(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
長腕遠位がｑ１１領域からｑ１２領域内で削除されたヒト１４番染色体断片を含むヒト人工染色体（HAC）ベクターであって、
該ヒト１４番染色体断片が、長腕遠位から長腕が削除された部位にヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を含み、かつヒト１４番染色体の長腕近位、ヒト１４番染色体のセントロメア並びに外来ＤＮＡを含むことを特徴とする、ＨＡＣベクター。
【請求項２】
長腕遠位がｑ１１領域からｑ１２領域内で削除されたヒト２１番染色体断片を含むヒト人工染色体（HAC）ベクターであって、
該ヒト２１番染色体断片が、長腕遠位から長腕が削除された部位にヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を含み、かつヒト２１番染色体の長腕近位、ヒト２１番染色体のセントロメア並びに外来ＤＮＡを含むことを特徴とする、ＨＡＣベクター。
【請求項３】
サブテロメア配列が１〜５００ｋｂである、請求項１または２記載のＨＡＣベクター。
【請求項４】
サブテロメア配列が５〜６０ｋｂである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項５】
ヒト染色体断片が１９Ｍｂ以下のサイズである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項６】
外来ＤＮＡが、タンパク質をコードする外来ＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項７】
外来ＤＮＡが、前記ヒト染色体断片において前記長腕遠位又は短腕遠位の削除位置より近位の部位に挿入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項８】
外来ＤＮＡがテロメア配列から１〜５００ｋｂの領域に挿入された請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター
【請求項９】
ヒト染色体断片が、ヒト染色体の短腕遠位が削除されておりかつ短腕近位を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１０】
ヒト染色体断片がヒト１４番染色体断片であり、かつ、ヒト１４番染色体断片の長腕遠位がヒト１４番染色体のＡＬ３９１１５６において又はＡＬ３９１１５６よりも近位の位置において削除されている、請求項１および３〜９のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１１】
ヒト染色体断片がヒト２１番染色体断片であり、かつ、ヒト２１番染色体断片の長腕遠位がヒト２１番染色体のＡＰ００１６５７において又はＡＰ００１６５７よりも近位の位置において削除されている、請求項２〜９のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１２】
ヒト染色体断片の短腕遠位がヒト染色体短腕のｐ１１領域内又はｐ１１領域からｐ１２領域内で削除されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１３】
ヒト染色体断片が、少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１４】
ヒト染色体断片が少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１５】
部位特異的組換え酵素の認識部位が、ヒト染色体断片の長腕近位及び／又は短腕近位に挿入されている、請求項１３又は１４に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１６】
部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項１３又は１４に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１７】
部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である、請求項１３又は１４に記載のＨＡＣベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＨＡＣベクターを有する細胞。
【請求項１９】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；並びに
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップを含む、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製方法。
【請求項２０】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト２１番染色体又は２１番ヒト染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；並びに
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップを含む、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位をヒト１４番染色体のＡＬ３９１１５６において又はＡＬ３９１１５６よりも近位の位置において削除する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
（ｅ）ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｅ）において、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｅ）において、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法により得られる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載のＨＡＣベクターを保持する細胞。
【請求項２７】
以下のステップ：
（ｂ）上記ヒト１４番染色体又は１４番ヒト染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；並びに
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップを含む、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製方法。
【請求項２８】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；並びに
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップを含む、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト１４番染色体又は１４番ヒト染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片に少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップを含む、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）の作製方法。
【請求項３０】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片に少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップを含む、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）の作製方法。
【請求項３１】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）上記ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｆ）ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｇ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｈ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｉ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項３２】
以下のステップ：
（ｂ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位をｑ１１領域からｑ１２領域内で削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕の部位にヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までの配列からなるテロメア配列およびサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）上記ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｆ）ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｇ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｈ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｉ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＨＡＣベクターを有する非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト染色体由来のセントロメア及びサブテロメア配列とテロメア配列を保持するヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター、並びに該ＨＡＣベクターを有するヒト細胞医薬若しくはヒト細胞を提供する。得られるヒト細胞（医薬品）は、遺伝子治療及び再生医療医薬品として有用である。また本発明は、上記ＨＡＣベクターを有するヒト細胞の作製方法、上記ＨＡＣベクター及びその作製方法を提供する。更に本発明により、上記ＨＡＣベクターによる治療用タンパク質製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＣベクター
哺乳動物細胞への遺伝子導入において汎用されるプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスなどの従来ベクターは、エピソームの場合には導入遺伝子の発現が一過性である点が、一方宿主細胞の染色体に組込まれる（インテグレーション）場合には宿主染色体の遺伝子を破壊する、導入遺伝子のコピー数が制御されない、導入遺伝子が不活性化される、組込まれた宿主染色体上の制御配列の影響を受ける、などの点が問題として挙げられる。
これらを解決する一つの方法として、本発明者の研究グループはヒト２１番染色体を出発材料として、構造が明らかで不要な遺伝子を除去した、外来ＤＮＡを簡便に導入可能な新規のＨＡＣ（２１ＨＡＣ）ベクター系を構築した（特許文献１及び非特許文献１）。この中で２１ＨＡＣベクターは、ヒトを含む哺乳動物細胞を宿主として自律複製／分配が可能で安定に保持されること、宿主染色体を破壊することなく一定コピー数の遺伝子が導入可能であることを示した。また、ｅｘ  ｖｉｖｏホルモン補充遺伝子治療を意図したモデルとして治療用遺伝子ヒトエリスロポイエチン（ｈＥＰＯ）を導入した２１ＨＡＣベクターをヒト正常初代培養繊維芽細胞に移入できること、ＥＰＯを長期間持続発現できること、その発現量はＣＨＯ細胞での約１／１０００に発現抑制を受けること、ＨＡＣ移入正常初代培養繊維芽細胞を単一コロニーから最大３．８×１０７細胞まで増幅できること、非選択条件下で６又は９代継代後６５．５〜９０．９％保持されること、を示してきた（特許文献１及び非特許文献２）。
一方、ヒヒにおけるｅｘ  ｖｉｖｏ  ＥＰＯ補充遺伝子治療モデルでは、レトロウイルスベクターでｈＥＰＯ遺伝子導入したヒヒ初代培養ＭＳＣｓ（０．８１〜６．６×１０６細胞／ｋｇ）のカプセル皮下移植により血中ＥＰＯ濃度上昇、貧血回復が報告されている（非特許文献３）が、遺伝子治療のためには、細胞あたりの更なる発現量向上が求められる。またヒト正常初代培養繊維芽細胞の分裂限界を考慮すると細胞分裂回数を少なくするのが望ましく、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果を発揮できる状態の治療用ＨＡＣ移入細胞を効率よく増幅するためには、ベクター安定性について改善・向上する余地が残されている。
上記課題を解決する一つの手段は、ベクターの基本骨格となるヒト染色体として安定性の高いヒト染色体を用いて機能的なテロメアを持つＨＡＣベクターを構築することである。
外来遺伝子の発現は、挿入された部位周辺のクロマチン構造や制御配列の有無により影響されることが知られている。また染色体を安定に維持するには機能的な十分な長さのテロメアが必要であること（非特許文献４）が知られている。ＨＡＣ上において、クロマチン構造や制御配列の影響排除のためインスレーターを利用した事例（非特許文献２３）はあるが、クロマチン構造や制御配列の影響排除の検証はなされておらず、またテロメア配列を操作するものではない。また、ＨＡＣ上においてテロメラーゼなどによるテロメア配列の付加・テロメア長の回復等、テロメア配列操作によるＨＡＣベクター安定性向上の検討はなされていない。
相同組換え効率の向上
外来遺伝子を導入する際、遺伝子導入細胞の選別のために薬剤耐性遺伝子の導入が汎用される。多くの場合、薬剤耐性遺伝子は目的の外来遺伝子と並列して同一ベクター上に配置される。遺伝子発現ユニットが複数並列すると、それらが互いに干渉し外来遺伝子の発現量が減弱することが知られている。従来、高発現生産系細胞の構築において、発現量向上のために、例えば薬剤耐性遺伝子をｅｘｏｎとして分断配置しスプライシングを経て発現させることにより薬剤耐性能を下げることで、導入外来遺伝子を高発現する細胞の選別が行われている（非特許文献２２）が、薬剤耐性遺伝子そのものの除去により外来遺伝子の発現が顕著に向上した報告はこれまでない。
また、薬剤耐性遺伝子除去については、抗体軽鎖κ遺伝子座に外来遺伝子をノックインする際、下流に存在する薬剤耐性遺伝子除去により相同組換え効率が向上することがマウスＥＳ細胞において知られている（特許文献２）が、これも外来遺伝子発現を向上するものではない。
ヒト染色体の安定性と遺伝子発現
マウスＥＳ細胞の実験では、導入した染色体断片が大きいほどこれを保持する細胞のキメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。本発明者の研究グループは、マウス胚幹細胞に抗体遺伝子を含むヒト１４番、２番、２２番染色体断片を移入し、キメラ個体が作製できること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、ヒト染色体断片がキメラ個体で安定に保持されること、生殖系列を経て次世代伝達可能なことを示した（非特許文献５及び６）。また、ヒト抗体重鎖遺伝子を保持するマウスを作製する目的で単離されたヒト１４番染色体由来の自然断片ＳＣ２０及びこれに抗体軽鎖遺伝子を含むヒト２２番染色体領域をクローニングしたＨＡＣについて、マウスでの安定性と生殖系列伝達を確認した（非特許文献７）。さらに上記ＳＣ２０由来ＨＡＣは、体細胞核移植により作出したクローンウシ個体で安定に保持されること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現することを示してきた（非特許文献８）。一方、上記のヒト１４番染色体由来の自然断片及びＨＡＣについて、ヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株での安定性及び発現の検討は未だなされていない。また、ヒト２１番染色体を除くその他のヒト染色体由来の自然断片及びＨＡＣについても、ヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株での発現・安定性の検討は未だ十分になされていない。ヒトＸ染色体由来のミニ染色体がヒト細胞株で保持された報告（非特許文献９）があるが、このミニ染色体では継代後に顕著な多コピー化が認められており、一定のコピー数を維持するには至っていない。
テロメアによる発現・安定性の制御
テロメアは、染色体末端に位置する繰り返し配列で、酵母からヒトを含む哺乳動物細胞まで広い生物種で保存されており、ヒト正常細胞の場合、（ＴＴＡＧＧＧ）の繰返しが１５〜０．４ｋｂの長さに及ぶ。テロメアは、細胞分裂の進行とともに短縮し、テロメア長の減少にともなって異常染色体（融合・脱落・分断・異数化など）の出現・増加が観察されることから、染色体の保護・安定維持に必要と考えられている（非特許文献１０及び１１）。以上のことから、十分な長さの機能的なテロメア構造を持つことにより染色体の安定性が向上すると考えられる。
テロメア長は、テロメラーゼの強制発現により、或いはテロメア結合タンパク質（ＰＯＴ・ＴＲＦ２）の欠失により人為的に伸長できる（非特許文献１２及び１３）。これらの方法によりヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株において分裂回数の増加・寿命延長は実証されたが、染色体安定性を回復・向上できるかについては依然として明らかでない。また、不死化細胞において、Ｃｒｉｓｉｓ後に内在性のテロメラーゼ活性が上昇し短縮したテロメアが一定の長さに伸長・維持されると異常染色体の出現頻度は増減せず維持された（非特許文献１４）例はあるが、この場合も染色体安定性の回復・向上には至っていない。
サブテロメアは、染色体末端のテロメア（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ繰返し配列のセントロメア側に隣接して位置し、分節・重複ドメインや（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ様の繰返し配列を持つ、約３００〜５００ｋｂにわたる染色体領域を指す。分節・重複ドメイン構造の持つ高ホモロジーのために、同一染色体上のサブテロメア内又は異なる染色体上のサブテロメア間において高頻度で転位や組換えが生じやすいことが知られている（非特許文献１５〜１７）。ヒト１４番染色体長腕のサブテロメア長は、分節重複領域として４９９ｋｂが同定され、また（ＴＴＡＧＧＧ）ｎのテロメア配列と上記サブテロメア領域との間に２０ｋｂ以下の未同定配列の存在が示唆されている（非特許文献１８）。サブテロメアの機能は、その高ホモロジーを利用した組換え促進によるテロメラーゼ非存在下でのテロメア修復・維持、サブテロメアの可塑性による新しい環境への適応、疾患を引き起こす転位・欠損の誘導などが示唆されているが、その詳細はまだ明らかではない。
テロメア又はテロメア及びサブテロメアと遺伝子発現の関係については、テロメア配列のランダム挿入により染色体末端がテロメア配列に置換した染色体を有する細胞において、テロメア近位での外来導入遺伝子発現がヘテロクロマチン化によるサイレンシング（テロメアポジション効果（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）；ＴＰＥ）をうけることが観察されている（非特許文献１９）。ＴＰＥに関しては、テロメア伸長とサイレンシングは相関性がある（非特許文献２０）とする報告がある。一方、内在性のテロメア領域遺伝子群の発現については、継代前後のヒト新生児包皮繊維芽細胞において、遺伝子発現パターンとテロメア長減少及びテロメア端からの距離は相関性がなかった（非特許文献２１）。以上のように、テロメアと遺伝子発現の関係についてはこれまで議論が決着されていない。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３１３８５号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−９４８４９号公報
【非特許文献１】Ｋａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ；３２１：２８０−２９０，２００４年
【非特許文献２】Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年
【非特許文献３】Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ａら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ；１２：１５２７−１５４１，２００１年
【非特許文献４】Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ  Ａら、Ａｎｕｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７３巻，ｐ．１７７−２０８，２００４年
【非特許文献５】Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（ＵＳＡ），第１６巻，ｐ．１３３−１４３，１９９７年
【非特許文献６】Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ），第９７巻，ｐ．７２２−７２７，２０００年
【非特許文献７】Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第１８巻，ｐ．１０８６−１０９０，２０００年
【非特許文献８】Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第２０巻，ｐ．８８９−８９４，２００２年
【非特許文献９】Ｍｉｌｌｓら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（ＵＫ），第８巻，ｐ．７５１−７６１，１９９９年
【非特許文献１０】Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ  Ａら、Ａｎｕｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第７３巻，ｐ．１７７−２０８，２００４年
【非特許文献１１】Ｎｉｎｇ  Ｙら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．，第１２巻、ｐ．１３２９−１３３６，２００３年
【非特許文献１２】Ｃｒｉｓｒｏｆａｒｉ  Ｃら、ＥＭＢＯ  Ｊ、第２５巻、ｐ．５６５−５７４，２００６年
【非特許文献１３】Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ  Ａら、Ａｎｕｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７３巻，ｐ．１７７−２０８，２００４年
【非特許文献１４】Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＣＭら、ＥＭＢＯ  Ｊ、第１１巻、ｐ．１９２１−１９２９，１９９２年
【非特許文献１５】Ｍｅｆｆｏｒｄ  Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．，第３巻、ｐ．９１−１０２，２００２年
【非特許文献１６】Ｒｉｅｔｈｍａｎ  Ｈら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，第１３巻、ｐ．５０５−５１５，２００５年
【非特許文献１７】Ｌｉｎａｒｄｏｐｏｕｌｏｕ  ＥＶら、Ｎａｔｕｒｅ，第４３７巻、ｐ．９４−１００，２００５年
【非特許文献１８】Ｒｉｅｔｈｍａｎ  Ｈら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，第１４巻、ｐ．１８−２８，２００４年
【非特許文献１９】Ｔｈａｍ  ＷＨら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，第２１巻，ｐ．５１２−５２１，２００２年
【非特許文献２０】Ｂａｕｒ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９２巻、ｐ．２０７５−２０７７、２００１年
【非特許文献２１】Ｎｉｎｇ  Ｙら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．，第１２巻、ｐ．１３２９−１３３６，２００３年
【非特許文献２２】Ｂａｒｎｅｔｔ  ＲＳら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ３、ｐ．２７−４０、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９５年
【非特許文献２３】Ｏｔｓｕｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ；３２９：１０１８−１０２５，２００５年
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、細胞中で安定に保持され外来遺伝子を高発現可能なヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法の提供を目的とする。また本発明は、遺伝子治療及び再生医療に有用なヒト細胞医薬及びその製造方法の提供を目的とする。更に本発明は、治療用タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒト染色体に存在するテロメア配列及びサブテロメア配列に着目し、人工染色体末端にテロメア配列及び／又はサブテロメア配列を含むヒト人工染色体ベクターの構築を試みた。
その一例として、ヒト１４番染色体の長腕から、ヒト１４番染色体のセントロメア領域、テロメア配列及びサブテロメア配列の一部を残して既知の遺伝子の殆どを削除し、長腕近位にｌｏｘＰ配列を部位特異的に挿入した、改変ヒト染色体（１４ＨＡＣ）ベクターを作製した（図１）。この１４ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞を非選択条件下で長期継代培養すると、１４ＨＡＣベクターは、殆ど脱落することなく一定コピー数で保持されること、この１４ＨＡＣベクターの安定性は従来の２１ＨＡＣベクター（ＷＯ２９９４／０３１３８５号）を顕著に上回ること、を確認した（図１３）。更にＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより赤血球増殖因子であるヒトエリスロポイエチン（ｈＥＰＯ）遺伝子を導入した１４ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞では、従来の２１ＨＡＣベクターと比べて２．５倍のｈＥＰＯの発現向上を確認した。更にこのｈＥＰＯ遺伝子を導入した１４ＨＡＣベクターを保持するヒト正常初代培養繊維芽細胞において、従来の２１ＨＡＣベクターの１１．７倍の顕著なｈＥＰＯ発現向上を確認した（図２１）。
更にまた、上記の作用効果が何に起因するかを調べることを目的として、テロメア配列とヒト１４番染色体由来のサブテロメア配列の一部を持つＨＡＣベクターの発現効率を比較した結果、該ＨＡＣベクターは、テロメア配列のみを長腕削除末端に持つ場合と比べて、ヒト正常繊維芽細胞において約４倍のｈＥＰＯ発現向上を実現した。両者は、その構造において長腕削除末端のサブテロメア配列の他は基本骨格の染色体、外来遺伝子（ｈＥＰＯ）導入位置は同じであることから、上記の顕著な発現上昇は、サブテロメア配列を、削除された長腕末端に持つようにヒト１４番染色体を改変したことによりもたらされたと考えられた。
ヒト人工染色体ベクターにおけるサブテロメア配列の存在は、外来遺伝子又は外来ＤＮＡの発現上昇のみならず、形質導入された細胞内での該ベクターの安定的な保持、子孫伝達率の向上などにも正の影響を及ぼすことが判った。このような作用効果は、ヒト１４番人工染色体ベクターだけでなくヒト２１番染色体から同様に作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターでも観察されたことから、上記の作用効果は、ヒト１４番及び２１番染色体以外の任意のヒト染色体から同様に作製されたＨＡＣベクターであっても、ヒト１４番及び２１番染色体由来のＨＡＣベクターと同様の作用効果を奏することを意味する。
これらの知見から、ヒト染色体に基づいて構築したＨＡＣベクターにより上記目的（又は課題）を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者は上記課題を解決するために、ヒト正常細胞又はヒト細胞株において導入遺伝子を高発現し安定に保持される染色体ベクターを構築することを課題として鋭意研究を行った。外来遺伝子を導入する際、遺伝子発現ユニットが複数並列すると互いに干渉して転写方向下流に位置するユニットの発現が減弱することが知られている（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ＮＪら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３２巻、ｐ．５６２−５６５、１９８６年、Ｋａｄｅｓｃｈ  Ｔら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、第６巻、ｐ．２５９３−２６０１、１９８６年）。上記のｈＥＰＯ導入２１ＨＡＣベクター（ＷＯ２９９４／０３１３８５号）はｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの下流に隣接してｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットが存在する。そこでｈＥＰＯ遺伝子発現を向上させる方法として、ＨＡＣベクター上からｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの下流に隣接するｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットを除去することが考えられる。すなわち、ヒト染色体の長腕から既知の遺伝子の殆どを削除した改変染色体を得、この改変染色体上の長腕近位にｌｏｘＰ配列及びＦＲＴ配列とｈＣＭＶプロモーターを部位特異的に挿入し、この改変染色体を保持するＣＨＯ雑種細胞においてＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによりｈＥＰＯ遺伝子を外来遺伝子として改変染色体に導入し、ＦＬＰｅ／ＦＲＴシステムによりｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットを除去し、更にこのｈＥＰＯ導入改変染色体保持するヒト正常初代培養繊維芽細胞に移入したところ、例えば本発明の１４ＨＡＣベクターの場合、従来の２１ＨＡＣベクターと比べて平均１８．５倍のｈＥＰＯ発現向上を確認した（図２１）。これらの知見から、本発明者らは、耐性遺伝子発現ユニットを削除したＨＡＣベクターにより上記目的（又は課題）を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の概要は以下の通りである。
本発明は、その第１の態様において、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、ヒト染色体由来のセントロメアと、前記の削除された長腕及び／又は短腕の遠位末端部位に付加又は結合されたテロメア配列及び／又はサブテロメア配列（好ましくはヒト染色体由来のサブテロメア配列）とを含むヒト染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクターを提供する。
本発明は、一実施形態において、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、（ｉ）ヒト１４番染色体由来のセントロメア、（ｉｉ）テロメア配列、並びに（ｉｉｉ）サブテロメア配列を含むヒト１４番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを提供する。
本発明はまた、別の実施形態において、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、（ｉ）ヒト２１番染色体由来のセントロメア、（ｉｉ）テロメア配列、並びに（ｉｉｉ）サブテロメア配列を含むヒト２１番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを提供する。
本明細書の全体を通して、本発明に係るＨＡＣベクターは、天然に存在するヒト染色体断片又は自然発生したヒト染色体断片を含むものではないが、それが上記特徴を有しかつ人為的に単離された場合には本発明に包含されるものとする。
また別の実施形態において、上記ＨＡＣベクターは、（ｉｖ）特定の部位に挿入された外来ＤＮＡ（又は外来遺伝子若しくは外来核酸）を含むものであってもよい。
本発明の別の実施形態において、前記ヒト染色体断片のサイズは、通常約１Ｍｂ以上、例えば約１Ｍｂ以上であって約１９Ｍｂ以下であり、好ましくは約１８Ｍｂ以下であり、さらに好ましくは約１７Ｍｂ以下である。しかし、このサイズは、上記の範囲に特に限定されないものとし、ヒト染色体の種類、ヒト染色体から長腕遠位又は短腕遠位を削除した後に染色体断片に残る長腕近位の長さ、或いは短腕近位又は短腕の長さ、などによって影響される。
本発明の実施形態によれば、ヒト染色体断片は、ヒト染色体の長腕遠位が削除されておりかつ長腕近位及び短腕を含むか、或いはヒト染色体の短腕遠位が削除されておりかつ短腕近位を含むか、或いはヒト染色体の長腕遠位及び短腕遠位がともに削除されておりかつ長腕近位及び短腕近位を含むことができる。
また、ヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位は、標的とする切断領域の塩基配列、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のオンラインゲノムデータベース  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）の塩基配列を基にして標的配列（ターゲティングベクター）を設計し、それを用いて切断・削除することができる。
本発明の別の実施形態によれば、ヒト染色体断片の長腕遠位は、ヒト染色体長腕のｑ１１領域内又はｑ１１領域からｑ１２領域内で削除される。
本発明のさらに別の実施形態によれば、ヒト染色体断片の短腕遠位は、ヒト染色体短腕のｐ１１領域内又はｐ１１領域からｐ１２領域内で削除される。
例えば、前記ヒト１４番染色体の長腕遠位は、例えば１４ｑ領域内、好ましくは１４ｑ１１領域内において削除され、より好ましくはＡＬ３９１１５６において又はＡＬ３９１１５６よりも近位の位置において、具体的にはＡＬ３９１１５６〜ＣＲ３８３６５９の間で削除され、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９において削除される。
また、前記ヒト１４番染色体の短腕遠位は、例えば１４ｐ領域内において削除され、好ましくは１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内において削除され、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域から１４ｐ１１．２領域内において削除され、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域内において削除され、さらに好ましくはＲＮＲ２、ＰＡＢＰＣＰ２からなる群より選択されるいずれか１の位置において削除される。
また、別の例として、ヒト２１番染色体の長腕遠位は、例えば２１ｑ領域内、好ましくは２１ｑ１１領域内、より好ましくは２１ｑ１１．１領域から２１ｑ１１．２領域内において削除される。削除位置は、例えば、２１ｑ１１．１のＮＴ＿０１１５１２よりも近位、好ましくはＮＴ＿０１１５１２含有領域内のうちＡＬ１６２０２よりも近位、より好ましくはＡＬ１６２０２含有領域内のＡＰ００１６５７又はＡＰ００１６５７よりも近位である。
また、前記ヒト２１番染色体の短腕遠位は、例えば２１ｐ領域内において削除され、好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内において削除され、さらに好ましくは２１ｐ１１．１領域内において削除され、さらに好ましくはＡＬ１６３２０１の位置において削除される。
また、一実施形態において、テロメア配列はＴＴＡＧＧＧなどの繰り返し配列を持つ塩基配列である。この配列は人工的に合成された配列及びヒトを含む哺乳動物の染色体長腕又は短腕由来のものなどが挙げられるが、特に限定されない。テロメア配列は、好ましくはヒト染色体由来のテロメア配列であり、より好ましくはサブテロメア配列と同じ染色体に由来するものである。
本発明の一実施形態において、前記テロメア配列の長さは、約０．４〜５０ｋｂであり、好ましくは約０．４〜２５ｋｂであり、さらに好ましくは約０．４〜１５ｋｂである。
一実施形態において、サブテロメア配列は、ヒト染色体の長腕又は短腕由来のサブテロメア配列であり、任意のヒト染色体由来の、例えばヒト１４番染色体又はヒト２１番染色体由来のサブテロメア配列である。具体的な実施形態において、上記ヒト染色体断片は、ヒト染色体から長腕遠位が削除された部位に、該ヒト染色体と同じ又は異なる、好ましくは同じ、ヒト染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。
さらなる本発明の別の実施形態において、前記サブテロメア配列の長さは、約１〜５００ｋｂであり、好ましくは約１〜３００ｋｂであり、さらに好ましくは約１〜１００ｋｂであり、さらに好ましくは約５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは５〜４０ｋｂ、さらに好ましくは約２５〜６０ｋｂでありさらに好ましくは約２５〜４０ｋｂである。
好ましい実施形態において、ヒト１４番又は２１番染色体断片は、上記のように削除された長腕遠位の部位にそれぞれヒト１４番又は２１番染色体の長腕由来のテロメア配列及びサブテロメア配列を含む。
一実施形態において、ヒト１４番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列である。好ましくは、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２．３３領域から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列であり、さらに好ましくはヒト１４番染色体のＡＢ０１９４３９、ＡＢ０１９４３８、ＡＢ０１９４３７のいずれかのマーカーから１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列であり、特に好ましくは、ヒト１４番染色体のＡＢ０１９４３７から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列である。
また、別の実施形態において、ヒト２１番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域から２１ｑ−ｔｅｌ領域内のテロメア末端までの配列及びテロメア配列である。サブテロメア配列は、好ましくは、ヒト２１番染色体の２１ｑ−ｔｅｌ領域内の任意の部位からテロメア末端までの配列であり、さらに好ましくは２１ｑ−ｔｅｌ領域内のＮＴ＿０１１５１５からテロメア末端までの配列である。
さらなる実施形態において、本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、前記ヒト染色体断片が少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位をさらに含むことができる。例えば、ヒト染色体断片の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入される。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト染色体の長腕又は短腕の削除部位（又は削除位置）よりもセントロメア側（すなわち、「近位」）に挿入される。
例えばヒト１４番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、１４ｑ領域内において、好ましくはヒト１４番染色体の長腕近位の１４ｑ１１領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはＡＬ３９１１５６〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９における前記削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト１４番染色体の短腕に、例えば１４ｐ領域内において、さらに好ましくはヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内において、さらに好ましくはヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１１領域内における前記削除位置より近位に挿入される。
さらに、例えばヒト２１番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、２１ｑ領域内において、好ましくはヒト２１番染色体の長腕近位の２１ｑ１１．１領域から２１ｑ１１．２領域内における削除位置より近位において、例えば、２１ｑ１１．１のＮＴ＿０１１５１２領域における、好ましくはＮＴ＿０１１５１２含有領域内のうちＡＬ１６２０２領域における、より好ましくはＡＬ１６２０２含有領域内のＡＰ００１６５７の削除位置か或いはＡＰ００１６５７における削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト２１番染色体の短腕に、例えば２１ｐ領域内において、好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内において、さらに好ましくはヒト２１番染色体の短腕近位の２１ｐ１１．１領域内において、さらに好ましくはＡＬ１６３２０１の位置における前記削除位置より近位に挿入される。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である。別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である。
本発明の別の実施形態において、本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含むヒト染色体断片を含むものであり、例えば、前記ヒト染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されている。これにより１種類の部位特異的組換え酵素／認識部位を外来遺伝子の導入に使用し、別の種類の部位特異的組換え酵素／認識部位を不要になった薬剤耐性遺伝子発現ユニットの除去などに使用することが可能となる。
この場合における部位特異的組換え酵素の複数の認識部位は、上記と同様に、ヒト染色体の長腕又は短腕の削除部位よりもセントロメア側（近位）に挿入される。
例えばヒト１４番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、上記と同様であり、すなわち、１４ｑ領域内において、好ましくはヒト１４番染色体の長腕近位の１４ｑ１１領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはＡＬ３９１１５６〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９における前記削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト１４番染色体の短腕に、例えば１４ｐ領域内において、さらに好ましくはヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内において、さらに好ましくはヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１１領域内における前記削除位置より近位に挿入される。
さらに、例えばヒト２１番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、２１ｑ領域内において、好ましくはヒト２１番染色体の長腕近位の２１ｑ１１．１領域から２１ｑ１１．２領域内における削除位置より近位において、例えば、２１ｑ１１．１のＮＴ＿０１１５１２領域における、好ましくはＮＴ＿０１１５１２含有領域内のうちＡＬ１６２０２領域における、より好ましくはＡＬ１６２０２含有領域内のＡＰ００１６５７の削除位置か或いはＡＰ００１６５７における削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト２１番染色体の短腕に、例えば２１ｐ領域内において、好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内において、さらに好ましくはヒト２１番染色体の短腕近位の２１ｐ１１．１領域内において、さらに好ましくはＡＬ１６３２０１の位置における前記削除位置より近位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素及び／又はＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列及び／又はＦＲＴ配列である。
また第２の態様において、本発明は、上記ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを保持する細胞を提供する。かかる細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞（例えば胚性及び体性幹細胞、体細胞、正常体細胞、上皮細胞、神経細胞、線維芽細胞、良性又は悪性腫瘍細胞、内皮細胞、真皮細胞、基底細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、間質細胞、骨髄細胞、血球細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、毛細胞、肝臓細胞、すい臓細胞、腎臓細胞、羊膜細胞、視覚細胞、聴覚細胞、嗅覚細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、Ａ９細胞などを用いることができる。
また、本発明は、その第３の態様において、以下のステップを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；並びに
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ。
テロメア配列とサブテロメア配列を１つの配列として作製したときには、ステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）を１つのステップとして上記配列を、上記削除された長腕及び／又は短腕の部位に付加することができる。
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）においては、前記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞として相同組換え効率の高いものを用いる。好ましい実施形態においては、相同組換え効率の高い細胞はニワトリＤＴ４０細胞由来のものである。
また本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除は、部位特異的組換え酵素を用いて行うことができる。例えば、部位特異的組換え酵素を用いて、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を、テロメア配列及び／又はサブテロメア配列との置換により削除することができる。
好ましい実施形態においては、ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位を１４ｑ領域、好ましくは１４ｑ１１領域から１４ｑ１２領域において削除し、短腕遠位を１４ｐ１２領域内において削除する。またさらに好ましい実施形態においては、ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位をＡＬ３９１１５６において又はＡＬ３９１１５６よりも近位の位置において、具体的にはＡＬ３９１１５６〜ＣＲ３８３６５９の間において、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７〜ＣＲ３８３６５９の間で、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９〜ＣＲ３８３６５９の間において削除する。別の実施形態において、ヒト１４番染色体の短腕遠位を例えば１４ｐ領域内において削除し、好ましくは１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内において削除し、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域から１４ｐ１１．２領域内において削除し、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域内において削除し、さらに好ましくはＲＮＲ２、ＰＡＢＰＣＰ２からなる群より選択されるいずれか１の位置において削除する。
別の実施形態において、ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位を２１ｑ領域、好ましくは２１ｑ１１．１領域から２１ｑ１１．２領域内において削除し、短腕遠位を２１ｐ１１．１領域から２１ｑ１１．２領域内において削除する。ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位を、例えば、２１ｑ１１．１のＮＴ＿０１１５１２を含む領域内、好ましくはＮＴ＿０１１５１２含有領域内のうちＡＬ１６２０２を含む領域内、より好ましくはＡＬ１６２０２含有領域内のＡＰ００１６５７において或いはＡＰ００１６５７より近位において削除する。また、前記ヒト２１番染色体の短腕遠位を、例えば２１ｐ領域内において、好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内において、さらに好ましくは２１ｐ１１．１領域内において、さらに好ましくはＡＬ１６３２０１の位置において削除する。
また更に本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除をテロメア配列との置換により削除して、ヒト染色体断片にテロメア配列を付加することができる。別の実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除をテロメア配列及びヒト染色体由来のサブテロメア配列との置換により削除して、ヒト染色体断片にテロメア配列及びサブテロメア配列を付加することができる。上記ヒト染色体由来のサブテロメア配列は、ヒト染色体、限定するものではないが、例えばヒト１４番染色体及びヒト２１番染色体由来のものであることが好ましい。
好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位における少なくとも２箇所を切断することにより、該長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加することができる。
別の好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｄ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位における少なくとも２箇所を切断することにより、該長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び／又は短腕の部位に該ヒト染色体又はヒト染色体断片由来のテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する。
また、好ましい実施形態においては、テロメア配列及びサブテロメア配列は、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列である。さらに好ましくは、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２．３３領域から１４ｑ−ｔｅｌ領域までの配列である。
また、別の好ましい実施形態において、ヒト２１番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域から２１ｑ−ｔｅｌ領域内のテロメア末端までの配列及びテロメア配列である。サブテロメア配列は、好ましくは、ヒト２１番染色体の２１ｑ−ｔｅｌ領域内の任意の部位からテロメア末端までの配列であり、さらに好ましくは２１ｑ−ｔｅｌ領域内のＮＴ＿０１１５１５からテロメア末端までの配列である。
具体的な実施形態において、部位特異的組換えシステム、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム又はＦＬＰｅ−ＦＲＴシステムの利用により基本骨格となる出発材料であるヒト染色体由来の天然テロメア配列及び／又はサブテロメア配列を残すように、長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除を行う。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｄ）において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕ｑ１１領域内又はｑ１１−ｑ１２領域内において長腕遠位を削除して、削除された長腕に該ヒト染色体又はヒト染色体断片のテロメア配列及びサブテロメア配列、例えばヒト１４番染色体の場合、例えば１４ｑ３２領域内の部位から１４ｑ−ｔｅｌ領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列、またヒト２１番染色体の場合、例えば２１ｑ２２．３領域内の部位から２１ｑ−ｔｅｌ領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する。
前記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位の削除は、例えば、長腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら２つの認識部位間を欠失して行う。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕遠位の１４ｑ３２領域より遠位にかつ長腕近位の１４ｑ１１領域より近位に、更に好ましくはの長腕遠位のＡＢ０１９４３７より遠位にかつ長腕近位のＡＬ３９１１５６より近位に挿入される。また、別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の長腕遠位の２１ｑ２２領域より遠位にかつ長腕近位の２１ｑ１１領域より近位に、更に好ましくは長腕遠位の２１ｑ２２．３より遠位に、例えばＮＴ＿０１１５１５の位置に、かつ、長腕近位の２１ｑ１１．２より近位に、例えばＮＴ＿０１１５１２より遠位に、好ましくはＡＬ１６２０２より遠位に、例えばＮＴ＿０１１５１５の位置に、より好ましくはＡＰ００１６５７の位置に又はＡＰ００１６５７より遠位に、それぞれ挿入される。
別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である。さらに好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である。
さらにまた、前記ヒト染色体又はヒト染色体断片の短腕遠位の削除は、例えば、短腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら２つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト染色体又はヒト染色体断片の短腕遠位の例えば短腕ｐ領域内より遠位に、好ましくはｐ１１領域内またはｐ１１領域からｐ１２領域内より遠位に、さらに好ましくはｐ１１領域内より遠位に、かつ、短腕近位のｐ１１領域内またはｐ１１領域からｐ１２領域内より近位に挿入される。
例えば、ヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、短腕遠位の例えば１４ｐ領域内より遠位に、好ましくは１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内より遠位に、さらに好ましくは１４ｐ１１領域内より遠位に、かつ、短腕近位の１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内より近位に、好ましくは１４ｐ１１領域内より近位に、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域から１４ｐ１１．２領域内より近位に、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域内より近位に、さらに好ましくはＲＮＲ２、ＰＡＢＰＣＰ２からなる群より選択されるいずれか１の位置より近位に挿入される。またヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト２１番染色体の短腕の例えば２１ｐ領域内より遠位に、好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内より遠位に、さらに好ましくは２１ｐ１１領域内より遠位に、かつ、短腕近位の２１ｐ１１領域から２１ｐ１２領域内より近位に、好ましくは２１ｐ１１領域内より近位に、さらに好ましくは２１ｐ１１．１領域から２１ｐ１１．２領域内より近位に、さらに好ましくは２１ｐ１１．１領域内より近位に、さらに好ましくはＡＬ１６３２０１の位置より近位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である。さらに好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である。
別の実施形態において、本発明に係るＨＡＣベクターの作製方法は、（ｅ）ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップをさらに含んでもよい。
本発明の一実施形態において、ステップ（ｅ）においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である。別の実施形態において、ステップ（ｅ）においては、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である。
さらなる実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片のＡＬ３９１１５６における前記削除位置又はＡＬ３９１１５６より近位の位置に、さらに好ましくはヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位の位置に挿入することができる。
