(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロペラスチンまたはその塩酸塩を含有する、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCB（ポリ塩化ビフェニル）汚染食物の摂取の多かった母親から産まれた子供に学習障害やIQ（知能指数）の低下が見られること、血液中に低レベルの鉛を含んだ子ども達は集中力に欠けたり、衝動的になったり、学習意欲に欠けたりするなど、環境化学物質により脳機能が障害されることはよく知られている。しかしながら、このような環境化学物質による脳機能障害に特異的な治療法や治療薬は未だに開発されていないのが現状である。【０００３】
一方、本発明者らは、過去２０数年にわたる中枢性鎮咳薬に関する研究の過程で、鎮咳薬はGタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）を抑制することを見出し、このGIRKチャネル活性化電流を抑制する薬物は、脳梗塞に伴う排尿障害も改善することを見出している（ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００４２６１）。【０００４】
また、特許文献１には、クロペラスチン又は塩酸カラミフェンなどのモルフィナン骨格を有しない非麻薬性の咳嗽反射抑制物質を含有してなる頻尿・尿失禁の予防・治療組成物が記載されている。【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２６４８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した通り、環境化学物質による脳機能障害に対する有効な治療薬はなく、優れた治療薬の開発が望まれていた。本発明は、環境化学物質による脳機能障害の機能改善薬を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、鎮咳薬の研究や脳機能に対する環境要因の影響に関する研究で得た実績を基に、GIRKチャネルの活性化電流を抑制する作用を有する化合物は、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能を改善するのではないかと考え、環境化学物質に起因する脳機能障害のモデルに対する、GIRKチャネルの活性化電流を抑制する作用を有する化合物の作用を検討した。その結果、GIRKチャネルの活性化電流を抑制する作用を有する化合物は、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能を改善できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００８】
即ち、本発明によれば、Gタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）の活性化電流を抑制する作用を有する化合物を含有する、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬が提供される。【０００９】
好ましくは、上記化合物は、クロペラスチンまたはその塩酸塩、もしくはフェンジゾ酸塩、塩酸カラミフェン、エタンジスルフォン酸カラミフェン、塩酸エプラジノン、ヒベンズ酸チペピジン、クエン酸チペピジン、クエン酸イソアミニルからなる群から選ばれる１種以上の化合物である。【００１０】
特に好ましくは、上記化合物は、クロペラスチンまたはその塩酸塩である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬に関する。本発明におけるクロペラスチンに代表されるGタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）の活性化電流を抑制する作用を有する化合物は、胎仔期後期に環境ホルモンを曝露したマウスの受動的回避反応において脳機能障害の機能を改善する作用を有し、また、海馬の脳由来神経栄養因子（BDNF）の発現レベルを増加させる作用を有し、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善、即ち、環境化学物質に起因する脳機能障害の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬は、Gタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）の活性化電流を抑制する作用を有する化合物を有効成分として含むことを特徴とする。このような化合物の具体例としては、非麻薬性の中枢性鎮咳薬として市販されている化合物を挙げることができる。【００１３】
GIRKチャネル活性化電流とは、GIRKチャネルの活性化により、カリウムイオンが細胞膜を横切って流れることに起因する膜電流である。このチャネルはセロトニン（５-HT）やノルアドレナリンなど様々な神経伝達物質受容体と共役しており、例えば5-HT1A受容体やアドレナリンα2受容体をそれぞれ刺激するセロトニンやノルアドレナリンにより活性化できる。【００１４】
