(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される核酸配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、レプリコン。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミドを含む、細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞から産生される、ウイルス粒子。
【請求項６】
請求項３に記載のプラスミド、請求項４に記載の細胞または請求項５に記載のウイルス粒子により感染した、非ヒト動物。
【請求項７】
請求項３に記載のプラスミド、請求項４に記載の細胞、請求項５に記載のウイルス粒子および／または請求項６に記載の感染非ヒト動物を利用するＣ型肝炎ウイルス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドおよびレポータ配列を含む、プラスミド。
【請求項９】
請求項８に記載のレポータ配列が、ルシフェラーゼをコードする核酸配列である、プラスミド。
【請求項１０】
請求項１に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項３に記載のプラスミド、請求項４に記載の細胞、および／または請求項５に記載のウイルス粒子を含む、Ｃ型肝炎ウイルス治療薬のスクリーニングキット。
【請求項１２】
請求項９に記載のプラスミドを含む、ウイルス増殖検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い感染性および高度の増殖能を有するゲノムタイプが１ｂのＨＣＶウイルスクローンの核酸配列、それを利用した治療薬のスクリーニング方法、ワクチンなどの治療薬および／または診断への利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは１９８９年にアメリカ合衆国のカイロン社の研究者により発見されたプラス鎖の１本鎖ＲＮＡウイルスである（ＣｈｏｏらＳｃｉｅｎｃｅ  ２４４，３５９−３６２（１９８９））。現在世界中でおよそ２億人が感染していると考えられており、このウイルスの持続感染は慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと進展することが知られている、重要な感染症である（非特許文献１）。
【０００３】
日本における肝細胞癌のおよそ７割はこのウイルスの感染に起因することが知られている。このウイルスには多数のサブタイプが存在することが知られており、遺伝子配列による分類が行われゲノタイプと呼ばれている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｆｏｒ  ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．  ２００５  Ｏｃｔ；４２（４）：９６２−７３）。ゲノタイプ１ｂは、中でもインターフェロン治療に対して抵抗性であることが知られている。
【０００４】
最近の治療法の改善によりペグインターフェロンとリバビリンを併用することによって、ゲノタイプ１ｂでも、治癒率が向上してきている。しかし、その治癒率はなお５０％程度にすぎない。
【０００５】
このウイルスの感染の診断は、ウイルスの有するポリペプチドの配列をもとに、抗体を検出する方法、ウイルスのコアタンパクを検出する方法、ＨＣＶ  ＲＮＡを検出する方法が考案されているが、感染早期の診断などにおいてはまだ不完全である。さらに、感染を防御するワクチンは未開発であり、治療用のワクチンも開発されていない。
【０００６】
最近ゲノタイプ２ａについては、感染性を有するウイルスを産生する系が開発されたが、ゲノタイプ１ｂのウイルスを増殖させることは困難であり、ゲノタイプが１ｂのウイルスを細胞株で高度に増殖し、継代培養できるようなＨＣＶはこれまでに報告されていない（非特許文献２）。また、実験動物に感染させることができるウイルスを産生するようなウイルス株についても報告されていない。このような特性を有するウイルス株は、治療薬の開発、診断薬の開発やワクチンの開発、さらには遺伝子治療に用いるウイルスベクターの構築において特に有用である。
【０００７】
また、治療薬となりうるような化合物を、ウイルスを産出している細胞株に添加し、その効果を測定することにより新規治療薬を開発する上で特に有用である。また、このようにして作製できるウイルスクローンは、点突然変異を導入することにより薬剤耐性を導入できることから、種々の抗ウイルス薬に対する耐性株の感受性や抵抗性を検討する上できわめて有用な手段となる。さらに実験動物にこのようなウイルスを感染させることができれば、生体内での薬物の治療効果を検討する上できわめて有用な実験系となる。
【非特許文献１】ＷＨＯ：  Ｇｌｏｂａｌ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ，  Ａｎｔｗｅｒｐ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ．  Ｊ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ  ６  （１９９９）  ３５−４７，  Ｋｉｙｏｓａｗａ  Ｋ，  Ｓｏｄｅｙａｍａ  Ｔ，  Ｔａｎａｋａ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，  ｎｏｎ−Ａ，  ｎｏｎ−Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １２  （１９９０）  ６７１−６７５．
