(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のリガンドに対して特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子と、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を含む凝集測定用試薬。
【請求項２】
測定対象のリガンドに対して特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子と、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物とを共存状態で含む1液試薬の凝集測定用試薬。
【請求項３】
不溶性担体粒子がラテックスである請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項４】
レセプターが抗体(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの反応性部位を含む断片)であり、免疫反応に基づく凝集を測定する請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項５】
測定対象のリガンドが、C反応性タンパク(CRP)、FDP、D-ダイマー、前立腺特異抗原(PSA)、ヘモグロビンA1C、アルブミン、ペプシノーゲンI(PGI)、ペプシノーゲンII(PGII)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンから選ばれるいずれか1以上である請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項６】
前記有機アミン化合物の含有量が、50〜1000mMである請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項７】
前記有機アミン化合物が、凝集反応の促進作用及び粒子分散性の安定化作用を有するものである請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項８】
前記粒子分散性の安定化作用が自然凝集の抑制である、請求項7に記載の凝集測定用試薬。
【請求項９】
測定対象のリガンドが2種以上であり、不溶性担体粒子が該測定対象と特異的に反応するレセプターをそれぞれ感作したものである、請求項1又は2に記載の凝集測定用試薬。
【請求項１０】
測定対象のリガンドに、該リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定する方法であって、少なくとも反応時に2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を共存させることを特徴とする測定方法。
【請求項１１】
測定対象のリガンドに、該リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定する方法であって、あらかじめ2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を共存させた不溶性担体粒子を用いることを特徴とする測定方法。
【請求項１２】
測定対象のリガンドが2種以上であり、リガンド(L1)と特異的に反応するレセプター(R1)が感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定し、実質的に、該反応が定常となった後、又は、該反応を定常とさせた後/該反応を定常とさせると同時に、さらに異なるリガンド(L2)と特異的に反応するレセプター(R2)が感作された不溶性担体粒子を添加して凝集反応の経時変化を測定する請求項11に記載の測定方法。
【請求項１３】
あらかじめ有機アミン化合物を共存させた不溶性担体粒子を用い、測定対象のリガンドが2種以上であり、リガンド(L1)と特異的に反応するレセプター(R1)が感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定し、実質的に、該反応が定常となった後、又は、該反応を定常とさせた後/該反応を定常とさせると同時に、さらに異なるリガンド(L2)と特異的に反応するレセプター(R2)が感作された不溶性担体粒子を添加して凝集反応の経時変化を測定し、かつ、
実質的に、該反応を定常とさせる方法が、L1と特異的に反応するR1を遊離状態で添加するものである、測定対象のリガンドに、該リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定する方法。
【請求項１４】
あらかじめ2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を共存させた不溶性担体粒子を用い、
測定対象のリガンドが2種以上であり、リガンド(L1)と特異的に反応するレセプター(R1)が感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定し、実質的に、該反応が定常となった後、又は、該反応を定常とさせた後/該反応を定常とさせると同時に、さらに異なるリガンド(L2)と特異的に反応するレセプター(R2)が感作された不溶性担体粒子を添加して凝集反応の経時変化を測定し、かつ、
実質的に、該反応を定常とさせる方法が、L1と特異的に反応するR1を遊離状態で添加するものである、測定対象のリガンドに、該リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定する方法。
【請求項１５】
