(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも96%のアンホテリシンB化合物と4%未満の非アンホテリシンBポリエン化合物又は内毒素化合物とを有する活性成分と、製薬上許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項２】
活性成分が少なくとも98%のアンホテリシンB化合物と2%未満の非アンホテリシンBポリエン化合物又は内毒素化合物とを有する請求項1記載の組成物。
【請求項３】
製薬上許容し得る担体が脂質担体である請求項１記載の組成物。
【請求項４】
活性成分と製薬上許容し得る担体とを含有してなり、活性成分が少なくとも96%のアンホテリシンを有し且つ4%未満の非アンホテリシンBポリエン化合物又は内毒素化合物の少なくとも1つを含有してなる医薬組成物。
【請求項５】
活性成分が少なくとも98%のアンホテリシンB化合物を有し且つ2%未満の非アンホテリシンBポリエン化合物又は内毒素化合物の少なくとも1つを含有してなる、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
製薬上許容し得る担体が脂質担体である請求項4記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、2002年10月３日出願の米国特許出願第60/415,671号の優先権を主張し、その内容は本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、高純度アンホテリシンＢ（アンホテリシンＢＨＰ）化合物、その組成物及び使用方法の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は哺乳動物の真菌感染症の治療に関する。
【０００３】
本発明の精製法は、ストレプトマイセス・ノドーサス（Streptomyces nodosus）培養液の上清からポリエン系抗真菌剤の単離を可能にする。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アンホテリシンＢ製品は、種々様々な真菌感染症、例えば全身性真菌感染症を治療するのに使用されている。
【０００５】
しかし、アンホテリシンＢは深刻な種々の有害反応を誘発する。この発明の背景では、アンホテリシンＢの種々の有害反応、これらの有害反応のメカニズムの発見及びこれらの反応のマーカーの説明を記載する。
【０００６】
アンホテリシンＢは、主として重度の真菌感染症の治療において静脈投与剤として使用される。しかし、その有用性は、副作用〔インフルエンザ様症状（発熱、悪寒、筋肉痛）、毛細血管漏出症候群（低血圧、低下した器官灌流）、肺うっ血、精神状態の変化（嗜眠、錯乱、煽動）、続発性低カリウム血症、低マグネシウム血症及び貧血を伴った腎機能障害、並びに肝機能障害〕の多発によって危うくなる。これらの有害反応は、治療患者の最大70％に認められる。これらの反応を招くメカニズムは、今日まで全く知られていない。
【０００７】
分子生物学的方法によって、本発明者らは、アンホテリシンＢに暴露された後にアップレギュレーションされる（細胞中で増加される）炎症性サイトカイン遺伝子を発見した。この遺伝子としては、インターロイキン-１、すなわち強力な炎症性サイトカインが挙げられる。インターロイキン-１の刺激に関連した副作用を、以下で論じる。
【０００８】
アンホテリシンＢによって誘発された“インフルエンザ様症候群”の提案されたメカニズムとしては、単核細胞によるインターロイキン−１(ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)又はプロスタグランジン類の発現が挙げられ、この場合に、単核細胞は発熱及び悪寒を誘発する視床下部の設定値を変化させる。内毒素の投与は、同様の反応を引き起こす。アンホテリシンＢに暴露された単核細胞は、独特の形態変化と、劇的に変えられたタンパク質発現とを誘発する。ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βなどのある種の宿主細胞タンパク質が、アンホテリシンＢによって誘導できることが報告されている。本発明者らは、このタンパク質の発現は予め形成されたタンパク質の放出に関係がないことを実証した；タンパク質の放出は、遺伝子のアップレギュレーション又は抑制遺伝子の抑制解除と関係がある。
【０００９】
現在、アンホテリシンＢの有害反応を抑制するために使用される薬剤は、前記の問題の小さな側面を扱うだけである。ヒドロコルチゾンは、インフルエンザ様症候群及び低血圧を防止するために使用される。アセトアミノフェンもまた、インフルエンザ様症候群を防止するために使用される。非経口的に投与される液体は、腎機能障害を防止するために使用される。また、脂質製品がアンホテリシンＢの毒性を低減するために開発されている。これらの製品は、アンホテリシンＢをカプセル化するか又はこれらの反応の要因から保護する。しかし、これらは全てが成功したわけではない。
【００１０】
この場合、必要なことは、副作用の多発のないアンホテリシンＢ製品及び治療方法である。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明は、アンホテリシンＢＨＰと呼ばれる精製によって得られるアンホテリシンＢの改良された単離方法の発見である。アンホテリシンＢＨＰは、細胞生存率 及びサイトカインマーカーの発現によって測定される細胞及び哺乳動物における毒性の低減に関係がある。従って、本発明は、アンホテリシンＢ製品を使用する場合に有害反応の減少を可能にする。本発明のある具体的態様において、アンホテリシンＢＨＰは、高圧液体クロマトグラフィー分別により得られる。
