(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）のアミノ酸配列を有し、かつ下記（ｂ）の活性を有するビタミンＤ水酸化酵素、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を発現する放線菌の形質転換体を、ビタミンＤの存在下で培養して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを得ることを特徴とする、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）０．２μＭ ビタミンＤ水酸化酵素の存在下で、１０μＭ ビタミンＤと１ｍＭ ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率は０．１０％以上である
【請求項２】
前記培養が、ビタミンＤ及び包摂化合物の存在下で実施される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記改変アミノ酸配列が、７３位のアルギニンがバリンに、及び８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換された配列である、請求項１〜３のいずれか１項に 記載の製造方法。
【請求項５】
前記ビタミンＤが、ビタミンＤ2又はビタミンＤ3である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記放線菌形質転換体が、放線菌を、放線菌Streptomyces griseolus由来のＦＤＸ１遺伝子及びStreptomyces coelicolor由来のＦＤＲ１遺伝子を前記ビタミンＤ水酸化酵素核酸の遺伝子の下流に連結したベクターを用いて形質転換したものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤ2及びビタミンＤ3並びにこれらの誘導体を含むビタミンＤの１α位及び２５位を水酸化させて得られる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、くる病、骨粗鬆症、乾癬の治療薬として使われるとともに、近年、癌の治療薬としても注目を浴びている、きわめて有用性の高い物質である。しかし、有機合成法によりビタミンＤを位置特異的および立体特異的に水酸化して１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することは、極めて困難であった。
【０００３】
生物学的にビタミンＤを水酸化する方法の一つとして、微生物変換による方法が知られている。本方法によれば、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる（特許文献１並びに非特許文献１及び２を参照）。しかし、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生産性が悪いことから、本方法によって１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを工業的規模で効率よく生産することができなかった。
【０００４】
生物学的にビタミンＤを水酸化する他の方法として、ビタミンＤを水酸化するビタミンＤ水酸化酵素を用いる方法がある。ビタミンＤ水酸化酵素として、哺乳動物内で生理的に重要なものは４種類存在する：肝臓に存在するＣＹＰ２７Ａ１（２５位水酸化酵素；非特許文献３及び４を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２７Ｂ１（１α位水酸化酵素；非特許文献５及び６を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２４Ａ１（２４位水酸化酵素；非特許文献７及び８を参照）；及び、ミクロソーム型ＣＹＰ２Ｒ１（２５位水酸化酵素；非特許文献９及び１０を参照）。
【０００５】
ビタミンＤにＣＹＰ２７Ｂ１及びＣＹＰ２７Ａ１若しくはＣＹＰ２Ｒ１を作用させることにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤはＣＹＰ２４Ａ１により不活化される。ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＹＰ２４Ａ１の３種は、ミトコンドリア型Ｐ４５０であり、いずれもミトコンドリア内膜に存在する。本発明者らは、近年、これらの哺乳動物由来のビタミンＤ水酸化酵素を、大腸菌又は酵母内で発現させ、構造と機能に関する研究を重ねてきた（非特許文献１１を参照）。微生物由来のビタミンＤ水酸化酵素としては、２５位水酸化活性を持つＣＹＰ１０５Ａ２が知られている（非特許文献１２を参照）。
【０００６】
しかし、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造する際には、１α位水酸化活性を有する酵素と２５位水酸化活性を有する酵素の少なくとも２種を併用しなければならないという問題があった。
【０００７】
上記問題に対して、本発明者らは、ビタミンＤの１α位及び２５位をともに水酸化する活性を有する酵素である、放線菌由来のＣＹＰ１０５Ａ１を取得することに成功した（非特許文献１３を参照）。さらに、本発明者らは、ＣＹＰ１０５Ａ１の結晶を構造解析することによって活性中心を突き止め、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンをそれぞれアラニンに置換したＣＹＰ１０５Ａ１変異体を作製した（非特許文献１４）。該ＣＹＰ１０５Ａ１変異体は、野生型と比べて、１α位水酸化活性のｋｃａｔ値［ｍｉｎ-1］が約２０倍、及び２５位水酸化活性のｋｃａｔ値が約２００倍であった。
【０００８】
【特許文献１】特許出願公告平４−６４６７８号公報
【非特許文献１】Sasaki, J., Mikami, A., Mizoue, K., and Omura, S., (1991), Appl Environ Microbiol. 57, 2841-2846
【非特許文献２】Sasaki, J., Miyazaki, A., Saito, M., Adachi, T., Mizoue, K., Hanada, K., and Omura, S., (1992), Appl Microbiol Biotechnol. 38, 152-157
【非特許文献３】Usui E, Noshiro M, Okuda K, (1990), FEBS Lett., 262, 135-138
【非特許文献４】Sawada N, Sakaki T, Ohta M, et al, (2000), Biochem Biophys Res Commun 273: 977-984
【非特許文献５】Takeyama, K., Kitanaka, S., Sato, T., Kobori, M., Yanagisawa, J., and Kato, S., (1997), Science 277, 1827-1830
【非特許文献６】Sakaki T, Sawada N, Takeyama K, et al., (1999), Eur J Biochem, 259: 731-738
【非特許文献７】Ohyama Y, Noshiro M, Okuda K., (1991), FEBS Lett. 1991 278, 195-198
【非特許文献８】Akiyoshi-Shibata M, Sakaki T, Ohyama Y, Noshiro M, Okuda K,Yabusak  i Y., (1994), Eur J Biochem. , 224(2):335-343
【非特許文献９】Cheng, J. B., Levine, M. A., Bell, N. H., Mangelsdorf, D. J., and   Russell, D. W., (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7711-7  715
【非特許文献１０】Shinkyo R, Sakaki, T, Kamakura M, Ohta, M., Inouye, K., (2004),   Biochem Biophys Res Commun 324: 451-457
【非特許文献１１】Sakaki, T., Kagawa, N., Yamamoto, K., and Inouye, K., (2005),   Frontiesr in Bioscience 10, 119-134 (2005)
【非特許文献１２】Kawauchi, H., Sasaki, J., Adachi, T., Hanada, K., Beppu, T., and Horinouchi, S., (1994), Biochim Biophys Acta. 1219, 179-183
【非特許文献１３】Sawada, N., Sakaki, T., Yoneda, S., Kusudo, T., Shinkyo, R., Ohta, M., and Inouye, K., (2004), Biochem Biophys Res Commun. 320, 156-164
