(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記生物集団に属する複数の個体からＤＮＡ断片の混合物を得る工程、ＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、ＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測する工程を含むことを特徴とする共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項２】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合し、混合した組織からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする請求項１に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項３】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから細胞を採取し、それらを同量ずつ混合し、混合した細胞からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする請求項１に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項４】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを同じ量ずつ混合し、混合したＤＮＡを断片化することによって得ることを特徴とする請求項１に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項５】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出して同一の手法で断片化し、断片化したＤＮＡを同じ量ずつ混合することによって得ることを特徴とする請求項１に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項７】
ＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項８】
単離した個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項９】
ＤＮＡ断片の混合物と単離した個々のＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖ＤＮＡ断片が特異的に標識されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１０】
ある生物集団に共通して存在し、別の生物集団には存在しない特異的ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とする特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合し、混合した組織からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする請求項１０に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから細胞を採取し、それらを同量ずつ混合し、混合した細胞からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする請求項１０に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを同じ量ずつ混合し、混合したＤＮＡを断片化することによって得ることを特徴とする請求項１０に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出して同一の手法で断片化し、断片化したＤＮＡを同じ量ずつ混合することによって得ることを特徴とする請求項１０に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１７】
単離した個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ断片の混合物と単離した個々のＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖ＤＮＡ断片が特異的に標識されることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項１９】
複数の特定の生物集団に共通して存在する特定集団間共通ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物を混合し、これを単離した個々のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とする特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の検出方法によって得られたＤＮＡ断片を用いてＤＮＡ鑑定を行うことを特徴とするＤＮＡ鑑定方法。
【請求項２１】
特定環境中に存在する微生物のＤＮＡの変化を検出する方法であって、ある時点において前記特定環境の一定体積に含まれる微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、断片化し、第一時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、第一時点の微生物群採取後に、第一時点とは異なる時点で前記特定環境の同一体積に含まれる第二時点の微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、第一時点のＤＮＡ断片混合物と同一の手法で断片化し、第二時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物とその混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、第二時点のＤＮＡ断片混合物と第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片について、第一時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合と第二時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合の結合したＤＮＡの量を比較する工程を含むことを特徴とする微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする請求項２１に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【請求項２３】
第一時点のＤＮＡ断片の混合物及び第二時点のＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【請求項２４】
第一時点のＤＮＡ断片の混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片を検出する方法（共通ＤＮＡ断片の検出方法）、ある生物集団に共通して存在し、別の生物集団には存在しない特異的ＤＮＡ断片を検出する方法（特異的ＤＮＡ断片の検出方法）、複数の生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片を検出する方法(特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法)、特定環境中に存在する微生物のＤＮＡの変化を検出する方法（微生物ＤＮＡの変化の検出方法）、及びある生物集団に属する個体の持つＤＮＡの断片のハイブリダイゼーション方法（ハイブリダイゼーション方法）に関する。
【０００２】
本発明の検出方法によって検出されるＤＮＡ断片は、種判別の鑑定や遺伝子組換え生物の鑑定などに有用である。種判別のＤＮＡ鑑定とは、生物集団によって異なる部分のＤＮＡで生物集団を判別する手法である。例えば、マグロを例にとると、ミナミマグロとキハダマグロの種判別をＤＮＡ鑑定で行う場合、ミナミマグロだけに存在するＤＮＡとキハダマグロだけに存在するＤＮＡが既知の情報となっていることが前提でなければ鑑定はできない。ＤＮＡ鑑定は、マグロに限らず、人を含む全ての動植物や微生物に関して行うことができ、法医学の分野では既に実用化されている。遺伝子組換え生物のＤＮＡ鑑定とは、天然に存在する生物の遺伝子に人工的に新たなＤＮＡが導入された生物を鑑定するもので、ＤＮＡの違いにより天然の生物と判別する手法である。
【０００３】
本発明の微生物ＤＮＡの変化の検出方法は、特定環境における微生物生態系の経時変化を解析するのに有用である。
【背景技術】
【０００４】
種判別のＤＮＡ鑑定に用いる特定の生物集団だけに存在するＤＮＡを求める手法は、以下の方法でおこなっている。
【０００５】
従来は、まず、ＤＮＡ塩基配列の解析による手法（例えば、非特許文献１参照。）で、例えば複数匹のミナミマグロのＤＮＡ塩基配列をそれぞれ個体ごとに読み取り、複数匹の塩基配列相互の相同性解析をおこない、複数匹すべてが同じ塩基配列である共通ＤＮＡと同じでない非共通ＤＮＡを求める。これにより、共通ＤＮＡはミナミマグロに共通するＤＮＡで、非共通ＤＮＡはミナミマグロでも個体により異なる個体別のＤＮＡであることがわかる。キハダマグロについても同様に複数匹のＤＮＡ塩基配列をそれぞれ個体ごとに読み取り、同様の相同性解析をおこない、共通ＤＮＡと非共通ＤＮＡを求める。さらに、ミナミマグロには存在するがキハダマグロには存在しない、またはキハダマグロには存在するがミナミマグロには存在しないようなそれぞれの種の特異的ＤＮＡを求めるには、ミナミマグロの共通ＤＮＡとキハダマグロの共通ＤＮＡを比較し、等しいＤＮＡがこれらのマグロに共通のＤＮＡで、異なるＤＮＡがミナミマグロまたはキハダマグロの特異的ＤＮＡという方法で求めている。しかし、この方法では、かかる時間とコストが大きかった。
【０００６】
そのため、最近では、予めＤＮＡ塩基配列の解析によって得た特異的ＤＮＡの塩基配列の情報に基づき、主としてpolymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(例えば、非特許文献２参照。)）による種判別が行われている。例えば、ミナミマグロの特異的ＤＮＡは切断するがキハダマグロの特異的ＤＮＡは切断しない制限酵素を作用させたＤＮＡを電気泳動し、特異的ＤＮＡが切断されたパターンが得られればミナミマグロ、切断されていないパターンが得られればキハダマグロと判別する方法である。この方法はＤＮＡ塩基配列の解析よりもはるかに工程が単純で少ないため短時間で安価に結果が得られ、しかも同時に複数の試料を解析することができ、効率が良い。しかしこの方法には、特異的ＤＮＡを切断できる制限酵素がなければ使用できないため利用範囲が限られること、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する際に増幅酵素によるエラーが起きて制限酵素による切断部位の塩基配列が変わり、切断ができなくなるなど、正確な種判別ができなくなる場合があることなどの問題点がある。
【０００７】
そこで新たに、制限酵素を用いない手法として、ＤＮＡマイクロアレイを用いた手法が使われ始めている。この手法は、ミナミマグロとキハダマグロの共通ＤＮＡ、それぞれのマグロの特異的ＤＮＡ、無関係なＤＮＡを、マイクロアレイを用いて判別する手法である。この方法では、ミナミマグロから抽出したＤＮＡを個体毎に一枚ずつのＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせて、個体が持つＤＮＡを求める。この実験を複数匹のマグロに対して繰り返し行い、その結果から、ミナミマグロとキハダマグロの共通ＤＮＡ、それぞれのマグロの特異的ＤＮＡ、区関係なＤＮＡを求めている。しかしこの手法では、実験を個体毎に繰り返し行うため、非常に手間とコストがかかるという問題がある。
【０００８】
また、この実験に市販のマイクロアレイを用いると、共通ＤＮＡを決定しようとしている生物種に存在するＤＮＡが、アレイ上に固定されていない場合も多く、このようなときは、市販のマイクロアレイでは、目的とする共通ＤＮＡや特異的ＤＮＡを求めることができないという問題がある。さらに、ＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション作業を複数匹分繰り返しおこなうため、その都度、温度、溶液濃度などの実験条件を同一に設定することが非常に難しいなどの問題もある。
【０００９】
【非特許文献１】Sambrook J & Russell DW  Chapter12 DNA sequencing.  Molecular Cloning : A laboratory manual. 3rd Ed. 2001; pp12.1-12.120.
【非特許文献２】Deng G R、”A sensitive non-radioactive PCR-RFLP analysis for detecting point mutations at 12th codon of oncogene c-Ha-ras in DNAs of gastric cancer.” Nucleic Acids Res. 1988 July 11; 16(13): 6231.
