(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の検出対象を検出するためのバイオセンサーであり、以下の構成要素、すなわち：
毛細管現象により充填されるように調節されたフィリングチャンバー、
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを有する反応チャンバーであり、前記プローブコンジュゲートが前記固相化結合部位と結合するように調節された結合パートナーを有し、前記固相化結合部位が少なくとも一つの磁気ビーズ上に位置し、前記固相化結合部位および前記プローブコンジュゲートが前記反応チャンバーの異なる表面上に位置する、反応チャンバー、
内部の電気化学的反応を検出する電極を有する検出チャンバー、及び
前記反応チャンバーと前記検出チャンバーとの間の液体流路、
を有し、前記液体サンプル中の検出対象の有無が、前記反応チャンバー中で結合したプローブコンジュゲートの量の変化となって表れ、前記変化が前記検出チャンバー中で電気化学的反応により検出可能である、バイオセンサー。
【請求項２】
前記固相化結合部位が抗原であり、前記結合パートナーが抗体である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記固相化結合部位が抗体であり、前記結合パートナーが抗原である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記反応チャンバーの毛細管のサイズが、前記フィリングチャンバーのサイズより小さい、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記検出チャンバーが通気口を有する、請求項１から４のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記通気口が前記バイオセンサーの外部層の貫通により開けることができる、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記通気口が前記バイオセンサーの外部層の部分を除去することにより開けることができる、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記通気口がミシン目に沿って破ることにより開けることができる、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記反応チャンバーが大気に向けて開口部を有する、請求項１から８のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
磁石を更に有する、請求項１から９のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記磁石が配置され、それにより、前記反応チャンバーに前記液体サンプルが添加された後に少なくとも一つの磁気ビーズが移動し、前記プローブコンジュゲートとの緊密な接触がなされる、請求項１０に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記プローブコンジュゲートが酵素を有する、請求項１から１１のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
メディエーター及び酵素基質を更に有する、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
液体サンプル中の検出対象を検出する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち：
請求項１から１３のいずれかに記載の前記バイオセンサーにサンプルを移送する工程、
前記反応チャンバーにおいて固相化結合部位及びプローブコンジュゲートの間での反応を進行させる工程、
前記サンプルを前記検出チャンバーに移動させ、プローブコンジュゲートのレベルを電気化学的に検出する工程であり、前記サンプルでの前記検出対象の存在が前記検出チャンバーにおいて検出されたプローブコンジュゲートの量の増減として表れる工程、を有する、方法。
【請求項１５】
前記固相化結合部位が標的抗原を含み、前記プローブコンジュゲートが前記標的抗原と結合するよう調節された抗体を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブコンジュゲートが酵素を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが前記反応チャンバーから前記検出チャンバーに毛細管現象により移動する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルの前記移動の工程が、通気口を開けることを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出チャンバーから受けた電気的シグナルに基づいて、前記サンプル中の標的抗原の量の定量を行う工程を更に有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち：
第１層を提供する工程、
前記第１層の一部を除去する工程であり、それによりフィリングチャンバー部分、反応チャンバー部分、及び検出チャンバー部分を形成する工程、
第２層を提供する工程、
前記第２層の第１面を前記第１層の第１面に取り付ける工程、
前記フィリングチャンバー部分にわたって広がりかつ前記フィリングチャンバー部分と実質的に重なる前記第２層の一部を除去する工程であり、前記第２層が前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって更に広がる工程、
第３層を提供する工程、
前記第３層の第１面を前記第１層の第２面に取り付ける工程であり、前記第３層が、前記フィリングチャンバー部分、前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって広がる工程、
密封層の第１面を前記第２層の第２面に取り付ける工程であり、それにより前記第１層、前記第２層、前記第３層及び前記密封層を含む前記の層が、複数の外部表面を有するストリップを形成する工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち：
第１層及び第２層を提供する工程、
前記第１層の少なくとも一部を前記第２層の第１面に取り付ける工程であり、それによりフィリングチャンバー部分、反応チャンバー部分及び検出チャンバー部分を形成する工程、
第３層を提供する工程、
前記第３層の第１面を前記第１層の第２面に取り付ける工程であり、前記第３層が、前記フィリングチャンバー部分、前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって広がる工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程、及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。
【請求項２２】
請求項１から１３のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち：
第１層を提供する工程、
第２層を提供する工程、
前記第２層の第１面を前記第１層の第１面に取り付ける工程、
第３層を提供する工程、
前記第３層の第１面を前記第１層の第２面に取り付ける工程、
前記第１層の一部を除去する工程であり、それによりフィリングチャンバー部分を形成する工程、
前記第１層の一部を除去する工程であり、それにより反応チャンバー部分を形成する工程、
前記第１層の一部を除去する工程であり、それにより検出チャンバー部分を形成する工程であり、それにより前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分が前記フィリングチャンバー部分との間で液体の移動のために連結される工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、
それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程、及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、ＵＳ特許出願番号第１０／１０５，０５０（発明の名称：「直接的イムノセンサー解析」（出願日：２００２年３月２１日））、及びＵＳ特許出願番号第１０／８３０，８４１（発明の名称：「イムノセンサー」（出願日：２００４年４月２２日））の一部継続出願に係る優先権を主張し、ここに本明細書の一部を構成するものとして上記の内容を援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術において、イムノアッセイを基本とするシステムを有する生物医学的センサーはこれまで、多種にわたる検出対象の存在及び／又は濃度を解析する手段として用いられてきた。イムノアッセイは一般に二つのカテゴリーに分類することができる。すなわち、競合的アッセイ及びサンドイッチアッセイである。競合的アッセイにおいては、テストサンプル中のその抗原は抗原−プローブ複合体（一般にはレポーター複合体と呼ばれる）と混合され、前記混合物は前記抗体との競合的結合に供される。前記プローブには、放射性同位元素、蛍光物質又は発色団が使用される。また、サンドイッチイムノアッセイにおいては、テストサンプル中の前記抗原は前記抗体と結合し、その後二次抗体−プローブ複合体が前記抗原と結合する。ただし、これらの先行技術に係るアッセイ方法では、通常一回又は複数回の洗浄工程が必要となる。また前記洗浄工程の存在により、前記アッセイの工程が複雑なものとなり、更にはバイオハザードとなる物質を含有する廃液が生じる。
【０００３】
通常、イムノアッセイにより、ユーザーは、一方では簡素な視覚的検出（例えば色の変化）による定性的な試験結果（ｙｅｓ／ｎｏ）を、また一方では抗原濃度として表れる定量的な試験結果を得ることができる。ただし多くの定性的な方法は、例えばシンチレーションカウンター（放射能の測定）、分光光度計、蛍光分光測定器（特許文献１）、表面プラズモン共鳴測定器（特許文献２）等の高価な装置類が必要となる。それゆえ、安価で簡便なイムノアッセイであり、家庭や野外での使用にも適用可能なイムノアッセイを開発することは有益なことである。なお、そのようなバイオセンサーは、遠心分離、希釈、ピペッティング、洗浄又は時間計測の工程が不要であり、更に廃棄物を最小化し得るものが望ましい。
【特許文献１】米国特許第５，１５６，９７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９６５，４５６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８２３，７５０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明においては、検出対象を検出及び／又は定量するためのバイオセンサー装置及びそれを用いた検出及び／又は定量方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一つの実施態様において、使い捨てのアッセイ装置が、液体サンプル中の検出対象を検出する目的で提供される。前記装置は反応チャンバーを有し、そこには固相化結合標的及びプローブコンジュゲートが含まれる。サンプルが前記反応チャンバーに添加されると、前記固相化結合標的、プローブコンジュゲート、及び／又は（存在する場合には）検出対象の間での結合反応が生じる。一つの代表的な実施態様において、前記検出対象が存在する場合には、前記固相化結合部位に結合するプローブコンジュゲートの量が変化する。この変化は検出チャンバーにおいて検出することができる。
【０００６】
前記固相化結合標的、プローブコンジュゲート及び検出対象には、多様な種類の公知のリガンドを含めることができる。例えば、当業者は前記固相化結合標的、プローブコンジュゲート及び検出対象に抗原又は抗体、ホルモン又は神経伝達物質、受容体、基質又はアロステリックエフェクター及び酵素、レクチン及び糖、ＤＮＡ又はＲＮＡ構造体、例えばアプタマー及びそれらの結合種（他のＤＮＡ又はＲＮＡ種又は結合タンパク質を有する）、タンパク質、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンシステム、酵素及びその基質及び阻害剤、脂質結合システム、並びにそれらの組み合わせを含めることができる。ただし本願明細書においては、記載する前記装置及びその使用方法の理解を促進するため、免疫学的リガンドのみを以降に記載し、また前記装置をイムノセンサー又はバイオセンサーと記載する。
【０００７】
一つの実施態様において、上記した前記検出チャンバーは、電極及び電気化学的試薬を有する。例えば、前記検出チャンバーにおける電気化学的反応は、前記反応チャンバーにおいて結合するプローブコンジュゲートの、前記標的抗原の存在による量の増減を測定するのに用いることができる。また、前記電気化学的反応により、前記検出チャンバーにおける前記プローブコンジュゲートの濃度に基づき、検出対象（例えば標的抗原）の濃度を測定するのに用いることができる。
【０００８】
一つの実施態様において、前記固相化結合部位は、標的抗原に結合するよう調節された抗体を含み、前記プローブコンジュゲートは、結合した標的抗原に結合するよう調節された抗体を有する。標的抗原が液体サンプル中に存在する場合、前記固相化結合部位は前記標的抗原の一つの側面に結合し、前記プローブコンジュゲートは前記標的抗原の他の側面に結合することができる。前記液体サンプル中の標的抗原の存在により、前記反応チャンバーにおける結合するプローブの量の増加、及び前記検出チャンバーにおけるプローブコンジュゲートの量の減少が生じる。
【０００９】
他の実施態様において、前記固相化結合部位は標的抗原を含み、前記プローブコンジュゲートは前記標的抗原に結合するよう調節された抗体を有する。前記反応チャンバーにサンプルが添加されたとき、標的抗原が存在する場合には、それが前記プローブコンジュゲートと結合する。その結果、前記液体サンプルの標的抗原の存在により、前記反応チャンバーにおける前記固相化結合部位に結合するプローブコンジュゲートの量の減少、及び検出チャンバーへ移動することが可能な非結合のプローブコンジュゲートの量の増加が生じる。結合したプローブコンジュゲートの減少は、前記検出チャンバーにおいて電気化学的反応により検出及び／又は定量することができる。一方、前記固相化結合部位は抗体を有し、前記プローブコンジュゲートは前記標的抗原を有することもできる。前記液体サンプルにおける標的抗原の存在は、同様に、前記反応チャンバーにおける結合したプローブコンジュゲートの量の減少を生じさせる。
【００１０】
一つの実施態様において、前記固相化結合部位及び前記プローブコンジュゲートは、前記反応チャンバーにおいて混合（ｉｎｔｅｒｍｉｘｅｄ）させることができる。あるいは、前記固相化結合部位及び前記プローブコンジュゲートは別々に調製することができる。例えば、固相化結合部位は前記反応チャンバーの表面で乾燥させた磁気ビーズの上に配置することができる。液体サンプルが前記反応チャンバーに添加されたとき、磁場により前記磁気ビーズ及び固相化結合部位を前記検出チャンバーに移動するのを防止することが可能となる。
【００１１】
本願明細書にて開示される他の実施態様において、液体サンプル中の標的抗原の検出方法が提供される。前記方法は、反応チャンバー及び検出チャンバーを有するバイオセンサー装置にサンプルを移送する工程を含めることができる。前記サンプルは、前記反応チャンバー内部に存在する固相化結合部位及びプローブコンジュゲートと反応させることができる。前記サンプルはその後、検出チャンバーに移動する。前記方法は更に、前記検出チャンバーにおいて前記プローブコンジュゲートを電気化学的に検出する工程を有する。前記検出工程により、ユーザーは、前記検出チャンバーにおいて検出されるプローブコンジュゲートのレベルに基づき、前記サンプル中での前記標的抗原を解析することができる。前記方法は更に、前記検出チャンバーから受ける電気的シグナルに基づいて前記サンプル中の標的抗原の量を定量する工程を含めることができる。
【００１２】
本発明は更に詳細に、添付の図を参照しつつ、以下の詳細な説明により理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願明細書において開示するのは、バイオセンサー装置及びその使用方法である。一つの実施態様において、前記センサーは反応チャンバー及び検出チャンバーを有する。前記反応チャンバー内に設置されるのは、目的とする検出対象又はそれに類する物質と結合する固相化結合部位である。また、このチャンバー内において、前記検出チャンバーにて検出され、かつ、前記固相化結合部位と結合することのできる種とのコンジュゲート又は結合が可能な、プローブ類が含まれる。これらは以下プローブコンジュゲートと称する。前記プローブコンジュゲート及び前記固相化結合部位は、前記サンプルにおける目的とする検出対象の存在により、前記プローブコンジュゲート及び前記固相化結合部位の相互作用が調節される。例えば、存在する場合、前記検出対象は前記プローブコンジュゲートが前記固相化結合部位と結合するのをブロックすることができる。あるいは、前記検出対象は前記プローブコンジュゲートと結合するための部位を提供することができ、それらにより結合したプローブコンジュゲートの量を増加させる。両方の実施態様において、検出対象の存在により前記反応チャンバーにおける前記プローブコンジュゲートの結合量が調節される。
【００１４】
