(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器であって、
アデニル酸キナーゼが固定された第１領域と、アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素が固定された第２領域とが設けられた流路を備えており、
上記流路は、上記アデノシン三リン酸と、アデニル酸と、上記アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素の基質とを、上記第１領域および上記第２領域の順に通過させるものであり、
上記第１領域は、上記アデノシン三リン酸をすべて消費するものであり、
上記第２領域は、上記アデノシン二リン酸をすべて消費するものであることを特徴とする反応器。
【請求項２】
上記アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素は、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、またはヘキソキナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の反応器。
【請求項３】
上記流路が複数連結されており、
上記第１領域および第２領域が交互に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の反応器。
【請求項４】
液体を、上記流路に沿って、上記第１領域から第２領域の方向に送液し、上記第１領域および第２領域を順に通過させ、
該第２領域を通過した液体を、再び、上記第１領域の上流から第２領域の方向に送液することを可能にする溶液循環機構をさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載の反応器。
【請求項５】
アデニル酸キナーゼが固定された第１領域と、アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素が固定された第２領域とが設けられた流路に沿って、アデノシン三リン酸とアデニル酸と上記酵素の基質とを、上記第１領域および第２領域の順に通過させ、
上記第１領域では、上記アデノシン三リン酸がすべて消費され、
上記第２領域では、上記アデノシン二リン酸がすべて消費されることを特徴とするアデノシン三リン酸の増幅方法。
【請求項６】
上記アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素と該酵素の基質との組み合わせは、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビンとの組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、酢酸キナーゼとアセチルリン酸との組み合わせ、クレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせ、またはヘキソキナーゼとヘキソースリン酸との組み合わせであることを特徴とする請求項５に記載のアデノシン三リン酸の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用に関するものであり、特に、微量なアデノシン三リン酸を定量するために利用可能なアデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、アデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ともいう）の測定法としては、ホタルルシフェラーゼを用いた生物発光による測定法が一般的に用いられている（非特許文献１を参照）。また、該測定法は、ＨＡＣＣＰ（Hazard Analysis Critical Control Point）において、生命体に含まれるＡＴＰを指標とした衛生検査の標準法となっている。
【０００３】
上記測定法によれば、幅広い濃度範囲でＡＴＰを定量的に検出することができる。しかし、超微量のＡＴＰや、１，０００個体以下の微量の微生物を検出対象とする場合、そのような微量のＡＴＰから生じる発光は市販のルミノメーターの検出可能域を大きく下回っているため、感度が不十分であるという問題がある。
【０００４】
そのような問題を解決するために、本発明者らは、これまでに、微量のＡＴＰを、アデニル酸キナーゼ（以下、「ＡＤＫ」ともいう）およびポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」ともいう）を用いた共役反応（連鎖的ＡＴＰ増幅反応）により、ＡＴＰを人為的に増幅するＡＴＰ増幅法を開発している（特許文献３を参照）。
【０００５】
具体的には、特許文献３のＡＴＰ増幅法では、ＡＤＫの触媒下でＡＴＰとアデニル酸（以下、「ＡＭＰ」ともいう）とから２分子のアデノシン二リン酸（以下、「ＡＤＰ」ともいう）を生成する反応（以下、「ＡＤＫ反応」ともいう）と、ＰＰＫの触媒下で該２分子のＡＤＰとポリリン酸（以下、「Ｐｎ」ともいう）とから２分子のＡＴＰを生成する反応（以下、「ＰＰＫ反応」ともいう）とを、１つの反応系内で行う。
【０００６】
該ＡＴＰ増幅法において、上記ＡＤＫ反応とＰＰＫ反応とを１サイクルとして、反応をｎサイクル行うと、ＡＴＰを２ｎ倍に増幅することができる。
【０００７】
また、本発明者らは、特許文献１に開示されるＡＴＰ増幅法において、不純物としてのＡＤＰを含まない酵素を用いることにより外因性のＡＴＰのみを増幅できることを見出している（非特許文献２を参照）。
【０００８】
また、非特許文献２には、該ＡＴＰ増幅法によれば、ＡＴＰ検出感度は、ＡＴＰを増幅しない従来法と比較して、１０，０００倍以上に感度が向上し、数ａｍｏｌレベルのＡＴＰを検出できることが記載されている。さらに、非特許文献２には、該ＡＴＰ増幅方法によれば、細胞１個レベルの微生物のＡＴＰを増幅、検出できることが記載されている。
【０００９】
さらに、本発明者らは、標的微生物特異的抗体を用いて、試料に含まれる微生物のうち標的微生物のみを分離した後に、非特許文献２に開示されるＡＴＰ増幅法を行うことにより、微生物の検出と微生物種の同定とを同時に行うことが可能であることを見出している（非特許文献３、特許文献２を参照）。具体的には、非特許文献３および特許文献２には、このような方法によれば、大腸菌や、牛乳中の黄色ブドウ球菌、ふき取り検査または環境水中に含まれる微生物を、１個体レベルで検出できることが記載されている。
【特許文献１】特開２００１−２９９３９０号公報（平成１３（２００１）年１０月３０日公開）
【特許文献２】特開２００６−８１５０６号公報（平成１８（２００６）年３月３０日公開）
【特許文献３】特開２００６−２２３１６３号公報（平成１８（２００６）年８月３１日公開）
【非特許文献１】DeLuca, M. and McElroy, W.D. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26, 912-925 (1974)
【非特許文献２】T. Satoh, J. Kato, N. Takiguchi, H. Ohtake, A. Kuroda ATP amplification for ultrasensitive bioluminescence assay: detection of a single bacterial cell Biosc. Biotechnol. Biochem.  68, 1216-1220 (2004).
