(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の代表的な化学構造を有するイソファゴミンの酒石酸塩（酒石酸イソファゴミン）の化合物
【化１】
0005292605.tif 000015
（ｎは、１または２である）。
【請求項２】
ｎ＝１である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
酒石酸イソファゴミンは、イソファゴミンのＬ−（＋）−酒石酸塩であり、ｎ＝１である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
酒石酸イソファゴミンを調製するための方法であって、
（ａ）イソファゴミン遊離塩基またはそのイオン化形態と酒石酸を溶媒中で反応させる工程と、
（ｂ）酒石酸イソファゴミンを単離する工程とを含む方法。
【請求項５】
酒石酸は、Ｌ−（＋）−酒石酸である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
高純度酒石酸イソファゴミンを工業規模で調製するための方法であって、
（ａ）１ｋｇ以上のイソファゴミン遊離塩基またはそのイオン化形態と酒石酸を溶媒中で反応させる工程と、
（ｂ）粗酒石酸イソファゴミンを得る工程と、
（ｃ）水溶液を使用して、粗酒石酸イソファゴミンを再結晶させる工程と、
（ｄ）高純度酒石酸イソファゴミンを単離する工程とを含む方法。
【請求項７】
高純度は、少なくとも９８重量％の純度である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
薬学的に有効な量の酒石酸イソファゴミンと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
酒石酸イソファゴミンの９０％以上は、粒径が１２００μｍ以下である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
薬学的に有効な量は、１用量当たり５から３００ｍｇの範囲である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容可能な賦形剤は、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウムまたは二塩基性リン酸カルシウムである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
酒石酸イソファゴミンは、結晶形態である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
結晶性酒石酸イソファゴミンの化合物。
【請求項１４】
結晶性酒石酸イソファゴミンは、（２シータ）９．２９±０．００９、１４．１７±０．００９、１６．３４±０．００９、１８．０７±０．００９、１８．７２±０．００９、１９．４４±０．００９、２０．５６±０．００９、２２．１３±０．００９、２３．０１±０．００９、２４．５４±０．００９および２７．１２±０．００９のうちの５つ以上のピークを含むＸ線粉末回折パターンを有する請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
治療有効量の酒石酸イソファゴミンを含むゴーシェ病治療薬。
【請求項１６】
さらに機能的グルコセレブロシダーゼ酵素を含む、請求項１５に記載のゴーシェ病治療薬。
【請求項１７】
水溶液を使用して１ｋｇ以上の規模で容易に再結晶され、酒石酸イソファゴミンであるイソファゴミンの薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]本願は、いずれも全面的に参照により本明細書に組み込まれている、２００６年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／８０８０２０号、および２００７年２月２０日に出願された第６０／８９０７１９号の優先権を主張するものである。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]ゴーシェ病は、病気にかかった個体の細胞、特に単球およびマクロファージにおけるグリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）の蓄積に伴うリソソーム蓄積疾病である。このＧＳＬの異常蓄積は、ＧＳＬグルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）を分解するリソソーム加水分解酵素であるリソソーム酵素酸β−グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ；ＧＣａｓｅ）をコードする遺伝子における遺伝子欠損（突然変異）に起因する。グルコセレブロシダーゼ遺伝子（Ｇｂａ）突然変異の大多数は、ＧＣａｓｅタンパク質を小胞体（ＥＲ）中で誤って折り畳ませる。誤って折り畳まれたＧＣａｓｅは、ＥＲ品質管理システムによって認識され、続いて、加工されてリソソームに送られる代わりに、分解される。
【０００３】
[0003]ゴーシェ病は、全人種的であり、５００００〜１０００００の出産に約１の全疾病頻度を有する。特定の人種は、より流行率が高い。アシュケナジユダヤ人種では、例えば、約１から１５人が、Ｇｂａ突然変異の保有者である。国家ゴーシェ財団によれば、約２５００人のアメリカ人が、ゴーシェ病にかかっている。
【０００４】
[0004]ゴーシェ病は、常染色体劣性疾患であり、最も一般的なリソソーム蓄積病である。該疾病は、神経の関与および疾病重度に応じて、３つの臨床型に分類された。１型は、最も一般的であり、神経の関与がないことによって特徴づけられる。患者は、広範な重度を示す。患者によっては、一生を通じて無症候でありうる。大抵の１型患者は、脾臓および肝臓の肥大、骨格異常および骨病変、および継続的炎症反応を示す。１型ゴーシェ病では、肝臓グルコセレブロシド値は、通常値の２３から３８９倍に増加する。
【０００５】
[0005]２型ゴーシェ病は、最も稀で、最も重症形態である。それは、急性神経病の早期発症に伴う。神経症が異性ゴーシェ病の特徴は、水平視の異常である。その疾病にかかっている患者は、進行性脳傷害、ならびに硬直およびパーキンソン様行動（パーキンソン症）等のピリミジン過剰症状を生じる。大抵の２型ゴーシェ病患者は、小児期の早い時期に、神経機能の低下による無呼吸または誤嚥で死亡する。
【０００６】
[0006]３型ゴーシェ病も神経が関与するが、２型より度合いが低い。これらの患者も１型に特徴的な肝脾腫および骨格欠陥、ならびに行動の協調不良（失調）、発作、眼筋の麻痺、てんかんおよび認知症を含む中枢神経系症状を有する。３型ゴーシェ病の患者は、成人まで生存しうるが、寿命が短いといえる。３型の３つの区分、すなわち顕著な肝脾腫および骨髄疾患に対応づけられる３ａ型、限定的な全身性症状に対応づけられる３ｂ型、および肝脾腫、角膜混濁、進行性失調および認知症、ならびに心臓弁および大動脈根石灰化に対応づけられる３ｃ型が報告された。
【０００７】
[0007]ゴーシェ病を治療するための手法としては、酵素置換療法（ＥＲＴ）、骨髄移植（ＢＭＴ）、基質還元療法（ＳＲＴ）、遺伝子療法および薬理学的シャペロン治療が挙げられる。イソファゴミンは、組換えヒト酸ベータ−グルコシダーゼ（ＧＣａｓｅ）の強力な阻害剤である。イソファゴミン等の酵素阻害剤を使用して、リソソーム蓄積疾患における突然変異酵素活性を強化するための薬理学的シャペロン法は、それぞれが全面的に参照により本明細書に組み込まれている、共有された米国特許第６，９１６，８２９号、第６，５９９，９１９号、第６，５８９，９６４号、第６，５８３，１５８号および第７，１４１，５８２号に開示されている。例えば、ＧＣａｓｅの阻害剤を線維芽細胞培地に添加すると、ＧＣａｓｅの輸送およびリソソーム活性の向上がもたらされることが示されており、当該阻害剤は、ゴーシェ病の治療において療法的関心の対象になりうることが示唆されている。
【０００８】
[0008]Ｇｂａ遺伝子における突然変異とパーキンソン病との間に関連があることが最近発見された。１つの調査において、稀な早期発症治療抵抗性パーキンソン症の１７人の患者のグループが、１型、すなわち非神経細胞疾患に典型的に対応づけられる突然変異である、Ｎ３７０Ｓに対する同型接合性および異型接合性個体を含む、Ｇｂａミスセンス突然変異を含む少なくとも１つの対立遺伝子を有することが見いだされた（Ｔａｙｅｂｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｃｔ．Ｍｅｔａｂ．２００３；７９；１０４−１０９）。他の調査において、特発性パーキンソン病の９９人のアシュケナジユダヤ人の集団を６つのＧｂａ突然変異（Ｎ３７０Ｓ、Ｌ４４４Ｐ、８４ＧＧ、Ｖ３９４ＬおよびＲ４９６Ｈ）について評価した。３１人のパーキンソン病患者が、１つまたは２つの突然変異Ｇｂａ対立遺伝子を有し、２３人が、Ｎ３７０Ｓに対して異型接合性であり、３人が、Ｎ３７０Ｓに対して同型接合性であり、４人が、８４ＧＧに対して異型接合性であり、１人が、Ｒ４９６Ｈに対して異型接合性であった（Ａｈａｒｏｎ−Ｐｅｒｅｔｚら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００４；３５１：１９７２−７７）。突然変異Ｎ３７０Ｓ対立遺伝子の頻度は、１５７３人の正常な被験者の該頻度の５倍であり、８４ＧＧの頻度は、正常な被験者の該頻度の２１倍であった。パーキンソン病の患者の中で、Ｇｂａ突然変異を保有する患者は、保有者でない患者より若かった。この調査は、Ｇｂａ突然変異に対する異型接合性は、アシュケナジユダヤ人をパーキンソン病にかかりやすくしうることを示唆している。イソファゴミンは、動物の血液脳関門を通過し、突然変異型および野生型のｇＣａｓｅ両方の活性を高めることが示されているため、ＧＣａｓｅにおいて異型接合性突然変異を有するパーキンソン病患者、または他の要因によりパーキンソン病を生じる危険性があるが、野生型ＧＣａｓｅのレベル向上の恩恵を受けることができる患者を治療するのに、それを使用することが可能である。
【０００９】
[0009]イソファゴミンの化合物は、強力で選択的な組換えヒト酸β−グルコシダーゼ（ＧＣａｓｅ）阻害剤であるが、医薬品に使用することには課題がある。例えば、イソファゴミン（イソファゴミン−ＨＣｌ）の塩酸塩が、米国特許第５，８４４，１０２号に開示されている。しかし、イソファゴミン−ＨＣｌ、ならびにイソファゴミン遊離塩基は、大規模で容易に精製されず、工業規模の製造プロセスおよび医薬製剤に使用するには固体状態特性が劣っている。
【発明の概要】
【００１０】
[0010]一実施形態において、本発明は、以下の化学構造で表されるイソファゴミンの酒石酸塩または酒石酸イソファゴミンの化合物を提供する
【化１】
0005292605.tif 000002
（式中、ｎは１または２である）。
本発明は、純度が高く、結晶形態の酒石酸イソファゴミンをも提供する。
【００１１】
[0011]他の実施形態において、本発明は、酒石酸イソファゴミンを好ましくは少なくとも５０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９９％含有する組成物を提供する。本発明は、少なくとも９０％以上の酒石酸イソファゴミンを含有する組成物であって、該酒石酸イソファゴミンの９０％が１２００μｍの粒径を有する組成物を提供する。
【００１２】
[0012]他の実施形態において、本発明は、酒石酸イソファゴミン、および１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００１３】
[0013]他の実施形態において、本発明は、酒石酸イソファゴミンを調製するための方法を提供する。高度に精製された酒石酸イソファゴミンを調製するための方法も提供される。
【００１４】
