(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子受容体に対する肝細胞増殖因子の結合を阻害する能力を有する、肝細胞増殖因子受容体に結合する抗体を有効成分とする、関節リウマチの処置剤。
【請求項２】
肝細胞増殖因子受容体に結合する抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＧである、請求項１に記載の処置剤。
【請求項３】
炎症症状の改善に用いるための、請求項１又は２に記載の処置剤。
【請求項４】
炎症症状が、四肢における浮腫又は発赤である、請求項３に記載の処置剤。
【請求項５】
骨変性の改善に用いるための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の処置剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な関節リウマチの処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いた略号について説明する。
ＣＩＡ：コラーゲン誘発関節炎（collagen-induced arthritis）
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor）
ＨＧＦＲ：肝細胞増殖因子受容体（hepatocyte growth factor receptor、HGF receptor）
ＲＡ：関節リウマチ（rheumatoid arthritis）【０００３】
ＲＡは、主に関節の滑膜に非特異的炎症を起こし、全身の多発性関節炎の病像を呈する疾患である。ＲＡに対する治療剤等に関する先行技術も存在するが（特許文献１及び特許文献２参照）、ＲＡは複雑な疾患であり、かつその処置も対症療法的なものに止まっており、ＲＡに対する新規な処置剤の提供が望まれている
【特許文献１】特開２００２−１８７８５６号公報
【特許文献２】特開２００３−１８３１７７号公報
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ＲＡに対して有効な、新規な処置剤を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＨＧＦＲに結合する抗体を有効成分とすることによって、新規かつ有効なＲＡの処置剤を提供できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、ＨＧＦＲに結合する抗体を有効成分とするＲＡの処置剤（以下、「本発明処置剤」という。）を提供する。
このＨＧＦＲに結合する抗体は、ＨＧＦＲに特異的に結合するものであることが好ましい。またこのＨＧＦＲに結合する抗体は、ＨＧＦＲに対するＨＧＦの結合を阻害する能力を有するもの（中和抗体）であることが好ましい。また、このＨＧＦＲに結合する抗体の免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧであることが好ましい。
また本発明処置剤は、炎症症状の改善に用いられるものであることが好ましい。この炎症症状は、四肢における浮腫又は発赤であることが好ましい。
また本発明処置剤は、骨変性の改善に用いられるものであることも好ましい。
本発明はまた、ＨＧＦＲに結合する抗体を投与することを特徴とする、ＲＡの処置法に関する。
本発明はまた、ＲＡを処置するための薬剤の製造におけるＨＧＦＲに結合する抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】抗ＨＧＦＲ抗体投与による炎症スコア（ＣＩＡモデル）を示す図である。
【図２】抗ＨＧＦＲ中和抗体投与による骨変性スコア（ＣＩＡモデル）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明処置剤の有効成分
本発明処置剤は、ＨＧＦＲに結合する抗体を有効成分とする、ＲＡの処置剤である。
本発明処置剤の有効成分として用いる「ＨＧＦＲに結合する抗体」は、ＨＧＦＲ分子に結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。そのなかでも、ＨＧＦＲに特異的に結合するものであることが好ましい。
また、この抗体が由来する動物種も特に限定されないが、哺乳類由来の抗体であることが好ましい。哺乳類としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ等を例示することができる。
またこの抗体は、モノクローナル抗体であってもよくポリクローナル抗体であってもよいが、大量生産の容易性、品質の均一性等の観点からすると、モノクローナル抗体であることが好ましい。【０００８】
この「ＨＧＦＲに結合する抗体」は、ＨＧＦＲ又はその一部分を抗原として、通常の抗体の製造方法によって取得することができる。「ＨＧＦＲの一部分」としては、ＨＧＦＲの細胞外ドメイン部分を例示することができる。
このような抗原の取得方法も特に限定されず、天然物から公知の方法で製造したり、それ自体既知であるＨＧＦＲのアミノ酸配列又はその一部分の配列に基づいて、ペプチドの公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇  道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善（株）参照）により製造することもできる。またこの抗原のアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。
例えば、ヒト由来のＨＧＦＲのアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列は、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, p6379-6383 (1987) 等に開示されたものを用いることができる。また例えば、マウス由来のＨＧＦＲのアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列は、Oncogene, 2, p593-599 (1988) 等に開示されたものを用いることができる。また、細胞外ドメイン部分の情報も、これらの文献に開示されている。【０００９】
そしてＨＧＦＲに結合する抗体の製造は、このような抗原を用い、モノクローナル抗体とするかポリクローナル抗体とするかに応じて、例えば以下の通り行うことができる。
モノクローナルな抗体は、前記の抗原を用いて、例えばKohlerとMilsteinの方法（Nature 256,495-497(1975)）によって製造することができる。【００１０】
