(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させた酵素反応溶液を含むジフラクトース ジアンヒドリドＩＩＩ（ＤＦＡ ＩＩＩ）粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、ＤＦＡ ＩＩＩを含有する溶液を清浄・濾過した後、濃縮して結晶化するまでの循環系の清浄濾過・濃縮・結晶化工程において、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する総ての溶液のｐＨをアルカリ剤の添加法、クロマトグラフィー法、アニオン交換樹脂法の少なくともひとつの方法により、５〜８に調整・維持することを特徴とする、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
【請求項２】
イヌリンのフラクトース重合度が１０から６０であってポリサッカライドの固形分純度が７０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
【請求項３】
結晶化母液又は粗結晶化母液の冷却結晶化における終点温度での溶解度に対する過飽和度が１．３〜４．１であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
【請求項４】
ＤＦＡ  ＩＩＩ含有の結晶化母液又は粗結晶化母液のフラクトース含量が固形分重量当たり５％以下であること、を特徴とする請求項３に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
【請求項５】
フラクトース含量が固形分重量当たり５％以下にする方法として、フラクトオリゴ糖及び／又はフラクトースをクロマトグラフィー法、イースト処理法のいずれかひとつ以上を用いて除去すること、を特徴とする請求項４に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ジフラクトース  ジアンヒドリドＩＩＩ（Ｄｉｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ＩＩＩ）（以下、ＤＦＡ  ＩＩＩともいう）結晶を効率的に製造する方法に関する。本発明は、循環式によるＤＦＡ  ＩＩＩの製造においても、その結晶化率を低下させることがなく、ＤＦＡ  ＩＩＩの工業的製造方法としても非常にすぐれている。
【背景技術】  ＤＦＡ  ＩＩＩは、カルシウムを始めとしてミネラル吸収促進や利尿効果、便通改善効果を有する機能性オリゴ糖で、２個のフラクトースの還元末端が、互いに一方の還元末端以外の水酸基に結合した環状二糖類であって（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−２’，１：２，３’−ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、水への溶解度が高く蔗糖の９０〜９５％を示すが、その甘味度は蔗糖の５２％程度である。また、熱や酸に強い物質である。
ＤＦＡ  ＩＩＩの製造法としては、イヌリン及び／又はイヌリン含有植物抽出液にアースロバクター・ウレアフアシエンスに属する細菌またはその産生する酵素を作用させてＤＦＡ  ＩＩＩの含有液を作成して、そのＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を活性炭カラムに通液してＤＦＡ  ＩＩＩを吸着させた後、エタノールで溶離してＤＦＡ  ＩＩＩの多い画分を回収し、蒸発乾固するＤＦＡ  ＩＩＩの製造方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、イヌリン及び／又はイヌリン含有植物抽出液を、固定化素材に固定化したイヌリンフラクトトランスフェラーゼを充填したカラムに通液して、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を産生し、その含有液を、イオン交換樹脂、活性炭等の精製工程を経て、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有シラップ又は蒸発乾固物を生成するＤＦＡ  ＩＩＩの製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
また、イヌリンにイヌラーゼ  ＩＩを作用させることにより、高純度のＤＦＡ  ＩＩＩを工業的に生産することが可能である旨が記載されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、これらの文献には、いずれも結晶化ＤＦＡ  ＩＩＩを得ることについては全く記載されておらず、ましてやＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を効率的に工業生産することなど報告例はなく全く未知である。
【特許文献１】特公昭５６−２６４００号公報
【特許文献２】特開平１−２８５１９５号公報
【特許文献３】特開平１１−４３４３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  近年、ＤＦＡ  ＩＩＩについて有用な用途が開発されるに伴い、ＤＦＡ  ＩＩＩの需要が高まってきている。そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食品用途に使用する場合においても、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の糖及び各種不純物を除去した高純度ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶が要望されており、特に、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液からより効率的にＤＦＡ  ＩＩＩの結晶を得る方法、及び結晶化ＤＦＡ  ＩＩＩの工業的製造方法の確立が要望されている。
【課題を解決するための手段】  本発明は、上記した技術の現状に鑑み、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を製造する方法、特に工業的に効率よく製造する方法を開発する目的でなされたものである。
