(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質又はその断片と、ビオチン標識配列との融合タンパク質を、磁性細菌内で発現させる工程と、
前記磁性細菌から磁気微粒子を単離する工程と、
を含むことを特徴とするビオチン標識磁気微粒子の製造方法。
【請求項２】
前記ビオチン標識配列が、配列番号２に示したアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ磁性細菌内でビオチン化されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビオチン標識配列が、配列番号２に示したアミノ酸配列の７２位〜１４９位のアミノ酸残基からなる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチン標識配列がビオチン受容ペプチド配列からなり、かつ単離された磁気微粒子と大腸菌又は酵母のビオチンリガーゼとを接触させる工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ビオチン受容ペプチド配列が、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される何れかである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質が、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される１又は複数のビオチン受容ペプチド配列をさらに含み、前記ビオチン標識配列及びビオチン受容ペプチド配列の夫々は、磁気微粒子膜表面において前記融合タンパク質の所定の位置に発現することを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３又はその断片と、配列番号２に示したアミノ酸配列の少なくとも７２位〜１４９位のアミノ酸残基を含むビオチン標識配列との融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換されてなる磁性細菌。
【請求項８】
磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３又はその断片と、配列番号２に示したアミノ酸配列の少なくとも７２位〜１４９位のアミノ酸残基を含むビオチン標識配列との融合タンパク質が磁気微粒子膜上に発現されてなる磁気微粒子。
【請求項９】
前記磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３の断片が、配列番号６に示したアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から少なくとも１〜８７個のアミノ酸残基を含む請求項８に記載の磁気微粒子。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される１又は複数のビオチン受容ペプチド配列をさらに含み、前記ビオチン標識配列及びビオチン受容ペプチド配列の夫々は、磁気微粒子膜表面において前記融合タンパク質の所定の位置に発現することを特徴とする請求項８又は９に記載の磁気微粒子。
【請求項１１】
前記ビオチン標識配列及びビオチン受容ペプチド配列が、磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３又はその断片のＣ末端及びＮ末端に夫々融合して発現する請求項１０に記載の磁気微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン標識された磁気微粒子の製造方法に関し、さらに詳細には、磁性細菌内にて磁気粒子膜タンパク質と、ビオチン標識配列との融合タンパク質を発現させることにより、磁性細菌が生産する粒径約５０〜１５０ｎｍの磁気微粒子上に簡便にビオチン標識する方法及び当該方法により製造された磁気微粒子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオセンサやイムノセンサ用のタンパク質固定化担体として磁気微粒子が利用されている。磁気微粒子は磁気による回収が容易であるため、イムノアッセイのみならず、ドラッグキャリア、細胞分離技術等の幅広い分野への応用も期待されている。イムノアッセイ等における物質の標識方法の１つとして、アビジン又はストレプトアビジンと、ビオチンとの間の結合がある。これらの結合は極めて安定である（解離定数１０−１５Ｍ）ことから、検出感度の向上や迅速なアッセイを行なうために有用である。例えば、検体中の抗原を測定するイムノアッセイの場合、抗原に結合したビオチン化抗体を、標識したアビジンまたはストレプトアビジンと反応させて、洗浄後、残存した標識強度を測定することが行われている。
【０００３】
抗体等のビオチン化のために、被ビオチン化物質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基（スルフヒドリル基またはメルカプト基）などを利用してビオチンを固定化できるビオチン化試薬が種々市販されている。しかし、これらの化学試薬はタンパク質の活性化部位にも無差別に結合してしまうため、タンパク質のもつ機能を阻害してしまうという問題点があった。そのため、タンパク質の機能を阻害しない、部位特異的な標識技術の開発が望まれていた。
【０００４】
細胞内でビオチンリガーゼによって認識されるタンパク質ドメインは、生物種を越えて広く保存されており、このタンパク質ドメインと融合させた種々のタンパク質が生体内でビオチン化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、このビオチン化されうるドメインは、最小でも７５アミノ酸残基を必要とする大きなポリペプチドである。小さな部位特異的ビオチン化タグを開発するために、種々のビオチン酵素のビオチン周辺配列を模倣して１５〜２７残基のランダムなアミノ酸配列をもつペプチドライブラリーを構築し、大腸菌内でビオチン化するペプチド配列が探索された。ビオチン受容ペプチドと名づけられた比較的短いペプチドは、大腸菌のビオチンリガーゼにより効率的にビオチン化されることが見出された（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
