(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（i）〜（iv）を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの測定方法。
（i）検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
（ii）前記工程（i）の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程；
（iii）前記工程（ii）で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が１１以上１２．８以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
（iv）前記工程（iii）で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
【請求項２】
工程（i）で生成する遊離型グリセロールが、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドから生成するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ii）の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールを工程（iv）の遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
工程（ii）の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を除去することにより行われる請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項５】
過酸化水素の除去が、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、酸化カップリング色原体の片方の存在下に、過酸化水素に過酸化活性物質を作用させることにより行われる請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
工程（iv）の遊離型グリセロールの測定が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を測定することにより行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール３−リン酸オキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールオキシダーゼを含有する試薬である請求項４〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
過酸化水素の測定が、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
胆汁酸誘導体の存在下に、工程（iii）のリポプロテインリパーゼを作用させる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式（Ｉ）
【化１】
0005191236.tif 000018
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子又は水酸基である］で表される化合物、及び一般式（ＩＩ）
【化２】
0005191236.tif 000019
（Ｘは、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、リポプロテインリパーゼ、及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩及びＨＬＢ値が１１以上１２．８以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、及び遊離型グリセロール測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリド測定用キット。
【請求項１２】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤が、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼを作用させるものである請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
遊離グリセロール除去試薬が、遊離グリセロールを遊離グリセロール測定試薬による測定に係る成分以外の成分に変換する酵素である請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１４】
遊離グリセロール除去試薬が、グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素除去試薬を含有する試薬である、請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１５】
過酸化水素除去試薬が、カタラーゼ、又は、酸化カップリング色原体の片方と過酸化活性物質とを含有する試薬である請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する試薬である、請求項１１〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール３−リン酸オキシダーゼとを含む試薬又はグリセロールオキシダーゼを含む試薬である請求項１４〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有する試薬である請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
第二試薬が、さらに胆汁酸誘導体を含有する請求項１１〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式（Ｉ）
【化３】
0005191236.tif 000020
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子又は水酸基である］で表される化合物、及び一般式（ＩＩ）
【化４】
0005191236.tif 000021
（Ｘは、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質である請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、及びカイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）の４つに大きく分類されている。
各リポ蛋白質は、脂質組成及びアポ蛋白の種類が異なっており、それ故生体中での働きが大きく異なる。また、ＶＬＤＬからＬＤＬへ代謝される過程において生成するリポ蛋白として、ＶＬＤＬとＬＤＬの密度の中間に相当する中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）が存在するが、広義にはＬＤＬとして分類されている。【０００３】
現在、動脈硬化診断のスクリーニングとして臨床検査分野では、総コレステロール、総トリグリセリド、ＨＤＬ中コレステロール、アポリポ蛋白ＡＩ、アポリポ蛋白Ｂなどが一般的に測定されている。最近では総コレステロールに代わり、動脈硬化形成に強く関与するといわれているＬＤＬ中コレステロールが頻繁に測定されるようになってきた。一方、血中のＬＤＬ中コレステロールが高くないにも関わらず冠動脈硬化病変を有する者も多く認められ、肥満、高トリグリセリド血症、高血圧症、高血糖を併せ持った状態が、冠動脈疾患の形成において極めて危険な病態であるともいわれている。また、血中ＬＤＬ中トリグリセリド値はＬＤＬ中コレステロール値以上に冠動脈疾患と関係するという報告もある。【０００４】
ＬＤＬ中トリグリセリドを測定する一般的な方法としては、超遠心、沈殿法、免疫反応を利用した方法により各リポ蛋白を分画分取し、その中に含まれるトリグリセリドを測定する方法があるが、いずれの分画法においても時間や手間がかかり、非常に煩雑である。
分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、第一工程でＬＤＬ以外の全てのリポ蛋白中のトリグリセリドを除去した後、第二工程で残ったＬＤＬ中のトリグリセリドを測定する方法（特許文献１及び特許文献２）が知られているが、ＶＬＤＬ中のトリグリセリドやＣＭ中のトリグリセリドが高い検体においては第一工程で除去しきれず第二工程に反応が持ち越され正の影響を受けるといった問題がある。【０００５】
また、分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、広義的にＬＤＬとして分類されるＩＤＬに含まれるトリグリセリドを測定する方法（特許文献３）が知られているが、通常のＬＤＬに含まれるトリグリセリドは測定対象としていない方法であり、ＬＤＬ中のトリグリセリドの測定法としては不適当である。
また、分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマー、特に、ポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンのトリブロックコポリマー存在下での酵素反応を特徴とする、ＬＤＬ中のトリグリセリドの測定方法（特許文献４）が知られている。
【特許文献１】国際公開第００／４３５３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００４／０８７９４５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ００／６０１１２号パンフレット
【特許文献４】特表２００２−５０８５１９公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確なＬＤＬ中のトリグリセリドの測定方法及び測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記[１]〜［２０］に関する。
[１] 下記工程（i）〜（iv）を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの測定方法。
（i）検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
（ii）前記工程（i）の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程；
（iii）前記工程（ii）で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が１１以上１２．８以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
（iv）前記工程（iii）で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
【０００８】
[２]  工程（i）で生成する遊離型グリセロールが、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドから生成するものである[１]記載の方法。
