(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の遺伝子発現を抑制するための修飾ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、長さが１２〜５０ヌクレオチドであり、発現の抑制をしようとするゲノム領域または遺伝子の一部分に、またはそのような遺伝子から転写されたＲＮＡに、相補的であり、各ＣｐＧが、アルキルホスホネートＣｐＧ、インバーテッドＣｐＧおよび２’−Ｏ−置換ＣｐＧから選ばれた修飾ＣｐＧであり、該オリゴヌクレオチドは、投与前に比べて投与後の血小板枯渇の程度が２０％以下であって、かつ非修飾ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて血小板枯渇を減少させることができる、修飾ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、遺伝子発現の研究およびアンチセンス治療法に有用である修飾オリゴヌクレオチドに関する。
関連技術の要約
アンチセンス治療法における特異的な遺伝子発現のインヒビターとして、オリゴヌクレオチドを使用する可能性は、最初に１９７７年および１９７８年に刊行された３つの文献で示唆された。パターソン（Paterson）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４:４３７０−４３７４（１９７７）はｍＲＮＡの無細胞系翻訳が、相補的であるオリゴヌクレオチドを該ｍＲＮＡに結合させることによって開始することができることを開示している。ザメクニク（Zamecnik）およびステフェンソン（Stephenson）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：２８５−２８８（１９７８）はラウス肉腫ウイルス（RSV）ゲノムの一部に相補的である１３−マーの合成オリゴヌクレオチドが感染細胞培養中でRSV複製を阻害することができ、ついで悪性肉腫細胞中に初代ニワトリ線維芽細胞のRSV-媒介形質転換を阻害することができることを開示している。
これらの初期の研究以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドがウイルス増殖を阻害することができる能力が確固として確認された。米国特許第４,８０６,４６３号は、ヒト免疫不全疾患ウイルスの増殖が該HIVゲノムの多様な領域に相補的なオリゴヌクレオチドによって阻害することができることを教示する。米国特許第５,１９４,４２８号は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ１遺伝子に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるインフルエンザウイルス複製の阻害を開示する。アグラワル（Agrawal）、Trends in Biotechnology 10：１５２−１５８（１９９２）は抗ウイルス剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を概説する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、抗−寄生虫剤として開発された。ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ９３／１３７４０号は、薬剤耐性マラリア原虫の増殖を阻害するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することを開示している。タオ（Tao）ら、Antisense Research and Development ５：１２３−１２９（１９９５）はアンチセンスオリゴヌクレオチドによる住血吸虫寄生虫の増殖の阻害を教示している。
一層最近では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞遺伝子の発現から生じる疾患の治療的応用の候補として見込みがあることを示す。ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ９５／０９２３６号は、βアミロイド発現を阻害するオリゴヌクレオチドによるβアミロイド誘発神経細胞株の形態的異常の完全消滅を開示する。ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ９４／２６８８７号は、グロビン遺伝子転写物の異常なスプライシングが、該転写物のある部分に相補的であるオリゴヌクレオチドによって消滅することを開示する。ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ９４／１３６８５号は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドによって腫瘍発生性が阻害されることを開示している。
治療剤および診断剤としての多様なアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発は、最近アグラワルおよびアイエル（Iyer）、Current Opinion in Biotechnology ６：１２−１９（１９９５）に概説されている。
アンチセンス治療法における関心が高まるにつれ、糖−リン酸骨格を修飾することにより、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改良するための多様な努力がなされてきた。米国特許第５,１４９,７９７号は、メチルホスホネートまたはホスホルアミデートフランキング領域間に置かれたホスホロチオエートコア領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを記載している。ＰＣＴ国際出願公開番号第ＷＯ９４／０２４９８号は、ＤＮＡコア領域をフランキングする２’−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域を有するハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示している。