【非特許文献３】Y. Asami, T. Satoh,A. Kuroda Polyphosphate-ATP amplification technology:principle and its application to specific bacteria detection J. Environ. Biotechnol.  6, 2, 105-108 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１および２、非特許文献２および３に開示されるＡＴＰ増幅法は、上述したように、微生物の有無を試験する１次的なスクリーニング等に有効である。
【００１１】
また、上記ＡＴＰ増幅法では、連鎖的ＡＴＰ増幅反応をバッチ内で行うため、連鎖的ＡＴＰ増幅反応は、ＡＭＰを消費し終わるまで増幅を続け、最終的には一定のＡＴＰ量に収束する（図１２を参照）が、反応系に加えるＡＴＰ量に応じて増幅速度に差があるため、一定の反応時間で区切ることにより、相対的なＡＴＰ測定を行うことができる。
【００１２】
具体的には、本発明者らは、ＡＴＰ増幅法を用いたＡＴＰ定量法として、特許文献３に開示される技術を開発している。特許文献３に開示される方法では、上述したようなＡＴＰ増幅法により増幅したＡＴＰをヘキソキナーゼ法により、試料中のＡＴＰを定量的に検出することができる。
【００１３】
しかしながら、特許文献３も含め、従来のＡＴＰ増幅法を用いたＡＴＰ定量では、図２に示すように、連鎖的ＡＴＰ増幅反応をバッチで行うため、ＡＴＰは指数関数的に増幅される。そのため、比較する両者で、酵素活性（または酵素量）に僅かな相違があるだけで、大きな誤差が生じる。その結果、微量ＡＴＰを定量する場合、ある程度の定量を行うことは可能であるが、高精度な定量は困難であるという問題がある。
【００１４】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、微量なＡＴＰを定量するために利用可能なＡＴＰを増幅させるための反応器およびＡＴＰの増幅方法、並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、アデニル酸キナーゼ、およびアデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素を固定化したフロー系によれば、ＡＴＰの増幅回数を所望に制御できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。
【００１６】
（１）アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器であって、アデニル酸キナーゼが固定された第１領域と、アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素が固定された第２領域とが設けられた流路を備えていることを特徴とする反応器。
【００１７】
（２）上記アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素は、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、またはヘキソキナーゼであることを特徴とする（１）に記載の反応器。
【００１８】
（３）上記流路が複数連結されており、上記第１領域および第２領域が交互に配置されていることを特徴とする（１）に記載の反応器。
【００１９】
（４）液体を、上記流路に沿って、上記第１領域から第２領域の方向に送液し、上記第１領域および第２領域を順に通過させ、該第２領域を通過した液体を、再び、上記第１領域の上流から第２領域の方向に送液することを可能にする溶液循環機構をさらに備えていることを特徴とする（１）に記載の反応器。
【００２０】
（５）アデニル酸キナーゼが固定された第１領域と、アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素が固定された第２領域とが設けられた流路に沿って、アデノシン三リン酸とアデニル酸と上記酵素の基質とを、上記第１領域および第２領域の順に通過させることを特徴とするアデノシン三リン酸の増幅方法。
【００２１】
（６）上記アデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素と該酵素の基質との組み合わせは、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビンとの組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、酢酸キナーゼとアセチルリン酸との組み合わせ、クレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせ、またはヘキソキナーゼとヘキソースリン酸との組み合わせであることを特徴とする（５）に記載のアデノシン三リン酸の増幅方法。
【００２２】
（７）アデニル酸キナーゼが固定された担体、およびアデノシン二リン酸をアデノシン三リン酸に変換する酵素が固定された担体の少なくとも一方を含むことを特徴とするアデノシン三リン酸の増幅キット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明にかかる反応器は、以上のように、ＡＴＰを増幅させるための反応器であって、ＡＤＫが固定された第１領域と、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素が固定された第２領域とが１つずつ設けられた流路を備えている。
【００２４】
したがって、上記流路に沿って、ＡＴＰと、ＡＭＰと、上記酵素の基質とを、上記第１領域および第２領域の順に通過させることにより、ＡＴＰを２倍に増幅することができる。さらに、同じ操作を繰り返し行うことにより、ＡＴＰを２の累乗倍に増幅することができる。
【００２５】
つまり、上記構成によれば、試料に含まれるＡＴＰの増幅回数（増幅倍率）を所望に制御することができる。それゆえ、試料中に含まれるＡＴＰを定量的に増幅することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について、図１および図２に基づき説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
＜Ｉ．ＡＴＰ増幅反応器＞
本発明にかかる反応器は、ＡＴＰを増幅させるための反応器（以下、「ＡＴＰ増幅反応器」ともいう）である。具体的には、該ＡＴＰ増幅反応器は、図１に示すように、ＡＤＫが固定された第１領域と、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素（以下、「ＡＤＰリン酸化酵素」ともいう）が固定された第２領域とが設けられた流路を備えている。
【００２８】
なお、上記ＡＤＰリン酸化酵素は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ピルビン酸キナーゼ（以下、「ＰＫ」ともいう）、ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」ともいう）、酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、およびヘキソキナーゼ等を挙げることができる。
【００２９】
上記構成によれば、ＡＴＰと、ＡＭＰと、上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質とを、上記流路に沿って、上記第１領域および第２領域の順に通過させることにより、ＡＴＰを２倍に増幅することができる。
【００３０】
この点について、図２を参照しながら、より詳細に説明する。なお、図２では、ＡＤＰリン酸化酵素としてＰＫを用いているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
ＡＴＰと、ＡＭＰと、ＰＫの基質であるホスホエノールピルビン酸（以下、「ＰＥＰ」ともいう）とを、上記流路に沿って第１領域を通過させる。第１領域には、ＡＤＫが固定されているため、１分子のＡＭＰと１分子のＡＴＰとが反応して、２分子のＡＤＰが生成される（図２を参照）。
【００３２】
この第１領域で生成された２分子のＡＤＰを、ＰＥＰと共に、上流路に沿って第２領域を通過させる。第２領域には、ＰＫが固定されているため、２分子のＡＤＰと２分子のＰＥＰとが反応して２分子のＡＴＰと２分子のピルビン酸とが生成される（図２を参照）。
【００３３】
このようなメカニズムにより、上記流路を通過したＡＴＰは２倍に増幅される。この一連の反応を連鎖的ＡＴＰ増幅反応ともいう。この連鎖的ＡＴＰ増幅反応を繰り返し行うことにより、ＡＴＰを２の累乗倍に増幅することができる。
【００３４】
このように、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器によれば、試料に含まれるＡＴＰの増幅回数（換言すれば、増幅倍率）を所望に制御することができる。そのため、試料中に含まれるＡＴＰを定量的に増幅させることができる。
