(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端のアミノ酸１−３１を含まず且つアミノ酸４５が欠失又は置換されているか、Ｎ末端のアミノ酸１−４５を含まないグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65タンパク質の可溶性組換え断片。
【請求項２】
インスリン依存性糖尿病の発症又はそのおそれを検査する方法であって、
インスリン依存性糖尿病患者から採取した血清試料を、請求項１の可溶性組換え断片に晒す工程；及び
該断片とグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65自己抗体間の相互作用を検出し、インスリン依存性糖尿病の発症又はそのおそれを検査する工程；
を含む方法であって、
可溶性組換えＧＡＤ65断片とＧＡＤ65自己抗体との特異的相互作用が検出される場合は、インスリン依存性糖尿病が発症していると判断するか、インスリン依存性糖尿病のリスクが存在すると判断する、前記方法。
【請求項３】
インスリン依存性糖尿病の発症又はそのおそれを診断するための組成物であって、請求項１の可溶性組換え断片を含む組成物。
【請求項４】
インスリン依存性糖尿病の進行を検査する方法であって、
インスリン依存性糖尿病患者から採取した血清試料を、グルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65のアミノ酸２４５−５８５を含む第１可溶性組換えグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65断片であって、Ｎ末端のアミノ酸１−３１を含まず且つアミノ酸４５が欠失又は置換されているか、Ｎ末端のアミノ酸１−４５を含まない上記断片に晒す工程；
該第１断片と第１のグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65自己抗体間の特異的相互作用を検出する工程；
該血清試料を、グルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65のアミノ酸２４５−５４５を含む第２可溶性組換えグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65断片であって、Ｎ末端のアミノ酸１−３１を含まず且つアミノ酸４５が欠失又は置換されているか、Ｎ末端のアミノ酸１−４５を含まない上記断片に晒す工程；及び
該第２断片と該第２のグルタミン酸脱炭酸酵素ＧＡＤ65自己抗体間の特異的相互作用を検出する工程；
を含む方法であって、
第１可溶性組換えＧＡＤ65断片とＧＡＤ65自己抗体との特異的相互作用がのみ検出される場合は、インスリン依存性糖尿病の進行が初期であると判断し、第２可溶性組換えＧＡＤ65断片とＧＡＤ65自己抗体との特異的相互作用が検出される場合は、インスリン依存性糖尿病の進行が中期又は後期であると判断する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本件出願は、1992年12月３日出願の米国特許出願第7/984,935号の一部継続出願であり、これを参考としてすべて引用する。本発明は、1991年９月６日出願の米国特許出願第07/756,207号に関連するものであり、これも参考としてすべて引用する。
政府関係の供述
本発明は、国立衛生研究所（#1PO1 DK41822-01）及び小児麻痺救済募金運動（6-FY93-0695）からの補助金によって助成されたものである。政府は本発明のある一定の権利を所有することができる。
本発明は、一般的には、インスリン依存性糖尿病又はスティフマン症候群に罹っているか又は罹りやすい患者の診断及び治療用改良試薬及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（１型糖尿病としても知られる）は、主として若年が発症する。インスリンは治療に有効であるが、この疾患に関する罹患率及び死亡率の数倍の増加には早期診断と予防方法の開発が必要である。ＩＤＤＭの臨床上の発症の前の膵臓β細胞（ランゲルハンス島のインスリン分泌細胞である）の破壊は、自己免疫機序が仲介する。この疾病に関して最も十分に研究された自己免疫異常の中でも、診断時にβ細胞特異的自己抗体を循環する頻度が高い。家系の研究により、明白なＩＤＤＭの前に数年だけ自己抗体が生じることが示され、臨床症状が現れる前に体液性自己免疫の前徴期間を示した。更に、家系の研究により、診断の数年前に静脈内グルコースに対してインスリン応答の緩徐な進行性喪失が示された。糖尿病前症期間におけるβ細胞特異的自己抗体の存在は進行中の自己免疫過程、最後には重要なβ細胞の欠乏及びインスリンの欠乏に至る過程を反映すると考えられる。臨床上の発症時には全β細胞量の１０％しか残っていないことが推定された。
【０００３】
ＩＤＤＭにおける膵臓β細胞内の自己抗体の標的は、初めはヒト膵島の界面活性剤溶解物を用いる免疫沈降実験により６４ｋＤａ自己抗原として同定された（Baekkeskovら（1982），Nature298:167-169）。６４ｋＤａ自己抗原に対する抗体は、ＩＤＤＭの臨床上の発症前に生じ、臨床上の発症時及び糖尿病前症期間中約８０％の出現率を有することが示された（Baekkeskovら（1987），J．Clin．Invest．79:926-934; Atkinsonら（1990），Lancet 335:597-602）（各々を参考としてすべて引用する）。ラット及びヒト６４ｋＤａタンパク質は、自己抗原エピトープに関して極めて相同である（Christieら（1990），J．Biol．Chem．265: 376-381）（参考としてすべて引用する）。ランゲルハンス島における６４ｋＤａ自己抗原は、疎水性及び画分化に関して３つの異なった形態：６５ｋＤａ及び約7.1のＰｉの可溶性の親水性形態；可溶性であるか又は膜結合活性が小さいかつ約6.7のＰｉを有する６４ｋＤａ疎水性形態；及び電気泳動移動度及びＰｉが同一のしっかりと膜に固定された疎水性形態として検出される。膜結合及び可溶性の疎水性６４ｋＤａ形態は、共に２つのイソ型、α及びβとして存在し、Ｐｉ及び疎水性は同じであるが約１ｋＤａだけ異なる（Baekkeskovら（1989），Diabetes38:1133-1141）（参考としてすべて引用する）。６４ｋＤａ自己抗原は、脳を含まない多くの組織の分析においてβ細胞特異的であることが判明した（上記Christieら）。
【０００４】
最近、膵臓β細胞の６４ｋＤａ自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ、Ｌ−グルタメート１−カルボキシ−リアーゼ、EC 4.1.1.15）であることが示された。ＧＡＤ酵素はグルタミン酸からＧＡＢＡを合成し、中枢神経系（ＣＮＳ）においてＧＡＢＡ分泌ニューロンの豊富なタンパク質である。同時係属出願第07/756,207号; Baekkeskovら（1990），Nature 347:151-157参照（参考としてすベて引用する）。
ＧＡＤは中枢神経系（ＣＮＳ）においてＧＡＢＡ分泌ニューロンの豊富なかつ部分的に確認されたタンパク質である。ＧＡＤ酵素は、２つの異なる非対立遺伝子でコードされた２つの形態、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65（ＧＡＤ−１及びＧＡＤ−２としても知られる）を有し、脊椎動物の系統発生で共通の祖先遺伝子から発達したものである。ＧＡＤ67及びＧＡＤ65は最初の９５個のアミノ酸では非常に多様性であるが分子の残りでは顕著な（約７５％）相同性を共有する。共にＮ末端から８０−９０個のアミノ酸にタンパク質分解ホットスポットがあり（Christgauら（1991），J．Biol．Chem. 266:21257-21264；Christgauら（1992），J．Cell.Biol．118:309-320）（参考としてすべて引用する）、これはドメイン境界を表すものである。Ｎ末端ドメインは翻訳後修飾をかくまっており、シナプス小胞の膜にＧＡＤ65を固定することになりかつこのタンパク質の異なる細胞下局在化を制御する。
【０００５】
脳組織においては、ＧＡＤ65及びＧＡＤ67双方が産生される（Buら（1992），Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2115-2119; Kaufmanら（1986），Science 232:1138-1140; Chang & Gottlieb（1988）, J．Neurosci. 8:2123-2130）（各々を参考としてすべて引用する）。ある種は、その膵島において両ＧＡＤタンパク質を発現する。しかしながら、ヒト膵島においては、ＧＡＤ65のみが発現される（Karlsenら（1991），Proc．Natl．Acad．Sci. （USA）88:8337-8341; Karlsenら（1991），Diabetes 41:1355-1359）（参考としてすべて引用する）。異種脊椎動物からの分離物ＧＡＤ65とＧＡＤ67間の免疫原の交差反応性は、齧歯類からヒトへ抗原決定基の高程度の保存を示している（Legayら（1986），J．Neurochem．46:1478-1486）。この所見と一致して、ヒトＧＡＤ65及びＧＡＤ67ポリペプチドは、他の哺乳動物における同族ポリペプチドと９０％を超えるアミノ酸配列の同一性を共有している。上記Buら。
【０００６】
ヒトＣＮＳＧＡＤ67及びＧＡＤ65のｃＤＮＡはクローン化及び配列決定された（上記Buら）。上記Karlsenら（1991）は、ヒト膵臓β細胞ＧＡＤ65の配列データを報告した。ラットＣＮＳＧＡＤ65及びＧＡＤ67（Erlanderら（1991），Neuron７：91-100；Julienら（1990），J．Neurochem．54:703-705）及びラットβ細胞ＧＡＤ65（Michelsonら（1991），Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）88:8754-8758）のＤＮＡ配列情報も入手できる（各々を参考としてすべて引用する）。
【０００７】
６４ｋＤａＩＤＤＭ自己抗原とＧＡＤが等価であることの証明は、ＩＤＤＭとスティフマン症候群と呼ばれる稀であるが重篤な神経性疾患と関連する初期の所見を説明するものであり、ＧＡＤは優先的自己抗原として認識された（Solimenaら（1988），N．Engl．J．Med．318:1012-1020；Sollmenaら（1990），N．Engl．J．Med．322:1555-1560）（参考としてすべて引用する）。ＧＡＢＡ分泌性ニューロン自己抗体陽性患者は、ほとんどすべて膵島細胞の細胞質抗体にも陽性であり、１／３はＩＤＤＭであった。更に、ＧＡＢＡ分泌性ニューロンに対する自己抗体は、ＳＭＳのない７４人のＩＤＤＭ患者の３人に検出された（上記Solimenaら（1988）及び上記Solimenaら（1990））。更に、他の研究により、ＳＭＳ患者において高頻度のＩＤＤＭが報告された（Lorishら（1989），Mayo Clin．Proc．64:629-636）。
【０００８】
６４ｋＤａ抗原とＧＡＤが等価であることの証明は、また、ＩＤＤＭの診断方法の改善をもたらした。以前には、６４ｋＤａ自己抗原は膵臓β細胞においてのみ同定され、効率のよい検出又は治療に必要な大量の試薬を調製することができるクローン化、配列決定又は他の確認をするのに十分な量で精製することができなかった。対照的に、脳におけるＧＡＤの存在量は、診断用試薬として多量のＧＡＤタンパク質（ＧＡＤ65あるいはＧＡＤ67）をクローン化することによりあるいはせずに容易に生産することができる。同時係属出願第07/756,207号参照。
【０００９】
