(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において胃癌を検出する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から得られた被験血液サンプルにおいて、アポリポタンパク質CIII0の濃度を測定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた濃度を、正常な対照血液サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0の濃度と比較する工程
を含んでなり、前記対照血液サンプルに対して前記被験血液サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0の濃度が減少していた場合に、前記哺乳動物に胃癌が存在することが示される、方法。
【請求項２】
アポリポタンパク質CIII0が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液サンプルが血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポリポタンパク質CIII0の濃度が、特異的抗体を用いるアッセイによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アポリポタンパク質CIII0の濃度が、８７６５ｍ／ｚの質量を有するペプチドピークのイオン強度として測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
正常な対照血液サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0の濃度が、予め測定されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物における胃癌の診断のためのキットであって、血液サンプル中のアポリポタンパク質CIII0の濃度を測定するための試薬を含んでなる、キット。
【請求項９】
前記血液サンプルが血漿サンプルである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
アポリポタンパク質CIII0の濃度を測定するための試薬が、アポリポタンパク質CIII0に特異的に結合する抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
哺乳動物において胃癌を検出する方法であって、
（ｉ）前記哺乳動物から得られた被験血液サンプルにおいて、８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質の濃度を測定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた濃度を、正常な対照血液サンプルにおける前記タンパク質の濃度と比較する工程
を含んでなり、前記対照血液サンプルに対して前記被験血液サンプルにおける前記タンパク質の濃度が減少していた場合に、前記哺乳動物に胃癌が存在することが示される、方法。
【請求項１３】
前記血液サンプルが血漿サンプルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質の濃度が、８７６５ｍ／ｚの質量を有するペプチドピークのイオン強度として測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
正常な対照血液サンプルにおける前記タンパク質の濃度が、予め測定されたものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物における胃癌の診断のためのキットであって、血液サンプル中の８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質の濃度を測定するための試薬を含んでなる、キット。
【請求項１８】
前記血液サンプルが血漿サンプルである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記タンパク質の濃度を測定するための試薬が、該タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、胃癌の診断法、および該方法に用いるためのキットに関する。
【０００２】
背景技術
胃癌は胃から発生する癌であり、主に、粘膜内の分泌細胞や、分泌物を胃の中に導く導管の細胞から発生する。近年の診断および治療の進歩により、胃癌は治りやすい癌の一つといわれている。しかしながら、胃癌は発生してから検出可能になるまで長期間を要する傾向があり、また、進行した状況で発見された場合には治療が困難であることが多いため、胃癌の早期発見は依然として重要である。
【０００３】
一般に、癌の早期発見には、血液検査による診断を可能とする腫瘍マーカーが有用である。胃癌の腫瘍マーカーとしては、ＡＣＴ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、Ｄｕｐａｎ−２、ＩＡＰ、ＫＭＯ−１、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＮＳＥ、ｓＩＣＡＭ−１、ＳＬＸ、ＳＯＤ、Ｓｐａｎ−１、ＳＴＮ、ＴＰＡ、ＹＨ−２０６、シフラ２１−１等が知られている。しかし、これらの腫瘍マーカーを用いても胃癌の早期発見にとって十分ということはできない。よって、胃癌の新たな腫瘍マーカーの開発が依然として望まれている。
【０００４】
アポリポタンパク質は、血漿リポタンパク質上に特異的に存在する一群のタンパク質である。アポリポタンパク質としては１０種以上のタンパク質が知られており、これらの主な機能は、リポタンパク質の構造の安定化、リポタンパク質代謝に関与する酵素の活性化、細胞表面に存在するリポタンパク質受容体に対するリガンドとしての作用などである。近年では、リポタンパク質代謝以外にも、神経に対する新たな機能も発見されつつあり、アルツハイマー病との関連も示されている。
