(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２記載のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有し、且つブレオマイシン耐性活性をもたらす、ブレオマイシン耐性蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３または４に記載の塩基配列を有し、ブレオマイシン耐性蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入されていることを特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
さらに、目的遺伝子が挿入されていることを特徴とする、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えベクターが導入されていることを特徴とする、形質転換細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡからなることを特徴とする、遺伝子マーカー。
【請求項８】
請求項５に記載の組換えベクターによる形質転換後、ブレオマイシン耐性を指標に目的遺伝子により形質転換された細胞を選択することを特徴とする、形質転換細胞のスクリーニング方法。
【請求項９】
配列番号１または２記載のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有し、且つブレオマイシン耐性活性をもたらすタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレオマイシン系抗生物質耐性蛋白質、ブレオマイシン系抗生物質耐性蛋白質をコードする遺伝子、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子マーカー、及びブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子マーカーによる組換え生物の選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓの生産する抗生物質ブレオマイシンは、糖ペプチド性の抗生物質である。酸素存在下でＤＮＡ切断活性を有し、原核細菌ばかりでなく、広く細胞全般に作用するが（例えば、非特許文献１参照）、用途としては、主に腫瘍細胞の治療に用いられている。
ブレオマイシンに対する抵抗性はブレオマイシン耐性蛋白質により与えられるが、これは放線菌自身の有する自己耐性遺伝子（非特許文献２参照）、トランスポゾンにコードされる遺伝子（非特許文献３参照）、あるいはプラスミドにコードされる遺伝子（非特許文献４参照）などが知られている。しかし、これまでに単離されている遺伝子はごく数種類であり、ブレオマイシン耐性遺伝子を薬剤耐性遺伝子マーカーとして利用する際の宿主細胞との適合性等の点で、十分な選択肢がない。
【０００３】
【非特許文献１】Ｕｍｅｚａｗａ  Ｈ，  Ｋ．  Ｍａｅｄａ，  Ｔ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｏｋａｍｉ．  １９６６．  Ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．  １９：２００-２０９．
【非特許文献２】Ｇａｔｉｇｎｏｌ，  Ａ．，  Ｈ．  Ｄｕｒａｎｄ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｉｒａｂｙ．  １９８８．  Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｒｕｇ-ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２３０：１７１-１７５．
【非特許文献３】Ｇｅｎｉｌｌｏｕｄ  Ｏ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｇａｒｒｉｄｏ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｍｏｒｅｎｏ．  １９８４．  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｎ５  ｃａｒｒｉｅｓ  ａ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ-ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．  Ｇｅｎｅ  ３２：２２５-２３３．
【非特許文献４】Ｓｅｍｏｎ，  Ｄ．，  Ｎ．  Ｒ．  Ｍｏｖｖａ，  Ｔ．  Ｆ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．  Ｅｌａｌａｍａ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄａｖｉｅｓ．  １９８７．  Ｐｌａｓｍｉｄ-ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  １７：４６-５３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明においては、環境中に存在する微生物の有するブレオマイシン系の薬剤に対する耐性遺伝子をスクリーニングにより取得し、遺伝子構造を明らかにし、組換えベクターにおける遺伝子マーカーとしての利用を確認し、遺伝子マーカーとしての利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、活性汚泥を環境試料としたＤＮＡライブラリ（メタゲノムライブラリ）を作成し、大腸菌の組換えクローンをブレオマイシン存在下で選択し、該耐性クローンに含まれる遺伝子にブレオマイシン耐性をコードする機能を確認し、発明を完成した。