最近、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性について一層多くが見出されている。アグラワルら、Clinical Pharmacokinetics ２８：７−１６（１９９５）およびザン（Zhang）ら、Clinical Pharmacokinetics ５８：４４−５３（１９９５）は、ヒト患者における抗−ＨＩＶオリゴヌクレオチドの薬物動態を開示している。これらの新規発見のいくつかは、治療剤としてのオリゴヌクレオチドの最大限での活用化に関して克服されるべき新規のチャレンジへと導く。例えば、クニープ（Kniep）ら、Nature ３７４：５４６−５４９（１９９５）は他のある配列によってフランキングされたＣＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが有糸分裂促進効果を保有することを開示している。本発明者らは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによって生じる多くの副作用が、ホスホロチオエート−結合ＣｐＧジヌクレオチドの結果であることを見出した。それゆえ、遺伝子発現の阻害特性は保有しているが、従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより副作用の減少した修飾オリゴヌクレオチドの必要性がある。
発明の簡単な要約
本発明は、遺伝子発現の実験およびアンチセンス治療法に有用である修飾オリゴヌクレオチドに関する。本発明は遺伝子発現を阻害し、かつ従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより生じる副作用の減少した修飾オリゴヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、従来のＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて脾腫を低減し、血小板の枯渇を減少させて遺伝子発現を調節するためにＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
第１の局面において、本発明は修飾ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび副作用が減少した、特定の遺伝子発現を阻害するための物質の組成物を提供する。そのような遺伝子発現の阻害は細胞または動物モデルにおいて特定の遺伝子の生物学的機能を決定するための突然変異分析の別法として使用することができる。そのような遺伝子発現の阻害はまた、ウイルスまたは病原の遺伝子発現または不適切な細胞遺伝子の発現によって引き起こされる疾患の治療に使用することができる。本発明のこの局面による好ましい１態様において、物質の組成物は１またはそれ以上の修飾ＣｐＧジヌクレオシドを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。ある特に好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に存在するすべてのＣｐＧジヌクレオシドが修飾される。本発明のこの局面において、ＣｐＧジヌクレオシドは修飾されて、その結果修飾されていないホスホロチオエートＣｐＧジヌクレオシドを有する同一の、別のオリゴヌクレオチドに比較して、哺乳動物に投与されると脾腫および血小板枯渇を引き起こす低減された能力をオリゴヌクレオチドに与えることができる。
第２の局面において、本発明は、副作用の減少した、哺乳類における遺伝子発現を調節する方法を提供する。本発明のこの局面に応じた方法において、本発明の第１の局面に応じた物質の組成物は哺乳動物に投与される（ここで、該オリゴヌクレオチドは哺乳動物に発現している遺伝子と相補的である）。
第３の局面において、本発明は、異常な遺伝子発現によって生じる疾病を治療的に処置するための、副作用の低い方法を提供し、該方法は、該疾病を有する個体に本発明の第１の局面に応じた物質の組成物を投与することを含む（ここで、オリゴヌクレオチドは異常に発現した遺伝子と相補的であり、そのような異常な発現が疾病を引き起こす）。この状況において、異常な遺伝子発現は、ウイルスまたは原核性もしくは真核性病原体の増殖に必要な遺伝子の宿主生物における発現、または宿主細胞遺伝子の不適切な発現を意味する。宿主細胞遺伝子の不適切な発現には、そのような不適切な宿主細胞遺伝子の発現が疾病を引き起こすような細胞遺伝子の突然変異体アレルの発現または細胞遺伝子の正常なアレルの発現不足または過剰発現を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、生理食塩水、従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（９１）、メチルホスホネート−修飾ＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５５）、インバーテッドＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５６）、および５−メチルＣＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５７）を腹腔内投与したＣＤ１マウスの血小板数の結果を示す。
図２は、生理食塩水、従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（９１）、メチルホスホネート−修飾ＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５５）、インバーテッドＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５６）、および５−メチルＣＣｐＧオリゴヌクレオチド（２５７）を腹腔内投与したＣＤ１マウスの脾臓重量分析の結果を示す。
図３は、生理食塩水、従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（１）、インバーテッドＣｐＧオリゴヌクレオチド（２）、インバーテッドＣｐＧオリゴヌクレオチド（３）、５−メチルＣＣｐＧオリゴヌクレオチド（４）、メチルホスホネート−修飾ＣｐＧオリゴヌクレオチド（５）、２’−Ｏ−置換オリゴヌクレオチド（６）を腹腔内投与したFisherラットの血小板の数（パネルＡ）、ＡＬＴレベル（パネルＢ）およびＡＳＴレベル（パネルＣ）の分析の結果を示す。