【特許文献１】特許公開２００４−６５２４２  「生体関連物質マイクロアレイ及びそれを用いた植物の品種判別法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような従来技術の問題に鑑みなされたものであり、ある生物集団に共通して存在するＤＮＡを求めるために、マイクロアレイを用いる従来の手法が持つ３つの問題点、すなわち、繰り返し実験を行うためにかかる手間と費用、マイクロアレイ上に求めるＤＮＡが固定されていないために結果が得られない危険性、および繰り返し実験毎の実験誤差の悪影響を解決し、従来より効率良く正確に、生物集団の共通ＤＮＡや特異的ＤＮＡを検出する手段を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を達成するため、本発明は以下の（１）〜（３１）を提供する。
（１）ある生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記生物集団に属する複数の個体からＤＮＡ断片の混合物を得る工程、ＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、ＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測する工程を含むことを特徴とする共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１２】
（２）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合し、混合した組織からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする（１）に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
（３）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の細胞を採取し、それらを同じ細胞数ずつ混合し、混合した細胞からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする（１）に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
（４）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを同じ量ずつ混合し、混合したＤＮＡを断片化することによって得ることを特徴とする（１）に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１３】
（５）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出して同一の手法で断片化し、断片化したＤＮＡを同じ量ずつ混合することによって得ることを特徴とする（１）に記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
（６）ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれかに記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
（７）ＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１４】
（８）単離した個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
（９）ＤＮＡ断片の混合物と単離した個々のＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖ＤＮＡ断片が特異的に標識されることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１５】
（１０）ある生物集団に共通して存在し、別の生物集団には存在しない特異的ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とする特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１６】
（１１）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合し、混合した組織からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする（１０）に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
（１２）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の細胞を採取し、それらを同じ細胞数ずつ混合し、混合した細胞からＤＮＡを抽出した後断片化することによって得ることを特徴とする（１０）に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
（１３）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを同じ量ずつ混合し、混合したＤＮＡを断片化することによって得ることを特徴とする（１０）に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１７】
（１４）ＤＮＡ断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出して同一の手法で断片化し、断片化したＤＮＡを同じ量ずつ混合することによって得ることを特徴とする（１０）に記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
（１５）ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする（１０）乃至（１４）のいずれかに記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
（１６）ＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする（１０）乃至（１５）のいずれかに記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１８】
（１７）単離した個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする（１０）乃至（１５）のいずれかに記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
（１８）ＤＮＡ断片の混合物と単離した個々のＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖ＤＮＡ断片が特異的に標識されることを特徴とする（１０）乃至（１５）のいずれかに記載の特異的ＤＮＡ断片の検出方法。
【００１９】
（１９）複数の特定の生物集団に共通して存在する特定集団間共通ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物を混合し、これを単離した個々のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とする特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法。
【００２０】
（２０）（１）乃至（１９）のいずれかに記載の検出方法によって得られたＤＮＡ断片を用いてＤＮＡ鑑定を行うことを特徴とするＤＮＡ鑑定方法。
【００２１】
（２１）特定環境中に存在する微生物のＤＮＡの変化を検出する方法であって、ある時点において前記特定環境の一定体積に含まれる微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、断片化し、第一時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点の微生物群採取後に、第一時点とは異なる時点で前記特定環境の同一体積に含まれる第二時点の微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、第一時点のＤＮＡ断片混合物と同一の手法で断片化し、第二時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物とその混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、第二時点のＤＮＡ断片混合物と第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片について、第一時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合と第二時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合の結合したＤＮＡの量を比較する工程を含むことを特徴とする微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【００２２】
（２２）ＤＮＡ断片の鎖長が、１０〜１０，０００ベースの範囲にあることを特徴とする（２１）に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
（２３）第一時点のＤＮＡ断片の混合物及び第二時点のＤＮＡ断片の混合物が、標識されていることを特徴とする（２１）又は（２２）に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
（２４）第一時点のＤＮＡ断片の混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片が、標識されていることを特徴とする（２１）又は（２２）に記載の微生物ＤＮＡの変化の検出方法。
【００２３】
（２５）ある生物集団に属する個体の持つＤＮＡの断片と、プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる方法であって、前記生物集団に属する複数の個体のそれぞれが持つＤＮＡの断片の混合物を調製し、これとプローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
（２６）ＤＮＡの断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合し、混合した組織からＤＮＡを抽出した後断片化することによって調製すことを特徴とする（２５）に記載のハイブリダイゼーション方法。
【００２４】
（２７）ＤＮＡの断片の混合物を、複数の個体のそれぞれから同様の細胞を採取し、それらを同じ細胞数ずつ混合し、混合した細胞からＤＮＡを抽出した後断片化することによって調製することを特徴とする（２５）に記載のハイブリダイゼーション方法。
（２８）ＤＮＡの断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを同じ量ずつ混合し、混合したＤＮＡを断片化することによって調製することを特徴とする（２５）に記載のハイブリダイゼーション方法。
（２９）ＤＮＡの断片の混合物を、複数の個体のそれぞれからＤＮＡを抽出して同一の手法で断片化し、断片化したＤＮＡを同じ量ずつ混合することによって調製することを特徴とする（２５）に記載のハイブリダイゼーション方法。
【００２５】
（３０）複数の生物の混合物に含まれる生物を同定する方法であって、混合物からＤＮＡ断片を調製する工程、前記調製したＤＮＡ断片と、混合物に含まれる可能性のある生物ごとの特異的ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片を検出する工程を含むことを特徴とする、混合物に含まれる生物の同定方法。
（３１）複数の生物の混合物が、板ノリ又は配合飼料である（３０）に記載の混合物に含まれる生物の同定方法。
【００２６】
本発明の基本的な考え方は以下の通りである。
まず、塩基配列の分かっていない魚種Ａと魚種Ｂとの種判別をおこなうために必要なそれぞれの魚種の特異的ＤＮＡを求める手段について、図１を用いて本発明の基本的な考え方を説明する。
【００２７】
