(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13糖単位未満のオリゴ糖を含み、かつ、以下のステップ：
a)  番号l-1507の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを生じさせ、糖質の同化可能な源の好気性醗酵により、ソルビトールを含む水性の栄養培地中で培養し；
b)  上記ステップａ）の培養工程で得られたものから、形成された多糖を回収し；
c)  上記形成された多糖を、適度な加水分解に供し、ここで、グルコシド結合が切断され；
d)  ステップc)の加水分解産物を、少なくとも１つのエンドフコシダーゼを用いて実施される酵素的加水分解に供し；そして
e)  オリゴ糖混合物を回収した後に上記酵素を不活化することにより形成する、
を含む方法を用いて得られることを特徴とする非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖混合物。
【請求項２】
前記混合物の総重量に対して少なくとも15重量%の、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13糖単位未満のオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項1に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項３】
前記混合物の総重量に対して20〜50重量%の、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13糖単位未満のオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項４】
前記混合物の総重量に対して25〜45重量%の、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13〜24糖単位を有するオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項５】
前記混合物の総重量に対して15〜35重量%の、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む54糖単位超のオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項６】
前記オリゴ糖が、フコース-ガラクトース-ガラクツロン酸反復モチーフを少なくとも一部として含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項７】
前記エンドフコシダーゼが、Fermizyme HCP（登録商標）であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項８】
化粧用又は医薬として活性な物質として、請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴ糖混合物の少なくとも1つ、及び化粧用又は医薬として許容される賦形剤の少なくとも1つを含むことを特徴とする化粧用又は医薬組成物。
【請求項９】
皮膚病学的な組成物であることを特徴とする、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴ糖混合物が、前記組成物の総重量に基づき、0.001〜20重量%の比率で存在することを特徴とする、請求項8又は9に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖の新しい混合物、並びに特に老化防止製品、例えば医薬品及び獣医薬、より特に、化粧用製品中で、上皮又は結合組織に対する活性が求められる、主に局所適用産物におけるその使用に関する。
【０００２】  老化の間に、皮膚は、平均で10年ごとに約6%薄くなる(Skin thickness changes in normal aging skin, Bran-chet et al, Gerontology, 1990, 36: 28-35)。老化の根底にある機構は、内因性なもの、及び外因性なものである。内因性の機構は、細胞増殖の減少と皮膚細胞外マトリックス(CEM)の顕著な喪失を含む。この喪失は、老化による、CEM合成の低下、及び皮膚マトリックスを攻撃する可能性がある分解酵素の合成の増加の結果である(D.L.ROBERT: aging, CNRS, Belin, 1994; Docteur L. ROBERT: aging, facts and theories, DOMINOS, Flammarion, 1995)。原因であるプロテアーゼは、本質的にはマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)であり、多様なそれらの中のいくつか(例えば、セリン・プロテアーゼ)は、皮膚マトリックス、及び特に弾性線維の構成要素のほとんどを分解する。
【０００３】  ここ数年、皮膚の老化に特定の結果を防ぐ活性化合物を得る目的で、おびただしい数の調査研究が行われた。最初の目的の1つは、このプロセスをより遅くすることである。他の目的は、皮膚、主に真皮を厚くする効果を得ることである。
【０００４】  糖質及び多糖は、主にそれらの含水特性について、化粧品中で周知の化合物である。これは、例えば単糖フコース、及びそれを含んでいる多糖の場合である。
