(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)に記載のDNAとその下流に配置された遺伝子とを含むベクター（但し、オボアルブミン遺伝子の-3119〜-3793の領域を含むベクターを除く）、
(a)配列番号１に記載の塩基配列で表されるDNA、
(b)配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列で表され、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)に記載のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的の遺伝子を含むベクター（但し、オボアルブミン遺伝子の-3119〜-3793の領域を含むベクターを除く）を、動物（ヒトを除く）の卵管の細胞に導入することを特徴とする遺伝子の卵管特異的発現方法、
(a)配列番号１に記載の塩基配列で表されるDNA、
(b)配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列で表され、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA。
【請求項３】
動物が、鳥類である請求項２に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【請求項４】
鳥類が、家禽類である請求項３に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【請求項５】
家禽類が、ニワトリである請求項４に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【請求項６】
以下の工程を含むことを特徴とするタンパク質の生産方法、
（１）以下の(a)又は(b)に記載のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（但し、オボアルブミン遺伝子の-3119〜-3793の領域を含むベクターを除く）を、卵生動物の卵管の細胞に導入する工程、
(a)配列番号１に記載の塩基配列で表されるDNA、
(b)配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列で表され、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA、
（２）卵生動物の卵の卵白から目的のタンパク質を採取する工程。
【請求項７】
卵生動物が、鳥類である請求項６に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項８】
鳥類が、家禽類である請求項７に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
家禽類が、ニワトリである請求項８に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵管特異的な遺伝子発現を誘導するDNA、そのDNAを含むベクター、そのDNAを利用した遺伝子の卵管特異的発現方法、及びそのDNAを利用したタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、動物をバイオリアクターとして利用し、動物にタンパク質製剤などを生産させる試みがなされている。例えば、GTC Biotherapeutics社は、遺伝子の乳腺特異的発現を誘導するDNAとアンチトロンビン遺伝子を導入したトランスジェニックヤギを作製し、そのヤギのミルク中にアンチトロンビンを分泌させる研究を進めている。また、PPL pharmaceuticals社は、同様な手法により、ウシのミルク中にα-1アンチトリプシンを分泌させる方法を提案している。
【０００３】
ニワトリは、ヤギやウシのようにミルクを出さないが、多量のタンパク質を含む卵を産む。従って、目的のタンパク質を卵白中に分泌させることにより、ニワトリもバイオリアクターとして利用可能である。
【０００４】
しかし、目的のタンパク質の遺伝子だけをニワトリに導入したのでは、遺伝子は組織非特異的に発現し、卵管の発現量が不十分となり、また、遺伝子が望ましくない部位で発現することにより、ニワトリの生命機能を損なう可能性がある。従って、ニワトリをバイオリアクターとして利用していくためには、遺伝子を卵管特異的に発現させることが必要である。
【０００５】
以前から卵管特異的な遺伝子発現を誘導するDNAに関しては幾つか報告がある。例えば、特許文献１は、卵白アルブミンプロモーター領域のセグメントが、鳥卵管の管状腺での遺伝子発現を誘導することを報告している。また、特許文献２は、トランスジェニック鳥類においてオボアルブミンのプロモーター中の卵管特異的に発現させる領域を用いてヒト生長ホルモンを生産できることを報告している。
【０００６】
【特許文献１】特表2001-520009号公報
【特許文献２】特開2004-236626号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、目的の遺伝子を卵管特異的に発現させる新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ニワトリのオボアルブミン遺伝子の6000塩基上流付近の配列が、エストロジェンの存在下で、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つことを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１０〕を提供するものである。