【０００５】
アポリポタンパク質ファミリーのメンバーであるアポリポタンパク質CIIIは７９アミノ酸からなり、その７４番目のスレオニン残基が糖鎖結合部位となっている（図１Ａ）。この糖鎖結合部位に糖鎖が付加されていないアポリポタンパク質CIIIは、アポリポタンパク質CIII0と呼ばれている（図１Ｂ）。さらに、アポリポタンパク質CIIIには、糖鎖修飾体であるアポリポタンパク質CIII1（図１Ｄ）およびCIII2（図１Ｅ）、ならびにアポリポタンパク質CIII0のＣ末端から１個のアラニンが欠失したCIII0'（図１Ｃ）などが報告されている（非特許文献１：Bondarenko et al. J. Lipid Res. 40: 543.1999）。
【０００６】
【非特許文献１】Bondarenko et al. J. Lipid Res. 40: 543.1999
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、胃癌患者の血液中において、アポリポタンパク質CIII0に対応する８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークのイオン強度が健常者に比べて顕著に低下していることを見出した。本発明は、この知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、胃癌の診断法を提供することを目的とする。
【０００９】
そして、本発明の第一の態様による診断法は、哺乳動物において胃癌を検出する方法であって、（ａ）前記哺乳動物から得られた被験血液サンプルにおいて、アポリポタンパク質CIII0の濃度を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた濃度を、正常な対照血液サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0の濃度と比較する工程を含んでなる方法である。該方法では、前記対照血液サンプルに対して前記被験血液サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0の濃度が減少していた場合に、前記哺乳動物に胃癌が存在することが示される。
【００１０】
本発明の第二の態様による診断法は、哺乳動物において胃癌を検出する方法であって、（ｉ）前記哺乳動物から得られた被験血液サンプルにおいて、８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質の濃度を測定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた濃度を、正常な対照血液サンプルにおける前記タンパク質の濃度と比較する工程を含んでなる方法である。該方法では、前記対照血液サンプルに対して前記被験血液サンプルにおける前記タンパク質の濃度が減少していた場合に、前記哺乳動物に胃癌が存在することが示される。
【００１１】
本発明によれば、胃癌を正確かつ早期に発見することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明において診断（検出）の対象とする胃癌には、胃において形成される全ての癌が含まれる。すなわち、診断の対象となる胃癌としては、胃の噴門部、体部および幽門部のいずれの部位から発生したものであってもよく、また、管状腺癌（高分化型および中分化型）、低分化腺癌、印環細胞癌等のいずれのタイプであってもよい。
【００１３】
本発明において診断の指標とする「アポリポタンパク質CIII0」または「Apo CIII0」は、診断の被検体となる哺乳動物に由来するアポリポタンパク質CIII0である。アポリポタンパク質CIII0はアポリポタンパク質CIIIの一種であり、アポリポタンパク質CIIIの７４番目のスレオニン残基に糖鎖が付加されていないものである（図１Ｂ）。アポリポタンパク質CIII0は、血漿中で８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示す唯一のタンパク質である。よって、本発明による診断法は、８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質を指標とするものと理解される。以下、「アポリポタンパク質CIII0」と「８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質」とを併せて、「マーカータンパク質」ということがある。
【００１４】
アポリポタンパク質CIII遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２に示されるヒト由来アポリポタンパク質CIIIの配列が挙げられる。また、これらの配列に２０残基のシグナルペプチドが付加したヒト由来アポリポタンパク質CIII前駆体の配列は、配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：Ｘ０１３８８）に示している。ヒト以外の哺乳動物についても、ヒト由来アポリポタンパク質CIIIに対応する同様の遺伝子およびタンパク質を利用することが可能である。
【００１５】
アポリポタンパク質CIIIには、CIII0のほかに、糖鎖修飾体であるCIII1（図１Ｄ）およびCIII2（図１Ｅ）、ならびにCIII0のＣ末端からアラニンが欠失したCIII0'（図１Ｃ）などが知られている。図１Ｄに示されるように、アポリポタンパク質CIII1にはＤ-ガラクトシル（１−３）−Ｎ−アセチルＤ−ガラクトサミンが付加されており、Ｄ-ガラクトシル残基のＣ３位にはシアル酸が付加している。また、図１Ｅに示されるように、アポリポタンパク質CIII2にはＤ-ガラクトシル（１−３）−Ｎ−アセチルＤ−ガラクトサミンが付加されており、Ｄ-ガラクトシル残基のＣ３位およびＮ−アセチルＤ−ガラクトサミン残基のＣ６位にはシアル酸が付加している。各タンパク質の精密質量は図１に示すとおりである。また、図２は血漿サンプルを用いて測定したマススペクトルであり、これによれば、アポリポタンパク質CIII1は９４２１ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示し、CIII2は９７１２ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示す。
