(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディファレンシャルディスプレー法において、
(1)ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡの３’末端に、既知の塩基配列からなるアンカーオリゴマー（オリゴｄＡを除く）を結合させる工程；
(2)上記アンカーオリゴマーが結合したｃＤＮＡを鋳型として、アンカーオリゴマーに相補的配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行って２本鎖ＤＮＡを調製する工程；
(3)上記２本鎖ＤＮＡ、アンカーオリゴマーに相補的配列を有するプライマー及び任意プライマーを用いてＰＣＲを行って増幅させる工程；及び
(4)ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で展開する工程；
からなることを特徴とする5’領域ディファレンシャルディスプレー法。
【請求項２】
ＲＮＡがｍＲＮＡである請求項１記載の5’領域ディファレンシャルディスプレー法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はディファレンシャルディスプレーに関する。より詳細には、擬陽性バンドが少なく、特にｍＲＮＡの５’領域（翻訳領域）ないし５’領域〜３’領域の広範囲の表示が可能であるディファレンシャルディスプレー法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、特異的発現バターンや発現量の差を指標とするＤＮＡクローニング法は分子生物学の研究で汎用されている手法である。ディファレンシャルディスプレー法とは、組織特異的な発現パターンを示す又は転写量に差のある遺伝子群を、ＰＣＲを用いてクローニングする方法の一種である。より具体的には、比較する２種類以上の細胞からｍＲＮＡを抽出し、これらのｍＲＮＡのポリ（Ａ）鎖の部分でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（アンカープライマー）と逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換する。なお、アンカープライマーは、通常のオリゴｄＴプライマーではなく、その３’末端に余分な塩基を付加したプライマー、即ちオリゴｄＴＸ（ＸはＧ、Ａ又はＣ）が使用される。次いで、前記のアンカープライマーと任意の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド群をプライマーとしてＰＣＲを行い、アンカープライマーと任意の塩基配列を持つプライマーで挟まれた複数のｃＤＮＡ断片を同時に増幅し、反応産物をゲル電気泳動で展開して、特異的泳動パターン又は強度に変化のあるバンドを検出することからなる（例えば、非特許文献１及び２参照）。
係るディファレンシャルディスプレー法は、多数の試料をゲル上で同時に比較できる；検出感度が高い；必要なｍＲＮＡ量が少ないなどの利点を有しており、新規遺伝子の検出、外的要因による遺伝子発現の変化などの研究に広く利用されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
【非特許文献１】遺伝子工学キーワードブック改訂第２版「ディファレンシャルディスプレイ」の項（緒方ら著、羊土社発行）
【非特許文献２】S. Cavallaro et.al. (1997) vol.94,pp.9669-9673. Proc. Natl. Acad.Sci. USA
【特許文献１】特開平９−２２４６７１号公報
【特許文献２】特開２００１−２９２７９９公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、従来のディファレンシャルディスプレー法は遺伝子分析の方法として極めて有用であるが、得られるＤＮＡ断片はｍＲＮＡの３’末端非翻訳領域が主体であり、当該領域は基本的に生物学的情報に乏しいという原理的な問題がある。また、感度が高いため、擬陽性バンドが出やすいという欠点がある。
このような問題点から、本発明者は、主に翻訳領域を含んだ５’領域を表示できるディファレンシャルディスプレー法について種々検討したところ、ｍＲＮＡから逆転写酵素反応により生成したｃＤＮＡの３’末端にアンカーオリゴマーを付加することにより、上記の問題が解消し得ることを見出して本発明を完成した。
本発明は係る知見に基づくものであり、ｍＲＮＡの５’領域（翻訳領域）の表示が可能であるディファレンシャルディスプレー法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、ディファレンシャルディスプレー法において、
