(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、複数のケトアミンオキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、及びε−糖化ペプチドを消去した後に、α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを用いて前記試料中のα−糖化ペプチドを測定することを含む、ただし、前記ケトアミンオキシダーゼが、α−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素と、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素との組合わせを含む、並びに、前記α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼが、フルクトシルペプチドオキシダーゼであることを特徴とする、糖化蛋白質の測定方法。
【請求項２】
ケトアミンオキシダーゼが、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、コリネバクテリウム属、アースロバクター属又はアグロバクテリウム属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、フサリウム属又はギベレラ属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、ギベレラ属、フサリウム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニウム属、デバリオマイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトアミンオキシダーゼであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
糖化蛋白質が糖化ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
α−糖化アミノ酸、並びに/或いは、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない複数のケトアミンオキシダーゼを含有し、血液試料中のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、及びε−糖化ペプチドを消去することを特徴とし、ただし、前記ケトアミンオキシダーゼが、α−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素と、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素との組合わせを含むことを特徴とする、糖化蛋白質測定用消去試薬。
【請求項８】
ケトアミンオキシダーゼが、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素をさらに含む、請求項７に記載の消去試薬。
【請求項９】
ケトアミンオキシダーゼが、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アグロバクテリウム属、フサリウム属又はギベレラ属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ギベレラ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニウム属、デバリオマイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトアミンオキシダーゼ、或いはそれらの組合わせであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の消去試薬。
【請求項１０】
プロテアーゼを含有する試薬、請求項７〜９のいずれか１項に記載の消去試薬、及びα−糖化ペプチドに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを含有する試薬を含む、かつ、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に使用するためのものである、糖化蛋白質測定用キット。
【請求項１１】
糖化蛋白質が糖化ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定における測定誤差を低減させ、正確な測定値を得るための糖化蛋白質の測定方法、測定誤差原因物質の消去試薬、及び糖化蛋白質測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質であり、糖、すなわちアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖及びその誘導体）側のアルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合することにより生成する。蛋白質側のアミノ基としては、Ｎ末端のα−アミノ基、内部リジン残基の側鎖ε−アミノ基などがあげられ、これらが糖化されることにより、α−糖化蛋白質及び/又はε−糖化蛋白質が生成する。これらの糖化蛋白質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転移を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれる。【０００３】
糖化蛋白質は、例えば生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含有される。血液中に存在する糖化蛋白質の例としては、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどが含まれ、これらの糖化蛋白質の生成は、血清中に溶解しているグルコースなどの糖類の濃度に強く依存する。糖尿病状態では糖化蛋白質の生成が亢進していることが知られており、糖化アルブミンや糖化ヘモグロビンは、血糖値を反映する指標として糖尿病の症状の診断や症状管理に利用され、中でも赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンは過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の症状の診断や症状管理において重要な測定指標となっている。【０００４】
従来、糖尿病の診断を目的とした糖化蛋白質の酵素法測定として、測定対象とする糖化蛋白質をプロテアーゼ等により消化して糖化ペプチド又は糖化アミノ酸を遊離させ、それらに特異的に作用する酵素を用いて測定する方法が知られている。例えば、糖化ヘモグロビンもしくは糖化アルブミンに由来する糖化アミノ酸を、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼを用いて測定する方法が知られている（特許文献１〜５参照）。さらに、これらの方法では正確な測定が困難であったヘモグロビンＡ１ｃ（ヘモグロビン「β鎖」Ｎ末端のＶａｌ（バリン）の、α−位のアミノ基にグルコースが結合した糖化蛋白質、以下ＨｂＡ１ｃとする）の測定に関し、本出願人により、α−糖化ペプチドに作用する酵素（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）を用いた方法が開示されている（特許文献６参照）。【０００５】
上記の各種測定において、糖化蛋白質から遊離し、測定対象となり得る糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとしては、α−糖化アミノ酸、α−糖化ペプチド、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドの４種がある。α−糖化アミノ酸及びα−糖化ペプチドは、糖化蛋白質の糖化されたＮ末端から遊離して生じる。一方、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドは、アミノ酸のε−位の側鎖が糖化された箇所（例えば蛋白質内のリジン残基やアルギニン残基において糖化が起こり得る）から遊離して生じる。【０００６】
例えば、糖化アルブミンの測定にはε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドの和を測定し、ＨｂＡ１ｃの測定にはα−糖化ペプチドを測定する等、測定対象とする糖化蛋白質の種類により、異なる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを、それぞれに特異性の高い酵素を用いて測定するが、この時に、真の測定対象物、すなわち、測定対象とする糖化蛋白質からプロテアーゼによって切り出される特定の糖化アミノ酸又は糖化ペプチド以外の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを測り込んでしまうことは、実際より高い測定値、すなわち測定誤差を生じ得る。そこでこれらへの対策として、糖化ヘモグロビン測定に関し、測定対象物質以外の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを消去する２つの方法が開示されている（特許文献７、８参照）。【０００７】
第１の方法は、予めε−糖化アミノ酸に特異性の高い酵素を用いて試料内の遊離のε−糖化アミノ酸を消去した後、α−糖化アミノ酸とε−糖化アミノ酸の両方に作用する測定酵素を使用することによって、α−糖化アミノ酸のみを測定するものである（特許文献７参照）。この方法は試料中の遊離のε−糖化アミノ酸やε−糖化ペプチドの一部の測り込みを回避できるが、例えば高カロリーのアミノ酸輸液を受けている患者等において、輸液中であるいは輸液を受けた後に血中で生成し得る遊離のα−糖化アミノ酸を消去することができないという問題を有している。すなわち、消去用酵素ではα−糖化アミノ酸夾雑物を消去できず、さらに測定用酵素では、同じα−糖化アミノ酸を遊離のものかプロテアーゼで切り出されたものかで区別できないため、この方法では遊離のα−糖化アミノ酸が消去されることなく測り込まれ、誤差原因となり得る。【０００８】
