(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、ポリペプチド：
（a）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（c）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項2記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項2記載のポリヌクレオチドまたは請求項3記載のベクターを保有する宿主細胞。
【請求項５】
以下の段階を含む、請求項1記載のポリペプチドを生産するための方法：
（a）請求項4記載の宿主細胞を培養する段階；
（b）宿主細胞にポリペプチドを発現させる段階；および
（c）発現されたポリペプチドを収集する段階。
を含む方法。
【請求項６】
請求項1記載のポリペプチドと結合する抗体。
【請求項７】
配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に対して相補的であって、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を定量するための、少なくとも15ヌクレオチドを含むプローブまたはプライマー。
【請求項８】
配列番号：1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号：２のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、またはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号：1のヌクレオチド配列中の１９−２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号：２のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNA。
【請求項９】
配列番号：16のヌクレオチド配列を含む請求項8記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１０】
その標的配列が、配列番号：93、94、95、および96のヌクレオチド配列を標的配列として含むヌクレオチドからなる群より選択される、請求項8記載の低分子干渉RNA。
【請求項１１】
対象から採取された標本の生物試料における、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子の発現レベルを細胞増殖性疾患のマーカーとして検出する段階を含む細胞増殖性疾患のマーカーを検出するための方法。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって発現レベルが検出される、請求項11記載の方法：
（a）配列番号：1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子のmRNAを検出する段階；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する段階；および
（c）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階。
【請求項１３】
細胞増殖性疾患が癌である、請求項11〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
次の要素(a)または(b)を含む細胞増殖性疾患の診断薬；
（a）配列番号：1のヌクレオチド配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド；または
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１５】
以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための候補化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、
（1）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（2）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（3）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階；
（b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；ならびに
（c）ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。
【請求項１６】
以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階；および
（b）配列番号：1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。
【請求項１７】
以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、
（1）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（2）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（3）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階；
（b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；ならびに
（c）被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較してポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階
であって、前記生物学的活性が細胞増殖活性である方法。
【請求項１８】
細胞増殖性疾患が癌である、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
配列番号：1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号：２のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドまたはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号：1のヌクレオチド配列中の１９−２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号：２のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、細胞増殖性疾患を治療するための組成物。
【請求項２０】
細胞増殖性疾患が癌である、請求項19記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年6月6日に提出された米国特許出願第60/386,985号（これは参照として本明細書に組み入れられる）に関する。
【０００２】
技術分野
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には癌研究の分野に関する。特に、本発明は、細胞の増殖機構に関与する新規遺伝子WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1、ならびにこれらの遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明の遺伝子およびポリペプチドは、例えば、細胞増殖性疾患の診断に、および、疾患に対する薬剤を開発するための標的分子として、用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
肝細胞癌（HCC）および結腸直腸癌は世界的に癌による死亡の主な原因となっている（Akriviadisら、Br J Surg 85(10)：1319-31 (1998)）。近年、診断および治療の戦略が進歩しているにもかかわらず、現在も数多くの患者は進行期になってから癌と診断されており、彼らを疾患から完全に治癒させることは差し迫った懸念事項である。腫瘍抑制遺伝子および/または癌遺伝子の変化が発癌に関与していることが最近の分子学的研究の進歩によって明らかになってきたが、その厳密な機序は依然として不明である。
【０００４】
最近の分子生物学の進歩により、肝臓癌の発生には、結腸腫瘍の発生および進行の場合と同じく、多段階プロセスが根底にあることが示唆されている。これらのプロセスは、さまざまな遺伝子産物の質的および量的な変化を伴う。βカテニン/Tcfシグナル伝達経路は、発生時の形態形成に関与することが報告されている（WodarzおよびNusse、Annu Rev Cell Dev Biol 14：59-88 (1998)；Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)；BienzおよびClevers、Cell 103：311-20 (2000)）。最近の癌研究の進歩により、結腸、肝臓、前立腺、胃、脳、子宮内膜またはそれ以外のいずれに生じるかにかかわらず、ヒト腫瘍の発生におけるシグナル伝達経路の重要性が強調されている（BullionsおよびLevine、Curr Opin Oncol 10：81-7 (1998)）。腫瘍抑制因子の1つである大腸腺腫様ポリポーシス（Adenomatous polysis coli）（APC）は、βカテニン、アキシン（Axin）、コンダクチン（conductin）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK-3β）と相互作用し、ユビキチン-プロテオソーム系を介してβカテニンの分解を促す（Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)）。ほとんどの散発性結腸直腸腫瘍ではAPC、AXIN1もしくはAXIN2（コンダクチン）における不活性化変異、またはCTNNB1（βカテニン）における安定化発癌性変異により、βカテニンが細胞質および/または核に蓄積し、その結果としてβカテニン/Tcf転写複合体の構成的活性化がもたらされる（Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)；Korinekら、Science 275：1784-7 (1997)）。その結果、この複合体はc-myc、サイクリンD1、マトリリシン（MMP-1）、c-jun、fra-1、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）、コネキシン43、CD44、PPAR-∂、AF-17およびENC-1などの標的遺伝子を活性化する（Heら、Science 281：1509-12 (1998)；Shtutmanら、Proc Natl Acad Sci USA 96：5522-7 (1999)；Brabletzら、Am J Pathol 155：1033-1038 (1999)；Crawfordら、Oncogene 18：2883-91 (1999)；Mannら、Proc Natl Acad Sci USA 96：1603-8 (1999)；van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9 (1998)；Wielengaら、Am J Pathol 154：515-23 (1999)；Heら、Cell 99：335-45 (1999)；Linら、Cancer Res 61：6345-9 (2001)；Fujitaら、Cancer Res 61：7722-6 (2001)）。しかし、結腸直腸癌におけるこの経路の活性化による腫瘍発生の厳密な機序はまだ解明されていない。
【０００５】
もう1つのタンパク質であるスタスミン（stathmin）も広範囲の癌と関係していることが知られている（Hanashら、J Biol Chem 263：12813-5 (1988)；Roosら、Leukemia 7：1538-46 (1993)；Nylanderら、Histochem J 27：155-60 (1995)；Friedrichら、Prostate 27：102-9 (1995)；Biecheら、Br J Cancer 78：701-9 (1998)）。スタスミン（Sobelら、J Biol Chem 264：3765-72 (1989)；Sobelら、Trends Biol Sci 16：301-5 (1991)）は148アミノ酸残基（19kD）からなるサイトゾル性リンタンパク質であり、p19、プロゾリン（prosolin）、Lap18、腫瘍性タンパク質18、メタブラスチン（metablastin）およびOp 18とも呼ばれている。スタスミンの発現は、種々の多能性胚性癌細胞において、およびマウス胚盤胞の内部細胞塊の多能性細胞において極めて高度であることがわかっている（Doyeら、Differentiation 50：89-96 (1992)）。スタスミンは複数の非リン酸化型およびリン酸化型として細胞内に存在し、多くの生体システムにおいてそのパターンは細胞の増殖、分化または活性化の状態に依存する（Sobelら、Trends Biol Sci 16：301-5 (1991)）。さらに、スタスミンの微小管脱重合活性はそのリン酸化レベルの変化によって調節されることが知られており、スタスミンの微小管脱分極活性は、細胞周期の種々の時期における微小管の動的不安定性の調節に決定的な役割を果たすことが報告されている（Marklundら、EMBO J15：5290-8 (1996)；Horwitzら、J Biol Chem 272：8129-31 (1997)）。有糸分裂時にはスタスミンの大規模なリン酸化が起こり（Strahlerら、Biochem Biophy Res Commun 185：197-203 (1992)；Luoら、J Biol Chem 269：10312-8 (1994)；Brattsandら、Eur J Biochem 220：359-68 (1994)）、これは細胞周期の進行に必須であるように思われる。しかし、スタスミンのリン酸化の厳密な機序およびその癌化との関係はまだ解明されていない。
【０００６】
cDNAマイクロアレイ技術により、正常細胞および悪性細胞における遺伝子発現の包括的プロファイルを得ることが可能になった（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。このアプローチは癌細胞の複雑な性質を明らかにすることを可能にし、発癌の機序を解明する一助となる。腫瘍において脱制御される遺伝子の同定は、個々の癌のより正確で間違いのない診断、および新規な治療標的の開発につながる可能性がある（BienzおよびClevers、Cell 103: 311-20 (2000)）。腫瘍の基礎をなす機序を全ゲノム的な観点から解明するため、ならびに診断および新規治療薬の開発のための標的分子を探索するために、本発明者らは、23040種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いて腫瘍細胞の発現プロファイルを分析してきた（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。
【０００７】
発癌の機序を明らかにする目的で設計された研究により、抗腫瘍薬の分子標的を同定することは既に容易である。例えば、Ras（その活性化は翻訳後ファルネシル化に依存する）が関係する増殖シグナル伝達経路を阻害するために当初開発されたファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）は、動物モデルにおけるRas依存性腫瘍の治療に有効であった（Heら、Cell 99: 335-45 (1999)）。抗癌剤と抗HER2モノクローナル抗体トラスツズマブ（trastuzumab）を併用したヒトに対する臨床試験がプロト癌遺伝子受容体HER2/neuの拮抗を目的として実施されており、乳癌患者の臨床効果および全般的な生存率の改善が達成されている（Linら、Cancer Res 61: 6345-9 (2001)）。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活性化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球のトランスフォーメーションに決定的な役割を果たす、慢性骨髄性白血病の治療を目的として開発された。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制する目的で設計されている（Fujitaら、Cancer Res 61: 7722-6 (2001)）。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明の1つの目的は、肝細胞癌または結腸直腸癌細胞の増殖機構に関与する新規タンパク質、これらのタンパク質をコードする遺伝子、さらにはこれらを生産して肝細胞癌（HCC）または結腸直腸癌の診断および治療に用いるための方法を提供することである。
【０００９】
肝細胞癌および結腸直腸癌の発生機序を解明するため、ならびにこれらの腫瘍の治療用の新規診断マーカーおよび/または薬剤標的を同定するために、本発明者らは、23040種の遺伝子を含むゲノム全域のcDNAマイクロアレイを用いて、肝細胞癌および結腸直腸癌の発生における遺伝子の発現プロファイルを分析した。薬理学的な観点からは、発癌シグナルを抑制する方が腫瘍抑制効果の活性化を行うよりも現実的には容易である。このため、本発明者らは、肝細胞癌および結腸直腸癌の発生に際して上方制御される遺伝子を探索した。
【００１０】
肝細胞癌において高頻度に上方制御される転写物の中から、新規ヒト遺伝子WDRPUH（WD40 repeat protein up-regulated in HCC）およびKRZFPUH（Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC）がそれぞれ染色体バンド17p13および16p11に同定された。WDRPUHまたはKRZFPUHの遺伝子導入は細胞の増殖を促進した。さらに、特異的なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるWDRPUHまたはKRZFPUHの発現低下はHCC細胞の増殖を阻害した。DNAおよび/またはRNA合成の阻害剤、代謝抑制物質ならびにおよびDNAインターカレーターといった多くの抗癌剤は、癌細胞のみならず、正常に増殖している細胞に対しても毒性を示す。しかし、WDRPUHおよびKRZFPUHの発現を抑制する薬剤は、これらの遺伝子の通常の発現がそれぞれ精巣、ならびに胎盤および精巣に限局しているため、他の臓器には有害な影響を及ぼさないと考えられ、このため、癌の治療に非常に重要となる可能性がある。
【００１１】
さらに、結腸直腸癌において高頻度に上方制御される転写物の中から、染色体バンド6p21.1に指定された遺伝子PPIL1（Peptidyl prolyl isomerase-like 1）が同定された。その上、免疫沈降アッセイにより、PPIL1タンパク質が、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質であるSNW1（SKI相互作用タンパク質）、および、細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質であるスタスミンと会合することが明らかになった。本発明者らは、肝臓癌および結腸直腸癌で異常に上方制御されるβカテニン/Tcf4複合体を調節する遺伝子も検索し、染色体バンド18p11.2に指定された新規遺伝子APCDD1（Down-regulated by adenomatosis polyposis coli）を同定した。その発現は野生型APCの形質導入によって減少し、大半の結腸癌組織では上昇した。PPIL1またはAPCDD1の遺伝子導入により、これらの遺伝子のいずれかの内因性発現が欠損した細胞の増殖が促進した。さらに、PPIL1またはAPCDD1に対する特異的アンチセンスS-オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるPPIL1またはAPCDD1の発現低下は、結腸直腸癌細胞の増殖を抑制した。
【００１２】
したがって、本発明は、癌の診断マーカーの候補であるとともに、診断のための新たな戦略および有効な抗癌剤を開発するための有望な標的候補でもある、単離された新規遺伝子WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1を提供する。さらに、本発明は、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのほか、その生産および使用も提供する。より具体的には、本発明は以下を提供する。
【００１３】
本出願は、新規ヒトポリペプチドWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1、または細胞増殖を促進し、HCCおよび結腸直腸癌などの細胞増殖性疾患において上方制御されるそれらの機能的同等物を提供する。
【００１４】
1つの好ましい態様において、WDRPUHポリペプチドは、配列番号：1のオープンリーディングフレームによってコードされる11個のWD40反復ドメインを有する推定620アミノ酸のタンパク質を含む。WDRPUHポリペプチドは、好ましくは、配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、WDRPUHポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：1に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる、単離されたタンパク質も提供する。
【００１５】
一方、1つの好ましい態様において、KRZFPUHポリペプチドは、ラット遺伝子ジンクフィンガータンパク質HIT-39（GenBankアクセッション番号AF277902）に対する相同性を有し、配列番号：3のオープンリーディングフレームによってコードされるクルッペル（Krupple）型ジンクフィンガードメイン（KRAB）を含む、推定500アミノ酸のタンパク質を含む。KRZFPUHポリペプチドは、好ましくは、配列番号：4に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、KRZFPUHポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：3に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる、単離されたタンパク質も提供する。
【００１６】
さらに、1つの好ましい態様において、PPIL1ポリペプチドは、Ppil1に対して98.1％、PPIAに対して41.6％、Cyp2に対して57.4％、CypEに対して50％の同一性を示し、配列番号：5のオープンリーディングフレームによってコードされる、推定166アミノ酸のタンパク質を含む。PPIL1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：6に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、PPIL1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：5に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたタンパク質も提供する。
【００１７】
さらに、1つの好ましい態様において、APCDD1ポリペプチドは、サーモバシラス・キシラニリチカス（Thermobacillus xylanilyticus）のエンド-1,4-βキシラナーゼに対して31％の同一性を示し、配列番号：7のオープンリーディングフレームによってコードされる推定514アミノ酸のタンパク質を含む。APCDD1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：8に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、APCDD1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：7に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたタンパク質も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、対応する非癌肝組織に比べてHCCの大半でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHも提供する。単離されたWDRPUH遺伝子は、配列番号：1に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、WDRPUH cDNAは、1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、WDRPUHタンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：1に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：1の縮重物および対立遺伝子変異体である。一方、単離されたKRZFPUH遺伝子は、配列番号：3に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、KRZFPUH cDNAは、1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、KRZFPUHタンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：3に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：3の縮重物および対立遺伝子変異体である。
【００１９】
さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて結腸直腸癌の大半でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子PPIL1も提供する。単離されたPPIL1遺伝子は、配列番号：5に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、PPIL1 cDNAは、498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、PPIL1タンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：5に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：5の縮重物および対立遺伝子変異体である。
【００２０】
さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて原発性結腸癌の大半でその発現が顕著に上昇しており、結腸癌細胞への野生型APC1の形質導入に応答して下方制御される、新規ヒト遺伝子APCDD1も提供する。単離されたAPCDD1遺伝子は、配列番号：7に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、APCDD1 cDNAは、1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、APCDD1タンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：7に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：7の縮重物および対立遺伝子変異体である。
【００２１】
本明細書で用いる場合、単離された遺伝子とは、その構造が、どの天然のポリヌクレオチドの構造とも同一でなく、別個の3つ以上の遺伝子にわたる天然のゲノムポリヌクレオチドのいかなる断片の構造とも同一でない、ポリヌクレオチドのことである。このため、この用語には、例えば（a）天然の生物のゲノム中に存在し、天然のゲノムDNA分子の部分配列を有するDNA、（b）結果として生じる分子がどの天然のベクターまたはゲノムDNAとも同一でないような様式で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられたポリヌクレオチド、（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片または制限断片などの独立した分子、および（d）ハイブリッド遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列、すなわち融合ポリペプチドをコードする遺伝子、が含まれる。
【００２２】
したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7に示されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一なヌクレオチド配列を含むことが好ましい。単離された核酸分子は、配列番号：1、3、5、または7に示されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上同一であることがより好ましい。単離されたポリヌクレオチドが参照配列、例えば配列番号：1、3、5、または7よりも長いか長さの等しい場合には、参照配列の完全長との比較が行われる。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、例えば配列番号：1、3、5、または7よりも短い場合には、同じ長さ（相同性の算出に必要なループは除外して）の参照配列のセグメントとの比較が行われる。
【００２３】
本発明はまた、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を行うこと、およびそのポリヌクレオチド配列を発現させることによる、タンパク質の産生方法も提供する。加えて、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する宿主細胞も提供する。このようなベクターおよび宿主細胞は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の産生のために用いることができる。
【００２４】
WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を認識する抗体も、本出願によって提供される。一部には、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスDNA）、リボザイムおよびsiRNA（低分子干渉RNA）も提供される。
【００２５】
本発明はさらに、標本の生物試料における遺伝子の発現レベルを決定する段階、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを正常試料におけるものと比較する段階、および、試料におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の高い発現レベルを癌などの細胞増殖性疾患を有するものとして定義する段階を含む、細胞増殖性疾患の診断のための方法を提供する。WDRPUHまたはKRZFPUHの発現レベルによって診断される疾患は好適には肝細胞癌である；PPIL1またはAPCDD1の発現レベルによって検出される疾患には結腸直腸癌がある。
【００２６】
さらに、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法も提供される。本方法は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを被験化合物と接触させる段階、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する段階を含む。
【００２７】
