(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ試料中の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを検出する方法であって、
目的塩基のみ塩基対を形成せず、目的塩基を有するバルジ構造を形成するよう；又は目的塩基のみミスマッチを形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、
バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する第２工程とを含むメチルシトシン検出方法。
【請求項２】
第１工程が、目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造を形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる工程であり、
第２工程が、バルジ構造を形成する前記シトシン又はメチルシトシンに特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する工程である請求項１に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項３】
第２工程においてメチルシトシンに特異的な反応を誘導する請求項１または２に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項４】
第２工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに酸化剤を作用させる第２Ａ工程と、酸化剤による酸化反応物の有無を検出する第２Ｂ工程とを含む請求項３に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項５】
第２Ａ工程が、酸化剤として核酸塩基の炭素原子を酸化できる酸化剤を用いるものであり、かつ
第２Ｂ工程が、塩基性物質を作用させる工程、および少なくとも１つのホスホジエステル結合が分解されたか否かを判定する工程を順次含む請求項４に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項６】
上記ホスホジエステル結合が分解されたか否かを判定する工程が、ＤＮＡ試料の断片を検出する工程を含む請求項５に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項７】
バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンを含む領域を増幅することにより、ＤＮＡ試料の断片を検出する請求項６に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項８】
塩基性物質として、窒素含有物質を用いる請求項５〜７のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項９】
第１工程の後、エキソヌクレアーゼ処理によりハイブリダイズ産物の１本鎖部分を除去する工程を有する請求項３〜８のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１０】
第２Ｂ工程が、第２Ａ工程で生成する酸化反応物を標識する工程と、標識物質を検出する工程とを含む請求項４に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１１】
前記第２Ｂ工程が、酸化剤による酸化反応物に対してさらに第２の酸化処理を行なってアルデヒドを生成し、このアルデヒドをイミノ基を介して酵素で標識する工程、を含む請求項１０に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１２】
第２Ｂ工程における、目的塩基の酸化反応物がピリミジン環の５位炭素原子の酸化反応物である請求項４〜１１のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１３】
第２工程における目的塩基に特異的な反応がシトシンに特異的な反応である請求項１または２に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１４】
第２工程が、目的塩基を重亜硫酸塩処理する第２Ｃ工程と、第２Ｃ工程で生成するウラシルを検出する第２Ｄ工程とを含む請求項１３に記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１５】
第２工程が、第１工程で得られたハイブリダイズ産物において、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第２Ｅ工程と、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクの有無を検出する第２Ｆ工程とを含む請求項１〜３のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１６】
ガイドプローブの長さが２０〜１００塩基の長さである請求項１〜１５のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１７】
ガイドプローブの長さが４０〜１００塩基である請求項５〜９のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【請求項１８】
ガイドプローブが固相担体に結合されたものである請求項１〜１７のいずれかに記載のメチルシトシン検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ試料中の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定するメチルシトシン検出方法、及びそれに用いるプローブ、キット、核酸チップ、及びメチルシトシン検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクスは、ゲノムを生理的に修飾するＤＮＡメチル化、ＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチン、クロマチンを構成する多くのタンパク質の翻訳後修飾から成立しており、統合的に遺伝子発現を制御している。【０００３】
クロマチン中のヒストンの修飾については、転写誘導の際に、ヒストン修飾によるクロマチン構造変換が重要な役割を果たす。例えば、ヒストンアセチル化酵素によるアセチル化が引き金となって、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子とＲＮＡポリメラーゼによる転写が開始する。また、ヒストンのメチル化やリン酸化は、転写の制御、サイレンシング、クロマチン凝縮などを引き起こす。【０００４】
また、多くの真核生物ではゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの６０〜９０％が、シトシン５位炭素原子のメチル化を受けている。メチル化ＣｐＧは反復配列を多く含むヘテロクロマチンやトランスポゾンに見られており、ウィルスやトランスポゾンの活性化を抑えていると考えられる。また、ＣｐＧのメチル化とヒストン修飾とは、相互に協調している。【０００５】
例外的に、多くの遺伝子のプロモーター領域にあるＣＧリッチな領域（ＣｐＧアイランド）ではメチル化を受けていない。さらにその例外として、インプリンティングされる遺伝子、女性の不活化Ｘ染色体ではＣｐＧアイランドがメチル化されている。また、がん細胞におけるがん抑制遺伝子のプロモーター領域でもＣｐＧアイランドがメチル化されている。従って、シトシンのメチル化は、癌の発生、再発、転移のマーカーとして使用することができ、遺伝子中のシトシンがメチル化されているか否かの簡単な検出方法が求められている。【０００６】
特許文献１，２は、ＤＮＡ試料を重亜硫酸塩で処理してメチル化されていないシトシンをウラシルに変化させ、次いで、ウラシルよりメチル化シトシンを優先的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無を検出することによりシトシンがメチル化されていたか否かを判定する方法を教えている。しかし、この方法は、メチルシトシンではなく大多数を占めるシトシンを変化させるため、全てのシトシンの変換効率が判定結果に影響を与え、その分判定精度が低くなる。【０００７】
また、特許文献３は、５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体を１本鎖ＤＮＡと接触させ、ＤＮＡ鎖に結合した抗体量を測定することにより、ＤＮＡメチル化率を決定する方法を教えている。しかし、この方法は、抗体の作成や、ＤＮＡ試料のＰＣＲによる増幅などを行う必要があり、手間がかかる。【０００８】
また、非特許文献１は、２本鎖ＤＮＡ試料を過マンガン酸カリウム及びヒドロキシルアミンで酸化し、次いでピペリジン処理することにより、２本鎖ＤＮＡにミスマッチが存在するか否かを検出できることを教えている。この方法はヒドロキシルアミンが必須である（図２、３参照）。しかし、この方法はミスマッチの存在を検出できるだけであり、ＤＮＡ試料中のシトシンとメチルシトシンとを区別することはできない。
【特許文献１】特表２００４−５２７２４１号
【特許文献２】特表２００４−５００８９２号
【特許文献３】特表２００４−３４７５０８号
【非特許文献１】Chinh Bui et al., “Chemical cleavage reactions of DNA on solid support: application in mutation detection”, BMC Chemical Biology,2003,Vol.3
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＤＮＡ試料中の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定できる簡便な方法、及びそれに用いるプローブ、キット、核酸チップ、及びメチルシトシン検出装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  メチルシトシンとシトシンとを区別するために、メチルシトシン，又はシトシンに特異的な反応を誘導し、その反応の有無を検出すれば、目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。しかし、このような反応は、ＤＮＡ試料中の各ヌクレオチドの塩基に対して等しく引き起こされ、シトシンであるかメチルシトシンであるかが問題となる目的塩基にのみ反応を引き起こすことはできない。
(ii)  そこで、目的塩基を有するヌクレオチドを除きそれに隣接する両側の領域と相補的なガイドプローブ（バルジ形成プローブ）とＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせれば、目的塩基を有するヌクレオチドのみ二重らせんから外部に飛び出したバルジ構造を形成し、ＤＮＡ試料中のその他のヌクレオチドは二重らせん構造中に埋没するため、目的塩基にのみ反応を引き起こすことができる。【００１１】
また、目的塩基と対応する塩基とだけがミスマッチしているガイドプローブ（ミスマッチ形成プローブ）とＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせれば、目的塩基を有するヌクレオチドを含む塩基対が二重らせん中で緩んだ構造をとり、ＤＮＡ試料中のその他のヌクレオチドは二重らせん構造中に埋没するため、目的塩基にのみ反応を引き起こすことができる。
(iii)  シトシンよりメチルシトシンの方が、メチル基が結合した炭素原子が酸化を受け易いため、酸化の有無によりシトシンとメチルシトシンとを区別することができる。【００１２】
従って、メチルシトシンに特異的な反応として、目的塩基にのみ酸化反応を誘導し、酸化反応物の有無を検出することにより、そのヌクレオチドがシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。