【００１２】
本発明の一つの態様は、実質的に純粋なアンホテリシンＢを含有してなる医薬組成物である。本発明の目的には、実質的に純粋とは約90％よりも高い純度である。好ましくは、実質的に純粋なアンホテリシンとは、約96％よりも高い純度である。別の態様において、実質的に純粋なアンホテリシンＢは約97％、98％又は99％よりも高い純度である。
【００１３】
本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の高純度アンホテリシンＢ化合物と製薬学的に許容し得る担体とを治療を必要とする哺乳動物に投与することからなる哺乳動物の真菌感染症の治療方法である。
【００１４】
本発明の別の態様は、薬剤を用いて治療される患者における毒性の試験方法である。この態様は、アンホテリシンＢを用いて治療される患者の試験方法を包含する。
【００１５】
本発明の別の態様は、アンホテリシンＢ製剤を含有してなる医薬組成物であって、アンホテリシンＢ製剤が約４％以下の不純物を含有するものである医薬組成物である。
【００１６】
これらの態様及びその他の態様は、本明細書の開示及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１７】
発明の詳細な説明
前記のように、アンホテリシンＢは特にその強い抗真菌性において有用な物質であると認められているが、その臨床使用（すなわち治療使用）は治療を受ける患者に対する深刻な副作用により限定されている。アンホテリシンＢは水溶液に溶解しない。従って、患者に投与するためのコロイド懸濁物を形成するためにグルコース溶液に懸濁されたアンホテリシンＢ、脂質担体、デスオキシコール酸塩及び／又は緩衝液の組合せとして商業的に供給される。アンホテリシンＢは、通常は２〜６時間にわたって静脈内に投与される。早い注入は、心毒性をもたらし得る。アンホテリシンＢの別の毒性効果は、それ自体腎機能障害、貧血、発熱及び低血圧として出現し得る。
【００１８】
アンホテリシンＢの毒性は、真菌感染症の治療に使用し得る薬剤の総量を制限する。また、アンホテリシンＢは好中球減少及び免疫不全患者には効かない場合が多く、これらの患者は真菌感染症に高感受性である。その結果、哺乳動物系に対するアンホテリシンＢの毒性を低下させ、同時に真菌感染症に対するその効果を高める系に対する要求がある。
【００１９】
最近、患者に投与する前にある種の薬剤を脂質担体へカプセル封入すると、これらの化合物の薬物動態、組織分布、代謝及び治療効果を著しく変えることができることが明らかにされた。また、これらの薬剤の分布及び薬物動態は、前記の薬剤をカプセル化する脂質担体の脂質組成、サイズ、電荷及び膜流動性を変えることによって変えることができる。
【００２０】
本発明の高純度アンホテリシンＢ組成物又は複合体は、医薬組成物に形成し得るし、またアンホテリシンＢ製品を投与する公知の方法に従って患者に投与し得る。
【００２１】
例えば、本発明の高純度アンホテリシンＢ組成物は、脂質組成物に形成し得る。慣用のアンホテリシンＢは、水溶液に溶解することを可能にする脂質成分と複合化し得、従って非経口投与を可能にし得る。過去二十年間にわたって、研究者らは、多量の親薬物及び同時に低い腎毒性を提供することを目的としてアンホテリシンＢをリン脂質ビヒクル（リポソーム）及び／又はコレステロールエステル類に配合する効用を研究して来た。現在までに、アンホテリシンＢの少なくとも３種類の脂質製剤：すなわちアンホテリシンＢ脂質複合体(ABLC、Abelcet)；アンホテリシンＢ硫酸コレステリル複合体〔アンホテリシンＢコロイド分散物(ABCD、Amphotec)とも呼ばれる〕；及びリポソームアンホテリシンＢ（L-AmB、AmBisome）が商業的に入手できる。本発明は、それぞれの商業的に入手できる製剤と一緒に使用し得、どのようにして市販の製剤に使用される商業的に入手できるアンホテリシンの代わりに本発明の高純度アンホテリシンＢを用いるかは当業者には理解されるであろう。
【００２２】
現在の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した前記の３種類の脂質製剤の用量は、次の通りであると考えられる：すなわち、L-AmB、３〜５mg/kg/日；ABLC、５mg/kg/日；及び
ABCD、３〜４mg/kg/日であると考えられる。これらの脂質製剤は、アンホテリシンＢの１日当たり用量よりも５〜１０倍高い１日当たり用量で安全に投与できる。
【００２３】
次の表は、本発明の高純度アンホテリシン製品を配合し得る市販のアンホテリシンＢ薬剤を示す。  
表１
市販のアンホテリシンＢ薬剤の例
0005170940.tif 000002
【００２４】
入手できるアンホテリシンＢ製品の化学的性質 及び物理的性質を以下の表２に要約する。  
表２
アンホテリシンＢ薬剤の例の化学的性質及び物理的性質
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【００２５】
本発明のアンホテリシンＢＨＰ組成物は、１日当たりにつき体重１kg当たり約0.001mgから１日当たりにつき体重１kg当たり約1000mgまでの範囲の量（その範囲の間に全ての中間用量を含む）で患者に投与し得る。本明細書の内容において“中間用量”とは、前記の範囲の用量を意味し、例えば１日当たりにつき体重１kg当たり約0.001mg、0.002mg、
