(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内生検手術において、生物学的対象となる分子の接触によるサンプリングのためのマイクロテクノロジーサンプリング装置（６）であって、
第二の面（１６）の反対側に設けられた平面状の第一の面（１４）と、前記第一の面（１４）に設けられた少なくとも１つの第一キャプチャーゾーン（１０）とを有する、マイクロテクノロジー基板の支持体（１２）と、
操作ロッドと、
生検を受ける組織へのサンプリング装置の通路を規定するガイドスリーブ（２）と、を備え、
前記第一キャプチャーゾーンの展開表面積（Ｓ）は少なくともその表面（ｓ）の三倍以上であり、
前記支持体は、前記操作ロッドの一端に配置され、サンプリングが前記第一キャプチャーゾーンにより行われ、
前記操作ロッドは、前記ガイドスリーブ内で摺動可能であり、
前記ガイドスリーブの直径は、前記操作ロッドの直径に略等しいことを特徴とするマイクロテクノロジーサンプリング装置（６）。
【請求項２】
前記操作ロッドは、前記マイクロテクノロジー基板と平行に延びることを特徴とする請求項１に記載の装置。  
【請求項３】
前記ガイドスリーブは閉じられた先端を有することを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記ガイドスリーブは、前記キャプチャーゾーンが周囲媒体に接触して配置されることを可能にする窓を備えることを特徴とする請求項２または３に記載の装置。
【請求項５】
前記第二面（１６）に設けられた少なくとも1つの第二キャプチャーゾーン（２０）をさらに備え、
前記第二キャプチャーゾーン（２０）の展開表面積は、その表面より大きいことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の装置。
【請求項６】
前記第二キャプチャーゾーン（２０）の展開表面積は、その表面の三倍以上であることを特徴とする、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
第一インターバルゾーン（１８）によって分離された前記第一面（１４）に設けられた複数の第一キャプチャーゾーン（１０ａ〜１０ｄ）を備えることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１つに記載の装置。
【請求項８】
第二インターバルゾーン（３４）によって分離された前記第二面（１６）に設けられた複数の第二キャプチャーゾーンを備え、
第一ゾーンのそれぞれは、１つの第二ゾーンの反対側に設けられることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記第一および第二インターバルゾーン（１８、３４）に設けられた前記キャプチャーゾーンを分離する分離手段（４２、４４、４６）を備えることを特徴とする、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１０】
前記分離手段は、前記第一および／または第二面（１４、１６）に設けられた切り込みを備えていることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記キャプチャーゾーン（１０）は複数の突起（２４）を有する底壁（２２）を備えることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１２】
前記第１のキャプチャーゾンは突起を有し、前記突起（２４）の高さは１０μｍ〜４００μｍであり、前記突起（２４）の表面は３×３μｍ〜８０×８０μｍであることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１３】
前記第１のキャプチャゾーンは突起を有し、前記突起（２４）は幅が５０μｍ以下の空間（２６）によって分離されることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１４】
前記第１のキャプチャゾーンは突起を有し、前記突起（２４）は六角形または八角形の断面を有することを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１５】
前記第１キャプチャーゾンは、官能基化された底面（２２）および／または官能基化された突起（２４）を有することを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１６】
前記突起（２４）の間の空間（２６）に設けられたマイクロビーズ（２８）をさらに備えることを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１７】
少なくとも１つのキャプチャーゾーン（３０）はキャビティ（３２）と前記キャビティ（３２）に配置されたマイクロビーズ（２８）とを備えることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１８】
前記キャプチャーゾーン（１０、３０）内に設けられた前記マイクロビーズ（２８）を保持する膜（３６）を備えることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記マイクロビーズ（２８）は官能基化されることを特徴とする、請求項１６乃至１８のいずれか１つに記載の装置。
【請求項２０】
前記マイクロビーズ（２８）の官能基化は、多数のタンパク質および小数のタンパク質に特有の少なくとも二つの異なる配位子を備えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記官能基化は、シリル化官能基によって前記表面に固定された配位子の存在を備えることを特徴とする、請求項１５、１９、２０のいずれか１つに記載の装置。