【０００５】  フコースは、ガラクトースに近いデオキシ-ヘキソースであり、立体配座を持つ。しかし、C6原子が第1級アルコール基(-CH2OH)でなくメチル基(-CH3)を持つという点で、フコースの構造は、本質的にガラクトースのそれと異なる。確かに、このメチル基が、フコースの分子に着目の部分的な疎水的性質を与え、この性質は、4の炭素原子上の他の原子の水酸基によって償われている。
【０００６】  特定の藻類及び菌類のオリゴ糖であるフコースは、系統発生の間で早く現れ、上記の特定の藻類及び菌類は、単独で又は他の化合物との組み合わせで、比較的に大量にそれらを含んでいる。同様に、それはフカン（fucanes）のような硫酸化形態で現われる。他方、フコースは、動物界の広範囲に存在し、そして特定のバクテリアで合成されもする。
【０００７】  しかし、フコース及びそれを含む多糖に関する相当の数の論文にもかかわらず、これまで成し遂げられた成果は、主に化粧用の製品における、産業規模の適用満足させるには程遠かった。
【０００８】  特に、単糖フコースの乏しいコスト/有効性の関係に加えて、フコースを含む既知の多糖は、先に記載のとおり、当業者が皮膚の老化と戦うことを可能にする顕著な活性を示さない。
【０００９】  こうして、例えば、フカンは、高分子量(>20 kD)を有する硫酸化重合体である。WO99/32099 (IFREMER)は、結合組織の損傷の修復の範囲内でのフカンの新しい用途を説明している。しかし、フカンは、それらのサイズ及び荷電が原因で効果的に皮膚の細胞層の全体と相互作用できない。さらに、逆に、フカンは、MMP-2を、つまり皮膚の正常な老化への化粧による処置(cosmetic treatment)に関するレドヒビトリー(redhibitory)特性を活性化することができる。
【００１０】  FR-2 750 863(L'OREAL)は、スケーリングを助ける、すなわち、表皮の角質層の表面にある「フライ(fly)」細胞の除去を助ける(3ページの6、及び7行目)、及び/又は表皮の再生を促進する、すなわち、表皮の再生を加速させる角質層の強制的な除去をもたらす(1ページの13〜23行目)、主に、フコースを含む多糖である、ポリホロシドの使用を記載し、これらの効果は、FR-2 750 863による皮膚の老化防止効果に類似した結果をもたらす。しかし、FR-2 750 863に記載の多糖は、その分子量及びその構造に関して、皮膚の種々の構成要素により満足な方法で当業者が統合することを許さない。
【００１１】  その後、全く予期しない、思いがけない方法により、皮膚の異なる構成要素に対して顕著な活性を示し、主に皮膚の優れた肥厚化によってはっきりと現れる真の老化防止の効果をもたらす、選ばれた微生物の特定の処置によって得ることができる、フコースを含むオリゴ糖の新しい混合物が発見された。
【００１２】  こうして、本発明は、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13糖単位未満のオリゴ糖を含み、そしてそれが微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae)からの多糖の少なくとも1ステップの分解を含むプロセスによって得ることができることを特徴とした非硫酸化にフコース・ベースのオリゴ糖混合物を提供する目的を持つ。
【００１３】  本発明による「非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖」に関して、当業者の一般的な知識に従って、当業者は、少なくとも1のフコース糖単位を含み、かつ、サルフェート基 -O(SO3)-を持たないオリゴ糖であると理解している。特に、フカンはこの定義から除外される。
【００１４】  本発明による「非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含むオリゴ糖」に関して、当業者の一般的な知識に従って、当業者は、上記オリゴ糖鎖の末端の位置に少なくとも1のフコース糖単位を含むオリゴ糖であると理解し、このフコース単位がアセタール型の結合によってオリゴ糖に続く次のオリゴ糖の次の糖単位と連結している。
【００１５】  以下の実施例に説明されるように、当業者に知られる技術を用いて、特にクロマトグラフィーHPLC技術を用いることによって糖単位の数を計測する。
【００１６】  好ましくは、本発明のオリゴ糖混合物は、上記混合物の総重量に対して、少なくとも15重量%、そしてより特に、及び好ましくは、20〜50重量%の、非還元の末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13糖単位未満のオリゴ糖鎖を含む。
【００１７】  より特に、本発明によるオリゴ糖混合物は、それが混合物の総重量に対して、25〜45重量%の、非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む13〜24の糖単位を持つオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする。
【００１８】  より特に、本発明のオリゴ糖混合物は、それが混合物の総重量に対して15〜35重量%の非還元末端の位置に少なくとも1のフコース単位を含む54糖単位超を持つオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする。
【００１９】  前記オリゴ糖混合物は、微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエからの多糖の分解のための少なくとも1のステップを含む方法を用いることにより得ることでき、好ましくは、上記オリゴ糖は、少なくとも一部にフコース-ガラクトース・ガラクツロン酸のモチーフを含む。
【００２０】  具体的には、上記オリゴ糖混合物は、以下のステップを含む方法によって得ることができる：
