(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛包細胞中の目的遺伝子の発現量を定量するための方法であって、以下の（１）〜（２８）に記載の遺伝子から選択される１以上の遺伝子を対照遺伝子として用いることを特徴とし、前記目的遺伝子は、発現量が日内変動する遺伝子である、遺伝子発現定量方法。
（１）配列番号１記載のCDC37 homolog遺伝子
（２）配列番号３記載のneuropathy target esterase遺伝子
（３）配列番号５記載のspinster遺伝子
（４）配列番号７記載のdiazepam binding inhibitor遺伝子
（５）配列番号９記載のDNA directed RNA polymerase II polypeptide L遺伝子
（６）配列番号１１記載のPDGFA associated protein 1遺伝子
（７）配列番号１３記載のmitofusin 2遺伝子
（８）配列番号１５記載のATP binding domain 1 family, member B遺伝子
（９）配列番号１７記載のmitochondrial ribosomal protein L34遺伝子
（１０）配列番号１９記載のproteolipid protein 2遺伝子
（１１）配列番号２１記載のribosomal protein P0遺伝子
（１２）配列番号２３記載のzinc finger protein 289, ID1 regulated遺伝子
（１３）配列番号２５記載のmediator of RNA polymerase II transcription, subunit 28 homolog遺伝子
（１４）配列番号２７記載のribosomal protein S2遺伝子
（１５）配列番号２９記載のguanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 13遺伝子
（１６）配列番号３１記載のpx19-like protein遺伝子
（１７）配列番号３３記載のzinc finger, CCHC domain containing 14遺伝子
（１８）配列番号３５記載のMAP3K12 binding inhibitory protein 1遺伝子
（１９）配列番号３７記載のribosomal protein L41遺伝子
（２０）配列番号３９記載のDR1-associated protein 1遺伝子
（２１）配列番号４１記載のRho guanine exchange factor 16遺伝子
（２２）配列番号４３記載のF-box and leucine-rich repeat protein 11遺伝子
（２３）配列番号４５記載のCCR4-NOT transcription complex, subunit 6遺伝子
（２４）配列番号４７記載のchromosome 17 open reading frame 37遺伝子
（２５）配列番号４９記載のCCR4-NOT transcription complex, subunit 10遺伝子
（２６）配列番号５１記載のeukaryotic translation initiation factor 4E member 2遺伝子
（２７）配列番号５３記載のzinc finger protein 574遺伝子
（２８）配列番号５５記載のring finger protein 149遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包細胞中の遺伝子発現定量方法に関する。より詳しくは、適切な対照遺伝子を用いた毛包細胞中の遺伝子発現量定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、各種疾患の分子メカニズムの解明や診断方法の確立、さらには創薬ターゲットの探索等を目的として、ＤＮＡマイクロアレイやリアルタイムＰＣＲといった手法を用いた遺伝子発現の定量解析（以下、「遺伝子発現解析」ともいう）が広く行われている。
【０００３】
これらの遺伝子発現解析では、まず、検体試料からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によってｃＤＮＡを得る。次に、必要に応じてｃＤＮＡを増幅した後、アレイへのハイブリダイズ反応やＰＣＲ反応を行なう。そして、ＤＮＡマイクロアレイではアレイにハイブリダイズしたｃＤＮＡ量を、リアルタイムＰＣＲでは増幅速度を、蛍光色素を用いて光学的に測定することにより遺伝子発現量の定量を行い、二以上の検体間で発現量の比較を行う。
【０００４】
この際、検体試料からのｍＲＮＡの抽出や、ｃＤＮＡの逆転写反応及び増幅反応等において、手技的な要因によるばらつきが生じると、遺伝子発現量の定量結果に誤差が生じることとなる。
【０００５】
例えば、検体試料の１つに、ＲＮＡ分解酵素の混入や、添加酵素量の不足などが生じた場合、試料中のｍＲＮＡが分解されてしまったり、ｃＤＮＡへの逆転写が不十分となったりすることで、試料中のｍＲＮＡ量を正確に反映した定量結果を得ることができなくなる。
【０００６】
このような手技的な要因による誤差をなくすため、検体試料中で常時一定の発現量を維持している遺伝子を対照遺伝子として用い、この対照遺伝子の定量値により、解析対象とする目的遺伝子の定量値を補正することが行われている。
