(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性剤存在下で安定性を有する新規なコレステロールオキシダーゼおよび新規なコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールオキシダーゼは、３β−ヒドロキシステロイドと酸素の間の反応を触媒し、相当する３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する酸化酵素である。現在までに、体液中のコレステロール濃度の測定（例えば、特許文献１参照）、コレステロール誘導体の製造（例えば、特許文献２参照）、殺虫剤（例えば、特許文献３参照）、洗剤（例えば、特許文献４参照）等に利用することを目的として研究開発されている。
【０００３】
該酵素はストレプトマイセス（例えば、特許文献５参照）、ブレビバクテリウム（例えば、特許文献６参照）、ロドコッカス（例えば、特許文献７参照）、シュードモナス（例えば、特許文献８参照）等多種の微生物により生産されることが知られている。
【０００４】
バークホルデリア セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）菌株ＳＴ−２００｛旧分類ではPseudomonas sp. 菌株ＳＴ−２００であり、１９９８年２月４日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６１である。｝より単離されたコレステロールオキシダーゼ（例えば、特許文献９参照）は、今までに知られたコレステロールオキシダーゼと比較して、コレステロールを基質とした際の生成物が異なること、反応機構が異なること、高い有機溶剤耐性、温度安定性を持つなどの特徴がある。バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼは遺伝子がクローニングされ、様々な宿主において組換え体コレステロールオキシダーゼの高生産が、分泌、細胞内を問わず可能である(例えば、特許文献１０参照)。
【０００５】
臨床診断薬に使用する酵素に求められる特性は、多くの場合、対象物に対する高い反応性、特異性、製品としての保存安定性に影響する熱安定性などであるが、コレステロール測定においては、対象物を高い特異性で測定するために、高濃度で界面活性剤を処方することが多く、そのため使用する酵素には上記の特性のほかに界面活性剤共存下での保存安定性が強く求められている。バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼは、先に述べた優れた性質を持つものの、界面活性剤共存下での保存安定性に劣ることが、コレステロール測定試薬への応用を妨げていた。
【０００６】
コレステロール測定系で使用される界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤としては、１−ペンタンスルホン酸塩、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸塩（コール酸ナトリウム）、コール酸、デヒドロコール酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド、N,N-ビス-3-D-グルコンアミドプロピルコールアミド、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシンなどが用いられている（例えば、特許文献１１〜１７参照）。また、陽イオン系界面活性剤としては、n-ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド等が用いられている（例えば、特許文献１７参照）。
【０００７】
非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル、アルキルポリオキシエチレンエーテル、n-ドデシル-β-D-マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、n-オクチル-β-D-グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、n-オクチル-β-D-チオグルコシド、セチルエーテル(C16)、ラウリルエーテル（C12）、オレイルエーテル、ベヘニルエーテル（C20）、ポリオキシエチレンモノラウレート等が用いられている（例えば、特許文献１２〜２５参照）。
【０００８】
また、両性界面活性剤としては、ベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等が用いられている（例えば、特許文献１４，１７〜１９参照）。
【特許文献１】特開平６−１６９７６５号公報
【特許文献２】特開平６−１１３８８３号公報
【特許文献３】米国特許第５５５８８６２号明細書
【特許文献４】国際公開第８９／０９８１３号パンフレット
【特許文献５】特開昭６２−２８５７８９号公報
【特許文献６】特開平４−２１８３６７号公報
【特許文献７】特表平３−５０３４８７号公報
【特許文献８】特開平６−１８９７５４号公報
【特許文献９】特許第３２４１７１２号公報
【特許文献１０】特開２００２−６５２７１号公報
【特許文献１１】特開平８−１１６９９６号公報
【特許文献１２】特許第２７９９８３５号公報
【特許文献１３】特開平１１−５６３９５号公報
【特許文献１４】特開２０００−６０６００号公報
【特許文献１５】特開２００２−１４２７９９号公報
【特許文献１６】特許第３５２９０８１号公報
【特許文献１７】特開平１０−８４９９７号公報
【特許文献１８】特開２０００−３２５０９７号公報
【特許文献１９】特開２００１−１２４７８０号公報
【特許文献２０】特開２０００−１１６４００号公報
【特許文献２１】特開平９−２９９号公報
【特許文献２２】特開２００１−３４６５９８号公報
【特許文献２３】特開平９−２２４６９７号公報
【特許文献２４】特許第３１９３６３４号公報
【特許文献２５】特開平１０−２１０９９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような従来のバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼの有する欠点を克服し、界面活性剤処方下で高い安定性を有するコレステロールオキシダーゼおよびそれをコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載）の改変を行った結果、界面活性剤処方下で高い安定性を有する新規なコレステロールオキシダーゼが得られること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、
１）下記の理化学的性質を有し、界面活性剤に対する安定性が改善されたことを特徴とする新規なコレステロールオキシダーゼであり、
（ａ）作用及び基質特異性：コレステロールに作用して、コレスト‐５‐エン‐３‐オンに変換する；コレスト‐５‐エン‐３‐オンに作用してこれを６β‐パーヒドロキシコレスト‐４‐エン‐３‐オンに変換する。３β−ステロール類に作用し、３α−ヒドロキシステロイドには作用しない。
（ｂ）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子であり、
（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
