(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト及び非ヒト動物を含む動物における経皮的エレクトロポレーション装置であって、
前記動物の表皮下に存在する標的組織に対して配置される一対の電極であって、一方の電極は、前記標的組織を覆う表皮表面に配置可能なプレート状電極であり、他方の電極は、前記標的組織又はその近傍に穿刺して配置可能な互いに平行な２本以上のニードルを備えるニードル状電極であり、前記プレート状電極と前記ニードル状電極とは前記標的組織を対向して挟持可能である前記一対の電極と、
前記一対の電極間に方形波の電圧パルスを印加可能なパルス発生部と、
を備える、装置。
【請求項２】
さらに、把持して開閉可能な一対の脚部を有するホルダーであって、前記脚部の各先端に前記プレート状電極と前記ニードル状電極とをそれぞれ有するホルダーを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ニードルは、前記核酸コンストラクトを含む液体が通過可能な中空部と開口とを備える、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記パルス発生部は、前記一対の電極に５０Ｖ以上７０Ｖ以下の電圧を印加可能である、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記核酸コンストラクトによって皮下疾患の治療をする皮下疾患治療用である、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記標的組織は固形腫瘍を含み、前記皮下疾患は固形腫瘍である、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記遺伝子は、血管内皮増殖因子遺伝子であり、前記疾患は、血管新生阻害によって進行抑制、改善又は治療が可能な疾患である、請求項５又は６に記載の装置。
【請求項８】
非ヒト動物の作製方法であって、
前記非ヒト動物の皮下の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項１〜７のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入する工程、
を備える、方法。
【請求項９】
治療剤の探索方法であって、
ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、
該非ヒト動物の表皮下の生体組織の細胞内に対して、請求項１〜７のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて、前記非ヒト動物において所定の遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを導入する工程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記非ヒト動物における病態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
治療剤の探索方法であって、
非ヒト動物の表皮下の標的組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項１〜７のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、
この非ヒト動物に化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。
【請求項１１】
創薬のための標的化合物の探索方法であって、
非ヒト動物の表皮下の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを請求項１〜７のいずれかに記載の経皮的エレクトロポレーション装置を用いて導入する工程と、
前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーション（electroporation:電気穿孔法）により生体に導入する技術及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞にＲＮＡ干渉により遺伝子の発現の抑制を引き起こす核酸コンストラクトを導入することにより、細胞内において所望の遺伝子の発現を抑制する試みが行われている。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制は、各種疾患の予防又は治療への適用が期待されており、生体へのこうした核酸の有効な導入手法やＲＮＡの安定化などが試みられている。【０００３】
例えば、アテロコラーゲンを用いた標的組織へのデリバリー法が既に開示されている（Y. Takeiら、CANCER RESEARCH 64, 3365-3370, MAY 15, 2004）。このデリバリー法により、マウスにおいて高い抗腫瘍効果が認められている。アテロコラーゲンは、ｓｉＲＮＡと複合体を構成した状態で組織に投与されるため、細胞への取り込み効率が高まるとともにｓｉＲＮＡが安定化されるものと考えられている。
【発明の開示】
【０００４】
ｓｉＲＮＡ等の核酸コンストラクトによってＲＡＮ干渉を発現させるにあたっては、細胞への導入効率が最も重要である。アテロコラーゲンは生体適合性に優れるマトリックスであり、アテロコラーゲンによるデリバリーシステムは徐放性の向上と生体内安定性（持続性）の向上への寄与が大きい反面、生体内への細胞への導入効率という面からみるとまだ改善の余地がある。したがって、アテロコラーゲンによる核酸コンストラクトのデリバリー法は、必ずしもＲＮＡ干渉を利用した各種の態様の遺伝子サイレンシングに十分な方法ではなかった。また、できるだけ核酸コンストラクトをnakedな状態で導入することも望まれている。
【０００５】
現在までに、エレクトロポレーションによりプラスミドＤＮＡの生体組織への導入が試みられており、in vivoでの遺伝子産物の発現に成功している。一方、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの各種細胞に対するデリバリーは、その手法により大きく遺伝子発現抑制効果が異なることが知られている。また、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を発現する核酸コンストラクトをエレクトロポレーションによって導入することによりin vivoで遺伝子サイレンシングを実現したことは確認されてはいない。
【０００６】
そこで、本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを生体に導入するための有効な技術及びその利用を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、表皮経由で表皮下近傍の標的組織に効果的に前記核酸コンストラクトを導入するための技術及びその利用を提供することを他の一つの目的とする。
【０００７】
本発明者は、遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより生体内に導入することにより、前記生体において遺伝子サイレンシングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明の一つの態様によれば、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の制御方法であって、前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの存在下、前記動物の生体組織に対して配置される前記エレクトロポレーション装置の電極に電圧を印加する工程、を備える、方法が提供される。
【０００９】
この態様においては、前記核酸コンストラクトは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドから選択することができる。また、前記核酸コンストラクトは、前記動物においてＲＮＡ干渉を発現可能な核酸コンストラクトとすることもできる。さらに、前記核酸コンストラクトは、ｓｉＲＮＡであることが好ましい。核酸コンストラクトがｓｉＲＮＡのとき、修飾により血清中での安定性が向上されていることが好ましく、前記核酸コンストラクトは、ヒト血清中での半減期が５０時間以上であることが好ましい。なお、この半減期とは、安定化されていない同一構成の核酸コンストラクトが、ヒト血清中における半減期が２時間以内のときの半減期である。
【００１０】
また、この態様においては、前記核酸コンストラクトは、血管新生を促進する遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉を発現可能なコンストラクトであることが好ましい。こうした遺伝子として、例えば、血管内皮増殖因子遺伝子が好適な遺伝子である。
【００１１】
さらに、この態様においては、前記生体組織は固形腫瘍を含むことができる。さらにまた、この態様においては、前記生体組織は表皮又は表皮下に存在する組織とすることができる。
【００１２】
本発明の一つの態様によれば、前記電極に電圧を印加するのに先立って若しくは印加後又は同時に、前記生体組織又はこれらの近傍に生分解性マトリックス材料を供給する工程を備えることが好ましい。また、前記電圧印加工程は、前記核酸コンストラクトを前記生体組織又はその近傍に供給した後又は供給しつつ前記生体組織に対して配置される前記電極に電圧を印加する工程とすることができる。
【００１３】
さらにまた、この態様においては、前記電極は少なくとも一つのプレート状電極を備えることもできるし、前記電極は、１本又は２本以上のニードル状電極を備えることもできるし、さらに、このニードル状電極には、前記核酸コンストラクトを含む液体が通過可能な中空部と開口とを備えることもできる。また、前記エレクトロポレーション装置は対極となる電極としてプレート状電極とニードル状電極とを備えることもできる。
【００１４】
本発明においては、前記プレート状電極は前記核酸コンストラクトを導入しようとする生体組織の表面に対して配置し、前記ニードル状電極は前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することもできる。また、前記生体組織は皮下固形腫瘍であり、前記プレート状電極は、前記皮下固形腫瘍を覆う表皮表面に当接して配置し、前記ニードル状電極は、前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することもできる。さらに、前記電極に印加する電圧は５０Ｖ以上７０Ｖ以下とすることもできる。
【００１５】
本発明の別の一つの態様によれば、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の制御方法であって、前記動物においてＲＮＡ干渉を発現可能なｓｉＲＮＡの存在下、前記動物の表皮下の罹患組織の下部に配置されたニードル状電極と前記罹患組織を覆う表皮表面に配置されたプレート状電極とに対して所定の電圧を印加する工程、を備える、方法が提供される。この態様においては、前記動物はヒトであり、前記罹患組織は血管新生阻害によって進行抑制、改善又は治療が可能な組織を含んでいることが好ましい態様である。
【００１６】
また、本発明のさらに別の一つの態様によれば、非ヒト動物の作製方法であって、前記非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程、を備える方法が提供される。この態様においては、前記核酸コンストラクトは、疾患関連遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉を発現可能な核酸コンストラクトであることが好ましい態様である。
【００１７】