【０００７】
対照遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子とも呼ばれており、従来、幅広い細胞種で発現している解糖系酵素であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）遺伝子や細胞骨格タンパクであるβ−アクチン遺伝子等が用いられてきた。
【０００８】
しかしながら、近年では、ヒトを含めた生物個体間において、発現量に個体差がみられる遺伝子が多く存在すること（非特許文献１参照）や、ほぼ全ての遺伝子がサーカディアンリズム（概日周期）と呼ばれる発現量の日内変動（時間変動）を示すこと（非特許文献２参照）が明らかにされ、遺伝子発現解析に際し、ハウスキーピング遺伝子としてどの遺伝子を用いるかについては、より慎重な選択が求められるようになっている。
【０００９】
すなわち、二以上の個体間で、所定の目的遺伝子について発現量の比較定量を行う場合に、仮に対照遺伝子として発現量に著しい個体差のある遺伝子を用いて目的遺伝子の定量値を補正してしまうと、個体間での目的遺伝子の発現量差を正確に評価することができなくなってしまう。
【００１０】
また、例えば、同一の個体について異なる時刻間で目的遺伝子の発現量の変化を調べる場合に、対照遺伝子として発現量が時間変動する遺伝子を用いてしまうと、目的遺伝子発現量の経時的変化を正確に評価することが困難となる。
【００１１】
従って、遺伝子発現解析に際しては、解析の対象とする検体試料に応じて、発現量の個体差や時間変動が少ない遺伝子を適切に選択して対照遺伝子として用いる必要がある。
【００１２】
一方、遺伝子発現解析に関しては、近年、より微量の検体を用いた解析が指向されてきており、ＤＮＡマイクロアレイやリアルタイムＰＣＲの検出感度の向上に伴って、指先を小さく傷付けて得た血液滴や、ごく少量掻き採った口腔粘膜などの微量試料を用いた遺伝子発現解析が行われるようになっている。
【００１３】
微量試料を用いた遺伝子発現解析は、検体採取のため被験者に与える肉体的及び精神的侵襲が低いため、臨床の現場での検体採取及びデータの集積を容易にし、各種疾患の分子メカニズムの解明や診断方法の確立に貢献するものと期待されている。
【００１４】
また、微量試料として、上述の血液滴や口腔粘膜に加え、毛髪が注目されるようになっている。毛髪は、血液滴や口腔粘膜に比してもさらに低侵襲に採取が可能であり、かつ、簡便に採取できるため、既にゲノムを用いた遺伝子型の判定等に利用され始めている。
【００１５】
特許文献１には、毛髪からＲＮＡを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００５−１９２４０９号公報。
【非特許文献１】Gene expression in head hair follicles plucked from men and women. Ann. Clin. Lab. Sci. 2006. 36(2):115-26.
【非特許文献２】Digital Signal Processing Reveals Circadian Baseline Oscillation in Majority of Mammalian Genes. PLoS Comput. Biol. 2007. 3(6): e120.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
毛髪の採取は、被験者への侵襲が極めて低く、かつ簡便に行なうことが可能であるため、遺伝子発現解析のための微量試料として好適な検体となり得る。
【００１７】
しかし、上述のように、遺伝子発現解析に際しては、解析の対象とする検体試料に応じて、発現量の個体差や時間変動が少ない遺伝子を適切に選択して対照遺伝子として用いる必要があるが、毛髪を用いた遺伝子発現解析においていかなる遺伝子を対照遺伝子として用いるべきかについてはこれまで明らかにされていなかった。
【００１８】
そこで、本発明は、毛包細胞中の遺伝子発現定量方法において、適切な対照遺伝子を用いた遺伝子発現量定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題解決のため、本発明は、毛包細胞中の目的遺伝子の発現量を定量するための方法であって、以下の（１）〜（２８）に記載の遺伝子から選択される１以上の遺伝子を対照遺伝子として用いることを特徴とする遺伝子発現定量方法を提供する。
（１）配列番号１記載のCDC37 homolog遺伝子
（２）配列番号３記載のneuropathy target esterase遺伝子
（３）配列番号５記載のspinster遺伝子
（４）配列番号７記載のdiazepam binding inhibitor遺伝子
（５）配列番号９記載のDNA directed RNA polymerase II polypeptide L遺伝子
（６）配列番号１１記載のPDGFA associated protein 1遺伝子
（７）配列番号１３記載のmitofusin 2遺伝子
（８）配列番号１５記載のATP binding domain 1 family, member B遺伝子
（９）配列番号１７記載のmitochondrial ribosomal protein L34遺伝子
（１０）配列番号１９記載のproteolipid protein 2遺伝子
