(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ（ε-カプロラクトン）に、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも１つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有することを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
親水性骨格を含むポリマー鎖が、疎水性ポリマー骨格100重量部に対して5重量部以上グラフトされている請求項１記載の細胞培養基材。
【請求項３】
表面の水接触角が25°〜60°である請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項５】
以下の工程を含む細胞培養基材の製造方法。
（１）水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ（ε-カプロラクトン）の表面を作製する工程
（２）工程（１）で作製した表面にポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも１つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトする工程
【請求項６】
工程（２）の親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフトがプラズマグラフト共重合によることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
工程（２）で親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトすることにより、表面の水接触角を25°〜60°とすることを特徴とする請求項５または６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖に用いる細胞培養基材に関する。さらに詳しくは、細胞接着性物質の固定化・吸着を必要とせず、安全に、効率よく細胞を増殖させることができる細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体組織の再生誘導を介した欠損組織の再生修復が可能となってきている。しかし、バイオマテリアルおよび人工臓器に完全に依存している現在の外科治療法では、その治療効果は一時的で侵襲が大きく、補助できる機能が単一であるという欠点がある。一方、臓器移植は臓器提供者の不足、および移植後の拒絶反応などといった問題を抱えている。
【０００３】
このような状況下で新たな治療法として再生医療が注目されている。再生医療の基本概念は、人工的に培養した細胞や組織を用いて細胞の増殖・分化を促進し、自己組織の再生を誘導することによって欠損組織、障害臓器の機能を再生修復することである。
【０００４】
一般に生体外（in  vitro）で細胞を培養する場合、細胞の機能を生体内の状態と同レベルで維持し、高密度に培養することが重要である。また、細胞を培養基材上に接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性が良好であるとともに、接着した細胞が伸展、増殖、移動できる状態であることが必要である。
【０００５】
従来細胞培養は、ガラス、ポリマー製培養皿、試験管、培養ビンなどを用いて行われてきた。従来から細胞培養基材として用いられている高分子材料、特にポリスチレンは、賦形性、耐久性、透明性、無毒性、および低コストの点で優れている。しかし、ポリスチレンは表面が疎水性のため、細胞接着性の点で不適当であった。更に、ポリスチレンの疎水性表面においては、細胞と該表面の吸着タンパク質との間で制御されない相互作用を生じ、該表面上でタンパク質の吸着・変性が起こるなどの問題があった。
【０００６】
そこで、ポリスチレンの疎水性表面をコロナ放電処理することにより、該表面のみに陰イオン導入し、親水性を付与して、細胞の接着性、増殖性を改善した細胞培養基材が開発され、広く用いられている。しかし、コロナ放電処理では、特異的な細胞の機能を発現させて長期間維持させることは困難であることがわかってきた。
【０００７】
また、細胞培養基材の疎水性表面を親水化させ、細胞培養の効率性を降下させるタンパク質の吸着を抑制する試みとしてコラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングする方法がある（特許文献１参照）。しかしながら、これら従来の方法では、該表面にコーティングした親水性化合物が細胞培養中に培地水溶液へ溶出し、細胞の機能・形態に影響を及ぼす可能性があった。
【０００８】
一方、親水性化合物を細胞培養基材の疎水性表面に固定化することにより、該表面に親水性を付与する方法もある。この方法によれば、該表面から培地水溶液中に伸びる親水性化合物により、高密度な含水層が形成されるとともに、排除体積効果が増大することによりタンパク質の吸着が抑制されるという報告がある。しかし、この方法では、当該表面上で細胞を培養すると細胞接着性が低いことが確認されている（特許文献２参照）。
【０００９】
そこで最近では、細胞培養の環境を、生体内の状態に出来る限り近づけることにより、細胞の接着、増殖、分化、および物質産生などの機能を向上させる技術が盛んに開発されている。例えば、細胞外マトリックスおよび細胞接着因子などの細胞接着性物質を用いた技術が開発されている（特許文献３参照）。
【００１０】
