(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）細胞集団を培養する工程、
（ｂ）前記細胞プールから単一細胞を単離する工程、および
（ｃ）アルブミン−トランスジェニック生細胞によって培地中に直接的に分泌されるアルブミンを含む馴化培地中で前記単一細胞を培養する工程
を含む、単一哺乳動物細胞を培養する方法。
【請求項２】
工程（ｃ）のアルブミンが、２００mg/Ｌ未満の濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、培養の１日目から４日目の間に採取されたアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、培養の２日目に採取されたアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞上清が、１００万〜４００万個のアルブミン−トランスジェニック細胞／mlを有する細胞培養液から採取される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）における馴化培地が、アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞の添加によって産生される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
最大で５０００００個のアルブミン−トランスジェニックフィーダー細胞／mlが添加される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
アルブミン−トランスジェニックフィーダー細胞が、工程ｃ）の培地中に少なくとも２週間の期間にわたって持続的に残存する、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）における馴化培地が、工程（ｂ）および（ｃ）からの単一細胞がアルブミン−トランスジェニック細胞であるという事実によって産生される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）において
ａ）アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞が添加されるか、または
ｂ）培養の１日目から４日目の間に採取されたアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）対象のタンパク質をコードする対象の遺伝子を含む細胞集団を産生する工程、
ｂ）細胞の成長を許容する培養条件下においてこれらの細胞を培養する工程、
ｃ）容器中において単一細胞を単離および堆積させる工程、
ｄ）前記単一細胞を、馴化培地中で、
ｉ）培養の１日目から３日目の間に採取した、アルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清、または
ｉｉ）アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞
の存在下で培養する工程、
ｅ）対象のタンパク質のその発現レベルに対応する細胞を選択する工程、
ｆ）対象のタンパク質を収集する工程、および
ｇ）対象のタンパク質を精製する工程
を含む、細胞において対象のタンパク質を産生する方法。
【請求項１２】
単一細胞が、ハムスター細胞またはマウス細胞であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アルブミン−トランスジェニック生細胞が、個々に堆積させた細胞と同じ種に由来することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）および（ｃ）における単一細胞が対象のタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象のタンパク質が、治療タンパク質であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ｉ．培養の１日目から３日目の間に採取したアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清、または
ｉｉ．培養を馴化するためのアルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞
を含む、単一哺乳動物細胞の培養を可能とさせる無血清馴化培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、細胞培養技術の分野に関し、そしてバイオ医薬品の生産に重要な細胞を、好ましくは細胞株を複製／クローニングする方法に関する。本発明はまた、得られそして複製された細胞と、個々の細胞の複製を可能とする組成物とを使用した、タンパク質の調製法に関する。
【０００２】
背景
ヒトを処置するためのバイオ医薬品の市場は世界中において急速に成長している。現在９００を超えるバイオ医薬品が臨床試験において試験されており、２０１０年における推定される見込み売上高は５００億である(Datamonitor 2007)。現在、増加の一途をたどるバイオ医薬品は、哺乳動物細胞において生産されており、これは、これらがヒトタンパク質の正しいプロセシングおよび修飾の能力を有しているためである。それ故、哺乳動物細胞における高収率のバイオ医薬品の成功裏の生産が重要であり、そしてそれは製造方法に使用される組換えモノクローナル産生細胞株の特徴に依存する。さらに細胞株発達の期間が、バイオ医薬品がどれだけ早く臨床試験に入ることができるかに関する重要な時間因子である。これらの局面を考慮して、細胞株を発達させる方法を加速しそしてそれをより効率的なものとする緊急の必要性がある。
【０００３】
哺乳動物細胞における生物学的に活性なタンパク質または治療タンパク質（いわゆるバイオ医薬品）のバイオテクノロジーによる生産のために、対応する哺乳動物細胞を、生物学的に活性なタンパク質（またはそのサブユニット）をコードするＤＮＡを用いてトランスフェクションする。トランスフェクション方法の後、数百万個の異なってトランスフェクションされた細胞のプールが通常得られる。それ故、効率的な産生細胞株の調製のための重要な工程は、一方で非常に安定に成長し、他方で治療タンパク質の高い比産生性（産物形成など）を示す細胞クローンの選択および複製にある。数百万個の異なる産物発現細胞が存在するので、複数の細胞をハイスループットで自動化を使用して個々に分析し、これにより非常に頑強に成長しなおかつ高い産物力価を生じる適切な候補（単一細胞クローン）を選別できることが重要である。単一細胞の単離および継代培養のこの方法はクローニングまたはリクローニング（recloning）として知られている。
【０００４】
バイオ医薬品の生産のための動物細胞培養液の使用は、遺伝子型的におよび表現型的に相同な、すなわちモノクローナルな細胞培養液を要求する。これは、「限界希釈法」などのリクローニング技術によってまたは蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による個々の細胞の自動的堆積によって達成される。
【０００５】
しかしながら、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）などの効果的に複製する典型的な組換え産生細胞の問題が存在し、特にそれらが、リクローニング後に、無血清懸濁培養液中における、すなわち現代的な産生に関連する細胞培養条件下における成長に適合し、これにより細胞が無血清培養条件下においてマイクロタイタープレート中に個々に堆積される場合に存在する。
【０００６】
この理由は、細胞がin vivoにおいては組織基質に包埋されており、そして隣接細胞によって分泌される自己分泌およびパラ分泌の成長因子が供給されることである。それ故、それらは単独の成長に適合しておらず、そしてそれらが新たな条件にゆっくりと適合しないならば成長因子による刺激無しには死滅する。
【０００７】
特に、リクローニング工程における無血清培地または化学的に成分が規定された培地の使用は、制限されたリクローニング効率をもたらす、すなわち、堆積された細胞のほんの少しの比率しか生存してモノクローナル細胞株へと成長しない。
【０００８】
現在使用されている「限界希釈法」およびＦＡＣＳリクローニング技術は当技術分野において周知である。
【０００９】
「限界希釈法」では細胞懸濁液が連続的に希釈され、その後、細胞はマイクロタイタープレート中に１ウェルあたり異なる細胞数で堆積される。多数の細胞を含むウェルにおいては、多くのまたは全ての細胞が、自己分泌成長因子の適切な分泌の結果として生存する。１ウェルあたりに播種される細胞の数が少なければ少ないほど、生存する細胞の数は少なくなり、よって１ウェルあたりに統計学的に唯一つの細胞が生存してモノクローナル株へと成長するように希釈をこのように調整することができる。これらの個々の細胞クローンは視覚によりおよび／または画像処理技術によって検出され、そして細胞クローンをより大きな培養容器中で成長させる。
【００１０】
ＦＡＣＳ技術では、フローサイトメーターを使用して単一細胞クローンを生成する。このために細胞を層流に配置し、そしてマイクロタイター皿のウェルに個々に導く。このことから、生存しているコロニーが本当に個々のクローンであることが確かめられる。それ故、ＦＡＣＳ技術は、限界希釈法と比較して好ましい方法である。
【００１１】
リクローニング工程における無血清培地または化学的に成分が規定された培地の使用は、制限されたリクローニング効率をもたらす、すなわち、個々に堆積された細胞のほんの僅かな比率しかモノクローナル細胞株へと成長しない。
【００１２】
低いリクローニング効率においては、それ故、所望の数の個々のクローンを得るために多くのマイクロタイタープレートを単一細胞で充填しなければならず、これは時間を消費しかつ高額の費用がかかる（例えば培地、皿などの点において）。
【００１３】
