(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワインから分離され、低温および低ｐＨでもマロラクティック発酵を行う、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｏｅｎｉ）に近縁なＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５３）である乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、低温および低ｐＨで働く新規マロラクティック発酵乳酸菌とこれを用いた乳酸発酵食品およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  マロラクティック発酵（以下、ＭＬＦと略）は、乳酸菌によって、酸味の強いリンゴ酸を酸味の柔らかい乳酸に変換する減酸発酵であり、ワインの品質を向上させる技術である。ＭＬＦの進行に影響を与える因子として、ｐＨおよび温度が挙げられる。通常は、ｐＨ３．３〜３．５を境にして、低ければＭＬＦは生起せず、高くなるに従って生起する傾向にある。また、温度は１５℃を下限温度域とし、それよりも高い２０〜２５℃で早く生起し、進行速度も速いことが知られている。【０００３】  寒冷地である北海道で収穫されるブドウは、その冷涼な気候により酸味が強いことから、ワインの品質向上においてＭＬＦが必要不可欠な工程である。現状では、原料のブドウ由来もしくは「蔵つき」と称される天然の乳酸菌によって、自然発生的にＭＬＦが進行する場合があるが、その開始時期や終了時期が一定しないため、ワインの品質の安定が望まれず、発酵管理および製造工程管理に支障を来している。また、市販のＭＬＦ乳酸菌スターターをアルコール発酵終了後のワインに添加することで、ＭＬＦを誘導する方法があるが、寒冷地の北海道では、醸造ワインのｐＨが低いことおよびワインの醸造時期と低温期が重なるため、ＭＬＦが誘導されないことも多く、従来の乳酸菌スターターでは、発酵管理が難しい状況にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  これまでの市販のＭＬＦ乳酸菌スターターでは、ｐＨの低いブドウ果汁を原料としたワインや低温域でのＭＬＦの安定した進行が期待できない。しかしながら、低温および低ｐＨ条件下で自然にＭＬＦを進行させている乳酸菌が存在していることも確認されている。低温および低ｐＨでも自然にＭＬＦの進行しているワイン中より当該菌を分離し、取得することができれば、低温条件でのＭＬＦが可能となり、低ｐＨワインおよび果汁でも円滑にＭＬＦを進行させることができる。また、寒冷地でのＭＬＦ管理が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明者らは、上記の課題を解決するために、自然にＭＬＦを進行させている道産赤ワインより、ＭＬＦに関与している乳酸菌の分離を試みた。分離した乳酸菌の中から、低温および低ｐＨでのＭＬＦ進行能の高いＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３５３）である新規な乳酸菌株を取得した。【０００６】  上記の新規取得株をアルコール発酵終了後の赤ワインに添加することで、低温および低ｐＨ条件でもＭＬＦが良好に進行することを確認し、本発明に至った。【０００７】  即ち、本発明の第一は、赤ワインより分離され、低温および低ｐＨでもマロラクティック発酵を行う、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉに近縁なＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３５３）である新規な乳酸菌株に関する。本発明の第二は、果汁、ワインまたは果汁およびワインに、請求項１記載の乳酸菌を添加してマロラクティック発酵させることにより得られる乳酸発酵食品に関する。発明の第三は、果汁、ワインまたは果汁およびワインに、請求項１記載の乳酸菌を添加して発酵させることにより得られる乳酸発酵食品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】  本発明のＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２は、これをブドウ果汁またはワインに添加することで、従来ではＭＬＦの進まなかった低温下でもＭＬＦを進行させ、また、原料果汁またはワインなどのｐＨが低い状況でもＭＬＦを進行させることができるため、ワインの品質を安定させ、ＭＬＦの発酵管理が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  本発明の実施の形態について、具体的且つ詳細に説明する。