -p blastp -d "nr pataa" -F Fに設定され、他の全てのオプションは、初期設定値に設定される。
【００１６】
本発明の別の特徴は、本発明の核酸の連続した塩基を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００個又はそれ以上含む単離又は組換え核酸、それと実質的に同一の配列、及びそれに相補的な配列を含む単離又は組換え核酸である。
【００１７】
一つの特徴において、単離又は組換え核酸は、熱安定性である、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、約３７℃〜約９５℃、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約９５℃、又は約９０℃〜約９５℃の温度範囲を含む条件下でセルラーゼ活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃、９７℃、９８℃、又は９９℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、若しくは約９０℃〜約９９℃の範囲、又は９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、若しくは９９℃又はそれ以上の温度でセルラーゼ活性を保持することができる。
【００１８】
別の特徴において、単離又は組換え核酸は、耐熱性であるセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、３７℃より高く約９５℃までの範囲の温度、又は５５℃より高く約８５℃までの範囲のいずれかの温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃、９７℃、９８℃、又は９９℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、又は約９０℃〜約９９℃の範囲、又はそれ以上の温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ４．５又はそれ以上で、９０℃より高く約９９℃までの範囲、又は９５℃、９６℃、９８℃若しくは９９℃の温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持する。
【００１９】
本発明は、本発明の例示的な配列、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４も参照すること）に記載の配列、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む、本発明の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離又は組換え核酸を提供する。一つの特徴において、前記核酸は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記核酸は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００個若しくはそれ以上の長さの残基であるか、又は遺伝子若しくは転写物の完全長でありえる。一つの特徴において、ストリンジェントな条件は、０．２xＳＳＣ中、約６５℃の温度で約１５分間洗浄することを含む洗浄工程を含む。 
【００２０】
本発明は、セルラーゼ活性、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離する核酸プローブを提供し、前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の連続する塩基を含み、結合又はハイブリダイゼーションにより核酸を同定する。前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０又は約６０〜１００個の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００２１】
本発明は、セルラーゼ活性、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離する核酸プローブを提供し、前記プローブは、本発明の例示的な核酸に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する、本発明の核酸、例えばポリヌクレオチドの少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の残基の配列を含む核酸を含む。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。別の特徴において、前記プローブは、本発明の核酸配列又はその部分配列の少なくとも約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０又は約６０〜１００個の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００２２】
本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を（例えば、ＰＣＲにより）増幅する増幅プライマー対を提供し、このプライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の１つの又はそれぞれのメンバーは、上記配列の少なくとも約１０〜５０個若しくはそれ以上の連続する塩基、又は上記配列の約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個若しくはそれ以上の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、増幅プライマー対を提供し、このプライマー対は、本発明の核酸の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第１のメンバーと、第１メンバーの相補鎖の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第２のメンバーとを含む。
【００２３】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。一つの特徴において、前記増幅プライマー対は、ライブラリーから、例えば環境ライブラリーのような遺伝子ライブラリーから核酸を増幅する。
本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法であって、本発明の核酸配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を増幅することができる増幅プライマー配列対により鋳型核酸を増幅することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は、本発明の核酸配列又はその部分配列を含む発現カセットを提供する。一つの特徴において、前記発現カセットは、プロモーターに機能的に結合した核酸を含むことができる。前記プロモーターは、ウイルス、細菌、哺乳動物又は植物のプロモーターであることができる。一つの特徴において、前記植物プロモーターは、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、コムギ、タバコ又はオオムギのプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。構成的プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓを含むことができる、別の特徴において、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。一つの特徴において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、又は環境的に調節されるか若しくは生育的に調節されるプロモーターであり得る。したがって、プロモーターは、例えば、種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的又は器官離脱誘導プロモーターであり得る。一つの特徴において、発現カセットは、更に、植物又は植物ウイルス発現ベクターを含む得る。
本発明は、本発明の発現カセット（例えばベクター）又は本発明の核酸を含むクローニングビヒクルを提供する。前記クローニングビヒクルは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含むことができる。クローニングビヒクルは、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又は哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）を含み得る。
【００２５】
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）、又は本発明のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞を提供する。一つの特徴において、前記形質転換細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞であることができる。一つの特徴において、前記植物細胞は、ダイズ、ナタネ、アブラナ、トマト、サトウキビ、穀類、ジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、タバコ又はオオムギ細胞であり得る。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。一つの特徴において、動物は、マウス、ラット、ブタ、ヤギ又はヒツジである。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック植物を提供する。トランスジェニック植物は、穀類、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、イネ、オオムギ又はタバコであることができる。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック種子を提供する。トランスジェニック種子は、穀類、トウモロコシ、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生又はタバコの種子であることができる。
【００２６】
本発明は、本発明の核酸に相補的であるか又は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、細胞内のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの翻訳を阻害する方法であって、本発明の核酸に相補的であるか若しくは本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は細胞で発現させることを含む方法を提供する。一つの特徴において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜５０，約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０、又は６０〜１００個の長さの塩基であり、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個又はそれ以上の長さの塩基である。本発明は、細胞内のセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの翻訳を阻害する方法であって、本発明の核酸に相補的であるか若しくは本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は細胞で発現させることを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明の配列の部分配列を含む二本鎖の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ又はＲＮＡ干渉）分子（転写を阻害する小型干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ、及び翻訳を阻害するミクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む）を提供する。一つの態様において、ｓｉＲＮＡは、長さが、約２１〜２４個の残基、又は少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個又はそれ以上の二重ヌクレオチドである。本発明は、細胞内のセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現を阻害する方法を提供し、前記方法は、本発明の配列又は部分配列を含む二重鎖阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を細胞に投与すること又は細胞内で発現させることを含む。
【００２８】
本発明は、本発明の例示的なポリペプチド又はペプチドと、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０個若しくはそれ以上の残基又はポリペプチドの完全長にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上又は完全な（１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。本発明の例示的なポリペプチド又はペプチド配列には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４及び配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）及びその部分配列、並びにその変種が含まれる。例示的なポリペプチドには、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００個若しくはそれ以上の残基の長さ、又は酵素の完全長にわたるフラグメントも含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の核酸によってコードされる配列が含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の抗体に特異的に結合するポリペプチド若しくはペプチド（例えば、エピトープ）、又は本発明の抗体を生成できるポリペプチド若しくはペプチド（例えば、免疫原）が含まれる。
【００２９】
一つの特徴において、本発明のペプチドは、少なくとも１つのセルラーゼ酵素活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する。別の特徴において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００３０】
一つの特徴おいて、本セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、熱安定性である。本ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、又は約９０℃〜約９５℃又はそれ以上の温度範囲を含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、本セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、耐熱性であり得る。前記ポリペプチドは、３７℃より高く約９５℃までの範囲又は５５℃より高く約８５℃までの範囲の温度に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、９０℃より高く約９５℃までの範囲の温度にｐＨ４．５で暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチド又はペプチド配列の連続した塩基を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０個又はそれ以上含む単離又は組換えポリペプチド若しくはペプチド、それと実質的に同一の配列、及びそれに相補的な配列を提供する。このペプチドは、例えば、免疫原性フラグメント、モチーフ（例えば、結合部位）、シグナル配列、プレプロ配列、又は活性部位であり得る。
【００３１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする配列とシグナル配列とを含む単離又は組換え核酸を提供し、前記核酸は本発明の配列を含む。シグナル配列は、別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素から、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼ酵素（異種酵素）に由来し得る。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離又は組換え核酸であって、前記配列がシグナル配列を含まず、本発明の配列を含む、前記単離又は組換え核酸を提供する。一つの特徴において、本発明は、シグナル配列の一部又は全てを欠いている本発明のポリペプチドを含む単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、単離又は組換えポリペプチドは、異種セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列のような、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列のような、異種シグナル配列を含む本発明のポリペプチドを含むことができる。
一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列を含む第１のドメインと、少なくとも第２のドメインとを含むキメラタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、融合タンパク質であることができる。前記第２のドメインは酵素を含むことができる。前記酵素は非酵素であってもよい。
【００３２】
本発明は、本発明のシグナルペプチド（ＳＰ）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含む少なくとも第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第２のドメインとを含むキメラポリペプチドを提供し、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない。一つの特徴において、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ではない。前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）のアミノ末端、カルボキシ末端又は両端にあってよい。
本発明は、キメラポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供し、前記キメラポリペプチドは、本発明のシグナルペプチド（ＳＰ）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含む少なくとも第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第２のドメインとを含み、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない。
【００３３】
本発明は、本発明のポリペプチドの、例えば例示的な配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）の残基１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜4３，１〜４４，１〜４５、１〜４６又は１〜４７に記載されている配列からなる、又は前記配列を含む単離又は組換えシグナル配列（例えば、シグナルペプチド）を提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ末端残基の最初の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０個又はそれ以上を含むシグナル配列を提供する。
【００３４】
一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、約３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約１２００単位、又はタンパク質１mgあたり約１００〜約１０００単位の範囲で比活性を含む。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、タンパク質１mgあたり約１００〜約１０００単位、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約７５０単位の範囲で比活性を含む。あるいは、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、約３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約７５０単位、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約１２００単位の範囲で比活性を含む。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約５００単位、又はタンパク質１mgあたり約７５０〜約１０００単位の範囲で比活性を含む。別の特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約２５０単位の範囲で比活性を含む。あるいは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約１００単位の範囲で比活性を含む。
別の特徴において、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の３７℃での比活性の少なくとも半分を保持することを含む。あるいは、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、タンパク質１mgあたり約１〜約１２００、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約１０００単位の範囲で３７℃での比活性を保持することを含むことができる。別の特徴において、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、タンパク質１mgあたり約１〜約５００単位の範囲で３７℃での比活性を保持することを含むことができる。
【００３５】
本発明は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む本発明の単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、前記グリコシル化はＮ結合グリコシル化であり得る。一つの特徴において、ポリペプチドを、P.パストリス（P. pastoris）又はS.ポンベ（S. pombe）で発現させて、グリコシル化することができる。
一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ６．５、ｐＨ６、ｐＨ５．５、ｐＨ５、ｐＨ４．５若しくはｐＨ４又はより酸性を含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、ポリペプチドは、約ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５若しくはｐＨ１１又はより塩基性のｐＨを含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ６．５、ｐＨ６、ｐＨ５．５、ｐＨ５、ｐＨ４．５若しくはｐＨ４又はより酸性のｐＨを含む条件に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５若しくはｐＨ１１又はより塩基性のｐＨを含む条件に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。
一つの態様において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、アルカリ性条件下、例えば腸、例えば小腸のアルカリ性条件下で活性を有する。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、胃の酸性ｐＨに暴露された後、活性を保持することができる。
【００３６】
本発明は、本発明のポリペプチド（ペプチドを含む）を含むタンパク質調製物を提供し、前記タンパク質調製物は、液体、固体又はゲルを含む。本発明は、本発明のポリペプチドと、第２のタンパク質又はドメインとを含むヘテロ二量体を提供する。ヘテロ二量体の第２のメンバーは、異なるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、異なる酵素、又は別のタンパク質であることができる。一つの特徴において、第２のドメインはポリペプチドであることができ、ヘテロ二量体は融合タンパク質であることができる。一つの特徴において、第２のドメインはエピトープ又はタグであることができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモ二量体を提供する。
【００３７】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する固定化ポリペプチドを提供し、前記固定化ポリペプチドは、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを含むポリペプチドと第２のドメインとを含む。一つの特徴において、前記ポリペプチドを、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又はキャピラリー管に固定化することができる。
本発明は、本発明の固定化核酸を含むアレイも提供し、例えば本発明のプローブが挙げられる。本発明は、本発明の抗体を含むアレイも提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離又は組換え抗体を提供する。これらの本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、本発明の抗体、例えば本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。本発明は、これらの抗体をコードする核酸を提供する。
【００３８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法であって、（ａ）本発明の抗体を提供する工程；（ｂ）ポリペプチドを含む試料を提供する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の試料を、抗体がポリペプチドと特異的に結合する条件下で工程（ａ）の抗体と接触させ、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明は、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素抗体を作製する方法であって、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、液性免疫反応を生じるのに十分な量で非ヒト動物に投与して、それによって抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素抗体を作製することを含む方法を提供する。本発明は、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ免疫反応（細胞性又は液性）を作製する方法であって、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、非ヒト動物に免疫反応（細胞性又は液性）を生じるのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
本発明は、組換えポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合する本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸をポリペプチドの発現が可能である条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを産生する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、宿主細胞を工程（ａ）の核酸を用いて形質転換し、続いて工程（ａ）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞において組換えポリペプチドを産生することを更に含むことができる。
【００４１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）のポリペプチド若しくはそのフラグメント又は変種を工程（ｂ）の基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出し、前記基質の減少又は前記反応生成物の量の増加により、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを検出する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、前記基質はセルラーゼ含有化合物である。
【００４２】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質を同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出し、前記基質の量が減少又は前記反応生成物の量が増加すれば、前記試験基質を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の基質として同定する工程を含む方法を提供する。
【００４３】
本発明は、試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する方法であって、（ａ）核酸又は核酸を含むベクターを、核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させるか（前記核酸は本発明の核酸を含む）、又は本発明のポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験化合物を提供する工程；（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性の調節因子を同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験化合物を提供する工程；（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験化合物と接触させ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の活性を測定する工程を含み、前記試験化合物の不在下での活性と比較して前記試験化合物の存在下で測定されるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性が変化すれば、前記試験化合物がセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を調節すると決定する方法を提供する。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質を提供し、前記基質の量の減少若しくは反応生成物の量の増加、又は前記基質の量の増加若しくは反応生成物の量の減少を検出することによって測定できる。試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して、試験化合物を用いた場合に基質の量が減少又は反応生成物の量が増加すれば、前記試験化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のアクチベーターとして同定する。試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して、試験化合物を用いた場合に基質の量が増加又は反応生成物の量が減少すれば、前記試験化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のインヒビターとして同定する。
【００４５】
本発明は、プロセッサーおよびデータ記憶装置を含むコンピュータシステムを提供し、前記データ記憶装置には本発明のポリペプチド配列又は核酸配列（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はペプチド）が記憶されている。一つの特徴において、本コンピュータシステムは、更に、配列比較アルゴリズム、及び少なくとも１つの基準配列が記憶されたデータ記憶装置を含むことができる。別つの特徴において、前記配列比較アルゴリズムは、多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。一つの特徴において、本コンピュータシステムは、更に、配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。本発明は、本発明のポリペプチド配列又は核酸配列が記憶されているコンピュータ読み出し可能媒体を提供する。本発明は、配列の特徴を同定する方法であって、（ａ）配列の１つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを使用して配列を読み取る工程であり、前記配列が本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む、前記工程；及び（ｂ）コンピュータプログラムにより配列の１つ以上の特徴を同定する工程を含む方法を提供する。本発明は、第１の配列を第２の配列と比較する方法であって、（ａ）配列を比較するコンピュータプログラムを使用して第１の配列及び第２の配列を読み取る工程であり、第１の配列が本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む、前記工程、及び（ｂ）第１の配列と第２の配列との差異をコンピュータプログラムにより決定する工程を含む方法を提供する。第１の配列と第２の配列との差異を決定する工程は、更に、多型性を同定する工程を含むことができる。一つの特徴において、この方法は、更に、配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。別の特徴において、この方法は、コンピュータプログラムを使用して第１の配列を読み取り、配列の１つ以上の特徴を同定することを含むことができる。
【００４６】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供する工程（このプライマー対は本発明の核酸を増幅することができる）；（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために増幅プライマー対に接近できるように環境試料を処理する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の核酸を工程（ａ）の増幅プライマー対と一緒にし、環境試料の核酸を増幅し、それによって環境試料からセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離又は回収する工程を含む方法を提供する。前記増幅プライマー配列対の１つの又はそれぞれのメンバーは、例えば本発明の配列の少なくとも約１０〜５０個の連続する塩基を有する、本発明の増幅プライマー配列対を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００４７】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、（ａ）本発明の核酸又はその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブに接近できるように環境試料を処理する工程；（ｃ）工程（ｂ）の単離された核酸又は処理された環境試料を工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；及び（ｄ）工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する工程を含む方法を提供する。前記環境試料は、水試料、液体試料、土壌試料、空気試料又は生物学的試料を含むことができる。一つの特徴において、前記生物学的試料は、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来することができる。
【００４８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を生成する方法であって、（ａ）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程；及び（ｂ）鋳型配列の１つ以上のヌクレオチドを改変、欠失、若しくは付加するか、又はこれらの組合せにより、鋳型核酸の変種を生成する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種を生成する核酸の変種を発現することを更に含むことができる。改変、付加又は欠失は、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、染色体飽和変異導入（ＣＳＭ）又はそれらの組合せを含む方法によって導入することができる。別の特徴において、>改変、付加又は欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成びそれらの組合せを含む方法によって導入される。
【００４９】
一つの特徴において、この方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドから変化した若しくは異なる活性、又は変化した若しくは異なる安定性を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が産生されるまで繰り返し反復することができる。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種は耐熱性であり、高温で暴露された後、いくらかの活性を保持する。別の特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種は、鋳型核酸によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と比較して、増加したグリコシル化を有する。あるいは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの変種は、高温でセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素活性を有し、鋳型核酸でコードされたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素は、高温下で活性ではない。一つの特徴において、この方法は、鋳型核酸のコドン使用頻度から変化したコドン使用頻度を有する配列をコードするセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素が産生されるまで、繰り返し反復することができる。別の特徴において、この方法は、鋳型核酸よりも高い又は低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素遺伝子が産生されるまで、繰り返し反復することができる。
【００５０】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加する方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。
【００５１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変する方法であって、（ａ）本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸のコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ核酸をコードする核酸のコドンを改変する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５２】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加させる方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。
【００５３】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を減少させる方法であって、（ａ）本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の少なくとも１つの好ましいコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドン又は低優先コドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を減少させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。一つの特徴において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であることができる。
【００５４】
本発明は、複数の改変セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを産生する方法であって、前記改変活性部位又は基質結合部位が、第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする配列を含む第１の核酸に由来し、（ａ）第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする第１の核酸を提供する工程であって、前記第１の核酸の配列は本発明の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性部位又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質結合部位をコードする核酸である、前記工程；（ｂ）前記第１の核酸内の複数の標的コドンにおいて天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異導入オリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；及び（ｃ）前記変異導入オリゴヌクレオチドのセットを使用して、変異が導入されるそれぞれのアミノ酸コドンにおいて一連のアミノ酸の変種をコードする活性部位コード核酸変種又は基質結合部位コード核酸変種のセットを生成し、それによって複数の改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する工程を含む、前記方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、最適化定方向進化系、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ及びこれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第１の核酸に変異を導入することを含む。別の特徴において、この方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成及びそれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第１の核酸又は変種に変異を導入することを含む。
【００５５】
本発明は、小分子を作製する方法を提供する。前記方法は、（ａ）小分子を合成又は改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素のうち１つは本発明の核酸によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む、前記工程；（ｂ）工程（ａ）の酵素の少なくとも１つに対する基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の基質を、複数の生体触媒反応を促進する条件下で酵素と反応させて、一連の生体触媒反応により小分子を生成する工程を含む方法を提供する。本発明は、小分子を改変する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はその部分配列を含む、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する工程；（ｂ）小分子を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）の酵素を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で工程（ｂ）の小分子と反応させ、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素反応により小分子を改変する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、本方法は工程（ａ）のための小分子基質を多く含むことができ、したがって、セルラーゼ、例えばエンドセルラーゼ、セロビオヒドロゲナーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって触媒された少なくとも一つの酵素反応によって製造された改変小分子ライブラリーを形成させる。一つの特徴において、この方法は、複数の酵素反応により産生される改変小分子のライブラリーを形成するために、酵素による複数の生体触媒反応を促進する条件下で複数の追加的な酵素を含むことができる。別の特徴において、この方法は、所望の活性を示す特定の改変小分子がライブラリー内に存在するかを決定するために、ライブラリーを試験する工程を更に含むことができる。ライブラリーを試験する工程は、更に、所望の活性を有する特定の改変小分子の存在又は不在について改変小型分の一部を試験し、所望の活性を有する特定の改変小分子を産生する少なくとも１つの特定の生体触媒反応を同定することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の一部を産生するのに使用される生体触媒反応の一つを除いて全部を系統的に排除する工程を含むことができる。
【００５６】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はその部分配列を含むセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性について残りの配列を試験し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する工程を含む方法を提供する。一つの態様において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質を提供し、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出することにより測定される。
【００５７】
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析を使用する新たな又は改変された表現型の全細胞操作の方法であって、（ａ）細胞の遺伝的構成を改変することにより改変細胞を作製する工程であって、前記遺伝的構成が本発明の核酸を細胞に添加することにより改変される、前記工程；（ｂ）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成する工程；（ｃ）工程（ｂ）の細胞培養物をリアルタイムでモニタリングすることにより細胞の少なくとも１つの代謝パラメーターを測定する工程；及び（ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して、測定パラメーターが類似の条件下で未改変細胞における対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって操作された細胞の表現型をリアルタイム代謝フラックス分析を使用して同定する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失若しくは配列の改変、又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変することができる。一つの特徴において、この方法は、新たに操作された表現型を含む細胞を選択することを更に含むことができる。別の特徴において、この方法は、選択された細胞を培養し、それによって新たに操作された表現型を含む新たな細胞株を生成することを含むことができる。
【００５８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドをグリコシル化することを含む、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を増加させる方法であって、前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸又は本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドを含み、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を増加させる方法を提供する。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の比活性は、約３７℃より高く約９５℃までの温度範囲で熱安定性又は耐熱性であることができる。
【００５９】
本発明は、本発明の核酸又は本発明の核酸配列を含むベクターを発現することを含む、細胞で組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを過剰発現させる方法であって、配列同一性が、配列比較アルゴリズムを用いる分析又は目視検査により決定され、過剰発現が、高活性プロモーター、２シストロンベクターの使用により、又はベクターの遺伝子増幅により実施される方法を提供する。
【００６０】
トランスジェニック植物を作製する方法であって、（ａ）本発明の核酸配列を含む異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を産生する工程；及び（ｂ）形質転換細胞からトランスジェニック植物を産生する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、工程（ａ）は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより異種核酸配列を導入することを更に含むことができる。別の態様において、工程（ａ）は、ＤＮＡ粒子衝撃により、異種核酸配列を植物組織に直接導入することを更に含むことができる。あるいは、工程（ａ）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien）宿主を使用することにより、異種核酸配列を植物細胞ＤＮＡに導入することを更に含むことができる。一つの態様において、植物細胞は、サトウキビ、ビート、ダイズ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、タバコ又はオオムギ細胞であってよい  。
【００６１】
本発明は、植物細胞において異種核酸配列を発現させる方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合した、本発明の核酸を含む異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程；（ｂ）前記異種核酸配列が植物細胞で発現する条件下で植物を生長させる工程、を含む方法を提供する。本発明は、植物細胞において異種核酸配列を発現させる方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合した、本発明の配列を含む異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程；（ｂ）異種核酸配列が植物細胞で発現する条件下で植物を生長させる工程を含む方法を提供する。
【００６２】
本発明は、本発明のポリペプチドを含む又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料又は食物を提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、食物、飼料、液体、例えば飲料（例えばフルーツジュース又はビール）、パン若しくは生地若しくはパン製品、又は飲料前駆体（例えば、麦芽汁）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、動物用の食物又は栄養補助食品を提供する。
【００６３】
一つの態様において、食物又は栄養補助食品中のポリペプチドは、グリコシル化されていてよい。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、食用酵素送達マトリックスを提供する。一つの特徴において、送達マトリックスはペレットである。一つの特徴において、ポリペプチドはグリコシル化されていてよい。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、耐熱性である。別の特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む食物、飼料又は栄養補助食品を提供する。本発明は、動物用食餌に栄養補助食品としてセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を利用する方法であって、本発明のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸を含むセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含有する栄養補助食品を調製すること；及び栄養補助食品を動物に投与することを含む方法を提供する。前記動物は、ヒトであるか、反芻動物又は単胃動物であってよい。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、細菌、酵母、植物、昆虫、真菌及び動物からなる群より選択される生物において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを発現することにより調製できる。前記生物は、S.ポンベ（S. pombe）、S.セレビシアエ（S. cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）、バチルス種（Bacillus sp.）及びラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）からなる群より選択することができる。
【００６４】
本発明は、熱安定性組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、例えば本発明のポリペプチドを含む食用酵素送達マトリックスを提供する。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素栄養補助食品を動物に送達する方法であって、顆粒食用担体及び熱安定性組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む食用酵素送達マトリックスをペレットの形態で調製すること、および、前記食用酵素送達マトリックスを動物に投与することを含み、前記ペレットが、含有されているセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を水性媒体に容易に分散する、前記方法を提供する。前記組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、本発明のポリペプチドを含むことができる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をグリコシル化して、ペレット化条件下で熱安定性をもたらすことができる。送達マトリックスは、穀物胚及びセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む混合物をペレット化することにより形成できる。ペレット化条件は、蒸気の適用を含むことができる。ペレット化条件は、約８０℃を越える温度を約５分間適用することを含むことができ、酵素は、酵素の１mgあたり少なくとも３５０〜約９００単位の比活性を保持する。
【００６５】
一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一つの特徴において、前記医薬組成物は、消化補助剤として作用する。
【００６６】
特定の特徴において、セルロース含有化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する本発明のポリペプチドと、約ｐＨ３．０〜９．０の範囲、１０．０、１１．０又はそれ以上のｐＨで接触させる。他の特徴において、セルロース含有化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と、約５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃又はそれ以上の温度で接触させる。
【００６７】
本発明の１つ以上の特徴の詳細が、添付図面及び以下の記載により説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、記載及び図面から、並びに請求項から明白となる。
本明細書で引用される全ての出版物、特許、特許出願、GenBank配列及びＡＴＣＣ寄託は、全ての目的において引用により本明細書に明確に組み込まれる。
図面は本発明の態様を説明し、請求項に包含される本発明の範囲を制限することを意図しない。
種々の図面中の同じ参照記号は同じ要素を示している。
（詳細な説明）
【００６８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製及び使用する方法を提供する。本発明は、セルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用も提供する。
一つの特徴において、本発明は、触媒率が高まり、基質の加水分解処理が改善された、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼを提供する。この触媒率の効率の高まりは、後で微生物によりエタノール生成のために用いられる糖を生成する効率を高める。一つの特徴において、本発明の酵素を生じる微生物は、エタノール生成微生物と共に使用される。したがって、本発明は、エタノール生成の方法、及びエタノールに基づく「クリーン燃料」を、例えばバイオエタノールを使用する輸送のために作製する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、酵素調製物、飼料、薬剤、栄養補助食品）を提供する。これらの組成物は、多様な形態、例えば、液剤、ゲル剤、丸剤、錠剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又はナノカプセル化形態を含むカプセル化形態として配合することができる。
【００６９】
例えば、ポリペプチドがセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するかを決定するために、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を測定するアッセイは、当該技術において周知であり、かつ本発明の範囲内である（例えば、Baker WL, Panow A, Estimation of cellulase activity using a glucose-oxidase-Cu(II) reducing assay for glucose, J Biochem Biophys Methods. 1991 Dec, 23(4):265-73; Sharrock KR, Cellulase assay methods: a review, J Biochem Biophys Methods. 1988 Oct, 17(2):81-105; Carder JH, Detection and quantitation of cellulase by Congo red staining of substrates in a cup-plate diffusion assay, Anal Biochem. 1986 Feb 15, 153(1):75-9; Canevascini G., A cellulase assay coupled to cellobiose dehydrogenase, Anal Biochem. 1985 Jun, 147(2):419-27; Huang JS, Tang J, Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal Biochem. 1976 Jun, 73(2):369-77を参照すること）。
【００７０】
本発明で利用される反応条件のｐＨは、本発明が提供する別の変数パラメーターである。特定の態様において、反応のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲で実施される。別の態様において、ｐＨは約４．５であるか、又はｐＨは約７．５であるか、又はｐＨは約９である。アルカリ性条件下で実施される反応条件も、例えば本発明の酵素の幾つかの産業又は医薬用途において有益でありうる。
本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを多様な形態又は配合で提供する。本発明の方法において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、多様な形態又は配合で使用される。例えば、精製されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、バイオエタノール生成又は医薬若しくは飲食補助用途で用いる酵素調製物に使用することができる。あるいは、本発明の酵素を、バイオエタノールの生成、クリーン燃料の製造、バイオマスの処理、食物、液体又は飼料の処理などに直接使用することができる。
【００７１】
あるいは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、当該技術で周知の手順を使用し微生物において発現させることができる。他の態様において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、本発明の方法で使用する前に、固体支持体に固定化することができる。酵素を固体支持体に固定化する方法は、当該技術で一般的に知られており、例えば、J. Mol. Cat. B: Enzymatic 6 (1999) 29-39; Chivata et al. Biocatalysis: Immobilized cells and enzymes, J Mol. Cat. 37 (1986) 1-24: Sharma et al., Immobilized Biomaterials Techniques and Applications, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (1982) 837-54: Laskin (Ed.), Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnologyである。
【００７２】
核酸、プローブ及び阻害性分子
本発明は、単離及び組換え核酸（例えば、下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表を参照すること）；本発明の例示的なポリヌクレオチド配列を含む、ポリペプチドをコードする核酸を提供する（例えば、本発明の核酸を含む発現ベクター及び多様なクローニングビヒクルのような発現カセットを含む、表１及び配列表を参照すること）。本発明は、本発明の核酸を使用して、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド配列を発見、同定又は単離する方法も含む。本発明は、本発明の核酸を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子及び転写物の発現を阻害する方法も含む。
【００７３】
また、提供されるものは、例えば、合成連結再アッセンブリ、最適化定方向進化系及び／又は遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）のような飽和変異導入により、本発明の核酸の変種を作ることを含む、核酸を改変する方法である。用語「飽和変異導入」、遺伝子部位飽和変異導入又は「ＧＳＳＭ」には、下記で詳細に記載される、ポリヌクレオチドへ点変異を導入するために縮退オリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法が含まれる。用語「最適化定方向進化系」又は「最適化定方向進化」には、関連する核酸配列、例えば関連する遺伝子のフラグメントを再集合する方法が含まれ、下記で詳細に説明される。用語「合成連結再アッセンブリ」又は「ＳＬＲ」には、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的様式で連結する方法が含まれ、下記で詳細に説明される。用語「変種」は、１つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン又はアミノ酸残基が（それぞれ）改変されているが、依然として本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼの生物学的活性を保持する本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。変種は、例えば、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、ＧＳＳＭ及びこれらの任意の組合せのような方法を含む、幾つかの方法により産生できる。
【００７４】
本発明の核酸は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、ＰＣＲによるメッセージ又はゲノムＤＮＡの増幅などによって、作製、単離及び／又は操作することができる。例えば、本発明の例示的な配列は、当初は環境供給源に由来する。したがって、一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸及びそれらによってコードされるポリペプチドを提供し、これらは共通の供給源、例えば環境、混合培養物又は細菌供給源に由来する点において共通の新規性を有する。
本発明の方法を実施するに際し、相同遺伝子は、本明細書で記載されているように、鋳型核酸を操作することによって改変できる。本発明は、化学及び特許文献で十分に記載されている、当該技術で既知の方法又はプロトコール又は装置のいずれかにより実施することができる。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、語句「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくはこれらのいずれかのフラグメントを意味するか、又は一本鎖若しくは二本鎖であることができ、センス若しくはアンチセンス（相補的）鎖を表すことができるゲノム由来若しくは合成のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は由来が天然若しくは合成である任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様材料を意味する。語句「核酸」又は「核酸配列」には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくはこれらのいずれかのフラグメントが含まれ、又は一本鎖若しくは二本鎖であってよくセンス若しくはアンチセンス鎖を表し得るゲノム由来若しくは合成のＤＮＡ若しくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）が含まれ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は例えば、ｉＲＮＡ、リボ核タンパク質（例えば、二本鎖ｉＲＮａ、例えばｉＲＮＰ）を含む、天然由来若しくは合成の任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様材料が含まれる。この用語は、核酸、すなわち、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含する（例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照すること）。「オリゴヌクレオチド」には、化学的に合成できる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれも含まれる。そのような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、したがって、キナーゼの存在下でＡＴＰによりリン酸を付加しないと、別のオリゴヌクレオチドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結することができる。
【００７６】
特定のポリペプチド又はタンパク質の「コード配列」又はそれを「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それは、コード領域の前後に領域（リーダー及びトレイラー）を含み、並びに当てはまる場合には、個別のコードセグメント（エクソン）の間に介在配列（イントロン）を含む。プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始するＤＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写するとき、コード配列に「機能的に結合」している。本明細書で使用されるとき、「機能的に結合」しているとは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的な関係を意味する。これは、転写調節配列と転写される配列の機能的な関係を意味することができる。例えば、プロモーターは、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、本発明の核酸のようなコード配列に機能的に結合している。一般に、転写配列に機能的に結合しているプロモーター転写調節配列は、転写された配列と物理的に隣接しており、すなわち、これらはシス作用性である。しかし、エンハンサーのような幾つかの転写調節配列は、それらが転写を強化しようとするコード配列に物理的に隣接しているか又は近接して配置される必要はない。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、用語「発現カセット」は、ヌクレオチド配列に適合性のある宿主において、構造遺伝子（すなわち、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のようなタンパク質コード配列）の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、少なくともポリペプチドコード配列に機能的に結合するプロモーター、及び場合により他の配列、例えば転写終結シグナルが含まれる。例えば、エンハンサー、アルファ因子のような発現を実施するのに必要であるか又は助けになる追加の因子を使用することもできる。したがって、発現カセットには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなども含まれる。「ベクター」には、細胞に感染、トランスフェクト、一過性又は永久的に形質導入することができる核酸が含まれる。ベクターは、裸の核酸、又はタンパク質若しくは脂質と複合体を形成した核酸でありうることが理解される。ベクターは、場合により、ウイルス若しくは細菌の核酸及び／若しくはタンパク質、並びに／又は膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ベクターには、ＤＮＡフラグメントが結合し複製できるようになったレプリコン（例えばＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が含まれるが、これらに限定はされない。したがって、ベクターには、自律的自己複製性環状又は直鎖状のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照すること）が含まれるが、これらに限定はされず、発現と非発現の両方のプラスミドが含まれる。組換え微生物又は培養細胞が「発現ベクター」の宿主として記載されている場合は、このベクターには、染色体外環状及び直鎖状ＤＮＡと、宿主染色体に取り込まれたＤＮＡの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持される場合、ベクターは、自律性構造物として有糸分裂時に細胞により安定的に複製されることができるか、又は宿主のゲノム内に取り込まれている。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え」は、その天然の環境では隣接していない「骨格」核酸に隣接する核酸を包含する。一つの特徴において、「濃縮」されているためには核酸は核酸骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約５％以上を表す。本発明の骨格分子には、発現ベクター、自律的複製核酸、ウイルス、組み込み核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用される他のベクター又は核酸のような核酸が含まれる。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約１５％以上を表す。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約５０％以上を表す。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約９０％以上を表す。
【００７９】
本発明の一つの態様は、本発明の配列の１つ、又は本発明の核酸の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続した塩基を含むフラグメントを含む単離若しくは組換え核酸である。単離又は組換え核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが挙げられるＤＮＡを含むことができる。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖である場合は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であることができる。あるいは、単離又は組換え核酸はＲＮＡを含む。
本発明の単離又は組換え核酸は、本発明のポリペプチドの１つを調製するために、又は本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントを調製するために使用できる。したがって、本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドの１つをコードする、又は本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つをコードする単離又は組換え核酸である。これらの核酸のコード配列は、本発明の核酸の１つのコード配列の１つと同一であることができるか、或いは、遺伝子コードの重複又は縮重の結果、本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を有する本発明の１つのフラグメントをコードする、異なるコード配列であることができる。遺伝子コードは、当業者には周知であり、例えば、B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997の２１４頁で得ることができる。
【００８０】
本発明のポリペプチドをコードする核酸には、本発明の核酸のコード配列、及びリーダー配列又はプロタンパク質配列のような追加のコード配列、及びイントロンのような又はコード配列の5'及び／若しくは3'非コード配列のような非コード配列が含まれるが、これらに限定はされない。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチド、並びに追加のコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
一つの特徴において、本発明の核酸配列には、部位特異的変異導入のような従来の技術、又は当業者に慣用の他の技術を使用して変異を導入し、本発明のポリヌクレオチドにサイレント変化を導入する。本明細書で使用されるとき、「サイレント変化」には、例えば、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を変えない変化が含まれる。そのような変化は宿主生物で頻繁に起こり、コドン又はコドン対の導入によりポリペプチドをコードするベクターを含有する宿主細胞により産生されるポリペプチドのレベルを増加するために、望ましい場合がある。
【００８１】
本発明は、また、本発明のポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすヌクレオチドの変化を有する、ポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチドの変化は、部位特異的変異導入、ランダム化学変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失及び他の組換えＤＮＡ技術のような技術を使用して導入することができる。あるいは、そのようなヌクレオチドの変化は、本明細書で提供される高度、中程度又は低度のストリンジェントな条件下で、本発明の配列（またはこれに相補的な配列）の１つの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続した塩基を含むプローブに特異的にハイブリダイズする核酸を同定することにより単離される、天然に存在する対立変種であり得る。
【００８２】
一般的技術
本発明を実施するのに使用される核酸は、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス又はそれらのハイブリッドであっても、多様な供給源から単離すること、遺伝子的に操作すること、増幅すること、及び／又は組み替えにより発現／生成することができる。これらの核酸から生成される組換えポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）は、個別に単離又はクローン化すること、及び所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含む、任意の組換え発現系を使用することができる。
あるいは、これら核酸は、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859;米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているように、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。
【００８３】
核酸を操作する技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えば、クレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学及び特許文献に十分に記載されている（例えば、Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照すること）。
【００８４】
本発明の方法の実施に使用される核酸を入手及び操作するのに有用な別の手段は、ゲノム試料からのクローン化、及び望ましい場合には、例えばゲノムクローン若しくはｃＤＮＡクローンから単離又は増幅した挿入物のスクリーニング及び再クローン化である。本発明の方法で使用される核酸の供給源には、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）（例えば、米国特許第５，７２１，１１８号、同第６，０２５，１５５号を参照すること）、ヒト人工染色体（例えば、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335を参照すること）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体（例えば、Woon (1998) Genomics 50:306-316を参照すること）、Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ）（例えば、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照すること）、コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミドに含まれるゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーが含まれる。
【００８５】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列と共に適切な態様で構築される。
本発明は、融合タンパク質及びそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドを、安定性の増強又は精製の簡便化のような所望の特性を付与する、Ｎ−末端識別ペプチドのような異種ペプチド又はポリペプチドと融合させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドは、例えば、より強い免疫原性をもつペプチドを産生する、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離する、抗体及び抗体発現Ｂ細胞を同定及び単離するなどのために、それらに結合した１つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成及び発現させることもできる。検出及び精製を容易にするドメインには、例えば、固定化金属上での精製を可能にするポリヒスチジン鎖及びヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immunex Corp, Seattle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインとモチーフ含有ペプチド又はポリペプチドとの間に、Ｘａ因子又はエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）のような切断可能リンカー配列を含めることは、精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、６個のヒスチジン残基と、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位に結合したエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば、Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414を参照すること）。ヒスチジン残基は、検出及び精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター及び融合タンパク質の適用に関する技術は、科学及び特許文献に十分に記載されている（例えば、Kroll  (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53を参照すること）。
【００８６】
転写及び翻訳制御配列
本発明は、ＲＮＡ合成／発現を誘導又は調節するために発現（例えば、転写又は翻訳）制御配列、例えばプロモーター又はエンハンサーに機能的に結合した本発明の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を提供する。発現制御配列は、発現ベクターに存在することができる。例示的な細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ及びマウスのメタロチオネインＩが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」には、細胞、例えば植物又は動物細胞においてコード配列の転写を駆動できる全ての配列が含まれる。したがって、本発明の構築物で使用されるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミング及び／又は速度の調節又は調整に関与するシス作用性転写制御エレメント及び調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、転写調節に関わる、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、5'及び3'非翻訳領域又はイントロン配列を含むシス作用性転写制御エレメントであることができる。これらのシス作用性配列は、タンパク質又は他の生物学的分子と相互作用して、転写（転写のＯＮ／ＯＦＦ、調節又は調整など）を実行する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で、及び生育又は細胞分化の状態で連続的に発現を駆動するプロモーターである。「誘導性」又は「調節可能」プロモーターは、環境条件又は生育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。誘導性プロモーターにより転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気的条件、高温、乾燥又は光の存在が含まれる。
【００８７】
「組織特異的」プロモーターは、例えば植物又は動物の特定の細胞又組織又は器官でのみ活性がある転写制御エレメントである。組織特異的調節は、所定の組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子が発現することを確実にする特定の固有因子によって達成できる。そのような因子は、哺乳動物及び植物に存在し、特定の組織を発達させることが知られている。
細菌でのポリペプチド発現に適切なプロモーターには、E. coliのｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、及びマウスのメタロチオネインＩプロモーターが含まれる原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターも使用することができる。細菌でのポリペプチド又はそのフラグメントの発現に適切なプロモーターには、 E. coliのｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰRプロモーター、ラムダＰLプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真菌プロモーターには、α因子プロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、及びマウスのメタロチオネインＩプロモーターが含まれる。原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターも使用することができる。
【００８８】
組織特異的植物プロモーター
本発明は、組織特異的な方法で発現させることができる、例えば組織特異的な方法で、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発現させることができる発現カセットを提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を組織特異的な方法で発現する植物又は種子も提供する。組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的などであることができる。
用語「植物」には、植物体全体、植物の部分（例えば、葉、茎、花、根など）、植物のプロトプラスト、種子及び植物細胞、並びにこれらの子孫が含まれる。本発明の方法で使用できる植物の部類は、一般的に、形質転換技術を施しやすい高等植物の部類と同様に広く、被子植物（単子葉及び双子葉植物）並びに裸子植物が含まれる。これには、倍数体、二倍体、半数体及び半接合状態が挙げられる多様な倍数性レベルを有する植物が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック植物」には、異種核酸配列、例えば本発明の核酸及び種々の組換え構築物（例えば、発現カセット）が挿入された植物又は植物細胞が含まれる。
【００８９】
一つの特徴において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターを、植物若しくは種子の特定の部分又は植物全体における発現に使用することができる。例えば、過剰発現のために、植物の幾つかの又は全ての組織、例えば再生植物で核酸の発現を誘導する植物プロモーターフラグメントを用いることができる。そのようなプロモーターは、本明細書では「構成的」プロモーターと呼ばれ、ほとんどの環境条件下及び生育又は細胞分化状態で活性である。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来１’−又は２’−プロモーター、及び当業者に既知の種々の植物遺伝子の他の転写開始領域が含まれる。そのような遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のＡＣＴ１１（Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139）;ArabidopsisのＣａｔ３（GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203）；アブラナ（Brassica napus）のステアロイル−アシル担体タンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176);トウモロコシのＧＰｃ１（GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208:551-565);トウモロコシのＧｐｃ２（GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112);米国特許第４，９６２，０２８号、同第５，６３３，４４０号に記載された植物プロモーターが含まれる。
【００９０】
本発明は、ウイルス由来の組織特異的又は構成的プロモーターを使用する。これは、例えば、トバモウイルスのサブゲノムプロモーター（Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683）；感染したイネの師部細胞でのみ複製し、強力な師部特異的レポーター遺伝子発現を駆動するプロモーターを有する、イネのツングロかん菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）；維管束エレメント、葉の葉肉細胞及び根の先端で最も強い活性を有する、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣＶＭＶ）プロモーター（Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139）を含む得る。
一つの特徴において、植物プロモーターは、特定の組織、器官又は細胞型においてセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現核酸の発現を誘導するか（すなわち、組織特異性プロモーター）、そうでなければ、より厳密な条件下若しくは生育制御下、又は誘導性プロモーターの制御下で前記発現を誘導し得る。転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気性条件、高温、光の存在、又は化学物質／ホルモンの噴霧が含まれる。例えば、本発明には、トウモロコシの乾燥誘導性プロモーター（Busk (1997) supra）；ジャガイモの低温、乾燥及び高塩誘導性プロモーター（Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897 909）が組み込まれる。
【００９１】
一つの特徴において、組織特異的プロモーターは、組織内において生育段階の一定の期間内でのみ転写を促進する。例えば、ArabidopsisのＬＥＡＦＹ遺伝子のプロモーターを特徴決定する、Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800を参照すること。また、A. thalianaの花の分裂組織同一性遺伝子ＡＰ１のプロモーター領域中の保存配列モチーフを認識する転写因子ＳＰＬ３について記載している、Cardon (1997) Plant J 12:367-77、及び分裂組織プロモーターｅＩＦ４について記載している、 Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004を参照すること。特定の組織の生活環の全体を通して活性である組織特異的プロモーターを使用することができる。一つの特徴において、本発明の核酸は、主に綿繊維細胞でのみ活性であるプロモーターに機能的に結合している。一つの特徴において、本発明の核酸は、例えばRinehart (1996) supraに記載されているように、主に綿繊維細胞の伸張期間に活性であるプロモーターに機能的に結合する。核酸は、綿繊維細胞で優先的に発現されるＦｂｌ２Ａ遺伝子プロモーターに機能的に結合することができる（同書）。また、綿繊維細胞特異的プロモーター及びトランスジェニック綿植物を構築する方法が記載されている、John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al.、米国特許第５，６０８，１４８号及び同第５，６０２，３２１号を参照すること。根特異的プロモーターを本発明の核酸の発現に使用することもできる。根特異的プロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが含まれる（DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60）。本発明の核酸を発現するのに使用できる他のプロモーターには、例えば、胚珠特異的、胚特異的、内胚葉特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモーター又はこれらの幾つかの組合せ；葉特異的プロモーター（例えば、トウモロコシの葉特異的プロモーターが記載されている、Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295を参照すること）；アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のＯＲＦ１３プロモーター（根で高い活性を示す。例えばHansen (1997) supraを参照すること）；トウモロコシの花粉特異的プロモーター（例えば、Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168を参照すること）；果実成熟時、葉及び頻度は低いが花の老化及び離脱時に活性であるトマトのプロモーター（例えば、Blume (1997) Plant J. 12:731 746を参照すること）；ジャガイモのＳＫ２遺伝子のめしべ特異的プロモーター（例えば、 Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431を参照すること）；トランスジェニックアルファルファの栄養及び花茎頂の表皮組織で活性であり、活発に生長しているシュート又は繊維の表皮層で外来遺伝子の発現を標的にするのに有用なツールとなる、エンドウマメのＢｌｅｃ４遺伝子；珠皮特異的ＢＥＬ１遺伝子（例えば、Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944を参照すること）；並びに／又は、分裂組織及び／若しくは急速に分裂している細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモーター領域について記載している、米国特許第５，５８９，５８３号（Klee）のプロモーターが含まれる。
【００９２】
一つの特徴において、本発明の核酸を発現させるためにオーキシンのような植物ホルモンへの暴露により誘導することができる植物プロモーターが使用される。例えば、本発明は、ダイズ（Glycine max L.）のオーキシン応答エレメントＥ１プロモーターフラグメント（ＡｕｘＲＥ）（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）；オーキシン応答ArabidopsisＧＳＴ６プロモーター（サリチル酸及び過酸化水素にも反応性である）（Chen (1996) Plant J. 10: 955-966）；タバコのオーキシン誘導性ｐａｒＣプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913)）；植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）；及びストレスホルモンアブシジン酸に応答するプロモーター（Sheen (1996) Science 274:1900-1902）を使用することができる。
【００９３】
本発明の核酸は、除草剤又は抗生物質のような、植物に適用できる化学試薬への暴露により誘導することができる植物プロモーターに機能的に結合していることもできる。例えば、ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される、トウモロコシのＩｎ２−２プロモーターを使用することができ（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）、異なる除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、及び茎頂分裂組織での発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばAvena sativa L.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むタバコのトランスジェニック植物について記載されたように（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）、例えばテトラサイクリン誘導プロモーターの制御下に、又はサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下に置くことができる。化学的に（例えばホルモン又は殺虫剤によって）誘導されるプロモーター、すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に対して応答するプロモーターを使用して、本発明のポリペプチドの発現を、植物の生育の特定の段階で誘導することができる。したがって、本発明は、また、その宿主域が、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ダイズ、トマト、コムギ、ジャガイモ又は他の農作物のような標的植物種に限定される、農作物の任意の生育段階で誘導可能な本発明のポリペプチドをコードする誘導性遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。
当業者は、組織特異的植物プロモーターが、標的組織以外の組織で機能的に結合した配列の発現を駆動することができることを理解するであろう。したがって、一つの特徴において、組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型で優先的に発現を駆動するが、他の組織でも同様にある程度の発現をもたらすことができるプロモーターである。
【００９４】
本発明の核酸は、化学試薬への暴露により誘導される植物プロモーターに機能的に結合することもできる。これらの試薬には、例えば、除草剤、合成オーキシン又は抗生物質が含まれ、これらはトランスジェニック植物に適用すること、例えば噴霧することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素産生核酸の誘導性発現によって、栽培者は最適なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ発現及び／又は活性を有する植物を選択することが可能になる。したがって植物の部分の生育を制御することができる。このようにして、本発明は、植物及び植物の部分の収穫を促進する手段を提供する。例えば、様々な実施態様において、ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される、トウモロコシのＩｎ２−２プロモーターが使用され（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）、異なる除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、及び茎頂分裂組織での発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列は、また、例えばAvena sativa L.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含有するタバコのトランスジェニック植物について記載されたように（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）、テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下、又はサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下である。
幾つかの態様において、適切なポリペプチド発現には、コード領域の３’末端のポリアデニル化領域を必要とする場合がある。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、多様な他の植物（若しくは動物、若しくは他の）遺伝子、又はアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの遺伝子に由来することができる。
【００９５】
発現ベクター及びクローニングビヒクル
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする配列を含む発現ベクター及びクローニングビヒクルを提供する。本発明の発現ベクター及びクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びＳＶ４０の誘導体）、Ｐ１系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、並びに目的の特定宿主（例えば、バチルス、アスペルギルス及び酵母）に特異的な他の任意のベクターを含むことができる。本発明のベクターは、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列を含むことができる。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。例示的なベクターには、細菌系：pQE（商標）ベクター（Qiagen）、pBLUESCRIPT（商標）プラスミド、pＮＨベクター、（ラムダ−ＺＡＰベクター（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Pharmacia）；真核細胞系：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Pharmacia）が含まれる。しかし、あらゆる他のプラスミド又は他のベクターも、それらが宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用することができる。低コピー数又は高コピー数ベクターを、本発明において用いることができる。「プラスミド」は、市販されているか、制限なく公的に入手可能であるか、又は発表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。本明細書に記載されたものと同等なプラスミドが当該技術で既知であり、当業者には明白である。
【００９６】
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含むことができる。ベクターは、発現を増幅させるために、適切な配列を含むこともできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むことができる。幾つかの態様において、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
一つの特徴において、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。そのような選択可能なマーカーには、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、E. coliではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS. cerevisiaeのＴＲＰ１遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、望ましい任意の遺伝子から選択することができる。
【００９７】
一つの特徴において、真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるベクターは、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含む。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、長さが約１０〜約３００bpであることができる。これらはプロモーターに作用してその転写を高めることができる。例示的なエンハンサーには、複製起点の後期側１００bp〜２７０bpにあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる
核酸配列を多様な手順によってベクターに挿入することができる。一般に、配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。例えばAusubel and Sambrookに記載されているように、多様なクローニング技術が当該技術で既知である。そのような手順及び他の手順は、当業者の技術範囲内であると認められる。
【００９８】
ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子又はファージの形態をであることができる。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主で使用される多様なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えばSambrookに記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、周知のクローニングベクターのｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、ＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７の遺伝子エレメントを含む、市販のプラスミドが含まれる。具体的な真核細胞ベクターには、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Pharmacia）が含まれる。しかし、任意の他のベクターを、宿主細胞内で複製可能かつ生存可能である限り使用することができる。
【００９９】
本発明の核酸を、発現カセット、ベクター又はウイルスで発現させることができ、植物細胞及び種子で一過性又は安定的に発現させることができる。一つの例示的な一過性発現系は、エピソーム発現系、例えば、スーパーコイルＤＮＡを含むエピソームミニ染色体の転写によって核内で生成されるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）のウイルスＲＮＡを使用する（例えば、Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637を参照すること）。あるいは、コード配列、すなわち本発明の配列の全又は部分フラグメントを植物宿主細胞ゲノムに挿入して、宿主染色体ＤＮＡの一部分となることができる。センス又はアンチセンス転写物を、この方法で発現させることができる。本発明の核酸からの配列（例えば、プロモーター又はコード配列）を含むベクターは、植物細胞又は種子に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことができる。例えば、マーカーは、殺生剤耐性、例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性のような抗生物質耐性、又はクロロスルフロン若しくはBasta対する耐性のような除草剤耐性をコードすることができる。
【０１００】
植物で核酸及びタンパク質を発現することができる発現ベクターは、当該技術で周知であり、例えば、Agrobacterium spp、ジャガイモウイルスＸ（例えば、Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684を参照すること）、タバコモザイクウイルス（例えば、Casper (1996) Gene 173:69-73を参照すること）、トマトブッシースタントウイルス（例えば、Hillman (1989) Virology 169:42-50を参照すること）、タバコエッチウイルス（例えば、Dolja (1997) Virology 234:243-252を参照すること）、ビーンゴールデンモザイクウイルス（例えば、Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476を参照すること）、カリフラワーモザイクウイルス（例えば、Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101を参照すること）、トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子（例えば、Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161194を参照すること）、及びトウモロコシサプレッサー−ミューテーター（Ｓｐｍ）転移因子（例えば、Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725を参照すること）、並びにこれらの誘導体のベクターを含むことができる。
【０１０１】
一つの特徴において、発現ベクターは、２つの生物、例えば、発現のため哺乳動物細胞又は昆虫細胞で維持され、クローニング及び増幅のために原核細胞宿主で維持されることが可能なように、２つの複製系を有することができる。更に、組み込み発現ベクターでは、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同性のある少なくとも１つの配列を含むことができる。この発現ベクターは、発現構築物にフランキングする２つの相同性配列を含むことができる。組み込みベクターは、ベクター内に含まれる適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特定の座位を指向することができる。組み込みベクターのための構築物は、当該技術でよく知られている。
本発明の発現ベクターは、形質転換された細菌株の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含むこともでき、例えば、遺伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性にする遺伝子である。選択可能なマーカーは、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路の遺伝子のような、生合成遺伝子を含むこともできる。
【０１０２】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に機能的に結合して、ＲＮＡ合成を誘導する。特に指定される細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰR、ＰL及びｔｒｐが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ及びマウスのメタロチオネインＩが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者の技能の範囲内である発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含むこともできる。ベクターは、発現を増幅させるために、適切な配列を含むこともできる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用して、望ましい任意の遺伝子から選択できる。加えて、一つの態様において、発現ベクターは、真核細胞培養においてジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性のような形質転換宿主細胞を選択するための表現型特性を与えるため、又はE. coli.においてテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性を与えるため、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０１０３】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むこともできる。幾つかの態様において、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるベクターは、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、通常長さが約１０〜約３００bpである、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、その転写を高めるプロモーターとして作用する。例には、複製起点の後期側１００bp〜２７０bpにあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
加えて、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。そのような選択可能なマーカーには、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、E. coliではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS. cerevisiaeのＴＲＰ１遺伝子が含まれる。
【０１０４】
幾つかの態様において、本発明のポリペプチド又は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列と共に適切な局面で構築される。一つの態様において、核酸は、本発明のポリペプチド又は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つが、安定性の増強又は精製の簡便化のような所望の特性を付与するＮ−末端識別ペプチドのような異種ペプチド又はポリペプチドと融合する、融合ポリペプチドをコードすることができる。
【０１０５】
適切なＤＮＡ配列を、多様な手順でベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。多様なクローニング技術が、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）で開示されている。そのような手順及び他の手順は、当業者の技術範囲内であると認められる。
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であることができる。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主で使用される多様なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)に記載されている。
【０１０６】
宿主細胞及び形質転換細胞
本発明は、本発明の核酸配列、例えば本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする配列、又は本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者に周知の宿主細胞のいずれであってもよい。例示的な細菌細胞には、ストレプトミセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）若しくはバチルス（Bacillus）のいずれかの種、又は例示的な種の大腸菌（E. coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が含まれる。例示的な昆虫細胞には、ドロソフィラS2（Drosophila S2）及びスポドプテラSf9（Spodoptera Sf9）を含む、Spodoptera又はDrosophilaのいずれの種も含まれる。例示的な動物細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ若しくはボーズメラノーマ、又は任意のマウス若しくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主の選択は当業者の技能の範囲内である。多種多様な高等植物種を形質転換する技術は周知であり、技術及び科学文献に記載されている。例えば、Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477;米国特許第５，７５０，８７０号を参照すること。
【０１０７】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はＴｉ媒介遺伝子伝達を含む、多様な技術のうちのいずれを使用して宿主細胞に導入してもよい。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))。
一つの特徴において、本発明の核酸又はベクターは、スクリーニングのために細胞に導入され、したがって核酸はその後の核酸の発現に適した方法で細胞に入る。導入方法は、主に標的細胞型によって決定される。例示的な方法には、ＣａＰＯ4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えばLIPOFECTIN（商標））、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸は、宿主細胞ゲノムに（例えば、レトロウイルス導入により）安定的に組み込まれるか、又は細胞質に一過性若しくは安定的に存在することができる（すなわち、慣例的なプラスミドを使用し、標準的な調節配列、選択マーカーなどを利用する）。多くの医薬的に重要なスクリーニングでは、ヒト又はモデル哺乳動物細胞の標的が必要なので、そのような標的にトランスフェクトすることができるレトロウイルスベクターを使用することができる。
【０１０８】
適切な場合には、操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように改変した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、適切な細胞密度に宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを、適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導し、細胞を更なる期間培養して所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段により破壊することができ、得られた粗抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者に周知である。発現されたポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて使用することができる。望ましい場合には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。
【０１０９】
宿主細胞内の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え生産手順で用いる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドは、また、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも、含まないこともある。
無細胞翻訳系を本発明のポリペプチドの産生に利用することもできる。無細胞翻訳系は、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用することができる。いくつかの態様において、ＤＮＡ構築物を、インビトロ転写反応を実施する前に直鎖化することができる。次に転写ｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物と共にインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生する。
発現ベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼのような形質転換宿主細胞を選択する表現型特性をもたらすため、又は真核細胞培養でネオマイシン耐性をもたらすため、又はE. coli.においてテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性をもたらすために、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。