一方、磁性細菌の菌体内において産生される磁気微粒子が知られている。この磁気微粒子又はその菌体自体は、磁石を用いることにより溶液から容易に分離することが可能であるため、タンパク質の製造及び単離、並びに種々の物質の回収、探索、検出及び定量に有用である。この磁気微粒子は、磁気微粒子膜と称されるリン脂質を主成分とする有機膜で被膜されており、この膜には種々の膜タンパク質が存在する（例えば、特許文献１〜３参照）。また、この膜タンパク質をアンカータンパク質として目的ポリペプチドとの融合タンパク質を磁気微粒子の表面で発現させる方法も報告されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平８−２２８７８２号公報
【特許文献２】国際公開９７／３５９６４号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７６９８９号公報
【特許文献４】特開２００６−３１４３１４号公報
【非特許文献１】Cronan, JE, The Journal of Biological Chemistry, (1990) Vol.265, pp.10327-10333
【非特許文献２】Schatz, PJ, Bio/Technology, (1993) Vol.11, pp.1138-1143
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ナノメートルスケールの磁性微粒子を効率的にビオチン標識するためには、磁気微粒子表面を被覆するポリマーにアミノ基等の官能基を導入しなければならず、作成工程が煩雑な上高価な試薬を用いることから、市販されているビオチン標識磁気微粒子は極めて高価である。また、磁性細菌の産生する磁気微粒子膜上に、上述のビオチン受容ペプチドを発現させた場合に磁性細菌内でビオチン化が起こるかどうかは未だ明らかではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、磁性微粒子膜タンパク質に種々のビオチン化されうるポリペプチド配列を融合させて磁性細菌内で発現させ、そして磁気微粒子を回収してビオチン化標識の有無を確認した。その結果、特定のアミノ酸配列を有する場合にのみ菌体内で効率的にビオチン化されることを発見した。さらに菌体内でビオチン化されないペプチド配列が、磁気微粒子を回収した後、インビトロにおいてビオチン標識しうることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、第一の視点において本発明のビオチン標識磁気微粒子の製造方法は、磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質又はその断片と、ビオチン標識配列との融合タンパク質を、磁性細菌内で発現させる工程と、前記磁性細菌から磁気微粒子を単離する工程と、を含むことを特徴とする。前記ビオチン標識配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列（ビオチンカルボキシル運搬タンパク質：ＢＣＣＰ）又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ磁性細菌内でビオチン化されうることが好ましい。１つの実施形態において、前記ビオチン標識配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列の７２位〜１４９位のアミノ酸残基からなることを特徴とする。
【００１０】
他の実施形態において、前記ビオチン標識配列がビオチン受容ペプチド配列（ＢＡＰ）からなり、かつ単離された磁気微粒子と大腸菌又は酵母のビオチンリガーゼとを接触させる工程をさらに含むことを特徴とする。前記ビオチン受容ペプチド配列は、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される何れかであることが好ましい。
【００１１】
さらに異なる実施形態において、前記融合タンパク質は、前記ＢＣＣＰとＢＡＰの両方を含み、夫々が磁気微粒子膜表面において前記融合タンパク質の所定の位置に発現することが好ましい。
【００１２】
本発明の他の視点において、磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３又はその断片と、配列番号２に示したアミノ酸配列の少なくとも７２位〜１４９位のアミノ酸残基を含むビオチン標識配列との融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換されてなる磁性細菌、並びに当該融合タンパク質が磁気微粒子膜上に発現されてなる磁気微粒子が提供される。前記磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３の断片は、配列番号６に示したアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から少なくとも１〜８７個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。１つの実施形態において、前記融合タンパク質が、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される１又は複数のビオチン受容ペプチド配列をさらに含み、前記ビオチン標識配列及びビオチン受容ペプチド配列の夫々は、磁気微粒子膜表面において前記融合タンパク質の所定の位置に発現することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、磁性細菌の生産能を利用して、菌体内及び菌体から抽出後の所望の時期にビオチン化されうるビオチン標識配列を磁気微粒子に導入することができる。菌体内でビオチン標識する方法は菌体外における方法に比べて効率的であり、磁性細菌から磁気分離により回収するだけの簡便な方法でビオチン標識磁気微粒子を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［定義］
