(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料（基質）として二糖類を用い、該二糖類の３位を微生物反応で酸化して３ケト二糖類を生成させ、これをさらに還元する反応により、希少糖を含む二糖類を生成させること、
上記の微生物反応が、３ケト二糖類を作る性質を有するアグロバクテリウム属微生物に由来する酸化酵素を作用させる酸化反応であること、
を特徴とする少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【請求項２】
上記の微生物が、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens、寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４８９）である請求項１に記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【請求項３】
３ケト二糖類を還元する反応が有機化学的な還元反応による請求項１または２に記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【請求項４】
３ケト二糖類が、ラクチトールまたはラクトースを微生物酸化して得られたものであり、希少糖結合二糖が、希少糖Ｄ−グロースを構成単糖とするものである請求項１ないし３のいずれか一項に記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【請求項５】
さらに反応混合物から希少糖を含む二糖類を分離する請求項１ないし４のいずれか一項に記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の二糖類の製造方法は、工業的に用いられている方法としては、主に以下の二つがあるといえる。第一に、多糖を加水分解酵素を用いて分解することで二糖を作る方法であり、これはデンプンを、βーアミラーゼを用いて分解し、マルトースを作る方法に代表される。同様の方法でセルロースからセロビオースを生産可能である。第二に、糖加水分解酵素の転移活性を用いての製造である。これは各種のオリゴ糖の生産に広く用いられている。例えば、ガラクトースまたはガラクトースを含む物質にα−ガラクトシダーゼを作用させて得られたα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖中の還元糖の分解、分離操作からなるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法、およびガラクトースとグルコースを含む物質に前記と同様にして得られるα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖中に混在するＧａｌ１α−１βＧａｌの加水分解、還元糖の分解、分離操作からなるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法が示されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、希少糖を含む二糖類の生産法として、上記二つの方法が使用できるかどうかについては以下のように考えられる。第一の方法、すなわち多糖を分解することでの、二糖類の生産法は用いることはできない。これは希少糖を構成糖とした多糖が存在しないからである。第二の方法は、希少糖を受容体として用いることで、希少糖を含む二糖を生産することは可能である。例えば、キシラナーゼを用いてキシランのＤ−キシロースを希少糖へ転移する反応は、既に実施されている（特許文献２）。
第一および第二の方法以外の方法として、既に特許出願をしているものとして、シュークロース・フォスフォリラーゼの逆反応を用いる方法で、シュークロースのＤ−フラクトースをＤ−プシコースにした二糖類の製造に成功している（特許文献３）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１６０５９４号公報
【特許文献２】特開２００６−１６９１２４号公報
【特許文献３】特開２００７−９１６６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の（１）ないし（５）に記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法を要旨としている。
（１）原料（基質）として二糖類を用い、該二糖類の３位を微生物反応で酸化して３ケト二糖類を生成させ、これをさらに還元する反応により、希少糖を含む二糖類を生成させること、
上記の微生物反応が、３ケト二糖類を作る性質を有するアグロバクテリウム属微生物に由来する酸化酵素を作用させる酸化反応であること、
を特徴とする少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