【００１０】
〔１〕以下の(a)〜(c)に示すDNA、
(a)配列番号１に記載の塩基配列で表されるDNA、
(b)配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列で表され、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA、
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA。
【００１１】
〔２〕〔１〕に記載のDNAとその下流に配置された遺伝子とを含むベクター。
【００１２】
〔３〕〔１〕に記載のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的の遺伝子を含むベクターを、動物の卵管の細胞に導入することを特徴とする遺伝子の卵管特異的発現方法。
【００１３】
〔４〕動物が、鳥類である〔３〕に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【００１４】
〔５〕鳥類が、家禽類である〔４〕に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【００１５】
〔６〕家禽類が、ニワトリである〔５〕に記載の遺伝子の卵管特異的発現方法。
【００１６】
〔７〕以下の工程を含むことを特徴とするタンパク質の生産方法、
（１）〔１〕に記載のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、卵生動物の卵管の細胞に導入する工程、
（２）卵生動物の卵の卵白から目的のタンパク質を採取する工程。
【００１７】
〔８〕卵生動物が、鳥類である〔７〕に記載のタンパク質の生産方法。
【００１８】
〔９〕鳥類が、家禽類である〔８〕に記載のタンパク質の生産方法。
【００１９】
〔１０〕家禽類が、ニワトリである〔９〕に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のDNAを用いることにより、任意のタンパク質をコードする遺伝子を卵管特異的に発現させ、そのタンパク質を卵白中に分泌させることができる。従って、本発明のDNAを利用することにより、タンパク質の効率的な生産が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明のDNAは、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つものであり、このDNAには、(a)配列番号１に記載の塩基配列で表されるDNA、(b)配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列で表され、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNA、(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能を持つDNAが含まれる。
【００２３】
(a)のDNAは、ニワトリのオボアルブミン遺伝子の上流領域から本発明者によって実際に取得されたDNAであり、実施例中に記載した「新規領域2」のDNAである。
【００２４】
(b)のDNAは、(a)のDNAに、(a)のDNAの機能（即ち、下流に配置された遺伝子を卵管特異的に発現させ得る機能）を失わせない程度の変異が導入されたDNAである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異した塩基の数は、前記した機能を失わせない限り、その塩基数は制限されないが、通常は、10塩基以内であり、好ましくは5塩基以内であり、更に好ましくは3塩基以内であり、最も好ましくは1塩基である。
【００２５】
(c)のDNAは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる(a)と同様の機能を持つDNAである。(c)のDNAにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性を指す。
【００２６】
本発明のDNA以外にも、卵管特異的な遺伝子発現を誘導するDNAは知られている。例えば、前述した特許文献１や特許文献２に開示されているDNAである。しかし、これらのDNAは、以下に述べるように本発明のDNAとは異なるものである。
【００２７】
特許文献１には、卵管特異的な遺伝子発現を誘導するDNAとして、卵白アルブミン遺伝子（オボアルブミン遺伝子）の転写開始点からその上流7.4kbまでの領域（-7400〜0）が記載されている（「００２２」、「００６２」、図１）。一方、本発明の(a)のDNAは、-5800〜-6200の領域であり、引用文献１のDNAに含まれるが、領域としては異なっている。また、特許文献１のDNAは、本発明の(a)のDNAの下流領域を含んでいるという点で、後述する実施例にある「6666塩基配列」（-6657〜+9）と同様の性質を持つと考えられる。この「6666塩基配列」は、卵管特異的な遺伝子発現を誘導する作用を持つものの、その作用は本発明の(a)のDNA（新規領域2)よりも弱い。従って、特許文献１のDNAの卵管特異的な遺伝子発現誘導作用も、本発明の(a)のDNAよりも劣るものと推定される。