レセプターが抗体(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの反応性部位をふくむ断片)である請求項10〜14のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１６】
2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を含む、凝集測定用試薬に用いる粒子分散性の安定化剤。
【請求項１７】
2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を含む、凝集測定用試薬に用いる自然凝集の抑制剤。
【請求項１８】
2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を含む、1液試薬の凝集測定用試薬に用いる粒子分散性の安定化剤。
【請求項１９】
2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を含む、1液試薬の凝集測定用試薬に用いる自然凝集の抑制剤。
【請求項２０】
凝集測定用試薬に、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を添加することを特徴とする凝集測定用試薬の粒子分散性の安定化方法。
【請求項２１】
凝集測定用試薬に、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を添加することを特徴とする凝集測定用試薬の自然凝集の抑制法。
【請求項２２】
凝集測定用試薬に、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を添加することを特徴とする1液試薬の凝集測定用試薬の粒子分散性の安定化方法。
【請求項２３】
凝集測定用試薬に、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、p-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩から選ばれる1以上の有機アミン化合物を添加することを特徴とする1液試薬の凝集測定用試薬の自然凝集の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的レセプターが感作された不溶性担体粒子の凝集反応によりリガンドを測定するための凝集測定用試薬及び凝集測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝集反応を検出する測定法は、凝集板法などで従前より汎用されてきた測定法であるが、なかでも感度・特異性・再現性の高さから抗原抗体反応を利用した免疫凝集法が主流である。
最近では、測定対象であるリガンドを抗原とする特異的抗体を感作させた不溶性担体粒子と汎用自動分析装置を利用し、より高感度かつ簡便にリガンドを測定できるようになったことから、免疫凝集法が臨床検査等で汎用されている。当該免疫凝集法は、抗原抗体反応に基づいて不溶性担体粒子を凝集させ、生じた凝集の程度を光学的に測定することにより測定対象であるリガンドの濃度を測定する方法であり、不溶性担体粒子としてはラテックスが多く用いられている。この場合は特に、ラテックス免疫比濁法（以下、ＬＴＩＡ法と略する）という。
これまで、ＬＴＩＡ法において、塩化ナトリウムやグアニジン類などの凝集促進剤を添加すると、免疫凝集の形成が促進され、測定感度が向上することが知られていた（特許文献１）。
しかし、これらの凝集促進剤を、抗体感作ラテックスと共存させておくと、免疫反応とは関係ない非特異的な抗体感作ラテックスの凝集（自然凝集とも称される）が生じ、長時間保管しておくと、ついには該粒子が沈降してしまうという問題があった。このため、ＬＴＩＡ法用の測定試薬では、抗体感作ラテックスと凝集促進剤を別々の構成試薬に処方しておき、測定時に混合するという２液の試薬から構成されているものが一般的である。
特許文献２には、ラテックス凝集反応において測定試料中の成分に由来する非特異的凝集を抑制し、保存安定性に優れることから、アミノスルホン酸塩を試薬中に溶解させ、ラテックス試薬を分散させる方法が開示されている。
また、特許文献３には、アミノ酸エステル又はポリアミンをラテックス試薬中に共存させることでタンパク質を安定化させ、ラテックスに結合させたタンパク質同士の非特異的凝集を抑制し、安定化する方法が開示されている。
しかし、これらの文献ではラテックスの非特異的凝集を抑制するという試薬の安定化についてしか言及されておらず、凝集反応の促進効果ついては不明である。
また、反応促進剤として塩化ナトリウムやグアニジン類を用いた場合であっても、自動分析装置を利用した測定のように、測定時間に制限のある場合には、必ずしも満足できる測定感度が得られるわけではなく、さらに効果の高い反応促進剤の提供が期待されていた。
【特許文献１】特開平１１−３４４４９３号公報
【特許文献２】特開平７−２２９９００号公報
【特許文献３】特開２００４−１０８８５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記従来技術の問題点を解決するためのものであって、レセプター感作ラテックスと共存させておいても該感作ラテックスの自然凝集が起こらない有機アミン化合物を用いた凝集測定用試薬及び測定方法の提供を課題とする。
また、本発明は、塩化ナトリウムやグアニジン類などの従来の反応促進剤よりも反応促進効果に優れる有機アミン化合物を用いた凝集測定用試薬及び測定方法の提供を別の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ラテックス凝集測定方法において、レセプター感作ラテックスの自然凝集が起こらない化合物について鋭意検討を行ったところ、ある種の有機アミン化合物が該感作ラテックスの自然凝集を起こさずに凝集反応を促進する効果があることを見出し本発明を完成するに至った。