(1)ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡ（以下、第１鎖ｃＤＮＡという）の３’末端に、既知の塩基配列からなるアンカーオリゴマー（以下、ＡＯという）を結合させる工程；
(2)上記アンカーオリゴマーが結合したｃＤＮＡを鋳型として、ＡＯに相補的配列（以下、ｃＡＯという）を有するプライマー（以下、ｃＡＯプライマーという）又は当該ｃＡＯプライマーの５’末端に塩基配列が付加したプライマーを用いてＰＣＲを行って２本鎖ＤＮＡを調製する工程；
(3)上記２本鎖ＤＮＡ、ｃＡＯプライマー又は当該ｃＡＯプライマーの５’末端に付加した塩基配列（以下、付加塩基配列という）からなるプライマー、及び任意プライマーを用いてＰＣＲを行って増幅させる工程；及び
(4)ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で展開する工程；
からなる５’領域ディファレンシャルディスプレー法であり、ＲＮＡとしてはｍＲＮＡが好適に使用される。また、アンカーオリゴマーとしては、オリゴｄＡが好適に使用される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の５’領域ディファレンシャルディスプレー法においては、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端にＡＯを結合させており、ｃＡＯプライマーなどのプライマーを用いることにより、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端（即ち、ｍＲＮＡの５’末端側）の配列ないし第１鎖ｃＤＮＡの３’末端〜５’末端を効果的に増幅させることが可能となり、多くの生物学的情報を取得することができる。また、当該ＡＯを用いることにより、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端側からの伸展はｃＡＯプライマーなどのプライマーから開始されるので、擬陽性バンドの出現を減少させることができる。
従って、本発明の方法によれば、従来のディファレンシャルディスプレー法では得られなかったような生物学的情報が高精度で得ることができるという格別な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
前記の工程からなる本発明において、第１工程は、ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡ（第１鎖ｃＤＮＡ）の３’末端に、既知の塩基配列からなるＡＯを結合させる工程である。
この工程において、第１鎖ｃＤＮＡは、従来のディファレンシャルディスプレー法と同様にして調製される。より具体的には、試験対象である生体組織・臓器などの細胞から、グアニジン・チオシアネート法、ＡＧＰＣ法などの常法に準じて全ＲＮＡ（又はｍＲＮＡ）を抽出する。抽出したｍＲＮＡを鋳型として、従来のディファレンシャルディスプレー法と同様に、オリゴｄＴＸ（Ｘは前記と同じ）、オリゴｄＴＶＸ（ＶはＧ、Ａ、Ｃが混合されていることを意味し、Ｘは前記と同じ）などの慣用のアンカープライマー、基質（ｄＮＴＰｓ）及び逆転写酵素(例えば、Super script II、MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptaseなど)を用いて、逆転写反応を行い、ついでアルカリ分解法などの常法に準じてＲＮＡを分解することにより、第１鎖ｃＤＮＡを調製することができる。なお、上記の試薬などに関しては、ディファレンシャルディスプレー法キットが既に市販されており、その試薬を使用し、マニュアルに準じて行うことができる。
また、上記のアンカープライマーを使用した場合には、ｍＲＮＡの３’末端のポリＡから逆転写された第１鎖ｃＤＮＡが生成するが、上記のアンカープライマーに代えてランダムプライマーを使用することにより、ｍＲＮＡの３’末端以外の個所からの逆転写を開始することができ、このような態様も本願発明に包含される。ランダムプライマーは既に市販されており、係る市販ランダムプライマーを使用することができる。
【０００８】
上記で調製された第１鎖ｃＤＮＡは、その３’末端にＡＯを結合させる。ＡＯの塩基配列は特に限定されず、配列が分かっている限り任意である。例えば、予め設計された塩基配列のＤＮＡであってもよく、同じ塩基が順次結合したオリゴｄＮ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）などであってもよい。当該オリゴｄＮとしては、オリゴｄＡが好ましい。即ち、後記の工程で、ｃＡＯプライマーが使用されるが、ＡＯがオリゴｄＡであると、ｃＡＯプライマーとしてオリゴｄＴプライマーが使用され、オリゴｄＴプライマーは既に種々市販されているので、市販品を使用できるという利点がある。
