(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メンブレンフィルター、および、該メンブレンフィルターの一方の面側に覆設され、該メンブレンフィルターとの間に空間を形成すると共に前記メンブレンフィルターとの密着が可能な透明フィルムから構成される試料捕集部と、
前記メンブレンフィルターを、その他方の面から支持する支持部材と、
前記メンブレンフィルターの他方の面側に設けられ、前記試料捕集部および前記支持部材を保持するとともに、前記メンブレンフィルターを透過した濾液が流入する濾液流入部と、
前記試料捕集部に前記空間と連通するように設けられた試料導入管と、
前記濾液流入部に連接された濾液排出管と、
を備えたことを特徴とするサンプリング装置。
【請求項２】
前記メンブレンフィルターの他方の面にその先端が対向するように、薬液注入管が設けられたことを特徴とする請求項１に記載サンプリング装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載のサンプリング装置を用いたサンプリング方法であって、
前記試料捕集部の空間内に、液体サンプルを導入し、該液体サンプルに含まれている微小物体を前記メンブレンフィルターの一方の面上に捕集した後、前記メンブレンフィルターの他方の面側から薬液を散布して前記捕集した菌体を染色し、次いで、前記メンブレンフィルターの一方の面側に前記透明フィルムを密着させることを特徴とするサンプリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体（液体）中に含まれる微小物体を捕集するためのサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法に関し、特に、流体（液体）中に含まれる菌体などの微生物を無菌状態で捕集するためのサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や食品・飲料製造ラインに設けられたバイオリアクターでは、製品の品質を保証するために、微生物汚染の有無を検査する必要がある。
従来、微生物を捕集（サンプリング）するには、サンプリングラインをスチーム滅菌した後、微生物を無菌的にサンプリングしていた。しかし、このようにスチーム滅菌を用いた場合、滅菌不良の可能性を否定できなかった。また、微生物をサンプリングするためのサンプリング容器には、これとバイオリアクターを接続する導管が連設されている。そして、微生物をサンプリングした後、その導管は、バイオリアクターとの接続部（接続口）からサンプリング容器までの間が開放系となるため、外部からの微生物の侵入が全くないとは言い切れなかった。
そこで、流体を無菌状態でサンプリングすることができる試料用容器を用いた流体サンプリング装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この装置は、無菌的に着脱可能なコネクタを介して、滅菌された試料用容器へ、無菌的にサンプリングするものである。
【特許文献１】特開２００５−１８１３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の流体サンプリング装置では、捕集したサンプルを分析する際、試料用容器から人手を介してサンプルを採取し、処理する必要があった。そのため、外部から試料用容器内へ微生物が侵入するおそれがあった。これらのことから、例えサンプルから微量の微生物が検出されても、その微生物がサンプルに由来するものであるという確証が得られなかった。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、流体（液体）中に含まれる微小物体を、無菌状態で捕集することができるサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るサンプリング装置は、メンブレンフィルター、および、該メンブレンフィルターの一方の面側に覆設され、該メンブレンフィルターとの間に空間を形成する透明フィルムから構成される試料捕集部と、前記メンブレンフィルターを、その他方の面から支持する支持部材と、前記メンブレンフィルターの他方の面側に設けられ、前記試料捕集部および前記支持部材を保持するとともに、前記メンブレンフィルターを透過した濾液が流入する濾液流入部と、前記試料捕集部に前記空間と連通するように設けられた試料導入管と、前記濾液流入部に連接された濾液排出管と、を備えたことを特徴とする。
【０００６】
前記メンブレンフィルターの他方の面にその先端が対向するように、薬液注入管が設けられたことが好ましい。
【０００７】
