(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）にて示されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
0005344274.tif 000010
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに、少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は、水素またはアセチル基である）
【請求項２】
下記の一般式（１）にて示されるマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法であって、
マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸または植物油を含む培地にて培養することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【化２】
0005344274.tif 000011
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに、少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は水素またはアセチル基である）
【請求項３】
前記脂肪酸が、リシノール酸であることを特徴とする請求項２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項４】
前記植物油が、ヒマシ油であることを特徴とする請求項２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項５】
前記微生物は、シュードザイマ属に属する微生物であることを特徴とする請求項２〜４の何れか１項に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項６】
前記シュードザイマ属に属する微生物は、Pseudozyma tsukubaensis、Pseudozyma antarctica、Pseudozyma aphidis、Candida sp. SY16、Pseudozyma parantarctica、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma fusiformata、Pseudozyma hubeiensis、Pseudozyma shanxiensis、Pseudozyma graminicola、またはPseudozyma crassaであることを特徴とする請求項５に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子構造中の側鎖脂肪酸に少なくとも１つの水酸基を含む新規マンノシルエリスリトールリピッド、および当該マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与するとともに、神経系または免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。
【０００３】
糖脂質は、糖に由来する性質である親水性と、脂質に由来する性質である親油性との二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であって、このような両親媒性物質は、界面活性物質と呼ばれている。例えば、当該界面活性物質の例としては、生体成分由来であるレシチンおよびサポニン等が知られている。そして、レシチンおよびサポニン等は、石油化学工業が隆盛となるまでは、生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）として広く利用されていた。
【０００４】
近年、石油化学工業の発展に伴って様々な合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加するとともに、日常生活には無くてはならない物質となっている。そして、これら合成界面活性剤が、従来から用いられていたバイオサーファクタントに代わって、広く用いられるようになっている。
【０００５】
現在、一般に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで考慮すれば、数千種類にものぼる。親水性基および／または疎水性基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じであっても分子量または立体構造の違いによって親水性疎水性バランス（ＨＬＢ）の異なる同族体など、様々な合成界面活性剤が開発されている。また、合成界面活性剤は、単一種類のみで用いられるだけでなく、混合されて用いられることにより、様々な産業分野において要求される幅広い性能に対応している。
【０００６】
しかしながら、このような合成界面活性剤の使用量が増加するにしたがって環境汚染が広がり、これによって様々な社会問題が生じている。従って、安全性が高いとともに、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性剤の開発が望まれている。
【０００７】
微生物などが生産する界面活性物質であるバイオサーファクントは、生分解性が高いとともに、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品、化粧品、医薬品、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く応用すれば、環境調和型の社会を実現できるとともに、高機能な製品を提供する上で極めて有意義である。したがって、近年、バイオサーファクタントを見直す動きが広がりつつある。
【０００８】
微生物が生産する界面活性物質は、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系および高分子系の界面活性物質の、５種類に分類することができる。なかでも、糖脂質系の界面活性物質については最もよく研究されている。
【０００９】
上記糖脂質系の界面活性物質としては、例えば、酵母（例えば、カンジダ属酵母）が生産するソホロースリピッド（例えば、特許文献１参照）およびマンノシルエリスリトールリピッド（例えば、非特許文献１〜６参照）などが知られている。
【００１０】
マンノシルエリスリトールリピッド（mannosyl erythritol lipid：ＭＥＬ）は、界面活性物質としての機能を有する以外に、抗微生物活性、白血病細胞および神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症および抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、および癌細胞増殖抑制活性などを有するが故に、多様な機能を有することが知られている。
【００１１】
ＭＥＬの製造方法に関しては、これまで酵母を用いた方法を中心に多くの報告があり、生産量の向上を目的として、菌株の種類、培養条件、または培地組成に関して検討されている。
【００１２】
酵母を用いてＭＥＬを製造する方法としては、例えば、Candida sp. B-7株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬを生産する方法（例えば、非特許文献１および２参照）、Candia antarctica T-34株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬを生産する方法（例えば、非特許文献３および４参照）、Candia antarctica T-34株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬを生産する方法（例えば、非特許文献５参照）、Candida sp. SY-16株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬを生産し、また、２０質量％の植物油から流加培養法により２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬを生産する方法（例えば、非特許文献６参照）、Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬを生産する方法（例えば、非特許文献７参照）などを挙げることができる。
【００１３】
また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油を原料としてCandia antarctica T-34株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７g／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬを生産する方法も報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００２−４５１９５号公報（平成１４年２月１２日公開）