さらにまた、本発明の別の一つの態様によれば、非ヒト動物の作製方法であって、ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程、を備える方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の一つの態様によれば、治療剤の探索方法であって、ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記モデル動物における病態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備える、方法が提供される。
【００１９】
本発明の別の一つの態様によれば、治療剤の探索方法であって、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、この非ヒト動物に１種又は２種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備える、方法が提供される。
【００２０】
さらに、本発明の別の一つの態様によれば、創薬のための標的化合物の探索方法であって、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する工程と、を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】エレクトロポレーション装置の一例を示す図。
【図２】核酸コンストラクトをエレクトロポレーションによって生体組織の細胞内に導入する操作フローの例（ａ）〜（ｄ）を示す図。
【図３】エレクトロポレーション装置を用いて核酸コンストラクトを導入する操作の一例を示す図。
【図４】ｈＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡ（ＣＤＳ）に対するｓｉＲＮＡの標的部位配列を示す図。
【図５】各種ｓｉＲＮＡの構造を示す図。
【図６】各種ｓｉＲＮＡによるＰＣ−３細胞におけるｈＶＥＧＦ−Ａ発現の抑制効果を示す図。
【図７】安定化ｓｉＲＮＡ、非修飾ｓｉＲＮＡ及びこれらのスクランブルｓｉＲＮＡによるＰＣ−３細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ発現の抑制効果を示す図。
【図８】ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションによる抗腫瘍効果（治療効果）を示す図。
【図９】治療開始４０日目の腫瘍の外観写真（ａ）〜（ｄ）を示す図。
【図１０】腫瘍内微小血管密度をＣＤ３１をマーカーとして用いた安定化ｓｉＲＮＡ投与群及びスクランブル配列を有する安定化ｓｉＲＮＡ投与群の免疫化学的染色像を示す図。
【図１１】実施例６におけるｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションによる抗腫瘍効果（治療効果）を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一つの態様としてのヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の制御方法は、前記動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトの存在下、前記動物の生体組織に対して配置される前記エレクトロポレーション装置の電極に電圧を印加する工程、を備えることを特徴としている。この方法によれば、前記動物の生体組織に配置される電極への電圧に印加により、生体組織を構成する細胞表面が穿孔され、細胞内に核酸コンストラクトが導入可能な状態となる。核酸コンストラクトは細胞内に導入された際、所定の遺伝子の発現を抑制することができる。【００２３】
また、本発明の他の一つの態様としての非ヒト動物の作製方法は、前記非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程、を備えることを特徴としている。この方法によれば、前記生体組織の細胞内にエレクトロポレーションにより核酸コンストラクトが導入されることにより、その細胞内において遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物が取得される。【００２４】
また、本発明のさらに他の一つの態様としての治療剤の探索方法は、ヒトの疾患モデルとして成立可能な病態、遺伝子変異又は生体組織若しくは細胞の表現型を有する前記非ヒト動物を準備する工程と、該非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記モデル動物における病態又は前記生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備えることを特徴としている。この探索方法によれば、細胞内に前記核酸コンストラクトが導入され、遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物における病態等を解析することにより、核酸コンストラクトの前記疾患に対する有効性を容易に評価することができる。この結果、所定の疾患の治療や予防に有用な核酸コンストラクトをスクリーニングすることができる。【００２５】
さらに、本発明のさらに他の一つの態様としての治療剤の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物において遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、この非ヒト動物に１種又は２種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析する工程と、を備えることを特徴としている。この探索方法によれば、前記非ヒト動物における病態等を解析することにより、前記化合物の前記疾患に対する有効性を容易に評価することができる。この結果、所定の疾患の治療や予防に有用な薬剤をスクリーニングすることができる。【００２６】
さらにまた、本発明の他の一つの態様としての創薬のための標的化合物の探索方法は、非ヒト動物の少なくとも一部の生体組織又は細胞に存在する１種又は２種以上の疾患関連遺伝子を標的として遺伝子の発現を抑制可能な核酸コンストラクトを、エレクトロポレーションによって前記生体組織又は細胞に導入する工程と、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析する工程と、を備えることを特徴としている。この探索方法によれば、前記生体組織又は細胞の表現型を解析することにより前記疾患関連遺伝子の発現抑制によって活性化若しくは発現量が増大する化合物や不活性化又は発現量が低下する化合物を見出すことができる。こうした化合物又はその化合物の活性を阻害剤は、前記疾患を予防又は治療する薬剤のための標的化合物となりえ、本発明の探索方法によれば、創薬のための新たな標的化合物を提供して前記疾患の予防や治療に有用な薬剤のスクリーニング系を提供することができる。【００２７】
これら本発明のいずれの態様においても、前記核酸コンストラクトはエレクトロポレーションにより動物の生体組織の細胞に導入される。さらに、エレクトロポレーションの電極の少なくとも一つとしてニードル状電極を用いることで、表皮経由で表皮下近傍の標的組織に対して効果的に核酸コンストラクトが導入される。【００２８】
本発明を拘束するものではないが、本発明者が見出した、ＲＮＡ干渉を発現する核酸コンストラクト等がエレクトロポレーションにより生体組織の細胞内に導入されることで良好な発現抑制効果を発揮する現象は、エレクトロポレーションによる導入効率、核酸コンストラクト分子の大きさ（分子のストークス径）等が関与しているものと推論される。まず、第一に、エレクトロポレーションは、極めて短時間で細胞内へと核酸コンストラクトを導入できるため、従来であれば細胞内に導入するまでに分解されてしまうであろう核酸コンストラクトが細胞内に導入されることで導入時点において高い核酸コンストラクトの細胞内濃度が達成され、それにより予想外の発現抑制効果が発揮されていると考えられる。したがって、ＤＮＡコンストラクトの他、一般的に不安定とされるｓｉＲＮＡ等のＲＮＡコンストラクトなど比較的低分子の核酸コンストラクトであっても高い発現抑制効果が得られると考えられる。【００２９】
また、エレクトロポレーション法によれば、細胞膜が電気的に穿孔されるのであるが、こうした電気的刺激による穿孔部分とｓｉＲＮＡなどの低分子の核酸コンストラクトに親和性が高いかあるいはこうした核酸コンストラクトが従来の一般的なＤＮＡ発現ベクター等に比較して小さい分子であるために容易に通過できたことが考えられる。本発明者らによれば、通常、電気穿孔法により細胞膜に孔（ｐｏｒｅ）が形成された場合、そのｐｏｒｅ径と導入される分子の径にある一定の平衡状態の関係が構築されると推論している。すなわち、例えば、分子量１０００程度の低分子化合物は、ｐｏｒｅを通過して細胞に導入されやすいが、この反応は平衡反応であるため、導入された低分子化合物は、同時に細胞外へ出やすいという不利益をあわせ持つ。ｓｉＲＮＡ（分子量約１３０００）などの低分子の核酸コンストラクトは、ほどよい分子量（分子径）をもち、電気穿孔により一たび細胞内に導入されれば、細胞外へ出にくいという利点を備えている。こうした傾向は、細胞レベルでのエレクトロポレーションよりも生体組織に対するエレクトロポレーションにおいてより顕著であると考えられる。【００３０】
さらに、コラーゲン等のマトリックスを核酸コンストラクトと共存させることで、核酸コンストラクトを導入しようとする細胞又は組織近傍に核酸コンストラクトを高濃度に維持できることが考えられ、これにより、効率的に核酸コンストラクトが導入されたものと考えられる。【００３１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、本発明の上記した各種態様について説明する。【００３２】
（エレクトロポレーション装置の制御方法）
（ヒト及び非ヒト動物）
本発明のエレクトロポレーション装置の制御方法は、ヒト及び非ヒト動物を含む動物におけるエレクトロポレーション装置の使用に関連している。本明細書において非ヒト動物とは、ヒト以外の霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等の動物を包含している。哺乳類としては、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物が挙げられる。魚類としては、ゼブラフィッシュ、メダカなどが挙げられる。特に、疾患モデルや研究用としては、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタ、ゼブラフィッシュ、メダカなどが好ましく用いられる。なお、本発明におけるヒト及び非ヒト動物は、胚、胎生及び生後個体のいずれの状態も包含するが、本発明の制御方法のほか、非ヒト動物の作製方法、治療剤の探索方法、創薬のための標的遺伝子の探索方法等においては、生後の個体を用いることが好ましい。【００３３】
（生体組織）
本発明の制御方法は、こうした動物の生体組織に配置されたエレクトロポレーション装置の電極に電圧を印加する。動物の生体組織としては、特に限定しない。後述するように生体組織に配置される電極の形態を選択すること及び電極の配置のための生体組織の切開等の処置の採用により、動物の表皮近傍のみならず、内部の生体組織の全てを対象とすることができる。電圧の印加を経皮的に行うことを考慮すれば生体組織は表皮又は表皮下（表皮直下あるいはその近傍）であることが好ましい。このような部位であれば、電極の少なくとも一部がニードル状などであって表皮に侵入可能な形態であれば、容易にこうした部位に電圧を印加することができる。例えば、経皮的に導入操作のしやすい生体組織としては、膝などの各種関節が挙げられる。関節は、表皮直下にあるとともに体外へ突出している点からも好ましい。その他、歯周組織などの口腔内も好ましい。なお、電極形態によっては血管などを介して経管的に到達できる生体組織も好ましい。また、内視鏡手術の手法により経口、経肛門又は経膣的若しくは経腹腔的な手法によって電極を配置可能な生体組織も好ましい。【００３４】
また、生体組織としては固形腫瘍を含む組織であることが好ましい。エレクトロポレーション装置によれば、固形腫瘍細胞内に核酸コンストラクトを導入できるからである。特に、本方法によれば、表皮直下又はその近傍の固形腫瘍に対しては経皮的な治療が可能となる。【００３５】
