(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記式（１）：
【化１】
0005261172.tif 000012
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表されるＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、下記式（４）：
【化２】
0005261172.tif 000013
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表される（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、請求項１に記載のポリペプチド、又は、請求項６又は７に記載の形質転換体を作用させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロ又はスレオ体のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルは、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。光学活性なＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する方法としては、不飽和エステルからシャープレスジヒドロキシレーション反応を経て製造する方法が知られている（非特許文献１参照）。【０００３】
しかし、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、光学活性なＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する方法は見出されていない。
【非特許文献１】Monica Alonso et al、Organic Process Research & Development，9，690-693，2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上述の非特許文献１に開示された製造法とは異なる、新規なエリスロ又はスレオ体のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
（１）本発明の一つの特徴は、
下記式（１）：【０００６】
【化６】
0005261172.tif 000002
【０００７】
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表されるＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、該化合物を下記式（２）：【０００８】
【化７】
0005261172.tif 000003
【０００９】
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表されるエリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることによる、エリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法である。
（２）本発明の別の特徴は、前記式（１）で表されるＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレヴァンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オエルスコビア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）属、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、サツルニスポラ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、コリネスポラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ）属、プレクトスファエレラ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）属からなる群より選ばれる微生物、又は該微生物から得られるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な形質転換体を作用させることを特徴とする、前記式（２）で表されるエリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法である。
（３）本発明の別の特徴は、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、該化合物を下記式（３）：【００１０】
【化８】
0005261172.tif 000004
【００１１】
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表されるスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることによる、スレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法である。
（４）本発明の別の特徴は、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、エウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ホルモコミス（Ｈｏｒｍｏｃｏｍｉｓ）属からなる群より選ばれる微生物を作用させることを特徴とする、前記式（３）で表されるスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法である。
（５）本発明の別の特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである。
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、下記式(４)：【００１２】
【化９】
0005261172.tif 000005
【００１３】
（Ｒは、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である）
で表される（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチド。
（６）本発明の別の特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と６０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつ、前記Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）本発明の別の特徴は、前記ＤＮＡを含むベクターである。
（８）本発明の別の特徴は、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む前記ベクターである。
（９）本発明の別の特徴は、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。
（１０）本発明の別の特徴は、前記ポリペプチド、又は、前記形質転換体を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、エリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した有用な光学活性アルコールの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組換えベクターｐＮＢＤＧの作製法および構造を示す
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。【００１７】
１．Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステル
本発明の「Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステル」は、下記式（１）【００１８】
【化１０】
0005261172.tif 000006
【００１９】
で示される化合物であり、Ｒ基は、置換または無置換の、アルキル基またはアリール基である。アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャルブチル基などが挙げられる。また、アリール基の例としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。この化合物は、既存の化学的合成を組み合わせることにより合成できる。例えば、J. Org. Chem. 1982, 47, 2663とJ. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5139に記載の手法を用いて合成できる。【００２０】
２．エリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法
本発明の「エリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法」は、基質となるＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに、該化合物を立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることを特徴とする。その酵素源としては、微生物菌体、該微生物より得られるポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な形質転換体が挙げられる。【００２１】
本明細書で後述する各微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能である。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる。例えば、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。【００２２】