0.003mgなど；0.01mg、0.02mg、0.03mgなど；0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、
0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mgなど；３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、10 mgなど；12mg、13mg、14mgなど；50mg、51mg、52mg、53mg、54mgなど；100mg、101mg、102mg、103mg、104mgなど；500mg、501mg、502mg、503mgなど；600mg、700mg、800mg、900mg及び約1000 mgを意味し、その範囲の間に全ての部分用量を含むことが容易に理解されるであろう。
【００２６】
別の態様において、本発明のアンホテリシンＢＨＰ組成物は、１日当たりにつき体重１kg当たり約0.01mgから１日当たりにつき体重１kg当たり約100mgまでの範囲の量（その範囲の間に全ての中間用量を含む）で患者に投与し得る。
【００２７】
本発明のさらに別の態様において、本発明のアンホテリシンＢＨＰ組成物は、１日当たりにつき体重１kg当たり約0.1mgから１日当たりにつき体重１kg当たり約10mgまでの範囲の量（その範囲の間に全ての中間用量を含む）で患者に投与し得る。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、公知の投与経路で、例えば非経口的に及びその他の経路で投与し得る。この投与経路としては、経口、経鼻（経鼻スプレー又は経鼻吸入器によって）、口腔内、直腸内、膣内又は局所投与が挙げられる。投与はまた、垂直向性(orthotropic)、皮内 皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射及び／又は注入によるものでもあってもよい。このような組成物は、薬理学的に許容し得る担体、緩衝液又はその他の賦形剤を含有する製薬学的に許容し得る組成物として投与してもよい。“薬理学的に許容し得る”という用語は、ヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応又はその他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物をいう。肺の疾患の治療については、好ましい経路は気管支肺胞洗浄などによる肺へのエアゾール送達である。
【００２９】
勿論、慣用のアンホテリシン静脈内注射及び／又は注入に関しては、最も一般的な送達経路であると思われる。このような態様において、本発明のアンホテリシンＢＨＰは、
0.001時間〜100時間の範囲の時間にわたって徐々に投与し得る。別の態様においては、本発明の医薬組成物の静脈内注射及び／又は注入による投与が好ましい経路である場合には、本発明の医薬組成物は、0.1時間〜50時間の範囲の時間にわたって徐々に投与すべきである。別の態様においては、本発明の医薬組成物の静脈内注射及び／又は注入による投与が好ましい経路である場合には、本発明の医薬組成物は、１時間〜10時間の範囲の時間にわたって徐々に投与すべきである。
【００３０】
前記のように、本発明の高純度アンホテリシンＢはHDLC（高い薬剤：脂質比の複合体）の一部であってもよい。この態様の一つの例として、本発明のアンホテリシンＢＨＰ組成物は、米国特許第6,406,713号公報（本明細書に参考として組み込まれる）に開示されているアンホテリシンＢ複合体と同じ方法で使用し得る。これらの態様としては、脂質と、生物活性剤、例えば薬剤とを含有するHDLC系が挙げられる。このようなHDLCは、リン脂質、例えばDMPC及びDMPGを、好ましくは７：３のモル比で含有してもよいし、あるいは飽和リン脂質又は脂肪酸リン脂質を含有してもよい。これらの態様の生物活性剤は、本発明の高純度アンホテリシンＢである。高純度アンホテリシンＢのモル％の例としては、その量が約６〜約70モル％である例が挙げられる。別の例は、約30〜約50モル％である。本発明のHDLCの医薬組成物は、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を含有してなり得、これらの組成物は非経口投与し得る。勿論、このような組成物は、これらの組成物を哺乳動物、例えばヒトに投与することによって真菌感染症などの感染症を治療するのに使用される。本発明のHDLC含有組成物としては、実質的にリポソームを含有しない組成物及び薬剤を捕捉するリポソームを実質的に含有しない組成物が挙げられる。本明細書において“実質的に含有しない”という用語は、一般的にリポソームの重量で約10％以下、約５％以下及び／又は約３％以下を意味する。
【００３１】
これらの態様のHDLCを調製する種々の方法は、高純度アンホテリシンＢを最初に溶媒、例えばDMSO又はメタノールに溶解する方法を含む米国第‘713号特許公報に記載されている。
【００３２】
別の方法では、約６％〜50モル％のアンホテリシンＢを含有する高純度アンホテリシンＢを含有する脂質粒子（すなわちリポソーム）を形成し、次いで該粒子（すなわちリポソーム）を約25℃〜約60℃での加熱サイクルに供する。このようなサイクルは、より高度に整えられ且つ毒性の低いアンホテリシンＢ／脂質複合体を形成する。
【００３３】
別の例とし、本発明のアンホテリシンＢＨＰは、米国特許第3,965,090号；同第
4,663,167号；同第4,766,046号；同第4,054,734号；同第5,965,156号；同第4,049,898号；同第5,194,266号及び同第4,035,568号各公報に記載の方法及び量で使用し得る。これらの特許公報は全て、本明細書に参考として組み込まれる。
