(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板上に形成されたフローセルと、
前記基板上に形成された第一の流路であって、前記フローセルの上流側に接続され、微粒子を含む試料液を導入するための流路と、
前記基板上に形成された第二の流路であって、前記フローセルの上流側に接続され、前記微粒子を含む試料液をシースするための流体を導入するための流路と、
前記基板上に形成されたさらなる複数の流路であって、前記フローセルの下流側に接続され、該フローセル内で振り分けられた前記微粒子をそれぞれ流下させるための複数の流路と、
を備える細胞選別用チップとともに使用する、流体中の微粒子画像計測装置であって、
前記フローセルの一部に光を照射するＬＥＤと、
該ＬＥＤの光が照射された前記フローセルを所定の速度で流下する前記微粒子の画像を撮像するためのカメラであって、シャッターが前記微粒子の流下する速度に応じて所定の周期でクリックするカメラと、
前記カメラのシャッターのクリックの周期と前記ＬＥＤの光の照射の繰り返し周期とが同期するように前記ＬＥＤの発光を制御するＬＥＤ制御部であって、前記カメラのシャッターのクリックに同期して前記ＬＥＤに駆動信号を与えて、該シャッターがオープンした時に前記微粒子の大きさおよび流下する速度に応じて、前記シャッターのオープン時間よりも短く、かつ前記微粒子が自身の流下方向の長さ分の距離を移動するために必要な時間よりも短い時間だけ前記ＬＥＤを発光させるように制御するＬＥＤ制御部と、
前記画像から得られる情報に基づいて前記微粒子を前記複数の流路に振り分けるように前記微粒子に電界を作用させるための電界印加手段と、
を備えることを特徴とする流体中の微粒子画像計測装置。
【請求項２】
前記電界印加手段が、
前記ＬＥＤの発光により照射されるフローセルの部分より下流側に配置され、前記フローセルを流下する流体に接するように前記フローセルの内面に露出する電極と、
前記カメラにより撮像された画像からフローセルを流下する微粒子を評価するとともに、該評価結果に応じて前記電極に所定の電圧を印加するための制御部と、
を備え、
前記評価結果に応じて前記電極により前記微粒子に所定の電界を印加できるように前記微粒子の流下する速度および前記微粒子の評価に要する時間に応じた所定の位置に配置されている、請求項1記載の流体中の微粒子画像計測装置。
【請求項３】
前記カメラのシャッターは１／２０００秒以下の周期でオープンするものであるとともに、前記ＬＥＤは前記カメラのシャッターのオープンに同期して０．１μ秒以上、１μ秒以下の時間発光する、請求項1または２記載の流体中の微粒子画像計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフローセルを流下する流体中の微粒子を鮮明に撮像できるようにし、この画像を基礎として微粒子を選別できる微粒子画像計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、特定の細胞を他の細胞から分離して収集するために、特定の細胞の条件に応じて細胞を蛍光標識するなどして細胞を選別することが広く行われる。しかし、標識により細胞がダメージを受けることも多いため、細胞が受けるダメージを回避するため、細胞を標識することなく、細胞の画像を識別して選別することが試みられている。
【０００３】
例えば、特開昭６３−９４１５６にはシース流とともにフローセルを流下する試料細胞を検知した時、所定時間経過後に撮像用レーザパルス光源を励起して細胞を撮像して細胞を分析することが提案されている。また、特表昭５７−５００９９５にはシース流とともにフローセルを流下する試料細胞を所定の周期で発光するフラッシュランプにより細胞を撮像して細胞を分析することが提案されている。特開昭６３−９４１５６でも、所定の周期で撮像用レーザパルス光源を励起して細胞を撮像することに言及されている。
【特許文献１】特開昭６３−９４１５６
【特許文献２】特表昭５７−５００９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特開昭６３−９４１５６に開示されるように、定常ランプ光源とカメラの組み合わせでは、カメラのシャッタースピードによって、試料の流速の制限があり、シャッタースピードが速いと照明が暗くなるという欠点があった。