本製造方法に使用できる微生物は、特に限定されないが、エリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する場合は、例えば、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレヴァンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オエルスコビア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）属、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、サツルニスポラ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、コリネスポラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ）属、プレクトスファエレラ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）属の微生物などが挙げられる。【００２３】
さらに好ましい微生物としては、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、バシラス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、オエルスコビア・ターバタ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｂａｔａ）、パエニバシラス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、デバリオマイセス・ポリモルファス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、ピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・ミヌータ・バー・ノンファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａ ｘｙｌｏｓａ）、ロドトルーラ・グルティニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）、サツルニスポラ・サイトーイ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ ｓａｉｔｏｉ）、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ウィリオプシス・サターナス・バー・ムラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍｒａｋｉｉ）、コリネスポラ・カシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、プレクトスファエレラ・ククメリナ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ）などが挙げられる。【００２４】
具体的には、当業者が容易に入手可能な以下の、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）ＡＴＣＣ２１２１８、バシラス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＢＲＣ１２１９５、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１４５９３、バシラス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ３９５１、ブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＮＢＲＣ１２０７２、オエルスコビア・ターバタ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１５０１５、パエニバシラス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＮＢＲＣ１３２６４、キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＮＢＲＣ０７０５、デバリオマイセス・ポリモルファス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）ＡＴＣＣ２０２８０、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）ＮＢＲＣ０１２０、ピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ０９７５、ピキア・ミヌータ・バー・ノンファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ１４７３、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａ ｘｙｌｏｓａ）ＮＢＲＣ０９５０、ロドトルーラ・グルティニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０４１５、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）ＮＢＲＣ０１０４、サツルニスポラ・サイトーイ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ ｓａｉｔｏｉ）ＮＢＲＣ１１３４、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ０６７１、ウィリオプシス・サターナス・バー・ムラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍｒａｋｉｉ）ＮＢＲＣ０８９５、コリネスポラ・カシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）ＮＢＲＣ３００４９、プレクトスファエレラ・ククメリナ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ）ＮＢＲＣ３０００５などが挙げられる。【００２５】
本製造方法に使用できる微生物は、特に限定されないが、スレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する場合は、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、エウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ホルモコミス（Ｈｏｒｍｏｃｏｍｉｓ）属の微生物などが挙げられる。【００２６】
さらに好ましい微生物としては、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、モルガネラ・モルガニイ・サブエスピー・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、エメリセラ・アングイス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｕｎｇｕｉｓ）、エウペニシリウム・バーネンセ（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂａａｒｎｅｎｓｅ）、ホルモコミス・レシナエ（Ｈｏｒｍｏｃｏｍｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ）などが挙げられる。【００２７】
具体的には、当業者が容易に入手可能な以下の、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＮＢＲＣ１３５３４、モルガネラ・モルガニイ・サブエスピー・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＮＢＲＣ３１６８、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ３８３０、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１２３８０、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１４０８２、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）ＮＢＲＣ４４５２、エメリセラ・アングイス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｕｎｇｕｉｓ）ＮＢＲＣ８０８７、エウペニシリウム・バーネンセ（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂａａｒｎｅｎｓｅ）ＮＢＲＣ６０９０、ホルモコミス・レシナエ（Ｈｏｒｍｏｃｏｍｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ）ＮＢＲＣ６３６７などが挙げられる。【００２８】
本発明の製造方法に使用する微生物、および、該微生物から得られるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な形質転換体は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味し、上述のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する活性が残存する限りはこれに含まれる。本発明の製造方法に使用する微生物および形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００２９】
上述のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに微生物菌体を作用させることを特徴とする光学活性Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法の実施形態としては、後述しているＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチルに、上述のブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）を作用させる、エリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造法などが挙げられる（実施例１参照）。【００３０】
