(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化ストレス条件下で外来遺伝子を発現するための乳酸菌であって、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％相同な配列を含む核酸であって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、からなる群から選択される核酸が導入されている乳酸菌に、α−アミラーゼ発現カセットを導入して発現させる、α−アミラーゼの生産方法。
【請求項２】
前記乳酸菌が、Lactococcus属またはLactobacillus属に属する乳酸菌である、請求項１に記載のα−アミラーゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレス耐性を付与した乳酸菌、およびその乳酸菌を作製するための発現カセット、ならびに、そのような乳酸菌を使用するタンパク質生産システムおよびタンパク質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、安全性の高い微生物と認識されており、有用タンパク質生産や医療用ワクチンの輸送体等としての利用が期待されている。特に、Lactococcus属およびLactobacillus属乳酸菌は、豊富な食経験から安全性の高い微生物と捉えられており、発酵食品等の食品製造における最重要な微生物である。また、これら乳酸菌は、タンパク質・ペプチドや乳酸等の有用物質生産システムの宿主として、およびワクチンやサイトカイン等を発現させた医療用物質輸送体として期待されている。
【０００３】
しかし、乳酸菌は酸化ストレスの消去能が欠如しており、実用過程で負荷される酸化ストレスによりタンパク質生産用の宿主としての機能が制限される。なぜならば、乳酸菌の利用過程、すなわち、培養過程や生体内環境において、乳酸菌には酸化ストレスが負荷され、タンパク質生産用宿主としての機能が制限されるからである。そのため、乳酸菌に酸化ストレス耐性を付与することが可能になれば、乳酸菌の利用が高度化されるとともに、乳酸菌を用いたタンパク質生産システムの用途も飛躍的に拡大するものと考えられる。
【０００４】
微生物を宿主としたタンパク質の生産は、主に大腸菌、枯草菌（特許文献１および２）、酵母（特許文献３）等を宿主として行われてきた。乳酸菌を宿主とするタンパク質生産も試みられてきたが（特許文献４〜６）、単に発現用ベクターの発明に留まっている。また、乳酸菌の酸素ストレス耐性に関与する遺伝子も見出されているが（特許文献７）、その遺伝子産物を異種タンパク質生産へ応用することは検討されていない。
【０００５】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【特許文献１】特開２００７−１３００１２
【特許文献２】特開２００６−２９６２４２
【特許文献３】特開２００４−８１２２２
【特許文献４】特開２００６−２６２７２４
【特許文献５】特開２００１−３４００９０
【特許文献６】特開２００４−５１１２４８
【特許文献７】特開２００１−３２７２９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、酸化ストレス存在下で培養した場合であっても、大量に異種タンパク質を生産できる改変乳酸菌が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明では、酵母等に由来する酸化ストレス消去系遺伝子を乳酸菌に導入して酸化ストレス耐性を付与した乳酸菌株を生産用宿主として利用することにより、問題点の解決をはかった。また、異種タンパク質の大量発現に最適なプロモーター及び分泌カセットを含む新規発現・分泌ベクターを構築した。さらに、構築した宿主とベクターを組み合わせることにより、好気培養や生体内環境において負荷される酸化ストレスの存在下においても、高効率に機能するタンパク質生産システムを確立した。
【０００８】
従って、本発明は、以下を提供する：
（項目１）  酸化ストレス消去系遺伝子を導入した、高度酸化ストレス耐性を有する乳酸菌。
【０００９】
（項目２）  酸化ストレス条件下で外来遺伝子を発現するための乳酸菌であって、カタラーゼをコードする核酸、スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸、メタロチオネインをコードする核酸、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡをコードする核酸、および、グルタチオンペルオキシダーゼをコードする核酸からなる群から選択される核酸が導入されている、乳酸菌。
【００１０】
（項目３）  前記カタラーゼをコードする核酸が、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目２に記載の乳酸菌。
【００１１】
（項目４）  前記スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸が、
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号４に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目２に記載の乳酸菌。
【００１２】
（項目５）  前記メタロチオネインをコードする核酸が、
配列番号５に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号５に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号６に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目２に記載の乳酸菌。
【００１３】
（項目６）  前記メチオニンスルホキシドリダクターゼＡをコードする核酸が、
配列番号７に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号７に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号８に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目２に記載の乳酸菌。
【００１４】
（項目７）  前記グルタチオンペルオキシダーゼをコードする核酸が、
配列番号９に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号９に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目２に記載の乳酸菌。
【００１５】
（項目８）  酸化ストレス条件下で外来遺伝子を発現するための乳酸菌であって、カタラーゼをコードする核酸、または、スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸、が導入されている、乳酸菌。
【００１６】
（項目９）  Lactococcus属またはLactobacillus属に属する、項目８に記載の乳酸菌。
【００１７】
（項目１０）  項目２に記載の乳酸菌、および、異種タンパク質発現カセットを含有する、タンパク質生産システムであって、ここで、異種タンパク質発現カセットは、分泌カセットを含む、タンパク質生産システム。
【００１８】
（項目１１）  項目１０に記載のタンパク質生産システムを使用する、異種タンパク質の生産方法。
【００１９】
（項目１２）  前記異種タンパク質がα―アミラーゼである、項目１１に記載の生産方法。
【００２０】
（項目１３）  乳酸菌に酸化ストレス耐性を付与するための、酸化ストレス消去系遺伝子を含む発現カセットであって、
ここで、該発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されており、
ここで、酸化ストレス消去系遺伝子は、カタラーゼをコードする核酸、スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸、メタロチオネインをコードする核酸、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡをコードする核酸、および、グルタチオンペルオキシダーゼをコードする核酸からなる群から選択される核酸である、発現カセット。
【００２１】
（項目１４）  前記カタラーゼをコードする核酸が、