目的のポリヌクレオチド、例えば本発明の核酸を含む宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように変更した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は遺伝子を増幅することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明白である。次に、特定の酵素活性を有することが同定されるクローンを配列決定して、高められた活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定することができる。 
【０１１０】
本発明は、本発明の核酸、例えば、少なくとも約１００個の残基の領域にわたって、本発明の例示的な配列と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞において、組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を過剰発現する方法を提供する。前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析により、若しくは目視検査により決定されるか、又は本発明の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列により決定される。過剰発現は、任意の方法、例えば高活性プロモーター、２シストロンベクターの使用により、又はベクターの遺伝子増幅により実施することができる。 
【０１１１】
本発明の核酸を、インビトロ又はインビボ発現系のいずれかで発現又は過剰発現させることができる。細菌、昆虫、酵母、真菌又は哺乳動物培養を含む任意の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現又は過剰発現させることができる。過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、ベクター（例えば、レプリコンベクター、２シストロンベクターの使用（例えば、Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8を参照すること））、媒質、培養系などを適切に選択することによって実施できる。一つの態様において、細胞系における選択マーカー、例えばグルタミンシンセターゼ（例えば、Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63を参照すること）を用いた遺伝子増幅を使用して、本発明のポリペプチドを過剰発現する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者に周知の宿主細胞のいずれであってもよい。適切な宿主の選択は当業者の技能の範囲内である。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はＴｉ媒介遺伝子伝達を含む、多様な技術のうちのいずれを使用して宿主細胞に導入してもよい。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))。
【０１１２】
適切な場合には、操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように変更した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、適切な細胞密度に宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを、適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導することができ、細胞を更なる期間培養して、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段により破壊することができ、得られた粗抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者に周知である。発現されたポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して、必要に応じて使用することができる。望ましい場合には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。
多様な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物発現系の例には、サル類腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman, Cell, 23:175, 1981に記載されている）、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株のような同等のベクターからタンパク質を発現することできる他の細胞株が含まれる。
【０１１３】
宿主細胞内の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子生成物を産生することができる。組換え産生手順で用いる宿主細胞に依存して、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることもされないこともある。本発明のポリペプチドは、また、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも、含まないこともある。
あるいは、例えば下記で考察されるような従来のペプチド合成により、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含む本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成的に作製することができる。他の特徴において、ポリペプチドのフラグメント又は一部分を用いて、ペプチド合成により対応する完全長ポリペプチドを作製することができ、したがって、完全長ポリペプチドを作製する中間体としてこれらのフラグメントを用いることができる。
ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に結するプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用して、無細胞翻訳系を用いて本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むそのフラグメントの１つを作製することもできる。いくつかの特徴において、インビトロ転写反応を実施する前にＤＮＡ構築物を直鎖化することができる。次に転写ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物と共にインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生する。
【０１１４】
核酸の増幅
本発明を実施するに際し、本発明の核酸、及び本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸、又は本発明の改変核酸を、増幅、例えばＰＣＲによって複製することができる。増幅は、本発明の核酸のクローン化又は改変にも使用することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供する。当業者は、これらの配列の任意の部分又は完全長のために増幅プライマー配列対を設計することができる。
【０１１５】
一つの特徴において、本発明は、本発明の増幅プライマー対により、例えば本発明の核酸の最初（５’）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基、及びその相補鎖の最初（５’）の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載されるプライマー対により増幅される核酸を提供する。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供し、前記プライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の１つ又はそれぞれのメンバーは、配列の少なくとも約１０〜５０個若しくはそれ以上の連続する塩基、又は配列の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、増幅プライマー対を提供し、前記プライマー対は、本発明の核酸の最初（’５）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第１のメンバーと、第１メンバーの相補鎖の最初（’５）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第２のメンバーとを含む。
【０１１６】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばＰＣＲによる、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。一つの態様において、増幅プライマー対は、ライブラリーから、例えば環境ライブラリーのような遺伝子ライブラリーから核酸を増幅する。
【０１１７】
増幅反応は、試料中の核酸の量（例えば、細胞試料中のメッセージの量）の定量化、核酸の標識化（例えば、核酸をアレイ又はブロットに適用する）、核酸の検出、又は試料中の特定の核酸の量の定量化のために使用することができる。本発明の一つの特徴において、細胞又はｃＤＮＡライブラリーから単離したメッセージが増幅される。
当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択及び設計することができる。増幅方法は、また、当該技術で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)及びPCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.を参照すること）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117を参照すること）、転写増幅（例えば、 Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173を参照すること）、自己持続性配列複製（例えば、 Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874を参照すること）、Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491を参照すること）、自動Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271を参照すること）、及び他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontarioを参照すること）が含まれる（また、Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; 米国特許第第4,683,195号及び同第4,683,202号; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564を参照すること）。
【０１１８】
核酸及びポリペプチドの配列同一性の決定
本発明は、本発明の例示的な核酸（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）と、少なくとも約５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性（相同性）を有する配列を含む核酸を提供する。本発明は、本発明の例示的なポリペプチド（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを提供する。前記配列同一性（相同性）の程度は、ＢＬＡＳＴ  ２．２．２又はＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８のような本明細書に記載されたものを含む、任意のコンピュータプログラム及び付属のパラメーターを初期設定値パラメーターと共に使用して、決定することができる。
【０１１９】
本発明の核酸配列は、本発明の例示的な配列及びそれと実質的に同一の配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸の相同性の配列及びフラグメントは、これらの配列と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性（相同性）を有する配列を指すことができる。前記相同性（配列同一性）は、初期設定値パラメーターを伴うＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８を含む、本明細書に記載された任意のコンピュータプログラム及びパラメーターを使用して決定することができる。相同性配列は本発明の核酸配列においてチミンがウリジンに代わっているＲＮＡ配列も含む。相同性配列は本明細書に記載されている任意の手順を使用して得ることができるか、シークェンシングエラーの修正からも生じ得る。本明細書の核酸配列は、伝統的な一文字様式（Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照すること）又は配列内のヌクレオチドの実体を記録する他の任意の様式で表現することができることが理解される。
【０１２０】
多様な特徴において、本明細書で確認された配列比較プログラムを、本発明のこの特徴において、すなわち、核酸又はポリペプチド配列が本発明の範囲内であるかを決定するために使用される。しかし、タンパク質及び／又は核酸配列同一性（相同性）は、当該技術で既知の任意の配列比較アルゴリズム又はプログラムを使用して評価することができる。そのようなアルゴリズム又はプログラムには、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＣＬＵＳＴＡＬＷが含まれるが、決してこれらに限定はされない（例えば、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993を参照すること）。
【０１２１】
一つの特徴において、相同性又は同一性は、配列分析ソフトウエアを使用して測定される（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705を参照すること）。そのようなソフトウエアは、種々の欠失、置換及び他の改変に対する相同性の程度を決めることにより、類似の配列をマッチさせる。一つの特徴において、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して用語「相同性」及び「同一性」は、比較ウインドウ又は指定の領域上で、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用するか又は手動アラインメント及び目視検査により測定にして最大一致を求めて比較及びアラインメントを実施したとき、同じであるか又は特定の率のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドが同じである２つ以上の配列を意味する。一つの態様において、配列比較では、一方の配列は基準配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び基準配列はコンピュータに入力され、必要な場合には部分配列同等物が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。初期設定値プログラムパラメーターを使用することができるか、又は代替パラメーターを指定することもできる。次に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一率を計算する。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、「比較ウインドウ」には、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される隣接位置の数の任意の数のセグメントに対する参照が含まれ、配列を、２つの配列の最適アラインメントが実施された後、同じ数の隣接位置の基準配列と比較することができる。配列比較のアラインメントを実施する方法は当該技術でよく知られている。配列比較のための最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970の相同性アラインメントアルゴリズム、person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）又は手動アラインメントと目視検査により実施することができる。相同性又は同一性を決定する他のアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）に加えて、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、ＡＭＰＳ(Protein Multiple Sequence Alignment)、ＡＳＳＥＴ(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ(Biological Sequence Comparative Analysis Node)、ＢＬＩＭＰＳ(BLocks IMProved Searcher)、ＦＡＳＴＡ、Intervals & Points、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Smith-Watermanアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Las Vegasアルゴリズム、ＦＮＡＴ(Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ(Fristensky Sequence Analysis Package)、ＧＡＰ(Global Alignment Program)、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、GenQuest、ＩＳＳＣ(Sensitive Sequence Comparison)、ＬＡＬＩＧＮ(Local Sequence Alignment)、ＬＣＰ(Local Content Program)、ＭＡＣＡＷ(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench)、ＭＡＰ(Multiple Alignment Program)、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、ＳＡＧＡ(Sequence Alignment by Genetic Algorithm)及びＷＨＡＴ−ＩＦが含まれる。そのようなアラインメントプログラムを、ゲノムデータベースをスクリーニングするために使用して、実質的同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定することもできる。多数のゲノムデータベースが入手可能であり、例えば、ヒトゲノムの実質的な部分が、 Human Genome Sequencing Project  (Gibbs, 1995)の一部として入手可能である。例えば、M. genitalium (Fraser et al., 1995)、M. jannaschii (Bult et al., 1996)、H. influenzae (Fleischmann et al., 1995)、E. coli (Blattner et al., 1997)及び酵母(S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997)並びにD. melanogaster (Adams et al., 2000)を含む、少なくともの２１個の他のゲノムが既に配列決定されている。また、顕著な進展が、マウス、C. elegans及びArabadopsis sp.ようなモデル生物体のゲノムの配列決定において起きている。幾つかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含む幾つかのデータベースが、種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【０１２３】
一つの特徴において、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが使用され、これらは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列内の長さがＷの短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（ＨＳＰ）を最初に同定し、これは、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するか又はいくらかの正の値をもつ閾値スコアＴの条件を満たす。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., supra）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索開始のシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下降したとき；累積スコアが、１つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために０若しくはそれ以下になったとき；又はどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定値として１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照すること）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【０１２４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、また、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993を参照すること）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される一つの類似性測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然によって生じる確率を示す。例えば、試験核酸と基準核酸の比較で最小合計確率が約０．２未満、更に一つの態様では、約０．０１未満、更には一つの態様において約０．００１未満である場合、核酸は基準配列と類似であると考えられる。
【０１２５】
一つの態様において、タンパク質及び核酸配列の相同性は、Basic Local Alignment Search Tool（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価される。特に、５つの特別なＢＬＡＳＴプログラムを使用して以下のタスクを実施することができる：
（１）ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴ３は、アミノ酸の問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドの問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸは、問い合わせヌクレオチド配列（その両方の鎖）の仮想的な６つのフレームの翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、問い合わせタンパク質配列（両方の鎖）を全ての６つの読み枠で翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；及び
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド問い合わせ配列の６つの読み枠翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６つの読み枠翻訳物と比較する。
【０１２６】
ＢＬＡＳＴプログラムは、類似のセグメントを同定することにより相同性のある配列を同定し、これは、本明細書では、問い合わせアミノ酸又は核酸配列と試験配列との間の「高スコアセグメント対」と呼ばれ、一つの態様では、タンパク質又は核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメント対は、一つの態様では、その多くが当該技術で既知であるスコアリングマトリックスにより同定される（すなわち、アラインメントが実施される）。一つの態様において、使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Gonnet (1992) Science 256:1443-1445; Henikoff and Henikoff (1993) Proteins 17:49-61）。一つの態様において、好ましさは劣るが、ＰＡＭ又はＰＡＭ２５０も使用することができる（例えば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships:  Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundationを参照すること）。ＢＬＡＳＴプログラムは、U.S. National Library of Medicineを通して利用可能である。 
上記のアルゴリズムで使用されるパラメーターは、研究される配列の長さ及び相同性の程度に応じて適合することができる。幾つかの態様において、パラメーターは、ユーザーからの指示が不在の場合では、アルゴリズムにより使用される初期設定値パラメーターであることができる。
【０１２７】
コンピュータシステム及びコンピュータプログラム製品
本発明は、本発明の核酸及びポリペプチド配列を記録又は記憶した、コンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。加えて、本発明の方法を実施するに際し、例えば、配列同一性（核酸が本発明の範囲内であるかを決定すること）、構造的相同性、モチーフなどをコンピュータシステムで決定及び同定するために、本発明の核酸又はポリペプチド配列を、コンピュータによって読み取り及びアクセスすることができる任意の媒体に記憶し、記録し、媒体により操作することができる。
【０１２８】
本明細書で使用されるとき、「記録」及び「記憶」という言葉は、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを意味する。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するあらゆる既知の方法を容易に適用して、本発明の１つ以上の核酸及び／又はポリペプチド配列を含む製品を生じることができる。本明細書で使用されるとき、用語「コンピュータ」、「コンピュータプログラム」及び「プロセッサ」は、最も広い一般的な状況において使用され、下記に詳細に記載されるような装置が全て組み込まれる。特定のポリペプチド又はタンパク質の「コード配列」又はそれを「コードする配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。
【０１２９】
本発明のポリペプチドは、本発明の例示的な配列、及びそれに実質的に同一の配列、並びに前記の配列のいずれかの部分配列（フラグメント）を含む。一つの特徴において、実質的に同一性又は相同性のポリペプチド配列は、本発明の例示的な配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性（相同性）を有するポリペプチド配列を意味する。
【０１３０】
相同性（配列同一性）は、本明細書に記載される任意のコンピュータプログラム及びパラメーターを使用して決定することができる。本発明の核酸又はポリペプチドを、コンピュータにより読み取り及びアクセスできる任意の媒体に記憶すること、記録すること、及び媒体で操作することができる。本明細書で使用されるとき、「記録」及び「記憶」という言葉は、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを意味する。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録する現在知られているいずれかの方法を容易に適用して、本発明の１つ以上の核酸配列、本発明の１つ以上のポリペプチド配列を含む製品を生じることができる。本発明の別の特徴では、本発明の少なくとも２、５、１０、１５若しくは２０個、又はそれ上の核酸又はポリペプチド配列を記録する、コンピュータ読み取り可能媒体である。
【０１３１】
本発明の別の特徴は、本発明の１つ以上の核酸配列が記録されているコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明の別の態様は、本発明の１つ以上のポリペプチド配列が記録されているコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明の別の態様は、上記の少なくとも２、５、１０、１５若しくは２０個、又はそれ上の核酸又はポリペプチド配列を記録する、コンピュータ読み出し可能媒体である。
コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体、及び磁気／光学媒体が含まれる。例えば、コンピュータ読み出し可能媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、又は読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、並びに当業者に既知の他のタイプの他の媒体であることができる。
【０１３２】
本発明の別の特徴には、システム（例えば、インターネットを利用したシステム）、例えば、本明細書に記載される配列情報を記憶し、操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム１００の一つの例が、図１のブロック線図に示されている。本明細書で使用されるとき、「コンピュータシステム」は、本発明の核酸配列のヌクレオチド配列、又は本発明のポリペプチド配列の分析に使用される、ハードウェア構成部分、ソフトウエア構成部分及びデータ記憶構成部分を意味する。一つの特徴において、コンピュータシステム１００は、配列データを処理し、それにアクセスし、それを操作するプロセッサを含む。プロセッサ１０５は、例えばIntel CorporationのPentium（登録商標）III又はSun、Motorola、Compaq、AMD若しくはInternational Business Machinesからの同様のプロセッサのような、周知のタイプの中央演算ユニットのいずれかであることができる。
【０１３３】
一つの特徴において、コンピュータシステム１００は汎用システムであり、プロセッサ１０５及びデータを記憶する１つ以上の内部データ記憶構成部分１１０、及びデータ記憶構成部分に記憶されたデータを検索する１つ以上のデータ検索装置を含む。当業者は、現在入手可能なコンピュータシステムのいずれも適していることを容易に理解することができる。
【０１３４】
一つの特定の特徴において、コンピュータシステム１００は、メインメモリー１１５（一つの態様では、ＲＡＭとして提供される）に接続しているバス接続したプロセッサ１０５、及び１つ以上の内部データ記憶装置１１０、例えばハードドライブ、及び／又はそれにデータが記録される他のコンピュータ読み出し可能媒体を含む。幾つかの態様において、コンピュータシステム１００は、更に、内部データ記憶装置１１０に記憶されたのデータを読み取るための１つ以上のデータ検索装置１１８を含む。
データ検索装置１１８は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、又は（例えば、インターネットを介した）遠隔データ記憶システムなどに接続することができるモデムを示すことができる。幾つかの態様において、内部データ記憶装置１１０は、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどのような取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体であり、制御ロジック及び／又はそれに記録されたデータを含む。コンピュータシステム１００は、有利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ記憶構成部分から制御ロジック及び／又はデータを読み出すための適切なソフトを含むか、又はソフトによってプログラムされることができる。
コンピュータシステム１００は、コンピュータのユーザーに出力結果を表示するために使用されるディスプレー１２０を含む。コンピュータシステム１００は、他のコンピュータシステム１２５ａ−ｃとネットワーク又は広域ネットワークで連結されて、コンピュータシステム１００への中央アクセスを提供することができることに留意するべきである。
【０１３５】
本発明の核酸配列のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列にアクセスし、処理するためのソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツール、及びモデリングツール）は、実行の際にはメインメモリー１１５に存在することができる。
幾つかの特徴において、コンピュータシステム１００は、更に、コンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較する配列比較アルゴリズムを含むことができる。「配列比較アルゴリズム」は、データ記憶手段内に記憶されている他のヌクレオチド配列及び／又は化合物とヌクレオチド配列を比較するために、コンピュータシステム１００に（端末又は遠隔端末から）提供される１つ以上のプログラムを意味する。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている本発明の核酸のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている基準配列と比較して、相同性又は構造モチーフを同定することができる。
【０１３６】
図２は、新たなヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較し、新たな配列とデータベースの配列との間の相同性のレベルを決定する方法２００の一つの態様を示す流れ図である。データベースの配列は、コンピュータシステム１００に記憶された個人的なデータベースであるか、又はインターネットを介して利用可能なジェンバンクのような公的なデータベースであることができる。
プロセス２００は、開始状態２０１で始まり、次に比較される新たな配列がコンピュータシステム１００のメモリーに記憶される状態２０２に移行する。上記で考察したように、メモリーは、ＲＡＭ又は内部記憶装置を含む任意のタイプのメモリーであることができる。
次にプロセス２００は、状態２０４に移行し、ここで配列のデータベースが分析及び比較のために開かれる。次にプロセス２００は、データベースに記憶されている第１の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態２０６に移行する。次に比較が状態２１０で実施され、第１の配列が第２の配列と同じであるかが決定される。この工程は、新たな配列とデータベースの第１の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。２つのヌクレオチド配列又はタンパク質配列を、たとえそれらが同一ではなくても比較する周知の方法は、当業者には既知である。例えば、ギャップを１つの配列に導入して、これら２つの試験配列間の相同性のレベルを高めることができる。比較の際にギャップ又は他の特徴を配列に導入するかどうかを制御するパラメーターは、通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。
【０１３７】
いったん２つの配列の比較が状態２１０で実施されたら、決定の状態２１０で２つの配列が同じかの決定が下される。当然のことながら、用語「同じ」は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーターの範囲内にある配列は、プロセス２００で「同じ」と示される。
２つの配列が同じであると決定が下されると、プロセス２００は状態２１４に移行し、ここで、データベースからの配列の名称がユーザーに表示される。この状態は、表示された名称の配列が入力した相同性の制約を満たすことをユーザーに知らせる。記憶配列の名称がいったんユーザーに表示されたら、プロセス２００はそれ以上の配列がデータベースに存在するかの決定が下される決定状態２１８に移行する。それ以上の配列がデータベースに存在しない場合には、プロセス２００は終了状態２２０で終了する。しかし、配列がデータベースに更に存在する場合はプロセス２００は状態２２４に移行し、ここでポインターは、データベースの次の配列に移動し、それを新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列がアラインメントを実施され、データベースのあらゆる配列と比較される。
配列が相同でないという決定が決定状態２１２で下された場合、プロセス２００は、直ちに決定状態２１８に移行し、データベース内に比較される他の配列が存在するかが決定されることに留意するべきである。
【０１３８】
したがって、本発明の一つの態様は、プロセッサ、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を記憶するデータ記憶装置、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と比較される基準ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列、及び比較を実施する配列コンペアラーを検索可能に記録するデータ記憶装置を含むコンピュータシステムである。配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すか、又は本発明の核酸配列若しくは本発明のポリペプチド配列の上記の核酸コードの構造モチーフを同定することができるか、或いは、これらの核酸コード及びポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。幾つかの態様において、データ記憶装置は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の配列を記憶することができる。
【０１３９】
本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と基準ヌクレオチド配列との間の相同性のレベルを決定する方法である。この方法には、相同性を決定するコンピュータプログラムの使用によって核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列との間の相同性レベルを決定することが含まれる。コンピュータプログラムは、本明細書に特に列挙されているもの（例えば、初期設定値パラメーター又は任意の変更パラメーターを伴うＢＬＡＳＴ２Ｎ）を含む、相同性レベルを決定する多数のコンピュータプログラムのいずれかであることができる。この方法は、上記に記載されたコンピュータシステムを使用して適用することができる。この方法は、コンピュータプログラムの使用により少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の上記の本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を読み取ること、及び核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列との間の相同性を決定することにより実施することもできる。
【０１４０】
図３は、２つの配列が相同であるかを決定するコンピュータ処理２５０の一つの態様を示す流れ図である。プロセス２５０は開始状態２５２で始まり、次に比較される第１の配列がメモリーに記憶される状態２５４に移行する。次に比較される第２の配列が状態２５６でメモリーに記憶される。次にプロセス２５０は状態２６０に移行し、そこで第１の配列中の第１の記号が読み取られ、次に状態２６２に移行し、そこで第２の配列の第１の記号が読み取られる。配列がヌクレオチド配列の場合、記号は通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ又はＵのいずれかであることが理解されるべきである。配列がタンパク質配列の場合は、一つの特徴では記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第１及び第２の配列を容易に比較することができる。
【０１４１】
次に２つの記号が同じであるかの決定が決定状態２６４で下される。それらが同じである場合、プロセス２５０は状態２６８に移行し、そこで第１及び第２の配列の次の記号が読み取られる。次に、次の記号が同じであるかの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス２５０は２つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の２つの記号が同じではないという決定が下された場合、プロセス２５０は決定状態２７４に移行して、いずれかの配列に読み取られる記号がそれ以上存在するかどうかが決定される。
読み取られる記号がそれ以上存在しない場合はプロセス２５０は状態２７６に移行し、そこで第１と第２の配列の間の相同性のレベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第１の配列内の記号の総数のうち同じであった配列間の記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第２の配列のあらゆる記号と最初の１００個のヌクレオチド配列のあらゆる記号とのアラインメントが達成された場合、相同性レベルは１００％となるであろう。
【０１４２】
あるいは、このコンピュータプログラムは、本発明に記載の核酸のヌクレオチド配列と１つ以上の基準ヌクレオチド配列とを比較して、本発明の核酸コードが１つ以上の位置で基準核酸配列と異なるか否かを決定するコンピュータプログラムであることができる。場合により、そのようなプログラムは基準ポリヌクレオチド又は本発明の核酸配列のいずれかの配列に対して、挿入、欠失又は置換されたヌクレオチドの長さ又は実体を記録する。一つの特徴において、このコンピュータプログラムは本発明の核酸配列が、基準ヌクレオチド配列に対して単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を含むかを決定するプログラムであることができる。 
【０１４３】
したがって、本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列が基準ヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドと異なっているかを決定する方法であって、核酸配列間の相違を同定するコンピュータプログラムの使用により核酸コード及び基準ヌクレオチド配列を読み取る工程、及びコンピュータプログラムにより核酸コードと基準ヌクレオチド配列の間の相違を同定する工程を含む。幾つかの態様において、このコンピュータプログラムは単一のヌクレオチド多型性を同定するプログラムである。この方法は、上記に記載されたコンピュータシステム及び図３に示された方法により適用することができる。この方法は、コンピュータプログラムの使用により少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の本発明の核酸配列及び基準ヌクレオチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コードと基準ヌクレオチド配列の間の相違を同定することによって実施することもできる。
【０１４４】
他の特徴において、コンピュータを使用するシステムは、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特徴を同定するアイデンティファイヤーを更に含むことができる。「アイデンティファイヤー」は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特定の特徴を同定する１つ以上のプログラムを意味する。一つの態様において、アイデンティファイヤーは、本発明の核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するプログラムを含むことができる。
【０１４５】
図４は、配列中に特徴が存在するかを検出するためのアイデンティファイヤ−プロセス３００の１つの特徴を示す流れ図である。プロセス３００は開始状態３０２で始まり、次に状態３０４に移行し、そこで特徴についてチェックされる第１の配列がコンピュータシステム１００のメモリー１１５に記憶される。次にプロセス３００は状態３０６に移行し、そこでで配列特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは、それぞれの特徴の属性リストを特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は「開始コドン」であり、その属性は「ＡＴＧ」でありうる。別の例では、特徴の名称は「ＴＡＡＴＡＡボックス」であり、特徴の属性は「ＴＡＡＴＡ」であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作製されている。あるいは、特徴は、アルファへリックス、ベータシートのような構造的なポリペプチドモチーフ又は酵素活性部位のような機能的ポリペプチドモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、又は当業者に既知の他のモチーフであることができる。
【０１４６】
いったん特徴のデータベースが状態３０６で開かれると、プロセス３００は状態３０８に移行し、そこで第１の特徴がデータベースから読み取られる。次に第１の特徴の属性と第１の配列との比較が状態３１０で実施される。次に特徴の属性が第１の配列内で見出されるかの決定が、決定状態３１６で下される。属性が見出された場合、プロセス３００は状態３１８に移行し、そこで見出された特徴の名称がユーザーに表示される
次にプロセス３００は決定状態３２０に移行し、そこでそれ以上の特徴がデータベースに存在するかの決定が下される。それ以上の特徴が存在しない場合には、プロセス３００は終了状態３２４で終了する。しかしそれ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス３００は状態３２６で次の配列特徴を読み取り、状態３１０に戻り、そこで次の特徴の属性が第１の配列に対して比較される。特徴の属性が決定状態３１６の第１の配列で見出されない場合、プロセス３００は決定状態３２０に直接移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するかを決定することに留意するべきである。
【０１４７】
したがって、本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特徴を同定する方法であって、特徴を同定するコンピュータプログラムの使用により核酸コード又はポリペプチドコードを読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード内の特徴を同定することを含む。一つの態様において、コンピュータプログラムは、オープンリーディングフレームを同定するコンピュータプログラムを含む。この方法は、コンピュータプログラムの使用により、単一の配列を読み取るか、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード又はポリヌクレオチドコードの特徴を同定することによって実施することもできる。
【０１４８】
本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を、種々のデータプロセッサプログラムにより多様な様式で記憶及び操作することができる。例えば、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を、Microsoft WORD（商標）又はWORDPERFECT（商標）のようなワードプロセッシングファイルでテキストとして、又はDB2（商標）、SYBASE（商標）又はORACLE（商標）のような当業者に周知の多様なデータベースプログラムでアスキーファイルとして記憶することができる。加えて、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを、配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、又は本発明の核酸配列若しくは本発明のポリペプチド配列と比較される基準ヌクレオチド配列若しくはポリペプチド配列の供給源として使用することができる。以下のリストは、本発明を制限することを意図せず、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列に有用であるプログラム及びデータベースの指針を提供することを意図する。
【０１４９】
使用できるプログラム及びデータベースには、以下が含まれるが、これらに限定はされない：MACPATTERN（商標）(EMBL)、DISCOVERYBASE（商標）(Molecular Applications Group)、GENEMINE（商標）(Molecular Applications Group)、LOOK（商標）(Molecular Applications Group)、MACLOOK（商標）(Molecular Applications Group)、BLAST及びBLAST2 (NCBI)、BLASTN及びBLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)、FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988)、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、CATALYST（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE（商標）(Molecular Simulations Inc.)、 Cerius2.DBAccess（商標）(Molecular Simulations Inc.)、HYPOGEN（商標）(Molecular Simulations Inc.)、INSIGHT II（商標）(Molecular Simulations Inc.)、DISCOVER（商標）(Molecular Simulations Inc.)、CHARMm（商標）(Molecular Simulations Inc.)、FELIX（商標）(Molecular Simulations Inc.)、DELPHI（商標）(Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、MODELER（商標）(Molecular Simulations Inc.)、ISIS（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medicinal Chemistryデータベース、Derwents's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース及びGenseqnデータベース。本発明の開示を考慮すると、他の多くのプログラム及びデータベースが当業者には明白であろう。
上記のプログラムを使用して検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターンーヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックス、ベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスのような転写調節に関与する配列、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位及び酵素切断部位をコードする配列が含まれる。
【０１５０】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の例示的な配列（例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること））にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離又は組換え核酸を提供する。前記ストリンジェントな条件は、本明細書に記載されている高いストリンジェンシー条件及び低いストリンジェンシー条件を含む、高度にストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件及び／又は低度にストリンジェントな条件であり得る。一つの態様において、下記に考察されるように、核酸が本発明の範囲内のものであるかを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。
【０１５１】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が相補的な鎖と塩基対合によって結合する過程を意味する。ハイブリダイゼーション反応は敏感で選択性があり、そのため目的の特定の配列を、その配列が試料中で低い濃度でしか存在しなくても同定することができる。適切にストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度によって、又はハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、それれは当該技術でよく知られている。別の特徴において、ストリンジェンシーは、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができる。別の特徴において、本発明の核酸は本明細書で記載される多様な（例えば高度、中程度及び低度の）ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【０１５２】
一つの態様において、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアルデヒドを含む。一つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、約３０℃〜３５℃での約３５％〜２５％のホルムアルデヒドの低ストリンジェンシー条件を含む。一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件は、例えば４２℃で約５０％ホルムアミド、５xＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ及び２００n/mlのせん断変性サケ精子ＤＮＡという高ストリンジェンシー条件を含む。一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件はこれらの低ストリンジェンシー条件を含むが、３５℃という下げた温度にて３５％のホルムアルデヒド条件を含む。ストリンジェンシーの特定のレベルに対応する温度範囲は、目的の核酸でのプリンとピリミジンの比率を計算し、それに応じて温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲及び条件の変動は当該技術で周知である。
別の特徴において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される本発明の核酸は、約５個の残基から本発明の核酸の完全長の間であることができ、例えば、これらは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の残基の長さであり得る。完全長よりも短い核酸も含まれる。これらの核酸は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプローブ、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ（一本若しくは二本鎖）、アンチセンス、又は抗体結合ペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードする配列として有用であることができる。
【０１５３】
一つの特徴において、本発明の核酸は、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。一つの特徴において、本発明の核酸は、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミドの条件を含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
あるいは、本発明の核酸は、４２℃で約５０％ホルムアミド、５xＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ及び反復配列ブロック核酸、例えば、ｃｏｔ−１又はサケ精子ＤＮＡ（例えば２００n/mlのせん断変性サケ精子ＤＮＡ）の条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。一つの態様において、本発明の核酸は、３５℃〜４２℃の低温で３５％〜４０％のホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【０１５４】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するのに使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変わる。例えば、核酸のハイブリダイズされる領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列構成（例えば、ＧＣ対ＡＴの含有量）及び核酸型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）を、ハイブリダイゼーション条件を選択するに際して考慮することができる。追加的な考慮は、核酸の１つが例えばフィルター上に固定化されているかということである。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下で実施することができる。核酸ハイブリダイゼーションの例として、固定化変性核酸を含むポリマー膜を、最初に、０．９M  ＮａＣｌ、５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、５．０mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０xデンハルト液及び０．５mg/mlのポリリボアデニル酸からなる溶液中、４５℃で３０分間プレハイブリダイズする。次に、およそ２x１０7cpm（比活性４〜９x１０8cpm/ug）の32Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを、溶液に加える。１２〜１６時間のインキュベーションの後、膜を、０．５％ＳＤＳを含有する１xＳＥＴ（１５０mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ）中、室温で３０分間、続いて、オリゴヌクレオチドプローブのために、新鮮な１xＳＥＴ中、Ｔm−１０℃で３０分間洗浄する。次に膜を、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のため、オートラジオグラフフィルムに露出する。前記のハイブリダイゼーションは、全て、高ストリンジェンシー条件下であると考えられる。
【０１５６】
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄して、非特異的に結合した検出可能なあらゆるプローブを除去することができる。フィルターを洗浄するのに使用するストリンジェンシーは、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列構成（例えば、ＧＣ対ＡＴの含有量）及び核酸型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）の応じて変えることもできる。漸進的に高くなるストリンジェンシー条件洗浄の例は、以下である：２xＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で１５分間（低ストリンジェンシー）；０．１xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で３０分間から１時間（中ストリンジェンシー）；０．１xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度、  と６８℃の間で１５〜３０分間（高ストリンジェンシー）；及び０．１５M  ＮａＣｌ、７２℃で１５分間（超高ストリンジェンシー）。最終の低ストリンジェンシー洗浄は、０．１xＳＳＣ中、室温で実施することができる。上記の例は、フィルターを洗浄するのに使用できる一組の条件を説明したに過ぎない。当業者は、多数の異なるストリンジェンシー洗浄の処方が存在することを知っているであろう。他の幾つかの例を下記に示す。
一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件は、１x１５０mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを含む溶液中、室温で３０分間の洗浄、続いて新たな溶液中で３０分間の洗浄を含む。
【０１５７】
プローブにハイブリダイズされた核酸は、オートラジオグラフィー又は他の従来の技術により同定される。
上記の手順を、プローブ配列に対する配列同一性（相同性）のレベルが低い核酸を同定するために、変更することができる。例えば、検出可能なプローブ配列に対して低い配列同一性（相同性）を持つ核酸を得るために、ストリンジェントの程度が低い条件を使用することができる。例えば、ハイブリダイゼーション温度を、およそ１MのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中、６８℃から４２℃に５℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによりハイブリダイゼーション温度で洗浄することができる。これらの条件は、５０℃を越える場合「中程度」の条件、５０℃未満の場合「低度」の条件と考えられる。「中程度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが５５℃で実施される場合である。「低度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが４５℃で実施される場合である。
【０１５８】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む６xＳＳＣのような緩衝液中、４２℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミドの濃度を５０％から０％まで５％ずつ減少させて、プローブに対して低いレベルの相同性を有するクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを６xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにより５０℃で洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアルデヒドが２５％を越える場合「中程度」の条件、ホルムアルデヒドが２５％未満である場合「低度」の条件と考えられる。「中程度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが３０％のホルムアルデヒドで実施される場合である。「低度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが１０％のホルムアルデヒドで実施される場合である。
【０１５９】
しかし、ハイブリダイゼーションの様式の選択は重要ではなく、核酸が本発明の範囲内であるかを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内である核酸を同定するのに使用される洗浄条件には、例えば以下が含まれる：ｐＨ７で塩濃度約０．０２M及び少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃の温度；或いは、塩濃度約０．１５M  ＮａＣｌ、７２℃で約１５分間；或いは、塩濃度約０．２xＳＳＣ、少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃の温度で約１５〜２０分間；或いは、ハイブリダイゼーション複合体を０．１％ＳＤＳを含有する約２xＳＳＣの塩濃度の溶液により室温で１５分間２回洗浄し、次に０．１％ＳＤＳを含有する約０．１xＳＳＣにより６８℃で１５分間２回洗浄する；或いは同等な条件。ＳＳＣ緩衝液及び同等な条件について記載は、Sambrook, Tijssen and Ausubelを参照すること。
【０１６０】
これらの方法は、本発明の核酸を単離又は同定するために使用することができる。例えば、前述の方法は、本発明の配列又は１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００個の連続した塩基を含むそのフラグメント及びそれに相補的な配列の１つからなる群より選択される核酸配列に、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性（相同性）を持つ配列を有する核酸を単離又は同定するために使用できる。配列同一性（相同性）は、アラインメントアルゴリズムを使用して測定することができる。例えば、相同性のポリヌクレオチドは、本明細書で記載されているコード配列の１つの天然に存在する対立変種であるコード配列を有すし得る。そのような対立変種は、本発明の核酸と比較したとき、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有し得る。加えて、上記の手順は、配列アラインメントアルゴリズム（例えば、初期設定値パラメーターを伴うＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８アルゴリズム）を使用して決定した場合、本発明のポリペプチド、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個の連続したアミノ酸を含むそのフラグメントに、少なくとも約９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％又は少なくとも５０％の配列同一性（相同性）を有するポリペプチドをコードする核酸を単離するために使用できる。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらの使用方法
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、又はそのフラグメントを、例えば同定、増幅又は単離するため、或いはセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子を同定するために使用できる核酸プローブも提供する。一つの態様において、プローブは、本発明の核酸の少なくとも約１０個の連続する塩基を含む。あるいは、本発明のプローブは、本発明の核酸で記載される配列の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０個、又は約１０〜５０個、約２０〜６０個、約３０〜７０個の連続した塩基であることができる。プローブは、結合及び／又はハイブリダイゼーションにより核酸を同定する。プローブは、例えば、キャピラリーアレイを含む本発明のアレイで使用することができる（下記の考察を参照すること）。本発明のプローブは、他の核酸又はポリペプチドを単離することにも使用できる。
【０１６２】
本発明の単離又は組換え核酸、それに相補的な配列、又は本発明の配列の１つの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の連続した塩基を含むフラグメント、又はそれに相補的な配列を、土壌試料のような生物学的試料が本発明の核酸配列を有する生物又は前記核酸が由来する生物を含むかを決定するプローブとして使用することもできる。そのような手順では、前記核酸が単離された生物を含むかもしれない生物学的試料を得て、その試料から核酸を得る。プローブが試料中に存在する相補性配列のいずれかと特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、前記核酸をそのプローブと接触させる。
【０１６３】
必要な場合には、プローブが相補性配列と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件は、プローブと、相補性配列を含むことが判明している試料からの相補性配列および相補的配列を含まない制御配列とを接触させることによって決定することができる。ばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度又はハイブリダイゼーションの温度のようなハイブリダイゼーション条件を変えて、プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件を同定することができる。
【０１６４】
試料が、核酸が単離された生物体を含む場合、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを、検出可能な作用物質、例えば放射性同位元素、蛍光染料又は検出可能な生成物の形成を触媒できる酵素で標識することにより検出できる。
標識プローブを使用して試料中の相補性核酸の存在を検出する多くの方法が、当業者にはよく知られている。これらには、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法及びドットブロットが含まれる。これらの手順のそれぞれのプロトコールが、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997)及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）で提供されている。 
【０１６５】
あるいは、２つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも１つは核酸試料に存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で使用して、試料が本発明の核酸配列を含む生物体（例えば、核酸が単離された生物体）を含むか決定することができる。一つの特徴において、プローブはオリゴヌクレオチドを含む。一つの特徴において、前記増幅反応はＰＣＲ反応を含むことができる。ＰＣＲプロトコールは、Ausubel and Sambrook, supraに記載されている。あるいは、増幅は、リガーゼ連鎖反応、３ＳＲ又は鎖置換反応を含むことができる。（例えば、Barany, F., “The Ligase Chain Reaction in a PCR World”, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991; E. Fahy et al., “Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991; and Walker G.T. et al., “Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992を参照すること）。そのような手順において、試料中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、得られた増幅生成物のいずれかを検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、ゲルを臭化エチジウムのような挿入剤で染色することによって検出することができる。あるいは、１つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在を検出してもよい。
本発明の配列の末端近くの配列に由来するプローブを染色体ウォーキング法で使用して本発明の配列に隣接して位置するゲノム配列を含むクローンを同定することもできる。そのような方法は宿主生物体からの更なるタンパク質をコードする遺伝子の単離を可能にする。
【０１６６】
一つの特徴において、本発明の単離又は組換え核酸、それに相補的な配列、本発明の配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続した塩基を含むフラグメント、又はそれに相補的な配列は、関連する核酸を同定及び単離するプローブとして使用される。幾つかの特徴において、関連する核酸は、核酸が単離された生物以外の他の生物からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであることができる。例えば、他の生物は関連する生物であり得る。そのような手順において、プローブが関連配列と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で核酸試料をプローブと接触させる。次に、プローブと関連生物からの核酸とのハイブリダイゼーションが、上記に記載した方法のいずれかを使用して検出される。
【０１６７】
検出可能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのような核酸を同定するために使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることによって、プローブに異なるレベルの相同性を有する核酸を同定し、単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの溶融温より低い温度を変えてハイブリダイゼーションを実施することによって変えることができる。溶融温度Ｔmは、標的配列の５０％が、完全に相補的なプローブとハイブリダイズする（定義されたイオン強度及びｐＨでの）温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴmの約５℃以下で選択される。 プローブの溶融温度は、以下の式を使用して計算することができる。
【０１６８】
１４〜７０個のヌクレオチドの長さプローブでは、溶融温度（Ｔm）は、以下の式を使用して計算される：Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。
ハイブリダイゼーションが、ホルムアミドを含有する溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を使用して計算できる：Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。
プレハイブリダイゼーションは、６xＳＳＣ、５xデンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μgの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、又は６xＳＳＣ、５xデンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μgの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中で実施することができる。ＳＳＣ及びデンハルト溶液の配合は、Sambrook et al., supraに列挙されている。
【０１６９】
一つの特徴において、ハイブリダイゼーションは、検出プローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性される。一つの特徴において、プローブがそれと相補的又は相同的な配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズできるように十分な時間フィルターをハイブリダイゼーション溶液と接触させる。２００個のヌクレオチドを超える長さのプローブでは、ハイブリダイゼーションはＴmより１５〜２５℃低く実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブのようなより短いプローブでは、ハイブリダイゼーションはＴmより５〜１０℃低く実施することができる。一つの特徴において、６xＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションはおよそ約６８℃で実施される。通常、５０％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションではハイブリダイゼーションはおよそ４２℃で実施される。
【０１７０】
セルラーゼ酵素の発現阻害
本発明は、本発明の核酸、例えばセルラーゼ酵素コード核酸、例えばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを含む核酸と相補的な核酸（例えば、アンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列を含む本発明の核酸は、セルラーゼ酵素コード遺伝子の輸送、スプライシング又は転写を阻害することができる。阻害は、ゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを標的とすることによって達成することができる。標的とされた核酸の転写又は機能は、例えばハイブリダイゼーション及び／又は切断によって阻害することができる。本発明により提供される一つの例示的なインヒビターのセットには、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子又はメッセージに結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれ、いずれの場合でもセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の産生又は機能を防止又は阻害する。この会合は配列特異的ハイブリダイゼーションによる可能性がある。別の有用なインヒビターの部類には、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの不活化又は切断を引き起こすオリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、リボザイムのように、そのような切断を引き起こす酵素活性を有することができる。オリゴヌクレオチドを、化学的に改変するか、又は相補性核酸を切断することができる酵素若しくは組成物と結合させることができる。多くの異なるそのようなオリゴヌクレオチドを含むプールを、所望の活性を有するものについてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、核酸及び／又はタンパク質レベルでセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素発現を阻害する多様な組成物、例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列、並びに本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ抗体を含む、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを提供する。
【０１７１】
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現の阻害は、多様な産業用途を有することができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現の阻害は、変質を遅延又は防止することができる。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現及び／又は活性を阻害する本発明の組成物、例えば、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの使用は、変質を遅延又は防止する。したがって、一つの特徴において、本発明は、変質の遅延又は防止のために、植物又は植物生成物（例えば、穀類、穀粒、果実、種子、根、葉など）に本発明の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮａを適用することを含む方法及び組成物を提供する。これらの組成物は、植物（例えば、トランスジェニック植物）又は別の生物体（例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子で形質転換された細菌又は他の微生物）によって発現させることもできる。
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現を阻害する本発明の組成物（例えば、アンチセンス、ｉＲＮＡ、リボザイム、抗体）を、医薬組成物として、例えば抗病原剤として使用することができるか、又は例えばSalmonella用の例えば抗菌剤として他の療法において使用することができる。 
【０１７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、一つの特徴では、ｍＲＮＡを標的にすることによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する戦略は、科学文献及び特許文献に十分に記載されており、当業者は、本発明の新規な試薬を使用してそのようなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素オリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするジーンウォーキング／ＲＮＡマッピングプロトコールは当該技術において周知である（例えば、強力なアンチセンス配列選択のために簡単で信頼できる方法を提供する、標準的な分子技術に基づいているＲＮＡマッピングアッセイを記載している、Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183を参照すること）。Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198も参照すること。
【０１７３】
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであることができ、別の特徴では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜１００，約１０〜８０、約１５〜６０、約１８〜４０である。最適な長さは日常的なスクリーニングにより決定することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度で存在することができる。最適な濃度は日常的なスクリーニングにより決定することができる。この潜在的な問題に対処することができる、多種多様な合成された天然に存在しないヌクレオチド及び核酸類似体が知られている。例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位のような非イオン性骨格を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用することができる。WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)に記載されているような、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本発明によって提供される合成ＤＮＡ骨格類似体を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドには、上記で記載されたように、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−Ｎ−カルバメート及びモルホリノカルバメート核酸を含めることもできる。
コンビナトリアル化学方法論を使用して、膨大な数のオリゴヌクレオチドを作り出すことができ、それらは、本発明のセンス及びアンチセンスのセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列のような任意の標的に対して適切な結合親和性及び特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば、Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584を参照すること）。
【０１７４】
阻害性リボザイム
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージと結合することができるリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、例えばｍＲＮＡを標的にして、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を阻害することができる。リボザイムを設計し、ターゲティングのためにセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素特異的アンチセンス配列を選択する戦略は、科学文献及び特許文献に十分に記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を使用してそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的ＲＮＡを切断するＲＮＡの酵素部分に近接して保持されているリボザイムの標的ＲＮＡ結合部分を介して標的ＲＮＡと結合することによって作用する。したがって、リボザイムは相補性塩基対合により標的ＲＮＡを認識し、これに結合し、正確な部位に結合すると酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断し、不活性化する。切断がコード配列で発生すると、そのような方法による標的ＲＮＡの切断は、コードされるタンパク質の合成を誘導するその能力を破壊する。リボザイムがそのＲＮＡ標的と結合し、それを切断した後、リボザイムはＲＮＡから遊離して新たな標的への結合及びその切断を繰り返すことができる。
【０１７５】
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は、他の技術、例えばアンチセンス技術（ここで、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳又は別の分子との結合を阻止するだけである）に比べて有利であり得る。なぜなら、治療処置を実施するのに必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも低くなり得るからである。この潜在的な利点は、リボザイムが酵素的に作用する能力に反映している。したがって、単一のリボザイム分子が、多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。一つの特徴において、リボザイムは高度に特異的なインヒビターであり、阻害の特異性は結合の塩基対合機構だけでなく、リボザイムが結合するＲＮＡの発現を分子が阻害する機構にも依存している。すなわち、阻害はＲＮＡ標的の切断によって引き起こされ、したがって特異性は非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比として定義される。この切断機構は、塩基対合が関与する要因に加えた要因に依存する。したがって、リボザイム作用の特異性は同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも高い可能性がある。
【０１７６】
本発明のリボザイム、例えば酵素リボザイムＲＮＡ分子は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループＩイントロンモチーフ及び／又はＲＮＡガイド配列と結合したＲＮａｓｅＰ様ＲＮＡモチーフとして形成することができる。例えば、ハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183によって、ヘアピンモチーフの例は、Hampel (1989) Biochemistry 28:4929及びHampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例は、Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; the RNaseP motif by Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849によって、並びにグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号（Cech）によって記載されている。これらの特定のモチーフの記載は、それらに限定することを意図したものではない。当業者は、本発明のリボザイム、例えば本発明の酵素ＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡ領域の１つ以上と相補的な特定の基質結合部位を有することができることを認識するであろう。本発明のリボザイムは、基質結合部位の中又はその周辺に分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することができる。
【０１７７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列を含むＲＮＡ阻害分子、いわゆる「ＲＮＡｉ」分子を提供する。ＲＮＡｉ分子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子の発現を阻害することができる。一つの態様において、ＲＮＡｉ分子は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上の長さの二重鎖ヌクレオチドである。本発明はいずれの特定の作用機構にも限定されないが、ＲＮＡｉは細胞内に入り、内因性ｍＲＮＡを含む類似又は同一の配列の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の分解を引き起こすことができる。細胞が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に暴露されるとき、相同性遺伝子に由来するｍＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる過程によって選択的に分解される。ＲＮＡｉの背後にある可能な基本的機構は、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、短小干渉性ＲＮＡと呼ばれる短い断片に分解し、この緩衝RNAがその配列と一致するｍＲＮＡを分解する引き金となる。一つの特徴において、本発明のＲＮＡｉは遺伝子サイレンシング治療で使用される（例えばShuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046を参照すること）。一つの特徴において、本発明は、本発明のＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを使用して選択的にＲＮＡを分解する方法を提供する。この方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで実施することができる。一つの特徴において、本発明のＲＮＡｉ分子を使用して、細胞、器官又は動物の機能喪失型変異を生じることができる。選択的にＲＮＡを分解するＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを作製及び使用する方法は、当該技術で既知である（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号、同第６，５１１，８２４号、同第６，５１５，１０９号、同第６，４８９，１２７号を参照すること）。
【０１７８】
核酸の改変−本発明の酵素変種の作製
本発明は、本発明の核酸の変種、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするものを生成する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によりコードされたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素から変化した若しくは異なる活性、又は変化した若しくは異なる安定性を有する、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を生成するために、反復することができるか又は多様な組合せで使用することができる。これらの方法は、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳又はメッセージ安定性における変種を生成するために、反復することができるか又は多様な組合せで使用することができる。別の特徴において、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のエクスビボでの改変、続く細胞への再挿入によって変更される。
【０１７９】
例えば、一つの特徴において、本発明は、配列番号１６３の少なくとも１つのヌクレオチド塩基残基の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。前記改変は、以下の変化：位置２６５〜２６７のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなること；位置３０７〜３０９のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなること；位置３２８〜３３０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなること；位置３４０〜３４２のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧとなること；位置４６９〜４７１のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣとなること；位置１４４１〜１４４３のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＴ若しくはＴＴＣとなること；位置１６４８〜１６５０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＡＡＴ若しくはＡＡＣとなること；又は位置１７６８〜１７７０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなることの１つ以上を含む。別の特徴において、本発明は、配列番号１６４の少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供し、ここで前記改変は、以下の変化：アミノ酸位置８９のメチオニンが改変されてアルギニンになること；アミノ酸位置１０３のフェニルアラニンが改変されてグリシンになること；アミノ酸位置１１０のプロリンが改変されてグリシンになること；アミノ酸位置１１４のチロシンが改変されてロイシンになること；アミノ酸位置１５７のアラニンが改変されてセリンになること；アミノ酸位置４８１のトリプトファンが改変されてフェニルアラニンになること；アミノ酸位置５５０のプロリンが改変されてアスパラギンなること；又はアミノ酸位置５９０のグリシンが改変されてアルギニンになることの１つ以上を含む。
【０１８０】
別の特徴において、本発明は、本発明の例示的な配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１など）のヌクレオチド残基配列の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。前記改変は、以下の変化：配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧに変わること；配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣに変わること；配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＴ若しくはＴＴＣに変わること；配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＡＡＴ若しくはＡＡＣに変わること；又は配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わることの１つ以上を含む。別の特徴において、本発明は、本発明の任意の核酸のヌクレオチド残基配列の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧに変わること；配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣに変わること；配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＴ若しくはＴＴＣに変わること；配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＡＡＴ若しくはＡＡＣに変わること；又は配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わることの１つ以上を含む。
【０１８１】
別の特徴において、本発明は、本発明の例示的な配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０など）のアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わること；配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンに変わること；配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンに変わること；配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに変わること；配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンに変わること；又は配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わることの１つ以上を含む。
【０１８２】
別の特徴において、本発明は、本発明の任意のポリペプチドのアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わること；配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンに変わること；配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンに変わること；配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに変わること；配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンに変わること；又は配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わることの１つ以上を含む。
【０１８３】
本発明の核酸は、あらゆる方法により変更することができる。例えば、ランダム若しくは確率論的な方法、又は非確率論的方法、又は「定方向進化」方法である（例えば、米国特許第６，３６１，９７４号を参照すること）。遺伝子のランダム変異の方法は当該技術で周知である（例えば、米国特許第５，８３０，６９６号を参照すること）。例えば、変異原を使用して遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば、紫外線若しくはガンマ線の照射、又は化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独又は組合せて、組換えによって修復されやすいＤＮＡ破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似体、例えばニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン又はアクリジンである。これらの作用物質は、ＰＣＲ反応においてヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって配列を変異させることができる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような挿入剤も使用することができる。
【０１８４】
分子生物学の任意の技術、例えばランダムＰＣＲ変異導入（例えば、Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471を参照すること）又はコンビナトリアルマルチカセット変異導入（例えば、Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196を参照すること）を使用することができる。あるいは、核酸、例えば遺伝子を、ランダム又は「確率論的」にフラグメント化した後で再集合させることができる（例えば、米国特許第６，２９１，２４２号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２８７，８６１号、同第５，９５５，３５８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１１，２３８号、同第５，６０５，７９３号を参照すること）。別の特徴において、改変、付加又は欠失は、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート改変ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成、染色体飽和変異導入（ＣＳＭ）及び／又はそれらの組合せ、並びに他の方法によって導入される。
【０１８５】
以下の出版物は、本発明の方法に組み込むことができる多様な反復組換え手順及び／又は方法を記載している：Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties” Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling“ Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding“Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution“ Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling,” Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines” Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling” Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391;及びStemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: “In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【０１８６】
多様性を生じる変異法には、例えば以下が含まれる：部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7;及びKunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); ウラシル含有鋳型を使用する変異導入(Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382;及びBass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245);オリゴヌクレオチド特異的変異導入(Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500;及びZoller (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350); ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異導入(Taylor (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802;及びSayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814); ギャップ含有二重鎖を使用する変異導入(Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207;及びFritz (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
【０１８７】
本発明を実施するために使用できる追加的なプロトコールには、以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887),修復欠損宿主株を使用する変異導入(Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; 及びCarter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403),欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), 全人工遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) ” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323;及びGrundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316),二本鎖切断修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。上記の方法の多くに関する更なる詳細は、Methods in Enzymology Volume 154で見出すことができ、これは、種々の変異導入の方法に関する問題を解決するための有用な管理について記載している。
【０１８８】
本発明を実施するにのに使用できるプロトコールは、例えば以下に記載されている：米国特許第5,605,793号（Stemmer）(Feb. 25, 1997), “Methods for In Vitro Recombination”；米国特許第5,811,238号（Stemmer et al.）(Sep. 22, 1998) “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”；米国特許第5,830,721号（Stemmer et al.）(Nov. 3, 1998), “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”；米国特許第5,834,252号（Stemmer, et al.）(Nov. 10, 1998) “End-Complementary Polymerase Reaction”；米国特許第5,837,458号（Minshull, et al.）(Nov. 17, 1998), “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”； WO 95/22625, Stemmer and Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”； WO 96/33207 by Stemmer and Lipschutz “End Complementary Polymerase Chain Reaction”； WO 97/20078 by Stemmer and Crameri “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”； WO 97/35966 by Minshull and Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”； WO 99/41402 by Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”； WO 99/41383 by Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”； WO 99/41369 by Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”； WO 99/41368 by Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”； EP 752008 by Stemmer and Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”； EP 0932670 by Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”； WO 99/23107 by Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”； WO 99/21979 by Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”； WO 98/31837 by del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”； WO 98/27230 by Patten and Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”； WO 98/27230 by Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection,” WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries,“ WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences,“ WO 98/42832 by Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers,“ WO 99/29902 by Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences,“ WO 98/41653 by Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library,“ WO 98/41622 by Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling,“及びWO 98/42727 by Pati and Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”。
【０１８９】
本発明を実施するのに使用できるプロトコール（種々の多様性を生じる方法に関する詳細を提供する）は、例えば以下に記載されている：米国特許出願(USSN) 09/407,800, “SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES” by Patten et al. filed Sep. 28, 1999; “EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION” by del Cardayre et al.,米国特許第6,379,964号; “OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” by Crameri et al.,米国特許第6,319,714号;同第6,368,861号;同第6,376,246号;同第6,423,542号;同第6,426,224号及びPCT/US00/01203; “USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING” by Welch et al.,米国特許第6,436,675号; “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” by Selifonov et al., filed Jan. 18, 2000, (PCT/US00/01202) and, e.g. “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” by Selifonov et al., filed Jul. 18, 2000 (U.S. Ser. No. 09/618,579); “METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS” by Selifonov and Stemmer, filed Jan. 18, 2000 (PCT/US00/01138); and “SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION” by Affholter, filed Sep. 6, 2000 (米国特許出願09/656,549);及び米国特許第6,177,263号;同第 6,153,410号。
【０１９０】
例えば、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）又はこれらの組合せのような飽和変異導入を含む非確率論的又は「定方向進化」方法を使用して、本発明の核酸を改変し、新たな又は変化した特性（例えば、極めて酸性又はアルカリ性の条件下、高温又は低温の条件下などでの活性）を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を生成する。改変された核酸によりコードされるポリペプチドは、グルカン加水分解又は他の活性について試験する前に、活性についてスクリーニングすることができる任意の試験様式又はプロトコールを、例えばキャピラリーアレイ台を用いて使用することができる。例えば、米国特許第６，３６１，９７４号、同第６，２８０，９２６号、同第５，９３９，２５０号を参照すること。 
【０１９１】
遺伝子部位飽和変異導入又はＧＳＳＭ
本発明は、本明細書に記載されているように、また、米国特許第６，１７１，８２０号及び同第６，５７９，２５８号に記載されているように、遺伝子部位飽和変異導入又はＧＳＳＭを使用して酵素を作製する方法を提供する。一つの特徴において、縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンプライマーを使用して、ポリヌクレオチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、又は本発明の抗体に点変異導入を導入し、それによって子孫ポリペプチドのセットを生成する。前記セットにおいては、全範囲の単一のアミノ酸置換がそれぞれのアミノ酸の位置、例えば、改変の標的となる酵素活性部位又はリガンド結合部位のアミノ酸残基で表れる。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第１の相同性配列、縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列、及び場合によって第２の相同性配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して得られる下流の子孫翻訳生成物には、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列の縮退が２０個全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。一つの特徴において、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば、１つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットから構成される）を使用して、親のポリヌクレオチド鋳型中の元のコドンのそれぞれが全範囲のコドン置換に付される。別の特徴において、（同じオリゴヌクレオチドか又は別のオリゴヌクレオチド中にある）少なくとも２つの縮退カセットが、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付すために使用される。例えば、２つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を１つのオリゴヌクレオチドに含ませ、２つ以上の部位でアミノ酸変異を導入することができる。この複数のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列は、直接隣接していてもよく又は１つ以上の更なるヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。別の特徴において、付加及び欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドを単独で又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンと組合せて使用して、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せ又は順列が導入される。
【０１９２】
一つの特徴において、隣接するＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット、すなわち縮退(N,N,G/T)n配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して２つ以上の隣接するアミノ酸位置の同時変異導入が行われる。別の特徴において、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列よりも小さい縮退度を有する縮退カセットが使用される。例えば、いくつかの場合では、ただ１つのＮを含む縮退トリプレット配列を（例えば、オリゴヌクレオチドで）使用することが望ましい場合があり、ここで前記Ｎは、トリプレットの第１、第２又は第３の位置に存在できる。任意の組合せ及び順列を含む他の任意の塩基も、トリプレットの残りの２つの位置で使用することができる。あるいは、いくつかの場合において、縮退Ｎ,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合がある。
【０１９３】
一つの特徴において、縮退トリプレット（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について全範囲の可能な天然アミノ酸（合計２０個のアミノ酸）の系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴においては、本方法は、各アミノ酸残基についてコドンの位置における可能な全ての置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、１００個のアミノ酸のポリペプチドの場合、２０００個の別個の種（すなわち、各位置につき２０個の可能なアミノ酸x１００個のアミノ酸位置）を生成することができる。縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレットを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのセットを使用することによって、３２個の個別の配列が２０個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのそのようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器において、２０個の別個のポリペプチドをコードする３２個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入での非縮退オリゴヌクレオチドの使用は、各反応容器につきただ１つの子孫ポリペプチド生成物を生じるだけである。場合により、非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーと組合せて使用することができ、例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを使用して対象のポリヌクレオチド中に特定の点変異導入を行うことができる。これは、特定のサイレント点変異導入、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異導入、並びに終止コドン及びポリペプチドフラグメントの対応する発現を発生させる点変異導入を生じさせる１つの方法を提供する。
【０１９４】
一つの特徴において、それぞれの飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において２０個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも２０個の子孫ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の態様では、２０個未満の天然の組合せの全てが使用される）。それぞれの飽和変異導入反応容器から生成される３２倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば、適切な宿主、例えばE. coli宿主に例えば発現ベクターを使用してクローン化し）、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（親のポリペプチドと比較したとき、例えばアルカリ性又は酸性条件下でグルカン加水分解活性が増加している）、子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
【０１９５】
一つの特徴において、本明細書に開示しているように、飽和変異導入を使用して親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に変異を導入すると、好ましいアミノ酸変化を２つ以上のアミノ酸位置において同定することができる。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は一部分の組合せを含む１つ以上の新たな子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの３つのアミノ酸位置のそれぞれで同定される場合、並べ換えには、それぞれの位置及び３つの位置で３つの可能性（元のアミノ酸から変化のないもの、及び２つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）が含まれる。したがって、３x３x３、又は合計２７の可能性が存在し、これらは以前に調べられた７つ−６つの単一の点変異導入（すなわち、３つの位置でそれぞれ２つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。 
