(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌をＬ−イソロイシンを含む培地で培養することを特徴とする（Ｓ）−２−メチル酪酸の製造方法。
【請求項２】
（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌がバシラス パミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス  サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス  シンプレックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、バシラス  アゾトフォルマンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）およびバシラス  サイクロサッカロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）から選ばれる請求項１に記載の方法。  
【請求項３】
製造される（Ｓ）−２−メチル酪酸の光学純度が７５％ｅ．ｅ．以上である請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香料、あるいは香料、医薬品などの製造原料として有用な（Ｓ）−２−メチル酪酸を高純度且つ高収率で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−メチル酪酸は、天然には、アンゲリカ根油、ストロベリーなどの果実、アルコール飲料などに広く存在が知られる化合物である。２−メチル酪酸には（Ｓ）体および（Ｒ）体の２つの光学異性体があり、（Ｓ）体は甘いフルーツ香気を有し、そして（Ｒ）体は汗、チーズ様の香気を有している（非特許文献１）。市販品の多くはラセミ体の合成品として販売されており、果実、ナッツ、ココア、発酵乳などの調合香料の原料として用いられている（特許文献１〜５）。
【０００３】
一方、納豆菌であるバシラス  サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が納豆中の納豆臭の原因となる短鎖分岐脂肪酸である２−メチル酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸を生産することは知られている（非特許文献１）が、２−メチル酪酸、イソ酪酸およびイソ吉草酸の生合成経路はいまだに解明されていない。
【０００４】
これまでこれらの化合物の光学異性体の製造に関する報告は意外に少なく、例えば、特許文献６にラセミ体の２−メチル酪酸または２−メチルペンタン酸に、（Ｓ）−２−メチル酪酸および（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有する微生物、特にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を作用させて（Ｒ）−２−メチル酪酸または（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を製造する方法が開示され、また、特許文献７に、チグリン酸をメタノール、エタノールのような溶媒に溶解し、ルテニウム−光学活性ホスフィンを加え、水素圧４〜１２５ｋｇ／ｃｍ２および反応温度５〜５０℃で１〜１００時間反応させることにより光学純度７０％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−２−メチル酪酸を大量に得る製造法が開示されている程度である。
【０００５】
このように、従来の提案はいずれも合成品または半合成品の原料を用いた（Ｓ）−２−メチル酪酸または（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造に関するものであり、天然の原料を用い、天然の方法、すなわち、植物体、微生物または酵素の作用により得られるナチュラルの（Ｓ）−２−メチル酪酸を高純度且つ高収率で製造する方法についての報告は見あたらない。
【非特許文献１】Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ  Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．１０，７７３〜７７９（２０００）
【特許文献１】特開２００４−１３５５２２号公報
【特許文献２】特開２００５−０１５６８６号公報
【特許文献３】特開２００６−０２５７０６号公報
【特許文献４】特開２００６−１２１９５８号公報
【特許文献５】特開２００６−１２４４９０号公報
【特許文献６】特開２００５−３４８７２７号公報
【特許文献７】特許３３７２３２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、天然の原料を用い、ナチュラルな（Ｓ）−２−メチル酪酸を高純度且つ高収率で製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、今回、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌をＬ−イソロイシンを含む培地で培養することにより高純度且つ高収率で（Ｓ）−２−メチル酪酸が得られることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
