(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池を製造する場合に、
上記正極上に酸素還元酵素を光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化するとともに、上記負極上に、単糖類の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を上記負極に渡す補酵素酸化酵素を上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化し、その上に上記単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素を上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化し、この際、上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化された上記酸化酵素を複数の島状の形状に形成するようにした燃料電池の製造方法。
【請求項２】
上記光硬化性樹脂は水溶性光硬化性樹脂であり、上記熱硬化性樹脂は水溶性熱硬化性樹脂である請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項３】
上記正極および／または上記負極上に上記酵素および上記光硬化性樹脂を含む溶液を塗布した後、光を照射することにより上記光硬化性樹脂を硬化させるようにした請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項４】
上記正極および／または上記負極に上記酵素を上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化した後、上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層するようにした請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項５】
上記正極および／または上記負極に上記酵素に加えて電子メディエーターを固定化する請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項６】
上記補酵素の酸化体がＮＡＤ+ であり、上記補酵素酸化酵素がジアホラーゼである請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項７】
上記酸化酵素がＮＡＤ+ 依存型グルコースデヒドロゲナーゼである請求項１記載の燃料電池の製造方法。
【請求項８】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極上に酸素還元酵素が光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化されているとともに、上記負極上に、単糖類の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を上記負極に渡す補酵素酸化酵素が上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化されており、その上に上記単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素が上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化されており、上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化された上記酸化酵素は複数の島状の形状に形成されている燃料電池。
【請求項９】
一つまたは複数の燃料電池を用い、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極上に酸素還元酵素が光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化されているとともに、上記負極上に、単糖類の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を上記負極に渡す補酵素酸化酵素が上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化されており、その上に上記単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素が上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化されており、上記光硬化性樹脂および／または上記熱硬化性樹脂により固定化された上記酸化酵素は複数の島状の形状に形成されているものである電子機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、燃料電池の製造方法、燃料電池および電子機器に関し、特に、酵素を用いたバイオ燃料電池およびこのバイオ燃料電池を電源に用いる各種の電子機器に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、正極（酸化剤極）と負極（燃料極）とが電解質（プロトン伝導体）を介して対向した構造を有する。従来の燃料電池では、負極に供給された燃料（水素）が酸化されて電子とプロトン（Ｈ+ ）とに分離し、電子は負極に渡され、Ｈ+ は電解質を通って正極まで移動する。正極では、このＨ+ が、外部から供給された酸素および負極から外部回路を通って送られた電子と反応してＨ2 Ｏを生成する。
【０００３】
このように、燃料電池は燃料の持つ化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する高効率な発電装置であり、天然ガス、石油、石炭などの化石エネルギーが持つ化学エネルギーを使用場所や使用時によらずに、しかも高い変換効率で電気エネルギーとして取り出すことができる。このため、従来から大規模発電用途などとしての燃料電池の開発研究が活発に行われている。例えば、スペースシャトルに燃料電池が搭載され、電力と同時に乗組員用の水を補給できることや、クリーンな発電装置であることを証明した実績がある。
【０００４】
さらに、近年、固体高分子型燃料電池など、室温から９０℃程度の比較的低温の作動温度域を示す燃料電池が開発され、注目を集めている。このため、大規模発電用途のみならず、自動車の駆動用電源、パーソナルコンピュータやモバイル機器などのポータブル電源などの小型システムへの応用が模索されつつある。
このように、燃料電池は大規模発電から小規模発電まで幅広い用途が考えられ、高効率な発電装置として多くの注目を集めている。しかしながら、燃料電池では、燃料として通常、天然ガス、石油、石炭などを改質器により水素ガスに変換して用いており、限りある資源を消費するとともに、高温に加熱する必要があったり、白金（Ｐｔ）などの高価な貴金属の触媒を必要としたりするなど、種々の問題点がある。また、水素ガスやメタノールを直接燃料として用いる場合でも、その取り扱いには注意を要する。
【０００５】
そこで、生物内で行われている生体代謝が高効率なエネルギー変換機構であることに着目し、これを燃料電池に適用する提案がなされている。ここでいう生体代謝には、微生物体細胞内で行われる呼吸、光合成などが含まれる。生体代謝は、発電効率が極めて高く、また、室温程度の穏やかな条件で反応が進行するという特長を兼ね備えている。
例えば、呼吸は、糖類、脂肪、タンパク質などの栄養素を微生物または細胞内に取り込み、これらの化学エネルギーを、数々の酵素反応ステップを有する解糖系およびクエン酸（ＴＣＡ）回路を介して二酸化炭素（ＣＯ2 ）を生成する過程でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）を還元して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とすることで酸化還元エネルギー、すなわち電気エネルギーに変換し、さらに電子伝達系においてこれらのＮＡＤＨの電気エネルギーをプロトン勾配の電気エネルギーに直接変換するとともに酸素を還元し、水を生成する機構である。ここで得られた電気エネルギーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成酵素を介して、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）からＡＴＰを生成し、このＡＴＰは微生物や細胞が生育するために必要な反応に利用される。このようなエネルギー変換は、細胞質ゾルおよびミトコンドリアで行われている。
【０００６】
また、光合成は、光エネルギーを取り込み、電子伝達系を介してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+ ）を還元して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とすることで電気エネルギーに変換する過程で、水を酸化し酸素を生成する機構である。この電気エネルギーは、ＣＯ2 を取り込み炭素固定化反応に利用され、炭水化物の合成に利用される。
上述のような生体代謝を燃料電池に利用する技術としては、微生物中で発生した電気エネルギーを電子メディエーターを介して微生物外に取り出し、この電子を電極に渡すことで電流を得る微生物電池が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
しかしながら、微生物および細胞には化学エネルギーから電気エネルギーへの変換といった目的の反応以外にも不要な反応が多く存在するため、上述の方法では望まない反応
