(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする保湿剤。
【請求項２】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項３】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗炎症剤。
【請求項５】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤。
【請求項６】
アマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｅｄｕｌｉｓ）抽出物を有効成分とすることを特徴とする美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い保湿効果、免疫賦活効果、抗老化効果、抗炎症効果、抗酸化効果、美白効果を発揮する保湿剤、免疫賦活剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤、及び皮膚外用剤、経口用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢や疾患による皮膚のバリア機能，水分保持機能の低下や冷暖房等の外的環境による低湿度状態から生じる皮膚の乾燥は、肌荒れをひき起こす重要な要因となっている。このため、皮膚の乾燥を防ぎ、乾燥による肌荒れを防止あるいは改善する保湿剤は、非常に有用性が高いと考えられ、これまで皮膚外用剤の分野では、様々な保湿剤の検索や配合検討がなされてきた。従来の保湿剤としては、グリセリン，１，３−ブチレングリコール，ソルビトール等の多価アルコール、アミノ酸，ピロリドンカルボン酸等の天然保湿因子、コラーゲン，ヒアルロン酸等の生体内高分子などが挙げられる。
また、近年ではシラネアオイ抽出物（特許文献１参照）やハマザクロ科植物抽出物（特許文献２参照）など新しい植物抽出物を用いた保湿剤が開発されており、その需要が高まっている。
【０００３】
また、従来より皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。
【０００４】
これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな抗老化剤や抗酸化剤、美白剤の検索及び配合検討が成されてきた。
【０００５】
例えば、抗老化剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献３参照）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特許文献４参照）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特許文献５参照）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特許文献６参照）やカユンアンギンの抽出物（特許文献７参照）等、さらに美白剤としては、ホンダワラの抽出物（特許文献８参照）等が知られている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−０２６６９８号公報
【特許文献２】特開２００３−３３５６２０号公報
【特許文献３】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献４】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献５】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献６】特開平１１−１８０８８６号公報
【特許文献７】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献８】特開平１０−３３０２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、免疫賦活作用、抗老化作用、抗炎症作用、抗酸化作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や経口用組成物などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、免疫賦活剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、アマニュウ抽出物に高い、保湿効果、免疫賦活効果、抗老化効果、抗炎症効果、抗酸化効果、美白効果を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、アマニュウ抽出物を有効成分として含有する保湿剤、免疫賦活剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤、並びに皮膚外用剤、経口用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、免疫賦活剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤、皮膚外用剤、経口用組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いられるアマニュウ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｅｄｕｌｉｓ）は、セリ科シシウド属の植物であり、北海道、本州、四国に分布する。
【００１１】
本発明におけるアマニュウの抽出物には、アマニュウの原体や乾燥物も抽出物に含まれるが、各種溶媒を用いて抽出した抽出物を用いるのが好ましい。抽出には、アマニュウの葉、花、種子、根、茎、芽などのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、葉、茎、芽を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１２】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。
【００１３】
アマニュウの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもでき、これらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。アマニュウの前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶解して用いることもできる。
【００１４】
アマニュウ抽出物は、優れた保湿効果、免疫賦活効果、抗老化効果、抗炎症効果、抗酸化効果、美白効果を有し、アマニュウ抽出物を有効成分として含有する保湿剤、免疫賦活剤、抗老化剤、抗炎症剤、抗酸化剤、美白剤、皮膚外用剤、経口用組成物として利用することが可能である。
【００１５】
アマニュウの抽出物を皮膚外用剤や経口用組成物に配合する際の配合量は、皮膚外用剤や経口用組成物の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２０．０質量％である。
【００１６】
アマニュウの抽出物を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系，カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール，リップスティック，ファンデーションなどの種々の剤型で提供することもできる。
【００１７】
なお、上記抽出物を配合する皮膚外用剤には、これらの抽出物の他に必要に応じて、通常医薬品，医薬部外品，皮膚化粧料，毛髪用化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分，保湿剤，粉体，色素，乳化剤，可溶化剤，洗浄剤，紫外線吸収剤，増粘剤，薬剤，香料，樹脂，防菌防黴剤，アルコール類等を適宜配合することができる。
【００１８】
また、アマニュウの抽出物を配合する経口用組成物の剤型は任意であるが、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの種々の剤型で提供することもでき、必要に応じて、医薬品・医薬部外品・食品などに配合される、油性成分，保湿剤，粉体，乳化剤，可溶化剤，増粘剤，薬剤，香料，防菌防黴剤，アルコール類，砂糖，練乳，小麦粉，食塩，ブドウ糖，鶏卵，バター，マーガリン，水飴，カルシウム，鉄分，調味料，香辛料、ビタミンＡ及びそれらの誘導体、カロテノイド類、リボフラビン及びその誘導体、ビタミンＢ類及びそれらの塩若しくは誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、コバラミン類、ビタミンＥ及びそれらの誘導体、ビタミンＫ、アデノシン及びその誘導体、フラボノイド類及びタンニン類を配合することもできる。
【００１９】
以下に、アマニュウの抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や経口用組成物としての処方例、使用試験について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
［抽出物１，２，３］
アマニュウの葉、新芽、茎をそれぞれ乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、アマニュウの葉の熱水抽出物（抽出物１）、アマニュウの新芽の熱水抽出物（抽出物２）、アマニュウの茎の熱水抽出物(抽出物３）をそれぞれ得た。
【００２１】
［抽出物４、５、６］
アマニュウの葉、新芽、茎をそれぞれ乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、アマニュウの葉のエタノール抽出物（抽出物４）、アマニュウの新芽のエタノール抽出物（抽出物５）、アマニュウの茎のエタノール抽出物(抽出物６）をそれぞれ得た。
【００２２】
［保湿作用］
保湿作用の評価は、表１に示すアマニュウ抽出物を試料とし、健常人前腕部を用いて行った。各試料を前腕部３×４ｃｍ2の範囲に２４μＬずつ塗布し、塗布前、塗布１５分後、３０分後、６０分後、及び１２０分後の角質水分量を測定した。角質水分量の測定は、ＳＫＩＣＯＮ−２００（アイ・ビイ・エス株式会社製）を用い、各塗布部位の５点における角質水分量を測定した。塗布部５点の測定値を平均し、塗布前の角質水分量を１とした相対値で表１に示した。また、精製水をネガティブコントロール、一般的な保湿剤であるグリセリン（0.1％水溶液）をポジティブコントロールとして同様に評価を行った。なお、表中の**は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）のものを示している。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