【０００５】
上記特表昭５７−５００９９５に開示される撮像方法は、特開昭６３−９４１５６にも言及されているように、フラッシュランプの照射光のパルス発光の繰り返し周波数は充放電現象によって支配され周波数が高いほど充電量が少なくパルス強度が弱くせいぜい４００Ｈｚ以下のものが実用化されているのみであり、試料の流速に制約があった。
【０００６】
特開昭６３−９４１５６に開示されるように、撮像用レーザパルス光源を利用して試料を照射すれば、照射光のパルス幅を短く出来るので、より高速の試料の流速に対しても画像を得ることが出来るが、コヒーレント光であるがために無数の干渉縞が生じ、それが画像処理による数値化において誤った結果が得られる原因となる。
【０００７】
したがって、インコヒーレントパルス光源により試料検出のスループットを上げることができる微粒子画像計測装置が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、上記状況を鑑み、繰り返し周波数が高くかつ高輝度なＬＥＤを用いたインコヒーレントパルス光源により試料検出のスループットを上げることができる微粒子画像計測装置を提供する。
【０００９】
（１）基板と、
前記基板上に形成された（好ましくは、横断面が長方形をした）フローセルと、
前記基板上に形成された第一の流路であって、前記フローセルの上流側に接続され、微粒子を含む試料液を導入するための流路と、
前記基板上に形成された第二の流路であって、前記フローセルの上流側に接続され、微粒子を含む試料液をシースするための流体を導入するための流路と、
前記基板上に形成されたさらなる複数の流路であって、前記フローセルの下流側に接続され、該フローセル内で振り分けられた前記微粒子をそれぞれ流下させるための複数の流路と、
を備える細胞選別用チップとともに使用する、流体中の微粒子画像計測装置であって、
前記フローセルの一部に光を照射するＬＥＤ（発光ダイオード）と、
該ＬＥＤの光が照射された前記フローセルを流下する微粒子の画像を撮像するためのカメラであって、シャッターが所定の周期でクリックするカメラと、
前記ＬＥＤを前記カメラのシャッターのクリックに同期して、該シャッターがオープンした時に所定時間発光させるように制御するＬＥＤ制御部と、
前記画像から得られる情報に基づいて前記微粒子を前記複数の流路に振り分けるように前記微粒子の電界を作用されるための電界印加手段と
を備えることを特徴とする流体中の微粒子画像計測装置。
（２）前記電界印加手段が、
前記ＬＥＤの発光により照射されるフローセルの部分より下流側に配置され、前記フローセルを流下する流体に接するように前記フローセルの内面に露出する電極と、
前記カメラにより撮像された画像からフローセルを流下する微粒子を評価するとともに、該評価結果に応じて前記電極に所定の電圧を印加するための制御部と、を備える（１）記載の流体中の微粒子画像計測装置。
（３）前記カメラのシャッターは１／２０００秒以下の周期でオープンするものであるとともに、前記ＬＥＤは前記カメラのシャッターのオープンに同期して０．１μ秒以上、１μ秒以下の時間発光する（１）記載の流体中の微粒子画像計測装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、試料検出のスループットを上げるため、検出対象である微粒子が流下するフローセルの微粒子検出領域を、該領域を撮像するカメラのシャッターのクリック（開閉）に同期して、シャッターがオープンした時に高輝度なＬＥＤを所定時間発光させて流体中の微粒子の画像を計測する。
【００１１】
本発明によれば、検出対象である微粒子が流下するフローセルの微粒子検出領域は、繰り返し周波数が高くかつ高輝度なＬＥＤを用いたインコヒーレントパルス光源により照射されるので試料検出のスループットを上げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１は本発明の微粒子画像計測装置を説明する概念図である。１はフローセルを形成する基板、２は基板１に形成されたフローセルであり、フローセル２は、好ましくは、横断面が長方形をしたものとされる。３，４は、それぞれ、フローセルの上流側に接続された流路である。流路３の上流端にはリザーバー５が設けられる。