(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で、下記式(1a)
X-(Pro-Y-Gly)ｎ-OH      (1a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは１〜１８の整数）を表し、ＹはＰｒｏまたはＨｙｐを表し、ｎは１〜２０の整数を表す）で示されるペプチド成分(A)と、下記式(2a)
X-(Z)ｒ-OH      (2a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは１〜１８の整数）を表し、ＺはGly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, Arg-Gly-Asp, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Ile-Lys-Val-Ala-Val, Val-Pro-Gly-Val-Gly, Asp-Gly-Glu-Ala, Gly-Ile-Ala-Gly, His-Ala-Val, Glu-Arg-Leu-Glu, Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu, Arg-Ser-Arg-Lysから選択された一種のアミノ酸残基又はペプチド鎖を表し、ｒは１〜２の整数を表す）で示されるペプチド成分(B)と、前記式(1a)及び／又は式(2a)においてＸがHOOC-(CH２)m-CO-（ｍは前記に同じ）であるとき、下記式(3a)
H２N-R-NH２      (3a)
（式中、Ｒは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を示す）
で表される化合物(C)を反応させ、少なくとも一部が３重らせん構造を形成可能である新規なポリペプチドを製造する方法であって、
前記脱水縮合剤が、カルボジイミド系縮合剤、フルオロホスフェート系縮合剤、及びジフェニルホスホリルアジドから選択された少なくとも一種であり、
前記縮合助剤が、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類、トリアジン類及び２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルから選択された少なくとも一種であり、
ペプチド成分(A)とペプチド成分(B)とを前者(A)／後者(B)＝１００／０〜７０／３０（モル％）の割合、および、前記式(1a)及び式(2a)においてＸがＨであるとき、化合物(C)を用いることなく、前記式(1a)及び／又は式(2a)においてＸがHOOC-(CH２)m-CO-（ｍは前記に同じ）であるとき、化合物(C)をペプチド成分(A)及び／又はペプチド成分(B)の総量１モルに対して実質的に１モルの割合で縮合させる方法。
【請求項２】
反応が非水系溶媒中で行われる方法であって、脱水縮合剤の割合が、請求項１に記載の反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、０．７〜５モルである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
反応が水系溶媒中で行われる請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
反応が水系溶媒中で行われる方法であって、脱水縮合剤の割合が、請求項１に記載の反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、２〜５００モルである請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
縮合助剤の割合が、請求項１に記載の反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、０．５〜５モルである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ｍが２〜１２の整数、ＲがＣ２−１２アルキレン基である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
ｎが１〜３である請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
ポリペプチドの分子量が２×１０４〜１００×１０４の範囲にピークを示す請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なポリペプチドおよびその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、病原体感染の危険性や好ましくない副作用が無く、安全性の高い生体材料又は生体適合材料、例えば、組織工学用の担体又は支持体、再生医療用の担体又は支持体、組織接着剤や癒着防止材、手術用縫合糸、止血材、コンタクトレンズなどの医療用材料、医薬品の製剤素材、化粧品の素材などとして有用な新規なポリペプチドおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、あらゆる多細胞動物にみられる繊維状蛋白質であり、皮膚や骨の主成分として哺乳類では全蛋白質の２５％を占める。典型的なコラーゲン分子は、３本のコラーゲンポリペプチド鎖が三重らせん構造と呼ばれるロープ状の超らせん構造をとる。コラーゲンには、プロリン（Pro）とグリシン（Gly）とが特に多く含まれ、両アミノ酸残基とも安定な３重らせん構造の形成に重要である。
【０００３】
コラーゲンの生体材料としての利用方法には、例えば、ブタの皮膚組織をそのままあるいは凍結乾燥した後、火傷などによる皮膚の損傷部位に移植する方法、酵素処理などによって細胞成分を除去して用いる方法、酸性溶液や酵素処理によって可溶化したコラーゲンを、所望の形態に再構成して用いる方法がある。一般的なコラーゲンの調製方法および定性方法は、Methods Enzymol., Vol.82, pp33-64, 1982年（非特許文献１）に記載されている。
【０００４】
コラーゲンの利用について種々の提案がなされている。例えば、特開平０８−０２７１９２号公報（特許文献１）には、皮膚に潤いを与え、かつ皮膚をなめらかにするため、コラーゲンを含有する動物組織をアルコールでエステル化して修飾した後、修飾コラーゲンを抽出するコラーゲン誘導体の製造方法、およびそれを用いた化粧品基剤が提案されている。
【０００５】
特開平０７−０９７４５４号公報（特許文献２）には、可溶性コラーゲンを、メチレン鎖の両端にイミドエステル基を有するアルキレンジイミデート二価性架橋試薬で架橋処理することにより、熱変性後における三重らせん構造の再生率が高く、水に可溶性の架橋コラーゲンの製造方法が記載されている。
【０００６】
特開平０８−０５３５４８号公報（特許文献３）には、コラーゲンを第１の合成親水性ポリマーと反応させてコラーゲン−合成ポリマーマトリックスを形成し、さらにコラーゲン−合成ポリマーマトリックスを、第２の合成親水性ポリマー、生物学的活性物質、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、化学的架橋剤、エステル化剤、アミド化剤、アシル化剤、アミノ酸、ポリペプチドなどと反応させることにより、免疫原性が低く、種々の医療用途で使用される生体適合性移植物の調製に有用なコラーゲン−合成ポリマーマトリックスが記載されている。
【０００７】
特開平０７−２７８３１２号公報（特許文献４）には、ｐＨ７で実質的に非繊維形態である化学的修飾コラーゲンと共有結合した親水性合成ポリマーを含む結合体が記載されている。この文献には、前記結合体が、特に眼科用デバイスにおいて有用であり、光学的に透明で生体適合性を有することが記載されている。
【０００８】
特開平０５−０００１５８号公報（特許文献５）には、コラーゲンマトリックスを砕断し、この砕断マトリックスを高遠心場で遠心し、沈殿を均質化してペーストとし、該ペーストを注型し、注型したペーストを３７℃以下の温度で乾燥するコラーゲン膜状物質の製法が記載されている。このコラーゲン膜状物質は、生体適合性で非炎症性、かつ人工移植物として組織の修復に有用であることも記載されている。
