(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、
（４）第三工程で取得された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と、を結合させて、該目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと該固定化メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成させる第四工程、
（５）第四工程で形成された複合体に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖ＤＮＡ（正鎖）にする第五工程と、
（６）第五工程で得られた一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を、該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）を有するプライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる第六工程と、
（７）第六工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に分離する第七工程と、
（８）第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第八工程と、
（９）第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）に対して相補性のある塩基配列（正鎖）を有するプライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第九工程と、
（１０）第八工程又は第九工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅する第十工程と、
（１１）第十工程で増幅されたＤＮＡの量を定量又は検出する第十一工程と、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＤＮＡメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又はＳｓｓ  Ｉメチラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第四工程において検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させることにより固定相へ吸着させる請求項１に記載の方法を用いたＤＮＡの濃縮方法。
【請求項４】
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＲＮＡから逆転写酵素により生成されたＤＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検体が、下記のいずれかの検体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
【請求項７】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、又は予め精製されてなるＤＮＡである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第二工程で目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法としては、例えば、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）によってＤＮＡを増幅させて検出する方法等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Chiquet C., Lina G., Benito Y., Cornut P.L., Etienne J., Romanet J.P., Denis P., Vandenesch F.,Polymerase chain reaction identification in aqueous humor of patients with postoperative endophthalmitis.,J. Cataract. Refract. Surg.,2007;33(4):635-641.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＰＣＲを利用する方法では、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、更に、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域のＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
[発明１]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する第三工程、
（４）第三工程で取得された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と、を結合させて、該目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと該固定化メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成させる第四工程、
（５）第四工程で形成された複合体に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖ＤＮＡ（正鎖）にする第五工程と、
（６）第五工程で得られた一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を、該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）を有するプライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる第六工程と、
（７）第六工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に分離する第七工程と、
（８）第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第八工程と、
（９）第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）に対して相補性のある塩基配列（正鎖）を有するプライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第九工程と、
（１０）第八工程又は第九工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅する第十工程と、
（１１）第十工程で増幅されたＤＮＡの量を定量又は検出する第十一工程と、
を有することを特徴とする方法。
[発明２]
ＤＮＡメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又はＳｓｓ  Ｉメチラーゼである発明１に記載の方法。
[発明３]
第四工程において検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させることにより固定相へ吸着させる発明１に記載の方法を用いたＤＮＡの濃縮方法。
[発明４]
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＲＮＡから逆転写酵素により生成されたＤＮＡである発明１〜４のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
検体が、下記のいずれかの検体である発明１〜５のいずれか一に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
[発明７]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、又は予め精製されてなるＤＮＡである発明１〜６のいずれか一に記載の方法。
[発明８]
第二工程で目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明１〜７のいずれか一に記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法（以下、本発明方法と記すこともある）に関するものである。
第一工程は、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する工程である。
【０００７】
本発明方法における「検体」としては、非生物由来検体と生物由来検体とが挙げられる。非生物由来検体とは、例えば食品、河川、土壌、一般市販製品の表面付着物等の真菌、細菌、ウイルス等の混入微生物や核酸が含まれ得るものを意味する。
尚、特に食品においては食中毒菌の有無の検査と原因菌の特定が重要であり、通常は微生物表面の抗原を利用した免疫法が使用される。しかし、免疫法は、抗原を作るために多大の労力を必要とし、更に病原菌の特定が必要となる。即ち、微生物検査における免疫法は、微生物種の特異性を利用しているため、一回の検査で複数菌種をまとめて、その有無を検査することが難しいだけでなく、免疫法を確立できない微生物に対しては、ＰＣＲ法等を用いる等、検査には多大の労力が必要となる。本発明方法は、まず、免疫法による検査が難しい場合でも、遺伝子から検査方法を確立でき、次に、複数の微生物を同時に検出することが可能な検査方法を提供できる。即ち、本発明方法は、非生物由来検体中に存在する真菌類、微生物類、ウイルス等の検査に利用できる。
また、本発明方法を用いることにより、例えば食品中の混入微生物やウイルスを検出することが可能となり、感染症の検査や食品汚染検査等で利用が期待できる。
【０００８】
生物由来検体とは、（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、等が挙げられる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液とは血漿、血清、リンパ液等を意味し、前記体分泌物とは尿や乳汁等を意味する。
【０００９】
検体中に含まれるＤＮＡとしては、前記生体試料や前記混入微生物から抽出して得られたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。
また、哺乳動物由来の検体がヒトの血液、体液又は体分泌物等である場合には、ヒトの定期健康診断における臨床検査等で採取したものを利用することができる。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【００１０】
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いればよい。また、ＲＮＡからＤＮＡを得るためには、市販のｃＤＮＡ作成キット等の逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成するようなキットを用いればよい。また、本発明方法においては、検体としては、人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
【００１１】
本発明方法における「哺乳動物」とは、哺乳動物に属する動物の全てを意味する。哺乳動物に属する動物とは、動物界 脊索動物門 脊椎動物亜門 哺乳綱（Mammalia）に分類される動物の総称であり、より具体的には、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を意味する。
【００１２】
本発明における「体液」とは、固体を構成する細胞間に存在する液体を意味し、血漿と間質液を意味し、多くの場合、固体の恒常性の維持機能を果たす。より具体的には、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、脳脊髄液、等を意味する。
【００１３】
本発明における「体分泌液」とは、外分泌腺からの分泌液を意味する。より具体的には、唾液、胃液、 胆汁、 膵液、腸液、 汗、 涙、 鼻水、 精液、 膣液、 羊水、 乳汁、等を意味する。
【００１４】
本発明における「細胞溶解液」とは、細胞培養用の10cmプレート等で培養した細胞、即ち細胞株や初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を意味する。細胞膜を破壊する方法としては、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液をを用いる方法等が挙げられる。尚、細胞を溶解するためには、様々なキット等を利用してもよい。
例えば具体的には、10cmプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、0.6mLのRIPAバッファー（1x TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxysholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide）を10cmプレートに加える。4℃で15分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、10cmプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の１/10容量の10mg/mL PMSFを添加してから、氷上で30-60分間放置する。4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を細胞溶解液として取得する。
