(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネＸＡ２１のキナーゼドメイン及び膜近傍（ＪＭ）ドメインを含む細胞内ドメインとイネＣＥＢｉＰの細胞外ドメインとを含む、細胞外ドメイン−膜貫通（ＴＭ）ドメイン−ＪＭドメイン−キナーゼドメイン型のキメラ受容体をコードする遺伝子であって、植物細胞においてキチン特異的にＨＲ細胞死等の防御応答反応をより強く誘導することができるキメラ遺伝子。
【請求項２】
配列番号１又は５と同一のアミノ酸配列からなるキメラ受容体をコードするキメラ遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子又は請求項３記載の発現ベクターを含む植物細胞。
【請求項５】
請求項４記載の植物細胞を含む植物組織。
【請求項６】
請求項４記載の植物細胞を含む植物体。
【請求項７】
請求項６記載の植物体から得られる種子。
【請求項８】
請求項１又は２記載のキメラ遺伝子によってコードされたキメラ受容体タンパク質。
【請求項９】
請求項１又は２記載のキメラ遺伝子を植物に導入することにより、植物のキチンエリシター応答性を高める方法。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の遺伝子又は請求項３記載の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１又は２記載のキメラ遺伝子を植物に導入することにより、植物に菌類病抵抗性を付与する方法。
【請求項１２】
請求項１又は２記載の遺伝子又は請求項３記載の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程を含む、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のエリシター応答性又は耐病性を向上させるキメラ受容体タンパク質、これをコードするキメラ遺伝子、この遺伝子を導入した植物及びその作出方法等に関し、さらに具体的には、キメラ受容体遺伝子の導入によりエリシター応答性又は耐病性を高めた植物及びその作出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病害抵抗性を向上させる方法としては、これまでに、i）真性抵抗性遺伝子（True resistance genes）の導入、ii）病害応答経路のシグナル伝達に関与する遺伝子の過剰発現、iii）過敏感反応（Hypersensitive reaction：ＨＲ）性細胞死を引き起こすタンパク質の感染時特異的発現、iv）病害応答反応の結果生成される抗菌性タンパク質の過剰発現、等が報告されている（非特許文献１：西澤洋子「耐病性植物の分子育種」植物細胞工学シリーズ19『分子レベルから見た植物の耐病性』、p.136-146、2004年、秀潤社）。
【０００３】
i）の真性抵抗性遺伝子の導入に基づく方法については、多くの場合、発病を完全に阻止する非常に強い抵抗性を発揮する反面、限られた病原菌に対してのみしか効果を示さない（抵抗性スペクトラムが狭い）ことや、病原菌側の遺伝子変異によって抵抗性が崩壊してしまうといった問題点がある。ii）の方法では、病害抵抗性が高まると同時に、矮化や収量の減少等を伴うことが多い。iii）の方法では、細胞死誘導タンパク質の発現を厳密に制御する必要があるが、感染時にのみ活性化するプロモーターの開発という課題が残る。また、iv）の方法では、十分な耐病性効果が得られないという問題がある。
【０００４】
例えば、耐病性向上のために溶菌酵素（キチナーゼ）又はエリシタータンパク質（Ｂ１ｘＡ２−７００、Pseudomonas syringae pv. syringaeのｈｒｐＺ）をコードする遺伝子を用いた遺伝子導入植物の作製例（特許文献１〜５）等が報告されている。
【０００５】
植物の受容体遺伝子を改変してキメラ受容体を発現させることにより、あるリガンドに対して元の植物で見られない生理反応を誘導させた例がある。すなわち、構造的に同じファミリーに分類される、シロイヌナズナのブラシノライド（植物ステロイドホルモン）受容体の遺伝子ＢＲＩ１とイネの白葉枯病抵抗性遺伝子Ｘａ２１とを融合し、イネ培養細胞で発現させたところ、ブラシノライド処理によってＨＲ性の細胞死が誘導された（非特許文献２：He et al., Science, 288, 2360-2363, 2000）。
【０００６】
しかし、この実験は、ＢＲＩ１とＸａ２１という、どちらもロイシン・リッチ・リピート（ＬＲＲ）を細胞外ドメインとして持つ、構造的に極めて類似したタンパク質（ＬＲＲ−ＲＬＫファミリー）の受容体同士を融合させたものであり、構造上異なるファミリーに属する細胞膜局在性の受容体同士を融合させた場合、細胞外のシグナルを期待どおりに細胞内に伝達することが可能であるかどうかは不明である。また、この報告は培養細胞を使った実験での結果であるから、植物体にした場合、期待どおりにブラシノライドでＨＲ細胞死を誘導できるかどうかも不明である。さらに、本報告は植物ホルモンに対する応答性を改変したものであり、植物ホルモンへの細胞応答研究に資することは述べられているが、植物ホルモン未処理植物の耐病性付与効果については言及されていない。
【０００７】
また、ダイズのグルカンエリシター受容体ＥＲのエリシター結合部位（アミノ酸番号２３９〜４４２）を含むドメインと、シロイヌナズナの真性抵抗性タンパク質ＲＰＳ２のＮ末端側ドメイン（ロイシンジッパー及び核酸結合部位の一部を含む）とを含むキメラ受容体の作製が報告されている（特許文献６）。グルカンエリシター受容体ＥＲは、膜貫通ドメインを有さないため、このキメラ受容体の細胞内局在性やトポロジーは不明である。このキメラ受容体遺伝子で形質転換された植物体は、グルカンエリシターに対して過敏感反応を生じることが記載されているが、実際に病害抵抗性が付与されているかどうかは不明である。さらに、このキメラ受容体は、種々の枝分かれ構造体が存在するグルカンオリゴ糖のうち、フィトフトーラ（Phytophthora）属菌由来のベータ-Ｄ-グルコヘキサオシド（β-D-glucohexaoside）を最小構造として含むグルカンオリゴ糖以外には有効ではない可能性が高い。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２５０３７０号公報
【特許文献２】特開平１０−２８６０３４号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２２９１号公報
【特許文献４】特開２００３−９６９０号公報
【特許文献５】特開２００２−３２５５１９号公報
【特許文献６】再表ＷＯ９８／５８０６５号公報（国際公開ＷＯ９８／５８０６５号公報）
【非特許文献１】西澤洋子、「耐病性植物の分子育種」植物細胞工学シリーズ19、『分子レベルから見た植物の耐病性』、p.136-146、2004、秀潤社
【非特許文献２】He et al., Science, 288, 2360-2363, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、従来法では、強い病害抵抗性を与える真性抵抗性遺伝子を利用した場合は、効果を示す病原菌の特異性が高いため汎用性が低く、逆に、広範囲の病原菌に作用する自己防御関連遺伝子を利用した場合は、発病を防ぐほどの十分な抵抗性を付与することが困難であるという問題がある。したがって、広範囲の病原菌に対して強い抵抗性反応を示す植物体及びその作出方法等が求められている。
【００１０】
本発明は、広範囲の病原菌に存在する物質を認識して強い防御応答反応又は病害抵抗性反応を引き起こす植物及びその作出方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
キチンは植物病原菌類を含む多くの菌類の細胞壁構成成分の一つであり、キチンから生成されるキチンオリゴ糖（キチンエリシター）は防御応答反応を誘起する。しかし、植物が感染を受ける際のキチンエリシターの生成量は少ないと予想され、また、キチンエリシターによって誘導される防御応答反応も細胞死を伴う程の強いＨＲではない。そのため、この防御機構のみで植物の発病を完全に防ぐことは困難である。
【００１２】
