(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に、基材結合基を介して、光分解性基及び細胞付着抑制基が順に共有結合で結合されている、細胞付着・培養用基材。
【請求項２】
前記光分解性基は、次の化学構造式
【化１】
0005167738.tif 000011
で表される２価の有機基である、請求項１に記載の細胞付着・培養用基材。
【請求項３】
前記細胞付着抑制基は、次の化学構造式
【化２】
0005167738.tif 000012
（ｍは３〜１２００の整数、ＲはＨ又はＣＨ３）
で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基である、請求項１又は２に記載の細胞付着・培養用基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞付着・培養用基材に、所定のパターンで光照射した後、洗浄して前記細胞付着抑制基を除いて得られる、所定パターンの細胞付着性領域付き細胞付着・培養用基材。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞付着・培養用基材の細胞付着性領域に、細胞を付着・増殖させて得られる、所定パターンの細胞塊付き基材。
【請求項６】
同じであっても異なってもよい種類の細胞塊が基材に各々、島状に離れて付着・存在している所定パターンの細胞塊付き基材であって、次の工程を含む方法により得られる細胞塊付き基材：
（１）  請求項１〜３に記載のいずれかの細胞付着・培養用基材の表面の一部に所定のパターンで光照射し、洗浄し、第一の細胞種を播種し、これを栄養培地中で保温して、前記光照射部に第一の細胞種を増殖させる工程（第一細胞種塊付き基材を得る工程）；
（２）  得られた前記第一細胞種塊付き基材の表面の他の一部に、所定のパターンで光照射し、洗浄し、第二の細胞種を播種し、これを栄養培地中で保温して、前記光照射部に第二の細胞種を増殖させる工程（第一及び第二細胞種塊付き基材を得る工程）；
（３）〜（ｎ）  以下、同様にして、前記細胞種塊付き基材の表面に、順次、第三、第四、…、及び第ｎ細胞種塊を形成させる工程。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞塊付き基材の細胞塊の近傍に、所定のパターンで光照射し、洗浄して当該光照射部の細胞付着抑制基を除いたのち、これを栄養培地中で保温することを特徴とする、細胞付着・培養用基材上で所定パターンに沿って細胞塊を増殖させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材（又は基板）表面に基材結合基を介し光分解性基及び細胞付着抑制基が結合された細胞付着・培養用基材に関し、また、この細胞付着・培養用基材と光照射とを利用して得られる所定パターンの細胞付着性領域付き細胞付着・培養用基材、あるいは所定パターンの細胞塊付き基材にも関するものであり、更には前記所定パターンの細胞塊付き基材と光照射とを利用して基材上で所定パターンに沿って細胞塊を増殖させる方法、にも関するものである。これらの基材又は方法は、細胞パターニング技術の基本として有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞パターニング技術は、細胞（主として動物由来の付着性細胞）に対して付着性を有する化学種と付着性を有しない（非付着性）化学種の二種類の化学種をパターン化した培養基材（又は基板）を用いて、細胞の付着領域と非付着領域を規定する技術であり、細胞生物学的な基礎研究に有用であるばかりではなく、組織再生等の組織工学や薬物センサー・環境汚染物質センサー等の細胞基盤センサーの新規開発に有用な技術である。特に、近年注目を集めている外部刺激に応じた細胞付着性変換技術では、温度（熱）、電気、光等の外部刺激によって表面で相転移、酸化・還元、光反応等の変換反応を起こす化学種をもつ機能性材料が用いられている。
そのような機能性材料を用いた「細胞付着のスイッチング技術」としては、次のようないくつかの方法が知られている。
【０００３】
（１）岡野らの温度応答性高分子膜を用いた方法（Yamada, N. et al., 1990；Nandkumar, M. A. et al., 2002）
温度応答性高分子膜ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（polyNIPAAm）を用いた方法である。PolyNIPAAmは、下限臨界溶液温度以下では親水性、それ以上では疎水性となる性質を有するが、polyNIPAAmをグラフトした培養皿においては、下限臨界溶液温度以下では細胞が非付着性、それ以上では細胞が付着することを岡野らは発見した。この性質を利用して、主に、移植に用いるためのシート状細胞を培養皿表面から剥離させる技術に展開しており、数々の組織に関して実用に向けた試験が進められている。この技術は複数細胞の共培養へも応用されている。
【０００４】
（２）MrksichらやWhitesidesらの電気化学活性のある単分子膜を利用した方法（Yousaf, M. N. et al., 2001；Yeo, W. S. et al., 2001；Yeo, W. S. et al., 2003；Jiang, X. Y. et al., 2003）