また、これらの有機アミン化合物の中には、従来の反応促進剤よりもさらに優れた効果を有するものがあることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）測定対象のリガンドに対して特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子と有機アミン化合物を含む凝集測定用試薬。
（２）有機アミン化合物が、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４−アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４−ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４−フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる１以上の化合物である前記（１）に記載の凝集測定用試薬。
（３）不溶性担体粒子がラテックスである前記（１）又は（２）に記載の凝集測定用試薬。
（４）レセプターが抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの反応性部位を含む断片）であり、免疫反応に基づく凝集を測定する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の凝集測定用試薬。
（５）測定対象のリガンドが、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ＦＤＰ、Ｄ−ダイマー、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヘモグロビンＡ１C、アルブミン、ペプシノーゲンＩ（ＰＧＩ）、ペプシノーゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンから選ばれるいずれか１以上である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の凝集測定用試薬。
（６）有機アミン化合物の含有量が、５０〜１０００mＭである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の凝集測定用試薬。
（７）有機アミン化合物が、凝集反応の促進作用及び粒子分散性の安定化作用を有するものである前記（１）〜（６）のいずれかに記載の凝集測定用試薬。
（８）測定対象リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子と、有機アミン化合物とを共存状態で含む前記（１）に記載の凝集測定用試薬。
（９）測定対象のリガンドが２種以上であり、不溶性担体粒子が該測定対象と特異的に反応するレセプターをそれぞれ感作したものである、前記（１）に記載の凝集測定用試薬。
（１０）測定対象のリガンドに、該リガンドと特異的に反応するレセプターが感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定する方法であって、少なくとも反応時に有機アミン化合物を共存させることを特徴とする測定方法。
（１１）あらかじめ有機アミン化合物を共存させた不溶性担体粒子を用いることを特徴とする前記（１０）記載の測定方法。
（１２）測定対象のリガンドが２種以上であり、リガンド（Ｌ１）と特異的に反応するレセプター（Ｒ１）が感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定し、実質的に、該反応が定常となった後、又は、該反応を定常とさせた後／該反応を定常とさせると同時に、さらに異なるリガンド（Ｌ２）と特異的に反応するレセプター（Ｒ２）が感作された不溶性担体粒子を添加して凝集反応の経時変化を測定する前記（１１）に記載の測定方法。
（１３）実質的に、該反応を定常とさせる方法が、Ｌ１と特異的に反応するＲ１を遊離状態で添加するものである前記（１２）に記載の測定方法。
（１４）レセプターが抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの反応性部位をふくむ断片）である前記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の測定方法。
（１５）有機アミン化合物を含む、凝集測定用試薬に用いる粒子分散性の安定化剤。
（１６）凝集測定用試薬に、有機アミン化合物を添加することを特徴とする凝集測定用試薬の粒子分散性の安定化方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の有機アミン化合物を用いた凝集測定用試薬は、以下の効果を有する。
（１）レセプター感作ラテックスと共存させても自然凝集を起こしにくいため、予めレセプター感作ラテックスに反応促進剤を共存させた１液試薬として調製することが可能である。
（２）１液試薬として調製した場合には、１段階の反応で測定ができるため、従来の２液試薬で要した測定時間の半分以下まで測定時間を短縮することができる。さらに、１液試薬において、従来と同一の測定時間反応させれば、より高い測定感度が得られることになる。
（３）また、２液試薬の測定システムに、前記の様な１液試薬を２種類組み合わせて使用すれば、同一の反応槽内で連続して２種類のリガンドの測定が可能になる。この効果は、同一試料中の２種類のリガンドの含有比率を求めるＰＧＩ／ＰＧＩＩ比やＨｂＡ１ｃの検査に特に有効である。