そこで、本発明者らは、キチンエリシター受容体を改変し、キチンエリシターで強いＨＲを誘導させることによって病害抵抗性を付与しようと考え、構造的に全く異なるファミリーに分類される２種類の受容体を融合させることによってリガンドと細胞応答を組換えることに成功した。すなわち、非特異的エリシター（キチンオリゴ糖）受容体（キチンエリシター結合タンパク質；ＣＥＢｉＰ）の細胞外ドメインと、特異的エリシター（ａｖｒＸａ２１由来）に対し強い抵抗性反応を誘導する受容体（ＸＡ２１）の細胞内ドメインとを融合させることによって、キチンエリシターに対し強い防御応答反応を起動するキメラ受容体遺伝子を構築し、このキメラ受容体遺伝子を導入した植物体を作製したところ、この植物体が広範囲の病原菌に共通するキチンエリシターに応答して強い病害抵抗性反応を引き起こすことを見い出し、本発明を完成した。本発明は、細胞膜上の受容体を改変することによる耐病性分子育種法によって実際に植物に菌類病抵抗性が付与されることが確認された初めての例である。
【００１３】
すなわち、本発明は、
〔１〕  ｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質のキナーゼドメイン及び膜近傍（ＪＭ）ドメインを含む細胞内ドメインとイネＣＥＢｉＰ又はその機能上のホモログタンパク質の細胞外ドメインとを含む、細胞外ドメイン−膜貫通（ＴＭ）ドメイン−ＪＭドメイン−キナーゼドメイン型のキメラ受容体をコードする遺伝子であって、植物細胞においてキチン特異的にＨＲ細胞死等の防御応答反応をより強く誘導することができるキメラ遺伝子；
〔２〕  前記ｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質が、イネＸＡ２１タンパク質である、前記〔１〕記載のキメラ遺伝子；
〔３〕  （ａ）配列番号１と同一のアミノ酸配列からなるキメラ受容体、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、ＬｙｓＭモチーフ、ＴＭドメイン、ＪＭドメイン及びキナーゼドメイン部分が配列番号１と同一又は保存的置換されており、その他の部分において異なるアミノ酸配列からなるキメラ受容体、
（ｃ）配列番号５と同一のアミノ酸配列からなるキメラ受容体、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、ＬｙｓＭモチーフ、ＴＭドメイン、ＪＭドメイン及びキナーゼドメイン部分が配列番号５と同一又は保存的置換されており、その他の部分において異なるアミノ酸配列からなるキメラ受容体
のいずれかのキメラ受容体をコードするキメラ遺伝子；
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の遺伝子を含む発現ベクター；
〔５〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の遺伝子又は前記〔４〕記載の発現ベクターを含む植物細胞；
〔６〕  前記〔５〕記載の植物細胞を含む植物組織；
〔７〕  前記〔５〕記載の植物細胞を含む植物体；
〔８〕  前記〔７〕記載の植物体から得られる種子；
〔９〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のキメラ遺伝子によってコードされたキメラ受容体タンパク質；
〔１０〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のキメラ遺伝子を植物に導入することにより、植物のキチンエリシター応答性を高める方法。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の遺伝子又は前記〔４〕記載の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程を含む、前記〔１０〕記載の方法；
〔１２〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のキメラ遺伝子を植物に導入することにより、植物に菌類病抵抗性を付与する方法；
〔１３〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の遺伝子又は前記〔４〕記載の発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程を含む、前記〔１２〕記載の方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、キチンを有する菌類全般に対して耐病性効果の高い植物の分子育種法を提供する。すなわち、キチンオリゴ糖は常に直鎖構造であり、エリシター活性の有無はその長さだけに依存するため、キチンを持つ各種菌類は、感染時にキチンエリシターを産生することになる。本発明は、植物のキチンエリシター応答性を高める方法を提供するので、イネいもち病菌に対するイネの耐病性付与に限らず、他の種々の植物とキチンを含む他の病原菌類の組合せについても利用することができる。したがって、本発明の方法は、汎用性の高い耐病性分子育種法であり、難防除病害の問題を抱える作物への適用も可能であるうえ、本発明の方法及び植物を用いることにより、多くの一般的な作物の減農薬栽培が可能となる。
【００１５】
さらに、本発明のキメラ受容体や、それを発現する植物細胞を利用して、キチンエリシター受容体の分子メカニズムや、リガンド認識後の細胞内シグナル伝達機構、真性抵抗性タンパク質の機能発現機構の解析等が可能である。
【００１６】
したがって、本発明は、多くの作物の品種改良に寄与することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のキメラ遺伝子は、ｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質由来の細胞内ドメインと、ＣＥＢｉＰ等のキチンエリシター受容タンパク質由来の細胞外ドメインとを含むキメラ受容体をコードする。
【００１８】
「ｎｏｎ−ＲＤキナーゼ」は、細胞外ドメイン−膜貫通（ＴＭ）ドメイン−膜近傍（ＪＭ）ドメイン−Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼドメインという構造を特徴とする受容体様キナーゼのうち、免疫に関係する可能性の高い一群の受容体キナーゼであり（Dardick and Ronald, PLoS Pathogens, 2, 14-28, 2006）、リガンド認識後細胞死を誘導するシグナル伝達系を起動するという点で同じ機能を有する。
【００１９】
例えば、イネ白葉枯病に対する真性抵抗性遺伝子Ｘａ２１によってコードされるＸＡ２１タンパク質は、ａｖｒＸａ２１遺伝子を持つ白葉枯病細菌を特異的に認識し、ＨＲ細胞死を起動する。Ｘａ２１遺伝子は、Ｘａ２１遺伝子を持つイネ系統（例えば、野生イネであるOryza longistaminata（国立遺伝学研究所から入手可能））からクローニングできる。
【００２０】
ｎｏｎ−ＲＤキナーゼとしては、このＸＡ２１（ＬＲＲ-ＲＬＫタイプ; Song et al., Science, 270, 1804-1806, 1995）のほか、ＦＬＳ２（シロイヌナズナ、アクセッション番号：ＮＭ＿１２４００３）、ＰＲ５Ｋ（シロイヌナズナ、アクセッション番号：Ｕ４８６９８）、ＬＲＫ１０（コムギ、アクセッション番号：Ｕ５１３３０）、Ｘａ２６（イネ、アクセッション番号：ＤＱ４２６６４６）、Ｐｉ−ｄ２（Chen et al., Plant J., 46, 794-804, 2006）等の遺伝子によってコードされる受容体タンパク質が挙げられる。
【００２１】
キチンエリシター受容体は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（キチンエリシター）を認識して、植物細胞における様々な防御応答反応を活性化することが知られている。キチンエリシター受容体遺伝子としては、例えば、イネのＣＥＢｉＰが知られている（ＬｙｓＭタイプ；Kaku et al., ProNAS, 103, 11086-11091, 2006）。ＣＥＢｉＰは、イネの原形質膜に存在するキチンエリシター受容体である。ＣＥＢｉＰをコードするＤＮＡ断片は、例えば、イネ（品種：日本晴）の核ＤＮＡからＰＣＲクローニングしたり、イネ完全長ｃＤＮＡクローンリソースセンター（http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html.en、アクセッション番号：ＡＫ０７３０３２）から入手可能である。
【００２２】
