(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホログラフィ顕微鏡観察によりサンプルのパラメータを決定する方法であって、サンプルへ光ビームを投射してサンプルの画像データを与える段階を含む方法において、
偏光ビームを発生し、そしてその偏光ビームをサンプルから散乱させて、ホログラムを発生するための画像データを与える段階と、
サンプルからの画像データにローレンツ・ミー分析を適用して、サンプルのプロパティを特徴付けるための分析データを与える段階であって、前記ローレンツ・ミー分析は、グラフィック処理ユニットを使用して、画像データのパラレル処理によりローレンツ・ミー分析を実行し、前記画像データを変換して、前記画像データにおける粒子の数の第１推定値、及び平面における粒子のおおよそのｘ、ｙ位置を決定することと、その変換されたデータを使用して、各粒子の軸方向位置（ｚ）の第１推定値を、各粒子のサイズ及び組成の第１推定値と共に決定することとを含み、前記ローレンツ・ミー分析は、サンプルの粒子の位置、サイズ及び屈折率の第２推定値を決定し、この第２推定値は、結果を更新する段階及び該結果を表示及びユーザアクションのために出力する段階の内の少なくとも１つの段階で、前記第１推定値より精度が高い、前記分析データを与える段階と、
前記サンプルのパラメータの分析データ特性から情報を発生する段階と、
前記サンプルのパラメータの情報特性を分析して、サンプルの粒子のサイズ、位置、屈折率、及びビードに基づく分子結合特徴、のうちの少なくとも２つをリアルタイムで同時に決定する段階と、
を備えた方法。
【請求項２】
前記ローレンツ・ミー分析は、散乱粒子の中心位置ｒp及び記録されたホログラムにおける位置rからの線セグメントに沿ったローレンツ・ミー散乱関数ｆs(ｋ（ｒ-ｒp）)を決定し、前記ホログラムにおける他の位置ｒ'における関数ｆs(ｋ(ｒ’−ｒp))を得るための補間を行って、処理時間を短縮すると共に、サンプルのリアルタイム分析を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光ビームは、コヒレント光の複数の波長を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ローレンツ・ミー分析を遂行する前記段階は、未処理状態にある粒子の画像データと、処理を受けた別の処理粒子との間の比較を含み、その処理された粒子に存在する分子層のリアルタイム特性を、その未処理粒子に対して決定できるようにする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リアルタイム特性は、屈折率及び粒子半径のグループから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
関連する複数のホログラムが、サンプル間の相互作用と、コヒレント光の複数の波長とによって形成され、コヒレント光の異なる波長に対するサンプルの異なる応答を決定できると共に、その異なる応答を分析して、サンプルのパラメータを識別できる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルの画像データを変換して前記画像データにおける粒子の数の第１推定値、
及び平面における粒子のおおよそのｘ、ｙ位置を決定する段階と、
前記変換されたデータを使用して、各粒子の軸方向位置（ｚ）の第１推定値を、各粒子のサイズ及び組成の第１推定値と共に決定する段階と、
各粒子の画像データのローレンツ・ミー分析を適用して、各粒子の位置、サイズ及び組成の第２推定値を決定する段階と、
を更に備え、前記第２推定値は、結果を更新しそして結果を表示してユーザにより解釈させるために与える少なくとも１つの段階で、前記第１推定値より精度が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルの１つの粒子のサイズの測定値を前記サンプルの処理された粒子と比較して、サイズの相違を分析し、粒子の処理から生じる粒子の被覆の特性を決定する段階を更に備えた、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サイズの相違を分析する前記段階は、粒子の被覆の厚み及び均一性の相違を決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サイズの相違を分析する前記段階は、粒子の組成非均質性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルの未処理粒子の屈折率の測定値を前記サンプルの処理された粒子と比較して、屈折率の相違を分析し、処理を行わない粒子とは異なる化学的組成を有する被覆の存在を決定する段階を更に備えた、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数の光波長を使用してサンプルの粒子を画像形成し、そして各光波長から生じる各ホログラムを分析し、粒子位置及びサイズの相違を評価して、粒子上の被覆の存在及び被覆のプロパティを決定する段階を更に備えた、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ホログラフィ顕微鏡観察により粒子のパラメータを特徴付けるシステムにおいて、
