(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを含む薬剤組成物であって、該組成物が少なくとも９８％の純度を有する１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン及び薬剤学的に受容されるキャリヤーで製剤化されている、上記薬剤組成物。
【請求項２】
前記少なくとも９８％純度の１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが、２％未満の１０−デアザアミノプテリンを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｉ）ホモテレフタル酸ジメチルエステルを臭化プロパルギルと反応させて、α−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステルを生成させ、
ｉｉ）検出可能な量のホモテレフタル酸ジメチルエステルが存在しないα−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステルを用いて１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステルを生成し；
ｉｉｉ)１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステルを加水分解して、１０−プロパルギル−１０−カルボキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を生成し；
ｉｖ）１０−プロパルギル−１０−カルボキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を脱炭酸して、１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を生成し、
ｖ）１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸とＬ−グルタミン酸ジメチルとをカップリングさせて１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステルを生成し、
ｖｉ）及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステルを加水分解して、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを生成させるステップを含む方法により得られる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ｉ）ホモテレフタル酸ジメチルエステルを臭化プロパルギルと反応させて、α−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステルを生成させ、
ｉｉ）検出可能な量のホモテレフタル酸ジメチルエステルが存在しないα−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステルを用いて１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステルを生成し；
ｉｉｉ)１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステルを加水分解して、１０−プロパルギル−１０−カルボキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を生成し；
ｉｖ）１０−プロパルギル−１０−カルボキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を脱炭酸して、１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸を生成し、
ｖ）１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸とＬ−グルタミン酸ジメチルとをカップリングさせて１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステルを生成し、
ｖｉ）及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステルを加水分解して、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを生成させるステップを含む、請求項１又は２に記載の組成物の調製方法。
【請求項５】
少なくとも１種類の付加的な細胞傷害性又は抗腫瘍性化合物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種類の付加的な細胞傷害性又は抗腫瘍性化合物がビンカアルカロイド、５−フルオロウラシル、アルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、ロイコボリン、タキソール及び抗生物質から選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
