(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン制御腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号３、４、又は１０を含む、ホルモン制御癌の治療のための組成物；
但し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの全長はヒトＩＧＦＢＰ−５をコードする遺伝子と相補的であることを条件とする。
【請求項２】
ホルモン制御腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号３、４、又は１０を含む、ホルモン制御癌の治療のための組成物であって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３０ヌクレオチドまでの長さを有する、上記組成物。
【請求項３】
腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドでホルモン制御癌を治療することにより、ホルモン制御腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性状態への進行を遅らせるための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍細胞は前立腺癌細胞である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍細胞は乳癌細胞である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ホルモン応答性癌に罹った個体中のホルモン応答性癌を治療するための請求項１又は２に記載の医薬組成物であって、ホルモン離脱を開始してホルモン応答性癌細胞のアポトーシス性細胞死を誘導した後に医薬組成物を個体に投与し、こうして個体のホルモン応答性癌細胞のホルモン非依存性状態への進行を遅らせる、上記医薬組成物。
【請求項７】
ホルモン応答性腫瘍は、前立腺癌である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ホルモン応答性癌細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するのに有効な量で哺乳動物に組成物を投与し、こうして哺乳動物のＩＧＦ−１感受性腫瘍の転移性骨性進行を阻害または遅らせることにより、腫瘍の転移性骨性進行を阻害または遅らせるための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＩＧＦ−１感受性腫瘍は前立腺癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９９年７月１９日に出願された米国仮出願第６０／１４４，４９５号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本出願は、インスリン様増殖因子結合タンパク（ＩＧＦＢＰ）−５に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、ホルモン制御腫瘍（例えば、乳癌および前立腺癌）の治療に関する。
【０００３】
前立腺癌は、男性が罹る最も一般的な癌であり、西洋の男性の癌の死亡の第２の死因である。前立腺癌は、アンドロゲン感受性腫瘍であるため、進行性の前立腺癌の患者の一部の治療に、アンドロゲン離脱（例えば、精巣除去による）が使用される。アンドロゲン離脱が前立腺癌の広範なアポトーシスを引き起こし、従って癌が退縮する。しかし、精巣除去に誘導されるアポトーシスは完全ではなく、生き残った腫瘍細胞が成長して最終的にアンドロゲン非依存性（androgen indepedence）となる。この進行は、生存率とクオリティオブライフの改善に対する大きな障害であり、従ってアンドロゲン非依存性細胞を標的とする試みが行われている。これらの試みは、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞を標的とする非ホルモン療法を中心としてきたが、これまでのところ、非ホルモン剤により生存率が改善したことはない。オー（Oh）ら、J. Urol 160:1220-1229 (1998)。従って別のアプローチが必要である。
【０００４】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１とＩＧＦ−IIは、多くの正常細胞および悪性細胞にとって強力な分裂促進因子である。蓄積している証拠は、前立腺疾患や乳癌の病態生理においてＩＧＦが重要な役割を果たすことを示唆している。ボウドン（Boudon）ら、J. CLin. Endocrin. Metab. 81:612-617 (1996)；アンゲロズ−ニコウド（Angelloz-Nicoud）ら、Endocrinology 136:5485-5492 (1995)；ニッカーソン（Nickerson）ら、Endocrinology 139:807-810 (1998)；フィグエロア（Figueroa）ら、J. Urol. 159:1379-1383 (1998)。
【０００５】
ＩＧＦに対する生物学的応答は、ＩＧＦＢＰを含む種々の因子により制御される。今日まで、６つのＩＧＦＢＰが同定されており、その機能は、高親和性相互作用を介するＩＧＦの生物学的作用の調節を含むと考えられる。ラジャラム（Rajaram）ら、Endocrin. Rev. 18:801-813 (1997)。しかし、一部の証拠は、ＩＧＦに依存しないＩＧＦＢＰの生物活性を示唆している、同上、アンドレス（Andress）ら、J. Biol. Chem. 267:22467-22472 (1992)；オー（Oh）ら、J. Biol. Chem. 268:14964-14971 (1993)、および細胞増殖に対するＩＧＦＢＰの刺激と阻害の両方の作用が、種々の実験条件下で報告されている。アンドレス（Andress）ら、前出；エルギン（Elgin）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3254-3258 (1987)；フイン（Huynh）ら、J. Biol. Chem. 271:1016-1021 (1996)；ダモン（Damon）ら、Endocrinology 139:3456-3464 (1998)。すなわち、ＩＧＦＢＰの正確な機能的役割は、まだ議論の余地がある。このため、報告された結果は、前立腺癌や乳癌へのＩＧＦの関与を示すが、この関与に基づく治療的アプローチを明確には示唆しない。
