(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養されたマンネンタケの菌糸を抽出する工程を含むことを特徴とする血小板凝集抑制剤の製造方法。
【請求項２】
梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養されたマンネンタケを抽出する工程を含むことを特徴とするＩＬ−８遺伝子発現抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマンネンタケの製造方法、特に得られたマンネンタケの生理活性向上に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンネンタケは霊芝とも呼ばれ、漢方薬などとして古来から用いられてきた、ヒダナシタケ目マンネンタケ科マンネンタケ属に属するキノコである。天然には各種広葉樹の枯れ木や切り株に発生する白色の腐朽菌であり、北半球の温帯に広く分布し、北米、およびアジアの太平洋岸、ヨーロッパ、中央アフリカの山地などに見られる。
マンネンタケは、縁起の良いものとして贈り物ののしに代えて使用されるなど、馴染み深いものであるが、近年マンネンタケの効能、効果についても確認が進んでおり、肝機能改善作用、抗炎症作用、抗高血圧作用、抗腫瘍作用、抗高脂血症作用、抗ＨＩＶ作用などが知られている。
これらの薬理作用の解明とともに、活性成分も明らかとなりつつあるが、一方でマンネンタケの培養に関しては、その収穫量の増大を図る試みは多々行われているものの、薬理活性と培養方法に関しては十分な検討が進んでいない。
【特許文献１】特開２００６−２７１２９８
【特許文献２】特開２００５−２２９９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は前記従来技術に鑑みなされたものであり、その解決すべき課題はマンネンタケの有する薬理活性を向上させ得る培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記課題を解決するために本発明者等が鋭意検討を行った結果、マンネンタケの培養に関しては、その収穫量の増大のための培地選択とは異なり、機能性改善のためには梅木ないし梅木粉を用いた場合に優れた機能性マンネンタケが得られることを見出した。
すなわち、本発明にかかる高生理活性マンネンタケの製造方法は、梅木ないし梅木粉を培地に用いて培養することを特徴とする。
また、前記方法において、生理活性は血小板凝集抑制機能、ケモカイン遺伝子発現抑制機能ないしアンギオテンシン転換酵素阻害活性機能であることが好適である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明にかかる培養方法によれば、梅木ないし梅木粉を培地に用いて、マンネンタケを培養することとしたので、その培養物から得られる薬理活性の向上が図られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
まず、本発明者等は、各種キノコと生育条件について検討する過程で、キノコの種が同じであっても、菌株の違いはもとより、光、温度、湿度、樹種などの生育条件の違いにより、子実体の形状、色合い、肉質、苦味などが微妙に変化し、さらに品質や内容成分にも差が見られることを見出した。
そこで、本発明者等は、まずマンネンタケを各地より収集し、その薬理作用について検討を行った。すなわち、供試菌株として、８都道府県から採取したマンネンタケ１８菌株を用いた。５系統は梅に生育していたもの、１０系統は梅以外の広葉樹に生育していたもの、３系統は人工栽培によって得られたものである。乾燥市販品はそのまま、また天然物のマンネンタケは、棚段式キノコ子実体乾燥機を用いて４０〜６０℃可変式により２４時間通風乾燥させ、ワーリングミキサーを用いて粉砕した。このようにして得られた乾燥粉末５ｇを１００ｍｌの３０％メタノール（室温）中で１２時間抽出した。濾液を減圧濃縮し、メタノール抽出物を得た。
これらの抽出物について、以下の機能性試験を行った。
【０００７】
［血小板凝集抑制試験］
種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患や肌荒れの発症には、アラキドン酸やその代謝物であるロイコトリエンやトロンボキサン、プロスタグランジンが関与していることが明らかにされつつある。例えば炎症性異常角化性疾患である乾癬では、その患部表皮において高いアラキドン酸代謝物の存在が認められており、アレルギー性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎、湿疹にもアラキドン酸代謝物の関与が示唆されている。また、プロスタグランジン類やトロンボキサン類は血小板を凝集させることから、アラキドン酸からプロスタグランジン類やトロンボキサン類への合成を抑制する化合物は、抗血栓効果、すなわち血流改善効果を有するものと考えられる。