レーザビーム源及び対物レンズを含むホログラフィ顕微鏡であって、レーザビームが粒子から散乱し、レーザビームの非散乱部分と相互作用して、ホログラフィ散乱パターンを与えるようなホログラフィ顕微鏡と、
前記ホログラフィ顕微鏡からの散乱パターンの画像データ特性を収集するための画像収集装置と、
コンピュータ及び該コンピュータにより実行されて画像データを分析するコンピュータソフトウェアを含むコンピュータシステムであって、このコンピュータソフトウェアは、グラフィック処理ユニットにより実行されてサンプルのパラメータ特性の実質的にリアルタイム出力与えるローレンツ・ミー方法を含み、前記ローレンツ・ミー方法は、ローレンツ・ミー分析を使用して、粒子の平面内座標を推定し、次に、レイリーゾンマーフェルトプロパゲータを適用して測定された光フィールドを逆方向伝播することによって粒子の軸方向座標を推定し、更に、ローレンツ・ミー分析を使用して、粒子位置の第２の改善された推定値を得、リアルタイム且つ改良された精度で粒子の位置情報を発生するコンピュータシステムと、
を備えたシステム。
【請求項１４】
前記パラメータは、サンプルに対して、サンプル粒子サイズ、サンプル粒子位置、サンプル粒子の屈折率、及びサンプル粒子のビードに基づく分子結合特徴、のうちの少なくとも２つを同時に含む、請求項１３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホログラフィビデオ顕微鏡観察を伴う自動的リアルタイム粒子特徴付け及び三次元速度測定に係る。
【０００２】
この研究は、ナショナルサイエンスファウンデーションによりグラントナンバーＤＭＲ−０６０６４１５を通してサポートされたものである。米国政府は、このナショナルサイエンスファウンデーショングラントに従う幾つかの権利を所有している。
【０００３】
関連特許出願の相互参照：本出願は、２００９年１月１６日に出願された米国プロビジョナル特許出願第６１／１４５，４０２号、２００８年６月１９日に出願された米国プロビジョナル特許出願第６１／０７３，９５９号、２００７年１０月３０日に出願された米国プロビジョナル特許出願第６１／００１，０２３号、及び２００８年１０月３０日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１７９４号の優先権を主張するものである。これら特許出願の内容は、参考としてここにそのまま援用する。
【背景技術】
【０００４】
特に球形のコロイド状粒子のこのような特徴付けは、工業化学、物理及び生物医学分野の多くの観点において重要で且つ蔓延した問題である。次のことを含む種々の特徴付けを遂行するために種々の重要な機能が求められている。１）ビードに基づく分子結合の分析評価、２）フローフィールド測定、３）ホログラムにおける自動粒子画像検出、及び４）粒子特徴のリアルタイム分析。例えば、コヒレントな照明は、それにより生じるホログラフィック画像を量的に解釈することが困難であるために、粒子画像速度測定には慣習的に広く使用されていない。その結果、蛍光収率の測定を使用し、１つの色でのホログラフィ画像を使用してビードに基づく分子結合の分析評価が行われている。しかしながら、このような方法は、非特定の蛍光体結合及び意図しない脱色に対するアーティファクトを排除するために数万個のビードを必要とする従来の分析評価での蛍光ラベリングを要求する。粒子が光学軸に沿って互いに閉塞するときでも、コロイド状粒子のホログラフィビデオ顕微鏡観察画像を使用して、三次元における粒子の中心を位置決めできることが最近立証された。観察された散乱パターンに対する現象モデルを使用する初期の立証では、従来の粒子画像形成方法で得られるものに匹敵する追跡解像度が達成された。これらの研究におけるコヒレントな照明の主たる利益は、従来の画像形成方法に比して作用距離及び焦点深度が著しく拡張されたことである。しかしながら、これらの方法は、不充分であり、リアルタイム分析を遂行できず、多数の特徴付け（上述した４つのような）を遂行することもできない。その結果、上述した特徴付けは、これまで可能にされず、商業的に実現されておらず、又、明確な解決策がなくて問題が続いている。
【発明の概要】
【０００５】
それ故、本発明の目的は、ホログラフィビデオ顕微鏡観察を使用して自動的にリアルタイムで球のようなコロイド状粒子を分析するための種々の特徴付け方法及びシステムを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】インラインホログラフィビデオ顕微鏡の一例を示す。
【図１Ｂ】サンプルの周りの図１Ａの拡大部分である。