第２の方法では、α−糖化アミノ酸もしくはα−糖化ペプチドに作用する酵素を、消去用と測定用に共に使用する（特許文献８参照）。すなわち、測定用酵素が作用し得る基質を、プロテアーゼ処理前の試料から予め消去しておき、プロテアーゼ処理により新たに生じる測定基質のみを測定することにより、測定対象糖化蛋白質のみに由来するα−糖化アミノ酸もしくはα−糖化ペプチドを測定する。この方法によれば、測定用酵素（＝消去用酵素）の基質であって、かつプロテアーゼ処理前に遊離状態である夾雑物に由来する測定誤差を回避することができるが、依然として測定用酵素（＝消去用酵素）の基質特異性に起因する問題が残る。この方法では、ε−糖化アミノ酸を模したモデル夾雑物が良好に消去される。すなわちこの方法の測定用酵素（＝消去用酵素）は測定対象のα−糖化アミノ酸もしくはα−糖化ペプチドにも、消去対象のε−糖化アミノ酸にも良好に作用する。ところで、プロテアーゼ処理に供される試料中にはヘモグロビン、さらに試料中に夾雑するヘモグロビン以外の血液蛋白質、及びプロテアーゼ自身を含む複数の蛋白質が混在し、それらの内部に複数のε−糖化部分を含むため、これらもまたプロテアーゼ処理により遊離してε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドを生じるが、この方法においては測定酵素によるこれらの測り込みが避けられない。従って、α−糖化アミノ酸又は糖化ペプチドのみを正確に測定する方法としては十分とは言えない。【０００９】
したがって、糖化蛋白質の酵素法測定において、測定誤差の原因となる物質を消去するための糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの消去方法及び消去試薬に関する技術は、さらなる向上が望まれていた。
【特許文献１】特公平５−３３９９７号公報
【特許文献２】特公平６−６５３００号公報
【特許文献３】特開平５-１９２１９３号公報
【特許文献４】特開平６−４６８４６号公報
【特許文献５】国際公開第９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献６】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献７】国際公開第０２／０６１１１９号パンフレット
【特許文献８】特開２００４−１１３０１４号公報
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定における測定誤差を低減させ、正確な測定値を得るための糖化蛋白質の測定方法及び測定誤差原因物質の消去試薬、並びに糖化蛋白質測定用キットを提供することである。より具体的には、測定試料中のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去した後に、α−糖化ペプチドに作用する酵素を用いて前記試料中のα−糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化蛋白質の測定方法、及びこの測定に使用する消去試薬、並びに糖化蛋白質測定用キットを提供することを課題とする。
【００１１】
発明の概要
上記の目的を達成するために、本発明者らは、糖化ヘモグロビンの測定において測定誤差の原因となる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの消去法について鋭意検討を行った。その結果、全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去した後に、α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを用いて前記試料中のα−糖化ペプチドを測定することにより、糖化蛋白質の測定方法における測定誤差が低減され、正確な測定値が得られることを見出した。
【００１２】
前記消去試薬は、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、又はそれらの組合わせ物に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有し、試料中のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする。
【００１３】
さらにこの消去試薬と、プロテアーゼを含有する試薬、及びα−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを含有する試薬を含むキットは、測定誤差が低減され、正確な測定値が得られる糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定のために有用であることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下に関する。
【００１５】
（１）全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去した後に、α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを用いて前記試料中のα−糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化蛋白質の測定方法。
【００１６】
（２）ケトアミンオキシダーゼが、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドを消去することを特徴とする、（１）に記載の方法。
【００１７】
（３）ケトアミンオキシダーゼが、α−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素、ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素、ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素、あるいはそれらの酵素の組合わせであることを特徴とする、（１）に記載の方法。
【００１８】
（４）α−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、コリネバクテリウム属、アースロバクター属又はアグロバクテリウム属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、（３）に記載の方法。
【００１９】
（５）ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドに作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、フサリウム属又はギベレラ属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、（３）に記載の方法。
【００２０】
（６）ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない酵素が、ギベレラ属、フサリウム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニウム属、デバリオマイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトアミンオキシダーゼであることを特徴とする、（３）に記載の方法。
【００２１】
（７）α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼが、フルクトシルペプチドオキシダーゼであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（８）糖化蛋白質が糖化ヘモグロビンであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（９）α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド又はそれらの組合わせ物に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有し、試料中のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする消去試薬。
【００２４】
（１０）ケトアミンオキシダーゼが、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アグロバクテリウム属、フサリウム属又はギベレラ属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ギベレラ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニウム属、デバリオマイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトアミンオキシダーゼ、またはそれらの組合わせであることを特徴とする、（８）に記載の消去試薬。
【００２５】
（１１）プロテアーゼを含有する試薬、（９）又は（１０）に記載の消去試薬、及びα−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを含有する試薬を含む糖化蛋白質測定用キット。
【００２６】
（１２）α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼが、フルクトシルペプチドオキシダーゼであることを特徴とする、（１１）に記載のキット。