【請求項２２】
組織（３）のマッピング方法であって、
組織内に請求項１乃至２１のいずれか１つに記載のマイクロテクノロジーの装置（６）を配置し、
前記装置は複数の層状キャプチャーゾーン（１０ａ−１０ｄ）を備え、１つのキャプチャーゾーン（１０）はその表面の三倍以上の展開表面積を有し、
前記組織（３）は前記キャプチャーゾーン（１０）と接触し、
サンプルを分析することを備えるマッピング方法。
【請求項２３】
前記層状キャプチャーゾーン（１０ａ−１０ｄ）を分離するように、前記装置（６）を区切ることを備える、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、侵襲性の臨床診断および／または追跡治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、接触によって生物学的に興味のある分子をサンプリングするための微細なサンプリング装置に関する。この装置では、アブレーションまたは生検（biopsy）を必要とせず、その構造は、それを挿入することによって周囲の組織を損傷しないように構成されている。本発明は、特にプロテオミクスまたはゲノミクスに適している。
【０００２】
本発明はまた、組織の異なる層のタンパク質構成を決定することを可能にする方法に関する。特に、この方法は腫瘍、例えば脳腫瘍のマッピングに適している。
【背景技術】
【０００３】
侵襲性を著しく低下させる外科手術と同様に、臨床診断および追跡治療技術は、様々なサンプリングおよび制御操作のために必要な手段の小型化に向かっている。
【０００４】
画像化の進展は、大きくこの発展に寄与してきた。特に、癌腫学、例えば二つのアプローチにより、癌腫瘍の検出限界は、同定および位置調整補助の方法を系統的に用いることによって外科手術支援において大きく改良されてきた。
【０００５】
同時に、ゲノムまたはプロテオームレベルでの分子生物学は著しく診断に関わりを持つようになってきた。ある場合には、例えばアナソモパソロジスト（anathomopathologist）の目を分子分析法によって置き換えることが構想され、生物マーカーを識別して特徴付けるためのプロテオミクスおよび関連する質量分析の分野において、多くの開発が行われている。
【０００６】
それにも関わらず、目標とする分子をサンプリングする方法は、依然として困難が伴うものであった。分子分析を行うために用いられる既存の手段は、全て生検の原理に基づいており、例えば、細胞または組織の全体をサンプリングし、次いで実験施設内で分析する。したがって、これらの技術は、生物的に完成されたものを悪化させる。さらに、特に脳のようないくつかの領域ではサンプリング装置の挿入が最小限にされなければならないので、それらは必ずしも用いられることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、その一態様において、既存のサンプリング装置の欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
分子インプリント（molecular imprint）は新しいアプローチである。これは、対象とする領域から組織を抽出し、そこにサンプリング手段を簡単に適用することによる。接触によって、関連づけられた適切な表面に、タンパク質のような多数の分子がこの手段に捕捉され、脱着され、実験施設内で分析され得る。
【０００９】
したがって、本発明は生物学的対象である分子をサンプリングするために接触のみを用いることを提案する。本発明の装置上に組織のインプリントが得られ、次いで、このように装置のキャプチャーゾーンに集められた分子を分析することができる。特に、通常、平面形状の装置はサイズが小さいので、本発明の装置のキャプチャーゾーンの展開表面積が増大される。これは、捕捉された分子の量が有効な分析を可能にするのに十分であることを意味する。
【００１０】
したがって、本発明のサンプリング装置は、少なくとも１つのキャプチャーゾーンを１つの面に有する支持体を備えている。キャプチャーゾーンは、その展開表面積が上方からみられるようにその表面の３倍以上大きくなっている。展開表面と突出面との間の面積の比は、２０およびそれ以上の因子に達し得る。
【００１１】
その用途については、本発明の装置は制限されたサイズからなり、特に“マイクロテクノロジー”的なサイズである。すなわち、その１ｍｍ×１ｍｍ以下の微視的な断面はマイクロテクノロジーの方法を用いて形成され得る。“マイクロテクノロジー”とは、特に本発明の装置の挿入断面が１ｍｍ２を越えず、好ましくは直径８００μｍのシリンダーに含まれるということを意味し、例えばそれは、３００〜６００μｍ×１００〜３００μｍのオーダーの平行６面体の断面を有する。
【００１２】
支持体は、第一面の反対側の面に他のキャプチャーゾーンを備えてもよい。
【００１３】
本発明の装置は、一方または両方の面にいくつかの層状のキャプチャーゾーンを備え、すなわち、好ましくは実質的に画定されたインターバルゾーンによって分離されることが有利である。したがって、装置が挿入された組織において異なる深さで存在する分子を分析することが可能である。
【００１４】
装置は、その異なるキャプチャーゾーンの間で分割されることが好ましい。例えば、支持体を部分的にエッチングすることによって得られる切り込みのような分離手段が、インターバルゾーンに存在する。
【００１５】
キャプチャーゾーンには、様々な実施形態が提供される。キャプチャーゾーンは、キャビティを画定する底壁を備えていてもよい。展開表面積を増加させるために、底壁は、半透膜によって適切な位置に保持されたマイクロビーズの土台としての役割を果たしても良く、および／または突起を有しても良い。
【００１６】
