(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の老化を遅延させる方法であって、該方法は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結された、ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む遺伝子構築物を、該植物中に導入することを包含する、方法。
【請求項２】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、
（ａ）本明細書の図１に示される配列（配列番号１）、ならびに
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｉｐｔ遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｐｔ遺伝子が、
（ａ）本明細書の図２に示される配列（配列番号２）、ならびに
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子構築物が、植物細胞の形質導入、トランスフェクション、または形質転換によって前記植物に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子構築物を取り込んでいる植物細胞が選択され、次いで、形質転換植物を再生するために培養される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
植物の老化を遅延させ得るベクターであって、該ベクターは、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結された、ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む、ベクター。
【請求項１０】
ターミネーターをさらに含み；前記プロモーター、遺伝子、およびターミネーターが作動可能に連結される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、
（ａ）本明細書の図１に示される配列（配列番号１）、ならびに
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ｉｐｔ遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ｉｐｔ記遺伝子が、
（ａ）本明細書の図２に示される配列（配列番号２）、ならびに
（ｂ）（ａ）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
遅延された老化特性を有する、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分であって、該植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結された、ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む遺伝的構築物、を含む、植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法によって産生された、請求項１６に記載のトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分。
【請求項１８】
請求項９に記載のベクターを含む、請求項１６に記載のトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分。
【請求項１９】
請求項１６に記載の植物細胞に由来する、植物、植物種子、または植物の他の部分。
【請求項２０】
請求項１６に記載の植物に由来する、植物、植物種子、または植物の他の部分。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物の老化を操作する方法に関する。本発明はまた、このような方法において有用であるベクター、改変された老化特性を有する形質転換植物、ならびに植物細胞、種子、およびこのような植物の他の部分にも関する。
【０００２】
葉の老化は、細胞死の前の細胞における代謝および構造上の変化に関係している。これはまた、活発に増殖している領域への栄養物質の再循環にも関係している。
【０００３】
サイトカイニンによる植物および植物器官の老化の調節は、重要な農業上の結果を有する。葉のサイトカイニンレベルの増大は、老化を遅らせる傾向にある。多数のプロモーターが、ｉｐｔ遺伝子の発現を調節するために使用されている。ｉｐｔの産物（イソペンテニルトランスフェラーゼ）は、サイトカイニンの合成の重要な工程を触媒する。しかし、一般的には、ｉｐｔ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物は、根および苗条（ｓｈｏｏｔ）の生長を遅らせること、根を形成しないこと、頂部優性を減少させること、および葉の面積を減少させることが報告されている。
【０００４】
本発明の目的は、先行技術に付随する問題点または不備の１つ以上を克服するかまたは少なくとも軽減することである。
【０００５】
１つの局面においては、本発明は、植物の老化を操作する方法を提供する。上記の方法は、サイトカイニンの生合成に関係している酵素をコードしている遺伝子またはその機能的に活性なフラグメントもしくは変異体に作動可能に連結された、ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは変異体を含む遺伝子構築物を、上記の植物中に導入することを包含する。
【０００６】
老化の操作は、植物および／または特異的な植物器官に関係している。種々の植物器官（例えば、葉、根、苗条、茎、塊茎、花、匍匐、および果実）の老化が操作され得る。植物および植物器官の老化の操作は、以下のような重要な農業上の結果を有する場合がある：例えば、園芸産物の果実、花、葉、および塊茎、ならびに切花の貯蔵期間の増大、園芸作物の腐敗しやすさの減少、老化を遅らせられた葉の中での炭素固定の増大（これによって収量の増大を導く）、飼料植物のバイオマスの産生量の増大、種子の産生量の増大など。
【０００７】
「老化の操作」は、一般的には、形質転換されていない対照植物と比較して、形質転換植物の老化を遅延させることに関する。しかし、一部の適用については、植物の老化を促進するかまたは別の方法で老化を改変することが所望される場合がある。老化は、例えば、アンチセンス遺伝子を利用することによって、促進され得るかまたは別な方法で改変され得る。
