(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート核酸、少なくとも一種類のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼが用いられるポリメラーゼ連鎖反応法であって、少なくとも一種類の標的基質がポリメラーゼ連鎖反応に添加される点で特徴づけられ、
このとき、標的基質がポリメラーゼ連鎖反応の条件下で二本鎖を形成することができる核酸であり、かつ修飾が核酸の３’末端に施されており、標的基質が伸長されず、ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるプライマーまたはテンプレート核酸の分解を減じることができる、方法。
【請求項２】
少なくとも一種類の標的基質が、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を部分的にまたは完全に阻害する点で特徴づけられる、請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３】
標的基質が一本鎖オリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４】
一本鎖オリゴヌクレオチドの３'末端の修飾がＯＨ基をリン酸基または別の残基で置換することによるか、または伸長されないことがジデオキシヌクレオチド；一個以上のインバース塩基；ＲＮＡ；塩基脱落部位；スペーサー；色素；ブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）を含むクエンチャー基；小溝結合剤；スーパー塩基、ハロゲン化塩基を含む修飾塩基；または適当な塩基アナログの手段によって達成される点で特徴づけられる、請求項３に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項３または４に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも３'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項５に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項５または６に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ二本鎖が形成されうるように、テンプレート核酸と少なくとも部分的に相補的である点で特徴づけられる、請求項３から７のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドがランダム配列を有する点で特徴づけられる、請求項３から７のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド塩基が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）、ユニバーサル塩基、一個以上のウラシル、メチルシトシン、塩基アナログおよび修飾塩基からなる群より選択される塩基を含む点で特徴づけられる、請求項３から９のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが一個以上のＰＮＡ（ペプチド核酸）またはＬＮＡ（ロックド核酸）を含む点で特徴づけられる、請求項３から１０のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドがホモオリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項３から７または請求項９から１１のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが１０から１００塩基長である点で特徴づけられる、請求項３から１２のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１４】
ポリメラーゼ連鎖反応中のオリゴヌクレオチドの濃度が０．１から２０μＭである点で特徴づけられる、請求項３から１３のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１５】
プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの標的基質に対する分子比が、１：１から１：１０００である点で特徴づけられる、請求項３から１４のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１６】
少なくとも一種類の標的基質が二本鎖オリゴヌクレオチドである点で特徴づけられる、請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項１６に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも３'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項１７に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項１７または１８に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２０】
標的基質が、自己相補ヘアピン構造を形成できる標的配列を有する点で特徴づけられる、請求項１６から１９のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２１】
標的基質が、塩基配列中におよび／またはＤＮＡの骨格中に少なくとも一種類の修飾を有する点で特徴づけられる、請求項２０に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２２】
標的基質がＤＮＡ二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項１６から２１のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２３】
アニーリングが温度４０から７０℃で実施される点で特徴づけられる、請求項２２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２４】
標的基質のヘアピン構造の場合、自己相補領域の長さが１０から１００塩基である点で特徴づけられる、請求項１６から２３のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２５】
標的基質が２０から２００塩基長である点で特徴づけられる、請求項１６から２３のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドの濃度がポリメラーゼ連鎖反応中に０．０５から２０μＭである点で特徴づけられる、請求項１６から２５のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２７】
プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼの標的基質に対する分子比が、１：０．５から１：１０００である点で特徴づけられる、請求項１６から２６のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドの５'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項１６から２７のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項２９】
少なくとも一種類の標的基質がポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーのための結合部位を含まない二本鎖ＤＮＡ分子である点で特徴づけられる、請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３０】
二本鎖ＤＮＡ分子の３’末端が修飾されている点で特徴づけられる、請求項２９に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３１】
二本鎖ＤＮＡ分子の３’末端がＯＨ基をリン酸基で置換することにより修飾されている点で特徴づけられる、請求項３０に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３２】
ＤＮＡ分子の骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項２９から３１のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３３】
ＤＮＡ分子の骨格が少なくとも３'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項３２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３４】
ＤＮＡ分子の骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項３２または３３のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドが環状ＤＮＡ分子である点で特徴づけられる、請求項２９から３４のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３６】
少なくとも一種類の標的基質が、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーのための結合部位を含まない一本鎖ＤＮＡ分子である点で特徴づけられる、請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３７】
一本鎖ＤＮＡ分子の３'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項３６に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３８】
一本鎖ＤＮＡ分子の３'末端がＯＨ基をリン酸基で置換することにより修飾されている点で特徴づけられる、請求項３７に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項３９】
ＤＮＡ分子の骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項３６から３８のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４０】
ＤＮＡ分子の骨格が少なくとも３'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項３９に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４１】
ＤＮＡ分子の骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項３９または４０に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドが環状ＤＮＡ分子である点で特徴づけられる、請求項３６から４１のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４３】
ポリメラーゼの標的基質に対する比が１：２０から１：１０００である点で特徴づけられる、請求項２９から４２のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４４】
用いられる標的基質が種々の配列モチーフを有するＤＮＡ分子のセットである点で特徴づけられる、請求項２９から４３のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４５】
標的基質がＤＮＡ二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項２９から４４のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４６】
アニーリングが温度４０から７０℃で実施される点で特徴づけられる、請求項４５に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４７】
標的基質が最大１０，０００塩基長である点で特徴づけられる、請求項２９から４６のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４８】
ＤＮＡ二本鎖の５'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項２９から３５のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項４９】
標的基質がＲＮＡである点で特徴づけられる、請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５０】
ＲＮＡがジデオキシヌクレオチドを含む点で特徴づけられる、請求項４９に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５１】
ＲＮＡの３'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項４９または５０に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５２】
ＲＮＡの３'末端がＯＨ基をリン酸基で置換することにより修飾されている点で特徴づけられる、請求項５１に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５３】
ＲＮＡの骨格が修飾されている点で特徴づけられる、請求項４９から５２のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドの骨格が少なくとも３'末端の最後の塩基と最後から二番目の塩基の間で修飾されている点で特徴づけられる、請求項５３に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドの骨格中のリン酸がホスホチオアートで置換されている点で特徴づけられる、請求項５３または５４に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５６】
ＲＮＡが種々の配列モチーフを有するＲＮＡ分子のセットを含む点で特徴づけられる、請求項４９から５５のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５７】
ＲＮＡ標的分子がホモポリマーである点で特徴づけられる、請求項４９から５６のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５８】
標的基質がＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を、少なくともポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング段階中に形成する点で特徴づけられる、請求項４９から５７のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項５９】
アニーリングが温度４０から７０℃で実施される点で特徴づけられる、請求項５８に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項６０】
標的基質が１０から１０，０００塩基長である点で特徴づけられる、請求項４９から５９のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項６１】
ＲＮＡの５'末端が修飾を有する点で特徴づけられる、請求項４９から６０のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項６２】
請求項１から６１のうちの一つに記載のポリメラーゼ連鎖反応法の実施のためのキットであって、少なくとも一種類の標的基質を含む点で特徴づけられ、さらに、少なくとも一種類のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＰＣＲ緩衝液、Ｍｇ2+イオンを含む溶液、ＰＣＲ添加剤および／またはプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼを含み、
このとき、標的基質がポリメラーゼ連鎖反応の条件下で二本鎖を形成することができる核酸であり、かつ修飾が核酸の３’末端に施されており、標的基質が伸長されず、ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるプライマーまたはテンプレート核酸の分解を減じることができる、キット。
【請求項６３】