これらの突起を形成するために、例えば、マイクロテクノロジーによるシリコンエッチング技術、またはプラスチック成形品が用いられ得るが、３から５０μｍまたは８０μｍ、例えば５から２０μｍの側面と、１０から４００μｍ、例えば５０μｍ台の高さを有する、四角形、六角形、または八角形の角柱の組織立ったネットワークを形成するようになっている。
【００１７】
キャプチャーゾーンが官能基化されることが有利であり、すなわち支持体の壁面および／またはマイクロビーズが、対象とする分子にたいして親和性のある官能基を運ぶマーカーと関連づけられる。また、このマーカーは多数種の飽和のために用いられてもよく、この場合、多数種と少数種とに特有の配位子を有するビーズの使用が好ましい。
【００１８】
本発明の装置は、好ましくは操作ロッドおよびガイドスリーブと関連づけられ、分析されるべき組織内に正確に位置づけることができる。特に、スリーブは、装置が適切な位置に設けられた時にのみ、キャプチャーゾーンが周囲の媒体と接触して配置されることを可能にする手段を備えていても良い。
【００１９】
本発明の他の態様によると、本発明は、マッピングするか、または目標とする区域の深さに依存して分化分析を行うことを可能にする方法に関する。いくつかの層状のキャプチャーゾーンを有する装置は分析されるべき組織内に挿入され、接触サンプリングが行われ、異なるキャプチャーゾーンによってサンプリングされた分子が分離して分析される。
【００２０】
分析を実行するために、キャプチャーゾーンは、装置の分割断面を切断することによって互いに分離されるか、またはキャプチャーゾーンの支持体が測定装置において用いられても良い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態による接触サンプリングシステム。
【図２】本発明による装置のためのキャプチャーゾーンの一実施形態。
【図３Ａ】本発明による装置のキャプチャーゾーンの他の実施形態の断面。
【図３Ｂ】本発明による装置のキャプチャーゾーンの他の実施形態の断面。
【図４】本発明による装置のキャプチャーゾーンの他の実施形態。
【図５】装置の表面の官能基化。
【図６Ａ】ビーズを用いる異なるタイプの官能基化。
【図６Ｂ】ビーズを用いる異なるタイプの官能基化。
【図６Ｃ】ビーズを用いる異なるタイプの官能基化。
【図７Ａ】本発明による装置のキャプチャーゾーンを分離する手段の異なる実施形態。
【図７Ｂ】本発明による装置のキャプチャーゾーンを分離する手段の異なる実施形態。
【図７Ｃ】本発明による装置のキャプチャーゾーンを分離する手段の異なる実施形態。
【図７Ｄ】本発明による装置のキャプチャーゾーンを分離する手段の異なる実施形態。
【図７Ｅ】本発明による装置のキャプチャーゾーンを分離する手段の異なる実施形態。
【図８】マッピングのための本発明による装置の使用方法。
【図９】本発明による装置（Ｂ）および官能基化（Ａ）を用いた分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の特徴および効果は、説明するために与えられるがそれに限定されない添付の図面を参照して以下に記載される明細書によってより理解される。
【００２３】
分子の生化学、例えばゲノミクス、特にプロテオミクス、つまりタンパク質の構造の研究は、対象とされる、特に生物学的に対象とされる個々の成分の解析を可能にする。
【００２４】
従って、図１に示される本発明によるサンプリングシステム１は、ガイドスリーブ２、例えばカテーテルを備えていてもよい。このガイド２は、とりわけ、このサンプリング装置の進路を画定するのに用いられる。それは、選択的に光学的なまたは放射線による監視下で、生体内あるいは例えば生検によって採取された後に、目的とするエリア３、例えば腫瘍または組織に予め配置されても良い。ガイドの端部４には、サンプリング装置６が挿入されたときにそれを保護し、サンプリング装置６が配置された時点で対象とする組織３と接触して配置されるようにするシール手段が設けられることが有利である。本発明において、シール手段５は先端が閉じられたガイド２の長軸に沿って配置されることが好ましい。このシール手段５は、例えば回転または摺動窓、あるいは部分的に再吸収性の膜であっても良い。
【００２５】
サンプリング装置６は、長さが用途および挿入深さに依存し、ガイド２内に摺動可能な操作ロッド７を備えることが有利である。操作ロッド７の端部は実際のサンプリング操作に用いられる。ガイド２および操作ロッド７は組織３を損傷しないように、非侵襲性のサンプリングを可能にするように、非常に小さな径からなることが有利である。したがって、操作ロッド７の直径は数ミリメートル、さらには１００μｍに制限されても良く、ガイド２の外径は操作ロッド７の直径に近くなる。操作ロッドは、例えば外科用のステンレス製のものである。
【００２６】
しかしながら、分子のような、対象とする領域内に存在する小数の成分の微調整した正確な解析のためには、採取された流体の量が、組織型の情報を抽出することを可能にするのに十分でなければならない。特に、直径の小さい普通の針７を用いることは、機械加工されたとしてもその表面積が小さく、その表面に捕捉された目的の分子の量が少ないので、それに続く有効な解析を困難にする。しかしながら、本発明によると、サンプリングシステムは、特に脳においても制限なしに用いられることができ、この装置６は９９５μｍ、またはそれ以下の直径を有するシリンダーに含まれる。
【００２７】
本発明によると、サンプリング装置６の端部８は、展開表面積が通常の表面積よりもはるかに大きく、３から２０倍以上であるような少なくとも１つのキャプチャーゾーン１０を有し、これは装置６のサイズを、サンプリングを維持しつつ適切な比率で減少させることを可能にする。
【００２８】