【００３４】
本発明の製剤の投与の様式は、アンホテリシンＢＨＰ化合物が送達されるであろう生物の部位及び細胞を決定し得る。一般的に言えば、本発明の高純度アンホテリシン組成物は、目的とする投与経路及び標準的な薬務に関して選択される製薬担体と混合して投与されるであろう。例えば、特定の部位への送達は、（感染症が外部である場合には、例えば眼、皮膚などの領域に、耳の中に、又は傷口又は火傷などの痛みの個所に）局所施用によって最も容易に達成し得る。このような局所施用は、苦しんでいる領域に直接施用するためにクリーム、軟膏、ゲル、乳液又はペーストの形であり得る。別法として、製剤は、非経口的に、例えば静脈内に、筋肉内に又は皮下に注射し得る。非経口投与については、製剤は例えばその他の溶質、例えば等張溶液を調製するのに十分な塩類又はグルコースを含有していてもよい滅菌水溶液の形で使用できる。その他の用途は、製剤の個々の性質に応じて、当業者が想定し得る。
【００３５】
ヒトへの治療投与については、処方する医師が最終的に所定のヒト患者に適した用量を決定するであろう。これは、真菌性又はウイルス性疾患の治療又は予防処置において、個人の年齢、体重及び応答並びに患者の症状の性質及び重症度に応じて変化させることが期待できる。HDLC又はリポソームの形の薬剤の用量は、一般に遊離の薬剤について採用される用量であろう。しかし、ある場合には、これらの制限を超える用量を投与することが必要であり得る。前記の量は、真菌症又はその他の感染症の治療又は予防処置に使用する場合には、変化させ得る。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明の態様を明らかにするために示す。以下の実施例は、本発明の態様を明らかにすることを目的とするものであり、本発明の要旨の例であり、それを限定することを目的とするものではない。
【００３７】
実施例は、本発明の別の態様を例証し且つ前記の方法を使用して高圧液体クロマトグラフィーにより分別できるアンホテリシンＢ成分の生体外評価として示される。
【００３８】
実施例１：試薬
粉末の約11.2mgのアリコートを、商用グレードのアンホテリシンＢ製品から測定した。本実施例において、Apothecon社及びSigma社によって製造されたアンホテリシンＢを利用した。これらのアリコートは、約５mgのアンホテリシンＢを含有していた。それぞれの試料を、微小遠心分離管に約４℃で保存し、それぞれの実験の直前に希釈した。それぞれのアリコートに約1.0 mLの滅菌水を加えることによって５μg/mL希釈液を調製した。５μg/mL保存液の約500μLの２：１希釈液を使用して2.5μg/mL希釈液を調製した。Sigma社品は医薬グレードの製品ではなく、“最小限度精製された”製品を代表する陽性対照として選択した。新たなアリコートをそれぞれの実験の直前に希釈し、使用直前に攪拌した。内毒素の混入を試験するために、それぞれのアンホテリシンＢ製剤から試料アリコートを取っておいた。
【００３９】
使用する別の薬剤としては、大腸菌内毒素（血清型 026:b6リポ多糖、Sigma社；ミズリー州セントルイス)(LPS)、デスオキシコール酸塩及びリン酸ナトリウム緩衝液（これらは、Sigma社から得られる）が挙げられる。これらの反応物（reactions）を、単核細胞からのＩＬ−β発現についての陽性対照及び陰性対照として使用した。ＩＬ−11β発現アッセイで使用される試薬を、培養ウエルに加えられる保存溶液0.01mlが記録される最終濃度をもたらすように滅菌水で希釈した。
【００４０】
実施例２：単核細胞の調製
非追加培地（RPMI-1640）をFlow Laboratories社（バージニア州McLean所在）から入手した。単核細胞［THP-1；ATCC 222：U937］を、補足培地（RPMI-1640、約10％自己血清、約100μg/mLストレプトマイシン及び約100μ/mLペニシリン）に、細胞約５×10６個／mLの最終濃度まで再懸濁した。約１mLの単核細胞をLimbro 24ウエルプレート（Flow Laboratories製；バージニア州McLean）に接種し、５％CO２中で37℃で24時間インキュベートした。
【００４１】
実施例３：アッセイ
高圧液体クロマトグラフィーによる単離及び確認： 実施例１のアンホテリシンＢアリコートを、4.6×150mm ５μのAquaＣ18(商標)カラム〔Phenomenex(登録商標)〕に加え、約70％メタノール：約30％５mMクエン酸ナトリウム（pH7.0)(容量：容量)を使用し、約１ml／分の流量で流して成分を一定組成として分割した。カラム溶出液を約305nm及び約405nmで監視した。溶媒の所定の組成を、約70：30（メタノール：クエン酸ナトリウム）から約75：25（メタノール：クエン酸ナトリウム）に変化させて高純度アンホテリシンＢとその他の成分との最もよい分離を達成した。
【００４２】