低いリクローニング効率は、単一細胞クローンのその後の分析を自動化システムを使用して行なおうとするならば特に不利である。分析ロボットは通常、生細胞を含むウェルと死滅細胞を含むウェルとを識別できず、そしてマイクロタイタープレート中の全てのウェルを自動的に測定する。僅か１０％のリクローニング効率により、これは、９０％の場合においてロボットは空のウェルを分析し、そしてこのために生細胞クローンを分析するのと同じ量の試薬を使用するだろうことを意味する。それ故、ここでの例では、時間の９０％および材料費の９０％が全くデータが得られないままに浪費されている。
【００１４】
この問題を解決するために、過去には、血清（例えばウシ胎児血清、ＦＣＳ）が培地に加えられることが多かった。血清は、細胞の生存および増殖を支持する、様々な可溶性タンパク質と成長因子との成分の規定されていない混合物を含む。しかしながら、通常の理由から、血清などの成分の規定できない添加物の使用は、一部にはウシウイルスによる感染のリスクのために次第に許容性が低くなっている。それ故、完全に無血清における細胞株の産生が、通常の観点から最新技術である。
【００１５】
別の可能な解決は、リクローニングのために「限界希釈法」を行なうことである。この方法だけが、統計学的に単一細胞クローンの産生をもたらすが、多くのクローンがまた１つのウェルに成長し得るので、得られた細胞株が本当に唯一つの単一クローンを起源としたことを確実にするために、この方法を数回（通常２〜３回）繰り返さなければならない。これらの反復サイクルには高い労働費および時間費用を伴い、これは必要とされる費用およびタイムラインに対して負の作用を有する。
【００１６】
別のアプローチは「フィーダー」細胞の使用である。この名称は、英単語「フィード（feed）」に由来し、そして、培養液中の所望の細胞に栄養分および分泌成長因子を供給するように作用する通常は非分裂の細胞との共培養をいう。リクローニング効率を、フィーダー細胞によって有意に増加させることができる。
【００１７】
別のアプローチにおいては、組換えタンパク質をリクローニング培地に加えて、個々に堆積させた細胞の生存および成長を促進させる。使用される組換えタンパク質の例は、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。これらの添加物は、精製タンパク質またはタンパク質溶液として得られ、そして培地に添加される。この方法のデメリットは、費用、組換えタンパク質の入手可能性への依存、およびその不安定性である。デメリットは、とりわけ以下：
−それらを−７０℃に保存する必要があること、
−凍結／解凍サイクルにより不活性化される、それ故、それを回避しなければならないこと、
−培養条件下において溶液中で活性が急速に消失すること
を含む。
【００１８】
本発明の目的は、ＦＡＣＳに基づいた無血清での産生細胞のクローニングにおけるリクローニング効率を増加させることである。
【００１９】
発明の要約
無血清培地、好ましくは化学的に成分が規定された培地および／またはインシュリンを含まない培地における減少したリクローニング効率というこの技術的問題への解決は、トランスジェニックアルブミンもしくはＨＳＡ産生細胞の使用によって、またはこのようなＨＳＡ産生細胞により馴化された培地の使用によって得られる。従って、ＨＳＡは外から精製タンパク質として培地に添加されるのではなくむしろ、生細胞によってリクローニング培地中に直接放出される。
【００２０】
以下：
１．単一細胞の堆積のための馴化培地を調製するためのＨＳＡ産生細胞の使用、
２．フィーダー細胞としてのＨＳＡ産生細胞の使用。１回培地に添加された組換えＨＳＡの使用とは対照的に、マルチウェルプレートにおけるフィーダー細胞は、単一細胞の堆積後にＨＳＡを持続的に産生し、従って、組換えタンパク質の１回の添加後よりも長い時間におよび堆積細胞の成長を支援する、
３．バイオ医薬品の生産のための宿主細胞としてのＨＳＡ産生細胞の使用。従って、細胞は、フィーダー細胞および組換え添加物の非存在下においてさえ、ＨＳＡの分泌によってその成長を自己的に促進することが可能である、
の態様が可能である。
【００２１】
最も高いリクローニング効率を、好ましくはこれらのアプローチの組合せによって、すなわち、ＨＳＡ産生宿主細胞およびＨＳＡ馴化培地の使用によって得ることができる。場合によりそしてその後の分析方法の性質に依存して、フィーダー細胞を追加して使用し得る。
【００２２】
宿主細胞またはフィーダー細胞または培地馴化剤としてのＨＳＡ産生細胞の使用により、リクローニング効率および従って得られるクローンの量を有意に増加させることができる。この効果は、クローニング培地中における２００mg/Ｌ未満、さらには１００mg/Ｌ未満のＨＳＡ濃度でさえも観察される。従って、リクローニング効率に対する分泌ＨＳＡの活性／効力は、通常４００mg/Ｌから２ｇ/Ｌ未満の濃度で添加される組換えＨＳＡのそれよりも有意に高い。
【００２３】
好ましい態様は、インシュリンを含まない培地中におけるＨＳＡ産生細胞の使用である。リクローニング効率に対するＨＳＡ産生細胞および／またはその培地の正の影響は、異なる培地におけるフィーダー細胞の存在下および非存在下の両方において明らかである。それはまた異なる細胞株／細胞型、例えばハムスター細胞およびマウス細胞、並びにヒト細胞系および様々な他の細胞系においても明らかである。
【００２４】
使用されるＨＳＡ産生細胞は、天然にＨＳＡを産生する細胞（例えばヒト肝細胞）およびまた他の種の遺伝子的に改変された細胞の両方であり得る。好ましい態様は、トランスジェニックなＨＳＡを産生する産生細胞株、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、Ｓｐ２／０またはＰｅｒ．Ｃ６−細胞からなる。特に好ましい態様はＨＳＡ産生ＣＨＯ細胞を含む。
【００２５】
ＨＳＡ産生細胞またはそれにより馴化された培地の使用によって無血清培地中におけるリクローニング効率を増加させるためのここで記載した方法は、より効果的なクローンスクリーニングをもたらし、よって、より効率的な細胞株発達方法をもたらす。
【００２６】
バイオ医薬品の開発において、リクローニングの第一の目標は高産生性細胞クローンを同定することである。得られたクローンがより広範囲であることを通して、そして産生性に関してクローンが正規分布である結果、より高いリクローニング効率は、高産生性細胞クローンが得られるより高い確率をもたらす。
【００２７】
同じ数の生細胞クローンを得るためにより少ない細胞をより高いリクローニング効率で皿に堆積しなければならないので、結果として費用だけでなく時間および努力の両方もまたかなり節約される。従って、方法工程は全体的により経済的である。
【００２８】
さらに、増加したリクローニング効率は、高度に効率的な自動化クローンスクリーニング法（スクリーニングロボット）の使用のための基盤を形成する。
【００２９】
この種類のシステムにおいては、一般的にマイクロタイタープレート中の個々のウェルの選択は全くされないが、それらが生細胞集団を含むかまたは含まないかに関係なく、全てが等しく測定される。プレート中の全てのウェルが分析される結果として、調べるクローンの数は、発生するクローンの数に正比例して増加する。僅か１０％のリクローニング効率は、ウェルの９０％が空であり、それ故、全く使用できるデータを供給できないが、依然として分析されることを意味する。経済の点において、これは、９０％の場合において、時間および試薬の形態でのお金が、全くデータが得られないままに消費されていることを意味する。それ故、迅速なクローンの選択のためのハイスループット自動化システムの効率は、単一細胞の堆積後に得られたクローンの数に比例して増加する。
【００３０】
記載した方法の別の利点は、宿主細胞および／または培地馴化剤としてのＨＳＡ産生細胞の添加が、リクローニング効率を、フィーダー細胞の必要が全くない点まで増加させることである。
【００３１】
一方、これはフィーダー細胞の産生および前培養に伴う努力を低減し、そして同時に、単一細胞クローニングの再現性を向上させる。さらに、それは、生細胞の数を視覚的に検出するための技術を、クローン分析のためのツールとして使用することを可能とさせる。培養培地中の産物の量は産生細胞の数と直線相関にあるので、技術開発は、産物の量と細胞の数の両方を検出することを探索し、これにより、これらから最も高産生性の細胞クローンを、すなわち最も高い比産生性を有する細胞クローンを決定する。
【００３２】
フィーダー細胞を、発生した産生細胞から視覚的に識別することが困難であるので、それらは細胞数の視覚的決定にも含まれ、これは細胞の全数の不正確な計算をもたらし、従って、比産生性の重要なパラメーターの不正確な決定をもたらす。それ故、フィーダー細胞を含まない方法が有利であり、そして好ましい態様を表わす。
【００３３】
記載した方法のための可能な適用は、特に、バイオ医薬品の生産に見出され得る。
【００３４】
バイオ医薬品の生産のための産生細胞の生成におけるリクローニング効率の増加は、高産生性クローンのより高い確率をもたらし、従って、改良または加速された製品の開発をもたらす。
【００３５】
方法はまた、この工程の経済性も高め、そしてまたハイスループット自動化クローン分析技術を使用することを可能とさせる。
【００３６】
リクローニング効率を増加させる目的のためのインシュリン含有培地への組換えタンパク質の添加は、実際に従来技術(WO2006047380)に記載されている。しかしながら、これとは対照的に、分泌されたアルブミンもしくはＨＳＡ、またはアルブミン−もしくはＨＳＡ−産生細胞からの培地の使用が、本特許出願において代替的かつ優れた可能性として明記される。ＨＳＡは、外来的に培地に組換え精製タンパク質として添加されず、しかしむしろＨＳＡはアルブミン−トランスジェニック細胞によってリクローニング培地中に直接分泌される。
【００３７】
