(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体における角膜新生血管形成の処置のための組成物であって、該組成物は、ヒト血管内皮増殖因子因子−２（ＶＥＧＦ−２）ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を含み、ヒト被験体の眼に投与されるものであり、該投与によって、該ヒト被験体における新たな血管形成が阻害され、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって発現される抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列に少なくとも９９％同一な第一のアミノ酸配列であって、該第一のアミノ酸配列は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマによって発現される抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３領域を含む、第一のアミノ酸配列、および
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって発現される抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列を含む第二のアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号７９で示される６９Ｄ０９  ＳｃＦｖのＶＨドメインのアミノ酸配列に少なくとも９９％同一な第一のアミノ酸配列であって、該第一のアミノ酸配列は、配列番号７９のアミノ酸残基２６〜３５のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ１、配列番号７９のアミノ酸残基５０〜６６のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ２、および配列番号７９のアミノ酸残基９９〜１０７のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ３を含む、第一のアミノ酸配列、ならびに
配列番号７９に示される６９Ｄ０９  ＳｃＦｖのＶＬドメインのアミノ酸配列を含む第二のアミノ酸配列
を含む、組成物。
【請求項２】
前記角膜新血管形成が、角膜感染、免疫学的プロセス、アルカリやけど、外傷、炎症、毒性状態、栄養欠乏状態、またはコンタクトレンズを装着することの合併症に関連したものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記角膜感染が、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症またはオンコセルカ症である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫学的プロセスが、角膜移植片拒絶またはスティーヴンズ−ジョンソン症候群である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が生理食塩水を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、前記ヒト被験体の眼に局所投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、注射によって、前記ヒト被験体の眼へ投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、角膜支質内への注射によって、前記ヒト被験体の眼へ投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、縁周囲角膜注射によって、前記ヒト被験体の眼へ投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、徐放性形態での注射によって、前記ヒト被験体の眼へ投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、ステロイドとともに投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、点眼剤形態で、前記ヒト被験体の眼へ投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、前記ヒト被験体の眼の、眼の異常な血管新生の領域と角膜との間に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、従来のステロイド療法の補助剤として、前記ヒト被験体に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、前記ヒト被験体の体重に対して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントの用量で投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記単離抗体はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記単離抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、またはジスルフィド結合Ｆｖである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって発現される抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列に少なくとも９９％同一な第一のアミノ酸配列であって、該第一のアミノ酸配列は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマによって発現される抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３領域を含む、第一のアミノ酸配列、および
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって発現される抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列を含む第二のアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（ｂ）配列番号７９で示される６９Ｄ０９  ＳｃＦｖのＶＨドメインのアミノ酸配列に少なくとも９９％同一な第一のアミノ酸配列であって、該第一のアミノ酸配列は、配列番号７９のアミノ酸残基２６〜３５のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ１、配列番号７９のアミノ酸残基５０〜６６のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ２、および配列番号７９のアミノ酸残基９９〜１０７のアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ３を含む、第一のアミノ酸配列、ならびに
配列番号７９に示される６９Ｄ０９  ＳｃＦｖのＶＬドメインのアミノ酸配列を含む第二のアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドに特異的な抗体、そのような抗体の使用、ならびにそのような抗体の産生に関する。本発明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーとして同定された。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）である。本発明の抗体は、そのようなＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して特異的である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【０００２】
新たな血管の形成、すなわち新脈管形成は、胚の発生、それに続く成長、および組織修復のために必須である。新脈管形成はまた、新生物（すなわち、腫瘍および神経膠腫）のような特定の病理学的状態に必須な部分である。異常な新脈管形成は、炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症のような他の疾患に関連する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２−４４７，（１９８７））。
【０００３】
酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子分子は、内皮細胞および他の細胞タイプについてのマイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）およびアンギオゲニンは、新脈管形成を誘導し得るが、これらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ（１５３−１７０頁）（１９９３））。血管内皮細胞に対して高度に選択的なマイトジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦであり（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２，（１９９２））、これは血管透過因子（ＶＰＦ）としても公知である。
【０００４】
血管内皮増殖因子は、その標的細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているようである、分泌型脈管形成マイトジェンである。マウスＶＥＧＦ遺伝子は、特徴付けられ、そして胚形成におけるその発現パターンが解析されている。ＶＥＧＦの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細胞において（例えば、脈絡叢および腎糸球体において）観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化の多機能性レギュレーターとしてのＶＥＧＦの役割に一致した（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１４：５２１−５３２（１９９２））。
【０００５】
ＶＥＧＦは、ヒト血小板由来増殖因子ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂとの配列相同性を共有する（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６−１３０９、（１９８９））。相同性の程度は、それぞれ、約２１％および２３％である。ジスルフィド結合の形成に寄与する８つのシステイン残基は、これらのタンパク質において厳密に保存される。これらは類似するが、ＶＥＧＦとＰＤＧＦとの間の特異的な相違が存在する。ＰＤＧＦは結合組織についての主要な増殖因子であるが、ＶＥＧＦは、内皮細胞に高度に特異的である。あるいは、スプライシングされたｍＲＮＡが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、およびＰＤＧＦのいずれにおいても同定されており、そしてこれらの異なるスプライシング産物は、生物学的活性およびレセプター結合特異性が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦは、ホモ二量体またはヘテロ二量体として機能し、そしてレセプターに結合し、これはレセプターの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を誘発する。
【０００６】
ＶＥＧＦは、選択的スプライシングによる、１２１、１６５、１８９、および２０６ア
ミノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、可溶性でありそして新脈管形成を促進し得る。一方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ−２０６は、細胞表面におけるヘパリン含有プロテオグリカンに結合される。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管の生理学的増殖に相関していた（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｃ．Ｍ．，およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３９：５７０−５７９，（１９８９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：８１１−８２２，（１９８９））。その高親和性結合部位は、組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊａｋｅｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２４４−２５３，（１９８９））。この因子は、下垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そしていくつかのヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４５−８４８（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与える（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１６０−１７０（１９９３））。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、免疫不全マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示された（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３））。さらに、ＶＥＧＦレセプターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける神経膠芽腫増殖を阻害することが示された。
【０００７】
血管透過因子（ＶＰＦ）はまた、傷害の停止後でさえも血漿タンパク質に対する持続的な微小血管の高透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な特性である）を担うことが見出されている。このことは、ＶＰＦが、創傷治癒における重要な因子であることを示唆する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３７５−１３７９（１９９２）。
【０００８】
ＶＥＧＦの発現は、血管新生した組織（例えば、肺、心臓、胎盤、および固形腫瘍）において高く、そして時間的および空間的の両方で新脈管形成に相関する。ＶＥＧＦはまた、インビボで脈管形成を誘導することが示されている。新脈管形成は正常組織、特に血管組織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織修復を促進させる際の使用が提案されてきた（例えば、アテローム性動脈硬化症において）。
【０００９】
Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発行された米国特許第５，０７３，４９２号は、適切な環境において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方法を開示する。この方法は、環境に、ＶＥＧＦ、エフェクター、および血清由来因子を添加する工程を包含する。また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮＡは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとしても存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そして、１９９２年９月３０日に公開された欧州特許出願第９２３０２７５０．２号に開示されるように、それ自体が血管の発達および修復の促進のために有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明のポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列相同性に基づいて、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定された。
【００１１】
本発明の１つの局面によれば、新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドである。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、それぞれ配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有する、全長型または短縮型のＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、あるいはＡＴＣＣ受託番号９７１４９（１９９５年５月１２日に寄託）またはＡＴＣＣ受託番号７５６９８（１９９４年３月４日に寄託）として細菌宿主中で寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列が提供される。
【００１３】
本発明はまた、生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、ＶＥＧＦ−２のフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
【００１４】
本発明のなお別の局面によれば、組換え技術により、そのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、このタンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回収を促進する条件下で培養する工程を包含する。
【００１５】
本発明のなおさらなる局面によれば、治療的目的のため（例えば、新脈管形成、創傷治癒、損傷した骨および組織の増殖を刺激するため、ならびに血管組織を修復する促進のため）に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。特に、末梢動脈疾患（例えば、重大な四肢虚血および冠状動脈疾患）の処置のために、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される
本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体、およびそのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供され、そして、このような抗体を利用するためのプロセスが提供される。
【００１６】
ファージディスプレイ技術を使用して、本発明者らは、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する単鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」）（例えば、全長ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの成熟形態に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＥＧＦ−２のプロタンパク質形態に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＥＧＦ−２の分泌形態に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ、および／またはＶＥＧＦ−２の全長形態および分泌形態の両方に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ）を同定した。これらのｓｃＦｖのフラグメントまたは改変体を含む分子、あるいはこれらのｓｃＦｖのフラグメントまたは改変体からなる分子（例えば、表２で言及されるアミノ酸配列いずれか１つを有する、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲが挙げられる）は、全長ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの成熟形態、ＶＥＧＦ−２のプロタンパク質形態、ＶＥＧＦ−２の分泌形態ならびに／またはＶＥＧＦ−２の全長形態および分泌形態の両方に免疫特異的に結合し、これらの分子はまた、これらのｓｃＦｖをコードする核酸分子および／または分子と同様に、本発明に含まれる。
【００１７】
特に、本発明は、以下の表２において言及される配列番号７２〜配列番号８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、これらのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖに関する。これらのｓｃＦｖのフラグメントまたは改変体を含む分子、またはこれらからなる分子（例えば、例えば、表２で言及されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲが挙げられる）は、全長ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−２のプロタンパク質形態、ＶＥＧＦ−２の分泌形態および／またはＶＥＧＦ−２の全長形態および分泌形態の両方に免疫特異的に結合し、これらの分子はまた、これらのｓｃＦｖをコードする核酸分子および／または分子と同様に、本発明に含まれる。
【００１８】
本発明は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントも
しくはＶＥＧＦ−２の改変体に免疫特異的に結合する、抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む）を包含する。特に、本発明は、ヒトＶＥＧＦ−２のポリペプチド（例えば、配列番号２または配列番号４、配列番号１８）またはポリペプチドフラグメントもしくは改変体、全長ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのプロタンパク質形態、成熟ＶＥＧＦ−２ポリペプチド、またはＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む）を包含する。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、全長ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する、抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む）を包含する。他の好ましい実施形態において、本発明は、分泌形態のＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む）を包含する。
【００２０】
本発明は、疾患または障害を予防、処置、または改善するための方法および組成物に関連し、この方法は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の、１以上の抗体またはそれらのフラグメントもしくは改変体あるい関連する分子を、動物、好ましくはヒトに投与する工程を包含する。特定の実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦ−２機能またはＶＥＧＦ−２レセプター（例えば、ｆｌｔ−４またはｆｌｋ−１）機能あるいは異常な、ＶＥＧＦ−２発現またはＶＥＧＦ−２レセプター（例えば、ｆｌｔ−４またはｆｌｋ−１）発現に関連する、疾患または障害を予防、処置、または改善するための方法または組成物に関連し、この方法は、ＶＥＧＦ−２またはそれらのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の、１以上の抗体またはそれらのフラグメントもしくは改変体あるいは関連する分子を、動物、好ましくはヒトに投与する工程を包含する。非常に好ましい実施形態において、本発明は、腫瘍および腫瘍転移、特に乳癌、脳腫瘍、結腸癌、または前立腺癌あるいはリンパ管腫に関連する腫瘍および腫瘍転移を予防、処置、または改善するための、抗体に基づく方法および組成物に関連する。本発明の抗体を使用して、処置、予防、そして／または回復され得る、他の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症および増殖障害。
【００２１】
本発明はまた、疾患または障害を検出、診断、または予後診断するための方法および組成物を包含し、この方法は、ＶＥＧＦ−２またはそれらのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の、１以上の抗体またはそれらのフラグメントもしくは改変体あるいは関連する分子を動物、好ましくは、ヒトに投与する工程を包含する。特定の実施形態において、本発明はまた、ＶＥＧＦ−２機能またはＶＥＧＦ−２レセプター機能あるいは異常な、ＶＥＧＦ−２発現またはＶＥＧＦ−２レセプター発現の発現に関連する、疾患または障害を検出、診断、または予後診断するための方法および組成物を包含し、この方法は、ＶＥＧＦ−２またはそれらのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の、１以上の抗体またはそれらのフラグメントもしくは改変体あるいは関連する分子を動物、好ましくはヒトに投与する工程を包含する。
【００２２】
非常に好ましい実施形態において、本発明は、腫瘍および腫瘍転移、特に乳癌、脳腫瘍、結腸癌、または前立腺癌あるいはリンパ管腫に関連する腫瘍および腫瘍転移を検出、診断、または予後診断するための、抗体に基づく方法および組成物に関連する。本発明の抗体を使用して、処置、予防、そして／または予後診断され得る、他の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症および増殖障害。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、生物学的サンプルの中のＶＥＧＦ−２発現をモニターする診
断ツールとして本発明の抗体を使用することを包含する。
【００２４】
本発明はまた、検出可能標識（例えば、酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識）に結合している１つ以上のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明はまた、治療剤または細胞傷害性因子に結合している１つ以上のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明はまた、放射性物質に結合している１つ以上のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【００２５】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合して、そしてＶＥＧＦ−２アゴニストまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストのいずれかとして作用する抗体を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、ＶＥＧＦ−２レセプター（例えば、ｆｌｔ−１および／またはｆｌｋ−４）に結合するＶＥＧＦ−２を阻害または破壊する抗体を提供する（例えば、実施例３３を参照のこと）。他の実施形態において、本発明の抗体は、Ｅｌｋ−１のＶＥＧＦ−２誘導性リン酸化を阻害する（例えば、実施例３５参照のこと）。なお他の実施形態において、本発明の抗体は、脈管のＶＥＧＦ−２誘導性増殖および／または内非細胞増殖を阻害する（例えば、実施例３４を参照のこと）。なお好ましい他の実施形態において、本発明の抗体は、脈管形成を阻害する（例えば、実施例１６または実施例２３参照のこと）。
【００２７】
非常に好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、腫瘍または腫瘍転移を処置、予防、改善するために使用される。他の非常に好ましい実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−２抗体は、単独で、または他の治療化合物（特に、抗癌剤）と併用して、個体に投与され、腫瘍および腫瘍転移を処置、予防、または改善する。なお他の非常に好ましい実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−２抗体は、単独で、または他の抗癌処置（例えば、放射線療法、または外科手術）と併用して、個体に投与され、腫瘍および腫瘍転移を処置、予防、または改善する。
【００２８】
本発明はまた、本発明の抗体（抗体フラグメントまたは抗体改変体を含むか、またはこれらからなる、分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン）を含む）をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の抗体（抗体フラグメントまたは抗体改変体を含むか、またはこれらからなる、分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）を含む）をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞およびそれらの子孫を提供する。本発明はまた、本発明の抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれらからなる分子を含む）を産生するための方法を提供する。本発明はさらに、核酸分子から、本発明の抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含む分子、またはそれららからなる、分子を含む）を発現する方法を提供する。本発明のこれらおよび他の局面は、以下にさらに詳細に記載されている。
【００２９】
本発明のさらなる別の局面に従って、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、このアンタゴニストは、このようなポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、腫瘍の脈管形成を妨げるために使用され得、従って、糖尿病性網膜症、炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬を処置するために、腫瘍増殖を阻害する。
【００３０】
本発明の別の局面に従って、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。
【００３１】
本発明の別の局面に従って、本発明の核酸配列およびこのような核酸配列によってコードされるタンパク質における変異に関連する、疾患または疾患に対する感受性を、診断する方法が提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる局面に従って、自然科学研究、ＤＮＡ合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のための、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用するためのプロセスが提供される。
【００３３】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
１次抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体は、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｂ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｃ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｄ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｅ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；および
（ｆ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、ポリヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記ＶＥＧＦ−２ポリペプチドが以下：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸１−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸３２−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸１０３−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸１１２−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる各々２つからなるポリペプチド二量体ＶＥＧＦ−２；
（ｆ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｋ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｌ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｍ）配列番号１８のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列、
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
（項目３）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体が、６９Ｄ０９ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目４）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくと
も９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目５）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗
体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび定常ドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目６）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインおよび定常ドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目７）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＨドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目８）
項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび定常ドメインならびにＶＬドメインおよび定常ドメインを含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一である、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９）
上記定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインである、項目５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１０）
上記定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１１）
上記第１の定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインであって、上記第２定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１２）
上記１次抗体がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、またはジスルフィド結合Ｆｖである、項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１３）
上記１次抗体がモノクローナル抗体である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１４）
上記１次抗体がヒト抗体である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１５）
上記１次抗体がヒト化抗体である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１６）
上記ポリヌクレオチドが、異種ポリヌクレオチドに融合されている、項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。（項目１８）
項目１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１９）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。（項目２０）
抗体を作製するための方法であって、以下：
（ａ）項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる抗体を発現させる工程；および
（ｂ）該抗体を回収する工程を包含する、方法。
（項目２１）
項目２０に記載の方法により作製される抗体。
（項目２２）
１次抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該１次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｂ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｅ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｆ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｇ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｈ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｉ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｊ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｋ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｌ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｍ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｎ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｏ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｐ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｑ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｒ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｓ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｔ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｕ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｖ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｗ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｘ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｙ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｚ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａａ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｂ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｃ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｄ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｅ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｆ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｇ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｈ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｉ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｊ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｋ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｌ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｍ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｎ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｏ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｐ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｑ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｒ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｓ）７２ＤＯ９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｔ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｕ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｖ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｗ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｘ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｙ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｚ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂａ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｂ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｃ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｄ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｅ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｆ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｇ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｈ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｉ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｊ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｋ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｌ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｍ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；および
（ｂｎ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、ここで、該１次抗体が、免疫特異的にＶＥＧＦ−２ポリペプチドを阻害する、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２３）
項目２３に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸１−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸３２−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸１０３−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸１１２−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｅ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｆ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧ
Ｆ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｋ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｌ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｍ）配列番号１８のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２５）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＬドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２７）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２８）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なく
とも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよび定常ドメインならびにＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目３０）
上記定常ドメインが、ＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインである、項目２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３１）
上記定常ドメインが、κ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目２７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３２）
上記第１の定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインであって、上記第２定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目２９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３３）
上記抗体がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、またはジスルフィド結合Ｆｖである、請求２２〜２３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３４）
上記１次抗体がモノクローナル抗体である、項目２２〜３３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３５）
上記１次抗体がヒト抗体である、項目２２〜３４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３６）
上記１次抗体がヒト化抗体である、項目２２〜３４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３７）
上記ポリヌクレオチドが、異種ポリヌクレオチドに融合されている、項目２２〜３６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３８）
項目２２〜３７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目３９）
項目３８に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
（項目４０）
項目２２〜３７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、単離され
た宿主細胞。
（項目４１）
抗体を作製するための方法であって、以下：
（ａ）項目２２〜３７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる抗体を発現させる工程；および
（ｂ）該抗体を回収する工程を包含する、方法。
（項目４２）
項目４１に記載の方法により作製される抗体。
（項目４３）
２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一な１次抗体であって、該２次抗体が、以下：
（ａ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｂ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｃ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｄ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｅ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；および
（ｆ）６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該１次抗体がＶＥＧＦ−２ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、単離された１次抗体。
（項目４４）
項目４３に記載の単離された１次抗体であって、上記単離された１次抗体が、以下：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸１−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸３２−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸１０３−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸１１２−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｅ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチド二量体ＶＥＧＦ−２；
（ｆ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｋ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（１）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｍ）配列番号１８のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列からなる群より選択されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドに免疫特異的に結合する、単離された１次抗体。
（項目４５）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９
ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目４６）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が
、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目４７）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９
ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび定常ドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目４８）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９
ｓｃＦｖのＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目４９）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９
ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＨドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目５０）
項目４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体が、６９Ｄ０９
ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび定常ドメインならびにＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目５１）
上記定常ドメインが、ＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインである、項目４７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５２）
上記定常ドメインが、κ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目４８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５３）
上記第１の定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインであって、上記第２定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目５０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５４）
上記単離された１次抗体がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、またはジスルフィド結合Ｆｖである、請求４３〜４４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目５５）
上記１次抗体がモノクローナル抗体である、項目４３〜５４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５６）
上記単離された１次抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目４３〜５５のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目５７）
項目４３〜５６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体は、以下：
（ａ）１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｂ）１０−８Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｃ）１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｄ）１０−１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｅ）１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｆ）１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
からなる群より選択される解離定数（ＫＤ）を有する、単離された１次抗体。
（項目５８）
項目４３〜５７のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体は、以下：
（ａ）１０−３／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｂ）１０−４／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｃ）１０−５／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｄ）１０−６／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｅ）１０−７／ｓｅｃ以下のオフレート
からなる群より選択されるオフレートを有する、単離された１次抗体。
（項目５９）
上記単離された１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアゴニストである、項目４３〜５８のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目６０）
上記単離された１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアンタゴニストである、項目４３〜５８のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目６１）
項目４３〜６０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体が、以下：
（ａ）ＶＥＧＦ−２の中和；
（ｂ）ｆｌｋ−１へのＶＥＧＦ−２の結合の阻害；
（ｃ）ｆｌｋ−４へのＶＥＧＦ−２の結合の阻害；
（ｄ）ｆｌｋ−１のＶＥＧＦ−２誘導性リン酸化の阻害；
（ｅ）血管内皮細胞のＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害；
（ｆ）リンパ球内皮細胞のＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害；
（ｇ）新脈管形成の阻害；および
（ｈ）ＶＥＧＦ−２活性の増強、
からなる群より選択される活性を有する、単離された１次抗体。
（項目６２）
項目４３〜６１のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該抗体が以下：
（ａ）腫瘍増殖の阻害；
（ｂ）腫瘍転移の阻害、
からなる群より選択される活性を有する、単離された１次抗体。
（項目６３）
項目４３〜６２のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体が、検出可能な標識または放射性標識にカップリングされているか、または結合体化されている、単離された１次抗体。
（項目６４）
上記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識である、項目６３に記載の単離された１次抗体。
（項目６５）
異種ポリペプチドにカップリングされているか、または結合体化している、項目４３〜６４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目６６）
治療的薬剤に結合体化している、項目４３〜６５のいずれか１項に記載の単離された１
次抗体。
（項目６７）
上記治療的薬剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、または抗新脈管形成剤である、項目６６に記載の単離された１次抗体。
（項目６８）
上記治療的薬剤が、抗有糸分裂薬、アントラシクリン、毒素、またはアポトーシス剤である、項目６６に記載の単離された１次抗体。
（項目６９）
上記単離された１次抗体が細胞傷害性薬剤に結合体化している、項目４３〜６８のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目７０）
単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド上の、項目４３〜６９のいずれか１項に記載の単離された１次抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する、単離された１次抗体。
（項目７１）
薬学的に受容可能なキャリア中の、項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目７２）
項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を発現するように操作された、細胞株。
（項目７３）
項目７２に記載の細胞株から発現された、単離された１次抗体。
（項目７４）
上記細胞がＮＳＯ細胞またはＣＨＯ細胞である、項目７２に記載の細胞株。
（項目７５）
項目７４に記載の細胞株から発現された、単離された１次抗体。
（項目７６）
上記単離された１次抗体が、ウェスタンブロットにおいてＶＥＧＦ−２レセプターに免疫特異的に結合する、項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目７７）
上記単離された１次抗体が、ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ−２レセプターに免疫特異的に結合する、項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目７８）
疾患または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、動物に、項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を投与する工程を包含する、方法。
（項目７９）
上記動物がヒトである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
上記疾患または障害が、以下：
（ａ）炎症性疾患または炎症性障害；
（ｂ）増殖性障害；
（ｃ）腫瘍；
（ｄ）腫瘍転移；
（ｅ）乳癌；
（ｆ）脳癌；
（ｇ）前立腺癌；
（ｈ）結腸癌；
（ｉ）リンパ管腫；
（ｊ）感染症；
（ｋ）カポージ肉腫；
（ｌ）自己免疫疾患；
（ｍ）慢性関節リウマチ；
（ｎ）乾癬；
（ｏ）糖尿病性網膜症；
（ｐ）ＶＥＧＦ−２の異常発現に関連する疾患または障害；
（ｑ）ＶＥＧＦ−２機能の欠失に関連する疾患または障害；
（ｒ）ＶＥＧＦ−２レセプターの異常発現に関連する疾患または障害；および
（ｓ）ＶＥＧＦ−２レセプター機能の欠失に関連する疾患または障害；
からなる群より選択される、項目７８〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
上記単離された１次抗体が、化学療法剤と組み合わせて投与される、項目７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目８２）
上記単離された１次抗体が、放射線療法と組み合わせて投与される、項目７８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
上記単離された１次抗体が、予防的に動物に投与される、項目７８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のＶＧＥＦ−２ポリペプチドの発現をアッセイする工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのレベルを、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの標準レベル（例えば、正常な生物学的サンプルにおけるレベル）と比較する工程、
を包含する、方法。
（項目８５）
癌または他の過剰増殖性障害を検出、診断、予後、またはモニターする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のＶＧＥＦ−２ポリペプチドの発現をアッセイする工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのレベルを、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの標準レベルと比較する工程、
を包含する、方法。
（項目８６）
項目４３〜７０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を備える、キット。
（項目８７）
コントロールの抗体を備える、項目８６に記載のキット。
（項目８８）
単離された１次抗体であって、該１次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｂ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｅ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｆ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｇ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｈ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｉ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｊ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｋ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ｌ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｍ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｎ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｏ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｐ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｑ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｒ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｓ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｔ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｕ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｖ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｗ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｘ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｙ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｚ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａａ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｂ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｃ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｄ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｅ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｆ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｇ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ａｈ）７２ＤＯ９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｉ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｊ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｋ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｌ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｍ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｎ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｏ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｐ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｑ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｒ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域；
（ａｓ）７２ＤＯ９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｔ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｕ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｖ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｗ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｘ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｙ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ａｚ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂａ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｂ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｃ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域；
（ｂｄ）７２Ｄ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｅ）２５Ａ０７  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｆ）３２Ｇ１０Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｇ）３０Ｅ０６Ｘ  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｈ）１７Ｄ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｉ）１６Ｃ１０  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｊ）１６Ｂ０６  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｋ）１９Ｂ０９  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｌ）２０Ｄ０５  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；
（ｂｍ）２０Ｇ０２  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域；および
（ｂｎ）２０Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００同一である、ここで、該１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを免疫特異的に阻害する、単離された１次抗体。
（項目８９）
項目８８に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体は、以下：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸１−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸３２−４１９を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸１０３−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸１１２−２２７を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｅ）各々配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｆ）各々が配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチド；
（ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全長ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｋ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされるプロタンパク質ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；
（１）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｍ）配列番号１８のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドに免疫特異的に結合する、単離された１次抗体。
（項目９０）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９１）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＬドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９２）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９３）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９４）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９５）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、上記１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよび定常ドメインならびにＶＬドメインおよび定常ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目９６）
項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該１次抗体が、２次抗体に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であり、該２次抗体は、以下：
（ａ）７２Ｄ０９；
（ｂ）２５Ａ０７；
（ｃ）３２Ｇ１０Ｘ；
（ｄ）３０Ｅ０６Ｘ；
（ｅ）１７Ｄ０６；
（ｆ）１６Ｃ１０；
（ｇ）１６Ｂ０６；
（ｈ）１９Ｂ０９；
（ｉ）２０Ｄ０５；
（ｊ）２０Ｇ０２；および
（ｋ）２０Ｇ１１
からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインを含む、単離された１次抗体。
（項目９７）
上記定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインである、項目９３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目９８）
上記定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目９４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目９９）
上記第１の定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインまたはＩｇＡ定常ドメインであって、上記第２定常ドメインがκ定常ドメインまたはλ定常ドメインである、項目９６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１００）
上記単離された１次抗体がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、またはジスルフィド結合Ｆｖである、項目８８〜８９のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１０１）
上記１次抗体がモノクローナル抗体である、項目８８〜１００のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目１０２）
上記１次抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目８８〜１０１のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１０３）
項目８８〜１０２のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体は、以下：
（ａ）１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｂ）１０−８Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｃ）１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｄ）１０−１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
（ｅ）１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；および
（ｆ）１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）；
からなる群より選択される解離定数（ＫＤ）を有する、単離された１次抗体。
（項目１０４）
項目８８〜１０３のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体は、以下：
（ａ）１０−３／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｂ）１０−４／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｃ）１０−５／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｄ）１０−６／ｓｅｃ以下のオフレート
（ｅ）１０−７／ｓｅｃ以下のオフレート
からなる群より選択されるオフレートを有する、単離された１次抗体。
（項目１０５）
上記単離された１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアゴニストである、項目８
８〜１０４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１０６）
上記単離された１次抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアンタゴニストである、項目８８〜１０４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１０７）
項目８８〜１０６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体が、以下：
（ａ）ＶＥＧＦ−２の中和；
（ｂ）ｆｌｋ−１へのＶＥＧＦ−２の結合の阻害；
（ｃ）ｆｌｋ−４へのＶＥＧＦ−２の結合の阻害；
（ｄ）ｆｌｋ−１のＶＥＧＦ−２誘導性リン酸化の阻害；
（ｅ）血管内皮細胞のＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害；
（ｆ）リンパ球内皮細胞のＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害；
（ｇ）新脈管形成の阻害；および
（ｈ）ＶＥＧＦ−２活性の増強、
からなる群より選択される活性を有する、単離された１次抗体。
