(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞増殖因子のアミノ酸配列におけるＣｙｓ３９−Ｈｉｓ８３、Ｈｉｓ９−Ｇｌｕ８０、Ｐｈｅ１１−Ｈｉｓ８３、Ｇｌｎ１−Ｈｉｓ８３、Ｐｈｅ１１−Ａｓｎ９６、若しくはＧｌｎ１−Ａｓｎ９６のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドの標識体、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなるヘパリン結合活性を有するポリペプチドの標識体を含む虚血性疾患又は悪性腫瘍の画像診断薬。
【請求項２】
前記部分ポリペプチドが、前記ヒト肝細胞増殖因子のアミノ酸配列におけるＰｈｅ１１−Ｈｉｓ８３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項１記載の画像診断薬。
【請求項３】
肝細胞増殖因子受容体イメージング剤である請求項１又は２記載の画像診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の受容体（ｃ−Ｍｅｔ）が関与する種々の疾患をイメージングによって検出する試薬及びこれらの疾患の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、分子量約６９ｋＤａのα鎖と３４ｋＤａのβ鎖が一本のジスルフィド結合で結ばれた約８５ｋＤａのヘテロ二量体のタンパク質である。α鎖にはヘアピンループ構造（アミノ酸配列Ｃｙｓ３９−Ｃｙｓ６５）と４つの連続したクリングル構造（アミノ酸配列Ｃｙｓ９７−Ｃｙｓ４３８）により構成されている。また、Ｎ末端のヘアピンループ構造を含む部位がヘパリンと結合することが知られている（非特許文献１）。β鎖にはセリンプロテアーゼに類似した構造（アミノ酸配列４９５−７２８）があり、全体として、プラスミノーゲンと約４０％の相同性を示すが、プロテアーゼ活性はない。ヒトでは染色体７ｑ２１に位置しており、Ｍｉｙａｚａｗａらによりクローニングされた（非特許文献２、３）。【０００３】
当初、ＨＧＦは、肝切除後の肝組織の再構成を調節する増殖因子と考えられたが（非特許文献４、５）、肝細胞（組織）の他にも、腎臓細管上皮細胞（非特許文献６）や乳腺の上皮細胞（非特許文献７）、メラニン細胞（非特許文献８）、表皮細胞（非特許文献９）、血管内皮細胞（非特許文献１０、１１）等、様々な上皮系細胞や内皮細胞、さらに一部の間葉系細胞の増殖促進活性があることが明らかになった（非特許文献１２）。【０００４】
ＨＧＦは肝臓の非実質細胞、肝臓や肺の内皮細胞、ある種の線維芽細胞など近隣の細胞で産生され、ＨＧＦ受容体を発現する上皮系細胞に対して増殖活性や形態形成活性を有することが知られている（非特許文献１３〜１９）。【０００５】
血管系においては、血管平滑筋細胞の増殖に影響を与えず、血管内皮細胞のみを増殖させる血管内皮特異的な増殖因子であり（非特許文献２０）、血管新生作用をもつ。【０００６】
癌細胞においては、増殖作用、細胞運動性亢進作用、形態形成誘導作用、血管新生作用により、癌細胞をとりまく間質細胞との総合作用により、腫瘍の浸潤、転移を誘導することが知られている（非特許文献２１、２２）。また、ある種の癌細胞の増殖を逆に抑制的に働きアポトーシスを誘導することもある（非特許文献２３）。【０００７】
ＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔは、最初に化学発癌物質により形質転換したヒト骨肉腫細胞から癌遺伝子として同定された（非特許文献２４、２５）。ｃ−Ｍｅｔは、５０ｋＤａのα鎖と１４５ｋＤａのβ鎖をジスルフィド結合で結合した１９０ｋＤａのヘテロ二量体で、膜貫通チロシンキナーゼをもつタンパク質である（非特許文献２６）。【０００８】
ｃ−ＭｅｔはＨＧＦの結合により細胞質領域に存在するチロシンキナーゼ活性が活性化される。ｃ−Ｍｅｔのチロシンがリン酸化されると、応答する細胞によって、増殖促進、血管新生、遊走促進、形態形成といった様々な反応を示す。正常の組織では、これら生物活性を介して組織の修復が促される。また、腫瘍組織においてはとりわけ細胞の遊走を強く促す活性が、癌細胞の浸潤、転移を誘発する（非特許文献３１、３２）。さらに、臨床においてＨＧＦ受容体（ｃ−Ｍｅｔ）が高頻度に発現している癌の報告が知られている。中でも、胃癌（非特許文献３３、３４）、大腸癌（非特許文献３５、３６）、口腔扁平上皮癌（非特許文献３７）、甲状腺癌（非特許文献３８）などで研究が進んでおり、報告も多い。これらの癌では、免疫組織染色の陽性率は６０〜１００％とかなり高い。さらに、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸部癌などにおいても比較的高い陽性率が報告されている。また、癌の進展とともに発現が増加する例や、高発現の症例では予後が悪いことなどの現象が報告されており、ＨＧＦ受容体（ｃ−Ｍｅｔ）は悪性度を反映する指標となり得る。【０００９】
ＨＧＦのｃ−Ｍｅｔに対する結合活性は、ＨＧＦ分子のＮ末端のヘアピンループ構造及びそれに続くクリングル構造であることが報告されている（非特許文献２７〜３０）。【００１０】
ｃ−Ｍｅｔへの結合に加えて、ＨＧＦは細胞表面又は細胞外マトリックスに存在するある種のヘパリン及びヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と結合することが確認されている（非特許文献３９、４０）。【００１１】
ＨＧＦ分子内のヘパリン結合部位及び生理活性部位を探し当てることを試みるいくつかの実験が報告されている。Ｍｉｚｕｎｏらは様々な欠失変異体ＨＧＦｓ（ｄ−Ｋ１（第一のクリングルドメインの欠失）；ｄ−Ｋ２（第二のクリングルドメインの欠失）；ｄ−Ｋ３（第三のクリングルドメインの欠失）；ｄ−Ｋ４（第四のクリングルドメインの欠失）；ｄ−ｂｅｔａ（ベータ鎖の欠失）；ｄ−Ｈ（Ｎ末端ヘアピンループの欠失）；そしてＨＫ１Ｋ２（Ｎ末端ヘアピンループと第一及び第二のクリングルドメインから構成される））を作製し、ヘパリンカラムに対する結合を調べた（非特許文献４３）。その結果、ｄ−Ｈとｄ−Ｋ２変異体はヘパリンアフィニティーカラムへの結合能が低下した。一方天然のＨＧＦとその他のＨＧＦ変異体（ｄ−Ｋ１、ｄ−Ｋ３、ｄ−Ｋ４、ｄ−ｂｅｔａ、ＨＫ１Ｋ２）はヘパリンカラムに結合することを報告している。さらにＡｏｙａｍａらは、より短いＮ末端側のヘアピンループ構造（アミノ酸配列７０−９６）を含む部位が、ヘパリンカラムに結合することを報告している（非特許文献１）。
また、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏらは、ＨＧＦ分子からＮ末端のヘアピンループ構造を欠失した変異体は、ＨＧＦの生理活性である肝細胞増殖促進活性を失うことから、ヘアピンループ構造は生理活性に必須の構造であることを報告している（非特許文献２７）。【００１２】
現段階における虚血性心疾患や末梢血管疾患などの虚血性疾患の治療は、血管拡張を含めた各種薬物療法、カテーテルなどを用いた血管形成術及び外科的に行われるバイパス手術である。これらの治療法の有効性については十分に検討がなされ、治療戦略はほぼ確立されている。
しかしながら、これらの治療法を施行しても再手術が必要となる症例や、当初より適応にならない症例、これらの治療法を施行しても改善の得られない症例などのような不応性虚血性疾患群が問題になっている。【００１３】
このような現状を受けて再生医療が近年注目されるようになり、世界規模で基礎研究と応用研究が試みられている。再生医療には、組織内の血管を再生する血管再生療法、組織を再生する組織再生療法等があるが、その中で血管新生を行うことにより虚血組織への血流を確保し、虚血部位の障害や壊死を軽減させることを目的とする血管再生療法が注目されている。
血管再生療法には、血管新生関連因子やその遺伝子による方法と幹細胞を用いた方法、サイトカインによる細胞動員療法が臨床研究として行われている。【００１４】
虚血性心疾患の虚血心筋細胞や血管、末梢血管疾患の血管では、正常組織に比べて、内因性ＨＧＦが低下しており、障害血管を救うのにＨＧＦ量が十分でないことを示している（非特許文献４５、４６）。また、血管内皮細胞に存在するＨＧＦの特異的受容体であるｃ−Ｍｅｔの発現が増加していること（非特許文献４７〜５３）から、そこにＨＧＦを補充することにより血管新生の促進を狙った治療法として、ＨＧＦ蛋白質、ＨＧＦ遺伝子を含むプラスミドやウイルスベクターによる遺伝子治療が開発された。【００１５】
動物の虚血性心疾患モデル及び末梢動脈疾患モデルに対するＨＧＦ蛋白質、ＨＧＦ遺伝子を含むプラスミドやウイルスベクターによる遺伝子治療では、良好な治療効果が報告されている（非特許文献５４〜６３）。
臨床研究ではＨＧＦ遺伝子を含むプラスミドによる遺伝子治療が最も進んでおり、大阪大学にて閉塞性動脈硬化症及びＢｕｅｒｇｅｒ症患者に投与され、その安全性と有効性の検討が行われ、安全性は概ね問題なく、良好な改善度が確認できたと報告している（非特許文献４４）。
現在は、全国多施設において末梢性血管疾患患者を対象にした臨床試験（ＰｈａｓｅＩＩＩ）が実施中である。【００１６】
末梢性血管疾患患者を対象にしたＨＧＦ遺伝子を含むプラスミドによる遺伝子治療では、Ｘ線やＭＲＩ用の造影剤等を用いて血管を造影することで虚血部位を判断し、その周辺筋肉内に治療薬を投与する（非特許文献６４）。【００１７】
虚血性心疾患の場合は通常、虚血部位を判断する方法として、Ｘ線やＭＲＩ用の造影剤による血管造影や放射性核種を用いた心筋血流製剤による方法、超音波による方法等がある。また、一般的ではないが、ＮＯＧＡシステムという、カテーテルの先のセンサーで心筋内膜側の電位及び空間的な位置を測定して心筋活動電位と局所壁運動から虚血部位を判断する方法がある。【００１８】
ＨＧＦプラスミドによる治療において、従来法であるＸ線やＭＲＩ用の造影剤による血管造影や放射性核種を用いた血流製剤、ＮＯＧＡシステム等の画像診断法は、虚血部位は確認できるが、最も治療効果が期待できる投与部位すなわちｃ−Ｍｅｔの発現部位を直接画像化する方法ではない。【００１９】