本発明に係るサンプリング方法は、本発明に係るサンプリング装置を用いたサンプリング方法であって、前記試料捕集部の空間内に、液体サンプルを導入し、該液体サンプルに含まれている微小物体を前記メンブレンフィルターの一方の面上に捕集した後、前記メンブレンフィルターの他方の面側から薬液を散布して前記捕集した菌体を染色し、次いで、前記メンブレンフィルターの一方の面側に前記透明フィルムを密着させることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のサンプリング装置によれば、メンブレンフィルター、および、該メンブレンフィルターの一方の面側に覆設され、該メンブレンフィルターとの間に空間を形成する透明フィルムから構成される試料捕集部と、前記メンブレンフィルターを、その他方の面から支持する支持部材と、前記メンブレンフィルターの他方の面側に設けられ、前記試料捕集部および前記支持部材を保持するとともに、前記メンブレンフィルターを透過した濾液が流入する濾液流入部と、前記試料捕集部に前記空間と連通するように設けられた試料導入管と、前記濾液流入部に連接された濾液排出管と、を備えたので、サンプリング終了後、試料捕集部を完全に密閉し、装置自体を顕微鏡観察に供するので、従来のように、試料用容器から人手を介してサンプルを採取する必要がないだけでなく、装置の外部から対象とするサンプルに微生物が侵入することを防止できる。したがって、検出された菌体などの微生物は全てサンプルに由来するものであると確証を得ることができ、厳密な微生物の検出を行うことができる。
【０００９】
本発明のサンプリング方法によれば、本発明に係るサンプリング装置を用いて、前記試料捕集部の空間内に、液体サンプルを導入し、該液体サンプルに含まれている微小物体を前記メンブレンフィルターの一方の面上に捕集した後、前記メンブレンフィルターの他方の面側から薬液を散布して前記捕集した菌体を染色し、次いで、前記メンブレンフィルターの一方の面側に前記透明フィルムを密着させるので、サンプリング終了後、試料捕集部を完全に密閉し、装置自体を顕微鏡観察に供するので、従来のように、試料用容器から人手を介してサンプルを採取する必要がないだけでなく、装置の外部から対象とするサンプルに微生物が侵入することを防止できる。したがって、検出された菌体などの微生物は全てサンプルに由来するものであると確証を得ることができ、厳密な微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のサンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法の最良の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１１】
図１は、本発明に係るサンプリング装置の一実施形態を示す概略構成図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
この実施形態のサンプリング装置１０は、メンブレンフィルター１１および透明フィルム１２から構成される試料捕集部１３と、支持部材１４と、濾液流入部１５と、試料導入管１６と、濾液排出管１７と、薬液注入管１８と、保持部材１９とから概略構成されている。
【００１２】
試料捕集部１３は、メンブレンフィルター１１、および、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ側に覆設され、すなわち、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａを覆うように設けられ、メンブレンフィルター１１との間に空間２０を形成する透明フィルム１２とから構成されている。また、メンブレンフィルター１１と透明フィルム１２は、隙間無く接合され、これらによって上記の空間２０が形成されている。
また、試料捕集部１３は、図１（ｂ）に示す二点鎖線で囲まれた部分が、保持部材１９と着脱可能となっていてもよい。
【００１３】
支持部材１４は、メンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂ側に設けられ、この他方の面１１からメンブレンフィルター１１を支持している。この支持部材１４は、試料捕集部１３の空間２０内に流入した液体の圧力によってメンブレンフィルター１１が変形することや、破損することを防止している。
濾液流入部１５は、その形状が摺鉢状をなしており、メンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂ側に設けられ、試料捕集部１３および支持部材１４を保持するとともに、メンブレンフィルター１１を透過した濾液が流入する部分である。
【００１４】
試料導入管１６は、試料捕集部１３に、その空間２０と連通するように設けられている。また、試料導入管１６の試料捕集部１３と連接している側とは反対の端部は、公知の無菌コネクタなどを介してバイオリアクターなどと着脱可能に連結されるようになっている。この試料導入管１６を介して、バイオリアクターなどから試料捕集部１３へ、微生物などの微小物体を含む液体を導入する。そのため、試料導入管１６の途中、かつ、試料捕集部１３とバイオリアクターなどとの間に、バイオリアクターなどから試料捕集部１３へ液体を送出するために、ペリスタポンプなどの送液ポンプ（図示略）が設けられている。
【００１５】
濾液排出管１７は、濾液流入部１５の摺鉢状の底部に連接され、メンブレンフィルター１１を透過した濾液を装置外へ排出するためのものである。また、濾液排出管１７の試料捕集部１３と連接している側とは反対の端部は、公知の無菌コネクタなどを介して濾液回収槽（容器）などと着脱可能に連結されるようになっている。また、濾液排出管１７の途中に、濾液流入部１５内の濾液を排出するために、ペリスタポンプなどの送液ポンプ（図示略）が設けられている。
【００１６】
