(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質の疎水性ポリマー膜に親水性ポリマーを含浸付着させたことを特徴とする電気泳動用媒体。
【請求項２】
前記親水性ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用媒体。
【請求項３】
前記多孔質の疎水性ポリマー膜が、ポリビニリデンジフルオリド、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレンから選ばれる少なくとも一種からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用媒体。
【請求項４】
タンパク質またはムコ多糖の分離用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を用い、電気泳動によりタンパク質を分離することを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、ムチン様糖タンパク質であることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、プロテオグリカン型糖タンパク質であることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の分離方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を用い、電気泳動によりムコ多糖を分離することを特徴とするムコ多糖の分離方法。
【請求項９】
電気泳動によりタンパク質またはムコ多糖を分離するのに用いるキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を備えることを特徴とするタンパク質またはムコ多糖の分離用キット。
【請求項１０】
検体中に含まれるタンパク質を請求項５〜８のいずれか１項に記載の分離方法により分離し、次いで分離された膜上のタンパク質に一次抗体として抗タンパク質抗体を反応させた後、酵素により標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするタンパク質の分離検出方法。
【請求項１１】
検体中に含まれる糖タンパク質またはムコ多糖を請求項５〜８いずれか１項に記載の分離方法により分離し、次いで膜上の分離された糖タンパク質またはムコ多糖の糖鎖を過ヨウ素酸により酸化した後、色素を標識したアミン誘導体を反応させ検出することを特徴とする糖タンパク質またはムコ多糖の分離検出方法。
【請求項１２】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のタンパク質またはムコ多糖の分離方法により分離された糖タンパク質またはムコ多糖から糖鎖を遊離する方法であって、電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことを特徴とする糖鎖の遊離方法。
【請求項１３】
電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことによって、電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖から糖鎖を遊離するのに用いるキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を備えることを特徴とする糖鎖遊離用キット。
【請求項１４】
請求項１２に記載の遊離方法で遊離された糖鎖を用いて、前記電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖中の糖鎖構造を解析することを特徴とする糖鎖構造の解析方法。
【請求項１５】
電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことによって、電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖から糖鎖を遊離し、該遊離された糖鎖を用いて、前記電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖中の糖鎖構造を解析するのに用いるキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を備えることを特徴とする糖鎖構造の解析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来試料のような複雑なタンパク質混合物中に存在するタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖を泳動分離する方法、該方法に用いる電気泳動用媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するタンパク質は、癌などの疾患時にその発現量が変化することが知られており、疾患により変化した分子群を捕えることで、新規診断マーカーとしての応用が期待できる。特に糖タンパク質は、疾患時の量的変化に加え、その糖鎖構造も変化することが知られており、疾患により変化した糖鎖構造やそれらを含む分子群を捕えることで、より優れた新規診断マーカーとして利用できる可能性がある。そのため、特定の性質によって分類される糖タンパク質群の選択的な分離分析法は、疾患の診断や治療にとって大切な臨床検査の１つとなる可能性が高い。例えば、セルロースアセテート膜電気泳動法は血清タンパク質の分離に使用され、分離パターンの変化や特定の分画の量的変化が臨床検査法として疾患の診断に利用されている。