【０００６】
本発明は、前立腺癌および乳癌の治療として、ＩＧＦＢＰ−５を標的とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を利用する。アンチセンスＯＤＮは、標的遺伝子のｍＲＮＡ領域に相補的な１本鎖ＤＮＡの化学的に修飾された一つながりであり、従ってＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖を形成することにより遺伝子発現を有効に阻害する。フィグエロア（Figueroa）ら、J. Urol. 159:1379-1383 (1998)。ホスホロチオエートＯＤＮは安定化されて、ＤＮＡの隣接するホスホリル酸素の１つをイオウで置換することにより、ヌクレアーゼ消化に抵抗する。最近、新生物進行に関与する遺伝子を特異的に標的とするいくつかのアンチセンスＯＤＮが、インビトロとインビボで評価されて、治療薬候補としてのアンチセンス法の有効性が証明された。モニア（Monia）ら、Nature Med. 2:668-675 (1996)；クッコ（Cucco）ら、Cancer Res. 56:4332-4337 (1996)；ジーグラー（Ziegler）ら、J. Natl. Cancr Inst. 89:1027-1036 (1997)；ジャンセン（Jansen）ら、Nature Med. 4:232-234 (1998)。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、ＩＧＦＢＰ−５をコードする遺伝子に一部に相補的なアンチセンスＯＤＮの投与により、ヒトを含む哺乳動物のホルモン制御腫瘍（例えば、乳癌および前立腺癌）を治療する方法に関する。シオノギ（Shionogi）腫瘍モデルをインビトロとインビボで使用して、そのようなＯＤＮを投与すると、腫瘍細胞の増殖が減少し、アンドロゲン非依存性への進行を遅らすことができることが証明された。すなわち、本発明において我々は、ヒトを含む哺乳動物の前立腺癌の治療法、およびアンドロゲン非依存性への前立腺癌の進行を遅らせる方法であって、ＩＧＦＢＰ−５をコードする核酸配列の一部に相補的であり、そのような配列とハイブリダイズしてＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害する、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの治療上有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、上記方法を提供する。本方法での使用に適した特異的アンチセンスＯＤＮは、マウス遺伝子配列から得られるＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴ（配列番号１）、およびヒト遺伝子配列から得られるＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴ（配列番号３）とＡＧＧＴＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣ（配列番号４）である。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ホルモン制御（前立腺癌または乳癌）腫瘍細胞のホルモン（例えば、アンドロゲンまたはエストロゲン）非依存性への進行を遅らせる方法、ホルモン制御腫瘍（例えば、乳癌または前立腺癌）に罹った個体（ヒトを含む）の治療法、およびそのような方法での使用に有効な治療薬を提供する。さらに、本発明の組成物は、前立腺癌、乳癌、および骨の他のＩＧＦ−１感受性腫瘍の増殖と転移性進行を阻害するかまたは遅らせるために使用することができる。本発明の治療法は、進行した乳癌または前立腺癌を有する個体の治療に最も一般的に使用される。
【０００９】
本発明の第１の態様において、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞のアンドロゲン非依存性への進行は、細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害することにより遅らせることができる。シオノギ腫瘍モデル中でインビトロおよびインビボで実験を行った。シオノギ腫瘍モデルは、雄の同系の皮下で増殖するアンドロゲン依存性マウス乳癌の異種移植片である。シオノギ腫瘍細胞は、発癌性が高く局所的侵襲性である。この細胞は、前立腺癌細胞の観察された挙動を模倣する方法でアンドロゲン離脱に応答することが証明されており、ヒトの前立腺癌の効果的なモデルとして受け入れられている。（ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Cancer Res. 50:2275-2281 (1990)；レニー（Rennie）ら、Cancer Res. 48:6309-6312 （1988)；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Cell 13:272-280 (1978)；グリーヴ（Gleave）ら、Genitourinary Oncology、pp. 367-378、ランゲ（Lange）ら編、Lippencott (1997)；グリーヴ（Gleave）ら、J. Urol. 157:1727-1730 (1997)；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、The Prostate 6:13-21 (1996)。すなわち、アンドロゲン離脱は、非常に再現性高くアポトーシスと腫瘍退縮を促進する。さらに精巣除去後およびアンドロゲン非依存性への進行中のヒトの前立腺癌でのペプチド（例えば、ＴＲＰＭ−２およびＢｃｌ−２）の発現の変化は、シオノギ腫瘍細胞で観察されたものと似ている。これらの類似性のために、シオノギ腫瘍モデルは、ヒト前立腺癌を模倣し、アンドロゲン非依存性の開始を遅らせる化合物の能力の評価のための非常に有用なモデルを提供する。精巣除去後の腫瘍の完全な退縮にもかかわらず、１ヶ月後に必ず急速に増殖するアンドロゲン非依存性シオノギ腫瘍が再発し、これはアンドロゲン非依存性への進行を遅らせることができる物質を評価するための信頼できる終点となる。
【００１０】