魚種Ａの個体ａ１の全ＤＮＡ２は、（ａ）のように、個体により異なる個体ａ１の非共通ＤＮＡ３と、魚種Ａの他の個体にも共通して存在する共通ＤＮＡ４とに区別できる。同様に、魚種Ａの別の個体ｂ５の全ＤＮＡ６も、個体ｂ２の非共通ＤＮＡ７と魚種Ａの共通ＤＮＡ４とに区別できる。これらの個体のＤＮＡをあわせて考えると、（ｂ）のように、二つの個体の両方に共通する共通ＤＮＡ４と、個体ごとに異なる個体ａ１の非共通ＤＮＡ３と個体ｂ２の非共通ＤＮＡ７に区別することができる。このような図を魚種Ａの多数の個体の全ＤＮＡについて重ねていくと、（ｃ）に示すように、魚種Ａの全ＤＮＡ８は、魚種Ａであれば共通に持っている魚種Ａの共通ＤＮＡ４と、魚種Ａの中でも個体によって異なる魚種Ａにおける非共通ＤＮＡの集合９の２つの部分に区別することができる。
【００２８】
魚種Ｂについても同様に、個体ｃ１０の全ＤＮＡ１１は、(ｄ)のように、個体により異なる個体ｃ１０の非共通ＤＮＡ１２と、他の個体にも共通して存在する魚種Ｂの共通ＤＮＡ１３とに区別することができ、魚種Ｂの別の個体ｄ１４の全ＤＮＡ１５も、個体ｄ１４の非共通ＤＮＡ１６と魚種Ｂの共通ＤＮＡ１３とに区別することができる。これらの個体のＤＮＡをあわせて考えると、(ｅ)のように、魚種Ｂの二つの個体の両方に共通な共通ＤＮＡ１３と、それ以外に、個体１０の非共通ＤＮＡ１２と個体１４の非共通ＤＮＡ１６が存在する。このような図を魚種Ｂの多数の個体の全ＤＮＡについて重ねていくと、（ｆ）に示すように、魚種Ｂの全ＤＮＡ１７は、魚種Ｂであれば共通に持っている魚種Ｂの共通ＤＮＡ１３と、魚種Ｂの中でも個体によって異なる魚種Ｂにおける非共通ＤＮＡの集合１８の２つの部分に区別することができる。
【００２９】
次に、魚種Ａの全ＤＮＡ８と魚種Ｂの全ＤＮＡ１７とを比較する。（ｇ）に示すように、魚種Ａの全ＤＮＡ８は、魚種Ａの個体に共通して存在する魚種Ａの共通ＤＮＡ４と、個体ごとに異なる魚種Ａにおける非共通ＤＮＡの集合９とに区別することができ、魚種Ｂの全ＤＮＡ１７は、魚種Ｂの個体に共通して存在する魚種Ｂの共通ＤＮＡ１３と、個体ごとに異なる魚種Ｂにおける非共通ＤＮＡの集合１８とに区別することができる。それぞれの魚種が持つ共通ＤＮＡのうちでどちらの魚種にも共通に存在するＤＮＡが、魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ１９であり、魚種Ａの共通ＤＮＡ４のうちで魚種Ｂには存在しないＤＮＡが魚種Ａの特異的ＤＮＡ２０であり、魚種Ｂの共通ＤＮＡ１３のうちで魚種Ａには存在しないＤＮＡが魚種Ｂの特異的ＤＮＡ２１である。
【００３０】
このように、魚種Ａおよび魚種ＢそれぞれのＤＮＡを基準ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションによる結合の結果得られるシグナルを整理すると、（ｈ）のハイブリダイゼーションのシグナル表２２のようになる。例えば、魚種Ａの持つＤＮＡを基準ＤＮＡとし、これを用いてＤＮＡマイクロアレイを作成し、魚種ＡのＤＮＡをハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーションのシグナル表２２の該当欄に示すように、魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ１９および魚種Ａの特異的ＤＮＡ２０はＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズして結合し、オンのシグナルとなるが、魚種Ａの中でも個体ごとにＤＮＡが異なる魚種Ａにおける非共通ＤＮＡの集合９については、ハイブリダイズさせたＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ上に固定された基準ＤＮＡとは異なるため、ハイブリダイズによる結合は起こらず、シグナルはオフとなる。同様に魚種Ａの持つＤＮＡを基準ＤＮＡとし、これを用いてＤＮＡマイクロアレイを作成し、魚種ＢのＤＮＡをこのＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーションのシグナル表２２の該当欄に示すように、魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ１９はＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズして結合し、オンのシグナルとなるが、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定された魚種Ａの特異的ＤＮＡ２０および魚種Ａにおける非共通ＤＮＡの集合９に属するＤＮＡは、ハイブリダイズさせた魚種Ｂに同じＤＮＡが存在しないため、ハイブリダイゼーションによる結合は起こらず、シグナルはオフとなる。逆に、魚種Ｂの持つＤＮＡを基準ＤＮＡとし、これを用いてＤＮＡマイクロアレイを作成し、魚種ＡのＤＮＡをこのＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーションのシグナル表２２の該当欄に示すように、魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ１９はＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズして結合し、オンのシグナルとなるが、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定された魚種Ｂの特異的ＤＮＡ２１および魚種Ｂにおける非共通ＤＮＡの集合１８に属するＤＮＡは、ハイブリダイズさせた魚種Ａに同じＤＮＡが存在しないため、ハイブリダイゼーションによる結合は起こらず、シグナルはオフとなる。同様に魚種Ｂの持つＤＮＡを基準ＤＮＡとし、魚種ＢのＤＮＡをこのＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーションのシグナル表２２の該当欄に示すように、魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ１９および魚種Ｂの特異的ＤＮＡ２１はＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズして結合し、オンのシグナルとなるが、魚種Ｂの中でも個体ごとにＤＮＡが異なる魚種Ｂにおける非共通ＤＮＡの集合１８については、ハイブリダイズさせたＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ上に固定された基準ＤＮＡとは異なるため、ハイブリダイズによる結合は起こらず、シグナルはオフとなる。
【００３１】
このように、基準ＤＮＡとする特定の生物集団の特異的ＤＮＡを求め、それに対して鑑定するＤＮＡがハイブリダイズして結合するか否かをみることによって、鑑定するＤＮＡが基準ＤＮＡと同種であるか否かを鑑定することができる。
以上の方法では、魚種ＡのＤＮＡからマイクロアレイを作製しているが、このような特定のＤＮＡから作製したマイクロアレイではなく、市販のマイクロアレイを用いても、特異的ＤＮＡを求めることは可能である。以下に、魚種Ｃの共通ＤＮＡを求める具体的な手法を例にとり、現行の手法と本発明の手法とを比較して、本発明の手法の利点を説明する。
【００３２】
まず、図１１の＜Ｉ＞に従って、現行の手法を説明する。魚種Ｃの個体を複数集めるが、実験は１個体毎に行う。最初に、魚種Ｃの個体ａ８２の実験について述べる。個体ａ８２から採取した組織８４を容器８３に取って個体ａのＤＮＡ８５を抽出し切断して、個体ａのＤＮＡ断片混合物８６を得る。これを蛍光色素等で標識し、市販のマイクロアレイにかけてハイブリダイゼーションを行い、個体ａのマイクロアレイの実験結果８７を得る。この一連の実験を、同じ魚種Ｃの他の個体、ｂ、ｃ、ｄについてもそれぞれ同様に個体の数だけ繰り返し、個体毎のマイクロアレイの実験結果を得る。その後、魚種Ｃのａからｄまでの結果をまとめるため、それらのマイクロアレイの実験結果の積算８８を行い、魚種Ｃ全体の結果８９を得る。この中から魚種Ｃの共通ＤＮＡを特定するため、使用した魚種Ｃのすべての個体由来のＤＮＡ断片がハイブリダイズして、強い蛍光強度を示したマイクロアレイのスポットのＤＮＡを選定する。その後、以上の一連の作業を魚種Ｃとの判別が必要な魚種Ｄについても行い、検出されたそれぞれの共通ＤＮＡ同士を比較して、共通するものを魚種Ｃと魚種Ｄとの種間共通ＤＮＡ、魚種Ｃの特異的ＤＮＡ，魚種Ｄの特異的ＤＮＡを求めている。
【００３３】
このため、現行の手法では、分析する個体の数だけ実験を繰り返し行い、最後にそれぞれのハイブリダイゼーションの実験結果を集積して魚種Ｃおよび魚種Ｄそれぞれの共通ＤＮＡを求めるため、費用も労力も個体数分必要となる。
【００３４】
これに対し、図１１の＜II＞に示した本発明の手法では、同じ魚種Ｃの共通ＤＮＡを求めるために、複数匹の魚種ＣをまとめてＤＮＡ抽出を行い、そのＤＮＡと市販のマイクロアレイとでハイブリダイズすることで、1回の実験で結果を得ることができることを特徴としている。まず、魚種Ｃ用の共通容器９１に、魚種Ｃの集団９０の各個体ａ、ｂ、ｃ、ｄから等量ずつ採取した魚種Ｃの同一部分の組織をこの段階でまとめて入れて、魚種Ｃの組織の混合物９２を作る。ここから先は、混合物を一つの検体として扱い、魚種Ｃの組織の混合物９２から魚種ＣのＤＮＡ混合物９３を抽出し、これを切断して、魚種ＣのＤＮＡ断片混合物９４を得る。これを蛍光色素等で標識し、市販のマイクロアレイ１枚にかけてハイブリダイゼーションを行い、魚種Ｃの全体の結果８９を得る。この中から魚種Ｃの共通ＤＮＡを特定するため、強い蛍光強度を示したマイクロアレイのスポットのＤＮＡを選定する。本発明の手法では、この結果がそのまま、魚種Ｃの共通ＤＮＡであるといえる。
【００３５】
本発明によれば、上記の方法を1匹ごとにおこなうのではなく、複数匹を集団処理することで効率よく区別することができる。集団処理とは、例えばミナミマグロを複数匹、ここでは１００匹と仮定するが、この１００匹の切り身を擂り潰してミックスしＤＮＡを抽出することでミナミマグロ１００匹のＤＮＡ混合物ができ、そのＤＮＡを制限酵素で切断し、半分を基準ＤＮＡとしてマイクロアレイ化し、残りの半分とハイブリダイズさせ、全数が結合したＤＮＡの部位はミナミマグロが共通に持つ共通ＤＮＡであり、一部だけしか結合しなかったＤＮＡの部位は個体別の非共通ＤＮＡと区別することができる。これと同様に、例えばキハダマグロを複数匹、ここでは１００匹と仮定するが、この１００匹のキハダマグロの切り身を擂り潰してミックスし抽出したＤＮＡ混合物を、ミナミマグロのＤＮＡの切断に用いたものと同一の制限酵素で切断する。こうすることで、ミナミマグロとキハダマグロの両方に存在する共通ＤＮＡは、ミナミマグロでもキハダマグロでも同一サイズで切断できる。このキハダマグロのＤＮＡ断片混合物を、ミナミマグロのＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を固定したマイクロアレイとハイブリダイズさせる。この結果、キハダマグロの全数が結合したＤＮＡはミナミマグロとキハダマグロに共通なこれらのマグロの共通ＤＮＡであり、結合しなかったＤＮＡはキハダマグロと比較したミナミマグロの特異的ＤＮＡとして区別することができる。ミナミマグロとキハダマグロとを入れ替えて同様の実験をおこなえば、ミナミマグロと比較したキハダマグロの特異的ＤＮＡを区別することができる。このようにして得られた情報を用いて、ミナミマグロとキハダマグロの種判別のＤＮＡ鑑定をおこなうシステムを構築できる。この方法はまた、ヒトを含む動植物、細菌、ウイルス等様々な生物の種判別のＤＮＡ鑑定を行うシステムも構築できる。また、この複数匹を集団処理するという考え方を応用することにより、板ノリや配合飼料のような複数生物の混合物に含まれる生物のそれぞれを同定することもできる。さらに、特異的ＤＮＡ断片ごとの量を求めることで、生物の配合の割合を求めることもできる。ＤＮＡ断片量の求め方は、一般的に用いられているＤＮＡマイクロアレイにおける蛍光強度や、リアルタイムＰＣＲなどで求めることが可能である。また、本発明によって求められた非共通ＤＮＡの情報を用いて、ヒトを含む動植物、細菌、ウイルス等様々な生物集団の個体のＤＮＡ鑑定を行うシステムも構築できる。また、本発明によれば、個体の数や切り身の大きさを必要に応じて変えて採取することで、ＰＣＲなどでＤＮＡを増幅することなく、解析に十分な量のＤＮＡを抽出できるため、ＤＮＡを増幅しておこなう場合より正確な種判別を行うことができ、また増幅にかかる時間や費用を削減することができる。
【発明の効果】
【００３６】
