(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む単離されたｓｉＲＮＡであって、該センス及びアンチセンス鎖がＲＮＡ二本鎖を形成し、且つ該センス鎖が、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の隣接する１９〜２５ヌクレオチド標的配列と同じヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含む、当該単離されたｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを、ＶＥＧＦ121ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ＶＥＧＦ165ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；ＶＥＧＦ189ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＶＥＧＦ206ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）よりなる群から選択する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
センスＲＮＡ鎖が、一つのＲＮＡ分子を含み、且つアンチセンスＲＮＡ鎖が、一つのＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ＲＮＡ二本鎖を形成するセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖が、単一鎖のヘアピンにより共有結合されている、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡが、非ヌクレオチド物質を更に含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖が、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されている、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
センスＲＮＡ鎖が、第一の３’オーバーハングを含み且つアンチセンスＲＮＡ鎖が、第二の３’オーバーハングを含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
第一の３’オーバーハングが、２ヌクレオチドを含み且つ第二の３’オーバーハングが、２ヌクレオチドを含む、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
第一及び第二の３’オーバーハングを構成する２ヌクレオチドが、ジチミジル酸（ＴＴ）又はジウリジル酸（ｕｕ）である、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡを含む網膜色素上皮細胞。
【請求項１１】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を含む組換えプラスミドであって、該センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖が、ＲＮＡ二本鎖を形成し、且つセンスＲＮＡ鎖が、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の隣接する１９〜２５ヌクレオチドの標的配列と同じヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含む、当該組換えプラスミド。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列が、誘導性又は調節可能なプロモーターを含む、請求項１１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列が、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含み、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含む、請求項１１に記載の組換えプラスミド。
【請求項１４】
プラスミドが、ｐＡＡＶｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の組換えプラスミド。
【請求項１５】
センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列を含む組換えウイルスベクターであって、該センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖は、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の隣接する１９〜２５ヌクレオチドの標的配列と同じヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含む、上記の組換えウイルスベクター。
【請求項１６】
ｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列が、誘導性又は調節可能なプロモーターを含む、請求項１５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列が、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含み、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含む、請求項１５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１８】
組換えウイルスベクターを、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターよりなる群から選択する、請求項１５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１９】
組換えウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、又はモコラウイルスからの表面タンパク質によりシュードタイプ分けすることができる、請求項１５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２０】
組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項１８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡ及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物であって、該ｓｉＲＮＡが、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、該センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、そしてセンスＲＮＡ鎖が、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の隣接する１９〜２５ヌクレオチドの標的配列と同じヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含む、上記の医薬組成物。
【請求項２２】
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン又はリポソームを更に含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１１に記載のプラスミド又は生理的に許容されるその塩、及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物。
【請求項２４】
リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン又はリポソームを更に含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１５に記載のウイルスベクター及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物。
【請求項２６】
患者に投与して、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体の発現を阻止するために用いられる組成物であって、該組成物は、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む有効量のｓｉＲＮＡを含み、該センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の隣接する１９〜２５ヌクレオチドの標的配列と同じヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含み、それでヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体を分解することを特徴とする当該組成物。
【請求項２７】
患者が、ヒトである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体の発現が、患者の一方又は両方の眼において阻止される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体の発現が、患者の網膜色素上皮細胞において阻止される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
ｓｉＲＮＡの有効量が、１〜１００ｎＭである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
ｓｉＲＮＡを、送達用試薬と共に投与する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
送達用薬剤を、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン及びリポソームよりなる群から選択する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
送達用薬剤が、リポソームである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
リポソームが、該リポソームを血管形成部位又はその近くの細胞を標的とさせるリガンドを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
リガンドが、腫瘍細胞又は血管内皮細胞上のレセプターに結合する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
リガンドが、モノクローナル抗体を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
リポソームが、オプソニン作用阻害成分で改変されている、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
オプソニン作用阻害成分が、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はこれらの誘導体を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ｓｉＲＮＡが、組換えプラスミドから発現される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４０】
ｓｉＲＮＡが、組換えウイルスベクターから発現される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４１】
組換えウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はヘルペスウイルスベクターを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
組換えウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、又はモコラウイルスからの表面タンパク質によりシュードタイプ分けすることができる、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
ｓｉＲＮＡを、新血管新生の治療のために非経口投与経路により投与する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４５】
非経口投与経路を、血管内投与、組織周辺及び組織内投与、皮下注射又はデポジション、皮下点滴、眼内投与、及び新血管新生部位又はその近くへの直接適用よりなる群から選択する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
血管内投与を、静脈内ボーラス注射、静脈内点滴、動脈内ボーラス注射、動脈内点滴及び血管系へのカテーテル点滴注入法よりなる群から選択する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
組織周辺及び組織内注射が、腫瘍周辺への注射又は腫瘍内部への注射を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
眼内投与が、硝子体内、網膜内、網膜下、テント下、眼窩周囲及び眼窩後、経角膜又は経強膜投与を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
新血管新生部位又はその近くへの直接適用が、カテーテル、角膜ペレット、眼滴瓶、坐薬、多孔性物質を含むインプラント、非多孔性物質を含むインプラント、又はゼラチン状物質を含むインプラントによる適用、を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
新血管新生部位が、眼内にあり、新血管新生部位又はその近くへの直接適用が、眼内インプラントによる適用を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５１】
眼内インプラントが、生物分解性である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
患者における血管形成を阻止するために用いられる組成物であって、該組成物は、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡの有効量を含み、該センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトのＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の１９〜２５の隣接ヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含む当該組成物。
【請求項５３】
血管形成が、病原性である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
血管形成を、患者の一方又は両方の眼において阻止する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
血管形成を、患者の網膜色素上皮細胞において阻止する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
