(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量平均分子量が５００〜３０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを有効成分とする免疫調節剤であって、
上記質量平均分子量が５００〜３０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンが、グルコース重合度が３〜１２の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを７０質量％以上含有し、且つグルコース重合度が４〜６の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを２０質量％以上含有することを特徴とする免疫調節剤。
【請求項２】
上記質量平均分子量が５００〜３０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンが、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを加水分解して得られたものであることを特徴とする請求項１記載の免疫調節剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫調節剤を含有する飲食品。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の免疫調節剤を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い免疫調節作用を示し、且つ、水への高い溶解性を有する免疫調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
βグルカンは、近年その優れた生体調節機能や生理活性機能、例えば、脂質代謝改善作用、整腸作用、血糖値上昇抑制作用、コレステロール低下作用、血糖値低下作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用、生活習慣病予防・改善作用等が解析され、その利用が注目されている素材である。
【０００３】
βグルカンは、多くの生物体、例えば、微生物類、担子菌類、穀物等の植物に含まれており、主にこれらの細胞壁を構成する成分として存在している（微生物によっては菌体外にβグルカンを分泌するものも知られている）。その構造は、β−１，３−グリコシド結合、β−１，４−グリコシド結合、β−１，６−グリコシド結合の少なくとも二種類以上を有するグルコースの重合体を主成分とする。
【０００４】
ここで、免疫調節作用とは、免疫担当細胞が、投与した分子を認識して結合させ又は細胞内に取り込むことによって細胞自身が活性化して増殖する作用、活性化した細胞が他の細胞に結合してその細胞を増殖させたり、活性化させたり、抑制する作用、あるいは、活性化された細胞がサイトカインやケモカイン等の生理活性タンパク質を産生して自身の細胞あるいは他の細胞を活性化あるいは抑制する作用のいずれかをいう。
βグルカンの場合、このような作用は、分子量に依存しており、ある一定範囲の分子量が必要であると考えられてきた。
【０００５】
例えば、β−１，３−グリコシド結合とβ−１，４−グリコシド結合を主体とする、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンの免疫調節活性は、高分子量（分子量１０万超）のβグルカンに比較して、これよりも低分子化されたものが優れており、その範囲は、質量平均分子量５０００〜１０万、好ましくは質量平均分子量１万〜６万の範囲にあるものがよいと報告されている。（たとえば特許文献１参照）
また、β−１，３−グリコシド結合とβ−１，６−グリコシド結合を主体とする、β−１，３-１，６−Ｄ−グルカンは、これよりもさらに大きい分子量数十万以上のものが免疫調節作用があり、健康食品として利用されている。（たとえば特許文献２参照）
しかし、これらのβグルカンは水溶性が低いため飲食品や医薬品へ広く適用することができず、また、強い免疫調節作用が得られないという問題があった。
【０００６】
一方、このようなβグルカンの水溶性を高める目的で、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを酵素処理した低分子βグルカン（例えば特許文献３参照）が提案されているが、これらのβグルカンの平均分子量が１万未満となるため、上述のように従来知られていた免疫調節作用を示す分子量範囲の下限未満であり、免疫についての調節作用は知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３２３００１号公報
【特許文献２】特開２００６−１３７７１９号公報
【特許文献３】特開２００５−３０７１５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、水への溶解性が高く、従来にない優れた免疫調節作用を有する免疫調節剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、従来から知られるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンの免疫調節活性をさらに高めることを目的に鋭意検討した結果、驚くべきことに、従来知られていた分子量よりもさらに低分子量の、特定の構造のβグルカン分子にこれまで以上の極めて強い免疫調節作用を見出した。
すなわち、本発明は、質量平均分子量が５００〜３０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを有効成分とする免疫調節剤であって、
上記質量平均分子量が５００〜３０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンが、グルコース重合度が３〜１２の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを７０質量％以上含有し、且つグルコース重合度が４〜６の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを２０質量％以上含有することを特徴とする免疫調節剤を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、上記免疫調節剤を含有する飲食品を提供するものである。
