(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の、前記患者の予後を予測するための検査方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列における２６番目の塩基G／T、配列番号２のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／C、配列番号３のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／G、配列番号４のヌクレオチド配列における６１番目の塩基A／G、配列番号５のヌクレオチド配列における６１番目の塩基C／T、配列番号６のヌクレオチド配列における６１番目の塩基G／C、配列番号７のヌクレオチド配列における３１番目の塩基A／G、配列番号８のヌクレオチド配列における３１番目の塩基C／G、及び、配列番号９のヌクレオチド配列における３１番目の塩基C／Tから選択される少なくとも１種の、前記患者が有するABCC1遺伝子における一塩基多型を検出することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
前記ABCC1遺伝子における一塩基多型が、配列番号１のヌクレオチド配列における２６番目の塩基G／T、配列番号２のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／C、及び、配列番号３のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／Gから選択される少なくとも1種である、請求項1に記載された検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の予後を予測するための検査方法に関し、更に詳しくは、トランスポーターをコードするABCC1遺伝子における特定の一塩基多型を検出することにより、前記がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の予後を予測するための検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの化学療法においては、他の薬物とは異なり、薬効量と副作用量とが近接する治療域の狭い抗がん剤を、最大の薬効を得ることを目的として最大耐用量近傍で投与せざるを得ない。しかしながら、薬物動態や薬効および毒性の発現には大きな個人差が存在し、重篤な毒性が発現したり、十分な効果が得られない場合が生じる原因となっている。
【０００３】
そのため、有効かつ安全な治療を行うためには、抗がん剤感受性因子を考慮した治療計画が重要であり、がんの化学療法には、未だ大きな改善および進歩が期待されている。最近では、遺伝子多型や遺伝子発現プロファイルを予後予測因子または抗がん剤感受性因子とした、個別化医療を目指した治療法の開発が注目されており、より正確に予後および効果を予測する因子についての研究が進展しつつある。
【０００４】
例えば、抗がん剤の薬剤応答を規定する宿主側およびがん細胞側の主要分子の情報を的確に捕捉し、その効果の大きさを評価することによって、個別化治療を強力に推進するための基礎情報を提供することが可能となる。さらに、各分子情報と有効性や有害事象との関連が定量化されれば、個別化治療の指針を作成することも可能となる。
このように、予測困難で時に致死的となる抗がん剤の毒性を遺伝子多型で説明することができれば、遺伝子多型に基づく治療の個別化により、重篤な毒性を回避することができる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明の目的は、膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の、前記患者の予後を予測するための検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、トランスポーター系遺伝子のSNPsについて鋭意研究を重ねた結果、トランスポーターをコードするABCC1遺伝子が、がん細胞を抗がん剤耐性とする原因遺伝子であり、抗がん剤を投与された膵がん患者の予後を規定する因子の一つであることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の、前記患者の予後を予測するための検査方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列における２６番目の塩基G／T、配列番号２のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／C、配列番号３のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／G、配列番号４のヌクレオチド配列における６１番目の塩基A／G、配列番号５のヌクレオチド配列における６１番目の塩基C／T、配列番号６のヌクレオチド配列における６１番目の塩基G／C、配列番号７のヌクレオチド配列における３１番目の塩基A／G、配列番号８のヌクレオチド配列における３１番目の塩基C／G、及び、配列番号９のヌクレオチド配列における３１番目の塩基C／Tから選択される少なくとも１種の、前記患者が有するABCC1遺伝子における一塩基多型を検出することを特徴とする検査方法である（請求項1）。