本発明によって得られた乳酸菌株は、北海道で醸造された赤ワインより分離された新規な乳酸菌株である。当該菌株を得るために、池田町ブドウ・ブドウ酒研究所で醸造されたワインを、ＭＬＦ乳酸菌分離に適した１４３培地（ＪＣＭ）で培養した。【００１０】  当該乳酸菌株は、２００１年に池田町ブドウ・ブドウ酒研究所で醸造された山ブドウワインの、ＭＬＦ進行中のワインから分離された。当該乳酸菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、塩基配列をデータベースと照合することにより、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉに近縁なＯｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．と推定された。また、顕微鏡観察および生理生化学試験を行ったところ、球状（連鎖あり）であり、グラム染色陽性、カタラーゼ陰性、グルコースおよびトレハロースを発酵せず、リボースおよびフラクトースを発酵するヘテロ発酵型乳酸菌であったことから、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉもしくはＯｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉの近縁種と推定された（表１）。【００１１】
【表１】
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【００１２】  さらに、当該乳酸菌株のＩＴＳ領域のＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の電気泳動パターンの違いから、道産赤ワインより分離した他の乳酸菌株およびクリスチャンハンセン社の市販株（ＭＬＦスターター；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｏｅｎｏｓ  ＤＳＭ７００８）とは異なる菌株であることが示された。【００１３】  当該菌株の低温・低ｐＨ条件下でのＭＬＦの進行速度を、市販株と比較した。山ブドウワインは、当該株を分離したワインであるため、これを試験培地とし、濾過除菌後Ｌ−リンゴ酸含量を１０ｇ／Ｌに調製し、ｐＨ２．８に調整した。各乳酸菌株を接種し、１５℃で培養した際の、各菌株の生育状態およびＭＬＦ能力を調べる形で行った。結果を図１、図２に示す。【００１４】  図１より、低温１５℃において、ｐＨ２．８という極めてｐＨの低い状況下においても両菌株ともＭＬＦを進行させているが、その進行速度は、当該株の方が速く、ＭＬＦ能がより高いことが認められる。一方、図２より、両株の生菌数は、常に市販株の方が当該乳酸菌株よりも高い。生菌数が低いにもかかわらず、ＭＬＦ進行速度が速いことから、当該株は、低温および低ｐＨでもＭＬＦを進行させ得る優れた菌株であることが示された。【００１５】  このように道産赤ワインから分離したＯｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉに近縁な新規乳酸菌株は、低温、低ｐＨ下でのＭＬＦ能力が高く、寒冷地でのワイン醸造に有益であることから、ＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２と命名し、平成１９年８月３１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託し、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３５３を得た。【００１６】  本発明における果汁とは、果実を搾汁して得られるものであって、特に種類は限定されないが、通常はワインを製造する原料であって、品種は問わないが、赤および白ブドウ果汁が好適に利用される。本発明では赤ブドウ品種、特に酸味の強いｐＨの低い果汁で用いられると、効果的である。【００１７】  本発明におけるワインとは、果汁を酵母でアルコール発酵を行って得られたもので、ＭＬＦが進行していないものであれば基本的にどのようなものでも良い。【００１８】  本発明における乳酸発酵食品とは、果汁、ワインまたは果汁およびワインに、ＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２を添加し、乳酸発酵することによって、ＭＬＦが進行、終了したもののことである。【００１９】  本発明における製造方法であるが、果汁、ワインまたは果汁およびワインに、ＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２を添加し、培養することによって、ＭＬＦを進行、終了させる。加えるＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２は、予め１４３液体培地などで培養した乳酸菌懸濁液または培養菌体を凍結乾燥や通風乾燥した菌体などを用いることができる。乳酸菌の添加量は、１０の６乗〜１０の８乗／ｍｌで、低温、低ｐＨという過酷な条件での発酵となるため、１０の７乗／ｍｌ以上であることが望ましい。
