(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）DNA中のピペリジン脆弱性部位をピペリジン処理によって3'リン酸末端に変換すること、
（2）DNA中のピペリジン脆弱性部位に由来する3'リン酸末端、およびもともと損傷DNA中に存在するリン酸を有する鎖切断部3'側末端のすべてを、ホスファターゼにより処理すること、
（3）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、
（4）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、
（5）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量、リン酸を有する鎖切断部3'側末端の量、そしてピペリジン脆弱性部位の量との合計量として定量すること、そして
（6）以下の工程（a）〜（c）：
（a）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端を、ホスホジエステラーゼにより認識すること、
（b）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出すこと、
（c）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量として定量すること、
を含む、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法、
により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量と、
以下の工程（i）〜（v）：
（i）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有する鎖切断部3'側末端を、ホスファターゼにより処理すること、
（ii）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、
（iii）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、
（iv）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量として定量すること、そして
（v）上記工程（a）〜（c）を含む損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を、上記（iv）で得られた合計量から差し引くこと、
を含む、損傷DNA中のリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法、
により定量したリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量を、上記（5）で得られた合計量から差し引くこと、
を含む、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量化する方法。
【請求項２】
ホスファターゼが、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ホスホジエステラーゼが、蛇毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
同一のDNAサンプルを使用して、
以下の工程（a）〜（c）：
（a）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端を、ホスホジエステラーゼにより認識すること、
（b）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出すこと、
（c）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量として定量すること、
を含む、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法、
により、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量すること、
以下の工程（i）〜（v）：
（i）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有する鎖切断部3'側末端を、ホスファターゼにより処理すること、
（ii）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、
（iii）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、
（iv）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量として定量すること、そして
（v）請求項1の方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を、上記（iv）で得られた合計量から差し引くこと、
を含む、損傷DNA中のリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法、
により、損傷DNA中のリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量を定量すること、そして
請求項1に記載の方法により、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量すること、
を含む、DNAサンプル中の鎖切断部位特徴を明らかにする方法。
【請求項５】
ホスホジエステラーゼが、蛇毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ホスファターゼが、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）である、請求項4または5に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホジエステラーゼを用いたDNA損傷スペクトルを分析する方法に関する。より具体的には、種々のDNA損傷部位を、前処理の後、ホスホジエステラーゼを用いて切断部3’末端のリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出すことにより、DNA損傷スペクトルを分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA損傷は、細胞死、変異、および発ガンの主要な原因であることが知られている。特に、糖-リン酸バックボーンに沿った鎖切断が完全には修復されない場合、それらは細胞恒常性を混乱させる可能性がある。以前に、電離放射線により誘導されたDNAの一本鎖切断または二本鎖切断の収率を、アガロース電気泳動を使用して計算し、そして幅広く報告した（非特許文献1）。しかしながら、この方法は、二本鎖損傷部位でのオーバーハングの化学的構造またはサイズなど、鎖切断末端の特徴については何ら追加の情報を生み出さない。実際、高線量エネルギー転移（linear energy transfer；LET）α粒子により生成された二本鎖損傷は、低LET 137Cs-γ-線により生成された損傷と比較して、生細胞中に再加入されにくい（非特許文献2、非特許文献3）。
【０００３】
