(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の電極を備える電極基板と、前記電極基板と対向して配置された細胞培養基板とを用い、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入し、前記電極に電圧を印加し、前記領域に不均一電場を発生させ、負の誘電泳動を利用して前記細胞培養基板上の電場強度の弱い位置に前記細胞を配列させ、所定のパターンで前記細胞が配列された細胞培養基板を得る、細胞のパターニング方法であって、
前記細胞懸濁液として複数の細胞懸濁液を準備し、前記複数の細胞懸濁液を前記領域に順次導入して前記細胞培養基板上に複数の細胞を順次配列させる際に、導入された細胞懸濁液中の細胞に応じて前記電場強度の弱い位置を変更し、所定のパターンで複数種類の細胞が配列された細胞培養基板を得る、細胞のパターニング方法。
【請求項２】
前記電場強度の弱い位置が、
前記複数の電極により電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上となる電場が前記細胞培養基板上に複数形成されている場合において、
電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上であり且つ電場強度の極大点間の間隔が３０〜２００μｍであるという条件を満たす近接する電場の極大点間の中間の領域である、請求項１に記載の細胞のパターニング方法。
【請求項３】
前記電場強度の弱い位置が、
前記複数の電極により電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上となる電場が前記細胞培養基板上に複数形成されている場合において、
電場強度の極大値が８×１０４〜１０×１０４Ｖ／ｍの範囲にあり且つ電場強度の極大点間の間隔が３０〜１５０μｍであるという条件を満たす近接する電場の極大点間の中間の領域である、請求項１又は２に記載の細胞のパターニング方法。
【請求項４】
前記電極基板と前記細胞培養基板との間の距離が３０〜５０μｍである、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の細胞のパターニング方法。
【請求項５】
前記細胞懸濁液中の前記細胞の含有量が５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の細胞のパターニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のパターニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞環境を生体外で再構成するための技術は、細胞生物学的な細胞機能の解析、細胞アレイチップによる個人個人に適した薬剤スクリーニング、再生医療を目指した細胞−細胞間や細胞−細胞外マトリクス間でのコミュニケーションの解明等の種々の分野への応用が期待されてきた。そして、このような生体内での細胞環境を生体外で再構築するための技術の一つとしては、細胞、細胞外マトリクス及び細胞接着性分子をマイクロスケールで任意な領域に配置する技術である細胞パターニング技術が注目されてきた。【０００３】
例えば、特開平２−２４５１８１号公報（文献１）においては、静電荷パターンを形成した電荷保持媒体上に生体組織を付着させ、組織のイオン性相互作用を利用して細胞培養を行うようにした静電荷パターンによる細胞のパターニング方法が開示されている。また、細胞のパターニング方法に利用可能な細胞培養用の基板としては、特開平５−１７６７５３号公報（文献２）に、細胞の接着率や接着形態に特異的に影響を与える物質を吸着させた表面部分を有している細胞培養用の基板が開示されている。また、特開２００５−１４３３８２号公報（文献３）においては、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層とを有する細胞培養用の基板が開示されている。また、細胞を分離等する方法としては、特開２００４−５２２４５２号公報（文献４）において、誘電泳動を介して細胞を分離する方法が開示されている。更に、特開２００５−２４９４０７号公報（文献５）においては、生体高分子を誘電泳動により導電路近傍に濃縮させてハイブリダイゼーションを行う方法が開示されている。
【発明の開示】
【０００４】
しかしながら、文献１に記載されているような細胞のパターニング方法においては、細胞培養用の基板を製造するための工程が煩雑であり、効率よく細胞をパターニングすることができなかった。また、文献１に記載されているような方法では、複数種類の細胞を１つの基板上にパターニングさせることが困難であった。また、文献２〜３に記載されているような細胞培養用の基板は、基板を製造する際にマイクロメートルオーダーのパターンを基板に形成させる必要があるため、その製造過程が煩雑であった。また、このような文献２〜３に記載されているような基板を用いた場合においても、複数種類の細胞を１つの基板上にパターニングさせることは困難であった。更に、文献４〜５に記載されているような方法を細胞パターニングに利用した場合には、誘電泳動現象を誘起させる電極基板と細胞培養基板が同一であるため、複雑な工程を経て製造された電極基板上に細胞が配列され、電極基板を再利用することが困難であった。また、文献４〜５に記載されているような方法を細胞パターニングに利用した場合には、複数種類の細胞を１つの基板上にパターニングさせることが困難であった。
【０００５】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、予め細胞培養基板に細胞を配列させるためのパターンを形成させる必要がなく、細胞培養基板上に細胞を所定のパターンで効率よく配列させることができるとともに、細胞培養基板と電極基板とを分離させて電極基板を繰り返し使用することを可能とする細胞のパターニング方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、複数の電極を備える電極基板と、前記電極基板と対向して配置された細胞培養基板とを用い、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入し、前記電極に電圧を印加し、前記領域に不均一電場を発生させ、負の誘電泳動を利用して前記細胞培養基板上の電場強度の弱い位置に前記細胞を配列させることにより、予め細胞培養基板に細胞を配列させるためのパターンを形成させる必要がなく、細胞培養基板上に細胞を所定のパターンで効率よく配列させることができるとともに、細胞培養基板と電極基板とを分離させて電極基板を繰り返し使用することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の細胞のパターニング方法は、複数の電極を備える電極基板と、前記電極基板と対向して配置された細胞培養基板とを用い、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入し、前記電極に電圧を印加し、前記領域に不均一電場を発生させ、負の誘電泳動を利用して前記細胞培養基板上の電場強度の弱い位置に前記細胞を配列させ、所定のパターンで前記細胞が配列された細胞培養基板を得る方法である。
