(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール及びＥＤＴＡとジアセチルスペルミンオキシダーゼを共存させることを特徴とする、ポリアミンオキシダーゼの安定化方法であって、該ジアセチルスペルミンオキシダーゼが、
以下の理化学的性質：
（１ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（１ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５；
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０；
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃；
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（１ｇ）分子量：９２，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（１）、又は、
以下の理化学的性質：
（２ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（２ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５；
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５；
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃；
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（２ｇ）分子量：９０，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（２）である、前記安定化方法。
【請求項２】
酵素（１）がデバリオミセス  マラムス（ＮＢＲＣ  ０６６８）、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）により生産される酵素であり、酵素（２）がキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）により生産される酵素である、請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
溶液中のエタノール濃度が５〜１０体積％である、請求項１又は２記載の安定化方法。
【請求項４】
ジアセチルスペルミンオキシダーゼを含有する試薬を試料に作用させて、ジアセチルスペルミンを測定することからなるジアセチルスペルミンの測定方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の安定化方法により安定化されたジアセチルスペルミンオキシダーゼを用いることを特徴とする前記方法。
【請求項５】
エタノール及びＥＤＴＡと、ジアセチルスペルミンオキシダーゼを含有することを特徴とする、安定化されたジアセチルスペルミンオキシダーゼ製剤であって、該ジアセチルスペルミンオキシダーゼが、
以下の理化学的性質：
（１ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（１ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５；
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０；
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃；
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（１ｇ）分子量：９２，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（１）、又は、
以下の理化学的性質：
（２ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（２ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５；
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５；
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃；
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（２ｇ）分子量：９０，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（２）である、前記製剤。
【請求項６】
酵素（１）がデバリオミセス  マラムス（ＮＢＲＣ  ０６６８）、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）により生産される酵素であり、酵素（２）がキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）により生産される酵素である、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
エタノール及びＥＤＴＡと、ジアセチルスペルミンオキシダーゼを含有することを特徴とする、ジアセチルスペルミン測定試薬であって、該ジアセチルスペルミンオキシダーゼが、
以下の理化学的性質：
（１ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（１ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５；
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０；
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃；
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（１ｇ）分子量：９２，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（１）、又は、
以下の理化学的性質：
（２ａ）作用：酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する；
（２ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン；
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５；
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５；
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃；
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下；及び
（２ｇ）分子量：９０，０００（ゲルろ過法）
を有する酵素（２）である、前記測定試薬。
【請求項８】
酵素（１）がデバリオミセス  マラムス（ＮＢＲＣ  ０６６８）、デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）により生産される酵素であり、酵素（２）がキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）により生産される酵素である、請求項７記載の測定試薬。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のジアセチルスペルミンオキシダーゼの安定化方法を用いることを特徴とする、ジアセチルスペルミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルスペルミンを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のジアセチルスペルミンオキシダーゼの安定化方法を利用することを特徴とする、ジアセチルスペルミンオキシダーゼの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断や有用物質生産等に用いられるポリアミンオキシダーゼの安定化方法、基質特異性の改良方法、ポリアミンオキシダーゼを用いるジアセチルポリアミンの測定方法、及び、それらを利用してポリアミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルポリアミンを製造する方法及びポリアミンオキシダーゼを精製する方法、並びに、安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤及びジアセチルポリアミン測定用試薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンとは、同一分子内に２個以上のアミノ基を有する化合物の総称であり、ヒトの体内には、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンの４種類のポリアミンとそれらのモノアセチル体及びジアセチル体が存在する。癌患者において、尿中ポリアミンの排泄量が増加することが１９７１年にＲｕｓｓｅｌによって報告されて以来、癌の診断を目的として尿中のポリアミン含量の測定が行われてきた（例えば、非特許文献１参照）。尿中ポリアミンの大部分はモノアセチル体で存在するため、従来はアセチル基を加水分解し、アセチルポリアミンとアセチル化されていない遊離型のポリアミンを区別しない総ポリアミン含量として測定されていた（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、尿中総ポリアミンにおいては悪性腫瘍患者の中に偽陰性例が相当数認められることが明らかになっている。また、悪性腫瘍以外にも、炎症性疾患、心筋梗塞、肝硬変、創傷治癒過程など、種々の病態に関連して有意に上昇することが明らかになり、腫瘍マーカーとしては実用的でないと考えられるようになった。【０００４】
