(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（I）：
【化１】
0005119442.tif 000013
［式（I）中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ３はカルボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基、又は次式（II）：
【化２】
0005119442.tif 000014
［式（II）中、＊はコラーゲン分子との結合部位を表す。］
で表される基を表し、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジアゾニウム基又はアリール基を表し、ｘ：ｙは０．１：０．９〜０．９：０．１であり、ｍ及びｎは１以上の整数を表す。］
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。
【請求項２】
請求項１記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
【請求項３】
前記カルボキシル基同士を１，４-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋して得られる請求項２記載のゲル
【請求項４】
請求項１又は２記載のゲルからなる医療用材料。
【請求項５】
請求項４記載の医療用材料からなる部分又は部材を有する医療用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル、該ゲルからなる医療用材料及び該医療用材料を利用した医療用器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは動物の真皮、腱、骨、筋膜等に豊富に含まれる生分解性の生体由来材料であり、コラーゲンゲル（コラーゲンハイドロゲル）は医療用材料として有用である。コラーゲンゲルを調製する際、コラーゲン分子間の架橋化が必要となるが、グルタルアルデヒド等の化学架橋剤を用いてコラーゲン分子間の架橋化を行うと、コラーゲンの重要な性質である生体適合性（生体親和性）が著しく損なわれる。【０００３】
このような問題を解決することができる技術として、特許文献１には、ポリアニオンが有するカルボキシル基と、コラーゲン分子が有するアミノ基又は水酸基とを、カルボジイミドを用いてアミド結合又はエステル結合させることによりコラーゲン分子間の架橋化を行い、コラーゲンゲルを調製する方法が開示されており、こうして調製されたコラーゲンゲルは、生体組織と高い接着性を示すので、生体接着剤、止血材、閉鎖材、死腔充填材等の非成形医療用材料や、代用血管等の成形医療用として有用であることが開示されている。特許文献１には、ポリアニオンとして、ヒアルロン酸、アルギン酸、アラビアゴム、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリリンゴ酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシル化デンプン等の生体に対して毒性の少ないポリアニオンが開示されている。【０００４】
一方、特許文献２〜４には、生体適合性の医療用材料として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステル等との共重合体が開示されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／５４２２４号パンフレット
【特許文献２】特許第２８９０３１６号公報
【特許文献３】特開２００５−６７０４号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ００／０１４２４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、医療用材料として有用なゲル、該ゲルからなる医療用材料、及び該医療用材料を利用した医療用器具を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、以下のゲル、医療用材料及び医療用器具を提供する。
（１）次式（I）：
【化１】
0005119442.tif 000002
［式（I）中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ３はカルボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基、又は次式（II）：
【化２】
0005119442.tif 000003
［式（II）中、＊はコラーゲン分子との結合部位を表す。］
で表される基を表し、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジアゾニウム基又はアリール基を表し、ｘ：ｙは０．１：０．９〜０．９：０．１であり、ｍ及びｎは１以上の整数を表す。］
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。
（２）前記（１）記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
（３）前記カルボキシル基同士を１，４-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋して得られる前記（２）記載のゲル
（４）前記（１）又は（２）記載のゲルからなる医療用材料。
（５）前記（４）記載の医療用材料からなる部分又は部材を有する医療用器具。
【発明の効果】
【０００７】
式（I）で表される繰り返し単位を有する架橋基（以下「架橋基（I）」という。）によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、又は架橋基（I）によってコラーゲン分子を架橋する際の反応溶媒（水溶液）のｐＨを調節することにより、本発明のゲルには、１種又は２種以上の所望の機能（例えば、機械的強度（引張強度）、膨潤度（柔軟性）、形態、生分解性（コラゲナーゼに対する分解耐性）、収縮温度（水分保持性及び寸法安定性）、細胞接着性又は細胞非接着性、血液凝固活性又は血液抗凝固活性等）が付与される。したがって、本発明のゲルは医療用材料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
式（I）において、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ１又はＲ２で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられるが、これらのうち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。【０００９】