そこで本発明者らは、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を清浄・濾過した後、これを濃縮し、粗結晶化して粗結晶シラップを分離し、得られた粗結晶を溶解し、これを清浄・濾過した後、濃縮し、結晶化して結晶シラップを分離して製品結晶を製造する方法を開発し、そして更に、効率化、工業化のために、上記において分離した粗結晶シラップ及び／又は結晶シラップを結晶化工程に再度戻してやり、循環系を構築して連続的にＤＦＡ  ＩＩＩの結晶の製造を実施したところ、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化率が時間の経過とともに低下していき、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造が困難になること、特にその工業生産は実質的にできなくなるという極めて重大な欠点にはじめて遭遇した。
本発明者らは、この新しく発見された重大な欠点を解決するためにＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化率低下の原因について各方面から徹底的に検討を行った。
ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液には、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の物質が含まれている。それらは、チコリ等の植物からイヌリンを抽出する際、チコリ由来の物質であったり、砂糖から酵素合成でイヌリンを生成する際に合成される物質由来であったり、イヌリンからＤＦＡ  ＩＩＩを酵素反応する際イヌリンの酵素分解物質等が考えられる。また、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有溶液が結晶ＤＦＡ  ＩＩＩを製造する過程で溶液の滞留が長くなり、また、溶液の濃縮過程で高温等の過酷な条件に長時間曝されるので、これらの条件で、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有溶液の組成が変質することにより新たな他の物質が生ずることも考えられる。以上のような種々の物質が、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化に影響を与えることが考えられる。また、ＤＦＡ  ＩＩＩの精製・結晶化工程でＤＦＡ  ＩＩＩ含有液の循環があるため、上記で生成したＤＦＡ  ＩＩＩ以外の新たな物質が蓄積する。
ＤＦＡ  ＩＩＩの原料の１つとなるイヌリンは、グルコース一個にフラクトースが多数連なった多糖類であり、このイヌリンに分解転移酵素を作用させた場合、ＤＦＡ  ＩＩＩを主成分として生成し、その他の副産物質として、４糖類（Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）や５糖類（Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）のフラクトオリゴ糖を生成する。これらの４糖類、５糖類は、熱等に弱く、濃縮等の高温下での工程で変化して更に分子量の小さい糖や、最終的には有機酸等に分解する。そして結果的にＤＦＡ  ＩＩＩ含有液のｐＨが下がり、特に製造工程を循環系としたときでは、その分解がＤＦＡ  ＩＩＩ清浄・結晶化工程でさらに加速されることを突きとめた。
また、イヌリンからＤＦＡ  ＩＩＩを生成する酵素反応工程は、６０℃前後の比較的温和な温度条件下で行われるが、酵素反応初期のｐＨは中性域（６〜７）であるものの、反応終了時点のｐＨは４台まで低下することが分かった。したがって、酵素反応法によって得られるＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成液のｐＨは、通常５以下となっており、その後のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化に至る工程で、４糖類、５糖類が分解する原因の一つとなることが分った。
すなわち、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化工程へと進むときには、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の物質としては、糖類由来のものが多く、単糖であるグルコース、フラクトース、二糖類である蔗糖、３糖類、４糖類以上（フラクトオリゴ糖）の物質、有機酸等が混在することになる。また、ＤＦＡ  ＩＩＩは、前述した通り熱や酸分解を起こしづらい物質である。
これらのことに鑑み、本発明者等は、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有溶液中の種々の物質が、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を製造する際に影響する事項について、鋭意調査検討した。その結果、驚くべきことに、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨ、加えて混在する糖類、特にフラクトースや蔗糖がＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化に特に影響することをはじめて見出した。
そこで、本発明者らは、本発明者らがはじめて見出した上記ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化に特に影響するファクターについて、各方面から鋭意研究を行った。
すなわち、本発明者等は、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の上記物質に着目し、種々検討の結果、ＤＦＡ  ＩＩＩ清浄・濃縮・結晶化工程に於けるＤＦＡ  ＩＩＩを含有する総ての溶液のｐＨ（ガラス電極法）が５以上、好ましくはｐＨ５〜８、更に好ましくはｐＨ６〜８に維持及び／又は調整することにより、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化の一連の工程で分解し易い物質の分解を抑制し、他の物質への変化を最小限に食い止めることが判った。また、（粗）結晶母液のｐＨが５以上、好ましくはｐＨ６〜８でＤＦＡ  ＩＩＩを結晶化することにより、結晶化率が低下せず維持上昇することを新たに見出した。