（エレクトロポレーション装置）
本発明におけるエレクトロポレーション装置としては、一般的なエレクトロポレーション装置を利用できる。図１には、エレクトロポレーション装置２の一例を示す。エレクトロポレーション装置２は、本体４と、本体４にケーブル１４とホルダー１２とを介して接続される電極部材２０を備えることができる。本体４にはパルス発生手段５を備えることができる。パルス発生手段６は、ケーブル１０及びホルダー１４内を挿通する導線を介して電極１０ａ、１０ｂに電圧を印加することができる。パルス発生手段６としては、一般交流電源を用いて電気パルスとしてＡＣ（交流）パルス、エクスポネンシャルパルス、ＤＣ（直流）パルスなどを印加できるものが知られている。特に限定しないが、ＤＣパルスを印加できるものが好ましい。パルス波形としては、方形波が好ましい。方形波は、セットされた電圧まで急激に上昇し所定時間（パルス長）だけその電圧を維持し、再び急激に０値にまで降下する波形である。より好ましくはこうした方形波を１秒間に複数回、好ましくは９９回までの周期で印加できるパルス発生手段を用いる。なお、ここで一周期とは、パルスのオン時間とオフ時間との時間和をいう。【００３６】
なお、本体４には、インピーダンス測定手段８を備えることもできる。インピーダンス測定手段８は、パルス印加前又はその後において電極１０ａ、１０ｂ間のインピーダンス（抵抗値）を測定することができる。【００３７】
本装置２は、本体４のパルス発生手段６に電気的接続される少なくとも一対の電極１０ａ、１０ｂを備えることができる。図１に例示する電極１０ａは、長方形状のプレート状の導体（例えば白金）であり、電極１０ｂは、３本のニードル状体が整列して全体としてフォーク状を形成して、電極１０ａに対向するように配置されている。こうしたプレート状電極は、表皮、粘膜、器官及び臓器などの生体組織、すなわち、核酸コンストラクトを導入しようとする生体組織に当接させて用いることが好ましい。電極１０ｂの３本のニードル状体は、３本がほぼ同様に緩やかに屈曲して、皮下の生体組織に侵入させやすくなっている。なお、本発明において用いることのできるニードル状電極は、1本又は２本以上のニードル状体で構成されていればよい。また、複数本のニードル状体の配列状態は特に限定しないが、例えば、互いに平行に一列又は複数列に整列させることができる。こうしたニードル状電極は、核酸コンストラクトを導入しようとする生体組織又はその近傍に穿針して用いることが好ましい。【００３８】
本発明においては、プレート状電極とニードル状電極とを用いるとともに、プレート状電極は核酸コンストラクトを導入しようとする生体組織の表面に対して配置し、ニードル状電極は前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することができる。こうすることで、生体組織に核酸コンストラクトを導入しやすい電流量を容易に確保でき、核酸コンストラクトを確実に導入することができるようになる。また、生体組織が皮下固形腫瘍であるときには、プレート状電極は、皮下固形腫瘍を覆う表皮表面に当接して配置し、前記ニードル状電極は、前記生体組織又はその近傍に穿刺して配置することもできる。こうすることで、安定して皮下固形腫瘍を保持でき、この結果、核酸コンストラクトを確実にかつ効率的に導入することができるようになる。【００３９】
さらに、プレート状電極を表皮に当接させるとともにニードル状電極を表皮下の固形腫瘍等の標的組織下に配置することにより、表皮下の組織に対して効果的に核酸コンストラクトを導入することができる。特に、表皮を介した場合には、通常、電流量がバラツキやすくしかも低下しやすいが、表皮下の生体組織に対して電極をこのように配置することによって、相対的に低い電圧であってもコンストラクトに十分な電流量を供給して導入効率を確保するほか、処置の低侵襲性を向上させることができる。【００４０】
本発明者らによれば、後述する実施例で形成した固形腫瘍に対してプレート状電極とプレート状電極との組み合わせ（固形腫瘍を挟むように保持）で通電した場合に比して、プレート状電極とニードル状電極との組み合わせ（固形腫瘍の底部にニードル状電極を差し込むとともに固形腫瘍の上部にプレート状電極を配置して挟むようにして保持）を用いた方が、十分な電流量を確保できることを確認している。すなわち、プレート状電極とニードル状電極（特に２本以上のニードル状電極が整列されたもの）を用いること又は標的細胞を含む生体組織に対してその表面とその内部とに対して電極を配置することにより、生体組織に意図した電流量を安定して供給できるという利点があるといえる。意図した電流量の安定した供給は、エレクトロポレーションによる核酸コンストラクトの安定かつ確実な導入を実現するために有利である。【００４１】
なお、電極１０ａ、１０ｂはこうしたプレート状電極とニードル状電極の組み合わせに限定するものではない。また、本発明において用いる電極の組み合わせは、例えば、双方がプレート状電極または１本または２本以上のニードル状体を備える電極であってもよい。また、電極は一対である必要はなく、１個又は２個以上の正極と１個又は２個以上の陰極との組み合わせとしてもよい。さらに、プレート状電極のプレート部の形状は、円形状、楕円状、正方形状等各種の形態を採ることができる。さらにまた、ニードル状電極を採用する場合には、その内部に液体が流通可能な流路を設けるとともにその先端に排出口を設けることができる。この場合、例えば、ニードル状電極の流路に注入用シリンジの先端を接続するなどして流路に対して核酸コンストラクトを含む液体を供給可能に構成することで、核酸コンストラクトを生体内に注入後直ちにあるいは注入しつつ電圧を印加することが可能となる。これにより、核酸コンストラクトが標的部位から拡散するのを抑制することができる。【００４２】
こうした電極１０ａ、１０ｂは、ホルダー１２とケーブル１４とを介してパルス発生手段６に接続されていることが好ましい。ホルダー１２は、片手で把持して開閉可能な一対の脚部１２ａ、１２ｂを有し、その各先端に電極１０ａ、１０ｂを備えることができる。ホルダー１２の一対の脚部１２ａ、１２ｂの基端部からは先端に端子１４ａ及び１４ｂを有するケーブル１４が固定されていてもよい。ホルダー及びケーブル１４内には電極１０ａ、１０ｂにそれぞれ接続される導線が挿通しており、ケーブル１４の先端側においてこれらの導線の端部が端子１４ａ、１４ｂとされてパルス発生手段６に電気的に接続されていてもよい。以上のようにして、本装置２においては、電極１０ａ、１０ｂ、ホルダー１２及びケーブル１４は、本体４に対して交換可能な電極ユニット（部材）２０を構成することができる。後述するように、こうした電極１０ａ、１０ｂを備えるエレクトロポレーション装置２は、ヒト及び非ヒト動物の生体組織（特に皮下組織）への核酸コンストラクトの導入装置及び遺伝子発現抑制装置並びに核酸コンストラクトによる治療装置（特に皮下の固形腫瘍等の皮下疾患部位の治療装置）として用いることができる。また、こうした電極１０ａ、１０ｂは、同様に、ヒト及び非ヒト動物の生体組織（特に皮下組織）への核酸コンストラクトの導入装置及び遺伝子発現抑制装置並びに核酸コンストラクト用の治療用電極（皮下の固形腫瘍等など特に皮下における疾患部位の治療用電極）として用いることができる。【００４３】
（核酸コンストラクト）
本発明における核酸コンストラクトは、遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。本明細書において遺伝子の発現を抑制するとは、遺伝子等をコードするＤＮＡとのハイブリダイズなどの相互作用により転写を阻害するアンチジーン核酸法、ｍＲＮＡなどのＲＮＡとのハイブリダイズなどの相互作用により転写又は翻訳を阻害するアンチセンス核酸法、ｍＲＮＡなどの転写物とのハイブリダイズ等の相互作用に基づいて転写物を分解又は翻訳を阻害するＲＮＡ干渉法、デコイ核酸法、リボザイム法等によるものが挙げられる。なお、遺伝子発現を抑制するものではないがアプタマーをエレクトロポレーションにより導入することもできる。また、核酸コンストラクトとしては、前駆体マイクロRNA（miRNA）や成熟miRNAなどのmiRNAやその作用を制御する小RNA分子を含んでいる。ここに、本明細書において「核酸」とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用語には、一本鎖（ＤＮＡ又はＲＮＡ、センス又はアンチセンス）又は二本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が包含される。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（二本鎖）やＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド（一本鎖）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチドも包含される。さらにまた、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が施されていてもよい。なお、本明細書において「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡによってその配列特異的に標的遺伝子のｍＲＮＡなどの転写産物を分解するか又は翻訳を阻害する現象を意味するものとする。ＲＮＡ干渉によれば、結果として標的遺伝子の発現を抑制することができる。ここで標的遺伝子の発現を抑制するとは、標的遺伝子がコードするｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳されるのを抑制し又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下することを意味している。【００４４】
標的遺伝子としては、特に限定しない。疾患の予防又は治療のための遺伝子、機能解析が必要される遺伝子などであってもよい。例えば、固形腫瘍等の治療目的には、ガン細胞によって放出され血管新生を誘導する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を始め、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、アンジオゲニンなどの血管新生を誘導する物質やガン細胞の増殖を促進する上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などをコードする遺伝子を標的遺伝子とすることができる。これらの血管新生関連遺伝子を標的とすることにより腫瘍特異性が高く福作用が抑制された治療が可能となる。また、血管新生に起因する各種の疾患の予防又は治療が可能となる。【００４５】
