(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸を製造するための方法であって、
塩化ナトリウム濃度が０．０５質量％以下の培地でＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を前培養する工程；および
塩化ナトリウム濃度が１．５質量％以上の培地で、前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を培養することにより、ポリ−γ−グルタミン酸を生産させる工程
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン酸の含有割合が９０％以上、９５．６％以下であるポリ−γ−グルタミン酸を製造するためのものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
液体培地中でＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を培養する請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
培地へのＬ−グルタミン酸の添加の有無によりポリ−γ−グルタミン酸の生産量を調節する請求項１〜３の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
培地の多価金属イオンとしてＭｇ2+を添加する請求項１〜４の何れかに記載の製造方法。
【請求項６】
Ｍｎ2+を実質的に含まない培地を用いる請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康ブームにより納豆に注目が集まっており、納豆の糸に関する研究も進んでいる。この納豆の糸は、主に納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌。以下、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ」属を「Ｂ．」と略記する場合がある）が産生するポリ−γ−グルタミン酸により構成されているものであり、さらにポリ−γ−グルタミン酸自体について、様々な用途が見出されている。
【０００３】
例えば特許文献１には、ポリ−γ−グルタミン酸の優れた保水作用に基づいた化粧料としての用途が開示されている。その他、ポリ−γ−グルタミン酸は生分解性であることから、ポリ乳酸と同様に環境に優しい新素材としての利用も期待されている。また、ポリ乳酸などポリエステル系の生分解性材料は基本的に硬質プラスチックであるのに対し、ポリ−γ−グルタミン酸は軟質プラスチックであるので、この点からも有用性は高い。
【０００４】
ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法では、従来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が用いられている。例えば特許文献２によれば、ポリ−γ−グルタミン酸の生産能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌であって、グルタミン酸合成酵素活性が欠損または減少した細菌を用いることによって、通常のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の場合よりも、ポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造できたとされている。しかし、当該技術ではポリ−γ−グルタミン酸の生産の場となる培地中に多量の抗生物質を投入しなくてはならず、また、組み換え体による二次的な汚染の懸念も避けられない。
【０００５】
なお、特許文献２では、使用する細菌として「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属」と包括的な記載がされており、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの他にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが開示されている。しかし、具体的に挙げられている菌株は、納豆菌として知られているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種に属する菌株のみであり、実施例で用いられているのもＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌のみである。
【０００６】
また、特許文献２に記載されているＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の中でも、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのポリ−γ−グルタミン酸生産性については、これまで実質的な調査がほとんど行われることはなく、ポリ−γ−グルタミン酸生産種としての優劣や特徴すらも分かっていない。
