(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする、軽度の血管障害の程度の検査方法。
【請求項２】
軽度の血管障害が、心疾患、脳疾患における軽度の血管障害である請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
心疾患における軽度の血管障害が冠動脈病変である請求項２記載の検査方法。
【請求項４】
被検試料が、血液、血清または血漿である請求項１〜３のいずれか１項記載の検査方法。
【請求項５】
支持体に固定した抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体と標識物質で標識された抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いる請求項１〜４のいずれか一項記載の検査方法。
【請求項６】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体が、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識する抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントである請求項１〜５のいずれか１項記載の検査方法。
【請求項７】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体が、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）又はＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）の産生物である請求項１〜６のいずれか１項記載の検査方法。
【請求項８】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有する、軽度の血管障害の程度の診断薬。
【請求項９】
支持体に固定した抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体と、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を含むものである請求項８記載の診断薬。
【請求項１０】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体が、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体である請求項８または９記載の診断薬。
【請求項１１】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体が、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）又はＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）の産生物である請求項１０記載の診断薬。
【請求項１２】
ハイブリドーマＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）又はハイブリドーマＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）が産生する、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識する抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）又はハイブリドーマＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）である、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識する抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中ＰＴＸ３を高感度に検出し、血管障害を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１（ＩＬ−１）刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献１）。【０００３】
ペントラキシンファミリーには炎症性タンパクとして知られているＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）やＳｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）などが存在する。ペントラキシンは、別名Ｌｏｎｇ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎとも呼ばれ、ＣＲＰはＳｈｏｒｔ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎともよばれる。ペントラキシンは構造中にＣＲＰ配列部分を有することからの呼称であり、炎症性タンパクとして機能していることが推定される。しかし、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰと異なりＩＬ−６による誘導を受けない。またＰＴＸ３タンパク質を発現する細胞種もＣＲＰやＳＡＰとは異なることから、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰとは異なる機能も有することが示唆されている（非特許文献２および３）。【０００４】
一方で、炎症反応の一種と考えられる急性心筋梗塞の患者でＰＴＸ３の血中濃度が高く上がること、小血管炎のインディケータとなりうる、進行性動脈硬化巣プラークにおける免疫染色による検出等が発見され、炎症への関与が推定された（非特許文献４〜６）。【０００５】
炎症と言う呼称は広範囲に渡り、皮膚炎、各種臓器の炎症等がある。それらの中で血管の炎症は心疾患、脳疾患等の重篤な疾患に繋がる。
心疾患においては、急性心筋梗塞の危険因子として血中高総コレステロール値、高血圧、糖尿病、肥満、喫煙が挙げられ、それらのコントロールにより急性心筋梗塞の予防がなされている。ところが、厚生労働省が毎年行っている「人口動態統計」の平成１６年のデータによると、日本人の１５．５％が心疾患で死亡しており、心疾患は日本人の死因の第二位であることが知られている。さらに、死因となった心疾患を詳細に調べると、心不全と急性心筋梗塞が多く、それぞれの疾患は死因の５．０％と、４．３％を占めている。これらの心疾患は、主に冠動脈病変が原因で生じることが知られている。冠動脈病変の合併症には、心不全や急性心筋梗塞以外に、狭心症や不整脈による心臓突然死等が挙げられる。また、米国においても、米国心臓病協会から約１２００万人以上の米国人が何らかの冠動脈疾患の病歴があると報告されているように、冠動脈病変が米国人の死亡原因の首位であり、年間死亡例の約５分の１も占めている。
また、脳疾患においては、血管障害による痴呆症等があげられ、アスピリンによる予防が行われている。
しかし、心および脳おける重篤な病態（心筋梗塞、脳梗塞などを含む）の診断方法は存在するものの、軽度の血管の炎症または血管の障害を診断する方法は知られていない。【０００６】
従来のＰＴＸ３の測定法として、非特許文献４〜６に記載のＥＬＩＳＡ法による方法が知られている。この測定法においては、ＰＴＸ３濃度は、心筋梗塞発作の７．５時間後に最大値０．５から２２ｎｇ／ｍＬとなり、その後急激に減少し、心疾患を有していないと思われる正常者の０．５から２．５ｎｇ／ｍＬになるとの記載がある。従来のＰＴＸ３測定結果によれば、心筋梗塞発作時に血中ＰＴＸ３タンパク質濃度が高くなることは知られているが、心筋梗塞になる以前の段階でＰＴＸ３タンパク質濃度がどのように変化しているのかは全くわかっていなかった。
【非特許文献１】Ｂｒｅｖｉｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（３１），２２１９０−７（１９９２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（３１），２２１９０−７（１９９２）
【非特許文献３】Ｄｏｍｙａｋｕ  Ｋｏｋａ（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ），２４（７−８），３７５−８０（１９９６）
【非特許文献４】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４４／１２（２８４１−５０），２００１
【非特許文献５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２，６３６−４１（２０００）
【非特許文献６】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００２；２２：ｅ１０−ｅ１４