（４）凝集反応の反応促進効果に優れるため、反応時間の短縮、ひいては測定時間の短縮、及び／又は測定感度の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ベンジルアミン塩酸塩含有アルブミン測定用ラテックス試薬によるアルブミンの測定結果を示すグラフである。
【図２】２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩含有アルブミン測定用試薬によるアルブミンの測定結果を示すグラフである。
【図３】ベンズアミジン塩酸塩含有アルブミン測定用試薬によるアルブミンの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（測定対象試料）
本発明の測定試薬の測定対象試料としては、例えば血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは臓器の抽出液等が挙げられる。【０００８】
（リガンド）
本発明で測定対象とするリガンドとは、凝集法により測定できるものであれば、いずれも対象とすることができる。具体的には、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ＦＤＰ、Ｄ−ダイマー、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヘモグロビンＡ１C、アルブミン、ペプシノーゲンＩ（ＰＧＩ）、ペプシノーゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシン等のタンパク質、その他、ペプチド、糖類、核酸、脂質などが挙げられる。【０００９】
（レセプター）
本発明で用いるレセプターとしては、測定対象であるリガンドが特異的に結合する物質を用いる。一般的にはウサギ、ヒツジ、ヤギ等に測定対象のリガンドを免疫して得られる抗リガンドポリクローナル抗体や抗リガンドモノクローナル抗体を用いることができる。その中でも特異性の点からはモノクローナル抗体の使用が特に望ましい。用いる抗体は、抗体全体でも構わないが、常法に従い酵素で切断した抗体のフラグメントであってもよい。
また、測定対象が抗体である場合には、抗原をレセプターとすることができる。その他、リガンドの種類によってはレクチン、核酸等もレセプターとして用いることができる。【００１０】
（担体粒子）
本発明で使用するレセプターを感作する不溶性担体粒子は、特に限定されないが、ラテックスが好ましい。ラテックスの材質としては、レセプターの感作方法に適したものなら良く、凝集測定法で一般的に用いられるポリスチレンを主成分とするラテックスの他に、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマーなどが挙げられる。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することもできる。担体粒子にレセプターを感作する方法としては、一般的に使用されている物理的吸着法の他、化学結合法も採用できる。
本発明で用いる担体粒子は同一種類、あるいは二種類以上を用いることができ、材質以外に、平均粒子径の異なる二種類以上を用いることもできる。【００１１】
（有機アミン化合物）
本発明の有機アミン化合物は、凝集反応を促進し、及び/又は、レセプターを感作した担体粒子と共存させた場合に、自然凝集を起こしにくいものであればよい。
ここで、ある有機アミン化合物が、自然凝集を起こしにくいかどうかについては、後述するスクリーニング方法により確認することができ、また、凝集反応を促進するかどうかについては、有機アミン化合物を用いた場合の凝集度合いを、無添加の場合と比較することにより確認できるので、容易に評価し、選択することが可能である。
具体的には、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、4-アミノアンチピリン、o-フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ-アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、2,4-ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸1,4-フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる１以上が好ましく用いられる。この中でも、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩がさらに好ましい。
尚、各有機アミン化合物の塩としては、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩など特に制限は無いが、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。【００１２】
有機アミン化合物の添加濃度は、無添加時に比較して凝集反応を促進し、及び/又は、担体粒子と共存させた場合に、自然凝集を起こしにくい濃度であればよく、５０〜１０００mＭが好ましい。使用する有機アミン化合物毎の最適な濃度は、本明細書の記載に従って実験的に求めることができる。【００１３】