本発明に至る研究において我々はまず、精巣除去後およびＡＩ進行中のシオノギ腫瘍モデル中のＩＧＦＢＰの変化を性状解析した。精巣除去前のＡＤ完全な腫瘍、精巣除去の４日および７日後の退縮腫瘍、および精巣除去の２８日後のＡＩ再発腫瘍中の、ＩＧＦＢＰ ｍＲＮＡ発現の変化を解析するために、ノーザンブロット解析を使用した。ＩＧＦＢＰ−２、−３、−４、および−５のｍＲＮＡ発現の変化の種々のパターンが観察された。ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−６  ｍＲＮＡは、シオノギ腫瘍モデル中では検出できない。シオノギ腫瘍中で発現されるＩＧＦＢＰのうちで、発現の最も大きな変化はＩＧＦＢＰ−５で観察された。ＡＤ完全腫瘍中では検出できないレベルであるにもかかわらず、ＩＧＦＢＰ−５発現は、精巣除去後には高度にアップレギュレートされ、ＡＩ腫瘍中で高度に発現されたままである。ＡＩ進行中のシオノギ腫瘍モデル中のＩＧＦＢＰ−５アップレギュレーションのパターンは、ラット前立腺（アンゲロズ−ニコウド（Angelloz-Nicoud）、前出）およびヒト前立腺癌（フィグエロア（Figueroa）、前出）中のパターンに似ており、従ってアンドロゲン非依存性への進行に及ぼすアジュバントアンチセンスＩＧＦＢＰ−５療法の作用を評価するためのこのモデルの使用を支持する。
【００１１】
このアップレギュレーションの機能的意義を調べるために、我々は、シオノギ腫瘍モデルを使用してインビトロとインビボの両方で、ＩＧＦ−１介在細胞増殖に及ぼすアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用を試験した。これらの試験は、マウスＩＧＦＢＰ−５遺伝子に対するアンチセンスＯＤＮを使用して行った。これらの実験は、マウスＩＧＦＢＰ−５翻訳開始部位に対応するホスホロチオエートアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮが、用量依存性にＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの発現を阻害することを証明した。２塩基ＩＧＦＢＰ−５ミスマッチＯＤＮを使用して配列特異性を確認したが、これは、シオノギ腫瘍細胞中のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡ発現には何の作用も及ぼさなかった。さらに我々は、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮは、標的特異的にＩＧＦＢＰ−５発現を低下させることを証明した。すなわち、他のｍＲＮＡ（ＩＧＦＢＰ−２、−３および−４）の発現は、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理に影響されなかった。
【００１２】
アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮは、シオノギ腫瘍細胞中で時間および用量依存的に、細胞増殖を阻害し細胞サイクル停止を誘導する。アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理は、インビトロまたはインビボでもアポトーシスを誘導しないようであり、これは、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ活性は、アポトーシスの誘導ではなく細胞増殖の阻害を介して起きることを示唆する。さらにアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの増殖阻害作用は、外因性ＩＧＦ−１により逆転させることができ、ＩＧＦ−１活性を抗ＩＧＦ−１抗体で中和すると、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理は、細胞増殖のさらなる阻害を引き起こさないことが観察された。我々はまた、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮがＭＡＰＫ活性を阻害すること、この阻害はまた、外因性ＩＧＦ−１により逆転することができたこと、およびＩＧＦ−１を抗ＩＧＦ−１抗体で中和すると、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮは、ＭＡＰＫ活性に独立の阻害作用を及ぼさないことも、見いだした。これらの知見はまとめて、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮは、少なくとも一部は、ＭＡＰＫの不活性化を含むＩＧＦ−１依存性機序を介して細胞増殖を阻害することを証明している。
【００１３】
このインビトロデータに基づいて我々は、アンチセンス方策を使用してアンドロゲンにより促進されるＩＧＦＢＰ−５アップレギュレーションをターゲティングすると、アンドロゲン非依存性への進行が阻害されるという仮説を立てた。我々のインビボ実験では、精巣除去後のアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの投与は、ＡＩ進行への時間を遅らせ、ＡＩ再発性の腫瘍増殖を阻害した。我々のインビトロ処理に一致して、シオノギ腫瘍を有するマウスをアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮで処理するとまた、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡ発現を阻害した。これらの知見は、ＯＤＮのインビボの全身性投与が、腫瘍細胞中の標的遺伝子の配列特異的ダウンレギュレーションを引き起こすことを示す。
【００１４】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）結合タンパク質−５（ＩＧＦＢＰ−５）は、アンドロゲン離脱後に正常および悪性前立腺腫瘍中で高度に  アップレギュレートされているが、精巣除去誘導性アポトーシスとアンドロゲン非依存性進行におけるその機能的役割はまだ不明である。ＩＧＦ−１介在有糸分裂誘発とアンドロゲン非依存性への進行中のＩＧＦＢＰ−５の過剰発現の機能的意義を解析するために、安定なトランスフェクションによりＩＧＦＢＰ−５を過剰発現しているヒトアンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を作成した。ＩＧＦＢＰ−５トランスフェクションＬＮＣａＰ細胞の増殖速度は、ジヒドロテストステロンの存在下および非存在下の両方で、親のまたはベクターのみでトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞と比較して、有意に速かった。