(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−Ｏ−脱硫酸度が全ウロン酸単位の６０％以下である２−Ｏ−脱硫酸ヘパリン誘導体であって、下記式（Ｉ）を有することを特徴とする２−Ｏ−脱硫酸ヘパリン誘導体：
【化１】
0005371167.tif 000016
（Ｉ）
［式中、Ｕ環は、以下の意味：
【化２】
0005371167.tif 000017
を有し；
ＸおよびＸ'は、同一または異なっていてよく、アルデヒド基または−ＣＨ２−Ｄ基であり、ここで、Ｄは、ヒドロキシル、アミノ酸、およびオリゴ糖からなる群から選択され；
ＲおよびＲ１は、同一または異なっていてよく、ＳＯ３またはアセチル残基であり；
ｎおよびｍは、同一または異なっていてよく、１〜４０であり；ｎ＋ｍの合計は、６〜４０の範囲であり；ｍ：ｎ比は、１０：２〜１：１の範囲であり、記号
【化３】
0005371167.tif 000018
は、ｍおよびｎを付した単位が多糖鎖に沿って統計学的に分布していることを示す］。
【請求項２】
天然起源ヘパリンからの下記式の化合物の製造法であって：
【化４】
0005371167.tif 000019
［式中、Ｕ環は、以下の意味：
【化５】
0005371167.tif 000020
を有し；
ＸおよびＸ'は、同一または異なっていてよく、−ＣＨ２−Ｄ基であり、ここで、Ｄは、アミノ酸、およびオリゴ糖からなる群から選択され；
ＲおよびＲ１は、同一または異なっていてよく、ＳＯ３またはアセチル残基であり；
ｎおよびｍは、同一または異なっていてよく、１〜４０であり；ｎ＋ｍの合計は、６〜４０の範囲であり；ｍ：ｎ比は、１０：２〜１：１の範囲であり、記号
【化６】
0005371167.tif 000021
は、ｍおよびｎを付した単位が多糖鎖に沿って統計学的に分布していることを示す］、
以下の工程を含む方法：
（ａ）室温〜１００℃の範囲の温度で、塩基性処理して、制御パーセンテージのイズロン酸の２位における硫酸基を脱離させ、エポキシド基を形成させる工程；
（ｂ）ｐＨ７で、５０℃〜１００℃の範囲の温度で、該エポキシド環を開環してガラクツロン酸の残基を得る工程； 
（ｃ）ジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してグリコシド環の開環および修飾残基１個につき２個のアルデヒド基の形成を生じる工程；および、
（ｄ）該アルデヒド基を一級アルコールに還元する工程；
ここで、該方法はさらに以下の工程を含んでいてもよい；
（ｅ）Ｄ基を、ヒドロキシル、アミノ酸およびオリゴ糖からなる群から選択される基に転換する工程。
【請求項３】
さらに、リアーゼ、ヘパリナーゼ、およびヘパリチナーゼからなる群から選択される酵素で部分酵素加水分解して、不飽和イズロン酸からなる非還元末端残基、Ｎ−スルホグルコサミンからなっていて少なくとも１個の開環イズロン酸残基を含有する還元残基を有するオリゴ糖を得る工程、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
活性成分として請求項１に記載の誘導体を医薬上許容される媒体および／または賦形剤と混合して含む医薬組成物。 
【請求項５】
転移を伴う腫瘍、腫瘍転移、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症および乾癬からなる群から選択される、異常な脈管形成に関連する疾患の治療用の請求項４記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、部分脱硫酸グリコサミノグリカン誘導体、詳しくは、ヘパリン、それらの製造法、それらの、抗脈管形成活性を有する薬剤、詳しくは、転移形態のような腫瘍の治療のための薬剤の調製のための活性成分としての使用、およびそれらを含む医薬組成物に関する。
【０００２】（従来技術）
抗脈管形成活性を有する最初の分子は、１９７５年にヘンリー・ブレム（Henry Brem）およびユダ・フォークマン（Judah Folkman）により軟骨中で発見された。その年以来、抗脈管形成を阻害する能力を有する３００種類を超える新しい分子が発見された。
【０００３】  '８０年代の初めには、腫瘍脈管形成の阻害物質としてのインターフェロン（α／β）の発見に伴って、この治療法に基づいた臨床試験が開始された。
【０００４】  １９９８年３月３日にニューヨークタイムズ（New York Times）によって、ボストンにあるハーバード・メディカル・スクール・アンド・チルドレンズ・ホスピタル（Harvard Medical School and Children's Hospital）のジェイ・フォークマンズ・ラボラトリーズ（J. Folkman's laboratories）において発見されたアンギオスタチンおよびエンドスタチンという２種類の分子が癌に対する闘争において非常に有望な結果を産み出しているというニュースが公表されるとマスメディアは相当な物議をかもした。これら２つの分子の高度な脈管形成阻害効力により、新しい化合物の探究が増加した。現今は、臨床試験段階［フェーズＩ−ＩＩＩ］に入った、抗脈管形成メカニズムを介して作用する抗癌活性を有する約３０種類の分子があり、ほとんど同数の会社および団体が関与している。
【０００５】  米国だけでは、抗脈管形成療法によって利益を得ることができる患者が約９００万人いると推定される。現今では、少なくとも４，０００人の患者が、特有の望まれない作用を示さないこの療法を用いる臨床試験に登録している。
【０００６】  脈管形成の一般的な概念の枠組み内で、本発明者らは、血管形成、すなわち、胎児発育中の血管の形成と、既存の血管から出発する出生後の生涯の間の新血管（毛細管）の形成を意味する用語の厳密な意味での脈管形成とを区別している。固体腫瘍の増殖に関する脈管形成の重要性は十分に立証されている。過去３０年間にわたって、腫瘍増殖および転移の形成が腫瘍塊を血管新生化する能力を有する新血管の発生に厳密に依存していることが報告されてきた。
【０００７】  脈管形成の阻害は、腫瘍内での壊死塊の形成または腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発を引き起こす。
【０００８】  正常な組織における新血管新生と腫瘍組織における新血管新生と間には明らかな差異がある。前者においては、血管内皮は、その構成細胞の非常に低い分裂指数を有する静止状態の組織であり（再生期間は数百日間で測定された）、血管網は、規則正しく、比較的均一であり、動静脈吻合なしで全ての組織に適当に酸素を送り込むのに適している。他方、腫瘍組織においては、内皮細胞の増殖の刺激は、後者において高い分裂指数を引き起こし（平均再生期間５日間）、新血管新生は、閉塞域について、しばしば、閉鎖端について、および、いくつかの箇所での動静脈接触について確かに不規則であり、最後に、基底膜は、ギャップを与え、いくつかの箇所で組織低酸素に導く。これらの差異は、腫瘍新血管新生を選択的に遮断する薬物を同定する機会を与える。
【０００９】  腫瘍において、新血管新生は、腫瘍発生における正確な段階と常に同時に起こるわけではない；実際に、腫瘍の発生前でさえ脈管形成が始まる場合（例えば、子宮頚癌）、２つのフェーズが一致する場合（例えば、膀胱癌および乳癌）、および新生物後に脈管形成が始まる場合（例えば、黒色腫および卵巣癌；例えば、“Manual of Medical Oncology”, IV ed. (1991) G. Bonadonna et al.を参照）がある。
【００１０】  抗脈管形成療法は、伝統的な標準化学療法と比較して多くの利点を提供する（Cancer Research 1998, 58, 1408-16）：
ａ）特異性：その標的は、プロセス、すなわち、腫瘍新血管新生である；
ｂ）生物学的利用能：その標的は、腫瘍細胞に直接作用する伝統的な化学療法の問題点を伴わずに容易に達することができる内皮細胞である；