【特許文献２】特開２００２−１０１８４７号公報（平成１４年４月９日公開）
【非特許文献１】T. Nakahara, H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 19（1983）
【非特許文献２】H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 143（1983）
【非特許文献３】D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 31（1990）
【非特許文献４】D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 37（1990）
【非特許文献５】D. Kitamoto, K. Fujishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T.Nakahara：Biotechnol. Lett., 14, 305（1992）
【非特許文献６】金、伊炳大、桂樹徹、谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨、p.195
【非特許文献７】Rau U, Nguyen LA, Schulz S, Wray V, Nimtz M, Roeper H, Koch H, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 66（5）,551-9（2005）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、上記従来から用いられてきたマンノシルエリスリトールリピッドは、水溶性が低いので、水溶性を必要とする用途には使用し難いという問題点を有している。
【００１５】
ＭＥＬは、エリスリトール、２個の脂肪酸、および２個のアセチル基がマンノースに結合した糖脂質であり、アセチル基の結合位置と数とによって、４種類のＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄ）が存在することが知られている。その中で、ＭＥＬ−Ａは水溶性が低いため、水溶性を必要とする用途では使用し難いという問題点を有している。また、マンノースの４位に１個の水酸基を有するＭＥＬ−Ｂ、マンノースの６位に１個の水酸基を有するＭＥＬ−Ｃ、マンノースの４位および６位いずれにも水酸基を有するＭＥＬ−Ｄは、ＭＥＬ−Ａと比較して親水性が向上しているものの、水溶性を必要とする用途では、やはりＭＥＬ−Ａ同様に使用し難いという問題点を有している。なお、従来型のＭＥＬ中で、側鎖脂肪酸残基に水酸基が導入されたものは、まだ知られていない。
【００１６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、高い分解性を備えるとともに毒性が低く、かつ水溶性が向上したマンノシルエリスリトールリピッド、および当該マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは鋭意検討した結果、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する微生物の培養液中に少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸を添加することによって、従来のマンノシルエリスリトールリピッドよりも水溶性の高い新規マンノシルエリスリトールリピッドを生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドは、上記課題を解決するために、下記の一般式（１）、つまり、
【００１９】
【化３】
0005344274.tif 000002
【００２０】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに、少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は、水素またはアセチル基である）
にて示されるマンノシルエリスリトールリピッドであることを特徴としている。
【００２１】
また、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、上記課題を解決するために、
下記の一般式（１）にて示されるマンノシルエリスリトールリピッド、つまり、
【００２２】
【化４】
0005344274.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに、少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は水素またはアセチル基である）
にて示されるマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法であって、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油を含む培地にて培養することを特徴としている。
【００２４】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、前記脂肪酸は、リシノール酸であることが好ましい。
【００２５】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、前記植物油は、ヒマシ油であることが好ましい。
【００２６】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、前記微生物は、シュードザイマ属に属する微生物であることが好ましい。
【００２７】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、前記シュードザイマ属に属する微生物は、Pseudozyma tsukubaensis、Pseudozyma antarctica、Pseudozyma aphidis、Candida sp. SY16、Pseudozyma parantarctica、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma fusiformata、Pseudozyma hubeiensis、Pseudozyma shanxiensis、Pseudozyma graminicola、またはPseudozyma crassaであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドは、分子構造中の側鎖脂肪酸に少なくとも１つの水酸基を有する新規マンノシルエリスリトールリピッドである。
【００２９】
それゆえ、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドは、従来のマンノシルエリスリトールリピッドと比較して水溶性が高いので、水溶性を必要とする用途に用いることができるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油を含む培地にて培養する方法である。
【００３１】
それゆえ、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、簡便な方法にて本発明のマンノシルエリスリトールリピッドを製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
〔１．マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）〕
従来型のＭＥＬは、ＭＥＬ生産菌の培養によって得られ、下記の一般式(２)に示すように、その化学構造は、４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールまたは１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールをその基本構造とするものである。
【００３３】
【化５】
0005344274.tif 000004
【００３４】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は、水素またはアセチル基である。また、Ｒ３は、水素または炭素数２〜２４の脂肪族アシル基である）。
【００３５】
より具体的には、従来型のＭＥＬとしては、マンノースの４位および６位のアセチル基の有無に基づいて、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、およびＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。
【００３６】