上述のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルに微生物より得られるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な形質転換体を作用させることを特徴とする光学活性Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法の実施形態としては、後述しているＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルに、上述のブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）より取得したポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた形質転換体を作用させる、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造法（実施例１０参照）、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルにキャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）より取得したポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた形質転換体を作用させる、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造法（実施例１１参照）、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルにピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）より取得したポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた形質転換体を作用させる、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造法（実施例１２参照）などが挙げられる。【００３１】
また、当業者であれば、これら以外の微生物においても、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する活性を有する微生物より、ポリペプチドの単離、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得、該活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する形質転換体の育種を実施することにより、ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する形質転換体を作用させることを特徴とするエリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法を実施することが可能である。【００３２】
３.ポリペプチド
本発明の「ポリペプチド」は、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド、好ましくはＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物などの生物から単離することができる。【００３３】
本発明のポリペプチドの実施形態としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。また、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の配列同一性を有し、かつ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等であり、本発明に含まれる。【００３４】
ここで配列の同一性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の配列同一性を有するポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの配列同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％であるポリペプチドを挙げることができる。【００３５】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を、上記の相同性検索プログラムＦＡＳＴＡを用いて相同性検索をしたところ、ストレプトマイセス・コエリコラ由来の推定酸化還元酵素と約５６％の配列同一性を示した。このストレプトマイセス・コエリコラ由来の酵素の機能はあくまでも推定であり、また、約５６％という低い配列同一性である。したがって、当業者の技術常識によれば、上記ストレプトマイセス・コエリコラ由来の酵素との相同性検索結果に基づいて、本発明の実施形態のポリペプチドが光学活性アルコールを生成する活性を有することは想到できないのが一般的である。【００３６】
このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。置換、挿入、欠失または付加を生じさせるアミノ酸の数は、実施形態のポリペプチドが備える活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０個以下であり、より好ましくは３０個以下であり、さらに好ましくは２０個以下であり、最も好ましくは１０個以下である。【００３７】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えば上述の２に示した微生物が挙げられ、好ましいものとしてはブレヴァンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとしてはブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。【００３８】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００３９】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。【００４０】
４．ＤＮＡ
本発明の「ＤＮＡ」は、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で本発明のＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明のＤＮＡを取得できる。【００４１】
まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００４２】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡを調製する。このＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。【００４３】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００４４】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの実施形態としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と一定値以上の配列同一性を有し、かつ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡと同等であり、本発明に含まれる。【００４５】
ここで塩基配列の同一性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つの塩基配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと一定値以上の配列同一性を有するＤＮＡとしては、当該ＤＮＡとの配列同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％であるＤＮＡを挙げることができる。【００４６】
さらに、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。さらに、配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。【００４７】
配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。【００４８】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。本明細書において記述されている、上記ＤＮＡの単離、および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００４９】
５．ベクター
本発明の「ベクター」は、適当な宿主細胞内で前記ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００５０】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、後述するｐＵＣＮ１８が好適に使用できる。【００５１】
前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００５２】
上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明のベクターの例としては、上記ｐＵＣＮ１８に配列番号１に示す塩基配列の６０３番目のＣがＴに変更された塩基配列からなるＤＮＡを導入した、後述するプラスミドｐＮＢＤを挙げることができる（実施例６参照）。【００５３】
６．宿主細胞
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００５４】
７．形質転換体
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味し、上述のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する活性が残存する限りはこれに含まれる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００５５】
本発明の形質転換体の例としては、後述するＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＢＤ）が挙げられる（実施例８参照）。【００５６】
８．光学活性アルコールの製造方法
本発明の「光学活性アルコール類の製造」は、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物と、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを導入された形質転換体を添加することにより実施できる。必要に応じて、ＮＡＤＨ等の補酵素を添加してもよい。反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例えば１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは例えば４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例えば０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。【００５７】