したがって、サンプリング装置６は、好ましくは操作ロッド７とは独立に設けられた支持体１２を備えている。この支持体の端部には操作ロッド７が好ましくは生体適合性のある接着剤で接着することにより固定されてもよい。これは、特に二つの部分のそれぞれの製造工程の分離を可能にし、操作およびサンプリングのための従来の低コストの生体適合性の操作ロッド７を用いることを可能にする。支持体１２は、生体適合性材料、特にシリコンから作られることが好ましく、それは以下に特定される。ガイドスリーブ２の異なる部分は、金またはプラスチックといった生物学でおよび／または医学で用いられるものともまた適合することが好ましい。
【００２９】
支持体１２は、どのような形状であっても良いが、以下の製造方法において記載されるようにウエハー状で平面状であることが有利である。その形状に関わらず、第一面１４およびその反対側の第二面１６を支持体１２上に画定することが可能であり、支持体１２が平面状でない場合、“面”および“反対側の面”という用語は、支持体の割線（secant）面に対して対称な支持体１２の外表面の部分を指定する。これらの面１４、１６を、長さ（ロッドの方向に）が１〜３ｃｍの範囲であり、厚さが２００〜４００μｍで、幅が３００〜８００μｍである支持体１２上に配置することが有利である。
【００３０】
支持体１２の第一面１４には、キャプチャーゾーン１０が設けられ、このキャプチャーゾーン１０は、ロッド７に容易に固定されるように十分に長い、例えば２〜５ｍｍの近接した自由端部８を残すことが好ましい。したがって、好ましい一実施形態Ｐは、３００μｍ×６００μｍ×２ｃｍの大きさのシリコンからなる長方形の支持体１２に関連し、その構造化されたゾーンはロッド７に固定された端部から３．２ｍｍ離れたところで始まっている。
【００３１】
好ましくは、さらに図示されるように、いくつかのキャプチャーゾーン１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄが支持体１２の面１４上にあり、インターバルゾーン１８によって分離されている。示された例には、キャプチャーゾーンが４つあるが、その数は目的とする用途、特に装置６のサイズ、目的とする領域３のサイズおよびこの領域３における対象とする分子の濃度、キャプチャーゾーン１０の展開表面積、および製造方法に依存することは明らかである。同様に、インターバルゾーン１８は“仮想”のものであってもよい。すなわち、キャプチャーゾーン１０はマクロレベルでは結果として一体となっているが、ミクロレベルではそれらを区別する手段があり、この手段はさらにそれらを分離することを可能にしてもよい。
【００３２】
第二面１６がキャプチャーゾーン２０を有することもまた可能である。以下により明瞭に説明されるように、第二のキャプチャーゾーン２０は第一のゾーン１０の反対側に位置を合わせて配置されていることが好ましい。第二キャプチャーゾーン２０は、第一のゾーン１０と同一の型および形状からなっていてもよい。また、それらは図１に示されるように異なっていても良い。以下に示す様々な実施形態が組み合わされても良い。
【００３３】
それぞれのキャプチャーゾーン１０、２０の展開表面積は、キャプチャーゾーン１０、２０の平面状の表面より３倍大きい。一実施形態が図２に示される。
【００３４】
キャプチャーゾーン１０は底壁２２を備えている。製造方法に依存して、底壁２２は支持体１２に配置されてもよく、また、キャビティをそこに画定してもよい（図４参照）。底壁２２は表面ｓを有し、また、複数の突起２４を有する。キャプチャーゾーンがキャビティを備えている場合、突起２４の高さはキャビティの深さと同一であることが好ましいが、それらの突起が突出することも可能である。支持体の表面がキャプチャーゾーン１０および分離手段（後述する）を除いて均一な、好ましくは平面であるということもまた好ましい。この平面状の表面は、例えば、衝撃エネルギーの均一性という点からみて、質量分析のレーザー脱離下でより容易に解析することができる。
【００３５】
したがって、キャプチャーゾーン１０の展開表面積Ｓは、突起２４の側壁のそれぞれの表面積が加えられた底壁２２の表面ｓに等しい。本発明によると、これらの表面はＳ＞３・ｓという関係が実証され、この因子「３」は、場合によっては、例えば「５」または「１０」という値を仮定することが有利である。
【００３６】
突起２４はどのような形状であってもよく、例えば角柱または六角形の断面を有する柱状であってもよい。突起２４は一定の間隔で、例えば四角または六角のメッシュ状のネットワークで配置されることが好ましい。好適な実施形態Ｐによると、表面の構造は、高さ５０μｍ、広さ２０または８０μｍのシリコンの八角形の柱の形状である。
【００３７】
キャプチャーゾーン１０には、異なる製造方法が想定され得る。例えば、支持体１２がプラスチックからなる場合、予め作られた成形品に対して反転パターンを与える複製によって部品を得ることを可能にする射出成形または熱エンボス技術を用いることが可能である。したがって、低コストで、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、パリレン、またはテフロン（登録商標）からなる支持体１２に、２０μｍの側面と５０μｍの高さを有する突起２４を製造することが可能である。選択肢としては、これらの材料のうち一つ、特にパリレンまたはテフロン（登録商標）を、プラスチック上に溶着することもまた可能であり、生体適合性にするために金属表面上にもまた、溶着することも可能である。
【００３８】
より高い表面／体積比が望まれる場合、マイクロテクノロジー技術を用いることが可能である。例えば、文献ＦＲ−Ａ−２８４６９５７における図７を参照して記載される方法が用いられても良い。しかしながら、この文献に記載された方法は、支持体１２のみが加工されているので単純化されている、つまり、通路および／またはカバーシールを提供する構造はなんら開示されていない。この方法を用いると、シリコンからなる支持体１２に、５μｍの側面および１００μｍの高さを有する突起２４を得ることが可能である。より一般的には、突起２４は、深さが５０〜４００μｍで、５〜２０μｍの側面（この方法を用いて８０または１００μｍまでのサイズが可能となる場合においてさえも）を有してもよく、支持体１２は方法の最後に装置が生体適合性を有するように機械加工される。特に、シリコンからなる支持体１２は生体適合性のガラスと同様の性能を有するＳｉＯ２でコーティングされるように酸化される。
