(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患の診断に使用されるマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抗原を検出する方法であって、
被験者由来のサンプルを質量分析法により分析し、前記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程を含み、
前記脂質抗原が、下記構造式で表されるＧＧＰＬ−ＩＩＩ：
0005265357.tif 000015
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）
であり、
前記脂質抗原ＧＧＰＬ−ＩＩＩ特有のスペクトルピークが、
（ｉ）前記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、８０９±１、８２３±１、８６４±１、９８８±１、１０４７±１、および１０７５±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークであり、
（ｉｉ）前記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、１８４±１、２３９±１、１０４９±１、および１０７７±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークであり、
前記サンプルのマススペクトル中に前記脂質抗原ＧＧＰＬ−ＩＩＩ特有のスペクトルピークの１つまたは２つ以上が存在することによって、前記マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的脂質抗原の存在を同定し、それによって前記被験者がマイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患に罹患していると判断される、脂質抗原検出方法。
【請求項２】
マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患の診断に使用されるマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抗原を検出することによってマイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患を診断する方法であって、
被験者由来のサンプルを質量分析法により分析し、前記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程を含み、
前記脂質抗原が、下記構造式で表されるＧＧＰＬ−Ｉ：
0005265357.tif 000016
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）
であり、
前記脂質抗原ＧＧＰＬ−Ｉ特有のスペクトルピークが、
（ｉ）前記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９０８±１、８８０±１、８０９±１、６４２±１、６２４±１、４０４±１、３８６±１、３１２±１、２９４±１、および１６８±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークであり、または
（ｉｉ）前記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９２４±１、８９６±１、６５８±１、６４０±１、４２０±１、４０２±１、３２８±１、３１０±１、１８４±１、および１０４±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークであり、
前記サンプルのマススペクトル中に前記脂質抗原ＧＧＰＬ−Ｉ特有のスペクトルピークの１つまたは２つ以上が存在することによって、前記マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的脂質抗原の存在を同定し、それによって前記被験者がマイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患に罹患していると判断される、脂質抗原検出方法。
【請求項３】
前記疾患が、関節リウマチ、湾岸戦争病、ベーチェット病、慢性疲労性症候群である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
マイコプラズマ・ニューモニエの脂質抗原を検出する方法であって、
サンプルを質量分析法により分析し、前記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程を含み、
前記脂質抗原が、下記構造式で表される化合物である、脂質抗原検出方法：
0005265357.tif 000017
（但し、式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨであり、ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）。
【請求項５】
前記脂質抗原特有のスペクトルピークが、前記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９１９±１、８９１±１、６８１±１、６６３±１、６５３±１、６３５±１、３９７±１、および３７９±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質抗原特有のスペクトルピークが、前記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９４３±１、９１５±１、６８７±１、６５９±１、４９７±１、４０５±１、４０３±１、３６５±１、３４７±１、２０２±１、および１８５±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
マイコプラズマ・ニューモニエの感染またはそれに起因する疾患の診断に用いるための、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、
ａ）被験者由来のサンプルを殺菌する工程、および
ｂ）前記サンプルを質量分析法により分析し、前記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程、
を含む、脂質抗原検出法。
【請求項１０】
前記工程ａ）において、前記サンプルと有機溶媒とを混合することにより前記サンプルを殺菌する、請求項９に記載の方法
【請求項１１】
工程ｂ）の前にさらに、
工程ａ）から得られたサンプルから前記脂質抗原を含む画分を抽出する工程、
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）から得られたサンプルと有機溶媒とを混合した後、当該混合物を水性相と有機溶媒相とに分離し、当該有機溶媒相を回収することによって、前記脂質抗原を含む画分を抽出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の前にさらに、
前記抽出した画分中の前記脂質抗原を濃縮する工程、
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カラムクロマトグラフィーを用いることによって、前記脂質抗原を濃縮する、請求項１３に記載の方法
【請求項１５】