近年、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン（化１）  （以下、単にジアセチルスペルミンと記載する）とＮ１，Ｎ８−ジアセチルスペルミジン（化２）の２種類のジアセチルポリアミンが尿中に排泄されていることが見出された（例えば、非特許文献２参照）。健常者の尿中においては、これらの成分は総ポリアミンのそれぞれ０．６％、１．４％を占めるにすぎないが、癌患者における増加の割合が総ポリアミンと比較して際立って高く、既存の腫瘍マーカーよりも真陽性率が高いことから、新たな腫瘍マーカーとして注目を集めている（例えば、非特許文献３、４参照）。【０００５】
【化１】
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【０００６】
【化２】
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【０００７】
ジアセチルポリアミンを特異的に測定する方法としては、例えば、ＨＰＬＣ−酵素法（例えば、非特許文献２参照）が挙げられる。まず検体中の各種ポリアミンをＨＰＬＣにて分離した後、ＨＰＬＣ検出器中にてアセチル加水分解酵素を作用させて生じるフリーポリアミンをポリアミンオキシダーゼで酸化し、生じる過酸化水素を電気化学検出器を用いて検出する方法である。しかしながら、本方法では多数の検体を短時間で処理できない等の問題が生じていた。最近、ジアセチルスペルミンに対する特異性が高い抗体が取得され、本抗体を用いる間接競合ＥＬＩＳＡ法による測定法も開発されたが（例えば、特許文献２、３、４、非特許文献３、４参照）、その操作は煩雑であり、測定値は試料の検体量に反比例するものであった。【０００８】
このような背景から、ジアセチルポリアミンに特異的に作用するポリアミンオキシダーゼやデヒドロゲナーゼを用いて、より簡便で直接的にジアセチルポリアミンを測定できる方法が開発されれば非常に有用であると期待されるが（例えば、非特許文献５参照）、これまでにこのような試みはなかった。その理由として、これまでに知られているほとんどのポリアミンオキシダーゼは、モノアセチルポリアミン（例えば、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、アセチルプトレッシン等）やアミノ基がアセチル化されていないフリーのポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、カタベリン等）に高い反応性を示すものであり、ジアセチルポリアミンの測定には不向きであったためと考えられる。【０００９】
しかしながら、最近になって、本発明者等によって、ジアセチルスペルミン（化１）に対して高い反応性を有し、（化３）に示す反応を触媒するポリアミンオキシダーゼがデバリオミセス、キャンディダ、ピキア等から単離された（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８参照）。【００１０】
【化３】
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【００１１】
このようなポリアミンオキシダーゼはジアセチルスペルミンの測定に有用であると考えられるが、実用化に向けては、酵素の安定性とジアセチルスペルミンに対する特異性をさらに改善することが必要であると考えられた。【００１２】
まず、酵素の安定性について説明する。一般的に、酵素は液体に溶解した状態では不安定であるという欠点を有している。ポリアミンオキシダーゼについても例外ではなく、この解決策として、種々の安定化方法が試みられてきたが有効な方法はなかった。【００１３】
次に、酵素の基質特異性について説明する。本発明者等によって発見された上記の酵素は、ジアセチルスペルミンに対する反応性を１００％とすると、例えば、Ｎ１−アセチルスペルミジンにはそれぞれ約３０％、５０％、９０％（ｐＨ７．５  リン酸緩衝液条件下）の反応性を示すものであり、ジアセチルスペルミン以外のポリアミンも測定してしまうという問題が生じていた。【００１４】
また、ポリアミンオキシダーゼは、ジアセチルポリアミンの測定という用途以外にも、ジアセチルスペルミン（化１）から医薬品や農薬の原料として有用なＮ１−アセチルスペルミジン（化４）を製造する方法に利用できることが報告されている（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８）。本法は、従来より知られていた有機合成法（例えば、非特許文献６、７参照）と比較すると工程数が少なく、簡便であるものの、酵素が不安定であるために多量の酵素が必要となるという欠点を有していた。また、基質特異性が不十分であるために、生成するＮ１−アセチルスペルミジンの一部がプトレッシンに変換されてしまい、収率が低下してしまうという欠点も有していた。【００１５】
【化４】
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【００１６】
【特許文献１】特開平１−８５０８０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０８１５６９パンフレット
【特許文献３】特開２００６−３８５９４号公報
【特許文献４】特開２００６−１９９６５５号公報
【非特許文献１】「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，（米国），１９７１年，３１巻，ｐ．１５５５−１５５８
【非特許文献２】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），１９９５年，１１７巻，ｐ．１０７−１１２
【非特許文献３】「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，（米国），２００５年，１１巻，ｐ．２９８６−２９９０
【非特許文献４】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（日本），２００６年，１３９巻，ｐ．３１５−３２２
【非特許文献５】「Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ」，（蘭国），２００４年，３４０巻，ｐ２１９−２２７
【非特許文献６】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｉ」，（英国），１９８８年，ｐ．１９０５−１９１１
【非特許文献７】「Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ」，（デンマーク），１９８９年，４３巻，ｐ．９９０−９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、ポリアミンオキシダーゼの安定化方法、基質特異性の改良方法、及びポリアミンオキシダーゼを用いるジアセチルポリアミンの測定方法、及び、それらを利用してポリアミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルポリアミンを製造する方法及びポリアミンオキシダーゼを精製する方法、並びに、安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤及びジアセチルポリアミン測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、（１）アルコール化合物及び／又はキレート試薬を共存させることにより、ポリアミンオキシダーゼの安定性が向上すること、（２）界面活性剤を共存させることにより、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性が改良されること、（３）ポリアミンオキシダーゼをｐＨ７．５未満で作用させることにより、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性が改良されることなどを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。【００１９】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）アルコール化合物及び／又はキレート試薬と、ポリアミンオキシダーゼを共存させることを特徴とする、ポリアミンオキシダーゼの安定化方法。
（２）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（１）に記載のポリアミンオキシダーゼの安定化方法。
（３）界面活性剤存在下にてポリアミンオキシダーゼを作用させることを特徴とする、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良方法。
（４）ポリアミンオキシダーゼをｐＨ７．５未満で作用させることを特徴とする、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良方法。
（５）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（３）〜（４）のいずれかに記載のポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良方法。
（６）ポリアミンオキシダーゼを含有する試薬を試料に作用させて、ジアセチルポリアミンを測定することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの測定方法。
（７）アルコール化合物及び／又はキレート試薬により安定化されたポリアミンオキシダーゼを用いることを特徴とする、上記（６）に記載の測定方法。
（８）界面活性剤により基質特異性が改良されたポリアミンオキシダーゼを用いることを特徴とする、上記（６）〜（７）のいずれかに記載の測定方法。
（９）ポリアミンオキシダーゼをｐＨ７．５未満で作用させることを特徴とする、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の測定方法。
（１０）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（６）〜（９）のいずれかに記載のジアセチルポリアミンの測定方法。
