(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位と、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む共重合体であって、前記共重合体の少なくとも片側の末端に下記の一般式［４］で表される構造を有し、
前記生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーであって、当該活性エステル基は、エステル基の片方の置換基に電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル基であることを特徴とする医療材料用高分子化合物。
【化１】
0005167811.tif 000014
（式中R１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【化２】
0005167811.tif 000015
（式［４］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基、フェノキシ基、アセトキシ基又は水酸基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項２】
前記重合体が、更に疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を含む共重合体であることを特徴とする、請求項１に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項３】
前記一般式［４］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基である請求項１又は２に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項４】
前記活性エステル基は、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類である請求項１〜３のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項５】
前記活性エステル基が−ＣＯＯＲ”で表され、Ｒ”がｐ−ニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フタルイミド、又は５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである請求項１〜４のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項６】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項１〜５のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるモノマーである請求項１〜６のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【化３】
0005167811.tif 000016
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項８】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである請求項１〜７のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項９】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である請求項８に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項１０】
前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基がアルキル基である請求項２〜９のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項１１】
前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基が炭素数３〜２０のアルキル基である請求項２〜１０のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項１２】
前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである請求項１１に記載の医療材料用高分子化合物。
【請求項１３】
下記の一般式［３］で表されるメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）と、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）をラジカル重合することにより、末端に下記の一般式［４］で表される構造を導入した高分子化合物を得、前記生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーであって、当該活性エステル基は、エステル基の片方の置換基に電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル基であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物の製造方法。
【化４】
0005167811.tif 000017
（式中R１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【化５】
0005167811.tif 000018
（式中Ｒ4は炭素数１〜２０のアルキル基を示し、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基、フェノキシ基、アセトキシ基又は水酸基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の医療材料用高分子化合物または請求項１３に記載の製造方法で得られる医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医療材料用表面コーティング材料を含む層を基板表面に形成したバイオチップ用基板。
【請求項１６】
前記基板がプラスチック製である請求項１５に記載のバイオチップ用基板。
【請求項１７】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項１６に記載のバイオチップ用基板。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。
【請求項１９】
前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖タンパク質から選ばれる少なくとも一つの生理活性物質である請求項１８に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療材料用高分子化合物、該高分子材料を含む表面コーティング材料、該高分子化合物を用いたバイオチップ基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高いタンパク質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、タンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものを総称する。【０００４】
現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、タンパク質、またはそれを捕捉する分子をガラス基板のようなチップ表面にスポット状に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。たとえば、タンパク質の物理的吸着による固定化などが行われている。このようなプロテインチップにおいてはシグナルが高いほうが好ましいため、よりタンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する能力の高いものが求められている。【０００５】
