(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検査対象の核酸、２種類のプローブ及び下記一般式
Ｒ−Ｘｎ
（式中、ｎは２又は３を表し、Ｘはそれぞれ同じであっても異なってもよいヌクレオチドを表し、Ｒは炭化水素鎖（ｎが２の場合には二価であり、ｎが３の場合には三価である。）を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。）で表されるヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる段階、及び
（ｂ）この水溶液中に生成する集合体の形状を顕微鏡で観察する段階から成る標的核酸を検出する方法であって、
一方のプローブが、該標的核酸の３’側の少なくとも５塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、ヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、他方のプローブが、該標的核酸において、該核酸１よりも５’側に位置する、少なくとも５塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、ヌクレオチドＸのうちの他のヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記（ａ）段階が、
（ａ’）前記２種類のプローブと前記ヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させ、一旦８０℃以上に加温して常温に冷却する段階、及び
（ｂ’）この水溶液に前記検査対象の核酸を加えて混合する段階、
から成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸がＤＮＡであり、前記ヌクレオチド脂質が、下記一般式
Ｒ−Ｘ２
（式中、Ｘは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｒは上記で定義したとおりである。）で表され、前記一方のプローブが、該標的核酸の３’末端の５〜１５０塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、デオキシリボヌクレオチドＸと塩基対を形成しうるデオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、前記他方のプローブが、該標的核酸の５’末端の５〜１５０塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、デオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドＸがモノリン酸であり、前記Ｒの炭素数が１２〜２０である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、検査対象の核酸と、標的核酸に基づいて設計された添加物を水溶媒に溶解させ、水溶液中に形成される分子集合体の形状を、顕微鏡を用いて観察することにより、標的核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、生命の基本となる生体分子で、生体のさまざまな現象に関わる非常に重要な物質の一つであり、核酸を検出する技術の開発には大きな需要がある。
このような技術として、例えば、電気泳動法は、従来核酸を検出する方法として広く用いられてきた。この手法は、一般にゲルの調製やエチジウムブロマイドによる染色などが必要であり、結果が得られるまでに要する時間が長く、分析手順が煩雑である。また、染色試薬として使うエチジウムブロマイドは人体への発ガン性をもつ化合物であり、使用に危険がともなう。さらに、二重らせん構造をもたないＲＮＡや一本鎖の核酸を分析するこは一般的に困難であるとされる。
また、近年では固体表面上に数多くの核酸を固定化したＤＮＡチップが開発されている（非特許文献１など）。ＤＮＡチップにおいては、核酸への化学修飾工程が必須であり、分析手順が煩雑である。また、バックグラウンドノイズや基板への非特異的吸着により、再現性よく蛍光シグナルを得ることが問題となることが多い。ＤＮＡチップはそれ自体が高価である上に、蛍光標識試薬及びその専用検出器も非常に高価であるという問題点もある。
さらに簡便な方法として、金コロイドとＤＮＡの複合体の凝集を用いる核酸検出法が報告されている（非特許文献２など）。しかし、このような複合体による凝集では、標的核酸が複数の微粒子を架橋することで凝集が起こるため、標的核酸の複数の領域と結合する複数のＤＮＡ固定化金コロイドを合成しておく必要があり、プローブへの化学修飾と金コロイドを結合させるための化学合成工程が必要である。したがって汎用性がないのが現状である。