【０００８】
また、本発明の細胞のパターニング方法としては、前記細胞懸濁液として複数の細胞懸濁液を準備し、前記複数の細胞懸濁液を前記領域に順次導入し、各細胞懸濁液中の細胞に応じて誘電泳動力の大きい所定の位置を選択して、前記細胞培養基板上に複数の細胞を順次配列させ、所定のパターンで複数の細胞が配列された細胞培養基板を得ることが好ましい。
【０００９】
上記本発明の細胞のパターニング方法としては、前記電場強度の弱い位置が、前記複数の電極により電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上となる電場が前記細胞培養基板上に複数形成されている場合において、
電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上（より好ましくは８×１０４〜１０×１０４Ｖ／ｍ、特に好ましくは９×１０４Ｖ／ｍ程度）であり且つ電場強度の極大点間の間隔が３０〜２００μｍ（より好ましくは３０〜１５０μｍ）であるという条件を満たす近接する電場の極大点間の中間の領域であることが好ましい。
【００１０】
また、上記本発明の細胞のパターニング方法においては、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の距離が３０〜５０μｍであることが好ましい。
【００１１】
また、上記本発明の細胞のパターニング方法においては、前記細胞懸濁液中の前記細胞の含有量が、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下であることが好ましく、更に、前記細胞懸濁液の溶媒が、前記細胞の分極率よりも大きな分極率を有する溶媒であることが好ましい。
【００１２】
なお、このような本発明の細胞のパターニング方法によって、上記目的が達成される理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、本発明においては、先ず、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入し、交流電圧を印加して、前記領域に不均一電場を発生させる。また、このようにして電圧を印加することで、細胞と溶媒の分極率の差によって双極子モーメントが生じる。そして、誘起された双極子モーメントと、電場強度の差との相互作用により、細胞には反発力が作用される。本発明においては、このような反発力が作用される現象の中でも電場強度の強い領域から反発力を受け電場強度の弱い領域に細胞が誘導される負の誘電泳動という現象を利用し、細胞を細胞培養基板上に配列させる。そのため、本発明においては、細胞培養基板に特殊な前処理を施すことなく、電場強度の弱い位置に所定のパターンで細胞を配列させることが可能となる。更に、本発明においては、細胞を電場強度の弱い領域に誘導して配列させるため、電圧を印加する電極の組み合わせを制御して電場強度の弱い位置を適宜変更することで、細胞を配列させるパターンを容易に変更することが可能となる。また、複数の細胞懸濁液を準備し、これを順次導入し、電場強度の弱い位置を適宜変更して細胞を配列させた場合には、複数種類の細胞を、それぞれ任意の位置に容易に配列させることまでも可能となることから、複数種の細胞によるパターン共培養が容易に可能となる。また、本発明においては、細胞を配列させる細胞培養基板と電極基板とが分離され、細胞培養基板上に細胞を配列させることから、電極基板は繰り返し使用することが可能となるものと本発明者らは推察する。
【００１３】
本発明によれば、予め細胞培養基板に細胞を配列させるためのパターンを形成させる必要がなく、細胞培養基板上に細胞を所定のパターンで効率よく配列させることができるとともに、細胞培養基板と電極基板とを分離させて電極基板を繰り返し使用することを可能とする細胞のパターニング方法を提供することが可能となる。更に、本発明によれば、複数種類の細胞を所定のパターンで配列させることも可能となり、複数種の細胞によるパターン共培養が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の細胞のパターニング方法に使用することが可能な装置の好適な一実施形態を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の細胞のパターニング方法を実施した際の図１に示す装置の好適な一実施形態を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の細胞のパターニング方法を実施した際の図１に示す装置の好適な一実施形態を示す模式図である。
【図４】図４は、図１に示す装置を用いて細胞のパターニングをした際に得られる細胞培養基板の好適な一実施形態を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明に好適に用いることが可能な電極基板を製造する際の工程を示す概略図であり、図５（ａ）はＩＴＯ電極基板の概略図を示し、図５（ｂ）はＩＤＡパターン（電極配線）が形成されたＩＴＯ電極基板の概略図を示し、図５（ｃ）は電極配線間を架橋するブリッジが形成されたＩＴＯ電極基板の概略図を示し、図５（ｄ）はブリッジと下地の電極配線を架橋する金電極が形成されたＩＴＯ電極基板の概略図を示す。
【図６】図６は、製造例１で製造した４極独立動作型ＩＤＡ電極（電極基板）の光学顕微鏡写真（図６（ａ））と、前記電極基板のサイクリックボルタモグラム（図６（ｂ））とを示す図である
【図７】図７は、製造例２で製造した細胞パターニング装置の縦（ｘ軸）９００μｍ×横（ｙ軸）１０μｍ×高さ（ｚ軸）３０μｍのモデルを用いて、４極独立動作型ＩＤＡ電極を用いた場合の電場強度を解析した結果を示すグラフであり、図７（ａ）は、電極基板中の電極（ii）を正極とし、電極（i）、（iii）及び（iv）を負極とした場合において、断面の電極強度の強弱を色の濃淡によって示したグラフであり、図７（ｂ）は、電極基板中の電極（ii）を正極とし、電極（i）、（iii）及び（iv）を負極とした場合において、電極基板から高さ（ｚ軸）３０μｍにある面の電場強度とｘ軸との関係を示すグラフであり、図７（ｃ）は、電極基板中の電極（iv）を正極とし、電極（i）、（ii）及び（iii）を負極とした場合における断面の電極強度の強弱を色の濃淡によって示したグラフであり、図７（ｄ）は、電極基板中の電極（iv）を正極とし、電極（i）、（ii）及び（iii）を負極とした場合における電極基板から高さ３０μｍにある面の電場強度と、ｘ軸との関係を示すグラフである。