【非特許文献１４】林恵子, 杉本宏, 新京楽, 山田雅人, 生城真一, 鎌倉昌樹, 城宜嗣, 榊利之, (2007), 放線菌学会要旨集、P-23
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンをそれぞれアラニンに置換したＣＹＰ１０５Ａ１変異体を用いれば、複数の酵素を用いることなく単一酵素系で、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造できる。しかし、該ＣＹＰ１０５Ａ１変異体は、２５位水酸化活性に比べると、１α位水酸化活性が著しく低い。したがって、該ＣＹＰ１０５Ａ１変異体を用いたビタミンＤからの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの変換率は非常に低かった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を用いれば、効率よくビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができると考えた。さらに、本発明者らは、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を正常に発現する形質転換体を用いれば、入手が困難な精製酵素を用いずに、工業的規模で大量にビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造できると考えた。
【００１１】
したがって、本発明は、従来の酵素と比べて、ビタミンＤから効率よく１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造し得る酵素を正常に発現する形質転換体の存在下で、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを工業的規模で大量に製造し得る方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは種々検討したところ、７３位及び８４位のアルギニンをともにアラニンで置換した変異体と比べて、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を正常に発現する形質転換体を用いることにより、簡便かつ高効率でビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することに成功した。
【００１３】
したがって、本発明によれば、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１種のアミノ酸配列を有し、かつ下記（ｄ）の活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を発現する形質転換体を、ビタミンＤの存在下で培養して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを得ることを特徴とする、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法が提供される。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）前記改変アミノ酸配列において、前記７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列
（ｃ）前記改変アミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する、前記７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列
（ｄ）０．２μＭ  ビタミンＤ水酸化酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率は０．１０％以上である
【００１４】
本発明の製造方法の一態様は、前記培養が、ビタミンＤ及び包摂化合物の存在下で実施される。
【００１５】
本発明の製造方法の一態様は、前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである。
【００１６】
本発明の製造方法の一態様は、前記改変アミノ酸配列が、７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン又はシステインに置換された配列である。
【００１７】
本発明の製造方法の一態様は、前記形質転換体の宿主が、大腸菌又は放線菌である。
【００１８】
本発明の製造方法の一態様は、前記ビタミンＤが、ビタミンＤ2又はビタミンＤ3である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の製造方法によれば、精製酵素を用いず、ＮＡＤＰＨを加えることなく、高効率にビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを生産することができる。したがって、本発明によれば簡易かつ高効率に大量の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができることから、本発明によって製造された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤにより、骨粗鬆症、くる病などのビタミンＤ代謝異常による諸症状、副甲状腺機能亢進症、乾癬などを治療するための新規な治療薬若しくは医薬中間体、又はこれらの症状を緩和するための食品添加物の生産及び開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ａ）ビタミンＤ水酸化酵素
ビタミンＤ水酸化酵素として、例えば、改変アミノ酸配列を有し、かつ０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するビタミンＤ水酸化酵素が挙げられる。
【００２１】
本明細書にいう「ビタミンＤ」には、天然型ビタミンであるビタミンＤ2、Ｄ3、Ｄ4、Ｄ5、Ｄ6及びＤ7だけでなく、人工的に作られたこれらの誘導体が包含される。したがって、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤには、１α位及び２５位が水酸化したビタミンＤ2、Ｄ3、Ｄ4、Ｄ5、Ｄ6及びＤ7、並びにこれらの誘導体が包含される。
【００２２】
改変アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンおよび８４位のアルギニンがそれぞれ別のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、Streptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列である。すなわち、上記ビタミンＤ水酸化酵素は、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列において２以上のアミノ酸の修飾が加わったＣＹＰ１０５Ａ１変異体であるといえる。
【００２３】
改変アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、又は電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸に置換されていることが好ましく、７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸が特に好ましい。
【００２４】
非極性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システインなどが挙げられる。酸性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸とは、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンなどが挙げられる。
【００２５】
改変アミノ酸配列の具体例として、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの改変アミノ酸配列は、配列表の配列番号５及び６に記載されている。
【００２６】
上記ビタミンＤ水酸化酵素による、ビタミンＤ3を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3に水酸化する過程を表したものを図１とした。図１で示した通り、該水酸化は、ビタミンＤ3→１α−ヒドロキシビタミンＤ3→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3という過程と、ビタミンＤ3→２５−ヒドロキシビタミンＤ3→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3という過程の二通りが想定される。ただし、７３位のアルギニンがバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列を有する上記ビタミンＤ水酸化酵素は、実施例で示されている通り、活性の強さが２５位水酸化活性＞１α位水酸化活性であるので、ビタミンＤ3→２５−ヒドロキシビタミンＤ3→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3という過程により、ビタミンＤ3を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3に変換すると考えられる。
