(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン類に対して分解能を有するダイオキシン類分解コンポストから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ法により解析し、該Ｔ−ＲＦＬＰ法によるフラグメントサイズを求め、ダイオキシン分解能力と前記フラグメントサイズとの関連によりダイオキシン類分解能を評価する方法であって、
前記コンポストから抽出されたＤＮＡはプライマー２７ｆと９０７ｒを用いてＰＣＲを行い、
制限酵素としてＨｈａ１を使用して得られるフラグメントの内、フラグメントサイズが３６８ｂａｓｅの検出比率（フラグメントサイズが３６８ｂａｓｅの検出輝度／全検出フラグメントの輝度の合計）によってダイオキシン類分解能を評価することを特徴とするＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【請求項２】
前記フラグメントサイズ３６８ｂａｓｅの検出比率が０．２％以上の時、ダイオキシン類分解能力が高いと評価することを特徴とする請求項１記載のＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法に関し、詳しくはダイオキシン類に汚染された土壌、底質、焼却灰、地下水等に対して浄化処理のために使用するダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン分解能力を迅速に評価するＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類は、主に生活ごみや産業廃棄物等を焼却する過程などで発生し、環境には排ガスや排水と共に排出され、一部は降水等により土壌に浸透し吸着される。
【０００３】
また、ダイオキシン類は、化学的に安定で分解されにくいため、汚染された土壌で育った植物類もダイオキシン類を取り込んでいる。
【０００４】
さらに、ダイオキシン類に汚染された水が流入した河川や港湾の底にも蓄積し、そこに生息する魚介類も汚染されている。
【０００５】
人間や動物がダイオキシン類に汚染されたものを摂取すると、体内に蓄積していくが、このダイオキシン類は低濃度で高い毒性を有し、発がん性、催奇性などが知られており、世界的な社会問題となっている。
【０００６】
ダイオキシン類に汚染された土壌、底質、焼却灰、地下水等を浄化する方法として、いくつかの方法が提案されているが、経済性、安全性、浄化後の再利用等を考慮すると、生物学的な処理方法が有効である。
【０００７】
生物処理では分解コンポストに含まれる微生物が、ダイオキシン類の持つ塩素の結合を切る（脱塩素化）することによって、ダイオキシン類を分解する。
【０００８】
この方法において、重要な点は、ダイオキシン類汚染物質に添加した分解コンポストのダイオキシン類の分解能力を把握し、分解能力が高く維持されるように管理することである。
【０００９】
古くは、ダイオキシン類の濃度を直接測定し、その濃度変化により分解能力の評価を行っていた。ダイオキシン類を直接測定する方法による評価は、最も確実なものではあるが、ダイオキシン類を抽出し、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）を用いて測定しなければならず、測定結果を得るまでに長い期間と、コストがかかってしまっていた。
【００１０】
そこで、特許文献１においては、あらかじめダイオキシン類分解の精度と関連を確認した指標となる塩化化合物を添加し、その半減期から能力を測る技術が開示され、ダイオキシン分解能を測定する期間を２〜３週間程度に短縮している。
【００１１】
また、特許文献２には、生物学的な処理に用いる微生物を検出するプローブを用いて、微生物群から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズして、有用微生物の挙動を検出し、ダイオキシン類の分解能力を評価する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−２５５６３１号公報
【特許文献２】特開２００５−２７８４３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
指標とする特定の塩化化合物濃度の変化からダイオキシン分解能力を評価するという特許文献１の技術によって、ダイオキシン類を直接測定する場合に比べれば評価に要する期間は短縮された。しかし、依然として数週間要しており、濃度変化から分解能力を直接評価するという方法は、評価の確実性は高いが、迅速に分解能力を評価したい場合には不向きであった。
【００１３】
ＤＮＡやＲＮＡに着目した方法は、調査に要する時間が数日程度で済むという利点がある。
【００１４】
また、ダイオキシン類を脱塩素化する微生物の多くは難培養性であるので、ＤＮＡやＲＮＡなどを用いた分子生物学的な手法は、そういった微生物の挙動を調査するためには、大変有効な手段だと思われる。
【００１５】
特許文献２の方法は、ダイオキシン類分解作用をもつ微生物を直接検出し、活性を測るというものである。しかし、コンポスト内の総微生物数に対して、ターゲットとする微生物の菌が占める割合は、ごくわずかであるため、検出が難しく、正確なモニタリングが困難な場合があった。