【特許文献１】ＷＯ２００５／０８０９８１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明者らは、ＷＯ２００５／０８０９８１号パンフレットにおいて、新たなＰＴＸ３測定系を開発し、血中ＰＴＸ３濃度を測定することにより不安定狭心症患者を診断することに成功し、血管障害の程度とＰＴＸ３濃度との間に相関を見出した。【０００８】
さらに、心筋梗塞や血管障害性痴呆症等になる以前や病態の初期における軽度の血管障害の程度が判定できれば、すなわち、心疾患、脳疾患等の初期症状の発現前あるいは発現時の初期症状の軽度の血管障害が診断できれば、早期の治療および予防が可能となることから、循環器系疾患あるいは代謝系疾患の死亡率の低下および患者のＱＯＬに貢献できる。
従って、本発明の目的は、心筋梗塞や血管障害性痴呆症等の危険因子としての血管障害を早期に、すなわち軽度の血管障害を判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＰＴＸ３は、全長３８１アミノ酸の１本鎖ポリペプチドからなるタンパク質である（以下、このタンパク質をＰＴＸ３タンパク質または全長ＰＴＸ３ともいう。（配列番号１および２）。配列番号２のアミノ酸番号１〜１７はシグナルペプチドであり、細胞外に分泌され成熟ＰＴＸ３タンパク質になる過程で切断される。ＰＴＸ３タンパク質のＮ端部位とは配列番号２のアミノ酸番号１８〜１７８（以下、ＰＴＸ３のＮ端部位という。）であり、Ｃ端部位とは配列番号２のアミノ酸番号１７９〜３８１（以下、ＰＴＸ３のＣ端部位という。）に相当する。Ｃ端部位はペントラキシンドメインと呼ばれている部位で、ペントラキシンファミリーに属するＣＲＰやＳＡＰと相同性の高い部位である。【００１０】
ＰＴＸ３を認識する抗体として、従来報告されているものには次のような抗体が挙げられる。
１６Ｂ５（Ｂｏｔｔａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７２（５２），３２８１７−２３，１９９７）；１Ｃ８（Ｂｏｔｔａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２（５２），３２８１７−３２８２３）；ＭＮＢ４（Ｐｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０００，１０２，６３６−６４１）；ＭＮＢ６（Ｐｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０００，１０２，６３６−６４１）；ＭＮＢ１０（ＷＯ２００５／１０６４９４、受託番号ＡＢＣ  ＰＤ０４００１）；Ｐｅｎ−３（ＷＯ２００５／１０６４９４、受託番号ＡＢＣ  ＰＤ０１００４）；ＰＰＭＸ０１０１（ＷＯ２００５／０８０９８１、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９７）；ＰＰＭＸ０１０２（ＷＯ２００５／０８０９８１、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２６）；ＰＰＭＸ０１１２（ＷＯ２００５／０８０９８１）；ＰＰＭＸ０１４８（ＷＯ２００５／０８０９８１）。【００１１】
従来知られている抗体のうち、ＭＮＢ４はＮ端、１６Ｂ５がＣ端を認識することが、Ｃｏｍｏｚｚｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１（３２），２２６０５−２２６１３，２００６）によって報告されている。また、この報告の中で、１２〜１３アミノ酸残基から成る合成ペプチドに抗体を反応させる方法により行われたエピトープマッピングの結果、ＭＮＢ４および１６Ｂ５は共に１２〜１３アミノ酸残基の短いペプチドを認識していることが報告されている。かような短いペプチドを認識している抗体は、立体構造に依存しないエピトープを認識する抗体と考えられる。【００１２】
そして、本発明では、軽度の血管障害を判定する方法を提供することを目的に、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体を開発し、測定感度および精度を改善することに成功した。また、当該モノクローナル抗体を用いて、安定狭心症、胸痛の患者を含む軽度の血管障害を持つ患者を解析対象として研究し、軽度の血管障害を持つ病態と健常人のＰＴＸ３濃度との間に有意差が認められることを見出した。【００１３】
本発明は、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする、軽度の血管障害の程度の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、上記抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体がＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントである軽度の血管障害の程度の判定方法を提供するものである。【００１４】
また、本発明は、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有する軽度の血管障害の程度の診断薬を提供するものである。【００１５】
また、本発明は、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識することを特徴とする抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供するものである。【００１６】
また、本発明は、ＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識する抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、急性心筋梗塞や血管障害性痴呆等が発症する以前や発症後の初期における軽度の血管障害を診断できることから、重篤な心疾患、脳疾患等に基づく重篤な血管障害への移行を早期に治療・予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例３で調製したリコンビナントＰＴＸ３タンパク質と、臨床検体中のＰＴＸ３タンパク質のゲルろ過の結果を示す(実施例４)。
【図２】抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体の還元／非還元条件下でのウェスタンブロットにおける全長ＰＴＸ３との反応性を示す。
【図３】実施例１１でＰＴＸ３ポリペプチドの発現物を試料とし、ＰＴＸ３感作マウス血清を一次抗体としてウェスタンブロットにより検定した結果を示す。  ＡおよびＡ‘：全長ＰＴＸ３をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＢおよびＢ‘：ＰＴＸ３のＮ端ポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＣおよびＣ‘：ＰＴＸ３のＣ端ポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＤおよびＤ‘：遺伝子導入していないＣＨＯ細胞培養上清溶解液をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料（陰性コントロール）。
【図４】実施例１１で抗ＨＢｓ抗体を産生するハイブリドーマ株Ｈｙｂ−３４２３培養上清を用いたウェスタンブロットを行った結果を示す。  ＡおよびＡ‘：全長ＰＴＸ３をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＢおよびＢ‘：ＰＴＸ３のＮ端ポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＣおよびＣ‘：ＰＴＸ３のＣ端ポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＤおよびＤ‘：遺伝子導入していないＣＨＯ細胞培養上清溶解液をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料（陰性コントロール）。
【図５】実施例１１で抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体ＰＰＭＸ０１０４を用いたウェスタンブロットを行った結果を示す。  ＡおよびＡ‘：全長ＰＴＸ３をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＢおよびＢ‘：ＰＴＸ３のＮ端ポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＣおよびＣ‘：ＰＴＸ３のＣ端ポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料。  ＤおよびＤ‘：遺伝子導入していないＣＨＯ細胞培養上清溶解液をそれぞれ還元条件、非還元条件で処理した試料（陰性コントロール）。
