(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンが結合していない直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩の、同ペプチドまたは同生理学的に許容されるその塩を必要とする動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療のための医薬の製造における使用方法であって、前記ペプチドは配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかである使用方法。
【請求項２】
動物の虚血組織または器官が再潅流される請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
動物は脳血管虚血に罹患しており、虚血組織は動物の脳に位置する請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
動物は心血管虚血に罹患しており、虚血組織は動物の心臓に位置する請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
ペプチドが再潅流の前か、再潅流と同時か、再潅流の後か、またはそれらを組み合わせた時に投与される請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
金属イオンが結合していない直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩の、同ペプチドまたは同生理学的に許容されるその塩を必要とする動物において金属イオン濃度を減少させる医薬の製造における使用方法であって、前記ペプチドは配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかである使用方法。
【請求項７】
外傷のために前記動物は前記ペプチドまたは前記生理学的に許容されるその塩を必要とする請求項６に記載の使用方法。
【請求項８】
前記動物が神経変性疾病に罹患しているために、前記動物は前記ペプチドまたは前記生理学的に許容されるその塩を必要とする請求項６に記載の使用方法。
【請求項９】
前記動物が炎症または炎症性疾患もしくは炎症性症状に罹患しているために、前記動物
は前記ペプチドまたは前記生理学的に許容されるその塩を必要とする請求項６に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記動物が癌の治療のために、前記動物は前記ペプチドまたは前記生理学的に許容されるその塩を必要とする請求項６に記載の使用方法。
【請求項１１】
金属イオンが結合していない直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩の、動物から除去した器官または組織における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療のための医薬の製造における使用方法であって、前記ペプチドは配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかである使用方法。
【請求項１２】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ1はアルキル、アリール、またはヘテロアリールである；請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が、
非ペプチド性金属結合官能基である置換基で置換され、該非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
ペプチドが配列表の配列番号１，３，６に記載のペプチドのいずれかであり、該ペプチドのＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ配列の部分が以下の式のうちの１つを有する請求項１３に記載の方法。
【化１】
0005349722.tif 000013
（式中、
Ｒ1はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ3はＨ、非ペプチド性金属結合官能基であるか、または２つのＲ3基が共に非ペプチド性金属結合官能基を形成し、
前記非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである）
【請求項１５】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物は、医薬として許容される担体と、金属イオンが結合していない直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩とを含有し、前記ペプチドは配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかであり、
前記ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ1はアルキル、アリール、またはヘテロアリールである、医薬組成物。
【請求項１６】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が、
非ペプチド性金属結合官能基である置換基で置換され、該非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療用の医薬組成物であって、医薬として許容される担体と、金属イオンが結合していない以下の式のうちの１つを有する直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩とを含有する医薬組成物。
【化２】
0005349722.tif 000014
（式中、
Ｒ1はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ3はＨ、非ペプチド性金属結合官能基であるか、または２つのＲ3基が共に非ペプチド性金属結合官能基を形成し、
前記非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである）
【請求項１９】
局所投与用に組成されている請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2である請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ローション、ゲル、クリーム、軟膏、またはペーストである請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
粉末、スプレー、エーロゾル、吸入剤、または滴剤である請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療用のキットであって、該キットは、金属イオンが結合していない直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩を保持する容器を備えており、前記ペプチドは配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかであり、
前記ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ1はアルキル、アリール、またはヘテロアリールである、キット。
【請求項２４】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2である請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が、
非ペプチド性金属結合官能基である置換基で置換され、該非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療用のキットであって、金属イオンが結合していない以下の式のうちの１つを有する直鎖の金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩を保持する容器を備えたキット。
【化３】
0005349722.tif 000015
（式中、
Ｒ1はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ3はＨ、非ペプチド性金属結合官能基であるか、または２つのＲ3基が共に非ペプチド性金属結合官能基を形成し、
前記非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである）
【請求項２７】
前記ペプチドが動物への局所投与用に組成されている請求項２３に記載のキット。
【請求項２８】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2である請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ローション、ゲル、クリーム、軟膏、またはペーストである請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
粉末、スプレー、エーロゾル、吸入剤、または滴剤である請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３１】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療に使用するための、配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかである金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩。
【請求項３２】
ペプチドの−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を生成するよう置換され、
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ1はアルキル、アリール、またはヘテロアリールである；請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
医薬として許容される担体と、請求項３１に記載のペプチドとを含有する医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３１に記載のペプチドを保持する容器を備えたキット。
【請求項３５】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療用の、配列表の配列番号１，３，４，５，６に記載のペプチドのいずれかであるペプチドであって、
該ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が、
非ペプチド性金属結合官能基である置換基で置換され、該非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである、ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩。
【請求項３６】
動物における虚血または虚血性の病気もしくは疾患の治療に使用するための、以下の式のうちの１つを有するペプチド。
【化４】
0005349722.tif 000016
（式中、
Ｒ1はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、Ｎ（Ｒ1）2、−ＯＲ1、またはＲ1であり；
Ｒ3はＨ、非ペプチド性金属結合官能基であるか、または２つのＲ3基が共に非ペプチド性金属結合官能基を形成し、
前記非ペプチド性金属結合官能基は、ポリアミン、ビシナル二酸、ポリアミノポリカルボン酸、ビシナルポリヒドロキシル、ビスピリジルエチルアミン、フェナントロリン、ポルフィリン、大環状キレート化剤、ジチオカルバメート、またはヒドロキシピリドンである）
【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の属する技術分野）
本発明は、活性酸素種（ＲＯＳ）が与える分子の損傷、細胞の損傷、および組織の損傷を減少させる方法に関する。本発明は、金属イオン（特に、Ｃｕ（II））に結合する一定の化合物、特に一定のペプチドおよびペプチド誘導体にも関する。本発明の化合物による金属イオンの結合は、ＲＯＳの形成および／または蓄積を阻害し、および／またはＲＯＳが与える損傷を化合物自身に向けさせる（即ち、本発明の化合物は、犠牲的抗酸化剤として作用し得る）。
【０００２】（背景）
活性酸素種（ＲＯＳ）としては、フリーラジカル（例えば、スーパーオキシドアニオン、並びにヒドロキシル、ペルオキシル、およびアルコキシルラジカル）、および非ラジカル種（例えば、一重項酸素および過酸化水素）が挙げられる。ＲＯＳは、甚大な細胞損傷および組織損傷を引き起こす可能性があり、それらは、様々な疾患および病気において重要な役割を果たしていることが報告されている。実際に、ＲＯＳは、１００種を超える疾患および病的状態に関与しており、ＲＯＳは、全てのヒト疾患に関与する一般的病理メカニズムを構成する可能性があると推測されている。Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995)。ＲＯＳ、それらの形成、それらが細胞および組織損傷を引き起こすメカニズム、並びに数多くの疾患および障害におけるそれらの関与を説明するレビューとしては、例えば、Manso, Rev. Port. Cardiol., 11. 997-999 (1992); Florence, Aust. N Z J. Opthalmol., 23, 3-7 (1992); Stohs, J. Basic Clin. Physiol Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Knight, Ann. Clin. Lab. Sci., 25, 111-121 (1995); Kerr et al., Heart & Lung, 25, 200-209 (1996); Roth, Acta Chir. Hung., 36, 302-305 (1997)を参照されたい。
【０００３】  虚血／再潅流は、世界中の疾病の第一因である。酸素を心臓に供給する身体能力が損なわれる心血管虚血は、米国での疾病および死亡の第一因である。脳虚血は、大脳血管障害（卒中）の前兆であり、米国での死亡原因の第三位である。虚血は、その他の臓器（例えば、腎臓、肝臓、肺、および腸管）、採取した器官（例えば、移植または研究用に採取した器官（例えば、潅流器官モデル））、および血流を遮断する手術の結果（開心術および冠動脈バイパス術）でも起こる。虚血は、一臓器に限定する必要はなく、それは、より全身的にもなり得る（例えば出血性ショックの場合）。
【０００４】  細胞および組織損傷は、虚血時に酸素欠乏の結果として起こる。しかし、虚血時に起こる損傷は、虚血組織および器官の再潅流時に起こる重度の損傷と比較すると、一般的に軽度である。例えば、Manso, Rev. Port. Cardiol., 11. 997-999 (1992); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Knight, Ann. Clin. Lab. Sci., 25, 111-121 (1995); Kerr et al., Heart & Lung, 25, 200-209 (1996); Roth, Acta Chir. Hung., 36, 302-305 (1997) を参照されたい。ＲＯＳは、虚血組織および臓器の再潅流により引き起こされる重度損傷の原因であることが報告されている。例えば、Manso, Rev. Port. Cardiol., 11. 997-999 (1992); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Knight, Ann. Clin. Lab. Sci., 25, 111-121 (1995); Kerr et al., Heart & Lung, 25, 200-209 (1996); Roth, Acta Chir. Hung., 36, 302-305(1997) を参照されたい。
【０００５】  金属イオン（主に、遷移金属イオン）は、ＲＯＳの生成および蓄積を引き起こす可能性がある。詳細には、貯蔵部位から放出された銅および鉄イオンは、損傷（虚血／再潅流傷害、並びに加熱、低温、外傷、過剰な運動、毒物、放射能、および感染による傷害など）後のＲＯＳの生成の主原因の一つである。Roth, Acta Chir. Hung., 36, 302-305 (1997)。銅および鉄イオンに加え、その他の遷移金属イオン（例えば、バナジウムおよびクロムイオン）がＲＯＳの生成を触媒することが報告されている。例えば、Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Halliwell et al., Free Radicals In Biology And Medicine, pages 1-19 (Oxford University 1989); Marx et al., Biochem. J., 236, 397-400 (1985); Quinlan et al., J. Pharmaceutical Sci., 81, 611-614 (1992) を参照されたい。その他の遷移金属イオン（例えば、カドミウム、水銀、およびニッケルイオン）およびその他の金属イオン（例えば、ヒ素および鉛イオン）は、自然な抗酸化的保護システムの一部の分子を枯渇させ、それによりＲＯＳの蓄積増加を引き起こすことが報告されている。例えば、Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995)を参照されたい。遊離銅イオンが、本質的にいずれかのタンパク質のアミノ基に非特異的に結合することは報告されているが（Gutteridge et al., Biochim. Biophys. Acta, 759, 38-41 (1983)）、タンパク質に結合する銅イオンは、少なくとも銅イオンが結合するタンパク質に損傷を与えるＲＯＳの生成をも引き起こす可能性がある。例えば、Gutteridge et al., Biochim. Biophys. Acta, 759, 38-41 (1983); Marx et al., Biochim. J., 236, 397-400 (1985); Quinlan et al., J. Pharmaceutical Sci., 81, 611-614 (1992) を参照されたい。
【０００６】  アルブミンは、細胞外抗酸化剤として特徴づけられている。例えば、Halliwell and Gutteridge, Arch. Biochim. Biophys., 280, 1-8 (1990); Das et al., Methods Enzymol., 233, 601-610 (1994); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Dunphy et al., Am. J. Physiol., 276, H1591-H1598 (1999)を参照されたい。アルブミンの抗酸化性は、アルブミンによる多くの生理学的機能の幾つか（アルブミンによる、金属（特に銅イオン）ヘの結合能力、脂肪酸への結合能力、ステロイドヘの結合およびステロイドの輸送能力、ビリルビンへの結合およびビリルビンの輸送能力、ＨＯＣｌの除去能力など）によるものである。例えば、Halliwell and Gutteridge, Arch. Biochem. Biophys., 280, 1-8 (1990); Halliwell and Gutteridge, Arch. Biochem. Biophys., 246, 501-514 (1986); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Dunphy et al., Am. J. Physiol., 276, H1591-H1598 (1999) を参照されたい。アルブミンは、数個の金属結合部位（Ｎ末端のものを含む）を含有している。いくつかのアルブミン（ヒト、ラット、およびウシ血清アルブミンなど）のＮ末端金属結合部位は、Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）に対して高い親和性を示し、これらの金属イオンの高親和性結合に関与するアミノ酸が同定されている。Laussac et al., Biochem., 23, 2832-2838 (1984); Predki et al., Biochem. J., 287, 211-215 (1992); Masuoka et al., J., Biol. Chem., 286, 21533-21537 (1993) を参照されたい。高親和性のＮ末端部位以外の金属結合部位でアルブミンに結合する銅は、フリーラジカルを生成し、これが「緩い」金属結合部位の位置により指定された部位でアルブミンに甚大な損傷を引き起こすことが報告されている。その結果、アルブミンは「犠牲的抗酸化物質」として特徴づけられている。Ma rx et al., Biochem. J., 236, 397-400 (1985); Halliwell et al., Free Radicals In Biology And Medicine, pages 1-19 (Oxford University 1989); Halliwell and Gutteridge, Arch. Biochem. Biophys., 280, 1-8 (1990); Quinlan et al., J. Pharmaceutical Sci., 81, 611-6 14 (1992) を参照されたい。
