(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入することを含む、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を有する高等植物の作出方法であって、前記融合タンパク質が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のタンパク質であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
(c) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
(d) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
【請求項２】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物の生長促進方法であって、前記融合タンパク質が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のタンパク質であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
(c) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
(d) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
【請求項３】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物のATP、NADPH、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１つの合成促進方法であって、前記融合タンパク質が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のタンパク質であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
(c) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
(d) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
【請求項４】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物の炭素固定促進方法であって、前記融合タンパク質が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のタンパク質であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
(c) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
(d) 配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
【請求項５】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入することを含む、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を有する高等植物の作出方法であって、前記遺伝子が以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項６】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物の生長促進方法であって、前記遺伝子が以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項７】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物のATP、NADPH、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１つの合成促進方法であって、前記遺伝子が以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項８】
シトクロムc6タンパク質に50〜80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを含む、高等植物の炭素固定促進方法であって、前記遺伝子が以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子であることを特徴とする、前記方法。
(a) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有する新規な高等植物の作出方法、及び、上記チラコイド内腔にシトクロムｃ６を存在させ高等植物の生長を促進させる方法又は高等植物の炭素固定能を促進させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、陸上植物等のいわゆる高等植物の生長促進に関する技術としては、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ等の酵素の活性を高めるなど、光合成暗反応（カルビン・ベンソンサイクル）に関する報告例、具体的には、関連酵素遺伝子の導入により葉を大きくした報告例（Ｓｈｉｇｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，９６５−９６９（２００１））等がある。しかしこのような技術は、様々な高等植物への適用の面で、汎用性に非常に乏しいものであった。
シトクロムｃ６は、光合成明反応における電子伝達タンパク質であって、本来、一部の藻類（ラン藻類等）にのみ存在するものであり、その電子伝達能力が極めて優れている（すなわち酸化還元電位が高電位である）ことが知られている（図１）。このため、様々な高等植物において、その葉緑体中に（詳しくはチラコイド内腔に）シトクロムｃ６を発現及び機能させ、光合成能を向上させる、汎用性に優れた技術の開発が強く望まれている。
ところで、シトクロムｃ６を細胞内で発現させるようにする技術としては、例えば、Ｆ．Ｐ．Ｍｏｌｉｎａ−Ｈｅｒｅｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４３，３０２−３０６（１９９８）；Ｔ．Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．，５３１，５４３−５４７（２００２）；Ｒ．Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１７，５６７−５７１（２００２）；Ｄ．Ｒ．Ｈｉｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０５，７３−８１（１９９１）等の文献に記載の技術が知られている。しかし、これら技術はいずれも、大腸菌、酵母あるいはラン藻といった高等植物ではない宿主細胞を用い、単に、上記シトクロムｃ６又はそれに類するタンパク質の大量生産や機能解析を目的としてなされたものであり、従来より当業者において通常行われている遺伝子発現法に含まれるものである。
そして、高等植物において光合成明反応の電子伝達体としてシトクロムｃ６を機能させること、つまり、高等植物細胞内の葉緑体中にあるチラコイドの内腔にシトクロムｃ６を存在させることに成功した報告例は全く無く、極めて困難であると考えられていた。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有する新規な高等植物の作出方法を提供すること、ひいては、高等植物の生長促進方法、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１つの合成促進方法並びに炭素固定促進方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、特定のシグナルペプチドを付加したシトクロムｃ６タンパク質の遺伝子を、高等植物のゲノムＤＮＡに導入し発現させるようにすれば、従来不可能であると考えられていた葉緑体包膜内及びチラコイド膜内へのシトクロムｃ６の輸送（通過）が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入することを特徴とする、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有する高等植物の作出方法。
（２）シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を存在させることを特徴とする、高等植物の生長促進方法。
（３）シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を存在させることを特徴とする、高等植物のＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１つの合成促進方法。
（４）シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を存在させることを特徴とする、高等植物の炭素固定促進方法。
上記（１）〜（４）の方法においては、前記融合タンパク質が以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であってもよい。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
また上記（１）〜（４）の方法においては、前記遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子であってもよい。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加されてなる融合タンパク質。
上記（５）の融合タンパク質は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であってもよい。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
（６）上記（５）の融合タンパク質をコードする遺伝子。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（８）上記（６）又は（７）の遺伝子を含む組換えベクター。
（９）上記（８）の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
上記（９）の形質転換体は、宿主がアグロバクテリウム菌の形質転換体であってもよい。
（１０）上記（６）又は（７）の遺伝子が植物ゲノム中に導入されている、形質転換高等植物。
上記（１０）の形質転換高等植物は、植物細胞中の葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有するものであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、葉緑体チラコイド膜の光合成電子伝達系を示す図である。。
図２は、本発明におけるアグロバクテリウムを介したシトクロムｃ６遺伝子の導入と植物内におけるシトクロムｃ６の発現様式を示す模式図である。
図３は、シアノバクテリア及び藻類と高等植物の間における電子伝達系の相違を示す図である。
図４は、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓシトクロムｃ６のｃＤＮＡの塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を示す図である。
図５は、Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓシトクロムｃ６遺伝子の成熟タンパク質領域をＰＣＲによって増幅した結果を示す図である。
図６は、植物導入用シトクロムｃ６遺伝子の構築に用いたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−ベクターを示す図である。
図７は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来プラストシアニンのシグナルペプチドとＰｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６の成熟タンパク質領域を融合させた遺伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を示す図である。
図８は、トリペアレンタルメイティングによるアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の形質転換法を示す模式図である。
図９は、植物に導入されたシトクロムｃ６遺伝子をＰＣＲによって特定した電気泳動結果を示す図である。（Ａ）は鋳型としてゲノムＤＮＡを用いたときの結果であり、（Ｂ）は鋳型として全ＲＮＡを用いたときの結果である。
図１０は、植物内で発現したシトクロムｃ６を電気泳動によって特定した結果を示す図である。（Ａ）はＣＢＢ染色の結果であり、（Ｂ）はシトクロムｃ６抗体と反応させたウエスタンブロッティングの結果である。
図１１は、生育日数の経過に伴う、野生型（○）及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（●）の背丈の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝２０）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１２は、生育日数の経過に伴う、野生型（○）及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（●）の根の長さのの変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝２０）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１３は、生育日数の経過に伴う、野生型（○）及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（●）の葉の大きさの変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝２０）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１４は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後におけるクロロフィル含量の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝８）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１５は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後におけるＡＴＰ含量の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝８）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１６は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後におけるＮＡＤＰＨ含量の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝８）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１７は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後における二酸化炭素同化能力の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝１０）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１８は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後におけるデンプン量の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝１０）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
図１９は、生育日数の経過に伴う、野生型及び形質転換Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの光照射３時間後におけるタンパク質量の変化を示す図である。グラフの各値は、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（ｎ＝８）を表す。アスタリスク（＊）は、５％の有意水準で有意に差が見られた値であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００５−２７０１２号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．本発明の概要