本発明はさらに、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法であって、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを被験化合物と接触させる段階、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性を抑制する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供する。
【００２８】
細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法であって、被験化合物、βカテニン/Tcf 4複合体およびレポーター遺伝子を、2つのTcf/LEF結合モチーフを含むAPCDD1の転写調節領域を持つレポーター遺伝子の発現に適した条件下で、接触させる段階、ならびにレポーター遺伝子の発現を阻害する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供される。
【００２９】
さらに、本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法であって、PPIL1とスタスミンまたはSNW1とを被験化合物の存在下で接触させる段階、および、PPIL1とスタスミンまたはSNW1との結合を阻害する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供する。
【００３０】
本出願はまた、癌などの細胞増殖性疾患を治療するための薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、例えば抗癌剤であってよい。薬学的組成物は、それぞれ配列番号：1、3、5、または7に提示および記載されたWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリヌクレオチド配列のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドまたはsiRNAの少なくとも一部として記載することができる。適したアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、配列番号：16、37、44、または89の群より選択されるヌクレオチド配列を含む。配列番号：16のヌクレオチド配列を有するものを含む、WDRPUHアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、肝臓癌および胃癌の治療に好適に使用でき；配列番号：37のヌクレオチド配列を有するものを含む、KRZFPUHのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、肝臓癌、胃癌および肺癌の治療に好適に使用でき；配列番号：44のヌクレオチド配列を有するものを含む、PPIL1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、結腸癌の治療に好適に使用でき；ならびに、配列番号：89のヌクレオチド配列を有するものを含む、APCDD1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、結腸直腸癌の治療に好適に使用できる。
薬学的組成物は、細胞増殖性疾患の治療のための化合物に関する本スクリーニング方法によって選択された化合物を含むものであってもよい。
【００３１】
薬学的組成物の作用経路は癌細胞の増殖を阻害するものであることが望ましい。薬学的組成物は、ヒトおよび家畜を含む、哺乳動物に対して適用しうる。
【００３２】
本発明はさらに、本発明によって提供される薬学的組成物を用いて細胞増殖性疾患を治療するための方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを投与する段階を含む、癌の治療または予防のための方法も提供する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドの投与により、抗腫瘍免疫が誘導されると考えられる。したがって、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを投与する段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導するための方法、ならびにWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを含む、癌の治療または予防のための薬学的組成物も提供する。
【００３４】
本発明の前記の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであって、本発明または本発明のその他の代替的な態様を制限するものではないことが理解される。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書で用いる「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
【００３６】
本出願では，対応する非癌肝組織に比べてHCCでその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHを同定する。WDRPUH cDNAは、配列番号：1に示された1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、11個のWD40反復ドメインを有する推定620アミノ酸のタンパク質をコードする。このため、このタンパク質はWDRPUH（WD40 repeats protein up-regulated in HCCs）と命名された。一方、KRZFPUH cDNAは、配列番号：3に示された1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、Kruppel型ジンクフィンガードメインを含む推定500アミノ酸のタンパク質をコードする。このため、このタンパク質はKRZFPUH（Krupple-type zinc finger protein up-regulated in HCCs）と命名された。
【００３７】
さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて結腸直腸癌でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子PPIL1およびAPCDD1も含む。PPIL1 cDNAは、配列番号：5に示された498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、推定166アミノ酸のタンパク質をコードする。PPIL1は、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質であるSKI相互作用タンパク質（SNW1）および細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質であるスタスミンと直接会合する。一方、APCDD1 cDNAは、配列番号：7に示された1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、既知のモチーフを含まない推定514アミノ酸のタンパク質をコードする。この遺伝子はAPCDD1（down-regulated by APC1）と命名された。さらに、APCDD1の発現はβカテニン/Tcf 4複合体とAPCDD1の転写調節領域内の2つのTcf/LEF結合モチーフとの結合によって増強される。
【００３８】
細胞におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の外因性発現は常に細胞増殖の亢進をもたらし、一方、アンチセンスS-オリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）によるその発現の抑制は癌細胞の顕著な増殖阻害をもたらした。これらの所見は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1が癌細胞に発癌活性を与えること、およびこれらのタンパク質の活性の阻害が癌の治療のための有望な戦略となりうることを示唆する。
【００３９】
本発明は、配列番号：1に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子WDRPUHのほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含むWDRPUHタンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。WDRPUHと機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトWDRPUHタンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトWDRPUHタンパク質の変異体が含まれる。
【００４０】
本発明はまた、配列番号：3に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子KRZFPUHのほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：4に示されたアミノ酸配列を含むKRZFPUHタンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。KRZFPUHと機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトKRZFPUHタンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトKRZFPUHタンパク質の変異体が含まれる。
【００４１】
さらに、本発明は、配列番号：5に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子PPIL1のほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：6に示されたアミノ酸配列を含むPPIL1タンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。PPIL1と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトPPIL1タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトPPIL1タンパク質の変異体が含まれる。
【００４２】
本発明においてはさらに、配列番号：7に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子APCDD1のほか、その縮重物および変異体も、配列番号：8に示されたアミノ酸配列を含むAPCDD1タンパク質またはその機能的同等物をコードする限りは含まれる。APCDD1と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトAPCDD1タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトAPCDD1タンパク質の変異体が含まれる。
【００４３】
本発明において、「機能的に同等な」という用語は、対象ポリペプチドが、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のように細胞増殖を促進するとともに癌細胞に発癌活性を付与する活性を有することを意味する。対象ポリペプチドが細胞増殖活性を有するか否かは、対象ポリペプチドをコードするDNAをそれぞれのポリペプチドを発現する細胞に導入し、細胞の増殖の促進またはコロニー形成活性の上昇を検出することによって判定される。このような細胞には、例えば、WDRPUHに対してはNIH3T3細胞、SNU475細胞、およびHepG2細胞；ならびに、KRZFPUHに対してはCOS7細胞、およびAlexander細胞；PPIL1に対してはNIH3T3細胞、HCT116細胞、SW480細胞、SNU-C4細胞、およびSNU-C5細胞；ならびにAPCDD1に対してはLoVo細胞およびSW480細胞が含まれる。または、対象ポリペプチドが、PPIL1と機能的に同等であるか否かを、そのSNW1またはスタスミン（stathmin）との結合能を検出することによって判定することもできる。
【００４４】
所定のタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを作製するための方法は当業者に周知であり、これにはタンパク質に変異を導入する既知の方法が含まれる。例えば、当業者は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列に部位特異的突然変異誘発法によって適切な変異を導入することによって作製することができる（Hashimoto-Gotohら、Gene 152: 271-275 (1995)；ZollerおよびSmith、Methods Enzymol 100: 468-500 (1983)；Kramerら、Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；KramerおよびFritz、Methods Enzymol 154: 350-367 (1987)；Kunkel、Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-492 (1985)；Kunkel、Methods Enzymol 85: 2763-2766 (1988)）。アミノ酸変異は自然下でも起こりうる。その結果生じる変異ポリペプチドがヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等であるという前提で、1つまたは複数のアミノ酸が変異したヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が本発明のポリペプチドに含まれる。このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般に10アミノ酸またはそれ未満、好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
【００４５】
変異タンパク質、またはある特定のアミノ酸配列の1つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である改変タンパク質は、元の生物学的活性を保つことが知られている（Markら、Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-5666 (1984)；ZollerおよびSmith、Nucleic Acids Res 10: 6487-6500 (1982)；Dalbadie-McFarlandら、Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。
【００４６】
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られる方法）。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および、以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；水酸基含有側鎖（S、T、Y）；硫黄原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；および芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。括弧内の文字はアミノ酸の一文字略号を示すことに注意されたい。
【００４７】
ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの一例は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を含む融合タンパク質である。融合タンパク質とは、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と他のペプチドまたはタンパク質との融合物のことであり、これは本発明に含まれる。融合タンパク質は、本発明のヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNAを他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとフレームが合致するように連結し、この融合DNAを発現ベクターに挿入して、それを宿主において発現させるといった当業者に周知の技法によって作製しうる。本発明のタンパク質と融合させるペプチドまたはタンパク質には制限はない。
【００４８】
本発明のタンパク質と融合させるペプチドとして用いうる既知のペプチドには、例えば、FLAG（Hoppら、Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)）、6個のHis（ヒスチジン）残基を含む6xHis、10xHis、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7タグ、HSVタグ、Eタグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、Bタグ、プロテインC断片などが含まれる。本発明のタンパク質と融合させうるタンパク質の例には、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（HA）、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）などが含まれる。
【００４９】
融合タンパク質は、上に考察したように融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAと、本発明のポリペプチドをコードするDNAとを融合させ、作製された融合DNAを発現させることによって作製しうる。
【００５０】
機能的に同等なポリペプチドを単離するための当技術分野で知られた代替的な方法には、例えば、ハイブリダイゼーション法を用いる方法がある（Sambrookら、「Molecular Cloning」第2版、9.47-9.58、Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)）。当業者は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNA配列（すなわち、配列番号：1、3、5、または7）の全体または部分に対して高い相同性を有するDNAを容易に単離して、単離されたDNAからヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを単離することができる。本発明のポリペプチドには、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNA配列の全体または部分とハイブリダイズするDNAによってコードされ、そしてヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子によってコードされるポリペプチド）が含まれる。ヒトWDRPUHタンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、精巣からの組織を用いることが特に好ましい。また、ヒトKRZFPUHをコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、胎盤または精巣からの組織を用いることが特に好ましい。さらに、ヒトPPIL1タンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、心臓、骨格筋、精巣、甲状腺、または副腎からの組織を用いることが特に好ましく；ヒトAPCDD1タンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、または末梢白血球からの組織を用いることが好ましく、特に好適には、心臓、膵臓、前立腺、または卵巣からの組織が用いられる。
【００５１】
ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択されうる。例えば、30分間またはそれ以上にわたる68℃でのプレハイブリダイゼーションを「Rapid-hyb緩衝液」（アマシャムライフサイエンス（Amersham LIFE SCIENCE））を用いて行い、標識したプローブを添加した上で、1時間またはそれ以上にわたって68℃で加温することによって、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば、低ストリンジェント条件下で行いうる。低ストリンジェント条件とは、例えば、42℃、2X SSC、0.1％SDS、または好ましくは50℃、2X SSC、0.1％SDSのことである。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。高ストリンジェント条件とは、例えば、室温の2X SSC、0.01％SDS中での20分間の洗浄を3回行った後に、37℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を3回行い、50℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を2回行うことである。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすと考えられ、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
【００５２】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを、タンパク質をコードするDNAの配列情報（配列番号：1、3、5、または7）に基づいて合成したプライマーを用いて単離するために用いることもできる。
【００５３】
以上のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法によって単離されたDNAによってコードされる、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドは、通常、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは一般に、40％またはそれ以上、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を指す。ポリペプチドの相同性は、「WilburおよびLipman、Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-730 (1983)」中のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、その産生のために用いる細胞もしくは宿主または用いる精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に関して差異があってもよい。しかし、それが本発明のヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のポリペプチドと同等な機能を有する限り、それは本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法により、組換えタンパク質として調製することもでき、または天然タンパク質として調製することもできる。組換えタンパク質は、本発明のポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を含むDNA）を適切な発現ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞に導入して抽出物を入手した上で、抽出物をクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、もしくは本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにかけることによって、または上述のカラムの複数を組み合わせることによってポリペプチドを精製することにより、調製することができる。
【００５６】
同様に、本発明のポリペプチドを宿主細胞（例えば、動物細胞および大腸菌）の内部でグルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または多数のヒスチジンを追加した組換えタンパク質として発現させる場合には、発現した組換えタンパク質をグルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。また、本発明のポリペプチドをc-myc、多数のヒスチジン、またはFLAGで標識したタンパク質として発現させる場合には、それぞれc-myc、His、またはFLAGに対する抗体を用いてそれを検出して精製することができる。
【００５７】
融合タンパク質を精製した後に、必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子で切断することにより、目的のポリペプチド以外の領域を除外することも可能である。
【００５８】
天然のタンパク質は、当業者に知られた方法によって、例えば、下記のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、本発明のポリペプチドを発現する組織または細胞の抽出物と接触させることによって単離することができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【００５９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの部分（partial）ペプチドも含む。部分ペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的なアミノ酸配列を有し、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは9アミノ酸またはそれ以上からなる。部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するために、本発明のポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングするために、および本発明のポリペプチドの促進物質または阻害物質をスクリーニングするために、用いることができる。
【００６０】
本発明の部分ペプチドは、遺伝子操作により、既知のペプチド合成方法により、または本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで消化することにより、作製可能である。ペプチド合成のためには、例えば、固相合成または液相合成を用いうる。
【００６１】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上記のように本発明のポリペプチドのインビボもしくはインビトロでの産生のために用いることができ、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的異常に起因する疾患に対する遺伝子治療のために用いることもできる。mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドを含む、本発明のポリヌクレオチドのいかなる形態を、それが本発明のポリペプチドをコードする限りは、用いることができる。本発明のポリヌクレオチドには、所定のヌクレオチド配列を含むDNAのほかに、その縮重配列も、結果として生じるDNAが本発明のポリペプチドをコードする限りは、含まれる。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に知られた方法によって作製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現する細胞からcDNAライブラリーを作製し、本発明のDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7）の部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことによって作製することができる。cDNAライブラリーは、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法によって作製しうる；または、市販のcDNAライブラリーを用いてもよい。cDNAライブラリーは、本発明のポリペプチドを発現する細胞からRNAを抽出し、本発明のDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7）の配列に基づいてオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、そして本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅することによって作製することもできる。
【００６３】
さらに、得られたcDNAのヌクレオチドのシークエンシングを行うことにより、cDNAによりコードされる翻訳領域を慣行的に決定し、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を容易に得ることができる。その上、得られたcDNAまたはその部分を用いてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
【００６４】
より具体的には、mRNAをまず、本発明の対象ポリペプチドが発現される細胞、組織または臓器（例えば、WDRPUHの場合は精巣；KRZFPUHの場合は胎盤または精巣；PPIL1の場合は心臓、骨格筋、精巣、甲状腺または副腎；そしてAPCDD1の場合は心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸または末梢白血球、好ましくは心臓、膵臓、前立腺または卵巣）から調製する。mRNAの単離には既知の方法が使用でき；例えば、全RNAはグアニジン超遠心（Chirgwinら、Biochemistry 18：5294-5299 (1979)）またはAGPC法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal Biochem 162：156-159 (1987)）によって調製できる。さらに、mRNAをmRNA精製キット（ファルマシア（Pharmacia））などを用いて全RNAから精製する、またはmRNAをQuickPrep mRNA精製キット（ファルマシア）によって直接精製することもできる。
【００６５】
得られたmRNAは、逆転写酵素を用いてcDNAを合成するために用いられる。cDNAは、AMV逆転写酵素第一鎖cDNA合成キット（生化学工業（Seikagaku Kogyo））などの市販のキットを用いて精製しうる。または、本明細書に記載のプライマー等、5'-Ampli FINDER RACEキット（クロンテック（Clontech））、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる5'-RACE法（Frohmanら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)；Belyavskyら、Nucleic Acids Res 17: 2919-2932 (1989)）に従って、cDNAの合成および増幅を行うこともできる。
【００６６】
所望のDNA断片をPCR産物から調製し、ベクターDNAと連結する。この組換えベクターを大腸菌などの形質転換に用い、選択したコロニーから所望の組換えベクターを調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（dideoxynucleotide chain termination）などの従来の方法によって検証する。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、発現のために用いる宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れることにより、より効率的に発現されるように設計することもできる（Granthamら、Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)）。本発明のポリヌクレオチドの配列を、市販のキットまたは従来の方法によって改変することもできる。例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適切なポリヌクレオチド断片の挿入、リンカーの付加、または開始コドン（ATG）および/もしくは終止コドン（TAA、TGAまたはTAG）の挿入によって配列を改変することができる。