また、本発明は、上記免疫調節剤を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の免疫調節剤は、優れた免疫調節作用を有するものでありながら、従来の免疫調節剤に比べて水への溶解性が高いため、さまざまな形態の医薬品をはじめ、飲食品や皮膚外用剤に適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明の詳細についてさらに説明する。
本発明の免疫調節剤は質量平均分子量が５００〜９０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを有効成分とするものである。
以下、本発明の免疫調節剤の有効成分である、質量平均分子量が５００〜９０００であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン（以下、低分子βグルカンともいう）について詳細に述べる。
【００１３】
上記低分子βグルカンは、その質量平均分子量が５００〜９０００である必要があり、好ましくは５００〜４０００、より好ましくは５００〜３０００である。
５００未満や９０００を超えると、高い免疫調節活性が得られず、また、９０００を超えると高い水溶性が得られない問題もある。
【００１４】
また、上記低分子βグルカンは、グルコース重合度が３〜１２の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンの含有量が２０質量％以上であることが好ましく、より好ましくは４０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上、もっとも好ましくは８０質量％以上である。
２０質量％未満であると、高い免疫調節活性を示す免疫調節剤が得られないおそれがある。なお、上限については、１００質量％である。
【００１５】
そして、上記低分子βグルカンは、グルコース重合度が３〜１２の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンのうち、１種または２種以上の重合度のβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを含むものであるが、好ましくは、２種以上の重合度のβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを含有するものであることが好ましく、より好ましくは３種以上の重合度のβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを含有するものであることが好ましい。
なお、上限については、特に制限はないが、１０種である。
【００１６】
また、上記低分子βグルカンは、グルコース重合度が４〜６の範囲内であるβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを含有することが好ましい。その好ましい含有量は５〜１００質量％、より好ましくはが２０〜１００質量％、さらに好ましくは６０〜１００質量％である。
【００１７】
上記低分子βグルカンは、好ましくは、天然に存在するβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを加水分解することによって得られる。
【００１８】
上記天然に存在するβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンとしては、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを含む穀類やその加工品が原料として適している。原料となる穀類は、ヘミセルロースを含有する穀類であればいかなるものも使用可能であり、大麦、オーツ麦、大麦ぬか、小麦胚芽、米ぬか、トウモロコシ外皮などがあるが、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含有量の比較的多い大麦、オーツ麦、大麦ぬか、オーツ麦の精麦粕、大麦外皮やオーツ麦外皮が好ましい。
【００１９】
また、上記天然に存在するβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンは、加水分解前に、あらかじめβグルカンの含有量が高めるために、濃縮処理することが好ましい。
該濃縮処理としては、上記穀類やその加工品から、温水、冷水、あるいは有機溶媒等を用いた抽出処理や、上記穀類やその加工品を粉砕後分級した分画処理が挙げられる。
【００２０】
また、上記濃縮処理された市販のβグルカン製剤も好ましく使用することができ、例えば、食品素材として販売されている大麦ベータグルカンC60-P（β−１，３−１，４−Ｄ−グルカン濃度６０質量％以上、ADEKA社製）、大麦ベータグルカンE70-S（β−１，３−１，４−Ｄ−グルカン濃度７０質量％以上、ADEKA社製）、や、この他、市販のオーツ麦抽出物（β−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含有量５０質量％前後）を使用することもでき、さらにこれらを精製して、純度を高めたβグルカン材料を使用することもできる。
【００２１】
また、上記加水分解方法としては、加熱処理、酸やアルカリ処理、酵素処理など通常の多糖類を加水分解する方法が使用できるが、なかでも、上記低分子βグルカンを高い濃度で生成させることが可能な点で、酵素処理が最適である。
【００２２】
上記酵素処理で用いる酵素としては、具体的には、リケナーゼ（EC 3.2.1.73）、セルラーゼ（EC 3.2.1.4）が挙げられ、この他、エンド型のβグルカナーゼ、１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、１，４−β−Ｄ−グルカナーゼやこれらの複合酵素などを用いることもできる。
【００２３】
なお、市販の酵素製剤には、これらの活性を含んだペクチナーゼ、キシラナーゼ、ヘミセルラーゼ、細胞壁溶解酵素、抽出物の粘度低減作用を示す酵素、果汁の成分の沈降防止用酵素製剤、ビールや果汁などの粘度を低下させる目的や濾過速度を促進するための目的で使用する酵素製剤などがあり、上記低分子βグルカンを生成させる目的でこれらの酵素製剤も使用することができるが、これらの酵素製剤には、βグルカンを２糖であるセロビオース、単糖のグルコースにまで分解する活性が存在する。