（i）Mrksichら：金蒸着したカバーガラス上に形成した電気化学活性のあるヒドロキノンを有するアルカンチオールの自己集合膜を用いた方法である。ヒドロキノンが印加電位に応じて可逆的にベンゾキノンに酸化されることを利用して、細胞付着性のＲＧＤペプチドを結合・解離させることによって、細胞を付着・脱着する。最近では、一つの基板上において、「付着→非付着→付着」の二段階で細胞付着性を変化させる技術も開発している。
（ii）Whitesidesら：金とチオールの結合自体が還元電位によって解離することを利用して、細胞付着性を変換する方法である。細胞付着領域が細胞非付着性エチレングリコール誘導体によって囲まれているパターン化自己組織化膜を作製し、細胞付着性を特定の領域内に制限した。この基板全体に電位をかけると、エチレングリコールが表面から解離するため，細胞の移動制限が解除される。彼らは、この方法を利用して細胞運動を阻害する薬剤の評価を行っている。
【０００５】
（３）西澤らの微小電極を用いて局所的に酸化剤を発生させる手法（Kaji, H. et al., 2004）
微小電極を用いて局所的にＨＢｒＯなどの酸化剤を発生させることによって、予め基板上に吸着させた細胞付着抑制性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を変性させ、細胞付着性へと変換する方法である。この方法では、初めに細胞をパターニングした表面に上書きすることが可能であり、従来は困難であった凹凸のある基板においても細胞の付着領域を形成できる。
【０００６】
（４）金森らのスピロピランを側鎖にもつ光応答性高分子を用いる方法（Edahiro, J. et al., 2005）
フォトクロミック化合物であるスピロピランを側鎖にもつ光応答性高分子（光によって可逆的に異性化する化合物）を用いて細胞播種後に付着性を制御する方法である。
【０００７】
（５）光分解性基で修飾した基板上に細胞付着抑制物質を物理吸着させる中西らの方法（特許文献１、非特許文献１参照）。
光分解性基を修飾した基板上に細胞付着抑制物質を物理吸着させる方法である。これにより、光照射による同種・異種の細胞の共培養や、細胞移動の光誘導などを実現できるが、基板上に物理吸着させた細胞付着抑制物質が、細胞培養液由来のタンパク質等と容易に交換するため、細胞パターンの維持が２〜３日と限られる。
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−００６２１４号公報
【非特許文献１】Nakanishi, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 16314-16315 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
基材（又は基板）表面に位置選択的に細胞を付着させ、これを培養することを可能とする基材は、先にも述べたように、細胞生物学的な基礎研究あるいは組織工学や細胞基盤センサーの新規開発に有用である。特に、熱・電位・光などの外部刺激によって表面の細胞付着性（接着性）を変換できる基材は、細胞の増殖・移動を誘導することを可能とし、また、外部刺激と細胞播種を繰り返すことによって、同一基材上で異種細胞を同居（共培養）させることを可能とするため、応用範囲が広い。遠隔操作性及び時間・空間分解能を考慮すると、光が最も理想的な外部刺激であると考えられるが、これまでに知られている前記（４）〜（５）の細胞付着性変換基材は、光によって細胞付着性を変換するものの、その維持時間が数日程度であり、長期にわたって細胞を基材上の特定位置に留めることは困難であった。そこで、本発明では、光照射によって細胞付着性を付与可能であり、且つ、長期の細胞培養に適した細胞付着・培養用基材（基板）を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明者らは、基材上に基材結合基を介して、光分解性基及び細胞付着抑制基を共有結合で結合することに着目し、種々検討して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、基材表面に基材結合基を介して光分解性基及び細胞付着抑制基が順に共有結合で結合されている細胞付着・培養用基材である。
【００１１】
また、本発明は、上記細胞付着・培養用基材に所定のパターンで光照射した後、洗浄して細胞付着抑制基を除いて得られる、言い換えれば、光照射部分に前記細胞付着抑制基を含まず、したがって、当該光照射部分は細胞付着性がある、所定パターンの細胞付着性領域付き細胞付着・培養用基材をも提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記した細胞付着・培養用基材の細胞付着性領域に、細胞を付着・増殖させて得られる、所定パターンの細胞塊付き基材も提供する。
【００１３】
また、本発明は、同じであっても異なってもよい種類の細胞塊が基材に各々、島状に離れて付着・存在している所定パターンの整列された細胞塊付き基材であって、次の工程を含む方法によって得られる細胞塊付き基材も提供する。