（項目１０８）
項目８８〜１０７のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該抗体が以下：
（ａ）腫瘍増殖の阻害；および
（ｂ）腫瘍転移の阻害、
からなる群より選択される活性を有する、単離された１次抗体。
（項目１０９）
項目８８〜１０８のいずれか１項に記載の単離された１次抗体であって、該単離された１次抗体が、検出可能な標識または放射性標識にカップリングされているか、または結合体化されている、単離された１次抗体。
（項目１１０）
上記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識である、項目１０９に記載の単離された１次抗体。
（項目１１１）
異種ポリペプチドにカップリングされているか、または結合体化している、項目８８〜１１０のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１１２）
治療的薬剤に結合体化している、項目８８〜１１１のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１１３）
上記治療的薬剤が、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、または抗新脈管形成剤である、項目１１２に記載の単離された１次抗体。
（項目１１４）
上記治療的薬剤が、抗有糸分裂薬、アントラシクリン、毒素、またはアポトーシス剤である、項目１１２に記載の単離された１次抗体。
（項目１１５）
上記単離された１次抗体が細胞傷害性薬剤に結合体化している、項目８８〜１１４のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１１６）
単離された抗体であって、該単離された抗体が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド上の、項目８８〜１１５のいずれか１項に記載の単離された１次抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する、単離された抗体。
（項目１１７）
薬学的に受容可能なキャリア中の、項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離さ
れた１次抗体。
（項目１１８）
項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を発現するように操作された、細胞株。
（項目１１９）
項目１１８に記載の細胞株から発現された、単離された１次抗体。
（項目１２０）
上記細胞がＮＳＯ細胞またはＣＨＯ細胞である、項目１１８に記載の細胞株。
（項目１２１）
項目１２０に記載の細胞株から発現された、単離された１次抗体。
（項目１２２）
上記単離された１次抗体が、ウェスタンブロットにおいてＶＥＧＦ−２レセプターに免疫特異的に結合する、項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１２３）
上記単離された１次抗体が、ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ−２レセプターに免疫特異的に結合する、項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体。
（項目１２４）
疾患または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、動物に、項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を投与する工程を包含する、方法。（項目１２５）
上記動物がヒトである、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
上記疾患または障害が、以下：
（ａ）炎症性疾患または炎症性障害；
（ｂ）増殖性障害；
（ｃ）腫瘍；
（ｄ）腫瘍転移；
（ｅ）乳癌；
（ｆ）脳癌；
（ｇ）前立腺癌；
（ｈ）結腸癌；
（ｉ）リンパ管腫；
（ｊ）感染症；
（ｋ）カポージ肉腫；
（ｌ）自己免疫疾患；
（ｍ）慢性関節リウマチ；
（ｎ）乾癬；
（ｏ）糖尿病性網膜症；
（ｐ）ＶＥＧＦ−２の異常発現に関連する疾患または障害；
（ｑ）ＶＥＧＦ−２機能の欠失に関連する疾患または障害；
（ｒ）ＶＥＧＦ−２レセプターの異常発現に関連する疾患または障害；および
（ｓ）ＶＥＧＦ−２レセプター機能の欠失に関連する疾患または障害；
からなる群より選択される、項目１２４〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
上記単離された１次抗体が、化学療法剤と組み合わせて投与される、項目１２４〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２８）
上記単離された１次抗体が、放射線療法と組み合わせて投与される、項目１２４〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２９）
上記単離された１次抗体が、予防的に動物に投与される、項目１２４〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３０）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のＶＧＥＦ−２ポリペプチドの発現をアッセイする工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのレベルを、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの標準レベル（例えば、正常な生物学的サンプルにおけるレベル）と比較する工程、
を包含する、方法。
（項目１３１）
癌または他の過剰増殖性障害を検出、診断、予後、またはモニターする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を用いて、個体由来の生物学的サンプル中のＶＧＥＦ−２ポリペプチドの発現をアッセイする工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのレベルを、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの標準レベルと比較する工程、
を包含する、方法。
（項目１３２）
項目８８〜１１６のいずれか１項に記載の単離された１次抗体を備える、キット。
（項目１３３）
コントロールの抗体を備える、項目１３２に記載のキット。
【００３４】
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、そして特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図２Ａ】図２Ａは、ＶＥＧＦ−２の短縮した、生物学的に活性な形態のヌクレオチド（配列番号３）配列および推定アミノ酸（配列番号４）配列を示す。このポリペプチドは、最初のおよそ２４個のアミノ酸がリーダー配列を表す、およそ３５０個のアミノ酸残基を含む。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＶＥＧＦ−２の短縮した、生物学的に活性な形態のヌクレオチド（配列番号３）配列および推定アミノ酸（配列番号４）配列を示す。このポリペプチドは、最初のおよそ２４個のアミノ酸がリーダー配列を表す、およそ３５０個のアミノ酸残基を含む。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＶＥＧＦ−２の短縮した、生物学的に活性な形態のヌクレオチド（配列番号３）配列および推定アミノ酸（配列番号４）配列を示す。このポリペプチドは、最初のおよそ２４個のアミノ酸がリーダー配列を表す、およそ３５０個のアミノ酸残基を含む。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＶＥＧＦ−２の短縮した、生物学的に活性な形態のヌクレオチド（配列番号３）配列および推定アミノ酸（配列番号４）配列を示す。このポリペプチドは、最初のおよそ２４個のアミノ酸がリーダー配列を表す、およそ３５０個のアミノ酸残基を含む。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＤＧＦａ（配列番号５）と、ＰＤＧＦｂ（配列番号６）と、ＶＥＧＦ（配列番号７）とＶＥＧＦ−２（配列番号４）の間のアミノ酸配列の相同性の例示である。枠で囲った領域は、保存された配列および８個の保存されたシステイン残基の位置を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＤＧＦａ（配列番号５）と、ＰＤＧＦｂ（配列番号６）と、ＶＥＧＦ（配列番号７）とＶＥＧＦ−２（配列番号４）の間のアミノ酸配列の相同性の例示である。枠で囲った領域は、保存された配列および８個の保存されたシステイン残基の位置を示す。
【図４】図４は、表の形式において、ＰＤＧＦａと、ＰＤＧＦｂと、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−２との間の相同性の百分率を示す。
【図５】図５は、ヒト乳房腫瘍細胞株におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの存在を示す。
【図６】図６は、ヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２のノーザンブロット分析の結果を示す。
【図７】図７は、本発明のポリペプチドのインビトロでの転写、翻訳、および電気泳動の後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１：１４Ｃおよびレインボー分子量（Ｍ．Ｗ．）マーカー；レーン２：ＦＧＦコントロール；レーン３：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＭ１３順方向プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２；レーン４：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ４プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２；レーン５：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ５プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２。
【図８Ａ】図８Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系において発現された。細胞の培地および細胞質由来のタンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系において発現された。細胞の培地および細胞質由来のタンパク質を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図９】図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。本発明の核酸配列で感染したＳｆ９細胞由来の培地を沈澱させた。再懸濁した沈澱物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１０】図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２を培地上清から精製し、そして還元剤であるｂ−メルカプトエタノールの存在下および非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１１】図１１は、ＲＰ−３００カラム（０．２１×３ｃｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用する精製ＶＥＧＦ−２の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。カラムを０．１％のトリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）で平衡化し、そしてタンパク質を、０％〜６０％の溶媒Ｂ（０．０７％ＴＦＡを含むアセトニトリルからなる）の７．５分間の勾配で溶出した。タンパク質溶出を、２１５ｎｍ（「赤」線）および２８０ｎｍ（「青」線）の吸光度によってモニターした。溶媒Ｂの百分率を「緑」線によって示す。
【図１２】図１２は、塩基性線維芽細胞増殖因子との比較における、血管内皮細胞の増殖に対する部分精製ＶＥＧＦ−２タンパク質の効果を例示する棒グラフである。
【図１３】図１３は、血管内皮細胞の増殖に対する精製ＶＥＧＦ−２タンパク質の効果を例示する棒グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ヒト胎児組織およびヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヒト胎児組織およびヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１５】図１５は、ヒト初代培養細胞におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＣＯＳ−７細胞中でのＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＣＯＳ−７細胞中でのＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現を示す。
【図１７】図１７は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ−２で刺激した増殖を示す。
【図１８】図１８は、皮膚微小血管内皮細胞のＶＥＧＦ−２で刺激した増殖を示す。
【図１９】図１９は、微小血管、臍帯、子宮内膜、およびウシ大動脈内皮細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２の刺激効果を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＰＤＧＦで誘導した血管（ヒト大動脈）平滑筋細胞の増殖の阻害を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＰＤＧＦで誘導した血管（ヒト大動脈）平滑筋細胞の増殖の阻害を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＶＥＧＦ−２によるＨＵＶＥＣの遊走の刺激を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＶＥＧＦ−２によるウシ微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の遊走の刺激を示す。
【図２２】図２２は、ＶＥＧＦ−２およびＶＥＧＦ−１によるＨＵＶＥＣの一酸化窒素放出の刺激を示す。
【図２３】図２３は、ＶＥＧＦ−２による微小血管内皮細胞（ＣＡＤＭＥＣ）の索形成の阻害を示す。
【図２４】図２４は、ＣＡＭアッセイにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−２、およびｂＦＧＦによる、新脈管形成の刺激を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｅ】図２５Ｅは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｆ】図２５Ｆは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｇ】図２５Ｇは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｈ】図２５Ｈは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｉ】図２５Ｉは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｊ】図２５Ｊは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｋ】図２５Ｋは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｌ】図２５Ｌは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｍ】図２５Ｍは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｎ】図２５Ｎは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２５Ｏ】図２５Ｏは、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜図２５Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜図２５Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜図２５Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜図２５Ｏ）。
【図２６Ａ】図２６Ａは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。図２６Ａは、ＶＥＧＦ−２で達成された拡張期血圧の用量依存性の低下を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。図２６Ｂは、ＶＥＧＦ−２で達成された拡張期血圧の用量依存性の低下を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。図２６Ｃは、ＶＥＧＦ−２で観察された平均動脈圧（ＭＡＰ）の減少を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。図２６Ｄは、ＶＥＧＦ−２で観察された平均動脈圧（ＭＡＰ）の減少を示す。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。パネルＥは、ＳＨＲラットの平均動脈圧（ＭＡＰ）に対する漸増用量のＶＥＧＦ−２の効果を示す。
【図２６Ｆ】図２６Ｆは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。パネルＦは、ＳＨＲラットの拡張期圧に対するＶＥＧＦ−２の効果を示す。
【図２６Ｇ】図２６Ｇは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。パネルＧは、ＳＨＲラットの拡張期血圧に対するＶＥＧＦ−２の効果を示す。
【図２７】図２７は、ＶＥＧＦ−２Ｎ＝およびＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害を示す。
【図２８】図２８は、ｐＨＥ４ａ発現ベクター（配列番号１６）の模式的な描写を示す。カナマイシン耐性マーカー遺伝子、複数のクローニング部位のリンカー領域、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード配列の位置を示す。
【図２９】図２９は、ｐＨＥ４ａプロモーター（配列番号１７）の調節エレメントのヌクレオチド配列を示す。２つのｌａｃオペレーター配列である、シャイン−ダルガルノ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩの制限酵素切断部位（イタリック体）を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ａは、ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト胸部癌腫増殖に対するαＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ｂは、ＶＥＧＦ−２抗体に曝露してから４２日後の、ＰＣ−３腫瘍の対するＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ｃは、リンパ節の転移頻度に対するＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ｄは、ＶＥＧＦ−２抗体に曝露してから４３日後の、ＰＣ−３腫瘍の重量に対するＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【図３０Ｅ】図３０Ｅは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ｅは、丁度、４０日間におよぶ、ＰＣ−３腫瘍の増殖速度に対するＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【図３０Ｆ】図３０Ｆは、腫瘍の、サイズ、重量および転移におけるＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。図３０Ｆは、ＶＥＧＦ−２抗体への曝露後４２日の、ＰＣ−３腫瘍体積に対するＶＥＧＦ−２抗体の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の１つの局面に従って、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）（これは、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された）を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ｃＤＮＡクローン（これは、１９９５年５月１２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号９７１４９を与えられた）を配列決定することによって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を得た。
【００３７】
本発明の別の局面に従って、図２の推定アミノ酸配列（配列番号４）（これは、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された）を有する短縮型ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ｃＤＮＡクローン（これは、１９９４年３月４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号７５６９８を与えられた）を配列決定することによって、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を得た。
【００３８】
別に示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することにより決定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのモデル３７３）を使用することによって決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、上記の決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、この自動化アプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一性、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％の同一性である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定され得る。また当該分野で公知のように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入または欠失が、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じ、その結果、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、これは、このような挿入または欠失の位置で開始する。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚（８〜９週）破骨細胞腫、成体心臓またはいくつかの乳癌細胞株から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、９週齢の初期のヒト胚由来ｃＤＮＡライブラリー中に発見された。それは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に関連する。それは、約４１９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、この最初のおよそ２３個のアミノ酸残基は推定のリーダー配列であり、その結果、成熟タンパク質は３９６個のアミノ酸を含む。そしてこのタンパク質は、ヒト血管内皮増殖因子に対して最も高いアミノ酸配列相同性（３０％の同一性）を示し、ＰＤＧＦａ（２４％）およびＰＤＧＦｂ（２２％）がそれに続く。（図４を参照のこと）。８つ全てのシステインが、ファミリーの４つのメンバー内全てで保存されることは特に重要である（図３のボックスで囲んだ領域を参照のこ
と）。さらに、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの特徴であるＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ（配列番号８）が、ＶＥＧＦ−２において保存される（図３を参照のこと）。ＶＥＧＦ−２と、ＶＥＧＦと２つのＰＤＧＦとの間の相同性は、タンパク質配列レベルにおいてである。ヌクレオチド配列の相同性は、全く検出され得ず、従って、単純なアプローチ（例えば、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション）を介してＶＥＧＦ−２を単離することは困難である。
【００４０】
本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、全長ポリペプチドならびに任意のリーダー配列および全長ポリペプチドの活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。活性フラグメントは、配列番号２に示す全長アミノ酸配列の全４１９アミノ酸よりも少ないアミノ酸を有するが、図３において保存されることが示される８つのシステイン残基をなお含み、そしてＶＥＧＦ−２活性をなお有する、全長アミノ酸配列の任意の部分を含むことを意味する。
【００４１】
正常組織には、少なくとも２つの交互にスプライシングされたＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡ配列が存在する。図７、レーン５における２つのバンドは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする交互にスプライシングされたｍＲＮＡの存在を示す。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する）であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖である場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１または図２に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複性または縮重の結果として、図１、図２のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００４３】
図１もしくは図２の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドについてのコード配列およびリーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列のような、さらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コード配列）。
【００４４】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００４５】
本発明はさらに、図１もしくは図２の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００４６】
従って、本発明は、図１もしくは図２に示されるような同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１もしくは図２のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含する。
【００４７】
本明細書中上記で示したように、このポリヌクレオチドは、図１もしくは図２に示されるコード配列、または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００４８】
本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで成熟ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌において補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そしてポリペプチドの成熟形態を形成するために、宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し得る。このポリヌクレオチドはまた、さらなる５’アミノ酸残基を付加されている成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性形態である。一旦プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残存する。
【００４９】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一、そしてより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠損するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の約１〜約３９６の位置のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００５２】
本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一であり、そしてより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠損するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号４の約１〜約３２６の位置のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００５３】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチド配列がＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５個までの点変異を含み得ることを除いて、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意図する。換言すると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までを、欠失し得るかまたは別のヌクレオチドで置換し得、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドを参照配列中に挿入し得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５Ｎ末端位置または３Ｎ末端位置で、あるいはこれらの末端位置の間のどこかに、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に分散してかまたは参照配列中に１以上の連続した群で分散してかのいずれかで生じ得る。
【００５４】
現実的な問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列にか、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１））を使用して従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の相同性の最も優れたセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００５５】
以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドを使用し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起し得、これらは、以下に記載されるようにＶＥＧＦ−２タンパク質の発現を検出するための診断アッセイにおいて、あるいはＶＥＧＦ−２タンパク質の機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、本発明に従う候補アゴニストおよび候補アンタゴニストでもある、ＶＥＧＦ−２タンパク質結合タンパク質を「捕捉」する酵母ツーハイブリッド系において使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６（１９８９）に記載される。
【００５６】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に惹起し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅａｃｔ  ｗｉ
ｔｈ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０〜６６６を参照のこと。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、しばしば、タンパク質の一次配列で示され、一連の単純な化学法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち免疫原性エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。極端に疎水性であるペプチドおよびそれらの６以下の残基は、一般に、模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘導する際に非効果的であり；より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含む可溶性ペプチドは、通常、効果的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出第６６１頁。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％をカバーする８〜３９個の残基を含む、これのガイドラインに従って設計された２０個のペプチドのうちの１８個は、ＨＡ１タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導し；そしてＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質由来の１８／１８は、それぞれのタンパク質を沈降させた抗体を誘導した。
【００５７】
従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合により得られた、高い割合のハイブリドーマは、一般に、ネイティブなタンパク質と反応する抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、第６６３頁。抗原性エピトープ保有ペプチドまたは抗原性エピトープ保有ポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣されたタンパク質を検出するために有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の運命をたどるために使用され得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣されたタンパク質についての種々の定性的アッセイまたは定量的アッセイにおいて、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。なぜなら、短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）でさえ、免疫沈降アッセイにおいて、より大きいペプチドを結合および置換し得ることが示されているからである。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７〜７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知である方法を使用する吸着クロマトグラフィーによる、模倣されたタンパク質の精製に有用である。
【００５８】
上記のガイドラインに従って設計される本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５個〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。しかし、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１５０個のアミノ酸を含む、あるいは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体までの任意の長さ、およびその全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きい部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドはまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはエピトープ保有ポリペプチドとみなされ、そしてまた、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中での実質的可溶性を提供するように選択され（すなわち、この配列は、比較的親水性の残基を含み、そして非常に疎水性の配列は、好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が、特に好ましい。
【００５９】
ＶＥＧＦ−２特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまたは抗原性ペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２の約ｌｅｕ−３７から約ｇｌｕ−４５まで、配列番号２の約Ｔｙｒ−５８から約Ｇｌｙ−６６まで、配列番号２の約Ｇｌｎ−７３から約Ｇｌｕ−８１まで、配列番号２の約Ａｓｐ−１００から約Ｃｙｓ−１０８まで、配列番号２の約Ｇｌｙ−１４０から約Ｌｅｕ−１４８まで、配列番号２の約Ｐｒｏ−１６８から約Ｖａｌ−１７６まで、配列番号２の約Ｈｉｓ−１８３から約Ｌｙｓ
−１９１まで、配列番号２の約Ｉｌｅ−２０１から約Ｔｈｒ−２０９まで、配列番号２の約Ａｌａ−２１６から約Ｔｙｒ−２２４まで、配列番号２のＡｓｐ−２４４から約Ｈｉｓ−２５４まで、配列番号２の約Ｇｌｙ−２５８から約Ｇｌｕ−２６６まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−２７２から約Ｓｅｒ−２８０まで、配列番号２の約Ｐｒｏ−２８３から約Ｓｅｒ−２９１まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−２９６から約Ｇｌｎ−３０４まで、配列番号２の約Ａｌａ−３０７から約Ｃｙｓ−３１６まで、配列番号２の約Ｖａｌ−３１９からＣｙｓ−３３５まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−３３９から約Ｌｅｕ−３４７まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−３６０から約Ｇｌｕ−３７３まで、配列番号２の約Ｔｙｒ−３７８から約Ｖａｌ−３８６まで、および配列番号２の約Ｓｅｒ−３８８から約Ｓｅｒ−３９６まで、のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、ＶＥＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを保有することが、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析により決定されている。
【００６０】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用する組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫の間のキャリアとして作用する、より大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、４週間未満で（ＥＬＩＳＡ型結合研究により）調製されそして特徴づけられたＨＡ１ポリペプチドのセグメントの１アミノ酸改変体を表す２４８個の異なる１３残基ペプチドを１０〜２０ｍｇ）の合成のための簡便な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ
ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５。この「同時多数ペプチド合成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに入れられ、固相法に包含される多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にしている。完全に手動の手順により、５００〜１０００以上の合成を、同時に行わせることが可能である。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、第５１３４頁。
【００６１】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般的に、動物は、遊離のペプチドで免疫され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、ペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）に結合させることによってブーストされ得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアに結合され得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアに結合させ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、例えば、約１００ｍｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含有するエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射により遊離ペプチドまたはキャリアに結合したペプチドのいずれかで免疫される。例えば、いくつかのブースター注射は、約２週間の間隔で、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより
、固相表面に吸着させた遊離のペプチドを使用して検出され得る抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要とされ得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方法に従って、固相上のペプチドへ吸着させ、そして選択された抗体を溶出することによる、抗ペプチド抗体の選択により増大され得る。
【００６２】
本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち、タンパク質全体が免疫原である場合、そのタンパク質のうちの抗体応答を誘発する部分は、当該分野で公知の方法に従って、同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて反応するに十分な純度の数百のペプチドの固相支持体上での、迅速な同時合成のための手順を開示する。次いで、合成されたペプチドと抗体との相互作用は、支持体からそれらを除去せずに容易に検出される。このようにして、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドが、当業者により慣用的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスの外被タンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、Ｇｅｙｓｅｎらによって、そのタンパク質の２１３アミノ酸配列全体をカバーする全２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットの合成により、７アミノ酸の解像度で位置づけられた。次いで、エピトープ内の全ての位置で全２０アミノ酸で次々と置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応に対して特異性を付与する特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法によって慣用的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）に対する米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載する。
【００６３】
さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９０）は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの幾何学的等価物（すなわち、アミモトープ（Ａｍｉｍｏｔｏｐｅ））であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第４，４３３，０９２号（１９８９）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に対して相補的であるリガンドの幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混合物（Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）に関するＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．らに対する米国特許第５，４８０，９７１号（１９９６）は、直線状Ｃ１−Ｃ７アルキルペルアルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、このようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用するための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により慣用的に作製され得る。
【００６４】
当業者に理解されるように、上記の本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの増大した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第一の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰＡ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。
【００６５】
本発明に従って、ＶＥＧＦ−２の新規な改変体がまた記載される。これらはＶＥＧＦ−２の一つ以上のアミノ酸を欠失または置換することによって産生され得る。天然の変異は、対立遺伝子バリエーションと呼ばれる。対立遺伝子バリエーションは、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化がない）であり得るか、または変化したアミノ酸配列を有し得る。
【００６６】
ネイティブのＶＥＧＦ−２の特徴を改善または変更するための試みにおいて、タンパク質操作が使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規のポリペプチドを作製するために使用され得る。ムテインおよび欠失は、例えば、増強された活性または増大した安定性を示し得る。さらに、それらはより高収量で精製され得、そしてより良好な可溶性を少なくとも特定の精製および保存条件下で示す。以下に示すのは、構築され得る変異の例である。
【００６７】
（アミノ末端およびカルボキシ末端欠失）
さらに、ＶＥＧＦ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動した場合、発現の際にタンパク質分解的に切断され、以下のサイズのポリペプチドフラグメントを生じるようである（サイズはおよそである）（例えば、図６〜８を参照のこと）：８０、５９、４５、４３、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３１、２９、２１、および１５ｋＤａ。これらのポリペプチドフラグメントは、そのタンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分の両方でタンパク質分解切断された結果である。これらのタンパク質分解的に生成されたフラグメント、特に２１ｋＤａのフラグメントは、活性を有するようである。
【００６８】
さらに、タンパク質操作は、ネイティブのＶＥＧＦ−２の一つ以上の特徴を改善または変更するために使用され得る。カルボキシ末端のアミノ酸の欠失は、タンパク質の活性を増強し得る。１つの例は、タンパク質のカルボキシ末端からの１０アミノ酸残基の欠失により、１０倍までのより高い活性を示すインターフェロンγである（Ｄｏｅｂｅｌｉら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。従って、本発明の１つの局面は、ネイティブのＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して増強された安定性（例えば、代表的なｐＨ、熱条件、または他の保存条件に曝露された場合）を示すＶＥＧＦ−２のポリペプチドアナログおよびそのようなアナログをコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００６９】
特に好ましいＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、以下に示される（番号付けは、タンパク質（図１（配列番号１８））中の第一のアミノ酸（Ｍｅｔ）で始まる）：Ａｌａ（残基２４）〜Ｓｅｒ（残基４１９）；Ｐｒｏ（２５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（３０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｐｈｅ（３１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（３２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（３３）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｙ（３４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｌｅｕ（３５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（３６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｌｅｕ（３７）〜（Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（３８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（３９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（４１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｐｒｏ（４２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（４３）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｙ（４５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（４６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｔｈｒ（４８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｔｙｒ（５０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（５２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（５４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｖａｌ（６２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｖａｌ（６５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｍｅｔ（４１８）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｎ（４１７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（４１６）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｒｇ（４１５）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｎ（４１４）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｔｒｐ（４１３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｔｙｒ（４１２）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｓｅｒ（４１１）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（４１０）；Ｍ
ｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｖａｌ（４０９）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｃｙｓ（４０８）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｒｇ（４０７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｃｙｓ（４０６）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｖａｌ（４０５）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｕ（４０４）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｕ（４０３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｓｅｒ（４０２）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｙ（３９８）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（３９７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｌｙｓ（３９３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｍｅｔ（２６３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｓｐ（３１１）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（３６７）；Ｍｅｔ（１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｍｅｔ（１）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（４７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１０）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１１）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１２）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１０）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１１）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１２）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｓｎ（１１５）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１０）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１１）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１２）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｙｒ（
１１４）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｅｕ（２２９）。
【００７０】
好ましい実施形態には、以下の欠失変異体が含まれる：図１（配列番号１８）の
【００７１】
【化１】
0005132008.tif 000002
本発明にはまた、Ｎ末端とＣ末端の両方からのアミノ酸欠失を有する欠失変異体が含まれる。このような変異体には、上記のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれる。これらの組み合わせは、当業者に公知の組換え技術を使用して作製され得る。
【００７２】
特に、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−３９６により記載され得、ここでｍは、−２３〜３８８の整数であり、ｍは、配列番号２に同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、Ｎ末端欠失は、図３の保存されたボックスで囲んだ領域（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ）（配列番号８）を保持する。配列番号２に示す本発明のポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２の
【００７３】
【化２】
0005132008.tif 000003
【００７４】
【化３】
0005132008.tif 000004
【００７５】
【化４】
0005132008.tif 000005
。１つの好ましい実施形態には、配列番号２のアミノ酸Ｓ−２０５〜Ｓ−３９６が含まれる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００７６】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式−２３−ｎにより記載され得、ここでｎは−１５〜３９５の整数であり、ｎは、配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、Ｃ末端欠失は、図３の保存されたボックスで囲んだ領域（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ）（配列番号８）を保持する。配列番号２に示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２の
【００７７】
【化５】
0005132008.tif 000006
【００７８】
【化６】
0005132008.tif 000007
【００７９】
【化７】
0005132008.tif 000008
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００８０】
さらに、本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方からの１つ以上のア
ミノ酸欠失を有するポリペプチドを提供し、それらは一般に、配列番号２において残基ｍ−ｎを有するとして記載され得、ここで、ｎおよびｍは、上記のような整数である。
【００８１】
同様に、配列番号２に示される本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失もまた好ましく、これらは以下のの残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２
【００８２】
【化８】
0005132008.tif 000009
【００８３】
【化９】
0005132008.tif 000010
【００８４】
【化１０】
0005132008.tif 000011
。配列番号２のアミノ酸残基Ｆ−９からＲ−２０３を含むポリペプチドフラグメント、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。配列番号２のポリペプチドのこのＦ−９〜Ｒ−２０３は、好ましくは、配列番号２のポリペプチドのＳ−２０５〜Ｓ−３９６と結合する。結合は、ジスルフィド、共有相互作用、もしくは非共有相互作用、リンカー（例えば、セリン、グリシン、プロリン連結）を介した連結による、または抗体によるものであり得る。
【００８５】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、配列データベースを介して公に利用可能であり、そしてアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号１の１〜１６６０の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１６７４の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが、本発明からは好ましくは、除外される。
【００８６】
従って、１つの局面において、本発明によりＮ末端欠失変異体が提供される。このような変異体には、図１（配列番号１８）の少なくとも最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−−Ｇｌｕ（２４）の欠失）であるか、少なくとも最初の１１５個以下のＮ末端アミノ酸残基以外の、図１（配列番号１８）に示されるアミノ酸配列を含むものが含まれる。あるいは、最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基（すなわち、図１（配列番号１８）の少なくともＭｅｔ（１）−−Ｇｌｕ（２４）の欠失）であるが、最初の１０３個以下のＮ末端アミノ酸残基などである。
【００８７】
別の局面において、本発明により、Ｃ末端欠失変異体が提供される。このような変異体には、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ（４１９））の欠失であるが、最後の２２０個以下のＣ末端アミノ酸残基（すなわち、図１（配列番号１８）のアミノ酸残基Ｖａｌ（１９９）−Ｓｅｒ（４１９）の欠失）以外の、図１（配列番号１８）に示されるアミノ酸配列を含むものが含まれる。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の２１６個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の２０４個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１９２個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１５６個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１０８個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の５２個以下のＣ末端アミノ酸残基である。
【００８８】
なお別の局面において、本発明には、Ｎ末端およびＣ末端残基の両方からのアミノ酸欠
失を有する欠失変異体もまた含まれる。このような変異体には、上記のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれる。
【００８９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；それは、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００９０】
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡまたは配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくとも１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにもっと好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図され、これらは本明細書で議論したように診断プローブおよびプライマーとして有用である。当然に、
【００９１】
【数１】
0005132008.tif 000012
長の大きなフラグメントもまた、本発明に従って、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列あるいは配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列の、全てではないが、ほとんどに対応するフラグメントと同様に有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントにより、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。
【００９２】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例には、例えば、ヌクレオチド数約
【００９３】
【数２】
0005132008.tif 000013
から配列番号１の最後までの配列、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡを有するフラグメントが含まれる。この状況において、「約」には、特に列挙した範囲と、いずれかの末端または両方の末端においていくつかのヌクレオチド（５、４、３、２、または１）大きいかもしくは小さい範囲とが含まれる。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９４】
本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長ｃＤＮＡを単離するため、および遺伝子に対して高い配列類似性もしくは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離するための、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。この型のプローブは、好ましくは、少なくとも３０塩基を有し、そして例えば、５０以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、そして調節領域およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを含有する完全遺伝
子を含むゲノムクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用することによって遺伝子のコード領域を単離することが含まれる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、どのライブラリーのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用される。
【００９５】
ＶＥＧＦ−２「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に含まれる配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、または、例えば、ＡＴＣＣ受託番号９７１４９または７５６９８、およびその相補体に含まれるｃＤＮＡクローンを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベーション、続く０．１×ＳＳＣにおける約６５℃でのフィルター洗浄をいう。
【００９６】
低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出における変化は、主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの低い割合は低ストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度を操作することによって達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件には、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション；続いて５０℃での１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。さらに、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに続いて行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００９７】
上記の条件の改変が、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑えるために使用される代替のブロッキング試薬を含ませること、および／またはそれで置換することにより、達成され得ることに注意されたい。代表的なブロッキング試薬には、Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の特許処方物が含まれる。特定のブロッキング試薬を含ませることは、適合性の問題により、上記のハイブリダイゼーション条件を改変することを必要とし得る。
【００９８】
当然、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末端ポリＡ＋領域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれらの相補体を含む任意の核酸分子（例えば、実際の任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれない。
【００９９】
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。上記および以下でより詳細に議論されるように、これらは、診断的なプローブおよびプライマーとして有用である。
【０１００】
「長さが少なくとも約２０ｎｔ」のポリヌクレオチド部分とは、例えば、参照ポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡもしくは配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列）に由来する２０以上の連続したヌクレオチドを意図する。当然、ポリＡ配列（例えば、配列番号１もしくは３に示されるＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡの３Ｎ末端ポリ（Ａ）領域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれらの相補体を含む任意の核酸分子（例えば、実際には任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズさせるために使用する本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【０１０１】
本出願は、核酸分子がＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、配列番号１もしくは３に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸分子に関する。なぜならこれは、特定の核酸分子がＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者が、この核酸分子の使用方法を依然として理解しているからである（例えば、ハイブリダイゼーションのプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして）。ＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、特に以下を含む：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＶＥＧＦ−２遺伝子もしくはそれらの対立遺伝子改変体の単離；（２）ＶＥＧＦ−２遺伝子の正確な染色体位置を規定するための、分裂中期染色体展開物へのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および特定の組織におけるＶＥＧＦ−２のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【０１０２】
しかし、配列番号１もしくは３に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列（これらは実際に、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする）に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子が好ましい。「ＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２活性を提示するポリペプチドを意図する。例えば、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性は、例えば、マイトジェンアッセイおよび内皮細胞遊走アッセイを使用して測定され得る。例えば、Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２５７６−２５８１（１９９６）およびＪｏｕｋｏｖら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２９０−２９８（１９９６）を参照のこと。
【０１０３】
当然、遺伝暗号の縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列または配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が、「ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを即座に認識する。事実、これらの核酸配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記した比較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、合理的な数がまた、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有するポリぺプチドをコードすることがさらに当業者に認識される。なぜならこれは、当業者が、タンパク質機能に有意に影響を及ぼしそうにないかまたは及ぼさないかのいずれかであるアミノ酸置換を十分に認識しているからである（例えば、脂肪族アミノ酸と第２の脂肪族アミノ酸との置換）。
【０１０４】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして行うかに関するガイダンスが、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０
（１９９０）において提供され、ここでこの筆者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを示している。
【０１０５】
従って、本発明は、配列番号２もしくは４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメント（これらのフラグメントは、少なくとも３０塩基対、好ましくは５０塩基対を有する）に対して、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。
【０１０６】
配列（ｓｅ）あたりの「同一性」は、当該分野で認識される意味を有し、そして出版された技術を使用して算出され得る（例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ならびにＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照のこと。）２つのポリヌクレオチド配列間もしくは２つのポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在する一方で、用語「同一性」は当業者に周知である。（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）。）２つの配列間の同一性もしくは類似性を決定するために通常使用される方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：これらの方法は「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，」Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９４），ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．および，Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に開示される。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを整列するための方法は、コンピュータープログラム内に集成され、これらとしては、以下が挙げられる：ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０），Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，ユニックス対応バージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを使用する，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））。本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまで���点変異を含み得ることを除いて、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを意図する。すなわち、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一な核酸配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列内の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が参照配列中に挿入され得る。問い合わせ配列は、配列番号１の全配列、ＯＲ
Ｆ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中に記載される任意の特定のフラグメントであり得る。
【０１０７】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良な全体的な一致（全体配列アラインメント（ｇｌｏｂａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）とも称される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。この全体配列アラインメントの結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算出するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）、である。
【０１０８】
対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合わせ配列より短い場合、手動での補正が結果に対してなされなければならない。これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で短縮された対象配列について、問い合わせ配列に対しての同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’および３’にある問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出され、最終的な同一性パーセントのスコアに達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用される。ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算出される。
【０１０９】
例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、この配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、従って１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’に塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性パーセントは手動で補正されない。繰り返すが、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正される。本発明の目的では、他の手動の補正はなされない。
【０１１０】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、対象ポリペプチ