前記反応チャンバーを設置することにより、前記プローブコンジュゲートの結合反応が十分行われた後、前記反応チャンバーからの液体が前記検出チャンバーに移される。すなわちそれによりフリーのプローブコンジュゲートを移動させ、結合したプローブコンジュゲートを後に残す形となる。その後、前記検出チャンバーにおいて、前記フリーのプローブコンジュゲートの量が検出される。例えば、前記検出チャンバーに存在する電極を用い、前記検出チャンバーにおけるプローブコンジュゲートのレベルを電気化学的に検出することができる。電気化学的反応により、検出対象の有無の解析、及び／又は前記検出チャンバー中の前記プローブコンジュゲートの量に基づく前記検出対象の濃度の解析が可能となる。
【００１５】
図１及び２に示すバイオセンサー２０の第一の実施態様は、電気化学的セルを有する検出チャンバー２８及び固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを有する反応チャンバー２２を有する。前記検出チャンバー２８及び反応チャンバー２２は、電気的に抵抗のあるスペーサー原料３６のシートを通って伸びているアパチュアを形成することにより調製することができる。前記アパチュアは、前記反応チャンバー２２及び検出チャンバー２８両方の側壁、またチャンバー２２、２８間のサンプル流路３８を規定する態様で形成される。また、前記アパチュアを反応チャンバー２２の基部の縁２４からセンサー２０の縁３７にかけて伸ばすことにより、サンプル注入口２５が形成される。一つの実施態様において、前記シート３６の厚さは前記反応チャンバー２２及び検出チャンバー２８の高さを決定し、また前記チャンバーは同じ高さを有する。この実施態様においては、前記検出チャンバーにおける前記毛細管力は、前記反応チャンバーのそれよりも大きくなければならない。このとは、前記反応チャンバー及び／若しくは検出チャンバーの表面を修飾すること、又は前記検出チャンバーに、本願明細書にて記載するような充填材料を添加することにより可能となる。
【００１６】
他の実施態様において、反応チャンバー２２の高さは、検出チャンバー２８よりも高い。検出チャンバー２８より高さの高い反応チャンバー２２は、例えば、多層の内部シート３２、３４、３６及び／又は外部の密封シート４２、４６と共に積層することにより調製することができる。例えば、図２において、センサー２０の中間シート３６は、上記のように反応チャンバー２２及び検出チャンバー２８の側壁を形成するアパチュアを有する。中間シート３６はその後、一つ又は複数の追加的な層３２、３４との間にサンドイッチされる。なお、前記追加的な層３２及び３４は、反応チャンバー２２とのみ対応するアパチュアを形成する。検出チャンバー２８については、層３２及び３４により前記チャンバーの端部壁６０、６２（すなわち上部及び底部の表面）が決定される。この実施態様において、前記検出チャンバーの前記端部壁６０及び６２は電極５４及び５２を含み、連結部品を介して計測回路と電気的に連結可能である。前記電極は以下に詳細に説明する。
【００１７】
一つの実施態様におて、前記電極５２及び５４は、連結端部６６を通ってメーター（図示せず）と電気的に連結できる態様で設置することができる。前記連結端部により、メーター（図示せず）は、導電性のトラック（図示せず）を介して前記検出チャンバー２８中の前記電極５２及び５４と連結される。前記結合領域６６と結合した前記メーターは、前記検出チャンバー２８における前記電極５２及び５４の間に電位を加え、電気化学的反応により生じた前記電気的シグナルを検出することができる。
【００１８】
使用に際し、ユーザーは最初に、前記センサーの第一のチャンバーである反応チャンバー２２に、サンプル注入口２５からサンプルを注入する。前記サンプルは毛細管現象又はウィッキングにより前記反応チャンバーに引き入れられる。前記反応チャンバーは通気口２６を有し、それは大気に向かって開いており、それにより前記サンプルにより置換された空気を外気に逃がすことができる。サンプルは前記反応チャンバーの通気口２６に到達するまで前記第一のチャンバーに引き込まれ、そこで注入が停止する。前記反応チャンバー２２の容量は、前記検出チャンバー２８の容量と比較し少なくとも同等、望ましくはより多い容量にて調節することができる。
【００１９】
図１における破線で描かれた円はアパチュア３０を示し、それは層３２、３４及び／又は３６を貫通するが、層４２及び４６を貫通しない。層４２及び４６は最初から貫通されていないため、前記検出チャンバー２８において大気に向けて開口しているのは反応チャンバー２２から開口しているサンプル流路３８のみである。それゆえ、反応チャンバー２２がサンプルで満たされたときは、空気は検出チャンバー２８に閉じ込められ、それによりサンプルがそこに浸入するのを実質的に防止する。前記検出チャンバー２８に向かって開いている前記開口部３８に前記サンプルが接触した後、前記開口部３８の反対側の端と接触するまでの間、サンプルは前記検出チャンバー２８に入ることができる。しかしながら、一旦前記サンプルが前記開口部３８から前記検出チャンバー２８全体に浸透した場合には、それ以上の検出チャンバー２８への浸入は生じない。
【００２０】
大気に続く通気口５６の前記開口部は、前記検出チャンバー２８に閉じ込められた空気を逃がすためのもので、それにより検出チャンバー２８を反応チャンバー２２からの反応後のサンプルにより満たすことができる。通気口５６は、例えば、前記装置の外部の層を突き刺すこと、装置の外部の層を除去すること、及び／又は装置の一部を破壊することなど、様々な方法により開口することができる。
【００２１】
前記通気口が開口されたとき、前記反応サンプルは、前記反応チャンバー２２と比較し大きな前記検出チャンバー２８の毛細管力により、前記検出チャンバー２８に引き込まれる。一つの実施態様において、そのように増加した毛細管力は、前記検出チャンバー２８の表面の適切なコーティング、又は、より望ましくは反応チャンバー２２のそれと比較してより小さい検出チャンバー２８の毛細管の長さを選択することにより、得ることができる。この実施態様において、前記毛細管の距離は前記チャンバーの最小のサイズにより決定される。当業者であれば、前記反応及び／又は検出チャンバーにおける前記毛細管力を、構成要素の数を変化させることにより最適化することができる。薄いチャンバーにおける毛細管力は、例えば、特許文献３において考察されており、またその内容も本発明において援用されている。
【００２２】
第二の代表的な実施態様として、三つのチャンバーを有するバイオセンサー１２０を図３から４Ｄに図示する。前記イムノセンサーは、反応チャンバー１２２及び検出チャンバー１２８に加えて、フィリングチャンバー１０７を有することができる。センサー１２０は上記のような、例えば、密封層１４２、下層１３４、スペーサー層１３６及び上層１３２を有する多層から形成することができる。一つの実施態様において、各層は絶縁性原料を含み、一方上及び下層１３２、１３４は、追加的に下記に詳細に述べるような導電性フィルムを有することができる。前記センサーにおいて異なる地点において前記の層を部分的に除去することにより、フィリングチャンバー１０７、反応チャンバー１２２及び検出チャンバー１２８が形成される。更に、前記上及び下層１３２、１３４における導電性フィルムの露出部分において、電気化学的反応のための電極１５２、１５４、並びに電気的連結領域１０１、１０２、１０３が、前記センサーとメーターとの電気的連結のために設置される。
【００２３】
フィリングチャンバー１０７は、患者又はユーザーからのサンプルを受け、他の二つのチャンバーに移送するためのサンプルを貯蔵する容器としての役割を果たす。反応チャンバー１２２及び検出チャンバー１２８は、フィリングチャンバー１０７との間で液体の移動のために連結されている。また、チャンバー間での液体の移動を促進するため、検出チャンバー１２８は、予め閉ざされている通気口１３０を有することができる。サンプルが前記反応チャンバーにおいて反応した後、通気口１３０が開かれることで検出チャンバー１２８内の空気が前記通気口を通って外に排出され、それにより液体が反応チャンバー１２２から前記検出チャンバーに入ることができる。通気口５６について上述したように、通気口１３０は前記装置の貫通、外部層の除去及び／又は前記装置の部分的な破壊（すなわちミシン目に沿った破砕）などの様々な方法により開口することができる。
【００２４】
前記センサーは、下部電極１５２との電気的連結を可能にする電気的連結部１０１、及び上部電極１５４との電気的連結を可能にする電気的連結部１０２、１０３を有することができる。点線１０６は、上部層１３２上に上部電極１５４を規定する、導電性フィルムの分断箇所を示す。前記分断箇所は、前記導電性フィルムが敷設されたときのパターン処理、又は製造時の前記分断の作成により設けることが可能である。前記分断箇所は、フィルムの引き剥がし、フィルムの部分的引き剥がし、フィルムの化学的エッチング、フィルムのレーザーによる剥離又は公知の他の方法に供することが可能である。前記導電性フィルムの分断箇所１０６は更に、ストリップの活性電極領域を、前記検出チャンバーにコーティングされた導電体を前記反応チャンバーにコーティングされたそれから電気的に隔離する役割を果たす。これにより、いかなる電気的シグナルも前記反応チャンバーに存在する前記導電性フィルムを流れることがなく、試験結果に影響を与えるような事態も防ぐことができるため、有利である。