【００６８】
具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を含むDNAを含む。
【００６９】
さらに、本発明は、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記の本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。当業者はストリンジェントな条件を適切に選択してよい。例えば、低ストリンジェント条件を用いることができる。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。これらの条件は上記のものと同じである。上記のハイブリダイズさせるDNAはcDNAまたは染色体DNAであることが好ましい。
【００７０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが内部に挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチド、特にDNAに本発明のポリペプチドを発現させるため、または本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療の目的で投与するために有用である。
【００７１】
大腸菌が宿主細胞であって、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue）の内部で大量に増幅および産生させる場合には、ベクターは、大腸菌内で増幅させるための「ori」、および、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有する必要がある。例えば、M13シリーズのベクター、pUCシリーズのベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどを用いることができる。さらに、上記のベクター同様、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7も、cDNAのサブクローニングおよび抽出のために用いることができる。本発明のタンパク質の産生のためにベクターを用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。例えば、大腸菌内で発現させようとする発現ベクターは、大腸菌内で増幅させるための上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現しうるプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら、Nature 341: 544-546 (1989)；FASEB J 6: 2422-2427 (1992)）、araBプロモーター（Betterら、Science 240: 1041-1043 (1988)）、またはT7プロモーターなどを有する必要がある。その点に関しては、例えば、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpressシステム」（キアゲン（Qiagen））、pEGFPおよびpET（この場合、宿主はT7RNAポリメラーゼを発現するBL21であることが好ましい）を上記のベクターの代わりに用いてもよい。さらに、ベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列をも含みうる。大腸菌の周辺質（periplasm）へのポリペプチド分泌を指令するシグナル配列の一例は、pelBシグナル配列（Leiら、J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば、塩化カルシウム法および電気穿孔法が含まれる。
【００７２】
大腸菌以外に、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロジェン（Invitrogen）)およびpEGF-BOS（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系」（ギブコBRL（GIBCO BRL））、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia発現キット」（インビトロジェン）、pNV11、SP-Q01）、および枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）を、本発明のポリペプチドの産生のために用いることもできる。
【００７３】
ベクターをCHO細胞、COS細胞またはNIH3T3細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターは、この種の細胞における発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（Mulliganら、Nature 277: 108 (1979)）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら、Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、CMVプロモーターなどを有する必要があるほか、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えば、ネオマイシン、G418）によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有することが好ましい。これらの特徴を備えた既知のベクターの例には、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。
【００７４】
さらに、本方法を、遺伝子を安定的に発現させるため、およびそれと同時に、細胞内の遺伝子のコピー数を増幅するために用いることもできる。例えば、相補的DHFR遺伝子を含むベクター（例えば、pCHO I）を、核酸合成経路が欠失したCHO細胞に導入した後に、メトトレキサート（MTX）によって増幅することができる。さらに、遺伝子の一過性発現の場合には、SV40の複製起点を含むベクター（pcDなど）を、SV40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に含むCOS細胞に形質転換導入する方法を用いることができる。
【００７５】
以上のようにして得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞の内部または外部（培地など）から単離して、実質的に純粋な均一なポリペプチドとして精製することができる。所定のポリペプチドに言及して本明細書で用いられる「実質的に純粋な」とは、そのポリペプチドが他の生体高分子から実質的に遊離していることを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量にして純度が少なくとも75％（例えば、少なくとも80、85、95または99％）である。純度は任意の適切な標準的方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定しうる。ポリペプチドの単離および精製のための方法は何らかの特定の方法には限定されない；実際には任意の標準的な方法を用いうる。
【００７６】
例えば、カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶化を適切に選択し、組み合わせて、ポリペプチドの単離および精製を行ってもよい。
【００７７】
クロマトグラフィーの例には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。これらのクロマトグラフィーを、HPLCおよびFPLCなどの液体クロマトグラフィーによって行ってもよい。したがって、本発明は、以上の方法によって調製された高純度のポリペプチドを提供する。
【００７８】
本発明のポリペプチドを、精製の前または後に適切なタンパク質修飾酵素でそれを処理することにより、随意に改変すること、または部分的に欠失させることも可能である。有用なタンパク質修飾酵素には、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、タンパク質キナーゼ、グルコシダーゼなどが非制限的に含まれる。
【００７９】
本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これにはウサギなどの動物を本発明のポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されたヒト化抗体が含まれる。
【００８０】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のポリペプチドは、任意の動物種に由来するものでよいが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のポリペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手しうる。
【００８１】
本発明によれば、免疫化抗原として用いるポリペプチドは、完全タンパク質でもよく、またはタンパク質の部分ペプチドでもよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ（N）末端またはカルボキシ（C）末端断片を含みうる。本明細書において、抗体は、本発明のポリペプチドの完全長または断片のいずれかと反応するタンパク質として定義される。
【００８２】
本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を既知の発現ベクターに挿入し、その後に本明細書に記載したような宿主細胞の形質転換に用いてもよい。所望のポリペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法によって宿主細胞の内部または外部から回収し、後に抗原として用いることができる。または、ポリペプチドを発現する細胞全体もしくはその可溶化物、または化学合成したポリペプチドを抗原として用いてもよい。
【００８３】
いかなる哺乳動物も抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯類（Rodentia）、ウサギ目（Lagomorpha）、または霊長類（Primate）の動物が用いられる。齧歯類の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長類の動物には、例えば、狭鼻猿類（Catarrhini）（旧世界サル）のサル、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル、マントヒヒ（sacred baboon）およびチンパンジーが含まれる。
【００８４】
動物を抗原で免疫するための方法は当技術分野で周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的に述べると、抗原を希釈して適切な量のリン酸緩衝食塩水（PBS）、生理食塩水などの中に懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適切な量の標準的アジュバントと混合して乳濁液とした上で哺乳動物に対して投与してもよい。その後に、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原の投与を4〜21日毎に数回行うことが好ましい。適切な担体を免疫化のために用いてもよい。上記のような免疫化の後に、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法によって検討する。
【００８５】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を、血清中の所望の抗体の増加に関して検討した免疫後の哺乳動物から血液を採取し、従来の任意の方法によって血液から血清を分離することによって調製することもできる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含む血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離することもできる。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のポリペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインAカラムまたはプロテインGカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【００８６】
モノクローナル抗体を調製するためには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を収集し、上記の通りに血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は脾臓から入手することが好ましい。上記の免疫細胞と融合させるためのその他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【００８７】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Milsteinら（GalfreおよびMilstein、Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って融合させることができる。
【００８８】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択しうる。細胞培養は通常、HAT培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である、数日間から数週間にわたって続けられる。その後に、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングおよびクローニングのために標準的な限界希釈を行う。
【００８９】
ハイブリドーマ調製用に非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの可溶化物によりインビトロで免疫することもできる。続いて、免疫後のリンパ球を、無限に分裂しうるU266などのヒト由来の骨髄腫細胞と融合させ、ポリペプチドと結合しうる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭63-17688号）。
【００９０】
得られたハイブリドーマを続いてマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムによって精製しうる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。さらに、この抗体を、本発明のポリペプチドと関連のある疾患に対する抗体療法に適用することもできる。得られた抗体を人体に対して投与する場合には（抗体療法）、免疫原性を抑えるためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【００９１】
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物は、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの可溶化物から選択される抗原で免疫することができる。続いて、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そのハイブリドーマからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる（国際公開公報第92-03918号、国際公開公報第93-2227号、国際公開公報第94-02602号、国際公開公報第94-25585号、国際公開公報第96-33735号、および国際公開公報第96-34096号を参照のこと）。
【００９２】
または、免疫したリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を、癌遺伝子によって不死化させ、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【００９３】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて組換えにより調製してもよい（例えば、BorrebaeckおよびLarrick、「Therapeutic Monoclonal Antibodies」、MacMillan Publishers LTD（英国）より刊行(1990)、を参照）。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などの免疫細胞からクローニングして適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製した組換え抗体も提供する。
【００９４】
さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの1つまたは複数と結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片を適切なリンカーによって連結した一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Hustonら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883 (1988)）。より具体的に述べると、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって抗体断片を作製することもできる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して発現ベクターに挿入した上で、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Coら、J Immunol 152: 2968-2976 (1994)；BetterおよびHorwitz、Methods Enzymol 178: 476-496 (1989)；PluckthunおよびSkerra、Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi、Methods Enzymol 121: 652-663 (1986)；Rousseauxら、Methods Enzymol 121: 663-669 (1986)；BirdおよびWalker、Trends Biotechnol 9: 132-137 (1991)を参照されたい）。
【００９５】
抗体を、ポリエチレングリコール（PEG）などの種々の分子と結合させることによって修飾することもできる。本発明は、このような修飾抗体を提供する。修飾抗体は抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は当技術分野で慣例的である。
【００９６】
または、本発明の抗体を、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体の定常領域とのキメラ抗体として、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）および定常領域を含むヒト化抗体として入手することもできる。このような抗体は、既知の技術を用いて調製可能である。
【００９７】
以上のようにして得られた抗体を均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体を、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って分離および精製することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動など（しかし、これらには限定されない）を適切に選択・組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（「A Laboratory Manual」、HarlowおよびDavid Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムはアフィニティーカラムとして用いうる。用いられるプロテインAカラムの例には、例えば、ハイパーD、POROSおよびセファロースF.F.（ファルマシア）が含まれる。
【００９８】
クロマトグラフィーの例には、アフィニティークロマトグラフィーを除いて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィーの手順を、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うこともできる。
【００９９】
本発明の抗体の抗原結合活性を測定するには、例えば、吸光度、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、放射免疫アッセイ法（RIA）および/または免疫蛍光検査法を用いうる。ELISAの場合には、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のポリペプチドをプレートに対して添加した後に、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。続いて、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加して、試料の抗原結合活性を評価するために吸光度を測定する。C末端断片またはN末端断片といったポリペプチドの断片を、ポリペプチドとして用いてもよい。BIAcore（ファルマシア）を、本発明による抗体の活性の評価に用いてもよい。
【０１００】
以上の方法は、本発明の抗体を本発明のポリペプチドを含むと想定される試料に対して曝露させ、抗体およびポリペプチドによって形成された免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のポリペプチドの検出または測定を可能にする。
【０１０１】
本発明によるポリペプチドの検出または測定の方法はポリペプチドを特異的に検出または測定することが可能であるため、本方法はポリペプチドが用いられる種々の実験に有用と思われる。
【０１０２】
本発明はまた、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号：1、3、5、または7）またはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするDNAと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましい。本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、他のタンパク質のコードするDNAとのクロスハイブリダイゼーションが、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、顕著には起こらないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードするDNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズする、プローブ、プライマー、ヌクレオチド、およびヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム）が含まれる。さらに、このようなポリヌクレオチドをDNAチップの調製のために利用することもできる。
【０１０３】
本発明は、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列の内部のいずれかの部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列のうち少なくとも15個の連続したヌクレオチドに対するものであることが好ましい。上記の少なくとも15個の連続したヌクレオチド中に1つの開始コドンを含む、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに好ましい。より具体的に述べると、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドには、WDRPUHの発現を抑制する目的で配列番号：16のヌクレオチド配列を；KRZFPUHの場合には配列番号：37のヌクレオチド配列を；PPIL1の場合には配列番号：44のヌクレオチド配列を；APCDD1の場合には配列番号：89のヌクレオチド配列を含むものが含まれる。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。このような修飾産物の例には、メチルホスホネート型またはエチルホスホネート型などの低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれる。
【０１０５】
本明細書で用いる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、DNAまたはmRNAの特定領域を構成するものに対応するヌクレオチドが完全に相補的であるものだけでなく、1つまたは複数のヌクレオチドにミスマッチがあるものも、そのDNAまたはmRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズしうる限りは含まれる。
【０１０６】
このようなポリヌクレオチドは、「少なくとも15個の連続したヌクレオチド配列の領域」内に、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するものとして含まれる。相同性の決定には本明細書に述べるアルゴリズムを用いうる。このようなポリヌクレオチドは、以下の実施例の項で述べるように、本発明のポリペプチドをコードするDNAの単離もしくは検出のためのプローブとして、または増幅用のプライマーとして有用である。
【０１０７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAと結合し、その転写または翻訳を阻害して、mRNAの分解を促進し、本発明のポリペプチドの発現を阻害して、それによってポリペプチドの機能を阻害することにより、本発明のポリペプチドを産生する細胞に対して作用する。
【０１０８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、誘導体に対して活性のない適した基材と混合することにより、リニメント剤または湿布剤などの外用製剤の形にすることができる。
【０１０９】
同様に、必要に応じて、誘導体を、賦形剤、等張剤、溶解補助剤、安定剤、保存料、鎮痛薬などを添加することにより、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻薬および凍結乾燥製剤として製剤化することもできる。これらは通常の方法に従って調製可能である。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、罹患部位に対して直接外用することにより、またはそれが罹患部位に到達するように血管内に注入することにより、患者に対して投与される。持続性および膜透過性を高めるためにアンチセンス用封入剤を用いることもできる。その例には、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体がある。
【０１１１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に従って適切に調整した上で、望ましい量を用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgの範囲の用量を投与することができる。
【０１１２】
本発明はまた、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列のセンス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含む、低分子干渉RNA（siRNA）も含む。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子のことを指す。siRNAを細胞に導入するためには、RNAを転写するための鋳型としてDNAを用いることを含む、標準的な技法が用いられる。このsiRNAは、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリペプチド（配列番号：1、3、5、または7）のセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、例えばヘアピンのように、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有するように構築される。
【０１１３】
本方法は、例えば細胞の悪性トランスフォーメーションの結果、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現が上方制御されている細胞における遺伝子発現を変化させるために用いられる。標的細胞におけるsiRNAとWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1転写物との結合は、細胞によるタンパク質産生の減少を引き起こす。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然の転写物程度の長さであってもよい。オリゴヌクレオチドは19〜25ヌクレオチド長であることが好ましい。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは75、50、または25ヌクレオチド長である。哺乳動物細胞における発現を阻害するWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1 siRNAオリゴヌクレオチドの例には、配列番号：93〜103のいずれかを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの配列はそれぞれ、以下のsiRNA配列の標的配列である。
配列番号：93、配列番号：24、および25（WDRPUH）；
配列番号：94、配列番号：26、および27（WDRPUH）；
配列番号：95、配列番号：28、および29（WDRPUH）；
配列番号：96、配列番号：30、および31（WDRPUH）；
配列番号：97、配列番号：104、および105（KRZFPUH）；
配列番号：98、配列番号：106、および107（KRZFPUH）；
配列番号：99、配列番号：108、および109（KRZFPUH）；
配列番号：100、配列番号：110、および111（KRZFPUH）；
配列番号：101、配列番号：47、および48（PPIL1）；
配列番号：102、配列番号：49、および50（PPIL1）；ならびに
配列番号：103、配列番号：51、および52（PPIL1）。
【０１１４】
これらのsiRNAのヌクレオチド配列は、アンビオン社（Ambion）のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手可能なsiRNA設計用のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。siRNAに関するヌクレオチド配列は、コンピュータプログラムにより、以下のプロトコールに基づいて選択される。
【０１１５】
siRNA標的部位の選択：