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カタラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【００２２】
（項目１５）  前記スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸が、
配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号４に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【００２３】
（項目１６）  前記メタロチオネインをコードする核酸が、
配列番号５に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号５に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号６に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、メタロチオネイン活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【００２４】
（項目１７）  前記メチオニンスルホキシドリダクターゼＡをコードする核酸が、
配列番号７に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号７に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号８に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【００２５】
（項目１８）  前記グルタチオンペルオキシダーゼをコードする核酸が、
配列番号９に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号９に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、および、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【００２６】
（項目１９）  前記酸化ストレス消去系遺伝子が、カタラーゼをコードする核酸、または、スーパーオキシドディスムターゼをコードする核酸である、項目１３に記載の発現カセット。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に従って、酸化ストレス耐性を付与した乳酸菌、およびその乳酸菌を作製するための発現カセット、ならびに、そのような乳酸菌を使用するタンパク質生産システムおよびタンパク質生産方法が提供され、その結果、乳酸菌を酸化ストレス条件下で培養しても、異種タンパク質を大量に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２９】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３０】
本明細書において使用する場合、用語「酸化ストレス消去系遺伝子」とは、酸化ストレス消去活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。本明細書において使用する場合、用語「酸化ストレス」とは、生体内または細胞内で生成する活性酸素群の酸化損傷力と、生体内または細胞内の抗酸化システムの抗酸化ポテンシャルとの差として定義される。本明細書において使用する場合、用語「酸化ストレス消去活性」とは、生体内または細胞内の酸化ストレスを除去する活性、すなわち、「生体内または細胞内で生成する活性酸素群の酸化損傷力」を低減する活性、および／または、「生体内または細胞内の抗酸化システムの抗酸化ポテンシャル」を増加する活性をいう。
【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「カタラーゼ」とは、カタラーゼ活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、カタラーゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有すポリペプチドである。
【００３２】
本明細書において使用する場合、用語「カタラーゼ活性」とは、過酸化水素を不均化して酸素と水に変える反応を触媒する酵素活性、すなわち、２Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋２Ｈ２Ｏという反応を触媒する酵素活性をいう。
【００３３】
本明細書において使用する場合、用語「スーパーオキシドディスムターゼ」とは、スーパーオキシドディスムターゼ活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、スーパーオキシドディスムターゼは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有すポリペプチドである。
【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「スーパーオキシドディスムターゼ活性」とは、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−、活性酸素）２分子間で電子の授受を行い、酸素分子と過酸化水素分子にする酵素活性をいう。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「メタロチオネイン」とは、メタロチオネイン活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、メタロチオネインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有すポリペプチドである。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「メタロチオネイン活性」とは、カドミウムのような重金属を結合する活性をいう。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ」とは、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有すポリペプチドである。
【００３８】
本明細書において使用する場合、用語「メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性」とは、活性酸素存在下でメチオニンを酸化する活性をいう。メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性は、例えば、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ活性は、メチオニン残基を含む合成ペプチドをパラコート（１０μＭ）存在下で１０分間インキュベートし、ｍｅｔ（Ｏ）の存在量をＭＡＬＤＩ質量分析計で分析することによって測定できる。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「グルタチオンペルオキシダーゼ」とは、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、グルタチオンペルオキシダーゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有すポリペプチドである。
【００４０】
本明細書において使用する場合、用語「グルタチオンペルオキシダーゼ活性」とは、過酸化水素を、グルタチオンの存在下で、水に代謝させ、酸化型グルタチオンを生成する活性、すなわち、Ｈ２Ｏ２＋２ＧＳＨ→２Ｈ２Ｏ＋ＧＳＳＧという反応を触媒する活性をいう。
【００４１】
本発明において、「酸化ストレス消去系遺伝子」としては、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、メタロチオネイン、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡ、および／または、グルタチオンペルオキシダーゼが利用可能であるが、これらに限定されない。好ましくは、「酸化ストレス消去系遺伝子」は、酵母由来であるが、その由来は、酵母に限定されない。
【００４２】