a)  微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを生じさせ、糖質の同化可能な源の好気性醗酵により水性の栄養培地中で培養し；
b)  醗酵に必須なもの(fermentation must)から、形成された多糖を回収し；
c)  形成された多糖を適度な加水分解に供し；
d)  ステップc)の加水分解産物を酵素的加水分解に供し；そして
e)  オリゴ糖混合物を回収した後に上記酵素を不活化することにより形成した。
【００２１】  より特に、これらのステップa)〜e)は、以下の方法で記載されうる：
ステップa)
好ましくは、我々は、番号1-1507の下でthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された微生物、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ、又はそれらの突然変異体を使用する。同時に、この微生物は、出願WO 96/23057に詳細に説明されている。
【００２２】  前記水性の栄養培地は、炭素、窒素、及び無機塩類の供給源を含む当業者に知られたあらゆる水性の培地であり、例えば出願WO 96/23057に説明されているものである。
【００２３】  前記醗酵は、およそ25℃〜35℃の温度で、約6.0〜7.5のpHで、好気的条件下で、かつ、撹拌しながら、2〜4日間実施する。
【００２４】  前記醗酵は、古典的な発酵槽中で、例えば約120℃の温度まで加熱することによるか、又はろ過滅菌することによって前もって滅菌された栄養培地への接種により行われる。
【００２５】  ステップb)
醗酵の期間の終わりに、醗酵に必須なものを回収し、そしてフコースに豊む多糖を以下の方法を用いてそこから単離する：
醗酵に必須なものを、特に約100〜約130℃、好ましくは約115〜約125℃の範囲の温度での、約30分〜約2時間、そして好ましくは約40分〜約1時間の間、そして特に約2〜約5.5、好ましくは約3〜約5.5の範囲のpHでの熱処理に供した。
【００２６】  熱処理産物を、プレートを用いた加圧ろ過器のような古典的な手段によりろ過する。
【００２７】  この方法により、我々は、全く細胞を含まない透明で、粘性のある多糖を得る。
【００２８】  次に、沈殿を、アルコール溶剤、好ましくはエタノール、イソプロパノール、及びそれらの混合物から選ばれるアルコール溶剤中で実施する。特に、我々は、約1〜約3.0容量の溶剤対1容量の多糖、そして好ましくは、約1.3〜約2.0容量の溶剤対1容量の多糖を使用する。
【００２９】  次に、我々は、粉末が得られるまで、特に約20〜約60℃、そして好ましくは、約30〜50℃の範囲の温度で減圧下で乾燥を行う。
【００３０】  ステップc)及びd)：多糖の加水分解
これは、ステップの必要不可欠な組み合わせである。実際に、我々は、好ましくはガンマ線の照射及び/又はプロトライシス(protolysis)による適度な加水分解のステップの組み合わせであり、古典的な加水分解、例えば酸性加水分解に類似し、我々が加水分解の十分に全体的な出力を有利に得ることを可能にし、しかし酵素的加水分解の特定の切断の利点を持つ、驚異的で、思いがけない方法を発見した。特に、無作為な性質などは統計的にレドヒビトリーな切断の獲得を導くので、古典的な酸性加水分解は、我々が本発明による特定のオリゴ糖混合物を得ることを不可能にする。さらに、古典的な酸性加水分解から得られた化合物は、生物学的に不活性であることが分かる。
【００３１】  ステップc)：多糖の適度な加水分解
適度な加水分解は、ガンマ線による処理、プロトリシス処理、又はこれら2つの連続する処理により実施される。好ましくは、我々は、ガンマ線、次にプロトリシス処理による処理を連続的に実施する。
【００３２】  ガンマ線による処理は、フリーラジカルの作用に起因する限られた分解により、粘性の顕著な低下を引き起こすことが分かった。それは、当業者に知られた照射手段により実施されうる。
【００３３】  非常に貫通性がある光線であるガンマ線による処理は、さらに、多糖の滅菌、つまり炎症を誘発するか又は肉芽腫を引き起こしさえする、存在する細菌の殺傷の利益を与える。この方法で、我々は、最終産物の生物製剤活性に好ましくない方法で妨げる防腐剤を培地に添加することなく細菌の攻撃を防ぐ。
【００３４】  それ故に、ガンマ線の照射を受けた、ステップb)で得られた多糖粉末を、同様にプロトリシス処理に供する。この目的のために、それを、水溶液の総重量に対して、特に1〜20重量%、好ましくは、2〜10重量%の割合で水溶液にする。
【００３５】  前記水溶液を、陽子発生樹脂、例えば商業化され、そして当業者に知られているもの、つまり水分子の固定によりグルコシド結合の切断を引き起こす陽子を発生する樹脂の存在下、熱処理、つまり1〜6時間の間、特に約75〜約120℃、好ましくは約90℃〜約100℃の温度で加熱する。
【００３６】  ステップd)：酵素加水分解
我々は、ステップb)で得られた加水分解物中に酸性緩衝物質、例えばクエン酸緩衝液(4.15 g/kg)-オリン酸水素ニナトリウム(約10.75 g/kg)を導入する。我々は、前記溶液の温度を特に約25〜約45℃、そして好ましくは約30〜約40℃の温度に調節する。
【００３７】  我々は、利用した多糖粉末の最初の重量に対して、特に約2〜約20重量%、そして好ましくは約5〜15重量%の含量に従って、少なくとも1のエンドフコシダーゼ、好ましくはGist Brocadesよって商業化されているFermizyme HCPを含む酵素製剤を導入する。