過去数十年間において、化学物質または電離放射線により誘導され、そして糖成分からの水素引抜きにより開始されたいくつかの鎖切断末端が、高-性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー分光測定、およびポリアクリルアミド電気泳動を含め、様々な技術を使用して特定された（非特許文献4）。
【０００４】
DNAオリゴマーを使用して行われたこれらの研究は、（i）糖成分からの水素引抜きが新規に生成したカルボニル基のために様々なアルカリ脆弱性部位を生成すること、（ii）糖ラジカルを介して生じる鎖切断は、しばしば、遊離の核酸塩基の放出により通常は達成されること、そして（iii）鎖切断に関連した糖残基が、3'-リン酸末端にほぼすべて位置すること（たとえば、3'-ホスホグリコレートおよび3'-ホスホグリコールアルデヒド）、ことを示した。
【０００５】
糖におけるC-H水素原子は、水分子の放射線分解およびFenton-様反応により生成されるヒドロキシル基により引き抜くことができるだけではなく、いくつかのエンジイン抗生物質および抗ガン剤（それぞれ、たとえば、ネオカルジノスタチン（neocarzinostatin）およびブレオマイシンなど）により引き抜くこともできる。したがって、中性糖炭素基由来の鎖切断末端が、幅広く研究された。
【０００６】
しかしながら、電離放射線のDNAに対する作用を考慮すると、“直接型効果（direct-type effects）”の可能性が生細胞においては非常に高いため、光子およびイオン粒子からの直接的なエネルギー転移およびヒドロキシル基による反応を考慮に入れなければならない（非特許文献2、非特許文献3）。
【０００７】
しかしながら、これまでは、DNA中のほぼすべての占有された電子がこれらの作用により切り出されそしてイオン化され得ることを部分的な理由として、直接型効果により生じた切断は、十分に評価されなかった。言い換えれば、直接型効果は、その他の薬剤により誘導されないイオン化放射線-特異的現象を引き起こす。しかしながら、上述したように、糖の中性ラジカルを、C-H+ラジカルカチオンを介して直接型効果により生成することができる（非特許文献5、非特許文献6）。
【０００８】
直接型効果により引き起こされる鎖切断末端についての化学的情報を得るためには、細胞中の実際の鎖切断は、高分子量のDNAにおいて生じるが、数十塩基対の長さを有する人工的オリゴヌクレオチドを、高解像度解析することが必要とされる（非特許文献7、非特許文献8）。さらに、32P-末端-標識ポリデオキシヌクレオチドは、放射線照射サンプルとして必要とされる（非特許文献9）。
【０００９】
これまで、損傷DNAを検出、検討するために、いくつかの方法が開発されてきた。たとえば、損傷DNA中の塩基損傷の一つとして知られる8オキソグアニン（8オキソG）を定量する方法、アルデヒド反応性プローブ（ARP）を用いて脱塩基部位（AP部位）を定量する方法、そして閉環型プラスミドDNAを用いて一本鎖切断（ssb）および二本鎖切断（dsb）を定量する方法などである。
【００１０】
8オキソグアニン（8オキソG）を定量する方法は、抗8オキソG抗体による8オキソGの認識を利用した方法であり、DNA中の8オキソG量を定量することができるものである（非特許文献10）。しかしながら、その選択制がさほど高くないという問題点を有し、また人食い的結合のためにバックグラウンド値がかなり高いという問題点も内包する。また、放射線によって生じるDNA損傷の種類には、8オキソG以外の損傷にも、30種類以上のDNA損傷が知られている。
【００１１】
アルデヒド反応性プローブ（ARP）を用いて脱塩基部位（AP部位）を定量する方法し、アルデヒド反応性の-ONH2基を有するビオチンを用いて、AP部位をビオチン標識し、このビオチンをアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ABC）免疫染色法システムを用いて検出する方法である（非特許文献11）。この方法では、AP部位を高感度で検出することが可能である。しかしながら、鎖切断末端部位の一形態である3'ホスホグリコアルデヒドなどの存在が知られているように、放射線で生じるアルデヒド部位がAP部位に限定される訳ではないため、この方法では、AP部位以外のアルデヒド部位もまた、同時に検出されてしまうという問題点を有する。さらに、ARPが、チミンの酸化損傷の一つである5-ホルミルウラシルと反応することも知られている。
【００１２】
また、閉環型プラスミドDNAを用いて一本鎖切断（ssb）および二本鎖切断（dsb）を定量する方法は、DNA上の一本鎖切断（ssb）および二本鎖切断（dsb）の収率を好感度で測定できる方法である（非特許文献12）。
【００１３】
しかしながら、これらいずれの方法でも、鎖切断末端の構造の違い、塩基損傷の種類や量に関する情報を得ることができず、ぞれぞれの方法のみではDNA損傷の特徴と線質とを関係づけることができないという欠点を有していた。
【非特許文献１】C. Leloup, et al.,  Int. J. Radiat. Biol. 81 (2005) 41-54.
【非特許文献２】T.J. Jenner, et al., Int. J. Radiat. Biol. 64 (1993) 265-273.
【非特許文献３】C.M. deLala, et al., Radiat. Res. 144 (1995) 43-49.
【非特許文献４】W.K. Pogozelski, and T.D. Tullius, Chem. Rev. 98 (1998) 1089-1107.
【非特許文献５】K. Fujii, et al., Radiat. Res. 161 (2004) 435-441.
【非特許文献６】S.G. Swarts, et al., Radiat. Res. 145 (1996) 304-314.
【非特許文献７】M.G. Debije, et al., J. Am. Chem. Soc. 123(2001)2917-2918.
【非特許文献８】Y. Razskazovskiy, et al., Radiat. Res. 160 (2003) 334-339.
【非特許文献９】W.D. Henner, et al., J. Biol. Chem. 257 (1982) 11750-11754.
【非特許文献１０】Ohno, M., et al., Genome Res., 16 (2006) 567-575
【非特許文献１１】Ide, H., et al., Biochemistry, 32 (1993) 8276-8283
【非特許文献１２】Hunniford, C.A., et al., Pys. Med. Biol., 52 (2007) 3729-3740
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、DNA損傷の特徴と線質との関係について、総合的に明らかにすることを目的とする。より具体的には、本発明は、電離放射線等によって生じるDNA鎖切断部の3'側末端のリン酸残基量、全体の鎖切断部の3'末端の量、および損傷塩基の量を、定量的に見積もることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明において、本発明者は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するホスホジエステラーゼにより、リン酸化2'-デオキシヌクレオチド（pdN）が鎖切断末端から生成される速度を明らかにすることにより、DNA鎖切断部の3'側末端のリン酸残基量、全体の鎖切断部の3'末端の量、および損傷塩基の量を、定量的に見積もることができ、その結果として上記課題を解決することができることを示した。