1．目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'側に隣接した19ヌクレオチドの出現率をsiRNA標的の可能性がある部位として記録する。Tuschlらは、siRNAを5'および3'非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン付近（75塩基内）の領域に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらの領域には調節タンパク質の結合部位が多く含まれる可能性があるためである。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2．標的の可能性がある部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有するどの標的領域も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはNCBIのサーバー：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上にある。
3．合成用の適格な標的配列を選択する。アンビオン社では、遺伝子の全長に沿っていくつかの標的配列を評価用に選択することができる。
【０１１６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは本発明のポリペプチドの発現を阻害し、そのため、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害物質も、それらが本発明のポリペプチドの生物学的活性を阻害しうるという点で有用である。このため、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は癌などの細胞増殖性疾患の治療に有用である。
【０１１７】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの発現レベルを診断マーカーとして利用して、細胞増殖性疾患を診断するための方法も提供する。
【０１１８】
この診断方法は、（a）本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを検出する段階、および（b）発現レベルの上昇を癌などの細胞増殖性疾患と関連づける段階を含む。
【０１１９】
個々の標本におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1遺伝子に対応するmRNA、またはWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1遺伝子によってコードされるタンパク質を定量することによって評価することができる。mRNAの定量法は当業者に周知である。例えば、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子に対応するmRNAのレベルは、ノーザンブロット分析またはRT-PCRによって評価しうる。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の完全長ヌクレオチド配列は配列番号：1、3、5、または7に示されているため、当業者はいずれも、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子を定量するためのプローブまたはプライマーのヌクレオチド配列を設計することができる。
【０１２０】
WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて分析することもできる。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の量を決定するための方法は以下に示されている。例えば、免疫アッセイ法は、生物材料におけるタンパク質の決定に有用である。いかなる生物材料も、タンパク質またはその活性の決定に有用な可能性がある。例えば、血液試料は、血清マーカーによってコードされるタンパク質の評価を目的として分析される。一方、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するためには、分析しようとする各タンパク質の活性に応じて適した方法が選択されうる。
【０１２１】
標本（被験試料）におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料における発現レベルと比較する。このような比較によって標的遺伝子の発現レベルが正常試料における発現レベルよりも高いことが示された場合には、その対象は細胞増殖性疾患に罹患していると判断される。正常試料由来および対象由来の標本におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは同時に決定してもよい。または、あらかじめ対照群から採取しておいた標本の遺伝子発現レベルを分析することで得た結果に基づく統計学的方法によって、発現レベルの正常範囲を決定することもできる。対象の試料をその正常範囲と比較する；その結果が正常範囲内に収まらない場合には、対象は細胞増殖性疾患に罹患していると判断される。本発明において、診断しようとする細胞増殖性疾患は、好ましくは癌である。より好ましくは、WDRPUHまたはKRZFPUH遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料におけるものと比較する場合、診断しようとする細胞増殖性疾患は肝細胞癌である；ならびに、PPIL1またはAPCDD1遺伝子をその発現レベルに関して評価する場合には、診断しようとする疾患は結腸直腸癌である。さらに、KRZFPUH遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料におけるものと比較する場合、診断しようとする細胞増殖性疾患は肝細胞癌に加え胃癌または肺癌でもよい。
【０１２２】
本発明においては、肝細胞癌および結腸直腸癌を含む癌などの細胞増殖性疾患を診断するための診断薬も提供される。本発明の診断薬は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと結合する化合物を含む。本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、または本発明のポリペプチドと結合する抗体をこのような化合物として用いることが好ましい。
【０１２３】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを用いる、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法の1つの態様には、（a）被験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる段階、（b）本発明のポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階、および（c）本発明のポリペプチドと結合する化合物を選択する段階が含まれる。
【０１２４】
スクリーニングに用いる本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドでも天然のタンパク質でもよく、またはそれらの部分ペプチドでもよい。任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物（synthetic micromolecular compound）、および天然化合物を用いることができる。被験化合物と接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドを用いて、タンパク質、例えば本発明のポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降方法により、具体的には以下の様式で行うことができる。pSV2neo、pcDNA IおよびpCD8といった外来遺伝子用の発現ベクターに対して遺伝子を挿入することにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を動物細胞などで発現させる。発現のために用いるプロモーターは一般に用いうる任意のプロモーターでよく、これには例えば、SV40初期プロモーター（Rigby、Williamson（編）、「Genetic Engineering」第3巻、Academic Press、London、83-141 (1982)）、EF-1αプロモーター（Kimら、Gene 91: 217-223 (1990)）、CAGプロモーター（Niwaら、Gene 108: 193-200 (1991)）、RSV LTRプロモーター（Cullen、Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、SRαプロモーター（Takebeら、Mol Cell Biol 8: 466 (1988)）、CMV最初期プロモーター（SeedおよびAruffo、Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-3369 (1987)）、SV40後期プロモーター（GheysenおよびFiers、J Mol Appl Genet 1: 385-394 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufmanら、Mol Cell Biol 9: 946 (1989)）、HSV TKプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための動物細胞への遺伝子の導入は任意の方法に従って行うことができ、これには例えば、電気穿孔法（Chuら、Nucleic Acids Res 15: 1311-1326 (1987)）、リン酸カルシウム法（ChenおよびOkayama、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)）、DEAEデキストラン法（Lopataら、Nucleic Acids Res 12: 5707-5717 (1984)；SussmanおよびMilman、Mol Cell Biol 4: 1642-1643 (1985)）、リポフェクチン法（Derijard、B Cell 7: 1025-1037 (1994)；Lambら、Nature Genetics 5: 22-30 (1993)：Rabindranら、Science 259: 230-234 (1993)）などがある。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのN末端またはC末端に対する特異性が判明しているモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ-抗体系を用いることもできる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。例えばβ-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合タンパク質を、マルチクローニングサイトを用いることによって発現させうるベクターが市販されている。
【０１２６】
融合によって本発明のポリペプチドの性質を変えないように数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって作製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Hisタグ）、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7遺伝子10タンパク質（T7タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSVタグ）、Eタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ-抗体系として用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０１２７】
免疫沈降の場合には、適切な界面活性剤を用いて調製した細胞可溶化物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体を形成させる。免疫複合体は、本発明のポリペプチド、そのポリペプチドとの結合能があるポリペプチド、および抗体からなる。以上のエピトープに対する抗体を用いることに加えて、免疫沈降を本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて行うこともでき、これらの抗体は上記の通りに調製することができる。
【０１２８】
免疫複合体は、抗体がマウスIgG抗体であれば、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって沈降させることができる。本発明のポリペプチドをGSTなどのエピトープとの融合蛋白質として作製する場合には、これらのエピトープと特異的に結合する基質、例えばグルタチオン-セファロース4Bを用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる時と同じ様式で免疫複合体を形成させることができる。
【０１２９】
免疫沈降は、例えば、文献中に記載された方法に倣ってまたは従って行うことができる（HarlowおよびLane、「Antibodies」、511-52、Cold Spring Harbor Laboratory publications、New York (1988)）。
【０１３０】
SDS-PAGEは免疫沈降したタンパク質の分析に一般に用いられており、結合したタンパク質はゲルを適切な濃度で用いてタンパク質の分子量によって分析することができる。本発明のポリペプチドと結合したタンパク質をクーマシー染色または銀染色などの一般的な染色法によって検出することは困難であるため、タンパク質に関する検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培養液中で細胞を培養し、細胞内のタンパク質を標識した上でタンパク質を検出することによって改善することができる。タンパク質の分子量がわかっている場合には、標的タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製して、その配列を決定することができる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を、本ポリペプチドを用いてスクリーニングするための方法としては、例えば、ウエスト-ウエスタンブロット分析（Skolnikら、Cell 65：83-90 (1991)）を用いることができる。具体的には、細胞、組織、臓器（例えば、WDRPUHと結合するタンパク質のスクリーニングのためには精巣；KRZFPUHと結合するタンパク質のスクリーニングのためには精巣および胎盤；PPIL1と結合するタンパク質のスクリーニングのためには心臓、骨格筋、精巣、甲状腺、および副腎；ならびにAPCDD1と結合するものに関しては心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢白血球、などの組織）または本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ファージベクター（例えば、ZAP）を用いてcDNAライブラリーを作製し、タンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現したタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識がなされた本発明のポリペプチドを上記のフィルターと反応させ、かつ本発明のポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することで、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンの結合を利用することにより、または本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体、または本発明のポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えば、GST）を利用することにより標識できる。放射性同位体または蛍光などを用いる方法を使用してもよい。
【０１３２】
または、本発明のスクリーニング方法のもう1つの態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いることもできる（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系（MATCHMAKER Two-Hybrid system）」「哺乳動物MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット（Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit）」「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系（MATCHMAKER one-Hybrid system）」（クロンテック）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系（HybriZAP Two-Hybrid Vector System）」（ストラタジーン（Stratagene））；参考文献「DaltonおよびTreisman、Cell 68: 597-612 (1992)」「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。
【０１３３】
2-ハイブリッド系では、本発明のポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現すると予想される細胞から、ライブラリーが発現した場合にVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させるように、cDNAライブラリーを作成する。続いてcDNAライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリーに由来するcDNAを単離する（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を酵母細胞で発現させる場合には、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる）。cDNAによってコードされるタンパク質は、以上のようにして単離したcDNAを大腸菌に導入してタンパク質を発現させることによって調製しうる。
【０１３４】
レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化し、本発明のポリペプチドと結合しうるタンパク質を含む被験化合物をカラムに対して適用してもよい。本明細書における被験化合物は、例えば、細胞抽出物、細胞可溶化物などであってよい。被験化合物のローディング後に、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。
【０１３６】
被験化合物がタンパク質である場合には、得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析して、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、そのオリゴDNAを、タンパク質をコードするDNAを得るためのプローブとして用いて、cDNAライブラリーをスクリーニングする。
【０１３７】
表面プラスモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合した化合物の検出または定量のための手段として本発明に用いることもできる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、本発明のポリペプチドと被験化合物との相互作用を表面プラスモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、本発明のポリペプチドと被験化合物との結合を評価することが可能である。
【０１３８】
本発明の固定化されたポリペプチドを合成化合物、または天然物バンク、またはランダムなファージペプチドディスプレイライブラリーに対して曝露させた場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、本発明のタンパク質と結合するタンパク質だけでなく化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、コンビナトリアル化学に基づくハイスループット技法を用いたスクリーニング方法（Wrightonら、Science 273: 458-64 (1996)；Verdine、Nature 384: 11-13 (1996)；Hogan、Nature 384: 17-9 (1996)）は当業者に周知である。
【０１３９】
このスクリーニングによって単離される化合物は、例えば、癌などの細胞増殖性疾患に起因する疾患の治療または予防を目的として、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する薬剤の候補である。本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する、本スクリーニング方法によって得られた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。
【０１４０】
さらにもう1つの態様において、本発明は、細胞増殖性疾患の治療において標的となる可能性のある候補物質をスクリーニングするための方法を提供する。以上に詳細に考察したように、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルを制御することにより、癌の発症または進行を制御することが可能である。このため、細胞増殖性疾患の治療における標的の可能性がある候補物質を、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルおよび活性を指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の状況において、このようなスクリーニングには、例えば、
a）候補化合物を、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1を発現する細胞と接触させる段階；および
b）WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階が含まれていてもよい。
【０１４１】
WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1のうち少なくとも1つを発現する細胞には、例えば、HCCまたは結腸直腸癌から樹立された細胞株が含まれる；このような細胞は本発明の上記のスクリーニングのために用いることができる。発現レベルは当業者に周知の方法によって評価しうる。このスクリーニング方法では、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1のうち少なくとも1つの発現レベルを低下させる化合物を候補薬剤として選択することができる。
【０１４２】
本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法のもう1つの態様において、本方法は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を指標として用いる。本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1タンパク質は細胞増殖を促進する活性を有するため、本発明のこれらのタンパク質のいずれかのこの活性を促進または阻害する化合物を、この活性を指標として用いてスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、（a）被験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる段階、（b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階、および（c）被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較してポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階を含む。
【０１４３】
いかなるポリペプチドも、それらがWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の生物学的活性を有する限り、スクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の細胞増殖活性、PPIL1のSNW1またはスタスミンと結合する活性が含まれる。例えば、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを用いることもできる。このようなポリペプチドは細胞によって内因性に発現させても外因性に発現させてもよい。
【０１４４】
任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物、または天然化合物を用いることができる。
【０１４５】
このスクリーニングによって単離される化合物は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドの機能を、そのポリペプチドとの結合によって活性化する分子を指す。同様に、「アンタゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドの機能を、そのポリペプチドとの結合によって阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のポリペプチドと分子（DNAおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補でもある。
【０１４６】
本方法において検出しようとする生物学的活性が細胞増殖である場合には、実施例の項に記載のように、例えば、本発明のポリペプチドを発現する細胞を作製し、細胞を被験化合物の存在下で培養して、細胞増殖の速度を評価し、細胞周期などを測定することにより、さらにはコロニー形成活性を測定することにより、生物学的活性を検出することができる。
【０１４７】
以上のスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のポリペプチドの活性を阻害する薬剤の候補であり、本発明のポリペプチドと関連のある疾患、例えば、癌を含む細胞増殖性疾患の治療に応用することができる。より具体的には、WDRPUHまたはKRZFPUHタンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は肝細胞癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。また、KRZFPUHタンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は肝細胞癌のほか、胃癌または肺癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。一方、PPIL1またはAPCDD1タンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は結腸直腸癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。
【０１４８】
さらに、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。
【０１４９】
または、本発明のスクリーニング方法は、
a）1つまたは複数のマーカー遺伝子がWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1からなる群より選択され、この1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞に、候補化合物を接触させる段階；
b）前記レポーター遺伝子の活性を測定する段階；ならびに
c）前記レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して低下させる化合物を選択する段階を含みうる。
【０１５０】
適したレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野で周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いることによって作製しうる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知である場合には、これまでの配列情報を用いることによってレポーター構築物を作製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合には、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントを、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから単離することができる。
【０１５１】
さらに、本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための方法のもう1つの態様において、本方法はAPCDD1のプロモーター領域を用いる。本発明によれば、βカテニン/Tcf4複合体は、APCDD1遺伝子の転写調節領域内にある2つのTcf/LEF結合モチーフと結合し、かつAPCDD1の転写活性化にかかわっていることが見いだされた。したがって、APCDD1の転写活性化を阻害する化合物は、本発明のAPCDD1ポリペプチドの活性を阻害する薬剤の候補としての役を果たし、このポリペプチドと関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、特に結腸直腸癌の治療に応用することができる。
【０１５２】
このスクリーニング方法は、（a）APCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフをレポーター遺伝子の上流に含むベクターを構築する段階；（b）段階（a）のベクターによって細胞の形質転換を行う段階；（c）βカテニン/Tcf 4複合体の存在下、被験化合物を段階（b）の細胞と接触させる段階；（d）レポーター遺伝子の発現を検出する段階；および（e）レポーター遺伝子の発現を被験化合物の非存在下と比較して抑制する被験化合物を選択する段階を含む。
【０１５３】
任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物（synthetic micromolecular compound）、天然化合物を用いることができる。
【０１５４】
このスクリーニングは、例えば、実施例28に記載された方法に従って実施しうる。例えば、レポーター遺伝子の上流にAPCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフを含むベクターは、レポーター遺伝子を含む発現ベクターに、APCDD1のプロモーター領域を挿入することによって構築することができる。APCDD1のプロモーター領域は、ヒトAPCDD1遺伝子（配列番号：7）の5'領域をプローブとして用いて、ゲノムライブラリーから入手できる。βカテニンおよびTcf-4は実施例28のようにして調製することができる。
【０１５５】
発現が検出可能である限り、任意のレポーター遺伝子をスクリーニングに用いることができる。レポーター遺伝子の例には、β-gal遺伝子、CAT遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子の発現の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じて行うことができる。ベクターを導入する細胞としては特に制限はないが、好ましい例としてはHeLa細胞が挙げられる。
【０１５６】