【００３８】  こうして得られた混合物を、緩衝混合物の存在により6にpHを調節し、特に約25〜約45℃、そして好ましくは約30〜約40℃の範囲の温度で、約8〜約24時間、そして好ましくは約10〜20時間の範囲で撹拌しながら維持する。
【００３９】  ステップe)
ステップd)の後に得られた加水分解産物を、古典的な手段、例えばプレート加圧ろ過器によりろ過する。
【００４０】  次に、前記酵素を、そしてより特にこの特異的酵素のフコシダーゼ活性を不活化するために、回収した溶液を、特に約75〜約120℃、そして好ましくは約90〜約105℃の範囲の温度で、約10〜約45分間、そして好ましくは約20〜35分間の範囲で熱処理した。
【００４１】  我々は、特に約20〜40℃の範囲の温度までそれに冷却する。
【００４２】  冷却中、防腐剤が溶液に添加されるかもしれない。
【００４３】  次に、我々は、無菌条件下で全体をろ過し、そして包装を行なう。
【００４４】  本発明によるこうして得られたオリゴ糖混合物は、当業者に周知の技術、特にHPLC、薄層、並びに他の方法及び化学物質用量のクロマトグラフィーを用いて特徴づけられうる。
【００４５】  この方法により、我々は、本発明によるオリゴ糖混合物が、フコースが主に非還元末端の位置で鎖の末端に存在することを調べることができる。
【００４６】  オリゴ糖混合物は、特に老化防止である化粧用の組成物中の、又は特に皮膚病学的(局所適用)である医薬医薬組成物中の活性混合物として特に好適である。特に、オリゴ糖のこの混合物で見つかった生物学的効果は、単糖フコースのそれに非常に類似し、そしてそれよりむしろ優れている。
【００４７】  こうして、本発明は、化粧用又は医薬として活性な物質として例えば前記の少なくとも1のオリゴ糖混合物、並びに化粧用又は医薬として許容される賦形剤を含むことを特徴とする化粧用又は医薬組成物を提供する目的を同様に有する。
【００４８】  前記組成物が医薬用である場合、それは、好ましくは局所適用のための皮膚病学的組成物であり、よってこの皮膚病学的適用にふさわしい少なくとも1の医薬用の賦形剤を有する。
【００４９】  前記化粧用又は医薬として許容される賦形剤は、化粧用又は医薬としての観点から組成物を改善するか、修飾するか、又は安定化させるために当業者に知られたさらなる他の成分を有する、クリーム、ローション剤、ゲル、軟膏などの形態、あるいはエマルジョンの形態において本発明による組成物を得る目的のために当業者に知られるいずれかのものである。
【００５０】  本発明によると、「医薬として許容される賦形剤」という表現は、組成物の獣医学の使用のために適合した賦形剤を含む。
【００５１】  本発明による組成物は、特に製剤への助けとしての他の添加剤、例えばフリーラジカルを防ぐための酸化防止剤を含むかもしれない。当業者は、特に純粋なビタミンE又はジ-アルファ-トコフェロールとその誘導体、そして2,6-ジ-テルト-ブチル-p-クレゾール(BHT)を引き合いに出すことができる。
【００５２】  有利には、本発明による組成物は、皮膚を構成する物質(例えば、スクアラン及びスフィンゴ脂質)、湿潤剤(例えば、グリセリン及びヒドロキシ・プロシランC)、皮膚軟化薬(例えば、ブチレン・グリコール及びセチル・ラクテート)、シリコン(例えば、シクロメチコン)、日焼け防止剤(例えば、Parsol 1789及びEusolex 6300)、乳化剤(特にトリエタノールアミン及び大豆レシチンに関連するCarbopol 1342)、増粘剤(特にキサンタンゴム)、捕捉剤(特にEDTA)、酸化防止剤(例えば、前記BUT)、香料、保存剤、水、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる少なくとも1の添加剤を特に含むかもしれない。
【００５３】  もちろん、本発明による化粧用又は医薬組成物を準備するための操作上の条件は、本技術分野の一般的な知識の一部である。
【００５４】  好ましくは、オリゴ糖混合物は、化粧用又は医薬組成物の総重量に対して、約0.001〜約20重量%、そしてより特に、及び好ましくは、約0.1〜約10重量%の範囲の割合に従って存在する。
【００５５】  しかし、あらゆる見解にとらわれることなく、本発明によるオリゴ糖混合物の、以下に挙げられた実施例で説明されている有利な活性は、特に、フコースの高度に利用可能なメチル基の疎水性官能基を介した細胞膜との相互作用のその非常に大きな能力から、並びに皮膚細胞、マクロファージ、又はランゲルハンス細胞のマンノース-フコース受容体とのその相互作用からもたらされる(Condaminet et al: Human epidermal Langerhans cells express the mannose-fucose binding receptor, Eur. J. Immuno. 1998, 28: 3541-3551)。一連のこれらの効果は、細胞の情報伝達を刺激する効果として特徴づけられうる。
【００５６】  こうして、本発明は、皮膚の細胞間の細胞の情報伝達を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有しもする。
【００５７】  他方では、本発明は、皮膚のケラチノサイトの細胞増殖を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有しもする。
【００５８】  さらに、本発明は、皮膚の繊維芽細胞の細胞増殖を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有する。
【００５９】  最後に、本発明は、先に記載のとおり、皮膚の繊維芽細胞によるエラスターゼ型のプロテアーゼの合成の抑制を意図した組成物の準備のためにオリゴ糖混合物を使用する目的を有する。
