(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：
配列番号382および配列番号525からなる群より選択されるアミノ酸配列、または
配列番号382および配列番号525からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号382および配列番号525からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸、
を含んでなる、単離された抗原性Porphorymonas gingivalisポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号382および配列番号525からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号382および配列番号525からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号382および配列番号525からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、
配列番号525で表されるアミノ酸配列、または
配列番号525で表されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号525で表される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸、
を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが配列番号525で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが配列番号525で表されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号525で表される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号525で表されるアミノ酸配列の24番目のアミノ酸から556番目のアミノ酸を含んでなる、単離された抗原性Porphorymonas gingivalisポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号118および配列番号261からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはストリンジェント条件下でそれと相補的な配列にハイブリダイズする配列を含んでなり、かつ抗原性Porphorymonas gingivalisポリペプチドをコードしてなる、単離されたDNA分子。
【請求項１１】
転写調節配列に機能しうる形で連結された請求項１０記載のDNA分子を含有する組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換え発現ベクターを含有する細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞をポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することを含んでなる、P. gingivalisポリペプチドの産生方法。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチド少なくとも１種および製薬上許容される担体を含有する、被験者においてP. gingivalisに対する抗体を誘導するための組成物。
【請求項１５】
前記組成物が請求項１０記載のDNA分子少なくとも１種をさらに含有する、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
製薬上許容される担体がアジュバントである、請求項１４または１５記載の組成物。
【請求項１７】
有効量の請求項１０記載のDNA分子少なくとも１種および製薬上許容される担体を含有する、被験者においてP. gingivalisに対する抗体を誘導するための組成物。
【請求項１８】
製薬上許容される担体がアジュバントである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチドに対して誘導された抗体。
【請求項２０】
ポリクローナルである、請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
モノクローナルである、請求項１９記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項記載の抗体少なくとも１種を含有する組成物。
【請求項２３】
経口使用に適している、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも18個のヌクレオチドを含み、配列番号118またはそれに相補的な配列で表される連続ヌクレオチドと同一である少なくとも18ヌクレオチドの連続配列を有するヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
検出可能な標識をさらに含む、請求項２４記載のヌクレオチドプローブ。
【請求項２６】
サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を検出する方法であって
(a) サンプルと請求項２４または２５記載のヌクレオチドプローブとを、該プローブと該サンプル中のP. gingivalis核酸との間でハイブリッドが形成される条件下で接触させ、
(b) ステップ(a)で形成されたハイブリッドを検出し、その際、ハイブリッドの検出が該サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を示す、
ことからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Porphorymonas gingivalis(ポルフォリモナス・ギンギバリス)ヌクレオチド配列、P. gingivalisポリペプチドおよびP. gingivalis検出用のプローブに関する。P. gingivalisポリペプチドおよびヌクレオチドは、P. gingivalisに対して被験者の免疫応答を生起させて、歯周炎として知られている症状を治療もしくは予防するための、またはその重症度を低減させるための組成物において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
歯周病は、細菌が関係している歯の支持組織の炎症性疾患であり、比較的軽症の歯肉炎（歯肉組織の非特異的で可逆的な炎症）から比較的進行した症状の歯周炎（歯の支持構造の破壊を特徴とする）までの範囲にわたっている。歯周炎は、特定のグラム陰性細菌の共同体が歯肉下に感染して歯周組織を破壊するため、公衆衛生上重大な問題となっている。特に関心がもたれている細菌の一つにP. gingivalisがある。この微生物の成人歯周炎病巣部からの回収率は、嫌気的に培養可能な歯肉下の細菌叢の最大50％に達しうるが、健康な部位からはP. gingivalisは稀にしか回収されず、回収されたとしても少数である。歯肉下プラーク中のP. gingivalisのレベルが比例的に増加することは歯周炎の症状の悪化と関連しており、また、培養可能な歯肉下微生物集団から該微生物を根絶することは同時にこの疾病の消散と関連している。非ヒト霊長類における歯周炎病変部の進行は、P. gingivalisの歯肉下植込みにより実証されている。動物とヒトの両方での上記知見により、成体の歯周炎が発生する際にP. gingivalisが重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０００３】
P. gingivalisは、黒い色素をもち、嫌気性、非糖分解性、タンパク質分解性のグラム陰性桿菌であり、特定のアミノ酸の代謝によりエネルギーを得ている。この微生物は鉄、特にヘムまたはそのFe(III)酸化物ヘミンの形の鉄に対して絶対的な生育要求性を有し、過剰のヘミンの条件下で生育させると実験動物にとって非常に有毒である。P. gingivalisの病原性にはいくつかの毒性因子が関与しており、例えば、莢膜、付着素(adhesin)、細胞毒、細胞外加水分解酵素などである。
【０００４】
P. gingivalisのコロニー形成を防止、排除または減少させる有効で安全なワクチンを開発するためには、免疫原として（おそらく特異的抗体の産生を介して）有用な、毒性に関係のある抗原を同定して生産することが必要である。P. gingivalisの培養物から抗原を直接単離しようとする試みは、可能ではあるものの、困難な場合が多い。例えば、上述したように、P. gingivalisは厳格な嫌気性菌であり、分離および増殖が厄介である。また、一部の微生物では、in vitroで培養すると、多くの毒性遺伝子がダウンレギュレートされて、コード化されたタンパク質がもはや発現されなくなることが知られている。通常の化学的手法を使用してワクチン候補を精製する場合には、潜在的に重要な（防御）分子が同定されないことがある。DNA配列決定を用いると、微生物をin vitroで生育させたときでさえ遺伝子は存在する（しかし、転写されない）ので、その遺伝子を同定してクローニングし、組換えDNAタンパク質として産生させることができる。同様に、防御抗原または治療標的は微生物によってin vitroで一過性に発現されるか、低レベルで産生され、このことが従来の方法によるこれらの分子の同定を非常に困難にしている。
【０００５】
治療標的の血清学的同定を用いると、ウエスタンブロッティングやELISAなどの標準方法を使って検出できる応答に制限されてしまう。その際の制限としては、動物またはヒトにより生じる応答のレベルと、その応答が防御的なのか、有害なのか、または無関係であるのかを判定すること、の両方がある。潜在的な治療標的または予防標的を同定する配列決定アプローチを用いる場合には、このような制限がまったく存在しない。
【０００６】
さらに、P. gingivalisが広い活性を示すプロテアーゼ類を産生するということは公知であり（メルボルン大学、国際特許出願PCT/AU96/00673、米国特許第5,475,097号および第5,523,390号）、こうしたプロテアーゼ類による分解のため無傷のタンパク質の同定が難しくなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,475,097号
【特許文献２】米国特許第5,523,390号
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、P. gingivalisポリペプチドの組換え生産に使用できるP. gingivalisヌクレオチド配列を単離して、P. gingivalisに特異的なヌクレオチドプローブを開発しようとした。以下に挙げたDNA配列は、多数のP. gingivalis配列からワクチン候補としてのそれらの潜在能力に従って選択されたものである。この直観的なステップは、P. gingivalis DNA配列から推定されたタンパク質配列と既知のタンパク質配列のデータベースとの比較を含んでいた。有用なワクチン候補の選択に使用された特徴の一部には次のものが含まれる。すなわち、予想される細胞位置（例えば、外膜タンパク質または分泌タンパク質）、類似タンパク質の特定の機能活性（例えば、酵素活性またはタンパク質分解活性を有するもの）、不活性化またはブロックしたとき微生物にとって有害または致死的でありうる必須の代謝経路に関与するタンパク質、微生物による疾病発生（例えば、赤血球溶解、細胞凝集または細胞受容体）において何らかの役割を担っていると予想されるタンパク質、およびワクチンとしての性能が証明されているタンパク質に類似するタンパク質である。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、抗原性のPorphorymonas gingivalisポリペプチドからなり、該ポリペプチドは、
配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列、または
配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸、
を含んでなる。
【００１０】
本発明の一実施形態では、前記ポリペプチドは、
配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列、または
配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または
配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸、
を含んでなる。
【００１１】
本明細書中で用いる場合、ポリペプチドについての同一性％は、標準的なタンパク質スコアリングマトリックス(Blosum 50)を用いてNeedlemanおよびMunsch(9)のアライメントアルゴリズムにより計算するものとする。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号386、配列番号424、配列番号425、配列番号434、配列番号447、配列番号458、配列番号475、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号387、配列番号400、配列番号411、配列番号419、配列番号420、配列番号427、配列番号429、配列番号433、配列番号437、配列番号438、配列番号443、配列番号444、配列番号448、配列番号449、配列番号452、配列番号455、配列番号457、配列番号459、配列番号461、配列番号462、配列番号463、配列番号467、配列番号468、配列番号469、配列番号482、配列番号484、配列番号485、配列番号494、配列番号508、配列番号509、配列番号510、配列番号520、配列番号521、配列番号522、配列番号525、配列番号526、配列番号528、配列番号389、配列番号390、および配列番号391からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号303の残基422〜531、配列番号303の残基534〜582、配列番号301の残基127〜232、配列番号301の残基240〜259、配列番号295の残基139〜156、配列番号295の残基160〜178、配列番号295の残基180〜207、配列番号295の残基221〜257、配列番号295の残基259〜323、配列番号299の残基885〜985、配列番号363の残基147〜259、配列番号344の残基140〜252、配列番号353の残基247〜356、配列番号353の残基359〜391、配列番号300の残基120〜254、配列番号286の残基287〜311、配列番号286の残基313〜352、配列番号286の残基354〜401、配列番号287の残基208〜252、配列番号287の残基259〜373、配列番号293の残基5〜120、配列番号293の残基123〜139、配列番号265の残基233〜339、配列番号278の残基67〜228、配列番号274の残基130〜172、配列番号274の残基174〜238、配列番号274の残基99〜112、配列番号274の残基114〜128、配列番号285の残基26〜69、配列番号285の残基71〜128、配列番号285の残基130〜146、配列番号327の残基620〜636、配列番号327の残基638〜775、配列番号301の残基397〜505、配列番号301の残基528〜545、配列番号301の残基556〜612、配列番号301の残基614〜631、配