基質となる「カルボニル基を有する化合物」としては、例えば、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル等が挙げられるが、上述の反応条件において還元され、「光学活性アルコール」に変換されるものであれば、特に限定されない。【００５８】
反応で生じた光学活性アルコール類は、常法により精製できる。例えば、反応で生じた光学活性アルコール類を含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製できる。【００５９】
９．光学活性アルコールの製造方法の変形例
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体、カルボニル基を有する化合物、および、必要に応じてＮＡＤＨ等の補酵素を接触させ、反応させることにより、当該カルボニル基を有する化合物を不斉的に還元し、光学活性アルコール類を製造することができる。この時、当該反応の進行に伴い、ＮＡＤＨ等の補酵素は酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。【００６０】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクターｐＮＢＤにバシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、後述するｐＮＢＤＧが挙げられる（実施例７参照）。【００６１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、前記ｐＮＢＤＧでＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、後述するＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤＧ）が挙げられる（実施例８参照）。【００６２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００６３】
本発明のポリペプチドと、補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて光学活性アルコール類を製造する場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。その他、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体の両者を利用して上記光学活性アルコール類を製造してもよい。【００６４】
とりわけ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要がなく、光学活性アルコール類の製造を効率良く行うことができる。【００６５】
上述の反応条件において、本発明の実施形態の一つであるＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤＧ）を添加し、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルを基質とした場合、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルが得られる（実施例１０参照）。【００６６】
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペプチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、例えば（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の優れた製造法が提供される
【実施例】
【００６７】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００６８】
各実施例で説明する各微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能である。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる。具体的は、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。【００６９】
（合成例１）
ベンゾフェノンイミン18.1gにグリシンターシャルブチルエステル塩酸塩20gと塩化メチレン100mlを加えた後、室温で62時間攪拌した。蒸留水100mlで分液後、有機層を減圧濃縮乾燥し、グリシン誘導体28.8gを得た。この化合物のTHF溶液（140ml）を、-70℃のKOtBu 10.9gを含むTHF溶液（60ml）に滴下した。その後、この溶液を-78℃のシクロヘキサンカルボニルクロリド 14.2gを含むTHF溶液（50ml）に滴下した後、１時間攪拌した。これに1Mクエン酸 150mlを加え、室温で15時間攪拌した。減圧濃縮によりTHFを除き、酢酸エチルで抽出後、得られた水層にエタノール100ml、Na2CO3 61.7g、Boc2O 23.3gを加えた後、室温で2時間攪拌した。ろ過により白色固体を取り除き、ろ液を酢酸エチルで抽出後、有機層を減圧濃縮乾燥し、黄色油状物26.2gを得た。これをシリカゲルカラムで精製し、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチルエステル 7.5gを得た。【００７０】
（実施例１）バクテリア菌体を用いたエリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造
大型試験管に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地プレートで培養しておいた、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）ＡＴＣＣ２１２１８、バシラス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＢＲＣ１２１９５、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１４５９３、バシラス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ３９５１、ブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＮＢＲＣ１２０７２、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＮＢＲＣ１３５３４、モルガネラ・モルガニイ・サブエスピー・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＮＢＲＣ３１６８、オエルスコビア・ターバタ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１５０１５、パエニバシラス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＮＢＲＣ３３４３、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ３８３０、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１２３８０、ペクトバクテリウム・カロトボラム・サブエスピー・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１４０８２、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＮＢＲＣ１３２６４、の各菌体を一白金耳接種し、３０℃で２４〜７２時間振とう培養を行った。【００７１】
得られた各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させた。【００７２】
得られた菌体懸濁液１ｍｌを試験管に入れ、さらにグルコース５ｍｇ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチル０．５ｍｇを加えて、振とうしながら３０℃で２４時間反応させた。反応後、酢酸エチル１ｍｌを加えて抽出を行った。Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ／エリスロ比の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＧＬサイエンス株式会社製ＩｎｅｒｔＣＡＰ５（ＩＤ０．２５ｍｍ×３０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。その結果を表１に示した。【００７３】
表１：Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチルを不斉的に還元するバクテリア【００７４】
【表１】
0005261172.tif 000007
【００７５】
（実施例２）酵母菌体を用いたエリスロ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造