ＨＳＡ産生ＣＨＯ細胞は実際に文献に記載されているが、ＨＳＡ以外のタンパク質の産生のための宿主細胞としてのＨＳＡ産生細胞の使用、またはリクローニング効率を増加させるためのフィーダー細胞としてもしくは培地馴化剤としての使用のいずれも全く記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の可能な適用。ＨＳＡ産生細胞の可能な態様の図解：（１）馴化培地の調製のため（２）フィーダー細胞として（３）バイオ医薬品生産のための宿主細胞としてのＨＳＡ産生細胞の使用、すなわち対象のタンパク質を産生する細胞はさらにＨＳＡも分泌し、そしてこれによりリクローニング中にそれ自身の成長も促進する。これらの可能な適用を組み合わせて、リクローニング効率をさらに一層増加させ得る。
【図２Ａ】リクローニング効率を増加させるためのＨＳＡ産生細胞の馴化培地の調製：（Ａ）これは、全く何も添加していない新鮮なリクローニング培地を使用した場合の相対的なリクローニング効率（陰性対照、白）、および５００mg/Ｌの組換えＨＳＡの添加による（陽性対照、グレイ）、または記載した日数の後に培養液から取り出され添加されたＨＳＡ産生細胞の培養液からの５０％馴化培地の添加による（黒い棒）、リクローニングにおける相対的な増加を示す。
【図２Ｂ】リクローニング効率を増加させるためのＨＳＡ産生細胞の馴化培地の調製：（Ｂ）前記培地中で測定したＨＳＡ濃度の表による要約。リクローニング効率は、２〜５日間馴化した培地を使用した場合にその最大である。それは、組換えＨＳＡを培地に添加した場合よりも有意に高いが、馴化培地中で測定したＨＳＡ濃度は５〜５０倍低い。これ以上長い時間の馴化は、培地中におけるより高いＨＳＡ含量にも関わらず、減少したリクローニング効率をもたらす。
【図３Ａ】ＨＳＡ馴化培地の使用の結果としてのリクローニング効率の増加：（Ａ）フィーダー細胞の存在下におけるＨＳＡ馴化培地の影響。この図は、１０，０００個の成長の抑止されたフィーダー細胞上に個々に堆積された細胞の相対的なリクローニング効率を示す。陰性対照は、全く何も添加していないベーリンガーの自社製の培地中におけるリクローニング効率を示し（ここでは１と設定する）、一方、陽性対照においては５００mg/Ｌの組換えＨＳＡが培地に添加されていた。ＨＳＡ産生細胞の２〜２日間培養の馴化培地の使用の結果として、リクローニング効率をさらに一層増加させることできる。この培地中で測定したＨＳＡ濃度を棒の上に示す。
【図３Ｂ】ＨＳＡ馴化培地の使用の結果としてのリクローニング効率の増加：（Ｂ）市販の培地(HyQ SFM 4 CHO培地)へのＨＳＡ馴化培地の添加の影響。グラフは、フィーダー細胞の使用を伴わない、（Ａ）の培地とは異なる培地におけるリクローニング効率を示す。この培地において、個々に堆積された細胞は全く、添加剤を含まない培地中において生存培養へと成長しない。数個の細胞が、組換えＨＳＡの添加のお陰で生存する（５００mg/Ｌ、ダークグレーの棒）。他方でより高いリクローニング効率が、ＨＳＡ産生細胞の馴化培地の使用によって達成される（ライトグレーの棒）。棒は、各条件について３〜５回評価した９６ウェルプレートの平均であり；エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】ＨＳＡ産生フィーダー細胞によってもたらされたリクローニング効率の増加：細胞集団由来の単一細胞を、自己ＣＨＯ−ＤＧ４４フィーダー細胞またはトランスジェニックＨＳＡ産生フィーダー細胞のいずれかの上に堆積する。ＤＧ４４細胞を使用したリクローニング効率を１と設定した（黒い棒）。グレイの棒は、ＨＳＡ産生フィーダー細胞を使用した場合のリクローニング効率の相対的増加を示す。棒は、各条件について３回評価した９６ウェルプレートの平均を示す。
【図５】ＨＳＡ産生フィーダー細胞と宿主細胞との組合せ：これは、自己フィーダー細胞上に堆積されたトランスフェクションされていないＤＧ４４細胞を含むバッチにおいて（１回配置、黒）、ＤＧ４４フィーダー細胞の存在下においてＨＳＡ産生細胞をリクローニングした場合（グレイ）のリクローニング効率を示す。組合せ、すなわち、ＨＳＡトランスジェニックフィーダー細胞上へのＨＳＡ産生細胞の堆積（白）は、リクローニング効率のさらに有意な増加をもたらす。図は、３回評価した９６ウェルプレートの平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】組換えＨＳＡの添加の結果としてのリクローニング効率の濃度依存的な増加：グラフは、組換えＨＳＡを特記した濃度で添加した場合のリクローニング効率を示す。この実験において１０００mg/Ｌの組換えＨＳＡをリクローニング培地に加えた場合に最大の効率が達成された；この数値は１００％と設定され、そして他のバッチについて測定された効率をそれと比べて記録した。
【００３９】
発明の詳細な説明
定義
以下の非制限的で例示的な態様を用いての本発明のより詳細な説明の前に、不定冠詞、例えば「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」、および定冠詞、すなわち「ｔｈｅ（その）」の使用は、２つの形態の１つが明確に除外されそして特定の形態（単数または複数）への言及がなされていなければ、問題の用語の単数および複数の両方を含むことが指摘されるべきである。従って、用語「１つの細胞（a cell）」は、唯一つの単一細胞を意味すると明記されていなければ、自動的に同様に「複数の細胞」も含む。単数は、例えば「ａ（１つの）」または「ｏｎｅ（１つの）」が（１）によって補足されている場合に明確に意図される。
【００４０】
用語「インシュリン」は、膵β細胞によって分泌される成長因子を示す。インシュリンは当業者に公知である。ヒト亜鉛インシュリンまたは組換えインシュリンは細胞培養において頻繁に使用される。インシュリンの濃度を、培養培地中において市販で入手できるインシュリン特異的ＥＬＩＳＡなどの通常の実験を使用して測定することができる。
【００４１】
用語「インシュリンを含まない」は、培養培地が全くインシュリンを、特に全く組換えインシュリンを含まないこと、そしてインシュリンが全くそれに添加されないことのどちらも意味する。
【００４２】
アルブミンは、血漿中で最も多く存在しているタンパク質である。それは肝臓において産生され、そして血中の浸透圧を維持するのに貢献する。アルブミンは栄養分および代謝物に結合し、従ってその輸送を支援する。
【００４３】
本発明における用語「アルブミン」は、アルブミンの生物学的活性を有するポリペプチド成分を示す。アルブミンは、一般に、動物アルブミン、特に哺乳動物アルブミン、例えばヒト、ウシ、イヌ、マウス、ラット様およびブタアルブミン、並びに特にニワトリなどのトリに由来するアルブミンなどを示す。好ましくは、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。本発明において用語「ＨＳＡ」および「アルブミン」は同義語として使用され、すなわち、「ＨＳＡ」は、ヒトアルブミンおよび他の動物種に由来するアルブミンの両方をいう。本発明において、外から培養培地に添加された組換えＨＳＡと、ＨＳＡ産生性生細胞によってリクローニング培地中に直接的に、すなわち精製または分離されることなく放出された「分泌ＨＳＡ」とを明確に区別する。アルブミン−トランスジェニック生細胞によって細胞培養培地中に直接的に分泌されたアルブミンまたはＨＳＡを言及する場合、これは、アルブミンまたはＨＳＡが精製タンパク質として外から添加されないことを意味する。
【００４４】
組換えＨＳＡの産生は従来技術において周知であり、そして例えば遺伝子的に改変された酵母(U.S. Pat. NO. 5,612,197)を使用して行なうことができる。組換えＨＳＡは、様々な業者から、例えばSigma-Aldrich(組換えＨＳＡ、製造番号A-7223)から商業的に入手され得る。これは、培養培地に添加することのできる精製タンパク質である。
【００４５】
本発明のデータは、「分泌ＨＳＡ」が、有意により低い濃度でリクローニング効率の実質的な増加をもたらすので、ＨＳＡよりも有意により高い活性／効力を有することを示す。
【００４６】
用語「有意により低い濃度」は、本発明によると：
−組換えまたは精製アルブミンと比較して少なくとも２倍低い濃度、
−組換えまたは精製アルブミンと比較して少なくとも５倍低い濃度、
−組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度より少なくとも２倍低いアルブミン濃度、
−組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度より少なくとも５倍低いアルブミン濃度、
−組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度より少なくとも２〜１００倍、２〜５倍、５〜１００倍、２０〜１００倍、５〜１０倍低いアルブミン濃度、
−２００mg/Ｌ未満、好ましくは１００mg/Ｌ未満、特に好ましくは６０mg/Ｌ未満のアルブミン濃度、
を意味する。
【００４７】
組換えＨＳＡとは対照的に、分泌ＨＳＡは、生存培養液のＨＳＡ産生細胞によって直接的にリクローニング培地中に放出される。それは３つの起源に由来し得る：（ａ）馴化培地の調製のために使用した予備培養液のＨＳＡ産生細胞から、（ｂ）ＨＳＡ産生フィーダー細胞から、または（３）ＨＳＡ分泌宿主細胞から（個々の堆積させた産生細胞が、それ自体がＨＳＡを分泌するように遺伝子的に改変されているならば）。
【００４８】
ＨＳＡの濃度を、市販で入手できるＥＬＩＳＡ（例えば、「ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット」、Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）などの通常の方法によって決定することができる。
【００４９】
用語「アルブミンもしくはＨＳＡ−トランスジェニック細胞」、「アルブミン−もしくはＨＳＡ−産生細胞」または「アルブミン−もしくはＨＳＡ−分泌細胞」は、アルブミンを培地中に放出するあらゆる細胞を示す。これは、アルブミンを天然に分泌する細胞（例えば肝細胞）、または細胞がアルブミンもしくはＨＳＡを発現しそしてそれを培地中に放出するように、例えば、アルブミン−もしくはＨＳＡ−発現構築物の導入によって遺伝子的に改変された細胞のいずれかであり得る。本発明の好ましい態様は、アルブミン−またはＨＳＡ−産生哺乳動物細胞、最も好ましくはアルブミン−またはＨＳＡ−産生げっ歯類細胞、特にアルブミン−またはＨＳＡ−産生ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞からなる。特記した用語、例えば「アルブミン−またはＨＳＡ−トランスジェニック細胞」、「アルブミン−またはＨＳＡ−産生細胞」および「アルブミン−またはＨＳＡ−分泌細胞」は、本出願において同義語として使用される。