ｃ）化学療法抵抗性：これは、おそらくこの療法の最も重要な利点であると思われる；実際、内皮細胞は、腫瘍細胞と異なり、遺伝的に安定であるので、薬物抵抗現象が生じるとは考えられない；
ｄ）転移性拡散：新血管新生の遮断は、血流を介する、腫瘍細胞の、身体の他の部分への増殖を制限する；
ｅ）アポトーシス：腫瘍における血管網の遮断は、酸素および栄養素の腫瘍細胞への供給を減少させる；アポトーシスは、これらの条件下で支持される；
ｆ）全身性毒性の低下；伝統的な化学療法に関してほとんど例外なく存在している、骨髄抑制、胃腸作用および一時的な毛髪損失などの毒物作用は、抗脈管形成療法について認められない。
【００１１】  多くの分子要素は、腫瘍脈管形成に関与することが知られている（Oncology 1997, 54, 177-84）。プロ−および抗−脈管形成内因性ファクターが新しい血管の形成における生物学的調節メカニズムに関与することが知られている。
【００１２】  脈管形成刺激因子のうち、本発明者らは、以下のものを挙げる：線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、トランスフォーミング成長因子−α、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血小板由来内皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子−β、インビトロ阻害物質（インビボ刺激因子ではない）、胎盤成長因子、インターロイキン−８、肝細胞成長因子、血小板由来成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、プロリフェリン、プロスタグランジン類（ＰＧＥ１、ＰＧＥ２）、ＧＭ１−ＧＴ１ｂ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、および一酸化窒素。
【００１３】  対照的に、脈管形成阻害物質としては以下のものが挙げられる：ｂＧＦＧの可溶性受容体、インターフェロン類（α、β、γ）、アンギオスタチン、トロンボスポンジン１、プロラクチン（１６ｋＤａ末端アミノフラグメント）、血小板因子４（ＰＦ４）、組織メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）阻害物質、胎盤プロリフェリン関連ペプチド、神経膠腫由来脈管形成阻害因子、アンギオスタチック（angiostatic）ステロイド類、軟骨由来阻害物質（ＣＤＩ）、ヘパリナーゼ、インターロイキン−１２、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質、レチノイド類、エンドスタチン、アンギオポエチン−２、ゲニステイン、一酸化窒素およびＧＭ３。
【００１４】  インテグリンは、細胞間相互作用および細胞−細胞外マトリックス相互作用を媒介する膜貫通型タンパク質の非常に大きなファミリーである。全てのインテグリンは、共通ペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（「ユニバーサル細胞認識部位」）を認識する能力を有する、もっともあらゆるインテグリンがこのトリペプチドの異なるコンホメーションを優先的に認識するが。特定のサブタイプのインテグリンの阻害は、また、脈管形成阻害物質の開発のために薬理学的見地から非常に興味深いことでもあり得る。
【００１５】  プロテインキナーゼ−Ｃ（ＰＫ−Ｃ）の抑制は、また、脈管形成の調節を可能にする。実際、脈管形成を完全にまたは部分的に遮断する能力を有する古典的ＰＫ−Ｃ阻害物質がある。
【００１６】  莫大な投資ならびに多数の団体および個人の研究センターがあるにもかかわらず、世界的な癌の問題は、なおも、決して明確に解決されるものではない。癌の犠牲者の予後は改善されていて、この３０年間にわたって生存率が平均３０％〜５０％上昇しており、腫瘍の発生に関する遺伝的、細胞的および生化学的メカニズムは現在よく知られているが、この種の病状を打ち破るかまたは少なくとも制限する可能性は、なおも、非常に感じられる関心のある問題であり、再発の可能性、完全な緩解および原発腫瘍の転移性拡散などの多くの局面がなおも解決されていない。
【００１７】  フォークマン（Folkman）の観察が国際科学コミュニティーによって確認され始めた'７０年代後半以来、抗脈管形成活性を有する数百種類の分子が天然源（植物、真菌類、生体液）から単離されており、かつ、研究室にて合成されてきた。
【００１８】  Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（ブリティッシュ・バイオテク（British Biotech.））、ｌ'ＡＧ３３４０（プリノマスト−アグロン（Prinomast-Agouron））、およびＮｅｏｖａｓｔａｔ（エテルナ（Aeterna））などの多くの薬物は、すでにフェーズＩＩＩであり、それらの全てはメタロプロテイナーゼとの干渉を必要とするメカニズムでもって主に肺レベル（ＳＮＣＬ）で作用する。ＲｈｕＭａｄ ＶＥＧＦ（これはジェネテク（Genetech）による抗ＶＥＧＦ抗体である）およびインターフェロンα（市販品）もまたフェーズＩＩＩであり、それらは、内皮細胞に対して直接作用するプロ−脈管形成成長因子またはＴＮＰ−４７０（ティエーピー・ファーム（TAP Pharm.））とのそれらの干渉のために固形腫瘍に対して活性である。最後に、ＣＡＩ（エヌシーアイ（NCI））およびＩＭ８６２（サイトラン（Cytran））などの薬物は、抗脈管形成性物質として活性であるが、メカニズムは非特異的であまり知られていない。
【００１９】  これらの上記薬物は、数年の間に腫瘍学者の治療用品の一部となり得るが、前臨床試験に基づいて非常に期待できる、Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ（オキシジーン（OxiGene））、メトキシ−エストラジオールおよびエンドスタチン（エントレメド（EntreMed））などの、最近、フェーズＩ／ＩＩ臨床試験に入った他の分子がある。ブリストル・マイヤーズ−スクイブ（Bristol Myers-Squibb）（ＢＭＳ−２７５２９１に関する）、ノバルティス（Novartis）（ＣＧＳ２７０２３Ａに関する）またはパーク−デーヴィス（Parke-Davis）（Ｓｕｒａｍｉｎに関する）などの会社がこの治療ストラテジーに関与している。
【００２０】
ヘパリン
ヘパリンは、種々の鎖長および種々の硫酸化度を有する天然起源多糖類の異種混合物であり、抗凝固活性を有し、肝臓（最初に単離された）、筋肉、肺、胸腺および脾臓に存在する結合組織マスト細胞によって分泌される。
規則的な配列に加えて、抗トロンビン活性についての活性部位に対応する配列がヘパリンにおいて同定された。
ヘパリンおよびその誘導体の抗腫瘍および抗転移活性は、ヘパラナーゼを阻害し、成長因子を遮断し、脈管形成を調節するその能力による。
【００２１】  ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、遍在性タンパク質リガンドである。該タンパク質は、タンパク質分解性分解作用に対する単純な固定化または保護から脈管形成のような生物活性の特異的調節までの種々の作用に関してＨＳ鎖に結合する。
【００２２】  ヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）における炭水化物骨格は、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびヘキスロン酸（Ｇｌｃ．ＡまたはＩｄＯ．Ａ）で交互に構成される。
ヘパリンにおいては、ＧｌｃＮ残基は主にＮ−硫酸化されているが、一方、ＨＳにおいては、それらはＮ−硫酸化およびＮ−アセチル化の両方がなされており、非置換Ｎ−は少量である。
ＨＳは、また、Ｏ−硫酸化が平均してヘパリンよりも少ない。
腫瘍、特に、転移、などの脈管形成障害の治療におけるヘパリンの使用は、実質的に、ヘパリンの抗凝固活性によって制限される。