さらに別の特徴において、位置飽和変異導入を、スクリーニングを伴って、シャッフリング、キメラ化、組換え及び他の変異導入法と一緒に使用することができる。本発明は、飽和変異導入を含む任意の変異導入法を繰り返して使用することを提供する。一つの例示において、任意の変異導入法を繰り返して使用することは、スクリーニングと組合せて使用される。
【０１９６】
本発明は、専用コドンプライマー（縮退Ｎ，Ｎ，Ｎ配列を含む）を使用してポリヌクレオチドに点変異導入を導入し、それによって子孫ポリペプチドのセットを生成することも提供し、そこでは、全範囲の単一アミノ酸置換がそれぞれのアミノ酸位置で表れる（遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ））。使用されるオリゴは、連続する第１の相同性配列、縮退Ｎ，Ｎ，Ｎ配列及び必ずしも必要ではないが一つの態様では第２の相同性配列から構成されている。そのようなオリゴを使用して得られる下流の子孫翻訳生成物には、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列の縮退が２０個全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。
一つの特徴において、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｎカセットから構成される）が、親のポリヌクレオチド鋳型中のもとのコドンのそれぞれを全範囲のコドン置換に付すために使用される。別の特徴において、（同じオリゴか又は別のオリゴの中にある）少なくとも２つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｎカセットが、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付すために使用される。したがって、２つ以上のＮ，Ｎ，Ｎ配列を１つのオリゴに含ませ、２つ以上の部位でアミノ酸変異を導入することができる。この複数のＮ，Ｎ，Ｎ配列は、直接隣接していてもよく１つ以上の更なるヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。別の特徴において、付加及び欠失の導入に役立つオリゴを、単独で又はＮ，Ｎ，Ｎ配列を含むコドンと組合せて使用して、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せ又は順列が導入される。
【０１９７】
一つの特徴において、隣接するＮ，Ｎ，Ｎトリプレット、すなわち縮退(N,N,N)n配列を含むオリゴを使用して、２つ以上の隣接するアミノ酸位置で同時に変異を導入することが可能である。別の特徴において、本発明は、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列よりも小さい縮退度を有する縮退カセットの使用を提供する。例えば、いくつかの場合では、ただ１つのＮを含む縮退トリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合があり、ここでＮは、トリプレットの第１、第２又は第３の位置に存在できる。任意の組合せ及び順列を含む他の任意の塩基も、トリプレットの残りの２つの位置で使用することができる。あるいは、いくつかの場合において、縮退Ｎ,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合がある。 
【０１９８】
一つの特徴において、縮退トリプレット（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列）の使用は、幾つかの理由で有益である。一つの特徴において、本発明は、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置において全範囲の可能なアミノ酸（合計２０個のアミノ酸）の置換を、系統的でかなり容易に生成する方法を提供する。したがって、１００個のアミノ酸ポリペプチドでは、本発明は、２０００個の別個の種（すなわち、各位置につき２０個の可能なアミノ酸x１００個のアミノ酸位置）を、系統的でかなり容易に生成する方法を提供する。縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴの使用によって、２０個の可能なアミノ酸のためにコードする３２個の個別の配列が提供されることが理解される。したがって、親のポリヌクレオチド配列が、そのようなオリゴを使用して飽和変異導入に付される反応容器において、２０個の別個のポリペプチドをコードする３２個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入での非縮退オリゴの使用は、各反応容器につきただ１つの子孫ポリペプチド生成物を生じるだけである。
本発明は、場合により、開示されている縮退プライマーと組合せて使用することができる、非縮退オリゴの使用も提供する。幾つかの場合において、対象のポリヌクレオチドに特定の点変異導入を生じさせるために、非縮退オリゴを使用することが有利であることが理解される。これは、特定のサイレント点変異導入、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異導入、並びに終止コドン及びポリペプチドフラグメントの対応する発現を発生させる点変異導入を生じる方法を提供する。 
【０１９９】
したがって、本発明の一つの特徴において、それぞれの飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されるコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において２０個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも２０個の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和変異導入反応容器から生成される３２倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば、発現ベクターを使用して適切なE. coli宿主にクローン化し）、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（親のポリペプチドと比較したとき）、子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
【０２００】
一つの特徴において、本明細書に開示しているように、飽和変異導入を使用して親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に変異を導入すると、好ましいアミノ酸変化が２つ以上のアミノ酸位置において同定される。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は一部分の組合せを含む、１つ以上の新たな子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの３つのアミノ酸位置のそれぞれで同定される場合、順列には、それぞれの位置及び３つの位置で３つの可能性（元のアミノ酸から変化のないもの、及び２つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）が含まれる。したがって、３x３x３、又は合計２７の可能性が存在し、これらは以前に調べられた７つ−６つの単一の点変異導入（すなわち、３つの位置でそれぞれ２つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。
【０２０１】
本発明は、更なる変異化法と組合せた飽和変異導入の使用を提供し、それは、２つ以上の関連するポリヌクレオチドを、ハイブリッドヌクレオチドが組換え及び還元的再組合せにより生成されるように、適切な宿主細胞に導入する方法である。
遺伝子の配列全体に沿って変異導入を実施することに加えて、本発明は、変異導入を使用して、ポリヌクレオチド配列における任意の数の塩基をそれぞれ代えることができ、変異を導入する塩基の数は、一つの態様において、１５〜１００，０００の全ての整数である。したがって、分子に沿った各位置に変異を導入する代わりに、各塩基又は不連続な数の塩基（一つの特徴において、合計１５〜１００，０００になるサブセット）を変異導入に付すことができる。一つの特徴において、ポリヌクレオチド配列に沿ったそれぞれの位置又は位置の群に変異を導入するために別個のヌクレオチドが使用される。変異が導入される３つの位置の群は、コドンであってよい。変異は、変異導入カセットとも呼ばれる、異種カセットを含む変異導入プライマーを使用して導入することができる。例示的なカセットは、１〜５００個の塩基を有することができる。そのような異種カセットにおけるそれぞれのヌクレオチド位置は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｇ又はＥであり、ここでＥは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴではない任意の塩基である（Ｅは、デザイナーオリゴと呼ぶこともできる）。 
【０２０２】
一つの特徴において、飽和変異導入は、変異が導入される定義されたポリヌクレオチド配列（ここで、変異が導入される配列は、一つの態様では、約１５〜１０００，０００個の塩基の長さである）において、変異導入カセットの完全なセット（ここで、それぞれのカセットは、一つの態様では、約１〜５００個の塩基の長さである）に変異を導入することから構成される。したがって、変異の一群（１〜１００の範囲の変異）が、変異が導入されるそれぞれのカセットに導入される。一つのカセットに導入される変異のグループ化は、一連の飽和変異導入の適用の際に、第２のカセットに導入される変異の第２のグループ化と異なる又は同一であることができる。そのようなグループ化は、欠失、付加、特定のコドンのグループ化、及び特定のヌクレオチドカセットのグループ化によって例示される。
【０２０３】
一つの特徴において、変異が導入される定義された配列には、全遺伝子、経路、ｃＤＮＡ、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び全プロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーター又は任意のポリヌクレオチド官能基が含まれる。一般に、この目的において「定義された配列」は、任意のポリヌクレオチドであることができ、１５塩基ポリヌクレオチド配列及び長さが１５塩基〜１５，０００塩基（本発明は、その間のあらゆる整数を具体的に指定する）のポリヌクレオチド配列である。コドンのグループ化の選択の際の考慮には、縮退変異導入カセットによりコードされるアミノ酸の種類が含まれる。
一つの特徴において、変異導入カセットに導入できる変異のグループ化のために、本発明は、特に、それぞれの位置で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０個のアミノ酸のために（縮退オリゴを使用して）コードする縮退コドン置換、及びそれらによりコードされるポリペプチドのライブラリーを提供する。 
【０２０４】
合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）
本発明は、「合成連結再アッセンブリ」又は単に「ＳＬＲ」、「定方向進化プロセス」と呼ばれる、新たな又は改変された特性を有するポリペプチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体を生成する非確率論的遺伝子改変システムを提供する
ＳＬＲは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、鎖状に連結される又はキメラ化されるのではなく、むしろ非確率論的に構築されるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号を参照すること。一つの態様において、ＳＬＲは以下の工程を含む：（ａ）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記鋳型ポリヌクレオチドが相同遺伝子をコードする配列を含む、前記工程；（ｂ）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記構築ブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと予め定められた配列で交差再集合を生じるように設計され、構築ブロックポリヌクレオチドが相同遺伝子の変種配列及び前記変種配列にフランキングする、前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む、前記工程；（ｃ）構築ブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再集合して相同遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成するように、前記構築ブロックポリヌクレオチドと前記鋳型ポリヌクレオチドとを組み合わせる工程。
【０２０５】
ＳＬＲは、再配列されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することに依存しない。したがって、本発明の方法は、１０100を超える異なるキメラから構成される子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に生成するために使用できる。ＳＬＲを使用して、１０1000を超える異なる子孫キメラを含むライブラリーを生成することができる。したがって、本発明の態様は、設計に従って選択された全体的なアッセンブルの順番を有する、完成したキメラ核酸分子のセットを生成する非確率論的方法を含む。この方法は、互いに適合する連結可能な利用可能な末端を有する複数の特定の核酸構築ブロックを設計に従って生成する工程、及び設計した全体的な集合（アッセンブリ）の順番が達成されるように核酸構築ブロックを集合させる工程を含む。
【０２０６】
集合される互いに適合する核酸構築ブロックの連結可能な末端は、これらが構築ブロックを予め定められた順序で結合させることができる場合、この種類の順序づけられた集合に対して「利用可能」であると考えられる。したがって、核酸構築ブロックが結合され得る全体的な集合の順番は、連結可能な末端の設計によって特定される。２つ以上の集合工程が使用される場合、核酸構築ブロックが結合し得る全体的な集合の順番は、集合工程の一連の順番によっても特定される。一つの態様において、アニールされた構築片が、リガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）のような酵素で処理されて、構築片の共有結合が達成される。
【０２０７】
一つの特徴において、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、完成キメラポリヌクレオチドの子孫セットを生成する基礎として役立つ、核酸配列鋳型の祖先セットを分析することによって得られる。したがって、これらの親のオリゴヌクレオチド鋳型は、変異が導入される、例えばキメラ化又はシャッフルされる核酸構築ブロックの設計の助けになる配列情報源として役立つ。この方法の一つの特徴において、複数の親核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して、１つ以上の境界点が選択される。境界点は相同領域に位置することができ、１つ以上のヌクレオチドから構成される。これらの境界点は、一つの特徴では、少なくとも２つの祖先鋳型によって共有される。それによって境界点は、親ポリヌクレオチドの再配列のために生成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くために使用することができる。祖先分子中で同定及び選択される境界点は、完成キメラ子孫分子の構築における潜在的キメラ化点として機能する。境界点は、少なくとも２つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同領域であり得る（少なくとも１つの相同的なヌクレオチド塩基から構成される）。あるいは、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同領域であり得るか、又は親ポリヌクレオチド配列の少なくとも３分の２によって共有される相同領域であり得る。さらに一つの特徴において、利用可能な境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも４分の３によって共有される相同領域であるか、又は親ポリヌクレオチド配列のほぼ全てによって共有されることができる。一つの特徴において、境界点は親ポリヌクレオチド配列の全てによって共有される相同領域である。
【０２０８】
一つの特徴において、連結再集合工程は、子孫キメラポリヌクレオチドの網羅的ライブラリーを生成するために網羅的に実施される。換言すると、完成したキメラ核酸分子のセット中で、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが提示される。同時に、別の特徴では、各組合せにおける集合の順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックの集合の順番すなわち、完成したキメラ核酸のそれぞれの配列の５’から３’方向における各構築ブロックの集合の順番）は、上記に記載したように、設計に従った（又は非確率論的な）ものである。本発明の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は著しく低減される。
【０２０９】
別の特徴において、連結再アッセンブリ法は系統的に実施される。例えばこの方法は、系統的に、例えば１つずつスクリーニングすることができる区画を有する区画化によって、系統的に区画化された子孫分子のライブラリーを生成するために実施される。換言すると、本発明は、連続工程による構築反応の選択的及び慎重な使用と併せて、特定の核酸構築ブロックを選択的及び慎重に使用することによって、特定の子孫生成物のセットが幾つかの反応容器のそれぞれで作製される設計が得られることを提供する。このことによって、系統的な調査及びスクリーニング手順を実施することが可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に非常に多数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。特に祖先分子間で低レベルの相同性が存在するときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な方法でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、これらの方法は多数の子孫分子から構成されるライブラリー（又はセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、一つの態様では、設計に従って選択された全体的な集合の順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異導入及び最適化された定方向進化方法も、異なる子孫分子種を生成することに使用できる。本発明は、境界点、核酸構築ブロックのサイズ及び数、並びに結合の大きさ及び設計に関して選択と制御の自由を提供することが理解される。更に、本発明の実施可能性に関して、分子間相同性の要件は大きく緩和されることが理解される。事実、境界点はほとんど又は全く分子間相同性がない領域においても選択することができる。例えば、コドンの揺らぎのために、すなわち、コドンの縮退のために、対応する祖先鋳型でもともとコードされていたアミノ酸を変更することなく、ヌクレオチド置換をアミノ酸構築ブロックに導入することができる。あるいは、コドンを、元のアミノ酸のコードが変わるように変更することができる。本発明は、分子間相同境界点の出現を高めるために、したがって構築ブロック間で達成される結合数を高めるため、次いで、生成される子孫キメラ分子数の増加を可能にするため、そのような置換が核酸構築ブロックへ導入できることを提供する。
【０２１０】
合成遺伝子再アッセンブリ
一つの特徴において、本発明は、合成遺伝子再アッセンブリと呼ばれる非確立論的な方法を提供し、これは、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル又は連鎖又はキメラ化されるのではなく、むしろ非確率論的に構築されるということを別として、確率的シャッフリングといくらか関連する。例えば、米国特許第６，５３７，７７６号を参照すること。
合成遺伝子再アッセンブリ法は、シャッフルされるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することに依存しない。本発明の方法は、１０100を超える異なるキメラから構成される子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に生成するために使用できる。おそらく、合成遺伝子再アッセンブリを使用して、１０1000を超える、異なる子孫キメラから構成されるライブラリーを生成することもできる。
したがって、一つの特徴において、本発明は、設計に従って選択された全体的な構築の順番を有する、完成したキメラ核酸分子のセットを生成する非確率論的方法を提供する。前記方法は、互いに適合する連結可能な利用可能な末端を有する複数の特定の核酸構築ブロックを設計に従って生成する工程、及び設計した全体的な構築の順番が達成されるように核酸構築ブロックを生成する工程から構成される。
【０２１１】
構築される互いに適合する核酸構築ブロックの連結可能な末端は、これらが構築ブロックを予め定められた順序で結合させることができる場合、この種類の順序づけられた集合に対して「利用可能な」ものであると考えられる。したがって、一つの態様において、核酸構築ブロックを結合できる全体的な集合の順番は、連結可能な末端の設計によって特定され、２つ以上の構築工程が使用される場合、核酸構築ブロックを結合できる全体的な集合の順番は、集合工程の連続的な順番によっても特定される。本発明の一つの特徴において、アニールされた構築片がリガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）のような酵素で処理されて、構築片の共有結合が達成される。
【０２１２】
別の特徴において、核酸構築ブロックの設計は、完成したキメラ核酸分子の子孫セットを生成する基礎として役割を果たす核酸鋳型の祖先セットの配列を分析することによって得られる。したがって、祖先核酸鋳型は、変異が導入される、例えばキメラ化又はシャッフルされる核酸構築ブロックの設計の助けとなる配列情報源として役立つ。
一つの例示として、本発明は、関連する遺伝子のファミリー及び関連する生成物のコードされたファミリーのキメラ化を提供する。特定の例示において、コードされた生成物は酵素である。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素には、本明細書に記載された方法に従って、変異を導入することができる。
【０２１３】
本発明の一つの特徴によると、１つ以上の境界点を選択するために複数の祖先核酸鋳型（例えば、本発明ポリヌクレオチド）にアラインメントを実施する。この境界点は相同領域に位置し得る。境界点は、生成される核酸構築ブロックの境界線を引くために使用することができる。したがって、祖先分子中で同定及び選択される境界点は、子孫分子の構築における潜在的キメラ化点として機能する。
一つの特徴において、利用可能な境界点は少なくとも２つの祖先鋳型によって共有される相同領域（少なくとも１つの相同性核酸塩基から構成される）であるが、境界点は少なくとも半分の祖先鋳型、少なくとも３分の２の祖先鋳型、少なくとも４分の３の祖先鋳型、及びある特徴ではほぼ全ての祖先鋳型によって共有される相同領域であり得る。さらにある特徴においては、利用可能な境界点は全ての祖先鋳型によって共有される相同領域である。 
【０２１４】
一つの特徴において、遺伝子再アッセンブリ法は、網羅的ライブラリーを生成するために網羅的に実施される。換言すると、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成したキメラ核酸分子のセットで提示される。同時に、各組合せにおける集合の順番（すなわち、完成したキメラ核酸のそれぞれの配列の５’から３’の方向における各構築ブロックの集合の順番）は、設計に従った（又は非確率論的な）ものである。この方法の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は著しく低減される。
別の特徴において、本方法は、遺伝子再アッセンブリ法を系統的に実施して、例えば、系統的に、例えば１つずつスクリーニングすることができる区画を有する系統的に区画化されたライブラリーを生成することを提供する。換言すると、本発明は、連続工程による集合反応の選択的及び慎重な使用と併せて、特定の核酸構築ブロックを選択的及び慎重に使用することによって、特定の子孫生成物のセットが幾つかの反応容器のそれぞれで作製される実験的設計が得られることを提供する。このことによって、系統的な調査及びスクリーニング手順を実施することが可能になる。したがって、この方法は、潜在的に非常に多数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。
【０２１５】
特に祖先分子間で低レベルの相同性が存在するときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な方法でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、本発明は多数の子孫分子から構成されるライブラリー（又はセット）の生成を提供する。本発明の遺伝子再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、一つの特徴では、設計に従って選択された全体的な集合の順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。特定の態様において、そのように生成されたライブラリーは、１０3を越え１０1000を越えるまでの種々の子孫分子種から構成される。
一つの特徴において、記載されたように産生された完成したキメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される。一つの特徴によると、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、人工遺伝子であり得る。一つの特徴によると、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、人工遺伝子経路であり得る。本発明は、本発明により生成される１つ以上の人工遺伝子を、真核生物（植物を含む）において操作可能な経路のような人工遺伝子経路に組み込むことができることを提示する。
【０２１６】
別の例示において、構築ブロックが生成される工程の合成的な性質が、核酸（例えば、コドン又はイントロン又は制御配列でありうる、１つ以上のヌクレオチド）の設計及び導入を可能にし、後で場合によりインビトロ過程（例えば、変異導入）又はインビボ過程（例えば、宿主生物体の遺伝子スプライシングの能力を利用すること）により除去することができる。多くの場合において、これらのヌクレオチドの導入は、利用可能な境界点を作り出す潜在的な利益に加えて、その他多くの理由のために望ましい場合もあることが理解される。
【０２１７】
したがって、別の特徴によると、本発明は、核酸構築ブロックを使用してイントロンを導入できることを提供する。したがって、本発明は、機能性イントロンを本発明の人工遺伝子に導入できることを提供する。本発明は、機能性イントロンを本発明の人工遺伝子経路に導入できることも提供する。したがって、本発明は、１つ（又はそれ以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。
本発明は、１つ（又はそれ以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成も提供する。一つの特徴において、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能的に役立つような方法で、遺伝子スプライシングにおいて１つ以上の宿主細胞で機能する。本発明は、組換え及び／又はスプライシングのために宿主生物体に導入される、人工イントロン含有ポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。
【０２１８】
本発明を使用して作製された人工遺伝子は、別の核酸による組換えのための基質としても機能することができる。同様に、本発明を使用して作製された人工遺伝子経路は、別の核酸による組換えのための基質としても機能することができる。一つの特徴において、前記組換えは、人工イントロン含有遺伝子と、組換えパートナーとして機能する核酸との間の相同領域により促進されるか又はその領域で発生する。一つの特徴において、前記組換えパートナーは、人工遺伝子又は人工遺伝子経路を含む、本発明により生成される核酸であることもできる。組換えは、人工遺伝子に人工的に導入された１つ（又はそれ以上）のイントロンに存在する相同領域により促進されるか、又は前記領域で発生し得る。 
一つの特徴において、本発明の合成遺伝子再アッセンブリ方法は、一つの態様ではそれぞれ２つの連結可能な末端を有する複数の核酸構築ブロックを利用する。それぞれの核酸構築ブロックの２つの連結可能な末端は、２つの平滑末端（すなわち、それぞれゼロ核酸のオーバーハングを有する）、又は一つの特徴では、１つの平滑末端と１つのオーバーハング、又はなおさらに一つの特徴では、２つのオーバーハングであることができる。一つの特徴において、この目的に有用なオーバーハングは、３’オーバーハング又は５’オーバーハングである。したがって、核酸構築ブロックは、３’オーバーハングか、あるいは５’オーバーハングか、あるいは２つの３’オーバーハングか、あるいは２つの５’オーバーハングを有することができる。核酸構築ブロックが再集合されて完成したキメラ核酸分子を形成する全体的な順番は意図的な実験設計により決定され、ランダムではない。
【０２１９】
一つの特徴において、核酸構築ブロックは、２つの１本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ばれる）の化学合成、及びアニーリングさせて二本鎖核酸構築ブロックを形成するようにそれらを接触させることによって生成される。二本鎖核酸構築ブロックは多様なサイズであってよい。これらの構築ブロックのサイズは大型であっても小型であってもよい。構築ブロックの例示的なサイズは、１塩基対（あらゆるオーバーハングを含まない）から１００，０００塩基対（あらゆるオーバーハングを含まない）の範囲である。他の例示的なサイズも提供され、これらは、下限の１bp〜１０，０００bp（その間の全ての整数を含む）及び上限の２bp〜１００，０００bp（その間の全ての整数を含む）を有する。
【０２２０】
本発明に役に立つ二本鎖核酸構築ブロックを生成できる多くの方法が存在し、それらは当該技術で既知であり、当業者によって容易に実施することができる。一つの特徴によると、二本鎖核酸構築ブロックは、最初に２つの１本鎖核酸を生成し、それらをアニーリングさせて二本鎖核酸構築ブロックを形成することによって生成される。２本鎖核酸構築ブロックの２本の鎖は、オーバーハングを形成するもの以外の全ての核酸と相補的であってよく、したがって、オーバーハング以外のミスマッチを含まなくてよい。別の特徴によると、２本鎖核酸構築ブロックの２本の鎖は、オーバーハングを形成するもの以外の全ての核酸よりは少ない核酸と相補的である。したがって、この特徴によると、２本鎖核酸構築ブロックをコドン縮退を導入するために使用できる。ある特徴において、コドン縮退は、本明細書に記載されている部位飽和変異導入を使用し、１つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットを用いて、あるいは１つ以上のＮ，Ｎ，Ｎカセットを用いて導入される。
【０２２１】
本発明のインビボ組換え法は、不明のハイブリッドのプール又は特定のポリヌクレオチド若しくは配列の対立遺伝子のプールで盲目的に実施することができる。しかし、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を知ることは必ずしも必要ではない。遺伝子の混合集団内で組換えを使用する手法は、任意の有用なタンパク質、例えば本発明のセルラーゼ又はその変種の生成に有用でありうる。この手法を使用して、変更された特異性又は活性を有するタンパク質を生成することができる。この手法はハイブリッド核酸配列、例えば、遺伝子のプロモーター領域、イントロン、エクソン、エンハンサー配列、３'非翻訳領域又は５'非翻訳領域の生成に有用であることもできる。したがって、この手法を使用して発現速度の増加した遺伝子を生成することができる。この手法は反復ＤＮＡ配列の研究においても有用でありうる。最後に、この手法は本発明のリボザイム又はアプタマーの作製に有用でありうる。
一つの特徴において、本明細書に記載されている本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は組換えにより得たタンパク質のような高度な複合体直線状配列の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用を対象とする。
【０２２２】
最適化定方向進化系
本発明は、「最適化定方向進化系」と呼ばれる、新たな又は改変された特性を有する本発明のポリペプチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。一つの特徴において、最適化定方向進化は、組換えによる核酸の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用を対象とする。
最適化定方向進化は、進化したキメラ配列の大集団の生成を可能にする。生成された前記集団は、所定数の交差事象を有する配列が著しく豊富である。交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は、通常、２つの親からのオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。この方法は、完成キメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、所定数の交差事象を有するキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
【０２２３】
加えて、この方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための都合のよい手段を提供する。以前は、反応の際に例えば１０13個のキメラ分子が生成された場合、そのような多くの数のキメラ変種を特定の活性について試験することは極めて困難であったであろう。更に、子孫集団の相当な部分が、特定の活性のレベルが増加している可能性が少ないタンパク質をもたらす非常に多数の交差事象を含むであろう。この方法を使用することによって、キメラ分子集団は、特定の数の交差事象を有する変種を豊富に含むことができる。したがって、反応の際に１０13個のキメラ分子が生成されたとしても、更なる分析のために選択されるそれぞれの分子は、例えば３つの交差事象だけを有する可能性が高くなる。得られた子孫集団が所定数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が下がる。これによって、元の親のポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を与える原因であるかを計算するときに、より操作しやすい数の変数が提供される。
【０２２４】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作り出す１つの方法は、それぞれの親の配列のフラグメント又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作り出すことである。一つの特徴において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ固有の重複領域を含み、これによりオリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、それぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番で集合した新たな変種をもたらす。本発明のこれらの方法を実施する代替的なプロトコールは、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号、同第６，３６１，９７４号で見出すことができる。
それぞれの親変種について生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作り出されたキメラ分子で得られる交差の総数と関係がある。例えば、３つの親のヌクレオチド配列変種が提供され、連結反応を受けて、例えば高温でより高い活性をもつキメラ変種を見つけることができる。一つの例としては、５０個のオリゴヌクレオチド配列のセットをそれぞれの親変種のそれぞれの部分に対応して生成することができる。したがって、連結再アッセンブリ過程の間に、それぞれのキメラ配列の中に５０個までの交差事象が存在することができる。生成されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、それぞれの親変種からのオリゴヌクレオチドを交互に含む確率は非常に低いそれぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが連結反応で同じモル量で存在する場合、いくつかの位置で同じ親からのオリゴヌクレオチドが互いに並んで連結され、したがって交差事象を生じない可能性がある。それぞれの親からのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、この例のいずれの連結工程でも一定に保たれる場合、同じ親変種からのオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結され、交差を生じないチャンスは１／３である（３つの親と仮定した）。
【０２２５】
したがって、親変種セットの数、それぞれの変種に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び連結反応の各工程におけるそれぞれの変種の濃度が与えられたならば、連結反応の各工程で生じる可能性がある交差事象をもつ集団を予測するために確率密度関数（ＰＤＦ）を決定することができる。ＰＤＦの決定の背景にある統計学及び数学は以下に記載される。これらの方法を利用することによって、そのような確率密度関数を計算することができ、したがって特定の連結反応から生じる所定の数の交差事象のためにキメラ子孫集団を豊富にすることができる。更に、交差事象の標的数を予め定めることができ、次に、所定数の交差事象に集中する確率密度関数をもたらすように、連結反応の各工程におけるそれぞれの親オリゴヌクレオチドの出発量を算出するために系をプログラミングすることができる。これらの方法は、組換えによりポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を可能にする還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用に関する。この系は、進化したキメラ配列の大集団の生成を可能にし、生成された集団は、所定数の交差事象を有する配列が著しく豊富である。交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は、通常、２つの親からのオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。この方法は、完成キメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、所定数の交差事象を有するキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
【０２２６】
加えて、これらの方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための都合のよい手段を提供する。本明細書に記載されている方法を使用することによって、キメラ分子集団は、特定の数の交差事象を有する変種を豊富に含むことができる。したがって、反応の際に１０13個のキメラ分子が生成されたとしても、更なる分析のために選択されるそれぞれの分子は、例えば３つの交差事象だけを有する可能性が高くなる。得られた子孫集団が所定数の交差事象を持つように偏向させることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が下がる。これによって、元の親のポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を与える原因であるかを計算するときに、より扱い易い数の変数が提供される。
【０２２７】
一つの特徴において、本方法は、それぞれの親の配列のフラグメント又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作り出すことによってキメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作り出す。一つの態様において、各オリゴヌクレオチドは、それぞれ固有の重複領域を含み、これによりオリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、それぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番で構築された新たな変種をもたらす。例えば、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号、同第６，３６１，９７４号も参照すること。
【０２２８】
交差事象の決定
本発明の特徴には、所望の交差確率密度関数（ＰＤＦ）、再集合される親遺伝子の数及び再集合におけるフラグメント数を入力としての受け取るシステム及びソフトが含まれる。このプログラムの出力は、再集合遺伝子を作製するための処方を決定するために使用することができる「フラグメントＰＤＦ」及びこれら遺伝子の推定交差ＰＤＦである。本明細書に記載されている処理は、一つの特徴では、プログラミング言語及びテクニカルコンピューティングのための開発環境である、MATLAB（商標）（The Mathworks, Natick, Massachusetts）で実施される。
【０２２９】
反復プロセス
本発明の任意のプロセスは繰り返し反復することができ、例えば、本発明の改変された又は新たなセルラーゼ表現型、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸は、同定され、再単離され、再び改変され、活性について再試験されることができる。このプロセスは、所望の表現型が作り出されるまで繰り返し反復することができる。例えば、完全な生化学的同化作用又は異化作用経路を、細胞の中に操作して入れることができ、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性が含まれる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが、所望の属性（例えば、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素表現型）対して全く影響を与えないことが確定される場合、除去すべき配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することによって、変数としてのこのオリゴヌクレオチドを除去することができる。配列をより大きな配列内に組み込むことによってあらゆる交差事象が防止されるので、子孫ポリヌクレオチド中にはこの配列の変種はもはや全く存在しないであろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の属性と最も関係があり、どのオリゴヌクレオチドが無関係であるかを決定するこの反復実施は、特定の属性又は活性を提供する可能性がある全ての可能なタンパク質変種のより効率的な探索を可能にする。
【０２３０】
インビボシャッフリング
多様な特徴の中で、分子のインビボシャッフリングは、本発明のポリペプチドの変種、例えば本発明の抗体、又は本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素などを提供する本発明の方法で使用される。インビボシャッフリングは、多量体を組換える細胞の天然の特性を利用して実施することができる。インビボ組換えは、分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、遺伝子組換えは、１）相同性の認識；２）鎖の切断、鎖の侵襲、及び組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；最後に３）キアズマを分離した組換え分子に解離させることを含む比較的複雑なプロセスを維持したままである。キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
【０２３１】
別の特徴において、本発明は、少なくとも第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを産生する方法を含む。本発明を使用して、少なくとも１つの部分的な配列相同性の領域を共有する第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド（例えば、１つ又はその両方は、本発明の例示的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード配列である）を適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドポリヌクレオチドを産生することができる。部分的な配列相同性の領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを産生する配列認識をもたらすプロセスを促進する。本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」は、本発明の方法によりもたらされ、かつ少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列からの配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じることができる。加えて、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、反復配列を利用してＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変更する分子内還元的再組合せプロセスにより生じることができる。
【０２３２】
一つの特徴において、  in vivo再組合せは、包括的に“組換え”と称される“分子間”過程（細菌では一般的に“RecA-依存”現象とみなされる）に集約される。本発明は、配列の組換え及び再組合せを生じる宿主細胞の組換え過程に依存するか、又は欠失により細胞内で準反復配列の複雑度を減少させる還元過程を媒介する細胞の能力に依存することができる。この「還元的再組合せ」過程は、「分子内」ＲｅｃＡ依存性プロセスにより生じる。
本発明の別の特徴において、新規ポリヌクレオチドは還元的再組合せの過程により生成することができる。この方法は、連続配列（元のコード配列）、適切なベクターへのそれらの挿入、続く適切な宿主細胞へのそれらの導入を含む構築物を生成することに関わる。個々の分子実体の再組合せは、相同性領域を含む構築物中の連続配列間、又は準反復単位間のコンビナトリアルプロセスにより生じる。再組合せプロセスは反復配列を組換え及び／又は反復配列の複雑度及び程度を低減し、新規分子種の産生をもたらす。多様な処理を適用して、再組合せの速度を向上することができる。これらは、紫外線による処理、又はＤＮＡ損傷化学物質、及び／又は上昇した「遺伝子不安定性」レベルを示す宿主細胞の使用を含むことができる。したがって、再組合せプロセスは、自己の進化を誘導するために相同組換え又は準反復配列の天然の特性を含み得る。
【０２３３】
反復又は「準反復」配列は、遺伝子不安定性において役割を果たす。一つの特徴において、「準反復」は、元の単位構造に限定されない反復である。準反復単位は構築物中に配列のアレイとして表れることができ、類似の配列の連続単位である。いったん連結すると、連続配列の間の接合部は、実質的に可視化され、得られた構築物の準反復特性は、ここで、分子レベルで連続性となる。欠失プロセスでは、細胞は、準反復配列間で作用する、得られた構築物の複雑度を低減するために機能する。準反復単位は、スリッページ事象が起こると、実質的に制限のない鋳型のレパートリーを提供する。一つの態様において、準反復を含む構築物は、したがって、十分な分子弾性を有効に提供し、欠失（及び潜在的には挿入）事象は、準反復単位内で実質的にどこでも起きることができる。 
準反復配列が同じ配向で、例えばヘッドからテールへ又はその逆の配向で全て連結される場合、細胞は個別の単位を区別することができない。したがって、還元性プロセスは配列の全体にわたって生じ得る。対照的に、例えば、単位がヘッドからテールではなくヘッドからヘッドで表れている場合、この逆位により隣接単位の終点が線引きされ、これによって欠失形成は個別の単位欠失を優先するようになる。したがって、配列が同じ配向であることが本発明にとって好ましい。準反復配列のランダム配向は、再組合せ効率の損失をもたらし、一方、配列の一貫性配向は最高の効率を提供するであろう。しかし、同じ配向で隣接した配列が少なくなると効率が減少するが、新規分子の有効な回収にとって依然として十分な弾力性が得られるであろう。構築物を同じ配向の準反復配列を有するように作製して、より高い効率を可能にすることができる。
【０２３４】
配列は、以下を含む多様な方法のいずれかを使用してヘッドからテールの配向で集合させることができる： 
ａ）ポリＡヘッド及びポリＴテールを含む（一本鎖で作製される場合に配向を提供する）プライマーを利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製（したがってRnaseHで容易に除去できる）することにより達成される。
ｂ）固有の制限切断部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、一連の固有の配列及び反復合成、並びに連結工程が必要であろう。
ｃ）プライマーの内部の幾つかの塩基をチオール化し、エキソヌクレアーゼを使用して適切にテールを切った分子を産生することができる。
【０２３５】
一つの特徴において、再組合せされた配列の回収は、低減した反復指数（ＲＩ）を有するクローニングベクターの同定に依存している。次に再組合せコード配列を増幅により回収することができる。生成物を再クローン化し、発現させる。低減したＲＩを有するクローニングベクターの回収は、以下のようにして実施することができる：
１）構築物の複雑度が低減したときにのみ安定して維持されるベクターの使用。
２）物理的な手順による短縮ベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離手順の使用及びアガロースゲル又は標準的手順を利用した低分子量カットオフのカラムによるサイズ分画を使用して回収される。
３）挿入物の大きさが減少したときに選択できる中断遺伝子を含有するベクターの回収。
４）発現ベクターによる直接選択技術及び適切な選択の使用。
【０２３６】
関連する生物からのコード配列（例えば、遺伝子）は高度な相同性を示し、非常に多様なタンパク質生成物をコードすることができる。これらの種類の配列は、準反復として本発明において特に有用である。しかし、下記に示される例は、ほぼ同一の元のコード配列（準反復）の再組合せを示すが、このプロセスはそのようなほぼ同一の反復に限定されない。
【０２３７】
以下の例は、本発明の例示的な方法を示す。３つの固有種由来のコード核酸配列（準反復）が記載される。それぞれの配列は、特性の別個のセットを有するタンパク質をコードする。それぞれの配列は、配列中の独自の位置で単一又は数個の塩基対により異なっている。準反復配列は、別々に又は集合的に増幅され、ランダム集合物へ連結され、これによって全ての順列及び組合せが連結分子の集団で利用可能になる。準反復単位の数は、構築条件により制御することができる。構築物中の準反復単位の平均数は、反復指数（ＲＩ）として定義される。 
いったん形成されるたなら、構築物を公表されたプロトコールに従ってアガロースゲルでサイズ分画して、あるいはせずに、クローニングベクターに挿入すること及び適切な宿主細胞にトランスフェクションすることができる。次に細胞を増殖させ、「還元的再組合せ」を実行する。還元的再組合せプロセスの速度は、望ましい場合はＤＮＡ損傷の導入により刺激することができる。ＲＩの低減が、「分子内」機構による反復配列の間の欠失形成によって媒介されるか、又は「分子間」機構を介した組換え様事象により媒介されるかは、重要ではない。最終結果は、可能な全ての組合せへの分子の再組合せである。
【０２３８】
場合により、この方法はシャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングして、例えば、タンパク質レセプター、オリゴ糖、ビリオン又は他の所定の化合物若しくは構造のような所定の高分子と、結合するか、そうでなければ相互作用するか又は特定の反応を触媒する（例えば、酵素の触媒ドメイン）能力を有するシャッフルされた個別のライブラリーメンバーを同定することを含む。
そのようなライブラリーから同定されたポリペプチドを、治療診断、研究及び関連する目的（例えば、触媒、水溶液などの浸透圧を増加する溶質）に使用することができ、並びに／又はシャッフリング及び／若しくは選択の１つ以上の追加のサイクルに付すことができる。 
【０２３９】
別の特徴において、組換え又は再組合せの前又はその間に、本発明の方法により生成されたポリヌクレオチドを、変異を元のポリヌクレオチドに導入することを促進する作用物質又はプロセスに付すことができる。そのような変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドの多様性を増大する。変異導入を促進する作用物質又はプロセスは、以下を含むことができるが、これらに限定はされない：（＋）−ＣＣ−１０６５、又は（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）のような合成類似体Ａｄｅｎｉｎｅ（Sun and Hurley, (1992)を参照すること）；ＤＮＡ合成を阻害することができるＮ−アセチル化又は脱アセチル化４’−フルオロ−４−アミノビフェニル付加物（例えば、van de Poll et al. (1992)を参照すること）；又はＤＮＡ合成を阻害することができるＮ−アセチル化又は脱アセチル化４−アミノビフェニル付加物（van de Poll et al. (1992), pp. 751-758も参照すること）;ＤＮＡ複製を阻害することができる三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）ＤＮＡ付加物、例えば、７−ブロモエチル−ベンズ〔ａ〕アントラセン（「ＢＭＡ」）、トリス（２，３−ジブロモプロピル）ホスフェート（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ〔ａ〕ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９−１０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、白金（ＩＩ）ハロゲン塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ〔４，５−ｆ〕−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）及びＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ〔４，５−ｆ〕−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＰｈＩＰ」）。ＰＣＲ増幅を遅延又は停止させる例示的な手段は、ＵＶ光線（＋）−ＣＣ−１０６５及び（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）からなる。特に包含される手段は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールからのＤＮＡ付加物を含むＤＮＡ付加物又はポリヌクレオチドであり、これらは更に処理される前にポリヌクレオチドを含む溶液を加熱することを含むプロセスにより放出又は除去できる。
別の特徴において、本発明は、本発明の条件下で野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含む試料を処理することによって、生物学的活性を有する組換えタンパク質を産生する方法を対象とし、これは、ハイブリッド又は再組合せポリヌクレオチドの産生のために提供される。
【０２４０】
配列変種の作製
本発明は、本発明の核酸（例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）配列の配列変種を作製する追加的な方法も提供する。本発明は、本発明の核酸及びポリペプチドを使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を単離する追加的な方法も提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード配列（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ又はメッセージ）の変種を提供し、これは、例えば、上記で記載したランダム若しくは確率論的方法又は非確率論的若しくは「定方向進化」方法を含むあらゆる方法によって変更することができる。 
【０２４１】
単離された変種は、天然に存在し得る。変種はインビトロで作り出すこともできる。変種は、部位特異的変異導入、ランダム化学変異導入、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失手順及び標準的クローニング技術のような遺伝子工学技術を使用して作り出すことができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、類似体又は誘導体は、化学的合成又は改変手順を使用して方法を使用して作り出すことができる。変種を作製する他の方法も当業者にはよく知られている。これらには、天然の単離物から得られた核酸配列を改変して、それらの産業的価値又は実験室適用を高める特徴を有するポリペプチドをコードする核酸を生成する手順が含まれる。そのような手順において、天然の単離物から得られた配列に対して１つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が生成され、特徴が決定される。これらのヌクレオチド相違は、天然の単離物の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化をもたらすことができる。
【０２４２】
例えば、変種は、エラープローンPCRを使用して作り出すことができる。エラープローンPCRの一つの態様において、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの複写忠実性が低い場合、高率の点変異がＰＣＲ生成物の全長に沿って得られるような条件下で実施される。エラープローンPCRは、例えば、Leung (1989) Technique 1:11-15) and Caldwell (1992) PCR Methods Applic. 2:28-33に記載されている。簡潔には、そのような手順では、変異が導入される核酸を、ＰＣＲプライマー、反応緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、Ｔａｑポリメラーゼ及び適切な濃度のｄＮＴＰと混合し、ＰＣＲ生成物の全長に沿って高率の点変異が達成される。例えば、反応は、２０fmoleの変異が導入される核酸、３０pmoleの各ＰＣＲプライマー、５０mM  ＫＣｌ、１０mMトリス（ｐＨ８．３）及び０．０１％ゼラチンを含む反応緩衝液、７mMのＭｇＣｌ2、０．５mMのＭｎＣｌ2、５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２mMのｄＧＴＰ、０．２mMのｄＡＴＰ、１mMのｄＣＴＰ、並びに１mMのｄＴＴＰを使用して実施される。ＰＣＲは、９４℃で１分間、４５℃で１分間、及び７２℃で１分間の３０サイクルにより実施することができる。しかし、これらのパラメーターは、適切であれば変えることができることが理解される。変異導入核酸は、適切なベクターにクローンされ、変異導入核酸によりコードされたポリペプチドの活性が評価される。
【０２４３】
一つの特徴において、変種は、目的の任意のクローン化ＤＮＡに部位特異的変異を生成するオリゴヌクレオチド特異的変異導入を使用して作り出される。オリゴヌクレオチド変異導入は、例えば、Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57に記載されている。簡潔には、そのような手順において、クローン化ＤＮＡに導入される１つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異が導入されるクローン化ＤＮＡに挿入される。一つの特徴において、変異が導入されたＤＮＡを含むクローンが回収され、発現され、それらによりコードされたポリペプチドの活性が評価される。
変種を生成する別の方法は、アッセンブリＰＣＲである。アッセンブリＰＣＲは、小型のＤＮＡフラグメントの混合物からＰＣＲ生成物を構築することを含む。多数の異なるＰＣＲ反応が同じバイアル中で並行して起こり、１つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリＰＣＲは、例えば米国特許第５，９６５，４０８号に記載されている。
【０２４４】
一つの特徴において、セクシュアルPCR変異導入は、本発明の変種を生成する例示的な方法である。一つの特徴において、セクシュアルＰＣＲ変異導入強制相同組換えが、配列相同性に基づくＤＮＡ分子のランダムなフラグメント化、それに続くＰＣＲ反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果として、異なっているが高度に関連しているＤＮＡ配列をもつＤＮＡ分子間でインビトロにおいて生じる。セクシュアルＰＣＲ変異導入は、例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751で記載されている。簡潔には、そのような方法では、組換えられる複数の核酸をＤＮａｓｅで消化して、平均サイズが５０〜２００ヌクレオチドのフラグメントを生成する。所望の平均サイズをもつフラグメントを精製し、ＰＣＲ混合物に再懸濁する。ＰＣＲは、核酸フラグメント間の組換えが促進される条件下で実施される。例えば、ＰＣＲは、０．２mMの各ｄＮＴＰ、２．２mMのＭｇＣｌ2、５０mMのＫＣＬ、１０mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液中、濃度１０〜３０ng/μlで精製フラグメントを再懸濁することによって実施することできる。反応混合物１００μlあたり２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、ＰＣＲを、以下のレジメンを使用して実施した：９４℃で６０秒間、９４℃で３０秒間、５０〜５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（３０〜４５回）及び７２℃で５分間。しかし、これらのパラメーターは、適切であれば変えることができることが理解される。幾つかの特徴において、オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に含めることができる。他の特徴において、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを、ＰＣＲ反応の最初のセットで使用し、Ｔａｑポリメラーゼをその後のＰＣＲ反応セットで使用することができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０２４５】
一つの特徴において、変種をインビボ変異導入により作り出す。幾つかの態様において、目的の配列におけるランダム変異は、１つ以上のＤＮＡ修復経路に変異をもつ細菌株、例えばE. coli株で目的の配列を繁殖させることによって生成される。このような「ミューテーター」株は、野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の１つでＤＮＡを繁殖させることによって、最終的にはＤＮＡ内にランダム変異が生成される。インビボ変異導入での使用に適切なミューテーター株は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／１６４２７（１９９１年１０月３１日公開、表題“Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Population”）に記載されている。
変種は、カセット変異導入を使用して生成することもできる。カセット変異導入において、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域が、天然の配列と異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”に代えられる。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全及び／又は部分的に無作為化抽出された天然の配列を含む。
【０２４６】
再帰的アンサンブル変異導入を使用して変種を生成することもできる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型的に関連する変種の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を産生するために開発された、タンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。この方法は、フィードバック機構を使用して、連続する一連のコンビナトリアルカセット変異導入を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は、例えば、Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815で記載されている。
幾つかの特徴において、変種は、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入を使用して作り出される。エクスポネンシャルアンサンブル変異導入は、独自で機能的な変種の割合の高いコンビナトリアルライブラリーを生成する方法であり、残基の小グループが並行してランダム化され、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸がそれぞれの変更された位置で同定される。エクスポネンシャル変異導入は、例えばDelegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552に記載されている。ランダム及び部位特異的変異導入は、例えば、Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455に記載されている。
幾つかの特徴において、変種は、シャッフリング手順を使用して作り出され、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が一緒に融合されて、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作り出し、米国特許第５，９６５，４０８号（１９９６年７月９日出願、表題“Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis”及び米国特許第５，９３９，２５０号（１９９６年５月２２日出願、表題“Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis”）に記載されている。
【０２４７】
本発明のポリペプチドの変種は、本発明のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（一つの態様では、保存アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされているものでも、いないものでもよい変種であり得る。
一つの特徴において、保存的置換は、ポリペプチド内の所定のアミノ酸が同様な特徴の別のアミノ酸により置換されるものである。一つの特徴において、本発明の保存的置換は以下の置き換えを含む：アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのような脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置き換えること；セリンをトレオニンに置き換えること、又はその逆；アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性残基を別の酸性残基に置き換える；アスパラギン及びグルタミンのようなアミド基をもつ残基を別のアミド基をもつ残基に置き換えること；リシン及びアルギニンのような塩基性残基を別の塩基性残基に交換すること；並びにフェニルアラニン、チロシンのような芳香族残基を別の芳香族残基に置き換えること。
【０２４８】
他の変種は、本発明のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものである。一つの態様において、他の変種は、ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と結合しているものである。追加的な変種は、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリペプチドの精製、濃縮若しくは安定化を促進する配列のような、追加のアミノ酸がポリペプチドと融合しているものである。
幾つかの特徴において、フラグメント、誘導体及び類似体は、本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を保持する。他の態様において、フラグメント、誘導体又は類似体はプロタンパク質を含み、これによって、フラグメント、誘導体又は類似体はプロタンパク質部分の切断により活性化され、活性ポリペプチドを産生することができる。
【０２４９】
宿主細胞における高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化
本発明は、コドン使用頻度を改変（例えば、最適化）するために、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸を改変する方法を提供する。一つの特徴において、本発明は、宿主細胞における発現を増加又は減少するために、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸中のコドンを改変する方法を提供する。本発明は、また、宿主細胞において発現を増加するように改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸、そのように改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、及び改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。この方法は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸において「非優先」又は「低優先」コドンを同定し、１つ以上のこれらの非優先又は低優先コドンを、置き換えられるコドンと同じ核酸をコードする「優先コドン」で置き換え、核酸中の少なくとも１つの非優先又は低優先コドンが、同じ核酸をコードする優先コドンで置き換えられていることを含む。優先コドンとは、宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンとは、宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである。
【０２５０】
本発明の核酸、発現カセット及びベクターを発現するための宿主細胞には、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる（上記の考察を参照すること）。したがって、本発明は、これら全ての細胞におけるコドンの使用を最適化する方法、コドン変更核酸及びコドン変更核酸により作製されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、大腸菌（Escherichia coli）のようなグラム陰性細菌、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）のようなグラム陽性細菌が含まれる。例示的な宿主細胞には、真核生物体、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）及びクレイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）を含むサッカロミセス種（Saccharomyces sp.）のような種々の酵母、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、哺乳動物細胞及び細胞株、並びに昆虫細胞及び細胞株も含まれる。したがって、本発明は、これらの生物体及び種での発現を最適化する核酸及びポリペプチドも含む。
【０２５１】
例えば、細菌細胞から単離されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸のコドンは、核酸が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が由来する細菌と異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞で最適に発現するように改変される。コドンを最適化する方法は、当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第5,795,737号; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253を参照すること）。また、マウス系におけるコドンの最適化を記載するNarum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253：酵母におけるコドンの最適化を記載するOutchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24；E. coliにおけるコドンの最適化を記載するFeng (2000) Biochemistry 39:15399-15409；E. coliにおける分泌に影響を与えるコドン使用頻度の最適化を記載するHumphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264を参照すること。
【０２５２】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクション若しくは形質転換細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明は、これらのトランスジェニック非ヒト動物の作製及び使用方法も提供する。
トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、本発明の核酸を含むイヌ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ（全てのブタ（swine、hog）及び関連する動物を含む）、ウシ、ラット及びマウスであることができる。これらの動物は、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を研究するインビボモデルとして、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性をインビボで変える作用物質をスクリーニングするためのモデルとして使用できる。トランスジェニック非ヒト動物で発現されるポリペプチドのためのコード配列は、構成的であるように、又は組織特異的、生育特異的若しくは誘導性転写調節因子の制御下にあるように設計することができる。
【０２５３】
トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術で既知のいずれかの方法を使用して設計及び生成することができる（例えば、形質転換細胞及び卵、並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ及びウシの作製及び使用を記載する、米国特許第６，２１１，４２８号、同第６，１８７，９９２、同第６，１５６，９５２号、同第６，１１８，０４４号、同第６，１１１，１６６号、同第６，１０７，５４１号、同第５，９５９，１７１号、同第５，９２２，８５４号、同第５，８９２，０７０号、同第５，８８０，３２７号、同第５，８９１，６９８号、同第５，６３９，９４０号、同第５，５７３，９３３号、同第５，３８７，７４２号、同第５，０８７，５７１を参照すること）。また、例えば、トランスジェニック乳畜のミルクにおける組換えタンパク質の産生を記載する、Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157、及びトランスジェニックヤギの作製を示す、Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461を参照すること。米国特許第６，２１１，４２８号は、ＤＮＡ配列を含む核酸構築物を脳の中で発現するトランスジェニック非ヒト動物の作製及び使用を記載する。米国特許第５，３８７，７４２号は、クローン化した組換え又は合成ＤＮＡ配列を受精マウス卵へ注入すること、注入卵を偽妊娠雌へ移植すること、及びトランスジェニックマウスと呼べるまで増殖させることを記載する。米国特許第６，１８７，９９２号は、トランスジェニックマウスの作製及び使用を記載する。
【０２５４】
「ノックアウト動物」も本発明の方法を実施するために使用できる。例えば、一つの態様において、本発明のトランスジェニック又は改変動物は、「ノックアウト動物」、例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発現する遺伝子に代えられているか又は本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む融合タンパク質に代えられている、内因性遺伝子を発現しないように操作された「ノックアウト動物」を含む。
【０２５５】
トランスジェニック植物及び種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクション若しくは形質転換細胞を含むトランスジェニック植物及び種子を提供する。本発明は、また、発明の核酸及び／又はポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）を含む植物生成物、例えば、油、種子、葉、抽出物などを提供する。トランスジェニック植物は、双子葉植物（双子葉類）又は単子葉植物（単子葉類）であることができる。本発明は、これらのトランスジェニック植物及び種子の作製及び使用方法も提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物及び種子細胞は、当該技術で既知のいずれかの方法に従って構築することができる。例えば、米国特許第６，３０９，８７２号を参照すること。
本発明の核酸及び発現構築物は、任意の手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、核酸及び発現構築物を、所望の植物宿主のゲノムに導入することができるか、又は核酸若しくは発現構築物はエピソームであることができる。所望の植物のゲノムへの導入は、宿主のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素産生が、内因性の転写又は翻訳制御エレメントによって調節されるような導入であることができる。本発明は、また、例えば相同組換えによる遺伝子配列の挿入が内因性遺伝子の発現を破壊した「ノックアウト植物」を提供する。「ノックアウト」植物を生成する方法は当該技術でよく知られている（例えばStrepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365を参照すること）。下記のトランスジェニック植物につての考察を参照すること。
【０２５６】
本発明の核酸を使用して、実質的にあらゆる植物、例えばジャガイモ、トマト、ダイズ、ビーツ、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギなどのデンプン生成植物に所望の属性を付与することができる。本発明の核酸を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の宿主の発現を最適化又は変更するために植物の代謝経路を操作することができる。これは、植物におけるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を変えることができる。あるいは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をトランスジェニック植物の生成に使用して、その植物により天然に生成されない化合物を生成することができる。このことは、生産費用を下げるか、又は新規の生成物を作り出すことができる。
一つの特徴において、トランスジェニック植物産生の第１の工程は、植物細胞で発現する発現構築物を作製することを含む。これらの技術は当該技術でよく知られている。これらには、プロモーターの選択及びクローニング、リボソームのｍＲＮＡへの効率的な結合を促進するコード配列の選択及びクローニング、及び適切な遺伝子ターミネーター配列の選択が含まれる。構成的プロモーターの一例は、カリフラワーモザイクウイルスに由来するＣａＭＶ３５Ｓであり、一般に植物において高度な発現をもたらす。他のプロモーターは、より特異的であり、植物の内部又は外部環境の合図に反応する。例示的な光誘導性プロモーターは、主要な葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質をコードするｃａｂ遺伝子に由来するプロモーターである。
【０２５７】
一つの特徴において、核酸は、植物細胞におけるより大きな発現を達成するために改変される。例えば、本発明の配列は、植物で見られるＡ−Ｔヌクレオチド対と比較して高い割合でＡ−Ｔヌクレオチド対を有する可能性があり、一部の植物は、Ｇ−Ｃヌクレオチド対を好む。したがって、コード配列におけるＡ−Ｔヌクレオチドを、アミノ酸配列を著しく変えることなくＧ−Ｃヌクレオチドで置換して、植物細胞における遺伝子生成物の産生を高めることができる。
選択可能なマーカー遺伝子を遺伝子構築物に付加して、導入遺伝子を組み込むことに成功した植物細胞又は組織を同定することができる。このことは、植物細胞において遺伝子の取り込み及び発現の達成が稀な事象であり、ごく僅かの割合の標的組織又は細胞でしか起こらないので必要である。選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質又は除草剤のような植物に通常毒性である作用物質に対して抵抗性を提供するタンパク質をコードする。適切な抗生物質又は除草剤を含有する培地で増殖させたとき、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞のみが生存する。他の挿入遺伝子のように、マーカー遺伝子も適切な機能のためにプロモーター及び終結配列を必要とする。
【０２５８】
一つの特徴において、トランスジェニック植物又は種子を作製することは、本発明の配列、及び場合によりマーカー遺伝子を標的発現構築物（例えば、プラスミド）へ組み込むことを、プロモーター及びターミネーター配列を配置することと共に含む。これは、適切な方法により改変遺伝子を植物に移すことを含むことができる。例えば、構築物は、植物細胞のプロトプラストのエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができるか、又は構築物は、ＤＮＡ粒子衝撃のような弾道法を使用して植物組織に直接導入することができる。例えば、導入遺伝子をコムギに導入する粒子衝撃の使用を記載する、Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69；及びＹＡＣを植物細胞に導入する粒子衝撃の使用について、Adam (1997) supraを参照すること。例えば、Rinehart (1997) supraは、粒子衝撃を使用してトランスジェニック綿植物を生成した。粒子を加速する装置は、米国特許第５，０１５，５８０号に記載され、BioRad (Biolistics) PDS-2000粒子加速機として市販されている（例えば、裸子植物の粒子媒介形質転換を記載する、米国特許第５，６０８，１４８号（John）及び米国特許第５，  ６８１，７３０号（Ellis）も参照すること）。
【０２５９】
一つの特徴において、プロトプラストを固定化して、核酸、例えば発現構築物をインジェクションすることができる。プロトプラストから植物を再生させることは穀類では容易ではないが、マメ科植物ではプロトプラスト由来カルスから体細胞胚形成を使用して植物の再生が可能である。器官化した組織は、遺伝子銃技術を使用して裸のＤＮＡにより形質転換することができ、この場合、ＤＮＡはタングステンの微小発射体上に被覆され、細胞のサイズの１／１００の弾丸で発射され、ＤＮＡを細胞及び細胞小器官の奥深くに運ぶ。次に形質転換組織を、通常体細胞胚形成により誘導して再生する。この技術は、トウモロコシ及びイネを含むいくつかの穀類種で成功した。 
【０２６０】
核酸、例えば発現構築物は、組換えウイルスを使用して、植物細胞に導入することもできる。植物細胞は、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクター（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）ようなウイルスベクター使用して形質転換することができる（Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants,” Mol. Biotechnol. 5:209-221を参照すること）。
あるいは、核酸、例えば発現構築物を、適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組合せて、従来のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクターに導入することができる。Agrobacterium tumefaciens宿主の病原性機能は、細胞が細菌に感染したとき、植物細胞ＤＮＡへの構築物及び隣接するマーカーの挿入を指令する。無力化及びバイナリーベクターの使用を含むAgrobacterium tumefaciens媒介形質転換技術は、科学文献で十分に記載されている。例えば、Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)を参照すること。A. tumefaciens細胞のＤＮＡは、細菌の染色体中に、並びにＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドとして知られている別の構築物中に含まれている。Ｔｉプラスミドは、感染過程で植物細胞に移行するＴ−ＤＮＡ（約２０kbの長さ）と呼ばれる一続きのＤＮＡ及び感染過程を誘導する一連のｖｉｒ（病原性）遺伝子を含む。A. tumefaciensは、傷から植物に感染することしかできない：植物の根又は茎が傷を受けたとき、特定の化学的シグナルを発し、それに応答してA. tumefaciensのｖｉｒ遺伝子は活性化され、Ｔｉプラスミドから植物染色体へのＴ−ＤＮＡの移行に必要な一連の事象を誘導する。次にＴ−ＤＮＡが傷から植物細胞に進入する。一つの推測は、Ｔ−ＤＮＡは植物ＤＮＡが複製又は転写されるまで待機し、次に露出した植物ＤＮＡに自身を挿入するということである。A. tumefaciensを導入遺伝子ベクターとして使用するためには、Ｔ−ＤＮＡ境界領域及びｖｉｒ遺伝子を保持しつつ、Ｔ−ＤＮＡの腫瘍誘導部分を除去しなければならない。次に、導入遺伝子をＴ−ＤＮＡ境界領域の間に挿入する（この場合、トランスジーンは植物細胞に移入し、植物染色体に組み込まれる）。
【０２６１】
本発明は、本発明の核酸を使用した、重要な穀類を含む単子葉植物の形質転換を提供する（ゲノムＤＮＡへのＴ−ＤＮＡの組み込みについて考察している、Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205218.  See also, e.g., Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148を参照すること）。また、穀類又は他の単子葉植物の細胞で機能する遺伝子を含むＤＮＡを安定して組み込むための方法を記載する、米国特許第５，７１２，１３５号（D'Halluin）を参照すること。 
【０２６２】
一つの特徴において、第３の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる全植物体の選択及び再生を含む。そのような再生技術では、組織培養の増殖培地において特定の表現型の操作を使用することができる。一つの特徴において、その方法は、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生剤及び／又は除草剤マーカーを使用する。培養プロトプラストからの植物再生は、Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生は、植物カルス、外植片、器官又はその部分から得ることもできる。そのような再生技術は、一般に、Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486で記載されている。未熟胚のようなトランスジェニック組織から全植物体を得るために、これらを栄養素及びホルモンを含有する一連の培地中で環境制御条件下で増殖させることができ、これは組織培養として既知の方法である。全植物体が再生され、種子を生じたなら、子孫の評価を開始する。
【０２６３】
一つの特徴において、発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、この発現カセットを有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれかを使用することができる。本発明の核酸の遺伝子導入発現は表現型に変化をもたらすので、本発明の組換え核酸を含む植物を第２の植物と有性交配して、最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の２つのトランスジェニック植物間の交配、又は本発明の植物と別の植物との間の交配由来し得る。所望の効果（例えば、本発明のポリペプチドを発現させて開花の挙動の変化した植物を生み出すこと）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）を発現するときに強化できる。所望の効果は、将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
【０２６４】
一つの特徴において、本発明の核酸及びポリペプチドを、任意の植物又は種子で発現させるか又はそれに挿入する。本発明のトランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であることができる。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばイチゴツナギ（ブルーグラス、Poa）、飼い葉用草類、例えばウシノケグサ、ドクムギ、寒地型牧草、例えばAgrostis、並びに穀類、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガム及びトウモロコシ（コーン）である。本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、ルピナスのようなマメ類、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメ及びダイズ、カリフラワーのような十字花植物（Brassicaceae科）、ナタネ、並びに近縁のモデル生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物及び種子には、アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトラス、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、ダイズ（Glycine）、ワタ（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、イネ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルセア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ソラマメ（Vicia）、ブドウ（Vitis）、アズキ（Vigna）、およびゼア（Zea）属の種が含まれるが、これらに限定はされない広範囲の植物が含まれる。
【０２６５】
別の態様において、本発明の核酸は、例えば、綿、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、砂漠ヤナギ、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ローゼル、ジュート、サイザルアバカ及びアマが挙げられる繊維細胞を含む植物で発現する。代替的実施態様において、本発明のトランスジェニック植物は、G.アロボレウム（G. arboreum）、G.ヘルバセウム（G. herbaceum）、G.バルバデンス（G. barbadense）及びＧ．ヒルスタム（G. hirsutum）のような任意のゴシピウム（Gossypium）種のメンバーを含むゴシピウム（Gossypium）属のメンバーであることができる。
【０２６６】
本発明は、多量の本発明のポリペプチド（例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体）を産生するために使用されるトランスジェニック植物も提供する。例えば、Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296（オーキシン誘導性二方向性マンノピンシンターゼ（ｍａｓ１’，２’）プロモーターを使用する、Agrobacterium tumefaciens媒介葉ディスク形質転換法による、トランスジェニックなジャガイモにおける母乳タンパク質のベータカゼインの産生）を参照すること。
既知の手順を使用して、当業者は、トランスジェニック植物で導入遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質の増加又は減少を検出することによって、本発明の植物をスクリーニングすることができる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出及び定量化の方法は、当該技術でよく知られている。
【０２６７】
ポリペプチド及びペプチド
一つの態様において、本発明は、本発明の例示的な配列、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）に記載の配列を有するタンパク質に、配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性若しくは相同性）を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。前記同一性の百分率は、ポリペプチドの完全長にわたることができるか、又は前記同一性は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個又はそれ以上の残基の範囲にわたることができる。
【０２６８】
本発明のポリペプチドは、また、例示的なポリペプチドの完全長よりも短いこともあり得る。別の特徴において、本発明は、サイズが約５からポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のような酵素）の完全長の間のサイズの範囲のポリペプチド（ペプチド、フラグメント）を提供する。例示的な前記サイズは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個又はそれ以上の残基、例えば、本発明の例示的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の隣接する残基である。本発明のペプチド（例えば、本発明の例示的なポリペプチドの部分配列）は、例えば、標識プローブ、抗原（免疫原）、トレラゲン、モチーフ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位（例えば、「触媒ドメイン」）、シグナル配列、及び／又はプレプロドメインとして有用でありうる。
【０２６９】
別の特徴において、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、特定の構造要素を共有するポリペプチド族のメンバーである。前記特定の構造要素とは、例えば、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性と相関するアミノ酸残基である。これらの共有構造要素を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ変種の日常的な生成に使用することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のこれらの共有構造要素を、本発明のポリペプチド族の範囲内のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ変種の日常的な生成のための指針として使用することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ」は、セルラーゼ、又は、セルラーゼ若しくはリグノセルロース材料の改変物、例えばリグノセルロースを含むバイオマス材料、の完全な若しくは部分的な分解及び／又は加水分解を触媒することができるあらゆるポリペプチド又は酵素を包含する（例えば、本発明の例示的なポリペプチド、また、下記の表１、２及び３、実施例１及び４を参照すること）。
【０２７０】
幾つかの特徴において、本発明のポリペプチドは、例えば下記の表３で記載される代替的な酵素活性を有することができる。例えば、下記で示されているように、例えば配列番号１６３によってコードされる、配列番号１６４に記載される配列を有するポリペプチドは、アルカリエンドグルカナーゼ／セルラーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１０９によってコードされる、配列番号１１０に記載される配列を有するポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１１によってコードされる、配列番号１２に記載される配列を有するポリペプチドは、ＮＡＤ結合オキシドレダクターゼ活性を有することができ、例えば配列番号１１７によってコードされる、配列番号１１８に記載される配列を有するポリペプチドは、短鎖デヒドロゲナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１３によってコードされる、配列番号１４に記載される配列を有するポリペプチドは、ＮＡＤＨ依存性デヒドロゲナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１３７によってコードされる、配列番号１３８  に記載される配列を有するポリペプチドは、ペプチダーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１６１によってコードされる、配列番号１６２に記載される配列を有するポリペプチドは、セルラーゼ活性に加えて、アルカリエンドグルカナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号４１によってコードされる、配列番号４２に記載される配列を有するポリペプチドは、システイニルｔＲＮＡシンセターゼ活性を有することができ、例えば配列番号３１によってコードされる、配列番号３２に記載される配列を有するポリペプチドは、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有することができ、例えば配列番号４９によってコードされる、配列番号５０に記載される配列を有するポリペプチドは、ｆｄｈｄ／ｎａｒｑオキシドレダクターゼ活性を有することができ、例えば配列番号５３によってコードされる、配列番号５４に記載される配列を有するポリペプチドは、ラジカルＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）活性を有することができ、例えば配列番号５７によってコードされる、配列番号５８に記載される配列を有するポリペプチドは、サブチリシン様プロテアーゼ活性を有することができる。 
【０２７１】
表３
0005343212.tif 000002
【０２７２】
表３つづき
0005343212.tif 000003
【０２７３】
表３つづき
0005343212.tif 000004
【０２７４】
表３つづき
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【０２７５】
表３つづき
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【０２７６】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分、若しくはサブユニット及び天然に存在する分子又は合成分子を意味する。「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」には、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分、若しくはサブユニット及び天然に存在する分子又は合成分子が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸（すなわちペプチド同配体）を意味し、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外に改変アミノ酸を含むことができる。翻訳後プロセッシングのような天然のプロセスによるか又は化学改変技術によりポリペプチドを改変することができ、これらは当該技術でよく知られている。改変は、ペプチド骨格、アミン酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのあらゆる場所で生じることができる。同じ種類の改変が、所定のポリペプチドの幾つかの部位で同じ程度又は異なる程度で存在しうることが理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の改変を有することができる。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラバンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストレル化、酸化、PEG化、グルカンヒドロラーゼプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びアルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加が含まれる。（Creighton, T.E., Proteins  Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照すること）。本発明のペプチド及びポリペプチドには、下記で更に詳細に記載されている、全ての「模倣」及び「ペプチド模倣」形態も含まれる。
【０２７７】
本明細書で使用されるとき、用語「単離」されているとは、物質（例えば、本発明のタンパク質又は核酸）がその元々の環境（例えば、天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然系で共存している物質の一部又は全てから分離している同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、そのようなベクター又は組成物は、その天然の環境の一部ではないという点において依然として単離されている。本明細書で使用されるとき、用語「精製された」とは完全な純度を必要とせず、むしろ相対的な定義として意図される。ライブラリーから得た個別の核酸は電気泳動的に均一に慣用的に精製されている。これらのクローンから得た配列は、ライブラリー又は全ヒトＤＮＡのいずれからも直接には得ることはできない。本発明の精製された核酸は生物体のゲノムＤＮＡの残りから少なくとも１０4〜１０6倍で精製されている。一つの特徴において、用語「精製された」には、ライブラリー又は他の環境にあるゲノムＤＮＡ又は他の配列の残りから、少なくとも１桁のオーダーで、例えば、一つの態様では、２若しくは３桁、又は４若しくは５桁の大きさで精製された核酸が含まれる。
【０２７８】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチド又はタンパク質を意味する。「合成」ポリペプチド又はタンパク質は、化学合成により調製されるものである。固相化学ペプチド合成法を使用して、本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成することもできる。そのような方法は１９６０年代前半から当該技術で知られており（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（また、Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12を参照すること）、最近、市販の実験室用のペプチド設計及び合成キット（Cambridge Research Biochemicals）に用いられている。そのような市販の実験室用キットは、一般に、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示を利用し、全て単一のプレートに接続されている多数の「ロッド」又は「ピン」の先端でペプチドの合成を提供する。
【０２７９】
２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同一」は、既知の配列比較アルゴリズムの１つ又は目視検査を使用して測定して、最大一致のために比較しアラインメントを実施したときに、例えば少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の核酸又はアミノ酸残基（配列）同一性を有する２つ以上の配列を意味する。別の特徴において、実質的な同一性は少なくとも約１００個又はそれ以上の残基の領域にわたって存在し、最も一般的には、これらの配列は少なくとも約１５０〜２００個又はそれ以上の残基にわたって実質的に同一である。幾つかの特徴において、配列はコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０２８０】
加えて、「実質的に同一」なアミノ酸配列は、１つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入により基準配列と異なっている配列である。一つの特徴において、置換は、分子の活性部位ではない部位で生じるか、あるいは置換は、ポリペプチドがその機能（酵素）特性を実質的に保持するのであれば、分子の活性部位である部位で生じる。保存的アミノ酸置換は、例えば１つのアミノ酸を同じ部類の別のアミノ酸で置換する（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンのような１つの疎水性アミノ酸を別のもので置換する、又は１つの極性アミノ酸を別のもので置換する、例えばアルギニンをロイシンで、グルタミン酸をアスパルギン酸で、又はグルタミンをアスパラギンで置換する）。１つ以上のアミノ酸を、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドから欠失して、ポリペプチドの構造に、その生物学的活性を実質的に変えることなく改変をもたらすことができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の生物学的活性に必要ではないアミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。本発明の改変ポリペプチド配列は、改変ポリペプチド配列を基質と接触させ、改変ポリペプチドがアッセイ中の特定の基質の量を減少するか、又は機能性セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドと基質との酵素反応のバイオ生成物を増加するかを決定することを含む多くの方法のいずれかによって、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の生物学的活性のためにアッセイすることができる。
【０２８１】
本明細書で使用されるとき、「フラグメント」は、少なくとも２つの異なるコンフォメーションで存在することができる天然に存在するタンパク質の部分である。フラグメントは、天然に存在するタンパク質と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有することができる。天然に存在するタンパク質と異なる三次元構造を有するフラグメントも含まれる。この例は、切断による改変で有意に高い活性を有する成熟した酵素を産生できる、低活性プロタンパク質のような「プロ形態」分子である。
一つの態様において、本発明は、本発明のタンパク質及びペプチド、例えばセルラーゼの結晶（三次元）構造を提供し、これらは当該技術で周知の日常的なプロトコールを使用して作製及び分析することができ、例えばMacKenzie (1998) Crystal structure of the family 7 endoglucanase I (Cel7B) from Humicola insolens at 2.2 A resolution and identification of the catalytic nucleophile by trapping of the covalent glycosyl-enzyme intermediate, Biochem. J. 335:409-416; Sakon (1997) Structure and mechanism of endo/exocellulase E4 from Thermomonospora fusca, Nat. Struct. Biol 4:810-818; Varrot (1999) Crystal structure of the catalytic core domain of the family 6 cellobiohydrolase II, Cel6A, from Humicola insolens, at 1.92 A resolution, Biochem. J. 337:297-304に記載されており、これらは、本発明のセルラーゼ変種の日常的な生成の指針として、及び本発明の範囲内の酵素種を同定する指針として、特定の構造要素を説明し同定する。
【０２８２】
本発明のポリペプチド及びペプチドを天然の供給源から単離することができ、合成又は組換え的に生成されたポリペプチドでもあり得る。ペプチド及びタンパク質をインビボ又はインビトロで組換え的に発現させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドを、当該技術で既知の任意の方法を使用して作製及び単離することができる。本発明のポリペプチド及びペプチドを、当該技術で周知の化学的な方法を使用して、全体的又は部分的に合成することもできる。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PAを参照すること。例えば、ペプチド合成は、多様な固相技術を使用して実施することができ（例えば、Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13を参照すること）、自動合成は、例えばBI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を使用し、製造会社から提供された説明書に従って達成することができる。
本発明のペプチド及びポリペプチドをグリコシル化することもできる。グリコシル化は翻訳後に化学的又は細胞生合成機構によって付加することができ、後者には、既知のグリコシル化モチーフの使用が組み込まれ、これは、配列にとって天然のものであってよく、又はペプチドとして若しくは核酸コード配列に付加することができる。このグリコシル化は、Ｏ−結合又はＮ−結合であり得る。
【０２８３】
上記で定義された本発明のペプチド及びポリペプチドには、全ての「模倣体」及び「ペプチド模倣体」形態が含まれる。用語「模倣体」及び「ペプチド模倣体」は、本発明のポリペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能特性を有する、合成化学化合物を意味する。模倣体は、アミノ酸の合成で非天然の類似体から完全に構成されていることができるか、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸及び部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子である。模倣体は、天然アミノ酸の保存的置換を、そのような置換が模倣体構造及び／又は活性を実質的に変えない限り任意の量で組み込むこともできる。本発明のポリペプチドの保存的変種又はメンバーである本発明のポリペプチドでは（例えば、本発明の例示的な配列に対して約５０％以上の配列同一性を有する）、慣用的な実験によって模倣体が発明の範囲内であるか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に変わっていないかが決定される。したがって、一つの態様において、模倣体組成物は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する場合は、本発明の範囲内である。
【０２８４】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は、任意の組合せの非天然構造成分を含むことができる。別の特徴において、模倣体組成物は以下の３つの構造原子団の１つ又は全てを含む：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造的模倣体を誘導する、すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス立体構造などを誘導若しくは安定化させる残基。例えば、本発明のポリペプチドは、その残基の全て又は幾つかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合される場合に、模倣体として特徴づけることができる。個別のポリペプチド模倣残基を、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のような、ペプチド結合、他の化学的結合、又はカップリング手段により結合することができる。伝統的なアミノ酸結合（「ペプチド結合」）の代替案となることができる結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステルが含まれる（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NYを参照すること）。 
【０２８５】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに、全て又は幾つかの非天然の残基を含むことによって、模倣体として特徴づけることもできる。非天然残基は、科学文献及び特許文献で十分に記載されており、天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な幾つかの非天然組成物及び指針を下記に記載する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−１、−２，３−若しくは４−ピレニルアラニン；Ｄ−又はＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアラニンにより置き換えて生成することができ、ここでアルキルは、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、sec−イソチル、イソ−ペンチル又は非酸性アミノ酸で置換されうるか又は非置換であることができる。非天然アミノ酸の芳香環には、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル及びピリジル芳香環が含まれる。
【０２８６】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸トレオニンで置換することによって生成できる。カルボキシル側鎖基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）を、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（R'-N-C-N-R'）との反応で選択的に改変することができる。アスパルチル又はグルタミルも、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジン及びアルギニンに加えて）、例えばアミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）−酢酸若しくは（グアニジノ）アルキル−酢酸による置換で生成することができ、ここで、アルキルは上記で定義されたとおりである。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基を、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロ−ヘキサンジオン又はニンヒドリンを含む、例えば１つ以上の従来の試薬と、一つの態様では、アルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えば２−クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなアルファ−ハロアセテート及び対応するアミンと反応させて、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得ることによって生成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えばブロモ−トリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによって生成することもできる。リジン模倣体（及びアミノ末端残基の改変は）は、リジニルを、例えばコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させることによって生成することができる。リジン及び他のアルファ-アミノ含有残基模倣体は、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロ−ベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することもできる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドによる反応によって生成することができ��。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−又は４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−若しくは４−メチルプロリン又は３，３−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカーボネート又はパラ−ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リシン、アルギニン及びヒスチジンのアルファ−アミノ基のメチル化；Ｎ−末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化若しくはＮ−メチルアミノ酸による置換；又はＣ−末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０２８７】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸を、反対のキラリティーをもつアミノ酸（又はペプチド模倣残基）に代えることもできる。一つの態様において、Ｌ型構造で天然に存在する任意のアミノ酸（化学成分の構造に応じてＲ又はＳと呼ぶこともできる）を、Ｄ−アミノ酸と呼ばれるが、Ｒ−又はＳ−型と呼部こともできる、同じ化学構造型又はペプチド模倣であるが反対のキラリティーのアミノ酸に代えることができる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを、翻訳後プロセッシングのような天然の過程（例えば、リン酸化、アセチル化など）又は化学的改変技術のいずれかによって改変する方法、及び得られた改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミン酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのあらゆる場所で生じることができる。同じ種類の改変が、所定のポリペプチドの幾つかの部位で同じ程度又は異なる程度で存在しうることが理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の改変を有することができる。一つの態様において、改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラバンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストレル化、酸化、PEG化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びアルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加が含まれる。例えば、Creighton, T.E., Proteins  Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照すること。
【０２８８】