また、イネのＣＥＢｉＰ遺伝子ホモログとしてはアクセッション番号：ＡＫ０６０６６４等がある。イネ以外の種々の植物の培養細胞におけるキチンエリシター結合活性を調べた結果、オオムギ、ニンジン等の培養細胞の原形質膜にもキチンエリシター結合タンパク質が見出されている（Okada et al., Plant Cell Physiol., 43, 505-512, 2002）。したがって、キチンエリシター受容体はイネ以外の植物からも調製できる。実際、ジャガイモ（Erwinia induced protein 1；アクセション番号：ＡＡＯ３２０６５）、ブドウ（unnamed protein product；アクセッション番号：ＣＡＯ４７４６３、unnamed protein product；アクセッション番号：ＣＡＯ４７４６４、及びhypothetical protein；アクセッション番号：ＣＡＮ６２１９５）、シロイヌナズナ（peptidoglycan-binding LysM domain-containing protein；アクセッション番号：ＮＰ＿５６５４０６、及びunknown protein；アクセッション番号：ＡＡＭ６５９１２）、コムギ（Sequence 142035 from patent US 7214786；アクセッション番号：ＡＢＴ５４５６５）等において、ＣＥＢｉＰ遺伝子の１次構造上のホモログが知られている。それらは、ＣＥＢｉＰと同様、細胞外ドメイン内に、ペプチドグリカンやキチン結合活性があると考えられているＬｙｓＭと呼ばれるモチーフを持つ。これらはＣＥＢｉＰと同様の機能を有し、ＣＥＢｉＰの機能上のホモログ、すなわち、キチンエリシター受容体であると考えられるが、たとえＣＥＢｉＰと１次構造があまり似ていなくても、キチンエリシター受容体として機能するタンパク質であるなら、本発明において細胞外ドメインのソースとして利用することができる。
【００２３】
本発明のキメラ遺伝子は、細胞外ドメイン−膜貫通（ＴＭ）ドメイン−細胞内ドメイン（ＪＭドメイン−キナーゼドメイン）の基本構造を有する。本発明のキメラ遺伝子の構築においては、目的の植物に応じて、その植物において細胞死を誘導し得るいずれかのｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質由来の細胞内ドメインと、ＣＥＢｉＰ又はその機能上のホモログタンパク質由来の細胞外ドメインとが選択される。例えば、細胞外ドメイン側としてはイネＣＥＢｉＰ遺伝子、細胞内ドメイン側としてはＦＬＳ２（シロイヌナズナ）、ＰＲ５Ｋ（シロイヌナズナ）、Ｐｉ−ｄ２（イネ）、Ｘａ２６（イネ）、ＬＲＫ１０（コムギ）を選択する等の組合せが可能である。
【００２４】
ｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質由来の細胞内ドメインには、少なくともキナーゼドメインと共にＪＭドメインが含まれる。ＪＭドメインは、ＴＭドメインのそばにある膜近傍配列で、ｎｏｎ−ＲＤキナーゼの場合、細胞内ドメインの一部であって、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの自己リン酸化のターゲットであるセリン、スレオニン残基を含む領域である（Xu et al., Plant Journal, 45, 740-751, 2006）。
【００２５】
また、細胞外ドメインと細胞内ドメインを結ぶ膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＣＥＢｉＰ由来のものでも、ｎｏｎ−ＲＤキナーゼ由来のものでもよいが、より強いキチンエリシターによる防御応答反応をもたらすには、ＣＥＢｉＰ由来のものが好ましい。
【００２６】
本発明の遺伝子は、それによってコードされるキメラ受容体タンパク質が植物細胞においてキチン特異的にＨＲ細胞死等の防御応答反応をより強く誘導することができる限りにおいて、例えば遺伝子コドンの縮重やアミノ酸の保存的置換などのために、細胞内ドメインが由来するｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質及び細胞外ドメインが由来するＣＥＢｉＰ又はその機能上のホモログタンパク質をコードする遺伝子とは異なる塩基配列であってもよい。
【００２７】
例えば、イネＸａ２１遺伝子の細胞内ドメイン及びイネＣＥＢｉＰ遺伝子の細胞外ドメインを有する本発明の遺伝子の好ましい具体例は、以下の実施例において詳細に説明されている、ＣＲＸａ１（配列番号２）及びＣＲＸａ３（配列番号６）である。これらによってコードされるキメラタンパク質はＣＲＸＡ１（配列番号１）及びＣＲＸＡ３（配列番号５）であり、本発明の遺伝子は、これらと同じアミノ酸配列のタンパク質をコードする限りにおいてＣＲＸａ１（配列番号２）及びＣＲＸａ３（配列番号６）と異なる塩基配列を有していてもよい。さらに、本発明の遺伝子は、それがコードするキメラ受容体タンパク質が植物細胞においてキチン特異的に防御応答反応をより強く誘導することができる限りにおいて、ＣＲＸＡ１（配列番号１）及びＣＲＸＡ３（配列番号５）と異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列、例えばこれらのうちＬｙｓＭモチーフ、ＴＭドメイン、ＪＭドメイン、キナーゼドメインのような重要部分が同一又は保存的置換されており、その他の部分において異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有していてもよい。
【００２８】
上記のような各遺伝子におけるドメインの特定及び選択は、公知の遺伝子及びタンパク質データベース、及び配列解析ソフトウェア等を用いて行うことができる。また、遺伝子クローニング、核酸の合成、キメラ遺伝子の構築及びキメラ遺伝子を含む発現ベクターの作製等は、当業者に一般的な遺伝子工学的手法によって容易に行うことができる。
【００２９】
本発明の発現ベクターは、例えば植物に導入した後、本発明の遺伝子が植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明の遺伝子が位置し、さらに該遺伝子の下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられるベクターは、植物への導入方法や植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーターや、トウモロコシのユビキチンプロモーター等を挙げることができる。また、上記ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターや、ノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を挙げることができる。しかし、植物細胞中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００３０】
また、本発明の遺伝子を導入された形質転換植物細胞を効率的に選択するために、上記発現ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子カセットを含むか、あるいは、選抜マーカー遺伝子カセットを含むＤＮＡと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性をもたらすネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の遺伝子ＤＮＡ断片あるいは本発明の遺伝子を含む発現ベクターの植物細胞への導入は、当業者においては公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等により実施することができる。また、本発明の遺伝子を導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な条件で培養することによって得られる。
【００３２】
本発明の遺伝子を導入した形質転換細胞から、植物体を再生することができる。植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、また、用いた遺伝子導入法に応じて当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、アグロバクテリウム法でカルスに遺伝子を導入した場合は、カルスから植物体を再生させる方法（Toki, et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006）、エレクトロポレーション法を用いた場合は、プロトプラストから植物体を再生させる方法（Toki, et al., Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992）等を用いることができる。一旦、ゲノム中に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物細胞や種子が得られれば、それを基に、該植物培養組織や植物体を量産することも可能である。