ＬＮＣａＰ細胞増殖のＩＧＦＢＰ−５誘導性上昇は、ＩＧＦ−１依存性およびＩＧＦ−１非依存性経路を介して起き、サイクリン（cyclin）Ｄ１  ｍＲＮＡ発現と細胞サイクルのＳ＋Ｇ２／Ｍ期中の細胞の画分との対応する上昇が起きる。ＬＮＣａＰ亜系中のＡｋｔ／タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）（ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の下流成分）の変化は、その増殖速度の変化とも対応した。ＰＩ３Ｋインヒビターによる処理は、対照とＩＧＦＢＰ−５を過剰発現しているＬＮＣａＰ細胞の両方でアポトーシスを誘導したが、このＰＩ３Ｋインヒビター誘導性アポトーシスは、ＩＧＦＢＰ−５トランスフェクタント中でのみ外因性ＩＧＦ−１処理により防止され、ＩＧＦＢＰ−５過剰発現は、ＩＧＦ−１の抗アポトーシス作用を強化することができることを示唆している。さらに、精巣除去後のＩＧＦＢＰ−５トランスフェクトＬＮＣａＰ腫瘍を有するマウス中では、精巣除去前の完全なマウス中で増殖させた時、対照と同様の腫瘍発生頻度と腫瘍増殖速度を有するにもかかわらず、腫瘍増殖と血清ＰＳＡレベルは数倍上昇した。まとめるとこれらのデータは、精巣除去後の前立腺癌細胞中のＩＧＦＢＰ−５過剰発現が、ＩＧＦ−１の抗アポトーシス作用および有糸分裂誘発作用の強化を助ける適応性細胞生存機序であり、こうしてＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路の活性化を介して、アンドロゲン非依存性への進行を加速することを示唆している。
【００１５】
ＡＩ進行を遅らせる合理的な方策は、分子的機序に基づくべきであり、確立されたホルモン抵抗性疾患の患者を治療する従来のアプローチより、アンドロゲン離脱により促進される遺伝子発現の適応的変化を標的とするであろう。進行の生物学的機序と遺伝子発現の精巣除去誘導性変化に基づいた、併用療法の組み込みと適切なタイミングは、ＡＩ進行を阻害する主要な手段を提供するかも知れない。本研究は、ＡＩ進行におけるＩＧＦＢＰ−５の機能的役割と、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを使用してＩＧＦＢＰ−５遺伝子発現の低下させると、ＡＩ腫瘍の再発と増殖を遅らせることを支持する直接の証拠を提供する。
【００１６】
本発明の治療は個々に使用することができる。しかしアンチセンスＯＤＮを他の治療法と一緒に使用して、アンドロゲン離脱を起こすことが好ましい。すなわち本発明のさらなる面において、前立腺癌に罹っている個体（ヒト個体を含む）の治療法は、アンドロゲン離脱を開始して個体の前立腺癌細胞のアポトーシス性細胞死滅を誘導し、腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与し、こうして個体のアンドロゲン非依存性状態への前立腺癌細胞の進行を遅らせることにより、行われる。骨でのＩＧＦＢＰ−５の発現の観点から、ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−５介在腫瘍細胞増殖はまた、骨でのＩＧＦ−１感受性代謝性腫瘍細胞の増殖を促進するのに重要な役割を果たすかも知れない。この増殖は、本発明のアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを使用することにより防止することができ、こうして転移性疾患の進行を阻害または遅らせることができる。
【００１７】
アンドロゲン離脱の開始は、外科的（両方の睾丸の除去）または内科的（テストステロンの薬剤誘導性抑制）精巣除去により行われ、これは現在前立腺癌の治療に必要とされている。内科的精巣除去は、種々の方法（ＬＨＲＨ剤と抗アンドロゲンを含む）で実施することができる。グリーブ（Gleave）ら、CMAJ 160:225-232 (1999)。可逆的アンドロゲン離脱が行われる間歇治療法は、グリーブ（Gleave）ら、Eur. Urol. 34、増刊３：37-41 91998に記載されている。乳癌の場合のホルモン離脱は、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）を用いる薬物療法により行うことができる。
【００１８】
ＩＧＦＢＰ−５発現の阻害は一過性でもよく、アンドロゲン離脱後に起きるべきである。ヒトでは、これは、発現の阻害は、アンドロゲン離脱の開始後数週間以内に開始し約３〜６ヶ月続くことが有効であることを意味する。これを行うには、数回の投与が必要である。しかしこの期間はより長いこと、すなわち精巣除去前に開始し、本発明の範囲から逸脱することなく、以後かなりの期間続くことが、理解されるであろう。
【００１９】
上記および下記例の試験で使用されるＯＤＮ（配列番号１）は、翻訳開始部位とのマウスＩＧＦＢＰ−５遺伝子重複の部分に相補的である。他のＯＤＮ種も使用され、翻訳開始部位と重複する少し長いかまたは少し短いＯＤＮ種（例えば、１５〜３０ｎｔの範囲）、および翻訳停止部位と重複するＯＤＮ種がある。中間的なＯＤＮもまた有効であり、例に記載の発現測定法を使用してＩＧＦＢＰ−５阻害の充分なレベルを提供する能力についてスクリーニングすることができる。これらの他のタンパク質の発現阻害は、好ましくない副作用を引き起こすことがあるため、使用するアンチセンスＯＤＮの選択において、他のＩＧＦＢＰとの実質的な相補性を避けることが好ましい。そこからそのようなＯＤＮが得られるマウスＩＧＦＢＰ−５の核酸配列を、配列番号１３に示す。
【００２０】
