(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態に配置された開口を有する質量分析部、を含む分析装置により、糖鎖を含む試料を分析する糖鎖分析方法であって、
上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、
上記排出部への電圧印加を行うことなく、泳動液が充填されたキャピラリーの試料導入側に電圧を印加するとともにキャピラリーの試料導入側の端部から排出部に向けてキャピラリー内および排出部内に圧力を加えることにより、泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流し該キャピラリーおよび排出部において前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させ、かつ、上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を上記排出部先端から噴霧することにより排出し前記開口にシースレスインターフェイスを経て導入すること、
を含み、かつ、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析方法。
【請求項２】
前記試料導入側のキャピラリー端部を、電源と接続した電極を配置した溶液槽中の溶液に浸漬した状態で、該電源から電圧を印加することによって、前記泳動電流を流す請求項１に記載の糖鎖分析方法。
【請求項３】
前記泳動液は、有機酸および／または有機酸塩を含む緩衝液である請求項１または２に記載の糖鎖分析方法。
【請求項４】
前記試料導入を、前記排出部と連結された端部とは反対の端部に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電圧を印加することにより行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法。
【請求項５】
前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部を含み、前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉し質量分析することを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法。
【請求項６】
前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部および飛行時間型質量分析部を含み、
前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉すること、および、前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを上記飛行時間型質量分析部へ導入し質量分析を行うこと、を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法。
【請求項７】
前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを開裂し、該開裂により生成したイオンを前記飛行時間型質量分析部へ導入して質量分析を行う請求項６に記載の糖鎖分析方法。
【請求項８】
前記試料中に含まれる糖鎖の総量は、試料１μｌあたりアトモル量〜フェムトモル量の範囲である請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法。
【請求項９】
電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態で配置された開口を有する質量分析部、およびシースレスインターフェイスを含み、かつ前記排出部への電界印加を行わない糖鎖分析装置であって、
前記キャピラリーから排出部先端まで泳動電流を流すことができる装置であり、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法に使用される糖鎖分析装置。
【請求項１０】
前記質量分析部はイオントラップ型質量分析部と飛行時間型質量分析部を含む請求項９に記載の糖鎖分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CE-MS（キャピラリー電気泳動質量分析）による糖鎖分析方法および糖鎖分析に使用されるCE-MS装置に関する。より詳しくは、試料中の微量糖鎖を高感度に分析することができる糖鎖分析方法および糖鎖分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に存在する複合糖鎖は極微量で多彩な生理機能を有する重要な生体構成成分であることから、生体に存在する複合糖鎖の極微量構造解析法の早急な確立は極めて重要である。
【０００３】
糖鎖構造解析の分野では、糖鎖をピリジルアミノ(PA)化などの芳香族アミノ蛍光標識誘導体として、蛍光検出器を用いて検出することが広く行われている（例えば非特許文献１参照）。分離分析装置としては、蛍光検出器を有する高速液体クロマトグラフィー(HPLC)やキャピラリー電気泳動(CE)などが通常使用されている。しかし、HPLCによる分析では、HPLCの吸着性により微量試料の高感度分析は困難である。そのため、複合糖鎖の分析法としてはCEが好適である。特にレーザー励起蛍光検出器(LIF)と直結したCE-LIFは、CEが有する低吸着性故、現在のところ極微量糖鎖の検出を可能にする唯一の方法であると考えられる（例えば非特許文献２および３参照）。
【０００４】
しかし、細胞には多種多様な糖鎖が含まれ、それらの含有量は極微量である。そのため細胞に含まれる糖鎖を高感度分析するためには、試料が極微量であっても複数の糖鎖を良好に分離できる手段が必要である。更に糖鎖には複数の異性体が存在するため、将来的にはそれら異性体をも同定するために、質量分析計の導入が不可欠となると考えられる。
【０００５】
従来のCE-MS（キャピラリー電気泳動質量分析）では、CE-MSインターフェイスがイオンスプレー幅の大きいシースフローインターフェイスである。これに対し、例えば非特許文献４および５には、CE-MSの新たなインターフェイスとして、シースレスインターフェイスが提案されている。シースフローインターフェイスでは、シース液とネブライズガスのアシストによってイオン化が行われるのに対し、シースレスインターフェイスは、上記アシストなしにイオン化を行う。シースフローインターフェイスは、操作が簡便であるものの、イオン化の直前に試料溶液がシース液により希釈されてしまい、更にスプレー幅が大きく拡散してしまうために、物理的に感度低下を免れることができない。例えば非特許文献５には、シースフローインターフェイスを用いた場合、シースレスインターフェイスでの分析結果に比べ１０倍ほどの感度低下が見られたことが報告されている。上記感度低下は、微量糖鎖の分析では高感度分析の大きな妨げとなる。
【非特許文献１】Structure analyses of oligosaccharides by tagging of the reducing end sugars with a fluorescent compound.  Hase, S., Ikenaka, T., Matsushima, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun., 85, 257-263 (1978).
【非特許文献２】Two-dimensinal mapping of N-glycosidically linked asialo-oligosaccharides from glycoproteins as reductively pyridylaminated derivatives using dual separation modes of high-performance capillary electrophoresis.  Suzuki. S., Kakehi. K., Honda. S., Anal. Biochem. 205, 227-236 (1992).
【非特許文献３】Multi-dimensional mapping of pyridylaminated-labeled N-linked oligosaccharides by capillary electrophoresis. Zieske. LR., Fu. D., Khan. SH., O'Neill. RA. J. Chromatogr. A. 720, 395-407 (1996).