癌の診断は、インビトロ試験及び画像診断法を組み合わせることによって診断される。画像診断法としては、例えば、Ｘ線コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、核磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）、超音波画像診断法及び放射性核種シンチグラフィー法がある。造影剤が患者に投与されることで、Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ及び超音波によって得られる画像が明瞭になる。腫瘍に局在化する放射性医薬品の投与は、放射性核種シンチグラフィー法に必要である。【００２０】
これら癌の画像診断のほとんどが存在診断であり、現在では、条件によっては数ｍｍほどの癌も発見することができる。
一方、癌の機能（性質）的な診断、特に浸潤性、転移性など悪性度を画像により診断する方法はない。【００２１】
ＨＧＦ受容体（ｃ−Ｍｅｔ）の過剰発現と悪性度についての研究は、数多くのグループで、ヒト乳癌及び前立腺癌について検証されており、乳癌では進行度との関連性（非特許文献７６〜７８）や前立腺癌での骨転移性との関連性（非特許文献７９〜８２）を報告している。
ＨＧＦ受容体は悪性度を評価する上で重要な指標となり得る標的分子であり、固形腫瘍においてＨＧＦ受容体の発現を画像化することで、存在のみならず悪性度を判断することができる診断薬の開発が望まれる。【００２２】
癌の治療には、外科的療法、化学療法、放射線療法、あるいはこれらを組み合わせた集学的療法等が行われている。
最近、血管新生阻害剤を用いて、癌細胞を休眠状態にするという腫瘍休眠療法が行われている。血管新生阻害剤により、腫瘍の血管新生を阻害し、癌細胞の成長に必要な栄養、酸素の供給経路を絶ち、癌細胞の細胞死を誘導し、癌細胞を休眠状態にするものである。
血管新生阻害剤として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的にしたヒト化モノクローナル抗体製剤のＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ）が欧米で承認され臨床使用されている（国内は臨床治験中）。開発中の血管新生阻害剤としては、アンジオスタチン（非特許文献６５）、エンドスタチン（非特許文献６６）、ＨＧＦ受容体を標的にした、ＨＧＦのアンタゴニストであるＮＫ４（特許文献２、非特許文献６７〜７０）、等が知られている。
しかし、この腫瘍休眠療法は、癌細胞を休眠状態にするもので、癌細胞を完全に死滅させる方法ではないため、癌の完治を目指した治療ではないといえる。
ＨＧＦ受容体を標的にした治療薬であるＮＫ４も癌の完治を目指したものではないため、ＨＧＦ受容体が発現している悪性度の高い腫瘍を標的とした、完治を目指した治療薬の開発が望まれる。【００２３】
ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインを有する、ＮＫ４遺伝子／蛋白質を用いた医薬の研究が行われている（特許文献２）。放射性核種（１２５Ｉ）で標識したＨＧＦを用いて、ＨＧＦの体内動態パラメーター（非特許文献７３）及び、ヘパラン硫酸・デルマタン硫酸との親和性（非特許文献７４）を調査した報告がある。抗ｃ−Ｍｅｔ  モノクローナル抗体を放射性核種（１２５Ｉ）で標識し、マウスにｃ−Ｍｅｔ発現癌細胞を移植し腫瘍を画像化した報告がある（非特許文献７５）。
【特許文献１】ＷＯ９４／０９９６９号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−２５０５４９号公報
【非特許文献１】Ａｏｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０２８６−１０２９１（１９９７）
【非特許文献２】Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６３（２）：９６７−９７３（１９８９）
【非特許文献３】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４０−４４３（１９８９）
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２２（３）：１４５０−１４５９（１９８４）
【非特許文献５】Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４：４４１４−４４１９（１９８４）
【非特許文献６】Ｉｇａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７４，８３１−８３８（１９９１）
【非特許文献７】Ｎｉｒａｎｊａｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，２８９７−２９０８（１９９５）
【非特許文献８】Ｒｕｂｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４１５−４１９（１９９１）
【非特許文献９】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９６，１１４−１２０（１９９１）
【非特許文献１０】Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１９，６２９−６４１（１９９２）；
【非特許文献１１】Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７９，１０４２−１０４９（１９９１）
【非特許文献１２】Ｇｏｈｄａら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９，１９７−２０５（１９９５）
【非特許文献１３】Ｎｏｊｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １７３，４２−４７（１９９０）
【非特許文献１４】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６５，１２２９−１２３４（１９８９）
【非特許文献１５】Ｍａｈｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１，２２４４−２２５２（１９９３）
【非特許文献１６】Ｙａｎａｇｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８２，８０２−８０９（１９９２）
【非特許文献１７】Ｒｕｂｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４１５−４１９（１９９１）
【非特許文献１８】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１９：５９１−６００（１９９６）
【非特許文献１９】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３９：６３９−６４４（１９９７）
【非特許文献２０】Ｈａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２２０：５３９−５４５（１９９６）
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【非特許文献２２】Ｊｉａｎｑら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２９：２０９−２４８（１９９９）
【非特許文献２３】Ｓｈｉｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８０：１１５１−１１５８（１９９１）
【非特許文献２４】Ｂｏｔｔａｒｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：８０２−８０４（１９９１）
【非特許文献２５】Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：５０１−５０４（１９９１）
【非特許文献２６】Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８４：６３７９−６３８３（１９８７）
【非特許文献２７】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１８１：６９１−６９９（１９９１）
【非特許文献２８】Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，８９：１１５７４−１１５７８（１９９２）
【非特許文献２９】Ｌｏｋｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ，１１：２５０３−２５１０（１９９２）
【非特許文献３０】Ｌｏｋｋｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６８：１７１４５−１７１５０（１９９１）
【非特許文献３１】Ｊｉａｎｑら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２９：２０９−２４８（１９９９）
【非特許文献３２】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ  Ｐｕｂ  Ｃｈａｐｔｅｒ６：１４３−１９３（２０００）
【非特許文献３３】Ｔａｎｇら、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ，１１：３３３−３３９（２００４）
【非特許文献３４】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｉｎｔ  Ｓｕｒｇ，８６：１５１−１５７（２００１）
【非特許文献３５】Ｔｒｏｖａｔｏら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，４８：２９１−２９７（２００４）
【非特許文献３６】Ｒｅｓｎｉｃｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０：３０６９−３０７５（２００４）