【００１６】
本発明による診断法では、アポリポタンパク質CIIIの総量ではなく、アポリポタンパク質CIII0のみの血中濃度が診断の指標として用いられる。よって、本発明による診断法では、アポリポタンパク質CIII0のみの血中濃度が特異的に測定され、CIII1、CIII2およびCIII0'は濃度測定の対象から除外される。言い換えると、本発明による診断法では、８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質のみの血中濃度が特異的に測定され、それぞれ９４２１ｍ／ｚ、９７１２ｍ／ｚおよび８６９３ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質は濃度測定の対象から除外される。
【００１７】
本発明において「被験血液サンプル」とは、診断の対象となる哺乳動物から得られる血液サンプルを意味する。また、「対照血液サンプル」とは、胃癌に罹患していない同種の哺乳動物、好ましくは胃癌に罹患した経歴のない哺乳動物から得られる血液サンプルを意味する。診断に用いられる血液サンプルは、哺乳動物から採取された血液であればよいが、好ましくはその血液から固形物を除いた血漿サンプルとされる。
【００１８】
本発明において診断の対象となる哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウスなどのいずれの哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒトとされる。
【００１９】
マーカータンパク質の濃度の測定には、当技術分野において公知の標準的な方法を用いることができる。例えば、アポリポタンパク質CIII0のアミノ酸配列として配列番号２で表されるものを挙げることができ、また、この配列を含んだ化学構造は図１Ｂに示す通りである。従って、当業者であればこの配列および化学構造を参照することによって適切にアポリポタンパク質CIII0の量を測定することが可能である。
【００２０】
本発明において測定されるタンパク質濃度は、所定量のサンプルに含まれるタンパク質の重量やモル数などの絶対的な数値として表されるものでなくてもよく、被験血液サンプルと対照血液サンプルとの間での比較を可能とする相対的な数値で表されるものであってもよい。
【００２１】
マーカータンパク質の濃度は、例えば、同タンパク質に結合する抗体を用いるアッセイによって好適に測定することができる。このような抗体は、好ましくはマーカータンパク質に特異的な抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。特異的抗体は、モノクローナル抗体の結合性断片、ＳｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ断片）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）または最小認識単位としてもよい。抗体を用いる濃度測定においては、マーカータンパク質と抗体との複合体の濃度を反映するシグナル発生手段、例えば、一次抗体または二次抗体に結合した蛍光色素などを利用することにより、被験血液サンプルと対照血液サンプルとの間での比較可能な測定値を得ることができる。
【００２２】
上述のようなアッセイに用いられる抗体は、当技術分野において公知の標準的な方法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の製造法として、”Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H.Zola(CRC Press,1988)および”Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J.G.R.Hurrell(CRC Press,1982)に記載の方法が挙げられる。さらに、適切に作製された非ヒト抗体は、公知の手法により、例えばヒト抗体のフレームワーク中へマウス抗体のＣＤＲ領域を挿入することにより、「ヒト化」することもできる。アポリポタンパク質CIII0に結合する抗体の特異性は、その抗体が血液中に存在する他のタンパク質に結合しないこと、特に、アポリポタンパク質CIII1、CIII2およびCIII0'のいずれにも結合しないことを確認することにより評価することができる。また、８７６５ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質に結合する抗体の特異性は、その抗体が血液中に存在する他のタンパク質に結合しないこと、特に、９４２１ｍ／ｚ、９７１２ｍ／ｚおよび８６９３ｍ／ｚの質量のペプチドピークを示すタンパク質のいずれにも結合しないことを確認することにより評価することができる。
【００２３】
他の実施態様によれば、マーカータンパク質の濃度は、その質量を指標として測定することができる。例えば、マーカータンパク質の濃度は、８７６５ｍ／ｚの質量を有するペプチドピークのイオン強度として測定される。
【００２４】
比較対照となる正常な対照血液サンプルにおけるマーカータンパク質の濃度は、被験血液サンプルについての濃度測定の前に、予め測定しておくこともできる。また、異なる複数の個体からの正常な対照血液サンプルについてマーカータンパク質の濃度を測定し、その平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な対照血液サンプルにおけるマーカータンパク質濃度のデータから、平均値−標準偏差などの適正値を設定しておき、被験血液サンプルにおけるマーカータンパク質濃度がその適正値よりも低い場合にマーカータンパク質濃度の減少があるものと判断してもよい。また、この適正値の下限（閾値）は、マーカータンパク質についてのＲＯＣ曲線を作成することによって適切に決定することもできる。