【００１６】
具体的には、本発明は、その第一の態様において、（a）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端を、ホスホジエステラーゼにより認識すること、（b）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（c）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量として定量すること、を含む、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、その第二の態様において、（i）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有する鎖切断部3'側末端を、ホスファターゼにより処理すること、（ii）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、（iii）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（iv）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量として定量すること、そして（v）第一の態様の方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を、上記（iv）で得られた合計量から差し引くこと、を含む、損傷DNA中の鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法もまた、提供する。
【００１８】
本発明は、その第三の態様において、（1）DNA中の塩基損傷と脱塩基部位（AP部位）などのピペリジン脆弱性部位をピペリジン処理によって3'リン酸末端に変換すること、（2）DNA中のピペリジン脆弱性部位に由来する3'リン酸末端、およびもともと損傷DNA中に存在するリン酸を有する鎖切断部3'側末端のすべてを、ホスファターゼにより処理すること、（3）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、（4）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（5）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量、リン酸を有する鎖切断部3'側末端の量、そしてピペリジン脆弱性部位の量との合計量として定量すること、そして（6）第二の態様の方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量を、上記（5）で得られた合計量から差し引くこと、を含む、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量化する方法もまた、提供する。
【００１９】
本発明は、その第四の態様において、同一のDNAサンプルを使用して、上述した第一の態様で定量された損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量、第二の態様で定量された損傷DNA中のリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量、および第三の態様において検出された損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量化ことにより、あるDNAサンプル中のすべての鎖切断部位の構造的特徴、塩基損傷の種類や量などの特徴を明らかにすることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法は、天然DNA中に誘導された鎖切断末端および塩基損傷部位の特徴を調べるためのモデルシステムとして機能する。すなわち、損傷DNA中のホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、ホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、およびピペリジン脆弱性部位の量をそれぞれ定量化することにより、あるDNAサンプル中のすべての鎖切断部位の構造的特徴、塩基損傷の種類や量などの特徴を明らかにすることができる。このような解析において様々な部位特異的酵素を戦略的に使用することは、電離放射線により誘導されたDNA損傷の種類の間での差異を明確にする。
【発明の実施の形態】
【００２１】
本発明者は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するホスホジエステラーゼを利用した、DNA中の放射線損傷を特徴づけるためのde novo法を開発した。より具体的には、ホスホジエステラーゼからなる酵素システム、およびホスホジエステラーゼとホスファターゼからなる酵素システムを使用して、鎖切断部位の3'末端を調べた。
【００２２】
DNAの損傷には、いくつかの型が存在することが知られている。たとえば、鎖切断末端の3'側末端にリン酸が存在しないタイプ（すなわち、ホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位）、鎖切断部位の3'側末端にリン酸が存在するタイプ（すなわち、ホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位）、ピペリジンの作用により3'末端にリン酸が導入されるピペリジン脆弱性部位、などが知られている。
【００２３】
ホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位は、ホスファターゼ前処理なしにホスホジエステラーゼにより直接的に認識されそして消化されうる鎖切断末端から構成される損傷である。
【００２４】
本発明においては、その第一の態様にとして、ホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位を定量する方法を開発した。具体的には、（a）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端を、ホスホジエステラーゼにより認識すること、（b）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（c）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量として定量すること、を含む、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法を提供する。
【００２５】
ホスホジエステラーゼは、鎖切断部位の3'側末端にリン酸が存在しない場合に、末端の2'デオキシヌクレオチドに対して特異的に結合することができ、リン酸化された2'デオキシヌクレオチド（pdN）を一つずつ順番に切断していくことができる3'→5'エキソヌクレアーゼである（図1Aを参照）。このような特徴を有するため、それ以外の構造を有する鎖切断部位の3'側末端には結合することができない。
【００２６】