また本発明においては、前記ABCC1遺伝子における一塩基多型が、配列番号１のヌクレオチド配列における２６番目の塩基G／T、配列番号２のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／C、及び、配列番号３のヌクレオチド配列における２６番目の塩基A／Gから選択される少なくとも1種であることが、特に好ましい（請求項2）。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の検査方法によれば、膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の、前記患者の予後を予測することができるため、塩酸ゲムシタビン投与前に膵がんの患者の遺伝子多型について解析を行うことにより、塩酸ゲムシタビン投与の有効性を予測することができ、これによって他の抗がん剤投与等の化学療法や放射線療法を選択することも可能となるので、初期の治療が重要となる難治性の膵がん患者に対して有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
膵がんの患者に対して塩酸ゲムシタビンを投与した後の予後を予測するための本発明の検査方法は、該患者が有するABCC1遺伝子における特定の一塩基多型を検出する検査方法である。
【００１０】
本発明において膵がんの患者に投与される塩酸ゲムシタビンは、代謝拮抗剤に分類されるデオキシシチジンの誘導体であり、細胞内でリン酸化された後、デオキシシチジンのリン酸化物と競合してDNAに取り込まれ、細胞死を引き起こす。構造的には、シタラビン（ara-C）と類似しているが、デオキシシチジン（dCyd）キナーゼによるリン酸化効率の良さ、リボヌクレオチドリダクターゼを抑制することによるdCyd三リン酸濃度の低下など、ara-Cにはない特性を有する。すでに各種の臨床試験の結果から、非小細胞肺がんおよび膵がんに対する有用性が示されており、広く一般臨床に用いられている抗がん剤である。
【００１１】
トランスポーター遺伝子であるABCC1遺伝子は、抗がん剤を細胞外に排出する薬物排出トランスポーターであり、がん細胞が抗がん剤に対して耐性となる直接の原因である。これらの薬物排出トランスポーターは、正常な腎臓、肝臓、消化管、血管内皮細胞などに発現し、種々の生理活性物質・薬物・毒物の輸送を行う。
【００１２】
本発明に係るABCC1遺伝子の一塩基多型としては、下記表１に示すNCBIの Reference SNP ID No.rs4148335、rs4148336、rs4148340、rs35604、rs35605、rs35620、rs35624、rs2074087、rs2239330がある。本発明の検査方法においては特に、rs4148335、rs4148336、rs4148340を利用することが好ましい（[online],平成19年8月17日,NCBI,インターネット<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>参照）。
図1にABCC1遺伝子における変異の位置を示す。なお、図1中の番号は配列番号を示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
患者の遺伝子における変異を検出する本発明の方法は、公知の方法により適宜実施することができるが、例えば、患者の末梢血白血球、毛根、頬粘膜等の細胞から該当遺伝子を含むDNAを調製し、遺伝子解析を行うことによって行うことができる。
【００１５】
上記の遺伝子解析の方法としては、公知の遺伝子解析手法を用いることができるが、例えば、ダイレクト・シークエンシング法、制限酵素断片長多型（RFLP）解析、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ASO）法、DNAチップ／マイクロアレイ法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS）法、TaqMan法、インベーダー法等が挙げられる。
【００１６】
ダイレクト・シークエンシング法は、目的とする遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用い、単離したDNAまたはRNAを鋳型として、PCR等により多型を含む塩基を増幅した後、ダイプライマー法やダイターミネーター法等のサイクルシークエンシング法により、増幅したDNAの塩基配列を決定する方法であり（Joseph Sambrook, David Russell.「Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)」参照）、例えば、ABCC1遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用い、単離したDNAを鋳型として多型を含む塩基をPCR増幅した後、サイクルシークエンシング法により増幅したDNAの塩基配列を決定することができる。
【００１７】