腫瘍の治療用薬剤を製造するための請求項１〜３及び５〜６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンが、４０〜１２０ｍｇ／ｍ２体表面積／日の量での投与用に製剤化されている、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が少なくとも１種類の付加的な細胞傷害性又は抗腫瘍性化合物を含む、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記少なくとも１種類の付加的な細胞傷害性又は抗腫瘍性化合物がビンカアルカロイド、５−フルオロウラシル、アルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、ロイコボリン、タキソール及び抗生物質から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が乳房腫瘍又は肺腫瘍である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は化合物１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの精製組成物と、この化合物を腫瘍の治療に用いる方法に関する。
【０００２】
１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン（“１０−プロパルギル−１０−ｄＡＭの合成と抗腫瘍活性”）は、今までに試験されて、幾つかの場合に腫瘍の治療に有用であると発見された大きな化合物クラスのメンバーである。図１に示した構造を有する、この化合物はＤｅＧｒａｗ等，“１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの合成および抗腫瘍活性”，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．３６：２２２８〜２２３１（１９９３）によって開示され、ネズミＬ１２１０細胞系統における成長阻害剤として、より軽度には、酵素デヒドロホレート還元酵素（“ＤＨＦＲ”）の阻害剤として作用することが判明している。さらに、Ｅ０７７１ネズミ乳房腫瘍モデルを用いた、この化合物の抗腫瘍性に関する幾つかの結果が提示されている。このデータは、試験に用いられたマウスが少数であること（投与量あたり３匹）と、データの信頼性を量化する標準偏差情報が無いことと、最高使用量が実際にはマウスに有害であったという事実とのために、あいまいである。それにも拘わらず、このデータがヒトの腫瘍の治療における薬物の効力を幾らか予言する価値を有するとしても、このデータはメトトレキセートに比べて、同等なレベルの耐性において、匹敵しうる又はやや良好な性質を有する薬物をせいぜい予言するに過ぎない。
【０００３】
発明の概要
しかし、意外にも、より高度に精製された１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ組成物は、ヒト腫瘍に対するそれらの効力に関して異種移植片モデルで試験したときに、メトトレキセート（“ＭＴＸ”）よりもはるかに優れており、さらに、より最近の臨床的候補であるエダトレキセテート（“ＥＴＸ”）よりも優れていることが今回判明した。さらに、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭは、治療の中断後の数週間、腫瘍増殖の徴候が無いように、腫瘍を治療する驚くべき能力を示した。したがって、本発明の第１態様は１０−プロパルギル−１０ｄＡＭを含有する、高度に精製された組成物である。この組成物は本発明によって腫瘍の治療に、特にヒト乳房腫瘍及びヒト肺癌の治療に用いることができる。
【０００４】
発明の詳細な説明
本出願は“高度に精製された”１０−プロパルギル−１０ｄＡＭに関する。本明細書と本明細書の請求の範囲とに用いるかぎり、“高度に精製された”組成物は、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの抗腫瘍活性を妨害する可能性のある、他の葉酸誘導体、特に１０−デアザアミノプテリンを実質的に含まない１０−プロパルギル−１０ｄＡＭを含有する。本発明の範囲内の組成物は、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭを治療用の適当な投与単位形に製剤化するために、キャリヤー又は賦形剤を包含することができる。
【０００５】
１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはＤｅＧｒａｗの論文（上記文献）又は米国特許第５，３５４，７５１号（これは本明細書に援用される）の実施例７に開示された方法を用いて合成することができる。この方法によって製造された生成物のＨＰＬＣ評価は、実質的な量（〜４．６％）の不純物Ａの存在を示し（図２）、この不純物は１０−デアザアミノプテリンと一致した保持時間を有する。したがって、この合成アプローチを用いるならば、ＤｅＧｒａｗ等の論文に開示された精製を越えるさらなる精製が必要である。このような精製は、存在する可能性がある、１０−デアザアミノプテリンと他の葉酸誘導体とを除去するために付加的なＨＰＬＣ又は結晶化によって行うことができる。
【０００６】