(iv)  酸化されたＤＮＡを塩基性物質で処理すると、酸化されたメチルシトシンの塩基と糖との間のＮ−グリコシド結合が分解されるとともに、その酸化メチルシトシンを有するヌクレオチドと隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合も加水分解される。従って、塩基性物質で処理した後に、ＤＮＡ断片の大きさをＰＣＲなどで検出することにより、問題となる塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。
(v)  また、目的塩基の酸化反応物を標識することによっても、その塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。この場合、ＤＮＡ試料中のプローブとハイブリダイズしない１本鎖部分にメチルシトシンが存在すれば酸化されてアルデヒドが生成し、誤検出の原因となる。これを避けるためには、バルジ形成プローブとＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせた後、酸化処理前に、ハイブリダイズ産物を１本鎖ＤＮＡ特異的なエキソヌクレアーゼで処理して１本鎖部分を除去すればよい。
(vi)  標識方法として、上記酸化反応物をさらに酸化してアルデヒドを生成し、このアルデヒドを例えばイミノ基を介して酵素で標識する方法がある。この方法によれば、問題となる塩基がメチルシトシンである場合にだけ酵素標識されることになる。
(vii)  ＤＮＡを重亜硫酸塩で処理すると、シトシンはウラシルに変化するが、メチルシトシンは変化しない。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシダーゼで処理し、次いで塩基性物質処理を行うと、目的塩基がウラシルである場合は、ウラシルと糖との間のＮ−グリコシド結合が分解されるとともに、ウラシルを有していたヌクレオチドと隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が加水分解される。従って、生じるＤＮＡ断片の大きさをＰＣＲなどで検出することにより、目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。【００１３】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記のメチルシトシン検出方法などを提供する。
項１．  ＤＮＡ試料中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、
バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する第２工程とを含むメチルシトシン検出方法。
項２．  第１工程が、目的とするシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造を形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる工程であり、
第２工程が、バルジ構造を形成する前記シトシン又はメチルシトシンに特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する工程である項１に記載のメチルシトシン検出方法。
項３．  第２工程においてメチルシトシンに特異的な反応を誘導する項１に記載のメチルシトシン検出方法。
項４．  第２工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに酸化剤を作用させる第２Ａ工程と、酸化剤による酸化反応物の有無を検出する第２Ｂ工程とを含む項３に記載のメチルシトシン検出方法。
項５．  第２Ｂ工程が、塩基性物質を作用させる工程を含む項４に記載のメチルシトシン検出方法。
項６．  第２Ｂ工程が、塩基性物質を作用させる工程の後、ＤＮＡ試料の断片を検出する工程を含む項５に記載のメチルシトシン検出方法。
項７．  バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンを含む領域を増幅することにより、ＤＮＡ試料の断片を検出する項６に記載のメチルシトシン検出方法。
項８．  塩基性物質として、窒素含有物質を用いる項５に記載のメチルシトシン検出方法。
項９．  第１工程の後、エキソヌクレアーゼ処理によりハイブリダイズ産物の１本鎖部分を除去する工程を有する項３に記載のメチルシトシン検出方法。
項１０．  第２Ｂ工程が、第２Ａ工程で生成する酸化反応物を標識する工程と、標識物質を検出する工程とを含む項９に記載のメチルシトシン検出方法。
項１１．  前記第２Ｂ工程が、酸化剤による酸化反応物に対してさらに第２の酸化処理を行なう工程を含む項１０に記載のメチルシトシン検出方法。
項１２．  標識酵素を用いて標識する項１０に記載のメチルシトシン検出方法。
項１３．  第２Ｂ工程における、目的塩基の酸化反応物がピリミジン環の５位炭素原子の酸化反応物である項４に記載のメチルシトシン検出方法。
項１４．  第２Ａ工程が、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンに酸化剤を作用させて、メチルシトシン部分に式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させる工程であり、
第２Ｂ工程が、前記オスミウム含有複素環基の有無を検出する工程である、項４に記載のメチルシトシン検出方法。
【００１４】
【化１】
0005167485.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又は置換アルキル基を示す）
項１５．  第２Ｂ工程が、標識物質により式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、標識化された当該オスミウム含有複素環基を検出する工程とを含む項１４に記載のメチルシトシン検出方法。
項１６．  第１工程で使用されるガイドプローブが、蛍光物質が結合されたガイドプローブであり、且つ
第２Ｂ工程が、前記蛍光物質に対して蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる蛍光物質を用いて、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、蛍光共鳴エネルギー移動の有無を測定する工程とを含む、
項１４に記載のメチルシトシン検出方法。
項１７．  第１工程で使用されるガイドプローブが、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の存在によって消光する蛍光物質を結合させたガイドプローブであり、且つ
第２Ｂ工程が、前記蛍光物質の消光の有無を測定する工程である、
項１４に記載のメチルシトシン検出方法。
項１８．  第２工程における目的塩基に特異的な反応がシトシンに特異的な反応である請求項１に記載のメチルシトシン検出方法。
項１９．  第２工程が、目的塩基を重亜硫酸塩処理する第２Ｃ工程と、第２Ｃ工程で生成するウラシルを検出する第２Ｄ工程とを含む項１８に記載のメチルシトシン検出方法。
項２０．  第２工程が、第１工程で得られたハイブリダイズ産物において、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第２Ｅ工程と、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクの有無を検出する第２Ｆ工程とを含む項３に記載のメチルシトシン検出方法。
項２１．  ガイドプローブの長さが２０〜１００塩基の長さである項１に記載のメチルシトシン検出方法。
項２２．  ガイドプローブの長さが４０〜１００塩基である項５に記載のメチルシトシン検出方法。
項２３．  ガイドプローブが固相担体に結合されたものである項１に記載のメチルシトシン検出方法。
項２４．  ＤＮＡ試料のシトシンであるかメチルシトシンであるかを検出するべき目的塩基を有するヌクレオチドを除く領域と相補的なメチルシトシン検出用プローブ。
項２５．  ＤＮＡ試料とハイブリダイズするメチルシトシン検出用プローブであって、ＤＮＡ試料のシトシンであるかメチルシトシンであるかを検出するべき目的塩基との間でのみミスマッチするメチルシトシン検出用プローブ。
項２６．  項２４又は２５に記載のプローブとＤＮＡ試料とのハイブリダイズ産物。
項２７．  項２４又は２５に記載のプローブと、メチルシトシンを酸化可能な試薬とを備えるメチルシトシン検出用キット。
項２８．  酸化されたメチルシトシンを有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間の結合を切断可能な塩基性物質を備える項２７に記載のメチルシトシン検出用キット。
項２９．  １本鎖ＤＮＡを特異的に分解するエキソヌクレアーゼと、末端にＮＨ２ＮＨ−基、又はＮＨ２Ｏ−基を有するビオチン又はアビジンと、アビジン又はビオチンと結合した標識酵素と、標識酵素の発色基質とを備える項２７に記載のメチルシトシン検出用キット。
項３０．  １本鎖ＤＮＡを特異的に分解するエキソヌクレアーゼと、下記式（１）又は（２）の標識物質とを備える項２７に記載のメチルシトシン検出用キット。【００１６】
【化２】
0005167485.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｒは標識物質を示す。）【００１８】
【化３】
0005167485.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｒは標識物質を示す。）
項３１．  メチルシトシンを酸化可能な試薬として、オスミウム酸塩とビピリジンとを備える項２７に記載のメチルシトシン検出用キット。
項３２．
メチルシトシン検出用プローブが、蛍光物質が結合されてなるものである、請求項３１に記載のメチルシトシン検出用キット。
項３３．  メチルシトシン検出用プローブが、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の存在によって消光する蛍光物質が結合されてなるものである、項３１に記載のメチルシトシン検出用キット。
項３４．  項２４又は２５に記載のプローブと、重亜硫酸塩とを備えるメチルシトシン検出用キット。
項３５．  メチルシトシンと特異的に結合可能な基を結合させた項２４又は２５に記載のプローブを備えるメチルシトシン検出用キット。
項３６．  項２４又は２５に記載のプローブの１種以上が、基体上に固定された核酸チップ。
項３７．  項３６に記載の核酸チップと、チップ上の発色パターンを検出できる装置とを備えるメチルシトシン検出装置。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１の方法の手順を説明する図である。
【図２】本発明の第２の方法の手順を説明する図である。
【図３】実施例１及び比較例１で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図４】実施例２で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図５】実施例３で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図６】実施例４で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図７】実施例５で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図８】実施例６で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図９】実施例７で行ったリアルタイムＰＣＲでの蛍光強度の変化を示す図である。（Ａ）はバルジ生成プローブを用いることによりメチルシトシンを検出できたことを示しており、（Ｂ）は酸化処理することによりメチルシトシンを検出できたことを示している。