（１１）配列番号２１記載のribosomal protein P0遺伝子
（１２）配列番号２３記載のzinc finger protein 289, ID1 regulated遺伝子
（１３）配列番号２５記載のmediator of RNA polymerase II transcription, subunit 28 homolog遺伝子
（１４）配列番号２７記載のribosomal protein S2遺伝子
（１５）配列番号２９記載のguanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 13遺伝子
（１６）配列番号３１記載のpx19-like protein遺伝子
（１７）配列番号３３記載のzinc finger, CCHC domain containing 14遺伝子
（１８）配列番号３５記載のMAP3K12 binding inhibitory protein 1遺伝子
（１９）配列番号３７記載のribosomal protein L41遺伝子
（２０）配列番号３９記載のDR1-associated protein 1遺伝子
（２１）配列番号４１記載のRho guanine exchange factor 16遺伝子
（２２）配列番号４３記載のF-box and leucine-rich repeat protein 11遺伝子
（２３）配列番号４５記載のCCR4-NOT transcription complex, subunit 6遺伝子
（２４）配列番号４７記載のchromosome 17 open reading frame 37遺伝子
（２５）配列番号４９記載のCCR4-NOT transcription complex, subunit 10遺伝子
（２６）配列番号５１記載のeukaryotic translation initiation factor 4E member 2遺伝子
（２７）配列番号５３記載のzinc finger protein 574遺伝子
（２８）配列番号５５記載のring finger protein 149遺伝子
この遺伝子発現量定量方法は、特に、発現量が日内変動する遺伝子を目的遺伝子とする場合に好適に用いられるものである。
【００２０】
ここで、本発明において「毛包細胞」とは、体毛を抜去した際、抜去された体毛の毛根部に付着する細胞群を広く包含するものとする。より具体的には、内毛根鞘（inner root sheath）、外毛根鞘（outer root sheath）及び毛乳頭（papilla）を形成する細胞が含まれる。なお、毛包細胞の取得のため抜去される体毛の部位は特に限定されず、例えばヒトを対象とする場合、頭髪や髭、腕や足の毛などを用いればよい。
【００２１】
また、「対照遺伝子」とは、検体間で遺伝子発現量を比較する際、各検体で得られた定量値を補正するための基準となる遺伝子（内部標準遺伝子）をいう。対照遺伝子には、検体試料中で常時一定の発現量を維持している遺伝子が用いられる。各検体について、この対照遺伝子発現量の定量値で、解析対象とする目的遺伝子発現量の定量値を補正することにより、手技的な要因による検体間の測定誤差を補正して、検体間での発現比較を行なうことが可能となる。
【００２２】
本発明に係る遺伝子発現定量方法は、ヒトの他、マウス・ラット・サルなど幅広い生物種に適用が可能であり、体毛を有する動物であれば特に限定されない。ここで、ヒト以外を対象動物とする場合、対照遺伝子には、上記配列番号に記載のヒト遺伝子の該対象動物におけるホモログ（相同遺伝子）を用いる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、適切な対照遺伝子を用いた毛包細胞中の遺伝子発現量定量方法が提供される。この方法においては、遺伝子発現量を正確に評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明者らは、毛包細胞中で常時安定して一定の発現量を維持している遺伝子を同定するため、複数の被験者から複数の時刻に採取した毛包細胞を用い、網羅的な遺伝子発現解析を行った。
【００２５】
その結果、以下の「表１」に掲げる遺伝子を同定するに至った。
【００２６】
【表１】
0005176424.tif 000002
【００２７】
表に示す遺伝子は、毛包細胞中における発現量の個体差及び時間変動が少ない遺伝子である。従って、これら遺伝子を対照遺伝子として用いることで、二以上の個体間や、同一個体において異なる時刻間での遺伝子発現量の比較を、手技的な要因による測定誤差を適切に補正して行うことが可能となる。
【００２８】
対照遺伝子には、表に示す全ての遺伝子を用いて、その定量値の平均値や中央値により目的遺伝子の定量値を補正してもよく、表に示す一部の遺伝子用いて同様に補正を行ってもよい。
【００２９】
本発明に係る毛包細胞中の遺伝子発現量定量方法は、ＤＮＡマイクロアレイのような網羅的な遺伝子発現解析手法や、リアルタイムＰＣＲのような個別的な遺伝子発現解析手法に基づいて行うことができる。
【００３０】
例えば、毛包細胞中の遺伝子Aの発現量を、被験者間で、又は同一被験者の異なる健康状態間で比較する場合、リアルタイムＰＣＲ等を用いて遺伝子Aと「表１」に示した遺伝子の発現量を定量し、遺伝子Aの定量値を「表１」に示した遺伝子の定量値で補正することで、遺伝子Aの発現量を正確に比較することができる。