【００１５】
本発明における「組織溶解液」とは、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより取得する細胞内液を含む溶解液を意味する。
より具体的には、動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合は、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷RIPAバッファー（プロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、RIPAバッファーの１/10容量の10mg/mL PMSFを添加しても良い）を組織1gあたり3mLの比率で添加し、４℃でホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に４℃に維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を組織溶解液として取得する。
【００１６】
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）とは、検体中に含まれるＤＮＡ領域のうち、本発明方法により検出又は定量したいＤＮＡ領域である。検体がＤＮＡである場合の目的とするＤＮＡ領域とは、ＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味し、検体がＲＮＡである場合には、ＲＮＡから逆転写酵素により作成されたＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味する。本発明方法においては、シトシンをメチル化して検出又は定量する方法であるため、目的領域はシトシン或いは後述のＣｐＧに富む領域を含むことが望ましい。
【００１７】
第一工程は、検体中から目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを取得する工程である。
「目的とするＤＮＡ領域」とは、例えばゲノムＤＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列を意味する。また、検体中に含まれるＲＮＡを検出する場合、「目的とするＤＮＡ領域」とは、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素により合成されたＤＮＡ上の塩基配列であって、ＲＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列を意味する。
【００１８】
第一工程で取得されるＤＮＡは、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であってもよく、また予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。他に、第一工程で取得されるＤＮＡ試料として、血液中の遊離ＤＮＡ、微生物ゲノム由来のＤＮＡ、検体中のＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡ等が挙げられる。更には、「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」は人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
【００１９】
目的とするＤＮＡ領域の塩基配列を含むゲノムＤＮＡを取得するには、例えば、検体が哺乳動物由来の場合は、市販のＤＮＡ抽出用キット（Genfind v2 Kit（ベックマン・コールター社製）、FastPure DNA Kit（タカラバイオ株式会社製））等を用いればよい。
また、検体が真菌等の微生物である場合、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法等を用いればよく、検体が大腸菌のような原核生物である場合、Molecular Cloning -A Laboratory Manual-（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いればよい。
また、検体が食品である場合、食品から微生物等を分離してからＤＮＡを取得してもよく、食品に含まれる微生物以外のゲノムＤＮＡと微生物由来のゲノムを同時に取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の組織であり、目的とするＤＮＡ領域がウイルス由来のＤＮＡである場合は、組織中から市販のＲＮＡ抽出用キット（ISOGEN（311-02501）（NIPPON GENE社製）、或いは、FastRNA Pro Green Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Blue Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Red Kit (フナコシ社製)、等）等を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によってＤＮＡを取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の検体である場合、ウイルス粒子を抽出してからウイルスのＤＮＡを抽出してもよく、或いはウイルス粒子を抽出してから市販のキット（QuickGene RNA tissue kit S II、富士フィルム社製）等を用いてウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。ウイルスが感染した組織からＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良いし、ウイルスが感染した組織からＤＮＡを取得して、ウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。
【００２０】
本発明方法における「メチル化ＤＮＡ」或いは「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のいずれかがメチル化されることを意味する。例えば、哺乳動物では、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンのみがメチル化されるという現象が知られている。シトシンのメチル化部位は５位である。ＣｐＧのシトシンメチル化現象は、細胞分裂に先立つＤＮＡ複製により新生二本鎖ＤＮＡでは、親細胞由来のＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態であるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生されたＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。このシトシンメチル化は、親細胞由来のＤＮＡ鎖中のメチル化されたシトシンを含むＣｐＧと相補的に結合する新生ＤＮＡ鎖のＣｐＧのシトシンをメチル化する。従って、親細胞のＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後の、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。「メチル化されたＤＮＡ」とは、このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。尚、「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖ＤＮＡを意味するものである。
また、本発明方法における「一本鎖メチル化ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡの塩基配列中の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンの５位がメチル化された一本鎖ＤＮＡを意味する。
【００２１】
本発明方法における前記「目的とするＤＮＡ領域」を換言すると、検体中のＤＮＡ含量を調べたいＤＮＡ領域ともいえる。例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）等を自由に挙げることができる。「目的とするＤＮＡ領域」においてメチル化されたＤＮＡを個々に検出又は定量することは勿論であるが、例えば１つの検出系において「目的とするＤＮＡ領域」がより多く存在すれば、それだけ定量精度及び検出感度を向上させることができる。
【００２２】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。
【００２６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。
【００２７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。
【００２８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。
【００２９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
【００３０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。
【００３１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。
【００３２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。
【００３３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。
【００３４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。
【００３５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。
【００３６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。
【００３７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。
【００３８】
本発明方法の第一工程における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」とは、目的領域が微生物由来の塩基配列である場合、検体中から抽出したゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片、或いはＲＮＡを逆転写酵素によりＤＮＡとした塩基配列を意味する。
【００３９】
本発明方法の第一工程における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡや、該微生物等由来のＲＮＡから逆転写酵素により取得したＤＮＡを挙げることができる。例えば、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma pneumoniae、Borrelia burgdorferi B31、Rickettsia prowazekii、Treponema pallidum、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Helicobacter pylori J99、Helicobacter pylori 26695、Haemophilus influenzae Rd、Mycobacterium tuberculosis H37Rv、Pseudomonas aeruginosa、Legionella pneumophila、Serratia marcescens、Escherichia coli、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Trichophyton ruburum、Trichophyton mentagrophytes、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus、Pneumocystis carinii、Coccidioides immitis、Cytomegalovirus、human herpesvirus 5、Epstein-Barr virus、Human Immunodeficiency Virus、Human Papilloma Virus、Enterovirus、Norovirus Influenza Virus、Toxoplasma gondii、Cryptosporidium parvum、Entamoeba histolyticaのゲノムＤＮＡや、それらのＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡは、検体中の感染症原因菌、或いは食品中の食中毒原因菌等の検出に利用できる。
【００４０】
第二工程は、第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する工程である。
第二工程において、「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する」とは、第一工程で得られたＤＮＡをメチル化酵素で処理し、メチル化ＤＮＡを取得することを意味する。