患者における血管形成性疾患を治療するために用いられる組成物であって、該組成物は、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む有効量のｓｉＲＮＡを含み、該センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、該センスＲＮＡ鎖は、ヒトのＶＥＧＦｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型若しくは変異体中の１９〜２５の隣接ヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、該センスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７の配列を含み、且つ該アンチセンスＲＮＡ鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８の配列を含み、それで、血管形成性疾患と関連する血管形成が阻止される当該組成物。
【請求項５７】
血管形成性疾患が、癌と関連する腫瘍を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
癌を、乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹部癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫及び血液癌よりなる群から選択する、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
血管形成性疾患を、糖尿病性網膜症、及び加齢関連黄斑変性よりなる群から選択する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６０】
血管形成性疾患が、加齢関連黄斑変性である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
ｓｉＲＮＡを、血管形成性疾患を治療するための医薬と共に投与し、該医薬が、ｓｉＲＮＡとは異なる、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６２】
血管形成性疾患が癌であり、医薬が化学療法剤を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
化学療法剤を、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン及びタモキシフェンよりなる群から選択する、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
ｓｉＲＮＡを、血管形成性疾患の治療のためにデザインされた他の治療法と組み合せて患者に投与する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６５】
血管形成性疾患が癌であり、ｓｉＲＮＡを、放射線療法、化学療法又は外科手術と組み合せて投与する、請求項６４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特に、血管形成を含む病気又は異常の治療のための、小型の干渉性ＲＮＡによる遺伝子発現の制御に関係する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成(新しい毛細血管の成長又は「新血管新生」として定義される)は、成長及び発生において、基礎的役割を演じる。成熟したヒトにおいて、血管形成を開始する能力は、すべての組織に存在するが、厳格な制御下に維持されている。血管形成の鍵となるレギュレーターは、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)(血管透過性因子(「ＶＰＦ」)とも呼ばれる)である。ＶＥＧＦは、ヒトにおいて、少なくとも４つの異なる選択的スプライス型(ＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ189及びＶＥＧＦ206)で存在する(これらすべては、類似の生物学的活性を発揮する)。
【０００３】
血管形成は、分泌されたＶＥＧＦがＦｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲレセプター(ＶＥＧＦレセプター１及びＶＥＧＦレセプター２とも呼ばれる)に結合した場合に開始され、これらは、内皮細胞の表面で発現されている。Ｆｔｌ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲは、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼであり、ＶＥＧＦの結合は、細胞シグナルカスケードを開始し、これは、周囲の組織における最終的な新血管新生を生じる。
【０００４】
異所的血管形成(又は、新血管の病的成長)は、多くの異常に関連している。これらの異常の内には、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出作用又は「湿型」加齢関連黄斑変性(「ＡＲＭＤ」)、リウマチ様関節炎及び他の炎症性疾患、並びに殆どの癌がある。これらの異常に関連する病気の組織又は腫瘍は、異常に高レベルのＶＥＧＦを発現し、且つ高度の新血管新生又は血管透過性を示す。
【０００５】
特にＡＲＭＤは、臨床的に重要な血管形成性疾患である。この異常は、加齢しつつある個人の一方又は両方の眼における脈絡膜新血管新生により特徴付けられ、工業国における失明の主要な原因である。
【０００６】
多くの治療の戦略は、異所的血管形成の阻止のためにあり、それらは、ＶＥＧＦの産生又は効果を減じることを意図している。例えば、抗ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦレセプター抗体(Kim ES等、(2002), PNAS USA 99: 11399-11404)及び可溶性ＶＥＧＦ「トラップ」(これらは、内皮細胞レセプターとＶＥＧＦ結合について競合する)(Holash J 等、(2002),PNAS USA 99:11393-11398)が開発されている。古典的なＶＥＧＦ「アンチセンス」又はアプタマー療法(ＶＥＧＦ遺伝子発現に向けられたもの)も又、提供されている(Uhlmann等の米国特許出願公開２００１／００２１７７２)。しかしながら、これらの療法で用いられた抗血管形成剤は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターの化学量論的減少を生じることができるだけであり、これらの剤は、典型的には、病気の組織によるＶＥＧＦの異常に高い産生によって圧倒される。それ故、利用可能な抗血管形成療法により達成された結果は、不満足なものであった。
【０００７】
ＲＮＡ干渉(以後「ＲＮＡｉ」)は、多くの真核生物で保存されている転写後遺伝子制御の方法である。ＲＮＡｉは、細胞中に存在する短い(即ち、３０ヌクレオチド未満)二本鎖ＲＮＡ(「ｄｓＲＮＡ」)分子によって誘導される(Fire A等、(1998), Nature 391:806-811)。これらの短いｄｓＲＮＡ分子(「短い干渉性ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる)は、１ヌクレオチド分離内でｓｉＲＮＡとの配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ(「ｍＲＮＡ」)の破壊を引き起こす(Elbashir SM等(2001), Genes Dev, 15:188-200)。ｓｉＲＮＡ及び標的のｍＲＮＡは、「ＲＮＡ誘導されたサイレンシング複合体」又は「ＲＩＳＣ」に結合し、これが標的ｍＲＮＡを開裂させると考えられている。このｓｉＲＮＡは、見かけ上、マルチプルターンオーバー酵素とよく似て、再利用され、一つのｓｉＲＮＡ分子が、約１０００のｍＲＮＡ分子の開裂を誘導することができる。それ故、ｓｉＲＮＡ媒介のｍＲＮＡのＲＮＡｉによる分解は、標的遺伝子の発現を阻止するための現在利用可能な技術より一層有効である。
【０００８】
Elbashir SM等(2001),(前出)は、２１及び２２ヌクレオチド長の合成ｓｉＲＮＡ(及び短い３’オーバーハングを有する)が、ショウジョウバエ細胞溶解物中の標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することができることを示している。培養哺乳動物細胞も又、合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ分解を示し(Elbashir SM等(2001)Nature, 411:494-498)、合成ｓｉＲＮＡにより誘導されるＲＮＡｉ分解が、最近、生きたマウスにおいて示された(McCaffrey AP等(2002), Nature, 418:38-39；Xia H等(2002), Nat.Biotech. 20:1006-1010)。ｓｉＲＮＡ誘導されたＲＮＡｉ分解の治療的潜在能力が、ｓｉＲＮＡに指図されたＨＩＶ−１感染の阻止(Novina CD等(2002), Nat.Med.8:681-686)及び神経毒性ポリグルタミン病タンパク質の発現の低下(Xia H等(2002), 前出)を含む幾つかの最近のイン・ビトロ研究において示された。
【０００９】
それ故、必要とされるものは、触媒的量又は化学量論的量より少量でＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターの発現を選択的に阻害する薬剤である。
【００１０】
発明の要約
本発明は、特異的に標的を定めて、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子からのｍＲＮＡの、ＲＮＡｉに誘導される分解を引き起こすｓｉＲＮＡに向けられている。この発明のｓｉＲＮＡ化合物及び組成物は、特に癌性腫瘍、加齢関連黄斑変性及び他の血管形成性疾患の治療のために、血管形成を阻止するために利用される。
【００１１】
従って、この発明は、ヒトのＶＥＧＦｍＲＮＡ、ヒトのＦｌｔ−１ｍＲＮＡ、ヒトのＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡ、又はこれらの選択的スプライス型、変異体若しくは同源体(cognate)を標的とする単離されたｓｉＲＮＡを提供する。このｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡを形成するセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。このセンスＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜２５の隣接ヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
この発明は又、この発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド及びウイルスベクター並びにこの発明のｓｉＲＮＡ及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物をも提供する。
【００１３】
この発明は、更に、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ、ヒトＦｌｔ−１ｍＲＮＡ、ヒトＦｌｋ-1／ＫＤＲｍＲＮＡ、これらの選択的スプライス型、変異体若しくは同源体の発現を阻止する方法であって、患者に有効量のこの発明のｓｉＲＮＡを投与し、それで標的ｍＲＮＡを分解することを含む当該方法をも提供する。
【００１４】
この発明は、更に、患者における血管形成を阻止する方法であって、患者に、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ、ヒトＦｌｔ−１ｍＲＮＡ、ヒトＦｌｋ-1／ＫＤＲｍＲＮＡ、これらの選択的スプライス型、変異体若しくは同源体を標的とする有効量のｓｉＲＮＡを投与することを含む当該方法をも提供する。
【００１５】
この発明は、更に、血管形成性疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ、ヒトＦｌｔ−１ｍＲＮＡ、ヒトＦｌｋ-1／ＫＤＲｍＲＮＡ、これらの選択的スプライス型、変異体若しくは同源体を標的とする有効量のｓｉＲＮＡを投与し、それで血管形成性疾患と関連する血管形成を阻止することを含む当該方法をも提供する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１Ａ及び１Ｂは、ｓｉＲＮＡで処理してない(「−」)；非特異的ｓｉＲＮＡで処理した(「非特異的」)；又はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した(「ＶＥＧＦ」)酸素欠乏２９３及びＨｅｌａ細胞におけるＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／ｍｌ)の棒グラフである。酸素欠乏でない２９３及びＨｅｌａ細胞におけるＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／ｍｌ)も示してある。各棒は、４つの実験の平均を表しており、誤差は、平均の標準偏差である。
図２は、ｓｉＲＮＡで処理してない(「−」)；非特異的ｓｉＲＮＡで処理した(「非特異的」)；又はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した(「ＶＥＧＦ」)酸素欠乏ＮＩＨ３Ｔ３細胞である。各棒は、６つの実験の平均を表しており、誤差は、平均の標準偏差である。
図３は、ＧＦＰｓｉＲＮＡ(濃い灰色の棒)又はヒトＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(薄い灰色の棒)の存在下でヒトＶＥＧＦを発現するアデノウイルス(「ＡｄＶＥＧＦ」)を注入したマウスの網膜におけるヒトＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／全タンパク質)の棒グラフである。各棒は、５つの眼の平均を表し、誤差棒は、平均の標準誤差を表している。
図４は、ＧＦＰｓｉＲＮＡの網膜下注入を受けた対照用眼(Ｎ＝９；「ＧＦＰｓｉＲＮＡ」)、及びマウスＶＥＧＦｓｉＲＮＡの網膜下注入を受けた眼(Ｎ＝７；「マウスＶＥＧＦｓｉＲＮＡ」)においてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)を示す棒グラフである。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。
図５は、ｐＡＡＶｓｉＲＮＡ(この発明の組換えＡＡＶウイルスベクターの生成に使用するシス作動性プラスミド)の図式表示である。「ＩＴＲ」：ＡＡＶ逆向き末端反復；「Ｕ６」：Ｕ６ＲＮＡプロモーター；「センス」：ｓｉＲＮＡセンスコード配列；「アンチ」：ｓｉＲＮＡアンチセンスコード配列；「ポリＴ」：ポリチミジン停止シグナル。
