(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤であって、抗原が以下の(a)の抗原であるQ熱ワクチン製剤。
(a) 培養細胞としてVero細胞を、無血清培地としてVP-SFM培地を用い、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株を無血清培養の後、ホルマリン処理により不活化処理を行うことで得られる不活化コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の全菌体
【請求項２】
コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤であって、抗原が、以下の(a)から(c)の工程により得られる抗原であるQ熱ワクチン製剤。
(a) 培養細胞としてVero細胞を、無血清培地としてVP-SFM培地を用い、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株を無血清培養し、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株培養調製物を製造する工程
(b)培養調製物からコクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の菌体を精製する工程
(c) コクシエラ菌培養調製物にホルマリンを添加して、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の全菌体を不活化する工程
【請求項３】
以下の(a)から(d)の工程を含むQ熱ワクチン製剤の製造方法。
(a) 培養細胞としてVero細胞を、無血清培地としてVP-SFM培地を用い、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株を無血清培養し、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株培養調製物を製造する工程
(b)培養調製物からコクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の菌体を精製する工程
(c) コクシエラ菌培養調製物にホルマリンを添加して、コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の全菌体を不活化する工程
(d) 不活化したコクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株の全菌体と、医薬上許容される添加物を混合する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤ならびに該Q熱ワクチン製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Q熱（コクシエラ症）は細菌の一種コクシエラ・バーネッティの感染により起こされる人獣共通感染症である。ヒトにおいてはQ熱と呼ばれ、原因不明不詳の慢性疲労性症候群との関連性も疑われている。動物（鳥類を含む）においてはコクシエラ症と呼ばれる。動物においては大部分が不顕性であり、致死性は低いと考えられている。【０００３】
Q熱の主な原因菌は細菌の一種であり、レジオネラ目コクシエラ科コクシエラ属のバーネッティ種に分類される。レジオネラ目の他の細菌と同様、コクシエラ菌は偏性細胞内寄生性であり、動物細胞内においてのみ分裂増殖する。本菌はグラム陰性、小桿菌で大小の多形性を示し、大腸菌のS/R（スムース/ラフ）変異に類似するI 相菌II相菌の相変異を示す。Ｉ相菌は新鮮分離菌の場合にみられ、強毒型であり、細胞表層は長鎖のリポ多糖（ＬＰＳ）に覆われている。II相菌は、Ｉ相菌の継代培養で生じ、弱毒であり、細胞表層は短鎖のＬＰＳで覆われている。【０００４】
Q熱の臨床像は多様であり、主に急性型と慢性型に分けられる。急性型は発熱、頭痛、筋肉痛、関節痛、発咳などを特徴とする、インフルエンザウイルス様感染が多い。また、肺炎や肝炎になる傾向も認められる。予後は一般に良好であり、通常2週間程度で解熱、回復する。一方、慢性型の症状は心内膜炎が多く、特に慢性肝炎、心筋炎を伴う。【０００５】
Q熱の治療法としては抗生剤（テトラサイクリン系）が利用できる。しかし、有用かつ簡便な診断薬が存在しない現状において、Q熱であるとの診断が下されるまでに時間がかかり、その後に漸く抗生剤が投与されるので、抗生剤の効果は感染の広がりを阻止する上で不十分である。