[0014]さらに他の実施形態において、本発明は、薬学的に有効な量の酒石酸イソファゴミンまたはその医薬組成物を投与することにより哺乳類におけるＧＣａｓｅ活性を高めることによって哺乳類におけるゴーシェ病を治療する方法を提供する。
【００１５】
[0015]他の実施形態において、本発明は、イソファゴミンのＬ−（＋）−酒石酸塩を提供する。本発明は、酒石酸とイソファゴミンの複合体をも提供する。
【００１６】
[0016]他の実施形態において、本発明は、結晶形態の酒石酸イソファゴミンを提供する。好ましくは、結晶形態は、（２シータ）９．２９±０．００９、１４．１７±０．００９、１６．３４±０．００９、１８．０７±０．００９、１８．７２±０．００９、１９．４４±０．００９、２０．５６±０．００９、２２．１３±０．００９、２３．０１±０．００９、２４．５４±０．００９および２７．１２±０．００９のうちの５つ以上のピークを含むＸ線粉末回折パターンを有する。より好ましくは、Ｘ線パターンは、（２シータ）９．２９、１４．１７、１６．３４、１８．０７、１８．７２、１９．４４、２０．５６、２２．１３、２３．０１、２４．５４および２７．１２のピークを含む。さらにより好ましくは、結晶形態は、図５に示されるパターンと実質的に同じであるＸ線粉末回折パターンを有する。
【詳細な説明】
【００１７】
[0029]本明細書に用いられている用語は、本発明の文脈の範囲内、および各用語が用いられる文脈内で、一般に当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように製造および使用するかを説明する上で、施術者にさらなる指針を示すために、以下または本明細書の他の個所で一定の用語について論述する。
【００１８】
[0030]「ゴーシェ病」という用語は、１型、２型および３型（３ａ、３ｂおよび３ｃを含む）、ならびに表現型発現に基づくそれらの中間体およびサブグループを含む。
【００１９】
[0031]「有効量」および「有効な量」という用語は、治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。治療応答は、使用者（臨床医）が、先述の症状および代理臨床マーカの改善を含む治療に対する有効な応答として認識する任意の応答でありうる。したがって、治療応答は、一般には、ゴーシェ病の１つまたは複数の症状の改善、例えば、２および３型ゴーシェ病における進行性神経変性の改善である。「治療有効量」は、使用される配合物、ゴーシェ病の種類およびその重度、ならびに治療される哺乳類の年齢、体重、身体状態および応答性に応じて異なる。治療応答は、パーキンソン病、または治療に酒石酸イソファゴミンが意図されるレーヴィ体認知症等の他のα−シヌクレイノパシーの１つまたは複数の症状の改善でもある。
【００２０】
[0032]「薬学的に許容可能な」という語句は、生理的に許容でき、人に投与される場合に許容不可能なレベルで厄介な反応を典型的にはもたらさない分子体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書に用いられるように、「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦または州政府の管理機関によって承認されている、あるいは米国薬局法、または動物、特にヒトにおける使用について広く認識された他の薬局法に列記されていることを意味する。
【００２１】
[0033]本発明の医薬組成物に適用される「担体」という用語は、酒石酸イソファゴミンがそれと共に投与される希釈剤、賦形剤または媒体を意味する。担体を、意図する投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することが可能である。医薬組成物は、担体として、または担体に加えて、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。当該医薬担体は、水、食塩溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロール水溶液、および石油、動物油、植物油、または落花生油、大豆油、鉱油およびゴマ油等の合成起源の油を含む油等の無菌液でありうる。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、第１８版による「レミントンの薬学」に記載されている。本発明の１つの特に好ましい実施形態において、担体は、即時放出、例えば６０分間以内のような短時間で活性成分の多くまたはすべてを放出することに好適であり、薬物の迅速な吸収を可能にする。
【００２２】
[0034]「薬学的に許容可能な担体」とは、全般的に安全であり、無毒であり、生物学的にもそれ以外にも有害でなく、医薬用途に許容可能である賦形剤を含む医薬組成物を調製するのに有用である担体を意味する。本願に用いられている「薬学的に許容可能な担体」とは、１つおよび２つ以上の当該担体を含む。
【００２３】
[0035]「ヒドロキシル保護基」という用語は、メトキシメチル、４−メトキシベンジル、ベンジル、ジメチルイソプロピルシリル、トリメチルシリルおよびアルキルカルボニル等の（ただし、それらに限定されない）、望ましくない反応を回避するためのヒドロキシルに対する任意の一般的な保護基を意味する。
【００２４】
[0036]「個体」とは、哺乳類、好ましくはヒト、家畜、齧歯類または霊長類、最も好ましくはヒトを意味する。
【００２５】
[0037]「治療を必要とする個体」は、ゴーシェ病、またはパーキンソン病等のα−シノクリエノパシーを生じた、または生じそうな個体である。一実施形態において、個体は、Ｇｂａ遺伝子における遺伝的突然変異によるゴーシェ病を生じていると診断された、または生じる危険性が高いと特定されたアシュケナジユダヤ人集団の一員である。しかし、「個体」という用語は、ゴーシェ病を有する、または遺伝的に生じる危険性がある、あるいはパーキンソン病等のα−シヌクレイノパシーを生じる危険性がある世界の任意の個体を包括する。
【００２６】
[0038]本明細書に用いられるように、ＧＣａｓｅ活性を「高める」という用語は、ＥＲにおける突然変異ＧＣａｓｅタンパク質の配座を、それが、ｉ）ＥＲから出ることを可能にする構造に折り畳み、結果としてＥＲにおけるＧＣａｓｅのレベルを高める構造に折り畳められ、および／またはｉｉ）細胞内のその原位置に達し、および／またはｉｉｉ）その脂質基質であるセレブロシドに対して異化活性を示すように安定化することを意味する。この用語は、また、外的投与されたＧＣａｓｅタンパク質の活性を高める、または延ばす、すなわち安定性を高め、ＧＣａｓｅの体内半減期を延ばすことによって、活性を延ばすことを意味する。
【００２７】
[0039]本明細書に用いられている「実質的に純粋の」という語句は、イソファゴミン塩が、他の化合物をせいぜい約５％しか含有していないことを意味する。好ましくは、「実質的に純粋の」イソファゴミン塩は、約２％以下の任意の他の化合物を含有する。さらにより好ましくは、「実質的に純粋の」イソファゴミン塩は、約１％以下の任意の他の化合物を含有する。
【００２８】
[0040]「約」および「およそ」という用語は、一般には、測定の性質または精度を想定して、測定された量に対する誤差の許容可能な程度を意味する。誤差の典型的な例示的程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、「約」および「およそ」という用語は、所定の値の１０倍以内、好ましくは１０または５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味しうる。本明細書に示されている数量は、特に指定がなければおよそであり、「約」または「およそ」という用語を、それが明記されていないときでも想定することが可能である。
【００２９】
[0041]本明細書に用いられているように、単数形「１つ（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に示していなければ、複数を含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）」担体という言及は、１つまたは複数の担体を含む。
【００３０】
[0042]本発明によれば、イソファゴミンの特定の形態、すなわち酒石酸イソファゴミンが提供される。酒石酸イソファゴミンは、先述したイソファゴミンと比較して、多くの改善された特徴を有する。例えば、酒石酸イソファゴミンは、特に水および／またはエタノール等の溶媒中でより容易に精製可能であり、イソファゴミンの他の知られている塩形態より安定性が高い。酒石酸イソファゴミンは、工業規模の製造、例えば１Ｋｇを上回る製品の製造に特に好適である。
【００３１】
[0043]イソファゴミンは、以下の化学構造を有する（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−３，４−ピペリジネジオールである。
【化２】
0005292605.tif 000003
【００３２】
[0044]それは、Ｃ６Ｈ１３ＮＯ３の分子式および１４７．１７ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。この化合物の合成は、Ｓｉｅｒｋｓらの米国特許第５，８４４，１０２号およびＬｕｎｄｇｒｅｎらの米国特許第５，８６３，９０３号に記載されている。米国特許第５，８４４，１０２号には、そこに記載されている化合物を、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イソチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸等の有機カルボン酸塩の塩を含む薬学的に許容可能な塩と組み合わせることが可能であることが開示されている。しかし、この特許（および出願人が認識している後の文献）において例示されている唯一の塩は、塩酸塩である。本明細書に記載されているように、塩酸塩は、工業生産、または剤形の設計に適さない。
【００３３】
[0045]本明細書に用いられている酒石酸イソファゴミンという用語は、イソファゴミンの酒石酸塩を意味し、以下の式で表すことが可能である
【化３】
0005292605.tif 000004
（式中、ｎは、１または２である）。
酒石酸は、異なる立体異性体形態、すなわちＤ−またはＬ−酒石酸、またはＤＬ−またはメソ酒石酸を有する。本発明、ならびに実施例は、好ましい実施形態としてのＬ−（＋）−酒石酸およびそのイソファゴミン塩について記載されている。しかし、酒石酸という用語は、ＤおよびＬ異性体、ならびにＤＬ混合物およびメソ−酒石酸を包括するように意図されているため、酒石酸イソファゴミンという用語は、Ｌ−酒石酸モノイソファゴミンまたはＬ−酒石酸ジイソファゴミン、Ｄ−酒石酸モノイソファゴミンまたはＤ−酒石酸ジイソファゴミン、ＤＬ−酒石酸モノイソファゴミンまたはＤＬ−酒石酸ジイソファゴミンおよび／またはメソ−酒石酸モノイソファゴミンまたはメソ−酒石酸ジイソファゴミンを含むように意図されている。Ｌ−酒石酸は、鏡像異性体純度が９７％以上の（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸であり、Ｄ−酒石酸は、鏡像異性体純度が９７％以上の（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸であり、ＤＬ−酒石酸は、鏡像異性体純度が９７％未満のＤ酒石酸とＬ−酒石酸の混合物である。
【００３４】
[0046]酒石酸イソファゴミンを、アルコール、好ましくはエタノールに溶解させたイソファゴミン遊離塩基から調製し、アミノ酸を含む置換カルボン酸、ジカルボン酸、またはジアシル酒石酸を含む酒石酸によりアルコール、好ましくはエタノール中で、室温で攪拌しながら処理することができる。酸塩が、エタノール溶液から析出する。粗酒石酸イソファゴミン塩を濾過によって回収する。イソファゴミン溶液を予め濾過することで、酸を添加する前にあらゆる粒子不純物を除去することができる。酸を添加した後に、塩を完全に析出させるための、得られた懸濁物を冷却することができる。