に化学エネルギーが消費されて十分なエネルギー変換効率が発揮されない。
そこで、酵素を用いて所望の反応のみを行う燃料電池（バイオ燃料電池）が提案されている（例えば、特許文献２〜１１参照。）。このバイオ燃料電池は、燃料を酵素により分解してプロトンと電子とに分離するもので、燃料としてメタノールやエタノールのようなアルコール類あるいはグルコースのような単糖類あるいはデンプンのような多糖類を用いたものが開発されている。
【０００８】
このバイオ燃料電池においては、電極に対する酵素の固定化が非常に重要であり、出力特性、寿命、効率などに非常に大きな影響を与えることが知られている。したがって、酵素固定化電極の製造過程において酵素にダメージをなるべく与えずに固定化することが非常に重要である。従来、酵素の固定化方法としては、共有結合法、物理的包括法、ゲル包括法などが知られている。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１３３２９７号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２１２４号公報
【特許文献３】特開２００４−７１５５９号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２１０号公報
【特許文献５】特開２００５−３１０６１３号公報
【特許文献６】特開２００６−２４５５５号公報
【特許文献７】特開２００６−４９２１５号公報
【特許文献８】特開２００６−９３０９０号公報
【特許文献９】特開２００６−１２７９５７号公報
【特許文献１０】特開２００６−１５６３５４号公報
【特許文献１１】特開２００７−１２２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の共有結合法では、酵素と例えばポリマーなどとの共有結合反応を行うために、リンカーと呼ばれる低分子化合物を用いることが多い。しかしながら、この方法は、反応条件を最適化する必要があるため比較的煩雑であり、また、結合数がポリマーの官能基の数に限られていることが欠点である。物理的包括法およびゲル包括法は、酵素と例えばポリマーとの物理的相互作用によっており、多数の酵素を固定化することができるものの、その相互作用力は小さいことが欠点である。このため、共有結合法と異なり、使用中に酵素固定化電極から酵素が脱離する可能性が高くなることが知られている。また、イオンバランスが崩れると酵素の脱離速度が速くなる欠点もある。
【００１１】
以上のことから、バイオ燃料電池の電極には、多数の酵素をダメージを少なく抑えて固定化する必要があり、上述の共有結合法、物理的包括法、ゲル包括法に代わる新たな酵素固定化技術を開発することが求められていた。
また、バイオ燃料電池の高出力化、高性能化を実現する一つの方法として、電極に多くの酵素や電子メディエーターなどを固定化する方法がある。しかしながら、酵素や電子メディエーターなどは本質的に水に溶けやすいという性質があるために、使用時に電解質液などに溶出し（漏れ出し）、顕著な経時的劣化を引き起こすという問題がある。また、電極に固定化した酵素や電子メディエーターなどの溶出はバイオ燃料電池の寿命を短くすることも大きな問題である。
【００１２】
そこで、この発明が解決しようとする課題は、正極および／または負極の最適な位置に一種または複数種の酵素をダメージを少なく抑えて容易に固定化することができ、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能の燃料電池を製造することができる燃料電池の製造方法およびそのような燃料電池ならびにこの燃料電池を用いた電子機器を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、正極および／または負極に固定化された酵素などの溶出を抑制することができ、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能の燃料電池を製造することができる燃料電池の製造方法およびそのような燃料電池ならびにこの燃料電池を用いた電子機器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、バイオ燃料電池の正極または負極に酵素を含む物質を固定化する場合に光硬化性樹脂を用いることが極めて有効であることを見出し、実験でその有効性を確認した。また、光硬化性樹脂の代わりに熱硬化性樹脂を用いてもよく、両者を併用してもよい。さらに、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により酵素を含む物質を固定化した後、その上にさらに光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層し、これを封止層とすることにより、固定化膜成分の溶出（漏れ出し）を抑制し、触媒電流値を劇的に上昇させることができることを見出した。光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂による酵素を含む物質の固定化と光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂による封止との併用により、バイオ燃料電池の高出力化、高効率化を図ることが可能である。バイオ燃料電池の正極または負極に酵素を含む物質を固定化する場合に光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂を用いることは、本発明者らの知る限り、これまでに提案はなされていない。
さらに、本発明者らは、正極または負極に酵素を含む物質を従来法であるポリイオンコンプレックス法により固定化した後、その上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層することによっても、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により酵素を含む物質を固定化した場合と同様な効果を得ることができることも見出した。
この発明は本発明者らが独自に得た上記の知見に基づいて案出されたものである。
【００１４】
すなわち、上記課題を解決するために、第１の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池の製造方法であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素を光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化する工程を有する
ことを特徴とするものである。
【００１５】
第２の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素が光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化されている
ことを特徴とするものである。
【００１６】
第３の発明は、
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素が光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化されているものである
ことを特徴とするものである。
【００１７】
第４の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池の製造方法であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素を固定化材により固定化する工程と、
上記固定化材上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層する工程とを有する
ことを特徴とするものである。
【００１８】
第５の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素が固定化材により固定化され、上記固定化材上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂が積層されている
ことを特徴とするものである。
【００１９】
第６の発明は、
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および／または上記負極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記正極および／または上記負極に上記酵素が固定化材により固定化され、上記固定化材上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂が積層されているものである
ことを特徴とするものである。
【００２０】
第１〜第６の発明において、正極および／または負極には、好適には、酵素に加えて電子メディエーターを固定化する。
第１〜第３の発明において、正極および／または負極に酵素を光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化する場合には、典型的には、正極および／または負極上に酵素ならびに光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を含む溶液を塗布し、必要に応じて乾燥を行った後、光照射および／または加熱を行うことにより光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を硬化させる。光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂としては、好適には、水溶性光硬化性樹脂および／または水溶性熱硬化性樹脂を用いる。正極および／または負極上には、必要に応じて、一層の酵素固定化層または互いに異なる酵素が含まれる二層以上の酵素固定化層を形成する。特に光硬化性樹脂を用いる場合には、必要に応じて、所定のマスクパターンを有するフォトマスクを用いて光を照射し、その後、現像を行って未露光の光硬化性樹脂を除去する。こうすることで、光硬化性樹脂により酵素が固定化された酵素固定化層を種々の形状に形成することができる。光硬化性樹脂として水溶性光硬化性樹脂を用いる場合には、水で現像を行うことで未露光の水溶性光硬化性樹脂を除去することができるので、環境への負荷の低減を図ることができる。