【００２７】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の活性は、実施例に記載の方法により測定することができる。ただし、上記活性測定法では、上記ビタミンＤ水酸化酵素へ電子を供与する電子供与体として、ホウレン草由来のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素を用いているが、これらの代わりに、例えば、放線菌由来のフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、シュードモナスプチダ由来のプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素などを用いることもできる。さらに、上記活性測定法では、反応が進むにつれて消費されるＮＡＤＰＨを再生し反応を持続させるために、グルコース脱水素酵素およびグルコースを添加するが、ＮＡＤＰＨを再生することができるものであればこれらに代えて使用することができる。上記測定法におけるカタラーゼは、反応の副産物として生じる過酸化水素を分解して反応を持続させるために、及びＮＡＤＰＨを再生させるために添加している。したがって、カタラーゼの添加は、ＮＤＡＰＨ再生系の長時間反応を持続させることができる。
【００２８】
上記ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤを水酸化する反応は、例えば、菌体を用いる方法を挙げることができ、実施例に記載の方法によりすることができる。菌体を用いる方法では、培養液の組成は限定されないが、増殖中の菌体培養液に直接基質を添加して培養を続ける方法（生菌体法）と、菌体を緩衝液に懸濁し、増殖させずにグルコースを添加して反応を進行させる方法（休止菌体法）がある。休止菌体法では、グルコースが菌体内に取り込まれるとＮＡＤＰＨが生成され、菌体内でビタミンＤの水酸化反応が進行する。酵素を用いる方法は、ＮＡＤＰＨを反応系に加えなければならない、酵素が失活した場合は反応系に新たな酵素を追加しなければならない、精製酵素を使用することが望ましい、酵素の保存が困難であることから反応の都度新しい酵素を使用しなければならない、酵素が不安定であることから反応時間は長くても１時間程度である、酵素の製造コストが増大するために工業的規模での生産は困難である、などの特徴がある。それに対して、菌体を用いる方法は、ＮＡＤＰＨを加えなくてもよい、ビタミンＤ水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができる（生菌体法）、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよい、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用できる、反応時間を１００時間以上とることができる、通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模でビタミンＤ水酸化体を大量生産ができる、などの特徴があり、酵素を用いる方法と比較すると、ビタミンＤ水酸化反応を圧倒的に簡便かつ効率よく実施できる。反応終了後にクロロホルムあるいは酢酸エチル等の有機溶媒を添加し、抽出する。抽出物の分析は公知のビタミンＤ類の分析法に準じて行えばよく、逆相系あるいは順相系の高速液体クロマトグラフィーを用いて分析することができる。上記ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤからの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの変換率は、反応後の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を基に、反応液に加えたビタミンＤのモル数当たりの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤのモル数により求めることができる。
【００２９】
改変アミノ酸配列を取得する方法は、特に制限されるものではなく、物理化学的に合成してもよいし、後述する通りに生物学的に改変アミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよいし、通常知られる手段を用いた各種スクリーニング法により取得してもよい。
【００３０】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第二の態様として、例えば、改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、かつ０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するビタミンＤ水酸化酵素が挙げられる。
【００３１】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第二の態様において、アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンがそれぞれ別のアミノ酸に置換されており、さらにこれら以外に１から数個のアミノ酸の欠失等の修飾を１以上有するアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第二の態様において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに生じた修飾の個数は、０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するのであれば特に限定されないが、１から２０個が好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９のいずれかの数がより好ましい。
【００３３】
アミノ酸の修飾について、アミノ酸の欠失は配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を、アミノ酸の置換は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを、アミノ酸の逆位は隣り合う２以上のアミノ酸残基の位置が逆になっていることを、アミノ酸の付加はアミノ酸残基が付け加えられていることを、アミノ酸の挿入は配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。アミノ酸の修飾は、同じ修飾態様が１又は２以上生じる場合もあるし、異なる修飾態様が２以上生じる場合もある。
【００３４】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様として、例えば、改変アミノ酸配列との相同性が高く、改変配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列を有し、かつ０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するビタミンＤ水酸化酵素が挙げられる。
【００３５】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様において、相同性は、０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するのであれば特に制限されないが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。ただし、ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンが改変アミノ酸配列と同様に置換されている。
【００３６】
上記ビタミンＤ水酸化酵素の第二及び第三の態様の取得方法は、改変アミノ酸配列の取得方法と同様に、特に制限されるものではなく、物理化学的に合成してもよいし、後述する通りに生物学的に改変アミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよいし、通常知られる手段を用いた各種スクリーニング法により取得してもよい。上記ビタミンＤ水酸化酵素は、その取得を容易にするなどのために、ヒスタグ（His-tag）やシグナルペプチド等をＮ末端側又はＣ末端側に適宜付加することができる。
【００３７】
上記ビタミンＤ水酸化酵素は、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造するために使用することができる。
【００３８】
（Ｂ）ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸
ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、例えば、改変アミノ酸配列をコードする核酸；改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列をコードする核酸；並びに、改変アミノ酸配列との相同性が高く、改変配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列をコードする核酸などが挙げられる。ただし、上記核酸の発現産物は、０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有する。
【００３９】
ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の第一の具体例は、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられる。配列表の配列番号２に記載の核酸は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号３に記載の核酸は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列をコードする。
【００４０】
ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の第二の具体例として、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列において、２１７〜２１９塩基及び２５０〜２５２塩基以外の箇所に、１から数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有する塩基配列であって、０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸が挙げられる。
【００４１】
ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の第二の具体例における塩基の修飾の個数は、修飾後の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であれば特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２７個、より好ましくは１から１５個程度である。塩基の修飾において、塩基の欠失は配列中の塩基の欠落もしくは消失することを、塩基の置換は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを、塩基の逆位は隣り合う２以上の塩基の位置が逆になっていることを、塩基の付加は塩基が付け加えられていることを、塩基の挿入は配列中の塩基の間に別の塩基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。なお、上記核酸の第二の具体例は、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列おける２１７〜２１９塩基及び２５０〜２５２塩基以外の塩基について欠失、置換、逆位、付加および／または挿入を有する。
【００４２】
ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の第三の具体例は、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該塩基配列中の２１７〜２１９塩基及び２５０〜２５２塩基と相補的な塩基を含む塩基配列であって、０．２μＭの該酵素の存在下で、１０μＭ  ビタミンＤと１ｍＭ  ＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換率が０．１０％以上である活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸が挙げられる。
【００４３】
上記核酸の第三の具体例において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とは、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列からなる核酸をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる核酸を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来の核酸または該核酸の断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる核酸等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と呼ぶ）、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと呼ぶ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、プローブとして使用する配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列と一定以上の相同性を有する核酸が挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する核酸が挙げられる。ただし、ハイブリダイズする塩基配列は、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列おける２１７〜２１９塩基及び２５０〜２５２塩基を含む。
【００４５】
上記核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、上記核酸は、配列番号２又は３に記載の塩基配列の情報に基づいて、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号１）から部位特異的変異誘発法によって得ることができ、サチュレーション変異法並びにモレキュラークローニング第２版及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。より詳しくは、上記核酸は、例えば、２１７〜２１９塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２１７〜２１９塩基が改変アミノ酸配列の７３位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第一のプライマーセットを用いて、ＣＹＰ１０５Ａ１をコードする塩基配列を含む核酸をＰＣＲによって増幅して第一のＰＣＲ産物を得る。次いで、２５０〜２５２塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２５０〜２５２塩基を改変アミノ酸配列の８４位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第二のプライマーセットを用いて、第二のＰＣＲ産物をＰＣＲによって増幅することにより取得することができる。ここで、第一のプライマーセットと第二のプライマーセットとの使用の順序は逆であってもかまわない。ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の取得方法の具体例は実施例に記載されている。
【００４６】
さらに上記核酸は、例えば、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは３に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてStreptomyces griseolus由来の染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより上記核酸を単離することができる。染色体ＤＮＡライブラリーは、ＣＹＰ１０５Ａ１を発現しているStreptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に、通常知られる方法によって変異を導入して作製することができる。
【００４７】
上記したプライマー及びプローブの調製、ＰＣＲ、染色体ＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどの操作は当業者に知られており、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４８】
さらに、上記核酸は、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号４）から、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列の情報に基づいて化学合成法により得ることができ、さらにＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法や紫外線を照射する方法により突然変異を誘発するなどの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。