前記脂質抗原に対する抗体を使用することによって、前記脂質抗原を濃縮する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒が、メタノールおよびクロロホルムである、請求項１０または１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、被験者由来の血液、関節液、髄液、咽頭ぬぐい液、組織、細胞、または尿である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マススペクトロメーターを用いた脂質抗原検出法に関する。特に、本発明は、マススペクトロメーターを用いて脂質抗原を検出することを含むマイコプラズマ感染の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマの種の同定または特異的抗原の同定のための方法としては、血清学的手法、菌の分離培養法、遺伝子解析法、特異的抗原を用いた免疫測定法などが知られている。血清学的手法では、培養菌体を用い抗血清を作製し、菌の増殖抑制を調べる。菌の分離培養法では、患者献体などから菌を分離培養し、同定する。遺伝子解析法では、その培養菌体から遺伝子を検出する。また、菌体抽出物などを用いた抗体検出キットが市販されている。
本発明者らは、これまでに、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的抗原ＧＧＰＬｓ（グリセロ糖リン脂質）（ＧＧＰＬ−ＩおよびＧＧＰＬ−ＩＩＩ）の単離、精製、および構造決定に成功し、それを全合成して確認した。また、特異抗体を作製し、抗体を用いた抗原の同定も可能になった（特開平７−２７８１７５号公報；特開平８−４８６９３号公報）。また、上記マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質抗原は、リウマチ性疾患の原因であると考えられている。
しかしながら、患者由来の血清や組織抽出物などの検体にはさまざまな物質が含まれ、それらの影響を受けずに検体から微量のマイコプラズマ特異的抗原を検出することは容易ではない。上記のように特異抗体の検出には多くの手法があり、比較的容易に検出する方法がいくつか知られているが、一般的に、患者の症状が改善し除菌された後でも抗体産生能は継続しており、擬陽性と区別が付かない場合もある。そのため、抗体を用いる検出法は、主に感染の補助的診断法または患者を絞り込むためのスクリーニング方法として有用であると考えられている。
このように、特異抗体を用いた方法を用いてもマイコプラズマ属や種の同定は容易ではなく、マイコプラズマの特異的抗原検出法は、これまでにほとんど報告されていない。
【発明の開示】
【０００３】
したがって、精度の高い脂質抗原検出・同定方法の新たな開発が望まれている。
上述のような状況に鑑み、本発明者らは、簡便な殺菌・抽出法を用いて血清や組織抽出物からサンプルを調製し、マススペクトロメーターを用いて直接抗原分子を解析する画期的なマイコプラズマ特異的脂質抗原検出・同定方法を開発した。
すなわち、本発明は、以下のような脂質抗原検出・同定方法を提供する。
（１）微生物の脂質抗原を検出する方法であって、
サンプルを質量分析法により分析し、上記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程を含む、
脂質抗原検出方法。
（２）上記微生物が、マイコプラズマである、上記（１）に記載の方法。
（３）上記（１）または（２）に記載の方法であって、
ａ）被験者由来のサンプルを殺菌する工程、および
ｂ）上記サンプルを質量分析法により分析し、上記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程、
を含む、脂質抗原検出法。
（４）上記工程ａ）において、上記サンプルと有機溶媒とを混合することにより上記サンプルを殺菌する、上記（３）に記載の方法
（５）工程ｂ）の前にさらに、
工程ａ）から得られたサンプルから上記脂質抗原を含む画分を抽出する工程、
を含む、上記（３）に記載の方法。
（６）工程ａ）からの上記サンプルと有機溶媒とを混合した後、当該混合物を水性相と有機溶媒相とに分離し、当該有機溶媒相を回収することによって、上記脂質抗原を含む画分を抽出する、上記（５）に記載の方法。
（７）工程ｂ）の前にさらに、
上記抽出した画分中の上記脂質抗原を濃縮する工程、
を含む、上記（５）に記載の方法。
（８）カラムクロマトグラフィーを用いることによって、上記脂質抗原を濃縮する、上記（７）に記載の方法
（９）上記脂質抗原に対する抗体を使用することによって、上記脂質抗原を濃縮する、上記（７）に記載の方法。
（１０）
上記有機溶媒が、メタノールおよびクロロホルムである、上記（４）または（６）に記載の方法。
（１１）上記サンプルが、被験者由来の血液、関節液、髄液、咽頭ぬぐい液、組織、細胞、または尿である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）上記脂質抗原が、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的抗原である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記特異的抗原が、下記構造式で表されるＧＧＰＬ−ＩＩＩである、上記（１２）に記載の方法：
0005265357.tif 000002
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）。
（１４）上記特異的抗原が、下記構造式で表されるＧＧＰＬ−Ｉである、上記（１２）に記載の方法：
0005265357.tif 000003
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）。
（１５）上記脂質抗原特有のスペクトルピークが、上記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、８０９±１、８２３±１、８６４±１、９８８±１、１０４７±１、および１０７５±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（１３）に記載の方法。
（１６）上記脂質抗原特有のスペクトルピークが、上記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、１８４±１、２３９±１、１０４９±１、および１０７７±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（１３）に記載の方法。
（１７）
上記脂質抗原ＧＧＰＬ−Ｉ特有のスペクトルピークが、上記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９０８±１、８８０±１、８０９±１、６４２±１、６２４±１、４０４±１、３８６±１、３１２±１、２９４±１、および１６８±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（１４）に記載の方法。
（１８）
上記脂質抗原ＧＧＰＬ−Ｉ特有のスペクトルピークが、上記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、９２４±１、８９６±１、６５８±１、６４０±１、４２０±１、４０２±１、３２８±１、３１０±１、１８４±１、および１０４±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（１４）に記載の方法。