本明細書において、用語「磁性細菌」とは、体内に磁気微粒子を蓄積する能力を有する細菌である。例えば、Magnetospirillum magneticum AMB-1, MS-1, 及びSR-1等のマグネトスピリラム種の微生物、並びにDesulfovibrio sp. RS-1等のデサルフォビブリオ種の微生物が挙げられるがこれらに限定されない。これらの磁性細菌は、マグネトソームとよばれる５０〜１００ｎｍ程度の粒径をもつチェーン状の磁性粒子を菌体内に生成，保持している。これらの磁性粒子は高い分散性，安定な有機薄膜の存在，単磁区微粒子といった特性を有する。
【００１５】
本明細書において、用語「磁気微粒子膜タンパク質」とは、上記磁性細菌の磁気微粒子を被覆する有機膜に存在するタンパク質をいう。磁性細菌において、これまでに細胞膜上又は磁気微粒子膜上に存在する種々のタンパク質が同定されている。例えば、マグネトスピリラム種の磁性細菌に由来する磁気微粒子膜タンパク質として、Ｍｍｓ５、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ７及びＭｍｓ１３等があり、これらをコードするＤＮＡの塩基配列はアクセス番号ＡＢ０９６０８１及びＡＢ０９６０８２としてＤＤＢＪやＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。
【００１６】
用語「ビオチン標識配列」ないし「ビオチン化配列」とは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼやトランスカルボキシラーゼのようなビオチン酵素（特定のリジン残基に結合したビオチンを補酵素として利用する酵素）に存在するような、ビオチンリガーゼの働きによってビオチン化されうるアミノ酸配列をいう。ビオチン酵素は同じ生物由来のビオチンリガーゼだけでなく、他種生物由来のビオチンリガーゼによってもビオチン化されることが知られている。これはビオチン化部位の立体構造が種を越えて保存されているためであると考えられる。この立体構造の相同性は、異なる生物に由来するビオチン酵素のアミノ酸配列の比較から推測することができるが、ビオチン化を受けるリジン残基周辺の配列が特に相同性が高いこと、及び多くのビオチン酵素においてＮ末端側に比べてＣ末端側の配列保存性が高いことが大きな特徴である。ビオチンリガーゼがこれらの配列を認識する詳細な機構は未だ解明されていない。なお、多くのビオチン酵素は、ビオチン標識配列からなるドメイン又はサブユニットを有し、これらを「ビオチンカルボキシル運搬タンパク質：ＢＣＣＰ(Biotin Carboxyl Carrier Protein)」と称する。
【００１７】
用語「ビオチン受容ペプチド」とは、上記ビオチン標識配列の一種であるが、ＢＣＣＰがビオチン酵素の比較的大きなポリペプチドであるのに対し、１５〜２７残基程度の比較的小さなペプチドをいう。このペプチドは、タンパク質の機能を阻害しない部位特異的ビオチン化タグとして利用するために開発された（非特許文献２参照）。
【００１８】
［ビオチン標識磁気微粒子の製造方法］
本発明のビオチン標識磁気微粒子の製造方法は、（ａ）磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質又はその断片とビオチン標識配列との融合タンパク質を磁性細菌内で発現させる工程と、（ｂ）前記磁性細菌から磁気微粒子を単離する工程と、を含む。
【００１９】
上記工程（ａ）は、磁気粒子膜タンパク質又はその断片をコードするＤＮＡと、ビオチン標識配列をコードするＤＮＡとを用いた発現ベクターを構築し、これを磁性細菌に導入して磁性細菌内で融合タンパク質を発現させる。この場合、上記発現ベクターは、磁性細菌内で転写制御可能なＤＮＡ断片をプロモーターとして含み、かつこのプロモーター配列の下流に融合タンパク質をコードするＤＮＡを挿入する。
【００２０】
このプロモーター配列は、磁性細菌内で転写可能であれば特に限定されないが、磁性細菌内で多量に存在するタンパク質を同定し、その発現を推進するプロモーター配列を使用することにより、転写活性の高いプロモーターを取得することができる。例えば、磁性細菌マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株の磁気微粒子膜上で発現されているタンパク質Ｍｓｐ１（ｍｍ１０）、Ｍｓｐ２（ｍｍ２４）、Ｍｓｐ３（ｍｍ１）及びＭｍｓ１６（ｍｍｓ１６）をコードするＤＮＡのプロモーター領域の配列を挙げることができる。これらのプロモーター配列は、本発明者らによりすでに報告されており（例えば、特開２００６−７５１０３号公報参照）、これらに開示された内容は引用により本願明細書に組み込まれる。
【００２１】
本発明において、磁気粒子膜タンパク質又はその断片は、磁気微粒子膜上にタンパク質を提示するためのアンカータンパク質として使用される。アンカータンパク質としては、磁性細菌マグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１株に由来する磁気微粒子膜タンパク質（例えば、Ｍｍｓ５、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ７、及びＭｍｓ１３等）が好適に用いられる。特に、Ｍｍｓ１３タンパク質は、磁気微粒子に強固に結合しているため好適である。Ｍｍｓ１３は、１２４アミノ酸残基からなる膜２回貫通型タンパク質であり、Ｎ末端及びＣ末端が磁性微粒子膜表面に局在していると考えられている。従って、Ｍｍｓ１３の全領域を用いて生成した融合タンパク質は、細胞膜上又は磁性微粒子膜上へのアンカリングが可能である。また、Ｍｍｓ１３は、そのＣ末端領域に膜貫通部位でない領域（配列番号６で示されるアミノ酸配のうち、８８〜１２４位のアミノ酸残基）を有し、この領域は存在していなくてもよい。すなわち、配列番号６に示したアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から少なくとも１〜８７個のアミノ酸残基を含んでいればよい。