【００６０】  ヒトの皮膚の線維芽細胞は、様々なプロテアーゼを合成し、そのいくつかはエラスターゼ型の活性がある。これは、とりわけMMP-2及びMMP-9、並びに膜MMPについて言えることである。
【００６１】  低濃度(1〜2 mg/ml)のヒアルロナン(hyaluronane)を添加した線維芽細胞は、エラスターゼ型の活性を大幅に増加させる。驚いたことに、そして意外にも、我々は、本発明によるオリゴ糖混合物がこの刺激を抑えることを発見することができた。ヒアルロナンが細胞周囲の環境に絶えず存在するので、この抑制活性は老化による皮膚マトリックスの分解を減らすことを当業者に可能にすると考えられる。
【００６２】  こうして、本発明は、ヒアルロナンによって誘発されるプロテアーゼMMP-2及びMMP-9の過剰発現の抑制を意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を同様に有する。
【００６３】  より特に、本発明は、皮膚の繊維芽細胞によるプロテアーゼMMP-2及びMMP-9の合成の抑制を意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的をも有する。
【００６４】  他方では、MMPの活性が接触による感作の場合に極めて重要であることが最近示された(M.C. Lebre et al, Arcg. Dermatol. Res., 1999, 291: 447-452)。MMP阻害剤の存在下、接触による感作の時点の場合であっても、表皮のランゲルハンス細胞は真皮を通して移動することができない。この方法で、本発明によるオリゴ糖混合物によるMMP活性の抑制作用は、刺激に対する皮膚の感受性を減少させる真の効果を提供する。
【００６５】  従って、刺激に対する皮膚の感受性を減少させることを意図した組成物の作製のための、先に記載のオリゴ糖混合物の使用は本発明の目的でもある。
【００６６】  本発明によるオリゴ糖混合物は、表皮及び真皮の厚さを増加させる効果を達成することを当業者に可能にさせる。統計的に、これらの2つの効果は、非常に顕著である。皮膚の厚さが老化により減少する時、本発明によるオリゴ糖混合物のこの栄養効果は、皮膚の老化の予防に非常に重要である。
【００６７】  より特に、当業者は、本発明によるオリゴ糖混合物により処置した皮膚の真皮のコラーゲンの線維束の補強を観察しうる。皮膚の安定におけるこれらのコラーゲン線維束の役割の重要性を考えると、これは大きな抗老化効果である。
【００６８】  その結果、本発明は、真皮におけるコラーゲン線維の蓄積を刺激することを意図した組成物の作製のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的をも有する。
【００６９】  好ましくは、オリゴ糖混合物は、組成物の総重量に基づき、約0.001〜約20重量%、そしてより特に、及び好ましくは、約0.1〜約10重量%の範囲の割合に従って先に記載のとおり使用される。
【００７０】  こうして準備された組成物は、さらに化粧用又は医薬として(特に皮膚病学的に)許容された賦形剤、例えば当業者に知られたものをさらに含む。
【００７１】  最後に、本発明は、先に記載のオリゴ糖混合物の少なくとも1つを含む化粧用組成物を皮膚に適用することを特徴とする、皮膚の化粧による処置を提供する目的をさらに有する。前記化粧用組成物は、化粧用に許容される賦形剤、例えば当業者に知られるものをさらに含む。
【００７２】  以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、つまりその範囲を制限するものとして解釈されるべきでは全くない。
【００７３】  実施例1：本発明によるオリゴ糖混合物の準備
a)  醗酵
我々は、番号1-1507の下でthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された微生物、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを使用する。栄養培地及び他の醗酵条件は以下の通りである：
接種材料の準備：
培地：
Neosorb(登録商標) 70-07 (ソルビトール含量：70% M.S.；ROQUETTE FRERES, Lille/Franceにより販売)：17.90 g/l (すなわち、12.5 g/lのソルビトール)
Peptona Biokar 104003 (タンパク質加水分解物、SOLABIABIOKAR, Pantin, Franceにより販売)：- 4.50 g/l
酵母エキス：0.05 g/l
KH2PO4:1.50 g/l
K2HPO4：4.50 g/l
MgSO4,7H2O：0.20 g/l
Pluronic(登録商標) PE 61000 (消泡剤)、BASF、D-6700 Ludwigshafen, Germanyにより販売：0.50 g/l
水中で溶液状態にする
培養条件：
30分間、121℃で滅菌
培養温度：30℃
接種率：5〜10％
エアレーション：1 VVM
pH調整なし(pH約7.00)
培養継続時間：24時間
培地の製造：
培地
Neosorb(登録商標) 70-07：54.00 g/l (すなわち、38 g/lのソルビトール)
Peptona Biokar(登録商標) b 104003:4.50 g/l
酵母エキス：0.05 g/l
KH2PO4:1.50 g/l
MgSO4,7H2O：0.20 g/l
Pluronic(登録商標) PE 61000：0.50 g/l
水中で溶液状態にする
培養条件(350リットルの有効容量を持つChemap発酵槽)：