【００３５】
上記流路上に、第１領域および第２領域を形成する方法は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ＡＤＫおよびＡＤＰリン酸化酵素をそれぞれ固定した担体を、上記流路上に配置（固定）することにより、上記第１領域および第２領域を形成することができる。
【００３６】
より具体的には、ＡＤＫおよびＡＤＰリン酸化酵素をそれぞれ固定した担体を用いて作製した中空カラムまたは充填カラムにより、上記第１領域および第２領域を形成することができる。
【００３７】
ＡＤＫおよびＡＤＰリン酸化酵素をそれぞれ担体に固定する方法は特に限定されるものではない。例えば、吸着法、化学修飾法、包括固定化法など、「固定化生体触媒」（千畑 一郎  編、講談社、1986年、ISBN-10: 4061396730）に例示されるような方式や、ポリイオンコンプレックス、抗原抗体反応を用いる方法、自己組織化膜法等から選択して用いればよい。また、これらの方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
中でも、ＡＤＫまたはＡＤＰリン酸化酵素を、共有結合法に代表される強固な固定化法により担体に固定する方法が好ましい。このような方法によれば、連鎖的ＡＴＰ増幅反応中に、酵素が担体から解離して漏出することを防止することができる。それゆえ、連鎖的ＡＴＰ増幅反応によるＡＴＰの回数をより精密に制御することができる。
【００３９】
また、上記担体は特に限定されるものではなく、タンパク質を固定することができる担体であれば、従来公知のものを用いることができる。
【００４０】
例えば、上記第１領域および第２領域を充填カラムにより形成する実施形態では、固定化担体には樹脂、ガラス、セラミックス、金属、多糖類など、充填カラムの充填剤として知られている各種部材を用いることができる。
【００４１】
充填カラムにより第１領域および第２領域を形成する実施形態では、固定化担体が、上記流路から漏出しないことが重要である。そのため、ＡＤＫまたはＡＤＰリン酸化酵素が固定された担体は、上記流路の送液方法の少なくとも下流側に向けてしっかりとせき止められていることが好ましい。
【００４２】
また、充填カラムにより第１領域および第２領域を形成する実施形態では、固定化担体は酵素固定化後に充填してもよいし、充填後に酵素を固定化してもよい。さらに、本発明ではカラム内での酵素固定化量濃度分布は特に限定されるものではない。
【００４３】
本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、上記流路が複数連結されていてもよい。このとき、上記第１領域と第２領域とが交互に配置されるように連結する。このような構成によれば、この連結された流路に沿って、ＡＴＰと、ＡＭＰと、上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質とを、第１領域、第２領域、第１領域、第２領域、・・・の順に通過させることにより、上記流路の連結数に応じて、１回の操作でＡＴＰを２の累乗倍に増幅することができる。
【００４４】
本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、上記流路以外の部材を備えていてもよい。具体的には、例えば、液体を、上記流路に沿って、上記第１領域から第２領域の方向に送液し、上記第１領域および第２領域を順に通過させ、該第２領域を通過した液体を、再び、上記第１領域の上流から第２領域の方向に送液することを可能にする溶液循環機構をさらに備えていてもよい。
【００４５】
上記溶液循環機構としては、具体的には、例えば、上記流路をループ状にして、第２領域を通過した液体を再び第１領域の上流に戻し、再び、該液体を上記第１領域から第２領域の方向に送液する機構が挙げられる。
【００４６】
また、別の実施形態として、第２領域を通過した液体を、第２領域から第１領域の方向に逆流させて、第２領域および第１領域を通過させ、該第１領域を通過した液体を、再び、上記第１領域から第２領域の方向に送液する機構が挙げられる。なお、連鎖的ＡＴＰ増幅反応の逆向きの反応は実質的に無視できる程度であるため、第２領域を通過した試料を同一流路上を逆流させても、繰り返し行う連鎖的ＡＴＰ増幅反応に影響を与えることはない。
【００４７】
このような構成によれば、上記流路の連結数に制限されることなく、連鎖的ＡＴＰ増幅反応を繰り返し行うことができる。また、上記流路の連結数を低減することができるため、ＡＴＰ増幅反応器を小型化することができる。
【００４８】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、上記流路に液体を送液するための送液部や、上記流路にＡＴＰ等の物質を注入するための注入部、第２領域を通過した液体を回収する回収部、上記流路の温度を制御するための温度制御部等を備えていてもよい。
【００４９】
上記送液部には、ポンプ、配管、インジェクター、コネクター、カラム、カラム充填剤、フラクションコレクター、検出器などが含まれうるが、これらは、耐圧性が高いことが好ましい。具体的には、０．１ＭＰａ以上の耐圧性能を有することが好ましい。
【００５０】
上記流路が複数連結された構成では、流路の全長が長くなり、送液時に圧力が上昇するが、上記構成によれば、そのように複数の流路を連結した場合であっても、液体を送液することができる。
【００５１】
本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、以上のような構成を備えているため、ＡＴＰを効率的に増幅することができる。さらに、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、任意の試料中に含まれるＡＴＰを定量性よく増幅することができる。したがって、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、任意の試料中に含まれる微量なＡＴＰを検出したり、定量したりする用途に好適に用いることができる。
【００５２】
ここで、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器を用いてＡＴＰを増幅させる方法（すなわち、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法）について説明する。
【００５３】
本発明にかかるＡＴＰ増幅方法では、上記ＡＴＰ増幅反応器が備える上記流路に沿って、ＡＴＰとＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質とを、第１領域および第２領域の順に、通過させる。
【００５４】
なお、その具体的な手段は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ＡＴＰとＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質とを含む試料溶液を、上記流路の第１領域上流に供し、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびＡＤＰリン酸化酵素の基質のいずれも含まない緩衝液を第１領域から第２領域の方向に送液することにより、上記流路に沿って、ＡＴＰとＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質とを、第１領域および第２領域の順に、通過させることができる。
【００５５】
また、別の実施形態として、例えば、ＡＴＰを含む試料溶液を、上記流路の第１領域上流に供し、ＡＭＰおよびＡＤＰリン酸化酵素の基質を含む緩衝液を第１領域から第２領域の方向に送液することにより、上記流路に沿って、ＡＴＰとＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質とを、第１領域および第２領域の順に、通過させることができる。
【００５６】
上記構成によれば、第１領域において、１分子のＡＭＰと１分子のＡＴＰとを反応させ、２分子のＡＤＰを生成することができる。さらに、この２分子のＡＤＰは、第２領域を通過する際、ＡＤＰリン酸化酵素の基質と反応し、２分子のＡＴＰを生成することができる。つまり、上記工程を１回実施することにより、ＡＴＰを２倍に増幅することができる。また、この操作を複数回繰り返すことにより、ＡＴＰを２の累乗倍に増幅することができる。
【００５７】
上記ＡＴＰ増幅反応器に導入する試料溶液の導入量は、あらかじめ試料（ＡＴＰ含有試料）と他の反応基質（ＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質）を混合後にＡＴＰ増幅反応器に導入する実施形態では、検出、あるいは回収されるまで、試料セグメントの一部が希釈されないだけ十分多量な試料を導入することが好ましい。このような必要量は、例えば、ダミーで色素をＡＴＰ増幅反応器に導入して送液して、該色素を検出、回収することにより実験的に知ることができる。
【００５８】