列番号301の残基633〜650、配列番号299の残基553〜687、配列番号289の残基305〜447、配列番号364の残基1〜52、配列番号364の残基65〜74、配列番号275の残基486〜604、配列番号272の残基158〜267、配列番号272の残基270〜282、配列番号273の残基163〜237、配列番号273の残基240〜251、配列番号282の残基213〜344、配列番号292の残基183〜324、配列番号292の残基327〜341、配列番号292の残基352〜372、配列番号271の残基141〜166、配列番号271の残基168〜232、配列番号302の残基1〜13、配列番号302の残基15〜28、配列番号302の残基30〜72、配列番号277の残基476〜529、配列番号299の残基41〜146、配列番号299の残基149〜162、配列番号299の残基166〜177、配列番号299の残基192〜203、配列番号290の残基71〜343、配列番号290の残基346〜363、配列番号331の残基36〜240、配列番号331の残基242〜270、配列番号375の残基1〜192、配列番号375の残基266〜290、配列番号279の残基23〜216、配列番号279の残基220〜270、配列番号279の残基285〜386、配列番号297の残基84〜234、配列番号297の残基248〜259、配列番号297の残基261〜269、配列番号294の残基275〜402、配列番号298の残基1〜171、配列番号307の残基403〜417、配列番号307の残基420〜453、配列番号307の残基456〜464、配列番号307の残基468〜690、配列番号304の残基1〜285、配列番号304の残基287〜315、配列番号304の残基318〜336、配列番号342の残基255〜269、配列番号342の残基271〜337、配列番号281の残基347〜467、配列番号375の残基116〜136、配列番号375の残基138〜357、配列番号364の残基133〜423、配列番号305の残基141〜299、配列番号296の残基202〜365、配列番号288の残基134〜426、配列番号276の残基1〜218、配列番号280の残基1〜246、配列番号364の残基444〜608、配列番号283の残基10〜686、配列番号296の残基1〜148、配列番号287の残基1〜191、配列番号287の残基193〜204、配列番号287の残基209〜373、配列番号284の残基211〜470、配列番号284の残基472〜482、配列番号281の残基133〜144、配列番号281の残基146〜336、配列番号303の残基1〜264、配列番号303の残基265〜295、配列番号303の残基297〜326、配列番号303の残基328〜338、配列番号353の残基247〜356、配列番号353の残基358〜391、配列番号298の残基257〜288、配列番号298の残基290〜385、配列番号298の残基245〜256、配列番号303��残基422〜802、配列番号303の残基803〜814、配列番号295の残基139〜156、配列番号295の残基160〜340、配列番号282の残基145〜361、配列番号282の残基363〜387、配列番号282の残基398〜471、配列番号320の残基573〜679、配列番号291の残基27〜168、配列番号291の残基170〜183、配列番号291の残基185〜415、配列番号364の残基1〜301、配列番号337の残基114〜702、配列番号321の残基377〜412、配列番号321の残基413〜772、配列番号265の残基14〜454、配列番号268の残基129〜614、配列番号300の残基1〜930、配列番号300の残基932〜1046、配列番号364の残基1〜301、配列番号381の残基1〜42、配列番号381の残基44〜973、配列番号358の残基1〜93、配列番号358の残基95〜179、配列番号358の残基181〜227、配列番号337の残基114〜702、配列番号355の残基1〜659、配列番号355の残基661〜907、配列番号370の残基1〜131、配列番号370の残基133〜601、配列番号344の残基1〜813、配列番号321の残基377〜412、配列番号321の残基413〜772、および配列番号364の残基189〜614からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、単離された抗原性のPorphorymonas gingivalisポリペプチドからなり、該ポリペプチドは、表３に示したリーダー配列を欠く配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１５】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズする配列を含む、単離されたDNA分子からなる。
【００１６】
単離されたDNA分子は配列番号１〜264、配列番号529および配列番号530からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むことが好適である。
【００１７】
第４の態様において、本発明は、転写調節配列に機能しうる形で連結された本発明の第２の態様のDNA分子を含有する組換え発現ベクターからなる。
【００１８】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターを含有する細胞も提供する。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、前記細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することを含む、P. gingivalisポリペプチドの産生方法からなる。
【００２０】
更に別の態様において、本発明は、被験者においてP. gingivalisに対する免疫応答を生じさせるための組成物を提供し、該組成物は、有効量の本発明の第１の態様のポリペプチド少なくとも１種、または本発明の第２の態様のDNA分子少なくとも１種、または両方、および製薬上許容される担体を含有する。製薬上許容される担体はアジュバントであることが好ましい。
【００２１】
他の態様において、本発明は、被験者のP. gingivalis感染を処置する方法を提供し、該方法は、該被験者に前記組成物を投与することによってP. gingivalis感染の処置を施すことを含んでなる。こうした処置は予防的または治療的処置であり得る。
【００２２】
更に別の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドに対して誘導された抗体を提供する。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。本発明はこれらの抗体を含む組成物も提供する。かかる組成物は経口使用に適するものが好ましく、例えば、歯みがき、うがい薬などであってよい。
【００２３】
更に他の態様において、本発明は、少なくとも18個のヌクレオチドを含み、配列番号１〜121、配列番号529およびそれらに相補的な配列からなる群より選択される連続ヌクレオチドと同一である少なくとも18ヌクレオチドの連続配列を有するヌクレオチドプローブを提供する。このプローブは検出可能な標識をさらに含むことが好ましい。
【００２４】
さらに、本発明は、サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を検出する方法を提供し、該方法は、
(a) サンプルとヌクレオチドプローブとを、該プローブと該サンプル中のP. gingivalis核酸との間でハイブリッドが形成される条件下で接触させ、
(b) ステップ(a)で形成されたハイブリッドを検出し、その際、ハイブリッドの検出が該サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を示す、
ことからなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】チャレンジ後４日の１つの実験結果を示す図である。
【図２】組換えタンパク質の組合わせを使った実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
定義
本明細書においては、精製された若しくは単離されたポリペプチドまたは実質的に純粋なポリペプチド調製品を互換して使用するが、これらは本明細書中では、天然に随伴するその他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、ポリペプチドはこれを精製するために使用される物質、例えば抗体またはゲルマトリックス、例えばポリアクリルアミドからも分離される。好ましくは、ポリペプチドは乾燥重量で少なくとも精製品の10、20、50、70、80または95％を構成する。好ましくは、調製品はタンパク質配列決定に十分な量で、少なくとも1、10または100 mgのポリペプチドを含有する。
【００２７】
精製された細胞調製品とは、植物または動物細胞の場合、in vitro細胞調製品を意味し、完全な植物または動物全部を意味するものではない。培養細胞または微生物細胞の場合、対象細胞が少なくとも10％、さらに好ましくは50％の調製品で構成される。
【００２８】
精製された若しくは単離された、または実質的に純粋な核酸、例えば実質的に純粋なDNA（これらは本明細書中で互換して使用される）とは、その核酸が由来 する生物の天然に存在するゲノム中では直接連続する（すなわち、5'末端側の１個と3'末端側の１個の）コード配列の両方とは直接連続しないものか、あるいはその核酸が由来する生物中に存在する核酸を実質的に含まないかのいずれか、またはその両方である。この用語には、例えばあるベクター中、例えば自律複製プラスミド若しくはウイルス中、または原核若しくは真核生物のゲノムDNA中に組 み込まれるか、あるいはその他のDNA配列とは独立した別の分子（例えばPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片） として存在する、組換えDNAが含まれる。実質的に純粋なDNAとして、別のP.gingivalis DNA配列をもコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAも含 まれる。
【００２９】
本明細書中で使用する「コンティグ(contig)」とは、ある生物のゲノム配列の１連続部分を表す核酸の意味である。
【００３０】
本明細書でORFとも称される「オープンリーディングフレーム」とは、あるポ リペプチドをコードする核酸の１領域である。この領域は１コード配列の一部でも全配列を表すものでもよく、終止から終止コドンまで、または開始から終止コドンまでとして確定することができる。
【００３１】
本明細書で使用する「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、メッセンジャーRNA中に転写され、かつ／またはポリペプチドに翻訳さ れる核酸である。コード配列の境界は5'末端の５個の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳終止コドンによって確定される。コード配列として、限定するわけではないが、メッセンジャーRNA合成DNAおよび組換え核酸配列が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用する核酸の「相補体」とは、当初の配列とWatson-Crick塩基対を形成する逆平行またはアンチセンス配列を意味する。
【００３３】
「遺伝子産物」とはある遺伝子によって特異的にコードされるタンパク質または構造RNAである。
【００３４】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、対象とする分子に特異的に結合する核酸、ペプチドまたはその他の化学物質の意味である。プローブは標識と結合させることが多く、または結合することができるものである。標識とは検出することができる化学的部分分子である。典型的な標識は染料、放射性同位元素、発光および化学発光部分分子、発蛍光団、酵素、沈殿剤、増幅用配列、などが含まれる。同様に、対象とする分子に特異的に結合してそれらの分子を固定化する核酸、ペプチドまたはその他の化学物質は本明細書で「捕捉リガンド」と称される。捕捉リガンドは典型的にはニトロセルロース、ガラス、ナイロン膜、ビーズ、粒子などの支持体と結合するか、または結合することができるものである。ハイブリダイゼーションの特異性はヌクレオチドの塩基対組成、ならびに反応の温度および塩濃度などの条件に依存する。これらの条件は、ルーチンの実験により、当業者が容易に認識し得るものである。
【００３５】
相同性とは２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を称する。比較する２つの配列のある位置が両者ともに同一の塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで構成されている場合、例えば２つのDNA分 子のそれぞれにおけるある位置がアデニンで構成されているならば、その分子はその位置で相同性である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは関数：[２つの配列に共有さ れる同一のまたは相同な位置の数／比較する位置の数]×100、である。
【００３６】
用語、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドは、本明細書中で互換して使用される。
【００３７】
本明細書で使用する「免疫原性成分」は、宿主動物中に体液性および／または細胞性免疫応答を誘発する能力があるP.gingivalisポリペプチド、それらの類似体または断片などの部分分子である。
【００３８】
本明細書で使用する「抗原性成分」は、特定の抗体に十分な高親和性で結合して検出し得る抗原-抗体複合体を形成する能力がある、P.gingivalisポリペプチ ド、それらの類似体または断片などの部分分子である。
【００３９】
本明細書で使用する用語「細胞特異的プロモーター」はプロモーターとして作用する、すなわちそのプロモーターに機能し得る形態で連結した、ある選択されたDNA配列の発現を調節し、そしてある組織の特定の細胞中でのその選択されたDNA配列の発現に影響を与えるDNA配列を意味する。この用語は、ある選択されたDNAの主として１組織中での発現を調節するが、別の組織中でも同様に発現をもたらす、いわゆる「漏出(leaky)」プロモーターをも包括する。
【００４０】
本明細書で使用する用語「制御配列」とは、宿主生物によって認識されて、この配列が連結したコード配列の発現に影響を与える塩基配列を有する核酸を称する。こうした制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物では、こうした制御配列として一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、そして場合によってはオペレーターが含まれ、真核生物では一般的にはこうした制御配列として、プロモーター、ターミネーター、そして場合によってはエンハンサーが含まれる。用語、制御配列は最低限、その存在が発現のために必要な成分全部を含むことを想定しており、その存在が好都合なその他の成分、例えばリーダー配列も含まれることがある。
【００４１】
本明細書で使用する用語「機能し得る形で連結された」とは、目的とする様相で機能するように結合または連結された配列を称する。例えば、制御配列は、制御配列および宿主細胞が共存し得る条件下でコード配列の発現が達成されるような様式の連結によってコード配列に機能し得る形で連結される。