５）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつ新規なコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、臨床診断用酵素として試薬中に処方する上で、より界面活性剤に対する安定性の高いコレステロールオキシダーゼおよびそれをコードする遺伝子が提供され、産業上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の新規なコレステロールオキシダーゼ（以下、「本発明オキシダーゼ」という）とは、下記の理化学的性質を有し、界面活性剤存在下での保存安定性が改善されたコレステロールオキシダーゼである。
（ａ）作用及び基質特異性：コレステロールに作用して、コレスト‐５‐エン‐３‐オンに変換する；コレスト‐５‐エン‐３‐オンに作用してこれを６β‐パーヒドロキシコレスト‐４‐エン‐３‐オンに変換する。３β−ステロール類に作用し、３α−ヒドロキシステロイドには作用しない。
（ｂ）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
常法により、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により求める。
【００１４】
このように、本発明オキシダーゼは、その理化学的性質において、公知の何れのコレステロールオキシダーゼとも異なっており、新規なコレステロールオキシダーゼである。従って、保存安定性の優れた臨床診断用酵素としてキット試薬中に処方することができる。
【００１５】
本発明オキシダーゼとしては、天然界よりスクリーニングして得られる種々の生物由来のオキシダーゼや従来公知のコレステロールオキシダーゼを改変して得られるオキシダーゼなどを挙げることができるが、例えば、一例として、以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）などの本発明オキシダーゼ等が挙げられる。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼ。
ここで「１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたことを意味する。また「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限がなく、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００１６】
本発明の新規なコレステロールオキシダーゼをコードするコレステロールオキシダーゼ遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）としては、例えば、上記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）などの本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や、さらに、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含む本発明オキシダーゼをコードする遺伝子等が挙げられる。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ中の連続する１５塩基以上、またはこれらに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ。
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Current Protocols in Molecular Biology  （WILEY Interscience，1989）等に記載されている方法に準じて行なうことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。本発明における、「全長又は塩基配列の１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡ」の相同性は、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００１７】
次に本発明オキシダーゼ及び本発明遺伝子の取得方法について説明する。
本発明オキシダーゼは、微生物や動物、植物起源の酵素を探索して、自然界より得ることができる。さらに、遺伝子工学的技術や変異処理などの方法を用い、本発明酵素と異なる理化学的性質を有するコレステロールオキシダーゼ（以下、「性質を異にするオキシダーゼ」という）を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることもできる。本発明でいう性質を異にするオキシダーゼとしては、先に述べた既知のオキシダーゼなどが挙げられるが、新たに探索して得られたコレステロールオキシダーゼや遺伝子工学的技術により改変して得られたコレステロールオキシダーゼなどでもよい。例えば、既知のオキシダーゼとしては、好ましくは、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（特許第３２４１７１２号、特開２００２−６５２７１号公報記載）などが挙げられる。上記コレステロールオキシダーゼは、本来はシグナル配列を持つ分泌たんぱく質であるが、シグナル配列を残したまま用いてもかまわないし、シグナル配列を除去して細胞内に生産してもかまわない。
【００１８】
性質を異にするオキシダーゼの理化学的性質を改変する方法としては、該オキシダーゼを生産する微生物などに、例えば、紫外線、Ｘ線、放射線などを照射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの変異誘発剤を接触させることにより、改変された本発明オキシダーゼを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明オキシダーゼを得る方法などが挙げられる。
【００１９】
しかし、一般的には、遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするオキシダーゼなどをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることができる。本発明に用いられる性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子としては、改変により本発明オキシダーゼを得ることのできる遺伝子であれば、如何なるコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子でも用いることができる。
【００２０】