リザーバー５には緩衝液とともに微粒子が格納されている。ここでは、三角印で示す微粒子と星印で示す微粒子が混在するものとして表示されている。リザーバー６には緩衝液が格納されている。リザーバー５から緩衝液とともに微粒子が流路３を流下してフローセル２に流入する。リザーバー６から緩衝液が流路４を流下してフローセル２に流入する。リザーバー５からフローセル２に緩衝液とともに流入する微粒子は、リザーバー６からフローセル２に流入する緩衝液によりシースされて、フローセル２を流下するときは、整然と流下するものとなる。７，８はＶ字型をしたゲル電極であり、Ｖ字のとがった部分でフローセル２の横長の両側面に、微細な開口を通して露出して、フローセル２を流下する緩衝液と接触し、電気的な影響を及ぼすことができるものとされる。９，１０は、それぞれ、フローセルの下流側に接続された流路である。１１，１２は、それぞれ、流路９，１０の下流側に接続されたリザーバーである。フローセル２を流下する微粒子は、後述するように、高速カメラで撮像され、画像処理による識別に応じて、流路９，１０のいずれかに振り分けられて流下する。したがって、リザーバー１１には、たとえば、星印の微粒子が格納され、リザーバー１２には、たとえば、三角印の微粒子が格納される。なお、１３はフローセルの下流側に接続された流路であり、１４は流路１３の下流側に接続されたリザーバーである。流路１３とリザーバー１４は微粒子が画像処理による識別では識別対象とされていないときの微粒子を格納するためのものである。
【００１３】
２１はＬＥＤ（発光ダイオード）であり、後述するように、高速カメラのシャッターがオープンとなった瞬時に発光するように制御される。２２は集光レンズであり、ＬＥＤの発光した光が、後述するフローセル２を流下する微粒子撮像領域２４に集中するようにする。２３はミラーであり、ＬＥＤの発光した光の光路を変更するものである。微粒子を含む試料液をシースするための流体を導入するための流路と、２４は、フローセル２の最上流領域に設定された微粒子撮像領域である。２５は対物レンズであり、微粒子撮像領域２４を流下している微粒子に、ＬＥＤの光が照射されるとき、微粒子を高速カメラで撮像するための所定の倍率を有する。２６はローパスフイルターであり、対物レンズ２５を通過した画像信号から所定の周波数成分以上のものをカットする。２７は高速カメラのシャッター、２８は高速カメラの本体である。２９は、ＬＥＤ２１の駆動回路（ＬＥＤ制御部）である。高速カメラ２８はシャッター２７をオープンするとき、ＬＥＤ２１の駆動回路２９にシャッター２７のオープンの信号を送る。この信号を受けて駆動回路２９はＬＥＤ２１に対して、きわめて短い駆動信号を送る。
【００１４】
３１は、いわゆる、パソコンである。パソコン３１は、高速カメラ２８がＬＥＤ２１の駆動回路２９にシャッター２７のオープンの信号Ｓ1を送るのに合わせて、このオープンの信号Ｓ1をフローセル２の撮像領域２４を流下する微粒子の撮像タイミング信号Ｓ2として受領する。さらに、これに引き続いて、パソコン３１は、高速カメラ２８の撮像した画像信号Ｓ3を送り込まれる。３２は、ゲル電極７，８の駆動回路であり、パソコン３１が与える駆動信号Ｓ4に応じて、ゲル電極７，８に所定の極性の電圧を与え、あるいは、電圧を与えない駆動信号Ｓ5を発生する（電界印加手段）。ここで、例えば、ゲル電極７，８に＋、−の電圧を与えたとき、フローセル２を流下する微粒子が流路９を流下するように振られるとし、ゲル電極７，８に−、＋の電圧を与えたとき、フローセル２を流下する微粒子が流路１０を流下するように振られるものとする。ゲル電極７，８に電圧が与えられないときは、フローセル２を流下する微粒子は流路１３を流下する。
【００１５】
パソコン３１（制御部）には、あらかじめ、フローセル２を流下する微粒子の流下速度の情報を与える。この情報は、微粒子の分離に先行する計測によって与えるものとしても良いし、フローセル２を含むシステムの設計により与えるものとしてもよい。また、パソコン３１には、流下する微粒子の取り込まれた画像信号Ｓ3が、あらかじめ準備されている画像情報と対応するか否かを判定する画像処理のプログラムが組み込まれている。パソコン３１は、微粒子の流下速度の情報と、画像処理のプログラムによって判定された画像信号Ｓ3の判定結果に応じて、微粒子がフローセルのゲル電極７，８の開口位置に到達するタイミングで、駆動信号Ｓ4を発生して、駆動回路３２はゲル電極７，８に所定の電圧を与え、あるいは与えない。これに応じて、フローセル２を流下する微粒子がリザーバー１１，１２あるいは１４に振り分けられる。