ヘパリンの抗腫瘍特性を保護すると同時にその抗凝固許容量を減少させるために、ヘパリンに対して化学的修飾が行われた。
【００２３】  抗トロンビン部位における一単位のグルクロン酸の開環は、抗トロンビンに対するヘパリンの親和性を低下させる：このようにして、抗凝固作用が低下したが、抗脈管形成特性をなおも保有しているヘパリンを用いることができる。
【００２４】  ヘパラナーゼ
「ヘパラナーゼ」は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびヘパリンの鎖の内部グリコシド結合を加水分解するエンドグリコシターゼのファミリーに属する酵素である。
これらのエンドグリコシダーゼは、腫瘍細胞の増殖、転移および腫瘍の新血管新生に関与している。このことは、それらが、また、ＦＧＦ（ＧＦＧ−１とも称される）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２とも称される）およびＶＥＧＦなどのヘパリンに結合した成長因子の、細胞外マトリックスからの放出の結果として腫瘍脈管形成に関与し得ることを示唆している。
【００２５】  これらの酵素は、抗脈管形成活性についての生物学的標的である。科学文献には、多数の構造／活性相関性研究が開示されている（例えば、Lapierre F. et al., Glycobiology, vol.6, (3), 355-366, 1996 を参照）。なおも多くの側面が明らかにされなければならないが、より選択的な新しい誘導体を得るためのガイドとして役立つ構造的なタイプの考察を出現させる特異的試験を用いるヘパリンおよびその誘導体によるヘパラナーゼの阻害に関する研究が報告された。
【００２６】  上記した  Lapierre et al.の研究では、２−Ｏ脱硫酸または「グリコールスプリット」（過ヨウ素酸塩での酸化、次いで、水素化ホウ素ナトリウムでの還元）によって得られたヘパリン誘導体が開示されている。ここで「２−Ｏ−脱硫酸ヘパリン」および「ＲＯ−ヘパリン」であると定義されたこれらの誘導体は、表ＩＩＩ（同書第360頁）において報告されているように、各々、コルチコステロイドの存在下でのＣＡＭ試験によって評価した場合、ヘパリンの抗脈管形成活性を部分的に維持していた。
【００２７】  ヘパリンおよびＦＧＦ
ＦＧＦは、細胞増殖および分化のような複数の生理学的プロセスを調節するが、腫瘍脈管形成のような病理学的プロセスに関与する機能もまた調節する。
ＦＧＦは、酸性（ＦＧＦ−１）および塩基性（ＦＧＦ−２）が最も研究されてきたものであり、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）に結合してそれを活性化するのに多糖コファクター、ヘパリンまたはＨＳを必要とする成長因子（１０を超えるポリペプチドからなるファミリー）である。
ヘパリンおよびＨＳがＦＧＦを活性化する正確なメカニズムは知られていないが、ヘパリン／ＦＧＦ／ＦＧＦＲが「三分子」または「三元」複合体を形成することは知られている。
仮定される一のメカニズムは、ヘパリンおよびＨＳがいわゆるＦＧＦのサンドイッチ二量体化を誘発し、このようにして二量体化されたものがＦＧＦＲと安定な複合体を形成することである。
【００２８】  ヘパリン誘導体の抗転移活性
原発腫瘍の転移細胞発生能は、おそらく抗癌療法が直面している主要な問題である。
実質的なヘパラナーゼ遮断能を有するヘパリン誘導体は、原発腫瘍および転移の両方における脈管形成を阻害する能力を同等に有すると考えられる。
加えて、ヘパラナーゼの阻害は、原発腫瘍から他の器官への腫瘍細胞遊走能を低下させる。
ヘパリンの場合の構造／抗転移活性相関性の例を下記表に示す。
【００２９】
【表１】
0005371167.tif 000002
【００３０】  この表のデータは、ヘパリンの非常に短いフラグメントがなおも良好な抗転移活性を有しているが、グルコサミンのアミン基がコハク酸と結合するとこの活性が低下することを示している。
【００３１】  脈管形成阻害作用に好都合であるヘパリン様分子の構造的必要条件は、遮断しようとする標的に基づいて２つのカテゴリーに分類することができる：
ａ）成長因子を放出する、ヘパラン硫酸のグリコシド結合を加水分解する酵素であるヘパラナーゼの遮断。
このために、ヘパリン様化合物は、好ましくは、Ｎ−アセチル−グルコサミン−グルクロン酸（またはＮ−硫酸化グルコサミンを含有する少なくとも８つの単糖単位の配列を含む（例えば、D .Sandback-Pikas et al., J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) および引用された文献を参照））。
ｂ）脈管形成性成長因子（線維芽細胞タイプ：ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２；血管内皮細胞タイプ：ＶＥＧＦ；血管透過性タイプ：ＶＰＦ）の遮断。
このために、ヘパリン様化合物は、好ましくは、２−硫酸化イズロン酸およびグルコサミンＮ，６−硫酸化を含有する少なくとも５つの単糖単位長の配列を有する（例えば、M. Maccarana et al., J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993) を参照）。
該文献において、トロンボスポンジン受容体に結合することにより作用する抗脈管形成活性を有する低分子量ペプチド（５〜１３アミノ酸）（University of Washingtonの米国特許第5,399,667号）、または長いペプチド（約５０アミノ酸）。
ＩＣ５０＝７ｎＭの内皮細胞増殖阻害能を有する修飾血小板因子が知られている（EP 0 589 719、Lilly）。
抗脈管形成活性を有するオリゴ糖フラグメントもまた十分に開示されている：実際、炭水化物配列を変えることによって相互作用選択性を増強させることができることが判明した。
【００３２】  加えて、ヘパリンは、ヘパリンの血管内皮細胞に対する親和性を利用して、いくつかのステロイド類のような自体抗脈管形成性である物質に対するビヒクルとして用いることができる；例えば、コルチゾールと結合したヘパリンがアジピン酸ヒドラジンのような酸不安定性リンカーと共にクレームされている、University of Texas and Imperial Cancer Research Technology の WO 93 /18793 を参照。コンジュゲート分子の抗脈管形成作用は、同時に投与された場合でさえ、非コンジュゲート分子のものよりも大きい。
【００３３】  Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96 には、ステロイド（例えば、コルチゾール）と結合した、２つの非コンジュゲート分子よりも大きい抗脈管形成活性を提供するＣ−２０にヒドラゾン基を有するヘパリンが記載されている。
Daiichi Sc. による EP 0 246 654 には、フェーズＩＩ試験について抗脈管形成活性を有する硫酸化多糖類が記載されている。
Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll. による EP 0 394 971 には、（ＦＧＦ−１）によって刺激される内皮細胞の増殖および脈管形成を阻害する能力を有する、低硫酸化の六糖類 − ヘパリンフラグメント − が記載されている。
Alfa Wasserman による EP 0 618 234 には、求核基を有するヘパリンまたはヘパラン構造をもつ半合成グリコサミノグリカン類の製造法が記載されている。
【００３４】  Glycomed による WO 95/05182 には、抗凝固活性、抗脈管形成活性および抗炎症活性を有する種々の硫酸化オリゴ糖類が記載されている。
Glycomed による米国特許5,808,021 には、イズロン酸の２位（Ｉ、２−Ｏ）およびグルコサミン単位の３位（Ａ、３−Ｏ）での脱硫酸パーセンテージが元のパーセンテージの約９９〜約７５％の範囲である、実質的に解重合されていない２−Ｏ,３−Ｏ脱硫酸ヘパリンの製造法が記載されている。この方法は、カルシウムまたは銅によって例示される二価の金属の陽イオンの存在下で行われる脱硫酸、次いで、得られた生成物の凍結乾燥を示している。該脱硫酸ヘパリンは、抗脈管形成活性を有する。