【０００９】
特開平０５−１２５１００号公報（特許文献６）には、魚鱗をそのまま若しくは脱灰した後、ペプシン処理することにより、高純度の可溶性魚鱗コラーゲンとその製造方法が記載されている。
【００１０】
特開平０６−２２８５０６号公報（特許文献７）には、７０〜９０％エタノール媒質中に、コラーゲン溶液をノズルより吐出して、糸状物あるいは膜状物を生成し、乾燥した後、裁断又は粉砕することにより、粒状又は粉状の可溶性コラーゲン乾燥物を製造する方法が記載されている。
【００１１】
特開平０８−２７６００３号公報（特許文献８）には、未焼成のヒドロキシアパタイト単結晶を、低抗原性化したコラーゲン線維の少なくとも一部に付着させ、骨などの生体硬組織を修復する材料として用いることが記載されている。
【００１２】
特開平０８−０４１４２５号公報（特許文献９）には、動物又は人間由来のコラーゲン中のプリオンを除去するために、コラーゲン溶液中の細胞および組織の断片を除去し、アルカリ処理する方法およびこの方法により得られるコラーゲンが記載されている。
【００１３】
また、コラーゲン類似物の化学合成の方法に関し、Pro-Ser-Glyのp-ニトロフェニルエステル、あるいはPro-Ala-Glyのp-ニトロフェニルエステルをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えて24時間静置することにより、分子量が16,000〜21,000の可溶性ポリアミドが得られることが報告されている（J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972年（非特許文献２））。これらの可溶性ポリアミドは円二色性スペクトルから３重らせん構造をとることが推定されているが、得られたポリマーの性質に関する記述はない。
【００１４】
エラスチン由来のVal-Pro-Gly-Val-Gly配列を含む５０量体のペプチドをジメチルスルホキシドに溶解し、２当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、および１．６当量のＮ−メチルモルフォリンを加えて１４日間静置した後、分子量カットオフが５万の透析膜で透析してポリアミドを得る方法も報告されている（Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46, pp.453-463, 1995年（非特許文献３））。
【００１５】
一方、前記特開平08-041425号公報に記載されているように、ヒツジの振戦病やウシの海綿状脳症の原因物質がプリオンと呼ばれる伝染性蛋白質であり、この伝染性タンパク質がヒトのクロイツフェルドーヤコブ病伝染の原因の一つと言われている。プリオンは、蛋白質であり、通常の滅菌、殺菌方法では失活し難く、しかも種を越えて感染することが指摘されている（Nature Review, Vol.2, pp.118-126, 2001年（非特許文献４））。
【００１６】
一般に、医療用具や医薬品、化粧品ではウシやブタ由来のコラーゲンを原料として用いることが多い。そのため、通常の滅菌、殺菌方法では除去できないプリオンなどの病原体（又は病原性因子）の感染（又は伝達）の危険性が常に存在している。
【００１７】
また、天然のコラーゲン中には種々の細胞接着サイトが含まれているため、用途に応じた細胞選択性が発揮できない。例えば、神経の軸索誘導材料としてコラーゲンを用いると、軸索の伸長速度より周囲の繊維芽細胞の遊走、増速速度が大きく瘢痕組織化して軸索が伸長することができない。このため、繊維芽細胞の遊走を防ぐ材料でコラーゲンの周囲を覆うことなどの措置が必要となる。
【特許文献１】特開平０８−０２７１９２号公報
【特許文献２】特開平０７−０９７４５４号公報
【特許文献３】特開平０８−０５３５４８号公報
【特許文献４】特開平０７−２７８３１２号公報
【特許文献５】特開平０５−０００１５８号公報
【特許文献６】特開平０５−１２５１００号公報
【特許文献７】特開平０６−２２８５０６号公報
【特許文献８】特開平０８−２７６００３号公報
【特許文献９】特開平０８−０４１４２５号公報
【非特許文献１】Methods Enzymol., Vol.82, pp33-64, 1982年
【非特許文献２】J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972年
【非特許文献３】Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46, pp.453-463, 1995年
【非特許文献４】Nature Review, Vol.2, pp.118-126, 2001年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞のない新規なポリペプチドおよびその製造方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、安全性の高い生体材料又は生体適合材料として有用な新規なポリペプチドおよびその製造方法を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、二量化や環化反応を抑制しつつ、前記のような特性を有するポリペプチドを効率よく製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは前記課題を解決するため鋭意検討の結果、特定のペプチド成分を縮合すると環化することなくコラーゲン様ポリペプチドが生成することを見出し、本発明を完成した。
【００２２】
すなわち、本発明では、下記式(1a)
X-(Pro-Y-Gly)ｎ-OH      (1a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは１〜１８の整数）を表し、ＹはＰｒｏまたはＨｙｐを表し、ｎは１〜２０の整数を表す）で示されるペプチド成分(A)と、下記式(2a)
X-(Z)ｒ-OH      (2a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは１〜１８の整数）を表し、Ｚは１〜１０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を表し、ｒは１〜２０の整数を表す）で示されるペプチド成分(B)とを反応させてポリペプチドを生成させる。
【００２３】
この反応において、前記式(1a)及び式(2a)においてＸがＨであるとき、下記式(3a)で表される化合物(C)を用いることなく、前記式(1a)及び／又は式(2a)のＸがHOOC-(CH２)m-CO-（ｍは前記に同じ）であるとき、下記式(3a)で表される化合物(C)が併用される。
【００２４】
H２N-R-NH２      (3a)
（式中、Ｒは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を示す）
前記ペプチド成分(A)とペプチド成分(B)との割合は、例えば、前者(A)／後者(B)＝１００／０〜３０／７０（モル％）程度であり、化合物(C)の使用量は、例えば、ペプチド成分(A)及び／又はペプチド成分(B)の総量１モルに対して実質的に１モル程度である。
【００２５】
反応は、通常、溶媒（水及び／又は有機溶媒）中、少なくとも脱水縮合剤（例えば、カルボジイミド系縮合剤、フルオロホスフェート系縮合剤、ジフェニルホスホリルアジドなど）の存在下で、各成分(1)〜(3)を縮合させることにより行うことができる。また、反応は、前記脱水縮合剤と縮合助剤（又は脱水助剤）（例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類など）、トリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなど）との存在下で行ってもよい。非水系溶媒（水を含まない溶媒）中で反応を行う場合、脱水縮合剤の割合は、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、０．７〜５モル程度であってもよく、水系溶媒（水を含む溶媒）中で反応を行う場合、脱水縮合剤の割合は、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、２〜５００モル程度であってもよい。縮合助剤の割合は、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、０．５〜５モル程度であってもよい。