図３は、本質的に、実施例１に述べた方法を用いて製造された本発明による１０−プロパルギル−１０ｄＡＭから成る、高度に精製された製剤のＨＰＬＣを示す。この場合に、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの量（ＨＰＬＣピーク面積によって測定される）は９８％に近く、１０−デアザアミノプテリンに対応するピークはプロセシング・ソフトウェア（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって検出されないが、この面積には小さい基線の波（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｒｉｐｐｌｅ）が存在する。
【０００７】
本発明による高度に精製された１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ製剤を、ヒト腫瘍細胞系統に対する細胞傷害性と抗腫瘍性とに関して、実施例２に述べるヌードマウスにおけるヒト腫瘍系統の異種移植片を用いて試験した。これらの試験の結果は表１と２に要約する。表に示すように、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはＭＴＸ（退化を生じなかった）又はＥＤＸのいずれよりもはるかに大きい程度にヒトＭＸ−１乳癌の完全な退化をもたらし、実際に、試験した２０匹のマウスのうちの９匹に治癒を生じることができた。１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはヒトＬＸ−１肺癌の異種移植片に対してＭＴＸ又はＥＤＸよりもはるかに有効であり、試験した１０匹のマウスのうちの４匹に治癒をもたらした。同様な結果がヒトＡ５４９肺癌細胞に関して観察された。この効力レベルはＤｅＧｒａｗ等の論文に記載されたＥ０７７１データに基づいて予測されることができた効力レベルをはるかに凌駕する。実際には、この研究では、低い非毒性用量レベル（２４ｍｇ／ｋｇ）の１０−プロパルギル−１０ｄＡＭによって治療されたマウスは腫瘍の完全な退化を示さず、この化合物の平均的効果はＭＴＸと同等程度にすぎなかった（ｎｏ  ｂｅｔｔｅｒ  ｔｈａｎ  ＭＴＸ）。これらの１０−Ｐ−ｄＡＭ治療マウスは３週間の終了時に腫瘍サイズの増加を示し、このことは治癒が達成されなかったことを示した。それ故、高度に精製された化合物が非常に低い用量レベル（３ｍｇ／ｋｇ）でヒト腫瘍に対して用いられることができ、非常に高いレベルの効力と多くの明白な治癒とを達成することができることは非常に意外である。
【０００８】
この活性増強に関して特定の機構に縛られることを意図する訳ではないが、ＤｅＧｒａｗ等の論文における製造されたサンプル中に観察される、例えば４．６％の１０−デアザアミノプテリンのような、他の葉酸誘導体の比較的少量の存在さえもが１０−プロパルギル−１０ｄＡＭに競合して、その活性を事実上阻害しうることが考えられる。このことはヒト腫瘍細胞中のホリルポリグルタメート・シンテターゼによって１０−プロパルギル−１０ｄＡＭのポリグルタミル化レベルにおいて起こりうる。この細胞傷害性決定因子の基質としての１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの利点は、この酵素とより効果的に相互作用するが、不充分に代謝されるので、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭと該酵素との相互作用を競合的に阻害する１０−ｄＡＭの存在によって危くされる可能性がある。しかし、この機構にも拘わらず、本発明の高度に精製された組成物は、ヒト癌細胞に対して、ＤｅＧｒａｗの論文に提示されたデータに基づいて予測されるよりも明らかに活性である。このことは、一貫して発見された、ヒト腫瘍細胞に対するＥＤＸに比べて１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの細胞傷害性の増強によっても示され、この細胞傷害性の増強はＤｅＧｒａｗ等によって報告されたような、ネズミ腫瘍細胞系統に対するこれらの２化合物の相対的同等性（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）と対照的である。ヒト腫瘍細胞に対するこの強化された活性を用いて、癌に罹患した、特に胸部癌又は肺癌に罹患したヒト患者に治療的利益を与えることができる。
【０００９】
このために、この高度に精製された１０−プロパルギル−１０ｄＡＭは薬剤製剤の一部として有利に製剤化される。特定の投与形は投与方法に依存するが、錠剤、カプセル、経口液体、及び静脈内、筋肉内又は腹腔内投与のための注射可能な溶液を包含しうる。ヒト異種移植片腫瘍に対して１０−デアザアミノプテリンを実質的に含まない、ＭＴＸ、ＥＤＸ及び１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの相対的効果と、ヒト臨床試験において適当であると判明したＭＴＸとＥＤＸの投与量とに基づくと、４０〜１２０ｍｇ／ｍ２体表面積／日の範囲内の、１０−デアザアミノプテリンを実質的に含まない１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの投与量が、治療スケジュールに依存して、有効である筈である。これより高い投与量は、以下に報告する動物試験においてこのようなレベルで観察される毒性のために、禁忌であるように思われる。
【００１０】
