(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、変形性関節症又は関節リウマチにおける関節痛の評価方法。
ステップ１：関節痛が疑われる患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定するステップ、
ステップ２：ステップ１で測定したＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量とを比較するステップ、
ステップ３：標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量に比べ、ステップ１で測定したＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が多いときには痛みが強いと評価するステップ。
【請求項２】
標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量が健常者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、変形性関節症又は関節リウマチにおける関節痛の治療薬剤のスクリーニング方法；
ステップ１：非ヒト関節痛モデル動物に薬剤を投与するステップ、
ステップ２：薬剤投与前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、薬剤投与後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量とを比較するステップ、
ステップ３：薬剤投与前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量に比べ、薬剤投与後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が低下していれば、当該薬剤が有効であると評価するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節痛の評価方法、関節痛の治療効果の判定方法及び関節痛の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、関節痛の評価方法としてはＶｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）が用いられているが、被験者による誤差が大きく、客観的な評価が困難であるという問題があった。
【０００３】
非特許文献１には、関節中のヌクレオシドトリホスフェートピロホスホヒドロラーゼの基質としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）が記載され、変形性関節症等における関節液中のＡＴＰ濃度が測定されたことが記載されているが（表１）、ＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と関節痛との関連については記載がない。
【０００４】
非特許文献２には、Ｐ２Ｚ／Ｐ２Ｘ７ ＡＴＰ受容体の選択的阻害剤である酸化ＡＴＰが炎症性の痛みを緩和することが記載されている。また、末梢皮下炎症組織におけるＡＴＰレベルは酸化ＡＴＰの投与によって顕著に減少すること（図４）等が記載されている。しかしながら、関節液中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量の痛みとの相関については記載がない。
【非特許文献１】Lawrence M Ryan, John W Rachow, Daniel J McCarty (1991) Synovial Fluid ATP: A Potential Substrate for the Production of Inorganic Pyrophosphate. J Rheumatology 18:5 716-720
【非特許文献２】Giacomo Dell'Antonioら、Relief of Inflammatory Pain in Rats by Local Use of the Selective P2X7 ATP Receptor Inhibitor, Oxidized ATP. Arthritis and rheumatism; 46(12)p3378-85
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、関節痛の程度を、患者に苦痛を与えずに、正確かつ簡便に評価できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が関節痛の程度とよく相関することを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定するステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の評価方法。
（２）下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の評価方法；
ステップ１：関節痛が疑われる患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定するステップ、
ステップ２：ステップ１で測定したＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量とを比較するステップ。
（３）標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量が健常者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡ
ＴＰ量である、（２）に記載の評価方法。
（４）関節痛の治療前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、関節痛の治療後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量とを比較するステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の治療効果の判定方法。
（５）下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の治療薬剤のスクリーニング方法；
ステップ１：非ヒト関節痛モデル動物に薬剤を投与するステップ、