【図１０】実施例７で行ったリアルタイムＰＣＲの増幅産物量を比較したグラグである。
【図１１】実施例８で行った矩形波ボルタンメトリー測定の結果を示す図である。
【図１２】実施例９で行った蛍光強度の測定の結果を示す図である。
【図１３】実施例１０で行った蛍光強度の測定の結果を示す図である。
【図１４】実施例１１で行った電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）メチルシトシン検出方法
ＤＮＡ試料中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、目的とする塩基であるシトシン又はメチルシトシンがバルジ構造又はミスマッチを形成するようＤＮＡ試料とガイドプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、バルジ構造又はミスマッチを形成する目的塩基に特異的な反応を誘導し、この反応の有無によりメチル化を検出する第２工程とを含む方法である。【００２２】
「目的塩基のバルジ構造」とは、ＤＮＡ試料とプローブとで形成される２本鎖核酸において、塩基対を形成せずに２本鎖から外部に飛び出した、目的塩基（シトシン又はメチルシトシン）を含むヌクレオチドからなる膨らみをいう。【００２３】
第２工程がメチルシトシンに特異的な反応を誘導するものである場合、第２工程は、それには限定されないが、バルジ構造又はミスマッチを形成するシトシン又はメチルシトシンを酸化処理する第２Ａ工程と、目的塩基の酸化の有無（具体的には、炭素原子の酸化の有無）を検出する第２Ｂ工程とを含むものとすることができる。第２Ｂ工程では、酸化反応物が検出されれば目的塩基がメチルシトシンであると判定することができる。【００２４】
さらに、第２Ｂ工程における判定方法により、第１及び第２の二つの方法に分類される。第１工程は、両方法で共通である。【００２５】
また、第２工程がシトシンに特異的な反応を誘導するものである場合、第２工程は、それには限定されないが、目的塩基を重亜硫酸塩処理する第２Ｃ工程と、目的塩基のウラシルへの変化の有無を検出する第２Ｄ工程とを含むものとすることができる。第２Ｄ工程では、ウラシルになっている場合に目的塩基がシトシンであると判定することができる。この方法を第３の方法とする。【００２６】
そして更に、第２工程は、第１工程で得られたハイブリダイズ産物において、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第２Ｅ工程と、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクの有無を検出する第２Ｆ工程とを含むものとすることができる。第２Ｆ工程では、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料がクロスリンクされている場合に目的塩基がメチルシトシンであると判定することができる。この方法を第４の方法とする。
ＤＮＡ試料
ＤＮＡ試料は、血液、尿、痰、精液、髪、皮膚などの生体サンプルそのものであってもよく、生体サンプルから単離されたものであってもよいが、単離されたＤＮＡを用いることが好ましい。
ハイブリダイゼーション
前述したように、ＤＮＡ試料中の目的塩基に特異的な反応を誘導するためには、酸化剤などが目的塩基に接近する必要があるが、通常各ヌクレオチドは２本鎖ＤＮＡのらせん構造中に埋没していて、酸化剤が接近できない。【００２７】
従って、本発明方法では、一つの選択肢として、シトシンであるかメチルシトシンであるかが問題となる目的塩基のみ塩基対を形成せずにその塩基を有するヌクレオチドが外部に飛び出した２本鎖ＤＮＡを作製する。このためには、例えば、ＤＮＡ試料の目的塩基を有するヌクレオチドを除く領域、即ち目的塩基を有するヌクレオチドを除きそれに隣接する両側の領域と相補的なガイドプローブとＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせる。このガイドプローブは、２本鎖ＤＮＡから飛び出した、目的塩基を有するヌクレオチドの「バルジ」を形成するためのバルシ生成プローブである。【００２８】
プローブは上記両側の領域に相補的である。メチルシトシンの他にチミンもピリミジン環の５位炭素にメチル基を有するため酸化を受け易い。従って、チミンの誤検出を避ける必要があるため、プローブは上記両側の領域に相補的なものとする。また、目的塩基のみ塩基対を作らないように設計され、これにより目的塩基に隣接してチミンが存在していても、それが酸化されてメチルシトシンの誤検出の原因となることがない。【００２９】
また本発明方法では、第２の選択肢として、目的塩基のみミスマッチするようにして２本鎖ＤＮＡを作製する。ミスマッチによって孤立したメチルシトシンは、バジル構造を形成した場合と同様に、酸化を受け易い。目的塩基のみでミスマッチさせるには、ＤＮＡ試料との間で目的塩基のみミスマッチするようなガイドプローブとＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせればよい。このガイドプローブは、２本鎖ＤＮＡ中でミスマッチ塩基対からなる緩んだ構造を形成するためのミスマッチ生成プローブである。ミスマッチ生成プローブとＤＮＡ試料との間では、ミスマッチ塩基対を除き全ての塩基対が相補的である。【００３０】
ガイドプローブの好適な長さは各方法で異なっており、通常、２０〜１００塩基程度が好ましく、２０〜５０塩基程度がより好ましい。中でも、第１の方法では４０〜１００塩基程度が好ましく、５０〜８０塩基程度がより好ましい。また、この程度の長さであれば、安定に２本鎖を形成できるとともに、ＤＮＡ自動合成機で合成することができる。第１の方法では、後述するように、プローブとの２本鎖形成領域に対してＰＣＲなどの核酸増幅を行う場合があるため、ＰＣＲプライマーが結合できる程度の長さのプローブが必要となる。【００３１】
また、ガイドプローブを、どの位置にバルジ又はミスマッチを形成するように設計するかは特に限定されない。好ましくは、目的塩基のバルジ又はミスマッチを２本鎖の中央付近に形成できるように設計すればよい。【００３２】
ガイドプローブは、上記領域とハイブリダイズできるようにそれに相補的なものであればよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、修飾核酸などのいずれであってもよい。ＤＮＡ試料として細胞抽出液のようにヌクレアーゼを含むものを用いる場合は、修飾核酸プローブとすることによりヌクレアーゼによる分解を受け難くなる。修飾核酸としては、ホスホロチオエート修飾核酸、モルホリノ修飾核酸、２'−Ｏ−アルキル核酸、２'−Ｎ−アルキル核酸、２'−Ｓ−アルキル核酸、２'−ハロゲン核酸などが挙げられる。また、ハイブリダイゼーションを安定化するため、プローブの配列中に２−アミノアデニン、５−アルキニルウリジンのような修飾塩基を有するヌクレオチドを配したり、プローブの末端又は内部をアミン、ポリアミン等で修飾したり、プローブの末端にジデオキシヌクレオチドを付加したりすることもできる。【００３３】
また、核酸プローブは、ビーズ状又は平板状の担体に固定されていることが好ましく、これにより、プローブに結合したＤＮＡ試料に対して順次異なる処理を行ったり、処理間にＤＮＡ試料を洗浄することができる。また、プローブの再利用が可能となる。このような担体材料として、例えば、ポリスチレン、金、ガラス、磁性を持つ酸化鉄微粒子、量子ドット性を持つ硫化亜鉛微粒子などが挙げられる。【００３４】
ハイブリダイゼーションの条件は特に限定されない。ＤＮＡ試料の種類、プローブの長さなどによって異なるが、例えば、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液などのハイブリダイゼーション溶液を用いて室温〜１００℃程度で５分間〜１時間程度処理した後、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液などを用いて５〜２５℃程度で１〜５分間程度洗浄する条件が挙げられる。
＜第１の方法・第２の方法＞
酸化処理
第１、第２の方法では、第２工程において目的塩基を含むハイブリダイズ産物を酸化剤で処理し、目的塩基がメチルシトシンである場合は、メチル基を有する炭素原子を酸化する（第２Ａ工程）。メチルシトシンとしては５−メチルシトシンが代表的である。５−メチルシトシンは、シトシンに比べて、ピリミジン環の５位炭素原子が酸化され易いため、酸化処理物を比較して、酸化反応物の有無を検出すること（第２Ｂ工程）により両者を識別できる。【００３５】
ＤＮＡ試料の５−メチルシトシン部分の酸化反応後の構造の代表例としては、下記の式（３）で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基、又は下記の式（４）で示されるエポキシ置換ピリミジル基が挙げられる。【００３６】
【化４】
0005167485.tif 000005
【００３７】
【化５】
0005167485.tif 000006
【００３８】
本発明方法では、炭素原子を酸化できる公知の酸化剤を制限なく使用できる。このような酸化剤として、ピリミジン環の５位炭素原子と６位炭素原子との間の２重結合を酸化できる酸化剤、例えば、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）のような過マンガン酸塩；四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）、オスミウム酸カリウム（Ｋ２ＯｓＯ４）のようなオスミウム酸塩、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ４）のようなタングステン酸塩、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａIＯ４）のような過ヨウ素酸塩、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）、過安息香酸及びその置換体（ｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）、３，５−ジニトロ過安息香酸）、ヨウ素（Ｉ２）、酸化レニウム（Ｒｅ２Ｏ７）、過酢酸（ＡｃＯＯＨ）及びその置換体、マンガン−サレン錯体などが挙げられる。【００３９】
また、上記の炭素−炭素２重結合を酸化できる酸化剤が還元状態になったときにこれを再酸化する作用のある酸化剤も使用できる。このような再酸化剤として、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド（ＮＭＯ）、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）等が挙げられる。２重結合の酸化剤とその再酸化剤とを含むものとしてオキソン（Oxone）（デュポン社製）・重過硫酸カリウム（ＫＨＳＯ５）のような重過硫酸塩が挙げられる。【００４０】
その他、酸化バナジウムアセチルアセトナート、酸素、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）のような次亜塩素酸塩、ジメチルジオキシランなどの酸化補助剤も使用できる。【００４１】
酸化処理は、酸化剤の種類に応じた濃度（例えば0.1〜1000 mM）の酸化剤水溶液をハイブリダイズ産物に添加して、温度０〜４０℃程度で１分間〜１時間程度行えばよい。酸化処理は、ｐＨ７〜９程度の塩基性条件下で行うことが好ましく、これにより酸化速度が高くなりシトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。また上記ｐＨ範囲内であれば、２本鎖が安定に保たれる。【００４２】
上記範囲内で、酸化剤の種類に応じて適した条件を選択すればよい。また、例えばオスミウム酸塩にはフェリシアン化カリウムやメチルモルホリンオキシド等の酸化活性化剤を併用することができる。【００４３】