部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えば１４ｑ領域内において、好ましくはヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の長腕近位の１４ｑ１１領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはＡＬ３９１１５６、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９領域内における前記削除位置より近位において、また例えばヒト１４番染色体又はヒト１４番染色体断片の短腕近位の１４ｐ領域内、さらに好ましくはヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１２領域内、さらに好ましくは１４ｐ１１領域内、における前記削除位置より近位に挿入することができる。
別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片のＡＰ００１６５７における前記削除位置又はＡＰ００１６５７より近位の位置に、さらに好ましくはヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の短腕近位の２１ｐ１１−ｐ１２領域内における削除位置より近位の位置に挿入することができる。
さらに本発明は、その第４の態様において、上記作製方法により得られる、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを提供する。
本発明はさらに、その第５の態様において、以下のステップを含むことを特徴とする、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ
（ｅ）ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；並びに
（ｆ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ。
また本発明の第６の態様において、以下のステップを含むことを特徴とする外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
好ましい実施形態において、ヒト染色体は、ヒト１４番染色体及びヒト２１番染色体である。
一実施形態において、少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素とその認識部位は、Ｃｒｅ酵素とｌｏｘＰ配列、及びＦＬＰｅ酵素とＦＲＥＴ配列である。また一実施形態において、薬剤耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。
上記の第５及び第６の態様の一実施形態において、外来ＤＮＡの挿入位置、すなわち部位特異的組換え酵素の挿入位置は、前述の部位特異的組換え酵素の挿入位置と同じである。例えば、ヒト１４番染色体については、長腕近位１４ｑ１１より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＬ３９１１５６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における前記削除位置より近位、又はヒト１４番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト２１番染色体については、長腕近位の２１ｑ１１．２より近位、好ましくは２１ｑ１１．１より近位、より好ましくはＡＬ１６２０２より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＰ００１６５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）の削除位置か又はＡＰ００１６５７における削除位置より近位、或いはヒト２１番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の２１ｐ１１．２領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
好ましい実施形態において、外来ＤＮＡの挿入位置は、前記ヒト染色体断片端のテロメア配列から約１〜５００ｋｂであり、好ましくは約１〜３００ｋｂであり、さらに好ましくは約１〜１００ｋｂであり、さらに好ましくは約５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは５〜４０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜４０ｋｂである。
また第７の態様において、本発明は、上記作製方法により得られる、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターである。
さらに第８の態様において、本発明は、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を提供する。かかる細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞（例えば胚性及び体性幹細胞、体細胞、正常体細胞、上皮細胞、神経細胞、線維芽細胞、良性又は悪性腫瘍細胞、内皮細胞、真皮細胞、基底細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、間質細胞、骨髄細胞、血球細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、毛細胞、肝臓細胞、すい臓細胞、腎臓細胞、羊膜細胞、視覚細胞、聴覚細胞、嗅覚細）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、Ａ９細胞などを用いることができる。
本発明はさらに、その第９の態様において、上記ＨＡＣベクター又は外来ＤＮＡを含むＨＡＣベクターを保持する細胞を含む医薬組成物を提供する。かかる場合、外来ＤＮＡは、以下のものに限定されないが、例えばエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）、アールスポンジン（Ｒｓｐｏｎｄｉｎ）、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などをコードする遺伝子を挙げることができる。
また本発明は、その第１０の態様において、以下のステップを含む、外来ＤＮＡを受容細胞に導入する方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｉ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞などであってもよい。
さらに本発明は、その第１１の態様において、以下のステップを含む、外来ＤＮＡを発現する細胞の作製方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｉ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞などであってもよい。
またさらに本発明は、その第１２の態様において、以下のステップを含む、タンパク質の製造方法を提供する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｉ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｊ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本発明の一実施形態において、上記タンパク質としては、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、第八因子、第九因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）、アールスポンジン（Ｒｓｐｏｎｄｉｎ）、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などが挙げられる。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中、「ヒト人工染色体ベクター」又は「ＨＡＣベクター」とは、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体を指す。
また本明細書中、「ヒト染色体」とは、ヒト細胞由来の天然のＤＮＡとタンパク質との複合体を指す。正常なヒト染色体は２３種（雄は２４種）（すなわち、常染色体である１番染色体から２２番染色体、並びに、性染色体であるＸ染色体及びＹ染色体）４６本存在し、それぞれ約５０〜３００Ｍｂの長さのＤＮＡを含むことが知られている。また「ヒト染色体断片」とは、独立染色体として安定に複製及び分配が可能な染色体の部分断片を指し、断片の大きさは通常１Ｍｂ以上だが、それ以下の場合もある。
本明細書中、染色体に関して「長腕」及び「短腕」とは、染色体上のセントロメア両側の腕（アーム）を指し、その長さに応じて長腕（ｑ）及び短腕（ｐ）と称される。またヒト染色体に関して「長腕遠位」及び「長腕近位」とは、長腕上のセントロメアから遠い位置（すなわちテロメア側）にある領域（遠位）及びセントロメアに近接する領域（近位）を意味する。具体的には、ヒト１４番染色体の場合には長腕遠位はＡＬ３５９２１８よりもテロメア側、長腕近位はＡＬ３９１１５６よりもセントロメア側であり、ヒト２１番染色体の場合には長腕遠位は２１ｑ２２．２よりもテロメア側であり、長腕近位は２１ｑ１１．２である。さらに「短腕遠位」及び「短腕近位」とは、短腕上のセントロメアから遠い位置にある領域（遠位）及びセントロメアに近接する領域（近位）を意味する。例えば、ヒト１４番染色体の場合にはリボソーマルＲＮＡ領域において境界がある。
本明細書中、「部位特異的組換え酵素」及び「部位特異的組換え酵素の認識部位」とは、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象に関して用いられる用語であり、それぞれその部位特異的に組換えを起こす酵素及び該酵素により認識される部位を指す。
本明細書中、「テロメア配列」とは、ＴＴＡＧＧＧの繰返し配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎを持つ配列を指す。テロメア配列の長さは、約０．４〜５０ｋｂであり、好ましくは約０．４〜２５ｋｂであり、さらに好ましくは約０．４〜１５ｋｂである。該テロメア配列は化学的に合成された又は人工的に生成されたものでも、染色体に由来するものでもよい。
本明細書中、「サブテロメア配列」とは、真核細胞中の染色体末端のテロメア（ＴＴＡＧＧＧ）ｎの繰返し配列のセントロメア側に隣接して位置し、分節・重複ドメインや（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ様の繰返し配列を持つ、約３００〜５００ｋｂにわたる染色体領域を指す。サブテロメア配列は、任意の染色体に由来するサブテロメア配列の全体若しくは一部でもよいし、又は任意の染色体に由来する複数のサブテロメア配列が結合されたものでもよいし、又は任意の染色体に由来するサブテロメア配列に他の配列が付加されたものでもよい。本発明においては、例えば部位特異的組換えを利用したテロメアトランケーションや転座によるテロメア配列又はサブテロメア配列の付加を行いうる。
本明細書中、「外来ＤＮＡ」とは、対象とする細胞にとって外部から導入されるＤＮＡを指し、物質生産、疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列（例えばプロモーター配列）などをコードするＤＮＡを意味し、同種又は異種のいずれでもよい。
本明細書中、「細胞」とは、生物個体・組織に由来する細胞を指す。例えば、体細胞、正常体細胞、生殖細胞、体性幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、精子由来幹細胞（ＧＳ細胞）等を意味し、同種又は異種のいずれでもよく、ヒト由来の上記細胞（ヒト細胞）でもよい。
本明細書中、「供与細胞」及び「受容細胞」とは、ヒト人工染色体ベクターを移入又は導入する場合に、最初に該ベクターを保持する細胞（供与細胞）と、供与細胞から該ベクターが移入される細胞（受容細胞）を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−１８８３９２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒト１４番染色体由来のＨＡＣベクターの構築の概要を示す。図中、「１４Ａ」はヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、テロメア配列が付加されたＨＡＣベクターを、「１４Ｎ」はヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、テロメア配列及びヒト１４番染色体由来の約２５ｋｂのサブテロメア配列を含有するＨＡＣベクターを、「１４ｇＮ」はヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、テロメア配列及びヒト１４番染色体由来の約６０Ｋｂのサブテロメア配列を含有するＨＡＣベクターの概要を表す。
図２は、テロメアトランケーション用ベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１の構造を示す。図中、ｔｅｌはテロメア側を、ｃｅｎはセントロメア側を示す。またｐｕｒｏはピューロマイシン遺伝子を示し、Ｔｅｌ配列はテロメア配列を示し、その配列中の黒矢印は反復配列を示す。
図３は、ヒト染色体１４ｑへのｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１ベクター導入についてのＰＣＲ解析の結果を示す。
図４は、ヒト染色体１４ｑへのｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１ベクター導入により生じるアレルを示す。
図５は、ヒト染色体１４ｑへのｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図６は、ヒト染色体１４ｑへのｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。（Ａ）ヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞。（Ｂ）長腕削除されたヒト１４番染色体断片を保持するＤＴ４０雑種細胞。
図７は、ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｔ１ｐＳＦ１ベクターの構造を示す。図中、Ｏｒｉは複製開始点、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子、Ｓｖ４０ｐＡはＳＶ４０ポリＡをそれぞれ示す。
図８は、１４ＡΔｑＨＡＣへのｔ１ｐＳＦ１ベクター導入についてのＰＣＲ解析の結果を示す。
図９は、１４ＡΔｑＨＡＣへのｔ１ｐＳＦ１ベクター導入により生じるアレルを示す。
図１０は、１４ＡΔｑＨＡＣへのｔ１ｐＳＦ１ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図１１は、１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図１２は、１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図１２ＡはＦＩＳＨ像を示し、図１２Ｂは１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図１３は、１４ΔｑＨＡＣベクター（１４ＡΔｑＨＡＣ、１４ＮΔｑＨＡＣ（Ｇ）、１４ｇＮΔｑＨＡＣ（ｇ））、及び２１ΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞における非選択条件下での長期安定性解析の結果を示す。
図１４は、ｈＥＰＯ遺伝子導入により生じる１４ＨＡＣベクターのアレルを示す。図中、ｈＥＰＯはヒトエリスロポエチン遺伝子、ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを示す。
図１５は、ｈＥＰＯ遺伝子導入１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図１６は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現を示す。
図１７は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図１７ＡはＦＩＳＨ像を示し、図１７ＢはｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図１８は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図１９は、ｈＥＰＯ−１４Ａ／Ｎ／ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のサザン解析の結果を示す。（Ａ）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣ；（Ｂ）ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣ；（Ｃ）ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣ。
図２０は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞：ＦＩＳＨ解析の結果を示す。図２０ＡはＦＩＳＨ像を示し、図２０ＢはｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図２１は、ｈＥＰＯ−１４Ａ／Ｎ／ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１でのｈＥＰＯ遺伝子発現を示す。
図２２は、ヒト１４番染色体長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌの構造を示す。
図２３は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター導入により生じるアレルを示す。
図２４は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター導入についてのＰＣＲ解析の結果を示す。
図２５は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図２６は、ヒト１４番染色体長腕近位セントロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１の構造を示す。
図２７は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクター導入により生じるアレルを示す。
図２８は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクター導入についてのＰＣＲ解析の結果を示す。
図２９は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１及びｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図３０は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応によるヒト染色体１４ｑ遠位削除で生じる染色体アレル（図３０Ａ：Ｇ／ｎ１；図３０Ｂ：ｇ／ｎ１）を示す。
図３１は、１４ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図３２は、１４ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図３２ＡはＧ９４ｎ５６細胞、図３２ＢはＧ９４ｎ５６Δｐ２５細胞におけるＦＩＳＨ像を示す。
図３３は、ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｐＳＦ１（Ｇ＋ｎ１）ベクターの構造を示す。
図３４は、１４ＮΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（Ｇ＋ｎ１）又はＧｎｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入（Ａ）、及び１４ｇＮΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（ｇ＋ｎ１）又はｇｎｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入（Ｂ）により生じるアレルを示す。
図３５は、１４ＮΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（Ｇ＋ｎ１）ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図３６は、１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図３７は、１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図３７ＡはＦＩＳＨ像を示し、図３７Ｂは１４ＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図３８は、ｈＥＰＯ遺伝子導入１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図３９は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図３９ＡはＦＩＳＨ像を示し、図３９ＢはｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図４０は、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現を示す。
図４１は、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図４２は、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図４２ＡはＦＩＳＨ像を示し、図４２ＢはｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図４３は、ｈＥＰＯ−１４ΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞での長期ｈＥＰＯ遺伝子発現を示す。
図４４は、ヒト１４番染色体長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２の構造を示す。
図４５は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター導入により生じるアレルを示す。
図４６は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター導入についてのＰＣＲ解析の結果を示す。
図４７は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図４８は、ヒト染色体１４ｑへのｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１及びｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図４９は、１４ｇＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図５０は、１４ｇＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図５０ＡはＦＩＳＨ像を示し、図５０Ｂは１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図５１は、ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｐＳＦ１（ｇ＋ｎ１）ベクターの構造を示す。
図５２は、１４ｇＮΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（ｇ＋ｎ１）ベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図５３は、１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図５４は、１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図５４ＡはＦＩＳＨ像を示し、図５４Ｂは１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図５５は、ｈＥＰＯ遺伝子導入１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図５６は、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図５６ＡはＦＩＳＨ像を示し、図５６ＢはｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図５７は、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現を示す。
図５８は、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図５９は、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図５９ＡはＦＩＳＨ像を示し、図５９ＢはｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型を示す。
図６０は、ＦＬＰ−ＦＲＴによるｎｅｏ耐性遺伝子ユニットの除去の概要を示す。
図６１は、１４ＡΔｑＨＡＣへのｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入により生じるアレルを示す。
図６２は、１４ＡΔｑＨＡＣへのｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図６３は、１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図６４は、１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。
図６５は、ｈＥＰＯ遺伝子導入により生じる１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターのアレルを示す。
図６６は、ｈＥＰＯ遺伝子導入１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター移入ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図６７は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図６７ＡはＦＩＳＨ像を示し、図６７ＢはｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターの核型を示す。
図６８は、ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットの除去により生じる１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター上のアレルを示す。
図６９は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図７０は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクター保持ＣＨＯ雑種細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。図７０ＡはＦＩＳＨ像を示し、図７０ＢはｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターの核型を示す
図７１は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクター保持ヒト正常繊維芽細胞のサザン解析の結果を示す。
図７２Ａ及びＢは、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクター保持ヒト正常繊維芽細胞のＦＩＳＨ解析の結果を示す。
図７３は、ＦＲＴ配列導入用ベクターＧｎｐＳＦ１−ＦＲＴの構造を示す。
図７４は、１４ＮΔｑＨＡＣへのＧｎｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図７５は、ＦＲＴ配列導入用ベクターｇｎｐＳＦ１−ＦＲＴの構造を示す。
図７６は、１４ｇＮΔｑＨＡＣへのｇｎｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入ＤＴ４０雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図７７は、２１ＨＡＣベクターの構築を示す。上側の図は、テロメアトランケーションによる２１ＡΔｑＨＡＣの作製手順を示し、また下図は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰによる欠失を利用した２１ＮΔｑＨＡＣの作製手順を示す。
図７８は、ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてｌｏｘＰ配列を挿入する方法の概略を示す。
図７９は、ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７において部位特異的切断を行う方法の概略を示す。
図８０は、ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入用ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃベクターを示す。
図８１は、２１ＡΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃベクター導入により生じるアレルを示す。図中、５’ＨＰＲＴは５’ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを示し、Ｈｙｇはハイグロマイシン遺伝子を示し、Ｔｋはチミジンキナーゼ遺伝子を示す。ＦＲＴはＦＬＰリコンビナーゼターゲットを示し、ＢＳはブラストサイジン耐性遺伝子を示し、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
図８２は、ＦＬＰ−ＦＲＴによるｎｅｏ耐性遺伝子ユニットの除去を示す。
図８３は、ヒト２１番染色体上の長腕ＮＴ＿０１１５１５においてｌｏｘＰ配列を挿入する方法の概略を示す。
図８４は、Ｃｒｅベクター導入により生じる長腕が削除されたヒト２１番染色体上のアレルを示す。
図８５は、ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入用ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄベクターを示す。
図８６は、２１ＮΔｑＨＡＣへのｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄベクター導入により生じるアレルを示す。
図８７は、ＥＰＯのインビボ薬効の経時変化を示すグラフである。図８７Ａは赤血球（ＲＢＣ）数を示し、図８７Ｂはヘモグロビン（ＨＧＢ）数を示し、図８７Ｃはヘマトクリット（ＨＣＴ）値を示す。また、図中、菱形はＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター支配下にｈＥＰＯ遺伝子を導入した１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞クローンｔ７Ｓ３８−８Ｅ５）の平均（Ｎ＝３；２８週Ｎ＝２；３２週以降Ｎ＝１）、四角はコントロール（ｓｈａｍ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の平均（Ｎ＝３；２０週、２８週及び４４週Ｎ＝２）をそれぞれ示す。
図８８は、ＥＧＦＰ−１４ＨＡＣベクターのＰＣＲ解析結果の概略を示す。図８８Ａはヒト１４番染色体ベクターにＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質；ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入して得られたＥＧＦＰ−１４ＨＡＣベクターの構造を示す。図８８Ｂは、１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクター及びの１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターのセントロメア側及びテロメア側におけるヒトマーカーの有無を示す。
図８９は、ｐＬＮ１ＩＲＥＳＥＧＦＰをＣＨＯ雑種細胞株に導入（＋）したとき、又は非導入（−）のときの、サザンブロット解析による断片サイズとベクター上の位置との関係を示す。
図９０は、ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクター又はＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターを保持する種々のＥＳクローンから作製されたキメラマウスにおける、ＨＡＣの保持をＰＣＲで判定した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ヒト人工染色体ベクター（以下、「本ＨＡＣベクター」ともいう）に関するものであり、該ＨＡＣベクターは、ヒト染色体に基づいて作製され、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除され、かつテロメア配列及びサブテロメア配列を含む、特にサブテロメア配列を含む、ヒト染色体断片を含むことを特徴とするものである。
本発明において、ヒト染色体の種類は、特に限定されないものとし、ヒト１番染色体から２２番染色体、Ｘ染色体及びＹ染色体からなる群から選択される。また、本発明において、ヒト染色体中の多型等の変異は許容の範囲内である。後述の実施例では、ヒト１４番染色体及びヒト２１番染色体を例示し、これらのヒト染色体又はヒト染色体断片からのヒト人工染色体ベクターの作製を示すが、そこに記載される方法、手段等は、その他のヒト染色体にも同様に適用して本発明のヒト人工染色体ベクターを作製することを可能にする。
以下に、本ＨＡＣベクターの作製、ベクターへの外来ＤＮＡの挿入、及び本ＨＡＣベクターの用途について記載する。
１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製
本ＨＡＣベクターは、上述したようにヒト染色体に基づいて作製する。本ＨＡＣベクターの作製には、以下の（ａ）〜（ｃ）のステップが含まれる：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；並びに
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ。
また、本ＨＡＣベクターの作製は、以下のステップ（ｅ）：
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップを含んでもよい。
ここで、上記ステップ（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）の順序、及び上記ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の順序は特に限定されない。
ステップ（ａ）：ヒト染色体を保持する細胞の作製
本ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト染色体（例えばヒト１４番染色体及びヒト２１番染色体を含むすべてのヒト常染色体）又はその断片を保持する細胞を用意する。そのような細胞としては、ヒト染色体又はその断片のみを保持し、かつその後の操作のために相同組換え率の高いものが好ましい。従って本発明においてはまずこれらの条件を満たすような細胞を作製する。
ヒト染色体を保持する細胞は、例えば、ヒト単一染色体を保持する公知のマウスＡ９雑種細胞ライブラリーからヒト染色体を保持するクローンを選択し、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウスＡ９雑種細胞ライブラリーは、薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト単一染色体を保持するものであり、例えば、ＷＯ００／１０３８３号、Ｔａｎａｂｅ，Ｈ．ら（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，８：３１９−３３４，２０００）などに記載されている。例えばヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）にＪＣＲＢ２２１４（細胞名Ａ９（Ｈｙｇｒｏ１４））として登録されており、その詳細な情報・培養法なども入手可能である。
上述のようにして入手したマウスＡ９雑種細胞に保持されるヒト染色体を、相同組換え率の高い細胞に移入する。ここで「相同組換え率の高い細胞」とは、その細胞において相同組換え操作を行った際に、相同組換えの頻度が高い細胞を指し、そのような細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１７４−１８２，１９９６）、マウスＥＳ細胞（相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５）、などが挙げられる。特に、操作の簡便性などの点から、本発明においてはニワトリＤＴ４０細胞を利用することが好ましい。
染色体の移入は、当技術分野で公知の染色体移入法に従って行うことができる。例えば、所望の染色体を１本だけ導入する手法として、Ｋｏｉら（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０：４１３−４１８，１９７３）に記載されているミクロセル法が挙げられる。この手法は、ある種の細胞において紡錘体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、これを受容細胞と融合することにより、少数の染色体を導入するというものである。このミクロセル法を利用してヒト染色体を移入する具体的な操作手順に関しては、例えばＷＯ９７／０７６７１号及びＷＯ００／１０３８３号を参照されたい。以上のようにしてヒト染色体を保持する細胞を作製することができる。
あるいは、本発明においては、全長のヒト染色体ではなく、部分断片化した染色体、例えばヒト１４番染色体の部分断片（ＳＣ２０）を保持する細胞を使用することも可能である（ＳＣ２０；Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，９７：７２２−７２７，２０００年）。ＳＣ２０は、ヒト１４番染色体の長腕遠位及び長腕近位の多くの部分を欠失していることが報告されている（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，９７：７２２−７２７，２０００年；Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第１８巻，ｐ．１０８６−１０９０，２０００年）。具体的には、ＳＣ２０は、ヒト１４番染色体長腕のテロメア配列からＡＬ１３７２２９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）を含む領域、及びこれよりさらにセントロメア側のＡＬ１２１６１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）からＡＬ１５７８５８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のテロメア側から２４−２６ｋｂまでを含む領域を保持している。また、ＡＬ１３７２２９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）とＡＬ１２１６１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）間の領域、及びＡＬ１５７８５８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のテロメア側２４−２６ｋｂからセントロメア間の領域を欠失している。一方、ＳＣ２０においてヒト１４番染色体の短腕領域は保持されている。ＳＣ２０の問題点は、１４番染色体１４ｑ３２領域の遺伝子を複数含んでいることであるが、本明細書に記載された方法でＳＣ２０を縮小化することにより、様々な細胞種で安定に維持され、かつ余分な遺伝子を含まないＨＡＣベクターを得ることができる。なお、ＳＣ２０染色体断片を保持するニワトリＤＴ−４０細胞（ＳＣ２０）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３が与えられている。
ステップ（ｂ）：ヒト染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除
ステップ（ｃ）：テロメア配列の付加
ステップ（ｄ）：サブテロメア配列の付加
ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞において、当該染色体又は染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除する。染色体の削除は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば部位特異的組換え酵素系を利用して行うことができる。また本ＨＡＣベクターの作製においては、染色体又は染色体断片の削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列の付加及びサブテロメア配列を付加するが、これも例えば部位特異的組換え酵素系を利用して行うことができる。部位特異的組換え酵素系の使用は、当技術分野で周知であり、例えば後述するステップ（ｅ）の項に例示される部位特異的組換え酵素とその認識部位を用いることができる。例えば好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である。別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＦＬＰｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である。
ステップ（ｂ）〜（ｄ）の順序は特に限定されるものではなく、例えば長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除した後、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよいし、テロメア配列との置換によって長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除した後、サブテロメア配列を挿入してもよいし、あるいはテロメア配列及びサブテロメア配列との置換によって長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除してもよい。これらのステップの順序は、目的とする本ＨＡＣベクターが最終的に得られるのであれば、任意の順序でかつ任意に反復して実施することができる。
長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除は、その結果得られるヒト染色体断片のサイズが、テロメア配列及びサブテロメア配列を含めて、通常約１Ｍｂ以上、例えば約１Ｍｂ以上約１９Ｍｂ以下となるように、好ましくは約１８Ｍｂ以下、さらに好ましくは約１７Ｍｂ以下となるように行う。
ヒト染色体断片の長腕及び／又は短腕の部位に付加されるテロメア配列はＴＴＡＧＧＧなどの繰り返し配列を持つ塩基配列からなるものであればいずれでもよい。テロメア配列は、例えば、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列に基づいて化学的に合成してもよいし、あるいは任意の染色体（例えばヒト染色体）から公知の方法を用いて作製することもできる。付加されるテロメア配列の長さは、約０．４〜５０ｋｂであり、好ましくは約０．４〜２５ｋｂであり、さらに好ましくは約０．４〜１５ｋｂである。
またヒト染色体断片の長腕及び／又は短腕の部位に付加されるサブテロメア配列は、哺乳動物染色体由来のサブテロメア配列、好ましくはヒト染色体由来のサブテロメア配列、より好ましくはヒト常染色体由来のサブテロメア配列、例えばヒト１４番染色体又はヒト２１番染色体由来のサブテロメア配列である。ヒト染色体由来のサブテロメア配列を用いる場合、任意の染色体の長腕及び／又は短腕由来のサブテロメア配列を用いることができる。ヒト染色体上のサブテロメアについては、Ｌｉｎａｒｄｏｐｏｕｌｏｕ  ＥＶら、Ｎａｔｕｒｅ，第４３７巻、ｐ．９４−１００，２００５年、Ｒｉｅｔｈｍａｎ  Ｈら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，第１３巻、ｐ．５０５−５１５，２００５年、Ｍｅｆｆｏｒｄ  Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．，第３巻、ｐ．９１−１０２，２００２年などの文献に、その詳細な構造、長さなどが記載されており、当業者であれば、これらの文献の記載に基づいて好適なサブテロメア配列を選択し設計することができる。
付加されるサブテロメア配列の長さは、約１〜５００ｋｂであり、好ましくは約１〜３００ｋｂであり、さらに好ましくは約１〜１００ｋｂであり、さらに好ましくは約５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは５〜４０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜４０ｋｂである。また使用するサブテロメア配列は、任意のヒト染色体に存在するサブテロメア領域の全体であってもよいし、その一部であってもよい。本ＨＡＣベクターにおいては、細胞内での安定性などを考慮してサブテロメア配列は約５〜６０ｋｂの一部を用いることが好ましい。サブテロメア配列は、任意のヒト染色体から公知の手法、例えば部位特異的組換え酵素系の利用、を用いて入手することができる。好ましくは、ヒト染色体断片は、ヒト染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、該ヒト染色体と同じ又は異なる、好ましくは同じ、ヒト染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。
好ましい実施形態においては、ヒト染１４番色体断片は、ヒト１４番染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、テロメア配列及びヒト１４番染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。ヒト１４番染色体由来のサブテロメア配列は、例えばヒト１４番染色体の１４ｑ３２領域より遠位の部分（すなわち１４ｑ−ｔｅｌ領域までの部分）であり、具体的には、ヒト１４番染色体の１４ｑ３２．３３領域、若しくはヒト１４番染色体のＡＢ０１９４３９からＡＢ０１９４３７の間、ＡＢ０１９４３８からＡＢ０１９４３７の間、好ましくはＡＢ０１９４３７における位置より遠位の部分のサブテロメア配列である。
別の好ましい実施形態においては、ヒト２１番染色体断片は、ヒト２１番染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、テロメア配列及びヒト２１番染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。ヒト２１番染色体由来のサブテロメア配列は、例えばヒト２１番染色体の２１ｑ２２．３領域より遠位の部分、例えば２１ｑ−ｔｅｌ領域内のＮＴ＿０１１５１５からテロメア末端までの配列である。なお、テロメア末端とは染色体から続くテロメアの端の部分をいい、染色体の末端（染色体末端）と同じ意味である。テロメア配列はテロメア末端を当然に含む。
例えば１つの例として、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除は、ＷＯ００／１０３８３号に記載されているテロメア配列との置換（テロメアトランケーション）により行うことができる。また同様にして、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除は、テロメア配列との置換によって行うことができる。すなわち、ステップ（ｂ）及び（ｃ）において、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位をテロメア配列と置換することによって、長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加する。長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体を保持する細胞において、テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロメア配列の挿入されたクローンを取得した後、テロメアトランケーションによる欠失変異体を得るというものである（Ｉｔｚｈａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，第２巻、ｐ２８３−ｐ２８７，１９９２年、及びＢｒｏｗｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，第９３巻、ｐ７１２５−７１３０，１９９６年を参照されたい）。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、この位置にテロメア配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される（テロメアトランケーション）。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができる。
例えばインタクトなヒト１４番染色体の長腕配列を削除する場合を例として説明する。
ヒト１４番染色体の長腕１４ｑ領域内、好ましくは１４ｑ１１領域内、さらに好ましくはＡＬ３９１１５６からＣＲ３８３６５９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。標的配列の設計は、ヒト１４番染色体の長腕がＡＬ３９１１５６において又はＡＬ３９１１５６よりも近位の位置において削除されるように、具体的にはＡＬ３９１１５６〜ＣＲ３８３６５９の間、より好ましくはＡＬ５１２３１０〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０１〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９１８２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５８９７４３〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ９２９６０２〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＡＬ５１２６２４〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５７〜ＣＲ３８３６５９の間、さらに好ましくはＣＲ３８３６５９の塩基配列に基づいて行われる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト１４番染色体上の例えば１４ｐ領域内、好ましくは１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内、好ましくは１４ｐ１１領域内、さらに好ましくはＲＮＲ２、さらに好ましくはＰＡＢＰＣＰ２（米国  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のオンラインゲノムデータベース
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍａｐｖｉｅｗ／ｍａｐｓ．ｃｇｉ？ＯＲＧ＝ｈｕｍ＆ＣＨＲ＝１４＆ＢＥＧ＝０．００＆ＥＮＩ））の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。ヒト１４番染色体の配列情報は、セントロメア領域を除く長腕全体について塩基配列が上記のデータベース上に公開されている（図１も参照）。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のＨＡＣベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また例えば、ヒト１４番染色体の長腕配列をＳＣ２０よりもさらにセントロメア側に削除する場合、ＡＬ１５７８５８の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト１４番染色体上の１４ｐ領域内、好ましくは１４ｐ１１領域から１４ｐ１２領域内、さらに好ましくは１４ｐ１１領域内、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域から１４ｐ１１．２領域内、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域内、よりさらに好ましくはＲＮＲ２、さらに好ましくはＰＡＢＰＣＰ２（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のオンラインゲノムデータベース
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍａｐｖｉｅｗ／ｍａｐｓ．ｃｇｉ？ＯＲＧ＝ｈｕｍ＆ＣＨＲ＝１４＆ＢＥＧ＝０．００＆ＥＮＩ））の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のＨＡＣベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また別の方法の例として、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除は、例えばＺｈｅｎｇ  Ｂ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，第２０巻、ｐ６４８−ｐ６５５，２０００年に記載されているように、２箇所の部位特異的組換え酵素の認識部位間の欠失により、前記長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料のヒト染色体又はその断片由来のサブテロメア配列を残し、テロメア配列を付加するように行うことが好ましい。すなわち、ステップ（ｂ）及び（ｃ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位における少なくとも２箇所を切断・欠失させることにより、該長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加することができる。また、ステップ（ｂ）〜（ｄ）において、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位上の少なくとも２箇所を切断・欠失させることにより、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除すると共に、削除された長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及び当該ヒト染色体由来のサブテロメア配列を付加する。
長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞において、部位特異的組換え酵素の認識部位を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入されたクローンを取得した後、部位特異的組換え酵素による組換え反応により欠失変異体を得るというものである。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位及び長腕近位又は短腕遠位及び短腕近位の切断位置であり、この位置に部位特異的配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができる。
例えば、前記ヒト染色体又はその断片の長腕遠位の削除は、長腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら２つの認識部位間を欠失して行う。また本発明の別の実施形態においては、前記長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料の染色体由来のテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を残すように行われる。例えば、前記ヒト１４番染色体の長腕遠位の削除は、長腕遠位及び近位に少なくとも２つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えにより２つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト１４番染色体の長腕遠位の１４ｑ３２領域より遠位に及び長腕近位の１４ｑ１１領域より近位に、更に好ましくは、ヒト１４番染色体の長腕遠位のＡＢ０１９４３７より遠位に及び長腕近位のＡＬ３９１１５６より近位に挿入される。
また例えば、前記ヒト１４番染色体の短腕遠位の削除は、短腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら２つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト１４番染色体の短腕遠位の例えば１４ｐ領域内より遠位に、好ましくは１４ｐ１２領域内より遠位に、さらに好ましくは１４ｐ１１領域内より遠位に挿入され、かつ短腕近位の１４ｐ１２領域内より近位に、さらに好ましくは１４ｐ１１領域内より近位に、さらに好ましくは１４ｐ１１．２領域内より近位に、さらに好ましくは１４ｐ１１．１領域内より近位に、さらに好ましくはＲＮＲ２、ＰＡＢＰＣＰ２からなる群より選択されるいずれか１の位置より近位に挿入されている。
さらにまた、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片のＡＰ００１６５７における削除位置又はＡＰ００１６５７より近位の位置に、さらに好ましくはヒト２１番染色体又はヒト２１番染色体断片の短腕近位の２１ｐ１１−ｐ１２領域内における削除位置より近位の位置に挿入することができる。