【図６】実施例１２において全長ＰＴＸ３の消化物を逆相ＨＰＬＣにより分離した結果を示す。
【図７】実施例１２の全長ＰＴＸ３の還元処理後のリジルエンドペプチダーゼ消化物とＰＰＭＸ０１０４との反応性をＥＬＩＳＡ法の結果として示す。
【図８】実施例１２の全長ＰＴＸ３の還元処理後のリジルエンドペプチダーゼ消化物とＰＰＭＸ０１０５との反応性をＥＬＩＳＡ法の結果として示す。
【図９】実施例１３で全長ＰＴＸ３を非還元条件下でリジルエンドペプチダーゼ消化しＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動後にクマシーブリリアントブルー染色した結果を示す。  １：分子量マーカー、２：分子量マーカー、３：未消化全長ＰＴＸ３、４：消化０時間後、５、消化０．５時間後、６：消化１時間後、７：消化２時間後、８：消化４時間後、９：消化８時間後。
【図１０】実施例１３における全長ＰＴＸ３の非還元条件下でのリジルエンドペプチダーゼ消化時間とＰＰＭＸ０１０４との反応性との関係を示す。
【図１１】実施例１３における全長ＰＴＸ３の非還元条件下でのリジルエンドペプチダーゼ消化時間とＰＰＭＸ０１０５との反応性との関係を示す。
【図１２】従来ＥＬＩＳＡキットと本発明ＥＬＩＳＡキットの標準曲線の比較を示す。
【図１３】健常人と心疾患患者の血中ＰＴＸ３濃度の比較を示す。
【図１４】冠動脈病変枝数と血中ＰＴＸ３濃度の関係を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にＰＴＸ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な測定としては、ＰＴＸ３タンパク質の濃度の測定、ＰＴＸ３タンパク質の量の測定などを挙げることが出来る。なおＰＴＸ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列を配列番号１に、ＰＴＸ３のアミノ酸配列を配列番号２に示す。【００２０】
被検試料とは、ＰＴＸ３のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。【００２１】
血管の障害は血管内皮細胞の障害、血管中膜平滑筋細胞の遊走、マクロファージの集積・泡沫化、血栓の付着、プラークの形成、血管の線維化、プラークの破裂といった経過を辿り、重篤な疾患を呈す。
すなわち、本発明における「血管障害」には、高脂血症および心疾患、脳疾患の他に高血圧症、糖尿病、肥満および喫煙が原因として生ずる血管障害が含まれる。特に、「軽度の血管障害」とは、血管障害を原因とする心疾患、脳疾患の初期症状の発現前や発現時の血管障害をいう。軽度の血管障害を持つ疾患には、胸痛、安定狭心症などが挙げられる。これらは、いずれも冠動脈病変に基づいた疾患であり、病変枝数が少ない程心疾患が軽度であることを意味する。
また、本発明における「血管障害の程度」とは、上記血管障害の進行過程に伴う障害の程度を言う。すなわち、上記進行過程をたどる血管障害は最終的なプラークの破裂に至る程度の尺度として病理組織的に次のように示される。（ａ）ｌｉｐｉｄ  ｃｏｒｅの大きさ、（ｂ）ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐの厚さ、（ｃ）ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ、（ｄ）炎症細胞の浸潤の程度の具合であり、（ａ）大きければ大きいほど、（ｂ）は薄ければ薄いほど、（ｃ）は強ければ強いほど、（ｄ）は強ければ強いほどプラーク破裂のしやすさは増す。したがって本発明における「血管障害の程度」は上記の（ａ）〜（ｄ）の程度を言う。【００２２】
本発明方法においては、ＰＴＸ３タンパク質の測定は、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ＰＴＸ３抗体を用いた測定法について詳細に説明する。【００２３】
＜１．抗ＰＴＸ３抗体の作製＞
本発明で用いられる抗ＰＴＸ３抗体は、ＰＴＸ３タンパク質に特異的に結合すればよいが、好ましくはＰＴＸ３タンパク質の立体構造エピトープを認識するものであり、より好ましくはＰＴＸ３の断片化されたＮ端部分ポリペプチドおよびＣ端部分ポリペプチドを認識せず、ＰＴＸ３タンパク質の立体構造エピトープを認識するものである。さらに好ましくはＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、且つ、ＣＲＰやＳＡＰに交差反応しない抗体である。最も好ましくは、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）である。
本明細書において「立体構造エピトープ」とは、全長ＰＴＸ３タンパク質の部分を認識するエピトープのうち、一次構造を認識するエピトープを除く、全長ＰＴＸ３の二次構造、三次構造、四次構造を認識するエピトープをいう。ここで、タンパク質の立体構造には、一次構造、二次構造、三次構造、四次構造という階層性があることが知られている（南山堂  医学大辞典  改定１７版（１９９０））。
後記実施例の通り、本発明の好ましい抗体は、非還元状態のＰＴＸ３を認識し、ＰＴＸ３断片とは反応せず、ＰＴＸ３タンパク質の立体構造エピトープを認識するものであり、従ってインタクトなＰＴＸ３と強く反応することにより、生体内で高次構造を保持するＰＴＸ３を識別することができる。【００２４】
抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
また、支持体に固定される抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識される抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。【００２５】
本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。【００２６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＸ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００２７】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＰＴＸ３を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表２００２−５０３６４２に開示された方法に従い得ることも出来る。
次に、この精製ＰＴＸ３タンパク質またはその断片を感作抗原として用いる。【００２８】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、もしくはウサギ、サル等が使用される。【００２９】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００３０】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００３１】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。【００３２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。【００３３】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【００３４】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００３５】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００３６】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。【００３７】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＸ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＸ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＸ３を投与して抗ＰＴＸ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＸ３に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。【００３８】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００３９】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００４０】
これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる方法が用いられる。【００４１】