また、酸化反応液に、ピリジン、ビピリジン、又はフェナンスロリンのような酸化剤に配位できる化合物を１０〜５００ｍＭ程度添加することにより反応速度が高くなる。なお、ビピリジンを添加して酸化処理を行う場合、式（３）で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基を生成させるには、Na2SO3のような亜硫酸塩で処理することが必要である。このような亜硫酸塩による処理条件は公知である。【００４４】
さらに、ピリジン、ビピリジン又はフェナンスロリンの存在下で、炭素−炭素２重結合を酸化できる酸化剤と再酸化剤とを併用するには、酸化速度が著しく高くなり、その結果、シトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。再酸化剤の使用量は、その種類により異なるが、通常１０ｍＭ〜１Ｍ程度とすることができ、１０〜１００ｍＭ程度が好ましい。
第１の方法
第１の方法を図１を参照しながら説明する。【００４５】
第１の方法では、ハイブリダイズ産物に含まれる目的塩基の酸化処理物を塩基性物質で処理する。これにより、酸化されたメチルデオキシシチジル酸が、酸化されたメチルシトシンと糖とに分解されるとともに、酸化されたメチルデオキシシチジル酸とそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が加水分解される。従って、第１の方法では、塩基性物質処理によりこのような分解が生じるような酸化剤を用いる。塩基の炭素原子を酸化できる酸化剤であれば、塩基性物質処理によりこのような分解が生じる。このような酸化剤として、例えば、上記例示したものを使用できる。中でも、酸化反応効率の点で、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、オスミウム酸カリウムのようなオスミウム酸塩が好ましく、四酸化オスミウムがより好ましい。【００４６】
酸化処理に続き、塩基性物質処理を行う（図１ａ）。目的塩基がメチルシトシンであればメチルシトシンが酸化されるため、プローブとハイブリダイズした領域は塩基性物質処理により目的塩基を有するヌクレオチドの部分で切断される。一方、目的塩基がシトシンであればシトシンは酸化されないため、プローブとハイブリダイズした領域は塩基性物質処理によっても切断されない。従って、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接する両ヌクレオチドとの間の少なくとも１つのホスホジエステル結合が分解されたか否かを判定すれば、目的塩基が酸化されたか否か、ひいては目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを判定することができる。即ち、塩基性物質処理によって、メチルシトシン部分で特異的な切断が生るため、生成するＤＮＡ断片の大きさを測定することによって、メチルシトシンの有無が判定できる。【００４７】
このような塩基性物質としては、例えばピペリジン、アニリン等の窒素含有塩基性物質を用いることができる。中でも、反応効率がよい点で、ピペリジンが好ましい。【００４８】
塩基性物質による処理は、その種類に応じて適切な濃度の水溶液をＤＮＡ試料に添加し、６０〜１００℃程度で１分間〜１時間程度行えばよい。【００４９】
ホスホジエステル結合の分解の有無は、塩基性物質処理により得られるＤＮＡ断片のうち目的塩基を有するヌクレオチドを含むものの大きさを検出することにより知ることができる。【００５０】
例えば、塩基処理後のＤＮＡ試料の目的塩基を有するヌクレオチドを含む領域に対して核酸増幅を行い、このＤＮＡ領域全体が増幅したか否かを電気泳動などで検出することにより、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が分解されたか否かが分かる。代表的には、プローブとハイブリダイズさせた領域全体を増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動に供すればよい（図１ｂ）。特に、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行うときには、ＰＣＲのサイクル毎の増幅効率をモニタリングすることができるため、増幅の有無を効率よく検出できる。また、採取した細胞群の中でどの程度の細胞がメチル化されているかを定量することができる。【００５１】
また、質量分析によりＤＮＡ断片の重さを測定したり、水晶発振子マイクロバランスを用いた電気化学的分析により、ホスホジエステル結合の有無を調べることによっても、目的塩基を有するヌクレオチドヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が分解されたか否かを検出することができる。さらに、表面プラズモン共鳴によるＤＮＡ断片の重量に対する応答量を検出することによってもホスホジエステル結合が分解されたか否かを検出することができる。【００５２】
第２の方法
第２の方法では、ハイブリダイズ産物に含まれる目的塩基の酸化処理物を特異的に検出することにより、目的塩基の酸化の有無を判定する。【００５３】
第２の方法では、通常目的塩基を酸化処理する前（第２Ａ工程前）に、１本鎖ＤＮＡ特異的なエキソヌクレアーゼで処理することにより、プローブとハイブリダイズしていない1本鎖の部分を除去しておくことが望ましい。これにより、プローブとハイブリダイズしない領域にメチルシトシンが存在していても、それによる誤検出を避けることができる。エキソヌクレアーゼの種類は特に限定されず、公知のものを使用することができる。このようなエキソヌクレアーゼは、例えばＵＳＢ社から市販されている。なお、エキソヌクレアーゼ処理は、目的塩基を酸化処理した後に行ってもよい。また、エキソヌクレアーゼ処理は、第２の方法だけでなく、第１の方法や第３の方法において行ってもよい。【００５４】
第２の方法の具体的実施態様としては、ハイブリダイズ産物に含まれる目的塩基を酸化処理して、式（３）で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基又は式（４）で示されるエポキシ置換ピリミジル基を形成させた後、これらの基を検出する方法（以下、第2-2の方法と表記する）が挙げられる。また、第２の方法の他の実施態様としては、ハイブリダイズ産物に含まれる目的塩基に対して、オスミウム酸塩及びビピリジル化合物を用いて処理して、下記の式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させた後、当該オスミウム含有複素環基を検出する方法（以下、第2-2の方法と表記する）が挙げられる。なお、本明細書において「第２の方法」と表記する場合には、上記第2-1の方法と第2-2の方法の双方を包含する意を示す。【００５５】
【化６】
0005167485.tif 000007
【００５６】
以下、第２の方法を上記第2-1の方法と第2-2の方法に分けて説明する。
第2-1の方法
第2-1の方法では、前述したようにして、酸化処理を行う（第２Ｂ工程）。第2-1の方法では、上記例示した炭素原子を酸化できる酸化剤を制限なく使用できる。中でも、反応速度が大きい点で、過マンガン酸カリウムのような炭素−炭素２重結合を酸化できる酸化剤が好ましい。【００５７】
次いで、酸化処理物を標識処理する。目的塩基がメチルシトシンであれば、前述の酸化処理によりジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基が生成するため、例えば化合物（１）を作用させることにより、下記のようにしてジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基が標識物質Ｒで標識される。標識は、酵素標識、蛍光標識、又は放射標識のいずれであってもよい。【００５８】
【化７】
0005167485.tif 000008
【００５９】
また、例えば化合物（２）を作用させることにより、下記のようにしてジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基が標識物質Ｒで標識される。【００６０】
【化８】
0005167485.tif 000009
【００６１】
上記化合物（１）及び（２）において、Ｒは標識物質を示す。【００６２】
また、ジヒドロキシ置換ピリミジル基又はエポキシ置換ピリミジル基をさらに別の官能基に変換してそれを介して標識物質を結合させることもできる。この方法の１例を図２を参照して説明する。図２において、１本鎖ＤＮＡ特異的なエキソヌクレアーゼで処理して、プローブとハイブリダイズしていない1本鎖の部分を除去した後（図２ａ）、酸化処理を行う（図２ｂ）。【００６３】
酸化処理した目的塩基に対して、さらに第２の酸化処理を行う。酸化剤の種類は特に限定されず、例えば上記例示したものを使用できる。中でも、過ヨウ素酸塩が好ましい。この酸化処理は、０〜４０℃程度で１分間〜１時間程度行えばよい。ＤＮＡ断片中に、前述の式（３）で示されるジヒドロキシ置換ピリミジル基、又は式（４）で示されるエポキシ置換ピリミジル基が存在していれば、いずれか一方の水酸基又はエポキシ基がアルデヒドに変換される（図２ｃ）。【００６４】
次いで、標識物質を用いてこのアルデヒドを検出する。標識物質とアルデヒドとの結合には、アルデヒドと反応してイミノ基を形成するような官能基を使用することができ、このような官能基として、ＮＨ２ＮＨ−又はＮＨ２Ｏ−などを挙げることができる（図２ｄ）。【００６５】
標識物質は、標識酵素、蛍光物質、放射性物質などのいずれであってもよい。中でも、標識酵素は酵素反応により検出感度が高くなる点で好ましい。標識酵素は特に限定されず、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ガラクトシダーゼなどの公知の標識酵素を制限なく使用できる。これらの酵素の発色基質は周知である。ＨＲＰで標識する場合は例えばＨＰＰＡ、オルトフェニレンジアミン、ＴＭＢＺのような発色基質を用いればよい。中でもＨＰＰＡは蛍光を発するため検出感度が高くなる。またアルカリフォスファターゼで標識する場合は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰのような発色基質を用いればよい。ガラクトシダーゼで標識する場合はｘ−ｇａｌのような発色基質を用いればよい。【００６６】
アルデヒドをイミノ基を介して標識するにあたっては、例えばビオチン−アビジン反応を利用することができる。詳述すれば、ＤＮＡ側のアルデヒドと、ＮＨ２ＮＨ−又はＮＨ２Ｏ−を結合させたビオチン誘導体とを反応させて、末端をビオチンとする。これに対してアビジンを結合させた標識物質を作用させて、５〜４０℃程度で１分間〜１時間程度反応させることによりビオチン−アビジン結合を形成すればよい。ビオチンとアビジンとの位置関係を逆にすることもできる。これにより、イミノ基及びビオチン−アビジン結合を介してアルデヒドを標識することができる。【００６７】
例えば標識酵素を使用する場合、その存在は発色基質との反応により検出できる。酵素反応により基質が発色すれば、目的ヌクレオチドの塩基にアルデヒドが存在していたこと、ひいては、目的ヌクレオチドが酸化されたこと、及び目的塩基がメチルシトシンであることが分かる。
第2-2の方法
第2-2の方法では、まず、ハイブリダイズ産物に対して、オスミウム酸カリウムのようなオスミウム酸塩と共に式（Ａ）で示されるビピリジン化合物を作用させて処理を行い、酸化反応物である式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させる。【００６８】
【化９】
0005167485.tif 000010
【００６９】
【化１０】
0005167485.tif 000011
【００７０】