他の哺乳動物（ヒトを含む）に本発明を適用するために、治療的アンチセンスＯＤＮは、標的種のＩＧＦＢＰ−５遺伝子中の対応する位置から得られる。例えばヒトの場合、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子の配列は、ヒトについてキーファー（Kiefer）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 17:219 (1991)、受け入れ番号M65062、およびマウスについてジェームズ（James）ら、J. Biol. Chem. 258:22305 (1993)、受け入れ番号L12447からわかる。図１０は、ヒトのＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害する能力について試験したいくつかのアンチセンスＯＤＮの位置は、配列番号３に示す配列を有することを示す。このＯＤＮは、ヒトＩＧＦＢＰ−５の翻訳開始部位と重複する。マウスモデルの場合のように、他のヒトの治療用アンチセンスＯＤＮが使用でき、翻訳開始部位と重複するかまたはその近傍の少し長いかまたは少し短いＯＤＮ種（例えば、１５〜３０ｎｔの範囲）（例えば配列番号４）、および翻訳停止部位と重複するＯＤＮ種（例えば、配列番号１０）がある。中間的なＯＤＮもまた有効であり、例に記載の発現測定法を使用してＩＧＦＢＰ−５阻害の充分なレベルを提供する能力についてスクリーニングすることができる。これらの他のタンパク質の発現阻害は、好ましくない副作用を引き起こすことがあるため、使用するアンチセンスＯＤＮの選択において、他のＩＧＦＢＰとの実質的な相補性を避けることが好ましい。そこから他のアンチセンスＯＤＮが得られるヒトＩＧＦＢＰ−５の完全な配列を、配列番号１４に示す。配列番号１５〜６６は、ヒトＩＧＦＢＰ−５の配列から設計される追加のアンチセンスＯＤＮ配列のリストである。
【００２１】
使用されるＯＤＮを修飾して、インビボのＯＤＮの安定性を上昇させてもよい。例えばＯＤＮは、ヌクレアーゼ消化に対して耐性の上昇したホスホロチオエート誘導体（非結合性ホスホリル酸素原子をイオウ原子で置換）として使用してもよい。２−メトキシエチル置換骨格を有する分子を使用して、ＯＤＮ安定性の上昇を達成することができる。
【００２２】
アンチセンスＯＤＮの投与は、当該分野で公知の種々の機序（そのまま投与および薬剤学的に許容される担体中で投与を含む）を使用して投与することができる。例えば、アンチセンス送達用の液体担体は、米国特許第５，８５５，９１１号と５，４１７，９７８号（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。一般にアンチセンスは、静脈内、腹腔内、皮下または経口経路により投与される。
【００２３】
投与されるアンチセンスＯＤＮの量は、乳癌または前立腺細胞中のＩＧＦＢＰ−５の発現を阻害するのに有効なものである。この量は、使用されるアンチセンスＯＤＮの効力、および使用される担体の性質により変動することは理解されるであろう。ある特定の組成物についての適切な量の決定は、当該分野の技術の範囲内であり、適切な治療レベルを評価するために設計される標準的シリーズの試験により行われる。
【００２４】
本発明の前立腺癌または乳癌の治療法は、化学療法剤および／または異なる標的に対する追加のアンチセンスＯＤＮの投与をさらに含む。例えばタキソール（パクリタキセルまたはドシタキセル）やミトキサントロン（mitoxanthrone）のような従来の化学療法剤が使用される。同様にアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮと他のアンチセンス種（例えば、Ｂｃｌ−２  ＯＤＮまたはＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ）との組合せを使用してもよい。
【００２５】
本発明を、以下の非限定例を参照してさらに説明する。
【００２６】
例１
移植可能なＳＣ−１１５  ＡＤマウス乳癌のトロント（Toronto）亜株からの細胞を使用し、５％熱不活性化胎児牛血清を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.）、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）で維持して、シオノギ腫瘍モデル実験を行った。インビボ試験のために約５×１０6細胞のシオノギ腫瘍を、成体の雄ＤＤ／Ｓ株マウスに皮下注射した。シオノギ腫瘍の直径が１〜２cmになった時（通常、注射の２〜３週間後）、メトキシフラン麻酔下で腹部切開により精巣除去を行った。マウス、腫瘍ストックおよび手術法の詳細は、既に記載されている。ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Cancer Res. 5)；2275-2282 (1990)；レニー（Rennie）ら、Cancer Res. 48:6309-6312 (1988)；ブルチョフスキー（Bruchovsky）ら、Cell 13:272-280 (1978)。
【００２７】
マウスホスホロチオエートアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（配列番号１）、またはアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮからの配列とは塩基が２つ異なる配列ＧＡＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴ（配列番号１２）を有するミスマッチ対照を用いる処理について、マウスをランダムに選択した。各実験群は、８匹のマウスから構成された。精巣除去の日から開始して、１５mg/kgのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５またはミスマッチ対照ＯＤＮを、腹腔内に１日１回、５０日間各マウスに注射した。毎週２回腫瘍の体積を測定し、式（長さ×幅×奥行き×０．５２３６）により計算した。グリーヴ（Gleave）、Cancer Res. 52:1598-1605 (1992)。データ点は、平均腫瘍体積±標準偏差として報告した。
【００２８】
試験の結果を図１に示す。アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理は、ミスマッチ対照ＯＤＮ処理と比較して、ＡＩ腫瘍の再発を遅らせた。精巣除去後６０日間の観察期間中に両方の群のすべてのマウスでＡＩ腫瘍が再発したが、最初の触知可能なＡＩ再発までの時間中央値は、ミスマッチ対照ＯＤＮに比較してアンチセンスＩＧＦＢＰ−５で処理したマウスで２８日から３５日まで２５％上昇した。腫瘍の大きさが３cm3または体重の１０％を超えた時は、マウスを屠殺する必要があった。再発性ＡＩ腫瘍の増殖は、ミスマッチ対照ＯＤＮ群に比較してアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理群で実質的に阻害された。マウスの屠殺までの時間は、ＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理群では実質的に延長し、ミスマッチＯＤＮ群では中央値５３日間後に、すべてのマウスで屠殺が必要であったが、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理群の８匹のマウス中１匹のみ６０日後（ｐ＜０．０５）に屠殺が必要であった。