【００５０】
細胞の「比産生性」は、時間単位あたりに細胞によって産生された、すなわち、分泌タンパク質の場合には培地中に放出された特定のタンパク質の量を示す。比産生性は、培地中における産物の濃度（＝力価、例えばＥＬＩＳＡによって決定）と、「ＩＶＣ」（経時的な生細胞の数の積分）としても知られる、考慮下の期間にかけて存在する産生細胞の数との商から計算される。比産生性は通常「ｐｃｄ」（＝pg／細胞＊日数＝１個の細胞あたり１日あたりの分泌タンパク質のｐｇ）で示される。
【００５１】
細胞培養に関連した用語「クローニング／リクローニング」、「クローン／リクローン」は、同一細胞の細胞集団を起源細胞から得ることのできる技術を意味する。従って、用語「細胞クローニング」または「単一細胞クローニング」は、単一細胞を、異なる遺伝子型の細胞を含む細胞プールから同定および単離し、そしてその後、複製して、複数の遺伝子的に同一の細胞からなる細胞集団を形成することができる方法を意味する。細胞を個々に、すなわち１つの培養容器あたり唯一つ（１）の細胞を堆積し、その後、増殖して同一細胞の細胞集団を形成するならば、この方法は「直接的な単一細胞クローニング」である。多くの細胞を同時に培養容器に堆積し、増殖させて細胞集団を形成し、そしてこれを反復希釈（＝限界希釈法）によって同一細胞の細胞集団へと分けるならば、これは「間接的クローニング」法として記載される。
【００５２】
「単一クローン」または「単一細胞クローン」または略して「クローン」は一つ（１）の単一細胞を起源とした遺伝子的に同一の細胞である。それ故に、同じ起源の同一細胞からなる細胞集団は、本明細書において以後「モノクローナル細胞集団」という。同じ起源の細胞の培養中にゲノムにおいて自発的な変化、例えば突然変異および／または転座があるならば、この細胞集団の個々の細胞は、本発明の目的にとって依然として同一細胞と捉えられ、そして培養液はモノクローナル細胞集団と捉えられる。これに対し、安定にトランスフェクションされた細胞のプール（トランスフェクション体）は、遺伝子的に同一な出発細胞を同一の核酸を用いてトランスフェクションしたとしても、同じ系統の細胞クローンではない、すなわち、それらはモノクローナル細胞集団ではない。
【００５３】
用語「サブクローン／継代培養」は、１回の細胞分裂または複数回の継代によって起源細胞または起源培養から産生された、様々な世代の細胞をいう。単語「サブクローン／継代培養」は、例えば、同一細胞または細胞培養を多くの世代にわたって培養および複製する場合に使用される。
【００５４】
用語「クローニング効率」または「リクローニング効率」は、堆積された後に生存し、分裂し、そして生命力のある細胞集団を形成する細胞の比率として定義される。例えば、細胞選別操作において１００個の細胞が１００個の培養容器に分布され、そしてこれらの１００個の個々に堆積された細胞の中の２５個が成長して培養を形成するならば、クローニング効率は２５％である。
【００５５】
「効果的または効率的なリクローニング」は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％のクローニング効率を意味する。本発明の特に好ましい態様によると、効果的なリクローニングという用語は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％の効率を有するクローニングを意味する。
【００５６】
本発明の目的のための用語「分裂できる／増殖できる」は、無限に、しかし少なくとも２回超、好ましくは４回の継代におよび分裂できる細胞／細胞集団の能力を記載する。この能力は、例えば、［１３７］Ｃｓを用いての照射によってまたはマイトマイシンＣ処理によって減少または完全に破壊され得る。
【００５７】
用語「誘導体／子孫」は、特定の出発細胞に遺伝子的に遡ることができ、そして例えば継代培養（選択圧力を伴うまたは伴わない）によって形成および／または遺伝子操作によって生成される細胞をいう。同じ細胞型の細胞の再単離も用語「誘導体／子孫」に含まれる。従って、例えば、全てのＣＨＯ細胞株は、それらが継代培養、再単離または遺伝子操作によって得られたかどうかに関わらず、Puck et al., 1958によってCricetulus griseusから単離されたハムスター卵巣細胞の誘導体／子孫である。
【００５８】
用語「フィーダー細胞」は英単語「フィード（feed）」に由来し、そして、培養液中の所望の細胞に栄養分および分泌成長因子を供給するように作用する通常は非分裂の細胞との共培養をいう。調製のために、生細胞を、ＵＶを用いた照射もしくはγ照射またはマイトマイシンＣを用いた処理によって成長を抑止する。得られたフィーダー細胞は生存しそして成長因子を産生および分泌するが、さらに分裂できない。
【００５９】
用語「自己フィーダー細胞」は、フィーダー細胞およびこのフィーダー細胞の存在下において培養しようとする細胞の両方が、分類学的に同じ起源に由来することを意味する。例えば培養しようとする細胞がハムスター細胞（サブファミリーCricetinae）、好ましくはCricetulus属またはMesocricetus属の細胞、例えばＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞であるならば、このサブファミリーを起源に単離された各々のフィーダー細胞は、サブファミリーCricetinaeのこれらのハムスター細胞に対して自己であるフィーダー細胞である。
【００６０】
好ましい態様によると、用語「自己フィーダー細胞」は、フィーダー細胞および培養しようとする細胞の両方が、分類学的に同じ属に由来するか、または同じ属（CricetulusまたはMesocricetus由来の細胞）を起源に単離されたことを意味する。例えば培養しようとする細胞がCricetulus属またはMesocricetus属のハムスター細胞、好ましくはＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞であるならば、問題の属を起源に単離された各フィーダー細胞は、本発明の意味において自己フィーダー細胞である。
【００６１】
別の好ましい態様によると、フィーダー細胞および培養しようとする細胞が同じ種、例えばCricetulus griseusまたはMesocricetus auratusに由来する場合、自己フィーダー細胞が存在する。特に好ましい態様によると、フィーダー細胞および培養しようとする細胞の両方が同じ種に由来し、そして同じ組織向性を有するならば（例えば、Cricetulus griseus由来の卵巣細胞、−ＣＨＯ細胞）、自己フィーダー細胞が存在する。
【００６２】
特に好ましい態様によると、フィーダー細胞および培養しようとする細胞の両方が、同じ基本の細胞を起源にするならば、例えば両方の細胞が最初はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはこれらの細胞の子孫であったならば、フィーダー細胞は自己フィーダー細胞である。別の好ましい態様によると、フィーダー細胞は、例えば抗生物質に対して、培養しようとする細胞と同じ耐性を付与する。これは、細胞堆積が、例えば抗生物質などの選択剤の存在下において行なわれる場合に特に有利である。
【００６３】
１つの局面において、本発明は、特に、リクローニング効率を増加させるための、ＨＳＡ産生フィーダー細胞の使用を記載する。好ましい態様において、自己ＨＳＡ産生フィーダー細胞が使用される。
【００６４】
用語「限界希釈法」は、リクローニングの代替法である。細胞懸濁液を連続的に希釈し、その後、細胞をマイクロタイタープレートに１ウェルあたり異なる細胞数で堆積させる。多数の細胞を含むウェルにおいて、多くのまたは全ての細胞が、自己分泌成長因子の適切な分泌の結果として生存するだろう。１ウェルあたりに播種される細胞の数が少なければ少ないほど、生存する細胞の数は少なくなり、これは、１ウェルあたりに統計学的に唯一つの単一細胞が生存してモノクローナル株へと成長するように希釈をこのように調整することができることを意味する。この方法だけが統計学的に単一細胞クローンの形成をもたらすが、数個のクローンが１つのウェルで成長することも可能であるので、得られた細胞株が本当に単一クローンに由来することを確実とするために、この方法を数回（通常２〜３回）繰り返さなければならない。
【００６５】
用語「馴化培地」とは、生細胞の培養液からの培地を意味する。馴化培地の効果は、予備培養液の細胞によって培地中に分泌され、これによりそれを「馴化」した成長因子のその含量に基づく。
【００６６】
従って、用語「培地馴化細胞」または「培地馴化剤」は、馴化培地の調製に使用される細胞をいう。
【００６７】
１つの局面において、本発明は、培地馴化剤としてのＨＳＡ産生細胞の使用を記載し、よって、このようにして得られた馴化培地は、とりわけ、これらの細胞によって分泌されたＨＳＡを含む。
【００６８】
用語「血清」は、血液の無細胞成分をいう。血清は、細胞の生存および増殖を支援する様々な可溶性タンパク質と成長因子との成分の規定されていない混合物を含む。細胞培養のために、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ血清（ＦＢＳ）が主に使用される。通常の濃度範囲は、培養培地への添加として１０〜２０％ＦＣＳまたはＦＢＳである。
【００６９】
用語「無血清」は、細胞を、動物血清および／またはヒト血清の非存在下において、好ましくは血清から単離されたあらゆるタンパク質の非存在下において、好ましくは非組換え的に産生されたタンパク質の非存在下において成長させることを特徴とする、培養培地およびまた培養条件を意味する。結果として、用語「無血清条件に適合した細胞」は、動物血清もしくはヒト血清または血清タンパク質の非存在下において複製できる細胞を意味する。