（１９）マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染に起因する疾患の診断に用いるための、上記（１２）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）上記疾患が、関節リウマチ、湾岸戦争病、ベーチェット病、慢性疲労性症候群である、上記（１９）に記載の方法。
（２１）上記脂質抗原が、マイコプラズマ・ニューモニエの特異的抗原である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（２２）上記特異的抗原が、下記構造式で表される化合物である、上記（２１）に記載の方法：
0005265357.tif 000004
（但し、式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨであり、ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）。
（２３）上記脂質抗原特有のスペクトルピークが、上記サンプルをネガティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３７９±１、６３５±１、６６３±１、８９１±１、および９１９±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（２２）に記載の方法。
（２４）上記脂質抗原特有のスペクトルピークが、上記サンプルをポジティブモードで分析した場合に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が、１８５±１、２０２±１、３４７±１、３６３±１、４０５±１、４９７±１、５２５±１、６５９±１、６８７±１、９１５±１、および９４３±１であるピークから選ばれる１つ以上のピークである、上記（２２）に記載の方法。
（２５）マイコプラズマ・ニューモニエの感染またはそれに起因する疾患の診断に用いるための、上記（２１）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（２５）に記載の方法。
本発明により、従来の方法に代わる新たなマイコプラズマ特異的抗原検出法が提供される。
本発明により、抗体、菌の分離培養、または遺伝子診断等を用いずとも、マイコプラズマ特異的抗原を高感度・特異的に検出することができる。
本発明により、簡単な手順のみで、被験者におけるマイコプラズマ感染の有無を確定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、オリシノール−硫酸染色されたＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓに感染したＭＴ−４  ｃｅｌｌより抽出した脂質画分の薄層クロマログラフィーの写真である。
図２（ａ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。
図２（ｂ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。１０４７の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図２（ｃ）は、ＧＧＰＬ−ＩＩＩの構造式およびネガティブモードで断片化される場合の結合切断部位を示す図である。
図３は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ネガティブ）スペクトルチャートである。マトリックスはトリエタノールアミンを使用した。
図４（ａ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。
図４（ｂ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。１０４９の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図４（ｃ）は、ＧＧＰＬ−ＩＩＩの構造式およびポジティブモードで断片化される場合の結合切断部位を示す図である。
図５は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートである。マトリックスはトリエタノールアミンを使用した。
図６は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートである。マトリックスはグリセロールを使用した。
図７は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートである。マトリックスはｍ−ニトロベンジルアルコールを使用した。
図８は、合成したＧＧＰＬ−ＩＩＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルチャートである。
図９（ａ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。
図９（ｂ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。８８０のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１０（ａ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。
図１０（ｂ）は、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。８９６のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１１（ａ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。
図１１（ｂ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。８９１の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１１（ｃ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。６３５のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１１（ｄ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。９１９の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１１（ｅ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。６６３のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１１（ｆ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートである。６３５のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ａ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。