【０００８】
上記の遺伝子構築物の有効量が、任意の適切な技術によって（例えば、形質導入、トランスフェクション、または形質転換によって）上記の植物に導入され得る。「有効量」によって、上記の植物、または植物種子、もしくはそれらが由来する植物の他の部分の定義可能な表現型形質を生じるために十分な量が意味される。このような量は、植物の型、投与経路、および他の関連する因子を考慮して、適切な当業者によって容易に決定され得る。このような当業者は、適切な投与量および投与方法を容易に決定することができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒを参照のこと。その開示全体が、本明細書中で参考として援用されている。
【０００９】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターは任意の適切な型であり得る。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来であり、より好ましくは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来である。最も好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、本明細書の図１に示される配列（配列番号１）、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび変異体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
適切なプロモーターは、Ｌｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ＭＹＢ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ  ９９−１３８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２１：３１３（１９９９）に記載されている。その開示全体が、本明細書中で参考として援用されている。
【００１１】
「機能的に活性な」によって、フラグメントまたは変異体（例えば、アナログ、誘導体、または変異体）が本発明の方法によって植物の老化を操作することが可能であることが、意味される。このような変異体には、天然に存在している対立遺伝子変異体、および天然には存在していない変異体を含む。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および誘導が、その改変がフラグメントまたは変異体の機能的活性の消失を生じない限りは、企図される。好ましくは、機能的に活性なフラグメントまたは変異体は、上記の配列の関連する部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を有する。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドの大きさを有する。
【００１２】
サイトカイニンの生合成に関係している酵素をコードする遺伝子は、任意の適切な型であり得る。好ましくは、この遺伝子は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子である。好ましくは、この遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来であり、より好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来である。最も好ましくは、遺伝子は、本明細書の図２に示される配列（配列番号２）、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび変異体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
「機能的に活性な」によって、フラグメントまたは変異体（例えば、アナログ、誘導体、または変異体）が、本発明の方法によって植物の老化を操作することが可能であることが意味される。このような変異体には、天然に存在している対立遺伝子変異体、および天然には存在していない変異体を含む。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および誘導が、その改変がフラグメントまたは変異体の機能的活性の消失を生じない限りは、企図される。好ましくは、機能的に活性なフラグメントまたは変異体は、上記の配列の関連する部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を有する。このような機能的に活性な変異体およびフラグメントとして、例えば、対応しているアミノ酸配列中に１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を生じる核酸変化を有しているものが挙げられる。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドの大きさを有する。
【００１４】
遺伝子構築物は、任意の適切な技術によって植物に導入され得る。本発明の遺伝子構築物を植物細胞中に取り込むための技術（例えば、形質導入、トランスフェクション、または形質転換による）は、当業者に周知である。このような技術として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質導入、組織、細胞、およびプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｏｒｇａｎ）への注入、未成熟胚への注入、ならびに細胞、組織、カルス、未成熟胚、および成熟胚および成熟胚への高速粒子発射導入（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。技術の選択は、形質転換される植物の型に大きく依存し、そして当業者によって容易に決定され得る。
【００１５】
本発明の遺伝子構築物を取り込んでいる細胞は、下記のように選択され得、次いで、当該分野で周知の技術を使用して形質転換植物を再生するために、適切な培地中で培養される。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、当業者に明らかである。得られた植物は、形質転換植物の良好な再生を生じるように、当該分野で周知の方法を使用して、有性交配または無性交配のいずれかで再生され得る。