【００３５】
[0047]他の実施形態において、置換カルボン酸または酒石酸を溶液に添加することによって、本発明のイソファゴミン酸塩を調製することができ、溶液中でイソファゴミンは、イソファゴミンを単離することなく原位置で調製される。
【００３６】
[0048]あるいは、本発明のイソファゴミン酸塩を塩酸イソファゴミン等のイソファゴミンの鉱酸塩から調製することができる。イソファゴミンを生成し、続いて遊離塩基を置換カルボン酸で処理することによって、変換を遂行することが可能である。例えば、鉱塩基、アンモニアガスまたは水酸化アンモニウム水溶液等の塩基性の供給源を塩酸塩で処理することによって、またはそれを塩基性樹脂支持固体または塩基性樹脂のカラムに接触させることによってイソファゴミン遊離塩基を形成することが可能である。塩基性樹脂を使用するときは、樹脂カラムを水、水酸化アンモニウム水溶液、または水酸化アンモニウムのメタノール、エタノールおよびＩＰＡ等のアルコール溶液で溶出させて、本発明のイソファゴミン酸塩に変換できるイソファゴミン遊離塩基を与えることが可能である。
【００３７】
[0049]酒石酸は二酸であるため、イソファゴミン遊離塩基に対して酒石酸が０．５モル当量から１モル当量の酸対塩基比の範囲で、酒石酸塩への変換を行うことが可能である。酒石酸は、ラセミ体（ＤまたはＬ形態）、またはＬ−（＋）体、Ｄ−（−）体およびメソ体の３つの立体異性体形態の１つでありうる。酒石酸塩を製造するための好ましい条件は、遊離塩基を生成するための水酸化アンモニウム溶液、シリカゲルカラム上で遊離塩基を溶出するための９：１エタノール／水酸化アンモニウム、溶媒および余剰水酸化アンモニウムの蒸発、水／エタノールにおける酒石酸塩の形成、および水／エタノールからの結晶化を用いる。
【００３８】
[0050]イソファゴミンと酒石酸を化学量論比の範囲で組み合わせることが可能である。酒石酸は二酸であるため、ＩＦＧ／酒石酸のモル比を２：１から１：１にすると、安定した塩が与えられる（実施例３参照）。好ましい比は、１：１である。該化学量論比の範囲は、酒石酸のすべての異性体に適用可能である。
【００３９】
[0051]大抵の広く用いられている精製方法、好ましくは再結晶を用いてイソファゴミン酸塩を精製することができる。例えば、粗酒石酸イソファゴミンをプロトン性または非プロトン性共溶媒、好ましくは例えばメタノール、エタノール、プロパノールまたはブタノール等のアルコールを利用して、または利用せずに水中で再結晶化することができる。再結晶を小規模のみならず工業規模、例えば準キログラム量で効果的に実施することができる。表１には、本発明に従って調製され、精製されたいくつかの実施例の純度および収率がまとめられている。
【表１】
0005292605.tif 000005
【００４０】
[0052]１つの好ましい実施形態において、粗酒石酸イソファゴミンを水に溶解させ、得られた溶液に等量のエタノールを添加して、化合物の析出物を得る。次いで、さらなるエタノール（１容量）を添加し、攪拌する。この手順をさらなる２倍の量のエタノールについて繰り返して、およそ４：１のエタノール／水比を与える。酒石酸イソファゴミンのほとんどは、第１の容量のエタノールを添加後に結晶化することになるが、収率を最大にするために、さらなる一定分量を使用することが可能である。再結晶後に、固体を濾過し、洗浄する。すべての精製を室温で行うことが可能である。酒石酸イソファゴミンを約９９％以上の純度までこの方法で精製することが可能である。したがって、本発明の一実施形態による酒石酸イソファゴミンは、９５％以上、好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の純度を有する。
【００４１】
[0053]他の溶媒、またはエタノール／水１：１、アセトン／水１：１、エタノール／水２：１、アセトン／水２：１またはエタノール／水３：１等の溶媒系を使用して、酒石酸イソファゴミンを生成することもできる。活性炭を使用して、あらゆる着色不純物を除去することもできる。これらの溶媒の各々は、約９５％の純度を与えることが可能であり、ほとんどの溶媒が、９８％を上回る純度を与えた。
【００４２】
[0054]酒石酸イソファゴミンの精製が容易であることを、凍結乾燥を必要とする水溶液におけるイソファゴミンのＨＣｌ塩の精製と比較することによって実証することが可能である。イソファゴミン−ＨＣｌを濾過する試みは、黄色を有する物質、および接着剤の均一性をもたらした。一方、本発明による酒石酸イソファゴミンは、製薬プロセスに好適である良好な粉末特性、例えば結晶サイズ、密度および流動性を有する。表２および３には、本発明に従って調製された酒石酸イソファゴミン試料の粉末特性がまとめられている。本発明に従って調製された酒石酸イソファゴミンは、微粉末ではなく、嵩密度が約０．４４ｇ／ｍｌで、カー（Ｃａｒｒ）指数１５％である中程度の粒径の粒子が多く占めるため、高い流動性、および製薬プロセスに好適な容易な取扱特性を有する。上記再結晶プロセスによって得られた酒石酸イソファゴミンも、０．７と１．５の間のベースライン間隔を有して、バッチ毎の粒径分布の均一性を示すため、配合プロセスにおける塩の正確な測定に有害でありうる大きい粒子が回避される。大抵のバッチは、粒径が約１２００μｍ以下の酒石酸イソファゴミンを、９８％を上回る割合、または最小限９０％の割合で与えた。
【表２】
0005292605.tif 000006
【表３】
0005292605.tif 000007
【００４３】
[0055]また、酒石酸イソファゴミンは、吸湿性ではなく、７５％ＲＨに８日間曝した後のその水分吸収量は、約０．０８％にすぎなかった。本発明に従って調製された６つの異なる酒石酸イソファゴミン試料の水分吸収試験結果が、表４および５にまとめられている。
【表４】
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【表５】
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【００４４】
[0056]したがって、本発明の酒石酸イソファゴミンを調製するための方法は、医薬組成物のための大量の酒石酸イソファゴミンを調製するのに好適である。本発明に従って調製された大量の酒石酸イソファゴミンを、調製の目的に応じて約８０％の純度を有するわずかに粗い形態として調製することが可能である。しかし、それを９０％以上、好ましくは少なくとも９９％の純度で、９０％の酒石酸イソファゴミンに対する粒径を約１２００μｍ以下で調製することが可能である。
【００４５】
[0057]ＨＰＬＣを用いて、本発明のイソファゴミン酸塩の効力および有機不純物の存在の両方を測定することができる。低波長ＵＶ検出は、基準に対する効力計算に好適である。当業者は、試料の濃度、カラム、溶媒の種類等に応じて、ＨＰＬＣ分析に対する適正な条件を判断することができる。しかしながら、酒石酸イソファゴミンに対する例として以下の条件を提示する。移動相は、０．５ｍＬ／分の流速の定組成型の１０ｍＭ炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）／アセトニトリル（ＣＡＮ）３０／７０であってもよい。ＨＰＬＣカラムは、５０℃で操作されるＡｌｌｔｅｃｈ  Ｐｅｒｖａｉｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍ）であってもよい。検出を１５分間の動作時間で２１０ｎｍに設定することができ、薬物物質の試料を１０μＬ注射容量で移動相に溶解させることができる。
【００４６】
[0058]帯電噴霧剤検出器（ＣＡＤ）を不純物の検出に使用できる。蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）およびＵＶ検出を用いて試料を分析することもできる。ＣＡＤ検出器は、Ｎ２キャリヤガスの存在下で分析物の脱溶媒を行う蒸発技術を用いる。コロナの火花はＮ２ガスに電荷を与え、電荷は分析物に送られる。分析物は、それらの電荷を電位計に伝達すると検出され、電流として測定される。ＣＡＤ検出器を使用するときは、Ｐｒｉｍｅｓｅｐ１００（４．６×１５０μｍ、粒径５μｍ）ＨＰＬＣカラムを２５℃で操作しながら、移動相を１．０ｍＬ／分の流速で定組成型の５ｍＭ酢酸アンモニウム／ＣＡＮ５０／５０に設定することができる。薬物物質の試料を移動相で調製し、１０μＬ注射容量を用いることができる。この方法についての操作時間は、約７０分間である。不純物は、試料が、１％の公称試料濃度で基準に対して定量される高／低連続注入を用いて測定される。
【００４７】
[0059]本発明のイソファゴミン酸塩の識別を、ＦＴ−ＩＲを用いて実施し、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲによってさらに確認することが可能である。図２〜５は、本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンの１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲおよびＩＲスペクトルを示す図である。残留溶媒をヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって監視することができる。水、燃焼残渣および重金属は、標準的な包括的技術によって監視される。最終的な水素化工程で使用される触媒であるパラジウムは、ＩＣＰ分光法によって監視される。
【００４８】
[0060]図６は、本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンのＸ線粉末回折パターンを示す図である。該パターンは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８高度回折計を使用して得られ、分析は、以下の条件を用いて、２−４５℃２−シータから実施された。
【表６】
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【００４９】
[0061]Ｘ線粉末回折図は、特定の固体形態の化合物、すなわち多構造形態を識別する上で有用であるが、その２−シータ値ならびに強度およびｄ−間隔は、試料調製またはパターンの取得時に生じる偏差のために変動しうる。また、２−シータおよびｄ−間隔の割当において、ある程度の誤差の範囲が起こりうる。２−シータ値は、±０．００９の偏差を有する。したがって、特定の結晶形態を識別するためにＸ線粉末回折パターンを比較する好ましい方法は、未知の形態のＸ線粉末回折パターンを既知の形態のＸ線回折パターンに重ねて、それらの特徴ピークを比較することである。しかしながら、図６の２−シータ、ｄ−間隔、強度および％強度値が表６にまとめられている。組成物における本発明の結晶形態の存在を判断する際に、表６に識別されているピークのうちの５つ以上の最も特徴的なピークを比較することができる。最も特徴的なピークとしては、９．２９、１４．１７、１６．３４、１８．０７、１８．７２、１９．４４、２０．５６、２２．１３、２３．０１、２４．５４および２７．１２が挙げられる。
【表７】
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【００５０】