【０００３】
ムチン様糖タンパク質は粘液中または粘膜上に存在し、セリン又はトレオニンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合したＮ−アセチルガラクトサミンを介してムチン型糖鎖が結合していることを特徴とする糖タンパク質である。また、ムチン様糖タンパク質は糖含量が高い高分子量糖タンパク質として知られている。一方、ムコ多糖の代表であるグリコサミノグリカンは、動物の結合組織を中心にあらゆる組織に普遍的に存在し、多くの場合、プロテオグリカンとしてタンパク質に付加した形で存在している。プロテオグリカン型糖タンパク質は、セリンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合したキシロースを介してグリコサミノグリカン鎖を持つことを特徴とする糖タンパク質である。また、タンパク質に結合してないグリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸が知られている。ヒアルロン酸は細胞外マトリクスに存在し、中皮腫のマーカー分子としても知られている。これらの糖タンパク質およびムコ多糖群はともに、疾患との関連が報告されており、新規診断マーカーのターゲット分子として重要である。また、肝癌マーカーや前立腺癌マーカーとして知られるαフェトプロテインや前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などは、血清中に含まれる糖タンパク質である。このように、血清糖タンパク質もまた新規診断マーカーのターゲット分子として重要である。
従来、これらの糖タンパク質を分離する技術としては、分離状態を視覚的にとらえることができる電気泳動法が好ましく用いられており、具体的には、血清糖タンパク質を例にした場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、セルロースアセテート膜電気泳動、等電点ゲル電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動等がある。また、ムチン様糖タンパク質やプロテオグリカン型糖タンパク質を例にした場合、アガロースゲル或いはアガロース／ポリアクリルアミド混成ゲルを用いた電気泳動（非特許文献１，２参照）、又はセルロースアセテート膜電気泳動（非特許文献３参照）等がある。
さらに、電気泳動法により分離した糖タンパク質の糖鎖を解析するためには、従来公知の転写法が適用できる。すなわち、電気泳動法により分離された糖タンパク質を、ゲルからポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ,polyvinylidene difluoride）膜に転写した後、該膜上での酵素反応やアルカリ処理によるβ−エリミネーション(β-elimination)反応により糖鎖を切り出し、切り出された糖鎖を質量分析計で解析する方法が用いられる（非特許文献２）。
【０００４】
一方、電気泳動法による蛋白質の分離分析方法においては、特許文献１に、分子量４万〜２００万のデキストラン等の親水性高分子を含有させたセルロースアセテート膜を用いて電気泳動法により検体中のリポ蛋白質を分離する方法、及び分離したリポ蛋白質ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのサブクラスの存在形態を確認することにより、脂質代謝異常に起因する疾患を検出することが提案されている。
【特許文献１】特開２００７−２４８１３１号公報
【非特許文献１】Spurr-Michaud S et al. Assay of mucins in human tear fluid. Exp. Eye Res. 2007, 84, 939-950
【非特許文献２】Thomsson KA, Schulz BL, Packer NH, Karlsson NG. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology 2005, 15, 791-804.