【００２５】
センサー１２０はまた、接触部１０３を有することができ、それはユーザーが前記導電性フィルムの部分を反応チャンバー１２２と電気的に接触させることを可能にする。反応チャンバー１２２にサンプルが満たされると、接触部１０３のモニタリングによりシグナルの検出が可能となり、それは前記ストリップが十分に満たされ、及び試験が開始可能であることをメーターに対して示す。図３から４Ｄに示す本発明の前記実施態様を用いてこれを達成するために、接触部１０１において前記下部導電性フィルムとの電気的連結、及び接触部１０３において前記反応チャンバーに存在する前記上部導電性フィルムとの電気的連結を構成することができる。その後電位を前記二つの連結部（１０１、１０３）間にかけ、電流、電圧及び／又は電気的抵抗をモニターし、前記反応チャンバーにサンプルが添加されたときの状態を解析する。この電位は、ＤＣ電位、又はＡＣ電位若しくは極性を変化させる一連の矩形波電位のパルスのように時間と共に変化する電位が使用可能である。前記電位負荷の結果としての電流、又は予め決定された電流を流すのに必要な電圧をモニターすることにより、前記反応チャンバーの前記導電性フィルムが塗れ始めたことを検知することができる。
【００２６】
電気的に下層１３４と接触し、前記下部導電性フィルムを乗せるための連結領域１０１は、下層１３４をスペーサー層１３６及び前記上部層１３２の端を越えて外に延ばすことにより形成される。接触領域１０２は、層１３４及び１３６の一部を除去し、上部層１３２の一部を露出させることにより形成される。接触領域１０３は同様に下層１３４及びスペーサー層１３６の一部を、図４Ｄ（図３の断面Ｄ−Ｄ’）のように除去することにより形成される。
【００２７】
フィリングチャンバー１０７は、下層１３４及びスペーサー層１３６の一部を除去することにより形成され、ただし上部層１３２及び密封層１４２は元のままである。密封層１４２は層１３４の外部表面と接着しており、また層１３４及び１３６の切除された部分の側面並びに層１３２を伴って空間を構成し、サンプルを毛細管現象により引き入れることができる毛細管チャネルを形成する役割を果たす。このチャネルを図４Ａ（図３の断面Ａ−Ａ’）に示す。
【００２８】
反応チャンバー１２２は前記スペーサー層１３６の一部を除去し、層１３４及び１３２を元のままとすることにより形成される。これは毛細管空間を形成し、そこでは毛細管スペーサーの高さが前記フィリングチャンバー１０７の高さよりも低くなっている。これにより、前記フィリングチャンバー１０７から前記反応チャンバー１２２へ液体を引き入れる毛細管現象による毛細管力が生じる。また、前記反応チャンバーが低いことにより、前記反応チャンバーにおける試薬の混合が比較的早くなる。一つの実施態様において、反応チャンバー１２２は、前記ストリップの側端部において開口しており、それにより、液体が前記反応チャンバーに入っている間、空気を通すことができる。
【００２９】
検出チャンバー１２８は、前記反応チャンバー１２２と同様、前記スペーサー層１３６の一部を除去し、前記層１３４及び１３２を元のままとすることにより形成される。当初、前記検出チャンバー１２８は一端において前記反応チャンバー１２２に向けて開口しており、他の開口部は存在しない。
【００３０】
通気口１３０は、前記検出チャンバー１２８の位置の上部層１３２（又は下層１３４）を一部除去又は貫通することにより形成される。図４Ｂ（図３の断面Ｂ−Ｂ’）に示す層１４６は、前記ストリップの上部面に積層され、前記開口部を密封する。あるいは、下層１３４の部分が除去される場合には、密封層１４２を通気口１３０を開けるために貫通／除去してもよい。
【００３１】
反応チャンバー１２２に液体サンプルが入ると、充填工程の一部として、それが検出チャンバー１２８の開口部との橋渡しとなる。すなわち、液体が検出チャンバー１２８の前記開口部を横切る形で反応チャンバー１２２に入ると、検出チャンバー１２８に空気が閉じ込められ、液体が更に入り込むのを防ぐ。これにより、前記の結合反応が進行する間、反応チャンバー１２２に液体が保持される。反応チャンバー１２２において起こりうる全ての結合反応が十分行われるのに要する一定時間が経過した後、層１４２又は１４６は何らかの手段により貫通（又は除去／破砕）され、検出チャンバー１２８から空気が排出され、それにより液体が反応チャンバー１２２から検出チャンバー１２８に移動する。検出チャンバー１２８の断面のサイズは、毛細管現象により前記検出チャンバーに液が浸入することができる程度のサイズである。
【００３２】
当業者であれば、本願に記載のイムノセンサーが他の代替可能な様々な構成（例えば、センサーの形態、チャンバーの数、電極の構成及び／又は電気的接触部の位置関係）を採るべく適宜改変することが考えられる。また、例えば代替的なセンサーの実施態様の例証ともなる他のセンサー装置が米国特許出願（発明の名称：「電気化学的解析のための方法及び装置」）として同日に出願され、また本発明においてもその内容が援用されている。更に、当業者であれば、前記の例証のような、通気口を用いてチャンバー間の液体の流れを制御するセンサーではなく、液体を移送する他の実施態様を想起するであろう。例えば、前記反応チャンバー及び前記検出チャンバーの間に物理的バリアを設置し、それを除去又は開放することによりチャンバー間の液体の流れを生じさせることができるし、更に本願において記載された前記センサーは、前記装置の間で液体を移動させるためにポンプ装置を採用することができる。
【００３３】
本発明のイムノセンサーは、上記のように電極５２、１５２及び５４、１５４を有する。ある実施態様において、電極構成は、前記の図において図示するように対向する位置関係以外にも、例えば、左右の位置関係又はオフセットの位置関係も採ることができる。前記電極は同一サイズ、実質的に同一のサイズ、又は異なるサイズ及び／若しくは異なる形態を採ることができる。前記電極は同じ誘電率の素材、又は異なる材料により構成されることができる。電極構成、スペースの設け方、並びに構成又は組み立てについての他の形態への変更は当業者であれば容易に行うことができる。
【００３４】
一つの実施態様において、前記電極は平行に対向する位置関係において、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、又は２００ミクロン以下の間隔で、より望ましくは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ミクロンから約７５、１００、１２５、１５０、又は１７５ミクロンの範囲の長さの間隔で設置される。但し、望ましい実施態様においては、前記電極間の間隔は５００ミクロン以上、例えば６００、７００、８００、９００、又は１０００ミクロン以上、あるいは１、２、３、４、又は５ｍｍ以上である。
【００３５】
前記電極の少なくとも一つを、センシング電極、すなわち抗酸化的条件の場合には一定量の還元剤に感受性であり、又は酸化的条件の場合には酸化剤に感受性である電極にすることができる。ここにおいて、前記センシング電極の前記電位が、存在する検出対象のレベルの反映として表れる電位差センサーの場合には、対照電極として機能する第二電極が存在し、それは対照電位を供給する役割を果たす。前記センシング電極の電流が、存在する検出対象のレベルを反映する電流センサーの場合には、少なくとも一つの他の電極が存在し、それは前記電気的回路を完成させる対極電極として機能する。この第二電極はまた、対照電極として機能することができる。あるいは、追加的電極（図示せず）を対照電極として機能させることもできる。
【００３６】
一つの実施態様において、電極５２、１５２、５４及びｌ５４を規定する前記導電性フィルムは、前記イムノセンサーの表面に接着剤により接着することができる。望ましい接着剤としては、例えば、熱活性型接着剤、圧力感受性接着剤、熱硬化型接着剤、化学的硬化型接着剤、熱溶融接着剤、熱流動型接着剤、及びそれらに類するものが適用可能である。その他の実施態様して、前記の導電性フィルムは、電気抵抗を有するシートを、適度な導電性素材、例えば、プラチナ、パラジウム、炭素、酸化インジウム、酸化スズ、インジウム／スズ酸化物の混合物、金、銀、イリジウム又はそれらの混合物、並びにそれらに類するものによりコーティング（例えば、スパッタリング又はスクリーンプリント）することにより調製する。前記電極として適する材料は、前記センサー２０、１２０に存在する試薬と相性の良いものが望ましい。電気的に抵抗のある望ましい材料としては、例えば、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、それらの混合物並びにそれらに類するものが挙げられる。
【００３７】
