(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸含有率が１．０質量％以下である甘草抽出物を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤（美白用途並びに慢性腎不全及び虚血性心疾患の予防・治療用途を除く。）。
【請求項２】
肝炎、肝機能障害、特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群、白内障、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、癌、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症及び不眠症からなる群より選択されるグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤であって、
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸含有率が１．０質量％以下である甘草抽出物を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。このグルタチオンは、細胞内においてラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、解毒機構への関与及び各種酵素のＳＨ供与体等としての役割を果たすことが知られている。
【０００３】
このような役割を果たすグルタチオンの細胞内濃度が低下すると、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ又はソバカスの生成、急性又は慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、生理学的な加齢に伴う老化現象、及び癌化等の病状が引き起こされることが知られている。このようなグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療には、従来、細胞内グルタチオン濃度の低下した細胞にグルタチオンを取り込ませることを目的として、グルタチオンを含有するグルタチオン製剤が用いられていた（特許文献１参照）。しかしながら、グルタチオン製剤の経口摂取による治療は、治療対象部位によっては思うような効果が期待できず、また、グルタチオン製剤の静脈注射による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等の問題を抱えていた。
【０００４】
したがって、生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進することにより細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができれば、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症の予防、治療又は改善が期待できるとともに、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の疾患の予防又は治療が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献２参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００５】
また、生体内において、グルタチオンは、活性酸素種を除去する作用を有する還元型グルタチオン、及び還元型グルタチオンと活性酸素種との反応により生産される酸化型グルタチオンとして存在する。近年、この酸化型グルタチオンが、神経細胞の興奮を抑制し、睡眠を促進する睡眠促進物質であることが確認されている。そのため、グルタチオンの産生を促進し、還元型グルタチオンのみならず、酸化型グルタチオンの細胞内濃度をも上昇させることができれば、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善に有効であると考えられている。このような考えに基づき、従来、酸化型グルタチオンを有効成分とする催眠剤が知られている（特許文献４参照）。
【０００６】
生体細胞においては、γ−グルタミルシステインシンテターゼの作用により、システインとグルタミン酸とが反応してγ−グルタミルシステインが生合成され、グルタチオンシンテターゼの作用により、γ−グルタミルシステインとグリシンとが反応してグルタチオンが生合成されることが知られている。そのため、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインを生合成するための触媒的役割を果たすγ−グルタミルシステインシンテターゼの発現を促進することで、生体細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができると考えられる。
【特許文献１】国際公開２００３／０３２９６６号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献３】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献４】特開平４−９３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用及びγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の飲食品及び飼料は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を配合したことを特徴とする。
【００１０】
なお、本発明において「グリチルリチン酸を実質的に含有しない」とは、甘草抽出物中のグリチルリチン酸含有率が、好ましくは１．０質量％以下であることを意味し、より好ましくは０．５質量％以下であることを意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れたグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について説明する。
〔グルタチオン産生促進剤，グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤〕
本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物（以下、単に「甘草抽出物」という場合がある。）を有効成分として含有する。
【００１３】
リクイリチン（liquiritin）、リクイリチゲニン（liquiritigenin）、イソリクイリチン（isoliquiritin）及びイソリクイリチゲニン（isoliquiritigenin）、を含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、植物の抽出処理に一般に用いられている方法によって得ることのできる甘草エキスからグリチルリチン酸を除去することで、得ることができる。
【００１４】
抽出原料としての甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza inflataを抽出原料として使用することが好ましい。
【００１５】
抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、花部等の地上部、根部、根茎部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根部又は根茎部である。
【００１６】
甘草エキスは、抽出原料としての甘草を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２２】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物には、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンのフラボノイド類の他、グリチルリチン酸も含まれているため、これらの抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物（甘草エキス）からグリチルリチン酸を除去する。
【００２３】
甘草エキスからグリチルリチン酸を除去するには、甘草エキスに８０〜９５容量％のアルコール水溶液を加え、アルコール水溶液中に甘草からの抽出物を分散させ、濾紙で沈殿物を吸引濾過する。グリチルリチン酸は、水溶性であり、アルコールに難溶であるため、甘草エキスに含まれるグリチルリチン酸は、アルコール水溶液にほとんど溶解せず、沈殿物として除去される。一方、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンは、アルコールに可溶であるため、アルコール水溶液に容易に溶解する。