【図８】図８（ａ）は、製造例２で製造した細胞パターニング装置を用いて、電極基板中の電極（ii）を正極とし、電極（i）、（iii）及び（iv）を負極として、負の誘電泳動によりポリスチレン微粒子をパターニングさせたときの細胞培養基板の光学顕微鏡写真であり、図８（ｂ）は、製造例２で製造した細胞パターニング装置を用いて、電極基板中の電極（iv）を正極とし、電極（i）、（ii）及び（iii）を負極として、負の誘電泳動によりポリスチレン微粒子をパターニングさせたときの細胞培養基板の光学顕微鏡写真である。
【図９】図９は、培地の導電率と周波数（交差周波数）との関係を示すグラフ（図９（ａ））及び周波数とＲｅ［Ｋ］との関係を示すグラフ（図９（ｂ））である。
【図１０】図１０（ａ）は、実施例１で細胞を配列させた後に装置から分離させて得られた細胞培養基板の分離直後の光学顕微鏡写真であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）に示す細胞培養基板を培地に浸漬して細胞を培養した際の培養開始から１時間経過した後の細胞培養基板を示す光学顕微鏡写真であり、図１０（ｃ）は、図１０（ａ）に示す細胞培養基板を培地に浸漬して細胞を培養した際の培養開始から２２時間経過した後の細胞培養基板を示す光学顕微鏡写真であり、図１０（ｄ）は、図１０（ａ）に示す細胞培養基板を培地に浸漬して細胞を培養した際の培養開始から９日間経過した後の細胞培養基板を示す光学顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、実施例１で用いた細胞パターニング装置（製造例２）を用いた場合の電圧とパターン効率（ｅp）との関係を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａ）は、実施例３で得られた細胞培養基板の光学顕微鏡写真であり、図１２（ｂ）は、実施例３で得られた細胞培養基板上の細胞を蛍光させた際の状態を示す光学顕微鏡写真であり、図１２（ｃ）は、実施例４で得られた細胞培養基板の光学顕微鏡写真であり、図１２（ｄ）は、実施例４で得られた細胞培養基板上の細胞を蛍光させた際の状態を示す光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。【００１６】
本発明の細胞のパターニング方法は、複数の電極を備える電極基板と、前記電極基板と対向して配置された細胞培養基板とを用い、前記電極基板と前記細胞培養基板との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入し、前記電極に電圧を印加し、前記領域に不均一電場を発生させ、負の誘電泳動を利用して前記細胞培養基板上の電場強度の弱い位置に前記細胞を配列させ、所定のパターンで前記細胞が配列された細胞培養基板を得る方法である。【００１７】
先ず、本発明の細胞のパターニング方法を実施する際に使用することが可能な装置の好適な一実施形態について説明する。図１は、本発明の細胞のパターニング方法に使用することが可能な装置の好適な一実施形態を示す模式図である。図１に示す装置は、複数の電極２を備える電極基板１と、細胞培養基板３と、スペーサー４とを備える。そして、細胞培養基板３は、電極基板１とスペーサー４を介して対向して配置されている。【００１８】
このような電極基板１は、複数の電極２が形成されたものであり、電極２に電圧を印加することで、電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に不均一電場を発生させることを可能とするものである。また、このような電極基板１としては特に制限されず、目的とする細胞のパターニングに合わせてその設計を適宜変更することができる。更に、このような電極基板の製造方法も特に制限されず、公知の方法で適宜製造することができ、例えば、フォトレジスト等により基板に電極を形成させることによって製造してもよい。また、電極基板１の材料としては、電極を配線することが可能な材料であればよく、特に制限されず、公知の材料を適宜用いることができる。更に、電極基板１に形成せしめる電極のデザインは、細胞培養基板３上に電場の弱い領域を発現させることができるような設計であればよく、特に制限されず、目的とする細胞のパターニングに合わせてその設計を適宜変更することができる。【００１９】
また、細胞培養基板３は、細胞を培養させることが可能な基板であればよく、特に制限されず、公知の細胞培養基板を適宜用いることができ、例えば、細胞培養用のプラスチックシャーレを好適に用いることができる。また、このような細胞培養基板３としては、従来のように細胞を配列させるためのマイクロメートルオーダーのパターンをフォトレジスト等により予め形成させた基板を用いる必要がなく、公知の細胞培養基板をそのまま用いることが可能である。このように、本発明においては、細胞培養基板をフォトレジスト等により前処理する必要がなくなるため、効率よく細胞を配列させることが可能となる。【００２０】
また、スペーサー４としては、電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に細胞懸濁液を導入することが可能となるような空間を形成させることができるものであればよく、その形状や材質等は特に制限されず、電極基板１や細胞培養基板３の形状等に応じて適宜その設計を変更して用いることができる。【００２１】
また、電極基板１と細胞培養基板３との間の距離は、用いる細胞や溶媒の種類、装置の設計、印加する交流電圧の大きさや周波数等によってその最適な距離が異なることから特に制限されるものではないが、３０〜５０μｍ程度であることが好ましい。前記距離が３０μｍ未満では、細胞と電極基板１もしくは細胞培養基板３との接触頻度が大きくなり、両基板上への細胞の非特異的な吸着が頻繁に起こり、パターニング精度が低下する傾向にあり、他方、５０μｍを超えると、誘電泳動力の弱い領域が広く現れ、パターニングされた細胞が細胞培養基板３に吸着されないばかりか、細胞のパターンが不鮮明になる傾向にある。【００２２】
次に、本発明の細胞のパターニング方法の好適な一実施形態として、上述の図１に示す装置を用いた場合の細胞のパターニング方法について説明する。【００２３】
このような細胞のパターニング方法においては、先ず、電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入する。【００２４】