ホスホジエステラーゼの作用により損傷DNAのホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位から切り出されたpdNは、ついで、ホスファターゼの作用を受けてリン酸と2'デオキシヌクレオチド（dN）とに分解されるため、生成されるdNの種類および数を測定することにより、損傷DNA中にもともと存在するホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位を定量することができる。
【００２７】
本発明において使用することができるホスホジエステラーゼとしては、蛇毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）などが知られるが、これには限定されない。
本発明において使用することができるSVPDは、たとえばAmersham-Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）から入手することができるものを使用することができる他、シグマアルドリッチジャパン株式会社（東京）などを使用することができる。
【００２８】
損傷DNAから切り出されたdNの定量は、HPLCシステムを使用して行うことができる。HPLCシステム（CLASS-VP, Shimadzu）には、C-18またはC-30逆相カラム（Develosil RPAQUEOUS；4.6×150 mm；Nomura Chemical）、オートサンプラー（SIL-10ADvp, Shimadzu）、および210および260 nmでモニタリングするフォトダイオードアレイUV-VIS検出器（SPD-M10Avp, Shimadzu）を装填する。サンプルを、50 mM酢酸アンモニウム中アセトニトリルの直線勾配（0〜40分間でアセトニトリルを0→20％、40〜45分の間アセトニトリルを20％に維持し、その後45〜45分でアセトニトリルを20→0％）を用いて、40℃、0.8 mL/分の流速で、溶出することができる。
【００２９】
損傷DNA中の鎖切断部位3'末端にリン酸が存在するタイプ（すなわち、ホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位）は、ホスファターゼ前処理後に初めてホスホジエステラーゼにより認識されそして消化されうる鎖切断末端の構造を形成する損傷である。このようなホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位は、ホスファターゼ前処理を行うと、当該部分の末端のリン酸が除去されるため、ホスファターゼ前処理を行った後のホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位の3'側末端の構造は、もともと損傷DNA中の鎖切断部位3'末端にリン酸が存在しないタイプ（すなわち、ホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位）と同一になる。
【００３０】
本発明においては、その第二の態様において、（i）損傷DNA中の鎖切断部3'側末端のうち、リン酸を有する鎖切断部3'側末端を、ホスファターゼにより処理すること、（ii）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、（iii）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（iv）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量として定量すること、そして（v）第一の態様の方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量を、上記（iv）で得られた合計量から差し引くこと、を含む、損傷DNA中のリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量を定量化する方法もまた、提供する。
【００３１】
この方法では、ホスファターゼ前処理を行った後、ホスホジエステラーゼにより認識されそして消化されうる鎖切断末端を測定することから、損傷DNA中にもともと存在するホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位の量とホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位の量との合計量を算出することができる。そして、前述の第一の態様で定量された損傷DNA中に存在するホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位の量を差し引くことにより、損傷DNA中に存在するリン酸を有する鎖切断部3'側末端（すなわち、ホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位）の量のみを算出することができる。
【００３２】
ここで使用するホスファターゼは、鎖切断部位の3'側末端にリン酸が存在する場合に、末端のリン酸に対して特異的に結合することができ、末端のリン酸のみを切除することができる、ホスファターゼである。このような特徴を有する結果、損傷DNAをホスファターゼで処理すると、すべての鎖切断部位がその3'側末端にリン酸が存在しないタイプの鎖切断部位になる。
【００３３】
本発明において使用することができるホスファターゼとしては、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）などが知られるが、これには限定されない。
本発明において使用することができるCIAPは、たとえばAmersham-Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）から入手することができるものを使用することができる他、シグマアルドリッチジャパン株式会社（東京）などを使用することができる。
【００３４】
ついで、第一の態様と同様にホスホジエステラーゼの作用により損傷DNAからpdNを切り出し、この切り出されたpdNのリン酸部分をホスファターゼの作用により除去することにより、2'デオキシヌクレオチド（dN）が得られ、dNの種類および数を測定することにより、損傷DNA中にもともと存在するリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量を定量することができる。
【００３５】
さらに、ピペリジン処理した放射線照射プラスミドDNAもまた、同一の酵素系により処理して、ピペリジン脆弱性部位を調べることができる。これは、DNA中の損傷塩基の一部や、塩基が脱離した部位（AP部位）が、ピペリジン処理により除去され、3'リン酸末端に置換されることに基づいている。すべての損傷塩基がピペリジンにより除去されるという訳ではないが、このようなピペリジン脆弱性部位を塩基損傷の指標として使用することは可能性があることである。
【００３６】