本発明でいう自然凝集とは、リガンドとレセプター間の特異的結合に基づかない担体粒子の凝集をいい、粒子分散性の安定化作用とは、レセプター感作不溶性担体粒子を含む試薬中に有機アミン化合物が共存することで自然凝集が起こりにくくなる作用をいう。後者の安定化作用は、例えば、レセプター感作不溶性担体粒子と本発明の有機アミン化合物を共存させ一定期間静置した後、自然凝集に伴う担体粒子の沈降が観察されないこと、あるいは該静置前後における有機アミン化合物を含有する試薬の光学的な変化の割合が一定以上とならないことを以って評価し、選択することができる。【００１４】
具体的には、レセプター感作担体粒子としてラテックスを用いる場合、レセプター感作担体粒子と有機アミン化合物を共存させ一定期間（例えば、４℃で３日以上）静置したときの、該静置前後における波長６００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度の比（Ａ600nm／Ａ800nm比）を測定し、静置前の値（初期値）に対する静置後の値を相対評価し、初期値に対する静置後の値の減少割合が３０％以下とならないような有機アミン化合物が安定化作用を有しており、好適に使用できる。また、該吸光度比の減少割合が１０％以下であるものがさらに好ましく、最も好ましいものは５％以下となるものである。【００１５】
上記は、レセプター感作担体粒子としてラテックスを用いる場合についてのものであるが、このように粒子分散性の安定化作用は容易に評価できることから、これを本発明の有機アミン化合物のスクリーニング方法とすることができ、具体的には、抗体感作不溶性担体と４℃で３日以上共存させた場合の、波長６００ｎｍ、及び８００ｎｍにおける吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比）の初期値に対する減少割合が３０％以下とならないような安定化作用を有する有機アミン化合物を選択する方法が挙げられる。【００１６】
本発明でいう凝集反応とは、レセプター感作不溶性担体粒子のレセプターと測定対象であるリガンドの特異的結合に基づく凝集反応をいい、凝集促進作用とは、試薬中に共存させることで特異的凝集を起こりやすくする機能をいう。該促進機能は例えば次のようにして確認できる。測定対象であるリガンドを含む試料にレセプター感作不溶性担体粒子を添加し、一定時間経過後の吸光度を有機アミン添加時と無添加時とで比較した場合、有機アミン添加時の方が無添加時に比べて高いか否かを確認すればよい。好ましい凝集促進剤としては、塩化ナトリウムを用いた場合と同等以上の促進機能を有するものが良く、上述の粒子分散性の安定化作用と凝集反応促進作用の両方を兼ね備えた有機アミン化合物が更に好ましい。このような両方の機能を兼ね備えた化合物のスクリーニングは、測定方法の簡便さから、粒子分散性の安定化作用を有するかどうかを先に調べ、次に凝集反応促進作用を有するかどうかを調べる方が化合物の絞込みを効率的に行うことができ、望ましい。【００１７】
上記では、専らレセプター感作担体粒子としてラテックスを用いる場合について説明したが、測定波長は、担体粒子の材質や平均粒子径を考慮して適切なものを選ぶことができる。また、吸光度比による評価方法を説明したが、粒子数（沈降すれば濃淡が生じる）、粒子サイズ測定（凝集すればサイズは大きくなる）、散乱光測定や吸収スペクトルの測定（凝集すれば増大もしくはシフトする）など当業者が用いうる手段に適宜置き換えることが可能である。さらに、光学的な検出を可能な範囲で電気化学的な検出によって置き換えることも可能である。【００１８】
（緩衝液）
本発明における凝集反応は、緩衝液中で行われ、その緩衝液は、凝集反応が最適に行われる種類、濃度、ｐＨが選択され、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を用いる事ができる。その緩衝液の緩衝剤の濃度は、５ｍＭ〜５００ｍＭ程度で用いられ、ｐＨは中性域から塩基性域で用いられることが多く、通常７．０〜９．５の範囲で用いられる。【００１９】
（凝集シグナルの測定方法）
凝集シグナルの測定は、通常凝集反応測定に用いられる測定方法であればいずれでもよく、吸光度、粒子数、粒子サイズ測定、散乱光測定などがあげられる。【００２０】
凝集シグナルの検出は、前記の如く種々の方法があるが、汎用の生化学分析装置を用いる方法が便利である。例えば、測定対象であるリガンドを含む試料に、有機アミン化合物とレセプターが感作されたラテックス等の不溶性担体粒子が含む試薬を加え、一定温度で一定時間インキュベートし、この間の吸光度を測定し、吸光度の変化量を検出し、予め濃度の判っている標準液を試料とした場合の検量線から被検試料中のリガンドの濃度を算出することができる。ラテックス凝集法では、通常５００〜９００ｎｍの波長の吸光度が用いられ、反応時の吸光度の変化量を定量に用いるのが一般的である。【００２１】
（凝集測定用試薬としての構成）
本発明の有機アミン化合物はレセプター感作ラテックスと共存させても自然凝集を起こしにくいため、予めレセプター感作ラテックスに反応促進剤を共存させた１液試薬として調製することが可能である。これより該１液試薬の凝集測定用試薬として構成することができる。１液試薬として調製した場合には、１段階の反応で測定ができるため、従来の２液試薬で要した測定時間の半分以下まで測定時間を短縮することができる。さらに、１液試薬において、従来と同一の測定時間反応させれば、より高い測定感度が得られることになる。このように１液試薬の凝集測定用試薬として構成することで本発明の効果を最も有効に享受することができる。
本発明の有機アミン化合物は、反応促進効果を有しているので、従来の２液試薬として調製し、凝集測定用試薬を構成することも可能である。【００２２】
また、本発明の効果を低下させないことを限度として、通常、凝集測定用試薬に添加、使用されている塩、糖、タンパク、界面活性剤、防腐剤などの使用も制限がない。【００２３】
（測定試薬としての使用方法）