【非特許文献３７】Ｋｌｏｓｅｋら、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ，１２：２９３−２９６（２００４）
【非特許文献３８】Ｉｐｐｏｌｉｔｏら、Ｔｈｙｒｏｉｄ，１１：７８３−７８７（２００１）
【非特許文献３９】Ｒｏｕｓｌａｈｔｉら、Ｃｅｌｌ  ６４：８６７−８６９（１９９１）
【非特許文献４０】Ｌｙｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１１２１６−１１２２３（１９９４）
【非特許文献４１】Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１６８７１−１６８７８（１９９５）
【非特許文献４２】Ｓｃｈｗａｌｌら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３３：７０９−７１８（１９９６）
【非特許文献４３】Ｍｉｚｕｎｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１１３１−１１３６（１９９４）
【非特許文献４４】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４４：２０３−２０９（２００４）
【非特許文献４５】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３３：１３７９−１３８４（１９９９）
【非特許文献４６】Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：ＩＩ３０１−８（１９９９）
【非特許文献４７】Ｕｅｄａら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６７：１７２６−１７３１（１９９９）
【非特許文献４８】Ｕｅｄａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ５１：４１−５０（２００１）
【非特許文献４９】Ｏｎｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：２５５２−２５５８（１９９７）
【非特許文献５０】Ｊｉｎら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０４：６５４−６６０（２００３）
【非特許文献５１】Ｌｉｕら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ６８：１５６−１６０（２００４）
【非特許文献５２】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：１５１１−１５１９（２０００）
【非特許文献５３】Ｓａｔｏら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌ  １０：２３５−２４０（２００１）
【非特許文献５４】Ａｏｋｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４１７−４２７（２０００）
【非特許文献５５】Ｋｏｎｄｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４４：６４４−６５３（２００４）
【非特許文献５６】Ｌｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：２４９９−２５０６（２００３）
【非特許文献５７】Ｊａｙａｓａｎｋａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２３０−ＩＩ−２３６（２００３）
【非特許文献５８】Ｔａｎｉｙａｍａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４０：４７−５３（２００２）
【非特許文献５９】橋弥ら、医学のあゆみ  ２１０：６５３−６５８（２００４）
【非特許文献６０】Ｙｏｓｈｉａｋｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：２３４４−２３５０（２００１）
【非特許文献６１】Ｔａｎｉｙａｍａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：１８１−９（２００１）
【非特許文献６２】Ｂｅｌｌｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：３８１−３９０（１９９８）
【非特許文献６３】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３３：１３７９−１３８４（１９９９）
【非特許文献６４】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４４：２０３−２０９（２００４）
【非特許文献６５】Ｃａｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０１：１０５５−１０６３（１９８８）
【非特許文献６６】Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：３４３−３４８（１９９９）
【非特許文献６７】Ｄａｔｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：３０４５−３０５４（１９９８）
【非特許文献６８】Ｋｕｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：６７３７−６７４３（２０００）
【非特許文献６９】Ｍａｅｈａｒａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４：８６４−８７３（２００１）
【非特許文献７０】Ｔｏｍｉｏｋａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１；７５１８−７５２４（２００１）
【非特許文献７１】Ｂａｋｅｒら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ４９：１５８３−９１（１９９１）
【非特許文献７２】Ｋｒｅｎｎｉｎｇら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ：２０，７１６−３１（１９９３）
【非特許文献７３】Ｌｉｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６３：Ｇ６４２−９（１９９２）
【非特許文献７４】Ｌｙｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１１２１６−１１２２３（１９９４）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２７１−２７８（１９９８）
【非特許文献７５】Ｈａｙら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｓｅｐ  ９：３８３９Ｓ−３８４４Ｓ（２００３）
【非特許文献７６】Ｎｉｅｍａｎｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４３：５３３−５４５（１９９８）
【非特許文献７７】Ｔｓａｒｆａｔｙら、Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｌ，２１：３９７−４０８（１９９９）
【非特許文献７８】Ｆｉｒｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：２３８６−２３９７（２０００）
【非特許文献７９】Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１４７：３８６−３９６（１９９５）
【非特許文献８０】Ｐｉｓｔｅｒｓら、Ｊ  Ｕｒｏｌ，１５４：２９３−２９８（１９９５）
【非特許文献８１】Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，１４１：１７３−１７８（１９９９）
【非特許文献８２】Ｋｎｕｄｓｅｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ，６０：１１１３−１１１７（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
しかしながら、ＨＧＦの標識体では、ＨＧＦの作用、すなわち癌の増殖や浸潤、転移を促進してしまう可能性がある。さらに、分子量が大きいため、血液中からゆっくり取り除かれ、その結果、画像において長期間の血液バックグランドを生じるため、画像化に長時間を要する等の欠点がある。また、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の標識体では、ＨＧＦ標識体よりも分子量が大きく、長期間の血液バックグランドを生じるため、画像化に長時間を要する、抗原性の問題等がある。【００２５】
従って、本発明は、虚血性疾患のＨＧＦ蛋白質、ＨＧＦ遺伝子を含むプラスミドやウイルスベクターによる治療において、効率よく血管新生を促進させるために、最も治療効果が期待できる投与部位すなわちＨＧＦ受容体の発現部位を画像化できる診断薬を提供することを目的とする。また、本発明のＨＧＦ受容体を発現する癌の原発腫瘍、転移腫瘍を画像化する診断薬及び治療薬を提供することを目的とする。さらに、本発明は、癌を含む血管新生により生じる疾患に対し有効な診断薬及び治療薬を提供することを目的とする。さらに本発明はＨＧＦ受容体が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
そこで本発明者らは、上記目的を解決するため種々検討した結果、ＨＧＦの部分ポリペプチドのうち、ヘパリン結合領域を含むポリペプチドの標識体が、ＨＧＦ受容体に特異的に集積し、かつ虚血性疾患及び悪性腫瘍を含む血管新生により生じる疾患のＨＧＦ受容体発現部位に特異的に集積し、その部位が明瞭に画像化できること、さらにはこれらの疾患の治療に有用であることを見出した。【００２７】