[３]  工程（ii）の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールを工程（iv）の遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することである［１］又は［２］記載の方法。【０００９】
[４]  工程（ii）の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を除去することにより行われる［１］又は［２］記載の測定方法。
[５]  過酸化水素の除去が、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、酸化カップリング色原体の片方の存在下に、過酸化水素に過酸化活性物質を作用させることにより行われる［４］に記載の測定方法。【００１０】
[６]  工程（iv）の遊離型グリセロールの測定が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を測定することにより行われる［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
[７]  遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール３−リン酸オキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールオキシダーゼを含有する試薬である［４］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。【００１１】
[８]  過酸化水素の測定が、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる［６］又は［７］に記載の方法。
[９]  胆汁酸誘導体の存在下に、工程（iii）のリポプロテインリパーゼを作用させる［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。【００１２】
[１０]  胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式（Ｉ）【００１３】
【化１】
0005191236.tif 000002
【００１４】
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子又は水酸基である］で表される化合物、及び一般式（ＩＩ）【００１５】
【化２】
0005191236.tif 000003
【００１６】
（Ｘは、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質である［９］に記載の方法。【００１７】
[１１] （ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、リポプロテインリパーゼ、及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩及びＨＬＢ値が１１以上１２．８以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、及び遊離型グリセロール測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリド測定用キット。
【００１８】
[１２] ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．２以上１４以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤が、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼを作用させるものである［１１］記載のキット。
【００１９】
[１３]  遊離グリセロール除去試薬が、遊離グリセロールを遊離グリセロール測定試薬による測定に係る成分以外の成分に変換する酵素である［１１］又は［１２］記載のキット。
[１４]  遊離グリセロール除去試薬が、グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素除去試薬を含有する試薬である、［１１］〜［１２］記載のキット。【００２０】
[１５]  過酸化水素除去試薬が、カタラーゼ、又は、酸化カップリング色原体の片方と過酸化活性物質との組み合わせを含有する試薬である［１４］記載のキット。
[１６]  遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する試薬である、［１１］〜［１５］のいずれかに記載のキット。【００２１】
[１７]  遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール３−リン酸オキシダーゼとを含む試薬又はグリセロールオキシダーゼを含む試薬である［１４］〜［１６］のいずれかに記載のキット。
[１８]  過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有する試薬である［１６］又は［１７］に記載のキット。【００２２】
[１９]  第二試薬が、さらに胆汁酸誘導体を含有する［１１］〜［１８］のいずれかに記載のキット。
[２０]  胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式（Ｉ）【００２３】
【化３】
0005191236.tif 000004
【００２４】
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子又は水酸基である］で表される化合物、及び一般式（ＩＩ）【００２５】
【化４】
0005191236.tif 000005
【００２６】
（Ｘは、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質である［１９］に記載のキット。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、簡便で、かつ、正確なＬＤＬ中のトリグリセリドの測定方法及び測定キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のＬＤＬ中のトリグリセリドの測定は、検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルと略記する。）、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルと略記する。）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物と略記する。）、及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテルと略記する。）からなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、これにより生成する遊離型グリセロールと検体に元々存在する遊離型グリセロールを除去し、該遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテルと略記する。）、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテルと略記する。）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルと略記する。）、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルと略記する。）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物と略記する。）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩と略記する。）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩と略記する。）、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテルと略記する）からなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させ、該生成した遊離型グリセロールを測定することにより行われる。【００２９】
なお、以後、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン基をＰＯＥ−ＰＯＡと略記し、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレン基をＰＯＰ−ＰＯＡと略記する。
本発明の好ましいＬＤＬ中のトリグリセリドの測定は、いずれの反応工程においても、検体中のＶＬＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制した状態、もしくは促進しない状態で行うことを特徴とする。これにより、トリグリセリドを豊富に含むＶＬＤＬに由来するトリグリセリドの測定値への影響を実質的に回避することができる。【００３０】
本発明の好ましいＬＤＬ中のトリグリセリドの測定は、いずれの反応工程においても、検体中のＶＬＤＬ及びＣＭ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制した状態、もしくは促進しない状態で行うことを特徴とする。これにより、トリグリセリドを豊富に含むＶＬＤＬ及びＣＭに由来するトリグリセリドの測定値への影響を実質的に回避することができる。【００３１】
本発明の特に好ましい具体的なＬＤＬ中のトリグリセリドの測定方法としては、ＨＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しない、もしくは促進し、かつ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し、もしくは促進しない、ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、ＨＤＬ中のトリグリセリド及び遊離のグリセロールを除去し、ついでＬＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しないもしくは促進し、かつＶＬＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し、もしくは促進しない、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下に、リポプロテインリパーゼを作用させ、これにより、ＬＤＬ中のトリグリセリドを選択的に測定する方法が挙げられる。【００３２】
本発明の特に好ましい具体的なＬＤＬ中のトリグリセリドの測定方法としては、例えば、ＨＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しない、もしくは促進し、かつＬＤＬ，ＶＬＤＬおよびＣＭ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し、もしくは促進しない、ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、ＨＤＬ中のトリグリセリド及び遊離のグリセロールを除去し、ついでＬＤＬ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しない、もしくは促進し、かつＶＬＤＬおよびＣＭ中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し、もしくは促進しない、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの、界面活性剤の存在下に、リポプロテインリパーゼを作用させ、これにより、ＬＤＬ中のトリグリセリドを選択的に測定する方法が挙げられる。【００３３】