また、これらの抗体は、ＰＴＸ３遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。【００４２】
前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。【００４３】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＰＴＸ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【００４４】
＜２．ＰＴＸ３の測定＞
被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００４５】
抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。【００４６】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。【００４７】
抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。【００４８】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。【００４９】
抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。【００５０】
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。【００５１】
抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。【００５２】
抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれらに限定されない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。【００５３】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。【００５４】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、例えば、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、実施例１７に記載の測定抗体の酵素標識法に記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。【００５５】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。【００５６】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。【００５７】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。【００５８】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。【００５９】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。【００６０】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。【００６１】
本発明は、血管障害の程度の診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は少なくとも抗ＰＴＸ３抗体を含む。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。【００６３】
＜実施例１  ＰＴＸ３のクローニング＞
ＰＴＸ３の全長ＯＲＦ領域を含む配列のクローニングを実施した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１本鎖ｃＤＮＡをｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。それを鋳型としてＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿００２８５２）よりデザインしたプライマーＰＴＸ３−Ｆ（ＫｐｎＩ）（配列番号３）とＰＴＸ３−Ｒ（ＢａｍＨＩ）（配列番号４）を用いて、ＰＣＲ法にて、全長ＯＲＦ遺伝子の単離を行った。ＰＣＲ法により得られたフラグメントをＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いベクター挿入し、塩基配列解析を定法にて実施した後、ＫｐｎＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトにて切断したフラグメントをｐｈＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へ挿入し、トランスファーベクターｐｈＣＭＶ−ＰＴＸ３を作製した。【００６４】
＜実施例２  全長ＰＴＸ３発現細胞の構築＞
ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に６ウェルディッシュに１ｘ１０５  ｃｅｌｌのＣＨＯ細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に８μｇの発現ベクターｐｈＣＭＶ−ＰＴＸ３と１６μＬのＦｕＧＥＮＥ  ６  ｒｅａｇｅｎｔを無血清ＤＭＥＭ培地１００μＬに混合し、２０分間の室温におけるインキュベーション後、細胞に添加した。トランスフェクション翌日に限外希釈法および選択試薬であるＧ４１８を用いてクローニングを実施した。各クローンの培養上清を回収し、ＰＴＸ３タンパク質発現細胞のスクリーニングを行った。その結果、約２〜３μｇ／ｍＬのＰＴＸ３タンパク質を恒常的に発現するクローン（以後、ＣＨＯ−ＰＴＸ３という。）を選択することが出来た。【００６５】
＜実施例３  リコンビナントＰＴＸ３タンパク質の取得＞
蛋白質の精製はＢｏｔｔａｚｚｉらの方法（Ｂｏｔｔａｚｚｉ  Ｂ，Ｖｏｕｒｅｔ−Ｃｒａｖｉａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（５２）：３２８１７−２３．）に準じて実施した。具体的にはＣＨＯ−ＰＴＸ３を１５０ｃｍ２のフラスコにて培養の後、ローラーボトル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い１ボトル当たり３００ｍＬの無血清培地（Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ，ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１分間当たり１回転になるようにローリングのスピードの調節を行い４日間培養し、培養上清を回収した。１Ｌの培養上清を、限外濾過膜濃縮装置、ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬデバイス  バイオマックス１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて５０ｍＬまで濃縮を行った。濃縮液を５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ６．６の緩衝液５Ｌに対し透析した。透析操作は同緩衝液に対し、２度実施した。次いで、ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  Ｑ  ＸＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。バックグランドレベルが低くなるまで洗浄した後、ＮａＣｌの濃度を０から０．５８Ｍに３５分間かけて増加させ、その後１ＭのＮａＣｌにてＰＴＸ３の溶出を行った。尚、溶出のモニターは２８０ｎｍの吸光度にて行った。ＰＴＸ３蛋白質を含むフラクションを集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００によるゲル濾過クロマトグラフィーをＰＢＳにて展開した。さらにＰＴＸ３のうち多量体ＰＴＸ３のみを得るためにＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社）を使用して精製した。すなわち、分子量スタンダードを用いキャリブレーションを行った後にＰＴＸ３をカラムへアプライし、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎにてＰＢＳにより溶出を行った。各溶出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行い、精製リコンビナント多量体ＰＴＸ３タンパク質を得た。【００６６】
＜実施例４  リコンビナントＰＴＸ３タンパク質と臨床検体中ＰＴＸ３分子量の同一性＞