【図１Ｃ（１）】干渉パターンを示す。
【図１Ｃ（２）】種々の測定値を得るためにローレンツ・ミー理論の予想に図１Ｃ(1)を適合したところを示す。
【図２】一次元ルックアップテーブル（方形）及び単一精度のＧＰＵ加速適合（円）を使用して２．２μｍ直径のシリカ球の測定されたホログラフィ画像への本発明により遂行される適合に対する処理速度及び相対的エラー（ｚp）を示すもので、挿入画像は、典型的な２０１ｘ２０１ピクセルホログラムを示し、ＣＰＵ（中央処理ユニット）の単一スレッドで得られた二重精度結果に対してエラーが計算され、その処理速度は、破線で示され、そして滑らかな曲線は、目に対する案内である。
【図３Ａ】３つのコロイド球のオリジナルのホログラフィ画像を示し、重畳された線セグメントは、３つの代表的なピクセルにより投じられる「票(vote)」を示す。
【図３Ｂ】３つのコロイド球の変換されたホログラフィ画像を示し、その強度は、票数でスケーリングされ、黒は０を表し、白は８００票を表し、重畳される表面プロットは、中間球の変換を示す（スケールバーは、１０μｍを示す）。
【図４】水中の１．５μｍ直径のシリカ球に対して推定されるホログラムの平方根エラーを、半径Δαp、屈折率Δｎp及び軸方向位置Δｚpの関数として示し、曲線は、Δｚpによりパラメータ化された最小エラーの経路を指示する。
【図５Ａ】圧力駆動流においてマイクロ流体チャンネルを下流へ移動する５００個のコロイド球の次元軌道を通して測定されたホログラフィ粒子画像の速度測定を示し、各球は、ホログラフィスナップショットの１つのフィールドにおける粒子位置を表し、フィールドシーケンスからの特徴は、軌道にリンクされ、グレースケールは、粒子測定速度の範囲を示す。
【図５Ｂ】チャンネルの上部及び下部ガラス壁との相互作用により陰影付けされた領域から粒子が除外されるようにして図５Ａのデータから得られる垂直方向に沿ったポアズイユ流れプロフィールを示す（破線の曲線は、予想される放物線流れプロフィールへの適合である）。
【図６Ａ（１）】ストリーミング粒子の分布を、水中のサンプルであり続ける商業的ポリスチレン球状粒子に対する観察サイズ及び屈折率の関数として示す。
【図６Ａ（２）】粒子サイズについての図６Ａ(1)からの２Ｄ断面図で、他のパラメータの平均値におけるものである。
【図６Ａ（３）】屈折率についての断面図で、他のパラメータの平均値におけるものである。
【図６Ｂ（１）】軌道平均半径及び屈折率を平均速度の関数として示す。
【図６Ｂ（２）】軌道平均半径及び屈折率を平均速度の関数として示す。
【図７Ａ】ビオチン化ポリスチレン球へのアビジン結合の検出を示すもので、明るい円は、在庫球における測定された粒子半径の確率分布であり、暗い円は、ニュートラアビジンでの培養の後の球のサンプルに対する対応する分布である。
【図７Ｂ】粒子の屈折率に対する等価分布であり、矢印は、在庫球の低密度テールから被覆サンプルのピークまでの確率の再分布を指示する。
【図８】本発明の方法を実施するコンピュータシステムの概略ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明を実施するために構成されたホログラフィ顕微鏡１００が図１Ａに概略的に示されている。サンプル１１０は、真空波長λ＝６３２．８ｎｍで動作するＨｅＮｅレーザー（ユニフェーズ５ｍＷ）からのコリメートされた線型偏光ビーム１２０で照明される。又、λ＝５３７のような他のレーザ波長を使用することもできる（５Ｗのコヒレントベルディ）。サンプル１１０で散乱された光１３０は、照明ビーム１２０の非散乱部分と干渉して、顕微鏡１００の焦点又は画像形成平面１２５にインラインホログラムを形成する。それにより生じるヘテロダイン散乱パターン（図１Ｃ(1)を参照）は、顕微鏡の対物レンズ１４５（Zeiss S Plan Apo 100x油浸漬、開口数１．４）によって拡大され、そして１ｘビデオ接眼レンズでビデオカメラ１３５（又はある実施形態では複数のカメラ）（ＮＥＣＴＩ−３２４ＡＩＩ）に投影され、これは、１０１μｍ／ピクセルのシステム倍率で３３ｍｓごとに１ｍｓ露出を記録する。以下に述べるように、この散乱又は干渉パターンは、ローレンツ・ミー理論（図１Ｃ(2)を参照）の予想に適合する。
【０００８】
このビデオ信号は、オフライン分析のために３０フレーム／秒の非圧縮デジタルビデオストリームとして商業用デジタルビデオレコーダ（Pioneer H520S）に記録することもできるし、又はArvoo Picasso PCI-2SQフレームグラバーで直接デジタル化して、８ビット画像Ａ(ｒ)を発生することもできる。以前に記録されたバクグランド画像Ｂ(ｒ)により各画像を正規化すると、光学的列における反射及び欠陥によるスプリアスな干渉縞が排除され、分析のための真の値のアレイａ(ｒ)＝ａ(ｒ)／Ｂ(ｒ)が与えられる。本発明の実施形態において、６４０／４８０アレイの各ピクセルは、ほぼ５ビットの情報を含む。
【０００９】