なかでもＶＥＧＦは強力な血管新生作用を持つことから、ＶＥＧＦ遺伝子はガン治療の標的遺伝子として非常に有用である他、ガン以外のＶＥＧＦ過剰発現をその主病因とする疾患、例えば眼内血管新生病（糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など）、動脈硬化症などの治療の標的遺伝子とすることができる。また、ＶＥＧＦは分子量約２２，０００のサブユニットが二量体を形成する構造を持ち、血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成を促進し、個体レベルでの血管新生・血管透過性の亢進を起こす。また、組織因子やプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ：ＰＡ）などの凝固系・線溶系因子の産生亢進、マトリックス・メタロプロテイナーゼやＰＡ受容体の発現などの亢進を誘導し、血管基底膜を分解する（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７７，５２７−５４３，１９９９）。また、ＶＥＧＦはＶＰＦという別名が示す如く、血管透過性を亢進する。ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ）はａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇにより、５個のサイズの異なるアイソフォーム（すなわちＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８９，ＶＥＧＦ２０６：下付の数字は構成アミノ酸数を示す）として存在することが知られている（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１９４７−１１９５４，１９９１）。ＶＥＧＦを産生している細胞は、何種類かのサブタイプを同時に産生している。通常、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５が優位であるが、ＶＥＧＦ１８９も多くの細胞で発現が観察されている。このようなａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇによって生合成される５種のＶＥＧＦサブタイプの遺伝子の１又は２以上を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡなどの核酸コンストラクトもまた有用である。また、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＬＧＦ（placenta growth factor）を標的とすることもできる。以上のことから、本発明の核酸コンストラクトは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＬＧＦなどを含むＶＥＧＦファミリーを標的とすることができる。さらに、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３等のＶＥＧＦＲファミリーの遺伝子を標的としてもよい。他のガン関連遺伝子としては、変異したｐ５３遺伝子やｅｚｈ２遺伝子などが挙げられる。【００４６】
また、標的とする生体組織が腫瘍組織（特に、皮下腫瘍組織）である場合には、腫瘍内部は、血管新生が活発であり血管透過性の高いことから、標的遺伝子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生を促進する血管新生関連遺伝子とする核酸コンストラクトを用いることが好ましいが、こうした組織においては、血管透過性も高くしかも水分が多いため、エレクトロポレーションによる核酸コンストラクトが好ましい。特に、後述するプレート状電極及びニードル状電極との組み合わせによれば、腫瘍組織近傍にニードル状電極を刺し込むために、こうした血管透過性や高水分により電流量が安定的にしかも容易に確保することができるため、効率的な核酸コンストラクトの導入が可能となる。【００４７】
標的遺伝子としては、核酸コンストラクトを導入しようとするヒト及び非ヒト動物の内在性遺伝子でなくてもよい。例えば、ウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療目的には、ＲＮＡウイルス中のＲＮＡ配列を標的とすることができる。例えば、ＨＩＶ−１ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルスなどのＲＮＡ配列を標的とすることができる。なお、こうしたウイルス感染疾患においては、ウイルス増殖に必要な内在性因子をコードする遺伝子も標的遺伝子としてもよい。【００４８】
また、炎症性疾患関連遺伝子も標的遺伝子とすることができる。例えば、炎症性疾患関連遺伝子としてはＩＬ−１（α及びβ）、ＩＬ−６、ＩＬ−４等が挙げられる。これらは、リウマチや慢性関節等の炎症性疾患に関連している。特に、体外から経皮的に導入操作がしやすいという観点から、こうした関節の炎症性疾患の関連遺伝子を標的とすることは本発明において効果的である。また、別の炎症性疾患関連遺伝子としては、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎疾患関連遺伝子であるＴＮＦα遺伝子及びＴＮＦα受容体ファミリーの遺伝子などが挙げられる。本発明によれば、皮膚炎疾患に対しても経皮的な導入操作が容易である。【００４９】
さらに他の標的遺伝子としては、抗アポトーシス関連遺伝子も挙げられる。抗アポトーシス関連遺伝子は、癌の発症や進行に関連する癌遺伝子である。こうした遺伝子としては、ｂｃｌ−２遺伝子を始めとする、ｂｃｌ−ｘ、ｂｃｌ−ｗ、ｍｃｌ−１、ｂｆｌ−１／Ａ１、ｂａｘ、ｂａｄ、ｂｉｋなどのｂｃｌ−２ファミリー遺伝子が挙げられる。特に、ｂｃｌ−２遺伝子を標的とすることが好ましい。ｂｃｌ２−遺伝子を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡは、例えば、特開２００５−１３１９９に記載されている。【００５０】
ＲＮＡ干渉を発現可能な核酸コンストラクトは、こうした標的遺伝子のｍＲＮＡ等の転写産物の少なくとも一部を標的としてこれら標的遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。こうした核酸コンストラクトの一つの態様は、互いにハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチドの二本鎖構造を有するＲＮＡコンストラクトである。すなわち、裸の（Naked）ＲＮＡである。具体的には、突出した３’末端をそれぞれ有するあるいは有しない比較的短い二本鎖オリゴリボヌクレオチド（small interfering RNA ：ｓｉＲＮＡ）及びヘアピン構造を形成する（又は有する）単一のオリゴリボヌクレオチド（short hairpin RNA : ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。これらのＲＮＡコンストラクトは、直接ＲＮＡ干渉を引き起こすことができる点において好ましい。また、ヘアピン構造を形成しない一本鎖オリゴヌリボヌクレオチドのＲＮＡコンストラクトもＲＮＡ干渉を発現することができる。【００５１】
ｓｉＲＮＡは、ターゲット配列に対応するセンス配列及びアンチセンス配列を有しており、これらセンス配列及びアンチセンス配列が一定長さでハイブリダイズして二本鎖構造を形成している。すなわち、センス配列及びアンチセンス配列は所定長さで対合する二重鎖をそれぞれ有している。なお、センス配列とアンチセンス配列は互いにハイブリダイズするが、一部において不対合部分を有していてもよい。例えば、センス配列において１又は数個のミスマッチ塩基及び／又は塩基欠損を有していてもよい。ｓｉＲＮＡにおけるセンス配列及びアンチセンス配列は、突出する３’末端を有していてもよいし、有していなくてもよい（ブラントエンドタイプ）。オーバーハングを有する場合、オーバーハングする３’末端側はｍＲＮＡ上の標的配列に対するセンス配列の一致性及びアンチセンス配列の相補性は必ずしも必要ではない。【００５２】
ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にターゲット配列に対応するセンス配列を５’側に、アンチセンス配列を３’側に有し、これらは一定長さで対合してステムを形成し、これらの配列間にヌクレアーゼによるプロセッシングを受ける部位を有するループ部位を有している。このため、ｓｈＲＮＡは、細胞内においてプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡとなる。ｓｉＲＮＡについて説明したように、ｓｈＲＮＡから誘導されるｓｉＲＮＡのオーバーハング部位に相当するセンス配列及びアンチセンス配列においても標的配列との一致性及び相補性は必須ではない。【００５３】
本態様の核酸コンストラクトにおけるセンス配列及びアンチセンス配列が対合する二重鎖の長さは、ＲＮＡ干渉効果が得られる限り特に限定しないが、好ましくは５０塩基対以下であり、典型的には１３〜２８塩基対であることが好ましく、より好ましくは１３〜２７塩基対の範囲であり、さらに好ましくは１９〜２１塩基対である。最も好ましくは、１９又は２０塩基対である。また、二重鎖を形成しない３’側構造を含めたセンス配列及びアンチセンス配列は、典型的には１５〜３０ｎｔであることが好ましく、より好ましくは１５〜２９ｎｔの範囲であり、さらに好ましくは２１〜２３ｎｔである。最も好ましくは、２１又は２２ｎｔである。また、ｓｉＲＮＡにおいて突出する３'末端は、２〜４ｎｔ
であることが好ましく、より好ましくは２ｎｔである。さらに、ｓｈＲＮＡにおけるループ部位は、こうした態様の二重鎖（ｓｈＲＮＡにおいてはステム）及び３’末端構造を形成し維持するのを妨げない程度のループ部位の長さを備えていればよい。【００５４】
この態様の核酸コンストラクトの標的遺伝子のターゲット配列は、例えば、以下のようなルールを適宜適用して決定し、適当なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを設計することができる。
（１）標的する遺伝子のＣＤＳにおいてＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ、ＡＡ（Ｎ２１）、ＮＡ（Ｎ２１）等となる配列をターゲットとする（ｓｉＲＮＡとしてはこれらの配列の第３〜２１塩基の１９塩基を使用する）、
（２）転写因子の結合部位を避けるためスタートコドンから下流５０〜１００塩基以上下流側とする、
（３）標的ｍＲＮＡの予想される二次構造を確認して立体障害により結合しにくい部位を避ける、
（４）ＢＬＡＳＴ等によるホモロジーサーチによって他の遺伝子と相同性のない配列を選択する、
（５）ＧＣ含量を５０％前後（特に、４７〜５２％）とする、等である。
なお、この他ターゲット配列の決定方法を含むｓｉＲＮＡの設計方法は、http://design.rnai.jp/sidirect/index.php、http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.htmlやRational siRNAdesign for RNA interference （Nature Biotechnology , vol. 22, 326 - 330 (2004), Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe,William S Marshall & Anastasia Khvorova）、Improved and automated prediction ofeffective siRNA(Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL.)等公開された各種のルールを適宜適用して行うことができる。【００５５】
例えば、ヒトＶＥＧＦのｍＲＮＡ（GenBANKアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６、Leung,D.W.etal.:Science,246,1306-1309,1989;Keck,P.J.et al.:Science,246,1309-1312)）の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡとしては、例えば、特開２００４-３１３１４１に示す＃１〜＃４のＶＥＧＦｓｉＲＮＡが挙げられる。これらの各ｓｉＲＮＡにおいては、センス配列及びアンチセンス配列はそれぞれ３’末端側に２ｎｔのオーバーハング部位を有している。なお、これらのｓｉＲＮＡのターゲット配列は、ＡＡおよびＣＡのいずれかを５’末端側に有するターゲット配列よりＧＣ含有量が４５〜５５％の２１塩基の候補配列１４種を選択し、「ＧＣの偏り」が比較的少ない配列７種に候補を絞り、さらにこの７種について、ＢＬＡＳＴサーチによる類似配列の検索を行い、類似配列の少ないターゲットを選択し、かつその近傍の二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ないと想定できたものである。【００５６】