【００７０】
用語「無タンパク質」は、培養培地が、動物タンパク質を全く含まないことを意味し；細菌、酵母または真菌から単離されたタンパク質は、動物タンパク質と捉えない。
【００７１】
用語「化学的に成分が規定された」は、無血清であり、好ましくは無タンパク質でもあり、そして化学的に成分が規定された物質からなる、細胞培養培地を記載する。従って、化学的に成分が規定された培地は、主に純粋な個々の物質の混合物からなる。化学的に成分が規定された培地の一例は、Messrs Invitrogen(Carlsbad, CA, US)によって生産されたＣＤ−ＣＨＯ培地である。
【００７２】
表現「懸濁液中で培養し得る細胞」は、液体培養液（「懸濁培養液」）中での成長に適合され、そして容器の表面、例えば細胞培養皿またはフラスコに接着する能力が制限されているかまたは失われている細胞をいう。無血清成長および懸濁液中における成長の両方に適合された細胞は、「無血清培地に適合された非接着性細胞」という。フィーダー細胞がこのような培養液から調製されるならば、これらの細胞は定義により「無血清培地に適合された非接着性フィーダー細胞」である。
【００７３】
対象のタンパク質／産物という用語は、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、レセプター、およびその誘導体または断片を含む、バイオ医薬的に重要なタンパク質／ポリペプチドをいう。しかしながら、対象のタンパク質／産物は、これらの例に制限されない。一般に、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するおよび／または治療的もしくは診断的用途を有する全てのポリペプチドが、重要であるかまたは対象である。対象の他のタンパク質は、例えば、いわゆる「細胞工学」の範囲内で宿主細胞の特性を変化させるのに使用されるタンパク質／ポリペプチド、例えば、抗アポトーシスタンパク質、シャペロン、代謝酵素、グリコシル化酵素、およびその誘導体または断片などであるが、これらに制限されるわけではない。
【００７４】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸配列またはタンパク質のために使用され、そして任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、またはタンパク質プロセシングなどの反応によって翻訳後に改変されたタンパク質を含む。ポリペプチドの構造は、例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入および他のタンパク質との融合によって、その生物活性を維持しつつ改変され得る。さらに、ポリペプチドは、多量体化し得、そしてホモマーおよびヘテロマーを形成し得る。
【００７５】
組換えタンパク質とは、宿主細胞において組換え発現によって産生されるタンパク質を意味する。このような組換えタンパク質は、コンタミのリスクを最小限にするために、最も厳しい純度条件下において産生される。組換えタンパク質が、通常、適切な宿主細胞、例えば酵母細胞、動物細胞または原核細胞（E.coliまたは他の細菌株）において、発現ベクター、例えば正ミド、バクテリオファージ、ネイキッドなＤＮＡまたはウイルスを使用して産生されることにより、宿主細胞に組換えタンパク質が導入される。組換えタンパク質は、通常、濃縮タンパク質溶液として精製形でまたは粉末形で市販されている。組換えＨＳＡは、例えば、様々な業者、例えばSigma Aldrichから入手することができる。
【００７６】
治療タンパク質の例は、インシュリン、インシュリン様成長因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および他の成長因子、レセプター、組織正ミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、−β、−γ、−ω、または−τ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦ−α、−β、または−γ、ＴＲＡＩＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＶＥＧＦである。他の例は、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異的および単鎖の抗体およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｃおよびＦｃ’断片、軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）免疫グロブリンおよびその定常、可変もしくは超可変領域並びにＦｖおよびＦｄ断片である(Chamov et al., 1999)。抗体はヒト起源または非ヒト起源であり得る。ヒト化およびキメラ抗体もまた可能である。
【００７７】
Ｆａｂ断片（抗原結合断片＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域によって共に保持されている両方の鎖の可変領域からなる。それらは、例えば、パパインなどのプロテアーゼでの処理によってまたはＤＮＡクローニングによって従来の抗体から産生され得る。他の抗体断片は、ペプシンを用いてのタンパク質分解消化によって産生することのできるＦ（ａｂ’）２断片である。
【００７８】
遺伝子クローニングとは、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみからなる短縮された抗体断片を調製することも可能である。これらはＦｖ断片（可変断片＝可変部分の断片）として知られる。定常鎖のシステイン基を介しての共有結合はこれらのＦｖ断片では不可能であるので、それらはいくつかの他の方法によって安定化されることが多い。この目的のために、重鎖および軽鎖の可変領域をしばしば、約１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の短いペプチド断片によって共に連結する。これにより、ＶＨおよびＶＬがペプチドリンカーによって共に連結された単一のポリペプチド鎖が産生される。このような抗体断片はまた、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）ともいわれる。ｓｃＦｖ抗体の例は公知でありそして記載されている、例えばHuston et al., 1988を参照。
【００７９】
過去に、多量体ｓｃＦｖ誘導体を産生するための様々な戦略が開発された。目的は、向上した薬物動態学的特性および増加した結合力を有する組換え抗体を産生することである。ｓｃＦｖ断片の多量体化を達成するために、それらは、多量体化ドメインとの融合タンパク質として産生される。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域またはヘリックス構造（「コイルドコイル構造」）、例えばロイシンジッパードメインであり得る。他の戦略において、ｓｃＦｖ断片のＶＨ領域とＶＬ領域との間の相互作用を多量体化（ジアボディ、トリアボディおよびペンタボディ）に使用する。
【００８０】
用語ジアボディは、当技術分野において、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を示すために使用される。ｓｃＦｖ分子におけるペプチドリンカーを５〜１０アミノ酸へと短縮すると、ＶＨ／ＶＬ鎖が重ね合わさることによってホモ二量体の形成がなされる。
【００８１】
ジアボディは、挿入されたジスルファイト橋によってさらに安定化され得る。ジアボディの例を、文献において、例えばPerisic et al., 1994において見出すことができる。
【００８２】
用語ミニボディは、当技術分野において、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を示すために使用される。それは、二量体化領域として、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む融合タンパク質からなる。これは、これもまたＩｇＧのヒンジ領域およびリンカー領域によってｓｃＦｖ断片を接続する。このようなミニボディの例は、Hu et al., 1996によって記載されている。
【００８３】
用語トリアボディは、当技術分野において、三価ホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を示すために使用される(Kortt et al., 1997)。リンカー配列の使用を伴わないＶＨ−ＶＬの直接的な融合により三量体が形成される。
【００８４】
二価、三価または四価構造を有する当技術分野においてミニ抗体として知られている断片もまた、ｓｃＦｖ断片の誘導体である。多量体化は、二量体、三量体または四量体コイルドコイル構造によって達成される(Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993)。
【００８５】
用語「抗体融合」または「抗体融合タンパク質」は、抗体または抗体の一部へのタンパク質の融合／カップリングを示す。特に、これらは、遺伝子工学によって産生された融合タンパク質を含み、この融合タンパク質においては、血清中のタンパク質の半減期／安定性を高めるために、治療タンパク質が抗体のＦｃ断片に結合している。この用語はまた、ペプチドおよび抗体または抗体の一部からなる抗体融合物も包含する。
【００８６】
本発明の目的のための好ましい宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはこれらの細胞株の誘導体／子孫である。特に好ましいのは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＢＨＫ２１細胞、特にＣＨＯ-ＤＧ４４およびＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。マウス由来の骨髄腫細胞、好ましくはＮＳ０およびＳｐ２／０細胞およびこれらの細胞株の誘導体／子孫も適切である。