【００２１】
正極および／または負極に酵素を光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂により固定化した後、必要に応じて、その上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を含む溶液を適当量積層することにより、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層するようにしてもよい。こうして積層された光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂は封止層として働き、正極および／または負極に固定化される成分（酵素や電子メディエーターなど）の溶出を抑制し、触媒電流値を大幅に増加させることが可能である。
【００２２】
水溶性光硬化性樹脂としては種々のものを用いることができ、必要に応じて選択されるが、一般に水溶性が高すぎると正極または負極の製造時に正極または負極に対する酵素固定化層の接着力が低下する傾向があるので、適度な水溶性を有するものを用いるのが好ましい。水溶性光硬化性樹脂としては、具体的には、例えば、アジド系感光基を有するものや、１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有するものなどを用いることができる。
【００２３】
１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する水溶性光硬化性樹脂は、一般に、３００〜３００００、好ましくは５００〜２００００の範囲内の数平均分子量を有し、水性媒体中に均一に分散する十分なイオン性または非イオン性の親水性基、例えば水酸基、アミノ基、カルボキシ基、リン酸基、スルホン酸基、エーテル結合などを含み、かつ波長が約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の光を照射したとき、硬化して水に不溶性の樹脂に変わるものが好適に使用される。そのような水溶性光硬化性樹脂としては、例えば、包括固定化用の固定化担体として既に知られているものを用いることができる（例えば、特公昭５５−４０号公報、特公昭５５−２０６７６号公報、特公昭６２−１９８３７号公報参照。）。この水溶性光硬化性樹脂の代表例を挙げると次の通りである。
【００２４】
（１）ポリアルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性不飽和結合を有する化合物。具体的には例えば下記の化合物を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
・分子量４００〜６０００のポリエチレングリコール１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２モルでエステル化したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類
・分子量２００〜４０００のポリプロピレングリコール１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２モルでエステル化したポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類
・分子量４００〜６０００のポリエチレングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシエチル化合物２モルを付加した不飽和ポリエチレングリコールウレタン化物
・分子量２００〜４０００のポリプロピレングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシエチル化合物２モルを付加した不飽和ポリプロピレングリコールウレタン化物
【００２５】
（２）高酸価不飽和ポリエステル樹脂
不飽和ポリエステル樹脂とは、無水マレイン酸やフマル酸などの不飽和結合を持つ２塩基酸と適度の架橋を得るために飽和結合を持ち重合性を持たない無水フタル酸およびエチレングリコール、プロピレングリコールなどの２価アルコールから作られた樹脂を重合反応性モノマー（スチレンモノマーなど）に溶解した樹脂溶液である。触媒として硬化剤や反応開始剤、パーオキサイドなどの有機化酸化物を用いる。
【００２６】
酵素および水溶性光硬化性樹脂を含む溶液には、必要に応じて、光重合開始剤を含ませる。この光重合開始剤は、重合開始種となって重合性不飽和基を有する樹脂間に架橋反応を起こさせるものであり、例えば、ベンゾインなどのα−カルボニル類、ベンゾインエチルエーテルなどのアシロインエーテル類、ナフトールなどの多環芳香族化合物類、メチルベンゾインなどのα−置換アシロイン類、２−シアノ−２−ブチルアゾホルムアミドなどのアゾアミド化合物などを挙げることができる。この場合、水溶性光硬化性樹脂と光重合開始剤との使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類などに応じて広範囲にわたって変えることができるが、一般的には、水溶性光硬化性樹脂１００質量部に対し、光重合開始剤は０．１〜５質量部、好ましくは０．３〜３質量部の割合で使用するのが適当である。
【００２７】
水溶性熱硬化性樹脂としては、例えば、水溶性塗料（水溶性ペイント）を用いることができる。水系塗料は、水で希釈可能な水溶液型と水に分散しているビーヒクルを持つディスパージョン型とエマルジョン型とに大別される。水溶液型塗料としては熱硬化性アクリルエマルジョンを主とした自己架橋性と水溶性メラミン樹脂架橋型とが優れており、良く用いられる。ディスパージョン型塗料は合成樹脂エマルジョンおよびラテックスを原料とし、分散媒が水と極少量の有機溶剤である。エマルジョン型塗料としては、酢酸ビニルエマルジョン、アクリル酸エステルエマルジョン、スチレンブタジエンラテックス、ＳＢＲラテックスなどがある。いずれの場合も有機溶媒含有量が極端に低いために、大気汚染防止効果が大きく、環境への負荷の低減を図ることができる。
【００２８】
第４〜第６の発明において、酵素を固定化する固定化材としては、基本的にはどのようなものを用いてもよく、ポリイオンコンプレックスなどの従来公知のものを用いることができるほか、上述の光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂などを用いることができる。ポリイオンコンプレックスとしては従来公知のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）をはじめとしたポリカチオンまたはその塩とポリアクリル酸（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ））をはじめとしたポリアニオンまたはその塩とを用いて形成されるポリイオンコンプレックスを用いることができる。
第４〜第６の発明において、ポリイオンコンプレックス上に積層する光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂としては、第１〜第３の発明に関連して説明したものと同じものを用いることができる。
【００２９】
第１〜第６の発明において、燃料としては、各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、代表的なものを挙げると、メタノール、エタノール、単糖類、多糖類、脂肪などである。単糖類、多糖類などを燃料に用いる場合、典型的には、これらをリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液に溶かした燃料溶液の形で用いる。
例えば、燃料としてグルコースのような単糖類を用いる場合には、好適には、負極として用いられる酵素固定化電極において、酵素として、単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素と、酸化酵素によって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素とが固定化される。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。酸化酵素としては例えばＮＡＤ+ 依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が、補酵素としては例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）あるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+ ）が、補酵素酸化酵素としては例えばジアホラーゼ（ＤＩ）が用いられる。
【００３０】