【非特許文献３】Yasueda SI, Yamakawa K, Nakanishi Y, Kinoshita M, Kakehi K. Decreased mucin concentrations in tear fluids of contact lens wearers. J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, 39, 187-195.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来公知のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点ゲル電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動、または非特許文献１，２に記載されたアガロースゲル或いはアガロース／ポリアクリルアミド混成ゲルを用いた電気泳動法は、糖タンパク質を分離した後にＰＶＤＦ膜に転写する工程を経るため、スループット性に欠け、臨床での診断法としての応用は困難である。また、転写効率に起因する定量性の低下などが問題となる。
また、特許文献１に記載の方法は、リポ蛋白質に関するものであって、糖タンパク質またはムコ多糖については何ら記載がないばかりでなく、この方法においても、電気泳動後のリポ蛋白質を、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜等に転写した後、転写膜上のリポ蛋白質を確認しているため、非特許文献１、２に記載された方法の場合と同様の問題がある。
【０００６】
一方、非特許文献３に記載されたセルロースアセテート膜電気泳動は、膜上でのムチン様糖タンパク質及びプロテオグリカン型糖タンパク質の分離が可能であり、転写工程の省略が期待できる。しかしながら、β−エリミネーション反応により生じる膜由来のセルロース誘導体が後の糖鎖分析の妨害となるため、この方法ではムチン様糖タンパク質及びプロテオグリカン型糖タンパク質の糖鎖構造情報を得ることができない。
【０００７】
以上のとおり、糖タンパク質またはムコ多糖を電気泳動法によって分離した後、電気泳動に用いた膜のまま糖鎖遊離処理を行い、糖タンパク質またはムコ多糖の糖鎖分析を可能とする膜電気泳動法はこれまでなかった。また、電気泳動に用いた膜のまま抗体を利用する免疫染色によって検出することを可能とする膜電気泳動法はこれまでなかった。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、マーカー探索や臨床現場での疾患診断に利用できる簡便なタンパク質またはムコ多糖の分離・分析法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように、ＰＶＤＦ膜を用いれば、膜上でのアルカリ処理によるβ−エリミネーション反応により糖タンパク質の糖鎖を切り出すことができ、切り出された糖鎖を質量分析計で解析することが可能である。また、抗体を用いて特定のタンパク質を特異的に染色し、検出することも可能である。
そこで、本発明者らは、ＰＶＤＦ膜を、電気泳動の媒体として利用することができれば課題を解決できると考え、ＰＶＤＦ膜を電気泳動用媒体としてタンパク質またはムコ多糖を分離する方法について鋭意検討した結果、ＰＶＤＦ膜に親水性ポリマーの溶液を含浸させ、その膜を電気泳動の媒体として利用することにより、タンパク質またはムコ多糖を泳動・分離できることを見出した。
さらにＰＶＤＦ膜の他、従来、電気泳動には使用されてこなかったタンパク質固定化用の疎水性ポリマー膜を用いたタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖の分離について検討した結果、ポリテトラフルオロエチレン膜（ＰＴＦＥ）、ナイロン膜（Ｎｙｌｏｎ）に親水性ポリマーの水溶液を含浸させた膜を用いた電気泳動によってもタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖を泳動・分離できることを見出した。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づいて完成に至ったものであり、以下のとおりのものである。
［１］多孔質の疎水性ポリマー膜に親水性ポリマーを含浸付着させたことを特徴とする電気泳動用媒体。
［２］前記親水性ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする［１］の電気泳動用媒体。
［３］前記多孔質の疎水性ポリマー膜が、ポリビニリデンジフルオリド、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレンから選ばれる少なくとも一種からなることを特徴とする［１］又は［２］の電気泳動用媒体。
［４］タンパク質またはムコ多糖の分離用であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかの電気泳動用媒体。
［５］［１］〜［４］のいずれかの電気泳動用媒体を用い、電気泳動によりタンパク質を分離することを特徴とするタンパク質の分離方法。
［６］前記タンパク質が、ムチン様糖タンパク質であることを特徴とする［５］のタンパク質の分離方法。
［７］前記タンパク質が、プロテオグリカン型糖タンパク質であることを特徴とする［５］のタンパク質の分離方法。
［８］［１］〜［４］の電気泳動用媒体を用い、電気泳動によりムコ多糖を分離することを特徴とする多糖の分離方法。