【非特許文献４】On-line sheathless capillary electrophoresis/nanoelectrospray ionization-tandem mass spectrometry for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.  Zamfir A., Seidler.
【非特許文献５】Sheathless electrospray ionization interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometric detection Advantages and limitations.  Issaq H.G., Janini. G.M., Chan. K.C., Veenstra T.D., J. Chromatogr. A. 1053, 37-42 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の知見から、本発明者らは、高感度なシースレスCE-MS法により微量糖鎖を分析するために検討を重ねた。しかしその結果、従来のシースレスCE-MSでは、安定なイオン化が困難であったり、スプレー部先端とMSの試料導入口との間でグロー放電が起こることにより、MSにおいて検出可能な量のイオンを得ることが困難であることが判明した。
【０００７】
そこで本発明の目的は、シースレスCE-MSにより微量糖鎖を高感度に分析するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、キャピラリー電気泳動に使用するキャピラリーだけでなく、該キャピラリーに連結した排出部にまで泳動電流を流すとともに、キャピラリーの内径と、試料溶液を排出する排出部先端内径との比を所定範囲とし、かつ排出部への電圧印加を行わずに試料を含む泳動液を排出することにより、シース液やネブライザガスによるアシストなしに安定な噴霧およびイオン化が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、上記目的は、下記手段によって達成された。
［１］電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態に配置された開口を有する質量分析部、を含む分析装置により、糖鎖を含む試料を分析する糖鎖分析方法であって、
上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、
上記排出部への電圧印加を行うことなく、泳動液が充填されたキャピラリーの試料導入側に電圧を印加するとともにキャピラリーの試料導入側の端部から排出部に向けてキャピラリー内および排出部内に圧力を加えることにより、泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流し該キャピラリーおよび排出部において前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させ、かつ、上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を上記排出部先端から噴霧することにより排出し前記開口にシースレスインターフェイスを経て導入すること、
を含み、かつ、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析方法。
［２］前記試料導入側のキャピラリー端部を、電源と接続した電極を配置した溶液槽中の溶液に浸漬した状態で、該電源から電圧を印加することによって、前記泳動電流を流す［１］に記載の糖鎖分析方法。
［３］前記泳動液は、有機酸および／または有機酸塩を含む緩衝液である［１］または［２］に記載の糖鎖分析方法。
［４］前記試料導入を、前記排出部と連結された端部とは反対の端部に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電圧を印加することにより行う［１］〜［３］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［５］前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部を含み、前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉し質量分析することを含む［１］〜［４］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［６］前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部および飛行時間型質量分析部を含み、
前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉すること、および、前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを上記飛行時間型質量分析部へ導入し質量分析を行うこと、を含む［１］〜［４］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［７］前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを開裂し、該開裂により生成したイオンを前記飛行時間型質量分析部へ導入して質量分析を行う［６］に記載の糖鎖分析方法。
［８］前記試料中に含まれる糖鎖の総量は、試料１μｌあたりアトモル量〜フェムトモル量の範囲である［１］〜［７］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［９］電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態で配置された開口を有する質量分析部、およびシースレスインターフェイスを含み、かつ前記排出部への電界印加を行わない糖鎖分析装置であって、
前記キャピラリーから排出部先端まで泳動電流を流すことができる装置であり、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする、［１］〜［８］のいずれかに記載の糖鎖分析方法に使用される糖鎖分析装置。