本発明による１０−プロパルギル−１０ｄＡＭは種々な他の細胞傷害性かつ抗腫瘍性化合物と組合せて製剤化することもでき、このような化合物は例えばビンブラスチン、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）及びビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）のようなビンカアルカロイド；５−フルオロウラシル；例えばシクロホスファミド又はイフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）のようなアルキル化剤；シスプラチン又はカルボプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）；例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）のようなタキソール（ｔａｘｏｌ）；及び例えばドキソルビシン及びマイトマイシンのような抗生物質を包含する。１０−プロパルギル−１０ｄＡＭとこれらの他の抗腫瘍剤の幾つかとの組合せも用いることができる。
【実施例１】
【００１１】
図４は本発明による１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの製造に有用な合成スキームを示す。１８ｍｌのシーブ乾燥（ｓｉｅｖｅ−ｄｒｉｅｄ）ＴＨＦ中の油分散液としての６０％ＮａＨ（１．０６ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の混合物を０℃に冷却した。この低温混合物を乾燥ＴＨＦ（７ｍｌ）中のホモテレフタル酸ジメチルエステル（５．０ｇ、２４ｍｍｏｌ、図４中の化合物１）の溶液によって処理し、この混合物を０℃において１時間撹拌した。臭化プロパルギル（２６．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃においてさらに１時間、室温において１６時間撹拌した。結果として生じた混合物を２．４ｍｌの５０％酢酸によって処理し、次に２４０ｍｌの水中に注入した。混合物をエーテル（２Ｘ１５０ｍｌ）によって抽出した。エーテル抽出物を一緒にして、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、橙黄色油状物になるまで濃縮した。シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８：１）によって溶離させるシリカゲル（６００ｍｌの２３０〜４００メッシュ）上でのクロマトグラフィーは生成物のα−プロパルギルホモテレフタル酸ジメチルエステル（化合物２）を白色固体（４．６６）として生成し、これはＴＬＣ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ、３：１）によって均質であると思われた。しかし、この生成物に関する質量スペクトルデータは、これが目的生成物２と、ジプロパルギル化化合物との混合物であることを示した。出発物質１は検出されなかった。ＨＰＬＣはモノプロパルギル化生成物のジプロパルギル化生成物に対する比率が約３：１であることを示す。ジプロパルギル化生成物は、化合物１とは異なり、次の工程の反応において好ましくない同時生成物（ｃｏｐｒｏｄｕｃｔ）を形成することがありえないので、この物質は化合物３への転化のために適切であった。合成において進行するために用いられる生成物中に出発化合物１が存在しないことが、最終生成物を生じるトランスフォーメーション中の１０−ｄＡＭの順次形成を避けるために非常に重要である、この理由は１０−プロパルギル−１−ｄＡＭから１０−ｄＡＭを完全に除去することが非常に困難であるからである。
【００１２】
油分散液としての０．３６ｇの６０％ＮａＨ（９ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＤＭＦと一緒にすることによって混合物を形成し、０〜５℃に冷却した。この低温混合物を１０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の第１反応の生成物（化合物２）（２．９４ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を滴加して処理し、次に０℃において３０分間撹拌した。−２５℃に冷却した後に、温度を−２５℃近くに維持しながら、１０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の２，４−ジアミノ−６−（ブロモメチル）プテリジン・ヒドロブロミド・０．２  ２−プロパノール（１．００ｇ，２．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。撹拌混合物の温度を−１０℃に２時間の期間にわたって上昇させた。−１０℃にさらに２時間維持した後に、温度を２０℃に上昇させ、室温における撹拌を２時間以上（２  ｈｏｕｒｓ  ｌｏｎｇｅｒ）続けた。次に、固体ＣＯ２の添加によって、反応をｐＨ７に調節した。真空下で濃縮して溶媒を除去した後に、残渣にジエチルエーテルを加えて撹拌して、エーテル不溶物を回収して、水によって洗浄して、真空下で乾燥させて１．４９ｇの粗生成物を得た。この粗生成物を、シリカゲルカラムに供給するために、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１０：１）中に溶解した。同溶媒系による溶離は１０−プロパルギル−１０−カルボメトキシ−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸メチルエステル（化合物３）を与え、これは４０％収率（４８５ｍｇ）でＴＬＣに関して均質であった。