このような核酸コンストラクトは、ホスホアミダイト法など公知のポリリボヌクレオチドの化学合成方法により合成することができる。また、in vitro転写法を用いて合成してもよい。例えば、こうしたポリリボヌクレオチドをコードするＤＮＡを合成し、このＤＮＡに対して、ＰＣＲ法を利用してＴ７ＲＮＡプロモータなどのＲＮＡプロモータ配列を有するプライマーを用いるとともにＤＮＡポリメラーゼを用いて転写用二本鎖ＤＮＡテンプレートを合成し、この転写用二本鎖ＤＮＡテンプレートに対してＲＮＡポリメラーゼを利用してin vitro転写反応を実施することもできる。こうすることで、所望の一本鎖ＲＮＡを得ることが出来る。ｓｉＲＮＡの場合には、こうして得たアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとをハイブリダイズさせて二本鎖ＲＮＡを作製し、適宜末端をＲＮａｓｅ等で分解して、得られた二本鎖ＲＮＡを精製することによりｓｉＲＮＡを得ることができる。また、ｓｈＲＮＡの場合には、センス配列とアンチセンス配列と、さらにこれらの配列間に各種の塩基特異的ＲＮａｓｅによってトリミングされるループ配列とを備える一本鎖ＲＮＡを作製し、センス配列とアンチセンス配列とをアニールさせて得ることができる。こうして得たｓｈＲＮＡのループ配列を塩基特異的ヌクレアーゼで処理してｓｉＲＮＡを得ることもできる。なお、in vitro転写法はこれに限らず各種の方法が知られているとともに、商業的に入手可能な各種のin vitro転写キットを用いて実施することができる。【００５７】
ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどのＲＮＡコンストラクトとしては、ヒト血清中での半減期が３０時間以上、好ましくは５０時間以上、より好ましくは６０時間以上、さらに好ましくは８０時間以上のＲＮＡコンストラクトを用いる。こうした核酸コンストラクトを用いることにより、ＲＮＡ干渉の効果を容易に持続させることができ、投与回数を低減することができる。なお、ここでいう半減期とは、同じヒト血清中において安定化されてない非修飾の同一のＲＮＡコンストラクトの半減期が２時間以内のときの半減期をいうものとする。こうした安定化されたこの種のＲＮＡコンストラクトは、ポリヌクレオチドのいずれかの部分にヌクレアーゼ耐性のための各種公知の修飾基を備えることもできる。こうした修飾としては、例えば、３’オーバーハング部位を分解に対して安定化させることができる。例えば、これらが、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように、選択することができる。また、２’ヒドロキシル基の欠如により、組織培地中の突出部のヌクレアーゼ耐性が有意に増強される。また、この種の核酸コンストラクトは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、標的特異的活性、例えば、ＲＮＡ干渉の媒介活性が実質的に影響を受けない位置、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端の領域内に配置することができる。特に、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、突出部を安定化させることができる。好ましいヌクレオチド類似体は、糖または骨格鎖修飾リボヌクレオチドから選択する。しかし、核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基ではなく、下記のように天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチドも好適である。すなわち、天然に存在しない核酸塩基としては、５位置で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどである。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、Ｈ、ＯＲ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮからなる群より選択される基で２’ＯＨ基を置換するが、ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。好ましい骨格鎖修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホジエステル基を、例えば、ホスホロチオエート基の修飾基で置換する。【００５８】
核酸コンストラクトのもう一つの態様は、上記の態様のＲＮＡコンストラクト、すなわち、sｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを発現可能にコードするベクターの態様である。こうした態様の核酸コンストラクトは、継続性のあるＲＮＡ干渉を実現できる点において好ましい。この態様において、ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、アンチセンス配列及びセンス配列の他ループ配列を、細胞内転写によりｓｈＲＮＡを構築可能な連続した一本鎖ＲＮＡが転写されるように構成することができる。また、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、所定のセンス配列及びアンチセンス配列を有するＲＮＡが転写されるように構成すればよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいては、センス配列及びアンチセンス配列は単一のベクターによって発現されるようにしてもよいし、また、それぞれ異なるベクターから発現されるようにしてもよい。【００５９】
こうした発現ベクターに用いるプロモータとしては、上記各ＤＮＡより対応するＲＮＡを産生し得るものであれば、ｐｏｌＩＩ系、ｐｏｌＩＩＩ系のいずれであってもよい。このｐｏｌＩＩＩ系のプロモータとしては、例えば、Ｕ６プロモータ、ｔＲＮＡプロモータ、レトロウイルス性ＬＴＲプロモータ、アデノウイルスｖａ１プロモータ、５ＳｒＲＮＡプロモータ、７ＳＫ ＲＮＡプロモータ、７ＳＬ ＲＮＡプロモータ、Ｈ１ ＲＮＡプロモータなどが挙げられる。ｐｏｌＩＩ系プロモータとしては、サイトメガロウイルスプロモータ、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ＲＳＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、β−アクチンプロモータ、γ−グロブリンプロモータ、ＳＲαプロモータなどを挙げることができる。【００６０】
発現ベクターは、プラスミドベクターやウイルスベクターの形態を採ることができる。ベクターの種類は特に問わないで、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。【００６１】
こうした発現ベクターの態様を採る核酸コンストラクトは、商業的に入手可能なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ作製用に構築されたベクターやそれらのプロトコールや実験医学別冊改訂ＲＮＡｉ実験プロトコール（羊土社、２００４年１０月１日発行）等に基づいて容易に構築することができる。【００６２】
なお、核酸コンストラクトは、アンチジーン核酸、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はリボザイムであってもよい。アンチジーン核酸は、ＤＮＡと相補的な塩基配列を有し、ＤＮＡと２本鎖又は３本鎖を形成することによりＤＮＡにコードされる遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ又はＲＮＡである。また、アンチセンス核酸は、任意のＲＮＡ（ゲノムＲＮＡ及びｍＲＮＡ）と相補的な塩基配列を有し、これらと２本鎖を形成することによって該ＲＮＡにコードされる遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制するものをいう。アンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り必ずしも標的配列に対して完全に相補的でなくてもよいし、修飾した塩基などを用いてもよい。通常、設計すべきアンチセンス核酸配列の長さは、遺伝子の発現を阻害し得る限り特に限定されるものではないが、例えば１０〜５０塩基、好ましくは１５〜２５塩基である。デコイ核酸（ＲＮＡ）は、例えば、任意の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するＲＮＡであって、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものである。また、リボザイムとは、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断して、このタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイム  は特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、FEBS Letter, 228; 228-230(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。【００６３】
（核酸コンストラクトの導入）
次に、こうした核酸コンストラクトを、エレクトロポレーション装置を用いて生体内の細胞に導入する操作及びエレクトロポレーション装置の制御について説明する。図２には、この操作のフローの例を示す。図２には、電圧印加のタイミングやマトリックス材料の添加形態の異なる４種類のフローを示している。図２（ａ）及び（ｂ）は、核酸コンストラクトの標的組織への供給及び到達後に電圧印加するフローを示し、図２（ｃ）及び（ｄ）は、核酸コンストラクトの標的生体組織への供給及び到達に伴って電圧印加するフローを示す。なお、これら操作フローは説明の容易化のために明示したが、これら４種のフローに示す操作を組み合わせて用いてもよい。また、これらの４種のフローの一部分を組み合わせて用いてもよい。【００６４】
核酸コンストラクトは、電圧の印加に先立って予め又は電圧の印加と実質的に同時に生体組織に供給される。核酸コンストラクトは、どのような形態で標的となる生体組織に供給してもよい。例えば、注射、注入、鼻咽頭吸入、皮膚吸収、経口等で可能である。核酸コンストラクトは全身に供給してもよいし、局所的に供給してもよい。静脈注射や経口等にて核酸コンストラクトを投与した場合には、好ましくは標的となる生体組織にデリバリーされるシステムを用いることが好ましい。また、核酸コンストラクトの供給には、表皮の切開等を伴う外科的手法を用いてもよいし、経皮経管的手法を用いることもできる。さらに、内視鏡的手法を用いることもできる。【００６５】
核酸コンストラクトは、標的となる生体組織の周囲に供給してもよいし、その内部に供給するようにしてもよい。また、電圧の印加方向を考慮してより多くの核酸コンストラクトが生体組織方向に移動するような箇所に供給してもよい。こうした核酸コンストラクトの具体的供給部位は、電極形態や標的組織との関係で適宜設定される。【００６６】
核酸コンストラクトは、適当な媒体を伴って生体組織に供給されることが好ましい。例えば、注射や注入による場合には、所定の緩衝液や生理的食塩液などの生体適合性のある媒体を用いることできる。また、局所に注入する場合には、電圧印加以前に核酸コンストラクトが生体組織から拡散するのを抑制するために、血管収縮剤などを媒体に含めるか又は別個に供給してもよい。さらに、経口、鼻咽頭吸入、皮膚吸収等による場合には、そうした投与形態の製剤形態に準じた媒体を用いることができる。【００６７】
また、核酸コンストラクトは、生体組織において生分解性マトリックスを形成可能なマトリックス材料とともに供給されてもよい。こうしたマトリックス材料が生体組織に存在することで、核酸コンストラクトの分解を抑制できるとともに、供給箇所からの核酸コンストラクトの拡散を抑制して、エレクトロポレーションにより導入効果を高めることができる。生体組織において生分解性マトリックスを供給可能なマトリックス材料としては、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、ペクチン酸、アガロースおよびこれらの誘導体などの多糖類、あるいはゼラチン、アテロコラーゲンなどの各種コラーゲン（コラーゲンのタイプおよびその抽出法はいずれでもよい）などの生体高分子系材料が挙げられる。また、感熱応答性ポリマー、ポリ乳酸グリコール酸などのポリ乳酸系ポリマーなどのポリマーのほか、マトリゲル（日本ＢＤ社製、商標）、プルロニック（ＢＡＳＦジャパン社製、商標）なども用いることができる。【００６８】