一般化されたローレンツ・ミー散乱理論の結果を使用してａ(ｒ)のデータを解釈する。顕微鏡の焦点平面における電界は、入射平面波
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と、ｒpを中心とする球による散乱パターン
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との重畳である。そこで、ｋ＝２πｎm／λは、屈折率ｎmの媒体における光の波数である。正規化の後に、次のようになる。
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散乱関数は、ベクトル球状高調波の級数において拡張される。
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一般化されたローレンツ・ミー拡張係数ａn及びｂnは、照明フィールドにおける散乱粒子のサイズ、形状、組成及び配向に依存する。波数ｋの平面波によって照明される半径ａの均質な等方性球については、これらの係数が次数ｎで急速に減少し、その級数は、多数の項
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の後に収斂することが分かる。水中のマイクロメータ規模のラテックス球については、ｎc≦３０である。個々の球の正規化画像は、球の位置ｒp、その半径ａ、及びその屈折率ｎmについて式（１）に適合することができる。
【００１０】
散乱係数は、非常に慎重に計算しなければならないが［１０、１１］、式（２）により表される数字的挑戦は、ｒpの試行値ごとにａ(ｒ)の各ピクセルにおいてベクトル球高調波
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及び
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を評価する。各球画像は、数万個のピクセルを抱くことができ、関数は、典型的に、各非線型適合の間に数百回評価されねばならない。関連球関数の最も計算効率の良い従来の公式化でも、完全に収斂する適合は、単一のプロセッサでは数秒を要する。
【００１１】
本発明の１つの最も好ましい形態は、特定のプログラミングステップに組み合わせてローレンツ・ミー技術を使用してこれらの適合を加速するための方法に関する。以下に示すように、この方法は、問題に対する解決策を明らかにし、これらの解決策がこれまで利用できなかったところで商業的に有効な特徴付けを可能にする。本発明の基準システムの１つは、室温において水中に自由に拡散するマイクロメータ規模のラテックス球より成り、その正規化されたホログラムが図１Ｃ(1)に示されている。ここでは、レベンベルグ・マルカンの非線型最小２乗適合ルーチンのＭＰＦＩＴ組の利点を取り入れて、ＩＤＬプログラミング言語（ＩＴＴビジュアルインフォメーションソルーション、ボールダー、ＣＯ）で開発されたソフトウェアでこのような画像を分析する。これら適合は、典型的に、粒子の平面内位置を３ｎｍ以内で、その軸方向位置を１０ｎｍ以内で、その半径を１ｎｍ以内で、そしてその屈折率を１０4の１パーツ以内で生じさせる。適合パラメータの不確実性から得られるエラー推定値は、動的な測定により独立して確認される。
【００１２】
正規化されたホログラフィ画像に式（１）を適合させる計算負担の多くは、線セグメント
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に沿ってｆs(ｋＲ)を評価し、次いで、
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を得るように補間することにより、緩和することができる。この解決策は、粒子の中心の周りのａ(ｒ)のおおよその半径方向対称性を利用する。図２のデータは、このようにして得られる処理時間の著しい減少を立証する。好都合ではあるが、一次元のルックアップテーブルは、球の画像における若干の偏光依存非対称性を考慮せず、ａ(ｒ)における急速に変化する特徴を捕獲することができない。その結果、補間型適合から得られる粒子の位置及び特性についての結果は、二次元適合で得られる基準値とは若干異なる。速度のために精度を犠牲にできる環境の下では、一次元適合及び二次元適合の両方に対する収斂公差を緩和して、より少ない最適化サイクルで結果を得るようにすることができる。例えば、平面における５ｎｍ及び軸方向における２０ｎｍの追跡エラーを受け容れると、図２に示すように、３．２ＧＨｚのIntel Core 2 Duoプロセッサにおいて２フレーム／ｓの２０１ｘ２０１ピクセル画像に対する追跡速度が得られる。
【００１３】