また、Q熱の予防治療を目的とする有効で安全なワクチンは少ない。Q熱ワクチンとしては、コクシエラ菌の不活化菌体を用いるワクチン（特許文献１）などが公知である。【０００６】
前記の通り、コクシエラ菌は偏性細胞内寄生細菌であり、動物細胞内でだけ分裂増殖するので、コクシエラ菌増殖用の細胞培養培地には、ウイルス増殖用に用いる培地と同様に、必須栄養因子として血清がこれまで添加使用されてきた。しかし、ウイルス培養の場合には、血清中に混入していた未知因子が病原因子として作用した例が認められるようになり、そこで、例えば、エイズ、肝炎、狂牛病の原因因子を混入させないことを目的に緊急の対策が講じられてきた。【０００７】
また、ウイルス株増殖用の細胞培養においては無血清培地が開発され、ウイルスワクチン製造用にも使用することが可能になった。しかし、コクシエラ菌増殖用の細胞培養に適した無血清培地に関する研究は全く実施されなかった。無血清培地でコクシエラ菌を増殖させ、この菌体もしくは個々から得られる抗原を利用して製造したQ熱ワクチンは、これまで開発が行われていなかった。【０００８】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】WO97/33614
【非特許文献１】Kazar J. et al. Acta Virol. 31. 158-167. 1987
【非特許文献２】Schneer N. et al. Zentblat. Bakteriol. Microbiol.Hyg.267.79-88. 1987
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、コクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤、該Q熱ワクチン製剤の製造方法ならびにコクシエラ菌の無血清培養方法およびその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らはQ熱の疫学、ならびにワクチン製剤の開発を行った。コクシエラ菌は偏性細胞内寄生菌の一種なので、通常はコクシエラ菌の培養は動物細胞培養の技術を用いる。動物細胞培養用培地には通常血清が添加されるので、コクシエラ菌の培養においても血清添加培養法が使用されてきた。こうして得られる培養物をワクチンに用いる場合、血清由来の未知病原因子が混入する危険を伴っていた。【００１１】
本発明者らは上記の問題を解決するために菌体の培養条件の検討を行った所、無血清培養法でコクシエラ菌の培養が可能であることを初めて見い出し、この菌体を用いることにより、無血清培養法によるワクチン製造が可能であることを明らかにした。【００１２】
即ち、本発明者らは、コクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤を製造することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は、より具体的には、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）コクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤。
（２）抗原が以下の(a)および(b)から選択される少なくとも１つの抗原である（１）に記載のQ熱ワクチン製剤。
(a) コクシエラ菌を無血清培養の後、不活化処理を行うことで得られる不活化全菌体コクシエラ菌
(b) 無血清培養したコクシエラ菌由来の１または複数の抗原タンパク質を不活化した、不活化抗原タンパク質
（３）抗原が、以下の(a)および(b)の工程により得られる抗原である、（１）に記載のQ熱ワクチン製剤。
(a) コクシエラ菌を無血清培養し、コクシエラ菌培養調製物を製造する工程
(b) コクシエラ菌培養調製物に不活化剤を添加して、全菌体コクシエラ菌を不活化する工程
（４）抗原が、以下の(a)および(b)の工程により得られる抗原である、（１）に記載のQ熱ワクチン製剤。
(a) コクシエラ菌を無血清培養する工程
(b) 無血清培養したコクシエラ菌由来の１または複数の抗原タンパク質に、不活化剤を添加して該抗原タンパク質を不活化する工程
（５）コクシエラ菌が野生株、臨床分離株、もしくはそれら由来の人工変異株、または組換え株の全菌体である（１）から（４）のいずれかに記載のQ熱ワクチン製剤。