図６は、(Ａ)網膜下又は(Ｂ)硝子体にマウス抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」)又は対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)を注入したマウスの眼における処理おいてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)の棒グラフを示している。誤差棒は、平均の標準誤差を表している。(Ｃ)は、硝子体に、レーザー誘導後１日目に、ｓｉＲＮＡを含まないリン酸緩衝塩溶液(「ＰＢＳ」；レーザー誘導後１４日目にＣＮＶ面積測定)；レーザー誘導後１４日目に、対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘導後２１日目にＣＮＶ面積測定)；又はレーザー誘導後１４日目に、マウス抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘導後２１日目にＣＮＶ面積測定)を注入されたマウスの眼においてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)の棒グラフである。誤差棒は、平均の標準誤差を表している。
図７は、ヒト抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「Ｃａｎｄ５」)及び対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)を、注入後０(ｎ＝２；プレ−ｓｉＲＮＡ注入)、６(ｎ＝３)、１０(ｎ＝３)及び１４(ｎ＝３)日目で網膜下に注入されたマウスの眼におけるＶＥＧＦタンパク質のパーセント(「ＶＥＧＦ％」)のグラフである。ＶＥＧＦ％＝(Ｃａｎｄ５眼中の[ＶＥＧＦ]／ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ眼中の[ＶＥＧＦ])＊１００。
【００１７】
発明の詳細な説明
別途示さない限り、本明細書中では、すべての核酸配列を、５’から３’への向きで与える。又、すべての核酸配列中のデオキシリボヌクレオチドは、大文字で表され(例えば、デオキシチミジンは、「Ｔ」である)、核酸配列中のリボヌクレオチドは、小文字で表される(例えば、ウリジンは、「ｕ」である)。
【００１８】
ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含む組成物及び方法は、特に血管形成性疾患の治療のために、血管形成を阻止するために有利に利用される。この発明のｓｉＲＮＡは、これらのｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介の分解を引き起こし、それで、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子のタンパク質産物は生成されないか又は減少した量で生成されると考えられる。Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲレセプターに対するＶＥＦＧの結合が、血管形成の開始及び維持に必要とされるので、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介の分解は、血管形成過程を阻止する。
【００１９】
それ故、この発明は、標的ｍＲＮＡに狙いを定めた約１７〜２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを含む単離されたｓｉＲＮＡを提供する。このｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対形成相互作用(以後、「塩基対合」)により一緒にアニールしたセンスＲＮＡ鎖及び相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。以下で一層詳細に記載するように、このセンス鎖は、標的ｍＲＮＡに含まれる標的配列と同一の核酸配列を含む。
【００２０】
本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な、一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、又は ２つの相補的な部分が塩基対合して一本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合された単一の一本鎖分子を含むことができる。如何なる理論に拘束されることも望まないが、後者の型のｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質(又は、その同等物)により細胞内で開裂されて、２つの別個の塩基対合したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる(Tuschl, T. (2002)、前出、参照)。
【００２１】
ここで用いる場合、「単離された」は、ヒトの介入によって自然状態から変更され又は取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物中に自然に存在するｓｉＲＮＡは、「単離された」とはいえないが、合成ｓｉＲＮＡ又は、自然状態で共存していた物質から部分的に若しくは完全に分離されたｓｉＲＮＡは、「単離された」といえる。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在してもよいし、非自然環境例えば、ｓｉＲＮＡが送達された細胞中に存在してもよい。
【００２２】
ここで用いる場合、「標的ｍＲＮＡ」は、ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡ、ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡに由来する変異体若しくは選択的スプライス型、又は同源のＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子に由来するｍＲＮＡを意味する。
【００２３】
ここで用いる場合、ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲと「同源の」遺伝子又はｍＲＮＡは、ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲと相同な他の哺乳動物種に由来する遺伝子又はｍＲＮＡである。例えば、マウス由来の同源ＶＥＧＦｍＲＮＡは、SEQ ID NO:１に与えてある。
【００２４】
ＶＥＧＦ121(SEQ ID NO:２)、ＶＥＧＦ165(SEQ ID NO:３)、ＶＥＧＦ189(SEQ ID NO:４)及びＶＥＧＦ206(SEQ ID NO:５)を含むヒトＶＥＧＦのスプライス変異体が知られている。ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１(SEQ ID NO:６)又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ(SEQ ID NO:７)遺伝子から転写されたｍＲＮＡを、当分野で周知の技術を利用して、更なる選択的スプライス型について分析することができる。かかる技術には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)、ノーザンブロッティング及びイン・シトゥーハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡ配列を分析するための技術は、例えば、Busting SA (2000), J.Mol.Endocrinol.25:169-193に記載されている(その全開示を、参考として本明細書中に援用する)。選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡの同定のための代表的技術も又、以下に記載する。
【００２５】
例えば、所定の病気遺伝子に関係するヌクレオチド配列を含むデータベースを利用して、選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡを同定することができる。かかるデータベースには、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ及びthe Cancer Genome Anatomy Project (ＣＧＡＰ)データベースが含まれる。例えば、ＣＧＡＰデータベースは、様々な種類のヒトの癌から発現された配列タグ(ＥＳＴ)を含む。ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子に由来するｍＲＮＡ又は遺伝子配列を利用して、かかるデータベースに問い合わせて選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡを表すＥＳＴがこれらの遺伝子について発見されているかどうかを決定することができる。
【００２６】
「ＲＮアーゼ防護」と呼ばれる技術を利用して、選択的スプライシングを受けたＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡを同定することもできる。ＲＮアーゼ防護は、遺伝子配列の合成ＲＮＡへの翻訳を含み、これは、他の細胞(例えば、新血管新生の部位にある又はその近くの組織に由来する細胞)に由来するＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイズしたＲＮＡを、次いで、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予想された断片より小さいことは、選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡの存在を示す。推定の選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡを、当業者に周知の方法によって、クローン化して配列決定することができる。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲは又、選択的スプライシングを受けたＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡを同定するためにも利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、病気の組織に由来するｍＲＮＡを、当業者に周知の方法を利用して、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換する。次いで、このｃＤＮＡの完全なコード配列を、３’未翻訳領域内に位置するフォワードプライマー及び５’未翻訳領域内に位置するリバースプライマーを利用するＰＣＲによって増幅する。それらの増幅された産物を、選択的スプライス型について、例えば、増幅産物のサイズを通常のスプライシングを受けたｍＲＮＡから予想される産物のサイズと例えばアガロースゲル電気泳動によって比較することにより、分析することができる。この増幅産物のサイズの如何なる変化も、選択的スプライシングを示しうる。
【００２８】
変異型ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子から生成されたｍＲＮＡも又、選択的スプライス型を同定するための上に記載した技術によって容易に同定することができる。ここで用いる場合、「変異型」ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子又はｍＲＮＡは、ここに示したＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ配列と配列が異なるヒトのＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子又はｍＲＮＡを包含する。従って、これらの遺伝子のアレル型及びそれらから生成されたｍＲＮＡは、この発明の目的に関して「変異型」と考えられる。
【００２９】
ヒトＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲｍＲＮＡが、それらの各選択的スプライス型、同源体又は変異体と共通の標的配列を含みうるということは、理解される。それ故、かかる共通の標的配列を含む単一のｓｉＲＮＡは、その共通の標的配列を含む種々のＲＮＡ型の、ＲＮＡｉ媒介の分解を誘導しうる。
【００３０】
この発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、又は組換えにより生成されたＲＮＡ並びに少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変化によって天然のＲＮＡと異なる変化されたＲＮＡを含むことができる。かかる変化は、ｓｉＲＮＡの末端などへの又はｓｉＲＮＡの内部の少なくとも１つのヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加を含みうる(ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする改変を含む)。
【００３１】
この発明のｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は又、３’オーバーハングをも含むことができる。ここで用いる場合、「３’オーバーハング」は、二本鎖形成したＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる少なくとも１つの未対合のヌクレオチドを指す。
【００３２】
従って、一具体例において、この発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの１〜約６ヌクレオチド長の、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長の、一層好ましくは１〜約４ヌクレオチド長の、特に好ましくは約２〜４ヌクレオチド長の３’オーバーハング(リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む)を含む。
【００３３】
このｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３’オーバーハングを含む具体例において、それらのオーバーハングの長さは、各鎖について同じであっても異なってもよい。最も好適な具体例において、３’オーバーハングは、このｓｉＲＮＡの両鎖に存在して、２ヌクレオチド長である。例えば、この発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸(「ＴＴ」)又はジウリジル酸(「ｕｕ」)の３’オーバーハングを含むことができる。
【００３４】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を増大させるために、３’オーバーハングを、分解に対して安定化させることもできる。一具体例において、これらのオーバーハングは、プリンヌクレオチド例えばアデノシン又はグアノシンヌクレオチドを含むことにより安定化される。或は、ピリミジンヌクレオチドの改変アナログによる置換例えば３’オーバーハング内のウリジンヌクレオチドの２’−デオキシチミジンによる置換は許容されて、ＲＮＡｉ分解の効率に影響しない。特に、２’−デオキシチミジン中の２’ヒドロキシルの不在は、組織培養培地において、３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増大させる。
【００３５】