本発明においては、その第三の態様において、（1）DNA中の塩基損傷と脱塩基部位（AP部位）などのピペリジン脆弱性部位をピペリジン処理によって3'リン酸末端に変換すること、（2）DNA中のピペリジン脆弱性部位に由来する3'リン酸末端、およびもともと損傷DNA中に存在するリン酸を有する鎖切断部3'側末端のすべてを、ホスファターゼにより処理すること、（3）ホスファターゼ処理によりリン酸を除去された鎖切断部3'側末端と、もともとリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とを、ともにホスホジエステラーゼにより認識すること、（4）ホスホジエステラーゼの作用により鎖切断部3'側末端からのpdNを切り出すこと、（5）pdNの切り出し速度を測定して、得られたpdNの量を、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量、リン酸を有する鎖切断部3'側末端の量、そしてピペリジン脆弱性部位の量との合計量として定量すること、そして（6）第二の態様の方法により定量したリン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の量との合計量を、上記（5）で得られた合計量から差し引くこと、を含む、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量化する方法もまた、提供する。
【００３７】
ピペリジンによるピペリジン脆弱性部位の処理は、1 Mピペリジンを含むDNA含有サンプルを90℃にて30分間インキュベートすることにより行うことができる。このピペリジン処理の結果、ピペリジン脆弱性損傷塩基は除去されて、脱プリン部位／脱ピリミジン部位（AP部位）を形成することができ、それらがピペリジン処理により完全に除去されて、3'リン酸末端を形成され、そして、その結果としてホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位と同一の末端構造を有する3'側末端が形成される。
【００３８】
このようなピペリジン脆弱性部位の例としては、塩基が脱離した部位（AP部位）のほか、8-オキソ-グアニンおよび8-オキソ-アデニン以外の酸化塩基を有するいくつかの損傷ヌクレオチドが知られている（レビューとしてBurrows and Muller （C.J. Burrows, and J.G. Muller, Chem. Rev. 98 (1998) 1109-1151）を参照）。
【００３９】
本発明は、その第四の態様において、上述した第一の態様で定量された損傷DNA中のホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、第二の態様で定量された損傷DNA中のホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、および第三の態様において検出された損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位の量を定量化することにより、あるDNAサンプル中のすべての鎖切断部位の構造的特徴、塩基損傷の種類や量などの特徴を明らかにすることができる。
【００４０】
このように、本発明において提案された方法は、天然DNA中に誘導された鎖切断末端および塩基損傷部位の特徴を調べるためのモデルシステムとして機能する。このような解析において様々な部位特異的酵素を戦略的に使用することは、電離放射線により誘導されたDNA損傷の種類の間での差異を明確にする。
【実施例】
【００４１】
本発明の以下において、ホスホジエステラーゼとして蛇毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）を、そしてホスファターゼとしてウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）をそれぞれ用いて、本発明を具体的に説明する。
【００４２】
本実施例において使用する材料は、以下の供給源から入手した。
化学物質  2686-bpのpUC19 DNAプラスミド（10 mM TEバッファー中1 mg/mL、pH 8.0）を、Bayou Biolabs（Haralan, LA）から購入した。2'-デオキシヌクレオシド（dN）、具体的には2'-デオキシシチジン（dC）、2'-デオキシグアノシン（dG）、チミジン（dT）、および2'-デオキシアデノシン（dA）、および核酸塩基、具体的にはシトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、およびアデニン（A）をSigma-Aldrich（Japan）から購入した。すべての化学物質は、さらなる精製をすることなく使用した。
【００４３】
酵素  Sma I（Serratia marcescens Sb、12ユニット/μL）、Sau 3AI（Staphylococcus aureus 3A、10ユニット/μL）、蛇毒ホスホジエステラーゼ（SVPD；Crotalus adamanteus、39.0ユニット/mg固体、1.29 A280mg/mL）、およびウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）は、Amersham-Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）から購入した。ヌクレアーゼのユニット定義は、以下にしたがった：Sma I、1ユニットは、1μgのλDNAを、1時間で、50μLのアッセイバッファー中、pH 7.5および30℃で、完全に消化するために必要とされる量の酵素として定義される；Sau 3AI、1ユニットは、1μgのλDNAを、1時間で、50μLのアッセイバッファー中、pH 7.5および30℃で、完全に消化するために必要とされる量の酵素として定義される；SVPD、1ユニットは、pH 8.9および25℃で、1分間あたり1μmolのp-ニトロフェニルチミジン5'-リン酸を加水分解するために必要とされる量の酵素として定義される；CIAP、1ユニットは、pH 8.0および37℃で、1分間あたり1μmolのp-ニトロフェニルホスフェートを加水分解するために必要とされる量の酵素として定義される。
【００４４】
実施例1：リン酸を有さない鎖切断部3'側末端からのリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）の切り出し
本実施例は、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端をSVPDで処理して、鎖切断部3'側末端のリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出し、そして定量することができることを確認するために行った。
【００４５】
Sma I消化による直鎖pUC19の調製
pUC19プラスミドDNA（TE中1 mg/mL、pH 8.0）を、エタノール沈殿により2回精製した。精製したEDTAを含まないpUC19を、バッファー（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、7 mM MgCl2、20 mM KCl、および7 mM 2-メルカプトエタノール）中、Sma I（84ユニット、7μL）により30℃にて7時間（約250μgのDNA/200μLの反応バッファー）中でインキュベートした。反応混合物をフェノール抽出して酵素を除去し、そしてDNAをエタノール沈殿により精製した。Sma I-消化pUC19（pUC19/Sma 1）の水溶液濃度は、OD260を測定することにより調べた。pUC19/Sma Iのサンプルの精製度は、OD260/OD280比を計算することにより確認した；1.8以上の比を有するpUC19/Sma Iのサンプルを、本研究において使用した。アガロース電気泳動解析から、消化の程度が、95％以上であることが示された（データは示さず）。DNA溶液を、さらに精製することなく使用した。