ド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同一であることを意図する。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかに分散される。
【０１１１】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来通りに、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体配列アラインメントとも称される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ  ＝  配列の長さ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）、である。
【０１１２】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動での補正が結果に対してなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算出する場合に、対象配列のＮ末端およびＣ末端の短縮を考慮しないからである。Ｎ末端およびＣ末端で短縮された対象配列について、問い合わせ配列に対する同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側にある問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに達する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本発明の目的で使用される。問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。
【０１１３】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、この配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、従って、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、従って問い合
わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端に残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性パーセントは、手動で補正されない。繰り返すが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示されるような、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１１４】
（ＶＥＧＦ−２ポリペプチド）
本発明はさらに、図１もしくは図２の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
【０１１５】
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１もしくは図２のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合は、図３に示すようなＶＥＧＦタンパク質の保存されたモチーフ、および本質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
【０１１６】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」は、配列番号２に含まれる短いアミノ酸配列または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「独立して存在（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」し得るか、またはそのフラグメントが一部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれ得る（最も好ましくは、単一の連続する領域として）。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、おおよそのアミノ酸番号１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、または２８１からコード領域末端までのフラグメントが挙げられる。さらに、ポリペプチドフラグメントは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸長であり得る。この脈絡において、「約」は、いずれかの末端もしくは両方の末端で、具体的に示される範囲よりいくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい範囲を含む。
【０１１７】
好ましいポリペプチドフラグメントは、分泌されたＶＥＧＦ−２タンパク質（好ましくは、配列番号１８の残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、または１１４で始まり、配列番号１８のアミノ酸残基２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、または２２９で終了するアミノ酸の二量体、プロタンパク質形態（好ましくは、配列番号１８のアミノ酸約３２〜４１９））ならびに成熟形態を含む。他の好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方から、連続した一連の欠失された残基を有する成熟形態を含む。例えば、任意の数のアミノ酸（１〜６０の範囲）が、分泌されたＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはその成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の範囲）が、分泌されたＶＥＧＦ−２タンパク質またはその成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、これらのＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた好ましい。
【０１１８】
構造ドメインまたは機能ドメイン（例えば、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高抗原性指標領域を含むフラグメント）によって特徴
付けられるＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントおよびポリヌクレオチドフラグメントもまた、好ましい。保存されたドメイン内に存在する配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本発明によって具体的に意図される（表２を参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図される。
【０１１９】
他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＶＥＧＦ−２フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの活性に対して類似の活性を示す（しかし、必ずしも同一である必要はない）フラグメントである。このフラグメントの生物学的活性としては、改善された所望の活性、または減少された所望されない活性が挙げられ得る。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドである。
【０１２１】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の有意な影響を伴わずに変更され得ることが当該分野で認識されている。配列におけるこのような差異が考慮される場合、タンパク質上に活性を決定する重要な領域が存在することを記憶しておかなければならない。
【０１２２】
従って、本発明はさらに、実質的なＶＥＧＦ−２ポリペプチド活性を示すか、またはＶＥＧＦ−２タンパク質の領域（例えば、以下で議論されるタンパク質部分）を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチドの改変体を含む。このような変異としては、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換が挙げられる。上記で示したように、表現型的にサイレントであるようなアミノ酸変更に関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得る。
【０１２３】
従って、図１もしくは２のポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは：（Ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存されたアミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されたもの（そのような置換されたアミノ酸残基は、この遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもなくてもよい）；または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの；または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））に融合されているもの；または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチド配列もしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列）が成熟ポリペプチドに融合されているもの；あるいは（ｖ）配列番号２もしくは４に示すより少ないアミノ酸残基を含み、そして保存されたモチーフを保持し、そしてなお依然としてＶＥＧＦファミリーのポリペプチドの活性特徴を保持しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると思われる。
【０１２４】
荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸との置換、および中性アミノ酸または負電荷アミノ酸との置換が、特に興味深い。後者の結果により、正電荷が減少し、ＶＥＧＦ−２タンパク質の特性が改善されたタンパク質が得られる。凝集の防止は、非常に好ましい。タンパク質の凝集は、活性の減少を生じるだけではなく、それらは免疫原性であり得ることが理由で、薬学的処方物を調製する際の問題も有し得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ
．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１２５】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変更し得る。Ｏｓｔａｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、特定の変異体が、２つの公知のＴＮＦレセプター型の１つのみへのＴＮＦ−ａの選択的な結合を生じることを記載する。従って、本発明のＶＥＧＦ−２は、天然の変異体または人為的操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。
【０１２６】
示されるように、変更は、好ましくは、小さな性質の変更（例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換（表１を参照のこと））である。
【０１２７】
【表１】
0005132008.tif 000014
当然、当業者の行うアミノ酸置換の数は、上記の因子を含む、多くの因子に依存する。一般的にいうと、任意の所定のＶＥＧＦ−２ポリペプチドについての置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、または３より多くない。
【０１２８】
本発明のＶＥＧＦ−２タンパク質における機能に必須のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニン走査型変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該分野で公知の方法により同定され得る。後者の手順は、分子内の残基毎に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合活性またはインビトロもしくはインビトロでの増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析により決定さ
れ得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１２９】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、均質にまで精製される。
【０１３０】
用語「単離された」は、その物質が、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部または全てから分離されている同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得るか、および／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、なおも単離されている。
【０１３１】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ未満の長さである。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−２コード配列のうちの少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むが、任意のＶＥＧＦ−２イントロンの全てまたはその一部は含まない。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２コード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、このゲノムにおけるＶＥＧＦ−２遺伝子に対して５’側または３’側）のコード配列を含まない。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、配列番号２および４のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてこれはまた、このようなポリペプチドの部分を含み、このポリペプチドのこのような部分は、一般に少なくとも３０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０のアミノ酸を含む。
【０１３３】
当該分野で公知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
【０１３４】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する全長ポリペプチドをペプチド合成によって生成するために用いられ得る；それゆえ、このフラグメントは、全長ポリペプチドを生成するための中間体として用いられ得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を用いて、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成し得る。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、リーダーを含む、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド；リーダーを含まない、寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号２におけるアミノ酸約−２３〜約３９６を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約−２２〜約３９６を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約１〜約３９６を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一、そしてより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチド
の部分を含む。
【０１３６】
（融合タンパク質）
任意のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して惹起される抗体は、ＶＥＧＦ−２に結合することによって、この第２のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、細胞の位置を輸送シグナルに基づいて標的とするので、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０１３７】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１３８】
さらに、融合タンパク質はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの特徴を改善するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞からの精製または続く操作および貯蔵の間の安定性および持続性を改善するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精製を容易にするためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの操作を容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用技術である。
【０１３９】
当業者に理解されるように、および上で議論されるように、本発明のポリペプチド（例えば、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含むポリペプチド）は、異種ポリペプチド配列と融合され得る。例えば、本発明のポリペプチド（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの一部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの一部分）と融合され得、キメラポリペプチドを生じる。別の非制限的な例としては、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、アルブミン（組換えヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントもしくは改変体（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０  ４１３  ６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号（これらは、本明細書によってその全体において参考として援用される）を参照のこと）を含むが、限定はされない）と融合され得る。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンの成熟形態（すなわち、欧州特許第０  ３２２  ０９４号（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）の図１および２に示されるようなヒト血清アルブミンのアミノ酸１〜５８５）と融合される。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｘを含むかあるいはそれらからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｘは、１〜５８５の整数であり、このアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミン活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、米国特許第５，７６６，８８３号（本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるように、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｚを含むか、あるいはそれからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｚは、３６９〜４１９の整数である。本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドはまた、本発明に含まれる。
【０１４０】
上記のような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮の障壁を横切る抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーに結合された抗原（例えば、インシュリン）について実証されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体分泌ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であることが見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のポリペプチドをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクローニングされ、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳により融合される。このタグは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１４１】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質またはその一部と共に免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改善された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望まれる。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合される（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２〜５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０１４２】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、マーカー配列（例えば、ＶＥＧＦ−２の精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））。
【０１４３】
従って、これら上記の融合物のいずれかが、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用して操作され得る。
【０１４４】
（ＶＥＧＦ−２の生物学的活性）
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、１つ以上の生物学的活性について試験するためのアッセイに用いられ得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−２ポリペプチドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、ＶＥＧＦ−２が、その生物学的活性に関連した疾患に関与し得る可能性がある。従って、ＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−２抗体を用いて、この関連する疾患を処置し得る。
【０１４５】
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡は、阻害の影響が勝っている平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ  ５６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において生じる、それらの稀な例において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖に特徴的）の下において、これらの調節は制御することができない。調節されない新脈管形成は病原化し、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼内障害ならびに乾癬を含む異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ編、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；ならびにＦｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０１４６】
本発明は、本発明の抗体の投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明の抗体を用いて処置され得る悪性状態および転移性状態としては、本明細書に記載される悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他の状態が挙げられるが、これらに限定されない（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置方法を提供し、この方法は、治療有効量の本発明の抗体を、その処置の必要な個体に投与する工程を包含する。例えば、抗体は、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさらなる方法において利用され得る。抗体により処置され得る癌としては、固形腫瘍（前立腺癌、肺癌、乳癌、脳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌が挙げられる）；原発性腫瘍および転移性腫瘍；黒色腫；神経膠芽細胞腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行した（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、抗体は、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような、癌を処置するために、局所送達され得る。
【０１４７】
なお他の局面において、抗体は、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置するために利用され得る。抗体は、腫瘍に直接的にか、または注射もしくはカテーテルを介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置される癌によって変化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
【０１４８】
抗体は、癌に加えて、新脈管形成に関与する他の障害を処置するのに有用であり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延性創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０１４９】
例えば、本発明の１つの局面において、本発明の抗体を過形成性瘢痕またはケロイドに投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法が提供される。
【０１５０】
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、過形成性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害の約１４日後）が経過した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０１５１】
さらに、本発明の抗体を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０１５２】
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記（抗体を含む））を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化される場合、角膜はまた混濁され、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、完全に視力喪失になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎
症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０１５３】
本発明の特に好ましい実施形態において、生理食塩水（眼科用調製物において一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、純粋な形態で調製され、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知の角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（おそらくステロイドと組み合わされる）は、その後の合併症を予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０１５４】
他の実施形態において、上記の抗体は、角膜支質に直接、顕微鏡下での誘導のもとで眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血管侵入を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０１５５】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効量の抗体を眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前眼房角（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｎｇｌｅ）の領域への注入によって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放出されるように、任意の位置に配置され得る。本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の抗体を眼に投与する工程を包含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０１５６】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜における抗体の局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置され得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開始されるべきである。
【０１５７】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の抗体を眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
【０１５８】
さらに、この抗体で処置、予防および／あるいは疾患され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性動脈硬化症斑、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オ
ースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
【０１５９】
さらに本発明の抗体で処置、予防、診断および／または予後診断され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ  ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
【０１６０】
出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、このようにして出産制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ）」方法を提供する。抗体はまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０１６１】
本発明の抗体は、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。
【０１６２】
抗体は、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
【０１６３】
本発明のさらなる局面において、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。この方法は、抗体を、切除後に腫瘍の切除縁に投与して、その部位での、癌の局所的再発および新血管形成を阻害するようにする工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、この抗脈管形成化合物（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、このＶＥＧＦ−２抗体を用いて、腫瘍の切除縁に綿棒で塗るか、ブラシで塗るか、または他の方法でコーティングすることによって塗布される）。あるいは、このＶＥＧＦ−２抗体は、投与の前に、公知の手術用ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、このＶＥＧＦ−２抗体は、悪性疾患の肝切除の後、および神経外科的手術の後に塗布される。
【０１６４】
本発明の１つの局面において、ＶＥＧＦ−２抗体は、広範な種々の腫瘍（例えば、胸部腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明１つの実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体が、神経学的腫瘍の部位に、切除の後に投与され得、その結果、その部位での新規な血管の形成が阻害される。
【０１６５】
本発明の抗体はまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代表例としては、以下が挙げられる：抗侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）因子、レチン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、プラスミノゲン活性化因子インヒビター１、プラスミノゲン活性化因子インヒビター２、および種々の形態の軽い方の（ｌｉｇｈｔｅｒ）「ｄ群」遷移金属。
【０１６６】
軽い方の「ｄ群」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種が、挙げられる。このような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体は、オキソ遷移金属錯体を含む。
【０１６７】
バナジウム錯体の代表的例は、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸塩錯体およびバナジル錯体）を含む。適切なバナジン酸塩錯体は、メタバナジン酸塩錯体およびオルトバナジン酸塩錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウム）を含む。適切なバナジル錯体は、例えば、バナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジル（硫酸バナジル水和物（例えば、硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物）を含む）を含む。
【０１６８】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的例もまた、オキソ錯体を含む。適切なオキソタングステン錯体は、タングステン酸塩錯体および酸化タングステン錯体を含む。適切なタングステン酸塩錯体は、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタングステン酸を含む。適切な酸化タングステンは、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）を含む。適切なオキソモリブデン錯体は、モリブデン酸塩錯体、酸化モリブデン錯体、およびモリブデニル錯体を含む。適切なモリブデン酸塩錯体は、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物を含む。適切な酸化モリブデンは、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（ＶＩ）、およびモリブデン酸を含む。適切なモリブデニル錯体は、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートを含む。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体は、例えば、グリセロール、酒石酸および糖から誘導された、ヒドロキソ誘導体を含む。
【０１６９】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例は、以下を含む：血小板第４因子；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ  ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェン）の存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン
；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）二ナトリウム、または「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０１７０】
（免疫活性）
ＶＥＧＦ−２抗体は、免疫細胞の増殖、分化、または動員（走化性）を活性化または阻害することによって、免疫系の不全または障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と称されるプロセス、すなわち、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生するプロセスを介して発生する。これらの免疫不全または免疫障害の病因は、遺伝性、体細胞性（例えば、ガンまたはいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化学治療または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、ＶＥＧＦ−２抗体は、特定の免疫系疾患または免疫系障害のマーカーまたは検出因子として使用され得る。
【０１７１】
ＶＥＧＦ−２抗体は、造血細胞の不全または障害を処置または検出する際に有用であり得る。特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連する障害を処置するための取り組みにおいて、ＶＥＧＦ−２抗体を使用して、多能性幹細胞を含む、造血細胞の分化および増殖を増加させ得る。免疫不全症候群の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ（Ｄｉｇｅｏｒｇｅ）症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素尿。
【０１７２】
さらに、ＶＥＧＦ−２抗体はまた、止血活性（出血を停止する）または血栓崩壊活性（血餅の形成）を調節するために使用され得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増加させることによって、ＶＥＧＦ−２抗体は、血液凝固障害（例えば、無フィブリノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、ＶＥＧＦ−２抗体を用いて、凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作、または瘢痕の処置に重要であり得る。
【０１７３】
ＶＥＧＦ−２抗体はまた、自己免疫障害を処置または検出する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来物質として不適切に認識することからもたらされる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害し得るＶＥＧＦ−２抗体の投与は、自己免疫障害を予防する際に有効な治療であり得る。
【０１７４】
ＶＥＧＦ−２抗体によって処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候
群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。
【０１７５】
同様に、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のようなアレルギー性反応および状態はまた、ＶＥＧＦ−２抗体により処置され得る。さらに、ＶＥＧＦ−２抗体を用いてアナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置し得る。
【０１７６】
ＶＥＧＦ−２抗体はまた、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防するために用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答を介して移植された組織を破壊することにより生じる。同様に、免疫応答はまた、ＧＶＨＤに関与するが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害するＶＥＧＦ−２抗体の投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防する際に有効な治療であり得る。
【０１７７】
同様に、ＶＥＧＦ−２抗体はまた、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、ＶＥＧＦ−２抗体は、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以下を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態）を処置するために使用され得る：感染に関連した炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流傷害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生からもたらされる状態。
【０１７８】
（過剰増殖性障害）
本発明のＶＥＧＦ−２抗体を用いて、過剰増殖性障害（新生物を含む）を処置または検出し得る。ＶＥＧＦ−２抗体は、直接的または間接的な相互作用によって障害の増殖を阻害し得る。あるいは、ＶＥＧＦ−２抗体は、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【０１７９】
例えば、免疫応答を増加させることにより、特に、過剰増殖性障害の抗原性の質を増加させるか、またはＴ細胞を増殖させるか、分化させるか、もしくは動員させるかにより、過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強することによってか、または新たな免疫応答を開始することによってかのいずれかによって、上昇し得る。あるいは、免疫応答を減少させることはまた、過剰増殖性障害（例えば、化学療法剤）を処置する方法であり得る。
【０１８０】
ＶＥＧＦ−２抗体によって処置または検出され得る過剰増殖性障害の例としては、以下に位置する新生物を含むがこれらに限定されない：腹部、骨、胸部、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頚部、脳、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、前立腺、脾臓、胸郭、および尿生殖器。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、乳癌を処置、予防または回復するために使用され得る。他の好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、脳の癌を処置、予防または回復するために使用され得る。他の好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、前立腺癌を処置、予防または回復するために使用され得る。他の好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、結腸癌を処置、予防または回復するために使用され得る。他の好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２抗体は、カポージ肉腫を処置、予防または回復するために使用され得る
同様に、他の過剰増殖性障害はまた、ＶＥＧＦ−２抗体によって処置または検出され得
る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖、および上記に列挙した器官系に位置する、新生物以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０１８１】
（結合活性）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−２に結合する分子について、またはＶＥＧＦ−２が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。ＶＥＧＦ−２とその分子の結合は、ＶＥＧＦ−２または結合した分子の活性を、活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）あるいは減少し得る。このような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）または小さい分子が挙げられる。
【０１８２】
好ましくは、この分子は、ＶＥＧＦ−２の天然のリガンド（例えば、そのリガンドのフラグメント）、あるいは天然の基質、リガンド、構造的模倣物または機能的模倣物に密接に関連する。（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、ＶＥＧＦ−２が結合する天然のレセプター（すなわち、ｆｌｋ−１またはｆｌｋ−４）または、少なくとも、ＶＥＧＦ−２に結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を使用して合理的に設計され得る。好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、分泌タンパク質としてか、または細胞膜上にのいずれかで、ＶＥＧＦ−２を発現する適切な細胞を生成する工程を含む。好ましい細胞は哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。次いで、ＶＥＧＦ−２を発現する細胞（またはこの発現されたポリペプチドを含む細胞膜）が、好ましくは、ＶＥＧＦ−２かまたはこの分子のいずれかの活性の結合、刺激、あるいは阻害を観察するために、この分子を含んでいる可能性がある試験化合物と接触される。
【０１８３】
このアッセイは、ＶＥＧＦ−２との候補化合物の結合を簡単に試験し得る。ここで、結合は、標識によってか、標識された競合物質との競合を含むアッセイにおいて検出される。さらに、このアッセイは、この候補化合物が、ＶＥＧＦ−２との結合によって生成されるシグナルを生じるかどうかを試験し得る。
【０１８４】
あるいは、このアッセイは、無細胞調製物、固体支持体に固定されたポリペプチド／分子、化学物質ライブラリー、または天然産物の混合物を使用して実行され得る。このアッセイはまた、候補化合物を、ＶＥＧＦ−２を含む溶液と混合する工程、ＶＥＧＦ−２／分子活性またはＶＥＧＦ−２分子結合を測定する工程、およびこのＶＥＧＦ−２／分子活性またはＶＥＧＦ−２分子結合を標準と比較する工程を単に包含し得る。
【０１８５】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、サンプル（例えば、生物学的サンプル）中のＶＥＧＦ−２レベルまたはＶＥＧＦ−２活性を測定し得る。この抗体は、ＶＥＧＦ−２に直接もしくは間接的に結合することによってか、または基質についてＶＥＧＦ−２と競合することによってのいずれかで、ＶＥＧＦ−２レベルあるいはＶＥＧＦ−２活性を測定し得る。
【０１８６】
これら上記のアッセイ全てが、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを使用して発見された分子は、このＶＥＧＦ−２／分子を活性化または阻害することにより、疾患を処置するために、あるいは患者に生じる特定の結果（例えば、血管成長）を引き起こすために使用され得る。さらに、このアッセイは、ＶＥＧＦ−２
の産生を阻害または増強し得る因子を、適切に操作された細胞あるいは組織から発見し得る。
【０１８７】
従って、本発明は、ＶＥＧＦ−２に結合する化合物を同定する方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）候補の結合化合物をＶＥＧＦ−２とともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたかどうかを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を包含する、アゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を含む：（ａ）候補化合物をＶＥＧＦ−２とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ＶＥＧＦ−２の生物学的活性が変化されたかどうかを決定する工程。
【０１８８】
（標的化された送達）
別の実施形態において、本発明は、組成物を、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドについてのレセプターを発現する標的化細胞、またはＶＥＧＦ−２ポリペプチドの細胞結合形態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０１８９】
本明細書中で議論される場合、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の抗体を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０１９０】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のＶＥＧＦ−２抗体を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０１９１】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
（薬物スクリーニング）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチドを、アンタゴニスト
活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性をアッセイする工程を包含する。
【０１９３】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントを使用することによって、治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポリペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドとの間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０１９４】
従って、本発明は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドによって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤をＶＥＧＦ−２ポリペプチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標識の量は、特定の薬剤がＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０１９５】
薬物スクリーニングについての別の技術は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプチドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそれを固定し得る。
【０１９６】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントへの結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出する。
【０１９７】
（結合ペプチドおよび他の分子）
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）として有用である。そのような抗体は、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
【０１９８】
この方法は、以下の工程を包含する：ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを多数の分子と接触させる工程；および、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する分子を同定する工程。
【０１９９】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によってもたらされ得る。例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを固体支持体上に固定化させ、そして多数の分子の溶液をこの固定したＶＥＧＦ−２ポリペプチドと接触させることを企図し得る。このような手順は、固定した本発明のポリペプチドから構成される親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。次いで、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、ポリペプチドのこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である。
【０２００】
あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々のポリペプチドを含む実質的に別々の分画へ分離され得る。例えば、多数のポリペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはまた、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで、個々の単離物は、本発明のポリペプチドによって「プローブ化」され得、必要に応じて発現に必要とされるはずのインデューサーの存在下で、本発明のポリペプチドと個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否かが決定される。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを個々のポリペプチドを含む各分画と接触させる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性クローンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、本発明のポリペプチドに対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から同定され得る。さらに、本発明のポリペプチドに対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
【０２０１】
特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと試みる前に、任意の未結合のポリペプチドを、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよび多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましくあり得る。このような洗浄工程は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたは多数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり得る。
【０２０２】
本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに特異的な分子をスクリーニングし得る無作為またはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である。化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉ
ｃｋｒｅｍｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３。
【０２０３】
ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
【０２０４】
インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成する。
【０２０６】
本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の内で、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖アナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペリジン、ベンゾピラン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロンを列挙している。
【０２０７】
非ペプチドライブラリーは、２つの型に大きく分類され得る：修飾されたモノマーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であり得る。
【０２０８】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用されているモノマー単位のうちで、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバージョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含んだ。近年のライブラリーは、１つより多くのモノマーを使用し、自由度が添加されたライブラリーを与える。
【０２０９】
ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８を参照のこと。
【０２１０】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを結合する分子を同定するためのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明のポリペプチドと接触させ、そしてＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合するライブラリーメンバーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
【０２１１】
別の実施形態において、酵母中で相互作用タンパク質を選択するためのツーハイブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２）が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに特異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
【０２１２】
結合している分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含む）から簡便に選択され得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子（この場合には、ペプチド）の収集の多様性を支配する１つ以上のパラメーターを制限するように操作されることを意味するために本明細書中に使用される。
【０２１３】
従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見出す可能性が２０全てのアミノ酸に関して同じである、ペプチドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンが５番目のアミノ酸毎に生じることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位がアルギニンのみを含むように固定されることを特定することによって、バイアスがライブラリーに導入され得る。明らかに、多くの型のバイアスは、意図され得、そして本発明は、いずれの特定のバイアスにも制限されない。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
【０２１４】
上記のように、ポリペプチドである結合分子の場合、このポリペプチドは、約６から約６０より少ないアミノ酸残基を有し、好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そして最も
好ましくは約６〜約２２アミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
【０２１５】
選択された結合ポリペプチドは、化学合成または組換え発現によって得られ得る。
【０２１６】
（ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成）
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、ならびに組換え技術によるＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはペプチドの生成のためにこれらを使用する方法に関する。
【０２１７】
宿主細胞は、本発明のベクター(これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベ
クターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入されるか、形質転換されるか、またはトランスフェクトされる)される。このベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明のＶＥＧＦ−２遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地において培養され得る。培養条件(例えば、温度、ｐＨなど)は、発現のために選択される宿主に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【０２１８】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、このポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ得る。そのようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含む。そのようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡを含む。しかし、宿主中で複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。
【０２１９】
適切なＤＮＡ配列が、種々の手順によりベクター中に挿入され得る。一般に、そのＤＮＡ配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
【０２２０】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列(プロモーター)に作動的に連結され、ｍＲＮＡの合成を指向する。そのようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ．ｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージλ  ＰＬプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。
【０２２１】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が挙げられる。
【０２２２】
本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換してその宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：細菌細胞(例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)；真菌細胞(例えば酵母)；昆虫細胞(例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９)；動物細胞(例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫)；ならびに植物細胞。適切な宿主の選択は、
本明細書の教示により当業者の範囲内であると考えられる。
【０２２３】
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を含む。これらの構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターまたはウイルス
ベクター)を含み、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入され
ている。この実施形態の好ましい局面において、この構築物はさらに、上記配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを含む)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。好ましい真核生物性ベクターのうちには以下がある：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。他の適切なベクターが、当業者に容易に明らかである。
【０２２４】
本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターおよびプロモーターエレメントを含む、新規な発現ベクターをさらに含む。このようなベクターの１例は、以下に詳細に記載されるｐＨＥ４ａである。
【０２２５】
図２８および図２９に要約されるように、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号１６）の構成成分としては、以下が含まれる：１）選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、６）ラクトースオペロンレプレッサ−遺伝子（ｌａｃＩｑ）、ならびに７）マルチクローニング部位リンカー領域。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）由来である。プロモーター配列およびオペレーター配列は、合成により作製された。核酸配列の合成的作製は、当該分野で周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ９５／９６カタログ、２１５〜２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ．１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ  ９４３０３。ｐＨＥ４ａベクターは、１９９８年２月２５日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号２０９６４５を与えられた。
【０２２６】
ＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、ＮｄｅＩ、およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８のいずれかでベクターを制限し、そしてゲル上で大きい方のフラグメント（マルチクローニング部位領域は約３１０ヌクレオチド）を単離することにより、ｐＨＥ４ａのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。適切な制限部位を有する、ＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、例えば、実施例１に記載のＰＣＲプロトコールに従って、ＮｄｅＩに関する制限部位（５’プライマーとして）、およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８のいずれかに関する制限部位（３’プライマーとして）を有するＰＣＲプライマーを使用して作製される。このＰＣＲ挿入物は、ゲル精製され、そして適合可能な酵素で制限される。この挿入物およびベクターは、標準的プロトコールに従って連結される。
【０２２７】
上記のように、ｐＨＥ４ａベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ＬａｃＩｑは、ｌａｃオペレーターの強固な調節を付与するｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子である。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５（１９８８）；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ
５１：２５５〜２６７（１９８７）。ｌａｃＩｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）配列の転写を阻止するレプレッサ−タンパク質をコードする。しかし、ｌａｃＩｑ遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下でｌａｃオペレーターから解離する。従って、ＶＥＧＦ−２は、ｐＨＥ４ａベクターを含む誘導されていない宿主細胞において、測定可能な量で産生されない。しかし、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＶＥＧＦ−２コード配列の発現を生じる。
【０２２８】
ｐＨＥ４ａベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号１７）は、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。１つのオペレーターは、転写開始部位の５’側に位置し、そしてもう一方は、同部位の３’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合せて存在する場合、ｌａｃオペロン誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）の非存在下で、下流配列の強固な抑制を付与する。ｌａｃオペレーターの下流に位置する、作動的に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロン誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）の添加によって誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａｃ誘導物質の結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの遊離、および作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロン調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＷＩＴＨ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ
ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１９９７）、８０２〜８０７頁に概説されている。
【０２２９】
ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＶＥＧＦ−２コード配列を除いて、全てのｐＨＥ４ａベクターの構成成分を含む。ｐＨＥ４ａベクターの特徴は、最適化された合成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびシャイン−ダルガーノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられており、その結果、挿入された遺伝子の発現は、強固に調節され得、そして誘導の際に高レベルの発現が生じる。
【０２３０】
本発明のタンパク質の産生における使用に適切な公知の細菌性プロモーターのうちには以下が挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ  ＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーター。適切な真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられる：ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）。
【０２３１】
ｐＨＥ４ａベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンの５’側にシャイン−ダルガーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンの約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’）に位置する短い配列である。これらの配列は、原核生物リボソームをＡＵＧ開始コドンへと本質的に指向する。
【０２３２】
従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号１６）によって例証される。
【０２３３】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、
または選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に有名な細菌性プロモーターには、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ  ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分当該分野の技術レベルの範囲内である。
【０２３４】
さらなる実施形態において、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法により達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０２３５】
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【０２３６】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、そのようなタンパク質を産生するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｄｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０２３７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０〜３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０２３８】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含む融合タンパク質をコードし得る。
【０２３９】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列
を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で挿入することにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するために１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
【０２４０】
代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。そのような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
【０２４１】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により抑制解除され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【０２４２】
細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【０２４３】
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得、そのような方法は、当業者に周知である。
【０２４４】
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列をも含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起源、早期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。
【０２４５】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、ＶＥＧＦ−２配列）を欠失もしくは置換するように、ならびに／または本発明のＶＥＧＦ−２配列に作動可能に結合され、そして内因性ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを活性化し、変更し、および／もしくは増幅する遺伝物質（例えば、異種プロモーター）を含むように操作されている初代の、二代目の、および不死化された、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の宿主細胞を含む。例えば、当該分野で公知の技術を使用して、異種制御領域および内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコードする）を相同組換えを介して作動可能に結合し得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された、米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された、国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８月４日に公開された、国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと（これらの開示の各々は、これら全体が参考として援用される））。
【０２４６】
宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）のような高等真核生物細胞、もしくは下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式において遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主株を選択し得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘発因子の存在下で増大され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現が、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後のプロセシングおよび改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、切断）の、特徴および特定の機構を有する。適切な細胞株は、発現されるタンパク質の、所望の改変およびプロセシングを保証するために選択され得る。
【０２４７】
ポリペプチドは、以前に使用された方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。これらの方法は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包含する。低濃度（約０．１〜５ｍＭ）のカルシウムイオンが、精製の間に存在することが好ましい（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９））。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質を完全な立体配置とするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得る。
【０２４８】
本発明のポリペプチドは、天然から精製された産物もしくは化学合成手順の産物であり得るか、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、培養中の細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞によって）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されてもよいし、あるいはグリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【０２４９】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して、化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５〜１１１を参照のこと）。例えば、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成機の使用によって合成され得る。さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログは、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド配列への置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、設計された（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、ならびに一般的なアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０２５０】