【０００７】
ところで、自然界で広く見出されるポリ−γ−グルタミン酸は、Ｄ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸の両方を含んだ混成型ポリマーであることが多い。例えば、納豆菌に代表されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌が生産するポリ−γ−グルタミン酸は、ほぼ等量のＬ−グルタミン酸とＤ−グルタミン酸から構成されているか、或いはＤ体をやや多く含む（非特許文献１）。
【０００８】
一方、光学異性体を有する化合物からなる高分子素材においては、光学純度が高いものほど優れた特性を有するのが一般的である。例えば、Ｌ−グルタミン酸の含有割合が高いポリ-γ-グルタミン酸は、より優れた保水性を有する。また、一方の光学異性体の含有割合が高い程、素材の結晶性は高く強度も高まるので、プラスチック材料として極めて優れたものになる。
【０００９】
自然界から得られるポリ−γ−グルタミン酸の中にも、光学純度の高いものがある。例えば、好塩古細菌の一種であるＮａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｐｔｉａｃａは、塩濃度が極端に高い極限的な環境下で起こる脱水現象から自身を保護するために、Ｌ−グルタミン酸に富むポリ−γ−グルタミン酸を生産する。一般的に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌が産生する光学純度の低いポリ−γ−グルタミン酸は、塩類が共存すると速やかにその保水性を喪失してしまうが、好塩古細菌由来の光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸には極めて優れた保水作用が備わっている。よって、好塩古細菌を利用すれば、品質がより高いポリ−γ−グルタミン酸が生産できると期待された。
【００１０】
しかしながら、好塩古細菌のポリ−γ−グルタミン酸の生産能は納豆菌等に比べてはるかに劣る。その上、大量生産に適する液体培養法で好塩古細菌を培養すると、ポリ−γ−グルタミン酸はほとんど生産されない。現実的には、光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸の製造には好塩古細菌は適するものではないと結論付けられている。
【００１１】
また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌の中には、Ｌ−グルタミン酸の添加、無添加に関わらずポリ−γ−グルタミン酸を生産するものも少なくない（非特許文献２）。この場合、培養の中期でポリ−γ−グルタミン酸の生産が開始されることが多く、これに伴って培地粘度の上昇が起こり、好気性のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌の増殖にとっては致命的な溶存酸素の低下という状態に陥る（非特許文献３）。結果として、十分な菌体量を得ることができず、ポリ−γ−グルタミン酸生産のさらなる効率化は困難となる。
【特許文献１】特開２０００−７２６５２号公報
【特許文献２】特開２０００−３３３６９０号公報
【非特許文献１】M．Ashiuchiら，アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Appl．Microbiol．Biotechnol.），第５７巻，第７６４〜７６９頁（２００１年）
【非特許文献２】Y．Itoら，バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．，第６０巻，第１２３９〜１２４２頁（１９９６年）
【非特許文献３】A．M．Cromwick，バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnol．Bioeng．），第５０巻，第２２２〜２２７頁（１９９６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様に、ポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造するために用いる細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌が知られている。しかし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌が生産するポリ−γ−グルタミン酸は、Ｄ体およびＬ体のグルタミン酸がランダムに配列した構造を有しており、実用化のためには、Ｌ−グルタミン酸の含有割合が高く品質のより高いものが求められていた。
【００１３】