従って、高い免疫調節機能を有する上記低分子βグルカンを得るためには、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンを重合度２以下まで加水分解しない酵素を使用することが好ましい。
【００２４】
これに該当する市販の酵素製剤としては、例えば、リケナーゼ（日本バイオコン社製）、セレミックス（ノボザイム社製）、グレイナーゼ（大和化成工業社製）、フィニザイム（ノボザイム社製）、セルクラスト（ノボザイム社製）、ウルトラフロＬ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、ビスコザイムＬ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、スミチームＮＸ（新日本化学工業社製）、セルロシンＴ２（エイチビィアイ社製）、スミチームＡＲＳ（新日本化学工業社製）が挙げられる。また、これらの酵素製剤からリケナーゼ活性を有する酵素を単離精製して使用してもよい。
なお、リケナーゼは、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンのβ−１，３−グリコシド結合を認識して、β−１，３−グリコシド結合のグルコピラノシルをその還元末端側に存在するβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する酵素である。
【００２５】
一方、大麦やオーツ麦に含まれるβグルカンは、主にβ−１，４−グリコシド結合が２〜４個に１カ所の割合でβ−１，３−グリコシド結合が挿入された直鎖状のβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカンであることが知られている。
従って、リケナーゼ活性を持つ酵素による加水分解処理は、大麦やオーツ麦由来のβグルカンをその分子内のβ−１，３−グリコシド結合を認識して、その還元末端側に存在するβ−１，４−グリコシド結合を加水分解するので、グルコースや２糖であるセロビオースを生成させることなく、上記低分子βグルカンを製造するために最も適している。そして得られた低分子βグルカンは、β−１、３−Ｄ−結合を還元末端側に1個だけ有し、その他は全てβ−１、４−Ｄ−結合であり、直鎖状のβ−１、３−１、４−グルカンとなり、この低分子βグルカンは、本発明の免疫調節剤の主要構成成分となる。
【００２６】
すなわち、上記低分子βグルカンは、大麦、オーツ麦、大麦ぬか、オーツ麦の精麦粕、大麦外皮やオーツ麦外皮を、リケナーゼ（日本バイオコン社製）、セレミックス（ノボザイム社製）、グレイナーゼ（大和化成工業社製）、フィニザイム（ノボザイム社製）、セルクラスト（ノボザイム社製）、ウルトラフロＬ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、ビスコザイムＬ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、スミチームＮＸ（新日本化学工業社製）、セルロシンＴ２（エイチビィアイ社製）、スミチームＡＲＳ（新日本化学工業社製）、さらには、これらの酵素製剤からリケナーゼ活性を有する酵素を単離精製して使用したもののうちの、１種又は２種以上の酵素製剤を使用して、酵素処理して得られたものであることが好ましく、さらに好ましくは、リケナーゼ（日本バイオコン社製）、及び／又はセレミックス（ノボザイム社製）を使用して酵素処理して得られたものであることが好ましい。
【００２７】
本発明の免疫調節剤は、上記低分子βグルカンを有効成分として含有するものであり、そのまま医薬品として使用可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で従来公知の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤などの添加剤と混合して、例えばペースト状、粉末状、顆粒状などの形態で製剤化してもよい。
【００２８】
本発明の免疫調節剤における上記低分子βグルカンの含有量は、その求められる免疫調節活性に応じ適宜設定可能であるが、好ましくは１０〜１００質量％、より好ましくは２０〜１００質量％、さらに好ましくは５０〜１００質量％である。
【００２９】
本発明の飲食品は、上記免疫調節剤を含有するものである。本発明の飲食品における上記免疫調節剤の含有量は、その目的に応じて配合量を決めればよいが、例えば飲食品中、上記低分子βグルカンが好ましくは０．０１〜８０質量％、より好ましくは０．５〜５質量％となる量である。
【００３０】
本発明の皮膚外用剤は、上記免疫調節剤を含有するものである。本発明の皮膚外用剤における上記免疫調節剤の含有量は、その目的に応じて配合量を決めればよいが、例えば皮膚外用剤中、上記低分子βグルカンが好ましくは０．０１〜１００質量％、より好ましくは０．０５〜３０質量％となる量である。
【００３１】
本発明の飲食品や皮膚外用剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、従来公知の乳化剤、食品改質剤、添加剤、その他の食品添加物をはじめ、他の生理活性成分、例えば、コレステロール上昇抑制剤、血圧上昇抑制剤、血中コレステロール調節機能剤、血糖値上昇抑制作用剤、腸内細菌叢改善剤、整腸作用剤、抗ガン作用剤、抗アレルギー作用剤、消化吸収調節作用剤、老化防止剤、抗酸化剤、血行促進剤、アミノ酸、ペプチド、脂質、多糖類、オリゴ糖類、タンパク質、糖質、食物繊維、酵素成分等を配合してもかまわない。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。尚、特に記述がない限り、実施例中の％は質量％によるものである。また、以下の実施例１〜１０のうち、実施例８のサンプル８及び１２並びに実施例９及び１０は参考例である。
【００３３】
＜分析例１（βグルカンの分子量測定法）＞
βグルカンの分子量範囲と質量平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用し測定した。その詳細な測定方法としては、以下の通りとした。