【００３５】  本発明の目的は、ヘパラナーゼ阻害および／またはＦＧＦ増殖因子阻害メカニズムに基づいて抗脈管形成活性を生じるのに最適なグリコサミノグリカン構造を見出すことである。本発明のさらなる目的は、ヘパリン誘導体の典型的な副作用、例えば、抗凝固活性を実質的に欠いている抗脈管形成活性を有する薬剤を提供することである。
【００３６】  発明の概要
この度、ヘパリン様グリコサミノグリカン、ヘパリン、または異なる程度にＮ−脱硫酸し、次いで、全部または部分Ｎ−アセチル化していてもよいグリコサミン残基を含有する修飾ヘパリンなどのグリコサミノグリカンを、全ウロン酸単位の６０％以下までの脱硫酸度に制御された２−Ｏ−脱硫酸処理に付して脈管形成成長因子結合特性を維持することが見出された。意外にも、その全ウロン酸単位の６０％以下までのヘパリン２−Ｏ−脱硫酸は、著しく抗脈管形成性である。
【００３７】  本発明における条件下で行われる脱硫酸は、また、２,３位にオキシラン環を有するイズロン酸単位の形成も生じる。本発明における条件下におけるオキシラン環の開環によりＬ−イズロン酸単位またはＬ−ガラクツロン酸単位が生じる。
【００３８】  本発明の目的は、全ウロン酸単位の６０％以下の脱硫酸度でもって選択的に部分脱硫した、グリコサミノグリカン誘導体、特に脱硫酸ヘパリンであり；これらの脱硫酸ギャップは、二糖三硫酸化単位の連続によって構成される規則的な配列の長さを減少させる。
【００３９】  一の特定の実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
0005371167.tif 000003
［式中、Ｕ環は、以下の意味：
【化５】
0005371167.tif 000004
を表すことができ；
ＸおよびＸ'は、同一または異なっていてよく、アルデヒド基または−ＣＨ２−Ｄ基であり、ここで、Ｄは、ヒドロキシルまたはアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物もしくはオリゴ糖の残基であり；
ＲおよびＲ１は、同一または異なっていてよく、ＳＯ３またはアセチル残基であり；
ｎおよびｍは、同一または異なっていてよく、１〜４０であり；ｎ＋ｍの合計は、６〜４０の範囲であり；ｍ：ｎ比は、１０：２〜１：１の範囲である］
で示される化合物に関する。好ましくは、ｍは、ｎよりも大きいかまたはｎと等しい。好ましくは、ｎは、ｎ＋ｍの合計の４０〜６０％の範囲である。記号
【化６】
0005371167.tif 000005
は、ｍおよびｎを付した単位が多糖鎖に沿って統計学的に分布しており、必ずしも連続している必要がないことを示す。
【００４０】  本発明の課題である化合物は、興味深い抗脈管形成特性を有しており、したがって、異常な脈管形成に基づく病理の治療用、特に、転移の治療用の薬物の製造のための活性成分として有用である。
【００４１】  有利には、本発明の化合物は、減少した抗凝固特性、そうでなければ存在しない抗凝固特性を提供し、かくして、ヘパリンの典型的な副作用を回避または減少させる。さらなる利点は、本発明の化合物をＮＭＲ分光法のような機器分析技法を用いて特徴付けることができ、かくして、工業的な観点から絶対的に望まれるプロセス制御を可能にするということに起因する。
【００４２】  修飾ヘパリンの場合もまた、分子量（ＭＷ）は、脈管形成阻害物質を調製する場合に非常に重要な機能を有する。実際、五糖単位に相当する値への分子量（ＭＷ）の減少は、抗脈管形成活性を喪失させない。対照的に、ある長さを超えるヘパリン鎖は、二量体化、かくして、ＦＧＦの活性化を阻害するよりもむしろそれに有利に働く。
【００４３】
発明の詳細な記載
脱硫酸度によって意味されるものは、出発ヘパリン中に元々存在する全ウロン酸に対する非硫酸化イズロン酸のパーセンテージである。脱硫酸パーセンテージについての一の初期の好ましい範囲は、約４０〜約６０％である。式（Ｉ）で示される化合物のうち好ましい化合物は、以下のものである：
分子量（ＭＷ）が１１２００Ｄであり、多分散指数Ｄが１.３であり、脱硫酸度が１.９９（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが約５０％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されているヘパリン（以下、ＳＴ１５１４とも称する）。該化合物は、他の対応する定義では、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎを付した単位が多糖鎖に沿って規則的に交互に分布している式（Ｉ）で示される化合物である。
【００４４】  本発明の化合物は、
（ａ）室温〜約１００℃の範囲の温度で、好ましくは、５０〜７０℃の範囲の温度で、さらに好ましくは、約６５℃で、塩基性処理して、制御パーセンテージのイズロン酸の２位における硫酸基を脱離させ、エポキシド基を形成させる工程；所望により、
（ｂ）約ｐＨ７で、約５０℃〜約１００℃の範囲の温度で、好ましくは、約７０℃で、該エポキシド環を開環してガラクツロン酸の残基を得る工程；または、
（ｃ）約０℃〜３０℃の範囲の温度で、好ましくは、約２５℃で、該エポキシド環を開環して、イズロン酸の残基を得る工程；および、所望により、
（ｄ）ジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してグリコシド環の開環および修飾残基１個につき２個のアルデヒド基の形成を生じる工程；
（ｅ）該アルデヒド基を第１アルコールに還元し、次いで、所望により、Ｄ基を、式（Ｉ）における定義において考えられるヒドロキシル以外の基に転換する工程；
（ｆ）任意の酸加水分解を行って規則的な配列に対応するオリゴ糖を得る工程；または
（ｇ）リアーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、または工程ｅ）で得られる生成物の等価物からなる群から選択される酵素で部分酵素加水分解して、不飽和イズロン酸からなる非還元末端残基、Ｎ−スルホグルコサミンからなっていて少なくとも１個の開環イズロン酸残基を含有する還元残基を有するオリゴ糖、好ましくは、四糖または八糖を得る工程；または
（ｈ）工程ａ）において得られた化合物、または工程ｂ）において得られた生成物を部分酵素加水分解によって処理する工程；および、所望により、
（ｉ）工程ａ）、ｂ）およびｅ）のうちの１つ工程において得られた生成物を部分６−Ｏ−脱硫酸に付す工程；または
（ｊ）部分的または完全に６−脱硫酸された出発ヘパリンを工程ａ）、ｂ）およびｅ）に付す工程
を含む方法により製造される。
【００４５】
本発明によると、好ましい化合物は、以下のものである：
工程ａ）が６０℃で４５分間行われ、工程ｂ）がｐＨ７で、７０℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量（ＭＷ）が１１２００Ｄであり、多分散指数Ｄが１.３であり、脱硫酸度が１.９９（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが約５０％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン（以下、ＳＴ１５１４とも称する）。
【００４６】  分子量は、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ（高速液体クロマトグラフィー − ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によって測定される。脱硫酸度は電導度測定法によって測定され、修飾ウロン酸のパーセンテージはＣ１３−ＮＭＲによって測定される。
【００４７】  ＭＷは、分子量であり、Ｄは、ＭＷ／Ｍｎで表される多分散指数である。