【００３１】
本発明において、毛包細胞の採取部位は、例えばヒトを対象とする場合、頭髪や髭、腕や足の毛などを用いることができ、特に限定されない。経時的な遺伝子発現定量を行なう場合には、数時間おきに複数回毛包細胞の採取を行なう。この際、測定のばらつきを抑えるため、各回の採取は可能な限り近傍の部位で行なうことが望ましい。
【００３２】
毛包細胞からのＲＮＡ抽出は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販の微量検体用ＲＮＡ抽出キットを使用できる。抽出したＲＮＡの逆転写反応（cDNA合成）も、従来公知の方法で行なえばよく、市販の逆転写酵素を使用できる。
【００３３】
本発明において、目的遺伝子としては、例えば、被験者の健康状態を判定するため遺伝子発現解析を行う場合には、特定の健康状態に関わる遺伝子又は遺伝子群とすることができる。また、例えば、薬剤応答性等の個人差を判定する場合には、薬物代謝酵素など薬剤に反応する遺伝子または遺伝子群とすることができる。
【００３４】
ここで、「表１」に示した遺伝子は、その発現量の個体差のみならず、同一個体内での時間変動も少ない遺伝子である。従って、目的遺伝子として、発現量が日内変動（時間変動）する遺伝子又は遺伝子群を採用すれば、これら遺伝子の発現量の日内変動を正確に評価することが可能である。近年、時計遺伝子と呼ばれる発現量が周期的に時間変動する遺伝子群が同定され、これら時計遺伝子が、睡眠覚醒サイクルや、体温・血圧・ホルモン分泌量の日内変動などの生体リズムを広く支配していることが明らかとされている。本発明に係る遺伝子発現定量方法を用いれば、経時的な採取が容易な毛包細胞を用い、正確に時計遺伝発現量の評価を行うことができ、生体リズムを簡便かつ正確に測定することが可能となる。
【実施例】
【００３５】
＜実施例１＞
毛包細胞の遺伝子発現検索
本実施例においては、３名の被験者からそれぞれ異なる時刻において採取した毛包細胞について、全発現遺伝子の発現量を測定し、この中から発現量の変動が最も少ない遺伝子を抽出した。
【００３６】
被験者Ａ（３２歳、男性）、被験者Ｂ（３１歳、男性）、被験者Ｃ（３３歳、男性）から、頭髪５本を抜去し、毛包細胞を採取した。採取は9:30, 12:30, 15:30, 18:30の４回行ない、合計１２のサンプルを準備した。
【００３７】
採取した毛包細胞から、市販のRNA抽出キット（Qiagen社：RNeasy total RNA purification kit）を用いてtotal RNAの抽出、精製を行った。得られたtotal RNAを、市販のRNA増幅キット（Ambion社：The Illumina RNA Amplification Kit）を用いてaRNAとして増幅し、定法により断片化および蛍光標識を行った。
【００３８】
蛍光標識した断片化aRNAをDNAマイクロアレイシステム（Illumina社：BeadStation500）及びDNAマイクロアレイ（同：Human-6 Expression BeadChip）を用いて解析し、全発現遺伝子について発現量の測定値（Raw data）を得た。
【００３９】
得られた測定値（Raw data）について、DNAマイクロアレイ解析ソフト（Agilent社：GeneSpring）を用い、以下に示す手順により各サンプルの測定値（Raw data）を標準化した。
（１）各サンプルにおいて、測定値（Raw data）が0.01以下の遺伝子は0.01に引き上げる。
（２）各サンプルにおいて、測定値（Raw data）が1以上の遺伝子について、その測定値の中央値を求める。
（３）各サンプルの中央値が等しくなるように、１２サンプルそれぞれについて全遺伝子の測定値（Raw data）の標準化を行なう。
【００４０】
標準化を行なった後の測定値（Standardized data）に基づいて、各遺伝子の測定値の１２サンプル中での変動率（標準偏差／平均）を求め、変動率が0.12未満の遺伝子を抽出した。
【００４１】
同時に、DNAマイクロアレイシステムにおけるDetection Valueが、12サンプル中5サンプル以上で0.7未満となっている遺伝子を排除した。これは、DNAマイクロアレイにおける非特異的なハイブリダイズ反応の結果、実際にはサンプル中に発現していないにもかかわらず、測定値（Raw data）が検出された遺伝子（フォールスポジティブ）を排除するための操作である。
【００４２】
以上の操作によって最終的に得られた遺伝子を「表２」に示す。表は、変動率の小さい遺伝子から上位に示した。
【００４３】
【表２】
0005176424.tif 000003
【００４４】
これらの遺伝子は、１２サンプル中における測定値（Standardized data）の変動率が最も少なかった遺伝子である。すなわち、これら遺伝子は、毛包細胞内における発現量の個体差及び時間変動が最も少ない遺伝子ということができる。
【００４５】
＜実施例２＞
測定値の補正方法による遺伝子発現量データの誤差評価
本実施例では、実施例１で得られた１２サンプルについての測定値（Raw data）を、従来方法により補正した場合と、「表１」に示した遺伝子群の測定値で補正した場合とで、得られる遺伝子発現量データのばらつき（誤差）を評価した。
【００４６】