結晶化母液のｐＨによって、糖の結晶化率が変化することは、ＤＦＡ  ＩＩＩのみならず他の糖類でも知られておらず、全く新規の知見である。
ＤＦＡ  ＩＩＩ製造における各工程液のｐＨを上記範囲で維持、調節する方法としては、可能な限り７０℃以下で工程液を管理することが効果的であり、またアルカリ剤を添加して積極的にｐＨ調節することが可能である。用いられるアルカリ剤としては、例として水酸化ナトリウム（苛性ソーダ）や水酸化カリウム（苛性カリ）、炭酸ナトリウム（ソーダ灰）等がある。また、クロマトグラフィーにより、工程液中の有機酸等の酸性物質およびＤＦＡ  ＩＩＩ以外の糖類を同時に除去することで、工程液のＤＦＡ  ＩＩＩの純度アップとｐＨ低下防止を同時に達成することが可能である。
また、上記以外の方法として、酸性物質を含むＤＦＡ  ＩＩＩ含有液をアニオン交換樹脂に通液することで、酸性物質がイオン交換により吸着し、酸性物質を除去することが可能である。
また、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する結晶化母液中に含まれるフラクトース、蔗糖が特にＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化の阻害要因となることを新たに見出した。フラクトースの含有量が、結晶化母液の固形分当たり５％以下、好ましくは１％以下であることがＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化をするにあたり結晶化率を高めることが判明した。
更に、結晶化母液ｐＨ５〜７の時、結晶化終点温度の溶解度に対する過飽和度（本発明では過飽和度Ｓと称する）が４．４以上の条件では、いずれの純度のＤＦＡ  ＩＩＩ含有結晶化母液においても、マスキットの流動性が著しく低下し、分蜜作業が困難と判断された。一方、過飽和度Ｓが４．１以下の条件では、マスキットは適度に流動性があり、分蜜作業は支障なく実施可能であった。従って、結晶化母液ｐＨが５以上であるＤＦＡ  ＩＩＩの工業的な結晶製造条件は、結晶化終点温度を基準とする過飽和度Ｓが４．１以下であることが分かった。過飽和度Ｓが１．３未満では結晶化率が２０％以下となることから、好ましくは、結晶化率の観点から過飽和度Ｓは１．３以上４．１以下、さらに好ましくは１．５以上４．１以下、またさらに好ましくは、２．３以上４．１以下が良いことが分かった。
なお、本発明で用いる「固形分濃度」とは、乾燥法により溶液中の水分を除去した後に残存する固形分の重量より算出される溶液中の固形分比率（ｗ／ｗ％）であり、実際の製造工程管理では、簡便法としてＲ−Ｂｘ（Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｒｉｘ  Ｄｅｇｒｅｅ）の値も代用できる。
本発明は、これらの有用新知見に基づき、更に研究、検討の結果、遂に完成されたものである。
以下、本発明について詳述する。
本発明は、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液体を精製して、高純度のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を、結晶化率を低下させることなく、効率的に工業生産するものであって、その際、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液体のｐＨの重要性にはじめて着目し、そして更に研究の結果、ｐＨ５以上とすることが必要であることをはじめてつきとめ、この有用新知見に基づき更に研究、検討を加え、遂に本発明の完成に至ったものである。
すなわち、本発明は、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液体を精製してＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を製造するに際して、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液体のｐＨが５以上であること、を重要な特徴とするものである。
従来、ＤＦＡ  ＩＩＩについては、工業的結晶化は行われておらず、したがってｐＨの検討はもとよりｐＨについては全く着目されていなかったのであるが、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化に及ぼすｐＨの影響は、本発明者らによるＤＦＡ  ＩＩＩの工業的結晶化に係る研究の過程においてはじめて着目されたものであって、全く新規な知見である。換言すれば、本発明は、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化に係る工業的研究においてはじめて問題点がクローズアップされたものであって、技術課題自体が新規であるということができ、してみれば、当然にその解決手段も新規である。
すなわち、本発明は、次のものを包含するものである。
１．ジフラクトース  ジアンヒドリドＩＩＩ（ＤＦＡ  ＩＩＩ）を含有する溶液のｐＨが５以上であることを特徴とする、ジフラクトース  ジアンヒドリドＩＩＩ（ＤＦＡ  ＩＩＩ）結晶の製造方法。
２．ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨをアルカリ剤の添加法、クロマトグラフィー法、アニオン交換樹脂法の少なくともひとつで調整・維持すること、を特徴とする上記第１項記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
３．ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液が、イヌリンにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させ、得られた液を清浄・濾過した溶液であることを特徴とする、上記第１及び２項記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
４．イヌリンのフラクトース重合度が１０から６０であってポリサッカライドの固形分純度が７０％以上であることを特徴とする、上記第３項記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