【００４２】
本明細書で使用する「サンプル」とは、例えば（限定するわけではないが、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙、唾液および組織切片を含む）個体から単離された組織若しくは液体またはin vitro細胞培養物成分などの生物学的サンプル、ならびに環境からのサンプルを意味する。
【実施例】
【００４３】
本発明の実施においては、別に指示しない限り、当業者に周知の、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技術を利用することとする 。こうした技術は以下のような文献中に記載され、説明されている：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown（編集）,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1 and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames（ 編集）,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995 and 1996)、ならびに F.M.Ausubelら（編集）,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,現在までの最新版の全部を含む）。これらの文献の開示を参照により本明細書中に組み入れる。
【００４４】
製薬上許容される担体
本発明の抗体、ポリペプチドおよびDNAを、担体または希釈剤を含む組成物に含めることができる。こうした組成物として、医薬組成物が含まれ、この場合、担体または希釈剤は製薬上許容されるものとされる。製薬上許容される担体または希釈剤として、経口、直腸、鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、クモ膜下および硬膜外を含む）投与に好適な組成物に使用されるものが含まれる。これらは使用する用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。製薬上許容される担体または希釈剤の代表的な例として、限定するわけではないが、水、好ましくは生理的pHに緩衝化された等張液（リン酸塩緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水など）が含まれ、マンニトール、ラクトース、トレハロース、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはポリペプチド（ヒト血清アルブミンなど）の１種以上を含んでもよい。組成物は便利なように単位投与量形態で存在させることができ、また薬剤学の分野で公知のどんな方法で調製してもよい。
【００４５】
当業者にとって十分理解されるように、配列表に提示したアミノ酸配列に変更を実施してもよい。これらの変更としてアミノ酸残基の欠失、挿入または置換がある。変更されたポリペプチドは天然に存在するもの（すなわち、天然の起源から精製または単離したもの）かまたは合成品（例えば、それをコードするDNA上に部位特異 的突然変異を起こさせた）のいずれかとすることができる。配列表に提示した配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％の同一性を有する、こうした変更を受けたポリペプチドが本発明の範囲内に入ることを意図する。これらの変更されたポリペプチドに対して生起した抗体もまた配列表に提示する配列の１つを有するポリペプチドに結合するはずである。同一性％レベルは上記のようにして算出すべきものとする。
【００４６】
タンパク質配列が共通の祖先からの分岐によって関連しているならば、それらは相同性である。その結果、タンパク質の種相同体は別の種中に天然に存在する等価なタンパク質となる。どんな種中でも、相同体は多数の対立遺伝子変異型として存在することができ、これらはそのタンパク質の相同体とみなされる。対立遺伝子変異型および種相同体は当業者に知られた以下の標準的技術によって取得することができる。
【００４７】
対立遺伝子変異型は個々の生物中で天然に存在する変異型ということになる。
【００４８】
突然変異体、変異型および相同性-核酸
突然変異ポリヌクレオチドはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である突然変異を１以上有することになる。突然変異体は天然に存在するもの（すなわち、天然の起源から精製したもの）かまたは合成品（例えば、DNA上に部位特異的 突然変異を起こさせたもの）のいずれかとすることができる。したがって、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するものか組換え体（すなわち、組換えDNA技 術を使用して調製したもの）のいずれかとすることができることが明らかである。
【００４９】
対立遺伝子変異型は個々の生物中で天然に存在する変異型となる。
【００５０】
ヌクレオチド配列が共通の祖先からの分岐によって関連しているならば、それらは相同性である。その結果、ポリヌクレオチドの種相同体は別の種中に天然に存在する等価なポリヌクレオチドとなる。どんな種中でも、相同体は多数の対立遺伝子変異型として存在することができ、これらはそのポリヌクレオチドの相同体とみなされる。対立遺伝子変異型および種相同体は当業者に知られた以下の標準的技術によって取得することができる。
【００５１】
抗体の作製
本発明のポリペプチドに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体は標準的な技術を使用して当業者が作製することができる。これらとして、限定するわけではないが、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press(1988)、およびD.Catty（編集者）,Antibodies:A Practical Approach,IRL Press(1988)によって記載されたものなどがある。
【００５２】
あるタンパク質のエピトープに対するポリクローナル抗体の作製のためには、当技術分野で知られた各種の操作法を使用することができる。ポリクローナル抗体の作製のためには、ポリペプチド調製品の１回以上の注射での免疫による抗体の産生用として、多数の宿主動物が許容される。これらとして限定するわけではないが、ウサギ、マウス、ラットその他が含まれる。宿主動物の種類に応じて、その宿主中の免疫学的応答を増強させるために、各種のアジュバントを使用することができる。これらとして、限定するわけではないが、（完全および不完全）Freund、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、オイルエマルジョン、キイホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(Bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００５３】
あるタンパク質のエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を与える任意の技術を使用することによって、調製することができる。これらとして限定するわけではないが、KohlerおよびMilstein（1975,Nature 256,493-497）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kesberら、1983,Immunology Today 4:72）ならびにEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、1985,Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.pp.77-96）が含まれる。その外、適切な抗原特異性を持つ抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性を持つヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる「キメラ抗体」の作製のために開発された技術を使用してもよい（Morrisonら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851-6855；Neubergerら、1984 Nature 312:604-608；Takedaら、1985 Nature 31:452-454）。あるいは、一本鎖抗体の作製のために記載された技術（米 国特許第4,946,778号）を４つの特異的な一本鎖抗体を作製するために応用する ことができる。
【００５４】
組換えヒトまたはヒト化バージョンモノクローナル抗体はヒトの治療適用にとって好ましい実施形態である。ヒト化抗体は文献中にある操作法に従って調製することができる（例えば、Jonesら、1986,Nature 321:522-25；Reichmanら、1988 Nature 332:323-27；Verhoeyenら、1988,Science 239:1534-36）。最近記載されたヒト化モノクローナル抗体の作製のための「遺伝子変換真正世代交代」(gene conversion metagenesis)戦略も、ヒト化抗体の作製において使用することができる（Carterら、1992 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285-89）。あるいは、重および軽領域のランダム組合せからなる組換えフェーズ(phase)ライブラリーを作製するための技術もまた、組 換え抗体を調製するために使用することができる（例えば、Huseら、1989 Science 246:1275-81）。
【００５５】
FuF(ab1)およびF(ab2)などの分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを既知の技術によって作製することもできる。例えば、こうしたフラグメントとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：完全抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab)E2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製することができるFab'フラグメント、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製することができる２つのFabフラグメント。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して（Huseら、1989,Science 246:1275-1281）、あるタンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能 にすることができる。
【００５６】
アジュバント
「アジュバント」は、ワクチン組成物の免疫原性および効力を強化する１種以上の物質を含む組成物を意味する。好適なアジュバントの限定するわけではない例として以下のものが含まれる：スクワランおよびスクワレン（若しくは動物起源のその他のオイル）；ブロックコポリマー；Tween(登録商標)-80などの界面活性剤；Quil(登録商標)A；Drakeol若しくはMarkolなどの鉱物油；落花生油などの植物油；Corynebacterium parvumなどのCorynebacterium由来のアジュバント；Propionibacterium acneなどのPropionibacterium由来のアジュバント；Mycobacterium bovis（Bacillus Calmetic and Guerinn若しくはBCG）；インターロイキン2およびインターロイキン-12などのインターロイキン；インターロイキン1などのモノカイン(monokine)；腫瘍壊死因子；ガンマインターフェロンなどのインターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウム若しくはQuil-A水酸化アルミニウムなどの組合せ；リポソーム；ISCOMアジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチド若しくはその他の誘導体などの合成グリコペプチド；Avridine；Lipid A；硫酸デキストラン；DEAE-Dextran若しくはリン酸アルミニウムを含むDHAE-Dextran；Carbopol'EMAなどのカルボキシポリメチレン；Neocryl A640（例えば米国特許第5,047,238号）などのアクリルコポリマーエマルジョン；ワクシニア若しくは 動物ポスウイルス(posvirus)タンパク質；コレラトキシンなどのサブウイルス粒子アジュバント、またはこれらの混合物。
【００５７】
本明細書で使用する場合、ストリンジェント条件は（１）洗浄のために低イオン強度および高温を使用する、例えば 0.015 M NaCl／0.0015 Mクエン酸ナトリ ウム／0.1％NaDodSO4、50℃；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド などの変性剤を使用する、例えば 0.1％ウシ血清アルブミンを含む 50％(vol/vol)ホルムアミド、0.1％Ficoll、0.1％ポリビニルピロリドン、750 mM NaCl、75
mMクエン酸ナトリウムを含むpH6.5の50 mMリン酸ナトリウムバッファー、42℃；または（３）50％ホルムアミド、5ｘSSC（0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナト リウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5ｘDenhardt溶液、超音波処理サーモン精子 DNA（50μg/ml）、0.1％SDSならびに0.2ｘSSCおよび0.1％SDS中 10％硫酸デキストラン、42℃を使用する、ものである。
【００５８】
後にわかるように、本発明はDNAワクチン接種をその範囲内に包含する。DNAワクチン接種に関する詳しい情報は Donnellyら、Journal of Immunological Methods 176(1994)145-152から知ることができ、この開示を参照により、ここに組み入れる。
【００５９】
この明細書において、用語「コンプライズ(comprise)＝含む」または「コンプライジズ」若しくは「コンプライジング」などのその変化形は示された要素若しくは整数または要素若しくは整数の群を包含するが、その他の要素若しくは整数または要素若しくは整数の群のどれも排除するものではないことを意味するものと理解されたい。
【００６０】
配列決定のためのP.gingivalisライブラリーの作製