表１より明らかなように、アマニュウ抽出物を塗布した場合には高い保湿作用が認められた。このことから、アマニュウ抽出物は優れた保湿作用を有することが明らかとなった。
【００２５】
［アルギナーゼ活性促進作用］
ヒト皮膚角化細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５質量％添加したものを用いた。２４時間後１．２ｍＭＣａＣｌ2を含む５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地によって、各濃度に調整した試料を含有するサンプル液に交換しさらに９日間培養した。培地は３日に１回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収（５７０ｎｍ）を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素Ｂ−テストワコーを用いて同様の測定を行い、検量線を作成した。また、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。試料を添加しないブランクの値を１００とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。なお試料としては、抽出物４（葉、エタノール抽出物）を用いた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
表２に示したとおり、アマニュウ抽出物は高い表皮におけるアルギナーゼ活性促進作用を示した。表皮細胞におけるアルギナーゼ活性を促進することにより、角質層内に尿素が産生され、水分保持能が向上することが知られており、高い保湿効果を発揮する。
【００２８】
[ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用］
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量％のＦＢＳを添加したＲｐｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。24時間後、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地にて各濃度に調整した試料を含有するサンプル培養液に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値にて表３に示す。なお試料としては、抽出物３（新芽、熱水抽出物）を用いた。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
表３に示したとおり、アマニュウ抽出物は有意なＴＨＰ−１細胞賦活作用を示し、免疫賦活効果を発揮する。
【００３１】
［真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した試料を含有するサンプル培養液に交換しさらに４８時間培養した。次にＭＴＴ試薬を４００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価は試料無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行い結果を表４に示す。なお試料としては、抽出物４（葉、エタノール抽出物）を用いた。
【００３２】
【表４】
0005241395.tif 000005
【００３３】
結果は、表４に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００３４】
［真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した試料を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ１コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価はネガティブコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。具体的には、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りＩ型コラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めた。なお試料としては、抽出物６（茎、エタノール抽出物）を用いた。
【００３５】
【表５】
0005241395.tif 000006
【００３６】
結果は、表５に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用が認められた。
【００３７】
［真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用］
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり４．０×１０４個となるように４８穴マイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した試料を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。次いで４８穴マイクロプレートから細胞上清を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、５ｍＭ硫酸マグネシウム，１００μＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  トリシン緩衝液，ｐＨ７．８を添加し、超音波処理にて細胞を破砕し、細胞中のＡＴＰを溶出した。作成した細胞溶解液を試験管に分注し、更に０．５ｍＭ  ルシフェリン，１．２５μｇ／ｍｌ  ルシフェラーゼ，１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  硫酸マグネシウム，１００μＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  トリシン緩衝液，ｐＨ７．８を添加して、生じた化学発光を発光スペクトル５６０ｎｍ（ヤマト社製コンパクトルミＶＳ５０１）にて測定した。試料無添加のブランクの値を１００とした相対値にてＡＴＰ産生促進能を評価した。なお試料としては、抽出物５（新芽、エタノール抽出物）を用いた。
【００３８】
【表６】
0005241395.tif 000007
【００３９】
結果は、表６に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。
【００４０】
［真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用］
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により書く濃度に調整した試料を含有するサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。さらにＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。得られた結果は、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのヒアルロン酸産生量を１００としたときの相対値により評価した。なお試料としては、抽出物５（新芽、エタノール抽出物）を用いた。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
結果は、表７に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００４３】
表４から表７に示したとおり、アマニュウ抽出物は有意な真皮線維芽細胞賦活作用、真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用、真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用、及び真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用を有することから、抗老化作用を発揮する。
【００４４】
［ヒアルロニダーゼ阻害作用］
市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。なお酵素溶液は用時調製とした。試験管に、緩衝液で各濃度に調整した試料を含有するサンプル溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬをとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４規定のＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ジメチルベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢＡ）溶液溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。なお試料としては、抽出物４（葉、エタノール抽出物）を用いた。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
【００４５】
【表８】
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【００４６】
結果は、表８に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意なヒアルロニダーゼ阻害作用が認められた。
【００４７】
［ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害作用］
最終濃度６０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整したホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）と、各濃度に調整した試料を含有するサンプル、及び１０ｍＭとなるように調整したＤＴＮＢ（５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を混合し、室温で１０分間静置した。さらに基質として１．６６ｍＭのジヘプタノイルチオ−ＰＣ（Ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ  Ｔｈｉｏ−ＰＣ）を添加し、室温で４５分間反応させた後、４１４ｎｍの吸光度を測定した。また、ＰＬＡ２溶液にかえてバッファーのみを添加した場合の吸光度を測り、両測定値の差を求めた。サンプル無添加のコントロールの値を（Ａ）、サンプル添加時の値を（Ｂ）としたとき、ＰＬＡ２酵素阻害作用は次式に定義される。なお試料としては、抽出物４（葉、エタノール抽出物）を用いた。
阻害率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