ＰＣＲ添加剤がベタイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および／または非イオン性であってもよい界面活性剤から選択される点で特徴づけられる、請求項６２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プルーフリーディング特性を示すＤＮＡポリメラーゼが用いられるポリメラーゼ連鎖反応のための方法に関する。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）は、遺伝子工学で用いられる、任意のＤＮＡ配列の数個の分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで短時間に１０6から１０8倍に増殖させることに成功する方法である。典型的には必要なのは、長さ約１５から３０ヌクレオチドで配列が増殖（「増幅」）すべきＤＮＡの姉妹鎖の開始配列および終部配列と相補的である合成によって調製された２種類のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー、４'−デオキシヌクレオチド−５'−三リン酸および少なくとも短時間の９５℃への加熱を機能の消失無しに耐えられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの混合物である。
【０００３】
しばしば、「プルーフリーディング」特性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（いわゆる「高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ」）もまたＰＣＲに用いられる。これらの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成における低いエラー率および高い精度によって特徴づけられる。そのような高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの使用に伴って、しかし、ＰＣＲの完全な失敗という程度まで（すなわち、ＰＣＲ産物が少しも生じない）、ＰＣＲ産物のごく小さい収率しか達成されないという問題がしばしば起こる。この問題は特に、少量のテンプレート核酸または低いプライマー濃度だけが利用可能である場合に起こる。理由は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性による、テンプレート核酸およびプライマーの分解である可能性が高い。テンプレート核酸およびプライマーのこの損失は、次いで増幅速度の劇的な低下に繋がり、それが今度は、ＰＣＲ産物の収率低下またはＰＣＲの完全な失敗さえを引き起こす。
【０００４】
ＤＮＡ骨格中で３'末端にてホスホロホスホチオアート結合を示すＰＣＲプライマーは、挿入された高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの３'−５'エキソヌクレアーゼ活性による分解に対して保護されていることが実証されている。そのようなプライマーの使用によって、高忠実度ＰＣＲの収率および信頼性は改善されうる。たとえば、デノロニャ（ｄｅ Ｎｏｒｏｎｈａ），Ｃ．Ｍ．およびムリンス（Ｍｕｌｌｉｎｓ），Ｊ．Ｉ．，『３'末端ホスホロホスホチオアート 結合を有するアンプリマーはベントポリメラーゼによる分解に耐性でありおよびＴａｑポリメラーゼ ミスプライミングを低減する』（Ａｍｐｌｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ３'−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏＰｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔ ｌｉｎｋａｇｅｓ ｒｅｓｉｓｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ），ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ，１９９２． ２（２），１３１−１３６；およびスケラ（Ｓｋｅｒｒａ），Ａ．，『ホスホロホスホチオアートプライマーはプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列の増幅を改善する』（ＰｈｏｓｐｈｏｒｏＰｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９２，２０（１４），３５５１−３５５４を参照。高忠実度ＰＣＲの感度および収率に対するそのようなプライマーの作用を、本発明に関する実験にしたがって試験した。そのようなプライマーの使用は、高忠実度ＰＣＲの感度および収率に対して、本発明の基礎となる原理よりもはるかに小さい作用を示すことが明らかになった。
【０００５】
上記の観察は今、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ反応の再現性および感度に、特に少量のテンプレートが用いられる場合に困難を生じることを示す。最適未満条件の多くの場合には、そのＰＣＲを成功させることはできない。高忠実度ＰＣＲは、たとえばＴａｑポリメラーゼを用いるＰＣＲに比べて、使用する開始テンプレートに遥かに大きく依存するため、したがって、大幅な改善を必要とする。
【０００６】
最新技術の上記の問題から見て、したがって、少ないテンプレート核酸開始材料を用いて高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、およびなおＰＣＲ産物の十分な収率を達成できる、ポリメラーゼ連鎖反応を提供することが、本発明の課題である。
【０００７】
本発明はこの課題を、独立請求項１で述べられる方法によって、および請求項６７で述べられるキットによって解決する。本発明の他の有利な態様、実施形態および詳細は、従属請求項、説明、実施例および図面から生じる。
【０００８】
このように、本発明は、テンプレート核酸、少なくとも一種類のプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼが用いられ、それによって反応はポリメラーゼ連鎖反応において少なくとも一種類の標的基質が加えられる点で特徴づけられる、ポリメラーゼ連鎖反応を開示する。ＤＮＡポリメラーゼの３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性を低減または最適な場合には遮断する任意の分子が、標的基質として適する。使用するＤＮＡポリメラーゼの３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性が標的基質に向かって偏向または転換されるともいうことができる。
【０００９】
高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの使用を伴うＰＣＲのＰＣＲ産物収率および感度および信頼性はしたがって、本発明によると、剰余（使用されていない）高忠実度分子の、反応に加えられた標的基質（「フィード」ともいう）の一つへの標的化偏向によって達成される。「標的基質」および「フィード」の語は、本発明の文脈の中では同義に用いられる。加えられた基質へのこの偏向によって、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるプライマーおよび／またはテンプレートＤＮＡの分解は低減され、そのため、「フィード」の添加無しではＰＣＲ産物の低収率またはＰＣＲの完全な失敗さえしか得られない条件下で、ＰＣＲ反応の信頼されうる実施が可能になる。そのため、ＰＣＲの成功が、明らかに可変な量の開始テンプレート核酸を伴う「フィード」の使用によって可能であることは特に有益である。この方法では、実験条件の費用のかかる最適化は顕著に低減され、それはまた時間および材料の消費を著しく減少させる。
【００１０】
添加される標的基質は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのための結合部位として作用できる二本鎖構造をＰＣＲ条件下で形成する能力を有する点で特徴づけられる。添加される標的基質はＰＣＲ反応を妨害してはならず、および、加えて、理想的には、ＰＣＲ反応に全く参加しない（すなわち、増幅されない）ように構築される。そうすれば、たとえば、一般的に存在する副産物が妨害的な量で生じず、またはフィードＤＮＡがそれ自身検出可能であるならば、増幅は障害されない。破壊的な量に到達するのは一般的に、生じる副産物がＰＣＲ産物分析法でバックグラウンドとして検出可能な場合に、またはたとえばクローニング、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳または突然変異誘発のような以降の用途に破壊的な影響を示す場合である。
【００１１】
添加される基質（標的基質）についての技術的解決法は、特に一本鎖、直鎖オリゴヌクレオチド、ヘアピンオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡおよびＤＮＡ分子である。可能な処方の例は下記に指定される。
【００１２】
プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））の使用中に、２種類の必要なプライマーそれぞれについて濃度１μＭの使用が、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ），ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いた高忠実度ＰＣＲをより安定にすることが明らかになった。これは、Ｔａｑポリメラーゼ（典型的には０．２〜０．４μＭ）を用いる標準的ＰＣＲに推奨されるよりも高い濃度である。この仮説に縛られることなく、本発明の発明者らは、濃度１μＭでのプライマーの優れた頑健性は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの一部の分解に起因しうると仮定する。
【００１３】
本発明に記載の方法は、すべての市販の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼについて実行可能である。これらの酵素は、「ホットスタート」機能を用いてまたは用いずに使用されうる。「ホットスタート」は、抗体を用いたまたは化学修飾による酵素活性の遮断を含むすべての通常の商業的方法を用いて実施できる（たとえばＵＳ−Ａ−５ ６７７ １５２，ＥＰ−Ａ−０ ７７１ ８７０およびＥＰ−Ａ−０ ９６２ ５２６と比較のこと）。
【００１４】
本発明によると、キットもまた提供される。そのようなキットは、標的基質または本発明の意味での「フィード」入りの少なくとも一種類の容器を含む。好ましい一実施形態では、このキットはまた、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）を好ましい型で、一個以上のＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ2+イオンを含む溶液、および／または一個以上の適当なＰＣＲ添加剤、たとえばベタイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、（非イオン性）界面活性剤または他の適当な物質を含む。各成分は、単独でもよく、または二種類以上の成分の混合物として処方されうる。好ましくは、本発明に記載のキットは、本発明に記載の方法を実施するように設計されている。したがって、本方法に関して言われるすべては同様にキットに当てはまる。
【００１５】
高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの偏向は、多数の異なる技術的解決法を用いて実行可能であり、それらは以降で詳細に記載されおよびそれらの機能はデータと共に例で証明される。いくつかの実施形態の個別の態様は、技術的におよび合理的に実行可能である限り、恣意的に相互に交換可能である。
【００１６】
本発明の最初の好ましい一実施形態は、ＰＣＲへの一本鎖オリゴヌクレオチドの、標的基質または「フィード」としての添加に関する。
【００１７】
本発明の適用可能な一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ条件下で、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのための結合部位として作用しうる二本鎖を形成する能力を有する点で特徴づけられる。添加される「フィード」オリゴヌクレオチドはまた、好ましくは、ＰＣＲ反応に望ましくない方法で参加しないように構築されるべきである。添加される「フィード」オリゴヌクレオチドの可能な技術的解決法および基礎的特性は、下記により詳細に記載される。
【００１８】
使用されるＤＮＡポリメラーゼによる標的基質または「フィード」オリゴヌクレオチドの３'−伸長の阻害が望ましい可能性がある。好ましい実施形態では、「フィード」オリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるべきでなく、すなわち、それ自身がプライマーとして作用すべきでない。これは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得ないように、オリゴヌクレオチドの３'末端の修飾によって達成できる。いくつかの解決法がこの目的のために可能であり、それは標的基質の合成中にすでに組み込み可能である。これらの解決法は、ジデオキシヌクレオチド、逆塩基、ＲＮＡ、塩基脱落部位、スペーサー、色素、消光残基、たとえばブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、副溝結合剤、修飾塩基、たとえばスーパー塩基またはハロゲン化塩基または塩基アナログ、および糖骨格へおよび塩基へのすべての他の有望な修飾、および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を触媒する能力を阻害する追加の側基の付加を含む。プライマーの伸長に対する保護のための好ましい解決法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中の必要な３'−ＯＨ基の代わりの３'−リン酸基の組み込みである。
【００１９】
別の可能性は、ＤＮＡ骨格の修飾による、標的基質の３'−短縮の防止に関する。３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性の結果として、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを３'末端で短縮することができ、それによって、３'−伸長の防止のための修飾が不必要に除去されうる。この３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮は、ＤＮＡの骨格における一または複数の変化によって防止されうる。このために好ましい解決法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格中のリン酸の代わりの、少なくとも一種類のホスホチオアートの付加である。３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮を完全に防止するためには、このために好ましい解決法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格中のリン酸の代わりの、少なくとも一種類のホスホチオアートの付加である。適当な置換を下記の構造式に示す（ホスホチオアート修飾を骨格中に有するＤＮＡの構造）。
【００２０】
【化１】
0005216203.tif 000002
エキソヌクレアーゼ短縮の防止のための別の可能性は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用によって達成されうる。
【００２１】
本発明の重要な一成分は、ＰＣＲ反応中に「フィード」として用いられる核酸が、それ自身、または存在する他の核酸分子と、二本鎖構造を形成する能力を有することである。
【００２２】
本発明の別の一態様は、標的基質の塩基配列に関する。「フィード」として用いられるオリゴヌクレオチドの塩基配列については、いくつかの可能な解決法がある。使用するテンプレート核酸中の選択された標的配列と相補的な、および塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）を含む多少ともランダムな配列（いわゆる「ランダムオリゴヌクレオチド」）、の両方のオリゴヌクレオチドが試験で成功した。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、一個以上のユニバーサル塩基（たとえばイノシン、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドール）、一個以上のウラシル、メチルシトシン、塩基アナログまたは修飾塩基を個別にまたは組み合わせで含むオリゴヌクレオチド、および同一の塩基（たとえばＯｌｉｇｏ−ｄＴ）、ユニバーサル塩基、修飾塩基または塩基アナログの配列から成るホモオリゴマーもまた使用できる。
【００２３】