【００８７】
本発明により使用することのできるハムスター細胞およびマウス細胞の例を、以下の表１に示す。しかしながら、これらの細胞の誘導体および子孫、ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯類、または真核細胞（酵母、昆虫、トリおよび植物の細胞を含むがこれらに限定されるわけではない）を含むがこれらに限定されるわけではない他の哺乳動物細胞も、バイオ医薬タンパク質の産生のための宿主細胞として使用し得る。
【００８８】
【表１】
0005343132.tif 000002
【００８９】
本発明によると、組換え哺乳動物細胞、好ましくはげっ歯類細胞、最も好ましくはマウス細胞、例えばＮＳ０細胞およびハムスター細胞、例えばＣＨＯまたはＢＨＫが特に好ましい。
【００９０】
本発明によると、宿主細胞は、好ましくは、全体として無血清条件下において確立、適合および培養される。特に好ましくは、宿主細胞は、無血清であるだけでなく、あらゆる動物タンパク質／ペプチドを含まない培地中において全体として確立、適合および培養される。
【００９１】
適切な栄養溶液の例は、市販で入手できる培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１２(Sigma, Deisenhofen, DE)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; Sigma)、最小必須培地(MEM; Sigma)、イスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM; Sigma)、ＣＤ−ＣＨＯ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、ＣＨＯ−Ｓ(Invitrogen)、無血清ＣＨＯ培地(Sigma)、および無タンパク質ＣＨＯ培地(Sigma)を含む。
【００９２】
用語「産生細胞」または「プロデューサー細胞」または「産生クローン」は、タンパク質の調製のために使用される細胞を示す。特に、これは、組換えタンパク質の工業的生産のために使用される遺伝子的に改変された細胞を含む。本発明の範囲内において、この用語は、特に、組換えタンパク質を発現しそしてこのタンパク質の調製のために使用される、遺伝子的に改変された真核宿主細胞を含む。これは、特に、治療タンパク質の産生のためのモノクローナル細胞株を含む。
【００９３】
本発明は、以下の工程を含む、単一細胞の培養法を記載する：（ａ）細胞集団を培養する工程、（ｂ）前記細胞プールから単一細胞を単離する工程、および（ｃ）ｉ）アルブミン−トランスジェニック生細胞によって培地中に直接的に分泌されるアルブミン、好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む馴化培地中で前記単一細胞を培養する工程。特定の態様において、本発明は、アルブミン−トランスジェニック生細胞によって分泌されるアルブミンが、有意により低い濃度において、リクローニング効率に対して組換えまたは精製アルブミンと同じ効果を有する方法を記載する。本発明は、特に、以下の工程を含む、単一細胞を培養する方法を記載する：（ａ）細胞集団を培養する工程、（ｂ）前記細胞プールから単一細胞を単離する工程、および（ｃ）ｉ）アルブミン−トランスジェニック生細胞によって培地中に直接的に分泌されるアルブミン、好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ｉｉ）有意により低い濃度において、リクローニング効率に対して組換えまたは精製アルブミンと同じ効果を達成するアルブミン−トランスジェニック生細胞によって分泌されるアルブミン、を含む馴化培地中で前記単一細胞を培養する工程。
【００９４】
特定の態様において、本発明は、アルブミン−トランスジェニック生細胞によって分泌されるアルブミンが、少なくとも２倍低い濃度において、リクローニング効率に対して、組換えまたは精製アルブミンと同じ効果を有する方法を記載する。好ましい態様において、本発明は、アルブミン−トランスジェニック生細胞によって分泌されるアルブミンが、少なくとも５倍低い濃度において、リクローニング効率に対して組換えまたは精製アルブミンと同じ効果を有する方法を記載する。特定の態様において、本発明は、ｉ）におけるアルブミン濃度が、組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍低い方法を記載する。別の特定の態様において、本発明は、工程（ｂ）および（ｃ）における単一細胞が対象のタンパク質を発現する方法を記載する。
【００９５】
好ましい態様において、工程ｃ）は、無血清条件下において、好ましくは化学的に成分が規定された培地および／またはインシュリン非含有培地を使用して行なわれる。特定の態様において、本発明は、工程（ｃ）においてアルブミンが、２００mg/Ｌ未満、好ましくは１００mg/Ｌ未満、特に好ましくは６０mg/Ｌ未満の濃度で存在する方法を記載する。別の特定の態様において、本発明は、工程（ｃ）ｉｉ）におけるアルブミンが、２〜１００倍、２〜５倍、５〜１００倍、２０〜１００倍、または５〜１０倍低い濃度で、好ましくは少なくとも５倍低い濃度で、最も好ましくは少なくとも１０倍低い濃度で存在する方法を記載する。
【００９６】
好ましい態様において、本発明は、工程（ｃ）において、培養の１日目から４日目に取り出されたアルブミン-トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される方法を記載する。特に好ましい態様において、本発明は、工程（ｃ）において、培養の２日目に取り出されたアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される方法を記載する。
【００９７】
別の特定の態様において、本発明は、細胞上清が、１００万〜４００万個、好ましくは１００万〜２００万個のアルブミン−トランスジェニック細胞／mlを有する細胞培養液から採取される方法を記載する。本発明の好ましい態様において、細胞上清は、１００万〜４００万個、好ましくは１００万〜２００万個のアルブミン−トランスジェニック細胞／mlを有する細胞培養液から採取され、そしてｉ）におけるアルブミン濃度は、組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度よりも、少なくとも５〜１０倍、好ましくは少なくとも１０倍低い。
【００９８】
別の好ましい態様において、本発明は、工程ｃ）における馴化培地が、アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞の添加によって産生される方法を記載する。好ましくは、最大で５０００００個のアルブミン−トランスジェニックフィーダー細胞／mlが添加される。また、アルブミン−トランスジェニックフィーダー細胞が工程ｃ）の培地中に持続的に少なくとも２週間の期間におよび残存する本発明による方法も好ましい。本発明の好ましい態様において、工程ｃ）における馴化培地は、５０００００個以下のアルブミン−トランスジェニックフィーダー細胞／mlが添加され、ｉ）におけるアルブミン濃度が、組換えまたは精製アルブミンを含む同等な培養混合物の濃度よりも少なくとも５〜１００、好ましくは２０〜１００倍（好ましくはまた１００超倍）低い、アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞の添加によって産生される。
【００９９】
別の好ましい態様において、本発明は、工程（ｃ）における馴化培地が、工程（ｂ）および（ｃ）からの単一細胞がアルブミン−トランスジェニック細胞であるという事実によって産生される方法を記載する。特に好ましい態様において、単一細胞は、アルブミンおよび対象の遺伝子の両方に対してトランスジェニックであり、そして単一細胞は、アルブミンおよびまた同時に対象のタンパク質の両方を産生する。特定の態様において、本発明は、工程（ｃ）において
ａ）アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞が添加されるか、または
ｂ）培養の１日目から４日目、好ましくは培養の２日目に取り出した、アルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清が添加される、
方法を記載する。
【０１００】
本発明はまた、本発明による方法の１つによって生成される細胞を記載する。
【０１０１】
本発明はさらに、以下の工程：
ａ）対象のタンパク質をコードする対象の遺伝子を含む細胞集団を産生する工程：
ｂ）これらの細胞を、細胞の成長を許容する培養条件下において培養する工程：
ｃ）容器中において、例えば９６ウェルプレートにおいて、単一細胞を単離および堆積させる工程、
ｄ）前記単一細胞を、馴化培地中で、
ｉ）培養の１日目から３日目の間に、好ましくは培養の２日目に採取したアルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清、または
ｉｉ）アルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞
の存在下で培養する工程、
ｅ）対象のタンパク質のその発現レベルに対応する細胞を選択する工程、
ｆ）対象のタンパク質を、例えば上清から細胞成分を分離することによって収集する工程、および
ｇ）対象のタンパク質を精製する工程
を含む、細胞、好ましくはＣＨＯ細胞において、好ましくは無血清培養条件下において対象のタンパク質を産生する方法を記載する。
【０１０２】
特定の態様において、本発明は、対象のタンパク質が組換えタンパク質、好ましくは治療タンパク質、好ましくは抗体または抗体融合タンパク質または抗体断片であることを特徴とする方法を記載する。
【０１０３】