【実験例】
【００２０】  以下に、本発明の乳酸菌を使うことで、ＭＬＦが順調に進行した実験例を示し、本発明を詳細に説明する。
【００２１】  実験例１．試験ワインとして、池田町ブドウ・ブドウ酒研究所で醸造された２００５年産山ブドウワインを使用した。供試ワインのＬ−リンゴ酸含量は、１０３７６．１ｍｇ／Ｌと非常に高く、ｐＨは３．０５であった。ＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２は、凍結保存していたものを解凍後、１４３培地もしくは変則１４３培地（Ｉ：１４３培地にＬ−リンゴ酸を１０，０００ｍｇ／Ｌ添加し、ｐＨ  ４．０に調整。使用直前にエタノールを５％になるように添加。ＩＩ：１４３培地にＬ−リンゴ酸を１０，０００ｍｇ／Ｌ添加し、ｐＨ  ３．２に調整。使用直前にエタノールを１０％になるように添加。）で、ワインへの馴化を考慮した前培養を行った。前培養終了後、試験ワイン４０ｍｌに１×１０８個／ｍｌになるように乳酸菌を接種し、１５℃で培養した。経日的にサンプリングを行い、Ｌ−リンゴ酸量、Ｌ−乳酸量を測定することで、ＭＬＦの進行を確認した。結果を図３に示す。
【００２２】  図３より、当該菌株を添加することによって、低温（１５℃）、低ｐＨ（３．０５）条件下でも２週間で、約半分のリンゴ酸が消費され、２か月でＬ−リンゴ酸が１００ｍｇ／Ｌ以下になり、ＭＬＦの終了が認められ、当該株の添加効果が示された。
【００２３】  実験例２．試験ワインとして、池田町ブドウ・ブドウ酒研究所で醸造された２００７年産清舞種ブドウワインを２００Ｌ使用した。供試ワインのＬ−リンゴ酸含量は、７１４６．５６ｍｇ／Ｌとかなり高く、ｐＨは３．１８であった。ＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２は、凍結保存していたものを解凍後、１４３培地もしくは変則１４３培地（ＩＩＩ：１４３培地の糖成分（グルコースとフルクトース）をフルクトースとリボースに置き換え、ｐＨ  ４．０に調整）で拡大培養した。ワインへの添加菌の馴化を考慮して、ブドウ果汁およびブドウ果汁＋５％エタノールでの培養を経て、１／１０量のワイン（２０Ｌ）で前培養を行った後、本培養へ移行した。本培養では、１×１０８個／ｍｌになるように乳酸菌を接種し、１５℃で培養した。経日的にサンプリングを行い、Ｌ−リンゴ酸量、Ｌ−乳酸量を測定することで、ＭＬＦの進行を確認した。結果を図４に示す。
【００２４】  図４より、Ｌ−リンゴ酸量が高く、ｐＨの比較的低いワイン（ｐＨ３．１８）にＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２を添加し、低温（１５℃）で培養しても、円滑にＭＬＦが進行し、約１０日間で終了した。ワインの試験量を増やしても、当該株の添加効果に変わりはないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｐＨ２．８の低ｐＨワインにＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２もしくは市販株（ＭＬＦスターター；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｏｅｎｏｓ  ＤＳＭ７００８）を添加し、１５℃で培養したときの、Ｌ−リンゴ酸量の変化を示したグラフである。
【図２】ｐＨ２．８の低ｐＨワインにＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２もしくは市販株（ＭＬＦスターター；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｏｅｎｏｓ  ＤＳＭ７００８）を添加し、１５℃で培養したときの、生菌数の変化を示したグラフである。
【図３】ｐＨ３．０５の山ブドウワインにＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２を添加し、１５℃で培養したときの、Ｌ−リンゴ酸量およびＬ−乳酸量の変化を示したグラフである。
【図４】ｐＨ３．１８の清舞種ブドウ醸造ワインにＴＯＫＡＣＨＩ−ＩＫＥＤＡ−０２を添加し、１５℃で培養したときの、Ｌ−リンゴ酸量およびＬ−乳酸量の変化を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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