(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｇ）  前記工程（Ｆ）において、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記工程（Ａ）におけるＤＮＡの断片化が、超音波処理又は制限酵素処理により行なわれる請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
対照ＤＮＡが、プラスミド又は合成されたオリゴヌクレオチドである請求項１又は２に記載の解析方法。
【請求項４】
前記工程（Ｃ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する請求項１〜３いずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
プライマーセットが、前記ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなるプライマーセットである請求項１〜４いずれかに記載の解析方法。
【請求項６】
ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である請求項１〜５いずれかに記載の解析方法。
【請求項７】
メチル化ＤＮＡの解析が、ＤＮＡチップにより行なわれる請求項１〜６いずれかに記載の解析方法。
【請求項８】
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項９】
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｈ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
（Ｉ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｊ）  前記工程（Ｉ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｋ）  前記工程（Ｊ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｈ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法。
【請求項１０】
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ）  下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ）  前記工程（Ｌ）で得られた産物中の増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ）  前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｃ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法。
【請求項１１】
（ａ）ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化して得られるＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡとの混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮したメチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、及び
（ｂ）前記メチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、
に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物中におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を算出して、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することを特徴とするメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ＤＮＡの解析方法及びプライマーセットに関する。より詳しくは、メチル化ＤＮＡの解析方法、プライマーセット、ＤＮＡ含有試料中に含まれる非メチル化ＤＮＡを検出するための指標用の対照ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法及びメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのＣｐＧ部位のメチル化は、遺伝子発現に大きな影響を与えている。例えば、ＤＮＡのメチル化の異常は、疾患の発症、例えば、細胞のがん化に関連する遺伝子の発現等に関与していることが知られている。そのため、がん等の疾患の診断方法や治療方法の開発のために、種々の遺伝子におけるＤＮＡのメチル化が、網羅的に解析されている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化の解析では、例えば、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化結合タンパク質を用いるメチル化ＤＮＡ免疫沈降法等によりメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれ、その後、得られた濃縮物に含まれるＤＮＡのプロファイリングが行われている。かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物に非メチル化ＤＮＡが含まれていた場合、解析の効率の低下を招くことがある。例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法では、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体、メチル化結合タンパク質又はビーズに対して、非メチル化ＤＮＡが非特異的に結合又は吸着する場合があるため、かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの有無や含有量の確認が行なわれている。
【０００４】
メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの検出は、メチル化されていないとされていたハウスキーピング遺伝子のプロモーター領域を指標として行なわれている（非特許文献１及び２を参照のこと）。非特許文献１に記載の方法では、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＡＰＤＨ」という）遺伝子のプロモーター領域が非メチル化ＤＮＡの指標として用いられている。かかる非特許文献１に記載の方法では、検出されたＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域で標準化することにより、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮量が決定されている。また、非特許文献２に記載の方法では、非メチル化ＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域及びβ−アクチン遺伝子のプロモーター領域が用いられている。かかる非特許文献２に記載の方法では、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物中にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域及びβ−アクチン遺伝子のプロモーター領域が検出されないことを指標として、メチル化ＤＮＡの濃縮率を評価している。
【０００５】
しかしながら、実際には、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域及びβ−アクチン遺伝子のプロモーター領域それぞれのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがある。そのため、ＧＡＰＤＨ遺伝子、β−アクチン遺伝子等のハウスキーピング遺伝子のプロモーター領域を指標として用いた場合、濃縮物中における非メチル化ＤＮＡを正確に検出できず、十分に評価できないことがある。
【非特許文献１】イラナ  ケシェット(Ilana Keshet)、他１０名、「癌細胞におけるデ・ノボ  メチル化の有益な機構の証拠(Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation incancer cells)」、ネーチャージェネティクス(NATURE GENETICS)、第３８巻、第２号、２０００６年１月２４日発行、ｐ．１４９−１５３
【非特許文献２】ハヤシ  ヒロシ、他７名、「オリゴヌクレオチドタイリングアレイを用いるヒトゲノムにおけるＤＮＡメチル化の高分解能マッピング(High-resolution mapping of DNA methylation in human genome usingoligonucleotide tiling array)」、ヒューマン  ジェネティックス(HumanGenetics)、第１２０巻、２００６年９月２６日発行、ｐ．７０１−７１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるメチル化ＤＮＡの解析方法を提供することを１つの課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるプライマーセット及び指標用の対照ＤＮＡを提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に判定することができるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法を提供することを他の課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法を提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に算出することができるメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法を提供することを他の課題とする。本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に評価することができる、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）  （Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｇ）  前記工程（Ｆ）において、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法、