本発明は、翻訳の間、または翻訳後に差次的に改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって）されたＶＥＧＦ−２ポリペプチドを包含する。任意の多くの化学的改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実行され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０２５１】
本発明に包含されるさらなる翻訳後改変としては、例えば、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格に対する化学的部分の付着、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖の化学的改変、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単離を可能にするために、酵素標識、蛍光標識、同位体標識またはアフィニティー標識のような検出可能な標識で改変され得る。
【０２５２】
本発明によってはまた、ＶＥＧＦ−２の化学的に改変された誘導体が提供される。これは、ポリペプチドの可溶性、安定性、および循環時間の増加、または免疫原性の減少のようなさらなる利点を提供し得る（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。このポリペプチドは、分子内の無作為な位置で改変されてもよいし、または分子内の予め決定された位置で改変されてもよいし、そして１つ、２つ、３つ以上の付着された化学的部分を含んでもよい。
【０２５３】
このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分岐していてもよいし、または分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関して、操作および製造の容易さのために、好ましい分子量は、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子が言及された分子量よりも大きく、いくつかは小さいことを示す）。他のサイズは、所望の治療的プロフィール（例えば、所望される徐放性の持続時間、（もしあるとすれば、生物学的活性に対する）効果、操作の容易性、抗原性の程度または欠損、および治療的タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して使用され得る。
【０２５４】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能性もしくは抗原性ドメインに対する効果を考慮して、このタンパク質に付着されるべきである。当業者に利用可能な多くの付着方法が存在する（例えば、本明細書中で参考として援用される、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、また、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５（１９９２）（トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を使用するＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告している）を参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）を介して、アミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性基として使用され得る。治療目的について好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基での付着のような、アミノ基での付着である。
【０２５５】
Ｎ末端で化学的に改変されるタンパク質を、特に所望し得る。本発明の組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分岐などによる）から、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行されるべきペグ化反応の型、および選択されるＮ末端がペグ化されたタンパク質を得る方法を選択し得る。Ｎ末端がペグ化された調製物を得る（すなわち、必要であれば、他のモノペグ化（ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）された部分からこの部分を分離する）方法は、ペグ化されたタンパク質分子の集団からＮ末端がペグ化された物質を精製することにより得る。Ｎ末端の改変において化学的に改変される選択的タンパク質は、特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な異なる型の一級アミノ基（Ｎ末端に対するリジン）の差示的な反応性を利用する、還元性のアルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下において、カルボニル基を含むポリマーを用いるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が、達成される。
【０２５６】
本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびより高次の多量体）であり得る。従って、本発明は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの単量体および多量体、これらの調製、およびこれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）に関する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体、または四量体である。さらなる実施形態において、本発明の多量体は、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
【０２５７】
本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で使用される場合、用語、ホモマーは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのみを含む多量体をいう（本明細書中に記載されるような、ＶＥＧＦ−２フラグメント、改変体、スプライス改変体、および融合タンパク質を含む）。これらのホモマーは、同一の、または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態において、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドのみを含む多量体である。別の特定の実施形態において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形態において、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一の、または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）、またはホモ三量体（例えば、同一の、および／または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態において、本発明のホモマーの多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
【０２５８】
本明細書中で使用される場合、用語、ヘテロマーは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施形態において、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態において、本発明のホモマーの多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
【０２５９】
本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性、および／もしくは共有結合性の会合の結果であり得、そして／または、例えば、リポソーム形成によって間接的に連結され得る。従って、１つの実施形態において、例えばホモ二量体またはホモ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態において、例えばヘテロ三量体またはヘテロ四量体のような本発明のヘテロ多量体は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。他の実施形態において、本発明の多量体は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドとの共有結合的会合、および／またはＶＥＧＦ−２ポリペプチド間の共有結合的会合によ
って形成される。このような共有結合的会合は、（例えば、配列番号２に示される、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる）ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つの例において、この共有結合的な会合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド中で相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別の例において、この共有結合的な会合は、化学的、または組換え的操作の結果である。あるいは、このような共有結合的な会合は、ＶＥＧＦ−２融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つの例において、共有結合的な会合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例において、この共有結合的な会合は、本発明のＶＥＧＦ−２−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（本明細書中に記載される通り）。別の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、共有結合的に会合する多量体を形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメンバーなど（例えば、オセテオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開番号ＷＯ９８／４９３０５を参照のこと。この内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される））からの異種ポリペプチド配列間にある。
【０２６０】
本発明の多量体は、当該分野で公知の化学的技術を使用して生成され得る。例えば、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長の最適化技術を使用して、化学的に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の多量体は、この多量体に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間での１つ以上の分子間架橋を形成するために、当該分野で公知の技術を使用して生成され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に対して、システインまたはビオチンを付加することによって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術を適用して、１つ以上のこれらの改変されたポリペプチドを含む多量体を生成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術を適用して、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２６１】
あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子操作技術を使用して生成され得る。１つの実施形態において、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載されるか、またはさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を使用して、組換え的に生産される（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。特定の実施形態において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に、次いで、さらに本来のＣ末端からＮ末端という逆方向で（リーダー配列を含まない）ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドに連結することによって生成される（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態において、本明細書中に記載されるか、またはさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、かつ膜再構築技術によってリポソームへ取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２６２】
（治療的使用）
本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、血管内皮細胞およびリンパ内皮細胞についての強力なマイトジェンである。図１２および１３において示されるように、配列番号２のＶＥＧＦ−２のポリペプチド（最初の４６アミノ酸を差し引く）は、血管内皮細胞についての強力なマイトジェンであり、そしてそれらの成長および増殖を刺激する。このポリペプチドをコードするＶＥＧＦ−２核酸配列について実施されたノーザンブロット分析の結果（ここでは、いくつかのヒト組織由来の２０ｍｇのＲＮＡを３２Ｐ−ＶＥＧＦ−２でプローブした）は、このタンパク質が心臓および肺において活性に発現されることを例示する。これはマイトジェン活性のさらなる証拠である。
【０２６３】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体（これはＶＥＧＦ−２の活性を増強する）は、血管形成を促進することによって、血管外傷を処置するために用いられ得る。例えば、冠状動脈バイパス手術が実施される移植組織の成長を刺激である。ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、創傷治癒を促進するため、特に、損傷した組織を再血管新生するか、または虚血の間および新しい毛細血管形成が所望される場合に側副枝の血流を刺激するために、用いられ得る。このような抗体は、全層性創傷（例えば、皮膚潰瘍（褥瘡、静脈潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む））を処置するために用いられ得る。さらに、ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、皮膚移植片および皮膚弁が熱傷または損傷を修復するために用いられる場合の全層性熱傷および損傷を処置するために用いられ得る。さらに、本発明のＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、形成外科、例えば、裂傷、熱傷または他の外傷の回復のために、用いられ得る。本発明のＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、眼に対する創傷および損傷の治癒を促進するため、および眼疾患を処置するために使用され得る。
【０２６４】
これらの同じ方向に沿って、アゴニスト抗体はまた、損傷した骨、歯周組織または靱帯組織の増殖を誘導するために使用され得る。このようなＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、例えば、歯周病または外傷により損傷した歯の支持組織（セメント質および歯周靱帯を含む）を再生するために用いられ得る。
【０２６５】
新脈管形成は、創傷を清潔にかつ感染しないまま保つことが重要であるので、ＶＥＧＦ−２この活性を増大するアゴニスト抗体は、外科手術と組み合わせて、そして切開術および切除の修復の後に用いられ得る。これらのＶＥＧＦ−２抗体はまた、感染の危険性の高い異常な創傷の処置のために用いられ得る。
【０２６６】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、血管移植手術における内皮形成の促進のために用いられ得る。移植材料または合成材料のいずれかを使用する血管移植片の場合、これらの抗体は、血管内皮細胞の増殖を促進するために、移植片の表面にかまたは接合部に適用され得る。ＶＥＧＦ−２のアゴニストとして作用する抗体は、心筋梗塞の結果としての心筋組織の損傷を修復するために用いられ得、そしてまた、虚血後の心血管系を修復するために用いられ得る。ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、冠状動脈疾患、ならびに末梢血管疾患およびＣＮＳ血管疾患の結果としての損傷血管組織を処置するために用いられ得る。
【０２６７】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、移植材料の拒絶を最小限にするため、および移植材料の血管形成を刺激するために身体内に移植される人工プロテーゼまたは天然器官を被覆するために用いられ得る。
【０２６８】
ＶＥＧＦ−２のアゴニスト抗体はまた、例えば、動脈硬化の間に生じる損傷の血管組織修復のために用いられ得、そして血管組織が損傷している場合には、バルーン血管形成の後に必要とされる。
【０２６９】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、末梢動脈疾患を処置するために用いられ得る。従
って、さらなる局面において、末梢動脈血管を処置するためにＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体を使用するためのプロセスが提供される。好ましくは、ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、末梢動脈疾患を軽減または処置するために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７０】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、リンパ組織またはリンパ管の内皮機能を促進し得、例えば、リンパ管の損失およびリンパ管の閉塞を処置する。ＶＥＧＦ−２のアゴニスト抗体はまた、リンパ球産生を刺激するために用いられ得る。アンタゴニストＶＥＧＦ−２抗体は、リンパ管腫を処置するために用いられ得る。
【０２７１】
アゴニスト抗体はまた、新生児における血管腫を処置するために使用され得る。従って、さらなる局面において、新生児における血管種を処置するためにＶＥＧＦ−２抗体を使用するためのプロセスが提供される。好ましくは、抗体は、新生児における血管種を軽減または処置するために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７２】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、早産新生児における異常な網膜発生を予防または処置するために使用され得る。従って、さらなる局面において、早産新生児における異常な網膜発生を処置するためにＶＥＧＦ−２抗体を使用するためのプロセスが提供される。好ましくは、ＶＥＧＦ−２抗体は、早産新生児における異常な網膜発生を軽減または処置するために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７３】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体は、原発性（突発性）リンパ水腫（ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む）を処置するために使用され得る。好ましくは、ＶＥＧＦ−２抗体は、原発性（突発性）リンパ水腫（ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む）を軽減または処置するために、個体に投与される。ＶＥＧＦ−２抗体はまた、水腫を処置するため、および動物において血圧に作用するために使用され得る。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７４】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、（ｉ）リンパ節およびリンパ管の除去，（ｉｉ）癌の処置における放射線治療および手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じるものを含む二次的（閉塞性）リンパ水腫を処置するために使用され得る。好ましくは、ＶＥＧＦ−２抗体は、（ｉ）リンパ節およびリンパ管の除去，（ｉｉ）癌の処置における放射線治療および手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じるものを含む二次的（閉塞性）リンパ水腫の目的のために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７５】
ＶＥＧＦ−２アゴニスト抗体はまた、カポージ肉腫を処置するために使用され得る。好ましくは、ＶＥＧＦ−２抗体は、カポージ肉腫を軽減または処置するために、個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は、以下に記載される。
【０２７６】
ＶＥＧＦ−２抗体は、癌および腫瘍増殖を支援するのに必要な脈管形成を阻害することによって、癌を処置するために使用され得る。
【０２７７】
（心臓血管障害）
本発明者らは、ＶＥＧＦ−２が、血管内皮細胞の増殖を刺激し、内皮細胞移動を刺激し、ＣＡＭアッセイにおいて脈管形成を刺激し、突発性高血圧ラットにおいて血圧を下げ、そしてウサギにおける虚血性四肢への血流を増加することを示した。従って、ＶＥＧＦ−２の活性を高めるアゴニスト抗体は、心臓血管障害（四肢虚血のような末梢動脈疾患を含
む）を処置するために使用され得る。
【０２７８】
心臓血管障害としては、動脈動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ  ｄｕｃｔｕｓ  ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、心臓内突起欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０２７９】
心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられる。
【０２８０】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ  ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０２８１】
心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒ  ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０２８２】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられる。
【０２８３】
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０２８４】
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダウ疾患、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる。
【０２８５】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられる。
【０２８６】
動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０２８７】
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０２８８】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０２８９】
虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ  ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０２９０】
ＶＥＧＦ−２の活性を増大するＶＥＧＦ−２抗体は、重症の四肢虚血および冠状動脈疾患の処置のために特に有効である。実施例１８に示されるように、実験的に誘導された虚血ウサギの後脚へのＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与は、血圧比、血流、血管造影的スコアおよび毛細血管密度を回復した。
【０２９１】
抗体は、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法
は当該分野で公知である。ＶＥＧＦ−２抗体は、下記でより詳細に記載される、薬学的組成物の一部として投与され得る。ＶＥＧＦ−２抗体を送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０２９２】
（遺伝子治療方法）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するための遺伝子治療方法に関する。この遺伝子治療法は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現を達成するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標的組織によるこのＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメントに作動可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であり、例えば、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０２９３】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態では、操作される細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈周囲の組織への直接注射によって、またはカテーテル注射によって患者に再度導入され得る。
【０２９４】
以下でより詳細に考察するように、このＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。このＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアにて送達され得る。
【０２９５】
１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドはまた、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは、当業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。
【０２９６】
遺伝子治療方法において使用されるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドベクター構築物は好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない、構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ
２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明白である。
【０２９７】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＶＥＧＦ−２  ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、ＶＥＧＦ−２についてネイティブなプロモーターであり得る。
【０２９８】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０２９９】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、細胞間の液体ムコ多糖類マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは筋肉細胞を外筒で覆っている接続組織内にまたは骨間隙中の同等のマトリクスを包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められる空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０３００】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。
【０３０１】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＶＥＧＦ−２  ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３０２】
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与、カテー
テル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で公知である。
【０３０３】
実施例１８により証明されるように、裸のＶＥＧＦ−２配列のインビボ投与は、ウサギの大腿動脈におけるＶＥＧＦ−２ポリペプチドの首尾良い発現を生じる。
【０３０４】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達方法は、当該分野で公知である。
【０３０５】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７））；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６０７７〜６０８１（１９８９））；および精製された転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１０１８９〜１０１９２（１９９０））の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０３０６】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７）をもまた参照のこと、）より入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３０７】
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ  ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０３０８】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
【０３０９】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴が、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブを装備したＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  モデル３５０超音波処理器を使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得るか、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知でありそして利用可能である。
【０３１０】
このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７（１９８３）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化される物質の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３９４：４８３（１９７５）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１７：７７（１９７９））；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４４３：６２９（１９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．、７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８（１９７９））；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１４５（１９７９））；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：１０４３１（１９８０）；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１４５（１９７８）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５：１６６（１９８２））が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
【０３１１】
一般に、ＤＮＡ  対  リポソームの割合は約１０：１から約１：１０までである。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までである。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３１２】
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカチオン性
リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
【０３１３】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２をコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１４】
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３１５】
このプロデューサー細胞株は、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、ＶＥＧＦ−２を発現する。
【０３１６】
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイルスは、それがＶＥＧＦ−２をコードし、そして発現し、それと同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安全特性を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８（１９７４））。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２））。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６（１９７９））。
【０３１７】
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米
国特許第５，６５２，２２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明において有用である。
【０３１８】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰプロモーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３１９】
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エキソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成するためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ．Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中ではない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３２０】
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクションする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を含み、そしてＶＥＧＦ−２を発現する。
【０３２１】
遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコードしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３２２】
当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とともに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、ＶＥＧＦ−２の所望の内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３２３】
プロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを用いて増幅し得る。好ましくは、増幅されるプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されるプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅されるプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されるプロモーターおよび標的化配列を消化し、そして共に連結する。
【０３２４】
プロモーター−標的化配列構築物を、裸のポリヌクレオチドとして、またはリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス、リポフェクション、沈降剤など（先により詳細に記載された）のようなトランスフェクション促進剤と組み合わせてかのいずれかで、細胞に送達する。Ｐプロモーター−標的化配列を、直接的な針注射、静脈内注射、局部投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法によって送達し得る。この方法を、以下により詳細に記載する。
【０３２５】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内因性配列との間の相同組換えが起こり、その結果、内因性ＶＥＧＦ−２配列がプロモーターの制御下におかれる。次いで、このプロモーターは、内因性ＶＥＧＦ−２配列の発現を駆動する。
【０３２６】
ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成（ａｎｇｉｏｎｇｅｎｉｃ）タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと共に投与され得る。血管由来タンパク質には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激性因子、マクロファージコロニー刺激性因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激性因子、および酸化窒素シンターゼ。
【０３２７】
好ましくは、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的には、このシグナル配列は、コード領域の５’末端の方向またはその５’末端にて発現されるポリヌクレオチドのコード領域に配置される。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、このシグナル
配列は、当該分野において公知の方法を用いて化学合成され得る。
【０３２８】
上記ポリヌクレオチド構築物のいずれかの任意の投与様式が、その様式が治療効果を提供するために十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用され得る。これは、直接針注射、全身性注射、カテーテル注入、微粒子銃インジェクター、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジ貯留物（ｄｅｐｏｔ）、他の市販されている貯留物材料、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口もしくは座剤固体（錠剤もしくは丸剤）薬学的処方物、および手術の間のデカントもしくは局所適用を包含する。例えば、ラット肝およびラット脾への裸のリン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接注入、またはタンパク質被覆プラスミドのブタ静脈への直接注入が、ラット肝における外来遺伝子の遺伝子発現を生じた（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５（１９８９））。
【０３２９】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によることである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体化された本発明の組換え分子は、動脈の領域への直接注射により投与されるか、またはその中に局所的に投与される。組成物を動脈の領域内へ局所的に投与するとは、動脈内に組成物を数センチメートル、および好ましくは数ミリメートル注射することをいう。
【０３３０】
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的創傷中にまたはその周囲に接触させることである。例えば、患者は、手術を受け得て、そしてポリヌクレオチド構築物は創傷の内側の組織の表面上に被覆され得るか、またはこの構築物は、創傷の内部の組織の領域に注入され得る。
【０３３１】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルに複合体化された本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するための適切な送達ビヒクルは、特定の部位に対してビヒクルを標的化するためのリガンドを含むリポソームを含む。
【０３３２】
全身投与の好ましい方法は、静脈注射、エアロゾル、経口および経皮（局所）送達を包含する。静脈注射は、当該分野で標準的な方法を使用して実施され得る。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を使用して実施され得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １８９：１１２７７−１１２８１、１９９２（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。経口送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、動物の腸における消化酵素による分解を耐え得るキャリアに対して複合体化することにより実施され得る。このようなキャリアの例には、当該分野で公知のもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が含まれる。局所送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、皮膚に通過し得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより実施され得る。
【０３３３】
送達されるべき有効量の物質を決定することは、多数の要因に依存し得る。このような要因には、例えば、物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重度、ならびに投与経路が含まれる。処置の頻度は、多数の要因に依存する。このような要因としては、例えば、１投与当たりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康および医歴が挙げられる。正確な量、投与回数、および投与時期は、かかりつけの医師または獣医によって決定される。
【０３３４】
本発明の治療組成物は、任意の動物に、好ましくは、哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれる。ヒトが特に好ましい。
【０３３５】
（核酸有用性）
ＶＥＧＦ−２核酸配列およびＶＥＧＦ−２ポリペプチドはまた、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のため、およびヒトの疾患を処置するための診断薬および治療薬の生産のために使用され得る。例えば、ＶＥＧＦ−２は、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用され得、ここで、ＶＥＧＦ−２は１０ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で馴化培地に添加される。
【０３３６】
全長ＶＥＧＦ−２遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用されて、この遺伝子に対する高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離し得る。このタイプのプローブは、一般に、少なくとも５０塩基対を有するが、それらはさらに多数の塩基を有し得る。このプローブはまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全なＶＥＧＦ−２遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用することによるＶＥＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離することが挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドが、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、このライブラリーのどのメンバーにこのプローブがハイブリダイズするかを決定するために使用される。
【０３３７】
本発明は、ＶＥＧＦ−２レセプターの同定のための方法を提供する。このレセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１）））によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここで、ポリアデニル化されたＲＮＡをＶＥＧＦ−２に応答する細胞から調製し、そしてこのＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを複数のプールに分割し、そしてＶＥＧＦ−２に応答しないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＶＥＧＦ−２に曝す。ＶＥＧＦ−２を、部位特異的プロテインキナーゼについての認識部位のヨウ素化または包含を含む、種々の手段によって標識し得る。固定およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そして反復サブプール化プロセスおよび再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０３３８】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識したＶＥＧＦ−２は、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性連結され得る。架橋した材料をＰＡＧＥによって分離し、そしてＸ線フィルムに曝す。次いで、ＶＥＧＦ−２を含有する標識した複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供する。微量配列決定から得られたアミノ酸配列は、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプターをコードする遺伝子を同定するために使用される。
【０３３９】
（ＶＥＧＦ−２アゴニストおよびＶＥＧＦ−２アンタゴニスト）
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２アゴニストまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストである化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の一例は、コマイトジェン（ｃｏｍｉｔｏｇｅｎ）Ｃｏｎ  Ａの存在下でヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激するＶＥＧＦ−２の能力を利用する。内皮細胞を得、そしてＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補充した反応混合物中で９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、本発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき化合物を添加する。３７℃でのインキュ
ベーションの後、３［Ｈ］を取り込むに十分な時間、１ＦＣｉの３［Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＢＧｑ；ＮＥＮ）を培養物に断続的に添加し、そしてグラスファイバーフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上に回収する。３連の培養物の平均の３［Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して決定する。化合物を除いたコントロールアッセイと比較して有意な３［Ｈ］チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
【０３４０】
アンタゴニストについてアッセイするために、上記のアッセイを行ない、そして化合物がＶＥＧＦ−２の存在下で３［Ｈ］チミジン取り込みを阻害する能力は、この化合物がＶＥＧＦ−２に対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、競合阻害アッセイに適切な条件下で、ＶＥＧＦ−２および潜在的なアンタゴニストと、膜に結合したＶＥＧＦ−２レセプターまたは組換えレセプターとを組み合わせることによって検出され得る。ＶＥＧＦ−２は、例えば、放射能によって標識され得、その結果、レセプターに結合したＶＥＧＦ−２分子の数が、潜在的なアンタゴニストの有効性を決定し得る。
【０３４１】
あるいは、ＶＥＧＦ−２とレセプターとの相互作用の後の公知のセカンドメッセンジャーシステムの応答を、この化合物の存在下または非存在下で測定し、そして比較する。そのようなセカンドメッセンジャーシステムは、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解を包含するが、これらに限定されない。別の方法では、ＶＥＧＦ−２レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、この化合物の存在下で、標識したＶＥＧＦ−２と共にインキュベートされる。次いで、この相互作用を増強またはブロックする、この化合物の能力が測定され得る。
【０３４２】
潜在的なＶＥＧＦ−２のアンタゴニストは、抗体、またはいくつかの場合にはオリゴヌクレオチドを含み、これはこのポリペプチドに結合し、そしてＶＥＧＦ−２の機能を有効に消去させる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−２レセプターに結合する、密接に関連するタンパク質であり得るが、それらはこのポリペプチドの不活性な形態であり、それによりＶＥＧＦ−２の作用を妨げる。これらのアンタゴニストの例は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を包含し、例えば、ＶＥＧＦ−２のヘテロ二量体形態の一方の鎖は優性であり得、そして生物学的活性が保持されないように変異され得る。ドミナントネガティブ変異体の例は、二量体ＶＥＧＦ−２の短縮バージョンを包含する。この短縮バージョンは別の二量体と相互作用して、野生型ＶＥＧＦ−２を形成し得るが、得られるホモ二量体は不活性であり、特徴的なＶＥＧＦ活性を示すことができない。
【０３４３】
別の潜在的なＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、３重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、このポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、ＶＥＧＦ−２の転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５
６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現してＶＥＧＦ−２の産生を阻害し得る。
【０３４４】
潜在的なＶＥＧＦ−２アンタゴニストはまた、ポリペプチドの活性部位に結合し、そしてこの部位を占め、それにより触媒部位が基質に接近できないようにし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる、低分子を含む。低分子の例としては、低分子ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４５】
アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）は、固形腫瘍転移に必要な新脈管形成を制限するために使用され得る。ＶＥＧＦ−２の同定は、血管内皮成長因子の特定のインヒビターの生成のために使用され得る。新脈管形成および新生血管形成は固形腫瘍増殖における必須工程であるので、血管内皮成長因子の新脈管形成活性の阻害は、固形腫瘍のさらなる増殖、退行、または抑制さえをも妨害するために非常に有用である。ＶＥＧＦ−２の発現レベルは、胸部を含む正常組織において極度に低いが、悪性腫瘍に由来する少なくとも２つの乳癌細胞株においては中程度で発現されることが見出され得る。従って、ＶＥＧＦ−２が腫瘍脈管形成および増殖に関与することが可能である。
【０３４６】
神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置され得る新生物の１つのタイプである。
【０３４７】
アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）はまた、血管透過性の増大により引き起こされる慢性炎症を処置するために使用され得る。これらの障害に加えて、アンタゴニストはまた、糖尿病に関連する網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置するために使用され得る。
【０３４８】
アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中以下に記載するような）を有する組成物中で使用され得る。
【０３４９】
（薬学的組成物）
ＶＥＧＦ−２抗体は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療的有効量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与の形態に合わせるべきである。
【０３５０】
本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的組成物の成分で充填した１つ以上の容器を備えた薬学的パックまたはキットを提供する。そのような容器には、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によって指定される形式の通知を伴い得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
【０３５１】
薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内の経路によるような好都合な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症を処置および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、薬学的組成物は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合はこれらは一日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、投薬は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３５２】
ポリペプチドであるＶＥＧＦ−２抗体はまた、上記の、インビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。
【０３５３】
従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２抗体をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【０３５４】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２抗体の発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のＶＥＧＦ−２抗体をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのまたはＶＥＧＦ−２抗体の発現のために患者に投与され得る。そのような方法により本発明のまたはＶＥＧＦ−２抗体を投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
【０３５５】
本明細書中上記で述べたレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス）、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０３５６】
ベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９９０（１９８９）に記載される）、または他の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞性プロモーターのような細胞プロモーター（ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびβ−アクチンのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない））が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者に明らかである。
【０３５７】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書上記の改変したレトロウイルスＬＴＲを含む）；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御するネイティ
ブプロモーターであり得る。
【０３５８】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｙＣＲＥ、ｙＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４頁（１９９０）に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱が挙げられるが、これらに限定されない。代替としては、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に投与され得る。
【０３５９】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞としては、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６０】
（診断アッセイ）
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２核酸配列における変異の存在に関する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、ＶＥＧＦ−２遺伝子の使用に関する。
【０３６１】
ＶＥＧＦ−２遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液）、尿、唾液、組織生検、および剖検材料から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のための直接使用され得るか、または分析の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のために使用され得る。例として、ＶＥＧＦ−２をコードする核酸に対して相補的であるＰＣＲプライマーは、ＶＥＧＦ−２変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型に対して比較した増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅したＤＮＡを、放射性標識したＶＥＧＦ−２  ＲＮＡ、または代替的に、放射性標識したＶＥＧＦ−２アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることによって、同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ  Ａ消化または融解温度の違いによって、一致していない二重鎖から区別され得る。
【０３６２】
ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は、変性剤の存在下または非存在下で、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動的な移動度の変化の検出によって達成され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高解像度のゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る。ここで、異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、ゲル中で、それらの特異的な融解温度または部分的な融解温度に従って異なる位置において遅れる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと）。
【０３６３】
特定の位置での配列の変化もまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）または化学的切断法によって示され得る（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮ
ＡＳ，ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
【０３６４】
従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限酵素ＤＮＡ断片長の多型（ＲＦＬＰ））、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。
【０３６５】
より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異誘発もまた、インサイチュ分析によって検出され得る。
【０３６６】
本発明はまた、種々の組織におけるＶＥＧＦ−２タンパク質の変化レベルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、通常のコントロール組織サンプルと比較したタンパク質の過剰発現は、疾患（例えば、異常な細胞増殖）の存在またはその疾患に対する感受性を検出し得るからである。宿主由来のサンプル中のＶＥＧＦ−２タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてこれには、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）、第６章、（１９９１））は、最初に、ＶＥＧＦ−２抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、検出可能な試薬（例えば、放射能、蛍光、またはこの例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）が結合される。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上のいかなる遊離のタンパク質結合部位も、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ））とインキュベートすることによって覆われる。次に、モノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合したいかなるＶＥＧＦ−２タンパク質とも結合する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。すべての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたレポーター抗体は、ディッシュ中に置かれ、これは、レポーター抗体の、ＶＥＧＦ−２に結合したモノクローナル抗体への結合を生じる。次いで、未結合のレポーター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間の期間で発色した色の量は、標準曲線に対して比較した場合に、患者サンプルの所定の容量中に存在するＶＥＧＦ−２タンパク質の量の尺度である。
【０３６７】
競合アッセイが利用され得、ここではＶＥＧＦ−２に特異的な抗体が固体支持体に結合される。次いで、本発明のポリペプチドは、例えば、放射能によって標識され、そして宿主由来のサンプルが固体支持体上を通過し、そして検出された標識の量（例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出される）は、サンプル中のＶＥＧＦ−２の量と相関し得る。
【０３６８】
「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンドイッチ」アッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２は、固体支持体上を通過し、そして固体支持体に結合している抗体に結合する。次いで、第２の抗体がＶＥＧＦ−２に結合される。次いで、標識されかつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は、固体支持体上を通過し、そして第２の抗体に結合し、次いで量が定量され得る。
【０３６９】
（染色体の同定）
本発明の配列はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、染色体上
の特定の部位を同定する必要性が現在存在する。実際の配列データ（反復多型のデータ）に基づく染色体マーキング試薬は、染色体位置のマーキングのために現在ほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子とそれらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工程である。
【０３７０】
手短には、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得る。ｃＤＮＡのコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡにおける１より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、それによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅フラグメントを産生する。
【０３７１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールからのフラグメントの群を用いて、サブローカリゼーションが、類似の様式で達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別された（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。
【０３７２】
中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブとともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０３７３】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の物理的位置を、遺伝子マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ
Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見い出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。
【０３７４】
次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体のいくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察されない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。
【０３７５】
物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現状の分解能を用いて、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられたｃＤＮＡは、５０個と５００個の間の潜在的な原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング分解能および２０ｋｂあたり１つの遺伝子を仮定している。）
罹患した個体および罹患していない個体の比較は、一般的に、染色体における構造的変化（例えば、欠失または転座）を探索することを第１に含み、この変化は、染色体のスプレッドから可視的であるか、またはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能である。最終的に、何人かの個体からの遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在を確認しか
つ多型性からの変異を区別するために必要とされる。
【０３７６】
（アンチセンス）
本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によって、インビボでＶＥＧＦ−２を阻害することに関する。アンチセンス技術を用いて、３重らせんの形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡを通して遺伝子発現を制御し得る。これらの方法は両方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、成熟ポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、ＶＥＧＦ−２の転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ−２への翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。
【０３７７】
あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、当該分野の手順によって細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡがインビボで発現して、上記の様式においてＶＥＧＦ−２の産生を阻害し得る。
【０３７８】
従って、ＶＥＧＦ−２に対するアンチセンス構築物は、ＶＥＧＦ−２の脈管形成活性を阻害し得、そして固形腫瘍のさらなる増殖を妨げるかまたは消失さえさせ得る。なぜならば、新脈管形成および新生血管形成は、固形腫瘍の増殖における必須の段階であるからである。これらのアンチセンス構築物をまた使用して、異常な新脈管形成によって全て特徴付けられる慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病網膜症およびカポージ肉腫を処置し得る。
【０３７９】
（エピトープ保有部分）
本発明は、配列番号２、配列番号４または配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）のエピトープ、あるいは、、ＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるかまたは配列番号１もしくは配列番号３の配列の相補物またはＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８に含まれる配列の相補物、上記で規定されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる全長ポリペプチドのエピトープ（またはそのフラグメントもしくは改変体）を、含むかあるいはそれらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列（例えば、配列番号２、配列番号４および配列番号１８で開示された配列）のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０３８０】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドおよびポリペプチド、ならびにこれらのエピトープ保有部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、本発明のポリペプチド全体
、またはそのフラグメントが免疫原である場合、インビボで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として規定される。一方、抗体が結合し得るポリペプチド領域が、「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」として規定される。タンパク質のインビボでの免疫原性エピトープの数は、一般に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２を参照のこと。しかし、抗体は、それが免疫原性エピトープであるか否かに関わらず、ファージディスプレイのような方法を用いることによって、任意の抗原性エピトープに対して作製され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｇ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５−４３１を参照のこと。従って、本発明には、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が含まれる。
【０３８１】
免疫原性エピトープが、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析によって決定される、予測される重要なアミノ酸残基を含むことが、特に指摘される。従って、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方、のいずれかにおけるさらなる隣接残基を、これらの配列に付加して、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成し得る。従って、免疫原性エピトープは、さらなるＮ末端アミノ酸残基またはＣ末端アミノ酸残基を含み得る。このさらなる隣接アミノ酸残基は、本発明のポリペプチド由来の連続した隣接Ｎ末端配列および／またはＣ末端配列、または異種ポリペプチド配列であり得るか、あるいは、本発明のポリペプチド由来の連続した隣接配列および異種ポリペプチド配列の両方を含み得る
抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域の別個のフラグメントから、調製される。しかし、抗体は、本明細書中に記載されるように、ペプチドの任意の領域から調製され得る。好ましいフラグメントは、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１、またはｆｌｔ−４）への結合を減少するかまたは完全に妨げる抗体を産生する。抗体は、全長ＶＥＧＦ−２またはそのレセプターの部分（例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの分泌形態またはこれらの領域の任意の部分）に対して開発され得る。抗体はまた、特定の機能的部位（例えば、レセプター結合部位、あるいは、グリコシル化されるか、リン酸化されるか、ミリストイル化されるか、またはアミド化される部位）に対して開発され得る。
【０３８２】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生され得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０３８３】
免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、少なくとも７アミノ酸残基の長さである。「少なくとも」とは、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、７アミノ酸残基の長さであり得るか、または７アミノ酸と本発明の全長ポリぺプチドのアミノ酸残基数との間の任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００のアミノ酸残基の長さである。しかし、７と全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各整数およびどの整数も本発明に含まれることが指摘される。
【０３８４】
免疫原性および抗原性エピトープ保有フラグメントは、上記のような連続するアミノ酸残基の数のいずれかによって特定され得るか、または配列番号２のアミノ酸配列におけるこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ末端位置によってさらに特定され得る。例えば、少なくとも７または少なくとも１５の連続したアミノ酸残基の長さのフラグメントが、配列番号２、配列番号４、または配列番号１８のアミノ酸配列上に占有し得る、Ｎ末端位置およびＣ末端位置のどの組み合わせも本発明に含まれる。再び、「少なくとも７つの
連続するアミノ酸残基の長さ」とは、７アミノ酸残基の長さ、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の任意の整数を意味する。詳細には、７と全長のポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各整数およびどの整数も、本発明に含まれる。
【０３８５】
本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するのに有用であり、そして本発明のポリペプチドを検出するイムノアッセイにおいて有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製において有用である。この抗体はまた、種々の定性的および定量的イムノアッセイ、特に当該分野において公知の方法を用いる本発明のポリペプチドについて慣用的に使用され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８）を参照のこと。
【０３８６】
好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープ、ならびに２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０３８７】
好ましい免疫原性エピトープは、本明細書中で開示される免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性エピトープの２、３、４、５またはそれ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に、抗体応答を誘発するために提供され得るか、またはこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドは、キャリアなしで提供され得る。しかし、８〜１０程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０３８８】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野において公知の合成方法および組換え方法を含む、ポリぺプチドを作製するための任意の従来の方法によって、生成され得る。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、大きな数のペプチド（例えば、２４８の個体の１０〜２０ｍｇ）およびＨＡ１ポリペプチドの単一のアミノ酸改変体のセグメントを提示する異なる１３残基のペプチドの合成についての簡単な方法を記載しており、それらの全ては、４週間未満で調製されそして特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究によって）（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５））。この「同時複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者らに対する米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）においてさらに記載される。この手順において、種々のぺプチドの固相合成についての個々の樹脂は、分離した溶媒浸透パケット中に含まれ、これは、固相方法に関与する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成を同時に行い得る（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３１−５１３５の５１３４）。