従来の方法に従って、共通ＤＮＡ断片、特異的ＤＮＡ断片、特定集団間共通ＤＮＡ断片、微生物ＤＮＡの変化を検出する場合、個体ごとの解析や塩基配列の解析が必要になる。個体ごとの解析や塩基配列の解析は、手間と費用がかかり、特に個体ごとの解析は、一回ごとの実験条件のばらつき及びそれに由来する実験結果の誤差が個体数分蓄積された結果を解析することになり、実験結果の信頼性が低くなる危険性がある。本発明の検出方法では、このような面倒な解析を行うことなく、効率的に共通ＤＮＡ断片、特異的ＤＮＡ断片、特定集団間共通ＤＮＡ断片、微生物ＤＮＡの変化を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）共通ＤＮＡ断片の検出方法
本発明の共通ＤＮＡ断片の検出方法は、ある生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記生物集団に属する複数の個体からＤＮＡ断片の混合物を得る工程、ＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、ＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測する工程を含むことを特徴とするとするものである。
【００３８】
本発明における生物集団とは、通常は、同一の分類学上の単位（例えば、目、科、属、種など）に属する集団を意味するが、分類学上の単位とは無関係な集団をも含む。また、生物集団は、二種類以上の分類学上の単位等を含んでいてもよい。
【００３９】
ＤＮＡ断片の混合物は、各個体から採取した組織、細胞等を混合し、それからＤＮＡを抽出し、その後、ＤＮＡを断片化することにより得られる。また、各個体から採取した組織、細胞等のそれぞれからＤＮＡを抽出し、それらを混合し、その後、ＤＮＡを断片化してもよい。更に、各個体由来のＤＮＡのそれぞれを同一の手法で断片化し、断片化した後に混合してもよい。このように各個体から採取した組織等を混合してＤＮＡ断片を調製することにより、以下のような利点がある。現行の検出方法では個体ごとに実験を行っているため、それぞれの個体から採取できる組織や細胞などの原材料の量が限られ、非常に少量の原材料から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法などを用いて人工的に増幅をおこなったものを検出に用いている。しかし本発明では、複数の個体を混合して検出に必要なＤＮＡ混合物を調製できるため、それぞれの個体から採取する量を少なくしても、人工的な増幅をおこなわずに検出できるだけのＤＮＡ量を確保することができる。また、共通ＤＮＡ断片を求めるためには全ての部位のＤＮＡを同じ効率で増幅することが必要であるが、これは非常に難しく、通常は部位により増幅効率に差が生じるため、検出精度が低くなる危険性がある。さらに、人工的な増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼが一定の確率で間違いを犯し変異塩基を導入する危険性があり、このことも、検出精度を低下させる。本発明によれば、これらの精度低下を招く要因を作ることなく検出を行うことができる。もちろん、個体から採取できる組織や細胞の量に上限があり、混合してもＤＮＡの量が不十分で増幅せずには検査が行えない場合には、可能な限りエラー率の低いＤＮＡポリメラーゼにより増幅したＤＮＡを用いて検出をおこなうこともできる。
【００４０】
各個体から採取した組織等の混合にあたっては、各個体由来のＤＮＡ量が等しくなるように混合する必要がある。ＤＮＡ量が等しくなるような混合方法は、生物の種類等に応じて適切な方法を選択すればよい。例えば、各個体が分類学的に近似した生物（例えば、同一の属、種等に属する生物）である場合、各個体から同様の組織を採取し、それらを同じ重量ずつ混合すればよく、また、同様の細胞を採取し、細胞数が同じになるように混合してもよい。各個体が分類学的に近似した生物でない場合、同様の組織や細胞を採取することが困難なので、各個体からＤＮＡを採取し、そのＤＮＡを等量ずつ混合すればよい。
【００４１】
ＤＮＡを断片化する手法は、厳密な再現性のある手法であればよく、代表的な手法は、制限酵素による切断である。制限酵素は、一種類でも複数種類を併用しても構わないが、ＤＮＡ鎖長はハイブリダイゼーションの状態に大きな影響を与えるため、ＤＮＡごとのハイブリダイゼーションの条件をできるだけ均一にして、条件を厳しく定め、より正確な検出結果を得るために、切断して生じる大部分のフラグメントができるだけ類似した鎖長になるような制限酵素の使い方をすることが望ましい。長い領域に渡るおおまかな共通ＤＮＡ断片を求めたい場合には、ゲノムにおける認識配列の存在頻度が高くない制限酵素を使用し、切断して生じる大部分のフラグメントの鎖長が１０〜１０，０００ベースの間、より好ましくは１０〜１，０００ベースの間、さらにより好ましくは１０〜１００ベースの間になるような切断をおこなうことが望ましい。一方、数塩基以下の微細な違いを排除して非常に厳密な形で共通ＤＮＡ断片を求めたい場合には、切断して生じる大部分のフラグメントの鎖長１０〜３０ベースの間になるような制限酵素を１種類または複数種類の組合せで用いることが望ましい。
【００４２】
ＤＮＡの抽出は、後で制限酵素で切断した際にＤＮＡが細断されすぎて制限酵素による切断の結果が正しく得られなかったり、抽出後の標識やハイブリダイゼーションの反応を阻害するような物質が残存していたりするような方法でなければ、どのような方法でも構わない。
ＤＮＡ断片の混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する方法は特に限定されず、例えば、混合物中に含まれるＤＮＡ断片をベクターにクローニングしてライブラリーを作製し、それから個々のＤＮＡ断片をそれぞれ独立して増やせば、個々のＤＮＡ断片を得ることができる。
【００４３】
ＤＮＡ断片の混合物と単離した個々のＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションはどのような方法で行ってもよいが、個々のＤＮＡ断片をＤＮＡマイクロアレイ上に固定して両者をハイブリダイズさせることが好ましい。
【００４４】
ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量は、ＤＮＡ断片を標識しておくことにより、計測できる。標識は、ＤＮＡ断片の混合物と個々のＤＮＡ断片のどちらに付加してもよいし、ハイブリダイゼーションの前に付加しても後に付加してもよい。ＤＮＡ断片の混合物と個々のＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションにより形成された二重鎖に特異的に結合する標識でも構わない。また、ＤＮＡ断片に直接的に付加しても間接的に付加してもよいし、ハプテンや低分子化合物などのタグをＤＮＡ断片に付加しておき、それらに対する抗体や強い結合力を持つ分子に結合した酵素とその基質となる呈色材などを含むシステムを用いてもよい。標識としては、色素・蛍光色素・放射性同位元素・導電体またはそれらの前駆体、ハイブリダイゼーション後に酵素などを結合させて呈色反応をおこなわせるための前述のタグなど、標識により検出できるシグナル量が個々のＤＮＡ断片とＤＮＡ断片混合物との結合量を正確に反映できるようなシステムであれば、どのようなものでも構わないが、ＤＮＡ断片の末端ごとに標識やタグを定量ずつ付加する方法であれば、ＤＮＡ断片の数と標識の数の対応がつけやすい。
【００４５】
ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測した後、個々のＤＮＡ断片から結合したＤＮＡの量が相対的に多いＤＮＡ断片のグループを選択する。上述したように、ＤＮＡ断片混合物中の各個体由来のＤＮＡ量は等しいので、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量は、ハイブリダイズ対象となる個々のＤＮＡ断片を持っていた個体の数に応じて多くなる。従って、結合したＤＮＡの量が相対的に多いグループに属するＤＮＡ断片は、その生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片（共通ＤＮＡ断片）である可能性が高く、特に結合したＤＮＡの量が最大値を示したＤＮＡ断片はその可能性がより高い。
【００４６】
（Ｂ）特異的ＤＮＡ断片の検出方法
本発明の特異的ＤＮＡ断片の検出方法は、ある生物集団に共通して存在し、別の生物集団には存在しない特異的ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と、単離した個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とするものである。
【００４７】
本発明の特異的ＤＮＡ断片の検出方法は、上記共通ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものであり、生物集団の意味、ＤＮＡ断片の混合物の調製方法、混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片の単離方法、ハイブリダイズさせる方法、結合したＤＮＡ断片の量の計測方法は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。
【００４８】
ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測した後、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物とハイブリダイズして結合したＤＮＡの量が相対的に多いＤＮＡ断片のグループを選択し、選択したＤＮＡ断片の中から、前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物とハイブリダイズしないＤＮＡ断片を選択する。上述したように、ＤＮＡ断片混合物中の各個体由来のＤＮＡ量は等しいので、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物とハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量は、ハイブリダイズ対象となる個々のＤＮＡ断片を持っていた個体の数に応じて多くなる。従って、結合したＤＮＡの量が相対的に多いグループに属するＤＮＡ断片は、前記ある生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片である可能性が高く、特に結合したＤＮＡの量が最大値を示したＤＮＡ断片はその可能性がより高い。しかし、このＤＮＡ断片は、前記別の生物集団にも存在することもあるので、特異的なＤＮＡということはできない。そこで、前記別の生物集団にも存在するＤＮＡ断片を排除するため、前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物とハイブリダイズしないＤＮＡ断片を選択する。
【００４９】
このようにして検出された特異的ＤＮＡ断片は、目的の個体がある生物集団に属するのか、あるいは別の生物集団に属するかを鑑定するのに使用できる。このような鑑定は個体レベルでだけでなく、加工食品の原材料など生物の原型を留めていない対象についても行うことができる。
【００５０】
（Ｃ）特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法
本発明の特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法は、複数の特定の生物集団に共通して存在する特定集団間共通ＤＮＡ断片を検出する方法であって、前記ある生物集団に属する複数の個体及び前記別の生物集団に属する複数の個体のそれぞれから同一の手法でＤＮＡ断片の混合物を得る工程、前記ある生物集団に属する複数の個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の一部をとり、その混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片を単離する工程、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物を混合し、これを単離した個々のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程を含むことを特徴とするものである。