（２）  前記工程（Ａ）におけるＤＮＡの断片化が、超音波処理又は制限酵素処理により行なわれる前記（１）に記載の解析方法、
（３）  対照ＤＮＡが、プラスミド又は合成されたオリゴヌクレオチドである前記（１）又は（２）に記載の解析方法、
（４）  前記工程（Ｃ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する前記（１）〜（３）いずれかに記載の解析方法、
（５）  プライマーセットが、前記ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなるプライマーセットである前記（１）〜（４）いずれかに記載の解析方法、
（６）  ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である前記（１）〜（５）いずれかに記載の解析方法、
（７）  メチル化ＤＮＡの解析が、ＤＮＡチップにより行なわれる前記（１）〜（６）いずれかに記載の解析方法、
（８）  被検対象のＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖とその相補鎖とからなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡの該ＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、
該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーと
からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
（９）  ＤＮＡが、癌細胞から調製されたＤＮＡである前記（８）に記載のプライマーセット、
（１０）  対照ＤＮＡが、配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と、該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡである前記（８）又は（９）に記載のプライマーセット、
（１１）  配列番号：２に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：３に示される塩基配列からなるプライマーとからなる前記（１０）に記載のプライマーセット、
（１２）  配列番号：１に示される塩基配列からなる、ＤＮＡ含有試料中に含まれる非メチル化ＤＮＡを検出するための指標用の対照ＤＮＡ、
（１３）  （Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、
（１４）  （Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｈ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
（Ｉ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｊ）  前記工程（Ｉ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｋ）  前記工程（Ｊ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｈ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法、
（１５）  （Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ）  下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ）  前記工程（Ｌ）で得られた産物中の増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ）  前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｃ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法、並びに
（１６）（ａ）ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化して得られるＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡとの混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮したメチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、及び
（ｂ）前記メチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、
に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物中におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を算出して、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することを特徴とするメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のプライマーセット及び指標用の対照ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に判定することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に算出することができるという優れた効果を奏する。本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に評価することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化することにより得られたＤＮＡ断片を含む試料中のメチル化ＤＮＡの濃縮に際して、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを添加し、かかる対照ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡの指標として用いることにより、非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるという本発明者らによる知見に基づく。
これにより、メチル化ＤＮＡの濃縮の前後における非メチル化ＤＮＡの量の変動を、簡便、かつ正確に調べることができ、メチル化ＤＮＡ濃縮物におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率やメチル化ＤＮＡの解析用試料としての適性をも評価することができる。
したがって、まず、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、プライマーセット及び指標用の対照ＤＮＡを説明する。
【００１０】
１．  メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、プライマーセット及び指標用の対照ＤＮＡ
本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法は、
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
を含む方法である。
【００１１】
本発明の検出方法では、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡが添加されているため、かかる対照ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡの指標として、メチル化ＤＮＡの濃縮の前後における非メチル化ＤＮＡの量の変動をモニタリングすることができる。また、本発明の検出方法では、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いた核酸増幅反応が行なわれるため、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの存在の指標となる前記対照ＤＮＡが存在している場合には、当該対照ＤＮＡを簡便に増幅させることができ、当該核酸増幅反応により得られる増幅産物を指標として非メチル化ＤＮＡを、簡便にかつ、正確に検出することができる。前記対照ＤＮＡは、例えば、従来、非メチル化ＤＮＡの指標として用いられていたＧＡＤＰＨ遺伝子のプロモーター領域、β−アクチン遺伝子のプロモーター領域のように、ヒト等の生体内のゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡのメチル化異常の影響を実質的に受けることがないため、本発明の検出方法では、メチル化ＤＮＡ濃縮物中における非メチル化ＤＮＡを正確に検出することができる。
【００１２】
本明細書において、メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されて、５−メチルシトシンとなっているＤＮＡをいう。また、本明細書において、非メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＤＮＡをいう。ＣｐＧ部位は、ゲノム中に存在するシトシンとグアニンとからなるＣＧジヌクレオチドの部位であり、メチル化の対象となる部位である。かかるＣｐＧ部位は、遺伝子発現の調節、がん、インプリンティング等に関与する。