このようにして決定したDNAの塩基配列を、公共ゲノムデータベースに登録されているABCC1遺伝子の配列、例えば、NC_000016.8 Reference assembly、NT_010393.15、AC_000059.1 Alternate assembly (based on Celera assembly)、NW_926051.1等と比較して、ABCC1遺伝子の遺伝子多型を検出する。公共ゲノムデータベースとしては、例えば、NCBI（"Entrez Genome",[online],平成19年8月17日,NCBI,インターネット<URL;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome>）等が挙げられる。
【００１８】
制限酵素断片長多型（RFLP）解析とは、特定の制限酵素によって認識される部位が、点突然変異等の変異によって消失したり出現したりすることを利用して、一塩基多型を検出する方法である。該当する遺伝子配列を含む領域のDNAを特定の制限酵素を用いて処理した後、サザンブロットハイブリダイゼーションを行うこと等によって解析を行うことができる。
【００１９】
アレル特異的オリゴヌクレオチド（ASO）法とは、変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドと試料DNAの間でハイブリダイゼーションを行わせると、一塩基置換を含む変異が存在する場合には、ハイブリッド形成の効率が低下する。これをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用する方法、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法等により検出する（Joseph Sambrook, David Russell.「Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)」参照）。
【００２０】
DNAチップ／マイクロアレイ法は、患者から多型部位を含むDNAを調整し、該DNAとヌクレオチドプローブが固定された基板を接触させ、該DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無またはその強度の差を検出して、前記多型の有無を判定する方法である。
上記検出は、例えば、予めDNA試料を蛍光色素等で標識しておき、蛍光シグナルをスキャナー等で読み取ることによって行うことができる。
【００２１】
なお、一般にDNAチップは、非透過性の基板の表層に、何千ものヌクレオチドプローブが高密度にプリントされている。この基板の表層は、一般的にはガラスであるが、その他の基板を使用することもできる他、ビーズ等を使用するものもある。
【００２２】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS）法は、対象とする多型部位の直前の塩基までを有するプライマーを用意し、これを、該多型部位を含むDNAとハイブリダイズさせ、次いで、該多型部位に該当する複数のダイデオキシ塩基を加え、酵素的に一塩基伸長させる。得られた一塩基伸長したプライマーの分子量をMALDI-TOF/MSにより解析すると、伸長した塩基の分子量の違いにより、多型部位の塩基を判定することができる（Wjst M et al (2005): Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Methods Mol Biol 311:125-37.参照）。
【００２３】
TaqMan法（登録商標）は、TaqManプローブ2種、該多型を含む領域を増幅するように設計したプライマーおよびTaq  DNAポリメラーゼを用いてPCRを行う方法である。TaqManプローブは、対象とする多型部位の塩基に相補的であり、2種類の異なる蛍光色素で5’末端を標識し、3’末端を消光物質で標識したものである。
該多型を含む領域のPCR増幅に伴い、前記多型部位の塩基と相補的な塩基を有するプローブが切断されるため、蛍光色素が消光物質と遊離し蛍光が検出される。前記DNAがホモ接合体であれば1種類の蛍光が検出され、ヘテロ接合体であれば2種類の蛍光が同時に検出され、検出される蛍光の種類や強度により、対象となった多型を判定するものである（Shi MM. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin Chem. 47(2):164-72, 2001.参照）。
【００２４】
インベーダー（登録商標）法は、ミスマッチ部分（フラップ配列）と多型部位配列を含むシグナルプローブと、多型部位がオーバーラップするインベーダーオリゴとを、多型部位を有するDNAに結合させた後、Cleavase（登録商標）と呼ばれる特別な酵素を作用させると、シグナルプローブの多型部位の塩基が該DNAの配列と相補的な場合にのみフラップ配列が切断される。切断されたフラップ配列は、シグナルを生成するFRETプローブ（蛍光色素と消光物質を有する）にインベーダーオリゴとなって作用する。その結果、FRETプローブが切断されて消光物質と蛍光色素が遊離して蛍光を発する。この蛍光の種類・強度により、対象となった多型を判定する（Olivier M. The Invader assay for SNP genotyping. Mutat Res. 573(1-2):103-10, 2005.参照）。
【００２５】
これらの方法によって、ABCC1遺伝子に一塩基多型が検出された場合には、該多型が検出された膵がん等のがん患者に塩酸ゲムシタビンを投与すると、予後が良くないことが予測される。
【００２６】
