(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）、これらの薬理学上許容し得る塩ならびにこれらのメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルおよびブチルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする神経幹細胞から神経細胞への分化を促進する神経分化促進剤。
【請求項２】
さらに、アルブミン、脂肪酸フリーのアルブミン、リン脂質、リポソーム、リポタンパク質および界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１つの、脂肪酸を培地になじみやすくする作用を有する化合物を含有する、請求項１に記載の神経分化促進剤。
【請求項３】
ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、これらの薬理学上許容し得る塩ならびにこれらのメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルおよびブチルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つが、唯一の神経幹細胞の分化誘導因子である、請求項１または２に記載の神経分化促進剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の神経分化促進剤を培養液に添加する工程を含む、神経幹細胞から神経細胞への分化を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経幹細胞の分化を促進する神経分化促進剤に関する。本発明はまた、神経分化促進剤を使用した神経幹細胞をはじめとする未分化な神経系細胞の分化促進方法に関する。本発明はまた、培養細胞と神経分化促進剤を含有する再生医療用組成物に関する。
本発明はまた、上記神経分化促進剤を含有する神経幹細胞をはじめとする未分化な神経系細胞のための培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器に対して、細胞を移植したり、内因性の自己細胞を刺激することにより、その機能の再生を図る再生医療が注目をあびている。神経系においても、脳血管障害やパーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷など、中枢神経系の細胞や組織の損傷や退化・減少を伴う疾患の治療方法として、神経再生医療に対する期待、重要性が高まっている。【０００３】
１９９０年代には、既に、パーキンソン患者に対する中絶胎児中脳腹側組織の移植が報告されている。しかし、この移植治療には、患者１人あたり約１０体の中絶胎児を集める必要があることなどから、倫理的問題や数の問題、細胞の質の問題など解決すべき点は多い。（非特許文献１）【０００４】
そこで近年注目されているのが、自己複製能と多分化能を有する神経幹細胞である。神経幹細胞は培養によって大量調製したり、分化因子存在下で試験管内で神経細胞やグリア細胞に分化させることが可能である。パーキンソン病様の症状を示すカニクイザルに胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化した神経幹細胞を移植し、症状が改善されたとの報告がなされている。（非特許文献２）
このように、神経幹細胞を効率よく分化させられれば、機能を失った組織に神経幹細胞を移植し、生体内で神経組織に分化させることや、あるいは予め試験管内で神経幹細胞を神経細胞やグリア細胞に分化させ、それらを移植することが可能になる。さらには、パーキンソン病の治療等においては、神経幹細胞から分化した細胞をさらに特定の神経細胞に分化させ、それを移植すること等が可能になり、神経疾患の新たな治療手段を提供することができる。【０００５】
神経幹細胞の分化に関わる因子のうち、神経幹細胞からニューロンへの運命づけにかかわる可溶性因子として、platelet derived growth factor(ＰＤＧＦ)が知られている。Insulin like growth factor(ＩＧＦ-Ｉ)およびbrain derived neurotrophic factor(ＢＤＮＦ)は神経幹細胞のニューロンへの運命づけとその後の分化成熟を促進することが報告されている。これらに加え、生体ラット海馬由来神経幹細胞の培養系ではレチノイン酸（ＲＡ）とフォルスコリン（ＦＳＫ）の共添加により、ニューロンが劇的に促進されることが報告されている。（非特許文献３）
また、オリゴデンドロサイトへの分化に関与する因子として、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、アストロサイトへの分化に関与する因子として、ＣＮＴＦ（ciliary neurotrophic factor)、あるいは、ＬＩＦ(leukemia inhibitory factor)とＢＭＰ-２(bone morphogenic protein-2)の共添加等が報告されている。（非特許文献４）【０００６】
しかしながら、これらの他にも、神経幹細胞に対して作用する生体因子は複数存在するものと考えられる。上述のＰＤＧＦ、ＩＧＦ-Ｉ、ＢＤＮＦ等は蛋白分子のため、生体内に多数存在するプロテアーゼの影響を受けやすく、また稀ではあるが自己抗体の出現の危険性もある。実際の治療を考えると、細胞や培養環境、移植先の体内環境、患者の体質、使用方法等に応じて最適な分化因子を選択して使用することが好ましく、神経幹細胞の分化に関わる物質のバリエーションの１つとして、新たな生理活性物質の同定が期待されている。【０００７】
ところで、不飽和脂肪酸は、心臓、循環器、脳、皮膚といった重要な器官や組織に必要な栄養成分として知られている物質である。特に、ＥＰＡやＤＨＡは、その「中性脂肪の低下」「血小板凝集の抑制」効果等から、医薬品やサプリメント等に広く使用されている。【０００８】
不飽和脂肪酸の精神神経領域での使用として、ＥＰＡの投与によって、アルツハイマー性痴呆、脳血管性痴呆（本明細書において、認知症／認知障害という場合がある）の認知機能改善効果が見られたとの報告がある。（非特許文献５）
また、「精神・神経障害のための高純度エチルＥＰＡ及びＥＰＡ誘導体」（特許文献１）で高純度ＥＰＡは精神分裂病、そううつ病、不安症、痴呆、ハンチントン病等精神・神経障害に有効であると述べている。【０００９】
しかしながら、非特許文献５は、ＥＰＡが最小動脈や血小板に作用して脳血流量を改善させた可能性が大きいことによると考察されており、また特許文献１は、主としてＥＰＡのホスホリパーゼＡ２阻害作用によると述べられており、いずれもＥＰＡと神経幹細胞に対する作用を示すものではない。【００１０】
また、若・加齢のラットにＤＨＡを長期服用させ、いずれのラットも記憶学習能が亢進したことが示されているが、これも、ＤＨＡの抗酸化作用によるものと考察されており、ＤＨＡの神経幹細胞への作用を示すものではない。（非特許文献６）【００１１】