[0062]本発明のイソファゴミン酸塩を、例えば錠剤、カプセルまたは液体の経口投与、または注射用無菌水溶液を含む任意の投与経路に好適な形態で投与することが可能である。即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出または徐放用途に応じた、香料および着色剤を場合によって有する錠剤、カプセル、卵（ｏｖｕｌｅｓ）、エリキシル、溶液または懸濁液、ゲル、シロップ、洗口液、または水または他の好適な媒体で使用前に編成される乾燥粉末の形態で経口投与することが可能である。錠剤、カプセル、糖衣錠、香錠、丸剤、巨丸剤、粉末、ペースト、顆粒、丸薬または予混製剤等の固形組成物を使用することもできる。経口用途のための固体および液体組成物を当該技術分野でよく知られている方法に従って調製することができる。当該組成物は、固体または液体形態で使用できる１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体および賦形剤を含有することもできる。具体的な実施形態において、酒石酸イソファゴミンは、粉末充填カプセルとして投与される。化合物が経口投与用に配合される場合は、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）、または水和剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容可能な賦形剤を用いて、従来の技術により錠剤またはカプセルを調製することが可能である。当該技術分野で知られている方法によって、錠剤にコーティングすることができる。
【００５１】
[0063]薬学的に許容可能な賦形剤としては、また、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性燐酸カルシウムおよびグリシン、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウムおよび一定の複合珪酸塩等の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシア等の顆粒化結合剤が挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルク等の滑沢剤を含むことができる。
【００５２】
[0064]類似した種類の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として採用することもできる。この点において好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁物および／またはエリキシルについては、薬剤を様々な乳化剤および／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、およびそれらの組合せ等の希釈剤と組み合わせることができる。
【００５３】
[0065]経口投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水または他の好適な媒体（例えば、エタノール、またはグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール等のポリオール、それらの好適な混合物および植物油）で戻される乾燥品として存在することができる。当該液体製剤を、懸濁剤（例えば水、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）および防腐剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）等の薬学的に許容可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。経口投与のための製剤を好適に配合して、本発明のイソファゴミン酸塩の徐放または持続放出物を与えることができる。
【００５４】
[0066]例えば、レシチン等のコーティング剤を使用すること、分散物の場合は必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することによって、適正な流動性を維持することが可能である。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコールおよびソルビン酸等によって、微生物の作用の防止をもたらすことが可能である。多くの場合、等張性薬剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが合理的である。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって注射可能組成物の長時間吸収をもたらすことが可能である。
【００５５】
[0067]（例えば静脈内大量瞬時注射または注入による、あるいは筋肉内、皮下またはクモ膜下腔内経路を介する）非経口／注射可能用途に好適な酒石酸イソファゴミンの医薬配合物としては、一般には、無菌水溶液、懸濁液、および無菌注射可能溶液または懸濁液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。酒石酸イソファゴミンは、必要に応じて添加防腐剤と共に、単位投与形態、アンプル、または他の単位投与容器または多回投与容器に存在することができる。注射用組成物は、油性または水性媒体における懸濁液、溶液または乳化剤の形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、溶解剤および／または分散剤等の配合剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に好適な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水で復元される無菌粉末の形態をとることができる。すべての場合において、該形態は、無菌でなければならず、容易なシリンジ使用性が得られる程度に流動性を有していなければならない。製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。無菌条件下における好適な非経口配合物の調製は、当業者によく知られている標準的な製薬技術によって容易に遂行される。
【００５６】
[0068]無菌注射可能溶液は、必要量の酒石酸イソファゴミンを、必要に応じて以上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に混入した後に、フィルタまたは最終滅菌することによって調製される。一般に、分散物は様々な活性無菌成分を、塩基性分散媒体、および以上に列挙した成分からの他の必要な成分を含有する無菌媒体に混入することによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、既に無菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００５７】
[0069]防腐剤、安定化剤、色素、およびさらには香料を医薬組成物に含めることができる。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤および懸濁剤を使用することもできる。
【００５８】
[0070]配合物中に含めることができるさらなる薬学的に許容可能な担体は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液等の緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミン、コラーゲンおよびゼラチン等のタンパク質；ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および塩化ナトリウム等の塩；リポソームポリビニルピロリドン；デキストラン、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロール等の糖；プロピレングリコールおよびポロエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール、グリシンまたは他のアミノ酸および脂質である。配合物と共に使用される緩衝液系としては、クエン酸、酢酸、重炭酸およびリン酸緩衝液が挙げられる。リン酸緩衝液は、好ましい実施形態である。
【００５９】
[0071]配合物は、非イオン性洗剤を含有することも可能である。好ましい非イオン性洗剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデットＰ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、ブリジ３５、プルロニックおよびツウィーン２０が挙げられる。
【００６０】
[0072]投与（送達）経路としては、経口（例えば錠剤、カプセルまたは他の消化性溶液として）、局所、粘膜（例えば経鼻噴霧剤、吸入用噴霧剤として）経鼻、非経口（例えば注射可能形態）、胃腸、髄腔内、腹膜内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮膚内、頭蓋内、気管内、鞘膜内、脳室内、脳内、皮下、眼（硝子体内または眼房内を含む）、経皮、直腸、口腔内、硬膜外および舌下の一種または複数種が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
[0073]酒石酸イソファゴミンの上記非経口配合物の投与は、製剤の塊の定期的注射によるものであってもよく、あるいは外部（例えば点滴バッグ）または内部（例えば生体内分解性性移植物）の液溜からの静脈内または腹膜内投与によって投与されてもよい。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，４０７，９５７号および第５，７９８，１１３号を参照されたい。肺内送達法および装置が、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６５４，００７号、第５，７８０，０１４号および第５，８１４，６０７号に記載されている。他の有用な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入系、ポンプ送達、封入細胞送達、リポソーム送達、針送達注射、無針注射、ネブライザ、エアロゾライザ、エレクトロポレーションおよび経皮パッチが挙げられる。無針注射器は、その明細書が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，８７９，３２７号、第５，５２０，６３９号、第５，８４６，２３３号および第５，７０４，９１１号に記載されている。これらの方法を用いて、上記配合物のいずれかを投与することが可能である。
【００６２】
[0074]また、再充填可能注射ペンおよび無針注射器等の患者利便性に合わせて設計された様々なデバイスを、本明細書に記載されている本発明の配合物に使用することができる。
【００６３】
[0075]典型的には、医師は、個々の被検体に最も好適である実際の投与物を決定し、該被検体に治療有効量を与えることになる。特定の個体に対する具体的な用量および投与頻度は、異なってもよく、化合物活性、治療されているゴーシェ病の種類、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食餌、投与方式および時間、排泄量、薬物組合せ、疾病の重度、および療法を受ける個体に依存することになる。経口および非経口投与については、薬剤の毎日投与量は、単一または分割用量であってもよい。好ましくは、本発明のイソファゴミン酸塩の有効量または用量は、突然変異グルコセレブロシダーゼ発現のレベルを、正常細胞、すなわちゴーシェ病を有さない個体の細胞において見いだされるレベルの約３〜５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約３０％高めるのに十分なものであり、および／または被検体における臨床的に有意な欠乏ＧＣａｓｅ活性を改善または防止することが可能である。
【００６４】