【００２６】
前記式(1)〜(3)のユニットで構成されたポリペプチドにおいて、通常、ｍは２〜１２の整数、ｎは１〜１５の整数であり、Ｚは、Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, His, Ala，Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基で構成されているペプチド鎖である。また、前記式において、通常、ｒは１〜１０の整数、ＲはＣ２−１２アルキレン基である。ｎは、１〜３であってもよい。
【００２７】
前記ポリペプチドは、通常、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。そのため、ポリペプチドの少なくとも一部（一部または全部）は、通常、３重らせん構造を形成している。また、前記ポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）を形成可能である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の新規なポリペプチドは、病原体感染の危険性や副作用の虞がなく、安全性が高く細胞親和性にも優れている。しかも、二量化や環化反応を抑制しつつ、縮合反応という簡単な操作で、前記ポリペプチドを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
【００３０】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Hyp ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Sar ：サルコシン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に位置させ、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて、ペプチド鎖のアミノ酸配列を記述する。
【００３１】
本発明の新規なポリペプチドを構成するペプチドユニット(1) ［-(OC-(CH２)ｍ-CO)ｐ-(Pro-Y-Gly)ｎ-］は、Pro-Y-Glyの繰返し配列を含むことが必要である。Pro-Y-Glyの繰返し数が、少ないと３重らせん構造の安定性が減少し、繰返し数が多すぎるとペプチドの合成が困難になる。従って、繰返し数ｎは、１〜２０、好ましくは２〜１５（例えば、３〜１５）、さらに好ましくは５〜１５程度である。
【００３２】
前記式(1)において、Ｙは、ＰｒｏまたはＨｙｐいずれであってもよいが、３重らせん構造の安定性からＨｙｐであるのがより好ましい。なお、Ｈｙｐは、通常、４Ｈｙｐ（例えば、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン)残基である。
【００３３】
さらに、メチレン鎖(CH２)の繰り返し数を示すｍは、ポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない範囲であればよいが、通常、１〜１８、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは２〜１０（特に２〜６）程度である。ｐは０又は１である。
【００３４】
前記ペプチドユニット(2)［-(OC-(CH２)ｍ-CO)ｑ-(Z)ｒ-］において、Ｚは１〜１０個のアミノ酸残基で構成された任意の配列のペプチド鎖を表す。Ｚは、得られるポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない限り、どのような配列でもよい。ポリペプチドが有用な物理的および生物学的性質を発揮するためには、例えば、ペプチド鎖Ｚは、通常、Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, His, Ala，Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基、特に、Gly, Ser, Glu, Asp, Lys、Arg、Proから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基を有している場合が多い。ペプチド鎖Ｚは、Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, Arg-Gly-Asp, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Ile-Lys-Val-Ala-Val, Val-Pro-Gly-Val-Gly, Asp-Gly-Glu-Ala, Gly-Ile-Ala-Gly, His-Ala-Val, Glu-Arg-Leu-Glu, Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu, Arg-Ser-Arg-Lysで示される配列を含むのが好ましい。
【００３５】
ペプチド鎖Ｚの繰り返し数を示すｒは、得られるポリペプチドが物理的および生物学的性質を発揮する範囲であればよい。繰返し数ｒが多すぎると合成が困難になり、また得られるポリペプチドの物理的性質が変化しやすい。従って、繰返し数ｒは、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５程度である。
【００３６】
メチレン鎖(CH２)の繰り返し数を示すｍは、前記式(1)と同様に、１〜１８、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは２〜１０（特に２〜６）程度である。ｑは０又は１である。
【００３７】
前記式(1)及び(2)において、ｐ及びｑのうち少なくとも一方が０であるとき、ポリペプチドは、前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］を含んでいる。この前記式(3)で表されるユニットにおいて、Ｒで表される直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基は、ポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない範囲であればよく、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレンなどのＣ１−１８アルキレン基が例示できる。前記アルキレン基Ｒは、直鎖状のメチレン鎖(CH２)ｓ（ｓは１〜１８の整数を表す）であってもよい。好ましいＲは、Ｃ２−１２アルキレン基（さらに好ましくはＣ２−１０アルキレン基，特にＣ２−６アルキレン基）である。
【００３８】
前記式(1)で表されるペプチドユニットと前記式(2)で表されるペプチドユニットとの割合（ａ／ｂ）は、１００／０〜３０／７０（モル比）、好ましくは１００／０〜４０／６０（モル比）、さらに好ましくは１００／０〜５０／５０（モル比）程度である。
【００３９】
さらに、前記式(3)で表されるユニットの割合は、前記式(1)のｐの値、前記式(2)のｑの値に応じて選択でき、ｐ＝１及びｑ＝０であるとき、ｃ＝ａ（＝１）であり、ｐ＝０及びｑ＝１であるとき、ｃ＝ｂ（＝１）である。また、ｐ＝１及びｑ＝１であるときｃ＝ａ＋ｂ（＝２）であり、ｐ＝０及びｑ＝０であるときｃ＝０である。
【００４０】