５．ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を清浄・濾過した後、濃縮して結晶化するまでの工程（精製・結晶化工程）において、少なくともひとつのＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨが５以上であること、を特徴とする上記第１〜４項のいずれか１項に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
６．精製・結晶化工程を循環系で行うこと、を特徴とする上記第５項に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
７．結晶化母液又は粗結晶化母液の冷却結晶化における終点温度での溶解度に対する過飽和度が１．３〜４．１であることを特徴とする、上記第１〜６項のいずれか１項に記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
８．ＤＦＡ  ＩＩＩ含有の結晶化母液又は粗結晶化母液のフラクトース含量が固形分重量当たり５％以下であること、を特徴とするＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
９．フラクトース含量が固形分重量当たり５％以下にする方法として、フラクトオリゴ糖及び／又はフラクトースをクロマトグラフィー法、イースト処理法のいずれかひとつ以上を用いて除去すること、を特徴とする上記第８項記載のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造方法。
１０．上記第１〜９項のいずれか１項に記載の方法で製造されたＤＦＡ  ＩＩＩの結晶。
本発明は、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を精製して高純度のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を効率的に工業生産するものであって、特にその際、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液について、少なくともひとつ、好ましくはすべての該溶液のｐＨが５以上であること、を重要な特徴のひとつとするものである。
本発明を実施するには、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造工程（その１例を図１に示す）において、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液の少なくともひとつあるいはすべての溶液について、ｐＨが５以上となるようにして結晶化を実施すればよい。
ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造法について、その１例を図示した図１を参照しながら以下に説明する。
ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液の原料としては、イヌリン又はイヌリン含有液にフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得たＤＦＡ  ＩＩＩ合成液のほか、ＤＦＡ  ＩＩＩ化学合成液がすべて包含される。
原料の１つであるイヌリンは、グルコース１個にフラクトースが多数連なったフラクトース重合体である。このイヌリンを原料として、ＤＦＡ  ＩＩＩを生成する酵素、広義でフラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくはイヌリンフラクトトランスフェラーゼ（ＩＦＴ）を作用させる。
ＩＦＴ生成微生物としては、次のものが例示される。
その非限定例を以下に示す；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ  ＩＦＯ  １２１４０；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  ＩＦＯ  １２１３７；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  １２１３９；Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．
これら微生物由来の酵素を使用する場合、分離精製した酵素のほか、粗精製酵素、微生物培養物、同処理物（培養上清、分離菌体、菌体破砕物等）も使用可能である。なお、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を食品用途に使用する場合には、酵素としてフラクトシルトランスフェラーゼ、特にＩＦＴを使用するのが好適であって、上記微生物由来の酵素のほか、今回、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６として国際寄託されたアースロバクター  エスピー  ＡＨＵ  １７５３（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＨＵ  １７５３）株は、ＩＦＴ生産能にすぐれているので、本菌株の酵素は好適に使用可能である。
例えば、上記したアースロバクター  エスピーＡＨＵ  １７５３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６）由来のイヌリンフラクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ＩＦＴ）の粗酵素、精製酵素、酵素含有物等を酵素５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンで、６０℃で２４時間攪拌しながら作用させて、加水・転移させて、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する酵素反応溶液を生成する。酵素を失活させて、ＤＦＡ  ＩＩＩ合成液を得る。また、化学合成によってＤＦＡ  ＩＩＩ化学合成液を得ることもできる。