【００１６】
本発明者らは、分子生物学的な手法で分解能力を測る際に、数量の少ない菌を直接モニタリングするのではなく、ダイオキシン分解能力が高いコンポストに特徴的な傾向が見られないかと、多くのコンポストについてダイオキシン類の分解能力と、Ｔ−ＲＦＬＰによる分析結果との関連について、鋭意研究を重ねた結果、本発明に至った。
【００１７】
そこで、本発明の課題は、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって示されたコンポスト内の細菌相の分析結果から、ダイオキシン類分解能力の高いコンポストに特徴的な傾向を見出し、ダイオキシン類分解能力を評価する方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題は以下の各発明によって解決される。
【００２０】
（請求項１）
ダイオキシン類に対して分解能を有するダイオキシン類分解コンポストから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ法により解析し、該Ｔ−ＲＦＬＰ法によるフラグメントサイズを求め、ダイオキシン分解能力と前記フラグメントサイズとの関連によりダイオキシン類分解能を評価する方法であって、
前記コンポストから抽出されたＤＮＡはプライマー２７ｆと９０７ｒを用いてＰＣＲを行い、
制限酵素としてＨｈａ１を使用して得られるフラグメントの内、フラグメントサイズが３６８ｂａｓｅの検出比率（フラグメントサイズが３６８ｂａｓｅの検出輝度／全検出フラグメントの輝度の合計）によってダイオキシン類分解能を評価することを特徴とするＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【００２１】
（請求項２）
前記フラグメントサイズ３６８ｂａｓｅの検出比率が０．２％以上の時、ダイオキシン類分解能力が高いと評価することを特徴とする請求項１記載のＴ−ＲＦＬＰ法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって示されたコンポスト内の細菌相の分析結果から、ダイオキシン類分解能力の高いコンポストに特徴的な傾向を見出し、ダイオキシン類分解能力を評価する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２５】
まず、本発明においてダイオキシン類とは、ＰＣＤＤ、ＰＣＤＦおよびＣｏ−ＰＣＢのダイオキシン類対策特別措置法に定められたダイオキシン類のことを指す。
【００２６】
また、本発明において、評価対象となるダイオキシン類分解コンポストとは、少なくともダイオキシン類に対して分解能を有する微生物を含み、嫌気性微生物およびまたは好気性微生物からなる微生物の複合体である。ダイオキシン類に対して分解能力を有するものであれば特に制限はなく、微生物製剤であってもよい。
【００２７】
ダイオキシン類分解コンポストの例としては、産業廃棄物、家畜糞、食品残渣、底質、下水汚泥などを発酵腐熟させたものが挙げられる。
【００２８】
このダイオキシン類分解コンポストをダイオキシン類汚染物質に接触させると、ダイオキシン類分解コンポスト内の微生物が、ダイオキシン類汚染物質に含まれるダイオキシン類を脱塩素化し、分解処理する。
【００２９】
このダイオキシン類分解コンポストを作用させる方法は、特に限定されず、ダイオキシン類汚染物質とダイオキシン類分解コンポストを分解装置内に入れて、温度、通気量、水分、ｐＨなどを管理しながら攪拌混合するものであってもよいし、ダイオキシン類汚染物質中に注入して作用させるものであってもよいし、浄化対象が土壌などである場合はその表面に覆土して作用させるものであってもよい。
【００３０】
本発明のＴ−ＲＦＬＰ法による評価法で用いるＤＮＡの抽出には、実施例のような方法で抽出することができ、これと同様の抽出精度があれば限定されない。
【００３１】
抽出したＤＮＡは、蛍光色素で標識したプライマー２７ｆ（配列番号１）と、９０７ｒ（配列番号２）を用いて、ＰＣＲを行う。ＰＣＲの増幅条件は、通常行われるプロトコルに従ってよい。
【００３２】
得られたＰＣＲ産物は、濃度調整をして、制限酵素Ｈｈａ１（ＴＡＫＡＲＡ製）で切断した後、電気泳動し、ＤＮＡシークエンサーなどで蛍光強度を測定し、全体の検出輝度に対する３６８ｂａｓｅ付近のフラグメントの検出比率を求める。
【００３３】
蛍光色素は、蛍光強度を測定する検出器に対応させたものとし、検出器は１ｂａｓｅの違いを検出できる精度を持つものであれば限定されない。
【００３４】
本発明者らは、ＰＣＲ産物を切断した後、電気泳動して得られたフラグメントの３６８ｂａｓｅ付近の検出比率と、ダイオキシン類分解能力に相関関係があり、このフラグメントの検出比率によってダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン類分解能力を評価可能であることを見出した。
【００３５】
なお、この検出比率とは、全体のフラグメント検出輝度に対する、３６８ｂａｓｅ付近の検出輝度の割合であり、
検出比率＝（３６８ｂａｓｅの検出輝度）／（全検出フラグメントの検出輝度の合計）
の計算式で求めることができる。
【００３６】