【００４６】
フッ素化ポリマーでコーティングしたシリコンプレートの調製
シリコンプレート（15×6.5 mm）を、超音波を使用して、エタノールで完全に洗浄した。一片のメンディングテープ（12×3 mm）をプレート上に静置した。部分的にシールしたプレートをフッ素化樹脂および石油エーテルの溶液中に浸漬した。ドラフトチャンバー中で室温にて乾燥させた後、テープを取り除いた。20μlの1 N水酸化ナトリウムを非コーティング領域に1分間静置し、表面の親水性を高めた。ついで、プレートを水で完全に洗浄し、アルカリ性溶液を完全に除去した。
【００４７】
照射用のpUC19/Sma Iの調製
24μlのpUC19/Sma I水溶液（2μg/μL）を、プレートの非コーティング領域にマウントし、そしてプレートをドラフトチャンバー中で部分的に乾燥させた。pUC19/Sma Iを保持するプレートを減圧下にてP2O5 上で数日間おくことで完全に乾燥させた。プレート上のそれぞれのサンプルを、ガラスチューブ（外径10 mm；内径6.8 mm）中に入れ、それを減圧下（約0.1 Pa）にてシールした。プレートを入れたガラスチューブを、より大型のガラスチューブ（全体のガラス厚4.0 mm）中に入れ、二次的な電子平衡を達成した。
【００４８】
pUC19/Sma Iのγ線照射
pUC19/Sma Iサンプルのγ線照射（60Co、1.17および1.33 MeV）を、Takasaki Advanced Radiation Research Institute（Japan Atomic Energy Agency）で行った。放射活性レベルは、実験の開始時において、10,800 TBqであった。各サンプルを、60Co源から277、158、56、23、および3 cm離れた位置に置き（それぞれ、曝露頻度が9.9、24.8、99.1、222.9、および445.8 C/kg/hであった）、そして120時間、室温にて照射した（それぞれ40、100、400、900、および1800 kGy）。線量測定はまた、アラニン-ポリスチレン線量測定を使用してチェックした（T. Kojima, et al., Radiat. Phys. Chem. 42 (1993) 757-760）（データは示さず）。pUC19/Sma Iプラスミドを構成する約90％の2'-デオキシヌクレオチドユニットは、1800 kGyの線量の照射後でも無傷のままであることは注目されるべきであった（データは示さず）。対照サンプルを、照射室の外においたこと以外は、同一の方法で調製した。各サンプルを、水中に溶解するまで、0〜4℃に保存した。
【００４９】
照射pUC19/Sma Iサンプルの、SVPDによる、そしてその後CIAPによる処理
照射pUC19/Sma Iサンプルをマイクロチューブに移しそして凍結乾燥した。残留物を150μLの冷水を用いて再懸濁し、これをストック溶液とした（0.32μg/μL）。10μlの照射DNAストック溶液を、1×SVPD反応バッファー29μlおよび0.0001ユニット/μL SVPD 1μlの最終反応条件で氷上であわせ、50-μL反応物中に追加した。反応混合物を含有するマイクロチューブを、水浴中に移し、31.4℃にて15分間インキュベートし、そしてチューブを液体窒素中（77K）に10秒間移すことにより反応を終了させた。
【００５０】
約0℃での溶液を、5-kDa分子量カットオフフィルター（Millipore）に移し、そして6000 gで0℃で遠心分離して、SVPDを除去した。フィルターを100μLの冷水で3回洗浄して、消化2'-デオキシヌクレオチド-5'-リン酸を回収した。フィルターをかけた溶液（約350μL）を凍結乾燥した。
【００５１】
得られた残留物を50μLの水中に再懸濁し、2μLのCIAPと混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。反応混合物を10-kDa分子量カットオフフィルター（Millipore）に移し、そして6000gで0℃で遠心分離して、CIAPを除去した。フィルターを100μLの冷水で3回洗浄して、dNを取り出し、dNを含有するフィルターをかけた溶液を、凍結乾燥した。
【００５２】
その後、得られた残留物に水を添加して30μlとし、そのうちの20μlを以下に記載するようにHPLCにより解析した。HPLCシステム（CLASS-VP, Shimadzu）には、C-30逆相カラム（Develosil RPAQUEOUS；4.6×150 mm；Nomura Chemical）、オートサンプラー（SIL-10ADvp, Shimadzu）、および260 nmでモニタリングするフォトダイオードアレイUV-VIS検出器（SPD-M10Avp, Shimadzu）を装填した。サンプルを、50 mM酢酸アンモニウム中アセトニトリルの直線勾配（40分間かけて0〜20％）を用いて、40℃、0.8 mL/分の流速で、溶出した。簡単なプロトコルを図1（A）に示す。
【００５３】
この結果、本実施例の方法により、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端からpdNを切り出すことができ、かつそのpdNをCIAPで処理した後のdNをHPLCにより定量的に測定することができた。詳細な結果については、実施例4にまとめる。
【００５４】
実施例2：リン酸を有する鎖切断部3'側末端からのpdNの切り出し
本実施例は、リン酸を有する鎖切断部3'側末端をCIAPで前処置した後、SVPDで処理して、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端両方のリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出し、そして定量することができることを確認するために行った。
【００５５】
照射pUC19/Sma IサンプルのCIAPおよびSVPDによる処理
実施例1に記載した通りに調製された照射したpUC19/Sma Iサンプルを、マイクロチューブに移し、そして凍結乾燥した。残留物を150μLの冷水中に再懸濁し、これをストック溶液とした（0.32μg/μL）。10μlの照射したDNAストック溶液を、1×SVPDバッファー（0.1 M Tris-HCl、0.1 M NaCl、および14 mM MgCl2、pH 8.0）、0.0001ユニット/μL SVPD、および0.08ユニット/μL CIAPの最終反応条件で氷上であわせ、50-mL反応物中に追加した。反応混合物を含有するマイクロチューブを、水浴中に移し、31.4℃にて15分間インキュベートし、そして反応物を0℃に冷却し、そして5μLの0.5 M EDTA（pH 8.0）を添加することにより反応を終了した。
【００５６】
約0℃での溶液を、5-kDa分子量カットオフフィルター（Millipore）に移し、そして6000 gで0℃で遠心分離して、SVPDを除去した。フィルターを100μLの冷水で3回洗浄して、消化2'-デオキシヌクレオチド-5'-リン酸を回収した。フィルターをかけた溶液（約350μL）を凍結乾燥した。
【００５７】
得られた残留物を50μLの水中に再懸濁し、2μLのCIAPと混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。反応混合物を10-kDa分子量カットオフフィルター（Millipore）に移し、そして6000gで0℃で遠心分離して、CIAPを除去した。フィルターを100μLの冷水で3回洗浄して、dNを取り出し、dNを含有するフィルターをかけた溶液を、凍結乾燥した。その後、得られた残留物に水を添加して30μlとし、そのうちの20μlを、実施例1に記載した様にしてHPLCにより解析した。簡単なプロトコルを図1（B）に示す。