【００１６】
本発明の方法は、以下を含む種々の植物に適用され得る：単子葉植物（例えば、草生（飼料および芝生（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ））、トウモロコシ、オート麦、小麦、および大麦））、双子葉植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、クローバー（例えば、白花クローバー、ムラサキツメクサ、地下クローバー（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｃｌｏｖｅｒ）、アルファルファ、カノラ、アブラナ、レタス、ホウレンソウ）、ならびに裸子植物。
【００１７】
本発明の第２の局面においては、植物の老化を操作することができるベクターが提供される。上記のベクターは、サイトカイニンの生合成に関係している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に作動可能に連結された、ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む。
【００１８】
本発明のこの局面の好ましい実施態様においては、ベクターは、ターミネーターを含む。上記のプロモーター、遺伝子、およびターミネーターは、作動可能に連結される。
【００１９】
「作動可能に連結された」によって、上記のプロモーターが植物細胞中で上記の遺伝子を発現することができること、および上記のターミネーターが植物細胞中での上記の遺伝子の発現を終結させることができることが、意味される。好ましくは、上記のプロモーターは、上記の遺伝子の上流に存在し、そして上記のターミネーターは上記の遺伝子の下流に存在する。
【００２０】
このベクターは、任意の適切な型であり得、そしてウイルス性または非ウイルス性であり得る。ベクターは発現ベクターであり得る。このようなベクターは、染色体配列、非染色体配列、および合成核酸配列（例えば、植物ウイルスの誘導体；細菌性プラスミド、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉプラスミドの誘導体；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のＲｉプラスミドの誘導体；ファージＤＮＡ，酵母の人工染色体；細菌の人工染色体；２成分の細菌の人工染色体；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクターを含む。しかし、任意の他のベクターが、それが植物細胞中で複製可能であるか組み込みが可能であるかまたは生存が可能である限りは、使用され得る。
【００２１】
プロモーター、遺伝子、およびターミネーターは、任意の適切な型であり得、そして標的植物細胞に対して内因性であり得るか、またはそれらが標的植物細胞中で機能的である限りは、外因性であり得る。
【００２２】
本発明のベクター中で使用され得る種々のターミネーターもまた、当業者に周知である。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子由来であり得るか、または異なる遺伝子由来であり得る。詳細には、適切なターミネーターは、ＣａＭＶ  ３５ＳポリＡ、ならびにノパリン合成酵素（ｎｏｓ）およびオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子に由来する他のターミネーターのような、ポリアデニル化シグナルである。
【００２３】
プロモーター、遺伝子、およびターミネーターに加えて、ベクターはさらに、遺伝子の発現に必要な以下のエレメントを異なった組合せで含み得る：例えば、ベクター骨格、複製起点（ｏｒｉ）、マルチクローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン（例えば、トウモロコシユビキチンＵｂｉイントロン）、抗生物質耐性遺伝子、および他の選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒまたはｐａｔ）遺伝子））、ならびにレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓＡ））。このベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含み得る。このベクターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。
【００２４】
形質転換された宿主細胞の選択のための表現形質を提供するための選択マーカー遺伝子の使用の代替的なものとして、形質転換された細胞中のベクターの存在が、当該分野で周知の他の技術（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、組織化学的アッセイ（例えば、ＧＵＳアッセイ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ノーザンおよびウェスタンブロットハイブリダイゼーション分析）によって決定され得る。
【００２５】
上記の遺伝子の発現を生じるように作動可能に連結されるベクターの種々の成分が、当業者に明らかである。本発明のベクターの成分を作動可能に連結するための技術が、当業者に周知である。このような技術には、リンカー（例えば、合成のリンカー）（例えば、１つ以上の制限酵素部位を含む）の使用を含む。
【００２６】
本発明のさらなる局面においては、改変された老化特性を有する、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分が提供される。好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または植物の他の部分は、本発明の方法によって産生される。
【００２７】
本発明はまた、本発明の植物細胞に由来する植物、植物種子、または植物の他の部分を提供する。
【００２８】
本発明はまた、本発明の植物に由来する植物、植物種子、または植物の他の部分を提供する。
【００２９】
本発明は、添付の実施例および図面を参照して本明細書中でより完全に記載される。しかし、以下の記載は単に例証であり、そして上記の本発明の普遍性の限定としては決して受け取られるべきではないことが理解されるはずである。