こうしたマトリックス材料としては、コラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲンとしては、可溶性コラーゲン又は可溶化コラーゲンを用いることができる。「可溶性コラーゲン」としては、酸性あるいは中性の水または塩を含有する水に可溶であるもの等が挙げられる。「可溶化コラーゲン」としては、例えば、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。【００６９】
コラーゲンの由来は特に問わないで、脊椎動物から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換え体を用いることができる。例えば、哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体を用いることができる。コラーゲンはＩ型〜Ｖ型までの種類があるが特に限定しないで用いることができる。なかでも、哺乳動物の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲンまたはそれらの遺伝子組換体が挙げられる。より望ましくは、例えば、仔牛の真皮から酸抽出した１型コラーゲン、遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンなどが挙げられる。遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンとしては仔牛の真皮由来またはヒトの真皮由来のものが好ましい。また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましく、１分子あたりチロシン残基が３以下であるアテロコラーゲンがより好ましい。【００７０】
コラーゲンをマトリックス材料として用いる場合、例えば、０．００１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下程度とすることができる。好ましくは、０．１ｖ／ｖ％以上５ｖ／ｖ％以下程度であり、より好ましくは、１．５ｖ／ｖ％以上３．７５ｖ／ｖ％以下程度である。【００７１】
なお、こうした生分解性マトリックス材料は、図２（ｂ）及び（ｄ）のフローに示すように、核酸コンストラクトと実質的に同時に生体組織に供給するほか、図２（ａ）及び（ｃ）のフローに示すように、核酸コンストラクトとは別個に、核酸コンストラクトの生体組織への供給到達に先立って当該生体組織に供給されてもよい。さらに、図２（ａ）及び（ｃ）のフローに示すように、核酸コンストラクトの生体組織への供給又は到達後にマトリックス材料を当該部位に供給してもよい。マトリックス材料の存在が核酸コンストラクトの導入効率を低下させる可能性がある場合には、マトリックス材料は電圧印加後に生体組織に供給してもよい。なお、マトリックス材料は、注射、注入等により局所的に標的となる生体組織に投与されることが好ましい。【００７２】
本方法においては、核酸コンストラクトの存在下、生体組織に配置される電極に対して電圧を印加する。これにより細胞膜が穿孔され、核酸コンストラクトが細胞内へ導入されることになる。電圧印加のタイミングには、２種類ある。一つは、核酸コンストラクトを電圧印加に先立って予め生体組織に供給到達させておき、核酸コンストラクトが当該生体組織に供給され到達すると同時にあるいはその後（好ましくは速やかに）、生体組織の所定位置に配置された電極に所定条件で電圧を印加するタイミングである（図２（ａ）及び（ｂ））。他の一つは、核酸コンストラクトを生体組織に供給しながら電圧を印加するタイミングである（図２（ｃ）及び（ｄ））。後者のタイミングで電圧を印加する場合には、予め生体組織の所定位置に電極をセットしておき、その状態で、核酸コンストラクトが当該生体組織に供給され到達されつつあるタイミングで電圧を印加することになる。なお、いずれの場合においても、電極の生体組織へのセットは、電圧印加に先立つ適切なタイミングで実施されることが好ましい。【００７３】
なお、電極に印加する電圧は５０Ｖ以上７０Ｖ以下とすることもできる。この範囲であると、固形腫瘍などの標的生体組織に０．２Ａ程度の電流量を確保することができる。この電流量は、本発明者らによれば、ｓｉＲＮＡなどの核酸コンストラクトを導入するのに適した電流量であることがわかっている。５０Ｖ未満であると核酸コンストラクトを導入するのが困難となり、７０Ｖを超えると細胞障害が強くなり組織が破壊されてしまうからでなる。【００７４】
電極は生体組織に対して生体組織の部位や電極の形態等によって様々な態様で配置することができる。例えば、固形腫瘍などの罹患組織を含む生体組織の場合には、当該罹患組織を２以上の電極で挟持するように電極を配置することもできるし、少なくとも一本のニードル状電極を罹患組織部分に侵入させた状態で残りの電極を罹患組織の周囲に当接させるようにしてもよい。また、表皮下の固形腫瘍などの罹患組織に対して電極を配置する場合には、罹患組織の底部の下側にニードル状電極を侵入させるとともに、罹患組織を覆う表皮に他方の電極を当接させてもよい。また、血管などの生体組織には、血管を一対のプレート状電極で挟持するように電極を配置する。こうした各種の電極配置形態は、当業者であれば必要に応じ適切に設定することができる。【００７５】
図３に、図１に示すエレクトロポレーション装置２を用い、図２の左側のフローに基づいて、表皮直下の固形腫瘍を標的生体組織としてｓｉＲＮＡ等の核酸コンストラクトの存在下に電圧を印加する操作の一例について示す。先ず、固形腫瘍の中央部分に、表皮を介して核酸コンストラクトを含む液体を注射する。固形腫瘍に核酸コンストラクトが均等に供給及び到達されるように固形腫瘍の中央部分の２箇所以上において注射用ニードルを侵入させて前記液体を注射する。【００７６】
次いで、核酸コンストラクトが供給された固形腫瘍の底部下側にニードル状電極１０ｂを挿入するとともに、固形腫瘍の上部を覆う表皮にプレート状電極１０ａを当接させて、電極１０ａ、１０ｂとができるだけ安定して一定距離を保てるようにホルダー１２の脚部１２ａ、１２ｂを強く把持し、その状態で本体４のパルス発信手段６を操作して方形波パルスを一定周期で一定時間印加する。これにより、電圧が印加された生体組織内の細胞が穿孔され、その孔部から核酸コンストラクトが細胞内に導入される。なお、電極１０ｂをパルス発生手段６のマイナス端子に接続し、電極１０ａを同じくプラス端子に接続した状態で電圧を印加することで、固形腫瘍の底部近傍に供給されマイナスに荷電した核酸コンストラクトは、固形腫瘍の上部側に移動するとともに穿孔により細胞内に導入されると考えられる。【００７７】
なお、プレート状電極１０ａとニードル状電極（好ましくはフォーク状）１０ｂとの配置態様によれば、ニードル状電極１０ｂが組織側に刺し込まれるために、一対のプレート状電極を用いるよりも電気抵抗値が低下するものと推測される。また、ニードル状電極１０ｂとプレート状電極１０ａとを対向させることで、両電極で皮下組織を直接挟持しても、あるいはニードル状電極１０ｂは皮下に配置しプレート状電極１０ａについては表皮に当接させて挟持しても、固形腫瘍等の生体組織を確実に挟持するとともに、電極間距離を一定とするように挟持することができる。このために、相対的に低い電圧で高い電流量を安定して得られやすいと推測される。さらに、腫瘍内部は、血管新生が活発であり血管透過性も高いため、こうした組織近傍にニードル状電極１０ｂが差し込まれることで、電流量を確保しやすいと考えられる。以上のことから、プレート状電極１０ａとニードル状電極１０ｂとの組み合わせが生体組織を直接あるいは皮下組織を低侵襲的に表皮を介して間接的に挟持してエレクトロポレーションを実現するのに好ましいといえる。【００７８】
本発明方法によれば、上記例示した操作におけるエレクトロポレーション装置の制御によって、標的生体組織の細胞内にＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトを容易に、しかも迅速にかつ大量に送達させることができる。さらに、必ずしもウイルスベクターやアテロコラーゲンなどの媒介物も必要とせずにnakedな核酸コンストラクトを送達させることができる。このため、ＲＮＡ干渉効果等の発現によって標的遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。また、複数の核酸コンストラクトを導入することも容易である。また、コラーゲンなどのマトリックスを核酸コンストラクトと共存させることにより、核酸コンストラクト自体の安定性を向上させるほか電圧印加時において核酸コンストラクトを標的組織近傍に保持できること等により導入効率を維持向上することができる。【００７９】
また、核酸コンストラクトにより標的遺伝子の発現を抑制することができることから、この方法によれば、標的遺伝子の発現抑制による疾患の予防又は治療方法や病態の改善方法も提供される。特に、血管新生を促進する遺伝子を標的とする核酸コンストラクトを用いた場合には、核酸コンストラクトが導入された腫瘍組織などの生体組織における血管新生を抑制することができる。この結果、標的遺伝子の発現抑制により血管新生を阻害できる場合には、固形腫瘍などのガンの進行抑制、予防又は治療方法、血管新生が起因となる眼内血管新生病（糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など）、動脈硬化症などの疾患の進行抑制、予防又は治療方法、リウマチやアトピー性皮膚炎などの炎症性疾患の進行抑制、予防又は治療方法も提供される。また、標的遺伝子が、ウイルスの遺伝子やウイルスの増殖に関連する内在性遺伝子の場合等には、ウイルスによる感染症の進行抑制、予防又は治療方法も提供される。【００８０】
（非ヒト動物の作製方法）
本発明の非ヒト動物の作製方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に前記非ヒト動物においてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入することを特徴としている。すなわち、本作製方法は、本発明のエレクトロポレーション装置の制御方法を非ヒト動物のみに適用した態様である。したがって、非ヒト動物、核酸コンストラクト及びエレクトロポレーション装置、その操作等については、上記した範囲の全てが非ヒト動物の作製方法についても適用される。【００８１】
この非ヒト動物作製方法によれば、例えば、部位特異的に所望の遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物を得ることができる。胚操作によれば致死的であるような遺伝子の発現抑制であっても、容易にこうした遺伝子発現を抑制できるため、広い用途が期待される。また、この方法によれば、２種以上の遺伝子を容易にノックダウンすることができるため、２種以上の遺伝子の発現抑制による複合的な疾患等の研究用途がある。【００８２】
また、血管新生を促進する遺伝子を標的とする核酸コンストラクトを用いた場合には、生体組織における血管新生が抑制された非ヒト動物を得ることができる。このような非ヒト動物は、血管新生の抑制による治療的効果又は他の治療との組み合わせの効果等を容易に評価できる。本発明の非ヒト動物の作製方法においては、特に、非ヒト動物は生後の個体であることが好ましい。こうした非ヒト動物は、例えば、１種又は２種以上の標的遺伝子の発現が抑制された細胞又は生体組織を有している。【００８３】
以上のように、本発明の非ヒト動物作製方法によれば、容易に所望の細胞又は生体組織での１種又は２種以上の遺伝子のノックダウンを実現できる。また、核酸コンストラクトとして、疾患関連遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能なｓｉＲＮＡなどの核酸コンストラクトを用いる場合には、得られる非ヒト動物は、一過性又は局所的な疾患モデル動物となるので、こうした非ヒト動物を用いる治療剤を探索するためのスクリーニング系も提供される。【００８４】