［１０］前記質量分析部はイオントラップ型質量分析部と飛行時間型質量分析部を含む［９］に記載の糖鎖分析装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数種の糖鎖を各々数百アトモル絶対量程度の極微量含有する試料から、各糖鎖の構造を迅速かつ正確に解析することが可能になる。これにより、生体に存在する極微量糖鎖の詳細な一斉構造解析が可能となり、糖鎖の質的および量的変化を伴う各種悪性腫瘍、神経疾患など多くの疾患の迅速な生化学的確定診断、ならびに病気予後の病態追跡に極めて有用なシステムを提供することができるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態に配置された開口を有する質量分析部、を含む分析装置により、糖鎖を含む試料を分析する糖鎖分析方法に関する。
本発明の糖鎖分析方法は、上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流すことにより、該キャピラリーおよび排出部において、前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させること、上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、上記排出部への電圧印加を行うことなく、該排出部先端から排出することにより前記開口に導入すること、を含む。更に、上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有する。
【００１２】
一般的なシースフローCE-MS装置の概略図を図１に示し、本発明において使用可能なシースレスCE-MS装置の概略図を図２に示す。但し、本発明において使用されるCE-MS装置は、図２に示す態様に限定されるものではない。以下、図面に基づき本発明の糖鎖分析方法の概要を説明する。
【００１３】
本発明の糖鎖分析方法は、CE（キャピラリー電気泳動）とMS（質量分析計）のインターフェイスとしてシースレスインターフェイスを使用する。一般的なシースフローインターフェイスは、図１に示すように、キャピラリー外へ排出された泳動液にシース液およびＮ2ガス等のネブライザガスを混合した後、スプレーチップ先端から噴霧することにより、エレクトロスプレーイオン化によって分析対象物質をイオン化した上でＭＳへ導入する。これに対し、本発明において使用されるシースフローCE-MSでは、図２に示すように、CEにおいて電気泳動した糖鎖は、引き続き排出部（図２に示す態様ではコネクタおよびスプレーチップ）において電気泳動した後、排出部先端から排出される。ここで、排出前の泳動液へのシース液やネブライザガスの混合は行われない。シースフローCE-MSは、シース液およびネブライザガスによるアシストによりエレクトロスプレーイオン化（ESI）を容易に行うことができるものの、シース液による希釈やスプレー中の拡散による感度低下の問題がある。これに対し、シースフローCE-MSによれば、上記の希釈化や拡散は生じない。しかし、先に説明したように、本発明者らの検討の結果、従来のシースレスCE-MS装置において、糖鎖を含む試料溶液をスプレーチップ先端から噴霧しようとすると、スプレーチップ先端とMSの試料導入口との間でグロー放電が生じたり、イオン化が不十分であるために、MSにおいて検出可能な量のイオンを得ることが困難であることが判明した。しかし驚くべきことに、本発明者らの更なる検討により、従来のシースレスCE-MSにおいて行われていたスプレーチップ先端への電圧印加を行わず、分析対象の糖鎖をキャピラリー内だけでなくMS開口へ向けて排出されるまで電気泳動を行い、かつスプレーチップ（排出部）先端の内径をCEに使用するキャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲とすることにより、電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を排出部先端から噴霧し、MSにおいて検出可能な量のイオンを安定に得ることができることが新たに見出された。これにより微量糖鎖の高感度分析が可能となる。従来のCE-MSでは、CEでの泳動液の流量は微量であるため泳動液をそのまま排出しても安定なイオン化を行うことができないと考えられていた。そのため、シース液やネブライザガスによるアシストや、スプレーチップ先端へ電圧印加を行わなければエレクトロスプレーイオン化による安定なイオン化は困難と考えられていたにもかかわらず、本発明によりシース液やネブライザガスの混合およびスプレーチップ先端への電圧印加なしに、安定なイオン化が可能となったことはきわめて驚くべき点である。この理由は定かではないが、キャピラリー内径とスプレーチップ先端内径との比の最適な範囲を見出したこと、およびMS開口に向けて排出されるまで泳動液に泳動電流を印加し続けることが理由と推察される。シース液やネブライザガスの混合のための装置や、スプレーチップ先端へ電圧を印加するための装置を導入することなくCE-MSが可能になったことは、装置の小型化、コスト低減等の点で、大きな利点である。
以下に、本発明の糖鎖分析方法について、更に詳細に説明する。
【００１４】
電気泳動
本発明における電気泳動は、電気泳動用キャピラリー内だけでなく排出部内でも行われる。本発明におけるシースレスCE-MS装置への泳動電流印加方法の説明図を図３に示す。以下に、図３に基づき本発明における電気泳動について説明する。但し本発明は、図３に示す態様に限定されるものではない。
【００１５】
一般的なCE-MSでは、キャピラリーの一端側に陽極、他端側に陰極を配置し、両電極間に電圧を印加する。この状態では陽極と陰極との間に泳動電流が流れる。これに対し、本発明では、図３に示すように、キャピラリーの試料導入側の端部を、電源と接続した電極を配置した溶液槽中の溶液に浸漬した状態で、電源から電圧を印加することが好ましい。これにより、キャピラリー内だけでなく排出部先端まで泳動電流を流すことができる。なお、ここでグランド（アース電位）を取ることは行わなくてよい。
【００１６】
キャピラリー電気泳動を行うための装置としては、キャピラリーから排出部先端まで泳動電流を流すことができる装置であればよく、公知のキャピラリー電気泳動装置の電源の接続方法を適宜変更し使用すればよい。また、使用するキャピラリーは、分離対象の糖鎖の性質や分離能を考慮し市販品から選択することができる。例えば、ポリイミドなどの樹脂でコーティングされたフューズドシリカキャピラリー等を使用することができる。