すなわち、本発明のポリペプチドには、（ａ）前記式(1)でｐ＝０であるペプチドユニット［-(Pro-Y-Gly)ｎ-］ａの繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｂ）前記式(1)でｐ＝０であるペプチドユニット［-(Pro-Y-Gly)ｎ-］ａと前記式(2)でｑ＝０であるペプチドユニット［-(Z)ｒ-］ｂとをａ：ｂの割合（モル％）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｃ）前記式(1)でｐ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH２)ｍ-CO)-(Pro-Y-Gly)ｎ-］ａと前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］ｃとをａ：ｃの割合（モル％）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｄ）前記式(1)でｐ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH２)ｍ-CO)-(Pro-Y-Gly)ｎ-］ａと前記式(2)でｑ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH２)ｍ-CO)-(Z)ｒ-］ｂと前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］ｃとをａ：ｂ：ｃの割合（モル％）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドが含まれる。
【００４１】
このようなポリペプチドは、環化により６員環を形成することなく、鎖状のポリペプチドを形成しており、溶媒（水、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの環状エーテル、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類などの親水性溶媒又はそれらの混合溶媒）に可溶である。ポリペプチドは、水系ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）において、球状蛋白質換算で、例えば、分子量５×１０３〜１００×１０４、好ましくは１×１０４〜１０×１０４程度の範囲にピークを示す。
【００４２】
さらに、本発明の新規なポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）を形成可能である。すなわち、本発明のポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。そのため、本発明のポリペプチドの少なくとも一部（すなわち、一部または全部）が３重らせん構造を形成可能であり、コラーゲン様ポリペプチドを形成する。なお、コットン効果とは、旋光性物質において特定の波長で左右の円偏光に対する吸収係数が異なるために起こる現象をいう。
【００４３】
本発明の新規なポリペプチドは、前記成分(1a)〜(3a)を縮合反応に供することにより得ることができる。本発明のペプチド鎖の合成は、通常のペプチド合成方法に従って行うことができる。ペプチドは、例えば、固相合成法または液相合成法によって調製できるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。ペプチド合成には、慣用の方法、例えば、縮合剤を用いるカップリング方法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル（ONp）、ペンタフルオロフェニルエステル（Opfp）などのフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ONSu）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミドエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（Obt）など）、混合酸無水物法、アジド法などが利用できる。好ましい方法では、少なくとも縮合剤（好ましくは下記の縮合剤、特に下記の縮合剤と縮合助剤との組合せ）を用いる場合が多い。
【００４４】
さらに、ペプチドの合成では、アミノ酸又はペプチドフラグメントの種類に応じて、アミノ基、カルボキシル基、他の官能基（グアニジノ基、イミダゾリル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、ω−カルボキシル基など）の保護基による保護と、接触還元や強酸処理（無水フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）による保護基の脱離・除去とが繰り返し行われる。例えば、アミノ基の保護基には、ベンジルオキシカルボニル基(Z)、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基(Z(OMe))、９−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基(Npys)などが利用でき、カルボキシル基の保護基には、ベンジルオキシ基(OBzl)，フェナシルオキシ基(OPac)，ｔ−ブトキシ基(OBu)、メトキシ基(OMe)、エトキシ基(OEt)などが利用できる。なお、ペプチド合成には自動合成装置を利用してもよい。
【００４５】
より具体的には、本発明のペプチド鎖の固相合成法による調製は、慣用の方法で行うことができる。固相樹脂（又は担体）としては、反応溶媒に不溶性の重合体、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが利用できる。
【００４６】
固相合成法では、通常、(i)前記重合体（樹脂）に対して、目的とするペプチドのＣ末端からＮ末端の方向に向かって、遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに官能基（少なくともＮ末端のα−アミノ基など）が保護基で保護されたアミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作と、(ii)結合したアミノ酸又はペプチド断片のうちペプチド結合を形成するα−アミノ基の保護基を除去する操作と、(iii)上記結合操作と除去操作とを順次繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させて目的ペプチドに対応するペプチド鎖を形成する工程と、(iv)ペプチド鎖を重合体（樹脂）から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより、目的とするペプチドを生成させ、生成したペプチドを精製することにより、ペプチドを製造できる。前記アミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作(i)では、前記ペプチド鎖のＣ末端に対応し、かつ遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに少なくともＮ末端が保護基で保護されたアミノ酸（例えば、Fmoc−アミノ酸、Boc−アミノ酸など）が使用される。なお、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、生成したペプチドの精製は、逆相液体クロマトグラフィーやゲルパーミエイションクロマトグラフィーなどの分離精製手段を利用して行うことができる。
【００４７】
本発明では、少なくとも下記式(1a)で表されるペプチド成分(A)を縮合し、ポリペプチドを調製する。
【００４８】
X-(Pro-Y-Gly)ｎ-OH      (1a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは前記に同じ）を表し、Ｙ及びｎは前記に同じ）
前記式(1a)で表されるペプチド成分(A)は、下記式(2a)で示されるペプチド成分(B)と共縮合させて、本発明のポリペプチドを調製してもよい。
【００４９】
X-(Z)ｒ-OH      (2a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH２)ｍ-CO-（ｍは前記に同じ）を表し、Ｚ及びｒは前記に同じ）