大型試験管に、グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4７ｇ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4１３ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．８ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６０ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ９０ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ５ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ１０ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、モルトエキス２００ｇ、寒天２０ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる寒天培地（ｐＨ７）で培養しておいた、キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＮＢＲＣ０７０５、デバリオマイセス・ポリモルファス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）ＡＴＣＣ２０２８０、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）ＮＢＲＣ０１２０、ピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ０９７５、ピキア・ミヌータ・バー・ノンファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ１４７３、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａ ｘｙｌｏｓａ）ＮＢＲＣ０９５０、ロドトルーラ・グルティニス・バー・ダイレネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ０４１５、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）ＮＢＲＣ０１０４、サツルニスポラ・サイトーイ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ ｓａｉｔｏｉ）ＮＢＲＣ１１３４、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ０６７１、ウィリオプシス・サターナス・バー・ムラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍｒａｋｉｉ）ＮＢＲＣ０８９５、の各菌体を一白金耳接種し、３０℃で２４〜７２時間振とう培養を行った。【００７６】
得られた各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させた。【００７７】
得られた菌体懸濁液１ｍｌを試験管に入れ、さらにグルコース５ｍｇ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチル０．５ｍｇを加えて、振とうしながら３０℃で２４時間反応させた。反応後、酢酸エチル１ｍｌを加えて抽出を行った。Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ／エリスロ比の測定は、実施例１と同様に行った。その結果を表２に示した。【００７８】
表２：Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチルを不斉的に還元する酵母【００７９】
【表２】
0005261172.tif 000008
【００８０】
（実施例３）カビ菌体を用いたエリスロ又はスレオ−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造
大型試験管に、グルコース１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、モルトエキス６０ｇ、寒天２０ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる寒天培地（ｐＨ６．２）で培養しておいたシルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）ＮＢＲＣ４４５２、エメリセラ・アングイス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｕｎｇｕｉｓ）ＮＢＲＣ８０８７、エウペニシリウム・バーネンセ（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂａａｒｎｅｎｓｅ）ＮＢＲＣ６０９０、ホルモコミス・レシナエ（Ｈｏｒｍｏｃｏｍｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ）ＮＢＲＣ６３６７、コリネスポラ・カシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）ＮＢＲＣ３００４９、プレクトスファエレラ・ククメリナ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ）ＮＢＲＣ３０００５、の各菌体を一白金耳接種し、３０℃で２４〜７２時間振とう培養を行った。【００８１】
得られた各培養液からろ過により菌体を集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させた。【００８２】
得られた菌体懸濁液１ｍｌを試験管に入れ、さらにグルコース５ｍｇ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチル０．５ｍｇを加えて、振とうしながら３０℃で２４時間反応させた。反応後、酢酸エチル１ｍｌを加えて抽出を行った。Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ／エリスロ比の測定は、実施例１と同様に行った。その結果を表３に示した。【００８３】
表３：Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸ターシャルブチルを不斉的に還元するカビ【００８４】
【表３】
0005261172.tif 000009
【００８５】
（実施例４）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、ブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株より、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。【００８６】
Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルに対する還元活性は、以下のように算出した。まず、試験管に適量の粗酵素液と１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて、総量で０．５ｍｌにする。さらにＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル０．２５ｍｇ、ＮＡＤＨ１ｍｇを加えて、振とうしながら３０℃で２時間反応させた。反応後、酢酸エチル１ｍｌを加えて抽出を行った。生成したＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＧＬサイエンス株式会社製ＩｎｅｒｔＣＡＰ５（ＩＤ０．２５ｍｍ×３０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。生成したＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの量から酵素活性を算出した。なお、本反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを生成する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。【００８７】
（微生物の培養）
５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）３Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株の培養液を１５ｍｌ接種し、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量０．９ＮＬ／ｍｉｎ、３０℃で１６時間培養を行った。【００８８】
（無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．８％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。【００８９】
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記の無細胞抽出液を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．３Ｍまで）により活性画分を溶出させた。【００９０】
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１.０Ｍとなるよう硫酸アンモニウム及び終濃度１０％となるようにグリセリンを溶解し、１.０Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％のグリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（５０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１.０Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。【００９１】
（５'−ＡＭＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した５'−ＡＭＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（１４ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから２Ｍまで）により活性画分を溶出させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。【００９２】
（実施例５）  遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作製）
実施例４で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５'−TGGGARATHGAYCTNGGNGA−３'（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５'−GGNGTRTCDATRTANCCYGG−３'（配列表の配列番号４）を合成した。【００９３】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例４と同様に培養したブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株の菌体からG NOMER DNA KIT（B-BIO gene社製）を用い、取り扱い説明書に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてダイレクトシーケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。【００９４】