一方、ＡＴＰ増幅反応器内で試料（ＡＴＰ含有試料）が試料セグメントの流れ方向前後にある他の基質（ＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質）と混合される実施形態では、最初の第１領域に到達するまでに混合可能なように十分少量な試料を導入することが好ましい。このような必要量は、例えばダミーで混合して発色するような色素を、ＡＴＰ増幅反応器に導入して送液して第１領域の手前で検出、回収することにより実験的に知ることができる。ＡＴＰ増幅反応器内で試料（ＡＴＰ含有試料）が、その他の基質（ＡＭＰとＡＤＰリン酸化酵素の基質）と並走して、送液し合流させることにより両者を混合する実施形態では、試料導入量は任意である。
【００５９】
上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質は、上記第２領域に固定されているＡＤＰリン酸化酵素の種類に応じて異なる。例えば、上記ＡＤＰリン酸化酵素がＰＫである場合、上記基質は、ＰＥＰである。また、上記ＡＤＰリン酸化酵素がＰＰＫである場合、上記基質は、ポリリン酸（以下、「Ｐｎ」ともいう）である。さらに、上記ＡＤＰリン酸化酵素が酢酸キナーゼである場合、上記基質は、アセチルリン酸である。上記ＡＤＰリン酸化酵素がクレアチンキナーゼである場合、上記基質は、ホスホクレアチンである。上記ＡＤＰリン酸化酵素がヘキソキナーゼである場合、上記基質は、ヘキソースリン酸である。
【００６０】
上記Ｐｎは特に限定されるものではなく、Ｐｎあるいはその塩を好適に用いることができる。好ましくは１０個〜１０００個、より好ましくは１０個〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものを用いる。Ｐｎは細菌由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成したものでもよい。
【００６１】
本発明にかかるＡＴＰ増幅方法に用いるＡＭＰおよびＡＤＰリン酸化酵素の基質は、ＡＴＰを含まないことが好ましい。ＡＭＰ、ＰＥＰ、Ｐｎはリン酸系物質であるため、通常、市販品には、極めて多量のＡＴＰが含まれている。したがって、ＡＭＰおよびＡＤＰリン酸化酵素の基質を精製し、ＡＴＰを除去して用いることが好ましい。より具体的には、ＡＭＰおよびＡＤＰリン酸化酵素の基質を含む試料溶液または緩衝液中の、ＡＭＰおよび該基質に由来するＡＴＰ濃度が、１ｍＭ以下となるようにすることが好ましく、１μＭ以下となるようにすることがより好ましい。
【００６２】
上記流路に送液する緩衝液、およびＡＴＰを含む試料溶液の調製に用いる緩衝液は、特に限定されるものではなく、適切な緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液を用いればよい。また、上記緩衝液には、例えばＭｇイオン等の二価金属イオンが含まれていることが好ましい。
【００６３】
上記緩衝液は、増幅されたＡＴＰを検出する方法に応じて適切な緩衝液を選択することが好ましい。ＡＴＰの検出方法として最も一般的に用いるルシフェラーゼ発光法を用いる場合、上記緩衝液は、ルシフェラーゼ反応の阻害剤をできる限り含まないことが好ましい。
【００６４】
ルシフェラーゼ反応は、例えば、後述の実施例に示すように、リン酸イオンや塩化物イオンにより阻害される。したがって、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法で増幅されたＡＴＰをルシフェラーゼ発光法により検出する場合、上記緩衝液のリン酸イオンおよび塩化物イオンの濃度はできるだけ低くすることが好ましい。
【００６５】
具体的には、リン酸イオン濃度は、１Ｍ以下とすることが好ましく、１ｍＭ以下とすることがより好ましい。また、塩化物イオン濃度は、１Ｍ以下とすることが好ましく、１ｍＭ以下とすることがより好ましい。
【００６６】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法を行う温度は特に限定されるものではなく、連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いる酵素の至適温度を越えない範囲で行えばよい。具体的には、４℃〜９８℃の温度範囲で実施することが好ましい。連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いる酵素の至適温度より低いと酵素活性が低くＡＴＰが充分増幅されなくなる傾向がある。一方、連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いる酵素の至適温度を超えると酵素が失活することによりＡＴＰが充分増幅されなくなる傾向がある。
【００６７】
したがって、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器が上記温度制御部を備える構成では、該温度制御部は、上記流路を室温〜連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いる酵素の至適温度の温度範囲で制御できるものであることが好ましい。
【００６８】
上記流路に沿って、上記緩衝液を送液するときの送液方式は特に限定されるものではなく、連続送液方式であってもよいし、ストップトフロー方式であってもよい。また、そのときの流速は特に限定されるものではなく、上記第１領域および第２領域において、連鎖的ＡＴＰ増幅反応が十分に進行可能な流速であればよい。該流速は、上記第１領域および第２領域に固定化した酵素量や酵素活性に依存するものであり、用いる流路に応じて適切に設定することが好ましい。具体的には、後述の実施例に示すような方法により、適切な流速を設定することができる。
【００６９】
特に、適切な流速範囲の中でも、できるだけ高い流速を選択することが好ましい。フロー系内の、反応に寄与しない部分をデッドボリュームといい、流速低減に伴いデッドボリューム分の送液時間は流速に反比例して増える。そのため、場合によっては、上記第１領域および第２領域への十分な滞留時間を確保するために、ストップトフロー方式をとることが好ましい。
【００７０】
上記第１領域および第２領域における反応は、ほぼ平衡状態に達することが好ましい。これにより、再現性よくＡＴＰを増幅することができる。具体的には、第１領域および第２領域における反応での分析対象側基質、すなわち第１領域にあってはＡＴＰが、第２領域にあってはＡＤＰが、ほぼすべて消費されることが好ましい。なお、再現性よくＡＴＰを増幅することが可能であれば、この限りではない。
【００７１】
本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器では、固定化酵素量が多いほど、また、その酵素の比活性が高いほど、平衡状態には早く達する。また、第１領域および第２領域での滞留時間が長ければ、より確実に平衡状態に達する。第１領域および第２領域の長さ（換言すれば、カラム長）は長く、また、第１領域および第２領域の、流れの軸方向に垂直な断面積が大きいほうが同じ流速でも滞留時間が長くなる。また、送液する流速は遅いほど滞留時間が長くなる。これらのフロー系設計条件および実施条件は、選択可能なフロー系部材の耐圧条件や、酵素活性などの制約に基づき、実験的に定めることができる。
【００７２】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法においては、上記流路にＡＴＰを供する前（換言すれば、連鎖的ＡＴＰ増幅反応を行う前）に、上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質を含む緩衝液を上記流路に送液することが好ましい。
【００７３】
上記ＡＤＰリン酸化酵素は、反応基質であるＡＤＰと複合体を形成するものが多い。具体的には、ＡＤＰリン酸化酵素であるＰＫおよびＰＰＫはいずれも、ＡＤＰと複合体を形成することが知られている。
【００７４】
ＡＤＰリン酸化酵素がＡＤＰとこのような複合体を形成していると、連鎖的ＡＴＰ増幅反応において、該ＡＤＰがＡＴＰに変換されるため、定量的なＡＴＰ増幅を行うことが困難になる。
【００７５】
しかしながら、上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質を含む緩衝液を上記流路に予め送液することにより、第２領域に固定されたＡＤＰリン酸化酵素がＡＤＰと複合体を形成していたとしても、該ＡＤＰを除去することができる。つまり、上記構成によれば、定量的にＡＴＰを増幅させることができる。
【００７６】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器を使用後、上記流路に上記ＡＤＰリン酸化酵素の基質を含む緩衝液を送液することにより、容易にＡＤＰリン酸化酵素と結合しているＡＤＰを除去することができる。それゆえ、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、容易なメンテナンス処理により、繰り返し使用することができる。