前記イムノセンサーにおいて使用される試薬、例えば、固相化抗体／抗原、プローブ結合抗原／抗体、バッファー、メディエーター、酵素基質、並びにそれらに類するものは、前記反応チャンバー２２、１２２の壁面、若しくはチャンバー内部、マトリックス内部に含まれる独立の支持体の上において支持され、又は自己支持も可能である。前記試薬を前記チャンバーの壁面又は前記電極上に支持する場合、前記試薬は公知の印刷技術、例えば、インクジェットプリント、スクリーンプリント、リソグラフ及びそれらに類する技術により施すことができる。その他の実施態様において、前記試薬を有する溶液をチャンバー内部の表面に施し、その後乾燥させることにより行うことも可能である。
【００３８】
本願明細書に記載の前記イムノセンサーは、他の実施態様において、免疫学的物質及び／又は電気化学的試薬は、一つ又は複数の前記センサーに設けられた独立の支持体に支持及び／又は含有させることができる。望ましい独立の支持体としては、メッシュ材料、波打たないシート材料、繊維状のフィリング材料、微多孔性膜、焼結された粉末、及び／又はビーズが含まれるが、それらに限定されない。独立の支持体を用いる利点としては、表面領域の拡大が挙げられ、それにより前記反応チャンバー２２、１２２に含まれる固相化結合部位、及びプローブコンジュゲートの増加につながる。一つの実施態様において、固相化抗体及び／又はプローブコンジュゲートは、支持材料上にて乾燥させ、その後前記反応チャンバーに設置される。あるいは、前記固相化結合部位又はプローブコンジュゲートのいずれかが、支持材料上に施され、他の構成要素は前記反応チャンバーの壁面に支持される。また、他の実施態様において、前記反応チャンバーの壁面は多孔質であり、そこに前記固相化結合部位及び／又はプローブコンジュゲートが施される。これは、微多孔性膜を用いて前記反応チャンバーの壁面を形成すること、及び前記反応チャンバーの周囲の膜を圧着し、反応に使用される領域の外にサンプルが漏洩するのを防止することによりなされる。
【００３９】
独立の支持体の材料として望ましいメッシュ材料、波打たないシート材料、及び繊維状の充填材には、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン、セルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルフォン、それらの混合物及びそれらに類するものが挙げられる。望ましい微多孔性膜は、ポリスルフォン、ポリビニリデンフルオライド（２フッ化）、ナイロン、セルロースアセテート、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、それらの混合物、及びそれらに類する重合体材料から調製することができる。
【００４０】
一つの実施態様において、前記固相化結合部位及び／又はプローブコンジュゲートは、ビーズ上に固定される。そのようなビーズには、重合体材料、例えばアガロース、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸等が使用可能であり、磁性体材料（例えばガンマＦｅ２Ｏ３−Ｆｅ３Ｏ４）を封入するものが望ましい。前記ビーズの材料は、抗体の支持体として機能するような材料から選択されるのが望ましい。望ましいビーズは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のような市販の材料を有することができる。あるいは、磁石を使用することも可能であり、それにより、前記反応チャンバーにおいて前記磁気ビーズを固定し、それらが前記検出チャンバーに移動するのを防止することができる。例えば、前記固相化結合部位は前記反応チャンバー内部に設置された磁気ビーズ上に設置することができる。
【００４１】
（抗原の有無を判定するための前記センサーの使用）
上記のとおり、センサー２０、１２０は、固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを有する。なお、以下の記載は図２のセンサー２０を参照しながらなされるものだが、センサー１２０にも同様であることは言うまでもない。
【００４２】
一つの実施態様において、固相化結合部位４４は、検出される抗原に対する抗体であり、前記プローブコンジュゲート５０は、検出される前記抗原又はシュードな抗原と結合した酵素である。
【００４３】
前記抗体４４は反応チャンバーに吸着又は固相化され、試験の間そこから移動することはない。あるいは、前記抗体４４を前記反応チャンバーの前記内部表面に施した後、この表面へのタンパク質の非特異的結合を防止するように設計された試薬を施すことができる（図示せず）。そのような試薬の一例として公知のものには、ウシ胎児血清（ＢＳＡ）が挙げられる。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ社）、又はＴｗｅｅｎ（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ社）などのような非イオン性界面活性剤もそのような試薬として使用可能である。前記非イオン性界面活性剤として選択されたものは、タンパク質を変性させないのが望ましい。
【００４４】
前記抗体と間隔を置いて存在するものは、プローブコンジュゲート５０（酵素結合抗原）である。プローブコンジュゲート５０に使用するのに望ましい酵素の例として、グルコースオキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられるが、それに限定されない。前記酵素結合抗原５０は、前記サンプルが浸透したときに前記サンプル中に遊離することができる様式にて、前記反応チャンバー内部に保持される。例えば、前記酵素結合抗原５０は前記反応チャンバー内部の表面上に乾燥させることができる、そこにおいては、前記酵素結合抗原５０と前記反応チャンバーとの間には弱い結合のみが存在する。一つの実施態様において、前記酵素結合抗原５０の溶解速度は、前記サンプルが前記反応チャンバーに満たされるのに要する時間の間、プローブコンジュゲートが、サンプル中に溶解するように調節することができる。この様式において、前記酵素結合抗原５０はサンプル注入の後、前記反応チャンバーの領域全体にわたって均一に分散される。
【００４５】
一つの実施態様において、前記酵素結合抗原５０及び抗体４４の比率は、酵素結合抗原５０よりも抗体４４の量が超過する態様にて調節することができる。一つの実施態様において、超過とは、前記超過が前記サンプルに存在する、検出対象の抗原分子の数と比較して少ない態様のことを指す。
【００４６】
したがって、前記反応チャンバーがサンプルで満たされると、前記酵素結合抗原５０は前記サンプルと混合する。その後、十分な時間、前記酵素結合抗原５０が前記抗体４４と接触する。抗体４４が超過量存在するため、抗原が前記サンプル中に存在しないときは、前記酵素結合抗原５０の実質的に全て、又は大多数の部分が前記抗体４４に結合し、効率的に固相化される。前記サンプル中に標的抗原が存在するときは、前記標的抗原は前記抗体４４と接触及び結合し、少なくとも一定割合の前記酵素結合抗原５０が、前記抗体４４との結合をブロックされる。ゆえに、前記標的抗原が前記サンプル中に存在するときは、反応の終了時点では、前記酵素結合抗原５０（又は少なくともその顕著な部分）は前記サンプル中に遊離したまま存在し、前記検出チャンバーに移動することができる。一方、標的抗原が前記サンプル中に存在しない場合は、前記酵素結合抗原５０は反応チャンバー４８に固相化される（又は少なくとも前記サンプル中に残存する量の顕著な減少が生じる）。当業者であれば、抗体４４の超過は必須ではないことを予想し、あるいは、前記酵素結合抗原５０及び抗体４４の配合比率を等しく、又は酵素結合抗原５０の量を多く存在させる態様にて調節することも可能である。
【００４７】
第二の実施態様において、前記固相化結合部位４４は、前記標的抗原の一部位と結合することができる抗体であり、及び前記プローブコンジュゲート５０は、結合した標的抗原と結合する抗体を結合させた酵素である。前記固相化結合部位及び前記プローブコンジュゲートに対して抗体を適用する利点としては、前記ストリップの製造工程中に標的に結合する試薬が十分混合され、共に乾燥吸着させることができる点が挙げられる。前記結合標的が拡散する距離は短くすることが可能で、それにより前記アッセイを行うのに必要な時間を潜在的に短縮する。
【００４８】
前記サンプルが前記反応チャンバーに入ると、前記反応チャンバー内の前記固相化結合部位は検出対象の一部位と結合する。前記プローブコンジュゲートは二次抗体を有し、それは前記固相化結合部位に付いている前記標的抗原上の第二部位に結合する。前記検出対象を有するサンプルが前記反応チャンバーに満たされたとき、前記プローブコンジュゲート及び前記固相化結合部位が前記サンプルと混合し、前記検出対象が一部位において前記プローブコンジュゲートと、第二の部位において前記固相化結合部位と結合する。前記検出対象はそれゆえ、前記プローブコンジュゲートの一部分を固相化する結合を形成し、それにより前記固相化部分は前記サンプル中の前記検出対象の存在を検出し、及び／又は濃度を定量する指標として用いることができる。例えば、固相化されたプローブコンジュゲートの量は、前記検出チャンバーに移動するフリーのプローブコンジュゲートの量の低下を観察することにより、定量化することができる。