【０００８】
そこで、マンネンタケについて、ＰＡＦ及びアラキドン酸ナトリウム惹起血小板凝集抑制効果を調べた。
試験方法は以下の通りである。
ヒト血液を室温にて１１００ｒｐｍで２０分間遠心し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分取した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心して乏血小板血漿（ＰＰＰ）を分取した。ＰＲＰ  ２２３μＬを３７℃にて予備加温した後、上記被検抽出物の２％ＤＭＳＯ溶液、又は対照例としてイオン交換水をそれぞれ２μＬ添加し、さらに３分間３７℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるＰＡＦ水溶液（５００ｎＭ）を２５μＬ添加した。
惹起された凝集はアグリゴメーター（ＭＣＭヘマトレーサー  ＭＣＭメディカル株式会社製）を用いて測定し、被験試料の最大凝集率（ＰＰＰの値を１００として被験試料の凝集曲線より求められた最大値）を対照例の最大凝集率と比較することにより、被験物質のＰＡＦ惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した（表中ＰＡＦ）。
また、炎症やアレルギー等の発生の原因物質であるアラキドン酸による血小板凝集に対する抑制作用（表中Ａ−Ｎａ）及びＡＤＰによる血小板凝集に対する抑制作用（表中ＡＤＰ）も、上記のＰＡＦ水溶液のかわりにアラキドン酸ナトリウム水溶液（５００μＭ）、ＡＤＰを用いることにより、同様に評価した。
【０００９】
［ケモカイン遺伝子発現抑制試験］
近年、種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患の発症に炎症性細胞の遊走・活性化を支配するケモカイン（Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が強く関与することが明らかにされつつある。ケモカインは分子量８〜１０ｋＤａのヘパリン結合性を有する塩基性蛋白の総称であり、生体において炎症に関わる様々な細胞の炎症部位への遊走・活性化に中心的に作用し、炎症の惹起に重要な役割を果たしているものと考えられている。
【００１０】
皮膚疾患においては、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの炎症部位に好中球や好酸球などの炎症細胞が遊走・活性化し、炎症の発生・増幅に関与していると考えられている。そして、この場合に皮膚の角化細胞、線維芽細胞などの細胞からインターロイキン−８（ＩＬ−８，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）等のケモカインが産生されることが知られている。また、炎症性異常角化性疾患である乾癬ではその皮膚患部にＩＬ−８が多量に存在していることが知られている。
従って、ＩＬ−８等のケモカインの発現を抑制することは、これらの炎症性あるいはアレルギー性の疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
そこで、マンネンタケ子実体抽出物におけるケモカイン遺伝子発現抑制作用を調べた（表中Ｋ−Ｍ）。
ケモカイン遺伝子発現抑制作用の測定方法は次のとおりである。
ヒト皮膚線維芽細胞を直径６ｃｍの培養皿で、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地に被験試料として、マンネンタケ抽出液、あるいはハイドロコルチゾン（陽性対照）を添加した。マンネンタケ抽出物及びハイドロコルチゾンの終濃度はそれぞれ０．００２５〜０．０４％（乾燥質量）及び１０−７Ｍとした。
【００１１】
さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で６時間培養した。
次に常法に従って、細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成したのち、定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法）により、ＩＬ−８遺伝子の発現量を測定した。内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得られたデータを補正した。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として入手可能であり、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよい。