P.gingivalisのDNA配列を決定するため、基本的にMamur J.が記載した方法（J.Mol.Biol.3,208-218,1961）によって、P.gingivalis株 W50（ATCC 53978）からゲノムDNAを単離した。基本的にFleischmannらの記載（Science;269,496-512,1995)(2)にしたがって、DNA断片のクローニングを実施した。簡単に述べると、精 製したP.gingivalisからのゲノムDNAを霧状化してDNAを断片化し、Bal31ヌクレ アーゼで処理して平滑末端を生成させ、次に調製用1％アガロースゲルに２回通 した。1.6-2.0 kbのDNA断片をゲルから切り取り、そのDNAを回収した。次にこのDNAをベクターpUC18（SmaI消化および脱リン酸化；Pharmacia）に連結し、1％調製用アガロースゲル中で電気泳動させた。線状ベクター＋１挿入物を含む断片を切り取り、精製し、そしてこのプロセスを反復して、挿入物を含まないベクターがあればそれを減少させた。回収したベクター＋挿入DNAをT4 DNAポリメラーゼ で平滑末端化し、次に環状DNAを作製するための最終連結を実施した。Epicurian Coli Electroporation-Competent Cells（Stratagene）のアリコートをこの連結したDNAで形質転換し、Ｘ-galを含有するSOBアガー抗生物質拡散プレート上にプレーティン グし、37℃で一晩インキュベートした。挿入物を含むコロニーは白色になり、挿入物を含まないもの（ベクターのみ）は青色になった。白色コロニーを取り出すまではプレートを4℃で保存し、その後配列決定のためのプラスミドDNAを抽出するために、拡大させた。
【００６１】
DNA配列決定
96ディープウェルプレート中、50-100 ug/mlアンピシリンを補充した LB、TB またはSOBブロス 1.5 ml中に細菌コロニーをピッキングすることによって、プラスミドDNAを調製した。QIAprep SpinまたはQIAprep 96 Turbo ミニプレプ(miniprep)キット（QIAGEN GmbH,Germany）を使用して、プラスミドDNAを単離した。DNAを96ウェル格子アレー中に溶離させて、-20℃で保存した。
【００６２】
M13 Universalフォワードおよびリバースシークエンシングプライマーを使用し、ABI PRISM Dye TerminatorおよびAmpliTaq DNAポリメラーゼ FSを含むABI PRISM BIGDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（PE Applied Biosystems,Foster City,CA）を使用して、配列決定反応を実施した。配列決定反応をPerkin-Elmer GeneAmp 9700（PE Applied Biosystems）またはHybaid PCR Express（Hybaid,UK）熱サイクルのいずれかで実行した。ABI PRISM 377 DNAシークエンサ ー（PE Applied Biosystems）で配列決定反応を分析した。
【００６３】
得られた配列を以下に示す。これらの配列間の関係を表１に示す。配列相同アラインメント（FASTA）、シグナル配列予測（PSORT,SignalP）またはORF予測（GeneMark）の組合せを使用して、開始コドンを算出した。
【表１】
0005349070.tif 000002
0005349070.tif 000003
0005349070.tif 000004
0005349070.tif 000005
0005349070.tif 000006
【００６４】
DNA配列分析
FASTAフォーマットのDNAファイルをGCGフォーマットファイルに変換し、デー タベース中に移入した。ANGIS（Australian Genomic Information Service,University of Sydney,Australia）から取得したプログラム、Flipを使用して、DNA ファイルをアミノ酸ファイルに翻訳した。潜在的なワクチン候補を選択するため、タンパク質について一連の生物学的情報(bioinformatic)分析を実施した。使用 したプログラムはFASTA相同性検索（１）、PSORT（２、３）、SignalP（４）、TopPred（５）、およびGeneMark（６）である。所望の特性を有するタンパク質の検索および探索のため、これらのタンパク質およびその生物学的情報の結果をカスタム書き込みデータベースに保存した。
【００６５】
次にこれらのタンパク質についてのFASTA相同性結果を、表面所在またはワク チン効力を示唆するタンパク質のどちらかのアラインメントについて調べた。FASTAアルゴリズムを使用するANGISによってコンパイルした重複していない(non-redundant）細菌タンパク質データベースに対する、相同性について、全タンパク質を検索した。FASTA検索のために使用したセッティングは、Ktup＝2、ギャップクリエイション(creation)ペナルティ＝-12、ギャップエクステンション(extension)ペナルティ＝-2、最適アラインメント誘導のための幅＝16、およびBlosum 50スコアリングマトリックスである。統計的確率およびアミノ酸アラインメントにより、有意な相同性について、個々のFASTA検索結果を調べた。結果を表２に示す 。
【００６６】
次に、タンパク質トリミング(trimming)プログラムの１つ（ANGIS）を使用し て、タンパク質ファイルを第１、２、３、４および第５メチオニン残基にトリミングした。次にトリミングしたタンパク質をPSORT分析にかけて、シグナル配列 の検出および細胞の所在部位の予測を行なった。外膜のPSORT確率が＞0.8を表すタンパク質を表面に局在することを意味するものとみなした。第２のシグナル配列検出プログラム、SignalPもまた実行したが、いくつかの例では、このプログ ラムはPSORTと一致しないシグナルを検出した。その他の方法によ って同定されたすべてのタンパク質もPSORTおよびSignalPによって分析した。以前から、細菌外膜タンパク質のC-末端アミノ酸が外膜上のタンパク質の組み立てにとって重要であることが示されている（7）。外膜タンパク質の典型的な構造 の定義がN-末端のシグナル配列およびC-末端のチロシン若しくはフェニルアラニンの存在によって確定されている。多数の選択されたタンパク質がこの特徴的な構造を表示する。プログラム、TopPredを使用して膜スパン(spanning)ドメイン （MSD）の存在および数を決定した。こうした配列の存在は外膜などの膜への付 着傾向を意味する。選択されたタンパク質のC-末端アミノ酸についてのPSORT、SignalPおよびTopPred分析の結果を表３に示す。
【００６７】
多数のP.gingivalis外膜タンパク質のC-末端からの70アミノ酸は50-100％のタンパク質配列同一性を共有している。これらのタンパク質の例はRGP1、RGP2、KGP、HagA、HagC、HagD、prtHおよびprtTである。この保存されたモチーフがタン パク質を外膜に付着または適合させることに関与しているらしい。このタンパク質データセットを上記のようにFASTA相同性を使用して検索したところ、C-末端 に同様のモチーフを表示する多数の新規なタンパク質が同定された。その結果を表４に示す。
【００６８】
TonBIIIボックスは広範な各種の細菌中のTonB外膜受容体内に存在する30アミ ノ酸のモチーフである。P.gingivalisのTonBIIIボックス（8）を使用して、上記のようにFASTAによる相同性について、タンパク質データセットを検索した。有 意な相同性を表示するタンパク質を表５に列挙する。
【表２】
0005349070.tif 000007
0005349070.tif 000008
0005349070.tif 000009
0005349070.tif 000010
0005349070.tif 000011
0005349070.tif 000012
0005349070.tif 000013
0005349070.tif 000014
0005349070.tif 000015
【００６９】
【表３】
0005349070.tif 000016
0005349070.tif 000017
0005349070.tif 000018
0005349070.tif 000019
0005349070.tif 000020
0005349070.tif 000021
0005349070.tif 000022
0005349070.tif 000023
0005349070.tif 000024
0005349070.tif 000025
【００７０】
【表４】
0005349070.tif 000026
【００７１】
【表５】
0005349070.tif 000027
【００７２】
組換えP.gingivalis遺伝子のクローニング、発現および精製
PG1
TaqPlus Precision PCR System(Stratagene)およびPTC-100(MJ Research)熱サイクラーまたは類似の装置を使用し、推定されるタンパク質の5'および3'領域についてのオリゴヌクレオチドを使用して、P.gingivalis W50ゲノムDNAの調製品 から目的の遺伝子を増幅した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCATATGCTGGCCGAACCGGCC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGTCAATTCATTTCCTTATAGAGである。PCR断片を精製し、NdeI、XhoI制限酵素（Promega）で消化し、プラスミド pProEx-1（Gibco-BRL）の対応する部位に連結し、大腸菌 ER1793細胞（Elizabeth Releigh,New England Biolabsからの寄贈品）中に形質転換した。生成した正しい挿入物を発現するクローンを選択し、0.1 mM IPTG（Promega）を存在させるかまたは存在させないで、組換えタンパク質の発現を誘導した。上記のウサギ抗血清の１つまたはP.gingivalis組換えタンパク質に融合させたヘキサヒスチジンタグを検出する抗ヘキサヒスチジン抗体（Clontech）を使用して、SDS-PAGE分析およびウエスタンブロットによって、組換えタンパク質の発現を確定した。結合バッファー（Novagen）中での超音波処理および最終濃度1％までのサルコシル（N-ラウロイルサルコシン）を添加して可溶化することによる大腸菌細胞の破壊によって、PG1を精製した。その後、調製物を結合バッファー中0.1％サルコシルまで希釈し、ニッケル-ニトリロトリ酢酸カラム（Ni-NTA；Qiagen）に結合させ、洗浄後、Qiagenの推奨にしたがって全バッファーに0.1％サルコシルを添加した溶離バッファー（Novagen）中の 1 Mイミダゾールで、結合したタンパク質を溶離させた。精製した後、サンプルを 500 mM NaCl、20 mM Tris、0.1％サ ルコシル、pH 7.4に対して透析してイミダゾールを除去し、必要に応じて濃縮し、使用まで4℃で保存した。（上記のものから）選択した抗血清を使用して、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって、精製度および抗原性を評価し、BCAアッセイ（Pierce）によってタンパク質濃度を決定した。
【００７３】
PG2
PG2のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGAAAAGAATGACGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGAAAGACAACTGAATACCであり、BstZ171およ びBglII制限部位を使用して、PCR産物をpGex-stop RBS(IV)（特許出願 WO9619496、JC Cox,SE Edwards,I Frazer and EA Webb.ヒト乳頭腫ウイルス抗原の変異型）中にクローン化した。PG2を可溶化するために2％サルコシルを使用し、可溶化バッファーおよびその他の全バッファーに8 M尿素を添加した。逐次透析（順に4 M、2 M、1 M、0.5 M、0 M尿素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、0.1％サルコシル中、pH 7.4）によって、精製したタンパク質から尿素を除去した。精製したタンパク質を必要になるまで4℃で保存した。
【００７４】
PG3
PG3のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAAGAAATCAAGTGTAG、3'オリゴ ヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTCTTCAGCGTACCTTGCTGTGであり、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）でDNAを増幅した。PCR産物を直接pCR-Blunt中にクローン化し、大腸菌 Top10F'（InVitrogen）中に形質転換した後、BstZ171およ びBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクロ ーン化し、大腸菌 BL21DE3（Pharmacia Biotech）中に形質転換した。PG3の精製のため、PG1の方法に以下の改変を実施した。組換えタンパク質を発現する細胞 を結合バッファー中での超音波処理によって破壊し、不溶性封入体を遠心分離によって濃縮した。次に封入体を結合バッファー中の6 M尿素（Sigma）に可溶化し、溶離バッファーに添加した6 M尿素で溶離させた。いくつかの例においては、こ れらのステップについて、尿素の代わりに6 M塩酸グアニジン（Sigma）を使用した。濃度を減少させた尿素に対する 逐次透析（順に3 M、1.5 M、0.5 M、0 M尿 素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、8％グリセロール中、pH 7.4）によって、精製したタンパク質から尿素（または代替の塩酸グアニジン）を除去した。精製したタンパク質を必要になるまで-80℃で冷凍保存した。Coomassie Plus タンパク質アッセイ（Pierce）によってタンパク質濃度を決定した。
【００７５】
PG4
PG4のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTTCTGTATACTTACAGCGGACATCATAAAATC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTTCCAGGAGGGTACCACGCAACTCTTCTTCGATであり、Tth XL PCRキット（Perkin Elmer）でDNAを増幅した。BstZ171およびKpnI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。
【００７６】
PG5
PG5のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTTGCAACATATGATCAGAACGATACTTTCA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCAATCTCGAGCGGTTCATGAGCCAAAGCであり、Tth XL PCRキットでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミドpET24（Novagen）中にクローン化し、大腸菌 BL21（Pharmacia Biotech）中に形質転換した。このタンパク質は低濃度側の尿素では不溶性なので、1 M尿素以上は尿素の除去を進めなかった。精製したタンパク質を必要になるまで4℃で保存した。
【００７７】
PG6
PG6のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTAAACATATGTGCCTCGAACCCATAATTGCTCCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGTCCGCGGAAGCTTTGATCGGCCATTGCTACTであり、Tth XL PCRキットでDNAを増幅した。NdeIおよびHindIII制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。