【００４８】
【表９】
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【００４９】
結果は、表９に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、有意なホスホリパーゼＡ２阻害作用が認められた。
【００５０】
表８、表９に示したとおり、アマニュウ抽出物は有意なヒアルロニダーゼ阻害作用、ホスホリパーゼＡ２阻害作用作用が認められることから、抗炎症作用を発揮する。
【００５１】
［メラニン産生抑制作用］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を９０ｍｍディッシュ１ディッシュ当り１．８×１０４個となるように播種し、５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。２４時間後に５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に試料を添加して各濃度に調整したサンプル培養液に交換した。さらに５日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、試料を添加せず５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、試料のかわりに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。なお試料としては、抽出物６（茎、エタノール抽出物）を用いた。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００５２】
【表１０】
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【００５３】
結果は、表１０に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、明らかなメラニン産生抑制作用が認められたことから、美白作用を発揮する。
【００５４】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用］
試料を５０質量％エタノール水溶液を用いて各濃度に調整し、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬずつ添加した。さらに０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、充分に混合後室温、暗所にて２４時間静置後、５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加のブランクの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、次式（２）の値をラジカル消去率とした。なお試料としては、抽出物６（茎、エタノール抽出物）を用いた。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）      （２）
【００５５】
【表１１】
0005241395.tif 000012
【００５６】
結果は、表１１に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、明らかなＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。
【００５７】
［ＳＯＤ様活性作用］
０．２５ｍＭ  ＷＳＴ−１及び１ｍＭハイポキサンチンを含有するＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬに、試料をＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液を用いて各濃度に調整したサンプル溶液２５μＬを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に替えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式（３）によって求めた。なお試料としては、抽出物１（葉、熱水抽出物）を用いた。
スーパーオキサイドアニオン消去率（％）＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００    （３）
【００５８】
【表１２】
0005241395.tif 000013
【００５９】
結果は、表１２に示した通りであり、アマニュウ抽出物は、明らかなスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
【００６０】
表１１、表１２に示したとおり、アマニュウ抽出物は、明らかなＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキサイドアニオン消去作用が認められ、抗酸化作用を発揮する。
【００６１】
続いて、本発明に係るアマニュウの抽出物を配合した組成物として、皮膚外用剤と食品の処方例を示す。
【００６２】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）    １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（10）精製水                                          ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液）                    ２０．０
（12）アマニュウ抽出物１                                ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００６３】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール                                      １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．３
（３）香料                                              ０．１
（４）精製水                                          ７８．３８
（５）クエン酸                                          ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                ０．１
（７）グリセリン                                        １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
（９）アマニュウ抽出物１                                ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００６４】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）セタノール                                        ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（７）グリセリン                                      １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）                  １５．０
（10）精製水                                          ３６．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １５．０
（12）アマニュウ抽出物３                                ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００６５】
［処方例４］美容液
（１）精製水                                          ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン                                      １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液)            １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル                      １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル            ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）          ２．０
（９）硬化パーム油                                      ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来）                        １．０
（11）ベヘニルアルコール                                ０．７５
（12）ミツロウ                                          １．０
（13）ホホバ油                                          １．０
（14）１，３−ブチレングリコール                      １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）                ２．０
（16）アマニュウ抽出物１                                ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００６６】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー                          ０．５（質量％）
（２）精製水                                          ８５．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）              ０．５