従来の方法について改良されたが、全長の精製ＧＡＤタンパク質を用いる診断はまだ完全に満足なものではない。ＧＡＤ分子はＮ末端領域に脂質修飾を有するので、界面活性剤の存在するとき以外は不溶性である。全長ＧＡＤ分子の不溶性は精製及び免疫沈降、ＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイのような簡便な分析におけるＧＡＤの使用を妨害する。更に、診断試薬として全長ＧＡＤの使用は、自己免疫疾患及び／又は別の疾患の種々の一時的段階を診断するＧＡＤ自己抗体の種々の種類を区別しない。更に、不溶性ＧＡＤタンパク質は、治療薬として生体内投与に適当でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述のことに基づき、ＩＤＤＭ及びスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者を診断及び治療するための改良試薬及び方法が求められていることは明らかである。本発明は、この及び他の要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１実施態様によれば、ＧＡＤ65タンパク質の可溶性断片が提供される。該断片は、ＧＡＤ65自己抗体の少なくとも１種と特異的に反応する。該断片は、通常、溶解性を制限するＮ末端アミノ酸を実質的に含まない。ある断片においては、ＧＡＤ65タンパク質のＮ末端アミノ酸２４−３１及び好ましくは４５が欠失又は突然変異している。他の断片は、アミノ酸１−２４４を含むことができるＮ末端配列の大きな欠失を含む。更に、ある断片は、ＧＡＤ65自己抗体と特異的に反応するエピトープを有するセグメントを実質的に含まない。これらの断片は、判別診断方法（例えば、ＩＤＤＭとスティフマン症候群を区別するか又はＩＤＤＭの種々の一時的段階を区別する）に有効である。例えば、ある断片では、アミノ酸５４５−５８５を含むセグメント、他の断片では、アミノ酸２４５−２９５のセグメントが除去される。
【００１２】
ある可溶性断片は、ＧＡＤ65タンパク質のアミノ酸２４５−５８５位からの相接する配列を含んでいる。これらの断片は、ＧＡＤ65タンパク質に対する自己抗体の異なった３種類と特異的に反応し、ＩＤＤＭを診断する。
【００１３】
他の可溶性断片は、アミノ酸１−２０又は７０−１０１から少なくとも８個のアミノ酸の相接する配列を含んでいる。これらの断片は、ＧＡＤ65タンパク質に対する自己抗体の２種類と特異的に反応し、スティフマン症候群を診断する。これらの断片は、アミノ酸２４５−５８５を実質的に含まないものもあり、そのことにより、ＩＤＤＭを診断する自己抗体の３種類に特異的に結合することができない。
【００１４】
本発明のもう１つの態様においては、血清中ＧＡＤ65自己抗体を検出する方法が提供される。ある方法においては、ＧＡＤ65の可溶性断片が診断試薬として用いられる。これらの方法においては、血清試料が可溶性ＧＡＤ65断片に露出され、ＧＡＤ65断片とＧＡＤ65自己抗体間の特異的相互作用が検出される。
【００１５】
他の方法においては、２成分を有する融合ポリペプチドが診断試薬として提供される。その２成分は、ＧＡＤ65自己抗体と特異的に反応するＧＡＤ65タンパク質又はその断片及びそのタンパク質又は断片のＮ末端に融合したエクステンションペプチドである。融合ポリペプチドは、エクステンションペプチドを介して固体支持体に固定化され、血清試料に露出される。エクステンションペプチドによる付着は、ＧＡＤ65タンパク質又はその断片中のＧＡＤ65自己抗体結合エピトープが自己抗体を結合するのに利用できることを確実にする。ＧＡＤ65タンパク質又は断片と血清中のＧＡＤ65自己抗体間の特異的相互作用が検出される。
【００１６】
他の方法においては、ＧＡＤ65タンパク質又はその断片は、ＧＡＤ65タンパク質又はその断片のアミノ酸１−２４４内に存在する第１エピトープと特異的に反応する抗体を介して固体支持体に固定化される。抗体による固定化は、ＧＡＤ65タンパク質又は断片の残部を残し、自己抗体に結合するのに利用できるＧＡＤ65自己抗体と特異的に反応する第２エピトープを含む。ＧＡＤ65タンパク質又は断片と血清中のＧＡＤ65自己抗体間の特異的相互作用が検出される。
【００１７】
本発明のもう１つの態様においては、判別診断方法が提供される。これらの方法は、ＩＤＤＭの種々の一時的段階を区別する及び／又はＩＤＤＭとスティフマン症候群を区別する。ＳＭＳとＩＤＤＭを区別するために、血清は、スティフマン症候群を診断するＧＡＤ65自己抗体と特異的に反応するエピトープを有しかつＩＤＤＭを診断する自己抗体と特異的に反応するセグメントを含まないＧＡＤ65断片に露出される。例えば、実質的にアミノ酸１−２０、７０−１０１及び１−１０１からなる断片が適切である。他の方法においては、血清試料は、ＧＡＤ65自己抗体の別の種類と反応するエピトープを有する別のＧＡＤ65断片に露出される。たいてい、自己抗体の別の種類は、ＩＤＤＭの別の一時的段階を診断するものである。
【００１８】
本発明のもう１つの態様においては、ＩＤＤＭ又はスティフマン症候群の治療方法が提供される。ある方法においては、ＧＡＤ65自己抗原に対する免疫耐性を誘導するためにＧＡＤ65自己抗体又はＴ細胞と特異的に反応する可溶性ＧＡＤ65断片の治療的に有効な用量が患者に投与される。もう１つの方法においては、患者から得られた末梢血液細胞からＧＡＤ65断片に特異的なＴヘルパー細胞を生じるように可溶性ＧＡＤ65断片が用いられる。そのように生じたＴヘルパー細胞又はその一部は、Ｔヘルパー細胞に対して生体内免疫応答を含むことができ、患者に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義 
ＧＡＤ65断片がアミノ酸セグメントを“実質的に含まない”と記載される場合、指定されたセグメント内のアミノ酸の少なくとも約５０％、更に一般的には少なくとも約７５％、最も一般的には少なくとも約９０％のアミノ酸が存在しないか又は置換されている。これらのアミノ酸を除去すると、自己抗体の種類と反応する能力の喪失又は水性溶媒における溶解性の獲得といった残留断片の生物学的又は化学的性質か変化する。
【００２０】
“特異的相互作用”及び“特異的に反応する”なる語は、リガンドと抗体の結合に対する解離定数が一般的には約１μＭ未満、更に一般的には約１０nM未満、最も一般的には約１nM未満であることを意味する。
“同族”なる語は、種間で進化的に及び機能的に関係のある遺伝子配列を意味する。例えば、ヒトゲノムにおいてはヒトＣＤ４遺伝子はマウスＣＤ４遺伝子に対して同族遺伝子であり、これはこれら２つの遺伝子の配列及び構造が極めて相同でありかつ両遺伝子がＭＨＣクラス１１制限抗原認識によってＴ細胞活性化をシグナルするのに機能するタンパク質をコードすることを示すからである。好ましい同族遺伝子は、ヒト、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ブタ、ネズミ及びハムスターである。
【００２１】
ＧＡＤ65類縁体なる語は、ＧＡＤ65自己抗体に結合する場合、Buら（1992），Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）89:2115-2119のラットＧＡＤ65タンパク質と競合するタンパク質を含むものである。類縁体としては、自然及び誘発突然変異ポリペプチドが含まれる。類縁タンパク質としては、２０個の慣用のアミノ酸の立体異性体（即ち、Ｄ−アミノ酸）、非自然アミノ酸、例えば、α，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。更に、類縁タンパク質としては、リン酸化、グリコシル化、パルミトイル化等で修飾された骨格を有するタンパク質が含まれる。
【００２２】
緊縮条件は、配列依存性であり、種々の環境中で異なる。一般に、緊縮条件は、特定のイオン強度及びｐＨにおいて特定配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選定される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に適合したプローブに対してハイブリッド形成する温度（特定のイオン強度及びｐＨ下）である。典型的には、緊縮条件は、塩濃度がｐＨ７において少なくとも約0.02モルでありかつ温度が少なくとも約６０℃であるものである。相補鎖の塩基組成及びサイズ、有機溶媒の存在及び塩基誤対合の程度をも含む他の因子も緊縮ハイブリッド形成に著しく影響するので、パラメーターの組合わせはいずれか１つの絶対尺度より重要である。
【００２３】
“実質的に可溶性の”なる語は、断片が、典型的には、水性溶媒中に少なくとも５０μg/ml、通常は少なくとも１００μg/mlの溶解度を示すことを意味する。
“ポリペプチド”なる語は、アミノ酸のポリマーを意味し、全長タンパク質及びその断片を含める。
【００２４】
個々の実施態様の説明Ｉ．ＩＤＤＭ及びスティフマン症候群の診断用試薬 
本発明の１実施態様によれば、ＩＤＤＭ及び／又はスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者の診断用試薬が提供される。ポリペプチドは、通常、これらの疾患の１つを診断する１種以上のＧＡＤ65自己抗体を結合する可溶性ＧＡＤ65断片である。
【００２５】
Ａ．ＧＡＤ65に対する自己抗体 
上記で述べたように、ＧＡＤ65はＧＡＤ酵素の２つの亜型をコードする２つの遺伝子の一方である（他方はＧＡＤ67である）。各非対立遺伝子亜型の中に、数種の対立遺伝子変異体が存在する（背景の項参照）。即ち、ＧＡＤ65自己抗体なる語は、ＧＡＤ65酵素の対立遺伝子変異体又はそのエピトープと反応する自己抗体が含まれる。例えば、ＧＡＤ65自己抗体なる語は、６４ｋＤａの膵臓β細胞自己抗原に対する自己抗体を包含する。ヒト血清中のＧＡＤ65に対する自己抗体の検出は、ＩＤＤＭ及び／又はスティフマン症候群を診断する。更に、ＧＡＤ67に対する自己抗体の検出は、実行可能な診断方法である。しかしながら、実施例３の結果は、ＧＡＤ65酵素に対する自己抗体はＧＡＤ67に対するものより非常に広く行われていることが示されている。即ち、ＧＡＤ65に対する自己抗体の検出が好ましい。
【００２６】
Ｂ．ＧＡＤ65ポリペプチドの生産 
しばしば、ＧＡＤ65ポリペプチドの断片を用いてＧＡＤ65酵素に対する自己抗体が検出される。これらの断片は、種々の方法によって生産される。本発明の断片は、天然の、即ち、ヒト又は非ヒトＣＮＳ及び膵細胞のような適切な起原から単離されたＣＮＳ又は膵臓ＧＡＤ65断片である。その単離方法は、Oertelら（1980），Brain Res．Bull．Vol．5，Suppl．2，pp 713-719；Oertelら（1981），Neurosci．6:2689-2700；及びChang & Gottlieb（1988），J．Neurosci．8:2123-2130に記載されている（各々を参考としてすべて引用する）。通常、天然ポリペプチドは、膵細胞よりＧＡＤ65が豊富なＣＮＳ細胞から単離される。膵臓ＧＡＤ65形態から精製された組成物は、基準としてＣＮＳＧＡＤ65を用いて完全に単離及び確認することができる。ＧＡＤ65遺伝子及びタンパク質は種の中で高度に保存されることから、本発明に利用されるＧＡＤ65タンパク質及びその断片はヒト又は非ヒトとすることができる。
【００２７】
天然ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーのような慣用の手法によって単離される。例えば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、予め精製されたＧＡＤ65に対して生じ、周知の手法によって適切なアフィニティーカラムに結合する。例えば、Hudson & Hay，Practical Immunology（Blackwell Scientific Publications，Oxford，United Kingdom，1980），Chap．８参照（参考としてすべて引用する）。通常、無傷ＧＡＤ65形態はそのような単離法によって得られる。ペプチド断片は、無傷分子の化学又は酵素切断により無傷ＧＡＤ65から作成される。
【００２８】
天然起原から無傷ＧＡＤ65タンパク質及びその断片を単離する変法として、これらのポリペプチドはＧＡＤ65遺伝子のクレオチド配列又はＧＡＤタンパク質のアミノ酸配列に基づいて調製される。種々の種からの広範囲のＧＡＤ65核酸及びアミノ酸配列データは既に得られている。（背景の項参照）。更に必要があれば、常法によりデータが容易に作成される。例えば、１つの種由来の既知のヌクレオチド配列を、他の種由来のＧＡＤ65遺伝子をクローン化するためにプローブとして用いることができる。また、既知のＧＡＤ65タンパク質に対する抗体は、ＧＡＤ65発現産物を検出するために用いることができる。クローン化されると、ＧＡＤ65遺伝子は常法により容易に配列が決定される。
【００２９】