本発明は、シトクロムｃ６とシグナルペプチドとの融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物内に導入し、高等植物細胞内の葉緑体中のチラコイド内腔において、光合成明反応の電子伝達体としての役割を果たすシトクロムｃ６を発現させ且つ機能させることにより、高等植物の生長を促進させる方法に係るものである（図２）。本発明により、高等植物細胞内でのＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質の合成が促進され、またこれに伴い、二酸化炭素（ＣＯ２）を炭水化物に変換する光合成暗反応（炭素固定反応）も促進され得る。本発明は、このような、高等植物におけるＡＴＰ等の合成や炭素固定を促進する方法を含み、また、生長促進、ＡＴＰ等の合成促進、及び炭素固定の促進がされ得る高等植物の作出方法をも含むものである。
一般に、光合成明反応（光合成電子伝達反応）においては、クロロフィルの電子が太陽光のエネルギーを獲得し、チラコイド内腔（チラコイド膜中）の電子伝達鎖を次々と移動するが、その際、クロロフィルは水から電子を獲得し、酸素（Ｏ２）を遊離する一方、上記電子伝達反応に伴いチラコイド膜を介してＨ＋のくみ出しが起こり、それで生じたプロトンの駆動力によって葉緑体のストロマ内でＡＴＰが合成される。そして、一連の反応の最後では、高エネルギー電子を（Ｈ＋とともに）ＮＡＤＰ＋が受け取り、ＮＡＤＰＨが合成される。
これに対し、光合成暗反応（炭素固定反応）では、光合成明反応で合成されたＡＴＰとＮＡＤＰＨがそれぞれエネルギー源と還元力として働くことで、葉緑体のストロマ内及び細胞質において、ＣＯ２が炭水化物に変換される。この炭素固定反応により、植物の葉等ではショ糖が合成される。ショ糖は、他の組織にも輸送され、様々な有機分子の合成材料として、ひいては植物自身の生長のためのエネルギー源として用いられる。
通常、高等植物における光合成明反応の電子伝達体（電子伝達タンパク質）は、プラストシアニン（ＰＣ）であるが、電子伝達能（酸化還元電位の高さ）に関しては、藻類における電子伝達体であるシトクロムｃ６の方が明らかに優れていることが分かっている（図３）。そのため、従来から、このシトクロムｃ６を高等植物内でも発現及び機能させ、光合成明反応及び暗反応を促進させようとする試みが種々なされてきた。しかしながら、このような試みは、実際のところ極めて困難であり、これまで成功例は無かった。
高等植物において、その細胞内のゲノム情報をもとに発現されたタンパク質が光合成明反応の電子伝達体としての機能を発揮するためには、チラコイド内腔に存在することが必須条件となる。そのためには、通常、「葉緑体包膜」及び「チラコイド膜」の２種の膜を通過する必要がある。この点が高等植物におけるシトクロムｃ６の機能発現を極めて困難にしている主要因であると考えられていた。そこで本発明者は、遺伝子組換え技術により、シトクロムｃ６遺伝子を高等植物のゲノム中に導入するにあたり、シトクロムｃ６タンパク質が、特定のシグナルペプチド（特定の長さ又は特定のアミノ酸配列のシグナルペプチド）が付加された融合タンパク質の状態で発現されるように、予めシグナル配列を付加した遺伝子を構築した上でその導入を行った。その結果、当該遺伝子導入により作出した植物体においては、チラコイド内腔にシトクロムｃ６タンパク質（シグナルペプチド無し）の存在が認められ、結果として、発現した融合タンパク質はそのシグナルペプチドの働きにより前述した２種の膜を通過し得るものであることが示され、本発明を完成した。
（１）ＰＹＣ６遺伝子導入系の検討
これまでに、ＰＹＣ６の酸化還元電位は高電位であることが知られており、また、そのＰＹＣ６遺伝子配列も明らかにされている。本発明においては、はじめにＰＹＣ６遺伝子をバイナリーベクターに連結し、形質転換用アグロバクテリウムを調製した。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）は、播種後低温処理を行ったのち長日条件で生育させ、抽台した段階で減圧浸潤により形質転換を行った。つづいて、得られた形質転換体において遺伝子の導入と発現を解析するため、植物体から抽出したゲノムＤＮＡとＲＮＡを鋳型とし、それぞれＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＰＹＣ６遺伝子の増幅が見られ、ＤＮＡシーケンサーによりその塩基配列はＰＹＣ６遺伝子と同様であることを確認した。次に、形質転換体中に確認されたＰＹＣ６遺伝子がタンパク質として発現しているかを解析するため、植物体から葉緑体タンパク質画分を抽出し、電気泳動後ウエスタンブロッティングを行った。その結果、ＰＹＣ６タンパク質の発現を確認した。また、得られた形質転換体中のＰＹＣ６タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を解析したところ、導入したＰＹＣ６のアミノ酸配列（ＰＩＲ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＪＣ５８４９）と一致した。この結果から、高等植物であるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ内で藻類由来ｃｙｔ  ｃ６（ＰＹＣ６）を発現させることに成功した。
（２）ＰＹＣ６導入による植物体の影響
後述の実施例に示すように、ＰＹＣ６導入植物の生育を観察したところ、葉の大きさは野生型（ＷＴ）に比べおよそ１．２〜１．３倍、背丈は約１．５倍増大していた。ＰＹＣ６導入植物は生育初期段階においてＷＴと比較して成長速度が上昇していた。また、ＰＹＣ６導入植物中のクロロフィル量を測定した結果、ＷＴのおよそ１．１〜１．２倍であった。このＰＹＣ６導入により植物体にみられた現象は、明反応最終産物であるエネルギー物質を利用して光合成反応全体が活性化されたためではないかと考えられる。そこで、ルシフェリン・ルシフェラーゼ法によりＰＹＣ６導入植物のＡＴＰ量を測定した結果、ＷＴと比較して約１．７倍増大していた。これはＡ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たな電子伝達体として紅藻ｃｙｔ  ｃ６が機能したことにより、明反応の電子伝達が活性化され、その最終生成物であるＡＴＰ量が増大し、さらには植物全体の生育が活性化されたためと考えられた。
なお、当該融合タンパク質が前述した２種の膜を通過するに際しては、第１の膜（葉緑体包膜）の通過時にはシグナルペプチドの一部が、第２の膜（チラコイド膜）の通過時にはその残りの部分が使用され、それぞれ使用後は脱離した後、最終的にシグナルペプチドの無い状態でＰＹＣ６がチラコイド内腔に輸送される。そして輸送されたＰＹＣ６タンパク質は、このチラコイド内腔でヘム（ヘムｃ）と結合し且つフォールディングすることにより電子伝達体として機能し得るシトクロムｃ６になると考えられる。
２．新規高等植物の作出方法
本発明の作出方法は、前述の通り、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有する新規な高等植物の作出方法であり、シトクロムαタンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入することを特徴とする方法である。
（１）作出対象となる高等植物
本発明の作出方法に用い得る高等植物、すなわち葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有するよう形質転換され得る高等植物としては、限定はされず、例えば以下の高等植物を挙げることができる。
本発明において対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞（カルスなどの組織培養を含む）のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、Ｃ３、Ｃ４、ＣＡＭ植物、及びこれらの中間植物等のすべてを含み、例えばアブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科、アカザ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、ヒユ科、パイナップル科、サボテン科、及びアロエ科等に属する植物（果実、野菜、花卉等を含む）が挙げられるが（下記参照）、これらの植物に限定されるものではない。
〔Ｃ３植物〕
・アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ）など
・ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ）など
・イネ科：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｎ）など
・マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ）など
・アカザ科：ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ）など
・バラ科：ヤマザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）など
・キク科：ハルジオン（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ）、タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｎ）など
・ウリ科：カボチャ（Ｃｕｃｕｒｄｉｄａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）など
・ヒルガオ科：サツマイモ（Ｉｐｏｍｅａ）など
・ラン科・ウチョウラン（Ｐｏｎｅｏｒｃｈｉｓ）など
〔Ｃ４植物〕
・イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｒｉｃａ）など
・ヒユ科：アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）など
〔ＣＡＭ植物〕
・パイナップル科：パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）など
・サボテン科：デフューサ（Ｌｏｐｈｏｐｈｏｒａ  ｄｉｆｕｓａ）、オプンティア（Ｏｐｕｎｔｉａ  ｓｐｐ．）など
・アロエ科：キダチアロエ（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アロエベラ（Ａｌｏｅ  ｖｅｒａ）など
〔Ｃ３−Ｃ４中間植物〕
・ツルナ科：クルマバザクロソウ（Ｍｏｌｌｕｇｏ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）など
・イネ科：キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉｏｉｄｅｓ）など
なかでも、本発明の作出方法の効果として、生長促進効果の高い植物が得られる点を考慮すると、例えば、より市場性の高い植物のほうが本発明の利用価値が高く、具体的には、葉物（ホウレンソウ、キャベツなど）、花物（バラ、コチョウランなど）、茎物（ジャガイモ、レンコンなど）、根物（ゴボウ、ダイコンなど）、穀物（イネ、コムギなど）、果実物（パイナップル、ブドウなど）、観賞用植物（マツ、カエデなど）、木材（スギ、ヒノキなど）などが好ましく挙げられる。
（２）融合タンパク質
本発明の作出方法においては、高等植物のゲノム中に特定の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入するが、当該融合タンパク質は、シトクロムｃ６タンパク質に特定の長さのシグナルペプチドが付加された融合タンパク質であることが重要である。
上記融合タンパク質は、シグナルペプチドの長さが５０〜８０アミノ酸残基であることが重要である。このようにシグナルペプチドが十分に長いことにより、シトクロムｃ６タンパク質を葉緑体包膜及びチラコイド膜のいずれにも通過させることができる。シグナルペプチドの配列は、高等植物から遺伝子クローニングすることにより決定することができる。
なお上記融合タンパク質におけるシグナルペプチドは、一般に、シトクロムｃ６タンパク質のＮ末端に付加されていることが好ましい。
本発明においては、上記融合タンパク質は、例えば、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムｃ６タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質
上記（ａ）のタンパク質は、配列番号６に示すように、シトクロムｃ６タンパク質を構成する８５個のアミノ酸（配列番号２）を含む配列のＮ末端側に、シグナルペプチドを構成する７２個のアミノ酸（配列番号４）からなる配列が付加（連結）されてなる、合計１５７個のアミノ酸を含むものであるが、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質であってもよい。但し、シグナルペプチドは、上記７２個に限定されるものではない。ここで、シトクロムｃ６タンパク質の由来は特に限定されるものではなく、紅藻（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）、ラン藻、褐藻、珪藻、および緑藻などを用いることができ、紅藻（Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）由来のタンパク質であることが好ましい。Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来のシトクロムｃ６タンパク質のアミノ酸配列は公知であり（ＰＩＲ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＪＣ５８４９）、データベース検索することにより入手することができる。
上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当する７２個のアミノ酸配列（配列番号４）において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。
なお、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質と同様に高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であることが重要であるため、例えば、第５３番目〜第７２番目のアミノ酸など、上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。
上記（ｃ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの前記シトクロムｃ６タンパク質に相当する８５個のアミノ酸配列（配列番号２）において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ（光合成明反応における）電子伝達能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。
ここで、上記の「電子伝達能を有するタンパク質」とは、本発明においては、上記（ｃ）のタンパク質を構成する全アミノ酸配列から前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列が除かれたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ヘム（ヘムｃ）と結合した後において、電子伝達能を有するタンパク質を意味する。
なお、上記（ｃ）のタンパク質は、シトクロムｃ６タンパク質と同様に電子伝達能を有するタンパク質であることが重要であるため、例えば、第１４番目〜第１８番目のアミノ酸、及び第４７番目〜第６０番目のアミノ酸など、高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。
上記（ｄ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの、前記シグナルペプチドに相当する７２個のアミノ酸配列（配列番号４）において１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、さらに前記シトクロムｃ６タンパク質に相当する８５個のアミノ酸配列（配列番号２）においても１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに（光合成明反応における）電子伝達能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。
ここで、上記の「電子伝達能を有するタンパク質」とは、上記（ｃ）のタンパク質の場合と同様の意味である。
なお、上記（ｄ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質と同様に高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であることに加え、シトクロムｃ６タンパク質と同様に電子伝達能を有するタンパク質であることも重要であるため、例えば、第５３番目〜第７２番目のアミノ酸などの上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列や、第１４番目〜第１８番目のアミノ酸、及び第４７番目〜第６０番目のアミノ酸などの高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。
上記（ｃ）及び（ｄ）のタンパク質の、電子伝達能の有無及び電子伝達能を有する場合、立体構造解析および酸化還元電位の測定を行うことにより確認・測定することができる。なお、シトクロムｃ６の酸化還元電位は、およそ３５０〜３７０ｍＶ程度である。
このような配列番号６で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６）等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換又は付加等の変異型をコードする遺伝子の作製には、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