（１１）アルコール化合物及び／又はキレート試薬と、ポリアミンオキシダーゼを含有することを特徴とする、安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤。
（１２）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記１６に記載の安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤。
（１３）ポリアミンオキシダーゼを含有することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの測定試薬。
（１４）アルコール化合物及び／又はキレート試薬と、ポリアミンオキシダーゼを含有することを特徴とする上記（１３）に記載のジアセチルポリアミンの測定試薬。
（１５）界面活性剤とポリアミンオキシダーゼを含有することを特徴とする上記（１３）又は（１４）のいずれかに記載のジアセチルポリアミン測定試薬。
（１６）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載のジアセチルポリアミン測定試薬。
（１７）上記（１）又は（２）記載のポリアミンオキシダーゼの安定化方法、及び／又は上記（３）〜（５）のいずれか一項に記載のポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良方法を利用することを特徴とする、ジアセチルポリアミンにポリアミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルポリアミンを製造する方法。
（１８）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（１７）記載のモノアセチルポリアミンの製造方法。
（１９）上記（１）又は（２）記載のポリアミンオキシダーゼの安定化方法を利用することを特徴とする、ポリアミンオキシダーゼの精製方法。
（２０）ポリアミンオキシダーゼがジアセチルスペルミンオキシダーゼである、上記（１９）記載のポリアミンオキシダーゼの精製方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、アルコール化合物及び／又はキレート試薬を共存させることにより、ポリアミンオキシダーゼを安定化することができる。また、界面活性剤を共存させる及び／又はｐＨ７．５未満の条件下とすることにより、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性を改良することができる。さらに、このような安定化方法及び／又は基質特異性の改良方法を用いて、ジアセチルポリアミンへポリアミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルポリアミンを製造したり、ポリアミンオキシダーゼを用いることによりジアセチルポリアミンを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アルコール化合物とキレート試薬を共存させることによる酵素の安定化効果を示すグラフである。
【図２】ポリアミンオキシダーゼ製剤の熱安定性を示すグラフである。
【図３】ジアセチルスペルミンオキシダーゼを含有する試薬を用い、ジアセチルスペルミン試料を測定したときの濃度と吸光度の関係を示すグラフである。
【図４】ジアセチルスペルミンオキシダーゼを含有する試薬を用い、尿にジアセチルスペルミンを添加した試料を測定したときの濃度と吸光度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いられる「ポリアミンオキシダーゼ」は、ジアセチルポリアミンを酸素存在下で酸化して、モノアセチルポリアミン、アルデヒド及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、如何なる起源のものでも用いることができる。例えば、微生物、植物、あるいは動物などの生産するポリアミンオキシダーゼ等、いずれであってもよく、特に制限されない。例えば、酵母等を起源とするポリアミンオキシダーゼ等が挙げられ、好ましくはデバリオミセス属、キャンディダ属、ピキア属由来の酵素等が用いられる。【００２３】
さらに具体的には、デバリオミセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、デバリオミセス・マラマ（Debaryomyces marama）、デバリオミセス・マラムス（Debaryomyces maramus）、キャンディダ・グラブラタ（Candida glabrata）及び「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」，（英国），２０００年，４７６巻，ｐ．１５０−１５４に記載のキャンディダ・ボイディニイ（Candida boidinii）由来のポリアミンオキシダーゼ等が好ましく用いられる。【００２４】
ポリアミンオキシダーゼの中でも、特にジアセチルスペルミンオキシダーゼは好ましく用いられる。ここで述べるジアセチルスペルミンオキシダーゼとは、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンに対する活性よりもジアセチルスペルミンに対する活性が高いポリアミンオキシダーゼを指し、例えば、デバリオミセス・ハンセニイ、デバリオミセス・マラマ、デバリオミセス・マラムス、キャンディダ・グラブラタ、ピキア・ミヌタ由来のジアセチルスペルミンオキシダーゼ等が挙げられる。【００２５】
このようなジアセチルスペルミンオキシダーゼの好適例として、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載されている以下の酵素を挙げることができる。【００２６】
すなわち、以下の（１ａ）〜（１ｇ）に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するジアセチルスペルミンオキシダーゼ（なお、下記の酵素の理化学的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる）：【００２７】
（１ａ）作用：化３に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
（１ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン
例えば、ｐＨ７．５の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を１００としたとき、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が９０以下、好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下、もっとも好ましくは４０以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるｐＨの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
（１ｃ）至適ｐＨ：６．５〜８．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ６．５〜８．５、好ましくはｐＨ７．０〜８．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｄ）安定ｐＨ：６．０〜８．０
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、それぞれのｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｅ）至適温度：３７〜５５℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として３７〜５５℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｆ）熱安定性：３７℃以下
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、それぞれの温度において３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは９０％以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、３７℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（１ｇ）分子量：約９２，０００（ゲルろ過法）
分子量はゲルろ過法、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約９２，０００（ゲルろ過法）の本発明酵素などが挙げられる。【００２８】
以下の（２ａ）〜（２ｇ）に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するジアセチルスペルミンオキシダーゼ（なお、下記の酵素の理化学的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる）：
（２ａ）作用：化３に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの２級アミンのＣ−Ｎ結合を開裂して、Ｎ１−アセチルスペルミジン、３−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
（２ｂ）基質特異性：ジアセチルスペルミン＞Ｎ１−アセチルスペルミン，Ｎ１−アセチルスペルミジン，Ｎ８−アセチルスペルミジン
例えば、ｐＨ７．５の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を１００としたとき、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が９０以下、好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるｐＨの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