固相化学ペプチド合成法を使用して、本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成することもできる。そのような方法は１９６０年代前半から当該技術で知られており（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（また、Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12を参照すること）、最近、市販の実験室用のペプチド設計及び合成キット（Cambridge Research Biochemicals）に用いられている。そのような市販の実験室用キットは、一般に、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示を利用し、全て単一のプレートに接続されている多数の「ロッド」又は「ピン」の先端でペプチドの合成を提供する。そのような系を利用するときは、ロッド又はピンのプレートは逆さまにされ、適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に結合又は固着させるための溶液を含んでいる対応するウエル又はレザーバーの第二のプレートに挿入される。そのような処理工程、すなわちロッド又はピンの先端を逆さまにして適切な溶液に挿入する工程を繰り返すことによって、アミノ酸が所望のペプチドの中に構築される。加えて、多数のＦＭＯＣペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチド又はフラグメントの構築は、Applied Biosystems, Inc.のModel 431A（商標）自動ペプチド合成機を使用して、固体支持体で実施することができる。そのような装置は、直接合成によるか、又他の既知の技術を使用して結合できる一連のフラグメントの合成によって、本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
【０２８９】
本発明のポリペプチドは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を活性又は不活性形態で含む。例えば、本発明のポリペプチドは、「成熟」する前、又は例えば「活性」な成熟タンパク質を生成するプロタンパク質コンバターゼのようなプロタンパク質プロセッシング酵素でプレプロ配列をプロセッシングする前のプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、他の理由で不活性なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、例えば、翻訳後プロセッシング事象により、例えばエンド−若しくはエキソペプチダーゼ又はプロテイナーゼ作用、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化又は硫酸化、二量体化事象などにより「活性化」される前に含む。本発明のポリペプチドは、活性部分配列、例えば酵素の触媒ドメイン又は活性部位を含む、全ての活性形態を含む。
【０２９０】
本発明は、固定化セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ抗体、並びにこれらのフラグメントを含む。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を、ドミナントネガティブ変種又は本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは抗ベータ−グルコシダーゼ抗体を使用して阻害する方法を提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含むヘテロ複合体、例えば、融合タンパク質、ヘテロニ量体などを含む。
【０２９１】
本発明のポリペプチドは、例えば極度のｐＨ及び／又は温度、酸化剤などの多様な条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有することができる。本発明は、例えば、温度、酸化剤及び変化する洗浄条件に対して種々の触媒効率及び安定性を有する、代替的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素調製物をもたらす方法を提供する。一つの特徴において、部位特異的変異導入及び／又はランダム変異導入の技術を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を作製することができる。一つの特徴において、定方向進化を使用して、代替的な特異性及び安定性を有する、多種多様なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を産生することができる。
【０２９２】
本発明のタンパク質は、また、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素調節因子、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のアクチベーター又はインヒビターを同定する研究試薬として有用である。簡潔には、試験試料（化合物、ブロス、抽出物など）を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素アッセイに加えて、基質の切断を阻害するその能力を決定する。この方法で同定されるインヒビターを産業及び研究で使用して、望ましくないタンパク質分解を低減又は防止することができる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって、インヒビターを組合せて活性のスペクトルを広げることができる。
本発明の酵素は、また、タンパク質を消化する研究試薬として、又はタンパク質の配列決定において有用である。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用して、例えば自動配列決定装置を使用する配列決定のために、ポリペプチドをより小型のフラグメントに分解することができる。
【０２９３】
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド及び抗体を使用して、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発見する方法も提供する。一つの特徴において、ファージミドライブラリーは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現に基づく発見のために、スクリーニングされる。別の特徴において、ラムダファージライブラリーは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現に基づく発見のために、スクリーニングされる。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは、毒性クローンの検出、基質の改善された利用、ライブラリーの大量の切り出しよりもたらされるあらゆる偏りの可能性を迂回する、宿主を操作する必要性の低減、及び低クローン密度でより速い増殖を可能にすることができる。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは、液相又は固相においてであることができる。一つの態様において、本発明は、液相でのスクリーニングを提供する。これによってアッセイ条件におけるより大きな融通性、更なる基質の融通性、弱いクローンに対する感度の強化、及び固相スクリーニングを超える自動化の容易さが提供される。
本発明は、高レベルの正確さ及び再現性を担保しながら、短時間、例えば１日あたり何千もの生物触媒反応及びスクリーニングアッセイの実施を可能にする、本発明のタンパク質及び核酸、並びにロボットによる自動化を使用するスクリーニング方法を提供する（下記のアレイの考察を参照すること）。その結果、誘導化合物ライブラリーを数週間で産生することができる。小分子を含む分子の改変の更なる教示には、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９１７４、米国特許第６，２４５，５４７号を参照すること。
【０２９４】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドのフラグメントは、生化学濃縮又は精製処理によって得られる。可能性のある相同性ポリペプチド又はフラグメントの配列は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼアッセイ（例えば、下記の実施例１、２及び３を参照すること）、ゲル電気泳動及び／又はマイクロシークエンシングにより決定することができる。本発明の予想されるポリペプチド又はフラグメントの配列を、上記で記載されたプログラムのいずれかを使用して、例えば少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続アミノ酸を含む本発明の例示歴なポリペプチド又はフラグメントと比較することができる。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドの酵素機能を保持する、本発明のフラグメント又は変種を同定するアッセイである。例えば、前記ポリペプチドのフラグメント又は変種を使用して、生化学反応を触媒することができ、このことは、フラグメント又は変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持することを示す。フラグメント又は変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持することを決定する例示的なアッセイは以下の工程を含む：ポリペプチドフラグメント又は変種をポリペプチドフラグメント又は変種が機能することを可能にする条件下で基質分子と接触させる工程、及び基質のレベルの減少又はポリペプチドと基質との反応での特定の反応生成物のレベルの増加のいずれかを検出する工程。
【０２９５】
本発明は、酵素の独自の触媒特性を利用する。化学転換における生体触媒（すなわち、精製又は粗触媒、非生細胞又は生細胞）の使用は、一般的に特定の出発化合物と反応する特定の生体触媒の同定を必要とするが、本発明は、選択された生体触媒を使用し、小分子のような多くの出発化合物に存在する官能基に特異的な反応条件を使用する。それぞれの生体触媒は、１つの官能基に又は幾つかの関連する官能基に特異的であり、この官能基を含む多くの出発化合物と反応することができる。
一つの特徴において、生体触媒反応は単一の出発化合物から誘導体の集団を産生する。これらの誘導体を別の一連の生体触媒反応に付して、誘導体化合物の第２集団を生み出す。生体触媒誘導体化のそれぞれの繰り返しにより元の小分子又は化合物の何千もの変種を作製することができる。
【０２９６】
酵素は、分子の残りの部分に影響を与えることなく出発化合物の特定の部位に反応する。このプロセスは、伝統的な化学法を使用して達成することが困難である。生体触媒の高度な特異性は、ライブラリー内で単一の活性化合物を同定する手段を提供する。ライブラリーは、それを産生するために使用された一連の生体触媒反応(いわゆる「生合成歴」)により特徴づけられる。ライブラリーを生物学的活性についてスクリーニングし、生合成歴を追跡することにより、活性化合物を生成する特定の反応系列が明らかにされる。この反応系列が繰り返され、合成された化合物の構造が決定される。この決定様式は、他の合成及びスクリーニング手法と異なり、固定化技術を必要とせず、化合物を合成し、実質的にあらゆる種類のスクリーニングアッセイを使用して溶液中で遊離状態で試験することができる。酵素反応の官能基に対する高度な特異性により、生体触媒的に産生されたライブラリーを構築した特定の酵素反応の「追跡」が可能となることに留意することは重要である。
【０２９７】
一つの特徴において、この手順の工程は、１日あたり数千の生体触媒反応及び／又はスクリーニングの実施を可能にし、同様に高レベルの正確性及び再生を確実にする、ロボットによる自動化を使用して実施される。ロボットによる自動化を使用して、ポリペプチドが本発明の範囲内であるかを決定するためにセルラーゼ活性をスクリーニングすることもできる。その結果、一つの特徴において、「伝統的な」化学又は酵素スクリーニング法を使用すると作製するのに何年もかかるところ、誘導体化合物のライブラリーを数週間で作製することができる。
特定の特徴において、本発明は、本明細書で記載されたポリヌクレオチドでコードされたポリペプチド又はその酵素的に活性なフラグメントを小分子と接触させて、改変小分子を産生することを含む、小分子の改変方法を提供する。改変小分子のライブラリーを試験して、所望の活性を示す改変小分子が、ライブラリー中に存在するかを決定する。所望の活性をもつ改変小分子を産生する特定の生体触媒反応は、ライブラリーの一部を産生するのに使用されたそれぞれの生体触媒反応を系統的に排除すること、次に、ライブラリーの前記一部中の産生された小分子を、所望の活性を有する改変小分子の存在又は不在について試験することによって同定される。所望の活性をもつ改変小分子を産生する特定の生体触媒反応は、場合により反復される。生体触媒反応は、小分子の構造内で見出される個別の構造部分と反応する生体触媒の一群で実施され、それぞれの生体触媒は、１つの構造部分又は関連する構造部分の一群に特異的であり、それぞれの生体触媒は、別個の構造部分を含む多くの異なる小分子と反応する。
【０２９８】
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列、プレプロ及び触媒ドメイン
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（例えば、シグナルペプチド（ＳＰ））、プレプロドメイン及び触媒ドメイン（ＣＤ）を提供する。本発明のＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤは、単離若しくは組換えペプチド、又は例えばキメラタンパク質の異種ドメインのような融合タンパク質の一部であり得る。本発明は、これらの触媒ドメイン（ＣＤ）、プレプロドメイン及びシグナル配列（ＳＰ、例えば本発明のポリペプチドのアミノ末端残基を含む／からなる配列を有するペプチド）をコードする核酸を提供する。
【０２９９】
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の例示的なポリペプチドの１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３、１〜４４、１〜４５、１〜４６若しくは１〜４７個、又はそれ以上の残基で記載される配列からなるか又はそれらを含む単離又は組換えシグナル配列（例えば、シグナルペプチド）を提供する（また表３、下記の実施例１及び４、並びに配列表を参照すること）。例えば、上記の表３は、本発明の例示的なシグナル（リーダー）配列を記載し、例えば、配列番号１６３によってコードされる配列番号１６４で記載される配列を有するポリペプチドは、アミノ酸末端３０残基を含む（又はからなる）シグナル配列又はＭＳＣＲＴＬＭＳＲＲＶＧＷＧＬＬＬＷＧＧＬＦＬＲＴＧＳＶＴＧを有する。追加のシグナル配列も同様に表３に記載されている。
【０３００】
一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ末端残基の最初の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０個又はそれ以上を含むシグナル配列を提供する。 
【０３０１】
本発明は、シグナル配列及び／又はプレプロ配列を有するか又は有さないポリペプチドを含む。本発明は、異種シグナル配列及び／又はプレプロ配列を有するポリペプチドを含む。プレプロ配列（異種プレプロドメインとして使用される本発明の配列を含む）を、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置することができる。本発明は、本発明の配列を含む単離又は組換えシグナル配列、プレプロ配列及び触媒ドメイン（例えば「活性部位」）も含む。本発明のシグナル配列を含むポリペプチドは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、或いは別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、又は別の酵素、又は他のポリペプチドであることができる。「プレプロ」ドメイン配列及びシグナル配列を同定する方法は、当該技術でよく知られている（例えば、Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136を参照すること）。例えば、プレプロ配列を同定するために、タンパク質を細胞外間隙から精製し、Ｎ−末端タンパク質配列を決定し、プロセッシングされていない形態と比較する。
【０３０２】
本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロ配列は、単離若しくは組換えペプチドであることができるか、或いは別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼと、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼポリペプチドと結合した配列、例えば融合（キメラ）タンパク質であることができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列を含むポリペプチドを提供する。一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロを含むポリペプチドは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と異種である配列を含む（例えば、本発明のＳＰ及び／又はプレプロと、別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼタンパク質からの配列とを含む融合タンパク質）。一つの特徴において、本発明は、異種ＳＰ及び／又はプレプロ配列、例えば酵母シグナル配列を含む配列を有する、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、異種ＳＰ及び／又はプレプロを、ベクター、例えばｐＰＩＣシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）の中に含むことができる。
【０３０３】
一つの特徴において、新規セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの同定に続いて本発明のＳＰ及び／又は配列が同定される。タンパク質が選別されてそれらの細胞内の適切な配置に輸送される経路は、しばしばタンパク質標的化経路と呼ばれる。これら全ての標的化系において最も重要な要素の一つは、シグナル配列と呼ばれる、新たに合成されたポリペプチドのアミノ末端にある短いアミノ酸配列である。このシグナル配列はタンパク質をその適切な細胞内の配置場所に向かわせ、輸送中に又はタンパク質がその最終目的地に到達したときに除去される。ほとんどのリソソームタンパク質、膜たんぱく質又は分泌タンパク質は、小胞体管腔への移送のための目印となるアミノ末端シグナル配列を有する。シグナル配列は、アミノ酸残基の長さにして約１０〜６５個又はそれ以上に変動し得る。シグナル配列を認識する多様な方法が当該技術で知られている。例えば、一つの態様において、新規セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰと呼ばれる方法により同定される。ＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチドとそれらの切断部位の両方を認識する複合神経ネットワークを使用する。(Nielsen (1997) "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites."  Protein Engineering 10:1-6）。
【０３０４】
幾つかの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、ＳＰ及び／又はプレプロ配列または「ドメイン」を有さない。一つの特徴において、本発明は、ＳＰ及び／又はプレプロドメインの全て又は一部を欠いている、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。一つの特徴において、本発明は、異なるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の核酸配列に機能的に結合した、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素からのシグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロをコードする核酸を提供するか、或いは、場合により非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／又は非ベータ−グルコシダーゼタンパク質からのシグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロドメインが望ましい場合がある。
【０３０５】
本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに異種配列を含む単離又は組換えポリペプチドも提供する。前記異種配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤと（例えば、酵素と）天然には結合していない配列である。ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤと天然には結合していない前記配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／若しくはＣＤのアミノ末端、カルボキシ末端、並びに／又はＳＰ及び／又はＣＤの両末端に存在することができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含むポリペプチドを含む（又はこれからなる）単離又は組換えポリペプチドを提供する。ただし、それらが天然に結合しているいずれの配列（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列）とも結合していないことを条件とする。同様に、一つの態様において、本発明は、これらのポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供する。したがって、一つの態様において、本発明の単離又は組換え核酸は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに異種配列（すなわち、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない配列）のコード配列を含む。異種配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤコード配列の３’末端、５’末端及び／又はその両末端に存在することができる。
【０３０６】
ハイブリッド（キメラ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びにペプチドライブラリー
一つの特徴において、本発明は、ペプチドライブラリーを含む、本発明の配列を含むハイブリッドセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに融合タンパク質を提供する。本発明のペプチドライブラリーを使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質、レセプター、酵素のような標的のペプチド調節因子（例えば、アクチベーター又はインヒビター）を単離することができる。本発明のペプチドライブラリーを使用して、リガンド、例えばサイトカイン、ホルモンなどのような標的の正式な結合パートナーを同定することができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／若しくは触媒ドメイン（ＣＤ）、又はこれらの組合せ、並びに異種配列を含むキメラタンパク質を提供する（上記を参照すること）。
【０３０７】
一つの特徴において、本発明の融合タンパク質（例えば、ペプチド部分）は、立体構造的に安定化され（直線状ペプチドと比較して）、標的に対するより高い結合親和性を可能にする。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と、既知のペプチド及びランダムペプチドを含む他のペプチドとの融合を提供する。それらは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の構造が顕著には乱されず、ペプチドが代謝的に又は構造的で立体配置的に安定化されるように融合することができる。このことは、細胞内でのその存在及び量の両方を容易にモニタリングできるペプチドライブラリーを作り出すことを可能にする。
【０３０８】
本発明のアミノ酸配列変種は、変種の予め定められた性質、つまり天然に存在する形態、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列の対立変種又は種間変種とそれらを区別する特徴によって特徴づけることができる。一つの特徴において、本発明の変種は、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性を示す。あるいは、変種は修正された特徴を有するものについて選択することができる。一つの特徴において、アミノ酸配列の変異を導入する部位又は領域が予め決定されているが、変異それ自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位における変異の成果を最適化するために、ランダム変異導入を標的コドン又は領域で実施し、発現されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位に置換変異を作る技術は周知であり、本明細書で考察されているように、例えばＭ１３プライマー変異導入及びＰＣＲ変異導入である。変種のスクリーニングは、例えばグルカン加水分解のアッセイを使用して実施することができる。別の特徴において、アミノ酸置換は、単一の残基であることができ、挿入は約１〜２０個のアミノ酸のオーダーであることができるが、はるかに大きな挿入も実施することができる。欠失は、約１〜約２０、３０、４０、５０、６０、７０個の残基又はそれ以上の範囲であることができる。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組合せを使用することができる。一般に、これらの変化は、分子の変更を最小限にするため、数個のアミノ酸に対して実施される。しかし、特定の環境ではより大きな変化も容認されうる。
【０３０９】
本発明は、ポリペプチド骨格構造、二次若しくは三次構造、例えばアルファ−ヘリックス又はベータ-シート構造が改変されている、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。一つの態様において、電荷又は疎水性が改変されている。一つの特徴において、側鎖の嵩が改変されている。保存性の低い置換を選択することによって、機能又は免疫学的同一性に実質的な変化がもたらされる。例えば、以下に対してより顕著な影響を与える置換を実施することができる：変更領域のポリペプチド骨格構造、例えばアルファ−ヘリックス又はベータ−シート構造；活性部位に存在し得る、分子の荷電又は疎水性部分；又は側鎖。本発明は、本発明のポリペプチドに以下のような置換を提供する：（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルで疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、バリル又はアラニルを置換する（又は前者を後者で置換する）；（ｂ）システイン又はプロリンで他の任意の残基を置換する（又は前者を後者で置換する）；（ｃ）陽性荷電側鎖をもつ残基、例えばリシル、アルギニル又はヒスチジルで陰性荷電残基、例えばグルタミル又はアスパルチルを置換する（又は前者を後者で置換する）；或いは（ｄ）嵩の大きな側鎖、例えばフェニルアラニンで側鎖をもたない残基、例えばグリシンを置換する（又は前者を後者で置換する）。変種は、同じ定性的生物学的活性（すなわち、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性）を示すことができるが、変種を選択してセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の性質を必要に応じて改変することができる。
【０３１０】
一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、エピトープ若しくは精製タグ、シグナル配列又は他の融合配列などを含む。一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、ランダムペプチドと融合して融合ポリペプチドを形成することができる。本明細書において、「融合」又は「機能的に結合」しているとは、ランダムペプチドとセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素構造の安定性の破壊を最小限にするような方法で、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持するような方法で、一緒に結合することを意味する。融合ポリペプチド（又は融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、複数のループに存在する複数のペプチドを含む更なる成分を含むこともできる。
【０３１１】
一つの特徴において、ペプチド及びそれらをコードする核酸はランダム化され、それは、完全なランダム化であるか、又はランダム化は、例えばヌクレオチド／残基頻度において全体的に若しくは位置毎に偏っている。「ランダム化された」は、各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的にランダムヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。一つの特徴において、ペプチドを生じる核酸は化学的に合成することができ、したがって、任意の位置に任意のヌクレオチドを組み込むことができる。したがって、核酸が発現されてペプチドを形成するとき、任意の位置に任意のアミノ酸残基を組み込むことができる。合成プロセスは、ランダム化された核酸が生成されるように設計して、核酸の全長にわたって可能な全ての又は大半の組合せを形成し、したがってランダム化された核酸ライブラリーの形成を可能にすることができる。ライブラリーは、構造的に十分にランダム化された多様な発現生成物集団を提供し、所望の反応を示す１つ以上の細胞の提供のために確率的に十分な範囲の細胞反応に影響を与えることができる。したがって、本発明は、ライブラリーメンバーの少なくとも１つが幾つかの分子、タンパク質又は他の因子に対する親和性を与える構造を有することができるように、十分に大きな相互作用ライブラリーを提供する。
【０３１２】
一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、シグナルペプチド、炭水化物結合モジュール、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素触媒ドメイン、リンカードメイン並びに／又は触媒ドメインを含むマルチドメイン酵素である。
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）をコードすることができるキメラポリペプチドを生成する方法及び配列を提供する。一つの特徴において、元のポリヌクレオチド（例えば、本発明の例示的な核酸）は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする。一つの特徴において、本発明の方法は、生じるハイブリッドポリペプチドが元の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、本発明のセルラーゼ又は抗体）に由来するがそれとは異なる活性を示すポリペプチドをコードするように、元のポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞性過程を利用して新規ハイブリッドポリペプチドを産生する。例えば、元のポリヌクレオチドは、種々の微生物からの又はそれらに見出される特定の酵素（例えば、セルラーゼ）をコードし得る。１つの生物からの第１のポリヌクレオチドでコードされた酵素又は変種は、例えば、特定の環境条件下、例えば高塩度で有効に機能することができる。種々の生物からの第２のポリヌクレオチドでコードされた酵素又は変種は、異なる特定の環境条件下、例えば超高温で有効に機能することができる。第１及び第２の元のポリヌクレオチドからの配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の性質を示す酵素をコードすることができる。したがって、本発明のハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第１及び第２ポリヌクレオチドでコードされたそれぞれの酵素により共有された環境条件下、例えば、高塩度及び極限温度で有効に機能することができる。
【０３１３】
一つの特徴において、本発明の方法により生成されるハイブリッドポリペプチドは、元の酵素では示されない特別な酵素活性を示すことができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再組合せの後、それぞれの元の酵素から得られた、特定の非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／又は非ベータ−グルコシダーゼ酵素活性、例えば、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、ホスホリダーゼなどの活性について、得られたハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドをスクリーニングすることができる。一つの特徴において、ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、ｐＨ又は塩濃度のような、元の親ポリペプチドからハイブリッドポリペプチドを識別する化学機能性を確認する。
【０３１４】
一つの特徴において、本発明は、以下のようにして、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを産生し、高められた活性についてそのようなポリペプチドをスクリーニングする方法に関する：
１）機能的結合した第１のポリペプチド及び機能的結合した第２のポリヌクレオチド（少なくとも第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは少なくとも１つの部分配列相同性の領域を共有する）を適切な宿主細胞へ導入する；
２）機能的結合したハイブリッドポリヌクレオチドを生じさせる配列再編成を促進する条件下で前記宿主細胞を増殖させる；
３）前記ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを発現させる；
４）前記ハイブリッドポリペプチドを、高められた生物学的活性の同定を促進する条件下でスクリーニングする；及び
５）前記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する。
【０３１５】
セルラーゼ酵素の単離及び発見
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びにそれらをコードする核酸を単離及び発見する方法を提供する。ポリヌクレオチド又は酵素は、個別の生物体から（「単離物」）、定義された培地（「濃縮培地」）で増殖された生物の集合物から、又は未培養生物（「環境試料」）から単離することができる。これらの生物は、例えば、インビボバイオパニングにより単離することができる（下記の考察を参照すること）。環境試料から新規生物活性をコードするポリヌクレオチドを得る培養非依存性手法は、生物多様性のある未利用の供給源を利用できるので、最も好ましい。ポリヌクレオチド又は酵素は、多数の生物体のいずれか、例えば細菌から単離することもできる。ポリヌクレオチド又は酵素は、全細胞に加えてこれらの生物、例えば細菌の培養物から得られる粗酵素調製物から単離することができる。
「環境ライブラリー」は環境試料から生成され、適切な原核細胞宿主で増殖することができる適切なクローニングベクターに収容された天然に存在する生物のゲノム集合体を代表する。環境試料からクローン化ＤＮＡが最初に直接抽出されるので、ライブラリーは純粋培養で増殖できる原核細胞画分が少量であることに限定されない。加えて、これらの試料に存在する環境ＤＮＡの正規化は、元の試料に存在する全ての種に対してＤＮＡがより平等に表れることを可能にする。これは、優勢な種と比較して数桁低く過小提示されているかもしれない試料の微小構成成分から興味深い遺伝子を効率的に見出すことを劇的に増やすことができる。
一つの特徴において、１つ以上の未培養微生物から生成される遺伝子ライブラリーを目的の活性についてスクリーニングする。目的の生体活性分子をコードする潜在的な経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形態で原核細胞に捕獲される。一つの態様において、目的の活性をコードするポリヌクレオチドをそのようなライブラリーから単離し、宿主細胞の中に導入する。組換え及び／又は還元的再組合せを促進する条件下で宿主細胞を増殖させて、新規の又は高められた活性を有する潜在的に活性な生体分子を作り出す。
【０３１６】
インビボバイオパニングは、ＦＡＣＳに基づき、非光学（例えば磁気）に基づく機械を利用して実施することができる。一つの特徴において、複合遺伝子ライブラリーは転写ＲＮＡを安定化させるエレメントを含むベクターで構築される。例えば、ＲＮＡの転写領域をフランキングするように設計された、ヘアピンのような二次構造によってもたらされる配列を含むことは安定性を向上させるのに役立ち、したがって、細胞内の半減期を延長するであろう。バイオパニングプロセスで使用されるプローブ分子は、プローブが標的分子と結合したときだけ蛍光するレポーター分子で標識されているオリゴヌクレオチドからなる。これらのプローブは、幾つかの形質転換法のうちの１つを使用して、ライブラリーからの組換え細胞に導入される。プローブ分子は転写標的ｍＲＮＡに結合して、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子をもたらす。プローブの標的への結合は蛍光シグナルを生じ、そのシグナルが検出され、スクリーニングプロセスの際にFACS装置によって選別される。
【０３１７】
一つの特徴では、目的の配列を更に単離するためサブクローニングを行う。サブクローニングにおいて、ＤＮＡの一部は、増幅され、一般に制限酵素により消化されて、所望の配列が切除され、所望の配列はレシピエントベクターと連結され、増幅される。サブクローニングのそれぞれの工程では、ＤＮＡの一部を目的の活性について調べ、構造タンパク質をコードするＤＮＡが排除されていないことを確認する。挿入物はサブクローニングの任意の工程で（例えばベクターへの連結前にゲル電気泳動によって）、またはレシピエントベクター含有または非含有細胞を例えば抗生物質（前記はレシピエントベクターを含まない細胞を死滅させる）を含む選択培地に入れる工程で精製してもよい。ベクターへのｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングする具体的な方法は、当該技術でよく知られている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。別の特徴において、本発明の酵素はサブクローンである。そのようなサブクローンは、例えば長さ、変異、タグ又は標識によって、親クローンと異なることがある。
【０３１８】
ポリヌクレオチドを発見、単離又は調製することができる微生物には、真正細菌及び古細菌のような原核微生物、並びに真菌、一部の藻類及び原生動物のような低級真核微生物が含まれる。ポリヌクレオチドを、環境試料から発見、単離又は調製することができ、この場合、核酸は、生物体を培養することなく回収することができるか、又は１つ以上の培養生物体から回収することができる。一つの態様において、そのような微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温菌、好塩菌、好圧性細菌及び好酸球のような好極限性細菌であることができる。好極限性微生物から単離される酵素をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。本発明の酵素は、例えば、陸上の温泉及び深海熱孔で見出されるもののように、１００℃を越える温度で機能することができるか、又は北極海で見出されるもののように、０℃より低い温度で機能することができるか、例えば死海で見出されるものように、飽和塩環境で機能することができるか、例えば石炭体積及び地熱硫黄豊富温泉で見出されるものように、約０のｐＨ値で機能することができるか、又は例えば下水汚泥で見出されるもののように、１１を越えるｐＨ値で機能することができる。一つの特徴において、本発明の酵素は、広範囲の温度及びｐＨを通して高い活性を有する。
【０３１９】
本明細書上記で記載されたように選択及び単離されたポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、組換え及び／又は還元的再組合せを促進することができる任意の細胞である。選択されたポリヌクレオチドは、一つの特徴では、適切な制御配列を含むベクターの中に予め存在する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高級真核細胞、又は酵母細胞のような低級真核細胞であってよく、或いは一つの特徴では、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション又はエレクトロポレーションにより実施することができる。
例示的な宿主には、E. coli、Streptomyces、Salmonella typhimuriumのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila S2及びSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；並びに植物細胞が含まれる（上記の考察を参照すること）。適切な宿主の選択は、本明細書の教示によって当業者の技能の範囲内であると認められる。
【０３２０】
多様な哺乳動物細胞培養系を用いて組換えタンパク質を発現することができ、哺乳動物発現系の例には、“SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981)に記載されているサル類腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株及び同等のベクターを発現することができる他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及びエンハンサー、また必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むことができる。ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
【０３２１】
別の特徴において、本発明の核酸、ポリペプチド及び方法は、生化学経路で使用されるか、或いは１つ以上のオペロン、又は遺伝子クラスター、若しくはその一部から、生化学経路をコードする新規ポリヌクレオチドを生成するために使用される。例えば、細菌及び多くの真核生物は、その生成物が関連するプロセスに関わる遺伝子を調節する協調機構を有する。遺伝子は、単一の染色体上に「遺伝子クラスター」と呼ばれるクラスターを構成し、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む単一の調節配列の制御下で一緒に転写される。したがって、遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して同一または関連する隣接する遺伝子の一群である（遺伝子クラスターによってコードされている生化学的経路の例はポリケチドである）。
【０３２２】
一つの態様において、遺伝子クラスターＤＮＡは種々の生物体から単離され、ベクター、例えば、連結遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質又はタンパク質関連アレイ活性の産生を制御及び調節することができる発現調節配列を含むベクターに連結される。外来性ＤＮＡ導入のために著しく大きな容量を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスターの使用のために適切であろう。そのようなベクターには大腸菌（E. coli）のｆ因子（又は稔性因子）が含まれることが一例として本明細書に記載される。このF因子は、接合中にそれ自体の高頻度の伝達に影響を与えるプラスミドであり、大きなDNAフラグメント、例えば混合微生物サンプルの遺伝子クラスターの安定的な増殖の達成に理想的である。ある特徴では「フォスミド」と呼ばれるクローニングベクター又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターが使用される。これらはE. coliのｆ因子に由来し、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを安定的に組み込むことができる。混合未培養環境試料からのＤＮＡを組み込むと、大型のゲノムフラグメントを安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形態で得ることが可能になる。本発明で使用される他の種類のベクターはコスミドベクターである。コスミドベクターは、元々はゲノムＤＮＡの大きなセグメントをクローン及び繁殖するために設計された。コスミドベクターへのクローニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に詳細に記載されている。適切なベクターに連結されると、異なるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む２つ以上のベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。遺伝子クラスターで共有される部分配列同一性の領域はハイブリッド遺伝子クラスターをもたらす配列再編成を生じるプロセスを促進する。次に新規のハイブリッド遺伝子クラスターを、元の遺伝子クラスターでは見られなかった、高められた活性についてスクリーニングすることができる。
多様な酵素活性についてスクリーニングする方法は、当業者には既知であり、本明細書全体を通して考察されている（例えば、下記の実施例１、２及び３を参照すること）。そのような方法は、本発明のポリペプチド及びポルヌクレオチドを単離するときに用いることができる。
一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの酵素の活性を改変する化合物を、全細胞手法を使用して発見及び単離する方法を提供する（下記の考察を参照すること）。ゲノムＤＮＡライブラリーからのセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼをコードする推定クローンをスクリーニングすることができる。
【０３２３】
スクリーニングの方法論及び「オンライン」モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置及び方法論を本発明のポリペプチド及び核酸と併せて使用して、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングすること、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性の潜在的な調節因子、例えばアクチベーター又はインヒビターとして化合物をスクリーニングすること、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸について、本発明のポリペプチドを発現する細胞についてスクリーニングすることができる。試料をスクリーニングする下記で詳細に記載されるアレイ様式に加えて、代替的なフォーマットを使用して、本発明の方法を実施することもできる。そのようなフォーマットには、例えば、質量分析計、クロマトグラフィー、例えばハイスループットＨＰＬＣ及び液体クロマトグラフィーの他の形態、並びに１５３６ウエルプレート、３８４ウエルプレートなどのより小型のフォーマットが含まれる。ハイスループットスクリーニング装置を、本発明の方法を実施するために適合させ使用することができる（例えば、米国特許出願第２００２０００１８０９号、同第２００５０２７２０４４号を参照すること）。 
【０３２４】
キャピラリーアレイ
本発明の核酸又はポリペプチドを、アレイに固定化するか又は適用することができる。アレイを使用して、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドと結合する能力又はそれらの活性を改変する能力についてスクリーニング又はモニタリングすることができる。GIGAMATRIX（商標）, Diversa Corporation, San Diego, CAのようなキャピラリーアレイ及び例えば米国特許出願第２００２００８０３５０Ａ１号、ＷＯ０２３１２０３Ａ、ＷＯ０２４４３３６Ａに記載されるアレイは、試料を保持及びスクリーニングする代替的な装置を提供する。一つの特徴において、キャピラリーアレイは、隣接するキャピラリーのアレイを形成する複数のキャピラリーを含み、それぞれのキャピラリーは、試料を保持する管腔を仕切る少なくとも１つの壁を含む。前記管腔は、壁が液体又は試料を保持する管腔を形成する限り、円筒状、正方形、六角形又は他の幾何学的形状のいずれであってもよい。キャピラリーアレイのキャピラリーは、近接して一緒に保持され、平面構造を形成することができる。キャピラリーを、融合（キャピラリーがガラス製である場合）、接着、結合又は並べて固定することによって一緒に束ねることができる。加えて、キャピラリーアレイはアレイ内の隣接するキャピラリーの間に配置された間隙物質を含み、それによって複数の貫通孔を含む固体平面装置を形成することができる。
【０３２５】
キャピラリーアレイを、任意の数の個別のキャピラリーで、例えば１００〜４，０００，０００本のキャピラリーの範囲で形成することができる。更に、約１００，０００本以上の個別のキャピラリーを有するキャピラリーアレイを、標準的実験室用装置の付属部品である標準的な大きさ及び形状のMicrotiter（登録商標）プレートに形成することができる。管腔を、毛管作用又は細い針を用いるマイクロインジェクションのいずれかを使用して、手動又は自動で充填する。続いて目的の試料を個別のキャピラリーから取り出して、更なる分析又は特徴決定に付すことができる。例えば、細い針のようなプローブを、選択したキャピラリーと液体連通する位置に置いて、管腔に材料を添加するか、又はそれから引き抜く。
【０３２６】
単一ポットスクリーニングアッセイにおいて、キャピラリーアレイに挿入する前に、アッセイ構成成分を混合して、目的の溶液を得る。少なくともアレイの一部が目的の溶液に浸されると、管腔が毛管作用により充填される。各キャピラリーにおける化学的若しくは生物学的反応及び／又は活性を、検出可能な事象についてモニタリングする。検出可能な事象は、多くの場合に「ヒット」と呼ばれ、通常、「ノンヒット」を生じるキャピラリーと光学的検出によって区別することができる。したがって、キャピラリーアレイは、「ヒット」の大規模並行検出を可能にする。
複数ポットスクリーニングアッセイにおいて、ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドを第１成分に導入することができ、これをキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部に導入する。次に気泡を第１のキャピラリーの第１の成分の後に導入することができる。次に第２の成分をキャピラリーに導入することができ、ここで第２の成分は、第１の成分と気泡によって分離される。次にキャピラリーアレイの両側に静水圧を適用し気泡を破裂させることによって、第１及び第２の成分を混合することができる。次にキャピラリーアレイを、２つの成分の反応又は未反応によりもたらされる検出可能な事象についてモニタリングする。
【０３２７】
結合スクリーニングアッセイにおいて、目的の試料を、検出可能な粒子で標識した第１の液体としてキャピラリーアレイのキャピラリーに導入することができ、ここでキャピラリーの管腔は、管腔に検出可能な粒子が結合するために結合物質で被覆されている。次に第１の液体をキャピラリー管から取り出すことができ、結合された検出可能な粒子は、キャピラリーの中に残り、第２の液体をそのキャピラリー管に導入することができる。次にキャピラリーを、粒子と第２の液体との反応又は未反応によりもたらされる検出可能な事象についてモニタリングする。
【０３２８】
アレイ又は「バイオチップ」
本発明の核酸又はポリペプチドを、アレイに固定化するか又は適用することができる。アレイを使用して、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドと結合する能力又はそれらの活性を改変する能力についてスクリーニング又はモニタリングすることができる。例えば、本発明の一つの態様において、モニタリングパラメーターは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子の転写発現である。細胞の１つ以上若しくは全ての転写物は、細胞の転写物を含む試料のハイブリダイゼーションによって測定することができるか、又は、細胞の代表的な若しくは細胞の転写物と相補的な核酸は、アレイ若しくは「バイオチップ」に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップの核酸「アレイ」を使用することによって、細胞の転写物の幾つか又は全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイを、本発明の方法によって新たに操作された株の遺伝子型を決定することにも使用できる。「ポリペプチドアレイ」を、複数のタンパク質の同時定量化に使用することもできる。本発明は、「マイクロアレイ」若しくは「核酸アレイ」若しくは「ポリペプチドアレイ」若しくは「抗体アレイ」若しくは「バイオチップ」又はこれらの変型ともよばれる、既知の「アレイ」のいずれかを用いて実施することができる。アレイは、一般に複数の「スポット」又は「標的エレメント」であり、それぞれの標的エレメントは、試料分子、例えばｍＲＮＡ転写物に特異的に結合している基板表面の確定された領域に固定化されている１つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドの確定された量を含む。
【０３２９】
本明細書で使用されるとき、用語「アレイ」又は「マイクロアレイ」又は「バイオチップ」又は「チップ」は、複数の標的エレメントであり、それぞれの標的は、基質表面の定義された領域に固定化されている１つ以上のポリペプチド（抗体を含む）又は核酸の定義された量を含み、下記に更に詳細に考察されている。
本発明の方法の実施に際して、既知のアレイ並びに／又はアレイの製造及び使用方法のいずれかを全体的に若しくは部分的に又はその変型を取り込むことができ、例えば以下に記載されている： 米国特許第第6,277,628号;同第6,277,489号;同第6,261,776号;同第6,258,606号;同第6,054,270号;同第6,048,695号;同第6,045,996号;同第6,022,963号;同第6,013,440号;同第5,965,452号;同第5,959,098号;同第5,856,174号;同第5,830,645号;同第5,770,456号;同第5,632,957号;同第5,556,752号;同第5,143,854号;同第5,807,522号;同第5,800,992号;同第5,744,305号;同第5,700,637号;同第5,556,752号;同第5,434,049号;例えば以下も参照すること：WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958;例えば以下も参照すること：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32。米国特許出願第20010018642号；同第20010019827号;同第20010016322号;同第20010014449号;同第20010014448号;同第20010012537号;同第20010008765号も参照すること。
【０３３０】
抗体及び抗体に基づくスクリーニング方法
本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素に特異的に結合する単離又は組換え抗体を提供する。これらの抗体は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は関連するポリペプチドを単離する、同定する又は定量化するために使用することができる。これらの抗体は、本発明の範囲内にある他のポリペプチド又は他の関連するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素を単離するために使用することができる。これらの抗体は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又ははベータ−グルコシダーゼ酵素の活性部位と結合するように設計することができる。したがって、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、本発明の抗体を使用して阻害する方法を提供する（本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素組成物の適用に関する上記の考察を参照すること）。
【０３３１】
用語「抗体」には、抗原又はエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントから誘導される、それらを模倣した、又はそれらにより実質的にコードされるペプチド又はポリペプチドが含まれる（例えば、Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson  (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97を参照すること）。抗体という用語には、抗原結合タンパク質、すなわち、抗原に結合する能力を保持する「抗原結合部位」（例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））が含まれ、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメントであるFabフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している２つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一腕のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（ｖ）VHドメインからなるdAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；並びに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体も、用語「抗体」に含まれる。
【０３３２】
本発明は、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメント（例えば、部分配列）を含む、本発明の酵素のフラグメント（例えば、ペプチド）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチド又はペプチド、及び佐剤又は担体を含む組成物を提供する。
抗体は、免疫沈降、染色、イムノアフィニティーカラムなどで使用することができる。望ましい場合、特異的な抗原をコードする核酸配列を、免疫、続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング、及びポリペプチドの本発明のアレイ上への固定化によって生成することができる。あるいは、本発明の方法を使用して、改変される細胞により産生される抗体の構造を改変することができ、例えば、抗体の親和性を増加又は減少させることができる。更に、抗体を作製又は改変する能力は、本発明の方法により細胞を操作して付与した表現型でありうる。
【０３３３】
免疫化、抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）の産生及び単離の方法は当業者に既知であり、科学文献及び特許文献に記載されている（例えば、Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照すること）。抗体は動物を使用する伝統的なインビボ方法に加えて、例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを使用して、インビトロで生成することができる。例えば、Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45を参照すること。
【０３３４】
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントを使用して、ポリペプチド又はフラグメントに特異的に結合する抗体を生成することができる。得られた抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で使用して、ポリペプチドを単離又は精製すること、又はポリペプチドが生物学的試料に存在するかを決定することができる。そのような方法において、抽出物のようなタンパク質調製物又は生物学的試料を、本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントの１つと特異的に結合することができる抗体と接触させる。
【０３３５】
イムノアフィニティー方法では、抗体を、ビーズ又は他のカラムマトリックスのような固相に付着させる。タンパク質調製物を、抗体が本発明のポリペプチド又はそのフラグメントの１つと特異的に結合する条件下で、抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶離させる。
生物学的試料中のタンパク質が抗体と結合する能力は、当業者に周知の多様な方法のいずれかを使用して決定することができる。例えば、結合は、抗体を蛍光物質、酵素標識又は放射性同位元素のような検出可能な標識で標識化して決定することができる。あるいは、抗体と試料との結合は、そのような検出可能な標識を有する二次抗体を使用して検出することができる。具体的なアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対して生成されるポリクローナル抗体は、動物、例えば非ヒト動物にポリペプチドを直接注入することによって又は動物にポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体と結合することができる。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の生成に使用できる。次にそのような抗体を使用して、ポリペプチドを発現している細胞からポリペプチドを単離することができる。 
【０３３６】
モノクローナル抗体の調製では、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれる。
単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適応して、本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対する単鎖抗体を産生することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを使用して、これらポリペプチド又はそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対して生成された抗体を、他の生物体及び試料からの同様のポリペプチドのスクリーニングに使用することができる。そのような技術では、生物体からのポリペプチドを抗体と接触させ、抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載した方法のいずれも抗体結合の検出に使用することができる。そのようなスクリーニングアッセイの一つが、“Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【０３３７】
キット
本発明は、組成物、例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、トランスジェニック種子又は植物若しくは植物部分、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ酵素）及び／又は抗体を含むキットを提供する。キットは、本明細書に記載されているように、本発明の方法論、並びに産業用途、医療用途及び飲食用途を教示する指示資料を含むことができる。
【０３３８】
全細胞操作及び代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的構成を改変することによって、新たな表現型、例えば新たな又は改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する新たな細胞株を開発するために、細胞の全細胞進化又は全細胞操作を提供する。米国特許出願第２００４００３３９７５号を参照すること。
遺伝的構成は、細胞に、本発明の核酸、例えば本発明の酵素のコード配列を加えることによって改変することができる。例えば、ＷＯ０２２９０３２、ＷＯ０１９６５５１を参照すること。 
新たな表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも１つの代謝パラメーターが細胞において「リアルタイム」又は「オンライン」の時間枠でモニタリングされる。一つの態様において、細胞培養のような複数の細胞が、「リアルタイム」又は「オンライン」でモニタリングされる。一つの特徴において、複数の代謝パラメーターが、「リアルタイム」又は「オンライン」でモニタリングされる。代謝パラメーターは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用してモニタリングすることができる。
【０３３９】
代謝フラックス分析（ＭＦＡ）は既知の生化学的フレームワークに基づいている。線形独立な代謝マトリックスを、細胞内代謝物に対する質量保存の法則及び見掛けの定常状態仮説（ＰＳＳＨ）に基づいて構築する。本発明の方法の実施に際して、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
全ての経路の基質、生成物及び中間代謝物の実体；
経路の代謝物を変換する全ての化学反応の実体、前記経路の反応の化学量論；
反応を触媒する全ての酵素の実体、前記酵素反応のキネティクス；
経路の構成要素間の調節的相互作用、例えばアロステリック相互作用、酵素−酵素相互作用など；
酵素の細胞内区画局在性又は酵素の分子レベルを超えるその他の機構；及び
代謝物、酵素又はエフェクター分子の何らかの濃度勾配又はそれらの移動に対する拡散障壁の存在。 
【０３４０】
ある株について代謝ネットワークがいったん確立されると、オンライン代謝物データが利用可能な場合は、マトリックス表記による数学的表現を導入して細胞内代謝フラックスを評価することができる。代謝表現型は、細胞内の全体的な代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、生育状態及び遺伝子型などに対応する経路利用の変化に左右される。本発明の方法の一つの態様において、オンラインＭＦＡ計算の後、細胞の動的態様、細胞の表現型及び他の特性が、経路の利用を精査することによって分析される。例えば、酵母の発酵時にグルコースの供給が増加し、酸素が減少する場合、呼吸経路の利用は低下及び／又は停止し、発酵経路の利用が優先的になるであろう。細胞培養の生理学的状態の制御は、経路分析の後で可能になるであろう。本発明の方法は、基質供給、温度、インデューサーの使用などをどのように変化させて、細胞の生理的条件を制御して所望の方向に向かわせるかを決定することによって、発酵の操作方法の決定に役立つことができる。本発明の方法の実施に際して、ＭＦＡの結果を、代謝の操作又は遺伝子シャッフリングなどのために、実験及びプロトコールを設計するトランスクリプトーム及びプロテオームのデータと比較することもできる。
本発明の方法を実施するに際し、細胞の新たな又は改善された特性を含む、あらゆる改変又は新たな表現型を付与及び検出することができる。代謝又は増殖のあらゆる態様をモニタリングすることができる。
【０３４１】
ｍＲＮＡ転写物発現のモニタリング
本発明の一つの態様において、操作された表現型は、細胞において、ｍＲＮＡ転写物（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージ）発現の増加若しくは減少、又は新たな（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）転写物の生成を含む。この発現の増加又は低下は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の存在について試験することによって、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性アッセイによって追跡することができる。ｍＲＮＡ転写物又はメッセージは、ノーザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどを含む当該技術で既知のいずれかの方法によって検出及び定量化することもできる。定量的増幅反応には、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又はＲＴ−ＰＣＲを含む定量的ＰＣＲ；定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ又は「リアルタイムキネティックＲＴ−ＰＣＲ」が含まれる（例えば、Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914を参照すること）。
【０３４２】
本発明の一つの態様において、操作される表現型は、相同遺伝子の発現をノックアウトすることによって生成される。遺伝子のコード配列又は１つ以上の転写制御エレメント、例えばプロモーター又はエンハンサーをノックアウトすることができる。したがって、転写物の発現は、完全に除去されるか又は単に減少させることができる。
本発明の一つの特徴において、操作される表現型は、相同遺伝子の発現の増加を含む。これは、シス−又はトランス−で作用する転写調節エレメントを含む負の制御エレメントのノックアウト、又は正の制御エレメントの変異導入によって実施できる。細胞の１つ以上若しくは全ての転写物は、細胞の転写物又は細胞の代表的転写物若しくは細胞の転写物と相補的な核酸を含む試料のアレイに固定化された核酸へのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０３４３】
ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸の発現のモニタリング
本発明の一つの態様において、操作される表現型は、細胞における、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）の発現の増加若しくは低下、又は新たなポリペプチドの生成を含む。この発現の増加又は低下は、存在するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の量を決定することによって、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性アッセイによって追跡することができる。ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質放射標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば、免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類装置（ＦＡＣＳ）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光分析、ラマン分光分析、ＧＣ−ＭＳ、並びにＬＣ−エレクトロスプレー及びｃａｐ−ＬＣ−タンデム−エレクトロスプレー質量分析などを含む、当該技術で既知の方法のいずれかによって検出及び定量化することもできる。新規な生物活性は、米国特許第６，０５７，１０３号に記載された方法又はその変形を使用してスクリーニングすることもできる。更に、下記で詳細に考察されるように、細胞のポリペプチドの１つ以上又は全てを、タンパク質アレイを使用して測定することができる。
【０３４４】
産業用途、エネルギー用途、医薬用途及び他の用途
本発明のポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼを有する）は、セルロースの分解を触媒することができる。本発明の酵素は、高度に選択的な触媒であることができる。本発明は、例えば、医薬又は栄養素補給（栄養補助食品）産業において、エネルギー産業において（「クリーン」なバイオ燃料を作るため）、食物及び飼料産業において、例えば食物及び飼料生成物、並びに食物及び飼料添加物を作製する方法において、本発明の酵素を使用する産業プロセスを提供する。一つの態様において、本発明は、例えば、医薬品、又はダイエット補助食品若しくはサプリメント、又は栄養補助食品及び食品添加物を作製するために、医療産業に本発明の酵素を使用するプロセスを提供する。加えて、本発明は、「クリーン」燃料の生成を含む、バイオエタノールでの本発明の酵素を使用する方法を提供する。
本発明の酵素は、鋭敏な立体選択性、部位選択性及び化学選択性を持って反応を触媒することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を操作して、多様な溶媒で機能し、極限ｐＨ（例えば、高ｐＨ及び低ｐＨ）、極限温度（例えば、高温及び低温）、極限塩度（例えば、高塩度及び低塩度）で作用し、天然の生理学的基質と構造的に無関係の化合物との反応を触媒することができる。
【０３４５】
バイオマス変換及びクリーンバイオ燃料の生成
本発明は、バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）を燃料（例えば、バイオエタノール）及び化学物質へ変換するための酵素及び方法を提供する。したがって、本発明の組成物及び方法は、石油系生成物の使用に対する有効で持続可能な代替物を提供する。本発明は、天然のバイオマス変換に関わる化学サイクルに参加する、本発明の酵素を発現する生物体を提供する。一つの特徴において、変換のための酵素及び方法を、セルロース及びヘミセルロースポリマーが代謝可能な炭素分子へ有効に脱重合されるために酵素集合物(ensemble;アンサンブル)に使用する。上記で考察したように、本発明は、これらの重要な新たな「バイオマス変換」及び代替エネルギーの産業プロセスを可能にする、最も効果的な酵素を発見及び適用する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明のポリペプチド、例えばセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質が、リグノセルロースバイオマスをエタノールに変換するプロセスで使用される。本発明はリグノセルロースバイオマスを含む組成物からエタノール（「バイオエタノール」）を作製する方法を提供する。リグノセルロースバイオマス材料は、食物又は飼料生産の副産物として農作物から、又は植物残渣及び古紙のようなリグノセルロース廃棄生成物として得ることができる。本発明のポリペプチドでの処理に適切な植物残渣には、茎、葉、殻、皮、穂軸など、並びに木材、木材チップ、木材パルプ及びおがくずが含まれる。本発明のポリペプチドでの処理に適切な古紙の例には、破棄コピー用紙、コンピュータのプリンタ用紙、ノート用紙、メモパッド用紙、タイプライター用紙など、並びに新聞紙、雑誌、厚紙及び紙系包装材料が含まれる。
一つの特徴において、本発明の酵素及び方法は、バイオマスからエタノールを作製する、より「伝統的な」方法、例えば、乾燥リグノセルロース材料を反応器中で強酸及び金属塩の稀釈溶液から構成される触媒に付すことによってリグノセルロース材料を加水分解することを含む方法と併せて使用することができ、これは、セルロース加水分解の活性化エネルギー又は温度を下げて糖を高収量で得ることができる（例えば米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照すること）。
【０３４６】
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、ヘミセルロース、セルロース及びリグニンを含有するリグノセルロース材料を、第１段階加水分解工程においてセルロースをグルコースに大きく脱重合することなく主にヘミセルロースの脱重合を実施するように選択された温度及び圧力で水性媒体中で加水分解することを含む。この工程はスラリーを生じさせ、そこでは、液体水性相はヘミセルロースの脱重合でもたらされた溶解した単糖を含有し、固体相はセルロース及びリグニンを含有する。第２段階の加水分解工程は、少なくともセルロースの主要な部分が脱重合するような条件を含むことができ、そのような工程は、セルロースの溶解／可溶性脱重合生成物を含有する液体水相をもたらす。例えば、米国特許第５，５３６，４２５号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。 
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、リグノセルロース含有バイオマス材料を、１つ以上の希酸加水分解の段階で約０．４％〜２％の強酸を用いて処理し、酸加水分解バイオマスの未反応固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニンして、生分解性熱可塑性の前駆体及び誘導体を生成することを含む。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。
【０３４７】
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、リグノセルロース材料を前加水分解反応器において前加水分解すること、酸性液体を固体リグノセルロース材料に添加して混合物を作製すること、前記混合物を反応温度に加熱すること、前記反応温度を、リグノセルロース材料がリグノセルロース材料からのリグニンを少なくとも２０％含有する可溶性部分とセルロースを含有する固体画分に分画するのに十分な時間保持すること、反応温度又はそれに近い温度で固体画分から可溶化部分を除去すること（前記固体画分中のセルロースが酵素消化を受けやすくなる）、および、可溶化部分を回収することを含む。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。
【０３４８】
本発明は、本発明の酵素又は方法を使用して作製される、燃料等級アルコールとブレンドする液体炭化水素に基づくモーター用（火花点火モーター用）の燃料組成物を作成する方法を提供する。一つの特徴において、本発明の酵素の使用により作製される燃料は、例えば石炭ガス、液体又は天然ガス、液体−エタノールブレンドを含む。一つの特徴において、共溶媒は、バイオマス誘導２−メチルテトラヒドロフラン（ＭＴＨＦ）である。例えば、米国特許第６，７１２，８６６号を参照すること。
リグノセルロースの酵素分解のための、例えばリグノセルロース材料からエタノールを生成するための本発明の方法は、バイオマス材料の超音波処理の使用を含むこともできる（例えば米国特許第６，３３３，１８１号を参照すること）。
本発明の酵素を使用した、エタノールを含むバイオ燃料を作製する別の例示的な方法は、少なくともヘミセルロース及びセルロースを含むリグノセルロース供給原料を含む出発材料を前処理することを含む。一つの特徴において、出発材料は、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、コムギ、ビート若しくはサトウキビ、又は成分、若しくは廃棄物、若しくは食物、若しくは飼料製造の副産物を含む。出発材料（「供給原料」）を、植物の繊維構造を分断してヘミセルロース及びセルロースの少なくとも部分的な加水分解を実施する条件下で反応させる。分断条件は、例えば、出発材料を、平均温度の１８０℃〜２７０℃、ｐＨ０．５〜２．５で約５秒間〜６０分間、又は２２０℃〜２７０℃の温度、ｐＨ０．５〜２．５で５秒間〜１２０分間、又は同等の条件に付すことを含むことができる。これは、本発明の酵素、例えばセルラーゼ酵素により消化されることが更に容易になる供給原料を生成する。米国特許第６，０９０，５９５号。
リグノセルロース材料のセルラーゼ加水分解における例示的な条件には、約３０℃〜４８℃の温度及び／又は約４．０〜６．０のｐＨでの反応が含まれる。他の例示的な条件には、約３０℃〜６０℃の温度及び約４．０〜８．０のｐＨが含まれる。
【０３４９】
動物飼料及び食物又は飼料添加物
ヒトが使用するダイエット補助食品物若しくはサプリメント、又は栄養補助食品及び食品添加物を提供することに加えて、本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明のセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに／又は本発明の抗体を有するタンパク質を使用して、動物飼料、並びに食物又は飼料添加物を処理する組成物及び方法も提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに／又は本発明の抗体を含む動物飼料、食物、及び添加物を提供する。動物は、任意の家畜又は任意の動物であり得る。
【０３５０】
本発明の動物飼料添加物は、飼料成分と容易に混合することができる顆粒酵素生成物であってよい。あるいは、本発明の飼料添加物は、プレミックスの成分の形態であることができる。本発明の顆粒酵素生成物は、被覆されていても非被覆であってもよい。酵素顆粒の粒径は、飼料及びプレミックス成分と適合性であってよい。これは、酵素を飼料に組み入れるために安全で都合のよい手段を提供する。あるいは、本発明の動物飼料添加物は、安定化された液体組成物であることができる。これは、水性又は油性スラリーであることができる。例えば、米国特許第６，２４５，５４６号を参照すること。
動物飼料又は食物の改変における本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、食物又は飼料を、インビトロ（飼料又は食物の成分を改変する）又はインビボのいずれかで飼料又は食物を処理することができる。本発明のポリペプチドを動物飼料又は食物組成物に加えることができる。 
【０３５１】
一つの特徴において、本発明の酵素は、別の酵素、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、 カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼと組合せて添加される。これらの酵素消化生成物は、動物でさらに消化されやすい。したがって、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、飼料若しくは食物の利用可能なエネルギーに、又はセルラーゼにより分解される食物若しくは飼料の消化性に寄与することができる。
【０３５２】
別の特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、穀粒、穀類、トウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ルピナスなどのような、トランスジェニック飼料作物（例えば、トランスジェニック植物、種子など）で直接酵素を発現させることによって供給することができる。上記で考察したように、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物、植物部分及び植物細胞を提供する。一つの態様において、核酸を、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が回収可能な量で産生されるように発現させる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、あらゆる植物又は植物部分から回収できる。あるいは、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、例えば食物又は飼料の質を改善するため、例えば栄養価、嗜好性などを改善するために使用できる。
【０３５３】
一つの特徴において、本発明の酵素送達マトリックスは、分離した複数個の粒子、ペレット又は顆粒の形態である。「顆粒」とは、例えば、ペレット化、押出し、又は同様の凝縮により圧縮又は凝縮されて、マトリックスから水分を除去した粒子を意味する。そのような粒子の圧縮又は凝縮は、粒子の粒子内凝集力も促進する。例えば、顆粒は、穀粒系基質をペレットミルでペレット化して調製することができる。それによって調製されたペレットを粉砕するか又崩壊させて、動物飼料の添加物としの使用に適切な大きさの顆粒にする。マトリックスはそれ自体飼料での使用が認可されているので、動物飼料で酵素を送達するための稀釈剤として使用することができる。
一つの特徴において、本発明の酵素送達マトリックス及び方法に含まれるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、高温及び／又は蒸気がペレット化酵素送達マトリックスを調製するために使用されうる製造の際に、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が不活性化に耐性であるように、本明細書に記載されている熱安定性のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素である。本発明の酵素送達マトリックスを含有する飼料の消化の際に、水性消化液が活性酵素の放出を引き起こす。他の種類の熱安定性酵素及び熱安定である栄養補助食品を、あらゆる水性条件下で放出するために送達マトリックスを組み込むこともできる。
一つの特徴において、動物飼料に風味又は栄養補助を加えるため、動物飼料補充物及び酵素の放出を胃の条件下で遅らせるためなどのような多くの異なる目的で酵素マトリックス粒子に被覆がなされる。一つの特徴において、機能的な目標を、例えばマトリックス粒子から酵素の放出を遅らせることが望ましい場合、又は酵素が放出される条件を制御することを達成するために被覆がなされる。被覆材料の組成は、感受性のある作用物質（例えば、熱、酸若しくは塩基、酵素又は他の化学物質）により選択的に分解されるようなものでありうる。あるいは、そのような異なる分解作用物質に感受性のある２つ以上の被覆を、マトリックス粒子に連続して適用することもできる。
【０３５４】
本発明は、酵素放出マトリックスの調製方法にも関する。本発明によると、この方法は、酵素放出マトリックスとして使用するのに適切な粒径を持つ穀粒系基質の分離した複数の粒子を提供することを含み、粒子は、本発明のアミノ酸配列によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む。一つの特徴において、この方法には、酵素放出マトリックスの粒子を凝縮又は圧縮して顆粒にすることを含み、一つの特徴において、ほとんどの場合はペレット化により達成される。成形抑制剤及び凝集剤は、使用する場合、任意の適切なときに添加することができ、一つの特徴では、穀粒系基質のペレット化の前に、所望の割合で穀粒系基質と混合される。一つの特徴において、ペレットミル中の飼料の水分量は、完成品の水分量に対して上記で記載した範囲であり、一つの特徴では約１４〜１５％である。一つの特徴において、水分を、酵素の水性調製物の形態で供給原料に添加し、供給原料をこの水分量にする。一つの特徴において、ペレットミルの温度を蒸気で約８２℃にする。ペレットミルを、供給原料がペレットを提供するのに十分な処理を付与するあらゆる条件下で作動することができる。ペレット化プロセスそれ自体は、酵素含有組成物から水を除去する費用効果の高い方法である。
【０３５５】
本発明の組成物及び方法は、プレバイオティクスの投与と併せて実施することができる。プレバイオティクスは、高分子量の糖であり、例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ＧＲＡＳ（安全性の確認された（Generally Recognized As Safe））材料である。これらのプレバイオティクスは、一部のプロバイオティック乳酸菌（ＬＡＢ）により代謝されうる。これらは大多数の腸内微生物によっては消化されない。
【０３５６】
食物処理及び食物加工
本発明は、本発明の酵素を含む食物及び飼料、並びに食物及び飼料の加工において本発明の酵素を使用する方法を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、食品加工産業において多数の用途を有する。本発明は、例えば植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは動物細胞、又は任意の植物若しくは植物部分、又は任意の食物若しくは飼料、廃棄生成物などを含む、セルラーゼ含有組成物を加水分解する方法を提供する。
例えば、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む飼料又は食物を提供し、例えば、飼料、液体、例えば飲料（例えばフルーツジュース若しくはビール）、パン若しくは生地若しくはパン製品、又は飲み物（例えばビール）若しくは飲料前駆体（例えば麦芽汁）である。
【０３５７】
本発明の食物処理方法は、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３５８】
一つの特徴において、本発明は、液体（液化）及び顆粒デンプンを加水分解する酵素及び方法を提供する。そのようなデンプンは、任意の供給源、例えばビート、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、マイロ、ソルガム、ライムギ又はブルガーに由来し得る。本発明は、液化（例えばバイオエタノールを作製するため）に有用である任意の植物デンプン供給源、例えば穀物デンプン供給源に適用され、液化に適切なデンプンを生成することが知られている他の任意の穀物又は植物供給源が含まれる。本発明の方法は、イネ、発芽イネ、トウモロコシ、オオムギ、マイロ、コムギ、マメ類、ジャガイモ、ビート、サトウキビ及びサツマイモのようなあらゆる天然材料からのデンプンを液化する（例えば、ビオエタノールを作製する）ことを含む。液化プロセスは、デンプンを実質的に加水分解してシロップを生成することができる。液化の温度範囲は、デンプンの液化を実施することが知られている任意の液化温度であることができる。例えば、デンプンの温度は、約８０℃〜約１１５℃、約１００℃〜約１１０℃、約１０５℃〜約１０８℃でよい。本発明の酵素及び方法を使用して作製されたバイオエタノールを、アルコール飲料を含む食物及び飼料での使用（又はそれらの作製）に加えて、下記で考察するように、燃料として又は燃料の中に（例えば、自動車燃料）使用することができる。
【０３５９】
廃棄物処理
本発明は、廃棄物処理における酵素の使用を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、多様な廃棄物処理、又は関連する産業用途、例えば燃料を生成するバイオマス変換に関連する廃棄物処理で使用することができる。例えば、一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用する、固体及び／又は液体廃棄物消化プロセスを提供する。この方法は、実質的に未処理の固体廃棄物の質量及び容量を低減することを含むことができる。固体廃棄物を、制御した温度で、酵素溶液（本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む）の存在下で、酵素消化プロセスによって処理することができる。これによって、添加微生物による明確な細菌発酵のない反応がもたらされる。固体廃棄物が、液化廃棄物及び任意の残留固体廃棄物に変換される。得られた液化廃棄物を前記の残留凝固廃棄物から分離することができる。例えば、米国特許第５，７０９，７９６号を参照すること。
一つの特徴において、本発明の組成物及び方法は、例えば、ブタ農場の動物排泄物ラグーンにおいて、他の動物排泄物管理系において、又は任意の産業用途若しくは食品加工用途において臭気除去、臭気防止、又は臭気低減に使用される。
【０３６０】
バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）を燃料（例えば、バイオエタノール）へ変換する酵素及び方法は自治体の固体廃棄物材料の処理／再利用を組み込むことができ、前記固体廃棄物には自治体から直接得た廃棄物、以前は埋められていたがその後回収された一般固体廃棄物、又は例えば相当量のセルロース材料を含む下水汚泥ケーキの形態の下水汚泥が含まれる。下水汚泥ケーキは、通常、実質的な量の再利用材料（アルミニウム、ガラス、プラスチックなど）を含まないので、濃硫酸により直接処理して（廃棄物のセルロース成分の重金属含有量を低減し）、エタノール生成系で処理することができる。例えば、米国特許第６，２６７，３０９号、同第５，９７５，４３９号を参照すること。
廃棄物材料から有機及び無機物を回収する本発明の酵素を使用する別の例示的な方法は、固体有機物を滅菌し、それを熱及び圧力に付して軟化させることを含む。この例示的な方法は、最初に廃棄物材料を撹拌し、次にそれを熱及び圧力に付し、滅菌し、含有された有機物を軟化することによって実施することができる。一つの特徴において、圧力下で加熱した後、圧力を有孔チャンバから突然放出させて、軟化有機物を容器の貫通を通して外側に押し出し、このようにして固体無機物から有機物を分離することができる。次に軟化した滅菌有機物を、例えば本発明の酵素を使用して、発酵チャンバで発酵させて、例えばマッシュ(mash)を形成する。マッシュを、遠心分離、蒸留カラム及び／又は嫌気性消化装置により更なる処理に付して、エタノール及びメタノールのような燃料、並びに動物飼料添加物を回収することができる。例えば、米国特許第６，２５１，６４３号を参照すること。
【０３６１】
本発明の酵素を、処理、例えば前処理に使用して、産業廃棄物又は畜産施設から生じる排泄物などの臭気を低減することができる。例えば、本発明の酵素を使用して排泄物貯蔵施設の動物排泄物を処理し、臭気を下げながら多量の有機物の効率的な分解を強化することができる。このプロセスは、硫化物を利用する細菌及び有機物を消化する細菌、並びに溶菌酵素（本発明の酵素に加えて）による接種も含むことができる。例えば、米国特許第５，９５８，７５８号を参照すること。
本発明の酵素は、移動系、例えば水性有害廃棄物のバイオレメディエーションためのバッチ型反応器で使用することもでき、例えば、米国特許第５，８３３，８５７号に記載されている。バッチ型反応器は、循環機能を有する大型の容器であってよく、細菌（例えば、本発明の酵素を発現する）が、反応器に投入される栄養素により十分な状態に維持される。廃液が反応器に送達されるか又は反応器が排水処理系に組み込まれるような系を、使用することができる。本発明の酵素を、小型又は一時的に遠隔地で使用される処理系、例えば携帯用の高容量高能率で汎用の排水処理系で使用することもできる。 
【０３６２】
本発明の廃棄物処理プロセスは、他のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むことができる。
【０３６３】
洗剤組成物
本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチド（セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性）を含む洗剤組成物、並びにこれらの組成物の製造及び使用方法を提供する。本発明には、洗剤組成物を製造及び使用する全ての方法が組み込まれる（例えば、米国特許第６，４１３，９２８号、同第６，３９９，５６１号、同第６，３６５，５６１号、同第６，３８０，１４７号を参照すること）。洗剤組成物は、１成分及び２成分水性組成物、非水性組成物、注型固体、顆粒形態、粒状形態、圧縮錠剤、ゲル及び／又はペースト、並びにスラリー形態であることができる。本発明は、これらの洗剤組成物を使用した、ひどい食物の汚れ、食物の残渣及び他のわずかな食物組成物の膜を迅速に除去できる方法も提供する。本発明の酵素は、デンプン多糖類の触媒的加水分解によりデンプン性の汚れの除去を促進することができる。本発明の酵素を、皿洗い洗剤、織物の洗濯洗剤として使用することができる。
洗剤溶液が所望の酵素活性を有すると仮定すると、実際の活性酵素の含有量は洗剤組成物の製造方法によって左右され、重要ではない。一つの特徴において、最終溶液に存在するグルコシダーゼの量は製剤組成物１ｇあたり約０．００１mg〜０．５mgの範囲である。本発明の方法及び組成物での使用のために選択される特定の酵素は、製品の物理的形態、使用ｐＨ、使用温度、及び分解又は変更される汚れの種類を含む最終的な利用条件によって左右される。酵素は、所定の利用条件のいずれに対しても最適な活性及び安定性を提供するように選択することができる。一つの特徴において、本発明のポリペプチドは、約４〜約１２のｐＨ範囲、約２０℃〜約９５℃の温度範囲で活性である。本発明の洗剤は、カチオン性、半極性非イオン性若しくは双性イオン性界面活性剤、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０３６４】
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、約０．０１〜約５質量％（好ましくは０．１質量％〜０．５質量％）で４．０〜１２．０のｐＨを有する粉末又は液体洗剤に配合することができる。これらの洗剤組成物は、既知のプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、又はエンドグリコシダーゼのような他の酵素、並びにビルダー及び安定化剤を含むこともできる。本発明の酵素を従来の洗浄組成物へ添加することは、特別な使用制限をもたらさない。換言すれば、ｐＨが上記の範囲内であり、温度が記載された酵素の変性温度を下回る限り、この洗剤に適した任意の温度及びｐＨも本発明の組成物に適切である。加えて、本発明のポリペプチドは、洗剤を含まない洗浄組成物において、この場合でも、単独で又はビルダー及び安定化剤と組合せて使用することができる。
本発明は、硬質表面を洗浄する洗剤組成物、布地を洗浄する洗剤組成物、皿洗い組成物、口内洗浄組成物、義歯洗浄組成物、及びコンタクトレンズ洗浄溶液を含む洗浄組成物を提供する。
一つの特徴において、本発明は、洗浄のために十分な条件下で対象物を本発明のポリペプチドと接触させることを含む、対象物の洗浄方法を提供する。本発明のポリペプチドは洗剤添加剤として含めることができる。本発明の洗剤組成物は、例えば、本発明のポリペプチドを含む手洗い又は機械洗濯洗剤組成物として配合することができる。汚れの付着した布地の前処理に適切な洗濯添加剤は、本発明のポリペプチドを含むことができる。生地柔軟剤組成物は、本発明のポリペプチドを含むことができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、一般的な家事用硬質表面洗浄作業で使用される洗剤組成物として配合することができる。別の特徴において、本発明の洗剤添加剤及び洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、別のグルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、別のセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラクターゼ及び／又はペルオキシダーゼのような、１つ以上の他の酵素を含むことができる。本発明の酵素の特性は、選択した洗剤に適合するように（すなわち、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分との適合性など）選択され、酵素は有効量で存在する。一つの特徴において、本発明の酵素を使用して、布地から悪臭物質が除去される。本発明の実施に使用できる種々の洗剤組成物及びそれらの作製方法は、例えば、米国特許第６，３３３，３０１号、同第６，３２９，３３３号、同第６，３２６，３４１号、同第６，２９７，０３８号、同第６，３０９，８７１号、同第６，２０４，２３２号、同第６，１９７，０７０号、同第５，８５６，１６４号に記載されている。
【０３６５】
本発明の洗剤及び関連する方法は、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３６６】
布地及び織物の処理
本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチド、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素を使用する、布地及び織物の処理方法を提供する。本発明のポリペプチドは、任意の布地処理方法で使用することができ、これは当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第６．０７７，３１６号を参照すること）。例えば、一つの特徴において、布地の感触及び外観は、布地を本発明の酵素と溶液中で接触させることを含む方法によって改善される。一つの特徴において、布地は、溶液中、圧力下で処理される。
一つの特徴において、本発明の酵素は、織物を織っている間、若しくは織った後で、又は脱サイズ工程の間又は１つ以上の追加的な布地加工工程で適用される。織物が織られている間、糸は強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、多くの場合、サイズ用デンプン又はデンプン誘導体で被覆されて、その引張り強さが高められ破断が防止される。本発明の酵素は、これらのサイズ用デンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用することができる。織物を織り上げた後、布地を脱サイズ工程へ進めることができる。この後に、１つ以上の追加的な布地加工工程が続くことができる。脱サイズは、織物からサイズを除去する作業である。織った後、均質性及び耐洗浄性を確実にするために布地を更に加工する前に、サイズ被覆を除去しなければならない。本発明は、本発明の酵素の作用によるサイズの酵素的加水分解を含む、脱サイズ方法を提供する。
【０３６７】
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、例えば水性組成物中で洗剤添加剤として使用して、綿含有布地を含む布地の脱サイズに使用することができる。本発明は、インジゴ染色デニム布地及び衣料にストーンウォッシュ加工した外観を生じる方法を提供する。衣服の製造のために、布地を切断して衣服又は衣料に縫製することができ、これは処理の終了後に完成される。特に、デニムのジーンズ製造の場合、異なる酵素仕上げ方法が開発されている。デニムの衣料の仕上げは、酵素による脱サイズ工程から始まり、その間、衣料はデンプン分解酵素作用に付されて、柔軟さが布地に提供され、綿をその後の酵素仕上げ工程に馴染みやすくする。本発明は、本発明の酵素を使用して、デニムの衣料を仕上げる方法（例えば「バイオストーニング工程」）、酵素的脱サイズ及び布地に柔軟さをもたらす方法を提供する。本発明は、脱サイズ及び／又は仕上げ工程でデニム衣料を迅速に柔軟化する方法を提供する。
本発明は、本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を含む消毒剤も提供する。
【０３６８】
本発明の布地又は織物処理プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３６９】
紙又はパルプ処理
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）は、紙若しくはパルプ処理、又は紙脱インキも可能である。例えば、一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素を使用した紙処理プロセスを提供する。一つの特徴において、本発明の酵素を使用して紙の中のデンプンを改変し、それによってそれを液化形態に変換する。別の特徴では、再生コピー用紙の紙成分を化学及び酵素脱インキするプロセスである。一つの特徴において、本発明の酵素は、他のセルラーゼ（他のエンドグルカナーゼ、セルビオヒドロラーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ）を含む他の酵素と組合せて使用することができる。木材、紙、紙製品又はパルプを以下の３つのプロセスにより処理することができる：１）本発明の酵素の存在下での分解；２）脱インキ化学物質及び本発明の酵素による分解；及び／又は３）本発明の酵素に浸した後での分解。本発明の酵素で処理した再生紙は、セルラーゼだけで処理された紙と比較して、トナー粒子が除去されているために高い明度を有することができる。本発明はいずれの特定の機構に限定されるものではないが、本発明の酵素の効果は、パルプ懸濁液中の界面活性剤としてのその働きによるものでありうる。
【０３７０】
本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドを使用して紙及び紙パルプを処理する方法を提供する。本発明のポリペプチドは、任意の紙処理及びパルプ処理方法で使用することができ、これは当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第６，２４１，８４９号、同第６，０６６，２３３号、同第５，５８２，６８１号を参照すること）。例えば、一つの態様において、本発明は、染料を含む印刷された紙を脱インキ及び脱色する方法を提供し、それは、印刷された紙をパルプ化してパルプスラリーを得て、本発明の酵素（他の酵素を添加することができる）の存在下でインクをパルプスラリーから除去することを含む。別の態様において、本発明は、本発明の酵素を含む（他の酵素、例えばペクチナーゼ酵素を含むこともできる）酵素混合物をパルプに添加すること、及び酵素処理パルプを生成する反応を起こす条件下で処理することによって、パルプ、例えば二次繊維から製造されたパルプのろ水度を高める方法を提供する。酵素処理パルプのろ水度は、明度が低下することなく二次繊維パルプの最初のろ水度より高められる。
【０３７１】
本発明の紙、木材若しくはパルプ処理、再生利用プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３７２】
再パルプ化：リグノセルロース材料の処理
本発明は、リグノセルロース繊維の処理方法も提供する。前記方法において、繊維はその繊維特性を改善するのに十分な量の本発明のポリペプチド（セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）により処理される。本発明の酵素は、デンプン補強古紙及び厚紙から、パルプ、紙及び厚紙のようなリグノセルロース材料を製造又は再生利用する場合に使用することもでき、特に、再パルプ化又は再生利用が７を超えるｐＨで実施され、本発明の酵素が廃棄物材料の分解を補強デンプンの分解により促進できる場合に使用することができる。本発明の酵素は、デンプン被覆印刷紙から製紙用パルプを製造する方法において有用でありうる。この方法は、例えばＷＯ９５／１４８０７で記載されているように実施することができる。例示的な方法は、紙を分解してパルプを生成し、分解前、分解中又は分解後にデンプン分解酵素で処理し、分解処理及び酵素処理後にインク粒子をパルプから分離することを含む。例えば、米国特許第６，３０９，８７１号及びそれに引用された他の米国特許も参照すること。したがって、本発明は、再生紙パルプを酵素で脱インキする方法を含み、ポリペプチドが繊維表面の効果的な脱インキに有効な量で適用される。
【０３７３】
醸造及び発酵
本発明は、本発明の酵素、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素を含む、ビールを醸造（例えば、発酵）する方法を提供する。一つの例示的な方法において、デンプン含有原料を分解及び処理してモルトを形成する。本発明の酵素は発酵処理の任意の時点で使用される。例えば、本発明の酵素をオオムギモルトの加工時に使用することができる。ビール醸造の主要な原料はオオムギモルトである。これは３段階のプロセスであることができる。第１に、オオムギの穀粒を浸漬して、水分含有量を例えば約４０％程度に増加させる。第２に、穀粒を３〜６日間、１５〜２５℃でインキュベートすることによって発芽させることができ、その間ジベレリンの制御下で酵素合成が刺激される。この期間中に酵素レベルは顕著に上昇する。一つの態様において、本発明の酵素はプロセスのこの段階（又は他の任意の段階）で添加される。酵素の作用は発酵可能な還元糖の増加をもたらす。これはジアスターゼ能力（ＤＰ）として表すことができ、ＤＰは、１２℃で５日間でおよそ８０から１９０に上昇することができる。
本発明の酵素は、米国特許第５，７６２，９９１号、同第５，５３６，６５０号、同第５，４０５，６２４号、同第５，０２１，２４６号、同第４，７８８，０６６号に記載されているように、任意のビール製造方法で使用することができる。
【０３７４】
地下層からの産出流体流の増加
本発明は、本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を使用する方法も含み、この方法は、産出作業中に形成され、完成した井孔を取り巻く地下層内で見出される粘稠なデンプンを含有する有害な流体を除去することによって、地下層から生じる産出流体流を増加させる。したがって、本発明のこの方法は、産出流体を井孔から流出させる。本発明のこの方法は、また、地下層からの産出流体流を予想される流速を下回って低下させる有害な流体の問題に対処する。一つの態様において、本発明は、水性流体と本発明のポリペプチドを一緒にブレンドすることによって酵素処理物を配合し（本発明の酵素を使用する）、酵素処理物を井孔内の所望の場所にポンプで送り込み、酵素処理物で粘稠なデンプン含有有害流体を分解させ、それによって地下層から井戸表面までの流体を除去することを提供し、ここで酵素処理物はデンプン含有流体中のアルファグルコシド結合の攻撃に有効である。
【０３７５】
本発明の地下層酵素処理プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３７６】
医薬組成物及び栄養補助食品
本発明は、本発明のセルラーゼ、（例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を含む、医薬組成物及び栄養補助食品（例えば、ダイエット補助食品）も提供する。セルラーゼ活性は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を含む。一つの態様において、医薬組成物及び栄養補助食品（例えば、ダイエット補助食品）は、例えば、高セルロース又はリグノセルロース成分を有する食物及び飼料の消化を改善するために、経口摂取用に配合される。
例えば、米国特許第６，７７６，９７９号で記載されているように、歯周病治療化合物は本発明の酵素を含むことができる。例えば、米国特許第６，４６８，９６４号で記載されているように、酸性胃症候群を治療又は予防する化合物及び方法は、本発明の酵素を含むことができる。
【０３７７】
別の特徴において、創傷包帯、インププラントなどは、本発明の酵素（例えば本発明の例示的な配列を含む）を含む抗菌（例えば、抗生活性）酵素を含む。本発明の酵素は、アルギン酸被覆材、抗菌バリヤ被覆材、熱傷被覆材、圧迫包帯、診断ツール、ゲル被覆材、ヒドロ選択性被覆材、ヒドロセルロース（泡）被覆材、ヒドロコロイド被覆材、Ｉ．Ｖ．被覆材、切開ドレープ、低付着被覆材、臭気吸収被覆材、ペーストバンデージ、手術後被覆材、瘢痕管理、スキンケア、透明フィルム被覆材、及び／又は創傷閉鎖に使用することもできる。本発明の酵素を、創傷洗浄、創傷床調製物、圧迫潰瘍の治療、下腿潰瘍、熱傷、糖尿病性潰瘍、瘢痕、ＩＶ固着、手術創及び非主要創傷に使用することができる。本発明の酵素を、滅菌酵素的壊死組織除去組成物、例えば軟膏に使用することができる。多様な特徴において、セルラーゼは、錠剤、ゲル剤、丸剤、移植錠、液剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又はカプセル剤として配合される。
【０３７８】
対生物防御用途
他の特徴において、本発明のセルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、生物防御（例えば、リグノセルロース材料を含む胞子又は細菌の破壊）に使用することができる。生物防御用途における本発明のセルラーゼの使用は、現在不明の又は将来的のあらゆる細菌との戦いに対して極めて迅速に開発できる点において、著しい利益を提供する。加えて、本発明のセルラーゼを、影響を受けた環境の汚染除去に使用することができる。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む生物防御又はバイオ解毒剤を提供し、ここでポリペプチドは、本発明の配列（例えば、本発明の例示的な配列を含む）又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド（例えば、本発明の例示的な配列を含む）を含み、場合によりポリペプチドは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する。
【０３７９】
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【０３８０】
以下の実施例は、説明のために提供され、本発明の請求の範囲を制限しない。
【０３８１】
実施例
実施例１：GIGAMATRIX（商標）スクリーニング
ある特徴において、本発明の方法は、Diversa Corporationが独自に開発したGIGAMATRIX（商標）プラットフォームを使用する。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／３８５８３；米国特許出願第２００５００４６８３３号；同第２００２００８０３５０号；米国特許第６，９１８，７３８号；意匠特許第Ｄ４８０，８１４号を参照のこと。例えば、ある特徴において、GIGAMATRIX（商標）は、あるポリペプチドがセルラーゼ活性を有し本発明の範囲内にあるかどうかを決定する方法に用いられ、また、セルラーゼ活性を有するペプチドを同定し単離するのに用いられる。
GIGAMATRIX（商標）プラットフォームは、従来の９６ウエルプレートの次元を有する１００，０００ウエルマイクロプレートに基づいたウルトラハイスループットスクリーニングを含むことができる。この実施例では、GIGAMATRIX（商標）スクリーニングを、ＣＢＨにより予め活性が示されていることに基づいて、２つの基質を使用して適用した。メチル−ウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）及びメチルウンベリフェリルラクトシド（ＭＵＬ）を試験した。基質が細胞内に拡散し、蛍光がより容易に検出できると思われるので、ファージミド型の種々のクローンをスクリーニングした。ラクトシド基質に対する活性を減少させるため、ベータ−ガラクトシダーゼを欠いている宿主株を使用した。ラクトシド基質は、僅かなヒットしかもたらさず、セロビオース基質よりも特異的であることが認められた。加えて、ラクトシド基質は僅かなベータ−ガラクトシダーゼヒットしかもたらさなかった。これらの基質をスクリーニングに使用することの可能性を試験するために、１４個のライブラリーを、これらのライブラリーが以前のスクリーニングプログラムでエンドグルカナーゼヒットを生じたという事実に基づいて、スクリーニングのために選択した。スクリーニングしたライブラリーのうち、スクリーニングした１１個のライブラリーから合計５０個の一次ヒットがあった。二次スクリーニングは、クローンをアガープレートで平板培養し、次にコロニーを取り出して、培地及びＭＵＬを含有する３８４ウエルプレートに入れることから構成された。ＭＵＬに対して活性なクローンを不活性クローンのバックグラウンドと区別した。次に個別のクローンを一晩増殖させ、蛍光を測定し、最も活性なヒットを配列決定のために取り出した。
【０３８２】
ヒットからの全てのゲノムクローン挿入物を配列決定した。一般に、ヒットは、１、２、５、６、１０及び１６を含む幾つかの異なるグリコシルヒドロラーゼファミリーからであった。幾つかの他のヒットは、オープンリーディングフレームがあらゆる既知のグリコシルヒドロラーゼファミリーと相同ではない場合に発見された。加えて、幾つかのヒットは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ遺伝子をコードしていた。
【０３８３】
表１．GIGAMATRIX（商標）ヒットの概要
0005343212.tif 000007
0005343212.tif 000008
0005343212.tif 000009
略語：ＣＢＭ−炭水化物結合モジュール
【０３８４】
酵素及び基質活性の特徴決定
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングで発見された３９ヒット（上記の表１を参照すること）を、最初にセロヘキサオースに対してスクリーニングして、セルロースオリゴマーに対する作用パターンを決定した。ゲノムクローンは多数のオープンリーディングフレームを含むであろうＤＮＡ挿入物全体を有するクローンとして定義される。例えば、上記の表１において、そのようなゲノムクローンの一つは酵素番号２２及び２２ａと注釈が付けられている２つのオープンリーディングフレームを含み、前記のオープンリーディングフレームは、それぞれ配列番号３７及び配列番号３５と示されている配列を有する。別のそのようなゲノムクローンは３つのオープンリーディングフレームを含み、酵素２７、２７ａ及び２７ｂと注釈が付けられている。サブクローンはゲノムクローンに由来し、単一のオープンリーディングフレームのみを含み得る。ゲノムクローンを抗体を含有するＴＢ培地で一晩増殖し、細胞を溶解し、溶解産物を遠心分離により清澄にした。サブクローンをＯＤ６００＝０．５に増殖し、適切なインデューサーで誘導し、次に更に３時間増殖させてから、細胞を溶解し、溶解産物を清澄にした。ゲノムクローンは、一般にサブクローンよりも活性が低いであろうが、広範囲のクローンで活性を評価するより容易な方法である。初期の研究は、通常２４時間実施される終点反応で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して実施した。また酵素を、酸処理による膨張でより無定形になった結晶質セルロースであるリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対して試験した。
【０３８５】
環境ライブラリーからクローン化された多数のセルラーゼは、ＰＡＳＣに対して活性であったが、セルトリオース及び／又はグルコースだけでなくセロビオースを放出した。GIGAMATRIX（商標）発見作業からのゲノムクローンも、ＰＡＳＣ及びセロヘキサオース（生化学, 日本）のようなセルロース基質に対して試験した。図６及び７で示されているように、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）実験は幾つかのゲノムクローンがセロヘキサオースを加水分解できることを示した。これらのクローンのうち多くのものは最終生成物としてグルコースを生成することができ、このことは、これらがベータ−グルコシダーゼを含むグリコシルヒドロラーゼファミリー１と配列同一性を有するという事実と一致している。幾つかの酵素はセロビオース及び／又は大型のフラグメントを産生するが、産生パターンの正確な特性はＴＬＣ実験からは識別することができず、したがってキャピラリー電気泳動（ＣＥ）方法を開発した。
【０３８６】
実施例２：キャピラリー電気泳動
幾つかの態様において、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は酵素活性をスクリーニングするアッセイで使用され、例えばＣＥは、ポリペプチドがセルラーゼ活性を有し、本発明の範囲内であるかを決定する方法、又はセルラーゼ活性を有するポリペプチドを同定及び単離する方法で使用される。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、より速い作動時間及びより大きいアッセイ感度という利点を提供する。ＣＥ方法は、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）を蛍光体として使用し、糖及び糖オリゴマーと共に使用して最適化された（Guttman (1996) High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Anal. Biochem 233:234-242）。セロヘキサオースに対して活性であることを示した酵素を、リン酸膨張セルロース、並びにセロヘキサオースでの試験に付した。遺伝子をサブクローニングし、発現させ、ニッケルキレートカラムを使用して精製した。酵素を基質と共に１時間インキュベートし、生成物を１０cm〜４８cmのキャピラリーを使用して分析した。セロヘキサオースを、１０及び４８cmのキャピラリーでそれぞれ２及び９分間溶離した。４８cmのキャピラリーは、糖の量が低い場合又は混合物に汚染物が存在する場合に生成物のより良好な分離を提供した。ＣＥ方法をＴＬＣ検出によってセロヘキサオースに対する良好な活性を示したGIGAMATRIX（商標）発見からの酵素についての研究に適用した。
【０３８７】
酵素２２／２２ａ（上記の表１を参照）は、ＰＡＳＣに対して良好な機能を示し（データは図８にグラフの形態でまとめられている）、主にセロビオースを遊離する。加えて、酵素２２／２２ａは、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）（FMC Corporation, Philadelphia, PA）（データは図９にグラフの形態でまとめられている）からセロビオースを遊離することができた。配列分析により、酵素２２及び２１は、約９２％同一であり、グリコシルヒドロラーゼファミリー５に属することが示された。ファミリー５は、主にエンドグルカナーゼを含むが、セロビオヒドロラーゼの例も存在する。クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）のＣｅｌＯは、非晶質及び結晶質セルロースからセロビオースしか遊離しない活性に基づいて、セロビオヒドロラーゼとして特徴決定された（Zverlov (2002) A newly described cellulosomal cellobiohydrolase, CelO, from Clostridium thermocellum: investigation of the exo-mode of hydrolysis, and binding capacity to crystalline cellulose. Microbiology 148:247-255）。