45分間、120℃で滅菌
培養温度：30℃
接種率：約5%
撹拌：300 rpm (Rushton型撹拌機)
エアレーション：1 VVM
NaOH 7Nにより7.0に調節したpH
圧力：100〜200 mbars
培養継続時間：60〜65時間
製造で達成された平均値：
サイクルの終わりの粘度：40000 MPa.s (粘度計：Brookfield DV-II+モデルLV、可動SP31、チャンバーSC4-34/13R、30℃)
L-フコースで計算した培地中の産生された多糖の濃度：
2g/l (Dische and Shettles法)
ソルビトール消費：(ソルビトールで) >35 g/l
20重量%でのNaOHの消費：15リットル/m3
pH調節の開始：発酵槽への接種後16〜17時間
醗酵培地の最終の乾燥抽出物〜20g /l
b)形成された多糖の回収
我々は、醗酵に必須なものを120℃の温度で45分間、そして5.5のpHで熱処理に供する。熱処理産物を、ザイツ型プレートによる加圧ろ過器の助けによりろ過する。この方法で、我々は、全く細胞を含まない透明で、粘性の多糖を得る。次に、我々は1.5容量のエタノール対1容量の多糖の状態で沈殿を実施する。そして、粉末が得られるまで25℃の温度で真空下、乾燥を行う。微生物を使用することを考ると、この多糖は三糖、フコース-ガラクトース-ガラクツロン酸の反復単位から構成され、よってそれは以下の構造体を示す：
【００７４】
【化１】
0005374675.tif 000002
【００７５】  c)  多糖の適度な加水分解
多糖粉末を、水性溶液の総重量に基づいて5重量%の割合で水性溶液の状態にする。前記水性溶液を、陽子発生樹脂の存在下で熱処理、すなわち100℃まで加熱し3時間に供する。
【００７６】  d)  酵素加水分解
我々は、加水分解物中に緩衝物質混合物、クエン酸(4.15 g/kg)-オリン酸水素二ナトリウム(約10.75 g/kg)を導入する。前記溶液の温度を37℃に調節する。我々は、使用した多糖粉末の総質量に対して、20重量%、すなわち、プロトリシスによる適度な加水分解について先に記載されたとおり、前記粉末を再び水中に入れた後の水溶液の総質量に対して0.05重量%の含量に従って、Gist Brocadesよって商業化された酵素製剤Fermizyme HCPを導入する。
【００７７】  こうして得られた混合物を、撹拌しながら、緩衝混合物の存在により6にpHを調節し、37℃の範囲の温度で、15時間維持する。
【００７８】  e)  前記酵素の不活化及びオリゴ糖混合物の回収
加水分解産物を、ザイツ型プレートを用いた加圧ろ過器でろ過する。次に、回収した溶液を、10℃で30分間熱処理し、前記酵素を不活化する。我々は、25℃の温度までこれを冷却する。それを冷却している間に、保存剤、フェノキシエタノール(1重量%)及びフェノニプ(phenonipe)(0.3重量%)を溶液に添加する。次に、全体を無菌条件下でろ過する。
【００７９】  こうして得られたオリゴ糖混合物を「混合物-1」と呼ぶ。
【００８０】  実施例2：混合物-1の特徴づけHPLC
実施例1で得られた混合物-1の分画を、その組成物のオリゴ糖及び多糖の割合を決定する目的のために実施した。
【００８１】  a)  カラム「XK 50/60 Superdex 75 prepgrade」を用いた予備の排除クロマトグラフィーによる分画
我々は、50 mlの、50 mg/mlに濃縮された混合物-1を予備カラム「XK 50/60 Superdex 75 prepgrade」(排除クロマトグラフィー)に通して、そして95の画分を回収し、次にHPLCに通した。
【００８２】
【表１】
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【００８３】  カラム「XK 50/60 Superdex 75 prepgrade」による混合物-1の分画の後に、95のフラクションを回収し、その45がオシド(osides)を含む。
【００８４】  b)  ultrahydrogel 120及びultrahydrogel 250カラムによるHPLC(排除クロマトグラフィー)によって得られた画分の特徴づけ
研究のこの第2部の目的は、これらの画分の構成要素の分子量と濃度を分析するためにHPLC排除カラム(Ultrahydrogel 120及び250カラム)に混合物-1の全95画分を通すことであった。
【００８５】  この研究のために、我々は、以下に記載のWatersHPLCシステムを用いて作業した。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】  c)  結果
表3に記載のFlukaの分子量の基準で得られた以下の方程式を用いることによって、調査した画分の構成要素の分子量が計算された：
成分の分子量=55290000*10^(-0.13942*X)
R2=0.982
X=溶出時間(分)
混合物-1の構成要素を含む最初の画分は、画分No.44で、最後のものは画分No. 89であり、それはわずかに高められた分子量の、同じ構成要素が89の画分が回収された後(89×12.5ミリリットル=1112.5ミリリットルの溶出後)に得られることを意味する。回収された画分は、モノ-、オリゴ-、及び約21kDaまでの184Da(単糖の混合物)の多糖を含む。従って、この画分は、平均117の単糖単位又は39の三糖単位により形成された多糖を含む。
【００８９】  画分No.77、78、79、81、82、83、84、85、及び86を除いて、ほとんどの画分が、単糖のピークを含む(分離は適用した分離法の感受性によって制限される)。