【００７８】
PG8
PG8のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGGAGTTCAAGATTGTG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGTTTTCTGAAAGCTTTTCであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pProEx-1中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。
【００７９】
PG8A
PG8AはPG8を短くしたバージョンで、最初の173アミノ酸が除去されている。PG8Aのために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGGAAAACTTAAAGAAC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGTTTTCTGAAAGCTTTTCであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。BstZ171およびBglII制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミドpGex-stop RBS(IV)中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。精製したタンパク質の透析の前に、EDTA（Sigma）を最終濃度10 mMとなるように添加した。
【００８０】
PG10
PG10のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGATATCATGGATAAAGTGAGCTATGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTTTTGTTGATACTCAATAATTCであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。PCR産物をEcoRVおよびBglIIで消化し、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中に連結し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。
【００８１】
PG11
PG11のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAGAGCAAACATTTGGCAGATACTTTCCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTGCGCAAGCGCAGTATATCGCCであり、Tli DNAポリメラーゼ（Promega）でDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blunt中にクローン化し、大腸菌 Top10F'中に形質転換した後、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。結合バッファー（Qiagen）中の2％サルコシルでの大腸菌細胞の可溶化によって、PG11を精製し、これを結合バッファー中0.1％サルコシルまで希釈し、ニッケル-ニトリロトリ酢酸カラム（Ni-NTA；Qiagen）に結合させ、洗浄後、Qiagenの推奨にしたがって1 Mイミダゾール（溶出バッファー中 0.7％CHAPS(Sigma)；Qiagen）で、結合したタンパク質を溶出させた。精製後、サンプルを 500 mM NaCl、20 mM Tris、0.7％CHAPS、20％グリセロール（Sigma）、pH 7.4に対して透析してイミダゾールを除去し、必要に応じて濃縮し、使用まで4℃で保存した。
【００８２】
PG12
PG12のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAATAGCAGACATCTGACAATCACAATCATTGCCGG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTGCTGTTCTGTGAGTGCAGTTGTTTAAGTGであり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blunt中にクローン化し、大腸菌 Top10F'細胞中に形質転換した後、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。組換えタンパク質の精製法は、以下を除いてPG11と基本的に同一とした：封入体を可溶化するために、サルコシルの代わりに 50 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0中の0.5％ DHPC（1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン；Avanti）を使用し、Ni-NTAへの添加前にDHPCを0.1％に希釈し、全バッファーに0.1％ DHPCを添加した。
【００８３】
PG13
PG13のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCATATGCGGACAAAAACTATCTTTTTTGCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGGTTGTTGAATCGAATCGCTATTTGAGCであり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24b中にクローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。組換えタンパク質の精製法は、6 M尿素を使用してPG3と基本的に同一とし、1％ NOG（n-オクチルグルコシド；Sigma）を透析バッファーに添加した。このタンパク質は低濃度側の尿素では不溶性なので、2 M尿素以上は尿素の除去を進めなかった。精製したタンパク質を必要になるまで4℃で保存した。
【００８４】
PG14
PG12のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGGCGCCATGACGGACAACAAACAACGTAATATCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGTTACTTGCGTATGATCACGGACATACCCであり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。EheIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミドpProEx-1中にクローン化し、大腸菌BL21中に形質転換した。組換えタンパク質の精製法はPG12と基本的に同一とした。
【００８５】
PG15
PG15のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCAAAAGTATACTAATAAATATCATTCTCAA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCTTATGGTACCTTTGGTCTTATCTATTATであり、Tth XL PCRキットでDNAを増幅した。BstZ171およびKpnI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミドpGex-stop RBS(IV)中にクローン化し、大腸菌ER1793中に形質転換した。
【００８６】
PG22
PG22のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCCCCGGATCCGATGCGACTGATCAAGGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCCCCCTCGAGCGGAACGGGGTCATAGCCであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。BamHIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24b中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。PG22を精製した後、1 Mイミダゾールを存在させた外はPG1と同様の方法で透析を実施した。
【００８７】
PG24
PG24のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGAATTACCTGTACATAC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGGATCCGTTCGATTGGTCGTCGATGGであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。PCR産物をBstZ171およびBamHIで消化し、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中に連結し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。PG24の発現は低レベルだったので、小スケール以外の精製は実施しなかった。
【００８８】
PG24A
PG24の改変バージョンもクローン化して、発現させた。PG24AはPG24と同一で、予測されるN-末端配列を除去したものである。PG24Aのために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGCATATGGAGATTGCTTTCCTTTCTTCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGCTCGAGTTAGTTCGATTGGTCGTCGであり、TaqPlus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド
pProEX-1中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。組換えタンパク質の精製法はPG3と基本的に同一としたが、封入体を可溶化するために8 M尿素を使用し、これをNi-NTAカラム精製用バッファー中で用いた。逐次透析（順に4 M、2 M、1 M、0.5 M、0 M尿素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、8％グリセロール中、pH 7.4）によって尿素を除去した。精製したタンパク質を必要になるまで-80℃に凍結して保存した。
【００８９】
PG29
PG29のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGATATCGCTAGCATGAAAAAGCTATTTCTC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTCTCGAGTTTGCCATCGGATTGCGGATTGであり、Pfu DNAポリメラーゼを使用してDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blunt（InVitrogen）中にクローン化し、大腸菌 Top10F'中に形質転換した後、EcoRVおよびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。精製過程中、6 M尿素を使用した。
【００９０】
PG30
PG30のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTACGGAATTCGTGACCCCCGTCAGAAATGTGCGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTTGATCCTCAAGGCTTTGCCCGGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。PG30の全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。テリフィック(terrific)ブロス中、組換え大腸菌の培養物10 mlをOD 2.0（A600nm）まで増殖させ、 0.5 mM IPTGで細胞を誘導し、誘導後４時間目のサンプルを分析用に使用した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９１】
PG31
PG31のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGGGAATTCGCAAAAATCAATTTCTATGCTGAA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTGTATGCAATAGGGAAAGCTCCGAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９２】
PG32
PG32のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCAGAATTCCAGGAGAATACTGTACCGGCAACG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGGAGCGAACGATTACAACACであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９３】
PG33
PG33のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCAGAATTCCAAGAAGCTACTACACAGAACAAA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９４】
PG35
PG35のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGAATTCATGAAACAACTAAACATTATCAGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGTGCGGCCGCGAAATTGATCTTTGTACCGACGAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９５】
PG36
PG36のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAAAGGAATTCTACAAAAAGATTATTGCCGTAGCA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACTCCTGTCCGAGCACAAAGTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９６】
PG37
PG37のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGGCGAATTCAAACGGTTTTTGATTTTGATCGGC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGCTAAAGCCCATCTTGCTCAGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９７】
PG38