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬の一次スクリーニングは、GIRKチャネル活性化電流を、好ましくは、Akaike, N. & Harata, N. (1994). Nystatin perforated patch recording and its applications to analyses of intracellular mechanisms. Jpn.J. Physiol., 44, 433-473に記載されているパッチクランプ法により測定することにより行う。パッチクランプ法にはニスタチン穿孔パッチクランプ法とホールセルパッチクランプ法の２種類がある。【００１５】
パッチクランプ法で用いる装置の１例を図５に示す。図５は本発明において膜電流を測定するためのシステムの１例を示した概要図である。図５において、１はニューロン、２はパッチクランプ用ガラス電極、３は試験液が流れるＹチューブ、４はYチューブの試験液噴出口、５はチューブ内の試験液を交換するための吸引ポンプ、６は培養皿、７は還流液流入口、８は還流液流出口、９はアンプ、１０はアース線である。【００１６】
図６は図５の要部拡大図で、１１はY−チューブ、１２はその噴出口、１３はニューロン、１４は膜電流を測定するための記録電極である。【００１７】
膜電流の測定に用いるニューロン、特に好ましい縫線核と中心灰白質の単一ニューロンを単離する方法自体は公知であり、例えば、赤池紀扶, 白崎哲哉.(1992). 神経細胞実験法. （編）岡部進. 生物薬科学実験講座14  臓器機能測定法I.  廣川書店,  p3-29で赤池らが提案している方法を採用することができる。この方法では例えば、ラットの脳幹から脳薄切片をスライスし、酵素及び器械的処理により単離することができる。【００１８】
上記装置を用いたパッチクランプ法により膜電流を測定する方法としては、ホールセルパッチクランプ法と、ニスタチン穿孔パッチクランプ法が知られている。ホールセルパッチクランプ法では、記録電極を上記の急性単離した縫線核単一ニューロンに接触させ、電極内を陰圧にしてギガオームシールを形成後、さらに陰圧をかけて電極先端の細胞膜を破壊し、電極内と細胞内を貫通させることでセロトニンなどの細胞外投与による膜電流を記録することができる。ニスタチン穿孔パッチクランプ法では、Akaike, N. & Harata, N. (1994). Nystatin perforated patch recording and its applications to analyses of intracellular mechanisms. Jpn.J. Physiol., 44, 433-473に記載されているように、記録電極にニスタチンを充填し、ギガオームシールを形成すると、電極内のニスタチンが細胞膜に穿孔を形成し、細胞内環境を維持したまま膜電流を記録することができる。【００１９】
膜電位および膜電流の記録にはパッチクランプ増幅器を用いることが好ましい。得られた電流波形は、オシロスコープ等で観察するとともにパソコンで解析し、必要であれば記録媒体、例えば、フレキシブルディスク、CD-R/RW、DVD、MO等に記録する。また、必要であれば、膜電流と膜電位を磁気テープに記録し、レコーダーで描画する。解析には、パッチクランプ解析システムを用いることが好ましい。【００２０】
GIRKチャネルなどの活性化電流を抑制するか否かの判断は、例えば、電流振幅を平均値±標準誤差として表し、薬物存在下と非存在下の間で統計学的に比較する。危険率ｐ＜０．０５のとき、その差を有意であるとする。【００２１】
上記GIRKチャネルの活性化電流を抑制する作用を有する化合物としては、海馬の脳由来神経栄養因子（BDNF）の発現レベルを増加させる作用を有する化合物を使用することが好ましい。【００２２】
Gタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）の活性化電流を抑制する作用を有する化合物の具体例としては、例えば、クロペラスチン、カラミフェン、エブラジノン、エタンジスルフォン酸、ヒベンズ酸チペピジン、イソアミニル、メモルファン、オキセラジン、ペントキシベリン、エプラジノン、ベンプロペリン、グアイフェネシン、これらの塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩もしくはフェンジゾ酸塩などがある。これらは混合して用いてもよい。【００２３】
これらの化合物の中ではクロペラスチンまたはその塩酸塩、もしくはフェンジゾ酸塩、塩酸カラミフェン、エタンジスルフォン酸カラミフェン、塩酸エプラジノン、ヒベンズ酸チペピジン、クエン酸チペピジン、クエン酸イソアミニルが好ましく、中でもクロペラスチンが最も好ましい。【００２４】
本発明で特に好ましい化合物として例示できるクロペラスチンは、下記構造式（１）で表される化合物（1-［２-［（４−クロロフェニル）フェニルメトキシ］エチル］ピペリジン）で、沸点は４２４℃、分子量は３３０で、緩和な抗ヒスタミン作用をもつ中枢性鎮咳薬として知られている。【００２５】
【化１】
0005135619.tif 000002
【００２６】
本発明で好ましい化合物として例示できるカラミフェンは、下記構造式（２）で表される化合物で、これも中枢性鎮咳薬として知られている。【００２７】
【化２】
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【００２８】
本発明で好ましい化合物として例示できるチペピジンは、下記構造式（３）で表される化合物で、これも中枢性鎮咳薬としても知られている。【００２９】
【化３】
0005135619.tif 000004
【００３０】
クロペラスチンを始め上記例示した化合物はいずれも非麻薬性の中枢性鎮咳薬として市販されており、鎮咳薬製造あるいは販売会社から容易に購入することができる。【００３１】