ある具体例において、この発明のｓｉＲＮＡは、配列ＡＡ(Ｎ１９)ＴＴ又はＮＡ(Ｎ２１)を含み、ここに、Ｎは、任意のヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％のＧＣを含み、好ましくは、約５０％のＧ／Ｃを含む。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ、(Ｎ１９)ＴＴ又はＮ２１(即ち、３〜２３位)に対応する。後者の場合、センスｓｉＲＮＡの３’末端は、ＴＴに変換される。この配列変換の原理は、センス及びアンチセンス鎖３’オーバーハングの配列組成に関して、対称的な二本鎖を生成することである。このアンチセンスＲＮＡ鎖を、次いで、センス鎖の１〜２１位に対する相補鎖として合成する。
【００３６】
これらの具体例における２３ｎｔセンス鎖の１位は、配列特異的な仕方でアンチセンス鎖によって認識されないので、このアンチセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド残基は、意図的に選択することができる。しかしながら、アンチセンス鎖の末位から二番目のヌクレオチド(両具体例における２３ｎｔセンス鎖の２位に相補的)は、一般に、標的配列に対して相補的である。
【００３７】
他の具体例において、この発明のｓｉＲＮＡは、配列ＮＡＲ(Ｎ１７)ＹＮＮを含み、ここに、Ｒは、プリン(例えば、Ａ又はＧ)であって、Ｙは、ピリミジン(例えば、Ｃ又はＵ／Ｔ)である。それ故、この具体例の代表的な２１ｎｔのセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、一般に、プリンヌクレオチドで始まる。かかるｓｉＲＮＡは、ｐｏｌＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初の転写されるヌクレオチドがプリンの場合には効率的であると考えられているだけなので、ターゲティング部位に変化を有しないｐｏｌＩＩＩ発現ベクターから発現させることができる。
【００３８】
この発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列(「標的配列」)の何れかにおいて約１９〜２５の隣接するヌクレオチドの任意のストレッチを標的とすることができる。ｓｉＲＮＡのための標的配列を選択するための技術は、例えば、Tuschl T等、「The siRNA User Guide」２００２年１０月１１日改訂(その全開示を参考として本明細書中に援用する)に与えられている。「The siRNA User Guide」は、ドイツ国、Gottingen、37077、AG 105、マック−スプランク生物物理化学研究所、細胞生化学部門、Thomas Tuschl博士が維持しているｗｗｗサイトで入手でき、マックス−プランク研究所のウェブサイトにアクセスして、キーワード「ｓｉＲＮＡ」を用いて検索することにより見出すことができる。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜２５ヌクレオチドの任意の隣接ストレッチと同一のヌクレオチド配列を含む
【００３９】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡ配列から選択することができる(好ましくは、開始コドンの５０〜１００ｎｔ下流即ち３’側から始まる)。しかしながら、この標的配列は、５’若しくは３’非翻訳領域内、又は開始コドンの近くの領域内に位置することができる(例えば、下記の表１内のSEQ ID NO:７３及び７４の標的配列を参照されたい)(これらはＶＥＧＦ121ｃＤＮＡの５’末端の１００ｎｔ内にある)。
【００４０】
他の例において、ＶＥＧＦ121ｃＤＮＡ配列内の適当な標的配列は：
【化１】
0005337337.tif 000002
である。
【００４１】
従って、この配列を標的とし、且つ各鎖に３’ｕｎオーバーハング(太字で示す)を有するこの発明のｓｉＲＮＡは：
【化２】
0005337337.tif 000003
である。
【００４２】
この同じ配列を標的とし、但し、各鎖に３’ＴＴオーバーハング(太字で示す)を有するこの発明のｓｉＲＮＡは：
【化３】
0005337337.tif 000004
である。
【００４３】
この発明のｓｉＲＮＡを誘導することのできる他のＶＥＧＦ121標的配列を、表１に与える。表１に列記したすべてのＶＥＧＦ121標的配列は、すべてのヒトＶＥＧＦ選択的スプライス型に共通するＶＥＧＦ121の選択的スプライス型の部分内にあるということは理解される。従って、表１のＶＥＧＦ121標的配列は又、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ189及びＶＥＧＦ206ｍＲＮＡをも標的とすることができる。特定のＶＥＧＦイソ型を標的とする標的配列も又、容易に同定することができる。例えば、ＶＥＧＦ165ｍＲＮＡを標的とするが、ＶＥＧＦ121ｍＲＮＡを標的としない標的配列は、AACGTACTTGCAGATGTGACA(SEQ ID NO:１３)である。ヒトＦｌｔ−１の代表的な標的配列を、SEQ ID NO:９１〜５０４に与え、ヒトＦｌｋ−１／ＫＤＲの代表的標的配列はを、SEQ ID NO:５０５〜８６４に与える。
【００４４】
【表１】
0005337337.tif 000005
0005337337.tif 000006
0005337337.tif 000007
【００４５】
この発明のｓｉＲＮＡは、当業者に公知の多くの技術を利用して得ることができる。例えば、このｓｉＲＮＡは、化学合成することができ又は当分野で公知の方法例えばTuschl等の米国特許出願公開２００２／００８６３５６号(その全開示を参考として本明細書中に援用する)に記載されたようなキイロショウジョウバエのイン・ビトロ系を利用して、組換えにより生成することもできる。
【００４６】
好ましくは、この発明のｓｉＲＮＡを、適当に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイト及び慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して化学合成する。このｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として合成することができ、又は２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することもできる。合成ＲＮＡ分子又は合成用試薬の商業的供給者には、Proligo(Hamburg, Germany)、Dharmacon Research(Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの部分、米国、イリノイ、Rockford在)、Glen Research(米国、バージニア、Sterling在)、ChemGenes(米国、マサチューセッツ、Ashland在)及びCruachem(英国、Glasgow在)が含まれる。
【００４７】
或は、ｓｉＲＮＡは又、組換え環状又は直鎖状ＤＮＡプラスミドから、任意の適当なプロモーターを利用して発現させることもできる。この発明のｓｉＲＮＡのプラスミドからの発現に適したプロモーターには、Ｕ６又はＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適当なプロモーターの選択は、当業者の内にある。この発明の組換えプラスミドは又、特定の組織又は特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導性の又は制御可能なプロモーターをも包含することができる。
【００４８】
組換えプラスミドから発現されたｓｉＲＮＡは、標準的技術によって、培養細胞発現系から単離することができ、又は細胞内で若しくは新血管新生の領域の近くでイン・ビボで発現させることができる。この発明のｓｉＲＮＡの細胞へのイン・ビボでの送達のための組換えプラスミドの利用は、以下で一層詳細に論じる。
【００４９】
この発明のｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから、２つの別々の相補的ＲＮＡ分子として、又は２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として発現させることができる。
【００５０】
この発明のｓｉＲＮＡの発現に適したプラスミドの選択、該ｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列をプラスミドに挿入するための方法、及び組換えプラスミドを関心ある細胞に送達する方法は、当業者の内にある。例えば、Tuschl, T.(2002), Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp TR等(2002), Science 296:550-553；Miyagishi M等(2002), Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison PJ等(2002), Genes Dev.16:948-958；Lee等(2002), Nat.Biotechnol.20:500-505；及びPaul CP等(2002), Nat.Biotechnol.20:505-508(これらの全開示を、参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。
【００５１】
この発明のｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列を含むプラスミドを、以下の実施例７に記載する。そのプラスミド(ｐＡＡＶｓｉＲＮＡと呼ばれる)は、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含み、ポリＴ停止配列に操作可能に結合されたアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする配列をヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下に含む。プラスミドｐＡＡＶｓｉＲＮＡは、最終的に、この発明のｓｉＲＮＡの発現のための同じ核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生成における利用を意図している。
【００５２】
ここで用いる場合、「ポリＴ停止配列に操作可能に結合された」は、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、５’方向からポリＴ停止シグナルと直接隣接することを意味する。プラスミドからのセンス又はアンチセンス配列の転写に際して、これらのポリＴ停止シグナルは、転写を停止させるように作用する。
【００５３】
ここで用いる場合、プロモーターの「制御下に」は、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、そのプロモーターの３’側に位置し、それで、該プロモーターが、それらのセンス及びアンチセンスコード配列の転写を開始することができることを意味する。
【００５４】
この発明のｓｉＲＮＡは又、細胞内で、イン・ビボの新血管新生部位又はその近くで、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。この発明の組換えウイルスベクターは、この発明のｓｉＲＮＡをコードする配列及びこれらのｓｉＲＮＡ配列の発現のための任意のプロモーターを含む。適当なプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適当なプロモーターの選択は、当業者の技能内にある。この発明の組換えウイルスベクターは又、特定の組織又は特定の細胞内環境でのｓｉＲＮＡの発現のための誘導又は調節可能なプロモーターをも含むことができる。この発明のｓｉＲＮＡの、イン・ビボでの、細胞への送達のための組換えウイルスベクターの利用は、以下で一層詳細に論じる。
【００５５】
この発明のｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子として又は２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として発現させることができる。
【００５６】
こ(れら)の発現させるべきｓｉＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることのできる任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス(ＡＶ)；アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)；レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(ＬＶ)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス)；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを利用することができる。これらのウイルスベクターの親和性も又、該ベクターの他のウイルスからのエンベロープタンパク質又は他の表面抗原によるシュードタイピングによって改変することができる。例えば、この発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなどからの表面タンパク質によりシュードタイプすることができる。
【００５７】
この発明で用いるのに適した組換えウイルスベクターの選択、ｓｉＲＮＡの発現のための核酸配列を該ベクターに挿入する方法、及び該ウイルスベクターを関心ある細胞に送達する方法は、当業者の技能の内にある。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap.2:301-310；Eglitis MA (1988), Biotechniques 6:608-614；Miller AD (1990), Hum Gene Therap.1:5-14；及びAnderson WF (1998), Nature 392:25-30 (これらの全開示を、参考として、本明細書中に援用する)を参照されたい。
【００５８】
好適なウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶに由来するものである。特に好適な具体例において、この発明のｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として、例えばＵ６若しくはＨ１ＲＮＡプロモーター又はサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターを含む組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００５９】
この発明のｓｉＲＮＡの発現に適したＡＶベクター、該組換えＡＶベクターを構築する方法、及び該ベクターを標的細胞に送達する方法は、Xia H等 (2002), Nat.Biotech.20:1006-1010に記載されている。
【００６０】
この発明のｓｉＲＮＡの発現に適したＡＡＶベクター、該組換えＡＡＶベクターを構築する方法、及び該ベクターを標的細胞に送達する方法は、Samulski R等 (1987), J.Virol.61:3096-3101；Fisher KJ等 (1996), J.Virol.,70:520-532；Samulski R等 (1989), J.Virol.63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ９４／１３７８８；及び国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ９３／２４６４１(これらの全開示を、参考として、本明細書中に援用する)に記載されている。この発明の組換えＡＡＶベクターを生成するための典型的な方法は、下記の実施例７に記載されている。