本発明に使用する乳酸菌としては、例えば、Lactococcus属またはLactobacillus属に属する乳酸菌が挙げられるが、これに限定されない。さらに、Pediococcus属またはTetragenococcus属、Carnobacterium属、Vagococcus属、Leuconostoc属、Weissella属、Oenococcus属、Atopobium属、Streptococcus属、Enterococcus属、Aerococcus属、Alloiococcus属、Melissococcus属またはParalactobacillus属に属する細胞も、本発明に使用可能である。
【００４３】
また、本発明において発現する異種タンパク質としては、どのようなタンパク質を用いてもよい。好ましい異種タンパク質としては、例えば、α―アミラーゼ、イソメラーゼ、リゾチーム、抗菌ペプチド、β‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペプチダーゼ、アミノ酸修飾酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼインヒビター、各種ホルモンペプチド、免疫グロブリン、ワクチン抗原、ビタミン合成酵素群、抗酸化ペプチド、抗血圧上昇ペプチド、胆汁酸抱合ペプチド、サイトカイン、その他機能性ペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００４４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００４５】
本明細書において「分泌カセット」とは、その上流または下流に連結された読み取り枠から発現するタンパク質の細胞外への分泌を促進する核酸配列をいう。
【００４６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４７】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４９】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００５０】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００５１】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【００５２】
配列番号２、４、６、８、または１０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１または３の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１、３、５、７、または、９に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００５３】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００５４】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００５５】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００５６】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００５７】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００５８】
（本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５９】
（遺伝子工学）
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、およびパーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法などが例示される。
【００６１】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６２】
ＬＡＢにおける発現系を改良するために、本発明者らは今回、異種タンパク質発現用の染色体改変宿主株を構築した。酸化ストレスに対する宿主株の耐性を向上させるために、本発明者らは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子（ｓｏｄ１）およびカタラーゼ遺伝子（ｃｔｔ１）を、乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ  １４０３の染色体に導入した。その耐性株（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）は、酸化ストレスに対して顕著な耐性を示した。これらの染色体改変株のタンパク質発現能を、それぞれ分泌用プラスミドであるｐＳＥＡ５およびｐＲＫ１を使用して、α−アミラーゼおよびバクテリオシンであるムンジチシンＫＳ産生能を測定することによって評価した。好気条件下におけるｐＳＥＡ５およびｐＲＫ１を保有する染色体改変株の細胞増殖は、同一のプラスミドを保有する野生型の細胞増殖よりも顕著に高かった。同様に、その染色体改変株のα−アミラーゼ活性およびバクテリオシン活性の双方とも、野生型のものよりも高かった。特に、ｐＳＥＡ５を保有するＩＬＳＯＤのα−アミラーゼ活性は、ｐＳＥＡ５を保有する野生型のα−アミラーゼ活性よりも７．５倍高かった。結論として、酸化ストレスに対して強力な耐性を付与するために染色体が改変された宿主株の構築により、タンパク質発現が顕著に改良され得る。
【００６３】
（導入）
乳酸菌（ＬＡＢ）は、異種タンパク質産生の宿主株として使用され得る。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ株およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株のようなＬＡＢは、乳酸、バクテリオシンおよびビタミンの産生のような産業分野において広範に使用されている（Ａｈｍｅｄ  ２００３；ＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚおよびＳｍｉｄ  ２００２）。抗原およびサイトカインの発現により、ＬＡＢはまた、生きたワクチンのような腸における治療ツールとして、そして炎症性疾患の処置における治療ツールとしても、使用されている（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。ＬＡＢの完全な利点を享受するために、発現ベクターの改良が、異種タンパク質産生のための発現系（例えば、ＮＩＣＥ（ナイシン制御発現）の誘導性プロモーター系、Ｓｅｃ−機構系（分泌−機構系）、および表面提示系）において必要とされている（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ２００６；Ｎｏｕａｉｌｌｅ  ２００３；Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。宿主ＬＡＢ株は、異種タンパク質の有効な発現に適しているが、より強力である必要がある。特に、ＬＡＢのような宿主細胞は、商業的過程の間、異種タンパク質発現においてストレスの多い条件に曝される。本発明者らの本発明の目的は、酸化ストレス条件下での異種タンパク質発現に適したＬＡＢ株の構築であった。
【００６４】
酸化ストレスは、ＬＡＢに対する最も有害なストレスのうちの１つであると考えられる。酸化ストレスは、ＬＡＢの種々の細胞成分（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）の損傷を生じる。なぜなら、ほとんどすべてのＬＡＢ株が、カタラーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼのような活性酸素種（ＲＯＳ）の無毒化酵素を欠いているからである（Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＬＡＢは、多くの場合、製造中にＬＡＢを含有する生成物の産生および保存において酸化ストレスに曝される。そのような産生の特定の工程中（例えば、乳酸発酵中）に、攪拌によって培地中に溶存酸素が生成され、ＲＯＳが生じる。なぜなら、酸素がＬＡＢのＮＡＤＨオキシダーゼによってスーパーオキシドおよび過酸化水素に変換されるからである（Ｍａｒｔｙ−Ｔｅｙｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。溶存酸素を含む乳中で成長したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの特定の種は、バイオマスの減少を示した（Ｍａｒｔｙ−Ｔｅｙｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。