【００１６】
このように、本発明では、高速カメラ２８は、自己のシャッター２７をオープンするその瞬時にのみ繰り返し周波数が高くかつ高輝度なＬＥＤを用いたインコヒーレントパルス光源により照射されるので試料検出のスループットを上げることができる。
【００１７】
本発明の一実施例について、具体的にデータを示すと以下のようである。
【００１８】
高速カメラ２８の撮影能力を１秒間に２０００枚とする。すなわち、５００μｓに１回の割りでシャッターがクリックするものとする。駆動回路２９はＬＥＤ２１に対して、１μｓのきわめて短い駆動信号を与えるものとする。リザーバー５，６には、適当な加圧手段、例えば、シリンジポンプにより加圧をして、フローセル２を流下する微粒子の速度を２００ｍｍ／ｓとする。ゲル電極７，８のフローセル２の開口の流下方向への長さを２０μｍとする。
【００１９】
この場合、ＬＥＤ２１が１μＳの発光をしている間に微粒子の移動する距離は０．２μｍとなるから、たとえば、微粒子が１０μｍの大きさの細胞であったとすると、撮像された細胞の画像は２％の重なりを持つに過ぎないものとなる。すなわち、画像としては鮮明なものである。５００μＳに１回の割りでシャッターがクリックするから、次のＬＥＤ２１の発光までに、微粒子はフローセル２を１００μｍ移動する。高速カメラ２８からパソコン３１への画像信号Ｓ3の転送とパソコン３１での画像処理にトータルとして１ｍｓを要するとすると、この時間に微粒子が移動する距離は２００μｍである。この２００μｍの移動距離に、前記１００μｍの移動距離は含まれる。したがって、高速カメラ２８の微粒子の撮像位置から２００μｍ下流の位置にゲル電極７，８の開口２０μｍの始点が来るようにゲル電極７，８を配置すればよい。ここで、ゲル電極７，８の開口の下流方向への長さは２０μｍであるから、微粒子は１００μｓでゲル電極７，８の開口部を通過する。したがって、駆動回路３２はこの時間内に、ゲル電極７，８が微粒子に対して、十分な電気的影響力を及ぼすことができるように構成されることが必要である。
【００２０】
図２は、上述した本発明の微粒子画像計測装置の構成に関する一例についての時間関係を模式的に表示した図である。
【００２１】
なお、上述の実施例では、高速カメラ２８の撮影能力を１秒間に２０００枚、すなわち、５００μｓに１回の割りでシャッターがクリックするものとし、これに対して、ＬＥＤ２１は、駆動回路２９により１μｓのきわめて短い駆動信号を与えられ、発光するものとして説明した。現在の技術でも、ＬＥＤは１０ＫＨｚの周波数応答を持つものとできるので、上記高速カメラ２８の撮影能力が１秒間に１００００枚、すなわち、１００μｓに１回の割りでシャッターがクリックするものとしても、これに対応することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の微粒子画像計測装置を説明する概念図である。
【図２】本発明の微粒子画像計測装置の構成に関する一例についての時間関係を模式的に表示した図である。
【符号の説明】
【００２３】
１…フローセルを形成する基板、２…基板１に形成されたフローセル、３，４…フローセルの上流側に接続された流路、５，６…流路３，４の上流端に設けられたリザーバー、７，８…Ｖ字型をしたゲル電極、９，１０…フローセルの下流側に接続された流路、１１，１２…流路９，１０の下流側に接続されたリザーバー、１３…フローセルの下流側に接続された流路、１４…流路１３の下流側に接続されたリザーバー、２１…ＬＥＤ、２２…集光レンズ、２３…ミラー、２４…フローセル２の最上流領域に設定された微粒子撮像領域、２５…対物レンズ、２６…ローパスフイルター、２７…高速カメラのシャッター、２８…高速カメラの本体、２９…ＬＥＤ２１の駆動回路、３１…パソコン、３２…ゲル電極７，８の駆動回路。
【図１】
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【図２】
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