細胞外マトリックスとは、細胞により合成され、細胞外に分泌されて蓄積する生体高分子の合成体を指す。細胞外マトリックスは細胞周辺に沈着した組織の構造支持体であり、細胞接着や細胞骨格の配向、細胞の形、細胞移動、細胞増殖、細胞内代謝、および細胞分化を調整する物質である。細胞外マトリックスとしては、主成分であるコラーゲンと、第2成分であるフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、およびグリコサミノグリカンなどが挙げられる。
【００１１】
細胞接着因子とは、細胞表面に存在し、細胞−細胞間および細胞−細胞外マトリックスの接着に関わる因子を指す。細胞−細胞間の接着に関わる因子としては、カドヘリンファミリー、Igスーパーファミリー、セレクチンファミリー、およびシアルムチンファミリーなどが挙げられる。また、細胞−細胞外マトリックスの接着に関わる因子としては、インテグリンファミリーなどが挙げられる。
【００１２】
細胞の接着、増殖を制御する細胞外マトリックス成分を培養用基材上に固定化した例として、コラーゲンをコートした細胞培養基材（非特許文献１参照）、フィブロネクチンをコートした細胞培養基材(非特許文献２参照)、細胞接着性タンパク質をコートした細胞培養基材(非特許文献３参照)などがある。
【００１３】
しかしながら、細胞培養基材表面に固定された細胞外マトリックスの高次構造を生体外で再現することは容易ではなく、再現性よく実現することは非常に困難であった。また、一般的に、上記細胞接着性物質は非常に高価であるという問題があった。
【００１４】
【特許文献１】特開平6-153905号公報
【特許文献２】特表2002-511496号公報
【特許文献３】特開2004-208692公報
【非特許文献１】K.Yoshizato.et al. Annals of Plastic Surgery. Vol.13, No.1 1984
【非特許文献２】F.Grinnell.Expl.Cell Res.,102. 51. 1984
【非特許文献３】P.T.Piccioano. et al, In Vitro Cellular and Developmental Biology 22(3). 24A. 1986
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、かかる従来の問題点を解決し、細胞接着性物質の基材表面への固定化・吸着を必要とせず、優れた細胞培養の効率性を有する細胞培養基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は上述の課題を考慮し、鋭意検討した結果、水接触角が75°〜100°であるポリスチレン、ポリ（ε-カプロラクトン）に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有する細胞培養基材によれば、細胞接着性物質の固定化・吸着を必要とせず、細胞培養の効率性が向上することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は下記の通りである。
【００１７】
１．水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ（ε-カプロラクトン）に、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも１つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有することを特徴とする細胞培養基材。
２．親水性骨格を含むポリマー鎖が、疎水性ポリマー骨格100重量部に対して5重量部以上グラフトされている請求項１記載の細胞培養基材。
３．表面の水接触角が25°〜60°である前項１または２に記載の細胞培養基材。
４．前項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
５．以下の工程を含む細胞培養基材の製造方法。
（１）水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ（ε-カプロラクトン）の表面を作製する工程
（２）工程（１）で作製した表面にポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも１つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトする工程
６．工程（２）の親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフトがプラズマグラフト共重合によることを特徴とする前項５に記載の製造方法。
７．工程（２）で親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトすることにより、表面の水接触角を25°〜60°とすることを特徴とする前項５または６に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞培養基材によれば、細胞接着性物質の基材表面への固定化・吸着を必要とせずに、細胞培養の効率性を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の細胞培養基材は、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有する。
【００２０】
本発明に用いる疎水性ポリマーは、水接触角75°〜100°のポリマーである。ここで、水接触角とは固体表面上に、液滴を乗せ、その雰囲気下で平衡になっているとき、下式により求めることができる値である。下式を「ヤングの式」と言い、液体表面と固体表面のなす角度を「接触角」と定義している。水接触角は、広く市販されている装置により測定することができ、例えば、DropMaster500（界面化学社製）により測定することができる。