好ましい態様の詳細な記載
本発明は遺伝子発現の実験およびアンチセンス治療法に有用な修飾オリゴヌクレオチドに関する。本明細書中に引用したすべての米国特許、特許公報および科学文献は、当該技術分野における知見レベルを明示するものであり、それゆえ参照のため本明細書に引用する。
本発明は、遺伝子発現を阻害し、従来のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより副作用の産生が少ない修飾オリゴヌクレオチドを提供する。特に、本発明は哺乳動物に投与される場合に、従来のＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比較して、脾腫を低減し、かつ血小板の枯渇を減少させる結果となる修飾ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、遺伝子の異常発現により引き起こされる疾患治療のための使用を含む、イン・ビボでの遺伝子発現を調節するためにそのようなオリゴヌクレオチドを使用する方法さらに提供する。
第一の態様において、本発明は修飾ＣｐＧ−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび副作用が少なく特定の遺伝子発現を阻害する原因となる組成物を提供する。そのような遺伝子発現の阻害は細胞または動物モデルにおける特定の遺伝子の生物学的な機能を決定するための変異分析の別法として使用されることができる。遺伝子発現のそのような阻害はまた、ウイルスまたは病原体の遺伝子発現または細胞遺伝子の不適切な発現によって引き起こされる疾患を治療上処置するために使用することができる。
本発明のこの局面の好ましい一態様において、問題の組成物は１またはそれ以上の修飾ＣｐＧジヌクレオシドを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオシドは５’−ＣｐＧ−３’、すなわち５’から３’の方向において、インターヌクレオシド結合によりＧヌクレオシドに共有結合的に結合したＣヌクレオシドである。本発明の目的のため、ＣｐＧジヌクレオシドはインターヌクレオシド結合がラセミ体ホスホロチオエート結合でありかつＣヌクレオシドの５’位が水素原子で占められる場合に、「修飾されていない」と考えられるべきである。ある特に好ましい態様において、該オリゴヌクレオチド中に存在するすべてのＣｐＧジヌクレオシドが修飾されている。本発明の目的のため、哺乳動物に投与されると、修飾されていないホスホロチオエートＣｐＧジヌクレオシドを有する他のすべての点では同一のオリゴヌクレオチドに関して、脾腫および血小板の枯渇を引き起こす弱い能力をオリゴヌクレオチドに付与することができるように修飾されていないＣｐＧジヌクレオシドから変えられる場合に、ＣｐＧジヌクレオシドは「修飾された」という。本発明の本局面によると、特定の遺伝子発現を低減した副作用で阻害する物質の組成物は、発現の阻害が望まれているゲノム領域の一部または遺伝子、またはそのような遺伝子から転写されたＲＮＡに相補的である修飾ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをいう。本発明の目的のためには、オリゴヌクレオチドなる語句には、２またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドモノマー、リボヌクレオチドモノマーまたは２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドモノマー、またはその任意の組み合わせのポリマーを含む。オリゴヌクレオチドなる語句にはまた、化学的に修飾した塩基または糖を有するポリマーおよび／または他の置換基、例えば、これらに制限するものではないが、親油性基、インターカレント剤（intercalating agents）、ジアミンおよびアダマンタンなどを有するポリマーを含む。本発明の目的のために「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」なる語句は、少なくとも１つのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合、好ましくは約２０％から約１００％のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合、および最も好ましくは約５０％から約１００％のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくはかかるオリゴヌクレオチドは約１２〜約５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１７〜約３５ヌクレオチドを有するであろう。本発明の目的のためには、「２’−Ｏ−置換」なる語句は、１−６の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、−Ｏ−アリールまたはアリル（２−６炭素原子を有する）基（かかるアルキル、アリールまたはアリル基は置換されていないか、または例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシまたはアミノ基により置換されていてよい）による、またはヒドロキシ、アミノまたはハロによる、ペントース残基の２’位の置換を意味するが、２’−Ｈ基の置換ではない。「相補的」なる語句はゲノム領域、遺伝子、またはそのＲ���Ａ転写産物に生理学的条件下でハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間での好ましくはワトソン−クリック型またはフーグスティーン型塩基対を形成する塩基特異的な水素結合の結果であるが、他の型の水素結合ならびに塩基積み重ねもまたハイブリダイゼーションに導き得る。実際問題として、かかるハイブリダイゼーションは特定の遺伝子発現阻害の観察から推論することができる。修飾オリゴヌクレオチド配列が相補的である遺伝子配列またはＲＮＡ転写配列は、修飾しようとされる生物学的効果に依存するであろう。