【００３９】
キャプチャーゾーン１０、２０を支持体１２の両側に形成するために、例えば予め作られた二つの支持体１２、１２’（図７Ｅ参照）を接着すること、またはシリコンもしくはプラスチック成形品にマイクロテクノロジー技術を用いて両面のあるモジュールを製造すること（図７Ｄ参照）が可能である。
【００４０】
キャプチャーゾーン１０の展開表面積をさらに増加させるために、突起２４の間の空間２６をマイクロビーズ２８で充填することが可能である。マイクロビーズ２８は通常マイクロ生物学において用いられる。それらの直径は、それらが官能基化され、また、生体適合性を保ったままにされるように、通常約１０ナノメートル程度から約１００ミクロンまでであり、多孔質または非多孔質のガラスから成っていてもよい。
【００４１】
キャプチャーゾーン１０の形成方法および突起２４の配置に続いて、ＦＲ−Ａ−２８４６９５７に説明されるように、突起２４の間の空間２６におけるビーズ２８を配列（図３Ｂ）することが可能であり、これは展開表面積の定量化を容易にする。例えば、突起の間の空間２６は５０μｍ以下の幅を有する。しかしながら、他の実施形態も可能であり、特にランダムに充填してもよい。第一ビーズ２８が正確に配置され、より小さい直径の第二ビーズ２８’が適切な位置に配置される（図３Ａ参照）ように、空間２６を寸法決めすることも可能である。
【００４２】
特に、マイクロビーズ２８はキャプチャーゾーン１０の展開表面積を著しく増加させる。この場合、突起２４を有さず、図４に示されるように、むしろビーズ２８で充填されたキャビティ３２からなるキャプチャーゾーン３０を有することもまた有利である。このキャプチャーゾーン３０のキャビティ３２は、支持体１２のマイクロテクノロジーのエッチングによって形成されても良い。例えば、壁網み３４を転写することによって、またはプラスチック材料を成形することによって、キャビティ３２が形成されても良い。次いで、それらキャビティ３２は、有利には内径を測定され、マイクロビーズ２８で充填される。
【００４３】
図３および４に示されるようにマイクロビーズを用いる場合、ビーズ２８を多孔質膜３６によって適当な位置に保持することが有利である。多孔質フィルム３６は、対象とする分子がキャプチャーゾーン１０、３０内に移動するように選択される。１μｍ以下の多孔性を有するポリカーボネートからなる市販のフィルターが用いられ、シルクスクリーン印刷（例えば、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）によるダイナマスク（Ｄｙｎａｍａｓｋ）によってキャビティに接着されてもよく、または、多孔性を達成するために、フォトリソグラフィーによって絶縁された感光性樹脂（例えば、エルガ（Ｅｌｇａ）によるオーディル（Ｏｒｄｙｌ）の乾燥フィルムが用いられても良い。この技術は、１μｍ以上の直径を有するビーズ２８にもっとも適している。
【００４４】
分析されるべき媒体３と接触したキャプチャーゾーン１０、３０の要素の全てあるいは部分を、官能基化することは、捕捉機能の最適化を保証し、および／またはある対象とする分子を目標とするのに重要である。特に、マーカーを突起２４および／またはビーズ２８および／または壁２２、３４に固定することが可能である。
【００４５】
官能基化するために、ＤＮＡプローブの固定、もしくは特定の抗体の固定、続く質量分析のための親和性マトリックスの固定が考えられる。例えば、表面に厚いＳｉＯ２の酸化物を有する図２の装置において化学的な結合を行うことが可能である。
【００４６】
注目すべきことに、ビーズおよび壁が異なるように官能基化されるという事実によって、あるいは、ＦＲ−Ａ−２８４６９５７に記載されるように特にビーズ２８、２８’の直径が異なる場合において、ビーズ２８、２８’の混合によって、同じキャプチャーゾーン１０、３０において、いくつかの異なる官能基を有することが可能である。
【００４７】
特に、装置の壁２２、２４、３４に関して、通常、官能基化は二つあるいは三つの
ステップにおいて為される（図５参照）。
１）タンパク質と有機支持体との間の非共有性の界面接着を可能にする、結合剤としての二官能基性の有機分子Ｙ−Ｅ−Ａを合成する。
２）結合材を非有機支持体１２に固定する。この非有機支持体１２は、結合官能基Ｗ（特に、シリカ酸化物層でコーティングされたシリコンからなる基板１２のためのＯ−Ｓｉシリル化された官能基Ｗ）を得るように予め処理されていても良い。この処理は、二つのＹ官能基のうちの１つと表面とが反応することによって行われ、他の官能基Ａは非共有結合を形成するタンパク質と反応する。
３）化学的な非親和性によって、タンパク質の吸着を可能にする末端の官能基Ａがシリル化された官能基を用いて合成されることができない場合、これが得られるまで、改良された支持体が１以上のポストシラニゼーション反応（post-silanisasion reaction）を経る。
【００４８】