γＳ=γＬcosΘ＋γＳＬ
（上記式において、γＳは固体の表面張力、γＬは液体の表面張力、γＳＬは固体／液体の界面張力、Θは接触角を示す。）
【００２１】
前記疎水性ポリマーは所望の適用に依存して、生分解性、非生分解性のいずれかに限定されない。また、疎水性ポリマーは生体内および生体外のいずれにおいても有用であるように、非毒性および生体適合性であり、機械的安定性、透明性および成型加工性に優れていることが好ましい。
【００２２】
前記疎水性ポリマーとしては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、およびポリアセタールなどのエンジニアプラスチック並びに汎用ポリマーまたはこれらの混合物が挙げられる。
【００２３】
また、疎水性ポリマーとして、生分解性ポリマーを用いてもよく、例えば、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンカーボネートなどの生分解性ポリマーが挙げられる。これらの生分解性ポリマーは、医療用途として用いる場合に、生体内に吸収されるという観点から好ましい。
【００２４】
前記疎水性ポリマーの中でも、透明性、加工性、および強度の点で優れていることから、ポリスチレンが好ましい。また、入手の容易性、価格等の観点から、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ乳酸が好ましい。さらに、有機溶媒への溶解性の観点から、ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネートが好ましい。
【００２５】
本発明に用いる親水性骨格を含むポリマーとしては、例えば、水酸基を含むポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート,ポリプロピレンオキシド；ビニル基を含むポリビニルピロリドン；酸アミド基を含むポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド;およびそれらを構成するモノマーとの共重合体などが挙げられる。中でも、放射線などを用いた滅菌に対する耐性の観点から、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの共重合体が好ましい。これらは、１種のみで用いることも可能であり、また２種以上を組み合わせて用いることも可能である。
【００２６】
前記親水性骨格を含むポリマー鎖の分子量の範囲は、500〜2000とすることが好ましい。この範囲内とすることによりポリマー鎖の配向性を良好に維持できるからである。また、親水性骨格を含むポリマー鎖が共重合体の場合、その組成比は特に限定されず、組成比を変えることで、分子内に含まれる親水基率を自在に制御できる。親水性骨格を含むポリマー鎖は、疎水性ポリマー骨格100重量部に対して5重量部以上、好ましくは10重量部以上グラフトすることが好ましい。5重量部以上とすることで十分な親水性が得られ、親水性骨格を含むポリマー鎖を均一にグラフトすることが可能となる。
【００２７】
親水性骨格を含むポリマー鎖を、疎水性ポリマー骨格にグラフトする方法は、特に限定されず、例えば、プラズマグラフト重合法、光グラフト重合法、および放射線グラフト重合法などが挙げられる。中でも、プラズマグラフト共重合は、ガスプラズマ処理において用いるプロセスガスの種類を選択することにより、表面にアミノ基、アミド基、カルボキシル基、カルボニル基、エステル基、およびヒドロキシル基などの極性基の導入、並びに化学結合の形成が可能であり、広範に利用できる点で好ましい（参考：B.J.Jeong et al., J.Colloid Interf.Sci., 178, 757(1996)）。
【００２８】
これらの方法は、ポリマー表面改質法として一般的に用いられる方法であり、固相系の反応である。これらの方法においては、高いエネルギー源によりポリマーの分子鎖全体にわたってポリマーラジカルが形成され、ポリマーラジカルの形成が表面層に限定されるため、表面層の改質に最も適している。
【００２９】
グラフト共重合により、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトする方法の具体例として、例えば以下の（Ａ）〜（Ｃ）の方法が挙げられる。
（Ａ）あらかじめ高いエネルギー源により疎水性ポリマーの分子鎖全体にわたってポリマーラジカルを形成させ、反応性の官能基を形成する。その後、親水性骨格を含むポリマー鎖の水溶液中で縮合反応させる（参考：Z.Cheng, S-H.Tech, Biomaterials 25(2004)1991-2001）。この場合、親水性骨格を含むポリマー鎖の末端、あるいは側鎖の1つ以上は、疎水性ポリマー骨格に形成された反応性官能基と反応し得る必要がある。当該反応性の官能基としては、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基などが挙げられる。
【００３０】
（Ｂ）あらかじめ高いエネルギー源により疎水性ポリマーの分子鎖全体にわたってポリマーラジカルを形成させ、二重結合を持つ親水性骨格を含むポリマー鎖の反応液と接触させてグラフトする（参考：Nakayama Y et.al., ASAIO,39,M754-M757(1993)）。この場合、用いる親水性骨格を含むポリマー鎖の末端、あるいは側鎖の1つ以上に二重結合を含む必要がある。このような親水性骨格を含むポリマー鎖としては、例えば、ポリ（N, N-ジメチルアクリルアミド）、ポリメタクリロイルオキシアルキルホスホリルコリンなどが挙げられる。