図１２（ｂ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。９１５の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ｃ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。６５９のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ｄ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。９４３の分子量イオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ｅ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。６５９のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ｆ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。６８７のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
図１２（ｇ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートである。３４７のイオンに対しＭＳ／ＭＳを測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．質量分析法を用いた微生物の脂質抗原の検出方法
本発明は、１つの局面において、サンプルを質量分析法により分析し、脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程を含む、微生物の脂質抗原を検出する方法を提供する。
本明細書中、「微生物」とは、哺乳類、特にヒトに対して病原性を有する細菌類のことをいい、例えば、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）菌体、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クラジミア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などが「微生物」に含まれる。本発明において、好ましい微生物は、マイコプラズマであり、さらにマイコプラズマ・ファーメンタンスおよびマイコプラズマ・ニューモニエが好ましい。
本発明の１つの好ましい実施形態において、上記方法は、
ａ）被験者由来のサンプルを殺菌する工程、および
ｂ）上記サンプルを質量分析法により分析し、上記脂質抗原特有のスペクトルピークを検出する工程、
を含む。
本明細書中、「サンプル」とは、被験者由来の血液、関節液、髄液、咽頭ぬぐい液、組織、細胞、尿などの生物学的試料を意味する。「被験者」には、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス等を含む哺乳動物、鳥類、は虫類、魚類などが含まれ得るが、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトであり、最も好ましくは、マイコプラズマ感染の危険性のある、マイコプラズマ感染が疑われる、またはマイコプラズマに感染しているヒトである。本発明において使用される「サンプル」は、被験者から直接得られた生物学的試料であってもよいし、または被験者から得られた生物学的試料から目的の分子を含む画分を任意の手段により抽出、濃縮、および／または精製したもの等であってもよい。
本発明の１つの好ましい実施形態では、上記工程ａ）において、上記サンプルと有機溶媒とを混合することにより上記サンプルを殺菌する。
さらに好ましい実施形態では、工程ｂ）の前にさらに、工程ａ）から得られたサンプルから上記脂質抗原を含む画分を抽出する工程を含む。この場合、好ましくは、工程ａ）からの上記サンプルと有機溶媒とを混合した後、当該混合物を水性相と有機溶媒相とに分離し、当該有機溶媒相を回収することによって、上記脂質抗原を含む画分を抽出する。
本明細書中、「有機溶媒」とは、サンプル中の脂質抗原を他の水溶性物質から抽出／分離するために使用される有機溶媒のことをいい、低級アルコールであるメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等、あるいはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン、ジオキサン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、キシレン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ベンゼン、クロロホルムおよびトルエン等が挙げられる。上記の溶媒を単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよく、水と有機溶媒を併用してもよい。上記の低級アルコールおよび多価アルコールを含水アルコールとして使用する場合は、水分含量４０％以下が好ましい。本発明において使用される有機溶媒としては、特に、メタノールおよびクロロホルムが好ましい。
本発明の脂質抗原の検出法の好ましい態様においては、典型的には、サンプルをメタノールに注入し、クロロホルムと水を加えた溶媒系にてサンプルと混合させた後、遠心分離もしくは静置して、二相に分離する。下の層（有機層）にマイコプラズマ脂質抗原を含む脂質画分が抽出される。典型的には、この下層をマススペクトル測定用サンプルとして使用する。
本発明の方法は、このような簡単な操作により、質量分析用にサンプルを調製することができるという利点を有する。さらに有機溶媒による抽出を行うことから、サンプルの殺菌処理も同時にできるため、安全なサンプルを調製することができるという利点を有する。
必要に応じて、下層を濃縮し、目的の脂質抗原を分離・濃縮する。この分離・濃縮の方法としては、例えば、次のような方法がある。一つの方法は、有機溶媒を用いる簡単なクロマトグラフィー（シリカゲルなどの吸着担体を用いる）を行う。もう一つの方法は、本抗原に対して特異的に結合する抗体を利用して抗原を濃縮する。例えば、目的に脂質抗原に対する抗体を用いたアフィニティーカラム、当該抗体を担持したバイオチップなどである。これらの方法にて処理することにより目的の脂質抗原を予備的に分離してもよい。この目的のために液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機能を持つマススペクトロメーターであるＬＣ−ＭＳを利用し、脂質抗原の分離とマス測定を同時に行うこともできる。なお、上記本発明において使用する抗体は、当該分野で周知の方法によって作製され得る。簡単には、微生物（例えば、マイコプラズマ）由来の糖脂質を抗原として動物を免疫し、その動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物から回収することによって得られる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、特に、モノクローナル抗体が好適である。
本明細書中、「脂質抗原」とは、マイコプラズマに特異的に存在する脂質分子のことをいう。脂質抗原としては、代表的には、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質（例えば、ＧＧＰＬ−Ｉ（下記構造式（Ｉ））およびＧＧＰＬ−ＩＩＩ（下記構造式（ＩＩ））、あるいはマイコプラズマ・ニューモニエに特異的に存在する下記構造式（ＩＩＩ）を有するグリセロ糖脂質（ＧＧＬ）などが挙げられる。
0005265357.tif 000005