スクリーニングによって単離された化合物は、本発明のAPCDD1タンパク質の発現を阻害する薬剤の候補であり、APCDD1タンパク質と関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、より具体的には結腸直腸癌の治療に応用することができる。さらに、APCDD1タンパク質の転写活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。
【０１５７】
本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための方法のさらにもう1つの態様において、本方法はPPIL1のSNW1（SKI相互作用タンパク質）またはスタスミンとの結合能力を利用する。本発明のPPIL1タンパク質は、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質、SNW1、および細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質、スタスミンと会合することが判明している。これらの所見は、本発明のPPIL1タンパク質が、SNW1およびスタスミンなどの分子との結合によって細胞増殖の機能を発揮することを示唆する。このため、PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害して細胞増殖を抑制することが考えられ、この結合を阻害する化合物は癌などの細胞増殖性疾患を治療するための医薬品として役立つと考えられる。本方法を用いてスクリーニングされた化合物により治療される細胞増殖性疾患は、好ましくは結腸直腸癌である。
【０１５８】
このスクリーニング方法は、（a）被験化合物の存在下で本発明のポリペプチドをスタスミンまたはSNW1と接触させる段階；（b）ポリペプチドとスタスミンまたはSNW1との結合を検出する段階；および（c）ポリペプチドとスタスミンまたはSNW1との結合を阻害する化合物を選択する段階を含む。
【０１５９】
このスクリーニングに用いられる本発明のPPIL1ポリペプチド、およびSNW1またはスタスミンは、組換えポリペプチドでも天然のタンパク質でもよく、または、相互の結合能を保っている限り、それらの部分ペプチドでもよい。スクリーニングに用いられるPPIL1ポリペプチド、SNW1またはスタスミンは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。
【０１６０】
任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物および天然化合物を用いることができる。
【０１６１】
PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害する化合物に関するスクリーニングの方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このようなスクリーニングは、インビトロアッセイ系、例えば細胞系において行うことができる。より具体的には、まず、PPIL1ポリペプチドまたはSNW1もしくはスタスミンのいずれかを支持体に対して結合させ、それに対してもう一方のタンパク質を被験試料とともに添加する。次に、混合物をインキュベートし、洗浄した上で、支持体と結合したもう一方のタンパク質を検出および/または測定する。
【０１６２】
タンパク質を結合させるために用いうる支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれる；以上の材料から作製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を用いることが好ましい。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填してもよい。
【０１６３】
タンパク質は、化学的結合および物理的吸着などの慣行の方法に従って支持体に結合させることができる。または、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンとビオチンの結合を利用して、タンパク質を支持体に結合させることもできる。
【０１６４】
タンパク質同士の結合は、緩衝液がタンパク質同士の結合を阻害しない限りは、例えばこれらに限定されないがリン酸緩衝液およびTris緩衝液の緩衝液中で行われる。
【０１６５】
本発明において、表面プラスモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合したタンパク質の検出または定量のための手段として用いることもできる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、タンパク質同士の相互作用を表面プラスモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、PPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を評価することが可能である。
【０１６６】
または、PPIL1ポリペプチドまたはSNW1もしくはスタスミンのいずれかを標識し、結合したタンパク質の標識を、結合したタンパク質の検出または測定に用いることもできる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識したタンパク質を被験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、洗浄後、結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。
【０１６７】
本方法におけるタンパク質の標識のためには、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン）およびビオチン/アビジンなどの標識物質を用いることができる。タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定を液体シンチレーションによって行うことができる。または、酵素で標識したタンパク質は、呈色などの基質の酵素的変化を検出するために、酵素基質を添加して吸光光度計で検出または測定することもできる。さらに、蛍光物質を標識として用いる場合には、結合したタンパク質を蛍光光度計を用いて検出または測定することができる。
【０１６８】
さらに、PPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を、PPIL1ポリペプチドおよびSNW1またはスタスミンに対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定させたPPIL1ポリペプチドを被験化合物およびSNW1またはスタスミンと接触させた後に、混合物をインキュベートし、洗浄した上で、SNW1またはスタスミンに対する抗体を用いて検出または測定を行うことができる。または、SNW1またはスタスミンを支持体上に固定化し、PPIL1に対する抗体を抗体として用いてもよい。
【０１６９】
抗体を本スクリーニングに用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、標識物質に基づいて検出または測定を行うことが好ましい。または、標識物質で標識した二次抗体によって検出されるように、PPIL1ポリペプチド、SNW1またはスタスミンに対する抗体を一次抗体として用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインGまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定することもできる。
【０１７０】
または、本発明のスクリーニング方法のもう1つの態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いることもできる（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系」「哺乳動物MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット」「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系」（クロンテック）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系」（ストラタジーン）；参考文献「DaltonおよびTreisman、Cell 68: 597-612 (1992)」「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。
【０１７１】
2-ハイブリッド系では、本発明のPPIL1ポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞において発現させる。本発明のPPIL1ポリペプチドと結合するSNW1またはスタスミンをVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させ、被験化合物の存在下で酵母細胞において同様に発現させる。被験化合物がPPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を阻害しなければ、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる。
【０１７２】
レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。
【０１７３】
本スクリーニングによって単離される化合物は、本発明のPPIL1タンパク質の活性を阻害する薬剤の候補であり、PPIL1タンパク質と関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、より具体的には結腸直腸癌の治療に応用することができる。さらに、PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。
【０１７４】
本発明の方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患（例えば、癌）を治療するために、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、チンパンジーに対して調合薬として投与する場合には、単離された化合物を直接投与してもよく、または既知の薬剤調製法を用いて剤形に製剤化してもよい。例えば、必要に応じて、薬剤を糖衣錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口投与することもでき、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液である注射剤の形態として非経口的に投与することもできる。例えば、化合物を、一般に認められる薬剤の実現のために必要な単位用量の形で、薬理学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、媒質、保存料、結合剤などと混合することができる。これらの製剤における有効成分の量により、指定された範囲内にある適した投与量が得られる。
【０１７５】
錠剤およびカプセル剤に混合しうる添加剤の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの結合剤；結晶セルロースなどの媒質；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸などの膨潤剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、冬緑油およびチェリーなどの香味剤がある。単位投与剤形がカプセル剤である場合には、油などの液体担体も上記の成分にさらに含めることができる。注射用の滅菌混合物は、通常の薬剤の実現に倣って、注射用の蒸留水などの媒体を用いて製剤化することができる。
【０１７６】
生理食塩水、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトールおよび塩化ナトリウムなどの佐剤を含むその他の等張液を、注射用の水溶液として用いることができる。これらは適した可溶化剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール、Polysorbate 80(商標)およびHCO-50などの非イオン性界面活性剤などと組み合わせて用いることができる。
【０１７７】
ゴマ油またはダイズ油は油脂性液体として用いることができ、これらを可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いることもでき、さらにこれらをリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液；塩酸プロカインなどの鎮痛薬；ベンジルアルコール、フェノールなどの安定剤；および抗酸化剤とともに製剤化することもできる。調製された注射剤は適したアンプルに充填することができる。
【０１７８】
本発明の医薬化合物を、例えば動脈内注射、静脈内注射、皮下注射として、および同じく鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与または経口投与として患者に対して投与するためには、当業者によく知られた方法を用いることができる。投与量および投与方法は患者の体重および年齢ならびに投与方法に応じて異なる；しかし、当業者は慣行的にそれらを選択しうる。前記化合物がDNAによってコードされうる場合には、DNAを遺伝子治療用のベクターに挿入し、治療を行うためにそのベクターを投与することができる。投与量および投与方法は患者の体重、年齢および症状に応じて異なるが、当業者はそれらを適切に選択しうる。
【０１７９】
例えば、症状によって若干の違いはあるものの、本発明のポリペプチドと結合してその活性を調節する化合物の投与量は、標準的な成人（体重60kg）に対して経口投与する場合、約0.1mg〜約100mg/日、好ましくは約1.0mg〜約50mg/日、より好ましくは約1.0mg〜約20mg/日である。
【０１８０】
標準的な成人（体重60kg）に対して注射剤の形態として非経口的に投与する場合には、患者、標的臓器、症状および投与方法に応じて若干の違いはあるものの、約0.01mg〜約30mg/日、好ましくは約0.1〜約20mg/日、より好ましくは約0.1〜約10mg/日の用量を静脈注射することが好都合である。同じく、他の動物の場合にも、体重60kgに換算した量を投与することが可能である。
【０１８１】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる、癌などの細胞増殖性疾患の治療または予防のための方法を提供する。本方法によれば、本発明のポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1タンパク質の発現は癌細胞で上方制御されている上に、これらのタンパク質の発現の抑制は細胞増殖活性の低下をもたらすため、抗体とこれらのタンパク質との結合により、細胞増殖性疾患の治療または予防が可能であると考えられる。このため、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のタンパク質の活性を低下させるのに十分な投与量（これは0.1〜約250mg/kg/日の範囲にある）で投与される。成人に対する用量の範囲は一般に約5mg〜約17.5g/日であり、好ましくは約5mg〜約10g/日、最も好ましくは約100mg〜約3g/日である。または、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーと結合する抗体を薬物送達のためのツールとして用いることもできる。例えば、細胞障害物質を有した抗体を、腫瘍細胞を損傷させるのに十分な用量として投与する。
【０１８２】
本発明はまた、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1タンパク質もしくはその免疫活性断片、またはタンパク質のいずれか1つをコードする核酸およびその断片を投与する段階を含む方法にも関する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質またはその免疫活性断片は、細胞増殖性疾患に対するワクチンとして有用である。本発明において、細胞増殖性疾患に対するワクチンとは、動物に接種した時に抗腫瘍免疫を誘導する作用を有する物質のことを指す。一般に、抗腫瘍免疫には以下のような免疫応答が含まれる：
‐腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
‐腫瘍を認識する抗体の誘導、および
‐抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【０１８３】
したがって、ある特定のタンパク質が、動物に接種された時にこれらの免疫応答を誘導する場合には、そのタンパク質は抗腫瘍免疫誘導作用を有すると判定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、宿主におけるタンパク質に対する免疫系の応答をインビボまたはインビトロで観察することによって検出しうる。
【０１８４】
例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出するための方法はよく知られている。生体の内部に進入する外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に対して提示される。APCにより提示された抗原に対して抗原特異的な様式で応答したT細胞は、抗原による刺激のために細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化した後に増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、特定のペプチドによるCTL誘導は、そのペプチドをAPCによりT細胞に対して提示させ、CTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCにはCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球およびNK細胞を活性化する作用もある。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞も抗腫瘍免疫において重要であるため、これらの細胞の活性化作用を指標として用いてペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用を評価することができる。
【０１８５】
例えば、樹状細胞（DC）をAPCとして用いてCTLの誘導作用を評価するための方法は周知である。DCは最も強いCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、まず被験ポリペプチドをDCと接触させ、続いてこのDCをT細胞と接触させる。DCとの接触後に目的の細胞に対する細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、被験ポリペプチドが細胞障害性T細胞を誘導する活性を持つことが示される。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば、51Cr標識した腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH（ラクトースデヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法もよく知られている。
【０１８６】
APCとしては、DCに限らず、末梢血単核細胞（PBMC）を用いてもよい。この場合、CTLの誘導は、PBMCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で培養することによって増強されうることが報告されている。同様に、CTLは、PBMCをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下で培養することによっても誘導されることが示されている。
【０１８７】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化作用とそれに続くCTL誘導活性とを有するポリペプチドである。このため、腫瘍細胞に対するCTLを誘導するポリペプチドは腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドとの接触によって腫瘍に対するCTLを誘導する能力を獲得したAPCも腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示によって細胞障害性を獲得したCTLを腫瘍に対するワクチンとして用いることもできる。APCおよびCTLに起因する抗腫瘍免疫を用いた、腫瘍に対するこのような治療方法は、細胞免疫療法と呼ばれる。
【０１８８】
一般に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合には、構造の異なる複数のポリペプチドを併用し、それらをDCと接触させることによってCTL誘導の効率が高まることが知られている。このため、DCをタンパク質断片で刺激する場合には、多くの種類の断片の混合物を用いることが有利である。
【０１８９】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導を、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することもできる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、ポリペプチドで免疫した実験動物において誘導された場合、および腫瘍細胞の増殖がこのような抗体によって抑制された場合に、そのポリペプチドは抗腫瘍免疫を誘導する能力がある。
【０１９０】
抗腫瘍免疫は本発明のワクチンを投与することによって誘導され、これにより、HCCまたは結腸直腸癌の治療および予防が可能になる。癌に対する治療または癌の発症の予防効果には、癌細胞の増殖の阻害活性、癌の退縮、および癌の発症の抑制といった段階のいずれか一つが含まれうる。そのほかに、癌を有する個体の死亡率が低下し、血液中の腫瘍マーカーが減少し、癌に付随する検出可能な症状なども緩和されうる。このような効果は統計学的に有意である、例えば、癌の発症に対する治療効果または予防効果をワクチンを投与しない対照と比較して、5％またはそれ未満の有意水準での観測結果等が好ましい。統計分析には、例えば、スチューデントのt検定、マン-ホイットニーのU検定またはANOVAを用いうる。
【０１９１】
免疫学的活性を有する上記のタンパク質、またはタンパク質をコードするベクターを、アジュバントと併用してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と同時に（または連続して）投与した場合に、そのタンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバンなどが含まれるが、これらには限定されない。さらに、本発明のワクチンを薬学的に許容される担体と適宜配合してもよい。このような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれる。さらに、必要に応じて、安定剤、懸濁剤、保存料、界面活性剤などを含んでもよい。ワクチンは全身的または局所的に投与される。ワクチン投与は単回投与でもよく、または複数回投与により追加刺激されてもよい。
【０１９２】
APCまたはCTLを本発明のワクチンとして用いる場合に、腫瘍を、例えばエクスビボの方法によって治療または予防することができる。より具体的に述べると、治療または予防を受ける対象のPBMCを採取し、細胞をエクスビボでポリペプチドと接触させ、APCまたはCTLの誘導後に、細胞を対象に対して投与することができる。ポリペプチドをコードするベクターをPBMC中にエクスビボで導入することによってAPCを誘導することもできる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは投与前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷させる活性の高い細胞のクローニングおよび増殖を行うことにより、細胞免疫療法をさらに効率的に行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLは、細胞が由来する個体における細胞免疫療法のみならず、他の個体の同様の種類の腫瘍にも用いうる。
【０１９３】
さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌などの細胞増殖性疾患の治療または予防のための薬学的組成物も提供する。この薬学的組成物は抗腫瘍免疫を生じさせるために用いることができる。WDRPUHおよびKRZFPUHの通常の発現はそれぞれ精巣、ならびに胎盤および精巣に限局しており、このため、これらの遺伝子の抑制は他の臓器には有害な影響を及ぼさないと考えられる。したがって、WDRPUHおよびKRZFPUHポリペプチドは細胞増殖性疾患、特にHCCを治療するのに好ましい。
【０１９４】
以下の実施例は、本発明を例示するとともに、当業者によるその作成および使用を補助する目的で提示される。実施例はいかなる形でも本発明の範囲を限定することは意図していない。
【０１９５】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討においては本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書中に引用するいかなる特許、特許出願および刊行物も参照として本明細書に組み入れられる。
【０１９６】
発明を実施するための最良の態様
本発明は以下の実施例によって詳細に例示されるが、これらの実施例には限定されない。
【０１９７】
実施例1：HCCにおいて高頻度に上方制御される2つの新規遺伝子WDRPUHおよびKRZFDUHの同定
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ（施設内で作製した）を用いて、20例のHCCの発現プロファイルを、対応する非癌肝組織のプロファイルと比較した。より具体的には、HCC組織および対応する非癌組織は、外科手術を受けた患者の外科手術標本からインフォームドコンセントを得た上で入手した。キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを顕微解剖組織から抽出した。抽出した全RNAをDNアーゼIで消化し、Ampliscribe T7転写キット（エピセンターテクノロジーズ（Epicentre Technologies））を用いて増幅し、逆転写時にCy色素（アマシャム（Amersham））を用いて標識した。非癌組織および腫瘍由来のRNAを標識するためにそれぞれCy5およびCy3を用いた。続いて、ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出をOnoらの方法（Cancer Res 60：5007-11（2000)）に従って行った。各標的スポットでのCy5およびCy3の蛍光強度をArray Visionソフトウエア（アマシャムファルマシア（Amersham Pharmacia））を用いて測定した。測定は2回ずつ行い、各標的スポットで検出された蛍光強度からバックグラウンドシグナルを差し引いた後に、平均値を算出した。続いて、各スライドについて、52種のハウスキーピング遺伝子の平均Cy5強度および平均Cy3強度が合致するように、スライド上で検出されたすべての蛍光強度を標準化した。Cy3およびCy5の両方に関して蛍光強度が25,000単位未満であった遺伝子は以降の検討から除外し、Cy3/Cy5シグナル比が＞2.0であったものを以降の評価のために選択した。
【０１９８】
HCCで高頻度に上方制御される遺伝子のうち、UniGeneクラスター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）のEST（Hs.122614）に対応する施設内アクセッション番号D3197の遺伝子が、12例のHCCのうち11例で、対応する非癌肝組織に比べ過剰発現していた（図1a）。この遺伝子はWD40反復を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでおり、このためWDRPUH（WD40 repeat protein up-regulated in HCCs）と命名された。WDRPUHはまた、2例の胃癌のうち1例でも上方制御されていた。さらに、14例のHCCのうち11例で、対応する非癌肝組織に比べ有意に上方制御される遺伝子として施設内アクセッション番号C6242（EST Hs.58461）の遺伝子が検出され（図1b）、この遺伝子は、それがコードするタンパク質がジンクフィンガーモチーフを含むことに基づいて、KRZFPUH（Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC）と命名された。KRZFPUHはまた、2例の被験胃癌症例の全例および36例の肺癌症例中2例でも上方制御されていた。
【０１９９】
引き続いて、WDRPUHおよびKRZFPUHの発現上昇を別の10例のHCC症例で確認するために半定量的RT-PCRを用いた（図1cおよびd）。具体的には、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ（TaKaRa））中に希釈した。続いて、以下のプライマーを用い、標準的なRT-PCR法によるPCR増幅を行った：
WDRPUHフォワードプライマー：5'-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3'（配列番号：9）およびリバースプライマー：5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3'（配列番号：10）；ならびに
KRZFPUHフォワードプライマー：5'-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3'（配列番号：11）およびリバースプライマー：5'-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3'（配列番号：12）。
【０２００】
増幅はGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を35サイクル。
【０２０１】
実施例2：新規ヒト遺伝子WDRPUHの発現、単離、および特徴分析
次に、WDRPUHのPCR産物をプローブとして用いる多組織ノーザンブロット分析を行った。より具体的には、ヒト多組織ブロット（クロンテック）をWDRPUHの32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンにより-80℃で24〜72時間行った。その結果、2kb転写物が精巣で大量に発現することが見いだされた（図2a）。D3197はノーザンブロット上で検出されたWDRPUH cDNAよりもサイズが小さかったため、本発明者らは次にWDRPUH cDNAの5'配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中のD3197に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド17p13に位置づけられているコスミド配列（GenBankアクセッション番号AC026855）を見いだした。このゲノム配列のエクソン配列候補をGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いて予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、cDNA末端の5'迅速増幅（5'RACE）を以下の通りに行った。Marathon cDNA増幅キット（クロンテック）を用い、製造者の指示に従って5'RACEを行った。WDRPUHの5'部分を、遺伝子特異的リバースプライマー5'-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3'（配列番号：13）およびキットに付属のAP-1プライマーを用いて調製した。cDNA鋳型はヒト精巣mRNA（クロンテック）から合成し、増幅産物をTAクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローニングし、その配列をABI PRISM 3700DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））で決定した。決定されたアセンブルされた配列は、620個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチド（GenBankアクセッション番号AB065281）からなっていた。Simple Modular Architecture Research Tool（SMART、http://smart.embl-heidelberg.de）を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質に11個のWD40反復ドメインがあることが判明した（図2b）。決定したWDRPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：1および2に示す。