実施例３で得たリコンビナントＰＴＸ３タンパク質と臨床検体中のＰＴＸ３タンパク質の分子量を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社）を使用してゲルろ過を行って得た分画を用いて解析した。すなわち、分子量スタンダードを用いキャリブレーションを行った後に、ＰＴＸ３濃度が測定限界以下のヒト血漿にリコンビナントＰＴＸ３タンパク質を３０ｎｇ／ｍＬになるように添加した試料をカラムにアプライし、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎにて緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２)により溶出を行った。ＥＬＩＳＡ法によりＰＴＸ３濃度が１０ｎｇ／ｍＬ検出された臨床検体(血漿)を試料として、同じ条件でゲルろ過を行った。各溶出フラクションのＰＴＸ３濃度をＥＬＩＳＡ法により検出した。
結果、リコンビナントＰＴＸ３タンパク質および臨床検体中のＰＴＸ３ともに分子量スタンダードを用いたキャリブレーションから約９００ｋＤａの溶出フラクションにピークが認められた。（図１）【００６７】
＜実施例５  抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体の作製＞
モノクローナル抗体は下記の操作により作製した。すなわち、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ＣＲＬ）あるいはＰＴＸ３ノックアウトマウスにＰＴＸ３を免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１）を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０）でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計２回行った。最終免疫については５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。ＰＴＸ３タンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＰＴＸ３に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。９６穴培養プレートに播種し、翌日よりＨＡＴ培地で選択後培養上清をＥＬＩＳＡで以下の通りスクリーニングした。実施例３に記載の全長ＰＴＸ３を固相化し、ハイブリドーマの培養上清を添加してインキュベーションした後、標識抗マウス抗体により検出を行う抗原固相ＥＬＩＳＡ法により行った。
陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養にて培養し上清を回収した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、ＰＴＸ３タンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗ＰＴＸ３抗体を多数得た。【００６８】
モノクローナル抗体の精製はＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出液は中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに採取し、直ちに中和した。抗体溶出画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行い緩衝液置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。【００６９】
＜実施例６  抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体のサブクラス＞
抗ＰＴＸ３抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従っておこなった。その結果、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭクラスの抗体が多数得られた。ＰＰＭＸ１０４およびＰＰＭＸ１０５共にＩｇＧ１であった。【００７０】
＜実施例７  ＰＴＸ３のＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）の調製＞
ＰＴＸ３のＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）をＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパクとして大腸菌により発現させ、精製した。また、Ｎ−ＰＴＸ３の発現ベクターの構築は一般的な方法を用いて行った。すなわちＮ−ＰＴＸ３の発現ベクターは、全長ＰＴＸ３をテンプレートとし塩基配列１〜５２２を適当な配列番号５および６のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅を行った。次に、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットＧａｔｅｗａｙ（Ｒ）システム、ｐＤＥＳＴＴＭ２４ベクター（いずれもインビトロジェン社）を用い付属マニュアルの用法容量に従いベクターの構築を行った。
構築したベクターを大腸菌ＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）にトランスフォーメーションし、アラビノースによる発現誘導にて目的の遺伝子発現を行った。次に発現誘導をかけた大腸菌細胞を回収し、ＮＰ４０などの界面活性剤、リゾチームの入ったバッファーにて可溶化を行い、遠心の後、上清を回収しＧＳＴカラムによる精製を行った。すなわちＧＳＴセファロースビースに融合タンパク質を結合させＰＢＳによるビーズ洗浄を行った。その後、還元型グルタチオン溶液にて融合タンパク質の溶出を行った。精製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、純度、分子量などの検定の後、抗原固相ＥＬＩＳＡ用抗原として用いた。【００７１】
＜実施例８  ＰＴＸ３のＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）を用いたエピトープ解析＞
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体（ＰＰＭＸ０１０１、ＰＰＭＸ０１０２、ＰＰＭＸ０１０４、ＰＰＭＸ０１０５）のＰＴＸ３タンパク質への結合部位の特定を以下のように行なった。
材料として実施例３で得た全長ＰＴＸ３タンパク質および実施例７に記載のＰＴＸ３のＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）を用いた。結合部位の特定方法として、一般的な抗原固相ＥＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、これらのタンパク質を５μｇ／ｍＬとなるように調製し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、一晩の反応にて固相化を行った。翌日、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、４０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマの培養上清あるいは希釈した精製モノクローナル抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え２時間室温でインキュベートした。次いで、１０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え２時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
全長のＰＴＸ３タンパク質にて高い吸光度が得られたモノクローナル抗体について認識部位を特定した。【００７２】
＜実施例９  全長ＰＴＸ３タンパク質を用いたウエスタンブロット法によるエピトープ解析＞
実施例３で精製した全長リコンビナントＰＴＸ３を、還元および非還元条件のサンプルバッファーで処理し、１レーン当たり６０ｎｇをアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次いで、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）膜に３８Ｖで１６時間転写し、タンパク質を膜にトランスファーした後、ブロックエース（雪印）を用いて室温で１時間ブロッキングした。次に抗ＰＴＸ３抗体０．３μｇを、４０％ブロックエース（雪印）／ＴＢＳ液に含ませ、室温で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０)で５分ｘ３回洗浄を行った。その後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社）を１０％ブロックエース（雪印）／ＴＢＳ を用いて５，０００倍に希釈した液を加え、室温で１時間反応させた後ＴＢＳＴで３回洗浄を行った。最後にＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を作用させ、得られた化学発光シグナルをＸ線フィルムに５分感光させた。