すなわち、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチドの標識体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチド、その標識体、あるいはその毒素結合体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の治療薬を提供するものである。【００２８】
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチドの標識体の、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチド、その標識体、あるいはその毒素結合体の、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の治療薬製造のための使用を提供するものである。【００２９】
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチドの標識体を投与し、当該標識体を検出することを特徴とする肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断方法を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチド、その標識体、あるいはその毒素結合体を投与することを特徴とする肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の治療方法を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチド又はその標識体と、肝細胞増殖因子受容体との結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び当該方法によりスクリーニングされた医薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の診断薬を用いれば、標識ポリペプチドがＨＧＦ受容体に特異的に集積するため、ＨＧＦ受容体発現部位だけを特異的に明瞭に画像化でき、ＨＧＦ受容体が関与する虚血性疾患及び悪性腫瘍を含む血管新生により生じる疾患が画像化できる。また、これらの疾患の治療も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＤＬ−２１（マウスモノクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体）を用いて行った、実験に使用した腫瘍細胞のｃ−Ｍｅｔの発現の確認結果を示す。                                          １：Ａ４３１  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ（市販ポジティブコントロール）。                                  ２：ＭｃＡ−ＲＨ  ７７７７  ホモジネート。                                                         ３：ＨｕＣＣＴ−１ホモジネート。          Ｍ：分子量マーカー。                                ＨｕＣＣＴ−１のレーンの約１４０ｋＤａの位置（三角マーク）に、ｃ-Ｍｅｔ（β鎖）が検出された。ＭｃＡ−ＲＨ  ７７７７が検出されなかった理由には、抗体の特異性（ＤＬ２１は、ヒト由来ｃ−Ｍｅｔに特異的）のためである。
【図２】ＳＰ２６０（ラビットポリクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体）を用いて行った、実験に使用した腫瘍細胞のｃ−Ｍｅｔの発現の確認結果を示す。                                          １：Ａ４３１  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ（市販ポジティブコントロール）。                                  ２：ＭｃＡ−ＲＨ  ７７７７  ホモジネート。                                                        ３：ＨｕＣＣＴ−１ホモジネート。          Ｍ：分子量マーカー。                                ＳＰ２６０のレーンの約１４０ｋＤａの位置（三角マーク）に、ｃ-Ｍｅｔが検出された。ＨｕＣＣＴ−１のｃ−Ｍｅｔ（β鎖）の検出が弱い理由には、抗体の特異性（ＳＰＦ２６０は、マウス、ラット由来ｃ-Ｍｅｔに特異性が高い）のためである。
【図３】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＳＰ−２６０及びＤＬ−２１）によるｃ−Ｍｅｔ特異的免疫組織染色像及びヘマトキシリンによる対比染色像を示す。
【図４】免疫組織染色における陰性コントロールの結果及びヘマトキシリンによる対比染色像を示す。
【図５】［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）ＮＨ２の集積像（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）を示す。
【図６】ＨＥ染色像（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）を示す。（右は拡大像である。）
【図７】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＳＰ−２６０）を用いた免疫組織染色像（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）を示す（右は拡大像である）。
【図８】ｈｒＨＧＦによる結合阻害実験結果を示す。
【図９】９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを用いた心イメージング像を示す。
【図１０】［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２を用いた心イメージング像を示す。
【図１１】図９の囲み部分の拡大ＨＥ染色像を示す。
【図１２】９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを用いた心筋虚血モデルラットＳＰＥＣＴ像を示す。
【図１３】［１２３Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２を用いた心筋虚血モデルラットＳＰＥＣＴ像を示す。
【図１４】図１２と図１３を重ね合せたＳＰＥＣＴ画像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の診断薬及び治療薬は、ＨＧＦの部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチド（以下、「ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド」ということがある。）あるいはその標識体を含有することを特徴とする。ＨＧＦのヘパリン結合領域としてはいくつか存在するが、このうちＨＧＦアミノ酸配列中のＣｙｓ３９−Ｃｙｓ６５であることが好ましく、本発明で用いるＨＧＦ受容体結合性ポ+リペプチドとしては、当該Ｃｙｓ３９−Ｃｙｓ６５を含むポリペプチドであることが好ましい。ここでヘパリン結合活性は、後記実施例のようにヘパリンカラムを用いた実験で検定することができる。なお、ＨＧＦアミノ酸配列は、ＨＧＦ前駆体から、シグナルペプチド部分が除かれている成熟ＨＧＦの配列なので、ＨＧＦアミノ酸配列のＧｌｎ１は、シグナルペプチド部分を含むアミノ酸配列のＧｌｎ３２に相当する。
【００３３】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドには、ＨＧＦの部分ポリペプチドの他に、ＨＧＦの部分ポリペプチドを示すアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチドが（以下、改変体ということがある）が含まれる。これらの改変は、１つ又は複数のアミノ酸の変異を導入するため、あるいは事前に決定されたアミノ酸残基の個所で蛋白質コード配列を切断するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に基づく技法や、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発を含めた当分野で周知の方法を用いて引き起こすことができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌらの方法を参照（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））。【００３４】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドの改変にはさらに、他の化合物たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体に結合したＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドが含まれる。ＰＥＧを含む化合物を用いて、ポリペプチドたとえばＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド表面のアミノ基を誘導体化させると、このようなポリペプチドの循環寿命を延ばし、ＨＧＦ受容体結合効果を持続することができる（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３１：２５−３３（１９８３））。用いるＰＥＧの分子量に特に限定はないが、通常は３００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１５，０００である。ＰＥＧを改変する方法は、当分野で周知の任意の方法でよい（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３１：２５〜３３（１９８３））。【００３５】