【００１３】
２−メトキシエタノール（５ｍｌ）中の化合物３（４００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液を水（５ｍｌ）によって処理し、次に１０％水酸化ナトリウム溶液（３．９ｍｌ）によって処理した。混合物を室温において４時間撹拌し、この間に溶液が生じた。この溶液を酢酸によってｐＨ８に調節し、高真空下で濃縮した。結果として生じた残渣を１５ｍｌの水に溶解して、ｐＨ５．５〜５．８に酸性化して、沈殿を形成させた。沈殿を回収して、水によって洗浄し、真空下で乾燥させて、３４０ｍｇの化合物４（９１％収率）を回収した。ＨＰＬＣ分析は９０％の生成物純度を示した。
【００１４】
化合物４（３３０ｍｇ）を１５ｍｌのＤＭＳＯ中で１１５〜１２０℃において１０分間加熱することによって脱炭酸した。１０分間後のＨＰＬＣによる試験は、転化が本質的に完了したことを確証した。真空下で蒸留する（４０℃における浴）ことによって、ＤＭＳＯを除去した。残渣を０．５Ｎ  ＮａＯＨと共に撹拌して、透明な溶液を得た。１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨ５．０に酸性化すると、１０−プロパルギル−４−デオキシ−４−アミノ−１０−デアザプテロイン酸（化合物５）が黄色固体として７０％収率で得られた。ＨＰＬＣはこの段階における生成物純度を９０％として示した。
【００１５】
化合物５（２２５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）は、トリエチルアミン（１４８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２８７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、ジメチル  Ｌ−グルタメート・ヒドロクロリド（１３７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。この混合物を２０〜２５℃において３時間撹拌して、次に蒸発乾固させた。残渣に水を加えて撹拌して、水に不溶な粗生成物を回収して、真空下で乾燥させた。この粗生成物（３５０ｍｇ）を、トリエチルアミン（０．２５容量％）を含有するＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１０：１）によって溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、１６５ｍｇの１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンジメチルエステル（化合物６、５０％収率）を回収した、これはＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ５：１）に関して均質であった。
【００１６】
化合物６（１６５ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの撹拌ＭｅＯＨ中に懸濁させて、これに０．７２ｍｌ（０．７２ｍｅｑ）の１Ｎ  ＮａＯＨを加えた。室温における撹拌を、数時間後に溶液が生じるまで、続けた。この溶液を２０〜２５℃に８時間維持し、次に１０ｍｌの水で希釈した。減圧下での蒸発によってメタノールを除去し、濃縮した水溶液を２０〜２５℃にさらに２４時間放置した。次に、ＨＰＬＣはエステル加水分解が完成したことを示した。透明な水溶液を酢酸によってｐＨ４．０に酸性化して、１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンを淡黄色固体として沈殿させた。回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた生成物は１２２ｍｇ（７９％収率）の重量であった。元素分析と、プロトンＮＭＲと、質量分光測定とによるアッセイは、割り当てられた構造（ａｓｓｉｇｎｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に完全に一致した。ＨＰＬＣ分析は９８％の純度を示し、生成物が１０−デアザアミノプテリンを含まないことを立証した。
【実施例２】
【００１７】
実施例１によって製造された、高度に精製された１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ製剤をヌードマウスにおけるヒト腫瘍系統の異種移植片を用いて抗腫瘍性に関して試験した。ヒトＭＸ−１乳癌の異種移植片を標準方法によってヌードマウスに移植した。
【００１８】