【００１７】
キャピラリー内への試料導入は、排出部と連結した端部とは反対の端部から行われる。試料導入は、圧力を加えることにより試料溶液をキャピラリー内へ導入する、一般に加圧導入法と呼ばれる方法を用いることもできるが、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより行うことが好ましい。
【００１８】
上記加圧導入法は、圧力を加えることにより試料溶液をキャピラリー内に導入する。例えば、泳動液を充填したキャピラリーの一端を、ゴム栓等により密閉されたバイアル中の試料溶液に浸漬した後、ゴム栓を上から押すことにより液面に圧がかかり試料溶液中に浸漬したキャピラリーの開口から試料溶液がキャピラリーに導入される。このような加圧導入法では、キャピラリー内への試料導入量はわずか数ｎｌ〜数１０ｎｌ程度である。装置にセットする試料溶液量を、操作上実用的な５μｌ（５，０００ｎｌ）程度にする場合、加圧導入法による試料導入では、９９．８％以上の試料が注入されず分析に供されないこととなる。
一方、泳動液を充填したキャピラリーの一端にプラグ領域（濃縮ゾーン）を形成し、この領域に試料（溶質）を電気泳動させることにより導入すれば、試料を溶液として導入する加圧導入法に比べて、多量の試料をキャピラリー内に導入することができる。試料中の分析対象糖鎖が少ないほど、試料導入時のロスは避けるべきである。従って、本発明では、上記方法によりキャピラリー内へ分析対象糖鎖を導入することにより、試料導入時のロスを低減し、検出感度を高めることが好ましい。
以下に、上記試料導入方法について更に詳細に説明する。
【００１９】
前記プラグ領域は、プラグ領域形成用の溶液を、加圧導入法と同様に圧力を加えてキャピラリーの一端から導入することにより形成することができる。プラグ領域の範囲は、濃縮効率と電気泳動時の分離効率を考慮し決定することが好ましく、例えばキャピラリー内の泳動液容量の60分の１〜200分の１程度とすることが好ましい。
【００２０】
プラグ領域形成用溶液としては、試料溶液をそのまま用いてもよいが、試料溶液調製用の溶媒（試料未含有）を使用することが好ましい。またプラグ領域において良好に濃縮を行うためには、キャピラリー内に充填した泳動液とは異なる種類の溶液を使用することが好ましく、泳動液中での電気泳動を良好に行うためには、泳動液の伝導度が高く、プラグ領域形成用溶液の伝導度が低いことが好ましい。具体的には、アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液、アセトン、アセトン／水混合溶液等を使用することができる。
【００２１】
次いで、プラグ領域を形成した側のキャピラリー末端を、試料を含む溶液（試料溶液）に浸漬することにより、プラグ領域端面を試料溶液と接触させる。この状態でキャピラリーに電界を印加すると、電気泳動により、試料溶液中の試料がプラグ領域内に導入される。プラグ領域形成用溶液は泳動液とは異なる溶液であり伝導度に差があるため、プラグ領域内に導入された試料は両液の界面付近に留まる。電界を印加するほど試料溶液の導入量が多くなるため、プラグ領域に試料を濃縮することができる。上記試料導入時に印加する電圧が過度に高いと、両溶液間に伝導度の差がある場合であっても試料が越えて泳動液中（泳動ゾーン）に導入されてしまう。そのため、試料導入時に印加する電圧は、界面での試料濃縮を良好に行うことができる範囲に設定することが好ましく、具体的には、5〜30ｋＶ程度とすることが好ましい。また、試料導入のための電界印加時間は、プラグ領域の容量等によって適宜設定すればよいが、例えば0.5〜2分間程度とすることができる。なお、上記電圧印加は、キャピラリー両端に陽極および陰極をそれぞれ配置して行ってもよく、前述のようにキャピラリーから排出部にかけて電流が流れるように行ってもよい。試料導入終了後、試料溶液中に浸漬していたキャピラリー末端をそのまま試料溶液中に浸漬した状態で、または適当な溶液（例えば電解液等）中に浸漬し、電気泳動を行う。
【００２２】
糖鎖分離のための電気泳動における印加電圧は、前記界面に濃縮された試料が泳動液中に導入されるように、前述の試料導入時の印加電圧より高く設定することが好ましく、具体的には、20〜30ｋＶ程度とすることができる。また、電界印加時間は分離すべき糖鎖の性質を考慮して設定すればよく特に限定されるものではないが、例えば10〜40分間程度とすることができる。前述のように、本発明では、電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、キャピラリーの一端に連結された排出部の先端から排出する。安定な噴霧およびイオン化を行うためには、少なくとも排出時まで泳動電流を流し続けることが好ましい。更に、安定な噴霧およびイオン化を行うためには、電気泳動開始から排出までの間、キャピラリーの試料導入側の端部から排出部に向けて、キャピラリー内および排出部内に圧力を加えることが好ましい。上記圧力は、前述の加圧導入法に準じて加えることができる。キャピラリー内および排出部内へ加える圧力は、1.4×104〜6.9×104Pa程度とすることができる。また、泳動液の温度は特に限定されるものではないが、例えば15〜50℃程度とすることができる。
【００２３】
本発明において糖鎖の電気泳動のために使用される泳動液としては、有機酸および／または有機酸塩を含む緩衝液（以下、「有機酸系バッファー」ともいう）を使用することが好ましい。有機酸系バッファーは揮発性が高いため、有機酸系バッファーの使用により、本発明におけるシースレスCE-MSにおいてエレクトロスプレーイオン化を良好に行うことができる。また、無機バッファーのようにMSを汚染することがないため、CEとMSを直接接続するCE-MSにおいて使用する泳動液として好適である。前記緩衝液としては、ギ酸緩衝液、ギ酸／ギ酸塩（例えばギ酸ナトリウム）緩衝液、酢酸緩衝液、酢酸／酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）緩衝液等を用いることができる。前記泳動液のｐHは、分離対象の糖鎖が電荷を帯びるように設定すればよい。
【００２４】