【０００９】
ＡＯの塩基数は特に限定されないが、通常１０〜５０塩基数、好ましくは２０〜４０塩基数、より好ましくは３０塩基数からなる配列が使用される。
上記第１鎖ｃＤＮＡとＡＯの結合は、常法に準じて、予め調製された塩基配列からなるＡＯを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーションにより行うことができる。また、第1鎖の３’末端に、オリゴｄＮを付加させる場合も常法に準じて行うことができ、例えば、オリゴｄＡを付加させる場合には、ｄＡＴＰの存在下、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)によって第1鎖の３’末端にｄＡテールを付加することができる。
【００１０】
本発明の第２工程は、上記で調製されたＡＯの結合した第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ｃＡＯプライマー又は当該ｃＡＯプライマーの５’末端に付加塩基配列を有するプライマー、基質及びTaq DNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、２本鎖ＤＮＡを調製する工程である。上記のプライマーのｃＡＯ部分は、ＡＯの全領域に相補的な配列であってもよく、またＡＯの一部に相補的な配列であってもよい。
上記のＰＣＲは常法に準じて行うことができ、反応時間・反応温度は適宜調整することができ、Taq DNAポリメラーゼも慣用の市販酵素（例えば、Gene Taq、TaKaRa Taqなど）を使用することができる。
【００１１】
本発明の第３工程は、上記で調製された２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ｃＡＯプライマー又は付加塩基配列からなるプライマー、任意プライマー、基質及びTaq DNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させる工程である。任意プライマーとしては、５〜３０塩基数、好ましくは１０〜２０塩基数のプライマーが使用される。
上記のＰＣＲは常法に準じて行うことができ、反応時間、反応温度、サイクル数などは適宜調整することができ、Taq DNAポリメラーゼも慣用の酵素を使用することができる。
【００１２】
なお、上記の付加塩基配列からなるプライマーを使用した場合について説明する。上記第２工程で、ｃＡＯプライマーの５’末端に付加塩基配列を有するプライマーを使用して２本鎖ＤＮＡを調製すると、その一方のＤＮＡは５’末端に付加塩基配列及びｃＡＯプライマーが付加したＤＮＡとなる。このＤＮＡにハイブリダイズした任意プライマーからのＤＮＡの伸長は、ｃＡＯプライマーを超えて付加配列塩基で終了する。即ち、３’末端に付加塩基配列と相補的配列を有するＤＮＡが生成することになる。従って、それ以後、付加塩基配列からなるプライマーと任意プライマーでＰＣＲが進行することになる。
上記の付加塩基配列からなるプライマーとしては、５〜３０塩基数、好ましくは１０〜２０塩基数のプライマーが使用される。
【００１３】
上記のＰＣＲで産生したＰＣＲ産物は、ｃＡＯプライマー又は付加塩基配列からなるプライマーと、使用された任意プライマーとで挟まれたＤＮＡ断片の混合物である。本発明の第４工程は、このＰＣＲ産物をゲル電気泳動に付して展開する工程である。
ゲル電気泳動のゲルとしては、寒天ゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルなどの慣用のゲルを使用すればよい。またゲル電気泳動は常法に準じて行うことができ、泳動終了後、慣用の染色剤によりＤＮＡを染色してバンドを検出する。
上記のゲル電気泳動に際して、使用するゲルに核酸染色剤を添加しておいてもよく、係る核酸染色剤を使用することにより、ＤＮＡ断片を簡便に検出することができる。当該核酸染色剤としては、例えば、SYBR Gold（商品名）などの蛍光染色剤が挙げられる。
なお、前記のＡＯ、ｃＡＯプライマー、任意プライマーなどを標識化しておいてもよく、係る標識としては、例えば、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣなど）、放射性標識（例えば、３２Ｐなど）などが挙げられるが、簡便性の観点から蛍光標識が好ましい。
【００１４】
ゲル電気泳動で展開されたＤＮＡ断片は、蛍光写真などで撮影して、フィンガープリンティング化する。そして、2種以上の試験細胞からのフィンガープリンティングを比較することにより、組織特異的な発現パターンを示す又は転写量に差のある遺伝子群を検出することができる。
検出された遺伝子は、バンドを切り出し、常法に準じてサブクローニング、塩基配列の解析を行うことにより、塩基配列を決定することができる。