（３）遺伝子
本発明の作出方法においては、高等植物のゲノム中に導入する遺伝子は、前述した融合タンパク質をコードする遺伝子であることが重要である。
本発明においては、上記遺伝子は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子であることが好ましい。なお、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡは、いずれも前述した融合タンパク質の構造遺伝子（すなわち、シグナルペプチドをコードする遺伝子と、シトクロムｃ６又はこれと同様の電子伝達能を有するタンパク質の構造遺伝子とが連結した遺伝子）であるが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に当該融合タンパク質の構造遺伝子の発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。なお、シトクロムｃ６をコードする塩基配列は、例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に公表されており公知である（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ４０８１８）。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
上記（ｂ）のＤＮＡは、上記（ａ）のＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列を含むＤＮＡ、又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、およびサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
また、シグナルペプチド部分をコードする塩基配列（配列番号３）、シトクロムｃ６をコードする塩基配列（配列番号１）の両方又はいずれか一方の一部に変異が生じていてもよい。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を適宜参照することができる。
ハイブリダイゼーション法を実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、温度が２５〜６５℃、好ましくは塩濃度が１５〜１５０ｍＭ、温度が４５〜５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば、５０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記（ｂ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
また、上記（ｂ）のＤＮＡは、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び３０℃〜８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を１〜２回行う条件が挙げられる。
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
なお、上記（ｂ）のＤＮＡは、高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが重要であるため、翻訳後のアミノ酸配列を考慮したときに、例えば、第５３番目〜第７２番目のアミノ酸などの上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列や、第１４番目〜第１８番目のアミノ酸、及び第４７番目〜第６０番目のアミノ酸などの高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列が、前述した（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されないような、塩基配列を有するものが好ましい。
上記（ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（ａ）のＤＮＡと完全に同一のものではないが、そのうちの第１０３番目の塩基を「Ｔ（チミン）」から「Ａ（アデニン）」に置換し翻訳されるアミノ酸が「Ｓｅｒ（セリン）」から「Ｔｈｒ（トレオニン）」になるよう変異させたもの、第２１６番目の塩基を「Ｃ（シトシン）」から「Ｔ（チミン）」に置換するが翻訳されるアミノ酸には変化がないよう変異させたもの、及びこれらの塩基置換を組み合わせて変異させたもの、などが好ましく挙げられる。
本発明において、上記遺伝子は、高等植物において発現させるものであるため、アミノ酸に対応するコドンが、転写後、植物一般において通常用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであることが必要である。
（４）遺伝子の導入方法
高等植物の他の形質を変えずに、そのゲノム中に前述した融合タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）を導入して、新規な高等植物（形質転換高等植物）を作出する方法としては、限定はされないが、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法等の公知の遺伝子組換え技術を任意に採用することができる。例えば、限定はされないが、目的遺伝子を含むバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム属細菌（根頭がん種病菌）を用いる減圧浸潤法等が好適である。以下に、詳細に説明する。
（ｉ）組換えベクター
前述した融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターとしては、限定はされないが、上記バイナリーベクターとして用い得るものが好ましい。具体的には、Ｖｉｒ領域遺伝子の働きで切り出されるＴ−ＤＮＡ領域を有するベクターの、当該Ｔ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノムに組込みたい目的遺伝子を（ＧＵＳ遺伝子の代わりに）挿入して構築される組換えベクターが好ましい。上記Ｔ−ＤＮＡ領域を有するベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；カナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとし、３５Ｓプロモーターの下流にＧＵＳ遺伝子を含む）、ｐＢＩ１０１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；カナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとし、ＧＵＳ遺伝子を含む）等が好ましく挙げられる。
また、減圧浸潤法に用い得るものではないが、宿主細胞に適した公知の発現ベクターに、目的遺伝子を挿入して構築される組換えベクターも、本発明の組換えベクターに含まれる。必要に応じ、当該遺伝子の上流に転写プロモーターやＳＤ配列（宿主が原核細胞の場合）やＫｏｚａｋ配列（宿主が真核細胞の場合）を、下流にターミネーターを、ＰＣＲ等により付加しておく。上記転写プロモーター等、融合タンパク質の発現に必要な各要素は、目的遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。このような組換えベクターは、例えば、前述した融合タンパク質の大量生産等に用いることができる。
なお、これら各種組換えベクターの作製においては、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法等、公知の遺伝子組換え技術及び条件等を適宜採用して行うことができる。
（ｉｉ）組換えベクターを導入してなる形質転換体
組換えベクターを導入する宿主としては、限定はされないが、最終的に減圧浸潤法を行う場合は、バイナリーベクターを導入する宿主としては、アグロバクテリウム属細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等）を使用する。なお、アグロバクテリウム属細菌を用いる場合は、一般には、当該細菌が本来有しているＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中のがん遺伝子が、潰されているか又は取り除かれている等して、予め形質転換されている菌体（アグロバクテリウム属細菌の形質転換体）を用いる。その他、組換えベクターとして発現ベクターを導入する場合は、公知の宿主、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、ヒトやマウス等の各種動物細胞等を用いることができる。
宿主の形質転換の方法は、限定はされず、宿主と組換えベクターとの組み合わせを考慮して、公知の方法から適宜選択し実施することができる。例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法等が好ましく実施できる。
得られる形質転換体においては、実際に用いた宿主と、組み換えベクターに含まれるＥＢＮＡ１変異体遺伝子のコドン型の宿主とが、一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。
（ｉｉｉ）高等植物の形質転換、及び形質転換高等植物
高等植物のゲノム中に目的遺伝子を導入し、形質転換高等植物を作製する方法は、限定はされないが、前述した減圧浸潤法が好ましい。また、形質転換を行う植物体の状態は、成体またはカルスを用いることが好ましい。
減圧浸潤法による高等植物の形質転換方法では、具体的には、（ａ）前述した融合タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換えベクター（バイナリーベクター）を含む形質転換細菌（アグロバクテリウム属細菌の形質転換体）を高等植物の葉片に感染させ、（ｂ）カナマイシン等の抗生物質を含む選択培地で培養し、（ｃ）不定芽カルスを形成させ栽培して、形質転換高等植物を得るようにする。なお、減圧浸潤法を行うにあたり、各処理工程における手段および処理条件等は、すべて公知の範囲から適宜選択して行うようにすればよく、限定はされない。
上述のようにして得られた形質転換高等植物は、そのゲノム中に、前述した融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されている。当該遺伝子を基にして発現された融合タンパク質は、前述したシグナルペプチドを有し植物細胞中の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するものである。よって、得られた形質転換高等植物は、チラコイド内腔にシトクロムｃ６（好ましくは光合成明反応の電子伝達体としてのシトクロムｃ６）を有するものである。
得られた形質転換高等植物においては、光合成明反応の電子伝達体として、プラストシアニン（ＰＣ）のみならずシトクロムｃ６も機能すると考えられ、効果的に生長促進が達成される。形質転換高等植物の成体の大きさ（背丈、根長、葉の大きさ等）は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上（例えば約１．９倍）となる。
また、形質転換高等植物においては、生長促進効果と同様に、各細胞中の各種分子数も増加する効果も得られる。例えば、クロロフィル分子の量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上（例えば約１．６倍）となり、より一層光合成能が向上したものとなる。
さらに、得られた形質転換高等植物は、光合成効率が向上するため、その生産物であるＡＴＰ合成量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上（例えば約１．７倍）となる。同様に、ＮＡＤＰＨの合成量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上（例えば約１．７倍）となる。
さらに、得られた形質転換高等植物においては、ＡＴＰ及びＮＡＤＰＨの合成量が増加することによって、これらがエネルギー源又は還元力となって働く、光合成暗反応の効率も向上したものとなる。例えば、形質転換高等植物は、二酸化炭素（ＣＯ２）を炭水化物に変換する炭素固定能が、野生型のものに比べ、例えば、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．４倍以上となる。
さらに、得られた形質転換高等植物においては、光合成明反応・暗反応の効率が促進されたことによりタンパク質合成の効率も向上したものとなる。例えば、形質転換高等植物は、タンパク質の含量が、例えば１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上となる。
また、硫酸および硝酸代謝や各種のアミノ酸合成、脂質合成量、色素ならびに花の増加なども期待できる。
なお、得られた形質転換高等植物においては、上述した各種作用効果を少なくとも１種有していることが好ましいが、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは全て有していることである。
３．高等植物の生長促進方法、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質の合成促進方法、並びに炭素固定促進方法
前述したように、得られた形質転換高等植物においては、（ｉ）生長促進、（ｉｉ）ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質の合成促進、並びに（ｉｉｉ）炭素固定促進といった効果が認められる。よって、本発明は、高等植物の生長促進方法、高等植物のＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１つの合成促進方法、並びに高等植物の炭素固定促進方法をも含むものである。
これら方法は、具体的には、シトクロムｃ６タンパク質に５０〜８０アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を存在させることを特徴とするものである。これら方法において、融合タンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子の高等植物ゲノム中への導入方法、及び、得られる形質転換高等植物における種々の作用効果等については、前述した本発明の高等植物の作出方法における説明及び例示等が同様に適用できる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
導入用シトクロムｃ６遺伝子と植物発現用ベクターの構築
（１）Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６成熟タンパク領域遺伝子の調製
本実施例では、Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６遺伝子をクローニングすることにより入手し、ベクターへと連結しプラスミドを作製した。このプラスミドを鋳型として、今回の目的ＤＮＡであるＰ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６成熟タンパク領域遺伝子を増幅させた。その後電気泳動を行い、ゲル抽出により目的遺伝子を抽出した後に制限酵素（Ｓａｃ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉ）で消化することで、遺伝子を調製した。
反応液は、以下の組成となるように０．５ｍｌアシストＰＣＲ用チューブに調製した。
0005229453.tif 000002
Ｐｒｉｍｅｒ（１）：ＰＹＣ６−Ｃ−ｔｅｒｍ  Ｓａｃ  Ｉ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（３０ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：４３．３％）
５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号７）
Ｐｒｉｍｅｒ（２）：Ｃｙｔ−ＳＤ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（２９ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：４８．２％）
５’−ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’（配列番号８）
上記反応液にミネラルオイルを１５μｌ重層した。その後、ＰＴＣ−１００ＴＭ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて反応を行った。反応は、９４℃で４８秒、６２℃で４８秒、７２で１分２４秒の反応を１サイクルとして、これを３１サイクル行った。
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物２０μｌにゲルローディング緩衝液４μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから目的ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡに入れ、７，３００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。遠心後Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ  ＭＣ（上側のカラム部分）を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０  ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、５０μｌのＴＥに溶解した。