式（５）及び（Ａ）において、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又は置換アルキル基を示す。アルキル基、又は置換アルキル基のアルキル基部分としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜６のアルキル基が例示される。置換アルキル基の置換基としては、例えばハロゲン原子、シアノ基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、低級アルコキシ基、低級アルカノイルオキシ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、低級アルコキシカルボニルアミノ基、（Ｎ−アミノ低級アルキル）アミノカルボニル基、低級アルキルスルホンアミド基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基等が挙げられる。ここで、「低級アルキル」とは、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜６のアルキル基であり、その具体例は、前記で例示した基が挙げられる。また、置換アルキル基の置換基の数は、１又は２以上であればよく、好ましくは１又は２である。【００７１】
特に、式（Ａ）で示されるビピリジン化合物の中でも、以下の式で示される化合物（以下、Bipyridyl Ligand 4と表記する）は、簡便に標識物質を結合できるように設計されており、好適である。【００７２】
【化１１】
0005167485.tif 000012
【００７３】
Bipyridyl Ligand 4の合成は、公知の方法に従って行うことができるが、代表的な合成経路としては、以下の化学式に示す合成経路が例示される。【００７４】
【化１２】
0005167485.tif 000013
【００７５】
オスミウム酸塩と式（Ａ）で示されるビピリジン化合物の使用量としては、特に制限されないが、通常、オスミウム酸塩を0.1〜1000ｍＭ程度、及び式（Ａ）で示されるビピリジン化合物を0.1〜1000ｍＭ程度とすることができ、オスミウム酸塩を1〜100ｍＭ程度、及び式（Ａ）で示されるビピリジン化合物を10〜100ｍＭ程度が好ましい。【００７６】
また、オスミウム酸塩及びビピリジンに加えて、フェリシアン化カリウムやメチルモルホリンオキシド等の酸化活性化剤を併用することができる。これらの酸化活性剤を併用する場合、その使用量は、通常0.1〜100ｍＭ程度、好ましくは0.1〜50ｍＭ程度に設定することができる。【００７７】
上記酸化処理は、温度0〜40℃程度で30秒〜1時間程度行えばよい。また、上記酸化処理は、ｐＨ７〜９程度の塩基性条件下で行うことが好ましく、これにより酸化速度が高くなりシトシンとメチルシトシンとを一層明確に区別できるようになる。また上記ｐＨ範囲内であれば、２本鎖が安定に保たれる。【００７８】
次いで、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の検出を行う。当該オスミウム含有複素環基は、例えば、以下の３つの検出方法に従って検出することができる。
（検出方法１）
検出方法１は、標識物質により式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、標識化された当該オスミウム含有複素環基を検出する工程とを行う。式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の標識は、酵素標識、蛍光標識、電気化学的標識、又は放射標識のいずれであってもよい。中でも、アントラキノンによる標識は、電気化学的に検出可能であり、簡便な検出ができる点で利点がある。式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の標識は、ポスト修飾法等の公知の方法に従って実施される。例えば、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基が形成された酸化処理物と、アントラキノンに−ＮＨＳを結合させたアントラキノン誘導体とを反応させることにより、アントラキノン標識オスミウム含有複素環基を得ることができる。当該アントラキノン標識オスミウム含有複素環基としては、具体的には、式（６）で示される基が例示される。【００７９】
【化１３】
0005167485.tif 000014
【００８０】
（式中、ＡＱとはアントラキノンを示す。Ｒ２は前記と同じ。）
標識化された当該オスミウム含有複素環基の検出は、標識物質の種類に応じた公知の方法で実施される。例えば、標識物質がアントラキノンの場合であれば、矩形波ボルタンメトリー（Square wave voltammetry）測定等の電気化学的な手法を用いて検出することができる。【００８１】
（検出方法２）
検出方法２では、蛍光物質を結合させたガイドプローブを使用して第１工程を実施した上で、以下の工程：
当該蛍光物質に対してFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じさせる蛍光物質を用いて式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を標識する工程と、
FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）の有無を測定する工程と、
を行う。【００８２】
当該検出方法２において、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基が存在する場合には、ガイドプローブに結合した蛍光物質と、オスミウム含有複素環基に結合した蛍光物質との間にFRETが生じて、ガイドプローブに結合した蛍光物質の蛍光波長領域又は蛍光強度に変化が認められる。一方、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基が存在しない場合には、ガイドプローブに結合した蛍光物質の蛍光波長領域又は蛍光強度に変化は認められない。【００８３】
当該検出方法２を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、蛍光物質の結合位置については特に限定されないが、バルジ構造を形成させるバルジ生成プローブの場合であれば、ＤＮＡ試料の目的塩基に隣接する塩基に対して、塩基対を形成する塩基に蛍光物質が結合されていることが好ましい。また、ミスマッチを形成させるミスマッチ生成プローブの場合であれば、目的塩基に対してミスマッチする塩基に蛍光物質が結合されていることが好ましい。【００８４】
FRETが生じる蛍光物質の組み合わせとしては、例えば、ＨＥＸとフルオレセイン；TAMRAとフルオレセイン；Cy3とCy5等が例示される。【００８５】
（検出方法３）
検出方法３では、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の存在によって消光する蛍光物質を結合させたガイドプローブを使用して第１工程を実施した上で、当該蛍光物質の消光の有無を測定する。当該検出方法３では、オスミウム含有複素環基が存在する場合には、ガイドプローブに結合させた蛍光物質の消光が認められる。【００８６】
検出方法３を採用する場合に、第１工程で使用されるガイドプローブとしては、具体的には、下記の式（７）で示される基が結合している塩基を含むガイドプローブが例示される。当該ガイドプローブにおいて、式（７）で示される基の結合部位については、該基が結合する塩基の種類に応じて適宜設定される。式（７）で示される基の結合部位の好適な例としては、結合対象となる塩基がアデニン又はグアニンの場合にはプリン環の６位の炭素に結合している窒素原子又は酸素原子が挙げられ；結合対象となる塩基がシトシン又はチミンの場合にはピリミジン環の４位の炭素に結合している窒素原子又は酸素原子、或いはピリミジン環の５位の炭素が挙げられる。【００８７】
【化１４】
0005167485.tif 000015
【００８８】
また、当該検出方法３を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、式（７）で示される基の結合位置については特に限定されないが、バルジ生成プローブの場合であれば、ＤＮＡ試料の目的塩基に隣接する塩基に対して、塩基対を形成する塩基に式（７）で示される基が結合されていることが好ましい。また、ミスマッチ生成プローブの場合であれば、目的塩基に対してミスマッチする塩基に式（７）で示される基が結合されていることが好ましい。【００８９】
＜第３の方法＞
第３の方法では、第２Ｃ工程において、目的塩基を重亜硫酸塩で処理する。この処理により、目的塩基がシトシンであればそれがウラシルに変化する。従って、第２Ｄ工程では、ウラシルになっているか否かを検出する。ウラシルになっている場合は目的塩基がシトシンであると判定することができる。【００９０】
重亜硫酸塩（酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのいずれであってもよい。またこの処理は、濃度０．１〜１０Ｍ程度、温度５〜９５℃程度で、０．５〜６０分間程度行えばよい。【００９１】
ウラシルの検出方法としては、それには限定されないが、重亜硫酸塩処理された目的塩基を有するハイブリダイズ産物を、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼで処理し、次いで塩基性物質で処理した後、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が分解されたか否かを検出する方法が挙げられる。【００９２】
目的塩基がウラシルに変化している場合、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ処理によりウラシルと糖との間のＮ−グリコシド結合が加水分解される。次いで、塩基性物質処理することにより、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接する両ヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が分解される。ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ処理は、例えば０〜５０℃程度で１〜３０分間程度行えばよい。塩基性物質処理については、第１の方法で説明した通りである。【００９３】
また、目的塩基を有するヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合が分解されたか否かは、第１の方法について説明した通り、例えば目的塩基を有するヌクレオチドを含む領域に対する核酸増幅などにより検出することができる。【００９４】
また、重亜硫酸塩処理された目的塩基を有するハイブリダイズ産物に対して、目的塩基がウラシルである場合にのみ増幅するようなプライマーを用いた核酸増幅を行うことによっても、目的塩基がウラシルに変化しているか否かを検出することができる。また、目的塩基がウラシルであってもメチルシトシンであっても増幅させることができるようなプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅産物の大きさの僅かな差異(ウラシルとメチルシトシンとの差)を検出することによっても、それがウラシルであるかメチルシトシンであるかを検出することができる。【００９５】
さらに、重亜硫酸塩処理されたハイブリダイズ産物をウラシルＤＮＡグリコシダーゼ処理したものに対して、目的のヌクレオチドが塩基を有さないヌクレオチドであってもメチルシトシンを有するヌクレオチドであっても増幅させることができるようなプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅産物の大きさの僅かな差異（メチルシトシンの大きさの差異）を検出することによっても、目的塩基がウラシルであるかメチルシトシンであるかを検出することができる。【００９６】
＜第４の方法＞
第４の方法は、第１工程において、メチルシトシンと特異的に結合可能な基が結合したガイドプローブを使用してハイブリダイゼーションを行った上で、以下の工程：
第１工程で得られたハイブリダイズ産物において、前記ガイドプローブとＤＮＡ試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる第２Ｅ工程と、
前記ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクの有無を検出する第２Ｆ工程と、
を実施する。【００９７】