【００１２】
［ＡＣＥ阻害活性］
アンギオテンシンＩ転換酵素（ＡＣＥ）は、アンギオテンシンＩを昇圧性物質のアンギオテンシンIIに転換して、血圧の調整に関与する膜酵素であり、その阻害により高血圧予防、治療効果が期待される。
そこで本発明者らは、各マンネンタケ抽出物についてＡＣＥ阻害活性を測定した（表中ＡＣＥ）。
測定方法は以下の通りである。
被検試料について、合成基質（Hippuryl-His-Leu)及びＡＣＥをもちいてCheung.H.Sらの方法に準じて測定し、水を対象とした場合の試料の阻害率を算出した。
【００１３】
図１に生育樹種の違いによる機能性評価試験の結果を示す。同図より明らかなように、ＰＡＦ及びアラキドン酸ナトリウム惹起血小板凝集抑制効果の両者で、梅木に育成したものは、広葉樹或いは培地で育成したものに対し、高い阻害率を示した。同様に、梅木で育成したものは、インターロイキンの産生抑制およびＡＣＥ阻害活性についても、他の栽培方法によるものよりも高い生理活性を示すことが理解される。
以上のように、採取したマンネンタケ子実体を用いた機能性評価試験の結果から、梅木から採取したマンネンタケが、他樹種から採取したもの或いは人工栽培のものに比較し、高い生理活性を有することが明らかとなった。この原因についてはいまのところ不明であるが、梅木成分が高蓄積されたか、或いはマンネンタケの生理活性成分が梅木成分により高濃度化されたことによると思われる。
【００１４】
本発明者等はさらにこの点について確認を行うため、梅木粉を利用した培地で育成した菌糸の機能性評価試験を行った。
すなわち、梅木（１年）、梅木（１０年以上）、ブナ、コナラ、サクラ、スギよりそれぞれ木粉を作成し、木粉：フスマ＝５：１、含水率６０％に調製し被検培地とした。そして、シャーレで１週間、菌糸体を成長させた後、４０〜６０℃で乾燥し、乾燥粉末を得た。乾燥粉末５ｇを１００ｍｌ−３０％メタノール抽出（２５℃／１２時間）し、前記各生理活性試験に供した。
結果を図２に示す。同図より明らかなように、子実体を検体とした場合よりも、樹種間の差異は小さくなってはいるが、特に血小板凝集抑制効果において顕著な差異が認められた。
なお、６種のマンネンタケ（Ｅ−８４０１，Ｍ−０６０１，Ｍ−０６０２，Ｍ−０６０３，Ｍ−０６０４，Ｍ−０６０５）について、ＳＭＹ培地（ショ糖−麦芽抽出エキス−酵母抽出エキス）と、コナラ木粉、梅木粉をそれぞれ用いた平板培地における菌糸成長速度を検討した結果、同一菌であればおおよそ同程度の成長を示した（図３）。
このように、菌糸の成長と機能性評価の結果は一致せず、菌糸の成長に依存した培養方法の決定は、少なくとも機能性素材としてマンネンタケを見た場合には、妥当ではないことが理解される。
【００１５】
さらに本発明者等は、４種のマンネンタケ（（ｄ）：Ｅ−８４０１，（ｅ）：Ｍ−０６０１，（ｆ）：Ｍ−０６０２，（ｇ）：Ｍ−０６０４）について、梅木粉と栄養剤（フスマ）との混合比率と菌糸成長の関係を検討した。結果を図４に示す。
同図に示すように、梅木粉と栄養剤（フスマ）の混合比率の変化は、平板培地における菌糸成長速度にはほとんど変化を与えない。
このように、キノコの生長或いは収穫量が多い培養条件と、収穫されたキノコの生理活性とは相関性が低く、成長に好ましい条件で優れた生理活性が必ずしも得られるものではない。
【００１６】
以上のように、生理活性を期待してマンネンタケの栽培を行う場合には、一般的に行われるように収穫量を基準に栽培方法を決めることは妥当ではなく、機能性の増大を評価基準として決定する必要がある。
そして、培地という観点からマンネンタケの生理活性向上を企図した場合には、梅木ないし梅木粉を用いて培養を行うことにより、優れた生理活性が得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マンネンタケの生育樹種の違いによる機能性評価試験の結果である。
【図２】各種培地を用いて生育させた菌糸の機能性評価試験の結果である。
【図３】各種平板培地における菌糸成長の状態を示す説明図である。
【図４】梅木粉と栄養剤（フスマ）の混合比と菌糸成長の関係を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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