（２ｃ）至適ｐＨ：７．０〜８．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ７．０〜８．５、好ましくはｐＨ７．５〜８．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｄ）安定ｐＨ：５．５〜９．５
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５〜７．５）、２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜９．５）を用い、それぞれのｐＨにおいて、３０℃で３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐＨ５．５〜９．５、好ましくはｐＨ６．５〜９．０の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｅ）至適温度：４５〜５５℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として４５〜５５℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｆ）熱安定性：３７℃以下
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、それぞれの温度において３０分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは９０％以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、３７℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
（２ｇ）分子量：約９０，０００（ゲルろ過法）
分子量は、ゲルろ過法、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については、特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約９０，０００（ゲルろ過法）の本発明酵素などが挙げられる。【００２９】
なお、上記の一番目に挙げた酵素はデバリオミセス  マラマ  ＨＵＴ  ７１９９、デバリオミセス  マラムス  ＮＢＲＣ  ０６６８及びデバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）、並びに、上記の二番目に挙げた酵素はキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２がそれぞれ生産するもので、当業者であれば、これらの菌体から容易に調製することができるし、酵素をコードする遺伝子をクローニングして、大腸菌や酵母等の他の宿主で組換え発現させて調製することもできる。【００３０】
デバリオミセス  ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ４２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）及びキャンディダ  グラブラタ  Ｎｏｄａ  １６２  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）は、本発明者らが茨城県内及び千葉県内の土壌よりそれぞれ分離して得た菌株であり、２００６年５月１０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託され、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３、及び、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２が付与されている。【００３１】
ポリアミンオキシダーゼには、ＦＡＤ又は銅を補酵素とするものが知られており、特に限定はされないが、ＦＡＤを補酵素として利用するポリアミンオキシダーゼが望ましい。これらのポリアミンオキシダーゼは、遺伝子組換え体によって製造されたものも用いることができる。【００３２】
［ポリアミンオキシダーゼの安定性の向上］
本発明において、ポリアミンオキシダーゼの安定性を向上させるために共存させるアルコール化合物とは、ヒドロキシル基（ＯＨ）を有する有機化合物であり、そのような官能基を有する化合物であれば当業者に公知の如何なる化合物でも本発明に用いることができる。特に脂肪族炭化水素の１個又は複数個の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物は、入手が容易であることから好ましく用いられる。より具体的には、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール及びグリセロール等の脂肪族アルコール、並びにトレハロース、キシリトール、スクロース及びグルコース等の糖類が挙げられる。本発明においては、上記アルコール化合物は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。【００３３】
ポリアミンオキシダーゼと共存させる前記アルコール化合物の溶液中の濃度については、ポリアミンオキシダーゼの安定化効果が発揮され、かつ酵素を含む試薬を取り扱う上で不都合のない範囲内であれば特に限定されず、各化合物について適切な安定化効果が認められる濃度で添加することができる。好ましくは０．５〜２０％、より好ましくは１〜１０％（以下、特に断りがない限り、「体積％」を意味する）の濃度で用いられる。【００３４】
本発明において、ポリアミンオキシダーゼの安定性を向上させるために共存させるキレート試薬とは、金属イオンに配位しキレート化合物を与えるような化合物であり、そのような作用を有する化合物であれば当業者に公知の如何なる化合物でも本発明に用いることができる。【００３５】
例えば、エチレンジアミン４酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、（以下「ＥＤＴＡ」と称する））、１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「Ｍｅ−ＥＤＴＡ」と称する）、Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「ＥＤＴＡ−ＯＨ」と称する）、ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「ＣｙＤＴＡ」と称する）、１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「ＤＴＰＡ−ＯＨ」と称する）、Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「ＥＧＴＡ」と称する）、Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（以下「ＴＴＨＡ」と称する）などのポリアミンカルボン酸系のキレート試薬や、クエン酸、リンゴ酸、イソクエン酸などのオキシカルボン酸系のキレート試薬等が挙げられる。上記キレート試薬に配位する塩の有無、種類や数については何ら限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩化合物が好ましく用いられる。【００３６】
上記キレート試薬は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。また、上記キレート試薬によって安定化させるポリアミンオキシダーゼとして、例えば、酵母等を起源とするポリアミンオキシダーゼが挙げられ、さらに具体的には、デバリオミセス・ハンセニイ、デバリオミセス・マラマ、デバリオミセス・マラムス、キャンディダ・グラブラタ由来のジアセチルスペルミンオキシダーゼ、及び「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」，（英国），２０００年，４７６巻，ｐ．１５０−１５４に記載のキャンディダ・ボイディニイ由来のＮ１−アセチルスペルミジンオキシダーゼ等が挙げられる。【００３７】
ポリアミンオキシダーゼと共存させる前記キレート試薬の溶液中の濃度については、ポリアミンオキシダーゼの安定化効果が発揮され、かつ酵素を含む試薬を取り扱う上で不都合のない範囲内であれば特に限定されないが、好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で用いられる。【００３８】
さらに、前記アルコール化合物と前記キレート試薬を併用することにより、ポリアミンオキシダーゼを安定化させることができる。前記アルコール化合物と前記キレート試薬は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。【００３９】
このとき、必要により、その他の試薬が共存していてもよい。通常、アルコール化合物及び／又はキレート試薬、ポリアミンオキシダーゼ及び他の試薬等が添加された固体粉末若しくはそれらの溶液をそれぞれ適宜混合することにより共存させることができる。【００４０】
本発明の安定化方法に用いられるポリアミンオキシダーゼの濃度は、特に制限されないが、例えば、溶液の場合、０．０５〜１０００ Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１００ Ｕ／ｍｌである。この酵素溶液には、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）等の過酸化水素検出試薬、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳやＷＳＴ−８（ホルマザン試薬）等の酸化還元系発色試薬、カタラーゼ等の酵素、ジアセチルスペルミン等の各種ポリアミン類のいずれか１つ以上を含有させることもできる。【００４１】
一般に酵素は、保存時のｐＨによりその安定性が大きく影響を受けるため、安定なｐＨ域の種々の緩衝液を同時に用いることが好ましい。本発明の酵素の安定化において用いられる緩衝液の種類及びその濃度、ｐＨは特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ６〜１０の間で緩衝能を有し、かつ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定されていることが望ましい。この様な緩衝液として、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の有機酸系緩衝液、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などを使用することもできる。【００４２】