第４の方法において、ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクが検出されると、目的塩基がメチルシトシンであると判定される。一方、ガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクが検出さればければ、目的塩基がシトシンであると判定される。【００９８】
検出方法４を採用する場合に、第１工程で使用されるガイドプローブは、メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基が結合されてなるものである。当該ガイドプローブに結合している「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」は、当該ガイドプローブとＤＮＡ試料がハイブリダイズした状態で、バルジ構造又はミスマッチを形成しているメチルシトシンと結合可能である限り、特に限定されるものではないが、好適な一例として、下記の式（８）で示される基が例示される。式（８）中、Ｒ２は前記と同様である。【００９９】
【化１５】
0005167485.tif 000016
【０１００】
（式（８）中、Ｒ２は前記と同じ。）
また、第４の方法を採用する場合に使用されるガイドプローブにおいて、「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」の結合位置については特に限定されないが、バルジ生成プローブの場合であれば、ＤＮＡ試料の目的塩基に隣接する塩基に対して、塩基対を形成する塩基に「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」が結合されていることが好ましい。また、ミスマッチ生成プローブの場合であれば、目的塩基に対してミスマッチする塩基に「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」が結合されていることが好ましい。【０１０１】
第４の方法において、第２Ｅ工程の前に、第２の方法と同様に、１本鎖ＤＮＡ特異的なエキソヌクレアーゼで処理することにより、プローブとハイブリダイズしていない1本鎖の部分を除去しておいてもよい。【０１０２】
第２Ｅ工程において、ガイドプローブとＤＮＡ試料中のメチルシトシンとをクロスリンクさせる条件は、ガイドプローブに結合している「メチルシトシンに対して特異的に結合可能な基」の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、式（８）で示される基が結合しているガイドプローブを使用する場合には、オスミウム酸塩を0.1〜1000ｍＭ程度、好ましくは1〜100ｍＭ程度の存在下で、0〜40℃程度で30秒〜1時間程度処理すればよい。かかる処理は、ｐＨ６〜７程度のｐＨ条件下で実施することが望ましい。更に、かかる処理では、フェリシアン化カリウムやメチルモルホリンオキシド等の酸化活性化剤を、0.1〜100ｍＭ程度、好ましくは0.1〜50ｍＭ程度添加して実施することにより、前記クロスリンクの形成速度を高めることができる。【０１０３】
なお、第２Ｅ工程は、第１工程と同時に実施してもよい。即ち、ガイドプローブ、ＤＮＡ試料、その他クロスリンク形成に必要な化合物を同時に混合し、所定の条件で反応させることにより、第４の方法を実施することもできる。【０１０４】
第２Ｆ工程は、簡便には、ＤＮＡ試料の質量分析又はゲル電気泳動による分子量の測定を行うことによって実施される。詳述すれば、以下の通りである。ガイドプローブとＤＮＡ試料とがクロスリンクしていれば、ハイブリダイズできない条件下でも、両者が結合した状態で存在する。一方、ガイドプローブとＤＮＡ試料とがクロスリンクしていなければ、ハイブリダイズできない条件下では、両者は分離して存在する。従って、ハイブリダイズできない条件下で、ＤＮＡ試料の質量分析又はゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ試料の重量又は分子量が増加していれば、ガイドプローブと被験ＤＮＡとがクロスリンクしており、ＤＮＡ試料の重量又は分子量に変動がなければ、ガイドプローブとＤＮＡ試料はクロスリンクしていないと判定される。【０１０５】
（ＩＩ）メチルシトシン検出用キット
本発明の第１のキットは、上記説明した本発明のメチルシトシン検出方法の内、第１又は第２の方法に供するキットである。このキットは、上記説明したガイドプローブとメチルシトシンを酸化できる試薬とを備える。メチルシトシンを酸化できる試薬は、代表的には前述した炭素原子を酸化できる酸化剤であるが、このような酸化剤に変化する前駆体もメチルシトシンを酸化できる試薬に含まれる。【０１０６】
また、第１の方法に供するものである場合は、さらに上記説明した塩基性物質を備えていればよい。さらに、ＰＣＲ試薬のセットを備えることが好ましい。【０１０７】
また、第2-1の方法に供するものである場合は、さらに、１本鎖ＤＮＡを特異的に分解できるエキソヌクレアーゼと、末端にＮＨ２ＮＨ−基、又はＮＨ２Ｏ−基を有するビオチン又はアビジンと、アビジン又はビオチンと結合した標識酵素と、この標識酵素の発色基質とを備えていればよい。また、第2-1の方法に供するキットとして、さらに、１本鎖ＤＮＡを特異的に分解できるエキソヌクレアーゼと、前述の式（１）の化合物、又は式（２）の化合物を備えるものも挙げられる。【０１０８】
また、第2-2の方法に供するものである場合は、酸化剤としてオスミウム酸塩が使用され、更にビピリジンを含むものが挙げられる。【０１０９】
また、上記説明した第３の方法に供する第２のキットは、バルジ生成プローブと、重亜硫酸塩とを備える。さらに、ＰＣＲ試薬のセットを備えることが好ましい。【０１１０】
また、上記説明した第４の方法に供する第３のキットは、上記説明したガイドプローブと、上記説明したガイドプローブとＤＮＡ試料とのクロスリンクさせるための試薬とを備える。【０１１１】
（ＩＩＩ）メチルシトシン検出用核酸チップ
基体上に、１種以上のガイドプローブが固定された核酸チップを用いれば、様々な遺伝子について様々な位置のシトシンのメチル化の有無を、一度に検出することができる。【０１１２】
プローブは、上記説明したプローブであるが、複数の目的塩基を判定できるように互いに異なるプローブを用いればよい。【０１１３】
この核酸チップの基体の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金などの公知の材料を用いることができる。基体上へのプローブのスポット径は例えば５０〜２００μｍ程度とすることができ、スポットピッチは例えば１００〜５００μｍ程度とすることができる。【０１１４】
この核酸チップ上のプローブ群に対して、上記説明した本発明方法の各操作を行えばよい。【０１１５】
第１の方法では、核酸チップ上のプローブ群に対して、同時にＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物を例えば、蛍光、吸収、蛍光偏光、蛍光寿命などを測定できるマイクロプレートリーダー（例えば、Berthold社のMithras LB940などの市販品）、マイクロチップリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光イメージャーなどにより検出すればよい。これにより、チップ上の各ＤＮＡ断片の大きさを検出でき、ひいては複数のＤＮＡ試料の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを一度に判定することができる。【０１１６】
また、第２の方法では、チップ上の発色パターンを、上記と同様にしてマイクロプレートリーダー等を用いて読み取ることができ、これにより、複数のＤＮＡ試料の目的塩基がシトシンであるかメチルシトシンであるかを一度に判定することができる。【０１１７】
第３の方法では、チップ上のプローブ群に対して、同時にＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物をマイクロプレートリーダーなどにより検出すればよい。【０１１８】
（ＩＶ）メチルシトシン検出装置
本発明のメチルシトシン検出装置は、上記説明した核酸チップと、チップ上の発色パターンを検出できる装置とを備える装置である。発色パターンの検出装置としては、蛍光、吸収、蛍光偏光、蛍光寿命などを測定できるマイクロプレートリーダー、マイクロチップリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光イメージャーなどが挙げられる。
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例及び比較例において、表記「mC」は５−メチルシトシンを意味する。
実施例１（第１の方法）
ここでは、PCRを行わずにDNA断片の大きさを電気泳動により検出するために、先ず、標的DNAを放射標識した。即ち、T4 polynucleotide kinase 2μL及び[γ-32P]ATP 4μLを、標的DNA断片の100 μM水溶液の4μLと混合させ、水を加えてtotal 20μLにした。メチルシトシンを含むDNA試料は、13mer DNA(5'-GCGTTGCGTTGCG)（配列番号１）であり、メチルシトシンを含むDNA試料は13merDNA(5'-GCGTTGnGTTGCG；nはmCを示す)（配列番号２）である。配列番号１のDNAは塩基番号７のヌクレオチドの塩基がシトシンであり、配列番号２のDNAは塩基番号７のヌクレオチドの塩基がメチルシトシンである。【０１２０】
この混合液を37℃で40分間静置して、5'末端の標識化を行った。反応溶液を15% polyacrylamide / 7 M ureaゲル電気泳動に供して、標的DNA断片を精製した。【０１２１】
次いで、ラベル化を行ったDNA 10μLとプローブとなる12merのDNA (5'-CGCAACCAACGC)（配列番号３）の1.33μM水溶液の20μLを300 mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0に溶解させ、水を加えてtotal 50μLにし、室温中で二本鎖を形成させた。【０１２２】
次いで、この二本鎖に5 mMカコジル酸緩衝液pH 6.0に溶解させた3.2 mMのKMnO4水溶液の50μLを加え酸化反応を開始させた。３分間静置後、1.5 M酢酸ナトリウム緩衝液pH 7.0に溶解させたβ-mercaptoethanol (1 M)を50μL添加し反応を終了させた。【０１２３】
反応後サンプルをエタノール沈澱により精製し、続いて1 M piperidine 50μLを加えて90℃で60分間静置した。【０１２４】
その後、真空乾燥し、水を加えた反応サンプルを、LSCを用いて放射線量を一定になるように調製した後、15% polyacrylamide / 7 M ureaゲル電気泳動で解析した。切断バンドの確認はMaxam-Gilbert G+A reactionを行ったレーンと比較することにより決定した。【０１２５】
比較例１
実施例１において、プローブとして、13merのDNA (5'-CGCAACGCAACGC)（配列番号４）を用いた他は、実施例１と同様の操作を行った。【０１２６】
配列番号４の下線を付したGは、DNA試料の配列番号１の塩基番号７のC、又は配列番号２の塩基番号７のmCと塩基対を形成させるためのものである。【０１２７】
電気泳動の結果を図１に示す。図１のレーン１は配列番号１のDNA試料(13mer；mC)に対して配列番号３のプローブ(12mer)をハイブリダイズさせた結果を示し、レーン２は配列番号２のDNA試料(13mer;C)に対して配列番号３のプローブ(12mer)をハイブリダイズさせた結果を示し、レーン３は配列番号１のDNA試料 (13mer；mC)に対して配列番号４のプローブ(13mer)をハイブリダイズさせた結果を示し、レーン２は配列番号２のDNA試料 (13mer;C)に対して配列番号４のプローブ(13mer)をハイブリダイズさせた結果を示す。【０１２８】