いくつかの場合において、ゲノム領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物はウイルス由来からのものである。好ましいウイルスには、これらに制限するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（１型または２型）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型または２型）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびパピローマウイルスが含まれる。他の場合においては、ゲノム領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物は内生哺乳類（ヒトも含まれる）染色体ＤＮＡからのものであってよい。かかるゲノム領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物の好ましい例には、これらに制限するものではないが、血管内皮増殖因子（VEGF）、βアミロイド、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、プロテインキナーゼＡ、ApoE４タンパク質、ｐ−糖タンパク、ｃ−ＭＹＣタンパク質、ＢＣＬ−２タンパク質およびＣＡＰＬをコードする配列を含む。更に別の場合では、ゲノム領域、遺伝子またはその転写物は真核または原核病原体、たとえば、これらに制限するものではないが、プラスモディウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、プラスモディウム・マラリエ（Plasmodium malarie）、プラスモディウム・オバレ（Plasmodium ovale）、スキストソーマ（Schistosoma）種、およびマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tubelculosis）からのものであってよい。
本発明の修飾オリゴヌクレオチドに加えて提供される副作用の少ない遺伝子発現を抑制する組成物は、所望により、公知の医療上許容される担体または希釈剤を含んでいてもよい。この組成物はさらに１以上の追加の本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。別態様として、この組成物は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオチド等の慣例的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの１以上を含んでいてもよく、また他の薬理活性剤を含んでいてもよい。
この観点から好ましい態様では、修飾ＣｐＧジヌクレオチドは、アルキルホスホネートＣｐＧ、インバーテッドＣｐＧ、５−メチルシトシンＣｐＧ、２’−Ｏ−置換ＣｐＧ、立体特異的ホスホロチオエートＣｐＧ、ホスホトリエステルＣｐＧ、ホスホルアミデートＣｐＧおよび２’−５’ＣｐＧから選ばれる。
アルキルホスホネートＣｐＧは、そのＣヌクレオシドとＧヌクレオシドとがアルキルホスホネートインターヌクレオシド結合を介して互いに共有結合したＣｐＧジヌクレオシドである。アルキルホスホネートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネートＣｐＧジヌクレオシドを、アルキルホスホネートインターヌクレオシド結合のオリゴヌクレオチドへの標準的な導入方法によって製造する以外は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて有利に製造される。
この工程のとくに好ましい一つの方法はアイエルらの文献〔Iyer et al, Bio organic and Medicinal Chemistry Letters ６：１３９３−１３９８（１９９６）〕に記載されている。好ましくは、アルキルホスホネート結合のアルキル部分は炭素数１〜６の低級アルキル基で、それらは任意に置換されていなくてもよいし、および／または置換されていてもよい。最も好ましいアルキルホスホネートＣｐＧはメチルホスホネートＣｐＧである。
インバーテッドＣｐＧは５’−ＧｐＣ−３’ジヌクレオシドである。インバーテッドＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ＧモノマーシントンをＣモノマーシントンの代りに（およびその逆）用いる以外は、オリゴヌクレオチド製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて製造される。
５−メチルＣ ＣｐＧは、そのＣヌクレオシドがシトシン塩基の５位でメチル化されたＣｐＧジヌクレオシドである。５−メチルＣ ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、５−メチルＣモノマーシントンをＣモノマーシントンの代りに用いる以外は、オリゴヌクレオチド製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて製造される。
２’−Ｏ−置換ＣｐＧは、ペントース部分の２’位が置換され、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基を有し、該アルキル、アリールまたはアリル基は非置換でもよく、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシまたはアミノで置換されていてもよく、またはヒドロキシ、アミノまたはハロゲン置換されていてもよいが２’−Ｈ基では置換されていてはならない。
最も好ましい２’−Ｏ−置換ＣｐＧは、２’−Ｏ−メチルシトシン含有ＣｐＧまたは２’−Ｏ−メチルグアノシン含有ＣｐＧまたは両者である。２’−Ｏ−置換ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−置換モノマーシントンをモノマーシントンの代りに用いる以外は、オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて製造される。