【００２８】
特許文献２には、卵管特異的に発現させる領域としてオボアルブミン遺伝子のエキソン１の上流3.8kbまでを含む領域を使用したという記載がある（「００３５」）。本発明の(a)のDNAは、オボアルブミン遺伝子の転写開始点より少なくとも5800塩基上流に存在し、また、オボアルブミン遺伝子の転写開始点は、エキソン１よりも上流に存在する。従って、特許文献２における卵管特異的に発現させる領域には、本発明の(a)のDNAが含まれないことは明らかである。
【００２９】
本発明のベクターは、本発明のDNAと遺伝子とを含むものであり、遺伝子は本発明のDNAの下流に配置されている。
【００３０】
ベクター中に含まれる遺伝子はどのようなものでもよいが、本発明のベクターは、主として医薬として利用可能なタンパク質の生産に利用されるので、医薬として利用可能なタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。具体的には、サイトカイン、成長・増殖因子、モノクローン抗体、ワクチン、インスリン、酵素、血液凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球増殖因子、エリスロポエチンなどのタンパク質をコードする遺伝子を例示できる。
【００３１】
本発明のベクターは、通常、本発明のDNAと遺伝子のほかに、プロモーターを含む。プロモーターは、本発明のDNAと遺伝子の間に配置される。プロモーターとしては、cis-acting 制御エレメントであるエンハンサーの助け無しでは機能しないのであればどのようなものでもよく、通常、卵管特異的に発現する遺伝子、例えば、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボグロブリン、リゾチームなどのプロモーターなどを使用することができる。それ以外に、他の組織特異的に発現する遺伝子、たとえば、MyoD、Cbfa1、THP (Uromodulin)などがある。
【００３２】
本発明の遺伝子の卵管特異的発現方法は、本発明のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的の遺伝子を含むベクターを、動物の卵管の細胞に導入することを特徴とするものである。
【００３３】
使用する遺伝子及びプロモーターは、本発明のベクターで使用するものと同様のものでよい。使用する動物は特に限定されないが、卵生動物であることが好ましく、鳥類であることが更に好ましく、ニワトリ、ウズラ、アヒル、七面鳥等の家禽類であることが特に好ましく、ニワトリであることが最も好ましい。卵管の細胞へのベクターの導入は、常法に従って行えばよく、例えば、実施例と同様に超音波を用いて行なうことができる。
【００３４】
本発明のタンパク質の生産方法は、（１）本発明のDNA、及びその下流に配置されたプロモーターと目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、卵生動物の卵管の細胞に導入する工程と、（２）卵生動物の卵の卵白から目的のタンパク質を採取する工程とを含むことを特徴とするものである。
【００３５】
使用する遺伝子及びプロモーターは、本発明のベクターで使用するものと同様のものでよい。使用する卵生動物は特に限定されないが、鳥類であることが好ましく、ニワトリ、ウズラ、アヒル、七面鳥等の家禽類であることが更に好ましく、ニワトリであることが最も好ましい。卵管の細胞へのベクターの導入及び卵白からの目的タンパク質の採取は、常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３７】
〔実験方法〕
候補遺伝子発現制御塩基配列の同定のためのDNAコンストラクトの構築
家禽類の卵管で特異的に、かつ体液中のエストロジェンの上昇に応答して標的となる遺伝子を発現させる塩基配列を探索するのが目的である。このモデルとして家禽類の卵白中に分泌されるオボアルブミンの遺伝子を選択した。発現制御塩基配列は遺伝子本体の上流、ないしは下流に存在し、その位置は数百塩基から、場合によっては数万塩基離れている可能性もある。探索の戦略としては、既知の制御領域がプロモーターの上流 -88〜-308（NRE領域）、 -785〜-900（SDRE領域）、-3119〜-3793（ERE領域）に存在することが知られているから、これらの領域とそれ以外のプロモーター上流に位置する新規領域において上記の条件を満たす最小塩基配列の探索を行った。
【００３８】
最初のステップでは単冠白色レグホン（雌）の血液からタンパク質を除去した後、フェノール・クロロフォルムでニワトリゲノムDNAを抽出した。その後、精製したDNAをポリメレース・チェイン反応（PCR）の鋳型として、ロングPCR法を用いて、6666塩基からなるオボアルブミン遺伝子プロモーター上流領域（nt -6657〜+9）を複写、増幅した。この塩基配列はプラスミド、pCRII-TOPO-ov6666として保存し、この後のDNAコンストラクトの作製に利用した。この領域をプロモーターに近い領域から、既知のNRE領域（221bp）とSDRE領域（116bp）、新領域1（2200bp）、ERE領域（675bp）、新領域2（401bp）と分割した。これらの領域と全領域（6666bp）をオボアルブミンプロモーター・リポーター遺伝子に連結して発現ベクターを作製し、個々の領域（塩基配列）の卵管様細胞でエストロジェン環境での遺伝子活性化能力を評価した。リポーター遺伝子としてはEGFP遺伝子を用い、卵管様細胞としてはニワトリ由来LMH細胞株を用いて評価した。この選抜過程で条件を一番良く満たす塩基配列領域は次のステージである単冠白色レグホン産卵鶏の卵管において評価し、生体での遺伝子発現制御機能を確認した。