次に、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，１２０ｍｉｎ．インキュベートすることで制限酵素Ｓａｃ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000003
インキュベート後のサンプル溶液に、等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，１２０ｍｉｎ．インキュベートすることで制限酵素Ｐｓｔ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000004
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物２０μｌにゲルローディング緩衝液４μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。その後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから目的ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡに入れ、７，３００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。遠心後Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ  ＭＣ（上側のカラム部分）を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
結果を以下に示す。
Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６遺伝子（全長）が挿入されているプラスミドを鋳型とし、シトクロムｃ６成熟タンパク領域（ＰＹＣ６）遺伝子をＰＣＲにより増幅させた（図４）。その後ＰＣＲ産物を２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＴＢＥ）電気泳動を行ったところ、３５７ｂｐ付近に単一なバンドを確認することができた（図５）。このバンドがＰＹＣ６遺伝子であると考えられた。そこでこのＰＹＣ６遺伝子を２つの制限酵素（Ｓａｃ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉ）で消化し、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＴＢＥ）電気泳動し、ＰＹＣ６遺伝子（Ｓａｃ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉサイト保有）と思われる２６５ｂｐ付近のバンドをゲルから抽出し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行うことで、Ｓａｃ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉサイトを保有したＰＹＣ６遺伝子を得た。
（２）シトクロムｃ６への葉緑体包膜及びチラコイド膜通過ペプチド遺伝子の付加
本項では、ＢａｍＨ  ＩとＰｓｔ  Ｉによる制限酵素処理と脱リン酸化（ＢＡＰ処理）を行った葉緑体包膜およびチラコイド膜通過ペプチド遺伝子と、Ｓａｃ  ＩとＰｓｔ  Ｉによる制限酵素処理を行ったＰ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６成熟タンパク領域遺伝子をライゲーションさせた。その後クローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＳＫ＋）にライゲーションさせ、サブクローニングした後、植物導入用シトクロムｃ６（ｓｐ＋ＰＹＣ６）遺伝子の塩基配列を確認した。なお、下記のユニバーサルプライマーをＤＮＡシーケンスの際に使用した。
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｆｗ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５−ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ−３’（配列番号９）
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｒｖ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５’−ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’（配列番号１０）
（２−１）植物導入用シトクロムｃ６遺伝子の調製
以下の組成になるように反応液を調製した。
0005229453.tif 000005
調製した反応液を低温恒温槽（１６℃）で一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。次に、この溶液にアルカリフォスファターゼを加え、脱リン酸化を行った。以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，３ｈｒｓ．インキュベートすることでＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅによる脱リン酸化を行った。
0005229453.tif 000006
インキュベート後のサンプル溶液に、等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
（２−２）クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＳＫ＋の調製
以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，５ｈｒｓ．インキュベートすることで制限酵素Ｓａｃ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000007
インキュベート後のサンプル溶液に、等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，５ｈｒｓ．インキュベートすることで制限酵素ＢａｍＨ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000008
反応終了後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物２０μｌにゲルローディング緩衝液４μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＡＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。その後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから目的ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、ゲル１００μｇを１００μｌに換算し、それに対しＮａＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを３ｖｏｌ．加えよく撹拌し、５５℃で５分インキュベートしゲルを溶解させた。これにＧＬＡＳＳＭＩＬＫを１０μｌ加え、室温で１５分間激しく撹拌し、１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｓｅｃ．遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にＮＥＷ  ＷＡＳＨ  ３００μｌを加え、よく撹拌後、１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｓｅｃ．遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を３度繰り返して得られた沈殿を乾燥させ、２０μｌの滅菌水に溶解させた。その後、溶液を０．５ｍｌアシストＰＣＲ用チューブへと移し、１４，０００ｒｐｍ，４℃，３０ｓｅｃ．遠心分離を行った。得られた上清を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
（２−３）植物導入用シトクロムｃ６遺伝子のサブクローニング
シトクロムｃ６遺伝子のサブクローニングは、公知方法に従って行った（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６（４），５５７−５８０（１９８３）．；中山  広樹等バイオイラストレイテッドＩＩ遺伝子解析の基礎，秀潤社，８３−８８（１９９６）．）。
植物導入用遺伝子と、クローニングベクターを以下の組成になるように調製した。
0005229453.tif 000009
調製した反応液を低温恒温槽（１６℃）で一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、１５０μｌのコンピテントセル（ＤＨ５α）を氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液４μｌを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で３０分間放置した。放置終了後、４２℃で２０秒間ヒートショックを行った。その後氷上で３分間静置し、ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ−Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧプレートにＶｅｃｔｏｒ：Ｉｎｓｅｒｔ＝１：１、１：３それぞれ、菌体液１００μｌ、５０μｌをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
（２−４）アルカリＳＤＳ法によるプラスミド調製
アルカリＳＤＳ法は、公知手法に従って行った（Ｗｅｉｓｓ．Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，４５４３−４５５５（１９６８）；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００，２４３（１９８３））。すなわち、３ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地で２００ｒｐｍ，３７℃，１６ｈｒｓ．震盪培養した菌体液を１．５ｍｌずつ１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに分注し、６，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿（菌体）に１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（５０ｍＭ  グルコース−２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、ボルテックスでよく撹拌し、２００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを加え、静かに転倒させ撹拌した。５分間室温で放置後、さらに１５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加え、氷上で３０分間放置後、１００μｌのクロロホルムを加え、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離した。上清を新しいチューブに回収し、それに２倍量の９９．５％エタノールを加え、静かに転倒させ撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、５００μｌの７０％エタノールを加え１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、得られた沈殿を３〜５分間ＴＯＭＹ  ＭＩＣＲＯ  Ｖａｃで乾燥させ、２０μｌのＴＥに溶かした。
得られたプラスミドに目的ＤＮＡが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，１２０ｍｉｎ．インキュベートすることで制限酵素Ｓａｃ  Ｉ，ＢａｍＨ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000010
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。この結果、目的ＤＮＡが組み込まれているサンプルに関してのみ、３ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地での培養の残りの菌体液（１．５ｍｌ）から、１００μｌを５ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地に植菌し、２００ｒｐｍ，３７℃，１６ｈｒｓ．震盪培養した。
（２−５）ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔによるプラスミドの調製
５ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地で培養した菌体液を６，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿（菌体）にキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ））に含まれているＢｕｆｆｅｒ  Ｐ１を２５０μｌ加え、十分に懸濁させた。
なお、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ）にはＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ、ＱＩＡ  ｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ１、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ２、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎ３、Ｂｕｆｆｅｒ  ＰＢ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＰＥ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢが含まれている。
上記懸濁液に、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ２を２５０μｌ加え、静かに転倒させ溶液が均一になるまで撹拌した。さらにＢｕｆｆｅｒ  Ｎ３を３５０μｌ加え静かに転倒させ撹拌し、１３，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離した。ここで得られた上清をあらかじめＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅにセットしておいたＱＩＡ  ｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに移し、１３，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ．遠心分離した。Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅにたまった濾液を捨て、ＱＩＡ  ｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＰＢを加え、１３，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ．遠心分離し、再び濾液を捨てた。さらにＱＩＡ  ｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにＢｕｆｆｅｒ  ＰＥを７５０μｌ加え、１３，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ．遠心分離し濾液を捨て、再び１３，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ．遠心分離し、ＱＩＡ  ｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎのみを新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移した。ＱＩＡ  ｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎの中央に５０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢを加え、室温で１分間放置し、１３，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ．遠心分離し、この濾液をプラスミドサンプルとした。
