(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞を含有する，肺気腫を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞を含有する，肺気腫における肺胞の再生を促進するための医薬組成物。
【請求項３】
造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞を含有する，肺気腫における毛管の血管新生を促進するための医薬組成物。
【請求項４】
患者から採取した間葉系幹細胞を培養することを含む，請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺気腫を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺気腫は，世界中で呼吸不全および死亡の主要な原因である。肺気腫は，末端細気管支から離れた気腔の異常な永久拡大により特徴づけられる（Lopez  AD,  Murray  CC,  1990-2020.  Nat  Med.  1998;4:1241-1243;  Michaud  CM,  Murray  CJ,  JAMA.  2001;285:535-539;  American  Thoracic  Society.  Standards  for  the  diagnosis  and  care  of  patients  with  chronic  obstructive  pulmonary  disease.  Am  J  Respir  Crit  Care  Med.  1995;152:S77-S121）。肺気腫は，進行性の気流制限を呈する疾患であり，労作性呼吸困難を生じる。末梢気道や肺胞壁の破壊や肺胞細胞のアポトーシスによって病態が進行し，いったん生じたこれらの病理学的変化は非可逆的であるといわれている。したがって現時点では，肺気腫の治療は生活の質や運動耐容能の改善を目的とする対症療法が中心である。肺胞壁の破壊や肺胞細胞のアポトーシス抑制に対して有効な治療法はなく，また肺組織の再生に有効な薬剤はない。また，肺気腫には重複する作用を有する多くのメディエータが関与しているため，この疾病の進行を予防するための有効な治療法はない（Barnes  PJ,  N  Engl  J  Med  2000;343:269-280）。【０００３】
肺気腫における病理学的変化の１つである肺胞壁の破壊は，非可逆的であると考えられてきた。しかし，最近の研究は，骨髄細胞が末梢血中に移動して，肺線維芽細胞および肺胞に分化することを示した（Ishizawa  K,  et  al.,  FEBS  Lett.  2004;556:249-252;  Yamada  M,  et  al.,  J  Immunol.  2004;172:1266-1272）。すなわち，肺気腫の治療には，骨髄細胞による肺再生が望ましいと考えられる。【０００４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は，骨髄中に存在する多能性成人幹細胞である（Pittenger  MF,  et  al.,  Science.  1999;284:143-147）。ＭＳＣは，造血性幹細胞とは異なり，接着性であり，培養により増殖させることができる。ＭＳＣは種々の中胚葉細胞，例えば，骨芽細胞，軟骨細胞，骨格筋細胞，心筋細胞，および血管内皮細胞に分化することができる（Reyes  M,  et  al.,  J  Clin  Invest.  2002;109:337-346;  Toma  C,  et  al.,  2002;105:  93-98;  Nagaya  N,  et  al,  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol.  2004;287:H2670-H2676）。しかし，ＭＳＣが，主として内胚葉に由来する肺組織の再生を誘導しうるか否かは不明である。最近の研究により，全身投与されたＭＳＣがブレオマイシン誘起性創傷に応答して肺に集積することが示された（Ortiz  LA,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2003;100:8407-8411）。また，ＭＳＣがインビトロで気道上皮細胞に分化することが示されている（Wang  G,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2005;102:186-191）。しかし，ＭＳＣを投与することで実際に肺気腫の肺機能が改善するか否かは知られていなかった。また，肺機能の改善には肺胞のみでなく同時に血管が必要であるが，肺に集積したＭＳＣは，肺胞と血管を同時に再生させることで肺組織を再生させることは知られていなかった。【０００５】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。
【非特許文献１】Lopez  AD,  Murray  CC,  1990-2020.  Nat  Med.  1998;4:1241-1243
【非特許文献２】Michaud  CM,  Murray  CJ,  JAMA.  2001;285:535-539
【非特許文献３】American  Thoracic  Society.  Standards  for  the  diagnosis  and  care  of  patients  with  chronic  obstructive  pulmonary  disease.  Am  J  Respir  Crit  Care  Med.  1995;152:S77-S121
【非特許文献４】Barnes  PJ,  N  Engl  J  Med  2000;343:269-280
【非特許文献５】Ishizawa  K,  et  al.,  FEBS  Lett.  2004;556:249-252
【非特許文献６】Pittenger  MF,  et  al.,  Science.  1999;284:143-147
【非特許文献７】Reyes  M,  et  al.,  J  Clin  Invest.  2002;109:337-346
【非特許文献８】Toma  C,  et  al.,  2002;105:  93-98.
