(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動ニューロン疾患の予防及び／または処置のために有用な医薬の調製のための、リルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種及び、ルミリセルゴールの、組み合わせ物の使用。
【請求項２】
ルミリセルゴール３０〜１２０重量部に対してリルゾール５０〜２００重量部を含む医薬の調製のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
同時の、別々のまたは時間を空けての使用のための医薬の調製のための、請求項１及び２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、幼児筋萎縮症、原発性側索硬化症の予防及び／または処置のための医薬の調製のための、請求項１〜３の１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、運動ニューロン疾患の予防及び／または処置における、ニセルゴリン及びルミリセルゴールから選択されたエルゴリン並びにリルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種、の組み合わせ物の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
リルゾールは筋萎縮性側索硬化症の処置のために市販されている。この化合物はまた、抗痙攣剤、抗不安薬及び催眠剤として（欧州特許第５０５５１号明細書）、精神分裂病の処置に（欧州特許第３０５２７６号明細書）、睡眠障害及びうつ病の処置に（欧州特許第３０５２７７号明細書）、脳血管障害の処置にそして麻酔剤として（欧州特許第２８２９７１号明細書）、脊髄、頭蓋または頭蓋脊髄外傷の処置に（国際公開第９４／１３２８８号パンフレット）、放射線回復促進剤として（国際公開第９４／１５６００号パンフレット）、パーキンソン氏病の処置に（国際公開第９４／１５６０１号パンフレット）、神経−ＡＩＤＳの処置に（国際公開第９４／２０１０３号パンフレット）、ミトコンドリア疾患の処置に（国際公開第９５／１９１７０号パンフレット）有用である。
【０００３】
ニセルゴリンもしくは（８β）−１０−メトキシ−１，６−ジメチルエルゴリン−８−メタノール−５−ブロモニコチネート（Sermion(R))はとりわけ、α−遮断性、α２−アドレナリン遮断性（CARPENE C.et al.,J.Pharmacol.,14,57-66(1983)）、抗虚血性（CAHN R. et al.,Chem.Abstracts,107,228784x(1987);UEDAT et al.,Chem.Abstaracts,118,225224f(1993)）、抗カルシウム性（TAKAHASI K. et al.,Br.J.Pharmacol.,100,705-710(1990)）、抗酸化性（TANAKA M.et al.,Neurosci.Let.,248,67-72(1998)）、抗血栓性（Chem.Abstracts,105,54314k(1986)）を示す。それは学習及び記憶能を高める（Chem. Abstracts,113,52358u(1990);Chem.Abstracts,111,108396h,1989;Chem.Abstracts,109,86208c,1988;Chem. Abstracts,106,12788e,1987;Chem.Abstracts,115,198237s,1991）。
【０００４】
ルミリセルゴールまたは１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンまたは１−メチル−１０α−メトキシ−９，１０−ジヒドロリセルゴールはニセルゴリンの代謝物の１種である（F.ARCAMONE et al.,Biochem.Pharmacol.,21(16)2205-2013(1972)）。この化合物はニセルゴリン様のしかしより軽度のα１−アドレナリン作用及び５ＨＴ１ａセロトニン作用性を示す。それは更にニセルゴリンの調製のための中間体として有用である（フランス特許第２，６１６，７８８号明細書）。
【０００５】
リルゾール及びニセルゴリンの組み合わせ物は痙攣性の処置に有用であることが既に記載されている（国際公開第００／３０６４３号パンフレット）。
【０００６】
インビトロで、何の栄養因子をも伴わずに培養された運動ニューロンは４８〜７２時間以内に死亡することが知られている（AG.ESTEVEZ et al.,J.Neurosci.,18(3),923-931(1998)及び18(10),3708-3714(1998)）。
【０００７】
更に、栄養因子除去により誘導されたニューロンの死亡は、運動ニューロンを星状細胞の単層上もしくは星状細胞から得た状態調節された培地の存在下で培養すると、一部抑制することができる。更に、運動ニューロンに対する栄養活性の星状細胞による生成はリルゾールにより促進される（H.PELUFFO et al.,Neuroscience letters,228,207-211(1997)）。
【０００８】
（発明の要約）
いまや、リルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種並びに、ニセルゴリン及びルミリセルゴールから選択されたエルゴリンの組み合わせ物は相乗的に作用し、星状細胞により分泌された栄養活性を著しく増加させることが見いだされた。従って、この組み合わせ物を運動ニューロン疾患の予防及び／または処置に使用することができる。
【０００９】
運動ニューロン疾患はとりわけ、筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、幼児筋萎縮症、原発性側索硬化症を含む。