ローレンツ・ミー形式を、ハイエンドコンピュータグラフィックカードに典型的に使用されるグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）の並列処理能力の利用と結合することにより更に相当の利得を得ることができる。ＧＰＵに関する更なる詳細は、図８及びコンピュータ２００を参照して説明する。従来のＣＰＵベースの具現化は、シーケンスにおける各ピクセルに対して動作するが、ＧＰＵイネーブル型アルゴリズムは、全てのピクセルに対して同時に動作する。本発明では、ホストコンピュータにインストールされたnVidia 280 GTXグラフィックカード（カリフォルニア州サンタクララのnVidia Corp）のＩＤＬへのＧＰＵｌｉｂ（コロラド州ボールダのTech-X Corp）拡張を使用して、ｆs(ｋｒ)のＧＰＵイネーブル型計算を実施した。ＧＰＵｌｉｂは、ＧＰＵにおいて数学計算を実施するのに典型的に必要とされる精巧なプログラミング技術を要求せずにＧＰＵにおける数学計算のための基礎的なＣＵＤＡフレームワークへのアクセスを与える。これらの向上に伴い、二次元の適合は、ほぼ３フレーム／ｓの全精度で実行され、これは、ＣＰＵベースの分析より２０倍も高速である。５ｎｍの平面内解像度及び５０ｎｍの軸方向解像度を受け容れることで、図２に示すように、５フレーム／ｓより速く粒子追跡及び特徴付けデータを生じさせる。マルチコアＣＰＵによりサポートされるときには、これは、多数の分析を並列に行うことができ、全処理速度の比例的増加を生じることを意味する。これは、ある用途では、リアルタイム性能と考えることができる。「リアルタイム」の意味は、画像データの各フレームスナップショットからの画像データが、次のフレームスナップショットが到着する前に、処理及び使用のために得られることである。以下に述べるように、これは、例えば、サンプルの位置、半径及び屈折率のようなサンプルの粒子のリアルタイム特徴付け、並びにビードに基づく分子結合特徴のような分子レベル被覆のリアルタイム特徴付けを行えるようにする。これらパラメータの少なくとも２つを一度に決定することができると共に、全てを同時に決定することもできる。最適化されコンパイルされたプログラミング言語において同じ適合アルゴリズムを実施することにより実質的な更なる加速を得ることができる。
【００１４】
粒子の画像への適合がリアルタイム用途にとって充分迅速に進行する場合でも、スナップショットを分析するのに、視野内のサンプル１１０の粒子を事前に識別し、そして全体的に最適な解決策へ収斂するための適合として充分に正確な粒子位置、サイズ及び屈折率を推定し始めることが要求される。このブートストラッププロセスは、ホログラフィ分析が無人自動処理に対して有用であるべき場合には、高速で且つ信頼性の高いものでなければならない。
【００１５】
各球は、図３Ａの例のようなスナップショットにおいて、同心的な明るいリング及び暗いリングのように見える。それ故、各ピクセルにおける強度の勾配は、画像形成平面における線セグメントを定義し、それに沿って球の中心が存在する。このような線の交点は、焦点平面における粒子の重心の推定値を定義する。最も好ましい実施形態では、粒子が球である。本発明では、オリジナル画像の各ピクセルが、重心となる変換画像のピクセルに対して「票」を投じる円形ハフ変換の簡単な変形でこのような交点を識別する。図３Ａは、オリジナル画像における３つの代表的なピクセルにより投じられる票を示す。単一ピクセルの票が、図３Ｂの例のように、変換画像に累積される。このケースでは、変換画像は、オリジナルと同じ解像度、即ち適度な精度及び速度の両方を生じる選択を有する。ほとんどの票を伴う変換画像のピクセルは、重心の候補であるとみなされ、それらの位置は、適合を初期化するための平面内座標として使用される。挿入表面プロットは、２つ以上の球のホログラフィ画像が重畳する場合でも、単一の球による拡張された干渉パターンが、どのようにして、鮮明に画成されたピークへと変換されるかを示す。この方法は、付加的なリソースを使用して各潜在的な円形領域の半径に関する情報を記録する従来の円形ハフ変換より計算効率が良い。変換画像の各特徴に対する輝度の輝度重み付け中心を計算することにより重心推定を定義することで、典型的に、粒子の重心を１ピクセルの数十分の１以内で、又は数十ナノメータで識別する。
【００１６】
粒子又は球を平面内座標で推定すると、レイリー・ゾンマフェルドプロパゲータを使用して測定された光フィールドを逆方向伝播することによりその軸方向座標を推定する。再構成された軸方向強度のピークは、粒子が光学軸に沿って互いに閉塞するときでも、粒子の位置に１００ｎｍ内で対応する。この逆方向伝播は、粒子の位置を中心とする画像データの一次元スライスで遂行することができ、それ故、非常に迅速に遂行することができる。
【００１７】