【００７７】
本発明にかかるＡＴＰ増幅方法では、さらに、上記流路にＡＴＰを供する前（換言すれば、連鎖的ＡＴＰ増幅反応を行う前）に、上記流路にリン酸を送液することが好ましい。
【００７８】
上記構成によれば、流路中にＡＴＰが付着（滞留）していたとしても、該ＡＴＰを洗い流すことができる。それゆえ、ＡＴＰを定量的に増幅させることができる。
【００７９】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器を使用後、上記流路にリン酸を送液することにより、容易に、流路上のＡＴＰを除去することができる。それゆえ、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器は、容易なメンテナンス処理により、繰り返し使用することができる。
【００８０】
本発明にかかるＡＴＰ増幅方法は、上記構成を備えているため、上記流路に供するＡＴＰのみを定量性よく増幅することができる。したがって、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器、および本発明にかかるＡＴＰ増幅方法は、試料中に含まれる微量なＡＴＰの高感度検出や、高感度定量に好適に用いることができる。もちろん、ＡＴＰの合成生産の目的に利用することも可能である。
【００８１】
したがって、本発明には、本発明にかかるＡＴＰ増幅反応器を用いてＡＴＰを検出する方法（以下、「ＡＴＰ検出方法」ともいう）、およびＡＴＰを定量する方法（以下、「ＡＴＰ定量方法」ともいう）も含まれる。なお、ＡＴＰ検出方法およびＡＴＰ定量方法については、後述する。
【００８２】
また、本発明には、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法、ＡＴＰ検出方法、およびＡＴＰ定量方法を実施するために好適に利用することが可能なＡＴＰ増幅キット、ＡＴＰ検出キット、ＡＴＰ定量キット（以下、これらのキット総称して「本発明にかかるキット」ともいう）も含まれる。
【００８３】
本発明にかかるキットには、ＡＤＫが固定された担体、およびＡＤＰリン酸化酵素が固定された担体のうち、少なくとも一方が含まれていればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
【００８４】
また、上記ＡＤＫが固定された担体、およびＡＤＰリン酸化酵素が固定された担体は、該担体にＡＤＫおよびＡＤＰリン酸化酵素のそれぞれが既に固定されている状態で本発明にかかるキットに含まれていてもよいが、該担体にＡＤＫおよびＡＤＰリン酸化酵素のそれぞれを固定するための試薬セットとして含まれていてもよい。
【００８５】
本発明にかかるキットには、連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いられる試薬、ＡＴＰの検出に用いられる試薬がさらに含まれていることが好ましい。
【００８６】
上記連鎖的ＡＴＰ増幅反応に用いられる試薬としては、具体的には、例えば、ＰＥＰ、ポリリン酸化合物、ＡＭＰ等を挙げることができる。
【００８７】
上記ＡＴＰ検出に用いられる試薬としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等を挙げることができる。
【００８８】
本発明にかかるキットには、上記例示したもの以外に、上記化合物等を溶解するための緩衝液、ＡＴＰ標準液、試料からＡＴＰを抽出するための試薬、反応に用いるプレート等が含まれていてもよい。
【００８９】
＜ＩＩ．ＡＴＰ検出方法およびＡＴＰ定量方法＞
本発明にかかるＡＴＰ検出方法は、試料中に含まれるＡＴＰを本発明にかかるＡＴＰ増幅方法によって増幅し、該増幅したＡＴＰを検出することにより、上記試料中のＡＴＰを検出する方法である。
【００９０】
一方、本発明にかかるＡＴＰ定量方法は、試料中に含まれるＡＴＰを本発明にかかるＡＴＰ増幅方法によって増幅し、該増幅したＡＴＰを定量することにより、上記試料中のＡＴＰを定量する方法である。
【００９１】
本発明にかかるＡＴＰ検出方法およびＡＴＰ定量方法により、ＡＴＰを検出または定量する対象となる試料は、特に限定されるものではなく、ＡＴＰを含む可能性があるものであればよい。ＡＴＰは、動物、植物、微生物等の全ての生物に存在するエネルギー物質であるので、生物由来の試料が本発明の対象試料となり得る。
【００９２】
本方法は超微量のＡＴＰを検出および定量することができるため、本方法の適用対象としては、例えば、抗ガン剤の薬効試験として、アポトーシスが起きて死滅した細胞の検出、生物が存在した痕跡として残るＡＴＰの検出、衛生検査現場における将来微生物が生息するであろう食品残渣の検査、極少数の微生物の検出等を挙げることができる。なかでも微生物の検出に適用すれば、非常に簡便に、かつ、極少数の微生物の存在を確認することができるため、微生物を含む可能性のある試料が本発明の対象試料として好適である。
【００９３】
試料からＡＴＰを抽出する方法は特に限定されるものではなく、試料の種類に応じて公知の方法から適宜選択して用いればよい。例えば、細胞を含む試料や微生物を含む試料からＡＴＰを抽出する場合には、物理的手段（例えばホモジナイザー、超音波等）により細胞または微生物を破砕する方法、酵素（例えばリゾチーム等）により細胞または微生物の膜を破砕する方法、界面活性剤（例えばTritonX-100（商品名）、Tween20（商品名）等）により細胞または微生物の膜を破砕する方法等を用いることができる。
【００９４】
ただし、細胞を破砕等するのみでは、細胞中に含まれるピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびアデニル酸キナーゼ等の酵素が、連鎖的ＡＴＰ増幅反応に影響を及ぼす可能性がある。そのため、細胞を破砕等してＡＴＰを抽出した後に加熱処理を行って酵素を失活させたり、細胞を加熱処理したりすることによりＡＴＰを溶出させる方法を用いることが好ましい。
【００９５】
本発明にかかるＡＴＰ検出方法およびＡＴＰ定量方法において、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法により増幅されたＡＴＰを検出および定量する方法は特に限定されるものではなく、ＡＴＰ検出法およびＡＴＰ定量法として従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
【００９６】
ＡＴＰの検出および定量に用いられる最も一般的な方法として、ルシフェラーゼとＡＴＰとの反応による発光量の測定を挙げることができる。本発明においても、該方法を好適に用いることができる。このような発光量の測定によりＡＴＰを測定する場合には、市販のルシフェラーゼを用いるＡＴＰ測定キットを用いてもよい。
【００９７】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９８】
本発明について、実施例および図３〜図１１に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正および改変を行うことができる。
【００９９】
〔実施例１：酵素固定化カラムを用いたＡＴＰ増幅〕
（１）酵素固定化カラムの作製
ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムを、以下の手順で作製した。
【０１００】
まず、リガンド固定化用カップリングカラム（商品名：HiTrap NHS-activated HPカラム１ｍｌ（GE Healthcare））に、あらかじめ氷上で冷やしておいた１ｍＭ ＨＣｌをシリンジで６ｍｌ通液した。
【０１０１】
直ちに、ＡＤＫ固定化カラムについては結合緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．４）で調製したニワトリ筋由来Myokinase（＝ＡＤＫ、SIGMA）３０μｇ／ｍｌ酵素溶液を、ＰＫ固定化カラムについては上記結合緩衝液で調製したウサギ筋由来Pyruvate kinase（SIGMA）１４４μｇ／ｍｌ酵素溶液を、それぞれ１ｍｌずつを通液し、２５℃で３０分間保温した。
【０１０２】
次に、それぞれのカラムに結合停止液（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を６ｍｌ通液し、２５℃で３０分間保温した。最後に、それぞれのカラムに移動緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を６ｍｌ通液した。これにより、ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムを得た。
【０１０３】
（２）基質の精製
連鎖的ＡＴＰ増幅反応において基質として用いるＡＭＰ、ＰＥＰを以下の手順で精製した。
【０１０４】