なお、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量範囲が１８０以上３０００未満であり、質量平均分子量が１８０以上２０００以下と測定された低分子βグルカンの各重合度のβグルカン毎の含有量、及び、上記低分子βグルカンをゲル濾過クロマトグラフィーにて分画して得たサンプルの分子量については、ゲルろ過クロマトグラフィーに代えて、ＴＯＦ−ＭＳを用いて分子量確認を行った。その詳細な測定方法としては、以下の通りとした。
【００３４】
〔ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量範囲と質量平均分子量の測定〕
βグルカンの５ｍｇをチューブに取り、１ｍｌの蒸留水を加えて、沸騰水中で溶解させた。０．２２μｍのフィルターを通してＨＰＬＣ用のサンプルとした。分離カラムは、ＨＰＬＣゲル濾過カラムであるＳｈｏｄｅｘのパックドカラムＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０４＋ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２（連結カラム、昭和電工社製）を用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ．、温度５０℃、検出にはＲＩ検出器、分離溶媒は水で実施した。
【００３５】
分子量マーカーとしては、Ｓｈｏｄｅｘプルラン標準液Ｐ−８２（昭和電工社製）、β−Ｇｌｕｃａｎ  ＭＷ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）、Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬）、Ｌａｍｉｎａｒｉｂｉｏｓｅ、Ｌａｍｉｎａｒｉｔｒｉｏｓｅ、Ｌａｍｉｎａｒｉｔｅｔｒａｏｓｅ、Ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｓｅ、ＬａｍｉｎａｒｉｈｅｘａｏｓｅおよびＬａｍｉｎａｒｉｈｅｐｔａｏｓｅ（型番４００４８５、４００４８７、４００４８９、４００４９１、４００４９３、４００４９５  生化学工業社製）を用い、測定サンプルの溶出時間から分子量を測定した。
【００３６】
また、３糖の保持時間を３５．３〜３７．５ｍｉｎとし．、４糖の保持時間を３４．３〜３５．３ｍｉｎ．とし、５糖の保持時間を３３．５〜３４．３ｍｉｎとし．、６糖の保持時間を３２．９〜３３．５ｍｉｎ．とし、７〜１２糖の保持時間を３１．５〜３２．９ｍｉｎ．として、各ピークの面積値から各重合度のβグルカンの含有量を求め、さらに、その含有量から、質量平均分子量を求めた。
【００３７】
〔ＴＯＦ−ＭＳによる低分子βグルカン中の各分子の分子量測定〕
βグルカンの１０ｍｇをチューブに取り、１ｍｌの水／メタノール（１：１）混合溶液を加えて溶解させ、測定試料とした。Matrixは１０ｍｇの２，５−DihydroxybenzoicAcidを１ｍｌメタノールに溶解させて使用した。ＴＯＦ−ＭＳシステムはVoyager-DETM STR (PerSeptive Biosystems社製)を用いた。測定は、測定試料２μｌ、Matrix ２０μｌとし、測定モードはAngiotensin Reflector (Psitive)、測定分子量範囲を ３０００以下とした。さらに、検出されたピーク面積値から各分子量のβグルカン含量を求めた。
【００３８】
＜分析例２（βグルカンの確認と純度検定試験）＞
〔βグルカンの確認〕
βグルカンであることの確認は、ＦＴ−ＩＲを用いて行なった。すなわち、粉末状のサンプルを減圧乾燥機を用いて十分に乾燥させた。乾燥サンプル１ｍｇに赤外スペクトル用KBr（キシダ化学）１００ｍｇを添加して、乳鉢で混合および微粒子化した。φ２ｍｍの錠剤を形成し、ＳＰ１７００（日本電子データム社製）を用いて測定し、解析ソフトＷｉｎｓｐｅｃ５０を用いて解析を行った。β結合の確認は８９８ｃｍ−１に特性吸収帯を持つことで確認し、同時にα結合（８５０〜８６０ｃｍ−１）が検出されないことを確認した。β結合を含有し、α結合が検出されないことをもって、測定したサンプルがβグルカンであること、とした。
【００３９】
〔β−１，３−１，４−Ｄ−βグルカンの純度検定〕
β−１，３−１，４−Ｄ−βグルカンの純度検定は、メガザイム社のβグルカン測定キットを用いて、McCleary法（酵素法）により行った。
まず、５００μｍ（３０メッシュ）のふるいにかけた各分画物の水分含量を測定し、その１０ｍｇを１７ｍｌチューブに取り、５０％エタノール溶液を２００μｌ加え、分散させた。次に４ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５) を加え、よく混合した後、煮沸した湯浴中にて１分間加温した。よく混合し、さらに２分間、湯浴中で加熱した。５０℃に冷却後、５分間放置してから、各チューブにリケナーゼ酵素溶液（キットに付属するバイアルを２０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液で希釈、残量は凍結保存）の２００μｌ（１０Ｕ）を加え、１時間、５０℃にて反応させた。チューブに２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を、５ｍｌ加えて、静かに混合した。室温に５分間放置し、遠心分離にて上清を得た。１００μｌを３本のチューブに取り、１本には１００μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を、他の２本には１００μｌ（０．２Ｕ）のβグルコシターゼ溶液（キットに付属するバイアルを２０ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液で希釈、残量は凍結保存）を加え、５０℃にて１０分間、反応させた。３ｍｌのグルコースオキシターゼ／ペルオキシターゼ溶液を加えて、５０℃にて２０分間反応させ、各サンプルの５１０ｎｍにおける吸光度（ＥＡ）を測定した。β−１，３-１，４−Ｄ−グルカン含有量は、次式により求めた。
【００４０】
β−１，３-１，４−Ｄ−グルカン（％，Ｗ／Ｗ）＝（ＥＡ）×（Ｆ／Ｗ）×８．４６
Ｆ＝（１００）／（グルコース１００μgの吸光度）
Ｗ＝算出された無水物質量（ｍｇ）
【００４１】