本発明の重要な一成分は、相補結合部位が、ＰＣＲ反応において「フィード」として用いられるオリゴヌクレオチドに利用可能である点である。これらの結合部位はそれら自身、テンプレートとして用いられる核酸に、およびまたそれら自身「フィード」として用いられるオリゴヌクレオチドの両方に存在しうる。この特性は、ランダムオリゴヌクレオチドによって満たされるが、それはたとえば、それらが結合部位をすべての可能なテンプレート核酸について見つけられるため、および加えてまた二本鎖分子を他のランダムオリゴヌクレオチドと形成できるためである。
【００２４】
ＤＮＡ二本鎖が形成される結合部位は、完全に相補的である必要は無い；一個以上の塩基誤対合を有する結合は、典型的なＰＣＲ条件下で、特にアニーリング段階中に発生しうる。長さ２０塩基以上のオリゴヌクレオチドでは特に、塩基誤対合の発生の可能性が非常に高い。
【００２５】
好ましくは、「フィード」オリゴヌクレオチドは、適当な反対ＤＮＡ鎖とＰＣＲ条件下で結合するのが可能な長さを有すべきである。したがって少なくとも、オリゴヌクレオチドは、効率的な結合をＰＣＲ緩衝液中で約４０℃〜９０℃にて可能にする長さを有しなければならない。典型的には、結合はＰＣＲのアニーリング段階中に起こるべきであり、それは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。この結果として、約１０から約１００塩基、より好ましくは約１２から約８０塩基、および特に約２０から４５塩基のオリゴヌクレオチドの好ましい長さが生じる。選択される好ましい長さは、たとえば、オリゴヌクレオチドの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００２６】
「フィード」オリゴヌクレオチドの好ましい有効濃度は、約０．１から約２０μＭ、より好ましくは約０．２から約２．５μＭ、および特に約０．５から約１．５μＭの範囲内にある。最適濃度は、オリゴヌクレオチドのその他の特性、たとえば長さおよび塩基配列によって共同決定されるが、それは反対ＤＮＡ鎖への結合の効率が同様に濃度によって影響されるためである。たとえば、２０から４５塩基の規定のまたはランダムな配列（ランダムオリゴヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチドについて好ましい濃度は、０．２ないし２．５μＭである。
【００２７】
さらに、標的基質の好ましい有効濃度もまた、使用する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの濃度に依存する。したがって１Ｕの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが約１ｐｍｏｌのポリメラーゼ分子に相当すると考えられるならば、これは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ分子の「フィード」オリゴヌクレオチドに対する好ましい比１：１ないし１：１０００、より好ましくは１：１ないし１：５０００および特に１：１ないし１：２００を与える。一般的にその比は、短いフィードオリゴヌクレオチドについてむしろ大きく、および長いフィードオリゴヌクレオチドについてむしろ小さいべきであると言われている。どちらの場合でも、フィードオリゴヌクレオチド分子の数および、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ分子と「フィード」オリゴヌクレオチド分子との間の比は、増幅が阻害されないように選択されるよう注意しなければならない。
【００２８】
「フィード」オリゴヌクレオチドの５'末端は、修飾されなくてもよく、または追加で修飾を有してもよい。５'−修飾は、オリゴヌクレオチドのテンプレートＤＮＡへの結合特性および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が妨害されない限り、本発明の意味では本質的に重要でない。可能な修飾は、Ｃ−リンカー（たとえばＣ３−、Ｃ６−、Ｃ９−、Ｃ１２−、Ｃ１８−リンカー）、５'−リン酸修飾、アミノ修飾、ＤＩＧを含むハプテン、フルオレセイン、ビオチン、蛍光色素、消光残基、チオール標識および、オリゴヌクレオチドおよび高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのテンプレート核酸への結合を妨害または防止しない他の公知の５'−修飾を含む。
【００２９】
「フィード」オリゴヌクレオチドの内部修飾もまた可能であり、および本発明の文脈で有利でありうる。内部修飾は塩基または糖−リン酸骨格が関係しうる。ＤＮＡ骨格への修飾は、ＤＮＡ骨格の修飾による３'−短縮の防止というキーワードで上記の項ですでに考察されている。そこで言及したＤＮＡ骨格の一個、数個またはすべての位置でのホスホチオアートでのリン酸の置換に加えて、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのテンプレート核酸への結合が完全に防止されない限り、骨格のすべての公知の変化が可能である。さらに、スペーサーによる塩基脱落部位の組み込みが可能であり、または塩基、骨格または側鎖への他の修飾が導入されうる。修飾された糖を有する点で特徴づけられるロックトＬｏｃｋｅｄ）核酸がここでは特に言及される。
【００３０】
本発明の第二の重要な実施形態は、二本鎖オリゴヌクレオチド（別名「ヘアピンオリゴヌクレオチド」）の標的基質としての使用に関する。
【００３１】
これらの二本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補ヘアピン構造を用いてＤＮＡ二本鎖を形成できる点で特徴づけられる。ヘアピンオリゴヌクレオチドの長さおよび塩基配列は、したがって、それらがＤＮＡ二本鎖少なくともＰＣＲのアニーリング段階中に存在するように選択される。添加される「フィード」オリゴヌクレオチドは好ましくはまた、ＰＣＲ反応にどのような望ましくない方法でも関与しないように構築すべきである。「フィード」オリゴヌクレオチドの可能な解決法および好ましい基本特性は下に記載する。
【００３２】
好ましい実施形態では「フィード」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であってはならず、すなわちそれ自身がプライマーとして作用してはならない。これは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによってそれ以上伸長され得ないように、オリゴヌクレオチドの３'末端の修飾によって達成されうる。これはいくつかの方法によって達成されうる。修飾は好ましくはＤＮＡ合成中にすでに組み込まれる。可能な適当な修飾は、ジデオキシヌクレオチド、逆塩基、ＲＮＡ、塩基脱落部位、スペーサー、色素、消光残基、たとえばブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、副溝結合剤、修飾塩基、たとえばスーパー塩基またはハロゲン化塩基または塩基アナログ、および「フィード」オリゴヌクレオチドの糖骨格へおよび塩基へのすべての他の可能な修飾、および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を触媒する能力を阻害する追加の側基の組み込みを含む。オリゴヌクレオチドの伸長に対する保護のための好ましい解決法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中の、ポリメラーゼに必要な３'−ＯＨ基の代わりの３'−リン酸基の組み込みである（上記参照）。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの３'−短縮の防止はまた、ＤＮＡ骨格の修飾によって可能である。３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性のために、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼはそのようなプライマーを３'−末端で短縮する能力を有し、それによって、望ましくない３'−伸長を防ぐための修飾が不必要に除去されうる。この３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮は、ＤＮＡの骨格における一または複数の変化によって防止されうる。このために好ましい解決法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格中のリン酸の代わりの、少なくとも一種類のホスホチオアートの付加である。完全な３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮を防止するためには、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの最後と最後から二番目の３'−塩基の間の骨格のリン酸を、ホスホチオアートで置換することで十分である。エキソヌクレアーゼ短縮の防止のための別の可能性は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用によって達成されうる。
【００３４】
「フィード」として用いられるＤＮＡオリゴヌクレオチドの塩基配列についてはまた、いくつかの可能な解決法がある。ヘアピンオリゴヌクレオチドについて好ましい解決法は、自己相補ヘアピン構造を形成できる規定の標的配列の使用である。これらのオリゴヌクレオチドは、塩基配列中およびＤＮＡの骨格中の両方に、いくつかの修飾を有しうる。したがって、ヘアピン構造は、一個以上の塩基誤対合または塩基脱落部位を含みうる。ユニバーサルまたは修飾塩基もまたＤＮＡ中に存在しうる。
【００３５】
本発明の重要な一態様は、ＰＣＲ中に「フィード」オリゴヌクレオチドとして用いられるオリゴヌクレオチドが、高忠実度ポリメラーゼのための結合部位として作用しうる二本鎖構造を形成する能力を有する点である。これらの結合部位は、テンプレートとして用いられる核酸への「フィード」オリゴヌクレオチドの結合によって生じる、およびそれ自身「フィード」として挿入されるヘアピンオリゴヌクレオチド上に存在する両方が可能である。
【００３６】
ＤＮＡ二本鎖が形成される結合部位は、完全に相補的である必要は無い；一個以上の塩基誤対合を有する結合もまた生じうる。本発明の意味での「フィード」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二本鎖を少なくともＰＣＲのアニーリング段階中に生じることができるべきである。アニーリングは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは、約１０から約１００塩基、より好ましくは約１２から約８０塩基、および特に約２０から４５塩基の、オリゴヌクレオチドのヘアピン構造の自己相補領域の好ましい長さを生じる。自己相補領域は、同一のオリゴヌクレオチドの多少とも相補的な構造とハイブリダイズして二本鎖になりうる、言及されたオリゴヌクレオチドの一本鎖部分である。選択される好ましい長さは、特に、オリゴヌクレオチドの配列、ＧＣ含量および他の可能な修飾に依存する。
【００３７】
好ましくは、「フィード」オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ条件下で、ＤＮＡ二本鎖の結合または適当な反対ＤＮＡ鎖との結合が可能である長さであるべきである。したがって少なくとも、オリゴヌクレオチドは、効率的な結合をＰＣＲ緩衝液中で約４０℃〜９０℃にて可能にする長さを有すべきである。典型的には、ＰＣＲのアニーリング段階での結合が起こるべきであり、それは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは、約１０から約１００塩基、より好ましくは約１２から約８０塩基、および特に約２０から４５塩基の、オリゴヌクレオチドのヘアピン構造の自己相補領域の好ましい長さを生じる。選択される好ましい長さは、たとえば、オリゴヌクレオチドの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００３８】
「フィード」オリゴヌクレオチドの有効濃度は好ましくは、たとえば約０．０５から約２０μＭ、０．２から１０μＭ、およびより好ましくは約０．２から約２．５μＭの範囲にある。最適濃度は、オリゴヌクレオチドのその他の特性、たとえば長さおよび塩基配列によって決定される。２０から４５塩基の規定のまたはランダムな配列（ランダムオリゴヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチドについて好ましい濃度は、０．２ないし２．５μＭである。加えて、有効濃度はまた、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの濃度に依存する。したがって１Ｕの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが約１ｐｍｏｌのポリメラーゼ分子に相当すると考えられるならば、これは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ分子の「フィード」オリゴヌクレオチドに対する好ましい比１：０．５ないし１：１０００、たとえば１：１ないし１：５０００、および特に１：１ないし１：２００を与える。
【００３９】
「フィード」オリゴヌクレオチドの５'末端は、修飾されなくてもよく、または追加で修飾を有してもよい。５'−修飾は、オリゴヌクレオチドのテンプレートＤＮＡへの結合特性および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が悪影響を受けない限り、本発明の意味では本質的に重要でない。可能な修飾は、Ｃ−リンカー（たとえばＣ３−、Ｃ６−、Ｃ９−、Ｃ１２−、Ｃ１８−リンカー）、５'−リン酸修飾、アミノ修飾、ＤＩＧを含むハプテン、フルオレセイン、ビオチン、蛍光色素、消光残基、チオール標識および、オリゴヌクレオチドおよび高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのテンプレート核酸への結合を妨害しない他の一般に公知の５'−修飾を含む。
【００４０】
「フィード」オリゴヌクレオチドの内部修飾もまた可能であり、および本発明の文脈で有利でありうる。内部修飾は塩基および糖−リン酸骨格の両方に影響しうる。ＤＮＡ骨格の可能な修飾はすでに上記でより詳細に考察されている。ＤＮＡ骨格の一個、数個またはすべての位置でのホスホチオアートでのリン酸の言及された置換に加えて、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が完全に防止されない限り、骨格の他の公知の変化もまた可能である。さらに、スペーサーによる塩基脱落部位の組み込みが可能であり、または塩基、骨格または側鎖への他の修飾が実施されうる。修飾された糖を有する点で特徴づけられるロックト核酸がここでは特に言及される。ＲＮＡの組み込みもまた可能である。
【００４１】
本発明の第三の重要な実施形態は、増幅すべき最終物質のプライマー結合部位を有しない任意の種類の二本鎖「フィード」ＤＮＡの使用に関する。「フィード」ＤＮＡの長さおよび塩基配列はしたがって、少なくともＰＣＲのアニーリング段階中にＤＮＡ二本鎖として存在するように選択される。加えて、使用する「フィード」ＤＮＡは、好ましくは、ＰＣＲ反応にどのような望ましくない方法でも関与しないように、および副産物を生じないように構築されるべきである。添加される「フィード」ＤＮＡの可能な解決法および好ましい基本的特性は下記に詳細に説明される。
【００４２】
好ましい実施形態では、「フィード」オリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるべきでなく、すなわち、それ自身がプライマーとして作用すべきでない。これは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによってそれ以上伸長され得ないように、フィードＤＮＡの３'末端の修飾によって達成できる。このためにはいくつかの解決法があり、ジデオキシヌクレオチド、逆塩基、ＲＮＡ、塩基脱落部位、スペーサー、着色料、消光残基、たとえばブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、副溝結合剤、修飾塩基、たとえばスーパー塩基またはハロゲン化塩基または塩基アナログ、塩基脱落部位、３'−ＯＨ基のブロッキング（たとえばリン酸による置換）、および糖骨格へおよび塩基へのすべての他の可能な修飾、および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を触媒する能力を阻害する追加の側基の組み込みを含む。これはまた、たとえば、酵素的または化学的修飾によっても実施されうる。別の可能性は、環状ＤＮＡ分子の「フィード」ＤＮＡとしての使用である。この環状ＤＮＡは、たとえば、プラスミドＤＮＡでもよく、またはより小さい、合成によって調製された環形のＤＮＡ分子でもよい。
【００４３】