【００４９】
（Ｃ）組換えベクター
上記核酸は適当なベクターに挿入して使用することができる。ベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製することが可能なベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、又は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、ゲノムＤＮＡと共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸は、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
自立的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐｋｋ２２３−３、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２ 、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、ｐｋｋ２２３−３、ｐＵＣ１９、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、およびｐＣＲ２．１が好ましく、枯草菌で発現させるにはｐＩＪ６０２１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２ 、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０が好ましい。上記組換えベクターに用いられるベクターは、後述する形質転換体の宿主細胞と相性がよく、安定して上記ビタミンＤ水酸化酵素を発現することができるものであれば、特に制限されるものではない。なお、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモータ、放線菌のｔｉｐＡ、ｅｒｍＥプロモータなどが挙げられる。
【００５１】
上記組換えベクターは選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００５２】
上記組換えベクターは、放線菌を形質転換する場合、活性上昇を目的として、例えば、放線菌Streptomyces griseolus由来のＦＤＸ１（Omer, C.A. et al, (1990), J Bacteriol., 172, 3335-3345）及びStreptomyces coelicolor由来のＦＤＲ１遺伝子（Chun YJ et al., (2007),  J Biol Chem. 282, 17486-17500）を上記核酸の下流に連結することができるが、これらに限定されるものではなく、上記した電子伝達系に関与する酵素の遺伝子を用いてもよい。したがって、上記核酸はプロモータ、ターミネータ、エンハンサー、分泌シグナル配列、電子伝達系酵素遺伝子などと連結されて適切なベクターに挿入されるが、これらの方法は当業者に通常知られる方法である。
【００５３】
（Ｄ）形質転換体
上記核酸又は上記組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸を導入してなる、又はビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸が挿入された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５４】
上記核酸を導入してなる形質転換体は、バクテリオファージなどによって、上記核酸を宿主細胞へ導入された、好ましくは、上記核酸が宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた形質転換体である。
【００５５】
上記核酸又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、放線菌、枯草菌等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられ、好ましくは放線菌又は大腸菌である。この中で、放線菌として好ましいのは、Streptomyces lividans  TK23株であり、大腸菌として好ましいのはＪＭ１０９株であるが、これらに限定されるものではない。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法等により行うことができる。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換するためには、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００５６】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００５７】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞を挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、通常知られる方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００５８】
（Ｅ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法
上記形質転換体を常法にしたがって適当な培地に接種し、ＮＡＤＰＨなどの還元型補酵素を加えることなく、ビタミンＤの存在下、好ましくはビタミンＤ及び包摂化合物の存在下、より好ましくはビタミンＤ、包摂化合物及びビタミンＤ水酸化酵素の発現を誘導する薬剤の存在下で培養することにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる。すなわち、本発明の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法は、反応系が菌体を用いる方法である。したがって、上記した通り、本発明の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法は、ＮＡＤＰＨを加えなくてもよく、ビタミンＤ水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができ（生菌体法）、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよく、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用でき、反応時間を１００時間以上とることができ、並びに通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模で大量生産ができることから、酵素を用いる方法と比較して、圧倒的に簡便かつ効率よく１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造できる。
【００５９】
ビタミンＤとしてはビタミンＤ又はビタミンＤ含有物（例えば、シイタケ抽出液や魚類肝臓抽出液）を用いることができる。ビタミンＤとして好ましいのはビタミンＤ2又はビタミンＤ3であり、これらを用いた場合に製造される１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3である。休止菌体を用いる場合、反応に使用する水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液等を用いることができる。
【００６０】
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造において使用する包摂化合物は、シクロデキストリン、ゼオライト（Ｎａ12・Ａｌ12Ｓｉ12Ｏ48）、フラーレン（Ｃ60、Ｃ70等）、クラウンエーテル又はカリックスアレーンが好ましく、シクロデキストリンがより好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。包摂化合物の濃度は、形質転換体がビタミンＤを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換することができる濃度であれば特に制限されないが、例えば、包摂化合物が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである場合、終濃度は１０〜３０００ｍｇ／ｌが好ましく、１００〜２０００ｍｇ／ｍｌがより好ましい。生菌体法及び休止菌体法のいずれの場合もビタミンＤの濃度は、包摂化合物の濃度に比例して高めることができ、例えば、２０〜２０００ｍｇ／ｌに設定することができる。Streptomyces griseolusのＣＹＰ１０５Ａ１の電子伝達系は図４で示した通りである。休止菌体法の場合、一般的にグルコースを含む緩衝液を用いて菌体内でNADPHを生産するが、菌体内にNADPHが生産され、電子伝達系が正常に機能するのであればよく、グルコース以外の化合物を使用することもできる。
【００６１】