薬液注入管１８は、メンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂ側から、この他方の面１１ｂにその先端１８ａが対向するように設けられている。この薬液注入管１８は、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ上に捕集された菌体などの微生物に、菌体の細胞壁処理薬液やＤＡＰＩ（４´，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）のような染色薬液を散布するためのものである。
【００１７】
保持部材１９は、上記の試料捕集部１３、支持部材１４、濾液流入部１５、試料導入管１６、濾液排出管１７および薬液注入管１８を保持し、試料捕集部１３において、バイオリアクターなどから導入された液体に含まれる微生物などの微小物体を捕集する操作を安定に行うためのものである。
【００１８】
メンブレンフィルター１１は、多孔質のフィルム状フィルターであり、均一で微細な孔（微細孔）が多数形成されたものである。
メンブレンフィルター１１をなす多孔質フィルムの材質としては、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、セルロースアセテートなどから選択される１種または２種以上が挙げられる。
また、メンブレンフィルター１１の微細孔の大きさは、捕集する微小物体の大きさに応じて適宜調整されるが、多くの菌体の大きさが０．５μｍ以上であることから、０．１μｍ〜０．４５μｍ以下であることが好ましく、目詰まりの具合から０．２０μｍ程度であることがより好ましい。
【００１９】
透明フィルム１２としては、透明かつ光透過性に優れる樹脂フィルムが用いられ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）などのポリエステル樹脂からなるフィルム；ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン樹脂からなるフィルム；ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレンなどのポリフッ化エチレン系樹脂からなるフィルム；ナイロン６、ナイロン６，６などのポリアミド樹脂からなるフィルム；ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリビニルアルコール、ビニロンなどのビニル重合体からなるフィルム；ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エチル、ポリアクリル酸エチル、ポリアクリル酸ブチルなどのアクリル系樹脂からなるフィルム；ポリスチレンからなるフィルム；ポリカーボネート（ＰＣ）からなるフィルム；ポリアリレートからなるフィルム；ポリイミドからなるフィルムなどが挙げられる。これらのフィルムの中でも、落射蛍光顕微鏡による観察を行う場合、無蛍光処理が施された無蛍光フィルムが用いられる。また、熱を加えることにより収縮するシュリンクフィルムも用いることができる。
【００２０】
支持部材１４は、金属や合成樹脂などからなるメッシュ状の部材であり、その網目の大きさは、メンブレンフィルター１１の微細孔よりも大きく設定される。
支持部材１４をなす金属や合成樹脂としては、バイオリアクターなどから試料捕集部１３内に導入される液体によって、腐食などにより劣化しない材質のものが用いられる。金属としては、例えば、ステンレスなどが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、上記の透明フィルム１２をなす樹脂と同様のものが挙げられる。
【００２１】
濾液流入部１５をなす材質としては、バイオリアクターなどから試料捕集部１３内に導入される液体によって、腐食などにより劣化しない金属や合成樹脂が用いられる。金属としては、例えば、ステンレスなどが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、上記の透明フィルム１２をなす樹脂と同様のものが挙げられる。
【００２２】
試料導入管１６および濾液排出管１７は、可撓性であり、バイオリアクターなどから試料捕集部１３内に導入される液体によって、腐食などにより劣化しない金属や合成樹脂が用いられる。金属としては、例えば、ステンレスなどが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、上記の透明フィルム１２をなす樹脂と同様のものが挙げられる。
【００２３】
薬液注入管１８をなす材質としては、バイオリアクターなどから試料捕集部１３内に導入される液体によって、腐食などにより劣化しない金属や合成樹脂が用いられる。金属としては、例えば、ステンレスなどが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、上記の透明フィルム１２をなす樹脂と同様のものが挙げられる。
【００２４】
保持部材１９の材質は特に限定されないが、バイオリアクターなどから試料捕集部１３内に導入される液体によって、腐食などにより劣化しない金属や合成樹脂が好ましい。
【００２５】
次に、このサンプリング装置１０の作用について、このサンプリング装置１０を用いた菌体のサンプリング法を例に挙げて説明する。
【００２６】
無菌コネクタによりバイオリアクターに接続された試料導入管１６を介して、サンプリング装置１０の試料捕集部１３の空間２０内に、液体のサンプル（液体サンプル）を導入する。この際、試料導入管１６に設けられたペリスタポンプなどの送液ポンプ（Ａ）を用いて、バイオリアクターから試料捕集部１３の空間２０内に液体サンプルを導入する。