３'５'−エキソヌクレアーゼ活性のために、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは「フィード」ＤＮＡを３'末端で短縮する能力を有し、それによって、望ましくない３'−伸長を防止するための修飾が不必要に除去されうる。この３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮は、ＤＮＡの骨格における変化によって妨害されうる。このために好ましい解決法は再び、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格中のリン酸の代わりの、少なくとも一種類のホスホチオアートの付加である。完全な３'−５'−エキソヌクレアーゼ短縮を防止するためには、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格中のリン酸の代わりの、少なくとも一種類のホスホチオアートの付加である。エキソヌクレアーゼ短縮の防止のための別の可能性は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用によって達成されうる。
【００４４】
別の好ましい一態様によると、「フィード」ＤＮＡは、可能な限り多数の異なる配列モチーフを有するＤＮＡ分子の一群を含むべきである。この方法では、十分な適当な結合部位が、使用する任意のテンプレート核酸中につねに存在し、それは選択された「フィード」ＤＮＡの一般的な有用性にとって有益である。「フィード」ＤＮＡは、ＤＮＡ塩基に、およびＤＮＡの骨格にもの両方に、いくつかの修飾を有しうる。ユニバーサルまたは修飾塩基もまた存在してよく、または側鎖への修飾が挿入されうる。
【００４５】
本発明の重要な一態様は、すでに上述の通り、ＰＣＲ反応中に「フィード」ＤＮＡとして挿入されたＤＮＡが他の「フィード」ＤＮＡ分子またはテンプレートＤＮＡと二本鎖構造を形成する能力を有することである。これらの二本鎖構造は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのための結合部位として作用する。結合部位はまた、テンプレートとして用いられる核酸への「フィード」オリゴヌクレオチドの結合によって生じる、およびそれ自身「フィード」として用いられるヘアピンオリゴヌクレオチド上に存在する、両方が可能である。
【００４６】
使用する「フィード」ＤＮＡの塩基配列は、好ましくは、一般的に存在する副産物が「フィード」ＤＮＡの存在を通して破壊的な量で検出可能でないように、またはフィードＤＮＡ自身が検出可能であるように構築されるべきである。破壊的な量に到達するのは一般的に、生じる副産物が、使用するＰＣＲ産物分析法でバックグラウンドとして検出可能な場合に、またはたとえばクローニング、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳または突然変異誘発のような以降の用途に破壊的な影響を示す場合である。
【００４７】
ＤＮＡ二本鎖が形成される結合部位は、完全に相補的である必要は無い；一個以上の塩基誤対合を有する結合もまた生じうる。本発明の意味での「フィード」ＤＮＡは、好ましくはＤＮＡ二本鎖を少なくともＰＣＲのアニーリング段階中に生じることができるべきである。アニーリングは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは、約１２ｂｐから約１０００ｂｐの好ましい長さの「フィード」ＤＮＡを生じる。選択される好ましい長さは、「フィード」ＤＮＡの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００４８】
好ましくは、「フィード」ＤＮＡは、ＰＣＲ条件下で、ＤＮＡ二本鎖の結合または適当な反対ＤＮＡ鎖との結合が可能である長さであるべきである。したがって少なくとも、オリゴヌクレオチドは、効率的な結合をＰＣＲ緩衝液中で約４０℃〜９０℃にて可能にする長さを有しなければならない。典型的には、ＰＣＲのアニーリング段階での結合が起こるべきであり、それは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは、少なくとも約１２塩基から数千塩基（たとえば約２０００、３０００、４０００、５０００または１０，０００塩基）の好ましい長さの「フィード」ＤＮＡ産物を生じる。選択される好ましい長さはまた、特に、「フィード」ＤＮＡの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００４９】
最適濃度は、「フィード」ＤＮＡの長さおよび塩基配列およびその他の特性によって決定される。長さ約１２ｂｐから約１０００ｂｐの「フィード」ＤＮＡについて好ましい濃度は、０．２μＭないし２．５μＭである。加えて、有効濃度はまた、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの濃度に依存する。したがって１Ｕの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼが約１ｐｍｏｌのポリメラーゼ分子に相当すると考えられるならば、これは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ分子の「フィード」オリゴヌクレオチドに対する好ましい比、たとえば１：０．５ないし１：１０００、１：１ないし１：５０００、および特に１：１ないし１：２００を与える。
【００５０】
「フィード」ＤＮＡの５'末端は、修飾されなくてもよく、または追加で修飾を有してもよい。５'−修飾は、オリゴヌクレオチドのテンプレートＤＮＡへの結合特性および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が障害されない限り、本発明の意味では本質的に重要でない。可能な修飾は、Ｃ−リンカー（たとえばＣ３−、Ｃ６−、Ｃ９−、Ｃ１２−、Ｃ１８−リンカー）、５'−リン酸修飾、アミノ修飾、ＤＩＧを含むハプテン、フルオレセイン、ビオチン、蛍光色素、消光残基、チオール標識および、「フィード」ＤＮＡおよび高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合を防止しない他の公知の５'−修飾を含む。
【００５１】
「フィード」ＤＮＡの内部修飾もまた可能であり、および本発明の文脈で有利でありうる。内部修飾は塩基および糖−リン酸骨格の両方に影響しうる。ＤＮＡ骨格の可能な修飾はすでに上記でより詳細に考察されている。ＤＮＡ骨格の一個、数個またはすべての位置でのホスホチオアートでのリン酸の言及された置換に加えて、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ二本鎖への結合が妨げられない限り、先端技術から知られる骨格の公知の変化が可能である。さらに、スペーサーによる塩基脱落部位の組み込みが可能であり、または塩基、骨格または側鎖への他の修飾が可能である。修飾された糖を有する点で特徴づけられるロックト核酸がここでは特に言及される。ＲＮＡの組み込みもまた実行可能である。
【００５２】
最後に、本発明の第四の好ましい実施形態は、標的基質または「フィード」としてのＲＮＡのＰＣＲへの添加に関する。
【００５３】
本発明の意味での別の可能な解決法は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡのＰＣＲへの添加である。驚くべきことに、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡのＰＣＲへの添加は、本発明の意味でのＰＣＲにおける感度の改善に目的の正の作用を示す。もっとも可能性の高い機構は、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成であり、それは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによって認識されうる。高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の認識もまた考えることができる。「フィード」ＲＮＡの長さおよび塩基配列はしたがって、少なくともＰＣＲのアニーリング段階中に二本鎖構造を生じる能力を有するように選択される。加えて、添加される「フィード」ＲＮＡは、ＰＣＲ反応に望ましくない方法で関与しないように、および副産物を生じないように構築されうる。しかし、そのような修飾が本発明の意味でＰＣＲ収率および感度の改善を達成することは必須でない。「フィード」ＲＮＡの可能な技術的解決法および基本特性は下記に詳細に説明される。
【００５４】
「フィード」ＲＮＡ自身が高忠実度ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーまたはテンプレートとして作用しうることは期待すべきでない。フィードＲＮＡの３’末端への修飾はしたがって、本発明の意味では、必須ではないがしかし実施されうる。いくつかの解決法がこれに適当であり、それによって修飾が好ましくは酵素的または化学的過程によって生じる。これらは、ジデオキシヌクレオチド、逆塩基、スペーサー、色素、消光残基、たとえばブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、副溝消光残基、修飾塩基、たとえばスーパー塩基、ハロゲン化塩基または塩基アナログ、塩基脱落部位、ブロックされた３'−ＯＨ基のＤＮＡへの組み込み（たとえば３'−ＯＨ基のリン酸による置換）および糖骨格へ、たとえば２−Ｏ−メチルＲＮＡ、および塩基へのすべての他の公知の修飾、および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を触媒する能力を阻害する追加の側基の組み込みを含む。これは酵素的または化学的修飾によっても達成されうる。別の可能性は、環状ＲＮＡ分子の「フィード」ＲＮＡとしての使用である。これは、たとえば、より小さい、合成によって製造された環形のＲＮＡ分子でもよい。
【００５５】
したがって、「フィード」ＲＮＡは好ましくは、可能な限り多数の異なる配列モチーフを有するＲＮＡ分子の一群を含むべきである。このようにして、十分な適当な結合部位が、使用する任意のテンプレート核酸中につねに利用可能であり、それは選択された「フィード」ＲＮＡの一般的な有用性にとって有益である。驚くべきことに、ＲＮＡホモポリマーに対する同等の効果もまた達成できた（ポリＡ ＲＮＡ、実施例８参照）。「フィード」ＲＮＡはいくつかの修飾塩基へ、および糖−リン酸骨格の両方に、いくつかの修飾を有しうる。ユニバーサルまたは修飾塩基もまた存在してよく、または側鎖への修飾が挿入されうる。
【００５６】
本発明の基礎的一態様は、「フィード」ＲＮＡ としてＰＣＲ反応中に挿入されたＲＮＡが、自身または存在する別の核酸分子と二本鎖構造を形成する能力を有する点である。 使用する「フィード」ＲＮＡの塩基配列は、一般的に存在する副産物が「フィード」ＤＮＡの存在を通して破壊的な量で検出可能でないように、またはフィードＲＮＡ自身が検出可能であるように構築されるべきである。破壊的な量に到達するのは一般的に、生じる副産物が、使用するＰＣＲ産物分析法でバックグラウンドとして検出可能な場合に、またはたとえばクローニング、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳または突然変異誘発のような以降の用途に破壊的な影響を示す場合である。
【００５７】
二本鎖が形成される結合部位は、完全に相補的である必要は無い；一個以上の塩基誤対合を有する結合もまた生じうる。本発明の意味での「フィード」ＲＮＡは、好ましくは二本鎖を少なくともＰＣＲのアニーリング段階中に生じることができるべきである。アニーリングは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは約１２塩基から数千塩基（たとえば２０００、３０００、４０００、５０００または１０，０００塩基）の好ましい長さの「フィード」ＲＮＡを生じる。選択される好ましい長さは、「フィード」ＲＮＡの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００５８】
好ましくは、「フィード」ＲＮＡは、ＰＣＲ条件下で、二本鎖の結合または適当な反対鎖との結合が可能である長さであるべきである。したがって少なくとも、オリゴヌクレオチドは、効率的な結合をＰＣＲ緩衝液中で約４０℃〜９０℃にて可能にする長さを有しなければならない。典型的には、ＰＣＲのアニーリング段階での結合が起こるべきであり、それは主に約４５℃〜７０℃の温度範囲で実施される。これは、少なくとも約１２塩基から数千塩基（約２０００、３０００、４０００、５０００または１０，０００塩基）の好ましい長さの「フィード」ＲＮＡ産物を生じる。選択される好ましい長さはまた、特に、「フィード」ＲＮＡの配列、ＧＣ含量およびおそらく他の修飾に依存する。
【００５９】
「フィード」ＲＮＡの有効濃度は、好ましくは約０．０４ないし４０ｎｇ／μｌの範囲にある。最適濃度は、「フィード」ＲＮＡの長さおよび塩基配列およびその他の特性によって決定される。長さ約１２塩基から約１０，０００塩基の「フィード」ＲＮＡについて好ましい濃度は、０．０４ｎｇ／μｌないし４０ｎｇ／μｌである。
【００６０】
「フィード」ＲＮＡの５'末端は、修飾されなくてもよく、または追加で修飾を有してもよい。５'−修飾は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が妨げられないように「フィード」ＲＮＡの結合特性が影響されないおよび限り、本発明の意味では本質的に重要でない。適当な修飾は、Ｃ−リンカー（たとえばＣ３−、Ｃ６−、Ｃ９−、Ｃ１２−、Ｃ１８−リンカー）、５'−リン酸修飾、アミノ修飾、ＤＩＧを含むハプテン、フルオレセイン、ビオチン、蛍光色素、消光残基、チオール標識および、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合を防止しない他の公知の５'−修飾を含む。
【００６１】
「フィード」ＲＮＡの内部修飾もまた可能であり、および本発明の文脈で有利でありうる。内部修飾は塩基、糖−リン酸骨格または挿入された側鎖に影響しうる。「フィード」ＲＮＡまたは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの結合が妨げられない限り、一般的にＲＮＡ骨格のすべての公知の変化を考えることができる。
【００６２】
本発明は以降で実施例によって詳細に説明される。
【実施例】
【００６３】
実施例１
この実施例では、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いたＥＲＣＣ１のＰＣＲ増幅に対する、異なる長さの「フィード」オリゴヌクレオチド（Ｐ２０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ３０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ４５−ＧＡＰＤＨおよびランダム８量体）の作用を調べる。オリゴヌクレオチドＰ２０−ＧＡＰＤＨ（２０量体）；Ｐ３０−ＧＡＰＤＨ（３０量体）；およびＰ４５−ＧＡＰＤＨ（４５量体）はヒトＧＡＰＤＨ遺伝子座と相補的である。これらは天然糖−リン酸骨格を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、３'−ＯＨ末端基の代わりに３'−リン酸を有する。ランダム８量体は、ランダム配列を有する８量体である（Ｎ8）。これは同様に天然糖−リン酸骨格および３'−ＯＨ基を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００６４】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）；カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１．２５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、１μＭのＥＲＣＣ１順方向および１μＭの逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。三連の検定（すなわち、３つの平行実験）で、ヒトゲノムＤＮＡ２０ｎｇまたは２ｎｇを各例で加え、および二連の検定（すなわち、２つの平行実験）で、同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＰ２０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ３０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ４５−ＧＡＰＤＨのうちの一つを本発明の意味での「フィード」オリゴヌクレオチドとして、および「ランダム８量体」を濃度１０μＭで各例に加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図１の見出し：「対照」）。
【００６５】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【００６６】
ＰＣＲプライマー配列：
ＥＲＣＣ１−ｆｏｒ： ＧＣＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＧＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＣＧＡ Ｇ
ＥＲＣＣ１−ｒｅｖ： ＧＣＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＣＧ ＡＴＴ