還元条件下では、ＰＰＭＸ０１０１、ＰＰＭＸ０１０２が全長ＰＴＸ３と反応し、ＰＰＭＸ０１０４、ＰＰＭＸ０１０５には反応性が認められなかった。非還元条件下では、いずれの抗体も全長ＰＴＸ３と反応した（図２）。【００７３】
＜実施例１０  ＰＴＸ３のＣ端部分のポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）の調製＞
ＰＴＸ３のＣ端部分のポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）(配列番号２の１７９−３８１位)のＣＨＯ細胞株における強制発現を以下の方法で行った。また、実施例７で調製したＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）とは異なる、配列番号２の１−１５１位のアミノ酸をコードするＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））の調製も行った。
まず、実施例１でクローニングしたヒトＰＴＸ３を鋳型にして、ＰＴＸ３の１７９−３８１番目のアミノ酸をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ｐＳＧ５ベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩサイトに挿入して、発現ベクターを構築した。ｃＤＮＡを取得する際、３‘側にＰＴＸ３のシグナルペプチドが付加されるようにプライマーを合成しＰＣＲ増幅を行った。
ＣＨＯ細胞におけるＰＴＸ３部分長タンパク質強制発現物の調製は、以下の手順で行った。１０ｃｍ ｄｉｓｈに０．８×１０6 個のＣＨＯ細胞を撒き込み、翌日、ＦｕＧＥＮＥ ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、８μgのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。
４８時間後、細胞をセルスクレーパーで剥がして回収し、２００μｌのＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ (１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、  １％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％  ＳＤＳ、  ｐＨ７．４）を加え、氷上で１５分間置き細胞を溶解した。次いで、１５，０００ｘｇ、１５分、４℃で遠心を行い、その上清を発現タンパク質溶液とした。
実施例７で調製したＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３）とは異なる、配列番号２の１−１５１位のアミノ酸をコードするＮ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））は、Ｃ−ＰＴＸ３と同様の方法により、１−１５１位のＰＴＸ３部分長ポリペプチドを得た。ただし、Ｎ端は１−１７位にシグナルポリペプチドを持つため、シグナルポリペプチドの付加は行っていない。
次に、発現物の確認を行った。発現タンパク質試料を還元条件（２−ＭＥ添加）または非還元条件（２−ＭＥ非添加）のサンプルバッファーで処理し、１レーンにつき発現タンパク質溶液２０μｇをアプライし、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ(ＧＥヘルスケア)に転写した後、膜を１００%ブロックエース(雪印乳業)に浸して、室温、１時間振盪し、ブロッキングを行った。次いで全長ＰＴＸ３で感作したマウスより採取した血清を４０%ブロックエース／ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に懸濁したものに膜を浸し、室温、１時間振盪して１次反応を行った。ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５分ｘ２回洗浄を行った後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケア、ｃａｔ.ＮＡ９３１）を、１０%ブロックエース／ＴＢＳを用いて５０００倍に希釈した液に膜を浸し、室温、１時間振盪して２次反応を行った。ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５分ｘ３回洗浄を行った後、ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア）を用いて発色を行った（図３）。また、ネガティブコントロールとして、一次抗体としてＰＴＸ３を認識しない、Ｂ型肝炎ウイルスＳ抗原（ＨＢｓ抗原）に対するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂ−３４２３の培養上清、二次抗体を抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社）としてウェスタンブロットを行った（図４）。【００７４】
＜実施例１１  ＰＴＸ３のＣ端部分のポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）を用いたエピトープ解析＞
実施例９で調製した、Ｎ端（Ｎ−ＰＴＸ３（２））及びＣ端ポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）を発現するＣＨＯ細胞溶解液、遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞の溶解液、精製した全長リコンビナントＰＴＸ３を、還元（２−ＭＥ添加）及び非還元（２−ＭＥ非添加）条件のサンプルバッファーで処理し、１レーン当たり、細胞溶解液は２０μｇ、全長ＰＴＸ３は３ｎｇをアプライし、一次抗体をＰＰＭＸ０１０４として実施例９に記載した方法によりウェスタンブロットを行った。【００７５】
その結果、ＰＰＭＸ０１０４は、還元条件下では全長ＰＴＸ３、Ｎ端部分のポリペプチド（Ｎ−ＰＴＸ３（２））、Ｃ端部分のポリペプチド（Ｃ−ＰＴＸ３）のいずれも認識しなかった。また、非還元条件下では全長ＰＴＸ３とのみ反応した（図５）。【００７６】
＜実施例１２  全長ＰＴＸ３タンパク質のプロテアーゼ分解物とモノクローナル抗体の還元条件下での反応性＞
ＰＴＸ３タンパク質へのより詳細な結合部位の同定を行う為、ＰＴＸ３を酵素消化により断片化し、断片を逆相ＨＰＬＣにより分画・分取した。その後、分取したペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡ法で検討した。
まず、ＰＴＸ３タンパク質を０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，６Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５に溶解し、モル比でＰＴＸ３の３１５倍量のＤＴＴを加え、３７℃で２時間静置し、還元処理を行った。次いで、モル比でＤＴＴの３．１倍量の４−ビニル−ピリジンを加え、暗所で室温２時間静置し、ＳＨ基のピリジルエチル化を行った。次に、これを純水、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３Ｍ  ｕｒｅａ，ｐＨ９．０に対して透析し、モル比でＰＴＸ３の５０分の１になるように、Ｌｙｓｙｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬）を加え、３７℃、１８時間の反応を行い、ＰＴＸ３タンパク質の酵素切断を行った。酵素消化物を、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）にアプライし、１５０分にわたるアセトニトリルの０−６０％グラジェントで溶出（流速０．８ｍＬ／分）を行い、溶出された断片を分取した（図６）。これらの断片をＰＢＳで５０倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃一晩の反応にて固相化を行った。ＥＬＩＳＡ法は次の通り行った。固相化を行った後、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、４０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、ＰＰＭＸ０１０４またはＰＰＭＸ０１０５抗体をブロッキング液と同一の溶液に最終濃度１０μｇ／ｍＬとして溶解したものを１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間インキュベートした。次いで、１０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で５，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え２時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