＜分析例３  低分子βグルカンが、β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンであることの確認試験（部分メチル‐アセチル化による結合様式解析）＞
ガスクロマトグラフィーを用いて結合様式解析を行った。すなわち、十分に乾燥させた低分子βグルカンを含有するサンプル３ｍｇに蒸留水１ｍｌを加えて撹拌し、１Ｎアンモニア水を添加してアルカリ雰囲気下にした後、水素化ホウ素ナトリウムを２ｍｇ加えて室温で２時間放置した。イオン交換樹脂を用いて中和したあと濃縮・乾固させた。乾固したサンプルにＤＭＳＯ ０．５ｍｌを加えた。サンプルを溶解させた後、ＮａＯＨ ６０ｍｇを加えてＮ2充填して密封し、室温で１時間撹拌した。ヨウ化メチル０．１ｍｌを加えて室温で１時間、４０℃で０．５時間、５０℃で０．５時間、６０℃で１時間撹拌した。Ｎ2を吹き付けてヨウ化メチルを除去したあと、メチル化糖をクロロホルム抽出して、濃縮した。
氷冷下で７２％硫酸 ０．１ｍｌを加えて１時間放置した。蒸留水０．８ｍｌを加えて硫酸を希釈し、１００℃で４時間加熱した。炭酸バリウムを適量加えて中和し、上清はイオン交換樹脂を用いて脱塩した。濃縮したものに蒸留水１ｍｌを加えて撹拌し、１Ｎアンモニア水を添加してアルカリ雰囲気下にしたあと、水素化ホウ素ナトリウムを２ｍｇ加えて室温で２時間放置した。イオン交換樹脂を用いて中和したあと濃縮・乾固させた。無水酢酸０．１ｍｌとピリジン０．１ｍｌを加えて１００℃で２時間加熱した。蒸留水１ｍｌを加えてよく撹拌し、濃縮した。
クロロホルム１００μｌを加えて溶解し、そのうち１μｌをガスクロマトグラフィー分析用サンプルとした。
ガスクロマトグラフィーは、キャピラリーカラム（CP-SIL 13CB 50m×0.25mm I.D.0.25μm VARIAN社製）を用いて、キャリアガスはＨｅ、カラム温度１８５℃、注入口温度２５０℃、検出器は水素炎イオン化検出器を用いた。
非還元末端Glcは、１位及び５位がアセチル化、２位、３位、４位及び６位がメチル化した部分メチル化グルシトール（保持時間１３．５ｍｉｎ．）、β−１，４−グリコシド結合由来Glcは、１位、４位及び５位がアセチル化、２位、３位及び６位がメチル化した部分メチルグルシトール（保持時間１９．７ｍｉｎ．）、β−１，３−グリコシド結合由来Glcは、１位、３位及び５位がアセチル化、２位、４位及び６位がメチル化した部分メチルグルシトール（保持時間１８．９ｍｉｎ．）、β−１，３−グリコシド結合還元末端Glcは、３位のみがアセチル化、１位、２位、４位、５位及び６位がメチル化した部分メチルグルシトール（１９．１ｍｉｎ．）、β−１，４−グリコシド結合還元末端Glcは、４位のみがアセチル化、した部分メチルグルシトール（２０．０ｍｉｎ．）として検出された。
【００４２】
〔実施例１〕
市販の大麦βグルカン（大麦から抽出したβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン７０質量％含有、製品名：大麦ベータグルカンE70-S、ADEKA社製）の１ｇを、４ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加して、７０℃で１５分間加温して十分に溶解させた。室温まで冷却した後、遠心分離（8000rpm、10分間）して上清を回収し、上清を凍結、融解させて再度、遠心分離（8000rpm、10分間）を行い、沈殿を回収した。この沈殿を乾燥させ粉末とし、分析例２に従ってβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン純度を測定したところ、９０．１％であった。この粉末を４ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに溶解させた。リケナーゼ１０００Ｕ／ｍｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）の１０倍希釈液を１０μｌ添加して、４０℃で２４時間インキュベートした。沸騰水浴中で１０分間加熱した後、室温まで冷却して凍結乾燥してサンプル１を得た。
サンプル１を分析例２に従って測定したところ、サンプル１はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含量（純度）は８９％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜２５００の範囲に検出され、質量平均分子量は８８０と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖および２糖は検出されず、３糖は６８質量％、４糖は２５質量％、５糖は３質量％、６糖は１質量％、７〜１２糖は３質量％であった。
【００４３】
〔実施例２〕
市販の大麦βグルカン（大麦から抽出したβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン６５質量％含有、製品名：大麦ベータグルカンC60-P、ADEKA社製）の１０ｇを、１００ｍｌの蒸留水に添加し、７０℃にて加熱しながら溶解させた。溶液を室温に戻した後、遠心分離（8000rpm、10分間）にて上清を得た。上清に２倍量のエタノールを加え、一昼夜、４℃に放置後、沈殿を遠心分離（8000rpm、10分間）にて回収し、凍結乾燥させ４．８ｇの乾燥物―１を得た。この乾燥物のβグルカン量を分析例２に従って測定したところ、純度は８８．５％であった。この乾燥物−１を用いて実施例1と同様の操作を行ない、サンプル２を得た。
サンプル２を分析例２に従って測定したところ、サンプル２はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含量（純度）は９４％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜２０００の範囲に検出され、質量平均分子量は９５０と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖および２糖は検出されず、３糖は６５質量％、４糖は２７質量％、５糖は４質量％、６糖は２質量％、７〜１２糖は２質量％であった。
【００４４】
〔実施例３〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いて実施例１と同様の操作を行ない、サンプル３を得た。