一方、プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。【０００６】
前述のタンパク質の物理的吸着による固定化では、タンパク質を固定化した後に２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化したタンパク質がコーティングされてしまい、２次抗体との反応性が悪くなるという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。【０００７】
バイオチップに対する生理活性物質の非特異的吸着量を低減させるには、バイオチップの親水性を向上させるのが有効であるが、このようなバイオチップを用いた場合、親水性が高いためにタンパク質を捕捉させた後の洗浄工程において基板に固定化したタンパク質またはそれを捕捉する分子が流出し、信号が低下するという問題があった。この問題に対する１つのアプローチとして、官能基、スペーサー基、および結合基を含む活性成分、架橋用成分、マトリックス形成成分を支持体上に被覆し、硬化させることで、支持体上に強固に結合した機能性表面を形成できることが開示されている（たとえば、特許文献２）。しかしながら、この開示された方法では支持体上で低分子成分の硬化が進行するが、硬化反応は反応物の体積収縮を伴うため、支持体がプラスチック基板の場合には反りや変形が起きる恐れがあった。また、網の目状に絡み合ったマトリックスが形成されることから、生理活性物質を固定化するための官能基の反応が抑制されたり、固定化した生理活性物質の機能発現の再現性が悪いなどの問題があった。また、洗浄を行ってもマトリックス内部に入り込んだタンパク質を除去しきれないために非特異吸着を十分に抑制できないといった問題もあった。【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特表２００４−５３１３９０号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有し、特にプラスチック基材表面へも好適にコーティング可能な医療用高分子化合物を提供すること、さらには前記特性に加えてタンパク質に対して非特異吸着のより少ない医療用高分子化合物を提供すること、ならびに該高分子化合物を用いてＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少ない医療材料用高分子化合物の開発を目指して鋭意検討を行った。その結果、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）からなる共重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有することを特徴とする医療材料用高分子化合物が、生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有し、プラスチック基板上にも均一にかつ反りやうねりなどの問題が生じることなくコーティングできること、および該高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）からなる成分を加えることによりタンパク質等の非特異吸着をより少なくできることを見出した。さらにはこれらの医療材料用高分子化合物が、バイオチップに好適に用いられることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち本発明は、
（１）少なくとも、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位と、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む共重合体であって、前記共重合体の少なくとも片側の末端に下記の一般式［４］で表される構造を有し、
前記生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーであって、当該活性エステル基は、エステル基の片方の置換基に電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル基であることを特徴とする医療材料用高分子化合物、
【００１２】
【化１】
0005167811.tif 000002
（式中R１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。
式［４］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基、フェノキシ基、アセトキシ基又は水酸基であり、その他はアルキル基を示す。）
（２）前記重合体が、更に疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を含む共重合体であることを特徴とする（１）に記載の医療材料用高分子化合物、
（３）前記一般式［４］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の医療材料用高分子化合物、
（４）前記活性エステル基は、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類である（１）〜（３）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（５）前記活性エステル基が−ＣＯＯＲ”で表され、Ｒ”がｐ−ニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フタルイミド、又は５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである（１）〜（４）記載の医療材料用高分子化合物、
（６）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（１）〜（５）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［２］で表されるモノマーである（１）〜（６）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
【００１３】
【化２】
0005167811.tif 000003
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（８）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである（１）〜（７）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（９）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（８）記載の医療材料用高分子化合物、
（１０）前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基がアルキル基である（２）〜（９）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（１１）前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基が炭素数３〜２０のアルキル基である（２）〜（１０）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（１２）前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである（１１）記載の医療材料用高分子化合物、