【００２２】
本発明の方法におけるビオチン標識配列は、ビオチンリガーゼによってビオチン化されうる配列であれば特に限定されない。自然界においてビオチン化されうるタンパク質は稀であり、大腸菌ではアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのＢＣＣＰのみが知られている。真核細胞においてビオチン化されうるタンパク質の数はもう少し多く、酵母では増殖条件に依存して４個又は５個のビオチンタンパク質を有する。従って、自然界に存在する何れかのビオチンリガーゼによってビオチン化されればよいが、好ましくは磁性細菌内においてビオチン化されうる配列である。磁性細菌のビオチンリガーゼは、未だ単離されていないが、ゲノムＤＮＡ配列から公知のビオチンリガーゼの相同体の存在が示唆されている。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、上記ビオチン標識配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ磁性細菌内でビオチンリガーゼによりビオチン化されうる配列である。「１又は複数のアミノ酸」とは、全長アミノ酸残基数の多くとも１０〜２０％程度をいい、例えば、１〜３０個程度、好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。ビオチンリガーゼ活性は、当業者に周知の種々の方法により測定することができ、例えば、トリチウム標識されたビオチンのタンパク質への取り込みを、放射活性の測定により行なうことができる。
【００２４】
本発明の方法において、前記融合タンパク質は、磁性細菌が保持しているビオチンリガーゼによって効率的にビオチン化される。磁性細菌の磁気粒子膜タンパク質は、細菌内で合成された後、細胞内膜に集まり、この内膜が陥没して脂質膜で構成された小胞が形成され、その後小胞内に鉄イオンが集積されることでマグネタイトが形成されると考えられる。この磁気粒子膜タンパク質と融合した上記ビオチン標識配列は、例えば細胞質内で、又は内膜に集積した段階で内在性のビオチンリガーゼと接触できるため、磁気粒子膜上に局在した後にビオチン化されるよりも高い効率でビオチン化されるのであろう。
【００２５】
本発明の他の実施形態において、上記ビオチン標識配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質からなり、かつ磁性細菌のビオチンリガーゼによりビオチン化されうる配列である。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。
【００２６】
このようなビオチン標識配列の変異体を作製する方法としては、当業者に公知の種々の方法を用いることができ、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させてビオチン標識配列変異体をコードするＤＮＡを取得し、これを磁性細菌に導入して発現させることができる。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はギャップ二重鎖(Gapped duplex)法等の公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができ、これらの手法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−ＫやＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を利用することができる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、前記ビオチン標識配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列の７２位〜１４９位のアミノ酸残基からなることが好ましい。ビオチン修飾されるタンパク質のリジン残基は、カルボキシル末端の近くのアミノ酸配列中に存在することが知られている。ビオチン化を受けるリジン残基の周辺配列の相同性から、本実施形態におけるビオチン化部位はカルボキシル末端から３５番目のリジン残基であると考えられる。
【００２８】
他の実施形態において、上述したビオチン標識配列はビオチン受容ペプチド配列であってもよい。大腸菌や酵母のビオチンリガーゼによってビオチン化されうる種々のペプチド配列が報告されている。例えば、配列番号３及び４に示したアミノ酸配列からなるペプチドは、ｌａｃリプレッサーに連結して合成されたペプチドライブラリーから大腸菌のビオチンリガーゼによりビオチン化されうるペプチドとしてスクリーニングされたものである（非特許文献２参照）。また、配列番号５に示したアミノ酸配列からなるペプチドは、ファージディスプレイペプチドライブラリーを用いて、酵母のビオチンリガーゼによってビオチン化されるが、大腸菌のビオチンリガーゼではビオチン化されないペプチド配列として見出された(Chen, I. et al., Journal of the American Chemical Society, (2007) Vol.129, pp.6619-6625)。本実施形態においては、これらのペプチドを上述したアンカータンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合させて発現することができる。そして、磁性細菌から磁性微粒子を単離した後に、インビトロで当該微粒子と大腸菌又は酵母のビオチンリガーゼとを接触させればよい。インビトロにおけるビオチン化反応の条件は公知であり、例えば、大腸菌のビオチンリガーゼは、エネルギー源としてのＡＴＰを必要とする。
【００２９】