上述のようにして、テロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を残すようにして長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除したヒト染色体断片を形成させ、それを保持する細胞が得られる。このようにテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列をヒト染色体断片末端に配置することにより、細胞における発現及び／又は安定性を達成することができる。
更にまた、上述のようにして、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片を形成させ、それを保持する細胞が得られる。このような染色体のサイズの縮小化により、細胞における安定性を達成することができる。また、本ＨＡＣベクターを保持する細胞、及び後述する本ＨＡＣベクターが導入される細胞の機能・増殖などに悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を除去することができる。
ステップ（ｅ）：部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入
本ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。このステップ（ｅ）は、上記ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の前、これらのステップの間又はこれらのステップの後のいずれで行ってもよく、これらの順番は特に限定されない。すなわち、ヒト染色体又はヒト染色体断片において、長腕遠位及び／又は長腕遠位を削除し、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入してもよいし、部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及び／又は長腕遠位を削除し、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよいし、あるいは長腕遠位及び／又は長腕遠位を削除した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、その後テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよい。
当技術分野においては、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象が知られており、本発明においてはそのような酵素及び認識部位の系を利用するが、その種類は下記の例に特に限定されない。例えば、そのような系としては、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムが知られている（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８５：５１６６−５１７０，１９８８を参照されたい）。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１由来の３８ＫＤのタンパク質であり、リコンビナーゼのＩｎｔ（インテグラーゼ）ファミリーに属するものである。この酵素は、約３４ｂｐの認識部位ｌｏｘＰ配列を認識して、この部位で特異的にＤＮＡの組換えを起こす。またこのｌｏｘＰ配列の方向性によって、２つのｌｏｘＰ配列間ＤＮＡの欠失又は転座が生じることが知られている。またその他の、特異的な配列を認識して組換え反応を起こす系としては、出芽酵母由来のレコンビナーゼＦＬＰ（Ｂｒｏａｃｈら，Ｃｅｌｌ，２１：５０１−５０８，１９８０）、ファージｐｈｉＣ３１由来のインテグラーゼ（Ｔｈｏｒｐｅら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，９５：５５０５−５５１０，１９９８）などがあり、哺乳動物細胞でもこれらの酵素によるＤＮＡ組換え反応が起きることが報告されている（Ｋｏｃｈら，Ｇｅｎｅ，２４９：１３５−１４４，２０００；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１：３９２６−３９３４，２０００）。
ヒト染色体に、上記部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するには、公知の遺伝子組換え手法、例えば相同組換え法を利用することができる。部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入位置は、当業者であれば、必須ではない遺伝子の位置などを考慮して適宜設定することができる。例えば、ヒト染色体の長腕近位又は短腕近位の任意の位置に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。かかる挿入位置としては、例えば、ヒト１４番染色体については長腕近位１４ｑ１１より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＬ３９１１５６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における前記削除位置より近位、又はヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト２１番染色体については、長腕近位の２１ｑ１１．２より近位、好ましくは２１ｑ１１．１より近位、好ましくはＡＬ１６２０２より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＰ００１６５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における削除位置又はＡＰ００１６５７より近位、或いはヒト２１番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の２１ｐ１１．２、領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
また、後述する外来ＤＮＡの挿入位置として、例えば前記部位特異的組換え酵素認識部位を用いることができる。従って、かかる挿入位置としては、例えば、ヒト１４番染色体については長腕近位１４ｑ１１より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＬ３９１１５６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における前記削除位置より近位、又はヒト１４番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト２１番染色体については、長腕近位の２１ｑ１１．２より近位、、好ましくは２１ｑ１１．１より近位、好ましくはＡＬ１６２０２より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＰ００１６５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における削除位置又はＡＰ００１６５７より近位、或いはヒト２１番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の２１ｐ１１．２領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
その後、後述する外来ＤＮＡの導入手法に従ってリポーター遺伝子を導入し、その発現を確認することによって、ヒト染色体上に挿入した認識部位の位置の適否を確認することができる。
上記例示した認識部位のうち１種類を１つ又は複数挿入してもよいし、あるいは、異なる系の認識部位を複数挿入してもよい。後述するように、本ＨＡＣベクターは、部位特異的組換え酵素の認識部位を有するため、外来ＤＮＡを部位特異的に導入が可能であり、さらに、認識部位の設定により外来ＤＮＡの導入位置を決定できるため、外来ＤＮＡの導入位置が一定となりポジション効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）を回避できる。また外来ＤＮＡの導入操作も簡便となる。さらに異なる系の認識部位を複数挿入することによって、複数の外来ＤＮＡを逐次挿入もできる。また、複数種の部位特異的酵素の認識部位を組み合わせて用いることにより、１種の部位特異的酵素の認識部位を利用して外来ＤＮＡを導入した後、ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子などの不要な遺伝子を別の種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を利用して欠失・削除することができる。
上述のようにしてヒト染色体を改変して作製した本ＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位の他、プロモーター、薬剤耐性遺伝子などのベクター構築において一般的に挿入される配列又はエレメントが挿入されていてもよい。またインスレーター（例えば特開２００６−９４８４９４号参照）、細胞骨格接着領域（Ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ：ＭＡＲ）、ヒト又はその他の生物種のゲノム領域など、遺伝子発現制御及び／又は細胞機能制御及び／又は組織機能制御及び／又は個体発生制御及び／又は生体機能統御に関わる配列又はエレメントが挿入されていてもよい。更にまたテロメラーゼなどの細胞寿命をコントロールするような遺伝子及び／又はチミジンキナーゼなどの自殺遺伝子及び／又は遺伝子発現制御や細胞機能制御や組織機能制御や個体発生制御や生体機能統御などに関わる遺伝子が挿入されていてもよい。そのような配列及び／又はエレメント及び／又は遺伝子は、上述したように相同組換え法を利用して本ＨＡＣベクターの所望の位置に挿入できる。
さらに本発明者は、上述のように作製した本ＨＡＣベクターを保持する細胞を、選択薬剤を含まない培地で長期にわたり継代培養し、経時的にＨＡＣベクターの保持率をＦＩＳＨ法により検定したところ、本ＨＡＣベクターは宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）において安定に保持されること、その安定性は、従来の２１ＨＡＣベクターを顕著に上回ることを確認できた。また、継代培養において、そのＨＡＣベクターの脱落が少ないことのみならず、導入したＨＡＣベクターのコピー数が過度に増減することなく安定に維持されることを確認できた。
さらにまた、驚くべきことに、本ＨＡＣベクターを用いることによって、テロメア配列の近傍に外来ＤＮＡを挿入した場合であっても、従来報告されていたテロメアポジション効果（ＴＰＥ）による外来遺伝子発現抑制事象を受けることなく、該外来ＤＮＡを高発現することができる。ここで近傍とは、テロメア末端からセントロメア側へ向かって約１〜５００ｋｂの領域をいい、好ましくは約１〜３００ｋｂであり、さらに好ましくは約１〜１００ｋｂであり、さらに好ましくは約５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは５〜４０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜６０ｋｂであり、さらに好ましくは約２５〜４０ｋｂである。
２．ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの導入（ステップ（ｆ））
上記ＨＡＣベクターの作製において、部位特異的組換え酵素の存在下にて外来ＤＮＡを挿入するステップ（ｆ）を行うことにより、本ＨＡＣベクターに外来ＤＮＡを導入することができる。このステップ（ｆ）は、上述したステップ（ｅ）の後に行うものであるが、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）との順序は特に限定されず、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の前、これらのステップの間又はこれらのステップの後に行うことができる。従って、ステップ（ｂ）〜（ｆ）の順序は明細書に記載する順序に限定されないことに留意されたい。
外来ＤＮＡとは、対象とする細胞にとって外部から導入されるＤＮＡを指し、遺伝子及びその他の機能配列などをコードするＤＮＡである。本発明において導入対象となる外来ＤＮＡとしては、物質生産、疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列などをコードするＤＮＡであれば特に限定されない。その他の機能配列とは、遺伝子が発現するために機能する配列を指し、例えば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列などが挙げられる。
外来ＤＮＡの導入は、部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。例えば、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列と外来ＤＮＡを保持するターゲティングベクターを構築する。続いて本ＨＡＣベクター（ヒト１４番染色体断片）を保持する細胞において、Ｃｒｅ酵素を細胞内で発現させることにより、ｌｏｘＰ配列とテロメア配列に挟まれた領域と、上記ターゲティングベクターとの部位特異的組換えにより、外来ＤＮＡを本ＨＡＣベクター上に挿入させることができる（黒岩ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：１０８６−１０９０，２０００）。
本ＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位（ｌｏｘＰ配列）を保持する環状ＤＮＡが挿入できる。このため大腸菌を宿主としたプラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣや、酵母を宿主とした環状ＹＡＣなど既存のベクターによりクローン化されたＤＮＡを挿入することができる。またヒト染色体に基づいて作製されていることから、本ＨＡＣベクターに導入可能な外来ＤＮＡのサイズの上限は１００ｋｂオーダーまで拡張され、従来発現実験に用いられてきたプラスミドベクターに組み込まれたｃＤＮＡだけではなく、遺伝子の発現制御領域を含むゲノムＤＮＡも導入可能である。
外来ＤＮＡの挿入位置は、上述したように、例えば前記部位特異的組換え酵素認識部位を用いることができる。かかる挿入位置としては、例えば、ヒト１４番染色体については長腕近位１４ｑ１１より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＬ３９１１５６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における前記削除位置より近位、又はヒト１４番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト２１番染色体については、長腕近位の２１ｑ１１．２より近位、、好ましくは２１ｑ１１．１より近位、好ましくはＡＬ１６２０２より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＰ００１６５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における削除位置又はＡＰ００１６５７より近位、或いはヒト２１番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の２１ｐ１１．２領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、複数の部位特異的組換え酵素の認識部位を利用することにより本ＨＡＣベクターから不要になった薬剤耐性遺伝子発現ユニットやＤＮＡエレメント等を除去できる。例えば、上記Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより導入した外来遺伝子発現ユニット下流に存在するＮｅｏ耐性遺伝子ユニットを除去する場合、上記外来ＤＮＡを保持するターゲッティングベクター上の外来遺伝子発現ユニットの下流、及び本ＨＡＣベクター上のＮｅｏ耐性遺伝子ユニット下流にｌｏｘＰとは別種類の認識部位（ＦＲＴ配列）を導入したコンストラクトを構築する。上記に従い外来ＤＮＡを導入した本ＨＡＣベクターを保持する細胞において、ＦＬＰｅ酵素を細胞内で発現させることによりＦＲＴ配列に挟まれたＮｅｏ耐性遺伝子ユニット領域を部位特異的組換えにより切出し除去できる（例えば図６０参照）。
なお、上記のような薬剤耐性遺伝子の除去は、ヒト１４番及び２１番染色体に限定されることなく、任意のヒト染色体に基づくヒト人工染色体ベクターの作製において実施することができると考えられる。従って、本発明は、以下のステップを含む外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法に関する：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも２種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｅ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
上記方法に従って作製された外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターは、薬剤耐性遺伝子が除去されており、その結果、外来ＤＮＡを高発現することができる（例えばヒト１４番染色体ベクターに関する図２１参照）。
従来のｃＤＮＡ強制発現ベクターを用いた遺伝子導入法では、過剰発現による細胞毒性や増殖抑制などの副作用が生じ、導入遺伝子を恒常的に発現する細胞株が得られない例が多い。この問題点を克服し、生理的な発現パターンを保ちながらなおかつ発現を人工的に制御するには、テトラサイクリンなどを利用した遺伝子発現誘導系の適用が望ましい。導入可能なインサートサイズが大きく、一定のコピー数が安定に保持されるという本ＨＡＣベクターの特徴はこのような目的に適っている。
組織特異的／生理的な遺伝子発現は、遺伝子をコードするゲノム領域からの転写、転写産物の編集、核外への輸送、翻訳の各段階で制御を受ける。一つの遺伝子に対して複数のプロモーターがあって転写開始点が異なる、或いはスプライシングにバリエーションが生じることで、組織特異的なアイソフォームが発現することが知られている。クローン化ｃＤＮＡは一つの遺伝子に由来する複数の転写産物バリアントの１つにすぎない。生理的な遺伝子発現を再現するためには、ゲノムＤＮＡとして制御配列を含んだ遺伝子領域を導入することが望ましい。本ＨＡＣベクターの利用はこのような目的に適うものである。
ヒトゲノムプロジェクトでは、ゲノムＤＮＡはＢＡＣクローンとして単離され、塩基配列が決定された。このため公開されているデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）では、塩基配列はＢＡＣ単位でも登録されている。遺伝子機能解析の１手段としてトランスジェニックマウスの作製がある。本ＨＡＣベクターをプラットフォームとしてＢＡＣを挿入することで、常に挿入部位が同一の条件で遺伝子の発現を解析することが可能になる。多くのＢＡＣベクターはｌｏｘＰ配列を保持しているため、本ＨＡＣベクターへの挿入をネガティブ選別する系を用いれば、塩基配列既知のＢＡＣを本ＨＡＣベクターにカセット形式で簡便に挿入できると考えられる。
上述した以外にも、本ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの導入手法及び導入の利点があり、以下にそのいくつかを例示する。
（１）相互転座による染色体部分断片の導入
部位特異的組換え（例えばＣｒｅ酵素によるｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え）は、線状染色体と環状インサート（外来ＤＮＡ）の場合は挿入反応が起こるが、線状染色体同士では相互転座の反応が起きる。これを利用すれば環状インサートにクローニングできないＭｂ単位以上の染色体断片を本ＨＡＣベクターに導入することができる（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７０８−７１２，２００２）。
（２）挿入体選別法
本明細書の実施例に記載する方法においては、本ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの挿入は、薬剤耐性遺伝子の再構成を指標としたポジティブ選別を利用している（組換え体のポジティブ選別に関しては、ＷＯ００／１０３８３号を参照されたい）。これに代わって、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系などのネガティブ選別により、インサート挿入体（外来ＤＮＡが挿入されたもの）を得ることも可能である。この場合、挿入する環状ＤＮＡには部位特異的組換え酵素の認識部位のみが含まれていればよい。ゲノムプロジェクトで用いられたＢＡＣライブラリーはｌｏｘＰ配列を含んでいるので、このようなネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲノムクローンを本ＨＡＣベクターに容易に挿入することが可能になる。
（３）複数インサートの挿入
本発明において好ましく用いられるｌｏｘＰ配列はＰ１ファージに由来する野生型の配列であり、Ｃｒｅ酵素によるＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。本明細書に記載する実施例においては、Ｃｒｅ酵素を一過性に発現させ、薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体を選別することにより構成的な挿入体が得られた。一度環状インサートが挿入されると、ＨＡＣベクター上に２つのｌｏｘＰ配列が残る。このため再度Ｃｒｅ酵素を発現させると逆反応（環状インサートの切り出し）が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するなどのさらなるＨＡＣベクターの改変は困難となる。一方、塩基置換を行った変異ｌｏｘＰ配列の組み合わせによっては、反応方向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある（Ｈｏｅｓｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：２２８７−２３００，１９８６；Ａｒａｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：８６８−８７２，１９９７；Ｌｅｅら，Ｇｅｎｅ，２１６：５５−６５，１９９８）。このような変異ｌｏｘＰ配列を用いることで、上述した逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築可能である。
（４）コピー数依存的発現制御
αグロビン遺伝子トランスジェニックマウスを用いて宿主染色体上にランダムに挿入された遺伝子のコピー数とｍＲＮＡ発現量の関係を解析した報告（Ｓｈａｒｐｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：１１２６２，１９９３）では、発現量と導入遺伝子コピー数との間に相関は認められない。これは、トランスジェニック動物系統により導入遺伝子の発現量が大きく異なり、また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発現が起こるポジション効果と呼ばれる現象によるものであると考えられ、トランスジェニック動物における遺伝子導入においては頻繁に起こる現象である。また、導入遺伝子のポジション効果を排除して比較するため外来ＤＮＡの挿入位置を予め宿主染色体上に導入した部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰサイト）に確定し部位特異的組換え反応（例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系）によりプラスミドベクターから目的のＤＮＡユニットを導入するトランスジェニックマウスの報告（Ｇａｒｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１８：５６−５９，１９９８）があるが、ここでもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
一方、チロシナーゼゲノム領域を導入したＹＡＣを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいて、導入したゲノム領域のコピー数依存的なチロシナーゼ発現が認められたが（Ｓｃｈｅｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１，１９９３）、生理的発現制御領域を含むゲノムを用いる点でポジション効果の影響を受けないと考えられ、本発明のような生理的制御領域を含まない人工的な遺伝子発現ユニットのみを多コピー化して発現させるものではない。また、各種のエピソームベクターは、宿主染色体と独立に存在し外来ＤＮＡ挿入位置も決まっているが、細胞内でのベクター自身のコピー数を厳密に制御するには至っていない（Ｍｏｒｌｉｎｏら、ｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５：４８０８−４０１３，１９９９；Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９４：６４５０−６４５５，１９９７）。
本発明においては、同一及び／又は異種の目的遺伝子の発現ユニットを多コピー連結して並列配置し、ＨＡＣベクター上の決まった位置（例えばｌｏｘＰサイト）に導入することにより、宿主染色体に変異を与えることなくコピー数依存的発現制御を行なうことができる。
従って、本発明の方法により、外来ＤＮＡとして多コピーの目的遺伝子を所望の細胞に導入し、該細胞において該目的遺伝子をコピー数依存的に発現させることが可能であると共に、該細胞を用いて作出したトランスジェニック動物においては、ポジション効果を受けることなく従来困難であったコピー数依存的な目的遺伝子の発現を達成することが可能となる。
３．ＨＡＣベクターの細胞への移入
本ＨＡＣベクター又は外来ＤＮＡを含む本ＨＡＣベクターを保持する細胞から、それらのベクターをその他の細胞へ移入することができる。移入先となる細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞（哺乳動物細胞）などが挙げられる。本発明においては、無傷の状態でヒト染色体を移入可能であることが知られているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いることが好ましい（ＷＯ００／１０３８３号参照）。ＣＨＯ細胞は、効率良くミクロセルを形成することが知られており（例えば、Ｋｏｉら、ＳＣＩＥＮＣＥ  ２６０：３６１−３６４，１９９３）、これにより本ＨＡＣベクターをＣＨＯ細胞からさらに別の細胞（ＣＨＯ細胞以外の細胞）へ移入することも可能である。また、本発明においては、本ＨＡＣベクターを多分化能を有する細胞に移入することも可能である。「多分化能を有する細胞」とは、所定の操作により、特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。例えば、宿主胚への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、キメラ動物の２種類以上の細胞又は組織に分化可能な細胞、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、精子由来幹細胞（ＧＳ細胞）などが含まれる。また、例えば、増殖因子（例：トランスフォーミング増殖因子；ＴＧＦ）などを添加した誘導培地における培養により、骨細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な細胞、具体的には、体性幹細胞（例：間葉系間細胞）などが含まれる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ＥＳ細胞とも称され、未分化性（全能性）を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、ＥＧ細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約８．５日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
また、ヒトを対象とした遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、ガン化などを避けるための安全性の観点から、不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましいとされている。本発明においては、ヒト染色体由来ＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞（ＨＦＬ）への移入が可能であることが示された。また、本発明の方法により、繊維芽細胞以外のヒト正常体細胞へのヒト１４番染色体由来断片又はヒト染色体由来ＨＡＣベクターの移入が可能である。さらに、本発明の方法に従って作製されたヒト染色体由来ＨＡＣベクターであれば、ヒト染色体に制限されることなく、ヒト正常体細胞に移入することが可能である。
ＨＡＣベクターの細胞への移入は、ミクロセル法を利用して行うことができる。ミクロセル法は、上記「１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。
また、ＨＡＣベクターの細胞への移入は、体細胞核移植法を利用して行うことができる。体細胞核移植法は、Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｙら  Ｎａｔｕｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、第２０巻、ｐ８８９−８９４、２００２年に記載のように行うことができる。
また、本ＨＡＣベクターの細胞への移入について、最初に用意したヒト染色体又は染色体断片を保持する細胞から、ヒト染色体への改変を行うステップの前、ステップの間、又はステップ後のいずれの段階においてもヒト染色体（ＨＡＣベクター）を他の細胞へ移入することが可能である。
４．ＨＡＣベクターの用途
本発明の目的は、ベクターという基本ツールとその利用技術の提供であり、学術研究から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。（ｉ）宿主染色体に挿入されず独立して維持される（宿主遺伝子の変異や癌化の懸念がない）、（ｉｉ）一定のコピー数で長期間安定に保持される（過剰発現、発現消失の懸念がない）、（ｉｉｉ）導入可能なＤＮＡの長さの制限がない（正常な発現制御を保証するＤＮＡエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能である）、という本ＨＡＣベクターの特徴は、従来のベクターで不可能であった多くのことを可能にすると想像される。本ＨＡＣベクターの用途としては、限定するものではないが主要なものを挙げると、（ｉ）動物培養細胞における遺伝子機能解析用ベクター、（ｉｉ）ヒト疾患遺伝子治療用ベクター、（ｉｉｉ）ヒト臓器幹細胞、胚幹細胞（ＥＳ細胞）への遺伝子導入用ベクター、（ｉｖ）遺伝子導入動物作製用ベクター（例：ヒト疾患モデル動物作製、ＫＯ動物と組み合わせた特定遺伝子のヒト化）、などが考えられる。以下に、本ＨＡＣベクターの用途の一例として、（１）外来ＤＮＡの受容細胞への導入、（２）外来ＤＮＡを発現する細胞の作製、（３）タンパク質の製造、（４）遺伝子機能解析用ベクター、（５）幹細胞への遺伝子導入用ベクター、（６）培養フィーダー作製用ベクター、（７）ヒト疾患治療用ベクター、及び（８）遺伝子導入動物作製用ベクターを説明する。
（１）外来ＤＮＡの受容細胞への導入
本ＨＡＣベクターは、細胞中で外来ＤＮＡを挿入したり、外来ＤＮＡが挿入されたＨＡＣベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来ＤＮＡを所望の受容細胞に導入することができる。外来ＤＮＡの受容細胞への導入には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも１つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｉ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｇ）及び（ｈ）においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体又はその断片を移入する。移入対象となるヒト染色体又はその断片は、ステップ（ｂ）〜（ｆ）における染色体又はその断片の改変前、改変ステップの途中、又は改変後のものとすることができる。従って、例えばステップ（ｆ）においてヒト染色体又はその断片に外来ＤＮＡを挿入する前に、ヒト染色体又はその断片を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体又はその断片を移入してもよい。その後、ステップ（ｆ）の外来ＤＮＡの挿入操作を受容細胞において行って、外来ＤＮＡが挿入されたヒト染色体又はその断片を受容細胞に保持させることもできる。これらのステップは他の順序で行うこともでき、ステップ（ｆ）〜（ｈ）の順序は、上記順序に限定されない。
ミクロセル法は、上記「１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。ここで用いる受容細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞、特に哺乳動物細胞（例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が好ましい。また、上述したような多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞などを受容細胞として用いることも可能である。
続いて、ステップ（ｉ）においては、受容細胞に外来ＤＮＡが導入（移入）されているか否かを確認する。この確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来ＤＮＡの制限酵素部位に対応するプローブを用いたサザンブロット解析などにより、外来ＤＮＡの導入を確認することができる。
本ＨＡＣベクターを用いることにより、大きなサイズの外来ＤＮＡを細胞に導入し、安定に保持させることが可能となる。
（２）外来ＤＮＡを発現する細胞の作製
本ＨＡＣベクターは、上述したように、細胞中で外来ＤＮＡを挿入したり、外来ＤＮＡが挿入されたＨＡＣベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することもできる。外来ＤＮＡを発現する細胞の作製には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｉ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｈ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｉ）においては、受容細胞において外来ＤＮＡの発現を確認し、外来ＤＮＡを発現する細胞を選択する。外来ＤＮＡの発現の確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来ＤＮＡに対応するプローブを用いたノーザン・ブロット法などが挙げられる。あるいは、外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質を、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の活性を検出することができる手段を用いて検出することにより、外来ＤＮＡの発現を確認することも可能である。
本ＨＡＣベクターを用いることにより、大きなサイズの外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することが可能となる。
（３）タンパク質の製造
本ＨＡＣベクターを利用することにより、上述したように、外来ＤＮＡを細胞に導入することや、外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することができるため、当該外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。タンパク質の製造には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ；
（ｄ）削除される長腕及び／又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ；
（ｅ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｆ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｇ）上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｈ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｉ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｊ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｈ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｉ）では、ステップ（ｈ）で融合した受容細胞を培地中で培養する。受容細胞を培養するための培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、上記受容細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば適切な培地を選択し、また必要により適宜修正を加えて培地を調製することができる。また、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件、温度、ｐＨ、培養期間なども適宜設定する。
培養後、ステップ（ｊ）に記載するように、得られる培養物からタンパク質を採取する。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。培養終了後、該培養物よりタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用いて得ることが出来る。例えば、細胞内に生産された場合は、常法により細胞を超音波破壊処理、磨砕処理、加圧破砕等によりタンパク質を抽出する。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。また、培養上清に生産された場合は、培養液そのものを用いることが出来る。そして、この溶液を濾過、遠心分離等を行い固形部分を除去し、必要によりプロトタミン処理等により核酸を除去する。
次いで、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗タンパク質溶液を得る。該タンパク質溶液を各種クロマトグラフィー、電気泳動等にかけて精製酵素標品を得る。例えば、セファデックス、ウルトラゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、又はこれらを組合せることにより、精製された目的のタンパク質を得ることが出来る。しかし、上記培養法、精製法は一例であって、これに限定されるものではない。
本発明において、製造対象となるタンパク質は、製造が望まれるタンパク質であれば特に限定されるものではないが、一例としては、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）、アールスポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などが挙げられる。このような製造対象のタンパク質をコードする遺伝子（すなわち外来ＤＮＡ）は、例えば公の遺伝子データベースなどを利用してその配列情報を入手することができる。
（４）遺伝子機能解析用ベクター
本ＨＡＣベクターに挿入した外来ＤＮＡは、細胞中でコピー数依存的かつ安定的に発現されるため、本ＨＡＣベクターは、遺伝子機能を解析するために利用することができる。
標的遺伝子をコードする塩基配列の一部に相補的な配列からなる二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）を発現させることにより標的遺伝子の発現を抑制する手法、ＲＮＡ干渉が知られている（例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関しては、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８，２００１；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８−３９，２００２を参照。また、Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｔ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７：１３４０−１３４５，２００３も参照）。ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを遺伝子発現誘導系とともにＨＡＣベクター上に導入することにより、標的遺伝子のコンディショナルな機能抑制が可能である。また、遺伝子発現誘導系に替えてゲノム領域を利用することで組織特異的／生理的な部位での機能抑制が可能である。また、ゲノム中に存在するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能解析を行なうことも可能である。
また、目的分子による作用効果を解析しようとする場合に、その目的分子の用量依存性を指標として解析する手法がある。この手法において、本発明に従って目的分子をコードする遺伝子の発現ユニットのコピー数を変えてＨＡＣベクター上へ導入し、細胞等（組織、個体も含む）に移入することにより、該細胞等におけるコピー数依存的発現制御に基づいて用量依存性解析を行なうことが可能である。また、遺伝子発現制御のために発現誘導系やゲノム領域を利用することでコンディショナル又は組織特異的／生理的な機能解析が可能である。
（５）幹細胞への遺伝子導入用ベクター
本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、胚性幹（ＥＳ）細胞又は間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｉｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）への遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。そして上記ＨＡＣベクターはＥＳ細胞又はＭＳＣにおいて長期間安定に存在できる。
また、本発明の方法により作製したＨＡＣベクター移入ＥＳ細胞から分化誘導した組織細胞においてもＨＡＣベクターが安定に保持されると考えられる。
また近年、様々な組織の幹細胞及び骨髄由来の多能性細胞が同定されている（横田ら、実験医学（増刊）、１９巻１５号、２００１年、羊土社、岡野ら、実験医学（増刊）、２１巻８号、２００３年、羊土社、Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，ｏｎｌｉｎｅ：３１  Ａｕｇｕｓｔ  ２００３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ９２５）。本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、組織幹／前駆細胞、例えば骨髄、血液、神経、筋肉、肝臓、膵臓、皮膚、内耳などに由来する多能性幹／前駆細胞、への遺伝子導入用ベクターとして利用可能である。
さらに、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、及び組織幹／前駆細胞のヒト臨床応用を考える場合、治療処置に必要な量の細胞を増幅し、所望の分化状態で提供することが求められる。従来では、多分化能を保持したまま幹細胞だけを大量に増幅することは容易ではなく、課題の一つとなっている（日野ら、実験医学、１９巻１５号増刊：１０、２００１、羊土社）。例えば、造血幹細胞や神経幹細胞を生体組織から採取し培養すると、幹細胞だけでなく幹細胞から分化した前駆細胞や成熟細胞も同時に増幅されるため、臨床用途には好ましくない（岡野  榮之、実験医学、１９巻１５号増刊：８０−９０、２００１、羊土社）。
本発明においては、多分化能保持に関わる因子、例えばマウスＥＳ細胞では、活性化型Ｓｔａｔ３，Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの転写因子（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：２０４８−２０６０，１９９８；Ｍａｔｓｕｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：４２６１−４２６９，１９９９；Ｎｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４：３７２−３７６，２０００；Ｍｉｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ，１１３：６３１−６４２，２００３；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ，１１３：６４３−６５５，２００３）をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製し幹細胞へ移入することにより、宿主染色体を変異させることなく多分化能を保持しかつ簡便に幹細胞を増幅させるために利用することが可能である。
また、幹細胞の分化制御においては、関与する分子の発現量のコントロールが重要な要素になっている。例えば、マウスＥＳ細胞における上記Ｏｃｔ−３／４による分化制御においてその発現量が生理的発現レベルを１００％とした場合は未分化状態を維持するが、５０％以下の場合は栄養外胚葉に分化し、また１５０％以上では原始内胚葉に分化する（Ｎｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４：３７２−３７６，２０００）。このような発現レベルの変化により分化を制御する場合には、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターに遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦ誘導系（例えばテトラサイクリンによる発現誘導系）を導入することにより、厳密な発現量のコントロールが可能となる。
また、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターに遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦ誘導系（例えばテトラサイクリンによる発現誘導系）と複数の分化誘導因子とを組み合わせて導入することにより、多分化能保持状態と分化誘導状態を切替えることが可能である。
幹細胞による組織再生を行う場合、移植細胞又はドナー由来の再生組織は、長期間（望ましくは生涯）にわたりレシピエント個体の一部となり機能する。それ故に癌化などの生理的制御の逸脱をドナー細胞に誘発する原因（例えば遺伝子変異）を与える操作は極力避けることが望ましい。本ＨＡＣベクターは、宿主染色体と独立に存在できることから、遺伝子導入を宿主染色体に変異を与えずに行なうことができる。また本明細書中実施例に示すとおり、ヒト細胞中で安定に存在できることから、長期間にわたり安定に目的分子を発現することができる。
本発明の方法に従って、分化させた組織で生理的に発現する遺伝子のゲノム領域又は組織特異的発現制御領域を含むゲノム配列下に目的の遺伝子を融合したＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製し、上記ＨＡＣベクターを移入した幹細胞を用いることにより、再生した組織において生理的／組織特異的に目的分子を発現することが可能である。
また、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターを保持する幹細胞を分化誘導した後、導入遺伝子の発現が必要なければＨＡＣベクターは不用となる場合がある。分化誘導後にＨＡＣベクター脱落クローンを、方法を特に限定するものではないが例えば選択培養における薬剤耐性を指標にして選別することにより、不用となったＨＡＣベクターを排除することが可能である。
（６）培養支持フィーダー細胞作製用ベクター
細胞培養法の一つとして、培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィーダー細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている（日本生化学会編、新生化学実験講座１４発生分化老化、１９９２年、東京化学同人）。例えば造血前駆細胞を増殖させる場合には、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒなどの必要な因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備し、培養液に添加して培養する（Ｕｅｄａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：１０１３−１０２１，２０００）。従来法により培養添加物の遺伝子を培養支持フィーダー細胞へ導入することが可能であるが、宿主染色体へのランダム挿入による変異・ポジション効果、発現不活化、多コピー発現ユニット並列による下流遺伝子発現の減弱などにより、全ての因子について望みの発現量を制御して供給することは困難と考えられる。本発明の方法によりこれらの必要因子をコードするＤＮＡ全て（又は一部）を導入したＨＡＣベクターを作製し、培養支持フィーダー細胞へ移入することにより、組換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必要な因子を全て補給することが可能である。また、遺伝子発現誘導系を利用することでこれら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
（７）ヒト疾患治療用ベクター
ヒト疾患治療用のベクターは、ウイルス性及び非ウイルス性ベクターが従来から各種研究されているが、免疫反応の惹起、導入ＤＮＡサイズの限界、宿主染色体挿入変異、低導入効率・低発現効率、発現量制御が困難（金田  安史、臨床免疫、３９巻：５５１−５５８、２００３年、科学評論社、小澤  敬也編、遺伝子治療、１９９７年、羊土社）など、様々な課題が指摘されている。いずれのベクターにも共通する課題として、「望ましい発現量を、望ましいタイミングで制御する」ことが求められている。
ＨＡＣベクターを用いた遺伝子細胞治療の戦略として、（ｉ）１次的に欠損している酵素やタンパク質の補充、（ｉｉ）２次的に減少している代謝産物を補充する対症療法、（ｉｉｉ）細胞に新機能を付加し、細胞の生存を高める方法（例えば改変細胞を用いる組織再生において、ＨＡＣベクターはゲノムを導入することにより生理的／組織特異的遺伝子発現制御を行なうことが可能である。またこれにより過剰発現又は発現不足による機能障害などの副作用を回避することができる。）、（ｉｖ）Ｇａｉｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎの形で進行する変性疾患の障害をくいとめる方法（例えばパーキンソン病におけるＧＤＮＦ補充治療）などが挙げられる。
すなわち、本ＨＡＣベクターは、ヒト疾患治療用ベクターとして使用することが可能であり、治療用の外来ＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを細胞へ移入後、その細胞を患者に投与するための医薬組成物として調製すること、および本ＨＡＣベクターを用いた遺伝子治療が可能である。また、かかるヒト疾患治療用ベクターは、疾患の治療のみならず、疾患の予防にも使用することが可能である。
適用範囲を特に限定するものではないが、以下にヒト疾患治療用ベクターとしての適用例を示す。
（Ａ）テロメラーゼの利用
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、その安全性観点から不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。しかし正常体細胞は、一定回数分裂すると増殖・分裂が止まりやがて死滅する、すなわち老化することが知られている（井出  利憲、実験医学、１６巻１８号増刊：１８−２４、１９９８、羊土社）。治療効果を長期間持続させるために、治療用細胞は一定期間、望ましくは罹患者の生涯を通して維持されることが必須である。染色体末端に存在する繰返し配列テロメアの修復酵素であるテロメラーゼは、正常細胞内で過剰発現させることにより細胞老化時に認められるテロメア短縮を抑制し、細胞の寿命を延長できることが知られている（Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：３４９−３５２，１９９８）。またテロメラーゼは、細胞内で過剰発現させても不死化又は癌化を導くものではないことが示されている（真貝  洋一、実験医学、１６巻１８号増刊：２５−３０、１９９８、羊土社、Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｔ．，２１：１１１−１１４，１９９９）。それゆえ、本発明の方法によりヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）をコードする遺伝子をＨＡＣベクター上に導入し標的となる細胞へ移入することにより、ＨＡＣ移入細胞の寿命を延長し、不死化又は癌化させることなく治療効果を長期間持続させることが可能である。また、遺伝子発現制御を発現誘導系やゲノム領域を利用することにより、コンディショナル又は組織特異的／生理的なテロメラーゼ発現が可能である。
（Ｂ）自己抗体生成の抑制
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、投与時の自己抗体（活性中和抗体）の生成が障害となっている（Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ，９８：３２４１−３２４８，２００１）。患者への投与方法を特に限定するものではないが、本発明の方法により作製した目的タンパク質をコードするゲノムを導入したＨＡＣベクターを、ヒト細胞、例えば産生組織の正常ヒト細胞へ移入後、これを患者へ移植する。該患者においてＨＡＣベクターから目的タンパク質を生理的／組織特異的に発現・供給することにより、患者における自己抗体生成の抑制が可能である。
また、組織特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的部位を導入遺伝子に付加するなどにより（Ｂｒｏｗｎ  ＢＤら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻、ｐ５８５−５９１、２００６年）、特定の組織・細胞において導入遺伝子を消失させることが可能であり、導入遺伝子に対する自己抗体生成の抑制、免疫応答回避が可能である。
（Ｃ）免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクター
再発白血病に対する治療法として、移植片対白血病反応により移植リンパ球が腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナーリンパ球輸注療法（Ｋｏｌｂら、Ｂｌｏｏｄ，７６：２４６２−２４６５，１９９０）が知られている。上記療法の副作用として、移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿主病が知られているが、これに対するひとつの対処法として、ドナーリンパ球へのレトロウイルスによる薬剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与によるドナーリンパ球の除去が行われている（小野寺ら、ゲノム医学，３巻：４５，２００３，メディカルレヴュー社）。上記方法の場合、ドナーリンパ球の染色体に変異を与える危険性が残る。
本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、宿主染色体に変異を与えない免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクターとして利用することが可能である。また、抗腫瘍活性促進を目的とした治療、例えばリンパ腫におけるＣＤ４０リガンドによる免疫活性化療法（加藤ら、ゲノム医学，３巻：５３，２００３，メディカルレヴュー社）や遺伝子ワクチン療法など、における遺伝子導入用ベクターとしても利用することが可能である。
（Ｄ）モノクロナール完全ヒト抗体補充
近年ヒト抗体産生マウスを利用した、完全ヒトモノクロナール抗体医薬品の創製が試みられている（石田ら、Ｂｉｏベンチャー、２巻：４４、２００２、羊土社、Ｍｏｒｉら，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，２００３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４４，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｕｌｙ  ２００３，ｐ１２８５，＃６４２２）。しかし、これを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なＴＰＯ投与のため病院への通院が必要となり患者のＱＯＬの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により作製したＨＡＣベクター上に、目的の抗体を産生するハイブリドーマから単離した目的抗体をコードするゲノム領域を導入し、例えば患者造血幹細胞やＢ細胞へ上記ＨＡＣベクターを移入後、患者へ再移植することにより、完全ヒト抗体を生理的発現制御により補充・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｅ）単一遺伝性疾患における欠損補充
（Ｅ−１）血友病