合成タンパク質及びポリペプチドは、少なくとも３種類の一般法で生産することができる。まず、約１５０個までのアミノ酸、一般的には約１００個より少ないアミノ酸、更に一般的には約７５個より少ないアミノ酸を有するポリペプチドは、アミノ酸が連続して成長鎖に加えられる周知のメリフィールド固相合成法により合成される。Merrifield（1963），J．Am．Chem．Soc．85:2149-2156参照。
【００３０】
自動ペプチドシンセサイザーは、多くの会社、例えば、カリフォルニア州、フォスターシティー、Applied Biosystemsから市販されている。
【００３１】
本発明のタンパク質及びポリペプチドを合成する第２の方法は、所望のＧＡＤ65遺伝子又はその一部をコードする組換えＤＮＡ分子の哺乳動物培養細胞中での発現を含んでいる。チャイニーズハムスター卵巣（ＤＨＯ）のような哺乳動物発現系は、タンパク質及びポリペプチドの翻訳後修飾を行い、そのことにより未変性ＧＡＤ65形態を有する合成産物の免疫学的類似性が高められる。更に、バキュロウイルス及び酵母発現系は、必要な翻訳後修飾をしばしば行う。ＧＡＤ65遺伝子はそれ自体天然でも合成でもよく、既知のアミノ酸配列に基づく縮重プローブを用いてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから入手できる天然遺伝子は上記Julienらに示されている。また、ポリヌクレオチドは、周知の方法により報告されたＤＮＡ配列に基づいて合成することができる。例えば、一本鎖ＤＮＡフラグメントは、Beaucage & Carruthers（1981），Tett．Letters 22:1859-1862によって記載されているホスホルアミダイト法により調製することができる。次いで、２本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、適切な条件下でその鎖を一緒にアニーリングするか又は相補鎖を適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて付加することにより得ることができる。
【００３２】
次いで、所望のＧＡＤ65タンパク質又は断片をコードする天然又は合成ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構築物に組込まれる。通常、ＤＮＡ構築物は、最初の操作及び構築物の操作を促進するために原核宿主中で複製することができる。構築物の十分量が得られた後、培養された哺乳動物、昆虫（例えば、ＳＦ９）、酵母又は他の原核細胞系に導入される。
【００３３】
細菌又は酵母に導入するのに適したＤＮＡ構築物は、通常、宿主によって認識された複製系、所望のタンパク質又はポリペプチド産物をコードするＧＡＤ65ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ構造配列の５′端に結合した転写及び翻訳開始及び調節配列及び構造配列の３′端に結合した転写及び翻訳終結調節配列が含まれる。
転写調節配列としては、宿主によって認識される異種プロモーターか含まれる。
【００３４】
便宜上、複製系及びＧＡＤ65ＤＮＡ配列の挿入部位と共に転写及び翻訳調節配列を含む入手できるクロ−ニングベクターを用いることができる。哺乳動物及び他の真核細胞系の形質転換の場合、ＤＨＦＲ遺伝子のような適切なマーカーの存在下細胞系の共移入を用いることかできる。移入は、化学又は電気さく孔法を用いて行うことができる。
【００３５】
ＧＡＤ65ポリペプチドは、場合によっては、種々の方法により組換え遺伝子を発現する細胞培養物から精製される。例えば、ポリペプチドは、サイズの差（ゲルろ過）、電荷（イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性（フェニル−セファロースクロマトグラフィー）又は他の物理的パラメーターに基づく常法の組合わせにより精製することができる。ＧＡＤ65に特異的な抗体を生じる免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。アフィニティークロマトグラフィーは、まず抗体を固相支持体に結合し、次にその結合抗体を精製されるべきポリペプチドの起原、例えば、ＣＮＳもしくは膵細胞又はＧＡＤ65を生産するように組換え修飾された細胞又は培養した際にＧＡＤ65を分泌するように組換え修飾された細胞の上清の溶解物と接触させることにより行われる。
【００３６】
ＧＡＤ６５ポリペプチドを合成する第３の方法は、試験管内転写／翻訳系を使用するものである。ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記のように発現ベクターでクローン化される。次いで、この発現ベクターは、例えばウサギ網状赤血球溶解系中で試験管内転写及び翻訳される。翻訳産物は、直接用いることもできるしまず精製することもできる。試験管内翻訳から得られたポリペプチドは、典型的には、生体内で合成されたポリペプチド上に存在する翻訳後修飾を含まない。例えば、試験管内翻訳ＧＡＤ65ポリペプチドは、典型的には、アミノ酸３１及び４５でパルミトイル化されず、これらのアミノ酸は必ずしも突然変異又は欠失されず水性溶媒における溶解性が付与される。
【００３７】
精製して使用する場合、ＧＡＤ65に対する抗体は、そのＧＡＤ65断片を慣用の方法に従って種々の脊椎動物に注入するこにより得ることができる。適切な脊椎動物としては、マウス、ラット、ヒツジ及びヤギが含まれる。通常、これらの動物は周期的に採血され、連続した採血が力価及び特異性を改良する。抗原は、筋肉内、腹腔内、皮下等に、通常完全又は不完全フロイントアジュバント中で注入される。モノクローナル抗体は、周知の方法により調製することができる。モノクローナルＦａｂフラグメントも生産することができる。例えば、Huseら（1989），Science 246:1275-1281参照。
本発明のＧＡＤ65断片は、粗溶解物の成分としてあるいは実質的に純粋な形として用いることができる。“実質的に純粋な”は、ポリペプチドが典型的には少なくとも純度約５０％w/w（重量／重量）でありかつ妨害タンパク質及び汚染物を実質的に含まない。断片は、しばしば、少なくとも約８０％w/w、好ましくは少なくとも約９５％w/wの純度で単離又は合成される。しかしながら、慣用の単離精製法を用いて、少なくとも９９％w/wの均一なぺプチドを得ることができる。
【００３８】
Ｃ．エピトープマッピング 
本発明のポリペプチド断片は、ＧＡＤ65タンパク質に対する抗体の少なくとも１種と反応する少なくとも１種のエピトープを含む。ＧＡＤ65タンパク質内のエピトープの局在化は、ＩＤＤＭ又はスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者から誘導されたＧＡＤ65と反応するモノクローナル抗体の利用可能性によって促進される。ヒトモノクローナル抗体の単離及びスクリーニング方法はRichterら（1992），Proc．Natl．Acad．Sci．（USA），89:8467-71に記載されている（このことにより参考としてすべて引用する）。手短にいうと、多数のＥＢＶ不死化β細胞系を新たに診断されたＩＤＤＭ患者の末梢血液から誘導した。ＩｇＧ産生モノクローナルＢ細胞系の６４ｋＤａ膵臓β細胞自己抗原に対する結合を、ヒト膵臓の凍結切片を関節蛍光染色によりスクリーンした。この細胞系を単細胞クローニングの反復により安定化した。この方法によって単離された６種の安定細胞系は、ＭＩＣＡ１−６と称するモノクローナル抗体を産生した。
【００３９】
ＧＡＤ65に対するヒトモノクローナル抗体又はＩＤＤＭ又はスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者からのポリクローナル血清は、ＧＡＤ65自己抗体の存在を検出するのに有効なＧＡＤ65エピトープの位置を決定するのに用いられる。ＧＡＤ65エピトープは、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清に結合するＧＡＤ65ペプチド（I.Ｂ項のように調製した）の収集物を試験することにより位置が決定される。結合は、通常、慣用の免疫沈降分析により検出される。結合は、また、ウェスタンブロット法により検出することもできる。しかしながら、ウェスタンブロット法が変性条件下で行われることから、線状エピトープへの結合のみを検出する。免疫沈降とウェスタンブロッティングからの結果を比較すると、エピトープが線状であり、立体配座であることが示される。
【００４０】
他の方法においては、エピトープは、タンパク質フットプリント法により位置が決定される。この方法においては、ＧＡＤ65タンパク質又はペプチドは抗体に結合され、次にプロテアーゼに露出される。モノクローナル抗体に結合するＧＡＤ65の残基は、タンパク質分解から保護され、アミノ酸配列決定により同定される。
【００４１】
Ｄ．診断試薬としてのＧＡＤ65断片 
自己抗体と反応するＧＡＤ65エピトープの配列座標が同定されると、診断試薬としてそのエピトープを１種以上含むＧＡＤ65断片を生産することができる。
ＧＡＤ65断片を定義するために用いられる配列座標は、Buら（1992），Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）89:2115-2119に開示され図１に示されている５８５アミノ酸ラットＧＡＤ65配列からのアミノ酸、Buら（図１に示されている）によって開示された５８５アミノ酸ヒトＧＡＤ65配列からの対応するアミノ酸又は他の同族又は類縁ＧＡＤ65ポリペプチドからの、そのポリペプチドがBuらのラットＧＡＤ65配列と最大限に配列される場合の対応するアミノ酸を意味する。タンパク質は、次の参考文献のいずれか１つの基準に従ってラットＧＡＤ65配列と“最大限に配列された”と考えられる：Smith & Waterman（1981），Adv．Appl．Math．2:482;Needleman & Wunsch（1970），J．Mol．Bio．48:443；Pearson & Lipman（1988），Proc．Matl．Acad．Sci．（U.S.A.）85：GAP，BESTFIT，FASTA & TFASTA，Wisconsin Genetics Software Pckage，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI（各々を参考としてすべて引用する）。通常、類縁タンパク質は、緊縮条件下ラットＧＡＤ65タンパク質をコードするＤＮＡに対してハイブリッド形成する能力を有する核酸によってコードされる。
【００４２】
通常、ＧＡＤ65断片は、水性溶媒における溶解性を制限するＮ末端アミノ酸を含まない。そのようなアミノ酸は、欠失及び／又は置換により除去することができる。除去又は突然変異されるＮ末端アミノ酸は、ＧＡＤ65タンパク質のＮ末端から２００個以上のアミノ酸を含むことができる。しかしながら、本発明のＧＡＤ65断片は、Ｎ末端領域から例えば約８、２５、５０、７５、１００及び１５０個のアミノ酸を含む短いＮ末端セグメントを含むものがある。最低限、位置２４−３１位からのアミノ酸が除去又は置換されなければならない。好ましくは、アミノ酸４５も除去又は置換されなければならない。即ち、例えば、アミノ酸１−３１を欠失しかつ好ましくはアミノ酸４５のシステイン残基をアラニン残基に置換した断片が可溶性である。アミノ酸１−４５を欠失している断片も可溶性である。
【００４３】
また、可溶性ＧＡＤ65ポリペプチドは、翻訳後修飾が起こらないような条件下でポリペプチドを合成することにより生産することができる。例えば、ポリペプチドは、試験管内翻訳系又はペプチドシンセサイザーで合成することができる。
上記ＩＢ項参照。ポリペプチドは、また、セルレインのような脂質結合開始剤の存在下生体内で合成することもできる。
【００４４】
ＧＡＤ65ペプチドの溶解性を付与するために除去されるアミノ酸はたいてい相接するが、これは必須ではない。要求されることのすべては、十分なＮ末端アミノ酸配列がタンパク質精製又は免疫分析に典型的に用いられる媒体のような水性媒体に可溶な又は実質的に可溶な残存するタンパク質断片のために欠失されることである。