このような細胞懸濁液としては特に制限されず、パターニングの目的となる細胞を含有しているものであればよく、公知の方法で調製したものを適宜用いることができる。また、このような細胞懸濁液の溶媒は特に制限されず、用いる細胞に応じて公知の溶媒から選択されたものを適宜使用することができる。更に、このような溶媒としては、負の誘電泳動を利用することから細胞の分極率よりも大きな分極率を有する溶媒を使用することが好ましい。また、細胞懸濁液中における細胞の含有量も特に制限されないが、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とすることが好ましい。このような含有量が前記上限を超えると、電場強度の弱い領域に細胞が集積化されるが、それ以外の領域にも細胞が存在することとなり目的とするパターンを形成させることが困難となる傾向にある。【００２５】
また、このような細胞懸濁液の導入方法としては特に制限されず、電極基板１と細胞培養基板３との間の領域へ細胞懸濁液を導入することが可能な方法であればよく、バッチ方式であってもフロー方式であってもよい。【００２６】
次に、前記領域に細胞を含有する細胞懸濁液を導入した後においては、電極２に電圧を印加し、前記領域に不均一電場を発生させ、負の誘電泳動を利用して細胞培養基板３上の電場強度の弱い位置に前記細胞を配列させ、所定のパターンで前記細胞が配列された細胞培養基板３を得る。【００２７】
このようにして印加する電圧の強度や周波数等は、特に制限されず、電極基板１と細胞培養基板３の距離や電極基板１の形状等の装置の設計、細胞や溶媒の種類等の細胞懸濁液の設計等に応じて適宜最適な値を設定することができる。なお、大きな電圧の印加により、多数の細胞の培養基板上への吸着が促進されるが電場による細胞の損傷が誘起される傾向にあり、小さな電圧の印加により細胞への電気的な損傷は軽減されるが細胞培養基板上にパターンが残らない傾向にあるため、印加電圧の最適化を図るために、例えば、予め種々の強度の電圧をそれぞれ印加して、それぞれの電圧における細胞のパターン形成率ｅｐを測定しておき、そのデータに基づいて細胞を配列させるために好適な電圧の強度を導き出す方法を採用してもよい。ここで、パターン形成率ｅｐは、下記式（１）
ｅｐ＝ｎ１ｈｒ／ｎｔｏｔａｌ            （１）
（式（１）中、ｎｔｏｔａｌは、５ｍｉｎ間の電圧の印加を停止した後にマイクロバンド電極上に存在する細胞数を示し、ｎ１ｈｒは、一時間細胞を培養した後の培養スライド上に存在する細胞数を示す。）
で表されるものである。なお、細胞数を測定する方法としては、培養スライド上に存在する細胞に対して蛍光染色を行うことで細胞を確認し、細胞数をカウントして測定する方法や、顕微鏡で細胞を観察して培養スライド上に存在する細胞数をカウントして測定する方法を採用することができる。そのため、上記式（１）中のｎ１ｈｒは、一時間細胞を培養した後、蛍光染色を行って確認される培養スライド上に存在する細胞数を示すか、あるいは、一時間細胞を培養した後、顕微鏡で細胞を観察して培養スライド上に存在する細胞をカウントして得られた細胞数を示す。【００２８】
また、本発明においては、電極２に電圧を印加することによって、不均一電場を発生させて、負の誘電泳動により細胞を所定の位置に誘導する。本発明においては、このようにして負の誘電泳動を利用するため、電極基板上には細胞のパターニングを行われないことから、電極基板を繰り返し用いることが可能となるため、細胞のパターニングをより効率よく行うことが可能となる。【００２９】
ここで、誘電泳動について簡単に説明する。誘電泳動は、外部から印加した不均一電場とそれにより誘起した細胞と溶媒の双極子モーメントとの相互作用の結果、細胞に力が作用する現象であり（Ｐｏｈｌ，Ｊｏｎｅｓ，Ｍｏｒｇａｎ，Ｈｕｇｈｅｓ）、細胞の表面状態により作用する力の方向は変化する。例えば、電場強度の強い領域へ細胞を誘導する場合を正の誘電泳動といい、電場強度の弱い領域へ細胞を誘導する場合を負の誘電泳動という。このような正の誘電泳動と負の誘電泳動の切り替えは外部より印加される電圧の周波数、溶液の導電率、細胞の表面電荷状態等に依存する。また、このような誘電泳動の際の誘電泳動力は下記式（２）で定義される。【００３０】
【数１】
0005170770.tif 000002
【００３１】
（式（２）中、ｒは粒子半径を示し、εＳは懸濁液中の溶媒の誘電率を示し、∇はベクトル演算子を示し、Ｅｒｍｓは時間平均電場強度を示し、Ｒｅ［Ｋ（ω）］は下記式（３）で定義されるＣｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ  ｆａｃｔｏｒの実数部を示す。）【００３２】
【数２】
0005170770.tif 000003
【００３３】
（式（３）中、εＳとεＰは、それぞれ溶媒と粒子の下記式（４）で定義される複素誘電率を示す。）【００３４】
【数３】
0005170770.tif 000004
【００３５】
（式（４）中、σは導電率を示し、εは誘電率を示し、ωは２πｆで定義される角周波数を示し、前記ｆは印加した交流電場の周波数を示す。）
そして、このような式（２）より、誘電泳動力は電場勾配の二乗に比例することが分かる。従って、電気力線が集中し大きな電場勾配が形成された部分の近傍では、細胞に対して、より大きな誘電泳動力が作用し、大きな反発力を細胞に作用させることができるため、細胞をより十分にパターニングすることが可能となる。すなわち、電場強度が弱く且つ誘電泳動力が大きい領域においては細胞をより十分に配列させることが可能となり、より明瞭なパターンで細胞をパターニングすることが可能となる。本発明においては、上述のような電場強度の強い領域に存在する細胞が負の誘電泳動により反発力を受けて電場強度の弱い領域に移動する現象を利用することによって、細胞をパターニングすることを可能とする。そして、このような細胞のパターニング方法においては、細胞が損傷しない範囲において、細胞に対する誘電泳動の力をより大きくすることで、すなわち、細胞への反発力をより大きくすることで、より明瞭な細胞のパターンを作製することが可能となる。【００３６】
このような電場強度の弱い位置としては、その位置が不均一電場内において相対的に電場が弱い位置であり、印加する電圧の強度や周波数等によって相対的に定められるものであることから一概には言えないが、前記電場強度の弱い位置が、前記複数の電極により電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上となる電場が前記細胞培養基板上に複数形成されている場合において、電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上（より好ましくは８×１０４〜１０×１０４Ｖ／ｍ、更に好ましくは９×１０４Ｖ／ｍ程度）であり且つ電場強度の極大点間の間隔が３０〜２００μｍ（より好ましくは３０〜１５０μｍ）であるという条件を満たす近接する電場の極大点間の中間の領域であることが好ましい。このような領域においては、配列された細胞が細胞培養基板により十分に押し付けられるため、細胞培養基板上に細胞をより十分に吸着させることが可能となる。また、このような領域以外では、十分な細胞のパターンが得られないか、あるいは、パターニングされても細胞が死滅する傾向にある。更に、このような電場の極大点間の中間の領域としては、前記極大点間の中心から３０μｍ（より好ましくは２０μｍ、更に好ましくは１０μｍ）以下の範囲の領域が好ましい。【００３７】