【０００７】  前述の事柄にも関わらず、脳虚血のための治療としてアルブミンを使用する試みは、まちまちの結果を示した。アルブミンは、脳虚血の動物モデルで神経保護性であることも、そうでないことも報告されている。Huh et al., Brain Res., 804, 105-113 (1998) およびRemmers et al., Brain Res., 827, 237-242 (1999) を、Little et al., Neurosurgery, 9 552-558 (1981) およびBeaulieu et al., J. Cereb. Blood Flow. Metab., 18, 1022-1031 (1998) と比較されたい。
【０００８】  まちまちな結果は、摘出心臓を保存する心停止液中にアルブミンを利用した場合にも得られている。Dunphy et al., Am. J. Physiol., 276, H1591-H1598 (1999) に報告されているように、摘出心臓を保存する標準的心停止液へのアルブミンの添加は、２４時間その溶液で潅流した心臓の機能を改善しなかった。アルブミンおよび複数の増強剤（インシュリン、ＡＴＰ、コルチコステロン、およびピルビン酸）を含有する心停止液で潅流した場合、心臓の機能改善が実証された。増強剤のみ、そしてアルブミンのみでは、心臓機能は有意に改善されなかったため、これは相乗効果であった。アルブミンを含有する心停止液を用いて心臓機能が改善されたという、より初期の報告も、増強剤とアルブミンの相乗作用に起因していた。Dunphy et al., Am. J. Physiol., 276, H1591-H1598 (1999) の最終段落、およびそこに引用されたHisatomi et al., Transplantation, 52, 754-755 (1991)を参照されたい。別の研究では、アルブミンを含有する心停止液で潅流した心臓は、アルブミンを含有しない溶液と比較すると、用量相関的に潅流傷害を増加させた。Suzer et al., Pharmacol. Res., 37, 97-101 (1998)。Suzer et al., は、彼等の研究および他者の研究に基づき、アルブミンが心臓保護にとって有効であるとは示されなかったと結論づけている。彼等は更に、アレルギー反応の可能性および血液製剤使用に関連するリスクから、心停止液中でのアルブミンの使用が危険となり得ることを言及している。
【０００９】  最後に、アルブミンは、抗酸化剤として特徴づけられたが、小グリア細胞によるスーパーオキシドアニオン生成を増加させることも報告されている（Si et al., GLIA, 21, 413-418 (1997) ）。この結果は、著者らを、「特定の傷害で崩壊された血液脳関門から漏出したアルブミンが、小グリア細胞によるスーパーオキシドアニオンの生成を増加させ、そしてこのスーパーオキシドアニオンの生成増加が、脳虚血／再潅流での神経損傷および一部の神経変性疾患の病因を担う」という推測に導いた。
【００１０】  上に言及したように、複数のアルブミンのＮ末端金属結合部位は、Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）に対して高い親和性を示す。これらの部位は、詳細にわたって研究されており、一般的なアミノ末端のＣｕ（II）−およびＮｉ（II）−結合（ＡＴＣＵＮ）モチーフが同定されている。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい。ＡＴＣＵＮモチーフは、Ｎ末端の遊離−ＮＨ2と、第３位のヒスチジン残基と、２つの介在するペプチドの窒素とを有するタンパク質またはペプチドに存在すると定義することができる。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい。このようにＡＴＣＵＮモチーフは、ペプチド配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｈｉｓ（式中、Ｘａａは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸である）により与えられる。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい。Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）は、わずかに歪んだ正方形平面構成のＡＴＣＵＮモチーフの３つのアミノ酸により提供される４つの窒素（遊離−ＮＨ2 の窒素、２つのペプチドの窒素、およびヒスチジンのイミダゾールの窒素）により結合される。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい。ＡＴＣＵＮモチーフを構成する３つのアミノ酸の側鎖基が、Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）の結合に関与する可能性があり、これら３つのＮ末端アミノ酸の近傍のアミノ酸も、これらの金属イオンの結合に影響を有する可能性がある。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997); Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 906-914 (1997)を参照されたい。例えば、ヒト血清アルブミンのＮ末端金属結合部位の配列は、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］であり、Ｎ末端ＡｓｐおよびＬｙｓ残基の自由側鎖カルボキシルが、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓにより提供される４つの窒素に加えて、Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）の結合に関与することが報告されている。Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997);Laussac et al., Biochem., 23, 2832-2838 (1984); およびSadler et al., Eur. J. Biochem, 220, 193-200 (1994)を参照されたい。
【００１１】  ＡＴＣＵＮモチーフは、アルブミン以外の天然タンパク質および非天然ペプチドでも見出されており、ＡＴＣＵＮモチーフを含むタンパク質が合成されている。例えば、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997); Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 906-914 (1997); Mlynarz et al., Speciation 98: Abstract, http://www.jate. u-szeged. hu/~spec98/abstr/mlynar.htmlを参照されたい。ＡＴＣＵＮ含有ペプチドおよびタンパク質のＣｕ（II）およびＮｉ（II）複合体は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を示すことが報告されている。Cotelle et al., J. Inorg. Biochem., 46, 7-15 (1992); Ueda et al., J. Inorg. Biochem., 55, 123-130 (1994)を参照されたい。ＳＯＤ活性のそれらの報告にも関わらず、これらの複合体は、ＤＮＡ、タンパク質、およびその他の生体分子を損傷するフリーラジカルを生成する。Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997); Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 915-21 (1997); Ueda et al., Free Radical Biol. Med. 18, 929-933 (1995); Ueda et al., J. Inorg. Biochem., 55, 123-130 (1994); Cotelle et al., J. Inorg Biochem., 46, 7-15 (1992)を参照されたい。その結果、インビボでの銅およびニッケルの有害な作用の少なくとも一部は、損傷性のフリーラジカルの生成を引き起こすＡＴＣＵＮ含有タンパク質へのＣｕ（II）およびＮｉ（II）の結合によるものであると仮定された。Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997); Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 915-921 (1997); Cotelle et al., J. Inorg. Biochem., 46, 7-15 (1992) を参照されたい（Koch et al., Chem. & Biol., 4, 549. 60 (1997) を比較）。ＡＴＣＵＮ含有ペプチドのＣｕ（II）複合体により生み出される損傷効果が、インビトロで癌細胞を殺傷するため、そしてインビボで抗腫瘍効果を生み出すために、利用されている。Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい。
【００１２】（発明の概要）
本発明は、動物に活性酸素種（ＲＯＳ）が与える損傷を減少させる方法を提供する。その方法は、有効量の、式Ｐ1 −Ｐ2 を有する金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩を、該動物に投与する工程から成る。
【００１３】  本発明は更に、動物から取り出した組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させる方法を提供する。この方法は、有効量のペプチドＰ1 −Ｐ2 または生理学的に許容されるその塩を含有する溶液に、組織または器官を接触させることを含む。
【００１４】  本発明は、金属濃度の低下を必要とする動物の金属濃度を低下させる方法も提供する。その方法は、有効量の、式Ｐ1 −Ｐ2 を有する金属結合ペプチドまたは生理学的に許容されるその塩を、動物に投与することを含む。
【００１５】  本発明は、医薬として許容される担体およびペプチドＰ1 −Ｐ2 または生理学的に許容されるその塩を含有する医薬組成物も提供する。
加えて本発明は、動物から取り出した組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させるためのキットを提供する。そのキットは、ペプチドＰ1 −Ｐ2 を保持する容器を含む。
【００１６】  式Ｐ1 −Ｐ2 において：
Ｐ1 は、Ｘａａ1  Ｘａａ2  Ｈｉｓ、またはＸａａ1  Ｘａａ2  Ｈｉｓ  Ｘａａ3 であり、
Ｐ2 は、（Ｘａａ4）n である。
【００１７】  Ｘａａ1 は、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、またはα−ヒドロキシメチルセリン（ＨＭＳ）である。Ｘａａ1 は、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＨＭＳである。より好ましくは、Ｘａａ1 は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。最も好ましくは、Ｘａａ1 は、Ａｓｐである。
【００１８】  Ｘａａ2 は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、またはＨＭＳである。Ｘａａ2 は、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、またはＨＭＳである。より好ましくは、Ｘａａ2 は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＨＭＳである。より好ましくは、Ｘａａ2 は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＨＭＳである。最も好ましくは、Ｘａａ2 は、Ａｌａである。
【００１９】  Ｘａａ3 は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｒｐであり、好ましくはＬｙｓである。
Ｘａａ4 は、任意のアミノ酸である。
最後にｎは、０〜１００、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜５、最も好ましくは０である。
【００２０】  好ましい実施形態において、β−Ａｌａが存在する場合にはβ−Ａｌａ以外のＰ1 のアミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸である。好ましくは、Ｄ−アミノ酸は、Ｘａａ1 、Ｈｉｓ、またはその両方である。最も好ましくは、β−Ａｌａ以外のＰ1 のアミノ酸は全て、Ｄ−アミノ酸である。別の好ましい実施形態において、β−Ａｌａ以外のＰ1 のアミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸であり、Ｐ2 のアミノ酸の少なくとも５０％も、Ｄ−アミノ酸である。最も好ましくは、Ｐ2 のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である。
【００２１】  別の好ましい実施形態において、Ｐ1 および／またはＰ2 の少なくとも１つのアミノ酸は、（ａ）金属イオンに結合するＰ1 の能力を変化させることなくペプチドの親油性を増大させる置換物、（ｂ）金属イオンに結合するＰ1 の能力を変化させることなくペプチドをタンパク質分解酵素から保護する置換物、または（ｃ）金属イオンに結合するペプチドの能力を改善する非ペプチド金属結合官能基である置換物、で置換されている。
【００２２】  本発明は、動物にＲＯＳが与える損傷を減少させる別の方法を提供する。その方法は、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた有効量の金属結合ペプチド（ＭＢＰ）を該動物に投与する工程から成る。金属結合ペプチドＭＢＰは、Ｐ1 −Ｐ2 ではない、いずれの金属結合ペプチドであってもよい。
【００２３】  本発明は更に、動物から取り出した組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させる別の方法を提供する。この方法は、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた有効量の金属結合ペプチドＭＢＰを含有する溶液に、組織または器官を接触させる工程から成る。
【００２４】  本発明は、金属濃度の減少が必要な動物の金属濃度を低下させる別の方法も提供する。その方法は、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた有効量の金属結合ペプチドＭＢＰを、該動物に投与する工程から成る。
【００２５】  本発明は、医薬として許容される担体と、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた金属結合ペプチドＭＢＰとを含有する医薬組成物も提供する。
本発明は、動物から取り出した組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させるためのキットも提供する。そのキットは、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた金属結合ペプチドＭＢＰを保持する容器を含む。
【００２６】  本発明は、動物に活性酸素種（ＲＯＳ）が与える損傷を減少させる更に別の方法を提供する。その方法は、有効量の式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 （式中、各Ｐ3 は、同じであっても異なっていてもよく、金属イオンと結合し得るペプチドであり、Ｌは、Ｃ末端アミノ酸を介して２つのＰ3 ペプチドに結合する化学基である）の金属結合ペプチド二量体を、動物に投与することを含む。好ましい実施形態において、２つのＰ3 ペプチドの一方または両方は、Ｐ1 である。
【００２７】  本発明は更に、動物から取り出した組織または器官でＲＯＳによりもたらされる損傷を減少させる方法を提供する。この方法は、有効量の式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 の金属結合ペプチド二量体を含有する溶液に、組織または器官を接触させる工程から成る。
【００２８】  本発明は、金属濃度の低下が必要な動物の金属濃度を低下させる方法も提供する。その方法は、式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 の有効量の金属結合ペプチド二量体を、動物に投与する工程から成る。
【００２９】  本発明は、医薬として許容される担体、および式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 の金属結合ペプチド二量体を含む医薬組成物も提供する。
加えて本発明は、動物から取り出した組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させるためのキットを提供する。そのキットは、式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 の金属結合ペプチド二量体を保持する容器を備える。
【００３０】  加えて本発明は、式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 を有するペプチド、または生理学的に許容されるその塩（式中、β−アラニン以外のＰ1 の少なくとも１つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である）を提供する。
【００３１】  更に本発明により提供されるのは、式Ｐ1 −Ｐ2 を有するペプチド、または生理学的に許容されるその塩であり、式中、Ｐ1 および／またはＰ2 の少なくとも１つのアミノ酸は、（ａ）金属イオンに結合するＰ1 の能力を変化させることなくペプチドの親油性を増大させる置換基、（ｂ）金属イオンに結合するＰ1 の能力を変化させることなくペプチドをタンパク質分解酵素から保護する置換基、または（ｃ）金属イオンに結合するＰ1 の能力を改善する非ペプチド金属結合官能基である置換基、で置換されている。
【００３２】  加えて本発明は、式Ｐ1 −Ｐ2 （式中、Ｐ1 は、上記と同義であり、Ｐ2 は、金属結合部位の配列を含むペプチド配列である）を有するペプチドを提供する。詳細には、Ｐ2 は、以下の配列の１つを有していてもよい：（Ｘａａ4 ）m   Ｘａａ3   Ｈｉｓ  Ｘａａ2   Ｘａａ5 、（Ｘａａ4 ）m  Ｈｉｓ  Ｘａａ2   Ｘａａ5 、（Ｘａａ4 ）m   Ｘａａ5   Ｘａａ2   Ｈｉｓ  Ｘａａ3 、または（Ｘａａ4 ）ｍ  Ｘａａ5   Ｘａａ2   Ｈｉｓ（式中、Ｘａａ5 は、自由側鎖−ＮＨ2 を有するアミノ酸であり、ｍは、０〜５である）。
【００３３】  本発明は、非ペプチド性金属結合官能基を取り付けた金属結合ペプチドＭＢＰも提供する。
最後に、本発明は、式Ｐ3 −Ｌ−Ｐ3 の金属結合ペプチド二量体を提供する。
【００３４】（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、式Ｐ1 −Ｐ2 のペプチドを提供する。Ｐ1 は、Ｘａａ1   Ｘａａ2   Ｈｉｓ、またはＸａａ1   Ｘａａ2   Ｈｉｓ  Ｘａａ3 （式中、Ｘａａ1  Ｘａａ2 、およびＸａａ3 は、上述に定義した通りである）である。Ｐ1 は、元素の周期表の１ｂ〜７ｂまたは８族の遷移金属イオン（Ｖ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｂａ、Ｚｎ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｕなど）ならびにその他の金属イオン（Ａｓ、Ｓｂ、およびＰｂなど）に結合する金属結合ペプチド配列である。Ｐ1 による金属イオンへの結合は、これらの金属イオンによるＲＯＳの生成および／またはＲＯＳの蓄積を阻害する（即ち、減少させるまたは防止する）、そして／或いは結合金属イオンにより生成され得るＲＯＳが与える損傷を、ペプチド自身に向けさせる。その結果、Ｐ1 への金属イオンの結合が存在しない時にＲＯＳにより引き起こされ得る損傷が、減少する。詳細には、Ｐ1 は、Ｃｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｃｏ（II）、およびＭｎ（II）に高い親和性で結合する。それ故、それは、銅およびニッケルによるＲＯＳの生成および蓄積により引き起こされた損傷を減少させるのに、特に有効となるはずである。