（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１に示した。ｉ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。【００９５】
（実施例６）  発現ベクターの構築
プライマー３：５'−AGGACAAGCATATGGATCACGACTTCGCAGGC−３'（配列表の配列番号６）、プライマー４：５'−CAGGGTGAATTCTTACTATTGCGCCGTATATCCG−３'（配列表の配列番号７）、プライマー５：５'−AGTGCGACGATCCCGTCAAATTCCTCCTGGCTGAC−３'（配列表の配列番号８）プライマー６：５'−GTCAGCCAGGAGGAATTTGACGGGATCGTCGCACT−３'（配列表の配列番号９）を用い、実施例５で得たブレヴァンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマー３と５の組合せ、及び、プライマー４と６の組合せで、それぞれ約０．６ｋｂｐ、０．２ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡが得られた。次に、これらの二本鎖ＤＮＡを混合したものを鋳型として、プライマー３と４の組合せでＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１に示す塩基配列の６０３番目のＣがＴに改変されＥｃｏＲＩサイトが破壊された塩基配列からなる遺伝子で、その開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＤを構築した。なお、ここで用いた１８５番目のＴ、及び、４７１−４７２番目のＧＣの記載は、GenBank Accession No. L09136の記載に従った。【００９６】
（実施例７）  グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー７：５'−CAGGAGCTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAAG−３'（配列表の配列番号１０）と、プライマー８：３'−CACGGATCCTTATCCGCGTCCTGCTTGG−５'（配列表の配列番号１１）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)に記載の方法で調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株（ＩＡＭカルチャーコレクション（〒１１３-００３２  東京都文京区弥生１−１−１）から入手できる）由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＳａｃＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＢａｍＨＩ認識部位が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、実施例６記載のプラスミドｐＮＢＤのｌａｃプロモーターの下流のＳａｃＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＤＧを構築した。ｐＮＢＤＧの作製法および構造を図１に示す。【００９７】
（実施例８）  形質転換体の作製
実施例６で構築した組換えベクターｐＮＢＤを用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤ）を得た。【００９８】
また、同様に、実施例７で構築した組換えベクターｐＮＢＤＧを用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤＧ）を得た。【００９９】
（実施例９）  形質転換体における遺伝子の発現
実施例８で得た２種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む形質転換体であるＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル還元活性、および、ＧＤＨ活性を測定し、比活性として表したものを、表４に示した。【０１００】
表４：無細胞抽出液の比活性【０１０１】
【表４】
0005261172.tif 000010
【０１０２】
表４に示すように実施例８で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル還元活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤＧ）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル還元活性は、実施例４に記載の方法で測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【０１０３】
（実施例１０）  形質転換体を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造
実施例９と同様に培養したＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＤＧ）の培養液５ｍｌに、グルコース２５ｍｇ、ＮＡＤ１ｍｇ、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル１０ｍｇを添加し、３０℃で４０時間攪拌した。反応８、２８時間経過後にＮＡＤ１ｍｇを追添加した。４０時間目の変換率は９７％であった。【０１０４】
反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。遠心によって硫酸ナトリウムを除去し、減圧下有機溶媒を留去して、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを得た。このものの光学純度は、スレオ：エリスロ比＝１．５：９８．５、９９％ｅｅ以上であった。【０１０５】
Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの定量およびスレオ／エリスロ比の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＧＬサイエンス株式会社製ＩｎｅｒｔＣＡＰ５（ＩＤ０．２５ｍｍ×３０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。また、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの光学純度の測定は、トリフルオロ酢酸無水物で処理した後、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：東京化成工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡ（ＩＤ０．２５ｍｍ×２０ｍ）、カラム温度：１２０℃、キャリアガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。
（実施例１１）  形質転換体を用いた（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造
形質転換体としてキャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）から取得したポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた形質転換体Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（国際公開第ＷＯ０１／０４０４５０号公報記載の方法で調製可能）を用いること、およびＮＡＤの代わりにＮＡＤＰを用いること以外は実施例１０と同様に実施した。その結果、４０時間目の変換率は５５％であり、得られた（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの光学純度は、スレオ：エリスロ比＝１５：８５、９９％ｅｅ以上であった。
（実施例１２）  形質転換体を用いた（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造
形質転換体としてピキア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）から取得したポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた形質転換体Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５Ｇ１）（国際公開第ＷＯ２００６−０１３８０１号公報記載の方法で調製可能）を用いること、およびＮＡＤの代わりにＮＡＤＰを用いること以外は実施例１０と同様に実施した。その結果、４０時間目の変換率は９７％であり、得られた（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの光学純度は、スレオ：エリスロ比＝０：１００、９９％ｅｅ以上であった。
（実施例１３）  ポリペプチドの基質特異性
０．４％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度２ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．１６７ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例４で調製した精製ポリペプチドを適当量添加し、３０℃で３分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これをＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表５に示した。表５から明らかなように本発明の実施形態としてのポリペプチドは、広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。
表５：カルボニル化合物に対する還元活性【０１０６】
【表５】
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【図１】
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【配列表】
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