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）。
0005265357.tif 000006
（但し、図中ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）
0005265357.tif 000007
（但し、式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨであり、ｎは、１２、１４、１６、または１８のいずれかである）
本発明の方法において、回収した有機層画分に含まれる脂質抗原は、質量分析法により同定される。本発明において用いる質量分析器としては、一般に市販により入手可能な任意の質量分析器を使用することができる。
本発明の方法において、マイコプラズマに特異的なグリセロ糖脂質は、質量分析法の手順に従って、任意のイオン化法（例えば、ＥＩ法、ＥＳＩ法、ＬＳＩ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法）を用いてサンプルをイオン化し、マススペクトルを取得し、マイコプラズマ特異的グリセロ糖脂質に特有のピークを検出することによって同定する。本発明者らは、これらの特有のピークを見出すことに成功した。
上記構造式（Ｉ）で表される、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的グリセロ糖リン脂質である、ＧＧＰＬ−Ｉについては、ポジティブモードで、質量電荷比９２４、８９６、６５８、６４０、４２０、４０２、３２８、３１０、１８４、または１０４ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出される。あるいは、ネガティブモードで、質量電荷比が９０８、８８０、８０９、６４２、６２４、４０４、３８６、３１２、２９４、および１６８ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出される。したがって、これらのピークのいずれか、または２つ以上が存在することを確認することによって、ＧＧＰＬ−Ｉの存在を確認することができる。ＧＧＰＬ−Ｉの同定は、サンプルのマススペクトルの中に上記ピークの１つ、または好ましくは、複数の上記ピークが存在すること、あるいは最も好ましくは、上記全てのピークが存在することを確認することにより行う。なお、低分解モードでのマススペクトルによる測定では、±１程度のマスナンバーのずれは一般的に起こることである。そのため、本発明における「特有のピーク」としては、上記のそれぞれのマスナンバーに対して好ましくは±２の値、最も好ましくは、マスナンバー±１が、その範囲に含まれるものとする（以下でも同様）。
なお、ここで、ポジティブモードとは、質量分析器において、正イオンで被検対象分子をイオン化する場合をいい、ネガティブモードとは、負イオンでイオン化する場合をいう。
上記構造式（ＩＩ）で表される、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的グリセロ糖リン脂質である、ＧＧＰＬ−ＩＩＩについては、ポジティブモードで、質量電荷比１８４、２３９、１０４９、または１０７７ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出される。あるいは、ネガティブモードで、質量電荷比が８０９、８２３、８６４、９８８、１０４７、または１０７５ｍ／ｚの特有のイオンピークが検出される。したがって、これらのピークのいずれか、または２つ以上が存在することを確認することによって、ＧＧＰＬ−ＩＩＩの存在を確認することができる。ＧＧＰＬ−ＩＩＩの同定は、サンプルのマススペクトルの中に上記ピークの１つ、または好ましくは、複数の上記ピークが存在すること、あるいは最も好ましくは、上記全てのピークが存在することを確認することにより行う。なお、上記と同様、低分解モードでのマススペクトルによる測定では、±１程度のマスナンバーのずれは一般的に起こることである。そのため、本発明における「特有のピーク」としては、上記のそれぞれのマスナンバーに対して好ましくは±２の値、最も好ましくは、マスナンバー±１が、その範囲に含まれるものとする。
一方、マイコプラズマ・ニューモニエに特異的な構造式（ＩＩＩ）で表されるグリセロ糖脂質に特有のピークは、ポジティブモードではナトリウム添加により明暸に観察され、質量電荷比１８５、２０２、３４７、３６３、４０５、４９７、５２５、６５９、６８７、９１５、もしくは９４３ｍ／ｚの位置に顕れる。あるいは、ネガティブモードで、質量電荷比３７９、６３５、６６３、８９１、もしくは９１９ｍ／ｚの位置に顕れる。したがって、これらのピークのいずれか１つまたは２つ以上が存在することを確認することによって、マイコプラズマ・ニューモニエに特異的な脂質抗原の存在を同定することができる。マイコプラズマ・ニューモニエ特異的脂質抗原の存在を確認するには、サンプルのマススペクトルの中に上記ピークの１つが検出されるだけでもよいが、複数の上記ピークが存在することが好ましく、上記全てのピークが存在することが最も好ましい。なお、上記と同様、低分解モードでのマススペクトルによる測定では、±１程度のマスナンバーのずれは一般的に起こることである。そのため、本発明における「特有のピーク」としては、上記のそれぞれのマスナンバーに対して好ましくは±２の値、最も好ましくは、マスナンバー±１が、その範囲に含まれるものとする。
２．本発明のマイコプラズマ特異的脂質抗原の検出方法を用いた疾患の診断方法
本発明はまた、別の局面において、マイコプラズマの感染が原因で生じる疾患の診断方法を提供する。この方法は、上記本発明のマイコプラズマ特異的脂質抗原の検出方法を用いることを特徴とする。
マイコプラズマの感染に起因する疾患の例としては、下記のものが挙げられる。
マイコプラズマ・ファーメンタンスに感染した場合の例として、関節リウマチ、湾岸戦争病、ベーチェット病、慢性疲労性症候群などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、マイコプラズマ・ニューモニエに感染した場合の例として、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のマイコプラズマ特異的脂質抗原の検出方法を用いた疾患の診断方法において、通常、被験者由来のサンプルを質量分析法により分析し、マイコプラズマ特有のピークを検出すれば、その被験者は、マイコプラズマの感染が原因で生じる疾患に罹患していると判断される。あるいは、別の態様では、健常者由来のサンプルと被験者由来のサンプルとが比較され、健常者由来のサンプルが示す特異的ピークの強度と比較して高い特異的ピークを有する被験者由来のサンプルが、当該被験者が上記疾患に罹患していることを示す。
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０００６】
実施例１．質量分析のためのサンプルの調製
ＨＴＬＶ−Ｉ  （Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉ：ヒトＴ細胞白血病ウイルス）およびマイコプラズマ・ファーメンタンスに重複感染したＭＴ−４細胞培養液状態で１ｍＬに水２００μＬ、クロロホルム：メタノール＝２：１溶液  ８００μＬ加え激しく攪拌した後静置して二層に分離させ、下層を脂質画分として取り出した。この下層溶液を薄相クロマトグラフィーに展開し、オリシノール−硫酸染色した。その結果を図１に示す。