ＭＥＬ−Ａは、上記一般式(２)中の置換基Ｒ２が、ともにアセチル基である。ＭＥＬ−Ｂは、上記一般式(２)中、マンノースの４位の置換基Ｒ２が水素であるとともに、マンノースの６位の置換基Ｒ２がアセチル基である。ＭＥＬ−Ｃは、上記一般式(２)中、マンノースの４位の置換基Ｒ２がアセチル基であるとともに、マンノースの６位の置換基Ｒ２が水素である。ＭＥＬ−Ｄは、上記一般式(２)中、置換基Ｒ２がともに水素である。
【００３７】
上記ＭＥＬ−Ａ〜ＭＥＬ−Ｄにおける置換基Ｒ１の炭素数は、ＭＥＬを製造するための培地に含有される油脂類中のトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数、および使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度によって変化させ得る。また、上記トリグリセリドが不飽和脂肪酸残基を有する場合、ＭＥＬ生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分を維持したままで、当該不飽和脂肪酸を用いてＭＥＬを合成することができれば、置換基Ｒ１として不飽和脂肪酸残基を含ませることが可能である。つまり、得られる各ＭＥＬは、通常、置換基Ｒ１の脂肪酸残基の部分が異なる化合物である。
【００３８】
また、上記ＭＥＬ−Ａ〜ＭＥＬ−Ｄの置換基Ｒ１は、炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるが、当該置換基Ｒ１中に水酸基は存在しない。
【００３９】
上記ＭＥＬ−Ａ〜ＭＥＬ−Ｄにおける置換基Ｒ３は、水素または炭素数２〜２４の脂肪族アシル基である。なお、当該置換基Ｒ３中にも水酸基は存在しない。
【００４０】
したがって、従来型のＭＥＬは疎水性が高いので、水溶性を必要とする用途には使用し難い。
【００４１】
一方、本発明のＭＥＬは、一般式（１）にて示される構造を有するとともに、側鎖脂肪酸中に少なくとも１つの水酸基を有するものである。なお、上記一般式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は水素またはアセチル基である。
【００４２】
【化６】
0005344274.tif 000005
【００４３】
上記一般式（１）中の置換基Ｒ１は、少なくとも１つの水酸基を有する飽和脂肪酸族アシル基であってもよく、少なくとも１つの水酸基を有する不飽和脂肪酸族アシル基であってもよく、特に限定されるものではない。
【００４４】
また、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１の炭素鎖は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、特に限定されない。
【００４５】
また、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１に含まれる水酸基の数および位置も、特に限定されない。なお、水溶性をより増加させるためには、水酸基の数は多いほど好ましい。
【００４６】
また、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１が酸素原子を含有する炭化水素基である場合、含有される酸素原子の数および位置（炭化水素基中の位置）も、特に限定されない。なお、水溶性をより増加させるためには、酸素原子の数は、多いほど好ましい。
【００４７】
更に具体的には、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１としては、例えば、１２−ヒドロキシ−９−ヘキサデセノイル基、１０−ヒドロキシ−７−ヘキサデセノイル基、８−ヒドロキシ−５−テトラデセノイル基、６−ヒドロキシ−３−ドデセノイル基、４−ヒドロキシデカノイル基、２−ヒドロキシオクタノイル基、６−ヒドロキシドデカノイル基、８−ヒドロキシテトラデカノイル基、１０−ヒドロキシヘキサデカノイル基、１２−ヒドロキシオクタデカノイル基、１４−ヒドロキシテトラデカノイル基、１２−ヒドロキシドデカノイル基、１０−ヒドロキシデカノイル基、８−ヒドロキシオクタノイル基などであることが好ましいが、これらに限定されない。
【００４８】
また、上記一般式（１）中の置換基Ｒ２は、いずれもアセチル基または水素であり得る。なお、水溶性をより増加させるためには、水素であることが好ましい。
【００４９】
本発明のＭＥＬは、従来型のＭＥＬと同様に高い界面活性作用を有するとともに、新たな生理活性および自己集合特性を有し、界面活性剤またはファインケミカルの分野において種々の触媒として用いることができる。さらに、本発明のＭＥＬは生分解性を有するとともに、高い安全性を有する点においても非常に意義のある物質である。つまり、本発明のＭＥＬは、幅広い用途に用いることができるとともに、低毒性で環境に優しいバイオサーファクタントである。
【００５０】
さらに、従来型のＭＥＬは様々な生理活性作用を有することが報告されている。例えば、ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株に従来型のＭＥＬを作用させると、顆粒系細胞を分化させる白血病細胞分化誘導作用があること。また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞に従来型のＭＥＬを作用させると、神経突起の伸長が生ずる神経系細胞分化誘導作用等の生理活性用を有すること、さらに、微生物由来の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（X. Zhao et. Al., Cancer Research, 59, 482-486（1999））、癌細胞増殖抑制作用があること、等が報告されている。これら従来型のＭＥＬの生理作用から考えて、本発明のＭＥＬにも種々の生理活性を有することが期待でき、例えば、抗ガン剤等の医薬品として、または新規化粧品材料として用いられ得る。
【００５１】
〔２．マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法〕
本発明のＭＥＬの製造方法は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を用いることを特徴としている。なお、本明細書において「マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物」とは、従来型のＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−ＣおよびＭＥＬ−Ｄ）の少なくとも１つを生産することができる微生物が意図される。
【００５２】
具体的には、例えば、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養することによって、上記一般式（１）にて示される構造を有する新規マンノシルエリスリトールリピッドを製造することが好ましい。なお、上記一般式（１）中、置換基Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに、少なくとも水酸基を１つ含む。また、置換基Ｒ２は、水素またはアセチル基である。
【００５３】
次いで、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法にて用いることができる微生物、培地および培養方法について説明する。
【００５４】
〔２−１．微生物〕
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養することによって、当該微生物に新規マンノシルエリスリトールリピッドを生産させる方法である。
【００５５】
上記微生物としては、ＭＥＬを生産する能力を有するものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、上記微生物としては、シュードザイマ属に属する微生物であることが好ましい。
【００５６】
上記シュードザイマ属に属する微生物としては特に限定されないが、例えば、Pseudozyma tsukubaensis NBRC1940（シュードザイマ・ツクバエンシス）、Pseudozyma antarctica NBRC 10736（シュードザイマ・アンタクティカ）、Pseudozyma aphidis DSM70725、Candida sp. SY16、Pseudozyma parantarctica、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma fusiformata、Pseudozyma hubeiensis、Pseudozyma shanxiensis、Pseudozyma graminicola、またはPseudozyma crassa等を用いることが好ましい。なお、上記微生物が、ＭＥＬを生産することは周知の事実である（例えば、（１）T. Morita, et al., FEMS Yeast Res., 7, 286-292（2007）、（２）M. Konishi, et al., Appl. Microbial. Biotechnol., 75, 521-531（2007）、（３）T. Fukuoka, et al., J. Oleo Sci., 56, 435-442（2007）、（４）特願２００７−１７９８９２、（５）T. Morita, et al., J. Oleo Sci., in press.など参照）。