得られたプラスミドに目的ＤＮＡが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅ  に調製し、３７℃、１２０ｍｉｎ．インキュベートすることで制限酵素Ｓａｃ  Ｉ，ＢａｍＨ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000011
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。ここで目的ＤＮＡが組み込まれており、単一性が確認されたものをシークエンスサンプルとした。
（２−６）ダイデオキシ法による塩基配列の決定
塩基配列の決定は、オートシークエンサーを用いて公知方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ＤＮＡ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０（１９８１））により決定した。塩基配列決定後は、解析ソフトであるＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いてデータの分析を行った。
（２−７）結果
２つの制限酵素（ＢａｍＨ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉ）消化と脱リン酸化（ＢＡＰ処理）を行ったｓｐ遺伝子を、２つの制限酵素（Ｓａｃ  Ｉ，Ｐｓｔ  Ｉ）消化を行ったＰＹＣ６遺伝子とライゲーションさせ、さらに再度ＢＡＰ処理を行い、フェノール抽出、エタノール沈殿により植物導入用シトクロムｃ６（ｓｐ＋ＰＹＣ６）遺伝子を作製することができた。
このｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子の塩基配列を確認するため、クローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（図６）を２つの制限酵素（ＢａｍＨ  Ｉ，Ｓａｃ  Ｉ）で消化したものにライゲーションし、サブクローニング後、ダイデオキシ法によるシークエンスを行い、ｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子の全塩基配列４７４ｂｐを決定した（図７）。
そのシークエンス結果をＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いて既知のｓｐ遺伝子とＰＹＣ６遺伝子と比較したところ、シグナルペプチド配列中の１０３番目のＴ（チミン塩基）がＡ（アデニン塩基）に変異している以外は完全に一致した。またＰｒｉｍｅｒ配列中に付加した制限酵素サイトも確認した（図７）。今回確認された塩基の変異は、コードするアミノ酸をＳｅｒからＴｈｒに変えるものであったが、ともに性質と分子量も類似しており、それによる二次構造（αヘリックスなど）の変化はなく、膜通過というシグナルペプチドとしての機能には影響がないと考えられたため、このサンプル（ｓｐ＋ＰＹＣ６）を以後の実験に用いた。
（３）植物導入用シトクロムｃ６発現ベクターの作製
本実施例では、塩基配列を確認した植物導入用シトクロムｃ６（ｓｐ＋ＰＹＣ６）遺伝子を発現ベクターｐＢＩ１２１に挿入し、植物へ導入用シトクロムｃ６発現ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）を構築した。
（３−１）植物発現用ベクターｐＢＩ１２１の調製
以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，５ｈｒｓ．インキュベートすることで制限酵素Ｓａｃ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000012
インキュベート後のサンプル溶液に、等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，５ｈｒｓ．インキュベートすることで制限酵素ＢａｍＨ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000013
反応終了後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物２０μｌにゲルローディング緩衝液４μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＡＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。その後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから目的ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、ゲル１００μｇを１００μｌに換算し、それに対しＮａＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを３ｖｏｌ．加えよく撹拌し、５５℃で５分インキュベートしゲルを溶解させた。これにＧＬＡＳＳＭＩＬＫを１０μｌ加え、室温で１５分間激しく撹拌し、１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｓｅｃ．遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にＮＥＷ  ＷＡＳＨ  ３００μｌを加え、よく撹拌後、１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｓｅｃ．遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を３度繰り返して得られた沈殿を乾燥させ、２０μｌの滅菌水に溶解させた。その後、溶液を０．５ｍｌアシストＰＣＲ用チューブへと移し、１４，０００ｒｐｍ，４℃，３０ｓｅｃ．遠心分離を行った。得られた上清を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
（３−２）植物発現用シトクロムｃ６発現ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）の調製
前記の通り作製した導入用シトクロムｃ６（ｓｐ＋ＰＹＣ６）遺伝子は、以下の組成になるように反応液を調製した。
0005229453.tif 000014
調製した反応液を低温恒温槽（１６℃）で一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。
結果を以下に示す。
塩基配列を確認したｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子（ＢａｍＨ  Ｉ，Ｓａｃ  Ｉ消化、ＢＡＰ処理済み）を、植物発現用ベクター（ｐＢＩ１２１）を２つの制限酵素（ＢａｍＨ  Ｉ，Ｓａｃ  Ｉ）で消化したものにライゲーションし、植物導入用シトクロムｃ６発現ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）を調製することができた。
【実施例２】
【０００７】
形質転換植物（シトクロムｃ６導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の作製
（１）植物感染用Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
（１−１）シトクロムｃ６発現ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）導入大腸菌の調製
本実施例では、植物導入用シトクロムｃ６遺伝子を挿入した植物発現用ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）を宿主大腸菌ＨＢ１０１に形質転換した。その後、数個のコロニーを選び３ｍｌのＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ液体培地で培養し、アルカリＳＤＳ法によるプラスミド調製を行うことでベクターの構築と宿主大腸菌ＨＢ１０１への形質転換の有無を確認した。
大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、１５０μｌのコンピテントセル（ＨＢ１０１）を氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液４μｌを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で３０分間放置した。放置終了後、４２℃で２０秒間ヒートショックを行った。その後氷上で３分間静置し、ＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎにそれぞれ菌体液１００μｌ、５０μｌをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
培養後、形質転換体（コロニー）をランダムに２０クローンピックアップし、そのコロニーを３ｍｌ  ＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地に植菌し、２００ｒｐｍ，３７℃，１６ｈｒｓ．震盪培養した。培養した菌体液を１．５ｍｌずつ１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに分注し、６，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿（菌体）に１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（前出）を加え、ボルテックスでよく撹拌し、２００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加え、静かに転倒させ撹拌した。５分間室温で放置後、さらに１５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ（前出）を加え、氷上で３０分間放置後、１００μｌのクロロホルムを加え、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離した。上清を新しい回収し、それに２倍量の９９．５％エタノールを加え、静かに転倒させ撹拌し、１５分間室温で放置した。その後、５００μｌの７０％エタノールを加え１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、得られた沈殿を３〜５分間ＴＯＭＹ  ＭＩＣＲＯ  Ｖａｃで乾燥させ、２０μｌのＴＥに溶かした。
得られたプラスミドに目的ＤＮＡが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに調製し、３７℃，１２０ｍｉｎ．インキュベートすることで制限酵素ＢａｍＨ  ＩとＳａｃ  Ｉによる消化を行った。
0005229453.tif 000015
反応終了後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＡＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
結果を以下に示す。
植物導入用シトクロムｃ６発現ベクター（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）を、宿主大腸菌ＨＢ１０１へと形質転換させた（図８）。その後、形質転換体（コロニー）をランダムに２０クローンピックアップした。その結果、２０サンプル中３クローンにｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子と思われるサイズ（４７４ｂｐ）付近に単一なバンドを確認することができた。よってこのプラスミド内にはｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子が挿入されていることが示された。このプラスミドを保有する大腸菌ＨＢ１０１を以後の実験に用いた。
（１−２）形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製と選抜
本項では、高等植物Ａ．ｔｈａｌｉａｎａへと目的遺伝子を導入するために必要な宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を調製するため、三者混合培養（トリペアレンタルメイティング）を行い、得られた形質転換体のうち、数個のコロニーを選び３ｍｌのＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ液体培地で培養し、アルカリＳＤＳ法によるプラスミド調製を行うことで宿主アグロバクテリウムへの形質転換の有無を確認した。
（１−２−１）各種菌体の培養
（ａ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４）＊ｐＡＬ４４０４保有
菌体のグリセロールストック溶液をＹＥＰ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）（３０μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、３０℃でおよそ４０ｈｒｓ．培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを５ｍｌ  ＹＥＰ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（３０μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）培地で２００ｒｐｍ，３０℃，３０ｈｒｓ．震盪培養した。
（ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）＊ｐＲＫ２０１３保有
菌体のグリセロールストック溶液をＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、３７℃で１６ｈｒｓ．培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを５ｍｌ  ＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地で２００ｒｐｍ，３７℃，１６ｈｒｓ．震盪培養した。
（ｃ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）＊ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６保有
菌体のグリセロールストック溶液をＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、３７℃で１６ｈｒｓ．培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを５ｍｌ  ＬＢ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地で２００ｒｐｍ，３７℃，１６ｈｒｓ．震盪培養した。
（１−２−２）トリペアレンタルメイティング
トリペアレンタルメイティングは、公知方法により行った（駒嶺  穆，野村  港二，「生物化学実験法  ４１」植物細胞工学入門，学会出版センター，２９８−３０２（１９９８））。すなわち、５ｍｌのＹＥＰ−Ｓｍ．液体培地あるいはＬＢ−Ｋｍ．液体培地で震盪培養した三種の菌体液（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４）＊ｐＡＬ４４０４保有、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）＊ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６保有、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）＊ｐＲＫ２０１３保有）を５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。洗浄のため培養時に使用した液体培地（ＹＥＰ培地あるいはＬＢ培地）を沈殿（菌体）に加えよく撹拌し、もう一度５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離した。遠心分離後、菌体を培養時に使用した液体培地（ＹＥＰ培地あるいはＬＢ培地）３ｍｌに溶解させた。次にそれぞれの菌体液を３０μｌずつＭｉｎ  Ａ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）に重ねるように滴下し、そのまま静置した状態で３０℃，３ｄａｙｓ培養した。培養後、最少培地であるＭｉｎ  Ａ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）に生えてきた菌体を白金耳を用いてすべてかき取り、その菌体を１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４２００μｌに溶解させた。その後、その菌体溶液を再びＭｉｎ  Ａ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ寒天培地（プレート）に白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、３０℃でおよそ３ｄａｙｓ．培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを５ｍｌ  ＹＥＰ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地で２００ｒｐｍ，３０℃，４０ｈｒｓ．震盪培養した。