これら３つの酵素は、全て、アシドテルムス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）のエンドグルカナーゼと比較すると、基質結合部位に近接した挿入を有する。この挿入は、基質結合部位を含むループを形成することができ、それによりこの酵素をエンドグルカナーゼからセロビオヒドロラーゼに変換しているのであろう。これらの酵素をセロヘキサオースに対して試験したとき、これらは、少量のセロトリオースを伴って、主にセロビオースを産生した。これらの結果は、セロビオヒドラーゼが、セロビオースとセロトリオースの両方を産生する能力を有するという事実によって説明される（Harjunpaa (1996) Cello-oligosaccharide hydrolysis by cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Association and rate constants derived from an analysis of progress curves. Eur. J Biochem 240:584-591）。 
【０３８８】
実施例３：配列に基づいた発見
本発明は、本発明の配列を使用して、セルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼを同定及び単離する方法を提供する。一つの例示的な方法において、セロビオヒドロラーゼを含む３つのリコシルヒドロラーゼファミリーの保存領域に相同性であるプライマーを使用して、ポリヌクレオチドライブラリー又は真菌試料由来のＤＮＡのいずれかをスクリーニングした。プライマーをファミリー４８の保存領域に対して設計し、９６個のライブラリーをスクリーニングして、１つのヒットを確認した。加えて、プライマーをファミリー６及びファミリー７に対して設計した。真菌ライブラリーをこれらのプライマーでスクリーニングして、ファミリー６で１ヒット、ファミリー７で５６ヒットを得た。ファミリー７のうちの一つを研究用に選択して、配列の完全長を抽出した。完全長配列を成功裏に得て、これはPenicillium janthinellumのエキソ−セロビオヒドロラーゼＩと７３％の同一性を示した。
【０３８９】
実施例４：セロビオヒドロラーゼ活性を有する酵素の遺伝子操作
この実施例は、本発明の例示的な酵素の遺伝子操作を記載した。この酵素を、バイオマスの燃料及び化学物質への変換において、並びに石油系生成物に対する有効で持続可能な代替物を作製するために使用できる。この酵素を、天然のバイオマス変換に関わる化学サイクルに参加するため、生物体（例えば、細菌のような微生物）で発現させることができる。一つの特徴において、この酵素は、セルロース及びヘミセルロースポリマーを代謝可能な炭素分子へ有効に脱重合するために「酵素集合物（アンサンブル）」として使用される。上記で考察したように、本発明は、これらの重要な新たな「バイオマス変換」及び代替エネルギーの産業プロセスを可能にする、最も効果的な酵素を発見及び適用する方法を提供する。
米国特許第６，９３９，６８９号に記載されているメタゲノム発見及び定方向進化の非確率論的方法（「DIRECTEVOLUTION（登録商標）」と呼ばれる）を使用する。これらには遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）（上記で考察されており、米国特許第６，１７１，８２０号及び同第６，５７９，２５８号も参照すること）及び可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ）（例えば、米国特許第６，５３７，７７６号を参照すること）技術が含まれる。この作業は、セルロースがグルコース、セロビオヒドロラーゼに還元するために重要な酵素成分を発見し、最適化することに集中していた。
【０３９０】
酵素発見スリーニングを、Diversa CorporationのGIGAMATRIX（商標）ハイスループット発現スクリーニングプラットフォーム（上記で考察した）を使用して適用し、基質としてメチルウンベリフェリルセロビオシドを用いてセロビオヒドロラーゼを同定した。合計１００個の複合環境ライブラリーをスクリーニングして、主にグリコシルヒドロラーゼファミリー５及び１０からの２５個の確認されたセロビオヒドロラーゼヒットを得た。これらのヒットを、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）（FMC Corporation, Philadelphia, PA）に対する活性について特徴決定した。この性能特性に基づいて、１つの酵素配列番号１６２（例えば配列番号１６１でコードされている）を、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）技術を使用して、最適化のための酵素として選択した。しかし、ＧＳＳＭ進化を実施する前に、シグナル配列（アミノ酸１〜３０）を配列番号１６２から除去し、開始メチオニンを付加した。本明細書以降で「野生型」と呼び、配列番号１６４（例えば配列番号１６３でコードされている）で表されるシグナルのない配列を親配列とし、ＧＳＳＭ技術を使用して最適化した。上記で考察したように、ＧＳＳＭ技術は、タンパク質中の全てのアミノ酸を迅速に１９個の他のアミノ酸に連続的に突然異変させることができる。変種を、繊維系アッセイを使用してスクリーニングし、単一のアミノ酸変化を表す潜在的な上方変異体（upmutant）を同定した。これらの上方変異体を合わせて、上方変異体の組合せを表す新たなライブラリーとした。このライブラリーをスクリーニングし、商業化のために幾つかの候補酵素を同定した。
【０３９１】
研究の概要
GIGAMATRIX（商標）スクリーニング
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングプラットフォームは、従来の９６ウエルプレートの大きさを有する１００，０００ウエルマイクロプレートに基づいたウルトラハイスループット方法である（詳細はフェーズＩＩ出願を参照すること）。スクリーニングは蛍光基質を用いて行う。ＧＭｘスクリーニングを、以前にセルラーゼで活性を示したことに基づいて２つの基質を使用して適用した。メチルウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）をスクリーニング基質として使用した。加えて、レソルフィン−ベータ−グルコピラノシドもスクリーニングに含めて、両方の基質に活性を有し、かつベータ−グルコシダーゼであると推定されるクローンを排除した。 
増幅されたファージ又はファージミド型の標的ライブラリーをスクリーニングした。ベータ−グルコシダーゼ遺伝子を欠いている２つの宿主株（ＣＥＨ６及びＧＡＬ６３１）を使用して、基質に対する内在性宿主活性を減少させた。１００個のライブラリーを、これらのライブラリーが以前のスクリーニングプログラムでセルラーゼヒットを生じたという事実に基づいて、スクリーニングのために選択した。スクリーニングしたライブラリーのうち、スクリーニングした６９個のライブラリーから合計３５５個の主要なヒットがあった。 
【０３９２】
二次スクリーニングは、クローンをアガープレートで平板培養し、次にコロニーを取り出して、培地及びメチルウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）を含有する３８４ウエルプレートに入れることから構成され、「ブレイクアウト（breakout）」と名付けた。図１０は、典型的なGIGAMATRIX（商標）（GMx）ブレイクアウトを示すデータをグラフの形態で示す。このデータを生成するために、ＭＵＣに対して活性な（すなわち、メチルウンベリフェリルセロビオシドを加水分解できる）クローンを、不活性クローンのバックグラウンドと区別した。次に個別のクローンを一晩増殖し、蛍光を測定し、最も活性なヒットを配列決定のために取り出した。図１０では、Ｘ軸は、試料の名称を示し、Ｙ軸は相対的蛍光単位である。陽性の「ヒット」をアガープレート上に置き、次にコロニーを取り出して、ＬＢ＋抗体と５０μMのＭＵＣを含有する３８６ウエルプレートに入れ、一晩増殖した。
【０３９３】
表２．GIGAMATRIX（商標）（GMx）ヒットの概要
0005343212.tif 000010
0005343212.tif 000011
【０３９４】
ヒットからの全てのゲノムクローン挿入物を配列決定した。上記の表１のように、同じゲノムクローンが１つ以上のオープンリーディングフレームを含んだ。例えば、そのようなゲノムクローンの一つが、酵素番号Ｈ８及びＨ８ａと注釈が付けられている２つのオープンリーディングフレームを含み、前記のオープンリーディングフレームは、それぞれ配列番号６７及び配列番号６９と示されている配列を有する。スクリーニングされた１７個のライブラリーから合計２５個のグリコシルヒドロラーゼヒットがあった。一般に、ヒットは、５及び１０を含む幾つかの異なるグリコシルヒドロラーゼファミリーからであった。表２（上記）は、ヒット及び／又はその実体を提示している。幾つかの他のヒットが発見され、それらのオープンリーディングフレームは既知のいずれのグリコシルヒドロラーゼファミリーとも相同ではなかった。加えて、幾つかのヒットはＧＴＰシクロヒドロラーゼ遺伝子をコードしていたが、これは基質の分解にかかわらず蛍光を発するのでこの系において偽陽性であることが知られている。総体的に、スクリーニングはＭＵＣに対して活性であった酵素を同定することに成功した。
【０３９５】
特徴決定
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングで発見された遺伝子を配列決定して、データを分析した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ソフトウエアシステムを使用して注釈を付けた。Ｃ末端ＨｉｓタグをコードするＤＮＡを導入してＯＲＦを適切なベクターにサブクローニングした。構築ＤＮＡで適切なE. coli宿主を形質転換し、特徴決定研究のために発現させた。遺伝子生成物をリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対してスクリーニングした。ＰＡＳＣは酸処理による膨張でより無定形になった結晶質セルロースである。ＰＡＳＣはAVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）から調製した。サブクローンを増殖させ、発現させ、溶解した。溶解物をＰＡＳＣと共にインキュベートし、反応生成物をビシンコニン酸（ＢＣＡ）還元糖アッセイを使用して分析した。最も活性なサブクローンを大規模増殖及び精製のために選択した。これらのサブクローンの特異的活性をＰＡＳＣに対して決定した。
サブクローンをキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によっても分析した。溶解物を基質と共に３０時間インキュベートした。反応生成物を蛍光体１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）により誘導体化した。この生成物を４８cmのキャピラリーを使用して分析した。セロビオースが６分間で溶離した。図１１はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析によりＰＡＳＣに対する選択された酵素の活性を示すデータをグラフ形態で示している。試料Ｈ９〜Ｈ１は個別のクローンである。図１１では、多数の試料が進化した酵素の代表的な反応生成物特性を有した。この進化酵素は、セロビオース／（グルコース＋セロトリオース）≧１０の比率を有すると定義される。最も活性な２つの強力な進化酵素は、ＰＡＳＣに対する比活性がそれぞれ０．３５及び０．０４Ｕ／mgであった。
【０３９６】
ピキア（Pichia）における真菌ＣＢＨ
新たに発見されたファミリー６及び７の真菌セロビオヒドロラーゼの遺伝子でP.パストリス（P. pastoris）を形質転換し、形質転換体を固体アガープレートに広げた。１６０個のコロニーをそれぞれの構築物のために選択した。試料を増殖及び誘導し、上澄みをＰＡＳＣと共にβ−グルコシダーゼの存在下でインキュベートした。反応生成物を、グルコース−オキシダーゼアッセイを使用して分析した。グリコシルヒドロラーゼファミリー６のセロビオヒドロラーゼは、P. pastorisで成功裏に異種発現された。
【０３９７】
エキソ−エンド作用セルラーゼ
野生型酵素である、酵素スクリーニングで発見されたファミリー９のグリコシルヒドロラーゼは、テルモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）Ｅ４と相同性である。Ｅ４は、エンド活性とエキソ活性の両方を有することが示されている。野生型酵素の初期試験は、それがＰＡＳＣとAVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）の両方に活性であることを示した。反応生成物のＨＰＬＣ分析は、主要な生成物がグルコース及びセロビオースであることを示した。野生型酵素はマルチドメインタンパク質であり、グリコシルヒドロラーゼファミリー９触媒ドメイン、ファミリー３セルロース結合ドメイン及び細胞付着に関連していると思われる３つの細菌Ｉｇ様ドメインを含む。野生型酵素の３つの追加的なサブクローン変種を試験して、活性に対するドメインの効果を決定した。野生型酵素を、１）触媒ドメイン単独（ＣＤ）、２）触媒ドメイン及び炭水化物ドメイン（ＣＣＤ）、並びに３）触媒ドメイン及び炭水化物結合ドメイン＋１１個の下流アミノ酸（ＣＣＤ＋１１）を用いてサブクローン化した。完全長タンパク質及び３個のサブクローン変異体を、VICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）でアッセイし、反応生成物をＢＣＡ還元糖アッセイにより分析し、データを図１２においてグラフの形態でまとめた。図１２に示されたデータは、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）と共に３７℃、ｐＨ５で７４時間インキュベートした、野生型酵素及び切断変異体のＢＣＡにより生成した。ＣＢＨ１は陽性対照である。陰性対照は挿入物のない宿主である。
野生型酵素である完全長タンパク質（例えば配列番号１６３でコードされている配列番号１６４）が最も活性であった。完全長タンパク質をＧＳＳＭ進化のために選択した。触媒及び炭水化物結合ドメインを進化させた。
【０３９８】
ＧＳＳＭスクリーニング
ＧＳＳＭ技術（上記で考察された）を使用して、標的タンパク質の触媒及び炭水化物結合ドメインの核酸を１９個の他のアミノ酸に迅速及び連続的に変異させた。ＧＳＳＭスクリーニングの目標は、不溶性微晶質セルロースの加水分解の程度を増大する変異体を同定することであった。ＧＳＳＭスクリーニングプロセスを促進するためにロボットを使用したスクリーニングの方法が開発された。
変異構築物からのＤＮＡでＤＨ１０ｂ宿主細胞を形質転換した。個別のコロニーを取り出して、自動コロニー取り出しシステムを使用して１５０uLのＬＢ／アンピシリンを含有する９６ウエルプレート（浅い）に入れた。プレートを３７℃、４００rpmで２４時間インキュベートした。１５uLの培養をそれぞれのウエルから誘導プレートに移した。誘導プレートの各ウエルは、１３５uLのＬＢ／アンピシリンと１．１mMのＩＰＴＧを含有した。誘導プレートを３７℃、４００rpmで２４時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、上澄みを廃棄した。
この時点でアッセイの自動化部分を開始した。ロボットにより、細胞を溶解して再懸濁した。１５０uLの溶解緩衝液（１２５uLの水＋０．２mg/mlリゾチーム及び２０単位/ml  ＤＮａｓｅＩを含有する２５uLのＢＰＥＲ）をそれぞれのウエルに加えた。１５uLの溶解物をそれぞれのウエルから反応プレートに移した。反応プレートの各ウエルは、１８５uLの反応混合物（１％AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）、５０mM酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）を含有させた。反応プレートを、９５％湿度、３７℃で３０時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを遠心分離し、１５uLの上澄みをＢＣＡプレートに移した。ＢＣＡプレートは、１ウエルあたり、５０uLの試薬Ａ、５０uLの試薬Ｂ及び８０uLの４００mM炭酸緩衝液をｐＨ１０で含有させた。プレートをゴム製のシール材で覆い、８０℃で３０分間インキュベートし、次に遠心分離により冷却し、吸光度をＡ５６０で読み取った。
【０３９９】
結果
少なくとも８０個のランダム変異コロニーを、それぞれのアミノ酸部位でスクリーニングした。一次ＧＳＳＭ（商標）スクリーニングデータの例が、図１３でグラフにより示されている。カラム６は野生型試料を含み、カラム１２は宿主／ベクター陰性対照を含んだ。AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）と共に３０時間インキュベートした後、野生型試料から生成されたシグナルは、およそ０．５３であり、標準偏差は０．０７であった。陰性対照は平均シグナルの０．２９を有した。陽性対照の平均＋２x標準偏差よりも高いシグナルを有する試料は、主要なヒットとみなした。このスクリーニングプレートから約１０個の主要なヒットを二次確認スクリーニングのために選択した。
主要なヒットを二次アッセイで再確認した。このアッセイは一次スクリーニングと同一であった。しかし試料を四重にアッセイした。二次ＧＳＳＭスクリーニングデータの例が、図１４でグラフにより示されている。ウエル中の試料Ｅ３−Ｈ３、Ａ４−Ｄ４、Ａ７−Ｄ７は、平均して、野生型よりも高い活性を有した。試料を四重にアッセイしたので、これらの１２個のウエルは３つのヒットに相当する。これらの試料は、図１３のウエルＥ４、Ｇ２及びＨ３で示される主要なヒットであった（プレート２９８０５−ＡＡ８９ＢＣＡプレート）。
二次スクリーニングからは７７個のヒットがあった。これらの試料を四重に実施した。３５個の試料ではアミノ酸の変化があり、２２個は、トランスポゾンの挿入があり、残りは野生型であるか又は欠失があった。 
二次スクリーニングからのヒットを更に分析した。ＧＳＳＭ上方変異体をT. fuscaＥ４の結晶構造上にマッピングした。試料に、アミノ酸の位置、アミノ酸の変化及び改善スコア倍数に基づいて優先順位をつけた。８個の上方変異体を、ＧＳＳＭスクリーニングから選択し、遺伝子再アッセンブリ進化、すなわち上記で考察した可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ）（米国特許第６，５３７，７７６号も参照すること）のために選択した。
【０４００】
表２．部位特異的変異導入再集合のために選択された上方変異体
0005343212.tif 000012
【０４０１】
上方変異体のブレンド
遺伝子再集合（可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ））技術を使用して、上記の表２で示されている上方変異体をブレンドして、最良の活性を有する候補を同定した。活性アッセイは、野生型酵素に対して上方変異体の活性を増加するように反応を更に稀釈した以外は、ＧＳＳＭスクリーニングと同一であった。図１５は、混合又は「ブレンド」ＧＳＳＭ（商標）スクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【０４０２】
まとめると、本発明は、配列番号１６４（例えば配列番号１６３でコードされている）に基づいた以下の配列を有するセルラーゼ活性を有する酵素を提供する。
【０４０３】
0005343212.tif 000013
【０４０４】
本発明の多数の態様を記載してきた。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく多様な変更を行えることが理解される。したがって、他の態様も請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０４０５】
【図１】  コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】  新規なヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較し、新規配列とデータベース配列との間の相同性を決定する方法の一つの態様を示す流れ図である。
【図３】  ２つの配列が相同であるかを決定するためのコンピュータ処理の一つの態様を示す流れ図である
【図４】  配列中に特徴が存在するかを検出するためのアイデンティファイヤ−プロセス３００の一つの態様を示す流れ図である。
【図５】  セロビオースの構造を示す。
【図６】  実施例１で詳細に考察されている、セロヘキサオースからの反応生成物のＴＬＣ分析の結果を示す。
【図７】  実施例１で詳細に考察されている、セロヘキサオースからの反応生成物のＴＬＣ分析の結果を示す。
【図８】  実施例２で詳細に考察されている、本発明の例示的な酵素２２／２２ａ（ＣＨＢ）によるＰＡＳＣからのセロビオースの放出を示すデータをグラフの形態で示す。
【図９】  実施例２で詳細に考察されている、本発明の例示的な酵素２２／２２ａ（ＣＨＢ）によるＡＶＩＣＥＬ（商標）ＭＣＣからのセロビオースの放出を示すデータをグラフの形態で示す。
【図１０】  典型的なGIGAMATRIX（商標）ブレイクアウトを示すデータをグラフの形態で示す。実施例４で詳細に考察されているように、メチルウンベリフェリルセロビオシドを加水分解できる酵素を発現する活性クローンが同定される。
【図１１】  実施例４で詳細に考察されている、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析によるリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対する選択された酵素の活性を示すデータをグラフの形態で示す。
【図１２】  AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）における本発明の例示的な酵素及びサブクローン変異体のアッセイからのデータをグラフの形態で示す。実施例４で詳細に考察されているように、反応生成物はＢＣＡ還元糖アッセイにより分析された。
【図１３】  実施例４で詳細に考察されている、一次ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【図１４】  実施例４で詳細に考察されている、二次ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【図１５】  実施例４で詳細に考察されている、混合又は「ブレンド」ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> DIVERSA CORPORATION
BLUM, David
GEMSCH, Joslin
DYCAICO, Mark
<120> CELLULASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM
AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM
<130> X1O2094
<150> US 60/662,224
<151> 2005-03-15
<160> 166
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 1
atgtcaacct ataaatttcc gcacaacttt ttttggggag ccgcaaccgc gtcttatcag     60
atcgaaggcg catggaacga ggatggcaaa ggcgaatcca tttgggatcg cttcagccat    120
acgcccggaa aggtcaccaa tgccgatacc ggtgacatcg cctgtgacca ctatcaccgt    180
tgggaggaag atatcgccct tatgcgccaa cttgggttga aggcgtaccg cttttccact    240
tcatggcccc gtgtgatccc ggcgggccgc agacgggtga atgtcaaagg gctggatttc    300
tacgatcgcc tggtggatgg tctgtgcgcc gcgaacatcg aaccgttcct caccctgtat    360
cactgggacc tgccgcaggc tcttcaagac gaaggcggct gggataatcg caacaccgcc    420
catgcctttg ccgattatgc cgcattgatg gtgaaacgac ttggcgaccg tatccgctat    480
tggacgacgt tcaacgaacc cagcgttgtg gcgttcaatg gtcattactc aggctcgcac    540
gccccgggca ttcaagatgc ccgtgttacc cgccaggtgg tgcatcattt gctggtggcg    600
catgggttgg ctgtgcaggc gatccgcggc gcaaactcca aagtggatgt gggcatcgtg    660
cttaatttat ggcccgccga acccgattcg gactcccccg aagatgccgc cgccgccgaa    720
gccgcctgga accggcacga gaccctgttc cttgacccca tctttaaggc gcattatccc    780
gtatctgccc ttgatgcgat tggggaggat atgccccgca tccacgacgg cgatctggcg    840
ttgatctctc aggaattgga ttttgtcggc atcaactatt actcccgcca tgtggtcagt    900
gccacaaaag aaataggcag gcttcccgaa tcggaataca ctgaaatggg ctgggaagta    960
tgcgcccccg cactccgccg cctgctggtc aagatccata acgattaccg tttgccgccc   1020
atctatatca ccgaaaacgg atcggcattc aaggacgaag ttaacgcaga cggaaaggtt   1080
catgacccgc ggcggttgga ttacctgaaa caacacctga ttcaactttg ccttgccatg   1140
caggacggcg tggatgtgcg cggctacatg gcttggtccc tgctggataa tttcgagtgg   1200
ggtcacggct tttccaagcg ctttggcttg gtccatgtgg attacgagag ccagaagcgg   1260
attattaaag actcgggtga atggtatgca agtgtgatac ggaagaacga ggttgttgaa   1320
taa                                                                 1323
<210> 2
<211> 440
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (2)...(438)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (10)...(24)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (351)...(354)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 2
Met Ser Thr Tyr Lys Phe Pro His Asn Phe Phe Trp Gly Ala Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu 
20                  25                  30          
Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Pro Gly Lys Val Thr Asn Ala 
35                  40                  45              
Asp Thr Gly Asp Ile Ala Cys Asp His Tyr His Arg Trp Glu Glu Asp 
50                  55                  60                  
Ile Ala Leu Met Arg Gln Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Thr 
65                  70                  75                  80  
Ser Trp Pro Arg Val Ile Pro Ala Gly Arg Arg Arg Val Asn Val Lys 
85                  90                  95      
Gly Leu Asp Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Gly Leu Cys Ala Ala Asn 
100                 105                 110         
Ile Glu Pro Phe Leu Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu 
115                 120                 125             
Gln Asp Glu Gly Gly Trp Asp Asn Arg Asn Thr Ala His Ala Phe Ala 
130                 135                 140                 
Asp Tyr Ala Ala Leu Met Val Lys Arg Leu Gly Asp Arg Ile Arg Tyr 
145                 150                 155                 160 
Trp Thr Thr Phe Asn Glu Pro Ser Val Val Ala Phe Asn Gly His Tyr 
165                 170                 175     
Ser Gly Ser His Ala Pro Gly Ile Gln Asp Ala Arg Val Thr Arg Gln 
180                 185                 190         
Val Val His His Leu Leu Val Ala His Gly Leu Ala Val Gln Ala Ile 
195                 200                 205             
Arg Gly Ala Asn Ser Lys Val Asp Val Gly Ile Val Leu Asn Leu Trp 
210                 215                 220                 
Pro Ala Glu Pro Asp Ser Asp Ser Pro Glu Asp Ala Ala Ala Ala Glu 
225                 230                 235                 240 
Ala Ala Trp Asn Arg His Glu Thr Leu Phe Leu Asp Pro Ile Phe Lys 
245                 250                 255     
Ala His Tyr Pro Val Ser Ala Leu Asp Ala Ile Gly Glu Asp Met Pro 
260                 265                 270         
Arg Ile His Asp Gly Asp Leu Ala Leu Ile Ser Gln Glu Leu Asp Phe 
275                 280                 285             
Val Gly Ile Asn Tyr Tyr Ser Arg His Val Val Ser Ala Thr Lys Glu 
290                 295                 300                 
Ile Gly Arg Leu Pro Glu Ser Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val 
305                 310                 315                 320 
Cys Ala Pro Ala Leu Arg Arg Leu Leu Val Lys Ile His Asn Asp Tyr 
325                 330                 335     
Arg Leu Pro Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ser Ala Phe Lys Asp 
340                 345                 350         
Glu Val Asn Ala Asp Gly Lys Val His Asp Pro Arg Arg Leu Asp Tyr 
355                 360                 365             
Leu Lys Gln His Leu Ile Gln Leu Cys Leu Ala Met Gln Asp Gly Val 
370                 375                 380                 
Asp Val Arg Gly Tyr Met Ala Trp Ser Leu Leu Asp Asn Phe Glu Trp 
385                 390                 395                 400 
Gly His Gly Phe Ser Lys Arg Phe Gly Leu Val His Val Asp Tyr Glu 
405                 410                 415     
Ser Gln Lys Arg Ile Ile Lys Asp Ser Gly Glu Trp Tyr Ala Ser Val 
420                 425                 430         
Ile Arg Lys Asn Glu Val Val Glu 
435                 440 
<210> 3
<211> 1389
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 3
atgagcgctc cgagtcccgc ccgccccgtg tcctttcctc cccgcttcgt gtggggagcc     60
gcggccgcat cctatcaaat cgagggcgcc gtccgggagg acggcaaggg cccttcggtg    120
tgggacatgt tctgcgagaa gccgggagcc gtcttcgagg ggcacgacgg ggcggtggct    180
tgcgatcact accaccgtta ccgggaagac gtggccctga tgcggcagat tgggctccag    240
gcttaccgcc tgagcgtgtg ctggcccagg gtgctgcccg aggggaccgg gcagcccaac    300
gagaaggggc tcgacttcta ctcccggctc gtcgacgcct tgctcgaggc ggggatcacg    360
ccttgggtca ccctttttca ctgggactac ccactagccc tatatcaccg gggaggctgg    420
ctcaatcggg atagctcaga ctggttcggc gagtacgcgg gtctgattgc ggagcgcctc    480
tccgatcggg tgagccactt cttcacccag aacgagcccc aggtgtacat cggcttcggg    540
cacctcgagg ggaaacacgc gccgggcgat acccttcccc tgtcgcagat gctgctggcc    600
ggtcaccaca gcctgctcgc ccatggaaag gccgtgcagg cgctgcgcgc ccacggcaag    660
cagcagctgc gggttggata cgctccggtg gggatgccgc tgcatccggt cagcgagtcc    720
gccgaagacg tggcggctgc acgcaccgcc actttccgcg tccgagagaa gaattcctgg    780
aacaacgctt ggtggatgga cccggtgtac ctcggtgagt accccgccca agggctcgag    840
ttctacgggc gagacgtccc cgcgatccgg tccggagaca tggaactcat ccggcaaccc    900
ttggactttt tcggcgtcaa catctaccag agcacgcccg tgcgcgccgc gggggcgccc    960
caggggttcg aggtcgtccg gcatccgacg ggccacccca tcaccgcgtt caactggccg   1020
gttacgccac aggccttgta ttgggggccg cggttcttct acgagcgcta tggcaagccc   1080
atcgtcatta cggaaaacgg gctttcctgc cgagacgtga tcgcccttga cggcaaggtg   1140
cacgatccgt cccgcatcga cttcaccacg cgctacctgc gcgagctcca ccgcgccatc   1200
gccgaaggca acgaggtgga gggctacttc cactggtcca tcatggacaa cttcgaatgg   1260
gctgccggat accgagaacg cttcgggctc gttcacgtgg attacgagac cctggtgagg   1320
acacccaagg actctgcggc gtggtaccgc caggtcatcc agagcaacgg ggccgtgctg   1380
ttcgattga                                                           1389
<210> 4
<211> 462
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (8)...(458)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (16)...(30)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (366)...(374)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 4
Met Ser Ala Pro Ser Pro Ala Arg Pro Val Ser Phe Pro Pro Arg Phe 
1               5                   10                  15      
Val Trp Gly Ala Ala Ala Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Val Arg 
20                  25                  30          
Glu Asp Gly Lys Gly Pro Ser Val Trp Asp Met Phe Cys Glu Lys Pro 
35                  40                  45              
Gly Ala Val Phe Glu Gly His Asp Gly Ala Val Ala Cys Asp His Tyr 
50                  55                  60                  
His Arg Tyr Arg Glu Asp Val Ala Leu Met Arg Gln Ile Gly Leu Gln 
65                  70                  75                  80  
Ala Tyr Arg Leu Ser Val Cys Trp Pro Arg Val Leu Pro Glu Gly Thr 
85                  90                  95      
Gly Gln Pro Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Arg Leu Val Asp 
100                 105                 110         
Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Phe His Trp 
115                 120                 125             
Asp Tyr Pro Leu Ala Leu Tyr His Arg Gly Gly Trp Leu Asn Arg Asp 
130                 135                 140                 
Ser Ser Asp Trp Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Leu Ile Ala Glu Arg Leu 
145                 150                 155                 160 
Ser Asp Arg Val Ser His Phe Phe Thr Gln Asn Glu Pro Gln Val Tyr 
165                 170                 175     
Ile Gly Phe Gly His Leu Glu Gly Lys His Ala Pro Gly Asp Thr Leu 
180                 185                 190         
Pro Leu Ser Gln Met Leu Leu Ala Gly His His Ser Leu Leu Ala His 
195                 200                 205             
Gly Lys Ala Val Gln Ala Leu Arg Ala His Gly Lys Gln Gln Leu Arg 
210                 215                 220                 
Val Gly Tyr Ala Pro Val Gly Met Pro Leu His Pro Val Ser Glu Ser 
225                 230                 235                 240 
Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Arg Thr Ala Thr Phe Arg Val Arg Glu 
245                 250                 255     
Lys Asn Ser Trp Asn Asn Ala Trp Trp Met Asp Pro Val Tyr Leu Gly 
260                 265                 270         
Glu Tyr Pro Ala Gln Gly Leu Glu Phe Tyr Gly Arg Asp Val Pro Ala 
275                 280                 285             
Ile Arg Ser Gly Asp Met Glu Leu Ile Arg Gln Pro Leu Asp Phe Phe 
290                 295                 300                 
Gly Val Asn Ile Tyr Gln Ser Thr Pro Val Arg Ala Ala Gly Ala Pro 
305                 310                 315                 320 
Gln Gly Phe Glu Val Val Arg His Pro Thr Gly His Pro Ile Thr Ala 
325                 330                 335     
Phe Asn Trp Pro Val Thr Pro Gln Ala Leu Tyr Trp Gly Pro Arg Phe 
340                 345                 350         
Phe Tyr Glu Arg Tyr Gly Lys Pro Ile Val Ile Thr Glu Asn Gly Leu 
355                 360                 365             
Ser Cys Arg Asp Val Ile Ala Leu Asp Gly Lys Val His Asp Pro Ser 
370                 375                 380                 
Arg Ile Asp Phe Thr Thr Arg Tyr Leu Arg Glu Leu His Arg Ala Ile 
385                 390                 395                 400 
Ala Glu Gly Asn Glu Val Glu Gly Tyr Phe His Trp Ser Ile Met Asp 
405                 410                 415     
Asn Phe Glu Trp Ala Ala Gly Tyr Arg Glu Arg Phe Gly Leu Val His 
420                 425                 430         
Val Asp Tyr Glu Thr Leu Val Arg Thr Pro Lys Asp Ser Ala Ala Trp 
435                 440                 445             
Tyr Arg Gln Val Ile Gln Ser Asn Gly Ala Val Leu Phe Asp 
450                 455                 460         
<210> 5
<211> 1098
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 5
atgactcgga ggtctatcgt gcgttcttct tccaacaagt ggcttgtcct tgccggtgcg     60
gcgctgctcg cctgcaccgc cctcgggtgc aagaaaaaag gcgagagcgg tgacgtcgcc    120
tcggccccgg ggcaggccca ggcgggcggc aagcagccgt ttcccgacga tgcgccgatc    180
accgaaccgc ccgctccgcc ccctcgtagc ggcaatcctc tggtgggcgc caagctcttc    240
gtcgacccgg aatctttggc catgttgcag gcgaacaagc tgcggcgcac cgacccggag    300
aaggcggcga ttttggatcg catcgcccag cagccccagg ctttgtggat gggcgagtgg    360
aacacgaaca tcttccgcgc ggtcgagcat ttcgtggctc gcgccaaggc ggagggcgcc    420
gtgcccgtca tgatcgccta caacatcccc caccgcgact gcgggcagta ctctcagggt    480
gggctttcct ccaaggaggc ttaccagcgc tggattcgga acgtcgccgc ggggattggc    540
agcgatgcag cggtcgtcgt gctcgagccc gacgcgctcg gccacttcca ggagtgtttg    600
accgaggagc agagcgccga gcgcatgttc ctgctcagcg acgccgtcaa ggtgctgcgc    660
caaaatccga agacggccgt gtacctggat gccgggcacg cgcgctgggt gccggtggag    720
gagatggccg agcgcctcaa gctcgcgggc atcgagcacg cccatggctt ttcgctcaac    780
acctcgaact acgtgggcac cgaggagaac gccgcttacg gccacaagct cgtcgaggcc    840
ctgggtggga acgtgcgctt cgtcatcgac acgagccgca atggggcggg cccctacgag    900
gaggccaaga acgccgagga gagctggtgc aacccgcccg gtcgcaagat cggcaagccg    960
ccgaccaccg agacggggga tcccctcatc gacggattcc tttggctgaa gcgcccgggc   1020
gagtcggacg gtcagtgcaa cggcgggccc aaggccggtg tgttctggct ggagcaggct   1080
ctccagcagg cccagtaa                                                 1098
<210> 6
<211> 365
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(29)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (81)...(358)
<223> Glycosyl hydrolases family 6
<220> 
<221> SITE
<222> (187)...(196)
<223> Glycosyl hydrolases family 6 signature 2. Prosite id = PS00656
<220> 
<221> SITE
<222> (263)...(266)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 6
Met Thr Arg Arg Ser Ile Val Arg Ser Ser Ser Asn Lys Trp Leu Val 
1               5                   10                  15      
Leu Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Cys Thr Ala Leu Gly Cys Lys Lys 
20                  25                  30          
Lys Gly Glu Ser Gly Asp Val Ala Ser Ala Pro Gly Gln Ala Gln Ala 
35                  40                  45              
Gly Gly Lys Gln Pro Phe Pro Asp Asp Ala Pro Ile Thr Glu Pro Pro 
50                  55                  60                  
Ala Pro Pro Pro Arg Ser Gly Asn Pro Leu Val Gly Ala Lys Leu Phe 
65                  70                  75                  80  
Val Asp Pro Glu Ser Leu Ala Met Leu Gln Ala Asn Lys Leu Arg Arg 
85                  90                  95      
Thr Asp Pro Glu Lys Ala Ala Ile Leu Asp Arg Ile Ala Gln Gln Pro 
100                 105                 110         
Gln Ala Leu Trp Met Gly Glu Trp Asn Thr Asn Ile Phe Arg Ala Val 
115                 120                 125             
Glu His Phe Val Ala Arg Ala Lys Ala Glu Gly Ala Val Pro Val Met 
130                 135                 140                 
Ile Ala Tyr Asn Ile Pro His Arg Asp Cys Gly Gln Tyr Ser Gln Gly 
145                 150                 155                 160 
Gly Leu Ser Ser Lys Glu Ala Tyr Gln Arg Trp Ile Arg Asn Val Ala 
165                 170                 175     
Ala Gly Ile Gly Ser Asp Ala Ala Val Val Val Leu Glu Pro Asp Ala 
180                 185                 190         
Leu Gly His Phe Gln Glu Cys Leu Thr Glu Glu Gln Ser Ala Glu Arg 
195                 200                 205             
Met Phe Leu Leu Ser Asp Ala Val Lys Val Leu Arg Gln Asn Pro Lys 
210                 215                 220                 
Thr Ala Val Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Arg Trp Val Pro Val Glu 
225                 230                 235                 240 
Glu Met Ala Glu Arg Leu Lys Leu Ala Gly Ile Glu His Ala His Gly 
245                 250                 255     
Phe Ser Leu Asn Thr Ser Asn Tyr Val Gly Thr Glu Glu Asn Ala Ala 
260                 265                 270         
Tyr Gly His Lys Leu Val Glu Ala Leu Gly Gly Asn Val Arg Phe Val 
275                 280                 285             
Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gly Ala Gly Pro Tyr Glu Glu Ala Lys Asn 
290                 295                 300                 
Ala Glu Glu Ser Trp Cys Asn Pro Pro Gly Arg Lys Ile Gly Lys Pro 
305                 310                 315                 320 
Pro Thr Thr Glu Thr Gly Asp Pro Leu Ile Asp Gly Phe Leu Trp Leu 
325                 330                 335     
Lys Arg Pro Gly Glu Ser Asp Gly Gln Cys Asn Gly Gly Pro Lys Ala 
340                 345                 350         
Gly Val Phe Trp Leu Glu Gln Ala Leu Gln Gln Ala Gln 
355                 360                 365 
<210> 7
<211> 2649
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 7
atgcaaggaa agaaaattga tttcattaac tcaaggttgt tagttcctga ttatccaatc     60
gttcccttca ttgagggaga tggtaccggc cctgatatct ggcgtgcttc agtcagggtg    120
ctggatgttg ctgttgacag ggcatattcc ggcaagcgaa aacttctctg gaaagaggtg    180
ctggctggcg aaaaggcatt tacaaatacc gggtcctggc ttccggagga aactcttaga    240
gcatttcgtg aatatcatgt tggaattaaa gggccactca ctacgccagt tggtggggga    300
attcgttctc tcaatgtagc cctcaggcaa gagcttgact tgtatgtttg cctgaggcca    360
gtcaaatggt ttaagggtgt accaagtcct ctaaaagatc cttccaaagt ggatatgcat    420
attttccgcg aaaacactga agatatttat gcaggtattg aatttatgca tggtgaaccg    480
gaggccctga aagttaagaa atttcttacc gaagaaatgg gaatcaagaa gtttcggttt    540
cccgatacat cctccattgg tatcaagcct atctcactcg aaggaacaga gcgtcttgta    600
agagcttcca ttcaatatgc acttgacagg aagttgcctt ccgtaacatt ggttcataaa    660
ggcaatatca tgaaattcac cgagggggca ttcaaaaaat ggggttatga acttgccgaa    720
agagaatttg gcgacagggt ttttacatgg tcaatgtatg accgtatcgc cgatgaacat    780
ggaacggaag aagctggcaa agtgcaatcc gaagcgattg caaaaggtaa actcctgata    840
aaggatgtga ttgctgatgc ttttctgcag caaatactac tcaggcctgc cgagtacagc    900
gttatcgcaa ccatgaacct gaatggcgat tatatcagcg atgcactggc agctatggtg    960
gggggtatag gaattgctcc cggagccaat attaaccatc aaactggcca tgcagtcttt   1020
gaagcaacac acggcacggc tcccaaatat gccaaccttg atcaggtaaa ccctggctca   1080
gtaatactaa gtggcgcgct gatgctcgaa tacatgggct ggaacgaagc cgctcagctc   1140
attaccaatg gattggaggc taccattcaa cagaaactgg taacctatga tttccatcgc   1200
ttaatggaag gtgctacaaa gttgaagact tcagaatttg gcgatgctgt gatccggccg   1260
gcacgttccg cctgggcgga cacggctgcc gatgccctct ccgggcggcg gcgtcgtgcg   1320
cggaacggcg ggcttgttgc cccgcccgcg gcctgtcgcc gggggcgggt acgggactca   1380
gcgcttgcgc gcctccttca gggtggactg cagggcgaag aaggccggct tgcggacgaa   1440
cttctccgtc atgaccgtgg cgctgccctc accctcgaag aagaccggca cccacgagta   1500
cttgtcggtg aagccccaga tggtgaagga gttgcagtcg ttcacggcca ggcaggccga   1560
cagtgcctgc tggtagtagt cggcctgctg ccgcagctgc tccttggtgg gcttgccgct   1620
cgccgggagg tccatgcgga cgtcgatctc ggtgatggcg gtctccagac cgaggtcggc   1680
gaaccgctgc aggttctgct gcaggtcgcc cgggaagccg tagcgggtgc tcaggtggcc   1740
ctgggcgccg aatccgtgga gcggcacgcc ctgctccagc atctcctggg cgagctcgta   1800
gtaggcgtcg ctcttggcgt tgatgccctc gacgttgtag tcgttgagga acagcttggc   1860
ctcggggtcg gcctcgtggg cccagcggaa ggcgtccgcg acgatctccg ggccgagctc   1920
acgtatccag atgttctcgt cggtgcgcag ctcggcctgg tcgttgaaga tctcgttggc   1980
cacgtcccac tgctggatct tgccggcgta gcggccgacg accgtgtcga tgtggtcctt   2040
gaggatggcg cgcagttcct ccttggtgaa gtcgccctcc tccagccatt cggggttctg   2100
gctgtgccac aggagggtgt gcccgcgcac ggcctggcgg ttccgctggg cgaactcgac   2160
gatggcgtcg gcctcctcga agcggtactg gtcgcgctcg gggtggatga actcccactt   2220
catctggttc tcggcggaga ccgagttgaa ctgctggccc aggatcttcc ggtacttctt   2280
gtcgaaggtg aaggggtccg ggtagtcctg ttcgaggtgg tggccgccgc cggccgccgc   2340
ggagcctatg aagaaccctt cgggggcggc ccagcgcagg cggtcgaact tggcgttgga   2400
gtggggcgcg gcctcgtggt cggcggacgg cttggccgtg gccgtcgacg tcaccagcgg   2460
gacggccagc gcggcggcga gagcaaaggt gacgatgcgg acggatctca tcagaggtcc   2520
ctcattcgat cgcggctccg aaagttttcg gaggattacc ggaatgtttc agggacctta   2580
aggcgcccgg agccgggtcg tcaacggttt ggcccggccc ggtcgaagct tctcccgacc   2640
aggcgttga                                                           2649
<210> 8
<211> 882
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (20)...(417)
<223> Isocitrate/isopropylmalate dehydrogenase
<220> 
<221> SITE
<222> (310)...(329)
<223> Isocitrate and isopropylmalate dehydrogenases signature. Prosite id = 
PS00470
<220> 
<221> SITE
<222> (868)...(871)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 8
Met Gln Gly Lys Lys Ile Asp Phe Ile Asn Ser Arg Leu Leu Val Pro 
1               5                   10                  15      
Asp Tyr Pro Ile Val Pro Phe Ile Glu Gly Asp Gly Thr Gly Pro Asp 
20                  25                  30          
Ile Trp Arg Ala Ser Val Arg Val Leu Asp Val Ala Val Asp Arg Ala 
35                  40                  45              
Tyr Ser Gly Lys Arg Lys Leu Leu Trp Lys Glu Val Leu Ala Gly Glu 
50                  55                  60                  
Lys Ala Phe Thr Asn Thr Gly Ser Trp Leu Pro Glu Glu Thr Leu Arg 
65                  70                  75                  80  
Ala Phe Arg Glu Tyr His Val Gly Ile Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro 
85                  90                  95      
Val Gly Gly Gly Ile Arg Ser Leu Asn Val Ala Leu Arg Gln Glu Leu 
100                 105                 110         
Asp Leu Tyr Val Cys Leu Arg Pro Val Lys Trp Phe Lys Gly Val Pro 
115                 120                 125             
Ser Pro Leu Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp Met His Ile Phe Arg Glu 
130                 135                 140                 
Asn Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Gly Ile Glu Phe Met His Gly Glu Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Ala Leu Lys Val Lys Lys Phe Leu Thr Glu Glu Met Gly Ile Lys 
165                 170                 175     
Lys Phe Arg Phe Pro Asp Thr Ser Ser Ile Gly Ile Lys Pro Ile Ser 
180                 185                 190         
Leu Glu Gly Thr Glu Arg Leu Val Arg Ala Ser Ile Gln Tyr Ala Leu 
195                 200                 205             
Asp Arg Lys Leu Pro Ser Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Met 
210                 215                 220                 
Lys Phe Thr Glu Gly Ala Phe Lys Lys Trp Gly Tyr Glu Leu Ala Glu 
225                 230                 235                 240 
Arg Glu Phe Gly Asp Arg Val Phe Thr Trp Ser Met Tyr Asp Arg Ile 
245                 250                 255     
Ala Asp Glu His Gly Thr Glu Glu Ala Gly Lys Val Gln Ser Glu Ala 
260                 265                 270         
Ile Ala Lys Gly Lys Leu Leu Ile Lys Asp Val Ile Ala Asp Ala Phe 
275                 280                 285             
Leu Gln Gln Ile Leu Leu Arg Pro Ala Glu Tyr Ser Val Ile Ala Thr 
290                 295                 300                 
Met Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Leu Ala Ala Met Val 
305                 310                 315                 320 
Gly Gly Ile Gly Ile Ala Pro Gly Ala Asn Ile Asn His Gln Thr Gly 
325                 330                 335     
His Ala Val Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Ala Asn 
340                 345                 350         
Leu Asp Gln Val Asn Pro Gly Ser Val Ile Leu Ser Gly Ala Leu Met 
355                 360                 365             
Leu Glu Tyr Met Gly Trp Asn Glu Ala Ala Gln Leu Ile Thr Asn Gly 
370                 375                 380                 
Leu Glu Ala Thr Ile Gln Gln Lys Leu Val Thr Tyr Asp Phe His Arg 
385                 390                 395                 400 
Leu Met Glu Gly Ala Thr Lys Leu Lys Thr Ser Glu Phe Gly Asp Ala 
405                 410                 415     
Val Ile Arg Pro Ala Arg Ser Ala Trp Ala Asp Thr Ala Ala Asp Ala 
420                 425                 430         
Leu Ser Gly Arg Arg Arg Arg Ala Arg Asn Gly Gly Leu Val Ala Pro 
435                 440                 445             
Pro Ala Ala Cys Arg Arg Gly Arg Val Arg Asp Ser Ala Leu Ala Arg 
450                 455                 460                 
Leu Leu Gln Gly Gly Leu Gln Gly Glu Glu Gly Arg Leu Ala Asp Glu 
465                 470                 475                 480 
Leu Leu Arg His Asp Arg Gly Ala Ala Leu Thr Leu Glu Glu Asp Arg 
485                 490                 495     
His Pro Arg Val Leu Val Gly Glu Ala Pro Asp Gly Glu Gly Val Ala 
500                 505                 510         
Val Val His Gly Gln Ala Gly Arg Gln Cys Leu Leu Val Val Val Gly 
515                 520                 525             
Leu Leu Pro Gln Leu Leu Leu Gly Gly Leu Ala Ala Arg Arg Glu Val 
530                 535                 540                 
His Ala Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Gly Leu Gln Thr Glu Val Gly 
545                 550                 555                 560 
Glu Pro Leu Gln Val Leu Leu Gln Val Ala Arg Glu Ala Val Ala Gly 
565                 570                 575     
Ala Gln Val Ala Leu Gly Ala Glu Ser Val Glu Arg His Ala Leu Leu 
580                 585                 590         
Gln His Leu Leu Gly Glu Leu Val Val Gly Val Ala Leu Gly Val Asp 
595                 600                 605             
Ala Leu Asp Val Val Val Val Glu Glu Gln Leu Gly Leu Gly Val Gly 
610                 615                 620                 
Leu Val Gly Pro Ala Glu Gly Val Arg Asp Asp Leu Arg Ala Glu Leu 
625                 630                 635                 640 
Thr Tyr Pro Asp Val Leu Val Gly Ala Gln Leu Gly Leu Val Val Glu 
645                 650                 655     
Asp Leu Val Gly His Val Pro Leu Leu Asp Leu Ala Gly Val Ala Ala 
660                 665                 670         
Asp Asp Arg Val Asp Val Val Leu Glu Asp Gly Ala Gln Phe Leu Leu 
675                 680                 685             
Gly Glu Val Ala Leu Leu Gln Pro Phe Gly Val Leu Ala Val Pro Gln 
690                 695                 700                 
Glu Gly Val Pro Ala His Gly Leu Ala Val Pro Leu Gly Glu Leu Asp 
705                 710                 715                 720 
Asp Gly Val Gly Leu Leu Glu Ala Val Leu Val Ala Leu Gly Val Asp 
725                 730                 735     
Glu Leu Pro Leu His Leu Val Leu Gly Gly Asp Arg Val Glu Leu Leu 
740                 745                 750         
Ala Gln Asp Leu Pro Val Leu Leu Val Glu Gly Glu Gly Val Arg Val 
755                 760                 765             
Val Leu Phe Glu Val Val Ala Ala Ala Gly Arg Arg Gly Ala Tyr Glu 
770                 775                 780                 
Glu Pro Phe Gly Gly Gly Pro Ala Gln Ala Val Glu Leu Gly Val Gly 
785                 790                 795                 800 
Val Gly Arg Gly Leu Val Val Gly Gly Arg Leu Gly Arg Gly Arg Arg 
805                 810                 815     
Arg His Gln Arg Asp Gly Gln Arg Gly Gly Glu Ser Lys Gly Asp Asp 
820                 825                 830         
Ala Asp Gly Ser His Gln Arg Ser Leu Ile Arg Ser Arg Leu Arg Lys 
835                 840                 845             
Phe Ser Glu Asp Tyr Arg Asn Val Ser Gly Thr Leu Arg Arg Pro Glu 
850                 855                 860                 
Pro Gly Arg Gln Arg Phe Gly Pro Ala Arg Ser Lys Leu Leu Pro Thr 
865                 870                 875                 880 
Arg Arg 
<210> 9
<211> 1134
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 9
atgagatccg tccgcatcgt cacctttgct ctcgccgccg cgctggccgt cccgctggtg     60
acgtcgacgg ccacggccaa gccgtccgcc gaccacgagg ccgcgcccca ctccaacgcc    120
aagttcgacc gcctgcgctg ggccgccccc gaagggttct tcataggctc cgcggcggcc    180
ggcggcggcc accacctcga acaggactac ccggacccct tcaccttcga caagaagtac    240
cggaagatcc tgggccagca gttcaactcg gtctccgccg agaaccagat gaagtgggag    300
ttcatccacc ccgagcgcga ccagtaccgc ttcgaggagg ccgacgccat cgtcgagttc    360
gcccagcgga accgccaggc cgtgcgcggg cacaccctcc tgtggcacag ccagaacccc    420
gaatggctgg aggagggcga cttcaccaag gaggaactgc gcgccatcct caaggaccac    480
atcgacacgg tcgtcggccg ctacgccggc aagatccagc agtgggacgt ggccaacgag    540
atcttcaacg accaggccga gctgcgcacc gacgagaaca tctggatacg tgagctcggc    600
ccggagatcg tcgcggacgc cttccgctgg gcccacgagg ccgaccccga ggccaagctg    660
ttcctcaacg actacaacgt cgagggcatc aacgccaaga gcgacgccta ctacgagctc    720
gcccaggaga tgctggagca gggcgtgccg ctccacggat tcggcgccca gggccacctg    780
agcacccgct acggcttccc gggcgacctg cagcagaacc tgcagcggtt cgccgacctc    840
ggtctggaga ccgccatcac cgagatcgac gtccgcatgg acctcccggc gagcggcaag    900
cccaccaagg agcagctgcg gcagcaggcc gactactacc agcaggcact gtcggcctgc    960
ctggccgtga acgactgcaa ctccttcacc atctggggct tcaccgacaa gtactcgtgg   1020
gtgccggtct tcttcgaggg tgagggcagc gccacggtca tgacggagaa gttcgtccgc   1080
aagccggcct tcttcgccct gcagtccacc ctgaaggagg cgcgcaagcg ctga         1134
<210> 10
<211> 377
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(26)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (44)...(371)
<223> Glycosyl hydrolase family 10
<400> 10
Met Arg Ser Val Arg Ile Val Thr Phe Ala Leu Ala Ala Ala Leu Ala 
1               5                   10                  15      
Val Pro Leu Val Thr Ser Thr Ala Thr Ala Lys Pro Ser Ala Asp His 
20                  25                  30          
Glu Ala Ala Pro His Ser Asn Ala Lys Phe Asp Arg Leu Arg Trp Ala 
35                  40                  45              
Ala Pro Glu Gly Phe Phe Ile Gly Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly His 
50                  55                  60                  
His Leu Glu Gln Asp Tyr Pro Asp Pro Phe Thr Phe Asp Lys Lys Tyr 
65                  70                  75                  80  
Arg Lys Ile Leu Gly Gln Gln Phe Asn Ser Val Ser Ala Glu Asn Gln 
85                  90                  95      
Met Lys Trp Glu Phe Ile His Pro Glu Arg Asp Gln Tyr Arg Phe Glu 
100                 105                 110         
Glu Ala Asp Ala Ile Val Glu Phe Ala Gln Arg Asn Arg Gln Ala Val 
115                 120                 125             
Arg Gly His Thr Leu Leu Trp His Ser Gln Asn Pro Glu Trp Leu Glu 
130                 135                 140                 
Glu Gly Asp Phe Thr Lys Glu Glu Leu Arg Ala Ile Leu Lys Asp His 
145                 150                 155                 160 
Ile Asp Thr Val Val Gly Arg Tyr Ala Gly Lys Ile Gln Gln Trp Asp 
165                 170                 175     
Val Ala Asn Glu Ile Phe Asn Asp Gln Ala Glu Leu Arg Thr Asp Glu 
180                 185                 190         
Asn Ile Trp Ile Arg Glu Leu Gly Pro Glu Ile Val Ala Asp Ala Phe 
195                 200                 205             
Arg Trp Ala His Glu Ala Asp Pro Glu Ala Lys Leu Phe Leu Asn Asp 
210                 215                 220                 
Tyr Asn Val Glu Gly Ile Asn Ala Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Glu Leu 
225                 230                 235                 240 
Ala Gln Glu Met Leu Glu Gln Gly Val Pro Leu His Gly Phe Gly Ala 
245                 250                 255     
Gln Gly His Leu Ser Thr Arg Tyr Gly Phe Pro Gly Asp Leu Gln Gln 
260                 265                 270         
Asn Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr Ala Ile Thr Glu 
275                 280                 285             
Ile Asp Val Arg Met Asp Leu Pro Ala Ser Gly Lys Pro Thr Lys Glu 
290                 295                 300                 
Gln Leu Arg Gln Gln Ala Asp Tyr Tyr Gln Gln Ala Leu Ser Ala Cys 
305                 310                 315                 320 
Leu Ala Val Asn Asp Cys Asn Ser Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr Asp 
325                 330                 335     
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr 
340                 345                 350         
Val Met Thr Glu Lys Phe Val Arg Lys Pro Ala Phe Phe Ala Leu Gln 
355                 360                 365             
Ser Thr Leu Lys Glu Ala Arg Lys Arg 
370                 375         
<210> 11
<211> 1080
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 11
atgccctgga gctcatcaac gggacctgca cctatgacga gtaacccgcc cctcaaacgc     60
cccctgcgta tcggtctggt cggcacgggc atcggctcac tgcacgccgc cggaatttcc    120
cggatgcctc agcttgccac gctgggggcc atctgtgggc ttgataccca cgccgtgaat    180
gccctagcca cacgctacgg ggtagaaaaa accacatctc gctatgagga tttactgaac    240
gatcccggcc ttgatgtcat cgatctgtgc gttcctcacg atgaacacat gcccatggcc    300
attgccgccg cccgggccgg aaaacatctc ctcatcgaaa aacctttggc ccgcaccctg    360
gaagaggccg atgcaatcct cgaggccgtg aaaagcgccg gtgtaacgct gatgatggga    420
cacaaccagc gttactacgc ccatcacgcc agggctaaag cattggtcga cgccggggtc    480
atcggaaaac cctacatgat cgtagcttcg gttcatgtgc acgggcagat tgatggtttt    540
cgccgctttc ttaagcacgc cgggggtggc acgttgatcg attcgggagt gcaccgcttc    600
gacctcattc gctggatcat gggtgaagtc gagaccgtct tcgctcaaac gggtcgcttc    660
ctccagatgc aaatggaagg agaagactgc gcggtggtca ccctccgctt ccgcagcgga    720
gccatcggga gcttctcatg cagctggagc gccaaaggcc ctgttccaga agaaacattg    780
caaattttcg gcccctatgg ttcgatttat accgaagacc acacccgcac cttacgcctt    840
tacaccgaaa gacccacccc cgaactggaa gacgtaaggc agtttgtctt cccggtcgat    900
caggctgagt ccatccgccg catgattgaa gcgcacttca ccagcctgca acaggggtta    960
ccccctccga tcaccggtat ggacggacgc gcttcccttg agctcagcat ggcctcctat   1020
cgctcggctc aaaccggcca gcctgttcat cttccccttc agagaggaaa ccagaaatga   1080
<210> 12
<211> 359
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (22)...(141)
<223> Oxidoreductase family, NAD-binding Rossmann fold
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (153)...(260)
<223> Oxidoreductase family, C-terminal alpha/beta domain
<400> 12
Met Pro Trp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Ala Pro Met Thr Ser Asn Pro 
1               5                   10                  15      
Pro Leu Lys Arg Pro Leu Arg Ile Gly Leu Val Gly Thr Gly Ile Gly 
20                  25                  30          
Ser Leu His Ala Ala Gly Ile Ser Arg Met Pro Gln Leu Ala Thr Leu 
35                  40                  45              
Gly Ala Ile Cys Gly Leu Asp Thr His Ala Val Asn Ala Leu Ala Thr 
50                  55                  60                  
Arg Tyr Gly Val Glu Lys Thr Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Asn 
65                  70                  75                  80  
Asp Pro Gly Leu Asp Val Ile Asp Leu Cys Val Pro His Asp Glu His 
85                  90                  95      
Met Pro Met Ala Ile Ala Ala Ala Arg Ala Gly Lys His Leu Leu Ile 
100                 105                 110         
Glu Lys Pro Leu Ala Arg Thr Leu Glu Glu Ala Asp Ala Ile Leu Glu 
115                 120                 125             
Ala Val Lys Ser Ala Gly Val Thr Leu Met Met Gly His Asn Gln Arg 
130                 135                 140                 
Tyr Tyr Ala His His Ala Arg Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Val 
145                 150                 155                 160 
Ile Gly Lys Pro Tyr Met Ile Val Ala Ser Val His Val His Gly Gln 
165                 170                 175     
Ile Asp Gly Phe Arg Arg Phe Leu Lys His Ala Gly Gly Gly Thr Leu 
180                 185                 190         
Ile Asp Ser Gly Val His Arg Phe Asp Leu Ile Arg Trp Ile Met Gly 
195                 200                 205             
Glu Val Glu Thr Val Phe Ala Gln Thr Gly Arg Phe Leu Gln Met Gln 
210                 215                 220                 
Met Glu Gly Glu Asp Cys Ala Val Val Thr Leu Arg Phe Arg Ser Gly 
225                 230                 235                 240 
Ala Ile Gly Ser Phe Ser Cys Ser Trp Ser Ala Lys Gly Pro Val Pro 
245                 250                 255     
Glu Glu Thr Leu Gln Ile Phe Gly Pro Tyr Gly Ser Ile Tyr Thr Glu 
260                 265                 270         
Asp His Thr Arg Thr Leu Arg Leu Tyr Thr Glu Arg Pro Thr Pro Glu 
275                 280                 285             
Leu Glu Asp Val Arg Gln Phe Val Phe Pro Val Asp Gln Ala Glu Ser 
290                 295                 300                 
Ile Arg Arg Met Ile Glu Ala His Phe Thr Ser Leu Gln Gln Gly Leu 
305                 310                 315                 320 
Pro Pro Pro Ile Thr Gly Met Asp Gly Arg Ala Ser Leu Glu Leu Ser 
325                 330                 335     
Met Ala Ser Tyr Arg Ser Ala Gln Thr Gly Gln Pro Val His Leu Pro 
340                 345                 350         
Leu Gln Arg Gly Asn Gln Lys 
355                 
<210> 13
<211> 1038
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 13
atgagcccgg tgcgcgttgc tgtcatcggc gccgggcaaa ttgcccagcg cgggcattta     60
cccgggcttc tggaagctgg cgccgaaatt accgttctgt gcgataattc ccttcctcag    120
cttgaagaaa ttggggccaa atttcacgtt caccgggtct accgcgactg gcacgccatg    180
ctggatgccg gcggattcga agccgtcacc atttgtaccc cgcccttcct ccatgccgag    240
atggccatcg aatgtgcccg cagagggttg catgtactgg tagaaaaacc catggctgta    300
aatctccaac aatgcgatca aatgatcgcc gcgtctgaac aggccggaac catcttaatg    360
gtctcgcata accagcgctt tatggaggca catcgtctgg ccaaagaaat ccttgatgcc    420
ggcctcctcg gcaggctcta cctggcgcac ggggtctttg gccacggcgg cccggaggtt    480
tggagcccaa cccagcaatg gtacttccga cctgaccgcg ccggcgctgg cgtgatcgct    540
gacctggggt atcataaact tgacctgatc cgctggctca ccgggcaaga aattaccgcg    600
gtgggagcac tgggcgccac ctttgaaaag caaacctcgc ttgaagactc tgctgtgatg    660
ctggttcacc tttcggaggg tactctcgcc accatccagg taagctgggt gttcaggcct    720
gactgggaaa acagcctggt ccttcgagga gaacgggggg tgctcgccat ccccactgat    780
gcctcgcaac ccctgcgggt ctcttacata tcttcttcgg gtcaggtcat tgaaagtacg    840
catcgttgcg actccggcga tacctccggc tggttcggag cgatccgggc atttctcacc    900
gcgatcgaaa aaagcgctcc cgctcccatt gacggaaaag aagggcgtgc tgtcatggcg    960
gcagttctgg cggccacacg ctccattcaa aaacatacga tcatttctat aaccgaggta   1020
gaaaccatcc atgactga                                                 1038
<210> 14
<211> 345
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (4)...(123)
<223> Oxidoreductase family, NAD-binding Rossmann fold
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (135)...(248)
<223> Oxidoreductase family, C-terminal alpha/beta domain
<400> 14
Met Ser Pro Val Arg Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Gln Ile Ala Gln 
1               5                   10                  15      
Arg Gly His Leu Pro Gly Leu Leu Glu Ala Gly Ala Glu Ile Thr Val 
20                  25                  30          
Leu Cys Asp Asn Ser Leu Pro Gln Leu Glu Glu Ile Gly Ala Lys Phe 
35                  40                  45              
His Val His Arg Val Tyr Arg Asp Trp His Ala Met Leu Asp Ala Gly 
50                  55                  60                  
Gly Phe Glu Ala Val Thr Ile Cys Thr Pro Pro Phe Leu His Ala Glu 
65                  70                  75                  80  
Met Ala Ile Glu Cys Ala Arg Arg Gly Leu His Val Leu Val Glu Lys 
85                  90                  95      
Pro Met Ala Val Asn Leu Gln Gln Cys Asp Gln Met Ile Ala Ala Ser 
100                 105                 110         
Glu Gln Ala Gly Thr Ile Leu Met Val Ser His Asn Gln Arg Phe Met 
115                 120                 125             
Glu Ala His Arg Leu Ala Lys Glu Ile Leu Asp Ala Gly Leu Leu Gly 
130                 135                 140                 
Arg Leu Tyr Leu Ala His Gly Val Phe Gly His Gly Gly Pro Glu Val 
145                 150                 155                 160 
Trp Ser Pro Thr Gln Gln Trp Tyr Phe Arg Pro Asp Arg Ala Gly Ala 
165                 170                 175     
Gly Val Ile Ala Asp Leu Gly Tyr His Lys Leu Asp Leu Ile Arg Trp 
180                 185                 190         
Leu Thr Gly Gln Glu Ile Thr Ala Val Gly Ala Leu Gly Ala Thr Phe 
195                 200                 205             
Glu Lys Gln Thr Ser Leu Glu Asp Ser Ala Val Met Leu Val His Leu 
210                 215                 220                 
Ser Glu Gly Thr Leu Ala Thr Ile Gln Val Ser Trp Val Phe Arg Pro 
225                 230                 235                 240 
Asp Trp Glu Asn Ser Leu Val Leu Arg Gly Glu Arg Gly Val Leu Ala 
245                 250                 255     
Ile Pro Thr Asp Ala Ser Gln Pro Leu Arg Val Ser Tyr Ile Ser Ser 
260                 265                 270         
Ser Gly Gln Val Ile Glu Ser Thr His Arg Cys Asp Ser Gly Asp Thr 
275                 280                 285             
Ser Gly Trp Phe Gly Ala Ile Arg Ala Phe Leu Thr Ala Ile Glu Lys 
290                 295                 300                 
Ser Ala Pro Ala Pro Ile Asp Gly Lys Glu Gly Arg Ala Val Met Ala 
305                 310                 315                 320 
Ala Val Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ile Gln Lys His Thr Ile Ile Ser 
325                 330                 335     
Ile Thr Glu Val Glu Thr Ile His Asp 
340                 345 
<210> 15
<211> 1347
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 15
atgactgacc atcgttttcc aaaaggattc atctggggaa ccgctacggc gtctttccag     60
attgaaggcg ccacccgcga agatggccgg ggcgaatcca tctgggaccg cttctgcgcc    120
acgccgggga aaattgtcac gggcgaaacc ggcgatcctg cctgcgactc ctatcatcgt    180
taccctgaag acatcgccct gatgaaggct atgtcgctca atggttaccg cttttcaatc    240
gcctggcctc gcgtcattcc tgacggagac ggtaaagtct gtcaggccgg gctcgactac    300
tacgatcgtg tggtagatgc tctcctggcg gagaatatcc aaccttttat caccctgtac    360
cactgggacc tgccccaggc attacaggat cggggtggct ggggcaaccg tgccacggtt    420
gaggcgttca ctcgctacgt agatattgtg gtttctcgcc tgggtgaccg cgtaaagtac    480
tggatgacac acaacgaacc ctggtgtgta tccattttga gccatgagct tggtgaacat    540
gcccccgggt tgaaggaccg aaaactggcc ctccaggtgg cgcaccatgt cctcgtttct    600
cacggcctgg ccgtgcccat catccgccag cgttgtaaag aggcgcaggt tggcatcgtg    660
ttgaattttt cacctgctta cccggccacc gatagcctgg ccgaccagat ggccacccgt    720
cagcaccacg cccggtttaa cctctggttc ctcgatccca tcgccgggcg cggctacccg    780
caggatgcct gggaagggta cggagccgat gttcccgcca tgaggcctga tgacatgcag    840
atcatcgccg cccccatcga cttcctgggc gtcaatttct acagtcgggc ggtctgccac    900
gatccggccg ggggcgaagg ttcccgggtg ctcaatgtgc gcagtaaaac cgaggccacc    960
gatcgagact gggagattta ccctcaggcg ctctacgatt tactcatctg gatccacaat   1020
ggataccagt tcagagatat ttacattacc gagaatggcg cctcatacaa cgatgtggtc   1080
tccccggatg ggaaagtgca cgatcctaaa cgtctggact atctgaaacg ccatctggcc   1140
atggctctgc gggccatcga agcgggcgtt ccactgcgtg gttatttctg ctggagcttg   1200
atggacaact tcgaatgggc catgggcacc agcagccgat tcgggttggc ctacaccgac   1260
ttcactaccc agaagcgtat tctcaaagac agtgggctct ggtttggcga agtggcacgg   1320
gcaaacgcct taatcgacct tccctga                                       1347
<210> 16
<211> 448
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (2)...(444)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (10)...(24)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (352)...(360)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 16
Met Thr Asp His Arg Phe Pro Lys Gly Phe Ile Trp Gly Thr Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Ser Phe Gln Ile Glu Gly Ala Thr Arg Glu Asp Gly Arg Gly Glu 
20                  25                  30          
Ser Ile Trp Asp Arg Phe Cys Ala Thr Pro Gly Lys Ile Val Thr Gly 
35                  40                  45              
Glu Thr Gly Asp Pro Ala Cys Asp Ser Tyr His Arg Tyr Pro Glu Asp 
50                  55                  60                  
Ile Ala Leu Met Lys Ala Met Ser Leu Asn Gly Tyr Arg Phe Ser Ile 
65                  70                  75                  80  
Ala Trp Pro Arg Val Ile Pro Asp Gly Asp Gly Lys Val Cys Gln Ala 
85                  90                  95      
Gly Leu Asp Tyr Tyr Asp Arg Val Val Asp Ala Leu Leu Ala Glu Asn 
100                 105                 110         
Ile Gln Pro Phe Ile Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu 
115                 120                 125             
Gln Asp Arg Gly Gly Trp Gly Asn Arg Ala Thr Val Glu Ala Phe Thr 
130                 135                 140                 
Arg Tyr Val Asp Ile Val Val Ser Arg Leu Gly Asp Arg Val Lys Tyr 
145                 150                 155                 160 
Trp Met Thr His Asn Glu Pro Trp Cys Val Ser Ile Leu Ser His Glu 
165                 170                 175     
Leu Gly Glu His Ala Pro Gly Leu Lys Asp Arg Lys Leu Ala Leu Gln 
180                 185                 190         
Val Ala His His Val Leu Val Ser His Gly Leu Ala Val Pro Ile Ile 
195                 200                 205             
Arg Gln Arg Cys Lys Glu Ala Gln Val Gly Ile Val Leu Asn Phe Ser 
210                 215                 220                 
Pro Ala Tyr Pro Ala Thr Asp Ser Leu Ala Asp Gln Met Ala Thr Arg 
225                 230                 235                 240 
Gln His His Ala Arg Phe Asn Leu Trp Phe Leu Asp Pro Ile Ala Gly 
245                 250                 255     
Arg Gly Tyr Pro Gln Asp Ala Trp Glu Gly Tyr Gly Ala Asp Val Pro 
260                 265                 270         
Ala Met Arg Pro Asp Asp Met Gln Ile Ile Ala Ala Pro Ile Asp Phe 
275                 280                 285             
Leu Gly Val Asn Phe Tyr Ser Arg Ala Val Cys His Asp Pro Ala Gly 
290                 295                 300                 
Gly Glu Gly Ser Arg Val Leu Asn Val Arg Ser Lys Thr Glu Ala Thr 
305                 310                 315                 320 
Asp Arg Asp Trp Glu Ile Tyr Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Ile 
325                 330                 335     
Trp Ile His Asn Gly Tyr Gln Phe Arg Asp Ile Tyr Ile Thr Glu Asn 
340                 345                 350         
Gly Ala Ser Tyr Asn Asp Val Val Ser Pro Asp Gly Lys Val His Asp 
355                 360                 365             
Pro Lys Arg Leu Asp Tyr Leu Lys Arg His Leu Ala Met Ala Leu Arg 
370                 375                 380                 
Ala Ile Glu Ala Gly Val Pro Leu Arg Gly Tyr Phe Cys Trp Ser Leu 
385                 390                 395                 400 
Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala Met Gly Thr Ser Ser Arg Phe Gly Leu 
405                 410                 415     
Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Thr Gln Lys Arg Ile Leu Lys Asp Ser Gly 
420                 425                 430         
Leu Trp Phe Gly Glu Val Ala Arg Ala Asn Ala Leu Ile Asp Leu Pro 
435                 440                 445             
<210> 17
<211> 1215
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 17
atgcggtacg tgctgatttc ctgccttgcg ctggcttccc tgtgcgcgca gcctcttcct     60
gtttccacgc ctgaaaaaga gggcttctcg gcggagcgcc tcgggcggat gcaccggtat    120