［９］電気泳動によりタンパク質またはムコ多糖を分離するのに用いるキットであって、［１］〜［４］に記載の電気泳動用媒体を備えることを特徴とするタンパク質またはムコ多糖の分離用キット。
［１０］検体中に含まれるタンパク質を［５］〜［８］の分離方法により分離し、次いで分離された膜上のタンパク質に一次抗体として抗タンパク質抗体を反応させた後、酵素により標識した二次抗体を反応させ、発色試薬を用いて検出することを特徴とするタンパク質の分離検出方法。
［１１］検体中に含まれる糖タンパク質またはムコ多糖を［５］〜［８］の分離方法により分離し、次いで膜上の分離された糖タンパク質またはムコ多糖の糖鎖を過ヨウ素酸により酸化した後、色素を標識したアミン誘導体を反応させ検出することを特徴とする糖タンパク質またはムコ多糖の分離検出方法。
［１２］［５］〜［８］のタンパク質またはムコ多糖の分離方法により分離された糖タンパク質またはムコ多糖から糖鎖を遊離する方法であって、電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことを特徴とする糖鎖の遊離方法。
［１３］電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことによって、電気泳動により分離された糖タンパク質または多糖から糖鎖を遊離するのに用いるキットであって、［１］〜［４］の電気泳動用媒体を備えることを特徴とする糖鎖遊離用キット。
［１４］［１２］の遊離方法で遊離された糖鎖を用いて、前記電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖中の糖鎖構造を解析することを特徴とする糖鎖構造の解析方法。
［１５］電気泳動に用いた媒体上で糖鎖遊離処理をおこなうことによって、電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖から糖鎖を遊離し、該遊離された糖鎖を用いて、前記電気泳動により分離された糖タンパク質またはムコ多糖中の糖鎖構造を解析するのに用いるキットであって、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体を備えることを特徴とする糖鎖構造の解析用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、タンパク質固定化に用いられる疎水性の高いポリマー上でタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖を泳動分離できることから、転写の工程を省略することができ、従来法に比べて分析のスループットが向上する。また、本発明は、迅速・簡便であり、抗体染色や糖鎖解析も可能であるため、タンパク質、糖タンパク質或いは多糖上の疾患関連糖鎖を指標とする診断キットへの応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の、タンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖の分離分析法は、親水性ポリマー層を形成した疎水性のポリマー膜を用いた電気泳動法によるものである。
本発明に用いる疎水性のポリマー膜とは、タンパク質を疎水性相互作用によって強く結合保持する性質を有するポリマー膜であって、特にＰＶＤＦ膜、ポリテトラフルオロエチレン膜（PTFE）、ナイロン膜（Nylon）を挙げることができるが、分解能の点からＰＶＤＦ膜が最も好ましい。
これらの疎水性のポリマー膜とは、特許文献１、非特許文献２に記載されているように、本来、この膜に、精製したタンパク質溶液を添加するか、又はゲル電気泳動によって分離したタンパク質を転写し、膜上で糖タンパクや抗原タンパクなどの同定をおこなうために、もっぱら、タンパク質固定化用に用いられているものである。
【００１２】
本発明においては、前記の多孔質の疎水性のポリマー膜に親水性ポリマーを含浸付着させた電気泳動用媒体を用いることにより、タンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖を、分離することが可能となるものである。
また、分離されたタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖は、親水性ポリマーを有する疎水性のポリマー膜上にあるため、疎水性のポリマーに非セルロース系のものを用いれば、膜のままβ−エリミネーション反応をおこなっても、従来のセルロース膜のようにβ−エリミネーション反応による膜由来のセルロース誘導体が後の糖鎖分析の妨害となるようなことがない。すなわち、本発明のタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖の分析方法によれば、転写工程を必要としない、簡便な方法でタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖或いは糖タンパク質の分析が可能となるものである。
【００１３】
本発明に用いる多孔質の疎水性のポリマー膜には、従来、電気泳動法により分離されたタンパク質を転写する膜として用いられているものをそのまま使用できる。