本発明者らは、既に開発した、二価又は三価の炭化水素鎖の分子端にヌクレオチドを有するハイドルゲル化剤（特許文献１）を、本発明に利用した。
【０００３】
【特許文献１】特許第3660282号
【非特許文献１】Science 1991, 251, 767-777
【非特許文献２】Science 2000, 289, 1757-1760
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を溶解させた水溶液を、そのまま又は乾燥させて顕微鏡で観察することにより、標的核酸を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
検査対象の核酸を溶解させた水溶液に、標的核酸の塩基配列に基づいて設計した一組のプローブと、二価又は三価の炭化水素鎖の分子端にヌクレオチドを有するヌクレオチド脂質（特許文献１）を混合すると、その水溶液中に標的核酸が存在する場合には、これらが相補的核酸塩基対を形成することにより自己集合してファイバーを形成する。本発明者らは、形成されたファイバーを顕微鏡で観察することにより、標的核酸の存在を検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、（ａ）検査対象の核酸、２種類のプローブ及び下記一般式
Ｒ−Ｘｎ
（式中、ｎは２又は３を表し、Ｘはそれぞれ同じであっても異なってもよいヌクレオチドを表し、Ｒは炭化水素鎖（ｎが２の場合には二価であり、ｎが３の場合には三価である。）を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。）で表されるヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる段階、及び
（ｂ）この水溶液中に生成する集合体の形状を顕微鏡で観察する段階から成る標的核酸を検出する方法であって、
一方のプローブが、該標的核酸の３’側の少なくとも５塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、ヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、他方のプローブが、該標的核酸において、該核酸１よりも５’側に位置する、少なくとも５塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、ヌクレオチドＸのうちの他のヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうるヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、標的核酸の検出方法である。
【０００７】
この（ａ）段階が、
（ａ’）前記２種類のプローブと前記ヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させ、一旦８０℃以上に加温して常温に冷却する段階、及び
（ｂ’）この水溶液に前記検査対象の核酸を加えて混合する段階、
から成ることが好ましい。
【０００８】
また、本発明は、前記標的核酸がＤＮＡであり、前記ヌクレオチド脂質が、下記一般式
Ｒ−Ｘ２
（式中、Ｘは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｒは上記で定義したとおりである。）で表され、前記一方のプローブが、該標的核酸の３’末端の５〜１５０塩基から成る核酸１に相補的な核酸の５’末端に、デオキシリボヌクレオチドＸと塩基対を形成しうるデオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合してなる核酸であり、前記他方のプローブが、該標的核酸の５’末端の５〜１５０塩基から成る核酸２に相補的な核酸の３’末端に、デオキシリボヌクレオチドＹが１０〜１５０個結合した核酸が結合して成る核酸である、上記の方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の標的核酸の検出方法は、ゲルの調製や染色などの工程が不要で、検出までの分析手順が容易である。また、危険物質の使用が必要なく、プローブに化学修飾や蛍光試薬をインターカレートする必要がない。また、本発明の標的核酸の検出方法は、一重鎖核酸を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、２種類のプローブとヌクレオチド脂質を用いて、標的核酸を検出する方法である。まず、この２種類のプローブとヌクレオチド脂質を、標的核酸に対応させて説明する。図１にその模式図を示す。