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬は、経口的（舌下投与を含む）または非経口的に投与される。このような薬剤の形態としては、錠剤 、カプセル剤 、細粒剤 、丸剤 、トローチ剤 、輸液剤 、注射剤 、坐剤 、軟膏剤 、貼付剤等を挙げることができる。【００３２】
化合物を生体内に投与する際の輸液剤としては、生理食塩水を主成分とし、それに必要に応じて他の水溶性の添加剤、薬液を配合したものを用いることができる。このような水に添加される添加剤としては、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属イオン、乳酸、各種アミノ酸、脂肪、グルコース、フラクトース、サッカロース等の糖質等の栄養剤、ビタミンA、Ｂ、C、D等のビタミン類、リン酸イオン、塩素イオン、ホルモン剤、アルブミン等の血漿蛋白、デキストリン、ヒドロキシエチルスターチ等の高分子多糖類等を挙げることができる。【００３３】
このような水溶液における化合物の濃度は、10-7Mから10-5Mの濃度の範囲とすることが好ましい。【００３４】
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬はまた、固形剤として生体に投与することができる。固形剤としては、粉末、細粒、顆粒、マイクロカブセル、錠剤等を挙げることができる。このような固形剤の中では、好ましくは嚥下しやすい錠剤の形状をしていることが好ましい。【００３５】
化合物とともに錠剤を形成するための充填剤、粘結剤としては公知のもの、例えばオリゴ糖等を使用することが出来る。錠剤の直径は２〜１０ｍｍ、厚さは１〜５ｍｍの範囲にあることが好ましい。本発明の環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬は、他の治療薬と混合されていてもよい。【００３６】
固形剤には通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可溶化剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、保存剤、無機充填剤等を挙げることができる。【００３７】
界面活性剤としては、高級脂肪酸石鹸、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルＮ−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤、ポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤があるが、これらに限定されるものではない。【００３８】
嚥下性等の改良等の目的のため配合される無機充填剤としては、例えば、タルク、マイカ、二酸化チタン等を挙げることができる。【００３９】
安定剤としては、例えば、アジピン酸、アスコルビン酸等を挙げることができる。可溶化剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリルアルコール等の界面活性剤、アスパラギン、アルギニン等を挙げることができる。甘味剤として、アスパルテーム、アマチャ、カンソウ等、ウイキョウ等を挙げることができる。【００４０】
懸濁化剤としては、カルボキシビニルポリマー等を、抗酸化剤としては、アスコルビン酸等を、着香剤としては、シュガーフレーバー等を、ｐＨ調整剤としてはクエン酸ナトリウム等を挙げることができる。【００４１】
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬は、通常１回１〜４０mg、好ましくは１０mg〜２０mg、１日３回までの範囲で体内に投与される。【００４２】
本発明による環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬は、環境化学物質に起因する脳機能障害の治療のために使用することができる。【００４３】
近年、樹脂関連化学物質、プラスチック可塑剤又は農薬などの環境中に存在する化学物質が生体に対して及ぼす影響が注目されている。このうち、動物の生殖機能に関する内分泌を撹乱するものが見いだされており、これらは、内分泌撹乱物質（環境ホルモン）と呼ばれている。上記したような内分泌撹乱物質は、生体内でホルモンのようなふるまいをし、実際のホルモンの働きを撹乱したり、ホルモンの働きを妨害するなどして、生体の生殖や発育に障害を与える場合がある。本発明で言う「環境化学物質」とは、このように環境中に存在する化学物質であって生体に対して影響を及ぼす物質のことを言う。また、環境化学物質に起因して脳機能障害が生じる場合があることが報告されている。本発明の薬剤は、このような環境化学物質に起因して生じる脳機能障害の機能改善のために使用されるものである。【００４４】