【００４９】
他の実施態様において、前記固相化結合部位４４は前記標的抗原であり、及び前記プローブコンジュゲート５０は抗体と組み合わされた酵素であり、それにより目的とする検出対象に結合することが可能となる。前記固相化結合部位及びプローブコンジュゲートは前記反応チャンバーにおいて隔離されて設置されるのが望ましく、それによりサンプル添加前に反応が行われるのを防止又は減少させることが可能となる。
【００５０】
前記標的抗原を有するサンプルが前記反応チャンバーに満たされると、前記サンプル中の前記標的抗原は前記プローブコンジュゲート（抗体）と結合し、前記固相化結合部位（抗原）と結合するプローブコンジュゲートの量を減少させる。前記標的抗原の有無により、前記反応チャンバーにおいて結合するプローブコンジュゲートの量に変化を生じさせる。前記固相化された部分は、前記サンプル中の前記検出対象の存在の検出及び／又は濃度の定量化の指標として用いることができる。例えば、固相化プローブコンジュゲートの量は、前記検出チャンバーに移動するフリーのプローブコンジュゲートの量の低下を観察することにより定量化することができる。
【００５１】
一つの実施態様において、前記固相化結合部位及び／又は前記プローブコンジュゲートはビーズに結合している。例えば、前記固相化結合部位（抗原）は前記反応チャンバーの一表面に乾燥されているビーズ上に設置し、一方前記プローブコンジュゲート（抗体）は前記反応チャンバーの他の表面に乾燥させて設置することができる。前記ビーズは磁気ビーズを使用することができ、それにより磁場を利用して前記反応チャンバーから除かれるのを防止することができる。サンプルが前記反応チャンバーに満たされると、前記サンプル中の抗原は前記プローブコンジュゲートの前記抗体と結合し、前記固相化結合部位（抗原）が前記プローブコンジュゲートと結合するのを防止し、それにより前記プローブコンジュゲートをフリーの状態にし、前記検出チャンバーに移動させる。
【００５２】
上記のとおり、ビーズは、前記サンプルが前記検出チャンバーに移動した後でも前記反応チャンバー内に残る性質を持つのが望ましい。例えば、適用された磁場の磁力線に沿って常磁性体の磁気ビーズを並べることができ、それにより前記磁力線により保持され、また前記サンプルが検出チャンバーに移動することを防止できる。前記磁場は電磁石のような適切な装置により施すことができ、あるいは、別の実施態様として、電力の消費を最小にする場合には、前記磁場を永久磁石により提供することができる。一つの実施態様において、前記磁石は、前記反応チャンバー内の前記プローブコンジュゲートの存在する位置に近い場所であり、かつ前記反応チャンバー内の常磁性体の前記磁気ビーズの存在する位置から遠い場所に設置することができる。このような配置により、前記ビーズは、前記磁場の影響により前記プローブコンジュゲートに向けて移動し、混合するように運動する。前記ビーズが前記プローブコンジュゲートに移動し、混合すると、前記の供給された磁場は前記ビーズが磁力線の希薄な位置に移動するのを防止するよう作用し、それにより前記ビーズは前記反応チャンバー中にて前記磁場により固相化される。
【００５３】
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートの前記構成とは無関係に、前記サンプルは、前記反応チャンバー内にて反応した後、前記検出チャンバーに移動する。これは前記サンプルが前記反応チャンバーに添加されてから予め決定された時間の後に行われる。例えば、その予め決定された時間は、実質的に全ての前記プローブコンジュゲートが結合するのに十分な時間となるように設定することができる。一つの実施態様において、前記反応チャンバー内での前記サンプルの滞留時間はユーザーにより任意に算出することができる。あるいは、前記滞留時間は前記センサーと電気的に結合しているメーターにより電気的に算出することもできる。
【００５４】
一つの実施態様において、前記反応チャンバー内の前記サンプルの滞留時間は、電極を通じてモニターされる。例えば、図１及び２の前記センサーにおいて、サンプルが前記反応チャンバー２２に満たされると、前記反応チャンバー２２に通じるその開口部３８に存在する前記検出チャンバー２８の一部分にサンプルが浸入する。前記電極５２及び５４は、前記検出チャンバー２８に設置され、少なくとも電極５２及び５４各々の一部が、前記反応チャンバー２２のへのサンプル充填の間、前記サンプルの接触を受け、また前記サンプルの存在が前記電極５２及び５４の架橋をすることとなり、それが計時装置のスイッチを入れるための電気的シグナルを発生させる。また、図３及び４の前記センサーとして示される他の実施態様においては、前記下部電極及び接触領域１０１との組み合わせで使用される、隔離された電気的な接触（接触１０３）は、前記反応チャンバー内のサンプルの存在を検出することができる。
【００５５】
前記サンプルが前記反応チャンバーに添加された後の、予め決定された時間内で、前記試験における免疫学的反応状態は完了すると考えられる。前記通気口３０、１３０は、その後空気中に向けて開放される。例えば、前記メーター内のソレノイドにより活性化された針を使用して層を貫通させ、通気口を開けることもできる。前記貫通は前記メーターにより、又はユーザーが任意に、例えば前記ユーザーが前記通気口を覆っている前記層を針で突き刺すことにより行うことができる。
【００５６】
更に、前記検出チャンバー２８、１２８に試薬６４が乾燥した状態で露出しており、それは酵素基質及びメディエーターを含み、検出可能なシグナルを発する前記プローブコンジュゲートの酵素部分と反応する。前記酵素基質及びメディエーターは、存在するときは、前記酵素基質と共存するいかなる酵素の反応速度も酵素の存在量により決定される程十分な量存在させるのが望ましい。例えば、前記酵素がグルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼであるときは、適切な酵素メディエーター及びグルコース（前記サンプルに予め存在しない場合）のような酵素基質が、検出チャンバー２８、１２８に露出される。他の実施態様において、添加されたサンプル中のグルコースレベルが多少異なっても、実質的に前記酵素反応速度を変化させない程十分な量のグルコースが、前記検出チャンバー２８、１２８に添加される。バッファーを添加し、検出チャンバー２８、１２８における前記サンプルのｐＨを調整することも可能である。一つの実施態様において、フェリシアニドが望ましいメディエーターである。他の望ましいメディエーターとしては、ジクロロフェニルインドフェノール及び遷移金属と窒素含有ヘテロ原子化合物との複合体が挙げられる。更に、フェナジンエトサルフェート、及び／又は２，３ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノンのような第二メディエーターであり、前記酵素から前記フェリシアニド類に電子をより効率的に供給する物質を添加することもできる。前記酵素基質、メディエーター、第二メディエーター、及びバッファーを有する試薬６４は、前記酵素と前記酵素基質との反応速度が前記酵素の存在する濃度により律速される程度に、十分な量存在するのが望ましい。
【００５７】
前記検出チャンバー２８、１２８がサンプルにより満たされると、前記試薬６４が前記サンプル中に拡散する。前記プローブコンジュゲートの酵素部分は、前記酵素基質及び前記メディエーターと反応し、還元されたメディエーターが生じる。この還元されたメディエーターは、電気化学的に陽電極として機能する前記検出チャンバー２８、１２８において酸化され、電流を生じさせる。一つの実施態様において、この電流の時間変化は、反応後のサンプル中に存在する酵素の存在及び量を示す指標として使用される。前記電流の変化の速度が予め決定された閾値よりも小さい（又は大きい）時は、すなわち少ない量（又は顕著な量）のプローブコンジュゲート５０が前記反応後のサンプル中に存在することを示し、それは最初のサンプル中に存在する抗原の存在（又は欠如）を示す。一方、前記電流変化の速度が閾値よりも大きい（又は小さい）時は、前記サンプル中の抗原の欠如（又は存在）を示す指標として使用することができる。一つの実施態様において、前記電流変化の速度は前記サンプルに最初に存在する抗原の含有濃度を測定するための手段として使用される。例えば、前記電流変化の速度はプローブコンジュゲート濃度を決定するのに使用することができ、それは前記サンプルに含まれる前記抗原の濃度と相関させることができる。
【００５８】
（プローブとしてのメリチンの使用）