【０３８９】
本発明のエピトープ保有ペプチドはまた、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９（この全体が本明細書中に参照として援用される）にＪ．Ｐ．Ｔａｍによって最初に記載された、複数抗原ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅ
ｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＡＰ）として合成され得る。ＭＡＰは、非免疫抗原性リジン核に結合する特定のペプチドの複数のコピーからなる。Ｍａｐペプチドは、通常、ＭＡＰ−４ペプチドまたはＭＡＰ−８ペプチドとしてしばしば称される４または８コピーのペプチドを含む。非限定的な例として、ＭＡＰは、ポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）支持体に結合するリジン核マトリックスにおいて合成され得る。目的のペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用してリジン残基において合成される。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、ＭＡＰ樹脂（例えば、ＭＡＰを合成するために使用され得るＦｍｏｃ樹脂４分枝（Ｆｍｏｃ  Ｒｅｓｉｎ  ４  Ｂｒａｎｃｈ）およびＦｍｏｃ樹脂８分枝（Ｆｍｏｃ  Ｒｅｓｉｎ  ８  Ｂｒａｎｃｈ）など）を提供する。樹脂からのＭＡＰの切断は、当該分野で公知の標準トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ベースのカクテルを使用して実施される。ＭＡＰの精製（脱塩を除く）は、必要ではない。ＭＡＰペプチドは、ＭＡＰとこのペプチドを由来とするネイティブのタンパク質の両方を認識する抗体を惹起する免疫ワクチンとして使用され得る。
【０３９０】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、例えば、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端にアミノ酸の添加によって改変され得る。このような改変は、例えば、エピトープ保有ポリペプチドの立体配座を変更するために実施され得、その結果、エピトープは、ネイティブのタンパク質におけるエピトープの構造により密接に関連する立体配座を有する。本発明の改変されたエピトープを保有するポリペプチドの例は、１つ以上のシステイン残基が、２つのシステイン間にジスルフィド結合の形成を可能にするためにポリペプチドに加えられたポリペプチドであり、非還元条件下でエピトープ保有ポリペプチドの安定なループ構造を生じる。ジスルフィド結合は、ポリペプチドに加えられたシステイン残基と、天然に存在するエピトープのシステイン残基との間に形成され得るか、または両方の天然に存在するエピトープ保有ポリペプチドに加えられた２つのシステイン間に形成され得る。さらに、ジスルフィド結合されたループ構造の形成を促進するためにシステインでこれらを置換することによって、天然に存在するエピトープ保有ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基を改変することが可能である。合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、当該分野で公知であり、そしてＰＣＴ公開ＷＯ９７／４６２５１（その全体が本明細書中に参照として援用される）に記載される技術を使用して慣用的に産生され得る。本発明によって企図されるエピトープ保有ポリペプチドの他の改変としては、ビオチン化が挙げられる。
【０３９１】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。これらの方法としては、インビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔｌｅら，（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得るが；抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドもしくはキャリア結合ペプチドまたはＭＡＰペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免
疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
【０３９２】
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、（例えば、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む）本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチド（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン、またはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。別の非制限的例により、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、アルブミン（組換えヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントもしくは改変体を含むが、これらに限定されない）と融合され得る（例えば、１９９９年３月２日に発行された米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０  ４１３  ６２２号、および１９９８年６月１６日に発行された米国特許第５，７６６，８８３号を参照のこと（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される））。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンの成熟形態（すなわち、欧州特許第０  ３２２  ０９４号の図１および２において示されるようにヒト血清アルブミンのアミノ酸１〜５８５）（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）と融合される。別の実施形態では、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基ｌ〜ｘを含むか、あるいは、これらからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｘは、１〜５８５の整数であり、そしてアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミン活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、米国特許第５，７６６，８８３号（本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるように、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｚを含むか、あるいは、これらからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｚは、３６９〜４１９の整数である。本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって含まれる。
【０３９３】
このような融合タンパク質は、上記のように、精製を容易にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮の障壁を横切る抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合体化された抗原（例えば、インスリン）について実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィド連結二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０３９４】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。ＤＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この方法を使用することにより、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によってその全体において参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１または配列番号３に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌクレオチド配列において変化を生じるように２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブルすることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはそのコードするポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。
【０３９５】
（抗体）
本発明は、さらに、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。この抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、（特定の抗体−抗原結合のアッセイについて当該分野で周知の免疫アッセイにより決定される場合）、本発明のポリペプチド、本発明の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、あるいは配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号１８の改変体、あるいは全長ポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）、プロタンパク質ポリペプチド配列、あるいはＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる分泌ポリペプチド、および／あるいはエピトープを特異的に結合する。
【０３９６】
本発明の抗体により結合されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびより高次の多量体）中にあり得る。従って、本発明は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの単量体および多量体、これらの調製物、およびこれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）を結合する抗体に関する。特定の実施形態において、本発明の抗体により結合されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、単量体、二量体、三量体、または四量体である。さらなる実施形態において、本発明の抗体により結合されるポリペプチドは、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも
四量体である。
【０３９７】
本発明の抗体によって結合される多量体ＶＥＧＦ−２は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。ＶＥＧＦ−２ホモマーは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド（本明細書中に記載される、ＶＥＧＦ−２フラグメント、改変体、および融合タンパク質を含む）のみを含む多量体をいう。これらのホモマーは、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態において、本発明の抗体により結合されるＶＥＧＦ−２多量体は、ホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有する２つのＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）、またはホモ三量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有する３つのＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）である。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−２のホモ三量体を結合する。さらなる実施形態において、本発明の抗体により結合されるホモマーのＶＥＧＦ−２多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
【０３９８】
ヘテロマーＶＥＧＦ−２は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに加えて、異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施形態において、本発明の抗体により結合されるＶＥＧＦ−２多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態において、本発明の抗体により結合されるヘテロマーＶＥＧＦ−２多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体、または少なくともヘテロ四量体である。
【０３９９】
本発明の抗体により結合されるＶＥＧＦ−２多量体は、疎水性、親水性、イオン性、および／もしくは共有結合性の会合の結果であり得、そして／または、例えば、リポソーム形成によって間接的に連結され得る。従って、１つの実施形態において、例えばホモ二量体またはホモ三量体のようなＶＥＧＦ−２多量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態において、例えば、ＶＥＧＦ−２ヘテロ三量体またはＶＥＧＦ−２ヘテロ四量体のような本発明のＶＥＧＦ−２ヘテロ多量体は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。別の実施形態において、ＶＥＧＦ−２多量体は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドとの共有結合的会合、および／またはＶＥＧＦ−２ポリペプチド間の共有結合的会合によって形成される。このような共有結合的会合は、（例えば、配列番号２、配列番号１４または配列番号１８に示される）ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つの例において、この共有結合的な会合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド中で相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別の例において、この共有結合的な会合は、化学的、または組換え的操作の結果である。あるいは、このような共有結合的な会合は、ＶＥＧＦ−２融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つの例において、共有結合的な会合は、融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例において、この共有結合的な会合は、ＶＥＧＦ−２−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、共有結合的に会合する多量体を形成し得る別のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーリガンド／レセプターメンバーに由来する異種ペプチド配列である。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に開示されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーにより分離される多量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０４００】
基本的な抗体の構造単位は、四量体を構成することが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１
つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原の認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。この鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のイソタイプを規定する。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第二版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（その全体が全ての目的のために参考として援用される）を参照のこと。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。
【０４０１】
従って、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二重機能性または二重特異性の抗体を除いて、これら２つの結合部位は、同じである。
【０４０２】
これらの鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとまた称される３つの高可変領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般的構造を示す。各対の重鎖および軽鎖由来のＣＤＲは、特定のエピトープに結合し得るフレームワーク領域によって並べられる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７(１９８７)；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０４０３】
二重特異性または二重機能性の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７  １５５３（１９９２）を参照のこと。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」として形成され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））または「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）ｔａｒｇｅｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  補遺  ７：５１−５２（１９９２））。
【０４０４】
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体が挙げられる）、細胞内で生成される抗体（すなわち、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））、および任意の上記の抗体のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を
含む分子）をいう。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭおよびＩｇＹが挙げられる。好ましい実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧ１イソタイプである。別の好ましい実施形態において、この免疫グロブリンはＩｇＧ２イソタイプである。別の好ましい実施形態において、この免疫グロブリンはＩｇＧ４イソタイプである。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖は、κまたはλ形態の軽鎖と対になり得る。
【０４０５】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、任意の動物起源（鳥類および哺乳動物を含む）に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結合フラグメントが、本発明に含まれる。
【０４０６】
抗原結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域のみを含み得るか、または以下の全体もしくは一部分と組み合せて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、本発明は、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０４０７】
本発明の抗体は、単一特異的、二価特異的、三価特異的またはより多価特異的であり得る。多価特異的抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドならびに異種の組成物（例えば、異種のポリペプチドまたは固体支持材料）の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、５，６０１，８１９号、４，７１４，６８１号、４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。
【０４０８】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのエピトープもしくは部分（抗体により認識されるかまたは特異的に結合される）に関して記載または特定化され得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書において記載のように（例えば、Ｎ末端位置およびＣ末端位置により、隣接するアミノ酸残基のサイズにより）、または表および図に列挙されるように、特定化され得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９または７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる全長ＶＥＧＦ−２タンパク質を結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９または７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＥＧＦ−２タンパク質のプロタンパク質形態を結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９または７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる分泌ＶＥＧＦ−２タンパク質を結合する。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、分泌ＶＥＧＦ−２タンパク質を結合するが、ＡＴＣＣ寄託番号
９７１４９または７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる全長ＶＥＧＦ−２タンパク質ではない。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−２タンパク質の分泌形態およびＡＴＣＣ寄託番号９７１４９または７５６９８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされる全長ＶＥＧＦ−２タンパク質の両方を結合する。
【０４０９】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７を結合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、各々配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを結合する。さらに他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸１１２〜２２７を結合する。さらに他の実施形態では、本発明の抗体は、各々配列番号１８のアミノ酸１１２〜２２７からなる２つのポリペプチドからなる二量体ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを結合する。
【０４１０】
本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体もまた除外される。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこのポリペプチドの除外を可能にする抗体を含む。
【０４１１】
本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載され得るか、または特定化され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、サルホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログ、ならびにその対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５％未満の、９０％未満の、８５％未満の、８０％未満の、７５％未満の、７０％未満の、６５％未満の、６０％未満の、５５％未満のおよび５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、任意の単一の特異的抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、あるいは本明細書に開示される、２、３、４、５以上の特定の抗原性ポリペプチドおよび／または免疫原性ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに本発明には、（本明細書中に記載されるような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみを結合する抗体が含まれる。
【０４１２】
本発明の抗体（その抗体フラグメントもしくは改変体を含むか、またはこれらからなる、分子を含む）は、ヒトＶＥＧＦ−２（配列番号２、配列番号４または配列番号１８）および／あるいはサルＶＥＧＦ−２のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＶＥＧＦ−２およびサルＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する。また好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＶＥＧＦ−２およびマウスＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する。さらに好ましくは、本発明の抗体は、マウスＶＥＧＦ−２よりもヒトＶＥＧＦ−２に、免疫特異的かつより高い親和性で結合する。
【０４１３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体（その抗体フラグメントもしくは改変体を含むか、またはこれらからなる、分子を含む）は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合し、そして
他の抗原と交差反応しない。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合し、そして、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−３（ＶＥＧＦ−Ｂ）、ＶＥＧＦ−４（ＶＥＧＦ−Ｄ）、ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦｂのような、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【０４１４】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合し、そして、例えば、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−３（ＶＥＧＦ−Ｂ）、ＶＥＧＦ−４（ＶＥＧＦ−Ｄ）、ＰＤＧＦａまたはＰＤＧＦｂのような、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの他のメンバーと交差反応する。
【０４１５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−２（配列番号２、配列番号４または配列番号１８）、またはそのフラグメントおよび改変体に対して、他の抗原（例えば、他のケモカインレセプターなど）を結合する能力と比べて、優先的に結合する。
【０４１６】
非限定的な実施例について、抗体が、第二の抗原についての抗体のＫＤ未満の解離定数（ＫＤ）で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体が第二の抗原についての抗体のＫＤよりも、少なくとも一オーダー程度より低い親和性で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は、第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。別の非限定的な実施例において、抗体が第二の抗原についての抗体のＫＤよりも、少なくとも二オーダー程度より低い親和性で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は、第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。
【０４１７】
別の非限定的な実施例において、抗体が第二の抗原についての抗体のｋｏｆｆ未満の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ）で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体が第二の抗原についての抗体のｋｏｆｆよりも、少なくとも一オーダー程度より低い親和性で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は、第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。別の非限定的な実施例において、抗体が第二の抗原についての抗体のｋｏｆｆよりも少なくとも二オーダー程度より低い親和性で第一の抗原に結合する場合に、この抗体は、第一の抗原に優先的に結合したとみなされ得る。
【０４１８】
本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対する結合親和性に関して記載されるかまたは特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、または１０−４Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する結合親和性が挙げられる。より好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、または１０−８Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する結合親和性が挙げられる。さらにより好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０４１９】
本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％まで、エピトープに対する結合を競合的に阻害する。
【０４２０】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合を妨げないがレセプターの活性化を妨げるレセプター特異的抗体が含まれる。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、（例えば、上記されたような）免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によって、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいはその基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非存在下の活性の、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％まで、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体を提供する。
【０４２１】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好ましくは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体を特徴とする。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは妨げない抗体が含まれる。さらに含まれるものは、レセプターを活性化する抗体である。これらの抗体は、リガンド媒介レセプター活性化により影響される全てかまたは全てに満たないかのいずれかの生物学的活性に対するアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定化され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．：５８（１５）：３２０９−３２１４；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９；Ｐｒａｔ  Ｍ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ  ９（４）：２３３−２４１；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（上記の参考文献はすべて、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０４２２】
本発明はまた、本明細書中に記載された１つ以上の抗体と同じ１つ以上の生物学的特徴を有する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を包含する。「生物学的特徴」とは、例えば、以下のような、抗体のインビトロまたはインビボでの活性または特性を意味する：ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する能力（例えば、実施例３３を参照のこと）、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する能力（例えば、実施例３５を参照のこと）、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する能力（例えば、実施例３４を参照のこと）、新脈管形成を阻害する能力（例えば、実施例１６および２３を
参照のこと）、ならびに／あるいは、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する能力（例えば、実施例３７および３８を参照のこと）。必要に応じて、本発明の抗体は、本明細書中で具体的に言及された少なくとも１つの抗体と同じエピトープに結合する。このようなエピトープへの結合は、当該分野で公知のアッセイを使用して、慣用的に決定され得る。
【０４２３】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供し、この抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３）を含むか、あるいはそれらからなる。「ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体を中和する」抗体は、例えば、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体（例えば、実施例３３を参照のこと）、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体（例えば、実施例３５を参照のこと）、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体（例えば、実施例３４を参照のこと）、新脈管形成を阻害する抗体（例えば、実施例１６および２３を参照のこと）、ならびに／あるいは、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体（例えば、実施例３７および３８を参照のこと）である。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体を中和する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２４】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供する（例えば、実施例３３を参照のこと）。このような抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのアミ
ノ酸配列を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２のそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１および／またはｆｌｔ−４）への結合を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２５】
本発明はまた、例えば、実施例３５に記載されるアッセイのような当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供する。このような抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ
ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイ
ン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ
ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２６】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供する（例えば、実施例３４を参照のこと）。このような抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２により誘導される血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２７】
非常に好ましい実施形態では、本発明はまた、新脈管形成を阻害する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供する（例えば、実施例１６および２４を参照のこと）。このような抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ
ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。１つの実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグ
メントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、新脈管形成を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２８】
他の非常に好ましい実施形態では、本発明はまた、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を提供する（例えば、実施例３７および３８を参照のこと）。このような抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み得るか、あるいはそれらからなり得る。１つの実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、腫瘍増殖および／または腫瘍転移を阻害する抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４２９】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２の活性を増強させる抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）を
提供し、この抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一部（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、またはＶＬ  ＣＤＲ３）を含むか、あるいはそれらからなる。限定することのない例として、「ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる」抗体は、ＶＥＧＦ−２がそのレセプター（例えば、ｆｌｋ−１またはｆｌｔ−４）に結合する能力、ＶＥＧＦ−２がＶＥＧＦ−２シグナル伝達カスケードを刺激する（例えば、ＶＥＧＦ−２により誘導されるＥｌｋ−１のリン酸化を増加させる（実施例３５を参照のこと））能力、ＶＥＧＦ−２が血管および／またはリンパ性内皮細胞の増殖を誘導する能力（例えば、実施例３４を参照のこと）、ならびに／あるいはＶＥＧＦ−２が新脈管形成を促進する能力を増加させる抗体である。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなり、そして表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメインまたはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２の活性を増強させる抗体は、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。１つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲドメイン、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体の活性を増強させる抗体は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４３０】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたはその改変体からなる分子、を含む）と異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質、あるいはそれらからなる融合タンパク質を提供する。好ましくは、上記抗体を融合する異種ポリペプチドは、機能のために有用であるか、または特定の細胞（腫瘍細胞、特に、前立腺癌細胞、乳癌細胞、脳の癌細胞、または結腸癌細胞）にＶＥＧＦ−２抗体を標的化させるために有用である。１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ以上のＶＨドメインのアミノ酸配列、もしくは表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ以上のＶＬドメインのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ、２
つ、３つ、もしくはそれより多いＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列、または表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ、２つ、３つ、もしくはそれより多いＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、表２において言及されたｓｃＦｖのＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなり、この融合タンパク質は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、表２において言及されたｓｃＦｖの少なくとも１つのＶＨドメインのアミノ酸配列、および表２において言及されたｓｃＦｖの少なくとも１つのＶＬドメインのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、融合タンパク質のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ、２つ、３つ、もしくはそれより多いＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列、および表２において言及されたｓｃＦｖの任意の１つ、２つ、３つ、もしくはそれより多いＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントもしくは改変体を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれより多いＶＨＣＤＲまたはＶＬＣＤＲが、本発明の単鎖抗体（または、ｓｃＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。
【０４３１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するための当該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する（インビトロおよびインビボの両方における診断方法および治療方法を含む）。例えば、この抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、この抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０４３２】
限定することのない別の例として、本発明の抗体は、受動免疫の形態として個体に投与され得る。あるいは、本発明の抗体をエピトープマッピングのために使用して、抗体により結合されるエピトープを同定し得る。このようにして同定されたエピトープは、次に、例えば、ワクチン候補物（すなわち、個体を免疫化し、天然に存在する形態のＶＥＧＦ−２に対する抗体を惹起するため）に使用され得る。
【０４３３】
本発明の抗体は、単独または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物または毒素）に、組換え的に融合され得るかまたは結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ０  ３９６  ３８７号を参照のこと。
【０４３４】
本発明の抗体は、改変された（すなわち、抗体に対する任意の分子型の共有結合による）誘導体を含む。例えば、限定を目的としてではなく、この抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、
既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実施され得る。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０４３５】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、この抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０４３６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマおよび組換え技術の使用を含む、当該分野で公知の広範な技術を用いて調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を介して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれを産生する方法に由来する抗体ではない。
【０４３７】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野で慣用的でありそして周知である。限定することのない例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応用が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体が、マウスの血清中に検出される）と、そのマウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次いで、その脾細胞を周知技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２／０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを、限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスに免疫することによって産生され得る。
【０４３８】
従って、本発明は、モノクローナル抗体を産生する方法および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、次いで本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって産生される。
【０４３９】
ポリクローナル性およびモノクローナル性のヒトＢ細胞株の両方を生産する別の周知の方法は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用する形質転換である。ＥＢＶ形質転
換Ｂ細胞株を産生するためのプロトコル（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇｅｎら編、１９９４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）の第７．２２章に概略されるプロトコル）が、当該分野で一般的に知られている。形質転換のためのＢ細胞の供給源は、一般的にヒト末梢血であるが、形質転換のためのＢ細胞はまた、以下に挙げられる他の供給源に由来し得るが、これらに限定されない：リンパ節、扁桃腺、脾臓、腫瘍組織、および感染した組織。一般的に組織は、ＥＢＶ形質転換の前に単一細胞懸濁液になされる。さらに、Ｂ細胞を含むサンプル中のＴ細胞を物理的に取り除くか、またはＴ細胞を不活化（例えば、シクロスポリンＡを用いる処理によって）する工程がとられ得る。なぜなら、抗ＥＢＶ抗体について血清陽性の個体由来のＴ細胞は、ＥＢＶによるＢ細胞の不死化を抑制し得るからである。一般的に、ヒトＢ細胞を含むサンプルにＥＢＶを接種し、そして３〜４週間培養する。ＥＢＶの代表的な供給源は、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶ形質転換の物理学的徴候は、一般的に、３〜４週間の培養期間の最後に観察され得る。位相差顕微鏡によって、形質転換された細胞は、大きく、明瞭で、毛様（ｈａｉｒｙ）に見え、そして細胞の密集したクラスター状に凝集する傾向にあり得る。一般的に、最初ＥＢＶ株はポリクローナルである。しかし、過剰に長期にわたった細胞培養物のＥＢＶ株は特定のＢ細胞クローンの選択的な増殖の結果としてモノクローナルまたはポリクローナルになり得る。あるいは、ポリクローナル性のＥＢＶ形質転換株は、適切な融合パートナでサブクローニング（例えば、限界希釈培養によって）され得るか、または融合され得、そして限界希釈でプレートされ、モノクローナルＢ細胞株を入手し得る。ＥＢＶ形質転換細胞株のための適切な融合パートナーとして、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロ骨髄腫細胞株（ヒト×マウス；例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、およびヒト細胞株（例えば、ＧＭ  １５００、ＳＫＯ−００７、ＲＰＭＩ  ８２２６、およびＫＲ−４）が挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはこれらのフラグメントに対するポリクローナル性またはモノクローナル性のヒト抗体を作製する方法を提供し、この方法は、ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換を包含する。
【０４４０】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって作製され得る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖含有領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０４４１】
あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡ技術の適用を通してかまたは合成化学を通して産生され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して調製され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望される結合特性を有するファージは、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原）を用いて直接的に選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドで安定化されたＦｖの抗体ドメインを有する糸状ファージ（ｆｄおよびＭ１３を含む）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕ．ら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（
１９９４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら（１９９７）、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９４）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；および同第５，７３３，７４３号（これらの参考文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０４４２】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離および使用され得、そして、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、例えば、以下に開示される：ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら（１９９５）、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０４４３】
単鎖のＦｖおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ，Ｌ．ら（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９；およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好適であり得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基で置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法（例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される））、同定される。
【０４４４】
抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（ＥＰ  ０  ２３９  ４００号；ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第
５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ０  ５９２  １０６号；ＥＰ  ０  ５１９  ５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９４）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ら（１９９４）、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３）、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。また、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ９８／４６６４５を参照のこと（これらの参考文献は、その全体において参考として援用される）。
【０４４５】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、およびＷＯ  ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０４４６】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ）が、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々にまたはそれと同時に非機能的になされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡大させ、そしてキメラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために交配させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスに保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；および同第６，１１４，５９８号（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に
類似した技術を用いて、選択された抗原に対して指向するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０４４７】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体を、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０４４８】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次いで、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために利用され得る。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ＆Ｂｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、リガンドに結合し、かつポリペプチドの多量体化および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ドメインを「模倣」し、そして結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを産生するために使用され得る。このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに結合するため、および／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用され得、そしてそれによってその生物学的活性が活性化されるか、またはブロックされる。
【０４４９】
イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）は、組換え核酸分子から発現される抗体（しばしば、ｓｃＦｖ）であり、そして細胞内に保持される（例えば、細胞質、小胞体、またはペリプラズムに保持される）ように操作される。イントラボディーを使用して、例えば、イントラボディーが結合するタンパク質の機能を排除し得る。イントラボディーの発現はまた、イントラボディーを含む核酸発現ベクター中の誘導可能なプロモーターの使用を介して調節され得る。本発明のイントラボディーは、以下に開示および概説されるように、当該分野で公知の方法を使用して産生され得る：Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９５〜６０１（１９９４）；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１１〜１５（１９９７）；ＲｏｎｄｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：２５７〜２８３（１９９７）；Ｐｒｏｂａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：２４５〜２５３（１９９８）；Ｃｏｈｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１７：２４４５〜２４５６（１９９８）；ＯｈａｇｅおよびＳｔｅｉｐｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１１９〜１１２８（１９９９）；Ｏｈａｇｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１２９〜１１３４（１９９９）；ＷｉｒｔｚおよびＳｔｅｉｐｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：２２４５〜２２５０（１９９９）；Ｚｈｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２０７〜２２２（１９９９）；およびこれらにおいて引用されている参考文献。特に、ＣＣＲ５イントラボディーが、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８０５〜８１０（２０００）によって産生されている。
【０４５０】
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ技術）
本発明による抗体は、挿入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分を有するが、外因性マウス抗体の産生を欠損させるトランスジェニックマウスの使用により調製され得る（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統はＡｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡから入手可能）。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、そしてマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生を欠損する。同じことを達成す
るために使用される技術が、特許、出願および本明細書中に開示される参考文献に開示される。
【０４５１】
ＹＡＣのメガベースの大きさのヒト遺伝子座をクローン化し、そして再構築する能力、およびそれらをマウスの生殖系列に導入する能力は、非常に大きなまたは大雑把にマッピングされた遺伝子座の機能的な成分の解明ならびにヒト疾患の有用なモデル作成に対する強力なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座のそれらのヒト等価物との置換のためのこのような技術の使用は、発生期のヒト遺伝子産物の発現および調節、それらの他の系との係わり合い、ならびに疾患の誘導および進行とそれらの関連に独特な知見を提供し得る。
【０４５２】
このようなストラテジーの重要な実用的適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のマウスへの導入において、外因性Ｉｇ遺伝子は不活化され、プログラムされた発現の基礎となるメカニズムを研究する機会を与え、そして抗体およびＢ細胞発生におけるこれらの役割を構築する。さらに、このようなストラテジーは、完全ヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の産生のための理想的な供給源を提供し得、ヒト疾患における抗体治療の期待を実現することへの重要な布石である。
【０４５３】
完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス誘導モノクローナル抗体に対する内因性の免疫原性およびアレルギー性の応答を最小にし、従って、投与される抗体の効力および安全性を高めることが期待される。完全ヒト抗体の使用は、繰り返し抗体の投与が必要な慢性的および再発性のヒト疾患（例えば、癌）の処置において実質的な利益を提供することが期待され得る。
【０４５４】
この目的に対する１つのアプローチは、マウス抗体産生を欠損するマウス系統を、このようなマウスが、マウス抗体の非存在下でヒト抗体の巨大レパートリーを産生することを予測して、ヒトＩｇ遺伝子座の巨大フラグメントを用いて操作することである。巨大ヒトＩｇフラグメントは、巨大可変遺伝子多様性ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保持する。抗体多様化および選択についてのマウスの機構ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的耐性の欠如を開発することによって、これらのマウス系統における再生されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対する高い親和性の抗体を生じるはずである。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトモノクローナル抗体は、容易に産生および選択され得る。
【０４５５】
この一般的なストラテジーは、１９９４年に発行された最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ系統の作製に関連して示された。Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１（１９９４）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ系統を２４５ｋｂおよび１０１９０ｋｂの大きさの生殖系列配置のフラグメント（それぞれ、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座（これらは核可変領域配列および定常領域配列に含まれる））を含む酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）で操作した。同上。ＹＡＣを含むヒトＩｇは、再配列および抗体の発現の両方のためにマウス系と適合するように検証され、そして不活化されたマウスＩｇ遺伝子を置換し得た。このことは、Ｂ細胞発生を誘発し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、そして抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成するこれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、より多数のＶ遺伝子、さらなる調節エレメント、およびヒトＩｇ定常領域を含むヒトＩｇ遺伝子座のより大きな部分の導入が、感染および免疫化に対するヒト体液性応答の特徴である完全レパートリーを実質的に再利用することを示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭマウスを作製するために、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座それぞれのメガベースの大きさの生殖系列配置のＹＡＣフラグメントの導入を介して約８０％より大きいヒト抗体レパートリーの導入にまで発展させた。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５
：１４６〜１５６（１９９７）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜４９５（１９９８）、Ｇｒｅｅｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３（１９９９）および米国特許出願番号０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０４５６】
このようなアプローチは、さらに以下において議論され、そして描写される：米国特許出願番号０７／４６６，００８（１９９０年１月１２日出願）、同０７／７１０，５１５（１９９０年１１月８日出願）、同０７／９１９，２９７（１９９２年７月２４日出願）、同０７／９２２，６４９（１９９２年７月３０日出願）、同０８／０３１，８０１（１９９３年３月１５日出願）、同０８／１１２，８４８（１９９３年８月２７日出願）、同０８／２３４，１４５（１９９４年４月２８日出願）、同０８／３７６，２７９（１９９５年１月２０日出願）、同０８／４３０，９３８（１９９５年４月２７日出願）、同０８／４６４，５８４（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６４，５８２（１９９５年６月５日出願）、同０８／４７１，１９１（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６２，８３７（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５３（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５７（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５９（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６２，５１３（１９９５年６月５日出願）、同０８／７２４，７５２（１９９６年１０月２日出願）、および０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６（１９９７）ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜４９５（１９９８）もまた参照のこと。欧州特許番号ＥＰ  ０
４７１  １５１  Ｂ１（１９９６年６月１２日許可公開）、国際特許出願番号ＷＯ  ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、国際特許出願番号ＷＯ  ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）および同ＷＯ  ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）もまた参照のこと。上記列挙した特許、出願、および参考文献のそれぞれの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０４５７】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、キメラまたは他のヒト化抗体を調製する産業をもたらした。キメラ抗体は、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含むが、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に慢性の抗体の利用または抗体の多回用量利用において観察されることが予想される。従って、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対する完全ヒト抗体が提供されることが、ＨＡＭＡ応答またはＨＡＣＡ応答の関連および／または影響を無くすために望まれる。
【０４５８】
ファージディスプレイ技術を使用して、本発明者らは、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する単鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」）を同定した。ＶＥＧＦ−２（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体であって、ＶＥＧＦ−２のプロタンパク質形態およびＶＥＧＦ−２の分泌形態を含む）に免疫特異的に結合する、これらのｓｃＦｖのフラグメントまたは改変体（例えば、表２において参照されるいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲが挙げられる）を含むか、またはこれらから構成される分子はまた、これらのｓｃＦｖおよび／または分子をコードする核酸分子であるように、本発明によって包含される。
【０４５９】
特に、本発明は、以下の表２において参照されるように、配列番号７２〜７８、好ましくは、配列番号７２および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖか、あるいは、これらの配列からなるｓｃＦｖに関する。ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する、これらのｓｃＦｖのフラグメントまたは改変体（例えば、表２に参照されるいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲが挙げられる）を含むか、あるいはこれらから構成される分子はまた、これら
のｓｃＦｖおよび／または分子をコードする核酸分子であるように、本発明によって包含される。
【０４６０】
本発明は、ＶＥＧＦ−２のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに免疫特異的に結合する、抗体（これらの抗体フラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）を提供する。特に、本発明は、表２に参照されるｓｃＦｖに対応する抗体を提供し、このようなｓｃＦｖは、慣用的に、以下の実施例３２においてより詳細に記載されるように、例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を、定常ドメイン配列を含む発現ベクターに挿入することによって、免疫グロブリン分子に「変換」され得、そして免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作され得る。
【０４６１】
（表２：ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合するｓｃＦｖ）
【０４６２】
【表２】
0005132008.tif 000015
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７２のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７２のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供す
る。
【０４６３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７３のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７３のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７４のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７４のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７５のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７５のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７６のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７６のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６７】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７７のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７７のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７８のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号７８のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４６９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号７９のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号８４において見出されるように、配列番号７９のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４７０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８０のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号８５において見出されるように、配列番号８０のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４７１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８１のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号８１のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４７２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８２のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号８２のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供す
る。
【０４７３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８３のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号８３のｓｃＦｖ（もしくはフラグメントまたはこれらの改変体）をコードする核酸分子を提供する。
【０４７４】
本発明は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド、またはこれらのフラグメント、改変体、もしくは融合タンパク質に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはそれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）を包括する。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドとしては、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１８のＶＥＧＦ−２ポリペプチド、またはそれぞれ１９９５年５月１２日および１９９５年５月４日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体によって結合されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−２の全長タンパク質、プロタンパク質、または分泌形態であり得る。ＶＥＧＦ−２は、配列番号２、配列番号４または配列番号１８のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＡＴＣＣ受託番号９７１４９または７５６９８のｃＤＮＡ）の組換え発現を介して産生され得る。
【０４７５】
本発明の１つの実施形態において、ＶＥＧＦ−２またはこれらのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体は、表２で参照されるｓｃＦｖのＶＨドメインのいずれか１つ、および／または表２で参照されるｓｃＦｖのＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、表２で参照されるｓｃＦｖからなる群より選択される同一のｓｃＦｖ由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。代替的な実施形態において、本発明の抗体は、表２で参照されるｓｃＦｖと異なるＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する表２で参照されるｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインの抗体フラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子はまた、これらのＶＨドメインおよびＶＬドメイン、分子、フラグメントならびに／または改変体のように、本発明により包含される。
【０４７６】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２のポリペプチド、もしくはポリペプチドフラグメントまたは改変体に免疫特異的に結合する抗体を提供し、ここで、この抗体は、表２に参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインに含まれるＶＨ  ＣＤＲのいずれかの１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。特に、本発明は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインに含まれるＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。別の実施形態において、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインに含まれるＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体は、表２に参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインに含まれるＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。ＶＥＧＦ−２もしくはＶＥＧＦ−２フラグメントまたはこれらの改変体に免疫特異的に結合するこれらの抗体もしくは抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子は、これらの抗体、分子、フラグメントおよび／または改変体をコードする核酸分子のように、本発明によって包括される。