ホスホトリエステルＣｐＧは、そのＣヌクレオシドおよびＧヌクレオシドがホスホトリエステルインターヌクレオシド結合を介して互いに共有結合したＣｐＧジヌクレオシドである。ホスホトリエステルＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステルＣｐＧジヌクレオシドを、ホスホトリエステルインターヌクレオシド結合のオリゴヌクレオチドへの標準的な導入方法によって製造する以外は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて有利に製造される。この工程のとくに好ましい方法はアイエルらの文献〔Iyer et al, Tetrahedron Letters ３７：１５３９−１５４２（１９９６）〕に記載されている。好ましいホスホトリエステル結合はメチルホスホトリエステル結合である。
ホスホルアミデートＣｐＧは、そのＣヌクレオシドとＧヌクレオシドとがホスホルアミデートインターヌクレオシド結合を介して互いに共有結合したＣｐＧジヌクレオシドである。ホスホルアミデートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートＣｐＧジヌクレオシドを、ホスホルアミデートインターヌクレオシド結合のオリゴヌクレオチドへの標準的な導入方法によって製造する以外は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて有利に製造される。この工程のとくに好ましい方法はアイエルらの文献〔Iyer et al, Tetrahedron Letters ３７：１５３９−１５４２（１９９６）〕に記載されている。最も好ましいホスホルアミデート結合は第１級ホスホルアミデートインターヌクレオシド結合である。
立体特異的ホスホロチオエートＣｐＧは、そのＣヌクレオシドとＧヌクレオシドとが立体特異的ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を介して互いに共有結合したＣｐＧジヌクレオシドである。立体特異的ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートＣｐＧジヌクレオシドを、立体特異的ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のオリゴヌクレオチドへの標準的な導入方法によって製造する以外は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコールを用いて有利に製造される。好ましくはアイエルらの文献〔Iyer et al, Tetrahedron Asymmetry ６：１０５１−１０５４（１９９５）〕に記載されている方法である。
２’−５’ＣｐＧは、そのＣヌクレオシドとＧヌクレオシドとが２’−５’インターヌクレオシド結合を介して互いに共有結合したＣｐＧジヌクレオシドである。２’−５’ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、２’−５’ＣｐＧジヌクレオシドを、立体特異的ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のオリゴヌクレオチドへの導入方法によって製造する以外は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの製造に通常用いられる固相合成プロトコール、例えば、ダファティらの文献〔Dougherty et al, J. Am. Chem. Soc. １１４：６２５４（１９９２）〕またはハシモトおよびスウイッツァーの文献に記載の方法、を用いて有利に製造される。
ＣｐＧジヌクレオシドの他の修飾は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を、これらに限られるものではないがホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンインターヌクレオシド結合等を含む、他のインターヌクレオシド結合で置き換える場合が含まれる。
この観点から本発明の組成物の好ましい態様では、そのオリゴヌクレオチドは、「キメラ」または「ハイブリッド」オリゴヌクレオチドとして構成されるもので、例えば、それぞれ、米国特許第５１４９７９７号およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２４９８号に記載される。概略説明すれば、キメラオリゴヌクレオチドは、イオン性インターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチド領域および非イオン性インターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチド領域を含有する。ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ含有オリゴヌクレオチド領域およびＲＮＡまたは２’−Ｏ−置換ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチド領域を有する。当該技術分野の習熟者ならば、これらの好ましい態様の要素を組合せることもでき、また、発明者がそれらの組合せも意図していることは容易に理解し得るであろう。例えば、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド領域は非イオンインターヌクレオシド結合の１部または全部を含んでいてもよい。別態様では、非イオン領域は２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドの１部または全部を有していてもよい。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート含有ＤＮＡ領域によりフランキングされたオリゴヌクレオチドのコア領域に２’−Ｏ−置換または非イオン領域を含有する、またはその逆でもよく、また、さらに、１以上の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域および１以上の非イオン領域の組合せであって、その一方または双方がホスホロチオエート領域によりフランキングされているものを含有してもよい〔その合成技術はNucleosides & Nucleotides １４：１０３１−１０３５（１９９５）を参照〕。