これらの腫瘍細胞に対する１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの抗腫瘍性を試験するために、３ｍｇ／ｋｇの化合物を、腫瘍移植後３日目から始めて全体で５日間にわたって、２０匹のマウスの各々に１日１回投与した。比較のために、非処置対照（２０匹マウス）、メトトレキセート処置マウス（１０匹マウス；同じ処置スケジュールで投与量２ｍｇ／ｋｇ）及びエダトレキセート処置マウス（２０匹マウス；同じ処置スケジュールで投与量１．５ｍｇ／ｋｇ）をも評価した。これらの投与量は全て“最大耐量”であるので、等毒性（ｅｑｕｉｔｏｘｉｃｉｔｙ）に基づく比較のために適当な根拠である。平均腫瘍直径を処置の開始後１４日目、即ち、処置の停止後の７日目に測定した。この時点において測定可能な腫瘍を有さないマウスは完全な退化を生じたと考えられた。さらに、１４日目に腫瘍を有さなかったマウスを治療停止後３週間目に腫瘍の再現に関して検査した。治療後３週間の終了時に腫瘍を有さないマウスは治癒したと見なされた。結果は表１に要約する。
【表１】
0005271677.tif 000002
表から知ることができるように、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはＭＴＸ又はＥＤＸのいずれよりも実質的に大きく有効であり、実質的な治癒数をもたらした。
【実施例３】
【００１９】
ヌードマウスにヒトＬＸ−１肺癌の異種移植片を用いて、実施例２を繰り返した。結果は表２に要約する。
【表２】
0005271677.tif 000003
この場合にも、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはＭＴＸ又はＥＤＸよりも実質的に大きく有効であることが判明し、実質的な治癒数をもたらした。
【実施例４】
【００２０】
ヌードマウスにヒトＡ−５４９肺癌の異種移植片を用いて、実施例２を繰り返した。結果は表３に要約する。
【表３】
0005271677.tif 000004
この場合にも、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはＭＴＸ又はＥＤＸよりも実質的に大きく有効であることが判明し、実質的な治癒数をもたらした。
【実施例５】
【００２１】
４種類のヒト腫瘍細胞系統に対して細胞傷害性研究を行って、各化合物への３時間パルス暴露を用いて、ＥＤＸの細胞傷害性を１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの細胞傷害性と比較した。各化合物に関して各細胞系統の３回反復実験を検査した。結果は表４に要約する。
【表４】
0005271677.tif 000005
各場合に、１０−プロパルギル−１０ｄＡＭはヒト腫瘍細胞系統に対してＥＤＸよりも実質的に大きく細胞傷害性であった。
【実施例６】
【００２２】
１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの毒性をラット、マウス及びイヌにおいて評価した。雄ＣＤラットと雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）と、ヤングアダルト雄ビーグルイヌ（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｆｒａｍｓ  ＵＳＡ社、Ｎｏｒｔｈｒｏｓｅ、ＮＹ）とを試験に用いた。全ての動物を１２時間明／１２時間暗の照明サイクルを備えた環境調節室（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｏｏｍ）に維持した。マウスとラットは生後５週間であるときに入手し、試験前の１〜２週間観察して、予備観察中のそれらの成長が体重増加に関する実験室基準に適合した場合にのみ用いた。イヌは使用前に少なくとも２〜３週間観察して、この期間中に良好な健康を保証するために規則的な間隔をおいて計量して、検査した。試験期間中に全ての動物を毎日計量して、食欲、糞便状態、全身外観及び毒性の徴候に関して観察した。イヌも毎日検査して、体温、心拍数及び呼吸数をモニターした。
【００２３】
全ての処置のために、薬物投与量を計量し、等張性の静菌性生理食塩水中に約２モル当量の１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって溶解した。この溶液のｐＨを、ｐＨ計を用いて測定しながら、ＮａＯＨ溶液の添加によって７〜７．２に調節した。溶液は直ちに用いたか又は、−２０℃において貯蔵されていた調合物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を解凍した後に用いた。マウス及びラットへの注入は０．０１ｍｌ／ｇ体重の一定量で行った。
【００２４】
マウスにおける毒性
Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（５匹／群）に１０−プロパルギル−１０ｄＡＭを週１回、３週間にわたって（１日目、８日目及び１５日目）表５に要約するような種々な濃度でｉ．ｐ．投与した。
【表５】