【００３１】
（Ｃ）反応系内に親水性ポリマー骨格を形成するモノマーを導入し、または接触させてラジカル反応開始剤を介してラジカル重合する（参考：Nakayama Y et.al., Macromolecules, 32, 5405-5410(1999)）。この場合、親水性骨格を有するモノマーまたはマクロモノマーは重合可能な鎖末端を含む必要がある。ラジカル反応開始剤として、例えば、α，α´―アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）、ベンゾイルパーオキサイド（BPO）などが挙げられる。当該重合可能な鎖末端を含むモノマーまたはマクロモノマーとしては、例えば、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルなどが挙げられる。
【００３２】
本発明の細胞培養基材はどのような形状であってもよく、例えば、平面、曲面または円筒面などにすることができる。中でも、親水性基を含むポリマー鎖をグラフトする工程においては、平坦面であることが好ましい。
【００３３】
平坦面の基材形状は、例えば、基材を熱溶融プレス加工することにより形成する。または、例えば、適当な溶剤に疎水性ポリマーを溶解し、ガラス、金属、およびシリコンウエハ等の無機材料基材、またはポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリエーテルケトンなどの耐有機溶剤性に優れた高分子基材上にスピンコート、ディッピング、溶液をキャストするなどして形成する。なお、表面の平滑性の観点から、無機材料基材を用いることが好ましい。
【００３４】
本発明の細胞培養基材で培養できる細胞の種類は特に限定されないが、動物細胞、特には接着性細胞であり、株化細胞、初代細胞を問わず、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、神経細胞等の培養に広く用いることができる。また、血球系細胞等のいわゆる浮遊細胞等にも広く使用することができる。
【００３５】
本発明の細胞培養基材を用いると、細胞外マトリックスおよび細胞接着因子などの細胞接着性物質の固定化・吸着を必要とせず、細胞培養の効率性を向上することができる。本発明の細胞培養基材は、シャーレ、プレート、培養容器、培養バッグ、フィルム、線維、マイクロキャリア、およびビーズ等の従来から細胞培養に用いられている基材、またはこれら以外の細胞培養に使用可能な基材のいずれにも適用することができる。
【００３６】
本発明の細胞培養基材の製造方法の具体例として、例えば、以下の工程（１）〜（２）を含む方法が挙げられる。
（１）疎水性ポリマー表面の作製工程
工程（１）は、疎水性ポリマー表面を形成する工程である。疎水性ポリマーを、クロロホルム、テトラヒドロフランなどの溶剤に0.3〜1.0質量％となるように溶解し、疎水性ポリマー溶液を調製する。該疎水性ポリマー溶液を高分子基材上にスピンコートし、室温で静置乾燥させて膜厚30〜150nmの疎水性ポリマーを含む薄膜を形成させる。スピンコート条件は、最大回転数3000〜5000rpm、30〜60秒間とする。
【００３７】
（２）疎水性ポリマー表面への親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフト
工程（２）は、工程（１）で形成した疎水性ポリマー表面に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトする工程である。上記したようにグラフトする方法は特に限定されないが、ここでは、上述したプラズマグラフト重合による方法（Ａ）を用いたグラフトについて説明する。
工程（１）で調製した疎水性ポリマーを含む薄膜を低圧プラズマ発生装置（例えば、Plasma Beam(Diner Electronic社製)、Micro Systems Apparatus(Roth & Rau社製)など）の反応器内に静置し、真空ポンプを用いて反応器内の気圧を1×10−3〜1×10−2mbarとする。反応器内の気体は窒素、アルゴン、アンモニア、水、水素、酸化硫黄などのガスを用い、ガス流量は10〜100cm3/秒とする。その後、プラズマ発生源（例えば、Electron Cyclotron Resonance(Roth & Rau社製)、ラジオ波発生器(Roth & Rau社製)など）を用い、100〜500Wの出力で、10〜600秒間疎水性ポリマーを含む薄膜を処理し、反応器内にプラズマを発生させる。この時、当該薄膜とプラズマ発生源との距離は、約100〜1000mmとする。
【００３８】
親水性骨格を含むポリマー鎖を水、リン酸緩衝液（PBS）などの液体化合物に5〜20mMとなるように溶解し、親水性骨格を含むポリマー鎖水溶液を調製し、pHを7.0〜7.5とする。当該ポリマー水溶液には、例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、1-エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの縮合剤を溶解してもよく、縮合剤のポリマー水溶液における濃度は50〜100mMとする。当該ポリマー水溶液中に工程（２）でプラズマ処理した疎水性ポリマーを含む薄膜を浸漬し、12〜24時間室温で静置する。その後、当該薄膜を蒸留水で洗浄した後、室温にて静置乾燥させる。
【実施例】
【００３９】