該多孔質の疎水性のポリマー膜に、親水性のポリマーを含浸付着させる方法としては、具体的には、多孔質の疎水性のポリマー膜を親水性ポリマー溶液中に浸漬する方法、多孔質の疎水性のポリマー膜上に親水性ポリマーを塗布する方法、等の方法が挙げられる。
【００１４】
本発明において、親水性ポリマーとしては、ポリマーの構成ユニットに酸素や窒素のようなヘテロ原子を少なくとも一つ含むポリマーであって水接触角が６０°以下の水との親和性を有するポリマーである。例としてポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドなどが挙げられるが、特に、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールが、分離能の点から好ましく、最も好ましいのは、ポリビニルアルコールである。
なお、本発明の目的からみて、本発明に用いる親水性ポリマーには、デキストリン等の多糖系のポリマーが含まれないことは当然のことである。
また、本発明において用いられる親水性ポリマーの分子量としては、１，０００〜４，０００，０００が好ましい。
【００１５】
本発明に用いる装置としては、従来のセルロースアセテート膜電気泳動装置をそのまま用いることができ、具体的には、EPC105AA型セルロースアセテート膜電気泳動装置（アドバンテック）などが使用できる。
本発明の前記電気泳動用媒体を用いた電気泳動は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）、「新生化学実験講座3・糖質II」（東京化学同人）等に記載された手法に従っておこなう。
すなわち、電気泳動用緩衝液としては、ベロナール緩衝液、トリス緩衝液、ピリジン−ギ酸緩衝液等を使用する。タンパク質および糖タンパク質の分離にはベロナール緩衝液やトリス緩衝液を中性付近のｐＨで使用するのが好ましい。ムチン様糖タンパク質およびプロテオグリカン型糖タンパク質に対してより明確な分離を行うにはピリジン−ギ酸緩衝液（ｐＨ３.０〜ｐＨ５.０）が好ましい。また、検体の塗布量は、一般的には、１スポットあたり、あるいは幅１ｃｍあたり、０.８〜２.４μＬとされており、通電条件としては、幅１ｃｍあたり０.５〜１.５ｍＡ程度の電流を流すことが好ましい。また、電気泳動中の媒体の温度は、一般的に１０〜２０℃の範囲において、一定とする。
【００１６】
前述のとおり、本発明の前記電気泳動用媒体は、さらに別の膜に転写することなく、そのまま、糖鎖遊離処理をおこなうことができるものであるが、本発明における糖鎖遊離処理として、酵素を用いる遊離反応や、前記非特許文献２に記載されたβ−エリミネーション反応が用いられる。
具体的には、酵素による遊離反応の場合、糖タンパク質を含むスポットあるいはバンドを切り取った膜片に、Ｎ−グリカナーゼなどの糖鎖切断酵素を含む溶液を加え、３７℃で一晩反応させる。反応後、塩類を除去することで遊離した糖鎖を得る。β−エリミネーション反応の場合、糖タンパク質を含むスポットあるいはバンドを切り取った膜片に、水酸化ナトリウムなどのアルカリと水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を含む水溶液を加え４５℃で１６時間反応させる。反応後、酸で中和し、塩類を除去することで遊離した糖鎖を得る。
【００１７】
さらに、遊離された糖鎖の糖鎖構造を分析する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、質量分析などがあるが、特に、質量分析法によるのが、感度、精度、そして簡便性の観点から好ましい。
また、前述のとおり、本発明の前記電気泳動用媒体は、さらに別の膜に転写することなく、そのまま、抗体染色により特定のタンパク質を検出することができるものである。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
〈実施例１〉
本実施例では、ウシ顎下線ムチン（ＢＳＭ）、ブタ胃ムチン（ＰＳＭ）、及び血漿由来タンパク質を用いて電気泳動をおこなった。
【００１９】
（親水性ポリマーでコーティングしたＰＶＤＦ膜の作成）
市販のＰＶＤＦ膜（Immobilon-P, ミリポア社製）を適した大きさに切り取り、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．２５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む泳動用緩衝液（０．１Ｍピリジン−ギ酸緩衝液、ｐＨ４．０）に３０分間浸した。
試料をスポットする直前に、前記泳動用緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。
【００２０】
（分析試料の前処理）
ＢＳＭ（５０μｇ）、ＰＳＭ（１００μｇ）、血漿由来タンパク質（血漿を脱塩して凍結乾燥したもの、約５０μｇ）を２０ｍＭジチオトレイトールおよび８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、１０μｌ）に溶解し、１００℃で２０分間反応させた。これを室温にて放冷後、２５０ｍＭヨードアセタミド水溶液（１μｌ、最終濃度２５ｍＭ）を加え、室温で１時間、暗所にて反応させた。