【００４１】
「ＤＮＡメチル化酵素」とは、ＤＮＡ中の塩基をメチル化する酵素であり、哺乳類細胞、細菌等から、多くのＤＮＡメチル化酵素が単離されている。ＤＮＡメチル化酵素は、基質の塩基の種類から、アデニンメチル化酵素、シトシンメチル化酵素等、複数種類に分類される。シトシンメチル化酵素は、ＤＮＡ塩基配列中の特定の配列を認識し、その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、認識する塩基配列により異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
また、ＤＮＡメチル化酵素の触媒するＤＮＡのメチル化反応は、制限修飾系と呼ばれる原始的な免疫系から、多数見出されている。制限修飾系とは、細菌で機能するゲノム全体を定期的なメチル化することにより、特定の配列を認識する制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）によって消化されないようにした上で、外来ＤＮＡ（特に、バクテリオファージ）を制限酵素によって消化する機能で、バクテリオファージ感染から微生物ゲノムを防御するシステムのことである。ゲノムのメチル化に機能している酵素は、シトシン或いはアデニンをメチル化し、多くは、プリン残基の６位の窒素（Ｎ６）、或いは、５位の炭素（Ｃ５）をメチル化することが知られている。このような酵素のうち、シトシンのＣ５をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、SssI(M.SssI)メチラーゼ、AluIメチラーゼ、HhaIメチラーゼ、HpaIIメチラーゼ、MspIメチラーゼ、HaeIIIメチラーゼ等が知られている。また、これらシトシンのＣ５位をメチル化する酵素は、認識する塩基配列が異なっており、ＣpＧを認識するシトシンメチル化酵素は、SssIのみである。
また、ヒトゲノム中のＤＮＡのメチル化反応としては、エピジェネティクス（遺伝子配列によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み）として、ＣｐＧのシトシンの５位（Ｃ５）のメチル化が知られており、このようなシトシンメチル化酵素として、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが知られている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、DnmtIメチルトランスフェラーゼが知られている。
従って、ヒト細胞中ではＣｐＧ配列のシトシンのＣ５位がメチル化されているため、人為的にゲノムをメチル化する場合には、SssIを用いることで、ヒト細胞内でのメチル化と同じ配列（ＣｐＧ）の、同じシトシンの、同じ位置をメチル化することが可能となる。
シトシンメチル化酵素によりメチル化されたＤＮＡにするためには、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。ＤＮＡ試料に、最適な10×緩衝液（NEBuffer2 (NEB社製)）を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーションすればよい。  第二工程におけるメチル化は、目的とするＤＮＡ領域を、メチル化ＤＮＡ抗体に結合させることにより、支持体へ結合するために実施するため、抽出したＤＮＡ試料の目的とする領域がメチル化されていれば、必ずしも、第二工程を実施する必要は無い。
【００４２】
第三工程は、第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する工程である。
第三工程における「目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得する」とは、「第二工程でＤＮＡメチル化酵素によりメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する」ことを意味し、メチル化された一本鎖ＤＮＡに分離するためには、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするための一般的は操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。
【００４３】
他に第二工程において、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際の好ましい態様として、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。
本発明方法における「カウンターオリゴヌクレオチド」とは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、ＤＮＡのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。
【００４４】
「メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。
【００４５】
第四工程は、第三工程で取得された目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と、を結合させて、該目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと該固定化メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成させる工程である。
第四工程における「目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と、を結合させて、該目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと該固定化メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成させる」とは、第三工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させて支持体に固定化することを意味する。
【００４６】
「固定化メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合するメチル化ＤＮＡ抗体を「支持体」に固定化したものである。抗体として、好ましくは一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体であればよく、より好ましくは、メチルシトシン抗体でも良い。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。従って、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成させることで、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡは支持体に固定化される。
「メチル化ＤＮＡ抗体」としては、より望ましくは、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体であればよく、より具体的には、メチルシトシン抗体でも良い。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
【００４７】
「支持体」としては、メチル化ＤＮＡ抗体が結合可能な支持体であれば、材質及び形状は何でも良い。例えば、形状は、使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質としては、通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、又は、前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでも良い。また、ガラス、多糖類若しくはその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でも良い。
【００４８】
メチル化ＤＮＡ抗体を支持体に固定化して「固定化メチル化ＤＮＡ抗体」として機能させる方法としては、該メチル化ＤＮＡ抗体が支持体に結合する方法であればどのような方法を用いても良い。メチル化ＤＮＡ抗体を支持体に結合させるには、メチル化ＤＮＡ抗体を通常の遺伝子工学的な操作又は市販のキット、装置等を用いて行えばよい（固相への結合）。具体的に、メチル化ＤＮＡ抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。他に、メチル化ＤＮＡ抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子に共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、或いは合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
【００４９】
メチル化ＤＮＡ抗体の支持体への結合は直接的であっても間接的であってもよく、例えば、メチル化ＤＮＡ抗体が直接支持体に固定化してもよく、或いはメチル化ＤＮＡ抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、該二次抗体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
【００５０】
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を支持体に固定（選択）するには、メチル化ＤＮＡ抗体を介して支持体に固定化されていればよく、
（１）一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とメチル化ＤＮＡ抗体との結合前に、メチル化ＤＮＡ抗体との結合により固定化されるものであってもよく、また
（２）一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とメチル化ＤＮＡ抗体との結合後に、該メチル化ＤＮＡ抗体が支持体に結合することにより固定化されてもよい。
【００５１】
メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的には、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を接触させて得られる抗体としては、動物から精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明においてはメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
【００５２】
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ  Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法等があげられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）等があげられる。
【００５３】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明の方法における「メチル化された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味しており、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されている一本鎖ＤＮＡに限った意味ではない。
【００５４】
尚、「相補的な（塩基対合による）結合」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとアデニン、グアニンとシトシンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」又は「相補性によって結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、又はアデニン、又はチミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
【００５５】
これらの第五工程から第十工程は、固定化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを、メチル化ＤＮＡ抗体から分離して鋳型とし、フォワード用プライマーとリバース用プライマーをプライマーとして用いてＰＣＲを実施することにより、目的とするＤＮＡ領域を増幅する工程である。
【００５６】
第五工程において、第四工程で得られた複合体に含まれる前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする。具体的には例えば、第四工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を得る。
【００５７】
第六工程において、第五工程で得られた一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を、該一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）を有するプライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。具体的には例えば、第五工程で得られた一本鎖状態のＤＮＡ（正鎖）とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM  dNTPを3μL、5N  ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。