〈実施例１および２〉
（ポリスチレン表面の調製）
実施例１および２では、疎水性ポリマーとしてポリスチレン（式１）を用いた。ポリスチレン（東洋スチレン社製：分子量約4300,000）をクロロホルム（WAKO  CHEMICAL社より購入）に溶解させ、濃度0.6wt/wt%となるように溶解し、疎水性ポリマー溶液を調製した。該疎水性ポリマー溶液を10×20mm2シリコンウエハ（接触角測定用）、直径15mmのカバーガラス（細胞培養用）にスピンコートして、膜厚約65nmの薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温にて静置乾燥した。
【００４０】
なお、タンパク吸着実験用サンプルは、金属薄膜センサーチップ上に60nm以下の超薄膜を形成する必要がある（測定可能下限値が60nm）ため、ポリスチレンをクロロホルムに溶解させ、濃度0.3wt/wt%となるように調製し、表面にスピンコートして、膜厚約30nmの薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温に静置させ乾燥させた。
【００４１】
【化１】
0005162784.tif 000002
【００４２】
（ポリスチレン表面への親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフト）
スライドガラス上に形成したポリスチレンを含む薄膜を低圧プラズマ発生装置の反応器内に静置し、真空ポンプを用いて反応器内の気圧を5×10-3mbarとした。反応器内の気体は酸素ガスを利用し、ガス流量は10cm3/秒とした。その後、2.46GHzエレクトロン・サイクロトロン・レゾナンス型の有磁場マイクロ波発生源を用い、250Wの出力で反応器内にプラズマを発生させた。この時、試料とプラズマ発生源との距離は、約200mmとした。試料のプラズマ処理は30秒間行った。
【００４３】
次に、酸素プラズマ処理したポリスチレンを含む薄膜に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトした。実施例１では、親水性骨格を含むポリマー鎖として、１つの末端がアミノ基を有するポリプロピレンオキサイド（以下PO）・ポリエチレンオキサイド（以下EO）共重合体［商品名：Jeffamine  XTJ-506  分子量約1,000、共重合比（mol比）PO:EO=3:19  HUNTSMAN社製］（式２）を用いた。当該ポリマー10mMと、1-エチル-3-(3-ジアミノプロピルカルボジイミド)(縮合剤として使用)50mMを1/15Mでリン酸緩衝生理食塩水と混合し、pH7.4の水溶液を調製した。
【００４４】
また、実施例２では、親水性骨格を含むポリマー鎖として、１つの末端がアミノ基を有するポリプロピレンオキサイド（以下PO）・ポリエチレンオキサイド（以下EO）共重合体［商品名：Jeffamine  分子量約2,000、共重合比（mol比）PO:EO=10:31  HUNTSMAN社製］（式２）を用いた。
【００４５】
【化２】
0005162784.tif 000003
【００４６】
上記式（２）において、EOの場合はR=Hであり、POの場合はR=CH3である。
【００４７】
上記の方法で酸素プラズマ処理したポリスチレンを含む薄膜を、反応器から取り出し、直ちに、親水性骨格を含むポリマー鎖水溶液中と接触させ、1時間室温で静置した。その後、蒸留水を用いて表面洗浄した後、室温にて静置乾燥した。
【００４８】
〈実施例３〉
（ポリε‐カプロラクトン表面の調製）
実施例３では、疎水性ポリマーとしてポリε‐カプロラクトン（式３）を用いた。ポリε‐カプロラクトン（WAKO  CHEMICAL社より購入：重量平均分子量：70,000〜100,000）をクロロホルム（WAKO  CHEMICAL社より購入）に溶解させ、濃度1.25wt/wt%となるように溶解して疎水性ポリマー水溶液を調製した。該疎水性ポリマー水溶液を10×20mm2シリコンウエハ（接触角測定用）、直径15mmのカバーガラス（細胞培養用）上にスピンコートして、膜厚約100nmのポリε‐カプロラクトンを含む薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温に静置乾燥した。
【００４９】
なお、タンパク吸着実験用サンプルは、金属薄膜センサーチップ上に50nm以下の超薄膜を形成する必要がある(測定可能下限値が60nm）ため、ポリε‐カプロラクトンをクロロホルムに溶解させ、濃度0.7wt/wt%となるように調製し、表面にスピンコートして、膜厚約51nmのポリε‐カプロラクトンを含む薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温に静置乾燥した。
【００５０】
【化３】
0005162784.tif 000004
【００５１】
（ポリε‐カプロラクトン表面への親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフト）
実施例１および２と同じ条件で、ポリε‐カプロラクトン表面に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトした。なお、実施例３では、親水性骨格を含むポリマー鎖として、１つの末端がアミノ基を有するポリプロピレンオキサイド（以下PO）・ポリエチレンオキサイド（以下EO）共重合体［商品名：Jeffamine  XTJ-506 分子量約1,000、共重合比（mol比）PO:EO=3:19  HUNTSMAN社製］（式２）を用いた。
【００５２】
〈比較例１〉