【００３５】  Ｐ1 では、Ｘａａ1 は、最も好ましくはＡｓｐであり、Ｘａａ2 は、最も好ましくはＡｌａであり、Ｘａａ3 は、最も好ましくはＬｙｓである。こうして、Ｐ1 の好ましい配列は、Ａｓｐ  Ａｌａ  ＨｉｓおよびＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］である。最も好ましくは、Ｐ1 の配列は、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］である。Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓは、Ｃｕ（II）およびＮｉ（II）の高親和性結合に必要なヒト血清アルブミンのＮ末端金属結合部位の最小配列であり、Ｌｙｓは、この部位へのこれら金属イオンの結合に寄与することが報告されでいる。Ｐ1 のその他の配列は、ヒト以外の動物での使用に好ましくなり得る。
【００３６】  Ｐ2 は、（Ｘａａ4 ）n（式中、Ｘａａ4 は、いずれかのアミノ酸であり、ｎは、０〜１００である）である。ｎが大きい場合（ｎ＞約２０）、そのペプチドは、ＲＯＳが与える損傷を細胞外で減少させる。小さなペプチドは、よりうまく細胞に侵入することができ、それ故小さなペプチドは、ＲＯＳが与える損傷を、細胞内および細胞外の両方で減少させるために使用することができる。ペプチドがより小さいと、タンパク質分解を受けることも少ない。それ故Ｐ2 では、好ましくは、ｎは、０〜１０であり、より好ましくは、ｎは、０〜５であり、最も好ましくは、ｎは、０である。Ｐ2 は、いかなる配列を有していてもよいが、Ｐ2 は、好ましくは、（１）遷移金属に結合する配列、（２）細胞膜を透過し、および／または標的組織に達する（例えば、血液脳関門を通過することができる）ペプチドの能力を増大させるために疎水性である配列、さもなければ（３）ペプチドの性能を安定化または向上させる配列、を含む。Ｐ1 と共にＰ2 は、銅およびニッケルと高親和性のＮ末端金属結合部位を有するタンパク質（ヒト、ラット、またはウシ血清アルブミンなど）のＮ末端配列であってもよい。ｎ＝１００の場合、そのペプチドは、これらのアルブミンのドメイン１にほぼ等しい配列を有している。
【００３７】  遷移金属イオンへの結合部位を含む多くのペプチドの配列が、公知である。例えば、米国特許第４，０２２，８８８号、同第４，４６１，７２４号、同第４，６６５，０５４号、同第４，７６０，０５１号、同第４，７６７，７５３号、同第４，８１０，６９３号、同第４，８７７，７７０号、同第５，０２３，２３７号、同第５，０５９，５８８号、同第５，１０２，９９０号、同第５，１１８，６６５号、同第５，１２０，８３１号、同第５，１３５，９１３号、同第５，１４５，８３８号、同第５，１６４，３６７号、同第５，５９１，７１１号、同第５，１７７，０６１号、同第５，２１４，０３２号、同第５，２５２，５５９号、同第５，３４８，９４３号、同第５，４４３，８１６号、同第５，５３８，９４５号、同第５，５５０，１８３号、同第５，５９１，７１１号、同第５，６９０，９０５号、同第５，７５９，５１５号、同第５，８６１，１３９号、同第５，８９１，４１８号、同第５，９２８，９５５号、および同第６，０１７，８８８号各明細書、ＰＣＴ出願国際公開第９４／２６２９５号、同第９９／５７２６２号、および同第９９／６７２８４号、欧州特許出願第３２７２６３号明細書、Lappin et al., Inorg. Chem., 17,1630-34 (1978) 、Bossu et al., Inorg. Chem., 17, 1634-40 (1978)、Chakrabarti, Protein Eng., 4, 57-63 (1990)、Adman, Advances In Protein Chemistry, 42, 145-97 (1991), Cotelle et al., J. Inorg. Biochem., 46, 7-15 (1992)、Canters et al., FEBS, 325, 39-48 (1993) 、Regan, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22, 257-281 (1993)、Ueda et al., J. Inorg. Biochem., 55, 123-130 (1994) 、Ueda et al., Free Radical Biol. Med. 18, 929-33 (1995)、Regan, TIBS, 20, 280-85 (1995)、Ueda et al., Chem. Pharm. Bull., 43, 359-61 (1995)、Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 906-914 (1997) 、Bal et al., Chem. Res. Toxicol., 10, 915-21 (1997)、Koch et al., Chem. Biol., 4, 549-60 (1997)、Kowalik-Jankowska et al., J. Inorg. Biochem. 66, 193-96 (1997)、Harford and Sarkar, Acc. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) 、Prince et al., TIBS, 23, 197-98 (1998)、Mlynarz et al., Speciation 98: Abstract, http://www.jate. u-szeged. hu/~spec98/abstr/mlynar.htm 、Aitken, Molec. Biotechnol., 12, 241-53 (1999) 、Whittal et al., Protein Science, 9, 332-343 (2000)を参照されたい。Ｐ2 は、これらのペプチドの１つ以上の金属結合部位の配列を含んでいてもよい。
【００３８】Ｐ2 が、金属結合部位を含む場合、それは好ましくは、Ｐ1 とＰ2 の金属結合部位との間の短いスペーサー配列を含む配列を有しており、その結果Ｐ1 およびＰ2 の金属結合部位は、潜在的に金属イオンに配位結合することができる（ペプチド：金属＝２：１の複合体と同様。実施例１０を参照）。好ましくは、スペーサー配列は、１〜５個、好ましくは１〜３個の中性アミノ酸から構成される。従ってスペーサー配列は、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＧＩｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙなどであってもよい。
【００３９】  詳細には、Ｐ2 が金属結合部位を含む場合には、それは好ましくは、以下の配列の１つを含む：（Ｘａａ4 ）m  Ｘａａ3  Ｈｉｓ  Ｘａａ2  Ｘａａ5 、（Ｘａａ4 ）m  Ｈｉｓ  Ｘａａ2  Ｘａａ5 、（Ｘａａ4 ）m  Ｘａａ5  Ｘａａ2  Ｈｉｓ  Ｘａａ3 、または（Ｘａａ4 ）m  Ｘａａ5  Ｘａａ2  Ｈｉｓ。Ｘａａ2 、Ｘａａ3 、およびＸａａ4 は、上記に定義した通りであり、ｍは、０〜５、好ましくは１〜３である。Ｘａａ4 アミノ酸は、Ｐ1 とＰ2 の金属結合部位との間の短いスペーサー配列を形成しており、その結果Ｐ1 およびＰ2 の金属結合部位が、金属イオンに配位結合することができ、Ｘａａ4 は、好ましくは中性アミノ酸（前の段落を参照）である。Ｘａａ5 は、自由側鎖−ＮＨ2 を有するアミノ酸であり、好ましくはＯｒｎまたはＬｙｓ、より好ましくはＯｒｎである。Harford and Sarkar, Ace. Chem. Res., 30, 123-130 (1997) を参照されたい（ペプチド配列内のＯｒｎの自由側鎖−ＮＨ2 が、ＡＴＣＵＮモチーフの自由Ｎ末端−ＮＨ2 での置換に成功することが報告されている）。このように、例えば、Ｐ1 −Ｐ2 は、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｏｒｎ［配列番号２］であってもよい。
【００４０】  ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその組み合わせであってもよい。好ましくは、Ｐ1 のアミノ酸の少なくとも1 つは、β−アラニンを除いてＤ−アミノ酸（好ましくは、Ｘａａ1 および／またはＨｉｓ）である。最も好ましくは、β−アラニン以外のＰ1 のアミノ酸は全て、Ｄ−アミノ酸である。更に、好ましくはＰ2 のアミノ酸の約５０％は、Ｄ−アミノ酸であり、最も好ましくはＰ2 のアミノ酸は全て、Ｄ−アミノ酸である。Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドは、タンパク質分解酵素（ヒト等の動物にペプチドを投与した時に遭遇する酵素、またはペプチドを含有する溶液で潅流した摘出臓器に存在する酵素など）に耐性があるため、Ｄ−アミノ酸が好ましい。さらに、Ｄ−アミノ酸の使用は、金属イオンに結合するペプチドの能力（銅に高い親和性で結合するペプチドの能力など）を変化させない。
【００４１】  本発明のペプチドは、従来技術で周知の方法により製造されてもよい。例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組み合わせのいずれを含有するペプチドも、標準固相ペプチド合成法で合成してもよい。適切な技術は、従来技術で周知であり、Merrifield, Chem. Polypeptide, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,85, 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Int'l, 10, 394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); 米国特許第３，９４１，７６３号および同第５，７８６，３３５号各明細書; Finn et al., The Proteins,3rd ed., Vol. 2, pp. 105-253 (1976); およびErickson et al., The Proteins 3rd ed., vol. 2, pp.257-527 (1976)に記載されるものを包含する。ポーランド特許第３１５４７４号明細書（ＨＭＳ含有ペプチドの合成）も参照されたい。或いは、そのペプチドが、Ｌ−アミノ酸のみを含有する場合には、それらは、組換えＤＮＡ技術により合成してもよい。組換えＤＮＡ法、並びに適切な宿主細胞、ベクター、およびそれに用いられるその他の試薬は、従来技術で周知である。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)を参照されたい。
【００４２】  本発明は更に、タンパク質分解酵素に対してより耐性があるか、より脂溶性がある（ペプチドを細胞膜により容易に透過させ、および／または脳など標的臓器により容易に到達させる）か、またはその両方であるペプチドＰ1 −Ｐ2 （Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組み合わせ、のいずれかで構成される）の誘導体を含む。図１Ａに示すように、Ｐ1 は、Ｐ1 の金属結合官能基を変化させることなく矢印に示される領域で修飾することができる。詳細には、Ｐ1 は、炭素１または２をＲ1 で置換することができ、Ｐ1 の末端−ＣＯＯＨは、保護基Ｒ2 で置換することができる（図１Ｂ〜Ｄ）。Ｐ2 は、Ｐ1 について記載されたのと同様の方法で修飾して、Ｐ2 をタンパク質分解酵素に対してより耐性にしても、より脂溶性にしても、またはその両方にしてもよい。
【００４３】  Ｒ1 は、１〜１６個の炭素原子を含有する直鎖または分子鎖アルキルであってもよく、用語「アルキル」は、ＲおよびＳ異性体を包含する。Ｒ1 は、一または二環を含有するアリールまたはヘテロアリールであってもよい。用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香族環（例えば、フェニル、ナフチル、およびジフェニル）を含有する化合物を意味する。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの環がＳ、Ｎ、またはＯの１つ以上の原子を含有するアリールを意味する。これらの置換は、金属イオンに結合するＰ1 の能力を実質的に低下させない。詳細には、高い親和性で銅に結合するＰ1 の能力は、これらの置換により低下しない。例えば、炭素２に結合するｎ−ブチル（図１Ｃを参照。Ｒ1 は、ｎ−ブチルである）のような置換基の一部は、アルキル基の誘導効果により、銅のような金属イオンに対するペプチドの親和性を増大させるはずである。アリール、ヘテロアリール、または長鎖アルキル（炭素原子が約６〜１６個）による炭素２（図１Ｃ）の置換は、脂質膜を通したペプチドの輸送を増加させるはずである。
【００４４】  先に言及したように、固相合成によるペプチドの合成方法は、周知である。これらの方法は、図１Ｂ〜Ｃに示す誘導体を調製するために改変することができる。例えば、図１Ｃに示すＰ1 の誘導体（式中、Ｒ1 は、オクチルである）は、図２Ａに示すように調製することができる。図２Ａでは、長円型の要素は、ポリマー樹脂を表し、Ｒpは、標準的カルボキシル保護基である。図２Ａに示すように、（新たに蒸留した）オクタン酸は、乾燥臭素と、その後三塩化リンとで処理する。その混合物を、約１００℃に加熱して、その温度を４時間保持する。α−ブロモオクタン酸が、蒸留により無色液体として得られる。ブロモ酸のアミノ化は、酸およびアンモニア溶液を４０〜５０℃で３０時間放置することにより達成される。アミノ酸のオクチル誘導体が、臭化アンモニウムをメタノール洗浄で除去することにより得られる。古典的解析方法により、所望の、光学的に純粋なＤ−形が与えられる。Ｒ1 がアルキル、アリール、またはヘテロアリールであるその他の誘導体を、図２Ａに示す手法で調製することができる。
【００４５】  加えて、図１Ｂに示すＰ1 の誘導体（式中、Ｒ1 は、フェニルである）は、図２Ｂに示すように調製することができる。図２Ｂでは、ポリマーは樹脂であり、ｔ−Ｂｕはｔ−ブチルであり、Ｂｚはベンジルである。Ｒ1 がアルキル、アリール、またはヘテロアリールであるその他の誘導体を、図２Ｂに示す手法で調製することができる。
【００４６】  Ｒ2 は、−ＮＨ2 、−ＮＨＲ1 、−Ｎ（Ｒ1 ）2 、−ＯＲ1 、またはＲ1 （式中、Ｒ1 は、上記と同義である）であってもよい（図１Ｄを参照）。これらの誘導体は、従来技術で周知の方法によりペプチドが樹脂から除去される前に、固相ペプチド合成の最終段階として調製することができる。Ｒ2 での置換は、金属イオンに結合するＰ1 の能力を実質的に低下させない。
【００４７】  加えてＰ1 およびＰ2 は、金属イオンに結合する非ペプチド性官能基で置換することができる。これらの金属結合官能基は、ペプチドの１つ以上の側鎖（Pendent groups）に結合することができ、得られたペプチド誘導体は、Ｐ1 により提供される結合部位、および場合によりＰ2 により提供される結合部位に加えて、金属イオンに結合し得る１つ以上の部位を保有する。結果として、金属イオンに結合するそのようなペプチド誘導体の能力は、対応する非修飾ペプチドと比較して改善される。例えば、そのペプチド誘導体は、１個ではなく２個の同種の金属イオン（例えばＣｕ（II）２個）に結合することができるか、またはそのペプチド誘導体は、１種の金属イオンではなく２個の異なる金属イオン（例えばＣｕ（II）１個およびＦｅ（III）１個）に結合することができるか、またはペプチド誘導体は、対応する非修飾ペプチドよりも良好に（例えば、より大きな親和性で）１個の金属イオンに結合することができる。
【００４８】  金属結合官能基は、ポリアミン（例えば、ジアミン、トリアミンなど）を包含する。適切なジアミンは、１，２−アルキルジアミン、好ましくはアルキルが２〜１０個の炭素原子を含有するアルキルジアミン（例えば、Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ2 （式中、ｎ＝２〜１０））を包含する。適切なジアミンは、１，２−アリールジアミン、好ましくはベンゼンジアミン（例えば、１，２−ジアミノベンゼン）も包含する。適切なジアミンは更に、１，２−環状アルカンジアミンを包含する。「環状アルカン」は、それぞれが５〜７個の炭素原子を含有する一〜三環を含有する化合物である。好ましくは、環状アルカンジアミンは、１，２−ジアミノシクロヘキサン（シクロヘキサンジアミン）である。
【００４９】  特に好ましいジアミンは、１，２−ジアミノシクロヘキサン（図３A 〜Ｂ）である。Rao & P. Williams （J. Chromatography A, 693, 633 (1995)）により実施された過去の研究では、シクロヘキサンジアミン誘導体が様々な金属イオンに結合することが示された（図３Ａ。式中、ＰＹＲは、ピリジンである）。得られた金属キレート化剤は、アミノ酸およびペプチドの解析に用いることに成功しており、その分子がα−アミノ酸に対して非常に高い親和性を有し、多くの点が独特である非常に安定した配位複合体を形成することが示された。１，２−ジアミノシクロヘキサンは、本発明のペプチドが結合し得る反応性アミノ官能基を保有する。図３Ｂ（式中、Ｍは、金属イオンで、少なくとも１つのＲ4 は、−アルキル−ＣＯ−ペプチド、−アリール−ＣＯ−ペプチド、−アリール−アルキル−ＣＯ−ペプチド、またはアルキル−アリール−ＣＯ−ペプチドである）を参照されたい（図３Ｃ〜Ｄも参照）。その他のＲ4 は、同じであってもよく、或いは−アルキル−ＣＯＯＨ、−アリール−ＣＯＯＨ、−アリール−アルキル−ＣＯＯＨ、またはアルキル−アリール−ＣＯＯＨであってもよい。図３Ｂに示すタイプの誘導体は、複数の金属結合部位を有しており、それ故、非置換ペプチドよりも容易に金属イオンに結合すると予測される。その上、シクロヘキサンの官能性があるため、その化合物は、脂質膜を通した輸送を援助する脂質に類似した特性を保有する。
【００５０】  本発明のペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体は、特に２つの経路で調製することができる。第一は、アルデヒドによる最初の縮合と、その後の還元とを含む（図３Ｃを参照。図３Ｃでは、Ｂｚは、ベンジルである）。多数のアルデヒド（アルキルおよびアリール）が、室温で容易にシクロヘキサンジアミンと反応し、オキシムを形成する。オキシムは、嫌気的条件下で水素化ホウ素ナトリウムにより還元して、二酸誘導体を与えることができる。カルボキシ部分は、その後カルボキシ保護されたＰ1 に存在する自由アミノ基と反応して、ペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体を与える。第二の経路は、図３Ｄに示す直接的なアルキル化プロセスである。例えば、シクロヘキサンジアミンを、ブロモ酢酸で処理して、二酢酸誘導体を与える。カルボキシル部分はその後、カルボキシ保護されたＰ1 に存在する自由アミノ基と反応して、その誘導体を与える。図３Ｄでは、Ｒ5 は、Ｈまたは別のペプチドである。Ｒ5 がＨである場合、その誘導体を、従来技術で周知の方法により、更に反応させて一般的なカルボン酸誘導体（エステルなど）を生成することができる。金属結合実験では、この基の有無が、分子全体の金属結合能との関係を有していないことが示された。しかし、これらの基は、置換基に応じて分子を疎水性または親水性のいずれかにし、加えて、これは、膜を通した分子の送達、または標的組織への送達に効果を有し得る。これら２つの合成経路は、上記の別のジアミンを用いたジアミンペプチド誘導体の合成のために役立つ。
【００５１】  さらなる適切なポリアミンおよびポリアミン誘導体、並びにそれらをペプチドに結合させる方法が、米国特許第５，１０１，０４１号、および同第５，６５０，１３４号各明細書に記載されている。ペプチドへの結合に適したその他のポリアミンキレート化剤が、公知である。例えば、米国特許第５，４２２，０９６号、同第５，５２７，５２２号、同第５，６２８，９８２号、同第５，８７４，５７３号、および同第５，９０６，９９６号各明細書、並びにＰＣＴ出願国際公開第９７／４４３１３号、同第９７／４９４０９号、および同第９９／３９７０６号を参照されたい。
【００５２】  ビシナル二酸が金属イオンに結合すること、および銅イオンに対する親和性が特に高いことは、周知である。それ故、ビシナル二酸官能基を有するペプチドは、金属の結合に極めて有効である想定される。適切なビシナル二酸としては、いずれかの１，２−アルキル二酸（二酢酸（コハク酸）など）およびいずれかの１，２−アリール二酸が挙げられる。