【非特許文献９】Nagaya  N,  et  al,  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol.  2004;287:H2670-H2676
【非特許文献１０】Ortiz  LA,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2003;100:8407-8411
【非特許文献１１】Wang  G,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2005;102:186-191
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は，肺気腫を治療する医薬組成物及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，ＭＳＣを成熟肺胞上皮細胞とともに共培養すると肺胞に分化し，肺胞形成を誘導しうこと，ならびに，静脈内投与したＭＳＣが肺に定着して，肺胞および血管系を再生し，このことによりラットのエラスターゼ誘起性肺気腫において肺構造および機能を改善しうることを見出した。【０００８】
すなわち，本発明は，造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含有する，肺気腫を治療するための医薬組成物を提供する。間葉系幹細胞とは，種々の中胚葉細胞，例えば，骨芽細胞，軟骨細胞，骨格筋細胞，心筋細胞，および血管内皮細胞に分化することができる多能性成人幹細胞である。
【０００９】
本発明はまた，造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞を含有する，肺気腫における肺胞の再生を促進するための医薬組成物を提供する。本発明はまた，造血幹細胞を含まずに間葉系幹細胞を含有する，肺気腫における毛管の血管新生を促進するための医薬組成物を提供する。投与方法としては，静脈内投与が好ましいが，手術時に患部に局所投与することや気管支鏡らを用いた経気道的投与も可能である。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，患者から採取した間葉系幹細胞を培養することを含む，上述の本発明の医薬組成物を製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は，成熟肺胞上皮細胞との共培養におけるＭＳＣの上皮様表現型への分化と共培養系における肺胞形成を示す。
【図２】図２は，インビボにおけるＭＳＣの上皮または内皮系への分化を示す。
【図３】図３は，肺におけるＭＳＣ誘起性血管新生を示す。
【図４】図４は，ＭＳＣによる血管新生因子および抗アポトーシス因子の産生を示す。
【図５】図５は，ＭＳＣを移植したエラスターゼ処置ラットにおける肺の構造および機能の変化を示す。
【図６】図６は，ＭＳＣを移植したエラスターゼ処置ラットにおける肺の構造および機能の変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の実施例において示されるように，ＭＳＣを成熟肺胞上皮細胞とともに共培養すると，ＭＳＣは上皮様の表現型を示し，マトリゲル中で成熟肺胞上皮細胞と一緒に肺胞様構造を形成した。また，エラスターゼ誘起性肺気腫のラットモデルにおいて，静脈内投与したＭＳＣは肺胞壁に取り込まれ，肺胞上皮細胞または血管内皮細胞に分化し，肺胞ネットワークおよび血管構造を形成し，このことにより，肺構造および機能が改善されることが明らかになった。【００１３】
これらの結果は，ＭＳＣの移植が，肺において肺胞および血管系の再生により肺気腫に有益な効果を有することを示す。したがって，ＭＳＣの移植は，肺気腫の新たな治療方法として有用である。【００１４】
間葉系幹細胞は，移植を受けるべき患者の骨髄，大腿骨，脛骨，脂肪組織，その他の組織から細胞を採取し，慣用の方法により培養することにより，容易に調製することができる。培養液としては，10〜15％の自己血清または牛胎児血清（FBS）及び抗生物質を補充したα−ＭＥＭやＤＭＥＭを用いることができる。必要に応じて塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）やアドレノメデユリンなどの成長因子を加えることがある。培養は，哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが，一般的には３７℃，５％ＣＯ2で数日間培養し，必要に応じて培地を交換する。間葉系幹細胞は培養基材に接着して増殖する性質を有するため，浮遊して増殖する造血性幹細胞と容易に分離することができる。間葉系幹細胞は，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ７１，ＣＤ９０，ＣＤ１０５等の細胞表面マーカーにより容易に確認することができる。また，培養した間葉系幹細胞は，慣用の方法を用いて凍結保存することが可能である。【００１５】