電子メディエーターとしては基本的にはどのようなものを用いてもよいが、好適には、キノン骨格を有する化合物、取り分け、ナフトキノン骨格を有する化合物が用いられる。このナフトキノン骨格を有する化合物としては各種のナフトキノン誘導体を用いることが可能であるが、具体的には、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ１などが用いられる。キノン骨格を有する化合物としては、ナフトキノン骨格を有する化合物以外に、例えば、アントラキノンやその誘導体を用いることもできる。電子メディエーターには、必要に応じて、キノン骨格を有する化合物以外に、電子メディエーターとして働く一種または二種以上の他の化合物を含ませてもよい。
【００３１】
燃料として多糖類（広義の多糖類であり、加水分解によって２分子以上の単糖を生じる全ての炭水化物を指し、二糖、三糖、四糖などのオリゴ糖を含む）を用いる場合には、好適には、上記の酸化酵素、補酵素酸化酵素、補酵素および電子メディエーターに加えて、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素も固定化される。多糖類としては、具体的には、例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。これらは単糖類が二つ以上結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。なお、アミロースとアミロペクチンとはデンプンに含まれる成分であり、デンプンはアミロースとアミロペクチンとの混合物である。多糖類の分解酵素としてグルコアミラーゼを用い、単糖類を分解する酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた場合には、グルコアミラーゼによりグルコースにまで分解することができる多糖類、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトースのいずれかを含むものであれば、これを燃料として発電することが可能となる。なお、グルコアミラーゼはデンプンなどのα−グルカンを加水分解しグルコースを生成する分解酵素であり、グルコースデヒドロゲナーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化する酸化酵素である。
【００３２】
分解酵素としてセルラーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、セルラーゼによりグルコースにまで分解することができるセルロースを燃料とすることができる。セルラーゼは、より詳しくはセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソセロビオヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）などのいずれか少なくとも一種である。なお、分解酵素としてグルコアミラーゼとセルラーゼとを混合して用いてもよく、この場合には、自然界で生産される多糖類の大半を分解することができるため、これらを多く含むもの、例えば生ごみなどを燃料とすることが可能となる。
【００３３】
また、分解酵素としてα−グルコシダーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、α−グルコシダーゼによりグルコースに分解されるマルトースを燃料とすることができる。
また、分解酵素としてスクラーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、スクラーゼによりグルコースとフルクトースとに分解されるスクロースを燃料とすることができる。スクラーゼは、より詳しくはα−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）、スクロース−α−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）、β−フルクトフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２６）などの少なくともいずれか一種である。
また、分解酵素としてβ−ガラクトシダーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、β−ガラクトシダーゼによりグルコースとガラクトースとに分解されるラクトースを燃料とすることができる。
必要に応じて、これらの燃料となる多糖類も負極上に固定化してもよい。
【００３４】
特に、デンプンを燃料とする燃料電池では、デンプンを糊化してゲル状の固形化燃料としたものを用いることもできる。この場合、糊化したデンプンを酵素などが固定化された負極に接触させるか、あるいは負極上に酵素などとともに固定化する方法をとることができる。このような電極を用いると、負極表面のデンプン濃度を、溶液中に溶解したデンプンを用いた場合よりも高い状態に保持することができ、酵素による分解反応がより速くなり、出力が向上するとともに、燃料の取り扱いが溶液の場合よりも容易で、燃料供給システムを簡素化することができ、しかも燃料電池を天地無用とする必要がないため、モバイル機器に用いたときに非常に有利である。
【００３５】
一つの例では、負極に電子メディエーターとしての２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、補酵素としての還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼおよび補酵素酸化酵素としてのジアホラーゼを固定化し、好適には、これらを１．０（ｍｏｌ）：０．３３〜１．０（ｍｏｌ）：（１．８〜３．６）×１０6 （Ｕ）：（０．８５〜１．７）×１０7 （Ｕ）の比で固定化する。ただし、Ｕ（ユニット）とは、酵素活性を示す一つの指標であり、ある温度およびｐＨにおいて１分間当たり１μｍｏｌの基質が反応する度合いを示す。
【００３６】
一方、正極に酵素を固定化する場合、この酵素は、典型的には酸素還元酵素を含む。この酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。この場合、正極には、好適には、酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。電子メディエーターとしては、例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、オクタシアノタングステン酸カリウムなどを用いる。電子メディエーターは、好適には、十分に高濃度、例えば、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上固定化する。
【００３７】
一方、本発明者らは、負極に酵素および電子メディエーターに加えてジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）などのリン脂質を固定化することにより、燃料電池の出力の大幅な向上を図ることができるという現象を見出した。すなわち、リン脂質は高出力化剤として機能することを見出した。このようにリン脂質の固定化により高出力化が可能な理由について種々検討を行ったところ、従来の燃料電池において十分に大きな出力が得られない理由の一つが、負極に固定化する酵素と電子メディエーターとが均一に混合せず、両者が互いに分離して凝集状態にあることにあるが、リン脂質の固定化により酵素と電子メディエーターとが互いに分離して凝集してしまうのを防止することができ、酵素と電子メディエーターとを均一に混合することができるためであるという結論に至った。さらに、リン脂質の添加により酵素と電子メディエーターとを均一に混合することができるようになる原因を究明したところ、電子メディエーター還元体の拡散係数がリン脂質の添加により大幅に上昇するという極めて稀有な現象を発見した。すなわち、リン脂質は電子メディエーター拡散促進剤として機能することを見出した。このリン脂質の固定化の効果は特に、電子メディエーターがキノン骨格を有する化合物である場合に著しい。リン脂質の代わりに、リン脂質の誘導体や、リン脂質またはその誘導体の重合体を用いても同様な効果を得ることができる。なお、高出力化剤とは、最も一般的に言うと、酵素および電子メディエーターが固定化された電極における反応速度を向上させ、高出力化を図ることができるものである。また、電子メディエーター拡散促進剤とは、最も一般的に言うと、酵素および電子メディエーターが固定化された電極の内部での電子メディエーターの拡散係数を増加させ、あるいは、電極近傍での電子メディエーターの濃度を維持するか上昇させるものである。
【００３８】
第１および第２の発明による燃料電池の好適な一実施形態においては、正極上に酸素還元酵素を水溶性光硬化性樹脂により固定化するとともに、負極上に、単糖類の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を負極に渡す補酵素酸化酵素を水溶性光硬化性樹脂により固定化し、その上に単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素を水溶性光硬化性樹脂により固定化し、この際、水溶性光硬化性樹脂により固定化された酸化酵素を複数の島状の形状に形成する。
【００３９】
正極または負極の電極材料としては各種のものを用いることができるが、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパーなどのカーボン系材料が用いられる。
プロトン伝導体としては種々のものを用いることができ、必要に応じて選択されるが、具体的には、例えば、セロハン、パーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜、ＰＳＳＡ−ＰＶＡ（ポリスチレンスルホン酸ポリビニルアルコール共重合体）や、ＰＳＳＡ−ＥＶＯＨ（ポリスチレンスルホン酸エチレンビニルアルコール共重合体）、含フッ素カーボンスルホン酸基を有するイオン交換樹脂（ナフィオン（商品名、米国デュポン社）など）などからなるものが挙げられる。