本発明の発現ベクターに融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで磁性細菌を形質転換し、得られた形質転換体を適切な条件下で培養すると、菌体内に磁気微粒子が産生され、磁気微粒子を被覆している磁性微粒子膜にアンカリングした形で融合タンパク質が発現する。従って、本発明の方法における工程（ｂ）は、磁性細菌の菌体を破壊又は溶解した後、磁気を利用して磁気微粒子を回収することにより、ビオチン標識磁気微粒子を容易に得ることができる。磁性細菌から磁気微粒子を単利する方法は、当該技術分野においてよく知られており、また、後述の実施例において１つの具体例が示される。
【００３０】
［ビオチン標識磁気微粒子］
本発明のビオチン標識磁気微粒子は、上述した製造方法により得ることができる磁気微粒子である。すなわち、本発明の好ましい磁気微粒子は、磁性細菌由来の磁気粒子膜タンパク質Ｍｍｓ１３又はその断片と、配列番号２に示したアミノ酸配列の少なくとも７２位〜１４９位のアミノ酸残基を含むビオチン標識配列との融合タンパク質が磁気微粒子膜上に発現されてなる磁気微粒子である。Ｍｍｓ１３タンパク質及びビオチン標識配列については、上述したとおりである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、磁気微粒子膜上に発現される融合タンパク質は、上述した配列番号２に示した磁性細菌由来のビオチン標識配列（ＢＣＣＰ）と、配列番号３〜５に示したアミノ酸配列から選択される１又は複数のビオチン受容ペプチド配列（ＢＡＰ）とを同時に含み、前記ビオチン標識配列及びビオチン受容ペプチド配列の夫々は、磁気微粒子膜表面において前記融合タンパク質の所定の位置に発現するものである。融合タンパク質の構築方法、具体的にはＭｍｓ１３タンパク質において磁気微粒子表面に露出する所望の位置に、ビオチン標識配列とビオチン受容ペプチド配列とを夫々連結することができ、これによって両者のビオチン標識間の距離を制御することが可能となる。例えば、磁気微粒子膜表面の近接した位置に時間をおいてビオチン標識することができれば、磁気微粒子膜上で相互作用しうる２種類の異なる分子で標識することができ、本発明の方法により製造された磁気微粒子に様々な化学的又は生物学的な機能を付加することができるようになる。
【００３２】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
１．実験方法
１−１．試薬及び器具
大腸菌由来ビオチンリガーゼはAVIDITY,LLC.(Colorado,USA)から購入した。金ナノ粒子標識ストレプトアビジンはNanocs inc.から購入した。ＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジンはBECKMA COULTERから購入した。アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンはCHEMICON International Inc.から購入した。その他の試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水を日本ミリポア株式会社のMilliQ Labで処理した超純水を用いた。発光強度測定にはアロカ株式会社のルミノメーターLucy-2を利用した。蛍光強度測定にはホリバ株式会社ホリバアイテックの蛍光分光光度計 FluroMax-4を利用した。
【００３４】
１−２．プラスミドの構築
ビオチン受容ペプチド（Biotin Acceptor Petide：BAP、アミノ酸配列：MAQRLFHILDAQKIEWHGPKGGS：配列番号３）、磁性細菌由来Biotin-Carboxyl Carrier Protein （ｍＢＣＣＰ；１４９アミノ酸残基、配列番号２）、及びｍＢＣＣＰのＣ末端側７８アミノ酸残基部分（ｍＢＣＣＰ７８）をそれぞれ磁性細菌粒子膜局在タンパク質Ｍｍｓ１３と融合したタンパク質発現ベクターを構築した（図１及び２）。
【００３５】
ｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３は、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧにＰｍｍｓ１６、及びその下流にｍｍｓ１３遺伝子を含むＰＣＲ産物をライゲーションしたプラスミドである（Applied and Environmentl Microbiology (2006) vol.72 p465, Methodのconstruction of expression vectors、参照）。
【００３６】
ｐＵＭ１３ＧＦＰＢＡＰは、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３にＧＦＰ遺伝子、及びその下流にＢＡＰ遺伝子を導入したプラスミドである。ビオチンアクセプターペプチド(Biotin Acceptor petide：ＢＡＰ）を融合したＧＦＰをコードする遺伝子（７８９ｂｐ）を増幅するため、プライマーＦｗ：ATGGTGAGCAAGGGCGC（配列番号７）、及びＢＡＰ遺伝子を含むプラーマーＲｖ：TTAAGAACCACCTTTCGGACCGTGCCATTCAATTTTCTGAGCGTCCAGAATGTGGAACAGACGCTGAGCCATCTTGTACAGCTCATCCATGC（配列番号８）を設計し、ｐＡｃＧＦＰ１（タカラバイオ）を鋳型として用いてＰＣＲを行った。増幅断片とＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３とのライゲーションを行い、得られたライゲーションサンプルを用いてｐＵＭ１３ＧＦＰＢＡＰを取得した（図１）。
【００３７】
ｐＵＭ１３ＧＦＰは、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３にＧＦＰ遺伝子を導入したプラスミドである。ＧＦＰをコードする遺伝を増幅するため、プライマーＦｗ：5’-GTGAGCAAGGGCGCCGAG-3’（配列番号９）及びプライマーＲｖ：5’-TTACTTGTACAGCTCATC（配列番号１０）を設計し、ｐＡｃＧＦＰ１（タカラバイオ）を鋳型として用いてＰＣＲを行った。増幅断片とＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３とのライゲーションを行い、得られたライゲーションサンプルを用いてｐＵＭ１３ＧＦＰを取得した。