式（I）において、Ｒ３はカルボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基、又は式（II）で表される基を表す。式（I）において、Ｒ３の一部又は全部が式（II）で表される基であり、カルボキシル基又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基と、式（II）で表される基とのモル分率は通常０：１００〜９９：１、好ましくは１０：９０〜９０：１０、さらに好ましくは６０：４０〜４０：６０である。【００１０】
アミノ基又は水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基としては、例えば、次式（III）：
【化３】
0005119442.tif 000004
[式（III）中、Ｒ７は水素原子、アルキル基又はアシル基を表す。]
で表される基が挙げられる。【００１１】
式（III）において、Ｒ７で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数１〜３の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられ、Ｒ７で表されるアシル基としては、例えば、アセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基等の炭素数１〜５の脂肪族アシル基；ベンゾイル基、３，５−ジメチルベンゾイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、２，６−ジメトキシベンゾイル基、２，４，６−トリメトキシベンゾイル基、２，６−ジイソプロポキシベンゾイル基、ナフチルカルボニル基、アントリルカルボニル基等の芳香族アシル基が挙げられる。Ｒ７で表されるアシル基は、カルボキシル基、水酸基等の置換基を有していてもよい。【００１２】
式（II）において、＊はコラーゲン分子との結合部位を表す。式（II）で表される基は、カルボキシル基又はその誘導基と、コラーゲン分子のアミノ基又は水酸基との結合により生じ、式（II）で表される基とコラーゲン分子との結合部位は−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＣＯ−Ｏ−という構造をとっている。【００１３】
式（I）において、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジアゾニウム基又はアリール基を表す。Ｒ４、Ｒ５又はＲ６で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられるが、これらのうち、メチル基、エチル基等の炭素数１〜２のアルキル基が好ましい。炭素数の大きいアルキル基である場合、疎水性が高まることにより、疎水性相互作用が増加し、ゲルの吸水性又は保水性が減じて、ゲルの生体適合性又は機械的強度が低下するおそれがあるからである。Ｒ４、Ｒ５又はＲ６で表されるアリール基としては、例えば、フェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、３，５−ジメトキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、３，５−ジメチルフェニル基、２，４，６−トリメチルフェニル基、ナフチル基等の置換又は非置換の芳香族炭化水素基；フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラリジニル基、キノリル基、イソキノリル基等の置換又は非置換の芳香族複素環基が挙げられる。【００１４】
式（I）において、ｘ及びｙはそれぞれの重合単位のモル分率であり、ｘ：ｙは通常０．１：０．９〜０．９：０．１、好ましくは０．３：０．７〜０．９：０．１である。【００１５】
式（I）において、ｍ及びｎは１以上の整数を表すが、ｍは通常２〜１０、好ましくは２〜６、さらに好ましくは２〜４の整数を表し、ｎは通常２〜１０、好ましくは２〜６、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。ｍ及びｎが大きくなると収率が低下するからである。【００１６】
式（I）で表される繰り返し単位を有する架橋基（以下「架橋基（I）」という。）によって複数のコラーゲン分子が架橋されてなる架橋コラーゲンにおいて、コラーゲン分子の種類は、ゲルの支持構造を形成し得る限り特に限定されるものではない。コラーゲン分子の種類としては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、アテロコラーゲン、アシル化コラーゲン、エステル化コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、チオール化コラーゲン、魚コラーゲン、合成コラーゲン等が挙げられるが、これらのうち、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン等が好ましい。軟組織の大部分がＩ型コラーゲンから、軟骨の大部分がＩＩ型コラーゲンからなり、それぞれ疾病治療に用いられているので、Ｉ型コラーゲン又はＩＩ型コラーゲンを使用する場合、本発明のゲルを医療用材料として好適に使用することができる。【００１７】
また、架橋コラーゲンは、１種類のみのコラーゲン分子からなっていてもよいし、２種類以上のコラーゲン分子からなっていてもよいが、１種類のみのコラーゲン分子からなっていることが好ましい。反応に必要なアミン基及びカルボキシル基の数が計算できるため、反応コントロール及び生成物の物性コントロールが容易となるからである。【００１８】
本発明のゲルに保持される溶媒は通常、水である。ゲルに保持される溶媒が水である場合、本発明のゲル（ハイドロゲル）を医療用材料として好適に使用することができる。ゲルに保持される水には、塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、有機溶媒（例えば、アルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド）等が含まれていてもよい。【００１９】
本発明のゲルは、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等の水溶液又は蒸留水中で、次式（IV）：
【化４】
0005119442.tif 000005
[式（IV）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｘ、ｙ、ｍ及びｎは前記と同義である。］