【００６１】
所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡの、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介による分解を引き起こす能力は、細胞中のＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定するための標準的技術を利用して評価することができる。例えば、この発明のｓｉＲＮＡを、培養細胞に送達して、標的ｍＲＮＡのレベルを、ノーザンブロット若しくはドットブロッティング技術により、又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。或は、培養細胞中のＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲレセプタータンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにより測定することができる。本発明のｓｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルに対する効果を測定するための適当な細胞培養系は、下記の実施例１に記載してある。
【００６２】
所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介による分解は又、新血管新生の動物モデル例えばＲＯＰ又はＣＮＶマウスモデルを用いて評価することもできる。例えば、ＲＯＰ又はＣＮＶマウスにおける新血管新生の領域を、ｓｉＲＮＡの投与の前後に測定することができる。ｓｉＲＮＡの投与に際して、これらのモデルにおいて、新血管新生の領域が減少したならば、それは、標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示している(下記の実施例６参照)。
【００６３】
上記のように、この発明のｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１若しくはＦｌｋ−１／ＫＤＲのｍＲＮＡ又はこれらの選択的スプライス型、変異体若しくは同源体を標的として、それらのＲＮＡｉ媒介による分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子からの機能的遺伝子産物の生成を低減させる。従って、この発明は、患者におけるＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲの発現を阻止する方法であって、有効量のこの発明のｓｉＲＮＡを患者に、標的ｍＲＮＡが分解するように投与することを含む当該方法を提供する。ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子の産物は、血管形成を開始して維持するのに必要であるので、この発明は、患者における血管形成を、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介による分解によって阻止する方法をも提供する。
【００６４】
ここで用いる場合、「患者」は、ヒト又は非ヒト動物を包含する。好ましくは、患者は、ヒトである。
【００６５】
ここで用いる場合、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介による分解を引き起こすのに十分な量、又は患者における血管形成の進行を阻止するのに十分な量である。
【００６６】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介による分解は、患者の細胞における標的ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、上記のようにｍＲＮＡ又はタンパク質を単離して定量するための標準的技術を利用して測定することにより検出することができる。
【００６７】
血管形成の阻止は、患者における病原性又は非病原性の血管形成の進行を、例えば新血管新生領域の大きさをこの発明のｓｉＲＮＡによる処理の前後で観察することにより、直接測定することによって評価することができる。血管形成の阻止は、新血管新生領域の大きさが同じか減少しているならば示される。患者における新血管新生領域の大きさを観察して測定する技術は、当業者の技能の内にあり；例えば、脈絡膜新血管新生の領域を、検眼鏡査法によって観察することができる。
【００６８】
血管形成の阻止は又、血管形成と関係する病状の変化又は逆戻りの観察から推断することもできる。例えば、ＡＲＭＤにおいて、視力の喪失を遅らせ、停止させ又は逆戻りさせることは、脈絡膜における血管形成の阻止を示す。腫瘍については、腫瘍の成長を遅らせ、停止させ若しくは逆戻りさせること、又は腫瘍の転移を遅らせ若しくは停止させることは、その腫瘍部位における又はその近くにおける血管形成の阻止を示す。非病原性の血管形成の阻止は、例えば、この発明のｓｉＲＮＡの投与の際の脂肪の喪失又はコレステロールレベルの低減から推断することもできる。
【００６９】
この発明のｓｉＲＮＡが、化学量論的量未満の量で、標的ｍＲＮＡを分解する(従って血管形成を阻止する)ことができるということは理解される。如何なる理論に束縛されることも望まないが、この発明のｓｉＲＮＡは、触媒的方法で、標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。従って、標準的な抗血管形成療法と比較して、治療効果を有するために、新血管新生部位又はその近くに送達されることが必要なｓｉＲＮＡは、有意に少ない。
【００７０】
当業者は、患者の大きさ及び体重；新血管新生又は病気の浸透の程度；患者の年齢、健康及び性別；投与経路；及び投与を局所投与にするか全身投与にするかなどの因子を考慮して、所定の患者に投与すべきこの発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定することができる。一般に、この発明のｓｉＲＮＡの有効量は、新血管新生部位又はその近くでの、約１ナノモル(ｎＭ)から約１００ｎＭへの、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭへの、一層好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭへの細胞間濃縮を含む。一層多い又は一層少ない量のｓｉＲＮＡを投与することができることは、企図されている。
【００７１】
本発明の方法を利用して、非病原性の血管形成(即ち、患者における正常の過程から生じる血管形成)を阻止することができる。非病原性の血管形成の例には、子宮内膜新血管新生、及び脂肪組織又はコレステロールの生成に関与する過程が含まれる。従って、この発明は、非病原性血管形成を、例えば、体重を制御し又は脂肪喪失を促進するため、コレステロールレベルを低減させ、又は妊娠中絶などのために阻止する方法を提供する。
【００７２】
本発明の方法は又、血管形成性疾患(即ち、病原性が不適当な血管形成又は制御されない血管形成と関連している病気)と関連する血管形成を阻止することもできる。例えば、殆どの癌様固形腫瘍は、その腫瘍部位の内部及び周囲に血管形成を誘導することによってそれら自身に十分な血液供給を生ぜしめる。この腫瘍に誘導された血管形成は、しばしば、腫瘍の成長に必要であり、転移細胞が血流に入ることをも可能にする。
【００７３】
他の血管形成性疾患には、糖尿病性網膜症、加齢関連黄斑変性(「ＡＲＭＤ」)、乾癬、リウマチ様関節炎及び他の炎症性疾患が含まれる。これらの病気は、新血管新生領域において新たに形成された血管による正常組織の破壊により特徴付けられる。例えば、ＡＲＭＤにおいては、脈絡膜が毛細血管により侵されて破壊される。ＡＲＭＤにおける脈絡膜の、血管形成に駆動される破壊は、最終的に、部分的な又は完全な失明へと導く。
【００７４】
好ましくは、この発明のｓｉＲＮＡを利用して、癌例えば乳癌、肺癌、頭頚部癌、脳癌、腹部癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫；皮膚癌(例えば、メラノーマ)、リンパ腫及び血液癌と関連する固形腫瘍の成長又は転移を阻止する。
【００７５】
一層好ましくは、この発明のｓｉＲＮＡを利用して、加齢関連黄斑変性における脈絡膜新血管新生を阻止する。
【００７６】
血管形成性疾患を治療するために、この発明のｓｉＲＮＡを、本発明のｓｉＲＮＡと異なる医薬と共に、患者に投与することができる。或は、この発明のｓｉＲＮＡを、血管形成性疾患の治療のためにデザインされた他の治療方法と組み合せて、患者に投与することができる。例えば、この発明のｓｉＲＮＡを、癌を治療し又は腫瘍の転移を阻止するために現在採用している治療方法(例えば、放射線療法、化学療法、及び外科手術)と組み合せて投与することができる。腫瘍を治療するために、この発明のｓｉＲＮＡを、好ましくは放射線療法と組み合せて、又は化学療法剤例えばシスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェンと組み合せて患者に投与する。
【００７７】
本発明の方法において、本発明のｓｉＲＮＡを、患者に、裸のｓｉＲＮＡとして、送達用試薬と一緒に、又はこのｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとして投与することができる。
【００７８】
本発明のｓｉＲＮＡと共に投与するのに適した送達用試薬には、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；又はポリカチオン(例えば、ポリリジン)又はリポソームが含まれる。好適な送達用試薬は、リポソームである。
【００７９】
リポソームは、ｓｉＲＮＡの、特定の組織例えば網膜又は腫瘍組織への送達を助成することができ、ｓｉＲＮＡの血中半減期を増大させることもできる。この発明で利用するのに適したリポソームは、標準的な小胞形成性脂質から形成され、これらは、一般に、中性又は負に帯電したリン脂質及びステロール例えばコレステロールを包含する。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームの大きさ及びそれらのリポソームの血流中での半減期などの因子を考慮することにより左右される。リポソームの製造のために、様々な方法が知られており、例えば、Szoka等(1980), Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；及び米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号、４，８３７，０２８号及び５，０１９，３６９号(これらの全開示を、本明細書中に参考として援用する)に記載されている。
【００８０】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを含むリポソームは、そのリポソームを血管形成部位又はその近くの特定の細胞又は組織を標的とするようにさせるリガンド分子を含む。腫瘍又は血管内皮細胞で優勢なレセプターに結合するリガンド例えば、腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体は、好適である。
【００８１】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡをカプセル封入したリポソームを、単核マクロファージ及び細網内皮系によるクリアランスを、例えば、構造表面に結合したオプソニン作用阻害成分を有することによって回避するように改変する。一具体例において、この発明のリポソームは、オプソニン作用阻害成分とリガンドの両方を含むことができる。
【００８２】
この発明のリポソームの製造において利用するためのオプソニン作用阻害成分は、典型的には、そのリポソーム膜に結合された大きい親水性ポリマーである。ここで用いる場合、オプソニン作用を阻害する成分は、例えば膜自体への脂溶性アンカーの相互作用により、又は膜脂質の活性基に直接結合することによって、化学的又は物理的に膜に結合された場合にリポソーム膜に「結合」される。これらのオプソニン作用を阻害する親水性ポリマーは、マクロファージ−単球系(「ＭＭＳ」)及び細網内皮系(「ＲＥＳ」)によるリポソームの取込みを有意に減少させる保護表面層を形成する(米国特許第４，９２０，０１６号に記載されており、その全開示を、参考として本明細書中に援用する)。従って、オプソニン作用阻害成分で改変したリポソームは、未改変のリポソームよりも遥かに長く循環中に残る。この理由の故に、かかるリポソームは、ときに、「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【００８３】
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性」微小血管系により養われる組織に蓄積することが知られている。従って、かかる微小血管系の欠損により特徴付けられる標的組織例えば固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に蓄積する(Gabizon等(1988), P.N.A.S., USA, 18:6949-53参照)。加えて、ＲＥＳによる減少した取込みは、ステルスリポソームの毒性を、肝臓及び脾臓における有意の蓄積を妨げることによって低下させる。従って、この発明のオプソニン作用阻害成分で改変されたリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞に送達することができる。
【００８４】
リポソームの改変に適したオプソニン作用阻害成分は、好ましくは、約５００〜４０，０００ダルトンの、一層好ましくは約２，０００〜２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。かかるポリマーには、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又はポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)誘導体例えばメトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；合成ポリマー例えばポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分枝鎖又は樹木状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えばポリビニルアルコール及びポリキシリトール(カルボキシル基又はアミノ基が化学結合したもの)並びにガングリオシド例えばガングリオシドＧＭ1が含まれる。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ又はメトキシＰＰＧ、又はこれらの誘導体も又、適している。加えて、オプソニン作用を阻害するポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドの何れかとのブロックコポリマーであってよい。オプソニン作用を阻害するポリマーは又、アミノ酸又はカルボン酸を含む天然の多糖類例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖類又はオリゴ糖類(直鎖又は分枝鎖)；又はカルボキシル化多糖類又はオリゴ糖類(例えば、カルボキシル基の生じた結合を有する炭酸の誘導体と反応したもの)であってもよい。
【００８５】