一つの実施態様において、抗原−メリチン複合体を有するプローブ結合抗原は、上記のように前記反応チャンバーの壁面に乾燥させることができる。その場合、前記検出チャンバーにはフェロシアニドのようなメディエーターを入れたリポソーム又は脂質の小胞を含めることができる。前記抗原−メリチン複合体が前記リポソームに到達すると、それらは破裂し、前記フェロシアニドを放出する。これにより前記シグナルの急速な増幅を誘導し、すなわち少量のフリーの抗原が前記抗体との結合部位において前記抗原−メリチン複合体と競合し、それが高濃度のフェロシアニド放出につながる。
【００５９】
（電気化学的アッセイにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼの使用）
従来技術のＥＬＩＳＡでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）は、高感度アッセイ用酵素として使用されている。しかしながら、これらの両酵素を電気化学的アッセイに適用することを可能にするような基質が開発された。本発明の実施態様において、ＡＰはｐ−アミノフェニルリン酸と共に、ＨＲＰはテトラチアフルバレンと共に使用することができる。
【００６０】
以下に本発明の原理及び実施例を示すが、本発明はそれに限定されない。また本発明の範囲及び技術思想の範囲内で様々な追加的な実施態様を想到することは、当業者にとって容易である。
【実施例】
【００６１】
ヒトＣ反応性タンパク質をコートした磁気ビーズ用い、血液中のヒトＣ反応性タンパク質に関し、代表的なイムノセンサーアッセイを行った。
【００６２】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を１．５ミクロンのカルボキシル化された磁気ビーズであるＢｉｏＭａｇ（カタログ番号ＢＭ５７０、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に共有結合させた。２１．９ｍｇのビーズ（１ｍｌ）を４回、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社））バッファー（ｐＨ５．２）を用いたインキュベートにより洗浄し、磁石を用いて前記ビーズを試験管の片側に集中させ、その２分後に前記バッファーをトランスファーピペットにより除去した。４回の洗浄の後、前記ビーズを最終０．３４ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー中に懸濁した。４０μｌの１００ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＡＣ（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、更に５分後に４５０μｇのＣＲＰをリン酸バッファー（Ｈｙｔｅｓｔ社）に溶解させて調製した溶液を添加した。ビーズを３０分室温にて更にインキュベートした。非結合のＣＲＰを、磁石を用いて上記のとおり前記ビーズを分離回収させることにより除去した。前記ビーズはその後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル）−ｌ，３プロパンジオール、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）及び１ｍｇ／ｍｌのウシ胎児血清（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を有するバッファー中で３０分間インキュベートしてブロッキングし、その後同じバッファー中で磁石による分離回収により４回洗浄した。ビーズを、０．０５％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を有するＴＢＳ／ＢＳＡバッファー中に保存した。
【００６３】
（グルコースデヒドロゲナーゼ／抗体のコンジュゲート）
グルコースデヒドロゲナーゼ（組み換え大腸菌由来酵素、キッコーマン社）であるＧＤＨ及びモノクローナル抗体４Ｃ２８のクローンＣ２（Ｈｙｔｅｓｔ社）のコンジュゲートを、ＭＢＳ試薬（Ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）を使用し、Ｏ  Ｓｕｌｌｉｖａｎらの文献（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００，１００−１０８，１９７９）に記載の方法に基づき行った。
【００６４】
本実施例において、ＭＢＳはＧＤＨのアミノ基と反応し、更に前記ＭＢＳ−ＧＤＨ中間体を精製した。その後、前記ＳＭＣＣ−ＧＤＨ複合体上のマレイミド基を、還元試薬であるシステアミン塩酸塩と共に反応系に添加された前記抗体のヒンジ領域に存在するフリーのスルフィドリル基と反応させた。
【００６５】
（１．ＩｇＧのヒンジ領域のジスルフィド結合の還元）
６ｍｇのシステアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを有するバッファー（反応バッファー）中に２ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｃ２を有する溶液１ｍｌと、３７℃にて９０分インキュベートした。前記混合液を反応バッファーで平衡化された脱塩カラム（ＰＤ−１０、Ａｍｅｒｓｃｈａｍ社）にアプライし、同じバッファーでそれに続き溶出させることにより、前記反応を終了させた。フラクションを１．５ｍｌずつ回収し、前記タンパク質の大半を有する３つのフラクションをプールした。プールの直後、この材料を前記マレイミドにより活性化された酵素と反応させた。タンパク質濃度は、Ｃ２抗体を１ｍｇ／ｍｌで有する溶液における２８０ｎｍの吸光度を１．３５と換算して測定された。
【００６６】
（２．前記酵素のマレイミドによる活性化）
同時に、２ｍｇのＧＤＨを１．０ｍｌの前記反応バッファーに溶解し、ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を７．６ｍｇ／ｍｌで含有するＤＭＳＯ溶液を５０μｌ添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。前記混合液を反応バッファーで平衡化された脱塩カラム（ＰＤ−１０、Ａｍｅｒｓｃｈａｍ社）にアプライし、同じバッファーでそれに続き溶出させることにより、前記反応を終了させた。フラクションを１．５ｍｌずつ回収し、前記タンパク質の大半を有する３つのフラクションをプールした。
【００６７】
（３．抗体の酵素へのコンジュゲート）
前記還元されたＩｇＧ及びマレイミドと反応したＧＤＨを、１ｍｇの抗体に対し０．９ｍｇのＧＤＨの割合で共に混合し、４℃にて一晩インキュベートした。前記反応は６ｍｇのシステアミン塩酸塩の添加により終了させ、室温にて１５分間インキュベートし、その溶液１．５ｍｌを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）を有するバッファーで平衡化した脱塩カラムにアプライし、またそのバッファー中に溶出させた。各カラムからの前記高濃度のタンパク質を有する前記３つの０．５ｍ１のフラクションをプールした。塩化カルシウムの最終濃度１ｍＭ、アジ化ナトリウムの最終濃度０．１％及びＰＱＱの最終濃度０．０５ｍｇ／ｍｌとした。コンジュゲートの使用の前に、４℃にて保存した。
【００６８】
（従来技術によるＣ反応性タンパク質のイムノアッセイ）
また、サンプルにおけるＣＲＰレベルを従来技術による酵素イムノアッセイにより測定した。全てのインキュベートを室温にて行った。
【００６９】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  １１  マイクロプレートのウェルを、ＴＢＳバッファーに１０μｇ／ｍｌにてモノクローナル抗体Ｃ２を溶解させた溶液５０μｌを用い、室温にて６０分間コートした。非結合の抗体を前記プレートの反転及びタッピングにより除去し、更にそのウェルを、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．１％有するＴＢＳバッファー２００μｌにより４回洗浄した。
【００７０】
更に５０μｌの濃度既知のスタンダード又はＣＲＰ含有濃度の不明なサンプルを添加し、通常の方法でＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で各ウェルを１００〜１０００倍希釈し、更に１時間インキュベートした。非結合の抗原をその後上記と同様の洗浄工程により除去した。次にビオチン化Ｃ６抗体溶液を２２０ｎｇ／ｍｌにてＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液に溶解した溶液５０μｌを添加し、更に１時間インキュベートした。非結合の二次抗体を洗浄により除去した後、５０μｌの１／１０００希釈のニュートラアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を添加し、前記反応を更に１５分間行った。最終的に、非結合の酵素を洗浄により除去した後、結合した酵素をＡＢＴＳ基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）の添加により検出した。