【００５８】
第七工程において、第六工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に分離する。具体的には例えば、第六工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡに一旦分離する。
【００５９】
第八工程において、第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる。具体的には例えば、(i) 生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）に、前記フォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記フォワード用プライマーのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。(ii)その後、室温に戻す。(iii)(i)でアニーリングさせた前記一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる。
【００６０】
第九工程において、第七工程で得られた目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性のある塩基配列（負鎖）の３’末端より更に３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）に対して相補性のある塩基配列（正鎖）を有するプライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる。具体的には例えば、上記(iii)の第八工程と同様に伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
【００６１】
第十工程において、第八工程又は第九工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、第十一工程において、増幅されたＤＮＡの量を定量又は検出する。具体的には、第六工程から開始して第十工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第六工程までを独立した反応として実施し、第七工程から第十工程をＰＣＲ反応として実施することもできる。目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明の方法の第五工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq  Gold  (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件が挙げられる。
【００６２】
第十一工程は、第十工程で増幅されたＤＮＡの量を定量又は検出する工程である。
第十一工程おいて、第十工程までにＰＣＲで得られたＤＮＡ増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、蛍光標識体の量の測定によりＰＣＲ反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度の僅かな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。また、ＤＮＡをエチジウムブロマイドやサイバーグリーン等によりＤＮＡを染色して検出しても良い。
【００６３】
尚、本発明方法において、第五工程から第十工程までを一連のＰＣＲ反応として実施しても構わないし、夫々の工程を独立して実施しても構わない。例えば、固定化メチル化ＤＮＡ固体が、ＰＣＲチューブに固定化されている場合、第五工程から第十工程までを一つのＰＣＲ反応として実施する事も可能である。
【００６４】
また、本発明方法に下記工程を更に加えることで検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域のメチル化されたＤＮＡの含量の割合を算出する方法（以下、メチル化割合算出方法と記すこともある）とすることもできる。
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域のメチル化されたＤＮＡをシトシンメチル化酵素によりメチル化せずに該目的とするＤＮＡ領域のメチル化されたＤＮＡ（元来メチル化されていたＤＮＡの総量）を第十工程で検出可能な量になるまで増幅して定量されたＤＮＡの量と、前記検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域のメチル化されたＤＮＡをシトシンメチル化酵素によりメチル化して該目的とするＤＮＡ領域のメチル化されたＤＮＡ（元来メチル化されていたＤＮＡ及び元来メチルされていなかったＤＮＡの総量）を第十工程で検出可能な量になるまで増幅して定量されたＤＮＡの量と、の差異を指標として前記目的とする領域のメチル化されたＤＮＡの割合を算出する工程。
【００６５】
メチル化割合算出方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の程度（度合い）を測定することが可能と考えられている。例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について本発明方法及び本メチル化割合算出方法を実施すれば、新たにメチル化されるＤＮＡの量は増加する。一方、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明方法及び本メチル化割合算出方法を実施すれば、新たにメチル化されるＤＮＡの量はほぼ０に近い値となる。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が高いＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明方法及び本メチル化割合算出方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示す。このため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。従って、本発明方法及び本メチル化割合算出方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。このように各種疾患の診断を目的としたメチル化割合を調べる際に、目的とするＤＮＡ領域をシトシンメチル化酵素によりメチル化するためには、ＣｐＧメチラーゼであるSssIメチラーゼを用いることが好ましい。
【００６６】
このような本発明方法及び本メチル化割合算出方法における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定、メチル化割合の測定を行うための各種方法において使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬としても有用である。本発明により、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として使用する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる検出用チップも提供可能となり、本発明方法及び本メチル化割合算出方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用も可能とするものである。
【００６７】
また、本発明方法の第四工程を行うことにより、検体中に含まれるＤＮＡ試料を、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させることにより、前記目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを固定相へ選択させるＤＮＡの濃縮方法（以下、本濃縮方法と記すこともある。）を提供することも可能である。一本鎖メチル化ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体との親和性を利用して、固定相へ一本鎖メチル化ＤＮＡを結合させる方法は、ＤＮＡの濃縮及び洗浄のための簡易方法としても利用できる。例えば、目的とするＤＮＡ領域中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていればメチルシトシン抗体と結合することができるため、Sss Iメチラーゼによりメチル化したＤＮＡ試料をメチルシトシン抗体により固定相に選択してＰＣＲに供することが可能になる。ＰＣＲ反応は、シトシンがメチル化されても阻害されないため、ＰＣＲに供するＤＮＡサンプルが微量な場合や、ＰＣＲに供するＤＮＡの濃縮工程を簡便にしたい場合には、本濃縮方法が有用である。また、生検サンプル中、或いは食品等に含まれるグラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡを検出しようとする場合、ＰＣＲによるゲノムの検出を実施しようとする場合がある。このような場合、通常、微量のＤＮＡを扱うことになり、ＰＣＲを開始するまでにＰＣＲに供するＤＮＡの濃縮や洗浄の操作が必要となるが、本濃縮方法を用いると、シトシンメチル化酵素によりメチル化したＤＮＡをメチルシトシン抗体でＰＣＲを実施するチューブへ固定することで、大幅に操作を単純化できる。
また、検体からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行う場合には、ＲＮＡから合成した極微量のＤＮＡを取り扱うことになる。極微量のＤＮＡを扱う場合、操作上の試料の喪失を少なくするために、作業工程数を少なくする必要があるが、本濃縮方法では、このような極微量のＤＮＡをＰＣＲへ供するための前操作としてのＤＮＡの濃縮や洗浄の工程を少なくすることが可能である。
【００６８】
通常、生検サンプルや食品中に含まれる病原性微生物の有無を検査する場合、各々微生物抗原に対して免疫法による検査により、該病原性微生物の有無を調べたり、該病原性微生物を特定する。しかし、この免疫法に用いる抗体の作製は容易ではなく、更に複数の病原性微生物を検出するためには、各々の病原性微生物の抗原に対する抗体を作製する必要がある。そこで、本発明方法を用いることにより、これら煩雑な抗体作製を行うことなく病原性微生物に対する簡易な検査が可能となる。また、本発明方法では、異なる病原性微生物の塩基配列を同時に検査できることから、一つの検体中に含まれる数種類の病原性微生物を、同時に検出できるようになる。
通常、生検サンプル中、或いは食品等の一般製品中に含まれる病原性微生物等の有無を検査する場合、各々病原性微生物等の抗原に対して免疫法による検査により、該病原性微生物の有無を調べたり、該病原性微生物を特定する。しかし、免疫法に用いる抗体の作製は容易ではなく、更に複数の病原性微生物を検出するためには、各々病原性微生物等の抗原に対する抗体を作製する必要がある。そこで、本発明方法を用いることにより、これら煩雑な抗体を作製を行うことなく病原性微生物に対する簡易な検査が可能となる。また、本発明方法では、異なる病原性微生物の塩基配列を同時に検査できることから、一つの検体中に含まれる数種類の病原性微生物を、同時に検出できるようになる。具体的には食中毒菌として、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Clostridium perfringens等が知られている。また、本発明方法は環境中の微生物等のゲノムを検出することにより、産業上の有用な微生物等の同定や土壌、河川又は湖沼の底質等の微生物群の簡易調査等にも用いることができる。環境中の微生物のうち、例えば、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH、Aquifex aeolicus、Pyrococcus horikoshii OT3、Archaeoglobus fulgidus、Thermotoga maritima MSB8、Aeropyrum pernix K1、Haloferax mediterraneiを生息を確認することが可能となる。また、Geobacter sulfurreducensのように工業に利用できうる細菌、Streptococcus thermophilusのような醗酵に用いられる微生物の検出及び同定も可能となる。
【００６９】
例えば、前記目的とするＤＮＡ領域としては、具体的には、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域（配列番号３１）、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685（配列番号４３）のように、遺伝子をコードしない塩基配列でもよい。また、種々の病原性微生物に共通する特徴的な遺伝子の、病原性微生物で保存された塩基配列を検出対象とすることは、複数の病原性微生物を同時に検出する方法を提供しうるものであるため有用である。具体的には、mce-family遺伝子（Micobacterium tuberculosis）、13番染色体上のtRNA-Tyr塩基配列（Cryptococcus neoformans）、chitin synthase activator (Chs3)は、Aspergillus fumigatus及びNeosartorya 属に特有の塩基配列を有することから、ヒトの痰、肺の生検サンプル中から抽出したＤＮＡ中に、これら微生物由来のＤＮＡが含まれるか否かを検定することで、微生物による感染症の検定に用いることができる。また、actA（Listeria monocytogenes）、pyrG（NC_002163、Campylobacter jejuni subsp. jejuni）等は食中毒菌に特有共通した遺伝子であることから、これらの遺伝子は、食中毒における微生物検定に用いることができる。また、thrAは、Salmonella enterica、Yersinia enterocolitica、Escherichia coliで保存された配列を有しており、ひとつの遺伝子で複数の微生物を検出することも可能である。