【００３３】
本発明のキメラ受容体遺伝子は、細胞内で発現されると、キチンエリシター受容体の細胞外ドメインによってキチンエリシターを認識し、細胞内ドメインを介してＨＲ細胞死を誘導することができるキメラ受容体タンパク質が生成される。その結果、本発明のキメラ受容体遺伝子及びキメラ受容体は、植物細胞又は植物体に、増強されたキチンエリシター応答性、又は、増強されたキチンエリシター応答性及び菌類全般に対する強い抵抗性を付与することができる。
【００３４】
「増強された」又は「より強い」防御応答反応又はキチンエリシター応答性とは、本発明の遺伝子を導入した細胞又は植物体と、本発明の遺伝子を導入していない宿主細胞又は植物体とを比較した場合に、本発明の遺伝子を導入した細胞又は植物体がキチンエリシターに対し防御応答反応の有意な向上を示すこと（具体的には、ＨＲ細胞死、活性酸素生成量、活性窒素生成量のいずれか一以上において有意に高い量を示すこと、又はいずれかの防御関連遺伝子の有意に早い又は強い発現誘導を示すこと等）をいう。このような防御応答反応又は防御関連遺伝子発現の確認のための試験は、公知の方法により行うことができる。例えば、細胞死の測定は、エバンスブルー染色法（Baker and Mock, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39, 7-12, 1994）、ニュートラルレッド染色法（Borenfreund and Puerner, Toxicology Letters, 24, 119-124, 1985）；活性酸素生成の測定は、ルミノール発光法（過酸化水素検出；Schwacke and Hager, Planta, 187, 136-141, 1992）、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色法（スーパーオキシド検出；Yamamoto et al., Plant Physiol., 128, 63-72, 2002）；活性窒素生成の測定は、ＤＡＦ-２ＤＡ法（一酸化窒素検出；Yamamoto et al., J. General Plant Pathology, 70, 85-92, 2004）、ＡＰＦ（アミノフェニルフルオレセイン）法（過酸化亜硝酸イオン検出；Saito et al., Plant Cell Physiol., 47, 689-697, 2006）；遺伝子発現の測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、マイクロアレイ法等によって行うことができる。
【００３５】
本発明によって罹患を防止又は軽減することができる植物の菌類病としては、イネについては、イネいもち病に加えて、イネの苗立枯病（Fusarium属菌、Trichoderma属菌、Rhizoctonia属菌等による）、ごま葉枯病（Cochliobolus miyabeanus）、褐色葉枯病（Metasphaeria albescens）、紋枯病（Thanatephorus cucumeris）等の菌類病が挙げられるが、これらに限らず細胞壁にキチンを有する菌類全般に起因する障害・疾患である。イネ以外の植物についても同様である。
【００３６】
本発明において用いられる植物としては、イネ、コムギ等の単子葉植物、タバコ、ジャガイモ、ブドウ等の双子葉植物が例示されるが、本発明は、これらに限らず、各種の作物、植物等に応用することができる。
【００３７】
本発明のキメラ受容体タンパク質は、それ自体を得ることもできる。本発明のキメラタンパク質は、それが植物細胞においてキチン特異的にＨＲ細胞死等の防御応答反応をより強く誘導することができる限りにおいて、例えば遺伝子コドンの縮重やアミノ酸の保存的置換などのために、細胞内ドメインが由来するｎｏｎ−ＲＤキナーゼタンパク質及び細胞外ドメインが由来するＣＥＢｉＰ又はその機能上のホモログタンパク質とは異なるアミノ酸配列であってもよい。例えば、イネＸａ２１遺伝子の細胞内ドメイン及びイネＣＥＢｉＰ遺伝子の細胞外ドメインを有する本発明のキメラタンパク質は、それが植物細胞においてキチン特異的にＨＲ細胞死等の防御応答反応をより強く誘導することができる限りにおいて、ＣＲＸＡ１（配列番号１）及びＣＲＸＡ３（配列番号５）と異なるアミノ酸配列、例えばこれらのうちＬｙｓＭモチーフ、ＴＭドメイン、ＪＭドメイン、キナーゼドメインのような重要部分が同一又は保存的置換されており、その他の部分において異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００３８】
本発明のタンパク質の生産は、通常のタンパク質精製技術により、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等を宿主としてキメラ受容体遺伝子を導入し、これらの宿主で発現させ、可溶化後、１）キチンカラムへの吸着能を利用した精製法、２）発現時にヒスチジンタグ等を付加しておき、タグに応じた方法（ヒスチジンタグならばニッケルカラム）等を行うことによって、精製タンパク質として得ることができる。このような精製された本発明のキメラ受容体タンパク質は、１）３次元構造解析（Ｘ線解析法、ＮＭＲ解析法等）、２）相互作用するタンパク質の単離（アフィニティークロマトグラフィー等）、３）再構築系におけるシグナル伝達機構解析、等の研究目的等での利用も可能である。
【実施例】
【００３９】
１．キメラ受容体遺伝子及びベクターの構築
ＣＥＢｉＰ遺伝子及びＸａ２１遺伝子のキメラ受容体をコードする遺伝子及びそれを含むベクターは、以下のようにして作製した。
【００４０】
ＣＥＢｉＰ遺伝子（Kaku et al., ProNAS, 103, 11086-11091, 2006）領域を増幅するために、イネ完全長ｃＤＮＡクローンデータベース（http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/）内のクローン（アクセッション番号：ＡＫ０７３０３２）を鋳型に、Ｃ１-Ｓｐｅ（gaactagtCTTTCCCCACCATGGCGTCGCT：配列番号９）とＣ２Ｒ-Ｎｈ（cagctagcAAGGAAACAGATAATGATCAA：配列番号１０）とのプライマー対を用いてＰＣＲを行った。増幅された、ＣＥＢｉＰ遺伝子のほぼ全体を含む約１．１kbのＤＮＡ断片（ＣＲ１２）を、ｐＧＥＭ-Ｔベクター（登録商標；プロメガ株式会社）のＴＡクローニング部位に挿入し、ｐＧＥＭ-Ｔ-ＣＲ１２を作製した。また、同様にしてＣ１-ＳｐｅとＣ３Ｒ-Ｎｈ（gtgctagcAGTTGCAAGGCTGGTTTGTAT：配列番号１１）とのプライマー対を用いてＰＣＲを行った後、増幅された、ＣＥＢｉＰの細胞外ドメイン領域を含む約１kbのＤＮＡ断片（ＣＲ１３）を、ｐＧＥＭ−ＴベクターのＴＡクローニング部位に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲ１３を作製した。
【００４１】
一方、イネ白葉枯真性抵抗性遺伝子Ｘａ２１の部分クローニングのために、Ｘａ２１遺伝子を持つイネ系統ＩＲＢＢ２１の種子（独立行政法人農業生物資源研究所  加来久敏博士より譲渡）を播種し、３葉期の幼苗の地上部から「RNeasy Plant Mini kit」（商品名；QIAGEN社）を使って全ＲＮＡを抽出した。それを鋳型として用いて、Ｘａ４−Ｎｈ（gagctagcGATCTACATCTGCCTCGATGT：配列番号１２）とＸａ７Ｒ−Ｓａ（atgagctcTCAGAATTCAAGGCTCCCACCT：配列番号１３）とのプライマー対でＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅された、Ｘａ２１の膜貫通ドメインからC末端までを含む約１．２ｋｂのバンド（Ｘａ４７）を、アガロースゲルから精製し、プラスミドベクターｐＧＥＭ−ＴのＴＡクローニング部位に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ４７を作製した。次いで、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ４７を鋳型に、Ｘａ５−Ｎｈ（tagctagccacaagagaactaaaaaggga：配列番号１４）とＸａ７Ｒ−Ｓａ（atgagctcTCAGAATTCAAGGCTCCCACCT：配列番号１３）とのプライマー対でＰＣＲした後、得られた、Ｘａ２１のＪＭドメインからＣ末端までを含む約１．１ｋｂの増幅産物（Ｘａ５７）を、ｐＧＥＭ−ＴのＴＡクローニング部位に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ５７を作製した。また、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ４７を鋳型に、Ｘａ６−Ｎｈ（cagctagcttcgcgccgaccaatttgttg:配列番号１５）とＸａ７Ｒ−Ｓａ（atgagctcTCAGAATTCAAGGCTCCCACCT：配列番号１３）とのプライマー対でＰＣＲした。得られた、Ｘａ２１のプロテインキナーゼドメインからＣ末端までを含む約１ｋｂの増幅産物（Ｘａ６７）を、ｐＧＥＭ−ＴのＴＡクローニング部位に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ６７を作製した。