【００１３】
本発明の検出方法では、まず、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る。
【００１４】
ＤＮＡ含有試料は、種々の動物種、組織、細胞等から得られるＤＮＡを含有する試料であればよい。ＤＮＡ含有試料として、例えば、血液、体液、及びヒトの組織の細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料などが挙げられる。前記ＤＮＡ含有試料としては、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料を用いてもよい。
【００１５】
ＤＮＡは、例えば、ヒトの組織の細胞を溶解させ、得られた溶解物から、フェノール等を用いてタンパク質を除去する方法等により得ることができる。ＤＮＡは、市販のＤＮＡ抽出キット等により抽出してもよい。ＤＮＡは、水や適切な緩衝液に溶解させてもよい。
【００１６】
ＤＮＡの断片化は、超音波処理、制限酵素処理等により行なわれる。
【００１７】
超音波処理は、ＤＮＡ含有試料に超音波を照射することにより行なわれる。超音波処理の条件は、ＤＮＡを、核酸増幅における鋳型として用いるに適した大きさとなるように断片化させる観点から、得られるＤＮＡ断片の大きさが好ましくは３００ｂｐ〜１０００ｂｐとなる条件であることが望ましい。
【００１８】
制限酵素処理は、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡを制限酵素により消化することにより行なわれる。用いられる制限酵素は、ＤＮＡを、核酸増幅における鋳型として用いるに適した大きさとなるように断片化させる観点から、好ましくは４〜６塩基認識の制限酵素が望ましい。制限酵素は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。制限酵素によるＤＮＡの処理は、用いられる制限酵素に応じた反応条件下で行なわれる。
【００１９】
つぎに、得られた試料に、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを添加して、混合物を得る。
【００２０】
非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡは、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡに存在しない塩基配列を有する。非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００２１】
ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡに存在しない塩基配列は、用いられるＤＮＡ含有試料の供給源となる生体のゲノムＤＮＡの塩基配列のデータベースを、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴアルゴリズムによるデフォルト値でのアライメント下にホモロジーサーチすることにより、ホモロジーが実質的にない塩基配列として選択することができる。塩基配列中におけるシトシンが非メチル化シトシンであるＤＮＡ鎖は、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列のＤＮＡ鎖を選択することにより得ることができる。
【００２２】
非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡは、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡに存在しない塩基配列からなるのであれば、プラスミド、合成オリゴヌクレオチド等のいずれであってもよい。
【００２３】
非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ、配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡ等が挙げられる。かかる配列番号：１に示される塩基配列は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、シロイヌナズナ等の植物、線虫等には存在しない塩基配列である。したがって、かかる配列番号：１に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ及び配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡは、本発明において、ＤＮＡ含有試料として、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、シロイヌナズナ等の植物、線虫等のゲノムＤＮＡを含有する試料を用いる場合に有用である。
【００２４】
なお、「相補鎖」とは、二本鎖ＤＮＡにおける一方のＤＮＡ鎖と対をなすＤＮＡ鎖をいう。
【００２５】
得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る。
【００２６】
メチル化ＤＮＡの濃縮は、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いることにより行なわれる。メチル化ＤＮＡの濃縮方法としては、例えば、抗メチル化シトシン抗体や抗メチル化シチジン抗体を用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法（ＭｅＤＩＰ法）、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質と、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体とを用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法、メチル化ＤＮＡをヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に結合させ、メチル化ＤＮＡが結合したヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質をニッケル固定化担体で回収し、メチル化ＤＮＡを回収する方法等が挙げられる。
【００２７】
抗メチル化シチジン抗体及び抗メチル化シトシン抗体は、ＤＮＡ内のメチル化シチジンやメチル化シトシン（５−メチルシトシン）に特異的に結合する抗体であればよく、例えば、メチル化シチジン又は分子内に当該メチル化シトシンを含むＤＮＡを抗原として用いて慣用の手法により動物を免疫させることにより作製することができる。
【００２８】
その後、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう。
【００２９】
プライマーセットは、被検対象のＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖とその相補鎖とからなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡの該ＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットが好ましい。
【００３０】
ＤＮＡとしては、特に限定されないが、例えば、疾患患者の細胞から調製されたＤＮＡ等が挙げられる。ＤＮＡとしては、具体的には、癌細胞から調製されたＤＮＡ等が挙げられる。
【００３１】
本発明には、前記プライマーセットも包含される。本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応により、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを容易に増幅させることができる。そのため、本発明のプライマーセットによれば、得られる増幅産物を非メチル化ＤＮＡの指標として用いて、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、正確に検出することが可能になる。また、本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応を行なうだけで、非メチル化ＤＮＡの指標となる増幅産物を得ることができるため、得られる増幅産物を非メチル化ＤＮＡの指標として用いて、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に検出することができる。さらに、本発明のプライマーセットを、メチル化ＤＮＡの解析に適用することにより、メチル化ＤＮＡを、簡便に、高い効率で解析することができる。また、本発明の検出方法及びプライマーセットによれば、例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法によるＤＮＡの濃縮、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いるＤＮＡの濃縮等において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質に非特異的に結合した非メチル化ＤＮＡの量を算出することが可能となる。これにより、メチル化ＤＮＡの濃縮率を評価することもできるため、メチル化ＤＮＡの濃縮の操作における条件の最適化が容易になる。
【００３２】
プライマーセットのフォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは２℃以内が望ましい。また、プライマーセットの各プライマーの塩基配列中におけるグアニン及びシトシンの割合は、好ましくは４０〜６０％が望ましい。プライマーセットの１つのプライマーの塩基配列中において、グアニンは４以上連続していないことが望ましい。プライマーセットの各プライマーの長さは、１７〜２５ヌクレオチド長が望ましい。さらに、プライマーセットの各プライマーは、ＰＣＲの際のアニーリング温度を、好ましくはＴｍに近い温度に設定することが望ましい。かかるプライマーセットによれば、核酸増幅反応を効率よく行なうことができるとともに、非メチル化ＤＮＡの指標となる前記対照ＤＮＡを容易に増幅することができる。
【００３３】