酵素を保存する際の緩衝液の濃度については特に限定されないが、好ましくは５〜５００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜１００ｍＭである。本発明のアルコール化合物及び／又はキレート試薬を緩衝液に添加する場合は、直接添加するか、又は、例えば、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ６〜８に調整したそれらの水溶液を添加すればよい。アルコール化合物及び／又はキレート試薬を添加することにより、ｐＨが目的とする範囲から外れるときは、例えば、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等の添加によりｐＨが目的の範囲内におさまるように調整するのが好適である。【００４３】
さらに、その他の試薬として、必要により、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリセロール、アミノ酸、界面活性剤、抗生物質、サルファ剤等の化学療法剤等を共存させてもよい。これらの試薬は、あらかじめ緩衝液に添加しておいてもよい。【００４４】
安定性の評価は、実際に用いる酵素の保存条件、輸送条件及び測定条件などに即した種々の条件下に、ポリアミンオキシダーゼを保存、放置して、経時的にその変化を測定することにより行なわれるが、一般に、短時間で評価を行うために、通常、加速試験が用いられる。例えば、一定の高温下にポリアミンオキシダーゼを保温して、経時的にその変化を測定する方法などが挙げられる。【００４５】
［安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤］
この様にして、アルコール化合物及び／又はキレート試薬を共存させることにより、ポリアミンオキシダーゼ、特にジアセチルスペルミンオキシダーゼを安定化することができる。この安定化方法を用いて、アルコール化合物及び／又はキレート試薬と、ポリアミンオキシダーゼを含有する安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤を製造することができる。【００４６】
例えば、アルコール化合物を１〜１０％、及び／又はキレート試薬を１〜５０ｍＭの濃度で含有する、ｐＨ６〜１０の緩衝液を調製し、この緩衝液にポリアミンオキシダーゼを濃度が０．０５〜１０００Ｕ／ｍｌとなるように添加する。次に、ＦＡＤなどの補酵素を０．０１〜１０ｍＭとなるように添加してもよい。さらに、必要により、例えば、ペルオキシダーゼを１０〜１０００Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳを０．０５〜５ｍＭ、４−アミノアンチピリンを０．１〜２０ｍＭとなるように加えてもよい。この混合液を撹拌し、ポリアミンオキシダーゼ製剤を製造することができる。【００４７】
さらに、必要により、この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよい。このようにして得られたポリアミンオキシダーゼ製剤は、従来の方法により製造された製剤に比べて著しく安定化されており、本発明の方法により、簡単な方法でかつ安価に、安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤を製造することができる。【００４８】
［ポリアミンオキシダーゼの精製方法］
また、この安定化方法を用いて、精製したポリアミンオキシダーゼを製造することができる。酵素の精製法としては、通常の酵素精製に用いられる方法が使用でき、例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。例えば、これらの精製工程のいずれか１工程若しくは複数の工程において、アルコール化合物及び／又はキレート試薬を添加、共存させることによってポリアミンオキシダーゼを安定化した状態で単離精製することができる。これにより酵素を高い回収率で製造することが可能となる。【００４９】
さらに具体的には、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のジアセチルスペルミンオキシダーゼは、ダイノーミルによる菌体破砕、硫安沈殿、透析、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過等を組み合わせて精製するが、これらの工程のいずれか１工程若しくは複数の工程においてアルコール化合物及び／又はキレート試薬を添加、共存させることによりジアセチルスペルミンオキシダーゼを安定化した状態で単離精製することができる。【００５０】
さらに、この安定化方法を用いて、Ｎ１−アセチルスペルミジンを効率よく製造することができる。例えば、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のように、ジアセチルスペルミンに対してジアセチルスペルミンオキシダーゼを作用させることにより、Ｎ１−アセチルスペルミジンを得ることができるが、このとき反応系にアルコール化合物及び／又はキレート試薬を添加、共存させることによってジアセチルスペルミンオキシダーゼが安定化されるため、より少量の酵素で反応を行うことが可能となり、産業上有利である。【００５１】
上記の反応は、通常緩衝液中で行うが、必要に応じ、カタラーゼ等の過酸化水素消去酵素やアジ化ナトリウム等の防腐剤を添加してもよい。緩衝液としては、ｐＨ５〜１０の通常の緩衝液であれば特に限定さないが、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の有機酸系緩衝液、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることができる。反応時間はいかなる時間でもよいが、１時間から３日間、好ましくは３時間から２日間程度で反応を停止させるのが好ましい。【００５２】
［ポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良］
本発明において、「ポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良」とは、ポリアミンオキシダーゼの「ジアセチルスペルミンに対する反応性」の「その他のポリアミンに対する反応性」に対する比、すなわち、「ジアセチルスペルミンに対する反応性／その他のポリアミンに対する反応性」を向上させることをいう。ここでいう「その他のポリアミン」とは、例えば、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、スペルミン、スペルミジンなどを指す。【００５３】
基質特異性の評価は、酵素活性の測定に用いる反応液に添加する基質の種類を変えて酵素活性を測定し、ジアセチルスペルミンに対する反応性とその他のポリアミンに対する反応性を比較することにより行う。ここでいう「その他のポリアミン」とは、例えば、Ｎ１−アセチルスペルミン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、スペルミン、スペルミジンなど測定する方法などが挙げられる。簡易的な評価を行うために、ジアセチルポリアミンに対する反応性と１種類のその他のポリアミン（例えば、Ｎ１−アセチルスペルミジン）に対する反応性を比較して評価することもできる。【００５４】
本発明において、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性を改良するために使用する界面活性剤とは、親水基と親油基（疎水基）とで構成されており、水に溶けて水の表面張力を低下させる活性を示す物質であり、そのような化合物であれば如何なる化合物でも用いることができる。一般的に、親水基の種類によって界面活性剤は、アニオン界面活性剤（陰イオン界面活性剤）、カチオン界面活性剤（陽イオン界面活性剤）、非イオン性界面活性剤（ノニオン界面活性剤）、両性界面活性剤の４種に分類されている。【００５５】
アニオン界面活性剤（陰イオン界面活性剤）とは、水中で電離して有機陰イオンとなるものであり、例えば、界面活性剤の分子中の親油基をＲとすると、ＲＣＯＯＮａ、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａなどがある。【００５６】
カチオン界面活性剤（陽イオン界面活性剤）とは、水中で電離して有機陽イオンとなるものであり、例えば界面活性剤の分子中の親油基をＲ、ハロゲンをＸとすると、Ｒ−ＮＨ３Ｘ、［Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ］Ｘ（第４級アンモニウム塩）、（Ｃ５Ｈ５−Ｎ）ＲＸ（アルキルピリジニウム塩）などがある。【００５７】
非イオン性界面活性剤（ノニオン界面活性剤）とは、親水基が非イオン性のものであり、親水基としてよく用いられるものとして、例えば、オキシエチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、ソルビタン、ショ糖のエステル、グリセリン誘導体のモノグリセリドなどがあり、例えば、界面活性剤の分子中の親油基をＲとすると、ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ、ＲＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈなどがある。【００５８】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両方をあわせもっているものである。【００５９】