【００５８】
この結果、本実施例の方法により、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端とリン酸を有する鎖切断部3'側末端鎖切断部3'側末端の両方ともからpdNを切り出すことができ、かつそのpdNをCIAPで処理した後に得られるdNをHPLCにより定量的に測定することができた。詳細な結果については、実施例4にまとめる。
【００５９】
実施例3：ピペリジン脆弱性部位からのpdNの切り出し
本実施例においては、ピペリジン脆弱性部位をピペリジンで処理してリン酸を有する鎖切断部3'側末端を作成し、この3'側末端をCIAPで前処置した後、SVPDで処理して、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の量とリン酸を有する鎖切断部3'側末端の両方ともに由来するリン酸化2'-デオキシヌクレオシド（pdN）を切り出し、そして定量することができることを確認するために行った。
【００６０】
照射pUC191Sma Iサンプルのピペリジンによる処理
実施例1に記載した通りに調製された照射したpUC19/Sma Iサンプルを、マイクロチューブに移し、そして凍結乾燥した。残留物を150μLの冷水中に再懸濁し、これをストック溶液とした（0.32μg/μL）。10μlの照射したDNAストック溶液を、10μlの2 Mピペリジンと混合することにより1 M ピペリジン溶液とした。溶液を90℃にて30分間インキュベートし、その後氷冷して反応を終了させた。このピペリジン処理によりピペリジン脆弱性の損傷ヌクレオシドのほとんどを取り除き、AP部位形成を介して3'-リン酸末端を生成した（図2）。
【００６１】
この溶液を凍結乾燥し、残留物に所定量の1×酵素反応バッファーを添加して溶解した（リン酸を有さない鎖切断部3'末端からpdNを切り出す操作を行う場合には49μl、リン酸を有する鎖切断部3'末端からもpdNを切り出す操作を行う場合には47μlを、それぞれ添加）。そして、リン酸を有さない鎖切断部3'末端からpdNを切り出す操作を行う場合には、実施例1に記載したとおり、リン酸を有する鎖切断部3'末端からもpdNを切り出す操作を行う場合には、実施例2に記載したとおり、その後の反応を行い、HPLCにより解析した。
【００６２】
この結果、本実施例の方法により、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位をピペリジン処理により3'-リン酸末端の生成を介して、損傷部位からpdNを切り出すことができ、かつそのpdNをCIAPで処理した後に得られるdNをHPLCにより定量的に測定することができた。詳細な結果については、実施例4にまとめる。
【００６３】
実施例4：損傷部位の種類ごとの定量化
本実施例は、実施例1〜3から得られた結果に基づいて、各種損傷部位の定量が可能であることを示すために行った。
【００６４】
実施例1では、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端からpdNを切り出し、その量を測定することにより、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の数を定量することができた。実施例1の方法により、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の数は、0.86μMの収率であった。
【００６５】
実施例2では、損傷DNA中のリン酸を有さない鎖切断部3'側末端およびもともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の両方ともからpdNを切り出し、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の数およびもともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の数の合計数を定量することができた。実施例2の方法により、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の数およびもともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の数の合計数は、4.23μMの収率であり、差し引きにより、もともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の数の数は3.37μMの収率であった。
【００６６】
実施例3では、損傷DNA中のピペリジン脆弱性部位をリン酸を有する鎖切断部3'側末端を形成することにより、結果としてリン酸を有さない鎖切断部3'側末端および／またはもともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の両方ともからpdNを切り出し、ピペリジン脆弱性部位の数を含め、鎖切断部3'側末端の数の合計数を定量することができた。ピペリジン処理の後に実施例1の方法を行うことにより、リン酸を有さない鎖切断部3'側末端の数のみが得られ、その数は1.10μMであった。一方、ピペリジン処理の後に実施例2の方法を行うことにより、ピペリジン脆弱性部位の数ともともとはリン酸を有する鎖切断部3'側末端の数との合計数が得られ、その数は、7.75μMの収率であった。
【００６７】
これらの結果を図3にまとめた。図3は、CIAP前処理γ線照射DNAサンプルおよびCIAP後処理γ線照射DNAサンプルから、ピペリジン処理をした場合およびしなかった場合に回収された無傷のdNの量を示す。値は、HPLCクロマトグラムに基づいて定量したものである（図4）。
【００６８】
ピペリジン処理なしの結果（ピペリジン（-））は、直接型作用により生じた迅速な鎖切断が、ホスホジエステル結合の5'側で主として生じることを意味している。一方、ピペリジン処理（ピペリジン（+））は、CIAP前処理した照射DNAから回収されたdNの量の増加を明らかに引き起こしたが、一方CIAP後処理サンプルからの回収レベルには影響を及ぼさなかった。これらの結果から、ピペリジン処理により、AP部位で損傷を受けた塩基のいくつかで新規の3'-リン酸末端が生成されたこと、そしてSVPDにより直接的に消化することができるCIAP-非依存的SVPD末端がピペリジン耐性であったこと、が示唆される。
【００６９】
参考例1：回収されたdNの量から鎖切断末端の量を推定するための標準曲線の構築
本参考例においては、pUC19/Sau 3AIフラグメントを検量線を構築するために使用して、鎖切断末端の量を推定した。
【００７０】
pUC19をSau 3AIを用いて処理することにより生成された15種類の二本鎖DNAフラグメントが、回収されたdNの濃度を3'末端の濃度に変換することができる検量線を得るために必要とされた。30箇所の凹型の3'-OH末端を有するこれらのフラグメントが、二本鎖DNAのモデル分子として機能することが予想された。
【００７１】