本発明の測定対象となるＬＤＬは、比重が１．００６〜１．０６３に分類される広義のＬＤＬ、比重が１．０１９〜１．０６３に分類される狭義のＬＤＬのいずれであっても良いが、広義のＬＤＬが測定対象となる場合、比重が１．００６〜１．０１９に分類されるＩＤＬ、及び、所謂ＶＬＤＬレムナントと称されるリポ蛋白粒子の一部であってＩＤＬと同一比重を有するリポ蛋白粒子からなるものも測定対象に含まれる。【００３４】
本発明に用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明に用いられるリポプロテインリパーゼとしては、リポタンパク中トリグリセリドを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のリポプロテインリパーゼ、遺伝子工学的な手法により製造されるリポプロテインリパーゼ等が挙げられる。また、リポ蛋白中トリグリセリドを加水分解する能力を有するコレステロールエステル加水分解酵素等も本発明のリポプロテインリパーゼに包含される。【００３５】
リポプロテインリパーゼとしては、化学的に修飾したものも使用することができる。また、市販品を使用することもできる。
市販されているリポプロテインリパーゼとしては、コレステロールエステラーゼ“Amano”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ−Ｍ；旭化成社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ３１１；東洋紡績製社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”６（ＬＰＬ６；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、ＥＳＴ“Amano”２（天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＢＰ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ［ＣＯＥ３１３（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製］等が挙げられる。【００３６】
リポプロテインリパーゼの化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。【００３７】
リポプロテインリパーゼを化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ヨードエステル等のα−ハロエステル等が挙げられる。【００３８】
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもSheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン-N,N,N’,N’’,N’’-ペンタ無水二酢酸(DTPA anhydride；同仁化学社製）等が挙げられる。【００３９】
リポプロテインリパーゼの化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾された酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。【００４０】
本発明の方法に用いられるリポプロテインリパーゼの濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上のリポプロテインリパーゼを組み合わせて用いることもできる。【００４１】
本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
本発明に用いられるＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。【００４２】
ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルそれぞれにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのオキシプロピレンの重合度としては、好ましくは２〜６０であり、より好ましくは４〜３０であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは１〜４０であり、より好ましくは１〜２０である。【００４３】
なお、本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルそれぞれにおけるＰＯＥ−ＰＯＡ及びＰＯＰ−ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマなどが挙げられる。【００４４】
ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテルの具体例（製品）としては、例えばニューコール２６０８Ｆ、ニューコール２６００ＦＢ（いずれも日本乳化剤社製）、ニューカルゲンＧＰ１２０、ニューカルゲンＣＰ１５−１５０（いずれも竹本油脂社製）等が挙げられる。【００４５】
本発明に用いられるＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物におけるポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物におけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。【００４６】
ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物の具体例（製品）としては、例えばニッコールＲ１０２０（日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。【００４７】
本発明に用いられるＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。ＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルにおける。多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルのＨＬＢ値としては、１３．１以上１５以下が好ましく、１３．２以上１４以下が特に好ましい。【００４８】
ＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルの具体例（製品）としては、例えばエマルゲンＢ６６（ＨＬＢ値１３．２  花王社製）、ニューコール６１０（ＨＬＢ値１３．８  日本乳化剤社製）、ニューコール７１０（ＨＬＢ値１３．６  日本乳化剤社製）、エマルゲンＡ−９０（ＨＬＢ値１４．５  花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮＴＳＰ−５０（ＨＬＢ値１６．９  青木油脂社製）、ニューコール７１４（ＨＬＢ値１５．０  日本乳化剤社製）、ニューコール２６１４（ＨＬＢ値１５．０  日本乳化剤社製）、ニューコール２６０９（ＨＬＢ値１３．０  日本乳化剤社製）、ニューカルゲンＣＰ１２０（ＨＬＢ値１３．０  竹本油脂社製）等が挙げられる。【００４９】
本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルの濃度としては、ＨＤＬ中トリグリセリドの反応を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０１〜１０％であることが好ましく、０．０２〜５％がより好ましい。また、本発明においては、これらの化合物を２種類以上組み合わせて用いることもできる。【００５０】
本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
本発明において用いられるＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。【００５１】
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテルそれぞれにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのオキシプロピレンの重合度としては、好ましくは２〜６０であり、より好ましくは４〜３０であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは１〜４０であり、より好ましくは１〜２０である。【００５２】
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテルそれぞれにおけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。【００５３】
なお、本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテルそれぞれにおけるＰＯＥ−ＰＯＡ及びＰＯＰ−ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマなどが挙げられる。【００５４】
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテルの具体的例（製品）としては、ワンダサーフＳ１４００、ワンダサーフＲＬ１００（いずれも青木油脂社製）等が挙げられる。
本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。【００５５】
本発明において用いられるＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルそれぞれにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのオキシプロピレンの重合度としては、好ましくは２〜６０であり、より好ましくは４〜３０であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは１〜４０であり、より好ましくは１〜２０である。【００５６】
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルそれぞれにおけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。【００５７】
なお、本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル及びＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルそれぞれにおけるＰＯＥ−ＰＯＡ及びＰＯＰ−ＰＯＡの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマなどが挙げられる。【００５８】
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテルの具体的例（製品）としては、エマルゲンＬ４０（花王社製）が挙げられる。【００５９】