【００４８】
本発明によると、出発物質は、種々の起源のグリコサミノグリカン、好ましくは、天然起源ヘパリンである。０〜１００％の範囲のＮ,６−二硫酸化の含有パーセンテージを有する化学的に修飾したヘパリンを用いることも可能である。異なる６−Ｏ−硫酸化グルコサミン含有量を有する生成物から出発して、一の開環イズロン酸と別のイズロン酸との間の規則的な配列の長さを調節することが可能である。グリコシド環の開環を提供する本発明のグリコサミノグリカンは、当業者により慣用的にＲＯ誘導体と称されており、これは、グリコシド環が、酸化作用、次いで、還元によって開環されたことを意味する（還元−酸化 − ＲＯ）。このグリコシド環の開環は、開環上に存在する２つの第１ヒドロキシの形成のために、慣用的にいわゆる「グリコールスプリット」（glycol split）とも称される。本明細書で言及される化合物は、「ＲＯ」または「グリコールスプリット」誘導体とも称される。
【００４９】  本発明のさらなる実施態様において、上記開環反応（「グリコールスプリット」）から誘導されたアルデヒドおよび第１ヒドロキシは、次なる機能付与に力を貸す。したがって、式（Ｉ）で示される化合物は、また、１個の糖またはアミノ酸から１単位を超える長さ（好ましくは、２または３単位）までの範囲の、グリコールスプリットから誘導される第１ヒドロキシ上に、ＸおよびＸ'について上記で定義した同一または異なる基、例えば、オリゴ糖またはペプチド基を有する。
【００５０】  ＸおよびＸ'が−ＣＨ２ＯＨである式（Ｉ）で示される化合物はまた、処方薬物の通常の製造条件および貯蔵条件下で安定な結合をもたらす能力を有するが、しかしながら、体内で、好ましくは、標的器官付近で輸送された薬物を放出するヘパリン部分との適当な結合によって、他のタイプの薬物についてのビヒクルとして用いることもできる。輸送され得る薬物の例は、大きい標的選択性および低い全身性毒性の関連する利点を有する、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド類、ならびに抗転移作用を有する他の薬物であり、この場合、本発明の化合物とそれに結合した抗転移剤との個別の固有活性の集約の結果として抗転移効果の有利な増強がある。これらの薬物の例は、メタロプロテイナーゼ阻害物質である。有用に輸送され得る他の薬物は、内皮レベルで作用するものである。ＸおよびＸ'がヒドロキシまたはアルデヒド以外である式（Ｉ）で示される化合物は、薬物用のビヒクルが薬物動態学または薬力学上の理由で望ましい場合、該ビヒクルとして用いることもでき、この場合、ＸおよびＸ'基は、輸送分子、すなわち、本発明のグリコサミノグリカンと、ビヒクルとして作用する分子との間の「スペーサー」として作用する。
【００５１】  本発明の化合物をヘパリンから誘導する場合、これらは、当業者に知られている脱硫酸技術によってヘパリン自体から出発して調製される。例えば、脱硫酸は、室温〜１００℃の範囲の温度、好ましくは、５０〜７０℃の範囲の温度、例えば、６０℃で、所望の脱硫酸を得るのに十分な時間、水酸化ナトリウムのようなアルカリ剤の存在下で行われる。脱硫酸は、反応物の濃度、温度および反応時間のようなプロセスパラメーターに基づいて作用することによって制御される。一の好ましい例は、８０ｍｇ／ｍｌの基質（グリコサミノグリカン）の一定濃度、１ＭのＮａＯＨの一定濃度、６０℃の一定温度を維持すること、および１５〜６０分の反応時間を用いて脱硫酸を制御することにある。当業者は、実験規範における通常の試行錯誤に基づいて、および該当業者の該課題の一般的な知識に基づいて、例えば、反応温度を上昇させたり、反応時間を短縮させたりすることによって、条件を変えることができる。
【００５２】  アルカリ剤での処理により、脱硫酸単位上のエポキシド環の存在によって特徴付けられる中間生成物が得られる。全く意外な方法で、これらの中間体は、式（Ｉ）で示される化合物の抗脈管形成特性と類似の抗脈管形成特性を持つことが証明された。したがって、本発明のさらなる目的は、脱硫酸部位上のエポキシド環によって特徴付けられる、部分的に脱硫酸されたヘパリンの誘導体、したがって、電荷が減少したヘパリン、特に、６０％以下脱硫酸されたヘパリンである。エポキシド環によって特徴付けられた該化合物は、また、本発明によって包含される目的、すなわち、それらを含有する医薬組成物および抗脈管形成活性を有する薬物の製造のためのそれらの使用にも属する。
【００５３】
以下の化合物が好ましい：
分子量（ＭＷ）が１２９００Ｄであり、多分散指数Ｄが１.５であり、脱硫酸度が２．０５（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基５％、酸化および還元ウロン酸残基２９％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン（以下、ＳＴ１５１３とも称する）；
分子量（ＭＷ）が１１０００Ｄであり、多分散指数Ｄが１.５であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基５％、酸化および還元ウロン酸残基２９％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン；
分子量（ＭＷ）が９２００Ｄであり、多分散指数Ｄが１.５であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基１１％、酸化および還元ウロン酸残基２７.５％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン。
【００５４】  本発明の可能な実施態様の一において、以下のものが好ましい：
工程ａ）が６０℃で１５分間行われ、工程ｂ）がｐＨ７で、７０℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量（ＭＷ）が１２９００Ｄであり、多分散指数Ｄが１．５であり、脱硫酸度が２．０５（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基５％、酸化および還元ウロン酸残基２９％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン（以下、ＳＴ１５１３と称する）；
工程ａ）が６０℃で３０分間行われ、工程ｂ）がｐＨ７で、７０℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量（ＭＷ）が１１０００Ｄであり、多分散指数Ｄが１．５であり、脱硫酸度が１．８（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基５％、酸化および還元ウロン酸残基２９％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン（以下、ＳＴ１５１６と称する）；
工程ａ）が６０℃で６０分間行われ、工程ｂ）がｐＨ７で、７０℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量（ＭＷ）が９２００Ｄであり、多分散指数Ｄが１．５であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基１１％、酸化および還元（スプリット）ウロン酸残基２７．５％である部分的に２−Ｏ−脱硫酸されたヘパリン（以下、ＳＴ１５１５と称する）。
【００５５】  エポキシド環の形成に次いで、公知技法によって後者を再度開環する。形成されたエポキシドのパーセンテージは、エポキシドを含有するウロン酸環の炭素２および３ならびにアノマーシグナルの総数（グルコサミンのＣ１およびウロン酸残基）の特徴を示す約５５ｐｐｍでの１３Ｃ−ＮＭＲシグナルの面積間の比から算出する。開環が高温で行われる場合、ガラクツロン酸残基が得られるが、一方、エポキシド環の開環が低温で行われる場合、イズロン酸残基が得られる。エポキシド環を含有する化合物の好ましい例は、上記方法によって得られ、各々、エポキシド化ウロン酸含有率１４％を有するもの（以下、ＳＴ１５０９と記す）、２４％を有するもの（以下、ＳＴ１５２５と記す）および３０％を有するもの（以下、ＳＴ１５２６と記す）である。