このようにして得られた間葉系幹細胞は，ＰＢＳ等の生理学的に許容しうる媒体に懸濁して，患者に投与することができる。投与方法としては，静脈内投与が好ましいが，手術時に患部に局所投与することや気管支鏡らを用いた経気道的投与も可能である。投与すべき間葉系幹細胞の数は，成人の場合，好ましくは1x107個〜１x109個である。細胞は，5〜10  mLのＰＢＳに懸濁して投与する。【００１６】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2005−117431号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。【００１７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００１８】
＜方法＞
骨髄ＭＳＣの培養
ＭＳＣは先に記載されている方法にしたがって増殖させた（Pittenger  MF,  et  al.,  Science.  1999;284:143-147）。簡単には，雄Ｌｅｗｉｓラットおよびグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックラットを犠牲死させ，大腿腔および脛骨腔をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）でフラッシングすることにより骨髄を回収した。骨髄細胞を１００ｍｍのディッシュに加え，１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したα−ＭＥＭ中で培養した。培養第５−７日までに目に見える対称のコロニーが形成された。非接着性の造血細胞を除去し，培地を交換した。接着した紡錘形状のＭＳＣ集団は，細胞を最初に播種してから約４−５代以内の継代で５０００万個以上に増殖した。【００１９】
肺気腫のモデル
この実験では，体重１８０−２１０ｇの雄Ｌｅｗｉｓラット（Charles  River  Japan  Inc.）を用いた。これらと同系のラットをＭＳＣのドナーおよびレシピエントとして用いて，自己移植を模倣した。肺気腫は，ブタ膵臓エラスターゼ（６００ユニット／ｋｇ；Sigma,  St.Louis,  MO）の気管内注入により生成させた。この実験プロトコルはThe  Animal  Care  Committee  of  the  National  Cardiovascular  Centerにより承認されたものである。【００２０】
ＭＳＣ移植
エラスターゼ注入の７日後，１．５ｘ１０６ＭＳＣ／５００μＬのＰＢＳまたは５００μＬのＰＢＳのみをラットの左頸静脈から静脈内投与した。擬似ラットにも５００μＬのＰＢＳを静脈内投与した。【００２１】
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色は，マウス抗サイトケラチン５および８モノクローナル抗体（Chemicon）（上皮細胞のマーカー）；ヤギ抗ＳＰ−Ａポリクローナル抗体（Santa  Cruz）（肺胞上皮細胞のマーカー）；およびウサギ抗フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ）（血管内皮細胞のマーカー）を用いて行った。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ＩｇＧ抗体（BD  Pharmingen）を二次抗体として用いた。【００２２】
統計学的分析
数値は特に記載しない限り平均±ｓｅｍ．で表す。３群間のパラメータの比較は，一元分散分析（ＡＮＯＶＡ），続いてシェフ（Scheffe）多重比較検定により分析した。３群間のパラメータの変化の比較は，反復測定用二元ＡＮＯＶＡ，続いてシェフ多重比較検定により行った。Ｐ＜０．０５を有意であると考えた。【００２３】
＜結果＞
肺胞上皮細胞との共培養における上皮分化および肺胞形成