標的核酸は原則的に任意の配列のＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり、本発明の方法を適用するためには、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも２０塩基の長さが必要である。
【００１１】
２種類のプローブは、それぞれ標的核酸とハイブリダイズするように設計された核酸、好ましくはＤＮＡである。
一方のプローブ（「プローブＡ」という。）は、図１に示すように、標的核酸の一部分である核酸（「核酸１」という。）に相補的な核酸を有する。標的核酸において、この核酸１は、後述のもう一方のプローブ（「プローブＢ」という。）とハイブリダイズする標的核酸の一部分である核酸（「核酸２」という。）よりも標的核酸の３’側に位置する。この核酸１は、標的核酸の３’末端に位置してもよいし、核酸１と標的核酸の３’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基が存在してもよい。この核酸１のサイズは、少なくとも５塩基、好ましくは５〜１５０塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。
プローブＡは、図１に示すように、核酸１に相補的な核酸の５’末端に、又は５’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基を介して、ヌクレオチドＹ１が１０〜１５０個、好ましくは１０〜１００個結合した核酸が結合してなる。このヌクレオチドＹ１は、後述のヌクレオチド脂質のヌクレオチドＸのうちの一つのヌクレオチドＸ１と塩基対を形成しうる塩基である。即ち、Ｘ１が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））である場合、Ｙ１は、ぞれぞれ、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）である。
【００１２】
もう一方のプローブＢは、図１に示すように、標的核酸の一部分である核酸（「核酸２」という。）に相補的な核酸を有する。標的核酸において、この核酸２は、上記プローブＢよりも標的核酸の５’側に存在し、核酸１と核酸２との間には０〜１００塩基が存在してもよい。この核酸２は、標的核酸の５’末端に位置してもよいし、核酸２と標的核酸の５’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基が存在してもよい。この核酸２のサイズは、少なくとも５塩基、好ましくは５〜１５０塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。
プローブＢは、図１に示すように、核酸２に相補的な核酸の３’末端に、又は３’末端との間に１００塩基以下の任意の塩基を介して、ヌクレオチドＹ２が１０〜１５０個、好ましくは１０〜１００個結合した核酸が結合してなる。このヌクレオチドＹ２は、後述のヌクレオチド脂質のヌクレオチドＸのうちの他の（即ち、Ｘ１以外の）ヌクレオチドＸ２と塩基対を形成しうる塩基である。なお、Ｘ１とＸ２とは同じであってもよい。Ｘ２が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））である場合、Ｙ２は、ぞれぞれ、チミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）である。
【００１３】
本発明で用いるヌクレオチド脂質は下記一般式で表される。
Ｒ−Ｘｎ
この式中、ｎは２又は３、好ましくは２を表す。
Ｘはヌクレオチドを表し、これらのヌクレオチドは、それぞれ同じであっても異なってもよいが、好ましくは同じである。このヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドであり、その３’又は５’の位置に１又は２以上のリン酸を含んでもよい。このヌクレオチド脂質の作製が容易であるという観点から、デオキシチミジンの３’位にモノリン酸が結合したものが好ましい。
【００１４】
Ｒは炭化水素鎖を表し、ｎが２の場合にはこの炭化水素鎖は二価となり、ｎが３の場合には三価となる。この炭化水素に特に制限はなく、直鎖、分枝、環式のいずれであってもよい。また、結合手（ｎ＝２の場合には２個、ｎ＝３の場合には３個）はその炭化水素鎖の末端にあることが好ましい。
この炭化水素鎖の炭素数は１２〜２０が好ましく、１８〜２０がより好ましい。また、この炭化水素鎖としては末端に結合手を有するオリゴメチレン基、特に−（ＣＨ２）ｍ−（ｍは好ましくは１２〜２０、より好ましくは１８〜２０である。）が好ましい。