【００５１】
本発明の特定集団間共通ＤＮＡ断片の検出方法は、上記共通ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものであり、生物集団の意味、ＤＮＡ断片の混合物の調製方法、混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片の単離方法、結合したＤＮＡ断片の量の計測方法は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。
ハイブリダイゼーションは、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物を混合し、この混合物同士の混合物を単離した個々のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせることにより行う。
【００５２】
ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量を計測した後、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量が相対的に多いグループに属するＤＮＡ断片を選択する。上述したように、ＤＮＡ断片混合物中の各個体由来のＤＮＡ量は等しいので、前記ある生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物と前記別の生物集団から得たＤＮＡ断片の混合物同士の混合物とハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片の量は、ハイブリダイズ対象となる個々のＤＮＡ断片を持っていた個体の数に応じて多くなる。従って、結合したＤＮＡの量が相対的に多いグループに属するＤＮＡ断片は、前記ある生物集団および前記別の生物集団に共通して存在するＤＮＡ断片である可能性が高く、特に結合したＤＮＡの量が最大値を示したＤＮＡ断片はその可能性がより高い。このようにして検出された特定種間共通ＤＮＡ断片は、それを共通に持つ複数種間の品種識別の実験の際、ハイブリダイゼーション反応がきちんと行われているかどうかを確認するための対照ＤＮＡとして用いることができる。
【００５３】
（Ｄ）微生物ＤＮＡの変化の検出方法
本発明の微生物ＤＮＡの変化の検出方法は、特定環境中に存在する微生物のＤＮＡの変化を検出する方法であって、ある時点において前記特定環境の一定体積に含まれる微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、断片化し、第一時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点の微生物群採取後に、第一時点とは異なる時点で前記特定環境の同一体積に含まれる第二時点の微生物群を採取し、その微生物群からＤＮＡを抽出した後、第一時点のＤＮＡ断片混合物と同一の手法で断片化し、第二時点のＤＮＡ断片混合物を調製する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物とその混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、第二時点のＤＮＡ断片混合物と第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡの量を計測する工程、第一時点のＤＮＡ断片混合物中に含まれる個々のＤＮＡ断片について、第一時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合と第二時点のＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズさせた場合の結合したＤＮＡの量を比較する工程を含むことを特徴とするものである。
【００５４】
本発明の微生物ＤＮＡの変化の検出方法は、上記共通ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものであり、ＤＮＡの抽出方法、ＤＮＡの断片化方法、ハイブリダイズさせる方法、結合したＤＮＡ断片の量の計測方法は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。なお、本発明における特定環境とは、河川、湖沼、海などの特定水域や特定の地域の土壌域、特定の地域の大気、生物の体内環境などをいう。
微生物ＤＮＡの変化を検出することにより、特定環境において微生物の組成等に変化があったかどうかを知ることができる。
【００５５】
（Ｅ）ハイブリダイゼーション方法
本発明のハイブリダイゼーション方法は、ある生物集団に属する個体の持つＤＮＡの断片と、プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる方法であって、前記生物集団に属する複数の個体のそれぞれが持つＤＮＡの断片の混合物を調製し、これとプローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とするものである。本発明のハイブリダイゼーション方法は、上記共通ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものであり、生物集団の意味、ＤＮＡの断片の混合物の調製方法、ハイブリダイゼーション方法は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。
プローブＤＮＡはどのようなものでもよく、例えば、市販のマイクロアレイなどを使用することもできる。
【００５６】
（Ｆ）複数の生物を混合した混合物に含まれる生物を同定する方法
本発明の複数の生物の混合物に含まれる生物を同定する方法は、混合物からＤＮＡ断片を調製する工程、前記調製したＤＮＡ断片と、混合物に含まれる可能性のある生物ごとの特異的ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズして結合したＤＮＡ断片を検出する工程を含むことを特徴とするものである。
【００５７】
本発明の同定方法において、ハイブリダイズさせる方法、結合したＤＮＡ断片の検出方法は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。また、混合物からのＤＮＡ断片の調製におけるＤＮＡの抽出、及びＤＮＡの断片化は、共通ＤＮＡ断片の検出方法と同様でよい。ハイブリダイゼーションに用いる生物ごとの特異的ＤＮＡ断片は、上述した本発明の共通ＤＮＡ断片の検出方法などによって得たものでもよく、また、塩基配列検索などから設計されたものであってもよい。本発明における混合物とは、複数品種を混合して作成する板ノリや配合飼料などをいう。
【００５８】
このようにして得られた生物の情報から、混合物に含まれる生物の構成を知ることができるため、成分表示の真偽の鑑定などを行うこともできる。
以下、本発明の検出方法の好ましい態様を図を用いて説明する。
【００５９】
図２は、塩基配列の分かっていない生物集団、たとえばミナミマグロとキハダマグロの種判別をするために、ミナミマグロの特異的ＤＮＡを求める実験の手順を示した図である。また、図３は、図２で得た実験結果をもとにして、ミナミマグロとキハダマグロの種判別をするために有効なミナミマグロの特異的ＤＮＡを特定するための解析手順を示した図である。
【００６０】
まず、図２において、複数匹のミナミマグロの集団２３のそれぞれの個体から等量ずつ採取したミナミマグロの同一部分の組織２４を1つのミナミマグロ用の容器２５の中に混合し、全体からミナミマグロのＤＮＡ混合物２６を抽出する。これを適当な長さの断片を与える制限酵素で切断して、ミナミマグロのＤＮＡ断片混合物２７とする。これを二つに分割し、分割したうちの片方のミナミマグロのＤＮＡ断片混合物２７を、適当なベクターにクローニングしてライブラリーを作製する。これを宿主に取り込ませて寒天培地２８に撒き、一つ一つのミナミマグロのコロニーまたはプラーク２９をピックアップする。これらを互いに独立に増殖させてクローニングしたＤＮＡ断片を増やし、クローンごとに基板上の異なる位置に固定して、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０を作製する。二つに分割したもう一方のミナミマグロのＤＮＡ断片混合物２７の末端を蛍光色素で標識して、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１を作製する。このミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１を先に作製したミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０にハイブリダイズさせて余剰のＤＮＡを除去し、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３２の蛍光シグナルを読み取る。蛍光標識はＤＮＡの末端に１分子ずつ付加しているため、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３２上で読み取れる各クローンの蛍光シグナルの強弱は、ハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡの分子数に比例し、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１の由来するミナミマグロの中で、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０に固定されたＤＮＡと同じＤＮＡを持つ個体の数に比例する。この結果、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたある特定のクローンのＤＮＡがすべてのミナミマグロに共通する共通ＤＮＡであれば、このミナミのマグロの共通ＤＮＡクローン３３に対応する蛍光標識したすべてのミナミマグロの個体由来のＤＮＡが、このクローンに同じ長さで完全にハイブリダイズするため、このミナミマグロの共通ＤＮＡクローン３３の蛍光シグナルは強くなる。一方、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定された別なクローンのＤＮＡが、ミナミマグロの個体ごとに異なる非共通ＤＮＡであれば、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１の中で、このミナミマグロの非共通ＤＮＡクローン３４のＤＮＡと異なる塩基配列のものはハイブリダイズしないため、このミナミマグロの非共通ＤＮＡクローン３４の蛍光シグナルは、同じマイクロアレイ上のミナミマグロの共通ＤＮＡクローン３３の蛍光シグナルよりも弱くなる。このような解析をミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定された全てのクローンについて行えば、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたおのおののクローンのＤＮＡが、ミナミマグロの共通ＤＮＡであるか非共通ＤＮＡであるかを知ることができる。
【００６１】