なお、前記ＸがHOOC-(CH２)ｍ-CO-に対応する化合物としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などのＣ３−２０の脂肪族ジカルボン酸又はそれらの酸無水物などが例示できる。これらの化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの化合物も慣用のアミド結合生成法（例えば、後述する第三級アミンなどを触媒とする反応など）反応や前記ペプチド合成法に従って反応させることにより、前記(1a)及び(2a)で示される化合物を得ることができる。
【００５０】
ペプチド成分(A)とペプチド成分(B)との使用割合は、例えば、前者(A)／後者(B)＝１００／０〜３０／７０（モル％）、好ましくは１００／０〜４０／６０（モル％）、さらに好ましくは１００／０〜５０／５０（モル％）程度である。
【００５１】
さらに、前記式(1a)及び／又は式(2a)においてＸがＨである場合には必要ではないが、ＸがHOOC-(CH２)m-CO-（ｍは前記に同じ）であるとき、前記ペプチド成分(A)及び／又はペプチド成分(B)は、アミド基を形成するため、下記式(3a)で表される化合物(C)との共縮合反応に供される。
【００５２】
H２N-R-NH２      (3a)
（式中、Ｒは前記に同じ）
前記式(3a)で表される化合物としては、前記式(3)に対応するジアミン類、例えば、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどのＣ１−１８アルキレンジアミン、ジエチレントリアミン、ヘキサメチレンテトラミンなどのポリアルキレンポリアミン類などが例示できる。これらの化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００５３】
前記ジアミン化合物(C)の使用量は、例えば、ペプチド成分(A)及び／又はペプチド成分(B)の総量１モルに対して、実質的に１モル（例えば、０．９５〜１．０５モル程度）用いる必要がある。なお、前記ペプチド成分(A)(B)のうち一方のペプチド成分がＸ＝HOOC-(CH２)m-CO-（ｍは前記に同じ）を有する場合、このような基を有するペプチド成分１モルに対して、前記ジアミン化合物(C)の使用量は、実質的に１モル（例えば、０．９５〜１．０５モル程度）用いる必要がある。
【００５４】
これらの成分(1a)(2a)(3a)の反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、上記ペプチド成分および化合物を溶解又は懸濁（一部または全部を溶解）可能であればよく、通常、水及び／又は有機溶剤が使用できる。溶媒としては、例えば、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミドなど）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンなど）、ニトリル類（アセトニトリルなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコールなど）、およびこれらの混合溶媒が例示できる。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが繁用される。
【００５５】
これらの成分(1a)(2a)(3a)の反応は、通常、少なくとも脱水剤（脱水縮合剤）の存在下で行うことができ、脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、二量化や環化を抑制しつつ、円滑にポリペプチドを生成できる。
【００５６】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に制限されず、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC=WSCI)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)など］、フルオロホスフェート系縮合剤［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP)など］、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)などが例示できる。これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩］である。
【００５７】
縮合助剤は、上記縮合剤の反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（HONB）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類［例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類］、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン(HOObt)などのトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが例示できる。これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類［HONSuなど］、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類［HOBtなど］である。
【００５８】
前記脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用できる。前記脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯｂｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯｂｔ）などが例示できる。
【００５９】
脱水縮合剤の使用量は、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）程度である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、通常、２〜５００モル（例えば、２〜５０モル）、好ましくは５〜２５０モル（例えば、５〜２５モル）、さらに好ましくは１０〜１２５モル（例えば、１０〜２０モル）程度である。縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、前記反応成分(1a)(2a)及び(3a)の総量１モルに対して、例えば、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モル程度である。
【００６０】
本発明の縮合反応において、反応系のｐＨを調節してもよく、反応に関与しない塩基を添加してもよい。ｐＨの調節は、通常、無機塩基［水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど］、有機塩基、無機酸［塩酸など］や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液が中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）にｐＨ調整される。前記反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチド成分および化合物中のアミノ基の総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００６１】