【００２９】
例２
ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡのレベルに及ぼすインビボのＯＤＮ処理の作用を調べるために、マウスのシオノギ腫瘍組織についてノーザンブロット解析を行った。精巣除去の日から開始して、１５mg/kgのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（ｎ＝３)またはミスマッチ対照（ｎ＝３）で腹腔内注射により、マウスを毎日処理した。精巣除去後４日目に、腫瘍組織を採取し、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡについてノーザンブロットで解析した。ミスマッチ対照ＯＤＮ処理腫瘍と比較してシオノギ腫瘍中のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮにより６１％低下した（図２）。
【００３０】
例３
アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（配列番号１）の配列選択性を、種々のレベルのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（配列番号１）またはミスマッチ対照（配列番号１２）で処理後に、インビトロで維持したシオノギ腫瘍細胞中のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの発現レベルを比較して確認した。細胞へのＯＤＮの取り込みを促進するために、陽イオン性脂質担体（リポフェクチン（登録商標）（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.））中でＯＤＮを調製した。以下のプロトコールを使用して、２日間にわたって細胞を２回処理した。細胞を、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.））中の４μg/mlのリポフェクチンで２０分間プレインキュベートし、次に選択された濃度のＯＤＮとリポフェクチンを含有する培地で４時間インキュベートした。次に培地を、例１に示した標準的培養培地と交換した。
【００３１】
細胞中のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット解析を使用して評価した。図３に示すように、５０、１００、５００または１０００nMのレベルのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（配列番号１）でシオノギ細胞を毎日処理すると、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡレベルが用量依存的に、それぞれ０、７、５４または８３％低下した。これに対して、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡレベルは、使用したどの濃度のミスマッチＯＤＮ（配列番号３）にも影響を受けなかった。すなわち、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用は、明らか配列特異的であった。
【００３２】
アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの特異性をさらに解析するために、シオノギ腫瘍細胞を１μＭのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ（配列番号１）で処理後にノーザンブロッティングを行い、ＩＧＦＢＰ−５と大きな配列相同性を有する他のＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−２、−３および−４）遺伝子の発現の変化を定量した。アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮは、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡ発現を顕著に低下させたが、ＩＧＦＢＰ−２、−３および−４発現レベルに対する作用は観察されなかった。これらのデータはまとめると、この試験で使用したＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮが、その標的遺伝子の配列特異的、遺伝子特異的、および用量依存的ダウンレギュレーションを誘導することを証明している。
【００３３】
例４
細胞増殖に及ぼすアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用を調べるために、我々は、１μＭのＩＧＦＢＰ−５またはミスマッチ対照ＯＤＮで１日１回、２日間シオノギ腫瘍細胞を処理し、７２時間にわたって細胞数を測定した。細胞のアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理は、７２時間にわたってシオノギ腫瘍細胞増殖を有意に阻害したが、細胞増殖は、ミスマッチ対照ＯＤＮを用いる処理により影響されなかった（図４）。
【００３４】
細胞増殖に及ぼすアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用はまた、１００〜１０００nMの濃度範囲にわたって用量依存的であった（図５）。これらの抗増殖作用は、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮによるシオノギ腫瘍細胞中のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの低下の程度と正相関した。これに対してミスマッチ対照ＯＤＮでは使用したいずれの濃度でも、細胞増殖に対する有意な作用は観察されなかった。
【００３５】
アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮが、アポトーシスの誘導を介して細胞死滅因子として作用した可能性を排除するために、アンチセンスまたはミスマッチＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理後の、生きた細胞および死滅細胞の数を計測した。各継代培養からの生きたおよび死んだシオノギ細胞を、ＯＤＮ処理後の４８時間目にトリパンブルーを使用して計測し、死滅細胞／総細胞の比を計算した。各測定は、三重測定で行った。アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理細胞の総細胞数に対する死滅細胞の観察された比は、ミスマッチ対照ＯＤＮ処理細胞（図６）の細胞数とはあまり異ならなかった。すなわち、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理後の細胞数の差は、増強されたアポトーシスの結果ではない。