【００５３】  ペプチドのアミノ基は、二酢酸と反応して、二酸誘導体を生成することができる（図４を参照）。これは、樹脂結合ペプチドのアミノ基をハロゲン化酢酸（例えば、ブロモ酢酸またはクロロ酢酸）またはハロゲン化酢酸誘導体（例えば、ベンジルオキシエステル）と反応させることにより簡便に果たすことができる。固相合成法は、溶媒で洗浄することにより未反応材料の除去を可能にする。最終産物は、加水分解的分離により樹脂から遊離される。本発明のペプチドの別の二酸誘導体を、同様の手法で製造することができる。
【００５４】  ポリアミノポリカルボン酸が、金属（銅および鉄など）と結合することは公知である。本発明のペプチドの誘導体を製造するための適切なポリアミノポリカルボン酸、およびそれらをペプチドに結合させる方法は、米国特許第５，８０７，５３５号、および同第５，６５０，１３４号各明細書、並びにＰＣＴ出願国際公開第９３／２３４２５号に記載されている。米国特許第５，７３９，３９５号も参照されたい。
【００５５】  ビシナルポリヒドロキシル誘導体も、本発明に包含される。適切なビシナルポリヒドロキシルとしては、単糖および多糖（即ち、二糖、三糖など）が挙げられる。現時点で好ましいのは、単糖である。図７を参照されたい。単糖は、２つの主なカテゴリー（フラノースおよびピラノース）に分けられる。フラノース環系の主要な例の１つは、グルコースである。グルコースのヒドロキシル基は、ベンジルまたは不安定なｔ−ブチルオキシ官能基として保護することができるが、アルデヒドにはテトラペプチドのアミノ基（例えば、リジンのアミノ基）を自由に反応させておく。穏やかな還元／加水分解により、単糖ペプチド誘導体が生成する。その他の単糖ペプチド誘導体を、この手法で調製することができる。
【００５６】  ビスピリジルエチルアミン誘導体が、二価金属イオンと強力な複合体を形成することは公知である。ペプチドに結合する場合、この官能基は、銅などの金属イオンに対する追加のキレート部位を提供する。テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチル誘導体を、図５に示している。このテトラペプチド誘導体の金属結合能は、非誘導体のペプチドと比較すると少なくとも３倍増加すると予測される。このビスピリジルエチルアミン誘導体の製造法は、二酸誘導体の合成法と若干の類似性を持つ。テトラペプチドの２つのアミノ基（一方はＡｓｐにあり、もう一方はＬｙｓにある）は、２−ブロモエチルピリジンと反応して、四置換されたペプチド誘導体を与える。その反応は、樹脂結合したテトラペプチドをブロモエチルピリジンと反応させ、その後樹脂から産物を分離することにより果たされる。
【００５７】  フェナントロリンは、二価金属イオンに結合し得る別の複素環式化合物である。ペプチドのフェナントロリン誘導体は、ビスピリジルエチルアミン誘導体と同様の手法で合成することができる。
【００５８】  ポルフィリンは、すべての生物に見出される化合物群であり、金属に結合し得るテトラピロリド大環を有する。ヘム、クロロフィル、およびコリンは、それぞれ鉄、マグネシウム、およびコバルトを含有するこの分類の化合物の主な例である。メソポルフィリンIX（図６Ａ〜Ｂ。式中、Ｍは金属イオンである）は、ヘムに由来し、銅に対する特異的親和性を保有することが観察されている。本発明のペプチドへのこの構造の付加は、銅の結合のための部位を複数保有するポルフィリン−ペプチド誘導体を生成する（図６Ｃを参照）。図６Ｃに示すテトラペプチドの３および３′位でのイミダゾール残基は、金属結合での役割に加えて、銅以外の金属の結合部位を提供し、それによりポルフィリン−金属複合体を安定化させることができる。詳細には、シアノコバラミン（ビタミンＢ−１２）は、ポルフィリン核にコバルトを金属として含有し、その複合体は、イミダゾール基により安定化されている。これの類推に基づくと、ポルフィリン−テトラペプチド誘導体は、ポルフィリン核内の通常の生理学的条件でコバルトに結合し、その複合体は、Ｈｉｓのイミダゾール基により安定化されると予測される。
【００５９】  図６Ｃに示すポルフィリン−ペプチド誘導体を調製するために、メソポルフィリンIXのカルボキシル基を活性化し、標準固相ペプチド合成を利用してペプチドのアミノ基とカップリングすることができる。典型的には、樹脂結合ペプチドのリジン残基の自由アミノ基は、カルボキシルで活性化されたポルフィリン核とカップリングすることができる。縮合産物は、標準的方法を用いて樹脂を分離させることができる。この方法は、本発明のペプチドの別のポルフィリン誘導体を合成するために用いることができる。
【００６０】  その他の適切なポルフィリンおよび大環状キレート化剤、並びにそれらをペプチドに結合させる方法が、米国特許第５，９９４，３３９号および同第５，０８７，６９６号各明細書に記載されている。ペプチドに結合し得る別のポルフィリンおよび大環状キレート化剤は、公知である。例えば、米国特許第５，４２２，０９６号、同第５，５２７，５２２号、同第５，６２８，９８２号、同第５，６３７，３１１号、同第５，８７４，５７３号、および６，００４，９５３号各明細書、並びにＰＣＴ出願国際公開９７／４４３１３号および同第９９／３９７０６号を参照されたい。
【００６１】様々な追加の金属キレート化剤、およびそれらをタンパク質に結合させる方法は、米国特許第５，６８３，９０７号明細書に記載されている。
ジチオカルバメートは、金属（鉄など）に結合することが公知である。本発明のペプチドの誘導体を製造する適切なジチオカルバメートは、米国特許第５，３８０，７４７号および同第５，９２２，７６１号各明細書に記載されている。
【００６２】  ヒドロキシピリドンも、鉄キレート化剤であることが公知である。本発明のペプチドの誘導体を製造するための適切なヒドロキシピリドンが、米国特許第４，９１２，１１８号および同第５，１０４，８６５号各明細書、並びにＰＣＴ出願国際公開９８／５４１３８号パンフレットに記載されている。
【００６３】  さらなる非ペプチド性金属キレート化剤は、従来技術で知られるか、またはこれから開発されることになろう。タンパク質およびペプチドに化学的化合物を結合させる方法は、従来技術で周知であり、本発明のペプチドに非ペプチド金属キレート化剤を取り付ける方法は、当該技術分野の熟練範囲内で行える。例えば、そのような取り付ける方法を記載する先に引用した特許を参照されたい。
【００６４】  理解されるように、非ペプチド金属結合官能基は、ペプチドＰ1 −Ｐ2 と同様の手法で、別の金属結合ペプチド（ＭＢＰ）に結合することができる。得られたペプチド誘導体は、ＭＢＰの金属結合部位に加えて、１つ以上の金属結合官能基を含有する。好ましくは、ＭＢＰは、２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含有する。好ましくは、ＭＢＰは、１つ以上のＤ−アミノ酸を含有し、最も好ましくは、ＭＢＰのアミノ酸全てが、Ｄ−アミノ酸である。上記のように、多くの金属結合ペプチドの配列は、公知である。これらのペプチド、およびこれらのペプチドの金属結合部位を含むペプチドは、ペプチドＰ1 −Ｐ2 での上記方法と同様の方法で調製することができる。そのペプチドに結合する１つ以上の金属結合官能基を有するこれらのペプチドの誘導体は、ペプチドＰ1 −Ｐ2 の誘導体での上記方法と同様の方法で調製することができる。
【００６５】本発明は、式：
Ｐ3 −Ｌ−P3
の金属結合ペプチド二量体も提供する。
Ｐ3 は、金属イオンに結合し得るいずれかのペプチドであり、各Ｐ3 は、同じであっても異なっていてもよい。各Ｐ3 は、好ましくは２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含有している。上記のように、金属結合ペプチドは、公知であり、各Ｐ3 は、これらのペプチドの１つ以上の金属結合部位の配列を含み得る。各Ｐ3 は、Ｐ1 およびＰ2 について先に記載したように、非ペプチド金属結合官能基で置換することができるが（特に、図６Ｃを参照）、Ｐ3 ペプチドは両方とも、好ましくは非置換である。Ｐ3 は、上記のような非ペプチド金属結合官能基で置換されたいずれかのアミノ酸配列を含んで、Ｐ3 の金属結合能を提供してもよい。好ましくは、各Ｐ3 は、非置換の金属結合ペプチド（即ち、金属イオンに結合するペプチド配列を含む非置換のペプチド）である。最も好ましくは，Ｐ3 基の一方または両方は，Ｐ1 である（即ち、その二量体は、配列Ｐ3 −Ｓ−Ｐ1 、Ｐ1 −Ｓ−Ｐ3 、または最も好ましくはＰ1 −Ｓ−Ｐ1 を有する）。
Ｐ1 は、上記と同義である。
【００６６】  Ｌは、各Ｐ3 のＣ末端アミノ酸に取り付けられるリンカーである。Ｌは、生理学的に許容されるそれらのＣ末端アミノ酸を介して２つのＰ3 ペプチドに結合し得るいずれかの化学基であり得る。「生理学的に許容される」とは、ペプチド二量体内にリンカーＬを含む結果、ペプチド二量体が投与される動物（ヒトなど）または臓器に対して、リンカーＬを含有するペプチド二量体が毒性がないこと、を意味する。好ましくは、Ｌは、２つのＰ3 に結合し、その結果それらは金属イオンに配位結合することができる（ペプチド：金属＝２：１の複合体と同様。実施例１０を参照）。Ｌも、好ましくは中性である。最も好ましくは、Ｌは、好ましくはアミド結合によりＰ3 に結合する、１〜１８個、好ましくは２〜８個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖アルカンまたはアルケン残基（例えば−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 ＣＨ2 −、−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 −、−ＣＨ2 ＣＨ2 （ＣＨ3 ）ＣＨ2 −、−ＣＨＣＨ−など）、或いは３〜８個、好ましくは５〜６個の炭素原子を含有する環状アルカンまたはアルケン残基（図１９Ａの化合物Ｄ1 を参照）である。そのようなリンカーは、ペプチド二量体に疎水性を付与するため、それらは特に好ましい。別の好ましい実施形態において、Ｌは、窒素含有複素環式アルカン残基（図１９Ａの化合物Ｄ2 、Ｄ3 、およびＤ4 を参照）、好ましくはピペラジド（図１９Ａの化合物Ｄ2 を参照）である。別の好ましい実施形態において、Ｌは、グリセリルエステルである（図１９Ａの化合物Ｄ5 を参照。式Ｄ5 において、Ｒは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含有する、アルキルまたはアリールである）。これらの好ましいリンカーＬは、２つのペプチドＰ3 を金属イオンに配位結合させ、生体適合性があり、そのペプチド二量体は、容易に且つ大量に製造することができる。「生体適合性がある」は、リンカーＬを含有するペプチド二量体が、ペプチド二量体が投与される動物（ヒトなど）または臓器で、リンカーによる望ましくないいずれの副作用も生み出さないことを意味する。
【００６７】  ペプチド二量体を合成する方法が、図１９Ｂ〜Ｄに示されている。一般に、２つのＰ3 基のＣ末端アミノ酸（従来技術で周知の方法および保護基で保護されている）はＬに結合し、得られたアミノ酸二量体は、ペプチド二量体を作製するための標準的ペプチド合成法で用いられる。
【００６８】  例えば、各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを有すルペプチド二量体は、酸塩化物として、またはペプチド合成で用いられる標準的カップリング剤を用いるか、のいずれかにより、自由ジアミン官能基に保護リジンをカップリングさせることにより合成することができる（図１９Ｂ〜Ｃ）。多くの適切なジアミンが市販されているか、または適切なジアミンを従来技術で知られる方法により容易に合成することができる。
【００６９】  例えば、リジン二量体２（図１９Ｂ）は、以下のように調製することができる。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１００ｍＬ、乾燥アルゴンで気流洗浄した）の中の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−およびｔ−ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−保護されたＤ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）（２０ミリモル）の攪拌溶液に、ブタン−１，４−ジアミン１および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，２，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ；０．５ミリモル）を添加する。その溶液を、室温で３６時間攪拌する。ビス保護されたリジン２を、シリカでのフラッシュクロマトグラフィーおよび酢酸エチル／メタノール混合物での溶出により単離する。その後ペプチド二量体３を、古典的ペプチド合成方法を利用して、保護されたリジン二量体２から調製する（図１９Ｂを参照）。
【００７０】  各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを有する別のペプチド二量体を、以下のように合成することができる。まず、異なる保護リジン二量体４を、ピペラジン５の２個のアミノ中心をアシル化することにより合成する（図１９Ｃを参照。Chambrier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 10824-10829 (1999)も参照）。その後、アミノ酸残基の残り部分を、標準的ペプチド合成方法を利用して付加し、ペプチド二量体６を与える（図１９Ｃを参照）。
【００７１】  各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを有し、Ｌがグリセリルエステルであるペプチド二量体は、以下のように合成することができる。図１９Ｄの式７の３−置換プロパン−１，２−ジオール（式中、Ｒは、アルキルまたはアリールである）は、市販されている。リジン二量体８（式中、Ｒは、メチルである）は、以下のように調製することができる（図１９Ｄを参照）。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２０ミリモル）の乾燥トルエン（１００ｍＬ、乾燥アルゴンで気流洗浄した）の攪拌溶液に、３−メトキシプロパン−１，２−ジオール（２００ミリモル）およびイミダゾール（１５ミリモル）を添加する。その溶液を、室温で３６時間攪拌する。溶媒を真空除去して、残留物を酢酸エチルに溶解する。この溶液を、クエン酸溶液（２％）、水、０．５Ｎ  ＮａＨＣＯ3 溶液で洗浄し、再度水で洗浄して、その後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥する（溶媒の除去により、淡黄色の残留物が与えられる）。ビス保護されたリジン８を、シリカでのフラッシュクロマトグラフィーおよび酢酸エチル／メタノール混合物での溶出により単離する。その後、ペプチド二量体９を、古典的ペプチド合成方法を利用して、保護されたリジン二量体８から調製する（図１９Ｄを参照）。
【００７２】  金属結合化合物の生理学的に許容される塩も、本発明に包含される。生理学的に許容される塩は、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸など）、または塩基（医薬として許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩など）から誘導された塩などの従来の無毒の塩を包含する。その塩は、従来の手法で（例えば、化合物の自由塩基形態を酸で中和することにより）調製される。
【００７３】  本発明の金属結合化合物は、ＲＯＳが与える損傷を減少させるため、または動物の過剰な金属イオン濃度を低下させるために用いることができる。そのようにするために、本発明の金属結合化合物が、動物に投与される。好ましくは、動物は、哺乳類（ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトなど）である。本発明の種々の化合物のための有効な投与剤形、投与の様式、および投与量は、経験的に決定してもよく、そのような決定は、当該技術分野の熟練範囲内で行える。有効用量は、約２〜約２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇであることが見出されている。しかし、投与量が用いられる個々の金属結合化合物、治療される疾患または病気、疾患または病気の重症度、投与経路、化合物の排出速度、治療期間、動物に投与されるいずれかの薬物の独自性、動物の年齢、サイズ、および種類、医学および獣医学の技術で知られる同様の因子、により変動することは、当業者には理解されよう。一般に、本発明の化合物の適切な日用量は、治療効果を生み出すのに有効な最低用量となる化合物量である。しかし、日用量は、信頼できる医療判断の範囲内で、担当する医師または獣医により決定される。所望なら、有効日用量は、２、３、４、５、６、またはそれ以上の分割用量で投与され、１日を適当な間隔に分け、分割して投与されてもよい。化合物の投与は、許容される反応に達するまで継続されなければならない。
【００７４】  本発明の化合物は、任意の適切な投与経路（経口、経鼻、経直腸、経膣、非経口（例えば静脈内、脊髄内、腹腔内、皮下、または筋肉内）、大槽内、経皮、頭蓋内、大脳内、および局所（頬面および舌下など）など）で、治療される動物患者に投与され得る。好ましい投与経路は、経口および静脈内である。
【００７５】  本発明の金属結合化合物は、単独投与が可能であるが、医薬製剤（組成物）としてその化合物を投与することが好ましい。本発明の医薬組成物は、金属結合化合物または本発明の化合物を、１つ以上の医薬として許容される担体と、場合により１つ以上の別の化合物、薬物、または別の材料との混合物中の有効成分として含有する。各担体は、その製剤の別の成分と適合性があり、動物に有害でないという意味で「許容」されなければならない。医薬として許容される担体は、従来技術で周知である。選択した投与経路に関わらず、本発明の化合物は、当業者に知られる従来法で、医薬として許容される投与剤形に製剤される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences を参照されたい。
【００７６】  経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、粉剤、顆粒剤の形態であっても、または水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液、または水中油型若しくは油中水型液状エマルションとして、またはエリキシル若しくはシロップとして、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムのような不活性な基材を用いる）などとして存在し、それぞれが、所定量の本発明の化合物を有効成分として含有していてもよい。本発明の化合物は、ボーラス、舐剤、またはペースト剤として投与されてもよい。
【００７７】  経口投与用の本発明の固体投与剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、粉剤、顆粒剤など）では、有効成分は、１つ以上の医薬として許容される担体（クエン酸ナトリウム、またはリン酸二カルシウムなど）、および／または以下のいずれかと混合される：（１）増量剤またはエキステンダー（デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロール、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、および／またはアラビアゴムなど）；（３）湿潤剤（グリセロールなど）；（４）崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ若しくはタピオカデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど）；（５）溶解遅延剤（パラフィンなど）；（６）吸収促進剤（第四級アンモニウム化合物など）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）；（８）吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレーなど）；（９）潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物など）；および（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤を含んでいてもよい。同様のタイプの固体組成物を、乳糖のような賦形剤だけでなく高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、ソフトおよびハードゼラチンカプセル中の増量剤として使用してもよい。
【００７８】  錠剤は、場合により１つ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造してもよい。圧縮錠は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈液、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、または架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または分散剤を用いて調製してもよい。成形錠は、不活性希釈液で加湿した粉末化合物の混合物を、適切な機械で成形することにより製造してよい。