【０２０２】
実施例3：WDRPUHの細胞内局在
WDRPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3'（配列番号：14）および5'-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3'（配列番号：15）を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター（インビトロジェン）中にクローニングした。続いて、構築されたベクターpcDNA3.1myc/His-WDRPUHをSNU475細胞（韓国細胞株バンク（Korea cell-line bank））に一過的にトランスフェクトし、この細胞をRPMI1640中で増殖させた。4％パラホルムアルデヒドを含むPBS中で細胞を15分間かけて固定し、続いて0.1％Triton X-100を含むPBSにより室温（RT）で2.5分間の透過化処理を行った。その後に、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2％BSA（PBS中）で覆い、4℃で24時間おいた。1：1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体（シグマ（Sigma））を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体（LeincoおよびICN）とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核は4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸（DAPI）で対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。その結果、タグ標識WDRPUHタンパク質が細胞の細胞質中に存在することが判明した（図3）。
【０２０３】
実施例4：細胞増殖に対するWDRPUHの作用
細胞増殖に対するWDRPUHの作用を分析するために、WDRPUHを発現するプラスミド（pcDNA-WDRPUH）をNIH3T3細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、WDRPUHに対応する全コード領域を実施例3の通りに増幅し、pcDNA3.1（インビトロジェン）中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-WDRPUHプラスミド、対照プラスミド（擬似）およびWDRPUHの相補鎖を発現するプラスミド（pcDNA-アンチセンス）のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で10〜21日インキュベートした。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。
【０２０４】
その結果、pcDNA-WDRPUHをトランスフェクトした細胞には、対照プラスミド（擬似）またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトした細胞よりも著しく多数のコロニーが形成された（図4aおよびb）。有意差を判定するためにスチューデントのt検定による統計分析を行った。
【０２０５】
実施例5：WDRPUHの発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる肝臓癌細胞の増殖抑制
WDRPUHの抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、WDRPUHの発現を抑制するよう設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。SNU475細胞（韓国細胞株バンク）を10cm培養皿にプレーティングし（2×10５個/培養皿）、これに対してWDRPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(WDRPUH-AS4；5'-GGCCTCACCATTGAAG-3'（配列番号：16））または対照S-オリゴヌクレオチド (WDRPUH-S4；5'-CTTCAATGGTGAGGCC-3'（配列番号：17））をLIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日にわたって培養した。この細胞を、RT-PCRおよびウエスタンブロットによってWDRPUHおよびGAPDHの発現に関して分析した。
【０２０６】
SNU475細胞におけるWDRPUHの内因性発現は、WDRPUH-AS4のトランスフェクションにより、対照（WDRPUH-S4）よりも有意に低下した（図5a）。
【０２０７】
次に、SNU475細胞を5×10５個/100mm培養皿の密度でプレーティングして、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイを行った。細胞に対して、WDRPUHの発現を抑制するように設計されたセンスS-オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを3連ずつトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後に、培地を500μg/mlのMTT（シグマ）を含む新たな培地と交換し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。その後、1mlの0.01N HCl/10％SDSを添加して細胞を可溶化し、ELISAプレートリーダーを検査波長570nm（基準630nm）で用いて可溶化物の吸光度を測定した。細胞生存度は吸光度を対照細胞の吸光度と比較して表した。
【０２０８】
RT-PCRおよびウエスタンブロットによる上記の分析と同様に、WDRPUH-AS4のトランスフェクションにより、生存細胞の数はWDRPUH-S4に比べ有意に減少し（図5b）、このことからWDRPUHが肝細胞癌細胞の細胞増殖および/または生存に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。この結果は3回の独立した実験によって確認された。
【０２０９】
実施例6：WDRPUH siRNAを発現するプラスミドの構築、およびHCC細胞の増殖に対するその効果
哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個および3'末端にチミジンまたはウリジンの相補的二量体を有する20〜21塩基長の二本鎖RNA（dsRNA）から構成される低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子発現の全体的な変化を伴わずに、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用を有することが最近示されている。このため、WDRPUHの発現に対する効果について検討するために、本発明者らはさまざまなWDRPUH-siRNAを発現するプラスミドを構築した。
【０２１０】
まず、psiH1BX3.0ベクターを以下のようにして構築した。H1RNA遺伝子はRNAポリメラーゼIIIで転写すると、ウリジンが3'末端に存在する短い転写物を生じることが報告されているため、プロモーター領域を含むH1RNA遺伝子のゲノム断片を、プライマーのセット：5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'（配列番号：18）および5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'（配列番号：19）；ならびに鋳型としてヒト胎盤DNAを用いてPCRを行い増幅した。その産物を精製し、TAクローニングキット（インビトロジェン）を用い、供給元のプロトコールに従ってpCR2.0プラスミドベクター中にクローニングした。H1RNA遺伝子を含む断片を、プライマーのセット：5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'（配列番号：20）および5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'（配列番号：21）を用いてPCRを行い増幅し、BamHIおよびXhoIで消化して精製した。続いて、H1RNA遺伝子を含む精製BamHI-XhoI断片を、pcDNA3.1(+)（インビトロジェン）のヌクレオチド1257〜56断片中にクローニングした。連結したDNAを鋳型に、プライマー：5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3'（配列番号：22）および5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'（配列番号：23）を用いてPCRを行った。この産物をHindIIIで消化し、その後、自己連結させてpsiH1BX3.0ベクタープラスミドを作製した。
【０２１１】
対照プラスミドおよびWDRPUH-siRNAを発現するプラスミドは、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。ベクター中にクローニングしたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiH1BX-WDRPUH01、5'-CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'（配列番号：24）および5'-AAAAAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'（配列番号：25）；
psiH1BX-WDRPUH02、5'-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'（配列番号：26）および5'-AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'（配列番号：27）；
psiH1BX-WDRPUH03、5'-CACCAAAGAGACGCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'（配列番号：28）および5'-AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'（配列番号：29）；
psiH1BX-WDRPUH05、5'-CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'（配列番号：30）および5'-AAAAAACGACGGTAAAATCCGAGCCTCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'（配列番号：31）；ならびに
対照psiH1BX-EGFP (擬似)、5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'（配列番号：32）および5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'（配列番号：33）。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
【０２１２】
FuGENE6試薬（ロシュ（Roche））を用い、供給元の推奨に従ってこれらのプラスミドをHepG2細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。
【０２１３】
その結果、これらのうちpsiH1BX-WDRPUH01は、psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05とは異なり、細胞におけるWDRPUHの発現を有意に抑制した（図6A）。WDRPUHの抑制が肝臓癌細胞の増殖抑制をもたらすか否かを検証するために、HepG2細胞に対してpsiH1BX-WDRPUH01、psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP、または擬似ベクターをトランスフェクトした。psiH1BX-WDRPUH01をトランスフェクトした細胞の生細胞数はpsiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP、または対照をトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからWDRPUHの発現低下によって肝臓癌細胞の増殖が抑制されることが示唆された（図6B）。
【０２１４】
実施例7：抗WDRPUH抗体の調製
WDRPUHの発現について検討し、その機能を解明するために、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、His標識した組換えWDRPUHを大腸菌で産生させ、Pro Bond（商標）ヒスチジンレジン（インビトロジェン）を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を血清から精製した。
【０２１５】
免疫前血清とは異なり、抗WDRPUH血清を用いたイムノブロットではFLAG標識WDRPUHの70kDバンドが検出され、これは抗FLAG抗体を用いて検出されたものとサイズが同じであった（図7）。
【０２１６】
実施例8：新規ヒト遺伝子KRZFPUHの発現、単離、および特徴分析
C6242 cDNAをプローブとして用いて、実施例2の通りに多組織ノーザンブロット分析を行った。その結果、2.8kb転写物が胎盤および精巣で大量に発現されることが示された（図8a）。C6242はノーザンブロット上で検出されたものよりもサイズが小さかったため、KRZFPUH cDNAの5'部分の配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中のC6242に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド16p11に位置づけられているワーキングドラフト（working draft）配列（GenBankアクセッション番号：NT-024802）を見いだした。このゲノム配列とGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いてエクソン配列候補を予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、プライマーとして5'-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3'（配列番号：34）を用いた以外は実施例2の通りに5'RACEを行い、その結果、500アミノ酸のタンパク質をコードする1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドのアセンブルされた配列（GenBankアクセッション番号AB065282）を得た。Simple Modular Architecture Research Tool（SMART、http://smart.embl-heidelberg.de）を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質がKruppel型ジンクフィンガードメインを含むことが判明した（図8b）。決定されたKRZFPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：3および4に示されている。
【０２１７】
実施例9：KRZFPUHの細胞内局在
KRZFPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3'（配列番号：35）および5'-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3'（配列番号：36）を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター（インビトロジェン）中にクローニングした。続いて、この構築物をSNU475細胞（韓国細胞株バンク）に一過的にトランスフェクトし、KRZFPUHの細胞内局在を実施例3の通りに調べた。細胞の免疫細胞化学染色により、タグ標識KRZFPUHタンパク質が核内に存在することが判明した（図9）。
【０２１８】
実施例10：細胞増殖に対するKRZFPUHの作用
細胞増殖に対するKRZFPUHの作用を分析するために、KRZFPUHを発現するプラスミド（pcDNA-KRZFPUH）をCOS7細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、KRZFPUHに対応する全コード領域を実施例9の通りに増幅し、pcDNA3.1（インビトロジェン）中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-KRZFPUHプラスミド、対照プラスミド（擬似）およびKRZFPUHの相補鎖を発現するプラスミド（pcDNA-アンチセンス）のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むDMEM中で10〜21日インキュベートした。その後に、細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。図10aおよびbに示したように、KRZFPUHの相補鎖を発現する対照プラスミド（pcDNA-アンチセンス）に比べ、pcDNA-KRZFPUHはCOS7細胞で著しく多くのコロニーを形成した。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントtのt検定による統計分析を行った。
【０２１９】
実施例11：KRZFPUHの発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる肝臓癌細胞の増殖抑制
KRZFPUH発現の抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、KRZFPUHの発現を抑制するために設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。Alexander細胞（ATCC、Rockville、MD）を10cm培養皿にプレーティングし（2×10５個/培養皿）、これに対してKRZFPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(KRZFPUH-AS4；5'-GGCCTCACCGAGCGCG-3'（配列番号：37））または対照S-オリゴヌクレオチドKRZFPUH-S4；5'-CGCGCTCGGTGAGGCC-3'（配列番号：38））をLIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。大量のKRZFPUHを構成性に発現するAlexander細胞において、KRZFPUHの内因性発現および生存細胞の数は、アンチセンスS-オリゴヌクレオチド（KRZFPUH-AS4）のトランスフェクションにより、対照センスS-オリゴヌクレオチド（KRZFPUH-S4）よりも有意に低下し（図11aおよびb）、このことからKRZFPUHがHCC細胞の細胞増殖および/または生存に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントのt検定による統計分析を行った。
【０２２０】
実施例12：KRZFPUH siRNAを発現するプラスミドの構築、およびHCC細胞の増殖に対するその効果
二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクター中にクローニングすることにより、KRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドを調製した。KRZFPUH-siRNA用に用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiU6BX-KRZFPUH1に対しては、5'-CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3'(SEQ ID NO：104) および5'-AAAAAACGAAACACCGATGACTGGGTCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO：105) ；
psiU6BX-KRZFPUH2に対しては、5'-CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO：106) および5'-AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO：107)；
psiU6BX-KRZFPUH3に対しては、5'-CACCAAACCTTGCCTACGACATGTTTTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO：108) および5'-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO：109) ；ならびに
psiU6BX-KRZFPUH4に対しては、5'-CACCAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO：110) および5'-AAAAAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO：111) 。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
【０２２１】
FuGENE6試薬（ロシュ）を用い、供給元の推奨に従って、psiU6BX-KRZFPUH、psiU6BX-EGFPまたはpsiU6BX-擬似プラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。
【０２２２】
哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個および3'末端にチミジンまたはウリジンの相補的二量体を有する20または21塩基長の二本鎖RNA（dsRNA）から構成される低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子発現の全体的な変化を伴わずに、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用を有することが最近示されている。このため、KRZFPUHの発現に対する効果について検討するために、本発明者らはさまざまなKRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドを構築した。これらのsiRNAのうちpsiU6BX-KRZFPUH2は、psiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、およびpsiU6BX-KRZFPUH4とは異なり、Huh7細胞、Alexander細胞、HepG2細胞およびSNU449細胞におけるKRZFPUHの発現を有意に抑制した（図12および13、データ非提示）。KRZFPUHの抑制により、肝臓癌細胞の増殖抑制がもたらされるか否かを検証するために、Huh7細胞、Alexander細胞に対してpsiU6BX-KRZFPUH2、psiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、psiU6BX-KRZFPUH4、psiU6BX-EGFPまたは擬似ベクターをトランスフェクトした。psiU6BX-KRZFPUH2をトランスフェクトした細胞の生細胞数はpsiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、psiU6BX-KRZFPUH4、psiU6BX-EGFP、または対照をトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからKRZPUHの発現低下によって肝臓癌細胞の増殖が抑制されることが示唆された（図12および13）。
【０２２３】
実施例13：ヒト結腸癌において高頻度に上方制御される新規遺伝子PPIL1の同定
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ（施設内で作製した）を用いて、実施例1のように、11例の結腸癌組織の発現プロファイルを対応する非癌結腸粘膜組織のものと比較した。この分析により、対応する非癌組織に比べ癌組織で発現レベルが高頻度に上昇している遺伝子が数多く同定された。それらのうち、CGI-124/PPIL1遺伝子（GenBankアクセッション番号：AF151882）に対応する施設内アクセッション番号B9486の遺伝子は、選択基準を満たした6例中全例において、対応する非癌粘膜に比べ癌組織で発現レベルが高く、倍率2.36〜4.68倍の範囲であることが判明した（図14a）。マイクロアレイの結果を明確にするために、別の結腸癌試料におけるこれらの転写物の転写の発現を、プライマー：5'-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3'（フォワード）（配列番号：39）および5'-CTCGACGAGTTCTCCCATCG-3'（リバース）（配列番号：40）を用い、実施例1の通りに半定量的RT-PCRを行って検討した。この半定量的RT-PCRによれば、PPIL1の発現は20例中17例で上昇していることが確認された（図14b）。
【０２２４】
実施例14：PPIL1の構造
PPIL1に対応するAF151882の配列に関する相同性検索を、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のBLASTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて公開データベースを対象にさらに行ったところ、PPIL1の5'部分または3'部分をそれぞれ含むBE908798、AK026636を含むESTが同定され、染色体バンド6p21.1に位置づけられているゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_007592）が同定された。アセンブルされたPPIL1のcDNA配列は、498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドを有していた。cDNA配列とゲノム配列との比較により、この遺伝子が4つのエクソンからなることが示された。この遺伝子の予想されるアミノ酸配列はマウスのものと98％の同一性を有していた（図15）。決定されたPPIL1のヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：5および6に示す。
【０２２５】
実施例15：細胞増殖に対するPPIL1の作用
細胞増殖に対するPPIL1の作用を分析するために、myc標識PPIL1を発現するプラスミド（pcDNA3.1myc/His-PPIL1）をNIH3T3細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。プラスミドは以下の通りに構築した。まず、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク）をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ）中に希釈した。続いて、PPIL1に対応する全コード領域を増幅するために、標準的なRT-PCR実験によるPCR増幅を以下のプライマーを用いて行った：5'-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3'（フォワード）（配列番号：41）および5'-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3'（リバース）（配列番号：42）。
【０２２６】
RT-PCRはGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー、Foster City、CA）を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を28サイクル。増幅断片をpcDNA3.1myc/His（インビトロジェン）ベクター中に挿入した。続いて、構築したpcDNA3.1myc/His-PPIL1をNIH3T3細胞にトランスフェクトした。
【０２２７】
NIH3T3細胞において、pcDNA3.1myc/His-PPIL1は、対照プラスミドpcDNA3.1myc/His-LacZ、またはPPIL1の相補鎖を発現するpcDNA3.1myc/His-asPPIL1に比べ著しく多くのコロニーを誘導した（図16a）。
【０２２８】
さらに、内因性PPIL1の発現量が少ないHCT116ヒト結腸癌細胞（ATCC、Rockville、MD）をpcDNA3.1myc/His-PPIL1のトランスフェクションに用いた以外は、上記と同様の実験を行った。その結果、トランスフェクトしたHCT116ヒト結腸癌細胞ではコロニー形成活性の上昇が認められた（図16b）。
【０２２９】
実施例16：PPIL1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる結腸癌細胞の増殖抑制
PPIL1の抑制により、結腸癌細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、PPIL1に対応する4組の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した：対照センスオリゴヌクレオチドPPIL1-S2、5'-CTTCGCTATGGCGGCA-3'（配列番号：43）；アンチセンスS-オリゴヌクレオチドPPIL1-AS2、5'-TGCCGCCATAGCGAAG-3'（配列番号：44）；およびスクランブル（scramble）S-オリゴヌクレオチドPPIL1-SCR2、5'-GTTGCACAGCGACGCA-3'（配列番号：92）。合成したオリゴヌクレオチドのそれぞれを、検討した11種の結腸癌細胞株の中でPPIL1発現レベルが高いことが示されたヒト結腸癌細胞SW480（ATCC、Rockville、MD）、SNU-C4およびSNU-C5（いずれも韓国細胞株バンク）に対して、LIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトした。どの培地にも適切な濃度のジェネティシンを加えた上で、SW480はライボビッツL-15培地中、SNU-C4およびSNU-C5はRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。
【０２３０】
アンチセンスS-オリゴヌクレオチドのうち、PPIL1-AS2はSNU-C5細胞におけるPPIL1の発現を対照センス（PPIL1-S2）に比べ有意に低下させた（図17a）。トランスフェクションから6日後の時点で、PPIL1-AS2をトランスフェクトした細胞の生存細胞数は、対照、PPIL1-S2、またはスクランブルS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-SCR2）をトランスフェクトした細胞よりも有意に少なく、このことからPPIL1の抑制により、トランスフェクト細胞の増殖および/または生存度が低下することが示唆された（図17b）。3回の独立した実験で一致する結果が得られた。