調製方法は、pUC19/Sma Iの調製方法と同様であった。簡単に説明すると、生成されたEDTAを含まないpUC19（約175μg）を、Sau 3AI（50ユニット、5μL）を含む200μLの反応バッファー（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、および1 mMジチオスレイトール）中で、37℃にて2時間インキュベートした。さらに50ユニットの酵素を反応混合物に対して添加して、そしてサンプルを37℃にて4時間インキュベートして、消化反応を終了させた。DNA溶液をさらに精製することなく使用した。
【００７２】
使用するHPLCシステムによるdNの検出限界およびDNA溶液の粘性を考慮して、pUC19/Sau 3AIの6種類の最終濃度、0.19、0.47、0.94、1.41、1.89、および3.77 g/L、を選択した。これらの濃度は、それぞれ、3.4、8.6、17.1、25.7、34.2、および68.4μMの3'-OH濃度に相当する。凍結乾燥したpUC19/Sau 3AIを、1×SVPDバッファー、0.0001ユニット/μL SVPD、および0.08ユニット/μL CIAPの最終反応条件と、氷上であわせた、50-μL反応物中に溶解した。反応混合物を含むマイクロチューブを、水浴に移し、31.4℃にて15分間インキュベートし、そして反応物を0℃に冷却しそして5μLの0.5 M EDTA（pH 8.0）を添加することにより終了させた。dNを含む反応混合物を、上述したようにHPLCにより解析した。
【００７３】
反応混合物中の酵素を、5-kDa分子量カットオフフィルターを使用して、そして0℃にて6000gで遠心分離して、除去した。チューブおよび濾過メンブレンを冷水（＞18 MW cm）を用いて0℃（全量300μL）で完全に洗浄した。フィルターをかけた溶液（全量約350μL）を凍結乾燥した。残留物を26μLの冷水中に0℃で溶解した。20μlのサンプルをHPLCにより解析した。HPLCシステム（CLASS-VP, Shimadzu）には、C-30逆相カラム（Develosil RPAQUEOUS；4.6×150 mm；Nomura Chemical）、オートサンプラー（SIL-10ADvp, Shimadzu）、および210および260 nmでモニタリングするフォトダイオードアレイUV-VIS検出器（SPD-M10Avp, Shimadzu）を装填した。サンプルを、50 mM酢酸アンモニウム中アセトニトリルの直線勾配（40分間かけて0〜20％）を用いて、40℃、0.8 mL/分の流速で、溶出した。
【００７４】
典型的なクロマトグラムを、図4に示す。基準dN溶液を、定量解析用に以下のように調製した：dA一水和物（FW 251.24、25.6 mg）、dC一水和物（FW 227.22、22.6 mg）、6％の水を含有するdG（FW 251.24、25.6 mg）、および無水dT（FW 242.23、24.2 mg）を、1000 mLの50 mMギ酸アンモニウム（pH 6.86）中に、一緒に溶解した。標準溶液中の各dNの最終濃度は、それぞれ、0.1019、0.0995、0.0958、および0.0999 mMであった。過剰量のCIAPで処理した後に、消化されていないpdNは何も検出されなかった。dCおよびTに対応するピークは、分離できなかった。dC：[dC]に対応するピーク領域は、式：［dC］＝［dC＋T］−［C］・（［T］/［C］）〔ここで、比（［T］/［C］）は酵素処理を何ら行わずに照射pUC19/Sma I溶液のクロマトグラムデータを使用して計算することができ（データは示さず）、このなかで、4種の変化しなかった塩基に対応するピークは、従前[19,20] と同様に見いだされた〕を使用して計算した。
【００７５】
図5は、SVPDとともに15分間のインキュベーションした後に回収されたdN濃度と、pUC19/Sma Iフラグメントの3'-OH末端の濃度との間の関連性を示す。この曲線は、SVPDにより切断することができる3'鎖切断末端の放射線化学収率（G値）を推定するための検量線として使用することができる。本研究において使用された酵素反応条件を用いて、この曲線の高い直線性により、照射DNAにおける鎖切断末端の量を推定することができる。本研究において、我々は、SVPDの初期消化速度が、存在する3'末端の種類（二本鎖切断部位での陥凹型のまたは突出型の3'末端、または一本鎖切断部位での3'末端など）によらず一定であると仮定した。68.4μMの3'-OH末端濃度でのデータ点を除き、最小二乗適合により得られた回帰直線の傾きは、0.723であった（相関係数：0.999）。検量線を使用して得られた見かけG値を表1に示す。
【００７６】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の方法は、天然DNA中に誘導された鎖切断末端および塩基損傷部位の特徴を調べるためのモデルシステムとして機能する。すなわち、損傷DNA中のホスファターゼ-非依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、ホスファターゼ-依存性ホスホジエステラーゼ部位の量、およびピペリジン脆弱性部位の量をそれぞれ定量化することにより、あるDNAサンプル中のすべての鎖切断部位の構造的特徴、塩基損傷の種類や量などの特徴を明らかにすることができる。このような解析において様々な部位特異的酵素を戦略的に使用することは、電離放射線により誘導されたDNA損傷の種類の間での差異を明確にする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図1は、ホスファターゼ-非依存的ホスホジエステラーゼ部位の収率を推定するための分析スキーム（A）およびホスファターゼ-依存的ホスホジエステラーゼ部位の収率を推定するための分析スキーム（B）をそれぞれ示す図である。
【図２】図2は、ピペリジン処理の結果として、ピペリジン脆弱性損傷塩基での鎖切断形成が生じることを示す図である。
【図３】図3は、CIAP前処理をした場合、またはしていない場合（後処理のみ）の、SVPD処理（31.4℃、pH 8.0にて15分）の後、900 kGyの60Co γ線を照射したpUC19/Sma Iから回収されたdNの量を示す図である。ピペリジン前処理の効果もまた調べた。バーおよびエラーバーは、2回の実験からの平均±1 SDを示す。
【図４】図4は、バッファー（pH 8.0）中31.4℃にて15分間CIAPおよびSVPDで処理した、900 kGyを照射したpUC19/Sma IのHPLCクロマトグラムを示す図である。dCおよびTに対応するピークは、分離できなかった。dC：[dC]に対応するピーク領域は、式：［dC］＝［dC＋T］−［C］・（［T］/［C］）〔ここで、比（［T］/［C］）は酵素処理を何ら行わずに照射pUC19/Sma I溶液のクロマトグラムデータを使用して計算することができ（データは示さず）、このなかで、4種の変化しなかった塩基に対応するピークは、従前[19,20] と同様に見いだされた〕を使用して計算した。
【図５】図5は、pUC19/Sau 3AIフラグメント中の3'-OH末端濃度と、バッファー（pH 8.0）中31.4℃にて15分間のSVPDおよびCIAP処理後に回収された全dNの相関関係を示す図である。68.4μMの3'-OH末端濃度でのデータ点を除き、最小二乗適合により得られた回帰直線の傾きは、0.723であった（相関係数：0.999）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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