【０４７７】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２のポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントまたは改変体に免疫特異的に結合する抗体を提供し、ここで、この抗体は、表２で参照される１
つ以上のｓｃＦｖのＶＬドメインに含まれるいずれかの１つ、２つ、または３つ以上のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。特に、本発明は、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＬドメインに含まれるＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。別の実施形態において、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＬドメインに含まれるＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＬドメインに含まれるＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれらから構成される。ＶＥＧＦ−２もしくはＶＥＧＦ−２フラグメントまたはこれらの改変体に免疫特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子はまた、これらの抗体、分子、フラグメントおよび／または改変体をコードする核酸分子のように本発明によって包括される。
【０４７８】
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド、またはＶＥＧＦ−２のポリペプチドフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）を提供し、ここで、この抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインに含まれるような、１つ、２つ、または３つ以上のＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、または３つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むか、あるいはこれらから構成される。特に、本発明は、ＶＥＧＦ−２のポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントまたは改変体に免疫特異的に結合する抗体を提供し、ここで、この抗体は、表２で参照される１つ以上のｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインに含まれる、ＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲの、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組み合わせを含むか、あるいはこれらから構成される。好ましい実施形態において、１つ以上のこれらの組み合わせは、表２に開示されるように同一のｓｃＦｖ由来である。ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する、これらの抗体のフラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子はまた、これらの抗体、分子、フラグメントまたは改変体をコードする核酸分子のように本発明に包括される。
【０４７９】
（ｓｃＦｖに対応するＶＥＧＦ−２抗体をコードする核酸分子）
本発明はまた、一般に、単離された、本発明の抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）をコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、表２において参照されるｓｃＦｖのいずれか１つのＶＨドメインのアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および表２において参照されるｓｃＦｖのいずれか１つのＶＬドメインのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むか、あるいはこれらからなる抗体（抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）をコードする。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、表２において参照されるｓｃＦｖのいずれか１つのＶＨドメインのアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または表２において参照されるｓｃＦｖのいずれか１つのＶＬドメインのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むか、あるいはこれらから構成される抗体（抗体フラグメントまたはこれらの改変体を含むか、あるいはそれから構成される分子を含む）をコードする。
【０４８０】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）の改変体（誘導体を含む）を含むか、あるいはこれらから構成される抗
体を提供し、ＶＥＧＦ−２またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準的技術を使用して、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入し得、この変異としては、例えば、アミノ酸置換を生じる部位指向変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発が挙げられる。好ましくは、改変体（誘導体を含む）は、参照のＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比較して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。あるいは、変異は、コード配列の全てまたは一部と共に、例えば、飽和変異誘発によって、ランダムに導入され得、そして、得られた変異体は、生物学的活性についてスクリーニングされて、活性（例えば、ＶＥＧＦ−２に結合する能力）を保持する変異体を同定し得る。
【０４８１】
例えば、フレームワーク領域のみかまたは抗体分子のＣＤＲ領域のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントな変異または中性ミスセンス変異（すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対する影響が全くないかまたはほとんどない）であり得る。これらの型の変異は、コドン使用を最適化するか、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中性ミスセンス変異は、抗原に結合する抗体の能力を変化し得る。大部分のサイレントな変異および中性ミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域に存在するようであるが、これは絶対的な必要条件ではないけれども、多くの非中性のミスセンス変異は、ＣＤＲ中に存在するようである。当業者は、抗原結合活性における無変化または結合活性の変化（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変化）のような所望の特性を有する変異分子を設計および試験し得る。変異誘発後、コードされたタンパク質は、慣例的に発現され得、そして、コードされたタンパク質の機能的および／または生物学的活性（例えば、ＶＥＧＦ−２に免疫特異的に結合する能力）は、本明細書中に記載される技術を使用してかまたは当該分野で公知の技術を慣例的に改変することによって決定され得る。
【０４８２】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、本発明の抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）は、ストリンジェントな条件下で（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションの後）、約５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での１回以上の洗浄、高度にストリンジェントな条件下で（例えば、約４５℃で６×ＳＳＣ中でフィルターに結合した核酸へのハイブリダイゼーションの後）、約６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中での１回以上の洗浄、または当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、表２において参照される１つのｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの１つをコードするヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される（例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、６．３．１〜６．３．６頁および２．１０．３頁を参照のこと）。これらの抗体をコードする核酸分子はまた、本発明によって包含される。
【０４８３】
同様のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体は、しばしば、同様の構造および多数の同じ生物学的活性を有することが当該分野で周知である。従って、１つの実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）は、表２に参照されるｓｃＦｖのＶＨドメインのアミノ酸配列に、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むか、あるいはこれらから構成される。
【０４８４】
別の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいはこれらから構成される分子を含む）は、表２に参照されるｓｃＦｖのＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むか、あるいはこれらから構成される。
【０４８５】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明の抗体（抗体フラグメントまたは改変体を含む）は、当該分野で公知の任意の方法によって産生され得る。例えば、本発明に従って、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得ることが理解される。特定の抗体についてのｃＤＮＡまたはゲノムクローンをコードする配列は、例えば、適切な哺乳動物宿主細胞もしくは非哺乳動物宿主細胞の形質転換のため、またはファージディスプレイライブラリーを作成するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチド抗体は、化学的に合成され得るか、または組換え発現系の使用を介して産生され得る。
【０４８６】
本発明の抗体を産生するための１つの方法は、表２に参照されるｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをクローン化することである。ハイブリドーマ細胞株からＶＨドメインおよびＶＬドメインを単離するために、ＶＨヌクレオチド配列またはＶＬヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー（実施例３２を参照のこと）を使用して、ファージによって発現されたＶＨ配列および発現されたＶＬ配列を増幅し得る。次いで、ＰＣＲ産物は、例えば、５’および３’の単一のＴヌクレオチド突出（これは、ＰＣＲ反応について使用される多数のＤＮＡポリメラーゼによって、ＰＣＲ産物の５’および３’末端に付加された突出する単一のアデニンヌクレオチドに相補的である）からなるＰＣＲ産物クローニング部位を有するベクターを使用してクローン化され得る。次いで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、当該分野で公知の従来の方法を使用して配列決定され得る。
【０４８７】
クローン化されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、１つ以上の適切な発現ベクター中に配置され得る。非制限的な例として、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ＶＨ配列またはＶＬ配列を増幅し得る。当業者に公知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅され
たＶＨドメインは、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、それぞれ、ＶＨドメインについてのヒトＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ４定常領域、ならびにκＶＬドメインおよびλＶＬドメインについてのヒトκ定常領域またはλ定常領域）を発現するベクターにクローン化され得る。好ましくは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを発現するベクターは、選択された発現系における重鎖および軽鎖の発現を指向するのに適したプロモーター、分泌シグナル、免疫グロブリン可変領域についてのクローニング部位、免疫グロブリン定常領域、およびネオマイシンのような選択マーカーを含む。ＶＨドメインおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する単一のベクターにクローン化され得る。次いで、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを、当業者に公知の技術を使用して、細胞株に同時トランスフェクトし、安定してかまたは一過的に全長抗体（例えば、ＩｇＧ）を発現する細胞株を作製する（例えば、Ｇｕｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８２：９２５〜３１（１９９７）およびＡｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−８６（１９９５）（これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０４８８】
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、またはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）、抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に結合し、好ましくは、配列番号２、配列番号４または配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０４８９】
ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、これは、簡単にいうと、以下を包含する：この抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅。
【０４９０】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、または適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはこれらから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および５’末端（実施例３２を参照のこと）にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローン化され得る。
【０４９１】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）を用いて操作されて、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するような、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
【０４９２】
特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０４９３】
いくつかの用途のために、例えば、本発明の抗体のインビトロ親和性成熟について、ファージディスプレイライブラリーにおける単鎖抗体またはＦａｂフラグメントのように本発明の１つ以上の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを発現することが有用であり得る。例えば、本発明の１つ以上の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡは、ファージディスプレイライブラリーを使用して、全てのあり得る組み合わせにおいて発現され得、改善した親和性または改善したオフレートのような好ましい結合特徴を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドと結合するＶＨ／ＶＬ組み合わせの選択を可能にする。さらに、ＶＨおよびＶＬセグメント（特に、本発明の１つ以上の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲ領域）は、インビトロで変異され得る。ファージディスプレイライブラリーにおける「変異」ＣＤＲを有するＶＨドメインおよびＶＬドメインの発現は、改善した親和性または改善したオフレートのような好ましい結合特徴を有するＶＥＧＦ−２レセプターポリペプチドと結合するＶＨ／ＶＬ組み合わせの選択を可能にする。
【０４９４】
ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトまたはマウスのリンパ系組織のｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｃｓＦｖリンカーによって共に結合され、そして、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローニングされる。このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレ−ションされ、そして、Ｅ．ｃｏｌｉは、ヘルパーファージに感染される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはファージ遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え的に融合される。目的の抗原（すなわち、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結
合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択され得るかまたは同定され得る（例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を使用して）。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８７１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ＷＯ９７／１３８４４；および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，７１７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３５，７４３号、および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。
【０４９５】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０４９６】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０４９７】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、細胞内免疫（すなわち、内部抗体技術）、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。抗体を産生する方法としては、ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ形質転換、および本明細書中に考察される他の方法ならびに以下に議論されるような組換えＤＮＡ技術の使用を含むが、これらに限定されない。
【０４９８】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、改変体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体
分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０４９９】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０５００】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、ＮＳＯ細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０５０１】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発
現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０５０２】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０５０３】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と同調していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０５０４】
さらに、宿主細胞株は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ
５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５０５】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０５０６】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０５０７】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、Ｂｅｂｂ
ｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０５０８】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれメチオニンスルホキシミン薬物またはメトトレキセート薬物の存在において増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株、ＮＳ０）の有効性である。グルタミンシンターゼ発現系はまた、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において機能して、さらなるインヒビターを提供することで内因性遺伝子の機能化を阻害し得る。グルタミンシンターゼを選択マーカーとして使用するベクターとしては、ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ  １７：７１１０（１９８９）に記載されるｐＥＥ６発現ベクターが挙げられるがこれに限定されない。グルタミンシンターゼ発現系およびそれらの成分は、ＰＣＴ公報：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；ＷＰ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７（本明細書中に参考としてその全体が援用される）に詳述される。さらに、本発明に従って使用され得るグルタミンシンターゼ発現ベクターは、供給業者（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）が挙げられる）から市販される。マウス骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を使用するモノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（本明細書中に参考としてその全体が援用される）に記載される。
【０５０９】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、そして発現可能である。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０５１０】
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより発現されると、免疫グロブリン分子の精製のための、当該分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後の特異的抗原に対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製を容易にする。
【０５１１】
（抗体結合体）
本発明のポリペプチドに組換えにより融合され、または化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）された抗体は、本発明にさらに含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、および第ＷＯ９３／２１２３２号；ＥＰ０，４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９２）、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２を参照のこと。上記参考文献は、その全体が参考として援用される。
【０５１２】
本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。この抗体の本発明のポリぺプチドに融合された部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の任意の組合せを含み得る。本発明のポリペプチドは、上記の抗体の部分に融合または結合され得、ポリペプチドのインビボでの半減期または当該分野で公知の方法を使用した免疫アッセイにおける使用の間増加する。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合または結合され得、多重体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ０，３０７，４３４；ＥＰ  ０，３６７，１６６；ＷＯ９６／０４３８８号；ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）、ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら（１９９５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００；およびＶｉｌ，Ｈ．ら（１９９２）、ＰＮＡＳ  ８９：１１３３７−１１３４１（上記の参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０５１３】
本発明は、組換えにより融合されるかまたは化学的に、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）されて、融合タンパク質を生成する抗体を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。本発明の抗体はまた、アルブミン（組換えヒト血清アルブミン（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号（１９９９年３月２日公開）、欧州特許第０  ４１３  ６２２号および米国特許第５，７６６，８８３号（１９９８年６月１６日公開）（本明細書中にその全体が参考として援
用される）を含むがこれらに限定されない）に融合され得、キメラポリペプチドを生じる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンの成熟形態（すなわち、欧州特許第０
３２２  ０９４号の図１および２において示されるようにヒト血清アルブミンのアミノ酸１〜５８５）（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）と融合される。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｘを含むか、またはそれからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｘは、１〜５８５の整数であり、そしてアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミン活性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）は、米国特許第５，７６６，８８３号（本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるように、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１〜ｚを含むか、またはそれからなるポリペプチドフラグメントと融合され、ここで、ｚは、３６９〜４１９の整数である。本発明の融合タンパク質をコードするポリペプチドもまた、本発明によって包含される。このような融合タンパク質は、例えば、精製を容易にし、そして、インビボ半減期を増加し得る。本発明のポリペプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２３２号；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ
８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
【０５１４】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合または結合された、本発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合または結合され得、多重体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ３０７，４３４；ＥＰ  ３６７，１６６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０４３８８号；ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０５１５】
上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１８の変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、配列番号２、配列番号４または配列番号１８に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の
定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ  Ａ  ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０５１６】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定されない。
【０５１７】
本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメンの効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーのような）を介して、連結または結合され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）
、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕが挙げられる。
【０５１８】
特定の実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンをポリペプチドに結合体化するために有用な大環状のキレート剤に結合される。好ましい実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合した大環状キレート剤と結合する放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合された大環状キレート剤と結合する放射性金属イオンは、９０Ｙである。特定の実施形態において、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ、Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。別の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合される。ポリペプチドへＤＯＴＡを結合体化するために有用なリンカー分子の例は、当該分野で周知であり、例えば、ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７，１９９９；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０，１９９９（これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。さらに、抗体に結合体化され得るキレート剤およびそれを作製および使用するための方法を開示する、米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、抗体にキレート剤を結合体化することに焦点をあてるが、当業者は、キレート剤を他のポリペプチドに結合体化するために、そこに開示された方法を容易に調整し得る。
【０５１９】
細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメチン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含む。
【０５２０】
本発明の抗体結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり得る。このようなタ
ンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０５２１】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０５２２】
このような治療部分を抗体に結合する技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０５２３】
あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号（その全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、二次抗体に結合され、抗体ヘテロ結合体を形成し得る。
【０５２４】
単独または細胞毒因子および／もしくはサイトカインと組合せて投与される抗体（その抗体に結合する治療部分を有するまたは有さない）は、治療剤として使用され得る。
【０５２５】
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には
、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
【０５２６】
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における微小残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖および／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能にする。
【０５２７】
（抗体結合アッセイ）
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的アッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使用する、少し例を挙げると、ＢＩＡｃｏｒｅ分析（例えば、実施例３３を参照）、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分離装置）分析、免疫蛍光検査、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これはその全体が本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に記載される（しかし限定として意図されない）。
【０５２８】
免疫沈降プロトコルは、一般に、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、４℃である時間（例えば、１〜４時間）インキュベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧのセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上、４℃でインキュベートする工程、ビーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロースビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する）ように改変され得るパラメータに関して、よく知っている。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．１６．１）を参照のこと。
【０５２９】
ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてメンブレンをブロッキングする工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（これは一次抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）でメンブレンをブロッキングする工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグランドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０５３０】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションを熟知している。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０５３１】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）またはそのフラグメントもしくは改変体と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉで標識した化合物）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。２つの抗体間のこの種の競合アッセイはまた、２つの抗体が同じエピトープに結合するのか、または異なるエピトープに結合するのかを決定するために使用され得る。
【０５３２】
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ動態学的分析が、ＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−２のフラグメントに対する、抗体（抗体フラグメントまたはその改変体を含む）の結合のオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）およびオフレートを決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ動態学的分析は、実施例３３に詳細に記載されるように、チップ表面上に固
定化されたＶＥＧＦ−２を有するチップへの抗体の結合およびこのチップからの解離を分析する工程を包含する。
【０５３３】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０５３４】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的にまたは全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０５３５】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あるいはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０５３６】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン治療、免疫治療、抗腫瘍剤、および抗レトロウイルス剤）との組み合わせで投与され得る。非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、単独で投与されてもよいし、または抗血管形成剤と組み合せて使用されてもよい。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト患者に投与される。
【０５３７】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。さらに好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍまたは１０
−８Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。なおさらに好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０５３８】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０５３９】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０５４０】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０５４１】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコードする配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラグメントを含む。
【０５４２】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子治療として公知である。
【０５４３】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核酸配列は
発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の多数の方法のいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェクトすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドとそれを結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０５４４】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、造血性幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子をこの造血性幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
【０５４５】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０５４６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０５４７】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養物中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それらの細胞は次いで、患者に送達される。
【０５４８】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現可能である。
【０５４９】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０５５０】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０５５１】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自己である。
【０５５２】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるように細胞に導入され
、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。
【０５５３】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である。
【０５５４】
（治療活性または予防活性の実証）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養中において増殖され、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０５５５】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０５５６】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０５５７】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテ
ルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０５５８】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用することに注意が払われなければならない。
【０５５９】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソームの形態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０５６０】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出系で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ
Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、僅かな全身用量しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０５６１】
他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０５６２】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすること
により、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０５６３】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０５６４】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単回投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０５６５】
本発明の化合物は、中性の形態または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０５６６】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患また
は障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る。
【０５６７】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０５６８】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０５６９】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログを、診断目的のために使用して、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０５７０】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生についての素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、またはより早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０５７１】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ
））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０５７２】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０５７３】
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０５７４】
用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０５７５】
１つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０５７６】
標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
【０５７７】
特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１
，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を用いて患者から検出される。
【０５７８】
（キット）
本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製された抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態においては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第二の抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０５７９】
本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、フローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物と結合体化され得る）。特定の実施形態においては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０５８０】
より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０５８１】
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクローナル抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクローナル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含み得る。
【０５８２】
１つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で
、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０５８３】
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０５８４】
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト抗体を備える。
【０５８５】
抗体は、さらに、特定の個体において腫瘍の存在を検出するためのイムノアッセイにおいて用いられ得る。酵素イムノアッセイは、個体の血液サンプルから実行され得る。ＶＥＧＦ−２のレベルの上昇は、癌の診断とみなされ得る。
【０５８６】
内皮細胞の成長を活性化しないダイマーを形成するように野生型のＶＥＧＦ−２と相互作用し得、従ってこれは内因性のＶＥＧＦ−２を不活性化するＶＥＧＦ−２の短縮バージョンがまた産生され得る。または、ＶＥＧＦ−２の変異形態は、それら自身でダイマーを形成し、そして標的細胞表面上の適切なチロシンキナーゼレセプターのリガンド結合ドメインを占有するが、細胞の成長は活性化しない。
【０５８７】
あるいは、本発明のポリペプチドが通常結合するレセプターに対して結合する、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストが使用され得る。このアンタゴニストは、密接に関連するタンパク質であり得、その結果、これらは天然のタンパク質のレセプター部位を認識し、そして結合するが、それらは、天然のタンパク質の不活性な形態であり、これによりレセプター部位が占有されるのでＶＥＧＦ−２の作用を妨げる。これらの方法において、ＶＥＧＦ−２の作用は、妨げられ、そしてアンタゴニスト／インヒビターは、ＶＥＧＦ−２により認識される腫瘍のレセプター部位を占有することにより、またはＶＥＧＦ−２自身を不活性化することにより抗腫瘍薬物として治療的に用いられ得る。このアンタゴニスト／インヒビターはまた、ＶＥＧＦ−２の血管透過性作用の上昇に起因する炎症を妨げるために用いられ得る。このアンタゴニスト／インヒビターはまた、固形腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性関節リウマチの処置のために用いられ得る。
【０５８８】
このアンタゴニスト／インヒビターは、例えば、本明細書において上記されたような薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて使用され得る。
【０５８９】
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はそのような実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０５９０】
以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に現れる方法および／または用語を記載する。
【０５９１】
「プラスミド」は、大文字および／または数字の前および／または後の小文字のｐにより示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販されるか、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいず
れかである。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０５９２】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２０Ｆｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜５０ｍｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より多量の容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。３７ＥＣにての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０５９３】
切断されたフラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０５９４】
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０５９５】
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０５９６】
他に明言しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載のように実施した。
【実施例】
【０５９７】
（実施例）
（実施例１）
（ヒト組織および乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２の発現パターン）
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織およびヒト組織中の乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２の発現のレベルを試験した。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌＴＭＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて単離した。各々の乳癌組織および特定化された細胞株から単離された約１０ｍｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。標識反応は、５０ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡを、５Ｐｒｉｍｅ÷３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ（Ｂｏｕｌ
ｄｅｒ，ＣＯ）のＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムを用いて精製した。次いで、フィルターを、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４および７％ＳＤＳ中１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの放射性標識した全長ＶＥＧＦ−２遺伝子で、６５℃にて一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる室温での２回の洗浄および６０℃での２回の洗浄後、次いで、フィルターを、増感スクリーンを用いて−７０℃で、一晩露光した。１．６Ｋｄのメッセージが、２つの乳癌細胞株において観察された。図５、レーン４は、極めて腫瘍形成性の細胞株を示し、これは、増殖についてエストロゲン非依存である。
【０５９８】
また、１０のヒト成体組織由来の１０ｍｇの全ＲＮＡを、アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした。次いで、そのフィルターを、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２；１％ＢＳＡ中の放射性標識したＶＥＧＦ−２プローブで、６５℃にて一晩ハイブリダイズした。０．２×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄後、このフィルターを、増感スクリーンを用いて−７０℃で、２４日間フィルムに露光した。図６を参照のこと。
【０５９９】
（実施例２）
（インビトロ転写および翻訳による短縮形態のＶＥＧＦ−２（配列番号４）の発現）
ＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡをインビトロで転写して、そして翻訳し、短縮形態のＶＥＧＦ−２および部分ＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡによりコードされる翻訳可能なポリペプチドの大きさを決定した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のＶＥＧＦ−２の２つの挿入物を、以下の３対のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した；１）Ｍ１３逆方向および順方向プライマー；２）Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ４；ならびに３）Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ５。これらのプライマーの配列は、以下のとおりである。
【０６００】
Ｍ１３−２逆方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’（配列番号９）。この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡ挿入物の５’末端の上流に位置し、そしてそのｃＤＮＡとアンチセンスの方向にある。Ｔ３プロモーター配列は、このプライマーとＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡとの間に位置する。
【０６０１】
Ｍ１３−２順方向プライマー：５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１０）。この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡ挿入物の３’末端の下流に位置し、そしてそのｃＤＮＡ挿入物とアンチセンスの方向にある。
【０６０２】
ＶＥＧＦプライマーＦ４：５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）。この配列は、ＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡ内にアンチセンス方向で、ｂｐ１２５９−１２３９に位置し、これは、このｃＤＮＡの終止コドンの３’末端から約１６９ｂｐ離れており、そしてこのｃＤＮＡの最後のヌクレオチドの約２６６ｂｐ前にある。
【０６０３】
３対全てのプライマーを用いるＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ挿入物の前にＴ３プロモーター配列を含む増幅産物を生成する。第１対および第３対のプライマーは、配列番号４に示されるＶＥＧＦ−２のポリペプチドをコードするＰＣＲ産物を生成する。第２対のプライマーは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端で３６アミノ酸コード配列を欠く、ＰＣＲ産物を生成する。
【０６０４】
第１対のプライマーからの約０．５ｍｇ、第２対のプライマーからの約１ｍｇ、第３対のプライマーからの約１ｍｇのＰＣＲ産物を、インビトロ転写／翻訳のために使用した。インビトロ転写／翻訳反応は、２５Ｆｌの容量で、ＴＮＴＪ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＡＴ＃Ｌ４９５
０）を使用して行った。詳細には、その反応は、１２．５ＦｌのＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物、２ＦｌのＴＮＴ反応緩衝液、１ＦｌのＴ３ポリメラーゼ、１Ｆｌの１ｍＭのアミノ酸混合物（メチオニン非含有）、４Ｆｌの３５Ｓ−メチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）、１Ｆｌの４０Ｕ／μｌ；ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター、０．５または１ｍｇのＰＣＲ産物を含む。ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏを添加して、容量を２５Ｆｌに合わせた。反応を、３０℃で２時間インキュベートした。５μｌの反応産物を、４〜２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。２５％イソプロパノールおよび１０％酢酸で固定した後、ゲルを乾燥し、そして７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに露光した。
【０６０５】
図７に示されるように、短縮型ＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号３に示されるような）を含むＰＣＲ産物、および３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）中の２６６ｂｐを欠くｃＤＮＡが、同じ長さの翻訳産物を生成し、それらの分子量は、３８〜４０ｄｋであると推定される（レーン１および３）。全ての３’ＵＴＲを欠き、かつＣ末端の３６アミノ酸をコードする配列を欠くｃＤＮＡは、推定分子量３６〜３８ｋｄのポリペプチドに翻訳された（レーン２）。
【０６０６】
（実施例３）
（バキュロウイルス発現系を使用するＶＥＧＦ−２のクローニングおよび発現）
Ｎ末端の４６アミノ酸を含まないＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ番号９７１４９を参照のこと）を、その遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０６０７】
５’プライマーは、配列ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＧＣ（配列番号１２）を有し、そしてＢａｍＨ１制限酵素部位（下線部）およびＶＥＧＦ−２の５’配列（ヌクレオチド１５０−１６６）に相補的な１７ヌクレオチド配列を含む。
【０６０８】
３’プライマーは、配列ＧＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＧ
ＴＧＧ  ＴＣＴ（配列番号１３）を有し、そして制限酵素ＸｂａＩに対する切断部位およびＶＥＧＦ−２の３’配列（終止コドンおよび終止コドン前の１５ヌクレオチド配列を含む）に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０６０９】
増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１およびＸｂａＩで消化し、次いで、再度１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、ｐＡｃＧＰ６７Ａバキュロウイルス転移ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にＢａｍＨ１およびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によってＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡをバキュロウイルスｇｐ６７遺伝子のシグナル配列とインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に位置した。これを、ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２と称する。
【０６１０】
ｇｐ６７遺伝子のシグナル配列を有するＶＥＧＦ−２を発現のためのｐＲＧ１ベクターにクローン化するために、シグナル配列およびいくらかの上流配列を有するＶＥＧＦ−２を、ＶＥＧＦ−２  ｃＤＮＡの上流に位置するＸｈｏ制限エンドヌクレアーゼ部位およびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素によって、ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２プラスミドから切り出した。このフラグメントを、１％アガロースゲル上でベクターの残部から分離し、そして「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キットを使用して精製した。これをＦ２と称した。
【０６１１】
ＰＲＧ１ベクター（ｐＶＬ９４１ベクターの改変）を、バキュロウイルス発現系（総説については；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、「Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと）を使用するＶＥＧＦ−２タンパク質の発現のために使用する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、Ｓｍａ１、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｐ７１８についての認識部位を含む。制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ１についての部位は、ＢａｍＨ１部位の上流に位置する。Ｘｈｏ１とＢａｍＨ１との間の配列は、ＰＡｃＧｐ６７Ａ（テープ上で静的な）ベクターにおける配列と同じである。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入され、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルがこれに続く。ポリヘドリン配列には、同時トランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側で隣接される。多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１に代わって使用され得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９））。
【０６１２】
プラスミドを、制限酵素ＸｂｏＩおよびＸｂａＩで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼを使用して、当該分野で公知の手順により脱リン酸化した。そのＤＮＡを次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを、Ｖ２と称する。
【０６１３】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そしてＶＥＧＦ−２遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃ  ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２）を含む細菌を、酵素ＢａｍＨ１およびＸｂａＩを使用して同定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０６１４】
５ｍｇのプラスミドｐＢａｃ  ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７））を使用して、１．０ｍｇの市販の線状化バキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＪ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトした。
【０６１５】
１ｍｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＪウイルスＤＮＡおよび５ｍｇのプラスミドｐＢａｃ  ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、５０ｍｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、１０ｍｌのリポフェクチンおよび９０ｍｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下した。プレートを前後に傾けて、その新しく添加した溶液を混合した。次いで、プレートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーター内に置き戻し、そして培養を、２７℃で４日間継続した。
【０６１６】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出に記載されるのと同様にプラークアッセイを行った。改変として、「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロースゲルを用いて、青色染色されたプラークの容易な単離を可能にした。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０６１７】
段階希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、青色染色されたプラークをＥｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００ｍｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに再懸濁した。寒天を手短な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞を感染させた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で保存した。
【０６１８】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させた。細胞に、１の感染多重度（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００  ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で置換した。４２時間後、５ｍＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５ｍＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、そして標識タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０６１９】
培地およびＳｆ９細胞の細胞質由来のタンパク質を、非還元条件下および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。それぞれ、図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと。培地を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．８に対して透析した。透析後、沈殿物を得て、そして１００ｍＭ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ５．０中に再懸濁した。再懸濁した沈殿を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより再度分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。図９を参照のこと。
【０６２０】
培地上清をまた、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．８中に１：１０で希釈し、そしてＳＰ−６５０Ｍカラム（１．０×６．６ｃｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）に流速１ｍｌ／分で適用した。タンパク質を、２００、３００および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの段階勾配で溶出した。ＶＥＧＦ−２は、５００ｍＭでの溶出を用いて得られた。溶出物を、還元剤ｂ−メルカプトエタノールの存在下または非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。図１０を参照のこと。
【０６２１】
（実施例４）
（ＣＯＳ細胞における組換えＶＥＧＦ−２の発現）
プラスミドＶＥＧＦ−２−ＨＡの発現は、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来し、このベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を含む：（１）ＳＶ４０複製起点、（２）アンピシリン耐性遺伝子、（３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、（４）ＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。ＶＥＧＦ−２前駆体全体およびその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、このベクターのポリリンカー領域内にクローン化した。従って、組換えタンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーター下で指向される。ＨＡタグは、（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））に以前に記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質
へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーは、以下に記載の通りである。
【０６２２】
ＶＥＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ番号９７１４９）を、以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲにより構築した：５’プライマー（ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＣＣＡ）（配列番号１４）は、ＢａｍＨ１部位を含み、続いて、開始コドンから始まるＶＥＧＦ−２のコード配列の１８ヌクレオチドを含む；
３’配列（ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ３’）（配列番号１５）は、ＸｂａＩ部位、ＨＡタグ、ＸｈｏＩ部位、およびＶＥＧＦ−２コード配列の最後の１５のヌクレオチド（終止コドンは含んでいない）に対する相補配列を含む。
【０６２３】
従って、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ部位、コード配列、これに続くＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびインフレームで融合されたＨＡタグ、ＨＡタグに続く翻訳終止コドン、ならびにＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ  ９２０３７）内に形質転換し、形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析によって試験した。組換えＶＥＧＦ−２発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））により発現ベクターでトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−２−ＨＡタンパク質の発現を、放射標識化および免疫沈降法（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））によって検出した。細胞を、トランスフェクションの２日後に３５Ｓ−システインで８時間標識した。次いで、培養培地を収集し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  ＤＯＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））で溶解した。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈降した。沈降されたタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０６２４】
（実施例５）
（血管内皮細胞の増殖に対する部分精製したＶＥＧＦ−２タンパク質の効果）
１日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６ユニット／ｍｌのヘパリン、および５０ユニット／ｍｌの内皮細胞増殖補完物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地中、２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２日目に、培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌのヘパリンを含む、Ｍ１９９で置換した。最初の４５アミノ酸残基を欠く配列番号２のＶＥＧＦ−２タンパク質、（ＶＥＧＦ）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を、示した濃度で添加した。４日目および６日目に、培地を置換した。８日目に、細胞数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒで決定した（図１２を参照のこと）。
【０６２５】
さらに、当業者は、上記のプロトコルを容易に改変し、ＶＥＧＦ−２で誘発されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例
えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の効果を試験し得る。
【０６２６】
（実施例６  血管内皮細胞の増殖への精製ＶＥＧＦ−２タンパク質の影響）
１日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６単位／ｍｌのヘパリン、５０単位／ｍｌの内皮細胞増殖補充物（ＥＣＧＳ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地に２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２日目に、培地を、１０％ＦＢＳ、８単位／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９と置き換えた。最初の４５アミノ酸残基を除いた配列番号２の精製ＶＥＧＦ−２タンパク質をこの時点で培地に添加した。４日目および６日目に、培地を新鮮な培地および補充物と置き換えた。８日目に、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒで細胞数を決定した（図１３を参照のこと）。
【０６２７】
さらに、当業者は、上記のプロトコルを容易に改変し、ＶＥＧＦ−２で誘発されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の効果を試験し得る。
【０６２８】