サンプル３を分析例２に従って測定したところ、サンプル３はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含量（純度）は９６％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜２０００の範囲に検出され、質量平均分子量は７２０と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖および２糖は検出されず、３糖は６０質量％、４糖は３３質量％、５糖は３質量％、６糖は１質量％、７〜１２糖は１質量％であった。
【００４５】
〔実施例４〕
ＯａｔＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いて実施例１と同様の操作を行ない、サンプル４を得た。
サンプル４を分析例２に従って測定したところ、サンプル４はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含量（純度）は９８％であった。また、分析例１に従って分析の結果、分子量は５００〜２０００の範囲に検出され、質量平均分子量は９００と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、３糖は５５質量％、４糖は３４質量％、５糖は５質量％、６糖は４質量％、７〜１２糖は２質量％であった。
【００４６】
〔実施例５〕
市販の大麦βグルカン（大麦から抽出したβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン７０質量％含有、製品名：大麦ベータグルカンE70-S、ADEKA社製）の１ｇを、４ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加して、７０℃で15分間加温して十分に溶解させた。これにセレミックス２ＸＬ  ３００ＢＧＵ／ｍｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を１００μｌ添加して５０℃で２４時間インキュベートした。沸騰水浴中で１０分間加熱した後室温まで冷却して凍結乾燥して、サンプル５を得た。
サンプル５を分析例２に従って測定したところ、サンプル５はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン含量（純度）は７５％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は１８０〜２０００の範囲に検出され、質量平均分子量は８００と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖は７．２質量％、２糖は８．３質量％、３糖は４４質量％、４糖は２１質量％、５糖は５質量％、６糖は２質量％、７〜１２糖は４質量％であった。
【００４７】
〔実施例６〕
実施例２で得た乾燥物―1を用いて、実施例５と同様の操作を行ない、サンプル６を得た。
サンプル６を分析例２に従って測定したところ、サンプル６はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、８８％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は１８０〜２５００の範囲に検出され、質量平均分子量は１０００と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖は９質量％、２糖は５質量％、３糖は４９質量％、４糖は２０質量％、５糖は６質量％、６糖は３質量％、７〜１２糖は５質量％であった。
【００４８】
〔実施例７〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いて実施例５と同様の操作を行ない、サンプル７を得た。
サンプル７を分析例２に従って測定したところ、サンプル７はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、９８％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜２０００の範囲に検出され、質量平均分子量は９３０と算出された。
さらに分析例１に従い、ＴＯＦ−ＭＳにて分子量を測定した結果、単糖は０質量％、２糖は０質量％、３糖は６１質量％、４糖は３２質量％、５糖は３質量％、６糖は２質量％、７〜１２糖は２質量％であった。
【００４９】
サンプル１〜７に含まれる単糖（分子量１８０）、２糖（分子量３４２）、３糖（分子量５０４）、４糖（分子量６６６）、５糖（分子量８２８）、６糖（分子量９９０）、７糖〜１２糖（分子量１１５２〜１９６２）の含有量を表１にまとめて示した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
〔実施例８〕[サンプル５から、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖〜１２糖の分取]
サンプル５の１ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解させた。０．２２μｍのフィルターを通したものを分取サンプルとした。分取条件は以下の通りとした。カラムはＨＰＬＣ分取用ゲル濾過カラムであるＴＳＫ‐ＧＥＬ  ＯＬＩＧＯ‐ＰＷ２１．５＊３００（東ソー社製）を用い、分離溶媒は水を用い、流量２．０ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度４０℃とし、検出にはＲＩ検出機を用いた。フラクションコレクター（型番ＦＣ２０５  ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、３糖（サンプル８）、４糖（サンプル９）、５糖（サンプル１０）、６糖（サンプル１１）、７糖〜１２糖（サンプル１２）の検出ピークを分取した。
分取サンプル７００μｌすなわち酵素分解生成物７０ｍｇから、３糖を２２．１ｍｇ、４糖を５．７ｍｇ、５糖を１．８ｍｇ、６糖を１．１ｍｇ、７〜１２糖を５．４ｍｇ回収した。上記と同様の作業を繰り返して、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖〜１２糖の分収を行い、分子量の確認と純度検定をＴＯＦ−ＭＳにて実施した。
また、サンプル８〜１２を分析例２に従って分析したところ、サンプル８〜１２はβグルカンであることが確認された。