【００５７】
また、上記微生物は、例えば、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）、ＣＢＳ（Centraalbureau voor Schimmelculues）、ＤＭＳＴ（Department of Medical Sciences, National Institute of Health, Thailand）、ＪＣＭ（Japan Collection of Microorganisms）、ＮＢＲＣ（National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Biological Resource Center）等から購入することが可能である。
【００５８】
〔２−２．培地および培養方法〕
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、上記微生物が、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油を含む培地にて培養される。
【００５９】
まず、微生物を培養するための培地について説明する。
【００６０】
上記培地としては、基本培地に対して、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油を含有させたものを用いることができる。
【００６１】
上記基本培地としては特に限定されず、例えば、微生物または酵母の培養に一般的に用いられる培地を用いることが好ましい。例えば、上記基本培地としては、ＹＰＤ培地（イーストエクストラクト  １０ｇ、ポリペプトン  ２０ｇ、およびグルコース  １００ｇ）を用いることが好ましい。
【００６２】
また、上記基本培地には、油脂類以外の他の成分を添加することも可能である。上記他の成分としては、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要な栄養源等を挙げることができるが、これに限定されない。上記炭素源、窒素源、無機塩類および栄養源としては、微生物が資化し得るものであればよく、特に限定されない。
【００６３】
具体的に上記炭素源としては、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロールまたはマンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖または乳糖等のオリゴ糖、デンプン、エリスリトール、ソルビトール、リビトール、グリセロール、アラビトールまたはマンニトール等の糖アルコール等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸またはリンゴ酸等）、アルコール類（エタノールまたはプロパノール等）を用いることが好ましい。
【００６４】
また、具体的に上記窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、またはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物等を用いることが好ましい。
【００６５】
また、具体的に上記無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅または炭酸カルシウム等が用いることが好ましい。
【００６６】
上記基本培地に対して、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油が添加される。
【００６７】
上記脂肪酸としては特に限定されず、製造するＭＥＬの構造に応じて、適宜選択することができる。例えば、上記脂肪酸は、ＤＬ−２−ヒドロキシ酪酸（DL-2-hydroxybutyric acid）、ＤＬ−３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸（DL-3-Hydroxy-n-butyric acid）、（±）−２−ヒドロキシヘキサン酸（（±）-2-Hydroxyhexanoic acid）、２−ヒドロキシ−ｎ−オクタン酸（2-Hydroxy-n-octanoic acid）、（±）−３−ヒドロキシデカン酸（（±）-3-Hydroxydecanoic acid）、（±）−２−ヒドロキシデカン酸（（±）-2-Hydroxydecanoic acid）、１０−ヒドロキシデカン酸（10-Hydroxydecanoic acid）、１２−ヒドロキシドデカン酸（12-Hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシミリスチン酸（3-Hydroxymyristic acid）、１５−ヒドロキシペンタデカン酸（15-Hydroxypentadecanoic acid）、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸（16-Hydroxyhexadecanoic acid）、２−ヒドロキシパルミチン酸（2-Hydroxypalmitic acid）、１２−ヒドロキシステアリン酸（12-Hydroxystearic acid）、またはリシノール酸であることが好ましい。さらに、上記脂肪酸は、リシノール酸であることが、より好ましい。リシノール酸以外のヒドロキシ脂肪酸は合成品であるので、高価である。それゆえ、リシノール酸以外のヒドロキシ脂肪酸を大量に入手するのは困難であるといえる。一方、リシノール酸はヒマシ油中に大量に含まれており、最も安価かつ安定的に入手することが可能である。また、リシノール酸では、脂肪酸鎖のほぼ中間位置に水酸基が存在するので、微生物内のＭＥＬ生合成経路において、その構造が影響を受けない。つまり、ＭＥＬの側鎖脂肪酸中にリシノール酸の水酸基がそのまま残存する可能性が高いので、容易に本願発明の新規ＭＥＬを得ることができる。
【００６８】
また、上記脂肪酸誘導体は、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸誘導体であればよく、特に限定されない。例えば、上述した脂肪酸の誘導体であることが好ましい。
【００６９】
なお、上記基本培地に対しては、上記脂肪酸または脂肪酸誘導体を１種類加えることも可能であるし、複数種類加えることも可能である。
【００７０】
また、上記少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸または脂肪酸誘導体は、例えば植物油由来のものであり得る。なお、上記植物油としては特に限定されないが、例えば、ヒマシ油であることが好ましい。ヒマシ油の主成分はリシノール酸である。したがって、上記植物油としてヒマシ油を用いれば、脂肪酸としてリシノール酸を用いた時と同様の効果を得ることができる。なお、上記基本培地に対しては、上記植物油を１種類加えることも可能であるし、複数種類加えることも可能である。
【００７１】
例えば、微生物としてシュードザイマ・ツクバエンシスNBRC 1940株を用いて新規ＭＥＬを生産する場合、以下の成分を含む培地を用いることが好ましい。つまり、上記培地には、０．０５％〜５％の酵母エキスが含まれていることが好ましく、０．１％〜３％の酵母エキスが含まれていることが特に好ましい。また、上記培地には、０．０５％〜５％の硝酸ナトリウムが含まれていることが好ましく、０．１％〜３％の硝酸ナトリウムが含まれていることが特に好ましい。また、上記培地には、０．０５％〜５％の大豆エキスが含まれていることが好ましく、０．１％〜３％の大豆エキスが含まれていることが特に好ましい。また、上記培地には、少なくとも１つの水酸基を有する脂肪酸が４％〜３０％含まれていることが好ましく、８％〜２０％含まれていることが特に好ましい。上記構成であれば、シュードザイマ・ツクバエンシスNBRC 1940株の生育が良好であるので、新規ＭＥＬの側鎖脂肪酸に少なくとも１つの水酸基を導入することが可能である。
【００７２】
次いで、培養方法について説明する。
【００７３】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、上記微生物を培養することによって、新規ＭＥＬを製造する。
【００７４】
上記微生物を培養する時の培養スケールは特に限定されない。例えば、試験管、フラスコ、またはジャー・ファーメンター等を用いて培養することが好ましい。また、上記スケールの異なる培養方法を組み合わせることも可能である。例えば、種培養、本培養およびＭＥＬ生産培養の順に、順次スケールアップしていくことも可能である。