また、本発明において、前記誘電泳動力の大きさとしては、用いる細胞や溶媒の種類、装置の設計、印加する電圧の大きさや周波数等によって異なるものであり一概には言えないが、１０〜１４Ｖｐｐ（Ｖｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ）程度の電圧を印加した場合に、１００ｐＮ以上であることが好ましい。このような誘電泳動力の大きさが１００ｐＮ以上であり且つ電場強度が弱い位置においては、より十分に細胞をパターニングすることが可能となり、装置から細胞培養基板を取り外した場合により十分に細胞が接着されている傾向にある。【００３８】
また、本発明においては、前記細胞懸濁液として複数の細胞懸濁液を準備し、前記複数の細胞懸濁液を前記領域に順次導入し、各細胞懸濁液中の細胞に応じて電場強度の弱い位置を選択して、前記細胞培養基板上に複数の細胞を順次配列させ、所定のパターンで複数の細胞が配列された細胞培養基板を得る方法を採用してもよい。かかる方法は、用いる細胞懸濁液の種類に応じて印加電圧の周波数等を適宜変更することにより、電場強度の弱い位置を細胞に応じて適宜制御して、前記細胞培養基板上に複数の細胞をそれぞれ所定の位置に順次配列させる方法である。このようにして複数種類の細胞を所定のパターンで配列させることにより、複数種の細胞によるパターン共培養が可能となる。【００３９】
以下、より具体的な例として、図１に示す装置を用い且つその電極２として４極が独立動作する交互くし型アレイ電極を用い、更に３本おきに配置したマイクロバンド電極とそれ以外の電極との間で位相の異なる交流電圧を印加した場合の細胞のパターニング方法について説明する。先ず、装置の電極基板１と細胞培養基板３との間の領域への細胞懸濁液を導入する。次に、交流電圧を印加し、負の誘電泳動を細胞に作用させる。これによって細胞は電場強度の弱い位置に誘導される。なお、本実施形態においては、電場強度の弱い位置は、細胞培養基板上の領域であって４本の連続して配列された電極のうちの位相の異なる１本の電極に対向した位置となる。そのため、本実施形態においては、位相の異なる１本の電極に対向した細胞培養基板上の位置に細胞は直線状に配列される（図２参照）。次いで、電場強度の弱い位置を変更するために交流電圧を印加する電極の組み合わせを変化させた場合には、細胞を初めのパターンとは異なる領域へも誘導することが可能となる（図３参照）。そして、このようにして細胞を配列させた後に、細胞培養基板を分離することで細胞が所定の電極のパターンと同様のパターンで配列された図４に示すような細胞培養基板を得ることができる。なお、細胞の配列を順次繰り返す際に、細胞培養液を複数準備し、これを順次変更して用いた場合には、異種細胞を細胞培養基板上にそれぞれ配列させることができ、複数種の細胞によるパターン共培養が可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４１】
（製造例１：電極基板の製造）
４極が独立動作するＩＤＡ電極をフォトリソグラフィにより形成させた電極基板を製造した。図５に、このような電極基板を製造する際の工程の概略図を示す。【００４２】
先ず、図５（ａ）に示すＩＴＯ電極基板１０（三容真空工業株式会社製：２５ｍｍ×３５ｍｍ）を洗浄した後、このＩＴＯ電極基板１０上に、ヘキサメチルジシラサン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｓｉｌａｓａｎｅ）、ポジ型のフォトレジスト（シプレイ（Ｓｈｉｐｌｅｙ）社製の商品名「Ｓ−１８１８」）を、この順にスピンコートした。その後、１１０℃の温度条件で３分間ベークした後、所定のＩＤＡ電極パターンを有したフォトマスクを介してＵＶ光（５００Ｗ、１０秒）を照射し、現像液（シプレイ社製の商品名「マイクロポジット  ＭＦ  ＣＤ−２６」）に浸漬し、フォトレジストのＩＤＡパターン（電極配線１１）を得た（図５（ｂ））。【００４３】
次に、フォトレジストを１２０℃の温度条件で６０分間焼成した後、レジストで被覆されていない部分を電気化学エッチングにより除去した。電気化学エッチングは、対極に白金板を用いて、ＨＣｌ：ＨＮＯ３：Ｈ２Ｏ＝５：４：５となる溶液中でファンクションジェネレータ（株式会社  エヌエフ回路設計ブロック製の商品名「ＷＦ１９６６」）により交流電圧（５００Ｈｚ、２０Ｖｐｐ）を２０分間印加することにより行った。その後、超音波処理をアセトン中で行ないレジストマスクを除去した後、ヤナコ社製の「ＬＴＡ−１０１」を用いて１００Ｗの条件で酸素プラズマ処理を３０秒間行って、微小な有機物を除去した。次いで、この電極基板にネガティブフォトレジスト（マイクロケム社製の商品名「ＳＵ−８  ２００２」）を３０００ｒｐｍの条件で３０秒間スピンコートし、露光、現像して電極配線１１間を架橋する所定の形状のブリッジ１２を形成させた（図５（ｃ）。【００４４】
その後、酸素プラズマ処理及び熱焼成（１６０℃、３０分間）を施した後、再度、フォトレジスト（シプレイ社製の商品名「Ｓ−１８１８」）を均一に塗布し、ブリッジ１２と下地の電極配線１１を架橋するようなレジストのパターンを作製した。ブリッジ１２と下地の電極配線１１を架橋する金電極はＴｉ／Ａｕのスパッタ蒸着（キヤノンアネルバエンジニアリング株式会社製の「Ｌ−３３２Ｓ−ＦＨ」）とアセトンによるリフトオフ法により作製した（図５（ｄ））。そして、電極１３の露出する部分（１．８ｍｍ×０．７５ｍｍ）をネガティブフォトレジスト（マイクロケム社製の商品名「ＳＵ−８  ２００２」）により規定した。【００４５】
そして、本製造例においては、上述のような工程により、４本のマイクロバンド電極（電極配線１１）を基本単位とし、その基本単位を３回繰り返し、且つマイクロバンド電極を交互にくし型に配置した４極独立動作型ＩＤＡ電極を形成せしめた。また、マイクロバンド電極は、その幅が５０μｍとなるようにし、１００μｍの間隔で配列させた。更に、配線を簡素化するために、４箇所のコンタクティングパッドとそれぞれのマイクロバンド電極が接続されるように配線し、電極配線が交差する部位は上述のようにしてネガティブレジストでブリッジを製造し、そのブリッジの上を架橋する金電極を配線した。また、電極基板上の溶液と直接接触する電極面積は１２×５０μｍ×０．７５ｍｍとし、その領域以外の部分はネガティブレジストにより絶縁被覆した。このようにして得られた４極独立動作型ＩＤＡ電極（電極基板）の光学顕微鏡写真を図６（ａ）に示す。【００４６】