【００３６】
例５
シオノギ腫瘍細胞増殖の制御におけるＩＧＦＢＰ−５とＩＧＦ−１の間の関係を解析するために、抗ＩＧＦ−１抗体および／または組換えＩＧＦ−１を用いてシオノギ腫瘍細胞増殖に及ぼすアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理の作用を評価した。最初の実験で、シオノギ腫瘍細胞の増殖に及ぼすアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ、抗ＩＧＦ−１抗体（アップステートバイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）、レークプラシッド、ニューヨーク州）、および／または組換えＩＧＦ−１（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）のインビトロ作用を、既に記載されている（ミヤケ（Miyake）ら、Oncogene 16:933-943 (1998)）ようにＭＴＴ測定法により評価した。簡単に説明すると、１×１０4細胞を、９６マイクロタイタープレートの各ウェルに接種し、一晩付着させた。次に細胞を、１日１回種々の濃度のＯＤＮで、５nMの組換えＩＧＦ−１または１０μg/mlの抗ＩＧＦ−１抗体を含有する培地中で２日間処理し、ＯＤＮ処理の４８時間後、ＰＢＳ中の５mg/mlのＭＴＴ（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））２０μｌを各ウェルに加え、次に３７℃で４時間インキュベートした。次にホルマザン結晶をジメチルスルホキシドに溶解した。マイクロカルチャープレートリーダー（ベクトンディッキンソンラボウェア（Becton Dickinson Labware）、リンカーンパーク（Lincoln Park）、ニュージャージー州）を用いて５４０nmで、光学密度を測定した。吸光度値を、ビヒクル処理細胞について得られた値に標準化して、生存パーセントを測定した。各測定は三重測定で行った。
【００３７】
図７に示すように、組換えＩＧＦ−１はシオノギ腫瘍細胞の増殖を上昇させ、抗ＩＧＦ−１中和抗体は、シオノギ細胞増殖を６０％阻害した。さらにアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮによる細胞増殖の阻害は、外因性組換えＩＧＦ−１処理により逆転した。ＩＧＦ−１中和抗体とともにアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを添加しても、抗ＩＧＦ−１中和抗体単独の阻害作用を増やすことはなかった。これらの知見はまとめると、細胞増殖に及ぼすＩＧＦＢＰ−５の増強作用およびＩＧＦ−１依存性作用を支持している。
【００３８】
ＭＡＰＫは、ＩＧＦ−１シグナル伝達の最も強力な経路の１つであるため、我々は、シオノギ腫瘍細胞中のＭＡＰＫ活性に及ぼす抗ＩＧＦ−１抗体および抗ＩＧＦ−１中和抗体の作用を測定した。有糸分裂誘発因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性は、ＭＡＰキナーゼアッセイキット（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー、マサチューセッツ州）を使用して測定した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液で溶解し、超音波処理し、４℃で２０分間微量遠心分離した。次に上清を、１：１００希釈した抗ホスホ−ＭＡＰＫ抗体で４時間インキュベートした。次にプロテインＡ−アガロースビーズを加え、さらに３時間インキュベートした。ペレットを、氷冷溶解緩衝液で２回洗浄し、キナーゼ緩衝液で２回洗浄した。ペレットを１００mMのＡＴＰと２０mg/mlのＥｌｋ１融合タンパク質（ＭＡＰＫの基質）で３０℃で３０分間インキュベートした。試料を沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。膜を、ブロッキング緩衝液中で室温で１時間インキュベートし、次に１：１０００希釈した抗ホスホ−Ｅｌｋ１抗体とプローブ結合させた。洗浄後、膜を１：１０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリンとインキュベートした。リン酸化Ｅｌｋ１の免疫反応性を、ＥＣＬ化学発光キットを使用して測定した。
【００３９】
ＭＡＰＫ活性の観察された変化は、これらの薬剤により誘導された細胞増殖の変化を反映した。すなわち、ＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮはＭＡＰＫ活性を低下させ、このＭＡＰＫ活性のアンチセンスＩＧＦＢＰ−５誘導性低下は、組換えＩＧＦ−１により逆転することができ、ＩＧＦ−１の有糸分裂誘発作用を抗ＩＧＦ−１抗体で中和すると、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５は、ＭＡＰＫ活性追加の阻害作用は及ぼさなかった。
【００４０】
例６
細胞サイクル制御におけるＩＧＦＢＰ−５発現レベルの変化の影響を調べるために、シオノギ腫瘍細胞でフローサイトメトリー解析を行った。ヨウ化プロピオジウム染色した核のフローサイトメトリー解析は、既に記載されているように（ミヤケ（Miyake）、前出）行った。簡単に説明すると、シオノギ腫瘍細胞を、５×１０6細胞の密度で６cmのプレートに入れ、前記したように処理した。ＯＤＮ処理の４８時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノールで４℃で５時間固定した。固定した細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１μg/mlのＲＮａｓｅＡ（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））で３７℃で１時間インキュベートし、ヨウ化プロピオジウム（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））で室温で１時間インキュベートした。染色した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎＴＭ（ベクトンディッキンソンラボウェア（Becton Dickinson Labware））で相対的ＤＮＡ含量について解析した。