さらに、腸障害のための治療ツールとして使用されたＬＡＢは、それが腸の中を通過する間に腸細菌および上皮細胞に由来するＲＯＳによって攻撃される（Ｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｐａｐａｓ  １９９７）。したがって、対策として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓカタラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓスーパーオキシドディスムターゼのような外因性抗酸化遺伝子が、しばしば、ＬＡＢ種（ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に添加されて、酸化ストレス耐性のＬＡＢが作製される（Ｂｒｕｎｏ−Ｂａｒｃｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２００４；  Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＬＡＢが商業的適用のための異種タンパク質発現の宿主として作用する特性を最適化するために、ＬＡＢの酸化ストレス耐性が改良されなければならない。
【００６５】
以前の報告では、高コピー数の発現プラスミドが、酸化ストレス耐性を与えるために主に使用された。しかし、遺伝子組み込みによる宿主細胞の染色体改変は、異種タンパク質発現の宿主株の構築のための優れた手段であり得る。なぜなら、染色体改変は安定であり、そして宿主株の表現型はいかなるストレス条件下でも持続的であるからである。さらに、種々の発現ベクターは、染色体改変された宿主細胞に容易に導入され得る。なぜなら、組換え宿主はプラスミドを有さず、異種タンパク質発現のためにマルチ選択マーカーを有する適合性ベクターを必要としないからである。本発明者らの知る限りでは、異種タンパク質発現の改良は、酸化ストレス耐性である染色体改変されたＬＡＢについて報告されていない。
【００６６】
本発明では、本発明者らは、ＬＡＢのモデルとして乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３を使用した。なぜなら、この株は、異種タンパク質発現のため、および消化管におけるタンパク質送達のために使用されるからである。酸化耐性宿主株の構築において、本発明者らは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＲＯＳの２つのコード無毒化酵素（すなわち、細胞質内Ｃｕ，Ｚｎスーパーオキシドディスムターゼ遺伝子（ｓｏｄ１）、およびヘム依存性カタラーゼ遺伝子（ｃｔｔ１））を使用した。なぜなら、真核生物におけるＲＯＳの無毒化系は、原核生物の無毒化系と比べて、抗酸化系としてより有効であると考えられるからである。これらの真核生物の酸化ストレス関連遺伝子を、二重交差機構を用いてＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３染色体上のｌａｃＺ遺伝子に組み込んだ。異種タンパク質のモデルとして、本発明者らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のα−アミラーゼ、およびクラスＩＩａバクテリオシンであるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｎｄｔｉｉのムンジチシンＫＳを選択した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼは、バイオテクノロジーにおいて（例えば、デンプンの糖化において）一般的に使用され、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｎｄｔｉｉのムンジチシンＫＳは、グラム陽性病原菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対する生物的保存剤として使用され得る（Ｄｒｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。本発明者らの結果は、抗酸化的生産がＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３に酸化ストレス耐性を与えたこと、および異種タンパク質発現が有意に増加されたことを示した。結論として、酸化ストレスに対して強力な耐性を有する宿主株の構築は、ＬＡＢにおける異種タンパク質発現の改良において有効であり得る。
【００６７】
（材料および方法）
（株、培地および培養条件）
表１  本研究において使用した細菌株および酵母株の一覧
【００６８】
【表１】
0005317081.tif 000002
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ株を、ｄｅＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ  （ＭＲＳ）培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で増殖させた。染色体を改変したＬ．ｌａｃｔｉｓ株を、１μＭのＣｕＳＯ４および１μＭのへミンを含むＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で増殖させた。ＣｕＳＯ４およびへミンは、ｈＣＭＲＳとして設計した。エリスロマイシン（５μｇ  ｍＬ−１）をその培地に添加し、ｐＲＨ１００由来プラスミドを保有するＬ．ｌａｃｔｉｓを培養した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを、５ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）および１０ｇのＮａＣｌからなるＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地において増殖させた。必要な場合は、アンピシリン（１００μｇ  ｍＬ−１）を加えた。プレーティングに使用する固体培地は、適切な液体培地に１．２％の寒天を加えることによって調製した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃを、１リットル当たり１０ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇペプトン（Ｄｉｆｃｏ）および２０ｇグルコースを含むＹＰＤ培地（ｐＨ６．５）中で増殖させた。
【００６９】
全てのＬＡＢ株は、他に記載のない限り、ＡｎｅｒｏＰａｃｋ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用して嫌気条件下で３７℃で培養した。酵母株は、３０℃で振盪培養した。
【００７０】
（ＤＮＡ単離、ＰＣＲ条件およびＤＮＡ操作）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＮＦＲＩ７４００からの全ＤＮＡの単離は、製造者の指示に従って、Ｆａｓｔ  ＤＮＡキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して実施した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ｌａｃｔｉｓ由来のプラスミドＤＮＡの単離は、製造者の指示に従って、Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した実施した。
【００７１】
表２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために使用した、適切な制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーの一覧である。ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で４分間の後、９８℃で１０秒間、４７℃で３０秒間および７２℃で２分間を３０サイクル、そして最終反応は７２℃で７分間からなり、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施した。
【００７２】
【表２】
0005317081.tif 000003