図６（ａ）に示す光学顕微鏡写真からも明らかなように、得られた電極基板においては、中央の１．８ｍｍ×０．７５ｍｍの正方形の中に幅５０μｍのマイクロバンド電極が１００μｍの間隔で１２本配列されており、また、中央の電極部位外はすべてネガティブレジストにより絶縁被覆されたものであることが確認できた。また、特に黒い部分はブリッジの上に作製された金電極であり、金電極と下地のＩＴＯ電極とが接続されていることが確認された。更に、一つのリード部分に対し、三本のマイクロバンド電極を配置され、合計１２本のマイクロバンド電極が配置されていることが確認された。【００４７】
次に、得られた電極基板の電気化学測定を以下のようにして行った。すなわち、電極基板の電気化学測定は、１００ｍＭのＫＣｌを含む４ｍＭのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］（関東化学株式会社製）水溶液中で行った。また、測定には、ワーキングに得られた電極基板を用い、カウンタに白金板を用い、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌを用いた。また、測定に際しては、電極基板に６×６ｍｍ四方の穴を有するシリコンシート（厚さ２ｍｍ）を介してアクリル製の溶液チャンバー（１０×２０×５ｍｍ）を設置し、１ｍＬのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］水溶液を充填し、自作のソフトウエアによりコンピュータ制御されたポテンシオスタット（北斗電工株式会社製の商品名「ＨＡ１０１０ｍＭ８」）を用いて、走査速度２０ｍＶ／ｓでサイクリックボルタンメトリーを行った。図６（ｂ）に得られたサイクリックボルタモグラムを示す。【００４８】
図６（ｂ）に示す結果からも明らかなように、図６（ａ）の光学顕微鏡写真に示す電極（i）〜（iv）のいずれを用いても、ほぼ同様のピーク電流値を得ることができ、また、その形状もＣＶ測定に特徴的なシグモイダルな形状を示した。また、下地のＩＴＯ電極（電極（i）及び（iv））と比較してブリッジ構造を介して配線した電極（電極（ii）及び（iii））の方が若干ではあるがピーク電流が大きいことが確認された。これは、ブリッジ上の金電極と、下地のＩＴＯ電極を架橋する部分の金電極とを完全に絶縁被覆できなかったためであると推察される。【００４９】
また、一つのリード部分に接続された三本のマイクロバンド電極はそれぞれ５５０μｍ間隔で存在し、十分に離れていることから、マイクロバンド電極一本のピーク電流値を計算し、そこから一つのリードあたりのピーク電流値を計算した。なお、マイクロバンド電極のピーク電流値Ｉｐは次式（５）：【００５０】
【数４】
0005170770.tif 000005
【００５１】
（式（５）中、Ｆはファラディー定数（＝９．６４８×１０４Ｃｍｏｌ−１）を示し、Ｒは気体定数（＝８．３１４Ｊｍｏｌ−１Ｋ−１）を示し、Ｔは絶対温度（＝２９８Ｋ）を示し、ＤはＦｅ［（ＣＮ）６］４−の拡散係数（＝６．５×１０−１０ｍ２ｓ−１）を示し、ｃ＊はＦｅ［（ＣＮ）６］４−のバルク濃度（＝４ｍｏｌm−３）を示し、ｗは電極幅（＝５．０×１０−５ｍ）を示し、ｂは電極長さ（＝７．５×１０−４ｍを示し、ｖは走査速度（＝２×１０−２Ｖｓ−１を示す。）
により求めた。このようにして一つのリード部分のピーク電流値（理論値）は０．８９μＡと導出できた。実際の測定結果（０．２５−０．２８μＡ）と比較すると理論値の方が若干大きくなったが、ほぼ理論と同様の電流値となった。以上のことより、得られたＩＤＡ電極は４極が完全に独立に電極として正確に機能することが確認された。【００５２】
（製造例２：細胞パターニング装置の製造）
図１に示すような構成の装置を製造した。このような装置においては、電極基板１に製造例１で製造した電極基板（４極独立動作ＩＤＡ電極）を用い、スペーサ４としてリンテック株式会社製の「ＴＬ−４１ＭＳ−０６Ｋ」を用い、細胞培養基板３としてカルチャースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製のｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｌｉｄｅ：２５×２５ｍｍ）を用いた。また、電極基板１と細胞培養基板３との間隔は３０μｍとした。【００５３】
このような細胞パターニング装置内の電場強度を、有限要素解析ソフトである「ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  ３．１ａ（スウェーデンＣＯＭＳＯＬ社製）」を用いて計算した。計算は三次元モデルで行い、そのモデルの大きさは縦（ｘ軸）９００μｍ×横（ｙ軸）１０μｍ×高さ（ｚ軸）３０μｍとした。電極基板を底面（ｚ＝０）とし、正極（図６（ａ）中の電極（ii））側に＋６Ｖ、負極（図６（ａ）中の電極（i）、（iii）及び（iv））側に−６Ｖを印加したときのｙ=０におけるｘ−ｚ平面の電場強度を計算した。なお、デバイス内は水（ε=７８ε０）で充填されていると仮定した。このような電場強度解析の結果を図７に示す。【００５４】
図７（ａ）中において、色の薄い領域が電場強度の強い領域を示し、色の濃い領域が電場強度の弱い領域を示す。また、図７（ｂ）はモデル上面（ｚ=３０μｍ）における電場強度の断面図である。このような図７（ａ）及び（ｂ）に示す結果から、電極（ii）に対して電気力線が集中し、その電極（ii）の上部において急激に電場強度が弱まっていることが確認され、残りの三極（電極（i）（iii）及び（iv））の上部に電場強度の弱い領域が広がって存在していることが確認された。【００５５】
次に、ポリスチレン微粒子（直径２μｍ、ポリサイエンス社製）２．７４質量％、並びに、溶媒としてのジメチルスルフォキシド１．３７質量％を含む懸濁液を、細胞パターニング装置の電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に導入し、電極に１ＭＨｚ、２０Ｖｐｐの交流電圧を印加して、ポリスチレン微粒子に負の誘電泳動を作用させた。得られた光学顕微鏡写真を図８（ａ）に示す。【００５６】