（１−２−３）アルカリＳＤＳ法によるＴｉプラスミド調製
５ｍｌ  ＹＥＰ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）液体培地で２００ｒｐｍ，３０℃，４０ｈｒｓ．震盪培養した菌体液を１．５ｍｌずつ１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに分注し、５，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。１ｍｌのＳ−ｂｕｆｆｅｒを沈殿（菌体）に加え、ボルテックスでよく撹拌し、８，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。
なお、Ｓ−ｂｕｆｆｅｒは、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（グルコース（Ｍ．Ｗ．：１８０．１６））を１３．５１２ｇ秤取り、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１２．５ｍｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌ加え、超純水で５００ｍｌに定容し、オートクレーブ処理（１２１℃、１０分）を行うことにより調製した。
沈殿に再び１００μｌのＳ−ｂｕｆｆｅｒと１０ｍｇ／ｍｌリゾチームを５μｌ加え、１０分間室温で放置した。そこに２００μｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ、ＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを３０μｌ加え、静かに転倒させ撹拌した。５分間室温で放置後、さらに１５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを加え、−２０℃で１５分放置した後、１２，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
得られたプラスミドに１ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａを加え、３７℃，９０ｍｉｎ．インキュベートすることでＲＮａｓｅ処理を行った。反応終了後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＡＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
結果を以下に示す。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４）はＹＥＰ−Ｓｍ．培地で培養し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）はＬＢ−Ｋｍ．培地で培養した。その後、トリペアレンタルメイティング（三者混合培養）によりＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４）へｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６を導入し、形質転換させた。次にトリペアレンタルメイティングによりＴｉプラスミド（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）が導入された形質転換体Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓをランダムに１０クローンピックアップした。そのコロニーを３ｍｌ  ＹＥＰ−Ｋｍ．培地にて培養し、その後、アルカリＳＤＳ法によってプラスミドを調製し、これを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＴＡＥ）電気泳動した。その結果、１クローンにおいて、ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６と思われるサイズ（１３．５ｋｂｐ）にバンドを確認することができた。よって形質転換体Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにはＴｉプラスミド（ｐＢＩ  ｃｙｔ  ｃ６）が導入されていることが示された。
（２）形質転換植物（シトクロムｃ６導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の作製
（２−１）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの栽培
よく水洗いした７．５×７．５丸型ポットにバーミキュライトを九分目位まで入れた。次に、ＨＹＰＯＮｅＸ原液を２，０００倍希釈した溶液を５００ｍｌ用意し、カッターで厚さ１ｃｍほどにスライスしておいたロックウールを入れた。十分に水分を含んで湿ったロックウールをピンセットでつまみ、７．５×７．５丸ポットの上に３つずつのせた。台所用三角コーナーのメッシュをポットの口を覆える位の大きさに切り、よく水洗いし、ポットの口にかぶせて輪ゴムでとめた。このポットに、種子を１粒ずつ播種した。種子を播種した後、４℃，３ｄａｙｓ低温処理を行った。低温処理終了後、植物育成用光照射インキュベーター内に移し、２２℃・長日条件下で栽培した。
発芽後は２日に１度程度水を与え、週に１度程１，０００倍希釈したＨＹＰＯＮｅＸを液体肥料として与えた。適当に間引きを行い、およそ３週間後植物体が抽台し始めたときに摘心し、竹串（支柱）を利用して成長した植物体を支え、種子が完全に熟したら採種し、乾燥状態で保存しておいた。
（２−２）形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの植物体への感染
次に、高等植物Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（ｃｏｌ−０）に植物導入用シトクロムｃ６（ｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子）を導入するためアグロバクテリウム法の一つである減圧浸潤法により、形質転換植物を作製した（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｎ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｇ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８２（１９９８））。具体的には以下の通りである。
（２−２−１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの培養
菌体のグリセロールストック溶液をＭｉｎ  Ａ−Ｋｍ．寒天培地（プレート）（４００μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、３０℃でおよそ４０ｈｒｓ．培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを１０ｍｌ  ＹＥＰ−Ｋｍ．（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地で２００ｒｐｍ，３０℃，３０ｈｒｓ．震盪培養（前培養）し、その培養液を新たに１００ｍｌ  ＹＥＰ−Ｋｍ．（４０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）培地に全量加え、さらに２００ｒｐｍ，３０℃，３０ｈｒｓ．震盪培養（本培養）した。
（２−２−２）植物体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ｃｏｌ−０）の栽培
形質転換させる植物として用いるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（ｃｏｌ−０）の播種から種子の採種までの栽培条件は以下のとおりである。
低温処理：４℃（暗所）で３日間静置
植物育成温度：２２℃
照射光：長日条件（１００μＥｍ−２ｓ−１）
液体肥料：ＨＹＰＯＮｅＸ（１／１，０００倍希釈）
植物個体によって多少差はあるが、Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ株の場合、播種後７日（低温処理３日間を含める）で発芽し、発芽後２０日前後で植物が抽台した。その後、摘心処理し５〜６日で側枝が伸長し始め、同時に最初の花の開花・結実が始まった。採種は緑色のさやが薄茶色になり縦裂し始めたものから回収した。一つのさやからおよそ５０粒の種子が得られた。回収した種子は、播種まで乾燥させた状態で保存しておいた。
（２−２−３）植物体への感染
感染用植物体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ｃｏｌ−０）を上記（２−２−２）に記載の方法に従って栽培し、抽台を始めたころまで生育させた。その後、茎から茎葉が誘導され始めたときに摘心し、すでに開花・結実している花を切除した。なお、実験は、この植物体と上記（２−２−１）の菌体培養液の準備が同時に整うよう調整した。
まず、浸潤操作を行う実験台にキムタオル敷いておいた。
次に、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養液を浸潤用懸濁培地でおよそ２／３倍希釈し、１Ｌ容ビーカーに入れた。そのビーカーを吸引鐘内にセットし、そこへ培養懸濁液を吸引しすぎないよう直前に十分に吸水させた植物体Ａ．ｔｈａｌｉａｎａを植えたポットごとビーカーの上に逆さにして固定し、植物体を培養懸濁液に浸けた。
減圧浸潤法で用いたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養液は、ＯＤ６００＝１．２〜１．５のものをＯＤ６００＝０．８となるように浸潤用懸濁培地で約２／３倍希釈したものを使用した。また減圧浸潤時間は３０秒、１分、５分、１０分と検討した結果、５分が最も適していた。それは、減圧浸潤時間が長くなるほどその後の植物体の生育は悪くなったが、５分間の処理の場合、それほど生育の悪化は見られず、花数及び結実したさや（種子）数も１分間処理したものと大差がなかったためである。
次に、培養懸濁液に浸した植物体を吸引鐘に入れ、アスピレーターで減圧した。減圧終了後、吸引鐘から植物体を取り出し、キムタオルで余分な培養懸濁液を落とした。その植物体をプラスチックトレイに横倒しにして、端に水を滴下し、ふたをして２０℃で２〜３日放置した（その間は水を与えなかった）。その後、ポットをおこし、植物育成用光照射インキュベーター内で２２℃、長日条件で通常どおり栽培を行った。２日に１度程度水やりを行い、週に１度程１，０００倍希釈したＨＹＰＯＮｅＸを液体肥料として与えた。適当に間引きを行い、およそ３週間後植物体が抽台し始めたら摘心し、竹串（支柱）を利用して成長した植物体を支え、種子が完全に熟したときは採種し、乾燥状態で保存しておいた。
【実施例３】
【０００８】
形質転換植物におけるシトクロムｃ６遺伝子導入と発現の解析
（１）ＰＣＲ法を用いたゲノムＤＮＡ中の導入遺伝子の解析
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａよりゲノムＤＮＡを抽出し、そのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより導入遺伝子の増幅の有無をもって植物体内への導入を確認した。
（１−１）形質転換体からゲノムＤＮＡの抽出
葉２〜３枚程度の形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａをあらかじめ冷却した乳鉢の中に入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料を１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに入れ秤量した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒに終濃度０．５％ととなるように２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えた溶液を、上記秤量後の試料に１ｍｌ加えよく混ぜた。１２，５００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離後、上清を捨てた。そこへＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉに終濃度１％となるように２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加えた溶液を３００μｌ加えボルテックスでよく混ぜた。次に、１％ＮａＢＨ４を３０μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを１５０μｌ加え、数秒ボルテックスにかけた。５０℃で１０分インキュベートし、その溶液にＩＳＯＰＬＡＮＴ  ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）に含まれる１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ−Ａと１２０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ−Ｂを入れ、氷上で１０分間放置した。
１２，５００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、水相を回収した。そこへ２倍量の９９．５％エタノールを加え、直ちに８，０００ｒｐｍ，室温，１ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。さらに７０％エタノールを１ｍｌ加え８，０００ｒｐｍ，室温，１ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物をある程度まで風乾させ、５０μｌのＴＥに溶解させた。この溶液に１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを１μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ゲノムＤＮＡの抽出を確認するために、得られたゲノムＤＮＡ  ５μｌにゲルローディング緩衝液１μｌを加え、マーカーにλＨｉｎｄＩＩＩを用いて１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにて電気泳動を行った。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＡＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
電気泳動によるゲノムＤＮＡ存在の確認後、その濃度測定を行うためゲノムＤＮＡ溶液を１００倍希釈し、分光光度計でＵＶ測定した。算出された濃度をもとに１０ｎｇ／μｌとなるようにゲノムＤＮＡ溶液を調製し、今後の実験に用いた。
（１−２）ＰＣＲ
ＰＣＲは、公知方法に従って行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｎ．Ｃｏｒｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｒｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
以下の組成となるように反応液を０．５ｍｌアシストＰＣＲ用チューブに調製した。
0005229453.tif 000016
この反応液にミネラルオイルを１５μｌ重層した。その後、ＰＴＣ−１００ＴＭ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて反応を行った。
プライマーとして以下のものを用いた。
Ｐｒｉｍｅｒ（３）  ＡＴＰ−ＮＡ１  Ｂａｍ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（３１ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：５４．８％）
５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  Ｇ−３’（配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ（１）  ＰＹＣ６−Ｃ−ｔｅｒｍ  ＳａｃＩ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（３０ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：４３．３％）
５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号７）
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｆｗ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５’−ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ−３’（配列番号９）
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｒｖ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５’−ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’（配列番号１０）