【００５６】  次いで、部分脱硫酸ヘパリンを、上記で定義した方法に従って「グリコール−スプリット」（略して、ＲＯ）およびスミス（Smith）分解（略して、ＳＤ）に付す。
【００５７】  別法として、式（Ｉ）で示される化合物は、また、エポキシド中間体を介さずに、すなわち、直接グリコールスプリットおよび次なるスミス分解によって得ることもできる。
【００５８】  ここまでに記載した方法により、ＸおよびＸ'基が共に−ＣＨ２ＯＨである式（Ｉ）で示される化合物が得られる。
【００５９】  −ＣＨ２ＯＨ以外のＸおよびＸ'については、ヒドロキシル基を、上記定義で示した他の基に転換する方法が当業者に利用可能である。例えば、アミノ酸またはペプチドとの結合は、グリコール−スプリット反応から誘導された中間アルデヒドを、水性溶媒中で行うことができ、ヘパリン構造の維持に適合する還元アミノ化反応で処理することにより行うことができる（Hoffmann J. et al., Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)）。
【００６０】  所望により、かつ、これが本発明のさらなる目的を構成する場合、式（Ｉ）で示される化合物を、適当なｐＨ条件下、例えば、ｐＨ４で、酸性薬剤で分解して抗脈管形成活性を維持するオリゴ糖類の混合物を得ることができる。
【００６１】  同様に、本発明の目的は、上記方法の工程ｇ）、ｈ）、ｉ）およびｊ）のうちの１つの工程によって得られる化合物である。
【００６２】  本発明の目的は、活性成分として、少なくとも１種類の式（Ｉ）で示される化合物を単独でまたは１種類もしくはそれ以上の式（Ｉ）で示される化合物と組合せて含有するか、または、該式（Ｉ）で示される化合物（単数または複数）を上記脱硫酸ヘパリン、例えば、エポキシド化中間体と組合せて含有する医薬組成物である。後者は、該医薬組成物において活性成分として単独で用いることができる。本発明の活性成分は、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook”（最終版）に記載されているような製薬技法において一般的に用いられる適当なビヒクルおよび／または賦形剤との混合物である。本発明の組成物は、治療上有効量の活性成分を含有する。投与量は、治療されるべき疾患の種類および患者の状態に従って、または、他の活性成分の投与に付随して、当業者、例えば、臨床医またはかかりつけ医によって決定される。一例として、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量が指示される。
【００６３】  医薬組成物の例は、経口もしくは非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または鼻もしくは経口スプレー剤の剤形で投与することができるものである。当該目的に適した医薬組成物は、錠剤、ハードもしくはソフトカプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、および即時液剤調製用固体形態である。非経口投与用組成物は、例えば、筋肉注射剤、静脈注射剤および皮下注射剤ならびに液剤、懸濁剤および乳剤の全てである。リポソーム処方物もまた挙げられる。該錠剤としてはまた、経口投与剤形、適当な層で被覆された錠剤、マイクロカプセル化散剤、シクロデキストリンとの複合体、デポー剤形、例えば、デポー注射剤もしくはインプラント剤のような皮下用剤形としてのいずれであっても活性成分の徐放用形態が挙げられる。
【００６４】  本発明の化合物は、抗脈管形成活性を有する。このことにより、それらは変化した脈管形成に罹患している対象、一般に、哺乳動物、特に、ヒト患者の治療に有用な薬物の調製に適当である。本発明の目的である薬物で治療される疾患の例は、原発腫瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬、水晶体後線維増殖症、脈管形成および冠状動脈バイパス後の再狭窄である。
【００６５】  有利には、本発明の化合物は、ヘパリンの典型的な副作用が実質的にない。詳しくは、本発明の化合物は、抗凝固活性が実質的にない。当業者は、かかる活性が実質的にないとは、臨床的使用の観点から活性が全くないかまたは無視できることを意味する。
【００６６】  脈管形成の役割を有することが見出された最初の成長因子の一は、ｂＦＧＦ（またはＦＧＦ−２）であり、そのすぐ後にａＦＧＦ（またはＦＧＦ−１）が見出された（該課題の検討については、Christofori, Oxford University, 1996 を参照）。これらの両タンパク質は、ヘパリンに対する高度の親和性によって特徴付けられる一群の成長因子のメンバーである。他の有効な脈管形成誘発物質は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ−Ｃである。３種類のＶＥＧＦ因子は全てＦＧＦのように体内で広範に発現される。これらの種類の因子ａ／ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２）ならびにＶＥＧＦは、共に、チロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型ドメインを有する特異的な高親和性受容体と結合する。これらのＶＥＧＦに対する３種類の受容体であるＶＥＧＦ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ−２（ｋｄｒ／ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦ−３（ｆｌｔ−４）は、内皮細胞上で特異的に発現するが、４種類のＦＧＦ受容体は、多くの器官および組織中で発現される（該課題の検討については、Risau and Flame 1995 Annu. Rev. Cell Dev: Biol. 11: 73-91 を参照）。ヘパリンまたはヘパラン硫酸のフラグメントに結合するｂＦＧＦは、有糸分裂誘発および分化の両方において内皮細胞を活性化するシグナルの伝達経路を活性化することによって、それらの二量体化およびそれら自体の受容体に結合する可能性を引き起こす。
【００６７】  かくして、ヘパリンまたはヘパラン硫酸のフラグメントとのＦＧＦ結合の阻害は、成長因子の局所または全身レベルの増加によって誘発される病理学的新脈管形成との戦いにおいて有効な治療標的である。
【００６８】  このために、それ自体の受容体と結合するｂＦＧＦによる種々の異なるヘパリン誘導体の妨害を評価する能力を有するインビトロモデルが設計された。
【００６９】  特に、表面にヘパラン硫酸を有するがＦＧＦ受容体１を欠いているチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いた。ＦＧＦ受容体１を発現するが前者の群とは異なって膜ヘパラン硫酸を有しない、ＣＨＯ−７４５ｆｌｇと称されるＣＨＯ細胞もまた使用した。これらの後者の細胞は、緑色蛍光タンパク質のｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされ、この理由のために、緑色発光の検出用フィルターと組合せた蛍光顕微鏡下で観察される。すなわち、当該技法は、ＦＧＦが２種類の細胞に添加される場合にだけ該２種類の細胞が相互作用する（安定な結合を形成する）可能性に基づいている。実際、この場合、ＣＨＯ−７４５ｆｌｇ細胞のヘパラン硫酸は、ＦＧＦに結合し、次いで、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合して、架橋を確立する。生じた結合は、ＣＨＯ−７４５ｆｌｇ細胞によって発せられる緑色蛍光の結果として検出可能である。