レーン１とレーン２とを比較すると、メチルシトシン（mC）を有するDNA試料に対してバルジを形成できるプローブを用いた場合はピペリジン処理によりDNA試料が切断されているが、シトシン（C）を有するDNA試料に対してバルジを形成できるプローブを用いた場合はピペリジン処理によりDNA試料が切断されなかったことが分かる。【０１２９】
また、レーン３、４から、バルジを形成できないプローブを用いた場合は、DNA試料がメチルシトシン（mC）を有する場合もシトシン（C）を有する場合も、ピペリジン処理によってはDNA試料が切断されなかったことが分かる。【０１３０】
実施例２（再酸化剤の併用）
DNA試料として、15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3'；nはmCを示す）（配列番号５）を用い、実施例１と同様にして、これらの5'末端を放射標識し、精製した。【０１３１】
次いで、ラベル化を行ったDNA 10μLとプローブとなる14merのDNA (5'-TTTTTTCCTTTTTT-3')（配列番号６）の1.33μM水溶液の20μLを300 mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0に溶解させ、水を加えてtotal 50μLにし、室温中で二本鎖を形成させた。【０１３２】
次いで、この二本鎖を、1mM EDTA,100mM Tris-HCl(pH7.7),100mMビピリジン、5mM K2OsO4, 10% MeCN,及び濃度10〜100mMのヘキサシアノ鉄錯体[Fe(III)(CN)6]3-の存在下又は非存在下で、０℃で3分間インキュベートすることにより酸化反応を行った。３分間のインキュベートの後、0.5 M酢酸ナトリウム緩衝液pH 7.0とHerring Sperm DNA (1mg/mL)を加え、エタノール沈殿操作を行った。【０１３３】
その後は、実施例１と同様にして、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１３４】
結果を図４に示す。図４からK2OsO4に[Fe(III)(CN)6]3-を併用することにより、酸化速度が向上して、メチルシトシンの検出が容易になったことが分かる。【０１３５】
実施例３（再酸化剤の併用）
DNA試料として、15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3'；nはmCを示す）（配列番号５）、及び15mer DNA(5'-AAAAAAGCGAAAAAA-3'）（配列番号７）を用い、プローブとして、14merのバルジ形成DNA (5'-TTTTTTCCTTTTTT-3')（配列番号６）、及びフルマッチDNA(5'-TTTTTTCGCTTTTTT-3')（配列番号８）を用いた。【０１３６】
また、酸化処理時の[Fe(III)(CN)6]3-の影響を検討するために、[Fe(III)(CN)6]3-を使用しない酸化と、濃度100mMで使用した酸化との双方を行った。その他は、実施例２と同様にして、DNA試料の標識、二本鎖形成、酸化処理、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１３７】
また、メチルシトシン検出のポジティブコントロールとして、プローブを用いない１本鎖のDNA試料に対して、実施例２と同様にして、酸化処理、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１３８】
結果を図５に示す。図５から、バルジ形成プローブを用いたときは、特に[Fe(III)(CN)6]3-を併用したときに、メチルシトシンの濃い切断バンドが検出され、シトシンとメチルシトシンとを明確に区別できたことが分かる。また、メチルシトシンであるときに検出される切断バンドは、プローブを用いない１本鎖DNA試料をピペリジンで切断したときと同じ大きさであり、バルジ形成プローブの使用により、目的とするメチルシトシンを正確に検出していることが分かる。一方、バルジを形成しないフルマッチプローブを用いたときは、メチルシトシンとシトシンとを区別できなかった。【０１３９】
実施例４（酸化処理に及ぼすｐＨの影響）
DNA試料として、15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3'；nはmCを示す）（配列番号５）、及び15mer DNA(5'-AAAAAAGCGAAAAAA-3'）（配列番号７）を用い、プローブとして、14merのバルジ形成DNA (5'-TTTTTTCCTTTTTT-3')（配列番号６）を用いた。【０１４０】
また、酸化処理は、1mM EDTA,100mM Tris-HCl(pH7.7),100mMビピリジン、5mM K2OsO4, 10% MeCNの存在下で、０℃で3分間インキュベートすることにより行った。ここでは、再酸化剤の[Fe(III)(CN)6]3-を併用しなかった。その他は、実施例１と同様にして、DNA試料の放射標識、2本鎖形成、酸化処理、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１４１】
結果を図６に示す。図６から、ｐＨ7.15〜9.01の範囲では、ｐＨ6.02又は6.54の場合に比べて、メチルシトシンの場合にのみより濃い切断バンドが検出され、メチルシトシンの検出感度が高いことが分かる。
実施例５（酸化処理時の酸化剤の配位子の検討）
DNA試料として、15mer DNA(5'-AAAAAAGnGAAAAAA-3'；nはmCを示す）（配列番号５）、及び15mer DNA(5'-AAAAAAGCGAAAAAA-3'）（配列番号７）を用い、プローブとして、14merのバルジ形成DNA (5'-TTTTTTCCTTTTTT-3')（配列番号６）を用いた。【０１４２】
また、酸化処理は、1mM EDTA,100mM Tris-HCl(pH7.7),100mMピリジン、ビピリジン又はフェナンスロリン、5mM K2OsO4, 10% MeCNの存在下で、０℃で3分間インキュベートすることにより行った。ここでは、再酸化剤の[Fe(III)(CN)6]3-を併用しなかった。その他は、実施例１と同様にして、DNA試料の放射標識、２本鎖形成、酸化処理、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１４３】
結果を図７に示す。図７から、ピリジン、ビピリジン又はフェナンスロリンのいずれを用いる場合でも、メチルシトシンとシトシンとを区別できるが、特にビピリジンを用いる場合には、メチルシトシンでのみ切断バンドが検出され、メチルシトシンとシトシンとをより明確に区別できたことが分かる。【０１４４】
実施例６（実在する遺伝子におけるメチルシトシンの検出）
実在する遺伝子では、メチルシトシンが近接して存在する場合が多い。このような場合でも、本発明方法により特定のメチルシトシンを検出できることを示すために、DNA試料としてp53の部分配列を用いて、メチルシトシンの検出を試みた。【０１４５】
DNA試料として、5'-TACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT-3'（配列番号９）、5'-TACTGGGAnGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT-3'（nは mCを示す;配列番号１０）、5'-TACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT-3'（配列番号１１）、及び5'-TACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGnGTGTTTGT-3'（ｎは mCを示す;配列番号１２）を用いた。配列番号９及び１０は、それぞれ塩基番号９の第１の目的塩基がシトシン及びメチルシトシンであり、配列番号１１及び１２は、それぞれ塩基番号１７の第２の目的塩基がシトシン及びメチルシトシンである。また、バルジ形成プローブとして、第１の目的塩基を検出ための5'-ACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCTCCCAGTA -3'（配列番号１３）、及び第２の目的塩基を検出ための5'-ACAAACACCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTA -3'（配列番号１４）を用いた。さらに、ネガティブコントロールとしてフルマッチプローブ5'-ACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTA -3'（配列番号１５）も用いた。【０１４６】
酸化処理は、1mM EDTA,100mM Tris-HCl(pH7.7),100mMビピリジン、5mM K2OsO4, 10% MeCNの存在下で、０℃で５分間インキュベートすることにより行った。ここでは、再酸化剤の[Fe(III)(CN)6]3-を併用しなかった。その他は、実施例１と同様にして、被験DNAの放射標識、２本鎖形成、酸化処理、ピペリジン処理、及び電気泳動を行った。【０１４７】
結果を図８に示す。図８から、第１及び第２の目的塩基を特異的に検出できるバルジ形成プローブを用いることにより、各塩基のメチル化の有無を検出できたことが分かる。【０１４８】
実施例７（リアルタイムＰＣＲによるメチルシトシンの定量）
DNA試料として、5'-GCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGA-3'（配列番号１６）、5'-GCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGnGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGA-3'（ｎは mCを示す;配列番号１７）を用いた。これらの配列はp53の部分配列である。本実施例では、ＰＣＲで切断断片を検出するため、DNA試料は放射標識しなかった。【０１４９】
また、バルジ形成プローブとして、5'-TCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC…PS-3'（配列番号１８）を用いた。このプローブは、3'末端がポリスチレンビーズに結合している。【０１５０】
先ず、ガイドプローブ少量、10nM DNA試料を10μL、10mM 1M Tris-HCl(pH7.7) 10μL、milliQ水 30μLを混合して合計50μLとした。ガイドプローブに対してDNA試料は大過剰存在している。この混合液を90℃で5分間インキュベートすることにより2本鎖を形成し、次いで終夜冷却した。【０１５１】
次いで、20mM  K2OsO4水溶液  25μL、1MビピリジンのMeCN溶液  10μL、milliQ水  15μLを混合して合計50μLとした。この混合液を0℃で5分間インキュベートして酸化処理し、3M  酢酸ナトリウム(pH6.0)200μLを添加して酸化反応を停止した。【０１５２】
次いで、以下のようにして1本鎖DNAを回収し、精製した。即ち、ボルテックス、遠心、上清廃棄、反応停止液（3M  酢酸ナトリウム(pH6.0)）200μL添加からなる操作を2回繰り返し、さらにボルテックス、遠心、上清廃棄を１回行った。上清を廃棄して得られたプローブ付きビーズに7M尿素50μLを添加し、55℃で20分間インキュベートし、上清を回収する操作を2回繰り返した。次いで、得られた上清に1mM冷エタノールを添加して−78℃で終夜静置し、-9℃の下1500rpmで15分間遠心し、上清を廃棄した後、150μLの80%冷エタノールを添加し、5分間遠心し、上清を廃棄した後、５分間エバポレートした。【０１５３】
このようにして得られた精製１本鎖DNAに1Mピペリジン50μLを加え、90℃で20分間インキュベートした後、40分間エバポレートした。さらにmilliQ水20μLを添加して、20分間エバポレートする操作を2回繰り返した。【０１５４】
ピペリジン処理したDNAをリアルタイムPCRに供した。また、ネガティブコントロールとして、酸化処理を行わなかったサンプルについてもリアルタイムPCRに供した。【０１５５】