【００１０】
使用された一般的なプロトコールはH.PELUFFO et al.,Neuroscience letters,228,207-211(1997)に記載されている。
【００１１】
（運動ニューロンの濃厚培養物）
運動ニューロンの濃厚培養物はR.L.SCHNAAR and A.E.SCHAFFNER,J.Neurosci.,1,204-217(1981)により記載され、W.CAMU and C.E.HENDERSON,J.Neurosci,Methods,44,59-70(1992)により修飾された遠心分離法を使用して調製する。運動ニューロンを、A.G.ESTEVEZ et al.,J.Neurosci.,18(3),923-931(1998)の方法に従って、ラミニン／オルニチンで前以てコートした培養皿上に、３５ｍｍの皿当たり２５００細胞の密度で、配置する。次に、培養物を、重炭酸ナトリウム（２２ｍＭ）、コナルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、プトレシン（０．１ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（３１ｎＭ）、グルコース（２０ｍＭ）、プロゲステロン（２１ｎＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬ１５培地（GIBCO BRL)中で維持する。
【００１２】
こうして得た運動ニューロンは長い分枝軸索をもつ、大きい（２５〜３０μＭ）、均一なニューロンから成る。細胞の７０％を越えるものがｐ７５神経栄養受容体及び脊髄運動ニューロンのためのマーカー小島（Islet）１／２に対して免疫反応性である。培養が栄養因子欠乏状態で実施される場合は、運動ニューロンの約７０％が皿添加後２４時間で、アポプトシスにより死亡する。
【００１３】
（脊髄星状細胞の培養）
星状細胞は、僅かに修正された（H.PELUFFO et al.,Neuroscience Letters,228,207-211(1997)）、神経化学の実施方法（A.J.TURNER and H.S.St JHON,IRL Press,Oxford-Washington DC,p27-63(1987)）におけるR.P.SANETO and J.DE VELLIS,の方法に従い、若い生後１日のWistarラットから得る。脊髄を殺菌法で切開し、髄膜及び背側の神経節を離し、切断し、その後、０．２５％のトリプシンを添加したＰＢＣ（リン酸バッファー生理食塩水、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、６．４５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4）中で、２５分間３７℃で培養する。酵素処理は、１０％のウシ胎児の血清（ＦＣＳ）を添加したドベルコの（Dubelcco's）修正イーグル（Eagle's）の培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌの添加により停止し、機械的溶解は１−ｍｌピペットの末端を使用して実施する。細胞を遠心分離により回収し、次に、ＦＣＳ１０％、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ中に培養培地２５ｃｍ2当たり１．５〜２×１０6個の細胞密度で皿に入れる。インビトロで３日後、培養物に毎日栄養を与える。細胞の可視の単層が完成すると、培養物を２５０ｒｐｍで４８時間撹拌し、単層を４８時間、チトシンアラビノシド（１０-5Ｍ）で処理する。こうして得た星状細胞の単層を培養培地中で４８時間維持し、次に２×１０4細胞／ｃｍ2の密度に増幅させる。
【００１４】
星状細胞の単層は神経膠の原繊維の酸性タンパク（ＧＦＡＰ）に対する免疫反応性により測定され、９８％を越える純度を示す。
【００１５】
（試験製品による星状細胞の処理）
試験製品による星状細胞の処理を以下の方法で実施する。エルゴリンを無水エタノール及び０．０１ＮのＨＣｌ中のリルゾールに溶解し、濾過滅菌し、調製直後に使用する。星状細胞の単層を２４時間、ビヒクルまたは試験製品の溶液にさらす。この培地を新鮮なＬ１５培地（Dubelco)中に１０倍に希釈して使用する。星状細胞の単層をＤＭＥＭで３回洗浄し、完全Ｌ１５培地で培養する。状態調整した星状細胞培地を２４時間後に取り出し、３分間２０００で遠心分離し、即座に使用するかまたは、栄養活性を損失せずに最高で２週間、−７０℃で貯蔵する。
【００１６】
運動ニューロンの免疫化学的標識のために、培養物を氷冷メタノール中に１５分間固定し、次に洗浄し、非特定部位をＰＢＳ中２％コウシ血清アルブメン（ＢＳＡ）＋０．１％のトリトンＸ１００でブロックする。培養物を室温で６０分間、神経フィラメントの２００ｋＤサブユニット（１：２００ Amersham)、繊維化された（biotylinated）ヤギ血清（１：１２５、Gibco）及びストレプタビジンペルオキシダーゼ（１：２００、Gibco）に対する抗体で継続して培養する。
【００１７】
（細胞の計数及び統計的分析）
神経フィラメントに免疫反応性で、細胞の直径より長い軸索を示す細胞は生存運動ニューロンであると考えられる。
【００１８】
運動ニューロン数は２００倍の倍率の顕微鏡下で０．４〜１ｃｍ2の表面積中の標識細胞を計数することにより評価する。全例において、値は栄養因子（ＢＤＮＦ）により維持された培養物中に存在する運動ニューロン数の百分率で表される。実験は少なくとも３回実施される。
【００１９】
統計的分析はスチューデント試験（ｔ−テスト）を使用して実施する。
【００２０】