ステップ２：薬剤投与前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、薬剤投与後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量とを比較するステップ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の関節痛の評価方法により、関節痛の程度を、患者に苦痛を与えずに、正確かつ簡便に評価することができる。さらに、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を関節痛の客観的なパラメーターとして利用することで、関節痛の治療効果の客観的な判定、関節痛の治療薬剤のスクリーニング、関節痛の原因分析を行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の評価方法は、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定するステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の評価方法である。
【００１０】
本発明の評価方法の評価対象は、各種の関節炎症患者等関節痛を訴える患者が好ましい。各種の関節炎症として、具体的には、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、ＣＰＰＤ関節症（ＣＰＰＤ）、特発性骨懐死（ＯＮ）等である。本発明の評価方法は、特に、ＯＡにおける関節痛の評価に適している。
【００１１】
関節液は、関節痛を評価する対象〔哺乳動物（ヒトを含む）〕から単離された関節液を用いることができる。例えば、ヒトの関節痛を評価する場合には、評価対象者の問題となる関節の関節液を採取して用い、イヌやウマ等の動物の関節痛を評価する場合には、評価対象動物の問題となる関節の関節液を採取して用いることができる。
【００１２】
なお、本発明で使用する関節液は、ＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量測定前に不溶性異物や血液、タンパク質等を除去するため、酸、有機溶媒等でのタンパク変性、フィルター、限外濾過膜等での濾過、遠心分離等の固液分離処理等を行うことが好ましい。また、生理食塩水等で適宜希釈した関節液を用いることもできる。
【００１３】
本発明の評価方法におけるＡＴＰ量としては、例えば関節痛を評価する対象から通常の整形外科的方法により採取できる関節液総量中に含まれるＡＴＰ量（本明細書において「ＡＴＰ総量」又は「関節液中ＡＴＰ総量」と略記することがある）を用いることができる。ＡＴＰ総量を指標として用いることにより、より精度の高い評価を行うことができ好ましい。
【００１４】
本発明の評価方法におけるＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量の測定方法は、関節液検体中に含まれるＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を定量的に測定できる方法である限りにおいて限定されず、常法を用いることができる。例えば、ＡＴＰと発光試薬を反応させて、発生した光を光センサーで計測する方法等が挙げられる。
【００１５】
ＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量の測定方法について、具体的な方法を次に説明するが、これに限定されるものではない。生理食塩水等で適当に希釈した関節液検体に、発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ2+等）を添加して、検体中のＡＴＰと発光試薬を反応さ
せる。そして、この反応により発生した光を光センサーで一定時間計測する。ＡＴＰ測定試薬及び光センサーは、市販のものを用いることができる。例えば、ＡＴＰ測定試薬としては、ルシフェラーゼ２５０プラス（キッコーマン株式会社製）等を用いることができる。
【００１６】
本発明の評価方法によれば、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が関節炎症に伴う痛みの程度とよく相関することを利用して、関節痛の評価を行うことができる。例えば、関節液検体中のＡＴＰ濃度が高い又はＡＴＰ量が多い時には痛みが強いと評価される。このような痛みの評価は、従来、患者の申告に基づくＶＡＳにより行われていたが、ＶＡＳによる痛みの評価は個人差等による誤差が大きい。本発明の評価方法においては、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を痛みの客観的パラメーターとして用いることにより、正確に痛みを評価することができる。
【００１７】
また、関節炎症患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、関節痛の程度の評価・判定基準となる、関節液検体中の標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量とを比較することにより、関節痛の評価を行うことができる。標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量としては、当該患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量、当該患者以外の患者又は健常者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量、及び複数の患者又は健常者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量から統計的に得られたＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量等を用いることができる。標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量は、評価・判定対象、目的及び疾患の種類等によって上記標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量から適宜選択される。このように、対象の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と標準ＡＴＰ濃度又は標準ＡＴＰ量とを比較することにより、関節痛の程度を評価することもできる。