本発明に用いる、性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、性質を異にするオキシダーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY Interscience，1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記性質を異にするオキシダーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。このようにして得られた性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載）などが挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来の性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡ（特開２００２−６５２７１号公報記載）から、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得られる。なお、本発明において用いることの出来るベクターＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなくそれ以外の、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることが出来る。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ+ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
【００２１】
次に、上記の方法で得られた性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより、本発明オキシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明においては、性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子が改変されることにより、その遺伝子により翻訳される性質を異にするオキシダーゼのアミノ酸配列が改変される。その結果、本発明オキシダーゼを含む、改変前の性質を異にするオキシダーゼと種々の性質の異なるコレステロールオキシダーゼが得られる。
【００２２】
改変に用いる性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様として、バークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来の性質を異にするオキシダーゼをコードする遺伝子（特開２００２−６５２７１号公報記載、配列番号３）などを挙げることができる。さらに、この遺伝子を宿主生物で発現させるのに適したようにアミノ酸残基を付加、欠失、置換しないように、又は付加、欠失、置換するように塩基配列を改変したものもあげることが出来る。
【００２３】
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前記の組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡ（特２００２−６５２７１号公報記載）に、ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触させる方法、またはＰＣＲ法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組換え体ＤＮＡを得る。この際、ｐＣｏｘ４ＤＮＡのコレステロールオキシダーゼのアミノ末端側のシグナル配列をコードする塩基配列を除去し、代わりに開始メチオニンをコードするATGを付加した組換え体ＤＮＡや、アミノ末端側をコードした塩基配列を大腸菌などの宿主生物で発現させるのに適した配列に置換した組換え体ＤＮＡを用いてもよい。
【００２４】
このようにして得られた種々の組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（共に東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ（株）製）等を形質転換又は形質導入し、種々の改変されたコレステロールオキシダーゼ遺伝子断片を保有する組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることが出来る。そして、例えば、形質転換体の場合、得られた形質転換体（その中に種々の変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドＤＮＡを含有している）より、目的の本発明の界面活性剤存在下での安定性を有する形質転換体（本発明オキシダーゼ生産株）を選抜する。
【００２５】
次に、本発明オキシダーゼ生産株を選抜するためには、例えば、次のような方法を用いることができる。先ず、得られた上記形質転換体のコロニーを滅菌したＬＢ液体培地を入れ、アンピシリンを添加した滅菌済み９６穴プレートに植え継ぎ培養する。十分に生育した後、リゾチームなどの溶菌剤を添加し、３７℃で１時間ほど静置し、溶菌させる。溶菌したら、適切な界面活性剤を含んだ０．２％牛血清アルブミンを含んだ０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を５０μＬ各セルに入れた９６穴プレートの対応したセルに、溶菌した培養液を５０μＬ加え懸濁し、３７℃、５時間処理する。その後、基質であるコレステロール、トリトンX−１００、コール酸ナトリウム、ペルオキシダーゼ、フェノール、４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ加え懸濁し、赤紫色の発色の度合いを観察する。改変前の性質を異にするオキシダーゼ生産株についても同様の工程で発色試験を行い、その比較により目的とする形質転換体を選抜する。
【００２６】
使用する界面活性剤は、先に述べたコレステロール測定系に用いられる界面活性剤であればどのようなものでもかまわないが、望ましくは陰イオン系界面活性剤としては、１−ペンタンスルホン酸塩、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（商品名、エマール２０Ｃ、エマールＮＣ−３５（以上花王製））、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸塩（コール酸ナトリウム）、コール酸、デヒドロコール酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド、N,N-ビス-3-D-グルコンアミドプロピルコールアミド、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシン等、また陽イオン系界面活性剤としては、n-ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド等、また非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（商品名、エマルゲン２２０、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０８、エマルゲン４０８など（以上花王製））、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（商品名、エマルゲン９０３、エマルゲン９０９、エマルゲン９１３など（以上花王製））、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（商品名、プルロニックＦ８８（旭電化製））、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商品名、Ｔｗｅｅｎ２１、Ｔｗｅｅｎ８１、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８５、Ｅｍａｓｏｌ４１３０など）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（商品名、ＡｔｌａｓＧ２１２７、Ｂｒｉｊ３６Ｔ、Ｂｒｉｊ５６など）、n-ドデシル-β-D-マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名、エマルゲン１２０など）、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル（商品名、エマルゲンＡ６０など）、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル（商品名、エマルゲンＢ６６など）、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテル（商品名、ＴｒｉｏｔｏｎＸ１００）、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル（商品名、エマルゲン７０５、エマルゲン７０９など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、n-オクチル-β-D-グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、n-オクチル-β-D-チオグルコシド、セチルエーテル(C16)、ラウリルエーテル（C12）、オレイルエーテル、ベヘニルエーテル（C20）、ポリオキシエチレンモノラウレート等、また両性界面活性剤としては、ベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等であることが望ましく、特に非イオン系界面活性剤であることがより一層望ましい。
【００２７】
この様にして本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体を得ることができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するバークホルデリア セパシア菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（特許第３２４１７１２号公報）について、上記改変方法を用いて得られた、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む本発明オキシダーゼなどを挙げることができる。さらに必要により、この本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体を用い、本発明遺伝子を、上記した改変方法により、さらに改変を繰り返し行なうことにより、さらに界面活性剤に対する安定性の高い改変された本発明オキシダーゼ及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。すなわち本発明においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼなども本発明オキシダーゼに含まれる。例えば、具体的には、後述の実施例に示す本発明オキシダーゼ（Ｒ７）などを挙げることができる。Ｒ７は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から３アミノ酸残基が置換されており、９０％以上の相同性を有している。また、このようにして得られた本発明オキシダーゼを生産する形質転換体の一例としては、界面活性剤共存下での残存活性率が８０％になった配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む本発明オキシダーゼ（Ｒ１）生産大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＣＰ１）を挙げることができる。
【００２８】
また本発明遺伝子の一例として、上記した本発明オキシダーゼ（Ｒ１）遺伝子（配列番号６）を挙げることができる。配列番号５をコードする配列番号６を含む遺伝子を含むプラスミドｐＮＣＰ１は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３４３として寄託されている。さらに本発明遺伝子として、配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼおよび配列番号２又は５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むコレステロールオキシダーゼなどの本発明オキシダーゼをコードする遺伝子や、さらに、配列番号４又は６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分、又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡや配列番号４又は６で表される塩基配列の全長又は１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡを含む本発明オキシダーゼをコードする遺伝子等が挙げられる。「１５残基以上の部分」の具体的な例としては、配列番号６の部分配列である４〜１８６塩基の塩基配列などが挙げられる。また配列番号４の１３０〜３１２塩基の塩基配列を配列番号６の４〜１８６塩基の塩基配列と交換したものも配列番号２のアミノ酸配列をコードしており、８０％以上の相同性を示す塩基配列を含むＤＮＡの例としてあげる事が出来る。
【００２９】
次に、本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物より該コレステロールオキシダーゼを採取することにより本発明オキシダーゼを製造する。本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物であれば、いかなる微生物も本発明オキシダーゼの製造に用いることができる。例えば、上記のようにして得られた本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体などが挙げられる。例えば、本発明オキシダーゼ生産能を有する、好ましくはエッシェリシア属に属する形質転換株を用いて本発明オキシダーゼを生産することができる。上記微生物を培養するには、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液などの１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガンなどの無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミンなどを適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、６〜９に調製するのが適当である。また培養は、２０〜４２℃、好ましくは２５℃前後で１０〜４０時間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明オキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることが出来る。培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明オキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることも出来るが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などにより、菌体から本発明オキシダーゼを採取するのが好ましい。
【００３０】