[0076]有効量は、日常的実験によってしばしば決定されうるが、０．０１μＭと１００μＭの間、好ましくは０．０１μＭと１０μＭの間、最も好ましくは０．０５μＭと２μＭの間の血清値をもたらす量であると予測される。酒石酸イソファゴミンの有効用量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇと１０００ｍｇの間、好ましくは０．５ｍｇと１００ｍｇの間、最も好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇと５０ｍｇの間であると予測される。具体的な実施形態において、用量は、約１〜６００ｍｇ／日、より具体的には５〜３００ｍｇ／日、より具体的には１０〜１５０ｍｇ／日である。非毎日投与も想定される。酒石酸イソファゴミンを使用するゴーシェ病の治療に想定される他の投与療法は、全面的に参照により本明細書に組み込まれている、２００７年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９１４，２８８号に記載されている。
【００６５】
[0077]酒石酸イソファゴミンと、ＥＲＴまたは遺伝子療法等の他の療法との組合せによる患者の治療に続く本発明の治療モニタリングも適用可能である。当該組合せ療法は、いずれも全面的に参照により本明細書に組み込まれている共有の米国特許出願公報第２００４／０１８０４１９号および第２００４／０２１９１３２号に記載されている。
【００６６】
[0078]本発明のイソファゴミン酸塩が第２の治療薬と併用される場合は、各化合物の用量は、化合物が単独で使用される場合の用量と異なっていてもよい。適切な用量は、当業者に容易に認識されるであろう。治療に使用するのに必要な本発明の化合物の量は、治療されている状態の性質、および患者の年齢および状態に応じて異なり、究極的には担当医師の裁量に委ねられることが認識されるであろう。
【００６７】
[0079]投与が順次的である場合は、本発明の化合物または第２の治療薬を最初に投与することができる。投与が同時的である場合は、組合せを同一または異なる医薬組成物で投与することができる。
【００６８】
[0080]同一配合物で組み合わせられる場合は、２つの化合物は、安定しており、互いに、および該組成物の他の成分と相溶性を有していなければならないことが理解される。個別に配合される場合は、個別に配合される場合は、それらを当該技術分野で当該化合物について知られているような任意の便利な配合で与えることができる。
【００６９】
[0081]Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９９０；３１（１６）、２２２９による文献に既に報告されている中間体を介してＤ−アラビノースからイソファゴミンを合成することができる。しかし、既に報告されている中間体への合成工程は、大規模合成にとっては経済的ではない。本明細書に開示されている方法は、それらの中間体（および新しい中間体）、ならびに工業規模で高純度の最終製品の確実で予測可能な製造を可能にする。これは、すべての中間体が、結晶化により単離されて、該方法を大規模製造に適したものとするためである。
【００７０】
[0082]イソファゴミンをスキーム１に示される合成経路によって合成することもできる。
【化４】
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【００７１】
[0083]溶媒（純反応物）を伴う、または伴わない適切なアルコール、および活性化剤を使用して、Ｄ−アラビノースを対応する保護グリコシド（Ａ）に変換することが可能である。例えば、アルコールの範囲は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４もしくは何らかの他の鉱酸、塩化アセチル、塩化プロピオニル、またはカルボン酸の他の酸塩化物等の活性化剤と共に、塩化メチレン、クロロホルム、ＴＨＦ、ジオキサン、ＤＭＦ、ＤＭＡまたはＮＭＰ等の溶媒中に、ベンジルアルコール、またはメトキシベンジルアルコール、クロロベンジルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびシクロヘキシルメチルアルコール等の置換ベンジルアルコールを含むことができる。反応を周囲温度から約１００℃の範囲の温度で、２から４８時間の範囲の時間にわたって実施することが可能である。本発明では、好ましいアルコールは、ベンジルまたは置換ベンジルアルコールであり、より好ましいのは、ベンジルアルコールである。好ましい溶媒としては、ジオキサン、ＴＨＦまたは純反応物が挙げられ、より好ましいのは、純反応物である。好ましい活性化剤としては、塩化アセチルおよびＨ２ＳＯ４が挙げられ、より好ましいのは、塩化アセチルである。純粋の生成物を非極性溶媒による析出によって単離することが可能である。この生成物に対する好ましい溶媒および温度は、メチル−ｔ−ブチルエーテルおよび周囲温度である。
【００７２】
[0084]得られた一般式Ａのグリコシドを、（純）極性補助溶媒を伴う、または伴わない酸の存在下で、ケトンまたはジメチルケタール、またはそのエノールエーテルによる（Ａ）からケタール（Ｂ）への変換により、３−および４−ヒドロキシル基においてアセトニドとしてさらに保護することが可能である。例えば、アセトン、２−ブタノン、ベンゾフェノン、シクロヘキサノンまたはアセトフェノン、またはそれらの対応するジアルキルケタール等の脂肪族または芳香族ケトンは、Ｈ２ＳＯ４、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸またはＴＭＳトリフレート等の酸の存在下で近隣ジオールと反応することが可能である。補助溶媒としては、塩化メチレン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡおよびＮＭＰが挙げられる。いくつかの場合において、アセトン等のケトンも溶媒でありうる。反応温度は、周囲温度から１００℃までの範囲でありうる。この反応では、好ましい条件は、４０℃においてｐ−トルエンスルホン酸を伴うアセトンおよび２，２−ジメトキシプロパンである。純粋の生成物を、極性および非極性成分を含む２つの成分系による結晶化によって容易に単離することが可能である。この生成に対する好ましい条件は、酢酸エチルおよびヘプタンである。
【００７３】
[0085]アセトニド（Ｂ）を、対応するアルコキシドに変換した後に、続いてアルキル化剤と反応させて、一般式Ｃの化合物を与えることによって、２−ヒドロキシル基においてエーテルとしてさらに保護することが可能である。既に報告されている保護には、より高価な臭化ベンジルおよびコストの高い酸化銀が利用されていた。アルコキシドの形成は、ジアルキルエーテル等の極性非プロトン性溶媒、あるいはＰＧ２に対応するＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰまたはＤＭＳＯ中のアルキル水素化物等の強塩基により容易に遂行される。アルキル化剤としては、塩化ベンジルまたは置換ベンジルが挙げられる。反応温度は、−２０℃から２０℃の範囲でありうる。この反応では、好ましい条件は、０℃から１０℃でアルコキシドを生成した後に、塩化ベンジルによるアルキル化を行うためのＤＭＦ中の水素化ナトリウムである。水および非極性洗浄液で析出させて、過剰の水を除去することによって純粋の生成物を容易に単離することが可能である。この生成のための好ましい非極性溶媒は、ヘプタンである。
【００７４】
[0086]一般式Ｃの化合物におけるアセトニドを除去して、一般式（Ｄ）のジオールを与えることは、周囲温度にて、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール中のＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４等の希鉱酸を用いて遂行される。この反応では、好ましい条件は、周囲温度でのメタノールにおけるＨＣｌである。水および非極性洗浄液で析出させて、過剰の水を除去することによって、純粋の生成物（Ｄ）を容易に単離することが可能である。この精製のための好ましい非極性溶媒は、ヘプタンである。
【００７５】
[0087]標的分子に対する修飾のために、ジオールのさらなる保護が必要とされる。還流温度での水−共沸溶媒におけるスズ指向手法に続いて、適温でのエーテル化を用いることによって、３−ヒドロキシル（Ｅ）の選択的エーテル化を遂行することが可能である。ベンゼン、トルエンまたはキシレン等の非プロトン性溶媒中のジフェニル、ジメチル、ジブチル、ジイソブチルまたはジオクチルスズ酸化物等のジアルキルまたはアリールスズ（ＩＶ）酸化物を使用して、スズエーテルを形成することが可能である。続くアルキル化を、臭化ベンジルまたは塩化ベンジル等のアルキルまたはアルキルアリールハロゲン化物を用いて遂行することが可能である。ＣｓＦまたは塩化テトラエチルアンモニウム等の薬剤の使用によって反応を加速させることが可能であり、反応温度は、周囲温度から１００℃の範囲でありうる。本発明では、好ましい方法は、塩化テトラブチルアンモニウムの存在下で、トルエンおよび塩化ベンジル中のジブチルスズ酸化物を使用する。水によるスズ試薬の析出によって精製を容易に遂行することが可能である。二溶媒系からの結晶化によって最終生成物を得ることが可能である。この反応のための好ましい結晶化溶媒は、エタノールおよびヘプタンである。
【００７６】
[0088]活性化系（Ｆ）を介して三重保護中間体アラビノース誘導体を対応するキシロース誘導体（Ｇ）にそのまま変換することが可能である。ミツノブ反転は、アルコール構造を反転させるのに広く用いられ、この具体的な変換について報告されてきたが、それらの条件は、製造スケールでは高コストである。代替的な経路は、アラビノースヒドロキシルを個別の単離可能な活性化系（Ｇ）に活性化させた後に、安価な酸素源を使用する反転によって置換させることである。−２０℃から周囲温度の温度にて、塩化メチレン、クロロホルムまたはトルエン等の非極性溶媒中におけるピリジン、コリジン、ヒューニッヒ塩基、トリエチルアミン等の有機塩基の存在下で対応する無水物、塩化スルホニルから形成されたｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩およびトリフルオロメタンスルホン酸塩等のエステルによって活性化が可能である。構成の反転による置換を、０℃から４０℃の温度にて、この種の反応に広く使用される溶媒、例えば塩化メチレン、アセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＡおよびＮＭＰ中の酸素求核試薬、好ましくはアルカリまたはアルカリ土類金属窒化物を用いて遂行することが可能である。好ましい条件は、−１０℃の塩化メチレン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物およびピリジンを使用した後に、精製を必要とせずにトリフレートを単離することである。トリフレートの置換のための好ましい条件は、周囲温度におけるＤＭＦ中の亜硝酸ナトリウムまたはカリウムである。極性および非極性成分を使用して、２つの溶媒系からの結晶化によって、精製された生成物を容易に得ることが可能である。この反応のための好ましい結晶化溶媒は、イソプロパノールおよびヘプタンである。
【００７７】
[0089]活性化系を介する構造の反転によって、一般式（Ｈ）の三重保護キシロース誘導体をニトリル（Ｉ）に変換することが可能である。上記方法と同様に、該経路は、キシロースヒドロキシルを個別の単離可能な系（Ｈ）に活性化した後に、シアノ源で置換することを含む。−２０℃から周囲温度の温度にて、塩化メチレン、クロロホルムまたはトルエン等の非極性溶媒におけるピリジン、コリジン、ヒューニッヒ塩基およびトリエチルアミン等の弱有機塩基の存在下対応する無水物または塩化スルホニルから形成されたスルホン酸アルキルまたはアリールのエステル、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩およびトリフルオロメタンスルホン酸塩等を使用して、再び活性化を行うことが可能である。好ましくは、０℃から４０℃の温度におけるＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰおよびＤＭＳＯ等の極性非プロトン性溶媒中のアルカリまたはアルカリ土類金属シアン化物またはシアン化テトラエチルアンモニウム等の試薬を用いて、構成の反転による置換を遂行することが可能である。好ましい条件は、−１０℃における塩化メチレン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物およびピリジンである。トリフレートの置換のための好ましい条件は、周囲温度におけるＴＨＦ中のシアン化テトラエチルアンモニウムである。抽出後に、アルコール溶媒から結晶化することによって、精製された生成物を得ることが可能である。好ましい溶媒はエタノールである。