驚くべきことに、実施例５に示された結果は、ＧＡＤ65のＮ末端から少なくとも最初の２４４個アミノ酸が欠失しても、ＩＤＤＭ自己抗体に対する主要なＧＡＤ65エピトープの反応性を損なわないことを示している。即ち、２４４個のＮ末端アミノ酸が存在しないが残りのＧＡＤ65アミノ酸（即ち、アミノ酸２４５−５８５（Ｃ末端アミノ酸）の相接する配列）を含む可溶性断片は、ＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３、ＭＩＣＡ４／ＭＩＣＡ６及びＭＩＣＡ２によって定義されるＩＤＤＭ自己抗体の３種類すべてと反応する。実施例５参照。タンパク質分解又は別のスプライシングパターンから得られる天然に存在する可溶性断片も適切である。これらの断片は、脳、β細胞及び組換え発現系の抽出液中で検出された。これらの断片は、通常、約５５−５７の分子量を有し、Ｎ末端から約６５−８０個のアミノ酸が存在しない。例えば、Christgauら（1992），J．Cell Biol．118:309-320参照。これらのＮ末端アミノ酸が存在しないと、断片を水性溶媒に実質的に可溶にする。天然に存在する断片は、アミノ酸６０−１２０位に含まれるエピトープに特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製されることが便利である。免疫分析用断片を固定化するために、この同じ抗体を用いることができる。
【００４５】
更に、本発明は、Ｎ末端（断片を可溶性にする）と他の所の両方で修飾している可溶性断片を提供するものである。そのような１断片は、Ｃ末端から少なくとも約４１個のアミノ酸（即ち、アミノ酸５４５−５８５）を実質的に含まない。
４１個のＣ末端アミノ酸を実質的に含まない断片は、ＭＩＣＡ４／ＭＩＣＡ６の特異性を有するＩＤＤＭ自己抗体を認識することができるが、ＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３又はＭＩＣＡ２の特異性で認識することはできない。
【００４６】
本発明により提供された他の断片は、Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換により可溶性にし、アミノ酸２４５−２９５位のセグメントも実質的に含まない。この断片は、ＭＩＣＡ２の特異性でＩＤＤＭ自己抗体を認識することができるが、ＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３又はＭＩＣＡ２／ＭＩＣＡ４の特異性を有する自己抗体はできない。
アミノ酸７０−１０１及び／又は１−２０を実質的に含まない断片もあり、そのことによりスティフマン症候群を診断する自己抗体と反応する２つの非立体配座エピトープを含まない。しかしながら、その断片は、立体配座エピトープを認識するスティフマン症候群自己抗体と反応する。ＩＤＤＭを診断する１種以上の自己抗体と反応するがＳＭＳを診断する自己抗体のいずれの種類とも反応しない断片は、ＩＤＤＭエピトープを最小又は最小に近い長さのペプチド断片に更に局在化することにより生産される。これらの断片は、Ladnerらの米国特許第5,223,409号(1993)（参考としてすべて引用する）に記載されているようにＧＡＤ65アミノ酸配列又は類縁ミニタンパク質を構成するものである。次に、断片又はミニタンパク質は、ＳＭＳ患者からの血清と反応性がないことがスクリーンされる。
【００４７】
更に、本発明は、ＳＭＳ自己抗体と反応する少なくとも１種の線状（又は非立体配座）エピトープを含む断片を提供するものである。上述したように、これらのエピトープは、アミノ酸１−２０（アミノ酸１−１０が結合に特に重要である）及び７０−１０１の中に含まれる。機能エピトープの場合、一般的には少なくとも約６、８又は１０個の同族アミノ酸、より一般的には指定セグメントの全部又は実質的に全部（即ち、７０、８０、９０又は９５％）が存在する。ＳＭＳエピトープは共に線状であるので、残りの分子の立体配座に無関係にＳＭＳ自己抗体と反応する。即ち、実質的に約７０−１０１のアミノ酸又は約１−２０のアミノ酸からなり、フランキングアミノ酸のない断片でさえ、ＳＭＳ自己抗体と反応する。そのような断片は、ＩＤＤＭ自己抗体の主要な種類に結合するのに要するエピトープがないことは当然のことである。しかしながら、ＩＤＤＭを診断する１種以上の他のエピトープが存在する長い断片が提供される。即ち、例えば、アミノ酸１−２０、７０−１０１及び２４５−５８５を含む断片は、ＩＤＤＭ自己抗体の主要な３種類すべて並びにＳＭＳ自己抗体の立体配座及び非立体配座の種類に対するエピトープを含む。
【００４８】
自己抗体結合エピトープを有するＧＡＤ65断片の提供は、無傷ＧＡＤ65と比べて多くの利点を与える。本発明の断片は、通常、可溶化に界面活性剤を要しかつ界面活性剤の存在下でさえ凝集体及び沈降物を形成する傾向のある無傷ＧＡＤ65と対照的に水性溶媒の溶解性が高い。凝集体が形成されると、エピトープが隠され、そのことにより、自己抗体検出の感受性及び精度が減じる。更に、界面活性剤を存在させると、ＥＬＩＳＡプレートへの結合にたいてい有害である。ＧＡＤ65はイオン性界面活性剤及び変性溶媒を用いて可溶化することができるが、その条件は立体配座エピトープの維持と適合しない。標準配座はＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３又はＭＩＣＡ４／ＭＩＣＡ６特異性を有するＩＤＤＭに対する自己抗体を検出するのに特に重要である。実施例４参照。
更に、本断片の利点は、ＩＤＤＭとスティフマン症候群とを区別することができることである。例えば、実質的にアミノ酸１−２０及び／又は７０−１０１からなる断片はＳＭＳ自己抗体のみと反応し、アミノ酸２４５−５８５の断片はＩＤＤＭ自己抗体及びＳＭＳ立体配座自己抗体と反応し、アミノ酸１−２０及び／又は７０−１０１及び２４５−５８５を含む断片は自己抗体のこれらの種類すべてと反応する。
【００４９】
更に、本断片の利点は、ＩＤＤＭの進行における種々の一時的段階を区別する能力である。実施例７に述べられるように、ＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３の結合特異性を有する自己抗体がまず生じ、次にＭＩＣＡ４／ＭＩＣＡ６の特異性を有する自己抗体を生じ、次にＭＩＣＡ２の特異性を有する自己抗体を生じると考えられる。即ち、患者の血清におけるこれらの種々の自己抗体の相対割合は、臨床上の罹患までの一次相により疾患を検査することができる。診断試薬として種々の断片を用いて、種々の自己抗体が容易に区別される。アミノ酸２４５−５８５位からのＧＡＤセグメントを含む断片は、自己抗体の３種類すべてを結合し、アミノ酸２４５−５４５位からの断片はＭＩＣＡ４／６種類のみを結合し、アミノ酸４４５−５８５位からの断片はＭＩＣＡ２種類のみを結合する。
【００５０】
Ｅ．他の診断試薬 
本発明のＧＡＤ65断片は、実験用動物を免疫するために用いることができ、そのことにより該断片に対するモノクローナル抗体を生じる。次に、そのモノクローナル抗体は、更に動物を免疫するとともに抗イディオタイプ抗体を生じるように用いられる。一次抗体への結合がＧＡＤ65断片によって阻害される抗イディオタイプが選ばれる。抗イディオタイプ抗体及びＧＡＤ65断片の両方が一次免疫グロブリンを結合することから、抗イディオタイプ免疫グロブリンはエピトープの“内部イメージ”を表すので、ＧＡＤ65断片を置き換えてもよい。抗イディオタイプ抗体は、ＧＡＤ65断片と実質的に同じ方法で診断方法において用いられる。
【００５１】
ＩＩ．使用方法 Ａ．診断及び予想分析 
本発明の診断方法には、リガンド（例えば、ＧＡＤ65断片）と自己抗体間の特異的相互作用を検出する方法を必要とする。選ばれる具体的な分析プロトコールは重要でなく、その分析が陽性であるとみなされる自己抗原の閾値レベルを検出するのに十分感受性のあることのみが必要である。適切な分析としては、固相（不均一）及び非固相（均一）プロトコールが含まれる。これらの分析は、競合的又は非競合的方式及び種々の標識、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光体、化学蛍光体、スピン標識等を用いて行うことができる。
【００５２】
ＧＡＤ65自己抗体は、たいてい、ＧＡＤ65ポリペプチドが同位元素又はリガンドで標識される免疫沈降法によって検出される。ポリペプチドは、合成中（例えば、35Ｓ−メチオニンを試験管内翻訳系又は細胞発現系に加えることによる）又は合成後標識される。標識されたポリペプチドは、血清試料とインキュベートされて免疫複合体を形成する。免疫複合体は、ポリエチレングリコール又はビーズ上に固定化されたスタフィロコッカスアウレウスもしくはプロテインＡと沈降する。数回洗浄した後、放射性抗原がどのくらい沈降したかを評価するために免疫沈降物が計数される。場合によっては、自己抗体に結合する標識ポリペプチドと競合するように非標識ＧＡＤ65ポリペプチドが加えられる。
【００５３】
ある分析は、自己抗体が血清中に存在すると形成するリガンド−自己抗体複合体を分離するために用いられる固相にリガンドを結合する不均一プロトコールによるものである。リガンドは、種々の固相、例えば、ディップスティック、微粒子、微小球、磁気粒子、試験管、マイクロタイターウェル及びニトロセルロース又はナイロン等に固定化されることが便利である。固相は、血清試料に露出されるので、自己抗体がもしあればリガンドによって捕捉される。次に血清試料から固相を除去することにより、捕捉された自己抗体は血清中の結合されない自己抗体及び他の汚染物から除去される。次に、捕捉された自己抗体は、自己抗体用標識リガンドが洗浄固相に露出される非競合的“サンドイッチ”法を用いて検出される。また、競合方式は、標識ＧＡＤ65抗体を血清試料に予め導入することによるので、標識及び非標識形態は固相に結合するのに競合する。そのような分析法は、周知であり特許及び科学文献の双方に十分記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号、同第3,817,837号、同第3,839,153号、同第4,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号及び同第4,098,876号参照（各々を参考としてすべて引用する）。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,879,262号及び同第4,034,074号に詳細に記載されている（各々を参考としてすべて引用する）。ＥＬＩＳＡ分析は、きわめて低いタイターの自己抗体を検出する。
【００５４】
更に、自己抗体は、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって検出することができる。固相は、固定化リガンドに結合するのに競合する放射能標識抗体の存在下に血清試料に露出される。この分析においては、固相に結合した放射能標識の量は、最初に血清試料に存在した自己抗体の量と逆の関係にある。固相を分離した後、非特異的結合放射能標識は洗浄によって除去され、固相に結合した放射能標識の量が求められる。また、結合放射能標識の量は、最初に試料に存在した自己抗体の量に関係する。
別の態様においては、リガンドがＬ−グルタメート１−カルボキシラーゼ活性を保持するのに十分なアミノ酸配列を含むＧＡＤ65断片である場合、自己抗体は自己抗体の結合についての酵素活性のクエンチングにより検出される。
【００５５】
ＧＡＤ65自己抗体を検出する少なくとも３種類の改良方法は、ＧＡＤ65Ｎ末端配列の実質量がＧＡＤ65自己抗体に結合するのに必要としないという発見に一部起因している。ある方法においては、ＧＡＤ65自己抗体は、ＧＡＤ65の可溶性断片を用いて検出される。Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換により断片を可溶性にする。上記で述べたように、少なくともアミノ酸２４−３１位及び好ましくはアミノ酸４５は除去及び／又は置換されなければならない。上記で述べた可溶性断片はすべて用いることができる。可溶性断片を用いる診断方法の利点、即ち、断片の精製の容易さ及び未変性条件下分析を行う能力は上記で述べた（Ｉ．Ｄ項参照）。
【００５６】