特許文献２ではＥＰＡ及びＤＨＡが繊維芽細胞樹立株でＮＧＦ（nerve growth factor）産生増強活性を示すことが記載されているが、ＮＧＦは、神経幹細胞の分化に関与する因子ではなく、また、ＥＰＡ及びＤＨＡの神経幹細胞への作用を検討したものでもない。【００１２】
一方、従来より、リノール酸、オレイン酸、コレステロールなどの脂質がＦＢＳ濃度の低減およびＦＢＳ代替として、各種細胞の培養時に必要な添加物として使用されている。しかし脂肪酸が神経分化を促進するとの報告はない。【００１３】
このようにＥＰＡ、ＤＨＡはもとより、不飽和脂肪酸の神経幹細胞に対する知見は、報告されていない。本明細書において不飽和脂肪酸は、不飽和脂肪酸の遊離体の他、その誘導体も含む場合がある。
【非特許文献１】岡野栄之、蛋白質  核酸  酵素  2063-2077、Vol.45 No.13（2000）
【非特許文献２】Yasushi Takagi等 The Journal of Clinical Investigation 102-109 Vol.15 No.1 (2005)
【非特許文献３】中島欽一、蛋白質  核酸  酵素  718-726、Vol.49 No.6（2004）
【非特許文献４】岡野栄之  実験医学  Vol.20 No.9 1276-1302（2002）
【非特許文献５】大塚美恵子、植木彰Dementia Japan Vol.15 No.1 April 21-29（2001）「痴呆患者の食事因子の解析およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）による認知機能改善効果の検討」
【非特許文献６】新技術情報提供サービス（http://www.s-iri.pref.shizuoka.jp/tech/top.htm）  食品・バイオ分野H14-No.39
【特許文献１】特表2002-535355号公報
【特許文献２】特開平８-143454号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は神経分化促進剤を提供すること、およびそれを使用する神経幹細胞をはじめとする未分化な神経系細胞の分化促進方法を提供することである。また、特に移植・再生医療分野において有用な再生医療用組成物を提供することである。また、神経幹細胞をはじめとする未分化な神経系細胞の培養において、その分化を促進する作用を有する培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸およびω-６系不飽和脂肪酸、とりわけ、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびＤＰＡが神経幹細胞の分化促進作用を有することを発見し、発明として完成させたものである。【００１６】
すなわち、本発明の第一の態様は、炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸、ω-６系不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つ、好ましくはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する神経分化促進剤を提供する。
本発明の第二の態様は、本発明の神経分化促進剤を添加する工程を含む未分化の神経系細胞の分化を促進する方法を提供する。
本発明の第三の態様は神経分化促進剤を添加して得られる培養物を主要構成とする再生医療用組成物を提供する。
本発明の第四の態様は本発明の神経分化促進剤を含有する未分化な神経幹細胞のための培地を提供する。
本発明の第五の態様は第一の態様の神経分化促進剤を用いて、神経系細胞を分化させる治療方法を提供する。
本発明の第六の態様は、神経分化促進剤を製造するための、炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸、ω-６系不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の神経分化促進剤は、神経幹細胞の分化を促進し、分化した細胞数の増加、神経細胞への分化の場合には、神経突起の伸長を促進する作用を有する。本発明の神経分化促進剤は、神経幹細胞がその分化に要する期間、継続して分化促進効果を有しており、本発明は、安全に、かつ、短期間に、神経幹細胞および前駆細胞の分化を誘導する、再生医療における新たな手段として有用であり、種々の神経疾患の治療及び／又は予防、神経の移植・再生医療分野において使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＥＰＡまたはＤＨＡ添加後４日目の図面代用写真である（比較としてコントロールを示した）。
【図２】ＥＰＡまたはＤＨＡ添加後７日目の図面代用写真である（比較としてコントロールを示した）。
【図３】ＥＰＡまたはＤＨＡ添加後７日目における１cm2 あたりの神経細胞数を示すグラフである。
【図４】ＥＰＡまたはＤＨＡ添加後７日目における全細胞数に対する分化した神経細胞数の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明における主な用語の意味内容を解説する。【００２０】
「神経幹細胞」とは増殖し継代を繰り返すことができる（自己複製能）と同時に、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトという中枢系を構成する３種類の細胞を作り出すことができる（多分化能）未分化な細胞である。主な特異マーカーはネスチン、Musashi1等である。（引用文献  蛋白質  核酸  酵素  Vol.45 No.13，2066（2000））【００２１】
「神経細胞（ニューロン）」とは、神経突起および軸索を伸長し、次のニューロンとの間にシナプスを形成し、神経伝達物質を分泌するものをいう。主な特異マーカーは、神経細胞はβ-tubulin等であり、幼若神経細胞の場合はTuj1等がある。
「アストロサイト」とは神経細胞の周囲にあり、神経細胞に栄養を送る細胞である。主な特異マーカーはＧＦＡＰ（グリア細胞線維性産生蛋白質）等がある。
「オリゴデンドロサイト」とはニューロンの軸索に巻きついて跳躍伝導の助けとなる細胞である。主な特異マーカーはGalC(ガラクトセレプロシド)等がある。【００２２】
「前駆細胞」とは、ある分化細胞の系譜に入り、限られた回数の分裂の後に分化を遂げるように運命づけられた細胞をいう。神経幹細胞から神経前駆細胞（神経細胞を作り出す）、グリア前駆細胞（アストロサイトとオリゴデンドロサイトを作り出す）の二種の前駆細胞が生じるといわれている。
「未分化な神経系細胞」とは、神経幹細胞、前駆細胞（神経前駆細胞、グリア前駆細胞）およびそれらの混合物である。【００２３】