反応は、（９４℃で４８秒、６４℃で４８秒、７２℃で１分２４秒）×３１サイクルの条件で行った。
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。
得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
（１−３）ＰＣＲ産物のゲル抽出
２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから、目的ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡに入れた。７，３００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。遠心後Ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｅ  ＭＣ（上側のカラム部分）を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のＴＥ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｐｈｅｎｏｌを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行った。水層を新しい１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１／２０ｖｏｌ．、９９．５％エタノールを２ｖｏｌ．加えた。よく撹拌した後、−２０℃で３０分放置した。その後１４，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に７５％エタノールを５００μｌ加え沈殿をよく洗浄した。さらに１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、２０μｌのＴＥに溶解させた。この溶液に目的のＤＮＡが単一に抽出・精製されているかを確認するため、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行った。得られたサンプル１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動には泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
（１−４）ＰＣＲ産物のサブクローニング
ＰＣＲ産物のサブクローニングは、公知手法に従って行った（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６（４），５５７−５８０（１９８３）．；中山  広樹等バイオイラストレイテッドＩＩ遺伝子解析の基礎，秀潤社，８３−８８（１９９６）．）。
ＰＣＲ生成物に以下の組成になるように調製した。
0005229453.tif 000017
調製した反応液を低温恒温槽（１６℃）で一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、１５０μｌのコンピテントセル（ＤＨ５α）を氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液４μｌを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で３０分間放置した。放置終了後、４２℃で２０秒間ヒートショックを行った。その後氷上で３分間静置し、ＬＢ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ−Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧプレートにＶｅｃｔｏｒ：Ｉｎｓｅｒｔ＝１：１、１：３それぞれ、菌体液１００μｌ、５０μｌをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
（１−５）アルカリＳＤＳ法によるプラスミド調製
本項におけるプラスミド調製は、実施例１（２−４）に記載した内容と同様にして行った。
（１−６）ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔによるプラスミドの調製
本項におけるプラスミド調製は、実施例１（２−５）に記載した内容と同様にして行った。
（１−７）ダイデオキシ法による塩基配列の決定
本項における塩基配列の決定は、実施例１（２−６）に記載の方法と同様にして行った。結果を以下に示す。
形質転換体Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの葉２〜３枚ほどから、ＩＳＯＰＬＡＮＴ  ＩＩを用いて純度の高いゲノムＤＮＡを抽出した。そのゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、植物導入用シトクロムｃ６遺伝子の導入の有無を確認するためＰＣＲにより目的遺伝子を増幅させた。その後ＰＣＲ産物を２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＴＢＥ）電気泳動を行ったところ、４７４ｂｐ付近に単一なバンドを確認した（図９）。この増幅した遺伝子の塩基配列を確認するため、ゲル抽出後、サブクローニングを行い、ダイデオキシ法によるシークエンスにより増幅した遺伝子の全塩基配列４７４ｂｐを決定した。そのシークエンス結果をＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いて既知のｓｐ遺伝子配列とＰＹＣ６遺伝子配列と比較したところ、導入遺伝子同様シグナルペプチド遺伝子配列中の１０３番目のＴ（チミン塩基）がＡ（アデニン塩基）に変異している以外は完全に一致した。以上の結果より植物体（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）内にｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子が導入されたことが示された。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた全ＲＮＡ中の発現遺伝子の解析
本項では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａより全ＲＮＡを抽出し、その全ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲにより導入遺伝子の増幅の有無をもって植物体内での遺伝子の発現を確認した。
Ｐｒｉｍｅｒ（３）  ＡＴＰ−ＮＡ１  Ｂａｍ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（３１ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：５４．８％）
５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  Ｇ−３’（配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ（１）  ＰＹＣ６−Ｃ−ｔｅｒｍ  ＳａｃＩ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（３０ｍｅｒ，ＧＣ−Ｃｏｎｔ．：４３．３％）
５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号７）
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｆｗ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５’−ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ−３’（配列番号９）
ユニバーサルＦＩＴＣ化Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ１３  Ｒｖ  ｐｒｉｍｅｒ）（２ｐｍｏｌ／μｌ）
５’−ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’（配列番号１０）
（２−１）形質転換体から全ＲＮＡの抽出
形質転換体から全ＲＮＡの抽出は、市販のキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））を用い、説明書に従って行った。
（２−２）ＰＣＲ
ＰＣＲは、公知手法に従って行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｎ．Ｃｏｒｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｒｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
以下の組成となるように反応液を０．５ｍｌアシストＰＣＲ用チューブに調製した。
0005229453.tif 000018
この反応液にミネラルオイルを１５μｌ重層した。その後、ＰＴＣ−１００ＴＭ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて反応を行った。
反応終了後、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたＰＣＲ生成物１０μｌにゲルローディング緩衝液２μｌを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液（１×ＴＢＥ）を用い、１００Ｖで３０分間行った。泳動終了後、０．１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで７分間染色を行い、１０分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをＵＶトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイドカメラで写真に記録した。
（２−３）ＰＣＲ産物のゲル抽出
本項におけるＰＣＲ産物のゲル抽出は、実施例３（１−３）と同様にして行った。
（２−４）ＰＣＲ産物のサブクローニング
本項におけるＰＣＲ産物のサブクローニングは、実施例３（１−４）に記載の方法と同様にして行った。
（２−５）アルカリＳＤＳ法によるプラスミド調製
本項におけるアルカリＳＤＳ法は、公知手法に従って、実施例１（２−４）に記載の方法と同様に行った（Ｗｅｉｓｓ．Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，４５４３−４５５５（１９６８）；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００，２４３（１９８３））。
（２−６）ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔによるプラスミドの調製
本項におけるＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔによるプラスミドの調製は、実施例１（２−５）に記載の方法と同様に行った。
（２−７）ダイデオキシ法による塩基配列の決定
本項における塩基配列の決定は、実施例１（２−６）に記載の方法と同様にして行った（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ＤＮＡ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０（１９８１））。
（２−８）結果
遺伝子の導入が確認された形質転換植物（ＰＹＣ６導入植物）の葉２〜３枚ほどから、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて発現している全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡ溶液を鋳型とし、ｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子の発現の有無を確認するためＲＴ−ＰＣＲにより目的遺伝子を増幅させた。その後ＰＣＲ産物を２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＴＢＥ）電気泳動を行ったところ４７４ｂｐ付近に単一なバンドを確認した（図９）。この増幅した遺伝子の塩基配列を確認するため、ゲル抽出後、サブクローニングを行い、ダイデオキシ法によるシークエンスにより増幅した遺伝子の全塩基配列４７４ｂｐを決定した。そのシークエンス結果をＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いて既知のｓｐ遺伝子配列とＰＹＣ６遺伝子配列と比較したところ、導入遺伝子同様シグナルペプチド遺伝子配列中の１０３番目のＴ（チミン塩基）がＡ（アデニン塩基）に変異している以外は完全に一致した。以上の結果より植物体（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）内にｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子が発現していると考えられた。
（３）ウエスタンブロッティング法を用いた発現タンパク質の解析
本項では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａより葉緑体を抽出し、そこから得られた葉緑体タンパク質画分に導入したシトクロムｃ６が発現していることを確認した。
（３−１）葉緑体画分の調製
葉緑体画分は公知手法に従って調製した（中村  研三等（監修），植物のタンパク質実験プロトコール，細胞工学シリーズ第９巻，秀潤社，１１４−１１７（１９９８））。
５〜６ｇ程度の形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａをあらかじめ冷却した乳鉢の中に入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に氷冷しておいた破砕Ｂｕｆｆｅｒを２０ｍｌ加えよく撹拌し、４重にしたミラクロスで濾過した。得られた濾液を１５ｍｌ容コーニングチューブに移し、７，０００ｒｐｍ，４℃，１５ｓｅｃ．遠心分離し上清を丁寧に取り除いた。沈殿にその５ｖｏｌ．の破砕Ｂｕｆｆｅｒを加え均一になるまで混ぜ、あらかじめ１０ｍｌの３０％パーコールをいれておいたガラス遠沈管に静かに重層し、２，０００ｒｐｍ，４℃，３ｍｉｎ．遠心分離した。終了後上清のパーコールを取り除き、沈殿を５ｍｌの破砕Ｂｕｆｆｅｒで均一になるまで混ぜ、再び２，０００ｒｐｍ，４℃，３ｍｉｎ．遠心分離した（この作業を２度繰り返す）。最後に沈殿を１ｍｌの破砕Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、その溶液を葉緑体画分とした。
（３−２）ウエスタンブロッティング
上記（３−１）で得られた葉緑体画分溶液にＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｐ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを１ｍｌ加え、１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、得られた上清を葉緑体タンパク抽出溶液とした。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに１μｇ／μｌ分子量標準マーカー５μｌと超純水を５μｌ、葉緑体タンパク抽出溶液を加え、それぞれのチューブに等量の試料用緩衝液を加え、よく撹拌した。調製したチューブを４０℃、３０ｍｉｎ．湯浴中でインキュベートし、泳動用試料とした。
泳動槽に陽極および陰極電極液、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをセットし、ウェルに泳動用試料２０μｌを慎重にアプライし、３０Ｖの定電圧で泳動用試料を分離ゲルの上端まで泳動し、１００Ｖの定電圧でマーカーがゲルの下端から約５ｍｍ程度まで泳動した。泳動中にあらかじめ、濾紙をブロッティング緩衝液Ａ、Ｂ、Ｃに各２枚ずつ浸し、ＰＶＤＦ膜は少量のメタノールに５ｓｅｃ．浸して、ブロッティングＣ液に浸した。泳動が終了したら、ゲルをガラス板から外し、ブロッティングＣ液に５ｍｉｎ．ほど浸した。セミドライブロッティング装置に下からＡの濾紙２枚、Ｂの濾紙２枚、ＰＶＤＦ膜、ゲル、Ｃの濾紙２枚の順で重ね、セット後に６０ｍＡの定電流で９０ｍｉｎ．転写した。ブロッティング終了後、直ちに以下に示す順に操作し、抗原抗体反応の操作を行った。
（ｉ）      ＰＶＤＦ膜をＴＢＳに浸し５分間震盪する（２回）。
（ｉｉ）    ５％ＢＳＡ  ｉｎ  ＴＢＳに浸し１時間から一晩震盪する。
（ｉｉｉ）  ＴＢＳに浸し５分間震盪する。
（ｉｖ）    ｓｔ−ａｎｔｉｂｏｄｙに浸し２時間震盪する。
（ｖ）      ＴＴＢＳに浸し５分間震盪する（２回）。
（ｖｉ）    ２ｎｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙに浸し１時間３０分震盪する。
（ｖｉｉ）  ＴＴＢＳに浸し５分間震盪する（２回）。
（ｖｉｉｉ）ＴＢＳに浸し５分間震盪する（２回）。
（ｉｘ）    ２ｎｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔに
浸し２０分震盪する（遮光）。
（ｘ）      超純水で洗浄する。
（３−３）結果