まず、市販のＡＭＰ（東京化成工業）およびＰＥＰ（SIGMA）を用いて、１０ｍＭ ＡＭＰ水溶液および５００ｍＭ ＰＥＰ水溶液を調製した。調製したＡＭＰ水溶液およびＰＥＰ水溶液をそれぞれ１００μｌずつ、緩衝液Ａ（１０ｍＭクエン酸、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．８５）で平衡化した陰イオン交換カラム（商品名：ＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー社））に供した。
【０１０５】
その後、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（１０ｍＭクエン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．４０）を用いて、緩衝液Ｂ濃度０％〜１００％のリニアグラジエントによりＡＭＰおよびＰＥＰをそれぞれ溶出した。なお、カラムに送液する流速は、１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。
【０１０６】
また、ＡＭＰについては、溶出された溶液の２５４ｎｍの吸光度（Ａ２５４）をモニターして、ピークの吸光度が２．５以上の画分を分取した。一方、ＰＥＰについては、溶出された溶液の２５０ｎｍの吸光度（Ａ２５０）をモニターして、ピークの吸光度が２．０以上の画分を分取し、精製したＡＭＰおよびＰＥＰを得た。
【０１０７】
こうして分取したＡＭＰおよびＰＥＰの画分について、それぞれ濃度検定を行ったところ、ＡＭＰ画分の濃度は、２．８ｍＭ、ＰＥＰ画分の濃度は、２５．８ｍＭであった。
【０１０８】
（３）酵素固定化カラムに送液する基質溶液の流速の検討
上記（１）で作製したＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムに基質溶液を送液したときに反応を十分に進行させることが可能な流速を、以下の手順で検討した。
【０１０９】
ａ）ＰＫ固定化カラムに送液する基質溶液の流速の検討
上記（１）で作製したＰＫ固定化カラムを自動送液装置（商品名：AKTA explorer 100 : GE Healthcare）に連結し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで移動緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を２ｍｌ以上通液し、平衡化した。
【０１１０】
平衡化後、ＰＫ反応液（５０ｎＭ ＡＴＰ、１．０ｍＭ ＰＥＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）１ｍｌを、流速０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、または４．０ｍｌ／ｍｉｎで通液し、フラクションコレクターで９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ計５ｍｌ分取した。次に、分取した各フラクションのＡＴＰ量およびＡＤＰ量を測定した。
【０１１１】
ＡＴＰ量の測定は、サンプル２０μｌに対して、ルシフェラーゼ溶液（ルシフェラーゼ（商品名：ルシフェラーゼＦＭ（バイオエネックス社））０．０２５ｍｇ／ｍｌ、ルシフェリンカリウム２ｍＭ、５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎ−ＮａＯＨ、１ｍＭ酢酸マグネシウム、５％トレハロース、ｐＨ７．８）２０μｌを加え、発光値をプレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））で測定することにより行った。
【０１１２】
一方、ＡＤＰ量の測定では、まず、サンプル４０μｌに対して、ＰＫ酵素溶液（ウサギ筋由来ＰＫ １０Ｕ／ｍｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４)２０μｌを加え、３７℃で６０分間保温した。その後、反応液４０μｌに対して、上記ルシフェラーゼ溶液２０μｌを加え、発光値をプレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））で測定した。こうして各フラクションのＡＤＰおよびＡＴＰを全てＡＴＰに積算した総ＡＴＰ量から、上記ＡＴＰ量の測定で得られたＡＴＰ量を差し引くことにより、ＡＤＰ量を算出した。
【０１１３】
上記方法により測定した各フラクションのＡＴＰ量およびＡＤＰ量から各流速でＰＫ反応液を送液したときの反応率を求めた。
【０１１４】
その結果、図３に示すように、１．０ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で上記ＰＫ反応液を送液すると、流速の上昇に伴って反応率の減少が見られた。この反応率の低下は、上記（１）で作製したＰＫ固定化カラムに固定化されている酵素量では、１．０ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で上記ＰＫ反応液を送液すると、該カラム通過中に十分に反応が進行するだけの反応時間が確保できないためと考えられる。
【０１１５】
ｂ）ＡＤＫ固定化カラムに送液する基質溶液の流速の検討
上記（１）で作製したＡＤＫ固定化カラムを自動送液装置に連結し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで上記移動緩衝液を２ｍｌ以上通液し、平衡化した。平衡化後、ＡＤＫ反応液（１００ｎＭ ＡＤＰ、０．１ｍＭ ＡＭＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）１ｍｌを流速０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、または４．０ｍｌ／ｍｉｎで通液し、フラクションコレクターで９６穴プレートに１００μｌずつ計５ｍｌ分取した。次に、分取した各フラクションのＡＴＰ量およびＡＤＰ量を上記と同様の方法で測定した。
【０１１６】
そして、測定した各フラクションのＡＴＰ量およびＡＤＰ量から各流速でＡＤＫ反応液を送液したときの反応率を求めた。
【０１１７】
その結果、図４に示すように、１．０ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で上記ＡＤＫ反応液を送液すると、流速の上昇に伴って反応率の減少が見られた。この反応率の低下は、上記（１）で作製したＡＤＫ固定化カラムに固定化されている酵素量では、１．０ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で上記ＡＤＫ反応液を送液すると、該カラム通過中に十分に反応が進行するだけの反応時間を確保できないためと考えられる。
【０１１８】
このように、ＰＫ固定化カラムおよびＡＤＫ固定化カラムのいずれのカラムについても、１．０ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で基質溶液を送液すると、十分に反応させることができなかった。一方、０．５ｍｌ／ｍｉｎ以下の流速で基質溶液を送液すると、図３および図４に示すように、反応率はほぼ１００％であった。そのため、以下の実験では、ＰＫ固定化カラムおよびＡＤＫ固定化カラムに送液する流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【０１１９】
（４）酵素固定化カラムを用いた連鎖的ＡＴＰ増幅反応
上記（１）の方法で作製したＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムをそれぞれ４本用意した。
【０１２０】
これら４本のカラムを用いて、（ａ）ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラムからなる連結カラム、（ｂ）ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラムからなる連結カラム、（ｃ）ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラムからなる連結カラム、（ｄ）ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラムからなる連結カラムを作製した。
【０１２１】
上記（ａ）〜（ｄ）の連結カラムをそれぞれ自動送液装置に装着し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで移動緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を２ｍｌ以上通液し、平衡化した。なお、同一の連結カラムを用いて複数回測定を行う場合、すべての測定間に、上記条件での平衡化を実施した。
【０１２２】
平衡化後、それぞれの連結カラムに、増幅反応液（６５ｎＭ ＡＴＰ、１．０ｍＭ ＰＥＰ、０．１ｍＭ ＡＭＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）２ｍｌを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで通液し、フラクションコレクターで９６穴マイクロプレートに２００μｌずつ計２０ｍｌ分取した。なお、上記増幅反応液の調製には、上記（２）の精製法１で精製したＡＭＰおよびＰＥＰを用いた。