（実施例７  遺伝子治療を介する発現）
線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られた組織を組織培養培地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコ中におよそ１０片を置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉し、そして室温に一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％  ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７℃でおよそ１週間インキュベートする。この時点で新鮮な培地を添加し、その後数日ごとに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップ（ｓｃａｌｅ）する。
【０６２９】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ  ７：２１９−２２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
【０６３０】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位をさらに含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、これを、適切に挿入された目的の遺伝子をベクターが有することを確認する目的のために、カナマイシン含有寒天上にプレーティングする。
【０６３１】
アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中の組織培養物中で、コンフルエントな密度になるまで増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０６３２】
新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、コンフルエントな
プロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そして直ちにプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
【０６３３】
次いで、操作された線維芽細胞は、単独で、またはｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注入する。この時点で、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０６３４】
（実施例８  ヒト胎児組織および成体組織におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現）
（実験設計）
ノーザンブロット分析を、ヒト胎児組織および成体組織におけるＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現のレベルを試験するために実行した。ＶＥＧＦ−２タンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブを、製造者の指示書に従って、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅｏＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３２Ｐで標識した。標識後、このプローブを、製造者のプロトコール番号ＰＴ１２００−１に従って、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１００＊カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。次いで、精製した標識化プローブを、ＶＥＧＦ−２
ｍＲＮＡについて種々のヒト組織を試験するために使用した。
【０６３５】
種々のヒト組織（胎児腎臓、胎児肺、胎児肝臓、脳、腎臓、肺、肝臓、脾臓、胸線、骨髄、睾丸、胎盤、および骨格筋）を含む、複数の組織のノーザン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手した。ＭＴＮブロットを、製造者のプロトコール番号ＰＴ１１９０−１に従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ＊ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、標識化プローブを用いて試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、このブロットを、増感スクリーンとともに−７０℃で一晩フィルムに曝露し、そして標準的な手順に従って現像した。
【０６３６】
（結果）
ＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現は、血管平滑筋およびいくつかの高度に血管化された組織において豊富である。ＶＥＧＦ−２は、造血活性または血管形成活性と関連する組織、すなわち胎児腎臓、胎児肺、骨髄、胎盤、脾臓および肺組織において有意により高いレベルで発現される。ＶＥＧＦ−２の発現レベルは、成体腎臓、胎児肝臓、成体肝臓、睾丸において低く；そして胎児脳および成体脳においてはほとんど検出不可能である（図１４Ａ〜Ｂを参照のこと）。
【０６３７】
初代培養細胞において、ＶＥＧＦ−２  ｍＲＮＡの発現は、血管平滑筋細胞および皮膚の線維芽細胞において豊富であるが、ヒト臍静脈内皮細胞においてはるかにより低い（図１５を参照のこと）。このｍＲＮＡ分布パターンは、ＶＥＧＦのそれと非常に類似する。
【０６３８】
（実施例９  アミノ末端欠失変異体およびカルボキシ末端欠失変異体の構築）
生物学的に活性なＶＦＧＦ−２ポリペプチドを同定および分析するために、ＶＥＧＦ−２の欠失変異体のパネルを、発現ベクターｐＨＥ４ａを使用して構築した。
【０６３９】
（１．ｐＨＥ４中のＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５
（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した：
５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴおよびコード配列の１８ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号１９）
３’−プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、およびコード配列の１５ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＧＣＡ−３’（配列番号２０）
上記の５’プライマー（配列番号１９）は、ＮｄｅＩ制限部位を組込み、そして上記の３’プライマー（配列番号２０）は、Ａｓｐ７１８制限部位を組込む。この５’プライマー（配列番号１９）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームであるＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方３’プライマー（配列番号２０）は、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームである１つの終止コドン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉで利用されるコドン）を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳の終結を確かにする。
【０６４０】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および、鋳型として、例えば実施例３において構築されるような、成熟ＶＥＧＦ−２についてのヌクレオチド配列（配列番号１８のアミノ酸２４〜４１９）を使用して行った。生じたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＨＥ４ａ発現ベクターにサブクローニングした。
【０６４１】
（２．ｐＨＥ４中のＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｒ２２７（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した：
５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴおよびコード配列の１８ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号１９）
３’−プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、およびコード配列の１５ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ−３’（配列番号２１）
上記のプライマーの場合、ＮｄｅＩまたはＡｓｐ７１８制限部位は、５’プライマーおよび３’プライマーにそれぞれ組込まれていた。この５’プライマー（配列番号１９）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームであるＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方３’プライマー（配列番号２１）は、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームである１つの終止コドン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉで利用されるコドン）を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳の終止を確かにする。
【０６４２】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および、鋳型として、例えば実施例３において構築されるような、成熟ＶＥＧＦ−２についてのヌクレオチド配列（配列番号１８のアミノ酸２４〜４１９）を使用して行った。生じたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＨＥ４ａ
タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。
【０６４３】
（３．ｐＡ２ＧＰ中のＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２  ＧＰを、バキュロウイルスリーダーおよびＳｕｍｍｅｒｓら、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号１５５５（１９８７）に記載されるような標準的な方法を用いて、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失させたＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）をコードするクローン化されたＤＮＡをバキュロウイルス中に挿入するために使用して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失させたＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびにＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同じ方向の弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下にある、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介の相同組換えのために両側がウイルス配列で隣接され、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
【０６４４】
多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）を、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナル（必要とされるようなシグナルペプチドおよびインフレームのＡＵＧを含む）を提供する限りは、上記のベクターの代わりに使用し得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１〜３９（１９８９）に記載される。
【０６４５】
図１における、Ｎ−末端の１０２アミノ酸を有さず、かつＣ−末端の２０４アミノ酸を有さないＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０６４６】
５’プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、続いてベクターによって供給されるシグナルペプチドとともにインフレームにとどまるための１スペーサーヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−２タンパク質のコード配列塩基の１７ヌクレオチドを含む配列
【０６４７】
【化１１】
0005132008.tif 000016
を有する。３’プライマーは、ＸｂａＩ制限部位（太字）、続いて終止コドンおよびＶＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な１７ヌクレオチドを含む配列
【０６４８】
【化１２】
0005132008.tif 000017
を有する。
【０６４９】
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位において、ｐＡ２  ＧＰバキュロウイルス移入ベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）と連結した。この連結を通して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）を表すＶＦＧＦ−２  ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子のシグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に配置した。これを、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０３−Ｌ２１５と命名した。
【０６５０】
（４．ｐＡ２ＧＰ中のＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
図１における、Ｎ−末端の１０２アミノ酸を有さず、かつＣ−末端の１９２アミノ酸を有さないＶＥＧＦ−２タンパク質（すなわち、配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０６５１】
【化１３】
0005132008.tif 000018
プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）を含み、続いてベクターによって供給されるシグナルペプチドとともにインフレームにとどまるための１スペーサーヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−２タンパク質のコード配列塩基の２６ヌクレオチドを含む配列（配列番号２４）を有する。３’プライマーは、ＸｂａＩ制限部位（太字）続いて終止コドンおよびＶＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な２１ヌクレオチドを含む配列
【０６５２】
【化１４】
0005132008.tif 000019
を有する。
【０６５３】
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位において、ｐＡ２  ＧＰバキュロウイルス移入ベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）と連結した。この連結を通して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）を表すＶＦＧＦ−２  ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子のシグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に配置した。この構築物を、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０３−Ｒ２２７と命名した。
【０６５４】
（５．ｐＣ１におけるＶＥＧＦ−２の構築）
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８〜４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０（１９８５））のフラグメントを含む。マルチプルクローニングサイト（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターはさらに、ラ
ットプレプロインシュリン遺伝子の３Ｎイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。
【０６５５】
ベクターｐＣ１を、ＶＦＧＦ−２タンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ［ＡＴＣＣ受託番号３７１４６］の誘導体である。両方のプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドを用いてトランスフェクトされた、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（アルファマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖させることによって選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に引証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７〜１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７〜１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６４〜６８を参照のこと）。ＭＴＸの濃度が増加した際に増殖する細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰増殖させることによって、薬物に対する耐性を発達させる。ＤＨＦＲ遺伝子に第２の遺伝子が連結されている場合、それは通常同時増幅され、そして過剰発現される。１，０００コピーより多い遺伝子を有する細胞株を発達させることは、技術水準である。引き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合には、細胞株は染色体に組込まれた増幅した遺伝子を含む。
【０６５６】
プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５年３月：４３８〜４４７０）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ
４１：５２１〜５３０（１９８５））から単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｒｕＩ。これらのクローニング部位の後では、プラスミドは、３つすべてのリーディングフレームにおける翻訳終止コドン、続いて３Ｎイントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含む。他の高度に効率的なプロモーター（例えば、ヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）もまた、発現のために使用され得る。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子またはグロビン遺伝子由来の他のシグナルが、同様に使用され得る。
【０６５７】
染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株はまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初に１つより多くの選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。
【０６５８】
プラスミドｐＣ１を、当該分野において公知の手順によって、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、そのベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０６５９】
ＶＥＧＦ−２（ＡＴＣＣ受託番号９７１４９）をコードするＤＮＡ配列を、ＶＥＧＦ−２遺伝子の５’末端および３’末端に対応する２つのプライマーを使用するＰＣＲによって構築した：５’プライマー（５’−ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＣＡＣ
ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＴＧＴ  ＴＣＴ
ＣＴＧ  ＣＴＣ  Ｇ−３’（配列番号２６））は、Ｋｌｅｎｏｗで平滑化されたＢａｍＨＩ部位および開始コドンから開始するＶＥＧＦ−２コード配列の４０ヌクレオチドを含む；３’プライマー（５’−ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＡＴＴ
ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＴＴ−３’（配列番号２７））は、ＢａｍＨＩ部位および終止コドンを含まないＶＥＧＦ−２コード配列の１６ヌクレオチドを含む。
【０６６０】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、上記のように１％アガロースゲルから単離し、次いでエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ１を含む細菌を同定する。挿入された遺伝子の配列および方向を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。この構築物を、ｐＣ１ＶＥＧＦ−２と呼ぶ。
【０６６１】
（６．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
プラスミドｐＣ４Ｓｉｇは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分の配列およびタンパク質シグナル配列を含むプラスミドｐＣ４（受託番号２０９６４６）である。
【０６６２】
ＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１０３〜２１５）のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびｐＣ４Ｓｉｇへのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ｎｔのコード配列）:
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＣ−３’（配列番号３４）:
３’プライマー（ＸｂａＩ、停止、および１５ｎｔのコード配列）：
５’−ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＴＣＧ  ＧＣＡ  Ｇ−３’（配列番号３５）。
【０６６３】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および例えば、実施例３で構築された成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＣ４Ｓｉｇベクターへサブクローニングした。
【０６６４】
（７．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
ＶＥＧＦ−２  Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１０３〜２２７）のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびｐＣ４Ｓｉｇへのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ｎｔのコード配列）:
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＣ−３’（配列番号３４）:
３’プライマー（ＸｂａＩ、停止、および２１ｎｔのコード配列）：
５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号２５）。
【０６６５】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を、鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢ
ａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＣ４Ｓｉｇベクターへサブクローニングした。
【０６６６】
（８．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｍ２６３の構築）
発現ベクターｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。マルチクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターは、さらにラットプレプロインシュリン遺伝子の３Ｎイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。
【０６６７】
この例示的な実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｍ２６３タンパク質（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１〜２６３）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０６６８】
ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｍ２６３のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：５’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号２８）；
３’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号２９）。
【０６６９】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるこのクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、このＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、１つの終止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０６７０】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。この構築物をｐＣ４ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｍ２６３と命名する。
【０６７１】
（９．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｄ３１１の構築）
この例示的実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｄ３１１タンパク質（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１〜３１１）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０６７２】
ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｄ３１１のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：５’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号３０）；
３’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  Ｇ−３’（配列番号３１）。
【０６７３】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてその領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてその領域とインフレームにある、１つの終止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０６７４】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。
【０６７５】
（１０．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｑ３６７の構築）
この例示的実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｑ３６７タンパク質（配列番号１８におけるアミノ酸１〜３６７）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０６７６】
ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｄ３６７のポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：５’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号３２）；
３’プライマー  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  Ｃ−３’（配列番号３３）。
【０６７７】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるこのクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、およびＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、１つの停止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０６７８】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。この構築物をｐＣ４ＶＥＧＦ−２  Ｍ１−Ｑ３６７と命名する。
【０６７９】
（実施例１０  ＣＯＳ−７細胞におけるＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現）
（実験設計）
例えば、実施例４において作製された構築物からのＶＥＧＦ−２−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗおよび共同研究者ら（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載される方法を用いて、放射性標識化および免疫沈降によって検出した。この目的を達するために、トランスフェクションの２日後に、細胞を３５Ｓシステインを含む培地中で８時間インキュベーションすることにより標識した。Ｗｉｌｓｏｎおよび共同研究者ら（前出）によって記載されるように、細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、次いで界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％
ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  ＤＯＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。
【０６８０】
（結果）
図１６Ａ〜Ｂに示すように、ｐｃＤＮＡ１  ＶＥＧＦ−２ＨＡでトランスフェクトした細胞は、５６ｋｄおよび３０ｋｄタンパク質を分泌した。この５６ｋｄタンパク質（３０ｋｄタンパク質ではなく）はまた、細胞溶解物において検出され得るが、コントロールでは検出されない。このことは、３０ｋｄタンパク質が５６ｋｄタンパク質の切断から生じるようであることを示唆する。ＨＡタグは、ＶＥＧＦ−２のＣ末端にあるので、この３０ｋｄタンパク質は切断されたタンパク質のＣ末端部分に相当しなければならないが、切断されたタンパク質のＮ末端部分は、免疫沈降によって検出されない。これらのデータは、哺乳動物細胞において発現されるＶＥＧＦ−２タンパク質は、分泌されそしてプロセシングされることを示す。
【０６８１】
（実施例１１  血管内皮細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２の刺激効果）
（実験設計）
ＶＥＧＦ−２の発現は、高度に血管化された組織において豊富である。従って、内皮細胞のいくつかの型の増殖の調節におけるＶＥＧＦ−２の役割を試験した。
【０６８２】
（内皮細胞増殖アッセイ）
増殖因子の有糸分裂活性の評価のために、電子カップリング試薬ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）と共に比色定量ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを行った（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を、９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）にて０．１ｍＬの血清を補充した培地に播種し、そして一晩付着させた。０．５％ＦＢＳ中で１２時間の血清飢餓後、ヘパリン（８Ｕ／ｍｌ）を有するかまたは有さずに、条件（０．５％ＦＢＳ中、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ−２）をウェルに４８時間添加した。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（１：０．０５）を、１ウェルあたり加え、３７℃で１時間インキュベートさせて、その後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。コントロールウェル（いくつかの培地、無細胞）からのバックグラウンド吸光度を差し引いて、そして７つのウェルについて各条件を並行して行った。Ｌｅａｋら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２−５１８（１９９４）を参照のこと。
【０６８３】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および皮膚微小血管内皮細胞の増殖をわずかに刺激した（図１７および１８）。ＶＥＧＦ−２の刺激効果は、子宮内膜内皮細胞および微小血管内皮細胞の増殖においてより明白である（図１９）。子宮内膜内皮細胞（ＨＥＥＣ）は、ＶＥＧＦ−２に対する最高の応答（微小血管内皮細胞に対するＶＥＧＦの効果の９６％）を示した。ＶＥＧＦ−２に対する微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の応
答は、ＶＥＧＦと比べると７３％であった。ＶＥＧＦ−２に対するＨＵＶＥＣおよびＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）の応答は、それぞれかなり低く１０％および７％であった。ＶＥＧＦ−２タンパク質の活性は、異なる精製の実行の間で変化し、ＨＵＶＥＣ増殖に対する特定のバッチの刺激効果は、他のバッチの刺激効果よりも顕著により高かった。
【０６８４】
さらに当業者は、上記プロトコールを容易に改変し、ＶＥＧＦ−２で誘導した内皮細胞の増殖に対する、ＶＥＧＦ−２アゴニストおよび／またはＶＥＧＦ−２アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の効果を試験し得る。
【０６８５】
（実施例１２  ＰＤＧＦ誘導した血管平滑筋細胞増殖の阻害）
ＶＥＧＦ−２発現は、血管平滑筋細胞において高い。平滑筋は、再狭窄のような血管疾患についての重要な治療標的である。平滑筋細胞に対するＶＥＧＦ−２の潜在的効果を評価するために、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡｏＳＭＣ）増殖に対するＶＥＧＦ−２の効果を試験した。
【０６８６】
（実験設計）
ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えばＢｒｄＵｒｄの取り込みによって測定し得る。簡単に言えば、４−チャンバスライド上で増殖させたサブコンフルエントな休止細胞を、ＣＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、細胞を１０％仔ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌ  ＢｒｄＵｒｄでパルスする。２４時間後、免疫細胞化学を、ＢｒｄＵｒｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによって行う。簡単には、細胞を、変性溶液への曝露後、ビオチン化マウス抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンと共にインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、細胞を、顕微鏡試験のためにマウントし、そしてＢｒｄＵｒｄ陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ指数を、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ陽性細胞の割合として計算する。さらに、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を、明視野照明および暗視野ＵＶ蛍光照明の同時使用によって個々の細胞について行う。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６；２７１（３６）：２１９８５−２１９９２（１９９６）を参照のこと。
【０６８７】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ＰＤＧＦによって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有するが、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）によって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有さない（図２０）。
【０６８８】
さらに当業者は、上記プロトコールを容易に改変し、血管平滑筋細胞の増殖によるＶＥＧＦ−２阻害に対する、ＶＥＧＦ−２アゴニストおよび／またはＶＥＧＦ−２アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の効果を試験し得る。
【０６８９】
（実施例１３  内皮細胞移動の刺激）
内皮細胞移動は、新脈管形成に関与する重要な工程である。
【０６９０】
（実験設計）
本実施例を用いて、ＶＥＧＦ−２がリンパ内皮細胞移動（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を刺激し得るという可能性を探求する。現在のところ、このようなモデルの刊行された報告は存在しない。しかし、本発明者らは、血管内皮細胞移動のモデルを、本質的に以下のように、リンパ内皮細胞での使用に適応させる：
内皮細胞移動アッセイを４８ウェル微量走化性（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）チ
ャンバを用いて行う（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ，Ｗ．，Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｈ．Ｊ．，およびＬｅｏｎａｒｄ，Ｅ．Ｊ．「Ａ
４８  ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８０；３３：２３９−２４７）。８μｍの孔径を有するポリビニルピロリドン非含有ポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、０．１％ゼラチンで、少なくとも６時間室温でコートし、そして滅菌空気下で乾燥する。試験物質を、０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭ１９９中で適切な濃度まで希釈し、そして２５μｌの最終希釈液を、改変したボイデン装置の下部チャンバに置く。サブコンフルエントな初期の継代（２〜６）のＨＵＶＥＣおよびＢＭＥＣ培養物を、洗浄し、そして細胞脱離を達成するのに必要とされる最小の時間でトリプシン処理する。下部チャンバと上部チャンバの間にフィルターを置いた後、１％ＦＢＳを含む５０μｌのＭ１９９に懸濁した２．５×１０５の細胞を、この上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、細胞移動を可能にするために５％ＣＯ２を含む加湿したチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートする。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そして非移動細胞を有するフィルターの上側を、ラバーポリスマンでスクラップする。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍｓａ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色する。移動を、各ウェル中の３つの無作為の高倍率視野（４０×）の細胞を計数することによって定量し、そして全てのグループを４連で行う。
【０６９１】
（結果）
４３ウェル微量走化性チャンバを用いてＨＵＶＥＣ移動を試験するアッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２は、ＨＵＶＥＣの移動を刺激し得た（図２１Ａ〜Ｂ）。
【０６９２】
さらに、当業者は、容易に上記のプロトコルを変更して、ＶＥＧＦ−２により誘導される内皮細胞の移動に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の影響を試験し得る。
【０６９３】
（実施例１４  内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激）
血管内皮により放出される一酸化窒素は、血管内皮弛緩のメディエータ−であると考えられている。ＶＥＧＦ−１は、ＶＥＧＦ−１に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を誘導することが実証されている。結果として、ＶＥＧＦ−２活性を、ＶＥＧＦ−２に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を決定することによってアッセイし得る。
【０６９４】
（実験の設計）
一酸化窒素を、２４時間の飢餓および引き続く４時間の様々なレベルのＶＥＧＦ−１およびＶＥＧＦ−２への曝露の後のコンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレートにおいて測定する。培地における一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用によって決定し、硝酸レダクターゼによる一酸化窒素由来硝酸の還元後の総亜硝酸塩量を測定する。一酸化窒素放出に対するＶＥＧＦ−２の効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験した。
【０６９５】
簡単に言えば、培養されたＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出を、ＮＯメーターに接続したＮＯ特異的ポーラログラフィー電極（Ｉｓｏ−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）（１０４９）で測定した。ＮＯ成分の較正を、以下の式に従って行った：２ＫＮＯ２＋２ＫＩ＋２Ｈ２ＳＯ４６２ＮＯ＋Ｉ２＋２Ｈ２Ｏ＋２Ｋ２ＳＯ４。
【０６９６】
標準検量線を、段階的濃度のＫＮＯ２（０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、
および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）をＫＩおよびＨ２ＳＯ４を含む検量液に添加することによって得た。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性は、真の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＮＯガス（１０５０）からのＮＯの測定によってあらかじめ決定した。培養培地を除去し、そしてＨＵＶＥＣをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。次いで、細胞を、６ウェルプレート中の５ｍｌの濾過したクレブス−ヘンゼライト溶液に添加し、そして細胞プレートを、温度を３７℃で維持するためにスライドウォーマー（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）上で保持した。ＮＯセンサープローブを、異なる条件を加える前にウェル中へ垂直に挿入した（溶液の表面の２ｍｍ下で電極のチップを保持する）。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を陽性コントロールとして用いた。放出したＮＯの量を、１×１０６個の内皮細胞あたりのピコモル濃度として表わした。報告された全ての値は、各グループにおける４〜６回の測定（細胞培養ウェルの数）の平均であった。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。
【０６９７】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ＶＥＧＦより高いレベルにまで、ＨＵＶＥＣ（図２２）での一酸化窒素放出を刺激することが可能であった。このことは、ＶＥＧＦ−２が血管透過性および脈管拡張を改変し得ることを示唆した。
【０６９８】
さらに、当業者は、容易に上記のプロトコルを変更して、内皮細胞からのＶＥＧＦ−２により誘導される一酸化窒素の放出におけるＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の影響を試験し得る。
【０６９９】
（実施例１５：新脈管形成における索形成に対するＶＥＧＦ−２の効果）
新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化に顕著な索形成である。このバイオアッセイは、微小血管内皮細胞がインビトロで培養した場合に毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【０７００】
（実験計画）
ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から増殖（継代２）細胞として購入し、そしてＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’  ＣＡＤＭＥＣ増殖培地中で培養し、そして継代５で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プレートのウェルをＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’  付着因子培地（２００ｍｌ／ウェル）を３０分間、３７℃でコーティングする。ＣＡＤＭＥＣをコーティングしたウェルに７，５００細胞／ウェルで播種し、増殖培地中で一晩培養する。次いで、増殖培地を、コントロール緩衝液または本発明のタンパク質（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する３００ｍｇのＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’  索形成培地で置き換え、そして細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さをＢｏｅｃｋｅｌｅｒ  ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析機の使用によって定量する。全てのアッセイを３連で行う。
【０７０１】
市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性コントロールとして使用する。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を陰性コントロールとして使用する。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして使用する。
【０７０２】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、内皮細胞増殖もまた刺激するＩＦＮａに類似の索形成を阻害することが観察された（図２３）。この阻害効果は、索形成プロセスと相互に両立しない内皮細胞増殖の二次的効果であり得る。
【０７０３】
さらに、当業者は、容易に上記のプロトコルを変更して、索形成のＶＥＧＦ−２阻害に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の影響を試験し得る。
【０７０４】
（実施例１６：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果）
ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分確立された系である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に視覚で確認でき、かつ定量化し得る。ＶＥＧＦ−２がＣＡＭにおいて新脈管形成を刺激し得る能力を試験した。
【０７０５】
（実験計画）
（胚）
白色レグホーンニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）の受精卵および日本ウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ）の受精卵を、３７．８℃および湿度８０％でインキュベートした。１６日齢ニワトリの分化したＣＡＭおよび１３日齢のウズラ胚を、以下の方法を用いて研究した。
【０７０６】
（ＣＡＭアッセイ）
発生４日目に、鶏卵の卵殻に窓を作製した。胚を正常な発生についてチェックし、そして卵をセロテープ（登録商標）で塞いだ。それらを、１３日目までさらにインキュベートした。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を約５ｍｍ直径のディスクに切った。滅菌かつ無塩の増殖因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスク上にピペットで移した。風乾後、逆にしたディスクをＣＡＭにアプライした。３日後、標本を３％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアミドで固定し、そして０．１２Ｍ  カコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスした。それらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ
Ｍ８］で撮影し、そして上記のように準超薄切片化および超薄切片化するために包埋した。コントロールをキャリアディスク単独で行った。
【０７０７】
（結果）
このデータは、ＶＥＧＦ−２が未処理コントロールと比較して、ＣＡＭアッセイにおいて９倍新脈管形成を刺激し得ることを実証する。しかし、この刺激は、ＶＥＧＦ刺激のレベルのわずか４５％である（図２４）。
【０７０８】
さらに、当業者は、容易に上記のプロトコルを変更して、ＣＡＭアッセイにおける新脈管形成のＶＥＧＦ−２刺激に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の影響を試験し得る。
【０７０９】
（実施例１７：マウスにおけるマトリゲルインプラントを使用する新脈管形成アッセイ）
（実験計画）
タンパク質活性を試験するため、新脈管形成のためのインビボモデルを確立するために、マウスおよびラットに、２０ｍｇのＢＳＡ（陰性コントロール）および１ｍｇのｂＦＧＦおよび０．５ｍｇのＶＥＧＦ−１（陽性コントロール）のいずれかを含むメチルセルロースディスクを皮下移植した。
【０７１０】
陽性コントロールディスクが脈管形成の兆候を示したのに対して、ＢＳＡディスクは血管新生をほとんど含まないようであった。９日目に、１匹のマウスは、ｂＦＧＦに対する明らかな応答を示した。
【０７１１】
（結果）
両方のＶＥＧＦタンパク質は、肉眼評価によって約２という因子によってマトリゲル細胞性を増強するようであった。
【０７１２】
さらなる３０匹のマウスにＢＳＡ、ｂＦＧＦ、および可変量のＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２−Ｂ８、およびＶＥＧＦ−２−Ｃ４を含むディスクを移植した。各マウスは、１つのコントロールおよび１つの実験ディスクではなく、２つの同じディスクを受けた。
【０７１３】
回収した全てのディスクのサンプルを、ディスクにおける内皮細胞の存在を検出するためのフォン・ビルブラント因子、ならびに血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞とを区別するためのｆｌｋ−１およびｆｌｔ−４で免疫染色した。しかし、新血管形成およびリンパ管形成の最終的な組織化学分析によって決定できなかった。
【０７１４】
さらに、当業者は、容易に上記のプロトコルを変更して、ＶＥＧＦ−２により調節された新脈管形成に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の影響を試験し得る。
【０７１５】
（実施例１８：ウサギ下肢モデルにおける虚血のレスキュー）
（実験計画）
ＶＥＧＦ−２の虚血に対するインビボ効果を研究するために、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載された（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈の外科的切除によって作製した。大腿動脈の切除は、外腸骨動脈の血栓および閉塞の逆行性増殖を生じる。結論として、虚血四肢に対する血流は、内腸骨動脈に由来する側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔によって、ウサギの術後回復および内因性側副血管の発生を可能にした。手術（０日目）して後１０日に、基底血管造影を行った後、虚血四肢の内腸骨動脈を、記載（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））のように、ヒドロゲルコーティングしたバルーンカテーテルを使用して、動脈遺伝子移入技術により５００ｍｇの裸のＶＥＧＦ−２発現プラスミドでトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−２を処置において使用した場合、５００ｍｇのＶＥＧＦ−２タンパク質またはコントロールの単回ボーラスを、１分間にわたって、注入カテーテルを用いて虚血四肢の内腸骨動脈に送達した。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギにおいて測定した。
【０７１６】
（結果）
ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５Ａ）および裸の発現プラスミド（図２５Ｂ）の両方は、虚血四肢において以下のパラメーターを回復し得た。血流の回復（血管造影スコア）は、５００ｍｇのタンパク質によるものと比較した場合、５００ｍｇのプラスミドの投与によってわずかに大きかったようである（図２５Ｃ）。回復の程度は、別個の試験のＶＥＧＦによる程度に匹敵する（データは示さず）。血管拡張薬は、同じ効果を達成できなかった。このことは、血流の回復が、単に血管拡張効果に起因するのではないことを示唆する。
【０７１７】
１．ＢＰ比（図２５Ａ〜Ｃ）
虚血四肢の収縮圧：正常四肢の収縮圧の血圧比。
【０７１８】
２．血流および血流予備能（図２５Ｄ〜Ｉ）
静止ＦＬ：非拡張状態の間の血流
最大ＦＬ：十分に拡張した状態の間の血流（また、血管量の間接測定）
血流予備能は、最大ＦＬ：静止ＦＬの比を反映する。
【０７１９】
３．血管造影スコア（図２５Ｊ〜Ｌ）
これは、側副血管の血管造影によって測定される。スコアは、交差する不透過性動脈をウサギ大腿の総数ｍで除算した、重複グリッドの円の割合によって決定される。
【０７２０】
４．毛細管密度（図２５Ｍ〜Ｏ）
側副毛細管の数は、後肢から採取した切片を光学顕微鏡で検鏡して決定した。
【０７２１】
議論されるように、ＶＥＧＦ−２は、同時精製されるＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントにプロセシングされる。Ｎ末端フラグメントは、インタクトな推定機能的ドメインを含み、そして生物学的活性を担っている可能性がある。
【０７２２】
（実施例１９：血管拡張に対するＶＥＧＦ−２の効果）
上記のように、ＶＥＧＦ−２は、血管内皮細胞拡張のメディエータであるＮＯ放出を刺激し得る。血管内皮細胞の拡張は、血圧を低下する際に重要であるため、ＶＥＧＦ−２が自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）における血圧に影響を及ぼす能力を試験した。ＶＥＧＦ−２は、拡張期血圧の用量依存性低下を引き起こした（図２６ａおよびｂ）。３００ｍｇ／ｋｇの用量を投与した場合、ＶＥＧＦ−２の用量の増加に伴い、拡張期血圧が確実に低下し、これは統計学的有意に達した。この用量において観察した変化は、アセチルコリンでみられた変化と異ならなかった（０．５ｍｇ／ｋｇ）。平均動脈圧（ＭＡＰ）の減少もまた観察した（図２６ｃおよびｄ）。ＶＥＧＦ−２（３００ｍｇ／ｋｇ）およびアセチルコリンは、正常レベルに対してこれらのＳＨＲ動物のＭＡＰを低下させた。
【０７２３】
さらに、漸増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）のＢ８、Ｃ５、およびＣ４プレップのＶＥＧＦ−２を、１３〜１４週齡の自然発症高血圧マウス（ＳＨＲ）に投与した。データを平均＋／−ＳＥＭとして表す。統計学的分析を対応のあるＴ検定（ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）で行い、そして統計学的有意性を、ｐ＜０．０５（緩衝液単独に対する応答に対して）と定義した。
【０７２４】
ＶＥＧＦ−２（Ｃ５プレップ）を用いた研究は、ＶＥＧＦ−２（Ｃ５プレップ）が血圧を有意に低下させたが、その応答の大きさが、９００ｍｇ／ｋｇの用量で用いられた場合ですら、ＶＥＧＦ−２（Ｂ８プレップ）で認められたほど大きくはないことを示した。
【０７２５】
ＶＥＧＦ−２（Ｃ４調製物）を用いた研究は、このＣＨＯ発現タンパク質調製物は、Ｃ５で認められた結果と同様の結果が得られたことを明らかにした（すなわち、統計学的有意ではあるが、Ｂ８調製物で認められた大きさよりはるかに小さい）（図２６Ａ〜Ｄを参照のこと）。
【０７２６】
コントロールとして、ならびにＶＥＧＦ−２のＣ４およびＣ５バッチは、わずかではあるが、統計的には有意な血圧の変化を得たために、実験を別のＣＨＯ発現タンパク質（Ｍ−ＣＩＦ）を用いる実験で行った。１０〜９００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でのＭ−ＣＩＦの投与は、拡張期血圧の有意な変化を生じなかった。平均動脈圧のわずかな統計学的有意な低下が１００および９００ｍｇ／ｋｇの用量で観察されたが、用量応答は顕著ではなかった。これらの結果は、ＶＥＧＦ−２のＣ４およびＣ５バッチで観察された血圧の低下が特異的であった（すなわち、ＶＥＧＦ−２関連であった）ことを示唆する。
【０７２７】
（実施例２０：ラット虚血皮膚弁モデル）
（実験計画）
評価パラメーターは、皮膚血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子、免疫組織化学的ま
たは内皮のアルカリホスファターゼ反応を含む。皮膚虚血の間のＶＥＧＦ−２発現は、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて研究する。
【０７２８】
このモデルにおける研究は、以下のとおり３部に分けられる：
ａ）虚血皮膚
ｂ）虚血皮膚創傷
ｃ）通常創傷
実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）３×４ｃｍ（単一の有茎完全厚ランダム皮膚弁）を作製（動物の下部背上の筋皮弁）
ｂ）虚血皮膚における切除による創傷（直径４〜６ｍｍ）（皮膚弁）
ｃ）以下の種々の投薬範囲での切除による創傷のＶＥＧＦ−２での局所的処置（創傷後０、１、２、３、４日目）：１ｍｇ〜１００ｍｇ
ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究およびインサイチュ研究のための創傷後３、５、７、１０、１４および２１日目での創傷組織採取。
【０７２９】
（実施例２１：末梢性動脈疾患モデル）
ＶＥＧＦ−２を用いた脈管形成治療を、新規な治療ストラテジーとして開発して、末梢性動脈疾患において虚血周辺の血流の回復を得た。
【０７３０】
（実験計画）
実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）大腿動脈の片側を結紮して、後肢の虚血筋肉を作製し、後肢の他方の片側は、コントロールとして用いる。
【０７３１】
ｂ）２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投薬量でＶＥＧＦ−２タンパク質を、２〜３週間の間１週あたり静脈内および／または筋肉内で３回（おそらくそれより多く）送達する
ｃ）虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、ＶＥＧＦ−２発現および組織学の分析のために１週、２週および３週で採取する。生検もまた、対側性の後肢の正常筋肉の他方の片側で行う。
【０７３２】
（実施例２２：虚血性心筋疾患モデル）
ＶＥＧＦ−２を、側副血管の発生を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後に新たな血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ＶＥＧＦ−２発現の改変をインサイチュで調査する。
【０７３３】
（実験計画）
実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）心臓を、ラットの左側を開胸して露出させる。直ちに、左冠状動脈を細い（６〜０）縫合糸で閉塞し、そして胸郭を閉じる
ｂ）２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投薬量でＶＥＧＦ−２タンパク質を、２〜４週間の間１週あたり静脈内および／または筋肉内で３回（おそらくそれより多く）送達する
ｃ）外科手術３０日後に、心臓を取り出し、そして形態分析およびインサイチュ分析のために薄片化する。
【０７３４】
（実施例２３：ラット角膜創傷治癒モデル）
この動物モデルは、ＶＥＧＦ−２の新血管形成に対する効果を示す。
【０７３５】
（実験計画）
実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）角膜の中央から間質層へ、１〜１．５ｍｍ長の切開を作製する
ｂ）眼の外側角膜に向き合う切開の縁の下にスパチュラを挿入する
ｃ）ポケットを作製する（その基底は、眼の縁から１〜１．５ｍｍ）
ｄ）５０ｍｇ〜５００ｍｇのＶＥＧＦ−２を含むペレットを、ポケット内に配置する
ｅ）ＶＥＧＦ−２処置を２０〜５００ｍｇの範囲の投薬量で角膜創傷に局所的に適用し得る（毎日処置（ｄａｉｌｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を５日間）。
【０７３６】
（代替プロトコル）
このプロトコルにおいて、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよび／またはＶＥＧＦ−２抗体を、以下に記載されるような角膜に挿入されるフィルターディスクを用いて、ラットの角膜に送達する。
【０７３７】
（フィルターディスク調製）
無菌角膜フィルターディスクを、標準傾斜カットオフおよび平板化チップの周りの機械傾斜グラウンドを有する滅菌した２０Ｇの注射針を用いて、生物学的に安全なフード下で、０．４５μｍの細孔サイズのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＡＷＰ０１３００フィルターからスタンピングする。スタンピングディスクを、２４Ｇスタイレットによって２０Ｇ注射針から除去する。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよび／またはＶＥＧＦ−２抗体溶液を、以下のように滅菌濾過した１×ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で調製する。このコントロール群は、１×ＴＢＳまたはフラッグペプチドのみを受ける。
【０７３８】
（角膜手術およびフィルターディスクの挿入）
一般的に、体重１７５〜２００ｇである２０匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、これらの実施例のために使用する。手術の日に、それぞれの動物を、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｍ；Ｐｈｏｅｎｉｘ番号ＮＤＣ  ５７３１９−２９１−０２）、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉｍ；Ｐｈｏｅｎｉｘ番号ＮＤＣ５７３１９−３２６−２６）およびアセプロマジン（１．０ｍｇ／ｋｇ  ｉｍ；Ｆｅｒｍｅｎｔａ番号１１７−５３１）で麻酔する。ラットを麻酔した後、感覚毛を切り取り、そしてラットに０．５ｍｇ／ｋｇの硫酸アトロピン（ＲＢＩ番号Ａ−１０５；Ｌｏｔ番号６９Ｈ０５４５）を注射する。このラットを、滅菌した包帯で巻く。滅菌したグローブを外科的手順のために使用する。外科的領域（眼および周囲の毛）を、生理食塩水、次いで５％のポビドンヨード（Ｐｅｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ番号Ｈ８１５１−Ｋ９７；Ｌｏｔ番号６Ｈ３１）で洗浄する。次いで、この眼を、滅菌した生理食塩水で洗浄し、そして２滴の２％リドカインＨＣｌ（Ｐｈｏｅｎｉｘ番号ＮＤＣ−５７３１９−０９３−０５；Ｌｏｔ番号００８０９９１）を眼に滴下する。眼を、生理食塩水で潅漑し、手順の間に乾燥するのを防ぐ。角膜輪部から滅菌した番号１５のメスの２ｍｍの刃を用いて切開する。角膜の厚さの約半分を切開する。切開した後、滅菌した顕微手術のハサミを使用して、縁から約０．７５ｍｍの切開の点から伸長するポケットを作製する。予浸した（氷上の滅菌したペトリ皿で２０μＬのそれぞれの試験溶液中で一晩浸す）ディスクを、ディスクの主要な縁が、角膜輪部から１ｍｍとなるようこのポケットに挿入する。
【０７３９】
手術が完了する後、眼瞼を閉じ、そして微細動脈瘤クランプと一緒に徐々に固定する。次いで、このラットを反転し、そして工程番号６で開始する手順を繰り返す。両目を終了する後、ラットを起きるまで隔離ゲージに置く。ラットが意識を回復し始めたらすぐに、微細動脈瘤クランプを除去する。
【０７４０】
（画像化）
手術の５日後、このラットに、０．５ｍｇ／ｋｇのアトロピンを服用させる。散瞳を観察する際、動物を安楽死させる。それぞれのラットの眼を、ＩｍａｇｅＰｒｏ  Ｐｌｕｓ
を用いて４．０倍でデジタル画像化する。表面積（画素）および密度（目的の領域のパーセント）を、フィルターディスクの直下およびどちらかの側の領域で定量化する。９つの表面積測定を、１つの眼あたりで獲得する。平均の脈管形成の表面積をそれぞれの眼に対して獲得する。
【０７４１】
当業者は、上記のプロトコルを容易に変更し得、ＶＥＧＦ−２により調節される新血管形成に対するＶＥＧＦ−２のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−２抗体）の効果を試験する。１つの変更において、フィルターディスクは、ＶＥＧＦ−２およびＶＥＧＦ−２抗体の等モル量で浸し得る。あるいは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドでのみ直接角膜を処置し得、そしてＶＥＧＦ−２抗体を全身、腹腔内注射、静脈内注射または皮下注射を介して投与する。全身注射が使用される場合、例えば、ラットは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの間の１回以上の用量を与えられ得る。
【０７４２】
（実施例２４：糖尿病マウスおよびグルココルチコイド欠陥創傷治癒モデル）
（実験計画）
実験プロトコルは、以下を包含する：
１．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋  マウスモデル
ＶＥＧＦ−２が治癒プロセスを促進することを決定するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける完全厚創傷治癒モデルは、十分に特徴づけられており、臨床的に明らかであり、そして創傷治癒の欠陥の再現可能なモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ、顆粒形成組織の形成および再上皮形成（ｒｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。
【０７４３】
糖尿病動物は、ＩＩ型糖尿病において観察される、多くの特有の特徴を有する。ホモ接合性（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合性（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異型糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、単一の常染色体劣性変異を、第４染色体上に有する（ｄｂ＋）（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症および多尿症を示す。変異型糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、血液グルコースの上昇、増加したインスリンレベルまたは正常インスリンレベル、および細胞性免疫の抑制を有する（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ；ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、心筋合併症、ならびに微小血管病変、基底膜肥厚および糸球体濾過異常がこれらの動物において記載されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２９（１）：６０−６７（１９８０）：Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３１（増補）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合性糖尿病マウスは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似する、インスリン耐性の高血糖症を発症する（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８））。
【０７４４】
これらの動物において観察される特徴は、このモデルにおける治癒がヒト糖尿病において観察される治癒と類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｈａｌｇｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ
Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【０７４５】
（動物）
遺伝性糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスおよびそれらの非糖尿病の（ｄｂ＋／＋ｍ）ヘテロ接合性同腹仔を本研究に使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。６週齢の動物を購入し、そして研究を開始した時は８週齢であった。動物は、個々に飼育し、そして食物および水を無制限に与えた。全ての操作は、無菌技術を使用して行なった。実験は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行なった。
【０７４６】
（外科的創傷）
創傷プロトコルは、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ、Ｒ．およびＲｉｆｋｉｎ、Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））に従って行なう。手短に言えば、創傷当日に、動物を脱イオン水中に溶解したＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射により麻酔する。動物の背側領域を剃毛し、そして皮膚を、７０％エタノール溶液およびヨードで洗浄する。外科手術領域を、創傷の前に滅菌ガーゼを用いて乾燥させる。次いで、全厚８ｍｍの創傷を、Ｋｅｙらの組織パンチを用いて作製する。創傷後すぐに、周囲の皮膚を創傷の拡大を排除するために、やさしく伸ばす。創傷は、実験の期間中開いたままにする。処置の適用は、創傷の日から、５日間連続で局所的に行なう。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびスポンジのガーゼでやさしく洗浄する。
【０７４７】
創傷を、手術の日およびそれから２日毎に、視覚的に試験し、そして一定間隔で写真に取る。創傷の閉鎖は、１〜５日目および８日目に毎日測定することにより決定する。創傷を、目盛りのついたＪａｍｅｓｏｎ  ｃａｌｉｐｅｒを使用して水平方向および垂直方向に測定する。肉芽組織が、もはや目に見えなくなり、そして創傷が、連続した上皮で覆われた場合に、創傷が、治癒したと考える。
【０７４８】
ＶＥＧＦ−２を、８日間、ビヒクル中４ｍｇ〜５００ｍｇ／創傷／日のＶＥＧＦ−２の異なる用量範囲を使用して投与する。ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受容する。
【０７４９】
動物は、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入で８日目に安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を組織学および免疫組織化学のために採取する。組織試料を、さらなるプロセスのために、組織診スポンジ間の組織カセット中で、１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０７５０】
（実験計画）
１０動物づつの３つのグループ（５匹が糖尿病性コントロールであり、そして５匹が非糖尿病性コントロールである）を、１）ビヒクルプラセボコントロール、２）ＶＥＧＦ−２について評価した。
【０７５１】
（創傷面積および閉鎖の測定）
創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸における面積の測定、および創傷の総平方面積を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷面積（０日目）と処置後の創傷面積（８日目）との間の違いを確立することにより、見積もる。１日目の創傷面積は、６４ｍｍ２であった（皮膚パンチの大きさに対応する）。計算は、以下の式を使用して行なった：［８日目の開口面積］−［１日目の開口面積］／［１日目の開口面積］。
【０７５２】
（組織像）
試料を１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを、創傷表面に垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを使用して切断する。通常のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の断面で行なう。創傷の組織学試験を使用して、治癒過程および修復された皮膚の形態的外観が、ＶＥＧＦ−２での処置により変化するかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮化および上皮の成熟度の存在の検査を含んだ（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。実験条件の伏せられた観測者が、目盛りつきレンズマイクロメーターを使用する。
【０７５３】
（免疫組織化学）
（再上皮化）
組織切片は、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用して、ポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体を用いて免疫組織化学的に染色する。ヒトの皮膚を、陽性組織コントロールとして使用し、一方非免疫ＩｇＧを、陰性コントロールとして使用する。ケラチノサイト増殖を、目盛りつきレンズマイクロメーターを使用して、創傷の再上皮化の程度を評価することにより決定する。
【０７５４】
（細胞増殖マーカー）
皮膚試料における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）の使用により実証する。ヒト結腸癌を、陽性組織コントロールとして使用し、そしてヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして使用する。各試料は、一次抗体の脱落、および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含んだ。これらの切片の順位は、わずかな増殖を反映するスケールの低い側から、強い増殖を反映する高い側への０〜８のスケールでの、増殖の程度に基づく。
【０７５５】
（統計的分析）
例示的なデータを、片側ｔ検定を使用して分析する。０．０５より大きいｐ値を、有意とみなす。
【０７５６】
（２．ステロイド障害性ラットモデル）
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系において十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．  Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成の阻害、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞の増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））の減少および循環する単球の一過性減少の生成（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ」Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２８０〜３０２頁（１９８９））により創傷治癒を遅らせる。創傷治癒の減弱に対するステロイドの全身投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０
３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ」Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ
Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２８０〜３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【０７５７】
ＶＥＧＦ−２が、治癒過程を加速し得ることを実証するために、メチルプレドニゾロンの全身投与により、治癒が損なわれているラットの皮膚の全厚切除創傷に対するＶＥＧＦ−２の複数の局所適用の効果を評価する。
【０７５８】
（動物）
重量が、２５０〜３００ｇの若い成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を本実施例に使用する。動物を、８週齢で購入し、そして９週齢で研究を開始した。ラットの治癒応答を、創傷時にメチルプレドニゾロンの全身投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット筋肉内）により損なわせる。動物を個々に飼育し、そして食物および水を無制限に与える。全ての操作は、無菌技術を使用して行なう。本研究は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ
ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイダンスに従って行なう。
【０７５９】
（外科的創傷）
創傷プロトコルは、上述のＡ節に従って行なう。創傷の日に、動物を、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。動物の背側領域を剃毛し、そして皮膚を、７０％エタノール溶液およびヨード溶液で洗浄する。外科手術領域を、創傷の前に滅菌ガーゼを用いて乾燥させる。全厚８ｍｍの創傷を、Ｋｅｙの組織パンチを用いて作製する。創傷は、実験の期間中開いたままにする。試験材料の適用は、創傷の日から７日間連続で、およびメチルプレドニゾロンの投与に引き続いて、一日１回、局所的に行なう。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびスポンジのガーゼでやさしく洗浄する。
【０７６０】
創傷を、創傷の日および処置の最後に、視覚的に試験し、そして固定した距離で写真に取る。創傷の閉鎖は、図のために１〜５日目および８日目まで毎日測定することにより決定する。創傷を、目盛りのついたＪａｍｅｓｏｎ  ｃａｌｉｐｅｒを使用して水平方向および垂直方向に測定する。肉芽組織が、もはや目に見えなくなり、そして創傷が、連続した上皮で覆われた場合に、創傷が治癒したと考える。
【０７６１】