反応後、試料溶液の一部（１μｌ）を、前記のＰＶＡでコーティングしたＰＶＤＦ膜上にスポットし、電気泳動に供した。
【００２１】
（電気泳動）
泳動槽には、セルロースアセテート膜電気泳動装置（ＥＰＣ１０５ＡＡ型、アドバンテック社製）を使用した。通電条件は、膜の幅１ｃｍあたり１．０ｍＡとし、泳動時間は３０分間とした。
【００２２】
（染色方法）
ＢＳＭ及びＰＳＭの染色には、０．１％酢酸に溶解した０．１％アルシアンブルー８ＧＸ溶液を使用した。また、血漿由来タンパク質の染色には、４０％エタノール／１０％酢酸水溶液に溶解した０．００８％のダイレクトブルー７１溶液を使用した。
【００２３】
（泳動結果）
泳動結果を図１に示す。左から順に、ＢＳＭ、ＰＳＭ、及び血漿由来タンパク質の結果であり、それぞれ、左側が、ＰＶＡコーティングなしの媒体を用いた結果（比較例）、右側が、本発明の媒体を用いた結果を示している。
図１から、明らかなように、ＰＶＡコーティングしていないＰＶＤＦ膜を用いて泳動した場合（比較例）、ＢＳＭ、血漿由来タンパク質は原点からほとんど泳動されなかった。また、ＰＳＭは僅かに泳動されたが、スポットのテーリングが観察され完全な分離には至らなかった。
一方、ＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜を用いた場合（本発明）、ＢＳＭは単一の成分として泳動され、ＰＳＭでは４種類の成分として泳動分離された。しかし、血漿由来タンパク質はＰＶＡコーティングした場合においても原点から泳動されなかった。
このことから、本発明のＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜を電気泳動用媒体として用いることで、ムチン様糖タンパク質が選択的に泳動分離されることが分かった。
【００２４】
（糖鎖の遊離）
次に、前記の本発明の方法により泳動分離されたＢＳＭ及びＰＳＭの各スポットを切り取り、膜ごとアルカリによるβ−エリミネーション反応を行い、ムチンのコアタンパク質から糖鎖を遊離させた。得られた糖鎖の完全メチル化誘導体を質量分析計で測定した結果を図２及び３に示す。
図２に示すとおり、ＢＳＭでは主要な成分として４種類の糖鎖ピークが検出され、これらの質量数は報告されているＢＳＭ中の主要な糖鎖構造の質量数と一致した。
従って、本発明はムチン様糖タンパク質を分離した後の糖鎖解析にも使用できることが分かった。
さらに、図３に示すとおり、４種類の成分として分離されたＰＳＭでは、３と４の成分から糖鎖ピークが検出された。これらの２種類の成分のうち、早く泳動された成分３は硫酸化糖鎖の割合が多く、遅く泳動された成分４は中性糖の割合が多いことが分かった。このように本発明により分離されたＰＳＭ中の各成分は異なる糖鎖構造パターンを示したことから、本発明はムチン様糖タンパク質の中に複数存在している、糖鎖構造が異なる分子群を分離できることが分かった。
【００２５】
（分解酵素で処理した試料の泳動）
図４に、コンドロイチナーゼＡＢＣ及びヒアルロニダーゼで処理した後のＰＳＭをＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で電気泳動した結果を示す。なお、参考として、処理しないＰＳＭの結果を図４ａに示す。
図４ｂに示すように、コンドロイチン硫酸類の分解酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣで予め処理した試料を泳動した場合、ＰＳＭ中の各成分のうち、より早く泳動された成分である１はスポットがほぼ消失した。従って、これらの成分はＰＳＭ中に混在しているコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンであることが示唆された。
また、図４ｃに示すように、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼで予め処理した試料を泳動した場合、ＰＳＭ中の各成分のうち、より早く泳動された成分である２のスポットが消失した。従って、これらの成分はＰＳＭ中に混在しているヒアルロン酸であることが示唆された。
このことから、本発明はムチン様糖タンパク質のみならず、グリコサミノグリカン等のムコ多糖およびプロテオグリカン型糖タンパク質の解析にも応用できることが分かった。
【００２６】
〈実施例２〉
本実施例では、ヒト唾液中ムチンの本発明による分離、および糖鎖の過ヨウ素酸酸化を利用する糖タンパク質の染色と抗体による免疫染色を行った。
【００２７】
（ＰＶＡでコーティングしたＰＶＤＦ膜の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
【００２８】
（分析試料の前処理）