さらに、本発明の範囲に含まれる改変ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドは、アフィニティーマトリクス上でポリペプチドが捕捉可能にさせるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。たとえば、ポリペプチド精製を支援するためにタグたとえばｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ）を使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端及びアミノ末端のいずれかを含めたポリペプチド内の任意の部位に挿入することができる。ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドはまた、ポリペプチドの検出を支援する、アルカリホスファターゼなど酵素との融合体として生成させることができる。【００３６】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドの好ましいものとしては、Ｃｙｓ３９−Ｃｙｓ６５を有し、そのＮ末端側に４〜４０アミノ酸、Ｃ末端側に４〜１１０アミノ酸を有するポリペプチド又はその改変体が挙げられる。さらに好ましくはＣｙｓ３９−Ｃｙｓ６５を有し、そのＮ末端側及び／又はＣ末端側に４〜４０アミノ酸を有するポリペプチド又はその改変体が挙げられる。最も好ましくはＣｙｓ３９−６５Ｃｙｓを有し、そのＮ末端側及び／又はＣ末端側に４〜３０アミノ酸を有するポリペプチド、又はその改変体である。このようなポリペプチドの例としては、ＨＧＦアミノ酸配列における、Ｃｙｓ３９−Ｈｉｓ８３、Ｈｉｓ９−Ｇｌｕ８０、Ｐｈｅ１１−Ｈｉｓ８３、Ｇｌｎ１−Ｈｉｓ８３、Ｐｈｅ１１−Ａｓｎ９６、Ｇｌｎ１−Ａｓｎ９６、Ｇｌｎ１−Ｃｙｓ１７５等が挙げられる。
このうち、Ｐｈｅ１１−Ｈｉｓ８３からなるポリペプチド、又はその改変体が特に好ましい。
【００３７】
なお、ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドの改変体としては、前記のようにアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたものであって、ヘパリン結合活性を有するものが含まれるが、そのような改変体は通常ＨＧＦの部分ポリペプチドとの相同性が９０％以上、さらに９５％以上であるのが好ましい。また、ヘパリン結合活性は、Ｃｙｓ３９−６５Ｃｙｓポリペプチドのヘパリン結合活性の１０％以上、さらに５０％以上、さらに６０％以上、さらに７０％以上、特に８０％以上を有するものが好ましい。【００３８】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドの標識体としては、通常診断目的に用いられる検出可能な標識体であればいずれも挙げられる。すなわち、診断用途のために、検出可能な部分を用いてＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドを標識することができる。この検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる。たとえば、検出可能な部分は、放射性核種、たとえば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ；蛍光又は化学発光化合物たとえばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルシフェリン；又は酵素たとえばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼであってよい。ポリペプチドを検出可能な部分に結合させる当分野で周知の任意の方法を利用することができる。たとえば、Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ４０：２１９（１９８２）；Ｎｙｇｒｅｎ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ３０：４０７（１９８２）参照。【００３９】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドはまた、ＨＧＦ受容体をイメージングするために、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに有用な検出可能な部分と結合させてもよい。
ＨＧＦ受容体結合性ペプチドを検出可能な部分たとえば放射性核種や放射線不透過性薬剤、常磁性薬剤、界面活性剤を用いて標識し、哺乳動物の好ましくは血流中に投与し、標識されたＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドの存在及び位置を外部から検出する。ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドは、核磁気共鳴、放射化学、超音波、周知の他の検出方法によって、哺乳動物内で検出可能なＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドのどのような部分を用いて標識してもよい。具体的には、ＨＧＦ受容体と結合するポリペプチド部分、所望により連結基、及び検出可能な部分からなる。検出可能な部分はγ線又は陽電子を放出する放射性診断剤、核磁気共鳴画像診断用造影剤、Ｘ線造影剤、又は超音波造影剤が挙げられる。【００４０】
より具体的には、ポリペプチド部位のチロシン残基、ヒスチジン残基等のアミノ酸残基や構造中に放射性核種たとえば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３４ｍＣｌ、３８Ｃｌ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２６Ｉ、１３１Ｉ等を１つ以上直接標識した放射性診断薬、又は、Ｘ線を吸収する、すなわち原子番号２０又はそれ以上の原子を１つ以上含むＸ線診断薬、あるいは常磁性化合物例えばニトロキシドを含む核磁気共鳴診断用造影剤が挙げられる。【００４１】
また、ポリペプチドに連結基として二官能性配位子やカルボニル化合物等を導入し金属錯体としてなる造影剤が挙げられる。ここで二官能性配位子としては、ポリアミノポリカルボン酸が好ましい。ポリアミノカルボン酸としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸ビスメチルアミド（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる。ポリアミノポリカルボン酸以外の二官能性配位子としてたとえば、６−ハイドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる。【００４２】
また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、内殻にある不対電子により常磁性を示す金属イオンたとえば、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｖ、Ａｕ、Ｆｅ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｂ、Ｈｏ及びＥｒからなる群より選ばれる金属元素の常磁性イオンを金属成分とする核磁気共鳴診断薬に有用な錯体も挙げられる。
また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、Ｘ線を吸収する、すなわち原子番号２０又はそれ以上のたとえば、Ｒｅ、Ｓｍ、Ｈｏ、Ｌｕ、Ｐｍ、Ｙ、Ｂｉ、Ｐｂ、Ｏｓ、Ｐｄ、Ｇｄ、Ｌａ、Ａｕ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ａｇ、及びＩｒからなる群より選ばれる金属元素の金属イオンを金属成分とするＸ線診断薬に有用な錯体も挙げられる。
また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、放射性核種である、たとえば、４７Ｓｃ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、７３Ｓｅ、７５Ｓｅ、７６Ａｓ、９５Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉからなる群より選ばれる放射性核種の金属イオンを金属成分とする放射性診断薬に有用な錯体も挙げられる。【００４３】
また、本発明のポリペプチドにおける標識部位は、Ｃｙｓ３９−Ｃｙｓ６５以外の部分であることが好ましい。【００４４】
さらに、β線、α線及びＡｕｇｅｒ又はＣｏｓｔｅｒ−Ｋｒｏｎｉｇ電子を放出する放射性核種に結合させたＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドは、ＨＧＦ受容体を標的にした治療薬として使用することができる。
治療に適した放射性核種としてたとえば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、及び２１７Ｂｉを有する放射性核種との安定な複合体を形成するように選択する。【００４５】
ポリペプチド部分と結合した界面活性部分からなり、生体適合性ガスの超微粒気泡、液体担体、界面活性剤ミクロスフェアを含む超音波造影剤も挙げられる。【００４６】