非ヒト動物の作製にあたっては、この非ヒト動物として疾患モデル動物などヒトの疾患のモデルとなるような病態、遺伝子変異又は生体組織又は細胞の表現型を有する非ヒト動物を準備し、この非ヒト動物に対して、これらの疾患等の関連遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトを導入することができる。こうした非ヒト動物の作製方法によって得られる非ヒト動物の病態の解析又は生体組織又は細胞の表現型を解析することにより、核酸コンストラクトの有効性評価を行うことができる。なお、核酸コンストラクトを導入するための非ヒト動物としては、商業的に入手可能な疾患モデル動物を用いてもよいし、正常な非ヒト動物にヒトの疾患モデルとなるように非ヒト動物に予め処置を施すこともできる。例えば、非ヒト動物に腫瘍を人為的に形成させたり、ウイルスを感染させたりしてもよい。腫瘍を人為的に形成するには、変異原の投与や、ウイルス感染、腫瘍細胞又は腫瘍組織を移植し、該移植部位において前記腫瘍細胞を増殖させ、前記腫瘍組織を拡大させ、又は前記移植部位を原発とする転移部を形成させることなどによることができる。【００８５】
なお、本明細書でいう病態の解析及び生体組織又は細胞の表現型の解析には、疾患が改善され、治療され、又は予防されたかどうかを評価するためのすべての解析を包含している。例えば、病態の解析としては、食餌、排泄、活動等の観察、全身及び身体部位の外観及び観察等が挙げられ、生体組織又は細胞の表現型の解析とは、生体組織又は細胞の観察や組織又は細胞特異的な遺伝子やタンパク質の発現や活性化の測定、代謝産物の測定等が挙げられる。【００８６】
（治療剤の探索方法：遺伝子治療剤）
本発明の治療剤の探索方法は、ヒトの疾患のモデルとなるような病態、遺伝子変異又は生体組織又は細胞の表現型を有する非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物においてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入し、前記核酸コンストラクトが導入された前記非ヒト動物における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析することを特徴としている。この方法によれば、エレクトロポレーションにより核酸コンストラクトを導入するため、導入した核酸コンストラクトの前記疾患に対する有効性を容易に評価することがで
きる。この結果、本発明によれば、遺伝子治療剤としての核酸コンストラクトを選抜できる有効なスクリーニング系が提供される。【００８７】
なお、本発明の探索方法における非ヒト動物、核酸コンストラクト、エレクトロポレーション装置及びその操作等については、上記した範囲の全てが適用される。また、ヒトの疾患モデルとなるような病態又は遺伝子変異を有する非ヒト動物は、上記非ヒト動物の作製方法において記載したような手法で作製することができる。【００８８】
（治療剤の探索方法：低分子化合物などの薬剤）
本発明の治療剤の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、前記非ヒト動物においてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入して前記非ヒト動物の少なくとも一部においてヒトの疾患における病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を形成する工程と、この非ヒト動物に１種又は２種以上の化合物を投与して前記病態又は生体組織若しくは細胞の表現型を解析することを特徴とする。この方法によれば、非ヒト動物に対して、エレクトロポレーションにより核酸コンストラクトを導入してヒトの疾患態様を形成し、化合物を投与してその効果を解析するものであるので、非ヒト動物において前記核酸コンストラクトにより形成された疾患態様に対する低分子化合物等の有効性を容易に評価できる。この結果、低分子化合物を有効成分とする薬剤を選抜できる有効なスクリーニング系を提供できる。なお、低分子化合物等の薬剤候補の投与形態は特に限定しないで、経口、注射、注入等従来公知の各種形態を採用できる。【００８９】
（創薬のための標的化合物の探索方法）
本発明の創薬のための標的化合物の探索方法は、非ヒト動物の生体組織の細胞内に、非ヒト動物における疾患関連遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトをエレクトロポレーションにより導入し、前記核酸コンストラクトが導入された前記生体組織又は細胞の表現型を解析することを特徴としている。この方法によれば、前記細胞又は生体組織の表現型を解析することにより、前記疾患の予防又は治療ための標的化合物を見出すことができる。標的化合物を見出すことにより、この化合物を活性化又は阻害する化合物などを探索するスクリーニング系が提供される。なお、この場合の細胞又は生体組織の表現型の解析とは、例えば、こうした細胞又は生体組織の観察や、細胞活性状態、タンパク質の発現量や活性化、各種代謝産物の測定などが挙げられる。なお、疾患関連遺伝子とは、疾患に関連することが明らかである遺伝子のみならず、疾患に関連する可能性のある遺伝子であってもよい。【００９０】
以上説明したように、本発明の各種の実施形態によれば、いずれも、ＲＮＡ干渉等により遺伝子の発現を抑制可能な１種又は２種以上の核酸コンストラクトを動物の細胞又は生体組織の少なくとも一部にエレクトロポレーションにより導入することにより、簡易に、迅速に、生体内においてＲＮＡ干渉等による遺伝子サイレンシングによるノックダウンを実現させることができる。特に、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ、より好ましくはｓｉＲＮＡであるＲＮＡコンストラクトを直接生体にエレクトロポレーションすることにより、直接的に生体において遺伝子サイレンシングが可能となっている。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。【００９２】
（実施例１）
本実施例では、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（以下、ｈＶＥＧＦ−Ａという。）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６）のＣＤＳ配列に基づいて５種類のｓｉＲＮＡを作製し、ｉｎｖｉｔｒｏでそのノックダウン効果を検討した。【００９３】
＜siRNAの作製＞
５種類のｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦ−Ａのターゲット配列を図４及び配列番号：１〜５に示す。なお、図４における遺伝子配列の標記はＣＤＳとなっている。また、合成したｓｉＲＮＡのセンス配列を配列番号：６〜１０に示し、二重鎖ＲＮＡとしての形態を図５に示す。なお、全てのｓｉＲＮＡは、ターゲット配列に基づいてＤｈａｒｍａｃｏｎ社に依頼して合成させた。【００９４】
＜siRNAの評価＞
各種のｓｉＲＮＡを、ＰＣ−３細胞におけるｈＶＥＧＦ−Ａ発現の抑制効果により評価した。ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３（ＡＴＣＣ）を３５ｍｍディッシュにまき（２×１０５個／皿）、１晩静置後、各ｓｉＲＮＡを無血清条件下で陽イオン脂質試薬（リポフェクトアミン・プラス：インビトロジェン社）にてトランスフェクション（３７℃、４時間）した。導入後、１０％ＦＢＳ１ｍｌを添加し、６時間培養後、ヘパリン２０μｇ／ｍｌ含有無血清培地に交換して１６時間培養後に、培養上清を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）でｈＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定した。結果を、図６に示す。【００９５】
図６に示すように、＃２及び＃３のｓｉＲＮＡが高いｈＶＥＧＦ−Ａ抑制効果を示し、＃３のｓｉＲＮＡが最も高い抑制効果を示した。【００９６】
（実施例２）
本実施例では、実施例１の＃３ｓｉＲＮＡ（安定化修飾基で修飾されていない）と、＃３ｓｉＲＮＡと同じターゲット配列に基づいて安定化されたｓｉＲＮＡを用いて、ｈＶＥＧＦ−Ａ発現の抑制効果を確認した。なお、安定化させたｓｉＲＮＡは、＃３のターゲット配列に基づいてＤｈａｒｍａｃｏｎ社に依頼して、同社による安定化修飾基で修飾したｓｉＲＮＡであるｓｉＳＴＡＢＬＥ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社の商標）として合成させた。【００９７】
＜ｓｉＲＮＡの評価＞
これら２種のｓｉＲＮＡを、ＰＣ−３細胞におけるｈＶＥＧＦ−Ａ発現の抑制効果により評価した。ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３（ＡＴＣＣ）を３５ｍｍディッシュにまき（２×１０５個／皿）、１晩静置後、各ｓｉＲＮＡを無血清条件下で陽イオン脂質試薬（リポフェクトアミン・プラス：インビトロジェン社）にてトランスフェクション（３７℃、４時間）した。導入後、１０％ＦＢＳ１ｍｌを添加し、６時間培養後、ヘパリン２０μｇ／ｍｌ含有無血清培地に交換して培養を継続した。導入後、４８，７２，９６，１２０，１４４及び１６８時間後に培養上清を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）でｈＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定した。なお、＃３のターゲット配列に対するスクランブル配列についてのそれぞれ非修飾のｓｉＲＮＡとＤｈａｒｍａｃｏｎ社によるｓｉＳＴＡＢＬＥによる安定化ｓｉＲＮＡについて同様の方法にてＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定した。これらの結果を、図７に示す。【００９８】
図７に示すように、＃３安定化ｓｉＲＮＡは導入４８時間後には約７０％のノックダウン率であったが、時間の経過とともにＲＮＡｉ効果を強く発揮する傾向があった。＃３非修飾ｓｉＲＮＡは、徐々にＲＮＡｉ効果が減弱していく傾向が認められたが、１６８時間後において＃３非修飾ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果は、依然として安定化ｓｉＲＮＡの約半分程度を維持していた。＃３ｓｉＲＮＡのスクランブル配列を備えるｓｉＲＮＡは、いずれも（安定化タイプも非修飾タイプの双方）、ＲＮＡｉ効果を全く示さなかった。なお、ｍｏｃｋ（導入脂質試薬のみ）でも、ｈＶＥＧＦ−Ａ分泌量は変化しなかった。【００９９】
（実施例３）
本実施例では、エレクトロポレーションにより、腫瘍にｓｉＲＮＡを導入するための至適電圧を決定した。エレクトロポレーションによる導入方法を以下に示す。ＰＣ−３細胞（３×１０６個／部位）をヌードマウス（日本ＳＬＣ：オス、８週齢）の鼠径部に皮下注射（２４Ｇ針）し、ＰＣ−３皮下移植腫瘍（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）担癌マウスを作成した。細胞移植後、３〜４週間経過すると、同部位に腫瘍が形成された（腫瘍体積＝５０ｍｍ３〜８０ｍｍ３）。こうしたマウスをエレクトロポレーション実験に用いた。なお、腫瘍体積は次式より求めた。
Ｖ＝（短軸）２×（長軸）÷２【０１００】
ネンブタール麻酔（補助麻酔：エーテル吸入）して四肢を固定した。また、図１に示すような形態を備えるプレート＆フォーク型電極（白金の長方形プレート状電極：６．６７ｍｍ×３．８７ｍｍ、ステンレス製フォーク状電極：フォーク３本、長さ６．６７ｍｍ、間隔１．３ｍｍ、ネッパジーン社製）のプレート状電極側にあらかじめＰＢＳを浸したパッドを貼っておいた。安定化ｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液を１０μｌずつ計２か所、合計２０μｌを盛り上がった皮下腫瘍の中央部に注入した。フォーク状電極側を皮下腫瘍下部に刺し、プレート状電極を腫瘍上部の表皮にかぶせて挟持した。この状態でＣＵＹ２１（ネッパジーン社製）にて通電した。通電条件は、Ｐｏｎ＝５０ｍｓｅｃ，Ｐｏｆｆ＝１００ｍｓｅｃで３回パルス発信した後、極性を切り替えて、同様に３回パルス発信して、合計６回パルス発信した。【０１０１】