そこで、本発明が解決すべき課題は、Ｌ−グルタミン酸の含有割合が高い高品質なポリ−γ−グルタミン酸を効率よく製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、特に高品質なポリ−γ−グルタミン酸の製造に適する微生物の探索を進めた。その結果、従来納豆菌として知られるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌ではなく、巨大菌であるＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌が、高品質なポリ−γ−グルタミン酸を効率良く生産できることを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
即ち、本発明に係るポリ−γ−グルタミン酸の製造方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を用いることを特徴とする。この方法は、特にＬ−グルタミン酸の含有割合が９０％以上である高品質なポリ−γ−グルタミン酸を製造できるものとして、非常に有用である。
【００１６】
上記方法においては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を液体培地中で培養する態様が好適である。液体培養は、ポリ−γ−グルタミン酸の大量生産に適するからである。
【００１７】
また、上記方法においては、培地中の塩化ナトリウム濃度によりポリ−γ−グルタミン酸の生産量および分子質量を調節することが好ましい。
【００１８】
従来方法であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌によるポリ−γ−グルタミン酸の製造では、一般的に培地中の塩化ナトリウム濃度は低く、塩化ナトリウム濃度が高まると生産量と分子質量共に低下する。しかし、本発明者らが見出した知見によれば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌によるポリ−γ−グルタミン酸の製造の場合、培地中の塩化ナトリウム濃度が低いと生産量と分子質量が共に低かった。その一方で、塩化ナトリウム濃度が高まると生産量が向上し、分子質量も少なくとも２０００ｋＤａｌのものが得られた。従って、細菌がポリ−γ−グルタミン酸の生産を開始すると増殖速度が極端に低下することから、先ず低濃度の低塩化ナトリウム培地でＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌の前培養を十分に行って細菌数を増やした後、次いで高濃度の塩化ナトリウム濃度培地で高分子質量のポリ−γ−グルタミン酸を効率よく生産させることができる。
【００１９】
上記方法においては、培地へのＬ−グルタミン酸の添加の有無によりポリ−γ−グルタミン酸の生産量を調節する態様が好適である。詳しくは、細菌によりポリ−γ−グルタミン酸を生産させると、培養の中期でポリ−γ−グルタミン酸の生産が開始され、細菌にとり十分な量のポリ−γ−グルタミン酸が生産された以降は、その生産量が減少するだけでなく細菌も増殖しなくなるという現象が確認される。よって、当初はポリ−γ−グルタミン酸を生産させずに細菌を十分に増殖させ、次いで生産を開始させることが、ポリ−γ−グルタミン酸の効率的な製造にとり理想的である。本発明者らによる知見によれば、培地にＬ−グルタミン酸が無いと、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量は顕著に抑制される。従って、Ｌ−グルタミン酸の添加の有無によって、ポリ−γ−グルタミン酸の生産量と細菌の増殖を調整することが可能になる。
【００２０】
培地の多価金属イオンとしてはＭｇ2+を用い、また、Ｍｎ2+を実質的に含まない培地を用いる態様が好適である。本発明者らによる知見によれば、培地にＭｎ2+が存在するとポリ−γ−グルタミン酸におけるＤ−グルタミン酸の割合が増加する。その一方で、Ｍｇ2+はＬ−グルタミン酸の含有割合を向上させるのに有用である。よって、かかる態様は、Ｌ−グルタミン酸に富んだポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造できるものとして有効である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るポリ−γ−グルタミン酸の製造方法によれば、Ｌ−グルタミン酸の含有割合の高い高品質なポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造することができる。従って本発明は、例えば、その優れた保湿性を活かした化粧品成分としての利用や生分解性の軟質プラスチック材料としての利用が期待できる光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸を効率的に製造できるものであることから、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に係るポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」という場合がある）の製造方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を用いることを特徴とする。より具体的には、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を培地中で培養し、菌体外に放出されるポリ−γ−グルタミン酸を回収するものである。