このヌクレオチドは、そのリン酸部分で該炭化水素鎖と結合する。
また、上記ヌクレオチドは必ずしも１種類である必要はなく、２種以上を用いてもよい。更に、炭化水素鎖も同様に２種以上を用いてもよい。
【００１５】
以下、本発明の標的核酸の検出方法を段階ごとに説明する。
（ａ）まず、検査対象の核酸、２種類のプローブ及びヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる。
溶媒は、水であり、必要に応じて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（通常濃度：０〜５ｍＭ）、ＮａＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）、ＫＣｌ（通常濃度：０〜５０ｍＭ）等を含んでもよい。
溶媒中の、ヌクレオチド脂質の濃度は、１×１０−３Ｍ〜３×１０−２Ｍが好ましく、より好ましくは１．８×１０−３Ｍ〜１．８×１０−２Ｍである。
プローブの濃度は、同じ核酸塩基が連続する結合部分（ヌクレオチドＸのと塩基対を形成しうる塩基Ｙの１０〜１５０個から成る核酸部分）がヌクレオチド脂質（Ｒ−Ｘｎ）のＸｎに対して等量から２分の１になるような濃度が好ましい。従って、塩基配列により最適濃度は異なる。
検査対象の核酸の濃度は、プローブ濃度の等量から１０分の１程度の濃度が好ましい。核酸の濃度が不明な場合は、検査対象の核酸が含まれる溶液の紫外−可視領域の吸収スペクトル測定を行って、特定波長における吸光度（例えば、波長２６０ｎｍの吸光度）から濃度を求めておくことができる。
溶液の温度は、通常０℃以上で、用いる標的核酸の融解温度（核酸によるが、通常４０〜６０℃程度である。）以下の範囲である。
【００１６】
検査対象の核酸、２種類のプローブ及びヌクレオチド脂質を水溶媒に溶解させる場合に、これらを水溶媒に分散させる処理を行なうことが好ましい。即ち、ヌクレオチド脂質の水への分散を促し、プローブとヌクレオチド脂質とのハイブリダイゼーションを確実に解離させるためである。
このような分散処理として、水溶液を加熱することや、超音波照射を行うことなどが挙げられる。
水溶液を加熱する場合は、この水溶液を一旦８０℃以上（但し、水溶液の沸点以下）に加温する。加温状態におく時間は好ましくは約１０〜３０分である。
超音波照射を行う場合は、例えば、超音波洗浄機により超音波照射（振動周波数２５Ｈｚ〜５０Ｈｚ）する。超音波照射する時間は好ましくは３０〜６０分である。
このような処理の後で、常温に冷却しておくことが好ましい。常温への冷却は、通常室温に放置しておけばよい。
【００１７】
検査対象の核酸（以下単に「核酸」ともいう。）、２種類のプローブ（以下単に「プローブ」という。）及びヌクレオチド脂質を混合する順番に特に制限はないが、例えば、以下のような手順が好ましい。
（１）プローブ、ヌクレオチド脂質、核酸を全て水溶媒に溶解し、分散処理を行い、常温に冷却する。
（２）水溶媒にヌクレオチド脂質を加えて分散処理を行い、常温に冷却し、これにプローブと核酸を加えて混合する。
（３）水溶媒にプローブとヌクレオチド脂質を加えて分散処理を行ない、常温に冷却し、これに核酸を加えて混合する。
【００１８】
また、既に検査対象の核酸が溶解した溶液を検査する場合には、以下のような手順が好ましい。
（４）この溶液に、プローブ及びヌクレオチド脂質を加え、分散処理を行い、常温に冷却する。
（５）別途、水溶媒にヌクレオチド脂質を加え分散処理を行い、常温に冷却した溶液を用意し、上記核酸が溶解した溶液に、このヌクレオチド脂質が溶解した溶液とプローブを加えて混合する。
【００１９】
このような操作の結果、ヌクレオチド脂質とプローブが相補的核酸塩基対を形成し、プローブと標的核酸が相補的核酸塩基対を形成する。なお、プローブと標的核酸の結合は、これらと上記ヌクレオチド脂質との結合よりも強いため、ヌクレオチド脂質が、プローブと標的核酸との間の相補的核酸塩基対形成を阻害することはないと考えられる。
【００２０】
（ｂ）次に、この溶液を顕微鏡で観察して、これらの集合体の形状を観察する。
検査対象の核酸が標的核酸である場合には、プローブ、ヌクレオチド脂質及び標的核酸は、相互作用により、前駆体同士が寄り集まり、一定方向へ伸長しファイバーを形成する。このファイバーは通常径が５．０〜１０ｎｍ、長さが０．１〜３．０μｍである。最終的に、この分子集合体は規則性をもった構造となるため、顕微鏡により観察することができる。
検査対象の核酸が標的核酸でない場合には、ファイバーは検出されず、プローブ、ヌクレオチド脂質及び核酸の各形態（通常はサイズが１０〜１００ｎｍ粒子）が観察される。