【００２７】
本発明によれば、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定における測定誤差が低減され、正確な測定値が得られるようになる。また、この測定に使用する消去試薬、及び、測定誤差が低減され正確な測定値が得られる糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質測定用キットを提供でき、臨床診断分野において有用である。
【００２８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-208737号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【００２９】
詳細な説明
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
【００３０】
本発明における糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質であり、糖、すなわちアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖及びその誘導体）側のアルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合することにより生成したものである。糖化蛋白質における糖化部位には、蛋白質分子を構成するポリペプチドにおけるＮ末端α−アミノ基が糖化されて生成するα−糖化部位と、蛋白質分子内部のアミノ酸残基の側鎖におけるε−アミノ基が糖化されて生成するε−糖化部位がある。
【００３１】
糖化蛋白質は、生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含有され、各種糖化蛋白質の生成は、その蛋白質が局在する環境中のグルコースなどの糖濃度に強く依存している。例えば、血液中の糖化蛋白質の生成は、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値と相関している。血液中に存在する糖化蛋白質の例としては、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、これらは血糖値を反映する指標として、糖尿病の症状の診断や症状管理において用いられている。
【００３２】
糖化ヘモグロビンはさらに、糖化のされ方、あるいは定義のされ方により数種類に区別されるが、糖尿病の症状の診断や症状管理において特に重要視されている糖化ヘモグロビンがＨｂＡ１ｃである。ＨｂＡ1ｃは、α２β２の４量体構造を有するヘモグロビン分子の、少なくとも「β鎖」におけるＮ末端のＶａｌ（バリン）が糖化されたものと定義され、ＨｂＡ1ｃは過去の一定期間の平均血糖値を良好に反映する指標として、特に重要視されている。
【００３３】
Ｄｅｌｐｉｅｒｒｅ、Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２７９:２７６１３−２０（２００４）に、糖化ヘモグロビンにおいて糖化を受けている残基が示されており、該文献中のＴａｂｌｅ ＩＩにおいて、糖化ヘモグロビンは「β鎖」のＮ末端のＶａｌ以外には、「α鎖」では１６番目、６１番目及び１３９番目のＬｙｓ（リジン）、「β鎖」では１７番目、５９番目、６６番目、１３２番目及び１４４番目のＬｙｓ残基が糖化を受けていることが記載されている。「α鎖」のＮ末端のＶａｌはほとんど糖化されておらず、これはヘモグロビン分子の立体構造特性によるものと考えられる。
【００３４】
通常、糖化ヘモグロビンを測定する場合には、上記の全ての糖化部位における糖化を測定する、すなわち、全ての糖化部位に由来する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを測定する。これに対し、ＨｂＡ1ｃを測定する場合には、糖化ヘモグロビン「β鎖」のＮ末端のＶａｌにおける糖化のみを測定する、すなわち、「β鎖」のＮ末端由来のα−糖化アミノ酸及び/又はα−糖化ペプチドのみを測定する。
【００３５】
なお、上記のように、ＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、α−糖化アミノ酸を測定する方法又はα−糖化ペプチドを測定する方法があるが、以下の理由により、α−糖化ペプチドを測定する方法がより好ましい。
【００３６】
第１に、糖化蛋白質からＮ末端のα−糖化ペプチドを効率よく遊離させることができるプロテアーゼが数多く知られているのに対し、Ｎ末端のα−糖化アミノ酸を遊離させることができるプロテアーゼは見出されていない。すなわち、糖化蛋白質の量を反映して糖化蛋白質のＮ末端のα−糖化部位から遊離してくる物質は、事実上α−糖化ペプチドのみである。
【００３７】
第２に、たとえ糖化蛋白質のＮ末端のα−糖化部位からα−糖化アミノ酸を効率よく遊離させることのできるプロテアーゼが見出された場合でも、これを用いて糖化ヘモグロビンからα−糖化アミノ酸を遊離させる際には、糖化ヘモグロビンの「α鎖」及び「β鎖」の糖化Ｎ末端から共にα−糖化アミノ酸が遊離して、これらを区別することができない。すなわち、糖化ヘモグロビンの「α鎖」及び「β鎖」のＮ末端の１残基目のアミノ酸配列はいずれもＶａｌであり、遊離するα−糖化アミノ酸は共にフルクトシルバリンであることから、「β鎖」の糖化のみを測定することができない。
【００３８】
糖化ヘモグロビンは赤血球中に局在する。すなわち、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合は、赤血球を含む試料を測定することが好ましく、具体的には、全血及び/又は血球試料が好適に使用できる。本明細書中に記載の全血及び/又は血球試料には、採血、又は保存用血液、市販の標準血液（例えば、ＨｂＡ１ｃ測定用常用標準物質：福祉・医療技術振興会製、東京、日本国）等を含み、各種方法により処理したものや、抗凝固剤その他の各種添加物質を添加したものを含む。
【００３９】
全血とは、血液の全成分を含むものであり、主要成分として赤血球、白血球、血小板、血漿等を含有する。血球試料とは、全血から血漿成分を分離除去した画分であり、主要成分として赤血球、白血球、血小板等を含有する。全血からの血球試料の分離方法は特に制限されず、例えば遠心分離操作や、血清分離シート（血球分離膜）の使用等により分離を行うことができる。
【００４０】
糖化ヘモグロビン測定の場合、全血及び/又は血球試料は、溶血させたものを測定に使用する。一般的な糖化ヘモグロビン測定においては、全血をそのまま溶血させ、又は全血から遠心分離等により血漿を除去し、血球画分を分離してこれを溶血させる。溶血方法は特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結融解による方法等が使用できる。このようにして得られた試料を、プロテアーゼ処理等を含む測定用の各処理に供する。
【００４１】
一方、ＨｂＡ1ｃと比べてより短期の血糖コントロールの指標として、糖化アルブミンが用いられる場合がある。血清中に主に含まれるタンパク質であるアルブミンは、内部の４箇所のＬｙｓ残基において糖化を受けることが知られている。ＨｂＡ1ｃを測定する場合と同様、糖化アルブミンを測定する際も、サンプル中に夾雑する糖化物を効率的に消去し、アルブミン内部の糖化されたＬｙｓ残基に由来する糖化物のみを測定する必要がある。
【００４２】
本明細書中において、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する各種オキシダーゼ（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、フルクトサミンオキシダーゼ、アマドリアーゼ、などの様々な名称で呼ばれる）を便宜上まとめて「ケトアミンオキシダーゼ」もしくは「消去用酵素」と称する。この定義によれば、本発明において測定用酵素として用いる、α−糖化ペプチドを測定するための酵素もケトアミンオキシダーゼに含まれ得るが、説明上の混乱を避ける目的で、この酵素のみ「α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼ」もしくは「測定用酵素」と記載する。なお実際に、既知の上記ケトアミンオキシダーゼの中でα−糖化ペプチドに特異性の高い酵素は存在しないので、そのような観点からも両者は明確に区別できる。
【００４３】
本発明の「測定用酵素」としては、α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼ、例えばフルクトシルペプチドオキシダーゼが好ましい。そのような酵素の例としては、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ属（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属又はアルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属由来の酵素等が挙げられる（Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８０：２２７−３１，２００３及び特開２００４−２７５０６３号）。市販の酵素としては、ＦＰＯＸ−ＥＥ、ＦＰＯＸ−ＣＥ（いずれもキッコーマン社製、日本国）が挙げられる。また、遺伝子操作糖化アミノ酸オキシダーゼ（特開２００１−９５５９８号）も知られている。本発明におけるフルクトシルペプチドオキシダーゼの活性は、特開２００３−２３５５８５号公報（新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ）記載の方法にて測定し、３７℃、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００４４】