で表される繰り返し単位を有するポリマー（以下「ポリマー（IV）」という。）を、カルボジイミド類（例えば、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−１−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−４―ブタンジオール−ジグリシジルエーテル（ＢＤＧＥ））、又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド（ＮＨＳＳ））と反応させた後、複数のコラーゲン分子と反応させることにより得ることができる。ポリマー（IV）が有するカルボキシル基又はその誘導基は、カルボジイミド類と反応した後、スクシンイミド類が存在する場合には、スクシンイミド類と反応し、次いで、コラーゲン分子が有するアミノ基（同一分子内のアミノ基又は異なる分子のアミノ基）と反応し、ポリマー（IV）とコラーゲン分子とが−ＣＯ−ＮＨ−を介して結合する。ポリマー（IV）が複数のコラーゲン分子と結合することにより、架橋基（I）によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンが形成され、これにより架橋コラーゲンを支持構造として有するハイドロゲルが形成される。【００２０】
反応溶媒である水溶液のｐＨは、通常７．０〜１１．０（アルカリ条件）又は２．０〜５．０（酸性条件）、好ましくは８．５〜９．５（アルカリ条件）又は４．５〜５．０（酸性条件）である。反応溶媒である水溶液のｐＨを調節することにより、形成されるゲルの機械的強度（引張強度）、膨潤度（柔軟性）、形態、コ生分解性（コラゲナーゼに対する分解耐性）、収縮温度（水分保持性及び寸法安定性）等を調節することができる。【００２１】
ポリマー（IV）と、カルボジイミド類又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類との反応において、反応温度は通常４〜３７℃、好ましくは４〜８℃であり、反応時間は通常３０〜９６０分、好ましくは６０〜２４０分であり、カルボジイミド類の添加量はポリマー（IV）に対して通常０．５〜１０モル当量、好ましくは４〜７モル当量であり、スクシンイミド類の添加量はポリマー（IV）に対して通常１．５〜１０モル当量、好ましくは２〜７モル当量である。【００２２】
カルボジイミド類又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV）と、コラーゲン分子との反応において、反応温度は通常４〜３７℃、好ましくは４〜８℃であり、反応時間は通常３０〜９６０分、好ましくは６０〜２４０分であり、水溶液中のコラーゲン濃度は、通常０．３〜５質量％、好ましくは０．５〜１質量％である。【００２３】
ポリマー（IV）は、次式（V）：
【化５】
0005119442.tif 000006
[式（V）中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｍ及びｎは前記と同義である。]
で表されるモノマーと、次式（VI）：
【化６】
0005119442.tif 000007
[式（VI）中、Ｒ２及びＲ７は前記と同義である。］
で表されるモノマーとを常法に従って共重合させることにより得ることができる。この反応において、反応溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム等を使用することができ、重合開始剤としては、例えば、２,２'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスマレノニトリル等の脂肪族アゾ化合物；過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等の有機過酸化物等を使用することができる。【００２４】
ポリマー（IV）を製造するにあたり、ｘ：ｙが通常０．１：０．９〜０．９：０．１、好ましくは０．２：０．８〜０．９：０．１、さらに好ましくは０．３：０．７〜０．７：０．３となるように、添加量、反応温度、反応時間等を制御する。ポリマー（IV）の分子量は、通常１０，０００〜７００，０００、好ましくは１０，０００〜５００，０００、さらに好ましくは１００，０００〜３００，０００である。ポリマー（IV）の分子量が上記範囲にある場合、ポリマー（IV）がコラーゲンと同等の分子量及び十分な反応基を有し、コラーゲン分子間を架橋することができる。【００２５】
モノマー（V）の具体例としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（式（V）において、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がメチル基であり、ｍ及びｎが２である化合物）が挙げられ、このモノマーは市販されている。【００２６】
カルボジイミド類又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV）と、複数のコラーゲン分子とを反応させる前に、予め、複数のコラーゲン分子を架橋しておいてもよい。複数のコラーゲン分子を予め架橋しておくことにより、最終的に形成されるゲルの機械的強度（引張強度）、膨潤度（柔軟性）、形態、生分解性（コラゲナーゼに対する分解耐性）、収縮温度（水分保持性及び寸法安定性）等を調節することができる。【００２７】
複数のコラーゲン分子の架橋化は例えばホルマリン、グルタルアルデヒド等の公知の架橋剤を使用して行うことができるが、本発明のゲルを医療用材料として使用する場合、生体適合性、透明性、機械的特性等の点から、コラーゲン分子のカルボキシル基（同一分子内のカルボキシル基又は異なる分子のカルボキシル基）とアミノ基（同一分子内のアミノ基又は異なる分子のアミノ基）又は水酸基（同一分子内の水酸基又は異なる分子の水酸基）とを反応させ、複数のコラーゲン分子を−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＣＯ−Ｏ−を介して架橋化することが好ましい。このような架橋化は、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等の水溶液又は蒸留水中、カルボジイミド類（例えば、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−１−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−４−ブタンジオール−ジグリシジルエーテル（ＢＤＧＥ））、又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド（ＮＨＳＳ））の存在下、複数のコラーゲン分子を反応させることにより得ることができる。【００２８】
反応溶媒である水溶液のｐＨは、通常７．０〜１０．０（アルカリ条件）又は２．０〜５．０（酸性条件）、好ましくは８．５〜９．５（アルカリ条件）又は４．５〜５．０（酸性条件）である。反応溶媒である水溶液のｐＨを調節することにより、最終的に形成されるゲルの機械的強度（引張強度）、膨潤度（柔軟性）、形態、生分解性（コラゲナーゼに対する分解耐性）、収縮温度（水分保持性及び寸法安定性）等を調節することができる。【００２９】
