(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含むキチナーゼ。
【請求項４】
請求項３に記載のキチナーゼをコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高活性耐熱性キチナーゼを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
キチンはセルロースに次いで豊富に存在するバイオマスであり、種々の生物種（海老、蟹、昆虫等）により地球上で年間一千億トン生産されている。キチンを加水分解して得られるN-アセチルグルコサミンは健康食品添加物だけでなく、最近、潤い成分として話題になっているヒアルロン酸の原料にもなることから化粧業界も注目している。また皮膚炎、変形関節症などの治療薬としても期待され、幅広い産業分野でその利用が期待されている。キチナーゼは、植物や微生物などから得られる酵素であり、キチンを加水分解して上述したように非常に付加価値の高いN-アセチルグルコサミンを得るための工業的利用において非常に重要な役割を果たす酵素で、その有効利用が期待されている。その有効利用のためにはキチナーゼの開発が重要課題の一つである。
【０００３】
キチナーゼは、種々の由来のものが単離され、耐熱性キチナーゼについても知られている（特許文献１〜２）。我々は超好熱菌ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のキチナーゼ遺伝子よりキチナーゼの触媒ドメインを単離、精製し、結晶化に成
功し、さらに結晶中での立体構造をX線結晶解析で決定し、蛋白質工学的手法を用いキチ
ナーゼ触媒活性を増強するため必要となる結晶中での本ドメインの構造情報とキチナーゼの触媒ドメインの結晶を提供する特許を出願している(特許文献３発明の名称：結晶性キ
チンを分解するキチナーゼの触媒ドメインの結晶）。
【０００４】
本発明者が先行特許（特許文献３）で示唆しているように、触媒ドメインを構成する298アミノ酸のうち、Gln526、Asp524、Asp522はキチナーゼ触媒活性に非常に重要であり、
キチナーゼ触媒能を向上した変異型ドメインを製造する場合、Gln526、Asp524、Asp522をまたはその周辺を改変するのが望ましい。そしてキチナーゼ触媒ドメインに導入されるアミノ酸変異は、１個〜数個、例えば１〜９個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に１〜２個である、と先行特許（特許文献３）に記載している。
【特許文献１】特開２００１−５４３８１号公報
【特許文献２】特開２００６−２５７０１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２６８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は高活性耐熱性キチナーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記特許出願に記載している高機能化に重要である触媒部位周辺のアミノ酸（図１）のうちの一つ486番のアラニンをセリンに置換した変異体を作製し、機能解析
を行い、本変異体が低分子合成基質に対する分解活性が野生型に比べ約2倍増強している
ことを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の発明に関する。
項１．配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
項２．項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
項３．項１に記載のポリペプチドを含むキチナーゼ。
項４．項３に記載のキチナーゼをコードする遺伝子。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高活性の改良耐熱性キチナーゼが提供される。本発明のキチナーゼを用いることにより、地球上に豊富に存在するバイオマスの一つであるキチンを有効利用することが可能となる。また、分解様式が異なるキチナーゼ(例えば大雑把にキチンを分解
するエンド型酵素)との混合することによりシナジー効果(共同的に働く)が期待できる。
さらに追記しておくと、本研究開発は耐熱性キチナーゼの触媒ドメインで行ったものであり、適切に基質結合ドメインを融合させることにより更なる活性向上が容易に期待できる。
【０００９】
本発明に係る酵素を利用することで耐熱性のキチン分解酵素の開発に弾みがつくものと期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明につき詳述する。
【００１１】
本発明のポリペプチドは、超好熱菌ピロコッカス・フリオサス由来キチナーゼの触媒ドメインと推定されるポリペプチド｛遺伝子データベース(http://gib.genes.nig.ac.jp)中のPF1233遺伝子にコードされるアミノ酸配列(配列番号２)中409番のアスパラギンから706番のフェニルアラニンに対応する298アミノ酸からなるポリペプチド｝において486番目のアラニンがセリンに置換されたアミノ酸配列(配列番号１)を含むポリペプチドである。更に本発明のポリペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたキチナーゼの触媒ドメインとしての機能を有するポリペプチドを作成することができる。例えば、表面に露出したアミノ酸については耐熱性を落とさずに変異可能である。また、本発明の上記ポリペプチドは触媒ドメインのみであってもキチナーゼとして機能できる。
【００１２】
本発明の該ポリペプチドをコードする遺伝子は、該ポリペプチドのアミノ酸のコドンに対応するDNA配列である。用いるコドンは当該遺伝子を発現させる生物種等により適宜選
択できる。
【００１３】