本発明の方法における測定値に及ぼす誤差原因物質の影響の程度は、測定用酵素であるフルクトシルペプチドオキシダーゼの基質特異性にも依存する。すなわち、使用するフルクトシルペプチドオキシダーゼの基質特異性が高いほど、必ずしも完全な消去操作を要さなくても正確な測定値が得られやすく、逆に、夾雑物質を測り込みやすい基質特異性を有するフルクトシルペプチドオキシダーゼを使用する場合には、より完全に各種夾雑物質を消去する必要が生じる。例えば、α−糖化アミノ酸を測り込みやすいフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いる場合、α−糖化アミノ酸の消去は、正確な測定値を得るために必須である。
【００４５】
また、同じα−糖化ペプチドであっても、その配列を識別して、特定のα−糖化ペプチドのみを測定できる基質特異性の高いフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いれば、さらに特定的な測定が可能である。例えば、糖化ヘモグロビンの「α鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドであるＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（フルクトシルバリルロイシン）には作用せず、「β鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドであるＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（フルクトシルバリルヒスチジン）には作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いることにより、「α鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドを消去することなく、「β鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドのみを測定することもできる。そのような酵素としては、ＦＰＯＸ−ＥＥ、ＦＰＯＸ−ＣＥ（いずれもキッコーマン社製、日本国）が知られている。
【００４６】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、かつ処理に供する試料中の測定対象糖化蛋白質、例えば糖化ヘモグロビンから、少なくともα−糖化ペプチドを有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いても良い。そのようなプロテアーゼの例としては、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン（ズブチリシン）、カルボキシペプチダーゼＢ、パンクレアチン、カテプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼが挙げられる。
【００４７】
特にα−糖化ペプチドを効率よく遊離するプロテアーゼとしては、アスペルギルス由来プロテアーゼでは、例えば、「ＩＰ酵素ＴＭ」、「ＡＯプロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、「モルシンＴＭ」（以上キッコーマン社製、日本国）、「プロテアーゼＡ５」（協和化成社製、日本国）、「ウマミザイム」、「プロテアーゼＡ」、「プロテアーゼＭ」、「プロテアーゼＰ」「ペプチダーゼＲ」（以上天野エンザイム社製、日本国）、「スミチームＭＰＴＭ」、「スミチームＬＰ−２０ＴＭ」、「スミチームＬＰＬＴＭ」、「スミチームＡＰＴＭ」（以上新日本化学工業社製、日本国）、「プロテイナーゼ６」（フルカ社製、米国）、リゾプス由来酵素では、「ペプチダーゼＲ」（天野エンザイム社製、日本国）、バチルス由来プロテアーゼから、「ディスパーゼ」（ロシュ社製、スイス）、「サチライシン」（ベーリンガー社製、ドイツ）、「プロテイナーゼＮ」（フルカ社製、米国）、「プロテイナーゼＴｙｐｅVII」（シグマ社製、米国）、「プロテイナーゼ,Ｂａｃｔｅｒｉａｌ」（フルカ社製、米国）、「プロテアーゼＮ」、「プロレザーＦＧ−ＦＴＭ」、「プロテアーゼＳ」（以上天野エンザイム社製、日本国）、「プロテイナーゼＴｙｐｅＸ」（シグマ社製、米国）、「サーモリシン」（大和化成社製、日本国）、「プロナーゼＥ」（科研化学社製、日本国）、「中性プロテアーゼ」（東洋紡績社製、日本国）、ストレプトマイセス由来プロテアーゼでは、「プロナーゼ」（ベーリンガー社製、ドイツ）、「プロテイナーゼＴｙｐｅＸＩＶ」（シグマ社製、米国）、「アルカリプロテアーゼ」（東洋紡績社製、日本国）、トリチラチウム由来プロテアーゼから、「プロテイナーゼＫ」（ロシュ社（スイス）、和光純薬社製（日本国））、スタフィロコッカス由来プロテアーゼでは、「Ｇｌｕ−Ｃ」（ベーリンガー社製、ドイツ）、植物由来プロテアーゼでは、パパイン（ロシュ社（スイス）、和光純薬社（日本国）、シグマ社、天野エンザイム社（日本国）、アサヒ社製（日本国））、フィシン（シグマ社製、米国）、ブロメライン（天野エンザイム社（日本国）、シグマ社（米国）製、）、動物由来プロテアーゼでは、「パンクレアチン」（和光純薬社製、日本国）、カテプシンＢ（シグマ社製、米国）等のプロテアーゼを含むものが特に好適に用いられる。
【００４８】
上記プロテアーゼは、単独で用いても、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、糖化ヘモグロビンは、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃにより、α−糖化ヘキサペプチド（フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）が生成することが知られている（Ｋｏｂｏｌｄ Ｕ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ４３： １９４４−１９５１）。そのため、Ｇｌｕ−Ｃと上記プロテアーゼを組み合わせることは、糖化ヘモグロビンからα−糖化ペプチドを製造するのに極めて有効な方法である。なお、上記のプロテアーゼ群は具体的な一例に過ぎず、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明においてプロテアーゼを選択する際には、測定対象とする糖化蛋白質から、α−糖化ペプチドを効率よく切り出してくることと同時に、夾雑物質の生成をできる限り抑制するという観点からの酵素の選択を行うこともできる。すなわち、測定試料中に含まれる、測定対象糖化蛋白質以外の糖化蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/又はペプチドを夾雑物質として予測し、それらを生成しにくいタイプのプロテアーゼを選択することにより、夾雑物質の生成を抑制できる。既知の各種プロテアーゼがどのようなアミノ酸残基間の結合を切断しやすいかに関しては非常に多くの知見があり、この情報などに基づいてプロテアーゼを選択することができる。
【００５０】
試料のプロテアーゼ処理条件は、用いるプロテアーゼが糖化ヘモグロビンに作用し、α−糖化ペプチドを短時間に効率よく遊離する条件であれば、いかなる条件でもよい。使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれる糖化ヘモグロビンの含量あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＰ、天野（株）販売、日本国）を、終濃度が０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように加える。さらに必要により適宜他のプロテアーゼを加えてもよい。
【００５１】
プロテアーゼで処理する際のｐＨは、無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ３〜８に調整してもよい。処理温度は、例えば、２０〜５０℃で行ってもよく、用いる酵素によっては、より高温域の４５〜７０℃で行ってもよい。この際の処理時間は、糖化蛋白質を分解するのに充分な時間であればよく、３０秒〜１８０分間、好ましくは１〜６０分間で行うことができる。得られる処理液は、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮、希釈等をしてもよい。
【００５２】
本発明に使用可能なプロテアーゼの活性はカゼインフォリン法により測定し、３７℃、１分間において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕと定義した。
【００５３】
本発明で消去の対象となる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドは、血液、血漿、血清等の中に含まれている遊離の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドのみならず、プロテアーゼ処理により測定対象物である糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドが生成するのと同時に生成する、ヘモグロビン及びヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む。すなわち、糖化ヘモグロビン測定の際には、糖化ヘモグロビンのプロテアーゼ処理で切り出されたα−糖化ペプチドのみが測定対象物となるが、ヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチド、さらには糖化ヘモグロビン由来のε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、α−糖化アミノ酸が誤差原因となり得る。
【００５４】