すなわち、本発明の特徴は以下のとおりである。
（１）配列番号１または２記載のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有し、且つブレオマイシン耐性活性をもたらす、ブレオマイシン耐性蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２）配列番号３または４に記載の塩基配列を有し、ブレオマイシン耐性蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）上記（１）または（２）に記載のＤＮＡを含み、その両端に制限酵素認識部位を有するＤＮＡ。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入されていることを特徴とする組換えベクター。
（５）さらに、目的遺伝子が挿入されていることを特徴とする、上記（４）に記載の組み換えベクター。
（６）上記（４）または（５）に記載の組換えベクターが導入されていることを特徴とする、形質転換細胞。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡからなることを特徴とする、遺伝子マーカー。
（８）上記（５）に記載の組換えベクターによる形質転換後、ブレオマイシン耐性を指標に目的遺伝子により形質転換された細胞を選択することを特徴とする、形質転換細胞のスクリーニング方法。
（９）配列番号１または２記載のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有し、且つブレオマイシン耐性活性をもたらすタンパク質。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、新規なブレオマイシン耐性遺伝子を遺伝子マーカーの利用に供することが可能となる。また、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子は、遺伝子マーカーとして、大腸菌、Thermus属菌のほか、微生物一般あるいは真核生物細胞を宿主とする場合にも適用可能であり、本発明は遺伝子工学において、有用な手段を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のブレオマイシン耐性遺伝子は、活性汚泥から環境ＤＮＡ（メタゲノム）を採取して、物理切断した該ＤＮＡをフォスミドベクターに連結し、該組換えフォスミドを含む大腸菌ライブラリをスクリーニングして得られたブレオマイシン耐性を有するクローンから取得されたものである。該遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするブレオマイシン耐性タンパク質のアミノ酸配列は、既知の遺伝子及びタンパク質のものとは異なり、新規なものである。
このようにして得られた、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、配列番号３及び４に示される。また、配列番号３及び４で示されるＤＮＡがコードするブレオマイシン耐性タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２に示され、該ブレオマイシン耐性タンパク質は、その発現により、遺伝子組換え微生物あるいは細胞にブレオマイシン耐性活性を付与する。
【０００８】
本発明のブレオマイシン耐性遺伝子は、ブレオマイシン耐性タンパク質が発現されて遺伝子マーカーとして機能するものであればよく、該遺伝子は上記配列番号３及び４に示す塩基配列からなるＤＮＡのみには限定されず、上記配列番号１，２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを包含する。また、配列番号３，４に示す各アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列をコードするものであっても、ブレオマイシン耐性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは本発明に包含される。本発明のブレオマイシン耐性遺伝子を入手するには、例えば、土壌、水圏、堆積物、活性汚泥等の環境試料からＤＮＡを抽出してメタゲノムライブラリを構築し、該メタゲノムライブラリをブレオマイシン耐性か否かを指標にしてスクリーニングすることで入手可能である。また、メタゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明の配列番号３、４で示される塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことによっても得ることができる。さらに、本発明の配列番号３，４に示す塩基配列からなるＤＮＡを直接合成してもよく、また、配列番号１，２に示すアミノ酸配列をもとにＤＮＡの塩基配列を設計し、該塩基配列を有するＤＮＡを合成してもよい。
【０００９】
本発明のブレオマイシン耐性遺伝子を遺伝子マーカーとして使用する手法は、従来の薬剤耐性遺伝子の使用法と基本的には同様である。
すなわち、まず、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子を、pUC118等のベクターに該遺伝子の発現が可能なように連結して、組み換えベクターを調製する。その際、ブレオマイシン耐性遺伝子の両端には制限酵素認識部位の塩基配列を付加しておくと操作が容易となる。
【００１０】