毒素に結合させたＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドは、ＨＧＦ受容体を標的にするための治療薬として使用することができる。ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドを、当分野で周知の手順によって細胞の細胞質中の細胞毒性効果を媒介する任意の毒素ポリペプチドに結合させることができる。好ましい毒素ポリペプチドには、リボソーム不活性化タンパク質、たとえばＡ鎖毒素（たとえばヒマ毒Ａ鎖）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）など植物性毒素、αサルシン（α−ｓａｒｃｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）など真菌性毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）など細菌性毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、胎盤性リボ核酸やアンジオゲニンなどリボ核酸が含まれる。他の有用な毒素ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド、たとえばＦａｓ  ｌｉｇａｎｄ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ａｐｏ−３  ｌｉｇａｎｄ、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋである。さらに、１つ以上（たとえば２、３、４又は６）の毒素の複数の機能性断片（たとえば２、３、４、６、８、１０、１５又は２０）をＨＧＦ受容体結合性ペプチドに結合させることができる。反復が含まれている場合は、互いにすぐ隣接、１つ又は複数の標的断片によって分離、又は上に記載の結合ペプチドによって分離されていてもよい。【００４７】
本発明に用いるＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドは、たとえばＨＧＦ蛋白質を酵素等で分解することや、特定の目的ポリペプチドを発現している組織培養細胞を用いて、アフィニティークロマトグラフィーやＨＰＬＣなどのポリペプチド精製技術により、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。加えて、ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドを生成するために、ポリペプチド合成技術を用いることもできる。ポリペプチド合成技術には、固相合成法、液相合成法等がある（「第５版  実験化学講座  １６  有機化合物の合成ＩＶ  カルボン酸・アミノ酸・ペプチド」日本化学会編、東京化学同人（２００５））。【００４８】
ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチドはまた、組換え方法によって生成することもできる。ヒトのＨＧＦのｃＤＮＡ配列が知られている（Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６３：９６７−９７３（１９８９）；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４０−４４３（１９８９））。ｃＤＮＡからタンパク質産物を発現させる方法は周知である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州、１６．１〜１７．４４ページ参照。適切な発現システムには、組換えバクテリオファージ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換させた微生物たとえば細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉやＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；組換え酵母菌発現ベクターを用いて形質転換させた酵母菌（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓやＰｉｃｈｉａ）；組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞システム；融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）やタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた、又は融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）を用いて形質転換させた植物細胞システム；哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーターやワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む発現構築体を用いて形質転換させた哺乳動物細胞システム（たとえば、ＨＥＫ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）が含まれるが、それだけには限定されない。哺乳動物から直接得た、プラスミドベクターを用いて形質転換させた、あるいはウイルスベクター（たとえば、とりわけヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオウイルス、シンビスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））で感染させた一次細胞又は二次細胞もまた宿主細胞として有用である。【００４９】
本発明の診断薬及び治療薬の対象疾患としては、ＨＧＦ受容体が関与している疾患、例えば虚血性疾患及び悪性腫瘍が挙げられる。虚血性疾患としては、前記虚血性心疾患、末梢血管疾患が挙げられる。悪性腫瘍としては、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、グリオーマ、メラノーマ等が挙げられる。またさらにＨＧＦ受容体を発現し血管形成に関連する状態にある疾患、例えば、心筋血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患も診断及び治療することができる。【００５０】
本発明の診断薬及び治療薬は、静脈注射による投与が最適であるが、その他一般的な手段たとえば、経口、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、関節内、滑液内等に投与が可能である。
本発明の診断薬及び治療薬は、例えば放射性薬剤の場合、その投与量は、患者の体重、年齢、性別及びＳＰＥＣＴ装置に代表される測定機器等の諸条件によって適宜決められる。一般的に、診断薬の場合、１２３Ｉの放射能として１１１ＭＢｑ〜２２２ＭＢｑ、治療薬の場合、１３１Ｉの放射能として３７ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲である。
本発明の診断薬を用いたイメージング（画像化）法としては、例えば、１２３Ｉの場合、本薬剤を上記の投与量の範囲で静脈内に投与し約１時間後、さらに経時的に全身又は疾患部位周辺をγカメラを用いてＰｌａｎａｒないし断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を行うのが望ましい。【００５１】
また、本発明の診断薬及び治療薬は、前記有効成分以外に、プロピレングリコール等の安定化剤；酸、塩基等のｐＨ調整剤；リン酸緩衝液等の緩衝剤；生理食塩水等の等張剤等を添加し、製剤とすることができる。【００５２】
また、前記ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド又はその標識体は、ＨＧＦ受容体が関与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。すなわち、ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド又はその標識体と、ＨＧＦ受容体との結合を阻害する物質を選択すれば、当該阻害物質はＨＧＦ受容体が関与する疾患の予防又は治療薬として有用である。当該結合阻害物質の選択方法は、通常の結合阻害試験により行うことができる。例えば、被験物質の存在下に、ＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド標識体とＨＧＦ受容体を反応させ、ＨＧＦ受容体に結合した、または結合していないＨＧＦ受容体結合性ポリペプチド標識体の量を測定すればよい。
かくして選択された結合阻害物質はＨＧＦ受容体が関与する疾患の予防又は治療薬として有用である。
【実施例】
【００５３】
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。【００５４】
実施例１
固相法を用いた自動ペプチド合成機を使用し、ポリペプチド（ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ2）を合成した。
【００５５】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
カラム  ＷＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ−ＯＤＳ−５−Ａ（２５０×４．６ｍｍ）
移動相  溶液Ａ：０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ
溶液Ｂ：０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ／ＡｃＣＮ（３０／７０）
２５分  ｌｉｎｅｒｇｒａｄｉｅｎｔ  ０％→１００％  溶液Ｂ
流速    １．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度    ３５℃
検出器  ＵＶ：２１０ｎｍ２０．ＡＵＦＳ
純度    ９５％以上
＜質量測定＞
実測測量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：８２９５．７１（計算値  ８２９４．８６［Ｍ＋Ｈ］＋【００５６】
実施例２
［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の合成
実施例１で得たＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）（Ｌｏｔ  ＨＧＦ１１−８３−ＮＨ２）に、［１２５Ｉ］を直接導入する方法にて調製した。【００５７】