後述するように酸性糖鎖と中性糖鎖との混合物を分析するためには、酸性糖鎖と中性糖鎖と逆向きの電界で電気泳動することが好ましい。酸性糖鎖は負電荷を帯び得るため、上記観点からは、中性糖鎖には塩基性置換基を導入することが好ましい。塩基性置換基としては、一般に糖鎖を蛍光標識するために使用される各種の芳香族アミノ基を挙げることができる。中性糖鎖と酸性糖鎖との混合物を分析する場合等では、カルボキシル基等の酸性基を持たない置換基を用いることが好ましい。好ましい置換基としては、具体的には、２−アミノピリジニル基、２−アミノベンズアミド基を挙げることができる。中でも、２−アミノピリジニル基は、糖鎖の蛍光標識化（ピリジルアミノ化（PA化））に広く用いられており糖鎖への導入方法も確立されているため特に好ましい。前記置換基の導入は公知の方法で行うことができ、例えばPA化については前述の非特許文献１〜３等を参照することができる。また、分析対象糖鎖は、例えば、糖脂質、糖タンパク、糖アミノ酸等から公知の方法で遊離することにより得ることができる。また、酸性糖鎖と中性糖鎖の混合物を分析するために、該混合物に対して置換基導入のための試薬を作用させ、混合物中の酸性糖鎖と中性糖鎖の両方に置換基を導入することもできる。この場合、酸性糖鎖と中性糖鎖を個別に分離可能とするためには塩基性置換基を導入することが好ましい。前述の２−アミノピリジニル基は、酸性糖鎖および中性糖鎖の還元末端にきわめて効率良く反応し、キャピラリー内および排出部内に充填した緩衝液のｐHの微妙な変化に対応して中性糖鎖と酸性糖鎖を個別かつ良好に分離することができるため特に好ましい。
【００２５】
異なる性質（帯電性等）を有する複数種の糖鎖を含む試料を分析するためには、電気泳動を二工程以上に分けて行い、第二工程以降の電気泳動を、直前に行われた電気泳動においてキャピラリー内および排出部内に充填した泳動液とはｐＨの異なる泳動液をキャピラリーおよび排出部内に充填した後、または直前に行われた電気泳動においてキャピラリー内および排出部内に充填した泳動液のｐHを変更した後に行うことが好ましい。または、直前に行われた電気泳動とは逆向きの電圧を印加して電気泳動を行ってもよく、電圧の向きの変更と泳動液の変更を組み合わせて行なってもよい。泳動液のｐHを変えることにより、該ｐHで帯電し得る糖鎖のみを選択的に電気泳動させることができ、電圧の印加方向を逆向きとすることにより、正電荷を帯びた糖鎖と負電荷を帯びた糖鎖のいずれか一方のみを選択的に電気泳動させることができる。より好ましくは、泳動液の変更と電圧の印加方向の変更を併せて行う。具体的には、塩基性の泳動液を使用し、プラグ領域側が−、他方が＋となるように電圧印加を行い酸性糖鎖の分離分析を行った後、泳動液を酸性に変更した上でプラグ領域側が+、他方が−となるように電圧印加を行い、塩基性置換基を導入した中性糖鎖の分離分析を行うことができる。これにより、中性糖鎖と酸性糖鎖を選択的に分離分析することができる。ほとんどの生体試料では、中性糖鎖と酸性糖鎖が混在しているため、同一試料中の中性糖鎖と酸性糖鎖を独立して分離分析できることは、糖鎖解析にきわめて有用である。
【００２６】
電気泳動を二工程以上に分けて行う場合、第二工程以降の電気泳動と直前に行われた電気泳動との間に、泳動液を充填したキャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより、キャピラリー内へ前記試料の少なくとも一部を導入する試料導入工程を再度行うこともできる。第一の工程で酸性糖鎖を分離分析し、続く第二の工程で塩基性置換基を導入した中性糖鎖を分離分析する場合のように、異なる向きの電荷を帯び得る糖鎖を個別に分離する際には、第一の工程で印加した電界とは逆向きの電界を印加することにより、プラグ領域内へ目的の糖鎖を選択的に導入することができる。
【００２７】
電気泳動により分離した試料は、シースレスインターフェイスを経て質量分析部へ導入される。以下、シースレスインターフェイスについて説明する。
【００２８】
シースレスインターフェイス
上記のように電気泳動後の糖鎖を含む泳動液は、キャピラリーの一端に連結された検出部の先端から排出され、その少なくとも一部が質量分析部の開口へ導入される。本発明では、前記排出部先端の内径を、キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲とする。これにより、上記排出時にエレクトロスプレーイオン化を起こし、質量分析部により検出可能な量のイオンを安定に発生させることができる。前記排出部先端の内径が、キャピラリー内径の５０％未満では、グロー放電が生じたり、排出部先端から溶液を安定に噴霧することが困難となることにより、エレクトロスプレーイオン化を起こすことが困難となる。一方、前記排出部先端の内径が、キャピラリー内径と同サイズまたはそれ以上、即ち１００％以上では、安定な噴霧のために排出部を連結する意義が薄れる。排出部先端のキャピラリー内径に対する比の上限は、安定な噴霧を行うためには、７０％程度が好ましく、６０％程度がさらに好ましいと考えられる。なお、本発明において「噴霧」とは、エレクトロスプレーイオン化が可能な程度に溶液を霧状に排出することをいい、排出部先端で噴霧が行われたことは、例えば質量分析によりフラグメントが検出されたことで確認することができる。
【００２９】
前記排出部先端の内径は、前述のように、キャピラリー内径の５０％以上１００％未満であり、好ましくは５０％〜７０％、さらに好ましくは５０％〜６０％である。キャピラリー内径は、例えば１０〜１００μｍ程度である。通常、キャピラリー全長にわたって内径は略一定であるが、キャピラリー内で内径差がある場合、排出部先端の内径は、キャピラリーの最大内径に対する比で規定するものとする。本発明では、キャピラリー内径に応じて排出部先端内径を決定することもでき、排出部先端内径に応じて好適な内径を有するキャピラリーを選択することもできる。
【００３０】
キャピラリーの全長は、特に限定されるものではないが、排出部先端から泳動液を噴霧しエレクトロスプレーイオン化を良好に行うためには、９０〜１３０μｍ程度とすることが好ましい。
【００３１】