【００２４】
分散媒として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコールを使用すればよい。
【００２５】
得られた濾液から溶媒を留去した残渣に水を加え、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させる。そして、アルコールで溶出される画分として、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を得ることができる。
【００２６】
カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
【００２７】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２８】
甘草エキスからグリチルリチン酸を除去し、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を得る方法としては、上述した方法以外にも、下記の方法が挙げられる。
【００２９】
例えば、甘草エキスに鉱酸（例えば、硫酸、硝酸、塩酸等）を加えてｐＨを１．０〜３．０程度に調整し、酸性析出（酸析）処理を行う。得られた酸析液を濾過して沈殿物を回収し、３０〜７０容量％のアルコール水溶液（例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコールの水溶液）を加えて、その後濾過する。
【００３０】
このようにして得られた濾液にアンモニア水を加えて濾液のｐＨを３．０〜３．５程度に調整し、グリチルリチン酸を析出させ、固液分離する。得られた濾液画分に炭酸ナトリウムを加えて中和し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させる。そして、アルコールで溶出される画分として、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含み、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を得ることができる。なお、カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、上述したものと同様のものが挙げられる。
【００３１】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００３２】
以上のようにして甘草エキスからグリチルリチン酸を除去することで、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を得ることができる。かかる甘草抽出物中のグリチルリチン酸含量は、１．０質量％以下であるのが好ましく、０．５質量％以下であるのがより好ましい。
【００３３】
以上のようにして得られるリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、グルタチオン産生促進作用を有しているため、その作用を利用してグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができる。なお、甘草抽出物は、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用も有しているため、その作用を利用してγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分としても使用することができる。
【００３４】
また、上記甘草抽出物は、そのグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの産生を促進することができるため、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）の予防・治療剤の有効成分としても使用することができる。
【００３５】
さらに、上記甘草抽出物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、その作用を利用して酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善剤の有効成分としても使用することができる。
【００３６】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、上記甘草抽出物のみからなるものであってもよいし、上記甘草抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００３７】
上記甘草抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、上記甘草抽出物は、他の組成物（例えば、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３８】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、グルタチオン産生促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
【００３９】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与、静脈投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００４０】
また、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００４１】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、上記甘草抽出物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することができ、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症や、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下等による種々の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のグルタチオン産生促進剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００４２】
後述する実施例において示されるように、特に上記甘草抽出物は、表皮角化細胞及び皮膚線維芽細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、上記甘草抽出物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞内で活性酸素種を消去することができ、表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞を酸化的ストレスによる傷害等から保護することができ、結果として、皮膚の老化等を効果的に防止することができる。
【００４３】
また、グルタチオンがチロシナーゼの成熟化を抑制する作用を有していることから、グルタチオンの産生を促進することによってチロシナーゼの成熟化をより抑制することができ、メラノサイトにおけるメラニンの生成を抑制することができる。そのため、上記甘草抽出物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、メラノサイトにおけるグルタチオンの産生を効果的に促進し、チロシナーゼの成熟化をより抑制することができるため、結果として、皮膚色素沈着症、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防することができる。
【００４４】
さらに、上記甘草抽出物は、肝細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、上記甘草抽出物を含有するグルタチオン産生促進剤は、グルタチオンの欠乏に起因する肝臓疾患を効果的に予防・治療することができる。
【００４５】
なお、上記甘草抽出物をγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤に含有せしめることで、上記甘草抽出物が有するγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進することができる。
【００４６】
本発明のグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、上記甘草抽出物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）を予防・治療することができるとともに、酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害を予防、治療又は改善することができる。