ＧＡＤ65分子の中間及びＣ末端部分における自己反応性エピトープの発見は、可溶性断片を生じるアミノ酸１−２４４のいくつか又は全部を欠失することができるばかりでなく、他の有効な修飾のためのＮ末端領域をほとんど含まない。例えば、主要自己抗体結合エピトープに影響を及ぼさずに、放射性及び／又は固定化部分を酵素のＮ末端部分に結合させることができる。即ち、本発明のある方法は診断試薬として融合タンパク質を利用し、その融合タンパク質は可溶性であってもなくてもよい。融合タンパク質は、２つのペプチド成分を有する。１つの成分は、ＧＡＤ65自己抗体と反応する少なくとも１種のエピトープを有するＧＡＤ65タンパク質又はそのペプチドである。第２のペプチドは、通常、ＧＡＤ65に関係がなく、融合タンパク質の精製及び／又は診断試薬として融合タンパク質の使用に適切な１種以上の性質を有するように処理される。例えば、モノクローナル抗体及びタンパク質キナーゼに特異的な部位の認識部位を有するアミノ末端エクステンションは、Blanar & Rutter (1992)，Science 256:1014-1018（参考としてすべて引用する）に記載されている。そのようなＮ末端エクステンション産物のＧＡＤ65タンパク質又は断片への融合は、Ｎ末端エクステンションに対するモノクローナル抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより単一工程でその融合タンパク質を精製することができる。断片は、糖尿病の立体配座エピトープを損傷するｐＨの極端さより対応するペプチドの量を競合することにより避けられる。次に、その分子を、Ｎ末端エクステンシヨンペプチドを認識するモノクローナル抗体を介してＥＬＩＳＡプレートに固定化することができる。この配向で固定化されると、ＩＤＤＭを診断する主要な自己抗体を結合するエピトープはプレートの末端であるので、結合に利用できる。このことにより、プレートを抗原で直接被覆することから生じる立体障害の問題が排除される。更に、モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、キナーゼ部位は極めて感受性がありかつ迅速なラジオイムノアッセイのために分子を32Ｐで標識することができる。例えば、心筋キナーゼ部位は32Ｐ−ＡＴＰと心筋キナーゼで標識される。
本発明の他の方法においては、ＧＡＤ65タンパク質又はそのペプチド断片は、Ｎ末端アミノ酸１−２４４の中に存在するエピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて固体支持体に固定化される。これらのアミノ酸は、主要なＩＤＤＭ自己抗体をＧＡＤ65に結合することを必要としないので、Ｎ末端配列による結合はこれらの自己抗体に対する結合を損なわない。Ｎ末端配列を固定するのに適切な抗体は、アミノ酸１−２４４（又はそのサブフラグメント）から形成されたペプチドをウサギ又はマウスのような実験用動物に注入し、常法によってモノクローナル抗体を単離することにより生じる。この方法は、アミノ末端エクステンションを上記ＧＡＤ65分子に付加することを必要としない。
【００５７】
抗体によるＧＡＤ65断片の固定化は、少なくとも２つの利点を有する。まず、ＧＡＤ65断片は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる（自己免疫エピトープの立体配座を保存する緩和な手順）。次に、精製したＧＡＤ65断片は、例えば免疫沈降分析における使用に利用できる。また、ＧＡＤ65の粗調製物は、ＥＬＩＳＡプレートに対する抗体により固定化される。
ＧＡＤ65は、エピトープをＩＤＤＭ自己抗体に利用できる配向でプレートに結合する。不純物は洗い流されるが、ＧＡＤ65は結合したままである。次に、自己抗体はＥＬＩＳＡによって検出される。
【００５８】
記載した改良診断方法の３つの種類のすべてを、実施例５及び７に記載されるようにＩＤＤＭを診断する自己抗体の主要な３種類の１種以上を検出するために用いることができる。これらの自己抗体を検出すると、患者がＩＤＤＭに罹っているか又は罹りやすい（即ち、患者は糖尿病前症である）ことが示される。糖尿病前症患者は、ＧＡＤ65に対する循環自己抗体を有するが、ＩＤＤＭに罹っているとして臨床上確認されるべきインスリン産生β細胞に対する十分な損傷をまだ受けていない。更に、該分析は、β細胞に対する自己免疫反応を遮断又は防止する免疫療法の効果を検査しかつ糖尿病前症から臨床上の糖尿病までの疾患の進行を検査するのに有効である。更に、該分析は、膵島細胞移植片を受けた糖尿病患者の移植膵臓β細胞の状態を検査するのに有効であり、ＧＡＤ65自己抗体が存在すると、移植細胞に対して不利な免疫応答が示される。
【００５９】
Ｎ末端融合タンパク質を用いる診断方法は、同様に、アミノ酸１−２０又は７０−１０１に形成された線状エピトープに結合するスティフマン症候群を診断する自己抗体を検出するのに適用できる。これらのエピトープは非立体配座であることから、Ｎ末端ペプチドを付加してもＳＭＳ自己抗体に対する結合能に影響しないと考えられる。しかしながら、Ｎ末端配列の実質量の検出又はＮ末端配列によるＧＡＤ65タンパク質又は断片の固定を含む他の改良法は、スティフマン症候群の検出の場合修飾されなければならない。例えば、Ｎ末端配列の実質的な長さは可溶性ペプチドを生産するために欠失することができるが、欠失した配列は通常アミノ酸１−２０又は７０−１０１を包含しない。同様に、ＧＡＤ65ペプチドがモノクローナル抗体を介して支持体に固定される方法においては、モノクローナル抗体は、１−２０及び７０−１０１エピトープを重複せずこれらのエピトープに遠い一般的には少なくとも１０個のアミノ酸、更に一般的には少なくとも５０個のアミノ酸であるエピトープに結合しなければならない。
【００６０】
更に、本発明は、不溶性ＧＡＤ65断片を用いてある種のＧＡＤ65自己抗体を検出する改良方法を提供するものである。実施例は、ＩＤＤＭ自己抗体の１種類（ＭＩＣＡ２によって例示される）及びＳＭＳ自己抗体の２種類が非立体配座エピトープを認識することを開示している。従って、これらのエピトープを含む断片は、立体配座の喪失が非立体配座エピトープを結合する自己抗体に対する結合能力を損なうことを考えずにイオン性界面活性剤に可溶化することにより精製することができる。即ち、これらの方法においては、非立体配座エピトープを含む（即ち、アミノ酸１−２０、７０−１０１又は５４５−５８５から少なくとも１つのセグメントを含む）無傷ＧＡＤ65又はその不溶性断片は、変性条件下で精製され、次に、復元せずにＧＡＤ65自己抗体を検出するために用いられる。
【００６１】
３．判別診断方法 本発明の他の態様においては、ＩＤＤＭとスティフマン症候群及び／又はＩＤＤＭの進行における種々の一時的段階を区別する診断方法が提供される。ある方法は、ＩＤＤＭを診断する自己抗体を検出せずにスティフマン症候群を診断する自己抗体を検出する。これらの方法においては、診断試薬は、スティフマン症候群と反応するエピトープを有しかつＩＤＤＭ自己抗体と反応するエピトープを含まないＧＡＤ65断片である。例えば、アミノ酸１−２０及び／又はアミノ酸７０−１０１を含み、３種の主要なＩＤＤＭ自己抗体結合エピトープすべてが存在しないようにアミノ酸２４５−５８５を実質的に含まない断片が適切である。
アミノ酸１−１０１を実質的に含む断片も適切である。
【００６２】
ＩＤＤＭの一時的進行を検査する他の方法が提供される。これらの方法は、初期及び後期エピトープ認識を区別することにより、免疫応答期間を推定する。この方法は、疾患の進行の種々の一時的段階を診断する異なった自己抗体の種類を結合する３種のエピトープを同定することに一部起因している。これらの方法においては、患者の血清試料が第１ＧＡＤ65自己抗体と反応するエピトープを有する第１ＧＡＤ65断片に露出される。血清中に存在する又は存在しないＧＡＤ65自己抗体との特異的相互作用の存在又は不在が検出される。次に、これらの工程が第２ＧＡＤ65自己抗体と反応するエピトープを有する第２ＧＡＤ65断片を用いて反復される。
【００６３】
ＩＤＤＭの一時的判別診断に適切なＧＡＤ65断片は、上記I.D.項で述べた。簡単に述べると、アミノ酸２４５−５８５の相接する配列を含む断片は、ＩＤＤＭ自己抗体の主要な３種類すべてと反応するエピトープを含有する。これらの種類は、ＭＩＣＡ１／ＭＩＣＡ３の結合特異性を有する自己抗体（最も初期に産生される）、ＭＩＣＡ４／６と同じ結合特異性を有する自己抗体（２番目に産生される）及びＭＩＣＡ２と同じ結合特異性を有する自己抗体（３番目に産生される）である。ほぼＣ末端の４１個のアミノ酸（即ち、５４５−５８５）の存在しない断片は、ＭＩＣＡ４／ＭＩＣＡ６種類の自己抗体とのみ反応する。アミノ酸５４５−５８５を含みかつアミノ酸２４５−２９５を実質的に含まない断片は、ＭＩＣＡ２種類の自己抗体とのみ反応する。即ち、例えば、２４５−５８５アミノ酸断片と特異的に相互作用するが、他の２種類の断片とはしないと、β細胞エピトープに対する自己免疫応答の初期相における患者を示す。２４５−５８５断片及び４１末端アミノ酸の存在しない断片と特異的に相互作用すると、自己免疫応答の中間相の患者を示す。３種すべての断片と反応すると、免疫応答の後期相を示す。
【００６４】
４．ＩＤＤＭを診断するＧＡＤ65自己抗体の予想値 
ＩＤＤＭの臨床上の症状の罹患後、患者の約７０％がＧＡＤ65自己抗体の少なくとも１種類を産生する。対照的に、普通の患者の約１−２％のみこれらの自己抗体を産生する。例えば、Karlsenら，Diabetes 41，1355-1359（1992）；Hagopianら，Diabetes 42，631-636（1993）（各々を参考としてすべて引用する）。
即ち、ＧＡＤ65自己抗体の検出は、ＩＤＤＭの確立を強く診断する。
【００６５】
正常な患者においてＧＡＤ65自己抗体が検出されると、ＩＤＤＭを発症する危険のある患者を確認することが高く予想される。１つの研究において、最初は健康な子供たちからの血清試料を１１年間かけて分析した。研究の最初に採取した試料の７つは、ＧＡＤ65自己抗体の少なくとも１種類を含むことが見られた。これらの試料が由来する７人の子供たちの５人は、研究の過程でＩＤＤＭの発症に進行した。対照的に、最初の試料がＧＡＤ65自己抗体を含まない１００人の子供たちのうち１人だけがＩＤＤＭを発症した。
【００６６】
Ｂ．治療方法 １．免疫耐性 
上記の可溶性ＧＡＤ65断片は、可溶性断片の抗原決定基に対する免疫原性耐性誘発させるために生体内で患者に投与される。ＧＡＤ65断片の投与が免疫応答を永続させないことを注意しなければならない。応答の種類（即ち、免疫原性又は寛容原性）は、抗原の用量、物理的形態及び投与経路に左右される。抗原の高又は低用量はたいてい免疫耐性を生じるが、中間用量は免疫原性である。抗原の単量体形態は通常寛容原性であるが、高分子量集合体は免疫原性であると考えられる。抗原の経口、経鼻、胃内又は静脈内注入はしはしは耐性を生じるが、皮内又は筋肉内抗原投与は特にアジュバントの存在下免疫原性応答を容易にする。自己免疫抗原の経口投与は、動物モデルにおいて実験用アレルギー性脳脊髄炎の発症を防御しかつ動物モデル及び臨床試験においてリウマチ様関節炎を抑制することが示された。Marx，Science 252，27-28 (1991)；Trenthamら，Science 261，1727-1730（1993）（各々を参考としてすべて引用する）。更に、自己抗原の経鼻投与は、実験用アレルギー性脳脊髄炎を防御することが報告されており、小さな断片の好ましい投与経路である。Metzler & Wraith，International Immunology 5，1159-1165(1993)（参考としてすべて引用する）参照。ある方法においては、免疫耐性は、免疫抑制治療に隠れて誘導される。Cobboldら，国際出願第90/15152号(1990)（参考としてすべて引用する）参照。
【００６７】
耐性は、自己免疫Ｔ又はＢ細胞の排除又はその非応答性の誘導により付与される。断片に対する細胞性及び体液性応答を抑制する可溶性断片によるサプレッサー機序の活性化によって部分的に誘導される。細胞応答の抑制は、ＩＤＤＭにおいて膵臓β細胞の破壊を防止する点で特に重要である。即ち、ＧＡＤ65自己反応性Ｔ細胞（ＧＡＤ65Ｔ細胞）に特異的に結合するＧＡＤ65断片は、免疫耐性を誘導するのに特に適切である。例えば、Kaufmanら，（1993），Nature 366:69-71；Tischら，（1993），Nature 366:71-75（参考としてすべて引用する）参照。
体液性応答の抑制は、スティフマン症候群におけるニューロンの損傷を防止するのに特に重要であると考えられる。
ある実施態様においては、非応答性及びその結果として自己免疫応答の損傷の発生は、本発明の可溶性ＧＡＤ65断片を免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ又は治療される患者のリンパ系細胞に結合することにより促進される。Bradley-Mullen（1982），Annals N.Y．Acad．Sci.392:156-166（参考としてすべて引用する）参照。