本発明において、前記式X-(Pro-Y-Gly)ｎ-OHで表されるペプチド鎖、および得られたポリペプチドが３重らせん構造を形成することは、通常、前記ペプチド鎖やポリペプチドの溶液について、円二色性スペクトルやゲルパーミエーションクロマトグラフィーを測定することにより立証できる。特に、円二色性スペクトルにおいては、３重らせん構造を形成する天然のコラーゲンおよびペプチド鎖が、波長２２０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を特徴的に示すことが報告されている（J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972年）。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーでは、３重らせん構造を形成する３量体の分子量に相当するピークが、単量体のピークと分離して観測されるので、３重らせん構造を形成するペプチドの割合が計算できる。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、コラーゲン組織を形成可能であり、副作用を起こさない。更に、病原体や病原性因子［例えば、病原性に転化したタンパク質（例えば、異常型プリオンなど）など］の感染や伝達の危険性がない。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、被検体（被験体）の組織（例えば、表皮組織及び真皮組織など）へ適用できる。被検体としては、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物）が例示できる。また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに由来して生じる感染又は伝達（例えば、ポリペプチドに存在する病原体又は病原性因子などの感染又は伝達）などを抑制又は予防するために使用できる。そのため、本発明のポリペプチドは、例えば、患部［例えば、疾病部や損傷部（例えば、擦傷および火傷などの損傷部）など］や、切開部［例えば、手術などの切開部など］において有効に利用できる。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、通常の公知の方法で種々の用途に応じて成形できる。そのため、ポリペプチドの利用形態は、液状（溶液又は懸濁液など）、粉粒状、二次元的形態（フィルムやシートなど）や三次元的形態であってもよい。例えば、ポリペプチドの溶液または懸濁液を、剥離性ベース（例えば、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート）上に流延して、乾燥することにより、ポリペプチドのシートやフィルムが得られる。また、高濃度の塩を含む溶液またはポリペプチドを溶解しない溶剤中に、ポリペプチドの溶液または懸濁液をノズルから押し出すことにより繊維状物が得られる。さらに、ポリペプチドの水溶液または懸濁液をそのまま静置したり、必要により多価架橋性試薬（グルタルアルデヒドなど）を添加して静置することによりゲル状物を得ることができる。さらに、生成したゲル状物を凍結乾燥することによりスポンジ状の多孔質体を得ることができる。さらには、ポリペプチドの水溶液または懸濁液を撹拌発泡して乾燥することによっても多孔質体を得ることもできる。
【００６５】
さらに、本発明のポリペプチドは被覆剤として利用してもよい。例えば、前記ポリペプチドの溶液または懸濁液を、基材の表面に塗布又は散布した後、乾燥することにより、基材の表面を本発明のポリペプチドで被覆することができる。前記基材は、金属、セラミックス、プラスティック、天然高分子などの様々な材料で作られた成形体であってもよく、成形体の形態は、粉粒状、線状又は繊維状、フィルム又はシート状などの二次元的構造や三次元的構造を有していてもよい。さらには、多孔質体（粉粒状多孔質体、セルロース繊維紙、不織布や織布などの二次元的多孔質体、円筒状などの三次元的多孔質体）にポリペプチドの溶液または懸濁液を含浸させ、ポリペプチドを保持させてもよい。
【００６６】
本発明のポリペプチドを医療用途に用いる場合には、殺菌又は滅菌して用いることが好ましい。殺菌、滅菌方法としては、種々の殺菌・滅菌方法、例えば、湿熱蒸気滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、薬剤殺菌、紫外線殺菌などが用いられる。これらの方法のうち、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌は、滅菌効率と材料に与える影響が少なく好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のポリペプチドは、安全性が高い。また、細胞親和性や生体適合性にも優れている。そのため、生体材料又は生体適合材料、例えば、人工コラーゲンなどとして有用である。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、例えば、組織工学用の担体又は支持体、再生医療用の担体又は支持体（人工皮膚など）、組織接着剤や癒着防止材、手術用縫合糸、止血材、コンタクトレンズなどの医療用材料、医薬品の製剤素材（又は基剤）、化粧品の素材（又は基剤）、食品添加剤などとして利用できる。
【実施例】
【００６９】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７０】
実施例１
式：H-(Pro-Pro-Gly)10-OH（配列番号：１）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)を0.25mg/mLの濃度で５０％のメチルアルコールを含む水に溶解し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-725、光路長：１ｍｍ）。その結果、227nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。また、同じ溶液について、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex Peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM リン酸緩衝液phosphate buffer（pH 7.4））により分子量の測定を行ったところ、３重らせん構造に相当する分子量約9000と、単量体に相当する分子量約3000の２本のピークが認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。ピークの面積から求めた３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約50％であった。なお、H-(Pro-Pro-Gly)10-OHを0.25mg/mLの濃度で水に溶解した溶液では、227nmに弱い正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測されたが、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーでは３量体に相当するピークは、極くわずかしか観測されず、３重らせん構造を形成しているペプチドの割合はほぼ0％であった。
【００７１】
5mg（0.002mmol）のH-(Pro-Pro-Gly)10-OHを2mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.31mg（0.0024mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.32mg（0.0024mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.46mg（0.0024mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【００７２】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が4万〜20万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７３】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、227nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７４】
実施例２
式：H-(Pro-Pro-Gly)５-OH（配列番号：２）で示されるペプチド鎖をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g (樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【００７５】