PG38のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCCTCGAATTCCAAAAGGTGGCAGTGGTAAACACT、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGATTCCGAGTTTCGCTTTTACであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９８】
PG39
PG39のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCTGGATCCCAAGGCGTCAGGGTATCGGGCTAT、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAATTCGACGAGGAGACGCAGGTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９９】
PG40
PG40のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCTGAATTCAAGACGGACAACGTCCCGACAGAT、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTTGACCATAACCTTACCCAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１００】
PG41
PG41のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGACTGAATTCCAAAACGCCTCCGAAACGACGGTA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTGTTCGGGAATCCCCATGCCGTTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０１】
PG42
PG42のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGTTTGAATTCGCAAATAATACTCTTTTGGCGAAG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGCCGGACATCGAAGAGATCGTCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０２】
PG43
PG43のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGAATTCAAAAAAGAAAAACTTTGGATTGCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTCAAAGCGAAAGAAGCCTTAACであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０３】
PG44
PG44のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCCGAATTCTGTAAGAAAAATGCTGACACTACC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTTTTCCCGGGCTTGATCCCGATであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０４】
PG45
PG45のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGACAGGATCCTGCTCCACCACAAAGAATCTGCCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGGGATAGCCGACAGCCAAATであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０５】
PG46
PG46のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTCGGAATTCCGTTATGTGCCGGACGGTAGCAGA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACGGATAGCCTACTGCAATGTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０６】
PG47
PG47のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCCGAATTCCAAACAGTGGTGACCGGTAAGGTGATCGATTCAGAA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTTTACACGAATACCGGTAGACCAAGTGCGGCCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０７】
PG48
PG48のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAAAATCCAAGCAGGTACAGCGA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTCGTAACCATAGTCTTGGGTTTTGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０８】
PG49
PG49のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAACGGATCCAACGAGCCGGTGGAAGACAGATCC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAATCTCGACTTCATACTTGTACCAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０９】
PG50
PG50のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCTGGGATCCGCGACAGACACTGAGTTCAAGTAC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACTTCACTACCAAGCCCATGTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１０】
PG51
PG51のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTCTTGAATTCGCGCAAAGTCTTTTCAGCACCGAA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCACTTTTTCGTGGGATCACTCTCTTであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１１】
PG52
PG52のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGAAGAATTCAAACGGACAATCCTCCTGACGGCA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTCTTTGCCCTGATAGAAATCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１２】
PG53
PG53のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCTGAATTCGCGAATCCCCTTACGGGCCAATCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGTCCGAAAGGCAGCCGTAATAGGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１３】
PG54
PG54のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCTGAATTCCAGATTTCGTTCGGAGGGGAACCC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTGCTTCACGATCTTTTGGCTCAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１４】
PG55
PG55のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGAGGGATCCGAGCTCTCTATTTGCGATGGCGAG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTTACCTGACTTCTTGTCACGAATであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１５】
PG56
PG56のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAAATGGATCCCGAAAAATTTTGAGCTTTTTGATG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTTGATTCGTAATTTTTCCGTATCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１６】
PG57
PG57のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAAGAGATCTCAGGCATGAATGCA、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCGGCCTCTTTATCTCTACCTTTTCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１７】
PG58
PG58のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGTGAATTCCAAACCCCACGAAATACAGAAACC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAAGTCCAGCTAAAACCGGCGAAであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１８】
PG59
PG59のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAACAAGAGAAGCAGGTGTTTCAT、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGATGCTCTTATCGTCCAAACGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１９】
PG60
PG60のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCGGAATTCCAGATGCTCAATACTCCTTTCGAG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGAGGTAGGAGATATTGCAGATであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１２０】
PG61
PG61のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCAGAATTCCCCGTCTCCAACAGCGAGATAGAT、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAATCGATTGTCAGACTACCCAGであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１２１】
PG62
PG62用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGCGGTTTCCGATGGTGCAGGGAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGTGAAATCCGACACGCAGCTGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２２】
PG63
PG63用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAAGAAGCAAACACTGCATCTGACであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAAGTGTACGCAACACCCACGCCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２３】
PG64
PG64用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGAGTCGTCCTGCTCTTAGACTGであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGCGAACACCGAGACCCACAAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２４】
PG65
PG65用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGGATCCATCGGACAAAGCCGCCCGGCACTTであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAAGCGGTAACCTATGCCCACGAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２５】
PG66
PG66用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGTTTGAATTCCAAGACGTTATCAGACCATGGTCAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAAATGAGTGGAGAGCGTGGCCATであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２６】
PG67
PG67用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAACGAGCTCGCGGAACGTCCTATGGCCGGAGCAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATACCAAGTATTCGTGATGGGACGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２７】
PG68
PG68用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCTTGCGGCCGCCCTTATGAAAGATTTGCAGATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGTGCTCGAGTATACTCAACAAGCACCTTATGCACであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にNot IおよびXho I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２８】