ttcgagaacc tgacgaaaac cggagagcgg cctggcgcga tcacgctgat cgtgcgcaac    180
gggcgcatcg tggactggcg cacgttcggg ctgcgcgacg tcgagaacaa tctgccgatg    240
gagaaggaca cgatcgtcca catctactcg atgacgaagc cggtgacgtc cgtggccgtg    300
atgatgctgg tggaggaggg caggctggcg ctggacgacc gggtggacaa gttcattccc    360
gagttcaagg ggatgaaggt gtacaagggc ggcacggtgg agcggccgga gctggaggac    420
gcggcgcggc cgatcacggt gaagcatctg ctgacgcaca cgagcgggct gagctacggc    480
tggggcaacg acaacgtctc cgcgatgtac cgcaaggccg acccgctcgg cgcgccgagc    540
ctgaaagagt ttatcgacag gctggtgaaa ctgccgctgg cattccaccc gggcgagcgt    600
tacgagtatt cgatgtcgat cgacgtgctg ggctacctgg tggaggctgt ctccggcgag    660
ccgttcgatc agttcgtgga gaagcggatc acggggccgc tgaagatgaa cgacacgcat    720
ttcagactgc cggaggcgaa gcgggcgcgg ctggcgaaga tctactcgcg gcgcgagggg    780
aagctgacgg cgcagcgcgg cctgcagacg ggaggcgttc cgtacggcgg catggggctg    840
tactcgacga tcggcgacta tgcgcggttc gcgcagatgc tgttgaacgg cggccatctc    900
gacggagtgc gcctgctggg gcggaagacg gtggatctga tgatgatgaa ccatctgggc    960
ggactgtcga agccgacgat cggcggcgat gattcagcgg gattcggact gggcggagcg   1020
gtgcggatcg atccggcgaa atcgggccgt ccgggcacgg aaggactctt cggctgggac   1080
ggggcggctt cgacgtattt ccgggtggac cggaaagaga agctggcgat gctgctgttc   1140
ctgcaatgga tgccgtttga tcaggggacg ctgaacctgt acgagacgct ggtctaccaa   1200
gctctggtgg actga                                                    1215
<210> 18
<211> 404
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (37)...(400)
<223> Beta-lactamase
<220> 
<221> SITE
<222> (43)...(46)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (167)...(170)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (240)...(243)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 18
Met Arg Tyr Val Leu Ile Ser Cys Leu Ala Leu Ala Ser Leu Cys Ala 
1               5                   10                  15      
Gln Pro Leu Pro Val Ser Thr Pro Glu Lys Glu Gly Phe Ser Ala Glu 
20                  25                  30          
Arg Leu Gly Arg Met His Arg Tyr Phe Glu Asn Leu Thr Lys Thr Gly 
35                  40                  45              
Glu Arg Pro Gly Ala Ile Thr Leu Ile Val Arg Asn Gly Arg Ile Val 
50                  55                  60                  
Asp Trp Arg Thr Phe Gly Leu Arg Asp Val Glu Asn Asn Leu Pro Met 
65                  70                  75                  80  
Glu Lys Asp Thr Ile Val His Ile Tyr Ser Met Thr Lys Pro Val Thr 
85                  90                  95      
Ser Val Ala Val Met Met Leu Val Glu Glu Gly Arg Leu Ala Leu Asp 
100                 105                 110         
Asp Arg Val Asp Lys Phe Ile Pro Glu Phe Lys Gly Met Lys Val Tyr 
115                 120                 125             
Lys Gly Gly Thr Val Glu Arg Pro Glu Leu Glu Asp Ala Ala Arg Pro 
130                 135                 140                 
Ile Thr Val Lys His Leu Leu Thr His Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Gly 
145                 150                 155                 160 
Trp Gly Asn Asp Asn Val Ser Ala Met Tyr Arg Lys Ala Asp Pro Leu 
165                 170                 175     
Gly Ala Pro Ser Leu Lys Glu Phe Ile Asp Arg Leu Val Lys Leu Pro 
180                 185                 190         
Leu Ala Phe His Pro Gly Glu Arg Tyr Glu Tyr Ser Met Ser Ile Asp 
195                 200                 205             
Val Leu Gly Tyr Leu Val Glu Ala Val Ser Gly Glu Pro Phe Asp Gln 
210                 215                 220                 
Phe Val Glu Lys Arg Ile Thr Gly Pro Leu Lys Met Asn Asp Thr His 
225                 230                 235                 240 
Phe Arg Leu Pro Glu Ala Lys Arg Ala Arg Leu Ala Lys Ile Tyr Ser 
245                 250                 255     
Arg Arg Glu Gly Lys Leu Thr Ala Gln Arg Gly Leu Gln Thr Gly Gly 
260                 265                 270         
Val Pro Tyr Gly Gly Met Gly Leu Tyr Ser Thr Ile Gly Asp Tyr Ala 
275                 280                 285             
Arg Phe Ala Gln Met Leu Leu Asn Gly Gly His Leu Asp Gly Val Arg 
290                 295                 300                 
Leu Leu Gly Arg Lys Thr Val Asp Leu Met Met Met Asn His Leu Gly 
305                 310                 315                 320 
Gly Leu Ser Lys Pro Thr Ile Gly Gly Asp Asp Ser Ala Gly Phe Gly 
325                 330                 335     
Leu Gly Gly Ala Val Arg Ile Asp Pro Ala Lys Ser Gly Arg Pro Gly 
340                 345                 350         
Thr Glu Gly Leu Phe Gly Trp Asp Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Phe Arg 
355                 360                 365             
Val Asp Arg Lys Glu Lys Leu Ala Met Leu Leu Phe Leu Gln Trp Met 
370                 375                 380                 
Pro Phe Asp Gln Gly Thr Leu Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Val Tyr Gln 
385                 390                 395                 400 
Ala Leu Val Asp 
<210> 19
<211> 1794
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 19
atgcccgttt tgttcgccct gtttcttgtt gcctcgtcct gcgcggcgca gtcgctggcc     60
gggccggttt ccctgcttgg cggagatgcg ggcgcggcgt tccgctatac cgggccatcg    120
gcgggcgcgg cgagcggctc ggccgaatgg gtggcggtgg agaacatgcc gttcacgcac    180
gcctggcggc tgcgcacgaa tccgctgccg gagagcggcg gcaacgaatg ggacctgcgc    240
atccgcgccc gcggagcggc ggctgtttcg gcaggggaca agatcctggc cgagttctgg    300
atgcgctgcg tggagcccga aaacggcgac tgcattctgc gcctgaacgt ggagcgcgac    360
gggtcgccgt ggaccaaatc catcagcaac ccctacccgg tgggccggga gtggcggcgg    420
ttccgcgtgc tgttcgagat gcgggagagc tacgccgccg gcggctacat gatcgatttc    480
tggatgggcc agcaggtgca gacggcggaa gtgggcggga tttccctgct gaattacggt    540
ccgcaggcca cggccgagca gcttggcctg gaccggtttt atgagggcgc ggcggcggac    600
gccgcgtggc ggcaggcggc cgagcagcgg atcgaggaga tccggaaagc gggcatgatc    660
atcgtggcgg tgacgccgga cggcgagccg atcgagggcg ctgaaatccg ggcgaagctg    720
aagcggcacg cgttcgggtg gggcacggct gtggcggcat cacggcttct ggggacggga    780
acggacagcg agcgctaccg caacttcatc cgcgagaact tcaacatggc ggtgctcgag    840
aacgacctga aatggggccc gttcgaagag aaccgcaacc gcgcgatgaa cgcgctgcgc    900
tggctgcatg agaacgggat cacgtggatc cgcgggcaca atctcgtctg gccgggctgg    960
cggtggatgc cgaacgacgt gcgcaacctg gcgaacaatc ccgaggcgct gcggcagcgg   1020
attctggacc gcatccggga cacggccacg gccacgcgcg ggctggtggt gcactgggac   1080
gtcgtcaacg agccggtggc cgagcgcgac gtgctgaaca ttctgggcga cgaggtgatg   1140
gcggactggt tccgcgccgc gaaggagtgc gatcccgagg cgaggatgtt catcaatgag   1200
tacgacattc tggcggcgaa cggggccaat ctgcggaagc agaacgcgta ttaccgcatg   1260
atcgagatgc tgttgaagct cgaggcgccg gtggagggca tcggcttcca gggccacttc   1320
gacacggcca cgccgccgga gcggatgctg gagatcatga accggtacgc ccggctcggg   1380
ctgccgatcg ccatcaccga gtacgatttc gccacggcgg acgaggagct gcaggcgcag   1440
ttcacgcgcg acctgatgat tctcgccttc agccatccgg cggtttcgga cttcctgatg   1500
tggggcttct gggaagggag ccactggaag ccgctgggcg ccatgatccg gcgcgactgg   1560
agcgagaagc cgatgtaccg cgtctggcgc gagctgatct tcgagcgctg gcagacggat   1620
gaaacaggcg tgacgccgga gcacggtgcc atctacgtgc ggggcttcaa gggcgactac   1680
gagatcacgg tgaaggcggg cgggcaggaa gtccgggtgc cgtacacgct gaaagaagac   1740
ggccaggtgc tgtgggtgac ggtgggcggg gcttctgaag agcgcgtgca gtaa         1794
<210> 20
<211> 597
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(20)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (235)...(533)
<223> Glycosyl hydrolase family 10
<220> 
<221> SITE
<222> (467)...(477)
<223> Glycosyl hydrolases family 10 active site. Prosite id = PS00591
<400> 20
Met Pro Val Leu Phe Ala Leu Phe Leu Val Ala Ser Ser Cys Ala Ala 
1               5                   10                  15      
Gln Ser Leu Ala Gly Pro Val Ser Leu Leu Gly Gly Asp Ala Gly Ala 
20                  25                  30          
Ala Phe Arg Tyr Thr Gly Pro Ser Ala Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ala 
35                  40                  45              
Glu Trp Val Ala Val Glu Asn Met Pro Phe Thr His Ala Trp Arg Leu 
50                  55                  60                  
Arg Thr Asn Pro Leu Pro Glu Ser Gly Gly Asn Glu Trp Asp Leu Arg 
65                  70                  75                  80  
Ile Arg Ala Arg Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala Gly Asp Lys Ile Leu 
85                  90                  95      
Ala Glu Phe Trp Met Arg Cys Val Glu Pro Glu Asn Gly Asp Cys Ile 
100                 105                 110         
Leu Arg Leu Asn Val Glu Arg Asp Gly Ser Pro Trp Thr Lys Ser Ile 
115                 120                 125             
Ser Asn Pro Tyr Pro Val Gly Arg Glu Trp Arg Arg Phe Arg Val Leu 
130                 135                 140                 
Phe Glu Met Arg Glu Ser Tyr Ala Ala Gly Gly Tyr Met Ile Asp Phe 
145                 150                 155                 160 
Trp Met Gly Gln Gln Val Gln Thr Ala Glu Val Gly Gly Ile Ser Leu 
165                 170                 175     
Leu Asn Tyr Gly Pro Gln Ala Thr Ala Glu Gln Leu Gly Leu Asp Arg 
180                 185                 190         
Phe Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Asp Ala Ala Trp Arg Gln Ala Ala Glu 
195                 200                 205             
Gln Arg Ile Glu Glu Ile Arg Lys Ala Gly Met Ile Ile Val Ala Val 
210                 215                 220                 
Thr Pro Asp Gly Glu Pro Ile Glu Gly Ala Glu Ile Arg Ala Lys Leu 
225                 230                 235                 240 
Lys Arg His Ala Phe Gly Trp Gly Thr Ala Val Ala Ala Ser Arg Leu 
245                 250                 255     
Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ser Glu Arg Tyr Arg Asn Phe Ile Arg Glu 
260                 265                 270         
Asn Phe Asn Met Ala Val Leu Glu Asn Asp Leu Lys Trp Gly Pro Phe 
275                 280                 285             
Glu Glu Asn Arg Asn Arg Ala Met Asn Ala Leu Arg Trp Leu His Glu 
290                 295                 300                 
Asn Gly Ile Thr Trp Ile Arg Gly His Asn Leu Val Trp Pro Gly Trp 
305                 310                 315                 320 
Arg Trp Met Pro Asn Asp Val Arg Asn Leu Ala Asn Asn Pro Glu Ala 
325                 330                 335     
Leu Arg Gln Arg Ile Leu Asp Arg Ile Arg Asp Thr Ala Thr Ala Thr 
340                 345                 350         
Arg Gly Leu Val Val His Trp Asp Val Val Asn Glu Pro Val Ala Glu 
355                 360                 365             
Arg Asp Val Leu Asn Ile Leu Gly Asp Glu Val Met Ala Asp Trp Phe 
370                 375                 380                 
Arg Ala Ala Lys Glu Cys Asp Pro Glu Ala Arg Met Phe Ile Asn Glu 
385                 390                 395                 400 
Tyr Asp Ile Leu Ala Ala Asn Gly Ala Asn Leu Arg Lys Gln Asn Ala 
405                 410                 415     
Tyr Tyr Arg Met Ile Glu Met Leu Leu Lys Leu Glu Ala Pro Val Glu 
420                 425                 430         
Gly Ile Gly Phe Gln Gly His Phe Asp Thr Ala Thr Pro Pro Glu Arg 
435                 440                 445             
Met Leu Glu Ile Met Asn Arg Tyr Ala Arg Leu Gly Leu Pro Ile Ala 
450                 455                 460                 
Ile Thr Glu Tyr Asp Phe Ala Thr Ala Asp Glu Glu Leu Gln Ala Gln 
465                 470                 475                 480 
Phe Thr Arg Asp Leu Met Ile Leu Ala Phe Ser His Pro Ala Val Ser 
485                 490                 495     
Asp Phe Leu Met Trp Gly Phe Trp Glu Gly Ser His Trp Lys Pro Leu 
500                 505                 510         
Gly Ala Met Ile Arg Arg Asp Trp Ser Glu Lys Pro Met Tyr Arg Val 
515                 520                 525             
Trp Arg Glu Leu Ile Phe Glu Arg Trp Gln Thr Asp Glu Thr Gly Val 
530                 535                 540                 
Thr Pro Glu His Gly Ala Ile Tyr Val Arg Gly Phe Lys Gly Asp Tyr 
545                 550                 555                 560 
Glu Ile Thr Val Lys Ala Gly Gly Gln Glu Val Arg Val Pro Tyr Thr 
565                 570                 575     
Leu Lys Glu Asp Gly Gln Val Leu Trp Val Thr Val Gly Gly Ala Ser 
580                 585                 590         
Glu Glu Arg Val Gln 
595         
<210> 21
<211> 1032
<212> DNA
<213> Clostridium thermocellum
<400> 21
atggtgagtt ttaaagcagg tataaattta ggcggatgga tatcacaata tcaagttttc     60
agcaaagagc atttcgatac attcattacg gagaaggaca ttgaaactat tgcagaagca    120
gggtttgacc atgtcagact gccttttgat tatccaatta tcgagtctga tgacaatgtg    180
ggagaatata aagaagatgg gctttcttat attgaccggt gccttgagtg gtgtaaaaaa    240
tacaatttgg ggcttgtgtt ggatatgcat cacgctcccg ggtaccgctt tcaagatttt    300
aagacaagca ccttgtttga agatccgaac cagcaaaaga gatttgttga catatggaga    360
tttttagcca agcgttacat aaatgaacgg gaacatattg cctttgaact gttaaatgaa    420
gttgttgagc ctgacagtac ccgctggaac aagttgatgc ttgagtgtgt aaaagcaatc    480
agggaaattg attccaccag gtggctttac attgggggca ataactataa cagtcctgat    540
gagcttaaaa accttgcaga tattgatgat gattacatag tttacaattt ccatttttac    600
aatccttttt tctttacgca tcagaaagcc cactggtcgg aaagtgccat ggcgtacaac    660
aggactgtaa aatatccggg acaatatgag ggaattgaag agtttgtgaa aaataatcct    720
aagtacagtt ttatgatgga attgaataac ctgaagctga ataaagagct tttgcgcaaa    780
gatttaaaac cagcaattga gttcagggaa aagaaaaaat gcaaactata ttgcggggag    840
tttggcgtaa ttgccattgc tgacctggag tccaggataa aatggcatga agattatata    900
agtcttctag aggagtatga tatcggcggc gcggtgtgga actacaaaaa aatggatttt    960
gaaatttata atgaggatag aaaacctgtc tcgcaagaat tggtaaatat actggcgaga   1020
agaaaaactt ga                                                       1032
<210> 22
<211> 343
<212> PRT
<213> Clostridium thermocellum
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (1)...(323)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (15)...(32)
<223> Cytosolic fatty-acid binding proteins signature. Prosite id = PS00214
<220> 
<221> SITE
<222> (135)...(144)
<223> Glycosyl hydrolases family 5 signature. Prosite id = PS00659
<220> 
<221> SITE
<222> (223)...(226)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 22
Met Val Ser Phe Lys Ala Gly Ile Asn Leu Gly Gly Trp Ile Ser Gln 
1               5                   10                  15      
Tyr Gln Val Phe Ser Lys Glu His Phe Asp Thr Phe Ile Thr Glu Lys 
20                  25                  30          
Asp Ile Glu Thr Ile Ala Glu Ala Gly Phe Asp His Val Arg Leu Pro 
35                  40                  45              
Phe Asp Tyr Pro Ile Ile Glu Ser Asp Asp Asn Val Gly Glu Tyr Lys 
50                  55                  60                  
Glu Asp Gly Leu Ser Tyr Ile Asp Arg Cys Leu Glu Trp Cys Lys Lys 
65                  70                  75                  80  
Tyr Asn Leu Gly Leu Val Leu Asp Met His His Ala Pro Gly Tyr Arg 
85                  90                  95      
Phe Gln Asp Phe Lys Thr Ser Thr Leu Phe Glu Asp Pro Asn Gln Gln 
100                 105                 110         
Lys Arg Phe Val Asp Ile Trp Arg Phe Leu Ala Lys Arg Tyr Ile Asn 
115                 120                 125             
Glu Arg Glu His Ile Ala Phe Glu Leu Leu Asn Glu Val Val Glu Pro 
130                 135                 140                 
Asp Ser Thr Arg Trp Asn Lys Leu Met Leu Glu Cys Val Lys Ala Ile 
145                 150                 155                 160 
Arg Glu Ile Asp Ser Thr Arg Trp Leu Tyr Ile Gly Gly Asn Asn Tyr 
165                 170                 175     
Asn Ser Pro Asp Glu Leu Lys Asn Leu Ala Asp Ile Asp Asp Asp Tyr 
180                 185                 190         
Ile Val Tyr Asn Phe His Phe Tyr Asn Pro Phe Phe Phe Thr His Gln 
195                 200                 205             
Lys Ala His Trp Ser Glu Ser Ala Met Ala Tyr Asn Arg Thr Val Lys 
210                 215                 220                 
Tyr Pro Gly Gln Tyr Glu Gly Ile Glu Glu Phe Val Lys Asn Asn Pro 
225                 230                 235                 240 
Lys Tyr Ser Phe Met Met Glu Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Lys Glu 
245                 250                 255     
Leu Leu Arg Lys Asp Leu Lys Pro Ala Ile Glu Phe Arg Glu Lys Lys 
260                 265                 270         
Lys Cys Lys Leu Tyr Cys Gly Glu Phe Gly Val Ile Ala Ile Ala Asp 
275                 280                 285             
Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp His Glu Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Glu 
290                 295                 300                 
Glu Tyr Asp Ile Gly Gly Ala Val Trp Asn Tyr Lys Lys Met Asp Phe 
305                 310                 315                 320 
Glu Ile Tyr Asn Glu Asp Arg Lys Pro Val Ser Gln Glu Leu Val Asn 
325                 330                 335     
Ile Leu Ala Arg Arg Lys Thr 
340             
<210> 23
<211> 3966
<212> DNA
<213> Clostridium thermocellum
<400> 23
atgtataaaa gattattgtc gtcagtactg ataattatgc tgttattatc agcctggtcg     60
ccaatatccg tacaagcttc tgatggaatc aatgacatta gaggtcattg ggctgaagaa    120
gacttgaaca aatggatgga aaaaggtatt ttggtgggct accaggatgg gacgataagg    180
cccgataata atatcacaag agccgaattt gtcacattaa ttaacaaggt tttcgggctt    240
tatgaattaa gccgggagca attcgcagat gttgaagact caaaatggta ttcccgtgaa    300
atattaaaag ccagggctgc gggatatatt gcaggttatg gaagcaatgt tttcaaacct    360
gacaattata ttacaagaca agaagccgtt gttataatcg cgaaagtttt tgaacttcaa    420
agcggcagca attatacaag caagtttaaa gatggaagtc tggtaaagga atacgcaaaa    480
gattccgtta gcgcgttggt tgaaaaaggc tacatagcag gttatgaaga tggcactttc    540
aggccggaca actacattac ccgtgcagaa acaataaaaa ttctgaataa aattattcct    600
tccttgtata acgagaaagg agattataaa aatgaagaag tagccggaaa cgctctgatt    660
aacaccgaag gagttatttt aaaagatacc gtaataaacg gggatttgta tcttgctcag    720
ggaattcaga acggcgatgt tacccttgac ggtgtgaatg taaaaggaac ggttttcgta    780
aatggtggag gaagcgacag catacatttt ataaatacga aaataaacag ggttgttgtc    840
aataaaacag gagttagaat tgtaacttcc ggcaatacct cggttgaaag tgttgtcgtt    900
aaatccggtg caaaacttga agaaaaagaa ttgacgggcg acggctttaa aaacgttaca    960
gtcgattctc aactttcagc cggcaatgaa ataatatttg tcggggattt tgaacaggtc   1020
gatgttctgg cggatgatgc cttgctggaa accaaagagg caaaaatgaa actgagaata   1080
ttcggccaaa ggattaaagt aaatggaaag gcaatagaaa aatcatcaaa gaactatatt   1140
gtaaacgggg aacttatatc aactgaggaa gaacccggtc cttccgacgc acccggtgcg   1200
gaagacgatc aaaattcagg tagtccgggc tcatcgacta atcctgcacc aaccaagaat   1260
ccgaatgaag agtggcgtct ggtttggagc gatgagttta acggttctga aataaatatg   1320
gctaattgga gctatgacga cccgaccaac ggaagatgga acggggaagt acaatcctac   1380
acacaaaaca atgcctatat caaagacggc gcgttggtta ttgaagcaag aaaagaagac   1440
attacggaac caagcggtga gacttatcat tatacatcgt caaagctgat taccaaaggc   1500
aaaaagtcat ggaagtacgg aaaatttgaa ataagggcaa aaatgccaca gggacaaggt   1560
atatggcctg caatctggat gatgccggaa gacgaaccct tctacggaac atggccaaag   1620
tgcggcgaaa tagatattat ggagcttttg ggccacgagc ctgataaaat ttatggaacg   1680
atccattttg gagagcctca taaagaatcc cagggaacgt ataccttgcc ggaaggccag   1740
acttttgctg atgatttcca cgtttattcg attgaatggg aaccgggaga aatacgctgg   1800
tatatagacg gcaagctgta tcatgtcgct aatgactggt actcgaggga cccgtacctt   1860
gccgatgact acacttatcc cgcacctttt gaccagaatt tcttcttgat tctcaatata   1920
tccgttggtg gcggctggcc gggatatcct gacgaaacga cagttttccc gcagcaaatg   1980
gttgtggact atgtgagagt atatcaaaaa gataaatatc ctcacaggga aaaaccggca   2040
aaggaagaag tgaagccaag agagcctctt gaggacggca attatatcta taacggcggt   2100
tttgatgtgg atgattctgc agcagttggt gtggacggtg ttccctatac gtcttactgg   2160
acattcttaa cagcatccgg tggagctgcg acagtcaatg tagaggaagg tgttatgcac   2220
gtacagatag aaaacggagg gacaaccgac tacggcgtac aattgcttca agctccgatt   2280
catcttgaaa aaggcgcaaa atataaagca tcttttgaca tgaaagctga aaatccaagg   2340
caggtaaaac tgaaaatagg cggagacggc gacaggggat ggaaagatta tgcggctatt   2400
ccaccgttta cggtctcaac agagatgacc aactatgagt ttgagtttac tatgaaagat   2460
gataccgatg ttaaggcacg gtttgagttt aatatgggtt tggacgataa tgatgtctgg   2520
attgacaatg ttaaactgat taaaacagaa gatgcgccgg ttatagatcc ttccgaaata   2580
gcaagacctc cgcttctttc cggcaactat atatacaacg gtacctttga ccaaggtccg   2640
aacagaatgg gattctggaa ttttgttgtg gatagcactg caaaggctac atactatatt   2700
ggaagcgatg ttaatgagcg caggtttgaa acaagaatag aaaaaggcgg aacatcgagg   2760
ggagccataa gattggttca gccgggaatt aacattgaaa acggcaaaac atacaaggtt   2820
agcttcgaag ccagtgcggc aaatacaaga actattgagg tggaaattgc aagcaatctt   2880
cacaacagca gcatttttgc gacaactttt gaaataagca aagagagcaa gatatacgaa   2940
tttgagttta caatggacaa agattcggac aagaacggag aacttaggtt caatctgggc   3000
ggaagcaacg tgaacgtcta tattgataat gtcgttatga aaagagtaag taccgatgaa   3060
gttgaaggaa acctgatttt aaacggcgta tttaacggcc tggcaggctg gggatatgga   3120
gcgtatgaac ctggatcggc agattttgaa agtcatgagg aacaatttag ggcaattatt   3180
agctctgtcg gtaatgaagg ttggaatgta cagttgtatc aggataatgt tccgctggaa   3240
caagggcaaa cctacgaagt ttcttttgat gcaaaatcaa cgattgacag aaagataatt   3300
gttcagctgc aaaggaacgg tacttcggat aataattggg actcctattt ctatcaagaa   3360
gttgaactta ctaatgaact taaaacattc aaatatgaat ttacaatgag taaacctaca   3420
gattcggcgt caagatttaa ttttgctttg ggtaatactg aaaacaaaac ttatgctcct   3480
catgaaataa taattgacaa tgttgtagta agaaaagttg cgactccttc tgcgctgata   3540
ttgaacggaa cctttgacga tggaatggat cattggctgc tatactgggg agacggtgaa   3600
ggcaattgcg atgtaactga cggagagctt gaaattaaca ttaccaaggt aggtaccgcg   3660
gattacatgc cgcagattaa acaggaaaac atagcgttgc aagagggtgt gacgtatact   3720
ttgtctctta aagcgagagc gcttgaggca agaagtatta aagtggacat attggattct   3780
tcttataact ggtatggcgg aactattttc gatttaacaa cggaagatgc cgtatacacg   3840
tttacattta cccaaagcaa gtcgataaat aacggtgtct taactataaa tttaggtacc   3900
atagaaggta agacatccgc cgcaactact gtctatcttg atgatatttt gctggaacaa   3960
cagtaa                                                              3966
<210> 24
<211> 1321
<212> PRT
<213> Clostridium thermocellum
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(26)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (30)...(71)
<223> S-layer homology domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (88)...(130)
<223> S-layer homology domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (149)...(192)
<223> S-layer homology domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (445)...(666)
<223> Glycosyl hydrolases family 16
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (693)...(849)
<223> Carbohydrate binding domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (868)...(1016)
<223> Carbohydrate binding domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (1023)...(1173)
<223> Carbohydrate binding domain
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (1177)...(1321)
<223> Carbohydrate binding domain
<220> 
<221> SITE
<222> (146)...(149)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (285)...(288)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (296)...(299)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (322)...(325)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (440)...(443)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (448)...(451)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (648)...(651)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (886)...(889)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (976)...(979)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (1123)...(1126)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (1172)...(1175)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (1200)...(1203)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (1231)...(1234)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 24
Met Tyr Lys Arg Leu Leu Ser Ser Val Leu Ile Ile Met Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15      
Ser Ala Trp Ser Pro Ile Ser Val Gln Ala Ser Asp Gly Ile Asn Asp 
20                  25                  30          
Ile Arg Gly His Trp Ala Glu Glu Asp Leu Asn Lys Trp Met Glu Lys 
35                  40                  45              
Gly Ile Leu Val Gly Tyr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Pro Asp Asn Asn 
50                  55                  60                  
Ile Thr Arg Ala Glu Phe Val Thr Leu Ile Asn Lys Val Phe Gly Leu 
65                  70                  75                  80  
Tyr Glu Leu Ser Arg Glu Gln Phe Ala Asp Val Glu Asp Ser Lys Trp 
85                  90                  95      
Tyr Ser Arg Glu Ile Leu Lys Ala Arg Ala Ala Gly Tyr Ile Ala Gly 
100                 105                 110         
Tyr Gly Ser Asn Val Phe Lys Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Arg Gln Glu 
115                 120                 125             
Ala Val Val Ile Ile Ala Lys Val Phe Glu Leu Gln Ser Gly Ser Asn 
130                 135                 140                 
Tyr Thr Ser Lys Phe Lys Asp Gly Ser Leu Val Lys Glu Tyr Ala Lys 
145                 150                 155                 160 
Asp Ser Val Ser Ala Leu Val Glu Lys Gly Tyr Ile Ala Gly Tyr Glu 
165                 170                 175     
Asp Gly Thr Phe Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Arg Ala Glu Thr Ile 
180                 185                 190         
Lys Ile Leu Asn Lys Ile Ile Pro Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Gly Asp 
195                 200                 205             
Tyr Lys Asn Glu Glu Val Ala Gly Asn Ala Leu Ile Asn Thr Glu Gly 
210                 215                 220                 
Val Ile Leu Lys Asp Thr Val Ile Asn Gly Asp Leu Tyr Leu Ala Gln 
225                 230                 235                 240 
Gly Ile Gln Asn Gly Asp Val Thr Leu Asp Gly Val Asn Val Lys Gly 
245                 250                 255     
Thr Val Phe Val Asn Gly Gly Gly Ser Asp Ser Ile His Phe Ile Asn 
260                 265                 270         
Thr Lys Ile Asn Arg Val Val Val Asn Lys Thr Gly Val Arg Ile Val 
275                 280                 285             
Thr Ser Gly Asn Thr Ser Val Glu Ser Val Val Val Lys Ser Gly Ala 
290                 295                 300                 
Lys Leu Glu Glu Lys Glu Leu Thr Gly Asp Gly Phe Lys Asn Val Thr 
305                 310                 315                 320 
Val Asp Ser Gln Leu Ser Ala Gly Asn Glu Ile Ile Phe Val Gly Asp 
325                 330                 335     
Phe Glu Gln Val Asp Val Leu Ala Asp Asp Ala Leu Leu Glu Thr Lys 
340                 345                 350         
Glu Ala Lys Met Lys Leu Arg Ile Phe Gly Gln Arg Ile Lys Val Asn 
355                 360                 365             
Gly Lys Ala Ile Glu Lys Ser Ser Lys Asn Tyr Ile Val Asn Gly Glu 
370                 375                 380                 
Leu Ile Ser Thr Glu Glu Glu Pro Gly Pro Ser Asp Ala Pro Gly Ala 
385                 390                 395                 400 
Glu Asp Asp Gln Asn Ser Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Asn Pro Ala 
405                 410                 415     
Pro Thr Lys Asn Pro Asn Glu Glu Trp Arg Leu Val Trp Ser Asp Glu 
420                 425                 430         
Phe Asn Gly Ser Glu Ile Asn Met Ala Asn Trp Ser Tyr Asp Asp Pro 
435                 440                 445             
Thr Asn Gly Arg Trp Asn Gly Glu Val Gln Ser Tyr Thr Gln Asn Asn 
450                 455                 460                 
Ala Tyr Ile Lys Asp Gly Ala Leu Val Ile Glu Ala Arg Lys Glu Asp 
465                 470                 475                 480 
Ile Thr Glu Pro Ser Gly Glu Thr Tyr His Tyr Thr Ser Ser Lys Leu 
485                 490                 495     
Ile Thr Lys Gly Lys Lys Ser Trp Lys Tyr Gly Lys Phe Glu Ile Arg 
500                 505                 510         
Ala Lys Met Pro Gln Gly Gln Gly Ile Trp Pro Ala Ile Trp Met Met 
515                 520                 525             
Pro Glu Asp Glu Pro Phe Tyr Gly Thr Trp Pro Lys Cys Gly Glu Ile 
530                 535                 540                 
Asp Ile Met Glu Leu Leu Gly His Glu Pro Asp Lys Ile Tyr Gly Thr 
545                 550                 555                 560 
Ile His Phe Gly Glu Pro His Lys Glu Ser Gln Gly Thr Tyr Thr Leu 
565                 570                 575     
Pro Glu Gly Gln Thr Phe Ala Asp Asp Phe His Val Tyr Ser Ile Glu 
580                 585                 590         
Trp Glu Pro Gly Glu Ile Arg Trp Tyr Ile Asp Gly Lys Leu Tyr His 
595                 600                 605             
Val Ala Asn Asp Trp Tyr Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Ala Asp Asp Tyr 
610                 615                 620                 
Thr Tyr Pro Ala Pro Phe Asp Gln Asn Phe Phe Leu Ile Leu Asn Ile 
625                 630                 635                 640 
Ser Val Gly Gly Gly Trp Pro Gly Tyr Pro Asp Glu Thr Thr Val Phe 
645                 650                 655     
Pro Gln Gln Met Val Val Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln Lys Asp Lys 
660                 665                 670         
Tyr Pro His Arg Glu Lys Pro Ala Lys Glu Glu Val Lys Pro Arg Glu 
675                 680                 685             
Pro Leu Glu Asp Gly Asn Tyr Ile Tyr Asn Gly Gly Phe Asp Val Asp 
690                 695                 700                 
Asp Ser Ala Ala Val Gly Val Asp Gly Val Pro Tyr Thr Ser Tyr Trp 
705                 710                 715                 720 
Thr Phe Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Thr Val Asn Val Glu Glu 
725                 730                 735     
Gly Val Met His Val Gln Ile Glu Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Gly 
740                 745                 750         
Val Gln Leu Leu Gln Ala Pro Ile His Leu Glu Lys Gly Ala Lys Tyr 
755                 760                 765             
Lys Ala Ser Phe Asp Met Lys Ala Glu Asn Pro Arg Gln Val Lys Leu 
770                 775                 780                 
Lys Ile Gly Gly Asp Gly Asp Arg Gly Trp Lys Asp Tyr Ala Ala Ile 
785                 790                 795                 800 
Pro Pro Phe Thr Val Ser Thr Glu Met Thr Asn Tyr Glu Phe Glu Phe 
805                 810                 815     
Thr Met Lys Asp Asp Thr Asp Val Lys Ala Arg Phe Glu Phe Asn Met 
820                 825                 830         
Gly Leu Asp Asp Asn Asp Val Trp Ile Asp Asn Val Lys Leu Ile Lys 
835                 840                 845             
Thr Glu Asp Ala Pro Val Ile Asp Pro Ser Glu Ile Ala Arg Pro Pro 
850                 855                 860                 
Leu Leu Ser Gly Asn Tyr Ile Tyr Asn Gly Thr Phe Asp Gln Gly Pro 
865                 870                 875                 880 
Asn Arg Met Gly Phe Trp Asn Phe Val Val Asp Ser Thr Ala Lys Ala 
885                 890                 895     
Thr Tyr Tyr Ile Gly Ser Asp Val Asn Glu Arg Arg Phe Glu Thr Arg 
900                 905                 910         
Ile Glu Lys Gly Gly Thr Ser Arg Gly Ala Ile Arg Leu Val Gln Pro 
915                 920                 925             
Gly Ile Asn Ile Glu Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ala 
930                 935                 940                 
Ser Ala Ala Asn Thr Arg Thr Ile Glu Val Glu Ile Ala Ser Asn Leu 
945                 950                 955                 960 
His Asn Ser Ser Ile Phe Ala Thr Thr Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ser 
965                 970                 975     
Lys Ile Tyr Glu Phe Glu Phe Thr Met Asp Lys Asp Ser Asp Lys Asn 
980                 985                 990         
Gly Glu Leu Arg Phe Asn Leu Gly  Gly Ser Asn Val Asn  Val Tyr Ile 
995                 1000                 1005             
Asp Asn  Val Val Met Lys Arg  Val Ser Thr Asp Glu  Val Glu Gly 
1010                 1015                 1020             
Asn Leu  Ile Leu Asn Gly Val  Phe Asn Gly Leu Ala  Gly Trp Gly 
1025                 1030                 1035             
Tyr Gly  Ala Tyr Glu Pro Gly  Ser Ala Asp Phe Glu  Ser His Glu 
1040                 1045                 1050             
Glu Gln  Phe Arg Ala Ile Ile  Ser Ser Val Gly Asn  Glu Gly Trp 
1055                 1060                 1065             
Asn Val  Gln Leu Tyr Gln Asp  Asn Val Pro Leu Glu  Gln Gly Gln 
1070                 1075                 1080             
Thr Tyr  Glu Val Ser Phe Asp  Ala Lys Ser Thr Ile  Asp Arg Lys 
1085                 1090                 1095             
Ile Ile  Val Gln Leu Gln Arg  Asn Gly Thr Ser Asp  Asn Asn Trp 
1100                 1105                 1110             
Asp Ser  Tyr Phe Tyr Gln Glu  Val Glu Leu Thr Asn  Glu Leu Lys 
1115                 1120                 1125             
Thr Phe  Lys Tyr Glu Phe Thr  Met Ser Lys Pro Thr  Asp Ser Ala 
1130                 1135                 1140             
Ser Arg  Phe Asn Phe Ala Leu  Gly Asn Thr Glu Asn  Lys Thr Tyr 
1145                 1150                 1155             
Ala Pro  His Glu Ile Ile Ile  Asp Asn Val Val Val  Arg Lys Val 
1160                 1165                 1170             
Ala Thr  Pro Ser Ala Leu Ile  Leu Asn Gly Thr Phe  Asp Asp Gly 
1175                 1180                 1185             
Met Asp  His Trp Leu Leu Tyr  Trp Gly Asp Gly Glu  Gly Asn Cys 
1190                 1195                 1200             
Asp Val  Thr Asp Gly Glu Leu  Glu Ile Asn Ile Thr  Lys Val Gly 
1205                 1210                 1215             
Thr Ala  Asp Tyr Met Pro Gln  Ile Lys Gln Glu Asn  Ile Ala Leu 
1220                 1225                 1230             
Gln Glu  Gly Val Thr Tyr Thr  Leu Ser Leu Lys Ala  Arg Ala Leu 
1235                 1240                 1245             
Glu Ala  Arg Ser Ile Lys Val  Asp Ile Leu Asp Ser  Ser Tyr Asn 
1250                 1255                 1260             
Trp Tyr  Gly Gly Thr Ile Phe  Asp Leu Thr Thr Glu  Asp Ala Val 
1265                 1270                 1275             
Tyr Thr  Phe Thr Phe Thr Gln  Ser Lys Ser Ile Asn  Asn Gly Val 
1280                 1285                 1290             
Leu Thr  Ile Asn Leu Gly Thr  Ile Glu Gly Lys Thr  Ser Ala Ala 
1295                 1300                 1305             
Thr Thr  Val Tyr Leu Asp Asp  Ile Leu Leu Glu Gln  Gln 
1310                 1315                 1320     
<210> 25
<211> 1347
<212> DNA
<213> Clostridium thermocellum
<400> 25
atgtcaaaga taactttccc aaaagatttc atatggggtt ctgcaacagc agcatatcag     60
attgaaggtg catacaacga agacggcaaa ggtgaatcta tatgggaccg tttttcccac    120
acgccaggaa atatagcaga cggacatacc ggcgatgttg catgcgacca ctatcatcgt    180
tatgaagaag atatcaaaat aatgaaagaa atcggtatta aatcatacag gttttccatc    240
tcatggccca gaatctttcc tgaaggaaca ggtaaattaa atcaaaaggg actggatttt    300
tacaaaaggc tcacaaatct gcttctggaa aacggaatta tgcctgcaat cactctttat    360
cactgggacc ttccccaaaa gcttcaggat aaaggcggat ggaaaaaccg ggacaccacc    420
gattatttta cagaatactc tgaagtaata tttaaaaatc tcggagatat cgttccaata    480
tggtttactc acaatgaacc cggtgttgtt tctttgcttg gccacttttt aggaattcat    540
gcccctggga taaaagacct ccgcacttca ttggaagtct cgcacaatct tcttttgtcc    600
cacggcaagg ccgtgaaact gtttagagaa atgaatattg acgcccaaat tggaatagct    660
ctcaatttat cttaccatta tcccgcatcc gaaaaagctg aggatattga agcagcggaa    720
ttgtcatttt ctctggcggg aaggtggtat ctggatcctg tgctaaaagg ccggtatcct    780
gaaaacgcat tgaaacttta taaaaagaag ggtattgagc tttctttccc tgaagatgac    840
ctgaaactta tcagtcagcc aatagacttc atagcattca acaattattc ttcggaattt    900
ataaaatatg atccgtccag tgagtcaggt ttttcacctg caaactccat attagaaaag    960
ttcgaaaaaa cagatatggg ctggatcata tatcctgaag gcttgtatga tctgcttatg   1020
ctccttgaca gggattatgg aaagccaaac attgttatca gcgaaaacgg agccgccttc   1080
aaagatgaaa taggtagcaa cggaaagata gaagacacaa agagaatcca atatcttaaa   1140
gattatctga cccaggctca cagggcaatt caggacggtg taaacttaaa agcatactac   1200
ttgtggtcgc ttttggacaa ctttgaatgg gcttacgggt acaacaagag attcggaatc   1260
gttcacgtaa attttgatac gttggaaaga aaaataaagg atagcggcta ctggtacaaa   1320
gaagtaatca aaaacaacgg tttttaa                                       1347
<210> 26
<211> 448
<212> PRT
<213> Clostridium thermocellum
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (2)...(448)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (10)...(24)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (225)...(228)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (299)...(302)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (356)...(364)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 26
Met Ser Lys Ile Thr Phe Pro Lys Asp Phe Ile Trp Gly Ser Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu 
20                  25                  30          
Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Pro Gly Asn Ile Ala Asp Gly 
35                  40                  45              
His Thr Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Glu Glu Asp 
50                  55                  60                  
Ile Lys Ile Met Lys Glu Ile Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Phe Ser Ile 
65                  70                  75                  80  
Ser Trp Pro Arg Ile Phe Pro Glu Gly Thr Gly Lys Leu Asn Gln Lys 
85                  90                  95      
Gly Leu Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Thr Asn Leu Leu Leu Glu Asn Gly 
100                 105                 110         
Ile Met Pro Ala Ile Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Lys Leu 
115                 120                 125             
Gln Asp Lys Gly Gly Trp Lys Asn Arg Asp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 
130                 135                 140                 
Glu Tyr Ser Glu Val Ile Phe Lys Asn Leu Gly Asp Ile Val Pro Ile 
145                 150                 155                 160 
Trp Phe Thr His Asn Glu Pro Gly Val Val Ser Leu Leu Gly His Phe 
165                 170                 175     
Leu Gly Ile His Ala Pro Gly Ile Lys Asp Leu Arg Thr Ser Leu Glu 
180                 185                 190         
Val Ser His Asn Leu Leu Leu Ser His Gly Lys Ala Val Lys Leu Phe 
195                 200                 205             
Arg Glu Met Asn Ile Asp Ala Gln Ile Gly Ile Ala Leu Asn Leu Ser 
210                 215                 220                 
Tyr His Tyr Pro Ala Ser Glu Lys Ala Glu Asp Ile Glu Ala Ala Glu 
225                 230                 235                 240 
Leu Ser Phe Ser Leu Ala Gly Arg Trp Tyr Leu Asp Pro Val Leu Lys 
245                 250                 255     
Gly Arg Tyr Pro Glu Asn Ala Leu Lys Leu Tyr Lys Lys Lys Gly Ile 
260                 265                 270         
Glu Leu Ser Phe Pro Glu Asp Asp Leu Lys Leu Ile Ser Gln Pro Ile 
275                 280                 285             
Asp Phe Ile Ala Phe Asn Asn Tyr Ser Ser Glu Phe Ile Lys Tyr Asp 
290                 295                 300                 
Pro Ser Ser Glu Ser Gly Phe Ser Pro Ala Asn Ser Ile Leu Glu Lys 
305                 310                 315                 320 
Phe Glu Lys Thr Asp Met Gly Trp Ile Ile Tyr Pro Glu Gly Leu Tyr 
325                 330                 335     
Asp Leu Leu Met Leu Leu Asp Arg Asp Tyr Gly Lys Pro Asn Ile Val 
340                 345                 350         
Ile Ser Glu Asn Gly Ala Ala Phe Lys Asp Glu Ile Gly Ser Asn Gly 
355                 360                 365             
Lys Ile Glu Asp Thr Lys Arg Ile Gln Tyr Leu Lys Asp Tyr Leu Thr 
370                 375                 380                 
Gln Ala His Arg Ala Ile Gln Asp Gly Val Asn Leu Lys Ala Tyr Tyr 
385                 390                 395                 400 
Leu Trp Ser Leu Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Tyr Gly Tyr Asn Lys 
405                 410                 415     
Arg Phe Gly Ile Val His Val Asn Phe Asp Thr Leu Glu Arg Lys Ile 
420                 425                 430         
Lys Asp Ser Gly Tyr Trp Tyr Lys Glu Val Ile Lys Asn Asn Gly Phe 
435                 440                 445             
<210> 27
<211> 1362
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 27
atggcaaaca agataacctt tcctgaaaat tttctgtggg gcgcggcaac ggcttcgtac     60
cagatcgaag gcgcctggaa caaacatggt aaaggcgaat ccacctggga tcgcttttca    120
cacacgcccg gtaagatcag gaacaacgat acgggcgatg tagcaaatga ccattatcgc    180
ctctggaaaa aagacattgg cttgatgaag aagatcgggt tgaaggctta tcgattttcc    240
atttcgtggc cgcgtattct tcctgctgga agaggcaagg tcaatcaaag agggctggat    300
ttttacaaca agatcgtaga tgagctgctg aaagcagata tcatcccatt tgttactctc    360
aatcactggg acctgcccca aaaactggaa gatgagggcg gctggccggc ccgttctact    420
gccgatgctt ttattgaata cacagatgtg atcacccgct cccttggcga ccgcgcaaag    480
aattggatca ctcacaatga acctgccgtc gttgcctgga tgggatactc cactggccaa    540
cacgcacccg gactgaagga ctatgggctt ggtgcccgcg ccgcgcatca cctgttgctc    600
tcacatggac aggctgtacc ggtcattcgc agcaatagcg cgggggcaga agtgggaatt    660
acgctcgata ttagctggcg gatcgctgcc tcaaacagcc gcgccgaccg ggagctggtc    720
cgtgaggatg atgggaggtg gttccgctgg tttgccgacc cgctttacgg gcgcggatat    780
ccctccgata aggtgtctga tttcactaag ttgggagcac tgcccaacgg acttgatttt    840
gtgcaggcag gcgacatgga cacgatcgcg acaccgactg attttatggg gctaaactac    900
tactcccgaa atgtctaccg cgcggacggt gcagataatg atccgcaaac tgttttccca    960
caaccgaaga tgcccgaaca ctggaccgag atgggctggg aaatttaccc ggatgggctg   1020
accaacattc tgggacgcgt ctatttcaac tatcagccgc gcaaactata cgtcacagaa   1080
aacggcgcca gttactccac gcctcctgat gataagggga atgtcgcgga tgaactccgc   1140
atccattatc tgaggacaca ttttgcagct gcctatcggg ccattcaaat gggcgtgcct   1200
ctggcaggat acttcgtctg gtccctcatg gacaactttg agtggtcatg gggctatatg   1260
caacgctttg gactcatctg ggtggattat gagacccaaa aacgcacttt aaaggatagc   1320
gcaaaatggt ataagcgcgt gatcaagaag aatgggctct aa                      1362
<210> 28
<211> 453
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (3)...(453)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (11)...(25)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (49)...(52)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (361)...(369)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 28
Met Ala Asn Lys Ile Thr Phe Pro Glu Asn Phe Leu Trp Gly Ala Ala 
1               5                   10                  15      
Thr Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Lys His Gly Lys Gly 
20                  25                  30          
Glu Ser Thr Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Pro Gly Lys Ile Arg Asn 
35                  40                  45              
Asn Asp Thr Gly Asp Val Ala Asn Asp His Tyr Arg Leu Trp Lys Lys 
50                  55                  60                  
Asp Ile Gly Leu Met Lys Lys Ile Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser 
65                  70                  75                  80  
Ile Ser Trp Pro Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Val Asn Gln 
85                  90                  95      
Arg Gly Leu Asp Phe Tyr Asn Lys Ile Val Asp Glu Leu Leu Lys Ala 
100                 105                 110         
Asp Ile Ile Pro Phe Val Thr Leu Asn His Trp Asp Leu Pro Gln Lys 
115                 120                 125             
Leu Glu Asp Glu Gly Gly Trp Pro Ala Arg Ser Thr Ala Asp Ala Phe 
130                 135                 140                 
Ile Glu Tyr Thr Asp Val Ile Thr Arg Ser Leu Gly Asp Arg Ala Lys 
145                 150                 155                 160 
Asn Trp Ile Thr His Asn Glu Pro Ala Val Val Ala Trp Met Gly Tyr 
165                 170                 175     
Ser Thr Gly Gln His Ala Pro Gly Leu Lys Asp Tyr Gly Leu Gly Ala 
180                 185                 190         
Arg Ala Ala His His Leu Leu Leu Ser His Gly Gln Ala Val Pro Val 
195                 200                 205             
Ile Arg Ser Asn Ser Ala Gly Ala Glu Val Gly Ile Thr Leu Asp Ile 
210                 215                 220                 
Ser Trp Arg Ile Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ala Asp Arg Glu Leu Val 
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Arg Glu Asp Asp Gly Arg Trp Phe Arg Trp Phe Ala Asp Pro Leu Tyr 
245                 250                 255     
Gly Arg Gly Tyr Pro Ser Asp Lys Val Ser Asp Phe Thr Lys Leu Gly 
260                 265                 270         
Ala Leu Pro Asn Gly Leu Asp Phe Val Gln Ala Gly Asp Met Asp Thr 
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Ile Ala Thr Pro Thr Asp Phe Met Gly Leu Asn Tyr Tyr Ser Arg Asn 
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Val Tyr Arg Ala Asp Gly Ala Asp Asn Asp Pro Gln Thr Val Phe Pro 
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Gln Pro Lys Met Pro Glu His Trp Thr Glu Met Gly Trp Glu Ile Tyr 
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Pro Asp Gly Leu Thr Asn Ile Leu Gly Arg Val Tyr Phe Asn Tyr Gln 
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Pro Arg Lys Leu Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ala Ser Tyr Ser Thr Pro 
355                 360                 365             
Pro Asp Asp Lys Gly Asn Val Ala Asp Glu Leu Arg Ile His Tyr Leu 
370                 375                 380                 
Arg Thr His Phe Ala Ala Ala Tyr Arg Ala Ile Gln Met Gly Val Pro 
385                 390                 395                 400 
Leu Ala Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ser 
405                 410                 415     
Trp Gly Tyr Met Gln Arg Phe Gly Leu Ile Trp Val Asp Tyr Glu Thr 
420                 425                 430         
Gln Lys Arg Thr Leu Lys Asp Ser Ala Lys Trp Tyr Lys Arg Val Ile 
435                 440                 445             
Lys Lys Asn Gly Leu 
450             
<210> 29
<211> 1362
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 29
atggcgaaca aaattacctt tcccgaaaat tttctttggg gcgcggcaac agcctcctac     60
cagatcgaag gtgcgtggga caaacatggc aagggtgaat ccatctggga tcgcttttcg    120
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aatcactggg acctgcccca aaagctggag gaggaaggcg gttggccggt tcgctccacc    420
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aattggatca cgcataatga gcctgccgtc gttgcctgga tgggatattc cacaggtcaa    540
cacgcacccg gtttgaagga ctatgggctt ggtgtgcgcg ccgcgcatca tctgctgctc    600
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cgtaaagatg acggactatg gttccgctgg ttcgccgatc cgctttatgg gcgcggatac    780
ccctcggata aagtcaccga ttttacaaag atcggcgcgc tgcccaatgg tctggacttt    840
atgcaagccg gtgatatgga tgcgatcgcc acgccaaccg atttcatggg gctgaactat    900
tatttccgaa atgtctaccg cgcgaatggc gaagacaatg atccgcaggt cgttttccca    960
caaccaaaga tgcccgaaca ctggacggag atgggctggg aaatctatcc ggatggactg   1020
acgaacatcc tgggacgcgt ttatttcaat taccagccac ataaactgta tatcacagag   1080
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actcattatt tacggacaca cttcgcggct gcctaccggg cgattcagat gggcgtgcct   1200
ctggcaggat actttgtctg gtccctcatg gacaactttg agtggtcctg gggatatatg   1260
cagcgctttg ggctcatctg ggtggactac gagacacaga aacgcaccct gaaggatagc   1320
gccaagtggt acaaacgtgt gatcaggaag aatgggtttt ag                      1362
<210> 30
<211> 453
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (3)...(453)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (11)...(25)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (49)...(52)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (361)...(369)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 30
Met Ala Asn Lys Ile Thr Phe Pro Glu Asn Phe Leu Trp Gly Ala Ala 
1               5                   10                  15      
Thr Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asp Lys His Gly Lys Gly 
20                  25                  30          
Glu Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Pro Gly Lys Ile Arg Asn 
35                  40                  45              
Asn Asp Thr Gly Asp Val Ala Asn Asp His Tyr Arg Leu Trp Lys Lys 
50                  55                  60                  
Asp Ile Gly Leu Met Lys Lys Ile Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser 
65                  70                  75                  80  
Ile Ser Trp Pro Arg Val Leu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Val Asn Gln 
85                  90                  95      
Lys Gly Leu Asp Phe Tyr Asn Arg Leu Val Asp Ala Leu Leu Lys Glu 
100                 105                 110         
Asp Ile Ile Pro Phe Val Thr Leu Asn His Trp Asp Leu Pro Gln Lys 
115                 120                 125             
Leu Glu Glu Glu Gly Gly Trp Pro Val Arg Ser Thr Ala Asp Ala Phe 
130                 135                 140                 
Val Glu Tyr Thr Asp Val Val Thr Arg Ser Leu Gly Asp Arg Val Lys 
145                 150                 155                 160 
Asn Trp Ile Thr His Asn Glu Pro Ala Val Val Ala Trp Met Gly Tyr 
165                 170                 175     
Ser Thr Gly Gln His Ala Pro Gly Leu Lys Asp Tyr Gly Leu Gly Val 
180                 185                 190         
Arg Ala Ala His His Leu Leu Leu Ser His Gly Gln Ala Val Pro Val 
195                 200                 205             
Ile Arg Ser Asn Ser Ala Asp Ala Glu Val Gly Ile Thr Leu Asp Ile 
210                 215                 220                 
Ser Trp Arg Ile Pro Ala Ser Asn Ser Arg Ala Asp Arg Glu Leu Val 
225                 230                 235                 240 
Arg Lys Asp Asp Gly Leu Trp Phe Arg Trp Phe Ala Asp Pro Leu Tyr 
245                 250                 255     
Gly Arg Gly Tyr Pro Ser Asp Lys Val Thr Asp Phe Thr Lys Ile Gly 
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Ala Leu Pro Asn Gly Leu Asp Phe Met Gln Ala Gly Asp Met Asp Ala 
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Ile Ala Thr Pro Thr Asp Phe Met Gly Leu Asn Tyr Tyr Phe Arg Asn 
290                 295                 300                 
Val Tyr Arg Ala Asn Gly Glu Asp Asn Asp Pro Gln Val Val Phe Pro 
305                 310                 315                 320 
Gln Pro Lys Met Pro Glu His Trp Thr Glu Met Gly Trp Glu Ile Tyr 
325                 330                 335     
Pro Asp Gly Leu Thr Asn Ile Leu Gly Arg Val Tyr Phe Asn Tyr Gln 
340                 345                 350         
Pro His Lys Leu Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ser Tyr Ser Thr Pro 
355                 360                 365             
Pro Asp Glu Lys Gly Asn Val Ala Asp Glu Leu Arg Thr His Tyr Leu 
370                 375                 380                 
Arg Thr His Phe Ala Ala Ala Tyr Arg Ala Ile Gln Met Gly Val Pro 
385                 390                 395                 400 
Leu Ala Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ser 
405                 410                 415     
Trp Gly Tyr Met Gln Arg Phe Gly Leu Ile Trp Val Asp Tyr Glu Thr 
420                 425                 430         
Gln Lys Arg Thr Leu Lys Asp Ser Ala Lys Trp Tyr Lys Arg Val Ile 
435                 440                 445             
Arg Lys Asn Gly Phe 
450             
<210> 31
<211> 1167
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 31
atggaagacc gcccgcacta ttacagcgac gaccatctct ggggtgtact gtgcgtgacc     60
gcctacatca aggaaactgg ggactttgca ttcctggacg agaaagttca cttttacgag    120
aaggacccgg tcgagggcgt gtctgtgctg gatcacgtta aacgggcctt gacctttacc    180
cgcaacaaca tcgggaaaca tggtctgcct ctcctcggct ttgcggattg gaacgacacg    240
atcaatctgg cgaagggcgc cgagtctctt ttcacgtcgc atctatatgg acgcgcgctg    300
ctggagttta ttgatctgct cacatatctt ggcaagaacg atgaagccga tgaatggcag    360
cgagcccacg ttgagatgca gtcccgcgtc gaaaaacatg cctgggatgg cgaatggtat    420
ttcatgtact ttgaccacga cggcagcccg gttgggtctc acacgaatca gtatggaaag    480
atccatctca acggacagag ctgggctgtg ctttcgggct ttgcctctcc gcagcgcgcc    540
cgccaggcca tggactcggt ttacaagcat ctcaacacaa agcacggcat caagctctcc    600
acgccgggct acaatggcta tgaccccaac tacggcggcg tgaccaccta cccaccggga    660
gcaaaggaaa acggcggcat cttcctgcac ccgaatccct gggccatgat cgcagagacc    720
atgctcgggg atggcgatcg cgcctacgag tattactcgc agatcaaccc ggccggcaag    780
aacgatgaca tcgacctgta cgaggtcgag ccatatgttt acgctcaaaa catcctgggc    840
gatgagcatc cgcagttcgg gctgggacgc aactcgtggc tctcgggtac ggcatcctgg    900
tgctatcagg ctgccacaca gtggatcctc ggaatccgcg ccgactatga agggctgcgc    960
atcgacccgt gcattccgtc caagtgggat gggttcaagg caacgcgcct gtatcgcggc   1020
gtgaagtaca acattacggt caccaacccg aagcacatct gcaaaggcgt ggaaaaagtt   1080
ctggtcaacg gcaaaccggt tgaggggaat gtggtccggg cagacgtggg tttgcgcgaa   1140
gtgaacgtgg aagttacctt aggataa                                       1167
<210> 32
<211> 388
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SITE
<222> (79)...(82)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (349)...(352)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 32
Met Glu Asp Arg Pro His Tyr Tyr Ser Asp Asp His Leu Trp Gly Val 
1               5                   10                  15      
Leu Cys Val Thr Ala Tyr Ile Lys Glu Thr Gly Asp Phe Ala Phe Leu 
20                  25                  30          
Asp Glu Lys Val His Phe Tyr Glu Lys Asp Pro Val Glu Gly Val Ser 
35                  40                  45              
Val Leu Asp His Val Lys Arg Ala Leu Thr Phe Thr Arg Asn Asn Ile 
50                  55                  60                  
Gly Lys His Gly Leu Pro Leu Leu Gly Phe Ala Asp Trp Asn Asp Thr 
65                  70                  75                  80  
Ile Asn Leu Ala Lys Gly Ala Glu Ser Leu Phe Thr Ser His Leu Tyr 
85                  90                  95      
Gly Arg Ala Leu Leu Glu Phe Ile Asp Leu Leu Thr Tyr Leu Gly Lys 
100                 105                 110         
Asn Asp Glu Ala Asp Glu Trp Gln Arg Ala His Val Glu Met Gln Ser 
115                 120                 125             
Arg Val Glu Lys His Ala Trp Asp Gly Glu Trp Tyr Phe Met Tyr Phe 
130                 135                 140                 
Asp His Asp Gly Ser Pro Val Gly Ser His Thr Asn Gln Tyr Gly Lys 
145                 150                 155                 160 
Ile His Leu Asn Gly Gln Ser Trp Ala Val Leu Ser Gly Phe Ala Ser 
165                 170                 175     
Pro Gln Arg Ala Arg Gln Ala Met Asp Ser Val Tyr Lys His Leu Asn 
180                 185                 190         
Thr Lys His Gly Ile Lys Leu Ser Thr Pro Gly Tyr Asn Gly Tyr Asp 
195                 200                 205             
Pro Asn Tyr Gly Gly Val Thr Thr Tyr Pro Pro Gly Ala Lys Glu Asn 
210                 215                 220                 
Gly Gly Ile Phe Leu His Pro Asn Pro Trp Ala Met Ile Ala Glu Thr 
225                 230                 235                 240 
Met Leu Gly Asp Gly Asp Arg Ala Tyr Glu Tyr Tyr Ser Gln Ile Asn 
245                 250                 255     
Pro Ala Gly Lys Asn Asp Asp Ile Asp Leu Tyr Glu Val Glu Pro Tyr 
260                 265                 270         
Val Tyr Ala Gln Asn Ile Leu Gly Asp Glu His Pro Gln Phe Gly Leu 
275                 280                 285             
Gly Arg Asn Ser Trp Leu Ser Gly Thr Ala Ser Trp Cys Tyr Gln Ala 
290                 295                 300                 
Ala Thr Gln Trp Ile Leu Gly Ile Arg Ala Asp Tyr Glu Gly Leu Arg 
305                 310                 315                 320 
Ile Asp Pro Cys Ile Pro Ser Lys Trp Asp Gly Phe Lys Ala Thr Arg 
325                 330                 335     
Leu Tyr Arg Gly Val Lys Tyr Asn Ile Thr Val Thr Asn Pro Lys His 
340                 345                 350         
Ile Cys Lys Gly Val Glu Lys Val Leu Val Asn Gly Lys Pro Val Glu 
355                 360                 365             
Gly Asn Val Val Arg Ala Asp Val Gly Leu Arg Glu Val Asn Val Glu 
370                 375                 380                 
Val Thr Leu Gly 
385             
<210> 33
<211> 1362
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 33
atggcaaata aaattctctt ccccgagaac tttctctggg gcacggcgac cgcatcctac     60
cagatcgagg gggcttggga taaacatggt aagggcgagt cgacctggga ccgttttacg    120
catacacctg gaaagatcaa aaacaatgat acgggcgatg tagcagatga ccattatcga    180
ttatggaaaa aagatatcgg cttgatgaag aagctcggct tgaaggctta tcgtttttcg    240
acttcctggc cgcgggtgct gccggccggg cgcggtaaga gcaatcaaaa aggactcgat    300
ttctacagca agctggttga tgagttgcta aaagcaaata tcatcccatt cgtgacattg    360
aatcactggg acatcccaca aaagttggag gacgagggtg gctgggccgt gcgctcaacg    420
gctgaggcat ttgtggaata tgccgatctc atgtcgcgca cgcttggaga ccgcgtcaag    480