【００７９】  本発明の医薬組成物の錠剤およびその他の固体投与剤形（糖剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤）は、場合によりコーティングおよび外皮（腸溶性コーティングおよび医薬製剤の分野で周知のその他のコーティング）を備えるようにスコアまたは調製されていてもよい。それらは、例えば所望の放出プロフィールを与えるよう様々な割合にしたヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを用いて、有効成分の緩徐な放出、または制御的放出を提供するように調製され得る。それらは、例えば細菌フィルターを通した濾過により滅菌されてもよい。これらの組成物は、場合により乳白剤を含有していてもよく、また、胃腸管の一定部分にのみまたは胃腸管の一定部分で優先的に（場合により遅延した様式で）有効成分を放出する組成物であってもよい。用い得る埋込み組成物の例としては、高分子物質およびロウが挙げられる。有効成分は、マイクロカプセル形態であってもよい。
【００８０】  本発明の化合物の経口投与用の液状投与剤形としては、医薬として許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。液体投与剤形は、有効成分に加えて、従来技術で一般に用いられる不活性希釈液（例えば、水若しくはその他の溶媒）、溶解剤、および乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（詳細には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル）、並びにそれらの混合物を含有する。
【００８１】  経口組成物は、不活性希釈液以外に、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、調味料、着色剤、香料、並びに防腐剤を含んでいてもよい。
活性化合物に加えて懸濁液は、懸濁剤を、例えばエトキシル化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶性セルロール、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、並びにそれらの混合物として含有していてもよい。
【００８２】  直腸内または膣内投与のための本発明の医薬組成物の製剤は、坐剤として存在していてもよく、その坐薬は、本発明の１つ以上の化合物を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス、またはサリチル酸塩を含む１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製することができ、室温では固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸または膣腔では溶解して活性化合物を放出する。膣内投与に適切な本発明の製剤としては、適切であることが従来技術で知られている担体などを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤が挙げられる。
【００８３】  本発明の化合物の局所または経皮投与のための投与剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、滴剤、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、医薬として許容される担体、およびいずれかの緩衝液、または必要ならば液体発泡剤と滅菌条件下で混合してもよい。
【００８４】  軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤（動物性および植物性脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物など）を含有していてもよい。
【００８５】  粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、賦形剤（乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物など）を含有していてもよい。スプレーは、追加として慣例的な液体発泡剤（クロロフルオロ炭化水素など）および揮発性の非置換炭化水素（ブタンおよびプロパンなど）を含有していてもよい。
【００８６】  経皮用パッチは、本発明の化合物の身体への制御的送達を提供するというさらなる利点を有している。そのような投与剤形は、本発明の化合物を適当な媒体（弾性マトリックス材料など）に溶解、分散、さもなければ混和することにより製造することができる。吸収増強剤は、皮膚を通した化合物の流動を増加させるために用いることもできる。そのような流動速度は、速度制御膜を提供するか、またはポリマーマトリックス若しくはゲル中に化合物を分散させる、のいずれかにより制御することができる。
【００８７】  非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明の化合物を、１または複数の医薬として許容される滅菌した等張の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液、エマルション、或いは使用直前に滅菌注射液または分散液で再構成できる滅菌粉末と共に含んでおり、抗酸化剤、緩衝液、溶質（製剤をレシピエントの血液と等張にする）、または懸濁若しくは増粘剤を含有していてもよい。
【００８８】  本発明の医薬組成物に用い得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、並びに注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が挙げられる。例えば、コーティング材料（レシチンなど）の使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、そして界面活性剤の使用により、適当な流動性が維持されてもよい。
【００８９】  これらの組成物は、補助薬（湿潤剤、乳化剤、および分散剤など）を含有していてもよい。組成物中に等張剤（糖、塩化ナトリウムなど）を包含することも所望となりうる。加えて、注射用医薬剤形の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）の包含により達成されてもよい。
【００９０】  場合によっては、薬物の効果を持続するために、皮下または筋肉注射による薬物の吸収を緩徐にすることが望ましい。これは、水溶性が小さい結晶または非晶性物質の懸濁液の使用により果たされてもよい。更に、薬物の吸収速度は、溶解率に依存し、加えて結晶サイズおよび結晶形態にも依存する可能性がある。或いは、非経口投与薬物の吸収遅延は、油性媒体に薬物を溶解、または懸濁させることにより果たされる。
【００９１】  注射用デポ剤形は、生分解性ポリマー（ポリラクチド−ポリグリコリドなど）中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより製造される。ポリマーに対する薬物の割合、および使用する個々のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。別の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射用デポ剤形は、リポソーム、または体組織に適合するマイクロエマルション中に薬物を封入することよっても調製される。注射用物質は、例えば細菌フィルターを通じた濾過により滅菌されてもよい。
【００９２】  製剤は、１回用量または複数回用量の密閉容器（例えばアンプルおよびバイアル）中に存在してもよく、使用直前に滅菌液状担体（例えば注射用水）を添加することのみを必要とする凍結乾燥状態で保存してもよい。即時使用注射液および懸濁液を、上記タイプの滅菌粉剤、顆粒剤、および錠剤から調製してもよい。
【００９３】  先に言及したように、ＲＯＳは、様々な疾患および病気で主要な役割を演じることが報告されている。Manso, Rev. Port. Cardiol., 11. 997-999 (1992); Florence, Aust. N Z J. Opthalmol., 23, 3-7 (1992); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995); Knight, Ann. Clin. Lab. Sci., 25, 111-121 (1995); Kerr et al., Heart & Lung, 25, 200-209 (1996)を参照されたい。過剰の金属イオンに関与する疾患、およびそれに引き起こされる疾患も、公知である。本発明の金属結合化合物は、これらの疾患および病気、並びにＲＯＳまたは遷移金属が役割を演じるその他の疾患および病気のいずれかを治療するために使用することができる。本発明の金属結合化合物で治療可能な特異的疾患および病気としては、成人性呼吸窮迫症候群、加齢、ＡＩＤ、動脈硬化（高血圧、老化、およびインポテンス）、関節炎、喘息、自己免疫疾患、癌（例えば、腎臓、肝臓、結腸、および脳）、発癌、電離線（例えば、腫瘍の放射線）により引き起こされる細胞損傷、慢性肉芽腫性疾患、肝硬変、クローン病、糖尿病（糖尿病性網膜症、腎臓病、インポテンス、および末梢血管疾患）、眼疾患（例えば、白内障、中心動脈閉塞、良性単クローン性免疫グロブリン血症、および黄斑変性）、気腫、炎症、虚血、新生物疾患、神経傷害（neurological trauma ）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症、および老人性痴呆）、膵臓炎、末梢血管疾患、肺塞栓症、腎臓病（透析患者）、再潅流、ショック、化学療法の実施時に起こる組織損傷、手術後の組織損傷（例えば、移植手術、開心術、および組織への血液供給が遮断される任意の手術、および四肢の外科的虚血（止血帯傷害））、毒性反応（例えば、除草剤中毒、遷移金属（銅、コバルト、およびニッケル）中毒、一酸化炭素中毒、および抗生物質毒性）、外傷性圧挫損傷、およびウイルソン病（先天的に高レベルの銅）が挙げられる。本発明の金属結合化合物で治療可能な特定の虚血性の病気および疾患としては：
【００９４】中枢神経系虚血−
手術後の脳虚血
高体温による脳傷害
周産期無酸素性虚血（脳性麻痺）
脊髄損傷
発作（血栓性、塞栓性、または出血性脳血管傷害）
一過性虚血発作
外傷性脳傷害
心臓虚血−
急性心筋梗塞
狭心症
不整脈
手術後の心臓虚血
先天的心不全
心筋性「失神（stunning）」
虚血性腸疾患
胎盤虚血
肺塞栓症
組織または器官への血液供給が遮断される手術−
血管形成術
心臓バイパス術
移植手術（ドナー臓器、およびその臓器のレシピエントの両方）
四肢の外科的虚血（止血帯傷害）
本発明の化合物は、好ましくは予防的に投与される。例えば、本発明の化合物は、好ましくは虚血組織または器官の再潅流の前、および／またはそれと同時に（例えば、血管形成術の前または組織プラスミノーゲン活性化剤等の血栓溶解剤による治療の前、および／またはそれと同時に）投与される。もちろん、本発明の化合物の投与は、再潅流が達成された後、ある期間継続されなければならない。同様に、本発明の化合物は、手術（例えば、開心術、または動物への臓器移植のための手術）の前、および／または手術の間投与されなければならず、化合物の投与は、手術の後ある期間継続されなければならない。予防的投与の別の例として、本発明の化合物は、重度な病気（例えば、脳血管虚血、または心臓血管虚血）の症状を呈する患者が、その病気を診断するためにテストされる間、本発明の化合物をその患者へ投与してもよい。この方法では、患者は、そのような病気を診断する時間中は保護されており、本発明の金属結合化合物での処置は、別の治療（例えば、脳血管虚血のための組織プラスミノーゲン活性化剤の投与）が実施され得る間持続されてもよい。更なる実施例として、本発明の化合物は、患者が放射線療法（腫瘍のための放射線、または骨髄移植の前の放射線）を受ける際に投与されてもよい。
【００９５】  本発明の化合物は、鈍的損傷を受けた患者の治療に用いることもできる。詳細には、低アルブミンレベルは、多発鈍的外傷の患者の死亡率の予測因子であることが見出されているため、本発明の化合物は、低アルブミンレベルを有する多発鈍的外傷に罹った患者を治療するのに非常に有利となり得る。より明確には、多発鈍的外傷に罹った患者３４名を、研究した。これらの患者は、１９９８年にSwedish Hospital, Denver, COの集中治療室に入院した。２群の患者は、外傷外科医により、患者のアルブミンレベルを知られることなく、年齢、傷害の重症度スコア（ＩＳＳ）、並びに傷害のタイプおよび面積に応じて適合された。１群は、死亡した患者から構成され、もう一方の群は、生存者から構成された。適合の後、入院時アルブミンレベルを、独立した観察者による医療記録から回収して、２群のアルブミンレベルを比較した。生存者１７名では、平均アルブミンレベルは、３．５０±１．００ｇ／ｄｌであった。死亡した患者１７名では、平均アルブミンレベルは、２．５２±０．７３ｇ／ｄｌであった。％分散値は、それぞれ２８．６および２８．９であり、ｐ値は、０．００２６（９５％信頼区間０．３４６２〜０．４７７１）であった。
【００９６】  本発明の化合物は、ＲＯＳが与える損傷を減少させるために単独で与えられてもよい。或いは、本発明の化合物は、「フリーラジカルスカベンジャー」と組合せて与えてもよい。「フリーラジカルスカベンジャー」としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、エブセレン、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ペニシルアミン、アロプリノール、オキシプリノール、アスコルビン酸、α−トコフェノール、トロロックス（水溶性α−トコフェノール）、β−カロテン、脂肪酸結合タンパク質、フェノザン、プロブコール、シアニダノール−３、ジメルカプトプロパノール、インダパミド、エモキシピン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。例えば、Das et al., Methods Enzvmol., 233, 601-610 (1994); Stohs, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol., 6, 205-228 (1995) を参照されたい。もちろん本発明の化合物は、所定の条件で標準的治療薬（例えば、糖尿病を治療するためのインシュリン）と共に与えられてもよい。
【００９７】  本発明の金属結合化合物は、動物から取り出された組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させるために用いることもできる。そのようにするために、組織または器官は、有効量の本発明の金属結合ペプチドを含有する溶液に接触させる。適切な溶液の多くは、公知である。例えば、Dunphy et al., Am. J. Physiol., 276, H1591-H1598 (1999); Suzer et al., Pharmacol. Res., 37, 97-101 (1998); Hisatomi et al., Transplantation, 52, 754-755 (1991);米国特許第５，７１０，１７２号明細書を参照されたい。そのような溶液に含まれるペプチドの有効量は、経験的に決定することができ、それは当該技術分野の熟練範囲内で行える。引き続き、採取した組織または器官は、レシピエントに移植するために、または研究目的で用いられてもよい（例えば、薬物をスクリーニングするために潅流肝臓を用いる）。
【００９８】  本発明は更に、動物から取り出された組織または器官にＲＯＳが与える損傷を減少させるためのキットを提供する。そのキットは、試薬を保持する１つ以上の容器、および採取した器官を保存するのに有用なその他の品目を組合せて包装されている。そのキットは、本発明の金属結合化合物を保持する容器を備える。適切な容器としては、瓶、バッグ、バイアル、試験管、シリンジ、および従来技術で知られるその他の容器が挙げられる。そのキットは、従来技術で知られ、商業的にも使用者の立場からも所望となり得るその他の品目（希釈液、緩衝液、空のシリンジ、管状材料、ガーゼ、消毒液など）を備えていてもよい。
【００９９】 実施例
実施例１：  テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の合成
この実施例は、標準固相合成法を用いた全部がＬ−アミノ酸からなるテトラペプチド  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の合成を説明する。先ず、Ｗａｎｇ樹脂上の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ａｓｐ（νＣＯＯ−エステル；Ｔｏｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）〔０．６ｍｍｏｌ；ノバ  バイオケム社（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）〕を、ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０％ｖ／ｖ；３ｍｌ）の溶液に、３０分かけてときどき攪拌しながら懸濁した。この後、溶媒を排出し、樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタン（ＤＣＭ；５×３ｍｌ）で順次洗浄した。ニンヒドリン試験を用いて反応をモニターした。樹脂はＤＭＦ（〜１ｍｌ）で膨潤した。アラニンのＣ保護ｔ−ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）エステルのＤＭＦ溶液を加え、次いでジイソプロピルアミン（８当量）と２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，２，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ−）（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振とうし、ニンヒドリン試験で反応をモニターした。この後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。溶液を排出し、ビーズをＤＣＭ（３×２ｍｌ）で洗浄した。ジペプチド−樹脂の保護基を外し、ビーズをＤＭＦに懸濁した。ヒスチジンのアミノ保護（ベンジルオキシ）誘導体（４ｍｍｏｌ）を加え、次に、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振とうし、ニンヒドリン試験で反応をモニターした。この後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。トリペプチド−樹脂を穏やかな窒素流中でしばらく乾燥し、窒素飽和ＤＭＦに懸濁した。保護リジンを加え、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振とうし、ニンヒドリン試験で反応をモニターした。この後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。Ｂｏｃ保護基を慎重に脱離して、典型的には５ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する、樹脂結合テトラペプチドを得た。樹脂結合テトラペプチド（０．２５ｇ；５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、２４時間振とうした。この後、ニンヒドリン試験で、樹脂からテトラペプチドが遊離したことを示す青色が示された。場合により、ＴＦＡに５％（ｖ／ｖ）のＤＭＦを添加して、樹脂からペプチドが遊離する速度を速めた。減圧下にＴＦＡを除去して、ＴＦＡ塩としてテトラペプチド（全Ｄ）を得、これを真空下に５℃で２４時間乾燥した。残留物は白色粉末であり、これを分光法により特性決定した。
【０１００】  この方法で、テトラペプチドの多くの鏡像異性体を調製し得る。例えば、ペプチド合成にＤ−アミノ酸を用いると、Ｄ−アミノ酸を含有するテトラペプチドが生成する。また、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の組合わせを用いることもできる。
【０１０１】実施例２：  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシロヘキサンジアミン誘導体の調製