上記した本発明の検査方法において用いられる検査用プライマーは、公知の方法により適宜作製することができ、前記ABCC1遺伝子における特定の一塩基多型を含むように増幅できるものである限り、特に制限されることはない。検査用プライマーとしては、15〜30塩基のヌクレオチドであることが好ましく、特に、15〜25塩基のヌクレオチドであることが好ましい。
【００２７】
上記した本発明の検査方法において用いられる検査用プローブは、前記ABCC1遺伝子における特定の一塩基多型を含むヌクレオチドであり、該ヌクレオチドを有するものであれば、特に制限されることはない。
ここで、前記ABCC1遺伝子における特定の一塩基多型を含む検査用プローブは、特定の一塩基多型の箇所を含む10〜50塩基のヌクレオチド、特に、特定の一塩基多型の箇所を含む15〜25塩基程度のヌクレオチドであることが特異性および結合性の点から好ましい。
【００２８】
本発明の検査方法においては、検出を容易にするために、適宜、公知の方法でプローブを標識して用いることが可能であり、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素等で標識して用いることができる。
【００２９】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
＜遺伝子のタイピング＞
抗がん剤である塩酸ゲムシタビン投与症例256名について、インベーダー法を用いてタイピングを行った。インベーダー法は、製造業者サードウェイブテクノロジーズ社のプロトコールに基づいて、血液試料を用いて下記の通り施行した。
【００３１】
（１）DNA調製
採血した血液5mlから、FlexiGene  DNA  キット(キアゲン社)を用いて、ゲノムDNAを得た。
【００３２】
（２）PCR
Taq混合物として、Taq  Start  Antibody(タカラバイオ社)250μl、および、ExTaq(タカラバイオ社)250μlを良く混合した後遠心を行い、次いで、25℃で10分間インキュベーションした。
PCR混合物は、蒸留水  480μl、10xVorgelsteinバッファー  480μl、2.9mg/ml  BSA(シグマ社)  288μl、dNTPミックス(各25mM；タカラバイオ社)  288μl、Forward  primer  ミックス（各プライマー1pmol/μl；96種のプライマーの混合物）  1200μl、および、Reverse  primer  ミックス（各プライマー1pmol/μl；96種のプライマーの混合物）  1200μlを良く混合し、合計3936μlとした後、遠心した。そこへ、上記Taq混合物を加え、転倒混和した後遠心し、4枚の96ウェルプレートの各ウェルに、9.2μlずつ分注した（384サンプル分）。
【００３３】
各ウェルに各サンプルDNA  10ng/μlを1.0μlずつ加え（但し、8ウェルには陰性コントロールとして蒸留水を加える）、熱変性94℃，2分、［熱変性94℃，15秒；アニーリング60℃，45秒；伸張反応72℃，3分］×37サイクルの条件でPCRを行い、その後、４℃に冷却した。
得られたPCR産物の0.5μlを用いて、3%アガロース電気泳動を行い、泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色した。目的のDNAのバンドが検出されることを確認した後、残りのPCR産物のうち6μlに蒸留水160μlを加えて希釈し、得られた希釈PCR産物0.8μlずつを384ウェルカードの各ウェルに分注した後、風乾した。
【００３４】
（３）インベーダー法によるＳＮＰタイピング
インベーダープローブ混合物を作成するにあたり、まず96プローブ分の混合物として、蒸留水  25.5ml、10xバッファー(サードウェイブテクノロジーズ社、以下TWT社とする)  1.7ml、10xFRETプローブ(TWT社)  1.7ml、1mM ROX(フルカ社)  0.1mlおよび10xCleavase(TWT社)  1.7mlを混合し、合計30.7mlとした。
次に各SNPを検出するアレルプローブとインベーダープローブが組になったプローブ(TWT社)  34μlに、上記の混合物306μlを加え、良く混和し、これをインベーダープローブ混合物とした。
【００３５】
各サンプルのPCR希釈産物を分注・風乾した上記384ウェルカードの各ウェルに、このインベーダープローブ混合物を0.6μlずつ分注し、乾燥する前に速やかに蓋を溶着した。
このカードを、95℃の水浴中で5分間浸してDNAを熱変性させた後、63℃の水浴中に45分間浸してインキュベーションした後、更に、氷水に浸けて反応を止めた。次いで、カードの水気を落とした後、蛍光検出器としてサファイア（テカン社）を用いて検出した。
【００３６】
rs4148335のSNPについては、フォワード・プライマーとして配列番号10のプライマーを、リバース・プライマーとして配列番号11のプライマーを用い、TアレルをVIC螢光色素で、GアレルをFAM螢光色素で標識したプローブでそれぞれ検出した。
rs4148336のSNPについては、フォワード・プライマーとして配列番号12のプライマーを、リバース・プライマーとして配列番号13のプライマーを用い、AアレルをVIC螢光色素で、CアレルをFAM螢光色素で標識したプローブでそれぞれ検出した。
rs4148340のSNPについては、フォワード・プライマーとして配列番号14のプライマーを、リバース・プライマーとして配列番号15のプライマーを用い、AアレルをVIC螢光色素で、GアレルをFAM螢光色素で標識したプローブでそれぞれ検出した。