（６）コクシエラ菌がコクシエラ・バーネッティである（１）から（５）のいずれかに記載のQ熱ワクチン製剤。
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のQ熱ワクチン製剤の製造方法。
（８）以下の(a)から(c)の工程を含む（７）に記載のQ熱ワクチン製剤の製造方法。
(a) コクシエラ菌を無血清培養し、コクシエラ菌培養調製物を製造する工程
(b) コクシエラ菌培養調製物に不活化剤を添加して、全菌体コクシエラ菌を不活化する工程
(c) 不活化した全菌体コクシエラ菌と、医薬上許容される添加物を混合する工程
（９）以下の(a)から(c)の工程を含む（７）に記載のQ熱ワクチン製剤の製造方法。
(a) コクシエラ菌を無血清培養する工程
(b) 無血清培養したコクシエラ菌由来の１または複数の抗原タンパク質に、不活化剤を添加して該抗原タンパク質を不活化する工程
(c) 不活化した抗原タンパク質と、医薬上許容される添加物を混合する工程
（１０）無血清培地で培養する工程を含むコクシエラ菌の培養方法。
（１１）コクシエラ菌を無血清培地で培養する工程を含む、コクシエラ菌培養調製物を製造する方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、コクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤を提供する。また本発明は、上記の安全性の改善されたQ熱ワクチン製剤の製造方法に関する。【００１５】
本発明のQ熱ワクチン製剤は、細菌抗原を培養および採取した後、細菌ワクチンの一般的製法に従い、抗原を不活化することで製造が行われる。【００１６】
本発明においては、抗原として全菌体、菌体成分、タンパク質、ＤＮＡ断片などを使用する。天然型の抗原、または変異体抗原も用いることができ、抗原タンパク質が培養液中に産生される場合にはこれらを採取して用いることもできる。【００１７】
本発明において、培養に使用する菌株としては、コクシエラ菌の野外株や臨床分離株などから純化して使用することができ、または、これらの菌種の人工変異株を使用することも可能である。菌種としてはコクシエラ・バーネッティが好ましく、本菌種の中でナインマイル株がより好ましい。コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株は菌株保存機関であるATCCからVR615株として入手することができる。コクシエラ・バーネッティ  ナインマイル株のII相菌を用いる場合には、臨床分離のII相菌を精製純化すれば、使用することが出来る。本発明者らはDr. Kazar,J.（スロバキア）より卵黄嚢乳剤として分与され、その後、北里研究所で保存している株を使用した。【００１８】
本発明のワクチン製剤の製造方法において、コクシエラ菌を無血清培養し、コクシエラ菌培養調製物を製造する工程について説明する。【００１９】
本発明において、コクシエラ菌を菌種として培養する場合、基質として動物細胞を使用し、細胞を増殖させてこの中でコクシエラ菌を増殖させる。用いる動物細胞を例示すれば、BGM(buffalo green monkey)細胞、Vero 細胞、L-929細胞、組み換え体の場合のCHO細胞などが挙げられる。【００２０】
本発明のワクチン製造に使用する動物細胞培養用の培地は無血清培地である。無血清培地は使用する細胞の増殖に適した組成ならば何れの組成でも使用可能である。培地には炭素源、窒素源、リン酸源、微量金属などを含ませることができるが、血清は使用しない。また、無血清培地は市販製品を使用することもできる。市販されている無血清培地としてコクシエラ菌の培養に使用可能なものを例示すれば、VP-SFM、Opti-Pro SFM、CD-CHOなどがより好ましいが、これらに限定されない。【００２１】
本発明における菌体の培養において、細胞培養の容器はガラス容器、ステンレス容器、プラスティック容器、市販の発酵槽などを使用できる。【００２２】
本発明の細胞培養における、培養温度は通常35〜37℃であるが、増殖可能な温度であれば、特にこの温度に限定されるものではない。【００２３】
本発明の細胞培養における、ｐＨ範囲は通常6.8〜7.6であるが、特にこのpHに限定されるものではなく、細胞が死滅しない酸性またはアルカリ性条件下においても培養を行うことができる。【００２４】