【００１５】
本発明の５’領域ディファレンシャルディスプレー法は、特異的発現バターンや発現量の差を指標とするＤＮＡクローニングとして分子生物学の研究などで有用であり、例えば外的要因（例えば、薬物や化学物質によるストレス、反復学習などによる脳の刺激、疾病など）を受けている生体の遺伝子発現状態を、外的要因を受けていない生体の遺伝子発現状態と比較することにより、外的要因により発現する遺伝子を同定することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、比較例及び実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
水迷路学習したマウスとコントロールマウスにおける脳の遺伝子発現状態の変化
４時間の水迷路学習したマウスとコントロールマウスにおける脳の海馬の遺伝子発現を比較した。水迷路学習したマウスの調製は前掲の非特許文献２に記載の方法に準じて行った。
まず、水迷路学習したマウス（以下、Ｗという）とコントロールマウス（以下、Ｃという）の脳の海馬からＡＧＰＣ法で全ＲＮＡをそれぞれ抽出し精製した。
上記で採取されたＲＮＡ、アンカープライマー(GT15V)、基質(4xdNTPs)及び転写酵素(Super script II)を用いて４２℃、５０分間反応させ、一本鎖ｃＤＮＡ（第１鎖ｃＤＮＡ）を作製する。アルカリ分解法を用いて、ｃＤＮＡとハイブリッド形成しているｍＲＮＡを分解した後、スピンカラムを用いて、脱塩と未反応のアンカープライマー及びＲＮＡ分解物を除去した。
【００１８】
精製した一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に、配列番号１で示される塩基配列からなるＡＯをT4 RNA ligaseを用いて、１５℃で一夜反応させ結合した。反応終了後、スピンカラムを用いて、未反応ＡＯを除去した。
ＡＯが結合した一本鎖ｃＤＮＡ、ｃＡＯプライマーとして配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー、基質(4xdNTPs)、Taq DNAポリメラーゼ(Gene Taq)を用いて、一回目のＰＣＲ（94℃１分、50℃3分、72℃1分）を行い、２本鎖ＤＮＡを調製した。続いて、任意プライマーとしてB13、B14、B16（それぞれ配列番号３〜５）を加えて、二回目のＰＣＲ（94℃18秒、45℃2分、72℃1分を40回）を行った。
配列番号１：5'agcatcgagtcggccttgttggcctactgg3’
配列番号２：5'caaggccgactcgatgct3'
配列番号３：5'ttcccccgca3'  (B13)
配列番号４：5'tccgctctgg3'  (B14)
配列番号５：5'tttgcccgga3'  (B16)
【００１９】
上記のＰＣＲ産物を、10000倍希釈したSYBR Goldを添加した２％ 寒天ゲルのウエルに入れて、130 V、30Aで３時間電気泳動した。紫外線ランプ（300nm)下で蛍光写真を撮影した。その結果を図１に示す。
【００２０】
図1に示されるように、Ｂ１３のＷにおいて、約350 bpのＤＮＡバンドが新たに現れ、Ｂ１４のＷにおいて、約400 bpと500 bpのＤＮＡバンドが新たに現れ、Ｂ１６のＷにおいて、約650 bpのＤＮＡバンドが新たに現れることが判明した。
【００２１】
実施例２
マウス海馬の発達段階固有の遺伝子発現
生後１週令と４週令のマウスの海馬から全ＲＮＡを抽出し、さらにｍＲＮＡを精製した。
各ｍＲＮＡ、ランダムプライマー（タカラバイオ社製）、基質4xdNTPsと逆転写酵素（Super script II）を用いて、２５℃で１０分間、そして４２℃で５０分間反応させ、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。リボヌクレアーゼ Hを用いて、ｃＤＮＡとハイブリッド形成しているｍＲＮＡを分解した。スピンカラムを用いて、酵素、未反応のプライマー、基質、ＲＮＡ分解物を除去した。
次いで、ｄＡＴＰ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)によって３７℃、１５分間反応させ、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端にｄＡテールを付加し、８０℃、３分間加熱してTdTを失活させた。
ｄＡテールを結合した第１鎖ｃＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列付加オリゴdTプライマー、配列番号７で示される当該付加塩基配列からなるプライマー、4xdNTPs、Taq DNAポリメラーゼを用いて、一回目のＰＣＲ（94℃１分、45℃3分、72℃1分）を行い、二本鎖ｃＤＮＡを作製した。配列番号８で示される任意プライマーB10又は配列番号９で示される任意プライマーB17を加えて、ＰＣＲ（ 94℃18秒、45℃2分、72℃1分を40回）を行った。