次に、複数匹のキハダマグロの集団３５から等量ずつ採取したキハダマグロの同一部分の組織３６を１つのキハダマグロ用の容器３７の中に混合し、全体からキハダマグロのＤＮＡ混合物３８を抽出する。これを図２でミナミマグロのＤＮＡを切断したものと同じ制限酵素で切断してキハダマグロのＤＮＡ断片混合物３９とする。このキハダマグロのＤＮＡ断片混合物３９の末端を蛍光色素で標識して、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０を作製する。このキハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０を、先に作製したミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０にハイブリダイズさせて余剰のＤＮＡを除去し、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ４１の蛍光シグナルを読み取る。ミナミマグロとキハダマグロは同じマグロ属の魚であり、ＤＮＡの塩基配列も共通部分が多いと考えられる。したがって、同じ制限酵素で切断すれば、両者のＤＮＡの切断部位はほとんどが共通であると考えられる。ハイブリダイゼーションの結果、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたある特定のクローンのＤＮＡがすべてのキハダマグロにも共通するＤＮＡクローン４２であれば、蛍光標識したすべてのキハダマグロの個体由来のこのクローンに対応するＤＮＡが、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたこのクローンに完全にハイブリダイズするため、このキハダマグロの共通ＤＮＡクローン４２の蛍光シグナル強くなる。一方、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定された別なクローンのＤＮＡが、キハダマグロの個体ごとに異なるキハダマグロの非共通ＤＮＡクローン４３であれば、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０の中で、このクローンのＤＮＡと異なる塩基配列のものはハイブリダイズしないため、このキハダマグロの非共通ＤＮＡクローン４３の蛍光シグナルは、キハダマグロの共通ＤＮＡクローン４２の蛍光シグナルよりも弱くなる。この場合の蛍光シグナルの強度は、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０の由来するキハダマグロの中で、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０に固定されたＤＮＡと同じ塩基配列のＤＮＡを持つ個体の数に比例する。また、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたさらに別なクローンのＤＮＡが、キハダマグロのどのＤＮＡとも異なるミナミマグロの特異的ＤＮＡであれば、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ４１の中のどのＤＮＡもこのクローンにハイブリダイズしないため、このミナミマグロの特異的ＤＮＡクローン４４は蛍光シグナルを全く発しない。このような解析をミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定された全てのクローンについて行えば、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定されたおのおののミナミマグロのクローンのＤＮＡが、キハダマグロの共通ＤＮＡであるか非共通ＤＮＡであるか、またはキハダマグロには存在しないＤＮＡであるかを知ることができる。
【００６２】
上記の図２の流れに従って得たミナミマグロおよびキハダマグロの実験結果を、図３のように比較解析する。まず、ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３２について、蛍光スキャナやＣＣＤカメラなどの読取装置を用いて、各クローンの蛍光シグナル強度を読み取る。たとえばミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物３１とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３２のスキャンライン４５の線上を蛍光スキャナでスキャンし、読み取った蛍光シグナル強度をスキャンライン４５に沿ってグラフに表すと、ミナミマグロのシグナルスキャングラフ４６のようになる。このようなグラフのデータに基づき、各クローンを蛍光シグナル強度で分類する。即ち、蛍光標識したＤＮＡに含まれる対応するすべてのＤＮＡがハイブリダイズして強い蛍光シグナル強度を与えるクローンをグループａと分類し、蛍光標識したＤＮＡに含まれる対応するＤＮＡの一部がハイブリダイズしてより弱い蛍光シグナル強度を与えるクローンをグループｂと分類する。この分類に従って、比較表４８のミナミマグロの欄を作成する。たとえばミナミマグロのシグナルスキャングラフ４６のデータからは、クローン番号９とクローン番号１１は、グループｂに分類され、クローン番号１０とクローン番号１２は、グループａに分類される。この場合、ミナミマグロのクローンにミナミマグロのＤＮＡをハイブリダイズさせているため、原則として、蛍光シグナルが皆無というクローンは存在しない。次に、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ４１について、蛍光スキャナやＣＣＤカメラなどの読取装置を用いて、各クローンの蛍光シグナル強度を読み取る。たとえばキハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ４１のスキャンライン４５の線上を蛍光スキャナでスキャンし、読み取った蛍光シグナル強度をスキャンライン４５に沿ってグラフに表すと、キハダマグロのシグナルスキャングラフ４７のようになる。このようなグラフのデータに基づき、キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物４０とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ４１上のおのおののクローンについて、蛍光標識したＤＮＡに含まれる対応するすべてのＤＮＡがハイブリダイズして最強の蛍光シグナル強度を与えるクローンをグループａと分類し、蛍光標識したＤＮＡに含まれる対応するＤＮＡの一部がハイブリダイズしてより弱い蛍光シグナル強度を与えるクローンをグループｂと分類し、さらに、蛍光標識したＤＮＡが全くハイブリダイズせずに蛍光シグナルが全く得られないクローンをグループｃと分類し、ミナミマグロのハイブリダイゼーション結果の比較表４８にキハダマグロの欄を追加して記入し、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上に固定したおのおののクローンのミナミマグロとキハダマグロの蛍光シグナルの強度を一覧できる比較表４８を作成する。たとえばキハダマグロのシグナルスキャングラフ４７のデータからは、クローン番号９とクローン番号１０はグループｃに分類され、クローン番号１１はグループｂに分類され、クローン番号１２はグループａに分類される。この比較表４８でミナミマグロとキハダマグロの実験結果の得点をおのおののクローンごとに比較し、ミナミマグロでグループａ、キハダマグロでグループｃと分類されるクローンを選出する。このようなクローンは、ミナミマグロの共通ＤＮＡでかつキハダマグロには存在しない無ＤＮＡであり、それはすなわち、ミナミマグロとキハダマグロの種判別を行う際のミナミマグロの特異的ＤＮＡである。比較表４８にこのようなクローンのみをマークする欄を設けて、ミナミマグロの特異的ＤＮＡを容易に見つけられるようにする。このようなクローンのみをピックアップすれば、より搭載クローン数の少ない種判別用ＤＮＡマイクロアレイ４９を作成することができ、これを用いて、ミナミマグロかキハダマグロかの種判別が必要な検査対象の種判別が可能なＤＮＡ鑑定をおこなうことができる。
【００６３】
この方法に従えば、手間と時間と費用のかかる塩基配列解析を行わずに特異的ＤＮＡを求めることができる。また、最初に複数個体を混合してＤＮＡを抽出し、ミナミマグロとキハダマグロのＤＮＡ断片混合物各１回ずつのＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションのみで、ミナミマグロおよびキハダマグロそれぞれの多数の共通ＤＮＡと非共通ＤＮＡとを区別して求めることが出来るため、これらの点でも実験の手間と時間と費用とを省くことができる。またこの方法によれば、簡便さばかりではなく、ハイブリダイゼーションを一度だけおこなうことにより、個体ごとに実験した場合に生じる1回ごとの実験条件のばらつき及びそれに由来する実験結果の誤差は入ることがなく、信頼性の高い結果が得られる。さらに、この方法によれば、ＤＮＡを増幅せずに検査に必要なＤＮＡ量を確保できるため、ＤＮＡ増幅によって生じる結果の間違いも引き起こす危険性がなくなり、この点でも、より信頼性の高い検出をおこなうことができる。
【００６４】
なお、ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ３０の上には、キハダマグロには存在するがミナミマグロには存在しないキハダマグロの特異的ＤＮＡは固定されていないため、このマイクロアレイを用いてキハダマグロの特異的ＤＮＡを求めることは出来ない。したがって、ミナミマグロとキハダマグロの種判別に用いるためのキハダマグロの特異的ＤＮＡを求めるためには、上記のミナミマグロとキハダマグロのＤＮＡを入れ替えて上記の実験及び解析を行い、キハダマグロの特異的ＤＮＡを求める必要がある。この方法を多数の生物集団に相互に当て嵌めれば、複数生物集団の種間共通ＤＮＡや複数生物集団に対する特定生物集団の特異的ＤＮＡを次々と求めることもできる。さらに、それらの複数生物集団それぞれの特異的ＤＮＡをまとめてひとつの検査システムとし、サンプルが複数生物集団の中のどの生物であるのかを同定するシステムを作成することもできる。
【００６５】
また、この方法により、複数生物集団の割合の変化を検出することも可能である。図４は、この特異的ＤＮＡ断片の検出法を応用して、特定水域における微生物生態系の経時変化を解析する手順の概略を示した図である。
【００６６】
まず、解析の基準となる時点１において、河川や湖沼、海などの特定水域の水を採取すると、この中には様々な微生物が様々な量含まれている。これを、特定水域の時点１の水とそれに含まれる微生物の集団５０とする。図３に示した工程と同様に、ここに含まれる微生物をまとめて回収して混合したままでＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で断片化して、特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物５１を作成する。これを二分し、片方の特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物５１中に含まれる個々のＤＮＡ断片を用いて、特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイを作成する。次に、もう片方の特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物５１を蛍光標識し、特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５２とハイブリダイズさせて、特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５３を得る。その後、特定水域で時点２において採取した水とそれに含まれる微生物の集団５４から、ここに含まれる微生物をまとめて回収して混合したままでＤＮＡを抽出し、これを特定水域の時点１の微生物全体の断片化したＤＮＡ断片混合物５１を断片化したものと同じ制限酵素で断片化して、特定水域の時点２の微生物全体のＤＮＡ断片混合物５５を作成する。これを蛍光標識し、特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５２とハイブリダイズさせて、特定水域の時点２の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５６を得る。特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５３の結果と、特定水域の時点２の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ５６の結果とを比較する。時点１から時点２までの時間経過において存在量の変化した微生物ＤＮＡのクローンは、二つのＤＮＡマイクロアレイにおいて、相対的にシグナル強度が異なることにより、変化があったと検出できる。採水を定期的に行い、変化の様子を追跡すれば、生態系における特定の微生物ＤＮＡの存在量の変化を、経時的に捉えることができる。
【００６７】
また、この方法を応用して、複数の生物の混合物に含まれる生物を同定することも可能である。まず、混合物に含まれる可能性のある生物すべてについて、上記の方法などにより、各々の生物ごとの特異的ＤＮＡ断片を求める。それらの生物ごとの特異的ＤＮＡ断片を用いて、たとえば生物同定用のＤＮＡマイクロアレイを作成する。次に、含まれる生物を同定したい混合物からＤＮＡを抽出し、上記の方法により断片化および蛍光標識を行って、生物同定用のＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせる。生物同定用のＤＮＡマイクロアレイ上で混合物のＤＮＡがハイブリダイズした特異的ＤＮＡが由来する生物を列挙すれば、それがすなわち、混合物に含まれる生物である。