【００２３】
本発明方法で用いるＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌は、２〜６μｍ×１．５μｍ程度の大きさを有する巨大なグラム染色陽性の桿菌である。本発明者らによる知見によれば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を用いてＰＧＡを製造すれば、培養条件によりＬ−グルタミン酸（以下、「Ｌ−Ｇｌｕ」という場合がある）の含有割合が高い高品質なＰＧＡが得られる。
【００２４】
使用できるＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌は、ＰＧＡの生産能を示すものであれば特に制限されないが、例えばＷＨ３２０株が有用生産菌として挙げられる。
【００２５】
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌は、ＰＧＡを生産させる前に十分に前培養しておくことが好ましい。かかる培養条件は、使用するＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌に応じて適宜調整すればよい。例えば、ポリペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウムを含む通常のＬＢ培地中、３０〜４５℃で１２時間〜２日間程度培養する。但し、当該前培養の培地には、Ｌ−Ｇｌｕを実質的に添加しないことが好ましい。ここで「実質的に添加しない」とは、酵母エキス等に含まれる以外にさらにＬ−Ｇｌｕを添加しないことをいうものとする。Ｌ−Ｇｌｕが培地中に十分量存在すると、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌がＰＧＡの生産を開始してしまい、菌の増殖が抑制されるおそれがあるからである。
【００２６】
前培養した後は、遠心分離等により菌体を分離し、さらに生理食塩水により数回洗浄し、ＰＧＡの生産に使用する。
【００２７】
本発明では、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を適切な条件で培養して、ＰＧＡを生産させる。適切な条件を用いることによって、Ｌ−Ｇｌｕの含有割合が高い、より具体的にはＬ−Ｇｌｕの含有割合が９０％以上の高品質なＰＧＡが得られる。
【００２８】
なお、Ｌ−Ｇｌｕの割合は、例えば以下の方法により測定できる。先ず、測定対象であるＰＧＡを分取し、６Ｎ塩酸に溶解した上で１０５℃、８時間程度の加水分解反応に供する。この際、ＰＧＡの主骨格はαアミド結合でなくγアミド結合を介するいわゆるポリイソペプチドであるため、ラセミ化され難い。得られた加水分解物に含まれるグルタミン酸について、キラル分割ＨＰＬＣにより解析し（M．Ashiuchiら，Appl．Environ．Microbiol．，Vol．70，p．4249-4255（2004年）を参照）、ＤＬ含有比を決定することによって、Ｌ−Ｇｌｕの割合を算出することができる。
【００２９】
培地には固体培地と液体培地があるが、本発明では液体培地がより好適である。固体培地ではＰＧＡを十分に生産させることが難しく、また、ＰＧＡの回収にも手間がかかる。一方、液体培地は大量生産に適しており、ＰＧＡの回収も容易である。
【００３０】
培地の添加成分は適宜調整すればよいが、Ｌ−Ｇｌｕ、硫酸アンモニウム、Ｍｇ2+、塩化ナトリウムを添加することが好ましい。
【００３１】
本発明方法において、塩化ナトリウムは重要な培地成分である。特に、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌によるＰＧＡの製造では、培地中の塩化ナトリウム濃度を調整することによって、ＰＧＡの生産量と分子質量を調節することができる。
【００３２】