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体重変化と致死率との結果を図５に要約する。１００、２００及び３００ｍｇ／ｋｇに示されるように、体重は初期に僅かに低下した（２ｇまで）が、その後の投与量ではもはや低下は生じなかった。これらの３つの投与量群における全てのマウスは３週間又は４週間中に体重を回復させ、生残した。４００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．ＱＷＸ３の投与量では、５匹のマウスのうちの４匹が１９、２０、２３及び２４日目に死亡し、６００ｍｇ／ｋｇでは、５匹のマウスのうちの４匹が９、１８、１９及び２１日目に死亡した。高い２種類の投与量で治療された動物は２０％より大きい体重低下、くしゃくしゃに乱れた毛皮及び下痢を有した。しかし、生存マウスは体重を増加させ、最後の処置後の２週間目に対照群に追いついた。大体のＬＤ５０は、用量効果関係とメジアン−効果プロット（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ  ｐｌｏｔ）とによって推定したときに、約３７０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．ＱＷＸ３であった（Ｃｈｏｕ等、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｄａｌｂｅｃｃｏ編集、２巻、２７１〜２７９頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）。
【００２５】
ラットにおける毒性
ＣＤラット（５匹／群）に１０−プロパルギル−１０ｄＡＭを週１回、３週間にわたって（１日目、８日目及び１５日目）表６に要約するような種々な濃度でｉ．ｖ．投与した。
【表６】
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体重変化と致死率との結果を図６に要約する。５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３において、体重の明白な変化は観察されなかった；１００ｍｇ／ｋｇでは、第３回投与量において体重の約１０ｇの低下が生じて、５匹の動物のうちの１匹は２３日までに死亡した。残りの動物は体重を増加させたが、対照動物よりも低い速度においてであった。
【００２６】
１５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３においては、５匹のラットのうちの３匹が１８、２０及び２３日目に死亡した。２００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３では、５匹のラットの全てが１２、１４、１５、２０及び２０日目にそれぞれ死亡した。３００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３においても、５匹のラットの全てが、２００ｍｇ／ｋｇ投与量におけるよりも多少迅速に、１１、１１、１２、１２及び１４日目にそれぞれ死亡した。１５０〜３００ｍｇ／ｋｇの投与量では注入の直後のラットのいずれにおいても即時の毒性は観察されなかった。これらのラットは翌日から体重を失い始め、死亡前の１〜３日間に最高に達した下痢と脱水の徴候と共に、くしゃくしゃに乱れた毛皮を有した。これらの徴候は実験の過程を通して持続され、第２回及び第３回の注入によって悪化した。
【００２７】
これらの実験からのデータはＬＤ１０又はＬＤ５０の正確な算出を可能にしなかった。用量効果関係とメジアン−効果プロットとによる、ラットにおけるＬＤ１０控えめの推定値（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）は約７５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３であり、ＬＤ５０は約１１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３である。
【００２８】
イヌにおける毒性
８匹の雄ビーグルイヌ（体重９．４〜１０．６ポンド）を４対に分けた。これらの対を１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの静脈内注入によって週１回、３週間にわたって（１、８及び１５日目）、０ｍｇ／ｋｇ（イヌＡとＢ）；３ｍｇ／ｋｇ（イヌＣとＤ）；８ｍｇ／ｋｇ（イヌＥとＦ）及び１２ｍｇ／ｋｇ（イヌＧとＨ）において処置した。３ｍｇ／ｋｇと８ｍｇ／ｋｇでは、２〜３ｋｇの最大体重低下が２０日目に生じたが、その後、３５日間の観察期間の終了時までに体重回復が生じた。１２ｍｇ／ｋｇでは、体重が着実に減少し、この減少は全体で３ｋｇまで（又は２０％より大きい減少）になり、動物は第３回投与量の前に１２日と１４日目に瀕死の状態になった。
【００２９】
８ｍｇ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇで処置されたイヌに関して嘔吐、下痢、水っぽい又は血の混じった糞便、嗜眠、食欲不振（ａｎｏｒｅｐｔｉｃ）及び全身衰弱を包含する、毒性の主要な徴候が観察された。３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３では、症状が明らかではなかった。推定ＬＤ５０は約８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３であった。
【００３０】
試験中に各イヌから血液サンプルを採取した。血液化学又は血液細胞数（ｂｌｏｏｄｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）の明白な又は持続的な変化は、毒性の末期を除いて、観察されなかった。白血球数、リンパ球数及び好中球数の幾らかの低下と、ヘモグロビン、総タンパク質及びアルブミンの減少と、アミラーゼ及び単球の増加とが、特に高い２投与量において観察された。
【００３１】