本発明の培養方法としては例えば、静置培養、ローラーボトル培養、マイクロキャリア浮遊培養、微少チップ培養、浮遊細胞培養など、公知のいずれの方法も使用可能である。培養期間や培養条件は、用いる菌体により最適なものを選定することが出来る。【００２５】
無血清培地を用いて培養を行った際には、必要に応じてコクシエラ菌の菌数を測定し、培養の進行度を確認する。本測定においては、封入体も計測して合計する。菌数の測定は、短期間培養後、染色して、顕微鏡で計測するか、または650nmの濁度で測定することも可能である。最近は定量PCRを用いたDNAコピー数として測定することも可能である。すなわち、コクシエラ菌の菌数（力価）の測定方法としては、公知の方法（Schneider, W. Zentralbl. Bakteriol. 271: 77-84, 1989）に従って、具体的に以下の方法を使用することが出来る。まず、BGM細胞をカバースリップ入りの24穴プレートで培養する。単層シート後、およそ100倍希釈したコクシエラ・バーネッティ生菌懸濁液を各穴0.5mlずつ接種し、30分間吸着後、1,500rpmで遠心する。遠心後、上清を除去し、各ウェルに1mlのMEMを加え、37℃（CO2 5％）で培養する。培養4日目に、カバースリップを回収し、冷アセトンにより固定する。封入体数は蛍光抗体法（FA）または酵素抗体法により計測することが出来る。蛍光抗体法では、一次抗体にコクシエラ・バーネッティ感染マウス血清をリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline（PBS））により希釈調整し、湿潤箱中で37℃、60分間反応させる。PBSで5分間、3回洗浄後、FITC標識抗マウスIgGヒツジ血清(CAPPEL社製)をPBSにより調整し、同様の方法で反応させる。洗浄後、ヨウ化プロピジウムと5分間反応させる。洗浄後、Slow Fade antifade Kits（Moleculer Probes社製）により封入し、蛍光顕微鏡（BX-50-FLA、OLYMPUS社製）下において強い発色を示した封入対の数を測定する。
【００２６】
本発明の組み換え抗原は組み換え細胞生物によっても生産することができ、以下の公知の方法を準用することができる。菌体としては、患者分離のコクシエラ菌を使用する。通常、臨床分離株はコクシエラ菌由来のタンパク質抗原と耐熱コクシエラ菌由来のタンパク質抗原の両方を持っている。まず、コクシエラ菌由来のタンパク質抗原を分離する。プラスミドから制限酵素処理などによりコクシエラ菌由来のタンパク質抗原をコードする遺伝子（以下「コクシエラ菌抗原遺伝子」と称する）（6.7kbp）を切り出し、pBR322などのプラスミドに連結する。コクシエラ菌抗原遺伝子の例として例えば下記の論文（Zhang,G.Q., et al. J.Clin.Microbiol. 42:423-428(1998), Nguyen, Sa V., et al. FEMES Microbiol.Lett. 175:101-106(1999), Nguyen,Sa V., et al, Microbiol.Immunol.43:743-749(1999)）に公表されたものを利用することが出来る。【００２７】
次に、コクシエラ菌抗原遺伝子をPCR法などで増幅した後、コクシエラ菌抗原遺伝子を別の発現ベクターに連結する。次に、このベクター上で位置特異的変異処理を行い、続いて選択的プライマーを用いてPCR法で増幅し、組み換え変異体であるコクシエラ菌由来のタンパク質抗原を生産する組み換え大腸菌の菌株を作成する。この組換え大腸菌を定法に従って培養し、培養液からコクシエラ菌由来のタンパク質抗原を得ることができる。【００２８】
上記の遺伝子組換え操作途中で位置特異的変異処理を行えば、コクシエラ菌由来のタンパク質抗原変異体を生産する組み換え大腸菌が得られる。これを培養し、精製すれば、コクシエラ菌由来のタンパク質抗原変異体を得ることができる。例えば上記のとおり、位置特異的変異処理法などを適用すれば、コクシエラ菌由来のタンパク質抗原のアミノ酸配列のなかで、任意の部位のアミノ酸残基を別の残基に変化させることも可能である。逆に、特定部位の特定のアミノ酸残基、たとえばグルタミン酸残基を変化させないで保持することが可能である。糖残基についても基本的に同様である。得られた変異体の中から、免疫原活性を有するものを選択し本発明のコクシエラ菌由来のタンパク質抗原変異体とする。なお、この変異体の持つコクシエラ菌抗原活性については、任意のレベルにあることができる。変異体を得るには、いくつかの試行錯誤的な実験が必要となるが、得られた組み換え変異体コクシエラ菌抗原は、一般的に、天然コクシエラ菌抗原に復帰しにくい利点がある。【００２９】