【００４１】
図８に示すように、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ処理により誘導されたＩＧＦＢＰ−５レベルの低下は、Ｇ１細胞サイクルの停止を引き起こし、こうしてＳ＋Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合を、ミスマッチ対照ＯＤＮ処理と比較して５０％以上低下させた。
【００４２】
例７
ヒトの治療で使用するための適切なアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮ配列を同定するために、ヒトＩＧＦＢＰ−５遺伝子の１０個の異なる部位に対するアンチセンスＯＤＮ配列（図９、配列番号２〜１１）を合成し、インビトロの細胞培養中のヒト前立腺癌ＰＣ３細胞とＬＮＣａＰ／Ｔ１（ＩＧＦＢＰ−５を過剰発現するように安定にトランスフェクトさせたＬＮＣａＰ細胞）中のＩＧＦＢＰ−５遺伝子発現を低下させる能力について試験した。結果を図１０に要約する。図示したように、配列番号３、４および１０は、ＩＧＦＢＰ−５発現の低下について活性であり、配列番号３が最も強い活性を有する。これらの３つの配列は、翻訳開始部位または翻訳停止部位と重複するかまたはすぐ近傍にある。
【００４３】
例８
転移性の前立腺癌と乳癌は、しばしば骨組織に侵入する。このような転移の治療は非常に困難であり、骨への癌の進行は一般に、長期生存の予後が悪いことを示す。すなわち、この進行を阻害するかまたは遅らせる方法を有することが好ましいであろう。ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−５はＩＧＦ−１感受性癌（特に、前立腺癌と乳癌を含む）の増殖にとって重要な因子であるため、骨中の高レベルのＩＧＦＢＰ−５の存在は、転移病変の増殖と進行を促進する重要な機序となり得ると推定された。従って、転移性前立腺癌の患者から得られた原発性ヒト骨組織の試料についてウェスタン解析を行った。この実験は、骨中のＩＧＦＢＰ−５の高レベルの存在を確認した。本発明のアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを使用してこれらのレベルを阻害することは、骨での転移性病変の進行を阻害または遅らせるための有効な治療法を提供するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、外科的アンドロゲン離脱後の腫瘍細胞の再増殖の低下におけるアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用を示す。
【図２】  図２は、インビボでのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを用いる治療後のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの低下を示す。
【図３】  図３は、インビトロでのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを用いる治療後のＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡの低下の用量依存性を示す。
【図４】  図４は、時間の関数としてのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを用いる治療後に存在する細胞の数を示す。
【図５】  図５は、濃度の関数としてのアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮを用いる治療後に存在する細胞の数を示す。
【図６】  図６は、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮで処理した試料中の死滅細胞の比率を示す。
【図７】  図７は、ＩＧＦ−１と抗ＩＧＦ−１抗体に関連するアンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮの作用を示す。
【図８】  図８は、アンチセンスＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮで処理した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図９】  図９は、記載の１０個のアンチセンスＯＤＮの位置を有する、ヒトＩＧＦＢＰ−５のヌクレオチド配列の略図である。
【図１０】  図１０は、ＩＧＦＢＰ−５  ｍＲＮＡレベルに及ぼす図９に記載の１０個のアンチセンスＯＤＮのそれぞれの作用を示す。
【配列表】
0005121106.tif 000002
0005121106.tif 000003
0005121106.tif 000004
0005121106.tif 000005
0005121106.tif 000006
0005121106.tif 000007
0005121106.tif 000008
0005121106.tif 000009
0005121106.tif 000010
0005121106.tif 000011
0005121106.tif 000012
0005121106.tif 000013
0005121106.tif 000014
0005121106.tif 000015
0005121106.tif 000016
0005121106.tif 000017
0005121106.tif 000018
0005121106.tif 000019
【図１】
0005121106.tif 000020
【図２】
0005121106.tif 000021
【図３】
0005121106.tif 000022
【図４】
0005121106.tif 000023
【図５】
0005121106.tif 000024
【図６】
0005121106.tif 000025
【図７】
0005121106.tif 000026
【図８】
0005121106.tif 000027
【図９】
0005121106.tif 000028
【図１０】
0005121106.tif 000029