ＶＥＧＦ−２を、８日間、ビヒクル中４ｍｇ〜５００ｍｇ／創傷／日のＶＥＧＦ−２の異なる用量範囲を使用して投与する。ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受容する。
【０７６２】
動物は、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入で８日目に安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を組織学のために採取する。組織標本を、さらなる加工のために、組織診スポンジ間の組織カセット中で、１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０７６３】
（実験計画）
１０動物ずつの４つのグループ（５匹がメチルプレドニゾロンで処置、そして５匹は、
糖質コルチコイドを有さない）を、１）未処置グループ、２）ビヒクルプラセボコントロール、３）ＶＥＧＦ−２処置グループについて評価する。
【０７６４】
（創傷面積および閉鎖の測定）
創傷閉鎖は、垂直軸および水平軸の面積を測定すること、および創傷の総面積を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、開始時の創傷面積（０日目）と処置後の創傷面積（８日目）との間の差異を確立することにより、見積もる。１日目の創傷面積は、６４ｍｍ２であった（皮膚パンチの大きさに対応する）。計算は、以下の式を使用して行なった：［８日目の開口面積］−［１日目の開口面積］／［１日目の開口面積］。
【０７６５】
（組織学）
標本を１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを、創傷表面に垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを使用して薄切する。通常のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の断面で行なった。創傷の組織学試験は、治癒過程および修復された皮膚の形態的外観が、ＶＥＧＦ−２での処置により改善されたかどうかの評価を可能にする。目盛りつきレンズマイクロメータを機械的な観察者が使用して、創傷間隙の距離を決定した。
【０７６６】
（統計的分析）
実験データを、片側ｔ検定を使用して分析する。０．０５未満のｐ値を、有意であるとみなす。
【０７６７】
（実施例２５：ＶＥＧＦ−２モノクローナル抗体産生のための特定のペプチドフラグメント）
４つの特定のペプチド（ＳＰ−４０、ＳＰ−４１、ＳＰ−４２およびＳＰ−４３と命名された）を、産生した。これらを用いて、ＶＥＧＦ−２プロセシングを分析するためのモノクローナル抗体を産生する。このペプチドを以下に示す：
１．「ＳＰ−４０」：ＭＴＶＬＹＰＥＹＷＫＭＹ（配列番号１８のアミノ酸７０〜８１）２．「ＳＰ−４１」：ＫＳＩＤＮＥＷＲＫＴＱＳＭＰＲＥＶ（配列番号１８のアミノ酸１２０〜１３６（１３１位でＣ−＞Ｓ変異に注意のこと））
３．「ＳＰ−４２」：ＭＳＫＬＤＶＹＲＱＶＨＳＩＩＲＲ（配列番号１８のアミノ酸２１２〜２２７）
４．「ＳＰ−４３」：ＭＦＳＳＤＡＧＤＤＳＴＤＧＦＨＤＩ（配列番号１８のアミノ酸２６３〜２７９）
（実施例２６：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル）
この実験的アプローチの目的は、ラット後肢でのリンパ性循環系のリンパ管形成および再形成におけるＶＥＧＦ−２の治療的効果を試験するために、適切かつ一致するリンパ水腫モデルを生成することである。有効性を、発症した後肢の体積の膨張、リンパ管の定量、総血液血漿タンパク質、および組織変化により測定する。急性リンパ水腫を、７〜１０日間観察する。おそらくより重要なことに、水腫の慢性的な進行は、３〜４週間まで続く。
【０７６８】
（実験的手順）
手術の開始に先立って、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採取した。約３５０ｇの雄性ラットに、Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌを投与する。引き続いて、右足を、膝から股関節部にかけて剃毛した。剃毛した領域を、７０％エタノールに浸漬したガーゼで拭き取る。血液を血清総タンパク質試験のために採取する。外周および体積測定を、足への色素の注入の前に、２つの測定レベルのマーキング（背側の足のｐｔの中間で、踵より０．５ｃｍ上）後に行なった。右足および左足の両方の背側の皮内に、０．０５ｍｌの１％  Ｅｖａｎ’ｓ  Ｂｌｕｅを注入する。次いで、外周および体積測定を、足への色素
の注入に続いて行なう。
【０７６９】
膝関節を目印として使用して、脚中部の鼠径部の切開を、大腿部の血管の周囲に位置し得るように行なう。鉗子および止血剤を使用して、皮弁を解体および分離する。大腿部の血管をつきとめた後、血管の側および下部に沿って走るリンパ管をつきとめる。次いで、この領域の主要なリンパ管を、電気的に凝固するか、または縫合結紮する。
【０７７０】
顕微鏡を使用して、脚の裏の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）および内転筋の近く）を、平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節をつきとめる。
【０７７１】
次いで、膝窩の節の２つの近位のリンパ管および２つの遠位のリンパ管ならびに遠位の血液供給を、縫合することにより結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随する脂肪組織を、結合組織をカットすることにより取り除く。
【０７７２】
この手順により生じる任意の穏やかな出血の制御するように注意を払った。リンパ管を閉塞した後、皮弁を、流動性の（ｌｉｑｕｉｄ）皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ  Ｂｕｃｋ）を使用することにより密封する。分離した皮膚の縁を、下にある筋組織にシールするが、脚の周囲の約０．５ｃｍの間隙は、そのままにする。皮膚をまた、必要であれば、下にある筋肉に縫合することにより固着し得る。
【０７７３】
感染を避けるために、動物をメッシュを用いて個々に飼育する（ベッドなしで）。回復する動物を、代表的には５〜７日までに生じる最適な水腫のピークによって、毎日チェックした。次いで、プラトーな水腫ピークを観察した。リンパ水腫の強度を評価するために、本発明者らは、手術前、および７日間毎日、各足の２つの指定された場所の外周および体積を測定した。血漿タンパク質がリンパ水腫に対して有する影響およびタンパク質分析が、有用な試験ペリメータであるかどうかの決定もまた、研究する。コントロールの肢と水腫肢の両方の重量を、２つの場所で評価する。分析を盲目様式により行なう。
【０７７４】
（外周測定）
肢の動きを防ぐために短いガス麻酔下で、布のテープを使用して、肢の外周を測定する。測定は、距骨および背側の足で、２人の異なる人により行ない、次いで、その２つの記録の平均を取る。記録は、コントロールの肢および水腫の肢の両方から取る。
【０７７５】
（体積測定）
外科手術の日、動物をＰｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌを用いて麻酔し、そして手術の前に試験する。毎日の体積測定のために、動物を簡単なハロタン麻酔し（急激に固定化し、そしてすぐに回収する）、両方の脚を剃毛し、そして脚に防水性マーカーを用いて同様に印付けする。最初に、脚を水につけ、次いで、個々の印のレベルを機器につけ、次いでＢｕｘｃｏ  ｅｄｅｍａソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）により測定する。データを１人の人が記録し、一方他の人は、印の領域に対して肢をつける。
【０７７６】
（血液血漿タンパク質測定）
総タンパク質およびＣａ２＋比較のために、外科手術の前、次いで終了時に、血液を採取し、遠心分離（ｓｐｉｎ）し、そして血清を分離する。
【０７７７】
（脚の重量比較）
血液を採取した後、動物を組織収集のために調製する。肢を、ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅを用いて切断し、次いで、実験用の脚およびコントロールの脚の両方を、結紮法で切断し、そして秤量した。第二の秤量を、脛骨−踵骨関節（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ  ｊｏｉｎｔ）を解体したときに行ない、そして足を秤量した。
【０７７８】
（組織学的調製）
膝の後ろ（膝窩）の領域に位置する横筋を解体し、そして金属の骨組みを配置し、凍結ゲルで満たし、冷却メチルブタン中に漬け、標識したサンプルバッグ中に入れ、切り出すまで−８０ＥＣで置いた。切り出す際に、筋肉をリンパ節について蛍光顕微鏡で観察した。他の免疫／組織学的方法が、現在評価されている。
【０７７９】
（実施例２７：ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの産生のための遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボでの遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療方法は、ＶＥＧＦ−２の発現を増加させるために、動物中への、プロモーターに作動可能連結されたＶＥＧＦ−２を含む裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入に関する。このような遺伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９、Ｃｈａｏ，Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４（１２）：３２８１−３２９０（本明細書に参照として引用される）を参照のこと。
【０７８０】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、動物細胞に注入可能物質を送達する任意の方法（組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質隙に注入するような）によって送達し得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物をまた、直接動脈内に送達し得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、薬学的に受容可能な液体または水溶性キャリア中に送達し得る。
【０７８１】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈降剤などを含む細胞への侵入の補助、促進、または亢進のために作用する、任意の送達ビヒクルを含まない配列をいう。しかし、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドをまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ  Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８５（１）：１−７に教示されるような）に送達し得る。
【０７８２】
遺伝子治療方法において使用するＶＥＧＦ−２ベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組みこまれないだけでなく、複製を可能にする配列をも含まない構築物である。他の遺伝子治療技術とは違って、標的細胞への裸の核酸配列の導入の１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一時的な性質である。研究は、非複製ＤＮＡ配列を、細胞内に導入し、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることを示した。
【０７８３】
ＶＥＧＦ−２構築物は動物内の組織の間隙質に送達され得、この間隙質としては、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織が挙げられる。これらの組織の間隙質は、細胞間液、器官組織の細網線維間、血管または室の壁における弾性線維間、線維性組織のコラーゲン線維間のムコポリ多糖マトリックス、あるいは結合組織鞘筋肉細胞内、または骨の裂孔におけるその同じマトリックスを含む。それは、同
様に、循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液によって占められる空間である。これらは、これらの細胞を含む組織中への注射によって、都合良く送達され得る。これらは、好ましくは、持続性の、分化した非分裂細胞に送達され、そしてこの非分割細胞において発現されるが、送達および発現を、未分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液幹細胞または皮膚線維芽細胞のような）において達成し得る。好ましくは、これらを動脈中への直接注射によって送達する。
【０７８４】
裸のポリヌクレオチド注射に関して、有効投薬量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が理解するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って異なる。適切かつ有効な投薬量の核酸配列を当業者は容易に決定し得、そしてこの投薬量は処置される状態および投与経路に依存し得る。投与の好ましい経路は、組織の間隙質内への、または直接的な動脈内への注射の非経口経路による。しかし、他の非経口経路（例えば、特に、肺または気管支組織、喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入）もまた、使用し得る。さらに、裸のＶＥＧＦ−２構築物をこの手順において使用するカテーテルによって血管形成中に動脈に送達し得る。
【０７８５】
注射されたＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物の、動脈中のインビボでの用量応答効果を以下のように決定する。ＶＥＧＦ−２をコードするｍＲＮＡ産生のための適切なテンプレートＤＮＡを標準の組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。テンプレートＤＮＡ（これは、環状または直鎖状であり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソーと複合体化するかのいずれかである。次いで、ウサギの動脈に種々の量のテンプレートＤＮＡを注射する。
【０７８６】
ウサギの後肢虚血を実施例１８に記載するように外科的に誘導する。この後すぐに、５つの異なる部位（内転筋（２部位）の、内側ラージ（ｌａｒｇｅ）（２部位）、および半膜様筋肉（１部位）における）を小さい皮膚切開を通して、改良型３ｍｌシリンジおよび２ゲージ針を使用して、ＶＥＧＦ−２をコードするプラスミドＤＮＡを直接注射する。次いで、皮膚を４．０ナイロンを使用して閉じる。
【０７８７】
後肢虚血をレスキューする能力を、非処置ウサギからの虚血性後肢、子ウシ血圧の測定および流速の動脈内ドップラーガイドワイヤー（Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｇｕｉｄｅｗｉｒｅ）測定と比較して、処置した後肢から採取した、光学顕微鏡切片中のキャピラリーの数を測定することによって決定する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６６２−６７０（１９９４））。ウサギにおける上記実験の結果を、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドの裸のＤＮＡを使用する、ヒトおよび他の動物における適切な投薬量および他の処置パラメーターを推測するために使用し得る。
【０７８８】
（実施例２８、遺伝子治療を使用した処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞（これは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを発現し得る）を患者に移植することである。一般的に、線維芽細胞は皮膚生検によって被験体から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを逆さまにし、密栓し、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地）を添加する。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０７８９】
この時、新鮮な培地を添加し、そして引き続いて数日毎に交換する。さらなる２週間の
培養後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップする。
【０７９０】
ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ、Ｐ．Ｔら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）（モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接する）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして引き続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製する。
【０７９１】
実施例１に示すように、ＶＥＧＦ−２をコードするｃＤＮＡを、５’および３’末端配列にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等しい量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格および増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物をこの２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で維持する。次いで、この連結混合物を使用して細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこの細菌ＨＢ１０１を、ベクターが適切に挿入されたＶＥＧＦ−２を含むことを確認する目的のため、カナマイシンを含む寒天上にプレートする。
【０７９２】
アンホトロピックなｐＡ３１７パッケージング細胞またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養物中でコンフルエントな密度まで、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させる。次いで、ＶＥＧＦ−２遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。ここで、パッケージング細胞は、ＶＥＧＦ−２遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と言われる）。
【０７９３】
新鮮な培地を形質導入されたプロデューサー細胞に添加し、引き続いて、この培地を１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から収集する。感染性のウイルス粒子を含む使用済みの培地をミリポアフィルターを通してろ過し、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地に迅速に置換する。この培地を除去し、そして新鮮な培地に置換する。ウイルスの力価が高い場合、次いで実質的に全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は、必要とされない。この力価が非常に低い場合、次いで、選択マーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染されると、線維芽細胞を分析して、ＶＥＧＦ−２タンパク質が産生されているかどうか決定する。
【０７９４】
次いで、単独か、またはサイトデクス（ｃｙｔｏｄｅｘ）３ミクロキャリアビーズ上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、操作された線維芽細胞を宿主内へ移植する。
【０７９５】
（実施例２９、遺伝子治療（相同的組換え）を使用した処置の方法、）
本発明に従った遺伝子治療の別の方法は、例えば、以下に記載されるような相同的組換えを介した、内因性ＶＥＧＦ−２配列をプロモーターと作動可能に結合させる工程を包含する：１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ  ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ  ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５  （１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）。この方法は、標的細
胞中に存在するが、その細胞中で発現しないか、または所望より低いレベルで発現する遺伝子の活性化を包含する。
【０７９６】
プロモーターおよび標的配列を含む、ポリヌクレオチド構築物が作製され、これらの標的配列は、このプロモーターに隣接する、内因性ＶＥＧＦ−２の５’非コード配列に対して相同性である。このプロモーターが、相同的な組換えに際して内因性配列と作動可能に連結されるように、この標的配列は、ＶＥＧＦ−２の５’末端に十分近接している。このプロモーターおよび標的配列をＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、増幅されたプロモーターは、５’および３’末端に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０７９７】
この増幅されたプロモーターおよび増幅された標的配列を適切な制限酵素で消化し、そして引き続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化した標的配列をＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物をこの２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製する。
【０７９８】
この実施例において、ポリヌクレオチド構築物をエレクトロポレーションを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス性配列、ウイルス性粒子、沈殿剤など）と共に投与され得る。このような送達の方法は、当該分野で公知である。
【０７９９】
一旦、細胞がトランスフェクトされると、相同的な組換えが生じ、これは、内因性のＶＥＧＦ−２配列と作動可能に連結されているプロモーターを生じる。これは、細胞中でＶＥＧＦ−２の発現を生じる。発現を、免疫学的な染色または当該分野で公知の任意の他の方法によって検出し得る。線維芽細胞を皮膚生検によって被験体から得る。得られた組織をＤＭＥＭおよび１０％胎仔ウシ血清中に置く。指数関数的な増殖期または初期の定常期の線維芽細胞をトリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸濁液のアリコートを計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ  デキストロース）中で再懸濁する。この細胞を再度遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／ｍｌ  アセチル化ウシ血清アルブミンを含む、エレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。最終的な細胞懸濁物は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションは、再懸濁後すぐに行うべきである。
【０８００】
プラスミドＤＮＡを標準の技術に従って調製する。ＶＥＧＦ−２遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を付加するＰＣＲで増幅する。２つのＶＥＧＦ−２非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメント１）を５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａ部位を付加して増幅する；他方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメント２）を５’末端のＢａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して増幅する。ＣＭＶプロモーターおよびＶＥＧＦ−２フラグメントを適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメント１−ＸｂａＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、共に連結する。得られた連結産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１８プラスミドで連結する。
【０８０１】
プラスミドＤＮＡを０．４ｃｍの電極ギャップを有する滅菌キュベット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に添加する。最終のＤＮＡ濃度は、一般に少なくとも１２０μｇ／ｍｌである。次いで、０．５ｍｌの細胞懸濁物（約１．５×１０６細胞を含有）をキュベットに添加し、そして細胞懸濁物およびＤＮＡ溶液を緩やかに混合する。エレクトロポレーションをＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて行う。電気容量および電圧を９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖにそれぞれ設定する。電圧が上がるにつれて、細胞の生存は減少するが、細胞のゲノム内に導入されたＤＮＡを安定に組み込む生存細胞のパーセンテージは劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、約１４〜２０ｍＳｅｃのパルス時間が観察されるはずである。
【０８０２】
エレクトロポレーションした細胞を室温で約５分間維持し、次いでキュベットの内容物を滅菌したトランスファーピペットを使用して、穏やかに取り出す。この細胞を直接、１０ｃｍディッシュ中で１０ｍｌの予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を有するＤＭＥＭ）に加え、そして３７℃（ＥＣ）でインキュベートする。次の日、培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
【０８０３】
次いで、操作された線維芽細胞を単独でか、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注射する。ここで、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０８０４】
（実施例３０、ＶＥＧＦ−２トランスジェニック動物）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをまた、トランスジェニック動物で発現し得る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ（ｃｏｗ）および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むが、これらに限定されない）は、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載された技術またはそうでなければ当該分野において公知の技術を使用して遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現させる。
【０８０５】
当該分野で公知の任意の技術を使用して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために、動物内に導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を導入し得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前核のマイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞系（胚盤胞または胚）へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を使用する本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞中に核酸構築物を導入する工程および胚盤胞中に幹細胞を戻す工程；ならびに精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９）；など。このような技術の概要については、Ｇｏｒｄｏｎ，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ」Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０８０６】
当該分野で公知の任意の技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを作製し得る（例えば、静止状態に誘導した、培養された胚性細胞、胎児細胞または成体細胞由来の核の、除核した卵母細胞への核移入）（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７））。
【０８０７】
本発明は、全てのこれらの細胞において導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物、ならびにいくつかの細胞において導入遺伝子を保持するが、全てのこれらの細胞において保持するのではない、トランスジェニック動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。この導入遺伝子を単一の導入遺伝子として、または多数のコピーとして（例えば、コンカテマー（例えば、頭−頭タンデムもしくは頭−尾タンデム）における）組み込み得る。この導入遺伝子をまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入し得、そして特定の細胞型で活性化し得る。このような細胞型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者にとって明らかである。このポリヌクレオチド導入遺伝子が内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子標的化が好ましい。
【０８０８】
簡潔には、このような技術が利用されるべき場合、内因性遺伝子と相同性のいくつかのヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同組換えを介して、内因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能の中に組み込む目的のため、およびこの機能を破壊する目的のために設計する。この導入遺伝子を特定の細胞型に選択的に導入し得、従って、この遺伝子は、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、その細胞型のみにおいて内因性遺伝子を不活性化する。このような細胞型特異的不活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。
【０８０９】
一旦、トランスジェニック動物が作製されると、組換え遺伝子の発現を標準技術を利用してアッセイし得る。導入遺伝子の組み込みが生じたことを確認するために、最初のスクリーニングを、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって、動物組織を分析するために達成し得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをまた、その動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない技術を使用して評価し得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルもまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的にまたは免疫組織化学的に評価し得る。
【０８１０】
一旦、創始動物が作製されると、これらを繁殖させるか、近系交配させるか、異系交配させるか、または異種交繁し、特定の動物のコロニーを作製し得る。このような繁殖戦略の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分離系統を確立するための１つより多い組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子のさらなる発現の効果に起因して、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを作製するための分離系統の近系交配；発現を増強させ、そしてＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を排除するため両方のために、所定の組み込み部位に対してホモ接合性の動物を作製するためのヘテロ接合性のトランスジェニック動物の交配；複合へテロ接合体系統または複合ホモ接合体系統を作製するための分離ホモ接合系統の交配；および目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置するための交配。
【０８１１】
異常なＶＥＧＦ−２発現に関連する状態および／または障害を研究し、ＶＥＧＦ−２ポ
リペプチドの生物学的な機能を詳しく述べる際に、ならびにこのような状態または障害を緩和する際に有効な化合物のスクリーニングの際に有用な動物モデル系が挙げられるが、これらに限定されない本発明のトランスジェニック動物を使用する。
【０８１２】
（実施例３１、ＶＥＧＦ−２ノックアウト動物）
内因性ＶＥＧＦ−２遺伝子発現はまた、標的化相同性組換えを使用してＶＥＧＦ−２遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性のポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード領域か、または調節領域のいずれか）に相同性のＤＮＡによって隣接する、本発明の変異型、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を選択マーカーおよび／または陰性の選択マーカーを有するか、または有さずに、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトするために使用し得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を使用して、目的の遺伝子を含むが発現しない細胞中でノックアウトを生成する。標的化相同的組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性の標的化遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究分野および農業分野において特に適している（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ  １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ  １９８９、前出）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が当業者に明らかな適切なウイルスベクターを使用してインビボで直接投与されるか、または必要とされる部位に標的化される場合、ヒトにおいての使用に慣用的に適合し得る。
【０８１３】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作される細胞（例えば、ノックアウト）をインビボで患者に投与する。このような細胞を患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから入手し得、そしてこれらの細胞は、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞等を含み得るが、これらに限定されない。この細胞を、例えば、形質導入（ウイルス性ベクター、および好ましくは細胞のゲノムに導入遺伝子を組みこむベクターを使用して）またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない）によって、細胞内に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいは、本発明のポリペプチドに関連するコード配列および／または内因性調節配列を破壊するために、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作される。本発明のポリペプチドのコード配列を、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成するために、強力な構成的プロモーターまたは強力な誘導性プロモーターあるいはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作された細胞を患者に全身的に（例えば、循環中において、または腹腔内に）導入し得る。
【０８１４】
あるいは、この細胞をマトリックス中に組み込み得、そして身体中に移植し得、例えば、遺伝子に操作された線維芽細胞を、皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝子操作された内皮細胞をリンパの移植片または血管移植片の一部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０８１５】
投与されるべき細胞が非自己の適合性細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、これ
らの細胞を、周知の技術を使用して投与し得、この技術は、導入細胞に対して宿主免疫応答の発生を妨げる。例えば、それらの細胞をカプセル化形態で導入し得、これは、初期の細胞外環境との成分の交換を可能にするが、導入細胞は、宿主免疫系によって認識されることを可能にしない。
【０８１６】
異常なＶＥＧＦ−２発現に関連する状態および／または障害を研究して、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの生物学的な機能を上昇する際、およびこのような状態および／または障害の回復に有効な化合物をスクリーニングする際に、有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない本発明のノックアウト動物を使用している。
【０８１７】
（実施例３２）
（ＶＨドメインおよびＶＬドメインの同定およびクローニング）
特定の抗体を発現する細胞株由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインを同定しそしてクローニングするための１つの方法は、ＶＨおよびＶＬ特異的プライマーを用いて抗体発現細胞株から作成されたｃＤＮＡに対してＰＣＲを実施することである。手短に言うと、ＲＮＡを細胞株から単離し、そしてＥＢＶ細胞株によって発現された抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを増幅するために設計したＲＴ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。細胞をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．ＭＤ）中で溶解し、そして５分の１容量のクロロホルムを加えて抽出し得る。クロロホルム添加後、この溶液を室温で１０分間インキュベートし、そして卓上遠心機中で、１４，０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した。その上清を回収し、そして等量のイソプロパノールを用いて、ＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを、卓上遠心機中で、１４，０００ｒｐｍで１５分間４℃での遠心分離によってペレット化した。遠心分離後、その上清を捨て、そして７５％のエタノールで洗浄した。洗浄後、そのＲＮＡを再び８００ｒｐｍで５分間４℃で遠心した。その上清を捨て、そしてそのペレットを風乾した。ＲＮＡをＤＥＰＣ水に溶解し、そして６０℃で１０分間加熱した。光学濃度測定を用いて、ＲＮＡを定量し得る。
【０８１８】
当該分野に公知の方法に従って、逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、１．５〜２．５マイクログラムのＲＮＡからｃＤＮＡを合成し得る。次いで、ｃＤＮＡをＶＨドメインおよびＶＬドメインのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅するために使用したプライマーを、表５に示す。代表的に、ＰＣＲ反応は、単一の５’プライマーおよび単一の３’プライマーを使用する。時々、利用可能なＲＮＡテンプレートの量が制限される場合、またはより大きな有効性のために、５プライマーおよび／または３’プライマーのグループを使用し得る。例えば、時々、５つのＶＨ−５’プライマー全ておよびＪＨ３’プライマーの全てを単一のＰＣＲ反応に使用する。このＰＣＲ反応を、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．７単位のＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ、５’プライマー混合物、３’プライマー混合物および７．５マイクロリットルのｃＤＮＡを含む５０マイクロリットル容量において実施する。ＶＨおよびＶＬの両方の５’プライマーおよび３’プライマーの混合物を、それぞれ、２２ｐモルおよび２８ｐモルの別個のプライマー各々と一緒にプールすることによって作成し得る。ＰＣＲ条件は、以下の通りである：９６℃５分間；続いて、９４℃１分間、５０℃１分間、そして７２℃１分間を２５サイクル；続いて７２℃１０分間の伸長サイクル。反応を完了した後、サンプルチューブを４℃で保存する。
【０８１９】
（表３：ＶＨドメインおよびＶＬドメインを増幅するために使用したプライマー配列）
【０８２０】
【表３】
0005132008.tif 000020
【０８２１】
【表４】
0005132008.tif 000021
次いで、ＰＣＲサンプルを１．３％のアガロースゲルで電気泳動した。期待したサイズのＤＮＡバンド（ＶＨドメインについて約５０６塩基対およびＶＬドメインについて３４４塩基対）をゲルを切り出し、そして当該分野で周知の技術を用いて精製し得る。精製したＰＣＲ産物をＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡからのＴＡベクター）に結合し得る。別個にクローニングしたＰＣＲ産物を、Ｅ．ｃｏｌｉのトランスフェクションおよび青／白の色選択後に同定し得る。次いで、当該分野で共通に公知の方法を用いて、クローニングしたＰＣＲ産物を配列決定し得る。
【０８２２】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＰＣＲバンドを用いて、全長のＩｇ発現ベクターを作成し得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを、重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４）または軽鎖（ヒトκもしくはヒトλ）の定常領域のヌクレオチド配列を含むベクター内にクローニングし得、その結果、適切な宿主細胞内にトランスフェクトした場合、これらのベクターから完全な重鎖分子または軽鎖分子を発現し得た。さらに、クローニングした重鎖および軽鎖の両方を１つの細胞において（１つまたは２つのベクターのいずれかから）発現する場合、それらを、細胞培地中に分泌される完全な機能性抗体分子内に構築し得る。完全な抗体分子をコードする発現ベクターを作成するために、ＶＨ抗体ドメインおよびＶＬ抗体ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いる方法は、当該分野で周知である。
【０８２３】
（実施例３３）
（ＶＥＧＦ−２結合ポリペプチドの親和性のＢＩＡｃｏｒｅ分析）
ＶＥＧＦ−２抗体のＶＥＧＦ−２への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって分析し得る。ＶＥＧＦ−２（もしくは他の抗原に対するＶＥＧＦ−２抗体の親和性を知りたい物質に対する他の抗原）またはＶＥＧＦ−２抗体のいずれかを、Ｎ−エチル−Ｎ’（ジメチルアミノプロピル）カルボイイミド（ｃａｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）／Ｎ−ヒドロキシスクシニミド化学を用いて、アミン基を介してＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ（ＣＭ５チップ）に共有結合的に固定化し得る。ＶＥＧＦ−２抗体またはＶＥＧＦ−２（もしくはＶＥＧＦ−２抗体の親和性を知りたい物質に対する他の抗原）、それぞれの種々の希釈物は、５０マイクロリットルの容量全てについて２５マイクロリットル／分で、フローセル中の誘導体化したＣＭ５チップ上を流れる。結合したタンパク質の量は、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  界面活性剤ｐ２０）でのフローセルの洗浄中に定量し得る。目的のタンパク質についての結合特異性は、目的のタンパク質の存在下で、可溶性競合物との競合によって決定される。
【０８２４】
このフローセル表面は、２０マイクロリットルの１０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．３で洗浄することにより結合タンパク質を置換することによって再生し得る。動態分析に関して、このフローセルを、ＣＭ５チップ上の異なる流速および異なるポリペプチド密度について試験する。オンの速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）およびオフの速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３ソフトウェアにおける動態評価プログラムを用いて決定し得る。
【０８２５】
ＢＩＡｃｏｒｅ技術はまた、例えば、ＶＥＧＦ−２のそのレセプターに結合する能力を阻害する、抗ＶＥＧＦ−２抗体の能力を定量的に決定するために使用し得る。
【０８２６】
（実施例３４：内皮細胞増殖アッセイ）
ＶＥＧＦ−２処置は、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞が増殖するのを誘導する。ＶＥＧＦ−２処置細胞においてこの活性を可能にするために、以下のアッセイを使用する。さらに、ＶＥＧＦ−２抗体が、内皮細胞の増殖を誘導するＶＥＧＦ−２タンパク質の能力を阻害し得るかどうかを決定するためにもまた、このアッセイを使用し得る。下記のプロトコルは、ＶＥＧＦ−２抗体の阻害活性を試験するためのアッセイを明示するが、当業者は、このアッセイを容易に改変して、内皮細胞増殖を誘導するＶＥＧＦ−２タンパク質の能力を試験するために、ＶＥＧＦ−２抗体を取り除き得る。
【０８２７】
（ウシリンパ管内皮細胞（ｂＬＥＣ）の継続的な継代培養）
ウシのリンパ管内皮細胞（ｂＬＥＣ）細胞（ＡＴＣＣ番号．ＰＴＡ−１１４９）を、７５ｃｍ２フラスコ内の完全培地（ＤＭＥＭ、１０％の、熱で不活化したＦＢＳ（Ｂｉｏｗ
ｈｉｔｔａｋｅｒのカタログ番号；１４−５０２Ｆ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、５ｍｌ／５００ｍｌの非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）の培地、１５０μｇ／ｍｌ  ウシの脳抽出物（ウシの脳抽出物は、Ｍａｃｉａｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，５６７４−５６７８（１９７９）に記載されるように調製する）、１００μｇ／ｍｌのヘパリン）中で増殖させる。コンフルーエンスに達したら、７５ｃｍ２フラスコから培地を除き、そして細胞を２０ｍｌのＰＢＳ（カルシウムもマグネシウムも含まない）で１回洗浄し、次いで、４ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで覆い（ｃｏｖｅｒ）、そして３〜５分間インキュベーターに戻した。次いで、静かに揺り動かして（ｇｅｎｔｌｅ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）プラスティックからその細胞を剥がし、トリプシンを不活化するために４ｍｌの完全培地を加える。次に、この細胞懸濁物を、１５ｍｌの遠心チューブに打つし、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞をペレット化する。その上清は除去し、そしてその細胞ペレットを完全培地に再懸濁する。この細胞を１：３に分けて、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で維持する。培地は、細胞を分ける必要性にかかわらず、週に２回交換する。
【０８２８】
（ＶＥＧＦ−２増殖アッセイプロトコル）
１日目：外側の列を除いて、９６ウェルプレート中で１ウェルにつき３５００個の細胞でｂＬＥＣをプレーとし、そして完全培地中で一晩培養する。後日、
２日目：完全培地を除去し、そして１００マイクロリットルの飢餓培地（飢餓培地）（：ＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓのカタログ番号；ＣＣ−３１２１）、０．５％  ＦＢＳ）を加える。
【０８２９】
３日目：ＶＥＧＦ−２タンパク質を飢餓培地で希釈し、３×濃縮物を生じる。１２ウェルプレートにおいて、全部で１４の希釈のために、各抗体（飢餓培地中のＶＥＧＦ−２の３×濃縮物を希釈剤として用いる）の連続希釈を作成する。実験プレートに抗体を加えた後の最終濃度は、三連で、４０００ｎｇ／ｍｌ〜０．０００６ｎｇ／ｍｌ（３倍希釈）の範囲にすべきである。最小の抗体量から始まる各希釈物５０マイクロリットルを９６ウェルプレートに移す。３７℃で、５％  ＣＯ２で３日間プレートをインキュベートする。
【０８３０】
６日目：１ウェルにつき３Ｈ−チミジン  ０．５ｍＣｉ（６．７  Ｃｉ／ｍＭ）を含む５０マイクロリットルの飢餓培地を各ウェルに補充し、そして細胞を、さらに１８〜２０時間インキュベートする。
【０８３１】
７日目：プレートを−８０℃で冷凍する。２〜３時間後、プレートを解凍する。細胞を回収し、そして３Ｈ−チミジン取り込みを測定する。
【０８３２】
（実施例３５：Ｅｌｋ−１リン酸化アッセイ）
ＶＥＧＦ−２は、Ｅｌｋ−１タンパク質をリン酸化するキナーゼを活性化するＶＥＧＦ−２応答細胞におけるシグナル伝達カスケードを誘導する。ＶＥＧＦ−２処置細胞においてこの活性を可能にするために、以下のアッセイを使用する。さらに、ＶＥＧＦ−２抗体が、Ｅｌｋ−１のリン酸化を誘導するＶＥＧＦ−２タンパク質の能力を阻害し得るかどうかを決定するためにもまた、このアッセイを使用し得る。下記のプロトコルは、ＶＥＧＦ−２抗体の阻害活性を試験するためのアッセイを明示するが、当業者は、このアッセイを容易に改変して、Ｅｌｋ−１リン酸化を誘導するＶＥＧＦ−２タンパク質の能力を試験するために、ＶＥＧＦ−２抗体を取り除き得る。
【０８３３】
手短に言うと、９６ウェルの平底培養プレートにウシのリンパ管内皮細胞（ｂＬＥＣ）を１ウェルにつき１００マイクロリットル容量の完全増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ４１４３からのＥＧＭ−ＭＶ）中に２５，０００細胞で播き、そして３７℃で５％  ＣＯ２で一晩インキュベートする。ＰＢＳ＋０．
０５％  ＢＳＡ（低い内毒素）中に０．２マイクログラム／ミリリットルでのＶＥＧＦ−２（例えば、全長のタンパク質またはＶＥＧＦ−２の分泌形態）の常用ストック溶液を調製する。
【０８３４】
別個のアッセイプレートにおいて、６ｎｇの全長ＶＥＧＦ−２タンパク質または２ｎｇの分泌形態のＶＥＧＦ−２タンパク質のいずれかを、１，５００ｎｇ（１００×モル濃度の過剰量の抗体を示す）のＶＥＧＦ−２抗体と混合し、そして、ヒト内皮−無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１１１−０４４）（ＳＦＭ）を用いて、総容量を１００マイクロリットルに調製する。全長のＶＥＧＦ−２、分泌されるＶＥＧＦ−２および抗体の最終濃度は、それぞれ、６０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬおよび１５μｇ／ｍＬである。抗体サンプルが調製済み培地である場合、アッセイに必要とする抗体量を計算するために、総ＩｇＧ濃度を用いる。ＶＥＧＦ−２−抗体複合体は、形成は、室温で１時間で形成され得る。
【０８３５】
抗体−抗原複合体を形成する間、細胞から完全増殖培地を除去してそれをＳＦＭ飢餓培地と置換し、そして細胞を（５つのインキュベートについて（ｆｏｒ  ５  Ｉｎｃｕｂａｔｅ））３７℃で５％  ＣＯ２で１時間インキュベートする。細胞の１時間のインキュベートが終わった後、細胞から飢餓培地をデカントし、そして５０マイクロリットルの各ＶＥＧＦ−２／ＶＥＧＦ−２抗体サンプルをアッセイプレートから細胞プレートに移す。次いで、細胞プレートを１５分間３７℃でインキュベートする。インキュベーション後、ＶＥＧＦ−２−抗ＶＥＧＦ−２複合体を含む液体を細胞からデカントし、そして１ウェルにつき５０マイクロリットルの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、１０％  グリセロール、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮａＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ［フレッシュなものを加える］、１×Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター［フレッシュなものを加える］）を加え、そして１〜３分間静置する。この溶解物は、キナーゼアッセイにおいて直ちに使用するか、または−７０℃で保存するべきである。
【０８３６】
（キナーゼアッセイ：）
ＧＳＴ−Ｅｌｋ１融合タンパク質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  番号；９１８４、またはＢｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ番号；１０１０）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬまで希釈し、そして９６−ウェルのＤｙｎｅｘ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  ２プレート（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ番号；７４１７）に１ウェルにつき５０マイクロリットル加える。プレートを静かに叩いて、液体が底部を完全に覆うようにする。室温で一晩または３７℃で１時間、インキュベートする。プレートを、１ウェルにつき２５０マイクロリットルの洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ＋ＰＢＳＴ）で１回洗浄する。次に、１ウェルにつきブロッキング緩衝液（１．０％  Ｎｏｎｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋ、ＰＢＳＴ）１５０マイクロリットルを用いて、ウェル中の使用されていない結合部位をブロックし、そして１時間室温でインキュベートする。次いで、１ウェルにつき２５０マイクロリットルの洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。アッセイプレートの各ウェルに、１５マイクロリットルのサンプル（２連で）および１０マイクロリットルの水を加える。１ウェルにつき２５マイクロリットルの２×キナーゼ緩衝液（２×キナーゼ反応緩衝液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＦ、０．２ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ［フレッシュなものを加える］、１ｍＭ  ＡＴＰ［フレッシュなものを加える］）を各ウェルに加えて、キナーゼ反応を開始する。精製し、活性化し、そして不活化したＥＲＫ１／２キナーゼ（それぞれ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、番号２０６１１０および番号２０６１２０）をコントロールとして含む。室温で１時間インキュベートする（１〜３時間の間、反応は直線である）。
【０８３７】
ＧＳＴ−Ｅｌｋ−１融合タンパク質を含む溶解物またはキナーゼコントロールのインキュベーションの後、プレートを１ウェルにつき２５０マイクロリットルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。次いで、抗体希釈剤（０．１％  ＢＳＡ、ＰＢＳＴ）で抗−リン酸−Ｅｌｋ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，番号９１８１）を１：１０００に希釈し、そして各ウェルに５０マイクロリットルを加える。室温で１時間インキュベートする。
【０８３８】
次いで、プレートを１ウェルにつき２５０マイクロリットルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。Ｚｙｍａｘのヤギの抗−ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、番号；８１−６１２２）を抗体希釈剤で１：４０００に希釈する。１ウェルにつき５０マイクロリットルの希釈した抗体を各ウェルに加え、そして１時間室温でインキュベートする。１ウェルにつき２５０マイクロリットルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。次いで、１ウェルにつき５０マイクロリットルのＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ  ＡＰ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，番号；１７５９７７９）（パッケージ中の「ＥＬＩＳＡ  使用説明書」に従って調製される）を加える。ルミノメーターでリードする前に、室温で１２分間インキュベートする。
【０８３９】
（実施例３６）
（腫瘍血管新生のＶＥＧＦ−２抗体の効果を研究するための容量チャンバーモデル）
マウスにおける透明ウィンドウシステムでの微小血管生理学の複数の局面の特性は、血管新生、炎症、微小血管輸送、組織の拒絶反応、および腫瘍生理学に関する貴重なデータを提供している（Ｍｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｊら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：２１３１−２１３８、（１９９５）；Ｆｕｋｕｍｕｒａ，Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４８２４−４８２９，（１９９５）；Ｙａｍａｄａ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８６：３４８７−３４９２，（１９９５）；Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，ら、Ｂｌｏｏｄ，８６：４７０７−４７０８，（１９９５）；Ｍｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ら、Ｍｉｃｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．５０，３５−４４，（１９９５）；Ｍｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
２：９９２−９９７，（１９９６）；Ｄｅｌｌｉａｎ，Ｍ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４９：５９−７１，（１９９６）；ならびにＬｅｕｎｉｇ  Ｍ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ  ５２：６５５３−６０（１９９２））。このアッセイを使用して、皮膚または軟膜表面の間質性コンパートメント（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に直接投与されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドが、微小血管系の構造および機能における変化を誘導するという仮説を試験し得る。これらの研究は、特に、観測ウィンドウ内に存在する脈管構造および移植ゲル中のこれらのタンパク質に応答して発達する新生脈管構造に対する活性を特徴付ける。以下の観察がなされる：
ａ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドでの処置に応答して皮膚または軟膜表面に生じる血管網状組織（血管網状組織）の長さ、直径および密度；
ｂ）処置した血管床での血流速度および白血球の流量；
ｃ）処置した血管床での回転白血球および接着性白血球の頻度；
ｄ）ＶＥＧＦ−２ポリペプチドでの処置に対する応答における、皮膚または軟膜表面での血管網状組織の存在の浸透性；
ｅ）ウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対する脈管形成応答；
ｆ）ウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、血流速度  白血球の流量ならびに回転白血球および接着性白血球の数；
ｇ）皮膚または頭部のウィンドウ調製物内に移植したコラーゲンディスクにおける、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対する応答における血管由来の血管網状組織の浸透性。
【０８４０】
このアッセイに関して、Ｓｗｉｓｓ  ｎｕ／ｎｕマウスを使用する。Ｓｗｉｓｓ  ｎｕ
／ｎｕマウスを使用する利点は、以下を含め、数倍である（ｓｅｖｅｒａｌ−ｆｏｌｄ）：ａ）研究期間の間、免疫応答の可能性を減少させる、ｂ）皮膚における色素沈着および毛の欠如に起因する光学を改善する、ｃ）同様の種々の研究を用いて、経過の一貫性を維持する。
【０８４１】
各実験グループおよびコントロールグループは、７匹のマウスを有する。雄マウスを用意する。なぜなら、雄マウスの方がより大きく、そして外科的ウィンドウ移植のためのより多くの皮膚を有する。試験するためのサンプルは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよび組み換えタンパク質コントロールを含む。存在する血管床上でのタンパク質活性を検査する各研究は、以下の５つの実験グループからなる：
グループ  １：緩衝液中の試験サンプル（用量１）
グループ  ２：緩衝液中の試験サンプル（用量２）
グループ  ３：緩衝液中の試験サンプル（用量３）
グループ  ４：緩衝液およびＢＳＡコントロール
グループ  ５：ポジティブコントロール（ｂＦＧＦ、１０ｎｇ）
滅菌したタンパク質溶液を１０μｌ容量として、背部の皮膚ウィンドウを有するマウスのウィンドウ調製物内に直接投与する。あるいは、上記に列挙されるようなタンパク質濃縮物を含む滅菌したコラーゲン／スクラルフェートディスクを、脈管形成能の評価のためにウィンドウ調製物に配置する。滅菌した抗体溶液を静脈内に投与する。
【０８４２】
これらの実験は、皮膚の血管外コンパートメントに投与されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドが、毛細管および後毛細管集合に存在する構造および機能における変化を誘導するという仮説を試験するために計画する。コラーゲンディスク中のポリペプチドの投与は、新脈管形成を調節する可能性を調べる。
【０８４３】
（方法）
（動物調製）
外科的手順を、Ｓｗｉｓｓヌードマウスにおいて実施する。外科的手順について、動物（２０〜３０ｇ）を体重１ｋｇにつき９０ｍｇのケタミンおよび９ｍｇのキシラジンのカクテルを皮下注射して麻酔する。外科的手順全てが、蒸気滅菌、気体滅菌または化学的に滅菌されている設備を備える水平な層状の流動性フードにおいて、特定の条件下で実施される。このベンチの無菌性は、使用しない場合、Ｕ．Ｖ．光によって維持される。手術中は、加熱作業面の手段によって、動物の体温を一定に維持する。マウス全てを別々に微小隔離飼育機（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ）ケージに収容し、そして処置全てを層状の流動性フード中で行う。手術後、任意の不快／苦痛について動物を観察する。不快の基準としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：体重減少（２０％）、移動不能、自傷の証拠、または食べることもしくは飲むことが出来ないこと。移植後３日間、ブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ  ｑ  １２時間）を鎮痛薬として使用する。手術後３日間、不快のサインを示す任意の動物は、ＣＯ２吸入を用いて安楽死させる。
【０８４４】
（背部皮膚チャンバー移植：）
チャンバーを、Ｌｅｕｎｉｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：６５５３−６５６０（１９９２）に記載されるように移植する。手短に言うと、このチャンバーを、チャンバーが背部表面上に広がる２層の皮膚（すなわち、「皮膚を挟む（ｐｉｎｃｈ  ｏｆ  ｓｋｉｎ）」）上に配置されるように、位置付ける。背部皮膚組織弁の一面の全厚さを、直径約１５ｍｍの円形領域で除去する。組織弁（表皮、筋膜、および横紋筋からなる）の第２の部位は、チャンバーのフレームおよび開口部（「ウィンドウ」）上に配置され、滅菌した、ガラスのカバースリップでカバーする。このチャンバーを、縫合糸（絹、４−０）を用いて適所に配置し、この縫合糸は、チャンバーの上部に沿って広がった皮膚および穴を介して通される．マウスは、７２時間で回復できる。
【０８４５】
この回復後、処置のために、各マウスを透明な、ポリカーボネートチューブ（直径２５ｍｍ）に配置する。カバースリップを注意深く除去し、続いて処置因子を加える。処置因子添加後、次いで、観察面上に、新しい、滅菌したカバースリップを配置する。測定は、ＣＣＤカメラおよびＳＩＴカメラ、Ｓ−ＶＨＳビデオカセットレコーダーならびに直接デジタル画像取得を用いる形態計測分析によって行う。移植チャンバーを有するマウスを、フローチャートに示すように、２８日間観察する。
【０８４６】
（測定）
マウスを、体重１ｋｇにつき９０ｍｇのケタミンおよび９ｍｇのキシラジンのカクテルのｓ．ｃ．注射により麻酔し、次いで、滅菌したプラスチックステージアセンブリ上に配置する。次いで、透過照明（背部表面ウィンドウ）または後の１００μｌのＢＳＡ−ＦＩＴＣ注射（１ｍｇ／ｍｌ、ｉ．ｖ．）および落射証明（頭部ウィンドウ）を用いて、ウィンドウの血管地図を作成する。血管床のビデオ録画を、オフライン分析のための倍率範囲（１×〜４０×）およびデジタルフレームで行う。血管密度、血流速度、および血管の寸法（剪断速度分析）について、画像を定量化する。さらに、毛細管細静脈および後毛細管細静脈のビデオ顕微鏡法後に、１０μｌのローダミン６−Ｇ注射によって循環する白血球相互作用を評価する。透過性測定を、５分、１０分、１５分および２０分でのＢＳＡ輸送の画像オフライン分析から行う。正常血管床および脈管形成血管床の毛細管密度の定量を、５セットの実験マウスおよびコントロールマウスの観察を７日間隔（計２８日間）でビデオテープのオフライン分析から行う。
【０８４７】
（実施例３７）
（結腸癌ＬＳ１７４Ｔ背部チャンバーモデル）
結腸癌（ＬＳ１７４Ｔ）は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを産生／分泌する。従って、ＶＥＧＦ−２抗体による処置が、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍増殖を遅らせるかまたは阻止するか、あるいはさらにＬＳ１７４Ｔ腫瘍後退に作用するかを試験することは特に興味深い。この仮説を試験するために、上記の背部チャンバーモデルが、背部チャンバー内の腫瘍増殖および血管新生を研究するために適し得る。
【０８４８】
背部チャンバーの移植３日後、２マイクロリットルのペレット化したＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞懸濁物（約２×１０５細胞を含む）をチャンバー内の皮下組織の横紋筋層上に接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）する。次いで、接種した腫瘍は、「取る」ことが出来るまで一時期放置し、そしてＶＥＧＦ−２処置を開始する前に、特定のサイズ（例えば、直径４〜６ｍｍ）まで成長させる。
【０８４９】
マウスに最初に０．４ミリグラムのＶＥＧＦ−２抗体を注射し、続いて０．２ミリグラムのＶＥＧＦ−２抗体を５日おきに３０日間注射する。注射は、腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）投与し得る。
【０８５０】
腫瘍増殖に対するＶＥＧＦ−２処置の効果を評価するために測定されるパラメータとしては、腫瘍サイズおよび（内皮およびリンパの）血管密度が挙げられる。
【０８５１】
さらに、このアッセイは、内因性ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの産生に関係なく、他の腫瘍に対するＶＥＧＦ−２処置の効果を試験するために改変し得る。
【０８５２】
（実施例３８）
（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるＶＥＧＦ−２抗体処置の効果）
このＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ＡＴＣＣ番号；ＨＴＢ−２６）は、乳癌細胞株である。以下のアッセイを用いて、ＶＥＧＦ−２抗体での処置がＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍増
殖を遅らせるかまたは阻止するかどうか、あるいはＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍退行に作用するかどうかをを試験する。以下の実施例は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を必要とする実験プロトコルの概要を述べるが、当業者は、他の腫瘍型に対するＶＥＧＦ−２抗体の処置の効果を試験するためにこのプロトコルを容易に改変し得る。
【０８５３】
第０日目に、マウスに１００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を有する乳房の詰め物を注入する。この移植した腫瘍は、２ｍｍ×２ｍｍ（通常、約５日間かかる）まで成長する。この腫瘍が２×２ｍｍ２の大きさまで達したら、動物に、初期用量の０４．ミリグラムのＶＥＧＦ−２抗体を投与する。従って、０．２ミリグラムのＶＥＧＦ−２抗体を、初期注入から５日後および１０日後に投与する。さらに、特定の例示的グループにおける動物にもまた、５ｍｇ／ｋｇのタキソール（またはたの適切な用量の別の化学療法剤）を毎日投与する。
【０８５４】
本発明の多数の改変および変更が上記の教示の観点から可能であり、従って、添付の請求項の範囲内で、本発明は、特に記載される以外の別の方法で実施され得る。
【０８５５】
本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、実験室マニュアル、書籍または他の文書を含む）の完全な開示は、本明細書により参考として援用される。
【０８５６】
【表５】
0005132008.tif 000022
ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８５７】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８５８】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８５９】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８６０】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８６１】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８６２】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８６３】
【表６】
0005132008.tif 000023
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８６４】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８６５】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８６６】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８６７】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８６８】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８６９】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８７０】
【表７】
0005132008.tif 000024
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８７１】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８７２】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８７３】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９５
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８７４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８７５】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８７６】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８７７】
【表８】
0005132008.tif 000025
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４１７９
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８７８】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８７９】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８８０】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４１７９
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８８１】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８８２】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８８３】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８８４】
【表９】
0005132008.tif 000026
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９６
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８８５】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８８６】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８８７】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０９６
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８８８】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８８９】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８９０】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８９１】
【表１０】
0005132008.tif 000027
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４１８０
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０８９２】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８９３】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０８９４】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４１８０
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０８９５】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８９６】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０８９７】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０８９８】
本明細書中の教示から、本発明のこれらおよび他の局面は、当業者にとって明らかである。
【図１Ａ】
0005132008.tif 000028
【図１Ｂ】
0005132008.tif 000029
【図１Ｃ】
0005132008.tif 000030
【図１Ｄ】
0005132008.tif 000031
【図１Ｅ】
0005132008.tif 000032
【図２Ａ】
0005132008.tif 000033
【図２Ｂ】
0005132008.tif 000034
【図２Ｃ】
0005132008.tif 000035
【図２Ｄ】
0005132008.tif 000036
【図３Ａ】
0005132008.tif 000037
【図３Ｂ】
0005132008.tif 000038
【図４】
0005132008.tif 000039
【図５】
0005132008.tif 000040
【図６】
0005132008.tif 000041
【図７】
0005132008.tif 000042
【図８Ａ】
0005132008.tif 000043
【図８Ｂ】
0005132008.tif 000044
【図９】
0005132008.tif 000045
【図１０】
0005132008.tif 000046
【図１１】
0005132008.tif 000047
【図１２】
0005132008.tif 000048
【図１３】
0005132008.tif 000049
【図１４Ａ】
0005132008.tif 000050
【図１４Ｂ】
0005132008.tif 000051
【図１５】
0005132008.tif 000052
【図１６Ａ】
0005132008.tif 000053
【図１６Ｂ】
0005132008.tif 000054
【図１７】
0005132008.tif 000055
【図１８】
0005132008.tif 000056
【図１９】
0005132008.tif 000057
【図２０Ａ】
0005132008.tif 000058
【図２０Ｂ】
0005132008.tif 000059
【図２１Ａ】
0005132008.tif 000060
【図２１Ｂ】
0005132008.tif 000061
【図２２】
0005132008.tif 000062
【図２３】
0005132008.tif 000063
【図２４】
0005132008.tif 000064
【図２５Ａ】
0005132008.tif 000065
【図２５Ｂ】
0005132008.tif 000066
【図２５Ｃ】
0005132008.tif 000067
【図２５Ｄ】
0005132008.tif 000068
【図２５Ｅ】
0005132008.tif 000069
【図２５Ｆ】
0005132008.tif 000070
【図２５Ｇ】
0005132008.tif 000071
【図２５Ｈ】
0005132008.tif 000072
【図２５Ｉ】
0005132008.tif 000073
【図２５Ｊ】
0005132008.tif 000074
【図２５Ｋ】
0005132008.tif 000075
【図２５Ｌ】
0005132008.tif 000076
【図２５Ｍ】
0005132008.tif 000077
【図２５Ｎ】
0005132008.tif 000078
【図２５Ｏ】
0005132008.tif 000079
【図２６Ａ】
0005132008.tif 000080
【図２６Ｂ】
0005132008.tif 000081
【図２６Ｃ】
0005132008.tif 000082
【図２６Ｄ】
0005132008.tif 000083
【図２６Ｅ】
0005132008.tif 000084
【図２６Ｆ】
0005132008.tif 000085
【図２６Ｇ】
0005132008.tif 000086
【図２７】
0005132008.tif 000087
【図２８】
0005132008.tif 000088
【図２９】
0005132008.tif 000089
【図３０Ａ】
0005132008.tif 000090
【図３０Ｂ】
0005132008.tif 000091
【図３０Ｃ】
0005132008.tif 000092
【図３０Ｄ】
0005132008.tif 000093
【図３０Ｅ】
0005132008.tif 000094
【図３０Ｆ】
0005132008.tif 000095
【配列表】
0005132008000001.app