（１）上記細胞付着・培養用基材の表面の一部に所定のパターンで光照射し、洗浄し、第一の細胞種を播種し、これを栄養培地中で保温して、前記光照射部に第一の細胞種を増殖させる、第一細胞種塊付き基材を得る工程；
（２）得られた前記第一細胞種塊付き基材の表面の他の一部に、所定のパターンで光照射し、洗浄して第二の細胞種を播種し、これを栄養培地中で保温して、前記光照射部に第二の細胞種を増殖させる、第二細胞種塊付き基材を得る工程；
（３）〜（ｎ）  以下、同様にして、前記細胞種塊付き基材の表面に、順次、第三〜第ｎ細胞種塊を形成させる工程。
【００１４】
また、本発明は、細胞塊付き基材の細胞塊の近傍に所定のパターンで光照射し、洗浄して当該光照射部の細胞付着抑制基を除いたのち、これを栄養培地中で保温することを特徴とする、細胞付着・培養用基材上で所定パターンに沿って細胞塊を増殖させる方法も提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の細胞付着・培養用基材においては、基材上に共有結合させた細胞付着抑制物質が、細胞培養液由来のタンパク質等と容易には付着せず、これに付着させた細胞（又はそのパターン）を安定に維持できる利点があり、したがって、本発明の細胞付着・培養用基材、細胞付着性領域付き細胞付着・培養用基材、又は所定パターンの細胞塊付き基材、あるいは、細胞付着・培養用基材上で所定パターンに沿って細胞塊を増殖させる方法は、細胞生物学的な基礎研究あるいは組織工学や細胞基盤センサー等の新規開発に有用な手段を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の細胞付着・培養用基材は、上で述べたように、基材表面に、基材結合基を介して、光分解性基及び細胞付着抑制基が順に共有結合で結合されている細胞付着・培養用基材である。
ここで、「基材」とは、細胞がその成長・増殖の足掛り（anchor）となる材料（substrate）の意味であり、その形状としては、平面板状のもの（基板）、凹状又は凸状にＲを有するもの、スティック状のもの、球状のもの等がありうるが、好ましくは、平面板状のもの（基板）である。
基材の素材は、細胞の付着に適するものであれば特に限定しない。ガラス，金，シリコン，ダイアモンド，金属酸化物，プラスチック（スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＰＥＴ等）等がある。
【００１７】
また、「基材結合基」とは、共有結合で基材表面に結合可能な化学基を意味する。用いる基材に応じてその化学基は変わるが、基材がガラスの場合には、次の構造式で示される化学基が好ましく用いられる。
【化３】
0005167738.tif 000002
【００１８】
また、基材が金の場合には、次の構造式で示される化学基が好ましく用いられる。
【化４】
0005167738.tif 000003
【００１９】
「光分解性基」とは、紫外線等の高エネルギー光を照射すれば、容易に分解する二価の化学基を意味し、例えば、次の２価の有機基が好ましく用いられる。
【化５】
0005167738.tif 000004
【００２０】
また、次のような２価の有機基も用いることができる。
【化６】
0005167738.tif 000005
【化７】
0005167738.tif 000006
【化８】
0005167738.tif 000007
【００２１】
「細胞付着抑制基」とは、細胞の付着（又は接着）を抑制（又は阻害）する化学基を意味し、代表的なものは、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリアクリルアミド、あるいはポリN-イソプロピルアミド（NIPAAｍ）を有する有機基であり、好ましくは、次の化学式で示されるポリエチレングリコール（PEG）を有する有機基、である。
【化９】
0005167738.tif 000008
（ここで、ｍは３〜１２００の整数、ＲはＨ又はＣＨ３である。）
【００２２】
また、付着・培養の対象となる「細胞」には、種々の動物細胞や植物細胞があるが、好ましくは、付着性の動物細胞である。
【実施例１】
【００２３】
実施例１は、基材がガラスの場合の例である。
（１）１−［３−ｍｅｔｈｏｘｙ−６−ｎｉｔｒｏ−４−（３−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ］  ｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅの合成
化学式１０の化学構造式で表される題記化合物（シランカップリング剤）は、特開２００７−１８６４７２号公報に記載の方法に従って合成した。
【化１０】
0005167738.tif 000009
【００２４】
（２）細胞固定用基板の作製
ガラス基板の表面処理手順（スキーム）を、化学式を用いて示したものが図１である。