【００４０】
プロトン伝導体として緩衝物質（緩衝液）を含む電解質を用いる場合には、高出力動作時に十分な緩衝能を得ることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにするために、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。緩衝物質は、一般的には、ｐＫa が５以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよいが、具体例を挙げると、リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（略称トリス）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸（Ｈ2 ＣＯ3 ）、クエン酸水素イオン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）などである。リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）を生成する物質は、例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）やリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）などである。緩衝物質としては、イミダゾール環を含む化合物も好ましい。このイミダゾール環を含む化合物は、具体的には、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン誘導体、ビピリジン誘導体、イミダゾール誘導体（ヒスチジン、１−メチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、イミダゾール−２−カルボン酸エチル、イミダゾール−２−カルボキシアルデヒド、イミダゾール−４−カルボン酸、イミダゾール−４，５−ジカルボン酸、イミダゾール−１−イル−酢酸、２−アセチルベンズイミダゾール、１−アセチルイミダゾール、Ｎ−アセチルイミダゾール、２−アミノベンズイミダゾール、Ｎ−（３−アミノプロピル) イミダゾール、５−アミノ−２−（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール、４−アザベンズイミダゾール、４−アザ−２−メルカプトベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、１−ベンジルイミダゾール、１−ブチルイミダゾール）などである。緩衝物質を含む電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１〜１４のいずれであってもよい。
【００４１】
この燃料電池はおよそ電力が必要なものすべてに用いることができ、大きさも問わないが、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができ、用途などによって出力、大きさ、形状、燃料の種類などが決められる。
電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、携帯電話、モバイル機器（携帯情報端末機（ＰＤＡ）など）、ロボット、パーソナルコンピュータ（デスクトップ型、ノート型の双方を含む）、ゲーム機器、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）、車載機器、家庭電気製品、工業製品などである。
【００４２】
上述のように構成されたこの発明においては、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂による酵素の固定化は、例えば、固定化したい酵素を光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を含む溶液と適当な割合で混合し、この溶液を正極または負極上に展開した後、光をある一定時間照射して水溶性光硬化性樹脂を硬化させたり、加熱を一定時間行って硬化させたりすることにより容易に行うことができる。この場合、正極または負極上の適当な位置に一種または複数種の酵素を安定にしかも高活性を保ったまま固定化することができる。また、光造型技術を用いてこの酵素固定化層を複数層、所望の形状で積層することにより、三次元的に酵素を固定化することができる。
また、正極および／または負極に酵素を任意の固定化材で固定化した後、この固定化上に光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層することにより、この光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂が封止層となって正極および／または負極に固定化された酵素などの溶出を抑制することができる。
【発明の効果】
【００４３】
この発明によれば、正極および／または負極上の最適な位置に一種または複数種の酵素をダメージを少なく抑えて容易に固定化することができ、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能の燃料電池を製造することができる。そして、このように高性能の燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。
また、この発明によれば、正極および／または負極に固定化された酵素などの溶出を抑制することができるので、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能の燃料電池を製造することができる。そして、このように高性能の燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下、この発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、実施形態の全図において、同一または対応する部分には同一の符号を付す。
図１はこの発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池を模式的に示す。このバイオ燃料電池では、燃料としてグルコースを用いるものとする。図２は、このバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す。
図１に示すように、このバイオ燃料電池は、負極１と正極２とがプロトン伝導体３を介して対向した構造を有する。負極１は、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ+ ）を発生する。正極２は、負極１からプロトン伝導体３を通って輸送されたプロトンと負極１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。
【００４５】
負極１は、例えば多孔質カーボンなどからなる電極１１（図２参照）上に、グルコースの分解に関与する酵素と、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素（例えば、ＮＡＤ+ ）と、補酵素の還元体（例えば、ＮＡＤＨ）を酸化する補酵素酸化酵素（例えば、ジアホラーゼ）と、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエーター（例えば、ＡＣＮＱ）とが、水溶性光硬化性樹脂により固定化されて構成されている。このような酵素、補酵素および電子メディエーターが固定化された負極１は、例えば、これらの酵素、補酵素および電子メディエーターを水溶性光硬化性樹脂を含む溶液と適当な割合で混合し、この溶液をスピンコート、バーコート、コンタクトプリント、ディップなどにより電極１１上に展開した後、光をある一定時間照射して水溶性光硬化性樹脂を硬化させることにより容易に形成することができる。水溶性光硬化性樹脂としては、例えば、既に挙げたものを用いることができる。この場合、これらの酵素、補酵素および電子メディエーターの固定化構造を階層性のある３次元構造体として形成することが可能であり、こうすることで、電極１１上の任意の場所にこれらの酵素、補酵素および電子メディエーターを配置することができる。例えば、電極１１上にまず補酵素の還元体を酸化する補酵素酸化酵素を固定化し、その上にグルコースの分解に関与する酵素を固定化する。そして、この際、例えば、補酵素酸化酵素を含む一層目の酵素固定化層は電極１１の全面に形成し、グルコースの分解に関与する酵素を含む一層目の酵素固定化層は互いに離れた複数の島状の形状に形成し、例えば二次元アレイ状に形成する。このようにグルコースの分解に関与する酵素を含む一層目の酵素固定化層を複数の島状の形状に形成することにより、燃料として用いられるグルコース溶液との接触面積が大きくなり、酵素反応の効率の向上を図ることができる。補酵素および電子メディエーターは、例えば、一層目の酵素固定化層に固定化する。複数の島状の形状の酵素固定化層は、水溶性光硬化性樹脂を硬化させるための光の照射をフォトマスクを用いて選択的に行うことにより容易に形成することができる。必要に応じて、酵素、補酵素および電子メディエーターを水溶性光硬化性樹脂により固定化した固定化層上にさらに水溶性光硬化性樹脂を積層し、これを封止層として用いてもよい。
【００４６】
グルコースの分解に関与する酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、好適にはＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。この酸化酵素を存在させることにより、例えば、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化することができる。