上記形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６２】
上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の炭素源としては、該形質転換体が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、糖蜜などの糖質、またはクエン酸、コハク酸などの有機酸、またはグリセリンや脂肪酸も使用することができる。
【００６３】
上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の窒素源としては、各種有機および無機の窒素化合物、さらに培地は各種の無機塩を含むことができる。たとえば、コーンスティープリカー、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源などの化合物が使用可能である。また、グルタミン酸などのアミノ酸および尿素などの有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。さらに、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトン、バクトソイトン、オキソイドマルトエキス、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も窒素源として使用できる。
【００６４】
上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。上記形質転換体の培養に用いる栄養培地のタンパク質成分としては、例えば、ＮＺ−ｃａｓｅやＮＺ−ａｍｉｎｅなどのカゼイン分解物が挙げられる。さらに、必要に応じて、アミノ酸ならびにビオチンおよびチアミンなどの微量栄養素ビタミンなども適宜用いられる。
【００６５】
培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。培養温度とｐＨは、使用する形質転換体の増殖に適し、かつビタミンＤ水酸化酵素の活性が高くかつ安定した条件を選べばよい。たとえば、上記形質転換体が微生物の場合の培養は、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは３０℃であり、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８〜１２０時間であり、さらに好ましくは上記ビタミンＤ水酸化酵素が最大に生成している時間帯である。微生物の増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれでもよい。
【００６６】
上記形質転換体の培養において、組換えベクターに選択マーカーを含有させている場合などでは、選択マーカーに対応した抗生物質を栄養培地とともに加える。たとえば、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したカナマイシン溶液を加える。
【００６７】
上記形質転換体を培養した後、培養物（液体分と形質転換体や不溶成分等の固形分とが混合したもの）に上記ビタミンＤ水酸化酵素の発現を誘導する薬剤を加える。発現を誘導する薬剤とは、例えば、チオストレプトンやイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを用いる。
【００６８】
上記ビタミンＤ水酸化酵素は、上記形質転換体の細胞内に蓄積される。上記形質転換体を培養して得た培養物をビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素として用いることができる。さらに、該培養物を遠心分離法、ろ過法等の操作によって固形分と培養上清に分離して得られた固形分をビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素とすることもできる。さらに、上記固形分や固形分中の菌体を適当な担体に包括、吸着あるいは化学的に結合させた菌体固定化担体などを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造に使用することができる。
【００６９】
製造された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを溶解することができる溶媒を用いて回収することができるが、活性炭処理、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせても回収することができる。具体例として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、培養液に２〜６倍容、好ましくは４倍容のクロロホルム−メタノール混合液を添加し、激しく攪拌することにより回収することができる。クロロホルム−メタノール混合液におけるクロロホルムとメタノールの混合比は、例えば、３：１に設定することができる。回収された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、例えば、下記条件により高速液体クロマトグラフィーにより分析できる：カラム：ＹＭＣ社製  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ  （内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０oＣ、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％  アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間）。
【００７０】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７１】
１．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体発現プラスミドの構築
野生型ＣＹＰ１０５Ａ１を大腸菌内で発現させるためのプラスミドは非特許文献１２及び１３に記載した方法にしたがって構築した。変異体をコードする遺伝子は変異体作成キットＱｕｉｃｋ  ＣｈａｎｇｅTM（ストラタジェン社）を使用し、それぞれの変異体に応じてプライマーＤＮＡ（２０ｍｅｒ程度）を用いた。プライマーの塩基配列を配列表の配列番号７〜２４に示した（表１を参照）。構築したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。発現系におけるベクターと大腸菌宿主については特に限定されるものではない。
【表１】
0005349846.tif 000002
【００７２】
２．組換え大腸菌の培養及び細胞質画分の調製
それぞれの変異体を発現する組換え大腸菌は５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地  （Sugimoto, H.et al., (2008), Biochemistry 47, 4017-4027）において３７℃で培養し、菌体濃度（Ｏ．Ｄ．660nm）が０．５に達した時点でイソプロピル−チオーβ―Ｄ―ガラクトピラノシドを終濃度１ｍＭになるまで、及びδ−アミノレブリン酸を終濃度０．５ｍＭになるまで添加した。その後、４０〜５０時間２５℃で培養し、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕し、遠心分離により細胞質画分を調製した。
【００７３】
３．変異体の定量
野生型および変異体の定量は吸収スペクトルを測定し４１７ｎｍにおける吸光度を求め、モル分子吸光係数１１０ｍＭ-1ｃｍ-1を用いて算出した。変異体の種類により発現量に違いが見られたが、培養液１Ｌあたりの発現量は１〜５μｍｏｌであった。
【００７４】
４．活性測定
活性は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中で、以下のものを含む再構成系を用いて測定した。基質：ビタミン  Ｄ3、１α−ヒドロキシビタミンＤ3（１α（ＯＨ）Ｄ3）、又は２５―ヒドロキシビタミンＤ3（２５（ＯＨ）Ｄ3）（それぞれ終濃度０．５〜１０μＭ）；０．２μＭ  シトクロムＰ４５０（野生型あるいは変異体を含む組換え大腸菌細胞質画分）；０．１ｍｇ／ｍｌ  ホウレン草由来フェレドキシン（Ｆｄｘ）、０．１Ｕ／ｍｌ  ホウレン草由来フェレドキシン還元酵素（Ｆｄｒ）、１Ｕ／ｍｌ  グルコース脱水素酵素；１％  グルコース；０．１ｍｇ／ｍｌ  カタラーゼ。
【００７５】
反応は終濃度１ｍＭになるまでＮＡＤＰＨを添加して３０oＣで反応を開始し、３０oＣで１０〜６０分反応させ、反応液の四倍容のクロロホルム：メタノール＝３：１を添加し、激しく攪拌した後、代謝物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。条件は以下のとおりである：カラム：ＹＭＣ社製  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ  （内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０oＣ、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％  アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間）