酒石酸塩としてシス／トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン〔アルドリッチ−シグマ社（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ）〕を分離して、トランス−ジアミノシクロヘキサンを調製した。Ｒ−トランス異性体は７５℃で融解し、Ｓ−トランス異性体は４３〜４５℃で融解する（Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｐ．Ｄ．Ｎｅｗｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕ．Ｋ．，１９９４）。次いで、トランス−ジアミノシクロヘキサン（１０ｇ）を無水トルエン（３０ｍｌ）に懸濁し、水浴中で５℃に冷却し、ブロモ酢酸（８ｇ）のトルエン（２５ｍｌ）溶液を滴下した。添加後、反応温度を３０℃に上げ、その温度をさらに５時間維持した。トルエンを蒸発させ、Ｒ−トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン二酢酸をヘキサン／トルエンから結晶化して白色固体（収率７０％）を得た。生成物を分光法により特性決定した。
【０１０２】  実施例１で調製した樹脂結合テトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁し、Ｒ−トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン二酢酸（２０ｍｇ）で処理した後、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂をローラー上で約２４時間振とうした。次いで、樹脂を、ＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍｌ）で洗浄し、部分乾燥した。樹脂結合反応生成物をＴＦＡで処理（５ｍｌ；５時間）して、樹脂結合を加水分解した。樹脂を分離し、ＤＣＭで洗浄した。洗液をＴＦＡと合わせ、真空濃縮した。残留物〔シクロヘキサンジアミンテトラペプチド；化学式は図３Ｄ（Ｒ5はＨ）に示されている〕を分光分析により特性決定した。
【０１０３】実施例３：  テトラペプチド四酢酸の調製
実施例１で調製した樹脂結合テトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁し、過剰な（１０倍）クロロ酢酸で処理した。樹脂を室温下に４８時間振とうし、次いで、さらに１時間かけて６０℃に加熱した。ＤＭＦを濾去し、樹脂を、ＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍｌ）で洗浄した。部分乾燥樹脂をさらに処理することなく次のステップに用いた。樹脂結合反応生成物をＴＦＡで処理（５ｍｌ；５時間）して、樹脂結合を加水分解した。樹脂を分離し、ＤＣＭで洗浄した。洗液をＴＦＡと合わせ、真空濃縮した（収率３０％）。生成物（化学式は図４に示されている）を分光法で特性決定した。
【０１０４】実施例４：  メソポルフィリンＩＸテトラペプチドの調製
実施例１で調製した樹脂結合テトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁し、メソポルフィリンＩＸジカルボン酸（１０μｍｏｌ；化学式は図６Ａに示されている）で処理し、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を暗室内に保管されたローラー上で約２４時間振とうした。樹脂を、ＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍｌ）で洗浄し、部分乾燥した。樹脂結合反応生成物をＴＦＡで処理（５ｍｌ；５時間）して、樹脂結合を加水分解した。樹脂を分離し、ＤＣＭ／ＴＦＡ混合物（１：１、５ｍｌ）で洗浄した。洗液を合わせ、真空濃縮した。ポルフィリンテトラペプチド（図６Ｃに示されている化学式）をセミ分取ＨＰＬＣにかけて精製した（収率６０％）。構造を分光法で確認した。
この手順を用いて、メソポルフィリン１および関連分子などの他のポルフィリン−ペプチドを合成することができる。
【０１０５】実施例５：  テトラビスピリジルエチルテトラペプチドの調製
実施例１で調製した樹脂結合テトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁し、ブロモエチルピリジン（２０μｍｏｌ）で処理した。次いで、ピリジン（０，５ｍｌ）を添加した。樹脂をローラー上で約４８時間振とうした。樹脂を、ＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍｌ）で洗浄して、未反応モノマーをすべて除去し、次いで、３０分間真空乾燥した。樹脂結合反応生成物をＴＦＡで処理（５ｍｌ；５時間）して、樹脂結合を加水分解した。樹脂を分離し、ＤＣＭ／ＴＦＡ混合物（１：１．５ｍｌ）で洗浄した。洗液を合わせ、真空濃縮した。ピリジルエチルテトラペプチド誘導体（化学式は図５に示されている）をセミ分取ＨＰＬＣにかけて精製した（収率５０％）。構造を分光法で確認した。
この手順は、フェナントロリンおよび関連分子などの他の複素環にも適用し得る。
【０１０６】実施例６：  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のアリール誘導体の調製
【０１０７】  図１Ｂに示されている化学式（式中、Ｒ1はフェニル）を有する誘導体を調製した。ジエチルアセトアミドマロネート（１０ｇ）の無水エタノール（１００ｍｌ）溶液を、ナトリウムエトキシドのスラリーのエタノール液（５ｇ；５０ｍｌ）に加え、３０分間加熱還流させた。生成物を冷却（１０℃）し、α−ブロモフェニル酢酸エチル（５ｇ）と反応させた。反応を完結するまで（２４時間）進め&nbsp;、過剰なナトリウムエトキシドを稀酸で中和した。トリエステルを酢酸エチル中に抽出し、溶媒を除去して、粘性液体を得た。粗生成物を塩酸（１００ｍｌ）で加水分解し、脱炭酸反応させて、フェニル置換アスパラギン酸（１０ｇ）を得た。標準反応系列を用いて、Ｎ−ベンゾイルオキシｔ−ブチル誘導体を調製した。１に記載のように調製した樹脂結合トリペプチド（Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｌａ）（２０ｍｇ）のＤＭＦ溶液中に、Ｎ−ベンゾイルオキシ−ｔ−ブチルアスパラギン酸誘導体を加え、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振とうし、ニンヒドリン試験で反応をモニターした。この後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。溶液を排出し、ビーズをＤＣＭ（３×２ｍｌ）で洗浄した。慎重に加水分解してテトラペプチド誘導体を分離した。分取スケールＨＰＬＣによりテトラペプチドの立体異性体を分離した。
【０１０８】実施例７：  テトラペプチド  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］によるＲＯＳ生成の阻害
配列Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］を有するテトラペプチド（Ｌ−テトラペプチド）は、アンシンス  サービセス社（ＡｎＳｙｎｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＱＣＢ社、ジェナシス社（Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびバウマン  リサーチ社（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含めた、注文ペプチド合成を提供する１社以上の会社から得た。ペプチドは標準固相合成法により調製した（実施例１も参照）。
【０１０９】  ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７５９：３８−４１（１９８３）およびＣｈｅｅｓｅｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５２：６４９−６５３（１９８８）に記載のように、Ｌ−テトラペプチドのＲＯＳ生成阻害能を試験した。手短に言えば、Ｃｕ（ＩＩ）とＨ2Ｏ2を混合して、フェントン型反応でヒドロキシルラジカルを生成した。ヒドロキシルラジカルは糖２−デオキシ−Ｄ−リボース（ＤＮＡの糖残基）を攻撃してフラグメントを生成させる。これらのフラグメントを低ｐＨで加熱すると、マロンアルデヒドが生成し、これに２−チオバルビツール酸を添加すると、５３２ｎｍで分光光度測定し得るピンク色の色素原が生成する。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、２−デオキシ−Ｄ−リボースに対する損傷の測度である。
【０１１０】  Ｌ−テトラペプチドを用いる場合と用いない場合でアッセイを実施した。結果は表１に要約されている。表１から分るように、Ｌ−テトラペプチドが１：１．２および１：２のＣｕ（ＩＩ）：テトラペプチド比で存在すると、２−デオキシ−Ｄ−リボースの分解はそれぞれ３８％および７３％阻害された。明らかに、Ｌ−テトラペプチドは、ヒドロキシルラジカルによる２−デオキシ−Ｄ−リボースの分解を阻害した。
【０１１１】
【表１】
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さらに、全部がＤ−アミノ酸からなる配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを有するテトラペプチド（Ｄ−テトラペプチド）を用いて、類似のアッセイを実施した。Ｄ−テトラペプチドは、アンシンス  サービセス社およびＱＣＢ社を含めた、注文ペプチド合成を提供する１社以上の会社から得た。ペプチドは、標準固相合成法により調製した（実施例１参照）。
【０１１２】  ＺｈａｏおよびＪｕｎｇにより、Ｆｒｅｅ  ＲＡｄｉｃ  Ｒｅｓ，２３（３），２２９−４３（１９９５）に記載されたように、Ｄ−テトラペプチドのＲＯＳ生成阻害能を試験した。手短に言えば、Ｃｕ（ＩＩ）とアスコルビン酸を混合して、フェントン型反応でヒドロキシルラジカルを生成した。過酸化水素ではなくアスコルビン酸を用いることの利点は、アスコルビン酸が、過酸化物を用いた場合とは異なり、他のアッセイ（すなわち、ＬＤＨアッセイ）に干渉しないことである。ヒドロキシルラジカルは糖２−デオキシ−Ｄ−リボースを攻撃してフラグメントを生成する。これらのフラグメントを低ｐＨで加熱すると、マロンアルデヒドが生成し、これに２−チオバルビツール酸を添加すると、５３２ｎｍで分光光度測定し得るピンク色の色素原が生成する。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、２−デオキシ−Ｄ−リボースに対する損傷の測度である。
【０１１３】  最適なＣｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸濃度を確立することがこのプロトコルを展開させる際の第１ステップであった。先ず、１０μＭが体内で見出される生理的濃度（結合および非結合Ｃｕ（ＩＩ））であることに基づいて、このレベルの一定Ｃｕ（ＩＩ）濃度を用いた。直線範囲を確立するために、アスコルビン酸濃度を変えた。選択されたアスコルビン酸濃度は５００μＭであったが、それは、この濃度が５３２ｎｍで最高の吸光度を与えると共に直線範囲内に含まれるからである。興味深いことには、アスコルビン酸濃度が５００μＭを超えると、ヒドロキシルラジカルが一定の割合で徐々に減少したが、これは、アスコルビン酸の低濃度におけるヒドロキシルラジカル生成体としての作用と高濃度における酸化防止剤としての作用の二重作用によるものと考えられる。
【０１１４】  上述のＣｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸濃度を用いて、Ｄ−テトラペプチドの滴定曲線を確立した。手短に言えば、アスコルビン酸添加の前に、Ｄ−テトラペプチドをＣｕ（ＩＩ）と共に室温下に１５分間プレインキュベートした。これを行うことにより、Ｄ−テトラペプチドはＣｕ（ＩＩ）と結合し、その結果、ＲＯＳの生成が阻害された。表から分るように、Ｃｕ（ＩＩ）：Ｄ−テトラペプチド比が４：１〜４：７の範囲のときには、ヒドロキシルラジカルの生成はほとんど全く阻害されなかった。比率が１：２以上のとき、ヒドロキシルラジカルの生成は完全に阻害された。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】実施例８：  Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ再潅流モデルにおけるＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｄ−テトラペプチドの試験
過去の研究〔Ｇａｌｉｎａｎｅｓら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：６７３−６８３（１９９３）；Ｋｏｌｏｃａｓｓｉｄｅｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９：Ｈ１４１５−Ｈ１４２０（１９９５）；Ｈｅａｒｓｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３１：１９６１−１９７３（１９９９）〕と実質的に同じように血液が潅流された心臓を準備した。図８参照。手順を以下に手短に説明する。
【０１１７】  英国のバンティン  アンド  キングマン  ユニバーサル社（Ｂａｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）から得た雄のウイスター系ラットを用いた。すべての動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより組織的に述べられた「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅにより作製され、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより出版された「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８５−２３，１９９６年改訂）に従って思いやりあるケアを受けた。
【０１１８】  サポートラット（３００〜４００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、ヘパリン（１０００ＩＵ／ｋｇ、静脈内）で凝固防止した。潅流心臓と血液循環させるために、右大腿静脈および左大腿動脈を鈍的剥離して露出させ、カニューレ挿入した（それぞれ、１８Ｇおよび２２Ｇ  Ａｂｂｏｃａｔｈ−Ｔカテーテル）。体外循環を確立し、Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標）代用血漿〔Ｂ．ブラウン  メディカル社、英国エールズベリー所在（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）〕で満たし、分離された心臓につなぐ前に１５分間維持した。この期間は、この充填溶液が適切にサポートラットの血液と混じること、および製剤全体が安定であることを確実にするためであった。各５００ｍｌのＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標）は、２０．００ｇのスクシネート化ゼラチン（平均分子量３０，０００）、３．６５ｇの塩化ナトリウム、５００ｍｌまでの注射用水（電解質ｍｍｏｌ／５００ｍｌ：カチオン  Ｎａ  ７７、アニオン  Ｃｌ  ６２．５、ｐＨ７．４）を含有する。ドナー心臓を潅流させる前に、同系ラット由来の７〜８ｍｌの追加血液を中央リザーバに加えた。これは、実験中、血液を再循環させずに、２分間捕集したときに、サポートラットが適切な血液供給量を有することを確実にするためであった。サポートラットの動脈流出ラインに蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｎｉｐｕｌｓ  ３）を配置し、１０分間で体外循環を通る流れを２．５ｍｌ／分の値に漸進的に増大させた。この漸進的増大により、２．５ｍｌ／分の流速が直ちに確立された場合に生じるであろう動脈圧の低下が防止された。血液は（その後で潅流心臓の大動脈に結合する）カニューレを介してポンプで汲み上げられ、重力により、リザーバおよびフィルターを介してサポート動物の静脈流入ラインに戻る。潅流カニューレ上方の空気で満たしたシリンジは、コンプライアンスチャンバの役割を果たし、分離された心臓の収縮およびポンプの蠕動作用の結果として生じた潅流圧の振動を減衰させる働きをした。サポート動物に、３５％ベンチューリフェイスマスクを介して、９５％Ｏ2＋５％ＣＯ2の混合物を吸入させた。血液ｐＯ2およびｐＣＯ2を生理的範囲内に維持するように流速を調整した。サーモスタット制御加熱パッドにより体温を３７．０（±０．５）℃に安定化させ、直腸体温計でモニターした。動脈ラインに取り付けた圧力変換器により血圧をモニターした。圧力変換器はすべて、ＭａｃＬａｂ〔ＡＤインスツルメンツ社、オーストラリア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｕｔｒａｌｉａ）〕に連結し、実験中、連続稼動させた。ドナー心臓を体外循環に連結する前と、各実験後に、サポートラットの血液中のガス（ｐＯ2、ｐＣＯ2、ｐＨ）、ヘマトクリット、グルコース、および電解質レベル（Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+）をモニターした。実験期間中、製剤の容量および安定性を維持するように、必要に応じて、（同系の別のラット由来の）最小量のドナー血液を輸血した。必要に応じ、中央リザーバにヘパリンおよびペントバルビタールを追加した。
【０１１９】  心臓を分離するために、各ラット（２７０〜３５０ｇ）をジエチルエーテルで麻酔し、ヘパリン（１０００ＩＵ／ｋｇ、静脈内）で血液凝固を防止した。次いで、心臓を直ちに切除し、冷（４℃）Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標）に浸漬した。大動脈に素早くカニューレ挿入し、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆモード〔Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｆｕｒ  ｄｉｅ  Ｇｅｓｌａｍｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ  ｄｅｓ  Ｍｅｎｓｃｈｅｎ  ｕｎｄ  ｄｅｒ  Ｔｉｅｒｅ，６１：２９１−３３２（１８９５）〕で、サポート動物の動脈血を、２．５ｍｌ／分の定流速で潅流させた。左心耳を除去した後、圧力変換器に取り付けた（左心室収縮期および拡張期圧、および差に基づく左心室発生圧測定用の）流体充満バルーンカテーテルを僧帽弁を介して左心室に導入した。４〜８ｍｍＨｇの左心室拡張終期圧（ＬＤＶＥＤＰ）が得られるまでバルーンを水で膨脹させた。圧力トレースから心拍数を計算し、拍動／分（ｂｐｍ）として表した。大動脈カニューレのサイドアームを介して潅流圧を測定した。圧力変換器はすべてＭａｃＬａｂに連結し、実験中連続稼動させた。
【０１２０】  切除した心臓を２つの処置群（図９参照；６心臓／群）にランダムに振り分け、（ｉ）３０分間の虚血期間直前の２分間塩類溶液を注入し、かつ再潅流開始時に２分間塩類溶液を注入する塩類溶液コントロール、および（ｉｉ）３０分間の虚血期間直前の２分間薬剤を注入（その結果、薬剤はその後の虚血期間中血管構造内に捕捉される）し、かつ再潅流開始時に２分間薬剤を注入する薬剤に先だって、２０分前に有酸素潅流させた。次いで、心臓を３０分間全体的に流動のない虚血状態にし、その間、心臓を３７．０℃下に塩類溶液に浸漬させた。虚血は、バイパスラインを介して、ポンプから大動脈カニューレに通じるラインを締め、それによって、流れを分離された心臓から逸らしてサポート動物に戻すように方向転換させて開始した。次いで、心臓を４０分間再潅流させ、その間、収縮機能を連続測定した。
【０１２１】  その正体が実験を行う研究者には不明であった薬剤は、テトラペプチドＤ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓであった。英国のバウマン  リサーチ社によって研究者に供給されたこのテトラペプチドを、１６．７ｍｇ／ｍｌの濃度で塩類溶液に溶かした。このテトラペプチドは希釈も修飾もせずに供給された状態のまま注入した。生理的塩類溶液は、英国のバクスター社（Ｂａｘｔｅｒ，ＵＫ）により供給され、コントロールとして用いた。毎日、塩類溶液および薬剤の新鮮な溶液を用いた。