さらに、このＤ−グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノキナーゼとフォスフォグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰｈＧＤＨ）との二つの酵素を存在させることにより、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに分解することができる。すなわち、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンは、加水分解によりＤ−グルコネートになり、Ｄ−グルコネートは、グルコノキナーゼの存在下、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸とに加水分解することでリン酸化されて、６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートになる。この６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートは、酸化酵素ＰｈＧＤＨの作用により、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに酸化される。
【００４７】
また、グルコースは上記分解プロセスのほかに、糖代謝を利用してＣＯ2 まで分解することもできる。この糖代謝を利用した分解プロセスは、解糖系によるグルコースの分解およびピルビン酸の生成ならびにＴＣＡ回路に大別されるが、これらは広く知られた反応系である。
単糖類の分解プロセスにおける酸化反応は、補酵素の還元反応を伴って行われる。この補酵素は作用する酵素によってほぼ定まっており、ＧＤＨの場合、補酵素にはＮＡＤ+ が用いられる。すなわち、ＧＤＨの作用によりβ−Ｄ−グルコースがＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化されると、ＮＡＤ+ がＮＡＤＨに還元され、Ｈ+ を発生する。
【００４８】
生成されたＮＡＤＨは、ジアホラーゼ（ＤＩ）の存在下で直ちにＮＡＤ+ に酸化され、二つの電子とＨ+ とを発生する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で二つの電子と二つのＨ+ とが生成されることになる。２段階の酸化反応では、合計四つの電子と四つのＨ+ とが生成される。
上記プロセスで生成された電子はジアホラーゼから電子メディエーターを介して電極１１に渡され、Ｈ+ はプロトン伝導体３を通って正極２へ輸送される。
【００４９】
上記の酵素、補酵素および電子メディエーターは、電極反応が効率よく定常的に行われるようにするために、プロトン伝導体３としてリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液を含む電解質層を用い、この緩衝液によって、酵素にとって最適なｐＨ、例えばｐＨ７付近に維持されていることが好ましい。リン酸緩衝液としては、例えばＮａＨ2 ＰＯ4 やＫＨ2 ＰＯ4 が用いられる。さらに、イオン強度（Ｉ．Ｓ．）は、あまり大きすぎても小さすぎても酵素活性に悪影響を与えるが、電気化学応答性も考慮すると、適度なイオン強度であることが好ましい。ただし、ｐＨおよびイオン強度は、用いる酵素それぞれに最適値が存在し、上述した値に限定されない。
【００５０】
図２には、一例として、グルコースの分解に関与する酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+ 、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエーターがＡＣＮＱである場合が図示されている。
【００５１】
正極２は、多孔質カーボン電極などに、例えばビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酸素を分解する酸素還元酵素を水溶性光硬化性樹脂により固定化したものである。この正極２の外側の部分（プロトン伝導体３と反対側の部分）は通常、多孔質カーボンよりなるガス拡散層により形成される。正極２には、好適には、上記の酸素還元酵素に加えて、この正極２との間で電子の受け渡しを行う電子メディエーターも固定化される。このような酸素還元酵素および電子メディエーターが固定化された正極２は、例えば、これらの酸素還元酵素および電子メディエーターを水溶性光硬化性樹脂を含む溶液と適当な割合で混合し、この溶液を電極上に展開した後、光をある一定時間照射して水溶性光硬化性樹脂を硬化させることにより容易に形成することができる。水溶性光硬化性樹脂としては、例えば、既に挙げたものを用いることができる。この際、酸素還元酵素を含む酵素固定化層は、例えば、電極上に、互いに離れた複数の島状の形状に形成し、例えば二次元アレイ状に形成する。このように酸素還元酵素を含む一層目の酵素固定化層を複数の島状の形状に形成することにより、外部から供給される酸素との接触面積が大きくなり、酵素反応の効率の向上を図ることができる。必要に応じて、酸素還元酵素および電子メディエーターを水溶性光硬化性樹脂により固定化した固定化層上にさらに水溶性光硬化性樹脂を積層し、これを封止層として用いてもよい。
この正極２においては、上記の酸素還元酵素の存在下で、プロトン伝導体３からのＨ+ と負極１からの電子とにより空気中の酸素を還元し水を生成する。
【００５２】
プロトン伝導体３は負極１において発生したＨ+ を正極２に輸送するためのもので、電子伝導性を持たず、Ｈ+ を輸送することが可能な材料により構成されている。このプロトン伝導体３としては、例えば、既に挙げたものを用いることができる。
以上のように構成されたバイオ燃料電池において、負極１側にグルコースが供給されると、このグルコースが酸化酵素を含む分解酵素により分解される。この単糖類の分解プロセスで酸化酵素が関与することで、負極１側で電子とＨ+ とを生成することができ、負極１と正極２との間で電流を発生させることができる。
【００５３】
次に、バイオ燃料電池の具体的な構造例について説明する。
図３ＡおよびＢに示すように、このバイオ燃料電池は、負極１と正極２とがプロトン伝導体３を介して対向した構成を有している。この場合、正極２の下および負極１の上にそれぞれＴｉ集電体２１、２２が置かれ、集電を容易に行うことができるようになっている。符号２３、２４は固定板を示す。これらの固定板２３、２４はねじ２５により相互に締結され、それらの間に、正極２、負極１、プロトン伝導体３（セロハンなど）およびＴｉ集電体２１、２２の全体が挟み込まれている。固定板２３の一方の面（外側の面）には空気取り込み用の円形の凹部２３ａが設けられ、この凹部２３ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴２３ｂが設けられている。これらの穴２３ｂは正極２への空気の供給路となる。一方、固定板２４の一方の面（外側の面）には燃料装填用の円形の凹部２４ａが設けられ、この凹部２４ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴２４ｂが設けられている。これらの穴２４ｂは負極１への燃料の供給路となる。この固定板２４の他方の面の周辺部にはスペーサー２６が設けられており、固定板２３、２４をねじ２５により相互に締結したときにそれらの間隔が所定の間隔になるようになっている。
図３Ｂに示すように、Ｔｉ集電体２１、２２の間に負荷２７を接続し、固定板２４の凹部２４ａに燃料として例えばリン酸緩衝液にグルコースを溶かしたグルコース溶液を入れて発電を行う。
【００５４】
このバイオ燃料電池の外部への液漏れを防止するために、正極２、負極１、プロトン伝導体３およびＴｉ集電体２１、２２の全体をラミネートフィルムで密封した構造としてもよい。ラミネートフィルムの材質は、ＰＥＴ、ポリエステル、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネートなどである。このラミネートフィルムのうちの正極２側の部分には空気取り込み用の穴を例えば穴２３ｂに対応した位置に設け、負極１側の部分には燃料取り込み用の穴を例えば穴２４ｂに対応した位置に設ける。このような構造とすることでバイオ燃料電池の製造プロセスの簡略化を図ることができる。すなわち、例えば、まず、負極１および正極２として何も固定化していない多孔質の電極（多孔質カーボンなど）を用い、正極２、負極１、プロトン伝導体３およびＴｉ集電体２１、２２の全体を透明なラミネートフィルムで密封する。上述のようにこのラミネートフィルムには正極２側の部分に空気取り込み用の穴が、負極１側の部分には燃料取り込み用の穴が設けられている。次に、ラミネートフィルムの空気取り込み用の穴を通じて正極２の多孔質電極に、酸素還元酵素および電子メディエーターに加えて光硬化性樹脂（水溶性光硬化性樹脂など）あるいはさらに電解質を含む溶液を添加し、全体に浸透させる。また、ラミネートフィルムの燃料取り込み用の穴を通じて負極１の多孔質電極に、酵素、補酵素および電子メディエーターに加えて光硬化性樹脂（水溶性光硬化性樹脂など）あるいはさらに電解質を含む溶液を添加し、全体に浸透させる。次に、ラミネートフィルムを通して正極２の多孔質電極に光を照射することにより光硬化性樹脂を硬化させ、酸素還元酵素および電子メディエーターあるいはさらに電解質を固定化する。また、ラミネートフィルムを通して負極１の多孔質電極に光を照射することにより光硬化性樹脂を硬化させ、酵素、補酵素および電子メディエーターあるいはさらに電解質を固定化する。上述の光硬化性樹脂の代わりに熱硬化性樹脂を用い、光の代わりに熱を用いて硬化させるようにしてもよい。なお、以上の方法は、バイオ燃料電池だけでなく、電極に酵素などを光硬化性樹脂により固定化する場合全般に適用することが可能である。