得られたペプチド樹脂（ペプチドを結合した樹脂）を、10mLのジメチルホルムアミドに懸濁し、50mg（0.5mmol）の無水コハク酸と13mg（0.1mmol）のジイソプロピルエチルアミンを加えて、室温で１２時間反応した。その後、メチルアルコールとジクロロメタンで交互に洗浄し、減圧乾燥した。
【００７６】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム14.5minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は1375であった(理論値：1374.52)。
【００７７】
得られたHOOC-(CH２)２-CO-(Pro-Pro-Gly)５-OHを、水、または50%のメチルアルコールを含む水に溶解し、濃度0.25mg/mLの溶液を調製し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-725、光路長：1mm）。いずれの溶媒中でも、220nm〜230nmの範囲に正のコットン効果は観測されず、200nm〜202nmに負のコットン効果のみが観測され、３重らせん構造を形成していないことが確認された。また、同じ溶液についてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex Peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））により分子量の測定を行ったところ、単量体に相当する分子量が2000以下にピークが１本認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。ピークの面積から求めた３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は0％であった。
【００７８】
1.4mg(0.001mmol)のHOOC-(CH２)２-CO-(Pro-Pro-Gly)５-OHと、0.06mg (0.001mmol)のエチレンジアミンとを0.05mLの水に懸濁し、混合液に、0.32mg（0.0024mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、4.6mg（0.024mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、室温で３日間振盪した。
【００７９】
反応溶液を水で100倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））により分子量を測定したところ、分子量が3万〜20万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８０】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、228nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００８１】
実施例３
式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を水、または50%のメチルアルコールを含む水に溶解し、濃度0.25mg/mLの溶液を調製し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-725、光路長：1mm）。水中では、225nmに正のコットン効果、195nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。また、同じ溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex  Peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、３重らせん構造に相当する分子量約9000のピークが１本認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。ピークの面積から求めた３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約100％であった。50%のメチルアルコールを含む水中でもほぼ同様の結果で、３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約100％であった。
【００８２】
5mg（0.0016mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)10-OHを2mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.23mg（0.0018mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.24mg（0.0018mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.65mg（0.0034mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【００８３】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が６万〜20万以上の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８４】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００８５】
得られたポリペプチドの水懸濁液をフッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート上に流延した後、風乾することによりキャストフィルムを作製した。このフィルムに金を蒸着した後、走査型電子顕微鏡で観測すると、図１に示すような繊維状の構造物が観測された。
【００８６】
実施例４
式：H-(Pro-Pro-Gly)5-OHで示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を水、または50%のメチルアルコールを含む水に溶解し、濃度0.25mg/mLの溶液を調製し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-725、光路長：1mm）。いずれの溶媒中でも、220nm〜230nmの範囲に正のコットン効果は観測されず、200nm〜202nmに負のコットン効果のみが観測され、３重らせん構造を形成していないことが確認された。また、同じ溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex Peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、単量体に相当する分子量が2000以下にピークが１本認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。ピークの面積から求めた３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は0％であった。
【００８７】
3.5mg（0.0026mmol）のH-(Pro-Pro-Gly)5-OHと、実施例２と同様の方法で合成した0.92mg（0.0011mmol）のH-(Val-Pro-Gly-Val-Gly)2-OH（配列番号：４）とを所定の割合（70モル％：30モル％）で1.5mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.52mg（0.0040mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.51mg（0.0038mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、1.45mg（0.0076mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【００８８】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））により分子量を測定したところ、分子量が8万〜45万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８９】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、227nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００９０】