結合官能基Ａは、ＣＨ３、アルケン、アルキン、アリル誘導体、ハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｆ）、有機金属誘導体、アルコール、フェノール、ジオール、エーテル、エポキシ、炭素誘導体（アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸塩、エステル、アミド、酸塩化物、酸無水物）、含窒素誘導体（アミン、ニトロ誘導体、ジアゾ誘導体、イミン、エナミン、オキシム、ニトリル）、含リン誘導体（ホスフィン、亜リン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩）、シリコン誘導体、硫黄誘導体（硫化物、二硫化物、チオール、チオエーテル、スルホン、亜硫酸塩、硫酸塩、スルホン酸、スルホン酸塩、炭素の代わりに窒素を含むスルホニウム（azasulfonium））、セレニウム誘導体等のような存在する全ての有機、無機官能基に対応する。
【００４９】
結合剤の二つの官能基Ａ、Ｙの間に用いられるスペーサ基Ｅは、特有の特性をシラニゼーションによって得られたフィルムに付与することを可能にする。官能基Ｅは、組織された単一層が得られることを可能にするラジカルのうちから選ばれる。長鎖アルキレン型のラジカルＥは、鎖間相互作用を可能にし（アルキレン型のラジカルＥのうち、８〜２４の炭素原子を有するものが特に好ましい）、二つの三重結合−Ｃ≡Ｃ−を含むラジカルＥは架橋を可能にし、対になった芳香族鎖を含むラジカルＥは非線形の光学特性を与え（例えば、フェニレン−ビニレンおよびフェニレン−アセチレンラジカル）、ピロール、チオフェン、またはポリシラン型のラジカルＥは、電子伝導を与え、多置換多環芳香族型のラジカルＥは、光／電界発光特性を与え（例えば、キノンおよびジアゾ化合物）、アルキルまたはフルオロアルキル型ラジカルＥ、特に、３〜２４の炭素原子を有するアルキルまたはフルオロアルキル基は、クロマトグラフィーまたは電気泳動によって得られる層を用いることを可能にする。
【００５０】
ビーズの官能基化のために、同様の原理が用いられる。
【００５１】
サンプリングエリア１０ｉに応じて、異なる型のビーズを置くことが可能であり、それにより層になった親和性官能基Ａを有する手段を得ることが可能となる。
【００５２】
例えば、シラン化されたＳｉＯ２のような親水性表面を有する基板１２のために、この手段に配置されたエステルの表面官能基は、一次の水酸基を運ぶように官能化されたビーズと反応する。ビーズ２８の固定化の後、この手段は展開された親水性表面を有する（図６Ａ参照）。
【００５３】
他の効果を得るために、ビーズ２８の官能基化を用いることもまた可能である、つまり、配位子運搬ビーズの層を使用することによって多数種の飽和させて質量分析の感度を増加させる（動的平滑化）。例えば、二つのキャリアビーズ、つまり、大多数のタンパク質に特有の配位子を運ぶ第一のキャリアビーズと、小数のタンパク質に特有の配位子を運ぶ第二のキャリアビーズとによって覆われた表面が組織に接触する場合、小数のタンパク質と同様に多くの多数のタンパク質を捕捉し、この表面は、質量分析による分析段階において二つめの種類の容易な検出を可能にする。自然において、多数／小数タンパク質のダイナミクスは１２ログ（log）なので、配列に置く前のサンプルの洗浄段階での配置についてのサイファーゲン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、登録商標）によって開発されたこのアプローチの利点は容易に理解される。本発明の装置を用いて、移動することなく接触サンプリングに対してこの原理を適用することが可能である。
【００５４】
選択肢の１つとして、ｎ本の試験管に、それぞれ特有の配位子を運ぶｎ種のタイプのビーズ２８を準備し、それらを混合し、次いで配位子Ｙ（図６ＢにおけるＮＨ２参照）を介してこの手段にそれらを固定する。他の選択肢として、特有の配位子のｎ種のタイプを混合し、予めビーズで官能基化された手段にそれらを固定する（図６Ｃ参照）。
【００５５】
また、サンプリング装置６がいくつかのキャプチャーゾーン１０ｉを有する場合（図１参照）、それぞれのキャプチャーゾーンに同じ官能基を用いることが可能であり、または、空間微分を、例えばＤＮＡチップにおいてよく知られる“スポッティング”法によって作ることも可能である。
【００５６】
用途に依存して、および特にサンプリングされた分子について行われる分析に依存して、１つの同じ装置６のキャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄを分離することは興味深い。特に、支持体１２は前述の実施形態のそれぞれにおいて得られる。
【００５７】
支持体１２の区分化を容易にするために、キャプチャーゾーン１０、３０の間のインターバルゾーン１８には分離手段が設けられることが有利である。例えば、突起２４および／または壁３４が形成されるのと同時に、切り込みがエッチングされても良い（図７参照）。そして、インターバルゾーン１８、３４は容易に区分されることができる。
【００５８】
異なる実施形態が考えられる。例えば、支持体１２を、キャプチャーゾーン１０を備えた面１４と反対側の面１６上で、例えばマスクおよびエッチングを用いてエッチングすることによって裂け目４２を入れることが可能である（図７Ａ参照）。切り込み４４は、“前”面１４に作られることができ、または等方性の化学エッチングが、例えばＫＯＨを用いて選択されてもよい（図７Ｂ参照）。
【００５９】
図４に示される１つのキャビティ３２を有するタイプの装置に関して、通常インターバルゾーンは壁３４から成る。この場合もまた、裂けた切り込み４６を、この壁の底の後面に画定することが好ましい（図７Ｃ参照）。
【００６０】
キャプチャーゾーン１０、２０が面１４、１６のそれぞれにある場合、分離手段をそれらの面のうちの１つの面にのみ配置させることも可能であり（図７Ｄ）、また、両面に配置させてもよい（図７Ｃ）。この点に関し、それらの相対する面１４、１６のそれぞれにキャプチャーゾーン１０、２０を有する装置の二つの実施形態において、１つの支持体１２（図７Ｄ）または二つの支持体１２、１２’の接着（図７Ｅ）が示される。
【００６１】
切り込み４２、４４、４６の異なる実施形態が独立に、または組み合わせて用いられ得るということは明らかである。