【００４７】
〔飲食品，飼料〕
本発明の飲食品又は飼料は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物を配合したものである。
【００４８】
上記甘草抽出物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、ヒト、動物、魚類等の消化管で消化されるようなものではないことが確認されており、また安全性に優れているため、一般食品、健康食品、保健機能食品若しくは栄養補助食品等の任意の飲食品、又は家禽、家畜等の動物用飼料若しくは養殖魚等の魚類用飼料、キャットフード、ドッグフード等のペットフード等の飼料に配合するのに好適である。この場合、上記甘草抽出物をそのまま飲食品又は飼料に配合してもよいし、上記甘草抽出物により製剤化したグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品又は飼料に配合してもよい。
【００４９】
上記甘草抽出物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品に配合する場合、それにおける有効成分の配合量は、使用目的、性別、症状等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日あたりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。
【００５０】
上記甘草抽出物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飼料に配合する場合の配合割合は、対象生物（家禽、家畜、養殖魚、犬・猫等のペット動物等）やその体重、使用目的等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飼料の一般的な摂取量を考慮して、０．０００１〜２０．０質量％であるのが好ましく、０．０１〜２．０質量％であるのが好ましい。
【００５１】
上記甘草抽出物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合し得る飲食品は、上記甘草抽出物の有するグルタチオン産生促進作用を妨げない限り、特に限定されるものではない。
【００５２】
具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などに上記甘草抽出物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合することができ、このとき、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００５４】
〔製造例１〕
甘草（Glycyrrhiza glabra）の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの水を加え、ゆるく攪拌しながら抽出し、デカンテーションで固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液をペースト状になるまで減圧濃縮した後、７０容量％エタノール水溶液を得られた濃縮物の１０倍量加え、攪拌機を用いて分散させた。分散液を５℃にて一夜保管し、生じた沈殿を濾紙で吸引濾過して除去し、濾液のエタノール水溶液を減圧下で留去した。
【００５５】
このようにして得られた残渣に水を加えて固形分を５％とし、多孔性合成吸着樹脂（ダイアイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）１０Ｌを充填したカラムにＳＶ＝１で通液した。カラムを５０Ｌの水で洗浄した後、８０容量％エタノール水溶液５０Ｌをさらに通液し、フラボノイド類を溶離させた。溶離液を集めて減圧蒸留してエタノール水溶液を留去したのち、蒸留残渣を４０℃で真空乾燥し、粉砕することで、３４５ｇの黄褐色粉末を得た（試料１）。
【００５６】
得られた粉末を下記の条件にて高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．５質量％、リクイリチン含量４．２質量％、イソリクイリチン含量３．６質量％、リクイリチゲニン含量２．５質量％、イソリクイリチゲニン含量１．５質量％であった。
【００５７】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ  ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００５８】
〔製造例２〕
甘草（Glycyrrhiza uralensis）の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの３％アンモニア水を加える以外は実施例１と同様にして処理し、黄褐色粉末４１０ｇを得た（試料２）。得られた粉末を実施例１と同様にして高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．９質量％、リクイリチン含量５．５質量％、イソリクイリチン含量４．６質量％、リクイリチゲニン含量３．９質量％、イソリクイリチゲニン含量３．５質量％であった。
【００５９】
〔製造例３〕
甘草(Glycyrrhiza inflata)の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの水を加え、ゆるく攪拌しながら抽出し、デカンテーションで固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液を攪拌しながら、５０％硫酸を加えて抽出液のｐＨを２に調整し、酸性析出処理を行い、ろ過により沈殿物を集めた。得られた沈殿物に水を加え、攪拌して分散させ、静置後上澄みをデカンテーションで除去した。この操作を繰り返して硫酸を除去した後、濾過を行って沈殿物を得た。
【００６０】
このようにして得られた沈殿物に９０容量％エタノール５Ｌを加え、常温で１時間攪拌分散させ、珪藻土を用いて吸引濾過した。得られた濾液にアンモニア水を加えて濾液のｐＨを５に調整し、５℃で２日間静置してグリチルリチン酸を析出させた後、遠心分離により固液分離を行った。濾液画分のエタノールを減圧蒸留して除去し、蒸留残渣に炭酸ナトリウムを加えて中和した。
【００６１】
このようにして得られた中和液を、多孔性合成吸着樹脂（ダイアイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）５Ｌを充填したカラムにＳＶ＝１で通液した。カラムを２５Ｌの水で洗浄したのち、９０容量％エタノール水溶液２５Ｌをさらに通液しフラボノイド類を溶離させた。溶離液を集めて減圧蒸留にかけてエタノール水溶液を留去したのち、蒸留残渣を４０℃で真空乾燥して粉砕し、２９３ｇの黄褐色粉末を得た（試料３）。
【００６２】
得られた粉末を実施例１と同様にして高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．８質量％、リクイリチン含量３．５質量％、イソリクイリチン含量２．８質量％、リクイリチゲニン含量２．５質量％、イソリクイリチゲニン含量１．８質量％であった。
【００６３】
〔試験例１〕表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００６４】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００６５】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００６６】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００６７】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0005334448.tif 000002
【００６９】
表１に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、表皮角化細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００７０】
〔試験例２〕皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００７１】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７２】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００７３】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００７４】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