具体的には、従来方法であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌によるＰＧＡの製造では、一般的に液体培地中の塩化ナトリウム濃度は０．０５質量％前後であり、塩化ナトリウム濃度が３質量％を超えると生産量と分子質量の両方が低下する（非特許文献１、およびY．Ogawaら，バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．，第６１巻，第１６８４〜１６８７頁（１９９７年）を参照）。しかし、本発明者らが見出した知見によれば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌の場合と同様に培地中の塩化ナトリウム濃度を低くすると、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌によるＰＧＡの製造の場合、生産量は皆無に等しい状態となった。その一方で、塩化ナトリウム濃度を２質量％以上に高めると生産量が向上した。さらに塩化ナトリウム濃度が１０質量％の場合、分子質量も少なくとも２０００ｋＤａｌのものが得られた。従って、細菌がＰＧＡの生産を開始すると増殖速度が極端に低下することから、先ず０．０５質量％以下と低濃度の低塩化ナトリウム培地でＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌の前培養を十分に行って細菌数を増やした後、次いで１．５質量％以上、より好ましくは２質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以下、最適には４〜６質量％という高濃度の塩化ナトリウム濃度培地で高分子質量のＰＧＡを効率よく生産させることができる。さらに、塩化ナトリウムを豊富に含む培地では雑菌の繁殖を抑えることができるため、納豆菌の様なＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌を用いる従来法に比べ、雑菌の繁殖に伴う汚染を防止できるという効果もある。
【００３３】
Ｌ−Ｇｌｕは、効率的なＰＧＡに必要な成分であり、培地中に十分量存在しないと、ＰＧＡの生産は進行し難い。よって、培養当初はＬ−Ｇｌｕを添加しないでＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を十分に増殖させた後、ＰＧＡの生産を開始する際にＬ−Ｇｌｕを添加してもよい。Ｌ−グルタミン酸の添加量は適宜調節すればよいが、１〜５質量％程度が好ましく、より好ましくは１〜３質量％程度とする。
【００３４】
硫酸アンモニウムは窒素源として好適なものであり、特にＬ−Ｇｌｕと併用することによりＰＧＡの効率的な製造が可能になる。その添加量は適宜調節すればよいが、０．１〜３質量％程度が好ましく、より好ましくは０．５〜２質量％程度とする。
【００３５】
培地中に添加する多価金属イオンとしては、Ｍｇ2+が好適である。また、培地には実質的にＭｎ2+を添加しないことが好ましい。従来の納豆菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種細菌）によるＰＧＡの生産では、多価金属イオンとして主にＭｎ2+が用いられていた。しかし本発明者らによる知見によれば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌の培養培地中にＭｎ2+が存在すると、生産されるＰＧＡにおけるＬ−Ｇｌｕの含有割合が低下する。例えば後述する実施例によれば、Ｍｇ2+０．５質量％に対してＭｎ2+が０．０５質量％存在するだけで、Ｄ−ＧｌｕがＬ−Ｇｌｕの含有割合を超えてしまう。一方、培地中にＭｇ2+が十分に存在すると、Ｌ−Ｇｌｕの含有割合が向上する。
【００３６】
なお、ここで「実施的にＭｎ2+を添加しない」とは、不可避的に混入するＭｎ2+は除き、意図的にＭｎ2+を含む成分を培地へ加えないことをいう。
【００３７】
Ｍｇ2+は、硫酸塩や塩化物塩などの水溶性の塩の形態で添加することが好ましい。また、Ｍｇ2+の添加量は適宜調節すればよいが、例えば硫酸マグネシウムに換算して０．０５〜２質量％程度が好ましく、より好ましくは０．１〜１質量％程度とする。
【００３８】
上記添加成分の他、培地には通常の成分を添加してもよい。通常用いられる添加成分としては、例えば、グルコースやスクロースなどの炭素源；Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4などの緩衝剤成分；ビタミン類などを挙げることができる。
【００３９】
液体培地の場合、蒸留水へ上記添加成分を溶解した後に通常の滅菌処理を行なえばよい。固体培地の場合には、さらに１〜２質量％程度の寒天を溶解し、滅菌処理した後に冷却して固化する。
【００４０】
ＰＧＡの生産の開始は、前培養したＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を、塩化ナトリウムおよびＬ−Ｇｌｕを適量含む培地に植菌することにより開始すればよい。或いは前述した様に、当初塩化ナトリウムおよびＬ−Ｇｌｕを含まない、または少量含む培地でＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌を十分に培養した後、塩化ナトリウムおよびＬ−Ｇｌｕを添加することによりＰＧＡの生産を開始してもよい。
【００４１】
具体的な培養条件は、使用するＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ種細菌の至適条件、または至適条件に近い条件を採用することができる。例えば、室温〜４０℃で振とう培養や静置培養すればよい。