【００７５】
また、培養温度も特に限定されず、微生物に応じて適宜設定することができる。例えば、培養温度としては、１５℃〜４５℃であることが好ましく、１７℃〜４０℃であることがより好ましい。上記温度であれば、微生物の生育が良好であるので、多量の新規ＭＥＬを製造することができる。また、上記温度であれば、培地中に添加される油脂の分散度が良くなるので、当該油脂を微生物が資化し易くなる。その結果、多量の新規ＭＥＬを製造することができる。また、上記温度であれば、製造された新規ＭＥＬによって培地の粘度が上昇することを抑制することができる。その結果、製造された新規ＭＥＬを容易に精製することができる。
【００７６】
また、培養時の培地のｐＨも特に限定されず、微生物に応じて適宜設定することができる。例えば、培養時の培地のｐＨとしては、３．０〜８．０であることが好ましく、４．０〜７．０であることがより好ましく、７．０であることが最も好ましい。上記ｐＨであれば、微生物の生育が良好であるので、多量の新規ＭＥＬを製造することができる。また、上記ｐＨであれば、製造された新規ＭＥＬが分解することを抑制することができる。なお、ｐＨを調節する場合には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸、またそれらの水溶液等を用いて培地のｐＨを調節することが好ましいが、これらに限定されない。
【００７７】
また、培養日数も特に限定されず、微生物に応じて適宜設定することができる。また、培養方法が回分培養であるか連続培養であるかによって、適宜設定することも可能である。例えば、回分培養の場合の培養日数としては、３日〜３０日であることが好ましい。培養日数が上記日数よりも少なければ、新規ＭＥＬの生産量が少なくなる。逆に、培養日数が上記日数よりも多ければ、培養途中で培地中の栄養源が枯渇する。
【００７８】
また、培養時の培地中の酸素量も特に限定されず、微生物に応じて適宜設定することができる。つまり、嫌気的条件下で培養することも可能であり、好気的条件下で培養することも可能である。本発明の製造方法では、微生物を好機的条件下で培養することが好ましい。好機的条件下で培養すれば、微生物を良好に生育させることができるとともに、新規マンノシルエリスリトールリピッドの生産量を増加させることができる。なお、好機的条件下で培養を行うためには、例えば、培養スケールに応じて、適宜公知の方法にて培地中に酸素を供給することができる。例えば、振盪培養法または通気撹拌培養法などによって、培地中に酸素を供給することができる。
【００７９】
更に具体的な培養方法を以下に記載するが、当該培養方法は一例であって、これらに限定されない。
【００８０】
例えば、Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を用いてＭＥＬを製造する場合の培養条件（培養温度、培養時間など）としては、２５℃、５００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．７５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件にて、５Ｌ−ｊａｒ中で１１日間培養することも可能である。
【００８１】
また、まず、２ｍＬの液体培地（グルコース  ４０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  ．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ．３ｇ／Ｌ）が入った試験管に１白金耳の種菌を接種して、２５℃で振とう培養を行う（種培養）。次いで、得られた菌体培養液１ｍＬを、２０ｍＬの液体培地（酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  ０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌ）の入った５００ｍｌ容坂口フラスコに接種して、２５℃で振とう培養を行う（本培養）。次いで、上記菌体培養液を、２．５Ｌのマンノシルエリスリトールリピッド生産培地（ヒマシ油  １００ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  ０．３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ０．３ｇ／Ｌ）が入った５Ｌ容ジャーファーメンターに接種して、２５℃で５００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行うことも可能である。
【００８２】
〔２−３．マンノシルエリスリトールリピッドの回収方法〕
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの分子構造は、基本的には上記一般式（１）における置換基Ｒ1の脂肪族アシル基の炭素数、あるいは二重結合および水酸基の有無などが異なる各種化合物の混合物の形態にて得られる。したがって、本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法では、微生物を培養した後、マンノシルエリスリトールリピッドを精製することが好ましい。
【００８３】
新規ＭＥＬを精製する方法は特に限定されず、適宜公知の脂質精製法を用いることができる。
【００８４】
例えば、各種溶媒を用いて、新規ＭＥＬを抽出することが可能である。上記溶媒としては特に限定されず、適宜公知の溶媒を用いることができる。例えば、上記溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、または、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独にて、または２種類以上の混合液にて使用することが好ましい。また、別々の培養物を混ぜ合わせた後、１つの培養物として抽出することも可能である。
【００８５】
また、上記抽出工程の後、上記溶媒を除去することが好ましい。上記除去方法としては特に限定されないが、例えば、常温および常圧下で溶媒の沸騰させることによって溶媒を気化させ、これによって溶媒を除去すればよい。
【００８６】
また、溶媒が除去された後の新規ＭＥＬはそのままの状態で利用できるが、更なる精製工程にかけることも可能である。これによって、更に純度の高い新規ＭＥＬを取得することが可能になる。なお、上記精製工程にかけた後の新規ＭＥＬは、例えば、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状にすることが好ましい。
【００８７】
上記精製工程としては特に限定されず、適宜公知の精製方法を用いることができる。例えば、上記精製工程としては、濾過工程またはカラムによる分離工程を挙げることができるが、これに限定されない。
【００８８】
上記濾過工程では、公知の濾過方法（例えば、ろ紙などに代表される各種フィルターを用いる濾過方法）によって、比較的大きな夾雑物を除去することができる。また、上記カラムによる分離工程では、各種カラム（例えば、イオン交換樹脂、活性炭カラム、またはシリカゲルカラム）を用いて、比較的小さな夾雑物を除去することができ、これによって、例えば脱臭・脱色等を行うことも可能である。
【００８９】
〔２−４．マンノシルエリスリトールリピッドの構造解析法〕
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法によって得られる新規ＭＥＬの構造解析は従来公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではない。
【００９０】
例えば、精製した後のＭＥＬを薄層クロマトグラフィー（thin layer chromatography：ＴＬＣ）によって解析することが好ましい。
【００９１】
薄層クロマトグラフィーを用いて解析する場合、解析に用いるＴＬＣプレートとしては特に限定されず、適宜公知のＴＬＣプレートを用いることが可能である。例えば、上記ＴＬＣプレートとしては、分離層としてシリカゲルを有するＴＬＣプレート（例えば、メルク社製のＴＬＣガラスプレート５７１５）を用いることが好ましい。
【００９２】
また、上記ＭＥＬをＴＬＣプレート上に展開する場合に用いる展開溶媒は、上記分離層に応じて、適宜選択することが可能である。例えば、上記展開溶媒としては、酢酸エチル、または、クロロホルム／メタノール混合溶媒（例えば、クロロホルム／メタノール／アンモニア水（または水）＝６５／１５／２）を用いることが好ましいが、これらに限定されない。
【００９３】
また、ＴＬＣプレート上に展開された試料は、硫酸（例えば、アンスロン−硫酸試薬）によって茶褐色（なお、アンスロン−硫酸試薬の場合は青色）に呈色することにより、糖脂質成分（ＭＥＬ）であると判断することが可能である。
【００９４】
なお、薄層クロマトグラフィーを用いて解析する場合には、同時に公知の従来型のＭＥＬをＴＬＣプレート上に展開しておけば、移動距離の違いから、新規ＭＥＬであるか否か確認することが可能である。