aactggatca cgcacaacga accggccgtc gtcgcctgga tgggatacgg gatgggcatc    540
cacgcgccgg gcttaacgga tttctcgatt gcggtgccgg tctcgcatca tctgctcctt    600
tcgcacggat gggccgtgcc tgtgattcgc ggtaacagcc cggatgccga ggtgggcatt    660
accctcaaca ttcaatgggg cgaagcagca tccaacagcc gggccgacct aaacgccctg    720
cgcctgaacg atggacagtg gttccgctgg tttgccgatc cggtttatgg ccgcggctat    780
ccttccgacg tggtggctga tttcgagaaa atgggcgcgc tgccgaacgg catgaatttc    840
gtgcaacctg gcgatatgga tgtcatcgcc acgccaaccg atttcctcgg gctcaattat    900
tattcccgcc atgtgcatcg cgtcaacaca ccggataacg atcaacaggt tgtgtttgcc    960
aaacagcagg gtcccgagaa ctggaccgag atgggctggg agatccatcc tgatggattg   1020
gccggaattt tatccagagc gtatttcaat taccagccgc gcaaagtata tgtgactgaa   1080
aacggtgcca gctattccac cgcgcccgat gagaatggta ttgtcaacga cattcaccgc   1140
gtcaattatc tacggacgca cttcgcggct gcccatcgcg ccctgcaggc gggcgtgcca   1200
ttggcaggat acttcgtctg gtcaatgctc gataacttcg aatggagtca cgggtacagc   1260
cagcgctttg gcatcgttta tgtggactat caaacccaga agcgttactt gaaagacagc   1320
gccaagtggt acaaaggtgt catcaaaaag aatgggttct aa                      1362
<210> 34
<211> 453
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (3)...(453)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (11)...(25)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (49)...(52)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (332)...(335)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (361)...(369)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 34
Met Ala Asn Lys Ile Leu Phe Pro Glu Asn Phe Leu Trp Gly Thr Ala 
1               5                   10                  15      
Thr Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asp Lys His Gly Lys Gly 
20                  25                  30          
Glu Ser Thr Trp Asp Arg Phe Thr His Thr Pro Gly Lys Ile Lys Asn 
35                  40                  45              
Asn Asp Thr Gly Asp Val Ala Asp Asp His Tyr Arg Leu Trp Lys Lys 
50                  55                  60                  
Asp Ile Gly Leu Met Lys Lys Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser 
65                  70                  75                  80  
Thr Ser Trp Pro Arg Val Leu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Ser Asn Gln 
85                  90                  95      
Lys Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Lys Leu Val Asp Glu Leu Leu Lys Ala 
100                 105                 110         
Asn Ile Ile Pro Phe Val Thr Leu Asn His Trp Asp Ile Pro Gln Lys 
115                 120                 125             
Leu Glu Asp Glu Gly Gly Trp Ala Val Arg Ser Thr Ala Glu Ala Phe 
130                 135                 140                 
Val Glu Tyr Ala Asp Leu Met Ser Arg Thr Leu Gly Asp Arg Val Lys 
145                 150                 155                 160 
Asn Trp Ile Thr His Asn Glu Pro Ala Val Val Ala Trp Met Gly Tyr 
165                 170                 175     
Gly Met Gly Ile His Ala Pro Gly Leu Thr Asp Phe Ser Ile Ala Val 
180                 185                 190         
Pro Val Ser His His Leu Leu Leu Ser His Gly Trp Ala Val Pro Val 
195                 200                 205             
Ile Arg Gly Asn Ser Pro Asp Ala Glu Val Gly Ile Thr Leu Asn Ile 
210                 215                 220                 
Gln Trp Gly Glu Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ala Asp Leu Asn Ala Leu 
225                 230                 235                 240 
Arg Leu Asn Asp Gly Gln Trp Phe Arg Trp Phe Ala Asp Pro Val Tyr 
245                 250                 255     
Gly Arg Gly Tyr Pro Ser Asp Val Val Ala Asp Phe Glu Lys Met Gly 
260                 265                 270         
Ala Leu Pro Asn Gly Met Asn Phe Val Gln Pro Gly Asp Met Asp Val 
275                 280                 285             
Ile Ala Thr Pro Thr Asp Phe Leu Gly Leu Asn Tyr Tyr Ser Arg His 
290                 295                 300                 
Val His Arg Val Asn Thr Pro Asp Asn Asp Gln Gln Val Val Phe Ala 
305                 310                 315                 320 
Lys Gln Gln Gly Pro Glu Asn Trp Thr Glu Met Gly Trp Glu Ile His 
325                 330                 335     
Pro Asp Gly Leu Ala Gly Ile Leu Ser Arg Ala Tyr Phe Asn Tyr Gln 
340                 345                 350         
Pro Arg Lys Val Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ala Ser Tyr Ser Thr Ala 
355                 360                 365             
Pro Asp Glu Asn Gly Ile Val Asn Asp Ile His Arg Val Asn Tyr Leu 
370                 375                 380                 
Arg Thr His Phe Ala Ala Ala His Arg Ala Leu Gln Ala Gly Val Pro 
385                 390                 395                 400 
Leu Ala Gly Tyr Phe Val Trp Ser Met Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ser 
405                 410                 415     
His Gly Tyr Ser Gln Arg Phe Gly Ile Val Tyr Val Asp Tyr Gln Thr 
420                 425                 430         
Gln Lys Arg Tyr Leu Lys Asp Ser Ala Lys Trp Tyr Lys Gly Val Ile 
435                 440                 445             
Lys Lys Asn Gly Phe 
450             
<210> 35
<211> 1116
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 35
atgaataaaa tcctcaaact cttcagcagc ctgctgcttt ttgcaggcat ctgtcccgcg     60
cttcaggcag agccagtaga aacctacttt cccctgtccc gcgggatcaa catgagccac    120
tggctctctc aagtgaatga aaacattccc gaccgttcca cctatgtgac ggagcgggat    180
ttgcaatttc tgcgggcagc cggtttcgac catgtgcgtc tgccaatcga tgaggtcgaa    240
ctctgggatg aagagggcaa tcagatcgag gaggcctggc aatacatgca taactttctc    300
cgttggagcc gaaagaacga tctccgggtc attctcgacc tgcacacggt attgtcccac    360
cacttcaacg cggtaaatat gggagaggtc aatacactct tcaatgatcc cagggaacag    420
gaaaagttcc tcaacctatg ggaacaaatc atggatgccg tgggtcacca tccgaatgag    480
tttctcgcct atgaaatgct caatgaggcg gtcgcggaag atgatgaaga ctggaatctg    540
ctcctcaacc gcgccattgt ccgcatccgg gaccgtgagc cttatcgggt gctgattgcg    600
gggtcgaact ggtggcagca tgccgaccgg gtccccaacc tgaggctccc gaaaggagac    660
cccaatatca tcatcagttt tcatttttat tccccttttc tcttcaccca ctaccgcagt    720
agctggactg cgatgcaggc gtaccagggc ttcgtccaat accctggcaa aaccatacct    780
tccatacatc tcgaaggcat gaactacccg gagtccttcg ttcatatgtg ggaagcgcac    840
aatcggtact atgacatcca ttccatgtat gccgaaatgg tcccggcggt gcgttttgcc    900
gaaaagttgg gacttcggct ctattgcgga gaattcgggg ccatgaagac cgttgatcgc    960
gcccagatgc tgcagtggta tcgggatgtt gtcactgtat ttaataaatt gggtattccc   1020
tatactgcct gggattatca gggaaccttc ggaatccgcg atgagctgac cggtgagccc   1080
gatcatgaaa tgatcgatat tctcctcggg cgctga                             1116
<210> 36
<211> 371
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(23)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (39)...(350)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (37)...(40)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 36
Met Asn Lys Ile Leu Lys Leu Phe Ser Ser Leu Leu Leu Phe Ala Gly 
1               5                   10                  15      
Ile Cys Pro Ala Leu Gln Ala Glu Pro Val Glu Thr Tyr Phe Pro Leu 
20                  25                  30          
Ser Arg Gly Ile Asn Met Ser His Trp Leu Ser Gln Val Asn Glu Asn 
35                  40                  45              
Ile Pro Asp Arg Ser Thr Tyr Val Thr Glu Arg Asp Leu Gln Phe Leu 
50                  55                  60                  
Arg Ala Ala Gly Phe Asp His Val Arg Leu Pro Ile Asp Glu Val Glu 
65                  70                  75                  80  
Leu Trp Asp Glu Glu Gly Asn Gln Ile Glu Glu Ala Trp Gln Tyr Met 
85                  90                  95      
His Asn Phe Leu Arg Trp Ser Arg Lys Asn Asp Leu Arg Val Ile Leu 
100                 105                 110         
Asp Leu His Thr Val Leu Ser His His Phe Asn Ala Val Asn Met Gly 
115                 120                 125             
Glu Val Asn Thr Leu Phe Asn Asp Pro Arg Glu Gln Glu Lys Phe Leu 
130                 135                 140                 
Asn Leu Trp Glu Gln Ile Met Asp Ala Val Gly His His Pro Asn Glu 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Ala Tyr Glu Met Leu Asn Glu Ala Val Ala Glu Asp Asp Glu 
165                 170                 175     
Asp Trp Asn Leu Leu Leu Asn Arg Ala Ile Val Arg Ile Arg Asp Arg 
180                 185                 190         
Glu Pro Tyr Arg Val Leu Ile Ala Gly Ser Asn Trp Trp Gln His Ala 
195                 200                 205             
Asp Arg Val Pro Asn Leu Arg Leu Pro Lys Gly Asp Pro Asn Ile Ile 
210                 215                 220                 
Ile Ser Phe His Phe Tyr Ser Pro Phe Leu Phe Thr His Tyr Arg Ser 
225                 230                 235                 240 
Ser Trp Thr Ala Met Gln Ala Tyr Gln Gly Phe Val Gln Tyr Pro Gly 
245                 250                 255     
Lys Thr Ile Pro Ser Ile His Leu Glu Gly Met Asn Tyr Pro Glu Ser 
260                 265                 270         
Phe Val His Met Trp Glu Ala His Asn Arg Tyr Tyr Asp Ile His Ser 
275                 280                 285             
Met Tyr Ala Glu Met Val Pro Ala Val Arg Phe Ala Glu Lys Leu Gly 
290                 295                 300                 
Leu Arg Leu Tyr Cys Gly Glu Phe Gly Ala Met Lys Thr Val Asp Arg 
305                 310                 315                 320 
Ala Gln Met Leu Gln Trp Tyr Arg Asp Val Val Thr Val Phe Asn Lys 
325                 330                 335     
Leu Gly Ile Pro Tyr Thr Ala Trp Asp Tyr Gln Gly Thr Phe Gly Ile 
340                 345                 350         
Arg Asp Glu Leu Thr Gly Glu Pro Asp His Glu Met Ile Asp Ile Leu 
355                 360                 365             
Leu Gly Arg 
370     
<210> 37
<211> 1383
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 37
atgagcaaac tccccaaatt cctctttgga gccggcacct caagttatca gatcgaaggt     60
gcctggaata tagatggcaa aggtccctcc atttgggatt tccacactcg ccatcccggc    120
gcggtttatc ggatgcacaa cggggatatg gcctgcgatc attatcatcg gtatcgaacg    180
gatatcgagc tgatgcagaa gatcggccta gaggcttacc gcttttccat aaactggccc    240
cgggttctgc cggaagggac cggtgccgcc aatgaagcag gtctggactt ttacgaccgg    300
ctggtggacg cactgttgga agcgggaatt cagccttgga tcacccttta tcactgggaa    360
ctcccctggg ctctccacct gcgcgggggt tggctcaatc gggacatgcc cgaccacatt    420
gagaactacg ccgccttggt cgccaggtgc ctcggtgacc gggtgaaaaa ctggattact    480
ttgaatgagc ctcaggtttt catcgggctt ggctatgcca gcggggttca tgcccccggc    540
tataagttgt ccttgcggga gtgcctggtc ggttcccacc atgccgtgct ttcccaccac    600
cgggcagtca aggcgatccg ggccaactgc gaaggcagcg tccagatcgg ctcagccccg    660
gtgggtgttg tctgccgacc ggaaacggag tcggcagcag acattgaggc tgcccgccag    720
gccacctacc atatcaacac tcccagcacc cacactcccg acaatctgat cggctgcctc    780
tggaacagca cttggtggat agatccaatg gttctgggga agtatccgga acacgggctg    840
aaagcctttg aaagctatct gccggacaac attcaggccg aactggatgc cgtattcgaa    900
ccgacggact ttgtcggttc caacatctac cacggccgca cggtgcgggc caagcaggat    960
ggtggttttg agtttatcga ccttccgccc ggcagccccc gcaccaccat gggctgggac   1020
atcaccccgg acatcctcta ctggggagga aagtatcttt acgaacgcta tggcaagccg   1080
atgtttatca cggaaaacgg cattgccgtc ccggaactgg tgaatgatga aggccaggtc   1140
gaggataccg tccgtgagca atacatgaag ctgcacctgc gtgggctgca gcgggcccgc   1200
gatgaaggca tcccctatgc cggatacttc cactggtccc tgctcgacaa cttcgagtgg   1260
gaacaaggct actcccagcg ctttggcatg gtctacgtcg actaccagac ccaggaacgt   1320
atcctcaaac gttcgggcca gcatttcgct gccatcgtcc gggaaatcac cggaaccgcc   1380
taa                                                                 1383
<210> 38
<211> 460
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (1)...(458)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (7)...(21)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (266)...(269)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (366)...(374)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 38
Met Ser Lys Leu Pro Lys Phe Leu Phe Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr 
1               5                   10                  15      
Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile Trp 
20                  25                  30          
Asp Phe His Thr Arg His Pro Gly Ala Val Tyr Arg Met His Asn Gly 
35                  40                  45              
Asp Met Ala Cys Asp His Tyr His Arg Tyr Arg Thr Asp Ile Glu Leu 
50                  55                  60                  
Met Gln Lys Ile Gly Leu Glu Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Asn Trp Pro 
65                  70                  75                  80  
Arg Val Leu Pro Glu Gly Thr Gly Ala Ala Asn Glu Ala Gly Leu Asp 
85                  90                  95      
Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ile Gln Pro 
100                 105                 110         
Trp Ile Thr Leu Tyr His Trp Glu Leu Pro Trp Ala Leu His Leu Arg 
115                 120                 125             
Gly Gly Trp Leu Asn Arg Asp Met Pro Asp His Ile Glu Asn Tyr Ala 
130                 135                 140                 
Ala Leu Val Ala Arg Cys Leu Gly Asp Arg Val Lys Asn Trp Ile Thr 
145                 150                 155                 160 
Leu Asn Glu Pro Gln Val Phe Ile Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Gly Val 
165                 170                 175     
His Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Ser Leu Arg Glu Cys Leu Val Gly Ser 
180                 185                 190         
His His Ala Val Leu Ser His His Arg Ala Val Lys Ala Ile Arg Ala 
195                 200                 205             
Asn Cys Glu Gly Ser Val Gln Ile Gly Ser Ala Pro Val Gly Val Val 
210                 215                 220                 
Cys Arg Pro Glu Thr Glu Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Arg Gln 
225                 230                 235                 240 
Ala Thr Tyr His Ile Asn Thr Pro Ser Thr His Thr Pro Asp Asn Leu 
245                 250                 255     
Ile Gly Cys Leu Trp Asn Ser Thr Trp Trp Ile Asp Pro Met Val Leu 
260                 265                 270         
Gly Lys Tyr Pro Glu His Gly Leu Lys Ala Phe Glu Ser Tyr Leu Pro 
275                 280                 285             
Asp Asn Ile Gln Ala Glu Leu Asp Ala Val Phe Glu Pro Thr Asp Phe 
290                 295                 300                 
Val Gly Ser Asn Ile Tyr His Gly Arg Thr Val Arg Ala Lys Gln Asp 
305                 310                 315                 320 
Gly Gly Phe Glu Phe Ile Asp Leu Pro Pro Gly Ser Pro Arg Thr Thr 
325                 330                 335     
Met Gly Trp Asp Ile Thr Pro Asp Ile Leu Tyr Trp Gly Gly Lys Tyr 
340                 345                 350         
Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Lys Pro Met Phe Ile Thr Glu Asn Gly Ile 
355                 360                 365             
Ala Val Pro Glu Leu Val Asn Asp Glu Gly Gln Val Glu Asp Thr Val 
370                 375                 380                 
Arg Glu Gln Tyr Met Lys Leu His Leu Arg Gly Leu Gln Arg Ala Arg 
385                 390                 395                 400 
Asp Glu Gly Ile Pro Tyr Ala Gly Tyr Phe His Trp Ser Leu Leu Asp 
405                 410                 415     
Asn Phe Glu Trp Glu Gln Gly Tyr Ser Gln Arg Phe Gly Met Val Tyr 
420                 425                 430         
Val Asp Tyr Gln Thr Gln Glu Arg Ile Leu Lys Arg Ser Gly Gln His 
435                 440                 445             
Phe Ala Ala Ile Val Arg Glu Ile Thr Gly Thr Ala 
450                 455                 460 
<210> 39
<211> 1521
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 39
gtgctcgccc ataaccgctc gcaccgtgaa gaactcctca atcgccggcc ggttgaattc     60
atcagcgccc tggaggcccg gggcgagctc cagcgcatca ccgccgaggt ggacccctac    120
ctcgagatca ccgagatctg cgatcgcacc ctgcgcgccg gcggcccggc gctgctgttc    180
gagaacgtca aggggcacga catgcctctg ctcggcaacc tcttcggcac gccgaagcgg    240
gttgccctcg gcatgggcca ggactccgtg gccgccctgc gcgaagtggg cgagctgctc    300
gccttcctca aggagccgga gcctcccaag ggctttcgcg acgcctggga caagctgccg    360
atcttcaagc aggtgatgag catggggccg aagaaggtcc gctcggcgcc ggtgcaggaa    420
aaggtgtacg agggcgacga ggtcgacctc gaccgcctgc cgatccagca ctgctggccc    480
ggcgacgccg cgcccctggt cacctggccg ctggtgatca cccgcgggcc ccacaagaag    540
cgccagaacc tcggcatcta ccgccagcag aagctgtcga agaaccggct gatcatgcgc    600
tggctctccc accgcggcgg ggcgctggac ttcctggagt tccagaaggc ccaccccggc    660
gagcccttcc cggtggcggt ggcgctgggc gccgacccgg cgaccatcct cggcgcggtg    720
accccggtgc cggattcgct ctccgagtac gccttcgccg ggctgctgcg cggctcgcgc    780
accgagctgg tcaagtgcgg ccacgccgac ctggacgtgc cggcctcggc ggagatcatc    840
ctggaggggt tcatctaccc ggatgacatg gcccccgagg gcccctacgg cgaccatacc    900
ggctactaca acgaggtgga taccttcccg gtcttcacgg tgacgcgtat gaccatgcgc    960
cgcgatgcca tctatcactc cacctacacc ggccggccgc ccgacgagcc ggcgatcctt   1020
gggctggcgc tcaacgaggt gttcgtgccg atcctgcgcc gccagttccc ggagatcgtc   1080
gacttctacc tgccgccgga gggctgctcc taccgcatgg cggtggtgac catgaagaag   1140
cagtacccgg gccacgccaa gcgggtgatg atgggcgtgt ggagcttcct gcgccagttc   1200
atgtacacca agttcgtggt ggtgctcgac gacgacgtca gcgcccggga ctgggaggac   1260
gtgatctggg ccatcaccac ccgcatggac ccggcccggg acaccgtggt ggtggagaac   1320
acccccatcg actacctgga cttcgcctcg ccggtctccg gcctcggttc caagatgggc   1380
ctggatgcca ccagcaagtg gcccggcgag accgaccgcg agtggggggt gcccatcgtc   1440
atggacgagg ccgtcaaggc ccgcgtcagc gagcgctgga acgagctggg catcgagctc   1500
cccgacaaca cgaccccctg a                                             1521
<210> 40
<211> 506
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (21)...(445)
<223> 3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate carboxy-lyase
<220> 
<221> SITE
<222> (5)...(8)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 40
Met Leu Ala His Asn Arg Ser His Arg Glu Glu Leu Leu Asn Arg Arg 
1               5                   10                  15      
Pro Val Glu Phe Ile Ser Ala Leu Glu Ala Arg Gly Glu Leu Gln Arg 
20                  25                  30          
Ile Thr Ala Glu Val Asp Pro Tyr Leu Glu Ile Thr Glu Ile Cys Asp 
35                  40                  45              
Arg Thr Leu Arg Ala Gly Gly Pro Ala Leu Leu Phe Glu Asn Val Lys 
50                  55                  60                  
Gly His Asp Met Pro Leu Leu Gly Asn Leu Phe Gly Thr Pro Lys Arg 
65                  70                  75                  80  
Val Ala Leu Gly Met Gly Gln Asp Ser Val Ala Ala Leu Arg Glu Val 
85                  90                  95      
Gly Glu Leu Leu Ala Phe Leu Lys Glu Pro Glu Pro Pro Lys Gly Phe 
100                 105                 110         
Arg Asp Ala Trp Asp Lys Leu Pro Ile Phe Lys Gln Val Met Ser Met 
115                 120                 125             
Gly Pro Lys Lys Val Arg Ser Ala Pro Val Gln Glu Lys Val Tyr Glu 
130                 135                 140                 
Gly Asp Glu Val Asp Leu Asp Arg Leu Pro Ile Gln His Cys Trp Pro 
145                 150                 155                 160 
Gly Asp Ala Ala Pro Leu Val Thr Trp Pro Leu Val Ile Thr Arg Gly 
165                 170                 175     
Pro His Lys Lys Arg Gln Asn Leu Gly Ile Tyr Arg Gln Gln Lys Leu 
180                 185                 190         
Ser Lys Asn Arg Leu Ile Met Arg Trp Leu Ser His Arg Gly Gly Ala 
195                 200                 205             
Leu Asp Phe Leu Glu Phe Gln Lys Ala His Pro Gly Glu Pro Phe Pro 
210                 215                 220                 
Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Ile Leu Gly Ala Val 
225                 230                 235                 240 
Thr Pro Val Pro Asp Ser Leu Ser Glu Tyr Ala Phe Ala Gly Leu Leu 
245                 250                 255     
Arg Gly Ser Arg Thr Glu Leu Val Lys Cys Gly His Ala Asp Leu Asp 
260                 265                 270         
Val Pro Ala Ser Ala Glu Ile Ile Leu Glu Gly Phe Ile Tyr Pro Asp 
275                 280                 285             
Asp Met Ala Pro Glu Gly Pro Tyr Gly Asp His Thr Gly Tyr Tyr Asn 
290                 295                 300                 
Glu Val Asp Thr Phe Pro Val Phe Thr Val Thr Arg Met Thr Met Arg 
305                 310                 315                 320 
Arg Asp Ala Ile Tyr His Ser Thr Tyr Thr Gly Arg Pro Pro Asp Glu 
325                 330                 335     
Pro Ala Ile Leu Gly Leu Ala Leu Asn Glu Val Phe Val Pro Ile Leu 
340                 345                 350         
Arg Arg Gln Phe Pro Glu Ile Val Asp Phe Tyr Leu Pro Pro Glu Gly 
355                 360                 365             
Cys Ser Tyr Arg Met Ala Val Val Thr Met Lys Lys Gln Tyr Pro Gly 
370                 375                 380                 
His Ala Lys Arg Val Met Met Gly Val Trp Ser Phe Leu Arg Gln Phe 
385                 390                 395                 400 
Met Tyr Thr Lys Phe Val Val Val Leu Asp Asp Asp Val Ser Ala Arg 
405                 410                 415     
Asp Trp Glu Asp Val Ile Trp Ala Ile Thr Thr Arg Met Asp Pro Ala 
420                 425                 430         
Arg Asp Thr Val Val Val Glu Asn Thr Pro Ile Asp Tyr Leu Asp Phe 
435                 440                 445             
Ala Ser Pro Val Ser Gly Leu Gly Ser Lys Met Gly Leu Asp Ala Thr 
450                 455                 460                 
Ser Lys Trp Pro Gly Glu Thr Asp Arg Glu Trp Gly Val Pro Ile Val 
465                 470                 475                 480 
Met Asp Glu Ala Val Lys Ala Arg Val Ser Glu Arg Trp Asn Glu Leu 
485                 490                 495     
Gly Ile Glu Leu Pro Asp Asn Thr Thr Pro 
500                 505     
<210> 41
<211> 1410
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 41
atgaagacgc cttcgatcta cgataccatg acgcggtcgg tgcagccgtt gacacccgcc     60
gacggcgaca ccttccgctt ttattgctgc ggccccaccg tctacgggcc ggcgcatgtc    120
ggcaatttcc gcaccttcat cattcaggac gtgctgcgac gcgttatcga agggtcgggc    180
ctcaaaacga gacacgtacg caacatcacc gatgtggacg acaaaaccat ccgccaatcg    240
caagcggaag gaaaatctct gaaaatcttc acagggtact ggctggaacg gttccacgcc    300
gattgcgacg cgctgaatct gctgcgcccg cacgtcgagc ccggcgccgt tgaccatatc    360
ccggcgcaaa tccggatgat cgaacaactg atcgaaaaag gccacgccta cgtggcggac    420
gacaactcgg tctattatcg cgttgcttcg ttcgaagcgt acggccggtt gtcacgcctg    480
caagaacgac acatcaccac cggctgcgcc gaacacgcgc ataccgacga tgaatacgag    540
cgcgaatcgg ccgccgactt cgccttgtgg aaagcgcata aatccgagga cggcccgaac    600
gcgtggccga gcccgtgggg cgacggacga cccggctggc acatcgagtg cagcgccatg    660
tccgtcgagt atctgggcga gacattcgat ctgcacggcg gcggcgtgga cctgaccttc    720
ccccaccacg aaaacgaaat cgcgcaaagc gaagccgcca ccggcaagcc cttcgcgcgt    780
atctggttcc attccgcgca tctcatggtc gaaggccaca agatgtccaa gagcctcggc    840
aacctgttta cgctcgacga tatccgcgcg cgcggattcg acgccatgac cctgcgctat    900
gtcctgcttt cgggcaatta ccgccaaccc ctcaatttca cgtgggactc ccttaacgcc    960
gcgcaaagcg ccttacgccg cctgcgtcag ctcaaccacg atctccagca ggcggcgggc   1020
aagacggtcg cgcccgctga tacttcgtgg gggccgttcg aaccggtgta cgacgcgctt   1080
gccgacaacc tgaacacgcc cgacgccctc ggccgcttat tctccgccct gcacagcatc   1140
gagcgcgcgc ttaacggcaa ggaaaggacg gccgaagagg ccgccctcgc ccgtgcgcag   1200
ttcctgcggg tcatggacct tttcggtttc agcctggacg cgccgccgac cgccgaagcg   1260
cccgaagaag tgcgtgcgct ggcgcagcag cgatgggacg ctaaacaagc gcgcgatttc   1320
gtccgcgccg acgccttgcg caaacaggtc accgacctcg gctggaccat ccgcgacgcc   1380
aaagacggct acgaactcgt ccaagagtaa                                    1410
<210> 42
<211> 469
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (16)...(323)
<223> tRNA synthetases class I (C) catalytic domain
<220> 
<221> SITE
<222> (69)...(72)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (316)...(319)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 42
Met Lys Thr Pro Ser Ile Tyr Asp Thr Met Thr Arg Ser Val Gln Pro 
1               5                   10                  15      
Leu Thr Pro Ala Asp Gly Asp Thr Phe Arg Phe Tyr Cys Cys Gly Pro 
20                  25                  30          
Thr Val Tyr Gly Pro Ala His Val Gly Asn Phe Arg Thr Phe Ile Ile 
35                  40                  45              
Gln Asp Val Leu Arg Arg Val Ile Glu Gly Ser Gly Leu Lys Thr Arg 
50                  55                  60                  
His Val Arg Asn Ile Thr Asp Val Asp Asp Lys Thr Ile Arg Gln Ser 
65                  70                  75                  80  
Gln Ala Glu Gly Lys Ser Leu Lys Ile Phe Thr Gly Tyr Trp Leu Glu 
85                  90                  95      
Arg Phe His Ala Asp Cys Asp Ala Leu Asn Leu Leu Arg Pro His Val 
100                 105                 110         
Glu Pro Gly Ala Val Asp His Ile Pro Ala Gln Ile Arg Met Ile Glu 
115                 120                 125             
Gln Leu Ile Glu Lys Gly His Ala Tyr Val Ala Asp Asp Asn Ser Val 
130                 135                 140                 
Tyr Tyr Arg Val Ala Ser Phe Glu Ala Tyr Gly Arg Leu Ser Arg Leu 
145                 150                 155                 160 
Gln Glu Arg His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Ala His Thr Asp 
165                 170                 175     
Asp Glu Tyr Glu Arg Glu Ser Ala Ala Asp Phe Ala Leu Trp Lys Ala 
180                 185                 190         
His Lys Ser Glu Asp Gly Pro Asn Ala Trp Pro Ser Pro Trp Gly Asp 
195                 200                 205             
Gly Arg Pro Gly Trp His Ile Glu Cys Ser Ala Met Ser Val Glu Tyr 
210                 215                 220                 
Leu Gly Glu Thr Phe Asp Leu His Gly Gly Gly Val Asp Leu Thr Phe 
225                 230                 235                 240 
Pro His His Glu Asn Glu Ile Ala Gln Ser Glu Ala Ala Thr Gly Lys 
245                 250                 255     
Pro Phe Ala Arg Ile Trp Phe His Ser Ala His Leu Met Val Glu Gly 
260                 265                 270         
His Lys Met Ser Lys Ser Leu Gly Asn Leu Phe Thr Leu Asp Asp Ile 
275                 280                 285             
Arg Ala Arg Gly Phe Asp Ala Met Thr Leu Arg Tyr Val Leu Leu Ser 
290                 295                 300                 
Gly Asn Tyr Arg Gln Pro Leu Asn Phe Thr Trp Asp Ser Leu Asn Ala 
305                 310                 315                 320 
Ala Gln Ser Ala Leu Arg Arg Leu Arg Gln Leu Asn His Asp Leu Gln 
325                 330                 335     
Gln Ala Ala Gly Lys Thr Val Ala Pro Ala Asp Thr Ser Trp Gly Pro 
340                 345                 350         
Phe Glu Pro Val Tyr Asp Ala Leu Ala Asp Asn Leu Asn Thr Pro Asp 
355                 360                 365             
Ala Leu Gly Arg Leu Phe Ser Ala Leu His Ser Ile Glu Arg Ala Leu 
370                 375                 380                 
Asn Gly Lys Glu Arg Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Ala Gln 
385                 390                 395                 400 
Phe Leu Arg Val Met Asp Leu Phe Gly Phe Ser Leu Asp Ala Pro Pro 
405                 410                 415     
Thr Ala Glu Ala Pro Glu Glu Val Arg Ala Leu Ala Gln Gln Arg Trp 
420                 425                 430         
Asp Ala Lys Gln Ala Arg Asp Phe Val Arg Ala Asp Ala Leu Arg Lys 
435                 440                 445             
Gln Val Thr Asp Leu Gly Trp Thr Ile Arg Asp Ala Lys Asp Gly Tyr 
450                 455                 460                 
Glu Leu Val Gln Glu 
465                 
<210> 43
<211> 984
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 43
atgacgactg aaaccaaatc caaactgtac ttgcataaag tgaacggcca gaaaggactg     60
gacctgcgcc agacctatca gcgcgacttc accgtgaccg aggcgtatcg cgatacgctg    120
ccggatatgc agaacgcttc cgaggcgttg cagggggcca atgtcgccat ccagaaagtc    180
ggcgtatcca atttcaagct gccactcaag taccgcaccc acacgggcga accgaccacg    240
ctggaaacca gcgtaaccgg cagcgtatcc ctgaagccgg gcctgaaggg catcaacatg    300
tcccgcgtca tgcggacctt ctacgacttc caggacgacg tgttcacgct cgacacgctg    360
gcccgtatac tggaagcgta caaacgggat gtcgacagca acgacgcaca tcttcggctg    420
agtttctcct acccgctgct tcaaaaaagt ctgcgcagcg aattattcgg ctggcaatat    480
taccaggtcg cattcgaggg acggatcgat gccgaaaatc gagtccgcac gttcattcat    540
tttgacttcg tgtattcctc cgcctgtccc tgttcggctg aactggccga acacgcgcgg    600
gaagtgcgcg gcctatacag catcccccac tcgcaacgca gcaaggcgcg cgtcttcgtg    660
gaagttcagc ccggcgccga actcaccatc gaagacgtgc acatgcactg cctgaacgcg    720
ctccaaacgg aaacgcaagt gatggtcaaa cgcgaagacg agcaggcgtt cgctgaaatg    780
aacggcgccg ccatcaaatt cgtcgaagac gccgcccgtc tgatctatga gcagttcgac    840
caggatccgc gcatcaagga tttcgaaatc gcctgcgcgc atctggaatc cttgcactcg    900
cacgacgccg tatcggtcat cgccaaaggc gtgcccggcg gcttccgcgc cgacttctcg    960
gacttcaaga gtctgatctg ctaa                                           984
<210> 44
<211> 327
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (39)...(308)
<223> Uncharacterized ACR, COG1469
<220> 
<221> SITE
<222> (45)...(48)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (100)...(103)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 44
Met Thr Thr Glu Thr Lys Ser Lys Leu Tyr Leu His Lys Val Asn Gly 
1               5                   10                  15      
Gln Lys Gly Leu Asp Leu Arg Gln Thr Tyr Gln Arg Asp Phe Thr Val 
20                  25                  30          
Thr Glu Ala Tyr Arg Asp Thr Leu Pro Asp Met Gln Asn Ala Ser Glu 
35                  40                  45              
Ala Leu Gln Gly Ala Asn Val Ala Ile Gln Lys Val Gly Val Ser Asn 
50                  55                  60                  
Phe Lys Leu Pro Leu Lys Tyr Arg Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Thr 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu Thr Ser Val Thr Gly Ser Val Ser Leu Lys Pro Gly Leu Lys 
85                  90                  95      
Gly Ile Asn Met Ser Arg Val Met Arg Thr Phe Tyr Asp Phe Gln Asp 
100                 105                 110         
Asp Val Phe Thr Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ile Leu Glu Ala Tyr Lys 
115                 120                 125             
Arg Asp Val Asp Ser Asn Asp Ala His Leu Arg Leu Ser Phe Ser Tyr 
130                 135                 140                 
Pro Leu Leu Gln Lys Ser Leu Arg Ser Glu Leu Phe Gly Trp Gln Tyr 
145                 150                 155                 160 
Tyr Gln Val Ala Phe Glu Gly Arg Ile Asp Ala Glu Asn Arg Val Arg 
165                 170                 175     
Thr Phe Ile His Phe Asp Phe Val Tyr Ser Ser Ala Cys Pro Cys Ser 
180                 185                 190         
Ala Glu Leu Ala Glu His Ala Arg Glu Val Arg Gly Leu Tyr Ser Ile 
195                 200                 205             
Pro His Ser Gln Arg Ser Lys Ala Arg Val Phe Val Glu Val Gln Pro 
210                 215                 220                 
Gly Ala Glu Leu Thr Ile Glu Asp Val His Met His Cys Leu Asn Ala 
225                 230                 235                 240 
Leu Gln Thr Glu Thr Gln Val Met Val Lys Arg Glu Asp Glu Gln Ala 
245                 250                 255     
Phe Ala Glu Met Asn Gly Ala Ala Ile Lys Phe Val Glu Asp Ala Ala 
260                 265                 270         
Arg Leu Ile Tyr Glu Gln Phe Asp Gln Asp Pro Arg Ile Lys Asp Phe 
275                 280                 285             
Glu Ile Ala Cys Ala His Leu Glu Ser Leu His Ser His Asp Ala Val 
290                 295                 300                 
Ser Val Ile Ala Lys Gly Val Pro Gly Gly Phe Arg Ala Asp Phe Ser 
305                 310                 315                 320 
Asp Phe Lys Ser Leu Ile Cys 
325         
<210> 45
<211> 1377
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 45
atgacacaac tggcttttcc atctaacttc atctggggaa cagctacttc cgcttaccaa     60
atcgaaggcg cctggaacgc agacggcaag ggcgaatcta tttgggatcg cttttcccat    120
acgcagggga agatcattga cggcagcaac ggcgatgtgg cctgcgatca ctaccaccgc    180
tggcgcgagg acgtggccct catgagagac ttgggtatgc aggcatatcg cttctccatc    240
tcctggccac gcatcctgcc caccggtcat ggacagatca atcaggctgg gctggacttt    300
tacaatcgcc tggtggacgg gttgctggaa gctggcatca agccctttgc caccctctac    360
cactgggacc tgccgctggc gctacaggct gacggcggct ggccggagcg ctccacggcc    420
aaggcctttg tcgaatacgc cgacgtggtc agccgcgcgc tgggcgatcg ggtgaagagc    480
tggatcaccc ataacgaacc gtggtgcatc agcatgctga gccatcaaat tggggagcat    540
gcgcccggct ggcgggactg gcaggctgcg ttggcggccg cgcaccacgt cctcctttcg    600
catggttggg ccgtgccgga actgcgtcgc aacagccgcg atgcagaaat cggcatcacg    660
ttgaacttta ccccggcgga gccagcttcg aacagcgcag ccgatttcaa ggcctatcgc    720
cagttcgatg gctacttcaa ccgctggttc ctggacccgc tctatggccg ccactatccg    780
gcagatatgg tgcacgatta catcgcgcaa ggctacctgc catcacaggg tttgactttc    840
gtggaagctg gtgacctgga cgcgatcgcg acgcgcaccg atttcctggg tgtgaactat    900
tacacgcgcg aagtggtccg tagccaggaa atcccagaga gtgagaacgc gccgcgcaca    960
gtcttgcgcg cgccacagga agagtggaca gagatgggct gggaagtgta tcctgagggc   1020
ctctacaggt tgctcaatcg gttgcacttt gaataccagc cgcgcaagct ctacgtgacc   1080
gagagcggtt gcagctactc cgatggaccc ggccccaacg gtcggatacc ggaccaacgc   1140
cgtatcaact acctgcgcga tcacttcgca gcggcgcatc aggcgataca atgcggcgtc   1200
ccgctggccg gctacttcgt ctggtcgttc atggacaact tcgagtgggc caaagggtac   1260
acccaacgtt ttggtatcgt atgggtggat tatcaatcgc aacgacggat accgaaagac   1320
agcgcctact ggtatcgcga tgtcgtcgcc gccaacgcgg tgcaagttcc tgattag      1377
<210> 46
<211> 458
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (2)...(454)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (10)...(24)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<400> 46
Met Thr Gln Leu Ala Phe Pro Ser Asn Phe Ile Trp Gly Thr Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Ser Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Ala Asp Gly Lys Gly Glu 
20                  25                  30          
Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Gln Gly Lys Ile Ile Asp Gly 
35                  40                  45              
Ser Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Trp Arg Glu Asp 
50                  55                  60                  
Val Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Met Gln Ala Tyr Arg Phe Ser Ile 
65                  70                  75                  80  
Ser Trp Pro Arg Ile Leu Pro Thr Gly His Gly Gln Ile Asn Gln Ala 
85                  90                  95      
Gly Leu Asp Phe Tyr Asn Arg Leu Val Asp Gly Leu Leu Glu Ala Gly 
100                 105                 110         
Ile Lys Pro Phe Ala Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu 
115                 120                 125             
Gln Ala Asp Gly Gly Trp Pro Glu Arg Ser Thr Ala Lys Ala Phe Val 
130                 135                 140                 
Glu Tyr Ala Asp Val Val Ser Arg Ala Leu Gly Asp Arg Val Lys Ser 
145                 150                 155                 160 
Trp Ile Thr His Asn Glu Pro Trp Cys Ile Ser Met Leu Ser His Gln 
165                 170                 175     
Ile Gly Glu His Ala Pro Gly Trp Arg Asp Trp Gln Ala Ala Leu Ala 
180                 185                 190         
Ala Ala His His Val Leu Leu Ser His Gly Trp Ala Val Pro Glu Leu 
195                 200                 205             
Arg Arg Asn Ser Arg Asp Ala Glu Ile Gly Ile Thr Leu Asn Phe Thr 
210                 215                 220                 
Pro Ala Glu Pro Ala Ser Asn Ser Ala Ala Asp Phe Lys Ala Tyr Arg 
225                 230                 235                 240 
Gln Phe Asp Gly Tyr Phe Asn Arg Trp Phe Leu Asp Pro Leu Tyr Gly 
245                 250                 255     
Arg His Tyr Pro Ala Asp Met Val His Asp Tyr Ile Ala Gln Gly Tyr 
260                 265                 270         
Leu Pro Ser Gln Gly Leu Thr Phe Val Glu Ala Gly Asp Leu Asp Ala 
275                 280                 285             
Ile Ala Thr Arg Thr Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Glu 
290                 295                 300                 
Val Val Arg Ser Gln Glu Ile Pro Glu Ser Glu Asn Ala Pro Arg Thr 
305                 310                 315                 320 
Val Leu Arg Ala Pro Gln Glu Glu Trp Thr Glu Met Gly Trp Glu Val 
325                 330                 335     
Tyr Pro Glu Gly Leu Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Leu His Phe Glu Tyr 
340                 345                 350         
Gln Pro Arg Lys Leu Tyr Val Thr Glu Ser Gly Cys Ser Tyr Ser Asp 
355                 360                 365             
Gly Pro Gly Pro Asn Gly Arg Ile Pro Asp Gln Arg Arg Ile Asn Tyr 
370                 375                 380                 
Leu Arg Asp His Phe Ala Ala Ala His Gln Ala Ile Gln Cys Gly Val 
385                 390                 395                 400 
Pro Leu Ala Gly Tyr Phe Val Trp Ser Phe Met Asp Asn Phe Glu Trp 
405                 410                 415     
Ala Lys Gly Tyr Thr Gln Arg Phe Gly Ile Val Trp Val Asp Tyr Gln 
420                 425                 430         
Ser Gln Arg Arg Ile Pro Lys Asp Ser Ala Tyr Trp Tyr Arg Asp Val 
435                 440                 445             
Val Ala Ala Asn Ala Val Gln Val Pro Asp 
450                 455             
<210> 47
<211> 1353
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 47
atgaaaaaat acctttttcc tgaaaatttt ttatggggtg ctgccacagc ttcgtatcaa     60
atcgaaggtt ctccctctgc tgatggcaaa ggtgaatcga tatgggaccg tttttctcac    120
acaccgggga acatttggaa cgctgaaacc ggggatatcg cctgcgatca ttaccggcgt    180
tacgtggatg atgtaaagct gatttcacaa atcgggctta acgcgtaccg tttttcaatt    240
tcctggccca gggtatttcc agaggggaga ggaaaagcaa atgaaaaagg actcgatttt    300
taccgcaggt tgattgaaca gctgcagcaa catcgaatca aaacggcagt gacactttac    360
cactgggatc ttccacaagt tctgcaggat cgcggcgggt gggcaaaccg tgatacggcg    420
aagtattttt ctgagtatgc cacctttctc tttgaaaaac tcgatctccc cgttgacatg    480
tggattactc ttaacgaacc atgggttatc gctattctgg ggcatgcttt tggtatccac    540
gctccaggga tgagtgactt cagcacagcc ctccaggtct cgcataacct gcttctgggg    600
cacgggttgg cggttaaagc atttcgggag tctaagaggg gtgatgaacc ggtaggtatt    660
acccttaacc ttgccccggt tgaaccgctg accgaaaagc ccgccgatct aaaggcagct    720
ttactttctg acggttttat gaaccgctgg taccttgatc ccctgttcaa aggtggttac    780
cctgaagata tgatggatat ctattcccgg aactttgaac tgcccaaaat tgaaaagggg    840
gatgctcagg ttattgccga accgatcgac ttcctgggca taaataacta taccagggtt    900
ctcgtggaag ccagcggtga tgaaaatgcc tttatgggca accctgtcaa cccccagggc    960
tctgaatata ctgaaatggg ttgggaggtt tatccgcagg gtctctacga cctgctgacc   1020
agggttcacc gggattacgg gccaatgccg ctatatataa ctgaaaacgg ggcagccttt   1080
cccgatgaac ttgacagcaa tgggcagata gatgatccaa ggcggataaa ttacctggaa   1140
acttatcttc atcagtgctg gaaggcagtt caggacggtg tgcctctaaa aggctatttt   1200
gtctggaccc tgatggataa cttcgagtgg gctttcggtt tcagcaagcg atttgggctc   1260
atatacgtag attaccagga tcagaaacgt tacttgaaaa acagcgccta ctggtatagc   1320
aaggttattg ggcgaaacgg cctcgagcta taa                                1353
<210> 48
<211> 450
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (4)...(448)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (10)...(24)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (300)...(303)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (356)...(364)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 48
Met Lys Lys Tyr Leu Phe Pro Glu Asn Phe Leu Trp Gly Ala Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ser Pro Ser Ala Asp Gly Lys Gly Glu 
20                  25                  30          
Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser His Thr Pro Gly Asn Ile Trp Asn Ala 
35                  40                  45              
Glu Thr Gly Asp Ile Ala Cys Asp His Tyr Arg Arg Tyr Val Asp Asp 
50                  55                  60                  
Val Lys Leu Ile Ser Gln Ile Gly Leu Asn Ala Tyr Arg Phe Ser Ile 
65                  70                  75                  80  
Ser Trp Pro Arg Val Phe Pro Glu Gly Arg Gly Lys Ala Asn Glu Lys 
85                  90                  95      
Gly Leu Asp Phe Tyr Arg Arg Leu Ile Glu Gln Leu Gln Gln His Arg 
100                 105                 110         
Ile Lys Thr Ala Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Val Leu 
115                 120                 125             
Gln Asp Arg Gly Gly Trp Ala Asn Arg Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Ser 
130                 135                 140                 
Glu Tyr Ala Thr Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asp Leu Pro Val Asp Met 
145                 150                 155                 160 
Trp Ile Thr Leu Asn Glu Pro Trp Val Ile Ala Ile Leu Gly His Ala 
165                 170                 175     
Phe Gly Ile His Ala Pro Gly Met Ser Asp Phe Ser Thr Ala Leu Gln 
180                 185                 190         
Val Ser His Asn Leu Leu Leu Gly His Gly Leu Ala Val Lys Ala Phe 
195                 200                 205             
Arg Glu Ser Lys Arg Gly Asp Glu Pro Val Gly Ile Thr Leu Asn Leu 
210                 215                 220                 
Ala Pro Val Glu Pro Leu Thr Glu Lys Pro Ala Asp Leu Lys Ala Ala 
225                 230                 235                 240 
Leu Leu Ser Asp Gly Phe Met Asn Arg Trp Tyr Leu Asp Pro Leu Phe 
245                 250                 255     
Lys Gly Gly Tyr Pro Glu Asp Met Met Asp Ile Tyr Ser Arg Asn Phe 
260                 265                 270         
Glu Leu Pro Lys Ile Glu Lys Gly Asp Ala Gln Val Ile Ala Glu Pro 
275                 280                 285             
Ile Asp Phe Leu Gly Ile Asn Asn Tyr Thr Arg Val Leu Val Glu Ala 
290                 295                 300                 
Ser Gly Asp Glu Asn Ala Phe Met Gly Asn Pro Val Asn Pro Gln Gly 
305                 310                 315                 320 
Ser Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Gln Gly Leu Tyr 
325                 330                 335     
Asp Leu Leu Thr Arg Val His Arg Asp Tyr Gly Pro Met Pro Leu Tyr 
340                 345                 350         
Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ala Phe Pro Asp Glu Leu Asp Ser Asn Gly 
355                 360                 365             
Gln Ile Asp Asp Pro Arg Arg Ile Asn Tyr Leu Glu Thr Tyr Leu His 
370                 375                 380                 
Gln Cys Trp Lys Ala Val Gln Asp Gly Val Pro Leu Lys Gly Tyr Phe 
385                 390                 395                 400 
Val Trp Thr Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala Phe Gly Phe Ser Lys 
405                 410                 415     
Arg Phe Gly Leu Ile Tyr Val Asp Tyr Gln Asp Gln Lys Arg Tyr Leu 
420                 425                 430         
Lys Asn Ser Ala Tyr Trp Tyr Ser Lys Val Ile Gly Arg Asn Gly Leu 
435                 440                 445             
Glu Leu 
450 
<210> 49
<211> 591
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 49
atggactttg agcgggcagt tgacaggaat atcattagat tacgctcttc gttaaaggaa     60
gaaatgaagg atctagttgc agttgaagct ccggtaacaa tatttttaaa tggcagcgag    120
ctggtaaccc tgctctgcac cccggagaaa attgatcgtt tggccctcgg tttccttcat    180
tcagaagggc tgcttaactc acttgatgat cttagtatga tcaggaccag ggagagcgaa    240
ggcctggttg aaattgaact taaagaggcc tcgccggcac ttgataaatt atacgggaag    300
aggacaatta cttccggttg cggtaaggga acaatttttt ttaatgttct cgattctctg    360
cgcagtaaac cactcgacgg aaagcttgtg attacaaccg aagagattca taaattaatg    420
gatgacctgc aggggcgggc ggaactgttc aaggctaccg ggggtgttca cagcgctgcg    480
cttgccgaca gaaaggaaat actctttttc agtgaagata tcggccgcca taatgctatc    540
gataaaattg tgggagagtg tttgctggag ggggtatctc ctgaagataa g             591
<210> 50
<211> 197
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (17)...(195)
<223> FdhD/NarQ family
<220> 
<221> SITE
<222> (37)...(40)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 50
Met Asp Phe Glu Arg Ala Val Asp Arg Asn Ile Ile Arg Leu Arg Ser 
1               5                   10                  15      
Ser Leu Lys Glu Glu Met Lys Asp Leu Val Ala Val Glu Ala Pro Val 
20                  25                  30          
Thr Ile Phe Leu Asn Gly Ser Glu Leu Val Thr Leu Leu Cys Thr Pro 
35                  40                  45              
Glu Lys Ile Asp Arg Leu Ala Leu Gly Phe Leu His Ser Glu Gly Leu 
50                  55                  60                  
Leu Asn Ser Leu Asp Asp Leu Ser Met Ile Arg Thr Arg Glu Ser Glu 
65                  70                  75                  80  
Gly Leu Val Glu Ile Glu Leu Lys Glu Ala Ser Pro Ala Leu Asp Lys 
85                  90                  95      
Leu Tyr Gly Lys Arg Thr Ile Thr Ser Gly Cys Gly Lys Gly Thr Ile 
100                 105                 110         
Phe Phe Asn Val Leu Asp Ser Leu Arg Ser Lys Pro Leu Asp Gly Lys 
115                 120                 125             
Leu Val Ile Thr Thr Glu Glu Ile His Lys Leu Met Asp Asp Leu Gln 
130                 135                 140                 
Gly Arg Ala Glu Leu Phe Lys Ala Thr Gly Gly Val His Ser Ala Ala 
145                 150                 155                 160 
Leu Ala Asp Arg Lys Glu Ile Leu Phe Phe Ser Glu Asp Ile Gly Arg 
165                 170                 175     
His Asn Ala Ile Asp Lys Ile Val Gly Glu Cys Leu Leu Glu Gly Val 
180                 185                 190         
Ser Pro Glu Asp Lys 
195         
<210> 51
<211> 1014
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 51
atgtccaggg gcatcctgat cctcgtcatg ctgtctgttc tgagcggcgc ggcgctggcc     60
caaccggccg ggctgccgcc gcgttcgccg gtgcagcgct gcatcaacct gggcaatatg    120
ctggaagcgc cggaggaggg ctggtggggg ctgcgcgtcg agcgcgacta cctgacgacg    180
atcgccgggg ccgggttcga tgcggtgcgc atcccgataa gctggtcaac ccatgctgcc    240
agcgagccgc cctacaccat cgatccggct ttcttcgccc gcgttgatga agtcgtcggc    300
tgggcgctgg cggacgggct gaaggccatc atcaacgtgc accactacga ggagatgatg    360
agcgatccgg cggggcattt cccccggctg cgcgcgctgt gggcgcagat cgcggagcac    420
tacgccgact acccgcccgc gctgatgttc gagctgctca acgaaccgtt cgaggcgctg    480
acgccgctgc ggtggaacga gtacgccgcc gatctgatcg cgctgatccg ccagaccaac    540
ccggggcgca ccctgatcgt cggcgggggc tggtggaaca gtgtggaagg gctgatgcag    600
ctccgcctgc cggatgatcc cgatctgctg gcgacgttcc attactacca cccgttcgag    660
ttcacgcatc agggggcgga gtggtcaccg gaagtgactg acctgagcgg gatcgcctgg    720
gggacgggcg aggaacggct cgatctggag tccaatatcc gtattgcggc ggcctgggcg    780
gtgtacaacc ggcgcccgct gctgttgggc gaattcggcg tctatggccg ggtggccgat    840
ctcgattcgc gcctgcgctg gacgacggcg gtgcgcgccg aggccgaggc gcagggcatc    900
ggctggtgct actgggaatt cgccgccggc ttcggcattt acgacccgga aagccggacg    960
ttcaacccgc tgtaccgcgc gctgatcccg caggccgggc cggcgcgccc ctga         1014
<210> 52
<211> 337
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(20)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (38)...(314)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (150)...(159)
<223> Glycosyl hydrolases family 5 signature. Prosite id = PS00659
<400> 52
Met Ser Arg Gly Ile Leu Ile Leu Val Met Leu Ser Val Leu Ser Gly 
1               5                   10                  15      
Ala Ala Leu Ala Gln Pro Ala Gly Leu Pro Pro Arg Ser Pro Val Gln 
20                  25                  30          
Arg Cys Ile Asn Leu Gly Asn Met Leu Glu Ala Pro Glu Glu Gly Trp 
35                  40                  45              
Trp Gly Leu Arg Val Glu Arg Asp Tyr Leu Thr Thr Ile Ala Gly Ala 
50                  55                  60                  
Gly Phe Asp Ala Val Arg Ile Pro Ile Ser Trp Ser Thr His Ala Ala 
65                  70                  75                  80  
Ser Glu Pro Pro Tyr Thr Ile Asp Pro Ala Phe Phe Ala Arg Val Asp 
85                  90                  95      
Glu Val Val Gly Trp Ala Leu Ala Asp Gly Leu Lys Ala Ile Ile Asn 
100                 105                 110         
Val His His Tyr Glu Glu Met Met Ser Asp Pro Ala Gly His Phe Pro 
115                 120                 125             
Arg Leu Arg Ala Leu Trp Ala Gln Ile Ala Glu His Tyr Ala Asp Tyr 
130                 135                 140                 
Pro Pro Ala Leu Met Phe Glu Leu Leu Asn Glu Pro Phe Glu Ala Leu 
145                 150                 155                 160 
Thr Pro Leu Arg Trp Asn Glu Tyr Ala Ala Asp Leu Ile Ala Leu Ile 
165                 170                 175     
Arg Gln Thr Asn Pro Gly Arg Thr Leu Ile Val Gly Gly Gly Trp Trp 
180                 185                 190         
Asn Ser Val Glu Gly Leu Met Gln Leu Arg Leu Pro Asp Asp Pro Asp 
195                 200                 205             
Leu Leu Ala Thr Phe His Tyr Tyr His Pro Phe Glu Phe Thr His Gln 
210                 215                 220                 
Gly Ala Glu Trp Ser Pro Glu Val Thr Asp Leu Ser Gly Ile Ala Trp 
225                 230                 235                 240 
Gly Thr Gly Glu Glu Arg Leu Asp Leu Glu Ser Asn Ile Arg Ile Ala 
245                 250                 255     
Ala Ala Trp Ala Val Tyr Asn Arg Arg Pro Leu Leu Leu Gly Glu Phe 
260                 265                 270         
Gly Val Tyr Gly Arg Val Ala Asp Leu Asp Ser Arg Leu Arg Trp Thr 
275                 280                 285             
Thr Ala Val Arg Ala Glu Ala Glu Ala Gln Gly Ile Gly Trp Cys Tyr 
290                 295                 300                 
Trp Glu Phe Ala Ala Gly Phe Gly Ile Tyr Asp Pro Glu Ser Arg Thr 
305                 310                 315                 320 
Phe Asn Pro Leu Tyr Arg Ala Leu Ile Pro Gln Ala Gly Pro Ala Arg 
325                 330                 335     
Pro 
<210> 53
<211> 1377
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 53
atgtggatgg ttcaagcgac atctttaatt caaaaataca atgtgcctgg cccacgctac     60
accagttatc caacggttcc ttattgggaa agtgagaatt tttcactaaa gcagtggcaa    120
caaacgctca aaaaatcctt tgatgagtcg aatcaaagtg aaggcatcag tctgtatatc    180
catttgccat tttgcgaaag tttatgcacc ttctgtggtt gccataaacg tgtgactaaa    240
aagcatgaga tggaaaagcc ttatatccaa gcggtattaa aagaatggga tttatattgc    300
caacttttgg tggataaacc tgtcattaaa gaaattcatt tgggtggggg aactccgaca    360
ttttttagtc ctgaacattt aacgcagctg attaagggga tattggctaa agccgaagtt    420
gcagatgagc atgagtttag ttttgaagga catcccaaca atacgacacg tgaacatttg    480
caagcgctct atgatgttgg atttcgacgt gtcagttatg gcgtgcagga ctataacgaa    540
actgtgcaaa aagccattca ccgcattcag ccctatgaaa atgttaaaaa tgtcaccgag    600
tgggcgcgtg agattggcta tacctctatt tcgcatgatt tggtctttgg cctgccgttt    660
caaagtttag acgatgtctt aaatacgatt gatcaaacca ataccttaat gccggatcgt    720
ttggctttgt atagctatgc ccatgtgcca tggattaaag gcaatggtca acgcggtttt    780
aaagatgctg atgtcccgaa agacgagatt aaacgtcaat gttatgagga aggcaaaaaa    840
aaattattag aacatggcta tcatgaaatt ggtatggatc attttgctct agaacaagac    900
agtatgtatc agtcttttaa agcagggagc ttgcatcgta atttcatggg ttataccgca    960
tcgaaaacgc aagtgatgat tgggcttggg atttcatcaa ttagtgacag ttggtacagc   1020
tttgcgcaaa acgtgaaaac attagatgaa tattatacct tgctagaaaa aaatcagatt   1080
cccgtgttta aagggcatgt cttgaatcag gaagatttga tcatccgtaa acatatttta   1140
aatttgatgt gtggcttcca aacctcatgg gcaaatcccg atatgcaatt tcctgaaatt   1200
cagtctgttt tggcacaatt agcagaaatg cagcaagatg gtttgattca aattgaagac   1260
gcatcggtca cagttttaga agcgggcaag ccttttgttc gaaatatttg tatggccttt   1320
gatttaagac tcaagcgcaa caagcctgag aatcggattt tttcgatgac gatttaa      1377
<210> 54
<211> 458
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (59)...(233)
<223> Radical SAM superfamily
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (316)...(431)
<223> HemN C-terminal region
<220> 
<221> SITE
<222> (33)...(36)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (51)...(54)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (155)...(158)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (181)...(184)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (200)...(203)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 54
Met Trp Met Val Gln Ala Thr Ser Leu Ile Gln Lys Tyr Asn Val Pro 
1               5                   10                  15      
Gly Pro Arg Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr Val Pro Tyr Trp Glu Ser Glu 
20                  25                  30          
Asn Phe Ser Leu Lys Gln Trp Gln Gln Thr Leu Lys Lys Ser Phe Asp 
35                  40                  45              
Glu Ser Asn Gln Ser Glu Gly Ile Ser Leu Tyr Ile His Leu Pro Phe 
50                  55                  60                  
Cys Glu Ser Leu Cys Thr Phe Cys Gly Cys His Lys Arg Val Thr Lys 
65                  70                  75                  80  
Lys His Glu Met Glu Lys Pro Tyr Ile Gln Ala Val Leu Lys Glu Trp 
85                  90                  95      
Asp Leu Tyr Cys Gln Leu Leu Val Asp Lys Pro Val Ile Lys Glu Ile 
100                 105                 110         
His Leu Gly Gly Gly Thr Pro Thr Phe Phe Ser Pro Glu His Leu Thr 
115                 120                 125             
Gln Leu Ile Lys Gly Ile Leu Ala Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu His 
130                 135                 140                 
Glu Phe Ser Phe Glu Gly His Pro Asn Asn Thr Thr Arg Glu His Leu 
145                 150                 155                 160 
Gln Ala Leu Tyr Asp Val Gly Phe Arg Arg Val Ser Tyr Gly Val Gln 
165                 170                 175     
Asp Tyr Asn Glu Thr Val Gln Lys Ala Ile His Arg Ile Gln Pro Tyr 
180                 185                 190         
Glu Asn Val Lys Asn Val Thr Glu Trp Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Thr 
195                 200                 205             
Ser Ile Ser His Asp Leu Val Phe Gly Leu Pro Phe Gln Ser Leu Asp 
210                 215                 220                 
Asp Val Leu Asn Thr Ile Asp Gln Thr Asn Thr Leu Met Pro Asp Arg 
225                 230                 235                 240 
Leu Ala Leu Tyr Ser Tyr Ala His Val Pro Trp Ile Lys Gly Asn Gly 
245                 250                 255     
Gln Arg Gly Phe Lys Asp Ala Asp Val Pro Lys Asp Glu Ile Lys Arg 
260                 265                 270         
Gln Cys Tyr Glu Glu Gly Lys Lys Lys Leu Leu Glu His Gly Tyr His 
275                 280                 285             
Glu Ile Gly Met Asp His Phe Ala Leu Glu Gln Asp Ser Met Tyr Gln 
290                 295                 300                 
Ser Phe Lys Ala Gly Ser Leu His Arg Asn Phe Met Gly Tyr Thr Ala 
305                 310                 315                 320 
Ser Lys Thr Gln Val Met Ile Gly Leu Gly Ile Ser Ser Ile Ser Asp 
325                 330                 335     
Ser Trp Tyr Ser Phe Ala Gln Asn Val Lys Thr Leu Asp Glu Tyr Tyr 
340                 345                 350         
Thr Leu Leu Glu Lys Asn Gln Ile Pro Val Phe Lys Gly His Val Leu 
355                 360                 365             
Asn Gln Glu Asp Leu Ile Ile Arg Lys His Ile Leu Asn Leu Met Cys 
370                 375                 380                 
Gly Phe Gln Thr Ser Trp Ala Asn Pro Asp Met Gln Phe Pro Glu Ile 
385                 390                 395                 400 
Gln Ser Val Leu Ala Gln Leu Ala Glu Met Gln Gln Asp Gly Leu Ile 
405                 410                 415     
Gln Ile Glu Asp Ala Ser Val Thr Val Leu Glu Ala Gly Lys Pro Phe 
420                 425                 430         
Val Arg Asn Ile Cys Met Ala Phe Asp Leu Arg Leu Lys Arg Asn Lys 
435                 440                 445             
Pro Glu Asn Arg Ile Phe Ser Met Thr Ile 
450                 455             
<210> 55
<211> 1389
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 55
atgagcgctt cgagtccctc ccgccccctg tccttcccag agcagttcgt ctggggtgct     60
gccgcggcct cctaccaagt cgagggcgcc gtccacgagg acgggaaggg cccctccgtc    120
tgggacatgt tctgcgagaa gcccggagcg gtcttccagg ggcacgacgg ggcggtggct    180
tgcgaccact atcaccgcta ccgagaggac gtggcgttga tgcgacaggt gggcctgcac    240
gcctaccgcc tgagcgtgtg ctggccccga gtgctcccgg agggcgtcgg gcagcccaac    300
gagaagggcc tcgacttcta ctcgcggttg gtggacgcgc tgctcgaggc agggattacg    360
ccctgggtaa cgctttttca ttgggactac cccttggctc tctatcaccg ggggggctgg    420
ctcaaccggg atagcgcgga ttggtttgcc gagtacgcgg gcctaatcgc cgatcgcctc    480
tccgaccggg tgcagcattt cttcactcag aacgagcccc aggtctatat cggcttcgga    540