その結果、酵素切断後のペプチドに対しては全く反応しなかった（図７および図８）。この事から、ＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５は、ＰＴＸ３の立体構造を認識する抗体であると推定出来た。また、ＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５は、酵素切断以前、即ち還元ピリジルエチル化したＰＴＸ３に対して、既に反応性をほぼ失っていたことからも、Ｓ−Ｓ結合によって構成されるＰＴＸ３の立体構造を認識する抗体であることが分かる。【００７７】
＜実施例１３  全長ＰＴＸ３タンパク質のリジルエンドペプチダーゼ分解物とモノクローナル抗体の非還元条件下での反応性＞
実施例３で得た全長ＰＴＸ３タンパク質をリジルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、和光純薬）を用いて２００ｍＭトリス塩酸緩衝液中で０、０．５、１、２、４、８時間の消化時間を設定し、３０℃で消化した。消化時間経過後にＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル）添加により消化をストップし、消化試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分画し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）でゲルを染色しＰＴＸ３が切断されていることを確認した（図９）。
リジルエンドペプチダーゼ消化した試料を用いて通常の固相ＩＬＩＳＡ法によって抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体ＰＰＭＸ０１０４、ＰＰＭＸ０１０５との反応性を確認した。具体的には、リジルエンドペプチダーゼ消化した試料をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、一次抗体としてＰＰＭＸ０１０４またはＰＰＭＸ０１０５を反応させ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇヤギ抗体（GEヘルスケア社）を二次抗体としてＥＬＩＳＡ法を行った。ＰＴＸ３のリジルエンドペプチダーゼ消化時間とＥＬＩＳＡ法の結果との関係を図１０、図１１に示す。【００７８】
これらの結果から、ＰＴＸ３の立体構造を認識するモノクローナル抗体を産生するＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５のハイブリドーマは、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０として（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した（寄託日：平成１７（２００５）年９月２２日）。【００７９】
＜実施例１４  ＰＴＸ３モノクローナル抗体の解離定数の測定＞
結合定数の測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム(ＢＩＡｃｏｒｅ, Ｕｐｐｓａｌａ, Ｓｗｅｄｅｎ)を用いて行った。まず、センサーチップＣＭ５に、抗マウスＩｇＧ抗体をＮＨＳ／ＥＤＣカップリング法を用いて固定化した。次に、抗ＰＴＸ３抗体（ＰＰＭＸ０１０４、ＰＰＭＸ０１０５）をＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ(１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０)に１０uｇ／ｍｌで懸濁させたものをインジェクションし、数百ＲＵ程度の抗体を固定化した。次いで、リコンビナントＰＴＸ３をＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁させたものをインジェクションし、結合・解離を測定した後、解析プログラム(ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ)を用いて解離定数を求めた。【００８０】
その結果、今回作製したＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５のいずれも低い解離定数を示したが、中でもＰＰＭＸ０１０４は最も低い解離定数を示し、高い親和性を示すことが示された。（表１）。【００８１】
【表１】
0005137015.tif 000002
【００８２】
＜実施例１５  抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体のＳＡＰおよびＣＲＰとの交差反応性＞
ＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５のＳＡＰおよびＣＲＰとの交差反応性の確認は、一般的な抗原固相化ＥＬＩＳＡ法によった。すなわち、全長ＰＴＸ３タンパク質、ヒトＣＲＰ（日本バイオテスト研究所）、ヒトＳＡＰ（和光純薬）を５μｇ／ｍＬとなるように調製し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃一晩の反応にて固相化を行った。翌日、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、４０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマの培養上清あるいは希釈した精製モノクローナル抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え２時間室温でインキュベートした。次いで、１０％ブロックエース（大日本製薬）を含有するＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で５，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え２時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
モノクローナル抗体ＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５は、全長ＰＴＸ３に強く反応したが、ＳＡＰおよびＣＲＰには全く反応しなかった（表２）。【００８３】
【表２】
0005137015.tif 000003
【００８４】
＜実施例１６  抗体のＦ（ａｂ’）２化＞
抗体のＦ（ａｂ’）２化は下記のように実施した。実施例４記載のモノクローナル抗体の作製方法により精製された抗体を希薄なバッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に対し透析を行なった。サブクラスＩｇＧ１の抗体に対してはｐＨ３．７並びにＩｇＧ２ａの抗体に対してはｐＨ４．０のＰｅｐｓｉｎ消化用バッファー（０．２Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を用い２倍希釈し、３７℃にて５分間加温した。次に、ｐＨ４．０のＰｅｐｓｉｎ消化用バッファーにて１０ｍｇ／ｍＬもしくは１ｍｇ／ｍＬのペプシン溶液を調製し、加温された試料に対しペプシン溶液をＩｇＧ１については質量比１３０：１（抗体：Ｐｅｐｓｉｎ）、ＩｇＧ２ａについては質量比８：１（抗体：Ｐｅｐｓｉｎ）となるように加えた。ペプシン溶液を添加後、３７℃にて２時間半インキュベーションした。そして、１０分の１容量の２Ｍ  Ｔｒｉｓを添加し消化反応を停止した。【００８５】
＜実施例１７  抗体の標識＞
抗体の直接標識には一般的にアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を過ヨウ素酸法やマレイミド法などによりアミノ基、ＳＨ基に結合させる方法がとられる。実施例１２で調製した抗体に対して、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ（（株）同仁化学）を用い、キット付属のマニュアルの用法容量に従いマレイミド法によりＳＨ基にペルオキシダーゼ標識を施した。【００８６】
＜実施例１８  ＥＬＩＳＡ系の構築と測定＞