本発明において、「神経幹細胞の分化を促進する」とは、神経幹細胞から分化した細胞である、神経細胞、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト、またはそれらの幼若細胞、前駆細胞のいずれかの細胞数を増加させることをいう。これらの分化した細胞は、形態学的に確認できるもののほか、前述の特異マーカーによって識別できる細胞、神経細胞への分化の場合には、神経突起を伸長させることを含む。また、さらに特定の方向に分化した細胞（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、運動ニューロン等）の増加として確認される場合も含まれる。【００２４】
「不飽和脂肪酸」とは二重結合をもつ脂肪酸をいう。
ω-３系不飽和脂肪酸とは、構造式のメチル基側から数えて３番目の炭素の位置に最初の二重結合のあるものをいう。炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸とは、具体的には、α-リノレン酸（炭素数：不飽和度）（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、ＥＰＡ（２０：５）、ＤＰＡ（２２：５）、ＤＨＡ（２２：６）が挙げられる。ω-６系不飽和脂肪酸とは、構造式のメチル基側から数えて６番目の炭素の位置に最初の二重結合のあるものをいう。炭素数が１８ないし２２のω-６系不飽和脂肪酸とは、具体的には、リノール酸（１８：２）、γ-リノレン酸（１８：３）、ジホモ-γ-リノレン酸（２０：３）、アラキドン酸（２０：４）があげられる。【００２５】
「神経の再生」とは、損傷した神経の機能を回復させることをいう。具体的には、神経幹細胞から神経細胞（ニューロン）やグリア細胞へと分化すること、機能に必要なタンパクや神経伝達物質を産生すること、軸索、シナプスを形成すること、などの段階を経て、最終的に損傷部位が修復され、神経を介した情報伝達が回復されることをいう。【００２６】
「神経の再生医療」とは、機能障害や機能不全に陥った神経組織に対して、その機能の再生を図るものをいう。例えば、障害・脱落した組織、細胞部分に外来性に神経幹細胞や神経組織を補充、移植する方法、若しくは患者の神経幹細胞や前駆細胞に刺激を与えて、神経細胞やグリア細胞へ分化・増殖させる方法がある。【００２７】
本発明の第一の態様の神経分化促進剤について説明する。
本発明の神経分化促進剤は、有効成分として、不飽和脂肪酸、好ましくは、炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸、炭素数が１８ないし２２のω-６系不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つ、好ましくは、炭素数が１８ないし２２のω-３系不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つ、さらに好ましくは、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つ、とりわけ好ましくは、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、神経幹細胞の分化を促進する作用を有する組成物である。
少なくとも１つとは、上記不飽和脂肪酸の単品であることはもちろん、これら２種以上の混合物であってもよい。
本発明の神経分化促進剤は神経幹細胞の分化を促進し、分化した細胞数の増加、神経細胞への分化の場合には、神経突起の伸長を促進する作用を有する。【００２８】
本発明の神経分化促進剤は、上記不飽和脂肪酸を、遊離脂肪酸として、またはその誘導体の形で含む。不飽和脂肪酸の誘導体には、薬理学上許容し得るエステル、塩、グリセリド、リン脂質、アミド、または任意の他の薬理学上許容される形態が包含される。誘導体の中でもエステル、塩の形で用いるのが望ましい。【００２９】
本発明の薬理学的に許容される不飽和脂肪酸のエステルとは、目的とする不飽和脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル等の化合物があげられ、これらに限定されないが、好ましくはエチルエステルである。
薬理学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基またはベンジルアミン塩、ジエチルアミン塩等の有機塩基あるいはアルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸等の塩基性アミン酸との薬理学上許容しうる塩等とすることができる。
また、目的の不飽和脂肪酸とグリセリンのエステルである脂肪酸グリセリドとしてもよい。脂肪酸グリセリドは、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、目的の不飽和脂肪酸基以外の脂肪酸で置換された混合グリセリド、およびこれらの混合物を含む。
さらに、目的の不飽和脂肪酸をグリセロリン脂質、アミドなどの形にしてもよい。【００３０】
本発明の有効成分である不飽和脂肪酸は天然物からの抽出、精製または化学合成など、公知の方法によって調製することができる。市販品の他、魚油やＥＰＡ産生菌、ＤＨＡ産生菌、及びそれらの培養液を公知の方法、例えば、連続式蒸留法、尿素付加法、液体クロマトグラフィー法、超臨界流体クロマトグラフィー法等あるいはこれらの組み合わせで精製して得ることができる。【００３１】
本発明の有効成分である不飽和脂肪酸の純度は特に規定されず、魚油からの精製の過程で得られる粗精製物であってもよいが、全脂肪酸質量に対して好ましくは２０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上、さらに好ましくは８５質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上、とりわけ好ましくは他の脂肪酸成分を実質的に含まない、不飽和脂肪酸のみである。本発明の有効成分としては、ω３多価不飽和脂肪酸、特にＥＰＡおよび／またはＤＨＡが好ましく、誘導体としては、ＥＰＡ−Ｅ（エイコサペンタエン酸エチルエステル）および／またはＤＨＡ−Ｅ（ドコサヘキサエン酸エチルエステル）が更に好ましい。
ＥＰＡであれば、既存の市販品、例えば、純度約９９％のエイコサペンタエン酸（遊離体）（ナカライテスク社製、sigma社製、）、純度約９０％のエイコサペンタエン酸ナトリウム塩（sigma社製）、および純度約９０％のエイコサペンタエン酸エチルエステル（東京化成工業社製）等を用いることができる。なお、閉塞性動脈硬化症および高脂血症治療薬としてエパデールおよびエパデールＳ（いずれも持田製薬社製）の商品名で高純度ＥＰＡ−Ｅ製剤が国内で市販されている。
ＤＨＡであれば、純度９８％以上のドコサヘキサエン酸（遊離体）（Cayman Chemical社製）、純度約９５％のドコサヘキサエン酸エチルエステル（東京化成工業社製）等を用いることができる。
また、ＥＰＡ−Ｅを約４６重量％およびＤＨＡ−Ｅを約３８重量％含有する軟質カプセル剤（オマコール、Ｏｍａｃｏｒ（ロスプロダクツ、Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））が高ＴＧ血症治療薬として既にアメリカ等で市販されている。これらを入手して使用することもできる。【００３２】