（２）上記の微生物が、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）である（１）記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
（３）３ケト二糖類を還元する反応が有機化学的な還元反応による（１）または（２）記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
（４）３ケト二糖類が、ラクチトールまたはラクトースを微生物酸化して得られたものであり、希少糖結合二糖が、希少糖Ｄ−グロースを構成単糖とするものである（１）ないし（３）のいずれかに記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
（５）さらに反応混合物から希少糖を含む二糖類を分離する（１）ないし（４）のいずれかに記載の少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、少なくとも一の希少糖を構成単糖とする希少糖結合二糖の生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
[本発明の特徴]
希少糖を含有する二糖類の生産法として、背景技術の項に記載の方法以外新規方法を開発した。すなわち、これまでの方法は単糖である希少糖をアクセプター（受容体）して使用する方法である。従って、まず、遊離の単糖としての希少糖を製造し、それに他の単糖を各種の方法で結合させるものであった。本発明の新規方法は以下の特徴の全く新しい発想によるものである。
本発明の新規方法では、原料として二糖類を用いること、そして、二糖類を加水分解することなく、二糖類のままで構成糖である単糖を希少糖へ変換するという方法である。この方法では、希少糖を生産してから結合するということがないため、希少糖を含む二糖の生産に有効な方法である。
【０００９】
[新規方法の原理] 
原料（基質）として二糖類を用い、二糖類のままで構成糖である単糖を希少糖へ変換する反応による本発明の新規方法の原理を図１ないし図３に示す。
３ケト二糖類を経由する反応であり、原料（基質）である二糖類の３位を微生物反応で酸化して３ケト二糖類を生成させる反応を包含する。より具体的には原料（基質）である二糖類の３位を微生物反応で酸化して３ケト二糖類を生成させ、これをさらに還元する反応である。原料（基質）としてラクチトール、ラクトース、トレハロースの酸化と還元反応をそれぞれ図１ないし図３に示す。
化１はラクチトールの場合の反応を示している。非還元側のＤ−ガラクトースの３位を酸化して（ii）、３―ケト・ラクチトールを生産することが可能である。すなわち、３ケト二糖類が、ラクチトールまたはラクトースを微生物酸化して得られたものであり、希少糖結合二糖が、希少糖Ｄ−グロースを構成単糖とするものである。二糖類ラクチトールは、そのままで構成糖である単糖が希少糖Ｄ−グロースへ変換するが、３ケト二糖類３−ケト−ラクチトールを経由する反応である（図１参照）。
【化１】
0005356704.tif 000002
【００１０】
二糖類の非還元側の単糖の３位を酸化して、３ケト二糖類を作る性質がアグロバクテリウム属微生物には存在する。アグロバクテリウム属微生物は、ラクチトールの場合、非還元側のＤ−ガラクトースの３位を酸化して（ii）、３―ケト・ラクチトールを生産する。
本発明の新規方法は、この３ケトの二糖類を還元することによって、ラクチトールの場合は、Ｄ−グロシルーＤ−ソルビトールを生産する方法である。この還元は不斉的には反応は進行する方法は現在のところ存在しないので、反応後の溶液中にはラクチトールも存在することになる。
【００１１】
［原料（基質）として二糖類］
この基本的原理は微生物の３位を酸化する二糖類であれば、どのような二糖類にも適用が可能である。すなわち、本発明によって希少糖を含む二糖類は、非還元側の単糖の３位が酸化されるものであれば各種の二糖類が利用できる。
ラクチトール、ラクトース、シュークロース、マルトース、マルチトール、トレハロース、などはその例である。それぞれの二糖類から、酸化される単糖の３位がエピ化した希少糖と結合した二糖類を生産することが可能である。
化２ではトレハロースの場合を示している。この場合は酸化する場所が二箇所存在することとなり、一つ酸化したものである３−ケトトレハロース、両方が酸化された３−ジケトトレハロースが得られることとなる。この酸化３ケトトレハロースを還元することにより、三種の二糖類が得られることとなる。すなわち、Ｄ−グルコースが二つ結合した原料であるトレハロース、一つのＤ−グルコースがＤ−アロースに還元されたＤ−アロースとＤ−グルコースとの結合した二糖類、さらに、Ｄ−アロースとＤ−アロースが結合した二糖類が生産されることとなる（図３参照）。
【化２】
0005356704.tif 000003
【００１２】
本発明の方法は、反応混合物から希少糖を含む二糖類を分離する工程を包含する。