すなわち、この系において測定対象とすべき物質とは、糖化ヘモグロビン由来のα−糖化ペプチドのみである。一方、消去の対象とすべき夾雑物質とは、遊離のα−糖化アミノ酸、α−糖化ペプチド、ε−糖化アミノ酸、及びε−糖化ペプチドであり、さらに、ヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来のα−糖化アミノ酸、α−糖化ペプチド、ε−糖化アミノ酸、及びε−糖化ペプチドであり、さらに、糖化ヘモグロビン由来のε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸である。
【００５５】
さらに、上記測定対象物質であるヘモグロビン由来のα−糖化ペプチドには、２種類がある。これはヘモグロビン分子が「α鎖」及び「β鎖」という異種のサブユニットからなり、両者のＮ末端アミノ酸配列が異なることに起因し、ヘモグロビン分子内のどちらのサブユニットから遊離してくるかの違いによって、構造の異なるα−糖化ペプチドが生じることによる。「α鎖」「β鎖」のいずれに由来するかによらず、α−糖化ペプチドの和を測定する場合には、両者を区別する必要はない。一方、特定のサブユニットに由来するα−糖化ペプチドの量のみを測定する意図がある場合には、他方のサブユニットに由来するα−糖化ペプチドもまた、夾雑物質とみなされる。例えば、ＨｂＡ１ｃ測定は、ヘモグロビン「β鎖」から遊離するα−糖化ペプチドを測定するものであるから、「α鎖」由来のα−糖化ペプチドは、原理上、誤差原因夾雑物質となり得る。以下、各種夾雑物質の消去について、又は消去が行えない夾雑物質が本発明の測定値に及ぼす影響に関し、順に説明する。
【００５６】
まず、ケトアミンオキシダーゼで消去可能な各種夾雑物質に関して述べる。測定用酵素であるフルクトシルペプチドオキシダーゼによりα−糖化ペプチドを測定する際に、例えばフルクトシルペプチドオキシダーゼの基質特異性が極めて高く、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、あるいはε−糖化ペプチドなどの夾雑物質に実質的に作用しないのであれば、これらの消去はあえて必要とされないことは当然である。しかし、これまでに知られている各種フルクトシルペプチドオキシダーゼはいずれも、程度の差はあれ多少夾雑物質に作用し、中でも、構造類似性の高いα−糖化アミノ酸に対しては作用しやすい傾向を有している。従って、本発明においては、正確な測定を実現するために、特にα−糖化アミノ酸の消去が重要である。従来のケトアミンオキシダーゼによる測定系ではα−糖化ペプチドとα−糖化アミノ酸との区別に着目した測定ができなかったが、本発明では各種ケトアミンオキシダーゼを消去用に、フルクトシルペプチドオキシダーゼを測定用に使うことにより、α−糖化アミノ酸を消去しα−糖化ペプチドのみを測定できるようになり、効率的な消去が実現される。
【００５７】
さらに測定誤差を低減するために、本発明では、ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドを重ねて消去することができる。当然ながら、試料の性質上あるいは測定用酵素の基質特異性上、あえて消去を必要としない場合には、追加的な消去を行わなくてもよい。また、消去用酵素の基質特異性を利用して、同一の酵素で同時に複数の物質を消去することもでき、あるいは複数の酵素を組み合わせて各酵素の作用により複数の物質を消去してもよい。例えば、ε−糖化アミノ酸とε−糖化ペプチドは、ある種の酵素により共に消去される傾向がある。
【００５８】
次に、ケトアミンオキシダーゼで消去不可能な夾雑物質について述べる。すなわちこの夾雑物質とはα−糖化ペプチドであり、具体的には、遊離のα−糖化ペプチド及びヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来のα−糖化ペプチド、さらに、ＨｂＡ１ｃ測定時におけるヘモグロビン「α鎖」由来のα−糖化ペプチドを指す。これらは消去用酵素であるケトアミンオキシダーゼでは消去できず、測定系内に残る可能性を有する。しかし、本発明の目的とする糖化蛋白質の測定系、特に糖化ヘモグロビンの測定系において、これらが測定値に与える影響は少ない。その根拠としては以下が考えられる。
【００５９】
まず１点目に、輸液等の影響を受けて増加する可能性が高い遊離の夾雑物の多くは糖化アミノ酸であり、遊離の糖化ペプチドが増加する可能性は低い。輸液中に多く含まれるのはペプチドではなくアミノ酸であるためである。
【００６０】
２点目に、糖化蛋白質のプロテアーゼ処理により遊離するα−糖化ペプチドは、原理上、その糖化蛋白質を構成する各ポリペプチドの各Ｎ末端から、最大１個ずつしか生じ得ないため、糖化蛋白質内部に複数のε−糖化部位を含むことにより多量に遊離する可能性を有するε−糖化ペプチドに比較して、夾雑し得る絶対量が少ない。
【００６１】
３点目に、ＨｂＡ１ｃにおいては、ヘモグロビン「α鎖」由来のα−糖化ペプチドの夾雑は現実にほとんど起こらない。Ｄｅｌｐｉｅｒｒｅ、Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２７９:２７６１３−２０（２００４）のＴａｂｌｅ ＩＩにおいて、糖化ヘモグロビンにおいて糖化を受けている部位ごとの相対量が示されており、これにおいて「β鎖」のＮ末端におけるα−糖化が最も多く、相対量０．３２である。また、「α鎖」内部のε−糖化の合計相対量は約０．４、「β鎖」内部のε−糖化の合計相対量は０．２２である。これに対し、「α鎖」のＮ末端におけるα−糖化の相対量は０．０１にすぎず、従って、ヘモグロビン「α鎖」由来のα−糖化ペプチドの夾雑は実質的な問題とならず、本発明の測定方法において、夾雑物としてのα−糖化ペプチドが消去されないことは測定値に実質的な悪影響を与えない。
【００６２】
万一、遊離のα−糖化ペプチドが特に多く夾雑するような状況が起こり得たとしても、その場合には、プロテアーゼ処理前にフルクトシルペプチドオキシダーゼによるα−糖化ペプチド消去を行うことにより、プロテアーゼ処理後に新たに遊離するα−糖化ペプチドのみを算出することができる。また、プロテアーゼの選択に関し上述した通り、夾雑物の生成が極力抑制されるような基質特異性を有するプロテアーゼを選択することによっても、夾雑物としてのα−糖化ペプチドの生成を十分に抑制することができる。
【００６３】
加えて、フルクトシルペプチドオキシダーゼの選択に関し上述した通り、例えば糖化ヘモグロビンの「α鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドであるＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（フルクトシルバリルロイシン）には作用せず、「β鎖」側から遊離し得るα−糖化ペプチドであるＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（フルクトシルバリルヒスチジン）には作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いることにより、測定酵素により夾雑物質を測り込むことなく、正確な測定値を得ることが可能である。
【００６４】
本発明の「消去用酵素」としては、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良い。「ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼ」、「α−糖化アミノ酸に作用するケトアミンオキシダーゼ」及び/又は「ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチド、及びα―糖化アミノ酸に作用するケトアミンオキシダーゼ」が好ましい。
【００６５】
「ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドに特異性の高いケトアミンオキシダーゼ」の例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属由来の酵素などが知られている。具体的には、フルクトシルリジンオキシダーゼ（フサリウム属由来、ギベレラ属由来、特開平11-243950参照）、ケトアミンオキシダーゼ（フサリウム属由来、Ｇｅｎｚｙｍｅ社（米国）販売）、フルクトサミンオキシダーゼ（旭化成（日本）製、ＰＣＴ／ＪＰ０２／００７２１参照）などが挙げられる。これらの酵素は、α−糖化アミノ酸に実質的に作用しない点で特徴的である。
【００６６】
また、「α−糖化アミノ酸に特異性が高いケトアミンオキシダーゼ」の例としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）由来の酵素などが知られている。ＦＡＯＸ−Ｃ（コリネバクテリウム由来、Ｂｉｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６：１２５６−６１，２００２参照）、ＦＡＯＸ−ＴＥ（コリネバクテリウム由来、キッコーマン社（日本）製）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（コリネバクテリウム属由来、シグマ・アルドリッチ社（米国）製）、ＡｇａＥ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（アグロバクテリウム属由来、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６：２３２３−９，２００２参照）、ＡｒＦＡＯＤ（アースロバクター属由来、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２７: ２７−３２，２００５参照）などが挙げられる。これらの酵素は、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに実質的に作用しない点で特徴的である。
【００６７】