0005334448.tif 000003
【００７６】
表２に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、皮膚線維芽細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００７７】
〔試験例３〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００７８】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７９】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表３を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００８０】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００８１】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
0005334448.tif 000004
【００８３】
表３に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、Ｂ１６メラノーマ細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００８４】
〔試験例４〕肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００８５】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり４００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００８６】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに４００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、２５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００８７】
このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００８８】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表４に示す。
【００８９】
【表４】
0005334448.tif 000005
【００９０】
表４に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、肝細胞においてグルタチオンの産生を促進し得ることが確認された。
【００９１】
〔試験例５〕表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９２】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養増殖培地（EpiLife-KG2）を用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【００９３】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表５を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【００９４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【００９５】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表５に示す。
【００９６】
【表５】
0005334448.tif 000006
【００９７】
表５に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、表皮角化細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【００９８】
〔試験例６〕皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９９】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【０１００】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表６を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【０１０１】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１０２】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表６に示す。
【０１０３】
【表６】
0005334448.tif 000007
【０１０４】
表６に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、皮膚線維芽細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１０５】
〔試験例７〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【０１０６】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【０１０７】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表７を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、１００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【０１０８】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１０９】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
0005334448.tif 000008
【０１１１】
表７に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、Ｂ１６メラノーマ細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１１２】
〔試験例８〕肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られた甘草抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【０１１３】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【０１１４】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜３，試料濃度は下記表８を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【０１１５】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１１６】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表８に示す。
【０１１７】
【表８】
0005334448.tif 000009
【０１１８】
表８に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、肝細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１１９】
上述した試験例１〜４から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、優れたグルタチオン産生促進作用を有している。また、試験例５〜８から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、優れたγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有している。このことから、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進し、それにより生体内でのグルタチオンの産生を促進しているものと推察される。
【０１２０】
〔試験例９〕養殖魚の含有グルタチオン量の測定