各種界面活性剤の中でも、特に非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤はポリアミンオキシダーゼの基質特異性を向上させるためにより好ましく用いられる。さらに具体的には、非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５ ［ｐ−ｔｅｒｔｉａｒｙ  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ−Ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙ  Ｅｔｈａｎｏｌｓ］、Ｔｗｅｅｎ ２０ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ］、Ｔｗｅｅｎ ４０ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ］、Ｔｗｅｅｎ ８０ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ］、Ｔｗｅｅｎ  ８５ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ］、Ｂｒｉｊ ３５ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２３）Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ］、Ｂｒｉｊ ５８ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｃｅｔｙｌ Ｅｔｈｅｒ］、Ｂｒｉｊ ７８ ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｔｅａｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、エマルゲン９１３ （Ｎｏｎｙｌ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）などが挙げられ、両性界面活性剤として、例えば、３‘−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＡＰＳＯ）などが挙げられる。【００６０】
上記界面活性剤は、それぞれ単独でも複数組み合わせても用いることができる。【００６１】
ポリアミンオキシダーゼと前記界面活性剤を同一の試薬内にあらかじめ混合し、共存する形で用いることができる。若しくは、ポリアミンオキシダーゼによる反応が進行するときに前記界面活性剤が存在していればよいので、例えば、ポリアミンオキシダーゼを含有する試薬Ａと前記界面活性剤を含有する試薬Ｂをそれぞれ別途調製し、これらを適宜混合して、前記界面活性剤存在下でポリアミンオキシダーゼ反応を進行させることもできる。ポリアミンオキシダーゼと共存するときの前記界面活性剤の濃度については特に限定されず、各化合物について適切な基質特異性改良効果が認められる濃度で添加することができる。好ましくは０．００１〜２０％、より好ましくは０．０１〜５％の濃度で用いられる。【００６２】
本発明の界面活性剤による基質特異性の改善において用いられる緩衝液の種類及びその濃度、ｐＨは特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ５〜１０の間で緩衝能を有し、かつ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定されていることが望ましい。この様な緩衝液として、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の有機酸系緩衝液、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などを使用することもできる。緩衝液の濃度については、例えば、好ましくは５〜５００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜１００ｍＭである。【００６３】
また、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性を改良するため、ｐＨ７．５未満にて酵素反応を行う方法も挙げられる。より好ましいｐＨ条件として、例えば、６．０以上７．５未満が挙げられる。本発明においては、同様にポリアミンオキシダーゼの基質特異性を改良する効果が得られる上記界面活性剤を共存させることもできる。【００６４】
ポリアミンオキシダーゼは、ｐＨ７．５未満、より好ましくはｐＨ６．０以上７．５未満の試薬内にあらかじめ含有される形で用いることができる。又は、ポリアミンオキシダーゼによる反応が進行するときにｐＨ７．５未満、より好ましくはｐＨ６．０以上７．５未満になっていればよいので、例えば、２種以上の試薬（いずれかがポリアミンオキシダーゼを含有する）をそれぞれ別途調製し、これらを適宜混合して、ｐＨ７．５未満、より好ましくはｐＨ６．０以上７．５未満の条件となるようにしてポリアミンオキシダーゼ反応を進行させることもできる。【００６５】
本発明の上記の界面活性剤存在下及び／又はｐＨ７．５未満にて酵素反応を行うことによる基質特異性の改良に用いられるポリアミンオキシダーゼの濃度は、特に制限されないが、例えば、溶液の場合、０．０５〜１０００ Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１００ Ｕ／ｍｌである。この酵素溶液には、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フェノール、ＴＯＯＳ、ＤＡ−６７等の過酸化水素検出試薬、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳやＷＳＴ−８（ホルマザン試薬）等の酸化還元系発色試薬、カタラーゼ等の酵素、ジアセチルスペルミン等の各種ポリアミン類のいずれか１つ以上が存在していてもよい。【００６６】
さらに、その他の試薬として、既に記載したような安定化剤であるアルコール化合物及び／又はキレート試薬やその他の試薬を共存させて用いることもできる。また、必要により、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリセロール、アミノ酸、抗生物質、サルファ剤等の化学療法剤等を共存させてもよい。【００６７】
さらに、上記の界面活性剤存在下及び／又はｐＨ７．５未満にて酵素反応を行うことによる基質特異性の改良方法を用いて、Ｎ１−アセチルスペルミジンを効率よく製造することができる。例えば、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のように、ジアセチルスペルミンに対してジアセチルスペルミンオキシダーゼを作用させることにより、Ｎ１−アセチルスペルミジンを得ることができるが、このとき反応系に基質特異性が向上しているため、生成物であるＮ１−アセチルスペルミジンがさらなるプトレッシンへの変換を受けにくくなり、回収率が向上するため、産業上有利である。【００６８】
［ジアセチルポリアミンの測定方法］
さらに本発明は、ポリアミンオキシダーゼを含有する試薬を試料に作用させて、ジアセチルポリアミンを測定する方法も含む。測定検体は特に限定されないが、例えば、尿、血清、食品やその抽出物等が挙げられる。測定検体中に含まれるジアセチルポリアミンの濃度についても特に限定されないが、例えば、１ｍＭ以下が挙げられるし、検体は適宜希釈することができる。用いるポリアミンオキシダーゼの量は、特に制限されないが、例えば、終濃度が０．０５〜１０００ Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１００ Ｕ／ｍｌとなるように添加すればよい。作用させるｐＨは特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、特に好ましくはｐＨ６．０以上７．５未満である。ｐＨの調整法は、特に限定されず、例えば、汎用的なトリス緩衝液やリン酸緩衝液を挙げることもできるし、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の有機酸系緩衝液、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のグッドバッファー、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などを使用することができる。この際、ポリアミンオキシダーゼの安定化剤であるアルコール化合物やキレート試薬、基質特異性改良剤である界面活性剤が適宜存在していてもよい。作用時間は、例えば、３０秒〜１２０分間、好ましくは１〜３０分間である。作用温度は、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。【００６９】
試料に添加するポリアミンオキシダーゼ溶液には、トリス、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン、グリシン、ホウ酸、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ、イミダゾール等の緩衝剤、ＦＡＤ等の補酵素、ポリアミンオキシダーゼの安定化剤であるアルコール化合物やキレート試薬、ポリアミンオキシダーゼの基質特異性改良剤である界面活性剤が添加されていてもよい。また、必要により、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ＢＳＡ、グリセロール、アミノ酸等を共存させてもよい。この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよい。【００７０】
ポリアミンオキシダーゼの反応による生成物は、いかなる方法により測定してもよい。例えば、生成する過酸化水素は、ペルオキシダーゼ及び適当な発色試薬、発光試薬を用いる酵素的測定法、若しくは酵素電極を用いる電気的方法等で測定することができる。また、生成するアルデヒドをアルデヒドオキシダーゼやアルデヒドデヒドロゲナーゼと適当な発色試薬を組み合わせて測定することもできる。例えば、酵素を用いる反応生成物の検出試薬には、トリス、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン、グリシン、ホウ酸、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ、イミダゾール等の緩衝剤、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フェノール、ＴＯＯＳ、ＤＡ−６７等の過酸化水素検出試薬、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳやＷＳＴ−８（ホルマザン試薬）等の酸化還元系発色試薬、カタラーゼ等の酵素のいずれか１つ以上を含有させることができる。これに、ポリアミンオキシダーゼの安定化剤であるアルコール化合物やキレート試薬、基質特異性改良剤である界面活性剤を適宜添加してもよい。また、必要により、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム等の各種無機塩、デキストラン等の多糖類、ＢＳＡ、グリセロール、アミノ酸等を共存させてもよい。この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよい。【００７１】