【０１２２】  薬剤およびビヒクルは、０．２５ｍｌ／分の定流速にセットされた蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｎｉｐｕｌｓ  ３）を用いて大動脈カニューレのサイドアームに注入した。大動脈カニューレを通過する血流は２．５ｍｌ／分であり、薬剤の注入は０．２５ｍｌ／分であるから、心臓に送り込まれる薬剤の最終濃度は、バウマン  リサーチ社によって供給されたものの１１分の１であった。２分間の虚血前ビヒクルまたは薬剤注入の間および図９に示されている複数の時点で、分析用に動脈および静脈血試料を捕集し、遠心して、凍結させた。次いで、再潅流期間の最初の２分間に注入を繰返し、その間、血液は捕集せず、再循環させた。
【０１２３】  予め決定した排除基準は：（ｉ）ドナー心臓のカニューレ挿入の前に安定な収縮期血圧≧８０ｍｍＨｇを達成しなかったサポート動物は研究から排除され、（ｉｉ）２０分間の介入前ベースライン読み取りで、ＬＶＤＰ≦１００ｍｍＨｇを超えたドナー心臓は研究から排除され、または（ｉｉｉ）血液化学値が正常範囲を超えたドナー心臓は研究から排除されるというものであった。
【０１２４】  結果は平均±ＳＥＭで表される。すべての回復値は、各個々の心臓について（実験開始から２０分後に測定した）介入前ベースライン値のパーセントとして表される。群間の２つの平均値を比較するために、スチューデントの両側無対ｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５のとき、差は統計的に有意であるとみなされた。
【０１２５】  品質管理および予め決定した排除基準の適用を可能にするために、（ドナー心臓を潅流させる直前および各実験後の）サポート動物および各潅流心臓の血液化学値（ｐＨ、ｐＯ2、ｐＣＯ2、ヘマトクリット、Ｎａ+、Ｋ+およびＣａ2+、グルコース）とベースライン収縮機能を測定して、システムの安定性および再現性をモニターした。表３は、測定された各指標に僅かな変化しかなかったことを表しており、これは、両研究群に類似の潅流条件が課されたこと、およびすべての値が許容し得る生理学的範囲内にあったことを裏付けるものである。サポートラットの収縮期圧と心拍数が表４に示されている。表から分るように、１５分間のベースライン読み取りでは、２つの研究群間に有意な差はなかった。
【０１２６】  表５は、ＬＶＤＰ、心拍数および潅流圧において、２０分間の有酸素潅流期間後（すなわち、薬剤またはビヒクルの注入直前）には群間に有意な差がなかったことを示している。このように、研究の一次終点であるＬＶＤＰの平均値は、塩類溶液コントロール群および薬剤処理群について１７７．３±１０．６ｍｍＨｇおよび１７７．２±５．６ｍｍＨｇであった。
【０１２７】  予想されたように、初期に拡張状態で心拍停止した状態で、心筋虚血により心筋収縮が停止した。しかし、虚血性傷害が経時的に増大すると、心臓が虚血性拘縮状態になるにつれ拡張状態の増大が起こった。各研究群における虚血性拘縮発生の時間プロフィールが図１０に示されている。表６から分るように、測定された指標のいずれにおいても差はなかったが、薬剤処理群では５０％拘縮までの時間を遅延させる傾向を示す徴候がある程度存在し、これは、保護を示唆している。
【０１２８】  図１１は、両研究群における（介入前ベースライン値のパーセントとして表された）ＬＶＤＰの平均回復プロフィールを示している。塩類溶液コントロール群の心臓は、４０分の再潅流期間が終わるまでに、ＬＶＤＰが介入前コントロールのわずか１５．３±３．２％であったように、回復が遅くかつ不良であったのは明らかである。それに対し、薬剤群の心臓は、より速やかかつより大幅に（５０．５±９．３％）回復した。
【０１２９】  図１２は、４０分の再潅流期間中の両研究群における左心室拡張終期圧の絶対値を示している。どちらの群においても、虚血時に発生した拘縮に起因する高レベルのＬＶＥＤＰは、経時的に介入前コントロール値に向かって低下した。しかし、薬剤群はそれらのＬＶＥＤＰを塩類溶液コントロール群に見られたものより速くかつ完全に正常化し、調べた各時点においてその差は有意であった。これは、薬剤群において再潅流時に見られた回復の向上とも一致するであろう。
【０１３０】  図１３に見られるように、塩類溶液コントロール群と薬剤群とで得られた心拍数の比較は、これら２つの群が実質的に同一（１１５．０±３．８対１２７．２±２２．８％）であったことを示している。
【０１３１】  図１４に示されているように、４０分の再潅流期間中の潅流圧は、両群において実質的に一定であり、４０分の再潅流期間後にも、それらの値は互いに有意に異なっていなかった。塩類溶液コントロールでは、再潅流後の平均値が、その介入前コントロールの１０９．９±８．２％であったのに対し、薬剤群の平均値は、その介入前値の８７．４±８．０％であった。したがって、薬剤群の値の方が（観測された心臓保護と一致して）再潅流期間を通して低下傾向があったが、これらの変化は統計的有意性には達しなかった。
【０１３２】  このパイロット研究の結果は、分離された血液潅流ラット心臓において、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓが、虚血後機能回復を約３倍半（３．５倍）（１５．３±３．２％対５０．５±９．３％）高めたことで評価されるような有意かつ実質的な保護特性を観察上有することを示す。保護の大きさは、研究された最も強力な介入法の一部に匹敵する。
【０１３３】
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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実施例９：  脳虚血モデルにおけるＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓの試験
先に記載されているように〔Ｋｏｉｚｕｍｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｓｔｒｏｋｅ，８：１−８（１９８６）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，１２（４）：６２１−６２８（１９９２）〕、雄の成体ウイスター系ラット〔２７０〜３００ｇ、チャールス  リバー  ラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）〕に、巣状虚血性梗塞を作成した。手術前に、動物が自由に食物と水を摂れるようにした。動物を３．５％ハロタンで麻酔し、フェイスマスクを用いて、７０％Ｎ2／３０％Ｏ2中１．０〜２．０％ハロタンで麻酔を維持した。手術中、フィードバック調節型水加熱システム〔Ｋ−２０／６４Ｎアクアティックブランケット、ハミルトン  インダストリーズ社，オハイオ州シンシナティ所在（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｃｉｎｃｉｎｎａａｔｉ，ＯＨ）に連結されたＹＳＩ７３Ａ直腸プローブ、フィッシャー社（Ｆｉｓｈｅｒ）〕を用いて、手術中の直腸温度を３７℃に維持した。先の研究で、このモデルでは虚血時と虚血後の直腸および脳の温度は同じであることが証明されている〔Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｃｅｒｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，１２（４）：６２１−６２８（１９９２）〕。血液ガスおよび血圧を測定するために、右大腿動脈に医療等級シリコーンチューブ〔テクニカル  プロダクツ社，ジョージア州ディケーター所在（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）〕をカニューレ挿入し、注入用に、大腿静脈にカニューレ挿入した。皮下トンネルを介してカニューレを引っ張り上げ、首の背側から出した。虚血の前と後にすべての動物の動脈血ガスを測定した。
【０１３４】  虚血手術のために、右総頚動脈をその分岐部で露出させた。次いで、火炎上で加熱してその尖端を丸くしたＡ４−０ナイロン縫合糸を外頚動脈から内頚動脈内に（動物の体重に応じて）１８．５〜１９．５ｍｍ進め、次いで、頭蓋内頚動脈に通して、尖端が中大脳動脈（ＭＣＡ）の起始部を閉塞するまで進めた。次いで、動物を麻酔から覚醒させた。ＭＣＡ閉塞の２時間後に、動物を再麻酔し、動脈内縫合糸を外頚動脈内に引っ込めた。
【０１３５】  閉塞の１分前から初めて、動物にビヒクルのみ（コントロール）または薬剤（Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓ）が入ったビヒクルを１分かけて静脈内注入した。薬剤の正体は実験を実施している研究者には不明であった。薬剤は、リン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４中の濃縮貯蔵溶液（１６．６７ｍｇ／ｍｌ）として研究者に供給され、−８０℃で貯蔵された。実施例７で説明したように、薬剤は、使用前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフリーラジカル生成阻害能を測定して生物学的に活性であると決定された。貯蔵溶液を使用直前に解凍し、２０ｍｇ／ｋｇの用量を与えるのに十分な量を投与した。薬剤またはビヒクルの静脈内投与の直後に、ナイロン縫合糸を進めて、ＭＣＡを閉塞した。ＭＣＡ閉塞の２時間後に、再び動物に薬剤またはビヒクルを１分かけて静脈内注入した。２回目の注入直後に、ナイロン縫合糸をＭＣＡ閉塞部から引き抜いて再潅流させた。さらに、２回目の注入後、動物を再麻酔し、カニューレを取り出した。動物を元のケージに戻し、そこで、食物と水を自由に摂れるようにした。
【０１３６】  虚血前および屠殺前に動物の体重を測定した。再潅流の１時間後および２４時間後に、Ｚｅａ  Ｌｏｎｇａら，Ｓｔｒｏｋｅ，２０：８４−９１（１９８９）に記載のように、神経検査を実施した。採点は以下の通りであった：０、正常；１、対側（左）前脚を完全に伸ばせない（軽度の巣状神経性欠損）；２、左側への回旋運動（中程度の巣状神経性欠損）；３、左側への転倒（重度の巣状神経性欠損）；；４、自発歩行が無く、意識レベルの低下。
【０１３７】  ＭＣＡ閉塞の２４時間後、ケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）をどちらも筋肉内に注入して動物を麻酔し、ヘパリン化塩類溶液、次いで、１０％緩衝ホルマリンを経心臓潅流させた。脳を取り出し、ラット脳マトリックスを用いて２ｍｍの冠状スライス〔アクチベイショナル  システム社、ミズーリ州ウォーレン所在（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｅｎ，ＭＩ）；合計７スライス〕に切断した。次いで、スライスをパラフィンに包埋し、各スライスの前面から６ｍｍの切片を切り取り、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）で染色した。コンピュータインターフェイス画像分析システム〔グローバル  ラブ  イメージ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｌａｂ  Ｉｍａｇｅ）システム、データ  トランスレーション社，マサチューセッツ州マールバロ所在（Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）〕を用い、「間接」法〔Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂｏｌ．，１０：２９０−２９３（１９９０）〕を用いて梗塞体積を測定した：各スライスについて同側（右）半球のインタクト領域面積およびインタクト対側（左）半球面積を測定し、前者を後者から減算して、１スライス当たりの梗塞面積を計算した。次いで、梗塞面積を合計し、スライスの厚さを乗じて１個の脳当たりの梗塞体積（ｍｍ3）を得た。
【０１３８】  その結果が以下の表７〜表１０に示されている。データの一部は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表されている。反復測定ＡＮＯＶＡおよび両側対または無対ｔ検定により、適切な場合にはボンフェローニ検定により、連続データを分析した。非連続挙動データは、Ｍａｎｎ−Ｓｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により分析した。
【０１３９】
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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実施例１０：  ＲＯＳ生成の阻害
テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］ならびに他のペプチドおよび化合物のＲＯＳ生成阻害能を試験した。試験した他のペプチドは以下のものであった：  Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号３］；Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号４］；Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号５］；およびアセチル化Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号６］。これらのペプチドは、アンシンス  サービセス社、ＱＣＢ社、ジェノシス社およびバウマン  リサーチ社を含めた、注文ペプチド合成を提供する１社以上の会社から得た。試験した他の化合物は、ヒスチジン〔シグマ  ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）〕、カタラーゼ（シグマ  ケミカル社）、およびスーパーオキシドジスムターゼ（シグマ  ケミカル社）であった。
【０１４０】Ａ．  ヒドロキシルラジカル生成の阻害
ヒドロキシルラジカルは恐らく最も反応性の高い酸素由来種である。ヒドロキシルフリーラジカルは、非常に強力、短寿命かつ毒性である。
過酸化水素およびスーパーオキシドラジカルの毒性はそれらのヒドロキシルフリーラジカルへの変換に起因するものであると示唆する研究者がいる。スーパーオキシドラジカルは、ハーバー−ワイス反応を介してヒドロキシルラジカルに直接変換され得る。あるいは、スーパーオキシドラジカルが過酸化水素に変換され、順に過酸化水素がフェントン反応を介してヒドロキシルラジカルに変換され得る。両経路とも、銅などの遷移金属を必要とする〔ＡｃｗｏｒｔｈおよびＢａｉｌｅｙ，Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＥＳＡ社  １９９７年）〕。
【０１４１】  銅が、アスコルビン酸の存在下で、ヒドロキシルラジカルを生成することも公知である。以下の反応機構が示唆された：
アスコルビン酸＋２Ｃｕ2+→２Ｃｕ+＋デヒドロアスコルビン酸＋２Ｈ+  （反応式１）
【０１４２】    Ｃｕ+＋Ｏ2→Ｏ2・-＋Ｃｕ2+  （反応式２）
Ｃｕ+＋Ｏ2・-＋２Ｈ+→Ｃｕ2+＋Ｈ2Ｏ2  （反応式３）
Ｃｕ+＋Ｈ2Ｏ2→ＯＨ-＋ＯＨ・＋Ｃｕ2+  （反応式４）
Ｂｉａｇｌｏｗら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２２（７）：１１２９−１１３８ページ（１９９７年）。
上記にリストした化合物のヒドロキシルラジカル生成阻害能を、ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７５９：３８−４１（１９８３）に記載のように試験した。手短に言えば、Ｃｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸を混合してヒドロキシルラジカルを生成した。次いで、デオキシリボースを加えると、ヒドロキシルラジカルが存在する場合には、ヒドロキシルラジカルがデオキシリボースを攻撃してフラグメントを生成した。これらのフラグメントを低ｐＨで加熱して、マロンアルデヒドを生成し、これに２−チオバルビツール酸を添加して、ピンク色の色素原を得、これを５３２ｎｍで分光測定した。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、デオキシリボースに対する損傷、したがって、ヒドロキシルラジカル生成の測度である。
【０１４３】  このアッセイを実施するために、ＣｕＣｌ2の入った緩衝液（２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７．４）、および試験化合物の入った緩衝液または緩衝液のみのいずれかを試験管に加えた（ＣｕＣｌ2の最終濃度は１０μＭであった）。試験管を室温下で１５分間インキュベートした。次いで、各試験管に、緩衝液中０．５ｍＭのアスコルビン酸と、緩衝液中１．９ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−リボースとを加え、試験管を３７℃で１時間インキュベートした。最後に、各試験管に、５０ｍＭ  ＮａＯＨ中１％（ｗ／ｖ）ＴＢＡ１ｍｌと１ｍｌの濃酢酸を加え、試験管を沸騰水中で１５分間インキュベートした。試験管を１５分間冷ました後、５３２ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１４４】  このアッセイにおいて、テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］は２：１以上のテトラペプチド／銅比でヒドロキシルラジカルの生成を完全に阻害することが判明した。２：１より低いテトラペプチド／銅比では効果がなかった。
【０１４５】  時間経過の結果が図１５Ａに示されている。図１５Ａで分るように、銅とアスコルビン酸（ペプチドは添加せず）は、速やかにＴＢＡ反応性物質を生成し、３０分後に最大に達した。テトラペプチドは２：１のテトラペプチド／銅比でＴＢＡ反応性物質の生成を阻止した。興味深いことには、テトラペプチドは１：１のテトラペプチド／銅比でＴＢＡ反応性物質の生成を遅らせた。これらのデータは、テトラペプチドは１：１テトラペプチド／銅比で、銅と結合することによりテトラペプチドに対する部位特異的ヒドロキシル攻撃を行うヒドロキシルラジカルからのある程度の保護をもたらし得ることを示唆している。ひとたび十分なテトラペプチドが破壊されると、銅が遊離し、それによって、デオキシリボースを攻撃するヒドロキシラジカルが生成する。
【０１４６】  テトラペプチドを２：１のテトラペプチド／銅比でもつと長い時間インキュベートすると、そのＴＢＡ反応性物質生成阻害能は徐々に損なわれた。図１５Ｂ参照。図１５Ｂから分るように、ＴＢＡ反応性物質の生成は、最初の４時間のインキュベーション中に９５％阻害された。２４時間までには、阻害レベルは、５０％に低下し、４８時間までには、阻害レベルは２０％に低下した。これらのデータは、ＴＢＡ反応性物質が、テトラペプチドの存在下でも生成し続けていることを示唆している。これらのデータはさらに、実験の時間経過中にテトラペプチドが分解され続けていることを示唆している。この分解は、テトラペプチドを攻撃し、分解して銅を遊離するフリーラジカルが、テトラペプチド／銅複合体に近接して生成するためであろう。ヒドロキシルラジカルなどのフリーラジカルは極めて反応性が高いために、接触状態になる最初の電子に富む分子、この場合にはテトラペプチドであると思われる分子を攻撃するのであろう。
【０１４７】  テトラペプチドによるヒドロキシルラジカル生成阻害に及ぼすｐＨの影響を２：１のテトラペプチド／銅比で試験した。この比率では、テトラペプチドは、ｐＨ７．０〜８．５でＴＢＡ反応性種の生成を＞９５％阻害した。これらは生理的ｐＨレベルおよび虚血時に予測されるｐＨレベルである（虚血組織ではアシドーシスが起こる）。ｐＨ６．０では、上記比のテトラペプチドはＴＢＡ反応性種生成阻害には効果がなかったが、これは、ヒスチジンの銅結合能が低いことによるものと思われる。ヒスチジンのイミダゾール環上の窒素原子は、６．０のｐＫａで銅結合に関与する。したがって、ｐＨ６．０では、ヒスチジンは５０％の銅と結合し得るに過ぎない。他の５０％の銅は、結合しないか、または他のアミノ酸を介してテトラペプチドにゆるく結合し、したがって、ＴＢＡ反応性種の生成に関与し得る。
【０１４８】  ヒスチジンおよび異なる位置にヒスチジンを有する数種のペプチドのヒドロキシルラジカル生成阻害能を、１：１および２：１のペプチド：銅比で試験した。さらに、Ｎ−末端アミノ酸としてアセチル化アスパラギン酸（Ａｃ−Ａｓｐ）を有するペプチドも試験した。結果は表１１に示されている。表１１において、阻害率％は、緩衝液のみの吸光度で割った緩衝液のみと比較した吸光度の低下パーセントである。
【０１４９】  表１１の結果から分るように、２位および３位にヒスチジンを有するペプチドは、２：１のペプチド：銅比で＞９５％の阻害を示したが、これらのペプチドは１：１のペプチド：銅比では効果がなかった。興味深いことには、２：１のペプチド：銅比では、１位にヒスチジンを有するペプチド、およびＮ−末端アミノ酸としてアセチル化アスパラギン酸を有するペプチドは、ある程度の保護（それぞれ、約４７％および約２８％の阻害）をもたらしたが、この保護は、これらのペプチドの、それぞれ７位と９位のヒスチジンに起因し得る。２：１のヒスチジン：銅比では、ヒスチジンのみである程度の保護（約２０％の阻害）をもたらした。