（１３）下記の一般式［３］で表されるメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）と、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）をラジカル重合することにより、末端に下記の一般式［４］で表される構造を導入した高分子化合物を得、前記生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が前記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーであって、当該活性エステル基は、エステル基の片方の置換基に電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル基であることを特徴とする（１）〜（１２）いずれか記載の医療材料用高分子化合物の製造方法、
【００１４】
【化３】
0005167811.tif 000004
（式中Ｒ4は炭素数１〜２０のアルキル基を示し、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個はアルコキシル基、フェノキシ基、アセトキシ基又は水酸基であり、その他はアルキル基を示す。）
（１４）（１）〜（１２）いずれか記載の医療材料用高分子化合物または（１３）の製造方法で得られる医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料、
（１５）（１４）記載の医療材料用表面コーティング材料を含む層を基板表面に形成したバイオチップ用基板、
（１６）前記基板がプラスチック製である（１５）記載のバイオチップ用基板、
（１７）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（１６）記載のバイオチップ用基板、
（１８）（１５）〜（１７）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ、
（１９）前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖タンパク質から選ばれる少なくとも一つの生理活性物質である（１８）記載のバイオチップ、
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程においても溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有し、特にプラスチック基材表面へも好適にコーティング可能な高分子化合物を提供することができる。また、高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を加えることにより、タンパク質の非特異吸着がより少ない医療用高分子化合物を提供できる。更には、該高分子化合物を用いてＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の高分子化合物は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有する医療材料用高分子化合物であることを特徴とする。この高分子化合物は、特定の生理活性物質を固定化する性質をしている。さらに、少なくとも片側の末端に反応性官能基を有することから、基材と共有結合を形成することが可能になり、これにより基材の表面に該高分子化合物をグラフトさせることができる。このようにして得られたグラフト化基材は、洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない。また、該高分子化合物は体積収縮を伴う程の硬化反応を必要とせず、基材上に形成される該高分子化合物の膜中には基本的に高度に発達した網目構造が形成されないので、プラスチック基板上にも均一にかつ反りやうねりなどの問題が生じることなくコーティングが可能になる。
更に、該高分子化合物の成分としてアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を加えることにより、アルキレングリコール残基がタンパク質の非特異的吸着を抑制する役割を果たすので、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質が増す。【００１７】
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレートなどがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高いビオチンが好ましい。なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基が最も好ましい。【００１８】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、下記の一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。特に、アルキレングリコール残基の連鎖は、それ自体がタンパク質の非特異吸着を抑制する性質を有している。このため、（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合したモノマーは、生理活性物質を固定化する性質とタンパク質の非特異吸着を抑制する性質とを併せ持つ。従ってこのようなモノマーの重合体は、たとえ単独の重合体であったとしても、少なくとも片側の末端に反応性官能基を有していれば、医療用高分子化合物として好適に用いることができる。なお、本発明において（メタ）アクリルはアクリル及び／又はメタクリルを示し、（メタ）アクリレートは、アクリレート及び／又はメタクリレートを示す。【００１９】
【化４】
0005167811.tif 000005
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）【００２０】
式［１］で、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。なおここで、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端又は両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。
Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、より好ましくは２〜５０の整数であり、更に好ましくは２〜３０の整数であり、最も好ましくは２〜２０の整数である。各種ｐの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸは同一であっても、異なっていてもよい。
式［１］で、Ｘがアルキル基の場合、ｐ個分のアルキル基の炭素数の合計（（Ｘ）ｐ）が１〜１００であることが好ましく、１〜２０であることがより好ましい。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。【００２１】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。【００２２】
このような活性エステル基としては、−ＣＯＯＲ”で表されるＲ”に上記酸性度が高い電子吸引性基を有するものが挙げられる。例えば上記Ｒ”がｐ−ニトロフェニルである、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基；上記Ｒ”がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、上記Ｒ”がフタル酸イミドである、フタル酸イミド活性エステル基；上記Ｒ”が５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でも保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。【００２３】