かくして、本発明は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌をＬ−イソロイシンを含む培地で培養することを特徴とする（Ｓ）−２−メチル酪酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌をＬ−イソロイシンを含む培地で培養することにより、ナチュラルの（Ｓ）−２−メチル酪酸を高純度且つ高収率で得ることができる。また、得られる（Ｓ）−２−メチル酪酸はラセミ体または（Ｒ）体の２−メチル酪酸に比べて、甘いフルーツ香気を有し、調合香料の原料として使用することができるのみならず、香料、医薬品などの原料として広い分野での利用が見込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で使用することができるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する（Ｓ）−２−メチル酪酸生産菌としては、例えば、バシラス パミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス  サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス  シンプレックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、バシラス  アゾトフォルマンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、バシラス  サイクロサッカロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）などを挙げることができ、市場で入手できる菌株としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７（独立行政法人 製品評価技術基盤機構による分譲菌株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ２４９９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ２０１１８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＡＭ１２３１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＪＣＭ２５０４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＪＣＭ２５０６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＪＣＭ１２３０７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＪＣＭ１２２１０（以上、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室による分譲菌株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ２３２９６（アメリカン・タイプカルチャー・コレクション）などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明において培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の培地に、Ｌ−イソロイシンを加えた培地またはＬ−イソロイシンを比較的多く含むアミノ酸混合物、ペプチド、蛋白質もしくはこれらを組み合わせた培地を用いることができる。Ｌ−イソロイシンとしては、例えば、市販品であるＬ−イソロイシン（協和醗酵社製）、Ｌ−イソロイシン（味の素社製）、Ｌ−イソロイシン  Ｗ５２７６０２（アルドリッチ社製）、Ｌ−イソロイシン（和光純薬社製）などを挙げることができ、また、Ｌ−イソロイシンを比較的多く含むアミノ酸混合物、ペプチドまたは蛋白質としては、例えば、チーズホエー、牛乳、鶏肉、鮭、大豆、小麦などを挙げることができる。
【００１２】
培地に配合しうる炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトースなどの糖類；クエン酸、リンゴ酸などの有機酸類；エタノール、グリセロールなどのアルコール類等が挙げられ、また、窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物；ペプトンなどの有機窒素源などを利用することができ、さらに、無機塩類としては、例えば、各種のリン酸塩、硫酸マグネシウムなどを使用することができ、そして培地には、さらに必要に応じて、微量の金属塩（鉄塩、カルシウム塩など）などを添加してもよい。
【００１３】
前記の如き菌株を使用して、（Ｓ）−２−メチル酪酸を製造する方法としては、例えば、以上に述べた如き炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地にＬ−イソロイシンを添加して該菌株を培養する方法；炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地で該菌株を１日〜３日程度前培養した後、Ｌ−イソロイシンを添加してさらに培養する方法；該菌株を炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地で培養した後、遠心分離等の手段により菌体を集め、該菌体を緩衝液等に分散させ、Ｌ−イソロイシンを添加して反応させる方法；該菌株をそれ自体既知の方法で固定化し、Ｌ−イソロイシンを添加して反応させる方法等を挙げることができる。
【００１４】
培養は好気条件下に行うことができ、例えば、空気中での振盪培養、通気撹拌培養などの方法を採用することができる。培養温度は約２０℃〜約４０℃の範囲内、そして培地のｐＨは６〜８の範囲内が好ましい。また、培養日数は特に限定されないが、通常、１日〜１４日程度が実用上好ましい。
【００１５】
Ｌ−イソロイシンの培地に対する添加濃度は、用いる培養方法等により異なり、厳密には限定されないが、一般には１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの範囲内を例示することができる。Ｌ−イソロイシンの添加濃度が１００ｇ／Ｌを超えると、微生物の生育阻害が起こり、Ｌ−イソロイシンから（Ｓ）−２−メチル酪酸への変換率が悪くなり、１ｇ／Ｌ未満では、（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量が少なすぎ、生産コストが上がるので好ましくない。
【００１６】
培地または培養後の菌体に上記濃度範囲でＬ−イソロイシンを加えることにより、培地中に０．１％〜８％程度の（Ｓ）−２−メチル酪酸を生成させることができる。
【００１７】
Ｌ−イソロイシンから（Ｓ）−２−メチル酪酸への変換率は、添加するＬ−イソロイシンの量などにもよるが、通常、５０％〜１０５％、好ましくは８０％〜１０５％の範囲内である。
【００１８】