生存率アッセイ：アンホテリシンＢ画分を、ヒト細胞生存率の効果について試験した。エリスロシンレッド又はトリパンブルー排除色素試験の他にトリチウム化チミジン取り込みアッセイを使用した。トリチウム化チミジンを使用する細胞毒活性のアッセイは、好気条件下で行った。アッセイすべき物質を、約10％ヒト又はウシ血清を含有するRPMIに希釈し、96ウエル平底組織培養プレートの第一の縦の列に加え、次いでマルチチップピペッターを使用してそれぞれの列の残りのウエルのRPMIに連続的に希釈した。薬剤を含有していないか又は可溶化剤（DMSO、DOC、グリセリン）を含有する対照の列を、これらの希釈剤の濃度がプレートを横断して(across)同様に低下するように同様に処理する。対数増殖相のTHP-1細胞を加え（細胞約106個／ウエル）、プレートをCO2インキュベーター（空気中約５％CO2；約37℃）中で約24時間保持した。この薬剤暴露相の終わりに、プレートを約５分間約200×ｇで遠心分離し、上清をすばやく傾瀉し、次いでウエルに再度PBSを満たした。第三のかかる洗浄の後に、ウエルに再度、薬剤を含有していないRPMIを満たした。プレートをCO2インキュベーターに戻し、残っている生存細胞を24時間増幅相中で増殖させた。次いで、このプレートをPBSで２回遠心洗浄し、そして約10％FBS及び約５mCi/ウエル[メチル-3H]チミジン（New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン）を含有するRPMI-1640（Sigma社製）でウエルを満たし、さらに約１時間インキュベートした。次いで、プレートを、蒸留水洗浄液を使用してガラス繊維紙に収集し、このガラス繊維紙を、Matrix96 ガスイオン化検出-βカウンター（Packard Instrument Co.,、コネティカット州メリデン）を用いてカウントした。それぞれの薬剤暴露を、単一のプレートの三重の列で行った。それぞれのプレートは、可溶化剤（DMSO、DOC、グリセリン）の細胞毒性についての対照と、薬剤を含有していない対照とを含んでいた。ウエル当たりの放射能を、マイクロソフト−エクセルで分析した。アッセイは、薬剤を洗い流した後に新たに合成されたDNA中の放射能の取り込みを測定したことにより、標的細胞死と薬剤誘発運動性の損失とを区別する。最小致死濃度(MLC)を、(一連の１：２連続希釈における)標的細胞全て殺す(取り込みをバックグラウンドレベルまで下げる)薬剤の最低濃度として定義する。それぞれのプレートについての100％対照レベル（殺さない）を薬剤を含有していない対照列のウエル当たりの中央平均放射能と定義する。実験結果を、100％として薬剤を含有していない対照を使用する対照平均の％として表す。このアッセイは、RPMIを10％FBS含有DMEに置き換えることによって及びRPMI/10％FBS中でのトリチウム化チミジンパルス標識時間を一夜インキュベーションまで延長することによって組織培養単層中の哺乳動物細胞を用いた使用に適合する。
【００４３】
生体外注入に関連した反応のアッセイ：  アンホテリシンＢを、Limbro製24ウエルプレートに約０μg/mL及び20μg/mLの最終濃度で加えた。次いで、細胞を約２時間インキュベートした。上清を３回凍結融解した後にそれぞれのウエルから回収し、約−70℃でアッセイまで保存した。試料を酵素結合免疫測定法（Cistron Biotechnology；ニュージャージー州パインブルック）(ELISA)を使用してＩＬ−１βについてアッセイした。この方法は、ＩＬ−１β特異モノクロナール抗体で被覆されたマイクロタイターウエル中で行われる４工程試験を含む。製造業者のデータは、20.0pg/mLのアッセイ感度及びIL-1βについての特異性を示した。ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α又はインターフェロンについて交差反応性はない。アッセイ精度の評価は、イントラアッセイ変動性について約5.3％〜約6.7％の変動係数を実証し且つインターアッセイ変動性について約6.6％〜約8.4％の変動係数を実証する。データは、二重反復アッセイの平均であり、製造業者から供給される標準に基づいてpg/mLで表される。
【００４４】
アンホテリシンＢアッセイ：  免疫アジュバント、カブトガニヘモシアニンと複合化させたアンホテリシンＢを用いて標準免疫処置した後のニュージーランド白ウサギからポリクロナールウサギ抗体を単離した。抗アンホテリシンＢ抗体を、血清を Aminolink 
Affinity-Pak カラム (ImmunoPure Ag/Ab；Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォールド)に通して濾過することにより精製し、最終濃度180μg/mLに希釈し、使用するまで約−70℃で凍結した。アンホテリシンＢ−ウシ血清アルブミン被覆マイクロタイタープレートから光保護膜を取り除くことによってELISAを開始した。1.0μg/mL被覆溶液を空にし、３回十分な洗浄を行った。洗浄溶液は、tweenを含有する標準リン酸緩衝塩溶液からなっていた。次いで、96ウエルプレートを、ウシ血清アルブミンを用いて約37℃で１時間ブロックし、再度３回洗浄した。アンホテリシン溶液(100μl)を加え、次いで抗アンホテリシンＢ抗体(100μl)を加え、次いで約37℃で約１時間インキュベートした。プレートを空にし、３回洗浄した。ブロットを乾燥した後に、緩衝液に１：1000希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗ウサギＩgGを加えた。プレートを再度、約37℃でさらに約１時間インキュベートし、３回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質溶液［Fast-P-9187；Sigma 
Chemical製、ミズリー州セントルイス］のアリコート200μLをそれぞれのウエルにピペットで取り、それぞれのELISAプレートを約10分後に405mnフィルターを使用して光学濃度（Dynatech multiscan；Flow Laboratories、バージニア州McLean）について試験した。最後に、アンホテリシンＢ混入(spiked)試料を、約−70℃で約60日間の保存中に安定性について試験した。2.5μg/mL及び５μg/mLのアンホテリシンＢ濃度で三重反復光保護試料をELISAでアッセイした。