【００７０】
データベース上で公開されている塩基配列のうち、微生物特有の塩基配列を探索することができる。例えば、ＰｕｂＭｅｄ等の公開データベース上にある塩基配列であれば、通常の操作により取得することが可能であり、取得した塩基配列は、通常の操作によるＢｌａｓｔ検索をかけることにより、特有の塩基配列であるか否かを検討することができる。尚、特有の塩基配列とは、検出対象中の塩基配列が検出対象となる微生物のゲノム塩基配列以外の生物由来の塩基配列と相同性を示す塩基配列を有さないことを意味する。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００７３】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００７４】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【００７５】
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号１９、Genbank Accession No. NC_001136等に示される酵母染色体ＩＶの塩基番号1264-1352に相当する領域）を増幅した。
【００７６】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
PR１：5’-AGTCTGTCCTACGTATCTGACA -3’ （配列番号１８）
【００７７】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’（配列番号１９）
【００７８】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【００７９】
得られたＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ： 100pg/20μL  TE溶液
溶液Ｂ： 10pg/20μL  TE溶液
溶液Ｃ： 1 pg/20μL  TE溶液
溶液Ｄ： TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８０】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＳをメチル化することにより、配列番号２０で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ２を得た。
【００８１】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ２：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACT -3’  （配列番号２０）
【００８２】
上記の反応液を、95℃にて10分間保温した後、４℃にて10分間保温し、ＤＮＡフラグメントを1本鎖状態とした。
【００８３】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号２０で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ２をＰＣＲチューブに固定した。
【００８４】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ２：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACT -3’  （配列番号２０）
【００８５】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１９で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓを増幅した。
【００８６】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- AGTCTGTCCTACGTATCTGACA -3’ （配列番号１８）
【００８７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
【００８８】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【００８９】
酵母ゲノム由来DNA断片の溶液Ａ（100 pg）、溶液Ｂ（10 pg）、及び、溶液Ｃ（1 pg）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 pg）では、増幅が確認されなかった。
【００９０】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【００９１】
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００９２】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００９３】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【００９４】
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号１９、Genbank Accession No. NC_001136等に示される酵母染色体ＩＶの塩基番号1264-1352に相当する領域）を増幅した。
【００９５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
PR１：5’- AGTCTGTCCTACGTATCTGACA -3’ （配列番号１８）
【００９６】
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’（配列番号１９）
【００９７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
【００９８】
得られたＤＮＡフラグメントＳについて、ヒト血液ゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を含有する以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ：100pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｂ：10pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｃ：1pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｄ：TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
【００９９】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＳをメチル化することにより、配列番号２０で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ２を得た。
【０１００】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ２：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACT -3’  （配列番号２０）
【０１０１】
上記の反応液を、95℃にて10分間保温した後、４℃にて10分間保温し、ＤＮＡフラグメントを1本鎖状態とした。
【０１０２】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号２０で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ２をＰＣＲチューブに固定した。
【０１０３】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ２：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACT -3’  （配列番号２０）
【０１０４】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１９で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓを増幅した。
【０１０５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- AGTCTGTCCTACGTATCTGACA-3’ （配列番号１８）
【０１０６】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
【０１０７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０１０８】
酵母ゲノム由来DNA断片の溶液Ａ（100 pg）、溶液Ｂ（10 pg）、及び、溶液Ｃ（1 pg）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 pg）では、増幅が確認されなかった。
【０１０９】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０１１０】
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１１１】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１１２】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１１３】
得られた酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ： 100ng/20μL  TE溶液
溶液Ｂ： 10ng/20μL  TE溶液
溶液Ｃ： 1ng/20μL  TE溶液
溶液Ｄ： TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１１４】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションし、配列番号２１で示されるからなるＤＮＡフラグメントＳ３を得た。
【０１１５】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ３：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCCGTTTTACAGTGACACCGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTACGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号２１）
【０１１６】
得られた夫々の反応液から20μＬとり、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号２１で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＳ３をメチル化することにより、配列番号３７で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ４を得た。
【０１１７】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ３：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCCGTTTTACAGTGACACCGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTACGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号２１）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ４：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCNGTTTTACAGTGACACNGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTANGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号３７）
【０１１８】
上記の反応液を、95℃にて10分間保温した後、４℃にて10分間保温し、ＤＮＡフラグメントを1本鎖状態とした。
【０１１９】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号３７で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ４をＰＣＲチューブに固定した。