カルボジイミド類又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV）と、複数のコラーゲン分子とを反応させてゲルを調製した後、当該ゲルが有するカルボキシル基同士を架橋することが好ましい。こうして得られるゲルは、高密度ネットワークを有しており、水中における安定性が高い。
架橋させるカルボキシル基同士は、コラーゲン分子が有するカルボキシル基同士であってもよいし、コラーゲン分子が有するカルボキシル基と架橋基（I）が有するカルボキシル基であってもよい。【００３０】
カルボキシル基同士の架橋は、例えば、カルボキシル基との反応性を有する官能基を複数個有する架橋剤を用いて行うことができる。カルボキシル基との反応性を有する官能基としては、例えば、アミン基、エポキシド基等が挙げられる。カルボキシル基との反応性を有する官能基を複数個有する架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド塩酸塩、ポリアミン、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等が挙げられる。ポリアミンとしては、例えば、コラーゲン、グルタミン、リシン、グルタルアルデヒド等が挙げられる。【００３１】
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いてカルボキシル基同士を架橋する場合、反応温度は通常０〜６０℃、好ましくは０〜３７℃であり、反応時間は通常１〜１６８時間であり、好ましくは１〜４８時間であり、ｐＨは通常１〜１４、好ましくは３〜１０であり、反応溶媒としては、例えば、蒸留水、ＭＥＳ緩衝液、リン緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、テトラホウ酸ジナトリウム十水和物（disodum tetraborate decahydrate）緩衝液等を用いることができる。【００３２】
また、ポリアミンを用いてカルボキシル基同士を架橋する場合、、反応温度は通常０〜６０℃、好ましくは０〜４０℃であり、反応時間は通常１〜１６８時間であり、好ましくは1〜４８時間であい、pＨは通常１〜１４、好ましくは３〜１０であり、反応溶媒としては、例えば、蒸留水、ＭＥＳ緩衝液、リン緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、テトラホウ酸ジナトリウム十水和物（disodum tetraborate decahydrate）緩衝液を用いることができる。【００３３】
本発明のゲルを製造する際、架橋基（I）によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、所望の機能性が付与されたゲルを製造することができる。
例えば、架橋基（I）によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、コラーゲンの細胞接着性と、架橋基（I）の細胞非接着性とのバランスを調節することができ、これにより、所望の細胞接着性又は細胞非接着性が付与されたゲルを製造することができる。【００３４】
また、架橋基（I）によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、コラーゲンの血液凝固性と、架橋基（I）の血液抗凝固活性とのバランスを調節することができ、これにより、所望の血液凝固活性又は血液抗凝固活性が付与されたゲルを製造することができる。なお、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが血液抗凝固活性を有することは公知である（Y. Iwasaki,et al., J. Biomed. Mater. Res. Vol. 36, pp.508-515 (1997)）。【００３５】
また、架橋基（I）によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、所望の機械的強度（引張強度）、膨潤度（柔軟性）、形態、表面特性（親水性、疎水性）、生分解性（コラゲナーゼに対する分解耐性）、収縮温度（水分保持性及び寸法安定性）等が付与されたゲル（例えば、機械的強度が大きく、しかも十分な柔軟性を有しているゲル）を製造することができる。【００３６】
従って、本発明のゲルは、医療用材料として好適に使用することができる。医療用材料は、例えば、医療用器具材料として使用することができる。医療用器具の全体が本発明のゲルで構成されていてもよいし、その部分又は部材が本発明のゲルで構成されていてもよい。医療器具としては、例えば、人工血管、癒着防止膜、創傷被覆材、血管カテーテル、カニューラ、モニタリングチューブ、人工腎臓、人工心肺、体外循環用血液回路、人工腎臓用Ａ−Ｖシャント、人工血管、人工心臓、人工心臓弁、血液の一時的バイパスチューブ、人工透析用血液回路、ステント、血液バッグ、血液成分分離装置のディスポーザブル回路、透析膜、人工肝臓、ナノ粒子被覆材、バイオセンサー被覆材等が挙げられる。【００３７】
例えば、本発明のゲルを人工血管用材料として使用する場合、本発明のゲルにより人工血管の全体を形成してもよいし、生体内の血管の内側又は外側を本発明のゲルで被覆してもよい。生体内の血管の内側又は外側を本発明のゲルで被覆することにより、血管への細胞浸潤を抑制することができ、これにより組織過増殖の抑制又は組織再生促進を図ることができる。
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕各種コラーゲンゲルの調製
１．ポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−メタクリル酸）（ＰＭＡ）の合成
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）０．０１ｍｏｌ及びメタクリル酸０．０２４ｍｏｌをエタノール１５ｍＬに溶かし、重合開始剤としてα,α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）１．２ｍｍｏｌを加えた後、６０℃で１６時間反応させることにより重合を行った。反応混合溶液をジエチルエーテルに投じて重合物を沈殿させ、これを濾別し、アセトニトリルで洗浄した後、減圧乾燥し、次式（VII）で表されるポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−メタクリル酸）（ＰＭＡ）を得た（収率８０％）。
【化７】
0005119442.tif 000008
【００３９】