本発明の該ポリペプチドを含むキチナーゼは該ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はその両方に1以上のアミノ酸を付加したキチナーゼである。付加する1以上のアミノ酸は好ましくは基質結合ドメインである。該ポリペプチドを基質結合ドメインや他の機能性ポリペプチドと融合させることにより、活性増強、あるいは菌体外の培地に発現蛋白質を放出させることができる等が可能となる。その他、既存のキチナーゼの触媒ドメインを本発明のポリペプチドと交換することによって酵素活性を向上させることが可能である。
【００１４】
本発明の該キチナーゼをコードする遺伝子は、該キチナーゼのアミノ酸のコドンに対応するDNA配列である。用いるコドンは当該遺伝子を発現させる生物種等により適宜選択で
きる。
【００１５】
PF1233遺伝子はその配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照〕
。
【００１６】
取得したPF1233遺伝子を利用して通常の遺伝子工学的手法により、変異体の鋳型となる耐熱性キチナーゼの触媒ドメインを含む発現プラスミドを作成し、DNAに所望の変異を導
入できる。そして、このプラスミドで大腸菌等の発現系を形質転換し、タンパク質を発現
することができる。また、常法に従い、目的のポリペプチド、キチナーゼを精製、単離することができる。
【００１７】
耐熱性キチナーゼの触媒ドメインの遺伝子の前後どちらか一方又は両方に、通常の遺伝子工学的手法により、基質結合ドメイン等に対応するDNA配列を連結することにより、ポ
リペプチドを含むキチナーゼを製造することができる。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、耐熱性菌由来のキチナーゼの触媒活性の増強方法を提唱するものであるが、他の微生物、植物、動物由来のキチナーゼであっても、本発明に示した変異導入部位(486番目)に構造学的上対応する場所がセリン以外のアミノ酸の場
合、本発明のデザイン方法に従い増強することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００２０】
実験方法
触媒ドメインの変異体作成法
変異体の鋳型となる耐熱性キチナーゼの触媒ドメインを含む発現プラスミドはMine S, Nakamura T, Hirata K, Ishikawa K, Hagihara Y, Uegaki K. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62. 791-793  (2006）で得たものを用いた。
変異体作成は次に示す合成DNAを用い、QuickChange mutagenesis kit (STARATAGENE社）
を用い行った。
各変異導入用合成DNAを以下に示す（下線が置換した後のコドン）
A486S (Ala→Ser 変異)
5’-GGAGAAGTAATAATATCCTTTGGTGGGGCTGTAG-3’
5’-CTACAGCCCCACCAAAGGATATTATTACTTCTCC-3’
M587Y (Met→Tyr変異)
5’-GTCAATCCAATGACGTACGATTACTACTGGACTC-3’
5’-GAGTCCAGTAGTAATCGTACGTCATTGGATTGAC-3’
M587A (Met→Ala変異)
5’-GTCAATCCAATGACGGCGGATTACTACTGGACTC-3’
5’-GAGTCCAGTAGTAATCCGCCGTCATTGGATTGAC-3’
D588N （Asp→Asn変異)
5’-CAATCCAATGACGATGAACTACTACTGGACTCC-3’
5’-GGAGTCCAGTAGTAGTTCATCGTCATTGGATTG-3’
D636N (Asp→Asn変異)
5’-CCAATGATAGGAGTAAATAACGACAAGAGTGTG-3’
5’-CACACTCTTGTCGTTATTTACTCCTATCATTGG-3’
D524N (Asp→Asn変異)
5'-GCCACTTACTTGGACTTTAACATAGAAGCCGG-3’
5'-CCGGCTTCTATGTTAAAGTCCAAGTAAGTGGC-3’
D524A  (Asp→Ala変異)
5'-GCCACTTACTTGGACTTTGCGATAGAAGCCGG-3’
5'-CCGGCTTCTATCGCAAAGTCCAAGTAAGTGGC-3’
E526Q  (Glu→Asn変異)
5'-GGACTTTGACATACAAGCCGGTATCGATGC-3’
5'-GCATCGATACCGGCTTGTATGTCAAAGTCC-3’
E526A  (Glu→Ala変異)
5'-GGACTTTGACATAGCGGCCGGTATCGATGC-3’
5'-GCATCGATACCGGCCGCTATGTCAAAGTCC-3’
【００２１】
キチナーゼの触媒ドメインを含有する形質転換体の作製
1.5ml容チューブ内に、大腸菌(E. coli)Rosetta(DE3)株(Novagen社)のコンピテントセ
ル0.04ｍl(20,000,000cfu/mg)と、上記調製した触媒ドメイン遺伝子含有プラスミドDNA溶液0.003ｍl(プラスミドDNA 8.4ng)を加え氷中に30分間放置した後、42℃で30秒間ヒート
ショックを与えた。次いで、チューブ内にSOC 培地を0.25mｌ加え、37℃で1時間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
【００２２】
変異体キチナーゼの触媒ドメインの精製
得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地に接種し、600ｎｍにおける吸光度が0.5に達するまで37℃で培養した後、発現量を高めるためにIPTG（isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を加え(最終濃度1mM)さらに19時間培養した。培養液を8,000rpmで10min
遠心分離することにより集菌した。集菌した菌体１０gに、BugBuster溶液（NOVAGEN社）
１００mlを加え、菌体を90Wの出力で３０分間超音波破砕した。破砕した菌液を 15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を採取した。BugBuster溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap-Chelating(GEヘルスケア社製)カラム（事前に100ｍM  NiCl2を10ml添加しNiを結