本発明の凝集測定用試薬は、処方されている有機アミン化合物の作用により凝集反応の反応促進効果に優れるため、反応時間の短縮、ひいては測定時間の短縮、及び／又は測定感度の向上を図ることができる。したがって、１液試薬の凝集測定用試薬として単位時間当たりの測定数を増やすような使用方法や、従来の２液試薬では感度が不足し測定が困難であったリガンドの測定に使用することができる。【００２４】
また、２液試薬の測定システムに、本発明の１液試薬を２種類組み合わせて使用すれば、同一の反応槽内で連続して２種類のリガンドの測定が可能になる。具体的には以下のような使用方法が採用されうる。すなわち、測定対象のリガンドが２種以上である場合、リガンド（Ｌ１）と特異的に反応するレセプター（Ｒ１）が感作された不溶性担体粒子を添加し、生ずる凝集反応の経時変化を測定し、実質的に、該反応が定常となった後、又は、該反応を定常とさせた後／該反応を定常とさせると同時に、さらに異なるリガンド（Ｌ２）と特異的に反応するレセプター（Ｒ２）が感作された不溶性担体粒子を添加して凝集反応の経時変化を測定する。【００２５】
Ｌ２とＲ２の測定結果に影響を与えるので、Ｌ２とＲ２の反応開始時点でＬ１とＲ１の反応が実質的に定常となっている必要があることは容易に推察される。測定対象リガンドの試料中の量（濃度）とレセプター感作ラテックスの量（濃度）とが好適に合致することが困難である場合には、Ｌ２とＲ２の反応開始前に、Ｌ１と特異的に反応する物質（遊離のＲ１であってもよい）を添加するなどして、定常とすることができる。【００２６】
本発明の１液試薬を２種類組み合わせて使用し、同一の反応槽内で連続して２種類のリガンドを測定する方法は、同一試料中の２種類のリガンドの含有比率を求めるＰＧＩ／ＰＧＩＩ比やＨｂＡ１ｃ等の検査に特に有効であり、このような方法は全く新規なものである。【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１
（不溶性担体粒子としてラテックスを使用した場合の粒子分散性の安定化作用を有する有機アミン化合物のスクリーニング）
表１に示した各種の有機アミン化合物を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、Ｄ−ダイマー測定用ラテックス試薬（ナノピアＤ−ダイマーのＤ−ダイマーラテックス試液(2)（第一化学薬品社製））と１：１で混和し、最終濃度が６２．５〜５００ｍＭの有機アミン化合物を含むラテックス試薬を調製した。また、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて同様に調製したものを用いた。更に、比較のため、最終濃度が１５０、３００、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含むラテックス試薬を同様に調製した。これらを４℃で３日間静置し、上清及び撹拌後のラテックス液の吸光度を波長６００ｎｍ及び８００ｎｍで測定し、その吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比）をそれぞれ算出した。表１には、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ−アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４−ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４−フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、及びベタイン塩酸塩の各種有機アミン塩酸塩について、検討した濃度範囲において、吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比）、及び上清の吸光度が低下していない、すなわち、自然凝集による粒子の沈降が抑制されているという結果を基に、分散状態がもっとも良好、かつ、ラテックスの沈降を生じなかった濃度の成績を示した。【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１より、４℃で３日間静置後の１５０、３００、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含むラテックス試薬の吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比；表１中では「600/800」と表記した）は上清と攪拌後で３０％以上の差が認められ、さらに、撹拌後の吸光度比は、ｃｏｎｔｒｏｌに比べて約６０％低下しており、従来、一般的に凝集促進剤として使用されている塩化ナトリウム共存下では、抗体感作ラテックスを分散状態で安定に保存できないことが判る。
これに対して、前記した有機アミン化合物を使用した場合は、上清と攪拌後の吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比）に殆どで差がなく、ｃｏｎｔｒｏｌの吸光度比の１０％以内であった。これらより、前記の有機アミン化合物を使用することで、抗体感作ラテックスの分散状態を維持し、自然凝集等による沈降が防止されていることが判る。【００３１】
実施例２
ベンジルアミン塩酸塩含有アルブミン測定試薬によるアルブミンの測定
（１）抗アルブミン抗体の調製
精製ヒトアルブミン（シグマ社製）１００μｇを１回の免疫に使用した。初回免疫はアルブミンとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン２００μLを用い、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。追加免疫にはフロインドの不完全アジュバンドを使用して同様に調製したエマルジョン２００μLを用い、２週間間隔で３回繰り返した。【００３２】
