(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
0005292824.tif 000008
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ｒ２はＣ１−４のアルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基を表す。）
で示されるオルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を式（２）の光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物に還元する能力を有し、下記微生物群から選ばれる微生物又はその処理物と接触させることを特徴とする、式（２）：
0005292824.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ意味を表し、＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子である。）
で示される光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物の製造方法。
微生物群：アクアスピリラム（Aquaspirillum）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、およびステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属からなる微生物群。
【請求項２】
前記微生物が、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii）、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia）、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum）、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum）、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis）、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）、またはステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii ）subsp.  nipponicum IFO 13615t、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris） IFO 13551、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia） JCM 1975t、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum） JCM 1344t、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum） JCM 1345t、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum） JCM 1480t、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum） JCM 1350t、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）JCM 7456、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）IFO 13935t、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）JCM 7509、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7511、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7515、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7519、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7512、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7520、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.） JCM 7513、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）JCM 7514、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）JCM13333、またはステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785)である請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性なオルト置換マンデル酸化合物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、フェニル基のオルト位に置換基を有する光学活性マンデル酸化合物を製造する方法としては、対応するオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物とルテニウムを含む不斉触媒とにより化学合成する方法（例えば、非特許文献１参照）等が知られているが、得られるアルコールの光学純度が、必ずしも満足の行くものではない。また、立体的に込み入った環境にあるカルボニル基を有するフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して良好な光学収率で対応する光学活性なマンデル酸化合物を製造する方法は知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】オーガニックレターズ（Organic Letters） (2005), 7(24), 5425-5427
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物から良好な光学収率で光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
１．式（１）：
0005292824.tif 000002
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−４のアルコキシで置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基を表す。）
で示されるオルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を式（２）の光学活性なオルト置換マンデル酸化合物に還元する能力を有し、下記微生物群から選ばれる微生物又はその処理物と接触させることを特徴とする、式（２）：
0005292824.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ意味を表し、＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子である。）
で示される光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物の製造方法。
微生物群：アクアスピリラム（Aquaspirillum）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、およびステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属からなる微生物群；
２．前記微生物が、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii）、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia）、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum）、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum）、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis）、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）、またはステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
３．前記微生物が、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii ）subsp.  nipponicum IFO 13615t、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris） IFO 13551、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia） JCM 1975t、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum） JCM 1344t、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum） JCM 1345t、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum） JCM 1480t、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum） JCM 1350t、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）JCM 7456、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）IFO 13935t、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）JCM 7509、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7511、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7515、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7519、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7512、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7520、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.） JCM 7513、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）JCM 7514、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）JCM13333、またはステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785)であることを特徴とする前項１記載の製造方法；等を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を良好な光学収率で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