以上に述べた培養により生産される（Ｓ）−２−メチル酪酸を含有する培地または反応液からの（Ｓ）−２−メチル酪酸の分離、精製は、それ自体既知の方法で行うことができ、例えば、培地または反応液に塩酸を加えた後、塩化ナトリウム、エーテルを加え、攪拌抽出し、濾過助剤を加えて濾過した濾液のエーテル層を分離し、これに無水硫酸マグネシウムを加え、蒸留を行いエーテルを除去することにより、粗製の（Ｓ）−２−メチル酪酸を得ることができる。さらに、常法に従い、例えば、減圧蒸留により分画することにより、通常、７５％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９５〜１００％ｅ．ｅ．の範囲内の光学純度、より好ましくはの９９．５〜１００％ｅ．ｅ．の範囲内の光学純度で精製（Ｓ）−２−メチル酪酸を得ることができる。
【００１９】
本発明の微生物菌株を利用する方法により得ることのできる（Ｓ）−２−メチル酪酸は、甘いフルーツ様の香気・香味を有しており、これを添加した嗜好性の高い各種の香料組成物は調合素材として利用することができる。
【００２０】
本発明によれば、例えば、炭酸飲料、果汁飲料、果実酒飲料類、乳飲料などの飲料類；アイスクリーム類、シャーベット類、アイスキャンディー類などの冷菓類；和・洋菓子、チューインガム類、パン類、コーヒー、紅茶、お茶、タバコなどの嗜好品類；和風スープ類、洋風スープ類などのスープ類；ハム、ソーセージなどの畜肉加工品；風味調味料、各種インスタント飲料乃至食品類、各種のスナック類などに、（Ｓ）−２−メチル酪酸を有効成分として含有する香料組成物の適当量を添加することにより、そのユニークな香気香味が賦与された飲食品類を提供することができる。また、本発明によれば、例えば、シャンプー類、ヘアクリーム類、その他の毛髪化粧料基剤；オシロイ、口紅、その他の化粧用基剤や化粧用洗剤類基剤などに、（Ｓ）−２−メチル酪酸を有効成分として含有する香料組成物の適当量を添加することにより、そのユニークな香気が賦与された化粧品類を提供することができる。さらにまた、本発明によれば、（Ｓ）−２−メチル酪酸を有効成分として含有する香料組成物の適当量が配合された洗濯用洗剤類、消毒用洗剤類、防臭洗剤類、その他各種の保健・衛生用洗剤類；歯磨き、ティッシュペーパー、トイレットペーパーなどの各種保健・衛生材料類；医薬品類などを提供することができる。
【００２１】
さらに、本発明の方法によって製造される（Ｓ）−２−メチル酪酸から、合成あるいは生化学的手法を用いて、医薬中間体、医薬品、各種工業製品を製造することもできる。
【００２２】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００２３】
実施例１
培  地
イーストペプトン１．５ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、リン酸ナトリウム・１２水０．８ｇ、リン酸１カリウム０．２ｇ、イオン交換水５０ｇおよびＬ−イソロイシン（協和発酵社製）０．５ｇを混合、溶解し、培地を調製した。
【００２４】
培養方法
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７を植菌したスラントから一白金耳を取り、生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、懸濁液１ｍｌを培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍで約５０時間培養を行った。培養は二連で行い、ｐＨおよび６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０）を測定した。
【００２５】
（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）、変換率（％）の算出
培養液にブタノールを添加し、４Ｎ 塩酸でｐＨを１．７ に調整し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清０．２μｌをガスクロマトグラフィー分析（以後、ＧＣ分析と呼ぶ）に供した。また、以下に示すブタノールを内部標準とする内部標準法により生成量を算出した。
【００２６】
検量線の作成
ブタノールと２−メチル酪酸を任意の重量比で混合し、ＧＣ分析を行った。ＧＣ分析結果から得られたブタノールと２−メチル酪酸のＡＲＥＡ％の比を表１に示す。この結果から得られたＡＲＥＡ％の比をＸ軸、重量比をＹ軸にプロットし、ゼロ点を通過する検量線を作成し、その検量線から二次方程式 ｙ=１．３２６ｘ−０．０２１１（図１）を得た。
【００２７】
【表１】
0005271606.tif 000002
【００２８】
（Ｓ）−２−メチル酪酸変換率％の算出
変換率％は、添加したＬ−イソロイシンから２−メチル酪酸へのモル変換率を表し、以下の式により算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００２９】
変換率％ ＝ {(２−メチル酪酸生成量×１．２９*)／Ｌ−イソロイシン添加量(％)｝ × １００
*Ｌ−イソロイシンの分子量／２−メチル酪酸の分子量＝１．２９
【００３０】
実施例２
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７に代え、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＪＣＭ２５０６を用いる以外は実施例１と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０、（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）および変換率（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３１】
実施例３
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７に代え、Ｂ．ｓｕｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ  ２４９９を用いる以外は実施例１と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０、（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）および変換率（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３２】