【００６７】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｐ２０−ＧＡＰＤＨ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]
Ｐ３０−ＧＡＰＤＨ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]
Ｐ４５−ＧＡＰＤＨ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]
（[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]：３'−ＯＨの代わりに３'−リン酸）
【００６８】
ランダム８量体： ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮ
【００６９】
各ＰＣＲの１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ドイツ、カールスルーエ、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図１は、異なる長さの「フィード」オリゴヌクレオチド（Ｐ２０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ３０−ＧＡＰＤＨ；Ｐ４５−ＧＡＰＤＨおよびランダム８量体）の、ＥＲＣＣ１のＰＣＲ増幅に対する作用に関するＰＣＲのアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【００７０】
図１から、テンプレートＤＮＡ２０ｎｇを用いた収率の改善が、対照と比較してすべての条件下で観察できることがわかる。増幅の成功、つまり感度の１０倍の改善が、「フィード」オリゴヌクレオチドＰ３０−ＧＡＰＤＨ（３０量体）およびＰ４５−ＧＡＰＤＨ（４５量体）を用いて達成された。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【００７１】
結論として、これは、融点（長さおよびＧＣ含量による）のためにＤＮＡ二本鎖をＰＣＲ条件下で形成する能力を有するオリゴヌクレオチドは、本発明の意味で「フィードオリゴヌクレオチド」として特に適していることを示唆する。
【００７２】
実施例２
この実施例では、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに対する、ヘアピン「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'ＰおよびＰ７８ ３'Ｐ−チオの作用を調べた。そのオリゴヌクレオチドは５'−領域に、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子座と相補的である配列を含む。３'−領域は、二本鎖ヘアピン構造が形成できるように、オリゴヌクレオチドの５'−領域と相補的である。これらは、３'−ＯＨ基の代わりに３'−リン酸を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐ−チオは、最後と最後から二番目の３'−塩基の間のＤＮＡの糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有する。
【００７３】
高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）；カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１．２５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＣＦＴＲ（ＣＹＳＴ）用の１μＭの順方向および１μＭの逆方向プライマー、および各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。二連の検定（すなわち、２つの平行実験）で、ヒトゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、５ｎｇまたは１ｎｇを各例に加え、および単一の検定で、同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＰ７８ ３'ＰおよびＰ７８ ３'Ｐ−チオのうちの一つを本発明の意味での「フィード」オリゴヌクレオチドとして、濃度２．５μＭ、１μＭ、０．５μＭおよび０．２μＭでそれぞれ各例に加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図２の見出し：「対照」）。
【００７４】
試料はＰＣＲの調製中に冷却した。
【００７５】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【００７６】
ＰＣＲプライマー配列：
ＣＹＳＴ ３： ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＡＣＡ Ｃ
ＣＹＳＴ ５： ＣＣＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＧＣ Ａ
【００７７】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｐ７８ ３'Ｐ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＧＣ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]（[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ ３'−ＯＨ）
【００７８】
Ｐ７８ ３'ｐ−チオ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＧ ＊Ｃ[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]（[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]：３'−ＯＨの代わりに３'−リン酸；＊：骨格中のホスホチオアート）
【００７９】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（１％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。
【００８０】
図２は、ヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチド（Ｐ７８ ３'Ｐ、Ｐ７８ ３'Ｐ−チオ）の、ヒトＣＦＴＲ遺伝子座由来１．５ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用を調べるためのＰＣＲのアガロースゲル分析を示す。トレース１：２５ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース２：５ ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース３：１ ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース４：ＮＴＣ；Ｍ＝マーカー。
【００８１】
図２から、ヘアピン「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'ＰおよびＰ７８ ３'Ｐ−チオの添加によって、１．５ｋｂ断片の高忠実度ＰＣＲの収率および感度は「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチド無しの対照と比較して明らかに上昇できたことが明らかである。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐは、１．５ｋｂ断片の高忠実度ＰＣＲ増幅の収率および感度に対して、０．２Ｍから２．５Ｍの試験した全範囲にわたって正の効果を有した。
【００８２】
「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐ−チオは、１．５ｂ断片の増幅において０．２Ｍから０．５Ｍの範囲内で正の効果を示した。より高い濃度では、ヘアピン「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドだけが２００ｂｐにてスメアとしてゲル上に検出可能であった。この効果は「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐでは起こらなかった。
【００８３】
結論として、これは、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性によって分解されることを示唆する。したがって、Ｐ７８ ３'Ｐ−チオと比較して、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＰ７８ ３'Ｐの顕著に高い濃度を使用することが可能である。Ｐ７８ ３'Ｐ−チオのように、３'−リン酸をホスホチオアートと組み合わせることによって、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドは明らかに未変化に留まり、およびしたがって、ＰＣＲ全体の間に高忠実度ＤＮＡポリメラーゼと結合する能力を有する。
【００８４】
実施例３
この実施例では、ランダム化部分またはユニバーサル塩基イノシンを含む「フィード」オリゴヌクレオチド（Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ； ｐＡ−Ｉ； βＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'）の、ヒトＣＦＴＲ遺伝子座由来の１．５ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用を調べた。
【００８５】
オリゴヌクレオチドＮ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ、ｐＡ−Ｉ、およびβＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'（配列は下記参照）を、ＰＣＲにおける成績について試験した。これらは、３'−ＯＨ末端基を有する天然糖−リン酸骨格を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００８６】
ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１．２５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭの順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。二連の検定で、ヒトゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、５ｎｇまたは１ｎｇを加え、および単一の検定で、同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＮ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ、ｐＡ−ＩおよびβＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'のうちの一つを各例で本発明の意味での「フィード」オリゴヌクレオチドとして濃度１０μＭで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図３の見出し：「対照」）。試料はＰＣＲの調製中に冷却した。
【００８７】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【００８８】
ＰＣＲプライマー配列：
ＣＹＳＴ ３： ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＡＣＡ Ｃ
ＣＹＳＴ ５： ＣＣＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＧＣ Ａ
【００８９】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ： ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＨ ＨＮＤ ＤＶＡ ＡＴＡ ＡＡ
ｐＡ−Ｉ：                   ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＡＡＴ ＡＡＡ
βＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'：    ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＴＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＡＩ ＩＩＩ ＩＩ
【００９０】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。
【００９１】
図３は、異なる長さの「フィード」オリゴヌクレオチド（Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ； ｐＡ−Ｉ； βＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'）の、ヒトＣＦＴＲ遺伝子座由来１．５ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用を調べるためのＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。トレース１：２５ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース２：５ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース３：１ ｎｇ ＨｕＤＮＡ；トレース４：ＮＴＣ；Ｍ＝マーカー。
【００９２】
「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＮ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡおよびｐＡ−Ｉの添加によって、高忠実度ＰＣＲの収率および感度は、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチド無しの対照と比較して明らかに上昇しうる。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【００９３】
３'末端に６個のイノシン塩基を持つ「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドβＡｃｔｐＡ−６Ｉ−３'は、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして不適当である。
【００９４】
結論として、これは、ランダム化配列またはユニバーサル塩基を持つオリゴヌクレオチドは「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして有効に使用されうることを示唆する。また、使用したポリメラーゼの３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性による分解から保護されていない標準オリゴヌクレオチドの、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしての使用は実行可能である。
【００９５】
実施例４
この実施例では、異なる特性を有する「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドの、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに対する作用を調べた。下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ、ＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオ、Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡおよびＰＡ−ＩをＰＣＲに加えた。オリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３´ＰおよびＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオはすでに実施例２に記載されており、およびオリゴヌクレオチドＮ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡおよびＰＡ−Ｉはすでに実施例３に記載された。
【００９６】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ））を含む反応容量２０μｌを含んだ。
【００９７】