【００９０】  異なる画分のおおよその濃度は、高めた濃度のフコース基準の評価範囲を使用することによって決定されうる。この種の「単一成分」評価レンジを、検出システム(屈折計による屈折指数の計測)のおかげで使用することができた。これらの結果によると、1 ng/mlのフコースの溶液は、平均で、29409 (システムの任意の単位)の外見的なピークを得る。分析された外見的なピークが既知であるので、それらの見掛け上の濃度を計算することが可能だった。
【００９１】  達成された結果は、混合物-1が約26%の低分子オシド(2 kDaまで、約4つの三糖単位)、約36%のオリゴ糖(4 kDaまで、8つの三糖単位)、及び約23%の10 kDaより高い分子量の多糖 (18の三糖単位)を含むことを示す。
【００９２】  混合物-1の準備のために使用される微生物及び特定の酵素(エンドフコシダーゼ)を考えると、混合物のオリゴ糖が非還元末端の位置にフコース単位を含むように思われる。
【００９３】  実施例3：ヒトの皮膚マトリックスのメタロプロテアーゼ活性に対するフコースの活性、及び混合物-1の活性
ここで、我々は、静止状態又はヒアルロナンによって刺激された状態の線維芽細胞のマトリックス・メタロプロテアーゼ(又はMMP)活性に対する前述の実施例1で作製された単糖フコース、及びオリゴ糖混合物「混合物-1」の効果を調査するために計画する。ヒト皮膚線維芽細胞の単層の細胞培養からだけでなく、皮膚のそれに最も近い細胞環境における異なる処理の効果を調べるために外植片の培養からも試験を実施した。実際、真皮の線維芽細胞は、インビボにおいて豊富な細胞外マトリックスにより囲まれており、従って、外植片の培養は上記細胞の天然環境を再構成する培養の種類であり、よって、我々が生理学的な条件に近い条件において線維芽細胞のMMP活性に対する処理効果を調査することを可能にする。
【００９４】  a)  方法
a.1)  皮膚外植片の培養
a.1.1)  不刺激皮膚の外植片のMMP活性
54歳の女性の腹部の皮膚からの外植片を、フェノールレッドを含まないDMEM (GIBCO)中、異なる処理を伴い48時間の37℃で撹拌しながら培養した。サンプルを10μg/mlの濃度で処理した。
【００９５】  サンプルの回収：
細胞外の媒体-1 mlの培地
細胞内の媒体-1 mlのMMP緩衝物質中でultraturaxにより外植片を挽いたもの
MMP緩衝液組成：
0.1 MのTris-HCl, pH 7.5、0.1 MのNaCl、10 mMのCaCl2、1 mMの酢酸亜鉛0.01%のBrij 35、0.01%のNaN3
ザイモグラフィー(zymography)
MMP-sの基質であるゼラチンを、1 mg/mlの終濃度で10%のポリアクリルアミドのゲルと共同重合させた。皮膚外植片の培養からの細胞外培地を、ゲルの上部に堆積させ、150ボルトで電気泳動を実施した。次に、このゲルをMMP緩衝液中、撹拌しながら37℃で24時間インキュベートした。次に、このゲルをクーマシー・ブルーにより着色し、その後蒸留水で脱色した。MMP活性に対応する範囲は、白く見え、一方、ゲルのバックグラウンドは青かった。タンパク質の移動距離の関数により、我々は、ゼラチンを消化している酵素の分子量を決定しうる。MMP活性を、Visiolabコンピュータを用いた形態計測解析によって定量化した。
【００９６】  a.1.2)  12 mg/mlのヒアルロナンにより刺激した皮膚の外植片のMMP活性
調査のプロトコールは、不刺激皮膚外植片のMMP活性の調査のために使われたものと同じであるが、培地に添加した12 mg/mlの濃度のヒアルロナン、及び10μg/mlの濃度のオリゴ糖サンプルを伴う。
【００９７】  a.2)  皮膚線維芽細胞の培養
a.2.1)  不刺激皮膚の線維芽細胞のMMP活性
45歳の女性の腹部の皮膚からの皮膚線維芽細胞を、1%の抗生物質及び抗真菌薬、並びに10%のウシ胎仔血清を含むDMEM Glutamax (GIBCO)中で7代目の細胞の継代まで培養し、そして実験に使用した。線維芽細胞を1ウェルにつき5.104細胞の密度で6ウェル・プレートに蒔いた。集密の時点で、前記培地を、0.1%のBSA、及び 10 μg/mlの濃度で処理されるべき異なる物質を含むフェノールレッド不含DMEM培地と交換した。37℃での24時間の培養(5% (v/v)のCO2、95% (v/v)の空気)の後にサンプルを回収した。
【００９８】  細胞外の媒体-1 mlの培地+0.25 mlのPBSによる2回のすすぎ液
細胞内の媒体-1 mlのMMP緩衝物質により超音波処理した細胞層(cellular carpet)
MMP緩衝液の組成：
0.1 MのTris-HCl, pH 7.5、0.1 MのNaCl、10 mMのCaCl2、1 mMの酢酸亜鉛0.01%のBrij 35、0.01 %のNaN3
皮膚外植片の培養の場合のように、線維芽細胞の培地をザイモグラフィーにより調査した。
【００９９】  a.2.2)  1 mg/mlのヒアルロナンにより刺激した皮膚の線維芽細胞のMMP活性
調査のプロトコールは、不刺激皮膚の外植片のMMP活性の調査のために使われたものと同じであるが、培地に添加した1 mg/mlの濃度のヒアルロナン、及び10μg/mlの濃度のオリゴ糖サンプルを伴う。
【０１００】  b)  結果
b.1)  皮膚外植片のMMP活性
MMP-sは、酵素原、つまり不活性な形態で分泌された酵素である。それらの活性化はタンパク質分解による開裂によって達成され、そしてこの酵素の活性型は、細胞外マトリックスの化合物を分解する。従って、MMP-sの発現レベルだけでなく、インビボにおいて細胞外マトリックス分解だけを可能にする、と同時に上記酵素が潜在型を活性化することができる、活性型で存在するMMPの割合を知ることも重要である。従って、結果を、酵素の活性型/不活性型の関係の形で示し、そして証明に関係するパーセンテージを、MMPの活性割合を減少させる、あるいは不活性型の活性化を抑えるためのその能力についてのフコース及び混合物-1の有効性を示すために計算した。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】  これらの結果を、図1に棒グラフの形で同様に示した。