【００４５】
公表データは0.15μg/mLのアッセイ感度を示す。ポリエン構造を有する薬剤、ナイスタチン及びハマイシンについて交差反応性がある。アッセイ精度の評価は、イントラアッセイ変動性について3.0％の変動係数を実証する。データは二重反復アッセイの中央平均値であり、標準としてのApothecon社品を基準にしてμg/mLで表した。
【００４６】
分光光度アッセイ：  ポリエンの分類及び定量化は、それぞれの薬剤の紫外線吸収に基づいて行うことができる。テトラエン類（ナイスタチン、アンホテリシンＡ）の紫外線スペクトルは約290nm、約305mμ及び約318mμに特性ピークを有するが、ヘプタエン類（アンホテリシンＢ）は約360nm、約378nm及び約405nmに特性ピークを生じる。ベールの法則の原理を使用してそれぞれの製剤中のアンホテリシンＡ又はＢの相対量を評価し、ナイスタチンをアンホテリシンＡについての本発明者らのアッセイで使用し、約290nmの光学濃度で試験した。Apothecon社によって製剤化されたアンホテリシンＢは、約360nmの光学濃度で試験した。これらの光学濃度は、アンホテリシンＡ及びＢそれぞれに対する特性により選択される。その他の光学濃度でのピークは、ペンタエン類とヘキサエン類に共有され、これらの溶液中の存在を排除することを困難にする。ペンタエン類の２つの固有のピークが、約325nm及び約333nmの光学濃度で確認された。それぞれのアンホテリシン製剤の試料を、約1.0mLのDMSOに希釈し、次いで約５mLのメタノールでさらに希釈した。この希釈液から400μLのアリコートをさらに約５mLのメタノールに希釈した。デオキシコール酸ナトリウムの希釈液は、光学濃度の測定に影響を及ぼさなかった。約200nm〜約450nmの紫外線吸光度をGilford社製の分光光度計を用いて測定し、ソフトウエア Response II
（Gilford；オハイオ州デートン）で分析した。データは、三重反復アッセイの中央平均値であり、アンホテリシン濃度を、アンホテリシンＢの標準としてApothecon社品を基準として及びアンホテリシンＡの標準としてナイスタチンを基準としてmg／mlで表した。
【００４７】
実施例４：感受性試験
抗真菌剤：  試料薬剤の保存溶液を、保存粉末をジメチルスルホキシド（DSMO）に溶解することにより調製し、次いで約0.165Mモルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)(PML Microbiologicals社、オレゴン州Wilsonville)を用いて約pH7.0に緩衝したRPMI 1640を試用して適切に希釈した。DMSOの最終濃度は、試験溶液の濃度が全溶液組成の約６％未満であるような濃度である。
【００４８】
試験分離株：  １種のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)分離株、American 
Type Culture Collection (ATCC) 株90028が選択される。
【００４９】
DMSO阻害試験：  MIC測定に対するDMSOの影響を、NCCLSブロス微量希釈ガイドライン及び試験分離株C. albicans 90028を使用して試験した。100μLのDMSOとRPMI溶液を、試験されるウエル中のDMSOの濃度が１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、25及び30％であるように微量希釈トレーのウエルに入れた。酵母接種材料を抗真菌感受性試験に記載のようにして調製し、100glをそれぞれのウエルに加えた。前記トレーを加湿暗室中で約35℃で約48時間インキュベートした。MICを対照と比較した際の増殖の可視変化として測定した。DMSO阻害試験は二重反復試験で行った。
【００５０】
抗真菌感受性試験：  試料MICをNCCLSガイドラインに従ってブロス微量希釈により測定した。分離株をジャガイモデキストロース寒天(PDA)プレート（Remei製、米国カンザス州Lenexa）上で２回継代培養した。真菌懸濁物を、約５mLの滅菌約0.9％食塩水に４〜５コロニーを移すことによって調製した。得られた懸濁物を分光光度法を使用して標準化し、次いで0.165M MOPS（PML Microbiologicals、オレゴン州Wilsonville）を用いて約pH7.0に緩衝したRPMI 1640に希釈して0.5×103〜2.5×103CFU/mLの初期接種材料を得た。100μLの接種材料を、RPMI溶液中に連続希釈薬剤100μLを含有するマイクロタイタートレーのそれぞれのウエルに加えた。約0.0039、約0.0078、約0.0156、約0.0312、約0.0624、約
0.125、約0.25、約0.5、約１、約２及び約４μg/mLの試料濃度を得た。このトレーを加湿暗室中で約35℃で約48時間インキュベートした。それぞれのMICを対照と比較した際の80％阻害及び100％阻害として記録した。MIC測定は最小限２回行い、試料薬剤の量がそれを可能にする場合には、さらに追加の設定を行った。最終MICを達成した試料について、MFCを測定することに決定した。MICを48時間で読み取った後に、96ピンレプリケーター
（Boekel製、ペンシルバニア州Feasterville）を用いてそれぞれのマイクロタイタートレーから試料１μLを取り出し、RPMI寒天プレートに塗布した。試料を加湿暗室中で約35℃で約48時間インキュベートした。MFCをプレート上に生物増殖が全くないことによって測定し、MICトレーの対応ウエルとして記録した。