本発明に用いられるＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物中のポリオキシエチレンにおけるオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。【００６０】
ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物における多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。
ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物の具体例（製品）としては、ニューカルゲンＥ１５０（竹本油脂社製）等が挙げられる。【００６１】
本発明に用いられるＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩中のポリオキシエチレンにおけるオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。
ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩におけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。【００６２】
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩の具体的例（製品）としては、ハイテノールＮ０８（第一工業社製）等が挙げられる。
本発明に用いられるＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩中のポリオキシエチレンにおけるオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。【００６３】
ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩における多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。
ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩の具体的例（製品）としては、ニューコール７０７ＳＦ（日本乳化剤社製）等が挙げられる。【００６４】
本発明に用いられるＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは１〜６０であり、より好ましくは２〜３０である。ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルのＨＬＢ値としては、１０以上１２．９以下が好ましく、１１以上１２．８以下が特に好ましい。【００６５】
ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。
ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルの具体的例（製品）としては、エマルゲンＡ６０（ＨＬＢ値１２．８  花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ１２．５（ＨＬＢ値１２．７  青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ２０（ＨＬＢ値１２．７  青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−９（ＨＬＢ値１１．４  青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−７．５（ＨＬＢ値９．２  青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＴＳＰ−１６（ＨＬＢ値１２．７  青木油脂社製）等が挙げられる。【００６６】
本発明に用いられるＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキレンアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルの濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの反応を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０１〜１０％であることが好ましく、０．０２〜５％がより好ましい。また、本発明においては、これらを２種類以上組み合わせて用いることもできる。【００６７】
なお、ＨＬＢ値とは、親水性−親油性均衡値を意味する。本発明に用いられるＰＯＥ多環フェニルエーテルのＨＬＢ値は、界面活性剤ハンドブック（吉田  時行ら著  工業図書株式会社）や新界面活性剤（堀口  博著  三共出版株式会社）に記載の方法で算出することが可能である。また、該ＨＬＢ値としては、各種界面活性剤の製造メーカーのカタログやパンフレットに記載されているＨＬＢ値を利用することも可能である。【００６８】
本発明に用いられる胆汁酸誘導体としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする胆汁酸誘導体であれば特に制限はないが、例えば陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体等が挙げられる。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。【００６９】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（Ｉ）【００７０】
【化５】
0005191236.tif 000006
【００７１】
［式中、Ｒ1は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ2は、水素原子又は水酸基である］で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）という］等が挙げられる。以下、Ｒ2が水素原子である化合物（Ｉ）をＣＨＡＰＳと、Ｒ2が水酸基である化合物（Ｉ）をＣＨＡＰＳＯとよぶ。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（ＩＩ）【００７２】
【化６】
0005191236.tif 000007
【００７３】
（Ｘは、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、置換もしくは非置換のアルキル、又は、置換もしくは非置換のアルカノイルを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩ）という］等が挙げられる。アルキル、アルカノイルにおけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数１〜１０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。置換アルキル及び置換アルカノイルにおける置換基としては、例えば水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
化合物（ＩＩ）のうち、Ｒ3及びＲ4が共に、【００７４】
【化７】
0005191236.tif 000008
【００７５】
（以下、置換基Ａという）である化合物が好ましい。以下、Ｘ、Ｒ3及びＲ4がそれぞれ、水素原子、置換基Ａ及び置換基Ａである化合物をｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、水酸基、置換基Ａ及び置換基Ａである化合物をＢＩＧＣＨＡＰという。
本発明に用いられる胆汁酸誘導体の濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。本発明においては、胆汁酸誘導体を２種類以上用いても良い。【００７６】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリドの測定において用いられる反応液としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。【００７７】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。【００７８】
本発明のＬＤＬ中のトリグリセリドの測定は、下記工程（i）〜（iv）を順次行うことによって達成される。
（i）検体及びＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程、
（ii）前記工程（i）の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程、
（iii）前記工程（ii）で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロール生成させる工程、
（iv）前記工程（iii）で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。【００７９】
各工程の反応の反応温度としては、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間としては、１〜２０分、好ましくは２〜１０分である。工程（i）と工程（ii）、及び工程（iii）と工程（iv）は、それぞれ同時に行うこともできる。
工程（ii）における、反応液中に存在する遊離型グリセロールの除去は、遊離型グリセロールを工程（iv）で生成する遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することにより行うことができる。なお、工程（iv）における遊離型グリセロールの測定方法との組み合わせで工程（ii）の遊離型グリセロールの除去方法は、当業者が適宜選択できる。【００８０】
遊離型グリセロールの除去は、例えば遊離型グリセロールから過酸化水素を生成する試薬を遊離型グリセロールに作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を除去することにより行う方法が挙げられる。該除去方法を用いる場合の工程（iv）の遊離型グリセロールの測定方法としては、例えば遊離型グリセロールから過酸化水素を生成する試薬を作用させ過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定する方法が挙げられる。【００８１】
遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬としては、例えばグリセロールキナーゼ及びグリセロール３−リン酸オキシダーゼを含有する試薬、グリセロールオキシダーゼを含有する試薬等が挙げられる。
本発明におけるグリセロールキナーゼとしては、グリセロールをＡＴＰの存在下グリセロール３−リン酸に変換する活性を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のグリセロールキナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるグリセロールキナーゼ等も用いることができ、グリセロールキナーゼ（ＧＹＫ−３０１；東洋紡績社製）、グリセロールキナーゼ（ＧＹＫ−３１１；東洋紡績社製）、グリセロールキナーゼ（ＧＫＺ；旭化成社製）等の市販品を使用することもできる。【００８２】
グリセロールキナーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたグリセロールキナーゼは、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の方法に用いられるグリセロールキナーゼの濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．１〜２０Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．２〜１０Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上のグリセロールキナーゼを組み合わせて用いることもできる。【００８３】
本発明におけるグリセロール３−リン酸オキシダーゼとしては、グリセロール３−リン酸から過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のグリセロール３−リン酸オキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるグリセロール３−リン酸オキシダーゼ等も用いることができ、Ｌ−α―グリセロリン酸オキシダーゼ（Ｇ３Ｏ−３０１；東洋紡績社製）、Ｌ−α―グリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯＭ；旭化成社製）、Ｌ−α―グリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯＳＰ；旭化成社製）等の市販品を用いることもできる。【００８４】
グリセロール３−リン酸オキシダーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたグリセロール３−リン酸オキシダーゼは、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の方法に用いられるグリセロール３−リン酸オキシダーゼの濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で１〜６０Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、２〜３０Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上のグリセロール３−リン酸オキシダーゼを組み合わせて用いることもできる。【００８５】
本発明におけるグリセロールオキシダーゼとしては、グリセロールより過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のグリセロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるグリセロールオキシダーゼ等も用いることができ、市販品を用いることもできる。グリセロールオキシダーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたグリセロール３−リン酸オキシダーゼは、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。本発明におけるグリセロールオキシダーゼの濃度としては、ＬＤＬ中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上のグリセロールオキシダーゼを組み合わせて用いることもできる。【００８６】
前記の方法により遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬を用いて遊離型グリセロールから発生させた過酸化水素は、過酸化水素除去試薬により除去することができる。該過酸化水除去試薬としては、例えばカタラーゼを含む試薬、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方、すなわち、フェノール系もしくはアニリン系等の水素供与体化合物又は４−アミノアンチピリン等のカプラーが挙げられる。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを含む試薬を用いる場合は、第一工程においてカタラーゼを該過酸化水素に作用させて該過酸化水素を水と水素に変換することにより、除去することができる。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方を用いる場合は、該過酸化水素を過酸化活性物質の存在下、該酸化カップリング型色原体の片方と反応させて、無色の物質を生成させることによって、除去することができる。【００８７】
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを含む試薬を使用する場合のカタラーゼの濃度としては、ＨＤＬ中トリグリセリド及び遊離のグリセロール由来の過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で５０〜４０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、１００〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度としては、該過酸化活性物質とＨＤＬ中のトリグリセリド及び遊離のグリセロール由来の過酸化水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度であれば特に制限はない。過酸化活性物質として、パーオキシダーゼを用いる場合、パーオキシダーゼの濃度としては、反応液中で１〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。【００８８】
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フェノール系水素供与体化合物としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。【００８９】
アニリン系水素供与体化合物としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。【００９０】
過酸化水素除去試薬として、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを使用する場合、該酸化カップリング型色原体の片方の濃度としては、生成した過酸化水素を除去し得る濃度であれば特に限定はされないが、好ましくは０．０５〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌである。
本発明の工程（ii）において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（iv）においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウム、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程（iv）で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であればとくに限定はされないが、好ましくは０．５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。【００９１】
本発明の工程（iv）において生成したＬＤＬ中トリグリセリド由来の過酸化水素の測定方法としては、例えば直接過酸化水素電極で測定する方法、過酸化水素測定試薬により測定する方法が挙げられる。過酸化水素測定試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光物質等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば前述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、発光物質を含有する。発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。【００９２】
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、発光物質を含有する過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、発光物質と反応させ、生じた光量子を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。【００９３】
酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。前述のように、４−ＡＡ等のカプラーとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とが酸化カップリング反応により色素を生成する。
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。【００９４】
工程（ii）において、過酸化水素除去試薬として、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを使用し、工程（iv）において、過酸化水素測定試薬として、酸化カップリング型色原体およびパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を使用する場合、工程（ii）において使用する酸化カップリング型色原体の別の片方を工程（iv）における過酸化水素測定試薬として使用することができる。即ち、工程（ii）の過酸化水素の除去工程において、酸化カップリング色原体として４−ＡＡ等のカプラーを用いた場合には、工程（iv）において、フェノール系もしくはアニリン系等の水素供与体化合物を添加すればよく、また、過酸化水素の除去工程において、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を用いた場合には、工程（iv）において、４−ＡＡ等のカプラーを添加すればよい。【００９５】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００Ｕ／ｍＬが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜５ｇ／Ｌがより好ましい。【００９６】
本発明の工程（ii）における、反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程と、工程（iv）における遊離型グリセロールの測定方法との組み合わせは前述の例に限定されない。
例えば、工程（ii）で、生成する遊離型グリセロールにグリセロールキナーゼを作用させて、該遊離型グリセロールをグリセロール３−リン酸に変換し、工程（iv）で、グリセロールキナーゼ不活性化剤等の存在下、グリセロールオキシダーゼを作用させて、生成する過酸化水素を測定する方法等を例示することができる。【００９７】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリドの測定用キットは、以下の第一試薬及び第二試薬からなる２試薬系が好ましいが、適宜３試薬系等のキット形態をとることもできる。【００９８】
第一試薬：
ＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、リポプロテインリパーゼ及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する試薬。【００９９】
第二試薬：
ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＰ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤及び遊離型グリセロール測定試薬を含有する試薬。【０１００】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリドの測定用キットに用いられる、リポプロテインリパーゼ、界面活性剤、遊離型グリセロール除去試薬、遊離型グリセロール測定試薬は、それぞれ、前述のものが挙げられる。【０１０１】
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおいては、トリグリセリドから過酸化水素を発生させる酵素群は第一試薬に含有されるが、さらに第二試薬にも含有されていてもよい。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有される。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合は、第二試薬はカタラーゼ活性阻害剤を含有するのが好ましい。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを含有する試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と該片方の酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねているので、特に過酸化水素除試薬を除去又は不活性化する必要はなく、第二試薬に、発色に必要な別の片方の酸化カップリング型色原体を含有させればよい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸化水素測定試薬中の一部の構成成分、特に、酸化カップリング型色原体の片方は第一試薬に含有されてもよい。胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されても良いが、第二試薬に含有されることが好ましい。【０１０２】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットには、必要に応じて、反応液、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、反応促進剤、非特異反応抑制等が含有されてもよい。反応液としては、例えば前述の反応液等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等の塩類等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物などが挙げられる。【０１０３】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いて検体中のＬＤＬ中トリグリセリドを測定する場合には、当該キットは前述の水性媒体または反応液に溶解して使用することができる。
本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるリポプロテインリパーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１２００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．０２〜６００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるグリセロールキナーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．１〜６０Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．２〜３０Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるグリセロール３−リン酸オキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜１８０Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、２〜９０Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。【０１０４】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおける界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜２０％となる含量が好ましく、０．０２〜１０％となる含量がより好ましい。
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるカタラーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０５〜１．２ｋＵ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．１〜６．０ｋＵ／ｍＬとなる含量がより好ましい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるカタラーゼ活性阻害剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．５〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、１〜９０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１０５】
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを含有する試薬を使用する場合のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．０５〜８ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、０．１〜４ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１０６】
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含有する試薬を使用する場合のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．０５〜８ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、０．１〜４ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１０７】
本発明のＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜２０％となる含量が好ましく、０．０２〜１０％となる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。【０１０８】
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製）、ＭＥＳ（同仁化学社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ＣＥＢＰ−Ｍ（リポプロテインリパーゼ活性を有する酵素；旭化成社製）、ＧＹＫ−３０１（グリセロールキナーゼ；東洋紡績社製）、ＧＰＯＭ（グリセロール３−リン酸オキシダーゼ；旭化成社製）、カタラーゼ（シグマ社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）、アジ化ナトリウム（関東化学社製）、エマルゲンＢ６６（花王社製）、ニューコール６１０（日本乳化剤社製）、ニューコール２６０８Ｆ（日本乳化剤社製）、ニューカルゲンＧＰ１２０（竹本油脂社製）、ニッコールＲ１０２０（日光ケミカルズ社製）、エマルゲンＡ６０（花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ１２．５（青木油脂社製）、ハイテノールＮ０８（第一工業社製）、エマルゲンＬ４０（花王社製）、ニューコール７０７ＳＦ（日本乳化剤社製）、ワンダサーフＳ１４００（青木油脂社製）、ニューカルゲンＥ１５０（竹本油脂社製）、コール酸ナトリウム（アクロス社製）、エマルゲン９０９（ＰＯＥノニルフェニルエーテル  ＨＬＢ１２．４：花王社製）、エマルミンＮＬ７０（ＰＯＥラウリルエーテル  ＨＬＢ１２．４：三洋化成社製）。
【実施例１】
【０１０９】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
【実施例２】
【０１１０】
以下の第一試薬（試薬Ｂ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニューコール６１０                            ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
【実施例３】
【０１１１】
以下の第一試薬（試薬Ｃ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニューコール２６０８Ｆ                        ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
【実施例４】
【０１１２】
以下の第一試薬（試薬Ｄ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニッコールＲ１０２０                          ２  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
【実施例５】
【０１１３】
以下の第一試薬（試薬Ｅ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｅ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニューカルゲンＧＰ１２０                      ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
【実施例６】
【０１１４】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｂ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＢＬＵＮＯＮ  ＤＳＰ１２．５                  １０  ｇ／Ｌ
【実施例７】
【０１１５】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｃ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｃ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ４０                              ５  ｇ／Ｌ