コクシエラ菌培養調製物を製造する工程において、無血清培地により培養生成した後、全菌体抗原を洗浄、純化、濃縮する。以下に洗浄、純化、濃縮の方法について説明する。【００３０】
無血清培地による培養終了後、細胞を集め、凍結融解、超音波処理などにより細胞を破壊し、ここからコクシエラ菌を採取する。本方法には遠心法、ゲル濾過法および塩析法等を使用することができる。通常、その後、菌体を食塩添加リン酸緩衝液、などにより、洗浄、純化を行う。純化には洗浄法、遠心法、撹拌法、濃縮法、カラム法などを使用できるが、これらに限定されるものではない。例えば、実施例１に記載の方法で精製菌を得ることが出来る。コクシエラ菌の培養、集菌、洗浄、純化操作は厳密な封じ込めが可能な環境下で実施しなければならない。通常は生物学的安全性規定レベル３（BSL３）の環境が必要である。【００３１】
また本発明においては、無血清培養したコクシエラ菌由来の1または複数の抗原タンパク質を採取してもよい。コクシエラ菌の菌体を部分的破壊、または全部破壊する処理を施して、1または複数の抗原タンパク質を採取することが出来る。【００３２】
また、サブユニットワクチンを製造する場合には、コクシエラ菌の菌体を部分的破壊、または全部破壊する処理を施して、有効な抗原画分を採取してもよい。さらに、培養液に産生された抗原タンパク質を使用する場合には、有効な遠心法、濃縮法、カラム法などを組み合わせて抗原タンパク質を濃縮、純化してもよい。【００３３】
洗浄、純化、濃縮の時期としては、不活化の前が好ましいが、不活化の後でも実施できる。不活化の前後両方に実施しても良い。【００３４】
本発明のワクチン製造方法において、コクシエラ菌培養調製物等に不活化剤を添加して、コクシエラ菌培養調製物等を不活化する工程について以下で説明する。【００３５】
抗原の不活化は種々の方法が使用可能であるが、一般に最適の不活化方法は抗原が全菌体であるかタンパク質であるかにより異なる。不活化は種々の化学品処理と物理化学的処理の方法で実施できる。その一例を示せば、以下のものを含むがこれらに限定されない。【００３６】
不活化を目的として菌体もしくは抗原含有タンパク質を処理するのに用いる化学処理物質として以下の物質があげられる。使用可能な濃度を合わせて示すがこれらに限定されるものではない。
ホルマリン(0.1-10 v/v % )、フェノール(0.1-5 v/v %)、クロロホルム
(10-60 v/v %)、アセトン(10-80 v/v %)、ＳＨ試薬 (1-100 mM)、
過酸化水素 (0.1-5 %)、過酢酸(0.5-10 w/v %)、二酸化炭素 (5-90 v/v %)、
オゾン(0.1-10 v/v %)、界面活性剤（0.01 -5 w/v %）、
また、不活化のための物理化学的処理法には下記の手段を使用できる。以下に使用可能な条件の一例を合わせて示すが、これらに限定されるものではない。【００３７】
加温処理（温度：30-70 ℃；加温時間：10-120 分）、γ線照射(線源：コバルト60；5-50 kGy (キログレー))、レーザー光照射(光源：各種レーザー照射装置；波長500-700 mn；光量：0.01-1 J(ジュール)/cm2),電子線照射(電子レンジ)、超音波照射、などがあげられる。
処理条件は固定的ではなく、菌体量、温度、緩衝液のpH、処理時間、などを変化させて、好適な条件を設定することが出来る。通常、無菌条件下で操作する。【００３８】
全菌体でも菌体由来のタンパク質（培養液由来の抗原タンパク質を含む）の何れであっても、これらの不活化方法を単独で使用してもよいし、複数の方法を組み合わせて使用しても良い。不活化の際にアミノ酸、アミン類を共存させることで不活化後の品質の安定性が改善される場合があり、必要に応じてこれらの物質を添加することも可能である。また、ホルマリン不活化に加えて、有機溶媒処理、加温処理、γ線照射処理を施すことにより、溶菌が起こりにくい品質の安定した不活化全菌体を得ることができる。【００３９】