顕微鏡は、上記のファイバーを観察できれば特に制限はなく、例えば、走査型プローブ顕微鏡、原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、水平力顕微鏡、化学力顕微鏡、磁力顕微鏡、フォースモジュレーション顕微鏡、高周波磁力顕微鏡、磁気抵抗感度マッピング、電気力顕微鏡、走査型静電容量顕微鏡、走査型広がり抵抗顕微鏡、トンネル原子間力顕微鏡、伝導原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、光学顕微鏡等を使用できる。
調製直後に顕微鏡観察してもよいが、混合溶液が標的核酸の融解温度以下に達し、かつ混合溶液が白濁してから観察することが好ましい。ハイブリダイズが起こり、ファイバー又は粒子状集合体ができると溶液全体が白濁するためである。
【実施例１】
【００２１】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
なお、薄層クロマトグラフィーのＲｆ値としては、クロロホルム／メタノール（容積比４／１）混合溶媒を展開溶媒としたときの値をＲｆ値とした。
製造例１
本製造例では、二価のヌクレオチド脂質を合成した。
ジクロロメタンに１，１８−オクタデカンジカルボン酸２．３ｇ（９．４ミリモル）、塩化チオニル３．３ｍｌ（２８ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１滴を加え、還流下で２時間加熱した。反応後、減圧下で溶媒を完全に留去して得られた酸クロライドを、テトラヒドロフランに溶解した。次に、テトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム０．５ｇ（１３ミリモル）を加え、−５０℃に保った。この溶液中に、先ほどの酸クロライド溶液をゆっくりと滴下した後、室温に戻し、還流下で３時間加熱した。その後２４時間室温で撹拌し、酢酸エチル、続いて飽和硫酸ナトリウム水溶液を気泡が発生しなくなるまで加えた。次に反応溶液を減圧下で溶媒を留去し、得られた固体をクロロホルムに懸濁して濾過し、ろ液を減圧下で留去した。得られた固体をヘキサン／酢酸エチル＝２／１の溶媒から再結晶し、白色の固体として１，２０−エイコサンジオール１．５ｇ（収率＝７４％）を得た。
【００２２】
この１，２０−エイコサンジオール０．１４ｇ（０．７ミリモル）と１Ｈ−テトラゾール０．２ｇ（３ミリモル）をテトラヒドロフランに溶解し、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシチミジン３’−Ｏ−[Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト]１．０ｇ（１．４ミリモル）を加えた。室温で２４時間かき混ぜた後、反応溶液中に７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド水溶液０．４ｍｌを加え、１時間撹拌した。その後、２８％アンモニア水溶液８ｍｌを加え、２４時間撹拌後、溶媒を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：クロロホルム／メタノール＝４／１）で精製した。カラム溶出液を減圧下溶媒留去し、得られた固体をクロロホルムに溶解し、トリフルオロ酢酸０．５ｍｌを加えて析出した固体をクロロホルムにより洗浄した後、クロロホルム／メタノール＝１／１溶液から再沈殿させることにより１，２０−（エイコサンジオキシ）ビス（３’−ホスファチジル−２’−デオキシチミジン）（ヌクレオチド脂質）０．２ｇ（収率３５％）を白色粉末として得た。
得られた化合物の物理的性質及び精密質量分析結果を次に示す。
融点：２３３℃（分解）  薄層クロマトグラフィーのＲｆ値＝０．６０（クロロホルム／メタノール＝１／１）  精密質量分析値（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ４０Ｈ６７Ｎ４Ｏ１６Ｐ２として）計算値：９２１．４０２７、実測値：９２１．４０２２
【００２３】
実施例１
図２に示すように、標的配列Ｔ（配列番号３）（ダイズレクチン遺伝子の塩基配列の一部、融解温度：５２℃（塩濃度５０ｍＭの条件下））を用意し、その１〜１１番目の塩基配列に相補的なＤＮＡの３’末端に、２０個のアデニンから成るＤＮＡを結合させたプローブＢ（ＰＢ）（配列番号２）と、その１２〜２１番目の塩基配列に相補的なＤＮＡの５’末端に、２０個のアデニンから成るＤＮＡを結合させたプローブＡ（ＰＡ）（配列番号１）を合成して用意した。また、比較のため、上記標的配列とは全く関係のない配列ＮＴ（配列番号４）（ダイズレクチン遺伝子の塩基配列の一部、融解温度：４３℃（塩濃度５０ｍＭの条件下））を用意した。