【０２３１】
SW480細胞、SNU-C4細胞およびSNU-C5細胞におけるPPIL1-AS2の増殖阻害作用を測定するために、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイをさらに行った。具体的には、細胞を5×10５個/100mm培養皿の密度でプレーティングし、それに対して、PPIL1の発現を抑制するように設計されたセンスS-オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを3連ずつトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後に、培地を500μg/mlのMTT（シグマ）を含む新たな培地と交換し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。その後に、1mlの0.01N HCl/10％SDSを添加して細胞を可溶化し、ELISAプレートリーダーを検査波長570nm（基準630nm）で用いて可溶化物の吸光度を測定した。細胞生存度は吸光度を対照細胞の吸光度と比較して表した。その結果、これらの3種類の細胞株において、PPIL1-AS2をトランスフェクトした細胞の生細胞数はPPIL1-S2をトランスフェクトした細胞よりも有意に少なかった（図17c）。
【０２３２】
実施例17：PPIL1タンパク質とSNW1との相互作用
PPIL1との相同性が高い2種類の原核生物タンパク質、Cyp2（分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe））およびCypE（細胞性粘菌（Dictiostelium discoideum））は、それぞれSnw1およびSnwAと相互作用することが報告されている。このため、PPIL1タンパク質はSnw1およびSnwAのヒトホモログであるSNW1/SKIPと会合するとの仮説を立てた。この仮説を検討するために、Flag標識PPIL1タンパク質を発現するpFLAG-PPIL1を構築した。まず、PPIL1の全コード領域を実施例15の通りに増幅し、その産物をpFLAG-CMV-5c（シグマ）のクローニング部位にクローニングしてpFLAG-PPIL1を調製した。同様に、SNW1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3'（フォワード）（配列番号：45）および5'-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3'（リバース）（配列番号：46）を用いてRT-PCRにより増幅し、pcDNA3.1myc/His（インビトロジェン）のクローニング部位にクローニングして、myc標識SNW1を発現するpcDNA3.1myc-SNW1を構築した。次に、pFLAG-PPIL1を単独で、またはpcDNA3.1myc-SNW1とともにCOS7細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトした。
【０２３３】
続いて、抗FLAG抗体による細胞可溶化物の免疫沈降を以下の通りに行った：pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトしたCOS7細胞をトランスフェクション48時間後に回収し、20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1％NP-40、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテルEDTA(-)（ベーリンガー（Boehringer））を含む可溶化緩衝液に溶解した。この細胞可溶化物を抗FLAG M2抗体（シグマ）によって免疫沈降させた。沈降したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、抗FLAG M2抗体を用いてイムノブロット分析を行った。
【０２３４】
免疫沈降の後に、抗c-Myc抗体を用いてイムノブロット分析を行った。具体的には、pFLAG-PPIL1および/またはpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトした細胞をPBSで2回洗い、可溶化緩衝液（150mM NaCl、1％Triton X-100、50mM Tris-HCl pH 7.4、1mM DTT、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ベーリンガー））中に回収した。細胞のホモジナイズ処理および10,000×g、30分間の遠心処理の後に、Bradfordアッセイ（Bio-Rad）によって上清をタンパク質濃度に関して標準化した。タンパク質を10％SDS-PAGEにより分離し、マウス抗myc抗体（サンタクルズ（SANTA CRUZ））を用いてイムノブロットを行った。HRP結合ヤギ抗マウスIgG（アマシャム）を、ECL検出システム（アマシャム）用の二次抗体として用いた。
【０２３５】
その結果、細胞に対して両方のプラスミドを同時にトランスフェクトした場合には、myc標識SNW1タンパク質に対応するバンドが観察された（図18）。さらに、抗cMyc抗体を用いて可溶化物の免疫沈降を行うと、Flag標識PPIL1タンパク質が沈降した。これらの結果から、PPIL1がインビボで直接的または間接的にSNW1と会合しうることが裏づけられた。
【０２３６】
実施例18：PPIL1とSNW1の共存
PPIL1とSNW1の会合をさらに確かめるために、COS7細胞におけるFLAG標識PPIL1タンパク質およびmyc標識SNW1タンパク質の細胞内局在を、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc-SNW1を同時トランスフェクトした細胞に対し抗FLAG抗体を用いて免疫組織化学染色することで検討した。具体的には、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトした細胞を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBS中に15分間おいて固定した後に、0.1％Triton X-100を含むPBS中に室温で2.5分間おいて透過化処理を行った。その後、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2％BSA（PBS中）で覆い、4℃で24時間おいた。1：1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体（シグマ）または1：2000に希釈したマウス抗FLAG抗体（シグマ）を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体（LeincoおよびICN）とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核はDAPIで対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。
【０２３７】
抗FLAG抗体を用いた細胞の免疫組織化学染色によって核内のシグナルが示され、抗myc抗体を用いた場合にも核および細胞質に同様の陽性染色が示された。マージ画像（図19aおよびb）およびDAPIの対比染色（図19c）により、FLAG標識PPIL1タンパク質およびmyc標識SNW1タンパク質が核内に共存することが示され（図19d）、これはPPIL1とSNW1が相互作用するという見解と一致した。
【０２３８】
実施例19：ヒト多組織におけるPPIL1の発現
PPIL1 cDNAをプローブとして用いて多組織ノーザンブロット分析を行った。具体的には、ヒト多組織ブロット（クロンテック、Palo Alto、CA）をPPIL1の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを-80℃で24〜72時間用いて行った。
【０２３９】
その結果、発現した1.7kb転写物の遍在性発現が示された。検討した組織のうち、心臓、骨格筋、精巣、甲状腺および副腎で大量の発現が観察された（図20）。
【０２４０】
実施例20：PPIL1 siRNAを発現するプラスミドの構築、および結腸癌細胞の増殖に対するその効果
PPIL1発現の影響を検討するために、さまざまなPPIL1-siRNAを発現するプラスミドを構築した。まず、psiH1BX3.0ベクターを実施例6と同じように構築した。さらに、対照ベクターpsiH1BX-EGFPも実施例6のように調製した。続いて、PPIL1-siRNAを発現するプラスミドを、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。ベクター中にクローニングしたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiH1BX-PPIL-A、5'-TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGAGAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3'（配列番号：47）および5'-AAAAGCATGCTCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3' （配列番号：48）；
psiH1BX-PPIL-B、5'-TCCCAGACTTCATGATCCAAGGATTCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3'（配列番号：49）および5'-AAAAAGACTTCATGATCCAAGGATCTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT 3'（配列番号：50）；ならびに
psiH1BX-PPIL-C、5'-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTTGTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'（配列番号：51）および5'-AAAATGGCAGCCAGTTCTTTGTGTCTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'（配列番号：52）。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
【０２４１】
FuGENE6試薬（ロシュ）を用い、供給元の推奨に従ってこれらのプラスミドを結腸癌細胞SNUC4またはSNUC5にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。
【０２４２】
これらのうちpsiH1BX-PPIL-Aは、psiH1BX-PPIL-BおよびpsiH1BX-PPIL-Cとは異なり、SNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1の発現を有意に抑制した（図21A）。PPIL1の抑制により、結腸癌細胞SNUC4およびSNUC5の増殖抑制がもたらされるか否かを検証するために、psiH1BX-PPIL-A、psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C、または対照psiH1BX-EGFPを細胞にトランスフェクトした。psiH1BX-PPIL-Aをトランスフェクトした細胞の生細胞数は、psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C、またはpsiH1BX-EGFPをトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからPPIL1の発現低下によって結腸癌細胞の増殖が抑制されることが示された（図21B）。
【０２４３】
実施例21：組換えPPIL1タンパク質の調製
PPIL1に対する特異的抗体を作製するために、PPILの組換えタンパク質を調製した。PPIL1の全コード領域は、プライマーのセット：5'-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3'（配列番号：53）および5'-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3'（配列番号：54）を用いてRT-PCRにより増幅した。その産物を精製し、BamHlおよびXholで消化し、pGEX-6P-1ベクター（pGEX-PPIL1）またはpET21aベクター（pET-PPIL1）の適切なクローニング部位にクローニングした。pGEX-PPIL1またはpET-PPIL1を大腸菌DH10B細胞またはBL21コドンプラス細胞に形質転換した。組換えタンパク質をIPTGの添加によって誘導し、製造者のプロトコールに従って抽出物から精製した。プラスミドを大腸菌細胞に形質転換したところ、SDS-PAGE上に予想されたサイズで組換えタンパク質の産生が観察された（図22AおよびB）。
【０２４４】
実施例22：細菌2-ハイブリッドスクリーニング系による、スタスミンがPPIL1相互作用性タンパク質であることの同定
PPIL1の機能を分析するために、細菌2-ハイブリッドスクリーニング系を用いてPPIL1相互作用性タンパク質を検索した。BacterioMatch 2-ハイブリッド系（ストラタジーン）を用い、製造者のプロトコールに従って細菌2-ハイブリッドアッセイを行った。実施例21の通りに入手したPPIL1の全コード配列をpBTベクターのBamHl-Xhol部位にベイト（bait）としてクローニングし、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（ストラタジーン）をスクリーニングした。同定された陽性クローンのうち、スタスミンは細菌でのpBT-PPIL1およびpTRG-STMNによる同時形質転換により、PPIL1との相互作用を示した（図23A）。
【０２４５】
さらに、免疫沈降アッセイを行った。具体的には、COS7細胞に対して、実施例17の通りに調製したFLAG標識PPIL1を発現するpFLAG-PPIL1、およびHA標識スタスミンタンパク質を発現するpCMV-HA-STMN、またはそれらの組み合わせをトランスフェクトし、PBSで洗浄し、150mM NaCl、1％NP-40、10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）を含むNET-N緩衝液中に溶解した。代表的な免疫沈降反応では、300μgの全細胞抽出物を、1μgのマウス抗FLAG抗体（シグマ）または3μgのラット抗HA抗体および20μlのプロテインGセファロースビーズ（ザイメッド（Zymed））とともに4℃で1〜2時間インキュベートした。ビーズを1mlのNET-N緩衝液で5回洗い、ビーズに結合したタンパク質を、SDS試料緩衝液中で煮沸することによって溶出させた。沈降したタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、抗HA抗体または抗FLAG M2抗体を用いてイムノブロット分析を行った。
【０２４６】
上記の通り、インビボでのFLAG標識PPIL1タンパク質とHA標識スタスミンタンパク質との会合が、COS7細胞における免疫沈降アッセイによって証明された（図23B）。興味深いことに、抗スタスミン抗体を用いたウエスタンブロット分析によって18kDaタンパク質および20kDaタンパク質に対応する2つのバンドが示され、このことから修飾型のスタスミンの存在が示唆された。スタスミンはセリン/トレオニンリン酸化部位と推定される部位（Ser16、Ser25、Ser38、およびSer63）を有することが示されているため、大きい方のバンドはリン酸化型のスタスミンに対応すると思われる。さらに、抗Flag抗体を用いた免疫沈降で20kDaタンパク質に対応する単一バンドが示されたことからみて、PPIL1はこの修飾型と会合するか、スタスミンとの結合によってその修飾を増加させる可能性がある。
【０２４７】
実施例23：細胞内におけるFlag標識PPIL1とHA標識スタスミンの共存
PPIL1およびスタスミンが細胞内で共存するか否かを検証するために、実施例22のように、COS7細胞に対してpFLAG-PPIL1およびpCMV-HA-STMNを同時にトランスフェクトし、免疫組織化学染色によって細胞内局在を検討した（図24）。抗FLAG抗体を用いた染色ではFlag標識PPIL1は核および細胞質の両方に局在することが示されたが、抗HA抗体による染色ではHA標識スタスミンが細胞質中にPPIL1と共存することが示された。このデータは、PPIL1およびスタスミンが細胞質中で相互作用するという見解を支持するものである。
【０２４８】
実施例24：PPIL1との相互作用に関するスタスミンの責任領域（responsible region）
さらに、この相互作用の責任領域を明らかにするために、pCMV-HA-STMNの種々の欠失変異体および野生型pFLAG-PPIL1を用いて、実施例22と同じように免疫沈降アッセイを行った。STMNの欠失変異体は、以下のプライマーのセット：
欠失変異体1に対しては、5'-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3'（配列番号：55）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：56）；
欠失変異体2に対しては、5'-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3'（配列番号：57）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：58）；
欠失変異体3に対しては、5'-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3'（配列番号：59）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：60）；
欠失変異体4に対しては、5'-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3'（配列番号：61）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：62）；ならびに
欠失変異体5に対しては、5'-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3'（配列番号：63）および5'-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3'（配列番号：64）を用い、完全長クローン（pFLAG-PPIL1）を鋳型に増幅した。PCR産物はpcDNA3.1myc/HisのKpnlおよびXhol部位にクローニングした。
【０２４９】
スタスミンのアミノ酸1〜43を欠失した欠失変異体（欠失変異体3）はPPIL1と会合可能であったが、1〜65を欠失した変異体（欠失変異体4）は会合不能であった。一方、アミノ酸1〜61を含む別の変異体は結合が可能であり（図25AおよびB）、このことから、コドン44〜61を含む領域が結合に非常に重要であることが示された。
【０２５０】
実施例25：スタスミンのリン酸化およびPPIL1との相互作用
抗Flag抗体を用いた免疫沈降によって修飾型のスタスミンに対応する単一のバンドが示されたため、セリンリン酸化部位と推定される部位でのその変異型を発現するプラスミドを調製し、それとPPIL1との結合を検討した（図26A）。具体的には、変異体（SerがAlaに置換）は、QuikChange部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン）およびプライマーのセット：
S16Aに対しては、5'-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3'（配列番号：65）および5'-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3'（配列番号：66）；
S25Aに対しては、5'-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3'（配列番号：67）および5'-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3'（配列番号：68）；
S38Aに対しては、5'-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3'（配列番号：69）および5'-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3'（配列番号：70）；
S63Aに対しては、5'-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3'（配列番号：71）および5'-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3'（配列番号：72）を用い、供給元の推奨に従って調製した。
【０２５１】
S16AまたはS63A変異体をトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析からは非リン酸化型およびリン酸化型が検出されたが、S38Aを用いた場合には非リン酸化型に対応する単一のバンドが示された。このため、スタスミンのセリン38は細胞内でリン酸化されると考えられる。驚くことには、スタスミン-S38A変異体はPP1L1と会合可能であった（図26B）。したがって、PPIL1とスタスミンの相互作用は、スタスミンのコドン44〜61にあるPPIL1結合部位に隣接したセリン38のリン酸化を増強するものと思われる。
【０２５２】
実施例26：APCによって調節される遺伝子としてのAPCDD1の単離
結腸直腸癌の発生には、βカテニン/Tcf経路の調節障害が初期段階としてかかわる。このため、次の手順として、この経路の下流遺伝子を検索した。結腸癌細胞へのAPCの形質導入は核内のβカテニンレベルを低下させ、引き続いてβカテニン/Tcf複合体の転写促進活性を抑制する（van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9（1998)）。このため、大量のβカテニンが核および細胞質に蓄積するSW480細胞の発現プロファイルを、実施例1と同様のマイクロアレイ手法を用いて比較した。
【０２５３】
βカテニン/Tcf複合体によって調節される遺伝子を同定するために、SW480細胞（ATCC、Rockville、MD）に対して、野生型APC（Ad-APC）またはLacZ（Ad-LacZ；対照遺伝子）を発現するアデノウイルス構築物をMOI＝100で感染させ、ライボビッツL-15培地中で培養した。感染から72時間後に、全RNAを細胞から抽出し、Satohら（Nat Genet 24：245-50（2000)）の通りにポリA RNAを抽出物から精製し、T7ベースのRNA増幅を行った。Ad-APCおよびAd-LacZを感染させたSW480細胞から増幅されたRNA（aRNA）をそれぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPで標識し、その同量をマイクロアレイスライド上での同時ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いた。
【０２５４】
APCのトランスフェクションによって発現レベルが下方制御された遺伝子の数を特定するために、Ad-APCを感染させたSW480細胞における23040種の遺伝子の発現プロファイルをAd-LacZのものと比較した。遺伝子のうち、NCBI（米国国立バイオテクノロジー情報センター）のUniGeneクラスターのEST、Hs.20665に対応する施設内アクセッション番号B7323Nの遺伝子を、発現レベルがAd-APCに反応してAd-LacZに比べ約4分の1に低下する遺伝子として同定した。
【０２５５】
その後に、APCの発現低下を確かめるための半定量的RT-PCR実験を行った（図27a）。具体的には、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク）をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ）中に希釈した。続いて、以下のプライマーを用い、標準的なRT-PCR実験によるPCR増幅を行った：フォワード、5'-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3'（配列番号：73）；およびリバース、5'-TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3'（配列番号：74）。増幅はGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー、Foster City、CA）を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を30サイクル。
【０２５６】
さらに、βカテニン/Tcf-4複合体の活性を同じく下方制御する野生型AXIN1を発現するアデノウイルスAd-Axinを用いて細胞を処理し、B7323Nの発現に関して検討した。その結果、AXIN1の形質導入によるB7323Nの発現低下が同様に観察された（図27a）。
【０２５７】
B7323NのcDNA配列を用いて公開データベースの相同性検索を行ったところ、100種を上回るEST、および、染色体バンド18p11.2に位置づけられている1つのヒトゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_019631）が同定された。B7323Nの完全長cDNA配列を決定するために、B7323Nに対する遺伝子特異的プライマー（5'-GCTCGTCTGACCGATAGATGATCC-3'（配列番号：75））を用いた点以外は実施例2の通りに5'RACEを行い、cDNA配列を入手した。その結果、その完全長cDNA配列が決定された。このcDNAは、予想分子量が58.8kDである推定514アミノ酸のタンパク質をコードする1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドから構成されていた（GenBankアクセッション番号AB104887）。予想されるAPCDD1タンパク質は、サーモバシラス・キシラニリチカス（Thermobacillus xylanilyticus）のエンド-1,4-βキシラナーゼと31％の同一性があった。コンピュータプログラムSMART（http://smart/embl-heidelberg/de/）およびPSORT II Prediction（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）を用いたモチーフ検索ではデータベース中に既知のドメインは同定されなかった。このため、この遺伝子はAPCDD1（down-regulated by APC1）と命名された。cDNA配列とゲノム配列とを比較してAPCDD1のゲノム構造を決定することが可能であり、これは5つのエクソンからなっており、約40kbのゲノム領域をカバーしていた（データ非提示）。決定されたAPCDD1のヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：7および8に示す。
【０２５８】
さらに、APCDD1に対して実施例2の通りにノーザンブロット分析を行った。このノーザンブロット分析により、APCDD1の2.6kb転写物は心臓、膵臓、前立腺、および卵巣で大量に発現するが、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢白血球における発現は乏しいことが示された（図27b）。
【０２５９】
実施例27：結腸癌組織におけるAPCDD1の発現
βカテニンの蓄積は結腸直腸腫瘍に高頻度にみられる特徴であるため、結腸癌組織および対応する非癌組織におけるAPCDD1の発現を実施例26の通りに半定量的RT-PCRによって検討したところ、検討した30例の腫瘍のうち20例（67％）で発現上昇が検出された（図27c）。この結果は、APCDD1がβカテニン/Tcf転写複合体の活性化に応答して上方制御されるという事実と一致した。
【０２６０】
実施例28：APCDD1のプロモーター活性はβカテニンおよび野生型Tcf4複合体によって上方制御される
APCDD1のプロモーター活性がβカテニン/Tcf4複合体によって制御されるか否かを検証するために、Tcf/LEF結合モチーフと推定される2つのモチーフ（TBM1および2）を含むレポータープラスミドP1を、活性化型である変異型βカテニンと野生型Tcf4の存在下または非存在下でHeLa細胞にトランスフェクトした（図28a）。より具体的には、APCDD1の転写開始部位（TIS）と推定される部位を、ヒトゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_019631.4）とAPCDD1 cDNAの配列とを比較して決定した。APCDD1の5'隣接領域の3つの断片をPCRによって増幅し（P1、P2、およびP3）、pGL3-Basicベクター（プロメガ（Promega））の適切な酵素部位にクローニングした。Tcf/LEF結合モチーフと推定されるモチーフを1つまたは2つ含むP1およびP2に対してQuickChange（商標）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン）を用いることによって部位特異的変異誘発法を実施した。活性化型である変異型βカテニンは、プライマーのセット：5'-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3'（配列番号：76）および5'-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3'（配列番号：77）を用い、HCT116結腸癌細胞から抽出したRNAを鋳型にRT-PCRによって調製し、その後にpcDNA3.1プラスミドベクター（インビトロジェン）の適切なクローニング部位にクローニングした。Tcf-4の全コード領域のヒトcDNA断片およびその5'欠失領域（wtTcf4、dnTcf4）は、プライマーのセット：TcfF1：5'-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3'（配列番号：78）およびTcfR1：5'-CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGGTGACGAGCGAC-3'（配列番号：79）、ならびにTcfF3：5'-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3'（配列番号：80）およびTcfR1をそれぞれ用い、RT-PCRによって増幅した。その産物もpcDNA3.1プラスミドベクター中にクローニングした。2μgの各レポータープラスミドおよび1.5μgの各発現構築物を、0.5μgのpRL-TKプラスミド（プロメガ）とともに、トランスフェクションの効率を標準化するためのFuGENE6（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））を用いて、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。レポーターアッセイはDual-Luciferaseレポーターアッセイ系を用い、供給元の推奨（プロメガ）に従って行った。
【０２６１】
プラスミドP1のレポーター活性は、活性化型のβカテニンおよび野生型Tcf4の導入によって有意に上昇した（図28b）。興味深いことに、この活性上昇は、P1をドミナントネガティブ型のTcf4とともに同時トランスフェクトした場合には抑制され、このことからTcf4がAPCDD1のプロモーター活性に影響を及ぼすことが示唆された。
【０２６２】
そのプロモーター活性の原因となる因子を明らかにするために、P1の種々の欠失変異体のそれぞれについてプロモーター活性をさらに比較した。P1の活性はP2およびP3のそれぞれの活性よりも有意に高く、TBM2のみを含むP2の活性はP3のものよりも有意に高かった（図28b）。これらのデータは、-971および-151を含む領域がβカテニン/Tcf4複合体と会合すること、およびそれがAPCDD1プロモーター活性に関与することを示唆する。この領域はTcf/LEF結合モチーフと考えられる2つのモチーフを含むため、これらのモチーフは転写活性化の原因になるとの仮説を立てた。