ポリアミンオキシダーゼ反応の生成物の測定を行う際、ポリアミンオキシダーゼ反応とその生成物の検出を同時に行うことも可能である。前述の反応生成物の検出試薬に、ポリアミンオキシダーゼを０．０５〜１０００ Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１００ Ｕ／ｍｌとなるように添加することが好ましい。この液状の製剤を凍結乾燥や噴霧乾燥してもよい。【００７２】
ジアセチルポリアミンの測定に用いる検体の量、上記の各試薬の添加量、比率については特に限定されない。【００７３】
［ジアセチルポリアミンの測定試薬］
さらに本発明では、上記測定方法に使用されるジアセチルポリアミンの測定試薬を提供する。ジアセチルポリアミンの測定試薬は上述の各試薬を異なる容器に含むものとして調製すればよく、例えば、液状品、又は液状品の凍結物若しくは凍結乾燥品として提供できる。あるいは、アルコール化合物及び／又はキレート試薬、及び／又は界面活性剤とポリアミンオキシダーゼを含有する測定試薬を調製することも可能である。【００７４】
［モノアセチルポリアミンを製造する方法］
さらに、これまで記載したポリアミンオキシダーゼの安定化方法、及び／又はポリアミンオキシダーゼの基質特異性の改良方法を用いて、ジアセチルポリアミンへポリアミンオキシダーゼを作用させてモノアセチルポリアミンを製造することが可能である。【００７５】
以下、実験例及び実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。本発明の技術的範囲は、これらの例により何ら限定されない。
【実施例１】
【００７６】
（ポリアミンオキシダーゼの活性測定法）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌ、７．０ｍＭ  ポリアミン（例えば、ジアセチルスペルミン）溶液  ０．１ｍｌ、１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液  ０．０４ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（キッコーマン社製）溶液  ０．０４ｍｌ、１．７６％（ｗ／ｖ）  ４−アミノアンチピリン溶液  ０．０２ｍｌの混合液を３７℃で５分間インキュベートした。酵素は希釈液Ａ［１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］若しくは希釈液Ｂ［１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］にて適宜希釈した。酵素サンプル  ０．０５ｍｌを反応液に添加、混合した。全容１．１５ｍｌを３７℃で３分間反応させ、反応開始から３分間の、反応溶液の５５５ｎｍにおける吸光度の変化を、分光光度計を用いて測定した。ジアセチルスペルミンオキシダーゼの酵素１Ｕは、上記測定条件下において、ジアセチルスペルミンを基質とするときに１分間あたり１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量とした。なお、本条件におけるミリモル分子吸光係数を１．５７ｃｍ２／μｍｏｌとした。なお、本測定方法は一例を示したものであり、活性測定の試薬の種類や濃度、ｐＨについては何ら制限するものではない。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の代わりにリン酸緩衝液等を用いることもできる。【００７７】
（ポリアミンオキシダーゼの安定性試験）
ポリアミンオキシダーゼの安定性試験は、各種試薬を添加した５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で酵素サンプルを希釈し、３０℃保存による加速試験後の残存活性を比較して行った。加速試験を行った後の該酵素溶液の残存活性は、該酵素溶液調製時における吸光度変化量を１００％としたときの相対量（％）として表した。【００７８】
（各種アルコール化合物の安定化効果の確認）
５％若しくは１０％の各種アルコール化合物を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ調製した。これらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液０．１Ｕ／ｍｌをそれぞれ調製した。なお、比較例として、アルコール化合物を含有しない５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記酵素溶液０．１Ｕ／ｍｌを調製した。各酵素溶液について３０℃、６時間の加速試験を行い、その結果を表１に示した。このように各種アルコール化合物について安定化効果が認められた。特開平５−２１１８６９に記載のように、エタノール等の有機溶媒の添加は酵素を失活させやすいと考えるのが一般的であるが、今回、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノールのような有機溶媒も本酵素の安定化剤として利用可能であることが示された。【００７９】
【表１】
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【実施例２】
【００８０】
（各種キレート試薬の安定化効果の確認）
１ｍＭ若しくは５ｍＭの各種キレート試薬を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ調製した。これらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液、キャンディダ・グラブラタ  Ｎｏｄａ１６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液、及び「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」，（英国），２０００年，４７６巻，ｐ．１５０−１５４に記載のキャンディダ・ボイディニイ  ＮＢＲＣ  １０５７４由来ポリアミンオキシダーゼ溶液を０．１Ｕ／ｍｌとしてそれぞれ調製した。【００８１】
なお、比較例として、キレート試薬を含有しない５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記各種酵素溶液０．１Ｕ／ｍｌを調製した。各酵素溶液について３０℃、１２時間の加速試験を行い、その結果を表２に示した。このように各種キレート試薬について、３種すべての酵素に対する安定化効果が認められた。なお、ＥＤＴＡの添加濃度が１ｍＭ及び５ｍＭ添加のときは、安定化効果はほぼ同等であった。【００８２】
【表２】
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【実施例３】
【００８３】
（アルコール化合物とキレート試薬の共存効果）
アルコール化合物である１０％（ｖ／ｖ）エタノール、及び／又はキレート試薬である５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ調製した。これらの各種試薬を含有する緩衝液を用いて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液０．１Ｕ／ｍｌをそれぞれ調製した。なお、比較例として、試薬を含有しない５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記酵素溶液０．１Ｕ／ｍｌを調製した。各酵素溶液について３０℃、６時間の加速試験を行い、加速試験後の酵素活性を測定した。加速試験前の酵素活性と比較して、加速試験後の安定性を評価し、その結果を図１に示した。アルコール化合物であるエタノール、及びキレート試薬であるＥＤＴＡを共存させることによりジアセチルスペルミンオキシダーゼがさらに安定に保持された。
【実施例４】
【００８４】
（安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤の製造）
１０％（ｖ／ｖ）  エタノール及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ９ｍｌ、１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液  ０．４ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（キッコーマン社製）溶液  ０．４ｍｌ、１．７６％（ｗ／ｖ）  ４−アミノアンチピリン溶液  ０．２ｍｌ、０．５Ｕ／ｍｌ  ジアセチルスペルミンオキシダーゼ［デバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８記載のとおり］０．５ｍｌを混合し、よく撹拌して、ポリアミンオキシダーゼ製剤（溶液）を製造した。対照製剤として、安定化剤を除いたポリアミンオキシダーゼ製剤を調製した。本発明製剤と対照製剤について、３０℃、２４時間の虐待試験を行い、その結果を図２に示した。対照製剤は、酵素活性がほとんど失われているのに対して、本発明製剤は、酵素活性が安定に保持されていた。
【実施例５】
【００８５】
（安定化されたジアセチルスペルミンオキシダーゼを用いるモノアセチルポリアミンの製造）