ガラス基板（カバーガラス：１８×１８mm2、０．１２〜０．１７ mm）を、Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２の混合溶液（７：３、容量比）（ピラニヤ溶液；爆発性があるので、有機物の近くで扱わない等の注意を要する）２０ｍＬ中で、９０〜１００℃で１時間半加熱し、有機物を除去した。続いて、純水で洗浄し、更に超音波洗浄処理をした。このカバーガラスを１．５ｍＭの前記１−［３−ｍｅｔｈｏｘｙ−６−ｎｉｔｒｏ−４−（３−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ］  ｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ（シランカップリング剤）のベンゼン溶液中で、２４時間還流することによりガラス表面を化学修飾した。得られた化学修飾基板を、０．１Ｍのｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ａｍｉｎｅ（ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ、分子量５，０００）の水溶液（０．４Ｍ  Ｋ２ＳＯ４／０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．１）に１８時間浸漬し、ＰＥＧを結合させた。
なお、上記化学式１０の化合物によるガラス基板（カバーガラス）の化学修飾、及びＰＥＧ−ａｍｉｎｅによる化学修飾は、基板表面の水の接触角を１２°（用いたカバーガラス）→６７°→４６°へと変化させた。この接触角の変化は、カバーガラスの表面化学種が、図１（上３段）のように変化したことと符号している。
【００２５】
（３）所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板の作製
このようにして得られた細胞固定用基板の一方の表面に、蛍光顕微鏡下で円形領域（直径約５００μｍ）に１０秒間光照射（λ＝３６５ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ２）し、その後精製水で洗浄してＰＥＧを洗い去り、所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板とした。
なお、光照射前後の基板表面の水の接触角は４６°（前）→６４°（後）と変化した。この接触角の変化は、カバーガラスの表面化学種が、図１（下２段）のように変化したことと符号している。
【００２６】
（４）所定（円形）パターンの細胞塊付き基板の作製
上記細胞付着性領域付き細胞固定用基板上で、無血清培地を用いて、２×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種し、炭酸ガスインキュベータ中、３７℃で保温した。播種１時間後に血清培地に交換し、播種１日後及び１４日後に位相差顕微鏡で基板上の細胞を観察した。細胞固定用基板上に設けた細胞付着性円領域にのみ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞が付着し、播種１日後には図２（ａ）のように増殖したコンフルエントの細胞群（コロニー）が形成され、さらに培養し続けると、細胞は更に増殖を続け、播種後７日目の長期間後においても、細胞群のパターンは維持されていた（図２（ｂ））。
【００２７】
（５）領域選択的に付着させた細胞の移動的増殖の誘導
上記（２）〜（４）の途中までを同様に行なって得た円形領域に細胞を付着させて、一晩培養後、その細胞群（コロニー）に近接した同様な大きさの円部分に再び光照射（二次光照射）を行ない（図３（ａ））、培養を継続した。すると、二次光照射した領域に細胞が移動しながら増殖し、コンフルエントなパターン（ピーナッツ状）に達し、播種後５日間以上、そのパターンが維持された（図３（ｂ））。この結果は、細胞培養中に基板上に更に光照射を行うことによって、細胞付着領域の逐次的増設が可能であることを示している。この例では、同種細胞付着領域の増設であるが、二次光照射後に異種細胞を播種することで、同一基板上に複数種の細胞を配置すること（異種細胞の共培養）も可能である。
【実施例２】
【００２８】
実施例２は、基材が金の場合の例である。
（１）Ｂｉｓ（１２−（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｌｙ）ｏｘｙｄｏｄｅｃｙｌ）  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅの合成
化学式１１の構造式で表される題記ジスルフィド化合物は、特願２００６−１２０００２に記載の方法によって合成した。
【化１１】
0005167738.tif 000010
【００２９】
（２）細胞固定用基板の作製
化学式を用いて示した金基板の表面処理手順（スキームＩ）を図４（ａ）に示す。
金スパッタ基板をＨ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２の混合溶液（２：１、容量比）（ピラニヤ溶液）５０ｍＬ中に１分浸漬し、有機物を除去した。続いて、純水で洗浄し、更に超音波洗浄処理をした。この基板をＢｉｓ（１２−（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｌｙ）ｏｘｙｄｏｄｅｃｙｌ）  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（０．５ｍＭ）のＤＭＳＯ溶液に浸漬して表面に有機単分子膜を形成した。続いて、この基板を、１ｗｔ％ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ（分子量５，０００）と０．４ＭのＫ２ＳＯ４を含むリン酸緩衝液に終夜浸漬し、表面にＰＥＧを修飾した。