血友病Ａは、血液凝固第８因子の変異、血友病Ｂは血液凝固第９因子の変異が原因となって起こる、伴性劣性遺伝性出血疾患である。治療法として第８又は第９因子濃縮製剤投与による補充療法が有効であるが、出血後投与では重篤な合症が生じること、濃縮製剤への病原体混入の可能性、反復投与による自己抗体（活性中和抗体）の発生、常時出血への対処準備による患者ＱＯＬの低下、高額な医療費など課題は多く、遺伝子治療法による解決が期待されている。従来ベクターによる臨床遺伝子治療研究が行われているが、十分な発現を長期間持続できず有意な治療効果を得るに至っていない。また、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを直接投与する臨床研究において被験者の精液中にベクター遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指摘されている（望月ら、ゲノム医学，３巻：２５，２００３，メデイカルレヴュー社）。第８因子をコードする遺伝子は、全長ゲノムで約１．５Ｍｂ、ｃＤＮＡで約７ｋｂにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長ｃＤＮＡの導入は可能であるが発現量の低下が、またＡＡＶベクターでは、導入ＤＮＡサイズが約４．９ｋｂ以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。
本発明の方法により血液凝固第８因子又は第９因子をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、罹患者への移植により補充することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記血液凝固第８因子又は第９因子のゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、該細胞の罹患者への移植により、生理的組織特異的発現により該因子を補充することが可能である。
（Ｅ−２）Ｘ−ＳＣＩＤ（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、液性及び細胞性免疫が先天的に障害される疾患である。ＳＣＩＤの約半数がＸ連鎖のＸ−ＳＣＩＤであり、その原因はインターロイキン２ファミリーの受容体が共有する共通γ鎖の変異であることが知られている。治療法として、造血幹細胞移植が行われているが、液性免疫の回復は不十分で免疫グロブリンの定期的投与が必要となる。そこで造血幹細胞へ共通γ鎖を導入し移植する遺伝子細胞治療法による解決が期待されている。１９９９年からレトロウイルスにより共通γ鎖を導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行われていたが、近年フランスにおいて移植細胞の白血病化が複数例報告された（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３４８：２５５−２５６，２００３；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：３２０，２００３）。何れのケースも遺伝子導入細胞染色体中の原ガン遺伝子の一つであるＬＭＯ２遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、ＬＭＯ２活性化と腫瘍化との関連が疑われている（久米ら、ゲノム医学，３巻：９，２００３，メデイカルレヴュー社）。
本発明の方法により共通γ鎖をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして上記ＨＡＣベクターを遺伝子導入用ベクターに用いることにより宿主染色体へのベクター配列挿入変異の危険を回避することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（例えばヒト骨髄由来正常造血幹細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による共通γ鎖の欠損機能相補を行うことが可能である。
（Ｅ−３）デイシェンヌ型筋ジストロフィー；ＤＭＤ
デイシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異によるジストロフィンの機能欠損が原因である、Ｘ連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ，５１：９１９−９２８，１９８７）。ＤＭＤの治療は、ジストロフィンが細胞骨格タンパク質であるため直接投与による補充は不可能であり、遺伝子治療法が期待されている。
ジストロフィン遺伝子は、全長ゲノムで約２．３Ｍｂ、ｃＤＮＡで１４ｋｂにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長ｃＤＮＡの導入は可能であるが発現量の低下が課題となっている（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４：４５，２００１；ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１２９７９−１２９８４，２００２）。またＡＡＶベクターでは、導入ＤＮＡサイズが約４．９ｋｂ以下に限られるため全長遺伝子を導入できず、また骨格筋への遺伝子導入実験において免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められた（Ｙｕａｓａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９：１５７６−１５８８，２００２）、などの課題が存在する。
遍在的な発現を誘導するＣＭＶプロモーター制御下にジストロフィンミニ遺伝子を導入したＡＡＶベクターによる骨格筋への遺伝子導入実験においては、免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められたが、プロモーターとして骨格筋特異的なＭＣＫプロモーターを使用することにより上記免疫応答が改善された（Ｙｕａｓａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：１５７６−１５８８，２００２）。このことから、ジストロフィンの発現には生理的組織特異的発現が必要であることが示唆される。
本発明の方法によりジストロフィンをコードするゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（特に限定するものではないが例えば自家ヒト正常筋芽細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現によるジストロフィン補充を行うことが可能である。
（Ｅ−４）適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば以下に示す単一性遺伝子疾患；α−１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ）、慢性肉芽腫症、家族性高コレステロール症、ファンコーニ貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、白血球接着欠損症、Ｃａｎａｖａｎ病、脳梁萎縮、ファブリー病、筋萎縮性側索硬化症、リソソーム病、フォンヴィルブランド病、サラセミア、などにおいて、本発明の方法により原因遺伝子を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。なお、疾患原因遺伝子情報については、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のオンライン文献データベース
ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ）
又はＯＭＩＭＴＭ−Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＭａｎＴＭ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）を参照されたい。
（Ｆ）その他疾患
（Ｆ−１）トロンボポイエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）は、血小板産生制御及び造血幹／前駆細胞の増殖を担う因子であり、例えば再生不良性貧血などの血液疾患、化学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。しかし、ＴＰＯ組換え体タンパク質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となっている（Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ，９８：３２４１−３２４８，２００１）。従って、ＴＰＯを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なＴＰＯ投与のため病院への通院が必要となり患者のＱＯＬの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法によりＴＰＯゲノムを導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的にＴＰＯを発現・供給することにより、自己抗体生成を抑制することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−２）エリスロポイエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）は、赤血球増殖因子であり、例えば糖尿病や腎疾患における腎性貧血などの治療薬として市販されている。慢性疾患（例えば糖尿病による腎性貧血など）では定期的なＥＰＯ投与のため病院への通院が必要であり患者のＱＯＬの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。本発明の実施例１４に示したように、ＥＰＯ  ｃＤＮＡ導入したＨＡＣベクターをヒト正常繊維芽細胞へ移入し患者へ移植することにより、該患者においてＥＰＯを発現・供給することが可能である。また、本発明の方法により、ＥＰＯゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的にＥＰＯを発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−３）パーキンソン病
パーキンソン病は、中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落により運動機能が障害される神経疾患である。治療法の一つとして、欠損したドーパミン補充を目的としたＬ−ＤＯＰＡ投与法があるが、中等以上の症状では薬効が減弱することや副作用による患者のＱＯＬ制限・投与量減少などの課題が存在する。これら課題は、ドーパミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与したＬ−ＤＯＰＡが線状体以外で作用することに起因するため、線状体での一定したドーパミンの生理的発現が求められる（武田ら、メデイカルサイエンスダイジェスト、２９巻：２０、２００３年、ニュー・サイエンス社）。現在、ドーパミン合成に関わる酵素３種類を各々導入したＡＡＶベクターによる遺伝子治療研究がなされているが、いずれも生理的発現制御を行うまでには至っていない。また、ドーパミン合成細胞の変性脱落抑制を目的とした治療法にＧＤＮＦ（Ｇｒｉａｌ−ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｆａｃｔｏｒ）投与があるが、被殻下にカテーテル留置による持続投与で効果が認められた（Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，９：５８９−５９５，２００３）一方で感染の危険性や患者のＱＯＬ制限などが課題となっている。ＡＡＶベクターによる遺伝子治療研究により動物モデルで効果が示された（Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：３８１−３８９，２００２）が、こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
本発明の方法により、ドーパミン合成に関わる酵素群又はＧＤＮＦゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（例えばヒト正常神経幹／前駆細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による導入遺伝子産物の補充が可能である。
（Ｆ−４）糖尿病
インスリン依存型糖尿病において、組換え体タンパク質製剤投与による治療が行われている。慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、患者のＱＯＬの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。インスリンの血中濃度は至適範囲がせまいため、多すぎても少なすぎても副作用が生じ、時には生命の危険に至る場合がある。また、遺伝子治療の研究がなされているが、体内におけるインスリン濃度のコントロールが課題となっている（森谷ら、蛋白質  核酸  酵素、４０巻：２７６４、１９９５、共立出版）。
本発明の方法によりインスリンゲノムを導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的に発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−５）適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば脳腫瘍、末梢動脈疾患（虚血など）、慢性間接リュウマチ、動脈再狭窄、肘部トンネル症候群、冠動脈疾患、アルツハイマー病、潰瘍、骨盤骨折、腎疾患、悪性腫瘍、などにおいて、本発明の方法に従って、疾患治癒に必要と考えられる物質をコードする遺伝子を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。
（８）遺伝子導入動物作製用ベクターおよびＨＡＣベクターを有する非ヒト動物
本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、遺伝子導入動物作製用ベクターとして利用可能である。例えば、上記非特許文献５、６又は７の方法に従い、外来遺伝子を含む本ＨＡＣベクターとしてマウス胚性幹細胞に移入しキメラ個体の作製が可能である。また移入した外来遺伝子を個体中で機能発現させること、及び上記外来遺伝子を含む本ＨＡＣベクターをキメラ個体で安定に保持させ生殖系列を経て次世代伝達させることが可能である。また、さらに外来遺伝子を含む本ＨＡＣベクターは、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年；上記）の方法に従い、体細胞核移植によりクローンウシ個体を作出し、個体中で安定に保持させ移入された外来遺伝子を個体中で機能発現させることが可能である。また、本願発明のＨＡＣを保持する動物を公知の手法（例えば、本出願人等による出願である、国際公開ＷＯ９７／０７６７１、ＷＯ０３／０４１４９５及びＷＯ０３／０９７８１２に記載される、胚性幹細胞を使用する方法、核移植法など）によって作製することもできる。動物種としては特に限定はないが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはウシ、ヤギ、豚、羊、犬、ラット、マウス、サル、などが挙げられる。
【実施例】
【０００６】
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例１〜５においては、ヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトＨＡＣベクター（以下、「テロメア型１４ＨＡＣ」又は「１４ＡΔｑＨＡＣ」などという）を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例６〜１１においては、ヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト１４番染色体に由来する約２５Ｋｂのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトＨＡＣベクター（以下、「テロメア・短サブテロメア型ＨＡＣ」又は「１４ＮΔｑＨＡＣ」などという）を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例１２〜１７においては、ヒト１４番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト１４番染色体に由来する約６０Ｋｂのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトＨＡＣベクター（以下、「テロメア・長サブテロメア型ＨＡＣ」又は「１４ｇＮΔｑＨＡＣ」などという）を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例１８〜２２においては、上記の３種のヒトＨＡＣベクター上のＮｅｏ耐性遺伝子ユニットの除去を行った。
下記実施例２３〜２５においては、ヒト２１番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトＨＡＣベクター（以下、「テロメア型２１ＨＡＣ」又は「２１ＡΔｑＨＡＣ」などという）を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例２６〜３０においては、ヒト２１番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト２１番染色体に由来する約８Ｋｂのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトＨＡＣベクター（以下、「テロメア・サブテロメア型ＨＡＣ」又は「２１ＮΔｑＨＡＣ」などという）を作製した。
実施例１
ヒト１４番染色体長腕遠位の削除によるテロメア型１４ＨＡＣ（１４ＡΔｑＨＡＣ）ベクターの作製
（１）テロメアトランケーションによるヒト１４番染色体長腕削除
（１−１）テロメアトランケーション用ベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１の構築
ヒト１４番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター（ターゲティングベクター）は、ｐＴＥＬｐｕｒｏ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第１８巻，ｐ．１０８６−１０９０，２０００年）を用いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＬ３９１１５６）から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000002
ヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９ｃ１１−１４ｃｈｒ、Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１０：１１６３−１１７５，２００１年）を培養し、細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をＰＣＲ法により増幅した。鋳型として約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用し、Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ実験マニュアル，ＨＢＪ出版局，１９９１）に従い、サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用してＰＣＲを行った。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃１０分を２５サイクル、伸長７２℃１０分で行った。７７９１ＦＮｈｅ１／１０６８０Ｒ（ＸｈｏＩ）による２．９ｋｂの増幅産物を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩにて、１０６５７Ｆ（ＸｈｏＩ）／１４６２０ＲｂａｍＨＩによる３．９ｋｂの増幅産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（ロシュ）で消化して、突出末端をもつＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをｐＴＥＬｐｕｒｏプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的なｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１コンストラクトのサイズは約１２．８ｋｂである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図２及び図３に示した。
（１−２）ヒト１４番染色体保持ＤＴ４０細胞へのテロメアトランケーションベクター導入
ヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞は、同染色体を保持する上記Ａ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるＤＴ４０はＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）に登録番号ＪＣＲＢ２２２１として登録されており、入手可能である。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約１×１０８個のＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞からミクロセルを調製した。２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が〜８０％飽和程度まで培養したＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞をコルセミド（０．０７５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ウシ胎仔血清；ＦＢＳ，０．８ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８，ＤＭＥＭ）中で４８時間培養して微小核を誘導した。実施例において、ＤＭＥＭはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温（３４℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃，８０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはＤＭＥＭ６ｍｌに再懸濁した。ＤＴ４０細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＣＳ（仔ウシ血清）、０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて培養後、ＤＭＥＭで２回洗浄し、１×１０７個をＤＭＥＭ５ｍｌに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温、１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＴ４０細胞懸濁液を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１：１．４溶液（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（ＵＳＡ），第１６巻，ｐ．１３３−１４３，１９９７年）で９０秒間融合処理した。融合細胞を６０ｍｌの１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴プレートの６枚に播いて２４時間培養した後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で約２週間選択培養した。２回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。ＰＣＲ解析によりヒト１４番染色体上に存在する領域ＮＥＫ２Ｐ、ＬＯＣ１２２７２７、ＡＬ３９０７９８、ＡＬ１２１８２０、ＡＬ１５７８５８、ＡＬ１３７１９０、ＡＬ１３７２２９、ＩＧＨＭＣ、ＩＧＨＶ３、及びＡＢ０１９４３７の存在を確認し、更にヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いた蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により１コピーのヒト１４番染色体を保持するクローンＤＴ４０（−１４）１−２及びＤＴ４０（−１４）２−４を確認し取得した。
ｐＴＥＬｐｕｒｏ−ｔ１コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、ヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。１×１０７個のＤＴ４０（−１４）１−２又はＤＴ４０（−１４）２−４細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇＤＮＡ存在下で室温１０分間静置した後、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温１０分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＣｈＳ、０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、９６穴プレート（ファルコン）２０枚に播種した。２４時間後に終濃度０．３μｇ／ｍｌとなるようピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，シグマ）を加え、２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。ＤＴ４０（−１４）１−２では、２回のトランスフェクションから合計２７６の薬剤耐性コロニーを、またＤＴ４０（−１４）２−４では４回のトランスフェクションから合計２９４の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト１４番染色体上に存在する遺伝子及びＳＴＳマーカーＤ１４Ｓ２７２及び以下の６遺伝子又はゲノム領域の存在をＰＣＲ法により確認した。ＳＴＳマーカーのプライマーオリゴヌクレオチドの配列は米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのオンラインデータベースＵｎｉＳＴＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）において閲覧可能である。上記のＳＴＳマーカーの登録番号はＵｎｉＳＴＳ：４５１２９である。その他にＧｅｎＢａｎｋデータベースより入手した塩基配列をもとに設計した遺伝子又はゲノム領域プライマーオリゴヌクレオチドの位置を図３（図中、プライマーを矢印で表す）に、配列を以下に示す：
0005345391.tif 000003
なお、ＳＴＳマーカーＤ１４Ｓ２８２のプライマーは公知のものを使用した。
約０．１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記６種の遺伝子又はゲノム領域とＤ１４Ｓ２７２マーカーの計７種についてＰＣＲ増幅（Ｉｎｎｉｓら，前記）を行った。ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃５分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング５６℃３０秒、伸長７２℃３０秒を３５サイクル行った。テロメアトランケーションにより長腕遠位が削除された場合ＮＥＫ２Ｐ、ＬＯＣ１２２７２７、及び７０−５を保持し、ＡＬ３９５４０９−ＡＬ３９５８１１、ＡＬ３９７２５８−３９７６５６、Ｄ１４Ｓ２７２マーカー、及びＩＧＨＶ３を保持しないことが予想される。ＡＬ３９７２５８−３９７６５６の有無で１次スクリーニングした後、残りのマーカー解析を行った。ピューロマイシン耐性５７０株のうち６株（ＤＴ４０（−１４）１−２由来５クローン、ＤＴ４０（−１４）２−４由来１クローン）において予想される増幅結果が得られた。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列内にプローブを設定した（図４）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した：
0005345391.tif 000004
１次スクリーニングで得た６株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＳｐｈＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。代表的な結果を図５に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で１０．４ｋｂ、野生型（非組換え体）で１１．１ｋｂであり、候補６株から合計６株の相同組換え体を確認した。
（１−５）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）及びＦＩＴＣ標識したＰＧＫ−ｐｕｒｏ断片（ｐＴＥＬｐｕｒｏベクターより切出して調製）をプローブに用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト１４番染色体及びＣｏｔ１で染まった短縮したヒト１４番染色体長腕端に２個のＦＩＴＣシグナルが検出された。代表的なＦＩＳＨ像を図６ａ及びｂに示す。図６ａにおいて白矢印はテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト１４番染色体を、図６ｂにおいて白矢印は長腕遠位を削除したヒト１４番染色体断片を示している。宿主であるＤＴ４０細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト１４番染色体が短縮したことを確認した。
以上より、得られたピューロマイシン耐性の６株（１２ｔ９７、１２ｔ１３４、１２ｔ１５９、１２ｔ２０１、１２ｔ２２５、及び２４ｔ８）がヒト１４番染色体を長腕削除により短縮した、テロメア配列を末端に持つ人工染色体（１４ＡΔｑＨＡＣ）を保持することを確認した。
（２）１４ＡΔｑＨＡＣ長腕近位へのクローニング部位の導入
（２−１）ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｔ１ｐＳＦ１ベクターの構築
実施例（１−１）で作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）にｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列を挿入するための基本プラスミドには、ｐＳＦ１（ライフテック）を用いた。ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ挿入部位であるヒト１４番染色体長腕近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（登録番号ＡＬ３９１１５６）。相同組換えの２つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000005
ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として２つの標的配列をＰＣＲにより増幅した。約５ｋｂのＤＮＡ断片制限酵素ＳａｌＩ（ロシュ）で、約２ｋｂのＤＮＡ断片をＦｓｅＩ及びＰａｃＩ（ロシュ）で消化し、突出末端をもつＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これらをｐＳＦ１▲３▼プラスミドのＳａｌＩないしＦｓｅＩ−ＰａｃＩサイトにクローニングした。ｐＳＦ１▲３▼ベクターは、ｐＳＦ１プラスミドのＸｈｏＩサイトに、相同組換え体の選別に用いるブラストサイジン耐性遺伝子を、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロジェン）より制限酵素ＸｈｏＩ（ロシュ）及びＳａｌＩ（ロシュ）消化により約１．３ｋｂの断片として切り出し３’ｎｅｏ配列と逆の転写方向に導入しさらに上記のブラストサイジン耐性遺伝子導入ｐＳＦ１コンストラクトをＡｐａＩ（ロシュ）消化後平滑末端化した部位へＳＮＥＳＰＦリンカー（ＳａｌＩ−ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｒｆＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ）を導入して構築した。以下にＳＮＥＳＰＦリンカーのＤＮＡ配列を示す。
0005345391.tif 000006
最終的なコンストラクトのサイズは約１３．４ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図７〜９に示した。なお、このようにして得られたコンストラクトをｔ１ｐＳＦ１ベクターという。
（２−２）１４ＡΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｔ１ｐＳＦ１ベクター導入
ｔ１ｐＳＦ１コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＡΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。１×１０７個の１２ｔ９７又は１２ｔ１３４細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇＤＮＡ存在下で室温１０分間静置した後、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温１０分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＣｈＳ、０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、９６穴プレート（ファルコン）２０枚に播種した。２４時間後に終濃度８μｇ／ｍｌとなるようブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、フナコシ）を加え、２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。１２ｔ９７では、２回のトランスフェクションから合計５６の薬剤耐性コロニーを、また１２ｔ１３４では１回のトランスフェクションから合計４３個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（２−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図７中、それぞれＳａｌＩ−ＳａｌＩ配列及びＰａｃＩ−ＦｓｅＩ配列で示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図８中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000007
ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は以下のとおり行った。５’ｇｅｎｏｍｅ解析；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃１０分を２５サイクル、伸長７２℃１０分。３’ｇｅｎｏｍｅ解析；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３０サイクル、伸長７２℃１０分。ＰＣＲ反応液にはＭｇＳＯ４（終濃度０．５ｍＭ）で添加した。
得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞９９株のうち１２株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約２ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（２−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列の外側にＮ５’（ｉ）及びＮ３’（ｉｉ）の２種類のプローブを設定した（図９）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、単離、精製した。
0005345391.tif 000008
１次スクリーニングで得た１２株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＳｔｕＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。代表的な結果を図１０に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析及び３’ｇｅｎｏｍｅ側解析ともに相同組換え体で２４．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補１２株から合計７株の相同組換え体を確認した。
以上の（２−１）〜（２−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位（ｌｏｘＰ配列）が挿入された１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞７株（１２ｔ９７Ｓ１、１２ｔ９７Ｓ３８、１２ｔ１３４Ｓ１、１２ｔ１３４Ｓ２、１２ｔ１３４Ｓ３、１２ｔ１３４Ｓ５、及び１２ｔ１５９Ｓ１）を取得した。
（３）ＣＨＯ細胞への１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入
（３−１）ミクロセル法による１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例１（２）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位（ｌｏｘＰ配列）が挿入された１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞（１２ｔ９７Ｓ１、１２ｔ９７Ｓ３８、及び１２ｔ１３４Ｓ２）を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。
はじめに約１０９個のＤＴ４０雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＤＴ４０雑種細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，インビトロジェン）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，ＲＰＭＩ１６４０）中で１３〜１８時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、予めポリＬ−リジンでコーティングした２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に藩種した。３７℃１時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した後、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＭＥＭで２回洗浄後５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した約１０７個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。４５％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ）１０％ＤＭＳＯ（シグマ）を含むＤＭＥＭ溶液で１２０秒間融合処理した。１２０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地（インビトロジェン）に懸濁し、４８穴プレート（ファルコン）５枚に播種し、２４〜３６時間後にブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ，Ｆ１２）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。６回の微小核細胞融合から計２８株（１２ｔ９７Ｓ１由来９株、１２ｔ９７Ｓ３８由来１０株、１２ｔ１３４Ｓ２由来９株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（３−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。方法は、上記実施例１（２−３）に従って行った。得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ細胞２２株のうち２０株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約２ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（３−３）サザンブロット解析
移入した１４ＡΔｑＨＡＣベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例１（２−４）と同様に行った。代表的な結果を図１１に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析及び３’ｇｅｎｏｍｅ側解析ともに相同組換え体で２４．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補２０株から合計１９株（１２ｔ９７Ｓ１由来６株、１２ｔ９７Ｓ３８由来８株、１２ｔ１３４Ｓ２由来５株）の相同組換え体を確認した。
（３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のうち１７株について解析した結果、計８株（１２ｔ９７Ｓ１由来１株；−１、１２ｔ９７Ｓ３８由来４株；−３、−６、−８、−９、１２ｔ１３４Ｓ２由来３株；−３、−５、−６）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーの１４ＡΔｑＨＡＣベクターが検出された。代表的なＦＩＳＨ像及び１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図１２Ａ及びＢに示す。
以上（３−１）から（３−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株８株が１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持することを確認した。
実施例２
１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例１に記載したＣＨＯ細胞株３株（１２ｔ９７Ｓ３８−６，−８，−９、以後１２ｔ７Ｓを略してｔ７Ｓ３８−６，−８，−９と表記する）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収しＦＩＳＨ用染色体標本を作製した。
（２）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。その結果を表１及び図１３に示す。
【表１】
0005345391.tif 000009
図１３において、「２１ΔｑＨＡＣ」はヒト２１番染色体由来のＨＡＣベクター（ＷＯ２００４／０３１３８５号パンフレット）を、「１４ＡΔｑＨＡＣ」は実施例１及び２で作製したＨＡＣベクターを、「１４ＮΔｑＨＡＣ（Ｇ）」は実施例６及び７において作製したＨＡＣベクターを、「１４ｇＮΔｑＨＡＣ（ｇ）」は実施例１２及び１３において作製したＨＡＣベクターの結果を示す。
１４ＡΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において長期継代培養後も安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）及び（２）の実験により、１４ＡΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例３
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現解析
（１）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターの構築
（１−１）１４ＡΔｑＨＡＣベクターへのｈＥＰＯ遺伝子の導入
実施例１で構築した１４ＡΔｑＨＡＣベクターへｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットを挿入する。具体的には、ｌｏｘＰ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。概略を図１４に示す。
実施例１で作製した１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞（ｔ７Ｓ１−１、ｔ７Ｓ３８−６、ｔ７Ｓ３８−８）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。ｌｏｘＰ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）１０μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）１０μｇの存在下でジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＢＳ添加したＦ１２培地（インビトロジェン製）を含む４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）５枚に播種した。２日後に０．８ｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、インビトロジェン）を含む培地と置き換えた。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計１１３個（ｔ７Ｓ１−１由来６個、ｔ７Ｓ３８−６由来７０個、ｔ７Ｓ３８−８由来３７個）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、１４ＡΔｑＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＥＰＯベクター上及び１４ＡΔｑＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認した。プライマー配列及びＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（１−１）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞から計６５株（ｔ７Ｓ１−１由来６株、ｔ７Ｓ３８−６由来３７株、ｔ７Ｓ３８−８由来２２株）において予想される増幅を確認した。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞６５株がｌｏｘＰ配列へのｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図１５に示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである（図１５）。上記（１−２）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞６４株から合計３３株（ｔ７Ｓ１−１由来４株、ｔ７Ｓ３８−６由来１３株、ｔ７Ｓ３８−８由来１６株）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（２）１４ＡΔｑＨＡＣベクターへ挿入されたｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現を培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記実施例３（１−３）において単離したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞３３株を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図１６に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞３３株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。また、その発現量は長腕削除型ＥＰＯ−２１ΔｑＨＡＣを上回ることを示した。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−３）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち１４株について解析した。その結果、計９株（ｔ７Ｓ１−１由来３株；Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、ｔ７Ｓ３８−６由来３株；Ｅ２５、Ｅ３０、Ｅ３４、ｔ７Ｓ３８−８由来３株；Ｅ５、Ｅ７、Ｅ２１）において観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを検出した。代表的なＦＩＳＨ像とｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図１７Ａ及びＢに示す。
以上（１）の実験から、得られたＧ４１８耐性９株は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認した。
実施例４
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下及び選択条件下（対照群）で長期継代培養を行った。実施例３で得たＣＨＯ雑種細胞３株（ｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５、ｔ７Ｓ３８−６Ｅ３４、ｔ７Ｓ３８−８Ｅ５）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子の発現及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞３株について、実施例３（２）の方法に従って行った。その結果、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞３株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。２連で行った実験結果の平均値を図１８に示す。図１８に示すクローン６Ｅ２５、６Ｅ３４及び８Ｅ５は、それぞれｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５、ｔ７Ｓ３８−６Ｅ３４及びｔ７Ｓ３８−８Ｅ５を表す。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記３株についてその結果を表２及び図１８に示す。
【表２】
0005345391.tif 000010
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において長期継代培養後も安定に保持された。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルを検出した。
以上の（１）から（３）の実験により、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＣＨＯ細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例５
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
（１）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
（１−１）微小核融合法によるｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１への移入
染色体供与細胞として、実施例３で得られたｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン（ｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５、ｔ７Ｓ３８−６Ｅ３４及びｔ７Ｓ３８−８Ｅ５）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。はじめに約１０７個のｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５又はｔ７Ｓ３８−８Ｅ５細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）２４本に細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養したｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５又はｔ７Ｓ３８−８Ｅ５細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，インビトロジェン）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，０．８ｍｇ／ｍｌＧ４１８，Ｆ１２）中で３日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＦＬ−１細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）２本に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、４５％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ）１０％ＤＭＳＯ（シグマ）を含むＤＭＥＭ溶液で１分間かけて融合した。２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて２４時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）２枚に播種した。１日後にブラストサイジン（３μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に置き換えた。約４週間の選択培養を行った。出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。２８回（ｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５；１３回、ｔ７Ｓ３８−６Ｅ３４；２回、ｔ７Ｓ３８−８Ｅ５；１３回）の微小核細胞融合から１３８個（ｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５由来；５６個、ｔ７Ｓ３８−６Ｅ３４由来；２６個、ｔ７Ｓ３８−８Ｅ５；５６個）の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてｔ７Ｓ３８−６Ｅ２５細胞を用いて得た細胞をｔ２５Ｈ細胞と、細胞を用いて得た細胞をｔ５Ｈ細胞と以下称する。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するか否かを実施例３（１−２）のプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２を用いて、ヒト染色体をＳＴＳマーカーＤ２Ｓ１３３４のプライマーを用いてＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従いＰＣＲ増幅により確認した。また、染色体供与ＣＨＯ細胞の混入の有無をＣＨＯ  ｆｕｒｉｎ遺伝子特異的プライマーｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒを用いてＰＣＲ増幅により確認した。設計したプライマー配列を以下に示す：
0005345391.tif 000011
反応条件は、９４℃５分の後、変性９４℃２０秒、アニーリング／伸長６８℃３分間を３２サイクル行った。ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞で染色体供与ＣＨＯ細胞の混入が無い場合に、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏＲｐ２により約１．０ｋｂｐの増幅、Ｄ２Ｓ１３３４プライマーにより約０．６ｋｂｐの増幅、ｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒによる増幅なし、が予想される。その結果、上記（１−１）で得たブラストサイジンン耐性株１３８株から計７株（ｔ５Ｈ３、４、２６、２７、２８、２９、ｔ２５Ｈ２）において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジンン耐性株６株がｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジンン耐性株のうち５株（ｔ５Ｈ３、７、２６、２７、２８）についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図１９のＡに示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。その結果、上記（１−２）で得たｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジンン耐性株５株全てにおいて予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト１４番及び２２番染色体特異的αサテライトＤＮＡプローブ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ、フナコシ）を用いて行った。ブラストサイジン耐性株のうち３株（ｔ５Ｈ３、２６、２８）について解析した結果、３株（ｔ５Ｈ３、２６、２８）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の１対のヒト１４番及び２２番染色体セントロメア領域の４箇所と１コピーの１４ＡΔｑＨＡＣベクター由来の１箇所にシグナルが検出された。その結果を図２０Ａ及びＢに示す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性株３株はｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＨＦＬ−１細胞であることが確かめられた。