未知の粒子のサイズ及び屈折率を正確に推定することは、実質的により困難である。好都合にも、非線型適合のエラー表面は、ａp、ｎp及びｚpにより画成されたパラメータスペースにおける非常に大きな集水域にわたる全体的に最適な値に向かって円滑に且つ単調に傾斜する。図４は、ｚp＝２０ｍｍにおいて水中の１．５ｍｍ直径のシリカ球に対して計算された局部的画像強度の平方根エラーを、Δａp、Δｎp及びΔｚp、各々、粒子の半径、屈折率及び軸方向位置のエラーとして示す。これらのデータは、初期の推定に屈折率で０．１、半径で０．５ｍｍ、軸方向位置で２ｍｍ以上のエラーがあっても、このような粒子の画像への適合が最適な値へと収斂しなければならないことを示す。エラー表面は、より高度に構造化され、従って、推定された平面内重心に百ナノメータ以上のエラーがある場合には、寛大さが少なくなる。好都合にも、投票アルゴリズムは、日常、頑健な収斂さを保証するに充分な正確な結果を生じる。一連の画像を通して粒子を追跡することは、１つの適合からの結果を次のための初期推定として使用することにより更に加速することができる。このケースでは、付加的な事前適合が必要とされない。
【００１８】
迅速な重心識別と加速画像適合との結合は、上述したリアルタイム又はほぼリアルタイムでコロイド球位置及び特性の正確且つ非常に精密な測定を生じさせる。無人のホログラフィ粒子追跡及び特徴付けは、プロセス制御及び品質保証、並びに高スループット及び組み合わせ分析評価に多数の用途がある。エキゾチックなハードウェア解決策に頼らずに、より積極的なソフトウェア最適化及びパラレル化を通して実質的なそれ以上の加速が可能となる。
【００１９】
ホログラフィ粒子追跡は、三次元粒子画像速度測定のための直接的用途を有する。図５Ａは、巾１００μｍ、深さ１７μｍ、長さ２ｃｍのマイクロ流体チャンネルを下流へ移動する各々１マイクロメータ直径の５００個のポリスチレン球（Duke Scientific、カタログナンバー５１００Ａ）の重畳軌道の形態の一例を示す。これらの球は、１０-5の体積分率で水中に分散され、そして重力に対して貯留器を上昇させることで形成される圧力駆動流により移流された。焦点面を下部のガラス／水界面よりほぼ５μｍ下にセットした状態でチャンネルの中央付近の５０ｘ７０μｍ2において画像が得られた。各スナップショットにおける球の位置が、１／６０間隔でサンプルされる単一粒子軌道ｒp(ｔ)への最大見込み形式論的解決策とリンクされる。各粒子トレースにおいてそのたびにステップが表されるのではない。というのは、流れの中間面付近の高速移動粒子が壁付近の低速移動粒子を時々覆い隠すからである。図５Ａは、明確に識別された粒子位置のみを示す。このような不完全な時間粒子を使用しても、粒子の瞬時速度を推定することができる。図５Ａのトレースは、軌道平均化速度に基づくグレースケールのものである。
【００２０】
又、これらの軌道は、三次元流れフィールドをマップするのにも有用である。図５Ｂの各点は、１つの粒子の速度を、マイクロ流体チャンネルにおけるその平均高さｚの関数として表す。１０００個のこのような軌道を重畳した結果は、チャンネルを下るポアズイユの流れに対して予想される放物線流プロフィール、即ちチャンネルの長い水平軸にわたる空間的な変動を反映するデータのクラスターの巾を明確に示す。垂直軸の範囲は、チャンネルの上部壁及び下部壁の位置を指示し、高さは、顕微鏡の焦点面に対して報告される。水平の破線は、ガラス壁との激しい球相互作用のために粒子が放浪できない流れの領域を表す。適合放物線は、チャンネルの境界で消滅する流れを示す。
【００２１】
又、各軌道は、各粒子の半径及び屈折率の軌道平均化測定値を個々に生じさせる。単一の粒子に関する複数の測定値を合成することで、照明における必然的な位置従属変動による系統的エラーを最小にする。図６Ａ(1)−Ａ(3)の結果は、水中に分散されたポリスチレンマイクロ球の商業的サンプルにおける球の半径及び屈折率を示す。図６Ａ(２)及びＡ(3)は、図６Ａ(1)から得られた２Ｄヒストグラムを示す。ａp＝０．４９９５μｍの平均半径は、半径について測定された２．５％の多分散性のように、従来の光散乱により得られる製造者の仕様に適合する。ｎp＝１．５９５の平均屈折率は、ポリスチレン球についての独立した測定値と一貫したものである。
【００２２】
単一粒子の特徴付けは、粒子分散を分析するための通常の基礎であるバルク光散乱測定に比して、ホログラフィ特徴付けの実質的な利益である。単一粒子測定から図６Ａ(1)−Ａ(3)の例のような分布を構築することで、母集団方法の必要性が排除され、従って、サンプルの組成に対するより一般的な洞察が与えられる。例えば、図６Ａ(1)−Ａ(3)において明白な粒子サイズと屈折率との間の反相関は、光散乱データには見えない。均質な流体小滴のホログラフィ分析ではこのような反相関が見えない。この観察の１つの解釈として、エマルジョンポリマー化サンプルにおける大きな球は、より多孔性であり、従って、屈折率が低い。
【００２３】
個々の粒子を同時に（且つ上述したように、リアルタイムで）追跡及び特徴付けすることで、動きに基づくアーティファクトが結果からなくなることを確認できる。コロイド状粒子の画像は、カメラのシャッターが開いている期間中にそれが動いた場合には、ぼけた状態になる。このぼけは、従来の明フィールドビデオ顕微鏡データに実質的なアーティファクトを導入する。しかしながら、図６Ｂ(1)及びＢ(2)の結果が示すように、５００μｍ／ｓのような高い速度では、動きのぼけは、ホログラフィ分析により得られる平均速度の関数として半径及び屈折率の値に対して認知し得る影響を及ぼさない。付加的な測定は、ピーク流れ速度が７００μｍ／ｓを越える場合だけ母集団平均値からの偏差を露呈する。