【００９５】
また、ＭＥＬの更に詳細な構造を解析する場合には、１Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲ、または二次元ＮＭＲによって得られたスペクトルデータと、構造が既知である従来型のＭＥＬ（例えば、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、およびＭＥＬ−Ｄ）のスペクトルデータとを比較することによって、容易に解析することができる。
【００９６】
また、側鎖脂肪酸の組成を解析する場合には、ＧＣ−ＭＳ分析法を用いることが可能である。ＧＣ−ＭＳ分析法の具体的な方法としては特に限定されず、適宜分析条件を設定することができる。例えば、まず１０ｍｇのＭＥＬを１ｍｌの５％塩酸メタノールに溶解し、９５℃で３０分間反応させた後、水を加えて反応を止める。次いで、ヘキサンにて脂肪酸メチルエステルを抽出し、ＧＣ−ＭＳ分析にて脂肪酸組成の解析を行えば、容易に、側鎖脂肪酸組成を確認することができる。
【実施例】
【００９７】
〔１．Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株の培養〕
保存培地（酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、大豆エキス  ５ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３  ５ｇ／Ｌ、グルコース  ４０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を、２ｍＬの液体培地（グルコース  ４０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、大豆エキス  ５ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３  ５ｇ／Ｌ）が入った試験管に、１白金耳接種した。
【００９８】
次いで、上記Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を、２５℃にて振とう培養（１８０ｒｐｍ）した。なお、培養日数は１日であった。
【００９９】
得られた１ｍＬの菌体培養液を、１００ｇ／Ｌの濃度にてヒマシ油が加えられた液体培地（酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、大豆エキス  ５ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３  ５ｇ／Ｌ）が２０ｍＬ入った５００ｍｌ容量の坂口フラスコに接種した。
【０１００】
次いで、上記Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を、２５℃にて振とう培養（１８０ｒｐｍ）した。なお、培養日数は１１日であった。
【０１０１】
以上のようにして得られた菌体培養液を用いて、以下の試験を行った。
【０１０２】
〔２．マンノシルエリスリトールリピッドの単離精製〕
培養終了後、菌体培養液に対して等量の酢酸エチルを加え、上下に撹拌した。撹拌後、菌体培養液と酢酸エチルとの混合溶液を静置させ、酢酸エチル層と菌体培養液層とを分離させた。分離後、酢酸エチル層を回収し、当該酢酸エチル層に対して等量の飽和食塩水を加えた。その後、酢酸エチル層と飽和食塩水との混合溶液を上下に撹拌させ、その後、当該混合溶液を静置させて、酢酸エチル層と飽和食塩水層とを分離させた。そして、分離後、酢酸エチル層を回収した。
【０１０３】
得られた酢酸エチル層の酢酸エチルをエバポレーションによって留去し、ＭＥＬ粗抽出物を得た。得られた粗抽出物に対して等量のアセトニトリルを加え、上記粗抽出物を溶解させた。当該溶解物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、ヘプタンとアセトンとの混合比が異なる各種混合溶液を用いて、順次溶出させた。具体的には、ヘプタン：アセトン（５０：１０）、ヘプタン：アセトン（５０：２０）、ヘプタン：アセトン（１０：１０）、アセトンの順番にて、各溶出液を用いて溶出させた。
【０１０４】
各溶出液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、酢酸エチルを用いて展開した。なお、上記ＴＬＣプレートとしては、メルク社製のＴＬＣガラスプレート５７１５を用いた。展開終了後、ＴＬＣプレートを硫酸にて発色させ、ＭＥＬが含まれている溶出液を確認した。そして、ＭＥＬが含まれている溶出液を集め、当該溶出液から溶媒を留去してＭＥＬを得た。
【０１０５】
〔３．マンノシルエリスリトールリピッドの構造解析−１〕
上述した方法によって得たＭＥＬの構造と従来型のＭＥＬの構造とを、薄層クロマトグラフィーによって比較した。
【０１０６】
従来型のＭＥＬとしては、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、およびＭＥＬ−Ｃを用いた。なお、従来型のＭＥＬ−Ａとしては、Pseudozyma antarctica KM-34（FERMP-20730）株をオリーブ油添加培地にて培養した後、原料油脂等の不純物を取り除いたものを用いた。また、従来型のＭＥＬ−Ｂとしては、Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株をオリーブ油添加培地にて培養した後、原料油脂等の不純物を取り除いたものを用いた。また、従来型のＭＥＬ−Ｃとしては、Pseudozyma hubeiensisをオリーブ油添加培地にて培養した後、原料油脂等の不純物を取り除いたものを用いた。なお、従来型のＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、およびＭＥＬ−Ｃは、上述した一般式（２）にて示される化合物である。
【０１０７】
薄層クロマトグラフィーの具体的な方法を以下に説明する。
【０１０８】
まず、上述した各種ＭＥＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、酢酸エチルで展開した。なお、上記ＴＬＣプレートとしては、メルク社製のＴＬＣガラスプレート５７１５を用いた。展開終了後、ＴＬＣプレートを硫酸にて発色させた。
【０１０９】
図１に結果を示す。レーン１〜レーン３は、それぞれ従来型のＭＥＬ−Ａ（ＭＥＬ−Ａ（ＯＬ））、ＭＥＬ−Ｂ（ＭＥＬ−Ｂ（ＯＬ））、およびＭＥＬ−Ｃ（ＭＥＬ−Ｃ（ＯＬ））を示し、レーン４は、ヒマシ油を原料に培養したPseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株から得られたＭＥＬ（ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ））を示す。
【０１１０】
図１のレーン２およびレーン４に示すように、同じPseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を用いてＭＥＬを生産しても、培地に添加する脂肪酸（植物油）の種類を変えることによって、異なる種類のＭＥＬを生産することができることが明らかになった。さらに、図１から、オリーブ油を原料に製造した従来型のＭＥＬ−Ｂ（ＯＬ）よりも、ヒマシ油を原料に製造したＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）の方が、親水性が高いことが明らかになった。
【０１１１】
〔４．マンノシルエリスリトールリピッドの側鎖脂肪酸解析〕
１０ｍｇの新規ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ））を１ｍｌの５％塩酸メタノールに溶解し、９５℃にて３０分間反応させた。その後、当該反応液に１ｍLの水を加えて、反応を止めた。
【０１１２】
次いで、上記反応液に２ｍｌのヘキサンを加えてヘキサン抽出を行い、当該抽出物に対してＧＣ−ＭＳ分析を行った。なお、ＧＣ−ＭＳ分析は以下の条件で行った。つまり、ＧＣ−ＭＳとしてＨＰ−６８９０／ＨＰ−５９７３（Agilent社製）、カラムとしてＨＰ−５ＭＳ（３０ｍｍ×Φ０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、オーブン温度として５０℃（２ｍｉｎ）−２８０℃（１０ｍｉｎ）、オーブン温度の変化速度として１５℃／ｍｉｎ、注入口温度として３００℃、スプリット比として２０：１、測定モードとしてＳＣＡＮモードを用いた。
【０１１３】
結果を、表１に示す。
【０１１４】
【表１】
0005344274.tif 000006
【０１１５】
表１に示すように、６０％程度の側鎖脂肪酸に水酸基が含まれていた。
【０１１６】
〔５．マンノシルエリスリトールリピッドの表面張力の測定〕