【０１５０】  カタラーゼがヒドロキシルラジカルの生成を阻止することは証明されている。ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７５９：３８−４１（１９８３）；Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１８（６）：６６７−６８２（１９９８）；Ｓａｍｕｎｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：１１９−１２４（１９８３）。したがって、このアッセイでは、カタラーゼ（０〜８０ｎＭ）を試験し、カタラーゼがピンク色の色素原の生成を阻止することが判明した（データは示さず）。この知見は、このアッセイで、カタラーゼが過酸化水素を水に分解するために、過酸化水素が形成されることを示唆しており、これは、上記の反応式３および４と一致する。さらに、カタラーゼは、Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］テトラペプチドが１：１のテトラペプチド／銅比で存在するときにピンク色の色素原の生成を阻止する（データは示さず）。上述のように、銅は、この比率でも、酸化還元反応に関与してヒドロキシルラジカルを生成し得る。これらの実験は、過酸化水素がヒドロキシルラジカルの生成に対する重要な前駆物質であることを示している。
【０１５１】
【表１１】
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Ｂ．  スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性のアッセイ
酵素スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、体内における（反応式３と類似の）スーパーオキシドの過酸化水素への分解に関与する天然酵素である。過酸化水素は次いでカタラーゼにより解毒され得る。
【０１５２】  ＳＯＤを前項に記載のアッセイで活性についてアッセイし、活性を全く有していないことを見出した（データは示さず）。この結果は驚くにはあたらない。というのは、ＳＯＤは実際にはスーパーオキシドラジカルを過酸化水素に変換するからである。次いで、過酸化水素は還元銅によりヒドロキシルラジカルに変換され得る。
【０１５３】  文献には、銅複合体がＳＯＤ活性を有するとの論文が存在する。Ａｔｈａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，３９（４）：８１３−８２１（１９９６）；Ｃｉｕｆｆｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．，３８（４）：２７９−２８７（１９９８）；Ｐｏｇｎｉら，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７３：１５７−１６５（１９９９）；ＷｉｌｌｉｎｇｈａｍおよびＳｏｒｅｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５０（１）：２５２−２５８（１９８８）；Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖａら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．，１２−１３：２１５−２２０（１９９１）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２：６４８９−６４９２（１９９０）。この知見は驚くにあたらない。というのは、ＳＯＤ自体がその活性部位に銅を有しているからである。
【０１５４】  テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］の銅複合体のＳＯＤ活性をアッセイした。ＢｅａｕｃｈａｍｐおよびＦｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４：２７６−２８７（１９７１）のキサンチンオキシダーゼアッセイを用いて、スーパーオキシドラジカルを生成した。キサンチンオキシダーゼは、酸素が電子受容体の役割を果たして、キサンチンを尿酸に変換する。これによって、スーパーオキシドラジカルが生成する。スーパーオキシドラジカルは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を還元する。還元ＮＢＴは５６０ｎｍのλｍａｘを有する。銅がキサンチンオキシダーゼ活性を阻害することは公知であり〔Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖａら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．，１２−１３：２１５−２２０（１９９１）〕、したがって、銅を含むすべての実験は、公知の銅キレート化剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）も含んでいた。ＥＤＴＡ−銅複合体をＳＯＤ活性について試験し、ＳＯＤ活性を全く有していないことが示された（データは示さず）。
【０１５５】  ＳＯＤ活性についてアッセイを実施するために、キュベット中で、０．１ｍＭ  キサンチン（シグマ  ケミカル社）、２５μＭ  ＮＢＴ（シグマ  ケミカル社）、５０ｍＭ  炭酸ナトリウム、および１．２μＭ  ＥＤＴＡ（シグマ  ケミカル社）を混合した（すべて最終濃度、最終ｐＨ  １０．２）。種々の量のテトラペプチド−銅複合体（１：１および２：１のテトラペプチド：銅比）および２０ｎＭのキサンチンオキシダーゼ（シグマ  ケミカル社）を加えて反応を開始させた。テトラペプチド−銅複合体は、テトラペプチドと銅（ＣｕＣｌ2として）とを混合し、混合物をキュベットに加える直前に１５分間室温下にインキュベートして調製した。試料は、５６０ｎｍで、０時間目と、６０秒毎に５分間読み取りを行った。
【０１５６】  １：１比のテトラペプチドと銅の複合体は、ＮＢＴ還元阻害（図１６参照）によって証明されるように、ＳＯＤ活性を有することが示された。しかし、このアッセイにおいて、この複合体は、ＩＣ50値（５０％阻害をもたらす量）に基づいて、ＳＯＤ自体の約５００分の１しか効果がなかった。２：１比のテトラペプチドと銅の複合体はＳＯＤ活性がないことが判明した（データ示さず）。
【０１５７】  １：１テトラペプチド：銅複合体がキサンチンオキシダーゼ活性に干渉しなかったことを検証するために、２９５ｎｍで尿酸の生成を測定した。Ａｔｈａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，３９（４）：８１３−８２１（１９９６）；Ｃｉｕｆｆｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．，３８（４）：２７９−２８７（１９９８）。このアッセイは、ＳＯＤアッセイと類似であるが、但し、ＮＢＴは存在しない。その代わりに、尿酸を２９５ｎｍで６０秒毎に５分間アッセイする。１：１テトラペプチド−銅複合体は、６００ｎＭの濃度で、尿酸の生成を１１％しか阻害しないことが判明した（データは示さず）。したがって、１：１テトラペプチド−銅複合体は真のＳＯＤ活性を有する。スーパーオキシドはこの複合体によって過酸化水素に変換されるので、これは、何故スーパーオキシドがヒドロキシルラジカル生成の阻止に効果がないかを説明するのに役立つであろう。
【０１５８】  １：１または２：１テトラペプチド−銅複合体を含有する溶液中でスーパーオキシドラジカルの生成を測定した。このアッセイは、ＴＢＡアッセイおよびキサンチンオキシダーゼアッセイの技術を組み合わせた。スーパーオキシドラジカルによる還元を定量するために、すべての試験管にＮＢＴを加えた。さらにアスコルベートおよび銅を含有する試料を、３７℃でインキュベートした。５分、１５分、３０分および６０分に、試料をインキュベータから取り出し、５６０ｎｍで読み取りを行った。結果が図１７に示されている。２：１テトラペプチド−銅複合体を含有する試料では、ＮＢＴの還元が経時的に増大し、３０分で最大に達した。１：１テトラペプチド−銅複合体を含有する試料もＮＢＴ還元の増大を示し、６０分で低い最大値に達した。これらのデータは、２：１テトラペプチド−銅複合体を含有する試料ではスーパーオキシドが堆積するのに対し、１：１テトラペプチド−銅複合体はスーパーオキシドジスムターゼに良く似ていることを示唆している。
【０１５９】  ヒドロキシラジカルの生成時に起こる同様な連続事象は以下の通りである：
Ｏ2→Ｏ２ ・-→Ｈ2Ｏ2→ＯＨ・  （反応式５）
１：１テトラペプチド−銅複合体がスーパーオキシドラジカル（Ｏ2・-）を過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に変換させ得ることは既に証明されている。これは、この複合体のＳＯＤ活性である。２：１テトラペプチド−銅複合体は、テトラペプチドの２分子が銅の全６配位結合を占めるためにこの変換を促進し得ない。これで、何故、２：１テトラペプチド−銅複合体が、過酸化水素の生成を阻害し、過酸化水素が還元銅と反応してフェントン反応を介してヒドロキシルラジカルを生成するためにそのように有効であるかがはっきりする。１：１テトラペプチド−銅複合体もスーパーオキシドラジカルを排除することにより有益な働きをする。この複合体は過酸化水素を生成しはするが、人体の殆どの小室は、過酸化水素を排除し得るに十分な量の酵素カタラーゼを有している。しかし、脳では、カタラーゼ活性は最小であると報告されている。Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６：１−８５（１９９０）。したがって、脳は、虚血に伴うアシドーシスによって銅が遊離するために、虚血期間中には特に損傷を受け易い器官である。
【０１６０】Ｃ．  ＤＮＡの保護
Ａｓａｕｍｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，３９（１）：７７−８６（１９９６）の方法にしたがって、ＤＮＡ鎖の破壊を測定した。手短かに言えば、１７μｇ／ｍｌのプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを、５０μＭのＣｕＣｌ2および０〜２００μＭの種々の濃度のテトラペプチドと共に、室温下に１５分間プレインキュベートした。次いで、各反応体に、２．５ｍＭのアスコルビン酸を添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。混合物の総量は１６μｌであった。次いで、０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）のキシレンシアノールＦＦおよび４０％（ｗ／ｖ）のスクロース水溶液を含有するローディング緩衝液３μｌを加えた。試料を７０ボルトで９０分間０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有するＩＸ  ＴＢＥ（トリス−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液）でゲルを３０分間染色した。次いで、ゲルを、ＩＸ  ＴＢＥ中で５分間脱染色してから、撮影した。
【０１６１】  結果は、このテトラペプチドがＤＮＡ鎖の破壊阻止に極めて有効であることを示した。図１８参照。最適な保護的テトラペプチド：銅比は２：１以上であった。というのは、これらの比率でも、依然としてゲル上に超らせん環状ＤＮＡが見られたからである。１：１以下のテトラペプチド：銅比では、ニックの入った環状ＤＮＡ、線状ＤＮＡおよびより損傷度の高いＤＮＡ（スミア）が見えた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】可能な置換箇所を示すテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｂ】可能な置換箇所を示すテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｃ】可能な置換箇所を示すテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｄ】可能な置換箇所を示すテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図２Ａ】  図１Ｃ（図２Ａ）の式の中に含まれるテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の誘導体の合成の略図。
【図２Ｂ】  図１Ｂ（図２Ｂ）の式の中に含まれるテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の誘導体の合成の略図。
【図３Ａ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｂ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシクロヘキサンジアミン誘導体の合成の略図。
【図３Ｄ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシクロヘキサンジアミン誘導体の合成の略図。
【図４】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の四酢酸誘導体の式。
【図５】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチルアミン誘導体の式。
【図６Ａ】結合する金属イオンＭを備えないメソポルフィリンIXの式。
【図６Ｂ】結合する金属イオンＭを備えたメソポルフィリンIXの式。
【図６Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のメソポルフィリンIX誘導体の式。
【図７】単糖の式。
【図８】単離した心臓が、同種のサポート動物由来の３７℃の血液によりランゲンドルフ様式で潅流される並体結合血液潅流システムの図。
【図９】図８に示した並体結合血液潅流システムによる薬物および塩類溶液での単離した潅流心臓の処置の図。
【図１０】図８および９に示した血液潅流したラット心臓モデルでの虚血時の拘縮に対する薬物（Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓ）の影響を示す、拘縮  対  虚血期間のグラフ。図１０では、−□−は、塩類溶液コントロールであり、−○−は、薬物である。
【図１１】図８および９に示した血液潅流したラット心臓モデルにおける左心室拡張期圧（ＬＶＤＰ；２０分間の介入前ベースライン値のパーセント値として表す）の虚血後回復に対する薬物Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓの影響を示す、ＬＶＤＰ  対  再潅流期間のグラフ。* は、ｐ＜０．０５を示す。図１１では、−□−は、塩類溶液コントロールであり、−○−は、薬物である。
【図１２】図８および９に示した血液潅流したラット心臓モデルにおける左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）の虚血後回復に対する薬物Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓの影響を示す、ＬＶＥＤＰ  対  再潅流期間のグラフ。* は、ｐ＜０．０５を示す。図１２では、−□−は、塩類溶液コントロールであり、−○−は、薬物である。
【図１３】図８および９に示した血液潅流したラット心臓モデルにおける心拍数（２０分間の介入前ベースライン値のパーセント値として表す）の虚血後回復に対する薬物Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓの影響を示す、心拍数  対  再潅流期間のグラフ。* は、ｐ＜０．０５を示す。図１３では、−□−は、塩類溶液コントロールであり、−○−は、薬物である。
【図１４】図８および９に示した血液潅流したラット心臓モデルにおける潅流圧（２０分間の予備介入ベースライン値のパーセント値として表す）の虚血後回復に対する薬物Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓの影響を示す、潅流圧  対  再潅流期間のグラフ。図１４では、−□−は、塩類溶液コントロールであり、−○−は、薬物である。
【図１５Ａ】ヒドロキシルラジカルの生成についてのアッセイでの５３２ｎｍでの吸光度（Ａ５３２）  対  インキュベーション時間のグラフ。図１５Ａにおいて、■＝アスコルビン酸のみ、◆＝銅およびアスコルビン酸、▲＝テトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）、銅、およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比１：１）、Ｘ＝テトラペプチド、銅、およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比２：１）。
【図１５Ｂ】ヒドロキシルラジカルの生成についてのアッセイでの５３２ｎｍでの吸光度（Ａ５３２）  対  インキュベーション時間のグラフ。図１５Ｂにおいて、◆＝銅およびアスコルビン酸、■＝テトラペプチド、銅、およびアスコルビン酸塩（テトラペプチド／銅の比２：１）。
【図１６】スーパーオキシドジスムターゼ活性についてのキサンチンオキシダーゼアッセイでの％阻害率  対  テトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）／銅比が１：１のテトラペプチド−銅錯体濃度のグラフ。
【図１７】スーパーオキシドラジカル生成についてのアッセイでの５６０ｎｍでの吸光度（Ａ５６０）  対  時間のグラフ。図１７において、■＝アスコルビン酸のみ、◆＝銅およびアスコルビン酸、△＝テトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）、銅、およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比１：１）、Ｘ＝テトラペプチド、銅、およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比２：１）。
【図１８】種々の方法で処置したＤＮＡの電気泳動後のゲル。レーン１：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ（未処置コントロール）；レーン２：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡおよび５０μＭ  ＣｕＣｌ2 ；レーン３：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡおよび２．５ｍＭアスコルビン酸；レーン４：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、５０μＭ  ＣｕＣｌ2 、および２００μＭテトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）（テトラペプチド／銅の比４：１）；レーン５：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、５０μＭ  ＣｕＣｌ2 、および１００μＭテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比２：１）；レーン６：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、５０μＭ  ＣｕＣｌ2 、および５０μＭテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比１：１）；レーン７：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、５０μＭＣｕＣｌ2 、および２５μＭテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比１：２）；レーン８：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、５０μＭ  ＣｕＣｌ2 、および１２．５μＭテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比１：４）；レーン９：１７μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭアスコルビン酸、および５０μＭ  ＣｕＣｌ2 （陽性コントロール）；並びにレーン１０：ＤＮＡラダー。
【図１９Ａ】本発明のペプチド二量体の式。
【図１９Ｂ】本発明のペプチド二量体の合成を示す図。
【図１９Ｃ】本発明のペプチド二量体の合成を示す図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【配列表】
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