ＭＳＣが上皮様表現型に分化するか否かを調べるために，ＧＦＰを発現するＭＳＣを，成熟肺胞上皮細胞とともに４日間共培養した。最初に，ヒト成熟肺胞上皮細胞（Ａ５４９）を播種し，１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＦ−１２Ｋ中で培養した。１日間培養した後，ＧＦＰを発現するＭＳＣを肺胞上皮細胞上に１：１の比率で播種した。細胞は，１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＦ−１２Ｋ中で４日間共培養した。次に，細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。【００２４】
結果を図１に示す。免疫細胞化学的分析により，培養した肺胞上皮細胞の大部分は，サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）陽性であることが示された（図１Ａ）。肺胞上皮細胞中に取り込まれたＧＦＰ発現ＭＳＣの一部はサイトケラチンを発現していた。【００２５】
次に，ＭＳＣがインビトロで成熟肺胞上皮細胞とともに肺胞形成を誘導するか否かを調べるために，ＭＳＣと肺胞上皮細胞をマトリゲル中で６時間共培養した。結果を図１Bに示す。ＧＦＰ発現ＭＳＣは成熟肺胞上皮細胞とともに取り込まれ，これらの細胞とともに肺胞様構造を形成した。【００２６】
ＭＳＣの取り込みおよび分化の評価
５匹のエラスターゼ処置ラットを用いて，移植されたＭＳＣの肺における取り込みおよび分化を調べた。先に報告されているようにして（Messina  LM,  et  al,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  1992;89:12018-12022），移植前に，懸濁したＭＳＣをPKH26  Red  Fluorescent  Cell  Linker  Kit（SigmaChemical  Co.）を用いて蛍光色素で標識した。エラスターゼ注入の７日後に蛍光標識ＭＳＣを静脈内投与し，エラスターゼ注入の４週間後にラットを犠牲死させた。肺を摘出し，サンプルをＯＣＴ化合物中に埋包し，液体窒素中で急速に凍結し，切片を作成した。【００２７】
結果を図２に示す。移植された細胞の一部は肺組織に集積し，肺胞壁に取り込まれた（図２Ａ）。移植された細胞は，ホスト肺胞上皮細胞と一緒に肺胞形成に関与し，サイトケラチン陽性であった。移植されホスト肺胞細胞とともに取り込まれた細胞の一部はＳＰ−Ａ陽性であり，肺胞形成に寄与した（図２Ｂ）。このインビボの結果は，ＭＳＣが肺胞上皮表現型を有する細胞に分化することを示唆しており，共培養系においてＭＳＣが成熟肺胞上皮細胞と一緒に肺胞形成を誘導したというインビトロの知見と一致する。すなわち，エラスターゼ処置肺において，移植されたＭＳＣがホスト細胞と一緒に肺胞の再生を誘導する可能性が示唆された。【００２８】
また，移植された細胞の少数が肺胞のインターセプトに認められ，これらの細胞はｖＷＦ陽性であった（図２Ｃ）。このことは，定着したＭＳＣの一部が肺において血管内皮細胞に分化したことを示唆する。【００２９】
肺血管系の再生
エラスターゼ処置ラットにＭＳＣを静脈内移植し，エラスターゼ注入の４週間後にラットを犠牲死させ，右肺（各ｎ＝５）からパラフィン切片を調製した。ＭＳＣの移植がエラスターゼ処置肺において血管新生を誘導するか否かを調べるため，組織切片をｖＷＦ（ＤＡＫＯ）について染色して，血管密度を評価した。肺胞数およびｖＷＦ陽性毛細管（直径１００μｍ未満）の数は，無作為に選択した１０高出力視野（ｘ２００）で計数した。毛細管密度は，１００個の肺胞あたりの毛細管の数として表した。【００３０】
図３に肺におけるＭＳＣ誘起性血管新生を示す。図中，スケールバー：１００μｍ；データは平均±ＳＥＭである；＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．擬似群；†Ｐ＜０．０５ｖｓ．エラスターゼ群。図３Ａは，擬似ラット（擬似群），ベヒクルを与えたエラスターゼラット（エラスターゼ群），およびＭＳＣを与えたエラスターゼラット（エラスターゼ／ＭＳＣ群）の肺におけるｖＷＦの免疫組織化学実験を示す。ＭＳＣの移植は肺における毛細管密度を増加させた。図３Ｂは，毛細血管密度の半定量的分析の結果を示す。【００３１】
全体として，ｖＷＦ陽性の肺血管数はエラスターゼ注入の４週間後に減少した。ＭＳＣを移植すると，エラスターゼ処置肺においてｖＷＦ−ポジティブ肺血管の数が有意に増加した。【００３２】
毛細管は肺胞壁の体積の実質的な部分を形成するため，肺気腫の進行にともなって毛細管ネットワークが破壊することは避けられない（Voelkel  NF,  Cool  CD.,  Eur  Respir  J  Suppl.  2003;46:28s-32s.  Review）。したがって，肺気腫による変化を修復するためには，肺胞のみならず血管系の再生を同時に達成することが重要である。本発明においては，移植されたＭＳＣの少数がｖＷＦ陽性であり，肺において血管形成に関与することが見いだされた。さらに，ＭＳＣ移植は，エラスターゼ処置肺において減少したｖＷＦ陽性の肺血管数を有意に増加させた。これらの結果は，ＭＳＣがエラスターゼ処置ラットの肺において血管新生を誘導したことを示唆する。【００３３】