不活化の一例を示せば以下の通りである。まず、コクシエラ菌生菌懸濁液に1％（v/v）ホルマリンを加え5日間室温に静置して不活化する。その後、13,000rpmで15分間遠心し、上清を除去後、等量の生理食塩添加リン酸緩衝液（0.1M, pH 6.8）に懸濁し、不活化コクシエラ・バーネッティ懸濁液とする。不活化完了の確認は不活化処理後に、試料の一部を取り、培養すると菌が生育しないことにより確認することができる。不活化処理の後、リン酸緩衝液などで洗浄することにより、不活化に使用した化学薬品を除去する。その後、650 nmの濁度が１−１０（約1-10 x 109 細胞/mL）程度になるように菌数を調整する。もしくは抗原タンパク質の濃度を調整する。【００４０】
前述のコクシエラ菌懸濁液または抗原蛋白液を一定量（例えば、0.5 mL, 1.0 mL, 10 mL）ずつバイアル、もしくはシリンジに分注して、ワクチンが製造される。
Ｑ熱ワクチンの一般的組成を以下に例示するが、ワクチン製剤組成としては以下に限定されるものではない。【００４１】
抗原：不活化全菌体コクシエラ菌  蛋白濃度50-100 mcg/mL
緩衝液:食塩添加0.01Mリン酸緩衝液 
ｐＨ：7.0
浸透圧: 1
容量：0.6 mL
保存剤： ソルビトール２％、ラクトース５％【００４２】
本発明のワクチン製剤には、医薬上許容しうる添加剤を添加してもよい。ここで医薬上許容される添加剤とは、それ自体は抗原（または免疫原性）とは異なる物質であって、ワクチン投与において抗原とともに投与可能な医薬上許容される材料を意味する。例えば、アジュバント、保存剤、安定剤等のワクチン添加物が例示できるが、これらに限定されるものではない。アジュバントとしてはヒト用ワクチンに認可されたアジュバントとして、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９などを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００４３】
安定剤としては、0.2%程度のゲラチンやデキストラン、0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約5%の乳糖や約2%のソルビトールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。保存剤としては、0.01%程度のチメロサール、0.1%程度のベータプロピオノラクトンや、0.5%程度のフェノキシエタノールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００４４】
注射剤を調製する場合、必要により、pH 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形 製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。【００４５】
本発明の細菌ワクチンの接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法としては皮下注射、筋肉内注射、経鼻接種、経口接種、経皮接種等が好ましく、筋肉注射がより好ましいがこれらに限定されるものではない。経鼻接種には鼻腔内スプレー、粉末スプレー、滴下、塗布などが含まれる。これらの接種法のうち経口接種や経鼻接種がより好ましく、その理由は、気道や消化管の粘膜が感染初期の重要な部位であるためである。適切な免疫増強活性の強いアジュバントを含むワクチンの接種により、局所粘膜における免疫機構を誘発し、できるだけ感染初期に防御効果を発揮させることが可能になる。【００４６】
どの接種方法が適切かはワクチン抗原の種類、剤型、抗体発現時期、抗体持続期間、接種対象者の年齢、等を考慮して決定される。また、接種を行う対象としてはヒト以外に、感染源として考えられている、愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類もあげることができる。接種方法は専門家による臨床試験を通じて最終決定され、これらの方法は同業者にとって公知である。一回接種用製品でも複数回接種用製品でも良い。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００４７】