本発明の神経分化促進剤は、必要に応じて細胞に影響を与える因子や、その他の物質を含有することができる。【００３３】
細胞に影響を与える因子とは、神経幹細胞の分化誘導因子や、神経幹細胞の自己増殖を阻害する因子、分化した神経細胞の増殖因子などである。例えばplatelet growth factor(ＰＤＧＦ)、Insulin like growth factor(ＩＧＦ-Ｉ)、brain derived neurotrophic factor(ＢＤＮＦ)、レチノイン酸（ＲＡ）とフォルスコリン（ＦＳＫ）の共添加、transforming growth factorβ(ＴＧＦβ)、ＮＧＦ、ciliary neurotrophic factor (ＣＮＴＦ)、ＮＴ-3、ＮＴ-4/5等があげられるが、これに限定されない。【００３４】
本発明の有効成分である不飽和脂肪酸は脂溶性であり、そのままでは培養液になじみにくい。本発明の神経分化促進剤は脂肪酸を培地になじみやすくする作用を有する化合物を含有してもよい。これを用いることで、神経分化促進剤が神経幹細胞に作用することが容易となり、効果が発揮しやすくなる。当該作用を有する化合物として、例えば、アルブミン、フォスファチジルコリンのようなリン脂質、リポソーム、リポタンパク質、界面活性剤（例えばTween80）等があげられ、好ましくは脂肪酸フリーのアルブミンである。【００３５】
本発明の有効成分である不飽和脂肪酸は、高度に不飽和であるため、本発明の分化促進剤は抗酸化剤を不飽和脂肪酸の酸化を抑制する有効量で含有することができる。抗酸化剤としては、例えばブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、プロピルガレート、没食子酸、医薬として許容されうるキノンおよびα-トコフェロールを使用することができる。【００３６】
本発明の神経分化促進剤は、これらの他にも、生理学的に許容されうる担体、または媒体の類、各種添加剤を適宜選択組み合わせて含ませることができ、例えば賦形剤、結合剤、着色剤、滅菌水、植物油、無機性有機溶媒、無害性溶解補助剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール）、乳化剤、懸濁化剤（例えばTween80、アラビアゴム溶液）、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、無痛化剤、などを必要に応じて含ませることができる。【００３７】
本発明の神経分化促進剤は、使用方法に応じて適宜、形態を変えて提供される。例えば、培養液に添加されるための剤、移植とともに投与されるための剤、注射剤や経口剤等、その他製剤学的に許容される剤形とすることができる。製剤の剤形としては、液剤、乳濁剤、懸濁剤、非水性、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、経口用液体製剤、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）等があるが、これらに限定されない。また、神経幹細胞の分化を一層効果的に促進するため、当業者に公知の方法を用いた徐放製剤とすることもできる。【００３８】
本発明の神経分化促進剤は、神経幹細胞をはじめとする未分化な神経系細胞の分化を促進する目的で、様々な分野で用いられるが、好ましくは再生医療における使用である。
ここで、神経の再生医療とは、用語の解説に記載したとおりであるが、本発明の神経分化促進剤は、単独で、または、上記の細胞に影響を与える因子と併用して、さらにその他の治療薬、治療方法と併用して使用でき、神経系の移植・再生医療を行う際の一部分としての役割を担うことができる。
本発明の神経分化促進剤は、例えば、神経の再生医療において移植に用いられる好適な分化の状態の神経系細胞を調製する際に使用される。移植に適した特定の細胞を得る一連の過程の中の、ある一段階で使用される場合であってもよい。また、未分化な神経系細胞の分化を目的とする治療において、生体に対して直接に投与することができる。
本発明の具体的な使用方法については後述する。【００３９】
本発明の分化促進剤は、神経組織、細胞の脱落・障害が原因となる神経系疾患、脳血管性あるいは老年性の認知症／認知障害、もしくはアルツハイマー病などにおける神経退行性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ロウ・ゲーリッヒ病）、パーキンソン病など種々の脳血管障害もしくは神経性疾患、あるいは外傷による脊髄損傷等を治療する目的で使用することができる。本発明の神経分化促進剤は、ヒトはもちろん、その他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、豚など）の上記疾患に適用することもできる。【００４０】
本発明の神経分化促進剤は、ヒト、サル等あらゆる動物の神経幹細胞に対して適用でき、その由来も限定されない、すなわち、これら動物の胎児や生体脳から分離・培養したものであっても、ＥＳ細胞からの分化誘導、神経系以外の幹細胞から分化転換した神経幹細胞であってもよく、公知の神経幹細胞の調製方法（例えば、治療学  vol.38 no.10,2004  参照)で調製されたいかなる神経幹細胞に対しても使用することができる。本発明の神経分化促進剤は、少なくとも、神経幹細胞から神経細胞への分化を促進する目的で使用することができる。
神経幹細胞の調製方法の例としては、neurosphere法[Journal of Neuroscience, Vol 12 4565-4574]があげられる。neurosphere法とは、１９９２年にReynoldsらによって開発された方法であり、中枢神経系から採取した細胞を、ＥＧＦ（上皮増殖因子）やbＦＧＦ（塩基性線維芽増殖因子）等、増殖因子の存在下、無血清培地で培養する方法である。細胞中に含まれる神経幹細胞が増殖因子に反応して増殖し、細胞塊（neurosphere）を形成するので、その細胞塊を分離して、培養する。【００４１】
以下に、本発明第二の態様の未分化な神経系細胞の分化を促進する方法を説明する。【００４２】
本発明の方法は、本発明の神経分化促進剤を添加する工程を含む、未分化な神経系細胞の分化を促進するためものである。未分化な神経系細胞とは、前述の用語の解説に示したとおりであるが、特に好ましくは神経幹細胞である。未分化な神経系細胞は、公知の方法で調製する。本発明の神経分化促進剤を添加する工程では、これらの未分化な神経系細胞の培養液中に神経分化促進剤を適当な量添加する、又は、神経分化促進剤を含有する培養液中にこれらの細胞を添加する。神経分化促進剤は、直接、あるいは適宜希釈剤等により調製した後に添加する。この時、これらの未分化な細胞の増殖因子を除去したり、それらを阻害する因子を加える等によって、これらの細胞が分化できる条件を整える。分化できる条件を整えた後に当該分化促進剤を添加することによって、分化が開始される。分化誘導開始後、当該神経分化促進剤を含有する培地（分化誘導用培地）で、適当な期間培養する。【００４３】