環境化学物質の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ジエチルスチルベストロール、ダイオキシン類（ポリ塩化ダイオキシン及びポリ塩化ジベンゾフラン、ポリ塩化ビフェニール類、ポリ臭化ビフェニール類、ベンゾ (a) ピレン、2,4-ジクロロフェノール、ベンゾフェノン、4-ニトロトルエン、オクタクロロスチレン、スチレンの２量体及び３量体、n-ブチルベンゼン、アルキルフェノール（4-オクチルフェノール、ノニルフェノールなど）、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ-n-ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、アジピン酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル、ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、シマジン、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、カルバリル、クロルデン、オキシクロルデン及びtrans-ノナクロル、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン、ＤＤＴ及びその代謝物、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン、ヘプタクロル及びヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリフルラリン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン、マンゼブ、マンネブ、メチラム、メトリブジン、合成ピレスロイド、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、有機スズ、カドミウム（Cd）、鉛（Pb）、水銀（Hg）【００４５】
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：行動科学実験（受動的回避反応試験）
妊娠マウス（妊娠11〜17日目）にジエチルスチルベストロールを1日1回  0.1マイクログラム 口腔内投与した。上記の妊娠マウスから出生したマウスについて、生後３２日目から生後４１日目まで、クロペラスチン又は生理食塩水を皮下投与した（投与量は以下に記載）。クロペラスチン又は生理食塩水の最終投与日の翌日（生後４２日目）から行動実験（受動的回避反応試験）を行った。上記した実験スケジュールは図１に示す。【００４７】
以下の4群を用いて行動実験を行った。
（１）Saline （正常マウスに生理食塩水を1日2回、10日間皮下投与）
（２）DES-Saline（ジエチルスチルベストロール曝露マウスに生理食塩水を1日2回、10日間皮下投与）
（３）DES-Clo10（ジエチルスチルベストロール曝露マウスにクロペラスチン10mg/kgを1日2回、10日間皮下投与）
（４）DES-Clo30（ジエチルスチルベストロール曝露マウスにクロペラスチン30mg/kgを1日2回、10日間皮下投与）【００４８】
行動実験（受動的回避反応試験）は、以下の通り行った。
実験には、白色光で照明した明室（15.5cm×9.6cm×高さ18.0cm）と床にグリッドを取り付けた暗室（32.0cm×32.0cm×高さ27.0cm）からなるケージを用いた。このケージの2室の間は可動式のギロチンドアで仕切られており、実験中、マウスは自由に明室と暗室を出入りできる。この試験は、マウスが暗い場所を好む習性を利用し、暗室に進入することによって負荷された電気ショックによる嫌悪体験を記憶した動物が再び同じ環境下に置かれると、もはや暗室に入ろうとしないことを利用したものである。観察指標は、明室に入れられた動物が暗室へ移動するまでの時間を反応潜時として記録し、その程度から学習・記憶能力を判定した。この試験は、以下の獲得試行と試験試行からなる。【００４９】
（１）獲得試行
まず、ギロチンドアを下ろした状態で、生後４２日目のマウス1匹を明室に入れる。20秒経過したところでギロチンドアを上げ、マウスが完全に暗室内に入ったところでギロチンドアを閉め、電気ショック (0.6mA, 1sec) 負荷による嫌悪体験を記憶させた。このとき、鳴き声や飛び上がる際の振動が小さいものや、300秒（5分）以内に暗室へ移動しなかったマウスは実験に使用しなかった。【００５０】
（２）試験試行
獲得試行の24時間後から、試験試行を1日1回 4日間行った。試験試行では、獲得試行と同様、マウスを明室に入れ、反応潜時を測定した。反応潜時が長ければ、マウスの記憶がそれだけ良好であると判定する。明室内滞在のカット・オフタイムは600秒（10分）に設定した。試験試行時に600秒を超えても暗室に入らなければ記憶を獲得したものとみなした。【００５１】
なお、獲得試行、試験試行ともに実験者は動物の目に入らないように注意した。また、試験終了後はエタノールで装置内をきれいに拭き、マウスのにおいを残さないようにした。【００５２】
上記行動実験の結果を図２に示す。図２の結果から分かるように、クロペラスチンは環境化学物質による脳機能障害を改善することが示された。【００５３】
実施例２：神経科学実験（イムノブロット法）−１
（１）試料の調製