PG69
PG69用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGGAAGGGGAGGGGAGTGCCCGAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGCTGTAGCGGGCTTTGAACCAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２９】
PG70
PG70用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGTGGATCCTCGCAAATGCTCTTCTCAGAGAATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAACGAAATATCGATACCAACATCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３０】
PG71
PG71用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGAACAATACCCTCGATGTACACであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTGCCGGTAGGATTTCCTTGTCCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３１】
PG72
PG72用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCGGAGAGCGACTGGAGACGGACAGCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATGATTGCCTTTCAGAAAAGCTATであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli）BL21DE3中にTGCTGAATTCGGAGAGCGACTGGAGACGGACAGCを形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３２】
PG73
PG73用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGTGAATTCCAACAGACAGGACCGGCCGAACGCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTAAGAAAGGTATCTGATAGATCAGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３３】
PG74
PG74用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAGAAAATAATACAGAAAAGTCAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAGGTTTAATCCTATGCCAATACTであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３４】
PG75
PG75用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCGGGATCCGCTCAGGAGCAACTGAATGTGGTAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTGGAACAAATTGCGCAATCCATCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３５】
PG76
PG76用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCAGAATTCGGAAACGCACAGAGCTTTTGGGAAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTACCTGCACCTTATGACTGAATACであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３６】
PG77
PG77用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAGAGAAAAAGGATAGTCTCTCTであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTTCTTATCGCCATAGAATACAGGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３７】
PG78
PG78用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAGGATTCTTCCCACGGTAGCAATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATCATGATAGTAAAGACTGGTTCTであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３８】
PG79
PG79用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCGTAGTGACGCTGCTCGTAATTGTCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGCCGTCCTGCCTTTCTGCCTGACGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３９】
PG80
PG80用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAATTCCAAAACGTGCAGTTGCACTACGATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTTGAAAGTCCATTTGACCGCAAGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４０】
PG81
PG81用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGTTTGAATTCCAGGATTTTCTCTATGAAATAGGAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGTTTATTACAAAAAGTCTTACGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４１】
PG82
PG82用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAACGAATTCCAGAACAACAACTTTACCGAGTCGであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTTCAGTTTCAGCTTTTTAAACCAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４２】
PG84
PG84用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAGAATGATGACATCTTCGAAGATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTGCGTCCCCGGCCACTACGTCCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４３】
PG85
PG85用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGTGAATTCGTACCAACGGACAGCACGGAATCGであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCAGATTGGTGCTATAAGAAAGGTAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４４】
PG86
PG86用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAAACGCATGATCATCTCATCGAAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTGGTTCAGGCCGTGGGCAAATCTであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４５】
PG87
PG87用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCGGAATTCCAGAGCTATGTGGACTACGTCGATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTACTGTGATTAGCGCGACGCTGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４６】
PG88
PG88用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCAGAATTCGCCGAATCGAAGTCTGTCTCTTTCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCGGCAAGTAACGCTTTAGTGGGGAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４７】
PG89
PG89用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAATCGAAGTTAAAGATCAAGAGCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTAGTCCAAAGACCCACGGTAAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４８】
PG90
PG90用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAAACAACGACGAACAGTAGCCGGであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTTTTGTTGTGATACTGTTTGGGCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４９】
PG91
PG91用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGACGATGGGAGGAGATGATGTCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTCCACGATGAGCTTCTCTACGAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５０】
PG92
PG92用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAATTCGCCGATGCACAAAGCTCTGTCTCTであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCGAGGACGATTGCTTAGTTCGTAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５１】
PG93
PG93用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAGCTCCAAGAGGAAGGTATTTGGAATACCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGCGAATCACTGCGAAGCGAATTAGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５２】
PG94
PG94用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAGCTCCAAGAGGAAGGTATTTGGAATACCであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGTCCTACCACGATCATTTTCTTであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５３】
PG95
PG95用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAGCTCTGTGGAAAAAAAGAAAAACACTCTであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAACTGTCTCCTTGTCGCTCCCCGGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５４】
PG96
PG96用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAGCTCCAAACGCAAATGCAAGCAGACCGAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTTGAGAATTTTCATTGTCTCACGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５５】
PG97
PG97用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCGGGATCCCAGTTTGTTCCGGCTCCCACCACAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTGTTTGATGAGCTTAGTGGTATAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５６】
PG98
PG98用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGCAGAATTCCAAGAAAGAGTCGATGAAAAAGTAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTAGCTGTGTAACATTAAGTTTTTTATTGATであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５７】
PG99
PG99用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCAAGGACAATTCTTCTTACAAACCTであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCGAATCACGACTTTTCTCACAAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５８】
PG100