【０１２０】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ４：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCNGTTTTACAGTGACACNGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTANGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号３７）
【０１２１】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡフラグメントＳ３（配列番号２１、Genbank Accession No. NC_001136等に示される酵母染色体ＩＶの塩基番号1220-1395に相当する領域）の部分配列である配列番号１９で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓを増幅した。
【０１２２】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- AGTCTGTCCTACGTATCTGACA -3’ （配列番号１８）
【０１２３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
【０１２４】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０１２５】
酵母ゲノムDNAの溶液Ａ（100 ng）、溶液Ｂ（10 ng）、及び、溶液Ｃ（1 ng）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 ng）では、増幅が確認されなかった。
【０１２６】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０１２７】
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１２８】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１２９】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１３０】
得られたゲノムＤＮＡについて、ヒト血液ゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を含有する以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ：100ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｂ：10ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｃ：1ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
溶液Ｄ：TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ含有）
【０１３１】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションし、配列番号２１で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＳ３を得た。
【０１３２】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ３：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCCGTTTTACAGTGACACCGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTACGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号２１）
【０１３３】
得られた夫々の反応液から20μＬとり、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号２１で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＳ３をメチル化することにより、配列番号３７で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ４を得た。
【０１３４】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ３：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCCGTTTTACAGTGACACCGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTACGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号２１）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ４：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCNGTTTTACAGTGACACNGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTANGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号３７）
【０１３５】
上記の反応液を、95℃にて10分間保温した後、４℃にて10分間保温し、ＤＮＡフラグメントを1本鎖状態とした。
【０１３６】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号３７で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＳ４をＰＣＲチューブに固定した。
【０１３７】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを表す）
Ｓ４：5’- TAGGTTTTGCTTTGATCNGTTTTACAGTGACACNGAACATAAGGGGAAGCTATTGACATGGTATNGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATANGTAGGACAGACTCTTTCCTGTGTAAATATTTGTGACAGCTANGTCTATTTTCTAC -3’  （配列番号３７）
【０１３８】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ１及びＰＲ１の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡフラグメントＳ３（配列番号２１、Genbank Accession No. NC_001136等に示される酵母染色体ＩＶの塩基番号1220-1395に相当する領域）の部分配列である配列番号１９で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓを増幅した。
【０１３９】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCG -3’  （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- AGTCTGTCCTACGTATCTGACA -3’ （配列番号１８）
【０１４０】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ：5’- GGAAGCTATTGACATGGTATCGAAAGGTTGTCCACATTGGGAAGTAACTTGGTTCTATGAATCTTCATGTCAGATACGTAGGACAGACT -3’  （配列番号１９）
【０１４１】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０１４２】
酵母ゲノムDNAの溶液Ａ（100 ng）、溶液Ｂ（10 ng）、及び、溶液Ｃ（1 ng）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 ng）では、増幅が確認されなかった。
【０１４３】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０１４４】
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１４５】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１４６】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１４７】
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号２４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０１４８】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
PR２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０１４９】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
【０１５０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０１５１】
得られたＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ： 100pg/20μL  TE溶液
溶液Ｂ： 10pg/20μL  TE溶液
溶液Ｃ： 1 pg/20μL  TE溶液
溶液Ｄ： TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１５２】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号２４で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴをメチル化することにより、配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ２を得た。
【０１５３】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ２：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２５）
【０１５４】
配列番号２４で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴの負鎖に相補性により結合可能な配列番号２６〜配列番号３５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１５５】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
【０１５６】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２６）
Ｃ２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号２７）
Ｃ３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号２８）
Ｃ４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号２９）
Ｃ５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号３０）
Ｃ６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号３１）
Ｃ７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号３２）
Ｃ８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号３３）
Ｃ９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号３４）
Ｃ１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号３５）
【０１５７】
前記のＤＮＡフラグメントＴの反応液について、以下の処理を施した。
【０１５８】
前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液に、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLを添加し、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
【０１５９】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ２をＰＣＲチューブに固定した。
【０１６０】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ２：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２５）
【０１６１】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔを増幅した。
【０１６２】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０１６３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２４）