図１に示されるように、ホスファチジルコリンやコレステロールなどの一般的な脂質と一緒に、マイコプラズマ・ファーメンタンス抗原糖脂質であるＧＧＰＬ−ＩＩＩの存在が確認できた。
実施例２．質量分析法を用いたマイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的抗原（ＧＧＰＬ−ＩＩＩ）の検出
ネガティブ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）モードでは、ＧＧＰＬ−ＩＩＩの脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ−Ｈ］−＝１０４７と１０７５の分子量イオンが観察される。さらに１０４７の分子量フラグメントよりＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的な官能基が脱離した９８８、８６４、８２３、および８０９のフラグメントが観察される。これは、１０４７に対してＭＳ／ＭＳを測定することにより明瞭に観察できる。よって、ネガティブモードでは以上の６つのフラグメントが鍵となる。
ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）モードでは、ＧＧＰＬ−ＩＩＩの脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９と１０７７の分子量フラグメントが観察される。またＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的なホスホコリンとホスホコリン＋セリノールに相当するフラグメントである１８４と２３９が観察される。これは同様に１０４９に対してＭＳ／ＭＳを測定することにより明瞭に観察できる。よって、ポジティブモードでは以上の３つのフラグメントが鍵となる。
結果は、以下の通りである。
（１）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャート
図２（ａ）〜（ｃ）に、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートを示す。
図２（ａ）に示すように、全スペクトル−［Ｍ−Ｈ］−である１０４７が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ−Ｈ］−＝１０７５も観察された。１０４７からトリメチルアミン基が脱離した９８８、セリノール部分で脱離した８０９のそれぞれのフラグメントが観察された。
図２（ｂ）に示すように、［Ｍ−Ｈ］−＝１０４７のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル−トリメチルアミン基が脱離した９８８、ホスホコリン基部分で脱離した８６４、セリノール部分のアミノ基結合炭素部分で脱離した８２３、セリノール部分で脱離した８０９のそれぞれのフラグメントが観察された。（下記のＧＧＰＬ−ＩＩＩの構造における各フラグメントの分子量を参照（図２（ｃ）も参照））。
0005265357.tif 000008
なお、測定条件は、以下の通りであった：
使用した質量分析器：ＴＳＱ７０  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（マトリックス）。
（２）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ネガティブ）スペクトルチャート
図３に、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ネガティブ）スペクトルチャートを示す。
［Ｍ−Ｈ］−＝１０４７と脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ−Ｈ］−＝１０７５が観察された。また１０４７よりトリメチルアミン基が脱離した９８８、ホスホコリン基部分で脱離した８６５（８６４）、セリノール部分のアミノ基結合炭素部分で脱離した８２３、セリノール部分で脱離した８０９のそれぞれのフラグメントが観察された。
なお、測定条件は、以下の通りであった：
使用機器：ＴＳＱ７０  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．８ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（マトリックス）。
（３）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャート
図４（ａ）〜（ｃ）に、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す。
図４（ａ）に示すように、全スペクトル−［Ｍ＋Ｈ］＋である１０４９が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０７７も観察された。また脂肪酸のヘテロ性に関係なくＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的に観察されるピークとして、ホスホコリン基のフラグメント１８４が観察された。
図４（ｂ）に示すように、［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル−ホスホコリン基の１８４、ホスホコリン＋セリノールの２３９のそれぞれのフラグメントが観察された（下記のＧＧＰＬ−ＩＩＩの構造における各フラグメントの分子量を参照（図４（ｃ）も参照））。
0005265357.tif 000009
なお、測定条件は、以下の通りであった：
使用質量分析器：ＴＳＱ７０  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（マトリックス）。
（４）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャート
図５に、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す。
［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９が観察された。またＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的なホスホコリン基の１８４とホスホコリン＋セリノールの２３９のそれぞれのフラグメントが観察された。
なお、測定条件は、以下の通りであった：
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．８ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（マトリックス）。
（５）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャート
図６は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す。
［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９と脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ＋Ｈ］＋−＝１０７７が観察された。またＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的なホスホコリン基のフラグメント１８４が観察された。