【００５１】
実施例５：統計分析
ANOVAを、Apothecon社品のアンホテリシンＢ製剤とSigma社品のアンホテリシンＢとを比較して行った。標準Ｔ検定を使用してANOVA内で同定された相違を比較した。約0.05のαと、約0.2のβとをこの比較に選択した。Sigma Stat［Jandel；カリフォルニア州 San Dimas］を統計分析に利用した。
【００５２】
実施例６：結果
商業的に製造されたアンホテリシンＢの高圧液体クロマトグラフィーは、多数のアンホテリシン製品と恐らくは細菌／真菌内毒素との同定をもたらす(図Ｉ)。約305nm及び約405nmの光学濃度でのそれぞれのピークの分離は、ポリエン化合物としてのこれらの製品又は内毒素としての同定をもたらした。複数の画分を商業品アンホテリシンＢからのアリコートから単離するか又はSigma社品アンホテリシンＢを約70％メタノール：30％５mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)(容量：容量)を約１mL/分の流量で使用して分割する。画分は、約305nM及び約405nMで監視した4.6×150mm ５μmのAquＣ18（商標）カラムから約12分でカラムから溶出する。この成分が高純度アンホテリシンＢ（アンホテリシンＢＨＰ)である。
【００５３】
生存率アッセイ
細胞の生存率は、アンホテリシンＢＨＰを可溶化させるのに使用されるDMSOの量に直接に関連する。従って、約６％未満の濃度のみを使用した。また、デオキシコール酸塩溶液を使用してアンホテリシンＢＨＰを可溶化した。デキシコール酸塩は、 アンホテリシンＢ約50mg当たり約20.2mg未満の量の対照と比較した生存率の低下を生じなかった。
【００５４】
≦５μg/mLの濃度でアンホテリシンＢＨＰに暴露させたTHP-１細胞の生存率は、同じ濃度の市販品又はSigma社品アンホテリシンＢに暴露させた細胞のviabilityよりも大きい（図II)。
【００５５】
生体外（in vitro）注入に関連した反応のアッセイ
ＩＬ−１β発現によって測定される注入に関連した反応を誘導するためのアンホテリシンＢ製剤それぞれの潜在能力を図IIIに示す。個々のアンホテリシンＢ製剤に暴露させたＴＨＰ−１細胞に関連したＩＬ−１βの発現量を、Apothecon社製剤に対して標準化し、発現％として表した。滅菌水又は脂質に暴露された対照細胞は約120pg/mL以下のＩＬ−１βを発現し、これに対してApothecon社品アンホテリシンＢは、0.1μg/mL及び10.0μg/mLの濃度それぞれについて約300pg/mL及び750pg/mのＬＩＬ−１βの発現を生じる。その他の製剤（Apothecon社製及びSigma社製）に比べてアンホテリシンＢＨＰに応答して発現されるサイトカイニンの量は少ない。この差はApothecon社品アンホテリシンＢと比べて著しい。
【００５６】
アンホテリシンＢアッセイ
保存バイアル中のアンホテリシンＢの定量を、ＩＬ−１βについて約12時間以内に終えた。Apothecon社品アンホテリシンＢは、製造業者によって報告された値の約５％以内で測定できる。ある濃度（５μg/mL）のSigma社品を約39.5±21.05μg/mLで測定した。また、Sigma社品アンホテリシンＢは、試験した全ての試料の製造業者標識の約５％越えることが決定された。これらのデータは、本発明者らのアンホテリシンＢ ELISAによって同定され且つアンホテリシンＢと異なる分光光度パターンを有する数種のポリエン系抗真菌剤がSigma社品アンホテリシンＢ中に存在することを示唆している。
【００５７】
分光光度アッセイ
アンホテリシンＡ、Ｂ及びＢＨＰの定量を分光光度法により終えた。ナイスタチンをアンホテリシンＡを代表するテトラエン系対照として使用し、Apothecon社品をヘプタエン系アンホテリシンＢの標準として使用した。アンホテリシンＡを算出するためにベールの法則(USP方程式)を利用することによって得られた値は、Apothecon社品に対するアンホテリシンＡの量を表す。Ａ又はＢにおける著しい相違は、臨床使用されるアンホテリシンＢ製剤では認めることができなかった（データを示さない）。Sigma社品アンホテリシンＢは、市販品と比べてアンホテリシンＡ化合物を著しく多く含有していた。これらの分光光度分析結果に基づいて、アンホテリシンＢのELISAはポリエン系抗真菌を一つの分類として実際に効果的に測定すると仮定できる。しかし、アンホテリシンＡの存在は、ELISAで測定されたアンホテリシンについて完全な説明ではない。アンホテリシンＢ濃度と、アンホテリシンＡ濃度（ｒ2＝0.8831；ｐ＜0.01）又はインターロイキン−１β濃度（ｒ2＝0.9633；ｐ＜0.01）との間に陽性の相互関係がある。アンホテリシンＢＨＰはポリエン系抗真菌剤と一致したパターンを実証した。
【００５８】
ヘキサエン系以外のこれらのポリエン類のそれぞれについて、固有の吸収最大値の分光光度評価を行った。ヘキサエン類は、ペンタン又はヘプタエンと分光光度ピークを共有する。ベールの法則を使用して、本発明者らはApothecon社品に対するそれぞれのポリエンの量を算出した。ペンタエン（固有のO.D.ピーク＝333）量は、Apothecon品と比べて
Sigma社品において最も高い(約167％)。ヘプタエン（固有のO.D.ピーク＝405）含有量は、Sigma社品（約10.8％）を除く全てにおいて無視し得る(約＜6.7％)。ペンタエン又はヘキサエンに対応する345、363及び386の光学濃度で異なるピークが存在する。これらのピーク（345、363及び386）では、前記の複数の製品における相違は、容易に視覚化できる（図III)。約12分で得られたピークは、ポリエン系抗真菌である。その他の時点で生じるピークもまた、ポリエン類である。