神経幹細胞及び前駆細胞の培養密度は、これらの細胞が増殖・分化しうる細胞密度であれば特に限定されないが、１×１０２〜１×１０９cell/cm２、好ましくは１×１０３〜１×１０７cell/cm2、また好ましくは、１×１０４〜１×１０６cell/cm2である。【００４４】
培養は接着因子をコーティングした培養皿を使用する等、公知の方法で行う。分化誘導用培地は、未分化な神経系細胞が分化しうる培地であれば特に限定されず、公知の細胞培養用合成培地（例えばDulbecco変法Eagle培地（ＤＭＥＭ）等）を用いて、当該神経分化促進剤の他、必要であればサプリメント、インスリン等のホルモン、トランスフェリン等の担体、メルカプトエタノール等の抗酸化剤、微量元素等、適宜添加してもよい。また、これらの細胞の分化を阻害しない範囲で、当該神経分化促進剤と同時に、もしくは前後して、細胞に影響を与える他の因子を加えてもよい。培地は２日毎程度で交換を行うのが望ましい。温度やＣＯ２濃度は、細胞培養での一般的な条件に従えばよく、通常、３７℃、５％ＣＯ２である。【００４５】
前述のように不飽和脂肪酸は脂溶性であり、そのままでは培養液になじみにくい。したがって、本発明の神経分化促進剤が、脂肪酸を培地になじみやすくする作用を有する化合物をあらかじめ含有していない場合は、培地には脂肪酸フリーのアルブミンやフォスファチジルコリンのようなリン脂質、リポソーム、リポタンパク質、界面活性剤（例えばTween80）等が添加された状態で、当該神経分化促進剤を添加するか、当該神経分化促進剤をあらかじめこれらの化合物と混合させてから、培地に添加することが好ましい。これら化合物の添加量は、細胞に対して毒性を示さない量であれば特に限定されないが、アルブミンであれば、好ましくは、終濃度で、０．０５〜０．５％、好ましくは、０．１〜０．３％である。【００４６】
分化誘導の期間は、特に限定されず、これらの細胞の分化の状況に応じて、適当な日数培養する。神経細胞であれば、培養日数が増えるに従い神経突起が伸長するため、細胞が希望する用途に適した段階まで分化したら、分化誘導を中止する。例えば、神経細胞であれば、２日〜７日の培養で神経突起の伸長が見られる。また、Ｔｕｊ1やＧＦＡＰなどの神経系細胞の分化マーカーを検出し、それを指標に分化の状況を判断し、培養日数を決定してもよい。【００４７】
本発明の神経分化促進剤を、培地中に添加する場合、神経分化促進剤の有効成分としての不飽和脂肪酸の濃度は0.1〜100μＭ、好ましくは0.1〜20μＭ、とりわけ好ましくは、1〜15μＭである。【００４８】
本発明の方法は、in vitroで実施されることが好ましいが、in vivoで実施されてもよい。例えば、脳血管障害やアルツハイマー、パーキンソン病の患者の脳や脊髄等で神経系の組織や細胞の脱落・障害を生じている部位に、神経幹細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞をはじめとする未分化の細胞を含む移植片の移植と同時に、若しくは前後して神経分化促進剤を投与する。神経分化促進剤の投与形態としては特に限定されないが、注入または持続注入（浸透圧ポンプを用いてもよい）、あるいは、神経分化促進剤を適当な器材にしみこませて、移植片とともに移植してもよい。【００４９】
上記の投与または移植が行われる位置は、神経系の組織や細胞の脱落・障害を生じている部位及び/又はこのような部位の近くであることが望ましいが、神経幹細胞が、自ら、脳内で、損傷を受けた部位に伸展していく例も報告されており、必ずしも、上記、障害を生じている部位近傍に限定されない。内在性の未分化な神経系細胞の増殖・分化を目的として、本発明の神経分化促進剤をこれらの未分化な細胞またはその近傍に直接投与することもできる。【００５０】
本発明の分化促進剤は、上述のように、未分化な神経系細胞の分化を目的とする治療において、投与方法を適宜選択して投与することができる。好ましくは、未分化な細胞周囲の不飽和脂肪酸濃度を、よりコントロールしやすい局所的な使用であり、また好ましくは、神経再生に好適な条件（細胞組成等）を整えることが容易な細胞の移植を伴った使用であり、とりわけ好ましくは、細胞の移植を伴った局所的な使用である。【００５１】
本発明の神経分化促進剤を脳や脊髄に直接投与する場合には、未分化な神経系細胞が分化するまでの間、これらの細胞部位の不飽和脂肪酸濃度が0.1〜100μＭ、好ましくは0.1〜20μM、とりわけ好ましくは1〜15μMに維持されることが望ましい。経口投与する場合には不飽和脂肪酸として0.1〜9ｇ／日、好ましくは0.5〜6ｇ／日、さらに好ましくは1〜3ｇ／日を3回に分けて投与する。必要に応じて全量を1回あるいは数回に分けて投与してもよい。静脈あるいは動脈内投与の場合は、不飽和脂肪酸として1〜200ｍｇ、好ましくは5〜100ｍｇ、さらに好ましくは10〜50ｍｇを1回あるいは数回に分けて投与するが、必要に応じて点滴等を用いて数時間から数日にかけて持続的に投与することもできる。
回数や使用量は、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。【００５２】
次に、本発明第三の態様の再生医療用組成物について説明する。
本発明の再生医療用組成物とは、神経幹細胞に本発明の神経分化促進剤を添加して得られる培養物を主要構成とする組成物である。ここでいう培養物とは、すなわち、神経幹細胞と本発明の神経分化促進剤、神経幹細胞に当該神経分化促進剤を添加して任意の期間培養して得られる細胞と当該神経分化促進剤、もしくは神経幹細胞に当該神経分化促進剤を添加して任意の期間培養して得られる培養混合物のことであり、本発明の組成物は、これらのいずれか１つ以上を含有する、再生医療のための移植用細胞を含む細胞組成物である。本発明の再生医療用組成物は、上記培養物の他、後述する任意成分を含有することで、さらに移植に適した組成物とすることができる。【００５３】
本発明の再生医療用組成物に含まれる細胞は、動物種およびその由来は特に限定されないが、好ましくは移植される動物と同種由来の細胞である。
神経幹細胞は前記のとおり、公知の方法で調製して得ることができる。
神経幹細胞に本発明の神経分化促進剤を添加して培養する方法は、前述したとおりである。培養期間は特に限定されない。培養した結果物から、形態学的変化や、細胞表面に発現したマーカーを指標に目的とする細胞を１種あるいは複数種選択する。これらの細胞としては、具体的には、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、またさらに特定の方向に分化した細胞（例えばドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、運動ニューロン等）からなる群から選ばれる１つ、もしくは、それらの混合物が例示される。選択される細胞として好ましくは、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞である。