【００７１】
Ｃ６抗体のビオチン化は以下の方法により行った。２ｍｇのモノクローナル抗体Ｃ６（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ｍｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに溶解し、ジメチルスルフォキシド（Ｓｉｇｍａ社）にビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステル（Ｐｉｅｒｃｅ社）を１ｍｇ／ｍｌにて溶解させた溶液２９μｌと反応させた。前記反応は３０分間の断続的な振とうにより行った。前記混合溶液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル）−ｌ，３プロパンジオール）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）により平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０；Ａｍｅｒｓｃｈａｍ社）にアプライすることにより、前記反応を終了させ、それに続き同じバッファーにて溶出を行った。フラクションを１．５ｍｌずつ回収し、前記タンパク質の大半を有する３つのフラクションをプールした。前記材料を４℃にて保存した。タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌのＣ６溶液の２８０ｎｍの吸光度を１．２と換算することにより測定した。
【００７２】
（センサーストリップ）
センサーストリップは以下のとおり作製した。
１）１７８μｍ厚のメリネックス（登録商標）を有する電極のウェブを金によりスパッタリングした。前記金コーティングの表面抵抗は８−１２ｏｈｍｓ／ｓｑであった。
２）前記電極を０．３ｍＭの２−メルカプトエタンスルフォン酸溶液により２０分間コーティングし、更に空気の噴射により乾燥させた。この工程により前記電極の親水性が保たれ、また空気浮遊炭化水素及び他の不純物によるフォールディングを減少させることができる。
３）ウェブの工程を、前記電極上に化学物質（例えば、上記の試薬）を乾燥させたストライプに適用した。前記ウェブは固定されたカミソリの刃の付近を通って移動し、それにより前記表面に引っ掻きを形成し、前記反応電極の領域の区画が行われた。前記ウェブはその後、以下の試薬すなわち
−前記引っ掻きに積層させるための前記電気化学的試薬（フェリシアニド、グルコース等）、及び
−前記電気化学的試薬から１〜２ｍｍ隔てた、引っ掻きと反対側の部分に施される前記抗体−酵素コンジュゲート
をそれぞれ蓄えたシリンジポンプにつながった、２本の鈍い先端のステンレスのピペッティングニードルの付近に移動させた。
４）前記化学物質のストライプを、赤外線ドライヤー及び５０℃の温風乾燥により形成した。
５）前記反応及び検出チャンバーを、ロータリー式のクラッシュカット装置を使用したスペーサー層のキスカットにより形成した。
６）前記スペーサーを、前記抗体−酵素コンジュゲートが前記反応チャンバーに位置し、前記電気化学的試薬が前記検出チャンバーに位置するように前記電極上に積層した。
７）前記フィリングチャンバーはオスメス打ち抜き装置を使用して前記二重ラミネートをパンチングすることにより形成した。
８）常磁性体磁気ビーズに結合した抗原を、別の電極フィルム上にストライプした。
９）その後前記常磁性体磁気ビーズを有する前記電極を、前記工程（６）の二重ラミネートに接着した。そこでは前記抗原−ビーズのストライプは前記反応チャンバーにおいて前記抗体−酵素コンジュゲートに対面して位置する。
１０）オスメス打ち抜き装置を使用して前記三重ラミネートをパンチングし、各センサーにつき前記通気口を形成した。
１１）前記通気口及び前記フィリングチャンバーの開口側を「マジックテープ（登録商標）」（３Ｍ）により被覆した。
１２）前記三重ラミネートのウェブを単離し、反応センサーを完成させた。
【００７３】
（ＧＤＨの電気化学的検出）
５ｍｇ／ｍｌの２，３ジメトキシ，５−メチル１，４ベンゾキノン（Ａｌｄｒｉｃｈ社）、３２６ｍｇ／ｍｌのカリウム−フェリシアニド及び４００ｍＭグルコースを、０．２６ｍｇ／ｍｌシトラコン酸（Ｓｉｇｍａ社）及び１３．３ｍｇ／ｍｌのシトラコン酸二カリウムを有するバッファーに溶解させた溶液を調製した。
【００７４】
（コンジュゲート）
４００μｇ／ｍｌのＧＤＨを有する溶液を、１ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２６ｍｇ／ｍｌのシトラコン酸、１３．３ｍｇ／ｍｌのシトラコン酸二カリウム、及び１０ｍｇ／ｍｌのスクロースを有する溶液により１００μｇ／ｍｌに希釈した。
【００７５】
（磁気ビーズ）
ＣＲＰコートされたビーズ５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌのスクロース、１ｍＭの塩化カルシウム、０．２６ｍｇ／ｍｌのシトラコン酸、及び１３．３ｍｇ／ｍｌのシトラコン酸二カリウムを有する溶液を調製した。
【００７６】
（サンプル調製）
通常のヘパリン化された血液であり、ヘマトクリットが４２％であり血漿中のＣＲＰ濃度が１μｇ／ｍｌの血液（ＣＲＰ血液）を以下の実験に使用した。ｌ００μｌの全血液に対して、リン酸バッファーに２．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＰを溶解した溶液１０μｌを添加した。また１０μｌのリン酸バッファーを別の１００μｌのサンプルに添加し、コントロールとした。
【００７７】
（試験手順）
約５μｌの血液を前記フィリングチャンバー（図３の符号１０７）に添加した。前記血液をフィリングチャンバー１０７及び反応チャンバー１２２に流し込んで満たし、検出チャンバー１２８の入口付近で止めた。前記血液は反応チャンバー１２２の壁面から前記コンジュゲートを溶解させ、それを前記反応チャンバー１２２の下に設置されている磁石によって反応チャンバー１２２の底に引っ張られている前記磁気ビーズとの反応のために供給した。ＣＲＰの添加がない場合は、コンジュゲートの大部分は前記磁気ビーズに結合する。
【００７８】
４０秒間インキュベートした後、図３の前記通気口１３０を針で突き刺した。これにより、血液は非結合のＧＤＨコンジュゲートと共に前記引っ掻き線（１０６）の側を流れ、前記検出チャンバーに流れ込み、前記検出チャンバー内での電極間の電流測定が開始された。その後４５秒間、ＧＤＨの存在により前記検出チャンバーにて発生する電流を測定した。以下の表は、コントロール血液又は２５０μｇ／ｍｌのＣＲＰを含有する同じ血液各６サンプルにおける結果、すなわち前記検出チャンバー１２８が満たされた後５秒後及び４５秒後の電流（μＡ）を示す。５秒後の電流と及び４５秒後の電流の差異は、前記サンプル中のＣＲＰ濃度の測定に使用される。
【表１】
0005288700.tif 000002
【００７９】
上記の表に記載のとおり、電流変化速度の顕著な差異が、コントロールサンプルと２５０μｇ／ｍｌのＣＲＰを添加されたサンプルとの間で観察された。ゆえに前記イムノセンサーにより、サンプル中のＣＲＰの存在を検出することができることが明らかとなった。
【００８０】
当業者であれば、上記の実施態様に基づき、本発明の特徴及び利点を想起することができるであろう。したがって、本発明は、添付された請求項により示された内容以外の、具体的に示されまた記載された内容に限定されることはない。本発明において記載された全ての刊行物及び参考文献は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本願明細書における一つの実施態様におけるバイオセンサーの平面図である。
【図２】線Ａ−Ａ’に沿った図１のバイオセンサーの断面図である。
【図３】本願明細書における他の実施態様におけるバイオセンサーの平面図である。
【図４Ａ】線Ａ−Ａ’に沿った図３のバイオセンサーの断面図である。
【図４Ｂ】線Ｂ−Ｂ’に沿った図３のバイオセンサーの断面図である。
【図４Ｃ】線Ｃ−Ｃ’に沿った図３のバイオセンサーの断面図である。
【図４Ｄ】線Ｄ−Ｄ’に沿った図３のバイオセンサーの断面図である。
【図１】
0005288700.tif 000003
【図２】
0005288700.tif 000004
【図３】
0005288700.tif 000005
【図４Ａ】
0005288700.tif 000006
【図４Ｂ】
0005288700.tif 000007
【図４Ｃ】
0005288700.tif 000008
【図４Ｄ】
0005288700.tif 000009