【００４２】
次に、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲ１２をＮｈｅＩとＳａｃＩで処理して開環し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ５７をＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して得られるＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲＸａ１を作製した。また、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲ１２をＮｈｅＩとＳａｃＩで処理して開環し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ６７をＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して得られるＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲＸａ２を作製した。
【００４３】
また、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲ１３をＮｈｅＩとＳａｃＩで処理して開環し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ４７をＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して得られるＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲＸａ３を作製した。さらに、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲ１３をＮｈｅＩとＳａｃＩで処理して開環し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｘａ６７をＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して得られるＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲＸａ４を作製した。
【００４４】
これらのベクター、及び各ベクターに含まれるキメラタンパク質遺伝子がコードするキメラタンパク質の模式図を、図１Ａ及び１Ｂに表す。図１Ｂにおいて、「ＬｙｓＭ」は推定キチン吸着ドメイン（ＣｈＢＤ）、「ＴＭ」は膜貫通ドメイン、「ＪＭ」は膜近傍ドメイン、「ｋｉｎａｓｅ」はプロテインキナーゼ、「ＬＲＲ」はロイシン・リッチ・リピートをそれぞれ表す。斜線部分はＣＥＢｉＰ由来、白抜き部分はＸＡ２１由来である。比較のため、ＣＥＢｉＰ及びＸＡ２１も示す。
【００４５】
こうして得られた各キメラ受容体遺伝子をイネで発現するために、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を４反復させた人工プロモーターＥＮ４（独立行政法人農業生物資源研究所  廣近洋彦博士より譲渡；配列番号１６）を用いて、発現ベクターを作製した。
【００４６】
ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２（Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999）は、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Clontech社）のＴ−ＤＮＡ領域内に、選抜マーカーカセットとして、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター：：ハイグロマイシンリン酸転移酵素（ＨＰＴ）：：ＣａＭＶターミネーターを持つ他、上記ＥＮ４と、その下流に、ＲＣＣ２（イネキチナーゼ遺伝子Ｃｈｔ−２;アクセッション番号：Ｘ５６７８７）とノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ３’）を持つ。このｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２を、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩで切断することによってＲＣＣ２を除き、そこに先にクローン化したｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＲＸａ１、２、３又は４由来のＳｐｅＩ−ＳａｃＩ断片を連結し、それぞれｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ１、２、３又は４を完成させた。
【００４７】
発現ベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ１、２、３及び４の構造を、図１Ｃに表す。これらによってコードされるキメラタンパク質の遺伝子をそれぞれ「ＣＲＸａ１」、「ＣＲＸａ２」、「ＣＲＸａ３」及び「ＣＲＸａ４」と呼び、その塩基配列を配列番号２、４、６及び８にそれぞれ示す。また、それらによってコードされるキメラ受容体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１、３、５及び７にそれぞれ示す。
【００４８】
ＣＲＸａ1（配列番号２）において、ヌクレオチド番号１〜６は制限酵素ＳｐｅＩ部位、ヌクレオチド番号１０８６〜１０９１は制限酵素ＮｈｅＩ部位、ヌクレオチド番号２１４２〜２１４７は制限酵素ＳａｃＩ部位であり、これらはキメラ遺伝子の構築の際に付加されたものである。同様に、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３及びＣＲＸａ４は、以下のように付加された配列を含む：
ＣＲＸａ２（配列番号４）：ヌクレオチド番号１〜６（制限酵素ＳｐｅＩ部位）、ヌクレオチド番号１０８６〜１０９１（制限酵素ＮｈｅＩ部位）、ヌクレオチド番号２０４９〜２０５４（制限酵素ＳａｃＩ部位）；
ＣＲＸａ３（配列番号６）：ヌクレオチド番号１〜６（制限酵素ＳｐｅＩ部位）、ヌクレオチド番号９７２〜９７７（制限酵素ＮｈｅＩ部位）、ヌクレオチド番号２１５４〜２１５９（制限酵素ＳａｃＩ部位）；及び
ＣＲＸａ４（配列番号８）：ヌクレオチド番号１〜６（制限酵素ＳｐｅＩ部位）、ヌクレオチド番号９７２〜９７７（制限酵素ＮｈｅＩ部位）、ヌクレオチド番号１９３５〜１９４０（制限酵素ＳａｃＩ部位）。
【００４９】
ＣＲＸＡ１（配列番号１）において、アミノ酸番号１〜３５６はＣＥＢｉＰ由来であり、アミノ酸番号１〜２８はシグナル配列、アミノ酸番号１１３〜１５９は1つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号１７７〜２２０は２つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号３３５〜３５６はＴＭドメインに相当する。アミノ酸番号３５７〜３５８（Ａｌａ-Ｓｅｒ）はＮｈｅＩ部位由来である。アミノ酸番号３５９〜７０７はＸａ２１由来であり、アミノ酸番号３６５〜３８９はＪＭドメイン、アミノ酸番号３９０〜６８６はＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼドメインに相当する。
【００５０】