ＭＳＣにおける血管新生，抗アポトーシス，および有糸分裂促進因子の産生
ＭＳＣが血管新生，抗アポトーシス，および成長因子を産生するか否かを調べるため，培地交換の２４時間後にコンディションド培地中のＶＥＧＦおよび幹細胞成長因子（ＨＧＦ）を測定した。ＶＥＧＦおよびＨＧＦは，酵素イムノアッセイ（VEGF  Immunoassay  R&D  Systems  Inc.;  rat  HGF  EIA,Institute  of  Immunology  Co.,Ltd.）により測定した。ＭＳＣまたはベヒクルの投与の前および２４時間後にＶＥＧＦおよびＨＧＦのインビボでの循環レベルを測定した（各群ｎ＝６）。【００３４】
結果を図４に示す。図中，データは平均±ＳＥＭである；＊Ｐ＜０．０５，ｖｓ．移植前。インビトロでは，２４時間培養後，ＭＳＣは線維芽細胞と比較して大量の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および幹細胞成長因子（ＨＧＦ）を分泌していた（図４ＡおよびＢ）。インビボでは，ＭＳＣの移植は，移植の２４時間後にＶＥＧＦの血中濃度を有意に増加させ，HGFも増加傾向を示したが，ベヒクル注入はこれらのパラメータを変化させなかった（図４ＣおよびＤ）。【００３５】
移植されたＭＳＣがインビボで大量の血管新生，抗アポトーシス，および有糸分裂促進因子，例えば，ＶＥＧＦおよびＨＧＦを分泌したことは，定着したＭＳＣがパラクライン様式で血管新生を誘導した可能性を示唆する。先の血管新生の結果と合わせると，ＭＳＣは，毛細管様構造を生成する能力によるのみならず，成長因子媒介性パラクライン制御によっても，肺における新生血管形成に寄与しうると考えられる。【００３６】
肺上皮の再生
ラットにおいてエラスターゼ誘起性肺気腫に及ぼすＭＳＣの静脈内投与の効果を調べるために，以下の３つの実験群を作製した：ＭＳＣを与えたエラスターゼラット（エラスターゼ／ＭＳＣ群，ｎ＝１１）；ＰＢＳを与えたエラスターゼラット（エラスターゼ群，ｎ＝１１）；培地を与えた擬似ラット（擬似群，ｎ＝１１）。【００３７】
エラスターゼ注射の４週間後，ラットを麻酔し，コンピュータ制御小動物換気装置（flexiVent;  Scireq,  Montreal,  PQ,  Canada）を用いて静的肺コンプライアンスを測定した。肺を除去し，２５ｃｍＨ2Ｏの一定の経肺圧で２４時間固定した。肺体積は，Ｓｃｈｅｒｌｅの方法（Scherle  W.  Mikroskopie  1970;26:57-60）により測定した。肺気腫の形態計測パラメータである平均肺胞径は，先に記載されているようにして（Thurlbeck  WM.  Thorax.  1967;22:483-496），光学顕微鏡により２０の無作為に選択した視野について計算した。【００３８】
結果を図５および図６に示す。図中，データは平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．擬似群；†Ｐ＜０．０５ｖｓ．エラスターゼ群。エラスターゼ注入の４週間後，エラスターゼ群においては肺胞壁の破壊にともなう気腔拡大の発達が認められたが（図５Ａ，倍率ｘ１００），ＭＳＣの移植はエラスターゼ誘起性肺気腫の変化（エラスターゼ／ＭＳＣ群）を弱めた。エラスターゼ群における平均肺胞径は，擬似群と比較して有意に増加したが（図５Ｂ），この増加はＭＳＣにより有意に弱められた。また，エラスターゼ群の肺体積は，擬似群と比較して有意に増加していたが（図６Ａ），肺体積の増加は，ＭＳＣ移植により有意に弱められた。静的肺コンプライアンスはエラスターゼ群において有意に増加し，この変化はＭＳＣにより有意に弱められた（図６Ｂ）。【００３９】
これらの結果は，ＭＳＣの移植が，エラスターゼ処置ラットにおいて，肺体積，静的肺コンプライアンス，および平均肺胞径の増加を有意に緩和したことを示す。したがって，ＭＳＣ誘起性肺胞再生の結果として，肺の構造および機能が改善されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は，肺気腫の治療に有用である。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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