例えば抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)等に投与する。そして、被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製する。なお細胞融合に用いるミエローマ細胞は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合のミエローマ細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、抗原に対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別する。
こうして選別されたハイブリドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗体が得られる。なお、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。【００１１】
またポリクローナルな抗体は、前記の抗原を用いて以下の通り製造することができる。
前記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に、抗原を被免疫動物に投与する。
被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によってイムノグロブリン画分を精製してもよい。【００１２】
抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。
なお抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して、Ｆａｂを含むフラグメント等としても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。このようなものも、本出願書類における「抗体」の概念に包含される。【００１３】
また、ＨＧＦＲに結合する抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合、そのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するものに限定されるものではなく、例えばヒトに対する異種抗原性を低下させることなどを目的として人為的に改変されたものであってもよい。例えば、ＨＧＦＲに結合するモノクローナル抗体として、ヒト以外の哺乳動物に由来する抗体の可変領域と、ヒトに由来する抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用してもよい。このようなキメラ抗体は、遺伝子工学的手法を用いた公知の方法で製造することができる。【００１４】
また、再構成したヒト化抗体を用いることもできる。例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて、ヒトに由来する抗体の相補性決定領域をヒト以外の哺乳動物に由来する抗体の相補性決定領域で置換することにより、このような抗体を得ることができる。
抗体が抗原に結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否かは、抗原を用い、公知の方法によって当業者が容易に決定することができる。
また、ＨＧＦＲに結合する抗体の免疫グロブリンクラス等も特に限定されないが、ＩｇＧであることが好ましい。【００１５】
また、このような「ＨＧＦＲに結合する抗体」は、ＨＧＦＲに対するＨＧＦの結合を阻害するものであることが好ましい。「ＨＧＦＲに結合する抗体」は、ＨＧＦＲに対するＨＧＦの結合を、抗体非存在下での結合と比較して、５０％以下に阻害するものであることが好ましく、１０％以下に阻害するものであることがより好ましい。このような抗体は、ＨＧＦとＨＧＦＲとを用いて、その両者の結合を阻害するか否かを指標とした公知の方法によって選択することができる。
このような抗体は、以上のような方法で自ら製造してもよく、また市販のものを用いてもよい。
なお「ＨＧＦＲに結合する抗体」は、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含有しないものが好ましい。
このような「ＨＧＦＲに結合する抗体」を用いることにより、極めて優れた薬理作用を有するＲＡの処置剤とすることができる。【００１６】
（２）本発明処置剤の投与方法等
本発明処置剤は、ＲＡの処置に用いることができる。本出願書類において「ＲＡ」は、医学上の厳密な定義におけるＲＡはもちろん、ＲＡと同様又は類似の疾患症状を呈することにより、当技術分野においてＲＡであると認識されるものをも含む趣旨である。
本発明処置剤は、上記のようなＨＧＦＲに結合する抗体を有効成分とするＲＡの処置剤である限りにおいて、その投与目的、投与対象、投与経路、投与方法、剤型、有効成分の配合量、投与量、投与間隔等も特に限定されない。【００１７】
本出願書類における「ＲＡの処置剤」の用語は、ＲＡに対する何らかの処置のために用いられる剤である限りにおいて特に限定されない。したがって、例えば、ＲＡの予防、維持（悪化防止）、軽減（症状改善）、治療等の目的で用いられる剤は、いずれも本発明処置剤の概念に包含される。すなわち本発明は、ＨＧＦＲに結合する抗体を有効成分とするＲＡ予防剤、維持剤（悪化防止剤）、軽減剤（症状改善剤）、治療剤等の概念をも包含するものである。【００１８】
また本発明処置剤は、ＲＡにおける炎症症状に対して特に優れた改善作用を発揮することから、ＲＡにおける炎症症状の改善のために用いられるものであることが好ましい。ここにいう炎症症状は、炎症によって呈される症状である限りにおいて特に限定されないが、四肢における浮腫又は発赤であることが好ましい。
さらに本発明処置剤は、ＲＡにおける骨変性に対して特に優れた改善作用を発揮することから、ＲＡにおける骨変性の改善のために用いられるものであることが好ましい。【００１９】
本発明処置剤の投与の対象となる動物は、ＲＡに罹患する可能性がある動物である限りにおいて特に限定されない。このような動物としては哺乳動物が例示され、そのなかでもヒト、サル、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ等が例示される。なかでもヒトが好ましい。本発明処置剤は、ＲＡの処置に資せんとするものであるから、ＲＡに対する処置が望まれる状況にある動物に対して適用することができる。【００２０】