【００２５】
本発明による診断法では、対照血液サンプルに対して被験血液サンプルにおけるマーカータンパク質の濃度が減少していた場合に、その哺乳動物に胃癌が存在するものと判定することができる。
【００２６】
以上のような本発明による診断法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、哺乳動物における胃癌の診断のためのキットが提供され、該キットは、血液サンプル中のマーカータンパク質の濃度を測定するための試薬を含んでなる。このような試薬は、実施しようとする具体的方法に応じて選択される。
【００２７】
本発明によるキットに含まれる診断用試薬としては、マーカータンパク質に特異的に結合するものが挙げられ、特に、ＥＬＩＳＡ等に用いられる特異的抗体とすることが好ましい。このような特異的抗体は、モノクローナル抗体もしくはその結合性断片、ＳｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ断片）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）または抗体の最小認識単位としてもよい。
【００２８】
本発明によるキットはさらに、実施しようとする具体的方法に応じて、他の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３０】
例１：８７６５ｍ／ｚの質量を有するタンパク質の血漿濃度と胃癌との関連
５８例の胃癌患者と４１例の健常者から（表１）、血漿サンプルを得た。これらの血漿検体の臨床背景を表１に示す。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
次いで、ｃ８逆相磁気ビーズカラムを用いて血漿サンプル中のタンパク質を精製し、質量分析法を用いて８７６５ｍ／ｚの質量を有するペプチドピークのイオン強度を調べた。この８７６５ｍ／ｚのペプチドピークは、少なくともヒトの血漿中では、アポリポタンパク質CIII0に特有のものである。
【００３３】
図３は、健常者２例および胃癌患者２症例における８７６５ｍ／ｚのイオン強度（矢印）を示すマススペクトルである。図３によれば、健常者において観察される８７６５ｍ／ｚのピークが、胃癌患者において大幅に低下していることがわかる。
【００３４】
図４は、健常者４１例および胃癌患者５８症例における８７６５ｍ／ｚのイオン強度、ならびにアポリポタンパク質CIII1およびCIII2に対応する９４２２ｍ／ｚおよび９７１２ｍ／ｚのイオン強度を示すグラフである。図４において、グラフ中の実線は平均値を示し、その数値はグラフの下に示している。また、グラフ上側の数値はMann-whitney Ｕ検定によるＰ値である。図４によれば、胃癌患者からの血漿サンプルにおけるアポリポタンパク質CIII0のイオン強度は、健常者からの血漿サンプルに比べて有意に低下していることがわかる（Ｕ検定  ｐ＜１．１１×１０−１５）。また、その有意性は、他のアポリポタンパク質CIIIに比べて格別に顕著である。
【００３５】
図５は、アポリポタンパク質CIII0、CIII1、およびCIII2のそれぞれのＲＯＣ曲線（receiver operating characteristic curve）とその曲線下面積（ＡＵＣ）を示した図である。ＲＯＣ曲線は、横軸を０〜１の偽陽性率とし、縦軸を０〜１の敏感度とし、ある診断用マーカーの様々なカットオフ値についてプロットしたグラフである。ＲＯＣ曲線では、曲線下面積が１に近いほど、その診断用マーカーの診断精度が高いことが示される。図５によれば、アポリポタンパク質CIII0の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９７４という驚くべき数値であり、他のアポリポタンパク質CIIIと比べても顕著に高い値であることがわかる。
【００３６】
図４および図５に示される結果から、各アポリポタンパク質CIIIについての、健常者と胃癌患者におけるイオン強度の平均値±標準偏差およびＰ値、ならびにＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を表２にまとめた。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
表２によれば、胃癌患者を正確に診断するためには、アポリポタンパク質CIIIの総量ではなく、糖鎖修飾を受けておらず、かつアミノ酸欠失の無いアポリポタンパク質CIII0の量を指標とすることが重要であると考えられる。つまり、アポリポタンパク質CIII0の血漿濃度の低下を調べることにより、胃癌を正確に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、４種のアポリポタンパク質CIIIの化学構造を示す図である。
【図２】図２は、血漿質量から予測される３つの血漿アポリポタンパク質CIIIピークスペクトル（CIII0、CIII1およびCIII2）を示すマススペクトルである。
【図３】図３は、健常者２例および胃癌患者２症例における８７６５ｍ／ｚのイオン強度（矢印）を示すマススペクトルである。
【図４】図４は、健常者４１例および胃癌患者５８症例における８７６５ｍ／ｚのイオン強度、ならびにアポリポタンパク質CIII1およびCIII2に対応する９４２２ｍ／ｚおよび９７１２ｍ／ｚのイオン強度を示すグラフである。
【図５】図５は、アポリポタンパク質CIII0、CIII1、およびCIII2のそれぞれのＲＯＣ曲線とその曲線下面積（ＡＵＣ）を示した図である。
【図１】
0005167541.tif 000004
【図２】
0005167541.tif 000005
【図３】
0005167541.tif 000006
【図４】
0005167541.tif 000007
【図５】
0005167541.tif 000008
【配列表】
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