培養混合物は、神経幹細胞に本発明の神経分化促進剤を添加して任意の期間培養して得られる結果物であり、細胞と培養液とからなる。ここに含まれる細胞は上述に例示された細胞のいずれか１つ、またはそれらの混合物であり、当初の神経幹細胞が存在していてもよい。培養液中には、本発明の神経分化促進剤が存在している。【００５４】
本発明の再生医療用組成物は、神経幹細胞、または神経幹細胞に本発明の神経分化促進剤を添加して任意の期間培養して得られる細胞に本発明の神経分化促進剤を添加する、またはこれらの細胞を適当な溶媒に懸濁し、そこに本発明の神経分化促進剤を添加する、本発明の神経分化促進剤を含む溶媒を入れた培養皿等にこれらの細胞を付着させる、もしくは神経分化促進剤を含ませた器材にこれらの細胞を付着させること等によって調製することができる。また、神経幹細胞を神経分化促進剤を含む培地で培養した結果の培養混合物そのものであってもよい。本発明の神経分化促進剤は、細胞部位の不飽和脂肪酸濃度として、0.1〜100μＭ、好ましくは0.1〜20μＭ、とりわけ好ましくは1〜15μＭとなるように添加される。また、好ましくは、上記の細胞や、培養混合物に、目的外の細胞（例えば癌細胞など）が存在しないことを、腫瘍マーカーの発現や形態学的特徴を指標に確認し、必要があれば、それらを除去して使用する。【００５５】
溶媒は神経系細胞及び生体環境の両方と生理的に適合するものが望ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などがあげられる。また、緩衝系ならびにアミノ酸、糖、ビタミンの栄養素からなる基本培地（ＢＭ）、ＤＭＥＭ（Dulbecco変法Eagle培地）、神経培養用基礎培地（neurobasal medium）、ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solution）等であってもよく、必要に応じて、細胞に影響を与える因子（例えばＢＤＮＦやＮＧＦ）、ビタミン、細胞培養用サプリメント（例えばB２７）、ホルモン（例えばインスリン、プロゲステロン）、担体（例えばトランスフェリン、血清アルブミン、リポタンパク質）、抗酸化剤（例えばメルカプトエタノール、Ｓｅ）、抗生物質（例えばペニシリン/ストレプトマイシン）、上記の細胞とともに用いることで一層の神経再生促進効果が期待できる他の細胞（例えば、別途調製した神経系の細胞）やその培養混合物等を含んでもよい。【００５６】
本発明の再生医療用組成物は、いかなる形で提供されるものであってもよい。例えば、細胞を付着させたプレートや、細胞を溶媒に懸濁したもの、もしくは培養混合物、細胞を付着させた器材やゲル（好ましくは生体分解性の器材やゲル）、カプセル、体内埋め込み型のポンプ等徐放化に適した形等、任意の形で提供される。
また、当該組成物は、後述の、賦形剤、希釈剤、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、防腐剤、担体等を含んだ形で提供されてもよい。【００５７】
本発明の再生医療用組成物は、公知の方法に従って、脳や脊髄をはじめ、神経の損傷や脱落の生じている部位やその近傍に移植、注入して用いることができ、手術的定位導入、カテーテル等による病巣内導入等を含む種々の経路を通じて投与できる。脳や脊髄内に移植、注入する方法として、具体的には、ダグラスコンジオルカの方法（Douglas Kondziolka et al., Neurology 55: 556-569, 2000）を用いることができる。すなわち、患者の頭蓋骨を切開して直径が約１ｃｍの開口部を設け、神経再生用組成物を３ヶ所ぐらいに注入する。この際、注入は長い針付きの注射器と、定位フレーム（stereotactic frame）を用いて行われる。【００５８】
１回投与量は、特に限定されず、治療する疾患、患者の症状、年齢、性別、投与経路等を考慮して決定することができるが、本発明の再生医療用組成物に含まれる細胞の数として、おおよそ１×１０２〜１×１０９細胞の範囲が好ましい。【００５９】
本発明の再生医療用組成物は、細胞の付着、生存および機能を向上させるため、さらに、通常の方法に従って、分化誘導された細胞や培養混合物を薬剤学的に許容可能な賦形剤、または担体と混合するか、薬剤学的に許容可能な希釈剤で希釈して用いることもできる。
担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン酸、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムミネラル油、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、キトサン、エラスチン、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンなどを挙げることができる。
その他、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、防腐剤などとともに使用することもできる。【００６０】
再生医療用組成物は、単独で、また、細胞に影響を与える因子と併用して用いることができ、併用する場合には、これらを時間差をおいて別々に、あるいは同時に投与することができる。本発明の再生医療用組成物は、ヒトはもちろん、その他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、豚など）の上記疾患に適用することもできる。【００６１】
次に、本発明第四の態様の培地について説明する。
本発明の培地は、本発明の神経分化促進剤を含有し、神経系細胞が成育可能な組成からなる培地であって、神経幹細胞の分化を促進し、分化した細胞数の増加、神経細胞への分化の場合には神経突起の伸長を促進する作用を有する。本発明の培地は、神経幹細胞に限らず、未分化な神経系細胞の分化を促進するためにも用いられる。本発明の培地は、神経系細胞と生理的に適合する任意の培地を基礎培地として、これに、本発明の神経分化促進剤を任意の量添加することにより調製することができる。基礎培地としては、緩衝系ならびにアミノ酸、糖、ビタミンの栄養素からなる基本培地（ＢＭ）や公知の細胞培養用合成培地、例えばDulbecco変法Eagle培地（ＤＭＥＭ）、Eagle's Minimum Essential Medium（ＥＭＥＭ）、Iscove変法Dulbecco培地（ＩＭＤＭ）、神経培養用基礎培地（neurobasal medium）等を用いることができる。本発明の培地は、再生医療の用途に用いる場合には、特に、無菌で、ウイルスフリー、かつ生体環境にも生理的に適合する培地が望ましい。
その他、上述の細胞に影響を与える因子、ビタミン、細胞培養用サプリメント（例えばB２７）、ホルモン（例えばインスリン、プロゲステロン）、担体（例えばトランスフェリン、血清アルブミン、リポタンパク質）、抗酸化剤（例えばメルカプトエタノール、Ｓｅ）、抗生物質（例えばペニシリン/ストレプトマイシン）等、必要に応じて含むことができる。