PG100用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAGTCTTTGAGCACAATCAAAGTAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGATAGCCAGCTTGATGCTCTTAGCであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５９】
PG101
PG101用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCAAAGGCAAGGGCGATCTGGTCGGGであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCTCTTCTCGAACTTGGCCGAGTAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１６０】
PG102
PG102用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGGCCGAATTCCAGATGGATATTGGTGGAGACGATであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTCTACAATGATTTTTTCCACGAAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１６１】
PG104
PG104用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAACGGATCCAACGTGTCTGCTCAGTCACCCCGAであり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCTGAGCGATACTTTTGCACGTATであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１６２】
動物抗血清およびヒト患者血清
組換えP.gingivalisタンパク質の発現および再生（refolding）を検出するため、様々な抗血清を産生させた。ニュージーランドシロウサギに、タンパク質約2mgを含有する超音波処理したP.gingivalis（株W50）の３つの用量を注射することによって全細胞抗血清を産生させた。第１用量はフロイント（Freund）の完全アジュバント（FCA）に入れて、また第２用量および第３用量はフロイントの不完全アジュバント（IFA）に入れて、3週間隔で与えた。用量（1ml）は後脚の筋内に与え、最後の用量投与の7日後にウサギから採血し、血液を凝固させ、血清を除去して必要時まで-20℃で貯蔵した。第２のウサギ抗血清は、免疫原として、ドイジおよびトラスト（DoidgおよびTrust Tら, 1994）の方法によりP.gingivalis W50から誘導したサルコシル（sarkosyl）不溶画分（各用量はタンパク質0.69mgであった）を使ったが、その他は同様な方法で作製した。第３のウサギ抗血清は、免疫原として、ドイジおよびトラスト（Doidg P.およびTrust TJ, 1994 Infect Immun 62:4526-33）の方法により誘導したP.gingivalis W50から誘導したサルコシル（sarkosyl）可溶画分（用量当たりタンパク質1mg）を使ったが、その他は最初と同様な方法で作製した。
【０１６３】
これらの研究では「防御ラット血清」プールも使い、このプールはFIA中のホルマリン死滅全P.gingivalis細胞（ATCC 33277株；2 x 109細胞の２用量、3週隔にて）を用いて免疫感作したラットから得た。その後、ラットは、最後の用量投与の2週後に、先に記載したように（Klaussen B.ら, 1991, Oral Microbiol Immunol 6:193-201）生P.gingivalis細胞（33277株）を経口投与してチャレンジし、最後のチャレンジ接種の6週後、犠牲にした時にこれらのラットから血清を得た。
【０１６４】
ヒト血清は、外来患者の診療所で歯周病の治療または評価を受けている成人患者から得た。これらの患者は、6mmの接着損失(attachment loss)をもつ歯が6本以上あり、かつP.gingivalis特異的DNAプローブを使って歯肉下プラーク中にP.gingivalisの存在が検出された。これらの患者から血清のプールを作り、歯周の健康な患者から得た血清のプールと比較した。
【０１６５】
免疫感作およびマウス病変モデルプロトコル
マウス膿瘍モデルを使って、マウスを皮下膿瘍の形成から防御する上で、組換えP.gingivalisタンパク質を用いてマウスを免疫感作することの有効性を評価した。このモデルは、他研究者も歯周病に対する可能性をもつワクチンの予測体として使っている（Bird PSら, 1995 J. Periodontol. 66:351-362）。6-8週齢のBALB/cマウスに、不完全フロイントアジュバント（IFA；Sigma）中に乳化した、組換えP.gingivalisタンパク質10または20μg、大腸菌（E.coli）溶解物タンパク質20μg、またはP.gingivalis 33277株ホルマリン死滅細胞2 x 109のいずれかを含有する0.1 mlを皮下注射して、第0日に免疫感作した。第21日に、マウスに同じ用量を再注射し、そして、1週後に採血し、抗体レベルを評価した。第35日に、全マウスに、生P.gingivalis（ATCC33277）の約2 x 109細胞を腹部に皮下注射してチャレンジした。チャレンジ後、次の10日間、毎日、マウスの体重減少および病変のサイズをモニターした。病変サイズの長さおよび巾を測定し、mm2で表現した。群をクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析（Kruskal-Wallis one-way ANOVA）を使って統計解析し、また個別にも、インスタット（Instat）統計パッケージを使って、アンペアード(unpaired) t検定またはマン・ホィットニー順位和検定（Mann-Whitney rank sum test）を使い試験した。
【０１６６】
図１は、チャレンジ後４日の１つの実験結果を示す（この時点で病変は最大サイズであった）。大腸菌（E.coli）溶解物で免疫感作した対照マウスは大きな病変を示したが、P.gingivalis 33277株の死滅細胞で免疫感作したマウスは完全に防御された。これは、全細胞がP.gingivalisに対して防御を与えるが、大腸菌（E.coli）タンパク質で免疫感作したマウスは防御されなかったことを示す。様々なPG組換えタンパク質を与えたマウスは、PG2、PG22、PG24およびPG29については、有意な防御レベル（p<0.05、アンペアードt検定）を示したが、PG8Aは大腸菌（E.coli）対照群と比較して有意とは言えなかった（p=0.07）。
【０１６７】
図２は、組換えタンパク質の組合わせを使った別の実験結果を示す。PG1+PG2を与えたマウスは、大腸菌（E.coli)溶解物を与えた対照マウスと比較して、有意な防御レベル（p<0.026アンペアードt検定）を示した。
【０１６８】
免疫スクリーニング
クローニングした候補物をテリフィック・ブロス（Terrific broth）15ml中で培養し、IPTGで誘導し、誘導の4時間後にサンプリングした。培養物の１mlを取り出し、ペレット化し、該細胞を、培養物のOD A600nmを8で除して決定したPBSの容積中に再懸濁した。溶解物のアリコート（100μl）の１つを、2xサンプル還元バッファー（125mM Tris pH 6.8、20%グリセロール、4% SDS、80mM DTT、0.03%ブロモフェノールブルー）の100μlに加え、10分間煮沸した。SDS-PAGEを、ラエムリ（Laemmli UK, 1970, Nature 227:680-685）の方法により、製造業者の推奨に従い4-20% 1.0mm Tris-グリシンゲル（Novex）を使って実施した。タンパク質を、トランスブロッティングによりHybond-C Extraニトロセルロースメンブラン（Amersham）上に移し、その後、該メンブランを2時間、室温（RT）で、20mM Tris、0.5M NaCl、0.05% Tween-20、pH7.5(TTBS)中の5%スキムミルクでブロックした。
【０１６９】
免疫スクリーニングは、別々に、ウサギ抗P.gingivalis全細胞血清、ラット防御血清、ヒト歯周病患者血清のプール、および多くの場合、抗T7タグ抗体HRPコンジュゲート（Novagen）を用いて実施した。使用前に、ウサギ、ラットおよびヒト血清は、TTBS中の5%スキムミルクにそれぞれ1/5000、1/1000および1/500に希釈し、100μl（ウサギ血清の場合）または250μl（ラットおよびヒト血清の場合）の大腸菌（E.coli)抽出物（20mg/ml；Promega）に6時間、室温で吸収させた。
【０１７０】
メンブランを、吸収させた抗血清とともに室温で一夜、または1/5000に希釈した抗T7タグコンジュゲートとともに室温で1時間、インキュベートした。TTBSで3 x 10分間洗浄した後、TTBS中の5%スキムミルクで1/5000に希釈したHRPコンジュゲート抗ウサギ（Silenus）、抗マウス（Silenus）または抗ヒト（KPL）抗体を1時間室温で加えた。メンブランを先のように洗浄した後、免疫反応性タンパク質検出のためのTMBメンブランペルオキシダーゼ基質（KPL）を添加した。組換えP.gingivalisタンパク質の反応性の結果を表７に示す。
【０１７１】
さらに、P.gingivalis組換えタンパク質で免疫感作した（チャレンジ前の）マウスからの複数の血清（1/1000に希釈したプールの血清）を、全天然のW50 P.gingivalisタンパク質のウェスタンブロットに対する反応性について、上に概説したのと同様な技術を使って分析した。PG2、PG8A、PG29およびPG3は全て、天然のW50ブロットの組換えPGタンパク質の分子量と類似の分子量のバンドを示した。これは、PGタンパク質がW50株で発現し、組換えタンパク質が天然タンパク質と少なくともいくらか同一の免疫原性を有することを示す。
【０１７２】
mRNA分析
熱フェノールRNA抽出
P.gingivalis W50細胞（150ml培養物）を嫌気的に中間対数期（OD A600=0.18）まで増殖させ、50%グリセロールと混合し、RNA抽出まで-70℃で貯蔵した。細胞を6000gで遠心分離してペレット化し、8ml ASE(20mM NaOAc, 0.5% SDS, 1mM EDTA)中に再懸濁した。等容積の20mM NaOAc(pH 4.5)飽和フェノールを加え、30秒間振とうして混合し、65℃で5分間インキュベートし、さらに5秒間振とうし、インキュベーションを繰り返した。冷却後、2mlクロロホルムを加え、5秒間振とうして混合し、該混合物を10000gで10分間4℃で回転させた。上部水相を移し、フェノールおよびクロロホルム工程を繰返して再抽出した。該水相を再び移し、100U RNase阻害剤（RNAsin；Promega）を加えた。RNAを、3容積の100%エタノールを用いて、-20℃で一夜沈降させた。RNA沈降物を、10000gで4℃で15分間、遠心分離して回収し、その後、100%エタノールで洗浄し、乾燥し、そして、600μlの無菌、脱イオンdH2O中に1μlの新しいRNase阻害剤と共に再懸濁した。RNAのアリコートをとり、-70℃で貯蔵した。RNA濃度を分光光度法により定量した。ホルムアルデヒドRNAゲルによりRNA純度を確かめた（Sambrook J.ら, 1989, Molecular Cloning. A laboratory manual（分子クローニング  実験室マニュアル）. Cold Spring Laboratory Press, New York,第2版）。
【０１７３】
RT-PCR
単離したRNAを逆転写（RT）用鋳型として使い、cDNAを作った。各RNA転写物が様々なレベルで存在しうるように、RTに使うRNA濃度を変化させた。続いてcDNAの増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使って実施した。RT-PCRは、次のPCR条件を除いて、製造業者のプロトコルに従いGeneAmp（登録商標）RNA PCRキット（Perkin Elmer）を使って実施した；次のPCR条件で35サイクルを実施した：融解期（melt phase）は95℃で30秒、アニール期（anneal phase）は50-60℃の間で変化させて30秒、伸長期（extension phase）は72℃で1分間。増幅は、PTC-100プログラマブルサーマルコントローラー（MJ Research Inc.）中で実施した。増幅産物が汚染DNAから生じなかったことを実証するための対照として、平行チューブはリバーストランスクリプターゼ（RTase）を省略した。該PCR産物を、エチジウムブロマイドで染色した1%アガロースゲル上でDNAマーカー（GIBCO 1kB ラダー）に対して試験した。
【０１７４】
以下の変更を除くと、先に記載の「組換えP.gingivalis遺伝子のクローニング、発現および精製（Cloning,expression and purification of recombinant P.gingivalis genes）」の節で使ったオリゴヌクレオチドプライマーを使って実施したRT-PCR結果を表６に示す。PG1に対して使った3'リバースプライマーは、GCGCCTCGAGATTCATTTCCTTATAGAGであり、PG4に対する5'フォワードプライマーはCTTCTTGTCGACTACAGCGGACATCATAAAATCでありかつ3'リバースプライマーはTTCCACCTCGAGTTAACGCAACTCTTCTTCGATであり、PG6に対する5'フォワードプライマーはTAAAGAATTCTGCCTCGAACCCATAATTGCTCCGであり、PG10に対する5'フォワードプライマーはCGCGCATATGGATAAAGTGAGCTATGCでありかつ3'リバースプライマーはCGCGCTCGAGTTTGTTGATACTCAATAATTCであり、PG13に対する5'フォワードプライマーはGCCCGGCGCCATGCGGACAAAAACTATCTTTTTTGCGでありかつ3'リバースプライマーはGCCCGGCGCCTTAGTTGTTGAATCGAATCGCTATTTGAGCであった。P.gingivalis転写物の増幅は、特定の候補に対するRNAが存在しそのタンパク質が産生される見込みのあることを示している。しかし、増幅が達成されない場合、この遺伝子が決して転写されないことを示すのでなく、培養条件または収穫時の細胞の状態の結果でありうる。
【表６】
0005349070.tif 000028
【０１７５】
【表７】
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0005349070.tif 000030
0005349070.tif 000031
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【０１７６】
当業者であれば、広く記載した本発明の精神または範囲から外れることなく、特定の実施様態で示したように多数の変更および／または改変を本発明に行いうることが理解されよう。それ故に、本発明の実施様態は、全ての点で、説明として考えられるべきであり、限定として考えられるべきでない。
【０１７７】
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【図１】
0005349070.tif 000033
【図２】
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【配列表】
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