式（１）のオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物、及び、式（２）のオルト置換マンデル酸化合物において、Ｒ１で表される置換基について説明する。
Ｒ１で表される置換されていてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基の他に、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などＣ１−６のアルキルアミノ基が例示される。また、置換されていてもよいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基およびオクチルオキシ基などのＣ１−８のアルコキシ基を挙げることができる。
次にＲ２で表される置換基について以下説明する。
Ｒ２で表されるＣ１−８のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基およびオクチル基などが例示される。
また、Ｃ１−４のアルコキシで置換されたＣ１−８のアルキル基としては、メトキシメチル基、メトキシエチル基、メトキシプロピル基、メトキシブチル基、メトキシペンチル基、メトキシヘキシル基、メトキシヘプチル基、メトキシオクチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、エトキシプロピル基、エトキシブチル基、エトキシペンチル基、エトキシヘキシル基、エトキシヘプチル基、エトキシオクチル基、プロポキシメチル基、プロポキシエチル基、プロポキシプロピル基、プロポキシブチル基、プロポキシペンチル基、プロポキシヘキシル基、プロポキシヘプチル基、プロポキシオクチル基、ブトキシメチル基、ブトキシエチル基、ブトキシプロピル基、ブトキシブチル基、ブトキシペンチル基、ブトキシヘキシル基、ブトキシヘプチル基、および、ブトキシオクチル基などが例示される。
【０００８】
式（１）の化合物としては、Ｒ１で表される置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基が、置換されていてもよいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、あるいは、エトキシ基が好ましい。また、Ｒ２で表されるＣ１−８のアルキル基としては、メチル基が好ましく、Ｃ１−４のアルコキシで置換されたＣ１−８のアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基が好ましい。式（１）の化合物としては、２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド、２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルが好ましい化合物として例示される。
本発明の方法では、前記のようなオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物を基質とした場合に得られる式（２）の光学活性なオルト置換マンデル酸化合物としては、具体的には、それぞれ２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチル、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチルの光学活性体が挙げられる。
【０００９】
本発明製造方法において用いられる微生物の菌体又はその処理物は、式（１）で示されるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物を式（２）で示される光学活性なオルト置換マンデル酸化合物に還元する能力を有する微生物の菌体又はその処理物であればよく、例えば、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii）等のアクアスピリラム属に属する微生物、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia）等のキサントモナス属に属する微生物、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum）、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum）等のクルトバクテリウム属に属する微生物、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）等のフラボバクテリウムに属する微生物、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis）、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）等のスフィンゴモナス属に属する微生物、或いは、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）、ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）などのステノトロフォモナス属に属する微生物等の菌体又はその処理物を挙げることができる。
さらに具体的には例えば、アクアスピリラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii ）subsp.  nipponicum IFO 13615t、キサントモナス・キャンペスツリス（Xanthomonas campestris） IFO 13551、キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia） JCM 1975t、クルトバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum） JCM 1344t、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum） JCM 1345t、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum） JCM 1480t、クルトバクテリウム・プシラム（Curtobacterium pusillum） JCM 1350t、フラボバクテリウム・フラベスセンス（Flavobacterium flavescens）JCM 7456、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）IFO 13935t、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）JCM 7509、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7511、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7515、スフィンゴモナス・ポウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis） JCM 7519、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7512、スフィンゴモナス・パラポウシモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis） JCM 7520、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）JCM 7513、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）JCM 7514、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas  rhizophila）JCM13333、ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785  受託日：2007年2月21日)の菌体又はその処理物が挙げられる。
【００１０】
ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７８５の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１９年２月２１日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、２４時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．７〜０．８×１.５〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陰性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：淡黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁スムーズ
コロニーの隆起：レンズ状
透明度  ：不透明
３．生理学的性質
（１） カタラーゼ：陽性
（２） オキシダーゼ：陰性
（３） ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas rhizophila）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。国際塩基配列データベースを用いたＢＬＡＳＴ検索においても、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属由来１６ＳリボゾームＤＮＡと高い相同性を示した。