【００２４】
数百マイクロメータ／秒で移動する粒子は、１ｍｓのシャッター周期の間に多数のカメラピクセルを横断するので、この頑健さは意外である。しかしながら、それにより得られる振動散乱パターンのインコヒレントな平均は、主として、動きの方向においてコントラストを減少するように働き、従って、ローレンツ・ミー適合にはほとんど影響を及ぼさない。このような量のぼけでも、高速シャッター又は照明用パルスレーザーの使用によって減少することができる。
【００２５】
個々のコロイド状粒子がマイクロ流体チャンネルを下流へ移動するときにそれらを特徴付けできることで、機能化されたビードの分子規模被覆を検出するための有効な基礎が与えられる。個々の球の半径がナノメータ程度であることが知られている場合には、同様の屈折率の分子被覆の存在は、半径の見掛け上の増加として認知できる。より一般的には、処理されたサンプルの特性を、未処理の球の制御測定と比較することができる。
【００２６】
図７Ａ及び７Ｂは、ニュートラアビジンで培養する前後の、２μｍ直径のビオチン化ポリスチレン球の１つのそのような比較例の調査を示す。この調査に使用したビオチン化ポリスチレン球は、Polysciences Inc（ペンシルバニア州ウォリントン）（カタログナンバー２４１７２）から得られたものである。ニュートラアビジンは、Invitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）（カタログナンバーＡ２６６６）から得られたものである。１ｍｇのニュートラアビジンを１ｍＬのリン酸緩衝含塩水（ＰＢＳ）（５０ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝５０ｍＭ）に添加することにより、濃度１ｍｇ／ｍＬのニュートラアビジン溶液が調製された。納入時分散の１０μＬをＰＢＳの９９０μＬに添加することによりビードの在庫サンプルを得た。又、納入時分散の１０μＬをニュートラアビジン溶液９９０μＬに添加することによりビードの被覆サンプルを得た。粒子を室温で培養し震動した後に、毛管作用によりマイクロ流体チャンネルへ導入した。吸収紙片をチャンネルの一端に導入することにより流れを誘起し、そして各サンプルから１０００個の球に対する結果が得られるまで画像を記録した。各データセットは、ほぼ５分の工程にわたって得られたほぼ５０００個のホログラフィ測定値で構成された。
【００２７】
これらの測定値から、未処理のサンプルは、製造者の仕様に一致する母集団平均化半径０：９９６±０：０１５μｍ（図７Ａを参照）を有すると決定された。培養された母集団は、見掛け上、６ｎｍ程度大きく、平均半径１：００２±０．０１５μｍである。図７Ａにプロットされた２つのサイズ分布が実質的に重畳しても、Wilcoxonのランク和テストは、それらの平均が９９％より高い確実性で相違することを示している。これは、分子規模の被覆の存在に合理的に帰する処理されたサンプルの半径の変化の統計学的に顕著な検出を構成する。被覆の厚みは、この場合、複数ドメインのアビジン導関数のサイズに一致する。
【００２８】
又、２つのサンプル間の顕著な相違が、図７Ｂにプロットされた屈折率の測定分布において明らかである。培養されたサンプルの分布は、著しく鮮明である。というのは、おそらく、屈折率がポリスチレンと同様のタンパク質が球の多孔性表面の水を押し退け、それらの有効屈折率を上昇させるからである。これは、屈折率分布の低い側のより多孔性の粒子に、その高い側のより濃密な粒子より影響を及ぼし、これにより、分布を先鋭にする。図７Ｂの矢印は、この再分布を指示する。
【００２９】
２つのデータセットのランダムなサンプルの同様の分析により、未処理サンプルの粒子は、全て、サイズ及び屈折率が製造者の仕様に一致する同じ母集団から到来することが更に確認される。対照的に、処理されたサンプルは、より大きなサイズ変化を示す。というのは、おそらく、結合されたアビジン層の厚み及び均一性が球ごとに変化するからである。
【００３０】
これらの結果は、機能化されたコロイド状球の分子規模被覆をリアルタイムで検出するためのハードウェア加速デジタルビデオマイクロ顕微鏡の有用性を示すものである。従来の分子規模分析評価とは異なり、ホログラフィ分析は、蛍光又は放射線マーカーを必要とせず、従って、ビードに結合された分子にラベル付けするのに通常必要とされる努力及び費用を排除する。
【００３１】