ＣＲＸＡ２（配列番号３）において、アミノ酸番号１〜３５６はＣＥＢｉＰ由来であり、アミノ酸番号１〜２８はシグナル配列、アミノ酸番号１１３〜１５９は1つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号１７７〜２２０は２つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号３３５〜３５６はＴＭドメインに相当する。アミノ酸番号３５７〜３５８（Ａｌａ-Ｓｅｒ）はＮｈｅＩ部位由来である。アミノ酸番号３５９〜６７６はＸａ２１由来であり、アミノ酸番号３５９〜６５５はＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼドメインに相当する。
【００５１】
ＣＲＸＡ３（配列番号５）において、アミノ酸番号１〜３１８はＣＥＢｉＰ由来であり、アミノ酸番号１〜２８はシグナル配列、アミノ酸番号１１３〜１５９は1つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号１７７〜２２０は２つ目のＬｙｓＭモチーフに相当する。アミノ酸番号３１９〜３２０（Ａｌａ-Ｓｅｒ）はＮｈｅＩ部位由来である。アミノ酸番号３２１〜７１１はＸａ２１由来であり、アミノ酸番号３３７〜３６２はＴＭドメイン、アミノ酸番号３６９〜３９３はＪＭドメイン、アミノ酸番号３９４〜６９０はＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼドメインに相当する。
【００５２】
ＣＲＸＡ４（配列番号７）において、アミノ酸番号１〜３１８はＣＥＢｉＰ由来であり、アミノ酸番号１〜２８はシグナル配列、アミノ酸番号１１３〜１５９は1つ目のＬｙｓＭモチーフ、アミノ酸番号１７７〜２２０は２つ目のＬｙｓＭモチーフに相当する。アミノ酸番号３１９〜３２０（Ａｌａ-Ｓｅｒ）はＮｈｅＩ部位由来である。アミノ酸番号３２１〜６３８はＸａ２１由来であり、アミノ酸番号３２１〜６１７はＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼドメインに相当する。
【００５３】
２．形質転換イネの作出
（１）アグロバクテリウムへの遺伝子導入法
Nagelらの方法（Microbiol. Lett., 67, 325, 1990）にしたがってｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ１、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ２、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ３、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ４を、それぞれエレクトロポーレーション法によりAgrobacterium tumefacience（ＥＨＡ１０５株）に導入した。その後、５０μg/mLのカナマイシン及び５０μg/mLのハイグロマイシンを含むＬＢ培地上で２８℃で２日間培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得た。
【００５４】
（２）イネへの遺伝子導入法
イネの形質転換は、超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号公報、又は、Toki et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006）にしたがって行った。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはメロペン（大日本住友製薬）を用いた。具体的には以下のようにして行った。
【００５５】
上記（１）で調製した形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液と、超迅速形質転換法にしたがって前培養したイネ（Oryza sativa 品種：日本晴）の種子を、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０g/L  スクロース、１０g/L  グルコース、０．３g/L  カザミノ酸、２mg/L  ２，４−Ｄ、１０mg/L  アセトシリンゴン、４g/L  ゲルライト、pH５．２）上で、暗黒下で３日間、２８℃で共存培養した。その後、２５mg/Lのメロペンを含有する滅菌水を用いて種子からアグロバクテリウムを洗浄後、種子を１２．５mg/Lのメロペン及び選抜マーカーとして５０mg/Lのハイグロマイシン、さらに４g/L  ゲルライトを加えたＮ６培地（選抜培地）に置床して、２８℃、暗所で約１０日間培養し、ハイグロマイシン耐性細胞を増殖し、カルスを得た。
【００５６】
選抜されたハイグロマイシン耐性カルスを再分化培地（６．２５mg/L  メロぺン及び５０mg/L  ハイグロマイシンを補充したＭＳ培地：３０g/L  スクロース、３０g/L  ソルビトール、２g/L  カザミノ酸、２mg/L  カイネチン、０．００２mg/L  ＮＡＡ、４g/L  ゲルライト、pH５．８）に移植して、再分化するまで、２８℃、明所で培養を続けた。
【００５７】
再分化個体を、発根培地（６．２５mg/L  メロぺン及び２５mg/L  ハイグロマイシンを補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地）に置床した。約１０日後、新しい発根培地に移植し、さらに約１週間後、形質転換植物が大きくなったところで、２〜３日の馴化を経て「呉羽粒培土−Ｄ」（商品名；呉羽化学）を詰めたポットに移植し、温室内で生育させ、次世代の自殖種子（Ｒ１世代）を得た。
【００５８】
当初得られるハイグロマイシン耐性カルスは、外来遺伝子がイネゲノム中の異なる部位に挿入された不均一な細胞の集団であると考えられる。そこで、形質転換カルスを用いる実験用に、導入カルス細胞を均一化する（単カルス化）ために、同一種子由来のハイグロマイシン耐性カルスを選抜培地に１カルスずつ離して置床し、２８℃で培養し、増殖してきた１カルス由来のハイグロマイシン耐性カルスを再び１カルスずつ離して新しい選抜培地に置床した。これをさらに４回繰り返すことによって、カルス細胞を均一化し、それぞれＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３、ＣＲＸａ４カルスとした。
【００５９】
３．形質転換イネにおける導入遺伝子の発現解析
イネカルス（Oryza sativa L.品種：日本晴）を、２mg/Lの２，４−Ｄ、３０g/Lのショ糖、４g/Lのゲルライトを含むpH５．８のＮ６培地に移植し、２８℃、暗所で２０日間培養した後、実験に供試した。ＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３又はＣＲＸａ４カルス、及びベクターコントロールカルス（ＣＲＸａの代わりにβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を持つベクターで形質転換したイネカルス）の培養には、上記Ｎ６培地に５０mg/Lのハイグロマイシンンを加えたものを用いた。
【００６０】
（１）ＣＲＸａ遺伝子転写産物量の解析
各ＣＲＸａ遺伝子（ＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３、ＣＲＸａ４）の転写産物量は、以下の方法で解析した。
【００６１】
前述した方法で単カルス化したカルス又は上記の温室で生育中のイネ植物葉から、「セパゾール」（商品名；ナカライテスク株式会社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡから、「River Tra Ace」（商品名；東洋紡）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を用いて、４０℃、２０分のＲＴ−ＰＣＲを行うことによってｃＤＮＡを合成し、以下のＰＣＲに供試した。１００ ngのｃＤＮＡ、１．２５単位のＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）、１×ＥｘＴａｑ  Ｍｇ２＋フリーバッファー、各１２５μMのｄＮＴＰｓ、１ mM  ＭｇＣｌ２、０．５μM  フォワードプライマー、０．５μM  リバースプライマーを含む２５μLのＰＣＲ反応液を、９４℃で２分反応させた後、９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で４分間反応させた。各ＣＲＸａ遺伝子の検出にはＣＥＢｉＰの塩基配列に相補的なＣＲ−ＱＦプライマー（5’-atggaacgctgaagcttggtgaga-3’：配列番号１７）及びＸａ２１の塩基配列に相補的なＸａ７Ｒ−Ｓａ（atgagctcTCAGAATTCAAGGCTCCCACCT：配列番号１３）を、ユビキチン遺伝子（Os06g0681400）の検出にはＵｂｉ５プライマー（5'-ccagtaagtcctcagccatgga-3'：配列番号１８）及びＵｂｉ３プライマー（5'-ggacacaatgattagggatcac-3'：配列番号１９）を、それぞれ使用した。