（２）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞におけるｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）において単離したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジン耐性ＨＦＬ−１細胞４株について、それぞれ約１０５細胞をブラストサイジン（３μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）１ｍｌをいれたコラーゲンＩコートした２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地に置き換え更に２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。その結果を図２１の「１４Ａ−ＨＡＣ」の項目に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞３株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例６
ヒト１４番染色体長腕遠位の削除による１４ＨＡＣ（１４ＮΔｑＨＡＣ）ベクターの構築
ＨＡＣベクターがテロメア配列及びヒト１４番染色体末端の短いサブテロメア配列（約５ｋｂ）を含有するように、長腕遠位及び近位にｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入し、Ｃｒｅによる部位特異的組換え反応により２箇所のｌｏｘＰ配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体（１４ＮΔｑＨＡＣ）ベクターを構築する。
（１）部位特異的組換え反応によるヒト１４番染色体長腕削除
（１−１）ヒト１４番染色体長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌの構築
ｌｏｘＰ配列挿入用ベクター（ターゲティングベクター）には、ｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ（ＷＯ００／１０３８３号）のＫｐｎＩサイトにＫｐｎＩ＊（サイトをつぶす配列）−ＳｒｆＩ−ＰａｃＩ−ＰｍｌＩ−ＫｐｎＩリンカーを挿入したｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ―ＰＧＫを用いた。上記ＫｐｎＩ＊−ＳｒｆＩ−ＰａｃＩ−ＰｍｌＩ−ＫｐｎＩリンカーの塩基配列を以下に示す：
0005345391.tif 000012
ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＢ０１９４３７）から、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター挿入の２箇所の標的配列を設計した。このＴｅｌ側標的配列（合計約９．５ｋｂ）は、以下に示すようにＡ９／＃１４ゲノムをテンプレートとして４断片に分けてＰＣＲ増幅した後ｐＵＣ１８上へクローニングし、制限酵素消化により５’及び３’側標的配列断片を切出して作製した。
断片（ｉ）；０ｋｂ−２．９ｋｂ（５’端にＳａｌＩサイトを付加、３’端にはＢａｍＨＩサイトが内在する）は、ＬＡ−ＰＣＲで増幅後、制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化しｐＵＣ１８のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ導入した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000013
断片（ｉｉ）；２．３ｋｂ−５．４ｋｂ（５’端にＢａｍＨＩサイトが、３’端にＡｃｃＩサイトが内在する）は、ＬＡ−ＰＣＲで増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｃｃＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩサイトへ導入した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000014
断片（ｉｉｉ）；４．５ｋｂ−６．７ｋｂ（５’端にＡｃｃＩサイトが、３’端にＫｐｎＩサイトが内在する）は、ＬＡ−ＰＣＲで増幅後、制限酵素ＡｃｃＩ及びＫｐｎＩで消化し上記断片（ｉｉ）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＡｃｃＩ−ＫｐｎＩサイトへ導入した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000015
断片（ｉｖ）；６．３ｋｂ−９．５ｋｂ（５’端にＫｐｎＩサイトが内在し、３’端にＥｃｏＲＩサイトを付加）は、ＬＡ−ＰＣＲで増幅後、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し上記断片（ｉ）を含むｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩへ導入した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000016
上記の断片（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、上記の断片（ｉ）及び（ｉｖ）を含むｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩサイトへ導入し、Ｔｅｌ側標的配列（合計約９．５ｋｂ）をクローニングした。ＰＣＲは、実施例１（１−１）の方法に従い、ヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９ｃ１１−１４ｃｈｒ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９４℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長７２℃３分を３０サイクル、伸長７０℃１０分で行った。
５’領域（ｔｅｌ側）４．４ｋｂは上記Ｔｅｌ側標的配列（合計約９．５ｋｂ）を含むｐＵＣ１８を制限酵素ＳｐｈＩ消化により線状化し、ＫｐｎＩ−ＳｐｈＩリンカー付加後、制限酵素ＫｐｎＩ及びＡｐａＩで消化し、精製して上記ｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ−ＰＧＫベクターのＫｐｎＩ−ＡｐａＩサイトへクローニングした。ＫｐｎＩ−ＳｐｈＩリンカーの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000017
また、３’領域（ｃｅｎ側）４．０ｋｂは、Ｔｅｌ側標的配列（合計約９．５ｋｂ）を含むｐＵＣ１８から制限酵素ＥｃｏＲＩ消化しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩサイトへサブクローニングした後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後平滑末端化し、更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化し精製して、上記５’領域（ｔｅｌ側）４．４ｋｂを含むｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ−ＰＧＫベクターのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶサイトへクローニングした。最終的なｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌコンストラクトのサイズは約１５．７ｋｂである。ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクターを図２２に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図２３に示した。
（１−２）ヒト１４番染色体保持ＤＴ４０細胞への長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクター導入
実施例１（１−２）の方法に従い、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌコンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、ヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞ＤＴ４０（＃１４）２−４に導入した。ブラストサイジン（終濃度８ｕｇ／ｍｌ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。２回のトランスフェクションから合計４８０個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在を実施例６（１−１）の方法に従い、ＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図２３中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対
を設計した。その位置は図２４に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000018
上記ブラストサイジン耐性４８０株のうち３株において５’及び３’側の２標的配列の存在を確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの５’及び３’側の２標的配列外側にプローブ（ＩＧＨ５’及びＩＧＨ３’）を設定した（図２３）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した：
0005345391.tif 000019
１次スクリーニングで得た３株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（５’側）又はＢａｍＨＩ（３’側）により（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。代表的な結果を図２５に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１４．０ｋｂ、野生型（非組換え体）で１０．６ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で７．４ｋｂ、野生型（非組換え体）で９．０ｋｂであり、候補３株から合計２株（２４Ｇ８、２４Ｇ９４）の相同組換え体を確認した。
（２）ヒト１４番染色体長腕近位セントロメア側へのｌｏｘＰ配列挿入
（２−１）ヒト１４番染色体長腕近位セントロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１の構築
ｌｏｘＰ配列挿入用ベクター（ターゲティングベクター）には、ｐｌｏｘＰｄｏｗｎＰＵＲＯ（ＷＯ００／１０３８３号）のＦｓｅＩサイトにＦｓｅＩ＊（サイトをつぶすような配列）−ＰｍｌＩ−ＰａｃＩ−ＳｒｆＩ−ＦｓｅＩリンカーを挿入したｐｌｏｘＰｄｏｗｎＰＵＲＯ−ＨＹＧを用いた。上記ＦｓｅＩ＊−ＰｍｌＩ−ＰａｃＩ−ＳｒｆＩ−ＦｓｅＩリンカーの塩基配列を以下に示す：
0005345391.tif 000020
0005345391.tif 000021
ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＬ３９１１５６）から、ｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクター挿入用の２箇所の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000022
実施例１（１−１）の方法に従い、ヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９ｃ１１−１４ｃｈｒ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて５’及び３’側の２つの組換え標的配列をＰＣＲ法により増幅した。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いた。５’側標的配列用の反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃１０分を３０サイクル、伸長７０℃１０分で行った。また、３’側標的配列用の反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３０サイクル、伸長７０℃１０分で行った。３’側標的配列用２．０ｋｂの増幅産物は、ＦｓｅＩ及びＰａｃＩ消化しｐｌｏｘＰｄｏｗｎＰＵＲＯ−ＨＹＧベクターのＦｓｅＩ−ＰａｃＩサイトへクローニングした。また、５’側標的配列５．０ｋｂの増幅産物は、制限酵素ＳａｌＩで消化し、上記の２．０Ｋｂの標的配列を持つｐｌｏｘＰｄｏｗｎＰＵＲＯ−ＨＹＧベクターのＳａｌＩサイトへクローニングした。最終的なｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１コンストラクトのサイズは約１６．１ｋｂである。ｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクターを図２６に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図２７に示した。
（２−２）ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌを導入したヒト１４番染色体保持ＤＴ４０細胞への長腕近位セントロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクター導入
実施例１（１−２）の方法に従い、ｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、実施例７（１−４）で作製したｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌを導入したヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞２４Ｇ８及び２４Ｇ９４に導入した。ピューロマイシン（終濃度０．３ｕｇ／ｍｌ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。６回のトランスフェクションから合計２３０個（２４Ｇ８由来５０個、２４Ｇ９４由来１８０個）のピューロマイシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（２−３）ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在を実施例６（２−１）の方法に従い、ＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図２７中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図２８中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000023
上記ブラストサイジン耐性２３０株のうち３４株（２４Ｇ８由来１４株、２４Ｇ９４由来２０株）において５’及び３’側の２標的配列の存在を確認した。
（２−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの５’及び３’側の２標的配列外側にプローブ（Ｎ５’（ｉ）及びＮ３’（ｉ））を設定した（図２７）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した：
0005345391.tif 000024
１次スクリーニングで得た３４株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＳｔｕＩ（ロシュ）により消化し、実施例６（１−４）と同様に行った。代表的な結果を図２９に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１２．５ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で１０．２ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂであり、候補３４株から合計２２株（２４Ｇ８由来１４株、２４Ｇ９４由来８株）の相同組換え体を確認した。これらのうち、２４Ｇ８由来のクローン２４Ｇ８ｎ７及び２４Ｇ９４由来のクローン２４Ｇ９４ｎ１８及び２４Ｇ９４ｎ５６を次のステップ（３）へ進めた。
（３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
（３−１）長腕遠位及び近位へｌｏｘＰ配列挿入したヒト１４番染色体保持ＤＴ４０雑種細胞へのＣｒｅ発現ベクターの導入
実施例１（１−２）の方法に従い、Ｃｒｅ発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅを実施例６（２）で取得した２４Ｇ８ｎ７及び２４Ｇ９４ｎ１８及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞に導入した。ハイグロマイシン（終濃度１．２５ｍｇ／ｍｌ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
２４Ｇ８ｎ７細胞においては、２回のトランスフェクションから合計５４個のハイグロマイシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。２４Ｇ９４ｎ１８及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞においては、１０クローンを１プールにまとめ、それぞれ２０プールを増殖させ以後の解析を行った。
（３−２）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として２つのｌｏｘＰ配列間の欠失をＰＣＲ法により確認した。長腕遠位欠失後に残ったｌｏｘＰ配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図３０Ａ中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000025
ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長７２℃１分を３５サイクルで行った。ＬｏｘＰ配列間の欠失により長腕遠位が削除された場合、約０．８ｋｂの増幅が予測される。その結果、上記２４Ｇ８ｎ７細胞由来のハイグロマイシン耐性５４株のうち１６株において、また２４Ｇ９４ｎ１８及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞由来の各２０プール全てにおいて予測される増幅産物を確認した。
（３−３）サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図３０Ａ及び図３０Ｂに示した。相同組換えの５’及び３’側の２標的配列外側にプローブ（ＩＧＨ５’（ｉ）及びＮ３’（ｉ））を設定した。
１次スクリーニングで得た２４Ｇ８ｎ７細胞由来の１６株及び２４Ｇ９４ｎ１８細胞由来の２０プール及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞由来の１０プールからゲノムＤＮＡを抽出し実施例６（１−４）と同様に行った。制限酵素（ロシュ）消化は、ＢｓｔＥＩＩ（５’側）又はＳｔｕＩ（３’側）により行った。代表的な結果を図３１に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で７．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で１４．０ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で８．３ｋｂ、野生型（非組換え体）で１０．２ｋｂである。その結果、２４Ｇ８ｎ７細胞由来の１２株及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞由来の１０プールにおいて長腕遠位欠失体を確認した。
（３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）及び実施例６（１−１）で作製したｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクターから制限酵素ＨｉｎｄＩＩにより消化、切出し精製した約４．２ｋｂの５’標的配列断片をプローブに用いて行った。上記（３−３）で取得した２４Ｇ８ｎ７細胞由来の４クローン（Ｇ８ｎ７Δｃ２／ｃ５／ｄ１／ｄ４）及び２４Ｇ９４ｎ５６細胞由来の４プール（Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１／ｐ２５／ｐ２８／ｐ３０）について解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーのシグナルと短縮された長腕の末端に２個のシグナルを検出した。代表的なＦＩＳＨ像を図３２Ａ及びＢに示す。
以上（３−１）から（３−４）の実験から、得られたハイグロマイシン耐性ＤＴ４０雑種細胞は、テロメアを残して長腕遠位を削除したヒト１４番染色体断片（１４ＮΔｑＨＡＣ）を保持することを確認した。
（４）１４ＮΔｑＨＡＣ長腕近位へのクローニング部位の導入
（４−１）ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｐＳＦ（Ｇ＋ｎ１）ベクターの構築
上記実施例６（３）で作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）にｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例１（２−１）で作製したｐＳＦ１▲３▼を用いた。ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ挿入部位である相同組換えの５’側標的配列は上記実施例７（１−１）で取得したｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクターで用いた配列から、３‘標的配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕近位の塩基配列（登録番号ＡＬ３９１１５６）から設計した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000026
５’側標的配列は、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌベクターからＸｂａＩ及びＳｎａＢＩ（ロシュ）で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、ｐＳＦ１▲３▼プラスミドのＮｈｅＩ−ＳａｌＩＩサイトにクローニングした。また３’側標的配列は、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。この約５．０ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＦｓｅＩ（ロシュ）で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、上記５’標的配列を挿入したｐＳＦ１▲３▼プラスミドのＦｓｅＩサイトにクローニングした。最終的なｐＳＦ１（Ｇ＋ｎ１）コンストラクトのサイズは約１５．０ｋｂある。ターゲティングベクターを図３３に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図３４Ａに示した。
（４−２）１４ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｐＳＦ（Ｇ＋ｎ１）ベクター導入
ｐＳＦ（Ｇ＋ｎ１）コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＮΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞６種（Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１／ｐ２５／ｐ２８／ｐ３０、Ｇ８ｎ７Δｃ２／ｃ５）にそれぞれ導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１／ｐ２５／ｐ２８／ｐ３０では、各２回のトランスフェクションから合計３２１個（それぞれ１１７／１５３／４６／７個）の薬剤耐性コロニーを、またＧ８ｎ７Δｃ２／ｃ５では各１回のトランスフェクションから合計１９１個（それぞれ９６／９５個）の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
（４−３）ＰＣＲ解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図３４中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図３４中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000027
ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、ＰＣＲ反応液にはＭｇＳＯ４（終濃度０．５ｍＭ）で添加した。反応条件は９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃８分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃８分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃８分を３０サイクル、伸長７２℃１０分で行った。
得られたブラストサイジン耐性株のうち１２株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約４．５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約５．０ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した（Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１／ｐ２５／ｐ２８／ｐ３０由来；２／１／２／２、計７株、Ｇ８ｎ７Δｃ２／ｃ５由来；１／４、計５株）。
（４−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンブロット解析を行った。プローブは、相同組換えの標的配列の外側にＩＧＨ５’（ｉ）（実施例６（１−４））及び３’側の標的配列外側にプローブＮ３’（ｉｉ）を設定した（図３４）。Ｎ３’（ｉｉ）プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した：
0005345391.tif 000028
１次スクリーニングで得た１２株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。代表的な結果を図３５に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析で相同組換え体１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で７．６ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析で相同組換え体１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補１２株から合計５株の相同組換え体を確認した。
以上の（４−１）〜（４−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列）が挿入された１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞５株（Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１Ｓ３９、Ｇ９４ｎ５６Δｐ２５Ｓ６１、Ｇ９４ｎ５６Δｐ２８Ｓ７、８、Ｇ８ｎ７Δｃ２Ｓ２０２、Ｇ８ｎ７Δｃ５Ｓ９０）を取得した。このうち、Ｇ９４ｎ５６Δｐ２１Ｓ３９、Ｇ９４ｎ５６Δｐ２５Ｓ６１、Ｇ８ｎ７Δｃ２Ｓ２０２、Ｇ８ｎ７Δｃ５Ｓ９０（以下Ｇ４Ｓ３９、Ｇ４Ｓ６１、Ｇ８Ｓ２０２、Ｇ８Ｓ９０と略称する）の４株を次のステップへ進めた。
（５）ＣＨＯ細胞への１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入
（５−１）ミクロセル法による１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例６（４）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列）が挿入された１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞（Ｇ４Ｓ３９、Ｇ４Ｓ６１、Ｇ８Ｓ２０２、Ｇ８Ｓ９０）をそれぞれ用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。方法は、実施例１（３−１）に従って行った。約２週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。８回（Ｇ４Ｓ３９；２回、Ｇ４Ｓ６１；２回、Ｇ８Ｓ２０２；２回、Ｇ８Ｓ９０；２回）の微小核細胞融合から計９２株（Ｇ４Ｓ６１由来１９株、Ｇ４Ｓ３９由来２３株、Ｇ８Ｓ９０由来２２株、Ｇ８Ｓ２０２由来２８株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（５−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。方法は、実施例６（４−３）に従って行った。またＤＴ４０細胞の混入チェックのためトリβアクチン検出用プライマーをＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たトリβアクチン遺伝子の塩基配列（登録番号Ｘ００１８２）から設計した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000029
ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング５６℃３０秒、伸長７２℃３０秒を３５サイクルで行った。得られたプラストサイジン耐性ＣＨＯ細胞株のうち６７株（Ｇ４Ｓ６１由来１５株、Ｇ４Ｓ３９由来２３株、Ｇ８Ｓ９０由来２０株、Ｇ８Ｓ２０２由来９株）において、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約４．５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約５．０ｋｂ）の増幅産物を与えること及びＤＴ４０細胞の混入が無いことを確認した。
（５−３）サザンブロット解析
移入した１４ＮΔｑＨＡＣベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例６（４−４）と同様に行った。代表的な結果を図３６に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析で相同組換え体１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で７．６ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析で相同組換え体１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補７４株（Ｇ４Ｓ６１由来１４株、Ｇ４Ｓ３９由来１６株、Ｇ８Ｓ９０由来２０株、Ｇ８Ｓ２０２由来２４株）から合計５２株（Ｇ４Ｓ６１由来１４株、Ｇ４Ｓ３９由来１６株、Ｇ８Ｓ９０由来１５株、Ｇ８Ｓ２０２由来７株）の相同組換え体を確認した。
（５−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のうち２３株（Ｇ４Ｓ６１由来７株、Ｇ４Ｓ３９由来１１株、Ｇ８Ｓ２０２由来１株、Ｇ８Ｓ９０由来４株）について解析した結果、計９株（Ｇ４Ｓ６１−１、６、８、９、１１、１２、Ｇ４Ｓ３９−１３、Ｇ８Ｓ９０−２，４）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーの１４ＮΔｑＨＡＣベクターが検出された。代表的なＦＩＳＨ像と１４ＮΔｑＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図３７Ａ及びＢに示す。
以上（５−１）から（５−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株９株は１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
実施例７
（７−１）１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例６に記載した１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞株２株（Ｇ４Ｓ３９−１３、Ｇ４Ｓ６１−１）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収しＦＩＳＨ用染色体標本を作製した。
（２）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記２株についてその結果を表３及び図１３に示す。図１３においては、「１４ΔｑＨＡＣ（Ｇ）」の項目に示す。
【表３】
0005345391.tif 000030
１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において１０継代後までの時点で安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）及び（２）の実験により、１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
（７−２）ＥＰＯ導入１４ＡΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ細胞移植によるインビボＥＰＯ薬効
実施例３で作製した、ＥＰＯ導入１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞クローンｔ７Ｓ３８−８Ｅ５を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、Ｂ細胞欠損により抗体産生できないＩｇμ−／−ノックアウトマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７，７２２−７２７，２０００）皮下へ移植し、末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリットの値を解析することによりｔ７Ｓ３８−８Ｅ５細胞から供給されるＥＰＯのインビボでの薬効評価を行った。上記３つの値が細胞カプセル移植群において対照群と比べ上昇すればＥＰＯ薬効有りと判断できる。
ＥＰＯ導入１４ＡΔｑＨＡＣベクター保持ＣＨＯ細胞クローンｔ７Ｓ３８−８Ｅ５を実施例３の方法に従って培養し、１ｘ１０６個を免疫細胞遮断カプセルＴｈｅｒａＣｙｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ４０μｌ  ｄｅｖｉｃｅ（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）へ添付のプロトコールに従って封入した。このカプセルをＩｇμ−／−ノックアウトマウス左背皮下へアバチン麻酔下で移植し、移植後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値をＡＤＶＩＡ１２０（バイエルメディカル社）により測定した。対照群としてカプセルなしの手術のみの群を実施した。その結果を図８７に示す。
移植後２週から細胞カプセル移植群において赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値が上昇し、最大４４週まで上記の上昇した値が維持された。以上により、ＥＰＯ−１４ＡＨＡＣ保持ＣＨＯ細胞移植による長期のインビボＥＰＯ薬効が示された。
（７−３）ＥＰＯ導入１４ＨＡＣベクター保持ヒト正常線維芽細胞移植によるインビボＥＰＯ薬効
下記実施例１９で作製した、ＥＰＯ導入１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するヒト正常線維芽細胞ＨＦＬ−１細胞クローンｔΔ６３Ｈから選択したｔΔ６３Ｈ１５、またはｔΔ６３Ｈ１５と同様の方法で作製したＨＦＬ−１細胞クローンｔΔ４７Ｈ２７，３０，３７を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、Ｂ細胞欠損により抗体産生できないＩｇμ−／−ノックアウトマウス皮下へ移植し、末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリットの値を解析することにより、上記ＨＦＬ−１クローンから供給されるＥＰＯのインビボでの薬効評価を行った。上記３つの値が細胞カプセル移植群において対照群と比べて上昇すればＥＰＯ薬効有りと判断できる。
ＥＰＯ導入１４−ＨＡＣ保持ＨＦＬ−１細胞クローンｔΔ６３Ｈ１５、またはｔΔ４７Ｈ２７，３０，３７を下記実施例１９の方法に従って培養し、１０６個の上記細胞をコラーゲンＩビーズ（ＫＯＫＥＮ）とともに免疫細胞遮断カプセルＴｈｅｒａＣｙｔｅｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ４０μｌ  ｄｅｖｉｃｅ（ＴｈｅｒａＣｙｔｅＩｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）へ添付のプロトコールに従って封入した。なお、細胞とビーズは準備したカプセルへ１ｍｌシリンジ（テルモ）にシリコン封入用アダプターを装着してカプセルポート（封入口）へ接続しカプセル内へ入れた。このカプセルを６ウェルプレートにてＤＭＥＭ−２０％ＦＢＳ培地を用いて３７℃６．５％  ＣＯ２で２〜６週間培養後、移植２日前および移植当日にヒトｂＦＧＦ（０または１０ｎｇ／ｍｌ）入り培地に交換して更に培養した。上記（７−２）と同様にしてＩｇμ−／−ノックアウトマウス左背皮下へ移植し、移植後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値をＡＤＶＩＡ１２０（バイエルメディカル社）により測定する。
上記のように、ＥＰＯ−１４ＨＡＣを保持するヒト正常線維芽細胞移植によって長期インビボＥＰＯ薬効を確認・実施することができる。
（７−４）１４ＨＡＣベクターのマウスにおける子孫伝達
１４ＨＡＣベクターのインビボにおける安定性および子孫伝達を検証するために、ＥＧＦＰを導入した１４ＨＡＣベクターを作製し、マウスＥＳ細胞へミクロセル法により移入後、キメラマウスを作製・交配して、マウス体細胞におけるＨＡＣ保持率を解析した。
（１）ＥＧＦＰ−１４ＨＡＣベクターの構築
ＣＡＧプロモーター支配下にＥＧＦＰ遺伝子を配置したプラスミドｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを作製し、ＣＨＯ細胞においてＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及び１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクター上へＥＧＦＰ遺伝子発現ユニットを導入した。
（１−１）ＥＧＦＰ発現プラスミドｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの作製
ｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ作製に先立って、ｐＬＮ１−ＰＧＫ−ＥＧＦＰを作製した。これは、２ステップで行った。まずステップ１は、ｐＬＮ１−ＥＰＯ（ＫａｋｅｄａらＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）のＣＭＶ−５’ｎｅｏ領域のＣＭＶプロモーターをＰＧＫプロモーターに置き換えて作製したプラスミドｐＬＮ１−ＰＧＫＥＰＯをＳａｌＩ消化後平滑化し、さらにＥｃｏＲＩ消化によりＥＰＯ発現ユニットを除去した。ここへｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック）をＡｆｌＩＩ消化後平滑化、さらにＥｃｏＲＩ消化により調製したＥＧＦＰ−Ｓｖ４０ｐｏｌｙＡユニットを導入した。次のステップ２は、ステップ１をＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化したところへ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅ（Ａｒａｋｉら、ＰＮＡＳ，９２，１６０−１６４，１９９５）をＳａｌＩ−ＸｂａＩ消化により調製したＣＡＧプロモーター前半部分と、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅを鋳型にしてＰＣＲ増幅とＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ消化により調製したＣＡＧプロモーター後半部分を同時に導入した。以下にＰＣＲで用いたプライマー配列を示す。
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次に、ｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを作製した。ｐＬＮ１（ＫａｋｅｄａらＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）をＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ消化し、ＣＭＶプロモーター及びＳｖ４０ｐｏｌｙＡを除去した。ここへ、ｐＬＮ１−ＰＧＫ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化により調製したＣＡＧプロモーター及びＥＧＦＰを含む断片と、ｐｃＤＮＡ３．０（インビトロジェン）由来のＩＲＥＳ配列を鋳型にしてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ消化により調製したＩＲＥＳ断片を同時に導入した。以下にＰＣＲで用いたプライマー配列を示す。
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最終的なｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰコンストラクトのサイズは約５．７ｋｂである。
（１−２）１４ＡΔｑＨＡＣベクターへのＥＧＦＰ遺伝子発現ユニットの導入
１４ＡΔｑＨＡＣ及び１４ＮΔｑＨＡＣベクターへＥＧＦＰ配列を含むＥＧＦＰ遺伝子発現ユニットを挿入する。ｌｏｘＰ配列を含むＥＧＦＰ発現プラスミドｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞ｔ７Ｓ３８−６及び１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞Ｇ４Ｓ３９−１３（実施例８）を用いて、実施例３または８の方法に従って行った。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計８０個（１ｔ７Ｓ３８−６由来４０個、Ｇ４Ｓ３９−１３由来４０個）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ＥＧＦＰ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及び１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター上及び１４ＡΔｑＨＡＣ及び１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクター上に設計したプライマーＥＧＦＰ３７４ＦおよびＮｅｏ  Ｒｐ２によって、ＰＣＲ増幅により確認した。概略を図８８に示した。
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組換え挿入体の場合は、プライマー  ＥＧＦＰ  ３７４ＦおよびＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．２ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（１−２）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞から計８０株（ｔ７Ｓ３８−６由来４０株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来４０株）において予想される増幅が確認された。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞計８０株がｌｏｘＰ配列へのＥＧＦＰ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
（１−４）サザンブロット解析
ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターにおいてＥＧＦＰ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。プローブは、ＥＧＦＰコード領域の塩基配列７８〜３９５番目の３１８ｂｐをＰＣＲ増幅して作製した。用いたプライマー配列を以下に示す。
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塩基配列から予想されるＥｃｏＲＩ消化による制限酵素断片長は、ＥＧＦＰ発現ユニットを含む７．５ｋｂである。概略を図８９に示した。
上記（１−３）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞８０株から合計７０株（ｔ７Ｓ３８−６由来３４株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来３６株）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−５）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−４）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち１５株（ｔ７Ｓ３８−６由来８株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来７株）について解析した。その結果、計１１株（ｔ７Ｓ３８−６由来６株；ｔ６ＥＧＩ−２，６，９，１１，２４，３０、Ｇ４Ｓ３９−１３由来５株；Ｇ１３ＥＧＩ−１，５，１５，１７，２０）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターを検出した。
以上（１−１）から（１−５）の実験から、得られたＧ４１８耐性１１株はＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞（ｔ６ＥＧＩ−２，６，９，１１，２４，３０）及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞（Ｇ１３ＥＧＩ−１，５，１５，１７，２０）であることを確認した。
（２）ＥＧＦＰ  −１４ＡΔｑＨＡＣ又はＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入マウスＥＳ細胞の作製
（２−１）マウスＥＳ細胞ＴＴ２ＦへのＥＧＦＰ  −１４ＨＡＣベクター移入
上記（１）で作製したＣＨＯクローンｔ６ＥＧＩ−１１，ｔ６ＥＧＩ−２４，Ｇ１３ＥＧＩ−１，Ｇ１３ＥＧＩ−５（以下それぞれｔ１１，ｔ２４，Ｇ１，Ｇ５と記す）をＨＡＣドナー細胞として、ミクロセル法により（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，１３３−１４３，１９９７）ＥＧＦＰ  −１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクター又はＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターをマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆへ移入した。その結果、１〜２週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計１２個のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（２−２）ＰＣＲ解析
上記（７−４）（１−３）の方法によりＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入クローン選別のためにＰＣＲ解析を行った。その結果、上記（２−１）で単離したＧ４１８耐性マウスＥＳ雑種コロニー全てにおいて予想される増幅が確認された。以上より、上記のＧ４１８耐性マウスＥＳ雑種細胞１２株がＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持することを確認した。
（２−３）サザンブロット解析
ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターにおいてＥＧＦＰ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記（７−４）（１−４）と同様にしてサザンブロット解析を行なった。その結果、上記（２−２）で得たＧ４１８耐性候補マウスＥＳ雑種細胞１２株から合計１１株において予測されるサイズのバンドを確認した。
（２−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−４）で得たＧ４１８耐性マウスＥＳ雑種細胞のうち８株（１−ｔ１１，２−ｔ１１，３−ｔ１１，４−ｔ１１，３２−Ｇ１，３３−ｔ２４，３４−ｔ２４，３５−ｔ２４）について解析した。その結果、計６株において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターを検出した。
以上（２−１）から（２−４）の実験より、得られたＧ４１８耐性マウスＥＳ雑種細胞５株（１−ｔ１１，２−ｔ１１，３−ｔ１１，３３−ｔ２４，３４−ｔ２４）はＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のマウスＥＳ細胞であることを確認した。
（３）キメラマウスにおける１４ＨＡＣベクターの保持率
（２）で得られたＥＧＦＰ−１４ＨＡＣを保持するＧ４１８耐性マウスＥＳ雑種細胞を用いて、（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，１３３−１４３，１９９７）の方法に従って行い、キメラマウスを取得した。キメラマウスにおける１４ＨＡＣベクター保持を確認するために上記（７−４）（２−２）の  方法及び下記のプライマーセットを用いてＰＣＲ解析を行った（概略は図８８）。
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その結果、得られたキメラマウスにおいて予想される増幅を確認した。まとめを図９０に示す。以上より、上記のキメラマウス体細胞においてＥＧＦＰ  −１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターが保持されていることを確認した。
（４）ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑ−ＨＡＣベクターの子孫伝達
上記（３）で得られたキメラマウス（雌）とＣ５７ＢＬ６マウス（雄）とを交配し、ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターの子孫伝達を検証した。方法は上記（７−４）（３）と同様にＰＣＲ解析を行い、ＨＡＣの保持を指標に評価した。その結果、ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターは、Ｆ１マウスにおいて４６．６％（Ｎ＝１３３）、Ｆ２マウスにおいて３６．９％（Ｎ＝８４）で、ＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、Ｆ１マウスにおいて５９．４％（Ｎ＝７９）の個体においてにおいて予想される増幅を確認した。以上より、ＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣ及びＥＧＦＰ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターの子孫伝達を確認した。
さらに、上記で得られたＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＦ１マウス（雄）と（雌）とを交配し、仔マウス尾線維芽細胞を採取培養後、カルノア固定し、ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。その結果、尾線維芽細胞中に２コピーのＥＧＦＰ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持する個体を確認した。
実施例８
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現解析
（１）ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターの構築
（１−１）１４ＮΔｑＨＡＣベクターへのｈＥＰＯ遺伝子の導入
実施例６で構築した１４ＮΔｑＨＡＣベクターへｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットを挿入する。ｌｏｘＰ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。実施例６で作製した１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞（Ｇ４Ｓ６１−１、９、Ｇ４Ｓ３９−１３、Ｇ８Ｓ９０−４）を用いて、実施例３（１−１）と同様にしてｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの挿入を行った。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計２４６個（Ｇ４Ｓ６１−１由来６１個、Ｇ４Ｓ６１−９由来７５個、Ｇ４Ｓ３９−１３由来７３個、Ｇ８Ｓ９０−４由来３７個）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、１４ＮΔｑＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＥＰＯベクター上及び１４ＮΔｑＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認した。プライマー配列及びＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（１−１）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞から計１１６株（Ｇ４Ｓ６１−１由来３１株、Ｇ４Ｓ６１−９由来３４株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来３５株、Ｇ８Ｓ９０−４由来１６株において予想される増幅が確認された。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞１１６株がｌｏｘＰ配列へのｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図３８に示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。上記（１−２）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞計１３０株（Ｇ４Ｓ６１−１由来３６株、Ｇ４Ｓ６１−９由来４０株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来３５株、Ｇ８Ｓ９０−４由来１９株）から、計６０株（Ｇ４Ｓ６１−１由来１３株、Ｇ４Ｓ６１−９由来１８株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来１９株、Ｇ８Ｓ９０−４由来１０株）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−３）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち２３株について解析した。その結果、計１５株（Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ６、９、Ｇ４Ｓ６１−９Ｅ２８、３４、３５、６５、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ３、４、５、１６、５５、６１、７１、Ｇ８Ｓ９０−４Ｅ１６、１８と以下称する）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを検出した。代表的なＦＩＳＨ像を図３９Ａに、また核型を図３９Ｂ及び図４１に示す。図４１に示す１３Ｅ４、１３Ｅ５５、ＩＥ６及び４Ｅ１６は、それぞれＧ４Ｓ３９−１３Ｅ４、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ５６、Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ６及びＧ８Ｓ９０−４Ｅ１６を表す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から得られた上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞１５株は、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認した。
（２）１４ＮΔｑＨＡＣベクターへ挿入されたｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１−３）において単離したｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞４８株（Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ由来１１株、Ｇ４Ｓ６１−９Ｅ由来１６株、Ｇ４Ｓ３９−１３由来１９株、Ｇ８Ｓ９０−４由来５株）を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図４０に示す。以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例９