１．０ｍｇ／ｍＬのＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）トリフルオロ酢酸塩水溶液２５μＬ、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）５０μＬ、［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液（１−１０ｍＣｉ）１０−２０μＬの混合溶液に０．２５ｍｇ／ｍＬのｐ−トルエンスルホンクロロアミドナトリウム水溶液１０μＬを添加し、室温で１時間放置した。この反応を数回繰り返し行なった後、すべての反応混合物を逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ−ＯＤＳ−５−Ａ  ４．６×２５０ｍｍ）を用いて、Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液とＢ液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝３０／７０混合溶液（０−５０分リニアグラジエント、溶液Ａ：１００％→０％）の移動相で１．０ｍＬ／分の流速にて分離精製した。このとき安定化剤として１０％ウシ血清アルブミン水溶液１００μＬを添加した。分取溶液を室温減圧下で有機溶媒を留去し、最終的に約０．５ｍＣｉ／ｍＬの１％ウシ血清アルブミン水溶液の組成になるように１０％ウシ血清アルブミン水溶液と水を適量添加した後、０．２０μｍのメンブランフィルターで濾過し、目的物の溶液を調製した。ヘパリン結合活性測定実験、腫瘍細胞移植モデル動物分布実験、虚血性心疾患モデル動物分布実験のために８週間まで−２０℃にて貯蔵した。上記の逆相カラムを用いる条件で分析するとき、分解物であるフリーの［１２５Ｉ］の放射化学的純度は１０％以下であった。【００５８】
実施例３
ヘパリンアフィニティカラムによる［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のヘパリン結合活性の確認
実施例１で得られた［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）について、ヘパリンカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによるヘパリン結合活性の測定を行った。
陽性コントロールとして強いヘパリン結合活性をもつｈｒＨＧＦ（ペプチド研究所）を使用した。【００５９】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
カラム  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ−５ＰＷ（０．７５×７．５ｃｍ）：東ソー製
移動相  溶液Ａ：１０ｍＭ  リン酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
溶液Ｂ：１０ｍＭ  リン酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋２Ｍ  ＮａＣｌ
０分−３分  溶液Ａ  １００％
３分−３０分  ｌｉｎｅｒｇｒａｄｉｅｎｔ  溶液Ｂ  ０％→１００％
流速    ０．７ｍＬ／ｍｉｎ
温度    室温（２５℃前後）
検出器  ＵＶ：２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ
ＲＩ
ｈｒＨＧＦの保持時間は、２３．４分で、約１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。【００６０】
［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の保持時間は、２０．３分で、約１．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出され高いヘパリン結合活性が確認された。このほかに、４．３分に遊離した１２５Ｉのピークが、９．９分に分解又は変性しヘパリン結合活性が低下したペプチドと考えられるピークが確認された。それぞれのピークの面積比は、７８．１％、３．１％、１８．８％であり、約８０％が強いヘパリン結合活性を保持していた。【００６１】
実施例４
［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍への集積
ｃ−Ｍｅｔ発現癌細胞を皮下移植したマウスの腫瘍への［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のｃ−Ｍｅｔ特異的集積をオートラジオグラフィ法及び免疫組織染色法により確認した。【００６２】
１．実験に使用した腫瘍細胞のｃ−Ｍｅｔの発現の確認
ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞（ラット由来肝臓癌細胞）及びＨｕＣＣＴ−１細胞（ヒト由来胆管癌細胞）にｃ−Ｍｅｔが発現していることを、ウェスタンブロッティング法により確認した。培養したＨｕＣＣＴ−１及びＭｃＡ−ＲＨ７７７７よりホモジネート（タンパク量１．０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。これらのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）により分離後、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写膜は、一次抗体にＤＬ２１（マウスモノクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体；ｕｐｓｔａｔｅ社）、ＳＰ２６０（ラビットポリクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｒｕｚ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）、二次抗体にＥＣＬ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（アマシャムバイオサイエンス社）又はＥＣＬ  Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて反応させた。その後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）で検出したところ、ＤＬ２１抗体では、ＨｕＣＣＴ１のレーンに、予測された分子量（約１４０ｋＤａ）の位置のバンドが検出された（図１）。ＳＰ２６０抗体ではＭｃＡ−ＲＨ７７７７のレーンに、約１４０ｋＤａの位置のバンドが検出された。ＨｕＣＣＴ１のバンドは弱く検出された（図２）。これより、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７、ＨｕＣＣＴ−１両細胞にｃ−Ｍｅｔが発現していることが確認された。【００６３】
２．免疫組織染色法によるｃ−Ｍｅｔ発現癌細胞の確認
ｃ−Ｍｅｔ発現ＨｕＣＣＴ１細胞（ヒト由来胆管癌細胞）をＬａｂＴｅｋチェンバースライド（ＮＵＮＣ社製）にて培養した。培養細胞を１０％ホルマリン緩衝液で固定を行い、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で前処理した後、１次抗体として、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＳＰ−２６０、ＤＬ−２１）及び、ＳＰ−２６０の陰性コントロールとして、無免疫のウサギ正常イムノグロブリン分画（ＤＡＫＯ社）、ＤＬ−２１の陰性コントロールとしてマウスＩｇＧ１（ＤＡＫＯ社）を添加し２時間、室温で反応させた。次に、ＳＰ−２６０及び無免疫のウサギ正常イムノグロブリン分画を処理したサンプルには、シンプルステインラットＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）（ニチレイ社）を、ＤＬ−２１及びマウスＩｇＧ１を処理したサンプルには、シンプルステインラットＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）（ニチレイ社）を添加し３０分間室温で反応させた。ＤＡＢ基質溶液（ＤＡＫＯ社）を添加し１０分間、室温で反応させ免疫組織染色を行った。その後、対比染色として、ヘマトキシリン染色を行った（図３，４）。
その結果、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による、ｃ−Ｍｅｔ特異的染色像が確認された。【００６４】
３．ｃ−Ｍｅｔ発現癌細胞を皮下移植したマウスの腫瘍への［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のｃ−Ｍｅｔ特異的集積のオートラジオグラフィ法及び免疫組織染色法による確認
ｃ−Ｍｅｔ発現ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞（ラット由来肝細胞癌細胞）懸濁液２００μｌ（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を６週齡ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ：日本エスエルシー株式会社）の右後肢皮下に注入した。９日目（腫瘍体積８２〜４７８ｃｍ３：ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞）に上記標識ＨＧＦ−ｆｒａｇｍｅｎｔ（３７０ｋＢｑ／１００μｌ）を静脈より投与した。投与後１５分後に腫瘍と近傍筋肉を一緒に摘出し、凍結切片を作製した。凍結切片をイメージングプレート（富士写真フィルム株式会社）に７日間、密着させた後、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ−１８００（富士写真フィルム株式会社）にて［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積像を得た（図５）。その結果、腫瘍部位に近傍筋肉部位より高い［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積が確認された。腫瘍への集積は近傍筋肉比で４．６〜８．１倍であった。さらに、連続する凍結切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色（図６）及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＳＰ−２６０）を用いて免疫組織化学染色を行った（図７）。腫瘍部位でｃ−Ｍｅｔ特異的な染色が確認され、［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積像と一致した。