新規ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ））の界面活性能について検討した。表面張力の測定には、協和界面科学社製のｄｒｏｐ  ｍａｓｔｅｒ  ＤＭ５００を用い、添付のプロトコールにしたがって、様々な濃度のＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）の表面張力を測定した。
【０１１７】
図２に示すように、表面張力の値は、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）の濃度が増加するとともに減少し、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に達すると一定となった。なお、図２から、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）のＣＭＣは２．２×１０−５Ｍであり、γＣＭＣは２８．５ｍＮ／ｍであった。
【０１１８】
側鎖脂肪酸に水酸基を含まない従来型のＭＥＬ−Ｂの場合、ＣＭＣが４．５×１０−６Ｍであることが知られている（例えば、D. Kitamotoら、J. Biotechnol., 29, 91-96（1993）参照）。したがって、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）は、ＣＭＣが５倍に上昇しているので、従来型のＭＥＬ−Ｂと比較して水溶性が向上していることが明らかになった。
【０１１９】
一方、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）のγＣＭＣは、従来型のＭＥＬ−ＢのγＣＭＣ（２８．２ｍＮ／ｍ）とほぼ同じであるので、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）が優れた表面張力低下能力を保持していることも明らかになった。
【０１２０】
〔６．マンノシルエリスリトールリピッドの構造解析−２〕
ヒマシ油を用いて微生物を培養することによって得られた新規ＭＥＬ−Ｂ（ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ））の構造を更に詳細に検討するために、１Ｈ  ＮＭＲ測定、１３Ｃ  ＮＭＲ測定、および二次元ＮＭＲ測定によって、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）の構造解析を行った。
【０１２１】
図３（ａ）に、オリーブオイルを用いて微生物を培養することによって得られた従来型のＭＥＬ−Ｂ（ＯＬ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの拡大図を示す。また、図３（ｂ）に、ヒマシ油を用いて微生物を培養することによって得られた、新規化合物であるＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの拡大図を示す。
【０１２２】
図３（ａ）および図３（ｂ）から明らかなように、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）では、ＭＥＬ−Ｂ（ＯＬ）と比較して、化学シフト７１．３２６ｐｐｍに新たなピークが確認された。なお、当該ピークは、側鎖脂肪酸に存在する水酸基が結合した炭素に由来するピークであった。
【０１２３】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルおよび二次元ＮＭＲスペクトルからも水酸基の存在が確認されており、以上の結果から、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）は側鎖脂肪酸に水酸基が結合していることが示された。なお、その化学構造を以下の、一般式(１)に示す。
【０１２４】
【化７】
0005344274.tif 000007
【０１２５】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であるとともに少なくとも水酸基を１つ含み、Ｒ２は水素またはアセチル基である）。
【０１２６】
さらに具体的には、脂肪酸組成分析の結果から、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）は、鎖長が異なるＲ１を有する様々なＭＥＬの混合物であった。基本的には、ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）は、２箇所のＲ１が、それぞれ８−ヒドロキシ−５−テトラデセノイル基である構造を有するもの（図６（ａ）参照）、または、２箇所のＲ１が、それぞれ８−ヒドロキシ−５−テトラデセノイル基とオクタノイル基とである構造を有するもの（図６（ｂ）参照）を主に含む混合物であった。なお、図６（ｂ）に示すように、上記オクタノイル基は２’位の炭素に、上記８−ヒドロキシ−５−テトラデセノイル基は３’位の炭素に導入されていると予想された。また、上記ＭＥＬ−Ｂ（ＣＬ）のＲ２に関しては、４’位の炭素に導入されたＲ２がアセチル基であって、６’位の炭素に導入されたＲ２が水素であった。
【０１２７】
Ｒ１は、その全体が、原料である脂肪酸または脂肪酸誘導体に由来する構造である。この時、脂質のβ酸化（例えば、D. Kitamoto, et al., Biotechnol. Lett., 20, 813-818 （1998）参照）を経て、炭素数が２ずつ減少した様々な脂肪酸が、Ｒ１としてＭＥＬ中に導入される。
【０１２８】
例えば、植物油脂のようにＣ１８脂肪酸が主成分である原料の場合、実際にＭＥＬ中に導入される脂肪酸は、Ｃ１８〜Ｃ２である脂肪酸等の混合物である。なお、導入される脂肪酸の鎖長のバリエーションは、用いる微生物の種類によって異なる。例えば、Pseudozyma tsukubaensisの場合、Ｃ１４脂肪酸などの比較的長い脂肪酸がＭＥＬ中に導入される。一方、後述するPseudozyma antarcticaなどの場合、Ｃ８〜１２脂肪酸などがＭＥＬ中に導入される。
【０１２９】
したがって、これらの事実に基づけば、培地中に添加される脂肪酸、脂肪酸誘導体または植物油を選択することによって、所望の新規ＭＥＬを製造することが可能になる。
【０１３０】
〔７．Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株の培養〕
保存培地（麦芽エキス  ３ｇ／Ｌ、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌ、グルコース  １０ｇ／Ｌ、寒天  ３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を、２ｍｌの液体培地（グルコース  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ／Ｌ）が入った試験管に１白金耳接種した。
【０１３１】
次いで、上記Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を、２８℃にて振とう培養した。なお、培養日数は１日であった。
【０１３２】
得られた菌体培養液を、４０ｇ／Ｌの濃度にてヒマシ油が加えられた液体培地（酵母エキス  １ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ／Ｌ）が２０ｍＬ入った坂口フラスコに接種した。
【０１３３】
次いで、上記Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を、２８℃で振とう培養した。なお、培養日数は７日であった。
【０１３４】
以上のようにして得られたPseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株のバイオサーファクタントの生産を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認した。なお、展開溶媒としては、クロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア水＝６５：１５：２である混合溶液を用い、指示薬としては糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン硫酸試薬を用いた。また、ＴＬＣプレートとしては、メルク社製のＴＬＣガラスプレート５７１５を用いた。また、対照実験としては、Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を大豆油添加培地で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた。
【０１３５】