以上の菌学的性質により、本菌はステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）と同定された。
【００１１】
このような微生物の菌体又はその処理物は、触媒量用いることにより、式（１）で示される化合物のカルボニル基を選択的に不斉還元できる。
【００１２】
次に、本微生物の調製方法について説明する。
本微生物は、炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物を培養するための培地を用いて培養すればよい。
【００１３】
当該培地に含まれる炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、グリセロール、でんぷん、有機酸又は廃糖蜜が挙げられ、窒素源としては、例えば、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティプリカー（corn steep liquor）、綿実粉、乾燥酵母、硫安又は硝酸ナトリウムが挙げられ、有機塩及び無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸カルシウム、酢酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄又は塩化コバルトが挙げられる。
【００１４】
培養方法としては、例えば、固体培養、液体培養（例えば、試験管培養、フラスコ培養、ジャーファーメンター培養等）が挙げられる。
培養温度及び培養液のｐＨは、本微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は約１５〜４５℃の範囲、培養液のｐＨは約４〜８の範囲を挙げることができる。培養時間は、培養条件により適宜選択することができるが、通常、約１〜７日間である。
【００１５】
本微生物の菌体は、そのまま本発明製造方法の用いることができる。本微生物の菌体をそのまま用いる方法としては、（１）培養液をそのまま用いる方法、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、集められた菌体（必要に応じて、緩衝液又は水で洗浄した後の湿菌体）を用いる方法等を挙げることができる。
【００１６】
また本発明製造方法において、本微生物の菌体処理物を用いることもできる。当該菌体処理物としては、例えば、培養して得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの若しくはアルカリ処理したもの、又は、菌体を物理的若しくは酵素的に破砕したもの、又は、これらのものから分離・抽出された粗酵素や、精製酵素等を挙げることができる。さらに、菌体処理物には、前記処理を施した後、公知の方法により固定化処理したものも含まれる。固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００１７】
本発明製造方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記す。）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。
また本発明製造方法は、さらに疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物が挙げられる。また本発明製造方法は、さらに親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００１８】
本発明製造方法は、通常、水層のｐＨが３〜１０の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【００１９】
本発明製造方法は、通常、約０〜６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【００２０】
本発明製造方法は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物であるカルボニル化合物の添加終了後、例えば、反応液中の当該カルボニル化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
【００２１】
本発明製造方法における原料化合物であるカルボニル化合物の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）の以下であり、反応系中のカルボニル化合物濃度をほぼ一定に保つために、当該カルボニル化合物を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【００２２】
本発明製造方法では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
【００２３】
反応終了後、反応液を有機溶媒抽出、濃縮等の通常の後処理を行うことにより、前記カルボニル化合物に対応したアルコールを反応液から回収すればよい。回収されたアルコールは、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することもできる。
【００２４】
また、本発明製造方法は、通常、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在下に行われる。本発明製造方法における原料化合物であるカルボニル化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+と記す）又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+は、還元型（ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としてのグルコース脱水素酵素はＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する際、基質としてグルコースを要するものであり、グルコースを酸化し、グルコノラクトンに変換する能力を有するタンパク質又はそのタンパク質を発現する微生物又はその処理物であってもよい。
また、ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。ここで処理物とは、前述にある「菌体処理物」と同等なものを意味する。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明製造方法を実施例により詳細に説明するが、本発明製造方法はこれらの例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１  （本発明製造方法による、２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドからの光学活性２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの製造例）
（１）２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
テトラヒドロフラン５０ｇとマグネシウム７．３ｇの混合液中に２−ブロモトルエンを４．４ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、２−ブロモトルエン４５ｇのテトラヒドロフラン（１３０ｇ）溶液を滴下し、２−ブロモトルエンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しグリニヤール試薬を調製した。
シュウ酸ジエチル８３ｇのトルエン（１７０ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したグリニヤール試薬を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で２時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２３４ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３４ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらに高真空下蒸留、シリカゲルカラム精製し、３３．１ｇの２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．６１（ｓ、３Ｈ）、４．３９−４．４７（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．７０（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル１８．１ｇとトルエン７２ｇ、メタノール３６ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２３．２ｇ添加し、２５℃で１時間保温した。その後、水を３６．２ｇ添加した後、有機層を回収した。５％塩酸１４３ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３６ｇ、水３６ｇでそれぞれ洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらにシリカゲルカラム精製し、１１．４ｇの２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．４８（ｓ、３Ｈ）、２．９６（ｄ、Ｊ＝５．１３Ｈｚ、３Ｈ）、７．１（６ｓ、１Ｈ）、７．２５−７．９３（ｍ、４Ｈ）
（３）微生物を用いた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）４ｍｌを入れ、これに表１で示された各種の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、０．８５％食塩水にて洗浄した後、湿菌体を得た。ねじ口試験管に２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド１．５ｍｇ、前記の湿菌体約１００ｍｇ、ＮＡＤＰＨ１０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）１．５ｍｌを添加し、３０℃で２３時間振とうした後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を留去し、油状の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  σ２．３７（Ｓ、３Ｈ）、２．７９（ｄ、Ｊ＝４．９６Ｈｚ、３Ｈ）、３．８７（１Ｈ）、５．１５（Ｓ、１Ｈ）、６．２１（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．２６（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドにアセトニトリルを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。また、得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した。転化率および光学純度分析の結果を表１に示す。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