ＤＮＡ操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載される方法に基づいて実施した。製造者から推奨されるプロトコールに従って、制限酵素および修飾酵素を使用した。プラスミド構築は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞において確立し、次いでＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３を、以前にＫａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載されたエレクトロポレーションによって、得られたプラスミドを使用して形質転換した。
【００７３】
（染色体改変されたＬＡＢの構築）
Ｌ．ｌａｃｔｉｓの染色体を改変するために、ｓｏｄ１およびｃｔｔ１の組み込みのための組み込み用プラスミド（それぞれｐＳＫＳＯＤおよびｐＳＫＣＴＴ、図１ａを参照のこと）を構築した。ｐＳＫＳＯＤおよびｐＳＫＣＴＴは、以下のように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）に５つのＰＣＲアンプリコンを挿入することによって構築した。この５つのアンプリコンは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのゲノムＤＮＡから増幅されたｌａｃＺ遺伝子の上流配列、（ｉｉ）Ｌ．ｌａｃｔｉｓのゲノムＤＮＡから増幅されたｌａｃＺ遺伝子の下流配列、（ｉｉｉ）ｐＲＫ１から増幅されたｍｕｎＡ遺伝子のプロモーター領域、（ｉｖ）ｐＲＨ１００から増幅されたｍｕｎＡ遺伝子のプロモーター領域、（ｉｖ）ｐＲＨ１００から増幅されたエリスロマイシン耐性遺伝子をコードするｅｒｍＡＭ、および（ｖ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ＣのゲノムＤＮＡから増幅されたｓｏｄ１遺伝子およびｃｔｔ１遺伝子、であった。このアンプリコンおよび親プラスミドを、適切な制限酵素（表２を参照のこと）で切断し、互いにライゲーションした。得られたプラスミドの構造を、ヌクレオチド配列決定およびＰＣＲフラグメント分析によって確認した。
【００７４】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３を、ｐＳＫＳＯＤおよびｐＳＫＣＴＴによって形質転換し、シングルクロスオーバー事象が起こった後の形質転換体を選択肢、次いで形質転換体選択用のエリスロマイシンを補充したＭＲＳ寒天培地上にプレーティングした。続いて、このエリスロマイシン耐性形質転換体を、エリスロマイシンを含まないＭＲＳ液体培地中で培養し、ダブルクロスオーバー事象が起こった後のエリスロマイシン感受性形質店簡単を得た。Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるｌａｃＺの染色体遺伝子座へのｓｏｄ１遺伝子およびｃｔｔ１遺伝子の導入は、ｔｈｇＡＦ／ｇａｌＥＲ、ＳＯＤ１Ｆ／ＲおよびＣＴＴ１Ｆ／Ｒのプライマーセットを使用して、ＰＣＲによって確認した。
【００７５】
（実施例１：α−アミラーゼ分泌のためのプラスミドの構築）
α−アミラーゼ分泌のためのプラスミドｐＳＥＡ５を、以下のように構築した。まず、発現ベクターｐＥＨ１００を、以下のように、ｍｕｎＡプロモーター領域およびｍｕｎＣターミネーター領域の挿入によって構築した。このｍｕｎＡおよびｍｕｎＣフラグメントを、ｐＲＫ１から増幅し、そしてｍｕｎＡｐ２／ｍｕｎＣＲプライマーセットを使用して融合ＰＣＲによって確認し、次いでＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで切断した融合ＰＣＲ産物をｐＲＨ１００に挿入した、ｐＥＨ１００を得た。次に、分泌ベクターｐＳＥ１１２７を、ｍｕｎＡｐ２およびｅｎｌｒ１プライマーを使用して増幅したｅｎｌＡリーダー配列と融合させたｍｕｎＡプロモーターのフラグメントを挿入することによって構築した。最後に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８から増幅したα−アミラーゼをコードするａｍｙＥ遺伝子を、ｐＳＥ１１２７のＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ部位に挿入し、それによって図３に図示するようにｐＳＥＡ５を得た。
【００７６】
（ＲＮＡ調製および逆転写ＰＣＲ）
発現分析のために使用したＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、組み換えＬＡＢ（約１０８細胞）から抽出した。逆転写ＰＣＲは、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用して実施した。ｓｏｄ１およびｃｔｔ１のＲＮＡの測定のために使用したＰＣＲは、それぞれＳＯＤ１Ｆ／ＲおよびＣＴＴ１Ｆ／Ｒ（表２）であった。
【００７７】
（染色体改変されたＬＡＢの酸化ストレス耐性）
定常期の株（ＩＬ１４０３、ＩＬ１４０３ＳＯＤおよびＩＬ１４０３ＣＴＴ）の細胞を、ｈＣＭＲＳ液体培地に播種し、ＯＤ６００＝１．０まで増殖させた。酸化ストレス条件下での生存率を測定するために、この細胞を遠心分離し、それぞれ０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、および８ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含むｈＣＭＲＳ液体培地に再懸濁した。３７℃で１時間のインキュベーション後、その細胞をＭＲＳ寒天プレート上に広げ、４８時間のインキュベーション後の生細胞数を計数した。
【００７８】
（好気条件下の染色体改変されたＬＡＢの増殖）
好気条件下での増殖を、以下のように評価した。５０μＬの一晩培養物を、５０ｍＬのｈＣＭＲＳ液体培地に播種し、５００ｍＬの攪拌フラスコを使用して１１０ｒｐｍで攪拌して、通気を実施した。その培養物の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）を、分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＵＶ２１００  ｐｒｏ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用してモニタリングし、その培養物のｐＨを、ｐＨメーター（ＨＭ−３０Ｇ，ＤＫＫ−ＴＯＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。
【００７９】
（α−アミラーゼ活性の測定）
培養物上清におけるα−アミラーゼ活性を、製造者の指示に従って、α−アミラーゼ測定キット（Ｋｉｋｋｏｍａｎ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。簡潔に述べると、適切な希釈のサンプル溶液を、基質（２−クロロ−４−ニトロフェニル６５−アジド−６５−デオキシ−β−マルトペンタオシド（ｍａｌｔｏｐｅｎｔａｏｓｉｄｅ）、グルコアミラーゼ、およびβ−グルコシダーゼと一緒に３７℃でインキュベートした。１単位のα−アミラーゼ活性を、本明細書中では、１分当たり１μモルの２−クロロ−４−ニトロフェノールを得るのに必要とされる酵素の量として定義される。
【００８０】
（ムンジチシンＫＳ活性の測定）
ムンジチシンＫＳ活性の測定は、以前に記載（Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）されたものに修正を加えて実施した。簡潔に述べると、１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって得られた培養物上清を、ＭＲＳ液体培地中に段階希釈し、次いで、その希釈した上清を、指標株であるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＩＦＯ１３７１２を含むプレート上にスポットした。３７℃で５時間のインキュベーション後、少なくとも直径２ｍｍの別個の明瞭かつ明確な阻害領域を、ポジティブとして記録した。ムンジチシンＫＳ活性のある任意の単位（Ｕ／ｍＬ）は、阻害領域を生じた最高の希釈の逆数として定義した。
【００８１】
（結果）
（実施例１：ＲＯＳの無毒化に関与する遺伝子を使用する染色体改変されたＬＡＢの構築）