【００３８】
Ｍｍｓ１３のＮ末端にＢＡＰ、Ｃ末端に緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを融合したタンパク質を発現するｐＵＭＢＡＰＭ１３ＧＦＰを構築するため、ＮｓｉＩサイト（下線を表示した配列）を付加したプライマーＮｓｉＩ−ＢＡＰ−Ｆ：5’-ATGCATATGGCTCAGCGTCTGTTCCA-3’（配列番号１１）、及びＮｓｉＩ−ＢＡＰ−Ｒ：5’-ATGCATAGAACCACCTTTCGGACCGT-3’（配列番号１２）を設計し、ｐＵＭ１３ＧＦＰＢＡＰをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、インサート配列のシークエンス解析を行った。次いで、ＮｓｉＩを用いてインサート配列を切り出し、ＮｓｉＩ消化したプラスミドｐＵＭ１３ＧＦＰとのライゲーションを行った。得られたライゲーションサンプルを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、インサート配列の挿入方向をシークエンス解析により確認した（図２）。
【００３９】
Ｍｍｓ１３のＣ末端にＢＡＰ、ｍＢＣＣＰ、及びｍＢＣＣＰ７８を融合したタンパク質をそれぞれ発現するｐＵＭ１３ＢＡＰ、ｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ、及びｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ７８を構築するため、ＢＡＰ増幅プライマーとしてＢＡＰ−Ｆ：5’-ATGGCTCAGCGTCTGTTCCA-3’（配列番号１３）、ＢＡＰ−Ｒ：5’-AGAACCACCTTTCGGACCGT-3’（配列番号１４）を、ｍＢＣＣＰ及びｍＢＣＣＰ７８増幅プライマーとしてｍＢＣＣＰ−Ｆ：5’-ATGGGCAACAAGACTCCCATC-3’（配列番号１５）、ｍＢＣＣＰ７８−Ｆ：5’-CATCCCGGCGCGGTG-3'（配列番号１６）、ｍＢＣＣＰ−Ｒ：5'-CTATTCGATGATCAGCAAGGGC-3'（配列番号１７）を設計した。ｐＵＭ１３ＧＦＰＢＡＰをテンプレートとしてＢＡＰのＰＣＲ増幅をおこなった。また、磁性細菌Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１ゲノムをテンプレートとしてｍＢＣＣＰ及びｍＢＣＣＰ７８のＰＣＲ増幅を行った。それぞれのＰＣＲ産物とＳｓｐＩ消化したプラスミドｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３とのライゲーションを行い、得られたライゲーションサンプルを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、インサート配列の挿入方向をシークエンス解析により確認した（図２）。
【００４０】
１−３．磁性細菌の形質転換、培養及びＢａｃＭＰｓの調製
野生株の磁性細菌Magnetospillum magneticum ＡＭＢ−１はＭＳＧＭ(Blakemore et al. 1979)４．５ｌに植菌し、アルゴンガスを１５分間バブリングすることにより微好気状態にした上で、室温にて約５日間、静置培養した。また、エレクトロポレーションによりプラスミドｐＵＭＢＡＰＭ１３ＧＦＰを導入した形質転換体は５μｇ／ｍｌ、アンピシリン含有ＭＳＧＭで培養し、ｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ、及びｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ７８を導入した形質転換体は５μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μＭビオチン含有ＭＳＧＭで培養した。
【００４１】
培養した菌体は７２００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離することにより集菌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）３０ｍｌに懸濁した後に、フレンチプレスを用いて２０００ｋｇ／ｃｍ２で破砕した。その後、菌体破砕液を入れた三角フラスコの底部にネオジウム−ボロン（Ｎｄ−Ｂ）磁石を取り付けて磁気微粒子（ＢａｃＭＰｓ）を磁気分離し、２−［４−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ］−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で超音波洗浄機を用いて１０回洗浄した。洗浄したＢＭＰｓはＰＢＳに懸濁し、４℃で保存した。
【００４２】
１−４．大腸菌由来ビオチンリガーゼによるＢＡＰのビオチン標識
５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭビオチン、１００ｍＭのＡＴＰ、及び１０μｇ／ｍｌ大腸菌由来ビオチンリガーゼ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１００μｌ）中に５０μｇのＢａｃＭＰｓを懸濁し、室温で１時間撹拌した。その後、磁気分離したＢａｃＭＰｓを５０μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【００４３】
１−５．ビオチン標識ＢａｃＭＰｓへのストレプトアビジンの固定化
磁性細菌M. magneticum AMB-1形質転換体から抽出したＢａｃＭＰｓ１０μｇに対し、２０μｇ／ｍｌのＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジン（ＴＲＩＴＣ−ＳＡ）を１００μｌ添加した、室温で１時間撹拌した。その後、１００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、ＢａｃＭＰｓを４００μｌのＰＢＳＴに懸濁し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４４】