また、「ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチド、及びα−糖化アミノ酸に作用するケトアミンオキシダーゼ」の例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属及びトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の酵素などが知られている。具体的には、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（フサリウム属由来、特開平８−１５４６７２参照）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ペニシリウム属由来、アスペルギルス・テレウス由来、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２： ４９９−５０５，１９９６参照）、フルクトシルアミンオキシダーゼ（アスペルギルス属由来、Ａｇｒｉｃ ｂｉｏｌ ｃｈｅｍ ５５： ３３３−８，１９９１参照）、アマドリアーゼI、II（アスペルギルス・フミガーツス由来、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２：３４３７−４３ １９９７参照）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス属由来、Ｄｉａｚｙｍｅ社（米国）製）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス・ニドランス由来、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８ ：３４４−５０，２００２参照）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５８８２−９０，２００４参照）、フルクトシルアミンデグリカーゼ（カンジダ属由来、米国特許第５３８７１０９号参照）、ケトアミンオキシダーゼ（アクレモニウム属、デバリオマイセス属由来、米国特許第５３７０９９０号参照）、フルクトシルアミンオキシダーゼ（ピキア属由来、Ｍａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６： ６２５−３２，２００４ 参照）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（トリコスポロン属由来、特開２０００−２４５４５４号参照）、フルクトシルアミン酸化酵素（バチルス属由来、特開２００２−１２５６６３号参照）、ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社（日本）製、特開２００４−２２２５７０号参照）、ＦＡＯＤ−Ｅ（キッコーマン社（日本）製）などが挙げられる。
【００６８】
なお、これらの酵素を含め上記した全てのケトアミンオキシダーゼは、α−糖化ペプチドに対し作用しない。従って、これらを任意に組み合わせて消去を行うことにより、α−糖化ペプチドを残して、夾雑物質を効率よく消去することができる。複数の酵素の組み合せにより、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドを全て消去することが、夾雑物質をより完全に消去できる点で最も好ましい。
【００６９】
ケトアミンオキシダーゼの活性は特開平１１−１５５５７９号公報（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子、新規な組換え体ＤＮＡ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法）記載の方法にて測定し、３７℃、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００７０】
本発明の「消去用酵素」は、処理液中に含まれる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、例えば、ｐＨ３〜１１、特に好ましくはｐＨ５〜９であり、ケトアミンオキシダーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように、緩衝剤を用いて調整するのが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。ｐＨの調製法は、特に限定されず、緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。また、必要により適宜、反応液のｐＨを、緩衝剤を用いて上記ｐＨに調整してもよい。
【００７１】
作用時間は、例えば、１〜１２０分間、好ましくは１〜３０分間であり、基質となる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの量にもよるが、ケトアミンオキシダーゼが、それらに作用するのに充分な時間であればよい。作用温度は、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
【００７２】
ケトアミンオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、カタラーゼ等によって分解してもよい。本発明に用いられる緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。さらに必要により、本発明の目的を損なわない範囲で、種々の添加物、例えば、溶解補助剤、安定化剤等として、界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
【００７３】
糖化ヘモグロビンを含有する試料をプロテアーゼ処理後、本発明の「消去用酵素」を用いて誤差原因物質を消去する。この消去をプロテアーゼ処理後に行うことは重要である。本発明者らは、実際にプロテアーゼ処理前に消去を行ったところ、定量的な正確な測定はできなかった。これに対して、本発明は、この消去を、プロテアーゼ処理後の試料に対し、１種類以上のケトアミンオキシダーゼを作用させて行うことを特徴とする。
【００７４】
消去用酵素は、α−糖化アミノ酸を消去する酵素、ε−糖化アミノ酸及び/又はε−糖化ペプチドを消去する酵素、あるいはこれらのいかなる組合わせで用いてもよいが、処理後に試料中の遊離のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、及びε−糖化ペプチドが消去され、α−糖化ペプチドが残ることが望ましく、このためには「α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用するケトアミンオキシダーゼ」及び「ε−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び/又はペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼ」を組み合わせて用いることが望ましい。また、ケトアミンオキシダーゼはα−糖化ペプチドに作用しないことが望ましい。プロテアーゼ処理前時点で消去対象物質が特に多量に存在することが明らかな場合等には、プロテアーゼ処理前に別途消去工程をさらに導入してもよい。
【００７５】
プロテアーゼ処理後に消去用酵素を作用させる際には、プロテアーゼが消去用酵素を迅速に分解してしまわないように、反応条件を工夫することができる。例えば、プロテアーゼと消去用酵素の反応至適ｐＨや作用適温の相違、また各酵素の活性に及ぼす塩類や金属、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤の影響などを考慮して、プロテアーゼが消去用酵素を分解しにくい条件を設定することができる。また、処理液の希釈や消去酵素の大量添加等により、両酵素の量的バランスを調整する方法も使用可能である。あるいは、膜濾過、クロマトグラフィー、塩析等の方法によりプロテアーゼを物理的に除去することもできる。又は熱処理、酸・アルカリ処理、希釈等によってプロテアーゼを失活させることも可能である。プロテアーゼによる消去用酵素の分解が測定値に悪影響を与えない程度にとどまるのであれば、特別な条件設定を行わないことも可能である。
【００７６】
本発明の方法はさらに、消去対象物質の消去後に、α−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを用いて、α−糖化ペプチド量を測定することを含む。例えば、消去後に、試料に「測定用酵素」であるＦＰＯＸなどのフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させてα−糖化ペプチド量を正確に測定することができる。
【００７７】
用いるフルクトシルペプチドオキシダーゼは処理液中に含まれるα−糖化ペプチドの量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、例えば、ｐＨ３〜１１、特に好ましくはｐＨ５〜９であり、フルクトシルペプチドオキシダーゼの至適ｐＨを考慮し、測定に適したｐＨとなるように、緩衝剤を用いて調整するのが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。ｐＨの調製法は、特に限定されず、緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。また、必要により適宜、プロテアーゼ処理後の処理液のｐＨを、緩衝剤を用いて上記ｐＨに調整してもよい。作用時間は、例えば、１〜１２０分間、好ましくは１〜３０分間であり、基質となる糖化ペプチドの量にもよるが、フルクトシルペプチドオキシダーゼが、それらのペプチドに作用するのに充分な時間であればよい。作用温度は、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