Ｌ．ｌａｃｔｉｓの酸化ストレス耐性株を構築するために、本発明者らは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｏｄ１およびｃｔｔ１を組込み遺伝子として使用した。なぜなら、これらの遺伝子は、ＲＯＳの無毒化に関与する遺伝子として周知であるからである。ダブルクロスオーバー機構によって、本発明者らは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの染色体ｌａｃＺ遺伝子座をｓｏｄ１およびｃｔｔ１で置換することにおいて使用するためのプラスミド（ｐＳＫＳＯＤおよびｐＳＫＣＴＴ）（図１ａを参照のこと）を構築した。ｓｏｄ１およびｃｔｔ１を有する染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓを得るために、本発明者らは、図１ａにおいて示される２段階手順を使用した。第一段階において、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの形質転換により得られたエリスロマイシン耐性組換え体を、ｐＳＫＳＯＤおよびｐＳＫＣＴＴを使用することによって選択した。エリスロマイシン耐性形質転換体は、染色体における上記組込みプラスミドとのシングルクロスオーバーによって作製した。第二段階において、これらのエリスロマイシン耐性形質転換体を、エリスロマイシンを含まないＭＲＳ液体培地において連続的に培養した。数回培養した後、エリスロマイシンに対して感受性である形質転換体（これらは、ダブルクロスオーバー機構によってｓｏｄ１またはｃｔｔ１を含む株であると予測された）を得た。その相同組換え部位の構造を、ｌａｃＺ遺伝子座の増幅のためのプライマー（Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマー）（図１ｂ）を使用するＰＣＲによって評価した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３の全ＤＮＡ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３ＳＯＤの全ＤＮＡおよびＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３ＣＴＴの全ＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントのサイズは、それぞれ、約３ｋｂ、約２．６ｋｂおよび約２．８ｋｂであった（図１ｃ）。この増幅フラグメントの長さは、上記株の染色体遺伝子座の推定上の長さに基づいて同定した。本発明者らはまた、ＩＬＳＯＤ株およびＩＬＣＴＴ株の全ＤＮＡにそれぞれ基づいて、ｓｏｄ１およびｃｔｔ１の増幅を確認した（データは示さない）。これらのデータは、ＩＬＳＯＤ株およびＩＬＣＴＴ株は、ダブルクロスオーバー機構を介して、その染色体中にｓｏｄ１遺伝子およびｃｔｔ１遺伝子がそれぞれ組み込まれたことを示す。組み込まれた遺伝子からの転写が、逆転写ＰＣＲにより確認された（データは示さない）。
【００８２】
（実施例２：ｓｏｄ１およびｃｔｔ１により染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓの酸化ストレス耐性）
ｓｏｄ１およびｃｔｔ１により染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓ株（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）の酸化ストレス耐性のレベルを、代表的な酸化剤であるＨ２Ｏ２に対して曝露した後に測定した生存度に基づいて評価した（図２）。
【００８３】
ＩＬＳＯＤ株、ＩＬＣＴＴ株、および野生型株を、４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の存在下および８ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の存在下でｈＣＭＲＳ液体培地中で１時間インキュベートし、その後、生存率を評価した。ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴの生存率は、４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の存在下では野生型株よりも約１０倍高かった（図２ａ）。８ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の存在下（図２ｂ）では、ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴの生存率は、野生型株よりも約５倍高かった。これらのデータは、ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴの両方が、野生型株よりも有意にＨ２Ｏ２に対して耐性であったことを示唆する。
【００８４】
（実施例３：好気的条件下でのｓｏｄ１およびｃｔｔ１を含む染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓにおけるα−アミラーゼ産生の増加）
本発明者らは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するα−アミラーゼを、染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓのタンパク質発現能力を評価する際に使用するモデルタンパク質として選択した。α−アミラーゼ産生のために、分泌プラスミドｐＳＥＡ５を構築した（図３）。このｐＳＥＡ５は、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＬＭＧ３２２２に由来するｅｎｌＡのリーダーペプチド配列に融合されたα−アミラーゼ構造遺伝子を、構成的ｍｕｎＡプロモーターの制御下に含んだ（図３）。ｐＳＥＡ５を保有する野生型株、およびｐＳＥＡ５を保有する染色体改変された株（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）を、好気的条件下で培養し、その後、α−アミラーゼ活性を測定した。図４は、これらの株の測定した細胞増殖（ＯＤ６００）、培養物のｐＨ、およびｐＳＥＡ５を保有するＬ．ｌａｃｔｉｓ株のα−アミラーゼ活性を示す。これらの結果は、好気的条件下での上記培養物中のｐＳＥＡ５を保有する染色体改変された株の細胞増殖が、ｐＳＥＡ５を保有する野生型よりも有意に高かったことを示す（図４ａ）。２４時間培養した後、ＩＬＳＯＤ（ｐＳＥＡ５）およびＩＬＣＴＴ（ｐＳＥＡ５）の細胞増殖は、ＩＬ１４０３ｐＳＥＡ５よりも、それぞれ約５．５倍および約３．５倍高かった。定常期（４８時間）において、ＩＬＳＯＤ（ｐＳＥＡ５）およびＩＬＣＴＴ（ｐＳＥＡ５）の細胞増殖は、ＩＬ１４０３ｐＳＥＡ５よりも、それぞれ、約１．６倍および約１．３倍高かった。これらのデータは、好気的条件下で、ｐＳＥＡ５を保有するＩＬＳＯＤおよびｐＳＥＡ５を保有するＩＬＣＴＴの両方が、野生型株よりもかなり高い増殖を示したことを示唆する。ｐＳＥＡ５を保有するＩＬＳＯＤおよびｐＳＥＡ５を保有するＩＬＣＴＴの両方の２４時間後のｐＨは、野生型よりもわずかに低かった（図４ｂ）。すべての株の最終ｐＨは、約５．０であった。ＩＬＳＯＤ（ｐＳＥＡ５）のα−アミラーゼ活性は、他の株よりも有意に高かった（図４ｃ）。ＩＬＳＯＤ（ｐＳＥＡ５）における最大のα−アミラーゼ活性は、４８時間目に存在し、それはＩＬ１４０３（ｐＳＥＡ５）よりも約７．５倍高かった。４８時間培養した後、ＩＬＣＴＴ（ｐＳＥＡ５）により産生されるα−アミラーゼ活性は、ＩＬ１４０３（ｐＳＥＡ５）よりも３．２倍高かった。
【００８５】
（実施例４：好気的条件下でのｓｏｄ１およびｃｔｔ１を含む染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓにおけるムンジチシンＫＳ産生の増加）
本発明者らは、ｓｏｄ１およびｃｔｔ１を含む染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓにおけるムンジチシンＫＳ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉによって天然で産生されるバクテリオシン）の産生能力を評価した。プラスミドｐＲＫ１（これは、ムンジチシンＫＳの構造遺伝子、およびムンジチシンＫＳトランスロケーションプロセシングに関与する遺伝子およびムンジチシンＫＳの免疫タンパク質に関与する遺伝子を含んだ）を、ＩＬＳＯＤ、ＩＬＣＴＴおよびＩＬ１４０３中に導入した。
【００８６】