マウスをエーテルで麻酔し断頭後、すばやく脳を取り出した。脳は氷冷したsucrose ringer溶液（252 mM sucrose, 3.5 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.3 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 2.4 mM CaCl2）にて1分間浸漬後、海馬を摘出し液体窒素で急速凍結した。摘出した海馬は、50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 4 mM EGTA, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 30 mM Na4P2O7・10H2O, 10 mM EDTA, 100 mM β-glycerophosphate disodium salt hydrate, 1% triton X-100, 0.1 mM leupeptin, 75μM pepstatin A, 50 μg/ml trypsin inhibitor, 5 mM DTT, 100 nM calyculin Aを含むhomogenizing buffer 300μlでハンドホモジナイズした。そのホモジネートを超音波発生機 (TOMY UD-201) で超音波処理した後、15,000rpmで15分間、超遠心分離機 (TOMY MX-300) で遠心分離した。上清（triton X-100可溶性分画）を回収し、laemmli溶液 (0.38 M Tris-HCl (pH 6.8), 12% SDS, 30% β-mercaptoethanol, 10〜15% glycerol, 0.05% bromophenol blue) を試料の1／5量加え、4分間煮沸した。これをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用の試料とした。【００５４】
（２）SDS-PAGE
15% acrylamide gel (running gel：15% acrylamide, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% SDS, 0.15% APS, 0.083% TEMED. stacking gel：5% acrylamide, 0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% SDS, 0.15% APS, 0.0625% TEMED)を作製し、1レーン当たり蛋白量50μgの試料およびprotein markerをゲルにアプライした。泳動装置（BIO CRAFT BE-140）に取り付け電気泳動を行った。【００５５】
（３）トランスファー
ブロッティングセルTrans-Blot Cell (Bio-Rad) を用いて、SDS-PAGEを行なったゲルからPVDF（Poly Vinilidene Difluoride）メンブレンであるImmobilonTM-P (MILLIPORE) に蛋白質をトランスファー（70 V、2時間の電気泳動）した。【００５６】
（４）抗原タンパク質の検出
137mM NaCl、8.1mM Na2HPO4・12H2O、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4 (pH 7.4)、4.5%(w/v) nonfat milkを含むblocking bufferで1.5時間インキュベートし、メンブレンに一次抗体を希釈し加え、4℃で一晩インキュベートした（希釈倍率： BDNF (1:200〜1:500)）。その後、137 mM NaCl、8.1mM Na2HPO4・12H2O、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4 (pH 7.4)、0.1% Tween-20を含むT-PBS溶液でメンブレンを3回洗い、二次抗体であるhorseradish peroxidase 標識抗体 (1:5000) の存在下で1時間インキュベートした。再び3回洗った後、化学発光試薬ECLで視覚化し、X線フィルム (FUJIFILM RX-U) に一定時間照射させバンドを得た。結果を図３に示す。【００５７】
（５）バンドの解析
バンドの定量化は画像解析ソフトImage Gauge software (FUJIFILM ver 3.4) を用いた。X線フィルムに写った露光量を特定のバンドの発光量として測定し、Control群の任意の1つのバンドの露光量を100として、それに対する比をそれぞれ求めた。結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、クロペラスチンは海馬のBDNF（脳由来神経栄養因子）の発現レベルを増加させることが示された。【００５８】
実施例３：神経科学実験（イムノブロット法）−２
（１）試料の調製（膜タンパク質）
マウスをエーテルで麻酔し断頭後、すばやく脳を取り出した。脳は氷冷したsucrose ringer溶液（252 mM sucrose, 3.5 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.3 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 2.4 mM CaCl2）にて1分間浸漬後、海馬を摘出し液体窒素で急速凍結した。既報(Okuhara DY, Beck SG, Muma NA,  Corticosterone alters G protein alpha-subunit levels in the rat hippocampus.  Brain Res, 745, 144-151 (1997))に基づき、海馬組織が入ったサンプルチューブにTBS（10mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 10% sucrose, 0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride）を300ml加え、ハンドホモジナイザーを用いてホモジナイズした。