特定の態様において、本発明は、単一細胞が、ハムスター細胞またはマウス細胞、好ましくはマウス骨髄腫細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞であることを特徴とする方法を記載する。別の特定の態様において、本発明は、アルブミン−トランスジェニック生細胞が、個々に堆積させた細胞と同じ種に由来することを特徴とする方法を記載する。好ましくは、細胞は「チャイニーズハムスター卵巣」（ＣＨＯ）細胞である。より好ましくは、細胞は、個々に堆積させた細胞の種に依存して、ハムスター細胞またはマウス細胞、好ましくはマウス骨髄腫細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞である。
【０１０４】
特定の態様において、本発明は、自己アルブミン−トランスジェニック細胞またはフィーダー細胞に関することを特徴とする方法を記載する。
【０１０５】
別の特定の態様において、本発明は、工程ｂ）における単一細胞の単離を、「限界希釈法」によってまたは「蛍光活性化細胞分取」（ＦＡＣＳ）装置を使用して行なうことを特徴とする方法を記載する。
【０１０６】
好ましい態様において、本発明は、工程（ｂ）および（ｃ）における細胞が、対象のタンパク質を発現することを特徴とする方法を記載する。特に、対象のタンパク質は、治療タンパク質、好ましくは抗体、抗体融合タンパク質または抗体断片である。
【０１０７】
本発明はまた、本発明により記載された方法によって調製されるタンパク質を記載する。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明による方法を使用して産生細胞を選択する方法を記載する。
【０１０９】
本発明はさらに、バイオ医薬タンパク質調製のための本発明による産生細胞の使用を記載する。
【０１１０】
本発明はさらに、
ａ）培養の１日目から４日目の間に、好ましくは培養の２日目に採取した、アルブミン−トランスジェニック生細胞の細胞上清、または
ｂ）培地を馴化するためのアルブミン−トランスジェニックフィーダー生細胞
を含む、単一細胞の培養を可能とする無血清馴化培養培地を記載する。
【０１１１】
好ましくは、本発明による培地は、２００mg/Ｌ未満、より好ましくは１００mg/Ｌ未満、特に好ましくは６０mg/Ｌ未満のアルブミン濃度を含む。好ましくは、自己フィーダー細胞を使用する。好ましい態様において、本発明は、そこで培養される単一細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする培地を記載する。特に好ましくはこの単一細胞は対象のタンパク質を発現する。
【０１１２】
本発明を実践に移すために、特記しない限り、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、発酵技術などの専門家に一般的に公知である従来の技術を使用する。以下の実験データは本来説明的なものであり、制限的なものではない。
【０１１３】
実験項
機器および方法
細胞の培養
細胞ＣＨＯ−ＤＧ４４／ｄｈｆｒ−／−(Urlaub et al., 1983)を、３７℃において加湿雰囲気および５％ＣＯ２中で、細胞培養フラスコ中の、ヒポキサンチンおよびチミジンの補充された無血清ＨｙＱ ＳＦＭ ４ ＣＨＯ培地（HyClone）またはベーリンガーインゲルハイムの自社製の培地中で懸濁細胞として永久的に培養する。細胞数および生存率を、ＣＥＤＥＸ細胞計測器(Innovatis, DE)を用いて、またはトリパンブルー染色によって決定し、その後、細胞を１〜３×１０５/mlの濃度で播種し、そして２〜３日毎に実行する。組換えＣＨＯ−ＤＧ４４を単一細胞クローニングのために使用する。クローン化された組換え細胞の培養をこれらの細胞と同じように行なう。再度、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まない、ＨｙＱ培地、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地(JRH, USA)またはベーリンガーインゲルハイムの自社製の培地を培地として使用する。
【０１１４】
細胞ＮＳ０を、３７℃において加湿雰囲気および５％ＣＯ２中で、細胞培養フラスコ中の、無血清ハイブリドーマ培地である動物成分を含まない培地(Sigma, Aldrich, St. Louis, USA)中で懸濁細胞として永久的に培養することができる。細胞数および生存率をＣＥＤＥＸ細胞計測器(Innovatis, DE)を用いて、またはトリパンブルー染色によって決定し、その後、細胞を１〜３×１０５/mlの濃度で播種し、そして２〜３日毎に実行する。
【０１１５】
照射によるフィーダー細胞の調製
血清およびタンパク質を伴わずに成長している懸濁ＣＨＯ細胞（トランスフェクションされていない細胞）を１８０ｇで１０分間遠心分離にかけ、そしてＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）中に１×１０６/mLの細胞濃度に調整する。
【０１１６】
その後、細胞に、４Ｇｙ／分のエネルギー量送達で放射能照射源（Molsgaard Medical A/S, Denmarkにより製造された、Ｃｓ１３７−照射器、Gammacell 2000）を用いて照射する。照射後、細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中の、細胞に特異的なＥｘ−Ｃｅｌｌ培地(JRH, USA)またはベーリンガーインゲルハイムの自社製の培地（例えばＴＨ−９）中に、１ウェルあたり約１００００個の細胞で播種し、そして約３７℃および５％ＣＯ２中でインキュベートチャンバー雰囲気中で保存する。
【０１１７】
ＨＳＡ産生フィーダー細胞も同じように産生される。方法は、ＮＳ０細胞に沿って行なわれるが、フィーダー細胞は、細胞に特異的な特定の培地中に保持／播種される。
【０１１８】
馴化培地の調製
馴化培地は、動物細胞培養液の上清から得られる。細胞を十分な播種密度に置き、そして１〜７日間培養する。上清を遠心分離によって細胞から分離し、その後、滅菌ろ過する。得られたろ液を馴化培地として使用する。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡによるＨＳＡ濃度の決定
ＨＳＡ濃度を、製造業者の指示に従って、Bethylによって製造されたヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット(カタログ番号E80-129)を使用して決定する。
【０１２０】
ＦＡＣＳに基づいた細胞堆積
自動細胞堆積（単一または複数の細胞の堆積）を、自動クローニングユニットを使用してアルゴンレーザー（４８８nm）の装着されたフローサイトメーター(Coulter EPICS Altra (Messrs. Beckman-Coulter, Miami, FL, USA)）を用いて行なう。指数関数的増殖期の細胞を遠心分離し、そして必要な細胞濃度が得られるまで緩衝液中に取り込む。その後、８０００〜１２０００細胞／秒の速度で「Hypersortオプション」を使用して、細胞を散乱光におけるその位置に従って選別する。蛍光タンパク質を発現する細胞は代替的には、細胞内で発現される蛍光タンパク質に関するその蛍光強度に従って選別されてもよい。細胞を、各々個々に、（場合により）フィーダー細胞の施された９６ウェルマイクロタイタープレート中に堆積させる。ＣＨＯ細胞の選別中に、細胞を、ＨＳＡおよび好ましくはＩＧＦまたはインシュリンの対応する補充物を含むＥｘ−Ｃｅｌｌ培地(JRH, USA)またはベーリンガーインゲルハイムの自社製の培地中に堆積させる。
【０１２１】
ＮＳ０細胞では、細胞堆積を、従って、ハイブリドーマ培地である動物の成分を含まない培地(Sigma, Aldrich, St. Louis, USA)中で行なう。
【０１２２】
リクローニング効率の計算
リクローニング効率は、１プレートあたりの陽性ウェルと、１プレートあたりのウェルの全数の商から計算される。陽性ウェルの定義は、正確に１つのクローンが存在するものである。
【０１２３】
実施例
実施例１：ＨＳＡ産生ＣＨＯ細胞の調製
懸濁液中で無血清で成長しているＣＨＯ−ＤＧ４４細胞(Urlaub and Chasin, 1980)を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および選択マーカーとしてのＤＨＦＲのための発現カセットを有する正ミドを用いてトランスフェクションする。安定にトランスフェクションされたＨＳＡ細胞プールを、ＨＴを含まない培地中で続けて培養することによって産生する。ＨＳＡ特異的ＥＬＩＳＡを使用して、最も多いＨＳＡを分泌するプールを選択する。それらをメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下における培養によって遺伝子増幅にかける。その後の限界希釈法により、ＨＳＡ産生細胞株を、最初は異種性であった細胞集団から調製し、そしてこれらの細胞株を順にその特異的ＨＳＡ産生性について試験する。これらの株を実質的に、ＨＳＡ分泌率をさらに増加させるために、上昇したＭＴＸ濃度を含む培地中における培養によるさらなる回の遺伝子増幅にかける。ＭＴＸはまた同時に細胞成長の減少ももたらし得るので、得られた細胞株を続いてその増加した産生性およびその成長特性の両方について調べ、そして最も高い産生性および良好な成長を有する細胞株を選択する。この細胞から、全ての将来の実験において利用できる細胞バンクが産生される。
【０１２４】
実施例２：ＨＳＡ産生細胞からの馴化培地の使用によるリクローニング効率の増加
本発明の１つの可能な態様は、リクローニング効率を増加させるためのＨＳＡ産生細胞の使用にある。リクローニング前に、数日間におよび培養培地を馴化する、すなわちＨＳＡ産生細胞によって培地中に分泌される成長因子、特にＨＳＡを放出する、ＨＳＡ産生細胞の培養を開始する。リクローニングの日に、この馴化培地を遠心分離によってＨＳＡ産生性生細胞から分離し、ろ過し（場合により）そして１：１の比でリクローニング培地に添加する。