【００１８】
なお、本発明の評価方法において、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と痛みの程度（ＶＡＳスコア等）との標準曲線（検量線）を用いて、評価を行うこともできる。すなわち、測定結果から得られるＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量に対する痛みの程度を検量線から読み取り、痛みの程度を評価することができる。
【００１９】
本発明の判定方法は、関節痛の治療前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、関節痛の治療後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量とを比較するステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の治療効果の判定方法である。なお、本明細書において「関節痛の治療」とは、関節痛のみを治療するものや、関節炎症及び関節痛両方を治療するもののいずれであってもよい。
【００２０】
関節炎症患者に抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬を投与する場合において、投与前及び投与後の当該患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を継続的に測定し、その濃度を比較することにより、そのＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が低下していれば、関節炎症による痛みが治療されていると判定することができる。同様に関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が変化しなければ、関節炎症による痛みが維持されていること、関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が上昇していれば、関節炎症による痛みが悪化していることが判定される。
【００２１】
このように、本発明の判定方法は、抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の治療効果の判定や、投与する抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の変更や選択等、治療方針に有用な情報を提供するものである。
【００２２】
また、初診の関節炎症患者のように、関節炎症の程度が未知の患者の場合は、本発明の評価方法により、当該患者由来の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定し、そのＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量から、当該患者の関節炎症による痛みがどの程度かを評価するこ
とができる。これによっても、投与する抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の選択等、関節炎症の治療方針に有用な情報を提供するものである。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法は、非ヒト関節痛モデル動物に薬剤を投与するステップと、薬剤投与前における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量と、薬剤投与後における関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量とを比較するステップを少なくとも含むことを特徴とする、関節痛の治療薬剤のスクリーニング方法である。
非ヒト関節痛モデル動物としては特に限定されないが、関節痛を発症するように処置されたマウス等のモデル動物である。
【００２４】
抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の候補物質の有効性を評価する場合において、当該候補物質投与前及び投与後の関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量を測定し、その濃度又は量を比較することにより、そのＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が低下していれば、当該候補物質が有効であると判定することができる。同様に関節液検体中のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ量が変化しなければ、当該候補物質が有効でないと判定される。
【００２５】
このように、本発明のスクリーニング方法は、抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の候補物質の有効性の評価等、抗関節炎薬及び／又は抗関節痛薬の開発に有用な情報を提供するものである。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］
各種関節炎症患者における関節液中及び血漿中のＡＴＰ濃度（平均値）を測定した。
動作における明確な痛み及び水腫性関節症を有する、４８人のＯＡ患者における５２膝の膝関節を被験対象とした。
化膿性関節症の患者で、過去３ヶ月以内にヒアルロン酸（ＨＡ）注射又はステロイド注射による治療を受けた患者、血清反応陰性関節炎の疑いの患者で、非ステロイド抗炎症薬を服用している患者を除いた。全ての患者に本実験の趣旨を説明し、同意を得た。
【００２８】
同様に、３人のＲＡ患者における５膝関節、７人のＣＰＰＤ患者における７膝関節、３人のＯＮ患者における３膝関節を被験対象とした。
【００２９】
対象より２２Ｇニードルで関節液及び血漿を静かに回収し、関節液及び血漿検体とし、ＡＴＰ濃度を測定した。
【００３０】
ＡＴＰ濃度の測定は、以下のようにして行った。