好ましくは、このオプソニン作用阻害成分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はこれらの誘導体である。ＰＥＧ又ｈＰＥＧ誘導体により改変されたリポソームは、ときに、「ＰＥＧ化(PEGylated)リポソーム」と呼ばれる。
【００８６】
オプソニン作用阻害成分は、リポソーム膜に、多くの周知の技術の内の任意のものによって結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合し、次いで、膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ(ＣＮ)ＢＨ3及びテトラヒドロフランと水などの溶媒混合物(６０℃で、３０：１２比)を利用する還元アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーによって誘導体化することができる。
【００８７】
この発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上で論じている。かかる組換えプラスミドは又、直接投与することもできるし、適当な送達試薬と共に投与することもでき、該送達試薬には、Mirus Transit LT１親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン(例えば、ポリリジン)又はリポソームが含まれる。この発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターも又、上で論じており、かかるベクターを患者の新血管新生領域に送達する方法は、当業者の技能の内にある。
【００８８】
この発明のｓｉＲＮＡは、該ｓｉＲＮＡを新血管新生領域又はその近くの組織の細胞に送達するのに適した任意の手段によって患者に投与することができる。例えば、このｓｉＲＮＡを、遺伝子銃、エレクトロポレーションにより又は他の適当な非経口若しくは腸内投与経路によって投与することができる。
【００８９】
適当な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達又は鼻内送達が含まれる。
【００９０】
適当な非経口投与経路には、血管内投与(例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内点滴、動脈内ボーラス注射、動脈内点滴及び脈管構造内へのカテーテル点滴注入)；組織周囲及び組織内投与(例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内への注入、網膜内注入又は網膜下注入)；皮下注射又はデポジション(浸透圧ポンプなどによる皮下点滴を含む)；新血管新生の部位又はその近くの領域への例えばカテーテル又は他の配置用デバイス(例えば、角膜ペレット又は坐薬、眼滴瓶、又は多孔性若しくは非多孔性又はゼラチン状物質を含むインプラント)による直接適用(例えば、局所適用)；及び吸入が含まれる。適当な配置用デバイスには、米国特許第５，９０２，５９８号及び６，３７５，９７２号に記載された眼内インプラント及び米国特許第６，３３１，３１３号に記載された生物分解性の眼内インプラントが含まれる(これらの全開示を、参考として本明細書中に援用する)。かかる眼内インプラントは、Control Delivery Systems, Inc.(マサチューセッツ、Watertown)及びOculex Pharmaceuticals, Inc.(カリフォルニア、Sunnyvale)から入手できる。
【００９１】
好適具体例において、このｓｉＲＮＡの注入又は点滴は、新血管新生の部位又はその近くに与える。一層好ましくは、このｓｉＲＮＡは、眼に、例えば、当業者の技能内にあるが、液体又はゲル形態で下眼瞼又は結膜円蓋へ局所的に投与する(例えば、Acheampong AA等、2002, Drug Metabol. and Disposition 30:421-429参照、この全開示を、参考として本明細書中に援用する)。
【００９２】
典型的には、この発明のｓｉＲＮＡは、眼に、約５〜７５マイクロリットルの量で、例えば約７〜５０マイクロリットルの量で、好ましくは約１０〜３０マイクロリットルの量で局所的に投与される。７５マイクロリットルにより大きい容積のｓｉＲＮＡの眼における局所的点滴注入は、こぼれること及び排液によるｓｉＲＮＡの眼からの喪失を生じうるということは理解される。従って、高濃度のｓｉＲＮＡ(例えば、１００〜１０００ｎＭ)を可能な限り小容積で投与することは好ましい。
【００９３】
特に好適な非経口投与経路は、眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、その投与経路がｓｉＲＮＡが眼に入ることを可能にするならば、眼への注射又は直接(例えば、局所)投与によって達成することができるということは理解される。上記の眼への投与の局所経路に加えて、適当な眼内投与経路には、硝子体内、網膜内、網膜下、テント下、眼窩周囲及び眼窩後、経角膜及び強膜投与が含まれる。かかる眼内投与経路は、当業者の技能の内にあり、例えばAcheampong AA等、2002, 前出；及びBennett等(1996), Hum.Gene Ther.7:1763-1769及びAmbati J等、2002, Progress in Retinal and Eye Res.21:145-151を参照されたい(これらの全開示を、参考として本明細書中に援用する)。
【００９４】
この発明のｓｉＲＮＡは、単一投与量で投与することもできるし、多数の投与量で投与することもできる。この発明のｓｉＲＮＡの投与を点滴による場合には、その点滴は、単一の持続的投与であってもよいし、多数の点滴により送達されてもよい。この薬剤の組織への直接的注射は、好適な新血管新生の部位又はその近くに行なう。この薬剤の、新血管新生部位又はその近くの組織への多数の注射は、特に好適である。
【００９５】
当業者は又、この発明のｓｉＲＮＡの、所定の患者への投与のための適当な投薬養生法を容易に決定することができる。例えば、このｓｉＲＮＡを、患者に、新血管新生部位又はその近くへの単一の注射又はデポジションによって一回投与することができる。或は、このｓｉＲＮＡを、毎日又は毎週、多数回、患者に投与することができる。例えば、このｓｉＲＮＡを、患者に、約３〜２８週間の、一層好ましくは約７〜１０週間の期間にわたって、週一回投与することができる。好適な投薬養生法においては、このｓｉＲＮＡを、新血管新生部位又はその近くに(例えば、硝子体内に)、７週間にわたって、週一回注射する。この発明のｓｉＲＮＡの周期的投与が、慢性的な新血管新生性疾患例えば湿型ＡＲＭＤ又は糖尿病性網膜症の患者については、無期限の長さで必要でありうるということは理解される。
【００９６】
投薬養生法が多数投与を含む場合には、患者に投与された有効量のｓｉＲＮＡが、全投薬養生法にわたって投与されたｓｉＲＮＡの全量を含みうるということが理解される。
【００９７】
この発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、患者への投与前に、当分野で公知の技術によって、医薬組成物として配合される。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌で且つ発熱物質を含まないことを特徴とする。ここで用いる場合、「医薬配合物」は、ヒトへの使用及び獣医学での利用のための配合物を包含する。この発明の医薬組成物の製造方法は、当業者の技能の内にあり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, １７版、Mack Publishing Company, ペンシルベニア、Easton,(1985)(この全開示を、参考として本明細書中に援用する)に記載されている。
【００９８】
本発明の医薬配合物は、この発明のｓｉＲＮＡ(例えば、０．１〜９０重量％)又は生理学的に許容しうるその塩を、生理学的に許容しうるキャリアー媒質と混合して含む。好適な生理学的に許容しうるキャリアー媒質は、水、緩衝された水、塩溶液(例えば、通常の塩溶液又は平衡化塩溶液例えばハンクス又はアールの平衡化塩溶液)、０．４％塩溶液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【００９９】
この発明の医薬組成物は又、慣用の製薬用賦形剤及び／又は添加剤をも含む。適当な製薬用賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、及びｐＨ調節剤が含まれる。適当な添加剤には、生理学的に生体適合性の緩衝剤(例えば、トロメタミンヒドロクロリド)、キレート剤の添加(例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドなど)又はカルシウムキレート錯体(例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド)、又は、随意のカルシウム若しくはナトリウム塩の添加(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム)が含まれる。この発明の医薬組成物は、液体形態での使用のためにパッケージ化することができ、又は凍結乾燥することができる。
【０１００】
この眼への局所的投与のために、慣用の眼内送達用試薬を利用することができる。例えば、局所的眼内送達のためのこの発明の医薬組成物は、上記のような塩溶液、角膜透過性増強剤、不溶性粒子、ペトロラタム又は他のゲルベースの軟膏、眼への点滴注入に際して粘度が増大するポリマー、又は粘膜付着性ポリマーを含むことができる。好ましくは、眼内送達用試薬は、角膜透過性を増大させ、又は粘性効果により若しくは角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用を確立することによってｓｉＲＮＡの前眼保持を長くする。
【０１０１】
局所的眼内送達に適当な不溶性粒子には、Bell等の米国特許第６，３５５，２７１号(その全開示を、参考として本明細書中に援用する)に記載されたリン酸カルシウム粒子が含まれる。眼内への点滴注入に際して粘度が増大する適当なポリマーには、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー例えばポロキサマー４０７(例えば、２５％の濃度で)、セルロースアセトフタレート(例えば、３０％の濃度で)、又は低アセチルゲランガム例えばゲルライト(登録商標)(CP Kelco, デラウェア、Wilmingtonより入手可能)が含まれる。適当な粘膜付着性ポリマーには、多数の親水性官能基例えばカルボキシル、アミド及び／又は硫酸基を有する親水コロイド；例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール(例えば、２００，０００より大きい数平均分子量)、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、及びキシロカンが含まれる。適当な角膜透過性増強剤には、シクロデキストリン、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル(例えば、Brij(登録商標)35)、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル(例えば、Brij(登録商標)78)、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル(例えば、Brij(登録商標)98)、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン及びポリオキシエチル化ヒマシ油例えばクレマフォーＥＬが含まれる。
【０１０２】
固体組成物のためには、慣用の無毒性固体キャリアー；例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュークロース、炭酸カルシウムなどを利用することができる。
【０１０３】
例えば、経口投与のための固体の医薬組成物は、上に列記した任意のキャリアー及び賦形剤及び１０〜９５％の、好ましくは２５〜７５％の、この発明の少なくとも一のｓｉＲＮＡを含むことができる。エアゾール(吸入)投与のための医薬組成物は、上記のリポソームにカプセル封入された０．０１〜２０重量％の、好ましくは１〜１０重量％の、この発明の少なくとも一のｓｉＲＮＡ、及び噴射剤を含むことができる。所望であれば、キャリアー(例えば、鼻内送達のためのレシチン)を含むこともできる。
【実施例】
【０１０４】
この発明を、今から、下記の非制限的実施例を用いて説明する。これらの実施例４〜６及び８〜９に記載した動物実験は、研究における動物の世話及び利用に関するペンシルベニア大学施設ガイドラインを用いて行なった。実施例１０に記載した動物実験は、Sierra Biomedical, 587 Dunn Circle, Sparks, NV, 89431の標準的操作手順に従って行なう。
【０１０５】
実施例１ − イン・ビトロでのｓｉＲＮＡトランスフェクション及び低酸素状態の誘導
ｓｉＲＮＡのデザイン − ヒトのＶＥＧＦｍＲＮＡの５’末端から３２９ｎｔに位置する１９ｎｔの配列：AAACCTCACCAAGGCCAGCAC (SEQ ID NO:５１)を標的配列として選択した。それが、如何なる他の遺伝子に由来するｍＲＮＡにも含まれないことを確実にするために、この標的配列を、ＮＣＢＩにより提供されたＢＬＡＳＴサーチエンジンにエンターさせた。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの利用は、Altschul等(1990), J.Mol.Biol.215:403-410及びAltschul等(1997), Nucleic Acids Res.25:3389-3402(これらの開示を、参考として、本明細書中にそっくりそのまま援用する)に記載されている。この標的配列を含む他のｍＲＮＡは見出されなかったので、ｓｉＲＮＡ二本鎖を、この配列を標的とするように合成した(Dharmacon Research, Inc., CO, Lafayette)。
【０１０６】
このｓｉＲＮＡ二本鎖は、下記のセンス鎖及びアンチセンス鎖を有した。
センス：
【化４】
0005337337.tif 000008
アンチセンス：
【化５】
0005337337.tif 000009
【０１０７】
一緒に、これらのｓｉＲＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖は、各鎖の３’側にオーバーハング(太字で表示)を有する１９ｎｔの二本鎖ｓｉＲＮＡを形成した。このｓｉＲＮＡは、「候補５」又は「Ｃａｎｄ５」と呼ばれた。ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とする他のｓｉＲＮＡをデザインして、記載したように、Ｃａｎｄ５について試験した。
【０１０８】
グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)ｍＲＮＡ中の下記の配列を標的とするｓｉＲＮＡを、非特異的対照として利用した：GGCTACGTCCAGCGCACC (SEQ ID NO:７９)。このｓｉＲＮＡを、Dharmacon(Lafayette, CO)から購入した。
【０１０９】