【００７６】
各基質濃度における初速度を求め、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社の解析ソフトＫａｌｅｉｄａ−Ｇｒａｐｈを用いてＫm値およびｋcat値を算出した。１α（ＯＨ）Ｄ3を基質とした場合は２５位水酸化活性により、及び２５（ＯＨ）Ｄ3を基質とした場合には１α位水酸化活性により、活性型ビタミンＤ3（１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3）を特異的に生成する。表２にＡｒｇ８４あるいはＡｒｇ７３を他のアミノ酸残基に変異させたＣＹＰ１０５Ａ１変異体の活性を示した。
【表２】
0005349846.tif 000003
【００７７】
作製したすべての変異体において、１α（ＯＨ）Ｄ3に対する２５位水酸化活性、及び２５（ＯＨ）Ｄ3に対する１α位水酸化活性の活性上昇が見られた。ｋcat値（基質濃度がＫm値よりも高い条件下で重要なパラメーター）を比較すると、すべての変異体において野生型と同様に、１α（ＯＨ）Ｄ3に対する２５位水酸化活性は２５（ＯＨ）Ｄ3に対する１α位水酸化活性よりも高かったが、ｋcat／Ｋm値（基質濃度が  Ｋm値よりも低い条件下で重要なパラメーター）を比較すると唯一、Ｒ８４Ｆにおいては２５（ＯＨ）Ｄ3の１α位水酸化活性の方が高かった。したがって、Ｒ８４Ｆは野生型や他の変異体とは酵素学的に異なることが示唆された。
【００７８】
表３にＡｒｇ７３とＡｒｇ８４の両方に変異を導入した二重変異体の活性を示す。
【表３】
0005349846.tif 000004
【００７９】
驚くべきことに、ｋcat値およびｋcat／Ｋmを比較すると、活性が相乗的に上昇したことがわかった。立体構造から、Ａｒｇ７３とＡｒｇ８４は基質をはさんで反対側に存在している（非特許文献１３を参照）。これらの部位の置換アミノ酸が、互いの効果を打ち消すことなく相乗作用を生じさせたと考えられるが、立体構造情報だけではこの相乗作用の理由を説明することはできない。二重変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａの１α（ＯＨ）Ｄ3に対する２５位水酸化活性および２５（ＯＨ）Ｄ3に対する１α位水酸化活性は天然型のビタミンＤ水酸化酵素であるＣＹＰ２７Ａ１やＣＹＰ２Ｒ１よりも高いことがわかった。また、これら二重変異体は、ビタミンＤ3に対する２５位水酸化活性が野生型よりも顕著に高く、ビタミンＤ3から２５−ヒドロキシビタミンＤ3を経て１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を生成する能力が高いことがわかった。これは、基質とした１α−ジヒドロキシビタミンＤ3又は２５−ジヒドロキシビタミンＤ3に、二重変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを上記４に記載の方法で反応させた後、反応液中の基質および代謝物を抽出し、これらを上記４に記載の方法で分析した結果（図２）によっても示されている。
【００８０】
５．ビタミンＤ2に対するＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ａの触媒作用
ビタミンＤ2、１α（ＯＨ）Ｄ2、又は２５（ＯＨ）Ｄ2を基質として活性を調べたところ、ビタミンＤ2および１α（ＯＨ）Ｄ2からは、２５位水酸化体及び２５位水酸化体にさらに水酸基が一つ導入された代謝物の２種類の代謝物が検出されたと推定され、２５（ＯＨ）Ｄ3からは１種類の代謝物が検出された。これらはいずれも野生型ＣＹＰ１０５Ａ１において見られた代謝物（非特許文献４を参照）と考えられるが、活性はＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ａの方がはるかに高かった。
【００８１】
６．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体の放線菌内での発現
変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを放線菌内で発現させ、組換え菌体を用いてビタミンＤ水酸化体を製造することを試みた。ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子の下流にはフェレドキシン（ＦＤＸ１）遺伝子を含んでいるが、フェレドキシン還元酵素遺伝子を含んでいないため、既存の放線菌内発現ベクターｐＩＪ６０２１のクローニング部位にStreptomyces coelicolor A3株由来のＦＤＲ１遺伝子を挿入し、その上流にＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ＋ＦＤＸ１遺伝子を連結することを試みた。
【００８２】
ＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子の取得は以下の方法で行なった。クローニングしやすいようにＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１のＮ末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、Ｃ末端にＰｓｔＩ部位を付加した配列表の配列番号２５及び２６に記載のプライマー（表４の１０５Ａ１  Ｎ−ＨｉｎｄＩＩＩ、１０５Ａ１  Ｃ−ＰｓｔＩ）を設計し、ｐｋｋ２２３−３にクローニングされているＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１を鋳型として増幅した。またＦＤＲ１遺伝子はＮ末端にＰｓｔＩ部位を、Ｃ末端にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列表の配列番号２７及び２８に記載のプライマー（表４  ＦＤＲ１  Ｎ−ＰｓｔＩ、ＦＤＲ１  Ｃ−ＥｃｏＲＩ）を用いてStreptomyces coelicolor A3（非特許文献２を参照）よりＰＣＲで取得し、ＰｓｔＩ部位で両者を連結してＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子を取得し、ｐＵＣ１９ベクターに結合した。
【表４】
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【００８３】
ＰＣＲはＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を使用し、９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間からなる反応工程を１サイクルとして３０サイクル行なった後、６８℃で７分間反応させる条件で行なった。さらに放線菌の制限修飾系を避けるためにメチル化欠損株大腸菌  ＳＣＳ１１０株を形質転換してプラスミドを構築した。前記した通り、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトにいったんクローニングし、そこからＨｉｎｄＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出してｐＩＪ６０２１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに連結した。次に、ＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を放線菌用ベクターｐＩＪ６０２１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに連結し、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８）に記載の方法を用いてStreptomyces lividans TK23株のプロトプラストに導入し、Ｒ５再生培地に塗布した。１６時間後に、カナマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を含む軟寒天培地を重層した後、３０℃で３日間培養し、カナマイシン耐性株を取得した。
【００８４】
７．組換え放線菌の培養