【非特許文献２】河田純男、白鳥康史，工藤正俊、榎本信幸（編）、肝疾患Ｒｅｖｉｅｗ  ２００６−２００７、１０９−１１３（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような理由から、細胞株に感染することができ、高度の増殖能力を有し、しかも実験動物に感染させることができるゲノタイプが１ｂのウイルス株は切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、重症のＣ型急性肝炎を発症した患者血清からＲＮＡを分離精製し、このＲＮＡを鋳型として、既知の方法でｃＤＮＡを作製し全長の核酸配列を有するクローンを得た。このクローンは、別に示す核酸配列を有していた。この配列はゲノタイプが１ｂに属するものであり、従来報告されているものとは異なっていた。
【００１０】
このウイルスｃＤＮＡを含むプラスミッドから、Ｔ７ポリメラーゼを用いて、ウイルスＲＮＡを作製し、培養細胞株にエレクトロポレーションにより導入したところ、大量のウイルスの産生がみられ、産生されたウイルスは実験動物に感染性を有していた。このウイルスクローンを産生している細胞株に抗ウイルス薬であるインターフェロンを添加したところ、用量依存性にウイルスの増殖抑制が認められ、このウイルスクローン感染細胞系が、抗ウイルス薬のスクリーニングに有用であることが判明した。
【００１１】
また、このように大量にモノクローナルなウイルスが産生されることはこれに対する抗体を産生する上での抗原を安定供給することができ、診断薬、ワクチンの開発に有用であることが判明した。
【００１２】
具体的には、本発明は、以下を提供する。
【００１３】
（項目１）  配列番号１に示される核酸配列。
【００１４】
（項目２）  配列番号１に基づくレプリコン。
【００１５】
（項目３）  配列番号１に示される核酸配列を含む、プラスミド。
【００１６】
（項目４）  配列番号１に示される核酸配列を含むプラスミドを含む、細胞。
【００１７】
（項目５）  配列番号１に示される核酸配列を含むプラスミドを含む、細胞から産生される、ウイルス粒子。
【００１８】
（項目６）  配列番号１に示される核酸配列を含むウイルス粒子により感染した動物。
【００１９】
（項目７）  配列番号１に示される核酸配列を含む、プラスミド、細胞、ウイルス粒子または感染動物を利用するＣ型肝炎ウイルス治療薬のスクリーニング方法
（項目８）  配列番号１に示される核酸配列およびルシフェラーゼなどのレポータ−配列を含む、プラスミド。
【００２０】
（項目９）  配列番号１に示される核酸配列を改変した、核酸配列。
【００２１】
（項目１０）  核酸配列１によりコードされるアミノ酸配列。
【００２２】
（項目１１）  項目９に記載のアミノ酸配列に基づくワクチン。
【００２３】
（項目１２）  配列番号１に示される核酸配列の一部または全部の配列の相補鎖にハイブリダイズする核酸配列
（項目１３）  項目１１に記載の核酸配列に、１以上の核酸の欠失、置換、付加を含み請求項１に記載の核酸配列の一部または全部の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列。  
【００２４】
（項目１４）  配列番号１または配列番号１を改変した核酸配列に基づく核酸ワクチン。
【発明の効果】
【００２５】
このクローンを使用することにより、Ｃ型肝炎ウイルスを細胞株を使って継代培養することができ、さらに実験動物にも感染させることができることから、ウイルスのバイオロジーの研究ひいては抗ウイルス薬の探索に使用することができる。また、このウイルス株は高度の増殖性を有していることから、診断用の抗体を作製する際の抗原を多量に安定供給できる。また、培養細胞株に基礎化合物を添加し、ウイルスの増殖速度を観察することにより、ウイルスの増殖を抑制する薬剤の開発を行うことができる。しかも、実験動物に感染させ、生体内での薬剤の効果を測定することも可能である。特に、薬剤耐性であることが知られているような変異を導入することにより、種々の薬剤の耐性株に対する効果を検定する際に有用である。また、感染防御のためのワクチンの産生に用いる抗原の安定供給にも有用である。また、治療的ワクチンの作製やウイルスベクターとしての使用などにも応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２７】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の薬学的組成物、その他の薬剤、およびキャリアを含む製品をいう。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
【００３０】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１もしくは３のいずれかに示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。
【００３１】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な核酸配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
【００３２】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００３３】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２もしくは４のいずれかに示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。
【００３４】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
【００３５】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００３６】