得られたＰＭＡの分子量をゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（標準物質：ポリエチレンオキサイド）により測定した結果、数平均分子量は約３００，０００であった。また、得られたＰＭＡにおけるＭＰＣ残基及びメタクリル酸残基のモル分率をプロトン核磁気共鳴装置（１Ｈ−ＮＭＲ）により測定した結果、ｘ＝３、ｙ＝７であった。【００４０】
２．コラーゲンゲルの調製
（１）ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋ゲル（Ｅ／Ｎ−ａｃゲル，Ｅ／Ｎ−ａｌゲル）の調製
コラーゲン（タイプＩコラーゲン（高研製））０．５質量％水溶液（ｐＨ３）をインキュベーター中で加温することにより、コラーゲンフィルムを調製した。コラーゲンフィルム０．０５ｇを１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−１−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）６×１０-5ｍｏｌ／ｍＬ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）６×１０-5ｍｏｌ／ｍＬを含有する２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）水溶液（ｐＨ１０）（ｐＨは水酸化ナトリウム滴下により調整）８ｍＬ中に浸漬し、４℃で４時間反応させることにより（ＣＯＯＨ：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：５：５）、コラーゲン分子が有するカルボキシル基とアミノ基とを結合させ、複数のコラーゲン分子が−ＣＯ−ＮＨ−を介して架橋されているコラーゲンゲル（Ｅ／Ｎ−ａｌゲル）を得た。【００４１】
また、ｐＨが酸性条件（ｐＨ４．５）であるＭＥＳ水溶液（ｐＨは塩酸滴下により調整）を用いて、上記と同様にコラーゲンゲル（Ｅ／Ｎ−ａｃゲル）を調製した。
各コラーゲンゲルは、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液中で２時間リンスし、蒸留水にて３日間洗浄した。【００４２】
（２）ＰＭＡ固定化ゲル（ＭｉＣ−ａｃａｃゲル，ＭｉＣ−ａｃａｌゲル，ＭｉＣ−ａｌａｃゲル，ＭｉＣ−ａｌａｌゲル）の調製
ＰＭＡ１２．５ｍｇを、ＭＥＳ水溶液（ｐＨ４．５又は１０）８ｍＬ中で、ＥＤＣ（６×１０-5ｍｏｌ／ｍＬ）／ＮＨＳ（６×１０-5ｍｏｌ／ｍＬ）と４℃で１０分間反応させた。その後、Ｅ／Ｎ−ａｃゲル（５０ｍｇ）又はＥ／Ｎ−ａｌゲル（５０ｍｇ）を加え、４℃で４時間反応させ、ＰＭＡ固定化コラーゲンゲルとして、ＭｉＣ−ａｃａｃゲル（Ｅ／Ｎ−ａｃゲルをｐＨ４．５で架橋）、ＭｉＣ−ａｃａｌゲル（Ｅ／Ｎ−ａｃゲルをｐＨ１０で架橋）、ＭｉＣ−ａｌａｃゲル（Ｅ／Ｎ−ａｌゲルをｐＨ４．５で架橋）、ＭｉＣ−ａｌａｌゲル（以下単に「ＭｉＣゲル」ともいう）（Ｅ／Ｎ−ａｌゲルをｐＨ１０で架橋）を調製した。
各コラーゲンゲルは、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液中で２時間リンスし、蒸留水にて３日間洗浄した。【００４３】
（３）ＰＭＡ多重固定化ゲル（ＭｉＣＩＩゲル，ＭｄＣゲル，ＭｄＣＩＩゲル）の調製
ＭｉＣ−ａｌａｌゲル（ＭｉＣゲル）に上記と同様のＰＭＡ固定化を再度行い、ＰＭＡの含有率の高いＭｄＣゲルを得た。また、ＰＭＡの架橋量を増加させるために、Ｅ／Ｎ−ａｌゲルと反応させるＰＭＡ及び架橋剤の量を２倍に増加させ、ＭｉＣＩＩゲルを調製した。ＭｉＣＩＩゲルに上記と同様のＰＭＡ固定化を行い、ＭｄＣＩＩゲルを調製した。
以上のように調製された各種コラーゲンゲルを表１に要約する。【００４４】
【表１】
0005119442.tif 000009
【００４５】
〔実施例２〕コラーゲンゲルの物性評価
１．コラーゲンゲルの表面分析
サンプルを凍結乾燥した後、表面をＸ線光電子分光解析法（ＸＰＳ）により光電子の放出角度を９０°にして分析した。そして、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ，ＳＭ−２００，Ｔｏｐｃｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して各種コラーゲンゲルの表面と破断表面を観察した。結果を図１に示す。なお、図示はしないが、MiC-acacゲル及びMiC-alalゲルは透明であった。【００４６】
２．コラーゲンゲルのネットワーク解析
（１）収縮温度
各種コラーゲンゲルの収縮温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ６０００，セイコー電子、Ｊａｐａｎ）で測定した。２０℃から１５０℃まで５℃／分の速度で温度を上げ、各種コラーゲンゲルの収縮温度（Ｔｓ（℃））を測定した。結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
0005119442.tif 000010
【００４８】
表２に示すように、MiC-acacゲル、MiC-acalゲル、MiC-alalゲル、MiC-alacゲル、MdCゲル及びMdC IIゲルの収縮温度は、Uc-ゲル、E/N-acゲル及びE/N-alゲルよりも高かった。特に、MiC-alalゲル、MiC-alacゲル、MdCゲル及びMdC IIゲルの収縮温度は、Uc-ゲル、E/N-acゲル及びE/N-alゲルよりも顕著に高かった。このことから、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化により、ゲルの収縮温度を高められること、すなわち、ゲルの水分保持性及び寸法安定性を高められることが明らかとなった。また、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化の際のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、又はＰＭＡによる架橋度を調節することにより、又はＥＤＣ／ＮＨＳ架橋ゲルの調製時のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、ゲルの水分保持性及び寸法安定性を調節できることが明らかとなった。【００４９】
（２）引張強度
各種コラーゲンゲルの引張強度を引張強度試験機（ＳＴＡ−１１５０，オリエンテック社製）で測定した。すなわち、各種コラーゲンゲル断片（４ｃｍ×１ｃｍ）を作製し、０．５ｍｍ／秒の速度で引っ張り、応力・歪み曲線及び引張強度を算出した。応力・歪み曲線を図２に示し、引張強度を表３に示す。【００５０】
【表３】
0005119442.tif 000011
【００５１】