血中のＰＴＸ３タンパク質を検出するため、ＰＴＸ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を以下のように構築した。すなわち、９６ウェルプレートにコートする抗体にはＦ（ａｂ’）２化ＰＰＭＸ０１０４を５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ、４℃、一晩インキュベーションし固相化を行った。【００８７】
翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＡＢＩ社のイムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ  ＃１０−６０１−００１）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、精製蛋白質、ヒト血清などを、動物血清などを含む希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬとなるように希釈したＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識Ｆａｂ’化ＰＰＭＸ０１０５抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。サンプル中のＰＴＸ３タンパク質濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｌａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｖｅｒ．３．０）を用いて解析した。【００８８】
＜実施例１９  従来の測定系との標準曲線の比較＞
ＥＬＩＳＡの標準曲線は濃度検定されたＰＴＸ３タンパク質標準品（ＡＬＥＸＩＳ社）を用いて、３、１．１、０．３７、０．１２、０．０４１、０．０１４、０．００５ｎｇ／ｍＬの標準品希釈液を用いて作製した。さらに、ＥＬＩＳＡの感度比較のためＷＯ２００５／０８０９８１号パンフレットにおいて患者血中濃度を測定したキットを用いて上記と同様に標準曲線を求めた。
今回作製した複数の測定系とＷＯ２００５／０８０９８１号パンフレットで使用の抗体による測定との比較において、プレートにコートする抗体にＰＰＭＸ０１０４、標識抗体としてＰＰＭＸ０１０５を使用したキットにおいて明らかに新規測定系の感度がすぐれていることが確認できた（図１２）。
尚、従来の測定系使用抗体の認識部位が、ＰＴＸ３分子のＮ端部位を認識する抗体であったのに対し、新たな測定キット使用のＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５はＰＴＸ３の立体構造エピトープを認識する抗体であった。【００８９】
＜実施例２０  従来測定系との比較（添加回収試験および再現性試験）＞
添加回収試験および再現性試験は、上記同様、ＥＬＩＳＡの感度比較のためにＷＯ２００５／０８０９８１において患者血中濃度を測定したキットを用いて測定も同時に行い比較検討用データを採取した。実際、添加回収試験に用いた試料は以下のように調製を行なった。すなわち、リファレンスとなる試料には検体希釈バッファーに、対照となる試料には８種類のヒト血漿サンプルに抗原を最終濃度２、５、１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し調整を行なった。また、再現性試験については、６人の健常者から調製された血漿サンプル、３種類の不安定狭心症患者から調製された血漿サンプルを用い後述の方法に従い測定を行なった。測定方法は以下の通りである。すなわち、検体希釈バッファー１００μＬを注入したウエルに、調整をしたサンプル１０μＬを注入し室温１時間の振盪反応を行った。次に、プレートを洗浄液（ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、標識抗体液を各ウエルに１００μＬ注入し、室温にて１時間の振盪反応を行なった。反応後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（Ｓｃｙ  Ｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウエルに１００μＬ注入し、室温にて３０分間反応させ、反応停止液（Ｓｃｙ  Ｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウエルに１００μＬ注入し反応を停止させマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長の吸光度測定を行なった。
その結果、新規測定系における添加回収は低濃度から高濃度のいずれにおいても良好な回収率を示したのに対し、既存測定系では低濃度の添加において低い回収率であった（表３）。一方、再現性試験において、新規測定系で良好なＣＶ値が得られたのに対し、既存測定系では低濃度のＰＴＸ３添加時特に無添加時に高いＣＶ値であった（表４）。これらの結果は、新規測定系の開発により高感度で精度ある測定を可能にできたことを示している。【００９０】
【表３】
0005137015.tif 000004
【００９１】
【表４】
0005137015.tif 000005
【００９２】
＜実施例２１  心疾患患者血液中ＰＴＸ３の測定＞
健康なヒトと心疾患患者の血中ＰＴＸ３濃度を比較するために、現在治療中の疾患がない健康なヒトの末梢血から採取した血漿検体９２検体（Ｎｏｒｍａｌ）、胸痛症状をもつ心疾患患者（胸痛症状を訴え、症状、負荷心電図、負荷心筋シンチレーションの検査結果から狭心症が疑われたが、冠動脈造影の結果動脈硬化は認められず、循環器内科の専門医による診断により狭心症が否定された患者）の冠動脈から採取した血漿検体３１検体（Ｃｈｅｓｔ  Ｐａｉｎ）、安定狭心症患者の冠動脈から採取した血漿検体２４検体（Ｓｔａｂｌｅ  Ａｎｇｉｎａ）について実施例１８で作製した新規測定キットを用いて測定を行なった。
具体的には、抗体固相化プレートに１００μＬの検体希釈バッファーを各ウエルに注入し、標準品および検体を各ウエルに１０μＬ注入後、室温にて１時間の振盪反応を行なった。次に、プレートを洗浄液（ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、標識抗体液を各ウエルに１００μＬ注入し、室温にて１時間の振盪反応を行なった。反応後、プレートを洗浄液で５回洗浄後、ＴＭＢ発色液（Ｓｃｙ  Ｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウエルに１００μＬ注入し、室温にて３０分間反応させ、反応停止液（Ｓｃｙ  Ｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウエルに１００μＬ注入し反応を停止させマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長の吸光度測定を行なった。
その結果、Ｎｏｒｍａｌの平均値が１．２７ｎｇ／ｍＬ、胸痛（Ｃｈｅｓｔ  Ｐａｉｎ）の平均値が２．５７ｎｇ／ｍＬ、安定狭心症（Ｓｔａｂｌｅ  Ａｎｇｉｎａ）の平均値が３．１３ｎｇ／ｍＬとなり健常人（Ｎｏｒｍａｌ）と胸痛（Ｃｈｅｓｔ  Ｐａｉｎ）、健常人（Ｎｏｒｍａｌ）と安定狭心症（Ｓｔａｂｌｅ  Ａｎｇｉｎａ）の間には有意差（ｐ＜０．０００１）が認められた（図１３）。
以上のことから、本発明の抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて血液中ＰＴＸ３濃度を測定することにより軽度の血管障害と判定することができることが認められた。【００９３】
＜実施例２２  冠動脈病変枝数と血液中ＰＴＸ３濃度＞
心疾患の程度と血液中ＰＴＸ３濃度の関連を検討するために、心疾患患者の血液中ＰＴＸ３濃度の測定を実施例１８で作製した新規測定キットを用いて行った。本研究に用いた検体は、冠動脈病変無しと診断されたヒトの末梢血から採取した血漿検体４４検体（０ＶＤ）、１つの冠動脈において病変が確認された患者から採取した血漿検体１５検体（１ＶＤ）、２つの冠動脈において病変が確認された患者から採取した血漿検体２２検体（２ＶＤ）、および３つの冠動脈において病変が確認された患者から採取した血漿検体１１検体（３ＶＤ）についてＰＴＸ３の測定を実施例１７の測定方法に従い実施した。その結果、ＰＴＸ３濃度は、０ＶＤの平均値が１．４９ｎｇ／ｍＬ、１ＶＤの平均値が１．７３ｎｇ／ｍＬ、２ＶＤの平均値が２．０３ｎｇ／ｍＬ、および３ＶＤの平均値が２．２９ｎｇ／ｍＬとなり、０ＶＤと２ＶＤの測定値の間にＰ＝０．０５、０ＶＤと３ＶＤの間にＰ＝０．０１でそれぞれ有意差が認められた（図１４）。
以上のことから、本発明の抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて血液中ＰＴＸ３濃度が高まるにつれ、心疾患の程度、例えば冠動脈病変の程度が重篤になるという相関が認められた。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【配列表】
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