本発明の第二は、副作用を減じて哺乳動物において遺伝子発現を調節する方法を提供するものである。この観点による本発明方法では、第一の発明による組成物を哺乳動物に投与するものであって、その場合、オリゴヌクレオチドは哺乳動物で発現される遺伝子に相補的である。好ましくは、投与は非経口、経口、経鼻腔または直腸内投与にて行なわれる。オリゴヌクレオチドの総投与量は、好ましくは、約０．１mgオリゴヌクレオチド／kg／日から約２００mgオリゴヌクレオチド／kg／日の範囲である。好ましい態様では、該組成物の投与により、脾腫および血少板減少の生物学的作用が、修飾ＣｐＧジヌクレオシドの代りに非修飾ジヌクレオシドを含む以外は同じであるオリゴヌクレオチドの同量を含む他の組成物を投与した場合の同作用に比べて、減少する。この好ましい生物学的効果はオリゴヌクレオチド投与前後の血小板の血中濃度を測定することによりモニターし得る。好ましくは、血小板は約２０％以下、より好ましくは約１０％以下で枯渇しうる。その生物学的効果は、オリゴヌクレオチド投与後の血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および血清アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）濃度を測定することによっても観察し得る。好ましくは、血清ＡＬＴおよびＡＳＴを２．５倍以下、最も好ましくは２．０倍以下まで増加し得る。
第三の発明態様では、本発明は、副作用を抑えて、遺伝子発現異常に起因する疾病の治療方法を提供するものであり、該疾病を有する患者に本発明の第一の発明の組成物を投与することからなり、その場合、該オリゴヌクレオチドは異常に発現される遺伝子に相補的である。このように、これは、上記第二の発明の哺乳動物における遺伝子発現を調節する方法の好ましい例に相当する。本明細書では、遺伝子発現異常とは、宿主生物における、ウイルスや原核または真核病原体の増殖に必要な遺伝子の発現、または宿主細胞遺伝子の不適当な発現を意味する。不適当な宿主細胞遺伝子の発現は、細胞遺伝子の変異アレルの発現、または細胞遺伝子の正常アレルの発現不足または過剰発現を含み、それら不適当な宿主細胞遺伝子の発現により疾病が引き起される。好ましい投与方法は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、経鼻または直腸内投与である。治療用組成物の投与は、公知の投与方法により疾病の症状または代用マーカーの減少をもたらす有効期間行う。全身的投与する場合は、治療用組成物は、オリゴヌクレオチドの血中濃度が約０．０１μモル〜約１０μモルに達するに充分な量で投与するのが好ましい。局所投与の場合は、この濃度より相当低い濃度で有効であり、より高い濃度でも耐えられる。好ましくは、オリゴヌクレオチドの総用量が約０．１mgオリゴヌクレオチド／患者／日〜約２００mgオリゴヌクレオチド／体重kg／日である。本発明の治療用組成物の１種または２種以上の治療有効量を、単一治療当り、個体に同時にまたは順次に投与するのが好ましい。好ましい態様では、組成物を投与したのち、脾腫、血小板減少の生物学的効果が、修飾ＣｐＧジヌクレオシドの代りに非修飾ＣｐＧジヌクレオシドを含む以外は同じであるオリゴヌクレオチドの同量を含有する組成物を投与した場合に得られる効果に比べて減少する。この好ましい生物学的効果は、オリゴヌクレオチド投与前後の血小板血中濃度を測ることによりモニターできる。好ましくは、血小板は約２０％以下、より好ましくは約１０％以下で枯渇しうる。その好ましい生物学的効果は、オリゴヌクレオチド投与後の血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および血清アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）濃度を測定することによっても観察し得る。好ましくは、血清ＡＬＴおよびＡＳＴを２．５倍以下、最も好ましくは２．０倍以下まで増加し得る。
以下の実施例は本発明のある種の好ましい態様をさらに説明するためのものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
オリゴヌクレオチドの合成、脱保護および精製
β−シアノエチルホスホルアミダイト法を用いた自動ＤＮＡ合成機（モデル８７００、バイオサーチ（Biosearch）、ベッドフォード、マサチューセッツ）を用いてオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを１０マイクロモルスケールで合成した。ホスホロチオエート結合を生成させるため、各カップリングの後に得られた中間体のホスファイト結合を３Ｈ,１,２−ベンゾジチオール−３Ｈ−オン−１,１−ジオキシド（ボーケージ（Beaucage）、Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, アグラワル（Agrawal）（編）、ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、３３〜６２頁（１９９３）を参照）を用いて酸化した。ホスホジエステル結合を生成させるために同様の合成を行ったが、標準ヨウ素試薬を用いて標準酸化を行った。メチルホスホネートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの合成も同様の仕方で行ったが、メチルホスホネート結合の組み立てはヌクレオシドメチルホスホルアミダイト（グレン・リサーチ（Glen Research）、スターリング、バージニア）を用い、ついでテトラヒドロフラン／２,６−ルチジン／水（７５：２５：０.２５）中の０.１Ｍヨウ素で酸化することにより行った（アグラワル＆グッドチャイルド（Goodchild）、Tet. Let. ２８：３５３９〜３５４２（１９８７）参照）。オリゴヌクレオチドの脱保護および精製は、メチルホスホネート含有領域を含むオリゴヌクレオチド以外は標準法に従った（パドマプリヤ（Padmapriya）ら、Antisense Res. & Dev. ４：１８５〜１９９（１９９４））。これらオリゴヌクレオチドについては、ＣＰＧ−結合オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウムで室温にて１時間処理し、上澄み液を除去し、蒸発させて薄黄色の残さを得、ついでこれをエチレンジアミン／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）で室温にて６時間処理し、再び減圧下で乾燥させた。