生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートやスクシンイミドオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを挙げることができるが、中でも、下記式で表されるｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートが好ましい。なお、エチレングリコールの繰り返し数ｐ及び／又はｐの平均値は２〜２０が好ましい。【００２４】
【化５】
0005167811.tif 000006
【００２５】
本発明の高分子化合物において、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜９９．７ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜７０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜５０ｍｏｌ％である。【００２６】
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、特に構造を限定しないが、一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。【００２７】
【化６】
0005167811.tif 000007
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）【００２８】
式中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。各種ｑの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｑは平均値として特定される。繰り返し数ｑが２以上の場合は、Ｙは同一であっても、異なっていてもよい。【００２９】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、生理活性物質の非特異的吸着の少なさ及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。中でも、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点から好ましく用いられる。【００３０】
本発明の高分子化合物において、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のから誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％である。【００３１】
本発明に使用する高分子化合物は、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有していれば、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）以外に、他のエチレン系不飽和重合性モノマーを含んでも良い。例えばプラスチック基板等への塗布性が向上する点から、更に疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる高分子化合物であってもよい。疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、生理活性物質を固定化する官能基や、アルキレングリコール残基を有することなく、疎水基を有すれば、特に構造は限定されない。疎水基としては、直鎖、分岐鎖、環状の脂肪族炭化水素基や芳香族炭化水素基などが挙げられる。疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）としては、（メタ）アクリル基（ＣＨ２＝ＣＲ５−ＣＯＯ−、ここでＲ５は、水素原子またはメチル基を示す。）に疎水基が結合したモノマーが好ましく、脂肪族炭化水素が結合した（メタ）アクリレート類や芳香族炭化水素が結合した（メタ）アクリレート類が挙げられる。より好ましくは、合成時の操作性の良さの点から、前記疎水基がアルキル基である（メタ）アクリレート類である。さらに好ましくは、前記アルキル基が炭素数３〜２０のアルキル基である（メタ）アクリレート類である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。【００３２】
具体的なモノマーの例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかでも入手性の良さの点から、最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートである。【００３３】
本発明の高分子化合物において、疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜７０ｍｏｌ％である。エチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）のポリマー中での組成比が上限値を超えるとタンパク質等の生理活性物質の非特異的吸着が多くなるおそれがある。【００３４】
前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基は、バイオチップ基板に用いられるような基板の表面と共有結合可能な官能基であれば、特に限定されるものではない。用いられる基板の表面に存在する官能基に合わせて、適宜、共有結合可能な反応性官能基を選択することができる。用いられる基板は、後述のように通常、プラスチック、ガラス基板等が多く用いられ、表面に水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基等を導入することができるため、末端に導入される反応性官能基としては、例えば、反応性シリル基、エポキシ基、アミノ基等が挙げられる。【００３５】
中でも、比較的温和な条件で基板と反応させることができることから、前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基は、反応性シリル基であることが好ましい。ここで、反応性シリル基としては、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、シラノール基などが挙げられる。加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、反応性シリル基としては、下記一般式［４］で表される構造が挙げられる。【００３６】
【化７】
0005167811.tif 000008
式［４］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性官能基内の反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。ここで、反応性部位とは、基板と共有結合し得る部位をいう。反応性部位としては、アルコキシル基、ハロゲン基、アミノ基、イソシアネート基、フェノキシ基、水酸基などが挙げられる。【００３７】
好適な反応性官能基としては、例えば、ハロゲン化シリル基（≡Ｓｉ−Ｘ、ここでＸはハロゲン基）、アルコキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＲ、ここでＲはアルキル基）、フェノキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＰｈ、ここでＰｈはフェニル基）、アセトキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＯＣＣＨ3）等が挙げられる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、中でもシラノール基を生成しやすい点からアルコキシシリル基が特に好ましい。【００３８】