マウス眼底静脈より採血した血液中の抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に供した。４回目の免疫から２週間後にアルブミン１００μｇを生理食塩液２００μLに溶解したものをマウス腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐした後、１５００ｒｐｍで遠心分離して脾細胞を回収した。これを牛胎児血清フリーのＰＲＭＩ１６４０培地で３回以上洗浄後、１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加えて懸濁し、脾細胞懸濁液とした。脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−ＡＧ１４を６対１の割合で混合した後、５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合させた。１５００ｒｐｍ  の遠心分離で沈殿部を集め、ＧＫＮ液（グルコース２ｇ、塩化カリウム０．４ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４１ｇ及びリン酸二水素ナトリウム二水和物０．７８ｇを精製水に溶かして１リットルとしたもの）に懸濁、遠心分離により洗浄後、沈殿部を回収した。これを１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬに懸濁し、９６穴マイクロプレート３枚に１ウエルあたり１００μLずつ、及び２００μLのフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を２．５×１０6個／ｍＬを含むＨＡＴ培地をそれぞれ分注し、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で培養した。【００３３】
培養上清中の抗アルブミン抗体の存在は、アルブミンを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。詳細には、１０μｇ／ｍＬのアルブミン及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳと略す）１００μLを９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で１晩放置した。次にこれを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ３００μLで３回洗浄した後、各ウエルの培養上清を５０μL／ウエル加え室温で１時間放置した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（第一化学薬品製）を５０μL／ウエル加え、室温で１時間放置した。これを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０μL／ウエルを加え、室温で１５分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μL／ウエルを加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の高いウエルを選択した。【００３４】
単クローン化は限界希釈法で行った。すなわちフィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１０6個ずつ分注した９６穴マイクロプレートに、陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／ｍＬとなるように希釈したものを０．１ｍＬずつ分注した。培地は、初回はＨＴ培地を、２回目以降は１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃にて５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して３０種の抗アルブミンモノクローナル抗体産生細胞を得た。各細胞の約１０5個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析し、３０種の精製抗体を得た。【００３５】
（２）抗アルブミンモノクローナル抗体の選択
各精製抗体を１．４ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍＬに、平均粒径０．３μｍの２％ラテックス（積水化学工業社製）懸濁液３ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．４％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）６ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。遠心分離後、上清を除去し、沈殿を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で、波長６００ｎｍにおける吸光度が１ＯＤとなるように再懸濁し、各抗アルブミン抗体感作ラテックス溶液を調製した。