このようにして得られた粗酵素液から本発明オキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。このようにして、本発明オキシダーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。また、上記精製方法を適宜組合わせて、用途に応じた精製度合いの異なる酵素標品を調整することもできる。
【００３１】
本発明オキシダーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。以下、本発明酵素の活性測定には、ことわりのない限り、コレステロールを基質として用いる。なお、酵素力価は、コレステロールを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：コレステロール溶液
５．０ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００に５００ｍｇのコレステロール（和光純薬製）を添加し、ヒーター上で攪拌溶解する。これに９０ｍｌのイオン交換水を添加後、煮沸後、氷上で冷却し、４．０ｇのコール酸ナトリウム（ナカライテスク製）を添加し、溶解した後、１００ｍｌに定容する。
（２）試薬２：６．０％フェノール溶液
フェノール６．０ｇをイオン交換水に溶解して１００ｍｌにする。
（３）試薬３：０．１５％ペルオキシダーゼ溶液
１５０ｍｇを１００ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。
（４）試薬４：４−アミノアンチピリン溶液
１．７６ｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
Ｂ．測定法
４．０ｍｌの試薬１と５１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合した後、２．０ｍｌの試薬２、２．０ｍｌの試薬３、１．０ｍｌの試薬４を順に加え、混合する。これを３．０ｍｌずつ試験管に分注し、氷冷保存する。測定時は、３．０ｍｌを３７℃で５分加温し、５０μｌの酵素液を加え混和し、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立社製）により、５００ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値（ΔODtest）は、５００ｎｍにおける２分後から４分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液（ΔODblank）は、酵素液の代わりに５０μｌの０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）とした。
【００３２】
【数１】
0005240970.tif 000002
１３．７８：上記の測定条件下でのミリモル分子吸光係数（cm2/micromole）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の２分子から形成するQuinoneimine色素は１分子であることによる係数。
１．０：光路長(cm)
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明で得られるコレステロールオキシダーゼ遺伝子を用い、低基質（コレステロール）濃度でも高い活性を示し、幅広いｐＨで作用しさらに熱安定性に優れているコレステロールオキシダーゼを安価に提供できる。該コレステロールオキシダーゼは界面活性剤に対する安定性が改善されており、体液や食品中でのコレステロールの測定に特に適するものである。また、有機溶媒重層下において強く活性化されることから、コレステロール類の酵素変換を効率的に行える特徴を有している。その他、本酵素を経口的に摂取させることにより殺虫剤としても使用でき、コレステロール類で汚染した衣類等の洗剤として使用することもできる。
【００３４】
以下に、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（Ａ）組換え体プラスミドの調製
性質を異にするオキシダーゼ遺伝子（配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）を有する組換え体プラスミドＤＮＡ、およびこの遺伝子の大腸菌における発現量を増加させるために本遺伝子のうちアミノ末端をコードする領域の塩基配列を大腸菌のコドンユセージに合うように改変したオキシダーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。以後に述べる本発明オキシダーゼを作製するに当たっては、何れの組換え体プラスミドＤＮＡを用いてもよいが、改変したオキシダーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドＤＮＡを用いることが、本発明オキシダーゼを大量に製造する上で有効である。
（１）組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡの調製
上述のオキシダーゼ遺伝子（配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）の組換え体プラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ｐＣｏｘ４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８００２）を、ＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、０．２５％ＮａＣｌ）２０ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し培養物を得た。この培養物を７０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡを抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＣｏｘ４ＤＮＡを１００μｇ得た。
（２）アミノ末端側塩基配列を改変した組換え体プラスミドｐＮＣＯＰＤＮＡの調製
配列番号６の部分配列である配列番号７〜１４に記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをシグマジェノシス社の受託合成サービスにより入手した。配列番号７〜１４のそれぞれをT4 Polynucleotide kinase（宝酒造社製）を用いてリン酸化する。一方、配列番号１を持つｐＣｏｘ４ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５、１６をプライマーとしてEx Taq polymerase（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃ末端側をコードする遺伝子断片を調製した。さらに、本断片をNdeI（第一化学薬品社製）、NspI（第一化学薬品社製）で処理した。さらにｐＫＦ１９ｋＤＮＡをNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（宝酒造社製試薬を使用）により脱リン酸化を行なった。こうして得られたリン酸化オリゴヌクレオチドのうち、８本のリン酸化オリゴヌクレオチド、ｐＣｏｘ４ＤＮＡ由来遺伝子断片、ｐＫＦ１９ｋ断片を適量混合し、Ligation Kit ver.2（宝酒造社製）を利用しライゲーションし、得られたプラスミドをｐＮＣＯＰと命名した。続いて、（１）に記載の方法によりｐＮＣＯＰ  ＤＮＡを１００μｇ調製した。