図８（ａ）に示す結果からも明らかなように、ポリスチレン微粒子は負の誘電泳動により電場強度の弱い領域に移動したことが確認された。特に、細胞培養基板上の電極（ii）の直上の領域に存在するポリスチレン微粒子は、電極（ii）の幅とほぼ同様の幅で配列されていることが確認された。このように、負の誘電泳動により、一極（電極（ii））の電極上にポリスチレン微粒子の明確なパターンが形成され、残りの３極上には幅広く微粒子が分布して明瞭なパターンを得られないことが確認された。これは、局所的に大きな電気勾配が形成されている電極（ii）の真上の領域の近傍においては、誘電泳動力によって十分に微粒子が配列されるのに対して、残りの３極の真上の領域においては、形成された電気勾配間の距離が大きく、十分な誘電泳動力が作用しないことから、微粒子が漂った状態となり、十分に微粒子が配列されないためであると推察される。このような結果から、電場強度の極大値が８×１０４Ｖ／ｍ以上であり且つ電場強度の極大点間の間隔が３０〜２００μｍであるという条件を満たす近接する電場の極大点間の中間の領域において、より明瞭なパターンで細胞を配列させることが可能となることが分かった。【００５７】
次に、正極を電極（iv）とし、負極を電極（i）〜（iii）とした上記細胞パターニング装置を用いて、電場強度の測定と、ポリスチレン微粒子を用いた負の誘電泳動とを行った。得られた結果を図７（ｃ）〜（ｄ）及び図８（ｂ）に示す。このような図７（ｃ）〜（ｄ）に示す結果から、電極（iv）の上部において急激に電場強度が弱まっていること以外は、電場強度の大きさ（図７（ｄ））や微粒子のパターニング精度（図８（ｂ））に変化がないことが確認された。このような結果から、複数の電極を有する電極基板を用い、印加電極を制御することで、微粒子を配列させる位置を制御することが可能となり、細胞を任意のパターンで配列させることが可能となることが確認された。【００５８】
（製造例３：細胞（Ｃ２Ｃ１２）の培養）
マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を培養した。すなわち、未分化のマウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を、非動化した１０容量％ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）、２５Ｕ／ｍＬペニシリン及び２５μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ社製）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：ギブコ社製）中、３７℃、５容量％ＣＯ２、水蒸気飽和の条件下において培養した。【００５９】
（製造例４：細胞（３Ｔ３  ｓｗｉｓｓ−ａｌｂｉｎｏ）の培養）
マウス繊維芽細胞（３Ｔ３  ｓｗｉｓｓ−ａｌｂｉｎｏ）を培養した。すなわち、マウス繊維芽細胞（３Ｔ３  ｓｗｉｓｓ−ａｌｂｉｎｏ）を、非動化した１０容量％ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ社製）を含むＲＰＭＩ（ギブコ社製）１６４０培地中で培養した。【００６０】
（製造例５：細胞懸濁液の製造）
コンフルエントまで培養したＣ２Ｃ１２細胞を用いて、細胞懸濁液を調整した。すなわち、細胞懸濁液は、培養したＣ２Ｃ１２細胞を０．２５ｗ／ｗ％トリプシンを含むＥＤＴＡ溶液で処理し、浮遊させ、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行った後、細胞濃度が２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、２容量％馬血清、２５Ｕ／ｍＬペニシリン及び２５μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（分化培地）に再懸濁して調製し、使用するまで４℃の温度条件下で保存した。【００６１】
（試験例１）
２５０ｍＭスクロース水溶液を添加し、種々の導電率に調整してＲＰＭＩ培地に３Ｔ３繊維芽細胞（製造例４）を懸濁した細胞懸濁液を製造し、これを細胞パターニング装置の電極基板と細胞培養基板との間の領域に導入し、細胞に誘電泳動を作用させた（電圧９．５Ｖｐｐ）。なお、細胞がＩＤＡ電極のエッジに誘引された場合を正の誘電泳動が作用したと定義し、細胞が細胞培養基板上に直線状にパターニングされた場合を負の誘電泳動が作用したと定義した。【００６２】
細胞を低導電率溶媒（σｓ=０．０１５Ｓｍ−１）に懸濁した場合、１０ｋＨｚ付近で負の誘電泳動が作用し、周波数の増加に伴いその力は減少した。周波数２５ｋＨｚ付近において細胞に誘電泳動力が作用しなくなり、更に周波数を増加させると正の誘電泳動が作用した。図９（ａ）に培地の導電率と、誘電泳動が作用しなくなる周波数（交差周波数）との関係を示すグラフを示す。なお、グラフの実線は、細胞を導電性の球が絶縁性の薄膜により被膜されているｐｒｏｔｏｐｌａｓｔモデルであると仮定し、細胞の理論的な交差周波数を実験値にフィッティングさせた線である。【００６３】
図９（ａ）に示すグラフからも明らかなように、溶媒の導電率の増加に伴い、交差周波数が高周波数側へ移動し、２５ｖ／ｖ％培地（σｓ=０．３３Ｓｍ−１）の場合、３ＭＨｚ程度まで負の誘電泳動が作用することが確認された。また、培地濃度を、それぞれ５０、７５、１００ｖ／ｖ％と増加させた場合においては、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの広範囲で負の誘電泳動が作用することが確認された。なお、ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔモデルにおけるクラウジウスモソッティ因子は次式（６）：【００６４】
【数５】
0005170770.tif 000006
【００６５】
（式（６）中、τｍ＝ｃｍｒ／σｃ、τｃ＝εｃ／σｃ、τｓ＝εｓ／σｓ、τ’ｍ＝ｃｍｒ／σｓであり、ｃｍは細胞膜容量［Ｆｍ−２］を示し、添え字ｃ、ｓはそれぞれ細胞質、溶媒を示す。）
で表される。また、物性値としては、細胞半径ｒ=６．７×１０−６［ｍ］、溶媒誘電率εs=７８ε０を用いて、Ｒｅ［Ｋ］=０となる周波数を計算した。計算にはＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ５．１（ＷＯＬＦＲＡＭＲＥＳＥＡＲＣＨ製）を使用し、フィッティングには最小二乗法を用いた。このようなフィッティングより細胞の物性値、細胞質の導電率σｃ=０．１９８Ｓｍ−１、細胞質誘電率εｃ=６０−７８ε0、膜容量ｃｍ=０．０２Ｆｍ−２を同定することができた。また、このような物性値を用いて式（６）から周波数変化に伴うＲｅ［Ｋ］をプロットし、得られた結果を図９（ｂ）に示す。【００６６】
図９（ｂ）に示す結果からも明らかなように、低導電率溶媒中においては、低周波数側及び数十〜数百ＭＨｚ領域で負の誘電泳動が作用し、その間の領域で正の誘電泳動が作用することが分かった。一方、導電率の高い培地中では、ほぼすべての周波数領域において負の誘電泳動が作用することが分かった。一方、導電率の高い溶媒において数１００ｋＨｚ以下の周波数では、電極反応に伴う気泡の発生や電極の腐食が観察された。このような結果から、上記装置を用いて細胞のパターニングを行う場合には、電圧の周波数を１ＭＨｚ程度に制御することが適当であることが分かった。【００６７】
（実施例１）
分化培地に懸濁したＣ２Ｃ１２筋芽細胞懸濁液（製造例５）を、細胞パターニング装置（製造例２）の電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に導入し、交流電圧（１２Ｖｐｐ）を印加した。このような細胞パターニング装置においては、図６（ａ）中の電極（ii）を正極とし、図６（ａ）中の電極（i）、（iii）及び（iv）を負極とした。このようにして、交流電圧（１ＭＨｚ、１２Ｖｐｐ）を５分間の印加し、細胞を電極上部に配置した細胞培養基板上に配列させた。このようにして得られた細胞培養基板を装置から分離させた後の光学顕微鏡写真を図１０に示す。【００６８】
図１０（ａ）に示す光学顕微鏡写真からも明らかなように、デバイスの分離に伴い、電極（i）、（iii）及び（iv）の上の領域において細胞培養基板上に非特異的に吸着された細胞や、電極（i）、（iii）及び（iv）の上の領域において弱い誘電泳動により、パターン形成されなかった細胞は除去され、電極（ii）上の領域において直線状に配列された細胞のみが細胞培養基板上に十分に配列されて細胞がパターニングされたことが確認された。【００６９】
次に、得られた細胞培養基板を培地に浸漬し、細胞を培養した。図１０（ｂ）〜（ｄ）に、１時間、２２時間及び９日経過した後の細胞培養基板の光学顕微鏡写真を示す。【００７０】
図１０（ｂ）〜（ｄ）に示す結果からも明らかなように、培養１時間後において細胞は球形の形状から扁平状の形状となり基板上に接着したことが確認できた。培養２２時間後においては、パターン構造は見られなくなり、培養９日目には顕著なチューブ様構造が確認された。このような結果から、電場に晒された筋芽細胞が分化能を失うことなく筋管を形成できることが確認された。【００７１】
このような結果から、本発明によれば、負の誘電泳動を利用して、迅速な細胞パターンの形成が達成できることが確認された。また、本発明によれば、細胞培養基板の表面処理を施すことなく細胞の位置制御が可能であることが確認され、これにより培養時間経過に伴う細胞の形態変化、移動度、成長度の追跡を容易に行うことが可能となることが確認された。【００７２】
（実施例２）
印加電圧を種々の値に変更した以外は実施例１と同様にして細胞培養基板に細胞を配列させた。種々の電圧に対するパターン効率（ｅp）のグラフを図１１に示す。【００７３】
図１１に示す結果からも明らかなように、電圧８Ｖｐｐを印加した場合においては、電圧印加に伴う細胞のパターン形成は確認されたが、装置から細胞培養基板を分離した後にパターン効率は必ずしも十分なものではなかった。一方、印加電圧を増加させるとパターン効率は増加し、１２Ｖｐｐを印加したときにパターン効率は最大になることが確認され、より大きな電圧１４Ｖｐｐを印加した場合においてはパターン効率が減少していることが確認された。これは、高電圧の印加により細胞の一部が損傷し、一度は基板に吸着されるものの、細胞が基板上に接着されることなく一時間の培養の過程で基板上から脱離するためであると推察される。【００７４】
（実施例３）
製造例２で得られた細胞パターニング装置を用い、細胞懸濁液を順次導入し、それぞれの細胞懸濁液ごとに電場強度の弱い領域を制御し、細胞を順次配列させて異なる領域への細胞のパターニングを行った。【００７５】
先ず、分化培地に懸濁したＣ２Ｃ１２筋芽細胞の含有された細胞懸濁液（製造例５）を、細胞パターニング装置の電極基板１と細胞培養基板３との間の領域に導入し、図６（ａ）に示す電極（ii）を正極とし、電極（i）、（iii）及び（iv）を負極として電極間に交流電圧（１２Ｖｐｐ、１ＭＨｚ）を５分間印加し、細胞培養基板上の電極（ii）の上部の領域に１回目のパターニングを行った。【００７６】
次に、蛍光色素ＣＭＦＤＡを前記領域に導入し、パターニングした細胞を染色した。次いで、１０μＭ  ＣＭＦＤＡを含む無血清最小培地Ｏｐｔｉ  Ｍｅｍ（ギブコ社製）で前記領域を置換し、２０分間室温でインキュベートした後、分化培地でデバイス内を洗浄した。その後、前記領域に新しい細胞懸濁液（製造例５）を導入し、電極（i）を正極とし、電極（ii）、（iii）及び（iv）を負極として、電極間に交流電圧（１２Ｖｐｐ、１ＭＨｚ）を５分間印加し、２回目のパターニングを行った。得られた細胞培養基板の光学顕微鏡写真を図１２（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図１２（ｂ）は、細胞を蛍光させた際の写真である。【００７７】
図１２（ａ）及び（ｂ）に示す結果からもあきらかなように、蛍光染色された細胞と染色されていない細胞とが２５０μｍ間隔に交互にパターニングされていることが確認された。【００７８】
（実施例４）
２回目のパターニングの際に、電極（iv）を正極とし、電極（i）、（ii）及び（iii）を負極とした以外は実施例３と同様にして、異なる領域への細胞のパターニングを行った。得られた細胞培養基板の光学顕微鏡写真を図１２（ｃ）及び（ｄ）に示す。なお、図１２（ｄ）は、細胞を蛍光させた際の写真である。図１２（ｃ）及び（ｄ）に示す結果からも明らかなように、蛍光染色された細胞の１００μｍ左の領域に染色されていない細胞が配列されていることが確認された。【００７９】
このような実施例３〜４に示す結果から、前記領域に複数の細胞懸濁液を順次導入し、導入された細胞に応じて電場強度の弱い位置を制御することで、細胞培養基板上に複数の細胞を所定のパターンで配列させることが可能となることが確認された。また、本発明によれば、細胞培養基板の前処理を必要とせずに、異種細胞を異なる領域へ容易にパターニングできることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上説明したように、本発明によれば、予め細胞培養基板に細胞を配列させるためのマイクロメートルオーダーのパターンを形成させる必要がなく、細胞培養基板上に細胞を所定のパターンで効率よく配列させることができるとともに、細胞培養基板と電極基板とを分離させて電極基板を繰り返し使用することを可能とする細胞のパターニング方法を提供することが可能となる。【００８１】
したがって、本発明の細胞のパターニング方法は、生体内での細胞環境を生体外で再構築するための技術として特に有用である。そして、本発明は、薬剤スクリーニング、再生医療を目指した細胞−細胞間や細胞−細胞外マトリクス間でのコミュニケーションの解明等の種々の分野への応用が可能である。
【図１】
0005170770.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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