【００３０】
（３）所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板の作製
得られた細胞固定用基板（金基板）の一方の表面に、蛍光顕微鏡下で円形領域（直径約５００μｍ）に光照射（λ＝３６５  ｎｍ、約１  Ｗ／ｃｍ２、６０ｓｅｃ）し、その後、精製水で洗浄してＰＥＧを洗い去り、所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板とした。
なお、上記有機試薬による金基板の化学修飾、次いでＰＥＧ−ａｍｉｎｅによる化学修飾は、基板表面の水の接触角を６５°（有機単分子膜を形成した金基板）→４５°→７０°へと変化させた。この接触角の変化は、金基板の表面化学種が、図４（ａ）のように変化したことと整合している。
【００３１】
（３）所定（円形）パターンの細胞塊付き基板の作製
上記細胞付着性領域付き細胞固定用基板上で、無血清培地中で２×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種して、１時間後に血清を含む培地に交換し、炭酸ガスインキュベータ中、３７℃で保温した。細胞は照射パターンに対応した付着を示した（図５（ａ））。さらに培養を続けると、細胞は増殖し続け、凝集塊を形成するにも関わらず、細胞播種後７日目の長期間後においても、細胞群のパターンは維持されていた（図５（ｂ））。
【実施例３】
【００３２】
実施例３も、実施例２と同様に基材が金の場合の例である。
（１）細胞固定用基板の作製
金基板の表面処理手順（スキームＩＩ）を図４（ｂ）に示す。
０．５  ｍＭのＢｉｓ（１２−（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｌｙ）ｏｘｙｄｏｄｅｃｙｌ）  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（分子量１０，０００）を１ｍＭのトリエチルアミンを含むＤＭＳＯ溶液中で終夜反応させた後、この反応液中に、実施例２と同様にしてピラニア・洗浄処理した金スパッタ基板を終夜浸漬し、その表面上に有機単分子膜を形成した。
（２）所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板の作製
得られた細胞固定用基板（金基板）の一方の表面に、蛍光顕微鏡下で円形領域（直径約５００μｍ）に光照射（λ＝３６５  ｎｍ、約１  Ｗ／ｃｍ２、６０ｓｅｃ）し、その後、精製水で洗浄してＰＥＧを洗い去り、所定（円形）パターンの細胞付着性領域付き細胞固定用基板とした。
（３）所定（円形）パターンの細胞塊付き基板の作製
上記細胞付着性領域付き細胞固定用基板上で、無血清培地中で２×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種して、１時間後に血清を含む培地に交換し、炭酸ガスインキュベータ中、３７℃で保温した。細胞は照射パターンに対応した付着を示した（図６（ａ））。さらに培養を続けると、細胞は増殖し続け、凝集塊を形成するにも関わらず、細胞播種後７日目の長期間後においても、細胞群のパターンは維持されていた（図６（ｂ））。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１に係る「基板の表面処理手順（スキーム）」である。図中のＡは基材（ガラス）を意味する。
【図２】所定パターン（円形）の細胞付着性領域付き細胞固定用基板（ガラス基板）上での細胞の選択的付着・増殖を示す位相差顕微鏡写真で、（ａ）は播種１時間後のもの、（ｂ）は播種７日後のものである。
【図３】細胞固定用基板（ガラス基板）上での移動的増殖の（光）誘導を示す明視野顕微鏡写真で、（ａ）は播種１日後のもので、点線内は第二次光照射領域であり、（ｂ）は播種５日後のものである。
【図４】実施例２及び実施例３に係る「基板の表面処理手順（スキーム）」で、（ａ）が実施例２に係るもの、（ｂ）が実施例３に係るものである。図中のＡは基材（金）を意味する。
【図５】実施例２に係る細胞固定用基板（金基板）上での細胞の選択的付着・増殖（Ｉ）を示す位相差顕微鏡写真で、（ａ）は播種１日後のもの、（ｂ）は播種７日後のものである。
【図６】実施例３に係る細胞固定用基板（金基板）上での細胞の選択的付着・増殖（ＩＩ）を示す位相差顕微鏡写真で、（ａ）は播種１時間後のもの、（ｂ）は播種１４日後のものを示す。
【図１】
0005167738.tif 000013
【図４】
0005167738.tif 000014
【図２】
0005167738.tif 000015
【図３】
0005167738.tif 000016
【図５】
0005167738.tif 000017
【図６】
0005167738.tif 000018