反応終了後、必要に応じて希少糖を含む二糖類を既知の方法により分離することができる。その後、所望により、ゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の精製手段を適用することにより希少糖を含む二糖類を精製することができる。
【００１３】
［微生物］
本発明で使用する３ケト二糖類を作る性質を有する微生物はアグロバクテリウム属に属する微生物である。
二糖類を酸化して非還元側の糖の３位を酸化する微生物の分離について以下に記述する。
分離場所：香川大学農学部内の土壌
株名：M31
菌種同定：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（英名  Agrobacterium tumefaciens）（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４８９）
すなわち、菌株 Agrobacterium tumefaciens M31 は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に２００８年２月１５日に国内寄託している（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４８９）
【００１４】
［培養条件］
M31株の単離のために、２%(w／w)の ラクチトール（D-ガラクトシルーD-ソルビトール）を単一炭素源として含む無機塩液体培地（表１）を用い３０℃で微生物の分離を行った。この条件で生育し、なおかつ二糖の状態で酸化し、その酸化物を培養上精に蓄積する能力を持つ菌株を分離した。微生物の単離や保存に用いる寒天培地は、表２に示す２％のTSB（トリプティック ソイ ブロース）寒天培地を用いた。
【００１５】
【表１】
0005356704.tif 000004
【００１６】
【表２】
0005356704.tif 000005
【００１７】
分離した菌株についてその酵素生産能力や、酵素生産条件を検討した。その結果、ラクチトールより安価な炭素源であるスクロースを添加することにより、目的の酵素が安定して誘導され産出できることを見出した。すなわち、２％TSBにD-リキソースを少量（０．１％〜３％、望ましい濃度は１％）添加した液体培地で酵素を大量に生産することを見出した。これよりもより安価な０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％塩化ナトリウム、１％スクロースにおいても安定に酵素が産出されることも確認している。他の二糖でも活性が生じるが、スクロース添加が最も効果が高かった。培養炭素源の影響を図４に示す。
【００１８】
M31株の２％ラクチトール無機塩培地における３-ケト‐ラクチトールの生産量は、培養後２４時間後が最も適した条件であった。また図５に１％ラクチトールを用いた洗浄菌体反応の結果を示した（A）。４０時間でほぼ１００％３−ケトーラクチトールに変換されているが、目的産物以外にもピークが生じているが、現時点では不明である（B）。なお、洗浄菌体反応の条件は、５０ｍMリン酸カリウム（ｐH７．０）、30度である。
【００１９】
次に、表３にM31の同定結果、および表４に培養炭素源によるケトース生産量の結果を示した。
なお、ケトース量は、システインカルバゾール法にて測定した。酵素活性は先と同様に実施した。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
【表４】
0005356704.tif 000007
【００２２】
洗浄菌体反応によって、３ケト二糖類を生産する活性（グルコシド３−デハイドロゲナーゼ）の性質。
１）ｐH
ｐH６〜９で活性を示すが、７〜８が望ましい。
２）金属イオン
特に活性を増加させる金属イオンはなく、二価の銅イオンで大きく阻害を受ける。
３）酸素の影響
窒素条件下では、ほとんど酸化されないが、空気条件下で撹拌するだけで十分に酸化される。
【００２３】
［二糖類の転換反応（培養MSM-スクロース）：ケトース生産量の推移（図６）］
図６に示されるように、
マルトース：すべて消費されてなくなる。
ラクトース：5時間後で反応が終了（１００％）、32時間後にはプロダクト以外にピークが生じる。
マルチトール：5時間後で反応が終了（21min、１００％）、32時間後では21minはなくなり、28minのピークが主となる。
ラクチトール：5時間後で反応が終了（18min、１００％）、32時間後もほぼ安定、29minにピークが生じる。
【００２４】
［固定化微生物での一例］
スクロース培養菌体３．０ｇ(w/w)、５０ｍM  Tris−HCｌ（ｐH７．０）  ５ｍｌにて懸濁、同量の４％アルギン酸ナトリウム水溶液と混合した。０．２MCaCl2溶液中に滴下し2時間放置。５０ｍM  Tris−HCｌ（ｐH７．０）で洗浄した。
反応（図７）：１％ラクチトール、１０ｍM  Tris−HCｌ（ｐH７．０）