各サンプルについて、実施例１で得られた全遺伝子の測定値（Raw data）を以下の方法により補正した。
（Ａ）「表２」に示した遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正
（Ｂ）測定値（Standardized data）が1以上の遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正
（Ｃ）「表３」に示した一般的なハウスキーピング遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正（従来方法）
【００４７】
【表３】
0005176424.tif 000004
【００４８】
図１は、上記（Ａ）の方法によって全遺伝子の測定値（Raw data）を補正して得られた遺伝子発現量データの２サンプル間でのばらつきを示すスキャタープロットである。図には、サンプルとして、実施例１中、被験者Ａ（9：30）と被験者A（12：30）を用いた場合の結果を示した。
【００４９】
また、図２は上記（Ｂ）の方法によって、図３は上記（Ｃ）の方法によって全遺伝子の測定値（Raw data）を補正して得られた遺伝子発現量データの２サンプル間でのばらつきを示すスキャタープロットである。
【００５０】
図１に示す（Ａ）の方法で補正した遺伝子発現量データのばらつきは、図２に示す（Ｂ）の方法で補正した場合に比べて、小さく抑えられていることが分かる。
【００５１】
また、図１に示す（Ａ）の方法で補正した場合と、図３に示す（Ｃ）の方法で補正した場合とでは、プロット上明らかな差異は認められないが、２サンプル間での各遺伝子の個別の変動率（標準偏差／平均）を比較すると、（Ｂ）の方法では変動率が0.95と大きかったのに対して、（Ａ）の方法では変動率が0.65と小さく、遺伝子発現量データのばらつきをより抑制できていることが明らかになった。
【００５２】
＜実施例３＞
測定値の補正方法による遺伝子発現量データの定量評価
本実施例では、実施例１で得られた測定値（Raw data）に基づいて、代表的な時計遺伝子であるBmal1遺伝子、Per2遺伝子及びPer3遺伝子の発現量の経時的変化を検索した。
【００５３】
被験者Ａ〜Ｃについて、採取時刻（9:30, 12:30, 15:30, 18:30）における各時計遺伝子発現量の測定値（Raw data）を、上記（Ａ）又は（Ｃ）の方法により補正を行った。
【００５４】
図４は、上記（Ａ）の方法によって各時計遺伝子の測定値（Raw data）を補正して得られた遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。図は、被験者Ａ〜Ｃの平均値を示す。図中横軸は時刻、縦軸は発現量を示している。
【００５５】
図５は、上記（Ｃ）の方法によって各時計遺伝子の測定値（Raw data）を補正して得られた遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。
【００５６】
図４に示す（Ａ）の方法によって補正した時計遺伝子発現量の経時的変化は、図５に示す（Ｃ）の方法で補正した場合に比べて、変動幅（振幅）が大きく、時計遺伝子発現量の日内変動が明確に検出されている。
【００５７】
以上、実施例２及び実施例３の結果から、「表２」に示した遺伝子の測定値（Raw data）の中央値を用いて全遺伝子の測定値（Raw data）を補正することにより、遺伝子発現量のデータのばらつき（誤差）を最小限に抑え、正確な発現定量を行い得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係る遺伝子発現定量方法は、各種疾患の分子メカニズムの解明や診断方法の確立、さらには創薬ターゲットの探索等に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】「表２」に示した遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正した場合の２サンプル間での遺伝子発現量データのばらつきを示すスキャタープロットである。
【図２】測定値（Standardized data）が1以上の遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正した場合の２サンプル間での遺伝子発現量データのばらつきを示すスキャタープロットである。
【図３】従来方法で補正した場合の２サンプル間での遺伝子発現量データのばらつきを示すスキャタープロットである。
【図４】「表２」に示した遺伝子の測定値（Raw data）の中央値で補正した場合の時計遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。
【図５】従来方法で補正した場合の時計遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。
【図１】
0005176424.tif 000005
【図２】
0005176424.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
0005176424.tif 000009
【配列表】
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