【０１６４】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０１６５】
酵母ゲノム由来DNA断片の溶液Ａ（100 pg）、溶液Ｂ（10 pg）、及び、溶液Ｃ（1 pg）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 pg）では、増幅が確認されなかった。
【０１６６】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０１６７】
実施例６
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１６８】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１６９】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１７０】
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号２４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
【０１７１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
PR２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０１７２】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
【０１７３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq  Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard  SV  Gel/PCR  Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０１７４】
得られたＤＮＡフラグメントＴについて、ヒト血液ゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を含有する以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ：100pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｂ：10pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｃ：1pg/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｄ：TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
【０１７５】
得られた夫々の溶液を20μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号２４で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴをメチル化することにより、配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ２を得た。
【０１７６】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ２：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２５）
【０１７７】
配列番号２４で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴの負鎖に相補性により結合可能な配列番号２６〜配列番号３５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１７８】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２４）
【０１７９】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２６）
Ｃ２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号２７）
Ｃ３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号２８）
Ｃ４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号２９）
Ｃ５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号３０）
Ｃ６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号３１）
Ｃ７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号３２）
Ｃ８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号３３）
Ｃ９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号３４）
Ｃ１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号３５）
【０１８０】
前記のＤＮＡフラグメントＴの反応液について、以下の処理を施した。
【０１８１】
前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液に、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLを添加し、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
【０１８２】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ２をＰＣＲチューブに固定した。
【０１８３】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ２：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２５）
【０１８４】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔを増幅した。
【０１８５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０１８６】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２４）
【０１８７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０１８８】
酵母ゲノム由来DNA断片の溶液Ａ（100 pg）、溶液Ｂ（10 pg）、及び、溶液Ｃ（1 pg）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 pg）では、増幅が確認されなかった。
【０１８９】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０１９０】
実施例７
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１９１】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１９２】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１９３】
得られた酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ： 10ng/20μL  TE溶液
溶液Ｂ： 1ng/20μL  TE溶液
溶液Ｃ： 0.1ng/20μL  TE溶液
溶液Ｄ： TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１９４】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションし、配列番号３６からなるＤＮＡフラグメントＴ３を得た。
【０１９５】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
【０１９６】
得られた夫々の反応液から20μＬとり、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号３６で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ３をメチル化することにより、配列番号３８で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ４を得た。
【０１９７】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ４：5’- TAGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’  （配列番号３８）
【０１９８】
配列番号３６で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ３の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２６〜配列番号３５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１９９】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
【０２００】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２６）
Ｃ２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号２７）
Ｃ３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号２８）
Ｃ４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号２９）
Ｃ５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号３０）
Ｃ６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号３１）
Ｃ７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号３２）
Ｃ８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号３３）
Ｃ９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号３４）
Ｃ１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号３５）
【０２０１】
前記の酵母ゲノムＤＮＡの反応液について、以下の処理を施した。
【０２０２】
前記で調製した酵母ゲノムＤＮＡの反応液に、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLを添加し、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
【０２０３】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号３８で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ４をＰＣＲチューブに固定した。
【０２０４】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ４：5’- TAGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’  （配列番号３８）
【０２０５】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔを増幅した。
【０２０６】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０２０７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２４）
【０２０８】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０２０９】
酵母ゲノムDNAの溶液Ａ（10 ng）、溶液Ｂ（1 ng）、及び、溶液Ｃ（0.1 ng）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 ng）では、増幅が確認されなかった。
【０２１０】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【０２１１】
実施例８
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０２１２】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０２１３】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０２１４】