得られた結果は以下である。リルゾール、ニセルゴリン及びルミリセルゴール単独及びそれらの組み合わせ物の、脊髄の星状細胞により生成される運動ニューロンの神経栄養活性に対する効果、
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これらの結果はリルゾールとニセルゴリンまたはリルゾールとルミリセルゴールの組み合わせ物が脊髄の星状細胞の単層により生成される運動ニューロンの栄養活性を相乗的に促進することを示す。
【００２１】
リルゾールは欧州特許第５０５５１号に記載の方法に従って調製することができる。
【００２２】
リルゾールの製薬学的に許容できる塩として、とりわけ、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸のような無機酸と、または酢酸、プロピオン酸、コハク酸、蓚酸、安息香酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸、テオフィリン酢酸、サリチル酸、フェノールフタリン酸、メチレン−ビス−β−オキシナフトエ酸のような有機酸との付加塩、あるいはこれらの誘導体の置換誘導体を挙げることができる。
【００２３】
ニセルゴリンは米国特許第３，２２８，９４３号明細書に従って調製することができる。
【００２４】
１，６−ジメチル−８β−ヒドロキシメチル−１０α−メトキシエルゴリンはフランス特許第２，６１６，７８８号明細書に記載の方法に従い調製することができる。
【００２５】
本発明はまた、純粋な状態または１種以上の、相容性で製薬学的に許容できる希釈剤及び／または補助剤との組み合わせ物の形態で、そして／または、場合によっては、もう１種の製薬学的に相容性で、生理学的に活性な製品と組み合わせて、リルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種及び、ニセルゴリン及びルミリセルゴールから選択されたエルゴリンとの組み合わせ物を含んで成る製薬学的組成物に関する。組み合わせ物を構成する製品は、組み合わせの最大の効果を得るために、同時に、別々にまたは時間をおいて投与することができる。
【００２６】
経口投与のための固形組成物としては、錠剤、ピル、末剤（ゼラチンカプセル、カシェ剤）または顆粒を使用することができる。これらの組成物においては、活性成分を、デンプン、セルロース、蔗糖、ラクトースまたはシリカのような１種以上の不活性な希釈剤とアルゴン流下で混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば１種以上の、ステアリン酸マグネシウムまたタルクのような潤滑剤、着色剤、コーティング（糖衣錠）またはグレーズを含んで成ることができる。
【００２７】
経口投与のための液体組成物としては、水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィン油のような不活性希釈剤を含む、製薬学的に許容できる液剤、懸濁液、エマルション、シロップ剤及びエリキシルを使用することができる。これらの組成物は希釈剤以外の物質、例えば湿潤化製品、甘味料、増粘剤、香料または安定剤を含んで成ることができる。
【００２８】
非経口投与のための滅菌組成物は好ましくは、水性または非水性の、懸濁液またはエマルションである液剤であることができる。溶媒またはビヒクルとしては、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、とりわけ、オリーブ油、注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルまたはその他の適した有機溶媒を使用することができる。これらの組成物はまた、補助剤、とりわけ湿潤化剤、等張剤、乳化剤、分散剤及び安定剤を含むことができる。滅菌は幾つかの方法で、例えば無菌濾過により、組成物中に殺菌剤を取り入れることにより、放射線照射によりまたは加熱により実施することができる。それらはまた、滅菌水またはあらゆる他の注射用滅菌溶媒中に、使用時に溶解することができる滅菌固形組成物の形態で調製することもできる。
【００２９】
直腸投与のための組成物は、活性製品に加えてココアバター、半合成グリセリドまたはポリエチレングリコールのような賦形剤を含む座薬または直腸カプセルである。
【００３０】
本発明はまた、運動ニューロン疾患及び、とりわけ筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、幼児筋萎縮症、原発性側索硬化症の予防及び／または処置に特に有用な医薬の調製のためのリルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種並びに、ニセルゴリン及びルミリセルゴールから選択されたエルゴリンの組み合わせ物の使用に関する。
【００３１】
本発明はまた、同時にまたは別々にまたは時間をおいてのいずれかで、リルゾールもしくはその製薬学的に許容できる塩の１種並びに、ニセルゴリン及びルミリセルゴールから選択されたエルゴリンの組み合わせ物を患者に投与することから成る、運動ニューロン疾患及び、とりわけ筋萎縮性側索硬化症、進行性脊髄筋萎縮症、幼児筋萎縮症、原発性側索硬化症を予防そして／または処置する方法に関する。
【００３２】
投与量は所望の効果、処置の期間及び使用される投与経路に依存し、それらは概括的にリルゾールに対しては１日に５０ｍｇ〜２００ｍｇで、ニセルゴリンまたはルミリセルゴールから選択されたエルゴリンに対しては、１日に３０ｍｇ〜１２０ｍｇである。
【００３３】
本発明はまた、５０〜２００重量部のリルゾールを３０〜１２０重量部の、ニセルゴリンまたはルミリセルゴールから選択されたエルゴリンに対して使用する、組み合わせ物に関する。