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例８で得たＣＨＯ雑種細胞４株（Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ６、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ４、５５、Ｇ８Ｓ９０−４Ｅ１６）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれに０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子の発現及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。上記Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ６、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ４、５５、Ｇ８Ｓ９０−４Ｅ１６株について実施例８（２）の方法に従って２連で行った実験結果の平均値を図４１に示す。以上より、上記ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞４株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記４株についてその結果を表４及び図４１に示す。
【表４】
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ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において１０継代後まで安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）から（３）の実験により、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＣＨＯ細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例１０
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
（１）ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
（１−１）ミクロセル法によるｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１への移入
染色体供与細胞として、実施例９で得られたｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン（Ｇ４Ｓ６１−１Ｅ６、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ４，５５、Ｇ８Ｓ９０−４Ｅ１６）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。微小核融合は上記実施例５（１）と同様に行った。約４週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。３２回（各８回×４株）の微小核細胞融合から４７個の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてＧ４Ｓ６１−１Ｅ６細胞を用いて得た細胞をＧ６Ｈ細胞と、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ４細胞を用いて得た細胞をＧ４Ｈ細胞と、Ｇ４Ｓ３９−１３Ｅ５５細胞を用いて得た細胞をＧ５５Ｈ細胞と、Ｇ８Ｓ９０−４Ｅ１６細胞を用いて得た細胞をＧ１６Ｈ細胞と、以下称する。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するか否かを実施例３（１−２）のプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２を用いて、ヒト染色体をＳＴＳマーカーＤ２Ｓ１３３４のプライマーを用いてＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従いＰＣＲ増幅により確認した。また、染色体供与ＣＨＯ細胞の混入の有無をＣＨＯ  ｆｕｒｉｎ遺伝子特異的プライマーｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒを用いてＰＣＲ増幅により確認した。方法は上記実施例５（１−２）と同様に行った。
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞で染色体供与ＣＨＯ細胞の混入が無い場合に、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐの増幅、Ｄ２Ｓ１３３４プライマーにより約０．６ｋｂｐの増幅、ｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒによる増幅なし、が予想される。その結果、上記（１−１）で得たブラストサイジン耐性株４７株から計１７株（Ｇ６Ｈ；２株、Ｇ４Ｈ；４株、Ｇ５５Ｈ；６株、Ｇ１６Ｈ；５株）において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジン耐性株１７株がｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジン耐性株のうち１３株についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図１９のＢに示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。その結果、上記（１−２）で得たｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジン耐性株９株（Ｇ４Ｈ２、４、５、Ｇ６Ｈ３、Ｇ１６Ｈ１７、２１、２３、Ｇ５５Ｈ７、９）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト１４番及び２２番染色体特異的αサテライトＤＮＡプローブ（Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ、フナコシ）を用いて行った。ブラストサイジン耐性株のうち３株（Ｇ４Ｈ２、Ｇ１６Ｈ１７、Ｇ５５Ｈ７）について解析した結果、計３株が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の１対のヒト１４番及び２２番染色体セントロメア領域の４箇所と１コピーの１４ＮΔｑＨＡＣベクター由来の１箇所にシグナルが検出された。その結果を図４２Ａ及びＢに示す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性株３株はｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＨＦＬ−１細胞であることが確かめられた。
（２）ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞におけるｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）において単離したｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジン耐性ＨＦＬ−１細胞９株（Ｇ４Ｈ２、４、５、Ｇ６Ｈ３、Ｇ１６Ｈ１７、２１、２３、Ｇ５５Ｈ７、９）について、それぞれ約１０５細胞をブラストサイジン（３μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）１ｍｌをいれたコラーゲンＩコートした２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地に置き換え更に２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｎｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。その結果を図２１の「１４Ｎ−ＨＡＣ」の項目に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例１１
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期ＥＰＯ発現
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例１０で得たｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞４株（Ｇ４Ｈ２、Ｇ１６Ｈ１７、Ｇ１６Ｈ２１、Ｇ５５Ｈ７）を使用した。非選択培養液は２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン３μｇ／ｍｌを添加した。ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞株は１〜３×１０５細胞をコラーゲン−ＩコートしたＴ−２５フラスコ（ファルコン）に播種し、細胞密度が９０％飽和程度まで培養し、再び１〜３×１０５細胞を播種し６〜１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、５及び１０継代前後に細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子発現解析及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞４株を、約１０４細胞にて２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍｌをいれたコラーゲン−Ｉコート２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図４３に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞４株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
以上の実験により、ｈＥＰＯ−１４ＮΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＨＦＬ−１細胞において、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例１２
サブテロメア領域を含む１４ＨＡＣ（１４ｇＮΔｑＨＡＣ）ベクターの構築
ＨＡＣベクターがテロメア配列及びヒト１４番染色体末端の約６０ｋｂのサブテロメア領域を含有するように、長腕遠位及び近位にｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入し、Ｃｒｅによる部位特異的組換え反応により２箇所のｌｏｘＰ配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体（１４ｇＮΔｑＨＡＣ）ベクターを構築する。
（１）部位特異的組換え反応によるヒト１４番染色体長腕削除
（１−１）ヒト１４番染色体長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２の構築
ｌｏｘＰ配列挿入用ベクター（ターゲティングベクター）には、実施例６（１−１）のｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ−ＰＧＫを用いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＢ０１９４３７）から、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター挿入の２箇所の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000039
実施例１（１−１）の方法に従い、ヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９ｃ１１−１４ｃｈｒ）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて５’及び３’側の２つの組換え標的配列をＰＣＲ法により増幅した。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、ＡＢ０１  ３８ＫｐｎＩＦｗ／ＡＢ０１  ４０ＡｐａＩＦｗによる反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３０サイクル、伸長７０℃１０分で行った。また、ＡＢ０１  ４２ＳｐｅＩＦｗ／ＡＢ０１  ４７ＥｃｏＲＶによる反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃８分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃８分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃８分を３０サイクル、伸長７０℃１０分で行った。ＡＢ０１  ３８ＫｐｎＩＦｗ／ＡＢ０１  ４０ＡｐａＩＦｗによる２．０ｋｂの増幅産物は、制限酵素ＫｐｎＩ及びＡｐａＩにて消化し、ｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ−ＰＧＫベクターのＫｐｎＩ−ＡｐａＩサイトへクローニングした。また、ＡＢ０１  ４２ＳｐｅＩＦｗ／ＡＢ０１  ４５Ｒによる３．０ｋｂの増幅産物をＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ消化し、またＡＢ０１  ４５Ｆ／ＡＢ０１  ４７ＥｃｏＲＶによる２．０ｋｂの増幅産物をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ消化し、上記の２フラグメントを一度ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングした後ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＶ消化し、上記の２．０Ｋｂの標的配列を持つｐｌｏｘＰｕｐＢＳＤ−ＰＧＫベクターのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶサイトへクローニングした。最終的なｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２コンストラクトのサイズは約１２．１ｋｂである。ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図４４及び図４５に示した。
（１−２）ヒト１４番染色体保持ＤＴ４０雑種細胞への長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２ベクター導入
実施例１（１−２）の方法に従い、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、ヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞ＤＴ４０（−１４）１−２及びＤＴ４０（−１４）２−４に導入した。ブラストサイジン（終濃度８ｕｇ／ｍｌ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。ＤＴ４０（−１４）１−２の場合は、６回のトランスフェクションから合計１７３８個のブラストサイジン耐性コロニーをＤＴ４０（−１４）２−４の場合は、４回のトランスフェクションから合計６１８個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在を実施例１２（１−１）の方法に従い、ＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図４５中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図４６中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000040
上記ＤＴ４０（−１４）１−２由来のブラストサイジン耐性１７３８株のうち２株において、ＤＴ４０（−１４）２−４由来のブラストサイジン耐性６１８株のうち５株において５’及び３’側の２標的配列の存在を確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの５’及び３’側の２標的配列外側にプローブ（ｇ２−５’及びｇ２−３’）を設定した（図４５）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した：
0005345391.tif 000041
１次スクリーニングで得たブラストサイジン耐性株から抽出したゲノムＤＮＡ約１０μｇを制限酵素（５’側）ＳａｃＩ又はＢｓｔＥＩＩ（３’側）により（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。代表的な結果を図４７に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で７．２ｋｂ、野生型（非組換え体）で４．８ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で２１．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．６ｋｂである。ＤＴ４０（−１４）１−２由来の候補株２株から合計１株（１２ｇ５）の相同組換え体を、ＤＴ４０（−１４）２−４由来の候補株５株から合計３株（２４ｇ１５、２４ｇ６７、２４ｇ９１）の相同組換え体を確認した。
（２）ヒト１４番染色体長腕近位セントロメア側へのｌｏｘＰ配列挿入
（２−１）ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌを導入したヒト１４番染色体保持ＤＴ４０細胞への長腕近位セントロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１ベクター導入
実施例６（２−１）で作製したｐｌｏｘＰＨＹＧＯＲ／ｎ１コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、実施例１３（１−４）で作製したｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ−２を導入したヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞１２ｇ５及び２４ｇ１５及び２４ｇ６７に導入した。方法は、実施例１（１−２）のに従った。２〜３週間の選択培養後、ピューロマイシン耐性コロニーが出現した。各２回、計６回のトランスフェクションから合計２５２個（１２ｇ５由来７８個、２４ｇ１５由来１２８個、２４ｇ６７由来４６個）のピューロマイシン耐性コロニーを単離して以後の解析を行った。
（２−２）ＰＣＲ解析
上記（２−１）で取得したピューロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在を実施例７（２−１）の方法に従い、ＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図２７中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図２８中に矢印で示した。上記ピューロマイシン耐性から３９株（１２ｇ５由来１３株、２４ｇ１５由来２４株、２４ｇ６７由来２株）において５’及び３’側の２標的配列の存在を確認した。
（２−３）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。方法は実施例６（２−４）に従った。代表的な結果を図４８に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１２．５ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で１０．２ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂであり、上記（２−２）で取得した候補株のうち２５株から合計２３株（１２ｇ５由来１１株、２４ｇ１５由来１０株、２４ｇ６７由来２株）の相同組換え体を確認した。これらのうち、２４ｇ１５由来のクローン２４ｇ１５ｎ２８（以下ｇ５ｎ８と称する）及び２４ｇ６７由来のクローン２４ｇ６７ｎ１９（以下ｇ７ｎ９と称する）を次のステップ（３）へ進めた。
（３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
（３−１）長腕遠位及び近位へｌｏｘＰ配列挿入したヒト１４番染色体保持ＤＴ４０雑種細胞へのＣｒｅ発現ベクターの導入
実施例１（１−２）の方法に従い、Ｃｒｅ発現ベクターｐＣＡＧＧＳＣｒｅを実施例１２（２）で取得したｇ５ｎ８及びｇ７ｎ９細胞に導入した。ハイグロマイシン（終濃度１．２５ｍｇ／ｍｌ）で選択培養を行い２〜３週間後に薬剤耐性コロニーが出現した。各２回、計４回のトランスフェクションから合計１６個（ｇ５ｎ８由来１１個、ｇ７ｎ９由来５個）のハイグロマイシン耐性コロニーを単離して以後の解析を行った。
（３−２）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として２つのｌｏｘＰ配列間の欠失をＰＣＲ法により確認した。方法は、実施例６（３−２）に従って行った。長腕遠位欠失後に残ったｌｏｘＰ配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図２８中に矢印で示した。その結果、上記ハイグロマイシン耐性株１６株のうち１２株（ｇ５ｎ８由来７株、ｇ７ｎ９由来５株）において予測される増幅産物を確認した。
（３−３）サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図３０Ｂに示した。相同組換えの５’及び３’側の２標的配列外側にプローブ（ｇ２−５’（ｉ）及びＮ３’（ｉ））を設定した（図３０Ｂ）。上記実施例１３（３−２）で得たハイグロマイシン耐性株９株（ｇ５ｎ８細胞由来５株及びｇ７ｎ９細胞由来４株）からゲノムＤＮＡを抽出し実施例１３（１−４）及び（２−４）と同様に行った。制限酵素（ロシュ）消化は、ＳａｃＩ（５’側）又はＳｔｕＩ（３’側）により行った。代表的な結果を図４９に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で９．２ｋｂ、野生型（非組換え体）で７．２ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で８．３ｋｂ、野生型（非組換え体）で１０．２ｋｂである。その結果、合計５株（ｇ５ｎ８細胞由来３株及びｇ７ｎ９細胞由来２株）において長腕遠位欠失体を確認した。
（３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（３−３）で取得した５株（ｇ５ｎ８Δｃ３／Δｄ１／Δｄ４、ｇ７ｎ９Δｃ１／Δｃ３）について解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーのシグナルを検出した。代表的なＦＩＳＨ像及びＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図５０Ａ及びＢに示す。
以上（３−１）から（３−４）の実験から、得られたハイグロマイシン耐性ＤＴ４０雑種細胞は、天然テロメアを残して長腕遠位を削除したヒト１４番染色体断片（１４ｇＮΔｑＨＡＣ）を保持することを確認した。
（４）１４ｇＮΔｑＨＡＣ長腕近位へのクローニング部位の導入
（４−１）ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列挿入用ｐＳＦ（ｇ＋ｎ１）ベクターの構築
上記実施例１２（３）で作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）にｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例１（２−１）で作製したｐＳＦ１▲３▼を用いた。ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ挿入部位である相同組換えの５’側標的配列は上記実施例１２（１−１）で取得したｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ２ベクターで用いた配列から、３’標的配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト１４番染色体長腕近位の塩基配列（登録番号ＡＬ３９１１５６）から設計した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000042
５’側標的配列は、ｐｌｏｘｐＰＧＫ−１４ｑｔｅｌ２ベクターからＳａｌＩ及びＳｒｆＩ（ロシュ）で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、ｐＳＦ１▲３▼プラスミドのＳａｌＩ−ＳｒｆＩサイトにクローニングした。また３’側標的配列は、ヒト１４番染色体を保持するＡ９ｃ１１−１４ｃｈｒ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、ＭｇＳＯ
４（終濃度０．５ｍＭ）を添加し、反応条件は９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃８分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃８分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃８分を３０サイクル、伸長７２℃１０分で行った。この約５．０ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＦｓｅＩ及びＳｒｆＩ（ロシュ）で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、上記５’標的配列を挿入したｐＳＦ１▲３▼プラスミドのＦｓｅＩ−ＳｒｆＩサイトにクローニングした。最終的なｐＳＦ１（ｇ＋ｎ１）コンストラクトのサイズは約１３．２ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図５１及び図３４Ｂに示した。
（４−２）１４ｇＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｐＳＦ（ｇ＋ｎ１）ベクター導入
ｐＳＦ（ｇ＋ｎ１）コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＮΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞３種（ｇ５ｎ８Δｃ３／Δｄ１，ｇ７ｎ９Δｃ１）にそれぞれ導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。３回のトランスフェクションから合計１５４個（ｇ５ｎ８Δｃ３；９９個、ｇ５ｎ８Δｄ１；３４個、ｇ７ｎ９Δｃ１；２１個）の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
（４−３）ＰＣＲ解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図３４Ｂ中に矢印で示した。５’側標的配列検出用プライマーの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000043
方法は、実施例１３（４−１）に従って行った。５’側標的配列検出用の反応条件は９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３０サイクル、伸長７２℃１０分で行った。得られたブラストサイジン耐性株のうち、１３株（ｇ５ｎ８Δｃ３；３株、ｇ５ｎ８Δｄ１；８株、ｇ７ｎ９Δｃ１；２株）が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約２．０ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約５．０ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（４−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンブロット解析を行った。プローブは、相同組換えの標的配列の外側にｇ２−５’（ｉ）（実施例１２（１−４））及びＮ３’（ｉｉ）（実施例６（４−４））を設定した（図３４Ｂ）。実施例１２（４−３）で得た薬剤耐性候補株からゲノムＤＮＡを抽出し実施例１２（１−４）と同様に行った。制限酵素（ロシュ）消化は、ＳｐｈＩ（５’側）又はＢｓｔＥＩＩ（３’側）により行った。代表的な結果を図５２に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側標的配列では相同組換え体で１１．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で４．６ｋｂであり、３’ｇｅｎｏｍｅ側標的配列では相同組換え体で１５．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。上記や薬剤耐性候補株１３株から合計９株の相同組換え体を確認した。
以上の（４−１）〜（４−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列）が挿入された１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞合計９株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３、ｇ５ｎ８Δｄ１ｓ３、４、６、８、９、１０、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９、２１）を取得した。このうち、ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３及びｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９の２株を次のステップへ進めた。
（５）ＣＨＯ細胞への１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入
（５−１）ミクロセル法による１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例１２（４）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ配列）が挿入された１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３及びｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９）をそれぞれ用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。方法は、実施例１（３−１）に従って行った。約２週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。４回の微小核細胞融合から計５５株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３由来３２株、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９由来２３株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（５−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。方法は、実施例６（５−２）に従って行った。得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯのうち５２株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３由来２９株、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９由来２３株））が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約２．０ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約５．０ｋｂ）の増幅産物を与えること及びＤＴ４０細胞の混入が無いことを確認した。
（５−３）サザンブロット解析
移入した１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例１２（４−４）と同様に行った。代表的な結果を図５３に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側標的配列では相同組換え体で１１．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で４．６ｋｂであり、３’ｇｅｎｏｍｅ側標的配列では相同組換え体で１５．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。上記ブラストサイジン耐性候補株３６株から合計３５株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３由来１７株、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９由来１８株）の相同組換え体を確認した。図５３及び５４において、「ｇ５Ｓ１３」及び「ｇ７Ｓ９」は、それぞれｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３由来株及びｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９由来を表す。
（５−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のうち１５株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３由来６株、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９由来９株）について解析した結果、計５株（ｇ５ｎ８Δｃ３ｓ１３−９，１２の２株：以下ｇ５Ｓ１３−９、ｇ５Ｓ１３−１２と称する、ｇ６７ｎ１９Δｃ１ｓ９−１１，１２，１７の３株：以下ｇ７Ｓ９−１１、ｇ７Ｓ９−１２、ｇ７Ｓ９−１７と称する）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーの１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターが検出された。代表的なＦＩＳＨ像及び１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図５４Ａ及びＢに示す。
以上（５−１）から（５−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株５株は、正常核型かつ１コピーの１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
実施例１３
１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例７に記載した１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞株２株ｇ５Ｓ１３−９、ｇ５Ｓ１３−１２を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収しＦＩＳＨ用染色体標本を作製した。
（２）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記２株についてその結果を表５及び図１３に示す。図１３においては、１４ｇΔｑＨＡＣ（ｇ）の項目に示す。
【表５】
0005345391.tif 000044
１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において１０継代後までの時点で安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）及び（２）の実験により、１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例１４
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現解析
（１）ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの構築
（１−１）１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターへのｈＥＰＯ遺伝子の導入
実施例７で構築した１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターへｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットを挿入する。ｌｏｘＰ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。実施例１３で作製した１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ｇ５Ｓ１３−１２及びｇ７Ｓ９−１１）を用いて、実施例３（１−１）と同様にしてｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの挿入を行った。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計１６９個（ｇ５Ｓ１３−１２由来７７個、ｇ７Ｓ９−１１由来９２個）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＥＰＯベクター上及び１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認した。プライマー配列及びＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（１−１）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞から計６９株（ｇ５Ｓ１３−１２由来３２株、ｇ７Ｓ９−１１由来３７株）において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞６９株がｌｏｘＰ配列へのｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図５５に示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。上記（１−２）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞計６５株（ｇ５Ｓ１３−１２由来２４株、ｇ７Ｓ９−１１由来４１株）から計３２株（ｇ５Ｓ１３−１２由来１０株、ｇ７Ｓ９−１１由来２２株）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−３）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち１７株について解析した。その結果、計５株（ｇ５Ｓ１３−１２由来１株；以下ｇ５Ｓ１３−１２Ｅ２３と称する、ｇ７Ｓ９−１１由来４株；以下ｇ７Ｓ９−１１Ｅ２８，４８，５７，６２と称する）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを検出した。代表的なＦＩＳＨ像及びｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図５６Ａ及びＢに示す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られたＧ４１８耐性５株は、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認した。
（２）１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターへ挿入されたｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記１）において単離しサザン解析でｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの存在及び構造を確認したｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞２８株を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え７日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図５７に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞２８株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例１５
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例１５で得たＣＨＯ雑種細胞３株（ｇ５Ｓ１３−１２Ｅ２３、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ２８，６２）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれに０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子の発現及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞３株を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え７日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図５８に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞３株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記３株についてその結果を表６及び図５８に示す。
【表６】
0005345391.tif 000045
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において１０継代後まで安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）から（３）の実験により、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＣＨＯ細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例１６
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
（１）ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
（１−１）ミクロセル法によるｈＥＰＯ−１４ＥＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１への移入
染色体供与細胞として、実施例１５で得られたｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン（ｇ５Ｓ１３−１２Ｅ２３、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ２８，６２）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。微小核融合は上記実施例５（１）と同様に行った。約４週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。２４回の微小核細胞融合から５１個（ｇ５Ｓ１３−１２Ｅ２３由来３個、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ２８由来２２個、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ６２由来２６個）の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてｇ５Ｓ１３−１２Ｅ２３細胞を用いて得た細胞をｇ２３Ｈ細胞と、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ２８細胞を用いて得た細胞をｇ２８Ｈ細胞と、ｇ７Ｓ９−１１Ｅ６２細胞を用いて得た細胞をｇ６２Ｈ細胞と以下称する。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するか否かを実施例３（１−２）のプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２を用いて、ヒト染色体をＳＴＳマーカーＤ２Ｓ１３３４のプライマーを用いてＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従いＰＣＲ増幅により確認した。また、染色体供与ＣＨＯ細胞の混入の有無をＣＨＯ  ｆｕｒｉｎ遺伝子特異的プライマーｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒを用いてＰＣＲ増幅により確認した。方法は上記実施例５（１−２）と同様に行った。ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞で染色体供与ＣＨＯ細胞の混入が無い場合に、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐの増幅、Ｄ２Ｓ１３３４プライマーにより約０．６ｋｂｐの増幅、ｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒによる増幅なし、が予想される。その結果、上記（１−１）で得たブラストサイジン耐性株５０株から計６株（ｇ２３Ｈ１、２、３、ｇ２８Ｈ１８、２２、ｇ６２Ｈ２６）において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジン耐性株６株がｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジン耐性株６株のうち４株（ｇ２３Ｈ１、３、ｇ２８Ｈ１８、ｇ６２Ｈ２６）についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図１９のＣに示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。その結果、上記（１−２）で得たｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジン耐性株３株（ｇ２３Ｈ１、３、ｇ６２Ｈ２６）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト１４番及び２２番染色体特異的αサテライトＤＮＡプローブ（Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ、フナコシ）を用いて行った。ブラストサイジン耐性株３株（ｇ２３Ｈ１，３、ｇ６２Ｈ２６）について解析した結果、２株（ｇ２３Ｈ３、ｇ６２Ｈ２６）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の１対のヒト１４番及び２２番染色体セントロメア領域の４箇所と１コピーの１４ｇＮΔｑＨＡＣベクター由来の１箇所にシグナルが検出された。その結果を図５９Ａ及びＢに示す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性株２株はｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＨＦＬ−１細胞であることが確かめられた。
（２）ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞におけるｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）において単離しサザン解析でｈＥＰＯ発現ユニット構造を確認したｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するブラストサイジン耐性ＨＦＬ−１細胞３株について、それぞれ約１０５細胞をブラストサイジン（３μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）１ｍｌをいれたコラーゲンＩコートした２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地に置き換え更に２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。その結果を図２１の「１４ｇＮ−ＨＡＣ」の項目に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＨＦＬ−１細胞３株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例１７
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例１６で得たｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞３株（ｇ２３Ｈ１、ｇ２３Ｈ３、ｇ６２Ｈ２６）を使用した。非選択培養液は２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン３μｇ／ｍｌを添加した。ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞株は１〜３×１０５細胞をコラーゲン−ＩコートしたＴ−２５フラスコ（ファルコン）に播種し、細胞密度が９０％飽和程度まで培養し、再び１〜３×１０５細胞を播種し５〜１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、５継代前後及び１０継代後に細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子発現解析及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞２株ｇ２３Ｈ１、ｇ６２Ｈ２６を、約１０４細胞にて２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２ｍｌをいれたコラーゲン−Ｉコート２４穴又は４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地に置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図４３に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞２株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
以上の実験により、ｈＥＰＯ−１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＨＦＬ−１細胞において、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例１８
Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターの構築
１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上及びｐＬＮ１／ＥＰＯプラスミド上のｈＥＰＯ発現ユニット下流にＦＲＴ配列を挿入し、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上からＦＲＴ／ＦＬＰｅ部位特異的組換えシステムによりＮｅｏ耐性遺伝子発現ユニットを除去する。その概略を図６０に示す。
（１）１４ＡΔｑＨＡＣクローニング部位へのＦＲＴ配列の導入
（１−１）ＦＲＴ配列導入用ベクターｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴの構築
実施例１で構築した１４ＡΔｑＨＡＣのクローニング部位へＦＲＴ配列を挿入するために、ＦＲＴ配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、実施例１（２−１）で構築したｔ１ｐＳＦベクターへクローニングした。合成したＦＲＴ配列を含むオリゴＤＮＡ配列を以下に示す：
0005345391.tif 000046
上記のＦＲＴ配列を含むオリゴＤＮＡをアニーリングにより２本鎖化した後、制限酵素ＦｓｅＩでカットし、ｔ１ｐＳＦベクターＦｓｅＩサイトへクローニングした。最終的なｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴコンストラクトのサイズは約１３．５ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図６１に示した。
（１−２）１４ＡΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴベクター導入
ｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴコンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＡΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。１２ｔ９７ｓＦでは、１回のトランスフェクションから合計１２個の薬剤耐性コロニーを、また１２ｔ１３４ｓＦでは１回のトランスフェクションから合計９４個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図６１中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）の存在を解析した。方法は、実施例１（２−３）に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞、１２ｔ９７ＳＦ由来１２株のうち３株が、１２ｔ１３４ＳＦ由来９４株のうち２株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約２ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。５’及び３’側の２箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例１（２−４）の方法に従って解析した。代表的な結果を図６２に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析及び３’ｇｅｎｏｍｅ側解析ともに相同組換え体で２４．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補、１２ｔ９７ＳＦ由来３株のうち２株（１２ｔ９７ＳＦ１、１２）が、１２ｔ１３４ｓＦ  ２株のうち２株（１２ｔ１３４ＳＦ６、２１）の相同組換え体を確認した。
以上の（１−１）〜（１−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位にＦＲＴ配列が挿入された１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞１２ｔ９７ＳＦ  ２株（−１、１２）、１２ｔ１３４ＳＦ  ２株（−６、２１）を取得した。
（２）ＣＨＯ細胞への１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター移入
（２−１）ミクロセル法による１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例１８（１）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位にＦＲＴ配列が挿入された１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞（１２ｔ９７ｓＦ１、１２ｔ９７ｓＦ１２、１２ｔ１３４ｓＦ２１）を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。ミクロセル法による１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入は、実施例１（３）に従って行った。
約２週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。３株×２回の微小核細胞融合から計３６株（１２ｔ９７ｓＦ１由来２５株、１２ｔ９７ｓＦ１２由来３株、１２ｔ１３４ｓＦ２１由来８株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（２−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持すること、及びＤＴ４０の混入がないことを確認する目的で、ＮＥＫ２Ｐ（＋）、ＩＧＨＶ３（−）及びＧｇｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ（−）の存在をＰＣＲ法により検出した。方法は、実施例１（１−３）及び実施例６（５−２）に従った。予測される検出パターンは、ＮＥＫ２Ｐ（＋）、ＩＧＨＶ３（−）及びＧｇｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ（−）である。得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株３６株のうち３３株（１２ｔ９７ｓＦ１由来２３株、１２ｔ９７ｓＦ１２由来３株、１２ｔ１３４ｓＦ２１由来７株）が、塩基配列から予想される増幅産物を与えることを確認した。
（２−３）サザンブロット解析
移入した１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例１（２−４）と同様に行った。代表的な結果を図６３に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析及び３’ｇｅｎｏｍｅ側解析ともに相同組換え体で２４．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で１８．２ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補ＣＨＯ株２７株から合計２６株（１２ｔ９７ｓＦ１由来２０株、１２ｔ９７ｓＦ１２由来２株、１２ｔ１３４ｓＦ２１由来４株）の相同組換え体を確認した。