得られたゲノムＤＮＡについて、ヒト血液ゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を含有する以下の溶液をそれぞれ２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｂ：1ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｃ：0.1ng/20μL  TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
溶液Ｄ：TE溶液（100ngヒト血液ゲノム/20μＬ）
【０２１５】
得られた夫々の溶液を20μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）５μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションし、配列番号３６からなるＤＮＡフラグメントＴ３を得た。
【０２１６】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
【０２１７】
得られた夫々の反応液から20μＬとり、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションし、配列番号３６で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ３をメチル化することにより、配列番号３８で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ４を得た。
【０２１８】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ４：5’- TAGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’  （配列番号３８）
【０２１９】
配列番号３６で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ３の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２６〜配列番号３５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０２２０】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ３：5’- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’（配列番号３６）
【０２２１】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２６）
Ｃ２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’  （配列番号２７）
Ｃ３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’  （配列番号２８）
Ｃ４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’  （配列番号２９）
Ｃ５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’  （配列番号３０）
Ｃ６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’  （配列番号３１）
Ｃ７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’  （配列番号３２）
Ｃ８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’  （配列番号３３）
Ｃ９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’  （配列番号３４）
Ｃ１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’  （配列番号３５）
【０２２２】
前記の酵母ゲノムＤＮＡの反応液について、以下の処理を施した。
【０２２３】
前記で調製した酵母ゲノムＤＮＡの反応液に、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLを添加し、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した。
【０２２４】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返し、配列番号３８で示される塩基配列からなるメチル化されたＤＮＡフラグメントＴ４をＰＣＲチューブに固定した。
【０２２５】
＜メチル化されたＤＮＡフラグメント＞（Ｎは５-メチルシトシンを示す）
Ｔ４：5’- TAGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3’  （配列番号３８）
【０２２６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔを増幅した。
【０２２７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’  （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２３）
【０２２８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’  （配列番号２４）
【０２２９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【０２３０】
酵母ゲノムDNAの溶液Ａ（10 ng）、溶液Ｂ（1 ng）、及び、溶液Ｃ（0.1 ng）で、増幅が確認された。コントロール溶液Ｄ（0 ng）では、増幅が確認されなかった。
【０２３１】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡをメチルシトシン抗体を用いて選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域を検出可能な量になるまで増幅できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２３２】
本発明により、検体中に含まれるＤＮＡ中の目的とする領域のメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルから、配列番号２０で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「Ｍ１」、ＤＮＡマーカー「Ｍ２」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルから、配列番号２０で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「Ｍ１」、ＤＮＡマーカー「Ｍ２」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプルから、配列番号２０で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「Ｍ１」、ＤＮＡマーカー「Ｍ２」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（10ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（100ng）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（10ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（100ng）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図４】図４は、実施例４において、調製されたサンプルから、配列番号２０で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「Ｍ１」、ＤＮＡマーカー「Ｍ２」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（10ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（100ng）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（10ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（100ng）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図５】図５は、実施例５において、調製されたサンプルから、配列番号２５で示される塩基配列からなるＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１.５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図６】図６は、実施例６において、調製されたサンプルから、配列番号２５で示される塩基配列からなるＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１.５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0pg）のサンプル「Ｄ」、DNAフラグメントの溶液Ｃ（1pg）のサンプル「Ｃ」、DNAフラグメントの溶液Ｂ（10pg）のサンプル「Ｂ」、DNAフラグメントの溶液Ａ（100pg）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図７】図７は、実施例７において、調製されたサンプルから、配列番号２５で示される塩基配列からなるＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１.５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（0.1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（1ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（10ng）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（0.1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（1ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（10ng）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【図８】図８は、実施例８において、調製されたサンプルから、配列番号２５で示される塩基配列からなるＤＮＡ領域をＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１.５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（0.1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（1ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（10ng）のサンプル「Ａ」、コントロール溶液Ｄ（0ng）のサンプル「Ｄ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｃ（0.1ng）のサンプル「Ｃ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ｂ（1ng）のサンプル「Ｂ」、酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ（10ng）のサンプル「Ａ」、での結果を示している。
【０２３４】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２０
実験のために設計されたメチル化されたＤＮＡフラグメント
配列番号２１
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２５
実験のために設計されたメチル化されたＤＮＡフラグメント
配列番号２６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号２７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号２８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号３７
実験のために設計されたメチル化されたＤＮＡフラグメント
配列番号３８
実験のために設計されたメチル化されたＤＮＡフラグメント
【図１】
0005151709.tif 000002
【図２】
0005151709.tif 000003
【図３】
0005151709.tif 000004
【図４】
0005151709.tif 000005
【図５】
0005151709.tif 000006
【図６】
0005151709.tif 000007
【図７】
0005151709.tif 000008
【図８】
0005151709.tif 000009
【配列表】
0005151709000001.app