表３に示すように、MiC-alalゲル及びMdCゲルの引張強度は、Uc-ゲル及びE/N-alゲルよりも高かった。このことから、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化により、ゲルの引張強度（機械的強度）を高められることが明らかとなった。また、ＰＭＡによる架橋度を調節することにより、ゲルの引張強度（機械的強度）を調節できることが明らかとなった。【００５２】
（３）膨潤度
各種コラーゲンゲルの膨潤度の測定は、次のようにして行った。凍結乾燥したサンプルを１０ｍｇに切断し、３ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の中に入れ、３７℃で２４時間で放置した。その後、膨潤したサンプルの重量を測定し、膨潤度（Swelling ratio（％））を算出した。膨潤度は次式にて算出した。【００５３】
膨潤度（％）＝（Ｗｈ−Ｗｄ）／Ｗｈ×１００
なお、Ｗｈは膨潤したサンプル重量、Ｗｄは凍結乾燥したサンプル重量を表す。  また、上記と同様にして、酸性水溶液（ｐＨ２．１）中での膨潤度を測定した。【００５４】
結果を図３に示す。
図３に示すように、MiC-acacゲル、MiC-acalゲル、MiC-alalゲル、MiC-alacゲル、MiC IIゲル、MdCゲル及びMdC IIゲルの膨潤度はいずれも１００％を越えており、十分な膨潤度（柔軟性）を有していることが明らかとなった。すなわち、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化により、ゲルの十分な膨潤度（柔軟性）を保持したまま、ゲルの引張強度（機械的強度）を高めることができることが明らかとなった。また、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化の際のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、又はＰＭＡによる架橋度を調節することにより、又はＥＤＣ／ＮＨＳ架橋ゲルの調製時のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、ゲルの膨潤度（柔軟性）を調節できることが明らかとなった。また、ゲルの膨潤度はｐＨに応答して変化することが明らかとなった。【００５５】
（４）コラーゲンゲルの生分解性評価
凍結乾燥したコラーゲンゲルを５×１０-3Ｍ 塩化カルシウム及び８×１０-4Ｍ アジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４)２ｍＬに入れ、１時間安定化させた。そして、そのゲルの重さを測定し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に戻した。その後、ゲルを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に、コラゲナーゼ（コラゲナーゼ活性：３００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）（ＥＣ３．４．２４．３）を１．３２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加し、コラゲナーゼの全体濃度を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬに調節した。３７℃でコラゲナーゼを活性化し、１時間から７２時間までのコラーゲンゲルの重量の変化を測定し、コラゲナーゼによるコラーゲンゲルの分解率を計算した。結果を図４に示す。【００５６】
図４に示すように、コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化により、ゲルのコラゲナーゼ分解耐性を高められることが明らかとなった。コラーゲンゲルへのＰＭＡ固定化の際のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、又はＰＭＡによる架橋度を調節することにより、又はＥＤＣ／ＮＨＳ架橋ゲルの調製時のｐＨ条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、ゲルのコラゲナーゼ分解耐性（生分解性）を調節できることが明らかとなった。【００５７】
〔実施例３〕コラーゲンゲルの物性評価
（１）各種コラーゲンゲルの調製
実施例１に準じて各種コラーゲンゲルを調製した。
架橋剤として１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−１−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスシニルイミド酸（ＮＨＳ）を使用した。まず、ＥＤＣ及びＮＨＳでコラーゲンフィルムを架橋し、ＥＤＣ／ＮＨＳコラーゲンゲル（Ｅ／Ｎゲル）を作製した。ＭＥＳ緩衝液（Ｃ６Ｈ１３ＮＯ４Ｓ・Ｈ２Ｏ；０．０５ｍｏｌ，ｐＨ９．０）２０ｍＬにＥＤＣ及びＮＨＳを溶かした後、コラーゲンフィルムを入れ、４℃で４時間反応させた（ＥＤＣ：ＮＨＳ：ＣＯＯＨ＝５：５：１）。その後、Ｅ／ＮゲルをＮａ２ＨＰＯ４水溶液で２時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して、未反応物質及び塩を除去した。また、コラーゲンフィルムをｐＨ９．０のＭＥＳ緩衝液に１日漬け、架橋されていないコラーゲンゲル（Ｕｃゲル）を作製し、Ｅ／Ｎゲルとともに対照ゲルとして使用した。【００５８】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ユニットを有するＰＭＡを使用し、コラーゲンとの架橋を行った。ＰＭＡをコラーゲンゲルに固定化するため、まずＰＭＡをＭＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）中でＥＤＣ及びＮＨＳと１０分間反応させ（ＥＤＣ：ＮＨＳ：ＣＯＯＨ＝５：５：１）、ＰＭＡのカルボキシル基を活性化した。その活性化ＰＭＡをコラーゲンフィルム又はＥ／Ｎゲルと４℃で４８時間反応させ、ＰＭＡ−活性化コラーゲンゲル（MPC immobilized collagen gel；ＭｉＣゲル）を作製した。このゲルをＮａ２ＨＰＯ４水溶液で２時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。最後に、コラーゲンゲルに含まれているＭＰＣの分率の上昇させるため、ＥＤＣ及びＮＨＳで活性化させたＰＭＡをＭｉＣゲルと反応させ、ＰＭＡ−二重活性化コラーゲンゲル（MPC double immobilized collagen gel；ＭｄＣゲル）を作製した。このゲルもＮａ２ＨＰＯ４水溶液で２時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。すべてのコラーゲンゲルは凍結乾燥して保存した。また、もっともＭＰＣの分率が高いリン質・コラーゲンハイブリッドゲルを作製するため、ＭｄＣゲルに、活性化したＰＭＡを反応させ、ＰＭＡ−三重活性化コラーゲンゲル（MPC triple immobilized collagen gel；ＭｔＣゲル）を作製した。【００５９】