PCR反応溶液としては、HotStarTaq Master Mix 10μL、5μL  プライマー混合物、５×104希釈SYBRI GREEN  6μLの合計20μLの混合液を用いた。プライマーとしては5'-TCACAGCACATGACGGAGGT-3'（配列番号１９）、及び5'-GCTATCTGAGCAGCGCTCAT-3'（配列番号２０）を用いた。【０１５６】
PCR条件は、95℃で15分間；94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分間のサイクルを40サイクル；その後40℃に冷却する条件とした。リアルタイムPCR装置としてはロシュ・ダイアグノスティックス株式会社・LightCyclerを用いた。【０１５７】
結果を図９に示す。バルジ形成プローブとメチルシトシン含有DNAとをハイブリダイズさせた場合のみ、増幅速度が遅かった（図９（Ａ））。また、酸化処理を行うことにより増幅速度が遅くなった（図９（Ｂ））。【０１５８】
また、リアルタイムPCRでの増幅曲線から検量線を用いて換算された増幅産物量を測定した結果を図１０に示す。バルジ形成プローブとメチルシトシンとのハイブリダイズ産物を酸化処理した場合のみ、増幅産物が少なかった。【０１５９】
これらの結果、リアルタイムＰＣＲを行うことにより、メチルシトシン化度を定量できることが分かる。【０１６０】
実施例８（オスミウム含有複素環基の形成によるメチルシトシンの検出−１）
DNA試料として、5’-GGGGCAGnGCCTCAC-3’（ｎはmCを示す;配列番号２１）、5’- GGGGCAGCGCCTCAC-3’（配列番号２２）を用いた。これらの配列はp53の部分配列である。【０１６１】
また、バルジ形成プローブとして、5’-GTGAGGCCTGCCCC-(CH2)6-SH- 3’（配列番号２３）を用いた。このプローブは、3'末端に基-(CH2)6 -SHが結合している。【０１６２】
先ず、10μＭバルジ形成プローブの１μＬを、洗浄した金電極表面上に滴下し、3時間、室温で固定化した。次いで、得られた金電極表面を少量のMilliQ水（500〜1000μL程度）で洗浄後、10mMのMCHを1μL滴下し、0.5時間室温で、該金電極表面のマスキングを行った。次に、少量のMilliQ水（500〜1000μL程度）で洗浄後、10μM DNA試料を1μL滴下し、1時間室温でインキュベートして、電極表面上でバルジ構造を有する２本鎖を形成させた。その後、電極表面上に残っている１本鎖のバルジ形成プローブを埋めるため、保護DNAとして5’- GGGGCAGGCCTCAC-3’を10μMで1μL滴下し、0.5時間室温でインキュベートして、電極表面上に２本鎖DNA又はバルジ構造を有する２本鎖DNAのみになるようにした。【０１６３】
また、別途、20 mM K2OsO4水溶液を25μL、1M Bipyridyl Ligand 4 in MeOHを10μL、10mM EDTAを10μL、1M Tris-HCl(pH 7.7)緩衝液を10μL、1M K3[Fe(CN)6]水溶液を10μL、及びMilliQ水を45μL混合して、反応液を調製した。この反応液1μLを前記処理後の電極表面上に滴下し、室温で30分間反応させた（式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の形成）。次いで、少量のMilliQ水（500〜1000μL程度）で洗浄後、5mMアントラキノン-NHS溶液（溶媒：H2O/N,N-Dimethylformamide＝90/10(容量比)）を1μL滴下し、ポスト修飾を室温で12時間行った（式（６）で示されるアントラキノン標識オスミウム含有複素環基の形成）。【０１６４】
次いで、少量のMilliQ水（500〜1000μL程度）で洗浄後、1M NaCl水溶液中で、電気化学測定装置ALS660Aを用いて矩形波ボルタンメトリー（Square wave voltammetry）測定を行った。【０１６５】
得られた結果を図１１に示す。配列番号２１のDNA試料を対象とした場合には、メチルシトシン部分が式（６）で示されるアントラキノン標識オスミウム含有複素環基に変換されていることに起因して、-0.66 Vでのピークトップでは、0.737μAと高い電流量を示した。これに対して、配列番号２２のDNA試料を対象とした場合には、式（６）で示されるアントラキノン標識オスミウム含有複素環基が形成されていないので、-0.66 Vでのピークトップでは、0.450μAの電流量しか示さなかった。以上の結果から、バルジ構造を形成しているメチルシトシンの検出は、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させ、該基を検出することによって可能になることが確認された。【０１６６】
実施例９（オスミウム含有複素環基の形成によるメチルシトシンの検出−２）
DNA試料として、5’-AAAAAAGnGAAAAAA-3’（ｎはmCを示す;配列番号２４）、5’-AAAAAAGCGAAAAAA-3’（配列番号２５）を用いた。【０１６７】
また、ミスマッチ形成プローブとして、5’-TTTTTTCnCTTTTTT-3’（nは介してフルオレセインがリンカーを介してデオキシウリジンのピリミジン環の５位の炭素にリンカーを介して結合している塩基を示す；配列番号２６）を用いた。【０１６８】
先ず、1 M Tris-HCl (pH 7.7)、10 mM EDTA、100 mM Bipyridyl Ligand 4、5 mM K2OsO4、及び100 mM Fe3(CN)6の存在下で、10 μM DNA試料を37℃で2時間インキュベートした（式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の形成）。次いで、HPLC(0.1 M TEAA/acetonitrile from 5% to 30% for 50 min)によりDNA試料を精製した。50 mM リン酸ナトリウム水溶液(pH 8.0)中に、上記処理後のDNA試料を添加し、更にHEX-NHS(1 mg/mL in DMSO)を10μL加え、全量を100μLにした後、37℃で（５）時間インキュベートした（HEX含有オスミウム含有複素環基の形成）。再度、HPLCにより、斯くして処理されたDNA試料を精製した。斯くして処理されたDNA試料を、50 mM リン酸ナトリウム水溶液(pH 8.0)中0.9 M NaCl存在下で、ミスマッチ形成プローブと混合した。インキュベート後の水溶液について、495nmで励起し、蛍光強度を測定した。【０１６９】
得られた結果を図１２に示す。配列番号２４のDNA断片を対象とした場合には、メチルシトシン部分が式（５）で示されるオスミウム含有複素環基に形成されていることに起因して、フルオレセイン由来の蛍光強度（520 nm）と共にHEX由来の蛍光強度（550 nm）も高い値を示した。一方、配列番号２５の被験DNA断片を対象とした場合には、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基が形成されていないので、HEX由来の蛍光強度（550 nm）は低い値であった。以上の結果から、バルジ構造を形成しているメチルシトシンの検出は、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させ、該基をFERTを利用して検出することによっても可能になることが確認された。【０１７０】
実施例１０（オスミウム含有複素環基の形成によるメチルシトシンの検出−３）
DNA試料として、5’-AAAAAAGnGAAAAAA-3’（ｎは mCを示す;配列番号２７）、5’-AAAAAAGCGAAAAAA-3’（配列番号２８）を用いた。【０１７１】
また、ミスマッチ形成プローブとして、5’-TTTTTTCnCTTTTTT-3’（nは、式（７）で表される基がグアニンのプリン環の６位の炭素上の酸素原子に結合している塩基を示す；配列番号２９）を用いた。【０１７２】
先ず、1 M Tris-HCl (pH 7.7)、10 mM EDTA、100 mM ビピリジル、5 mM K2OsO4、及び100 mM Fe3(CN)6の存在下で、10 μM DNA試料を37℃で2時間インキュベートした（式（５）で示されるオスミウム含有複素環基の形成）。インキュベート後の反応液をゲルろ過スピンカラムに供してろ液を回収し、得られたろ液を濃縮した。次いで、50 mM リン酸ナトリウム水溶液(pH 8.0)中に、得られたろ液を添加し、更に1μM ミスマッチ形成プローブを加え、全量を100μLにした後、37℃で3時間インキュベートした。インキュベート後の水溶液について、380 nm又は390 nmで励起し、蛍光強度を測定した。また、配列番号２７のDNA試料を使用し、オスミウム含有複素環基の形成を行う工程を削除して、上記と同様の方法で実験を行い、蛍光強度を測定した（図１３中、Ｍと表記する）。また、配列番号２８のDNA試料の１本鎖の場合に呈する蛍光強度についても測定した（図１３中、ＳＳと表記する）。【０１７３】
得られた結果を図１３に示す。配列番号２７のDNA試料を使用した場合（図１３中、ＭＯＳと表記する）には、メチルシトシン部分が式（５）で示されるオスミウム含有複素環基に形成されていることに起因して、式（７）で示される基由来の蛍光が減弱されていることが確認された。一方、。配列番号２８のDNA試料を使用した場合（図１３中、Ｃと表記する）には、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基が形成されていないことに起因して、式（７）で示される基由来の蛍光の減弱は認められなかった。以上の結果から、ミスマッチを形成しているメチルシトシンの検出は、式（５）で示されるオスミウム含有複素環基を形成させ、該基を利用した蛍光物質の消光を検出することによっても可能になることが確認された。【０１７４】
実施例１１（オスミウム含有複素環基の形成によるメチルシトシンの検出−３）
DNA試料として、5'-GGTGGGGGCAGnGCCTCACA-3'（ｎはmCを示す;配列番号３０）、5'-GGTGGGGGCAGCGCCTCACA-3'（配列番号３１）を用いた。本DNA試料の5'は32Pにより放射標識されている。【０１７５】
また、ミスマッチ形成プローブとして、5'-TGTGAGGCYCTGCCCCCACC-3'（Ｙは、式（８）で表される基がアデニンのプリン環の６位の炭素上の窒素原子に結合している塩基を示す；配列番号３２）を用いた。【０１７６】
先ず、5 μMミスマッチ形成プローブ、5 mM 四酸化オスミウムカリウム塩、1 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、及び100 mM フェリシアン化カリウム(pH 7.0)の存在下で、10 μM DNA試料を50℃で10分間インキュベートした（DNA試料とミスマッチ形成プローブとのハイブリダイズ及びクロスリンクの形成）。その後、1 mg/mL Salmon Sperm DNAを10μL、3 M 酢酸ナトリウム(pH 5.0)水溶液を15 μL、更に冷却エタノールを900 μM加え、十分撹拌した後に-20℃で30分間放置した。次いで、15分間冷却遠心を行い、上澄みを廃棄後、80%冷却エタノールを150 μM加えて遠心後、再び上澄みを廃棄した。5分間減圧留去した後、2000 CPM/μLになるように Loading Bufferで希釈したサンプルをゲル電気泳動で流した。【０１７７】
得られた結果を図１４に示す。配列番号２９のDNA試料を使用した場合には、配列番号２９のDNA試料単独のバンドに加えて、DNA試料とミスマッチ形成プローブとの複合物に相当するバンドが検出された。一方、配列番号３０のDNA試料を使用した場合には、DNA試料とミスマッチ形成プローブとのクロスリンクが認められず、配列番号３０のDNA試料のバンドのみが観察された。以上の結果から、ミスマッチを形成しているメチルシトシンの検出は、ミスマッチ形成プローブと当該メチルシトシンとをクロスリンクさせることによっても検出できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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