（２−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のうち１４株（１２ｔ９７ｓＦ１由来１１株、１２ｔ９７ｓＦ１２由来１株、１２ｔ１３４ｓＦ２１由来２株）について解析した結果、計６株（１２ｔ９７ｓＦ１由来５株、１２ｔ９７ｓＦ１２由来０株、１２ｔ１３４ｓＦ２１由来１株）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーの１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターが検出された。代表的な結果を図６４に示す。
以上（２−１）から（２−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株６株（１２ｔ９７ｓＦ１−２、５、８、１７、２１及び１２ｔ１３４ｓＦ２１−２）はＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去用１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持することを確認した。これらのうち、１２ｔ９７ｓＦ１−５及び１２ｔ１３４ｓＦ２１−２（以下Ｆ１−５及びＦ２１−２と称する）を以下の実験に用いた。
（３）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターの構築
（３−１）ｈＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯへのＦＲＴ配列の導入
ｈＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）へ実施例１８（１−１）で用いたＦＲＴ配列を含む合成オリゴＤＮＡを挿入する。
上記のＦＲＴ配列を含むオリゴＤＮＡ  ＦＲＴ  ｌｉｎｋｅｒＳとＦＲＴ  ｌｉｎｋｅｒＡＳをアニーリングにより２本鎖化し制限酵素ＳｐｅＩで消化した後、ｐＬＮ１ＥＰＯベクターから制限酵素ＸｂａＩ消化によりｎｅｏ耐性遺伝子ドライブ用のＣＭＶプロモーターを除去した後のＸｂａＩサイトへクローニングした。更に上記ｎｅｏ耐性遺伝子ドライブ用ＣＭＶプロモーターを導入したリンカー内のＮｈｅＩサイトへ再導入した。最終的なｐＬＮ１−ＥＰＯＦコンストラクトのサイズは約４．９ｋｂである。
（３−２）１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターへのｈＥＰＯ遺伝子の導入
１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターへＦＲＴ配列を含むｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットを挿入する。ｌｏｘＰ及びＦＲＴ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯＦを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。その概略を図６５に示す。実施例１８（２）で作製した１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（Ｆ１−５及びＦ２１−２）を用いて、実施例３（１−１）の方法に従って行った。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計９２個（Ｆ１−５由来４５個及びＦ２１−２由来４７個、以下それぞれ５ＥＦ及び２ＥＦ細胞と称する）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３−３）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、１４ＡΔｑＦＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＥＰＯＦベクター上及び１４ＡΔｑＦＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認した。プライマー配列及びＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶ及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（３−２）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞から計５１株（５ＥＦ細胞２３株、２ＥＦ細胞２８株）において予想される増幅が確認された。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞計５１株がｌｏｘＰ配列へのｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
（３−４）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図６６に示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。上記（３−２）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞６５株から合計２３株（５ＥＦ細胞８株、２ＥＦ細胞１５株）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（３−５）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（３−４）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち１６株（Ｆ１−５由来５株、Ｆ２１−２由来１１株）について解析した。その結果、計２株（５ＥＦ−１、２ＥＦ−３６）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを検出した。代表的な結果を図６７Ａ及びＢに示す。
以上（３−１）から（３−５）の実験から、得られたＧ４１８耐性２株は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認した。
（４）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記１）において単離したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞２株（５ＥＦ−１、２ＥＦ−３６）を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を表７に示す。
【表７】
0005345391.tif 000047
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞４株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
（５）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターからのＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去（５−１）ＦＬＰｅ発現ベクターｐＯＧ４４ＦＬＰｅの構築
ｐＯＧ４４ベクター（インビトロジェン）上のＦＬＰ遺伝子配列をＦＬＰｅ遺伝子配列（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第１６巻、ｐ６５７−６６２）へＬ３３Ｓ、Ｌ７０Ｆ、Ｙ１０８Ｎ、Ｓ２９４Ｐの４箇所にＰＣＲ法により変異を導入して改変した。まずＦＬＰ（Ｄ４、Ｌ７０）→ＦＬＰｗｔ（Ｄ４Ｇ、Ｌ７０Ｆ）を作製し、続いてＦＬＰ（Ｄ４、Ｌ７０）とＦＬＰｗｔ（Ｇ４、Ｆ７０）両方を用いてＦＬＰｅ（Ｄ４・Ｆ７０／Ｌ３３Ｓ、Ｙ１０８Ｎ、Ｓ２９４Ｐ）を作製した。ＰＣＲは、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長７２℃３０秒を３５サイクルで行った。
アミノ酸配列置換Ｄ４Ｇ及びＬ７０Ｆのため、塩基配列置換Ａ１４Ｇ及びＧ２１０ＣをｐＯＧ４４ベクターを鋳型として行った。ＰＣＲ法により行った用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000048
ｐＯＧ４４ベクターからＰｓｔＩ消化によりＦＬＰ遺伝子配列を切り出した後、ＰｓｔＩ消化した上記ＰＣＲ増幅断片に入れ替えた（ｐＯＧ４４−ＦＬＰｗｔ（Ｄ４Ｇ、Ｌ７０Ｆ））。
次にアミノ酸配列置換Ｓ２９４Ｐのため塩基配列置換Ｔ８８０ＣをｐＯＧ４４ベクターを鋳型としてＰＣＲ法により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000049
ｐＯＧ４４ベクターからＥｃｏＲＶ−ＮｓｉＩ領域を除去した後、ｐＯＧ４４ベクター由来のＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ：０．５ｋｂ）とＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｓｉＩ消化した上記ＰＣＲ増幅断片をクローニングした（ｐＯＧ４４−ＦＬＰｅ（Ｄ４・Ｓ２９４Ｐ）。
更にアミノ酸配列置換Ｌ３３Ｓ及びＹ１０８Ｎのため塩基配列置換Ｔ１０９Ｃ及びＴ３２２ＡをＰＣＲ法により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000050
0005345391.tif 000051
上記ｐＯＧ４４−ＦＬＰｗｔ（Ｄ４Ｇ、Ｌ７０Ｆ）ベクターを鋳型として、プライマーＦＬＰＦｗ（Ｔ１０９Ｃ）−ＦＬＰＲｖ（Ｔ３２２Ａ）Ｅｖを用いてＰＣＲにより塩基置換を行い、更にこのＰＣＲ産物を鋳型にしてプライマーＦＬＰＦｗ（３３−８１）Ｂｓ３６−ＦＬＰＲｖ（Ｔ３２２Ａ）Ｅｖを用いて５‘末端に制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉサイトを付加した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ及びＥｃｏＲＶで消化し、ｐＯＧ４４−ＦＬＰｅ（Ｄ４・Ｓ２９４Ｐ）ベクターのＢｓｕ３６Ｉ−ＥｃｏＲＶ領域と入れ替えた（ｐＯＧ４４−ＦＬＰｅ（Ｄ４・Ｆ７０／Ｌ３３Ｓ、Ｙ１０８Ｎ、Ｓ２９４Ｐ）。以上によりｐＯＧ４４ＦＬＰｅを取得した。
（５−２）ＦＬＰｅによるＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去
上記実施例２３（３）で作製したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞中でＦＬＰｅ組換え酵素を一過性に発現させることでＦＲＴ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体からＮｅｏ耐性遺伝子ユニットを切出し除去する。組換え挿入体の選別は、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットの欠失を指標とした。
実施例１８（３）で作製したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（５ＥＦ−１及び２１ＥＦ−３６）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。２０〜１００μｇのＦＬＰｅ酵素発現ベクターｐＯＧ４４ＦＬＰｅ存在下でジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地（インビトロジェン製）を含む９６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）８枚（１細胞／ウエルで４枚、０．１細胞／ウエルで４枚）に播種した。２〜３週間後ブラストサイジン耐性コロニーが出現し、計１４９個（５ＥＦ−１由来８２個、２１ＥＦ−３６由来６７個）のコロニーを単離して、以後の解析を行った。
（５−３）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター上からＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるため、ｐＬＮ１−ＥＰＯＦベクター上及び相同組換え領域上にプライマーを設計し（図６８）ＰＣＲ増幅により確認した。オリゴヌクレオチドプライマー配列を以下に示す：
0005345391.tif 000052
0005345391.tif 000053
ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃４．５分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃４．５分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃４．５分を２５サイクル、伸長７２℃１０分で行った。Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去がされている場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＡＬ３９  ５４１６９Ｆにより約０．４ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（５−２）で得たＢｓｄ耐性ＣＨＯ雑種細胞から計６６株（５ＥＦ−１由来３４株、２１ＥＦ−３６由来３２株）において予想される増幅が確認された。以上より、上記のＢｓｄ耐性ＣＨＯ雑種細胞計６６株がＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されていることが確認された。
（５−４）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクター上からＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図６９に示す。塩基配列から予想されるＥｃｏＲＩ消化による制限酵素断片長は、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットが除去されｈＥＰＯ発現ユニットのみの場合３．８ｋｂ、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット及びｈＥＰＯ発現ユニット両方を含む場合６．６ｋｂである。上記実施例２３（５−２）で得た候補ＣＨＯ雑種細胞６６株（５ＥＦ−１由来３４株、２１ＥＦ−２由来３２株）から、合計３６株（５ＥＦ−１由来１８株、２ＥＦ−２由来１８株）において予測されるサイズのバンドを検出した。以上より、上記ＣＨＯ雑種細胞３６株において、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去を確認した。Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットが除去されたｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを以下ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターと称する。
（５−５）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（５−３）で得た候補ＣＨＯ雑種細胞のうち５ＥＦ−１由来の８株について解析した。その結果、計２株（５ＥＦ１Δ３８、５ＥＦ１Δ６３）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターを検出した。代表的なＦＩＳＨ像及びｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターの核型をそれぞれ図７０Ａ及びＢに示す。
以上（５−１）から（５−５）の実験から、得られた上記ＣＨＯ雑種細胞２株は、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ雑種細胞であることを確認した。
（６）Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記実施例２３（５）において単離したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞２株（５ＥＦ１Δ３８、５ＥＦ１Δ６３）を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を表８に示す。
【表８】
0005345391.tif 000054
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞２株においてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例１９
Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
（１）ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
（１−１）ミクロセル法によるｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１への移入
染色体供与細胞として、実施例１８で得られたｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞株５ＥＦ１Δ３８及び５ＥＦ１Δ６３を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。方法は、実施例５（１−１）に従った。約２〜４週間の選択培養を行い、出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。６回の微小核細胞融合（５ＥＦ１Δ３８で２回、５ＥＦ１Δ６３で４回）から５６個の薬剤耐性コロニー（５ＥＦ１Δ３８から８クローン、５ＥＦ１Δ６３から４８クローン）を得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞として５ＥＦ１Δ３８及び５ＥＦ１Δ６３を用いて得た細胞をそれぞれ以下ｔΔ３８Ｈ細胞及びｔΔ６３Ｈ細胞と称する。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するか否かを実施例３（１−２）のプライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２を用いて、ヒト染色体をＳＴＳマーカーＤ２Ｓ１３３４のプライマーを用いてＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従いＰＣＲ増幅により確認した。また、染色体供与ＣＨＯ細胞の混入の有無をＣＨＯ  ｆｕｒｉｎ遺伝子特異的プライマーｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒを用いてＰＣＲ増幅により確認した。設計したプライマー配列を以下に示す：
0005345391.tif 000055
反応条件は、９４℃５分の後、変性９４℃２０秒、アニーリング／伸長６８℃３分間を３２サイクル行った。ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞で染色体供与ＣＨＯ細胞の混入が無い場合に、プライマーＳＶｐＡＮｐ１及びＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐの増幅、Ｄ２Ｓ１３３４プライマーにより約０．６ｋｂｐの増幅、ｆｕｒｉｎ３’ｓｕｂＦ及びｆｕｒｉｎＥｘ６−２８Ｒによる増幅なし、が予想される。その結果、上記（１−１）で得たブラストサイジンン耐性株５６株から計３９株（ｔΔ３８Ｈ４株、ｔΔ６３Ｈ３５株）において予想される予測されるサイズのバンドを確認した。
以上より、上記のブラストサイジンン耐性株３９株がｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞であることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジンン耐性株３９株のうち３１株（ｔΔ３８Ｈ；３株、ｔΔ６３Ｈ；２８株）についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。代表的な結果を図７１に示す。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。その結果、上記（１−２）で得たｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するブラストサイジンン耐性株２８株（ｔΔ３８Ｈ；３株、ｔΔ６３Ｈ；２５株）予測されるサイズのバンドを確認した。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト１４番及び２２番染色体特異的αサテライトＤＮＡプローブ（Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ，フナコシ）を用いて行った。上記（１−３）で得たブラストサイジン耐性株のうち８株について解析した結果、計８株が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の１対のヒト１４番及び２２番染色体セントロメア領域の４箇所と１コピーの１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクター由来の１箇所にシグナルが検出された。その結果を図７２Ａ及びＢに示す。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性株８株はｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持する正常核型のＨＦＬ−１細胞であることが確かめられた。
（２）Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターのＨＦＬ−１細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞２９株（ｔΔ３８Ｈ４株、ｔΔ６３Ｈ２８株）を、約１０４細胞にて２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍｌをいれたコラーゲン−Ｉコート２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図２１の「１４ＡΔｎｅｏ−ＨＡＣ」の項目に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞２９株（ｔΔ３８Ｈ３株、ｔΔ６３Ｈ２６株）おいてｈＥＰＯの発現を確認した。
実施例２０
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期ＥＰＯ発現解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例２３で得たｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞１１株（ｔΔ３８Ｈ３株、ｔΔ６３Ｈ８株）を使用した。非選択培養液は２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン３μｇ／ｍｌを添加した。ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞株は１〜３×１０５細胞をコラーゲン−ＩコートしたＴ−２５フラスコ（ファルコン）に播種し、細胞密度が９０％飽和程度まで培養し、再び１〜３×１０５細胞を播種し１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、５継代前後及び１０継代後に細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子発現解析及びＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−１４ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞９株を、約１０４細胞にて２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍｌをいれたコラーゲン−Ｉコート２４穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後７日間培養し、新しい培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。２連で行った実験結果の平均値を図４３の「１４ＡΔｎｅｏ」の項目に示す。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターを保持するＨＦＬ−１細胞８株において長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
以上の実験により、ｈＥＰＯ−１４ＡΔｑΔｎｅｏＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＨＦＬ−１細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例２１
Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去１４ＮΔｑＨＡＣベクターの構築
（１）１４ＮΔｑＨＡＣクローニング部位へのＦＲＴ配列の導入
（１−１）ＦＲＴ配列導入用ベクターＧｎｐＳＦ１−ＦＲＴの構築
実施例１８で構築したｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴベクターをＳｃａＩ−ＥｃｏＲＶ消化しＦＲＴ配列を含む７．４ｋｂのＤＮＡ断片へ、実施例６で構築したｐＳＦ１（Ｇ＋ｎ１）ベクターをＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ消化して得たＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ  ７．０ｋｂとＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ  ０．５５ｋｂのＤＮＡ断片を導入してＦＲＴ配列を含むＧｎｐＳＦＩ−ＦＲＴベクターを作製した。概略を図７３に示す。最終的なＧｎｐＳＦ１−ＦＲＴコンストラクトのサイズは約１５．０ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図３４Ａに示した。
（１−２）１４ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのＧｎｐＳＦＩ（ＦＲＴ）ベクター導入
ＧｎｐＳＦ１（ＦＲＴ）コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＮΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。Ｇ４ｎ６Δｐ２５では、２回のトランスフェクションから合計２４０個の薬剤耐性コロニーを単離して、以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図３４Ａ中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）の存在を解析した。方法は、実施例７（４−３）に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞、Ｇ４ｎ６Δｐ２５ｓＦ  ９６株のうち５２株が、配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約２ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。５’及び３’側の２箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例１（２−４）の方法に従って解析した。代表的な結果を図７４に示す。
塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析では相同組換え体で１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で７．６ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析では相同組換え体で１９．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補、Ｇ４ｎ６Δｐ２５ｓＦ  １８株のうち１６株の相同組換え体を確認した。
以上の（１−１）〜（１−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位にＦＲＴ配列が挿入された１４ＮΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞Ｇ４ｎ６Δｐ２５ｓＦ  １６株を取得した。
実施例２２
Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去１４ｇＮΔｑＨＡＣベクターの構築
（１）１４ｇＮΔｑＨＡＣクローニング部位へのＦＲＴ配列の導入
（１−１）ＦＲＴ配列導入用ベクターｇｎｐＳＦ−ＦＲＴの構築
実施例１８で構築したｔ１ｐＳＦ１−ＦＲＴベクターをＳｃａＩ−ＥｃｏＲＶ消化しＦＲＴ配列を含む７．４ｋｂのＤＮＡ断片へ、実施例６で構築したｐＳＦ１（ｇ＋ｎ１）ベクターをＳｃａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶ消化して得たＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ５．４ｋｂとＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ  ０．４５ｋｂのＤＮＡ断片を導入してＦＲＴ配列を含むｇｎｐＳＦＩ−ＦＲＴベクターを作製した。概略を図７５に示す。最終的なｇｎｐＳＦ１−ＦＲＴコンストラクトのサイズは約１３．３ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図３４Ｂに示した。
（１−２）１４ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｇｎｐＳＦ（ＦＲＴ）ベクター導入
ｇｎｐＳＦ１（ＦＲＴ）コンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した１４ＮΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。ｇ５ｎ７Δｃ３では、２回のトランスフェクションから合計１１６個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’及び３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図３４Ｂ中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）の存在を解析した。方法は、実施例７（４−３）に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞、ｇ５ｎ７Δｃ３ｓＦ  １１６株のうち５４株が、配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約２ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。５’及び３’側の２箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例１（２−４）の方法に従って解析した。代表的な結果を図７６に示す。
塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析では相同組換え体で１１．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で４．６ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析では相同組換え体で１５．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．８ｋｂである。ブラストサイジン耐性候補、ｇ５ｎ７Δｃ３ｓＦ  ３６株のうち４株の相同組換え体を確認した。
以上の（１−１）〜（１−４）の実験により、相同組換えによりクローニング部位にＦＲＴ配列が挿入された１４ＮΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞ｇ５ｎ７Δｃ３ｓＦ  ４株を取得した。
実施例２３
ヒト２１番染色体長腕遠位の削除による２１ＨＡＣ（２１ＡΔｑＨＡＣ）ベクターの作製
（１）ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位へのクローニング部位（ＨＰＲＴ再構築型）の導入
（１−１）ｌｏｘＰ及び５’ＨＰＲＴ配列挿入用ｋｋベクターの構築
ヒト２１番染色体の長腕近位にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるヒト２１番染色体近位のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＡＰ００１６５７）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000056
ＭＣ１−ＴＫ配列を、Ｖ８３０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からＲｓｒＩＩ（ＮＥＢ）により切り出し、Ｖ９０１プラスミドの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位にクローニングした（Ｖ９０１Ｔ−１）。次にヒト２１番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９＜２１−２＞、Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１０：１１６３，２００１年）を培養し、細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をＰＣＲ法により増幅した。反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。配列番号１１０−１１１で増幅したＤＮＡ断片（相同領域１）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）とＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で、配列番号１１２−１１３で増幅したＤＮＡ断片（相同領域２）をＸｈｏＩＩ（プロメガ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０１プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩないしＢｇｌＩＩサイトにクローニングした。さらにＶ９０１プラスミドのＡｓｃＩとＫｐｎＩサイトにＡｓｃＩとＫｐｎＩにより切り出した５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｓｉｎ）をクローニングした。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ハイグロマイシンはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列とＰＧＫハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）配列（Ｌｙｏｎｓ  Ｉ博士から分与）をクローニングすることで作製した。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１３．５ｋｂである（ｋｋベクターとする）。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図７８に示す。
（１−２）ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０細胞へのｋｋベクター導入
ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞は、同染色体を保持する上記Ａ９＜２１−２＞細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるＤＴ４０はＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）に登録番号ＪＣＲＢ２２２１として登録されており、入手可能である。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約１×１０８個のＡ９＜２１−２＞細胞からミクロセルを調製した。２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が〜８０％飽和程度まで培養したＡ９＜２１−２＞細胞をコルセミド（０．０７５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％  ウシ胎仔血清；ＦＢＳ，０．８ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８，ＤＭＥＭ）中で４８時間培養して微小核を誘導した。本実施例において、ＤＭＥＭはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温（３４℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃，８０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはＤＭＥＭ６ｍｌに再懸濁した。ＤＴ４０細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＣＳ，０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて培養後、ＤＭＥＭで２回洗浄し、１×１０７個をＤＭＥＭ５ｍｌに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＴ４０細胞懸濁液を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１：１．４溶液（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（ＵＳＡ），第１６巻，ｐ．１３３−１４３，１９９７年）で９０秒間融合処理した。融合細胞を６０ｍｌの１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ），０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴プレートの６枚に播いて２４時間培養した後、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で約２週間選択培養した。２回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。ＰＣＲ解析によりヒト２１番染色体上に存在する領域ＣＢＲ，ＡＰＰ，ＴＴＣ３，ＰＣＰ４の存在を確認し、更にヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いた蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により１コピーのヒト２１番染色体を保持するクローンＤＴ４０（２１−２−３）を確認し取得した。
次にｋｋベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）消化により線状化し、長腕遠位を削除したヒト２１番染色体を保持するを保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。１×１０７個のＤＴ４０（２１−２−３）細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇ  ＤＮＡ存在下で室温１０分間静置した後、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温１０分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、９６穴プレート（ファルコン）２０枚に播種した。２４時間後に終濃度１．５ｍｇ／ｍｌとなるようハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ、ＷＡＫＯ）を加え、２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。２０回のトランスフェクションで得た合計２３７個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋ））。
（１−３）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するためハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在を以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により検出した。そのプライマーの位置は図７８に示した。その配列を以下に示す。
0005345391.tif 000057
ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は以下のとおり行った。５’ｇｅｎｏｍｅ解析（配列番号１１４−１１５）；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃５分を２５サイクル、伸長７２℃１０分。３’ｇｅｎｏｍｅ解析（配列番号１１６−１１７）；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃７分を３０サイクル、伸長７２℃１０分。ＰＣＲ反応液にはＭｇＳＯ４（終濃度０．５ｍＭ）で添加した。部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ、５’側では４．５ｋｂのバンドが検出され、３’側では６．５ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０およびＤＴ４０（２１−２−３）ではバンドは検出されなかった。その頻度は２３７クローン中４６個で組換え頻度は約２０％であった。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト２１番染色体を保持するＡ９＜２１−２＞細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、単離、精製した。相同組換えの標的配列の外側に５’ｐｒｏｂｅ−１（配列番号１１８−１１９）および３’ｐｒｏｂｅ−１０（配列番号１２０−１２１）の２種類のプローブを設定した（図７８）。
0005345391.tif 000058
１次スクリーニングで得たうちの１２株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＳｐｈＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析においては相同組換え体で６．１ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析においては相同組換え体で６．０ｋｂ、野生型（非組換え体）では５’ｇｅｎｏｍｅ側解析および３’ｇｅｎｏｍｅ側解析ともに１１．５ｋｂである。解析した１２株の全てにおいて相同組換え体を確認した。
（１−５）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記（１−４）で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびハイグロマイシン（ｋｋベクターより切出して調製）をプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１−１）〜（１−５）により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７に５’−ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇｒｏ−ＴＫを挿入することが確認できた。
（２）テロメアトランケーションによるヒト２１番染色体長腕削除
（２−１）テロメアトランケーション用ベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−２１ｑの構築
ヒト２１番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター（ターゲティングベクター）は、ｐＴＥＬｈｉｓＤ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（ＵＳＡ），第１８巻，ｐ．１０８６−１０９０，２０００年）を用いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト２１番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＰ００１６５７）から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000059
ヒト２１番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Ａ９＜２１−２＞、Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１０：１１６３，２００１年）を培養し、細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をＰＣＲ法により増幅した。鋳型として約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用し、Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ実験マニュアル，ＨＢＪ出版局，１９９１）に従い、サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用してＰＣＲを行った。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃１０分を２５サイクル、伸長７２℃１０分で行った。７．０ｋｂの増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ（ロシュ）で消化して、突出末端をもつＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをｐＴＥＬｈｉｓＤプラスミドのＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的なｐＴＥＬｈｉｓＤ−２１ｑコンストラクトのサイズは約１４．４ｋｂである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図７９に示した。
（２−２）ヒト２１番染色体保持ＤＴ４０細胞へのテロメアトランケーションベクター導入
ｐＴＥＬｈｉｓＤ−２１ｑコンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ消化により線状化ＤＮＡとし、実施例２３（１）で作製した長腕近位にｌｏｘＰを導入したヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。１×１０７個のＤＴ４０（ｋｋ１３９）細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇ  ＤＮＡ存在下で室温１０分間静置した後、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温１０分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、９６穴プレート（ファルコン）２０枚に播種した。２４時間後に終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるようヒスチジノール（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，シグマ）を加え、２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。５回のトランスフェクションから合計１０５の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（２−３）ＰＣＲ解析
ヒスチジノール耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在をＰＣＲ法により確認した。ゲノム領域プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000060
約０．１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記４種のゲノム領域についてＰＣＲ増幅（Ｉｎｎｉｓら，前記）を行った。ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃５分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長７２℃３０秒を３５サイクル行った。テロメアトランケーションにより長腕遠位が削除された場合、上記４種のプライマーでは検出されないことが予想される。次に上記プライマーで検出されなかった１０クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置を図７９に示す。配列は以下のとおりである。
0005345391.tif 000061
１０クローンのうち部位特異的に組換えが起こった２クローンでのみ７．５ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）ではバンドは検出されなかった。
（２−４）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）およびＦＩＴＣ標識したｈｉｓＤ断片（ｐＴＥＬｈｉｓＤベクターより切出して調製）をプローブに用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体およびＣｏｔ１で染まった短縮したヒト２１番染色体長腕端に２個のＦＩＴＣシグナルが検出された。宿主であるＤＴ４０細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト２１番染色体が短縮したことを確認した。
以上より、得られたヒスチジノール耐性の２株がヒト２１番染色体を長腕削除
（３）２１ＡΔｑＨＡＣ長腕近位へのクローニング部位（ｎｅｏ再構築型）の導入
（３−１）ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入用ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃベクターの構築
実施例２３（２）で作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）にｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例１８（１）で作製したｔ１ｐＳＦ１（ＦＲＴ）を用いた。ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入部位であるヒト２１番染色体長腕近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（登録番号ＡＰ００１６５７）。相同組換えの２つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000062
ヒト２１番染色体を保持するＡ９＜２１−２＞細胞から抽出したグノムＤＮＡを鋳型として２つの標的配列をＰＣＲにより増幅した。配列番号１３４−１３５で増幅した約３．４ｋｂのＤＮＡ断片（相同領域１）をＰａｃＩおよびＮｈｅＩ（ロシュ）で消化し、配列番号１３６−１３７で増幅した約２．８ｋｂのＤＮＡ断片（相同領域２）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｒｆＩ（ロシュ）で消化し、突出末端をもつＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。次に制限酵素消化した相同領域１のＤＮＡ断片とＮｈｅＩおよびＳｃａＩで消化したｔ１ｐＳＦ１（ＦＲＴ）プラスミド（実施例１８（１）で作製）と実施例１（２−１）で作製したｐＳＦ１▲３▼をＳｃａＩおよびＰａｃＩで消化した３つのＤＮＡ断片を３フラグメントライゲーションした。このベクターをＳａｌＩおよびＳｒｆＩにより消化し、制限酵素消化した相同領域２をクローニングし、ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃとした。最終的なｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃコンストラクトのサイズは約１２．６ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図８０および図８１に示した。
（３−２）２１ＡΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０細胞へのｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃベクター導入
ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｃコンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した２１ＡΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。１×１０７個のＤＴ４０（ｋｋｑ７９）細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇ  ＤＮＡ存在下で室温１０分間静置した後、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温１０分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、９６穴プレート（ファルコン）２０枚に播種した。２４時間後に終濃度８μｇ／ｍｌとなるようブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、フナコシ）を加え、２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。４回のトランスフェクションから合計５１個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図８１中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図８１中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000063
配列番号１３８−１１６（５’ｇｅｎｏｍｅ）、配列番号１３９−１１４（３’ｇｅｎｏｍｅ）の組み合わせでＰＣＲを行った。
ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は以下のとおり行った。９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃６分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃７分を３０サイクル、伸長７２℃１０分。ＰＣＲ反応液にはＭｇＳＯ４（終濃度０．５ｍＭ）で添加した。
得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞５１株のうち２３株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約６．７ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約６．１ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（３−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。プローブは実施例１（１−４）で用いた５’ｐｒｏｂｅ−１および３’ｐｒｏｂｅ−１０を用いた。
１次スクリーニングで得たうちの６株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＳｐｈＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’ｇｅｎｏｍｅ側解析においては相同組換え体で７．８ｋｂ、ＤＴ４０（ｋｋｑ７９）（非組換え体）で６．１ｋｂ、３’ｇｅｎｏｍｅ側解析においては相同組換え体で９．５ｋｂ、ＤＴ４０（ｋｋｑ７９）（非組換え体）で６．０ｋｂである。解析した６株全てにおいて相同組換え体を確認した。
（３−５）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記（３−４）で組換えを確認した６クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびブラストサイジン（ｐＣＭＶ／Ｂｓｄベクターより切出して調製）をプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にブラストサイジン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（３−１）〜（３−５）の実験により、相同組換えによりクローニング部位（ｌｏｘＰ配列）及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列が挿入された２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞６株（ＤＴ４０（２１ｑＡＨＡＣ）−２，１３，１６，２９，３９，５１）を取得した。
（４）ＣＨＯ細胞への２１ＡΔｑＨＡＣベクター移入
（４−１）ミクロセル法による２１ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例２３（３）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列）が挿入された２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０雑種細胞（ＤＴ４０（２１ｑＡＨＡＣ）−２，３９，５１）を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。