（２）各種コラーゲンゲルの生物学的特性
（ａ）透明性
Ｕｃゲル及びＭｉＣゲルの透明性を図５に示す。なお、図５（ａ）はブルーライトを当てた状態を示し、図５（ｂ）は明るい場所で観察した状態を示し、ＡはＵｃゲル、ＢはＭｉＣゲルを示す。
図５に示すように、ＭｉＣゲル（架橋されたコラーゲンゲル）は高い透明性を有する。また、ブルーライトを当てたＵｃゲル（架橋されていないゲル）は青色を反射し、白く見える（若干青色）が、ブルーライトを当てたＭｉＣゲル（架橋されたゲル）は、透明だった。【００６０】
（ｂ）表面分析
接触角及びＸ線光電子分光法（X-ray photoelectron spectroscopy；ＸＰＳ）により、各種コラーゲンゲルの表面分析を行った。各種コラーゲンゲルの接触角については、ゴニオメーターを用いて静的接触角を測定した。Bil-mont注射器で試料の表面に水滴を形成させ、その接触角を測定した。また、ＸＰＳについては、光電子の放出角を９０°にし、各種コラーゲンゲルの表面分子状態を調べた。
接触角の測定結果を図６に示す。
図６に示すように、リン脂質ポリマー（ＰＭＡ）の固定が進むとともに接触角が低下することが確認された。コラーゲンゲル表面の親水化はタンパク質の吸着と細胞の接着を抑制する因子の一つである。リン脂質ポリマーの固定化は、コラーゲンゲル表面を親水化した。また、再架橋による接触角の低下が観察された。これは、リン脂質ポリマーで再架橋すると緻密なポリマー層が形成され、表面がより親水化されるからであると考えられる。そして、表面の親水化によって、タンパク質の吸着と細胞の接着が抑制されることが期待される。【００６１】
ＸＰＳの結果を図７に示す。
図７に示すように、ＰＭＡで架橋したコラーゲンのみリンピークが検出された。これにより、コラーゲンゲル層の外部にＰＭＡ層が生成されていることが確認された。即ち、ＰＭＡがコラーゲン層の中に入り込まずに、コラーゲン層の表面全体に固定化されることにより、細胞及び生物的活性を抑制するリン脂質基がゲルの表面に存在し、これによりゲルの表面特性が変化したことが示された。【００６２】
（ｃ）収縮実験
各種コラーゲンゲルを８０℃で３時間最小必須培地（ＭＥＭ）中で放置した後、各種コラーゲンゲルの体積を測定し、放置前の体積と比較して、収縮した体積を算出した。
結果を図８に示す。なお、図８中、ＡはＵｃゲル、ＢはＥＮゲル、ＣはＭｉＣゲル、Ｄはグルタルアルデヒド架橋ゲルを示す。
図８に示すように、８０℃で３時間各コラーゲンゲルを放置した結果、架橋されていないコラーゲンゲルの場合、温度上昇とともに収縮し、最終的に解けることが確認された。架橋されたゲルの場合、収縮が抑えられることが確認された。架橋されていない場合、収縮率は約６７％であり、ＰＭＡで架橋されたゲルの場合、収縮率は約７〜８％であった（表４）。このことは、リン脂質ポリマー／コラーゲンハイブリッドゲルの場合、リン脂質ポリマー（ＰＭＡ）とコラーゲン繊維間架橋により、コラーゲンの収縮を防ぐことが可能であることを意味する。【００６３】
【表４】
0005119442.tif 000012
【００６４】
（ｄ）タンパク質吸着実験
タンパク質吸着実験はフィブリノゲン血漿を使って行った。フィブリノゲン血漿（１ｍｇ／ｍＬ）に試料を入れ、３７℃で３時間培養した。その後、ＰＢＳで洗浄し、１ｗｔ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使ってタンパク質を全部剥がした。剥がしたタンパク質を回収し、Micro BCA キット（波長７５０ｎｍ）で吸着タンパク質濃度を測定した。
結果を図９に示す。
図９に示すように、架橋されたコラーゲンゲルは、架橋されていないコラーゲン及び内部架橋ゲル（ＥＮゲル）に比べ、タンパク質吸着量が減ることが確認された。フィブリノゲン血漿は血液に含まれているタンパク質で、血液が材料表面と接触した時、表面で活性化されて血小板及び細胞の接着を助ける。しかしながら、リン脂質ポリマーを固定した場合、フィブリノゲン血漿の吸着を防ぐことができ、血小板及び細胞の接着を抑制することが可能である。【００６５】
（ｅ）細胞接着実験
Ｌ−９２９細胞（マウス繊維雅細胞）を使用して、コラーゲンゲルと細胞との間の接着特性を調べた。Ｌ−９２９細胞をEagle’s Minimum Essential Medium（最小必須培地；Ｅ−ＭＥＭ）で培養した。０．２５％トリプシンで処理後、細胞の密度を５×１０３cells/dishに調整し、コラーゲンゲルの表面に播いた。２４時間又は４８時間後、乳酸脱水素酵素分析（ＬＤＨ；波長５６０ｎｍ）を使い、ゲルの表面に接着した細胞の数を数えた。接着した細胞の形態は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して観察した。試料に接着した細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％グルタルアルデヒドで固定した。そして、試料を脱水化し、真空で乾燥した。乾燥した試料はすべて滅菌し、走査電子顕微鏡で観察した。
結果を図１０に示す。
図１０に示すように、４８時間で約１６，０００個の細胞が吸着されたＵｃゲルに対し、Ｅ／Ｎゲルは約４，５００個、ＭｉＣゲル及びＭｄＣゲルは約２，０００個の細胞が吸着された。細胞の吸着抑制は、ＰＭＡのリン脂質基による。すなわち、ゲル表面の外側に並んであるリン脂質基がタンパク質との相互作用を防ぐ機能がある。そして、ＰＭＡを固定化することによってコラーゲンゲルの表面は親水化され、細胞の吸着が難しくなると考えられる。ＵｃゲルとＥＮゲルの場合、接着した細胞はゲルの表面と強い相互作用を起こすため、接着した細胞の形態は扁平化した（図１１）。一方、ＭｉＣ、ＭｄＣ及びＭｔＣゲルの場合、接触した細胞の形態は丸だった。これはＰＭＡ表面と細胞との間の相互作用が弱いことを示しており、細胞は増殖できないと考えられる。【００６６】
（ｆ）毒性実験
毒性実験は3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide （ＭＴＴ）キットを使って行った。Ｌ９２９細胞（５，０００cells/well）を試料に播き、４８時間培養した。その後、ＰＢＳで試料をよく洗い、ＭＴＴ溶液２００μＬ（0.5 mg/mL in medium, filter-sterilized）を試料に加え３７℃で４時間放置した。そして、ＭＴＴを捨て、ブルーフォルマザンを１００μＬのジメチルスルホキシドに溶かし、試料に添加した。Micro BCA kit（波長５７０ｎｍ）を使い、毒性を調べた。ＴＣＰＳ（Tissue culture polystyrene）に接着した細胞の数を１００％に設定し、比較した。
結果を図１２に示す。