【００５５】
〈実施例１〉
負極１の電極１１上に２種類の酵素、具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびジアホラーゼ（ＤＩ）を階層性を持って固定化し、所望の場所に所望の量を配置した。酵素はサイズがｎｍ程度で非常に小さくそのままでは検出しづらいため、ここでは２種類の酵素にそれぞれ別の蛍光色素を共有結合にてラベルした。
酵素の固定化に用いる水溶性光硬化性樹脂としては、ＡＷＰ（Azide-unit Pendant Water-soluble Photopolymer)（東洋合成工業株式会社製）を用いた。ＡＷＰは、アジド系感光基をポリビニルアルコールにペンダントした水溶性光硬化性樹脂であり、図４に示すような構造を有する。
【００５６】
まず、ＡＷＰを、蛍光ラベルしたＤＩを含む溶液と適当な割合で混合した後、この溶液を電極１１上に滴下し、スピンコーターにより展開し、所望の厚さを有する平膜を作製した。その後、この平膜に紫外光（ＵＶ）照射装置により紫外光を照射し、ＡＷＰを硬化させた。こうして、図５に示すように、ＤＩがＡＷＰにより固定化された一層目の酵素固定化層３２を電極１１の全面に形成した。次に、ＡＷＰを、蛍光ラベルしたＧＤＨを含む溶液と適当な割合で混合した後、この溶液を酵素固定化層３２上に滴下し、スピンコーターにより展開し、所望の厚さを有する平膜を作製した。その後、８０μｍ×８０μｍの大きさの正方形の開口が１５μｍ間隔で二次元アレイ状に形成されたフォトマスクを用いてこの平膜にＵＶ照射装置により紫外光を選択的に照射し、ＡＷＰを硬化させた。この後、こうして露光を行った平膜を水で現像し、未露光部を除去する。こうして、図５に示すように、ＧＤＨがＡＷＰにより固定化された二層目の酵素固定化層３３を８０μｍ×８０μｍの大きさの正方形の形状の島状に１５μｍ間隔で二次元アレイ状に形成した。酵素固定化層３２、３３の合計の厚さは約１μｍである。
こうして電極１１上に形成された酵素固定化層３２、３３の光学顕微鏡写真を図６に示す。
この実施例１により、電極１１上にＧＤＨおよびＤＩを階層性を持って三次元的に固定化することが可能であることが実証された。
【００５７】
〈実施例２〉
上述のように、負極１の電極１１上には、典型的には、２種類の酵素、具体的には、ＧＤＨおよびＤＩと補酵素と電子メディエーターとが固定化される。この実施例２では、電極１１としてグラッシーカーボン電極を用い、その上にこれらのＧＤＨおよびＤＩと補酵素と電子メディエーターとを固定化する実験を行った結果について説明する。
図７Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示すように４つの試料（試料１〜４）を作製した。図７Ａに示す試料１は、電極１１上に、酵素としてのＧＤＨおよびＤＩと補酵素としてのＮＡＤＨとをＡＷＰにより固定化した酵素および補酵素固定化層４１を形成し、その上に水溶性光硬化性樹脂層４２を３層形成したものである。図７Ｂに示す試料２は、電極１１上に、酵素および補酵素固定化層４１を形成し、その上に電子メディエーターとしてのＡＮＱをＡＷＰにより固定化した電子メディエーター固定化層４３を形成し、その上に水溶性光硬化性樹脂層４２を２層形成したものである。図７Ｃに示す試料３は、電極１１上に、酵素および補酵素固定化層４１を形成し、その上に電子メディエーターとしてのＡＮＱをＡＷＰにより固定化した電子メディエーター固定化層４３を２層形成し、その上に水溶性光硬化性樹脂層４２を１層形成したものである。図７Ｄに示す試料４は、電極１１上に、酵素および補酵素固定化層４１を形成し、その上に電子メディエーターとしてのＡＮＱをＡＷＰにより固定化した電子メディエーター固定化層４３を３層形成したものである。これらの試料１〜４における補酵素固定化層４１、水溶性光硬化性樹脂層４２および電子メディエーター固定化層４３の１層の厚さを接触型厚さ測定装置にて測定したところ、およそ３μｍであることがわかった。
【００５８】
上述のようにして作製された試料１〜４を用いてグルコース溶液中で電気化学的測定を行った。グルコース濃度は４００ｍＭとした。電子メディエーターが固定化されていない試料１では、電子伝達をすることができないため電流密度はほぼ０ｍＡ／ｃｍ2 であるが、電子メディエーター固定化層４３を１層形成した試料２（ＡＮＱの固定化量は４μＬ）では電流密度は約０．２１ｍＡ／ｃｍ2 、電子メディエーター固定化層４３を２層形成した試料３（ＡＮＱの固定化量は８μＬ）では電流密度は約０．３２ｍＡ／ｃｍ2 、電子メディエーター固定化層４３を３層形成した試料４（ＡＮＱの固定化量は１２μＬ）では電流密度は約０．４２ｍＡ／ｃｍ2 であった。このことから、電流密度は電子メディエーター固定化層４３の層数にほぼ比例していることがわかった。
この実施例２により、電極１１上に酵素として、ＧＤＨおよびＤＩ、電子メディエーターとしてＡＮＱ、補酵素としてＮＡＤＨを積層することが可能であることが実証された。また、触媒電流を得るためには、この酵素の組み合わせにおいては電子メディエーターが必須であり、ある範囲においては電子メディエーターの固定化量に比例することが実証された。
【００５９】
〈実施例３〉
多孔質カーボン電極上に水溶性光硬化性樹脂を用いて酵素を固定化した。
水溶性光硬化性樹脂を酵素やその他の構成成分と一緒に電極上で硬化させるには、まず適当な波長の紫外光が照射される必要がある。例えば空隙率が６０％程度の多孔質カーボン電極では、光が透過するのはおよそ、０．３ｍｍ程度であることがわかっている。そのため、厚さが０．５ｍｍの多孔質カーボン電極を用いることにし、紫外光の照射を裏表から行うこととした。こうすることで多孔質カーボン電極の内部の全体に紫外光を照射することができ、水溶性硬化樹脂溶液を含む酵素などの溶液により多孔質カーボン電極上に固定化層を形成することができる。
【００６０】
具体的には、厚さ０．５ｍｍの多孔質カーボン電極に、酵素（ＧＤＨ、ＤＩ）ストック溶液８μＬ、ＮＡＤＨ溶液２μＬ、緩衝液としてのリン酸緩衝液１２μＬ、ＡＮＱ溶液１８．７μＬ、ＡＷＰ溶液２０μＬを混合した溶液を３０μＬずつ多孔質カーボン電極の両面に添加し、適当に乾燥させた後、紫外光を適当な時間照射した。こうして、ＡＷＰによりＧＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨおよびＡＮＱを固定化した多孔質カーボン電極を作製した。上記の方法により酵素などが固定化された厚さ０．５ｍｍの多孔質カーボン電極を４枚重ねて２ｍｍの厚さとした後、単極セルにて電気化学的測定を行った。
【００６１】
また、比較のために、従来法であるポリイオンコンプレックス法によりＧＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨおよびＡＮＱを固定化した多孔質カーボン電極を作製した。具体的には、厚さ２ｍｍの多孔質カーボン電極の両面に、酵素（ＧＤＨ、ＤＩ）ストック溶液３２μＬ、ＮＡＤＨ溶液８μＬ、緩衝液としてのリン酸緩衝液４０μＬ、ＡＮＱ溶液７４．８μＬを混合した溶液を７５μＬずつ滴下し、適当に乾燥させ、さらに、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）溶液を２０μＬずつ、多孔質カーボン電極の両面に滴下した後、適当に乾燥させた。さらに、多孔質カーボン電極の両面にポリアクリル酸溶液を２４μＬずつ添加した後、適当に乾燥させた。こうして、比較用の多孔質カーボン電極を作製した。
【００６２】
電解質溶液の組成はイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）であり、グルコース濃度を６００ｍＭとしたときの電気化学的評価を行った。その結果、光硬化性樹脂を用いて作製した多孔質カーボン電極（実施例３）と比較用の多孔質カーボン電極（比較例）とを比較したところ、いずれの場合においても、触媒電流値を得ることができることがわかった。また、１０分後および１時間後の電流値を比較したところ、固定化にポリイオンコンプレックス法を用いた比較例ではそれぞれ、８．５６ｍＡ／ｃｍ2 、３．１９ｍＡ／ｃｍ2 となったが、固定化に水溶性光硬化性樹脂を用いた実施例３ではそれぞれ、１１．９ｍＡ／ｃｍ2 、４．２７ｍＡ／ｃｍ2 であることがわかった。したがって、固定化に水溶性光硬化性樹脂を用いることにより、多孔質カーボン電極を用いたときにも触媒電流値を得ることができることがわかり、さらに、固定化に従来法であるポリイオンコンプレックス法を用いた場合よりもはるかに大きい触媒電流値を得ることができることがわかった。
この実施例３により、グラッシーカーボン電極のような平板な電極のみならず、三次元的に複雑な構造を持った多孔質カーボン電極上においても水溶性光硬化性樹脂を用いた酵素の固定化層の作製が可能であり、かつ従来法であるポリイオンコンプレックス法で作製した多孔質カーボン電極と比較してはるかに大きな触媒電流値を得ることができることが実証された。
【００６３】