神経分化促進剤が脂肪酸を培地になじみやすくする作用を持つ化合物を含有していない場合には、本発明の培地は、脂肪酸フリーのアルブミン、フォスファチジルコリンのようなリン脂質、リポソーム、リポタンパク質、又は界面活性剤（例えばTween80）等を含むことが好ましい。【００６２】
本発明の培地は、そのまま細胞の培養に使用するものであっても、適当な緩衝液で希釈して使用するものであってもよい。培地中の神経分化促進剤の有効成分である不飽和脂肪酸の濃度は、神経幹細胞の分化が促進される濃度であれば特に限定されないが、培養時に0.1〜100μＭ、好ましくは0.1〜20μＭ、さらに好ましくは、1〜15μＭとなる濃度で含まれていることが好ましい。【００６３】
本発明の第五の態様の、本発明の神経分化促進剤を用いて神経系細胞を分化させる治療方法を説明する。本発明の治療方法は、本発明の第二の態様の、未分化な神経系細胞の分化を促進する方法を、その治療の少なくとも１ステップとして含むものである。本発明の神経分化促進剤の使用形態、投与経路、投与方法は、本発明の第二の態様に記載したとおりである。神経系の組織や細胞の脱落・障害を生じている患者に対して、神経の再生を目的として施される。特に治療に適する疾患は既に記載のとおりである。本発明の治療方法を複数組み合わせて実施してもよく、また、他の治療方法と組み合わせても実施してもよい。【００６４】
以下に実験例、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。本発明はこれらに限定されるものではない。【００６５】
実験例１  ＥＰＡ及びＤＨＡのラットの神経幹細胞における分化促進作用
（１）神経幹細胞の調製
異なる４匹の親ラットからＥ１５胎児（embryonic day15）の終脳を単離し、neurosphere法（引用文献：Journal of Neuroscience , Vol 12 4565-4574）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。培養液はｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）（R&D SYSTEM 233-FB）20ng/mL及びheparin(2μg/mL)を含むＮ２メディウムを使用した。Ｎ２メディウムは、最終組成がN-2 supplement(100×）(Invitrogen)、0.6％glucose、0.11％sodium bicarbonate solution、２mM L-Glutamine、５mM HEPES buffer solution (Invitrogen)、25μg/mL insulinとなるよう、4×DMEM/F12（1：1）に、各種試薬を加えて滅菌水で調製した。形成されたneurosphereを回収してピペッティングで再びsingle cellの状態にして、これを神経幹細胞として以下の実験に用いた。【００６６】
（２）分化誘導
２４ウェルプラスチックプレート（培養面積２cm２）に１５μg/mLポリ-Ｌ-オルニチン溶液（Sigma.）を加え、３７℃で一晩放置した後、滅菌水で3回洗浄してコーティングを行った。プレートを洗浄後、各ウェルに４５０μLのＮ２メディウム、１００μＭ ＥＰＡ又はＤＨＡ、１％脂肪酸-フリーウシ血清アルブミン（fatty acid-free bovine serum albumin、以下FA-free BSAと略す）(CALBIOCHEM）を含むＮ２メディウム５０μLを添加し、３７℃でインキュベートした。コントロール群には0.1% FA-free BSAのみを含有するＮ２メディウムを添加した。この操作を再度行った。
一方、（１）で調製した神経幹細胞をＮ２メディウムで懸濁し、前述の各ウェルに２×１０５cellsとなるよう添加した。３７℃、５％ＣＯ２存在下培養して神経幹細胞の分化を誘導し、４日目及び７日目に測定を行った。なお、培地交換は２，４日目に行った。【００６７】
（３）免疫組織化学染色
分化誘導開始後4日目と7日目の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＴＢＳで10分間３回洗浄した後、３％正常ヤギ血清でブロッキングを行った。Mouse anti-Tuj1(R&D SYSTEM)を一次抗体として４℃で一晩放置した。一次抗体をＴＢＳで10分間2回洗浄後、FITC conjugated goat anti-mouse IgG (Southern Bio.)を二次抗体として、１時間室温処理した。二次抗体をＴＢＳで10分間2回洗浄後、２μg/mLプロピジウムイオダイド(ＰＩ)(同仁化学)、０．２５％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳで30分間室温処理し、その後ＴＢＳで10分間2回洗浄し、核染色を行った。【００６８】
（４）データ解析
各ウェルあたり７箇所のランダムフィールドをサンプリングして共焦点レーザースキャン顕微鏡（Flow view FV300 オリンパス）で観察し、画像をNIH image software又はAdobe Photoshop上で解析した。各フィールドあたりのＰＩ陽性細胞数とＴｕｊ１陽性細胞数を計測し、7箇所の平均値を当該ウェルのデータとした。ＰＩ陽性細胞数は全細胞数を、Ｔｕｊ１陽性細胞数は神経細胞に分化した細胞数を表す。
統計的解析は、One-way ANOVA及びBonfferoni post-hoc analysisにて行った。【００６９】
（５）結果
ＥＰＡまたはＤＨＡ添加群、コントロール群の、４日目と７日目の写真を図１、２として示した。図１、２から明らかなように、コントロール群では、神経細胞に分化している細胞はわずかであったが、ＥＰＡ添加群、ＤＨＡ添加群では分化している細胞数の増加、神経突起の伸長が認められ、ＥＰＡ,ＤＨＡの神経幹細胞の分化促進作用が確認された。
図３はＥＰＡまたはＤＨＡ添加後７日目における１cm2 あたりの神経細胞数を示す。ＥＰＡ、ＤＨＡともにコントロールと比較し、神経細胞に分化している細胞数が有意に増加している。
図４はＥＰＡまたはＤＨＡ添加後７日目における全細胞数に対する分化した神経細胞数の割合を示す。ＥＰＡ、ＤＨＡともにコントロールと比較し、神経細胞に分化している細胞の割合が有意に増加している。【００７０】
以上よりＥＰＡおよびＤＨＡは神経幹細胞の分化を促進する作用、神経突起の伸長を促進する作用を有することが確認された。上記の結果は、炭素数１８−２２のω-３およびω-６不飽和脂肪酸の神経幹細胞に対する作用を代表する結果と考えられる。
細胞に作用する因子の中には、ごく限られた時期の細胞にのみ作用し、その後は、マイナスの作用を示す場合もあるが、上記実験では、４日目に引き続き７日目でも神経分化が認められたことから、ＥＰＡおよびＤＨＡによる分化促進効果は、これらの期間において継続していたことが分かる。このことから、これら不飽和脂肪酸は、これらの期間の細胞の分化を阻害することはなく、神経幹細胞のみならず、前駆細胞に対しても分化促進効果を示すものと考察された。したがって、再生医療等に使用した場合でも、一度添加したこれら不飽和脂肪酸を除くことなく、神経細胞やグリア細胞等の細胞への分化が誘導できるものと示唆された。【００７１】