はじめに約１０９個のＤＴ４０雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＤＴ４０雑種細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，インビトロジェン）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，ＲＰＭＩ１６４０）中で１３〜１８時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、予めポリＬ−リジンでコーティングした２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に藩種した。３７℃１時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した後、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＭＥＭで２回洗浄後５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した約１０７個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。４５％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ）１０％ＤＭＳＯ（シグマ）を含むＤＭＥＭ溶液で１２０秒間融合処理した。１２０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地（インビトロジェン）に懸濁し、４８穴プレート（ファルコン）５枚に播種し、２４〜３６時間後にブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ，Ｆ１２）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。３回の微小核細胞融合から計１６株（ＤＴ４０（２１ｑＡＨＡＣ）−２由来８株，ＤＴ４０（２１ｑＡＨＡＣ）−３９由来３株，ＤＴ４０（２１ｑＡＨＡＣ）−５１由来５株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（４−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出した。方法は、上記実施例１（３−３）に従って行った。得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ細胞１６株のうち１１株が、塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約６．７ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約６．１ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認した。
（４−３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株のうち１０株について解析した結果、計３株（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣ）−５，６，１７）が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーの２１ＡΔｑＨＡＣベクターが検出された。
以上（４−１）から（４−３）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株３株が２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持することを確認した。
実施例２４
２１ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
２１ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例１に記載したＣＨＯ細胞株３株（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣ）−５，６，１７）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収しＦＩＳＨ用染色体標本を作製した。
（２）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。その結果を表９に示す。
【表９】
0005345391.tif 000064
２１Ａδｑｈａｃベクターは、ＣＨＯ細胞において長期継代培養後も安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
実施例２で示した図１３より、ＷＯ２００４／０３１３８５パンフレットで開示した２１δｑｈａｃのＣＨＯ細胞におけるＨＡＣ保持率（％）は、培養開始時では、「薬剤選択あり」の場合で８６％、７週倍用語では、「薬剤選択なし」の場合は６６．０％、「薬剤選択あり」の場合は８６．０％である。したがって、本願発明の２１番染色体由来の新規ＨＡＣベクター２１Ａδｑｈａｃは、長期培養においてもほぼ脱落が見られず、従来のＨＡＣベクターに比べ顕著に安定なＨＡＣベクターであることがわかった。
以上の（１）及び（２）の実験により、２１Ａδｑｈａｃベクターは、ＣＨＯ細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例２５
Ｈｅｐｏ−２１ＡδｑｈａｃベクターのＣＨＯ雑種細胞でのｈｅｐｏ遺伝子発現解析
（１）ｈｅｐｏ−２１Ａδｑｈａｃベクターの構築
（１−１）２１Ａδｑｈａｃベクターへのｈｅｐｏ遺伝子の導入
実施例２３で構築した２１Ａδｑｈａｃベクターへｈｅｐｏ遺伝子発現ユニットを挿入する。Ｌｏｘｐ配列を含むｈｅｐｏ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘｐ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。概略を図７７に示す。
実施例１で作製した２１Ａδｑｈａｃベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞（ＣＨＯ（２１ｑａ−ＨＡＣ）−５，６）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。Ｌｏｘｐ配列を含むｈｅｐｏ発現プラスミドｐｌｎ１−ＥＰＯ（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）１０μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐｂｓ１８５（ライフテック）１０μｇの存在下でジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＢＳ添加したＦ１２培地（インビトロジェン製）を含む４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）５枚に播種した。２日後に０．８ｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、インビトロジェン）を含む培地と置き換えた。２〜３週間後にはＧ４１８耐性コロニーが出現し、計４８個（ＣＨＯ（２１ｑａ−ＨＡＣ）−５由来２０個、ＣＨＯ（２１ｑａ−ＨＡＣ）−６由来２８個）のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（１−２）ＰＣＲ解析
Ｈｅｐｏ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、２１Ａδｑｈａｃベクター上のｌｏｘｐ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘｐ配列部位を挟むようにｐｌｎ１−ＥＰＯベクター上及び２１Ａδｑｈａｃベクター上に設計したプライマーｓｖｐａｎｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈｅｐｏ遺伝子を、プラスミドベクターｐｂｓ２２６上のＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認した。プライマー配列およびＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーｓｖｐａｎｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ５プライマーＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、上記（１−１）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち計４０株において予想される増幅を確認した。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞４０株がｌｏｘｐ配列へのｈｅｐｏ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
（１−３）サザンブロット解析
Ｈｅｐｏ−２１Ａδｑｈａｃベクターにおいてｈｅｐｏ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。塩基配列から予想されるｘｂａｉ消化による制限酵素断片長は、ｈｅｐｏ発現ユニットを含む５．５ｋｂである（図１４）。上記（１−２）で得たＧ４１８耐性候補ＣＨＯ雑種細胞のうちの６株について解析を行った結果、合計３株（ＣＨＯ（２１ｑａｈａｃｅ−１３，１４，３７）において予測されるサイズのバンドを確認した。
（２）２１Ａδｑｈａｃベクターへ挿入されたｈｅｐｏ遺伝子の発現
Ｈｅｐｏ遺伝子の発現を培養上清中に産生されるｈｅｐｏタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
上記実施例１０３（１−３）において単離したｈｅｐｏ−２１Ａδｑｈａｃベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞６株を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収および細胞数を計数した。Ｈｅｐｏ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量した。
以上の結果から、上記ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞６株全てにおいてｈＥＰＯの発現を確認した。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−３）で得たＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞のうち６株について解析した。その結果、計５株において観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターを検出した。
以上（１）の実験から、得られたＧ４１８耐性５株は、ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認した。
実施例２６
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下および選択条件下（対照群）で長期継代培養を行った。実施例２５で得たＣＨＯ雑種細胞２株（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３，１４）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれに０．８ｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収し、ｈＥＰＯ遺伝子の発現およびＦＩＳＨ解析を行った。
（２）長期継代培養後のｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。上記（１）で長期継代培養したｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞２株について、実施例３（２）の方法に従って行った。その結果、上記ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞２株全てにおいて長期継代培養後もｈＥＰＯの発現を確認した。
（３）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数およびＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記２株についてその結果を表１０に示す。
【表１０】
0005345391.tif 000065
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において長期継代培養後も安定に保持された。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルを検出した。
以上の（１）から（３）の実験により、ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＨＡＣベクターは、長期継代培養後のＣＨＯ細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、ｈＥＰＯ遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例２７
Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターの構築
２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上及びｐＬＮ１／ＥＰＯＦプラスミド（実施例１８（３）にて作製）上のｈＥＰＯ発現ユニット下流にはＦＲＴ配列が挿入されている。ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上からＦＲＴ／ＦＬＰｅ部位特異的組換えシステムによりＮｅｏ耐性遺伝子発現ユニットを除去する。その概略を図８２に示す。
（１）ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクターからのＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去
（１−１）ＦＬＰｅによるＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去
上記実施例２５で作製したｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞中で実施例１８（５−１）で作製したＦＬＰｅ組換え酵素を一過性に発現させることでＦＲＴ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体からＮｅｏ耐性遺伝子ユニットを切出し除去する。組換え挿入体の選別は、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットの欠失を指標とした。
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３及びＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１４）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。２０〜１００μｇのＦＬＰｅ酵素発現ベクターｐＯＧ４４ＦＬＰｅ存在下でジーンパルサーＩＩ（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地（インビトロジェン製）を含む９６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）８枚（１  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで４枚、０．１  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで４枚）に播種した。２〜３週間後ブラストサイジン耐性コロニーが出現し、計１２０個（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３由来６０個、ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１４由来６０個）のコロニーを単離し、同じクローンを２４ｗｅｌｌプレート２連にまき、一方はブラストサイジンで、一方はＧ４１８とブラストサイジンで培養した。Ｇ４１８を加えたｗｅｌｌで死滅したクローンはｎｅｏ遺伝子が欠失していると考えられる。Ｇ４１８で死滅したクローンは１２０個中１２クローン（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３由来３個、ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１４由来９個）であった。このクローンを用いて、以後の解析を行った。
（１−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上からＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるため、ｐＬＮ１−ＥＰＯＦベクター上及び２１ＡΔｑＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって確認した。プライマー配列およびＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。Ｎｅｏカセットを含む組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。一方、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットが除去されていれば、上記２種類のプライマーでは増幅産物はみられない。その結果、上記（１−１）で得たＧ４１８非耐性ＣＨＯ雑種細胞計１２株のうち計１０株において予想される増幅産物がみられないことを確認した。以上より、上記のＢｓｄ耐性かつＧ４１８非耐性ＣＨＯ雑種細胞計１０株がＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されていることが確認された。
（１−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑ−ＨＡＣベクター上からＮｅｏ耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。塩基配列から予想されるＥｃｏＲＩ消化による制限酵素断片長は、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットが除去されｈＥＰＯ発現ユニットのみの場合４．９ｋｂ、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット及びｈＥＰＯ発現ユニット両方を含む場合７．６ｋｂである。上記実施例２７（１−１）で得た候補ＣＨＯ雑種細胞１２株（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３由来３株、ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１４由来９株）から、合計１０株（ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１３由来２株、ＣＨＯ（２１ｑＡ−ＨＡＣＥ）−１４由来８株）において予測されるサイズのバンドを検出した。以上より、上記ＣＨＯ雑種細胞１０株において、Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニット除去を確認した。Ｎｅｏ耐性遺伝子ユニットが除去されたｈＥＰＯ−２１ＡΔｑＦ−ＨＡＣベクターを以下ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターと称する。
（１−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（５−３）で得た候補ＣＨＯ雑種細胞のうち１０株について解析した。その結果、計４株（ＣＨＯ（２１ｑＡＨＡＣＥΔ）−４，８，１０，１１）において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつＣｏｔ１で染まった１コピーのｈＥＰＯ−２１ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターを検出した。
以上（１−１）から（１−４）の実験から、得られた上記ＣＨＯ雑種細胞４株は、ｈＥＰＯ−２１ＡΔｑΔｎｅｏ−ＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ雑種細胞であることを確認した。
実施例２８
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いてヒト２１番染色体長腕遠位を削除した２１ＨＡＣ（２１ＮΔｑＨＡＣ）ベクターの構築
ＨＡＣベクターがテロメア配列及びヒト２１番染色体末端の短いサブテロメアは配列（約８ｋｂ）を含有するように、長腕遠位及び近位にｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入し、Ｃｒｅによる部位特異的組換え反応により２箇所のｌｏｘＰ配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体（２１ＮΔｑＨＡＣ）ベクターを構築する。
（１）部位特異的組換え反応によるヒト２１番染色体長腕削除
（１−１）ヒト２１番染色体長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ベクターＮＴの構築
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。Ｖ８３０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からＲｓｒＩＩ（ＮＥＢ）によりＭＣ１−ＴＫ配列を切り出したのちＶ９０１プラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位にクローニングした（クローン名：Ｖ９０１Ｔ−２）。ＬｏｘＰ挿入部位であるヒト２１番染色体遠位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＴ＿０１１５１５）。相同組み換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
0005345391.tif 000066
ヒト２１番染色体を保持するＡ９＜２１−２＞細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして標的配列をＰＣＲにより増幅した。上記のプライマーを用いて、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）ないしＨｉｎｄＩＩＩ（ニッポンジーン）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０１Ｔ−２プラスミドのＥｃｏＲＩないしＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングした。さらにＶ９０１Ｔ−２プラスミドのＡｓｃＩとＫｐｎＩサイトにＡｓｃＩとＫｐｎＩにより切り出した３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＢＳをクローニングした。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＢＳはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列とＣＭＶ−ＢＳ配列（インビトロジェン）をクローニングすることで作製した。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１３ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組み換えにより生じる染色体アレルを図８３に示した。
（１−２）長腕近位ｌｏｘＰ挿入済みヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０細胞への長腕遠位テロメア側ｌｏｘＰ配列挿入用ＮＴベクター導入
実施例１（１−２）の方法に従い、ＮＴコンストラクトを制限酵素ＮｏｔＩ消化により線状化ＤＮＡとし、実施例２３（１）で作製した長腕近位ｌｏｘＰ挿入済みヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞ＤＴ４０（ｋｋ１３９）に導入した。ブラストサイジン（終濃度８ｕｇ／ｍｌ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。２回のトランスフェクションから合計１２個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（１−３）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在を実施例６（１−１）の方法に従い、ＰＣＲ法により検出した。２つの標的配列（図８３中、それぞれ５’ｇｅｎｏｍｅ及び３’ｇｅｎｏｍｅで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図８３に矢印で示した。その配列を以下に示す：
0005345391.tif 000067
ＰＣＲは配列番号１３８−１４５（３’ｇｅｎｏｍｅ）、配列番号１３９−１４４（５’ｇｅｎｏｍｅ）の組み合わせで行った。
上記ブラストサイジン耐性１２株のうち５株において５’および３’側の２標的配列の存在を確認した。
（１−４）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの３’側の標的配列内側にプローブを設定した（図８３）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト２１番染色体を保持するＡ９＜２１−２＞細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した（３’ｐｒｏｂｅ−６とする）。
0005345391.tif 000068
１次スクリーニングで得た５株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＫｐｎＩ（ロシュ）によりにより消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、相同組換え体で７．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で２３ｋｂであり、候補５株から合計２株（ＤＴ４０（ｋｋＮＴ）−７，１１）の相同組換え体を確認した。これらの２クローンを用いて次のステップ（３）へ進めた。
（２）長腕近位および遠位へｌｏｘＰを導入したヒト２１番染色体のＣＨＯ細胞への移入
（２−１）ミクロセル法による改変ヒト２１番染色体のＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例２８（１）で得られた、長腕近位および遠位へｌｏｘＰを導入したヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞（ＤＴ４０（ｋｋＮＴ）−７，１１）を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）を用いた。
はじめに約１０９個のＤＴ４０雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＤＴ４０雑種細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，インビトロジェン）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，１％ＣｈＳ，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，ＲＰＭＩ１６４０）中で１３〜１８時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、予めポリＬ−リジンでコーティングした２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に藩種した。３７℃１時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した後、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＭＥＭで２回洗浄後５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した約１０７個のＣＨＯｈｐｒｔ−／−細胞を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。４５％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロシュ）１０％ＤＭＳＯ（シグマ）を含むＤＭＥＭ溶液で１２０秒間融合処理した。１２０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地（インビトロジェン）に懸濁し、４８穴プレート（ファルコン）５枚に播種し、２４〜３６時間後にブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ，Ｆ１２）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。２回の微小核細胞融合から計１０株（ＤＴ４０（ｋｋＮＴ）−７由来５株，ＤＴ４０（ｋｋＮＴ）−１１由来５株）のブラストサイジン耐性ＣＨＯｈｐｒｔ−／−株を得た。
（２−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在を実施例２３（１−３）および実施例２８（１−３）記載のＰＣＲ法により確認した。解析した１０クローン全てにおいて増幅産物が確認できた。
（２−３）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（２−２）で取得したうちの６クローンについて解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてＣｏｔ１で染まった１コピーのシグナルを検出した。
（３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
（３−１）長腕遠位及び近位へｌｏｘＰ配列挿入したヒト２１番染色体保持ＣＨＯ雑種細胞へのＣｒｅ発現ベクターの導入
実施例１（１−２）の方法に従い、Ｃｒｅ発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅを実施例２８（２）で取得したＣＨＯ（ｋｋＮＴ）−１及びＣＨＯ（ｋｋＮＴ）−５及びＣＨＯ（ｋｋＮＴ）−６細胞に導入した。ＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ，終濃度１ｘ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
３回のトランスフェクションから合計１２個のＨＡＴ耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（３−２）ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として２つのｌｏｘＰ配列間の欠失をＰＣＲ法により確認した。長腕遠位欠失後に残ったｌｏｘＰ配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図８４中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
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ＴＡＱポリメラーゼはＥＸ  ＴＡＱ（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃１分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長７２℃１分を３５サイクルで行った。ＬＯＸＰ配列間の欠失により長腕遠位が削除された場合、約３５０Ｂの増幅が予測される。また配列番号１４８−１４５、配列番号１１４−１４９、配列番号１１４−１４５の組み合わせでは５．７ＫＢ，６．３ＫＢ，１２ＫＢの増幅が予測される。ＴＡＱポリメラーゼはＬＡ  ＴＡＱ（宝酒造）を用い、反応条件は以下のとおり行った。配列番号１４８−１４５、配列番号１１４−１４９の解析；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃１０分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を２５サイクル、伸長７２℃１０分。配列番号１１４−１４５の解析；９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃６分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃１０分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３０サイクル、伸長７２℃１０分。ＰＣＲ反応液にはＭＧＳＯ４（終濃度０．５ＭＭ）で添加した。
その結果、上記ＨＡＴ耐性１２株のうち６株において上記組み合わせのプライマーでの予測される増幅産物を確認した。
（３−３）サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図８４に示した。相同組換えの５’側プローブは実施例１（１−４）記載の５’ＰＲＯＢＥ−１を３’側プローブは実施例２８（１−４）記載の３’ＰＲＯＢＥ−６を用いた。
１次スクリーニング（ＰＣＲ）で得た候補６クローンからゲノムＤＮＡ約５ＭＧを制限酵素ＫＰＮＩ（ロシュ）により消化し、ＡＵＳＵＢＥＬら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１６．５ｋｂ、組換え前のクローンで１２ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で１６．５ｋｂ、組換え前のクローンで７．６ｋｂである。その結果、６株全てにおいて長腕遠位欠失体を確認した。
（３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（３−３）で取得した６クローンについて解析した結果、４クローンにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片がＣｏｔ１で染まっており、１コピーのシグナルを検出した。
以上（３−１）から（３−４）の実験から、得られたＨＡＴ耐性ＣＨＯ雑種細胞は、テロメアおよびサブテロメアを残して長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片（２１ＮΔｑＨＡＣ）を保持することを確認した。
実施例２９
２１ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞での長期安定性解析
（１）非選択培養条件下での長期継代培養
２１ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例２８に記載した２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞株２株（ＣＨＯ（２１ｑＮ−ＨＡＣ）１７，１８）を使用した。非選択培養液は１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地であり、選択培養液はこれに１ｘＨＡＴを添加した。ＣＨＯ細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養した細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１０継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。ＣＨＯ細胞株は１０継代後にそれぞれ細胞を回収しＦＩＳＨ用染色体標本を作製した。
（２）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数およびＨＡＣ保持率は２連で行った結果の平均値を算出した。上記２株についてその結果を表１１に示す。
【表１１】
0005345391.tif 000070
２１ＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において１０継代後までの時点で安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２個のシグナルが検出された。
以上の（１）及び（２）の実験により、２１ＮΔｑＨＡＣベクターは、ＣＨＯ細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例３０
ｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ雑種細胞でのｈＥＰＯ遺伝子発現解析
（１）２１ＮΔｑＨＡＣ長腕近位へのクローニング部位の導入
（１−１）ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入用ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄベクターの構築
ヒト人工染色体（２１ＮΔｑＨＡＣ）にｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例１８（１）で作製したｔ１ｐＳＦ１（ＦＲＴ）を用いた。ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列挿入部位であるヒト２１番染色体長腕近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（登録番号ＮＴ＿０１１５１５）。相同組換えの２つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
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ヒト２１番染色体を保持するＡ９＜２１−２＞細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として２つの標的配列をＰＣＲにより増幅した。配列番号１３４−１３５で増幅した約３．４ｋｂのＤＮＡ断片（相同領域１）をＰａｃＩおよびＮｈｅＩ（ロシュ）で消化し、配列番号１５０−１５１で増幅した約２．０ｋｂのＤＮＡ断片（相同領域４）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｒｆＩ（ロシュ）で消化し、突出末端をもつＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。次に制限酵素消化した相同領域１のＤＮＡ断片とＮｈｅＩおよびＳｃａＩで消化したｔ１ｐＳＦ１（ＦＲＴ）プラスミド（実施例１８（１）で作製）と実施例１（２−１）で作製したｐＳＦ１▲３▼をＳｃａＩおよびＰａｃＩで消化したの３つのＤＮＡ断片を３フラグメントライゲーションした。このベクターをＳａｌＩおよびＳｒｆＩにより消化し、制限酵素消化した相同領域４をクローニングし、ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄとした。最終的なｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄコンストラクトのサイズは約１１．８ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図８５および図８６に示した。
（１−２）長腕近位および遠位へｌｏｘＰを導入したヒト２１番染色体のｈｐｒｔ欠損ＤＴ４０細胞への移入
長腕近位および遠位へｌｏｘＰを導入したヒト２１番染色体を保持するｈｐｒｔ欠損ＤＴ４０雑種細胞は、同染色体を保持する実施例２８（２）で作製したＣＨＯ（ｋｋＮＴ）６細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるｈｐｒｔ欠損ＤＴ４０はＤＴ４０３２株（Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６）を用いた。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約１×１０８個のＣＨＯ（ｋｋＮＴ）６細胞からミクロセルを調製した。２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が〜８０％飽和程度まで培養したＣＨＯ（ｋｋＮＴ）６細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む焙養液（２０％ウシ胎仔血清；ＦＢＳ，０．８ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８，Ｆ１２）中で７２時間培養して微小核を誘導した。本実施例において、ＤＭＥＭはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温（３４℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃，８０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはＤＭＥＭ６ｍｌに再懸濁した。ＤＴ４０３２細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＣＳ，０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて培養後、ＤＭＥＭで２回洗浄し、１×１０７個をＤＭＥＭ５ｍｌに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し、これにＤＴ４０３２細胞懸濁液を重層後、室温，１５００ｒｐｍ，５分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１：１．４溶液（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（ＵＳＡ），第１６巻，ｐ．１３３−１４３，１９９７年）で９０秒間融合処理した。融合細胞を６０ｍｌの１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ），０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴プレートの６枚に播いて２４時間培養した後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で約２週間選択培養した。２回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。Ｇ４１８耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在を実施例２８（２−２）記載のＰＣＲ法により確認し、更にヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いた蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により１コピーのヒト２１番染色体を保持するクローンＤＴ４０３２（ＫＫＮＴ）８，９を確認し取得した。
（１−３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
（１−３−１）長腕遠位及び近位へｌｏｘＰ配列挿入したヒト２１番染色体保持ＤＴ４０３２雑種細胞へのＣｒｅ発現ベクターの導入
実施例１（１−２）の方法に従い、Ｃｒｅ発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅを実施例３０（１−２）で取得したＤＴ４０３２（ｋｋＮＴ）−８及びＤＴ４０３２（ｋｋＮＴ）−９細胞に導入した。ＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ，終濃度１ｘ）で選択培養を行い、２〜３週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
４回のトランスフェクションから合計４３個のＨＡＴ耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
（１−３−２）ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として２つのｌｏｘＰ配列間の欠失を実施例３０（３−２）と同様にＰＣＲ法により確認した。
その結果、上記ＨＡＴ耐性４３株のうち４０株において上記組み合わせのプライマーでの予測される増幅産物を確認した。
（１−３−３）サザンブロット解析
１次スクリーニング（ＰＣＲ）で得た候補のうちの２５クローンからゲノムＤＮＡを抽出し実施例３０（３−３）と同様にサザンブロット解析を行った。その結果、２５クローン中５株おいて長腕遠位欠失体を確認した。
（１−３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行った。上記（１−３−３）で取得した５クローンについて解析した結果、４クローンにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片がＣｏｔ１で染まっており、１コピーのシグナルを検出した。
以上（１−３−１）から（１−３−４）の実験から、得られたＨＡＴ耐性ＤＴ４０３２雑種細胞は、テロメアおよびサブテロメアを残して長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片（２１ＮΔｑＨＡＣ）を保持することを確認した。
（１−４）２１ＮΔｑＨＡＣ保持ＤＴ４０３２細胞へのｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄベクター導入
ｐＳＦ１（ＦＲＴ）−Ｄコンストラクトを制限酵素ＳｒｆＩ（ロシュ）消化により線状化し、長腕遠位を削除した２１ＮΔｑＨＡＣを保持するＤＴ４０３２雑種細胞３種（ＤＴ４０３２（ｋｋＮＴＣ）１５，１７，２２）にそれぞれ導入した。方法は、実施例１（２−２）に従って行った。２〜３週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。ＤＴ４０３２（ｋｋＮＴＣ）１５では、各２回のトランスフェクションから合計１２５個の薬剤耐性コロニーを、ＤＴ４０３２（ｋｋＮＴＣ）１７では、各２回のトランスフェクションから合計１１０個の薬剤耐性コロニーを、またＤＴ４０３２（ｋｋＮＴＣ）２２では各２回のトランスフェクションから合計１２４個の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
（１−５）ＰＣＲ解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在を配列番号１１４−１３９のプライマーセットおよび配列番号１４５−１３８のプライマーセットを用いたＰＣＲ法により検出できる。その位置は図８６中に矢印で示す。ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、ＰＣＲ反応液にはＭｇＳＯ４（終濃度０．５ｍＭ）で添加した。反応条件は９４℃１分の後、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７２℃８分を３サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長７０℃８分を２サイクル、変性９８℃５秒、アニーリング／伸長６８℃８分を３０サイクル、伸長７２℃１０分で行うことができる。
（１−６）サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行うことができる。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図８６に示す。相同組換えの５’側プローブは実施例２３（１−４）記載の５’ｐｒｏｂｅ−１を３’側プローブは実施例２８（１−４）記載の３’ｐｒｏｂｅ−６を用いる。
１次スクリーニング（ＰＣＲ）で得た株から抽出したゲノムＤＮＡ約５μｇを制限酵素ＫｐｎＩ（ロシュ）により消化し、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）に記された方法でサザンブロット解析を行うことができる。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ９２１０（モレキュラーダイナミクス）により検出できる。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１１ｋｂ、組換え前のクローンで１６．５ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で６．２ｋｂ、組換え前のクローンで１６．５ｋｂである。
以上の（１−１）〜（１−６）の実験により、相同組換えによりクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列）が挿入された２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０３２雑種細胞を取得できる。
（２）ＣＨＯ細胞への２１ＮΔｑＨＡＣベクター移入
（２−１）ミクロセル法による２１ＮΔｑＨＡＣベクターのＣＨＯ細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例３０（２）で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位（ｌｏｘＰ及び３’ｎｅｏ及びＦＲＴ配列）が挿入された２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０３２雑種細胞をそれぞれ用いる。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いる。方法は、実施例１（３−１）に従って行うことができる
（２−２）ＰＣＲ解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として５’および３’側の２標的配列の存在をＰＣＲ法により検出できる。方法は、実施例３０（１−５）に従う。塩基配列から予想されるサイズ（５’ｇｅｎｏｍｅ約７．５ｋｂ及び３’ｇｅｎｏｍｅ約５．３ｋｂ）の増幅産物を与えることを確認できる。
（２−３）サザンブロット解析
移入した２１ＮΔｑＨＡＣベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例３０（１−６）と同様に行うことが出来る。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、５’側標的配列では相同組換え体で１１ｋｂ、組換え前のクローンで１６．５ｋｂであり、３’側標的配列では相同組換え体で６．２ｋｂ、組換え前のクローンで１６．５ｋｂである。（２−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行うことができる
以上（２−１）から（２−４）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株は２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持することを確認できる。
（３）ｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターの構築
（３−１）２１ＮΔｑＨＡＣベクターへのｈＥＰＯ遺伝子の導入
実施例３０（２）で構築した２１ＮΔｑＨＡＣベクターへｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットを挿入する。ｌｏｘＰ配列を含むｈＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ耐性遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。実施例３０（２）で作製した２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ雑種細胞を用いて、実施例３（１−１）と同様にしてｈＥＰＯ遺伝子発現ユニットの挿入を行った。２〜３週間後にはＧ４１８耐性のコロニーを単離して増殖させることができる。
（３−２）ＰＣＲ解析
ｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、２１ＮΔｑＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにｐＬＮ１−ＥＰＯベクター上及び１４ＮΔｑＨＡＣベクター上に設計したプライマーＳＶｐＡＮｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２によって、また挿入されたｈＥＰＯ遺伝子を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２プライマーによって、ＰＣＲ増幅により確認できる。プライマー配列およびＰＣＲはＫａｋｅｄａらの方法（Ｋａｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従う。組換え挿入体の場合は、プライマーＳＶｐＡＮｐ１およびＮｅｏ  Ｒｐ２により約１．０ｋｂｐ、プライマーＭ１３ＲＶおよびＮｅｏ  Ｒｐ２により約２．７ｋｂｐの増幅が予想される。以上より、上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞がｌｏｘＰ配列へのｈＥＰＯ遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認できる。
（３−３）サザンブロット解析
ｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターにおいてｈＥＰＯ発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行うことができる。方法は、Ｋａｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１２：８５２−８５６，２００５年）に従った。塩基配列から予想されるＸｂａＩ消化による制限酵素断片長は、ｈＥＰＯ発現ユニットを含む５．５ｋｂである。（３−４）ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的Ｃｏｔ１（インビトロジェン）をプローブに用いて行うことができる。以上（３−１）から（３−４）の実験から得られた上記のＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞＊＊株は、ｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持する正常核型のＣＨＯ細胞であることを確認できる。
（４）２１ＮΔｑＨＡＣベクターへ挿入されたｈＥＰＯ遺伝子の発現
ｈＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるｈＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量できる。
上記（３）において単離したｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞を、約１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ１２培地２ｍｌをいれた１２穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種し、コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え２日間培養し、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地１ｍｌに置き換えさらに２４時間培養した後、上清を回収および細胞数を計数できる。ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のｈＥＰＯを定量できる上記ｈＥＰＯ−２１ＮΔｑＨＡＣベクターを保持するＧ４１８耐性ＣＨＯ雑種細胞においてｈＥＰＯの発現を確認できる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法が提供される。かかるＨＡＣベクターは、細胞において安定に保持され、かつ挿入された外来ＤＮＡを高発現可能なものである。従って、かかるＨＡＣベクターは、遺伝子発現解析、遺伝子治療、遺伝子導入、タンパク質製造などの多様な用途に有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１〜１０９：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１１０〜１１７：プライマー
配列番号１１８〜１２１：プローブ
配列番号１２２〜１７７：プライマー
配列番号１７８〜１７９：リンカー
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図７９】
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【図８７】
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【図９０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図５９】
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【図６１】
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【図６９】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７７】
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【図７８】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８９】
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