【０１２５】
培地馴化の最適な期間を決定するために、馴化培地は、２、３、４、５、６および７日目の培養液から得られ、そしてリクローニング実験に使用される。使用される陽性対照は、５００mg/Ｌの精製組換えＨＳＡが添加された新鮮な培地である。
【０１２６】
図２Ａ、Ｂから分かるように、ＨＳＡ産生細胞の馴化培地の使用は、陰性対照と比較して単一細胞堆積の効率の有意な増加をもたらす。組換えＨＳＡ（陽性対照）の添加により、リクローニング効率もまた増加するが、２〜５日間馴化させたＨＳＡ分泌細胞の培地ほどではない。馴化培地中のＨＳＡ濃度は経時的に持続的に増加するが、リクローニング効率は、５日間より長い間馴化しておいた培地を使用した場合には減少する。驚くべきことに、効率の最大の増加は、２、３または４日目の馴化培地によって得られ、１０〜約６０mg/ＬのＨＳＡ濃度は、陽性対照において使用される組換えＨＳＡの濃度よりもはるかに低い。このことは、分泌ＨＳＡが低い濃度においてさえ活性であり、そして組換えＨＳＡと比較してリクローニング効率の増加に関して５〜５０倍高い効力を有することを示す。
【０１２７】
実施例３：異なる培地におけるリクローニング効率の増加
ＨＳＡ産生細胞からの馴化培地を使用することによって観察されるリクローニング効率の増加が、培地とは独立的に作動するかどうかを試験するために、単一細胞を異なる培地中でリクローニングする：１つのバッチにおいては単一細胞をベーリンガーインゲルハイムの自社製の培地中にＣＨＯ−ＤＧ４４フィーダー細胞の存在下において堆積させ（図３Ａ）、そして別のバッチにおいてはそれをフィーダー細胞を含まない市販の培地中に堆積させる（図３Ｂ）。
【０１２８】
両方の培地において、ＨＳＡ分泌細胞からの馴化培地の使用が、リクローニング効率の有意な増加をもたらし、これは、組換えＨＳＡがリクローニング培地に添加された陽性対照よりも陰性対照においての方が両方共により高い。市販培地中にフィーダー細胞を含まないバッチにおいては、細胞は陰性対照においては全く生存していないが、ＨＳＡ産生細胞の馴化培地の使用によって５〜１３％のリクローニング効率を達成することができる。
【０１２９】
両方の実験において、馴化培地から分泌されたＨＳＡが、有意により低い濃度において作用し、従って、培地中に組換え的に添加されたＨＳＡよりも効率的であることが再度示される。
【０１３０】
実施例４：ＨＳＡ産生フィーダー細胞の結果としてのリクローニング効率の増加
ＨＳＡ産生細胞の予備培養液からの馴化培地を、個々に堆積させる細胞を播種する前に１回リクローニング培地に添加する。従って、これらの細胞は、リクローニング後の３週間の発生期間の間に開始時に１回だけＨＳＡ含有培地を受ける。これとは対照的に、ＨＳＡ産生フィーダー細胞は、発生する単一細胞クローンに持続的にＨＳＡを供給することができた。
【０１３１】
ＨＳＡ産生フィーダー細胞の使用が、リクローニング効率のさらなる増加をもたらすかどうかを調べるために、４つの９６ウェルプレート中のＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に１つづつ、ＨＳＡ産生およびＨＳＡ非産生フィーダー細胞と供に堆積する。前の実施例のように、リクローニング培地は、ＨＳＡ産生予備培養液からの５０％馴化培地を含む。３週間後、各細胞培養プレート中に発生するモノクローナル細胞コロニーを計測し、そしてリクローニング効率を計算する。
【０１３２】
図４に示したように、ＨＳＡ産生フィーダー細胞を使用した場合のリクローニング効率は、正常なフィーダー細胞を含むプレートよりも有意に高い。増加は約２５％である。従って、ＨＳＡ馴化培地とＨＳＡ産生フィーダー細胞とを組み合わせることによって、リクローニング効率の別の有意な増加を達成することが可能である。
【０１３３】
実施例５：ＨＳＡ産生宿主細胞は増加したリクローニング効率を示す
リクローニング効率を増加させる別の可能な方法は、治療タンパク質を産生するためのＨＳＡ産生宿主細胞の使用であり得る。このようにリクローニング中に個々に堆積させたプロデューサー細胞は、それ自体、ＨＳＡを産生でき、そして自己分泌ループを介してそれ自体を刺激することができる。この方法が実際に増加したリクローニング効率をもたらすかどうかを確認するために、正常なＣＨＯ−ＤＧ４４細胞およびＨＳＡ産生細胞の両方を個々にＤＧ４４−およびＨＳＡ−産生フィーダー細胞上に播種する。３週間後、発生したコロニーを計測し、そして３つ全てのバッチにおけるリクローニング効率を計算する。
【０１３４】
図５は、リクローニング効率が、改変されていないＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞およびフィーダー細胞を含む培養皿において最も低いことを示す。他方でＨＳＡ産生細胞がリクローニングされるならば、より多くのモノクローナルコロニーが早急に発生する。このことは、生存しリクローニングしそして複製できる培養液を形成するＨＳＡ産生細胞の確率が、ＨＳＡを分泌しない細胞の確率よりも高いことを示す。
【０１３５】
リクローニング効率の最大の増加は、ＨＳＡ産生宿主細胞がＨＳＡ産生フィーダー細胞上に播種された組合せによって得られる。この混合物は、４０％超というリクローニング効率のさらなる増加をもたらす。ＨＳＡ産生フィーダー細胞を含まない対照混合物と比較して、５０％超の増加さえあり得る。
【０１３６】
実施例６：ＮＳ０細胞の増加したリクローニング効率
前の実験は、ハムスター細胞のリクローニング効率を、分泌ヒト血清アルブミンによって増加させることができることを示す。これらの結果は、ＨＳＡが、種間を超えてリクローニング効率に対して正の効果を有することを示す傾向があるだろう。
【０１３７】
この仮定を試験するために、治療タンパク質を産生するマウスＮＳ０ハイブリドーマ細胞をリクローニングにかける。それらは、最初に、新鮮な培地に入れられ、そして第二にＨＳＡ産生ＣＨＯ細胞培養液からの馴化培地が添加された培地中に、およびＨＳＡ産生フィーダー細胞上の第三バッチ中に入れられる。
【０１３８】
新鮮な培地またはＨＳＡ非分泌細胞の細胞培養液の馴化培地中でのリクローニングと比較して、ＨＳＡ産生細胞の使用は、リクローニング効率に対して正の効果を有する。これは、ＨＳＡ分泌細胞からの馴化培地およびまたＨＳＡ産生フィーダー細胞の使用の両方に当てはまる。
【０１３９】
このことは、ハムスター細胞によって分泌されるヒトＨＳＡがマウス細胞のリクローニングを支援できることを示す。
【０１４０】
実施例７：分泌ＨＳＡの使用はヒト細胞のリクローニング効率を増加させる
この所見をさらにより広い範囲で設定するために、ヒトＨＥＫ２９３に基づいた産生細胞を、ＨＳＡ産生細胞の馴化培地の存在下および非存在下においてリクローニングする。
【０１４１】
新鮮培地またはＨＳＡ非分泌細胞の細胞培養液の馴化培地中でのリクローニングと比較して、ＨＳＡ産生細胞の使用は、リクローニング効率に対して正の効果を有する。これは、ＨＳＡ分泌細胞の馴化培地およびまたＨＳＡ産生フィーダー細胞の使用の両方に当てはまる。
【０１４２】
これから、分泌ＨＳＡの効果は、数種の個々に堆積させた細胞のリクローニング効率に対して作用する、すなわち活性は種間を超えて働くと結論づけることができる。
【０１４３】
実施例８：ＨＳＡ産生細胞によって増加したリクローニング効率は、高産生性細胞の同定の確率を増加させる
異種細胞集団におけるプロデューサー細胞の比産生性のレベルは正規分布する。このことは、細胞の大半が平均的な産生性を有し、一方でいくつかの細胞は大量を産生し、そしてほんの非常に僅かな比率が非常に大量の組換え産物を産生することを意味する。この事実は、細胞スクリーニングおよび工業的細胞株開発プログラムにおける高産生性細胞の同定に費やされた努力を説明する。それはまた、これらの高いプロデューサーを発見する確率が、リクローニング効率と直接的に相関し：リクローニング後により多くの細胞が発生すればするほど、それらの間で高産生性細胞が存在するであろう確率が高くなることを意味する。
【０１４４】
これを実際に検証するために、治療タンパク質を分泌する安定にトランスフェクションされたＣＨＯ産生細胞の異種集団をリクローニングにかける。いくつかは、親ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からの５０％馴化培地が添加されたリクローニング培地に入れ（バッチ１）、そしていくつかは、ＨＳＡ産生細胞の培養液からの５０％馴化培地に入れる（バッチ２）。
【０１４５】
前の実施例のように、ＨＳＡ産生細胞からの培地が使用されたバッチにおいてより多くの細胞がクローン細胞株へと成長する。
【０１４６】
次の工程において、１００個のクローンを、２つのリクローニング試験から選択し、そしてその産生性を産物特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。これらの１００個のクローンに対する比産生性の分布は、両方の場合において正規分布を示す。ＨＳＡ馴化培地からの培地を使用してリクローニングした細胞から発生した１００個のクローンにおいて（バッチ２）、この曲線の平均値は、右に、より高い産生性へと有意にシフトしていた。このバッチ２からの１０個の最も高い産生性の細胞の産生性の平均値は、ＨＳＡ産生細胞を含まないリクローニングバッチ（バッチ１）からの１０個の最も高い細胞株の平均値よりも高い。従って、治療タンパク質の産生のための最も高い産生性のクローンとして選択された細胞株はバッチ２に由来する。
【０１４７】
このことは、より高い産生性を有するより多くの細胞が、実際に、ＨＳＡ産生細胞を含むリクローニングバッチから得られ、従って、それらを同定する確率が高まることを確認する。同時に、非常に大量に組換えタンパク質産物を産生する僅かな細胞を発見する確率がより高くなり、従って、産生のための高産生性クローンを選択および使用することが可能となる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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