【００６２】
好適な実施形態Ｐによると、直径１００ｍｍのシリコンのウエハーが切断の後最終的な装置１４２を得るために機械加工される。シリコンから成る支持体１２は、印が付けられているのが有利であり、特に装置の名前、位置合わせの十字、切断の目印が、例えばマスクおよびドライエッチングを用いてフォトリソグラフィーによって５００ｎｍにエッチングされる。
【００６３】
後面は、切り込み４６を形成するために、同様の処理（前述のマスクに合わせられたマスクを用いたフォトリソグラフィー、５〜１０μｍのドライエッチング、マスク樹脂の除去）を受ける。次いで、前面は、フォトリソグラフィーおよび位置を合わせたマスク、５０μｍの深いドライエッチング、および該樹脂の除去によるミクロ構造化のために模様が付けられてエッチングされる。次いで、この表面は生物学的および／または医学的使用を可能にするように処理される。特に、エッチング処理の間にキャビティの側面に形成されたポリマー（Ｃ４Ｆ８）が全面的な脱酸素化によって除去され、１００ｎｍにわたって湿式酸化され、次いで完全な脱酸素化が行われる。そして、最終的なＳｉＯ２層が５００ｎｍにわたる湿式酸化によって得られる。
【００６４】
図８に示される本発明による装置の利用の一実施形態によると、ガイド２はまず、好ましくは監視下で目標とするエリア３内に適切な位置になるように配置され、支持体１２はロッド７の端部に接着される。ロッド７は、その正確な位置取りが保証されるように、特にキャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄのそれぞれに対応する腫瘍３の領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを決定するように、光学的な制御下でガイド２に挿入される。一度キャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄが適切な位置をとると、シール手段５が開けられ、取り付けることによってサンプリングが行われる。装置自体の操作はなんら必要とされず、キャプチャーゾーン１０の接触面が直接入手可能（例えば、カバーなしで）になる。これは、全体として、特に支持体１２の小型化を可能にする。次いで、シール手段５は選択的に再び閉じられても良い。続いて、ロッド７はガイド２から取り除かれ、支持体１２がガイドから分離され、キャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄが分析される。
【００６５】
採取されたサンプルの処理のための二つのアプローチが採られ得る。
１）装置６が切られ、それぞれのゾーン１０ａ〜１０ｄが分離され、独立して処理される。一度ロッド７が引かれると、支持体１２は分割ラインに沿って破れ、異なるゾーン１０ａ〜１０ｄは洗浄・抽出管５０ａ〜５０ｄに移される。抽出された分子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄはデータバンク内に保管されることができ、および／または分析、例えば特にセルディ−トフ（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＦ、登録商標）のようなプロテオーム分析のための質量分析のために用いられるサイファーゲン配列のために配列に置かれることができる。
２）支持体１２を切断しないこともまた可能であり、この支持体１２はしたがって画定され、腫瘍３内に並べられた活性ゾーンＡ−Ｄを維持する。支持体１２自身が、例えばレーザー補助直接脱離による最終解析装置６０のための基板の役割を果たす。
【００６６】
選択されたアプローチに関わらず、対象とする組織のマップが目標とするエリア３における深さに対するタンパク質組成についての結果とともに得られる。
【００６７】
したがって本発明のサンプリング装置は特別に有利な特性を有する。
−サンプリングの侵襲性が少ない：特に、目標とする分子の十分な捕捉のための展開表面積を維持しつつ、装置６の、さらにはシステム１の見かけの直径が数ミリメートル、好ましくは１ｍｍに減少される。
−サンプリングの攻撃性が少ない：組織３を切断することなく接触により（または‘固定により’）為される。
−実際にサンプリングに用いられる装置の機械加工された部分のサイズが減少され、低コストの操作ロッド７と関連づけられる支持体１２を覆うだけである、
−サンプリング１２のために用いられる部分の機械加工は、他の機械的な要素なしで、および、付加的な接合または接着段階なしで、接触ゾーン１０、２０、３０の形成に減少される。
−キャプチャーゾーン１０、２０、３０の大きな展開表面積は、小型化を補い、信頼性のある分析を提供する。
−装置６は生体内の操作において、または操作後に、または分子分析を必要とするサンプリングされた組織について生体外でさえも用いることが可能である。
−層状のキャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄの存在は、インプリントの後にサンプリングエリア３における対象とする分子の分布の分析を可能にする。
−それぞれのキャプチャーゾーン１０、３０は、目標とする分子および／または最終的な分析（ゲノミクス、プロテオミクス）のタイプに応じて官能基化され得る。
−それぞれのキャプチャーゾーン１０ａ〜１０ｄは他から分離され、ゾーン固有の技術を用いて分析され得る。
−支持装置１２は分析装置と互換性を有することができる。例えば、それは、質量分析のための特有のマトリクッスを備えても良い。
−分析されるエリア３の深さ軸に沿ってマッピングすることは、装置に沿って分化された一連の活性領域Ａ−Ｄに応じて決定されうる。立体鏡（stereoscopy）の下での操作方法は、装置６の正確なガイドを可能にし、また、どのエリアＡ−Ｄが検出されるのかを正確に決定する。