図５は、好気的条件下でのｐＲＫ１を保有するＬ．ｌａｃｔｉｓの測定した細胞増殖、ｐＨ、およびバクテリオシン活性を示す。定常期において好気的条件下でここに試験したｐＲＫ１を保有する染色体改変された株の細胞増殖は、ｐＲＫ１を保有する野生型よりも高かった（図５ａ）。３６時間培養した後、ＩＬＳＯＤ（ｐＲＫ１）およびＩＬＣＴＴ（ｐＲＫ１）の両方の細胞増殖は、それぞれ、ＩＬ１４０３ｐＳＥＡ５よりも約１．２倍および約１．４倍高かった。この細胞増殖に関するこれらのデータは、好気的条件下では、ｐＳＥＡ５を保有する染色体改変された株（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）が、野生型株よりもかなり良好な増殖を示したことを示す。実験期間の間に、ｐＲＫ１を保有するすべての株の間でそのｐＨの有意な差異は観察されなかった（図５ｂ）。好気的条件下で、ＩＬＳＯＤ（ｐＲＫ１）およびＩＬＣＴＴ（ｐＲＫ１）の両方の最大のムンジチシンＫＳ活性は、２４時間目および３６時間目においてＩＬ１４０３（ｐＲＫ１）よりも約１．５倍高かった（図５ｃ）。抗酸化酵素（Ｓｏｄ１およびＣｔｔ１）に関与する遺伝子を含む染色体改変されたＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３におけるムンジチシンＫＳ（ムンジチシンＫＳ活性）の産生は、好気的条件下では、野生型ＩＬ１４０３と比較して有意に増加した。
【００８７】
（考察）
ＬＡＢを完全に利用するために、多くの研究グループが、異種タンパク質産生のための発現ベクター系の開発（Ｎａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；  Ｎｏｕａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）およびＬＡＢの分子育種（Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｔｅｒｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）に焦点を合わせてきた。  他のグループは、シグナルペプチドおよび誘導性プロモーターの改変によって、ＬＡＢにおける異種タンパク質の分泌効率を増大させることに成功した（Ｌｅ  Ｌｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。しかし、本発明者らが知る限り、染色体改変されたＬＡＢにおける異種タンパク質発現のために使用される宿主株（これは、増大した増殖性能を示す）の開発に関して、いかなる研究も報告されていない。本研究において、本発明者らは、染色体改変により宿主株の酸化ストレス耐性を改善することが、異種タンパク質発現のために有効であり得ることを示した。酸化ストレス耐性ＬＡＢは、異種タンパク質発現のための有効で強力な宿主株として有用である。なぜなら、酸化ストレスは、異種タンパク質の商業的産生の間において最も損傷を与えるストレスのうちの１つであるからである（Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。
【００８８】
本研究において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｏｄ１遺伝子およびｃｔｔ１遺伝子で、ダブルクロスオーバー機構によって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３染色体上にあるｌａｃＺ遺伝子を個々に置換した（図１）。得られた株（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）は、酸化ストレスに対して有意な耐性を示した（図２）。この染色体改変された株における非ストレス条件下での増殖速度が落ちることを回避するために、本発明者らは、ｌａｃＺ遺伝子を、遺伝子置換のためのＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３染色体上の標的遺伝子として選択した。このｌａｃＺ遺伝子置換は、その増殖速度には影響を与えない。なぜなら、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３は、グルコースを含む培地（例えば、ＭＲＳ培地）においてβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）陰性表現型を示すからである（Ａｌｅｋｓａｎｄｒｚａｋ−Ｐｉｅｋａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。
【００８９】
４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２に曝露した後の染色体改変されたＬＡＢ（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）の生存率は、その野生型株ＩＬ１４０３よりも約１０倍高かった（図２）。数種のレポートには、原核生物に由来する異種スーパーオキシドジスムターゼおよび異種カタラーゼがＬＡＢ中に導入された、酸化ストレス耐性ＬＡＢの開発が記載されている（Ｂｒｕｎｏ−Ｂａｒｃｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｒｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。本明細書において、初めて、スーパーオキシドジスムターゼをコードする真核生物遺伝子（ｓｏｄ１）およびカタラーゼをコードする真核生物遺伝子（ｃｔｔ１）が、ＬＡＢ中に導入された。本発明者らの結果は、このような遺伝子の導入は、ＬＡＢの酸化ストレス耐性を増強すること、そして種々の真核生物抗酸化系が、ＬＡＢの分子育種における有効なツールであり得ることを、明らかに示す。
【００９０】
異種タンパク質のモデルとして、本発明者らは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のα―アミラーゼおよびＥ．ｍｕｎｄｔｉｉのムンジチシンＫＳを使用した。本発明者らの結果は、このようなタンパク質が、タンパク質発現用プラスミドを保有する染色体改変されたＬＡＢによって有効に産生されることを示した（図４および図５）。プラスミドｐＳＥＡ５（α―アミラーゼの発現のために構築された）は、有効な発現および分泌の系のための完全な遺伝子セット（すなわち、ｍｕｎＡプロモーター、マルチクローニングサイト、ａｍｙＥ、およびｍｕｎＣ  ｒｈｏ非依存性ターミネーター）を含んだ。本発明者らは、他の細菌種（例えば、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＩＦＯ１３７１２）におけるこのプラスミドの発現能力を評価した。その結果は、ｐＳＥＡ５が、これらの他の細菌株における有効なα−アミラーゼ分泌において機能することを示した（データは示さない）。
【００９１】
酸化ストレス耐性が増強された染色体改変された宿主（ＩＬＳＯＤおよびＩＬＣＴＴ）により発現されるα−アミラーゼおよびムンジチシンＫＳの両方の活性は、その野生型株であるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３よりも有意に高かった（図４および図５）。ｐＳＥＡ５またはｐＲＫ１を保有する染色体改変された株の細胞増殖もまた、ｐＳＥＡ５またはｐＲＫ１を保有する野生型（ＩＬ１４０３）よりもそれぞれ高かった。この野生型よりも高いα−アミラーゼ産生およびムンジチシンＫＳ産生に関する一因は、これらの染色体改変された株の野生型よりも高い細胞増殖であり得る。別の理由は、異種タンパク質の安定性であり得る。なぜなら、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼ活性は、温度および酸化剤によって影響を受けると報告されているからである（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。さらに、α−アミラーゼの活性化部位付近に位置するプロリン残基の酸化が、α−アミラーゼが９０℃まで加熱された場合に生じる（ＴｏｍａｚｉｃおよびＫｌｉｂａｎｏｖ  １９８８）。
【００９２】
本発明者らの未公開データにおいて、このα−アミラーゼ活性は、過酸化水素によって低減された。一方、ムンジチシンＫＳの活性は、影響を受けなかった。本発明者らは、Ｓｏｄ１およびＣｔｔ１は、α−アミラーゼの酸化を低減し得、結果的には、そのα−アミラーゼ活性は、野生型と比較して有意に増加され得たと推測する。
【００９３】