ワクチン開発にとってワクチン有効性の判定を行うことは重要である。これらの試験はワクチン従事者には公知であるが、一般的な方法を以下に記載する。防御抗原もしくは発症防止抗原を含む可能性のある抗原材料を不活化した後、実験動物を免役する。次に免疫した動物を強毒型のコクシエラ菌で攻撃し、実験動物の生死、もしくは感染コクシエラ菌数の減少などにより、試験材料の有効性を判定する。コクシエラ菌は人獣共通感染なので、多くの実験動物に感染させられる。実験動物においては生死の判定、または臓器内のコクシエラ菌感染の程度を計測する方が適している。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  Q熱菌の無血清培養
菌株としては標準株であるコクシエラ菌ナインマイル株（ATCC VR 615）を用いた。コクシエラ菌の細胞培養には Vero細胞（ATCC  CCL-81）を用い、細胞増殖用培地には無血清培地であるVP-SFMを用いた。【００４９】
無血清培養のVero細胞を単層にシートさせた大型のフラスコ、またはマイクロキャリアで培養したVero細胞にコクシエラ菌を接種し、37℃で5〜7日間培養後に細胞変性効果（CPE）が表れたのを確認後、培養液を回収した。培養液をポアサイズ0.45μmのフィルターを用いて濾過をした。【００５０】
その後の操作は全て微生物封じ込めが可能な施設環境下で実施した。
回収したコクシエラ菌培養液を4℃で7,500rpm、60分間遠心し、沈査をPBSに浮遊させた。浮遊液を4℃で1,500rpm、10分間遠心し、上清を回収した。沈査は適量のPBSに浮遊させ、4℃で1,800rpm、5分間遠心し、上清を回収した。以上の操作を再度繰り返し、回収したすべての上清を4℃で7,500rpm、60分間遠心した。得られた沈査を少量のPBSに浮遊させ、30％スクロースを含む7.6％ウログラフィン（日本シエーリング）含有PBSに重層し、RPD40Tローター（Hitachi）を用い、4℃で10,000rpm、60分間遠心した。上清除去後、チューブの下部に形成した白濁層を回収した。回収した白濁層をPBSに重層し、同ローターを用い、4℃で14,000rpm、60分間遠心した。上清除去後、沈査をPBSに浮遊させ、粗精製菌とした。【００５１】
次に、粗精製菌の密度勾配遠心を行った。76％ウログラフィンをPBSにより25、30、35および40％に希釈し、静かに重層させた。2時間静置後粗精製菌を重層し、同ローターを用い4℃で24,000rpm、60分間密度勾配遠心を行った。遠心後、25-30％、30-35％、35-40％間に形成した層をそれぞれ回収した。回収した菌は、PBSに重層し、同ローテーターを用い4℃で14,000rpm、60分間遠心した。上清除去後、沈査を少量のPBSに浮遊させ、精製菌とした。
精製菌体の濃度は1 mg/mL（蛋白濃度）に調製した。
培養上清中の菌体及び精製後菌体について、その性状を血清存在下で培養した菌体と比べたところ、電気泳動で調べた場合、実質的な違いは認められなかった。【００５２】
〔実施例２〕  Q熱ワクチンの製造、接種、および抗体確認
実施例１の生菌懸濁液（PBS中100 mL）にホルマリン0.5 % を添加し２週間4℃に放置して不活化した。その後PBSで透析しホルマリンを除去した。
その後タンパク量として60〜100μg/mlになるように希釈し、安定剤をいれワクチン原液とした。
安定剤は、ラクトース、ソルビトールなど、一般的生物製剤に用いられているものをそのまま使用した。【００５３】
ワクチンをBalb/C マウス（5週齢）５匹に注射し、４週後に再度接種した。２回目ワクチン接種後２週目にマウスから採血した。血清中の抗コクシエラ菌抗体を測定したところ、抗体陽性であることがわかった（IFA抗体価64倍以上）。この結果より、本ワクチンは十分な免疫原性を保持していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
これまでにも、Q熱ワクチンとして血清添加培養により製造されたワクチン製剤が存在していたが、血清に含まれる未知の病原因子が混入されていた可能性が考えられ、安全性が高いとは言えなかった。本発明のコクシエラ菌を無血清培養することで得られる抗原を有効成分として含有するQ熱ワクチン製剤は、無血清培地でコクシエラ菌を増殖させることで、血清中に含まれる未知の病原因子の混入を防ぎ、従来のワクチンよりもより安全性が高く、医療・製薬分野で非常に有益なものである。【００５５】
このような安全性の高いQ熱ワクチン製剤は、ヒトのQ熱予防だけでなく、ヒトへの感染源と考えられている愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類の予防と治療にも適用が可能であり、畜産業の分野等においても有益なものである。