【００６２】
５μLのＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅産物を検出し、導入遺伝子が同程度発現している系統を以後の実験に用いるために選択した。
【００６３】
結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。ＣＲ−ＱＦ／Ｘａ７Ｒ−Ｓａプライマーで増幅された１．２kb前後のバンドの濃さがほぼ同じカルス系統（ＣＲＸａ１−２、−６、ＣＲＸａ２−７、−８、ＣＲＸａ３−１、−４、ＣＲＸａ４−４、−６）、及びイネ系統（ＣＲＸａ１−１５以外）を、以降の実験に供試した。
【００６４】
（２）ＣＲＸＡタンパク質の検出
ＣＲＸＡタンパク質（ＣＲＸＡ１、ＣＲＸＡ２、ＣＲＸＡ３、ＣＲＸＡ４）は、以下の方法で検出した。
【００６５】
１０％グリセロール、５mM  ジチオスレイトールを含むリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline；ＰＢＳ）中でイネカルスを破砕し、破砕液を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を可溶性画分（水溶性画分）、沈殿をミクロソーム画分（膜画分）とした。各画分に１０％のＳＤＳを加え、１００℃で熱変性させた後、全タンパク質を２０μgに調整して、１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。泳動後、タンパク質をメンブレン上にブロッティングし、抗ＣＥＢｉＰ／ウサギ抗体（Kaku et al., ProNAS, 103, 11086-11091, 2006）、アルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギ／ヤギ抗体（Whole Molecule、 Aurora、Ohio、米国）を用い、小岩井ら（Koiwai et al., Plant Journal, 51, 92-104, 2007）の方法にしたがってウェスタン解析を行った。
【００６６】
結果を図３に示す。ＣＲＸＡ１〜３はＣＲＸａ１〜３カルスの膜画分（パネルＢ）から、ＣＲＸＡ４はＣＲＸａ４カルスの水溶性画分（パネルＡ）から、それぞれ抗ＣＥＢｉＰ抗体と反応するバンドとして検出された。したがって、ＣＲＸＡ１〜３はＣＥＢｉＰやＸＡ２１と同じ細胞膜に、ＣＲＸＡ４は細胞質に、それぞれ局在していると考えられる。
【００６７】
４．形質転換カルス細胞のキチンエリシター応答性
キチンエリシターとして、7量体のキチンオリゴ糖（Ｎ−アセチルキトヘプタオース、ＧＮ７）を用いた。これは、甲殻類由来の７量体のキトサンオリゴ糖（焼津水産化学工業より譲渡）を伊藤らの方法（Ito et al., Plant Journal, 12, 347-356, 1997）で再アセチル化することにより調製した。
【００６８】
各実験結果について、各時間のベクターコントロールの値に対して有意差検定（ダネット検定（Dunnett's test）、Ｐ＜０．０５）を行った。
【００６９】
（１）細胞死の測定
イネカルスの細胞死は、白須ら（Shirasu et al., Plant Cell, 9, 261-270, 1997）のエバンスブルー染色法を参考にして、以下のように検出した。
【００７０】
Ｎ６培地中で１日間馴化させたイネカルスを、0.１μg/mLのＧＮ７で処理した。このエリシター処理後、カルスを経時的に採取し、pH７．２の５０mM  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファーで洗浄後、０．０５％エバンスブルーで１５分間染色した。カルスを再び５０mM  ＨＥＰＥＳバッファーでよく洗浄し、ジメチルホルムアミドで５０分間脱染した。ジメチルホルムアミド中に溶出されたエバンスブルー量を反映したＯＤ  ５９５値を、分光光度計を用いて測定した。Delledonneら（Delledonne, et al., ProNAS, 98, 13454-13459, 2001）の方法にしたがい、エタノール処理で完全に死滅させたカルスのＯＤ  ５９５値を１００％に、また、無処理のコントロールカルスのＯＤ  ５９５nm値を０％に、それぞれ設定し、各カルスの細胞死の割合を相対的に評価した。
【００７１】
結果を図４に示す。ＣＲＸａ１カルス及びＣＲＸａ３カルスでは、キチンエリシター処理によってベクターコントロールと比較して有意にＨＲ細胞死が引き起こされたが、ＪＭドメインを持たないＣＲＸＡ２や、細胞膜に局在しないＣＲＸＡ４は、キチンエリシターシグナルを細胞死誘導シグナルに変換できないことが示された。
【００７２】
（２）活性酸素の測定
活性酸素は、ＨＲに伴って生成が増大するセカンドメッセンジャーとして知られている。そこで、イネカルスから発生するＨ２Ｏ２量を、ルミノール法（Schwacke and Hager, Planta, 187, 136-141, 1992）により測定した。
【００７３】
Ｎ６培地中で１日間馴化させたイネカルスを、０．１μg/mLのＧＮ７で処理して、経時的に培地を採取した。培地をpH７．９の５０mMカリウム−リン酸バッファー内に１７倍希釈し、触媒として１．４mMのフェリシアン化カリウム、基質として５５μMのルミノールを加え、溶液中のＨ２Ｏ２が触媒するルミノール発光（４６０nm）をルミノメーター（製品名：TD-20/20 Luminometer、メーカー名：Turner Designs（サニーベル、米国））により１０秒間積算した。培地中のＨ２Ｏ２濃度は、市販のＨ２Ｏ２溶液（和光純薬）を培地中に希釈した同解析から作製した検量線をもとに算出した。
【００７４】
結果を図５に示す。ＣＲＸａ１カルス及びＣＲＸａ３カルスでは、キチンエリシター処理による活性酸素の生成量がベクターコントロールと比較して有意に増大した。したがって、これらのカルス系統においてキチンエリシター処理によってＨＲがより強く誘導されることが明らかになった。
【００７５】
（３）活性窒素の測定
活性窒素（一酸化窒素）もまた、ＨＲに伴って生成が増大するセカンドメッセンジャーとして知られている。イネカルス内のＮＯ量は、山本ら（Yamamoto et al., J. General Plant Pathology, 70, 85-92, 2004）の方法を参考に以下のようにして検出した。
【００７６】
Ｎ６培地中で１日間馴化させたイネカルスを、５００μMの塩化カルシウムと５００μMの硫酸カリウムを含む５mM  ２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー中に移した。1時間後、１０μMのジアミノフルオレセイン  ２−ジアセテート（ＤＡＦ−２ＤＡ）（第一化学薬品）及び０．１μg/mLのＧＮ７で処理し、経時的にカルスを採取した。カルスを５mM  ＭＥＳバッファー中で破砕し、カルス内のエステラーゼとＮＯの二段階の触媒によってＤＡＦ−２ＤＡから生じたＤＡＦ−２Ｔを、バッファー内に溶出させた。１６，０００×ｇの遠心分離により残渣を除いた後、蛍光分光光度計で４８５nmで励起し、５３５nmの蛍光を測定した。各サンプルのＮＯ量は、蛍光分光光度計によって検出された蛍光強度を相対的に比較することで評価した。すなわち、キチンエリシター添加直前（０時間）のベクターコントロールの蛍光量を１としたときの相対値で表した。
【００７７】
結果を図６に示す。ＣＲＸａ１カルス及びＣＲＸａ３カルスでは、キチンエリシター処理による一酸化窒素の蓄積量がベクターコントロールと比較して有意に増大した。したがって、このことからも、これらのカルス系統においてキチンエリシター処理によってＨＲがより強く誘導されることが確認された。
【００７８】
５．形質転換カルス細胞のリポ多糖応答性
キチンを含まないエリシターとして、細菌性のリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、上記４．に記載したのと同様に細胞死の検出及び活性酸素の検出を行った。ＬＰＳとしては、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, 米国）から市販されている「Lipopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa serotype 10」を使用し、５０μg/mLで処理した。実験結果について、各時間のベクターコントロールの値に対して有意差検定（ダネット検定（Dunnett's test）、Ｐ＜０．０５）を行なった。