【０１２３】
次に、分取した各フラクションのＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量測定はサンプル２０μｌに対して、ルシフェラーゼ溶液（ルシフェラーゼ（商品名：ルシフェラーゼＦＭ（バイオエネックス社）） ０．０２５ｍｇ／ｍｌ、ルシフェリンカリウム２ｍＭ、５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎ−ＮａＯＨ、１ｍＭ酢酸マグネシウム、５％トレハロース、ｐＨ７．８）２０μｌを加え、発光値をプレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））で測定することにより行った。
【０１２４】
さらに、ＡＴＰを含まない増幅反応液（バックグラウンド）を各連結カラムに供し、同様の操作を行った。分取した各フラクションについて、上記の方法を用いてＡＴＰ量を測定し、該測定値を、上記ＡＴＰを含む増幅反応液を用いた場合の測定値から差し引くことにより、連鎖的ＡＴＰ増幅反応後のＡＴＰ量を算出した。
【０１２５】
その結果、図５に示すように、各連結カラム（増幅カラム）に増幅反応液を通液することで、２ｍｌの反応液は希釈され、約５ｍｌのＡＴＰ濃度勾配を持ったピークで流出した。
【０１２６】
また、１回〜４回のいずれの増幅回数でも、ピークトップの約１．５ｍｌは一定数値に収束していた。このことから、この画分は、希釈の影響を受けずに反応した溶液の画分であると考えられた。
【０１２７】
さらに、１回〜４回のいずれの増幅回数でも、ピークトップのＡＴＰ濃度は、反応前のＡＴＰ濃度と比較して、上昇が見られた。このことから、いずれの増幅回数であっても、連鎖的ＡＴＰ増幅反応が進行することが確認された。
【０１２８】
加えて、連結するカラム数の増加に伴い、ＡＴＰ濃度の増加が見られた。そこで、各増幅回数で増幅されたサンプル（ピークトップを含め、前後２フラクション、計５フラクション）の平均値と増幅回数の関係を片対数プロットした。
【０１２９】
その結果、図６に示すように、１．９Ｎで増幅し、理論値の２Ｎに近い値で指数関数的に増幅する傾向が見られた。以上の結果から、ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムの連結数によって、増幅回数を制御し、その結果、ＡＴＰ増幅を制御できることが明らかとなった。
【０１３０】
つまり、従来のバッチ法でのＡＴＰ増幅反応では、増幅回数の制御が反応時間に依存していたため、微妙な酵素活性の違いでＡＴＰ増幅度が大きく変動し、定量的な高感度測定が難しかった。しかし、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法では、固定化酵素を用いたフロー系での連鎖的ＡＴＰ増幅反応を行う。このＡＴＰ増幅方法では、ＡＴＰの増幅回数は、連結する酵素固定化カラムの数に依存する。そのため、増幅回数（換言すれば、ＡＴＰの増幅度）を増幅カラム数によって厳密に制御することができることが明らかとなった。
【０１３１】
〔実施例２：酵素固定化カラムを用いたＡＴＰの高感度定量〕
酵素固定化カラムを用いたＡＴＰ増幅により、ＡＴＰの高感度定量が可能である否かを検証した。連結カラムとして、実施例１の（４）で作製した（ｄ）ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラム−ＡＤＫ固定化カラム−ＰＫ固定化カラムからなる連結カラムを用いた。すなわち、実施例２では、連鎖的ＡＴＰ増幅反応によるＡＴＰの増幅回数を４回とした。
【０１３２】
上記連結カラムを自動送液装置に装着し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで緩衝液Ａ（１０ｍＭクエン酸、５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．８５）を２ＣＶ以上通液し、平衡化した。なお、以後すべての測定間では同様の条件で平衡化を実施した。
【０１３３】
平衡化後、ＡＴＰ希釈反応液（ＡＴＰ、１．０ｍＭ ＰＥＰ、０．１ｍＭ ＡＭＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）２ｍｌを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで通液し、フラクションコレクターで９６穴マイクロプレートに２００μｌずつ計２０ｍｌ分取した。なお、上記ＡＴＰ希釈反応液の調製には、実施例１で精製したＡＭＰおよびＰＥＰを用いた。また、ＡＴＰ希釈反応液のＡＴＰ濃度は、５００ｆＭ、５ｐＭ、５０ｐＭ、５００ｐＭ、５ｎＭ、および５０ｎＭとした。
【０１３４】
次に、分取した各フラクションのＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰはサンプル５μｌに対して、上記ルシフェラーゼ溶液２０μｌを加え、発光値をプレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））で測定し、ＡＴＰ量を測定した。
【０１３５】
さらに、ＡＴＰを含まないＡＴＰ希釈反応液（バックグラウンド）についても同様の操作を行った。そして、ＡＴＰ希釈反応液を用いて得られた測定値から、バックグラウンドを得られた測定値を差し引き、連鎖的ＡＴＰ増幅反応後のＡＴＰ量を算出した。
【０１３６】
また、比較対照（連鎖的ＡＴＰ増幅反応を行っていないコントロール）として、上記ＡＴＰ希釈反応液を５μｌに対して、上記ルシフェラーゼ溶液を２０μｌ加え、発光値をプレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））で測定し、発光値を測定した。
【０１３７】
その結果、図７に示すように、連鎖的ＡＴＰ増幅反応による４回増幅によって、各ＡＴＰ希釈反応液に含まれるＡＴＰは増幅され、発光値が５０ｐＭ以上の各ＡＴＰ濃度において増加した。より具体的には、ＡＴＰ希釈反応液のＡＴＰ濃度が５０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲で発光値とＡＴＰ濃度との間に比例関係が成立し、定量可能域であった。
【０１３８】
これに対して、増幅前のＡＴＰ希釈反応液をルシフェラーゼアッセイで測定すると、ＡＴＰ濃度５００ｐＭ〜５０ｎＭの範囲で発光値とＡＴＰ濃度との間には比例関係が成立し、定量可能域であった。しかし、５０ｐＭ以下のＡＴＰ濃度では、プレートリーダー（商品名：Wallac 1420 Arvo SX（Perkin Elmer社））検出限界以下のため、発光値に差は見られなかった。
【０１３９】
つまり、上記条件でＡＴＰを増幅させると、ＡＴＰ濃度が４回増幅によって約１６倍に増幅され、ＡＴＰ希釈反応液のＡＴＰ濃度が５０ｐＭであっても、ＡＴＰは増幅され、増幅されたＡＴＰから生じる発光値は検出範囲内となった。
【０１４０】
以上の結果、固定化酵素を用いたＡＴＰ増幅により、ＡＴＰのルシフェラーゼアッセイの定量感度を向上させることができることが明らかとなった。具体的には、ＡＴＰの４回増幅によって、従来のルシフェラーゼアッセイによるＡＴＰ定量と比較して感度を１０倍向上させることができた。
【０１４１】
また、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法によれば、ＡＴＰの増幅回数を所望に制御することができるため、該ＡＴＰの増幅回数を増加させることにより、ＡＴＰのルシフェラーゼアッセイの定量感度をより一層向上させることができる。
【０１４２】
〔実施例３：酵素固定化カラムを用いたＡＴＰ増幅の反復処理〕
ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムのセットを複数セット連結するのではなく、ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムを１つずつ連結した連結カラムに複数回サンプルを通液することにより、複数回ＡＴＰ増幅を行った。
【０１４３】
具体的には、ＡＤＫ固定化カラムおよびＰＫ固定化カラムを１つずつ連結した連結カラムを自動送液装置に装着し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでrunning buffer（１ｍＭ ＰＥＰ、０．１μＭ ＡＭＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）を通液し、平衡化した。なお、上記running bufferの調製には、未精製のＡＭＰおよびＰＥＰを用いた。
【０１４４】
平衡化後、上記running bufferで調製した５０ｐｍｏｌのＡＴＰ溶液１ｍｌをインジェクトし、０．１ｍｌずつ、計５ｍｌサンプリングした。
【０１４５】
次に、上記サンプリングしたサンプル５ｍｌを、再び、同じ連結カラムにインジェクトし、同様の方法で、０．１ｍｌずつ計１０ｍｌサンプリングした。