【００６８】
２．ＧＡＤ65阻止ペプチドによるＴ細胞活性化阻害 
可溶性ＧＡＤ65断片は、また、例えは、Wraithら（1989），Cell 59:247-255（参考としてすべて引用する）に記載されている方法を用いて、自己抗原のＭＨＣレセプターへの結合を遮断することによりＴ細胞の活性化を阻害するために用いられる。これらの方法に有用なＧＡＤ65断片は、まず天然に存在する配列の修飾に供される。修飾は、例えば、ＧＡＤ65ＤＮＡ断片の試験管内突然変異誘発又はペプチドシンセサイザーによる類縁体の合成によって行われる。可溶性ＧＡＤ65断片に導入された修飾は、断片のＭＨＣ分子への結合能を維持又は好ましくは高めつつ、可溶性ＧＡＤ65断片のＴ細胞レセプターに対する結合親和性を低減又は排除するように働く。所望の結合特異性を有する分子は、ファージディスプレイテクノロジーによってスクリーンすることができる。例えば、Devlin，国際出願第91/18980号（参考としてすべて引用する）参照。この方法で修飾された可溶性ＧＡＤ65断片は、ＭＨＣ分子に結合するＧＡＤ65自己抗原と競合するが、結合した場合Ｔ細胞を活性化することはできない。即ち、ＭＨＣレセプターに結合した標準ＧＡＤ65自己抗原の量及びその結合によって生じたＴ細胞仲介免疫応答の程度が低減される。
【００６９】
３．ＧＡＤ65自己抗原に特異的なＴ細胞の排除 
自己免疫疾患を治療するもう１つの方法は、自己免疫疾患の仲介に関与するＴ細胞に対向するＢ細胞免疫応答の誘導に基づくものである。一般に、Sinhaら(1990)，Science 248:1380-1388参照。これらの方法においては、可溶性ＧＡＤ65断片は、ＧＡＤ65自己抗原に特異的なヘルパー又は細胞障害性Ｔ細胞のクローン単離物の増殖及び単離に用いられる。次に、これらのＴ細胞又はその成分は、Ｂ細胞免疫応答を誘発するワクチンとして用いられる。
【００７０】
末梢血液リンパ球は、ＩＤＤＭ又はスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者から採取される。末梢血液リンパ球内のヘルパー又は細胞障害性Ｔ細胞は、当該技術において周知の方法を用いて可溶性ＧＡＤ65ペプチドに露出することにより刺激される（例えば、Leukocyte Typing II，Vol.1（Reinherzらeds.，Springer Verlag，NY，1986参照）（参考としてすべて引用する）。通常、他のマイトジェン及び増殖エンハンサー、例えば、フィトヘマグルチニン、インターロイキン２等を存在させる。Ｔヘルパー細胞又は細胞障害性Ｔ細胞のクローンは、これらの培養物から単離される。次に、Ｔ細胞のクローンは、生体内投与の医薬組成物に組込まれる前に弱毒化される（例えば、放射線に露出することによる）。弱毒化の代わりに、免疫原として作用することができるがそれ自体無傷細胞のＴヘルパー又はＴ細胞障害活性のないＴ細胞の一部は、例えば、生化学分別により単離される。Ｔ細胞のクローン単離物に特異的な免疫応答できるＴ細胞レセプター又はその免疫原性断片が特に適切である。Ｔ細胞レセプターの断片は、慣用の組換えＤＮＡ技術によって調製される。
【００７１】
Ｃ．医薬組成物 
ＧＡＤ65可溶性断片又はＴ細胞成分は、インスリン依存性糖尿病の罹患に関係する膵臓β細胞の破壊又はスティフマン症候群に関係するニューロンの損傷を弱毒化、阻害又は予防するのに有効な医薬組成物に組込むことができる。この組成物は、薬学的に許容しうる担体中ＧＡＤ65及び／又はＴ細胞成分（例えは、Ｔ細胞レセプター断片）の少なくとも１種の可溶性断片の治療又は予防量を含まねばならない。医薬担体は、ポリペプチドを患者に送達するのに適切な適合しうる非毒性物質とすることができる。滅菌水、アルコール、脂肪、ろう及び不活性固形物が担体として用いられる。薬学的に許容しうるアジュバント、緩衝剤、分散剤ら医薬組成物中に組込まれる。医薬組成物中ＧＡＤ65ペプチド又は他の活性剤の濃度は、広範囲に、即ち、約0.１重量％から変動させることができ、通常、少なくとも約１重量％から２０重量％以上までである。
経口投与の場合、有効成分は、カプセル剤、錠剤及び散剤のような固形剤形又はエリキシル剤、シロップ剤及び懸濁液剤のような液状剤形で投与される。活性成分は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、スターチ、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウム等の不活性成分及び粉末担体と共にゼラチンカプセルに封入することもできる。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散又は他の既知の所望の特徴を得るために添加される追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等である。圧縮錠剤を製造するために同様の希釈剤を用いることができる。錠剤及びカプセル剤は、共に長時間にわたって投薬の連続的放出を与えるために徐放性製剤として製造される。圧縮錠剤は、不快な味をかくしかつ錠剤を雰囲気から保護するために糖剤皮又はフィルムコーティングが施されたり胃腸管での選択崩壊のために腸溶剤皮が施される。経口投与用液状剤形は、患者の受容を高めるために着色剤及び香味剤を含むことができる。
【００７２】
経鼻投与の場合、ポリペプチドはエーロゾルとして処方される。“エーロゾル”なる語は、細気管支又は鼻道に吸入されることが可能な本発明の化合物のガス支持浮遊相が含まれる。詳細には、エーロゾルは、定量吸入器もしくはネブライザー又は噴霧器で生じるように本発明の化合物の小滴をガス支持浮遊させたものが含まれる。更に、エーロゾルには、空気又は他のキャリヤガス中に浮遊した本発明の化合物の乾燥粉末組成物が含まれ、例えば、吸入装置からインサフレーションにより送達される。Ganderton & Jones，Drug Delivery to the Respiratory Tract，Ellis Horwood（1987）；Gonda（1990）Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313；及びRaeburnら（1992）J.Pharmacol．Toxicol．Methods 27:143-159参照。
【００７３】
静脈内注入用の典型的な組成物は、滅菌リンゲル液１００〜５００ml及びＧＡＤ65ペプチド又はＴ細胞レセプターペプチド１００〜５００mgを含有するように調製される。筋肉内注射用に典型的な医薬組成物は、例えば、滅菌緩衝水１ml及び本発明の精製リガンド１〜１００μｇを含有するように調製される。非経口的に投与できる組成物を調製する方法は、当該技術において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science（15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980）（参考としてすべて引用する）を含む種々の情報に更に詳細に記載されている。
【００７４】
Ｄ．投与方法 
本発明の医薬組成物は、通常、静脈内又は経口投与される。事情によっては、皮内又は筋肉内投与も可能である。本組成物は、本発明の診断方法によって確認されたＩＤＤＭ又はスティフマン症候群に罹っている又は罹りやすい患者の予防治療に投与することができる。治療用の場合、本医薬組成物は、β細胞破壊を更に阻害又は防止するのに十分な量で確立された糖尿病に罹っている患者に投与される。ＩＤＤＭ又はスティフマン症候群に罹りやすい患者の場合、本医薬組成物は、β細胞の免疫破壊を防止あるいは阻害するのに十分な量で予防的に投与される。これを行うのに適切な量は、“治療的に有効な用量”として定義される。その有効な用量は、自己免疫応答の程度及び患者の健康の全身状態に左右されるが、一般的には体重１キログラム当たり精製リガンド約１〜５００mgであり、１キログラム当たり約５〜２５mgの用量が通常用いられる。
【００７５】
ＩＩＩ．ＧＡＤ65断片に特異的なＴ細胞 
更に、可溶性ＧＡＤ65断片に露出することにより刺激されたＴ細胞が提供される。このＴ細胞は、通常、ヘルパーＴ細胞又は細胞障害性Ｔ細胞である。このＴ細胞は、ＭＨＣ分子に複合した断片を生じる細胞に対して特異的結合を示す点でＧＡＤ65断片に特異的である。更に、ＧＡＤ65特異的Ｔ細胞に対して免疫応答を誘発させることができるＴ細胞の成分が提供される。その成分は、通常、Ｔ細胞レセプター又はその断片である。レセプター断片は、断片由来のＴ細胞のクローン単離物に対して免疫応答を誘発させることができなければならない。
【００７６】
下記実施例は、具体的に説明するためであり、限定するものではない。
実施例
実施例１：ＧＡＤ65及びＧＡＤ67タンパク質の発現 
ヒトＧＡＤ65ｃＤＮＡクローンの1.８ｋｂＢａｍＨＩ断片をバキュロウイルスベクターｐＶＬ９４１（Dr．D.Morgan，UCSFから入手）に及びヒトＧＡＤ67の2.7ｋｂＥｃｏＲＩ断片又はラットＧＡＤ65ｃＤＮＡクローンの2.4ｋｂＥｃｏＲＩ断片をバキュロウイルスベクターｐＶＬ１３９２（Invitrogen、カリフォルニア州、サンジエゴ）に結合することにより、ヒト及びラットＧＡＤ65及びヒトＧＡＤ67を発現する組換えバキュロウイルスベクターを構築した。ヒトＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡは、Dr．A．Tobln，UCLAから入手した。確立されている方法（Summers & Smith（1987），Tex．Agric．Exp．Stn．Bull．1555:1-56）を用いて記載されているように（Christgauら（1992），J.CellBiol．118:309-320参照）、組換えウイルスを誘導及び単離した。全長ラットＧＡＤ65を固定する組換えバキュロウイルスは前に記載した（上記Christgauら(1992)参照）。
【００７７】
実施例２：ＧＡＤ65の欠失変異体の発現 
最初の１０１個のアミノ酸の存在しないＮ末端欠失変異体を、ｐＶＬ１３９２ベクターに挿入した全長ＧＡＤ65構築物のオリゴヌクレオチド特定突然変異（Kunkel（1985），Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）82:488-492参照）（参考としてすべて引用する）により作成し、昆虫細胞中で発現した。
ＣＯＳ−７細胞（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、メリーランド州、ベテスダ）中で発現させる他の欠失変異体を、次の通り調製した。ラットＧＡＤ65をｐＳＶ−ＳＰＯＲＴベクター（BRL，メリーランド州、ゲイテルスブルグ）のＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。Ｎ末端及びＣ末端欠失変異体の収集を、固定プライマーを用いて所定部位のポリメラーゼ連鎖反応（saikiら（1988），Science 239:487-494参照）（参考としてすべて引用する）によって作成した。アミノ酸３６３−４２２の存在しない内部欠失変異体を、ＧＡＤ65のＮｓｉＩ制限部位を用いて作成した。同様に、ＢｇＩＩＩ制限部位を用いて、ラットＧＡＤ67のアミノ酸１−９５及びラットＧＡＤ65のアミノ酸３５３−５８５を含むハイブリッド分子を作成した。
【００７８】
タンパク質断片の発現を、プローブとしてＧＡＤ65特異的又はＧＡＤ67特異的抗体を用いるウェスタンブロット法により分析した。これらの抗体は次の所から入手した：ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の未変性形態を認識するマウスモノクローナルＧＡＤ１（Gottliebら（1986），Neurobiol．83:8808-8812参照）は、アメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクションから入手した。ＧＡＤ65に特異的なマウスモノクローナルＧＡＤ６（Chang & Gottlieb（1988），J．Neurosci．7:2123-2130参照）は、Dr．D．Gottlieb（ワシントン大学、セントルイス州）によって寄与された。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の双方を認識するラットＧＡＤ67のＣ末端ペプチドに対して生じたポリクローナルウサギ抗体は、Dr．J.S．Petersen，Hagedorn Research Laboratory，コペンハーゲンから贈られた。ＧＡＤ67を主に認識するＫ２抗原は、Dr．A．Tobin，UCLAから贈られた。ＳＭＳ患者の血清は、Dr．Vanda Lennon（Mayo Clinic、ニューヨーク州、ロチェスター）から入手した。