キャピラリーと連結される排出部は、キャピラリーの一端とスプレーチップとを連結するためのコネクタと、該コネクタを介してキャピラリー一端と接続されるスプレーチップからなることができる。コネクタは、キャピラリーとスプレーチップを連結できるものであればよく特に限定されるものではない。但し、図２に示すようにコネクタをコネクタホルダーにより固定する場合、コネクタホルダーが伝導性であるのであれば、不要な電流リークを回避するためにコネクタは非伝導性であることが好ましい。コネクタの内径は、キャピラリー内径と略同一であることが好ましい。また、スプレーチップとしては、コネクタと接続される側の端部の内径がコネクタ内径と略同一であり、他方の端部の内径がキャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲のスプレーチップを用いることができる。スプレーチップとしては、一般にナノエレクトロスプレー用として市販されているスプレーチップが好適であり、例えばナノエレクトロスプレー用として市販されているガラス細管を使用することができる。安定な噴霧およびイオン化のためには、金属コーティングされたスプレーチップを使用することが好ましい。
【００３２】
上記コネクタおよびスプレーチップを含む排出部の全長は特に限定されるものではないが、安定なイオン化のためには５〜６ｃｍ程度であることが好ましい。また、安定な連結が可能であれば、コネクタを使用せずスプレーチップをキャピラリー端部に直接接続することも可能である。この場合、排出部全長とはスプレーチップの全長を意味する。
【００３３】
前記排出部先端から排出された泳動液は、少なくとも一部が排出部先端と非接触状態に配置された質量分析部開口へ導入される。排出部先端と質量分析部開口との距離は、グロー放電を起こさず、かつエレクトロスプレーイオン化によりイオン化された糖鎖を大きなロスなく捕捉できる範囲に設定することが好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度とすることができる。開口の径は、少なくとも排出部先端内径より大きくすることが好ましく、排出部先端からの噴霧物の噴霧幅に応じて決定することが更に好ましい。また、質量分析部開口は、図２に示すように排出部（スプレーチップ）先端の開口部と対向するように配置してもよく、図３に示すように、例えば３０〜５０°程度傾斜をつけて配置しても構わない。
次に、上記開口から導入されたイオン化された糖鎖を分析する質量分析部について説明する。
【００３４】
質量分析部
質量分析部として使用する質量分析装置としては、磁場型質量分析装置（Sector MS）、四重極型質量分析装置（QMS）、飛行時間型質量分析装置（TOFMS）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分析装置（FT-ICRMS）、イオントラップ型質量分析装置（ITMS）等を挙げることができる。本発明におけるMS分析のためにはイオントラップ型質量分析装置を使用することが好ましい。但し、一般的なイオントラップ型質量分析装置では、トラップするイオンの質量数の範囲は比較的広域（例えば目的物の擬似分子イオン［M＋H］+（Mは目的物）の質量対電荷比(m/z)が200〜2,000amu程度）であるのに対し、本発明では、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比＋４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉することが好ましい。これは、上記広域質量範囲設定では、イオントラップ部に捕捉可能なイオン量が制限されている（一般に数千〜数万個のイオンが捕捉可能と言われている）ため、設定した質量範囲内の質量数を有するイオンの一部が捕捉されず排出されてしまうことによりロスが生じることが、感度低下の原因となるためである。微量分析では、このロスによる感度低下も回避すべきである。これに対し、トラップするイオンの質量範囲を上記の通りきわめて狭レンジとすれば、分析すべきイオンのロスを顕著に低減することができ、高感度分析可能な量のイオンをイオントラップ部へトラップし分析することができる。これにより、更なる高感度分析が可能となる。
【００３５】
更に、混合物の分析に適するMS/MS等のMSn測定（nは多段分析におけるMSスペクトルの測定回数）を行うためにはタンデム型質量分析装置を使用することが好ましく、イオントラップ型質量分析部と飛行時間型質量分析部とを含むイオントラップ（IT）／TOF-MSを使用することが更に好ましい。この場合もイオントラップ型質量分析部にトラップする質量対電荷比は、上記範囲とすることが好ましい。イオントラップ型質量分析部に捕捉したイオンを、例えば、不活性ガスを導入しつつ外部から交流電圧を印加して共振させることによって開裂させてフラグメントイオンを生成した後、生成したフラグメントイオンを飛行時間型質量分析部において質量分析することにより、MS/MS測定が可能となる。これにより、目的糖鎖の構造解析を行うことができる。イオントラップ型質量分析部における質量範囲の設定を変え2回以上イオントラップとTOF-MSによる質量分析を行えば、様々な質量数を有するイオンを高感度に分析することができ、結果的に上記広域質量設定による分析と比べて、例えば20倍以上の感度向上が可能となる。上記スイッチング回数は、試料中に含まれる糖鎖の種類に応じて設定すればよく、例えば4種の糖鎖を含む試料を分析するためには4回のスイッチングにより計8種のスペクトル（1種の糖鎖に対しイオントラップ型質量分析部において取得されるMSスペクトルと飛行時間型質量分析部において取得されるMS/MSスペクトルの計2種のスペクトル×試料中の糖鎖種の数4）を得ることができ、これにより各糖鎖の構造解析が可能となる。例えば、現在市販されている質量分析装置によれば、上記MS測定は1測定当たり100msec程度ときわめて高速に行うことができ、MS測定とMS/MS測定の1サイクルは1秒程度で行うことができる。前記IT/TOF-MSとしては、例えば株式会社島津製作所製商品名LCMS-IT-TOF質量分析計のIT-TOF質量分析部を使用することができる。
【００３６】