【００７０】  加えて、当該化合物をそれらの細胞増殖阻害活性についてアッセイした。実際、ＦＧＦの主な作用の１つは、ＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１）を発現する細胞において、血清の不在下で細胞増殖を刺激することである。
【００７１】  このために、共にＦＧＦＲ−１を発現する２つの細胞系（Ｌ６ＷＴ１およびウシ大動脈細胞）を用い、その増殖を、阻害活性が予想されるヘパリン誘導体を添加するかまたは添加せずにＦＧＦの存在下で評価した。
【００７２】  ＦＧＦ２媒介細胞間接着の阻害
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２４ウェルプレート中で９０，０００細胞／ｃｍ２の密度でシード添加した。２４時間後、該細胞を、４℃で２時間、ＰＢＳ中３％グルタルアルデヒド中で固定し、０．１Ｍグリシン／ＰＢＳで洗浄した。固定単層上で、ＣＨＯ  ７４５／ｆｌｇ細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２および漸増量の試験化合物を含有するＤＭＥＭ中にて５０，０００細胞／ｃｍ２の密度でＦＧＦＲ−１でトランスフェクトした。３７℃で２時間インキュベートした後、倒立顕微鏡下で接着細胞を計数した。結果を、試験化合物の不在下で測定したものに対する接着している細胞の数のパーセンテージとして表した。該化合物を１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の６種類の濃度で三重反復試験し、各化合物についてＩＤ５０を算出した（表１）。
【００７３】
【表２】
0005371167.tif 000006
【００７４】  ＦＧＦＲ−１でトランスフェクトしたＬ６細胞におけるＤＮＡ合成の阻害
Ｌ６−ＷＴ１細胞（ＦＧＦＲ−１でトランスフェクトしたラット筋芽細胞）を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、４８ウェルプレート中にて２５，０００細胞／ｃｍ２の密度でシード添加した。２４時間後、該細胞を無血清培地で洗浄し、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＣＳと一緒に４８時間インキュベートした。次いで、該細胞を、試験化合物の存在下（全て、１００μｇ／ｍｌ）または不在下で１５および３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２と一緒に１６時間インキュベートした。該インキュベーションの最後に、培地を交換せずに、３Ｈ−チミジン（０．２５μＣｉ／ウェル）を添加した。６時間後、沈降性ＴＣＡを測定した。各実験点は、３つの測定の平均である。結果を表２に示す。
【００７５】
【表３】
0005371167.tif 000007
【００７６】  ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）におけるＤＮＡ合成に対する作用
ＢＡＥＣ細胞を、ＥＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ完全培地中、４８ウェルプレート中にて２，５００細胞／ｃｍ２の密度でシード添加した。２４時間後、該細胞を、ウシ脳抽出物およびｈＥＧＦを含まないＥＧＭ培地中、血清の不在下で培養した。さらに２４時間後、該細胞を、漸増濃度の試験化合物の存在下、３０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで処理した。１６時間後、該培地に１μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンを添加した。６時間後、沈降性ＴＣＡ活性を測定した。各実験点は、８つの測定の平均である。結果を表３〜６に示す。
【００７７】
【表４】
0005371167.tif 000008
【００７８】
【表５】
0005371167.tif 000009
【００７９】
【表６】
0005371167.tif 000010
【００８０】
【表７】
0005371167.tif 000011
【００８１】  ＢＡＥＣにおける細胞増殖試験
第７継代のＢＡＥＣ細胞を、ウシ脳抽出物およびｈＥＧＦを含まないＥＢＭ培地中、９６ウェルプレート中にて２，５００細胞／ｃｍ２の密度でシード添加した。この培地に３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の５種類の濃度の各試験化合物を添加した。３日後、該細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーによって光学密度を測定した。各実験点を四重反復で行い、ＩＤ５０を算出した。結果を表７に示す。
【００８２】
【表８】
0005371167.tif 000012
【００８３】  胎仔ＢＡＥＣ  ＧＭ  ７３７３における細胞増殖試験
ＧＭ７３７３細胞を、ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地中、９６ウェルプレート中にて７０，０００細胞／ｃｍ２の密度でシード添加した。２４時間後、該細胞を無血清培地で洗浄し、０．４％ＦＣＳを含有する培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２で処理した。８時間後、該培地に１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の５種類の濃度の試験化合物を添加した。さらに１６時間後、該細胞をトリプシン処理し、Ｂｕｒｋｅｒチャンバー中で計数した。各化合物についてＩＤ５０を算出した。結果は、三重反復で行った２つの実験の平均である。結果を表８に示す。
【００８４】
【表９】
0005371167.tif 000013
【００８５】  脈管形成の阻害
脈管形成の研究について、用いたモデルは、ニワトリ胎仔漿尿膜（ＣＡＭ）モデルであった（Ribatti et al., Int. J. Dev. Biol., 40, 1189 (1996)）。
【００８６】  胎仔を有する鶏卵３００個を一定の湿度条件下にて３７℃でインキュベートした。インキュベーションの３日目に、ＣＡＭを殻から剥がすために、卵のとがった極から卵白２〜３ｍｌを吸引した後、殻をはさみで切って窓を設けた。かくして、ＣＡＭの下にある血管が暴露された。該窓を透明なガラスパネルで閉じ、卵をインキュベーター中に戻した。インキュベーションの８日目に、無菌状態で、１ｍｍ２の大きさに計り取った無菌ゼラチンスポンジの使用を含む、最近開発された技法を用いて以下に記載したプロトコールに従ってＣＡＭを処理した（Ribatti et al., J. Vasc. Res. 34, 455 (1997)）。各分子を胎仔１個につき５０または１００μｇの濃度でＰＢＳ３μｌに再懸濁させた。正の対照として、ＣＡＭに対する強力な脈管形成活性が証明されている（Ribatti et al., Dev. Bio.170, 39, (1995)）ＦＧＦ−２を用いた（スポンジ１個当たり１μｇ）。該スポンジをまずＣＡＭの表面上に載せ、次いで、該スポンジの表面上に試験物質の溶液３μｌをピペットで添加した。写真装置を装備したＺｅｉｓｓ  ＳＲ立体顕微鏡を用いて該ＣＡＭを毎日試験した。インキュベーションの１２日目に該試験を中止し、分子の脈管形成活性の全体にわたる評価を行い、開始および完了した試験の数に対する阻害パーセンテージとして表した（表９）。加えて、胎仔1個につき１００μｇの濃度でアッセイされた化合物ＳＴ１５１４について、Brooks et al. によって提案された技法（Science, 264, 569, (1994)）に従って、アンギオスタティック活性の肉眼的定量的評価もまた行ってスポンジの周りの血管の数を計数した。該血管の数を、ＰＢＳ（試験化合物のビヒクル）で処理した対照スポンジのものおよびＦＧＦ−２で処理した対照スポンジのもの（正の対照）と比較した。結果を表１０に示す。
【００８７】
【表１０】
0005371167.tif 000014