本発明処置剤の投与経路は、本発明処置剤によるＲＡに対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（関節腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等が例示される。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与など、所望の部位等によって適宜選択することができる。
このような投与経路や投与方法等に応じて、有効成分とするＨＧＦＲに結合する抗体を適宜製剤化して、本発明処置剤とすることができる。【００２１】
その剤型としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬分野において慣用されている溶媒に、有効成分とするＨＧＦＲに結合する抗体を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水混和性有機溶媒を含有する水等が例示される。
本発明処置剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、凍結乾燥物等のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。【００２２】
本発明処置剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ＨＧＦＲに結合する抗体に対して悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、医薬分野において通常用いられている成分を使用できる。【００２３】
本発明処置剤における有効成分であるＨＧＦＲに結合する抗体の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、有効成分物質の種類、本発明処置剤の投与目的、投与対象、投与経路、投与方法、剤型、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、成人１人１回当り５ｍｇ〜５０ｇ程度が例示される。
また本発明処置剤の投与は、１回限りでもよく、複数回投与してもよい。複数回投与する場合には、連日投与してもよく、また１日間〜７日間程度の間隔をあけて投与してもよい。また１日１回投与してもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
１．ＲＡのモデル動物（ＣＩＡモデル）の作製方法
ＣＩＡモデルは、６〜７週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャールズリバー社）の尾根部皮内に、ウシ由来のII型コラーゲン（3mg/ml、0.01Ｍ酢酸で溶解したもの）と完全フロインドアジュバントとを等量混和したエマルジョンを150μg/0.1ml注入することによって感作し、さらに初回感作から２１日目に追加感作することによって作成した。追加感作の方法は、初回感作と同様である。このＣＩＡモデルでは、追加感作後４〜５日目に四肢における炎症が惹起され、追加感作後１０〜２０日目に炎症がピークになることが知られている。ＣＩＡモデルは、ヒトの関節リウマチのモデルとして、また治療薬開発のためのツールとして広く利用されている。【００２５】
２．薬効薬理試験
（１）ＨＧＦＲに結合する抗体によってモデル動物の病態が改善されるか調べるため、このモデルにＨＧＦＲに結合する抗体を投与する試験を行った。この抗体は、ＨＧＦＲに対するＨＧＦの結合を阻害する能力を有する抗体（抗マウスＨＧＦＲ抗体（Anti-mouse HGF R Antibody）； R&D SYSTEMS社 ; カタログ番号：AF527）を用いた。この抗体は、マウス由来ＨＧＦＲの細胞外ドメイン部分を抗原として得られたポリクローナル抗体の精製品であり、ＨＧＦＲに対して特異的に結合し、その免疫グロブリンクラスはＩｇＧである（以下、この抗体を「抗ＨＧＦＲ抗体」という）。
この抗ＨＧＦＲ抗体は、生理食塩水で終濃度2mg/mlとしたものを用いた。【００２６】
（２）ＲＡモデルとして、前記の方法で作成されたＣＩＡモデルを用いた。
初回感作後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、前記の抗ＨＧＦＲ抗体を200μg/0.1ml/匹（約10mg/kg体重）で腹腔内に投与した（抗ＨＧＦＲ群；ｎ＝１０）。また抗ＨＧＦＲ抗体の対照群は、初回感作後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、抗ＨＧＦＲ抗体のアイソタイプコントロールである正常ヤギIgG（Cappel社; 55926）を200μg/0.1ml/匹（約10mg/kg体重）で腹腔内に投与したものとした（Isotype群、ｎ＝１０）。
また正常群は、前記のＣＩＡモデルと同じ週齢の正常マウスを用い、試験開始後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、生理食塩水を0.1ml/匹で腹腔内に投与したものとした（ｎ＝３）。【００２７】
（３）関節炎の病態改善は、四肢における炎症スコア（両足の親指を除く指、甲及び踵並びに両手の親指を除く指及び甲（計２２箇所）を観察し、浮腫、発赤の見られた個所に１点をつける。従って、スコアの最高は２２点/匹となる。）によって評価した（追加感作の後、週３回評価した。）。
各群及び各時点における炎症スコアの平均値±標準偏差をグラフ化した。その結果を図１に示す。
その結果、抗ＨＧＦＲ群でも、Isotype群（陰性対照）に比して炎症スコアが改善していることが示された（図１）。【００２８】
（４）また初回感作後４１日目に、マウス後肢（両足）のレントゲン写真を撮影して、足根骨、距踵骨、中足骨及び頸骨における足根骨側の４箇所の骨変性の程度を観察した。骨の変性の程度に応じて、０（無変化）、１（軽度の変性）、２（中度の変性）、３（重度の変性）としたスコア（１匹あたりのスコアの最高は２４点となる。）をつけ、両後肢の骨変性の程度を評価し、各群における平均値±標準偏差をグラフ化した。結果を図２に示す。
その結果、抗ＨＧＦＲ群において、対照群（Isotype群）に比して骨変性スコアが改善していることが示された。
この結果から、抗ＨＧＦＲ抗体を投与することによって、ＲＡの病態が改善されることが示された。
以上の結果から、抗ＨＧＦＲ抗体を有効成分とすることにより、ＲＡに対して有効な処置剤とすることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、ＲＡに対する新規かつ有効な処置剤が提供されることから、極めて有用である。
【図１】
0005137818.tif 000002
【図２】
0005137818.tif 000003