【００７８】
フルクトシルペプチドオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、いかなる方法により測定してもよく、例えば、酸素電極を用いる電気的方法、好ましくは、パーオキシダーゼ及び適当な発色基質を用いる酵素的方法等が挙げられる。例えば、本発明では、酵素的方法を用いて、短時間に、簡単な操作で測定を行うことが好ましい。酵素的方法により過酸化水素を測定するための試薬としては、例えば、緩衝剤（ｐＨ４〜１０が好ましい）５〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭ、発色基質として４−アミノアンチピリン０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．１〜２０ｍＭ、パーオキシダーゼ０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜２０Ｕ／ｍｌ等の組成を含む試薬を挙げることができる。測定系に用いられる緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
【００７９】
発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。
【００８０】
さらに必要により種々の添加物、例えば、溶解補助剤、安定化剤等として、界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
【００８１】
過酸化水素の測定を行う際、一般に、オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成する工程を同時に行うことが好ましく、本発明では、前述の過酸化水素を測定するための試薬に、フルクトシルペプチドオキシダーゼを、例えば、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬ添加することが好ましい。これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。
【００８２】
また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。測定温度は、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。測定に要する時間は、種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．１〜６０分間、特に、１〜１０分間が好ましい。上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
【００８３】
本発明はさらに、α−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド又はそれらの組合わせ物に作用し、かつα−糖化ペプチドに作用しない１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有し、試料中のα−糖化アミノ酸、ε−糖化アミノ酸、ε−糖化ペプチド又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする消去試薬を提供する。
【００８４】
本発明で消去用に用いるケトアミンオキシダーゼを組み合わせることにより、消去試薬を調製することができる。この消去試薬を使用することによって、目的とする複数の消去対象物質を同時に効率よく消去できる。この消去試薬は、基質特異性の異なる、上で説明した１種類以上のケトアミンオキシダーゼを含有し、さらに、消去効率を向上させ、酵素の安定化に貢献する各種の安定剤や緩衝剤その他の成分を含んでも良い。
【００８５】
ケトアミンオキシダーゼの具体例は、上記「消去用酵素」の具体例に挙げた酵素、即ち、フルクトシルリジンオキシダーゼ（フサリウム属又はギベレラ属由来）、ケトアミンオキシダーゼ（フサリウム属由来、Ｇｅｎｚｙｍｅ社（米国）販売）、フルクトサミンオキシダーゼ（旭化成（日本）製）、ＦＡＯＸ−Ｃ（コリネバクテリウム由来）、ＦＡＯＸ−ＴＥ（コリネバクテリウム由来、キッコーマン社（日本）販売）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（コリネバクテリウム属由来、シグマ・アルドリッチ社（米国）販売）、ＡｇａＥ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（アグロバクテリウム属由来）、ＡｒＦＡＯＤ（アースロバクター由来）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ペニシリウム属由来、アスペルギルス・テレウス由来）、フルクトシルアミンオキシダーゼ（アスペルギルス属由来）、アマドリアーゼI、II（アスペルギルス・フミガーツス由来）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス属由来、Ｄｉａｚｙｍｅ社（米国）販売）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス・ニダランス由来）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（アスペルギルス・オリゼー由来）、フルクトシルアミンデグリカーゼ（カンジダ属由来）、ケトアミンオキシダーゼ（アクレモニウム・デバリオマイセス由来）、フルクトシルアミンオキシダーゼ（ピキア属由来）、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（トリコスポロン属由来）、フルクトシルアミン酸化酵素（バチルス属由来）、ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社（日本）製）、ＦＡＯＤ−Ｅ（キッコーマン社（日本）製）またはそれらの組合わせである。
【００８６】
さらに本発明は、上記消去試薬と、プロテアーゼ処理用のプロテアーゼ含有試薬、及び測定用のα−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを含有する試薬を含む、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質測定用のキットを提供する。本発明の糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定用キットは、上述の各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００８７】
本発明において好ましいα−糖化ペプチドに作用するオキシダーゼは、フルクトシルペプチドオキシダーゼである。
【００８８】
本発明に基づく糖化ヘモグロビンを定量する酵素反応試薬には、各種既知の成分、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。
【００８９】
さらに本発明の測定方法、消去試薬およびキットは、電極等を用いる過酸化水素の定量等の系に応用してもよい。
【００９０】
具体的には、α−糖化ジペプチドに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼの力価は、例えば、下記の方法で測定することができ、他の方法でも測定可能である。
【００９１】
（１）試薬の調製
試薬１（Ｒ１）：１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略称する。キッコーマン社（日本国）製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（以下、４ＡＡと略称する。東京化成社（日本国）製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
【００９２】
試薬２（Ｒ２）：５００ｍｇのＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、同仁化学社（日本国）製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍＬに定容する。
【００９３】
試薬３（Ｒ３）：フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ（ＭＷ４１６、製造方法は特開２００３−２３５５８５参照）１．２５ｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍＬに定容する。
【００９４】
（２）測定
２．７ｍＬのＲ１に、１００μＬのＲ２を加え、さらに、１００μＬのフルクトシルペプチドオキシダーゼを含む酵素液を加えて混和し、３７℃で、５分間予備加温する。
【００９５】
その後、１００μＬのＲ３を加えてよく混合したのち、分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社（日本国）製）を用い、３７℃、５分間の５５５ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。なお、対照液は、１００μＬのＲ３の代わりに、１００μＬのイオン交換水を加える以外は前記と同様に操作する。予め調製した過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成する色素量（吸光度）との関係より得られたグラフから、吸光度の変化に相当する過酸化水素量を求め、この数値を酵素液中の活性単位とする。１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕとする。
【実施例】
【００９６】