製造例１で得られた甘草抽出物（試料１）を養殖用飼料として用いて、下記条件で養殖した養殖魚の筋組織中に含まれるグルタチオン量を測定した。
【０１２１】
（１）供試魚：平均１ｋｇの養殖マダイ
（２）試験時期：９〜１０月
（３）試験尾数：１０／６０００(放尾数)
（４）投与量：２０ｍｇ−試料１／ｋｇ−魚体重
（５）投与方法：４日給餌，３日休餌（１ヶ月）
（６）測定日：試験開始１ヶ月後
【０１２２】
養殖魚の筋組織中に含まれるグルタチオン量は、下記のようにして測定した。
試料１投与群の養殖マダイの筋肉（背側）を５％５−スルホサリチル酸中でホモジナイズし、４℃にて遠心分離後、上清を試料溶液とした。９６ｗｅｌｌプレートに試料溶液２５μＬ及び０．１Ｍのリン酸緩衝液１２５μＬを加えた後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後の波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。還元型グルタチオン濃度は、還元型グルタチオン標準品を用いて作成した検量線をもとに算出した。また、コントロール群として、試料１を与えない以外は同様の条件で養殖した養殖マダイの筋肉（背側）中の還元型グルタチオン濃度を同様にして算出した。
結果を表９に示す。
【０１２３】
【表９】
0005334448.tif 000010
【０１２４】
表９に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、養殖マダイの筋肉中のグルタチオン量を効果的に増加させる作用を有することが確認された。
【０１２５】
〔試験例１０〕マウス皮膚中のグルタチオン量の測定
ＨＲ−１／Ｈｏｓ系の５週齢の雌性ヘアレスマウス（星野試験動物飼育所より購入）を１週間馴化した後、製造例１で得られた甘草抽出物（試料１）を粉末試料（ラボＭＲストック，清水実験材料社製）に混餌し、甘草抽出物（試料１）の１日あたりの摂取量が５０（ｍｇ／ｋｇ−マウス体重）となるように、３週間毎日給餌した。給餌終了後、皮膚を採取し、テフロンホモジェナイザーを用いて、採取した皮膚１ｍｇあたり１００μＬの１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００含有ＰＢＳ中で皮膚を可溶化し、４℃にて遠心分離（１２０００ｒｐｍ，１５分間）した後、上清を測定試料とした。
【０１２６】
得られた測定試料のうちの２５μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに測定試料２５μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液１２５μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度：１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を用いて作成した検量線をもとに算出して得られた値から、皮膚重量あたりのグルタチオン量として算出した。また、コントロール群として、粉末飼料に甘草抽出物（試料１）を添加しない以外は同様にしてマウスの皮膚中の総グルタチオン濃度を算出した。
結果を表１０に示す。
【０１２７】
【表１０】
0005334448.tif 000011
【０１２８】
表１０に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出物は、マウスの皮膚中のグルタチオン量を効果的に増加させる作用を有することが確認された。
【０１２９】
〔配合例１〕
常法により、以下の組成を有する配合飼料を製造した。
甘草抽出物（製造例１）                                      １質量％
魚粉                                                      ７５質量％
小麦粉                                                    １０質量％
でん粉                                                      ７質量％
魚油                                                        ３質量％
ミネラル類                                                  ２質量％
ビタミン類                                                  ２質量％
【０１３０】
〔配合例２〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
甘草抽出物（製造例１）                                    ３０．０ｍｇ
乳清ミネラル（カルシウム２５〜３０％含有）              １００．０ｍｇ
ビタミンＫ２（１％含有粉末）                                １．５ｍｇ
マルチトール                                            １５６．０ｍｇ
グリセリン脂肪酸エステル                                  １２．５ｍｇ
【０１３１】
〔配合例３〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
甘草抽出物（製造例２）                                    １５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム２０％、マグネシウム１０％含有）    ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド                                    １６．７ｍｇ
ビタミンＣ                                                ３３．４ｍｇ
マルチトール                                            １２６．８ｍｇ
コラーゲン                                                １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル                                      １２．０ｍｇ
【０１３２】
〔配合例４〕
常法により、以下の組成を有するカプセル剤を製造した。なお、カプセルとしては、１号ハードゼラチンカプセルを使用した。
＜１カプセル（１錠２００ｍｇ）中の組成＞
甘草抽出物（製造例２）                                    ２０．０ｍｇ
コーンスターチ                                            ６０．０ｍｇ
乳糖                                                    １００．０ｍｇ
乳酸カルシウム                                            １０．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ）                １０．０ｍｇ
【０１３３】
〔配合例５〕
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
甘草抽出物（製造例３）                                    ０．４質量％
ソルビット                                              １２．０質量％
安息香酸ナトリウム                                        ０．１質量％
香料                                                      １．０質量％
硫酸カルシウム                                            ０．５質量％
精製水                                                    残部
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、皮膚の老化、シミ、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）、酸化型グルタチオンの欠乏に起因する不眠症等の睡眠障害等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。