二連の検定で、Ｋ５６２ ｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、実施例の最後の一般的方法を参照）１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０．００１ｎｇを各例に加え、および同様に同等量の水を別の二連の検定にネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ、ＧＡＰ Ｐ７８ ３´Ｐ−チオ、Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡおよびＰＡ−Ｉを各例で本発明の意味での「フィード」として濃度０．２５μＭ、０．５μＭおよび１０μＭで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図４Ａから４Ｄの見出し：対照）。試料はＰＣＲの調製中に冷却した。
【００９８】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【００９９】
ＰＣＲプライマー配列：
ＢＡＣＴ−ＴＭ．５： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
ＢＡＣＴ−ＴＭ．３： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１００】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＡＰ Ｐ７８ ３´Ｐ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＧＣ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]
（[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸）
ＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＧ＊Ｃ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]
（[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸；＊：骨格中のホスホチオアート）
Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ： ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＨ ＨＮＤ ＤＶＡ ＡＴＡ ＡＡ
ｐＡ−Ｉ： ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＩＩＩ ＡＡＴ ＡＡＡ
【０１０１】
各ＰＣＲ反応の５μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図４Ａから４Ｄは、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、異なる特性を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＰ Ｐ７８ ´Ｐ、ＧＡＰ Ｐ７８ ３'ｐ−チオ、Ｎ１４−ｄｅｇＡＡＴＡＡＡ、ＰＡ−Ｉ）の作用を分析するための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１０２】
ゲノムＤＮＡとの使用について実施例２および３ですでに試験成功している「フィード」オリゴヌクレオチドを、高忠実度ＰＣＲを用いる実施例４でｃＤＮＡ由来の３００ｂｐ断片を増幅するためのテンプレート核酸として使用した。すべての例で、収率および感度の明らかな改善が達成できる。「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチド無しのＰＣＲ反応と比較して、相当に少ない量のテンプレートｃＤＮＡを用いてＰＣＲの成功が可能であった。感度は最大１００倍（図４Ａの通りの実験）、最大１０，０００倍（図４Ｂの通りの実験）、最大１，０００倍（図４Ｃの通りの実験）および最大１０，０００倍（図４Ｄの通りの実験）上昇可能であった。実施例４で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、したがって、高忠実度ＰＣＲの収率および感度の上昇のための「フィード」オリゴヌクレオチドとして適している。
【０１０３】
実施例５
この実施例では、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによるβ−アクチンのＰＣＲ増幅に対する作用を調べた。
【０１０４】
下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドＧＡＰ４５−３'ＰおよびＧＡＰ４５−３'Ｐ−チオをＰＣＲに加えた。これらは、３'−ＯＨ基の代わりに３'−リン酸を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。両種は、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在（ＧＡＰ４５−３'Ｐ−チオ）または非存在（ＧＡＰ４５−３'Ｐ）が異なる。
【０１０５】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２０μｌを含んだ。二連の検定で、Ｋ５６２ｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、実施例の最後の一般的方法を参照）１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０．００１ｎｇを各例に加え、および同様に同等量の水を別の二連の検定にネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＧＡＰ４５−３´ＰおよびＧＡＰ４５−チオを各例で本発明の意味での「フィード」として濃度０．３μＭ、１．０μＭ、３．０μＭおよび１０μＭで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図５Ａの見出し：「対照」）。試料はＰＣＲの調製中に冷却した。
【０１０６】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１０７】
ＰＣＲプライマー配列：
ＢＡＣＴ−ＴＭ．５： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
ＢＡＣＴ−ＴＭ．３： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１０８】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＡＰ４５−３'Ｐ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ
ＧＡＰ４５−チオ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＡ＊Ｇ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ] （[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸； ＊：骨格中のホスホチオアート）
【０１０９】
各ＰＣＲ反応の５μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図５Ａから５Ｃは、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。
【０１１０】
両方の４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドを用いてすべての例で、収率および感度の明らかな改善が達成できた。「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチド無しのＰＣＲ反応と比較して、相当に少ない量のテンプレートｃＤＮＡを用いてＰＣＲの成功が可能であった。対照（図５Ａ）と比較した感度は、ＧＡＰ４５−３'Ｐを用いて最大１，０００倍（図５Ｂ）およびＧＡＰ４５−チオを用いて最大１０，０００倍上昇可能であった。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【０１１１】
実施例６
この実施例では、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＧ４５−ＴＰ−１ｓｐ−ｄおよびＧ４５−ＴＰ−２ｓｐ−ｄの、β−アクチンによる高忠実度ＰＣＲに対する作用を調べた。下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドＧ４５−ＴＰ−１ｓｐ−ｄおよびＧ４５−ＴＰ−２ｓｐ−ｄをＰＣＲに加えた。これらは、３'−ＯＨ基の代わりに３'−リン酸を有し、およびＤＮＡ骨格中の最後と最後から二番目の３'−塩基の間のリン酸の代わりにホスホチオアートを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。両種は、塩基脱落スペーサーの存在（Ｇ４５−ＴＰ−１ｓｐ−ｄ）および非存在（Ｇ４５−ＴＰ−２ｓｐ−ｄ）が異なる。
【０１１２】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２０μｌを含んだ。二連の検定で、ｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、実施例の最後の一般的方法を参照）１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０．００１ｎｇを各例に加え、および単一の検定で同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、オリゴヌクレオチドＧ４５−ＴＰ−１ｓｐ−ｄおよびＧ４５−ＴＰ−２ｓｐ−ｄを各回で本発明の意味での「フィード」として、濃度０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図５Ａの見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１１３】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１１４】
ＰＣＲプライマー配列：
ＢＡＣＴ−ＴＭ．５： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
ＢＡＣＴ−ＴＭ．３： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１１５】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｇ４５−ＴＰ−１ｓｐ−ｄ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴ [ｓｐ−ｄ]ＧＴＣ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＧＡ ＊Ｇ[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]（[ｓｐ−ｄ]：塩基脱落スペーサー[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]：３'−リン酸）
【０１１６】
Ｇ４５−ＴＰ−２ｓｐ−ｄ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴ[ｓｐ−ｄ] ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＧＴ [ｓｐ−ｄ]ＧＴＣ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＧＡ ＊Ｇ[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]（[ｓｐ−ｄ]：塩基脱落スペーサー，[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]：３'−リン酸；＊：骨格中のホスホチオアート）
【０１１７】
各ＰＣＲ反応の５μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図６Ａから６Ｃは、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１１８】
１個の塩基脱落スペーサー（図６Ｂ）または２個の塩基脱落スペーサー（図６Ｃ）を有する４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの両方を用いたすべての例で、収率および感度の明らかな改善が達成できた。「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチド無しのＰＣＲ反応（図６Ａ）と比較して、相当に少ない量のテンプレートｃＤＮＡを用いてＰＣＲの成功が可能であった。対照（図６Ａ）と比較した感度は、最大１，０００倍（図６Ｂの通りの実験）およびまた図６Ｃの通りの実験では最大１０，０００倍上昇可能であった。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【０１１９】
実施例７
この実施例では、本発明の意味で「フィード」として用いられるＲＮＡの、高忠実度ＰＣＲ（β−アクチンのＰＣＲ増幅）に対する作用を調べた。市販の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、Ｒ８５０８、シグマ社（Ｓｉｇｍａ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ミュンヘン、タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ））およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ、Ｒ６７５０、シグマ社）を、高忠実度ＰＣＲの「フィード」として加えた。
【０１２０】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２０μｌを含んだ。三連の検定でＫ５６２ｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、一般的方法を参照）１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇを各例に加え、および単一の検定で同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、本発明の意味での「フィード」を、各例でｔＲＮＡを２０μｌの反応検定あたり濃度４ｎｇ、４０ｎｇ、４００ｎｇおよび４０００ｎｇで、およびｒＲＮＡを２０μｌの反応検定あたり濃度４ｎｇ、４０ｎｇおよび４００ｎｇで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」ＲＮＡ無しで実施した（図７Ａの見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１２１】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１２２】
ＰＣＲプライマー配列：
β−アクチン順方向： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
β−アクチン逆方向： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１２３】
各ＰＣＲ反応の５μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図７Ａおよび７Ｂは、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、本発明の意味での「フィード」としてのＲＮＡの作用を調べるためのアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１２４】
驚くべきことに、本発明の意味での「フィード」としてのＲＮＡは、高忠実度ＰＣＲの収率および感度を改善するのに適している。ｔＲＮＡの使用（図７Ａ）は感度を最大１００倍改善できた。ｒＲＮＡの使用（図７Ｂ）は感度を最大１，０００倍にさえ改善できた。同時に、ＲＮＡの添加によって（図７ＡおよびＢ）、高忠実度ＰＣＲにおいてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【０１２５】
実施例８
この実施例では、本発明の意味での「フィード」としてのＲＮＡの、高忠実度ＰＣＲ（β−アクチンのＰＣＲ増幅）に対する作用を調べた。市販のポリＡ−ＲＮＡ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、１０１０３７３）を、高忠実度ＰＣＲの「フィード」として加えた。これはホモ−Ａ−ポリマーであり、異なる長さのポリ（Ａ）分子の不均一な混合物を含む（主画分０．２ｋｂないし５．０ｋｂ）。