プライマーセットの具体例としては、配列番号：２に示される塩基配列からなるプライマー（QC-CGF-1 Fプライマー、5’-TTCGCGGGATTTTTTAGAAGAGC-3’）と配列番号：３に示される塩基配列からなるプライマー（QC-CGF-1 Rvプライマー、5’-CACTAATAACGAAAACTACGACGACG-3’）とからなるプライマーセット等が挙げられる。かかるプライマーセットによれば、非メチル化ＤＮＡの指標となる配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する対照ＤＮＡを効率よく増幅することができる。また、配列番号：２に示される塩基配列及び配列番号：３に示される塩基配列は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、シロイヌナズナ等の植物、線虫等には存在しない塩基配列である。したがって、かかるプライマーセットは、本発明において、ＤＮＡ含有試料として、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、シロイヌナズナ等の植物、線虫等のゲノムＤＮＡを含有する試料を用いる場合に有用である。
【００３４】
プライマーセットは、核酸増幅反応を行なう核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法、市販のプライマー設計用ソフトウエア等を用いることにより設計することができる。前記プライマー設計用ソフトウエアとしては、例えば、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。
【００３５】
核酸増幅反応を行なう核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法、、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法等が挙げられる。なかでも、増幅産物の定量が迅速かつ簡便にできる観点から、ポリメラーゼ連鎖反応法のひとつであるリアルタイムＰＣＲが望ましい。リアルタイムＰＣＲでは、増幅産物のＤＮＡをリアルタイムでモニタリングし、指数関数的増幅領域で、該ＤＮＡの定量を行なうため、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき、正確に、該ＤＮＡを定量することができる。リアルタイムＰＣＲとしては、蛍光を発するインターカレーターを用いるインターカレーター法、及び増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブ等）を用いるプローブ法がある。これらのなかでは、増幅産物の検出及び定量を簡便に行なうことができる観点から、好ましくはインターカレーター法である。インターカレーター法では、インターカレーターは、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質である。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡとして得られる増幅産物に結合しているインターカレーターの蛍光に基づく蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。インターカレーターとしては、例えば、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標）  ｇｒｅｅｎ等が挙げられる。
【００３６】
増幅産物の検出は、公知の方法によって確認することができる。例えば、慣用のアガロースゲル電気泳動、標識プローブを増幅産物にハイブリダイズさせて検出する方法、核酸増幅で生じる副生成物の濁りを検出する方法等により行なわれる。本発明の検出方法では、増幅産物が検出されることが、メチル化ＤＮＡ濃縮物中に非メチル化ＤＮＡが存在することの指標となる。
【００３７】
２．  メチル化ＤＮＡの解析方法
本発明の検出方法のように、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを添加した混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なうことにより、増幅産物を指標として、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を調べることができるため、メチル化ＤＮＡの解析における非特異的なバックグラウンドを予め検証することができる。また、本発明の検出方法及びプライマーセットによれば、前述のように、メチル化ＤＮＡの濃縮工程の信頼性を判定することができ、精度管理をすることができる。そのため、本発明の検出方法及びプライマーセットは、高い効率でのメチル化ＤＮＡの解析を可能にする。
【００３８】
本発明は、他の側面では、
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｄ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｇ）  前記工程（Ｆ）において、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ解析用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法に関する。
【００３９】
本発明の解析方法では、メチル化ＤＮＡ濃縮物と前記プライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行なうことにより、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮を確認することができ、メチル化ＤＮＡの解析に適した量のメチル化ＤＮＡの濃縮試料を予め得ることができるため、高い効率でのメチル化ＤＮＡの解析が可能になる。
【００４０】
また、本発明の解析方法では、プライマーセットによる増幅産物自体が生体内においてメチル化されないＤＮＡに基づくものであるため、前記工程（Ａ）〜（Ｅ）を行なうことにより増幅産物としての非メチル化ＤＮＡの検出を行なうごとに、メチル化状態を確認することを行なわなくてもよく、簡単な操作で、低コストでメチル化ＤＮＡを解析することができる。
【００４１】
図１に本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００４２】
本発明の解析方法では、図１のフローチャートのステップＳ１−１において、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る。かかるステップＳ１−１における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ａ）の操作と同様である。
【００４３】
つぎに、図１のフローチャートのステップＳ１−２において、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、得られたＤＮＡ断片を含有する試料に添加して、混合物を得る。かかるステップＳ１−２における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｂ）の操作と同様である。
【００４４】
その後、図１のフローチャートのステップＳ１−３において、得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る。かかるステップＳ１−３における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｃ）の操作と同様である。
【００４５】
つぎに、図１のフローチャートのステップＳ１−４において、対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、メチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう。かかるステップＳ１−４における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｄ）の操作と同様である。
【００４６】
つぎに、図１のフローチャートのステップＳ１−５において、得られた産物中の増幅産物を検出する。かかるステップＳ１−５における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｅ）の操作と同様である。
【００４７】
その後、本発明の解析方法では、図１のフローチャートのステップＳ１−６において、増幅産物の検出結果に基づいて、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する。
【００４８】
ここで、前記メチル化ＤＮＡ濃縮物を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量が、メチル化ＤＮＡの濃縮を行なう前の試料を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量と同じであるか少ない場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切である（「ＹＥＳ」）と判断することができる。
【００４９】
一方、前記メチル化ＤＮＡ濃縮物を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量が、メチル化ＤＮＡの濃縮を行なう前の試料を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量よりも多い場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切ではないと判断することができる。この場合、本発明の解析方法は、図１のフローチャートのステップＳ１−１に戻り、ＤＮＡの断片化から、再度実行される。
【００５０】
図１のフローチャートのステップＳ１−６において、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切である（「ＹＥＳ」）と判断された場合、図１のフローチャートのステップＳ１−７において、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡの解析が行われる。その後、本発明の解析方法は、終了する。