【００３０】
（実施例）
（実施例１：ａｔｍｙｂ３２：ｉｐｔトランスジェニック植物の産生）
トランスジェニック白色クローバー植物（Ｔｒｏｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ  ｃｖ．ＨａｌｆａおよびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ）を、キメラａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子を保有している２成分ベクターを使用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって産生した（図３ａ）。トランスジェニック植物を、ｉｐｔプライマーおよびｎｐｔＩＩプライマーを使用するＰＣＲによってスクリーニングした（図３ｂ）。サザンＤＮＡハイブリダイゼーション分析に供したＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＤＮＡサンプルは、４．４ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントが、ｉｐｔプローブおよびｎｐｔＩＩプローブの両方によって全ての株において検出されることを示した。このことは、全長のＴ−ＤＮＡの白色クローバーのゲノム中での存在およびその中への組み込みを示している（図３）。トランスジェニック株Ｈｍｉ０１、ｌｍｉ０６、ｌｍｉ１１、およびｌｍｉ１８（それぞれ、レーン１、３、５、８、および１２）は、ゲノム中に組み込まれた１コピーの全長のＴ−ＤＮＡを有することが明らかである。他のトランスジェニック株は、複数のコピーのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ導入遺伝子を有した。
【００３１】
（実施例２：トランスジェニック植物中でのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子の発現）
トランスジェニック白色クローバー（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物中でのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ導入遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ｉｐｔ  ｍＲＮＡを、試験した全てのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー植物の葉組織中で検出した。これは、種々のレベルのＰＣＲ産物を有した（図４）。
【００３２】
（実施例３：ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の切り取った葉の老化の遅延）
ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の切り取った葉の老化を評価するための実験を行った。迅速な黄変を、非形質転換白色クローバー植物およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡトランスジェニック白色クローバー植物の両方の栽培品種から切り取った葉において、１週間以内に観察した。トランスジェニック株Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８、ｌｍｉ１６、およびｌｍｉ１８は、老化の遅延を示したが、ｌｍｉ１１およびｌｍｉ１２は、７日間の終わりには黄変の徴候を示さなかった。２週間後、全てのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の葉は、非形質転換植物およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照トランスジェニック植物のものよりもはるかに緑色であった（図５）。切り取った葉の老化の程度は、ｃｖ．Ｈａｌｆａについては、ＨＣ、Ｈｍｇ＞Ｈｍｉ０１＞Ｈｍｉ０８の順序であり、そしてｃｖ．Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎについては、ＩＣおよびＩｍｇ＞ｌｍｉ１６＞ｌｍｉ１８＞ｌｍｉ１１およびｌｍｉ１２であった。ＨＣは、Ｈａｌｆａの非形質転換対照であり、ＨｍｇはＨａｌｆａのａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照であり、ＩＣは、Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎの非形質転換対照であり、Ｉｍｇは、Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎのａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照である。Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８、Ｉｍｉ１６、Ｉｍｉ１８、Ｉｍｉ１１、およびＩｍｉ１２は、それぞれ、栽培品種Ｈａｌｆａ（Ｈ）およびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ（Ｉ）に由来する別々のａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー植物である。
【００３３】
（実施例４：ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の正常な植物形態学および根の生育）
正常な植物形態学、ならびに正常な苗条および正常な根の生育を、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー植物において観察した（図６）。従ってこれは、ａｔｍｙｂ３２プロモーターの制御下でのｉｐｔ遺伝子の調節された発現が、トランスジェニック白色クローバー植物の根の形成および頂部優性のいずれにも負の影響は与えないことを示している（表１）。
（表１）
【００３４】
【表１】
0005186076.tif 000002