次に、本発明の実施例を詳細に述べるが、本発明の範囲は何らこれにより限定されるものではない。【００９７】
実施例１
＜ＨｂＡ１ｃ測定における夾雑物質消去試験＞
ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定対象糖化蛋白質として、プロテアーゼ処理により生じるα−糖化ペプチドをＦＰＯＸで測定する系において、遊離及びプロテアーゼ処理により生じると考えられる各種夾雑物質を人為的に添加したモデル系を使用し、ＨｂＡ１ｃ測定試験における本発明の夾雑物質消去効果を検証した。【００９８】
（１）測定対象糖化蛋白質：  ＨｂＡ１ｃ測定用常用標準物質（福祉医療技術振興会スタンダードレファレンスセンター（日本国）製）１３０ｇ／Ｌ（ＨｂＡ１ｃ値：５．８％）
（２）添加夾雑物質：Ｆｒｕ−Ｖａｌ（フルクトシルバリン、α−糖化アミノ酸）、Ｆｒｕ−Ｇｌｙ（フルクトシルグリシン、α−糖化アミノ酸）、ε−Ｆｒｕ−Ｌｙｓ（ε−フルクトシルリジン、ε−糖化アミノ酸）、Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（フルクトシルバリルロイシン、α−糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンの「α鎖」Ｎ末端から遊離するα−糖化ジペプチドに相当）
（３）夾雑物質添加ＨｂＡ１ｃの調製
（１）のＨｂＡ１ｃを６区分に小分けし、第１区分にＦｒｕ−Ｖａｌを、第２区分にＦｒｕ−Ｇｌｙを、第３区分にε−Ｆｒｕ−Ｌｙｓを、第４区分にＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕを、それぞれ試料中濃度が２５０μＭとなるように添加した。また第５区分には、全ての夾雑物質を試料中濃度が各２５０μＭとなるように添加した。これらの添加夾雑物を、遊離のもの及びプロテアーゼ処理により生じた測定誤差原因となる夾雑物質とみなし、以下の消去処理を含む測定に供した。また、第６区分には夾雑物質の代わりに生理食塩水を添加して、添加物なしの試料とした。【００９９】
（４）試薬の調製
表１に示す組成で、測定に使用する試薬を調製した。
【表１】
0005204483.tif 000002
【０１００】
Ｂの消去試薬１には、基質特異性の異なる２種類のケトアミンオキシダーゼを共に含む。ＦＡＯＸ−ＴＥはα−糖化アミノ酸に、ＦＡＯＤ−Ｅはε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに特異性が高いタイプのケトアミンオキシダーゼである。また、さらに本発明の消去試薬として、ケトアミンオキシダーゼのうちＦＡＯＸのみを含むもの（消去試薬２）及びＦＡＯＤのみを含むもの（消去試薬３）を調製した。【０１０１】
（５）測定方法
（３）で調製した各試料２０μｌに対し、溶血剤（スルホライザ：シスメックス（株）製、日本国）４０μｌ及び精製水４０μｌを混合して溶血試料とした。次いで、この溶血試料各１０μｌに、Ａのプロテアーゼ含有試薬試薬３０μｌを混合し、３７℃、９０分間プロテアーゼ処理を行った。処理後の試料４０μｌにＢの消去試薬２２０μｌを混合し、３７℃、５分間反応させた。７５０ｎｍにおける吸光度を測定し（Ａ０）、Ｃの測定用試薬１００μｌを添加し、３７℃、５分間インキュベーションし、７５０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ１）。また、試料の代わりに生理食塩水を用いた系によりブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。さらに、既知濃度の検体を用いて、ブランクの吸光度変化を差し引いた検体の吸光度変化（Ａ１−Ａ０）−ブランクΔＡを求めることにより、糖化ヘモグロビンの濃度を算出し、糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で割ることにより、糖化ヘモグロビン値（ＨｂＡ１ｃ値（％））を算出した。消去試薬１、２、３のそれぞれを使用した系について測定を行い、比較例として、Ｂの消去試薬を使用せず、消去工程を行わない系で同様の測定を行った。以上の結果を表２に示す。
【表２】
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【０１０２】
消去１、消去２、及び消去３は、消去試薬としてそれぞれ消去試薬１、２、及び３を使用した時の結果を示す。【０１０３】
表１に示すとおり、消去を行わない糖化ヘモグロビン測定においては、夾雑物質の添加をそのまま反映して、添加物質なしの測定値よりもＨｂＡ１ｃ値が顕著に高く測定され、正確な値が得られなかった。特に、α−アミノ酸であるＦｒｕ−Ｖａｌ及びＦｒｕ−Ｇｌｙを添加したものについて測定誤差が大きかった。全ての夾雑物質を共存させた時は、添加なしの系の測定値が５．８％であるのに対し４３．７％であり、夾雑物質存在下では実際と著しくかけ離れた測定値となった。これに対し、本発明の消去試薬１を用いた消去工程を含む測定においては、全ての添加物について夾雑物質による測定誤差がなくなり、添加物質なしの系で得られたＨｂＡ１ｃ値と一致した結果が得られ、夾雑物質が効率よく消去されて正確な測定が行えることが確認できた。【０１０４】
本発明の消去試薬１は、α−糖化アミノ酸に特異性が高いタイプとε−糖化アミノ酸及びε−糖化ペプチドに特異性が高いタイプの２種類のケトアミンオキシダーゼを共に含み、各種夾雑物質の完全な消去が達成された。別の組成の消去試薬を用いた例として、消去２及び消去３を示したが、これらにおいても、比較例とくらべて測定値の正確性が顕著に向上していることがわかる。消去２及び消去３においては、消去酵素の基質特異性によって消去しきれない夾雑物質が若干残った。これらは消去し残した物質に特異性の高い既知のケトアミンオキシダーゼを消去試薬に組みこむことで完全に消去できることが消去１の結果より明らかである。そのような方法以外にも、例えば、ε−Ｆｒｕ−Ｌｙｓが残る場合については、ε−Ｆｒｕ−Ｌｙｓに作用しにくい性質のＦＰＯＸ（ＦＰＯＸ−ＥＥ、キッコーマン社（日本国）製）を測定酵素として用いることにより、ε−Ｆｒｕ−Ｌｙｓの測り込みを低減し、測定誤差を低減することができる。【０１０５】
なお、消去系の有無及び種類によらず、実施例における測定値は、Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ添加の影響を全く受けなかった。これは使用したＦＰＯＸの基質特異性を反映した結果であるが、このことより、本発明において、α−糖化ペプチド以外の各種糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドが効率よく消去されることに加えて、α−糖化ペプチドの中でも糖化ヘモグロビン「β鎖」由来のＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ及び「α鎖」由来のＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕが区別され、精度よく、「β鎖」由来のＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓのみ、すなわちＨｂＡ１ｃを測定できることが示された。すなわち本発明において、測定誤差原因となる各種夾雑物質を消去することによりＨｂＡ１ｃの正確な測定が実現することが示された。【０１０６】
実施例２
＜ヒト血液サンプルに対する夾雑物質消去効果の確認＞
ヒト血液サンプル中のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定対象糖化タンパク質として、プロテアーゼ処理により生じるα−糖化ペプチドをＦＰＯＸで測定する系において、遊離及びプロテアーゼ処理により生じる夾雑物質に対する消去効果を検証した。さらに実施例１と同様、プロテアーゼ処理後に夾雑物質を添加したときにも、消去効果が認められるかどうかをあわせて確認した。測定対象のＨｂＡ１ｃとして、ヒト血液サンプルを用いる以外は、実施例１に示した方法と同様の実験を行った。表３には、750nmの吸光度を測定し、検体の吸光度変化からブランクの吸光度変化を差し引いた値を示した。
【表３】
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【０１０７】
まずコントロール実験として、実施例１と同様にHbA1c標準物質を用いたときの消去効果を確認した。例えば消去３においても消去効果が認められるが、消去２，３を組み合わせた消去１において、最も高い消去効果が認められた。この結果はヒト血液サンプルを用いたときもほぼ同様であり、消去１によって系に含まれる夾雑物質が良好に消去され、正確なHbA1cの測定が出来るようになったと考えられる。【０１０８】
さらにヒト血液サンプルに夾雑物質を添加したときの消去効果も確認した。夾雑物質としてα位のアミノ基が糖化されたFru-Val（輸液等によって生じるα糖化アミノ酸）と、ε位のアミノ基が糖化されたε-Fru-Lys（系に夾雑する血液タンパクやプロテアーゼ自身の切断によって生じるε糖化アミノ酸）を加えたとき、本発明の消去を行わずに測定すると、非常に高い値を示してしまう。しかし本発明の消去を行うと、良好に夾雑物質の影響を除くことができた。コントロール実験と同様、最も高い消去効果は消去１で認められ、この時の値0.021はヒト血球に夾雑物質を添加せずに消去１を行った値と同じレベルにまで下がることが示された。このことは、例えば輸液に含まれる糖とアミノ酸によってヒト血液中の糖化アミノ酸の濃度が上昇した場合においても、また系に夾雑するタンパク等の切断によって生じるε糖化アミノ酸が存在していても、本消去法によって良好に誤差原因物質を消去できることを意味している。【０１０９】
以上の結果より、本発明の夾雑物質消去法の有用性が示唆された。【０１１０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。