初速度はフリーの1/3〜1/2に低下するが、最終的に100％転換される。
【００２５】
本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
ラクチトールを用いた希少糖含有二糖類の生産の実施例を下記に記す。
［培養］
２％TSBに１％スクロースを添加した３ｍｌの培地で30度、10時間、前培養した。全量を同組成の３Lの培地にて培養した。培養装置は５L、有効容積３Lのジャーファーメンターで通気量3L/min、400rpmの撹拌で行った。なお信越シリコーン製の消泡剤を３ｍｌ添加した。30度で15時間培養した。15時間後の菌体濃度はOD660＝６．７４であった。
【００２７】
［１］洗浄菌体反応（図８）
菌体を9000rpmで遠心分離後、１０ｍMのリン酸緩衝液（ｐH７．５）で洗浄した。これをOD660＝３０、終濃度２％ラクチトールとなるように調製した。この条件だと今回は約６３０ｍｌとなり、十分に通気させるために５００ｍｌ用のバッフル付三角フラスコで約１００ｍｌ入れ振とう培養機にて洗浄菌体反応を実施した。約27時間後に１００％ラクチトールが3ケトーラクチトールに変換されていた。
【００２８】
この後、遠心分離機にて菌体および反応液を分離後、再度同条件にて反応を開始させた。およそ20時間後には100％3-ケトーラクチトールに変換されていた。同様にこれらの作業を計8回続けることが可能であった。計９６ｇのラクチトールを100％の3-ケトーラクチトールを含む液に変換することができた。さらに洗浄菌体反応を続けることも可能であったが今回は8回（期間は1週間）で終了とした。これほど長期間反応が可能となった理由は、M31株はゆっくりラクチトールを代謝して栄養源を得ていたことであると推測している。実際希少糖を生産する場合にも洗浄菌体反応はよく使用される手段であるが、これほど長期間酵素活性を維持する例はこれまでにない。実際反応終了後の糖の回収率は６５％の６３ｇであった。図５に洗浄菌体反応の結果をHPLC分析結果で示す。
【００２９】
［２］洗浄菌体反応後の精製（図９）
反応後の糖液には多くのタンパク質や菌体残渣が混在しているため、中空糸フィルターによる精製を実施した。旭化成製のマイクロモジュールSLP-1053（分画＜分子量3000）を用いてタンパク質を除去した。この時点で相当する糖量は６０ｇ。
【００３０】
精製後の3-ケトーラクチトール  ３０ｇを含有した液を５００ｍｌ（６％  w/v）に調製し、ラネーニッケル水素添加法によって3-ケトーラクチトールを還元させた。耐圧硝子工業株式会社製のTEM-1000Mを用いて50度で加温しつつ水素圧１．２Mpa（ゲージ圧）で７００ｒｐｍに攪拌速度を保ち６時間反応を行った。ラネーニッケルの活性化は、以下のように実施した。５０％ラネーニッケル（ナカライテスク（株）製）１０ｇに対し、２０％ＮａＯＨ水溶液を１００ｇ添加した。添加後８０℃、８時間の加温を行った。気泡の発生が止まったことを確認した後、デカンテーションにより蒸留水で触媒を洗浄した。洗浄は、洗浄液がｐＨ９．２になるまで行った。図９に洗浄菌体反応後の精製の結果をHPLC分析結果で示す。
【００３１】
（理論上、もとのラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールが１：１で生じるが、17.46分（ラクチトールのRT）のみで、構造が非常に類似するために、二者はこのカラムでは分離できないものと考えられる。26.39分はD-ソルビトール。3-ケトーラクチトールもしくはD-グルシル-D-ソルビトールが不安定なのか分解されているものと推定される。）
ラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールは脱塩樹脂によって異性化、もしくは二糖間の結合が切断される現象が見られた。これについての理由は明らかにしていないが、糖によっては脱塩処理を長時間処理した場合、異性化などの変化を受けてしまうことが一般的に知られている。本発明の3-ケトーラクチトール、D-グルシル-D-ソルビトールは新規物質であり、その性質については未知な部分が多い。しかし、この原因の解明は本発明の主眼とははずれるため実施しなかった。次のステップの支障となるためにD-ソルビトールの除去を実施した。ワンパス方式クロマト分離装置（日進機械（株）製  NK-26）を用いて上記した糖混合液２７ｇ相当を分離した。表５に分離条件および図１０に分離後のHPLCの結果を以下に示す。
【００３２】
【表５】
0005356704.tif 000008
【００３３】
上記の２０画分のうちNo.6〜No.10までをラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールの１００％画分として回収した。
【００３４】
回収量は９．６ｇであった。２７ｇのうち約1/3がソルビトールであったため残り１８ｇがラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールであるので回収率は約５３％であった。