イヌＧとＨをそれぞれ１２日目と１４日目に安楽死させ、完全な剖検を行った。他の対の各々からの１匹の動物を実験の３３日目（イヌＥ）又は３４日目（イヌＢとＣ）に組織病理学的検査のために安楽死させた。
【００３２】
イヌＧでは、器官の大部分は正常に見えた。小腸と大腸との粘膜は浮腫と出血とを示した。胃と大腸及び小腸とは空であった。イヌＨは１４日目には安楽死前に重度に抑うつ状態であり、表在呼吸と心拍数低下とを示した。安楽死させたときに、胃が胆汁の色を帯びた粘液で満たされていることが発見され、腸は水っぽい糞便で満たされていたが、血液の痕跡はなかった。胃、腸又は食道に潰瘍は観察されなかった。肝臓は青白く、斑点があった。脾臓は暗紫色であり、表面がざらざらしていた。
【００３３】
８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３を投与されたイヌＥでは、大抵の器官が正常に見えたが、肺の両面は若干の血液スポットを含むピンク色であった。大腸及び小腸と肝臓とはラベンダー色を示し、腎臓は浮腫と紫色とを示した。胃と腸は食物で充満され、膀胱は尿で充満されていた。
【００３４】
３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３を投与されたイヌＣは３４日目に安楽死の前に正常に見えた。大抵の器官が正常に見えた。右肺はピンク色で、大きく、小腸は紫色であった。肝臓は暗紫色を示した。胃と腸は食物で充満され、膀胱は尿で充満されていた。
【００３５】
０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３で処置されたイヌの組織の組織病理学的検査は、回収された器官標本における重大な病変を示さなかった。８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３では、大腸はマルチコカルな（ｍｕｌｔｉｃｏｃａｌ）軽度な結腸炎を示した。１２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ＱＷＸ３では、亜急性〜慢性潰瘍性食道炎と重度な壊死性小腸結腸炎が観察された。例えば脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、唾液腺、睾丸及び脾臓のような、他の器官は重大な病変を示さなかった。
【実施例７】
【００３６】
１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの薬物動態をモニターするために、３ｍｇ／ｋｇの単回量を２匹のイヌＩとＪの各々に静脈内投与した。血液サンプルを−５分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、３時間、４時間、６時間、２４時間、３０時間及び４８時間目に回収した。血漿中の１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ濃度を蛍光測定による（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法によって、Ｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８カラム、１５％アセトニトリル／ＫＨ２ＰＯ４５０ｍｍ移動相、ｐＨ７．０を室温において１ｍｌ／分の流速度によって用いて、測定した。注入量は１μｌであった。１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの保持時間は１８．５分間であった。
【００３７】
イヌＩの血漿半減期（ｔ１／２）は動力学のα相、β相及びγ相に対して２６．７分間、０．４９時間及び３７．４時間であった。イヌＪでは、観察されたｔ１／２値は２１．２分間、１．２６時間及び１６．３時間であった。種々な時点における平均血漿濃度を図７に示す。
【００３８】
１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの投与後３０分間、１時間、２時間及び４時間目に各イヌから尿標本を回収して、ＨＰＬＣによって分析した。１０−プロパルギル−１０ｄＡＭは主として無変化で排出された（保持時間１８．５分間）。１時間目と４時間目に、それぞれ、総尿中１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの＜０．３１％及び＜３．５％を占める、６．３分間の保持時間を有する少量の代謝産物が存在した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの構造を示す；
【図２】先行技術によって製造された不純な１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ製剤のＨＰＬＣを示す；
【図３】本発明による、高度に精製された１０−プロパルギル−１０ｄＡＭ製剤のＨＰＬＣを示す；
【図４】本発明による化合物の製造に有用な合成スキームを示す；
【図５】マウスにおける毒性試験の結果を要約する；
【図６】ラットにおける毒性試験の結果を要約する；
【図７】イヌにおける１０−プロパルギル−１０ｄＡＭの投与後の平均血漿濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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