前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基の導入割合は、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０．２〜１０ｍｏｌ％であることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｏｌ％である。【００３９】
また、末端に反応性官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）を溶媒中でラジカル重合する方法が簡便で好ましい。必要に応じて上記モノマー（ｂ）、上記モノマー（ｃ）、その他を添加しても良い。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が連鎖移動剤として働くため、末端に反応性官能基を有する高分子化合物が得られる。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）は特に限定されるものではないが、下記の一般式［３］で表されるメルカプトシラン化合物が好ましい。【００４０】
【化８】
0005167811.tif 000009
式［３］でアルキル基Ｒ4の炭素数は１〜２０であり、より好ましくは１〜５であり、最も好ましくは１〜３である。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性官能基内の反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。反応性部位としては、アルコキシル基、ハロゲン基、アミノ基、イソシアネート基、フェノキシ基、水酸基などが挙げられるが、中でもシラノール基を生成しやすい点からアルコキシル基が最も好ましい。また、ポリマーの長期保存が必要な場合に、保存性が良い点からは、反応性官能基内の反応性部位は１つであることが好ましい。【００４１】
アルコキシル基を有するメルカプトシラン化合物としては、たとえば（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。入手性から（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシランが好ましい。中でも、ポリマーの長期保存が必要な場合に、保存性が良い点から、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシランがより好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００４２】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーおよび反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。【００４３】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。【００４４】
本発明の高分子化合物の化学構造は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーから誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有するものであれば、当該重合体が共重合体の場合の結合方式はランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。【００４５】
本発明の高分子化合物の分子量は、基板に均一に塗布しやすくなり、且つ高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５，０００以上１，０００，０００以下が好ましく、１０，０００以上５００，０００以下がより好ましい。なおここで、数平均分子量はＮＭＲ測定の解析より求めた組成を基に、全ての高分子の片側の末端に反応性官能基が導入されていると仮定して算出したものである。
生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）等を予め共重合させることなく、各モノマー成分の混合物を用いて基板に塗布し塗布後に硬化反応させるような場合には、上記モノマー成分の混合物は、基板若しくはモノマー成分同士の親和性により基板に均一に塗布できない場合がある。それに対し、本発明のように予めモノマー成分を予め共重合させた高分子化合物とすることにより、基板に均一に塗布できるようになる。【００４６】
本発明の高分子化合物は、架橋して網目状マトリックスを形成するような樹脂とは異なり、基板（該高分子化合物が有する反応性官能基と共有結合しない不活性表面を有する基板）に０．１〜１μｍ程度塗布後、加熱処理した後も、エタノール等の後述するような有機溶剤に容易に溶解することを特徴とする。なお、上記基板としては、後述するような基板表面を活性化させる表面処理を行っていないポリオレフィン樹脂基板等を用いることができる。また、加熱処理としては、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理することが挙げられる。【００４７】
本発明の高分子化合物は、基材表面を該高分子化合物で被覆することにより、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することができる。また、該高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基が存在する場合は、特定の生理活性物質を固定化する性質に加えてタンパク質の非特異吸着を抑制する性質をさらに付与することができる。さらに、末端の反応性基が基材と結合しうることから、該高分子化合物を化学的にグラフトすることができるため、基材洗浄による信号低下のおそれがない。【００４８】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。【００４９】
本発明の高分子化合物は末端の反応性官能基を用いて基材と共有結合させることができる。結合させる条件は官能基に応じて任意に選択することができる。例えば、末端にアルコキシシリル基を有する高分子化合物の場合、加水分解により生成されたシラノール基が、基材表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基材表面にグラフトされた高分子化合物は容易に溶解したり、基材から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。【００５０】
エタノールやメタノールなど極性の高い有機溶剤を用いる場合や、高分子化合物自体の親水性が高い場合は、溶剤に含まれる水分や塗布後空気中の水分により、高分子末端のアルコキシシリル基の加水分解が生じるため、特別な加水分解工程を施さなくとも、基板を加熱するだけでグラフト化することができることが多い。加水分解が不足する場合は、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が供給されれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量を１５重量％以下にするのが好ましい。含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。【００５１】
本発明に使用するバイオチップ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、中でも熱可塑性樹脂がより好ましい。【００５２】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する単独重合体または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。【００５３】
該高分子化合物を基材にグラフトさせるには、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。【００５４】