【実施例】
【００６８】
前述の装置Ｐ（八角形の突起を有する６００×３００μｍ２のＳｉからなる支持体１２）はシラン化されカルボン酸官能基を与えるように官能化された。生理的なｐＨでは、生体系および特にタンパク質は必然的に帯電している。イオン相互作用（クロマトグラフィーの原理に基づいて）がタンパク質のマーカーの特異吸着に用いられ得る。アニオン性（負に帯電）の表面のために、カルボン酸塩誘導体がもっとも頻繁に用いられる。
【００６９】
カルボン酸塩およびシラン官能基は適合しないので、トリメトキシシリルウンデカン−１０−酸のメチルエステルを介して間接的な合成方法が選択された。
【化１】
0005265795.tif 000002
【００７０】
酸官能基は、ウンデセン酸をスルホン酸およびメタノールと反応させた後に、メチルエステルの形状に保護される。シリル基の混和は、通常ヒドロシリル化反応によって実施される。
【００７１】
例えば、トリメトキシシリルウンデカン−１０−酸のメチルエステルを形成するために、１０−ウンデス−１−エン酸が次の方法を用いて作られる。
−５００ｍＬのメタノールに溶解されたウンデセン酸（９８％）（１０．４７ｇ；１１．５ｍＬ；５６ｍｍｏｌ）の溶液に、濃硫酸が加えられる（１２．８８ｇ；７ｍＬ；１３１ｍｍｏｌ；２．３当量）。反応は０℃で４時間行われる。
−メタノールを蒸発し、酢酸エチルに回収したのち、反応混合物を続いてＥＤＩと塩化ナトリウムの飽和溶液とで洗浄し（×２）、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで濃縮され無水液体（１０．９９ｇ、９９％）を得る。これは、次の特性を与える。
δＨ（２００ＭＨｚ；  ＣＤＣｌ３）：１．３０（１０Ｈ；ｍ；Ｈ５−９）
：１．６２（２Ｈ；ｍ；Ｈ４）
：２．０４（２Ｈ；ｍ；Ｈ１０）
：２．３１（２Ｈ；ｔ；Ｈ３）；３ＪＨ−Ｈ＝７．４Ｈｚ）
：３．６７（３Ｈ；ｓ；Ｈ１）
：４．９７（２Ｈ；ｍ；Ｈ１２）
：５．８１（１Ｈ；ｍ；Ｈ１１）
δＣ（２００ＭＨｚ；  ＣＤＣｌ３）：２５．３１
：２９．２６
：２９．４２
：２９．５０
：２９．５８
：２９．６６
：３４．１６
：３４．４４
：５１．７６（Ｃ１）
：１１４．５１（Ｃ１２）
：１３９．４６（Ｃ１１）
：１７４．６１（Ｃ２）
−１０−ウンデス−１−エン酸のメチルエステル（１０．５８ｇ；５３ｍｍｏｌ）をトリメトキシレン（９５％）（８．７５ｇ；９．１ｍＬ；６８ｍｍｏｌ；１．３当量と混合する。カールシュテット触媒（０．１３ｇ；０．１３ｍｍｏｌ；０．００２５当量）を非常にゆっくり加える。室温で１６時間反応を行う。反応生成物を蒸留により精製し、無色液体（０．５ｍｂａｒで１２０−１２５℃；１１．７ｇ；７０％）を得る。
δＨ（２００ＭＨｚ；  ＣＤＣｌ３）：０．６５（２Ｈ；ｍ；Ｈ１２）
：１．２７（１４Ｈ；ｍ；Ｈ５−１１）
：１．６２（２Ｈ；ｍ；Ｈ４）
：２．３０（２Ｈ；ｔ；Ｈ３）；３ＪＨ−Ｈ＝７．４Ｈｚ）
：３．５７（９Ｈ；ｓ；Ｈ１３）
：３．６７（３Ｈ；ｓ；Ｈ１）
δＣ（２００ＭＨｚ；  ＣＤＣｌ３）：９．２１（Ｃ１２）
：２２．６８
：２５．０４
：２９．２３
：２９．３８（２Ｃ）
：２９．５０（２Ｃ）
：３３．１７
：３４．１９
：５０．５５（Ｃ１３）
：５１．４６（Ｃ１）
：１７４．３８（Ｃ２）
δＳｉ（２００ＭＨｚ；  ＣＤＣｌ３）：−４１．３０（ｓ）
【００７２】
熱酸化物の５００ｎｍの層でコーティングされたシリコン基板の水酸化を、３．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液中で、無水トリクロロエチレン中で１０−２Ｍシラン化溶液を用いて、２時間行う。シラン化反応を、２℃の制御温度で２４時間行う。
【００７３】
改良された支持体は、ヨウ化アルミニウムの溶液に接触して、カルボン酸基を解放し、次々に水酸化ナトリウム水溶液と反応させ、対応するカルボン酸塩基を得る。
【００７４】
この装置は、エグゼルシス（exeresis）の後に得られた脳腫瘍（神経膠腫）の質量分析に用いられた。
【００７５】
組織が手段に取り付けられ、次いで、洗浄しマトリックス上に置いた後に、表面上で分析が直接行われた。
【００７６】
商標名プロテインチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ、登録商標）システムシリーズ４０００に基づいてサイファーゲンによって市販されるセルディ−トフ上に得られた質量分析が図９に示され、斜線部分は、多数のヘモグロビンと、トランスフェリンタンパク質とを表す。
【００７７】
注目すべきことは、化学を用いない表面Ｂの分析において示される印は、化学的に改良された表面Ａ（ＣＯＯ−を介してアニオン性である）上よりもはるかに少ないので、表面化学が重要な役割を担っている。
結果。
【図１】
0005265795.tif 000003
【図２】
0005265795.tif 000004
【図３Ａ】
0005265795.tif 000005
【図３Ｂ】
0005265795.tif 000006
【図４】
0005265795.tif 000007
【図５】
0005265795.tif 000008
【図６Ａ】
0005265795.tif 000009
【図６Ｂ】
0005265795.tif 000010
【図６Ｃ】
0005265795.tif 000011
【図７Ａ】
0005265795.tif 000012
【図７Ｂ】
0005265795.tif 000013
【図７Ｃ】
0005265795.tif 000014
【図７Ｄ】
0005265795.tif 000015
【図７Ｅ】
0005265795.tif 000016
【図８】
0005265795.tif 000017
【図９】
0005265795.tif 000018