サンプル８〜１２に含まれる単糖（分子量１８０）、２糖（分子量３４２）、３糖（分子量５０４）、４糖（分子量６６６）、５糖（分子量８２８）、６糖（分子量９９０）、７糖〜１２糖（分子量１１５２〜１９６２）の含有量を表２にまとめて示した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
なお、サンプル１２（７糖〜１２糖）の組成分析を、ＴＯＦ−ＭＳ分析したところ、７糖が６４．６％、８糖が１０．８％、９糖が１３．８％、１０糖が６．２％、１１糖が３．１％、１２糖が１．５％の組成比であった。
【００５４】
〔実施例９〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１ｇに４ｍＭクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１００ｍｌを添加して７０℃で１５分間加温して十分に溶解させた。室温まで冷却した後、セレミックス２ＸＬ  ３００ＢＧＵ／ｍｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を２μｌ添加して５０℃で４時間インキュベートした。沸騰水浴中で１０分間加熱した後室温まで冷却して凍結乾燥して、サンプル１３を得た。
サンプル１３を分析例２に従って測定したところ、サンプル１３はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、９５％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜４５００の範囲に検出され、質量平均分子量は３２００と算出された。
また、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、単糖は０質量％、２糖は０質量％、３糖は４．５質量％、４糖は２質量％、５糖は４質量％、６糖は５質量％、７〜１２糖は１２質量％であった。
【００５５】
〔実施例１０〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１ｇに４ｍＭクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１００ｍｌを添加して７０℃で１５分間加温して十分に溶解させた。室温まで冷却した後、セレミックス２ＸＬ  ３００ＢＧＵ／ｍｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を１μＬ添加して５０℃で６時間インキュベートした。沸騰水浴中で１０分間加熱した後室温まで冷却して凍結乾燥して、サンプル１４を得た。
サンプル１４を分析例２に従って測定したところ、サンプル１４はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、９４％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は５００〜３５００の範囲に検出され、質量平均分子量は２０００と算出された。
また、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、単糖は０質量％、２糖は０質量％、３糖は１０．０質量％、４糖は４．３質量％、５糖は５質量％、６糖は６質量％、７〜１２糖は２４．１質量％であった。
【００５６】
〔比較例１〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を比較サンプル１とした。比較サンプル１を分析例２に従って測定したところ、比較サンプル１はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、９６％であった。また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は、６万〜８万の範囲に単一のピークが認められ、質量平均分子量７万と算出された。
また、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、単糖、２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７〜１２糖は０質量％、７万のピークは１００質量％であった。
【００５７】
〔比較例２〕
ＢａｒｌｅｙＢｅｔａＧｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１ｇに４ｍＭクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１００ｍｌを添加して７０℃で１５分間加温して十分に溶解させた。室温まで冷却した後、セレミックス２ＸＬ  ３００ＢＧＵ／ｍｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を１μｌ添加して５０℃で２時間インキュベートした。沸騰水浴中で１０分間加熱した後室温まで冷却して凍結乾燥して、比較サンプル２を得た。
比較サンプル２を分析例２に従って測定したところ、比較サンプル２はβグルカンであることが確認され、また、そのβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン量（純度）を分析例２に従って測定したところ、９４％であった。
また、分析例１に従ってゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、分子量は３０００〜３万の範囲に検出され、質量平均分子量は１万と算出された。
また、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量測定の結果、単糖、２糖、３糖、４糖、５糖、６糖は０質量％、７〜１２糖は３．２質量％であった。
【００５８】
サンプル１３、１４、比較サンプルに含まれる３糖（分子量５０４）、４糖（分子量６６６）、５糖（分子量８２８）、６糖（分子量９９０）、７糖〜１２糖（分子量１１５２〜１９６２）の含有量、分子量範囲を表３にまとめて示した。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
サンプル８および９を分析例３にしたがって結合様式解析した結果を表４に記載した。