ＰＡ（１．６ｍｇ）及びＰＢ（１．５ｍｇ）を、それぞれ１５７ｍｍ３及び１３８ｍｍ３のバッファー水溶液で溶解した。一方、製造例１で得たヌクレオチド脂質４．６ｍｇ（５μｍｏｌ）をサンプル容器に計り取り、ＰＡ及びＰＢの水溶液を１３８ｍｍ３ずつ加え、９０℃以上に保った水浴中で３０分間放置し、溶解させた。得られた水溶液を室温下で放置したところ、数日後に水溶液は粘性の高いゲル状態となった。
このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、そこへバッファー水溶液（アプライドバイオシステムズ社、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ、ｐＨ＝８．０）１ｍｍ３を加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルａという。
同様に、このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、標的核酸Ｔ（１×１０−４ｍｏｌ／ｄｍ３）を含むバッファー水溶液を１ｍｍ３加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルｂという。
同様に、このゲル状の水溶液を１ｍｍ３取り、ＮＴ（１×１０−４ｍｏｌ／ｄｍ３）を含むバッファー水溶液を１ｍｍ３加え、２４時間以上放置した。得られた溶液をサンプルｃという。
【００２４】
サンプルａを１ｍｍ３取り、高配向熱分解グラファイト上に滴下した。これを数分間放置し、さらに１０ｍｍ３のミリＱ水（イオン交換水）を滴下し、すぐに濾紙で余分な水分を吸収し除去した。この操作を２回繰り返し、１０分以上室温で乾燥させたものをサンプルとし、原子間力顕微鏡（セイコーエスアイアイ・ナノテクノロジー社製、ＮａｎｏＮａｖｉシステム）によって観察した。サンプルｂ、サンプルｃについても同様に原子間力顕微鏡によって観察した。これらの原子間力顕微鏡写真を図３に示す。
サンプルａについては、高さ約１０ｎｍの円状又は楕円状の構造体が凝集したものが観察された。
サンプルｂについては、高さ約７ｎｍ、長さ数百ｎｍ〜数μｍのらせん状のファイバー構造が観察された。このらせんのピッチは５０〜６０ｎｍであった。
サンプルｃについては、楕円状又は円状の構造体が凝集したものが観察された。
すなわち、標的核酸を含む水溶液を加えたサンプルｂのみが、らせん状ファイバー構造を形成していることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
電気泳動やＤＮＡチップにより核酸を検出する場合、試薬や装置が高価であること、再現性の確認のため繰り返し実験と統計処理が必要であることなどから、現状では非常にコストがかかるため、実際にはまだ現場では使用されていない。本発明の核酸の検出方法は、従来法に比べ分析工程が簡便であり、走査型プローブ顕微鏡などの顕微鏡により構造を観察することで標的核酸を検出するため、危険物質の使用や核酸への化学修飾が必要ない。また、プローブと相互作用し分子集合体を形成させるヌクレオチド脂質（Ｒ−Ｘｎ）は、加熱、あるいは有機溶媒へ溶解させたり、カラム処理をすることによりプローブと解離させ、回収し、再利用することも可能である。従って、従来法と比較しコストを抑えることもできる。このため、様々な分野の遺伝子検出に用いることができる汎用性の高い方法である。例えば、病気に関わる遺伝子の検出においては医療分野、また遺伝子組み換え作物等に含まれる遺伝子の検出においては農業や食品分野への応用が期待できる。また、原子間力顕微鏡や電子顕微鏡などの原子分解能をもつ装置を使えば、極少量の標的核酸を検出できるため、現在核酸を分析する前によく行われているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）による核酸増幅過程を省略することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明で用いる各化合物を示す図である。
【図２】実施例で用いた各化合物を示す図である。ＰＡはプローブＡ、ＰＢはプローブＢ、Ｔは標的核酸、ＮＴは標的核酸Ｔとは全く関係のない配列を持つ核酸を示す。
【図３】実施例で調整した溶液の原子間力顕微鏡写真を示す図である。Ａはサンプルａ、Ｂはサンプルｂ、Ｃはサンプルｃを示す。
【図１】
0005176234.tif 000002
【図２】
0005176234.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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