【００６８】
また、検出の方法は、本実施の形態で説明したものに限定されるわけではない。このほか、本発明の要旨を逸脱することなくその他の種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００７０】
図１の（ｇ）のように分類される特定種間共通ＤＮＡ、特異的ＤＮＡおよび非共通ＤＮＡを、（ｈ）に示すようなシグナルのオンオフの状態で検出できるかどうかを、本発明の検査方法で調べた。
【００７１】
まず、図５の表に示したような塩基配列を持つ40merのオリゴヌクレオチド１０種を合成した。これらのうち、オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＧと、オリゴヌクレオチドＣはオリゴヌクレオチドＨと、およびオリゴヌクレオチドＤはオリゴヌクレオチドＩと、それぞれ互いに相補的な塩基配列を持ち、オリゴヌクレオチドＡ、オリゴヌクレオチドＥ、オリゴヌクレオチドＦ、オリゴヌクレオチドＪは、これら１０種のオリゴヌクレオチドの中には相補的な塩基配列を持たない。最初に、これら１０種のオリゴヌクレオチドの相補性と特異性を確認するための実験を行った。これら１０種のオリゴヌクレオチドの1μM水溶液を、図６の（ａ）および（ｂ）の配置図に従って、１枚目の96穴マイクロタイタープレート５８および２枚目の96穴マイクロタイタープレート６７（日本ジェネティクス  Multi Semi-skirted PCR Plate 35801）の該当する各ウェルに各々22μlずつ分注した。すなわち、オリゴヌクレオチドＡの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分５９、オリゴヌクレオチドＢの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６０、オリゴヌクレオチドＣの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６１、オリゴヌクレオチドＤの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６２、オリゴヌクレオチドＥの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６３、オリゴヌクレオチドＦの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６４、オリゴヌクレオチドＧの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６５、オリゴヌクレオチドＨの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６６、オリゴヌクレオチドＩの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６８、およびオリゴヌクレオチドＪの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６９の各2列ずつの各ウェルに、該当するオリゴヌクレオチドの1μM水溶液22μlずつを分注した。１枚目の96穴マイクロタイタープレート５８および２枚目の96穴マイクロタイタープレート６７のウェルのうちで、オリゴヌクレオチドを1種類しか分注しないウェルには、蒸留水22μlを、また、オリゴヌクレオチドを全く分注しないウェルには、蒸留水44μlを、それぞれ分注した。このことにより、オリゴヌクレオチドＡ〜Ｅのいずれか１種とオリゴヌクレオチドＦ〜Ｊのうちのいずれか１種とが同じウェルに分注されたウェルが、少なくとも4ウェルずつすべての組合せで作成でき、また、対照として、Ａ〜Ｊの各オリゴヌクレオチドが1種のみ分注されたウェル、およびオリゴヌクレオチドが全く入っていないウェルも、各マイクロタイタープレートに４ウェルずつ作成できた。
【００７２】
次に、二枚のマイクロタイタープレートの全てのウェルに、x10TE（100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH8.0）を5.5μlずつ分注し、ウェルごとによくピペッティングして溶液を混合した。これらのマイクロタイタープレート二枚にアルミ箔製のシール（アズワン  アルミテープ  AH-132）を被せて、ウェル間で溶液や蒸気が交換されないように、しっかり加熱圧着した後、マイクロタイタープレートをサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン（株）Gene Amp PCR System 9700）にセットし、96℃で3分間加熱後、17分かけて温度を25℃まで下げ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行わせた。プレートの水気をよくふき取り、これらのマイクロタイタープレートの各ウェルから45μlずつとって、同じ配置を保って、２枚の９６穴の平底マイクロタイタープレート（Nunc  96ウェルオプティカルボトムプレート  265301）に移した。溶液を移した二枚の平底マイクロタイタープレートの全てのウェルに、二本鎖ＤＮＡ検出試薬（SYBR Green I, TaKaRa F0513）の20000倍希釈液を5μlずつ分注し、ウェルごとによくピペッティングして溶液を混合した後、アルミ箔製のシール（アズワン  アルミテープ  AH-132）を被せて、ウェル間で溶液や蒸気が交換されないように、しっかり加熱圧着した。これらの平底マイクロタイタープレートを37℃で15分暗所に保存した。
【００７３】
これらの平底マイクロタイタープレートの蓋をはずし、フルオロ・イメージアナライザー（富士フイルム(株)  FLA-5000）で蛍光強度を測定（フィルター：LPB、励起波長：473nm、pmt値：400V）して画像を撮影した。これらの中から、同じ組合せのオリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行った4ウェルずつの画像を図7に示した。また、同じ組合せのオリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行ったウェル同士の測定値の算術平均を求め、その値からオリゴヌクレオチドの含まれていないウェルの測定値の算術平均をバックグラウンドとして引き去った値を求めた後、2枚の96穴マイクロタイタープレートの値を両方に存在するオリゴヌクレオチドＨのハイブリダイゼーションにより得られた蛍光強度の測定値で補正したところ、各組合せのハイブリダイゼーションによる相対的な蛍光強度値は、図７の表の数値のようになった。
【００７４】
図７の画像で明らかなように、互いに相補性のあるオリゴヌクレオチド同士の組合せであるオリゴヌクレオチドＢとオリゴヌクレオチドＧ、オリゴヌクレオチドＣとオリゴヌクレオチドＨ、およびオリゴヌクレオチドＤとオリゴヌクレオチドＩの組合せが同じウェルに入っている部位だけで強い蛍光シグナルが検出でき、相補性のないオリゴヌクレオチドの組合せ、オリゴヌクレオチドが1種類しか入っていないウェル、およびオリゴヌクレオチドが全く入っていないウェルの蛍光シグナルは、非常に低くしか検出されなかった。また、図７の表に示したように、相対的な蛍光強度を数値化した場合にも、同様の結果が得られた。したがって、これら１０種のオリゴヌクレオチドは、塩基配列で相補性を確認しているオリゴヌクレオチドＢとオリゴヌクレオチドＧ、オリゴヌクレオチドＣとオリゴヌクレオチドＨ、およびオリゴヌクレオチドＤとオリゴヌクレオチドＩの組合せでのみ、特異的にハイブリダイゼーションが検出できることが示された。
【００７５】
そこで、これらのオリゴヌクレオチドを用いて、図１の（ｇ）に示したような２種類の生物集団に含まれるＤＮＡのモデル系を想定した。すなわち、図８に示すように、生物集団（１）の全ＤＮＡ７１および、生物集団（２）の全ＤＮＡ７２を仮定し、オリゴヌクレオチドＡおよびオリゴヌクレオチドＦを生物集団（１）の非共通ＤＮＡ７３、オリゴヌクレオチドＢおよびオリゴヌクレオチドＧを生物集団（１）の特異的ＤＮＡ７４、オリゴヌクレオチドＣおよびオリゴヌクレオチドＨを生物集団(１)および(２)の種間共通ＤＮＡ７５、オリゴヌクレオチドＤおよびオリゴヌクレオチドＩを生物集団（２）の特異的ＤＮＡ７６、オリゴヌクレオチドＥおよびオリゴヌクレオチドＪを生物集団（２）の非共通ＤＮＡ７７と仮定した。オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌクレオチドＦはともに生物集団（１）の非共通ＤＮＡ７３であるが、由来する個体が異なるため配列の異なるＤＮＡ部位と仮定することができる。同様に、オリゴヌクレオチドＥとオリゴヌクレオチドＪも、生物集団（２）の異なる個体由来の非共通ＤＮＡ７７のＤＮＡ部位と仮定できる。図８では、相補的な配列を持つオリゴヌクレオチド同士を＝で結んで表した。このモデル系にしたがって、生物集団（１）および生物集団（２）の特定種間共通ＤＮＡ７５、生物集団（１）の特異的ＤＮＡ７４、生物集団（２）の特異的ＤＮＡ７６、生物集団（１）の非共通ＤＮＡ７３、生物集団（２）の非共通ＤＮＡ７７を、本発明の方法により、ハイブリダイゼーションを用いて検出する実験を行った。
【００７６】
まず、オリゴヌクレオチドＡ，Ｂ，Ｃそれぞれの3μM水溶液を等量混合し、生物集団（１）に属する1つの個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の1μMの水溶液を作成した。同様に、オリゴヌクレオチドＣ，Ｄ，Ｅそれぞれの3μM水溶液を等量混合し、生物集団（２）に属する1つの個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の1μMの水溶液を作成した。
【００７７】
次に、生物集団（１）に由来するＤＮＡ断片としてオリゴヌクレオチドＦおよびＧ、生物集団（２）に由来するＤＮＡ断片としてオリゴヌクレオチドＩおよびＪ、生物集団（１）および（２）に共通に由来するＤＮＡ断片としてオリゴヌクレオチドＨの5種のオリゴヌクレオチドを、図９に示した配置に従って、本実験の96穴マイクロタイタープレート７８（日本ジェネティクス  Multi Semi-skirted PCR Plate 35801）の該当する各ウェルに各々22μlずつ分注した。すなわち、オリゴヌクレオチドＦの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６４、オリゴヌクレオチドＧの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６５、オリゴヌクレオチドＨの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６６、オリゴヌクレオチドＩの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６８、およびオリゴヌクレオチドＪの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分６９の各2列ずつの各ウェルに、該当するオリゴヌクレオチドの1μM水溶液22μlずつを分注した。
【００７８】
この、横長に置いた本実験の96穴マイクロタイタープレート７８に、図９に示した配置に従って、図の最上段と上から五段目の各ウェル７９に、先に調整した、生物集団（１）に属する1つの個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の1μMの水溶液を、各ウェルに22μlずつ分注した。さらに、三段目と七段目の各ウェル８０に、先に調整した、生物集団（２）に属する1つの個体から得られたＤＮＡ断片の混合物の1μMの水溶液を、各ウェルに22μlずつを分注した。本実験の96穴マイクロタイタープレート７８のウェルのうちで、一種類のオリゴヌクレオチドまたは混合オリゴヌクレオチドのどちらか1種類しか分注しないウェルには、蒸留水22μlを、また、どちらも分注しないウェルには、蒸留水44μlを、それぞれ分注した。
【００７９】