１％  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈ、０．５％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％  ＮＺ−ｃａｓｅ、０．２％  Ｄｉｆｃｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、０．１％  ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３％  ＣａＣＯ3よりなる培地（滅菌前ｐＨ  ７．０）を１０ｍＬずつ１００ｍＬ容の試験管に分注し、１２１℃、２０分間滅菌した。この培地にＢｅｎｎｅｔｔ’ｓ寒天培地（０．１％  Ｄｉｆｃｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％  Ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．２％  ＮＺ−ａｍｉｎｅ、１％  ｍａｌｔｏｓｅ、２％  ａｇａｒ）に生育させた形質転換体をかき取って接種し、３０℃で２日間振盪培養し、種培養液とした。本培養は３種類の培地のいずれかを用いて行なった：（１）種培養液と同様の組成の培地；（２）１．５％  ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％  Ｄｉｆｃｏ  ｂａｃｔｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ、０．５％  Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ、０．５％  ＮａＣｌ、０．２％  ＣａＣＯ3よりなる培地（滅菌前のｐＨ  ７．０）；（３）ＹＥＭＥ培地（０．３％  Ｄｉｆｃｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、０．３％  ｏｘｏｉｄ  ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ｇｌｕｃｏｓｅ、３４％  ｓｕｃｒｏｓｅ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ。これらの培地をＫ型フラスコ（５００ｍＬ容）に１００ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分間滅菌し、種培養液をそれぞれ１％接種し、３０℃、２００回転／分で培養した。
【００８５】
８．Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを発現する放線菌を用いた２５（ＯＨ）Ｄ3  及び１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3の製造
変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子をｐＩＪ６０２１ベクターに連結し、放線菌Streptomyces lividans TK23株に組込んだ形質転換体を前記（２）の培地を用いて２４時間培養した後、１００ｍｌ培養液中にチオストレプトンを０．１ｍｇ添加し、さらに２４時間培養を続けた後、０．２ｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を１ｍｌ添加し、また、４ｍｇ／ｍＬのビタミンＤ3エタノール溶液を０．５ｍｌ添加し、６７時間培養を続けた。次に、培養液に２倍容のクロロホルム：メタノール＝３：１を添加し、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収し、減圧乾固し、アセトニトリルに溶解した。この溶液を上記４と同じ条件で分析した結果、２５（ＯＨ）Ｄ3および１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3のピークが検出され、変換率はそれぞれ２．９％および１．６％であった（図３を参照）。図３に見られるように、放線菌の菌体を用いた場合は２５（ＯＨ）Ｄ3および１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3への変換率がそれぞれ２．９％、および１．６％と、酵素を用いた場合（下記比較例１の表５を参照）に比べ、１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3の割合がきわめて高くなっている。これは疎水性が極めて高いビタミンＤ3に比べ２５（ＯＨ）Ｄ3の方が菌体に取り込まれやすいことに依ると考えられる。
【００８６】
比較例１．二重変異体の活性比較
シトクロムＰ４５０として、Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ、Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ又はＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ｆを、基質であるビタミンＤ3（最終濃度  ６μＭ）に２０分間作用させて、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の変換率を比較した。結果を表５に示した。なお、表中の「Ｎ．Ｄ．」は、検出下限である０．１０％未満であることを示す。Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４ＡおよびＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ｆにおける１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3への変換率はＲ７３Ａ／Ｒ８４Ａよりも有意に高かった。
【表５】
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【００８７】
表５が示すとおり、ビタミンＤに二重変異体を作用させると、代謝物として２５（ＯＨ）Ｄ3と１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3が主として得られる。１α（ＯＨ）Ｄ3が検出されなかった理由はビタミンＤ3に対する水酸化活性の強さが２５位水酸化活性＞１α位水酸化活性であることと、少量生じた１α（ＯＨ）Ｄ3が１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3に変換されやすいことに基づくと考えられる（表３）。Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａでは１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3が検出できなかったが、Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４ＡおよびＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ｆにおいては１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3の生成が認められる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法によれば、精製酵素を用いず、ＮＡＤＰＨを加えることなく、高効率に、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを生産することができる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤはカルシウムの吸収促進や代謝促進、細胞分化誘導、免疫調節作用などの多岐にわたる生理作用を有し、骨粗鬆症、くる病などのビタミンＤ代謝異常による諸症状、副甲状腺機能亢進症、乾癬などを治療するための治療薬若しくは医薬中間体、又はこれらの症状を緩和するための食品添加物として使用される。骨粗鬆症の患者数は予備軍を含めると国内で約２０００万人、乾癬の患者数は世界で約１億２５００万人いると言われている。したがって、本発明によれば簡易かつ高効率に上記症状を治療又は緩和させる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができることから、本発明は医薬分野及び食品分野に多大な貢献をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＣＹＰ１０５Ａ１野生型および変異体によるビタミンＤ3水酸化経路の概略を示す。
【図２】図２は、ＣＹＰ１０５Ａ１変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ  による代謝物の分析結果を示す。（Ａ）Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを含む再構成系において１α−ヒドロキシビタミンＤ3を基質として添加した系（Ｂ）Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを含む再構成系において２５−ヒドロキシビタミンＤ3を基質として添加した系
【図３】図３は、Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを発現する放線菌を用いた２５（ＯＨ）Ｄ3及び１α，２５（ＯＨ）2Ｄ3の製造結果を示す。
【図４】図４は、Streptomyces griseolusのＣＹＰ１０５Ａ１電子伝達系の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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