【０１４６】
さらに、上記サンプリングしたサンプル１０ｍｌを、再度、同じ連結カラムにインジェクトし、同様の方法で０．１ｍｌずつ計１５ｍｌサンプリングした。
【０１４７】
これにより、５０ｐｍｏｌのＡＴＰ溶液１ｍｌのＡＴＰを３回増幅させたサンプルを得た。さらに、ＡＴＰを含まないサンプル（バックグラウンド）についても同様の処理を行い、実施例１および２と同様の方法を用いて、１回増幅後、２回増幅後、３回増幅後のＡＴＰ量を測定した。
【０１４８】
その結果、図８に示すように、１セットの連結カラムに試料を複数回通液することによっても、複数セットを連結した連結カラムの場合と同様に、ＡＴＰを増幅できることが明らかとなった。
【０１４９】
また、実施例１および実施例２では、連鎖的ＡＴＰ増幅反応の基質となるＡＭＰおよびＰＥＰは、ＡＴＰを含むＡＴＰ希釈反応液および増幅反応液に添加した。これに関し、実施例３では、ＡＴＰ希釈反応液や増幅反応液にはＡＭＰおよびＰＥＰを加えず、running bufferに添加したが、この場合でも、連鎖的ＡＴＰ増幅反応が進行することが確認できた。
【０１５０】
〔実施例４：ＫＣｌによるルシフェラーゼ活性阻害〕
ルシフェラーゼアッセイによるＡＴＰ定量において、ＫＣｌ（換言すれば、塩化物イオン）がルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を以下の方法により検証した。
【０１５１】
１００、１０、１、０．１、および０ｍＭ ＫＣｌをそれぞれ含む反応液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ ＡＴＰ）を調製した。
【０１５２】
次に、２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ溶液２０μｌと、上記反応液４０μｌとを混合し、ルミノメーター（商品名：ルミテスター  Ｃ−１００（キッコーマン社））で発光値を測定した。
【０１５３】
その結果、図９に示すように、反応液に１０ｍＭ以上のＫＣｌ（換言すれば、塩化物イオン）が含まれていると、顕著にルシフェラーゼ活性が阻害され、１００ｍＭのＫＣｌが含まれると、ＫＣｌが全く含まれない場合の約２０％に発光値が低下することが分かった。
【０１５４】
〔実施例５：リン酸水素ナトリウムによるルシフェラーゼ活性阻害〕
ルシフェラーゼアッセイによるＡＴＰ定量において、リン酸水素ナトリウム（換言すれば、リン酸イオン）がルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を以下の方法により検証した。
【０１５５】
７５、７．５、０．７５、および０ｍＭリン酸水素ナトリウムをそれぞれ含む反応液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ ＡＴＰ）を調製した。
【０１５６】
次に、２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ溶液２０μｌと、上記反応液４０μｌとを混合し、ルミノメーター（商品名：ルミテスター  Ｃ−１００（キッコーマン社））で発光値を測定した。
【０１５７】
その結果、図１０に示すように、反応液にリン酸水素ナトリウム（換言すれば、リン酸イオン）が含まれていると、ルシフェラーゼ活性が阻害され、７．５ｍＭのリン酸水素ナトリウムが含まれると、リン酸水素ナトリウムが全く含まれない場合の約２７％に発光値が低下し、７５ｍＭのリン酸水素ナトリウムが含まれると、ほとんど発光しないことが明らかとなった。
【０１５８】
〔実施例６：ＡＭＰおよびＰＥＰの精製方法の検討〕
（１）各ＡＭＰにおけるＡＤＰ、ＡＴＰ量の測定
市販のＡＭＰ、市販のＡＭＰを再結晶したＡＭＰ、実施例１で精製したＡＭＰをそれぞれ１．０ｍＭになるように調製した。各ＡＭＰサンプル１０μｌに対して、ＰＫ酵素溶液（ウサギ筋由来ＰＫ １０Ｕ／ｍｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）９０μｌを加え、３７℃で保温した。反応開始から０、１０、３０、６０分後に反応液５μｌに対して、２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ溶液４５μｌを加え、発光値をルミノメーター（商品名：ルミテスター  Ｃ−１００（キッコーマン社））で測定した。
【０１５９】
その結果、図１１に示すように、実施例１で精製したＡＭＰに含まれるＡＴＰ（図１１中、「ＨＰＬＣ」と記載）、ＡＤＰ量は市販のＡＭＰ（図１１中、「精製無」と記載）、市販のＡＭＰを再結晶したＡＭＰ（図１１中、「再結晶法」と記載）と比較して少なく、ＨＰＬＣで精製することで効果的にＡＴＰ、ＡＤＰを除去できることが示唆された。
【０１６０】
（２）実施例１の方法でＡＭＰおよびＰＥＰを精製する前後におけるＡＴＰおよびＡＤＰ量の変化
市販のＡＭＰおよびＰＥＰ、実施例１で精製したＡＭＰおよびＰＥＰに含まれるＡＴＰおよびＡＤＰ量を測定した。ＡＴＰ量は、市販のＡＭＰおよびＰＥＰ、実施例１で精製したＡＭＰおよびＰＥＰをそれぞれ１．０ｍＭになるように調製し、各サンプル５μｌに対して、２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ溶液４５μｌを加え、発光値をルミノメーター（商品名：ルミテスター  Ｃ−１００（キッコーマン社））で測定し、発光値からＡＴＰ量を求めた。
【０１６１】
ＡＤＰ量は各サンプルを１０ｍＭになるように調製し、各サンプル１０μｌに対して、ＰＫ酵素溶液（ウサギ筋由来ＰＫ １０Ｕ／ｍｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４)９０μｌを加え、３７℃で６０分間保温後、反応液５μｌに対して、２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ溶液４５μｌを加え、発光値をルミノメーター（商品名：ルミテスター  Ｃ−１００（キッコーマン社））で測定した。
【０１６２】
発光値からＡＴＰおよびＡＤＰ量を求め、上記方法で求めたＡＴＰ量を差し引き、ＡＤＰ量を求めた。
【０１６３】
その結果、表１に示すように、実施例１で得られたＡＭＰおよびＰＥＰに含まれるＡＴＰ、ＡＤＰは効果的に除去され、それぞれ１ｐＭ以下であった。
【０１６４】
【表１】
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なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
以上のように、本発明では、ＡＴＰを人為的に増幅する際、増幅回数を所望に制御できるため、試料に含まれるＡＴＰ量が微量であっても、該ＡＴＰを定量的に増幅することができる。そのため、本発明は、試料に含まれるＡＴＰを定量することが必要なあらゆる産業分野に広く用いることができる。特に、微生物の検査が必要な食品産業、医薬品産業、臨床検査分野、環境衛生分野等に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、本発明の一実施形態にかかるＡＴＰ増幅反応器の要部を示す図である。
【図２】図２は、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法の原理を示す図である。
【図３】図３は、ＰＫ固定化カラムの流速と反応率の関係を示す図である。
【図４】図４は、ＡＤＫ固定化カラムの流速と反応率の関係を示す図である。
【図５】図５は、本発明にかかるＡＴＰ増幅方法を用いた各増幅回数における流量とＡＴＰ濃度との関係を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態にかかるＡＴＰ増幅反応器から排出された試料のＡＴＰ濃度のピークトップの平均値と増幅回数との関係を示す図である。
【図７】図７は、各ＡＴＰ希釈溶液の増幅後のＡＴＰ濃度ピークトップ５サンプルの平均値の発光値と増幅前ＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図８】図８は、ＡＤＫ固定化カラムとＰＫ固定化カラムとを連結して形成された流路を複数回、通液することにより試料中のＡＴＰを増幅させた結果を示す図である。
【図９】図９は、ＫＣｌによるルシフェラーゼの活性阻害を示す図である。
【図１０】図１０は、リン酸によるルシフェラーゼの活性阻害を示す図である。
【図１１】図１１は、市販のＡＭＰ、市販のＡＭＰを再結晶したＡＭＰ、実施例１で精製したＡＭＰにおけるＡＤＰおよびＡＴＰ量を測定した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、従来技術であるバッチ法による連鎖的ＡＴＰ増幅反応における反応時間とＡＴＰ増幅との関係を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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