図１２に示すように、各種コラーゲンゲルに接着している細胞は殆ど生きていることが分かった。組織 SHAPE  \* MERGEFORMAT 培養用ポリスチレン（ＴＣＰＳ）を基準として生きている細胞の割合を調べた結果、ＴＣＰＳとあまり変わらないことが分かった。このことは、接着細胞の数の減少は毒性ではなく、コラーゲンゲル表面と細胞との間の弱い相互作用による細胞接着抑制特性に起因することを示している。【００６７】
〔実施例４〕コラーゲン繊維間架橋とコラーゲン繊維／ポリマー架橋による高密度ネットワークゲルの作製
ＥＤＣ及びＮＨＳを利用したコラーゲンとポリマーの架橋は、反応後、架橋剤が残らない長点があることから汎用されている。しかしながら、ＥＤＣ及びＮＨＳとポリマーとの反応率は低いため、我々はポリマー再固定化（再架橋）を行い、ポリマーの架橋率を高めることに成功した。このシステムの場合、コラーゲンの内部架橋は微小繊維間架橋によるものの、コラーゲン繊維間架橋は存在しない。微小繊維間架橋とコラーゲン繊維間架橋の役割はあまり知られていないので、内部架橋の明確な役割に関して調べる必要がある。そこで、我々は、１,４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）を使い、その問題点の解決に望んだ。ＢＤＤＧＥは酸性の条件ではカルボキシル基と反応し、アルカリ性の条件ではアミン基と反応する特徴を持っている。そこで、我々は内部架橋されていないリン脂質ポリマー/コラーゲンハイブリッドゲルにＢＤＤＧＥを酸性条件で架橋し、リン脂質ポリマーとコラーゲン繊維架橋、コラーゲン繊維間架橋を行い、もっとも強くて高い安定性を持つ新しいタイプの高密度ネットワークゲルドゲルを作製した。このゲルを使用し、微小繊維間架橋とコラーゲン繊維間架橋の差異を調べた。【００６８】
（１）コラーゲンゲルの作製
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ユニットを有するＰＭＡを使用し、コラーゲンとの架橋を行った。ＰＭＡをコラーゲンゲルに固定化するため、まずＰＭＡをＥＤＣ／ＮＨＳと１０分間ＭＥＳ緩衝液で反応させ（ＥＤＣ：ＮＨＳ：ＣＯＯＨ＝５：５：１）、ＰＭＡのカルボキシル基を活性化した。その活性化ＰＭＡをコラーゲンフィルム及びＥ／Ｎゲルと４℃で４８時間反応させ、ＰＭＡ−活性化コラーゲンゲル[MPC immobilized collagen gel （without intrahelical cross-links）；ＭｉＣ−０ゲル]を作製した。このゲルをＮａ２ＨＰＯ４水溶液で２時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。
ＭｉＣ−０ゲルが有するカルボキシル基同士を架橋し、もっと緻密なネットワークを有するコラーゲンゲルを作製するため、ＢＤＤＧＥを含有するＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５）にＭｉＣ−０ゲルを入れ、２５℃で５日間反応させた。その後、ゲルを水で３０分間４回洗い、カルボキシル基間架橋を有するＭｉＣ−０／ｄｉｏｌゲル（高密度ネットワークゲル）を作製した。高密度ネットワークゲルの構造式を図１３に示す。【００６９】
（２）含水率
乾燥した試料（高密度ネットワークゲル）を蒸留水の中に入れて重さの変化を測定し、膨潤度を計算した。各試料を２５℃又は３７℃の蒸留水中に入れ、２４時間放置した。その後、水を軽く拭いて膨潤したゲルの重さを量り、含水率を計算した。含水率（％）は以下の式に基づき算出した。
含水率（％）＝（Ｗｈ−Ｗｄ）／Ｗｈ×１００
なお、Ｗｄは乾燥した試料の重さ、Ｗｈは膨潤した試料の重さである。
また、含水率実験の前の試料の重さと実験後の乾燥した試料の重さの変化を測定し、コラーゲンゲルの浸食率も計算した。【００７０】
結果を図１４に示す。なお、図１４（ａ）は含水率に関する結果であり、図１４（ｂ）は浸食率に関する結果である。
図１４（ａ）に示すように、コラーゲンゲルの含水率は架橋とともに低下した。ＭｉＣ−０／ｄｉｏｌゲルは、ＭｉＣ−０ゲルと比較して含水率が最も低下した。含水率を膨張度に換算すると、約７０％にも及ばなかった。また、Ｅ／Ｎゲルと比較しても、非常に含水率が低かった。これは、カルボキシル基間架橋がかなり緻密な構造を形成させることを示している。結局、このゲルは水の中に高い安定性を持つことを表している。２５℃及び３７℃における含水率を比べた結果、Ｕｃゲル以外に変化は見られなかった。これは、コラーゲンゲルの膨潤を抑え、α−へリックス構造の水による変性を防ぐことにより、安定したネットワーク構造が維持されるからであると考えられる。
また、図１４（ｂ）に示すように、約３０％の浸食率が観察されたＵｃゲルに対し、高密度ネットワークゲルの浸食率は約２％以下だった。他のゲルと比べても、非常に低い浸食率であった。このことは、このゲルが非常に安定性が高く、緻密なネットワークを形成していることを示している。すなわち、微小繊維間架橋よりもコラーゲン繊維間架橋の方が安定したコラーゲンゲルを形成できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】各種コラーゲンゲルの表面と破断表面の観察結果を示す図である。
【図２】各種コラーゲンゲルの応力・歪み曲線を示す図である。
【図３】各種コラーゲンゲルの膨潤度の測定結果を示す図である。
【図４】コラゲナーゼによる各種コラーゲンゲルの分解率を示す図である。
【図５】Ｕｃゲル（Ａ）及びＭｉＣゲル（Ｂ）の透明性を示す図であり、（ａ）はブルーライトを当てた状態を示し、（ｂ）は明るい場所で観察した状態を示す。
【図６】接触角の測定結果を示す図である。
【図７】Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）の測定結果を示す図である。
【図８】収縮実験の結果を示す図であり、ＡはＵｃゲル、ＢはＥＮゲル、ＣはＭｉＣゲル、Ｄはグルタルアルデヒド架橋ゲルを示す。
【図９】タンパク質吸着実験の結果を示す図である。
【図１０】細胞接着実験の結果を示す図である。
【図１１】ゲルの表面に接着した細胞の形態を示す図である。
【図１２】毒性実験の結果を示す図である。
【図１３】カルボキシル基間架橋を有するＭｉＣ−０／ｄｉｏｌゲル（高密度ネットワークゲル）の構造を示す図である。
【図１４】（ａ）は含水率の測定結果であり、（ｂ）は浸食率の測定結果である。
【図２】
0005119442.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１】
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【図５】
0005119442.tif 000026
【図８】
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【図１１】
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