cacctcgagg gtaagcatgc tccaggagac accttgccca tgtcccaggt gctgcttgcg    600
gggcatcata gcctactggc gcacggcaag gccgtgcagg cgctccgcgc ccaggcgaag    660
cagcagctgc gcgtcggcta cgctcccgtc ggcatgcccc tccatccctt cacggactcg    720
gccgaggacg tggccgctgc gcggaaggcg accttttggg ttcgggagaa gaactcctgg    780
aacaacgcct ggtggatgga cccggtgttc ttgggtgagt acccggctca gggcctcgcc    840
ttcttcggcc gggacgtgcc gcaggtgcgc gagggagaca tgcagctcat cgcgcagccc    900
ttggacttct ttggggtcaa catctaccag agcacccccg tgcgcgcgtc tagcgccgaa    960
agcggcttcg aggtcgtccc ccatccaacg ggctatccta tcactgcctt caactggccg   1020
atcacgcccc aggccctcta ctggggtccg cgcttcttct acgagcgcta ccagaagccg   1080
atcgtcatca cggagaacgg actgtcctgt cgggacgtcg tcgctgtgga cgggaaggtt   1140
cacgatccgg ctcgcatcga tttcaccacc cgctatctgc gcgagctcca ccgagccgtc   1200
gcggacggcg tcgcggtcga gggctacttc cactggtcca tcatggacaa cttcgaatgg   1260
gctgccggct accgcgagcg gttcgggctc attcacgtcg actacgagac cctggcgcgg   1320
acgcccaagg cgtccgctgc gtggtatcgc aaggtaatcg agagcaacgg agcgaccctt   1380
ttcggatga                                                           1389
<210> 56
<211> 462
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (8)...(458)
<223> Glycosyl hydrolase family 1
<220> 
<221> SITE
<222> (16)...(30)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 N-terminal signature. Prosite id = 
PS00653
<220> 
<221> SITE
<222> (366)...(374)
<223> Glycosyl hydrolases family 1 active site. Prosite id = PS00572
<400> 56
Met Ser Ala Ser Ser Pro Ser Arg Pro Leu Ser Phe Pro Glu Gln Phe 
1               5                   10                  15      
Val Trp Gly Ala Ala Ala Ala Ser Tyr Gln Val Glu Gly Ala Val His 
20                  25                  30          
Glu Asp Gly Lys Gly Pro Ser Val Trp Asp Met Phe Cys Glu Lys Pro 
35                  40                  45              
Gly Ala Val Phe Gln Gly His Asp Gly Ala Val Ala Cys Asp His Tyr 
50                  55                  60                  
His Arg Tyr Arg Glu Asp Val Ala Leu Met Arg Gln Val Gly Leu His 
65                  70                  75                  80  
Ala Tyr Arg Leu Ser Val Cys Trp Pro Arg Val Leu Pro Glu Gly Val 
85                  90                  95      
Gly Gln Pro Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Arg Leu Val Asp 
100                 105                 110         
Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ile Thr Pro Trp Val Thr Leu Phe His Trp 
115                 120                 125             
Asp Tyr Pro Leu Ala Leu Tyr His Arg Gly Gly Trp Leu Asn Arg Asp 
130                 135                 140                 
Ser Ala Asp Trp Phe Ala Glu Tyr Ala Gly Leu Ile Ala Asp Arg Leu 
145                 150                 155                 160 
Ser Asp Arg Val Gln His Phe Phe Thr Gln Asn Glu Pro Gln Val Tyr 
165                 170                 175     
Ile Gly Phe Gly His Leu Glu Gly Lys His Ala Pro Gly Asp Thr Leu 
180                 185                 190         
Pro Met Ser Gln Val Leu Leu Ala Gly His His Ser Leu Leu Ala His 
195                 200                 205             
Gly Lys Ala Val Gln Ala Leu Arg Ala Gln Ala Lys Gln Gln Leu Arg 
210                 215                 220                 
Val Gly Tyr Ala Pro Val Gly Met Pro Leu His Pro Phe Thr Asp Ser 
225                 230                 235                 240 
Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Arg Lys Ala Thr Phe Trp Val Arg Glu 
245                 250                 255     
Lys Asn Ser Trp Asn Asn Ala Trp Trp Met Asp Pro Val Phe Leu Gly 
260                 265                 270         
Glu Tyr Pro Ala Gln Gly Leu Ala Phe Phe Gly Arg Asp Val Pro Gln 
275                 280                 285             
Val Arg Glu Gly Asp Met Gln Leu Ile Ala Gln Pro Leu Asp Phe Phe 
290                 295                 300                 
Gly Val Asn Ile Tyr Gln Ser Thr Pro Val Arg Ala Ser Ser Ala Glu 
305                 310                 315                 320 
Ser Gly Phe Glu Val Val Pro His Pro Thr Gly Tyr Pro Ile Thr Ala 
325                 330                 335     
Phe Asn Trp Pro Ile Thr Pro Gln Ala Leu Tyr Trp Gly Pro Arg Phe 
340                 345                 350         
Phe Tyr Glu Arg Tyr Gln Lys Pro Ile Val Ile Thr Glu Asn Gly Leu 
355                 360                 365             
Ser Cys Arg Asp Val Val Ala Val Asp Gly Lys Val His Asp Pro Ala 
370                 375                 380                 
Arg Ile Asp Phe Thr Thr Arg Tyr Leu Arg Glu Leu His Arg Ala Val 
385                 390                 395                 400 
Ala Asp Gly Val Ala Val Glu Gly Tyr Phe His Trp Ser Ile Met Asp 
405                 410                 415     
Asn Phe Glu Trp Ala Ala Gly Tyr Arg Glu Arg Phe Gly Leu Ile His 
420                 425                 430         
Val Asp Tyr Glu Thr Leu Ala Arg Thr Pro Lys Ala Ser Ala Ala Trp 
435                 440                 445             
Tyr Arg Lys Val Ile Glu Ser Asn Gly Ala Thr Leu Phe Gly 
450                 455                 460         
<210> 57
<211> 414
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 57
atgattgctt catctatgtt ctatggaacg gttcgtggaa tacaagagct aactcaaaac     60
gttattgcat tggataccgc aatggtttcg cttaccagag ttgctgacgg aagtgatttt    120
gagtttgata gagttattga acgctcgatt gaaaacgtaa ccgaactatc aggtaagcta    180
actgattaca tggatttagt aacggagttt gctagaactg gtaaaacaat agatgaatct    240
tttaatttag ctaatacaac acaaatgtta atgaatattt ctgaattaac agcagatgaa    300
tcagtaaata gtttaactgc cgcaatgatt gcttttaata ttaacgcaga tgatagtatt    360
agaattgctg ataagttgaa tgaggttaac aatatcagcc tccttttgtg gtaa          414
<210> 58
<211> 137
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SITE
<222> (52)...(55)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (86)...(89)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (93)...(96)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (133)...(136)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 58
Met Ile Ala Ser Ser Met Phe Tyr Gly Thr Val Arg Gly Ile Gln Glu 
1               5                   10                  15      
Leu Thr Gln Asn Val Ile Ala Leu Asp Thr Ala Met Val Ser Leu Thr 
20                  25                  30          
Arg Val Ala Asp Gly Ser Asp Phe Glu Phe Asp Arg Val Ile Glu Arg 
35                  40                  45              
Ser Ile Glu Asn Val Thr Glu Leu Ser Gly Lys Leu Thr Asp Tyr Met 
50                  55                  60                  
Asp Leu Val Thr Glu Phe Ala Arg Thr Gly Lys Thr Ile Asp Glu Ser 
65                  70                  75                  80  
Phe Asn Leu Ala Asn Thr Thr Gln Met Leu Met Asn Ile Ser Glu Leu 
85                  90                  95      
Thr Ala Asp Glu Ser Val Asn Ser Leu Thr Ala Ala Met Ile Ala Phe 
100                 105                 110         
Asn Ile Asn Ala Asp Asp Ser Ile Arg Ile Ala Asp Lys Leu Asn Glu 
115                 120                 125             
Val Asn Asn Ile Ser Leu Leu Leu Trp 
130                 135         
<210> 59
<211> 1044
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 59
atgagaattt ttgaaggatt tcagcgaggt gtaaaccttg gcggctggat ctcccagttc     60
gacaagtacg accatgagca tttccgcagc tttattacgg aaaatgacat cgccgccatt    120
gcagctcttg gttttgacca tgtccgcgtg ccggtggatt ataacgtgct ggaggatgag    180
gagggcaacc gcatcgacag cggatttgtc tacctgagaa gctgctacga gtggtgccgc    240
aaacacgacc tgaacatgct ggtggatctt cacgagtgct acggctactc cttcgatccg    300
ctgaaaaaag atatggaccg caaacgcttc ttctatgccg aagctctgca ggagcgtttt    360
ctgaagctct gggagcagat ctgtgaaacc tttaaagacg atcctgtgca cgtggcattc    420
gagccgctga atgagatcgt tttaggagag gtcgcagacg cctggaacgt gatgatccgc    480
aaatatatca agaccgtccg cgccatctgc ccggagcact atctggtcct tggaagcgtg    540
cactacagcc acgttaccac catccctctt cttgaggcac cggcagatga caagatcgtc    600
ttcaacttcc actgctacga gccgctggtc ttcacccacc agggcgcata ctggctggag    660
gatatgattc cggatttccg catgacctat cctgccacca tggaagagtt ctacgaagca    720
acaaagaaga tcctgccaaa catgagtccg gatggattta aggatttcga tcaggagatg    780
ggtccgggct tctttgagaa gatcttcaca ccggccctga aacgtgccga gcaggacaat    840
gtagccctct actgcggcga gtacggcgtc attgatctgg cagataacca tgccaagatc    900
cgctggctca aagacatcca caccaccttc tccaaatacg gcatcggaag tgccctctgg    960
aactacaagg gcaaggattt cggctatgta gatgatcgct tcgccgagtg cagagaagca   1020
tttatcgagt gcctgaaggc ctga                                          1044
<210> 60
<211> 347
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (14)...(330)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<400> 60
Met Arg Ile Phe Glu Gly Phe Gln Arg Gly Val Asn Leu Gly Gly Trp 
1               5                   10                  15      
Ile Ser Gln Phe Asp Lys Tyr Asp His Glu His Phe Arg Ser Phe Ile 
20                  25                  30          
Thr Glu Asn Asp Ile Ala Ala Ile Ala Ala Leu Gly Phe Asp His Val 
35                  40                  45              
Arg Val Pro Val Asp Tyr Asn Val Leu Glu Asp Glu Glu Gly Asn Arg 
50                  55                  60                  
Ile Asp Ser Gly Phe Val Tyr Leu Arg Ser Cys Tyr Glu Trp Cys Arg 
65                  70                  75                  80  
Lys His Asp Leu Asn Met Leu Val Asp Leu His Glu Cys Tyr Gly Tyr 
85                  90                  95      
Ser Phe Asp Pro Leu Lys Lys Asp Met Asp Arg Lys Arg Phe Phe Tyr 
100                 105                 110         
Ala Glu Ala Leu Gln Glu Arg Phe Leu Lys Leu Trp Glu Gln Ile Cys 
115                 120                 125             
Glu Thr Phe Lys Asp Asp Pro Val His Val Ala Phe Glu Pro Leu Asn 
130                 135                 140                 
Glu Ile Val Leu Gly Glu Val Ala Asp Ala Trp Asn Val Met Ile Arg 
145                 150                 155                 160 
Lys Tyr Ile Lys Thr Val Arg Ala Ile Cys Pro Glu His Tyr Leu Val 
165                 170                 175     
Leu Gly Ser Val His Tyr Ser His Val Thr Thr Ile Pro Leu Leu Glu 
180                 185                 190         
Ala Pro Ala Asp Asp Lys Ile Val Phe Asn Phe His Cys Tyr Glu Pro 
195                 200                 205             
Leu Val Phe Thr His Gln Gly Ala Tyr Trp Leu Glu Asp Met Ile Pro 
210                 215                 220                 
Asp Phe Arg Met Thr Tyr Pro Ala Thr Met Glu Glu Phe Tyr Glu Ala 
225                 230                 235                 240 
Thr Lys Lys Ile Leu Pro Asn Met Ser Pro Asp Gly Phe Lys Asp Phe 
245                 250                 255     
Asp Gln Glu Met Gly Pro Gly Phe Phe Glu Lys Ile Phe Thr Pro Ala 
260                 265                 270         
Leu Lys Arg Ala Glu Gln Asp Asn Val Ala Leu Tyr Cys Gly Glu Tyr 
275                 280                 285             
Gly Val Ile Asp Leu Ala Asp Asn His Ala Lys Ile Arg Trp Leu Lys 
290                 295                 300                 
Asp Ile His Thr Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Trp 
305                 310                 315                 320 
Asn Tyr Lys Gly Lys Asp Phe Gly Tyr Val Asp Asp Arg Phe Ala Glu 
325                 330                 335     
Cys Arg Glu Ala Phe Ile Glu Cys Leu Lys Ala 
340                 345         
<210> 61
<211> 1230
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 61
ttggtatgga caccagctcg atcaacgctt gctggatctt ctgaaatccc actaatgaca     60
atgaatatat tccccaatag aaaagactca cgaatgtccc tctggatcaa gcttggcata    120
ctttgtatga tggctggaac ggtgatggtt cacggagcgc agactggtca aggagaagca    180
acaatgaatc aagcaaatgg cttcaaggta agcaacggga ccaatatcag ccattggttg    240
tcccagtgtt ttgaaacaat gccaccccgg cgcggatttt tctccgaact ggatgttatc    300
ttcatccgct cgctggggat ggatcatttc cgtcttccgg tggacgagaa ggaactttgg    360
acggaggatc ttgagaagat tcccgaagcg tgggattacc tcaggaatgc tctaagctgg    420
gctagaaagc atgagcttcg tgtgattgtg gatcttcacg tcgtgcggtc ccatcacttt    480
aatgcggcaa atgaaggggg aaccaacact ctgtgggatg atccggaggc gcaggaaagt    540
ttcctcaacc tttggaggca gctttcggca gagctcgcct acaccgatgt ggactgggtg    600
gcctatgaga tcatgaatga ggccgtcgcg gatgatccgg aggactggaa tcgtctcatc    660
gccaaagccc actccttgat ccgcgagcgt gagccaaggc gcacactcgt catcggatcc    720
aaccggtggc aaattccgtc aacgttcccg gatctgaaga ttccggacgg agatccgaac    780
atcctcctga gtttccattt ctacgcgcct ctgcttttca cccactatcg ggcaacctgg    840
gttgcctttt acgattatga tgggccggtt tcctatcctg gcaggatcgt tgatgatgca    900
gctcttgaga aaaatgatta tactcctgca ttcaaagaca agattcgtgc gttgaatggt    960
gtgtatgaca tcgacgctct cgaaaaagaa atgcagccgg ctatcgaata cgcaaaacag   1020
aaagggttac cactgtattg cggagagtgg ggatgttttc atgctgtgga aagaaaacaa   1080
cgcttgcaat ggtacaaaga tatatccact attttgaaac gcaatgggat cgcccatgcc   1140
acatgggatt acaagggcga gttcggcatt gtggacactt ggacactagg tgttgattgg   1200
aatttggtag gagcaatcct gtcagagtag                                    1230
<210> 62
<211> 409
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (62)...(390)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (73)...(76)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 62
Met Val Trp Thr Pro Ala Arg Ser Thr Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ile 
1               5                   10                  15      
Pro Leu Met Thr Met Asn Ile Phe Pro Asn Arg Lys Asp Ser Arg Met 
20                  25                  30          
Ser Leu Trp Ile Lys Leu Gly Ile Leu Cys Met Met Ala Gly Thr Val 
35                  40                  45              
Met Val His Gly Ala Gln Thr Gly Gln Gly Glu Ala Thr Met Asn Gln 
50                  55                  60                  
Ala Asn Gly Phe Lys Val Ser Asn Gly Thr Asn Ile Ser His Trp Leu 
65                  70                  75                  80  
Ser Gln Cys Phe Glu Thr Met Pro Pro Arg Arg Gly Phe Phe Ser Glu 
85                  90                  95      
Leu Asp Val Ile Phe Ile Arg Ser Leu Gly Met Asp His Phe Arg Leu 
100                 105                 110         
Pro Val Asp Glu Lys Glu Leu Trp Thr Glu Asp Leu Glu Lys Ile Pro 
115                 120                 125             
Glu Ala Trp Asp Tyr Leu Arg Asn Ala Leu Ser Trp Ala Arg Lys His 
130                 135                 140                 
Glu Leu Arg Val Ile Val Asp Leu His Val Val Arg Ser His His Phe 
145                 150                 155                 160 
Asn Ala Ala Asn Glu Gly Gly Thr Asn Thr Leu Trp Asp Asp Pro Glu 
165                 170                 175     
Ala Gln Glu Ser Phe Leu Asn Leu Trp Arg Gln Leu Ser Ala Glu Leu 
180                 185                 190         
Ala Tyr Thr Asp Val Asp Trp Val Ala Tyr Glu Ile Met Asn Glu Ala 
195                 200                 205             
Val Ala Asp Asp Pro Glu Asp Trp Asn Arg Leu Ile Ala Lys Ala His 
210                 215                 220                 
Ser Leu Ile Arg Glu Arg Glu Pro Arg Arg Thr Leu Val Ile Gly Ser 
225                 230                 235                 240 
Asn Arg Trp Gln Ile Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Lys Ile Pro Asp 
245                 250                 255     
Gly Asp Pro Asn Ile Leu Leu Ser Phe His Phe Tyr Ala Pro Leu Leu 
260                 265                 270         
Phe Thr His Tyr Arg Ala Thr Trp Val Ala Phe Tyr Asp Tyr Asp Gly 
275                 280                 285             
Pro Val Ser Tyr Pro Gly Arg Ile Val Asp Asp Ala Ala Leu Glu Lys 
290                 295                 300                 
Asn Asp Tyr Thr Pro Ala Phe Lys Asp Lys Ile Arg Ala Leu Asn Gly 
305                 310                 315                 320 
Val Tyr Asp Ile Asp Ala Leu Glu Lys Glu Met Gln Pro Ala Ile Glu 
325                 330                 335     
Tyr Ala Lys Gln Lys Gly Leu Pro Leu Tyr Cys Gly Glu Trp Gly Cys 
340                 345                 350         
Phe His Ala Val Glu Arg Lys Gln Arg Leu Gln Trp Tyr Lys Asp Ile 
355                 360                 365             
Ser Thr Ile Leu Lys Arg Asn Gly Ile Ala His Ala Thr Trp Asp Tyr 
370                 375                 380                 
Lys Gly Glu Phe Gly Ile Val Asp Thr Trp Thr Leu Gly Val Asp Trp 
385                 390                 395                 400 
Asn Leu Val Gly Ala Ile Leu Ser Glu 
405                 
<210> 63
<211> 1152
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 63
atgaaacgga gggaattcat gttggggggt gcgggtgttg ctgcgttggc atcgactctt     60
ggagtctccg ccggttccac ttccgggcag ggagtgaacg agaatgtgag ggtataccgg    120
aatgcgattc cccgttggag ggggttcaac ctcatgccct ttttctcggc aatgagcacc    180
aacccggaat acaatggtct gacggtgccg gaggatgacc taaactggat ccgcgactgg    240
ggttttgact atgtccggct tccgattgat tactggattc tggttgattc cgattggcga    300
gatgcaaagc gcatgcgggt agaggatgtt cgcaaggccg accagaaggg atattcacgg    360
ctggacgctg tgattgaagc ctgtatcgcg aagggtttgc acctcaacct gaatatgcat    420
cggtgtcccg ggtattgcat caatggctgg gaactggagc cctataacct cttcaaggat    480
gagcaggcgg aggatgattt tgtctaccat tgggagttgc tcgcgagacg ctataaggga    540
atcgatcctt cgctgctgag tttcaatctg ctgaatgagg ctcccaatcc tggagacaag    600
atgtcgtcgg aggattatcg tcgggtgatg cttcgatccg ctgctgttat tcgggggata    660
agcccggacc gcatgattat tgtggacggg ctggaaatcg gtaaatcagt tgttccaggg    720
ctgatgcatg agccatttgc ccaagctgtt catgcctacg agccccacga gttgagccat    780
tataatgcgc cttggacgtc ggtgtttatg ggtattcctg agccatcctg gccgacagtt    840
cgtttggatg gttctctgtt cgaccgcaag cgactggagt tgtatttcgc gccgtggggg    900
gagttggtcc gccagggggt aggggtccac tgtggggaga ccggttgcta cattcatacg    960
ccccatcggg tgtttctgtc ctggttcgaa gatgttttgg atatcctgac cggatacgac   1020
atagggtggg ctctatggaa tttccgggga gatttcggaa tacttgattc caaacgcaag   1080
gatgtgcaat atgtcgattg gtatggacac cagctcgatc aacgcttgct ggatcttctg   1140
aaatcccact aa                                                       1152
<210> 64
<211> 383
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(24)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (48)...(357)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<400> 64
Met Lys Arg Arg Glu Phe Met Leu Gly Gly Ala Gly Val Ala Ala Leu 
1               5                   10                  15      
Ala Ser Thr Leu Gly Val Ser Ala Gly Ser Thr Ser Gly Gln Gly Val 
20                  25                  30          
Asn Glu Asn Val Arg Val Tyr Arg Asn Ala Ile Pro Arg Trp Arg Gly 
35                  40                  45              
Phe Asn Leu Met Pro Phe Phe Ser Ala Met Ser Thr Asn Pro Glu Tyr 
50                  55                  60                  
Asn Gly Leu Thr Val Pro Glu Asp Asp Leu Asn Trp Ile Arg Asp Trp 
65                  70                  75                  80  
Gly Phe Asp Tyr Val Arg Leu Pro Ile Asp Tyr Trp Ile Leu Val Asp 
85                  90                  95      
Ser Asp Trp Arg Asp Ala Lys Arg Met Arg Val Glu Asp Val Arg Lys 
100                 105                 110         
Ala Asp Gln Lys Gly Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Val Ile Glu Ala Cys 
115                 120                 125             
Ile Ala Lys Gly Leu His Leu Asn Leu Asn Met His Arg Cys Pro Gly 
130                 135                 140                 
Tyr Cys Ile Asn Gly Trp Glu Leu Glu Pro Tyr Asn Leu Phe Lys Asp 
145                 150                 155                 160 
Glu Gln Ala Glu Asp Asp Phe Val Tyr His Trp Glu Leu Leu Ala Arg 
165                 170                 175     
Arg Tyr Lys Gly Ile Asp Pro Ser Leu Leu Ser Phe Asn Leu Leu Asn 
180                 185                 190         
Glu Ala Pro Asn Pro Gly Asp Lys Met Ser Ser Glu Asp Tyr Arg Arg 
195                 200                 205             
Val Met Leu Arg Ser Ala Ala Val Ile Arg Gly Ile Ser Pro Asp Arg 
210                 215                 220                 
Met Ile Ile Val Asp Gly Leu Glu Ile Gly Lys Ser Val Val Pro Gly 
225                 230                 235                 240 
Leu Met His Glu Pro Phe Ala Gln Ala Val His Ala Tyr Glu Pro His 
245                 250                 255     
Glu Leu Ser His Tyr Asn Ala Pro Trp Thr Ser Val Phe Met Gly Ile 
260                 265                 270         
Pro Glu Pro Ser Trp Pro Thr Val Arg Leu Asp Gly Ser Leu Phe Asp 
275                 280                 285             
Arg Lys Arg Leu Glu Leu Tyr Phe Ala Pro Trp Gly Glu Leu Val Arg 
290                 295                 300                 
Gln Gly Val Gly Val His Cys Gly Glu Thr Gly Cys Tyr Ile His Thr 
305                 310                 315                 320 
Pro His Arg Val Phe Leu Ser Trp Phe Glu Asp Val Leu Asp Ile Leu 
325                 330                 335     
Thr Gly Tyr Asp Ile Gly Trp Ala Leu Trp Asn Phe Arg Gly Asp Phe 
340                 345                 350         
Gly Ile Leu Asp Ser Lys Arg Lys Asp Val Gln Tyr Val Asp Trp Tyr 
355                 360                 365             
Gly His Gln Leu Asp Gln Arg Leu Leu Asp Leu Leu Lys Ser His 
370                 375                 380             
<210> 65
<211> 1131
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 65
atgaacacac tcctaccacg gcggcgactg tggtcctcca cggcgatcct gcgcacgctg     60
gcggccgggg cgctggcggc cggtatggtc ctggcacccg tcagtgccgc caacgcggcc    120
accaccctcg gtgcctcggc ggcggagaag ggccggtact tcggtgcggc cgtcgggacg    180
tacaagttca acgacagcac ctacatgtcg gtgctgaacc gcgagttcaa cagcctggtc    240
gccgagaacg agatgaagtg ggacgcgacc gagccccagc gcggcgtgtt caactacagc    300
gccggggacc gcatcgtcaa ccacgcccga tcccagggca tgaaggtacg cggacacgcc    360
ctgttgtggc acgcccagca gccacgctgg acggagggcc tgtccggcgg cgacctgcgc    420
aacgccgcga tcaaccatgt cacccaggtg gccagccact tccgggggca gatctactcc    480
tgggacgtgg tgaacgaggc tttcgccgac ggtggcagcg gtgcccggcg ggactcgaac    540
ctccagcgca ccggcaacga ctggatcgag gcggcgttcc gtgccgcccg ggcagccgat    600
cccaacgcca agctctgcta caacgactac aacaccgacg ggatcaacgc gaagtccacc    660
ggcgtctaca acatggtgcg tgacttcaag tcccgtgggg tgccgatcga ctgcgtgggc    720
ttccagtcac acctgggcac caccctcccc ggtgactacc aggccaacct tcagcgcttc    780
gccgacctgg gcgtcgacgt ggagatcacc gagctggaca tcacccaggg cggaaaccag    840
gccaacatgt acggcgccgt cacccgcgcc tgcctggcga tctcgcgctg caccggcatc    900
accgtgtggg gggtacggga ctgcgactcc tggcgtggtg gggacaacgc cctgctgttc    960
gactgcgccg gcaacaagaa gcccgcgtac acggccgtcc tcgacgccct caacagcggc   1020
tcgaacccga accccaaccc caccggcaac cggctgcgca acgaggcctc cggtcgatgc   1080
ctggacgtca acggcgcaag ctccgccaac gggtcacaaa tgatccaaag a            1131
<210> 66
<211> 377
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(39)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (42)...(337)
<223> Glycosyl hydrolase family 10
<220> 
<221> SITE
<222> (99)...(102)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (268)...(278)
<223> Glycosyl hydrolases family 10 active site. Prosite id = PS00591
<220> 
<221> SITE
<222> (375)...(377)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 66
Met Asn Thr Leu Leu Pro Arg Arg Arg Leu Trp Ser Ser Thr Ala Ile 
1               5                   10                  15      
Leu Arg Thr Leu Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Gly Met Val Leu Ala 
20                  25                  30          
Pro Val Ser Ala Ala Asn Ala Ala Thr Thr Leu Gly Ala Ser Ala Ala 
35                  40                  45              
Glu Lys Gly Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Val Gly Thr Tyr Lys Phe Asn 
50                  55                  60                  
Asp Ser Thr Tyr Met Ser Val Leu Asn Arg Glu Phe Asn Ser Leu Val 
65                  70                  75                  80  
Ala Glu Asn Glu Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Gln Arg Gly Val 
85                  90                  95      
Phe Asn Tyr Ser Ala Gly Asp Arg Ile Val Asn His Ala Arg Ser Gln 
100                 105                 110         
Gly Met Lys Val Arg Gly His Ala Leu Leu Trp His Ala Gln Gln Pro 
115                 120                 125             
Arg Trp Thr Glu Gly Leu Ser Gly Gly Asp Leu Arg Asn Ala Ala Ile 
130                 135                 140                 
Asn His Val Thr Gln Val Ala Ser His Phe Arg Gly Gln Ile Tyr Ser 
145                 150                 155                 160 
Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Arg 
165                 170                 175     
Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile Glu Ala Ala 
180                 185                 190         
Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Cys Tyr Asn 
195                 200                 205             
Asp Tyr Asn Thr Asp Gly Ile Asn Ala Lys Ser Thr Gly Val Tyr Asn 
210                 215                 220                 
Met Val Arg Asp Phe Lys Ser Arg Gly Val Pro Ile Asp Cys Val Gly 
225                 230                 235                 240 
Phe Gln Ser His Leu Gly Thr Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Gln Ala Asn 
245                 250                 255     
Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly Val Asp Val Glu Ile Thr Glu Leu 
260                 265                 270         
Asp Ile Thr Gln Gly Gly Asn Gln Ala Asn Met Tyr Gly Ala Val Thr 
275                 280                 285             
Arg Ala Cys Leu Ala Ile Ser Arg Cys Thr Gly Ile Thr Val Trp Gly 
290                 295                 300                 
Val Arg Asp Cys Asp Ser Trp Arg Gly Gly Asp Asn Ala Leu Leu Phe 
305                 310                 315                 320 
Asp Cys Ala Gly Asn Lys Lys Pro Ala Tyr Thr Ala Val Leu Asp Ala 
325                 330                 335     
Leu Asn Ser Gly Ser Asn Pro Asn Pro Asn Pro Thr Gly Asn Arg Leu 
340                 345                 350         
Arg Asn Glu Ala Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Asn Gly Ala Ser Ser 
355                 360                 365             
Ala Asn Gly Ser Gln Met Ile Gln Arg 
370                 375         
<210> 67
<211> 1023
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 67
atgaaatata tattttcgta tataataatg atgattttaa tcggttttat accggtctat     60
ggattcggcg attcacctga ccaaacatac tctctcccct tcctcagcgt agaaggaaat    120
tcattcgtcg atgaaaacgg tgaggaggtt attttgcggg gtgtatcgtt tcccgatccc    180
aatcgattgg atgatgctac tcaatggaac aaacggtatt tccaggcagc aaaagattgg    240
aactgtaatg tcgtcagaat accggttcat ccgcaaagat ggcgggaaag gggaaaagaa    300
aattatctga aacttttaga taagggtatc gagtgggccg gtgaactcgg tatgtacgtg    360
atcattgact ggcacactat cggcaatccg attaccgaag tgttcttcgg cgagctctat    420
aatacgaccc agaccgaaac gttccggttc tggagaacaa tagcggagcg atatgcaggt    480
aatcccgttg ttgcatttta tgaattgttt aatgaaccga ccgattataa cggtcggctc    540
gggaggatga cctgggatca atataaagaa ttcatcgaag agatcattta tataatttat    600
gcacacgacg aaaccgtgat accgcttgta ggcggtttcg attggggata tgatctcagg    660
aatgttagag ataatccgat aaatgccccg ggtatcgcgt atgttactca cccgtatccg    720
caaaagcggg accaaccgtg ggaagaaaaa tgggaaaggg atttcggttt cgtagccgac    780
acctaccctg tgtttgctac cgagttcgga tttatgagtg aggatggttt gggtgcacat    840
attcccgtta tcggtgatga aacatacggt gaagcgatca tcagttactt caatgagaaa    900
ggtatatcgt ggacggcctg ggtgttcgat ccgctctggt cgccgcagct tattaaagac    960
tggtatttta ccccgacccg gcagggacag ttttttaaag agaagctaat ggagttgaat   1020
taa                                                                 1023
<210> 68
<211> 340
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(23)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (40)...(317)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (143)...(146)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 68
Met Lys Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Ile Met Met Ile Leu Ile Gly Phe 
1               5                   10                  15      
Ile Pro Val Tyr Gly Phe Gly Asp Ser Pro Asp Gln Thr Tyr Ser Leu 
20                  25                  30          
Pro Phe Leu Ser Val Glu Gly Asn Ser Phe Val Asp Glu Asn Gly Glu 
35                  40                  45              
Glu Val Ile Leu Arg Gly Val Ser Phe Pro Asp Pro Asn Arg Leu Asp 
50                  55                  60                  
Asp Ala Thr Gln Trp Asn Lys Arg Tyr Phe Gln Ala Ala Lys Asp Trp 
65                  70                  75                  80  
Asn Cys Asn Val Val Arg Ile Pro Val His Pro Gln Arg Trp Arg Glu 
85                  90                  95      
Arg Gly Lys Glu Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Asp Lys Gly Ile Glu Trp 
100                 105                 110         
Ala Gly Glu Leu Gly Met Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Thr Ile Gly 
115                 120                 125             
Asn Pro Ile Thr Glu Val Phe Phe Gly Glu Leu Tyr Asn Thr Thr Gln 
130                 135                 140                 
Thr Glu Thr Phe Arg Phe Trp Arg Thr Ile Ala Glu Arg Tyr Ala Gly 
145                 150                 155                 160 
Asn Pro Val Val Ala Phe Tyr Glu Leu Phe Asn Glu Pro Thr Asp Tyr 
165                 170                 175     
Asn Gly Arg Leu Gly Arg Met Thr Trp Asp Gln Tyr Lys Glu Phe Ile 
180                 185                 190         
Glu Glu Ile Ile Tyr Ile Ile Tyr Ala His Asp Glu Thr Val Ile Pro 
195                 200                 205             
Leu Val Gly Gly Phe Asp Trp Gly Tyr Asp Leu Arg Asn Val Arg Asp 
210                 215                 220                 
Asn Pro Ile Asn Ala Pro Gly Ile Ala Tyr Val Thr His Pro Tyr Pro 
225                 230                 235                 240 
Gln Lys Arg Asp Gln Pro Trp Glu Glu Lys Trp Glu Arg Asp Phe Gly 
245                 250                 255     
Phe Val Ala Asp Thr Tyr Pro Val Phe Ala Thr Glu Phe Gly Phe Met 
260                 265                 270         
Ser Glu Asp Gly Leu Gly Ala His Ile Pro Val Ile Gly Asp Glu Thr 
275                 280                 285             
Tyr Gly Glu Ala Ile Ile Ser Tyr Phe Asn Glu Lys Gly Ile Ser Trp 
290                 295                 300                 
Thr Ala Trp Val Phe Asp Pro Leu Trp Ser Pro Gln Leu Ile Lys Asp 
305                 310                 315                 320 
Trp Tyr Phe Thr Pro Thr Arg Gln Gly Gln Phe Phe Lys Glu Lys Leu 
325                 330                 335     
Met Glu Leu Asn 
340 
<210> 69
<211> 1182
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 69
atgagtttta aaaaccacat acttttgtcg ctcctcatag tattgctttt cttttcagcg     60
tgcgatatcg aagaaccgat cgccggagat tatcatacac ttgtggatca aaacgctata    120
tcgcacaccc gcgcattatt caccaacctc gaacgtatcc gtcacgatca tatcctcttc    180
ggtcatcagg atgcgcttgc atacggtgtt cactggcgca acgatgagcc gggtcgatcg    240
gatgtattcg aagtaaccgg ttcgtatcct gcggtgtatg gctgggagat tggcgatatt    300
gaacttggtg caccggaaaa tctggataac gtaaacttcg atcaaatgca gggctggatt    360
cgcgaagggt acgaacgcgg cggtataatt acgattagct ggcatatgaa caatccggca    420
tcgggtggtg attcgtggga tgtgaatgga ggtcataaag cggtaactaa gatacttccc    480
ggcggagaac ttcacgatac gtttaaagaa tggctggata cgtttgcaaa attcgcgaag    540
agccagattg cttttcccga aacaaataat gaacacctta tcccggtcat attccggccg    600
tatcatgaaa acaccggaag ctggttctgg tggggcgccg accactgtac acctgaagaa    660
tataaaaagt tatggcgatt taccgtcgaa tacctgcgcg atgtaaaagg tgttcacaat    720
ctcctctggg cgtattcacc tgccggcaat gctgcggatt cagaggaagc atattttgct    780
cggtatcccg gcgacgacta tgttgatatt attggattcg acgattacgg cagtgtgcgg    840
aaaccgtatc aaatcgaacg ttttactaac cggattcgaa cgattgtaaa cttcgccgaa    900
gcacgaaata aaatcccggc aataacggaa accggctatg aaactatccc cgatccgcaa    960
tggtggacgg gtacattgct tagtgcactt gatcacgatt tgacaacccg gagaatagca   1020
tacgtacttg tgtggcgaaa ttcaaacaat gctaccgacc ggcagaatca ttattacgct   1080
ccgtatcccg gacatccaag tgctgacgat tttatcgcgt tcaggaatca cccgttgata   1140
gttttcgaag atgatctgcc gggtatgtat acactaccgt aa                      1182
<210> 70
<211> 393
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(20)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (35)...(351)
<223> Glycosyl hydrolase family 26
<220> 
<221> SITE
<222> (355)...(358)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 70
Met Ser Phe Lys Asn His Ile Leu Leu Ser Leu Leu Ile Val Leu Leu 
1               5                   10                  15      
Phe Phe Ser Ala Cys Asp Ile Glu Glu Pro Ile Ala Gly Asp Tyr His 
20                  25                  30          
Thr Leu Val Asp Gln Asn Ala Ile Ser His Thr Arg Ala Leu Phe Thr 
35                  40                  45              
Asn Leu Glu Arg Ile Arg His Asp His Ile Leu Phe Gly His Gln Asp 
50                  55                  60                  
Ala Leu Ala Tyr Gly Val His Trp Arg Asn Asp Glu Pro Gly Arg Ser 
65                  70                  75                  80  
Asp Val Phe Glu Val Thr Gly Ser Tyr Pro Ala Val Tyr Gly Trp Glu 
85                  90                  95      
Ile Gly Asp Ile Glu Leu Gly Ala Pro Glu Asn Leu Asp Asn Val Asn 
100                 105                 110         
Phe Asp Gln Met Gln Gly Trp Ile Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Gly Gly 
115                 120                 125             
Ile Ile Thr Ile Ser Trp His Met Asn Asn Pro Ala Ser Gly Gly Asp 
130                 135                 140                 
Ser Trp Asp Val Asn Gly Gly His Lys Ala Val Thr Lys Ile Leu Pro 
145                 150                 155                 160 
Gly Gly Glu Leu His Asp Thr Phe Lys Glu Trp Leu Asp Thr Phe Ala 
165                 170                 175     
Lys Phe Ala Lys Ser Gln Ile Ala Phe Pro Glu Thr Asn Asn Glu His 
180                 185                 190         
Leu Ile Pro Val Ile Phe Arg Pro Tyr His Glu Asn Thr Gly Ser Trp 
195                 200                 205             
Phe Trp Trp Gly Ala Asp His Cys Thr Pro Glu Glu Tyr Lys Lys Leu 
210                 215                 220                 
Trp Arg Phe Thr Val Glu Tyr Leu Arg Asp Val Lys Gly Val His Asn 
225                 230                 235                 240 
Leu Leu Trp Ala Tyr Ser Pro Ala Gly Asn Ala Ala Asp Ser Glu Glu 
245                 250                 255     
Ala Tyr Phe Ala Arg Tyr Pro Gly Asp Asp Tyr Val Asp Ile Ile Gly 
260                 265                 270         
Phe Asp Asp Tyr Gly Ser Val Arg Lys Pro Tyr Gln Ile Glu Arg Phe 
275                 280                 285             
Thr Asn Arg Ile Arg Thr Ile Val Asn Phe Ala Glu Ala Arg Asn Lys 
290                 295                 300                 
Ile Pro Ala Ile Thr Glu Thr Gly Tyr Glu Thr Ile Pro Asp Pro Gln 
305                 310                 315                 320 
Trp Trp Thr Gly Thr Leu Leu Ser Ala Leu Asp His Asp Leu Thr Thr 
325                 330                 335     
Arg Arg Ile Ala Tyr Val Leu Val Trp Arg Asn Ser Asn Asn Ala Thr 
340                 345                 350         
Asp Arg Gln Asn His Tyr Tyr Ala Pro Tyr Pro Gly His Pro Ser Ala 
355                 360                 365             
Asp Asp Phe Ile Ala Phe Arg Asn His Pro Leu Ile Val Phe Glu Asp 
370                 375                 380                 
Asp Leu Pro Gly Met Tyr Thr Leu Pro 
385                 390             
<210> 71
<211> 1089
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 71
atgaaacttt taaaactttt aatctttctc cttattacgg taattttttc tgatgtttcg     60
gctcaaactt ttcaaataca aaaaggcaag aacattagcc attggctgtc ccaaagtaaa    120
agaaggggag aagagcgaaa agagttcttt actaagaatg acgtagaatt tattgcaggc    180
atcggcttcg atcatattcg tattcctatt gacgaggagc aaatgtggga tgaaaaaggc    240
aacaaagagc ctgaagcgtt tcagttgctg cacaacgcga tagaatggag caggcaatcg    300
aacttaaaag ttattgtgga cctgcatatt ttgaggtcgc attatttcaa cgcggaagaa    360
aaaccgcttt ttacggaccc taaagctcag gaacgttttt accaatgttg ggcggatctg    420
tctggtgaat tgaaaaaata tccgaataca ctggtggctt atgaattaat gaacgaacct    480
gtagccgatg atccggaaga ctggaataga attgtaagag aatcagtaaa aaggctaagg    540
gtgcttgagc ccaatagggt tattgtaatc gggtctaacc gatggcagca ttatgacact    600
ctgaaggatt tatacgtgcc ggaaaacgac aaaaacatca ttttaagctt tcatttttat    660
aaccctatgt tgcttacgca ttacagggcc agctgggtaa atttcggcga ttaccagggt    720
cccgttaact acccgggaca gttggtagac tcaaagcatt tgtcgggact gagcgaagat    780
ttaagaaaga aagtcgagca aaacaatggc gtttataata aggctcggat tgagaaaatg    840
atagccgaag ccgttgctgt agcaaaaaag cacaacctcc ctttgtattg tggtgaatgg    900
ggtgcctacg aaaaagcgcc aagggagccc aggctacaat ggtacagaga catggtggat    960
gtgttgaaca aaaacaatat tgcctggact acctgggact ataaaggagg cttcggcata   1020
gttgacgcca aaggaaacaa agacgaacag ttgatcaatg tattaacagg aaaagagaaa   1080
aaaatgtaa                                                           1089
<210> 72
<211> 362
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> SIGNAL
<222> (1)...(21)
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (22)...(340)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (31)...(34)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (154)...(163)
<223> Glycosyl hydrolases family 5 signature. Prosite id = PS00659
<400> 72
Met Lys Leu Leu Lys Leu Leu Ile Phe Leu Leu Ile Thr Val Ile Phe 
1               5                   10                  15      
Ser Asp Val Ser Ala Gln Thr Phe Gln Ile Gln Lys Gly Lys Asn Ile 
20                  25                  30          
Ser His Trp Leu Ser Gln Ser Lys Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys Glu 
35                  40                  45              
Phe Phe Thr Lys Asn Asp Val Glu Phe Ile Ala Gly Ile Gly Phe Asp 
50                  55                  60                  
His Ile Arg Ile Pro Ile Asp Glu Glu Gln Met Trp Asp Glu Lys Gly 
65                  70                  75                  80  
Asn Lys Glu Pro Glu Ala Phe Gln Leu Leu His Asn Ala Ile Glu Trp 
85                  90                  95      
Ser Arg Gln Ser Asn Leu Lys Val Ile Val Asp Leu His Ile Leu Arg 
100                 105                 110         
Ser His Tyr Phe Asn Ala Glu Glu Lys Pro Leu Phe Thr Asp Pro Lys 
115                 120                 125             
Ala Gln Glu Arg Phe Tyr Gln Cys Trp Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu 
130                 135                 140                 
Lys Lys Tyr Pro Asn Thr Leu Val Ala Tyr Glu Leu Met Asn Glu Pro 
145                 150                 155                 160 
Val Ala Asp Asp Pro Glu Asp Trp Asn Arg Ile Val Arg Glu Ser Val 
165                 170                 175     
Lys Arg Leu Arg Val Leu Glu Pro Asn Arg Val Ile Val Ile Gly Ser 
180                 185                 190         
Asn Arg Trp Gln His Tyr Asp Thr Leu Lys Asp Leu Tyr Val Pro Glu 
195                 200                 205             
Asn Asp Lys Asn Ile Ile Leu Ser Phe His Phe Tyr Asn Pro Met Leu 
210                 215                 220                 
Leu Thr His Tyr Arg Ala Ser Trp Val Asn Phe Gly Asp Tyr Gln Gly 
225                 230                 235                 240 
Pro Val Asn Tyr Pro Gly Gln Leu Val Asp Ser Lys His Leu Ser Gly 
245                 250                 255     
Leu Ser Glu Asp Leu Arg Lys Lys Val Glu Gln Asn Asn Gly Val Tyr 
260                 265                 270         
Asn Lys Ala Arg Ile Glu Lys Met Ile Ala Glu Ala Val Ala Val Ala 
275                 280                 285             
Lys Lys His Asn Leu Pro Leu Tyr Cys Gly Glu Trp Gly Ala Tyr Glu 
290                 295                 300                 
Lys Ala Pro Arg Glu Pro Arg Leu Gln Trp Tyr Arg Asp Met Val Asp 
305                 310                 315                 320 
Val Leu Asn Lys Asn Asn Ile Ala Trp Thr Thr Trp Asp Tyr Lys Gly 
325                 330                 335     
Gly Phe Gly Ile Val Asp Ala Lys Gly Asn Lys Asp Glu Gln Leu Ile 
340                 345                 350         
Asn Val Leu Thr Gly Lys Glu Lys Lys Met 
355                 360         
<210> 73
<211> 1146
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 73
gtggatatta ccggacatcc cgaccacatc gccttcgcgc gggaagttgc cgagcaaagc     60
atggtcttgc tgcaaaaccg tgcgaacctc gccccccttt cggtatctga ctattccacc    120
attgccgtga tcggcccgaa tgccaatgac actttgctgg gttcttacag cggcgttccg    180
aaaacctact acacggtact cgacgggata cggtcctatg tcggtgaccg ggcgaatgtg    240
gtttacgctc aggggccgaa gataaccaaa cccggccatc gggaggacaa tgaagtattt    300
ccaccggatc ctgaaaacga ccggagacga ctggccgaag cgatagctgt cgccgagaac    360
gccgacctga tcatcctcgc gatcggcggc aatgaactga cgggacgaga ggcatgggcg    420
gcgcatcatc ccggtgatcg accggatctg tcgttgctcg gtttgcagga ggatcttgtt    480
gacgcagttg gagcgatggg ggttccatct gtcgcattgg ttttcggtgc acggccgctg    540
gacctcggca atgtcgccga aaaaattgat gtggtcttcc aaaactggta cctgggccag    600
gaaaccggca atgccgtcgc caatgtgctg tttggcgagg tgtcaccgtc cgccaaactc    660
cccatcagct tcccgcggac tgccgggcac attcctgcct actacaatta caaaccatcg    720
gctcgacggg tctacctttt tgacgatgtc actccgcgtt accatttcgg gtacggcctc    780
agctatacga cgtttgaata cggggaaccg cagctatcgg atacactact gtctggcgat    840
ggtgaaataa ccctctacgt tgaagttacc aacaccggag agcgaggcgg ttcggaagtc    900
gtgcaactgt acatcaacca cgaatacaga tccgtcaccc ggccggtaaa ggagctcaag    960
ggattcgaaa aggtgtatct cgagccgaat gaaactgccg gtgtatcgtt caccatcact   1020
tcagatcagt tgaggttctg gaatatcgac atggagttta ccgctgaatc cggtaaagtg   1080
aacctgatgg tcggctcatc cagccgtgac gaagacctgc agacgacggc aatttttctt   1140
gaataa                                                              1146
<210> 74
<211> 381
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (21)...(264)
<223> Glycosyl hydrolase family 3 C terminal domain
<220> 
<221> SITE
<222> (49)...(52)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<220> 
<221> SITE
<222> (335)...(338)
<223> N-glycosylation site. Prosite id = PS00001
<400> 74
Met Asp Ile Thr Gly His Pro Asp His Ile Ala Phe Ala Arg Glu Val 
1               5                   10                  15      
Ala Glu Gln Ser Met Val Leu Leu Gln Asn Arg Ala Asn Leu Ala Pro 
20                  25                  30          
Leu Ser Val Ser Asp Tyr Ser Thr Ile Ala Val Ile Gly Pro Asn Ala 
35                  40                  45              
Asn Asp Thr Leu Leu Gly Ser Tyr Ser Gly Val Pro Lys Thr Tyr Tyr 
50                  55                  60                  
Thr Val Leu Asp Gly Ile Arg Ser Tyr Val Gly Asp Arg Ala Asn Val 
65                  70                  75                  80  
Val Tyr Ala Gln Gly Pro Lys Ile Thr Lys Pro Gly His Arg Glu Asp 
85                  90                  95      
Asn Glu Val Phe Pro Pro Asp Pro Glu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala 
100                 105                 110         
Glu Ala Ile Ala Val Ala Glu Asn Ala Asp Leu Ile Ile Leu Ala Ile 
115                 120                 125             
Gly Gly Asn Glu Leu Thr Gly Arg Glu Ala Trp Ala Ala His His Pro 
130                 135                 140                 
Gly Asp Arg Pro Asp Leu Ser Leu Leu Gly Leu Gln Glu Asp Leu Val 
145                 150                 155                 160 
Asp Ala Val Gly Ala Met Gly Val Pro Ser Val Ala Leu Val Phe Gly 
165                 170                 175     
Ala Arg Pro Leu Asp Leu Gly Asn Val Ala Glu Lys Ile Asp Val Val 
180                 185                 190         
Phe Gln Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Glu Thr Gly Asn Ala Val Ala Asn 
195                 200                 205             
Val Leu Phe Gly Glu Val Ser Pro Ser Ala Lys Leu Pro Ile Ser Phe 
210                 215                 220                 
Pro Arg Thr Ala Gly His Ile Pro Ala Tyr Tyr Asn Tyr Lys Pro Ser 
225                 230                 235                 240 
Ala Arg Arg Val Tyr Leu Phe Asp Asp Val Thr Pro Arg Tyr His Phe 
245                 250                 255     
Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Gly Glu Pro Gln Leu 
260                 265                 270         
Ser Asp Thr Leu Leu Ser Gly Asp Gly Glu Ile Thr Leu Tyr Val Glu 
275                 280                 285             
Val Thr Asn Thr Gly Glu Arg Gly Gly Ser Glu Val Val Gln Leu Tyr 
290                 295                 300                 
Ile Asn His Glu Tyr Arg Ser Val Thr Arg Pro Val Lys Glu Leu Lys 
305                 310                 315                 320 
Gly Phe Glu Lys Val Tyr Leu Glu Pro Asn Glu Thr Ala Gly Val Ser 
325                 330                 335     
Phe Thr Ile Thr Ser Asp Gln Leu Arg Phe Trp Asn Ile Asp Met Glu 
340                 345                 350         
Phe Thr Ala Glu Ser Gly Lys Val Asn Leu Met Val Gly Ser Ser Ser 
355                 360                 365             
Arg Asp Glu Asp Leu Gln Thr Thr Ala Ile Phe Leu Glu 
370                 375                 380     
<210> 75
<211> 1014
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 75
atgctgcgca agttgatcgt ctcggtcttc ggcttcgtca tgctgactag tgcggcagcg     60
gcgcagactc ctcccgcctt agcggaatcc gcgcctgctc tccggcgcgg aatgaacgtt    120
ctgggctacg acccaatctg gcacgacccg aagaaaggtc ggttcgaaga gcggcacttc    180
gccgagattc gcaagggcgg cttcgacttc gttcgggtga acctccacgg gttcaaacat    240
atgaacgccg cggacaaact cagtccggag ttcctgagcc gcgtggactg gatcgtgaag    300
cacgccagtg cggcgggcct gtcggtcatc ctagacgagc atgaatatga ggaatgctcg    360
gacgacgtcg caatgtgccg gcggcgtttg gcggcattct ggacgcaggt cgcgccgcgc    420
tacaagggcg cgcccgatac ggttctgttc gagcttctca atgagccgca cgacaagttg    480
gatgccgaca cctggaacgc cttgtttccc gacatcctgg ccatcgtgcg gcagtcgaac    540
ccgaagcgcc gcgtggtgat cggcccgact cagtggaaca acttcagcca gctggacacg    600
ctcaagctgc cggcagacga ccggaacatc gtcgtcacct tccattatta cgatccgttc    660
ccgtttaccc accagggcgc gccgtgggtt ccggacatgc tcaaggtgaa aggcatcgag    720
tggaagcccg agcagagggc gaagatcgcc gaggacttcg gcaaggtcgc ggaatggtcg    780
cagaaaaccg gccgcgaaat cttgctcggc gagttcgggg cctacgatgt gagcggtacg    840
ccaaccgcca tgcgttcagc ttatacggaa gcggtggcgc gcgaggcgga acgccacggc    900
ttcgcttggg cctactggca gttcgacagc aatttcctgg cttgggacat gaagacaaac    960
ggctgggtcg agccgatcca caaggcactc atccccgagg cgaagcagcc ttag         1014
<210> 76
<211> 337
<212> PRT
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<220> 
<221> DOMAIN
<222> (37)...(316)
<223> Cellulase (glycosyl hydrolase family 5)
<220> 
<221> SITE
<222> (150)...(159)
<223> Glycosyl hydrolases family 5 signature. Prosite id = PS00659
<400> 76
Met Leu Arg Lys Leu Ile Val Ser Val Phe Gly Phe Val Met Leu Thr 
1               5                   10                  15      
Ser Ala Ala Ala Ala Gln Thr Pro Pro Ala Leu Ala Glu Ser Ala Pro 
20                  25                  30          
Ala Leu Arg Arg Gly Met Asn Val Leu Gly Tyr Asp Pro Ile Trp His 
35                  40                  45              
Asp Pro Lys Lys Gly Arg Phe Glu Glu Arg His Phe Ala Glu Ile Arg 
50                  55                  60                  
Lys Gly Gly Phe Asp Phe Val Arg Val Asn Leu His Gly Phe Lys His 
65                  70                  75                  80  
Met Asn Ala Ala Asp Lys Leu Ser Pro Glu Phe Leu Ser Arg Val Asp 
85                  90                  95      
Trp Ile Val Lys His Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ser Val Ile Leu Asp 
100                 105                 110         
Glu His Glu Tyr Glu Glu Cys Ser Asp Asp Val Ala Met Cys Arg Arg 
115                 120                 125             
Arg Leu Ala Ala Phe Trp Thr Gln Val Ala Pro Arg Tyr Lys Gly Ala 
130                 135                 140                 
Pro Asp Thr Val Leu Phe Glu Leu Leu Asn Glu Pro His Asp Lys Leu 
145                 150                 155                 160 
Asp Ala Asp Thr Trp Asn Ala Leu Phe Pro Asp Ile Leu Ala Ile Val 
165                 170                 175     
Arg Gln Ser Asn Pro Lys Arg Arg Val Val Ile Gly Pro Thr Gln Trp 
180                 185                 190         
Asn Asn Phe Ser Gln Leu Asp Thr Leu Lys Leu Pro Ala Asp Asp Arg 
195                 200                 205             
Asn Ile Val Val Thr Phe His Tyr Tyr Asp Pro Phe Pro Phe Thr His 
210                 215                 220                 
Gln Gly Ala Pro Trp Val Pro Asp Met Leu Lys Val Lys Gly Ile Glu 
225                 230                 235                 240 
Trp Lys Pro Glu Gln Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asp Phe Gly Lys Val 
245                 250                 255     
Ala Glu Trp Ser Gln Lys Thr Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Glu Phe 
260                 265                 270         
Gly Ala Tyr Asp Val Ser Gly Thr Pro Thr Ala Met Arg Ser Ala Tyr 
275                 280                 285             
Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Ala Glu Arg His Gly Phe Ala Trp Ala 
290                 295                 300                 
Tyr Trp Gln Phe Asp Ser Asn Phe Leu Ala Trp Asp Met Lys Thr Asn 
305                 310                 315                 320 
Gly Trp Val Glu Pro Ile His Lys Ala Leu Ile Pro Glu Ala Lys Gln 
325                 330                 335     
Pro 
<210> 77
<211> 1125
<212> DNA
<213> Unknown
<220> 
<223> Obtained from environmental sample
<400> 77
atgaaaagga 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瑣杣挠瑡杣条捣⁣†㈠〴戼㹲㰊牢ਾ慧杧慡杧捧愠瑴捴捴捣⁧杣捣捡捣捴朠捡慣瑣捡⁣杧杣慣杴瑡挠捧瑣捧杴⁣†㌠〰戼㹲㰊牢ਾ杣杣捡慣杣朠捧杴捧捣⁣杧杴瑧慧捣琠捴慣捣捡⁴捴捡慣捣捣挠杣瑣杧捧⁣†㌠〶戼㹲㰊牢ਾ捧杧捣杧杧朠瑣捧杴瑧⁣杣捡捣杧捴愠捣捧杣条⁣捧瑴杣捣杣琠慴瑣捧慧⁧†㐠〲戼㹲㰊牢ਾ杣慣捣瑧杧挠杣捣瑣杣⁧杣捡慧慧捴朠杣瑡杧捣⁴捧捡慧捴慡挠慧捧杣慡⁣†㐠〸戼㹲㰊牢ਾ瑡杣杴捧慣挠捣捴杧瑧⁡瑣捴瑣杣捧朠条瑴捣杣⁣杣捧杣捴捧挠慧捣捣慧⁣†㔠〴戼㹲㰊牢ਾ杣瑣捡杣捧愠杧杣慡杣⁡慣杣瑣慧捴挠捧捧捣瑡⁣捧瑣杣捣慴挠慧杧杣瑣⁧†㘠〰戼㹲㰊牢ਾ慡杧捣杧捧挠杣捧慧瑧⁴捣捣瑧杣捧挠捴捡捣杴⁴杣瑡杧捣慧朠瑴杣捴捧⁣†㘠〶戼㹲㰊牢ਾ慧捧捣杧杣朠杣条捧捣⁡捣捴捧捣条朠捴杣捧捡⁡杣瑡杧条慧挠瑡瑣捴瑣⁧†㜠〲戼㹲㰊牢ਾ慧杧捣捧捣朠杧捧慧杣⁡瑣捴瑡杣杧朠杴慣慧捣⁴捡条捣捧瑡朠杣瑣捴杧⁴†㜠〸戼㹲㰊牢ਾ捣杣捡捴捧挠慧捴捣捧⁴杣杧捣杧捣朠条杧杣捴⁧条瑧杣捴慣朠瑡杧杧慴⁣†㠠〴戼㹲㰊牢ਾ慧瑧捡杴捧挠瑧杧捧捧⁴杣条捧慧杣愠捴杣捧捧⁧捣捧杣条瑧挠捡杣捧捡⁧†㤠〰戼㹲㰊牢ਾ捧杧捴慣杣琠慣捣慧慧⁡杣捧瑡杣杧愠捣捧杣捡⁧捡捡捧条杣朠瑧杣捣慴⁣†㤠〶戼㹲㰊牢ਾ瑧慣捣慧杧挠捣捴杣杧⁧捧杴杣捧捧琠捧瑣杣捡⁧捡杧慣捴慧挠瑧捣捧条⁣†〱〲戼㹲㰊牢ਾ慴瑣捴慴瑣朠慧杣瑣捧⁴杣捡慡瑣捴朠条杴慧杣⁣捧杧瑣捡瑧朠捣慧杣瑴⁣†〱〸戼㹲㰊牢ਾ杧捧捴瑧杣挠杣捴慧捣⁧慣捣捡捣条挠捧杣瑧杣⁧杴慡捧杣条挠捧杧杴杴⁧†ㄱ〴戼㹲㰊牢ਾ瑣杣捧慧杧琠杣捣杣慣⁣慧捡杣捣捴朠条瑣捣杣⁧捡杣瑣慧††††††††ㄱ㠸戼㹲㰊牢ਾ氦㭴ㄲ☰瑧※㐱㰴牢ਾ氦㭴ㄲ☱瑧※㤳㰵牢ਾ氦㭴ㄲ☲瑧※剐㱔牢ਾ氦㭴ㄲ☳瑧※湕湫睯㱮牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〲朦㭴㰠牢ਾ氦㭴㈲☳瑧※扏慴湩摥映潲⁭湥楶潲浮湥慴⁬慳灭敬戼㹲㰊牢ਾ氦㭴㈲☰瑧※戼㹲☊瑬㈻ㄲ朦㭴䐠䵏䥁㱎牢ਾ氦㭴㈲☲瑧※ㄨ⸩⸮㌨〹㰩牢ਾ氦㭴㈲☳瑧※汇捹獯汹栠摹潲慬敳映浡汩⁹㰱牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〲朦㭴㰠牢ਾ氦㭴㈲☱瑧※䥓䕔戼㹲☊瑬㈻㈲朦㭴⠠⤹⸮⠮㌲㰩牢ਾ氦㭴㈲☳瑧※汇捹獯汹栠摹潲慬敳⁳慦業祬ㄠ丠琭牥業慮⁬楳湧瑡牵⹥倠潲楳整椠⁤‽戼㹲倊こ㘰㌵戼㹲㰊牢ਾ氦㭴㈲☰瑧※戼㹲☊瑬㈻ㄲ朦㭴匠呉㱅牢ਾ氦㭴㈲☲瑧※ㄨ㠸⸩⸮ㄨㄹ㰩牢ਾ氦㭴㈲☳瑧※ⵎ汧捹獯汹瑡潩⁮楳整‮牐獯瑩⁥摩㴠倠こ〰㄰戼㹲㰊牢ਾ氦㭴〴☰瑧※㐱㰴牢ਾ敍⁴桔⁲汉⁥桔⁲桐⁥牐⁯獁⁰汇⁹桐⁥牔⁰牔⁰汇⁹桔⁲汁⁡桔⁲汁⁡戼㹲ㄊ†††††††㔠†††††††††ㄠ‰††††††††ㄠ‵††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汁⁡楈⁳汇⁮慖⁬汇⁵汇⁹汇⁹獁⁮牔⁰獁⁮桔⁲獁⁰牔⁰牔⁰汁⁡祔⁲戼㹲 †††††㈠‰††††††††㈠‵††††††††㌠‰††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汇⁵楈⁳汁⁡牐⁯汇⁹桔⁲牁⁧祃⁳汁⁡汇⁵牐⁯敓⁲汇⁹獁⁰汁⁡祃⁳戼㹲 †††㌠‵††††††††㐠‰††††††††㐠‵††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ獁⁰楈⁳牔⁰楈⁳牁⁧祔⁲牐⁯汇⁵獁⁰汉⁥汁⁡敌⁵敌⁵汁⁡汁⁡敌⁵戼㹲 †㔠‰††††††††㔠‵††††††††㘠‰††††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汇⁹桐⁥敓⁲汁⁡祔⁲牁⁧桐⁥敓⁲慖⁬汇⁵牔⁰汁⁡牁⁧汉⁥汇⁵牐⁯戼㹲㘊‵††††††††㜠‰††††††††㜠‵††††††††㠠‰㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汇⁵汇⁵汇⁹楈⁳桐⁥敓⁲牁⁧汁⁡桔⁲敌⁵獁⁰楈⁳祔⁲牁⁧牁⁧敍⁴戼㹲 †††††††㠠‵††††††††㤠‰††††††††㤠‵††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汉⁥汁⁡祃⁳祃⁳牁⁧獁⁰楈⁳汇⁹敌⁵汁⁡牐⁯慖⁬慖⁬桔⁲桐⁥楈⁳戼㹲 †††††ㄠ〰††††††††ㄠ㔰††††††††ㄠ〱††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ楈⁳桐⁥桔⁲桔⁲牐⁯牁⁧牔⁰汁⁡汁⁡汁⁡汇⁹汇⁹祃⁳牔⁰敓⁲獁⁰戼㹲 †††ㄠ㔱††††††††ㄠ〲††††††††ㄠ㔲††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ牐⁯慖⁬桔⁲汁⁡汇⁵牁⁧桐⁥汁⁡牁⁧祔⁲祃⁳汇⁵牁⁧桔⁲慖⁬汁⁡戼㹲 †ㄠ〳††††††††ㄠ㔳††††††††ㄠ〴††††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汁⁡敌⁵汇⁹獁⁰汇⁵汉⁥汁⁡敍⁴汁⁡祃⁳桔⁲汉⁥獁⁮汇⁵牐⁯獁⁮戼㹲ㄊ㔴††††††††ㄠ〵††††††††ㄠ㔵††††††††ㄠ〶㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汉⁥慖⁬汁⁡桔⁲敌⁵汇⁹祔⁲桐⁥敌⁵汇⁹汇⁵桐⁥牐⁯牐⁯汁⁡慖⁬戼㹲 †††††††ㄠ㔶††††††††ㄠ〷††††††††ㄠ㔷††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汁⁡獁⁰牐⁯獁⁰牁⁧祔⁲牁⁧汇⁮汁⁡獁⁮獁⁰桔⁲敌⁵汉⁥牁⁧汁⁡戼㹲 †††††ㄠ〸††††††††ㄠ㔸††††††††ㄠ〹††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ楈⁳牁⁧敌⁵汁⁡祔⁲汇⁵汁⁡敌⁵祌⁳汁⁡汇⁹牐⁯汇⁹汇⁵桐⁥牐⁯戼㹲 †††ㄠ㔹††††††††㈠〰††††††††㈠㔰††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ慖⁬汇⁹敌⁵桔⁲敌⁵敓⁲敍⁴汁⁡汇⁵桐⁥慖⁬汁⁡汇⁵牐⁯汇⁹汇⁹戼㹲 †㈠〱††††††††㈠㔱††††††††㈠〲††††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汇⁵汁⁡楈⁳敌⁵汁⁡汇⁮慖⁬牁⁧楈⁳桔⁲敍⁴汇⁵獁⁰汉⁥桐⁥敌⁵戼㹲㈊㔲††††††††㈠〳††††††††㈠㔳††††††††㈠〴㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汇⁵汁⁡汁⁡牁⁧汇⁹獁⁰獁⁰桐⁥汉⁥汇⁹慖⁬汇⁮桔⁲祔⁲敓⁲牁⁧戼㹲 †††††††㈠㔴††††††††㈠〵††††††††㈠㔵††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ敍⁴牁⁧桐⁥汇⁹牐⁯獁⁰敓⁲牐⁯汉⁥牐⁯敌⁵汇⁹牐⁯汁⁡汇⁵汇⁹戼㹲 †††††㈠〶††††††††㈠㔶††††††††㈠〷††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ慖⁬汇⁵慖⁬慖⁬汇⁮敍⁴汇⁹祔⁲汇⁵祔⁲牔⁰牐⁯牔⁰汁⁡敌⁵汇⁵戼㹲 †††㈠㔷††††††††㈠〸††††††††㈠㔸††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汁⁡桔⁲汉⁥牁⁧牁⁧汁⁡汁⁡汇⁵慖⁬桔⁲汇⁹桔⁲汁⁡慖⁬楈⁳慖⁬戼㹲 †㈠〹††††††††㈠㔹††††††††㌠〰††††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ桔⁲汇⁵獁⁮汇⁹汉⁥汇⁹桔⁲汁⁡獁⁰獁⁰桔⁲汇⁮牁⁧慖⁬汁⁡祔⁲戼㹲㌊㔰††††††††㌠〱††††††††㌠㔱††††††††㌠〲㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ慖⁬桔⁲汇⁵汁⁡敌⁵牁⁧汇⁹敌⁵牁⁧牁⁧祃⁳敌⁵獁⁰獁⁰汇⁹汉⁥戼㹲 †††††††㌠㔲††††††††㌠〳††††††††㌠㔳††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ獁⁰慖⁬牁⁧敓⁲祔⁲桐⁥祔⁲牔⁰桔⁲敌⁵敌⁵獁⁰獁⁮桐⁥汇⁵牔⁰戼㹲 †††††㌠〴††††††††㌠㔴††††††††㌠〵††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ桔⁲牁⁧汇⁹祔⁲慖⁬牐⁯桔⁲桐⁥汇⁹敌⁵慖⁬汁⁡慖⁬獁⁰牁⁧桔⁲戼㹲 †††㌠㔵††††††††㌠〶††††††††㌠㔶††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ桔⁲汇⁮牁⁧牁⁧敓⁲慖⁬祌⁳牐⁯敓⁲汁⁡慖⁬牔⁰敌⁵汇⁹汇⁵慖⁬戼㹲 †㌠〷††††††††㌠㔷††††††††㌠〸††††††††㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ汁⁡牁⁧桔⁲獁⁮牁⁧敌⁵汇⁵敌⁵牐⁯獁⁰牁⁧戼㹲㌊㔸††††††††㌠〹††††††††㌠㔹㰠牢ਾ戼㹲㰊牢ਾ氦㭴ㄲ☰瑧※㐱㰵牢ਾ氦㭴ㄲ☱瑧※㌱㘸戼㹲☊瑬㈻㈱朦㭴䐠䅎戼㹲☊瑬㈻㌱朦㭴唠歮潮湷戼㹲㰊牢ਾ氦㭴㈲☰瑧※戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴传瑢楡敮⁤牦浯攠癮物湯敭瑮污猠浡汰㱥牢ਾ戼㹲☊瑬㐻〰朦㭴ㄠ㔴戼㹲愊杴捴瑧瑴⁣杣条慡瑡瑴挠瑣瑧杧杧⁡捴条捣捡瑣挠瑣捣慴捣⁡慡捴慧条捧††㘠㰰牢ਾ戼㹲朊捣杴捧慡⁧慡慧杣捧慡愠杧捣慣慡⁴瑡瑣杧慧杣琠瑧瑴捴捡⁡慣捣捣杧杧††㈱㰰牢ਾ戼㹲愊慡瑧杣捣⁡瑡杧杣捡捡挠杧杴瑡瑡⁣捧慣捴慧捣愠瑣捡慣捣⁧瑡捡杣条捡††㠱㰰牢ਾ戼㹲朊捡瑧杴捣⁣杴瑡杧瑣慧朠瑣杴慧瑣⁴慣杧慣慴捣朠瑴捴捴瑧⁴瑣捣杴杧捣††㐲㰰牢ਾ戼㹲愊慧瑡慡杴⁣杣慧条慧捧愠杧捣捣瑡⁣慧捧慡杣杧朠捴杴慧瑣⁴瑣捡慧捣捧††〳㰰牢ਾ戼㹲挊捴瑡杴瑡⁧慣瑣捧杴慧朠慡慡捡瑡⁣慣捡捣瑡杧挠慣捣瑣瑣⁡捣捡杴杧瑡††㘳㰰牢ਾ戼㹲琊慴捣条捣⁧慣瑣捧慡慧挠条条杧杧⁧杴慧瑣慡捣朠杣捡条杣⁣瑧捣杴瑧瑴††㈴㰰牢ਾ戼㹲朊瑣慧瑣捡⁴慣捧杣瑴瑧琠慣杣捡捧⁴瑴瑴瑣慧捣朠杧杴杧慡⁴瑧杧捧慡杣††㠴㰰牢ਾ戼㹲琊杴慡杣条⁣杣杴杧杴捴琠捧瑡瑴瑴⁧杧捣捡杧慡挠杴捧瑡捣⁡杣慣捣杴捧††㐵㰰牢ਾ戼㹲愊捴捡慡捧⁣捣慣杣杣捧朠瑴杣捣捧⁧杧捧瑡慣捣琠捧瑴瑣杧⁧捧瑡杧慣条††〶㰰牢ਾ戼㹲朊捣瑡捣慡⁧杣瑡捧捧捧琠慣瑡杣捴⁴条慣捣慣捡琠杧慧瑡杴⁴瑴杴慡捣捴††㘶㰰牢ਾ戼㹲朊捣捣杣杴⁴瑡瑣杣慡杧琠慧慣捣捣⁴捧杴捡慣捣挠杧瑣慣慣⁣瑣捣瑧杧慣††㈷㰰牢ਾ戼㹲挊慴慣杣瑡⁧捣瑡瑴杴慡琠杧瑧杴杴⁧捡条条捣捧琠捴杴杣瑣⁣慣慧慴捣捣††㠷㰰牢ਾ戼㹲朊捡瑣捧瑴⁣瑴慣捡慴杧挠慧慣杴瑧⁧捡慡慡慡慣琠捣捡慧杣⁧杴捡瑣杣捣††㐸㰰牢ਾ戼㹲愊捴瑡杧捣⁧条捣慧瑴慧挠杴慧杴杧⁣瑡慣捡慴瑣愠捣条慧慣⁴慴慧瑴杴杴††〹㰰牢ਾ戼㹲朊捣捡杴瑡⁧瑴捧捣捣捡朠捧慴捡捣⁧瑡杧捣捣捴挠杧瑧慡杣⁡捣杴捣杧捧††㘹㰰牢ਾ戼㹲愊捣瑧杣杧⁧杴慧捧瑣捧朠捣条慣瑡⁣杧慡捡瑡慣挠慣捧瑴杴⁧瑣杧捴慣捣†ㄠ㈰㰰牢ਾ戼㹲愊捣捣杣捡⁧慧瑣捧慧瑧愠瑣瑧杴瑧⁧杧捣杴慧杴愠杧慡慴杣⁡慣捡瑣捣杣†ㄠ㠰㰰牢ਾ戼㹲挊杣瑡瑡捴⁡瑴捡杣慡慡挠杧瑧瑧捧⁴慴杣瑡慴捣挠杣捴慧杧⁡杣瑧瑧杣捴†ㄠ㐱㰰牢ਾ戼㹲愊捡慧慣捣⁣瑴杣杴捴捡愠慴慣杴杣⁡慧捡捡瑣慣挠杣杣瑴瑧⁣捧条捧慣瑴†ㄠ〲㰰牢ਾ戼㹲朊条捧杧瑧⁧杴慡杴捴杣朠杧瑣瑡瑡⁧慣瑣杧捴捴琠瑧捴慧慣⁡瑣捴慧瑧杧†ㄠ㘲㰰牢ਾ戼㹲朊捣慧条杧⁴瑡杣捣慡杣挠瑴杴捧瑡⁧瑧捧捡瑧杣愠瑣瑴慧慧⁣瑣杴慧捧杧†ㄠ㈳㰰牢ਾ戼㹲愊瑣捣慣慡⁧捣捴条瑣慣挠慴瑣瑡捴⁡杣杴捴瑡慣挠慡瑡慡杣⁣捣捴捴杴捡†ㄠ㠳㰰牢ਾ戼㹲朊捡杴⁡††††††††††††††††††††††††††††††ㄠ㠳㰶牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〱朦㭴ㄠ㘴戼㹲☊瑬㈻ㄱ朦㭴㐠ㄶ戼㹲☊瑬㈻㈱朦㭴倠呒戼㹲☊瑬㈻㌱朦㭴唠歮潮湷戼㹲㰊牢ਾ氦㭴㈲☰瑧※戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴传瑢楡敮⁤牦浯攠癮物湯敭瑮污猠浡汰㱥牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〲朦㭴㰠牢ਾ氦㭴㈲☱瑧※佄䅍义戼㹲☊瑬㈻㈲朦㭴⠠⤱⸮⠮㔴⤸戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴䜠祬潣祳⁬票牤汯獡⁥慦業祬ㄠ戼㹲㰊牢ਾ氦㭴㈲☰瑧※戼㹲☊瑬㈻ㄲ朦㭴匠呉㱅牢ਾ氦㭴㈲☲瑧※㜨⸩⸮㈨⤱戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴䜠祬潣祳⁬票牤汯獡獥映浡汩⁹‱ⵎ整浲湩污猠杩慮畴敲‮牐獯瑩⁥摩㴠㰠牢ਾ卐〰㔶㰳牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〲朦㭴㰠牢ਾ氦㭴㈲☱瑧※䥓䕔戼㹲☊瑬㈻㈲朦㭴⠠㌳⤷⸮⠮㐳⤰戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴丠札祬潣祳慬楴湯猠瑩⹥倠潲楳整椠⁤‽卐〰〰㰱牢ਾ戼㹲☊瑬㈻〲朦㭴㰠牢ਾ氦㭴㈲☱瑧※䥓䕔戼㹲☊瑬㈻㈲朦㭴⠠㠳⤶⸮⠮㠳⤹戼㹲☊瑬㈻㌲朦㭴丠札祬潣祳慬楴湯猠瑩⹥倠潲楳整椠⁤‽卐〰〰㰱牢ਾ戼㹲☊瑬㐻〰朦㭴ㄠ㘴戼㹲䴊瑥匠牥倠敨倠潲䄠杲䄠湳倠敨䰠略吠灲䜠祬匠牥䄠慬吠牨匠牥匠牥吠特㰠牢ਾ‱†††††††‵†††††††††〱†††††††††㔱†††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䜊湬䤠敬䜠畬䜠祬䄠慬吠灲䜠湬䜠畬䄠灳䜠祬䰠獹䜠祬倠潲䄠湳䤠敬吠灲㰠牢ਾ††††††〲†††††††††㔲†††††††††〳†††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䄊灳嘠污倠敨匠牥䠠獩吠牨倠潲䜠祬䰠獹嘠污䄠慬䄠湳䜠祬䄠灳吠牨䜠祬㰠牢ਾ††††㔳†††††††††〴†††††††††㔴†††††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䄊灳䤠敬䄠慬䤠敬䄠灳䠠獩吠特䠠獩䄠杲吠特䄠杲䄠灳䄠灳嘠污䄠慬䰠略㰠牢ਾ††〵†††††††††㔵†††††††††〶†††††††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䴊瑥䄠慬䜠畬䰠略䜠祬䰠略䜠湬䄠慬吠特䄠杲倠敨匠牥倠敨匠牥吠灲䄠慬㰠牢ਾ㔶†††††††††〷†††††††††㔷†††††††††〸†戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䄊杲䤠敬䴠瑥倠潲䜠畬䜠祬䄠慬䜠祬倠潲䤠敬䜠畬䜠湬䄠杲䜠祬䰠略䄠灳㰠牢ਾ††††††††㔸†††††††††〹†††††††††㔹†††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲倊敨吠特䄠灳䄠杲䰠略䤠敬䄠灳䄠慬䰠略䰠略䜠畬䰠獹䄠湳䤠敬䜠湬倠潲㰠牢ਾ††††††〱‰††††††††〱‵††††††††ㄱ‰††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䴊瑥䄠慬吠牨䰠略吠特䠠獩吠灲䄠灳䰠略倠潲䄠慬䄠慬䰠略䜠湬䄠灳䄠杲㰠牢ਾ††††ㄱ‵††††††††㈱‰††††††††㈱‵††††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䜊祬䜠祬吠灲吠牨䄠湳䄠杲䄠灳匠牥䄠慬匠牥吠灲倠敨䄠慬䄠灳吠特匠牥㰠牢ਾ††㌱‰††††††††㌱‵††††††††㐱‰††††††††戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䄊慬嘠污嘠污䠠獩䄠灳䄠慬倠敨匠牥䄠灳䄠杲嘠污䜠祬䴠瑥吠灲䄠慬吠牨㰠牢ਾ㐱‵††††††††㔱‰††††††††㔱‵††††††††㘱‰戼㹲㰊牢ਾ戼㹲䰊略䄠湳䜠畬倠潲吠灲嘠污匠牥䄠慬倠敨䰠略䜠祬䠠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