参考例１  ＤＨＡの神経幹細胞の増殖活性に与える影響
実験例１と同様に、神経幹細胞をＤＨＡ群とコントロール（ＤＨＡ無添加）群に分けて、分化誘導の培養条件下、10μＭ 5-bromo-2’-droxyuridine (BrdU ; Sigma)を添加して24時間培養した。その後、細胞を２Ｎ HClで37℃10分間処理し、0.1Ｍ borate buffer (Na2B4O7, PH8.5)で5分間処理した。マウス抗-BrdU抗体(1:1000 Chemicon)で処理した後、ＦＩＴＣ標識2次抗体で処理した。
各ウェルあたり７箇所のランダムフィールドをサンプリングして、BrdU陽性細胞数をカウントし、全細胞数に対するBrdU陽性細胞数の割合を算出した。全細胞数はＰＩ染色によりカウントした。統計的解析はstudent’s t-testで評価した。
その結果、ＤＨＡ群におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合はコントロール群と比較して低かった。（コントロール群：23.6±2.2%, n=6; ＤＨＡ群：16.3±1.0%, n=6; P=0.02）両群の間で全細胞数に差はなかったことから、ＤＨＡは、神経幹細胞の分化の初期段階において、神経幹細胞の増殖を抑制する作用を有すると考えられ、これは、EPAおよびDHAが神経幹細胞の分化を誘導する作用を示す実験例１の結果と矛盾しなかった。【００７２】
参考例２  ＤＨＡが神経幹細胞および神経幹細胞より分化した細胞のアポトーシスに及ぼす影響
実験１と同様に、神経幹細胞をＤＨＡ群とコントロール（ＤＨＡ無添加）群に分けて、分化誘導の培養条件下で7日間培養した後、ＰＩ染色によりピクノティックセルを評価した。ピクノティックセルは、凝縮した核、収縮した細胞という特徴的な形態と、弱いＰＩ染色像を示した。
これらのピクノティックセルにアポトーシスが起こっていることをＴＵＮＥＬ染色により確認した。ＴＵＮＥＬ染色には、Red In Situ Apoptosis Detection キット (Chemicon)を使用した。前記分化誘導条件で7日間培養したＤＨＡ群とコントロール群の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、TdTの存在下digoxigenin-dUTPとともに37℃で1時間インキュベートした。ＴＵＮＥＬラベルされた細胞をRhodamine conjugated anti−digoxigenin antibody で検出し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
ＴＵＮＥＬ染色は、細胞のアポトーシスにより破壊されたＤＮＡらせん構造の３’-ＯＨ末端を特異的にラベルするが、上記のピクノティックセルはＴＵＮＥＬ染色陽性を示し、一方、完全な形態を保持した細胞はＴＵＮＥＬ染色陰性であった。このように、ＰＩ染色によりピクノティックセルの像を示す細胞は、ＴＵＮＥＬ染色によりアポトーシスが起こっていることが確認された。
観察の結果、ＤＨＡ群はコントロール群と比較して、全細胞数に対するピクノティックセルの割合は低かった（コントロール群：60.0±3.2%, n=6; ＤＨＡ群：54.3±3.7%, n=6; P=0.01）。全細胞数は両群に差はなかった。【００７３】
参考例３  ＤＨＡが成人ラット海馬歯状回領域の神経新生に及ぼす影響
３世代魚油抜き飼料で飼育した１８週齢Wister系雄ラットを使用し、ＤＨＡ群として、５％アラビアゴム溶液で懸濁化した4,7,10,13,16,19-docosahexaenoateを、300mg/kg/dayで７週間連日経口摂取させた。コントロール群は、同じ用量の５％アラビアゴム溶液のみを同様に摂取させた。経口投与開始から２週間後から、ＰＢＳ(−)に溶解したＢｒｄＵを１日１回５日間、ラット腹腔内に注射した（50mg/kg）。
ＢｒｄＵ投与終了から４週後に、ラットの心臓からＰＢＳ(−)を還流させ、４％パラホルムアルデヒドで固定した。脳を摘出してさらに２４時間パラホルムアルデヒドで固定し、25% sucroseに交換した。Coronal sections（冠状断面 ４０μｍ）をマイクロトームで切断し、以下の手順でＢｒｄＵラベルされた核を検出した。Flating法により脳のスライスを、５０％ホルムアルデヒド-２×ＳＳＣ（0.3Ｍ NaClと0.03Ｍ sodium citrate）で65℃、2時間処理し、２Ｎ HClで37℃、30分間インキュベートした。その後、0.1Ｍ boric acid（ｐＨ8.5）で処理し、ラット抗-BrdU抗体(Oxford Biotech.)と0.3％Triton-X100を含むＴＢＳ中３％goat serumとともに24時間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄後、Cy5標識2次抗体を加え、25℃で1時間インキュベートした。マウス抗-NeuN抗体(Chemicon)処理の後、ＦＩＴＣ標識2次抗体処理を行った。上記と同様に、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
歯状回全体における顆粒細胞層のrostro caudal領域全体から、２４０μｍ間隔で６つのセクションを選び、顆粒細胞層とsubgranular zone（顆粒細胞層に沿った内側の部位) のBrdU-NeuN二重陽性細胞をカウントした。６つのセクション付近を２μｇ／ｍＬのＰＩで染色し、セクション内の全細胞数のばらつきがないことを確認した。顆粒細胞層の参照容量はサンプリングした各セクションの面積から算出した。
歯状回の顆粒細胞層全体のBrdU-NeuN二重陽性細胞数は、ＤＨＡ群ではコントロール群の1.6倍であった（各セクションにおける平均のBrdU-NeuN二重陽性細胞数，n=3，コントロール群：538±60.2個；ＤＨＡ群：878±72.3個  P=0.005）。顆粒細胞層の参照容量は両群で差はなく（コントロール群：0.919±0.0515mm3, ＤＨＡ群：0.920±0.0547mm3, P=0.993）、顆粒細胞層の大きさに影響はなかった。【００７４】
実施例１  神経幹細胞のための培地
調製した神経幹細胞のための培地の最終組成を、下記に記載した。
（１）培地調製例  １
１０μＭ    ＤＰＡ
0.1％      脂肪酸-フリーウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（1：1）
Ｎ-2  supplement【００７５】
（２）培地調製例  ２
１０μＭ    ＤＨＡ
0.1％      脂肪酸-フリーウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（1：1）
Ｎ-2  supplement
【図１】
0005240757.tif 000002
【図２】
0005240757.tif 000003
【図３】
0005240757.tif 000004
【図４】
0005240757.tif 000005