【００５１】
メチル化ＤＮＡの解析は、例えば、疾患関連遺伝子のＤＮＡ、転写因子のＤＮＡ、発現制御因子のＤＮＡ等を固定化したＤＮＡチップ、マイクロアレイ等により行なわれる。これにより、例えば、正常細胞のＤＮＡと異常細胞のＤＮＡとを用いて、ＣｐＧ部位のメチル化に起因して生体内での動態が変化する遺伝子等を解析することもできる。このように、本発明の解析方法は、ＣｐＧ部位のメチル化に起因して、生体内での動態が変化する遺伝子等を解析することができるため、疾患の発症、疾患状態の進行、悪性度の指標となる因子、薬物の標的となる因子、予後予測因子等の解析にも有用である。
【００５２】
３．  メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法
本発明の検出方法のように、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを添加した混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なうことにより、増幅産物の有無や量を指標として、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を調べることができるため、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を簡便に判定することができる。したがって、本発明には、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法も包含される。
【００５３】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｈ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
（Ｉ）  前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｊ）  前記工程（Ｉ）で得られた産物中の増幅産物を検出する工程、
（Ｋ）  前記工程（Ｊ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｈ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む方法である。
【００５４】
図２は、本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法の一実施態様を示すフローチャートである。図２のフローチャートにおいて、ステップＳ２−１〜ステップＳ２−３は、図１のフローチャートのステップＳ１−１〜ステップＳ１−３と同様である。
【００５５】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法では、図２のフローチャートのステップＳ２−３において得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物の一部が、図２のフローチャートのステップＳ２−４に用いられ、図２のフローチャートのステップＳ２−３において得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物の残りの一部が、図２のフローチャートのステップＳ２−５に用いられる。
【００５６】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法では、図２のフローチャートのステップＳ２−５において、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡの解析が行われる。メチル化ＤＮＡの解析は、本発明の解析方法におけるメチル化ＤＮＡの解析と同様の手法により行なわれる。
【００５７】
図２のフローチャートのステップＳ２−４において、対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、メチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いて核酸増幅反応を行なう。かかるステップＳ２−４における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｄ）の操作と同様である。
【００５８】
図２のフローチャートのステップＳ２−６において、得られた産物中の増幅産物を検出する。かかるステップＳ２−６における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｅ）の操作と同様である。
【００５９】
その後、図２のフローチャートのステップＳ２−７において、ステップＳ２−６の増幅産物の検出の結果に基づき、ステップＳ２−５のメチル化ＤＮＡの解析の結果が信頼できるものであるかが評価される。その後、本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法が終了する。
【００６０】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法では、メチル化ＤＮＡの解析とともに、対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、メチル化ＤＮＡ濃縮物とを用いた核酸増幅反応による増幅産物の検出の後、増幅産物の検出結果に基づいて、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する。本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法では、前記メチル化ＤＮＡ濃縮物を用いた核酸増幅反応による増幅産物が存在しないこと、又は前記メチル化ＤＮＡ濃縮物を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量が、メチル化ＤＮＡの濃縮を行なう前の試料を用いた核酸増幅反応による増幅産物の量に比べ、より少ないことが、メチル化ＤＮＡの解析結果が、より信頼できるものであることの指標となる。
【００６１】
４．  メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法
前記非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを増幅することができるプライマーセットと、メチル化ＤＮＡの濃縮前後の試料とを用いて核酸増幅反応を行なうことにより得られた増幅産物の量それぞれと、メチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、メチル化ＤＮＡの濃縮前後の試料とを用いて核酸増幅反応で得られた増幅産物の量とを比べることにより、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出することができる。本発明には、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法も包含される。
【００６２】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、
（Ａ）  ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ）  前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、前記工程（Ａ）で得られた試料に添加して、混合物を得る工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ）  下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）  前記工程（Ｃ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ）  前記工程（Ｂ）で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ）  前記工程（Ｌ）で得られた産物中の増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ）  前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｃ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む方法である。
【００６３】
図３に本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００６４】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法では、図３のフローチャートのステップＳ３−１において、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る。かかるステップＳ３−１における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ａ）の操作と同様である。
【００６５】
つぎに、図３のフローチャートのステップＳ３−２において、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを、得られたＤＮＡ断片を含有する試料に添加して、混合物を得る。かかるステップＳ３−２における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｂ）の操作と同様である。
【００６６】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法では、図３のフローチャートのステップＳ３−２で得られた混合物の一部が、図３のフローチャートのステップＳ３−３で用いられ、図２のフローチャートのステップＳ３−２で得られた混合物の一部が、図２のフローチャートのステップＳ３−６及びステップＳ３−７で用いられる。
【００６７】
図３のフローチャートのステップＳ３−３において、得られた混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る。かかるステップＳ３−３における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｃ）の操作と同様である。