至適電圧の決定にあたっては、ｓｉＲＮＡとしてＣｙ３標識した＃３ｓｉＳＴＡＢＬＥ−ｍｏｄｉｆｉｅｄｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社に合成依頼した。）を用いて、ｓｉＲＮＡの腫瘍への導入における至適電圧を決定した。Ｃｙ３標識安定化ｓｉＲＮＡ（４０μＭ）を腫瘍あたり２０μｌ（１０μｌ×２か所）づつ注入し、上記方法にて、エレクトロポレーションを施した。電圧を３５，５０，６０，７０，９０，１００Ｖに設定し、通電を行い、実際に腫瘍に流れた実効電流値を記録した。２４時間後に腫瘍を摘出、凍結切片を作成し、共焦点レーザー顕微鏡にてＣｙ３の赤色蛍光を観察・追跡した。また、サイトックス・グリーン（インビトロジェン社）試薬にて、細胞の核を染色した（緑色蛍光）。Ｃｙ３標識安定化ｓｉＲＮＡ（４０μＭ）を腫瘍あたり２０μｌ（１０μｌ×２）づつ注入後、通電しない群も合わせて検討した。これらの結果から、５０Ｖ以上７０Ｖ以下の設定電圧で通電するとｓｉＲＮＡが効率よく細胞内に導入されることがわかった。【０１０２】
（実施例４）
本実施例では、ｓｉＲＮＡの腫瘍内の滞留性について評価した。すなわち、通電導入後に、５，１０，１５及び２０日後に評価し、腫瘍の摘出から凍結切片の作製を行う以外は、実施例３と同様の操作を行い、同様に共焦点レーザー顕微鏡にてＣｙ３標識物を追跡観察した。この結果、Ｃｙ３標識安定化ｓｉＲＮＡが少なくとも２０日間は腫瘍内に滞留することが証明された。【０１０３】
（実施例５）
本実施例では、エレクトロポレーションによるｓｉＲＮＡの抗腫瘍効果（治療効果）について評価した。方法を以下に示す。安定化＃３ｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液（６．２５，１２．５，２５μＭ液）を、実施例３と同様にしてＰＣ−３皮下腫瘍（治療開始体積＝５０〜８０ｍｍ３）に注入し（１０μｌ×２回）、直ちにプレート＆フォーク型電極のフォーク側を腫瘍下部に刺し、通電した（設定電圧一律７０Ｖ）。なお、対照としてＰＢＳを腫瘍に注入し（１０μｌ×２回）、通電する群も設定した。また、スクランブル配列を備える安定化ｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液（２５μＭ）を注入する（１０μｌ×２回）群も置いた。さらに、通電しない全くの無処置群も置いた。治療開始日をｄａｙ０とし、ｄａｙ２０に２回目の治療を全く同様の手法で再施行し、４２日目まで腫瘍径をモニタし、治療効果の指標としては、ｄａｙ０の腫瘍体積（計算式は実施例３に記載）に対する所定日数経過時点での腫瘍体積の比を治療効果の指標とした。なお、各治療群において担癌マウス５匹を対象とした。なお、腫瘍あたりのｓｉＲＮＡの使用量は以下のとおりであった。結果を図８に示す。
腫瘍あたりのｓｉＲＮＡ量              
６．２５μＭ液を２０μｌ注入    １２５ｐｍｏｌ
１２．５μＭ液を２０μｌ注入    ２５０ｐｍｏｌ
２５μＭ液を２０μｌ注入        ５００ｐｍｏｌ【０１０４】
また、治療開始４０日目の腫瘍の外観の写真を図９（ａ）〜（ｄ）に示す。図９（ａ）は、安定化ｓｉＲＮＡであって、ｓｉＲＮＡ量が５００ｐｍｏｌ／腫瘍（エレクトロポレーションあり）の腫瘍外観であり、図９（ｂ）は、ＰＢＳのみ（エレクトロポレーションあり）の腫瘍外観であり、図９（ｃ）は、スクランブル配列を備えるスクランブル化・安定化ｓｉＲＮＡであって、ｓｉＲＮＡ量が５００ｐｍｏｌ／腫瘍（エレクトロポレーションあり）の腫瘍外観であり、図９（ｄ）無処理（エレクトロポレーションなし）の腫瘍外観である。【０１０５】
さらに、安定化ｓｉＲＮＡ（５００ｐｍｏｌ／腫瘍）によって治療を施した腫瘍及びスクランブル化・安定化ｓｉＲＮＡ５００ｐｍｏｌ／腫瘍）を投与した腫瘍について、腫瘍内微小血管密度をＣＤ３１（血管内皮細胞上の表面抗原）をマーカーとした免疫化学的染色法にて測定した。治療開始から起算して、１０、２０、３０日目の腫瘍について検討した。結果を図１０に示す。【０１０６】
図８に示すように、安定化ｓｉＲＮＡについては、腫瘍あたりのｓｉＲＮＡ量が２５０ｐｍｏｌ及び５００ｐｍｏｌのとき、ほぼ同等の治療効果（抗腫瘍効果）が認められた。一方、同量が１２５ｐｍｏｌのときには、これらよりは治療効果が減弱した。また、図８及び図９に示すように、スクランブルでは、全く治療効果は認められなかった。さらに、ＰＢＳを注入してから通電する群も治療効果が認められず、通電なしの無処置群と同等であった。通電による組織障害による癌退縮は全く観察されなかった。以上のことから、エレクトロポレーションによるｓｉＲＮＡのデリバリーは、簡易かつ迅速な手法であるとともに局所適用に優れ、さらに、高い治療効果が得られることがわかった。【０１０７】
また、本発明者らが既に行ったアテロコラーゲンを用いるｓｉＲＮＡデリバリー法による結果（Y. Takeiら、CANCER RESEARCH 64, 3365-3370, MAY 15, 2004）と比較すると、本実施例のエレクトロポレーションによるデリバリー法において腫瘍あたりのｓｉＲＮＡ量が２５０ｐｍｏｌ時の治療効果が、アテロコラーゲンデリバリー法おいて同量が５００ｐｍｏｌ時の治療効果と一致していた（なお、アテロコラーゲンデリバリー法では、非修飾ｓｉＲＮＡを用いている。）。以上のことから、エレクトロポレーションによるｓｉＲＮＡデリバリーはアテロコラーゲンーゲンデリバリー法に匹敵するか又はそれ以上の有効性を有していることがわかった。【０１０８】
さらに、図１０に示すように、安定化ｓｉＲＮＡにより治療群では、スクランブル配列を備える安定化ｓｉＲＮＡ治療群と比較して、明らかに腫瘍内微小血管密度が減少していた。以上の結果より、本治療による癌増殖抑制効果はｓｉＲＮＡによる腫瘍内ｈＶＥＧＦ−Ａ量の低下に起因する腫瘍内血管新生の抑制のメカニズムによるものであることが証明された。【０１０９】
（実施例６）
本実施例では、安定化＃３ｓｉＲＮＡ単体のＰＢＳ溶液（１２．５μＭ）をｓｉＲＮＡ溶液と用いる以外は、実施例３と同様にしてＰＣ−３皮下腫瘍（治療開始体積＝５０〜８０ｍｍ３）に注入し（１０μｌ×２回）、直ちにプレート＆フォーク型電極のフォーク側を腫瘍下部に刺すとともに、プレート型電極を表皮に当接させて皮下腫瘍を挟持して通電した（設定電圧一律７０Ｖ）。なお、ｓｉＲＮＡは、腫瘍あたり２５０ｐｍｏｌとなるように導入した。また、比較例として、未修飾＃３ｓｉＲＮＡ（１２．５μＭ）とアテロコラーゲン（1.75％）とを含有する溶液をｓｉＲＮＡ量が同量となるように皮下腫瘍に注入（１０μｌ×２回）する群も設定した。さらに、対照例としてＰＢＳを皮下腫瘍に注入し（１０μｌ×２回）、通電する群も設定した。初回治療日をｄａｙ０とし、２０日後にもう一度、上記治療を行い、４０日後まで腫瘍の大きさをそれぞれにつき計測した。結果を図１１に示す。【０１１０】
図１１に示すように、安定化＃３ｓｉＲＮＡ単体をエレクトロポレーションにて導入した群（図中、白抜き丸印）は、未修飾の＃３ｓｉＲＮＡをアテロコラーゲンで導入した群（比較例）（黒三角印）よりも治療効果があった。以上のことから、ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションによる導入方法によれば、アテロコラーゲン導入法よりも優れたｓｉＲＮＡの作用発現効果、すなわち、遺伝子発現抑制効果及び腫瘍抑制効果が得られることがわかった。【０１１１】
（実施例７）
本実施例では、エレクトロポレーションに使用する電極形状と通電量について検討した。実施例３と同様にしてヌードマウス皮下にＰＣ−３（ヒト前立腺癌）細胞を移植して腫瘍を形成し、腫瘍体積が５０〜８０ｍｍ３程度となった腫瘍組織に対して、一対のプレート状電極（プレート電極（白金の長方形プレート状電極：６．６７ｍｍ×３．８７ｍｍ）ネッパジーン社製））とプレート状電極とニードル状電極（図１に示すような形態を備えるプレート＆フォーク型電極（白金の長方形プレート状電極：６．６７ｍｍ×３．８７ｍｍ、ステンレス製フォーク状電極：フォーク３本、長さ６．６７ｍｍ、間隔１．３ｍｍ、ネッパジーン社製））とを用いて組織障害が生じない程度の電圧（７０Ｖ）を印加したときの腫瘍内の実測抵抗値及び実測電流値を計測した。なお、一対のプレート状電極は、表皮を介して腫瘍の側面から固形腫瘍を挟持するように配置し、プレート状電極及びニードル状電極は、ニードル状電極を皮下固形腫瘍の底部の下に刺し込むとともにプレート状電極を表皮を介して固形腫瘍の上方に配置して挟持するようにした。また、各実測値は、それぞれの電極形状につき５つの固形腫瘍を用いて計測したものである。エレクトロポレーション装置としては、ＣＵＹ２１（ネッパジーン社製）を用い、各実測値の計測のための通電条件（‘通電条件は、Ｐｏｎ＝５０ｍｓｅｃ，Ｐｏｆｆ＝１００ｍｓｅｃで３回パルス発信した後、極性を切り替えて、同様に３回パルス発信して、合計６回パルス発信した。）は同一とした。結果を表１に示す。
【表１】
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【０１１２】
表１に示すように、プレート状電極とニードル状電極とを用いた場合には、一対のプレート状電極を用いた場合と比較して抵抗値には有意差はなかったが、有意に高い電流値が計測された。本発明者は、腫瘍組織へのｓｉＲＮＡの効率的な導入には、０．２アンペア程度の電流量であるという知見を得ており、当該知見によれば、プレート状電極を用いた場合、腫瘍組織に生体障害性の低い７０Ｖの印加電圧では、siＲＮＡの安全な導入は期待できないことが推測される。なお、印加電圧を増大させれば、電流量が増大するが、組織障害や脱落が生じてしまい生体に対する安全性を確保できない場合も起こりうる。【０１１３】
このようなプレート状電極とニードル状電極との配置態様によれば、ニードル状電極とプレート状電極とを対向させることで、両電極で皮下組織を直接挟持しても、あるいはニードル状電極は皮下に配置しプレート状電極については表皮を介して挟持しても、固形腫瘍等の生体組織を確実に挟持するとともに、電極間距離を一定とするように挟持することができる。このために、高い電流量が得られやすいと推測される。さらに、腫瘍内部は、血管新生が活発であり血管透過性の高いため、こうした組織近傍にニードル状電極が差し込まれることで、電流量を確保しやすいと考えられる。以上のことから、プレート状電極とニードル状電極との組み合わせが生体組織を直接あるいは皮下組織を低侵襲的に表皮を介して間接的に挟持してエレクトロポレーションを実現するのに好ましいといえる。【０１１４】
さらに、標的とする生体組織が腫瘍組織（特に、皮下腫瘍組織）であり、導入するｓｉＲＮＡ等の核酸コンストラクトの標的遺伝子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である場合には、プレート状電極及びニードル状電極との組み合わせが適切であり、上記した固形腫瘍に対する配置態様での電圧印加によるエレクトロポレーションが有効であると考えられる。【０１１５】
本出願は、２００５年７月１６日に出願された日本国特許出願第２００５−２０７０６７号を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが引用により含まれる。
【産業上の利用の可能性】
【０１１６】
本発明は、エレクトロポレーション装置の製造及びその利用に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号1〜５： target sequence of siRNAto human VEGF-A
配列番号６〜１０： sense sequence of siRNA
【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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