【０２６３】
この仮説を検討するために、Tcf/LEF結合モチーフの候補が、βカテニン/Tcf4複合体を結合できないCTTTGGC（配列番号：81）へと改変されたレポータープラスミドP1MおよびP2Mを構築した。これらの5種類のプラスミドを用いてレポーターアッセイを行い、変異したモチーフを含むP1M断片およびP2M断片はAPCDD1の転写を活性化する能力が低下していること；ならびにそのルシフェラーゼ活性がP2断片またはP3断片と同等であることを明らかにした（図28b）。これらの結果は、Tcf/LEF結合モチーフと推定されるモチーフが両方ともAPCDD1の転写活性化に関与することを意味する。
【０２６４】
実施例29：電気泳動移動度シフトアッセイ
βカテニン/Tcf4複合体がTBM1およびTBM2と直接会合するか否かを検討するために、TBM1配列（APCDD1-TBM1）およびTBM2配列（APCDD1-TBM2）を含むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行った。具体的には、EMSAは以前の記載（van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9（1998)）の通りに、SW480細胞の無傷核から得た抽出物を用いて行った。2つの二本鎖16ヌクレオチドDNAプローブを、APCDD1-TBM1に関してはFF（5'-GCTTTGATTGTGGTGA-3'（配列番号：82））およびRR（5'-TCACCACAATCAAAGC-3'（配列番号：83））を、APCDD1-TBM2に関してはFF2（5'-CCCCTTTGAACACCTT-3'（配列番号：84））およびRR2（5'-AAGGTGTTCAAAGGGG-3'（配列番号：85））をアニーリングさせることによって調製した。
【０２６５】
βカテニン/Tcf4とAPCDD1-TBM1およびAPCDD1-TBM2の双方との結合に対応するバンドのシフトが、抗βカテニン抗体の添加によって観察されたが、P53抗体（対照）の添加によっては観察されなかった（図29）。予想された通り、この結合は野生型非標識オリゴヌクレオチドの添加によって阻害されたが、変異型非標識オリゴヌクレオチドによっては阻害されなかった。
【０２６６】
実施例30：インビトロでのLoVo細胞における細胞増殖に対するAPCDD1の作用
結腸直腸腫瘍発生におけるAPCDD1の役割を明らかにするために、少量のAPCDD1を発現するLoVo細胞（ATCC、Rockville、MD）においてコロニー形成アッセイを行う目的で、APCDD1（pcDNA-APCDD1）およびAPCDD1の相補鎖（pcDNA-アンチセンス）を発現するプラスミドを調製した。より具体的には、APCDD1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3'（配列番号：86）および5'-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3'（配列番号：87）を用い、RT-PCRによって増幅した。このPCR産物をpcDNA3.1（インビトロジェン）の適切なクローニング部位にクローニングした。続いて、LoVo細胞に対して構築したpcDNA-APCDD1またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたハムF-12培地中で細胞を10〜21日間インキュベートした。細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。
【０２６７】
その結果、対照プラスミドpcDNA-アンチセンスまたはpcDNAと比較して、pcDNA-APCDD1は著しく多くのコロニーを生じた（図30a）。この結果は3回の独立した実験によって確認された。細胞増殖に対するその効果をインビトロで裏づけるために、外因性APCDD1を発現するLoVo細胞（LoVo-APCDD1細胞）を樹立し、その増殖を、擬似ベクターをトランスフェクトした対照細胞と比較した（図30b）。LoVo-APCDD1細胞は対照LoVo-擬似細胞に比べ著しく高い速度で増殖した（図30c）。
【０２６８】
実施例31：ヌードマウスにおける腫瘍増殖に対するAPCDD1の効果
インビボでのAPCDD1の役割を調べるために、ヌードマウスでのLoVo-APCDD1細胞の2種類のクローンまたはLoVo-擬似細胞の2種類のクローンのいずれかを、12匹のBALBcAnN Crj-nu/nuマウスに同時に移植した。具体的には、腫瘍細胞、LoVo-APCDD1、またはLoVo-ベクターを最終濃度が5×10７個/mlになるように調整し、その100μlをBALB/cAnN Crj-nu/nuマウスの中背部後方にそれぞれ皮下注射した。腫瘍の計測は7日毎に8週間にわたって行い、体積を式V＝π/6×a２×bによって概算したが、ここで「a」は短軸であり、「b」は長軸である。
【０２６９】
その結果、LoVo-APCDD1クローンの腫瘍の平均サイズは移植8週後に約482mm３および653mm３に達したが、LoVo-擬似では65mm３および277mm３であった；このことはAPCDD1の導入がインビボの細胞に対して増殖促進効果をもたらすことを示している（図30d）。
【０２７０】
実施例32：APCDD1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖阻害作用
APCDD1の増殖促進的な役割を評価するために、APCDD1に対応する、さまざまな対の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成し、それらを、検討した11種の結腸癌細胞株のなかでAPCDD1を大量に発現するSW480細胞にトランスフェクトした。この方法は、SNU475細胞の代わりにSW480細胞を用い、以下のS-オリゴヌクレオチドを用いた点以外は、実施例5に記載した手順に従って行った：対照センスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-S2、5'-ATGTCCTGGCCGCGCC-3'（配列番号：88）；アンチセンスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-AS2、5'-GGCGCGGCCAGGACAT-3'（配列番号：89）；リバースS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-R2、5'-TACAGGACCGGCGCGG-3'（配列番号：90）；およびスクランブルS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-Sc2、5'-ATCTGGTCCGGCGCGG-3'（配列番号：91）。
【０２７１】
これらのオリゴヌクレオチドのうち、APCDD1-AS2は、細胞におけるAPCDD1の発現を対照APCDD1-S2に比べ有意に抑制した（図31a）。興味深いことに、トランスフェクションから6日後の時点でのAPCDD1-AS2の導入は細胞の増殖巣形成をAPCDD1-S2に比べ明らかに抑制し、このことからAPCDD1の抑制によってトランスフェクト細胞の増殖および/または生存度が低下することが示唆された（図31b）。MTTアッセイにより、APCDD1-R2、APCDD1-Sc2および非処理細胞と比較して、APCDD1-AS2に応答して細胞生存度が低下することが裏づけられた（図31c）。
【０２７２】
実施例33：結腸癌細胞株におけるAPCDD1の発現
APCDD1の発現および機能について検討するために、APCDD1に対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、組換えHis標識したAPCDD1タンパク質を大腸菌で産生させ、Pro Bond（商標）ヒスチジンレジン（インビトロジェン）を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、APCDD1に対するポリクローナル抗体を血清から精製した。ウエスタンブロット分析に関しては、タンパク質を10％SDS-PAGEによって分離し、抗APCDD1抗体を用いてイムノブロットを行った。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG（サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））をECL検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク）用の二次抗体として用いた。
【０２７３】
抗APCDD1抗体を用いたSW480細胞および凍結組織の免疫組織化学染色も実施例18に記載の通りに行った。パラフィン包埋した組織切片を、製造者の推奨する方法に従ってSAB-POペルオキシダーゼ免疫染色システム（ニチレイ、東京、日本）に供した。抗原は、脱パラフィン処理および再水和を行った組織から、スライドをクエン酸緩衝液（pH6）中に入れて電子オーブンにより700Wで10分間前処理することにより回収した。HCT116、SNUC4およびSW480を含む結腸癌細胞の抽出物を用いた、抗APCDD1抗体によるウエスタンブロット分析により、APCDD1に対応する58kDaバンドが示された（図32）。内因性APCDD1タンパク質のサイズは、抗FLAG抗体によって検出された外因性Flag標識APCDD1タンパク質と非常に類似していた。APCDD1の発現は3種類の結腸癌細胞株の中でSW480細胞が最も高かった。
【０２７４】
実施例34：結腸癌細胞および組織におけるAPCDD1の細胞内局在
その細胞内局在を調べるために、SW480細胞を用いてAPCDD1の蛍光免疫組織化学染色を行った。細胞を固定し、抗APCDD1で染色し、フルオレセインを結合させた二次抗体によって可視化した。シグナルは細胞間境界および細胞質で観察された（図33）。
【０２７５】
非癌結腸粘膜組織および癌組織におけるAPCDD1発現も調べたが、これは染色により、非癌細胞および癌細胞の細胞質中に認められた（図34）。注目されることとして、上皮細胞の頂部境界域に強いシグナルが観察された。
【０２７６】
実施例35：結腸の正常上皮、腺癌、および腺腫におけるAPCDD1の発現
APCDD1タンパク質の発現レベルを非癌上皮細胞と腫瘍細胞との間で比較するために、パラフィン包埋した組織を免疫組織化学染色に供した。癌細胞の方が非癌上皮細胞よりも抗APCDD1抗体によって強く染色された（図35）。また、腺腫細胞でも弱いシグナルが観察された（図36）。
【０２７７】
産業上の利用可能性
新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHの発現は非癌肝組織に比べ肝細胞癌で顕著に上昇している。一方、新規ヒト遺伝子PPIL1およびAPCDD1の発現は非癌組織に比べ結腸癌細胞で顕著に上昇している。したがって、これらの遺伝子は癌の診断マーカーとして役立つと思われ、それらによってコードされるタンパク質は診断アッセイに用いることができると考えられる。
【０２７８】
本発明者らは、新規タンパク質WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現が細胞増殖を促し、一方、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAによって細胞増殖が抑制されることも示した。これらの所見は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質が発癌活性を誘発することを示唆する。このため、この新規癌タンパク質は癌に対する医薬品の開発のための有用な標的となる。例えば、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現を阻止する薬剤、またはその活性を妨げる薬剤は、抗癌剤、特にHCCおよび結腸癌の治療用の抗癌剤として治療上有用な可能性がある。このような薬剤の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1を認識する抗体が含まれる。
【０２７９】
さらに、本発明者らは、PPIL1がスタスミンと直接会合することも示しており、この結果は、PPIL1にインビボでスタスミンのリン酸化を増強させる能力があることを示唆する。スタスミンは細胞周期の進行に関与するとともにさまざまな種類の癌と関係していることが報告されているため、この複合体の活性を阻害する薬剤も結腸直腸癌の治療および予防に有用な可能性がある。
【０２８０】
さらに、本発明により、βカテニン/Tcf-4複合体とAPCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフとの結合がAPCDD1の転写活性化に関与することが示された。したがって、この複合体と結合モチーフとの結合を阻害する薬剤も結腸直腸癌の治療および予防に有用な可能性がある。
【０２８１】
本発明を詳細に特定の態様を参照しながら説明してきたが、発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更および改変を行いうることは当業者には明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２８２】
【図１】HCCにおけるWDRPUHおよびKRZFPUHの発現を示す。図1aは、cDNAマイクロアレイで調べた20例のHCCにおけるWDRPUHの相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準（Cy3シグナルおよびCy5シグナルの両方が25,000を上回る）を満たした12例のHCCのうち11例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図1bは、20例のHCCにおけるKRZFPUHの相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準を満たした14例のHCCのうち11例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図1cおよび1dは、別の10例のHCC症例を用いて半定量的RT-PCRにより分析したWDRPUH（c）およびKRZFPUH（d）の発現を示した写真を提示している（T、腫瘍組織；N、正常組織）。GAPDHの発現を内部対照として用いた。
【図２】種々のヒト組織におけるWDRPUHの発現、ならびにWDRPUHの予想されるタンパク質構造およびタンパク質モチーフを示す。図2aは、多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるWDRPUHの発現を示した写真である。図2bはWDRPUHの予想されるタンパク質構造を示す。
【図３】pcDNA3.1myc/His-WDRPUHをトランスフェクトしたSNU475細胞に対する免疫細胞化学により、具体的には抗mycモノクローナル抗体および可視化のためのFITC結合二次抗マウスIgG抗体を用いて観察したWDRPUHの細胞内局在を示した写真である。核はDAPIにより対比染色した。
【図４】NIH3T3細胞の細胞増殖に対するWDRPUHの作用を示す。図4aは、WDRPUH、WDRPUHに対するアンチセンス、およびベクター単独をトランスフェクトしたNIH3T3細胞に対するコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図4bは電気的密度測定（electric densitometry）によって算定したコロニー数を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。
【図５】WDRPUHを抑制するように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図5aは、センス（WDRPUH-S4）またはアンチセンス（WDRPUH-AS4）オリゴヌクレオチドにより12時間処理したSNU475細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図5bは、MTTアッセイによって測定した、オリゴヌクレオチド処理から72時間後のSNU475細胞の細胞生存度を示す。
【図６】WDRPUH-siRNAの増殖抑制作用を示す。図6Aは、WDRPUH-siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図6Bは、対照-siRNAまたはWDRPUH-siRNAで処置した生細胞のギムザ染色の結果を示した写真を示す。
【図７】抗WDRPUH抗血清（#1、#2および#3）、免疫前血清、および抗FLAG抗体を用いた、FLAG標識WDRPUHタンパク質のスロットブロット分析の結果を示した写真である。
【図８】種々のヒト組織におけるKRZFPUHの発現、ならびにKRZFPUHの予想されるタンパク質構造およびタンパク質モチーフを示す。図8aは、多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるKRZFPUHの発現を示した写真である。図8bはKRZFPUHの予想されるタンパク質構造を示す。
【図９】pcDNA3.1myc/His-KRZFPUHをトランスフェクトしたSNU475細胞に対する免疫細胞化学により、具体的には抗Hisモノクローナル抗体および可視化のためのローダミン結合二次抗マウスIgG抗体を用いて観察したKRZFPUHの細胞内局在を示した写真である。核はDAPIにより対比染色した。
【図１０】COS7細胞の細胞増殖に対するKRZFPUHの作用を示す。図10aは、KRZFPUH、およびKRZFPUHに対するアンチセンスをトランスフェクトしたCOS7細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図10bは、電気的密度測定によって算定したコロニー数を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。
【図１１】KRZFPUHを抑制するように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図11aは、センス（KRZFPUH-S4）またはアンチセンス（KRZFPUH-AS4）オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたAlexander細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図11bは、KRZFPUH-S4またはKRZFPUH-AS4のいずれかで12時間処理したSNU475細胞におけるKRZFPUHの発現を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。
【図１２】Huh7細胞におけるKRZFPUHの発現に対するKRZFPUH-siRNAの増殖抑制作用を示す。図12Aは、psiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）、psiU6BX-EGFP（EGFP）、または擬似ベクター（擬似）をトランスフェクトしたHuh7細胞から抽出したRNAを用いて行った半定量的RT-PCRの結果を示す。GAPDHを内部対照として用いた。図12Bは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）、またはKRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトした生細胞に対してトランスフェクション5日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。（*）はFisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。図12Cは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトした生細胞に対してトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。（*）はFisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。図12Dは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトした生細胞のギムザ染色の結果（トランスフェクション10日目）を示した写真を示す。
【図１３】種々の細胞の生存度に対するKRZFPUH-siRNAの作用を示す。図13Aは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトしたAlexander細胞を用いてトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。図13Bは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトしたSNU449細胞を用いてトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。図13Cは、MTTアッセイによって測定した、HepG2細胞の生存度に対するKRZFPUH-siRNAの作用を示す。（*）は、Fisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。
【図１４】結腸癌におけるPPIL1の発現を示す。図14aは、cDNAマイクロアレイで調べた11例の結腸癌症例におけるPPIL1の相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準を満たした6例中6例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図14bは、別の20例の結腸癌症例を用いて半定量的RT-PCRによって分析したPPIL1の発現を示した写真を示している（T、腫瘍組織；N、正常組織）。GAPDHの発現を内部対照として用いた。
【図１５】PPIL1（ヒト）、Ppil1（マウス）、Cyp2（分裂酵母）およびCypE（細胞性粘菌）の間における類似性を示す。
【図１６】NIH3T3細胞およびHCT116細胞の細胞増殖に対するPPIL1の作用を示す。図16aは、PPIL1をトランスフェクトしたNIH3T3細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図16bは、PPIL1をトランスフェクトしたHCT116細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。いずれの実験においても、pcDNA-LacZ、およびPPIL1のコード領域の相補鎖を発現するpcDNA3.1-アンチセンスを陰性対照として用いた。
【図１７】ヒト結腸癌細胞株SW480におけるPPIL1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図17aは、センスS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-S2）、アンチセンスS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-AS2）またはスクランブルS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-SCR2）で処理したSW480細胞におけるPPIL1およびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図17bは、PPIL1-AS2の増殖抑制作用を示した写真である。図17cは、MTTアッセイによって測定した、オリゴヌクレオチド処理から72時間後のSW480細胞、SNUC4細胞、およびSNUC5細胞の細胞生存度を示す。
【図１８】インビトロでPPIL1がSNW1と会合することを示した写真を示す。COS7細胞に、pFLAG CMV-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1を同時トランスフェクトした。この細胞から得た可溶化物を抗c-Mycポリクローナル抗体または抗FLAGモノクローナル抗体によって免疫沈降させるとともに、抗FLAGモノクローナル抗体または抗c-Mycポリクローナル抗体をそれぞれ用いてイムノブロットを行った。
【図１９】FLAG標識PPIL1およびmyc標識SNW1タンパク質の細胞内局在を示した写真を示す。図19aは、pFLAG CMV-PPIL1をトランスフェクトし、抗FLAG M2モノクローナル抗体で染色したCOS7細胞の写真である。標識タンパク質は、ローダミンで標識した抗マウスIgG抗体を用いて可視化した。図19bは、pcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトし、抗c-Myc抗体で染色したCOS7細胞の写真である。標識タンパク質は、FITCで標識した抗ウサギIgG抗体を用いて可視化した。図19cは、核をDAPIで対比染色した細胞の写真である。図19dは（a）（b）および（c）のマージ画像である。PPIL1およびSNW1は核内に共存していた。
【図２０】多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるPPIL1の発現を示した写真である。
【図２１】SNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1-siRNAの増殖抑制作用を示す。図21Aは、PPIL1-siRNAをトランスフェクトしたSNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1およびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図21Bは、対照-siRNAまたはPPIL1-siRNAで処理した生細胞のギムザ染色の結果を示した写真を示す。
【図２２】大腸菌におけるPPIL1組換えタンパク質の発現を示す。図22Aは、GSTと融合させたPPIL1タンパク質の発現を示した写真である。図22Bは、His標識PPIL1タンパク質の発現を示した写真である。
【図２３】細菌2-ハイブリッド系におけるPPIL1とスタスミンの相互作用を示す。図23Aは、2-ハイブリッド系におけるPPIL1とスタスミンの相互作用を示した写真である。図23Bは、インビボでのPPIL1とスタスミンの相互作用を示した写真である。
【図２４】pFLAG-PPIL1およびpCMV-HA-STMNを同時トランスフェクトしたCOS7細胞の細胞質におけるPPIL1およびスタスミンの共存を示す。図24は、COS7細胞の細胞質におけるPPIL1およびスタスミンの蛍光免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。
【図２５】インビボにおけるスタスミンの種々の欠失変異体とPPIL1の相互作用を示す。図25Aは、スタスミンの種々の欠失変異体の構造の概略図を示す。図25Bは、インビボにおけるスタスミンの発現およびPPIL1と欠失変異体の共沈を示した写真を示す。
【図２６】インビボにおけるスタスミン変異体の発現およびPPIL1との相互作用を示す。図26Aは、SerをAlaで置換したスタスミン変異体の概略図を示す。図26Bは、インビボにおけるスタスミンの発現およびPPIL1と変異体の共沈を示した写真を示す。
【図２７】APCDD1の発現を示した写真を示す。図27aは、Ad-APCまたはAd-AxinをトランスフェクトしたSW480細胞におけるAPCDD1の発現低下を示した写真を示す。RNAおよびタンパク質抽出物は、指定のアデノウイルスをMOI 100で感染させ、72時間インキュベートしたSW480細胞から単離した。図27bは、ノーザンブロットによって分析した、成人組織におけるAPCDD1の発現を示す写真である。APCDD1は主として心臓、膵臓、前立腺、および卵巣で発現したが、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢血細胞でもわずかに発現した。図27cは、半定量的RT-PCRによって測定した、結腸癌組織（T）および対応する非癌粘膜（N）におけるAPCDD1の発現を示した写真を示す。検討した30例のうち20例（67％）で発現上昇が観察された。GAPDHの発現を内部対照として用いた。
【図２８】APCDD1の種々のプラスミドを用いて行ったレポーターアッセイの結果を示す。図28aは、APCDD1の5'隣接領域に存在する推定上のTcf4結合因子、およびAPCDD1の種々のレポータープラスミドを示した概略図である。転写開始部位と推定される部位からのヌクレオチド位置をプラスまたはマイナスを付けた数字で示す。図28bは、レポータープラスミドと発現プラスミド（pcDNA-擬似、pcDNA-mutβカテニン、pcDNA-wtTcf-4またはpcDNA-dnTcf4）とを種々組み合わせて同時トランスフェクトしたHeLa細胞のルシフェラーゼ活性を示す。レポーターアッセイはトランスフェクションから48時間後に3回ずつ行った。バーは標準偏差を示す。（*）はシェフェ（Scheffe）のF検定による評価での有意差（P＜0.01）を表す。
【図２９】TBM1またはTBM2を含む因子とβカテニン/Tcf4複合体との相互作用を示したEMSAの結果を示す写真である。複合体を表すバンドのスーパーシフトは、抗βカテニン抗体（レーン2）の添加後には観察されたが、抗P53抗体（レーン3）の添加後には観察されなかった。Tcf4プローブおよびβカテニン/Tcf4プローブに対応するバンドは、標識していない野生型プローブ（レーン5）の添加によって特異的にブロックされた。
【図３０】インビトロでのLoVo細胞における細胞増殖に対するAPCDD1の作用を示す。図30aは、LoVo細胞におけるコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。細胞にはpcDNA3.1-APCDD1、pcDNA、またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトした。図30bは、外因性APCDD1を発現するLoVo細胞（LoVo-APCDD1）および対照細胞（LoVo-ベクター）におけるAPCDD1の発現を示した写真である。図30cは、LoVo-APCDD1細胞およびLoVo-ベクター細胞の増殖を示す。図30dは、LoVo-APCDD1細胞の2種類のクローンおよびLoVo-ベクター細胞の2種類のクローンによる、ヌードマウスでの腫瘍の増殖を示す。
【図３１】APCDD1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖阻害作用を示す。図31Aは、センスS-オリゴヌクレオチド（APCDD-S2）またはアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（APCDD-AS2）で24時間処理したSW480細胞におけるAPCDD1の発現を示した写真を示す。GAPDHの発現を内部対照として用いた。図31Bは、APCDD-AS2の増殖抑制作用を示した写真である。図31Cは、MTTアッセイにより測定した、オリゴヌクレオチド処理後のSW480細胞の細胞生存度を示す。バーは標準偏差を示す。（*）は、シェフェ（Scheffe）のF検定による評価での有意差（P＜0.01）を表す。
【図３２】APCDD1を単独で、またはpFLAG-APCDD1とともにトランスフェクトしたCOS7細胞、および結腸癌細胞株のウエスタンブロット分析を示した写真である。
【図３３】SW480細胞におけるAPCDD1タンパク質の細胞内局在を示した写真を示す。
【図３４】結腸の非癌粘膜（A）および腺癌（B）におけるAPCDD1の蛍光免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。
【図３５】結腸癌組織におけるAPCDD1の免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。
【図３６】結腸腺腫におけるAPCDD1の免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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