【００４２】
培養時間は特に制限されず、目視や培養物の粘度などでＰＧＡの十分な生産を確認できるまでとすればよいが、例えば２〜１０日間程度とすることができる。
【００４３】
得られたポリ−γ−グルタミン酸の精製は、常法により行なえばよい。例えば、遠心分離や濾過などにより菌体を除き、６Ｍ硫酸などにより得られた粗溶液を酸性にして多糖類等を分解し、さらに過剰量のエタノールを加えてＰＧＡを含む高分子物質を沈殿させる。また、ＰＧＡに影響を与えないプロテイナーゼＫなどにより他のタンパク質を分解する処理を適宜行なってもよい。得られた沈殿物を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）等に溶解して透析を繰り返して精製した後、凍結乾燥すれば、ＰＧＡが得られる。さらに高度なポリマー精製を要する場合には、陰イオン交換クロマトグラフィーを適用できる（C．Parkら，J．Mol．Catal．B：Enzym．，第３５巻，第１２８〜１３３頁（２００５年）を参照）。
【００４４】
本発明方法により製造されたポリ−γ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸の含有割合が高い。従って、Ｄ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸がランダムに配列したものとは異なり、保湿性により優れ高強度であり、化粧料成分や生分解性のプラスチック材料として、非常に有効なものである。
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４６】
実施例１  B．megateriumを用いたポリ-γ-グルタミン酸生産実験：培養方法の検討
B．megateriumのＷＨ３２０株（MoBiTec社、ドイツ、Gottingen）を、液体培地であるＬＢ培地（５ｍＬ）で十分に前培養した。さらに、１ｍＬの培養液を採取し、ＬＢ培地（２００ｍＬ）を入れた１Ｌコルベン中で一晩培養した。適量の生理食塩水で１〜２回洗浄し、最終的には約２ｍＬの生理食塩水に懸濁した。このうち５００μＬを、下記表１の組成を有するＬＳＮ液体培地（５０ｍＬ）に植菌し、３０℃で５日間培養してＰＧＡを生産させた。なお、表１中のパーセンテージは質量％であり、また、ムラシゲ−スクーグビタミン溶液（１０倍濃縮液）は、Photo Technology Laboratories（米国）社製である。
【００４７】
【表１】
0005119435.tif 000002
【００４８】
その後、培養液を１０ｍＬ分取して、ＰＧＡの生産を確認した。具体的には、先ず多糖類を分解するために、分取した培養液に６Ｍ硫酸を滴下してｐＨを３．０とし、４℃で１２時間放置した。次に処理液へ３倍量のエタノールを加え、残った高分子物質（主としてＰＧＡ）を沈澱させ、遠心分離により回収した。得られた沈澱を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１０００倍量の同緩衝液を用いて４℃で一昼夜透析した。透析後の高分子物溶液を遠心分離により回収し、これにプロテイナーゼＫ（宝酒造製、２０μｇ／ｍＬ）を添加して共存するタンパク質を完全に分解した。なお、ＰＧＡは、この処理に対して完全に耐性である。さらに、１０００倍量の蒸留水を用いて４℃で一昼夜透析し、ＰＧＡを精製した。透析後の溶液を凍結乾燥により乾燥し、最終的には３００μＬの蒸留水に溶解した。
【００４９】
比較のために、上記ＬＳＮ液体培地に寒天（１．５％）を加え、これを直径１４５ｍｍの大プレート中で固化させた固体培地を作成し、当該固体培地に植菌して同様にＰＧＡを生産させた。次に、生理食塩水（５０ｍＬ）を使用して固体培地表面に繁殖した菌体を完全に懸濁回収し、遠心分離でポリマーを含む上清を調製し、得られた上清の１０ｍＬから上記と同様の方法によりＰＧＡを精製した。
【００５０】
上記で得られたＰＧＡの精製溶液（各４例ずつ）から１０μＬを分取してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、メチレンブルー染色法で視覚化した。結果を図１に示す。なお、図１の（１）は液体培地を用いた結果を示し、（２）は固体培地を用いた結果を示す。また、各結果においてレーンＭは分子量マーカー（Amersham Pharmacia Biotech製、イギリス、Little Chalfont）を電気泳動した結果である。
【００５１】
図１の通り、ブロードなバンドが観察されるが、これは、産生されたＰＧＡが様々な分子量を有していることを示す。しかし少なくとも、ＰＧＡは２００ｋＤａを超える分子量を有している。また、固体培養した場合には再現性が悪いが、液体培養した場合の再現性は良好であり、安定してＰＧＡを製造できることが明らかにされた。
【００５２】
試験例１  ポリ-γ-グルタミン酸を構成するＤ体とＬ体の割合