その結果を図４に示す。図４において、レーン１は、Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を大豆油添加培地で培養することによって得た従来型のＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃの解析結果を示し、レーン２は、Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株をヒマシ油添加培地で培養することによって得たＭＥＬの解析結果を示す。
【０１３６】
図４から明らかなように、Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株をヒマシ油添加培地で培養して得られた培養物をＴＬＣ分析に供したところ、従来のＭＥＬ−Ａのほか、ＴＬＣチャート上において従来のＭＥＬ−Ａよりもさらに下方、すなわち極性の高い領域に２つの大きなスポットが検出された。つまり、従来のＭＥＬ−Ａよりも極性の高い複数のＭＥＬが生産されることを確認できた。
【０１３７】
上記２つのスポットに相当するＭＥＬをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルムとアセトンとの混合比が異なる各種混合溶液を用いて、順次溶出した。具体的には、（クロロホルム：アセトン）の比が（８０：２０）、（５０：５０）、（３０：７０）、（０：１００）である混合溶液を用いて、順次溶出した。これによって、上記２つのスポットの各々に相当するＭＥＬを分離した。
【０１３８】
各スポットに相当するＭＥＬについてＮＭＲ測定を行ったところ、図４における上側のスポットに相当するＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａタイプ（Ｒ２が共にアセチル基）の側鎖脂肪酸鎖中に水酸基が含まれる新規ＭＥＬと、従来型ＭＥＬ−Ｃとの混合物であることが明らかになった。一方、図４における下側のスポットに相当するＭＥＬは、ＭＥＬ−Ｃタイプ（４’位のＲ２は水素、６’位のＲ２はアセチル基）の新規ＭＥＬであることが明らかになった。
【０１３９】
上記ＭＥＬ−Ａタイプの新規ＭＥＬの構造を、一般式（３）として以下に示す。
【０１４０】
【化８】
0005344274.tif 000008
【０１４１】
なお、一般式（３）中、ｎは、６〜１０の整数であり、ｍは、０〜４の整数である。
【０１４２】
また、上記ＭＥＬ−Ｃタイプの新規ＭＥＬの構造を、一般式（４）として以下に示す。
【０１４３】
【化９】
0005344274.tif 000009
【０１４４】
なお、一般式（４）中、ｎは、６〜１０の整数であり、ｍは、０〜４の整数である。
【０１４５】
〔８．Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養〕
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用いて、上述したPseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株の場合と同じ組成の培地を用い、３４℃の温度にてジャー・ファーメンターを用いてPseudozyma parantarcticaの培養を行った。なお、以下に具体的な手順について説明する。
【０１４６】
保存培地（麦芽エキス  ３ｇ／Ｌ、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌ、グルコース  １０ｇ／Ｌ、寒天  ３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma parantarctica JCM 11752株を、２ｍｌの液体培地（グルコース  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ／Ｌ）が入った試験管に１白金耳接種した。
【０１４７】
次いで、上記Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を、２８℃にて振とう培養した。なお、培養日数は１日であった（種培養）。
【０１４８】
得られた菌体培養液を、上記液体培地が３０ｍＬ入った坂口フラスコに接種し、さらに２８℃で振とう培養した。なお、培養日数は２日であった（前培養）。
【０１４９】
得られた菌体培養液を、４０ｇ／Ｌの濃度にてヒマシ油が加えられた液体培地（酵母エキス  １ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム  １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ／Ｌ）が５００ｍＬ入ったジャー・ファーメンターに接種し、３４℃にて培養した。なお、培養中は、培地に対して１ｍＬ／ｍＬ（ｖ／ｖ）の速度で通気するとともに、当該培地を６００ｒｐｍにて撹拌した。なお、培養日数は７日であった。
【０１５０】
培養終了後、菌体培養液に対して等量の酢酸エチルを加えて撹拌した後、遠心分離によって酢酸エチル層と菌体培養液層とを分離させた。分離後、酢酸エチル層を回収し、エバポレーションによって溶媒を留去することで、ＭＥＬ粗抽出物を得た。
【０１５１】
図５に、得られたＭＥＬ粗抽出物のＴＬＣチャートを示す。当該ＴＬＣチャートの結果は、実施例７においてPseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株の培養物から得たＭＥＬ粗抽出物の場合と類似していた。
【０１５２】
次いで、得られたＭＥＬ粗抽出物を実施例７と同様にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離し、得られた高極性糖脂質に関してＮＭＲ分析を行った。その結果、実施例７と同様に、ＴＬＣチャート上の１つのスポットに相当するＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａタイプ（Ｒ２が共にアセチル基）の側鎖脂肪酸鎖中に水酸基が含まれる新規ＭＥＬと、従来型ＭＥＬ−Ｃとの混合物であることが明らかになった。また、ＴＬＣチャート上の別のスポットに相当するＭＥＬは、ＭＥＬ−Ｃタイプ（４’位のＲ２は水素、６’位のＲ２はアセチル基）の新規ＭＥＬであることが明らかになった。なお、得られた全ＭＥＬの重量は約４．９ｇ（収量９．８ｇ／Ｌ）であって、そのうち新規ＭＥＬであると考えられる画分は３１ｗｔ％であった。
【０１５３】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッド（例えば、トリアシルＭＥＬ）の側鎖脂肪酸の中に少なくとも１つの水酸基が含まれるマンノシルエリスリトールリピッドおよびその製造方法が提供される。そして、上記製造方法では、微生物を培養することによって、新規マンノシルエリスリトールリピッドを効率よく製造することができる。
【０１５５】
本発明の新規マンノシルエリスリトールリピッドは、従来のＭＥＬよりも水溶性が高い。また、本発明の新規マンノシルエリスリトールリピッドは、分解性が高いとともに毒性が低いので、環境にやさしい。したがって、本発明の新規マンノシルエリスリトールリピッドおよびその製造方法は、例えばバイオサーファクタントとして、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等において広く利用することができる。また、本発明の新規マンノシルエリスリトールリピッドから得られた液晶は、糖骨格に起因する水素結合のネットワークにより、極めて安定性が良いとともに温度変化に対して強固であるから、化粧品または医薬品等の安定化剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】本発明の新規ＭＥＬが従来型のＭＥＬよりも親水性が高いことを示す、薄層クロマトグラフィーの展開図である。
【図２】本発明の新規ＭＥＬの特性を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、従来型ＭＥＬの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの拡大図であり、（ｂ）は、本発明の新規ＭＥＬの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの拡大図である。
【図４】Pseudozyma antarcticaKM-34（FERMP-20730）株を培養することによって製造された新規ＭＥＬの、薄層クロマトグラフィーの展開図である。
【図５】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を培養することによって製造された新規ＭＥＬの、薄層クロマトグラフィーの展開図である。
【図６】（ａ）および（ｂ）は、Pseudozyma tsukubaensis NBRC 1940株を培養することによって製造された新規ＭＥＬの一例を示す構造式である。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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