【００３９】
検索DNAコンストラクトとしては、プロモーター近接領域（-87〜+9）をEGFP遺伝子領域に連結した基盤コンストラクトがある。プロモーター近接領域（-87〜+9）は上記のプラスミド、pCRII-TOPO-ov6666を鋳型として、PCRで複写・増幅した。このコンストラクトではLMH細胞株を用いた実験でEGFP遺伝子を活性化させないこと、つまり、細胞にこのコンストラクトを導入した場合に緑色蛍光を発しないことが確認され、以後の実験ではブランク値として利用した。
【００４０】
同様にNRE領域とSDRE領域、新領域1（2200bp）、ERE領域（675bp）、新領域2（401bp）の塩基配列をpCRII-TOPO-ov6666を鋳型として、PCRで複写・増幅した。単独の塩基配列領域以外に、塩基配列領域の組み合わせをも作製し、プロモーター近接領域（-87〜+9）、EGFP遺伝子領域に連結して、総計16種類のDNAコンストラクトを作製し、評価・選抜に用いた。
【００４１】
卵管様細胞でのエストロジェン応答性遺伝子活性化
上記のDNAコンストラクトを、リポフェクション法でトランスフェクトすることでニワトリ由来LMH細胞株（（独）医薬基盤研究所、ロット＃  JCRB0237）に導入し、遺伝子活性化能力を評価した。エストロジェン応答性を検討するために、細胞をβ−エストラジオール（濃度：1x10-7 M）存在下、それに加えて、実験コントロール（対照区）としてのステロイドホルモン不在、ステロイドコントロールとしてコルチコステロン（濃度：1x10-6 M）存在下にて培養し、実験を行った。細胞はWaymouth’s MB752/1に10% 胎児性仔牛血清、100μg/ml ペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを加えた培地にて37℃で培養した。リポフェクションにはLipofectamine reagent（Invitrogen）と Plus reagent（Invitrogen）を用い、5 X 104細胞を2.75 x 10-14モルDNAで200μlの培地を含む培養ウエルにてトランスフェクトした。トランスフェクションしてから24時間後にEGFP遺伝子発現による緑色蛍光をマルチラベルカウンターで励起波長の485nmと発光波長の535nmで測定し、遺伝子活性化の指標とした。すべての測定値はプロモーター近接領域（-87〜+9）からなる基盤コンストラクトをブランク値として補正した。細胞実験は14回繰り返し、実験区のデータとしては個々の実験での平均値を1データとし、総計14データで統計処理を行った。
【００４２】
産卵鶏卵管での候補遺伝子制御塩基配列の機能確認
卵管様細胞において強いエストロジェン応答性を示した塩基配列は標的となる動物・器官での機能性の確認が行われた。本実験では、対象となる塩基配列が産卵中のニワトリの卵管細胞に導入された場合、プロモーター近接領域（-87〜+9）に連結したEGFP遺伝子の活性化を誘導し、他の組織・器官では活性化を誘導しないとの確認を行った。細胞実験（in vitro 実験）は生体（in vivo）での反応をシミュレートするモデルシステムであり、in vitro 実験の結果は必ずしもin vivoで再現できるとは限らない。実用的な側面からも、本発明の塩基配列が産卵中のニワトリの卵管でのみ機能することを証明する必要がある。
【００４３】
実験に用いた動物は6ヶ月令の単冠白色レグホン産卵鶏である。尺骨静脈中へのネンブタール注射で麻酔し、供試鶏の左側下腹部を約3cm切開し、卵管を露出し、40μgのDNAコンストラクトを卵管壁に注射し、その部位を6mmプローブで2.5W/cm2の強度で5分間超音波を照射した。その24時間後に開腹部位を再切開し、卵管を摘出して、注射部位の組織を採集してパラフィン切片を作製した。対照区として、腸管と胸筋を同様に処理した。
【００４４】
本実験では卵管特異的遺伝子発現の誘導を目的としているので、ポジティブコントロールとして、プラスミド、pCXを用いた。このDNAコンストラクトはウイルス由来のCMVエンハンサーがニワトリ・β−アクチンプロモーターとEGFP遺伝子に連結した発現ベクターであり、細胞に導入されると卵管、腸管、胸筋などで組織非特異的に発現する。
【００４５】
卵管、腸管、胸筋組織でのEGFP遺伝子の発現は組織切片の免疫染色にて探知した。採集された組織はパラフィン切片とし、二抗体法で蛍光染色した。一次抗体にはmouse anti-GFPモノクローン抗体、二次抗体にはAlexa Flour 488と複合したgoat anti-mouse IgGを用い、緑色蛍光を励起波長の495 nm、発光波長の519 nmで探知した。
【００４６】
〔実験結果〕
卵管様細胞、LMH株でのエストロジェン応答性遺伝子活性化
LMH細胞株での既知の制御領域であるNRE（999bp, nt. -88〜-308）、SDRE（675bp, nt. -785〜-900）による遺伝子活性化の実験結果は表1にまとめてある。
【００４７】
【表１】
0005152708.tif 000002