ＰＧＡを構成するＧｌｕのＤ体とＬ体の割合を、以下の方法により求めた。上記実施例１で得たＰＧＡの水溶液（２０μＬ）に６Ｎ塩酸（４００μＬ）を加え、１０５℃で８時間加熱して加水分解した。この際、ＰＧＡの主骨格はαアミド結合でなくγアミド結合を介するいわゆるポリイソペプチドであるため、ラセミ化され難い。得られた加水分解物に含まれるグルタミン酸について、キラル分割ＨＰＬＣ（ダイセル社製、４．６ｍｍ×５０ｍｍ）を装備したＨＰＬＣ装置（島津製作所製）により分割し、ピーク強度によりＤ体とＬ体の割合を求めた。また、ＰＧＡ生産に用いた菌体重量を、電子天秤により湿体重量として秤量した。菌体重量当りのポリ-γ-グルタミン酸の生産量と、得られたＰＧＡにおけるＤ−ＧｌｕとＬ−Ｇｌｕの割合を表２に示す。なお、表２の各データは、６回の実験結果の平均と標準誤差である。
【００５３】
【表２】
0005119435.tif 000003
【００５４】
表２の結果の通り、B．megateriumにより生産されたＰＧＡは、９０％を超えるＬ−Ｇｌｕにより構成されていることが実証された。また、液体培養によりＰＧＡを生産せしめた場合、固体培養に比して２倍以上のＰＧＡが得られることが分かった。
【００５５】
実施例２  B．megateriumを用いたポリ-γ-グルタミン酸生産実験：塩化ナトリウムの添加効果
上記実施例１でポリマー生産に用いたＬＳＮ液体培地には、塩化ナトリウムが５質量％含まれている。この濃度を０、０．０５、０．２、０．５、１、２、５、１０質量％と変化させた改変培地を用意し、塩化ナトリウム濃度がＰＧＡの生産にどのような影響を与えるかを調べた。具体的には、ＬＳＮ液体培地を上記の通り改変した以外は実施例１と同様の条件によりB．megateriumを液体培養し、ＰＧＡを生産させた。各改変培地による実験は２回ずつ行ない、実施例１と同様の方法でＰＧＡを精製して秤量し、培養液１ｍＬ当りのＰＧＡの生産量を求めた。結果を図２に示す。また、得られたＰＧＡ溶液を、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してメチレンブルーで染色した。結果を図３に示す。
【００５６】
図２の結果の通り、２％を超える高塩培地で効率的にＰＧＡが生産できるようになり、５％が好適であることが実証された。従って、B．megateriumを用いたＰＧＡ生産では、塩化ナトリウム濃度による生産調節が可能であることが分かった。さらに、図３の結果の通り、塩化ナトリウム濃度を変化させることで分子質量の調節をも可能であることが明らかとなった。特に注目すべきは、１０％の塩化ナトリウムを添加した場合で、計測限界を超える超高分子質量ＰＧＡ（少なくとも２０００ｋＤａl以上）の生産に成功した点である。
【００５７】
実施例３  B．megateriumを用いたポリ-γ-グルタミン酸生産実験：窒素源の検討
上記実施例１の通り、ポリマー生産に用いるＬＳＮ液体培地では、窒素源として標準的に（１）２％のＬ−Ｇｌｕと１％の硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）を使用している。これに対して、（２）２％Ｌ−Ｇｌｕのみ、（３）１％硫酸アンモニウムのみ、並びに（４）両者を無添加とする改変培地を用意し、窒素源の変更がＰＧＡの生産にどのような影響を与えるかを調べた。具体的には、ＬＳＮ液体培地を上記の通り改変した以外は実施例１と同様の条件によりB．megateriumを液体培養し、ＰＧＡを生産させた。得られたＰＧＡ溶液を、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してメチレンブルーで染色した。各改変培地による実験は２回ずつ行なった。結果を図４に示す。
【００５８】
また、各改変培地による実験を４回ずつ行ない、培養液１ｍＬ当りのＰＧＡの生産量と、上記試験例１と同様の方法により求めたグルタミン酸のＤ体とＬ体の割合の平均を、表３に示す。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
図４と表３の結果の通り、B．megateriumを用いたＰＧＡの製造では、特にＬ−Ｇｌｕの添加効果が大きいことが分かる。この結果は、Ｌ−Ｇｌｕの添加時期を調製することによるＰＧＡの生産の制御が可能であることを示唆している。また、Ｌ−Ｇｌｕと硫酸アンモニウムを併用することによって、ＰＧＡの生産能と、それを構成するＬ−Ｇｌｕの割合が増加することが明らかとなった。
【００６１】
実施例４  B．megateriumを用いたポリ−γ−グルタミン酸生産実験：Ｌ−Ｇｌｕの濃度効果
上記実施例１において、ＬＳＮ液体培地に含まれるＬ−Ｇｌｕ濃度を０．０２、０．１、０．２、０．５、２質量％と変化させた改変培地を用意し、Ｌ−Ｇｌｕ濃度の差がＰＧＡの生産にどのような影響を与えるかを調べた。具体的には、ＬＳＮ液体培地を上記の通り改変した以外は実施例１と同様の条件によりB．megateriumを液体培養し、ＰＧＡを生産させた。各改変培地による実験は２回ずつ行ない、実施例１と同様の方法でＰＧＡを精製して秤量し、培養液１ｍＬ当りのＰＧＡの生産量を求めた。結果を図５に示す。また、得られたＰＧＡ溶液を、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してメチレンブルーで染色した。結果を図６に示す。