そのホモジネートを超音波発生機（UD-201, Tomy）で超音波処理した後、4℃、20,000×gで30分間、微量高速冷却遠心機（MX-300, Tomy）で遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿に上記のTBSを300ml加え、ハンドホモジナイザーを用いて再懸濁させた後、4℃、20,000×gで30分間遠心分離し、再び上清を取り除いた。その沈殿にTBS（10mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% sodium cholate）を200ml加え、ハンドホモジナイザーを用いて再懸濁させた後、マイクロミキサー（E-36, Taitec）で1時間ミキシングした。その懸濁液を4℃、35,000rpmで1時間、卓上微量高速冷却遠心機（Optima TLX, Beckman Coulter）で遠心分離した。上清を回収し、laemmli溶液 (0.38 M Tris-HCl (pH 6.8), 12% SDS, 30% β-mercaptoethanol, 10〜15% glycerol, 0.05% bromophenol blue) を試料の1／5量加え、4分間煮沸した。これをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用の試料とした。【００５９】
（２）SDS-PAGE
10% acrylamide gel (running gel：10% acrylamide, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% SDS, 0.15% APS, 0.083% TEMED. stacking gel：5% acrylamide, 0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% SDS, 0.15% APS, 0.0625% TEMED)を作製し、1レーン当たり蛋白量30μgの試料およびprotein markerをゲルにアプライした。泳動装置（BIO CRAFT BE-140）に取り付け電気泳動を行った。【００６０】
（３）トランスファー
ブロッティングセルTrans-Blot Cell (Bio-Rad) を用いて、SDS-PAGEを行なったゲルからPVDF（Poly Vinilidene Difluoride）メンブレンであるImmobilonTM-P (MILLIPORE) に蛋白質をトランスファー（70 V、2時間の電気泳動）した。【００６１】
（４）抗原タンパク質の検出
150mM NaCl、20mM Tris-HCl (pH 7.6)、4.5%(w/v) nonfat milkを含むblocking bufferで1.5時間インキュベートし、メンブレンに一次抗体を希釈し加え、4℃で一晩インキュベートした（希釈倍率： セロトニン１A受容体、GIRK１ともに 1:200）。その後、150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、0.1% nonidet P-40を含むN-TBS溶液でメンブレンを3回洗い、二次抗体であるhorseradish peroxidase 標識抗体 (1:5000) の存在下で1時間インキュベートした。再び3回洗った後、化学発光試薬ECLで視覚化し、X線フィルム (FUJIFILM RX-U) に一定時間照射させバンドを得た。【００６２】
（５）バンドの解析
バンドの定量化は画像解析ソフトImage Gauge software (FUJIFILM ver 3.4) を用いた。X線フィルムに写った露光量を特定のバンドの発光量として測定し、Control群の任意の1つのバンドの露光量を100として、それに対する比をそれぞれ求めた。結果を図４に示す。図４の結果から分かるように、クロペラスチンは海馬のセロトニン１A受容体とGIRK１の発現レベルを減少させることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善薬に関する。本発明におけるクロペラスチンに代表されるGタンパク質共役型内向き整流性カリウムイオンチャネル（GIRKチャネル）の活性化電流を抑制する作用を有する化合物は、胎仔期後期に環境ホルモンを曝露したマウスの受動的回避反応において脳機能障害の機能を改善する作用を有し、また、海馬の脳由来神経栄養因子（BDNF）の発現レベルを増加させる作用を有し、環境化学物質に起因する脳機能障害の機能改善、即ち、環境化学物質に起因する脳機能障害の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、クロペラスチンの脳機能改善作用に関する行動科学実験のスケジュールを示す。
【図２】図２は、クロペラスチンの脳機能改善作用に関する行動科学的データを示す。
【図３】図３は、イムノブロット法により海馬のBDNFの発現レベルを測定した結果を示す。
【図４】図４は、イムノブロット法により海馬のセロトニン１A受容体とGIRK１の発現レベルを測定した結果を示す。
【図５】図５は、パッチクランプ法で用いる装置の一例を示した概略図である。
【図６】図６は、図５のパッチクランプ法で用いる装置の要部拡大図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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