（４）エタノール                                      １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（６）香料                                              ０．１
（７）アマニュウ抽出物３                                ３．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００６７】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン                                      ７７．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル    １５．０
（３）精製水                                            ３．０
（４）アマニュウ抽出物１                                ５．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００６８】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸                                    １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸                                    １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（４）グリセリン                                      ２０．０
（５）水酸化ナトリウム                                  ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン                １．０
（７）精製水                                          ３１．５
（８）アマニュウ抽出物４                                ６．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００６９】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン                                      １０．２(質量％)
（２）セタノール                                        ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル      ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル                  １．０
（５）プロピレングリコール                            １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（７）精製水                                          ６５．４
（８）酸化チタン                                        １．０
（９）ベンガラ                                          ０．１
（10）黄酸化鉄                                          ０．４
（11）香料                                              ０．１
（12）アマニュウ抽出物６                                ５．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００７０】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン                              ２．０(質量％)
（２）スクワラン                                        ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      ５．０
（４）セタノール                                        １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル              １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール                        ８．０
（８）キサンタンガム                                    ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）精製水                                          ５３．４
（11）酸化チタン                                        ９．０
（12）タルク                                            ７．４
（13）ベンガラ                                          ０．５
（14）黄酸化鉄                                          １．１
（15）黒酸化鉄                                          ０．１
（16）香料                                              ０．１
（17）アマニュウ抽出物１                                ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００７１】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン                                  ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）ワセリン                                          ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル                    ５．０
（５）塩化ナトリウム                                    １．３
（６）塩化カリウム                                      ０．１
（７）プロピレングリコール                              ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）アマニュウ抽出物４                                ５．０
（11）精製水                                          ４３．４
（12）香料                                              ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００７２】
［処方例１１］パック
（１）精製水                                          ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール                            １２．０
（３）エタノール                                      １７．０
（４）グリセリン                                        ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）      ２．０
（６）アマニュウ抽出物３                                ５．０
（７）香料                                              ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００７３】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料                                              ０．３(質量％)
（２）アマニュウ抽出物４                                ５．０
（３）炭酸水素ナトリウム                              ４６．０
（４）硫酸ナトリウム                                  ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００７４】
［処方例１３］飲料
（１）アマニュウ抽出物３                                ２．０(質量％)
（２）エリスリトール                                    １．０
（３）クエン酸                                          ０．１
（４）ステビア                                          ０．０１
（５）精製水                                          ９６．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００７５】
［処方例１４］錠剤
（１）アマニュウ抽出物４                                ０．３０（質量部）
（２）還元麦芽糖水飴                                    ０．５３
（３）トウモロコシデンプン                              ０．１５
（４）グリセリン脂肪酸エステル                          ０．０２
製法：（１）〜（３）を篩過して混合し、さらに（４）を添加して混合した。打錠機にて打錠を行い、全量３００ｍｇの錠剤を得た。