以上説明したように、本発明によれば、シースレスCE-MSによる安定なイオン化が可能になることにより、インターフェイスにおける試料ロスを大幅に低減することができ、これにより微量糖鎖の分析における検出感度を大幅に高めることができる。本発明によれば、例えば２種以上、更には４種以上の異なる種類の糖鎖を含む試料の高感度分析が可能となる。更に、前記プラグ領域形成による試料導入→前記シースレスインターフェイスの使用→狭レンジでの高速スイッチチングによる質量分析、により、加圧試料導入→シースフローインターフェイスの使用→広域質量範囲設定での質量分析、による糖鎖分析と比べて、例えば2万倍以上の感度向上を達成することができる。こうして本発明によれば、試料中に含まれる糖鎖の総量が、例えば試料１μｌあたりアトモル(amol)量〜フェムトモル(fmol)量と極微量であったとしても、高感度に糖鎖の構造解析を行うことができる。なお、アトモルとは10-18mol、フェムトモルとは10-15molを意味する。一般に、細胞１つに存在する糖鎖量は数アトモルオーダーと言われているため、アトモルオーダーの分析を可能にすることは、糖鎖分析の最終目標である。従って、本発明は、糖鎖分析において極めて大きな意義を有する。
【００３７】
更に本発明は、電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態で配置された開口を有する質量分析部、を含み、かつ前記排出部への電界印加を行わない糖鎖分析装置であって、上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析装置に関する。本発明の糖鎖分析装置は、本発明の糖鎖分析方法において好適に使用することができる。その詳細は、本発明の糖鎖分析方法において説明した通りである。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づき説明する。但し、本発明は実施例に示す態様に限定されるものではない。
【００３９】
分析対象糖鎖
下記実施例、比較例および参考例で使用したPA化中性糖鎖は以下の四種類で、すべてタカラバイオから購入した。
CDH-PA (Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝420（擬似分子イオン=421）
CTH-PA (Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝582（擬似分子イオン=583）
Globoside-PA (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝785（擬似分子イオン=786）
Forssman antigen-PA (GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝988（擬似分子イオン=989）
【００４０】
［実施例１］
シースレスCE-MSによる糖鎖分析
図２に概略を示すシースレスCE-MS装置により、以下の方法によってGloboside-PAの質量分析を行った。
(i)CE分析装置
CE分析装置として、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter製)に、[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(pH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒を充填したフューズドシリカキャピラリー(50μm i.d. x 95 cm、GLサイエンス製)を装着し、CEキャピラリーにスプレーチップ（New Objective製PicoTip、50/30μm i.d.）をコネクタ（φ50μm、長さ2cm、New Objective 製PicoClear）で接続し、島津製作所製LCMS-IT-TOFのIT-TOF部と直接結合したオンラインシステムを使用した。後述するプラグ形成、試料導入および電気泳動時の電圧印加は、図３に示すようにキャピラリーの一端を浸漬した試料溶液に白金電極を介してプラス30kVの電圧を印加することで行った。コネクタとスプレーチップからなる排出部の全長は約5cm、スプレーチップ先端と質量分析部開口との距離は1〜2mm程度とした。質量分析部開口は、水平面から30〜50°程度傾斜をつけて配置した。
(ii)プラグ形成
ミクロバイアル(PCRチューブ、Axgen製PCR-02-NC)に予め分注したアセトニトリルにキャピラリーの一端を浸漬し、3.4x103Pa、10秒の条件下でアセトニトリルを加圧導入し、プラグを形成した。キャピラリー中の泳動液（上記排出部中の泳動液は含まず）は、約2000nl、プラグ容量は約10nlであった。
(iii)試料導入
次に、100amol/μl濃度のGloboside-PA溶液（溶媒：アセトニトリル-水（7:3、v/v））10μlをPCRチューブに分注後、プラグを形成した側のキャピラリー末端を浸漬し、10kVの電圧（プラグ側が+、他方がマイナス）を120秒印加することで、予めキャピラリーに注入したアセトニトリルプラグの中に上記糖鎖を電気的に導入した。
(iv)キャピラリー電気泳動およびスプレーチップ先端からの溶液噴霧
次に、カラム温度を25℃、印加電圧を30kV（プラグ側が+、他方が−）に設定し、かつプラグ側からスプレーチップ側へ向かって6.9×104Paの圧力を加えることにより、キャピラリーからスプレーチップにわたり電気泳動を行った。上記条件において、電気泳動後の泳動液をスプレーチップ先端から噴霧することができた。噴霧物を質量分析部へ導入し、質量対電荷比m/z786-790のイオンをイオントラップ部においてトラップした後、飛行時間型質量分析部に導入しマススペクトル測定を行った。質量分析に要した時間は100msecであった。質量分析計の検出器電圧を2.0kV、CDL(脱溶媒管)の温度を200℃に設定した。得られたマススペクトルおよびマスクロマトグラムを図４（ａ）に示す。
【００４１】
［比較例１］
加圧試料導入−シースフローCE-MS（広域質量範囲設定）による糖鎖分析
図１に概略を示すシースフローCE-MS装置により、以下の方法によってGloboside-PAの質量分析を行った。