【０１２６】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、２．５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量５０μｌを含んだ。三連の検定でｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、実施例の最後の一般的方法を参照）１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇを反応ごとに加え、および単一の検定で同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、本発明の意味での「フィード」としてポリＡ−ＲＮＡを、各例で５０μｌ反応検定あたり濃度２０ｎｇ、２００ｎｇ、２０００ｎｇおよび２０，０００ｎｇで加えた。対照として、対応する反応を各例で「フィード」ＲＮＡ無しで実施した（図８Ａの見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１２７】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての４０サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１２８】
ＰＣＲプライマー配列：
β−アクチン順方向： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
β−アクチン逆方向： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１２９】
各ＰＣＲ反応の１０ μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（１％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図８Ａおよび８Ｂは、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、添加されるポリＡ−ＲＮＡの作用を調べるためのアガロースゲル分析を示す。
【０１３０】
驚くべきことに、本発明の意味での「フィード」として使用したポリＡ−ＲＮＡもまた、高忠実度ＰＣＲの収率および感度を改善するのに適している。ポリＡ−ＲＮＡの使用は、感度を最大１０，０００倍改善できた。同時に、ＲＮＡの添加によって（図８ＡおよびＢを比較）高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【０１３１】
実施例９
この実施例では、ＤＮＡの糖−リン酸骨格の最後と３'−塩基の間にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーの、高忠実度ＰＣＲ（β−アクチンのＰＣＲ増幅）に対する作用を調べおよび標準ＰＣＲプライマーと比較することになっていた。文献では（スケラ（Ｓｋｅｒｒａ），Ａ．，ホスホロホスホチオアートプライマーはプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列の増幅を改善する（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏ ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９２，２０（１４），３５５１−３５５４）、糖−リン酸骨格に最後と最後から二番目の３'−塩基の間にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーについて正の効果が記載されている。この実験では、実施例４から８で使用したβ−アクチンＰＣＲ系の増幅に対するそのようなプライマーの作用を、標準プライマーと比較して調べることになっていた。プライマーの作用は、濃度範囲０．２μＭから１μＭで試験した。
【０１３２】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、２．５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各０．２μＭ、０．５μＭまたは１μＭのβ−アクチン順方向−チオおよび逆方向−チオプライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量５０μｌを含んだ。二連の検定でＫ５６２ ｃＤＮＡ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇを各例に加え、および同様に二連の検定で、同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。対照として、対応するＰＣＲ反応を各例で、０．２μＭ、０．５μＭまたは１μＭの両方の標準プライマー（β−アクチン順方向および逆方向）を用いて実施した（見出し：「標準プライマー」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１３３】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての３５サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。プライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１３４】
ＰＣＲプライマー配列：
β−アクチン 順方向： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
β−アクチン 逆方向： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
β−アクチン 順方向−チオ： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ ＊Ａ
β−アクチン 逆方向−チオ： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ ＊Ｇ
（＊：骨格中のホスホチオアート）
【０１３５】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図９は、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、標準ＰＣＲプライマーと比較した、最後と最後から二番目の３'塩基の間のＤＮＡの糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーの作用を調べるためのアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１３６】
最後と最後から二番目の３'塩基の間に糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーを用いて、標準 プライマーと比較して収率および感度に小さい改善を達成することが可能であった。感度の上昇は最大１０倍であった。対照的に、実施例４ から８における同一のＰＣＲ系での感度は最大１０，０００倍上昇した。
【０１３７】
同時に、最後と最後から二番目の３'塩基の間のＤＮＡの糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーの使用は、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドの低減を示さなかった。最新技術と比較して、本発明の意味での「フィード」の使用は、高忠実度ＰＣＲの顕著な改善を実証した。
【０１３８】
実施例１０
この実施例は、ヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドの、酵素ＶｅｎｔＲを用いるマウスＰＫＣ遺伝子座由来の２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用に関する。特に、ヘアピン「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いる高忠実度ＰＣＲに対する作用をこの実施例で調べた。酵素ＶｅｎｔＲ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），Ｍ０２５４Ｓ）は元来サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ）に由来し、一方、前記の実施例で使用したプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ポリメラーゼは元来パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）から単離された。加えて、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ポリメラーゼと比較して、ＶｅｎｔＲはまたＰＣＲホットスタートを欠く。オリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオは実施例２ですでに詳細に記載された。
【０１３９】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。ＶｅｎｔＲポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘサーモポル（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ）反応ＰＣＲ緩衝液、２．５ＵのＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ、各０．４μＭのＭＰＵＣ順方向および逆方向プライマーおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量５０μｌを含んだ。三連の検定で３Ｔ３ ＤＮＡ１００ｎｇ、２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および０．２５ｎｇを各例に、および同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。対照として、対応するＰＣＲ反応を「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図１０の見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１４０】
ＰＣＲ手順は、３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての４０サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１４１】
ＰＣＲプライマー配列：
ＭＰＵＣ ３： ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＧ
ＭＰＵＣ５＋２５８： ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＴＣ
【０１４２】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＡＰ Ｐ７８ ３´Ｐ−チオ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＧ＊Ｃ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ] （[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸； ＊：骨格中のホスホチオアート）
【０１４３】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図１０は、ＶｅｎｔＲ酵素を用いるマウスＰＫＣ遺伝子座由来２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対するヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１４４】
本発明の意味での「フィード」の使用はまた、別の古細菌種に由来する他の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼと適合し、および高忠実度ＰＣＲの収率および感度における改善を可能にする。ここでは、ヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドＧＡＰ Ｐ７８ ３'Ｐ−チオの添加は、２ ｋｂ ＰＣＲ産物について最大４０倍の感度改善に繋がる。
【０１４５】
実施例１１
この実施例では、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＮ４０−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いる高忠実度ＰＣＲ（β−アクチンのＰＣＲ増幅）に対するに対する作用を試験した。ポリメラーゼＶｅｎｔＲ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），Ｍ０２５４Ｓ）は元来サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ）に由来し、一方、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ポリメラーゼは元来パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）から単離された。加えて、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ポリメラーゼと比較して、ＶｅｎｔＲはまたＰＣＲホットスタートを欠く。「フィード」オリゴヌクレオチドは、ランダム配列ｏｆＡ、Ｃ、ＧおよびＴ（Ｎ）のランダム配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドであり、３'−ＯＨ基の代わりに３'−リン酸を有し、およびまたＤＮＡの糖−リン酸骨格の最後と最後から二番目の３'−塩基の間にホスホチオアートを含む。
【０１４６】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。ＶｅｎｔＲポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘサーモポル（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ）反応ＰＣＲ緩衝液、１．２５ＵのＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼ、各０．４μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。三連の検定でＫ５６２ ＤＮＡ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇを各例に、および同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、本発明の意味の「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオを、各例に濃度０．３μＭ、０．７μＭまたは１μＭで加えた。対照として、対応するＰＣＲ反応を「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図１１の見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１４７】
ＰＣＲ手順は、３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての４０サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１４８】
ＰＣＲプライマー 配列：
β−アクチン 順方向： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
β−アクチン 逆方向： ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１４９】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｎ４０−チオ： ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮ＊Ｎ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ] （Ｎ： Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ； [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'− リン酸； ＊：骨格中のホスホチオアート）
【０１５０】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（１％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図１１は、ＶｅｎｔＲ酵素を用いるβ−アクチンのＰＣＲ増幅に対する「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１５１】