【００７８】
[0090]ニトリル中間体の塩酸イソファゴミンへの変換を、保護基の選択に応じて一工程で行うことが可能である。環状イミンのニトリル還元、三重保護、環閉鎖および水素化を水素化条件下で単一工程で遂行して、高収率のイソファゴミンを与えることが可能である。プロトン性または非プロトン性極性溶媒、好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、エステルまたは酢酸において、１４ｐｓｉから１００ｐｓｉの範囲の水素ガス圧力下で、１％から２０％の充填率のＰｄ／Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ、ＰｔＯ、デグサ触媒、または触媒の組合せを含む当該水素化に使用される一般的な様々な触媒によって触媒水素化を実施することが可能である。水素化をＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＣｌＯ４、Ｈ３ＰＯ４、Ｈ２ＳＯ４、酢酸、トリフルオロ酢酸または酒石酸等の酸の存在下で実施することが可能である。生成物分解の危険性を伴わずに、短時間または長時間にわたって水素化を実施することが可能である。好ましい条件は、ＨＣｌを含むアルコール溶媒において、４０ｐｓｉから１００ｐｓｉの圧力下で、充填率が５％から２０％のＰｄ／ＣとＰｄ（ＯＨ）２／Ｃの混合物との反応を実施することである。より好ましい条件は、ＨＣｌを含むエタノールにおける８０ｐｓｉの水素ガス下の充填率１０％のＰｄ／Ｃおよび充填率１０％のＰｄ（ＯＨ）２／Ｃである。この塩酸塩を本発明のイソファゴミン酸塩に変換することが可能である。
【００７９】
[0091]イソファゴミンおよび酒石酸イソファゴミンを調製するための他の改善された合成方法が最近開発され、したがって個別の特許出願が提出されている。新しい方法は、ジケタール中間体を介してＤ−（−）−アラビノースまたはＬ−（−）−キシロースを利用する。
【００８０】
[0092]本発明をさらに例示するために、以下の実施例を示す。当該実施例の利用は、例示にすぎず、いかなる場合も本発明または任意の例示的な用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載されている特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、本明細書を読めば、本発明の多くの修正および変更を当業者なら理解するであろう。
【００８１】
比較例Ａ：イソファゴミン遊離塩基の精製
[0093]Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ５０樹脂カラム（ＮＨ４＋；２．５ｃｍＩＤ  Ｘ  １００．０ｃｍＬ、容量４５０ｍＬ）を使用してイソファゴミン遊離塩基をクロマト分析した。カラムを０．５ＮのＮＨ４ＯＨ溶液（３倍、１２００ｍＬ）で洗浄し、次いでＤＩ水（５倍、２２５０ｍＬ）で洗浄した。粗イソファゴミン（１．０ｇ）を４．０ｍＬの水に溶解させ、カラムに充填した、カラムを０．１ＮのＮＨ４ＯＨ／水（１．３６：１）で溶出した。１０ｍＬの画分を回収した。
【００８２】
[0094]異なる画分に対するＴＬＣ（シリカゲル、イソプロパノール：水：ＮＨ４ＯＨ（７：２：１））を実施し、イミノ糖およびニンヒドリンスプレーを介して検出した。イミノ糖スプレーで陽性を示した画分を分析して、純度を測定し、次いで一緒にし、７２時間にわたって凍結乾燥させた。
【００８３】
比較例Ｂ：イソファゴミン−ＨＣｌの精製
[0095]イソファゴミン遊離塩基（３０ｍｇ）をイソプロパノールおよびアセトン（４．０ｍＬ）中のＭｅＯＨ（５ｍＬ）および４ＮのＨＣｌ（０．５ｍＬ）に溶解させた。試料を一晩冷凍保存し、濾過した。溶液中に結晶が認められた。しかし、濾過すると、生成物は、のり状の粘性を有する黄色の物質になった。
【００８４】
[0096]水およびアンモニアで溶出するイオン交換クロマトグラフィーを用いてこの粗イソファゴミン−ＨＣｌを精製した。
【００８５】
[0097]イオン交換カラムからの画分を凍結乾燥によって濃縮して、ゴム状の半固体物質を与えた。
【００８６】
実施例１：Ｄ−（−）−アラビノースからの酒石酸ＩＦＧの合成
[0098]反応をＴＬＣによって監視し、５％Ｈ２ＳＯ４／メタノール、リンモリブデン酸溶液、または２５４ｎｍのＵＶ光で視覚化した。
【００８７】
[0099]工程１：Ｄ−アラビノース（５０ｋｇ、３３０．０４モル）およびベンジルアルコール（１３２．２ｋｇ、４．３３当量）を攪拌し、３５℃に加熱した。塩化アセチル（１０．９ｋｇ、０．４２当量）、温度を４５℃未満に保ち、次いで５０℃で一晩攪拌した。混合物を２０℃に冷却し、ＭＴＢＥ（６００ｋｇ）で希釈した。混合物を０．５〜５時間攪拌した。固体を濾過によって回収し、ＭＴＢＥ（２×４０ｋｇ）で洗浄した。材料をフィルタ乾燥器で乾燥させた。オフホワイトの固体（７０．９ｋｇ（８８．６％））として２−ベンジル−Ｄ−アラビノースを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．３２（ｍ，５Ｈ）、４．７６（ｓ，１Ｈ）、４．６６（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５９（ｍ，３Ｈ）、４．４５（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、３．７０（ｍ，４Ｈ）、３．４７（ｄｄ，Ｊ＝１２，３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００８８】
[00100]工程２：２−ベンジル−Ｄ−アラビノース（７３．５ｋｇ、３０５．９２モル）をアセトン（５２２ｋｇ）と混合した。２，２−ジメトキシプロパン（２６．６ｋｇ、１．９当量）を一度に添加した後に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（３９．３ｇ、０．０００７当量）を添加した。混合物を４０℃で１８時間攪拌した。反応が完了した後に、トリエチルアミン（１９３ｍＬ、０．００４６当量）を添加した。高濃度の油が得られるまで、溶媒を３０℃の減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（２×２０ｋｇ）と共に同時蒸着させた。酢酸エチル（１９．２ｋｇ）を添加して、溶液を形成した。ヘプタン（１４５．８ｋｇ）を一度に溶液に添加し、−１０℃〜０℃に一晩かけて冷却した。固体を濾過によって回収し、ヘプタン（２×５１．５ｋｇ）で洗浄した。材料を、窒素パージしながらフィルタ乾燥器で乾燥させた。オフホワイトの固体（７０．４ｋｇ（８２％））としてアセトニド誘導体（３ａＲ，６Ｒ，７Ｓ，７ａＳ）−６−（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチルテトラヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピラン−７−オールを得た。融点：５８〜５９℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（ｍ，５Ｈ）、４．９２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、４．７９（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５４（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．００（ｄｄ，Ｊ＝１３，３Ｈｚ，１Ｈ）、３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１３，２Ｈｚ，１Ｈ）、３．８０（ｍ，１Ｈ）、２．２４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ）、１．５２（ｓ，３Ｈ）、１．３５（ｓ，３Ｈ）。
【００８９】
[00101]工程３：アセトニド誘導体（７８．２ｋｇ、２７８．９７モル）をＤＭＦ（２９５ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり３．７７ｋｇ）と混合し、５℃に冷却した。水素化ナトリウム（１３．４ｋｇ、１．２当量）を反応器に３または４回に分けて加え、反応混合物を１０℃未満に維持し、次いで１．５時間攪拌した。２℃の温度で、塩化ベンジル（４５．９ｋｇ、１．３当量）を１時間にわたって添加した。反応物を１０℃から１５℃で１２時間攪拌した。反応が完了した後に、混合物を２℃に冷却し、水（２０ｋｇ）を１時間にわたって添加した。水のさらなる充填物（５７０ｋｇ）を４時間にわたって添加した。混合物をこの温度で１０時間攪拌した。生成物を遠心濾過によって回収し、水（２×１０ｋｇ）およびヘプタン（２×１５ｋｇ）で洗浄し、一晩スピン乾燥させた。白色の固体（７４．０ｋｇ（７１．６％））としてジベンジル誘導体（３ａＲ，６Ｒ，７Ｓ，７ａＲ）−６，７−ビス（ベンジルオキシ）−２，２−ジメチルテトラヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピランを得た。
【００９０】
[00102]工程４：ジベンジル誘導体（３７．６ｋｇ、１０１．５０モル）をメタノールに添加し、ＡＲ（２５９ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり８．７ｋｇ）および内容物を１５℃に冷却した。２．５ＮのＨＣｌ溶液（７６．２ｋｇ、１．８当量）を１時間にわたって添加した。さらなる水（２０ｋｇ）を添加し、混合物を１５℃で１２時間攪拌した。水（１０３５ｋｇ、メタノールの４倍容量、ＡＲ）を反応器に加え、少なくとも０．５時間攪拌した。生成物を遠心器上に濾過し、水（２×１０ｋｇ）およびヘプタン（２×１５ｋｇ）で洗浄し、一晩スピン乾燥させた。白色の固体（３１．５ｋｇ（９４％））としてのジオール（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−５，６−ビス（ベンジルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジオールを得た。
【００９１】