磁性細菌M. magneticum AMB-1形質転換体から抽出したＢａｃＭＰｓ（５０μｇ）に対し、１／１００希釈アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ）溶液（タンパク質濃度５．４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ含有）を１００μｌ添加し、室温で１時間撹拌した。１００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＢａｃＭＰｓを５０μｌのＰＢＳに懸濁し、ルミホス５３０（３．３×１０−４ｍｏｌ／ｌ、５０μｌ）を加え、５分後の発光強度を測定した。
【００４５】
ＢａｃＭＰｓ上に固定化できるストレプトアビジン量を測定するため、ＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジンを固定化し、蛍光強度を測定した。２００μｌのＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジン溶液を１００μｇのＢａｃＭＰｓに添加し、室温で１時間撹拌した。その後、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μｇのＢａｃＭＰｓを５００μｌのＰＢＳに懸濁した。その後、粒子の蛍光強度（励起波長：５４５ｎｍ、蛍光波長：５８０ｎｍ）を、蛍光分光光度計を用いて測定した。検量線作成のため、５０μｇの野生株由来ＢａＭＰｓ（ＷＴ−ＢａｃＭＰｓ）に既知濃度のＴＲＩＴＣ溶液（５００μｌ）を添加し、同様に蛍光強度を測定した。
【００４６】
１−６．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1から抽出した２ｍｇの磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液に懸濁し、１００℃で３０分間煮沸することでＢａｃＭＰｓ膜タンパク質を抽出した。抽出した膜タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー（終濃度：6.25 mM Tris-HCl [pH6.8], 5 % 2-mercaptoethanol, 2 % SDS, 5 % sucrose and 0.002 % bromophenol blue）に混合し、12.5 %（wt/vol）ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。その後、クマシンブリリアントブルーＲ−２５０を用いてゲルを染色した。
【００４７】
１−７．ビオチン標識ＢａｃＭＰｓへのストレプトアビジンの固定化
ＢａｃＭＰｓ上にストレプトアビジンを固定化できることを確認するため、金ナノ粒子標識ストレプトアビジンを固定化し、透過型電子顕微鏡による観察を行った。ＰＢＳＴを用いて１／２希釈した２００μｌの金ナノ粒子標識ストレプトアビジン溶液を１０μｇのＢａｃＭＰｓに添加し、室温で１時間撹拌した。その後、１００μｌのＰＢＳＴで３回、１００μｌの超純水で１回洗浄した。洗浄後、ＢａｃＭＰｓを超純水に懸濁し、グリッド上で３０分間乾燥させた。その後、透過型電子顕微鏡（Ｈ７００Ｈ、日立製作所）を用いて粒子を観察した。
【００４８】
２．結果
２−１．ｍＢＣＣＰ（７８）提示ＢａｃＭＰｓのインビボ(in vivo)ビオチン標識
ｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ形質転換体から磁気微粒子（ｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓ）を抽出し、ＴＲＩＴＣ−ＳＡを用いてビオチン標識の有無を確認した。その結果、ｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓ上にＴＲＩＴＣ−ＳＡが固定化している様子が観察された。このことから、ＢａｃＭＰｓ上に提示されたｍＢＣＣＰが磁性細菌体内においてビオチン標識されることが示された（図３）。
【００４９】
次いでＢａｃＭＰｓ上にディスプレイしたビオチン標識タグ、ｍＢＣＣＰＡの短縮化を試みた。一般的にＢＣＣＰの持つアミノ酸配列のうち、ビオチン化に関与する配列はＣ末端側に集中していることが知られている。そこで、磁性細菌M. magneticum ＡＭＢ−１由来ｍＢＣＣＰのアミノ酸配列を、近縁種であるM. magnetotacticum ＭＳ−１、M. gryphiswaldense ＭＳＲ−１、Rhodospirirum rubrum由来のＢＣＣＰと比較した（図４）。その結果、７２〜１４９残基目のＣ末端側７８残基（ｍＢＣＣＰ７８）に相当する部分に共通配列が集中していることがわかった。そこで、ｍＢＣＣＰ７８をＭｍｓ１３のＣ末端に融合したタンパク質を発現するプラスミドｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ７８を用いてM. magneticum ＡＭＢ−１を形質転換し、磁気微粒子（ｍＢＣＣＰ７８−ＢａｃＭＰｓ）を抽出した。
【００５０】
このｍＢＣＣＰ７８−ＢａｃＭＰｓが磁性細菌体内においてビオチン標識されているかをＳＡ−ＡＬＰを用いて確認しところ、ｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓと同程度の発光強度を示した（図５）。このことから、１４９アミノ酸残基からなるｍＢＣＣＰのうち、Ｃ末端側７８アミノ酸残基のみを持つｍＢＣＣＰ７８も、磁性細菌体内においてビオチンリガーゼによって認識されてビオチン標識されることが示された。
【００５１】
２−２．ＢＡＰ提示ＢａｃＭＰｓのインビトロ(in vitro)ビオチン標識