得られたポリペプチドの水懸濁液をフッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート上に流延した後、風乾することによりキャストフィルムを作製した。このフィルムを、150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4）に浸漬するとシート状のゲル状物が得られた。このシート状のゲル状物は、室温では透明であったが、40℃以上の温度で可逆的に白濁した。
【００９１】
実施例５
式：H-(Pro-Hyp-Gly)5-OH（配列番号：５）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を水、または50%のメチルアルコールを含む水に溶解し、濃度0.25mg/mLの溶液を調製し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-725、光路長：1mm）。水中では、223nmに正のコットン効果、201nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。また、同じ溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex Peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、３重らせん構造に相当する分子量約4100のピークが１本認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。ピークの面積から求めた３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約100％であった。50%のメチルアルコールを含む水中でもほぼ同様の結果で、３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約100％であった。
【００９２】
5mg（0.0033mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)5-OHを2 mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.44mg（0.0034mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.46mg（0.0033mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、1.3mg（0.0068mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で14日間撹拌を続けた。
【００９３】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が4万〜10万以上の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００９４】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００９５】
実施例６
5mg（0.0016mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を0.5mLの10mMリン酸塩緩衝液（8.1mMのNa2HPO4・12H2O、1.5mMのKH2PO4、2.7mMのKCl、pH 7.4）に溶解し、20℃で撹拌した。この溶液に、0.24mg（0.0018mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、31mg（0.16mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で24時間撹拌を続けた。
【００９６】
反応溶液を水で60倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM リン酸塩緩衝液（pH 7.4））に供したところ、平均分子量４０万に相当するポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００９７】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００９８】
実施例７
式：H-(Pro-Hyp-Gly)1-OHで示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を濃度0.25mg/mLの濃度で水に溶解し、円二色性スペクトルを測定した（日本分光（株）社製、J-820、光路長：1mm）。その結果、214nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していないことが確認された。また、同じ溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex peptide PE 7.5/300、流速：0.25mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mMリン酸塩緩衝液（pH 7.4））に供したところ、単量体に相当する分子量約250のピークが１本認められた。分子量はGel Filtration LMW Calibration Kit（アマシャム・バイオサイエンス（株）製）、ヒトインスリン（sigma社製）及びグリシン（和光純薬（株）製）を標準物質として使用し、算出した。３重らせん構造を形成しているペプチドの割合は約0％であった。
【００９９】
25mg（0.088mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)1-OHを2.5mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH 7.4）に溶解し、20℃で撹拌した。この溶液に、12.1mg（0.09mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、168mg（0.88mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で24時間撹拌を続けた。
【０１００】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM リン酸塩緩衝液（pH 7.4））に供したところ、分子量が２万〜３万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１０１】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１０２】
試験例
実施例１および３で得られたポリペプチドから作製したキャストフィルムに25kGyのガンマ線を照射して滅菌した。このフィルム上にマウス正常繊維芽細胞株NIH3T3を約10,000個分注し、ウシ胎児血清を10％含む培地（Eagle’s Minimum Essential Medium）中で、5％ＣＯ2存在下、37℃で３日間培養した。NIH3T3細胞は、実施例１および３で得られたポリペプチドからなるフィルムに良好に接着・増殖し、細胞の形態などに異常は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は実施例３で得られたフィルムを示す走査電子顕微鏡写真である。
【図１】
0005162363.tif 000002
【配列表】
0005162363000001.app