イン・ビトロでのｓｉＲＮＡトランスフェクション及び低酸素状態の誘導 − ヒト細胞株(２９３；Ｈｅｌａ及びＡＲＰＥ１９)を、別々に、２４ウェルプレート中に、２５０マイクロリットルの完全ＤＭＥＭ培地中に、トランスフェクションの１日前に、トランスフェクション時に約５０％集密となるように播種した。細胞を、２．５ｎＭ Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡ、及び対照としてのｓｉＲＮＡなしの対照又は２．５ｎＭの非特異的ｓｉＲＮＡ(ＧＦＰを標的とする)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションを、すべての細胞株において、「Transit TKO Transfection」試薬を、製造者(Mirus)の勧めるように用いて行なった。
【０１１０】
トランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞において、デスフェロキサミドメシレートを、各ウェル当たり１３０マイクロモルの終濃度で加えることにより低酸素状態を誘導した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養培地をすべてのウェルから取り出して、ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ(R&D system, ミネソタ、Minneapolis)を、その培養培地について、Quantikine ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡプロトコール(製造者より入手、その全開示を参考として本明細書中に援用する)に記載されたように行なった。
【０１１１】
図１で見られるように、Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡにより誘導されたＲＮＡｉ分解は、低酸素状態の２９３及びＨｅＬａ細胞により生成されるＶＥＧＦの濃度を有意に低下させる。ｓｉＲＮＡなしの対照又は非特異的ｓｉＲＮＡ対照の何れかで処理した低酸素状態の細胞により生成されるＶＥＧＦの量において本質的に差異はなかった。類似の結果が、同じ条件下で処理したヒトＡＲＰＥ１９細胞においても見られた。従って、ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、イン・ビトロでヒトの培養細胞におけるＶＥＧＦの病原性のアップレギュレーションを破壊する。
【０１１２】
上で概説した実験を、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞について、マウス特異的ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを用いて反復し(実施例６参照)、ＶＥＧＦ生成を、マウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ (R&D systems, ミネソタ、Minneapolis)を用いて、Quantikine マウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡのプロトコール(製造者より入手可能、その全開示を参考として本明細書中に援用する)に記載されたようにして定量した。ヒトの細胞株について図１に示したのと類似の結果が得られた。
【０１１３】
実施例２ − ｓｉＲＮＡ濃度の増大の、ヒト培養細胞におけるＶＥＧＦ生成に対する効果
実施例１で概説した実験を、ヒト２９３、ＨｅＬａ及びＡＲＰＥ１９細胞で、濃度１０〜５０ｎＭの範囲のｓｉＲＮＡを利用して反復した。Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡの、ＶＥＧＦ生成をダウンレギュレートする能力は、約１３ｎＭ ｓｉＲＮＡまで穏やかに増大したが、これより高濃度では平坦効果が見られた。これらの結果は、平坦効果が、このｓｉＲＮＡをトランスフェクトされなかった少数の細胞からのＶＥＧＦ生成を反映しているようなので、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介のＲＮＡｉ分解の触媒的性質を強調している。このｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞の大部分について、低酸素状態により誘導された増大したＶＥＧＦｍＲＮＡ生成は、約１３ｎＭより高いｓｉＲＮＡ濃度において、標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ誘導された分解により追い越される。
【０１１４】
実施例３ − ｓｉＲＮＡターゲティングの特異性
ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を、２４ウェルプレート中で、標準的条件下で、これらの細胞が、トランスフェクションの１日前に約５０％集密になるように生育させた。ヒトＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ Ｃａｎｄ５を、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞に実施例１におけるようにトランスフェクトした。次いで、低酸素状態を、トランスフェクトされた細胞において誘導して、マウスＶＥＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡによって、実施例１におけるように測定した。
【０１１５】
ヒトＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ Ｃａｎｄ５により標的とされた配列は、マウスＶＥＧＦ ｍＲＮＡと１ヌクレオチドだけ違っている。図２で見られるように、ヒトＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡは、マウス細胞のマウスＶＥＧＦを低酸素状態後に調節する能力に対して影響を有しない。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ誘導されたＲＮＡｉ分解が、１ヌクレオチド分離内まで配列特異的であることを示している。
【０１１６】
実施例４ − ｓｉＲＮＡのマウス網膜色素上皮細胞へのイン・ビボ送達
ＶＥＧＦは、加齢関連黄斑変性(ＡＲＭＤ)のヒト患者の網膜色素上皮(ＲＰＥ)細胞においてアップレギュレートされる。機能的ｓｉＲＮＡが、ＲＰＥ細胞にイン・ビボで送達されうることを示すために、ＧＦＰを、マウスの網膜で組換えウイルスを用いて発現させ、ＧＦＰ発現をｓｉＲＮＡを用いて抑制した(silenced)。
【０１１７】
５匹のＣ５７／Ｂｌａｃｋ６成体マウス(Jackson Labs, メイン、Bar Harbor)の各々の一方の眼に、Bennett等(1996), 前出に記載されたように、網膜下に、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰを含むアデノウイルス約１×１０8粒子及びtransit TKO reagent (Mirus)と結合体化されたｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ２０ピコモルを含む混合物を注射した。
【０１１８】
陽性対照として、反対側性の眼に、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰを含むアデノウイルス約１０8粒子及びtransit TKO reagent (Mirus)と結合体化されたヒトＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ２０ピコモルを含む混合物を注射した。ＧＦＰの発現を、眼底検査法により、注射の４８及び６０時間後に検出した。動物を、注射後４８時間又は６０時間で犠牲にした。それらの眼を摘出して、４％ホルムアルデヒド中で固定し、検鏡板用試料として調製し又は蛍光顕微鏡検査用に処理して１０ミクロンの低温切片とした。
【０１１９】
ＧＦＰ蛍光は、５匹のマウスの内の４匹において、ＧＦＰｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを受けた眼における眼底検査法によっては検出されなかったが、ＧＦＰ蛍光は、非特異的な対照用ｓｉＲＮＡを受けた反対側性の眼において検出可能であった。蛍光顕微鏡により分析した代表的な検鏡板用試料は、非特異的な対照用ｓｉＲＮＡを受けた眼と比較して、ＧＦＰｓｉＲＮＡを受けた眼におけるＧＦＰ蛍光の欠如を示した。他の網膜の低温切片は、組換えアデノウイルスが、効率的に、ＲＰＥ細胞を標的とし、アデノウイルスに、ＧＦＰｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡが伴う場合には、ＧＦＰ導入遺伝子の発現が停止することを示した。
【０１２０】
ＧＦＰｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを受けた眼に蛍光顕微鏡により検出可能な幾らかのＧＦＰ蛍光がある場合、その蛍光は、非特異的ｓｉＲＮＡを受けた対照と比較して、大いに抑制されている。これらのデータは、機能的ｓｉＲＮＡが、イン・ビボで、ＲＰＥ細胞へ送達されうることを示している。
【０１２１】
実施例５ − マウス網膜におけるヒトＶＥＧＦのイン・ビボ発現及びｓｉＲＮＡ誘導されたＲＮＡｉ分解
ｓｉＲＮＡが、イン・ビボで機能化されたＶＥＧＦを標的とすることを示すために、外因性のヒトＶＥＧＦ発現カセットを、実施例４におけるように、網膜下注射により、アデノウイルスによってマウスＲＰＥ細胞に送達した。一方の眼は、Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡを受け、反対側性の眼は、ＧＦＰ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを受けた。これらの動物を、注射の６０時間後に犠牲にして、それらの注射された眼を取り出して、摘出後、液体Ｎ2中で急速冷凍した。次いで、それらの眼を、溶解用緩衝液中でホモジェナイズして、総タンパク質を、標準的なBradfordタンパク質アッセイ(Roche, ドイツ国)を利用して測定した。これらの試料を、ヒトＶＥＧＦを実施例１に記載したようにＥＬＩＳＡによってアッセイする前に、総タンパク質につき標準化した。
【０１２２】
ＶＥＧＦの発現は、動物間で幾らか変化した。ＶＥＧＦレベルの変動は、実施例４のＧＦＰ実験において認められたものとによく相関し、注射間の幾らかの誤差、及び各動物において標的遺伝子を送達するアデノウイルスの示差的能力に帰することができる。しかしながら、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡを受けた各眼におけるＶＥＧＦ発現の、非特異的対照用ｓｉＲＮＡを受けた眼と比較しての、有意の減衰があった(図４)。これらのデータは、Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡが、マウスＲＰＥ細胞におけるイン・ビボでのヒトＶＥＧＦ発現の抑制(silencing)において強力且つ有効であったことを示している。
【０１２３】
実施例６ − マウスＣＮＶモデルにおける脈絡膜新血管新生の阻害
ＡＲＭＤにおける脈絡膜新血管新生は、ＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦのアップレギュレーションのためであるという証拠がある。このヒトの病状は、レーザーを利用して網膜上の一点を焼くこと(「レーザー光凝固」又は「レーザー誘導」)により、マウスにおいてモデル化することができる。治癒過程に際して、ＶＥＧＦは、焼かれた領域のＲＰＥ細胞においてアップレギュレートされ、これが、脈絡膜の血管再生へと導くと考えられる。このモデルは、マウス脈絡膜新血管新生(「ＣＮＶ」)モデルと呼ばれる。
【０１２４】
マウスＣＮＶモデルの救済のために、実施例１のヒト「Ｃａｎｄ５」ｓｉＲＮＡに由来する１ヌクレオチドの変化を組み込んだマウスｓｉＲＮＡをデザインした。このマウスｓｉＲＮＡは、配列 AAACCUCACCAAAGCCAGCAC (SEQ ID NO:８０)で、マウスＶＥＧＦｍＲＮＡを特異的に標的とした。マウスＶＥＧＦを標的とする他のｓｉＲＮＡも又、デザインして試験した。実施例１で非特異的対照として用いたＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、ここでも、非特異的対照として利用した。
【０１２５】
レーザー誘導の２４時間後に、１１匹の成体Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウス(Jackson Labs, メイン、Bar Harbor)の各々の一方の眼に、実施例４におけるように、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＬａｃＺを含むアデノウイルス約１×１０8粒子及びtransit TKO reagent (Mirus)と結合体化したマウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ２０ピコモルを含む混合物を、網膜下に注射した。対照として、反対側性の眼は、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＬａｃＺを含むアデノウイルス約１×１０8粒子及びtransit TKO reagent (Mirus)と結合体化されたＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ２０ピコモルを含む混合物を受けた。
【０１２６】
レーザー処理の１４日後に、これらのマウスにフルオレセインを潅流させて、新血管新生領域を、焼いた点の周囲で測定した。反対側性の眼の焼いた点の領域を、対照として利用した。マウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡを受けた動物の焼いた点の周囲の新血管新生部位は、平均で、対照領域の面積の１／４であった。これらのデータは、ＡＲＭＤの治療のための、ＶＥＧＦに向けられたｓｉＲＮＡ(「抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる)の利用を指示している。
【０１２７】
実施例７ − ｓｉＲＮＡの発現のためのアデノ随伴ウイルスベクターの生成
この発明のｓｉＲＮＡの送達のための組換えＡＡＶベクターの生成のための「シス作用性」プラスミドを、本質的にSamulski R等(1987), 前出に記載されたようにして、ＰＣＲベースのサブクローニングにより生成した。このシス作用性プラスミドは、「ｐＡＡＶ ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる。
【０１２８】
ｐｓｕｂ２０１のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を、次の配列で、この順序で置き換えた：ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下の操作可能にポリＴ停止配列と結合させた１９ｎｔのセンスＲＮＡ鎖コード配列、及びヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下の操作可能にポリＴ停止配列と結合させた１９ｎｔのアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列。ｐＡＡＶ ｓｉＲＮＡの図式表示を、図５に与える。
【０１２９】