CE分析装置として、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter製)に、[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(ｐH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒を充填した、参考例１で使用したものと同様のフューズドシリカキャピラリー(50μm i.d. x 95 cm、GLサイエンス製)を装着し、CEキャピラリーに島津製作所製シースフローインターフェースを装着し、４μl/minの[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(pH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒と、約1L/minの窒素ガスを導入し、シースフローインターフェースに2.0Kvの電圧を加えてイオン化を行った。試料導入は、2pmol/μlのGloboside-PAを10μlミクロバイアル(PCRチューブ、Axgen製PCR-02-NC)に採取し、3.4x103Paの圧力で60秒間加圧することで行った。マススペクトル測定には参考例１と同様に島津製作所製LCMS-IT-TOFを使用したが、イオントラップ部の質量範囲設定を質量対電荷比m/z200〜2,000とした。質量分析に要した時間は100msecであった。得られたマススペクトルおよびマスクロマトグラムを図４（ｂ）に示す。
【００４２】
図４(ａ)に示すマスクロマトグラム（Ｂ）と図４（ｂ）に示すマスクロマトグラム（Ｂ）は、強度およびそのS/Nがほぼ同じであった。これにより、Globoside-PAを20pmol/tube用いた比較例１の結果と、Globoside-PAを1fmol/tube用いた実施例１の結果がほぼ同等であることがわかる。この結果から、プラグ形成による試料導入によるキャピラリー電気泳動→シースレスインターフェイスによるMSへの試料導入→狭レンジスキャンによる質量分析により、従来型CE-MSに比べ約20,000倍の感度向上が達成できることが明らかとなった。
【００４３】
［実施例２］
試料溶液中のGloboside- PA量を5fmol/tubeに変更した以外は実施例１と同様の操作を行ったところ、スプレーチップ先端から安定な噴霧を行うことができ、質量分析部において高感度な質量分析が可能であった（感度：2psi）。
【００４４】
［比較例２］
スプレーチップとして先端内径が８μｍのものを使用した以外実施例２と同様の操作を行ったが、スプレーチップからの噴霧が不安定となり、質量分析部において質量分析可能な量のイオンを得ることができなかった。
【００４５】
［比較例３］
スプレーチップとして先端内径が５μｍのものを使用した以外実施例２と同様の操作を行ったところ、スプレーチップ先端からの噴霧が不安定となり放電も観察され、質量分析部において質量分析可能な量のイオンを得ることができなかった。
【００４６】
［実施例３］
試料溶液としてGloboside-PAを10μl中に100fmol含む試料溶液を使用した点以外は実施例１と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。
【００４７】
［比較例４〜６］
スプレーチップに高圧アンプにより1〜3kVの電圧を印加した点以外は実施例２と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。
【００４８】
スプレーチップへの電圧印加の影響
実施例３および比較例４〜６で得られたマススペクトルを図５に示す。図５に示すように、スプレーチップに電圧を印加した比較例４〜６では、電圧を印加しなかった実施例３と比較して約３０〜４０％の感度低下が観察された。更に、スプレーチップに電圧を印加した場合には、たびたび放電が観察された。放電が観察された場合には極端に感度が低下し、スペクトルを得ることができなかった。
【００４９】
[実施例４]
高感度CE-MSによるPA化中性糖鎖混合物の構造解析
試料溶液として以下のPA化中性糖鎖混合物を使用した点および下記方法により質量分析を行った点を除き、実施例１と同様の方法により糖鎖分析を行った。
(i)PA化中性糖鎖混合物
前述の4種のPA化中性糖鎖混合物（各500amol/l、5 x 10-15モル）の溶液10μl（溶媒：アセトニトリル-水（7:3、v/v））を使用した。
(ii)質量分析
各PA化中性糖鎖について、イオントラップ部においてMSスペクトル取得を行うとともに、捕捉したイオンを開裂させ得られたフラグメントイオンを飛行時間型質量分析部へ導入しMS/MSスペクトル取得を行った。各PA化中性糖鎖のMSスペクトル取得に各100msec、MS/MSスペクトル取得に各150msecを設定し、4種のMSスペクトルおよび4種のMS/MSスペクトル計8種のスペクトルを、１サイクル１.0秒でスイッチングしながら繰り返し測定するという手法を用い、検出器電圧2.0kVで検出した。各々の質量対電荷比の範囲は、CDH-PAでm/z420-424、CTH-PAでm/z582-586、Globoside-PAでm/z786-790、antigen-PAでm/z 989-993とした。マススペクトル測定結果を図６に示す。
【００５０】
図６左図に示すように、上記４種のPA化中性糖鎖について、それぞれを構成する単糖の種類およびその配列が、MS/MSスペクトルで明瞭に示された。さらに、図４右図に示すマスクロマトグラムにおいて、[M+H]イオンおよびMS/MSで得られた構造特異的なフラグメントイオンが明瞭に分離された状態で検出できることから、キャピラリー電気泳動による分離が良好に行われ、かつMSにより検出可能な量のイオンを質量分析部へ導入できたことがわかる。ターゲットとなる糖鎖の分子量情報を前もって得ることができれば、本方法はきわめて有用な高感度構造解析法となる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、細胞レベルの糖鎖分析が可能となるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】一般的なシースフローCE-MS装置の概略図である。
【図２】本発明において使用可能なシースレスCE-MS装置の概略図である。
【図３】本発明におけるシースレスCE-MS装置への泳動電流印加方法の説明図である。
【図４】図３（ａ）に、実施例１で得られたマススペクトル測定結果を示し、図３（ｂ）に比較例１で得られたマススペクトル測定結果を示す。
【図５】実施例２および比較例２〜４で得られたマススペクトル測定結果を示す。
【図６】実施例４で得られたマススペクトル測定結果を示す。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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