図１は、後述する実施例および比較例において得られた、Ｔ−ＲＦＬＰ法によってダイオキシン類分解コンポストを分析し、求めた３６８ｂａｓｅの検出比率と、各ダイオキシン類分解コンポストを実際に用いてダイオキシン類汚染物質の浄化処理を行った場合に確認されたダイオキシン類の半減期との関係を示す。
【００３７】
なお、この半減期とは、ダイオキシン類分解コンポストを添加する前に測定されたダイオキシン類濃度が、５０％（１／２）となるまでに要する期間のことであり、この半減期が短いほど、ダイオキシン類の分解能力が高い。
【００３８】
図１から、３６８ｂａｓｅ付近のフラグメントの検出比率と、ダイオキシン類の半減期の分布には相関関係が見られ、示された近似式で半減期を比較すると、検出比率が０％のダイオキシン類分解コンポストでは４５０日以上であるのに対し、０．２％では、２００日程度、０．３％では１００日程度である。
【００３９】
本発明者らの実験に基づく評価方法によると、半減期が２００日程度になるとダイオキシン分解能力が高いと判断することができるので、３６８ｂａｓｅ付近のフラグメントの検出比率が０．２％以上となるか否かをダイオキシン分解能力の指標とすることができる。
【００４０】
この評価法を用いることによって、ダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン類分解能力を短時間で（数日のうちに）評価することができるので、ダイオキシン類汚染物質の浄化処理をするにあたっては、ダイオキシン分解能力の高いコンポストを選択することができる。
【００４１】
また、分解処理中の試料からＤＮＡを抽出し、ダイオキシン類分解能力を評価すれば、分解処理が順調に行われているかを監視することもできる。
【００４２】
評価が低く、能力が落ちていると考えられる場合には、新たに分解コンポストを添加するほか、温度やｐＨを調節するなどの措置を講じることでダイオキシン類分解能力を向上させるように調整することができ、ダイオキシン類を計画的に分解するための管理が容易にできるようになる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００４４】
実施例１
ダイオキシン類分解コンポストＡから、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．の方法を改変した方法でＤＮＡを抽出した。
【００４５】
まず、遠心分離して得られたダイオキシン類分解コンポストのペレットを１５ｍＬ容チューブに入れ、１００μＬの酵母ＲＮＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１．２ｍＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウム、８００μＬの０．４％スキムミルクを添加しホモジナイズした。
【００４６】
これに粉末リソチーム２０ｍｇを添加し、３７℃、３０分振とう保温した後、３００μＬの２０％ＳＤＳを添加し、混合して６５℃で３０分保温し、続いて３回の凍結融解処理を行い、上清を回収した。
【００４７】
上清に５００μＬの７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液を添加し、５分間氷冷した後、遠心し、上清を回収した。これに０．８倍容のイソプロパノールを添加しよく混合して室温で２時間放置した後、遠心し、上清を除いて得られたＤＮＡ沈殿物を２００μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４８】
ＤＮＡ−ＴＥ溶解液に等量のＰＣＩを加え、除タンパクし、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。
【００４９】
回収したＤＮＡをさらにＲＮａｓｅ処理して精製した。
【００５０】
蛍光物質（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）で標識したプライマー２７ｆ（配列番号１）と、９０７ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲは、９５℃  １分、４７℃  １分、７２℃  １．５分を２１サイクル行ってＰＣＲ産物を得た。
【００５１】
ＰＣＲ産物濃度を測定し、サンプルのＰＣＲ産物濃度が１５０ｎｇ／ｔｕｂｅとなるように調整した。
【００５２】
調整したサンプルに、制限酵素Ｈｈａ１（ＴＡＫＡＲＡ製）を加え、３７℃で２時間酵素処理を行い、９７℃４分間変性処理をして氷冷し、アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を１０時間行った。
【００５３】
フラグメントの解析には、４０ｂａｓｅから９００ｂａｓｅ付近の範囲をフラグリス（日立製作所）を用いて行った。
【００５４】
解析の結果から、全体の輝度における３６８ｂａｓｅの検出比率を算出したところ、０．３１％であった。
【００５５】