【００６２】
図５と６の結果の通り、B．megateriumによるＰＧＡの生産量はＬ−Ｇｌｕ濃度に大きく影響されることが分かった。０．５％を超えるＬ−Ｇｌｕを含む培地において効率的にＰＧＡが生産できるようになり、２％が好適であることが実証された。また、データは示していないが、２％以上、例えば５％の高濃度でＬ−Ｇｌｕを添加しても収量上大きな変化がないことを確認している。
【００６３】
実施例５  B．megateriumを用いたポリ-γ-グルタミン酸生産実験：金属イオンの影響
上記実施例１の通り、ポリマー生産に用いるＬＳＮ液体培地では、生産促進因子である金属イオンとしてＭｇ2+のみを使用している。これに対し、納豆菌のＰＧＡ生産によく利用されるＭｎ2+を代用あるいは共存させた場合、ＰＧＡの生産にどのような影響があるかを調べた。具体的には、実施例１において、ＬＳＮ液体培地の多価金属イオン源として（１）０．５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＋０．０５％ＭｎＣｌ2、（２）０．５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏのみ、（３）０．０５％ＭｎＣｌ2のみ、並びに（４）両者を無添加とする改変培地を用いる以外は同様にして、B．megateriumにＰＧＡを生産させた。
【００６４】
図７は生産されてきたＰＧＡをメチレンブルー染色法で視覚化したもの（独立した２回の試行分）、表４はその生産量とＬ−およびＤ−Ｇｌｕ含有率の平均値（独立した４回の試行分）を示したものである。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
表４の結果の通り、培地にＭｇ2+を添加しても、その約１０％のみのＭｎ2+を添加するだけで、ＰＧＡのＬ−Ｇｌｕ含有割合は５０％未満にまで低下してしまう。その一方で、培地中の多価金属イオンとしてＭｇ2+のみを用いることによって、ＰＧＡのＬ−Ｇｌｕ含有割合を９０％以上にまで高められることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】B．megateriumを用いて製造したＰＧＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。（１）は液体培地を用いた場合、（２）は固体培地を用いた場合の結果である。
【図２】B．megateriumのＰＧＡ生産に及ぼす塩化ナトリウムの効果を示す結果である。縦軸は培養液培養液１ｍＬ当りに含まれるＰＧＡの総量を示し、横軸はＬＳＮ改変培地中の塩化ナトリウム濃度を示す。
【図３】B．megateriumを用いてＰＧＡを生産する場合における塩化ナトリウムの添加効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、（１）は塩化ナトリウム無添加、（２）は０．０５質量％、（３）は０．２質量％、（４）は０．５質量％、（５）は１質量％、（６）は２質量％、（７）は５質量％、（８）は１０質量％添加した場合である。
【図４】B．megateriumを用いてＰＧＡを生産する場合における窒素源の影響を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、（１）は窒素源としてＬ−Ｇｌｕと硫酸アンモニウムを併用した場合、（２）はＬ−Ｇｌｕのみを用いた場合、（３）は硫酸アンモニウムのみを用いた場合、（４）は両者を添加しなかった場合である。
【図５】B．megateriumを用いてＰＧＡを生産に対する、培地中のＬ−Ｇｌｕの濃度の影響を示す結果である。縦軸は培養液培養液１ｍＬ当りに含まれるＰＧＡの総量を示し、横軸にはＬＳＮ改変培地中のＬ−Ｇｌｕ濃度を示す。
【図６】B．megateriumを用いてＰＧＡを生産する場合におけるＬ−Ｇｌｕの濃度効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、（１）はＬ−Ｇｌｕを０．０２質量％、（２）は０．１質量％、（３）は０．２質量％、（４）は０．５質量％、（５）は２質量％添加した場合である。
【図７】B．megateriumを用いてＰＧＡを生産する場合における多価金属イオンの影響を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、（１）は多価金属イオンとしてＭｇ2+とＭｎ2+を併用した場合、（２）はＭｇ2+のみを用いた場合、（３）はＭｎ2+のみを用いた場合、（４）は両者を添加しなかった場合である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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