実施例２
修飾ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドを用いて減少したインビボ脾腫
ＣＤ−１マウスおよびフィッシャーラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）、レイレイ、ノースカロライナ）に、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−置換ＣｐＧ、または対照としての食塩水を３〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で静脈内に毎日、７日間注射した。８日目に動物を安楽死させ、脾臓を取りだし、重さを計量した。メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、または２−Ｏ−置換ＣｐＧで処理した動物は、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した動物に比べて脾臓重量の増大が有意に小さかった。同様の結果は、ホスホトリエステルＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホルアミデートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび２’−５’ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについても観察されることが期待される。
実施例３
修飾ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドを用いて減少したインビボ血小板枯渇
ＣＤ−１マウスおよびフィッシャーラットに、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−置換ＣｐＧ、または対照としての食塩水を３〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で静脈内に毎日、７日間注射した。８日目に動物から採血し、血小板数をカウントした。メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、または５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した動物は、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した動物に比べて血小板の枯渇が有意に小さかった。同様の結果は、ホスホトリエステルＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホルアミデートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび２’−５’ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについても観察されることが期待される。
実施例４
修飾ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドを用いて減少した血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルのインビボ上昇
ＣＤ−１マウスおよびフィッシャーラットに、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−置換ＣｐＧ、または対照としての食塩水を３〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で静脈内に毎日、７日間注射した。８日目に動物から採血し、ロシュ・コバ・ファラ・ケミストリー・アナライザー（Roche Cobas Fara Chemistry Analyzer）（ロシュ・ダイアグノスティック・システムズ（Roche Diagnostic Systems）、ブランチバーグ、ニュージャージー）を用いて血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルを測定した。メチルホスホネートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、インバーテッドＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、５−メチルＣ ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−置換ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した動物は、ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した動物に比べて血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルの上昇が有意に小さかった。同様の結果は、ホスホトリエステルＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホルアミデートＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび２’−５’ＣｐＧ−含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについても観察されることが期待される。
【図１】
0005265067.tif 000002
【図２】
0005265067.tif 000003
【図３】
0005265067.tif 000004