本発明の高分子化合物を基材に塗布することで容易に、生理活性物質の固定化能力に優れ、更に基材に生理活性物質の非特異的吸着を抑制されたバイオチップ基板を作製できる。また、該高分子化合物は化学結合により基板に結合させることができるので、洗浄工程での流出がない。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基材はバイオチップに好適に用いることができる。【００５５】
本発明のバイオチップ基板を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質などがある。例えば核酸を固定化する場合は、活性エステル基との反応性を高めるため、核酸にアミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。【００５６】
本発明において生理活性物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散した液体を点着する（スポット）方法が好ましい。【００５７】
点着後、静置することにより、生理活性物質が表面に固定化される。例えばアミノ化された核酸を用いた場合は室温から８０℃において１時間静置することにより、固定化が可能である。処理温度は高いほうが好ましい。生理活性物質を溶解または分散させる液体としてはアルカリ性であることが好ましい。【００５８】
洗浄後は生理活性物質を固定化した以外の基板表面の官能基を不活性化処理する。活性エステル基やアルデヒド基の場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。【００５９】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。【００６０】
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。【００６１】
このように生理活性物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断、遺伝子マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。
【実施例】
【００６２】
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）    
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂株式会社製Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。【００６３】
（高分子化合物の合成例１）
数平均分子量Ｍｎ＝約１１００のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ１１００と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）を脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ１１００、ＭＥＯＮＰの順に８５：１５である。そこにさらに（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（以下ＭＰＴＭＳと記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）および２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ０．００３ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、３．４ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、０．７ｐｐｍ付近に現れるＭＰＴＭＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００６４】
（高分子化合物の合成例２）
高分子化合物の合成例１と同様に数平均分子量Ｍｎ＝約２０８０のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ２０８０と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製５０ｗｔ％水溶液を脱水して使用。）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）を脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ２０８０、ＭＥＯＮＰの順に８５：１５である。そこにさらに（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（以下ＭＰＴＭＳと記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）および２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ０．００３ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、３．４ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、０．７ｐｐｍ付近に現れるＭＰＴＭＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００６５】
（高分子化合物の合成例３）
上記合成例１において（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（以下ＭＰＴＭＳと記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた代わりに、（３−メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン（以下ＭＰＤＥＳと記載）を用いた以外は、上記合成例１と同様にして高分子化合物を得た。上記と同様に高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００６６】
（高分子化合物の合成例４）
上記合成例２においてＭＰＴＭＳを用いた代わりに、ＭＰＤＥＳを用いた以外は、上記合成例２と同様にして高分子化合物を得た。上記と同様に高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００６７】
【表１】
0005167811.tif 000010
【００６８】
（実施例１〜４）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この固相基板を高分子化合物の合成例１〜４にて得られた高分子化合物の１．０重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む共重合体であって、前記共重合体の少なくとも片側の末端にアルコキシル基を有する高分子化合物を含む層を導入した。この基板を１００℃、２ｈｒ加熱乾燥することにより、基板と該高分子を含む層とを化学的に結合させた。【００６９】
（比較例１）
（ノンコート基板）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。【００７０】
(比較例２)
（アルデヒド基板）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作製した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この基板を２体積％の３−アミノプロピルトリメトキシシランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、４５℃にて２時間熱処理することによりアミノ基を導入し、さらに１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。【００７１】