実施例４
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７に代え、Ｂ．ｓｉｍｐｌｅｘ  ＪＣＭ１２３０７を用いる以外は実施例１と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０、（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）および変換率（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３３】
比較例１
実施例１の培地組成からＬ−イソロイシン０．５ｇを除いた培地を用いる以外は実施例１と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０および（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３４】
比較例２
実施例１の培地組成からＬ−イソロイシン０．５ｇを除いた培地を用いる以外は実施例２と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０および（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３５】
比較例３
実施例１の培地組成からＬ−イソロイシン０．５ｇを除いた培地を用いる以外は実施例３と同様な方法で培養し、ｐＨ、ＯＤ６６０および（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）を測定または算出した。その結果を後記表２にまとめて示す。
【００３６】
〔（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量、変換率の比較〕
【００３７】
【表２】
0005271606.tif 000003
【００３８】
表２に示すように、Ｌ−イソロイシンを添加した培地で培養した実施例１〜４の培養液は、いずれも、（Ｓ）−２−メチル酪酸を培地中に生産していることが確認された。特に、実施例１、２および３で用いたＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＪＣＭ２５０６およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ２４９９による変換率は９１．１％、５３．１％および７６．０％と高かった。実施例４で用いたＢ．ｓｉｍｐｌｅｘ  ＪＣＭ１２３０７はこれらに次ぐ３０．７％の変換率であった。また、培養物から分離した（Ｓ）−２−メチル酪酸を分析したところ、その光学純度は表２のように９９．５〜９９．９ｅ．ｅ．の範囲内の数値となり、非常に高い値であった。
【００３９】
一方、Ｌ−イソロイシンを添加しない培地で培養した比較例１〜３の培養液も（Ｓ）−２−メチル酪酸を培地中に生産していたが、その生産量（％）は０．０８〜０．０９と非常に低く、Ｌ−イソロイシンを添加した実施例１〜４の場合の約１／３〜１／９程度であった。
【００４０】
以上の結果より、バシラス属に属する菌株はいずれも（Ｓ）−２−メチル酪酸を生産する能力を有するが、Ｌ−イソロイシンを添加した培地で培養することにより、その生産性は大きく向上することが確認された。また、菌株の中ではＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＪＣＭ２５０６およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ２４９９の生産性が良好であった。
【００４１】
実施例５
前培養
ひだ付き三角フラスコに、イーストペプトン３．０ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、リン酸ナトリウム・１２水１．５ｇ、リン酸１カリウム０．３ｇ、イオン交換水１００ｇおよびＬ−イソロイシン（協和発酵社製）１．０ｇを入れ、混合、溶解、殺菌し、培地とした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７を植菌したスラントから一白金耳取り、上記培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍで２９．５時間前培養を行った。
【００４２】
本培養
イーストペプトン３０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、リン酸ナトリウム・１２水１５．３ｇ、リン酸１カリウム３．３ｇ、イオン交換水１０００ｇおよびＬ−イソロイシン（協和発酵社製）２２５ｇを混合溶解させた培地を用意し、２Ｌ容発酵槽を用いて本培養を行った。培地殺菌後、前培養液50ｍｌを本培養培地に接種し、３０℃、６００ｒｐｍ、通気量０．３〜０．４リットル／分で９０時間培養を行い、ｐＨおよびＯＤ６６０を測定した。また、実施例１と同様、ＧＣ分析により（Ｓ）−２−メチル酪酸の濃度を求め、生成量（％）および変換率（％）を算出した。
【００４３】
培養の結果
表３に２Ｌ容発酵槽を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ１４３６７の培養におけるｐＨ、ＯＤ６６０、生成量（％）および変換率（％）の経時変化を示す。
【００４４】
【表３】
0005271606.tif 000004
【００４５】
表３に示すように、時間の経過とともに（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成量（％）は増加し、９０時間後に２．０６％と最大になった。変換率も同様に上昇し、８６．５時間、９０時間では１０５．７、１０６．４％となった。これにより、添加したＬ−イソロイシンはすべて（Ｓ）−２−メチル酪酸に変換されていたことがわかる。また、９０時間後の（Ｓ）−２−メチル酪酸を分離し、分析したところ、その光学純度は９９．５ｅ．ｅ．であった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はブタノール及び２−メチル酪酸の検量線である。
【図１】
0005271606.tif 000005