ヒト唾液約５００μｌを１００００ｇで５分間遠心分離し、上清を限外ろ過膜（１００ｋＤaカット）により脱塩・濃縮した後、凍結乾燥したものを粗ムチン分画とした。凍結乾燥標品を２０ｍＭジチオトレイトールおよび８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、２０μｌ）に溶解し、１００℃で２０分間反応させた。これを室温にて放冷後、２５０ｍＭヨードアセタミド水溶液（２μｌ、最終濃度２５ｍＭ）を加え、室温で１時間、暗所にて反応させた。
反応後、試料溶液を、８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）で２倍希釈し、その一部（１μｌ）を、前記のＰＶＡでコーティングしたＰＶＤＦ膜上にスポットし、電気泳動に供した。
【００２９】
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により行った。
【００３０】
（染色方法）
アルシアンブルーによる染色は実施例１と同様に行った。糖鎖の過ヨウ素酸酸化を利用する糖タンパク質の染色にはＰｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用した。抗体による免疫染色は、泳動後の膜を５％酢酸／メタノール中で３０分間振とうし、糖タンパク質を膜へ固定化した後、従来公知の方法に従い実施した。すなわち、固定化後の膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、抗ＭＵＣ７ヤギＩｇＧをＰＢＳ−Ｔで２００倍希釈した溶液に浸し、３時間振とうした。膜をＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧをＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。ＰＢＳ−Ｔで振とう洗浄後、ＥＣＬ法により検出した。
【００３１】
（泳動・染色結果）
ヒト唾液中ムチンの泳動結果ならびに各染色法により染色した結果を図５に示す。
ヒト唾液中のムチンを本発明により泳動した後、アルシアンブルーで染色した結果、図のようにブロードなバンドとして観察された（左の図）。一方、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄで染色した場合、アルシアンブルーで染色した場合と同様の染色パターンが得られた（中央の図）。抗ＭＵＣ７抗体による免疫染色では、原点のタンパク質に対する顕著な抗体の非特異吸着が見られたものの、アルシアンブルーとＰｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄにより染色された部位が主に染色された（右の図）。また、免疫染色した時にのみ、速く泳動される成分がわずかに検出された。
以上の結果から、本発明による親水性ポリマーでコーティングされたＰＶＤＦ膜を用いる電気泳動によって分離された糖タンパク質は、糖鎖の過ヨウ素酸酸化を利用する糖タンパク質の染色や抗体による免疫染色によっても検出することが可能であることが分かった。
【００３２】
〈実施例３〉
（他の親水性ポリマーによる検討）
ＰＶＡ以外の親水性ポリマーを用いて、実施例１と同様の手順によりＰＶＤＦ膜をコーティングし、ＢＳＭ、ＰＳＭ、及び血漿由来タンパク質を泳動した結果を図６に示す。左から順に、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレートによりコーティングしたＰＶＤＦ膜を用いた結果を示している。
図６から明らかなように、ＰＶＡ以外の親水性ポリマーによってコーティングを行ってもＰＶＡの場合と同等の効果が得られ、グリコサミノグリカンおよびムチン様糖タンパク質が選択的に泳動分離されることが分かった。
【００３３】
〈実施例４〉
（血漿タンパク質の分離）
本発明は電気泳動に用いる緩衝液の種類を変えることによって、血漿タンパク質のような複雑なタンパク質混合物の分離にも使用することができる。泳動用緩衝液に０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて、本発明により血漿タンパク質を泳動した。また、比較としてセルロースアセテート膜電気泳動を行った。図７には、セルロースアセテート膜で電気泳動した結果と、本発明により泳動した結果を示して比較している。図７に示すようにセルロースアセテート膜電気泳動では血漿たんぱく質が６個の分画に分離されたのに対して、本発明では９個の分画に分離された。従って本発明は従来法に比べて分解能が高いことが分かった。
【００３４】
〈実施例５〉
（他の疎水性高分子膜による検討）
ＰＶＤＦ膜以外の疎水性ポリマー膜についても実施例１と同様の手順によって、ＰＶＡによりコーティングし、これらの膜を用いて血漿タンパク質を分離した例を図８に示す。左からＰＶＤＦ膜、ポリテトラフルオロエチレン膜（ＰＴＦＥ）、ナイロン膜（Nylon）を用いた結果を示している。使用する疎水性高分子膜によって泳動パターンは異なったが、電気泳動による分離が認められた。したがって、図８は本発明で使用する疎水性ポリマー膜がＰＶＤＦ膜に限定されるものではないことを示している。
【００３５】
〈実施例６〉
（血漿中のハプトグロビンの抗体染色）