（比較例３）
特許文献２（特表２００４−５３１３９０号公報）の実施例Ｘに従いアミン反応性スライドガラス基板を作製した。
具体的には、まず以下のようにコーティング溶液を調製した。
＜コーティング溶液の調製＞
ポリプロピレンのバイアル中にて、２６．５μｌの（３−トリメトキシシリルプロピル）−ジエチレントリアミン（ゲレスト社）を１０ｍｌの有機溶媒中に加えることによって、アミノシランの有機溶媒溶液を調製した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）を溶媒として使用することができる（どちらもアルドリッチ社から市販）。次いで、この溶液の１．０ｍｌを４０ｍｇの量のビオチン−ＰＥＧ−ＳＰＡ（シェアウォーターポリマー社；ＳＰＡは、アミン基に対して反応性を示す、プロピオン酸のスクシンイミジル誘導体である。）に加えた。ビオチン−ＰＥＧ−ＳＰＡのＳＰＡ基がアミノシラン上の末端アミンと反応してビオチン−ＰＥＧ−シラン分子を形成する。ビオチン−ＰＥＧ−シラン／ＤＭＡＣ溶液を溶液Ａと呼ぶ。
別のバイアルにおいて、７０．６μｌの６−アジドスルホニルヘキシル−トリエトキシシランを１０ｍｌのＤＭＳＯに加えた。この溶液に１２５μｌのマトリックス形成剤（ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、アルドリッチ）を加えて溶液Ｂを得た。溶液Ａと溶液Ｂとを１：４の体積比で混合（１ｍｌの溶液Ａを４ｍｌの溶液Ｂに加える）して、コーティング溶液混合物を得た。
次に、２５×７５ｍｍの顕微鏡用スライドガラスを高周波スパッタリングによる約４００オングストロームの酸化ケイ素層で被覆し、次いで以下のように清浄化した。先ずスライドガラスを高純度水ですすぎ洗いした。スライドガラスをガラス・ステイニング・ラック中に入れ、６０℃の脱気した１％アルコノックス溶液（アルカリ性のガラスクリーナー）中に浸漬し、１５分超音波処理した。次いでスライドガラスを多量の高純度水ですすぎ洗いし、６０℃の高純度水中でさらに１５分超音波処理した。次いでスライドガラスを多量の高純度水ですすぎ洗いし、乾燥工程にかけるまで新鮮な超純水中に浸漬した。スライドガラスを圧縮Ｎ2ガスで充分に吹きつけ乾燥し、使用するまで乾燥状態のまま保存した。清浄化し、予備処理したスライドガラスをスピンコーター中に据え付け、３５００ｒｐｍで回転させた。予備処理したスライドガラス上に０．５ｍｌのコーティング溶液混合物を分与し、９０秒回転させた。
塗被した２５×７５ｍｍのスライドガラスを真空オーブン中に入れ、引き続き真空ポンプで１５０ｍｍＨｇの圧力になるまで３０分減圧した。オーブンのスイッチを入れ、約７０℃に加熱した。熱処理の合計時間（加熱の傾斜と加熱の保持）は１時間であった。次いで支持体を周囲空気中にて室温に自然冷却した。【００７２】
＜実験１＞
実施例、比較例で得られた各基板について、以下のように評価を行った。実施例１〜４の基板および比較例３の基板については下記実験を５回繰り返して再現性を確認した。再現性は抗原であるマウス  ＩｇＧ２ａを添加しない系で行った。【００７３】
工程１（１次抗体の固定化）
実施例、比較例で得られた各基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該各基板に自動スポッターにより炭酸バッファ（和光純薬製ｐＨ９．５）で３．３μｍｏｌ／リットルに調製された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａをスポット後、室温の環境下に２４時間静置することにより一次抗体を固定化した。【００７４】
工程２（吸着防止処理）
その後、実施例１〜４の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）と０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液との１：１（体積比）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。また、比較例１の基板は市販の吸着防止剤であるブロックエース（大日本製薬株式会社製）をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）にて４倍希釈した溶液に２時間浸漬することにより吸着防止処理を施した基板と、吸着防止処理を施さない基板とで行った。比較例２の基板は市販の吸着防止剤であるブロックエース（大日本製薬株式会社製）を上記と同様に４倍希釈した溶液に２時間浸漬することにより吸着防止処理を施した。【００７５】
工程３（抗原抗体反応１）
その後、ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス  ＩｇＧ２ａを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液および抗原であるマウス  ＩｇＧ２ａを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。【００７６】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるビオチン標識抗マウス  ＩｇＧ２ａをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中９．６ｇ溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。【００７７】
工程５（標識化）
最後にＣｙ５標識されたストレプトアビジンをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中９．６ｇ溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて３０分反応させた後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄することにより標識化をした。【００７８】
各基板について蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。バックグランド値の結果を表２に、スポットシグナル強度の結果を表３に、再現性試験結果を表４に示す。【００７９】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。【００８０】
実施例１〜４および比較例１のブロックエース処理無しを比較することにより、本発明のバイオチップ基板とすることによりバックグランドが低減されることが確認された。【００８１】
また、実施例１〜４および比較例２を比較することにより、本発明によるバイオチップ基板は、従来のアルデヒド基板に市販の吸着処理剤を処理するよりもバックグランドが低くシグナルが高いバイオチップ基板であることがわかった。【００８２】
実施例１〜４および比較例３を比較することにより、本発明によるバイオチップ基板は特許文献２に記載の基板よりも、バックグランドが低い、すなわち、血清中に含まれる非特異的なタンパクを吸着し難く、且つ、１次抗体スポット部の抗原なしの時のシグナル強度が低い、すなわち、基板に１次抗体がその抗体機能を保持した状態で固定化されているバイオチップ基板であることがわかった。また、本発明によるバイオチップ基板は、再現性に関しても優れるバイオチップ基板であることがわかった。【００８３】
【表２】
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【００８４】
【表３】
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【００８５】
【表４】
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