本発明において、ブレオマイシン耐性遺伝子は、ブレオマイシン耐性タンパク質を発現させるために、通常、プロモータ配列の下流側に位置させるが、このプロモータは、上記ベクターが本来的に有しているものを利用してもよく、また新たに導入してもよく、宿主に対して好適なものを選択して用いればよい。
例えば、大腸菌の場合、JM109、DH5α等が挙げられる。
また、エンハンサーあるいはリボソーム結合部位の塩基配列もベクターに導入して、さらにブレオマイシン耐性遺伝子の発現効率を向上させることもできる。
このようなエンハンサーあるいはリボソーム結合部位の配列としては、例えばシャイン・ダルガノ配列を挙げることができる。
このようにして得られた組み換えベクターは、クローニングベクターとして有用である。
【００１１】
上記のようにして得られた組換えベクターは、例えば、目的遺伝子を組換えベクターに挿入し、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子及び目的遺伝子を有する組換えベクターを宿主微生物に導入して形質転換体を得る。宿主としては、ブレオマイシンに耐性を有しない微生物、細胞であれば特に制限はなく、例えば、大腸菌、サーマス（Thermus）属、その他微生物一般、真核生物細胞等を挙げることができる。組み換えベクターの導入手法も従来公知の手法を用いればよく、これらとしては、例えば、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等を挙げることができる。なお、サーマス属微生物の場合、自然形質転換能力を有するので、単に培地中に本発明の組み換えベクターを含有させて培養することによっても形質転換体を得ることができる。
【００１２】
得られた形質転換体は、ブレオマイシンを含有する培地で培養するが、この際、上記組換えベクターを含有しない宿主は生育できず。本発明の組換えベクターを有する形質転換体をスクリーニングすることができる。
本発明の上記組換えベクターを調製する場合には、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子に加えて、さらに、第２の薬剤遺伝子、あるいは酵素遺伝子等の他の遺伝子マーカーも挿入してもよく、これによりさらにスクリーニングの精度が向上する。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
実施例１
新規ブレオマイシン耐性遺伝子の単離、同定
（１）活性汚泥より抽出したメタゲノムＤＮＡを平均鎖長２-３ｋｂとなるように物理剪断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドにライゲーションした。フォスミドへのライゲーションにはＴ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を使用した。このフォスミドへライゲーションしたものを、ＭａｘＰｌａｎｘ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  を行なった。宿主微生物として大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＰＩ−３００Ｔ１Ｒを使用した。そして、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ（ＬＢ／Ｃｍ）寒天プレートで、形質転換大腸菌を選択した。
【００１４】
大腸菌のコロニーをとり、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（ＬＢ／Ｃｍ）２００マイクロリットル中で、３７℃で１８時間、１４００ｒｐｍで培養した。ついで、本大腸菌をマイクロレプリケータを用い、ブレオマイシン蛍光性物質の一種であるフレオマイシン１０μｇ／ｍＬを含む２００マイクロリットルのＬＢ／Ｃｍ培地に移し、１４００ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて１４時間培養した。生育のよかった４クローンをさらに２０μｇ／ｍＬのフレオマイシンを含むＬＢ／Ｃｍ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養した。生育の見られた３株について、ブレオマイシン耐性の表現型を与えるクローンとして単離した。クローン名を４Ｈ７、７Ａ１０、８Ｄ４とした。フレオマイシンの濃度をさらに向上させ選抜を行った結果、すべてのクローンで、４００μｇ／ｍＬのフレオマイシンにおける生育が確認された。以上の結果から、選抜された全てが、ブレオマイシン耐性遺伝子を含み、大腸菌フォスミドベクターにコードされた場合に、様々な形態で遺伝子マーカーとして利用することが可能であることが示された。
【００１５】
（２）次に、陽性フォスミドクローンのショットガンライブラリをｐＵＣ１１８プラスミドベクターを用いて構築し、該ライブラリにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを５００μｇ／ｍＬのフレオマイシン存在下でスクリーニングし、陽性クローンを得た。これらのクローンはいずれもフォスミドインサート断片上の共通の領域を含んでいた。このことから、大腸菌プラスミドベクターにコードされた場合に、様々な形態で遺伝子マーカーとして利用することが可能であることが示された。