この結果により、［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積が、ｃ−Ｍｅｔ特異的集積であることが確認された。【００６５】
実施例５
［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のＨＧＦ受容体への結合の確認
ｃ−Ｍｅｔ発現ＨｕＣＣＴ−１細胞（ヒト由来胆管癌細胞）への［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の結合が、ヒトリコンビナントＨＧＦ（ｈｒＨＧＦ）により阻害されるかをバインディングアッセイ法により確認した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングしたエッペンドルフチューブに結合阻害試験用に調整したＨｕＣＣＴ１細胞の細胞懸濁液１００μＬ（１．５×１０5個）を入れ、ｈｒＨＧＦ（ペプチド研究所）を終濃度３７９ｎＭに調整した溶液５０μＬを添加した。ネガティブコントロールとして、ｒｈＨＧＦ溶液の代わりにバインディングバッファー（０．２％ＢＳＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  Ｈａｎｋｓ’ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ７．０）を５０μＬ添加したものを用意した。さらに、０．７５８ｎＭ  ［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）溶液を５０μＬ添加した（終濃度０．１９０ｎＭ、ｈｒＨＧＦとの量比は１：２０００）。細胞の入ったエッペンドルフチューブは撹拌の後、室温で１時間インキュベート後、４℃で遠心（３０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）して細胞を沈降し、上清をアスピレーターで除いた。細胞を氷冷したバインディングバッファー５００μＬ加え撹拌後、遠心（３０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）する洗浄操作を３回繰り返した。細胞の入ったエッペンドルフチューブの放射能をガンマカウンターで測定した。その後、ｈｒＨＧＦ溶液を添加したもの（ｈｒＨＧＦ（＋））とバインディングバッファーを添加したもの（ｈｒＨＧＦ（−））の放射能のカウント（ｃｐｍ）について平均値、標準偏差を求めた。平均値については、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により平均値の差を検定した。
その結果、ＨｕＣＣＴ１細胞に結合した［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）由来の放射能は、ｈｒＨＧＦ（−）で２６１３６．２±２５８０．８ｃｐｍ（ｍｅａｎ±ＳＤ：以下同様）となり、ｈｒＨＧＦ（＋）では、２０９１６．９±１５７４．２ｃｐｍとなった。モル濃度で２０００倍のｈｒＨＧＦを添加することにより、細胞への結合は２０％減少した。また、この減少は統計学的に有意（Ｐ＝０．０４０）であった（図８）。以上のことから、［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）が、ＨｕＣＣＴ１細胞のＨＧＦ受容体に結合していることが明らかになった。【００６６】
実施例６
［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）による心筋虚血モデルラットのＨＧＦ受容体発現部位の確認【００６７】
＜心筋虚血モデルの作製＞
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（１０週齢）ペントバルビタールＮａを３５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与し麻酔をかけた。気管を切開し、人工呼吸器を装着させた。左胸部を開胸し、この状態を冠動脈結紮術前状態として、心電図を記録した。冠動脈とその周辺数ｍｍの組織を含めて縫合糸で結紮した。心電図にて、ＳＴの上昇により虚血状態を確認し記録した。心電図測定後、閉胸した。気管及び皮膚を縫合した。【００６８】
＜オートラジオグラフィ＞
心筋虚血モデル作製後３日後に血流イメージング剤９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩ（製品名  カーディオライト注射液  株式会社第一ラジオアイソトープ研究所）と［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）を投与し、２核種オートラジオグラフィ、ＨＥ染色により評価した。９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを大腿静脈より６０ＭＢｑ投与した。９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩ投与１５分後に［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）を大腿静脈より７４０ｋＢｑ投与し、１５分後に心臓を摘出した。実験当日に、イメージングプレートに３０分間密着させた後、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ−１８００にて９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩの集積像を得た（図９）。その後９９ｍＴｃの減衰を７日間待ち、再度イメージングプレートに７日間密着させた後、バイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ−１８００にて［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積像を得た（図１０）。【００６９】
２核種オートラジオグラフィの結果から、９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩの集積が低下している境界付近で［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積が観察された（正常心筋比１．４〜２．３倍の集積）。連続切片のＨＥ染色から、［１２５Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）の集積部位がＨＧＦ受容体を過剰に発現しているとされる梗塞境界であることが確認された（図１１）。【００７０】
実施例７
心筋虚血モデルＨＧＦ受容体発現部位の［１２３Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）による画像化【００７１】
＜心筋虚血モデルの作製＞
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（８週齢）にイソフルラン（フォーレン（Ｒ）アボット）にて麻酔をかけた後、気管を切開し、麻酔器を接続した人工呼吸器を装着させた。左胸部を開胸し、この状態を冠動脈結紮術前状態として、心電図を記録した。冠動脈とその周辺の組織を含めて縫合糸で結紮した。結紮する際に冠動脈と縫合糸の間にナイロン糸を挟み込みことで結紮強度を弱め完全に血流を遮断しないようにした。心電図にて、ＳＴの上昇により虚血状態を確認し記録した。その後、閉胸して気管及び皮膚を縫合した。【００７２】
＜ＳＰＥＣＴ収集＞
イソフルラン吸入麻酔下で心筋虚血モデルラットに、９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを左大腿静脈より投与した（９０ＭＢｑ）。続いて実施例２と同様の手法を用いて調整した［１２３Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）を右大腿静脈より投与した（１００ＭＢｑ）。投与３０分後から、ガンマカメラ（ＰＲＩＳＭ２０００  島津製作所）にてＰｉｎｈｏｌｅ−ＳＰＥＣＴ撮像を行った（撮像条件  Ｐｉｎｈｏｌｅコリメーター、マトリックスサイズ２５６×２５６、Ｍａｇ１．０、エネルギーウインドウ９９ｍＴｃ：１４０ｋｅＶ  １０％、１２３Ｉ：１５９ｋｅＶ  １０％、３°  ６０ｓｅｃ／ステップ）。さらに、撮像後心臓を摘出し、ｅｘ  ｖｉｖｏでＰｉｎｈｏｌｅ−ＳＰＥＣＴ撮像を行った（撮像条件は同じ）。【００７３】
その結果、９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩのＰｉｎｈｏｌｅ−ＳＰＥＣＴ像にて血流の低下が観察されたことから、心筋虚血モデルができていることが確認された（図１２）。また、［１２３Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）のＰｉｎｈｏｌｅ−ＳＰＥＣＴ像から、９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩの集積が低下している部位の境界周辺に集積が高いことが確認された（図１３）。さらに、ＨＧＦ受容体が発現しているとされる血流低下領域で［１２３Ｉ］ＨＧＦ（１１−８３）−ＮＨ２（７３ａａ）が高集積することが、Ｐｉｎｈｏｌｅ−ＳＰＥＣＴ画像からも明らかにされた。（図１４）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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