次に、本実験の96穴マイクロタイタープレート７８の全てのウェルに、x10TE（100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH8.0）を5.5μlずつ分注し、ウェルごとによくピペッティングして溶液を混合した。この本実験の96穴マイクロタイタープレート７８にアルミ箔製のシール（アズワン  アルミテープ  AH-132）を被せて、ウェル間で溶液や蒸気が交換されないように、しっかり加熱圧着した後、マイクロタイタープレートをサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン（株）Gene Amp PCR System 9700）にセットし、96℃で3分間加熱後、17分かけて温度を25℃まで下げ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行わせた。プレートの水気をよくふき取り、本実験の96穴マイクロタイタープレート７８の各ウェルから45μlずつとって、同じ配置を保って、96穴の平底マイクロタイタープレート（Nunc  96ウェルオプティカルボトムプレート  265301）に移した。溶液を移した96穴の平底マイクロタイタープレートの全てのウェルに、二本鎖ＤＮＡ検出試薬（SYBR Green I, TaKaRa F0513）の20000倍希釈液を5μlずつ分注し、ウェルごとによくピペッティングして溶液を混合した後、アルミ箔製のシール（アズワン  アルミテープ  AH-132）を被せて、ウェル間で溶液や蒸気が交換されないように、しっかり加熱圧着した。この平底マイクロタイタープレートを37℃で15分暗所に保存した。
【００８０】
この平底マイクロタイタープレートの蓋をはずし、フルオロ・イメージアナライザー（富士フイルム(株)  FLA-5000）で蛍光強度を測定（フィルター：LPB、励起波長：473nm、pmt値：400V）して画像を撮影した。これらの中から、同じ組合せのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った4ウェルの画像を図１０に示した。また、同じ組合せのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行ったウェル同士の測定値の算術平均を求め、その値からオリゴヌクレオチドの含まれていないウェルの測定値の算術平均をバックグラウンドとして引き去った値を求めた相対的な蛍光強度値は、図１０の表の数値のようになった。画像及び数値のどちらからも、オリゴヌクレオチド（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）の混合液とオリゴヌクレオチドＧおよびオリゴヌクレオチドＨ、オリゴヌクレオチド（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ）の混合液とオリゴヌクレオチドＨおよびオリゴヌクレオチドＩの各組合せの場合のみ、強い蛍光シグナルが検出でき、その他の相補性のないオリゴヌクレオチドの組合せ、オリゴヌクレオチドが1種類しか入っていないウェル、およびオリゴヌクレオチドが全く入っていないウェルの蛍光シグナルは、非常に低くしか検出されなかった。以上の結果から、オリゴヌクレオチド（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）の混合液すなわち生物集団（１）の全ＤＮＡとオリゴヌクレオチド（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ）の混合液すなわち生物集団（２）の全ＤＮＡを、生物集団（１）および（２）に由来する個々のＤＮＡとのハイブリダイゼーションさせることによって、生物集団（１）のＤＮＡおよび生物集団（２）のＤＮＡの両方にハイブリダイズして蛍光シグナルを発するオリゴヌクレオチドＨを種間共通ＤＮＡ、生物集団（１）のＤＮＡにはハイブリダイズして蛍光シグナルを発するが生物集団（２）のＤＮＡにはハイブリダイズせず蛍光シグナルを発しないオリゴヌクレオチドＧを生物集団（１）の特異的ＤＮＡ、生物集団（１）のＤＮＡにはハイブリダイズせず蛍光シグナルを発しないが生物集団（２）のＤＮＡにはハイブリダイズして蛍光シグナルを発するオリゴヌクレオチドＩを生物集団（２）の特異的ＤＮＡ、生物集団（１）の個体由来のＤＮＡではあるが生物集団（１）および（２）のどのＤＮＡともハイブリダイズせず蛍光シグナルを発しないオリゴヌクレオチドＦを生物集団（１）の非共通ＤＮＡ、生物集団（２）の個体由来のＤＮＡではあるが生物集団（１）および（２）のどのＤＮＡともハイブリダイズせず蛍光シグナルを発しないオリゴヌクレオチドＦを生物集団（２）の非共通ＤＮＡとして、それぞれ検出することが出来た。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】魚種Ａと魚種Ｂの種判別に必要な、それぞれの魚種の特異的ＤＮＡを求める考え方を示した図である。
【図２】ミナミマグロとキハダマグロの種判別をするために、ミナミマグロの特異的ＤＮＡを求める実験の手順を示した図である。
【図３】ミナミマグロとキハダマグロの種判別をするために、実験で得られた結果を解析して種判別用ＤＮＡマイクロアレイを作製する流れを示した図である。
【図４】特定水域に生息する微生物全体のＤＮＡを用いて特定水域における微生物生態系の経時変化を解析する手順の概略を示した図である。
【図５】実施例の検査に用いた各オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補性を示した図である。
【図６】実施例の検査に用いた各オリゴヌクレオチドの相補性と特異性を確認する実験の、各ＤＮＡの配置図である。
【図７】実施例の検査に用いた各オリゴヌクレオチドの相補性と特異性を確認した実験結果の図である。
【図８】実施例の検査に用いた各オリゴヌクレオチドを、図１（ｇ）の分類にあわせたモデル系として分配した状態を示した図である。
【図９】実施例のモデル系の実験における各ＤＮＡの配置図である。
【図１０】実施例のモデル系の実験結果を示した図である。
【図１１】魚種Ｃの共通ＤＮＡを求める現行の手法と本発明の方法との比較を示した図である。
【符号の説明】
【００８２】
１・・・魚種Ａの個体ａ、２・・・個体ａの全ＤＮＡ、３・・・個体ａの非共通ＤＮＡ、４・・・魚種Ａの共通ＤＮＡ、５・・・魚種Ａの個体ｂ、６・・・個体ｂの全ＤＮＡ、７・・・個体ｂの非共通ＤＮＡ、８・・・魚種Ａの全ＤＮＡ、９・・・魚種Ａにおける非共通ＤＮＡの集合、１０・・・魚種Ｂの個体ｃ、１１・・・個体ｃの全ＤＮＡ、１２・・・個体ｃの非共通ＤＮＡ、１３・・・魚種Ｂの共通ＤＮＡ、１４・・・魚種Ｂの個体ｄ、１５・・・個体ｄの全ＤＮＡ、１６・・・個体ｄの非共通ＤＮＡ、１７・・・魚種Ｂの全ＤＮＡ、１８・・・魚種Ｂにおける非共通ＤＮＡの集合、１９・・・魚種Ａと魚種Ｂとの特定種間共通ＤＮＡ、２０・・・魚種Ａの特異的ＤＮＡ、２１・・・魚種Ｂの特異的ＤＮＡ、２２・・・ハイブリダイゼーションのシグナル表、２３・・・複数匹のミナミマグロの集団、２４・・・等量ずつ採取したミナミマグロの同一部分の組織、２５・・・ミナミマグロ用の容器、２６・・・ミナミマグロのＤＮＡ混合物、２７・・・ミナミマグロのＤＮＡ断片混合物、２８・・・寒天培地、２９・・・ミナミマグロのコロニーまたはプラーク、３０・・・ミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ、３１・・・ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物、３２・・・ミナミマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ、３３・・・ミナミマグロの共通ＤＮＡクローン、３４・・・ミナミマグロの非共通ＤＮＡクローン、３５・・・複数匹のキハダマグロの集団、３６・・・等量ずつ採取したキハダマグロの同一部分の組織、３７・・・キハダマグロ用の容器、３８・・・キハダマグロのＤＮＡ混合物、３９・・・キハダマグロのＤＮＡ断片混合物、４０・・・キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物、４１・・・キハダマグロの蛍光標識ＤＮＡ断片混合物とハイブリダイズしたミナミマグロのＤＮＡマイクロアレイ、４２・・・キハダマグロの共通ＤＮＡクローン、４３・・・キハダマグロの非共通ＤＮＡクローン、４４・・・ミナミマグロの特異的ＤＮＡクローン、４５・・・スキャンライン、４６・・・ミナミマグロのシグナルスキャングラフ、４７・・・キハダマグロのシグナルスキャングラフ、４８・・・比較表、４９・・・種判別用ＤＮＡマイクロアレイ、５０・・・特定水域の時点１の水とそれに含まれる微生物の集団、５１・・・特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物、５２・・・特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ、５３・・・特定水域の時点１の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ、５４・・・特定水域の時点２の水とそれに含まれる微生物の集団、５５・・・特定水域の時点２の微生物全体のＤＮＡ断片混合物、５６・・・特定水域の時点２の微生物全体のＤＮＡ断片混合物でハイブリダイズした特定水域の時点１のＤＮＡマイクロアレイ、５７・・・オリゴの塩基配列と特徴の表、５８・・・1枚目の96穴マイクロタイタープレート、５９・・・オリゴヌクレオチドＡの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６０・・・オリゴヌクレオチドＢの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６１・・・オリゴヌク��オチドＣの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６２・・・オリゴヌクレオチドＤの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６３・・・オリゴヌクレオチドＥの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６４・・・オリゴヌクレオチドＦの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６５・・・オリゴヌクレオチドＧの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６６・・・オリゴヌクレオチドＨの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６７・・・2枚目の96穴マイクロタイタープレート、６８・・・オリゴヌクレオチドＩの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、６９・・・オリゴヌクレオチドＪの溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、７０・・・オリゴヌクレオチドの相補性と特異性の確認のための実験結果の表、７１・・・生物集団（１）の全ＤＮＡ、７２・・・生物集団（２）の全ＤＮＡ、７３・・・生物集団（１）の非共通ＤＮＡ、７４・・・生物集団（１）の特異的ＤＮＡ、７５・・・生物集団（１）と生物集団（２）の種間共通ＤＮＡ、７６・・・生物集団（２）の特異的ＤＮＡ、生物集団（２）の非共通ＤＮＡ、７８・・・モデル系の実験の96穴マイクロタイタープレート、７９・・・オリゴヌクレオチドＡ，Ｂ，Ｃの混合溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、８０・・・オリゴヌクレオチドＣ，Ｄ，Ｅの混合溶液を分注した96穴マイクロタイタープレートのウェルの部分、８１・・・モデル系の実験結果の表、８２・・・魚種Ｃの個体ａ、８３・・・容器、８４・・・個体ａから採取した組織、８５・・・個体ａのＤＮＡ、８６・・・個体ａのＤＮＡ断片混合物、８７・・・マイクロアレイの実験結果、８８・・・マイクロアレイの実験結果の積算、８９・・・魚種Ｃの全体の結果、９０・・・魚種Ｃの集団、９１・・・魚種Ｃ用の共通容器、９２・・・魚種Ｃの組織の混合物、９３・・・魚種ＣのＤＮＡ混合物、９４・・・魚種ＣのＤＮＡ断片混合物
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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