ＰＹＣ６導入植物よりパーコールの密度勾配遠心により葉緑体画分を分離し、得られた葉緑体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動的に分子量でふるい分けた。次に、分離した全てのタンパク質をＰＶＤＦ膜へと転写した後、Ｐ．ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ由来シトクロムｃ６を認識する一次抗体（ウサギ抗体）と抗ウサギ抗体（二次抗体）を用いて抗原抗体反応を行ったところ、ＰＹＣ６導入植物のみに抗原抗体反応を検出することができた（図１０）。以上の結果から、ＰＹＣ６導入植物において導入したＰＹＣ６は葉緑体中で発現していることが明らかとなった。
（４）発現したシトクロムｃ６タンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析
本項では、上記（３）で抗原抗体反応を示したＰＹＣ６タンパクのＮ末端アミノ酸配列を解析し、シグナルペプチド切断の有無を確認した。
上記（３−１）で得られた葉緑体画分溶液にＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｐ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを１ｍｌ加え、１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、得られた上清を葉緑体タンパク抽出溶液とした。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに１μｇ／μｌ分子量標準マーカー５μｌと超純水を５μｌ、葉緑体タンパク抽出溶液を加え、それぞれのチューブに等量の試料用緩衝液を加え、よく撹拌した。調製したチューブを４０℃、３０ｍｉｎ．湯浴中でインキュベートし、泳動用試料とした。
泳動槽に陽極および陰極電極液、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをセットし、ウェルに泳動用試料２０μｌを慎重にアプライし、３０Ｖの定電圧で泳動用試料を分離ゲルの上端まで泳動し、１００Ｖの定電圧でマーカーがゲルの下端から約５ｍｍ程度まで泳動した。泳動中にあらかじめ、濾紙をブロッティング緩衝液Ａ、Ｂ、Ｃに各２枚ずつ浸し、ＰＶＤＦ膜は少量のメタノールに５ｓｅｃ．浸して、ブロッティングＣ液に浸した。泳動が終了したら、ゲルをガラス板から外し、ブロッティングＣ液に５ｍｉｎ．ほど浸した。セミドライブロッティング装置に下からＡの濾紙２枚、Ｂの濾紙２枚、ＰＶＤＦ膜、ゲル、Ｃの濾紙２枚の順で重ね、セット後に６０ｍＡの定電流で９０ｍｉｎ．転写した。ブロッティング終了後、ＣＢＢ染色、脱色操作を行い、目的タンパク質部分を１ｍｍ  ｘ  ５ｍｍの大きさに切り１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに移した。これをシーケンスサンプルとしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ４９２型でアミノ酸配列の解析を行った。
形質転換植物より得られたＰＹＣ６抗体と抗原抗体反応を示す分子量およそ９．１ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列をエドマン法により解析した結果、その配列はＮ末端１残基目から順にＡＤＬＤＮＧＥＫＶＦ（配列番号１２）であった（下記表を参照）。
0005229453.tif 000019
これはＰＹＣ６の成熟タンパク領域のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致しており、植物体内でシグナルペプチドの切断が行われ、正確に葉緑体チラコイド膜を通過しルーメン側で発現していることが明らかになった。すなわち、得られた形質転換体中のＰＹＣ６タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の解析結果より、葉緑体輸送シグナルが切断された成熟領域アミノ酸配列と一致したことから、ｓｐ＋ＰＹＣ６遺伝子は転写・翻訳後葉緑体へと輸送されていることが確認できた。
【実施例４】
【０００９】
形質転換植物の生育測定と表現型の観察
（１）生育観察（背丈、根長、葉の大きさ）
本項では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの播種後の生育を観察した。
形質転換体を播種した後、植物体の「背丈」、「根長」及び「葉の大きさ」を１０日おきに観察測定した。植物試料は野生株と形質転換体共に２０個体行い、その平均を算出し、統計処理により有意差を求めた。
ＰＹＣ６導入植物の生育（表現型）の観察を行った結果、ＰＹＣ６導入植物の背丈は、最大で１．９倍（播種後４０日）野生型（ＷＴ）に比べて大きくなり、約６０日目で１．３倍増大していた（図１１）。根長は、最大で１．３５倍（播種後４０日）ＷＴに比べ大きくなり、約６０日目で１．１７倍増大していた（図１２）。葉の大きさは、最大で１．９倍（播種後４０日）の差が見られ、約６０日目で１．３倍増大していた（図１３）。これらＰＹＣ６導入植物にみられた現象は、植物体内でのＰＹＣ６の発現により何らかの形で植物の生育に非常に重要な光合成反応が活性化されたためと考えられ、その影響により植物体の生育速度が上昇したと思われた。
（２）総クロロフィル量の測定
本項では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａより全クロロフィルをアセトンにより抽出し、定量した。
形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの葉をリーフパンチで採取し、秤量した。あらかじめ冷却した乳鉢の中に試料を入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に８０％アセトンを加え４ｍｌに定容した。その溶液の６６３ｎｍと６４５ｎｍの吸光度を分光光度計ＵＶ−ＶＩＳＩＢＬＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲで測定した。
得られた６６３ｎｍと６４５ｎｍの吸光値を以下に示した式に代入し、クロロフィル量を算出した。
総クロロフィル量（μｇ／ｍｌ）
＝８．０２×ＡＢＳ（６６３）＋２０．２１×ＡＢＳ（６４５）
ＰＹＣ６導入植物中のクロロフィル量を測定した結果、播種後４０日から７０日の間においてはＷＴよりも１．１〜１．２倍増大していた（図１４）。これは、ＰＹＣ６の導入により明反応が活性化され、それにより増大した明反応最終産物であるエネルギー物質（ＡＴＰ）がクロロフィルの合成に利用された影響ではないかと考えられた。
【実施例５】
【００１０】
形質転換植物の光合成活性測定
（１）方法及び結果
光合成活性の指標として、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ）含量、ＮＡＤＰＨ量、二酸化炭素同化能力、デンプン量、及びタンパク質量を、それぞれ、以下に示す方法で測定した。
（１−１）総ＡＴＰ含量の測定
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａより全ＡＴＰを抽出し、ルシフェリン・ルシフェラーゼ法を用いて定量した。
形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの葉を予め秤量した。秤量後、冷却した乳鉢の中に試料を入れ、素早く液体窒素を加えて、植物体がパウダー状になるまで乳棒でホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に０．２５Ｍ過塩素酸を２ｍｌ加え、その溶液を１５ｍｌ容コーニングチューブに回収した。１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ．遠心分離し、得られた上清を別の１５ｍｌ容コーニングチューブに移し、１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した。調製後、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で５ｍｌに定容し、これをＡＴＰ抽出液とした。
ＡＴＰ抽出液１００μｌを１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｔｕｂｅに準備し、ＥＮＬＩＴＥＮ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを２０μｌ添加してから９０ｓｅｃ．後ルミノメーター（ＧＥＮＥ  ＬＩＧＨＴ５５）で１０ｓｅｃ．反応液の発光強度を積算し、得られたＲＬＵ値から溶液のＡＴＰ濃度を算出し、そこから植物重量当たりのＡＴＰ量を換算した。
その結果、ＰＹＣ６導入植物の総ＡＴＰ量は、最大で１．９３倍（播種後６０日）増大していた（図１５）。これは、ＰＹＣ６導入植物において機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たな電子伝達体として紅藻ｃｙｔ  ｃ６（ＰＹＣ６）が機能したことにより、明反応の電子伝達が活性化され、その最終生成物であるＡＴＰ量が増大したものと考えられた。
（１−２）総ＮＡＤＰＨ含量の測定
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａより全ＮＡＤＰＨを抽出し、定量した。
形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａを予め秤量した。その後、７０℃程度のホットバスで温めた０．１Ｎ  ＮａＯＨを入れ、ポリトロンホモジェナイザーを用いて破砕した。その後、アイスバスに移し、約２ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌを加え、ｐＨ試験紙でｐＨ７．５に調整した。次に０．１ｍｌのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、よく撹拌し、メスシリンダーに移し、液量を測定する。測定後、１５ｍｌ容コーニングチューブに移し、１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上清を１５ｍｌ容コーニングチューブに回収し、−８０℃で一晩冷却し、溶解後、１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、定量に用いた。
ＮＡＤＰＨ抽出液１００．０μｌ、０．１Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７．４）３４６．０μｌ、０．２Ｍニコチンアミド２００．０μｌ、３．２ｍｇ／ｍｌフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）８２．０μｌ、５ｍｇ／ｍｌチアゾールブルー６７．０μｌ、グルコース−６−リン酸２ナトリウム水和物２００μｌを混ぜ、分光光度計Ｕ３３１０にセットした。を用いて５７０ｎｍ、２５℃で測定する。Ｕ３３１０に温度制御ユニットを取り付け、２５℃にセットする。その後、５７０ｎｍにおける吸光度の変化を３０秒おきに２分間測定し、得られた吸光値の差からＮＡＤＰＨ量を算出し、そこから植物重量あたりのＮＡＤＰＨ量を算出した。
その結果、ＰＹＣ６導入植物の総ＮＡＤＰＨ量は播種後４０〜７０日で１．２〜１．４倍増大していた（図１６）。これは、ＰＹＣ６導入の高等植物への導入によって、野生型よりも多く電子が伝達され、その最終生成物であるＮＡＤＰＨ量が増大したものと考えられた。
（１−３）二酸化炭素同化能力の測定
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの葉を用いて二酸化炭素の同化能力を測定した。
二酸化炭素の同化能力は、ＣＯ２ガス分析機ＣＩＲＡＳ−１（小糸工業製）を用いて行った。また、二酸化炭素の供給量は３５０ｐｐｍに設定し、飽和光下で測定した。
その結果、ＰＹＣ６導入植物の二酸化炭素の同化能力は最大で２．２倍増大していた（播種後５０日）（図１７）。これは、ＰＹＣ６導入の高等植物への導入によって、ＡＴＰやＮＡＤＰＨ量が増大したことにより、そのエネルギーを利用する暗反応（カルビン・ベンソンサイクル）が活性化され、二酸化炭素の同化能力が増大したものと考えられた。
（１−４）デンプン量の測定
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａよりデンプンを抽出し、定量した。
植物葉を採取後、乾燥させる（７０度、２日）。約５ｍｇを量り取り乳鉢に入れ、３ｍｌの３２％過塩素酸を加えて、乳棒でよく破砕する。その後、全て試験管に移し、２０℃で２０分静置した。次に、６．０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａ  ｇｒａｓｓ  ｆｉｂｒｅ  ｄｉｓｋで濾過し、濾液に５ｍｌのヨウ素溶液を加え、よく混ぜ、約４℃で３０分間静置する。その後、１．５ｃｍのＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａ  ｇｒａｓｓ  ｆｉｂｒｅ  ｄｉｓｃで濾過し、フィルターを乾燥させる。
乾燥したフィルターを試験管に入れ、４ｍｌの０．７５Ｍ硫酸を加え、沸騰湯浴中で３０分間インキュベートする。その後、上清を回収し、フェノール硫酸法により発色させ、分光光度計を用いて４８５ｎｍの吸収を測定した。
その結果、ＰＹＣ６導入植物のデンプン量は播種後４０〜７０日で１．１５〜１．２５倍増大していた（図１８）。これは、ＰＹＣ６導入の高等植物への導入によって、ＣＯ２の同化能が増大し、それに伴いデンプンの合成も促進されたと考えられた。
（１−５）タンパク質量の測定
本実施例では、形質転換体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａよりタンパク質を抽出し、Ｌｏｗｒｙ法を用いて定量した。
植物体の重量を測定し、記録する。乳鉢に適量の植物体を入れ、液体窒素下、乳棒で充分に破砕する。常温まで戻した後、植物体１ｇあたり２ｍｌのＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｐ（Ｓｉｇｍａ製）を入れ、乳棒でよく磨砕し、試験管に移す。１５分室温で転倒混和後、遠心分離する。この上清を抽出タンパク質とする。
次に、Ｌｏｗｒｙ  Ａ液：０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に２％になるように炭酸ナトリウムを加えたもの、Ｌｏｗｒｙ  Ｂ液：０．５％硫酸銅五水和物と１％クエン酸ナトリウムになるように調製したもの、Ｌｏｗｒｙ  Ｃ液：１Ｎフェノール溶液、Ｌｏｗｒｙ  Ｄ液：Ｌｏｗｒｙ  Ａ液＋Ｌｏｗｒｙ  Ｂ液を作製した。その後、抽出したタンパク質溶液、０．１ｍｌにＬｏｗｒｙ  Ｄ液１．０ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、３０℃、１５ｍｉｎインキュベートした。次にＬｏｗｒｙ  Ｃ液０．１ｍｌを加えて、速やかにボルテックスミキサーで撹拌した後、３０℃、３０ｍｉｎインキュベートし、７７０ｎｍの吸光値を測定した。
その結果、その結果、ＰＹＣ６導入植物のタンパク質量は、最大１．３倍（播種後５０日）増大していた（図１９）。これは、ＰＹＣ６導入の高等植物への導入によって、増産されたＡＴＰやＮＡＤＰＨがタンパク質の合成を活性化したのではないかと考えられた。
（２）考察
本発明で得られた知見として、ＰＹＣ６導入植物はＷＴと比較して成長速度が上昇していた。これはＰＹＣ６導入植物中のＡＴＰ及びＮＡＤＰＨが増大していたことから、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たに導入した電子伝達体である紅藻ｃｙｔ  ｃ６が機能したことにより、明反応の電子伝達が２回路となったためにその最終生成物であるＡＴＰ及びＮＡＤＰＨ量が増大し、さらに植物全体の生育が活性化される結果となったと推測された。これまで陸上植物への暗反応（カルビン・ベンソンサイクル）の関連酵素の補強による成分量の増進についての研究は行われているが、本発明のように明反応を活性化させた例はない。
また、これまでｃｙｔ  ｃ６を機能させることを目的として植物へと導入した例はなく、本発明の内容は今後他種の植物にも十分応用可能であり、有用な植物の生長促進法や植物の生産技術（果実物、葉物、生花など）などの基盤となる汎用性の高い発明であるといえる。さらに、植物体内で増産されたＡＴＰ及びＮＡＤＰＨを利用することで他の物質代謝も活性化され、汚染物質（ＣＯ２など）の除去法の分野にも極めて有効と考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明によれば、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムｃ６を有する新規な高等植物の作出方法を提供することができ、ひいては、高等植物の生長促進方法、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、デンプン及びタンパク質の合成促進方法及び炭素固定促進方法を提供することができる。
また、葉緑体のチラコイド内腔にまで輸送され得るシグナルペプチド付加シトクロムｃ６タンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、及び当該遺伝子が植物ゲノム中に導入されている形質転換高等植物を提供することもできる。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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