大腸菌由来ビオチンリガーゼの働きによりＢａｃＭＰｓ上に発現したＢＡＰがビオチン標識されることを確認するため、ビオチンリガーゼ処理もしくは未処理のＢＡＰ−Ｍｍ１３−ＧＦＰ発現ＢａｃＭＰｓとＭｍ１３−ＧＦＰ発現ＢａｃＭＰｓにＳＡ−ＡＬＰを添加した。その結果、ビオチンリガ−ゼ処理したＢＡＰ−Ｍｍ１３−ＧＦＰ発現ＢａｃＭＰｓにおいてのみ高い発光強度が得られた（図６）。このことから、ビオチンリガーゼを用いてＢａｃＭＰｓ上のＢＡＰを特異的にin vitroビオチン標識できることが示された。また、ビオチンリガーゼ未処理ＢＡＰ−Ｍｍ１３−ＧＦＰ発現ＢａｃＭＰｓにＡＬＰ−ＳＡが結合しなかったことから、ＢＡＰはＡＭＢ−１体内ではビオチン標識されないことが示された。
【００５２】
なお、図５及び図６に示したグラフの縦軸は、ストレプトアビジン標識したアルカリフォスファターゼの活性を蛍光強度により表したものである。用いた磁気微粒子（ＢａｃＭＰｓ）の量が同じにもかかわらず、蛍光強度が約１０倍異なることからインビトロでのビオチン化反応に比べて、磁性細菌内におけるビオチン化反応の方が顕著に効率的であることが分かる。
【００５３】
２−３．ＢａｃＭＰｓ上におけるＭｍｓ１３−ｍＢＣＣＰ融合タンパク質の発現確認
M. magneticum AMB-1野生株、およびＢａｃＭＰｓ上の膜タンパク質Ｍｍｓ１３とＡＭＢ−１由来ビオチン結合タンパク質ｍＢＣＣＰとの融合タンパク質を発現するプラスミドｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ上の膜タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図７に示す。ｐＵＭ１３ｍＢＣＣＰ形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ（ｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓ）において、３０から４３ｋＤａ付近に顕著なバンドが得られた。Ｍｍｓ１３−ｍＢＣＣＰ融合タンパク質は約３１ｋＤａのタンパク質であることから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたバンドはＭｍｓ１３−ｍＢＣＣＰであると考えられた。以上の結果より、Ｍｍｓ１３−ｍＢＣＣＰ融合タンパク質がＢａｃＭＰｓ上に高発現に導入されていることが確認された。
【００５４】
２−４．ＢａｃＭＰｓ上に固定化された金ナノ粒子の観察
ＢａｃＭＰｓ上にストレプトアビジンが導入されていることを確認するため、ＷＴ−ＢａｃＭＰｓおよびｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓに金ナノ粒子標識ストレプトアビジンを添加し、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果を図８に示す。ｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓ上にはＷＴ−ＢａｃＭＰｓに比べて多くの金ナノ粒子が固定化されていることが確認された。このことから、ＢａｃＭＰｓ上に提示されたｍＢＣＣＰがビオチン化され、そこにストレプトアビジンを固定化できることが示された。
【００５５】
２−５．ＢａｃＭＰｓ上に固定化されたＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジン量の測定
ＢａｃＭＰｓ上に固定化できるストレプトアビジン量を測定するため、ＷＴ−ＢａｃＭＰｓおよびｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓにＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジンを添加し、蛍光強度を測定した。その結果を図９に示す。１ｍｇのｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓ上に約１３００ｎｇのストレプトアビジンを固定化できることが示された。これは一粒子のＢａｃＭＰｓ（粒径：７５ｎｍ、密度：５．２ｇ／ｃｍ３と近似）上に約１５分子のストレプトアビジン（６０ｋＤａ）を固定化できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】磁性細菌内における発現ベクターの構築方法を示す模式図である。
【図２】本発明の方法に用いる融合タンパク質発現プラスミドの構築方法を示す模式図である。
【図３】ＴＲＩＴＣ標識ストレプトアビジンを本発明の方法で製造した磁気微粒子に加え、洗浄した後の顕微鏡観察像である。（スケールバー：１０μｍ）
【図４】Magnetospirillum magneticum AMB-1及びその近縁種由来のＢＣＣＰ及びＢＡＰのアミノ酸配列を比較したアライメントである。
【図５】磁性細菌内において発現させた融合タンパク質がインビボでビオチン化されるか否かを調べた結果である。
【図６】ストレプトアビジン標識したアルカリフォスファターゼを用いて、磁気微粒子のインビトロでのビオチン標識を確認した結果である。
【図７】ＷＴ−ＢａｃＭＰｓ及びｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓから抽出した膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図８】金ナノ標識ストレプトアビジンをＷＴ−ＢａｃＭＰｓ及びｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓに加え、洗浄した後の透過型電子顕微鏡観察像である。
【図９】ＷＴ−ＢａｃＭＰｓ及びｍＢＣＣＰ−ＢａｃＭＰｓへのＴＲＩＴＳ標識ストレプトアビジンの結合飽和曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図３】
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【図７】
0005181179.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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