正常な植物の形態学および正常な根の形成を、分析した１０個の独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー株中で観察した。１０個の独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー株中の見積もったｉｐｔ遺伝子のコピー数を示す。
【００３５】
本明細書中で開示されそして定義される本発明が、本文または図面に記載されるかまたはそれから明らかである個々の特徴の２つ以上の代替的な組合せの全てに及ぶことが、理解される。これらの異なる組み合わせの全てが、本発明の種々の代替的な局面を構成する。
【００３６】
最後に、種々の変更、改変、および／または付加が本明細書中に概説される本発明の精神を逸脱することなく行われ得ることが、理解される。
【００３７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（またはその文法上の変形）は、本明細書中で使用される場合には、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と等価であり、そして他の要素または特徴の存在を排除するように受け取られるべきではないこともまた、理解される。
【００３８】
本明細書中で引用されている文献は、参照の目的だけのためであり、そしてそれらの内容は、それらが関連分野での共通の一般的な知識の一部を形成することの認定ではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｍｙｂ３２遺伝子（ａｔｍｙｂ３２）に由来するプロモーターのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図２】  図２は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号２）。
【図３】  図３は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）植物のＰＣＲおよびサザンＤＮＡ分析を示す。ａ）サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブの制限酵素部位および位置を示す、ｐａｔｍｙｂ３２：ｉｐｔのＴ−ＤＮＡ領域。ｂ）ＰＣＲ増幅した５９９ｂｐのｎｐｔＩＩおよび５８３ｂｐのｉｐｔ産物のエチジウムブロマイド染色した１％のアガロースゲル。ｃ）ｉｐｔプローブとハイブリダイズしたＰＣＲ陽性の白色クローバー植物から単離した、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した全ゲノムＤＮＡでのサザンハイブリダイゼーションブロット。ｄ）ｎｐｔＩＩプローブとハイブリダイズしたＰＣＲ陽性白色クローバー植物から単離した、ＨｉｎｄＩＩＩ消化した全ゲノムＤＮＡとのサザンブロットハイブリダイゼーション。レーン１〜２：２つの別々のカナマイシン耐性のｃｖ．Ｈａｉｆａ再生植物（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ）、コード：それぞれ、Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８；レーン３〜１２：１２個の別々のカナマイシン耐性のｃｖ．Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ再生植物、コード：それぞれ、ｌｍｉ０６、ｌｍｉ０７、ｌｍｉ０８、ｌｍｉ０９、ｌｍｉ１０、ｌｍｉ１１、ｌｍｉ１２、ｌｍｉ１４、ｌｍｉ１６、ｌｍｉ１８；レーンＣ：形質転換されていない白色クローバー；レーンＰ：陽性の対照プラスミドｐａｔｍｙｂ３２ｉｐｔ。
【図４】  図４は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物中でのｉｐｔ  ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１〜１１は、図４．８のような対応する植物コードを有する１１個の異なるトランスジェニック株に由来するサンプルである；レーンＣ、対照の非形質転換植物；レーンＰ、陽性対照としてのプラスミド。全ＲＮＡを、葉組織から単離した。全ＲＮＡ（１３μｇ）をそれぞれ逆転写反応に使用し、そしてＲＴ産物の１／５をＰＣＲによって増幅した。右のゲルのＤＮＡ産物を、２×３０サイクルの集約ＰＣＲ（Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ＰＣＲ）によって増幅した。別のレーンに充填した対応するＲＴ−ＰＣＲ反応には逆転写酵素を添加しなかった。
【図５】  図５は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物から切り取った葉の老化の生物学的試験を示す。少なくとも３０枚の葉を、それぞれの株から植物株の匍匐上の同様の位置から回収した。Ａ．切り取った葉の総数の関数としての黄変している葉の数。Ｂ．２週間の間、光線下の水上で維持した葉の典型的な外観。植物株についての重要事項：それぞれ、ＨＣ、ＩＣおよびＨｍｇ、Ｉｍｇ、非形質転換植物およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡトランスジェニック植物（ｃｖ．ＨａｌｆａおよびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ）；０１および０８、それぞれ、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックＨａｌｆａ株Ｈｍｉ０１およびＨｍｉ０８；１１、１２、１６、および１８、それぞれ、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ株、それぞれ、ｌｍｉ１１、ｌｍｉ１２、ｌｍｉ１６、およびｌｍｉ１８。
【図６】  図６は、Ａ）全体的な植物の形態学、Ｂ）正常な苗条の生育、およびＣ）対照植物（左）と比較した、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック白色クローバー（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）（右）植物における正常な根の生育。
【配列表】
0005186076.tif 000003
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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