【００８８】
天然起源ヘパリンが活性を有しないことに注目すべきである。
【００８９】
【表１１】
0005371167.tif 000015
【００９０】
天然起源ヘパリンが活性を有しないことに注目すべきである。
【００９１】  Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるヘパリン毒性の評価
体重２０ｇの６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）２０匹を偶発的な無作為化により複数の群に分け、参照としてヘパリンナトリウム、および、ＳＴ１５１４と称される本発明の化合物で処理した。処理スケジュールは、ｑ２ｄｘ５タイプのものであった。すなわち、溶液１０ｍｌ当たり５０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのマウス１匹につき２００μｌの皮下投与を、２日おきに合計５回行った。
物質は、以下のとおり可溶化された。
【００９２】  ヘパリンナトリウム：  Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有しないＰＢＳ（１ｘ、ｐＨ７．４）４ｍｌに粉末１６０ｍｇを可溶化することによって溶液を調製し；２４３μｌのアリコートに小分けし、−２０℃で貯蔵する。処理時に、該溶液を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有しないＰＢＳ（ダルベッコ、修飾処方）（１ｘ、ｐＨ７．４）で希釈して、物質の最終濃度を５０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌおよび２５ｍｇ／ｋｇ／ｌ０ｍｌとする。
【００９３】  ＳＴ１５１４：  Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有しないＰＢＳ（１ｘ、ｐＨ７．４）４ｍｌに粉末１６０ｍｇを可溶化することによって溶液を調製し；２４３μｌのアリコートに小分けし、−２０℃で貯蔵する。処理時に、該溶液を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有しないＰＢＳ（ダルベッコ、修飾処方）（１ｘ、ｐＨ７．４）で希釈して、物質の最終濃度を５０ｍｇ／ｋｇ／ｌ０ｍｌおよび２５ｍｇ／ｋｇ／ｌ０ｍｌとする。
【００９４】  試験物質の最後の投与の４８時間後、全血球算定および血液学的分析のために血液試料を採取する。
【００９５】  血液サンプリング：  密閉した箱の中にマウスを入れ、十分な量のＣＯ２を吹き込んで該動物を気絶させる。次いで、各動物の水晶体後神経叢から血液（マウス１匹につき約１ｍｌの血液）を採取し、全血球算定および血液学的分析を行うためにＶｉｓｔｅｒヘパリン（５０００Ｕ／ｍｌ）２０μｌを入れたエッペンドルフ試験管にマウス１匹につき血液０．４ｍｌを分配し；プロトロンビン経時測定を行うために３．８％クエン酸ナトリウム５０μｌを入れた別のエッペンドルフ試験管に同量の血液を分配する。血液試料を採取した後、各動物を頚部脱臼により屠殺する。
【００９６】  試料の数：  マウス１匹につき２つの血液試料を採取し、それを用いて２つの全血球算定を行い、２つのスライドおよび血漿試料を得て−２０℃で貯蔵する。
【００９７】  全血球算定：  機器（Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ５８０  Ａ、ＤＥＬＣＯＮ）をオペレーティングマニュアルに記載されている標準的な方法に従って用いる。希釈器によって血液試料（２５μｌ）を採取し、等張液（ＰＬＡＴ生理食塩水、ＤＥＬＣＯＮ）で１０ｍｌの容量にした（希釈率１：４００）。該希釈器は、自動的に、この溶液（溶液Ａと称する）から１００μｌの試料を採取し、１０ｍｌの容量にし（希釈率１：１００）、かくして、溶液Ｂを得る。赤血球の溶解のために溶液ＡにＥｍｏｓｏｌ（ＤＥＬＣＯＮ）３滴を添加する。この溶液はＷＢＣ読み取りのために用いられる。他方、溶液ＢはＲＢＣおよび血小板（ＰＬＴ）読み取りのために用いられる。各試料を二重反復で測定する。
得られたデータは、ＡＮＯＶＡを用いて分析する。
【００９８】  ５０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌおよび２５ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌのヘパリンナトリウムで処理した動物群は、接種部位に著しい血腫を示す；この現象は、ＳＴ１５１４での処理を受けた群においては生じない。実験動物において行われた剖検により、５０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌおよび２５ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌの用量のヘパリンナトリウムでの処理を受けた群は肝臓に異常な特徴をもつが、一方、ＳＴ１５１４で処理された群においてはかかる現象が検出されないことが明らかにされる。
【００９９】  血液学的分析に関するデータにより、対照群と比較して、５０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇの用量のヘパリンナトリウムで処理された両方の群においては赤血球の減少が示されるが、一方、ＳＴ１５１４で処理した群においてはかかる差異は検出できない。
【０１００】  ２５ｍｇ／ｋｇの用量のヘパリンナトリウムで処理された群は、対照群と比較して有意な血小板欠乏を示す。対照群と比較して白血球の数の有意な差異を示す実験処理群はない。
【０１０１】  以下の実施は本発明をさらに例示する
【０１０２】
実施例１
ヘパリン１ｇを１Ｎ ＮａＯＨ １２.５ｍｌに溶解する。該溶液を６０℃で４５分間加熱撹拌する。該反応を急冷および中和により停止させる。次いで、エポキシド環が完全に開環するまで、該溶液をｐＨ７で７０℃にて加熱する（反応の方向は、ＮＭＲによって制御する）。脱硫酸試料（ここでは、Ｇ２９９９Ｈと称する）を水２０ｍｌに溶解し、４０℃に冷却する。ＮａＩＯ４の０.２Ｍ溶液２０ｍｌを添加した後、該溶液を暗所で２０時間撹拌し、エチレングリコールを添加することにより該反応を停止し、接線方向限外濾過により塩を除去する。ＮａＢＨ４ ４００ｍｇをいくつかに小分けし、脱塩溶液（３０〜４０ｍｌ）に添加する。該溶液を室温で３時間撹拌し、次いで、希ＨＣｌで中和し、接線方向限外濾過により脱塩する。生成物７１０ｍｇ（ここでは、ＳＴ１５１４と称する）を得る。
分子量（ＭＷ）：  １１２００Ｄ、多分散指数Ｄ １.３；全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージは約５０％である。該化合物は、ＮＭＲ分光法により特徴付けられた（図１）。
【０１０３】
実施例２〜４
塩基性溶液を、各々、１５、３０および６０分間加熱した以外は実施例１におけると同様の方法を適用して、以下の特徴を有する化合物を得た：
ＳＴ１５１３：  分子量（ＭＷ）１２９００Ｄ、多分散指数Ｄ １.５、脱硫酸度２.０５（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ：エポキシド基５％、酸化および還元（スプリット）ウロン酸残基２９％；
ＳＴ１５１６：  多分散指数Ｄ １.５、脱硫酸度１.８（ＳＯ３−：ＣＯＯ−モル比として表す）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ：エポキシド基５％、酸化および還元（スプリット）ウロン酸残基２９％；
ＳＴ１５１５：  分子量（ＭＷ）９２００Ｄ、多分散指数Ｄ １.５、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ：エポキシド基１１％、酸化および還元（スプリット）ウロン酸残基２７.５％。
【図１】
0005371167.tif 000022