本明細書では、アミノ酸配列および核酸配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００３７】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００３８】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００３９】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００４１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの核酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ
、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４４】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００４５】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００４６】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【００４７】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００４８】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００４９】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００５０】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００５１】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００５２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５３】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５５】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００５６】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【００５７】
本明細書中で、「生物学的サンプル」とは、例えば、血液、血清、尿、および／または腫瘍生検をいうが、これらに限定されない。
【００５８】
「マーカー」とは、生物学的因子を明確に同定する、生物学的因子の高分子的、微視的、または分子的特徴をいう。
【００５９】
「抗体」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本発明の抗体は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、特異的に反応する。
【００６０】
「中和」は、生物学的活性を有する物質が、それに対する抗体に結合することにより、活性を失う現象をいう。本明細書中では、この生物学的活性は特に、転移および／または浸潤活性である。
【００６１】
「中和抗体」は、生物学的活性を中和する抗体をいう。本明細書中における「中和抗体」は、特に、癌細胞の転移および／または浸潤活性を中和する抗体をいう。
【００６２】
本発明の核酸または抗体は、抗癌剤と組み合わせて使用され得る。この抗癌剤としては、当該分野で公知の任意の抗癌剤（抗悪性腫瘍薬剤、細胞毒性薬剤（例えば、ＤＮＡ相互作用剤（例えば、シスプラチンまたはドキソルビシン）等）；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼＩＩインヒビター（例えば、エトポシド）；トポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、イリノテカン（すなわちＣＰＴ−１１）、カンプトスターまたはトポテカン）；微小管相互作用剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポシロン）；ホルモン剤（例えば、タモキシフェン）；チミジル酸合成インヒビター（例えば、５−フルオロウラシル）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート）；アルキル化剤（例えば、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲＴＭ）、シクロホスファミド）；ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター（例えば、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ（４−［２−［４−［（１１Ｒ）−３，１０−ジブロモ−８−クロロ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−１１−イル−］−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド、またはＳＣＨ  ６６３３６）、チピファルニブ（ＺａｒｎｅｓｔｒａｓまたはＲ１１５７７７）、Ｌ７７８，１２３（ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター）、ＢＭＳ  ２１４６６２（ファネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター）；シグナル伝達系インヒビター（例えば、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａ（ＥＧＦＲキナーゼインヒビター）、ＥＧＦＲに対する抗体（例えば、Ｃ２２５）、ＧＬＥＥＶＥＣＴＭＣ−ａｂｌキナーゼインヒビター）；インターフェロン（例えば、イントロン、Ｐｅｇ−イントロン）；ａｒａ−Ｃ、アドリアマイシン、シトキサンおよびゲムシタビン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物と組み合わされて使用される、特に有用な抗癌剤は、シスプラチンまたは５−ＦＵである。