【００７９】
結果を図７に示す。ＣＲＸａ１〜ＣＲＸａ４のいずれについても、ＬＰＳ処理による細胞死（パネルＡ）及び活性酸素の生成量（パネルＢ）にベクターコントロールとの間に有意差はなく、キチン以外のエリシター処理では、キメラ受容体の効果は認められなかった。したがって、キメラ受容体は、キチンエリシターを特異的に認識してＨＲ細胞死を引き起こすことが確認された。
【００８０】
６．形質転換イネ葉のキチンエリシター応答性
エリシター処理によるイネ葉の細胞死は、以下の方法により検出した。
【００８１】
自殖種子（Ｒ１世代）、及びコントロールとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子とＧＵＳ遺伝子とを持つバイナリーベクター（ｐＢＩ３３３）で形質転換したイネ種子を、籾殻の除去後、次亜塩素酸ナトリウムで滅菌し、２５mg/Lハイグロマイシンを含む寒天プレート上で約１０日間栽培し、ハイグロマイシン耐性個体を各系統１０個体ずつ「呉羽粒培土−Ｄ」（商品名；呉羽化学）に鉢上げした。２８℃、自然光下で生育させた、播種後約１ヶ月のイネ苗を実験に供試した。エリシター処理１週間前のイネ苗を、２．５mMの硫酸アンモニウムで処理した。
【００８２】
イネの切葉を、直径２mmの菌移植パンチで軽くつぶして、シャーレ内の湿らせたろ紙上に置床した。パンチでつぶした部位に１００μg/mLのＧＮ７（２０μL）又は０．５mg/mLのＬＰＳ（２０μL）を滴下し、シャーレに蓋をした。処理葉は、室温２６℃、１５０μmolm-2s-1の光条件下で維持した。処理から２日後、処理葉を０．０５％のエバンスブルーで１時間染色後、水で洗浄し、エバンスブルーで染色された壊死部の面積を画像解析ソフト「Image J」（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いた岸本らの方法（Kishimoto et al., Phytochemistry, 67, 1520-1529, 2006）にしたがって解析した。実験結果について、３グループそれぞれ毎にチューキー・クラマー（Tukey-Kramer）のＨＳＤ検定（Ｐ＜０．０５）で統計的に解析した。
【００８３】
結果を図８に示す。ＧＮ７又はＬＰＳの代わりに水を滴下した場合（水処理）ではいずれの形質転換イネも細胞死は低レベルしか起きなかった。また、ＬＰＳ処理ではいずれの形質転換イネも同程度レベルの細胞死が誘導された。一方、キチンエリシター（ＧＮ７）処理では、ＣＲＸＡ１イネおよびＣＲＸＡ３イネで有意に細胞死が誘導された。したがって、植物体においても、ＣＲＸａ１あるいはＣＲＸａ３遺伝子を発現する系統特異的にキチンエリシター処理で細胞死がより強く誘導されることが確認された。
【００８４】
７．形質転換イネ葉のいもち病抵抗性検定法
接種試験は以下の方法で行った。
自殖種子（Ｒ１世代）、及びコントロールとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子とＧＵＳ遺伝子とを持つバイナリーベクター（ｐＢＩ３３３）で形質転換したイネ種子を、籾殻の除去後、次亜塩素酸ナトリウムで滅菌し、２５mg/Lハイグロマイシンを含む寒天プレート上で約１０日間栽培し、ハイグロマイシン耐性個体を各系統１０個体ずつ「呉羽粒培土−Ｄ」（商品名；呉羽化学）に鉢上げした。
【００８５】
昼間２８℃、夜間２３℃の閉鎖系温室内で約１ヶ月栽培した苗を実験に供試した。接種試験１週間前には、感染効率を上げるために、２．５mMの硫酸アンモニウムを施肥した。
【００８６】
イネいもち病菌（Magnaporthe grisea Ai79-142株、レース037.3）をオートミール寒天培地上で２５℃、約２週間生育させた後、ブラックライトランプを４日間照射することにより胞子を形成させた。この胞子を滅菌した絵筆でかき取り、１×１０６conidia/mLに調整して、いもち病菌胞子懸濁液を調製した。
【００８７】
イネの切葉を、湿らせたろ紙上に置床し、胞子懸濁液を１０μlずつ滴下接種した。接種葉は、遮光した２５℃インキュベーター内に１日間置いた後、２６℃、１５０μmolm-2s-1の光条件下で維持し、接種から７日後、葉面上の壊死斑の長径を測定し、コントロールと比較した。実験結果をチューキー・クラマー（Tukey-Kramer）のＨＳＤ検定（Ｐ＜０．０５）で統計的に解析した。
【００８８】
結果を図９、パネルＡ及びパネルＢに示す。ＣＲＸａ１発現イネ及びＣＲＸａ３発現イネでは、いもち病抵抗性が有意に向上していた。特に、ＣＲＸａ１発現イネでは、いもち病菌胞子懸濁液の滴下部位に壊死が認められただけで、ほとんど病斑が伸展しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】図１Ａは、作製した各中間ベクターの構造を示す模式図である。矢印は挿入されたＤＮＡ断片、実線はｐＧＥＭ−Ｔベクターを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例において作製されたキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子（ＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３及びＣＲＸａ４）、及びもとのＣＥＢｉＰ及びＸa２１遺伝子にコードされるタンパク質の模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、イネの形質転換に用いた発現ベクター、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＣＲＸａ１、２、３及び４の構造を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、形質転換イネカルスにおけるＣＲＸａ遺伝子（ＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３、ＣＲＸａ４）の転写産物量をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、形質転換イネ葉におけるＣＲＸａ遺伝子の転写産物量をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を表す図である。
【図３】図３は、形質転換イネカルスにおけるＣＲＸＡタンパク質の発現を水溶性画分（パネルＡ）及び膜画分（パネルＢ）の各々についてウェスタンブロット法で調べた結果を表す図である。
【図４】図４は、キチンエリシター処理によるＣＲＸａ発現カルスにおける細胞死誘導を表す図である。  図４〜７において、「ｖ．ｃｏｎｔ」（点線と斜線のシンボルで表したグラフ）はベクターコントロールを表す。実線と黒の４種のシンボルで表したグラフは、ＣＲＸａ１、ＣＲＸａ２、ＣＲＸａ３及びＣＲＸａ４をそれぞれ表す。「＊」は、ダネット検定（Dunnett's test）において有意差（Ｐ＜０．０５）があることを表す。
【図５】図５は、キチンエリシター処理後の形質転換カルスにおける活性酸素（Ｈ２Ｏ２）生成量を示す図である。
【図６】図６は、キチンエリシター処理後の形質転換カルスにおける活性窒素（一酸化窒素）蓄積の相対値を示す図である。
【図７】図７は、ＬＰＳエリシター処理による形質転換カルスにおける細胞死（パネルＡ）及び活性酸素（Ｈ２Ｏ２）生成量（パネルＢ）の経時変化を表す図である。
【図８】図８は、キメラ受容体を発現する形質転換イネ葉における細胞死を壊死部の面積によって表す図である。パネルＡは、イネ葉の写真を表す。パネルＢは、壊死斑面積を表す。パネルＢにおいて、グラフ内のアルファベットａ, bは統計解析結果（チューキー・クラマー（Tukey-Kramer）のＨＳＤ検定、Ｐ＜０．０５）を表し、異なるアルファベットが付いた数値は、グループ内の他の数値と有意に異なることを示す。
【図９】図９は、キメラ受容体を発現する形質転換イネ葉におけるいもち病抵抗性検定の結果を表す図である。パネルＡは、病斑長径の長さを示す。パネルＡにおいて、グラフ内のアルファベットａ〜cは統計解析結果（チューキー・クラマー（Tukey-Kramer）のＨＳＤ検定、Ｐ＜０．０５）を表し、アルファベットが付いた数値は他の数値と有意に異なることを示す。パネルＢは、イネ葉の写真を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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