このダイオキシン類コンポストＡと、ダイオキシン類による汚染が５１ｎｇ／ｇである汚染土壌と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を純度９９．５％の窒素ガス（酸素分圧０．５％）の、有機物負荷量を１日あたり５ｇ（含水率８０％）、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して１５０日処理を行なった後、ダイオキシン濃度を測定したところ、１６ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった（半減期は７９日）。
【００５６】
実施例２
ダイオキシン類分解コンポストＢについて、実施例１と同様に、３６８ｂａｓｅの検出比率を求めたところ、０．２％であった。
【００５７】
このダイオキシン類分解コンポストＢを用いて、実施例１と同様にダイオキシン類による汚染が８４ｎｇ／ｇであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を純度９９．５％の窒素ガス（酸素分圧０．５％）の、有機物負荷量を１日あたり５ｇ（含水率８０％）、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して９０日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は３９ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった。（半減期は８６日）。
【００５８】
実施例３
ダイオキシン類分解コンポストＣについて、実施例１と同様に、３６８ｂａｓｅの検出比率を求めたところ、０．２％であった。
【００５９】
このダイオキシン類分解コンポストＣを用いて、実施例１と同様にダイオキシン類による汚染が８３ｎｇ／ｇであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を酸素分圧１０％、有機物負荷量を１日あたり５０ｇ（含水率８０％）、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して９０日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は５８ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった。（半減期は１８７日）。
【００６０】
実施例４
ダイオキシン類分解コンポストＤについて、実施例１と同様に、３６８ｂａｓｅの検出比率を求めたところ、０．２％であった。
【００６１】
このダイオキシン類分解コンポストＤを用いて、実施例１と同様にダイオキシン類による汚染が８４ｎｇ／ｇであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を酸素分圧２０％、有機物負荷量を１日あたり５０ｇ（含水率８０％）、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して９０日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は６１ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった。（半減期は２２３日）。
【００６２】
比較例１
ダイオキシン類分解コンポストＧについて、実施例１と同様に、３６８ｂａｓｅの検出比率を求めたところ、０．０４８％であった。
【００６３】
このダイオキシン類分解コンポストＧを用いて、実施例１と同様にダイオキシン類による汚染が７２ｎｇ／ｇであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を酸素分圧２０％、有機物負荷量を１日あたり５ｇ（含水率８０％）、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して９０日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は５９ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった。（半減期は４６４日）。
【００６４】
比較例２
ダイオキシン類分解コンポストＨについて、実施例１と同様に、３６８ｂａｓｅの検出比率を求めたところ、０．０５５％であった。
【００６５】
このダイオキシン類分解コンポストＨを用いて、実施例１と同様にダイオキシン類による汚染が６９ｎｇ／ｇであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを１：１：１で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を２５℃、気相を酸素分圧２０％、有機物負荷量を１日あたり油脂５．６ｇ、１時間に５分程度撹拌を行なうように管理して９０日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は５７ｎｇ／ｇ（汚染物質の重量換算）であった。（半減期は５７８日）。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】３６８ｂａｓｅ付近のフラグメントの検出比率と、ダイオキシン類の半減期との関係を示す図。
【図１】
0005140358.tif 000002
【配列表】
0005140358000001.app