【００６８】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法では、図３のフローチャートのステップＳ３−３で得られたメチル化濃縮物の一部が、図３のフローチャートのステップＳ３−４に用いられ、図２のフローチャートのステップＳ３−３で得られたメチル化濃縮物の残りの一部が、図３のフローチャートのステップＳ３−５に用いられる。
【００６９】
図３のフローチャートのステップＳ３−４において、メチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応〔核酸増幅反応（ｉ）〕が行なわれる。かかるステップＳ３−３における操作は、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法における工程（Ｄ）の操作と同様である。
【００７０】
また、図３のフローチャートのステップＳ３−５において、メチル化ＤＮＡ濃縮物と、ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応〔核酸増幅反応（ｉｉ）〕が行なわれる。
【００７１】
さらに、図３のフローチャートのステップＳ３−６において、ステップ３−２〔工程（Ｂ）〕で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応〔核酸増幅反応（ｉｉｉ）〕が行なわれる。
【００７２】
ステップ３−２〔工程（Ｂ）〕で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料は、例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降によりメチル化ＤＮＡを濃縮する場合には、ステップ３−２〔工程（Ｂ）〕で得られた混合物と、メチル化ＤＮＡに特異的に結合しない抗体である抗ＩｇＧ抗体とを用いた免疫沈降を行なうことにより得られる試料であってもよく、ステップ３−２〔工程（Ｂ）〕で得られた混合物であってもよい。
【００７３】
また、図３のフローチャートのステップＳ３−６において、ステップ３−２〔工程（Ｂ）〕で得られた混合物中に含まれるメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応〔核酸増幅反応（ｉｖ）〕が行なわれる。
【００７４】
なお、核酸増幅反応は、増幅産物の量を定量的に簡便、かつ迅速に測定できる観点から、好ましくは、リアルタイムＰＣＲやリアルタイムＬＡＭＰ等の定量的ＰＣＲ及び定量的ＬＡＭＰである。
【００７５】
核酸増幅反応は、核酸増幅反応を行なう方法と用いられるプライマーセットとに応じた条件で行なわれる。
【００７６】
対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとして、本発明のプライマーセットが用いられる。
【００７７】
また、ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、ＤＮＡ含有試料の供給源となる組織の細胞において、シトシンがメチル化されていることが知られているＤＮＡを増幅することができるプライマーセットであればよい。具体的には、ＤＮＡ断片のうち、メチル化ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなり、該メチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセット等が挙げられる。かかるプライマーセットとしては、例えば、ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡにおいて、プロモーター領域がメチル化されているグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域の塩基配列を標的配列とするGSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：４)とGSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：５)とからなるGSTP1プライマーセット等が挙げられる。
【００７８】
つぎに、図３のフローチャートに示されるステップＳ３−８において、ステップＳ３−４〜ステップＳ３−７それぞれで得られた各産物中の増幅産物の量を測定する。
【００７９】
増幅産物の量の測定は、慣用の手法により行なわれる。具体的には、例えば、核酸増幅反応をリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲにより行なう場合、増幅産物の量は、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質、増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ等に基づく蛍光強度をリアルタイムにモニタリングし、指数関数的増幅領域で、増幅産物の定量を行なうことにより、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき測定することができる。
【００８０】
その後、図３のフローチャートに示されるステップＳ３−８において、ステップＳ３−８で測定された増幅産物の量に基づき、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する。ステップＳ３−４における核酸増幅反応（ｉ）により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれる非メチル化ＤＮＡの割合の指標となる。ステップＳ３−５における核酸増幅反応（ｉｉ）により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。ステップＳ３−６における核酸増幅反応（ｉｉｉ）により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる非メチル化ＤＮＡの割合の指標となる。ステップＳ３−７における核酸増幅反応（ｉｖ）により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。
【００８１】
メチル化ＤＮＡの濃縮率は、下記式（１）：
【００８２】
メチル化ＤＮＡの濃縮率＝〔核酸増幅反応（ｉｖ）により得られた増幅産物の量／核酸増幅反応（ｉｉｉ）により得られた増幅産物の量〕／〔核酸増幅反応（ｉｉ）により得られた増幅産物の量／核酸増幅反応（ｉ）により得られた増幅産物の量〕                （１）
【００８３】
により算出することができる。
【００８４】
５．  メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法
本発明の検出方法のように、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡを添加した混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なうことにより、増幅産物を指標として、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を調べることができるため、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することができる。本発明には、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法も包含される。
【００８５】
本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを断片化して得られるＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖を有する、非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡとの混合物に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮したメチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、及び
（ｂ）前記メチル化ＤＮＡ濃縮物と、
前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットと、
を用いた核酸増幅反応を行なうことにより得られる増幅産物の量、
に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物中におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を算出して、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することを特徴としている。
【００８６】
ＤＮＡ断片を含む試料の調製方法、メチル化ＤＮＡの濃縮方法、及び増幅産物の量の測定方法は、本発明の解析方法における方法と同様である。また、対照ＤＮＡ及びプライマーセットは、本発明の解析方法に用いられる対照ＤＮＡ及びプライマーセットと同様である。
【００８７】
本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法では、増幅産物の量（ｂ）／増幅産物の量（ａ）の値が大きくなるほど、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度が高いことの指標となる。
【００８８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
（参考例）
ハウスキーピング遺伝子の一つであり、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないと考えられているＧＡＰＤＨ遺伝子のメチル化状態を調べた。
【００９０】