タンパク質断片は、Christgauら（1991），J．Biol．Chem，266:21257-21264；Christgauら（1992），J．Cell Biol．118:309-320）に記載されている分析用細胞から精製した。
【００７９】
実施例３：ＩＤＤＭ患者由来のＧＡＤ67に対するモノクローナル抗体 
Ｓｆ９昆虫細胞又はＣＯＳ−７細胞中で発現された未変性ヒトＧＡＤ65及び／又はＧＡＤ67タンパク質を認識する１型糖尿病患者由来の１組のモノクローナル抗体（ＭＩＣＡ１−６、上記Richterら参照）の能力を試験した。ＧＡＤ65に対する抗体の結合は、上記Christgauら（1992）；Baekkeskovら（1990），Nature 347:151-157）に記載されているように免疫沈降により分析した。
ＭＩＣＡ１、２、３、４及び６は、すべて未変性条件下でＧＡＤ65を認識したが、ＧＡＤ67を認識しなかった。（図２参照）。
【００８０】
実施例４：インスリン依存性糖尿病自己抗体によって認識されたエピトープの立体配座依存性の決定 
立体配座依存性は、ウェスタンブロット法で決定されるように、変性条件下ＧＡＤ65タンパク質に対して結合するＭＩＣＡＩ−４及び６の能力を試験することにより求めた（上記Christgauら（1992），上記Baekkeskovら（1990）参照）。
ＭＩＣＡ２のみ変性ＧＡＤ65をウェスタンブロットにより認識した。更に、ＭＩＣＡ１−６由来の１型糖尿病患者の血清は、ウェスタンブロットにより変性ＧＡＤ65を弱く染色したが、ＧＡＤ67をしなかった。結果は、ＭＩＣＡ１、３、４及び６のみ非線状又は立体配座エピトープを認識するが、ＭＩＣＡ２はＧＡＤ65分子に特異的な線状エピトープを認識することを示す。即ち、ＧＡＤ65タンパク質は、ＧＡＤ67分子に存在しない線状及び非線状又は立体配座自己免疫エピトープをかくまっている。
【００８１】
実施例５：欠失変異体の分析によるインスリン依存性糖尿病自己抗体のエピトープマッピング 
免疫沈降実験においては、ＭＩＣＡがすべて最初の１０１個のアミノ酸の存在しない欠失変異体を認識した（図４）。ＭＩＣＡによって認識されたドメインを更に局在化するために、ＣＯＳ−７細胞中で発現されたラットＧＡＤ65の多数のＮ末端及びＣ末端欠失変異体のＭＩＣＡに対する結合を試験した。発現ＧＡＤ65断片のサイズ、アミノ酸配列におけるその位置及び種々のＭＩＣＡとの反応性は、図６Ａに纏められている。最初の１９４個のアミノ酸の存在しないＮ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｎ４４及び更に５０個のアミノ酸（Δ１−２４４）を消失しているＮ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｎ３９は、免疫沈降実験においてモノクローナルすベてによって認識された（図６Ａ及び６Ｂ）。しかしながら、更に５１個のアミノ酸がＮ末端から欠失されたＮ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｎ３３は、ＭＩＣＡ１、４及び６によって認識されず、免疫沈降実験においてＭＩＣＡ３と極めて弱い陽性あるいは陰性でありＭＩＣＡ２と弱い陽性であった（図６Ａ及び６Ｂ）。ＭＩＣＡ２は、全長分子とのようにウェスタンブロットによりこの形態と同様に十分に反応した。しかしながら、ＭＩＣＡは、免疫沈降実験において弱い陽性でしかなく、このモノクローナル抗体によって認識された線状エピトープは端を切り取った折りたたみタンパク質中に隔離されていることを示した。
【００８２】
Ｃ末端欠失変異体の分析により、Ｃ末端の４１個のアミノ酸を除去すると、ＭＩＣＡ１、ＭＩＣＡ２及びＭＩＣＡ３（図６Ａ及び６Ｃ）の結合が消滅することが示された。しかしながら、ＭＩＣＡ４及びＭＩＣＡ６は、この変異体（ＧＡＤ65Ｃ６１、Δ５４５−５８５）及び更にＣ末端に６９個のアミノ酸が存在しないＣ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｃ５３（Δ４７６−５８５）の両方を認識した（図６Ａ及び６Ｃ）。ＭＩＣＡ４は、ＭＩＣＡ６より両変異体に対して強い結合を示した。モノクローナルは、いずれもＣ末端に１００個のアミノ酸を更に消失しているＣ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｃ４１（Δ３７６−５８５）に対して反応性を示さなかった（図６Ａ）。
【００８３】
分子の内部における欠失の影響を分析するために、酵素のピリドキサルホスフェート欠失部位をかくまっているアミノ酸３６３−４２２の存在しない欠失変異体、ＧＡＤ65Ｉ５９に対するＭＩＣＡの結合を分析した。ＭＩＣＡ２を除くＭＩＣＡは、いずれも免疫沈降実験においてこの変異体を認識しなかった。しかしながら、ＭＩＣＡ２はこの変異体及び全長分子とウェスタンブロットにより同様に十分に反応したが、免疫沈降実験においては弱く結合するだけであり（図６Ａ）、線状ＭＩＣＡ２エピトープは免疫沈降の未変性条件下部分的にしか露出されないことを示した。同様の反応パターンが、ＧＡＤ65の最後の２３３個のアミノ酸に結合したＧＡＤ67のアミノ酸を含むハイブリッド分子で観察された（図６Ａ）。ＧＡＤ65分子の最後の４１アミノ酸の中のアミノ酸はＭＩＣＡ２の線状エピトープの一部であることが結論される。その４１個のアミノ酸の中の最後の１６は、ＧＡＤ67と同一であり（Erlanderら（1991），Neuron．7:91-100参照）かつこの配列を含むペプチドの過度の量がＭＩＣＡのＧＡＤ65への結合に影響しなかったことにより役割を果たさないと考えられる。残りの２５個のアミノ酸中ＧＡＤ65とＧＡＤ67間で異なる５個のアミノ酸の中で、１個が保存変化である。従って、残りの４個のアミノ酸の１個以上はＭＩＣＡ２のエピトープにおいて主な役割を果たすと考えられる。
【００８４】
欠失変異体の分析により、ＭＩＣＡの３種の主要な認識パターンが示される。
ＭＩＣＡ４及び６によって特定される第１のパターンは、分子中最後の４１個のアミノ酸に左右される。ＭＩＣＡ４及び６によって特定される第２のパターンは、これらの残基と無関係であり、分子の中央の方のアミノ酸に限定される。
ＭＩＣＡ２によって特定される第３のパターンは、分子中最後の４１個のアミノ酸に左右されるが、他のアミノ酸と無関係である。
ＧＡＤ67及びＧＡＤ65は、最初の９５個のアミノ酸では非常に多様性であるが、分子の残りでは顕著な（約７５％）相同性を共有している。上記Erlanderら（1991）参照。しかしながら、驚くべきことに、ＭＩＣＡによって認識されたＧＡＤ65特異的エピトープのいずれもＮ末端の最初の２４４個のアミノ酸に局在化されなかった。即ち、ＭＩＣＡのエピトープは、Ｎ末端膜固定ドメインから著しく離れた分子の領域に集中する。Ｃ末端の最後の１１０個のアミノ酸は、分子の中央の残基にかかっているＭＩＣＡ４及び６エピトープに関与しない。対照的に、Ｃ末端の４１個のアミノ酸を欠失すると、ＭＩＣＡ１及び３エピトープが消滅する。更に、アミノ酸２４５−２９５を欠失すると、ＭＩＣＡ２のこの変異体に対する弱い欠失によって示されるように、Ｃ末端領域の立体配座変化がすべて消滅するが、Ｃ末端のアミノ酸１−４１及び４２−１１０を欠失すると、ＭＩＣＡ４及び６エピトープが無傷のままであるＧＡＤ65分子の中央領域に影響しないと考えられる。最後に、ＭＩＣＡ３はＧＡＤ65Ｎ３３変異体に弱く結合したが、Ｃ末端欠失変異体への欠失は検出されなかった。即ち、アミノ酸２４４−２９５を欠失すると、Ｃ末端領域の立体配座に影響すると考えられるか、Ｃ末端アミノ酸を欠失すると、直接ＭＩＣＡ１及び３に影響すると考えられる。線状ＭＩＣＡエピトープの重要な部分は、アミノ酸５４５と５６９間に局在化され、即ち、Ｃ末端に近接する。
【００８５】
実施例６：タンパク質フットプリント法によるＧＡＤ65自己抗体のエピトープマッピング
ＭＩＣＡによるエピトープ認識における類似性及び差異を、５００μｌのＭＩＣＡ上清又は１０μｌのＧＡＤ６又はＧＡＤ１各腹水を用いてタンパク質フットプリント法により分析した（Sheshberadaran & Payne（1988），Proc．Natl．Acad．Sci．85:1-5）（参考としてすべて引用する）。免疫複合体を、プロテインＡ−セファロースに結合することにより単離し、洗浄した。免疫複合体を安定化するために、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ特異的、Ｆ（ａｂ）2フラグメント、Jackson）を抗原抗体ＰＡＳ複合体と４℃で４５分間インキュベートした後、プロテアーゼとインキュベートした。プロテアーゼとのインキュベーションは、氷上で３０分間（キモトリプシン及びトリプシン）又は３７℃で１時間（キモトリプシン）とした。プロテアーゼ処理は、ＩＭＰバッファー中でＰＡＳ結合複合体を洗浄することにより停止し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びフルオログラフィーを行った。個々のＭＩＣＡに結合しかつ二次抗体に結合することにより安定化したＧＡＤ65の免疫複合体をトリプシン及びキモトリプシンで消化した。次に、ＭＩＣＡによる分解から保護された断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００８６】
図５は、ＭＩＣＡ１、２及び３をＭＩＣＡ４及び６と区別する２つの異なった主要なフットプリントパターンを示すものである。第１グループの中でＭＩＣＡ１と３は、同様であるがＭＩＣＡ２とは異なる同一パターンを示した。更に、第２グループではＭＩＣＡ４とＭＩＣＡ６はわずかな差異しか示さなかった（図５）。
ＭＩＣＡ４及びＭＩＣＡ６は、共に全長ＧＡＤ65分子及びＮ末端の存在しない５５ｋＤａ断片（上記Christgauら（1992）参照）をＭＩＣＡ１、２及び３より効果的に保護した。即ち、ＭＩＣＡ４及び６と対照的に、長時間キモトリプシンインキュベーション後、全長ＧＡＤ65分子又は５５ｋＤａ断片はＭＩＣＡ１、２及び３との複合体に検出されなかった。（図５、レーン１０及び１１とレーン７と９を比較する）。これらの結果は、ＭＩＣＡ６がＮ末端に近い方の分子の領域を結合するので、分子のこの部分をＭＩＣＡ１、２及び３より保護することを示している。
ＭＩＣＡ１、３、４及び６は、キモトリプシンとの長時間インキュベーシヨン後、なお複合体フットプリントパターンを示したが（図５、レーン７−１２）、約１４ｋＤａの１バンドだけその条件下ＭＩＣＡ２によって保護された（図５、レーン８）。
要するに、ＭＩＣＡ１、３、４及び６の複合体フットプリントパターンは非線状エピトープ認識と一致するが、ＭＩＣＡ２によって保護された１４ｋＤａ単一断片はこのモノクローナル抗体による線状エピトープ認識と一致する。更に、フットプリント結果は、ＭＩＣＡ４及び６がＭＩＣＡ１、２及び３よりＮ末端の方の領域を認識することを示している。
【００８７】
実施例７：１型糖尿病患者の血清を診断するためのＧＡＤ65断片の使用 
新たに診断された９人の年齢４−１／２〜２６才（６Ｆ、３Ｍ）の若い１型糖尿病患者（Ｄ１−９、図７）及び罹患の臨床上の発症３２ヵ月前に採取した１人の糖尿病前症患者（Ｐ１、女、１１才）からの血清のＮ末端及びＣ末端欠失変異体に対する結合を分析した。１型糖尿病患者の血清は、Dr．H.J．Aanstoot（ロッテルダム大学、オランダ）から入手したものか又は前に記載されたものである（Baekkeskovら（1987），J．Clin．Invest．79:926-934参照）（参考としてすべて引用する）。