ここで、本発明者らは、染色体改変された宿主Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３を使用する新規な異種タンパク質発現系を確立しようと試みた。以前の研究（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）においては、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおける異種タンパク質（α−アミラーゼ；ａｍｙＱ）分泌が、適合性プラスミドを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのシャペロン様タンパク質ＰｒｓＡと共発現させることによって、増強された。その研究においては、ａｍｙＱおよびｐｒｓＡが共発現され、その分泌α−アミラーゼの活性は、ｐｒｓＡを欠くコントロールよりも６倍高かった。本発明者らの研究において、抗酸化物質（Ｓｏｄ１およびＣｔｔ１）を有するＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３により産生された分泌α−アミラーゼ活性は、その野生型よりも７．５倍高かった。これらの研究に基づいて、染色体改変された宿主株を使用する本発明者らの新規な異種タンパク質発現系は、異種タンパク質発現のための優れたツールである。従って、染色体改変は、異種産物（例えば、α−アミラーゼ）を発現するために使用される宿主株を有意に改善し得る。なぜなら、比較的少ない適合性ベクターとは対照的に、種々の発現ベクターが利用可能であるからである。
【００９４】
結論として、本研究は、酸化ストレスに対する強力な耐性のために染色体改変されている宿主株の構築が、異種タンパク質の発現を有意に改善し得ることを明らかにする。本発明者らの結果は、攪拌が必須工程である製造プロセスにおいて使用される商業的および治療的に重要なタンパク質および腸障害の治療において使用される商業的および治療的に重要なタンパク質の、細菌による産生を増大することを補助する。
【００９５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
酸化ストレス耐性を付与した乳酸菌、およびその乳酸菌を作製するための発現カセット、ならびに、そのような乳酸菌を使用するタンパク質生産システムおよびタンパク質生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、染色体ｌａｃＺ遺伝子を異種遺伝子（ＳＯＤ１またはＣＴＴ１）で置換したものを示す。（ａ）染色体組み込みの二重交差（ダブルクロスオーバー）機構の全体像である。組み込みベクターは、恒常性ｍｕｎＡプロモーター（黒棒）の下にあるｌａｃＺ相同性領域および異種遺伝子（灰色矢印）からなる。ｐＳＫＳＯＤ、ｐＳＫＣＴＴ；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）の誘導体。（ｂ）ｌａｃＺ遺伝子と異種遺伝子との間の交換のＰＣＲ同定の戦略。Ｐ１およびＰ２は、プライマー（それぞれ、ｔｈｇＡＦおよびｇａｌＥＲ）を示す。（ｃ）染色体ｌａｃＺ領域のＰＣＲ増幅。（Ｍ）ＤＮＡラダーマーカー；Ｐ１／２プライマーを用いて（１）ＩＬ１４０３、（２）ＩＬＳＯＤおよび（３）ＩＬＣＴＴから増幅したフラグメント。
【図２】図２は、染色体改変実験の表現型分析を示す。（ａ）４ｍＭ過酸化水素および（ｂ）８ｍＭ過酸化水素に１時間曝した後の（１）ＩＬ１４０３、（２）ＩＬＳＯＤおよび（３）ＩＬＣＴＴの生存率。各データ点は、これらの独立した実験の平均に対応する。エラーバーは、標準偏差に対応する。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８からのα−アミラーゼ分泌のための発現プラスミドｐＳＥＡ５を示す。プラスミドｐＳＥＡ５は、恒常性ｍｕｎＡプロモーターの下でｅｎｌＡリーダー配列に融合したα−アミラーゼからなる。この構築物の詳細は、材料および方法の節において示される。
【図４】図４は、野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３およびα−アミラーゼ分泌のためのｐＳＥＡ５を有する酸化的ストレス耐性ＬＡＢにより生成されるα−アミラーゼ活性を示す。好気性条件下での（ａ）細胞増殖、（ｂ）培養ｐＨ、（ｃ）およびα−アミラーゼ活性の変化。丸は、ＩＬ１４０３ｐＳＥＡ５を示す；三角は、ＩＬＳＯＤｐＳＥＡ５を示す；四角は、ＩＬＣＴＴｐＳＥＡ５を示す。各データ点は、三連の実験の平均に対応する。エラーバーは、標準偏差に対応する。
【図５】図５は、野生型Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３およびムンジチシンＫＳ遺伝子クラスターを含むｐＲＫ１を有する酸化的ストレス耐性ＬＡＢにより生成されるバクテリオシン活性を示す。好気性条件下での（ａ）細胞増殖、（ｂ）培養ｐＨ、（ｃ）およびα−アミラーゼ活性の変化。丸は、ＩＬ１４０３ｐＳＥＡ５を示す；三角は、ＩＬＳＯＤｐＳＥＡ５を示す；四角は、ＩＬＣＴＴｐＳＥＡ５を示す。各データ点は、三連の実験の平均に対応する。エラーバーは、標準偏差に対応する。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１は、カタラーゼの核酸配列である。
【００９９】
配列番号２は、カタラーゼのアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号３は、スーパーオキシドディスムターゼの核酸配列である。
【０１０１】
配列番号４は、スーパーオキシドディスムターゼのアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号５は、メタロチオネインの核酸配列である。
【０１０３】
配列番号６は、メタロチオネインのアミノ酸配列である。
【０１０４】
配列番号７は、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡの核酸配列である。
【０１０５】
配列番号８は、メチオニンスルホキシドリダクターゼＡのアミノ酸配列である。
【０１０６】
配列番号９は、グルタチオンペルオキシダーゼの核酸配列である。
【０１０７】
配列番号１０は、グルタチオンペルオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号１１は、lacZ5Fプライマーの核酸配列である。
【０１０９】
配列番号１２は、lacZ5Rプライマーの核酸配列である。
【０１１０】
配列番号１３は、lacZ3Fプライマーの核酸配列である。
【０１１１】
配列番号１４は、lacZ3Rプライマーの核酸配列である。
【０１１２】
配列番号１５は、thgAFプライマーの核酸配列である。
【０１１３】
配列番号１６は、galERプライマーの核酸配列である。
【０１１４】
配列番号１７は、munAプロモーター用核酸配列である。
【０１１５】
配列番号１８は、munAプロモーター用核酸配列である。
【０１１６】
配列番号１９は、ermFプライマーの核酸配列である。
【０１１７】
配列番号２０は、ermRプライマーの核酸配列である。
【０１１８】
配列番号２１は、SOD1Fプライマーの核酸配列である。
【０１１９】
配列番号２２は、SOD1Rプライマーの核酸配列である。
【０１２０】
配列番号２３は、CTT1Fプライマーの核酸配列である。
【０１２１】
配列番号２４は、CTT1Rプライマーの核酸配列である。
【０１２２】
配列番号２５は、ySOD1Fqtプライマーの核酸配列である。
【０１２３】
配列番号２６は、ySOD1Rqtプライマーの核酸配列である。
【０１２４】
配列番号２７は、yCTT1Fqtプライマーの核酸配列である。
【０１２５】
配列番号２８は、yCTT1Rqtプライマーの核酸配列である。
【０１２６】
配列番号２９は、munAp2プライマーの核酸配列である。
【０１２７】
配列番号３０は、munApRLプライマーの核酸配列である。
【０１２８】
配列番号３１は、munCTerFプライマーの核酸配列である。
【０１２９】
配列番号３２は、munCRプライマーの核酸配列である。
【０１３０】
配列番号３３は、enlAFSphプライマーの核酸配列である。
【０１３１】
配列番号３４は、enlARSalプライマーの核酸配列である。
【０１３２】
配列番号３５は、enlR1プライマーの核酸配列である。
【０１３３】
配列番号３６は、mcsF1プライマーの核酸配列である。
【０１３４】
配列番号３７は、AmyENプライマーの核酸配列である。
【０１３５】
配列番号３８は、AmyECプライマーの核酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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