【００６３】
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウンすることが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、実施例に示すような方法によって調製できる。さらに、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。ｓｉＲＮＡの調製法については、実施例の一般的手法の項を参照のこと。
【００６４】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
【００６５】
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
【００６６】
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
【００６７】
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００６８】
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００６９】
本発明の配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって実行され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、原核生物系において最も頻繁に使用されるが、他の多くの細菌（例えば、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓの株）が、当該分野で公知であり、そしてコレラも同様に、使用され得る。配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードする核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を包含する。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。
【００７０】
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための広範な種類のベクターを包含する。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多く（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）である。配列番号２または４に記載のポリペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターもしくはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドプロモーター（例えば、ｐｔａｃ）を含むベクター（ｐＤＲ５４０）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５〜２３６を参照のこと。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：２０３５〜２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６８：２５９に開示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において、高レベルで発現され得る。
【００７１】
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明の配列番号２または４に記載のポリペプチドの組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。
【００７２】
（実施例１：Ｃ型肝炎ウイルスの増幅）
重症Ｃ型急性肝炎患者血清よりＲＮＡを抽出、ゲノタイプ１ｂの高度に保存された領域に設定されたプライマーを使用してポリメーラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行った。アガロースゲル電気泳動により期待される位置にバンドが検出された。Ｃ型肝炎ウイルスのほぼ全領域をこのようにして増幅することが可能であった。さらに、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥを行うことにより全配列を増幅することができた（図１）。
（実施例２：Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの転写）
実施例１で得られたＤＮＡ断片をそれぞれプラスミッドベクターにクローニングし、その後、一つのプラスミッドベクターに連結させることにより、Ｃ型肝炎ウイルスの全長を有するｃＤＮＡをクローニングすることができた。Ｔ７プロモータをその上流に配置しておくことにより、３’末端を制限酵素で切断後にＣ型肝炎ウイルスと同等のＲＮＡを転写することが可能であった(図２)。転写されたＲＮＡは変性アガロースゲルで電気泳動すると、予測される位置にバンドが確認された。
（実施例３：Ｈｕｈ７細胞によるウイルスの産生）
実施例２で作製されたＲＮＡをエレクトロポレーションによりＨｕｈ７細胞に導入し、その後経時的に培養上清に産出されるウイルスを、ＨＣＶ  ＲＮＡを定量することにより測定した。培養上清にウイルスが産出され、徐々にその濃度が上昇することが観察された(図３)。