１０％（ｖ／ｖ）エタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／ｍｌ  カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）及び７ｍＭ  ジアセチルスペルミン・２塩酸塩（１５０ｍｇ）を含有する６０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、ジアセチルスペルミンオキシダーゼ［デバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のとおり］を１Ｕ／ｍｌとなるように添加した。３０℃で２日間インキュベートし、ＴＬＣでＮ１−アセチルスペルミジンの生成を確認した（クロロホルム：メタノール：アンモニア水：水＝２：４：１：１、ニンヒドリン発色）。【００８６】
セントリプレップ１０（アミコン社製）を用いて水で透析し、酵素タンパクを除去した。透析外液を陽イオン交換樹脂［ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗ−Ｘ４（Ｈ＋）］カラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に通し、反応生成物を吸着させた。水で洗浄後、１Ｍ  アンモニアで溶出させた。溶出液を減圧濃縮した後、クロロホルム：メタノール＝１：１の溶媒に溶解させて、シリカゲルカラムカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）に吸着させた。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール（１：１〜０：１）を用いて溶出させ、Ｎ１−アセチルスペルミジン溶出画分に塩酸を添加した後減圧濃縮し、８２ｍｇのＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩を得た（収率７６％）。【００８７】
上記の８２ｍｇのＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩をエタノールで再結晶し、５２ｍｇのＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩を得た（収率４７％）。融点と１Ｈ,１３Ｃ−ＮＭＲの測定値は文献既知の値（「Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ」，（デンマーク），１９８９年，４３巻，ｐ．９９０−９９４）と一致した。かくして、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のＮ１−アセチルスペルミジンの製造方法では２Ｕ／ｍｌのジアセチルスペルミンオキシダーゼを用いていたが、今回、安定化剤を用いることにより、半分の酵素量で同量のＮ１−アセチルスペルミジン２塩酸塩を得ることができた。
【実施例６】
【００８８】
（各種界面活性剤の基質特異性改良効果の確認）
０．３％の各種界面活性剤を含有する０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をそれぞれ調製した。これらの各種界面活性剤を含有する緩衝液を用いて、前記のポリアミンオキシダーゼの活性測定法にて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液及びキャンディダ・グラブラタ  Ｎｏｄａ１６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼについて、ジアセチルスペルミン及びＮ１−アセチルスペルミジンに対する酵素活性を測定、比較した。その結果を表３に示した。このように各種界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤を添加することにより、基質特異性の改善効果が認められた。【００８９】
【表３】
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【実施例７】
【００９０】
（ｐＨ条件の基質特異性改良効果の確認）
ｐＨ６．５〜７．５の０．２Ｍ  リン酸緩衝液をそれぞれ調製した。これらの緩衝液を用いて、前記のポリアミンオキシダーゼの活性測定法にて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液及びキャンディダ・グラブラタ  Ｎｏｄａ１６２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０２）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼについて、各種ポリアミンに対する酵素活性を測定、比較した。その結果を表４に示した。このようにｐＨを７．５未満にすることにより、基質特異性の改善効果が認められた。【００９１】
【表４】
0005166259.tif 000009
【実施例８】
【００９２】
（界面活性剤の添加とｐＨ条件を組み合わせた基質特異性改良効果の確認）
０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）を調製し、前記のポリアミンオキシダーゼの活性測定法にて、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１０６４８に記載のデバリオミセス・ハンセニイ  Ｔｓｕｋｕｂａ４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６０３）由来ジアセチルスペルミンオキシダーゼ溶液について、各種ポリアミンに対する酵素活性を測定、比較した。その結果を表５に示した。このようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、かつｐＨを７．５未満とすることにより、さらなる基質特異性の改善効果が認められた。なお、いずれの条件においてもプトレッシンには反応しなかった。【００９３】
【表５】
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【実施例９】
【００９４】
（ポリアミンオキシダーゼを含有する試薬を用いる、ジアセチルポリアミンの測定方法。）
第１試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）      ５０ｍＭ
ＤＡ−６７                      ０．０５ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００          ０．０４％
アジ化ナトリウム                ０．０９％
第２試薬
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）            ５０ｍＭ
ジアセチルスペルミンオキシダーゼ（デバリオミセス由来）  ２４Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）    １５Ｕ／ｍＬ【００９５】
生理食塩水で希釈調製したジアセチルスペルミン試料（１２５ｎＭ〜５００ｎＭ）各１０μＬに第１試薬８０μＬを混和し、３７℃で５分間加温した。続いて第２試薬３０μＬを添加し、５分間反応させた後の６５８ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図３に示した。かくして、ジアセチルスペルミンオキシダーゼを用いた試薬でジアセチルスペルミンを簡便かつ短時間に測定することができることがわかった。
【実施例１０】
【００９６】
（ポリアミンオキシダーゼを含有する試薬を用いる、尿検体中のジアセチルポリアミンの測定方法。）
第１試薬
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．７）      ５０ｍＭ
ＴＯＯＳ                        １ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００          １．５％
ＫＣｌ                          ７０ｍＭ
カタラーゼ                      ３００Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ      ３Ｕ／ｍＬ
第２試薬
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．７）          ５０ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００              １．５％
ＫＣｌ                              ７０ｍＭ
４−アミノアンチピリン              ４ｍＭ
ジアセチルスペルミンオキシダーゼ（デバリオミセス由来）  ２４Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  １５Ｕ／ｍＬ
アジ化ナトリウム                    ０．０９％
【００９７】
尿検体にジアセチルスペルミン（３２ｎＭ〜５００ｎＭ）を添加して調整した試料各１０μＬに、第１試薬８０μＬを混和し、３７℃で５分間加温した。続いて第２試薬３０μＬを５分間反応させた後の５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図４に示した。
かくして、ジアセチルスペルミンオキシダーゼを用いた試薬で尿試料中のジアセチルスペルミンを測定することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の安定化方法を用いて、アルコール化合物及び／又はキレート試薬とポリアミンオキシダーゼを含有する安定化されたポリアミンオキシダーゼ製剤を、簡単な方法でかつ安価に製造することができる。また、本発明の基質特異性の改良方法を用いて、界面活性剤とポリアミンオキシダーゼを含有する基質特異性が改良されたポリアミンオキシダーゼ製剤を、簡単な方法でかつ安価に製造することができる。さらに、ジアセチルポリアミン測定用試薬を簡単な方法でかつ安価に製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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