本発明の一実施形態では、本発明の方法は、図８に示すコンピュータシステムを使用することにより当該パラメータ及び特徴を決定するように実施することができる。図８のシステムは、コンピュータ２００（ローレンツ・ミー分析に関連してここに述べる最も好ましい実施形態ではＣＰＵ及び／又はＧＰＵを含むことができる）を備え、これは、例えば、コンピュータアドレス可能な記憶媒体２１０に埋め込まれるインストラクションでコンピュータソフトウェアモジュールのようなコンピュータ読み取り可能なメディアを実行することができる。従って、コンピュータ２００のＧＰＵを使用すると、分子被覆のようなパラメータ、及び／又は粒子の位置、半径及び屈折率のリアルタイム分析及び同時評価を行うことができる。データを書き込むことのできるこの記憶メディア２１０は、読み取り／書き込み可能である。この特徴は、その後の静的又は動的データ分析を行えるようにし、その分析結果で、ユーザは、好都合な用途に対してその情報に対して行動することができる。コンピュータ２００は、上述した本発明の方法により発生されるデータを分析するようにコンピュータソフトウェアのモジュールインストラクションを実行する。このようなデータは、記憶メディア２１０から得られ、装置２２０を経て入力することができる。出力装置２３０（例えば、ディスプレイ、プリンタ及び／又は記憶メディア）のような他の従来の装置は、データを見たり更に分析したりできるようにする。このような分析は、粒子の位置及び特性に関する情報をリアルタイム又は遅延時間で発生することができる。
【００３２】
上述したある実施形態は、単一波長でホログラフィビデオ顕微鏡を使用し、マイクロメータ直径の絶縁性コロイド状球の分子規模被覆を検出する。この検出は、被覆分子へ露出された球の母集団を分析し、そしてその結果を、露出されない球の同等の母集団を分析することにより得られた結果と比較することによって行われる。各母集団における個々の球のホログラフィスナップショットが、光散乱のローレンツ・ミー理論で分析されて、球の半径及び複素数屈折率の推定値を得る。ローレンツ・ミー分析は、各球の半径をナノメータ解像度で生じると共に、その屈折率を１０００のパーツ内で生じる。これらのプロパティの母集団分布における系統的な相違が、分子を検出するための基礎を構成する。被覆された球は、被覆の厚みに一致する量だけ系統的に大きく見える。
【００３３】
別の実施形態では、ローレンツ・ミー分析は、２色又は多色ホログラムを使用し、球の母集団ではなく単一の球のみを使用して同等の検出解像度を与えることができる。従って、図１Ａの入力ビーム１２０は、多色ホログラムの出力を与える。この実施形態は、同時のホログラフィ画像を２つ以上の波長で形成する。これらの多色ホログラムは、画像を分離するためのフィルタを使用して個別のビデオカメラ１３５（図１Ａを参照）に記録することができる。或いは又、それらをカラーカメラ１３５に記録することができ、記録されたカラーチャンネルから個別の画像を得ることができる。
【００３４】
これら形式の測定に使用される球は、使用する波長に同等の光学的プロパティを有していなければならない。しかしながら、被覆は、少なくとも２つの波長に著しく異なるプロパティを有していなければならない。例えば、被覆は、１つの波長では純粋な絶縁体であり、別の波長では強力な吸収体である。被覆が存在しないときには、複数波長で得られるホログラムは、粒子の位置及びサイズに対して同じ結果を生じなければならない。被覆された球のホログラムは、推定サイズ、及び各波長から得られる推定屈折率の質的特徴が著しく相違しなければならない。このような相違は、分子規模被覆の検出を構成する。波長、球サイズ及び球組成の適当な選択は、被覆の厚み又は完全性に関する量的情報を与えねばならない。
【００３５】
本発明の実施形態の以上の説明は、例示の目的でなされたものである。これは、余すところのないものでもないし、本発明を、ここに開示する正確な形態に限定するものでもなく、以上の教示に鑑み修正や変更が考えられるし、又、本発明の実施からも修正や変更が考えられる。以上の実施形態は、本発明の原理及びその実際的な応用を説明売るために選択され記述されたもので、当業者であれば、本発明を種々の形態で、及び意図された特定の使用に適するように種々変更して、利用することができるであろう。
【符号の説明】
【００３６】
１００：ホログラフィ顕微鏡
１１０：サンプル
１２０：コリメートされた線型偏光ビーム
１２５：焦点面又は画像形成面
１３５：カメラ
１４５：顕微鏡の対物レンズ
２００：コンピュータ
２１０：記憶メディア
２３０：出力装置
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ（１）−（２）】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５Ｂ】
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【図６（Ａ）（１）−（３）】
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【図６（Ｂ）（１）−（２）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８】
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