更に、ＭＩＣＡが由来する患者（Ｄ１０）及び膵島細胞の細胞質自己抗体に陽性であるが１型糖尿病の臨床症状のないもう１人の患者（Ｐ２）の血清を平行して分析した（図７）。１１個の新しい血清は、すべて全長分子と同様に十分にＮ末端欠失変異体ＧＡＤ65Ｎ４４（Δ１−１９４）（図７）を認識した。２４４個のＮ末端アミノ酸を欠失すると（ＧＡＤ65Ｎ３９）血清との反応性をわずかに低下するものもあったが（図７）、更に５１個のアミノ酸を欠失すると（ＧＡＤ65Ｎ３３）血清のすべてによる認識が消滅した。血清は、Ｃ末端の４１個のアミノ酸が存在しない変異体（ＧＡＤ65Ｃ６１）の分析において区別できた。罹患の臨床上の発症３２ヵ月前に採取した糖尿病前症患者（ＰＩ）の血清及び全員がＧＡＤ65抗体に強い陽性であった新たに診断された３人の患者（Ｄ３、女１１才、Ｄ４、男4.5才及びＤ５、男２６才）の血清を含む４つの血清は、ＧＡＤ65Ｃ６１変異体との反応性が極めて弱いかあるいは全く示さなかった（図７）。血清の残りは、この端を切り取ったタンパク質にも強い陽性であった（図７）。要するに、Ｎ末端からＧＡＤ65分子の１／３を欠失すると糖尿病血清との免疫反応性が検出できる低下を生じなかったが、Ｃ末端から４１個のアミノ酸を欠失すると患者の血清によって認識されたエピトープがほとんど消滅した。１１個の患者血清はいずれもウェスタンブロットによりＧＡＤ65を認識しなかったので、ＭＩＣＡ２のような線状エピトープを認識する自己抗体を含まなかった。
【００８８】
３種類の異なった糖尿病自己抗体が種々の血清試料中に生じる相対頻度は、産生される時間に関係する。自己免疫疾患においては、体液性及び細胞性両自己免疫は初期相においてはたいてい主な単一エピトープに対するものであるが、自己免疫応答の期間の長い自己抗原においては他の領域に広がる（McNeilageら（1990），J.Immunol．145:3829-3835；St．Clarら（1990），J．Clin．Invest．85:515；Lehmannら（1992），Nature 358:155-157参照）（各々を参考としてすべて引用する）。ＧＡＤ65自己抗体は、たいていβ細胞の大多数が消える数年前であり臨床症状が進行する膵臓β細胞破壊の初期相で検出された（上記Baekkeskovら（1987）、Atkinsonら（1990），Lancet 335:1357-1360参照）（参考としてすべて引用する）。これらの所見は、一次自己免疫応答が単一エピトープに対する自己抗体に限定され、より多様な自己抗体は引き続いて一次自己免疫応答で生じることを示している。従って、ＭＩＣＡによって特定されるＧＡＤ65エピトープは初期及び後期両体液性応答を表すと考えられる。試験したすべての血清によって確認されたＭＩＣＡ１及び３によって特定されたエピトープは、初期体液性応答を表すと考えられる。試験した血清であるがすべてでない血清によって認識されたＭＩＣＡ４及び６によって特定されたエピトープは、中間体液性応答を表すと考えられる。ＭＩＣＡが由来する患者の血清によってのみ認識されたＭＩＣＡ２によって特定されたエピトープは、後期体液性応答を表すと考えられる。エピトープの異なった種類に対して示された進行性の一時的応答は、糖尿病前症患者の血清試料を時間が経つにつれて検査することにより確認することができる。
【００８９】
実施例８：スティフマン症候群自己抗体のエピトープマッピング 
ＧＡＤ65分子についてＳＭＳ患者の血清によって認識されたエピトープを局在化するために実験を行った。最初の６９−７０個又は最初の１０１個のアミノ酸を欠失したＮ末端ＧＡＤ65欠失変異体を構築した。変性条件下ＳＭＳ患者の血清中の自己抗体に対するこれらの断片の結合を試験した。図８は、無傷ＧＡＤ67、無傷ＧＡＤ65、最初の６９−７０個のアミノ酸が存在しないＧＡＤ65の５７ｋＤａのトリプシン断片及び最初の１０１個のアミノ酸が存在しないＧＡＤ65の５５ｋＤａ欠失変異体のｉ）ＧＡＤ65を認識するがＧＡＤ67を認識しない、全長タンパク質より５７ｋＤａで弱い染色を示し５５ｋＤａ欠失変異体と反応性を示さない典型的なＳＭＳ血清、ｉｉ）すべての断片を染色する対照ウサギポリクローナルウサギ血清によるウェスタンブロット染色を示すものである。
【００９０】
図８は、ＳＭＳ血清とＧＡＤ65タンパク質との反応性が最初の６９−７０個のアミノ酸が存在しないＧＡＤ65断片中で顕著に低下することを示すものであり、線状エピトープがこれらの残基の中に局在化されることを示している。Δ１０１ＧＡＤ65断片での反応性の完全な喪失は、第２エピトープがアミノ酸６９又は７０とアミノ酸１０１との間に位置することを示している。分析したＳＭＳ血清の２６試料のうち２２試料が上記の結果を示した。
ウェスタンブロット法によって同定された２つの線状エピトープは、人工ＧＡＤ65ペプチドを用いる競合的結合実験によって更に局在化された。ＧＡＤ65アミノ酸１−２０又は７０−１０１を含むペプチドは、ＧＡＤ65に対する結合の場合ＳＭＳ血清と効果的に競合することが判明した。結果は、アミノ酸１−２０に一方のエピトープを、アミノ酸７０−１０１にもう一方のエピトープを局在化する。
ＩＤＤＭとスティフマン症候群患者の自己抗体間のエピトープ認識の明瞭な差異は、ＧＡＤ65に対する体液性自己免疫がおそらくスティフマン症候群又はＩＤＤＭが生じる異なった病因機序に関係があることを示している。
【００９１】
実施例９：無傷タンパク質に不溶性を付与するＧＡＤ65Ｎ末端ドメインの局在化 
前述のように、ＧＡＤ65のＮ末端ドメインは無傷タンパク質を水性溶媒に不溶にする脂質修飾を含んでいる。本実施例は、修飾が生じ、可溶性ＧＡＤ65断片を作成するために除去しなければならないアミノ酸部位を局在するものである。位置３０及び４５のシステイン残基がパルミトイル化部位であるかを試験するために、これらの残基の一方又は双方をアラニン残基に置き換える部位特定変異誘発によりＧＡＤ65変異体ポリペプチドを構築した。単一変異体を３０Ａ及び４５Ａと称し、二重変異体を３０／４５Ａと称した。これらの３種のＧＡＤ変異体を含むベクター、野生型ＧＡＤ65又はＧＡＤ65Δ１０１変異体は、［3Ｈ］-パルミチン酸又は［35Ｓ］-メチオニンを含む媒体中のＣＯＳ細胞中で一時的に発現した。ＧＡＤ65ポリペプチドを免疫沈降し、ＳＤＳＰＡＧＥで分析した。図９は、野生型；３０Ａ変異体、４５ａ変異体、Δ１−１０１変異体及び３０／４５Ａ変異体における標識の取込みを比較するものである。該図は、３０／４５Ａ二重変異体がパルミトイル化される能力を消失したが、３０Ａ又は４５Ａ単一変異体は消失しないことを示している。Δ１０１変異体もパルミトイル化される能力を消失した。
【００９２】
上記分析はパルミトイル化部位としてアミノ酸３０及び４５を同定するが、他のＮ末端アミノ酸は他の脂質修飾の主体である。Ｎ末端配列の増加量が欠失しているＧＡＤ65３０／４５Ａ断片の一連の欠失変異体を構築することにより、この可能性を試験した。その断片を発現べクターに挿入し、ＣＯＳ細胞に形質転換した。ＧＡＤ65又はＮ末端欠失変異体を発現するＣＯＳ細胞の全細胞性タンパク質をヘペスバッファーと１％ＴＸ−１１４で抽出し、ＴＸ−１１４分配分析において水相（Ａ）及び界面活性剤相（Ｄ）に分配した。画分をＳＤＳｐａｇｅによって分析し、ＧＡＤ65ポリペプチドをプローブとしてＧＡＤ65Ｃ末端ペプチドに対する血清を用いてウェスタンブロット法により検出した。図１０は、野生型ＧＡＤ65及び３０／４５ＡΔ１−８、３０／４５ＡΔ１−１５及び３０／４５ＡΔ１−２３欠失変異体の場合、ＧＡＤ65断片は水相及び界面活性剤相の両方に出現することを示している。しかしながら、３０／４５ＡΔ１−３１及び３０／４５ＡΔ１−３８変異体の場合、ＧＡＤ65断片は水相にのみ出現する。疎水性と親水性ポリペプチド内に存在するアミノ酸を比較すると、酸２４−３１はＧＡＤ65ポリペプチドの疎水性を付与することを示している。
これらの結果は、野生型ＧＡＤ65又はその３０／４５ＡΔ１−３８欠失変異体を発現する無傷細胞の免疫蛍光分析により確認した。野生型ＧＡＤ65タンパク質は膜固定と一致して周辺膜構造に集中して見られるが、Ｎ末端欠失変異体の位置は細胞質ゾルである。
【００９３】
可溶性ＧＡＤ65断片は、アミノ酸２４−３１の欠失、好ましくはアミノ酸４５の突然変異によって作製されることが結論される。これらの変化を包含するより実質的なＮ末端欠失、例えば、アミノ酸１−４５の欠失も有効であることは当然のことである。更に、可溶性ＧＡＤ65断片は、翻訳後修飾が起こらない条件、例えば、試験管内翻訳によって断片を合成することにより作製される。
理解を明らかにするために前述の発明を詳細に記載してきたが、ある種の変更が添付の請求の範囲内で実施されることは明らかである。このことにより、上記で引用したすべての文献及び特許は、各々が別個に示されたのと同じ範囲まで参考としてすべて引用する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ヒト（上段）及びラット（下段）ＧＡＤ65タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。ラット配列の場合、ヒト配列と異なるアミノ酸のみが示される。
【図２】ＭＩＣＡ）ヒトＩｇＧ（対照）、ＧＡＤ65特異的マウスモノクローナルＧＡＤ６及びＧＡＤ67特異的ウサギ抗血清Ｋ２によるＳｆ９細胞中バキュロウイルスベクターから発現された35Ｓメチオニン標識ヒトＧＡＤ65及びＧＡＤ67の免疫沈降結果を示すものである。野生型バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の免疫沈降が平行して示される（レーン１５−２１）。
【図３】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の両方を認識する１２６６抗血清（レーン１−３）：ＧＡＤ65（レーン４−６）、ＭＩＣＡＩ（レーン７−９）；及びＭＩＣＡ２（レーン１０−１２）を特異的に認識するＧＡＤ抗血清を用いるＳｆ９細胞及び野生型バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞（対照）中のバキュロウイルスベクターから発現されたヒトＧＡＤ65及びＧＡＤ67のウェスタンブロットを示すものである。
【図４】ＭＩＣＡ、ＧＡＤ６（マウス抗ＧＡＤ65モノクローナル抗体）又はヒトＩｇＧ（対照）によるＳｆ９細胞中のバキュロウイルス構築物から発現された35Ｓメチオニン標識野生型ラットＧＡＤ65及び端を切り取ったタンパク質の免疫沈降結果を示すものである。野生型バキュロウイルスを感染したＳｆ９細胞の免疫沈降が平行して示される。
【図５】ＭＩＣＡ又はヒトＩｇＧ（対照）とＳｆ９細胞由来の35Ｓメチオニン標識ヒトＧＡＤ65間の免疫複合体のタンパク質フットプリントを示すものである。
【図６】ＭＩＣＡとＧＡＤ65欠失変異体との反応性を示すものである。Ａ．ＣＯＳ細胞中で発現されたラットＧＡＤ65変異体に結合する抗体のまとめ。ＧＡＤＩ及びＧＡＤ６はマウス抗ＧＡＤモノクローナル抗体である（Gottllebら，1986，Chang & Gottlieb 1988）。ＧＡＤＩは、無傷ＧＡＤ65のみを認識する点で他のモノクローナルと異なる。ＧＡＤ６は、未変性及び変性状態で同様に十分に反応する以外はＭＩＣＡ２と同様の認識パターンを有する。Ｂ．ＭＩＣＡ、ＧＡＤ６及びヒトＩｇＧ（対照）によるＣＯＳ−７細胞中で発現されたラットＧＡＤ65のＮ末端欠失変異体の免疫沈降。Ｃ．ＭＩＣＡ、ＧＡＤ６及びヒトＩｇＧ（対照）によるＣＯＳ−７細胞中で発現されたラットＧＡＤ65のＣ末端欠失変異体の免疫沈降。
【図７】新たに診断された９人の無関係な糖尿病患者からの血清（Ｄ１−９）によるＣＯＳ−７細胞中で発現されたラットＧＡＤ65のＮ末端及びＣ末端欠失変異体の免疫沈降を示すものである。糖尿病前症患者（ＰＩ）、膵島細胞細胞質抗体（Ｐ２）及び２人の健康な対照患者（Ｃ１及びＣ２）からの血清も分析された。Ｄ１０血清は、ＭＩＣＡ１−６が誘導された患者からのものである。
【図８】典型的なＳＭＳ血清及び陽性対照血清で染色されたＧＡＤ67、ＧＡＤ65、ＧＡＤ65Δ１−６９／７０及びＧＡＤ65Δ１−１０１のウェスタンブロットを示すものである。
【図９】［3Ｈ］-パルミチン酸及び［35Ｓ］-メチオニンで標識されたＧＡＤ65及び変異体タンパク質のＳＤＳゲル分析を示すものである。
【図１０】ＧＡＤ65Ｃ末端ペプチドと反応する血清で染色されたＣＯＳ細胞発現ＧＡＤ65及びＮ末端欠失変異体由来の全細胞性タンパク質の水性（Ａ）及び界面活性剤（Ｄ）画分のウェスタンブロットを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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