【００２２】
配列番号６：5'gactcgattcgacatcga(t)153'
配列番号７：5'gactcgattcgacatcg3’
配列番号８：5'ctgctgggac3’  (B10)
配列番号９：5'agggaacgag3’  (B17)
【００２３】
上記のＰＣＲ産物を、10000倍希釈したSYBR Goldを添加した２％ 寒天ゲルのウエルに入れて、130 V、30Aで３時間電気泳動した。紫外線ランプ（300nm)下で蛍光写真を撮影した。その結果を図２に示す。
図２に示されるように、経時的にバンドの変化が認められた。
【００２４】
なお、配列番号６及び７で示されるプライマーに代えて、ＧＴ１５Ｘ（Ｘ＝Ａ，Ｃ，Ｇ）を用いても同様にＰＣＲを行うことができた。
【００２５】
実施例３
マウス脳の各部位固有の遺伝子発現
マウスの大脳、小脳、海馬のそれぞれから全ＲＮＡを抽出した。各ｍＲＮＡ、GT15Xプライマー、基質4xdNTPsと逆転写酵素（Super script II）を用いて、４２℃で５０分間反応させ、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。リボヌクレアーゼ Hを用いて、ｃＤＮＡとハイブリッド形成しているｍＲＮＡを分解した。スピンカラムを用いて、酵素、未反応のプライマー、基質、ＲＮＡ分解物を除去した。
次いで、ｄＡＴＰ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)によって３７℃、１５分間反応させ、第１鎖の３’末端にｄＡテールを付加した。８０℃、３分間加熱してTdTを失活させた。
ｄＡテールを結合した第1鎖ｃＤＮＡ、4xdNTPs、前記配列番号６で示される塩基配列からなるプライマー、Taq DNAポリメラーゼを用いて、一回目のＰＣＲ（94℃１分、40℃/45℃3分、72℃1分）を行い、二本鎖ＤＮＡを作製した。前記配列番号８で示される塩基配列からなる任意プライマー(B10)と前記配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーを加えて、ＰＣＲ（94℃18秒、40℃/45℃2分、72℃1分を35回）を行った。
なお、上記の方法においては、第１鎖ｃＤＮＡの５’末端にオリゴｄＴが結合しているので、それから得られる２本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡの３’末端にはオリゴｄＡが付加していることになる。従って、上記の２本鎖ＤＮＡからのＰＣＲにおいては、当該３’末端のｄＡからの増幅も合わせて起り、その結果、当初ｍＲＮＡの３’末端をも調べることができる。
【００２６】
上記のＰＣＲ産物を、10000倍希釈したSYBR Goldを添加した２％ 寒天ゲルのウエルに入れて、130 V、30Aで３時間電気泳動した。紫外線ランプ（300nm)下で蛍光写真を撮影した。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、脳の部位によりバンドの変化が認められた。
【００２７】
なお、配列番号６及び７で示されるプライマーに代えて、ＧＴ１５Ｘ（Ｘ＝Ａ，Ｃ，Ｇ）を用いても同様にＰＣＲを行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】水迷路学習したマウス（Ｗ）及びコンロールマウス（Ｃ）の海馬のｍＲＮＡについて、本発明の５’領域ディファレンシャルディスプレーを行った結果を示す電気泳動写真である。なお、図中、ＭＷはＤＮＡサイズマーカー、Ｂ１３、Ｂ１４及びＢ１６はそれぞれ配列番号３〜５に示される任意プライマーである。
【図２】マウス海馬の発達段階固有の遺伝子発現について、本発明の５’領域ディファレンシャルディスプレーを行った結果を示す電気泳動写真である。なお、図中、ＭはＤＮＡサイズマーカー、Ｂ１０及びＢ１７はそれぞれ配列番号８及び９に示される任意プライマーである。
【図３】マウス脳の各部位固有の遺伝子発現について、本発明の５’領域ディファレンシャルディスプレーを行った結果を示す電気泳動写真である。なお、図中、ＭはＤＮＡサイズマーカー、Ｂ１０は配列番号８に示される任意プライマーである。
【図１】
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【図２】
0005322141.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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