【００３５】
［４］  ラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールの組成確認
前記の［３］で得られた糖がどのような糖から構成されているかを調べた。希塩酸を用いて酸加水分解を実施した。糖液を２％（w/v）濃度の４８０ｍｌとし１Nの塩酸を等量混合させ、80度で６時間処理した。処理後、中和脱塩したのちHPLCで組成を分析した。その分析結果を図１１に示す。
図１１に示すように、
10分あたりのピークは除去しきれなかった塩
17.53分のピーク：D-ガラクトース
21.27分のピーク：D-グロース
26.45分のピーク：D-ソルビトール
これらの構成比はD-ガラクトース：D-グロース：D-ソルビトール＝3.7：１.3：５であった。このことから得られた3-ケトーラクチトールから水素添加した際に生じる糖はラクチトール７５％、D-グルシル-D-ソルビトール２５％であることがわかった。
【００３６】
理論上、もとのラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールが１：１で生じるはずであるが、実際の組成はおよそ３：１であった。この原因についてはさらに検討する必要がある。
【００３７】
［５］D-グロースのNMRによる確認
前記の［４］で得られた酸加水分解液を回収・濃縮して約８．５ｇ相当の糖液を得た。上記のワンパス方式クロマト分離装置を用いてD-グロースを精製した。条件と結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
0005356704.tif 000009
【００３９】
９８％以上の純度の画分（No.１０およびNo.11）を回収した。収量は０．４２ｇであった。図１２に１３C NMR（Authentic,Product）の分析結果を示す。
【００４０】
この加水分解物からＤ−グロースが確認されたことは、本発明の基本的構想が正しいことを示している。すなわち二糖類であるラクチトールの非還元末端のＤ−ガラクトースの３位を酸化し、３ケトラクチトールとする。それを還元することで、希少糖Ｄ−グロースを含む二糖が生産されていることを確実に示している。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
希少糖の生産法に関しては、微生物反応や酵素反応を利用した研究が進められ全希少糖の生産戦略であるイズモリングを設計図として種々の研究が進められている。これらの単糖である各種希少糖は、量的にも多く生産できているため産業的な利用面での研究が進んでいる。
一方、希少糖を含む二糖に関する研究は、多糖の加水分解酵素の糖転移反応を用いた方法、シュークロースフォスフォリラーゼの逆反応を利用した方法などが開発されているが、何れも希少糖を作り、それを受容体として他の単糖を結合させるという方法である。そのため生産量も少なく、希少糖を原料として用いるためコストも高くなる欠点がある。本発明においては二糖類を原料として用いて、二糖に結合したまま構成糖である単糖を希少糖へ変換するという方法のため大量に生産が可能となる。
希少糖を含む二糖はこれまで十分量を得ることができなかったため、殆ど生理活性などの研究が行われていない。本発明によって量的に大量の生産が可能となる方法を確立できたことによって、今後、全く新しい糖質として、食品などへの用途の開発が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ラクチトールを用い、二糖類のままで構成糖である単糖を希少糖へ変換する酸化と還元反応を説明する化学式を示す図面である。
【図２】ラクトースを用い、二糖類のままで構成糖である単糖を希少糖へ変換する酸化と還元反応を説明する化学式を示す図面である。
【図３】トレハロースを用い、二糖類のままで構成糖である単糖を希少糖へ変換する酸化と還元反応を説明する化学式を示す図面である。
【図４】分離した菌株について培養炭素源の影響を示す図面である。
【図５】M31株の１％ラクチトールを用いた洗浄菌体反応の結果を示す図面である。
【図６】二糖類の転換反応（培養MSM-スクロース）：ケトース生産量の推移を示す図面である。
【図７】固定化微生物での相対活性の推移を示す図面である。
【図８】実施例１の洗浄菌体反応の結果をHPLC分析結果で示す図面である。
【図９】洗浄菌体反応後の精製の結果をHPLC分析結果で示す図面である。
【図１０】分離後のHPLC分析結果を示す図面である。
【図１１】ラクチトールとD-グルシル-D-ソルビトールの組成確認HPLC分析結果を示す図面である。
【図１２】NMR（Authentic,Product）分析結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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