[00103]工程５：ジオール誘導体（３７．５ｋｇ、１１３．５１モル）をトルエン（２０７．６ｋｇ、ジオール１ｋｇ当たり５．５ｋｇ）およびジブチルスズオキシド（３１．１ｋｇ、１．１当量）と混合した。反応器にＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を装備し、除去するための水が回収されなくなるまで（８〜１２時間）反応器内容物を加熱して還流させた（約１１０℃）。反応器内容物を３５℃に冷却し、塩化テトラブチルアンモニウム（１８．３ｋｇ、０．５当量）を一度に添加した。塩化ベンジル（１５．８ｋｇ、１．１当量）を、温度を４０℃未満に維持する速度で添加し、３５℃で１２時間攪拌を続けた。反応が完了するまで、該添加および１２時間攪拌を４日間にわたって毎日繰り返した。反応が完了した後に、混合物を２５℃に冷却し、水（１５０ｋｇ）を一度に添加し、内容物を一晩攪拌した。反応混合物をセライト床（ジオール１ｋｇ当たり１ｋｇ）で濾過し、床をトルエン（１０ｋｇ）で濯いだ。濾液を（１時間）沈降させ、層を分離させた。水添加、攪拌、濾過および分離を繰り返した。水層を一緒にし、酢酸エチル（２５ｋｇ）で抽出し、層を分離させた。有機層を一緒にし、最小の攪拌可能容量になるまで４５℃にて真空下で濃縮した。ヘプタン（１０２．６ｋｇ）を添加した。混合物を２０分間攪拌し、０℃に冷却し、８〜１２時間攪拌した。固体を濾過によって回収し、ヘプタン（１０ｋｇ）で洗浄した。粗固体を６：１のヘプタン／２００ｐｆエタノール（粗固体１ｋｇ当たり７ｋｇ）に３５℃で溶解し、−５〜０℃に冷却し、一晩攪拌した。固体を濾過によって回収し、ヘプタン（１０ｋｇ）で洗浄した。生成物純度をＴＬＣで監視した。不純物を除去するのに、典型的には、２回以上の再結晶が必要であった。精製されたトリベンジル誘導体を３０℃の真空炉で乾燥させた。白色の固体（１７．５ｋｇ（３７％））としての（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−４，５，６−トリス（ベンジルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−オールを得た。融点：５９〜６０℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３８（ｍ，１５Ｈ）、４．８９（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、４．８２（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７１（ｍ，３Ｈ）、４．５７（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５５（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．０１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．９５（ｄｄ，Ｊ＝１０，３Ｈｚ，１Ｈ）、３．８３（ｍ，２Ｈ）、３．７１（ｄｄ，Ｊ＝１２，２Ｈｚ，１Ｈ）、２．５６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【００９２】
[00104]工程６：トリベンジルアラビノース誘導体（１２．０ｋｇ、２８．５４モル）を塩化メチレン（７９．２ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり６．６ｋｇ）およびピリジン（１１．３ｋｇ、５当量）と混合し、−１０℃に冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１０．１ｋｇ、１．２５当量）を、０℃未満の温度を維持する速度で添加した。出発材料が消費されるまで、反応混合物を−１０℃から０℃で攪拌した。完了すると、反応混合物を７．５％ＨＣｌ溶液（３×６８ｋｇ、１７当量）および水（４８ｋｇ）で洗浄した。洗浄中は、反応混合物の温度を５℃未満に維持した。混合物を、７，５％ＮａＨＣＯ３溶液（５５．０ｋｇ）で洗浄することによってｐＨ６以上に調整した。トリエチルアミン（０．４ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり０．３ｋｇ）を添加し、有機層を無水Ｋ２ＣＯ３（１．２ｋｇ、０．１当量）で乾燥させた。混合物を濾過し、２０℃から３５℃の真空下で濃縮して乾燥させて、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−４，５，６−トリス（ベンジルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−オールを得た。トリフレートを精製せずに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３１〜７．１６（ｍ，１５Ｈ）、５．１２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．８３（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、４．７６（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１Ｈ）、４．６４（ｍ，２Ｈ）、４．５０（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、３．９７（ｄｄ，Ｊ＝１０，３Ｈｚ，１Ｈ）、３．８６（ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７７〜３．７２（ｍ，２Ｈ）。
【００９３】
[00105]工程７：トリフレートをＤＭＦ（３６．２ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり３．０２ｋｇ）に溶解し、１０℃に冷却した。亜硝酸ナトリウム（５．９ｋｇ、３．０当量）を添加し、溶液を発熱させて約３０℃とし、次いで反応混合物を１５〜２５℃に冷却し、１２から１６時間攪拌した。混合物を５℃に冷却し、水（１５２ｋｇ、ＤＭＦ１ｋｇ当たり４．２ｋｇ）を、温度を１５℃未満に維持する速度で添加した。得られた混合物を１０℃で２時間攪拌した。固体を濾過し、水（２×１２ｋｇ）で洗浄した。濾過した固体を酢酸エチル（２１．６ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり１．８ｋｇ）に溶解した。溶液を塩水（１５．５ｋｇ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４（２．５ｋｇ）で乾燥させ、濾過し、濾液を３５℃の真空下で濃縮して乾燥させた。イソプロパノール（９．５ｋｇ）を添加し、７５℃に加熱して、粗生成物を溶解した。ヘプタン（２４．６ｋｇ）を溶液に添加し、混合物を１５〜２５℃に冷却した。混合物をさらに０℃に冷却し、一晩攪拌した。固体を濾過し、ヘプタン（２×８．２ｋｇ）で洗浄した。材料を真空炉で乾燥させた。黄色の固体（５．３ｋｇ（４４％））としての（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−４，５，６−トリス（ベンジルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−オールを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３７（ｍ，１５Ｈ）、４．９６（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１Ｈ）、４．８０（ｍ，２Ｈ）、４．６８（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．６１（ｍ，２Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、３．７８（ｍ，１Ｈ）、３．６７（ｍ，３Ｈ）、３．５０（ｄｄ，Ｊ＝９，３Ｈｚ，１Ｈ）、２．４２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【００９４】
[00106]工程８：トリベンジルキシロース誘導体（１０．４ｋｇ、２４．７３モル）を塩化メチレン（６８．６ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり６．６ｋｇ）およびピリジン（９．８ｋｇ、５当量）と混合し、−１０℃に冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（８．７ｋｇ、１．２５当量）を、温度を０℃未満に維持する速度で添加した。出発材料が消費されるまで、反応混合物を−１０℃から０℃で攪拌した。完了すると、反応混合物を７．５％ＨＣｌ溶液（３×５８．９ｋｇ、１７当量）および水（４１．６ｋｇ）で洗浄した。洗浄中は、反応混合物の温度を５℃未満に維持した。混合物を、７，５％ＮａＨＣＯ３溶液（４４．６ｋｇ）で洗浄することによってｐＨ６以上に調整した。トリエチルアミン（０．４ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり０．３ｋｇ）を添加し、有機層を無水Ｋ２ＣＯ３（１．２ｋｇ、０．１当量）で乾燥させた。混合物を濾過し、２０℃から３５℃の真空下で濃縮して乾燥させた。ＮＭＲ？
【００９５】
[00107]工程９：トリフレートをＴＨＦ（２９ｋｇ、出発材料１ｋｇ当たり２．８ｋｇ）に溶解させ、１０℃に冷却した。シアン化テトラエチルアンモニウム（４．６ｋｇ、１．２当量）を添加し、溶液を発熱させ、次いで反応混合物を２０℃に冷却し、１２時間攪拌した。酢酸エチル（２１．８ｋｇ）を添加し、有機相を１０％ＮａＣｌ溶液（３×１４．３ｋｇ）で洗浄した。一緒にした水層を酢酸エチル（２１．８ｋｇ）で抽出した。有機層を一緒にし、ＭｇＳＯ４（２ｋｇ）で乾燥させ、濾過し、濃縮して乾燥させた。エタノール（２００ｐｆ、出発材料１ｋｇ当たり３．２３ｋｇ）を添加し、７０℃に加熱して、粗生成物を溶解した。溶液を２０℃に冷却し、次いでさらに５℃に冷却し、一晩攪拌した。固体を濾過し、ヘプタン（２×１０．４ｋｇ）で洗浄した。２００ｐｆエタノール（固体１ｇ当たり７ｍＬ）からの結晶化を繰り返した。固体を濾過し、ヘプタン（２×１０．４ｋｇ）で洗浄した。材料を真空炉で乾燥させた。淡褐色の固体（６．３ｋｇ（５９％））としての（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリス（ベンジルオキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−カルボニトリルを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（ｍ，１５Ｈ）、４．９０（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ）、４．８１〜４．７３（複雑，３Ｈ）、４．７０（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５５（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、３．９９（ｄｄ，Ｊ＝９，５Ｈｚ，１Ｈ）、３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１２，３Ｈｚ，１Ｈ）、３．８２〜３．７４（重なりあうシグナル，２Ｈ）、３．１３  ｍ，１Ｈ）。
【００９６】
[00108]工程１０：ニトリル誘導体（２．５ｋｇ、５．８モル）を無水エタノール（１３８．１ｋｇ）に溶解し、透明な溶液が得られるまで３５℃で加熱した。加湿した炭素上パラジウム（２５０ｇ；１０％ｗ／ｗ）を添加した後に、水酸化パラジウム（２５０ｇ；２０％ｗ／ｗ）および塩酸（０．６Ｌ）を添加した。溶液を窒素で２回、水素で１回パージした。溶液を水素で８０ｐｓｉに加圧し、攪拌し、７２時間にわたって３５℃に加熱し、必要に応じて再加圧した。混合物を濾過し、３０℃から３５℃にて真空下で濃縮した。粗塩酸イソファゴミンをＮＨ４ＯＨ水（３Ｌ）と混合した。９：１のＥｔＯＨ／水ＮＨ４ＯＨ溶媒系を使用して、シリカゲルカラム（約２０ｋｇ）で精製した。生成物を３５℃から４０℃にて真空下で濃縮した。イソファゴミン遊離塩基を無水エタノール（残渣１ｇ当たり７．７ｍＬ）に溶解した。Ｌ−（＋）−酒石酸（１１８５ｇ、残渣１ｇ当たり１ｇ）を無水エタノール（残渣１ｇ当たり７．７ｍＬ）に溶解し、濾過し、イソファゴミンをエタノールに溶解させた溶液に徐々に添加した。この溶液を４５分間攪拌し、濾過し、エタノール（２．５Ｌ、出発材料１ｇ当たり１ｍＬ）で洗浄した。生成物を４４℃の真空炉で一定の重量まで乾燥させた。白色の固体（１．２ｋｇ（純度９７．５％））としての酒石酸イソファゴミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．４０（ｓ，２Ｈ）、３．７０（ｄｄ，Ｊ＝１２，４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６６〜３．５８（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｍ，３Ｈ）、２．８３（ｔ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ）、２，７９（ｔ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ）、１．８８〜１．７７（ｍ，１Ｈ）。