表１に示すように、培地にホルモンの存在しない対照区、17ベータエストラジオールの存在する実験区、コルチコステロンの存在する実験区では、NREとSDREはリポーター遺伝子であるEGFP遺伝子の発現を基盤領域（オボアルブミン近接プロモーター領域）による遺伝子活性化と比較して、有意に上昇させることは出来なかった。
【００４８】
LMH細胞株での新規領域1（2200bp, nt. -901〜-3120）、ERE領域（675bp, nt. -3119〜-3793）、新規領域2（401bp, nt. -5800〜-6200）による遺伝子活性化の実験結果は表2にまとめている。
【００４９】
【表２】
0005152708.tif 000003
表２に示すように、新規領域1はホルモンの存在しない環境ではEGFP遺伝子の発現を有意に上昇させていたが、17ベータエストラジオールやコルチコステロンが存在する環境では遺伝子発現を増加させなかった。既知領域EREはホルモンの存在しない環境、もしくはどのようなホルモン環境でも遺伝子の発現を増加することができなかった。新規領域2は17ベータエストラジオールの存在下では統計的に有意に遺伝子発現を向上させ、エンハンサーとしての機能を持つことを示している。同じステロイドホルモンであるコルチコステロンの存在下では遺伝子発現の誘導能力を示さなかった。一方、プロモーターの上流6666塩基のすべてを含む領域では、17ベータエストラジオールの存在下での統計的に有意な遺伝子発現の向上は証明されなかった。新規領域2と6666塩基配列を比較した場合、新規配列2の遺伝子活性化能力は6666塩基配列の2倍以上であった。6666塩基配列にはサプレッサー要素も存在すると考えられ、新規領域2にはこれらのサプレッサー要素が含まれていないと考えられる。
【００５０】
細胞実験の結果から導かれる結論としては、新規領域2の401塩基配列にはエンハンサーの機能のみが含まれ、卵管特異的、エストロジェン応答遺伝子発現を誘導すると考えられる。
【００５１】
LMH細胞株での新規領域2（401bp, nt. -5800〜-6200）とERE領域（675bp, nt. -3119〜-3793）を連結した塩基配列よる遺伝子活性化の実験結果は表3にまとめている。
【００５２】
【表３】
0005152708.tif 000004
表3に示すように新規領域2は17ベータエストラジオールの存在下では統計的に有意に遺伝子発現を向上させ、活性化能力はERE領域の3.9倍である。この二つの領域を連結し、遺伝子の活性化を調べた結果、ERE領域を加えることによって、新規領域2の機能は失われた。この結論は新規領域2と新規領域2＋既知領域EREの遺伝子活性化能力が統計的にも異なっていることから証明できた。
【００５３】
LMH細胞株での新規領域2（401bp, nt. -5800〜-6200）とNRE領域（221bp, nt. -88〜-308）、ないしはSDRE領域（116bp, nt. -785〜-900）を連結した塩基配列よる遺伝子活性化の実験結果は表4にまとめている。
【００５４】
【表４】
0005152708.tif 000005
表4に示すように新規領域2は単独で17ベータエストラジオールの存在下では統計的に有意に遺伝子発現を向上させた。しかし、新規領域にNRE又はSDREを連結することによっては遺伝子の活性化の向上は見られなかった。
【００５５】
これら一連の細胞実験の結果から導かれる結論としては、新規領域2の401塩基配列にはエンハンサーの機能のみが含まれ、卵管特異的、エストロジェン応答遺伝子発現を誘導するだけでなく、新規領域2よりプロモーターに近くに位置する既知の制御領域と組み合わせることは、遺伝子活性化のエンハンサー機能の低下を招き、望ましくないと考えられ、6666塩基配列が新規領域2よりも遺伝子活性化能力が低い事実の説明にもなる。結論としては、新規塩基配列（401bp, nt. -5800〜-6200）はすべての要求する機能を満たし、単独で使用するのが最適である。
【００５６】
産卵鶏卵管での候補遺伝子制御塩基配列の機能確認
新規領域2をオボアルブミン近接プロモーターに連結したEGFP遺伝子と連結し、裸のDNAを組織に注入して生体での遺伝子の発現を観察した。遺伝子の発現はリポーター遺伝子であるEGFPタンパク質を免疫化学的に探知・測光することによって証明した。細胞・組織非特異的なプロモーター・エンハンサーにEGFP遺伝子を連結したプラスミドであるpCXは、卵管、腸管、胸筋で発現したが、新規領域3塩基配列をオボアルブミン近接プロモーターとEGFP遺伝子に連結したDNAコンストラクトは卵管でのみ発現が観察された（表5）。
【００５７】
【表５】
0005152708.tif 000006
卵管、腸管、胸筋での遺伝子発現の顕微鏡写真はそれぞれ、図1、図2、図3として添付してある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】新規領域3塩基配列とEGFP遺伝子を含むDNAコンストラクトを導入した卵管の組織切片の写真。
【図２】新規領域3塩基配列とEGFP遺伝子を含むDNAコンストラクトを導入した腸管の組織切片の写真。
【図３】新規領域3塩基配列とEGFP遺伝子を含むDNAコンストラクトを導入した胸筋の組織切片の写真。
【図１】
0005152708.tif 000007
【図２】
0005152708.tif 000008
【図３】
0005152708.tif 000009
【配列表】
0005152708000001.app