合）を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は0.5Mイミダゾールを含む25ｍM
トリスヒドロキシメチルアミノメタン、 500mM NaCl (pH8.5)の直線グラジエントを用い
た。得られた目的分画にPreScission  Protease(GEヘルスケア社製)を添加し、透析チュ
ーブ(分画サイズMw.3500)に入れ、25mMトリスヒドロキシアミノメタン、25mM NaCl (pH8.5)溶液で4℃、16時間、透析をおこなった。
【００２３】
透析終了後、再び、25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl  （pH8.5）溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrapーChelating(GEヘルスケア社製)カラム(事前に100ｍM  NiCl2を10ml添加しNiを結合)に添加し、カラムを素通りした分画を回収し、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン, 25ｍM NaCl(pH8.5)緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のHiTrapQ(GEヘルスケア社製)カラムに回収した分画を添加し、イオン交換
クロマトグラフィーを行った。目的タンパク質を含む分画にはSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれていた。
【００２４】
変異体の活性測定
酵素活性はp-ニトロフェニル-Di-N-アセチル-β-キトビオシド(生化学工業)を測定基質として用い、酵素反応により遊離したp-ニトロフェノールの量を定量した。反応はすべて50℃でおこなった。p-ニトロフェノールの定量は反応液と0.2M炭酸ナトリウム溶液pH10を50μlずつ混合後、405nmの吸光度を測定した。以下に示す反応条件により行った。
1)図２に示す酵素活性の時間変化の測定
100mM 酢酸ナトリウム pH 4.8  
野生型キチナーゼ(14.1nM)あるいは変異体(6.9nM)
0.96mＭ  p-ニトロフェニル-Di-N-アセチル-β-キトビオシド
2)図３に示す基質飽和曲線の測定
100mM 酢酸ナトリウム pH 5.5  
野生型キチナーゼ(14.1nM)あるいは変異体(6.9nM)
種々のp-ニトロフェニル-Di-N-アセチル-β-キトビオシド濃度で６0分までの反応曲線を
測定し反応速度を算出し、基質濃度に対し反応速度をプロット
3)表１野生型と変異型の反応速度論的パラメーターの比較
図３により測定した基質飽和曲線からミカエリス・メンテンの式に則り酵素と基質の親和性を表すKm(ミカエリス・メンテン定数)とタンパク質1分子あたり、1秒間に何個の基質を触媒するか、を示すkcat(分子活性)を算出した。
【００２５】
【表１】
0005182861.tif 000002
【００２６】
4)図４に示す他の変異型と野生型の活性比較
100mM 酢酸ナトリウム pH 5.5
0.48mＭ  p-ニトロフェニル-Di-N-アセチル-β-キトビオシド
の反応液に以下の酵素濃度になるように各々、酵素を加え15分反応を行った。
野生型、変異型キチナーゼ(A486S,M587Y,D588N,D636N,D524N)(最終濃度14nM)、変異体(M587A,D524A,E526Q,E526A)に関しては(最終濃度1200,1200,2200,2200nM)で行った。野生型
を100%と各変異体の相対比較値を示す。
【００２７】
反応速度パラメーターの解析
図２に示しているように酵素反応の時間変化は明らかに野生型に比べ変異型の方が高活性であることが分かった。しかしこの現象は酵素反応論的に言えば基質結合が強化されたこと(Km)によるか、あるいは反応効率が強化されたこと(kcat)によるのか区別する必要がある。そこでどちらの効果がより強いのかを知るために図３に示す基質濃度に依存した反応速度をプロットし（基質飽和曲線）、酵素反応パラメーターを求めた。表１はその結果を示しているが、野生型、変異体共に基質との親和性を示すKmは大きく変化することがなく、反応効率を示すkcatが2倍以上強化されたことがわかった。このことから変異導入す
ることにより変異体の低分子合成基質に対する分解活性がおおきく増強した酵素開発に成功したと結論できる。触媒部位を形成する他のアミノ酸(524D、526E、587M、588D、636D
図１参照)に対し変異導入を行い、活性の変化を調べた（図４）。その結果、486Aを除き
他のアミノ酸変異では活性増強は見られず、変異を行ったアミノ酸すべてにおいて活性低下を引き起こすことが分かった。以上の解析結果から、本研究で活性増強に効果のあったアミノ酸変異体はA486Sのみであることが分かった。だたし、注意しておくべき点は変異
により活性が低下したアミノ酸の位置(524D、526E、587M、588D、636D)は活性に重要な役割を果たしている事は本実験から明らかであり、例えば他のアミノ酸変異、あるいはこれらのアミノ酸に複数個所に変異導入を行う事により、活性増強を果たすことができる可能性は残っている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】キチナーゼの触媒部位周辺のアミノ酸の立体配置図である。Gln526、Asp524、Ala486、M587、D588、D636の空間配置を示す。
【図２】実施例において酵素活性の時間変化を表す図である。
【図３】実施例において基質飽和曲線を表す図である。
【図４】実施例において他の変異型と野生型の酵素活性の比較を表す図である。
【図１】
0005182861.tif 000003
【図２】
0005182861.tif 000004
【図３】
0005182861.tif 000005
【図４】
0005182861.tif 000006
【配列表】
0005182861000001.app