ＤＮＡ抽出キット（キアジェン社製、商品名：QIAmp Blood Maxi Kit）を用いて、乳癌細部株ＭＣＦ７からゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、０．３Ｍ  ＮａＯＨ  ４００μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液４００μＬを添加し得られた混合物を７０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製し、分析用試料を得た。以下のＰＣＲにおいては、前記分析用試料をＰＣＲのための鋳型として用いた。
【００９１】
前記鋳型１μＬに対して、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ〕０．１２μＬと、緩衝液（タカラバイオ株式会社製、商品名：10× Ex Taq Buffer）１．５μＬと、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１．２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと水９．９８μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。
【００９２】
フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットとして、フォワードプライマー〔GAPDH-seq1-F:5'-GAGATTTTTTTAAAATTAAGTGGGG-3'（配列番号：６）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq1-Rv:5'-ATAAAAAAACCAATCCCCAAAAC-3'（配列番号：７）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセット、及びフォワードプライマー〔GAPDH-seq2-F:5'-TAGAGGGGTGATGTGGGGAGTA-3'（配列番号：８）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq2-Rv:5'-CTAACCCCAACCACATACCAAAA-3'（配列番号：９）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いた。
【００９３】
ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４分３０秒のインキュベーション後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。また、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４．５分間のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６．７℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。
【００９４】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン社製、商品名：TA
cloning kit）を用いて、前記クローニングキットに添付のベクターに組み込み、プラスミドを得た。得られたプラスミドと、Ｍ１３Ｒｖプライマーとを用いて、ＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。
【００９５】
その結果、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがわかる。このように、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子は、非メチル化ＤＮＡの指標として不適切な場合があることが明らかになった。
【００９６】
（実験例１）
ＤＮＡ抽出キット（株式会社キアゲン製、商品名：QIAmp Blood Maxi Kit）を用いて、乳癌細胞株ＭＣＦ７からゲノムＤＮＡを抽出した。つぎに、得られたゲノムＤＮＡ  １μgを、超音波ホモジナイザー（日本エマンソン株式会社製、商品名：ＳＯＮＩＦＩＥＲ）で超音波処理を行なった。
【００９７】
得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供して、ＤＮＡ断片の大きさを確認した。その結果を図４に示す。図４は、ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。図４中、レーン１は、１ｋｂラダーのマーカー、レーン２は、未処理のＤＮＡ、レーン３は、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ断片、レーン４は、超音波処理後のＤＮＡ断片、レーン５は、１００ｂｐラダーのマーカーを示す。
【００９８】
図４に示される結果から、超音波処理を行なうことにより、ＤＮＡ断片の大きさが３００〜１０００ｂｐとなっているため、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法に適した大きさのＤＮＡ断片が得られていることがわかる。
【００９９】
（実施例１）
（１）非メチル化ＤＮＡの指標の作製
ヒトゲノムＤＮＡに存在しない塩基配列を有するＤＮＡを設計し、合成した。その結果、配列番号：１に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ（QC-CGF-1 オリゴ）が得られた。
【０１００】
また、前記配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖とその相補鎖とからなるＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとして、フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差が２℃以内で、プライマーの塩基配列中におけるグアニン及びシトシンの割合が４０〜６０％であり、プライマーの塩基配列中においてグアニンが４以上連続せず、各プライマーの長さが１７〜２５ｂｐであり、ＰＣＲの際のアニーリング温度をＴｍに近い温度に設定することができる塩基配列からなる１対のプライマーからなるプライマーセットを設計した。
【０１０１】
その結果、標的配列を配列番号：１に示される塩基配列とするフォワードプライマーとして、QC-CGF-1 Fプライマー（5’-TTCGCGGGATTTTTTAGAAGAGC-3’、配列番号：２）とQC-CGF-1 Rv（5’-CACTAATAACGAAAACTACGACGACG-3’、配列番号：３）とからなるQC-CGF-1プライマーセットが得られた。
【０１０２】
（２）メチル化ＤＮＡ免疫沈降
乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出されたゲノムＤＮＡを、超音波ホモジナイザー（日本エマンソン株式会社製、商品名：ＳＯＮＩＦＩＥＲ）に供し、実験例１と同様の条件で超音波処理を行ない、３００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片４μｇを、９５℃で１０分間インキュベーションして熱変性させた。
【０１０３】
熱変性後のＤＮＡ断片４μｇに、緩衝液（アップステート社製、商品名：ChIP dilution buffer）６８μＬと、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：protein G sepharose beads）３０２μＬとを添加し、得られた混合物を、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。その後、得られた混合物の上清を回収した。
【０１０４】
得られた上清に、配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ（QC-CGF-1 オリゴＤＮＡ）  １μＬ〔１０7コピー相当量（３．３×１０7ｐｇ）〕を添加し、混合物を得た。得られた混合物に、抗メチル化シチジン抗体を添加し、得られた混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベーションすることにより、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を行なった。
【０１０５】
その後、免疫沈降アッセイ用キット（アップステート社製、商品名：Chromatin Immuoprecipitation Assay Kit）と、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア株式会社製、商品名：Protein G Sepharose beads）とを用いて、免疫沈降後のＤＮＡ−抗体複合体を回収し、複合体からＤＮＡを回収した。対照として、抗メチル化シチジン抗体に代えて、マウスＩｇＧ抗体を用いたことを除き、同様に操作を行なった。
【０１０６】
回収されたＤＮＡを含む試料に、プロテイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物を５０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた混合物から、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いてＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。
【０１０７】
前記鋳型１μＬに対して、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。対照として、抗マウスＩｇＧ抗体による免疫沈降後の上清をＰＣＲの鋳型として用いた。
【０１０８】
フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットとして、QC-CGF-1 Fプライマー（5’-TTCGCGGGATTTTTTAGAAGAGC-3’、配列番号：２）とQC-CGF-1 Rv（5’-CACTAATAACGAAAACTACGACGACG-3’、配列番号：３）とからなるQC-CGF-1プライマーセットを用いた。また、対照として、ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡでは、プロモーター領域がメチル化されていることが知られているグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域（ＧＳＴＰ１  ＤＮＡ）の塩基配列を標的配列とするGSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：４)とGSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：５)とからなるGSTP1プライマーセットを用いた。
【０１０９】
ＰＣＲの条件は、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件とした。
【０１１０】
得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した。ＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図５に示す。図５中、レーン１は、免疫沈降前のＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図５中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、QC-CGF-1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１１１】
図５のパネル（ａ）のレーン２とレーン３とに示される結果から、抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量に比べ、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量が増加していることから、メチル化ＤＮＡ免疫沈降によりメチル化ＤＮＡであるＧＳＴＰ１  ＤＮＡが濃縮できていることがわかる。一方、図５のパネル（ｂ）のレーン２とレーン３とに示される結果から、抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のQC-CGF-1オリゴＤＮＡの量と、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のQC-CGF-1オリゴＤＮＡの量とが同じであることがわかる。したがって、これらの結果より、配列番号：１に示される塩基配列からなるQC-CGF-1オリゴのＤＮＡをメチル化ＤＮＡ免疫沈降における試料中の非メチル化ＤＮＡの指標として用いることができることが示唆される。
【０１１２】
（３）濃縮率の算出
抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量及びQC-CGF-1オリゴＤＮＡの量、並びに抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量及びQC-CGF-1オリゴＤＮＡの量それぞれを測定した。つぎに、抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量とQC-CGF-1オリゴＤＮＡの量との割合（ａ）（ｎｇ/コピー数）、すなわち、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合（ａ）を、式（２）：
【０１１３】
〔抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡ（メチル化ＤＮＡの指標）の量〕／〔QC-CGF-1オリゴＤＮＡ（非メチル化ＤＮＡの指標）の量〕                    （２）
【０１１４】
により算出した。また、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡ（メチル化ＤＮＡの指標）の量とQC-CGF-1オリゴＤＮＡ（非メチル化ＤＮＡの指標）の量との割合（ｂ）(ｎｇ／コピー数)、すなわち、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合（ｂ）を、式（３）：
【０１１５】
〔メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより得られたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ後に得られた産物中のＧＳＴＰ１  ＤＮＡ（メチル化ＤＮＡの指標）の量〕／〔QC-CGF-1オリゴＤＮＡ（非メチル化ＤＮＡの指標）の量〕                    （３）
【０１１６】
により算出した。その結果を図６に示す。
【０１１７】
図６に示される結果から、抗マウスＩｇＧ抗体を用いた免疫沈降の場合の試料に比べ、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降の場合のメチル化ＤＮＡ濃縮物では、メチル化ＤＮＡであるＧＳＴＰ１  ＤＮＡの量が増えていることがわかる。このように、被験対象のＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない配列番号：１に示される塩基配列からなるQC-CGF-1オリゴＤＮＡを非メチル化ＤＮＡの指標となる対照ＤＮＡとして用い、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を算出することにより、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価できることが示唆される。
【０１１８】
また、抗マウスＩｇＧ抗体を用いた免疫沈降の場合に比べた抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降の場合のメチル化ＤＮＡの濃縮率を、式（４）：
【０１１９】
メチル化ＤＮＡの濃縮率
＝割合（ｂ）／割合（ａ）
＝〔メチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応により得られた増幅産物の量／メチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれていない試料と、対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕／〔メチル化ＤＮＡ濃縮物と、ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応により得られた増幅産物の量／メチル化ＤＮＡ濃縮物と、対照ＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとを用いた核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕              （４）
【０１２０】
により、算出した。
【０１２１】
その結果、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降の場合、抗マウスＩｇＧ抗体を用いた免疫沈降の場合に比べ、メチル化ＤＮＡが約５０００倍に濃縮されていることがわかる。
【０１２２】
したがって、これらの結果より、被験対象のＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡに存在しない配列番号：１に示される塩基配列からなるQC-CGF-1オリゴＤＮＡを対照ＤＮＡとして用いることにより、メチル化ＤＮＡの濃縮の成否、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度や濃縮率を評価することができることが示唆される。
【０１２３】
（実施例２）
実施例１のQC-CGF-1オリゴＤＮＡ、QC-CGF-1 Fプライマー及びQC-CGF-1 Rvプライマーそれぞれの塩基配列について、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)により、データベースを検索し、種々の生物のゲノムＤＮＡの塩基配列に対する相同性を調べた。その結果を表１に示す。
【０１２４】
【表１】
0005322471.tif 000002
【０１２５】
表１に示されるように、QC-CGF-1オリゴＤＮＡ、QC-CGF-1 Fプライマー及びQC-CGF-1 Rvプライマーそれぞれの塩基配列は、種々の生物においても存在していないことがわかる。したがって、かかる結果から、QC-CGF-1オリゴＤＮＡ、QC-CGF-1 Fプライマー及びQC-CGF-1 Rvプライマーは、種々の生物種のゲノムＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの濃縮に際して、非メチル化ＤＮＡの指標として用いることができることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図３】本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図４】ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である
【図５】本発明のプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図６】非メチル化ＤＮＡに対するメチル化ＤＮＡの割合を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号：１は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：２は、プライマーの配列である。
配列番号：３は、プライマーの配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
配列番号：８は、プライマーの配列である。
配列番号：９は、プライマーの配列である。
【図１】
0005322471.tif 000003
【図２】
0005322471.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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