以上のように、この第１の実施形態によれば、負極１上に水溶性光硬化性樹脂により２種類の酵素、補酵素および電子メディエーターを固定化し、正極２上に同じく水溶性光硬化性樹脂により酵素および電子メディエーターを固定化しているので、これらの酵素にダメージを与えることがなく、活性を維持したまま酵素を所望の位置に固定化することができる。また、光造型技術を用いることにより、酵素を三次元的に所望の位置に所望の配置で所望の量だけ固定化することができる。特に、水溶性光硬化性樹脂を硬化させるための光照射に半導体プロセスなどで用いられているフォトマスクを用いることにより、ナノメートルあるいはマイクロメートルのスケールの微小な酵素固定化構造体を二次元的または三次元的に自在に形成することが可能である。このため、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能のバイオ燃料電池を得ることができる。加えて、酵素などの物質の固定化は、この物質を水溶性光硬化性樹脂を含む溶液と混合し、この溶液を塗布し、光照射により水溶性光硬化性樹脂を硬化させるだけでよいので、固定化を容易に行うことができ、ひいてはバイオ燃料電池の製造コストの低減を図ることができる。
【００６４】
次に、この発明の第２の実施形態によるバイオ燃料電池について説明する。
このバイオ燃料電池においては、負極１上にポリイオンコンプレックス法などの従来公知の方法を含む任意の方法により酵素、補酵素および電子メディエーターを固定化し、正極２上に同じくポリイオンコンプレックス法などの従来公知の方法を含む任意の方法により酸素還元酵素および電子メディエーターを固定化した後、この固定化層上に第１の実施形態と同様な方法により光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層し、これを封止層として用いる。
このバイオ燃料電池の上記以外のことは第１の実施形態と同様である。
【００６５】
〈実施例４〉
実施例１〜３のように、水溶性光硬化性樹脂を含む溶液を用いることにより、グラッシーカーボン電極のような平板電極のみならず、多孔質カーボン電極といった複雑な構造を持つ電極においても酵素などを含む固定化層を形成することが可能である。また、それを積層することも可能であることが実証されている。この実施例４では、任意の方法で作製された固定化層に水溶性光硬化性樹脂を積層する工程を適用し、その効果を見る実験を行った結果について説明する。
【００６６】
ここでは、従来法であるポリイオンコンプレックス法により固定化層を作製する。具体的には、グラッシーカーボン電極に、酵素（ＧＤＨ、ＤＩ）ストック溶液８μＬ、ＮＡＤＨ溶液２μＬ、緩衝液としてのリン酸緩衝液１０μＬ、ＡＮＱ溶液１８．７μＬを混合した溶液を滴下し、適当に乾燥させ、さらに、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）溶液を１０μＬずつ、滴下した後、適当に乾燥させた。さらに、ポリアクリル酸溶液を１２μL ずつ添加した後、適当に乾燥させた。こうして、比較用のグラッシーカーボン電極を作製した（試料１１）。
【００６７】
比較用の電極の上にさらに、水溶性光硬化性樹脂を積層したものを試料１２とした。
さらに、光硬化性樹脂により酵素を固定化する方法により電極を作製したものを試料１３とした。具体的には、酵素（ＧＤＨ、ＤＩ）ストック溶液８μＬ、ＮＡＤＨ溶液２μＬ、ＡＮＱ溶液１８．７μＬ、ＡＷＰ溶液１０μＬを混合した溶液をグラッシーカーボン電極上に添加し、適当に乾燥させた後、紫外光を適当な時間照射した。こうして、ＡＷＰによりＧＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨおよびＡＮＱを固定化したグラッシーカーボン電極を作製し、これを試料１３とした。
【００６８】
電解質溶液の組成はイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）であり、グルコース濃度を４００ｍＭとしたときの電気化学的評価を行った。１時間後の０．１Ｖでの定電位測定結果では、ポリイオンコンプレックス法を用いて作製したグラッシーカーボン電極（試料１１）では、０．２６ｍＡ／ｃｍ2 、さらに水溶性光硬化性樹脂を積層した試料１２では１．３７ｍＡ／ｃｍ2 、水溶性光硬化性樹脂で酵素を固定化した上で、さらに水溶性光硬化性樹脂を積層した試料１３では０．８９ｍＡ／ｃｍ2 であることがわかった。水溶性光硬化性樹脂を積層することによる触媒電流値の顕著な増加は、酵素などの固定化方法によらないことから、積層した水溶性光硬化性樹脂の効果であることが推定された。また、この積層した水溶性光硬化性樹脂により、酵素などを固定化した固定化膜が保護され、良好な反応場を与えるとともに、封止層として機能し、構成成分である酵素などの電解質溶液への溶出を抑制していると考えられた。
この実施例４により、任意の固定化方法により酵素などを固定化した固定化層上に水溶性光硬化性樹脂を積層することが可能であること、また、１時間後の触媒電流値が飛躍的に上昇することが実証できた。
【００６９】
〈実施例５〉
実施例４では固定化層の上に水溶性光硬化性樹脂により積層した膜が封止層として機能することを示したが、実施例５では光硬化性樹脂に留まらず、他の性質を持った機能性樹脂が封止層として機能することを示す実験結果について説明する。
具体的には、実施例４と同様にポリイオンコンプレックス法によりグラッシーカーボン電極上に固定化層を作製し、これを試料２１とした。
さらに、この上に水溶性のアクリル系合成樹脂塗料（大創産業社製）を純水にて適当に希釈した溶液を１０μＬ滴下し、乾燥させたものを試料２４とした。
試料２１と試料２２とを０．１Ｖでの定電位測定により比較したところ、１時間後では試料２１が０．２６ｍＡ／ｃｍ2 であったのに対して、試料２２は１．０６ｍＡ／ｃｍ2 であることがわかった。
この実施例５により、ポリイオンコンプレックス法で作製された酵素などの固定化層に、水溶性のアクリル系合成樹脂塗料を積層しても実施例４と同様の触媒電流値の上昇があることが判明した。
【００７０】
〈実施例６〉
実施例５では平板のグラッシーカーボン電極上に固定化層を作製したが、実施例６では多孔質カーボン電極上に酵素などの固定化層を形成した電極と多孔質カーボン電極上に酵素などの固定化層を形成し、その上にさらに水溶性のアクリル系合成樹脂塗料を積層した電極との比較実験結果について説明する。
具体的には、厚さ２ｍｍの多孔質カーボン電極の両面に、酵素（ＧＤＨ、ＤＩ）ストック溶液３２μＬ、ＮＡＤＨ溶液８μＬ、緩衝液としてのリン酸緩衝液４０μＬ、ＡＮＱ溶液７４．８μＬを混合した溶液を７５μＬずつ滴下し、適当に乾燥させ、さらに、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）溶液を２０μＬずつ、多孔質カーボン電極の両面に滴下した後、適当に乾燥させた。さらに、多孔質カーボン電極の両面にポリアクリル酸溶液を２４μＬずつ両面に添加した後、適当に乾燥させた。こうして、比較用の多孔質カーボン電極を作製した。これを試料３１とした。
さらに、試料３１の多孔質カーボン電極の上に水溶性のアクリル系合成樹脂塗料を積層し、これを試料３２とした。
【００７１】
上記２つの多孔質カーボン電極を０．１Ｖでの定電位測定により比較したところ、１時間後では、試料３１では２．３９ｍＡ／ｃｍ2 、試料３２では３．０１ｍＡ／ｃｍ2 であることがわかった。実施例５と同様、水溶性のアクリル系合成樹脂塗料を積層することにより、約１．３倍の触媒電流値を得ることができた。これは実施例３、４で示したような水溶性光硬化性樹脂による固定化層からの構成成分の溶出の抑制効果と推察された。
この実施例６により、多孔質カーボン電極上にポリイオンコンプレックス法により酵素などを固定化した固定化層上にアクリル系合成樹脂塗料を積層することにより、極めて良好な触媒電流値が得られることが実証された。
【００７２】
以上のように、第２の実施形態によれば、負極１上に任意の方法で酵素、補酵素および電子メディエーターを固定化し、正極２上に同じく任意の方法で酸素還元酵素および電子メディエーターを固定化し、この固定化層上に水溶性の光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂を積層することにより、この光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂が封止層となって固定化層の構成成分の溶出を抑制することができるとともに、この光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂が固定化膜の保護層となって良好な酵素反応場を形成することができ、出力特性、寿命、効率などに優れた高性能のバイオ燃料電池を得ることができる。さらに、固定化層上に積層される光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂は保護層ともなるため、外部の物体との接触などにより固定化層に傷が付いたり、損傷が生じたりするのを防止することができる。
【００７３】
以上、この発明の実施形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池を示す略線図である。
【図２】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。
【図３】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の具体的な構成例を示す略線図である。
【図４】ＡＷＰの化学構造を示す略線図である。
【図５】実施例１の試料を示す断面図である。
【図６】実施例１の光学顕微鏡写真を示す図面代用写真である。
【図７】実施例２の試料を示す断面図である。
【符号の説明】
【００７５】
１…負極、２…正極、３…プロトン伝導体、１１…電極、２１、２２…Ｔｉ集電体、２３、２４…固定板、２７…負荷、３１…電極、３２、３３…酵素固定化層、４１…酵素および補酵素固定化層、４２…水溶性光硬化性樹脂層、４３…電子メディエーター固定化層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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