表４からわかるとおり、サンプル８は、非還元末端グルコース、３位にグルコシド結合を有する還元末端グルコース、及び、１位と４位にグルコシド結合を有するグルコースを含有するが、１位と３位にグルコシド結合を有するグルコース、及び、４位にグルコシド結合を有する還元末端グルコースを含有しないことから、β−１、３−Ｄ−結合を還元末端側に、β−１、４−Ｄ−結合を非還元末端側に有し、直鎖状のβ−１、３−１、４−グルカンであることが確認された。
【００６１】
また、サンプル９は非還元末端グルコース、３位にグルコシド結合を有する還元末端グルコース、及び、１位と４位にグリコシド結合を有するグルコースを含有するが、１位と３位にグルコシド結合を有するグルコース、及び、４位にグルコシド結合を有する還元末端グルコースを含有しないことから、β−１、３−Ｄ−結合を還元末端側に1個だけ有し、その他は全てβ−１、４−Ｄ−結合であり、直鎖状のβ−１、３−１、４−グルカンであることが確認された。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
＜試験例１：免疫調節作用の評価（骨髄由来の樹状細胞からのIL-6産生量の測定）＞
Ｃ５７−Ｂ６マウス（オス、6週齢）を頸椎脱臼させた後、下腹部から足首まで切開して膝関節を切断、筋を除去して骨を取り出した。２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で洗浄後、両端を切断して、シリンジを用いて骨髄腔から細胞を採取した。細胞は２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で洗浄後、溶血バッファーで処理し、遠心分離で回収して、さらに新たな１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に懸濁させBD-Falconセルストレーナー（40μm）に通した。最終的に１０ｍｌの骨髄細胞浮遊液を得た。細胞数を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地にて５ｘ１０５cells／mlに調整し、これにＧＭ−ＣＳＦ（PEPROTECH社製）を最終濃度で２０ng／mlとなるよう添加し、９６ウェルプレートへ２００μ分注した。３７℃で７日間培養した後、各サンプルをＲＰＭＩ培地に溶解し、最終濃度で５０μｇ／mlとなるように添加して３日間培養を続けた。
なお、陽性コントロールであるＬＰＳは、１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３日間培養を続けた。陰性コントロールは、生理食塩水、グルコース、シュークロース、マルトース、セロビオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオースを用いた。
また、β−１，３-１，６−Ｄ−グルカンとしてアウレオバシジウム培養液から抽出したものをサンプルとして用いた。高分子β−１，３−１，４−Ｄ−グルカンとして大麦βグルカンＭＷスタンダード（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製、純度９７％以上、分子量35.9万）を用いた。
培養上清中に産生されたインターロイキン６（IL-6）の産生量をＥＬＩＳＡキット（BDバイオサイエンス社製）を用いて測定した。
【００６４】
結果は表５に示すように、実施例１〜１０で得られたサンプル１〜１４を添加した細胞培養上清からリポポリサッカライド（LPS）を添加した場合と同様のIL-6の産生が認められた。他方、分子量が５０００以上のβ−１，３−１，４−Ｄ−グルカン、あるいはβ−１，３-１，６−Ｄ−グルカンを添加した培養上清からは、IL-6の産生は検出されなかった。コントロールとして用いた、グルコース、シュークロース、マルトース、オリゴ糖においてもIL-6の産生は認めなかった。
以上のように、実施例１〜１０で得られたサンプル１〜１４はIL-6の産生促進作用を有しており、樹状細胞の活性化、抗体産生やリンパ球の活性化に寄与するものと考えられ、低分子βグルカンの免疫調節作用が確認された。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
＜試験例２：免疫調節作用の評価（経口投与後、脾臓細胞からのサイトカイン産生量の測定）＞
次に、サンプルをICRマウスに経口投与し、脾臓細胞からのインターロイキン１２（IL-12）産生を評価した。
実施例で得られたサンプル６、比較サンプル１、比較サンプル２を５％となるようにＭＦ飼料に添加混合し、試験飼料Ａ（サンプル６）、Ｂ（比較サンプル１）、Ｃ（比較サンプル２）を作成した。無添加のＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業社製）をコントロールとした。
これら飼料を２週間、ICRマウスに自由摂取させ、各マウスより脾臓を摘出、ホモジナイザーで破砕し、ＲＰＭＩ培地にて洗浄、ストレーナーを通して細胞懸濁液を得た。細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地にて調整し、培養プレート（96ウェル）の各ウェルに２００μｌ添加した。ＲＰＭＩ培地にて乳酸球菌（Enterococcus facaris）死菌体の１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、その２０μｌを各ウェルに添加し、２４時間３７℃にて培養した。培養上清のインターロイキン１２（IL-12）濃度をＥＬＩＳＡ測定キット（BDバイオサイエンス社製）を用いて測定した。その結果を表６にまとめて示した。
【００６７】
実施例６で得られたサンプル６をICRマウスに経口投与することで、脾臓中の細胞を活性化しIL-12産生を促進することが判った。
IL-12は、マクロファージの活性化によって誘導され細胞性免疫の増強に作用するサイトカインである。実施例６で得られたサンプル６をICRマウスに経口投与することによってIL-12が産生促進されることから、ＮＫ細胞の活性化やインターロイキン４（IL-4）の産生抑制に働き、その結果、感染防御能の亢進やアレルギー反応の抑制などに寄与するものと考えられ、低分子βグルカンの免疫調節作用が確認された。
【００６８】
【表６】
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