【実施例８】
【０１１６】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｄ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ハイテノールＮ０８                            ６  ｇ／Ｌ
【実施例９】
【０１１７】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｅ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｅ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                        ５  ｇ／Ｌ
【実施例１０】
【０１１８】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｆ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｆ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ワンダサーフＳ１４００                        ６  ｇ／Ｌ
【実施例１１】
【０１１９】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｇ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｇ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ニューカルゲンＥ１５０                        ６  ｇ／Ｌ
比較例１【０１２０】
以下の第一試薬（試薬Ｆ）及び第二試薬（試薬ａ）からなるＬＤＬトリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｆ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
比較例２【０１２１】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｈ）からなるＬＤＬトリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
比較例３【０１２２】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｉ）からなるＬＤＬトリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｉ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲン９０９                              １０  ｇ／Ｌ
比較例４【０１２３】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｊ）からなるＬＤＬトリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｊ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルミンＮＬ７０                            ６  ｇ／Ｌ
【実施例１２】
【０１２４】
「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重＞１．０６３）、狭義のＬＤＬ（比重１．０１９〜１．０６３）、ＩＤＬ（比重１．００６〜１．０１９）、ＶＬＤＬ（比重０．９６〜１．００６）及びＣＭ（比重＜０．９６）の５つのリポ蛋白分画をそれぞれ分取し、実施例１〜１１並びに比較例１〜４のキットを用いて、各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率を算出した。
（１）各リポ蛋白分画中トリグリセリドとそれぞれ実施例１〜１１並びに比較例１〜４のキットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。【０１２５】
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いでそれぞれ実施例１〜１１並びに比較例１及び２のキットの第一試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応（第一反応）を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、この反応液にそれぞれ実施例１〜１１並びに比較例１〜４のキットの第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温して反応（第二反応）を行い、第二反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いて、吸光度変化（ΔＥリポ蛋白分画）を算出した。また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥブランク）を算出した。最後に、下記式により、各リポ蛋白分画における「反応吸光度」を算出した。
【数１】
0005191236.tif 000009
【０１２６】
（２）各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、色原体としてＥＭＳＥを使用したトリグリセリド測定用キットであるデタミナーＣ  ＴＧ（協和メデックス社製）を実施例１のキットの代わりに用いる以外は（１）の場合と同様の方法で、「反応吸光度」を算出し、以下の計算式にて、それぞれ実施例１〜１１並びに比較例１〜４のキットにおける各リポ蛋白分画中トリグリセリドとの反応率（％）を算出した。尚、デタミナーＣ  ＴＧを用いた測定において算出した「反応吸光度」は、対象とするリポ蛋白中のトリグリセリドが全て反応した際の「反応吸光度」を意味する。
【数２】
0005191236.tif 000010
【０１２７】
実施例１〜１１並びに比較例１〜４のキットにおける各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率について、それぞれ反応率が０〜１０％を「−」、１０〜２０％を「±」、２０〜４０％を「＋」、４０〜６０％を「＋＋」、６０〜８０％を「＋＋＋」、８０〜１００％を「＋＋＋＋」と表しまとめたものを第１表に示す。【０１２８】
【表１】
0005191236.tif 000011
【０１２９】
第一試薬中にＰＯＥ−ＰＯＡ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢ値が１３．０以上１７．０以下のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる一つの界面活性剤を含有し、かつ第二試薬中にＰＯＥ−ＰＯＡアルキルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＡアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル縮合物、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸塩及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる一つの界面活性剤を含有したキットのみＬＤＬ中トリグリセリドが優先的に反応することが判明した。
【実施例１３】
【０１３０】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｋ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｋ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６  ｇ／Ｌ
【実施例１４】
【０１３１】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｌ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｌ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ハイテノールＮ０８                            ６  ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６  ｇ／Ｌ
【実施例１５】
【０１３２】
以下の第一試薬（試薬Ａ）及び第二試薬（試薬ｍ）からなるＬＤＬ中トリグリセリド測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹＫ−３０１                                ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
カタラーゼ                                    ２００  ｋＵ／Ｌ
第二試薬（試薬ｍ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０                              ２０  ｇ／Ｌ
ハイテノールＮ０８                            ６  ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６  ｇ／Ｌ
【実施例１６】
【０１３３】
実施例１、実施例８，実施例１３〜１５及び比較例２のキットを用いて、実施例１２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、ヒト血清３０検体中のトリグリセリドの反応吸光度を測定した。
次に、キドニー  インターナショナル（Kidney International）、  Ｖｏｌ．３９，７５５ページ（１９９１）に記載された超遠心法を基準法とし、該血清３０検体各々からＬＤＬ（比重１．００６〜１．０６３）を超遠心分離し、得られたＬＤＬ分画中のトリグリセリド量をデタミナーＣ ＴＧ（協和メデックス社製）を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを用いた測定と、基準法による測定との相関係数を第２表に示す。【０１３４】
【表２】
0005191236.tif 000012
【０１３５】
実施例１又は実施例８のキットを用いた測定と、比較例２のキットを用いた測定との比較より、ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテル又はＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩を含有する第二試薬を用いることにより、基準法との相関係数が向上することが判明した。また、実施例１と実施例１３のキットを用いた測定、及び、実施例８と実施例１４のキットを用いた測定との比較より、ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテル又はＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩を含有する第二試薬にさらに胆汁酸であるコール酸を加えることにより、基準法に対する相関係数が向上することが判明した。また、実施例１５のキットを用いた測定より、ＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のＰＯＥ多環フェニルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸塩及び胆汁酸を含有する第二試薬を用いた場合においても、基準法に対し良好な相関係数が得られることが判明した。