（実施例４：ウイルス粒子の蔗糖密度勾配遠心法による分離）
実施例３において培養上清に産出されたウイルスを蔗糖密度勾配遠心により分離した。全体を１２のフラクションに分けて、ＨＣＶ  ＲＮＡの濃度を測定した。ウイルスのピークは密度１．１の位置に分画され、ウイルス粒子の存在が示唆された（図４）。
（実施例５：免疫不全マウスにおけるＣ型肝炎ウイルスの静脈注射による感染）
実施例３により産出されたウイルスを、ヒト肝細胞を移植した免疫不全マウスに静脈注射することにより投与した。静脈注射後２週間で、マウス血液中のＣ型肝炎ウイルス濃度が上昇し、ＨＣＶ  ＲＮＡを測定したところ１０５ｃｏｐｙ／ｍｌに達していた（図５）。
（実施例６：免疫不全マウスにおけるＣ型肝炎ウイルスの肝臓内注射による感染）
実施例２において作製したＨＣＶ  ＲＮＡを、ヒト肝細胞を移植した免疫不全マウスの肝臓内に直接注入した。その後２週間でマウスの血液中にウイルスが増加してきた。このウイルス量はＨＣＶ  ＲＮＡを測定することによりその後さらに上昇していることがわかった（図６）。
（実施例７：パッセージ感染実験）
実施例６によりウイルス量が増加したマウス血清を次のマウスに投与したところ（パッセージ実験）、投与されたマウスの血中にウイルス粒子が増加してきていることが、ＨＣＶ  ＲＮＡを測定することにより検出された（図７）。
（実施例８：ゲノムタイプの異なるＣ型肝炎ウイルス感染に対するインターフェロンの効果の比較）
実施例６や７により、ウイルスが血中に増加したマウスに対して、インターフェロンを投与した。異なる量のインターフェロンに対して、用量依存性のウイルスの減少が見られ、インターフェロンなど、抗ウイルス薬の効果の検証に有用なモデルとなることが示された。インターフェロン投与によりウイルスは減少したが、ゲノタイプ２ａのウイルスに比べて、ゲノタイプ１ｂのウイルスは血中濃度が高く、増殖能力が高いことが示唆されたが、インターフェロンの治療効果はゲノタイプ２ａのウイルスと比較すると明らかに少なく、臨床的に経験される、ゲノタイプ１ｂはインターフェロン抵抗性であることを再現できるモデルであることがわかった（図８）。
（実施例９：ゲノムタイプの異なるＣ型肝炎ウイルス感染に対するインターフェロンの効果の比較）
実施例６や７により、ウイルスが血中に増加したマウスとゲノタイプ２ａのウイルスが感染したマウスのインターフェロンの効果を比較した。ゲノタイプ２ａに比べて、１ｂのウイルスは血中濃度が高く、増殖能力が高いことが示唆されたが、インターフェロンの治療効果はゲノタイプ２ａのウイルスと比較すると明らかに少なく、臨床的に経験される、ゲノタイプ１ｂはインターフェロン抵抗性であることを再現できるモデルであることがわかった（図９）。
実施例１０
実施例３で作製した、ウイルス産生細胞株に抗ウイルス薬であるインターフェロンを、培養上清に添加した。添加した薬剤の濃度により、より強いウイルス増殖抑制作用が認められた。  
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明に従って、抗Ｃ型肝炎ウイルス治療薬のスクリーニング手段が提供される。さらにそのようなスクリーニングに使用するためのプラスミド、細胞、ウイルス粒子および感染動物もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は患者血清から抽出されたＲＮＡを用いて，ＰＣＲ反応、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ行なって増幅した試料のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン１は、Ｃ型肝炎患者血清、レーン２はＣ型肝炎患者血清、レーン３は当該患者血清、レーン４は陰性コントロールを示す。
【図２】図２は、C型肝炎ウイルスの全長を有するcDNAをクローニングすることができるプラスミドベクターを示す。
【図３】図３は、実施例２で作製されたRNAをエレクトロポレーションによりHuh7細胞に導入し、その後経時的に培養上清に産出されるウイルス粒子の濃度に相当するHCV RNAの定量結果を示す。
【図４】図４は、実施例３において培養上清に産出されたウイルスを蔗糖密度勾配遠心により分離したフラクションのHCV RNA濃度（ウイルス粒子の濃度）の測定結果を示す。
【図５】図５は、実施例３により産出されたウイルスを、ヒト肝細胞を移植した免疫不全マウスに静脈注射で投与後２週間のマウス血液中のC型肝炎ウイルス濃度の測定結果を示す。
【図６】図６は、実施例２において作製したHCV RNAを、ヒト肝細胞を移植した免疫不全マウスの肝臓内に直接注入し、その後２週間のマウスの血液中ウイルス濃度の測定結果を示す。
【図７】図７は、実施例６によりウイルス量が増加したマウス血清を次のマウスに投与し（パッセージ実験）、その投与されたマウスの血中ウイルス粒子濃度の測定結果を示す。
【図８】図８は、実施例６や７により、ウイルスが血中に増加したマウスに対するインターフェロンの効果を示す。
【図９】図９は、実施例６や７により、ゲノムタイプ１ｂのウイルスが血中に増加したマウスとゲノタイプ2aのウイルスが感染したマウスに対するインターフェロンの効果の比較を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１は、ＨＣＶ-ＫＴ９クローンのＣ型肝炎ウイルスの核酸配列である。
【図２】
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【図６】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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