【００３６】
（Ｂ）本発明オキシダーゼ及び本発明オキシダーゼ生産能を有する形質転換株の作製
（１）改変操作（変異の導入）
上記組換え体プラスミド、ｐＮＣＯＰＤＮＡを鋳型としてプライマーとして配列番号１７、２５を用いてＰＣＲ法を実施した。この際、反応系に１０％のＤＭＳＯを添加することで増幅のミスを誘発させ、変異を導入した。このようにして得たＤＮＡ断片を制限酵素NdeIで処理した後、プラスミドpKF19kを同じくNdeIで処理した後、ＢＡＰ処理（宝酒造社製試薬を使用）により脱リン酸化を行なったものと混合し、Ligation Kit ver.2（宝酒造社製）を利用しライゲーションし、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って大腸菌ＪＭ１０９(東洋紡社製)を形質転換し、約２５００株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。
（２）本発明オキシダーゼ生産株の選抜
まず、得られた上記形質転換体の全てを１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだ滅菌済みＬＢ培地を１００μｌずつ各セルに含んだ９６穴プレートに植ぐ。各プレートのうち１セルは、ｐＮＣＯＰを保持したＪＭ１０９を植え、ネガティブコントロールとする。２５℃で２４時間培養した。こうして得られた培養液を−８０℃のフリーザーにプレートごと１時間入れて溶菌させる。その後、１００μｌの１０％エマルゲン９１３を含んだ０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）とプレート上で混合し、３７℃、５時間静置する。その後、各処理液５０μｌをとって下記の組成の反応試薬５０μｌと混ぜ合わせ反応させ、ネガティブコントロールと比較して発色の増加しているものを選択する。
１５ｍｌ  コレステロール溶液
５．０ｍのＴｒｉｔｏｎＸ−１００に５００ｍｇのコレステロール（和光純薬製）を添加し、ヒーター上で攪拌溶解する。これに９０ｍｌのイオン交換水を添加後、煮沸後、氷上で冷却し、４．０4ｇのコール酸ナトリウム（ナカライテスク製）を添加し、溶解した後、１００ｍｌに定容する。
１７．５ｍｌ  ０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０
３．５ｍｌ  １．７６％４−アミノアンチピリン溶液
７ｍｌ  ６％フェノール水溶液
７ｍｌ  ０．１５％ペルオキシダーゼ溶液
１５０ｍｇを１００ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。
ここで選択された発色した１０株について２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇカナマイシン添加）で液体培養し、プラスミドに含まれる改変されたコレステロールオキシダーゼを生産させた。培養後、得られた培養物を超音波破砕し、８０００ｒｐｍで５分間遠心して得たその粗酵素抽出液０．５ｍｌを０．５ｍｌの１０％エマルゲン９１３を含有する０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混ぜ、３７℃で一晩反応させた。この反応液と未処理の粗酵素液の２倍希釈液の活性を測定し、活性残存率（反応液の活性／未処理の粗酵素抽出液の活性）を算出した。同様にして培養、抽出、熱処理をし、活性測定をした改変前の性質を異にするオキシダーゼと活性残存率の比較を行い、活性残存率が４０％から８０％に向上した改変されたコレステロールオキシダーゼとその生産大腸菌３株を得た。そのうちの１種（Ｒ１）遺伝子をコードするプラスミドｐＮＣＰ１を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３４３として寄託した。
（３）改変の起こった部位の同定
改変されたコレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを回収し、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡ解析システム（ベックマンコールター社製）を用いて塩基配列を決定し、それを元に改変されたアミノ酸残基の同定を行った。
これにより、本発明オキシダーゼ（Ｒ１）は、配列番号１に表されるアミノ酸配列において配列番号２に示すように、１７５番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されていることが分かった。これは、配列番号５においては１３３番目に相当する。同様に本発明オキシダーゼ（Ｒ７）では、配列番号１に表されるアミノ酸配列において、１７３番目のプロリンがロイシンに、２２０番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されていることが分かった。また、これらは配列番号５においてはそれぞれ１３１番目、１７８番目に相当する部位の変異である。
（４）変異点の分離と組み合わせ
これらの変異点をそれぞれ単独で導入してみた。即ち、ｐＮＣＯＰ  ＤＮＡに配列番号１７，１８（配列番号５の１３３番目をアスパラギン酸がアスパラギンに置換するようにデザインされている）の配列をプライマーとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動にてプラスミドの全長に相当するＤＮＡ断片の増幅を確認し、制限酵素ＤｐｎＩ（メチル化したＤＮＡに作用する；第一化学薬品製）で処理した後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、カナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。生育してきたコロニーをカナマイシン入りの液体培地で培養し、コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを回収し、塩基配列を確認し目的どおりの変異が導入されていることを確認する。配列番号５の１３１番目（プロリンをロイシンに置換）、１７８番目（アスパラギン酸をグルタミン酸に置換）についても１３１番目については配列番号１９，２０を、１７８番目については配列番号２１，２２を代わりに用いて同様の方法で、部位特異的変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を得た。さらに、ここで得られた部位特異的変異コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを鋳型に２重変異体コレステロールオキシダーゼ遺伝子を得た。この際、１３１番目と１３３番目の変異点は近接しているため、配列番号２３，２４を用いて行った。さらに３重変異体コレステロールオキシダーゼ遺伝子を保持するプラスミドを得た。
（５）変異点と界面活性剤耐性
上記で得た変異点の異なる変異型コレステロールオキシダーゼ遺伝子をもつプラスミドを保持した大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ添加ＬＢ−カナマイシン培地１０ｍｌで３０℃、２４時間攪拌培養し、得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して集菌し、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ懸濁した。その後、超音波により菌体を破砕し、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収した。これらの粗酵素抽出液２００μｌを２００μｌの２％エマルゲン９１３入り０．２％牛血清アルブミン含有１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、３０℃、７日間静置し、界面活性剤未処方で３０℃、７日間静置したものと酵素活性の残存率を比較した（表１）。