組換えＡＡＶｓｉＲＮＡベクターを、ｐＡＡＶｓｉＲＮＡを、Fisher KJ等(1996), 前出に記載されたように、予めＥ１を欠失させたアデノウイルスを感染させたヒト２９３細胞にトランスフェクトすることにより得た。これらのＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ機能は、Samulski R等(1989), 前出に記載されたように、トランス作用性プラスミドｐＡＡＶ／Ａｄにより与えられた。この組換えＡＡＶｓｉＲＮＡベクターの製造ロットを、ゲノムコピー数／ｍｌに従って、Fisher KJ等(1996), 前出に記載されたようにして力価を測定した。
【０１３０】
実施例８ − ＶＥＧＦに向けられたｓｉＲＮＡは、実験的脈絡膜新血管新生を阻止する
マウスのＶＥＧＦに向けられたｓｉＲＮＡの、実験的レーザー誘導性脈絡膜新血管新生(ＣＮＶ)をマウスにおいて阻止する能力を、下記のように試験した。
【０１３１】
雌のＣ５７ＢＬ／６成体マウスの網膜を、８１０ｎｍダイオードレーザーを利用して、レーザー光凝固させた(７５ｕｍ、１４０ｍｗ、０．１０秒)(OcuLight Six；IRIS Medical、カリフォルニア、Mountain View)。３つのレーザースポットを各マウスの両眼に加えた。レーザー光凝固の３６時間後に、マウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」)を、各マウスの一方の眼の網膜下又は硝子体に送達した。網膜下注射のために、このｓｉＲＮＡを、Transit TKO トランスフェクション試薬(Mirus)と結合体化して組換えアデノウイルス(ｒアデノウイルス)と混合した。硝子体内注射のために、このｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬及びｒアデノウイルスの非存在下で送達した。対照として、各マウスの反対側性の眼は、マウスＶＥＧＦに対する相同性を有しないＧＦＰを標的としたｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)と同じ配合物の網膜下又は硝子体内注射を受けた。
【０１３２】
レーザー処理の１４日後に、すべての動物を、高分子量のＦＩＴＣ−デキストランで潅流し、脈絡検鏡板用試料を上記のように調製して、それらの検鏡板用試料を、マスクした仕方で顕微鏡的に写真撮影して分析した。各検鏡板用試料におけるＣＮＶの面積を、オープンラブソフトウェア(Improvision, マサチューセッツ、Boston)を用いて測定した。ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡで処理した眼におけるＣＮＶの平均面積は、網膜下(図６Ａ；Ｐ＜０．００３)及び硝子体内(図６Ｂ；Ｐ＜０．０４)送達の両方について、ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ処理された眼における面積より有意に小さかった。
【０１３３】
第二の実験において、雌のＣ５７ＢＬ／６成体マウスの網膜を、上記のようにレーザー光凝固させて、それらの動物を対照グループと試験グループとに分けた。レーザー光凝固の１日後に、リン酸緩衝塩溶液を、対照グループの動物の硝子体内に送達し、それらを、レーザー処理の１４日後に、デキストラン−フルオレセインで潅流した。次いで,検鏡板用試料を調製して、各検鏡板用試料におけるＣＮＶの面積を上記のように測定した。
【０１３４】
レーザー光凝固の１４日後に、ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡを、硝子体内注射により、試験グループの各マウスの一方の眼に注射した。対照として、反対側性の眼に、ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを注射した。これらの試験グループの動物を、高分子量のデキストラン−フルオレセインでレーザー処理の２１日後に潅流した。次いで、検鏡板用試料を調製して、各検鏡板用試料におけるＣＮＶの面積を上記のように測定した。
【０１３５】
この後者の実験において、抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡを、ＣＮＶの成長前ではなく、ＣＮＶの成長中に投与し、それは、湿型ＡＭＤを呈するヒト患者の一層代表的病状である。図６に見られるように、ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ処理した眼のＣＮＶの平均面積は、ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ処理した眼において測定された面積より有意に小さかった(図６Ｃ；Ｐ＜０．０５)。ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ処理した２１日目の眼及び１４日目の対照用(「ＰＢＳ」)眼におけるＣＮＶの平均面積は、有意に異ならなった(図６Ｃ；Ｐ＝０．４６９)。
【０１３６】
これらの実験結果は、加齢関連黄斑変性を、抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡにより治療できることを示している。
【０１３７】
実施例９ − マウスＲＰＥ細胞において抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡにより誘導されたヒトＶＥＧＦのイン・ビボＲＮＡ干渉
Ｃａｎｄ５ｓｉＲＮＡの、イン・ビボで経時的にＶＥＧＦのＲＮＡｉを誘導する能力を下記のように評価した。
【０１３８】
ヒトＶＥＧＦをアデノ随伴ウイルスベクターから発現するＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦを、寛大にも、A. Auricchio博士から提供された。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦを、５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの網膜下に及び両眼に注射した。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦの注射の２８日後に、Ｃａｎｄ５ｓｉＲＮＡを、硝子体内注射により、一方の眼に送達して、対照用ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを、硝子体内注射により、各動物の反対側性の眼に送達した。
【０１３９】
ｓｉＲＮＡ注射後、０日目(プレ−ｓｉＲＮＡ注射)、６、１０及び１４日目に、これらのマウスを犠牲にして、それらの眼を、摘出後、液体窒素中で急速冷凍した。次いで、これらの眼を、溶解緩衝液(Roche, スイス国、Basel)中でホモジェナイズし、全タンパク質を、Bradford アッセイを利用して、上記の実施例５におけるように測定した。２匹のマウスを、０日目の時点のために利用し(ｎ＝２)、６、１０及び１４日目の時点のために、各３匹のマウスを利用した(ｎ＝３)。これらの試料を、全タンパク質について標準化してから、ヒトＶＥＧＦについて、製造者(R & D systems, ミネソタ、Minneapolis)の勧めに従ってＥＬＩＳＡによりアッセイした。各マウスについてのＶＥＧＦのパーセント(ＶＥＧＦ％)を、Ｃａｎｄ５を注射された眼におけるＶＥＧＦ濃度(「[ＶＥＧＦ]」)を、ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを注射された眼における[ＶＥＧＦ]で除して１００を乗ずることにより計算した。
【０１４０】
図７から分かるように、Ｃａｎｄ５の単一注射は、ｓｉＲＮＡの注射後６日で約７０％のＶＥＧＦレベルのＲＮＡｉ媒介による減少を誘導し、ＶＥＧＦ生成の約３５％の減少をｓｉＲＮＡ注射後少なくとも１４日間持続した。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦに向けられたｓｉＲＮＡが、持続的期間にわたるヒトＶＥＧＦのイン・ビボでのＲＮＡｉを誘導することができることを示している。
【０１４１】
実施例１０ − 抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡによるサルにおけるＶＥＧＦのイン・ビボでのＲＮＡ干渉
１０匹の自然のままのカニクイザル(Macaca fascicularis)が、両眼の網膜のレーザー光凝固にかけられ、脈絡膜新血管新生(「ＣＮＶ」)が誘導されることが予想される。下記は、Ｃａｎｄ５ｓｉＲＮＡの、サルにおけるＣＮＶの面積を減少させる能力を評価するために意図された実験計画を表す。Ｃａｎｄ５により標的とされたＶＥＧＦ ＲＮＡ配列は、ヒトと M. fascicularisの両方において同じであり、Ｃａｎｄ５は、M. fascicularisのＶＥＧＦ ＲＮＡのＲＮＡｉを誘導することが予想される。
【０１４２】
この実験を、Sierra Biomedical (「SBi」), 587 Dunn Circle, Sparks, NV, 89431により、SBi's Standard Operating Proceduresに従って行なう。すべてのサルは、身体検査、血液学的及び眼科学的評価、血清化学、並びに網膜電図検査法(「ＥＲＧ」)よりなる完全予備研究健康スクリーンを受ける。サルの眼の予備研究のフルオレセイン血管造影法も又、行なって、眼内圧を予備研究及び２つの追加の時点で研究期間中に測定する。
【０１４３】
０日目に、１０匹すべてのサルの両眼をレーザー光凝固させて、脈絡膜新血管新生を誘導する。これらの動物は、実験中、ケージ側面からの観察を、一日２回受け、食物消費の一日一回の定性的評価を受ける。レーザー誘導後１４日目に、これらのサルは、硝子体内に、治療用及び対照用配合物の５０マイクロリットルの単一投与量を、各眼に、ランダムに、二重盲検法で受ける(下記参照)。例えば、所定の動物は、処理１用量を右眼に、対照用量を左眼に受けることができる。他の動物は、処理１用量を右眼に、処理３用量を左眼に受けることができる。全部で１つの対照及び各４つの眼の４つの処理グループなので、４つの眼が各配合物を受けることが予想される。
【０１４４】
これらの配合物は：対照 − 平衡化塩溶液(「ＢＳＳ」)のみ；処理１ − １ｍｇ／ｍｌ Ｃａｎｄ５(ＢＳＳ中)；処理２ − ２．５ｍｇ／ｍｌ Ｃａｎｄ５(ＢＳＳ中)；処理３ − ５ｍｇ／ｍｌ Ｃａｎｄ５(ＢＳＳ中)；及び処理４ − １０ｍｇ／ｍｌ Ｃａｎｄ５(ＢＳＳ中)となる。注射前に、各配合物のｐＨ、浸透性、及び２６０ｎｍでの吸光度が測定されるということが予想される。
【０１４５】
レーザー誘導後に、毎週、各サルの両眼について、レーザー誘導後７週間にわたって、フルオレセイン血管造影法が行われる。次いで、これらのサルを犠牲にして、全組織収集(硝子体試料を含む約４５組織)及び集めた組織の組織病理学的評価を用いて、完全な検屍を行なう。ＥＲＧは、検屍前に行なわれる。
【０１４６】
ＣＮＶのレーザー誘導された面積は、Ｃａｎｄ５ ｓｉＲＮＡの投与に際して減少し、ＣＮＶ面積は、Ｃａｎ５の投与量を増すと減少するということが予想される。しかしながら、上記の実施例２におけるような平坦効果が認められうる。このＣａｎｄ５ ｓｉＲＮＡは、眼の脈絡膜を除いて他の如何なる器官又は組織においても効果を有するとは予想されない。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】ｓｉＲＮＡで処理してない(「−」)；非特異的ｓｉＲＮＡで処理した(「非特異的」)；又はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した(「ＶＥＧＦ」)酸素欠乏２９３細胞におけるＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／ｍｌ)の棒グラフである。
【図１Ｂ】ｓｉＲＮＡで処理してない(「−」)；非特異的ｓｉＲＮＡで処理した(「非特異的」)；又はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した(「ＶＥＧＦ」)酸素欠乏Ｈｅｌａ細胞におけるＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／ｍｌ)の棒グラフである。
【図２】ｓｉＲＮＡで処理してない(「−」)；非特異的ｓｉＲＮＡで処理した(「非特異的」)；又はヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで処理した(「ＶＥＧＦ」)酸素欠乏ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／ｍｌ)の棒グラフである。
【図３】ＧＦＰｓｉＲＮＡ(濃い灰色の棒)又はヒトＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(薄い灰色の棒)の存在下でヒトＶＥＧＦを発現するアデノウイルス(「ＡｄＶＥＧＦ」)を注入したマウスの網膜におけるヒトＶＥＧＦ濃度(ｐｇ／全タンパク質)の棒グラフである。
【図４】ＧＦＰｓｉＲＮＡの網膜下注入を受けた対照用眼(Ｎ＝９；「ＧＦＰｓｉＲＮＡ」)、及びマウスＶＥＧＦｓｉＲＮＡの網膜下注入を受けた眼(Ｎ＝７；「マウスＶＥＧＦｓｉＲＮＡ」)においてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)を示す棒グラフである。
【図５】ｐＡＡＶｓｉＲＮＡ(この発明の組換えＡＡＶウイルスベクターの生成に使用するシス作動性プラスミド)の図式表示である。
【図６Ａ】網膜下にマウス抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」)又は対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)を注入したマウスの眼における処理おいてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)の棒グラフを示している。
【図６Ｂ】硝子体にマウス抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」)又は対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)を注入したマウスの眼における処理おいてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)の棒グラフを示している。
【図６Ｃ】硝子体に、レーザー誘導後１日目に、ｓｉＲＮＡを含まないリン酸緩衝塩溶液(「ＰＢＳ」；レーザー誘導後１４日目にＣＮＶ面積測定)；レーザー誘導後１４日目に、対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘導後２１日目にＣＮＶ面積測定)；又はレーザー誘導後１４日目に、マウス抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘導後２１日目にＣＮＶ面積測定)を注入されたマウスの眼においてレーザー誘導されたＣＮＶの平均面積(ｍｍ2)の棒グラフである。
【図７】ヒト抗ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ(「Ｃａｎｄ５」)及び対照用ｓｉＲＮＡ(「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」)を、注入後０(ｎ＝２；プレ−ｓｉＲＮＡ注入)、６(ｎ＝３)、１０(ｎ＝３)及び１４(ｎ＝３)日目で網膜下に注入されたマウスの眼におけるＶＥＧＦタンパク質のパーセント(「ＶＥＧＦ％」)のグラフである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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