なお、測定条件は、以下の通りであった：
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １ｇ／０．５Ｌ  グリセロール（マトリックス）。
（６）天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャート
図７は、天然物より精製したＧＧＰＬ−ＩＩＩ画分のＦＡＢ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す。
［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９と脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ＋Ｈ］＋−＝１０７７が観察された。またＧＧＰＬ−ＩＩＩに特異的なホスホコリン基のフラグメント１８４が観察された。
なお、測定条件は、以下の通りであった：
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−ＩＩＩ  １ｇ／０．５Ｌ  ｍ−ニトロベンジルアルコール）（マトリックス）。
（７）合成したＧＧＰＬ−ＩＩＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルチャート
図８は、合成したＧＧＰＬ−ＩＩＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルチャートを示す。
ＧＧＰＬ−ＩＩＩの検出限界について検討した。［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０４９について、３８０ａｍｏｌまで問題なく検出できた。
使用機器：ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）
マトリックス：ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））
実施例３．質量分析法を用いたマイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的抗原（ＧＧＰＬ−Ｉ）の検出
ネガティブ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）モードでは、ＧＧＰＬ−Ｉのコリン基のひとつのメチル基が脱離して観察される。脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ−ＣＨ３］−＝８８０と９０８のイオンが観察される。さらに８８０のフラグメントよりＧＧＰＬ−Ｉに特異的な官能基が脱離した８０９、６４２、６２４、４０４、３８６、３１２、２９４、および１６８のフラグメントが観察される。これは、８８０に対してＭＳ／ＭＳを測定することにより明瞭に観察できる。よって、ネガティブモードでは上記１０個のフラグメントが鍵となる。
ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）モードでは、ＧＧＰＬ−Ｉの脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ＋Ｈ］＋＝８９６と９２４の分子量フラグメントが観察される。またＧＧＰＬ−Ｉに特異的なホスホコリンに相当するフラグメントである１８４が観察される。さらに８９６のイオンに対してＭＳ／ＭＳを測定すると、構造特異的な官能基が脱離した６５８、６４０、４２０、４０２、３２８、３１０、１８４、および１０４が観察される。よって、ポジティブモードでは上記１０個のフラグメントが鍵となる。
結果は、以下の通りである。
（１）天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャート
図９（ａ）および（ｂ）に、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートを示す。
図９（ａ）に示すように、全スペクトル−［Ｍ−ＣＨ３］−である８８０が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ−ＣＨ３］−＝９０８も観察された。
図９（ｂ）に示すように、［Ｍ−ＣＨ３］−＝８８０のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル−コリン基が脱離した８０９、脂肪酸が脱離した６４２、６２４、４０４および３８６、グリセロ脂質部分が脱離した３１２および２９４、ホスホコリン基の１６８が観察された。（下記のＧＧＰＬ−Ｉの構造における各フラグメントの分子量を参照。）
0005265357.tif 000010
なお、測定条件は、以下の通りであった：
使用質量分析器：ＴＳＱ７０  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−Ｉ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（マトリックス）。
（２）天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャート
図１０（ａ）および（ｂ）に、天然物より精製したＧＧＰＬ−Ｉ画分のＬＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す。
図１０（ａ）に示すように、全スペクトル−［Ｍ＋Ｈ］＋である８９６が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ＋Ｈ］＋＝９２４も観察された。また脂肪酸のヘテロ性に関係なくＧＧＰＬ−Ｉに特異的に観察されるピークとして、ホスホコリン基のフラグメント１８４が観察された。
図１０（ｂ）に示すように、［Ｍ＋Ｈ］＋＝８９６のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル−脂肪酸が脱離した６５８、６４０、４２０および４０２、グリセロ脂質部分が脱離した３２８および３１０、またホスホコリン基の１８４およびコリン基の１０４が観察された。（下記のＧＧＰＬ−Ｉの構造における各フラグメントの分子量を参照。）
0005265357.tif 000011
なお、測定条件は、以下の通りであった：
使用質量分析器：ＴＳＱ７０  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、
Ｃｓ  ２０ｋＶ，ＥＭ  １．５ｋＶ，ＣＤ  ２０ｋＶ，
ＧＧＰＬ−Ｉ  １μｇ／０．５μＬ  トリエタノールアミン（マトリックス）。
実施例４．質量分析法を用いたマイコプラズマ・ニューモニエの特異的抗原の検出
下記構造式で表されるマイコプラズマ・ニューモニエ抗原糖脂質化合物について質量分析を行った。
0005265357.tif 000012
天然より抽出・精製した抗原糖脂質には脂肪酸の長さにヘテロ性がある。質量分析によって、脂肪酸が２本ともＣ１６：０の化合物（Ｍ＝８９２）と、脂肪酸がＣ１６：０、Ｃ１８：０を１本ずつ持つ化合物（Ｍ＝９２０）の化合物が確認できる。
ネガティブモードでは、糖脂質の脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ−Ｈ］−＝８９１と９１９の分子量フラグメントが観察される。［Ｍ−Ｈ］−＝８９１の分子量フラグメントに対しＭＳ／ＭＳを測定すると、脂肪酸一本が脱離した６５３および６３５が観察され、６３５に対しＭＳ／ＭＳを測定すると脂肪酸が２本脱離した３９７および３７９が観察される。また９１９に対してＭＳ／ＭＳを測定すると脂肪酸が一本脱離することにより６５３と６３５、もしくは６８１と６６３が観察され、これらのピークに対してＭＳ／ＭＳを測定すると２本目の脂肪酸が脱離して３９７および３７９のフラグメントに収束する。よってネガティブモードでは、分子量フラグメントである８９１と９１９、これらに対するＭＳ／ＭＳで観察される６つのフラグメントが鍵となる。