また、試料捕集部１３内への液体サンプルの導入を開始するとほぼ同時か、あるいは、導入を開始してからしばらく後に、濾液排出管１７に設けられたペリスタポンプなどの送液ポンプ（Ｂ）を用いて、メンブレンフィルター１１を透過し、濾液流入部１５内に流入した濾液の排出を開始する。
【００２７】
この際、試料導入管１６に設けられた送液ポンプ（Ａ）と、濾液排出管１７に設けられた送液ポンプ（Ｂ）とを調節し、試料捕集部１３内に導入される液体サンプルの流量（流速）と、濾液流入部１５から排出する濾液の流量（流速）とを等しくして、メンブレンフィルター１１上部の空間（メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ側の空間）には圧力が加わらないようにする。これにより、メンブレンフィルター１１および透明フィルム１２の破損を防止することができる。
【００２８】
試料捕集部１３の空間２０内に流入した液体サンプルは、メンブレンフィルター１１を透過し、濾液流入部１５から濾液排出管１７を介して、サンプリング装置１０の外部に排出される。また、液体サンプルに含まれていた菌体は、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ上に捕集される。
【００２９】
液体サンプルの濾過が終了した後、薬液注入管１８からメンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂに対して、菌体の細胞壁処理薬液やＤＡＰＩ（４´，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）のような染色薬液を散布し、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ上に捕集された菌体を染色する。このように、メンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂ側から薬液を散布すれば、薬液はメンブレンフィルター１１を透過すし、菌体を染色することができる。一方、サンプリング装置１０外からメンブレンフィルター１１の他方の面１１ｂ側に微生物が侵入したとしても、細菌レベルの大きさではメンブレンフィルター１１を透過することができないため、この微生物がメンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ上に捕集された菌体と混在した状態になることはない。したがって、本発明では、液体サンプルに由来する菌体のみを捕集することができる。
【００３０】
菌体の染色が完了した後、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ側に透明フィルム１２を密着させる。これにより、試料導入管１６も密閉され、試料捕集部１３は完全に密閉された状態となる。メンブレンフィルター１１に透明フィルム１２を密着させるには、真空ポンプなどにより、試料捕集部１３の空間２０内空気またはガスを排除して、空間２０内を減圧するか、あるいは、シュリンクフィルムを用いた場合、瞬時に１００℃程度まで加熱してフィルムを収縮させる。
【００３１】
透明フィルム１２の密着が完了した後、試料導入管１６をバイオリアクターから取り外すとともに、濾液排出管１７を濾液回収槽（容器）から取り外し、サンプリング装置１０を蛍光顕微鏡のステージに載置する。
そして、メンブレンフィルター１１の一方の面１１ａ上に捕集された菌体について、落射蛍光顕微鏡観察を行う。
なお、透明フィルム１２として、耐油性のフィルムを用いれば、その表面にオイルを塗布することができるので、油浸による観察も可能である。
【００３２】
この実施形態のサンプリング装置１０、および、このサンプリング装置１０を用いたサンプリング法によれば、サンプリング終了後、試料捕集部１３を完全に密閉し、装置自体を顕微鏡観察に供するので、従来のように、試料用容器から人手を介してサンプルを採取する必要がないだけでなく、装置の外部から対象とするサンプルに微生物が侵入することを防止できる。したがって、検出された菌体などの微生物は全てサンプルに由来するものであると確証を得ることができ、厳密な微生物の検出を行うことができる。
【００３３】
なお、この実施形態では、サンプリング終了後、サンプリング装置１０を顕微鏡観察に供しているが、本発明はこれに限定されず、上述のように、試料捕集部１３を保持部材１９に対して着脱可能とし、試料捕集部１３のみを顕微鏡観察に供してもよい。
また、この実施形態では、液体サンプルに含まれる微生物をサンプリングする場合を例示したが、本発明はこれに限定されず、流体（液体）中に含まれるその他の微小物体をサンプリングし、その微小物体を顕微鏡観察する場合にも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係るサンプリング装置の一実施形態を示す概略構成図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【符号の説明】
【００３５】
１０・・・サンプリング装置、１１・・・メンブレンフィルター、１２・・・透明フィルム、１３・・・試料捕集部、１４・・・支持部材、１５・・・濾液流入部、１６・・・試料導入管、１７・・・濾液排出管、１８・・・薬液注入管、１９・・・保持部材、２０・・・空間。
【図１】
0005167898.tif 000002