実施例４と同様の手順により、本発明により血漿タンパク質を泳動した。ハプトグロビン抗体による免疫染色は、泳動後の膜をアセトン中で１５分間振とうし、血漿タンパク質を膜へ固定化した後、従来公知の方法に従い実施した。すなわち、固定化後の膜を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔ（0.05% tween）で5分間洗浄し、この洗浄操作を合計3回繰り返した。振とう洗浄後、ウサギ抗ヒトハプトグロビン抗体(IgG、1ｍｇ/ｍL)をＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（0.05% tween）で5分間洗浄し、この洗浄操作を合計3回繰り返した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（0.05% tween）で5分間洗浄し、この洗浄操作を合計3回繰り返した後、コニカイムノステインキット（イムノステインHRP-1000、コニカミノルタ社製）により検出した。
【００３６】
（染色結果）
ヒト血漿タンパク質の泳動結果ならびに抗ヒトハプトグロビンにより染色した結果を図９に示す。
ヒト血漿タンパク質を本発明により泳動した後、ＤＢ−７１で染色した結果、図９のように９本のバンドとして観察された（図９−左）。一方、抗ハプトグロビン抗体で染色した場合、１本のバンドの染色パターンが得られた（図９−右）。ハプトグロビンは、従来用いられてきたセルロースアセテート膜電気泳動による血漿タンパク質のデータ（標準臨床検査医学  第２版  医学書院）との類似性から、バンド４に存在すると推定される。抗ハプトグロビン抗体にて染色されたバンドは、バンド４に一致することから、本手法により血漿中のハプトグロビンを特異的に染色できたと考えられる。
【００３７】
以上の結果から、本発明による親水性ポリマーでコーティングされたＰＶＤＦ膜を用いる電気泳動によって分離されたタンパク質は、タンパク質固定化用の疎水性膜に転写することなく、抗体による免疫染色によって特異的に検出することが可能であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の多孔質の疎水性ポリマー膜に親水性ポリマーを含浸付着した電気泳動用媒体を用いると、タンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖を選択的に、明確に分離することができ、また、該媒体上で分離された糖タンパク質またはムコ多糖に、そのまま、糖鎖の遊離反応をさせて、糖タンパク質またはムコ多糖の中に存在する糖鎖構造の解析が可能となる。また、該媒体上で分離されたタンパク質、糖タンパク質或いはムコ多糖は、特異的抗体を用いた免疫染色法や、糖鎖の過ヨウ素酸酸化を利用する糖タンパク質の染色法による検出も可能である。これらのことから、本発明は疾患の検知に用いる検査キットとしての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＢＳＭ、ＰＳＭ及び血漿由来タンパク質を、それぞれ、ＰＶＡコーティングしていないＰＶＤＦ膜、及びＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で電気泳動した結果を示す図。
【図２】ＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で分離したＢＳＭから糖鎖を遊離し、質量分析により解析した結果を示す図。
【図３】ＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で分離したＰＳＭから糖鎖を遊離し、質量分析により解析した結果を示す図。
【図４】コンドロイチナーゼＡＢＣで処理する前のＰＳＭと処理した後のＰＳＭをＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で電気泳動した結果を示す図。
【図５】ヒト唾液中のムチンをＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜により電気泳動した後、アルシアンブルー、Ｐｒｏ−Ｑ  Ｅｍｅｒａｌｄ、免疫染色により染色した結果を示す図。
【図６】ＢＳＭ、ＰＳＭ及び血漿由来タンパク質を、それぞれ、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレートによりコーティングしたPVDF膜で電気泳動した結果を示す図。
【図７】血漿由来タンパク質をセルロースアセテート膜とＰＶＡコーティングしたＰＶＤＦ膜で電気泳動した結果を示す図。
【図８】ＰＶＡコーティングしたPVDF膜、ポリテトラフルオロエチレン膜（PTFE）、ナイロン膜（Nylon）を用いて血漿由来タンパク質を電気泳動した結果を示す図。
【図９】ヒト血漿タンパク質の泳動結果ならびに抗ヒトハプトグロビンにより染色した結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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