比較例１として、親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしなかった以外は実施例１と同様に作製したポリスチレン表面を形成した。
【００５３】
〈比較例２〉
比較例２として、親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしなかった以外は実施例２と同様に作製したポリε‐カプロラクトン表面を形成した。
【００５４】
実施例１〜３および比較例１、２で調製した表面の特性を以下の（１）〜（３）により評価した。
（１）接触角測定
実施例１〜３および比較例１、２で調製した表面の水に対する静的接触角を接触角測定装置（DropMaster500、界面化学社製）を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００５５】
（２）タンパク質の吸着性
実施例１〜３および比較例１、２で調製した表面に対するタンパク質の吸着性は、フィブロネクチン（SIGMA  Aldrich社より購入）を用い、表面プラズモン共鳴（Surface  Plasmon  Resonance:以下SPR）システム（Biacore J、Biacore社製）を用いて評価した。
【００５６】
ここで、前記装置の測定原理を説明する。厚み50nm程度の金属薄膜センサーチップ表面にプリズムを介してレーザー光を入射すると、全反射角領域のある一定角度において特有の光の吸収(反射光の減衰)が観測される。これが表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。ある分子が金属薄膜センサーチップ表面に固定されると、金属薄膜センサーチップ表面とその上を流れる液体とのインターフェイスの屈折率が変わり、その結果として反射光に生じる暗線の角度（SPRアングル）が変わる。金属薄膜センサーチップ表面の分子の結合または解離によって引き起こされるSPRアングルの変化は結合分子の質量変化に比例しており、その変化をセンサーグラムとして記録する。サンプルを金属薄膜センサーチップ表面に添加すると分子が相互作用を起こすとセンサーグラムのシグナルが増加する。相互作用が平衡に達するとシグナルは一定の値に留まる。サンプルの添加を終え、緩衡液に切り替えると、結合分子が解離し、その結果としてセンサーグラムのシグナルが減少する。その結果、認識、結合、解離など分子間の相互作用に関して完全なプロフィールがリアルタイムに得られる。このプロフィールから相互作用の特異性、アフィ二ティー、カイティクス、さらには目的分子の濃度、吸着量を知ることができる。
【００５７】
測定用試料をSPR測定装置にセットし、Fn溶液30μl/分の流速で室温（約25℃）にてフィブロネクチンの吸着量を測定した。その結果を表１および図１に示す。
【００５８】
（３）細胞培養の効率性
実施例１〜３および比較例１、２で調製した表面を、エチレンオキサイドガス滅菌（40℃、20分）した。次に滅菌した表面を24穴細胞培養皿（IWAKI社より購入）の底部に挿入し、細胞数40個/mm2のL6細胞（マウス骨格筋由来Cell  Line：ATCC社より購入）を播種し、DMEM（１％ペニシリン/ストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清）中で5％CO2存在下、37℃にて4日間培養した。リファレンスとして、未処理表面も同条件で実験を行った。なお、細胞数の計測は、培養１日目と4日目で行った。計測は、WSTアッセイキット（DOJINDO社製）を使用して行った。その結果を表１および図２に示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
表１から分かるように、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面（実施例１〜３）は、親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしていない疎水性ポリマー骨格表面（比較例１および２）と比較して顕著に親水化した。
【００６１】
また、表１および図１から分かるように、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面（実施例１〜３）は、未処理表面（比較例１および２）と比較して、タンパク質（Fn）の吸着性が減少した。
【００６２】
さらに表１および図２から分かるように、実施例１〜３では、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面（実施例１〜３）を用いて細胞培養をした結果、未処理表面（比較例１および２）と比較して、細胞培養4日目の生細胞数が、1日目に対し顕著に増加した。また、比較例１では、細胞培養4日目の生細胞数が、1日目より減少した。これは、細胞がポリスチレン表面で長期にわたり生存できないことを示す。
【００６３】
すなわち、疎水性ポリマー骨格表面に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトすることにより、表面が親水化してタンパク質の吸着性の低い表面であっても、細胞培養の効率性が顕著に向上することが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】タンパク質の吸着性を評価した結果を示す。
【図２】細胞培養の効率性を評価した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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