【００３７】
【表１】
0005240970.tif 000003
P131L変異は、131位のプロリンをロイシンに置換したもの。
D133N変異は、133位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したもの。
D178E変異は、178位のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したもの。
さらに、エマルゲン９１３に対する安定化効果の認められた変異型コレステロールオキシダーゼについて他の界面活性剤（エマルゲン１２０、エマール２０Ｃ、エマール２０ＣＭ）に対する保存安定性を検討した。条件は前試験に準じ、それぞれ粗酵素抽出液２００μｌを２００μｌの２％界面活性剤入り０．２％牛血清アルブミン含有１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、３０℃、３日間静置により行った（表２）。
【００３８】
【表２】
0005240970.tif 000004
【００３９】
（Ｃ）本発明オキシダーゼの生産及びその理化学的性質
上記のようにして得られた本発明オキシダーゼ（Ｒ１）を生産する形質転換体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＣＰ１）を１ｍＭ  ＩＰＴＧ入りＬＢ−カナマイシン培地１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度６００ｒｐｍの条件で、３０℃、２４時間攪拌培養した。得られた培養液１０Ｌを７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁した。その後、超音波により菌体を破砕し、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素液とした。この粗酵素液を６０℃、３０分熱処理を行い、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈後、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収する。これを限外膜ＡＩＰ−２０１３（旭化成製）で５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）に透析し、５００ｍｌに濃縮する。その後、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で平衡化した２００ｍｌのＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０に懸濁し、ろ液と２００ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で洗いこんだものを活性画分として回収する。回収した本発明オキシダーゼ（Ｒ１）の比活性は４．０Ｕ／Ａ２８０であった。
【００４０】
得られた本発明オキシダーゼ（Ｒ１）の理化学的性質は、下記の通りであった。
（１）作用
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてコレステロールに対する反応を確認した。
（２）示適ｐＨ
緩衝液として、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５〜６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．２２）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５８〜９．５）、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４３〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行った結果、その相対活性は、図１に示す通りであった。図１より、本発明オキシダーゼの示適ｐＨは６．５〜８．０であることが判かった。
（３）作用適温の範囲
前述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った結果、図２に示す通りであった。図２より、本発明オキシダーゼの作用適温の範囲は、５５〜６５℃であった。
（４）安定ｐＨ範囲
緩衝液として、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．２２）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５８〜９．５）、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．４３〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、２５℃で２０時間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性を測定した結果、図３に示す通りであった。図３より、安定ｐＨ範囲は、ｐＨ３．５〜８．５であった。
（５）熱安定性
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、各温度で１５分間処理した場合の熱安定性の結果は、図４に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、７０℃付近まで安定であった。
（６）分子量
常法により、マルチゲル１０／２０（第一科学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。約６０，０００であった。
（７）界面活性剤耐性
もとのバークホルデリア セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）菌株ＳＴ−２００由来のコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ（ＷＴ））と界面活性剤に対する安定性を比較した。それぞれ２％の界面活性剤を含む０．２％牛血清アルブミン入り１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）と２Ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼを等量混合し、３７℃で２４時間保存したものである（表３）。
【００４１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明オキシダーゼの示適ｐＨを示す図。
【図２】本発明オキシダーゼの作用適温の範囲を示す図。
【図３】本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。
【図４】本発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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