【００３７】
＜統計解析＞
塩酸ゲムシタビンとSNPの関連性を調べるため、患者の生存期間とSNPの関連性を調べた。
タイピングした256名のうち、遠隔転移のある臨床病期IVの浸潤性膵管がん患者のうち、塩酸ゲムシタビンが初回・単剤投与されている71名を対象にして、SNPごとに、その生存期間との関係について統計解析を行った。
【００３８】
生存時間は「全生存期間」とした。この「全生存期間」は、登録日を起算日としてあらゆる原因による死亡日までの期間とし、生存例では最終生存確認日をもって打ち切りとした。また、追跡不能例では、追跡不能となる以前で生存が確認されていた最終日をもって打ち切りとして算出した。
なお、Cox回帰法によって行った統計解析の結果を表２に示す。これらの統計解析は、統計解析パッケージのSAS Ver.9.13 for window(SAS Institute Inc., Cary, NC;)を用いて行った。なお、表２中のＭＡＦはマイナーアレル頻度であり、日本人集団におけるマイナーアレルを持つ割合を意味する。
【００３９】
【表２】
0005337962.tif 000003
【００４０】
配列番号1から9まで全てのP値が0.01以下であることから、この領域に存在するSNPsは生存期間と関連があることを示している。特に、rs4148335およびrs4148336は、多重性を考慮した場合にも統計学的に有意になることから、これらのSNPsが生存期間に直接影響を与える薬剤反応性SNPsであることが示唆される。
【００４１】
更に、ABCC1(rs4148335)の遺伝子型について、生存期間との関連を図２に示す。ABCC1(rs4148335)の遺伝子型としてGGあるいはTGを持つ患者（8例）は、TTを持つ患者（63例）に比して生存期間中央値が小さく、非常に予後が悪い。また、遺伝子型ごとにPD（Progressive Disease)の割合を調べたところ、TTを持つ患者のPD割合は30%（53例中16例）、TGまたはGGを持つ患者のPD割合は100%（8例中8例）であった。即ち、TGまたはGGを持つ患者は、塩酸ゲムシタビンを投与してもがんが進行しており、予後が悪いことが確認された。
一方、統計学的仮説検定を多数回行うと、第一種の過誤確率が名義有意水準を保てなくなり、得られた結果に多くの偽陽性が生じる場合がある。このような問題を解決するために、Bonferroni法を適用し、多重性の調整を行ったところ、その後も、ABCC1(rs4148335)の遺伝子型は統計学的に有意であった。
【実施例２】
【００４２】
＜多変量解析＞
がん治療には早期診断予後予測を可能とする新規腫瘍マーカーの開発が望まれている。このような遠隔転移のある臨床病期IVの浸潤性膵管がんの予後因子として、CRP(C-reactive protein)、CEA(carcinoembryonic antigen)及びCA19-9(carbohydrate antigen 19-9 )が報告されている(Ueno et al., 2000; Ikeda et al., 2001; Sawaki et al., 2006;参照)。
【００４３】
そこで，膵がん予後予測モデルを構築することを目的として、これまでに数多く報告されかつ有用とされた上記の予後因子(CRP，CEA，CA19-9)、及び、臨床情報(PS、性別、年齢)を用いて、COXの比例ハザードモデルにおける変数選択法による解析を行った。なお、変数選択法については変数増減法を用い、モデルの当てはまりの評価については、赤池の情報量基準(AIC)を用いた。
その結果、ABCC1遺伝子の一塩基多型（Reference SNP ID No.rs4148335）と二つの腫瘍マーカー(CRP及びCA19-9)を変数として含んだモデルが、AIC最小となったことから(AIC:432.4)、膵がん予後予測モデルとして選択された。このモデルの各統計量を下記表３に示す。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
ABCC1（Reference SNP ID No.rs4148335）のハザード比は、二つの腫瘍マーカーのハザード比より大きいことから、従来報告された予後因子よりもABCC1の方が、予後因子として影響が強いことが示唆される。
以上の結果より、ABCC1遺伝子に変異を有する患者に、塩酸ゲムシタビンを投与した場合、予後が悪いことが予想される。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
抗がん剤塩酸ゲムシタビンを投与する前にABCC1遺伝子の変異を調べることにより、他の抗がん剤投与等の化学療法や放射線療法を選択することも可能となるので、本発明は、特に初期の治療が重要となる難治性の膵がんなどのがん患者に対して有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ABCC1遺伝子における変異の位置を示す図である。
【図２】塩酸ゲムシタビンの投与後の生存期間とABCC1(rs4148335)の遺伝子型との関連性を示す図である。
【図１】
0005337962.tif 000005
【図２】
0005337962.tif 000006
【配列表】
0005337962000001.app