「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオの添加は、ここでは１０倍の収率における改善および感度における改善につながる。したがって、それは本発明の意味での適当な「フィード」オリゴヌクレオチドである。
【０１５２】
実施例１２
この実施例では、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＧＡＰ４５−チオの、いくつかの古細菌種に由来する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いる高忠実度ＰＣＲ（マウスＰＫＣ遺伝子座由来２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅）に対する作用を調べた。使用した酵素ＶｅｎｔＲ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），Ｍ０２５４Ｓ） は元来サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ）に由来し、一方、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ポリメラーゼは元来パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）から単離された。オリゴヌクレオチドＧＡＰ４５−チオは実施例５にすでに詳細に記載されている。
【０１５３】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。ＶｅｎｔＲポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘサーモポル（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ）反応ＰＣＲ緩衝液、１．２５ＵのＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼ、各０．４μＭのＭＰＵＣ順方向および逆方向プライマーおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。三連の検定でＲｘＮ１００ｎｇ、２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および０．２５ｎｇを各例に加え、および二連の検定で、同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、ＧＡＰ４５−チオを本発明の意味の「フィード」オリゴヌクレオチドとして濃度０．３μＭ、０．７μＭまたは１μＭで加えた。対照として、対応する反応を「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図１２の見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１５４】
ＰＣＲ手順は、３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての４０サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１５５】
ＰＣＲプライマー配列：
ＭＰＵＣ ３： ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＧ
ＭＰＵＣ５＋２５８： ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＴＣ
【０１５６】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＡＰ４５−チオ： ＧＣＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＡ＊Ｇ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ] （[Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸； ＊： 骨格中のホスホチオアート）
【０１５７】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）。で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図１２は、ＶｅｎｔＲ酵素を用いるマウスＰＫＣ遺伝子プール由来２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１５８】
「フィード」オリゴヌクレオチドＧＡＰ４５−チオの使用は、感度を最大４００倍改善できた。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドもまた明らかに減少した。
【０１５９】
実施例１３
この実施例では、「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオの、ＰＣＲプライマーの濃度変化と関連した、β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する作用を調べた。この実施例では、特に、「フィード」ＤＮＡオリゴヌクレオチドＮ４０−チオの高忠実度ＰＣＲに対する作用を、さまざまな濃度のＰＣＲプライマーの存在下で調べ、および「フィード」オリゴヌクレオチド無しの反応と比較した。使用した「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオは実施例１１にすでに詳細に記載されている。プライマー濃度の作用は濃度範囲０．２μＭから１μＭで試験した。
【０１６０】
高忠実度ＰＣＲの設計および手順は下記の通りであった。プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０２２０５）をＰＣＲ反応に用いた。各反応検定は１ｘプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＰＣＲ緩衝液、１．２５Ｕのプルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、各０．２、０．５および１μＭのβ−アクチン順方向および逆方向プライマーおよび各０．３ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む反応容量２５μｌを含んだ。二連の検定で、Ｋ５６２ ｃＤＮＡ（Ｋ５６２細胞由来、実施例の最後の一般的方法を参照）１ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇを反応ごとに各例に加え、および単一の検定で同等量の水をネガティブ対照として加えた（ＮＴＣ：「テンプレート無し対照」）。加えて、Ｎ４０−チオを本発明の意味での「フィード」オリゴヌクレオチドとして濃度１μＭで加えた。対照として、対応する反応を「フィード」オリゴヌクレオチド無しで実施した（図１３の見出し：「対照」）。ＰＣＲの調製中に試料を冷却した。
【０１６１】
ＰＣＲ手順は、プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼの５分間９５℃にて最初の再活性化（「ホットスタート」）、次いで３０秒間９４℃にて、６０秒間６１℃にておよび１分３０秒間７２℃にての４０サイクル、および１０分間７２℃にての最終段階（「最終伸長」）を含んだ。オリゴヌクレオチドおよびプライマーの下記の配列は５'−３'方向に記載されている。
【０１６２】
ＰＣＲプライマー配列：
β−アクチン 順方向： ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ Ａ
β−アクチン 逆方向： ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＧ Ｇ
【０１６３】
「フィード」オリゴヌクレオチドの配列：
Ｎ４０− チオ： ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮ＊Ｎ [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ] （Ｎ： Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ； [Ｐｈｏｓｐ−Ｑ]： ３'−リン酸； ＊： 骨格中のホスホチオアート
【０１６４】
各ＰＣＲ反応の１０μｌをエチジウムブロマイド染色アガロースゲル（２％）で分析した。１００ｂｐラダー（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５６２８−０５０）をサイズ標準として用いた。図１３は、「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオの、ブロックされたＰＣＲプライマーと関連した、β−アクチンの増幅に対する作用を示す。Ｍ＝マーカー。
【０１６５】
さまざまなプライマー濃度を用いてさえ、収率および感度の改善が「フィード」オリゴヌクレオチドの存在下で達成された。同時に、高忠実度ＰＣＲ反応においてしばしば「スメア」として現れるバックグラウンドは明らかに減少した。
【０１６６】
一般的方法
Ｉ．テンプレート核酸：
１．ゲノムＤＮＡ：使用したヒトゲノムＤＮＡ（ＨｕＤＮＡおよびｇＤＮＡ）は、キアンプＤＮＡ血液マキシキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号５１１９２）またはフレキシジーンＤＮＡキット（ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ）（キアゲン社、カタログ番号５１２０４）を用いて血液から単離された。マウスゲノムＤＮＡは、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞からＤＮイージー・組織キット（ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ）（キアゲン社、カタログ番号６９５０４）を用いて抽出された。単離されたＤＮＡの濃度は、後で光度法（ＯＤ２６０）によって測定した。
【０１６７】
２．ｃＤＮＡ：「相補ＤＮＡ」を表し、およびＲＮＡ分子の一本鎖または二本鎖ＤＮＡコピーの名称である。
【０１６８】
ＩＩ．逆転写による作製
１．ＲＮＡ：Ｋ５６２細胞由来の総ＲＮＡを、ＲＮイージー・ミディ・キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、カタログ番号７５１４２）を用いて単離した。
【０１６９】
２．逆転写：ｃＤＮＡを作製するために、総ＲＮＡ１μｇを、オムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）ＲＴキット（キアゲン社（ＱＵＩＡＧＥＮ）、カタログ番号２０５１１０）を用いて、ランダムおよびオリゴ−ｄＴ（１５）プライマー（ランダム８量体１０μＭ、オリゴヌクレオチドｄＴ（１５）１μＭ）の混合物を使用して、取扱説明書に従って逆転写した。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】異なる長さの「フィード」ヌクレオチドの、ＥＲＣＣ１のＰＣＲ増幅に対する作用を調べるためのＰＣＲのアガロースゲル分析。
【図２】ヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドの、ヒトＣＦＴＲ遺伝子 座由来１．５ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用を調べるためのＰＣＲのアガロースゲル分析。
【図３】異なる長さの「フィード」オリゴヌクレオチド、ヒトＣＦＴＲ遺伝子座由来１．５ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する作用を調べるためのＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【図４Ａ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、異なる特性を有するオリゴヌクレオチドの作用を分析するための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【図４Ｂ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、異なる特性を有するオリゴヌクレオチドの作用を分析するための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【図４Ｃ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、異なる特性を有するオリゴヌクレオチドの作用を分析するための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【図４Ｄ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、異なる特性を有するオリゴヌクレオチドの作用を分析するための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【図５Ａ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析；
【図５Ｂ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析；
【図５Ｃ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ＤＮＡ骨格中のホスホチオアートの存在が異なる一本鎖４５量体「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるための、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析；
【図６Ａ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図６Ｂ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図６Ｃ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、塩基脱落スペーサーを含む「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図７Ａ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、本発明の意味での「フィード」としてのＲＮＡの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図７Ｂ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、本発明の意味での「フィード」としてのＲＮＡの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図８Ａ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ポリＡ ＲＮＡの添加の作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図８Ｂ】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、ポリＡ ＲＮＡの添加の作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図９】β−アクチンのＰＣＲ増幅に対する、標準ＰＣＲプライマーと比較した、最後と最後から二番目の３'塩基の間のＤＮＡの糖−リン酸骨格にホスホチオアートを有するＰＣＲプライマーの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図１０】ＶｅｎｔＲ酵素を用いるマウスＰＫＣ遺伝子プール由来２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対するヘアピン「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図１１】ＶｅｎｔＲ酵素を用いるβ−アクチンのＰＣＲ増幅に対する「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図１２】ＶｅｎｔＲ酵素を用いるマウスＰＫＣ遺伝子座由来２ｋｂ断片のＰＣＲ増幅に対する「フィード」オリゴヌクレオチドの作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図１３】「フィード」オリゴヌクレオチドＮ４０−チオの、さまざまな濃度のＰＣＲプライマーと関連した、β−アクチンの増幅に対する作用を調べるためのアガロースゲル分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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