【０１０３】  フコースと混合物-1は、酵素の活性型/不活性型の関係を減少させることができる。この現象は、MMP-2よりMMP-9に関してさらに重要である。この関係の減少は、その結果インビボにおいて細胞外マトリックスを分解しうる活性酵素の量が、皮膚外植片をフコース又は混合物-1の存在下で培養した場合、重要ではないことを示唆する。
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】  これらの結果を、図2に棒グラフの形で同様に示した。
【０１０６】  皮膚外植片の培地中のヒアルロナンの存在は、MMP-sの活性型の増加を引き起こす。フコース及び混合物-1は、この増加を減らして、その結果、活性酵素の放出の刺激を抑えることができる。
【０１０７】  b.2)  線維芽細胞のMMP活性
線維芽細胞を単層で培養した場合、広く分泌されるMMP-2だけが目に見えるが、しかしながら存在する非常に少量のMMP-9を伴う。MMP-2酵素の不活性型だけが放出される。
【０１０８】
【表６】
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【０１０９】  これらの結果を、図3の棒グラフに同様に示す。
【０１１０】  我々は、フコース及び混合物-1がMMP-2の発現を減少させることを観察しうる。混合物-1は、この表現の減少に関してフコースより有効であるように思われる。
【０１１１】
【表７】
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【０１１２】  c)  結論
フコース及び混合物-1が、ヒト皮膚の線維芽細胞によるMMP-2及びMMP-9の合成、並びに活性化を減少させうることがこれらの実験から裏付けられる。同様に、より効果的な様式で、フコース及び混合物-1は、ヒアルロナン存在下のメタロプロテアーゼの過剰発現を遮断することができる。老化の間の皮膚の細胞外マトリックスの分解におけるこれらのメタロ-エンドペプチダーゼの重要な役割を考慮すると、これは大きな老化防止の効果である。
【０１１３】  実施例4：ヒト皮膚線維芽細胞に対するフコース及び混合物-1の活性
この調査の目的は、細胞の情報伝達の独特の指標、及びヒト皮膚の線維芽細胞の老化を防ぐ作用の1つ、すなわち：ヒトの皮膚の線維芽細胞の細胞増殖の刺激に対する実施例1の混合物-1の作用を分析することであった。
【０１１４】  a)  方法論：細胞増殖の調査
この調査で使用したヒト皮膚の線維芽細胞は、20歳の女性の切除した皮膚から生じる(26回継代)。この細胞を、12ウェル・プレートを用いて10%のウシ胎仔血清(SVF)、1%の抗生物質と抗真菌薬(PSF)、及び1 μCi/mlの[3H]-チミジン(ICN)を含むDMEM培地中で72時間、各々のサンプルについて2つの最終の濃度：1μg/mlと10 μg/mlを有する試験すべき産物の存在下で培養した。
【０１１５】  サンプルの存在下、温室(stove) (5% (v/v)のCO2、95% (v/v)の空気)内における37℃での72時間の培養の後に、PBSにより細胞を4回洗い、そして細胞層を0.05%のトリプシンで分離させた。次に、1点のサンプルにつき3 mlのシンチレーション液体を加え、そして細胞中に取り込まれた放射活性を、シンチレーションを用いてコンピュータにより読み取った。
【０１１６】  b)結果：細胞増殖に対する作用
試験された2点のサンプル(1 μg/mlと10 μg/mlの濃度)を伴う線維芽細胞の72時間のインキュベーションは、不刺激細胞(以下の表8を参照のこと)に比べて細胞増殖を顕著に促進した。
【０１１７】
【表８】
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【０１１８】  実施例5：老化防止クリーム
【０１１９】
【表９】
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【０１２０】  実施例6：老化防止クリーム
【０１２１】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  皮膚の外植片によって分泌されたMMP-2及びMMP-9に関係する活性形態/不活性形態を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例3.b.1において示された結果を報告する棒グラフである。
【図２】  ヒアルロナンによって刺激された皮膚の外植片によって分泌されたMMP-2及びMMP-9に関係する活性形態/不活性形態を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例3.b.1において示された結果を報告する棒グラフである。
【図３】  皮膚の外植片のMMP-2発現を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例3.b.2において示された結果を報告する棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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