【００５９】
細菌内毒素の混入は、製品同士の間でスイッチする(switching)場合の注入に関連した反応の増大した観察結果を説明できる。1990年代初期にLyphomed Pharmaceuticals社によって製造されたアンホテリシンＢは、汚染されている可能性があると同定された。従って、本発明者らは、内毒素混入について本発明者らの薬剤の試験に精を出した。希釈剤（滅菌水)、培地、試薬及び培養プレートから得た試料を、カブトガニアメーバ様細胞溶解液を利用する製造業者による内毒素についてアッセイした。カブトガニアメーバ様細胞溶解液（LAL：Associates of Cape Cod Inc.製；マサチューセッツ州Woodshole）試験は、大腸菌内毒素標準を3.0pg/mlの低い検出限界で用いた。アンホテリシンＢは、凝血塊形成及び凝血塊付着を分離させることによってLALアッセイを妨害し、この試験を行い且つ解明することを困難にする。臨床使用中に達成できる濃度で、アンホテリシンＢ妨害は最小限であると思われる。2.5μg/mL及び５μg/mLのアンホテリシンＢ製剤のSigma社品及び
Apothecon社品の試験により、内毒素がないことが認められた。
【００６０】
感受性試験
DMSO阻害試験。DMSO阻害試験の結果は、約８％DMSOでは増殖の完全阻害を示し、約７％では部分阻害を示した。約６％DMSOを有するウエルは、対照と目に見える相違を示さなかった。従って、約６％をウエルのDMSOの最大許容量として設定した。可能な低い濃度を使用する場合には、限定された試料サイズによるが、約６％に近いレベルがウエルで最も高い薬剤濃度で使用される場合が多い。
【００６１】
抗真菌感受性試験：  試料＃１の場合を除いて全ての場合において、試験する直前に抗真菌剤を調製した。DMSOを加えた後には、薬剤は完全に可溶化していなかったと思われた。これは暗室中に室温で約48時間置くことを必要とした。次いで、所定量のRPMIを試験管に加えた。明らかな発熱反応が起こり、熱を放出し、残りのペレットを完全に溶解した。次いで、試料を感受性試験で通常に使用した。
【００６２】
その他の制限は、比較的小さいサイズの薬剤試料で生じた。試料２〜７は、二重反復試験で行い、試料１、８〜12は三重反復試験で行った。これらの低い濃度はまた、それぞれの試料について全ての範囲の薬物濃度を試験することを不可能にした。試料３及び６は、１μg/ml程度の高い濃度でのみ試験し、試料２、５及び７は最大約２μg/ml まで試験した。最後に、前記で緒論じたように、試料は通常利用される濃度よりも高い濃度を必要とした。
【００６３】
表３
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)に対するHPLC画分の活性
0005170940.tif 000004
１  カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) B311に対して試験した。
【００６４】
２  カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ATCC90028（NCCLS推奨株）に対して試験した。
【００６５】
MIC＝増殖を80％阻害する濃度(μg/ml)
MFC＝細胞全てに対して殺真菌性である（増殖が寒天プレート上で認められない）濃度(μg/ml)細胞
NT＝不活性により試験しなかった
NA＝活性ではない
AmB＝アンホテリシンＢ高純度
時間＝分で表した経過時間
ＭＩＣデータは３回の試験の平均を表す。
【００６６】
中央平均感受性結果を表３に示す。符号“＞”を伴う結果は、前記の試験濃度で又はそれ以下で阻害が認められないことを表す。試料＃２は、80％の低下がこのウエルで認められることを意味するMIC80について“２”を示す。表に示さなかったが、試料＃２は２μg/mLで若干の低下を生じる。
【００６７】
本発明において本発明の範囲又は精神から逸脱することなく種々の部分変更及び改変をなし得ることは当業者には明白であろう。本発明の別の態様は、明細書及び本明細書に開示された発明の実施の考慮により当業者には明らかであろう。明細書及び実施例は単なる例とみなされることを意図するものであり、本発明の範囲及び精神を限定することを意図するものではない。
【００６８】
特に明示しない限りは、明細書及び特許請求の範囲に使用した成分の量を表す全ての数値、反応条件のような性質などは、全ての場合において用語“約”で修飾されると理解されるべきである。従って、特に示されない限りは、明細書及び特許請求の範囲に挙げた数値パラメーターは、本発明によって決定されると所定の性質に応じて変化し得る近似である。
【００６９】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメーターが近似値であるにも関わらず、実験又は実施例で挙げた数値はできる限り正確であると報告される。しかし、数値は、それぞれの試験装置に認められる標準偏差から必然的に生じるある誤差を本質的に含む。
【００７０】
本出願全体を通じて、種々の刊行物が参照される。このような参考文献は全て本明細書に参考として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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