【００９７】
実施例２：酒石酸イソファゴミンの再結晶
[00109]酒石酸イソファゴミン（１７６７ｇ）を周囲温度で水（１７６７Ｌ）に溶解した。無水ＥｔＯＨ（１．７６７Ｌ）を添加し、３０分間にわたって攪拌した。さらなる一定分量の無水ＥｔＯＨ（１．７６７Ｌ）を低速流で一滴ずつ添加し、３０分間攪拌した。このプロセスを（３０分間の攪拌を含めて）２回繰り返して、４：１のＥｔＯＨ／水を得た。固体を濾過し、ＥｔＯＨ／水（４：１）で洗浄し、４３℃の真空炉で一定重量（すなわち、さらなる２時間にわたる再乾燥後の総重量減が１％を下回る）まで乾燥させた。再結晶による収率は９１％であった。試料は、ＨＰＬＣに基づいて、１．３％の不純物を有することがわかった。再結晶生成物のＮＭＲスペクトルを図３および図４に示す。融点：１６８〜１６９℃。
【００９８】
実施例３：酒石酸イソファゴミン塩の合成
イソファゴミンＬ（＋）−酒石酸塩（２：１）
[00110]Ｌ−（＋）−酒石酸（１０２ｍｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）を脱イオン水（１．０ｍＬ）に溶解させた溶液を、イソファゴミン（２００ｍｇ、２．０当量）を脱イオン水（２．０ｍＬ）に溶解させた溶液に室温で添加した。溶液を１０分間攪拌し、一晩凍結乾燥した。残渣を４５℃の真空下で３日間さらに乾燥させて、所望の塩（２７５．６ｍｇ、９１％）を得た。融点９２〜９３℃。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．２２（ｓ，２Ｈ）、３．７１（ｄｄ，Ｊ＝１２，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．６７〜３．５９（ｍ，２Ｈ）、３．４４〜３．３７（ｍ，３Ｈ）、２．８５（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、１．８５（ｍ，１Ｈ）（図８Ａ）
【００９９】
イソファゴミンＤ−（−）−酒石酸塩（２：１）
[00111]Ｄ−（−）−酒石酸（１０２ｍｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）を脱イオン水（１．０ｍＬ）に溶解させた溶液を、イソファゴミン（２００ｍｇ、２．０当量）を脱イオン水（２．０ｍＬ）に溶解させた溶液に室温で添加した。溶液を１０分間攪拌し、一晩凍結乾燥した。残渣を４５℃の真空下で３日間さらに乾燥させて、所望の塩（２８７．２ｍｇ、９５％）を得た。融点：９４〜９５℃。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．２２（ｓ，２Ｈ）、３．７１（ｄｄ，Ｊ＝１２，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．６７〜３．５９（ｍ，２Ｈ）、３．４４〜３．３６（ｍ，３Ｈ）、２．８５（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ）（図８Ｂ）。
【０１００】
イソファゴミンＤ−（−）−酒石酸塩（１：１）
[00112]Ｄ−（−）−酒石酸（２０４ｍｇ、１．３５９ｍｍｏｌ）を脱イオン水（２．０ｍＬ）に溶解させた溶液を、イソファゴミン（２００ｍｇ、２．０当量）を脱イオン水（２．０ｍＬ）に溶解させた溶液に室温で添加した。溶液を１０分間攪拌し、一晩凍結乾燥した。残渣を４５℃の真空下で３日間さらに乾燥させて、所望の塩（３９６．９ｍｇ、９８％）を得た。融点：７３〜７４℃。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．４１（ｓ，２Ｈ）、３．７１（ｄｄ，Ｊ＝１２，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．６６〜３．５９（ｍ，２Ｈ）、３．４４〜３．３６（ｍ，３Ｈ）、２．８４（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ）（図８Ｃ）
実施例４：酒石酸イソファゴミンカプセルの配合物
【表８】
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【表９】
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実施例５：ゴーシェ病患者の線維芽細胞におけるＧＣａｓｅ活性の細胞内強化
【０１０１】
[00113]Ｌ−（＋）−酒石酸イソファゴミンの細胞内強化活性を、ゴーシェ病患者から構築された線維芽細胞を用いて調査した。突然変異ＧＣａｓｅレベルに対するＩＦＧの効果を評価するために、４０人の患者の末梢白血球から誘導されたマクロファージおよびＥＢＶ形質転換リンパ芽球による生体外応答調査を実施した。
【０１０２】
[00114]調査は、Ｉ型ゴーシェ病の男性２１人と、ＩＩＩ型ゴーシェ病の男性１人と、Ｉ型ゴーシェ病の女性１８人とを含んでいた。患者の年齢は７歳から８３歳で、４０人の患者のうち３８人が酵素補充療法（ＥＲＴ）を受けていた。４０人の患者のうちの３４人からマクロファージの誘導に成功し、そのうちの３２人は、酒石酸ＩＦＧで（５日間）治療されると、用量に応じたＧＣａｓｅレベルの増加（平均２．８倍）を示した。５人のさらなる患者から誘導されたリンパ芽球細胞系についても同様の結果が認められた。ＩＦＧは、Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ（１１）、Ｎ３７０Ｓ／Ｌ４４４Ｐ（８）、Ｎ３７０Ｓ／８４ｉｎｓＧ（１１）、Ｎ３７０Ｓ／Ｒ１６３Ｘ、Ｎ３７０Ｓ／Ｙ２１２Ｈ、Ｌ４４４Ｐ／ｄｅｌ  １３６Ｔ、Ｌ４４４Ｐ／Ｆ２１６Ｙ、Ｌ４４４Ｐ／Ｌ１７４Ｆ、Ｇ２０２Ｒ／Ｒ４６３ＣおよびＫ７９Ｎ／複合Ｂエキソン９／１０（ＩＩＩ型ＣＤ）を含む異なる遺伝子型の患者の細胞のＧｃａｓｅレベルを有意に高めた。約３０μｍのＩＦＧでマクロファージにおけるＧＣａｓｅの最大限の強化が達成された。
実施例６：ゴーシェ病の治療のための新しい薬理シャペロンである酒石酸イソファゴミンの安全性、薬物動態および薬動力の段階Ｉ調査
【０１０３】
[00115]酒石酸イソファゴミンは、リソソーム蓄積疾患ゴーシェ病の治療のために開発されている薬理シャペロンである。細胞ベースのモデルおよび動物モデルを使用して、イソファゴミンは、ゴーシェ病において欠乏する酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）の細胞レベルを高めることを示した。無作為二重盲式段階Ｉ臨床試験を７２人の健康な志願者（男性３９人、女性３３人）において実施した。酒石酸イソファゴミンを水溶液として経口投与した。ファーストインヒューマン（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ）単回漸増投与試験において、８、２５、７５、１５０（二集団）および３００ｍｇの用量を投与した（各集団において活性６、偽薬２）。漸増多回投与試験において、２５、７５および２２５ｍｇの用量を７日間にわたって毎日投与した（各集団において活性６、偽薬２）。いずれの試験においても、酒石酸イソファゴミンはすべての用量で全体的に良好に許容され、両試験における治療下で発現した有害事象は、ほぼ軽いものであった。深刻な有害事象は発生しなかった。
【０１０４】
[00116]酒石酸イソファゴミンは、経口経路を介する良好な全身曝露性を示した。単回投与試験において、血漿ＡＵＣおよびＣ最大値は、投与量と直線的に相関していた。平均血漿レベルは３．４時間でピークに達し（ＳＥＭ：０．６時間）、血漿消失半減期は１４時間であった（ＳＥＭ：２時間）。多回投与試験において、経口投与の７日後に、薬物動態挙動は、用量と直線関係にあり、イソファゴミンの予想外の蓄積はなかった。Ｔ最大値および半減期は、単回投与試験で認められたのと同様であった。
【０１０５】
[00117]多回投与試験において、単離された白血球におけるＧＣａｓｅ活性を酒石酸イソファゴミンの投与中の１、３、５および７日目に測定し、治療後洗い出し期間中の９、１４および２１日目に測定した。酒石酸イソファゴミンを受けたすべての被検体において、治療期間中にＧＣａｓｅレベルが顕著に増加した後に、薬物を除去すると低下し、２１日目までにベースライン値付近に戻った（図９）。酵素レベルの増加は、用量に比例し、ベースライン値のおよそ３．５倍に達した。健康な志願者における安全性、薬物動態および予備的な薬力学的効果のためのこれらの結果は、ゴーシェ病の治療のための酒石酸イソファゴミンのさらなる評価を裏づけるものである。
【０１０６】
[00118]本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態によって範囲が限定されない。実際、本明細書に記載されていること以外の本発明の様々な変更が、先述の説明および添付の図面から当業者に理解されるであろう。当該変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
【０１０７】
[00119]すべての値は、概算値であり、説明のために提示されている。
【０１０８】
[00120]特許、特許出願、公報、製品説明およびプロトコルが本願を通じて引用されており、それらの開示内容は、すべての目的に対して全面的に参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンに対する陽性ＥＳＩを用いた質量スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンのＤ２Ｏにおける１Ｈ  ＮＭＲを示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンのＤ２Ｏにおける１３Ｃ  ＮＭＲを示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンのＤ２Ｏにおけるスピンエコー１３Ｃ  ＮＭＲを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンのＸ線粉末回折パターンを示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンの熱重量分析（ＴＧＡ）を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンの赤外線スペクトルを示す図である。
【図８】Ａは、本発明の一実施形態に従って調製されたイソファゴミンＬ−（＋）−酒石酸塩（２：１）の１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）を示す図である。Ｂは、本発明の一実施形態に従って調製されたイソファゴミンＤ−（−）−酒石酸塩（２：１）の１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）を示す図である。Ｃは、本発明の一実施形態に従って調製されたイソファゴミンＤ−（−）−酒石酸塩（１：１）の１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）を示す図である。
【図９】健康な個体のＧＣａｓｅ活性に対する酒石酸ＩＦＧの結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に従って調製された酒石酸イソファゴミンの粒径分布分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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