【実施例１７】
【０１３６】
超遠心法並びに本発明の実施例１５のキットを用いて、新鮮ヒト血清３検体について、各検体中のＬＤＬ中トリグリセリドを以下の方法により定量した。
（１）超遠心法を用いたＬＤＬ中トリグリセリドの定量
新鮮ヒト血清３検体を用いてキドニー  インターナショナル（Kidney International）、  Ｖｏｌ．３９，７５５ページ（１９９１）に記載された超遠心法にて該検体中のＬＤＬ（比重１．００６〜１．０６３）を遠心分離し、得られたＬＤＬ分画中のトリグリセリド量をデタミナーＣ ＴＧ（協和メデックス社製）を用いて測定した。
（２）検量線の作成
超遠心法による測定より、ＬＤＬ中トリグリセリド濃度が４０．０ｍｇ／ｄＬであることが判明している新鮮ヒト血清を標準品として用いて、これを検量線作成用サンプルとした。実施例１２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サンプル中のＬＤＬ中トリグリセリド濃度との関係から検量線を作成した。
（３）ヒト血清３検体中のＬＤＬ中トリグリセリドの定量
検量線作成用サンプルの代わりに新鮮ヒト血清３検体を用いて、上記（２）と同様の方法により、該２検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記（２）で作成した検量線とから、各検体中のＬＤＬ中トリグリセリド濃度を定量した。
３検体について、上記（１）で測定した超遠心法を用いた測定値と、上記（３）で測定した実施例１５のキットを用いた測定値を表３に示す。【０１３７】
【表３】
0005191236.tif 000013
参考例１【０１３８】
以下の第一試薬および第二試薬からなる測定用キットＡおよび測定用キットＢを調製した。
測定用キットＡ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ【０１３９】
測定用キットＢ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
エマルゲンＢ６６                              ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
参考例２【０１４０】
以下の第一試薬および第二試薬からなる測定用キットＡおよび測定用キットＢを調製した。
測定用キットＡ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューコール６１０                            ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ【０１４１】
測定用キットＢ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューコール６１０                            ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
参考例３【０１４２】
以下の第一試薬および第二試薬からなる測定用キットＡおよび測定用キットＢを調製した。
測定用キットＡ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューコール２６０８Ｆ                        ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ【０１４３】
測定用キットＢ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューコール２６０８Ｆ                        ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
参考例４【０１４４】
以下の第一試薬および第二試薬からなる測定用キットＡおよび測定用キットＢを調製した。
測定用キットＡ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューカルゲンＧＰ１２０                      ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ【０１４５】
測定用キットＢ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニューカルゲンＧＰ１２０                      ５  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
参考例５【０１４６】
以下の第一試薬および第二試薬からなる測定用キットＡおよび測定用キットＢを調製した。
測定用キットＡ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＣＥＢＰ−Ｍ                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニッコールＲ１０２０                          ２  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ【０１４７】
測定用キットＢ
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                              ０．５  ｇ／Ｌ
ＧＹ−３０１                                  ２  ｋＵ／Ｌ
ＧＰＯＭ                                      １０  ｋＵ／Ｌ
ニッコールＲ１０２０                          ２  ｇ／Ｌ 
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
参考例６【０１４８】
実施例１２に記載の方法と同様に、超遠心法により５つのリポ蛋白分画を分取し、参考例１〜５の測定用キットＡおよび測定用キットＢをそれぞれ用いて、各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率を算出した。
（１）各リポ蛋白分画中トリグリセリドと各測定用キットとの反応による反応吸光度の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により反応吸光度を算出した。
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いで参考例１〜５の測定用キットＡまたは測定用キットＢの第一試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応（第一反応）を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
次いで、この反応液に参考例１〜５の測定用キットＡまたは測定用キットＢの第二試薬（０．０５ｍＬ）をそれぞれ添加しさらに３７℃で５分間加温して反応（第二反応）を行い、第二反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いて、吸光度変化（ΔＥリポ蛋白分画）を算出した。
また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥブランク）を算出した。各リポ蛋白分画における「反応吸光度」は、下記式１により算出した。【０１４９】
【数３】
0005191236.tif 000014
式１より求めた参考例１〜５の測定用キットＡおよび測定用キットＢのリポ蛋白分画における反応吸光度を用い、参考例１〜５における各リポ蛋白分画中に存在する遊離グリセロールの反応を差し引いた各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応吸光度を下記式により算出した。【０１５０】
【数４】
0005191236.tif 000015
（２）各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率の算出
実施例１２と同様、デタミナーＣ  ＴＧ（協和メデックス社製）を用い、リポ蛋白中トリグリセリドが全て反応した際の「反応吸光度」を算出し、参考例１〜５における各リポ蛋白分画中トリグリセリドとの反応率（％）を以下の計算式にて算出した。【０１５１】
【数５】
0005191236.tif 000016
参考例１〜５における各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率を第３表に示す。なお、反応率が０〜１０％を「−」、１０〜２０％を「±」、２０〜４０％を「＋」、４０〜６０％を「＋＋」、６０〜８０％を「＋＋＋」、８０〜１００％を「＋＋＋＋」とした。【０１５２】
【表４】
0005191236.tif 000017
【０１５３】
第４表の通り、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル（ニューコール２６０８Ｆ、ニューカルゲンＧＰ１２０）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物（ニッコールＲ１０２０）及びＨＬＢが１３．０以上１７．０以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（エマルゲンＢ６６、ニューコール６１０）からなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する試薬において、ＨＤＬ中のトリグリセリドが優先的に反応することが判明した。【０１５４】
従って、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びＨＬＢが１３．０以上１７．０以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選ばれる界面活性剤で処理した試料中には、ＨＤＬ以外、具体的には、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のトリグリセリドが残存し、この処理した試料をさらに、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩、及びＨＬＢ値が９．０以上１３．０未満のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤で処理することにより特異的にＬＤＬ中のトリグリセリドが測定できることが示される。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明により、動脈硬化などの冠動脈疾患の診断に有用な低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キットが提供される。