２０  １０：９０
３０    １：９９
３０.１  ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１０．４分
【００２７】
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１６．０分
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：２０．１分、２３．３分
【００２８】
【表１】
0005292824.tif 000004
実施例２  （本発明製造方法による、２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルからの光学活性２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの製造例）
基質として２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例１（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．４３（Ｓ、３Ｈ）、３．５６（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３−４．２９（ｍ、２Ｈ）、５．３５（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．３０（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルにアセトニトリルを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。また、得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した。転化率および光学純度分析の結果を表２に示す。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
２０  １０：９０
３０    １：９９
３０.１  ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：１７．１分
【００２９】
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：８．９分
２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１１．６分、１３．３分
【００３０】
【表２】
0005292824.tif 000005
実施例３  （本発明製造方法による、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドからの光学活性２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの製造例）
（１）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液５９．８ｇを６０℃に昇温させ、o−ブロモベンジルブロマイド７０.４ｇとメタノール７０.４ｇの混合液を滴下し、６０℃で２時間保温した。室温にまで冷却後、トルエン２１１ｇと水２１１ｇを添加して攪拌し、分液後有機層を回収した。水層をトルエン２１１ｇにて３回抽出し、回収有機層と水２１１ｇを加えて、洗浄後、濃縮し、５５．３ｇの１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを得た。
テトラヒドロフラン４６．４ｇとマグネシウム５．４ｇの混合液中に１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを４.６ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼン４１．７ｇのテトラヒドロフラン（１３９ｇ）溶液を滴下し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しGrignard剤を調製した。
シュウ酸ジエチル６４．４ｇのトルエン（１７７ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したGrignard剤を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で４時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２１１ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３３ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、シリカゲルカラム精製し、さらに高真空下蒸留にて、３８．５ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．０８Ｈｚ、３Ｈ）、３．４４（ｓ、３Ｈ）、４．４１（ｑ、２Ｈ）、４．７５（ｓ、２Ｈ）、７．５５−７．６９（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル２８．３ｇとトルエン１０９ｇ、メタノール５４．４ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２８．６ｇ添加し、２５℃で２時間保温した。その後、水を５４．４ｇ添加した後、トルエンを８０ｇ追加し、静置後有機層を回収した。５％塩酸１７８ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５４．４ｇ、水５４．４ｇでそれぞれ洗浄した後、エバポレータ-にて濃縮し、１２．０ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．９５（ｄ、Ｊ＝５．１４Ｈｚ、３Ｈ）、３．２８（ｓ、３Ｈ）、４．６６（ｓ、２Ｈ）、７．０４（ｓ、１Ｈ）、７．３６−７．７２（ｍ、４Ｈ）
（３）微生物を用いた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを用いること以外は実施例１（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  σ２．７７（ｄ、Ｊ＝４．８５Ｈｚ、３Ｈ）、３．４７（Ｓ、３Ｈ）、４．３８（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８１（Ｓ、１Ｈ）、５．２３（Ｓ、１Ｈ）、７．１６（Ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．４３（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドにアセトニトリルを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。また、得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した。転化率および光学純度分析の結果を表３に示す。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
２０  １０：９０
３０    １：９９
３０.１  ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：９．２分
【００３１】
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１８．５分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：２０．４分、２１．０分
【００３２】
【表３】
0005292824.tif 000006
実施例４  （本発明製造方法による、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルからの光学活性２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの製造例）
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例１（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．０９Ｈｚ、３Ｈ）、３．３９（Ｓ、３Ｈ）、４．１６−４．２６（ｍ、２Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝６．３６Ｈｚ、２Ｈ）、５．３９（Ｓ、１Ｈ）、７．３１−７．３７（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルにアセトニトリルを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。また、得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した。転化率および光学純度分析の結果を表４に示す。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
２０  １０：９０
３０    １：９９
３０.１  ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１５．４分
【００３３】
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：９．３分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１２．８分、１３．６分
【００３４】
【表４】
0005292824.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により、光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を容易に製造することができる。