次に、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）１００μLに、アルブミンを含有する試料液３μLを加え、３７℃で５分間加温後、前記の各抗アルブミン抗体感作ラテックス溶液の２種類の組合わせ（１：１混液）１００μLを加えて撹拌し、主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍで５分間の吸光度変化量を測定し、最も大きい吸光度変化を示す抗体の組合わせを選択した。【００３６】
（３）アルブミン測定用ラテックス試薬の調製
選択した抗アルブミンモノクローナル抗体１．４ｍｇ／ｍＬを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍＬを用い、前記と同様に操作し、アルブミン測定用ラテックス試薬を調製した。【００３７】
（４）ベンジルアミン塩酸塩の至適濃度決定
最終濃度で１５０、３００、５００ｍＭのベンジルアミン塩酸塩（東京化成工業株式会社）を含むよう、アルブミン測定用ラテックス試薬を調製した。これを４℃で３日間静置し、上清及び懸濁液の波長６００ｎｍ、８００ｎｍにおける吸光度を測定し、その吸光度比（Ａ600nm／Ａ800nm比；表２中では「600/800」と表記）を算出した（表２）。この結果から、アルブミン測定用ラテックス試薬において実施した範囲で上清の吸光度が低下していない、すなわち、自然凝集による粒子の沈降が抑制されており、分散状態がもっとも良好なベンジルアミン塩酸塩濃度は、５００ｍＭと決定した。【００３８】
【表２】
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【００３９】
（５）ベンジルアミン塩酸塩含有アルブミン測定用ラテックス試薬の調製
最終濃度で５００ｍＭのベンジルアミン塩酸塩を含むよう、ベンジルアミン塩酸塩含有アルブミン測定用ラテックス試薬を調製した。【００４０】
（６）アルブミンの測定
ベンジルアミン塩酸塩含有アルブミン測定用ラテックス試薬２００μLに、０〜５０μg／ｍＬアルブミンを含有する試料液３μLをそれぞれ加え、撹拌後、主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍにおける３７℃で５分間（図１のＡ）、及び１０分間（図１のＢ）の吸光度変化量を測定した。【００４１】
（７）比較例
５００ｍＭベンジルアミン塩酸塩、或いは５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）１００μLに、０〜５０μｇ／ｍＬアルブミンを含有する試料液３μLをそれぞれ加え、３７℃で５分間加温後、前記のアルブミン測定用ラテックス試薬１００μLをそれぞれ加え、撹拌後、３７℃で５分間の主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した（図１のＣ及びＤ）。【００４２】
（８）結果
図１より、ベンジルアミン塩酸塩を使用した１液試薬５分間測定時（図１のＡ）の測定感度は、反応時間が、従来の測定方法である２液試薬１０分間測定時（図１のＣ）の１／２でありながら、これと同等の測定感度を有し、塩化ナトリウム使用時（図１のＤ）の測定感度と比較しても同等の測定感度を有することが判る。従って、ベンジルアミン塩酸塩を使用し、１液試薬にすることにより、大幅な測定時間の短縮が可能となる。また、１液試薬１０分間測定時（図１のＢ）は、２液試薬１０分間測定時（図１のＣ）よりも測定感度が大幅に上昇しており、従来と同一時間の測定を行う場合には、測定感度の大幅な上昇が可能であることが判る。【００４３】
実施例３
２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩含有アルブミン測定用試薬によるアルブミンの測定
有機アミン化合物として２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩を用いた以外は、前記実施例１と同様に試薬調製を行い、アルブミンの測定を行なった。結果を図２に示す。図２より、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩についても、ベンジルアミン塩酸塩と同様の効果を有することがわかった。【００４４】
実施例４
ベンズアミジン塩酸塩含有アルブミン測定用試薬によるアルブミンの測定
有機アミン化合物としてベンズアミジン塩酸塩を用いた以外は、前記実施例１と同様に試薬調製を行い、アルブミンの測定を行なった。結果を図３に示す。
図３より、ベンズアミジン塩酸塩についても、ベンジルアミン塩酸塩と同様に１液試薬にすることにより、大幅な測定時間の短縮が可能であり、従来と同一時間の測定を行う場合には、測定感度の大幅な上昇が可能であることが判る。さらに、従来の反応促進剤である塩化ナトリウムを用いた場合（図３のＤ）に比べ、塩化ナトリウムの代わりにベンズアミジン塩酸塩を用いただけ（図３のＣ）で、測定感度が大幅に上昇していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、試薬としての安定性及び測定感度に優れたリガンドの凝集測定用試薬を提供可能であり、レセプター感作担体粒子と反応促進剤を予め共存させた場合には、１液試薬としての提供が可能である。
特に、１液試薬として調製した場合には、測定が簡便で、反応時間を短縮することができる、即ち、従来と同一時間内における測定感度が上がることになる。さらに、２種類の１液試薬を組み合わせることにより、同一の反応槽内で連続して２種類のリガンドを測定できる試薬の提供も可能となり、臨床検査分野において画期的な測定試薬として利用価値が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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