ポジティブモードでは、ナトリウム（ＮａＩ）添加にて測定したほうが感度よく観察される。糖脂質の脂肪酸のヘテロ性に由来する［Ｍ＋Ｎａ］＋＝９１５と９４３の分子量フラグメントが観察される。９１５の分子量フラグメントに対しＭＳ／ＭＳを測定すると、脂肪酸が１本脱離した６５９が観察され、６５９に対しては非還元末端のヘキソースが脱離した４９７、２本目の脂肪酸が脱離した４０５および４０３、グリセロール脂質部分が脱離した３６５および３４７が観察される。また９４３に対してＭＳ／ＭＳを測定すると、脂肪酸が１本脱離して６８７もしくは６５９が観察され、これらのピークに対しては非還元末端のヘキソースが脱離したそれぞれ５２５と４９７、２本目の脂肪酸が脱離した４０５（収束する）、グリセロール脂質部分が脱離した３６５と３４７が観察される。さらに３４７に対してＭＳ／ＭＳを測定すると、二糖構造が分解して１つずつのヘキソースのフラグメントとなった２０２，１８５が観察される。よって、ポジティブモードでは分子量フラグメントである９１５と９４３、これらに対するＭＳ／ＭＳで観察される９つのフラグメントが鍵となる。
結果は以下の通りである。
（１）天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャート
使用機器は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）であった。
図１１（ａ）〜（ｆ）は、天然物より抽出・精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ）スペクトルチャートを示す。
図１１（ａ）に示すように、分子量イオン−［Ｍ−Ｈ］−である８９１が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ−Ｈ］−＝９１９も観察された。
図１１（ｂ）に示すように、８９１のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳ−脂肪酸が１本脱離した６５３および６３５が観察された。
図１１（ｃ）に示すように、６３５のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳ−脂肪酸が２本脱離した３９７および３７９が観察された。
図１１（ｄ）に示すように、９１９のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳ−パルミチン酸が脱離した６８１および６６３とステアリン酸が脱離した６５３および６３５が観察された。
図１１（ｅ）に示すように、６６３に対するＭＳ／ＭＳ−さらに２本目の脂肪酸が脱離した３９７および３７９が観察された。
図１１（ｆ）に示すように、６３５に対するＭＳ／ＭＳ−さらに２本目の脂肪酸が脱離した３９７および３７９が観察された。
0005265357.tif 000013
（２）天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャート
図１２（ａ）〜（ｆ）は、天然物より精製した糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ）スペクトルチャートを示す（ナトリウム添加によりイオンフラグメントはすべて＋Ｎａ（＋２３）にて観察された）。
図１２（ａ）に示すように、分子量イオン−［Ｍ＋Ｎａ］＋である９１５が観察された。また、脂肪酸の１つがＣ１８：０である［Ｍ＋Ｎａ］＋＝９４３も観察された。
図１２（ｂ）に示すように、９１５のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳ−脂肪酸が１本脱離した６５９が観察された。
図１２（ｃ）に示すように、６５９に対するＭＳ／ＭＳ−非還元末端のヘキソースが脱離した４９７、２本目の脂肪酸が脱離した４０５および４０３、さらにグリセロール部分が脱離した３６５、３４７が観察された。
図１２（ｄ）に示すように、９４３のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳ−パルミチン酸が脱離した６８７とステアリン酸が脱離した６５９が観察された。
図１２（ｅ）に示すように、６５９に対するＭＳ／ＭＳ−非還元末端のヘキソースが脱離した４９７、２本目の脂肪酸が脱離した４０５および４０３、さらにグリセロール部分が脱離した３６５、３４７が観察された。
図１２（ｆ）に示すように、６８７に対するＭＳ／ＭＳ−非還元末端のヘキソースが脱離した５２５、２本目の脂肪酸が脱離した４０５および４０３、さらにグリセロール部分が脱離した３６５、３４７が観察された。
図１２（ｇ）に示すように、３４７に対するＭＳ／ＭＳ−二糖構造が分解して１つずつのヘキソースフラグメントとなった２０２、１８５が観察された。
0005265357.tif 000014
上記実施例に例示的に示すとおり、本発明の方法によれば、サンプル中のマイコプラズマ特異的脂質抗原を、簡易かつ高感度で検出することができる。
なお、本発明の実施に使用され得る質量分析のための測定機器、イオン化法、およびマトリックスは、上記実施例において使用されたものに限定されない。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の方法は、微生物（例えば、マイコプラズマ）に特異的な脂質抗原分子を高感度かつ特異的に検出することができるため、サンプル中の微生物特異的脂質抗原の検出に有用である。本発明の方法により、サンプル中のマイコプラズマ特異的脂質抗原の検出することによって、被験者のマイコプラズマへの感染の診断が可能である。したがって、本発明の方法は、マイコプラズマによる感染に起因する疾患（例えば、関節リウマチ）の診断に有用である。
【図２ａ】
0005265357.tif 000018
【図２ｂ】
0005265357.tif 000019
【図２ｃ】
0005265357.tif 000020
【図３】
0005265357.tif 000021
【図４ａ】
0005265357.tif 000022
【図４ｂ】
0005265357.tif 000023
【図４ｃ】
0005265357.tif 000024
【図５】
0005265357.tif 000025
【図６】
0005265357.tif 000026
【図７】
0005265357.tif 000027
【図８】
0005265357.tif 000028
【図９ａ】
0005265357.tif 000029
【図９ｂ】
0005265357.tif 000030
【図１０ａ】
0005265357.tif 000031
【図１０ｂ】
0005265357.tif 000032
【図１１ａ】
0005265357.tif 000033
【図１１ｂ】
0005265357.tif 000034
【図１１ｃ】
0005265357.tif 000035
【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１】
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