ＡＴＰはルシフェラーゼアッセイ（ルシフェラーゼ２５０プラス、キッコーマン株式会社製）により測定した。関節液及び血漿を２２Ｇニードルで0.5ccを静かに吸引し、タンパク質を除去するため、5mlの0.6N  過塩素酸（除タンパク液）とすばやく混合した。混合液を3,000rpm、10分、4℃で遠心分離し、上清を分離した。上清を、2.5mol/L  炭酸カリウム及び0.5mol/L  トリエタノールアミン塩酸塩を含むバッファー（中和液）と、1:10の割合で混合し、ホモジナイズし、安定するまで10分、4℃で静置した。これを3,000rpm、10分、4℃で遠心分離し、上清を分離した。50mlの発光試薬を50mlの上清に加えた。発光強度を測定し、検量線に基づいてＡＴＰ濃度を求めた。除タンパク液及び中和液で希釈された割合から、血漿及び関節液中のＡＴＰ濃度を算出した。
結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
0005241255.tif 000002
【００３２】
［実施例２］
関節炎症患者における、関節炎治療前及び治療後における、血漿中及び関節液中ＡＴＰ濃度、関節液中ＡＴＰ総量、関節液総量及びＶＡＳスコアを比較した。また、ΔＶＡＳスコア及び関節液中ΔＡＴＰ総量間の相関、ΔＶＡＳスコア及びΔ関節液総量の相関、関節液中ＡＴＰ総量と関節液総量の相関、及び血漿中ＡＴＰ濃度と関節液中ＡＴＰ濃度の相関を調べた。ΔＶＡＳスコアは、治療前のＶＡＳスコアから治療後のＶＡＳスコアを減じることにより決定した。関節液中のΔＡＴＰ総量は、治療前の関節液中のＡＴＰ総量から治療後の関節液中のＡＴＰ総量を減じることにより決定した。Δ関節液総量は、治療前の関節液総量から治療後の関節液総量を減じることにより決定した。
【００３３】
実施例１における関節炎症患者中、１６人のＯＡ患者に、定期的に５回のＨＡ注射を処置した。すなわち、ヒアルロン酸製剤（HA90:Artz（登録商標）、生化学工業株式会社製、平均分子量900kD）を関節注射にて用いた。上記ヒアルロン酸製剤は５週間に渡り、１週間に１回投与した。１回目の投与の際に、２２Ｇニードルで関節液及び血漿を静かに回収した。１回目の投与の６週間後、関節液及び血漿を再度回収した。関節液に血液を含む場合、血液を除去し、ＡＴＰ濃度を測定した。関節痛を100mm ＶＡＳにて１回目及び５回目の投与後１週間後に評価した。
【００３４】
（ＡＴＰ濃度）
血漿中のＡＴＰ濃度は、治療前で63.4±20.2μmol/L、治療後で55.2±16.4μmol/Lであった。関節液のＡＴＰ濃度は、治療前で0.070±0.087μmol/L、治療後で0.033±0.018μmol/Lであった。結果を図１に示す。
関節液中のＡＴＰ濃度は、治療後では治療前に比べて有意に低かった(p=0.04)。血漿中のＡＴＰ濃度は、治療後と治療前の差は関節液中のＡＴＰ濃度ほど顕著には見られなかった。
【００３５】
（ＡＴＰ総量）
関節液中のＡＴＰ総量は、治療前と治療後でそれぞれ0.369±0.44nmol及び0.142±0.13nmolであった。結果を図２に示す。
関節液中のＡＴＰ総量は、治療後では治療前に比べて有意に低かった(P=0.02)。
【００３６】
（関節液総量）
関節液総量とは、ニードルを関節腔に刺して関節液を吸引する場合において、吸引できる関節液の総量のことである。
関節液総量は、治療前と治療後でそれぞれ9.0±7.1ml及び6.8±5.7mlであった。結果を図３に示す。
関節液総量は、治療後では治療前に比べて有意に低かった(P=0.02)。
【００３７】
（各対象のＡＴＰ総量）
各対象の治療前と治療後における関節液中のＡＴＰ総量を図４に示す。
各対象の関節液中のＡＴＰ総量は、治療後で治療前に比べて低いケースがほとんどであった。
【００３８】
（ＶＡＳスコア）
ＶＡＳスコアは、治療前と治療後でそれぞれ60.9±20.8mm及び33.7±24.8mmであった。結果を図５に示す。
ＶＡＳスコアは、治療後では治療前に比べて有意に低かった(p=0.002)。
【００３９】
（ΔＶＡＳスコア及びΔＡＴＰ総量間の相関）
ΔＶＡＳスコアと関節液中のΔＡＴＰ総量との相関を検討した。結果を図６に示す。
ΔＶＡＳスコアは関節液中のΔＡＴＰ総量と有意に相関した(R=0.05, P=0.04)。
【００４０】
（ΔＶＡＳスコア及びΔ関節液総量間の相関）
ΔＶＡＳスコアとΔ関節液総量との相関を検討した。結果を図７に示す。
ΔＶＡＳスコアはΔ関節液総量と有意に相関した(R=0.74, P=0.004)。
【００４１】
（関節液中ＡＴＰ総量及び関節液総量間の相関）
関節液中ＡＴＰ総量と関節液総量との相関を検討した。結果を図８に示す。
関節液中ＡＴＰ総量は関節液総量と有意に相関した(R=0.89, P<0.0001)。
【００４２】
（関節液中ＡＴＰ濃度及び血漿中ＡＴＰ濃度間の相関）
関節液中ＡＴＰ濃度と血漿中ＡＴＰ濃度との相関を検討した。結果を図９に示す。
関節液中ＡＴＰ濃度は血漿中ＡＴＰ濃度と相関しなかった(R=0.09, P=0.54)。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒアルロン酸製剤の関節注射前と関節注射後における、血漿及び関節液におけるＡＴＰ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【図２】ヒアルロン酸製剤の関節注射前と関節注射後における、関節液におけるＡＴＰ総量（ｎｍｏｌ）を示す。
【図３】ヒアルロン酸製剤の関節注射前と関節注射後における、関節液総量（ｍｌ）を示す。
【図４】ヒアルロン酸製剤の関節注射前と関節注射後における、各対象の関節液におけるＡＴＰ総量（ｎｍｏｌ）を示す。
【図５】ヒアルロン酸製剤の関節注射前と関節注射後における、ＶＡＳスコアを示す。
【図６】ΔＶＡＳスコアと関節液におけるΔＡＴＰ総量（ｎｍｏｌ）との関係を示す。
【図７】ΔＶＡＳスコアとΔ関節液総量（ｍｌ）との関係を示す。
【図８】関節液総量（ｍｌ）と関節液におけるＡＴＰ総量（ｎｍｏｌ）との関係を示す。
【図９】血漿中ＡＴＰ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と関節液中ＡＴＰ濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）との関係を示す。
【図１】
0005241255.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005241255.tif 000009
【図８】
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【図９】
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