（３）次に、ショットガンライブラリを用いてフォスミドインサートの遺伝子配列を解析した結果、共通の領域には、４Ｈ７においては配列番号３のまた７Ａ１０においては配列番号４記載のオープンリーディングフレームが含まれていることが判明した。いずれの場合も該オープンリーディングフレームの両末端の一部を欠失したショットガンクローンはフレオマイシン耐性を示さなかったことから、配列番号３および４に示されるオープンリーディングフレームがフレオマイシン耐性遺伝子であると結論した。配列番号３、４でそれぞれ示されるブレオマイシン耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１，２）は、既知のブレオマイシン耐性蛋白質と２５-３０％程度の弱い相同性を示した。通常、この程度のアミノ酸配列の相同性からは既知の蛋白質と同じ機能を有することを結論することは全く出来ず、今回得られた耐性遺伝子が新規なものと判断された。
【００１６】
実施例２
遺伝子マーカとしての利用
大腸菌以外の宿主での利用を検証するため、配列番号４記載のブレオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを構築し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを形質転換することを試みた。
先ず、配列番号４の塩基配列を含むブレオマイシン耐性遺伝子カートリッジを作成した。Ｔｈｅｒｍｕｓ菌内での蛋白質発現効率を上げるために、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８株のクエン酸合成酵素遺伝子由来のリボソーム結合配列を耐性遺伝子のコーディングフレームの前に付加した。配列番号４の塩基配列全長を含むショットガンクローンのＤＮＡを鋳型として、５'-プライマー（５'-ＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧ-３'、  配列番号５）及び３'-プライマー（５'-ＴＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣ-３'、  配列番号６）を用いて定法によりＰＣＲを行い、リボソーム結合配列が付加されたオープンリーディングフレームＤＮＡ断片を増幅した。この増幅したＤＮＡ断片を大腸菌プラスミドｐＵＣ８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入することにより、両端がＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトよりなるブレオマイシン耐性遺伝子カートリッジ（配列番号７）をもつプラスミドｐＢＬ１２１を得た。
【００１７】
ブレオマイシン耐性遺伝子のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７株のへの導入には、好熱菌由来のアデニレートキナーゼ遺伝子のプロモーター断片を持つＴｈｅｒｍｕｓ菌発現ベクターｐＹＫ１４１（図１）を用いた。なお、ｐＹＫ１４１は発明者がＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のクリプティックプラスミドｐＴＴ８をもとにＴｈｅｒｍｕｓ  Ｔ２株由来のトリプトファン合成酵素遺伝子（ｔｒｐＢ）およびアデニレートキナーゼ遺伝子のプロモーター断片を組み合わせて独自に開発したものであり、そのプラスミドを保持する株Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７  ｔｒｐＢ５  （ｐＹＫ１４１）は特許生物寄託センターに寄託している（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ-１９６９９）。
このｐＹＫ１４１と上記のｐＢＬ１２１のＤＮＡを  制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼで連結することにより、ｐＹＫ１４１プラスミド上のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトに挟まれるトリプトファン合成酵素遺伝子（一部）をブレオマイシン耐性遺伝子カートリッジで置き換えたＤＮＡを作成した。このＤＮＡを用いてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７野生株を形質転換した。
【００１８】
Ｔｈｅｒｍｕｓ菌は普通の培養条件で自分の周りにあるＤＮＡを取り込む自然形質転換の能力を持っているので、形質転換は以下のようにして行った。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７野生株（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ-１６３）をＴＭ培地（０．４％トリプトン、０．２％酵母抽出物、０．１％ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））で一夜培養したものを新しいＴＭ培地で１００分の１に希釈し、７０℃で２時間振騰培養した。培養物（１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をＤＮＡと混合し、７０℃で４０分、６０℃で３０分、５５℃で３０分、振騰しながらインキュベートした後、８０μｇ／ｍｌフレオマイシン、１．５％寒天を含む  ＴＭ平板培地上に撒いた。５５℃および６０℃で３日間培養したところ、連結ＤＮＡ１μｇ当たり約１万個のフレオマイシン耐性のコロニーが出現した。
上記の結果、本発明のブレオマイシン耐性遺伝子が大腸菌以外の宿主細胞においても遺伝子マーカーとしての利用が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例２で用いたプラスミドｐＹＫ１４１の構造の概略を示す図
【図１】
0005131828.tif 000002
【配列表】
0005131828000001.app