このようにして得たＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成又は化学合成液は、それ単独かあるいはそれにＤＦＡ  ＩＩＩを含有する他の溶液等を混合してＤＦＡ  ＩＩＩ粗液とする。ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液は、次に清浄濾過する。清浄濾過は、ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液の活性炭処理及び固液分離処理を指すものである。活性炭処理は、ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液に粉末活性炭を少量添加して、必要あれば加熱及び／又は攪拌して、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の不純物を活性炭に吸着せしめる処理である。
粉末活性炭としては、平均粒径が１５〜５０ミクロン、好ましくは２５〜４５ミクロン、更に好ましくは約３５ミクロン；最大粒径が２００ミクロン以下、好ましくは１７０ミクロン以下、更に好ましくは１５０ミクロン以下、例えば１４７ミクロン以下のものが使用される。その添加量は、固形分に対して、５％以下、好ましくは０．１〜３％、更に好ましくは０．５〜１．５％とするのが良く、ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液の組成に応じて適宜規定する。
固液分離処理としては、ハイフロスーパーセル（和光純薬製）やケイソウ士濾過等の濾過助剤を使用する濾過（例えば、セラミック濾過機による濾過：日本ポール（株）製ＰＲ−１２型が使用可能）、メンブランフィルター（ＭＦ）濾過、連続遠心分離法、分子篩法、逆浸透膜法、場合によっては限外濾過（ＵＦ）膜の少くともひとつが適宜利用される。固液分離は、常圧、加圧、又は減圧の少くともいずれかで実施される。
具体的には、例えば、ＩＦＴ酵素失活液に固形分当たり１％の割合で太閤活性炭Ｓ（二村化学工業製：平均粒径約３５ミクロン、１４７ミクロン以下）を添加し６０℃、１０分間攪拌する。この完了液を珪藻土（昭和化学工業製ラジオライト７００）濾過を行う。すなわちセラミック製の筒（日本ポール（株）製ＰＲ−１２型セラミックチューブ）の外面に上記珪藻土をプレコートしておき、筒外に活性炭含有反応液を加圧通過させて、加圧濾過し、筒内から濾液を回収する。
ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液（粗液）の清浄濾過処理によって得た濾液は、常法によって濃縮する。例えば、砂糖等の製造で用いられるカランドリア型濃縮効用缶により濃縮（例えば、６０〜８０℃、１２０ｍｍＨｇ以下）し、濃縮液を得る。濃縮液は、固形分濃度６０〜８５％、例えば７７％程度に濃縮すればよい。
本発明においては、上記したＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成液又は化学合成液から得たＤＦＡ  ＩＩＩ粗液は清浄・濾過さらに濃縮までの工程の間で、ｐＨを５以上に保持することが好ましい。例えば、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ５以上に調整すればよい。
上記で得た濃縮液である母液、つまり粗結晶化母液（約６０℃）を結晶機に移し、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶を冷却又は煎糖方式で生成させ粗結晶を得る。この場合、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を乳鉢等で粉砕したものをアルコール等に分散させたシード（種結晶）を適当量、適切なタイミングで母液に添加して育晶する。シード法には、フルシーディング法とショックシーディング法がある。フルシーディング法では、結晶化母液中又は粗結晶化母液中ＤＦＡ  ＩＩＩ量に対してシード量が１％以上にすることで、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の粒度分布を小さい方へシフトすることができる。また、冷却結晶化方法では、前記両用法のシード温度が低い程、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶粒度は、小さくなる。冷却結晶時の温度勾配は、最初は小さく、その後は大きくする方が結晶粒度のバラツキが少ない。結晶機は、循環方式及び／又は撹拌方式が付加されたものを用いるのが好ましい。
結晶を析出した粗結晶化母液は分離機（３０００ｒｐｍ、１２００Ｇ）でＤＦＡ  ＩＩＩ粗結晶と粗結晶シラップに分離する。
ＤＦＡ  ＩＩＩ粗結晶は、お湯で再溶解してＤＦＡ  ＩＩＩ精製液とし、清浄、濾過工程を経て、濃縮し、粗結晶と同様の方法で結晶化して、製品結晶を得る。得られた結晶は、無臭であり、中性域にある無色透明の八面体結晶であり、融点：１６３．７℃、旋光度〔α〕Ｄ：１３４．５であった。
本発明のように、各工程液のｐＨを５以上に維持、調節した場合では、上記フローにおいて分離された粗結晶シラップ及び／又は結晶シラップを、所望に応じて結晶製造系に戻してやり、循環系とすることで、さらにＤＦＡ  ＩＩＩの回収率の向上を達成することが可能となる。一方、各工程液のｐＨの維持、調節を行わず循環系とすると、工程液中に単糖（特にフラクトース）や蔗糖といったＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化阻害物質が著しく増加・蓄積し、また結晶化母液のｐＨが著しく低下するため、ＤＦＡ結晶化工程で結晶化率の低下、さらに最悪の場合、結晶化不能といった状況に陥る。
本発明では、各工程液のｐＨを５以上に維持、調節することにより、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化阻害要因である単糖や蔗糖、あるいは酸性物質（有機酸など）の生成を抑制できることを見いだした。さらに、アルカリ性剤を添加する方法に加えて、上記阻害物質を含む工程液を、クロマトグラフィー（以下、クロマトということもある）分離法やイースト処理をすることで、上記阻害物質を除去し、ＤＦＡ  ＩＩＩを精製して結晶化することも可能である。すなわち、ＤＦＡ  ＩＩＩ精製結晶化の全工程（図１）で生成する各種生成物をクロマト処理原液（固形分濃度  ４０〜７５％）として、これをクロマト処理し、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を精製して結晶化することが可能である。そのクロマト処理による精製フローの一例を図２に示す。
クロマト処理原液（固形分濃度  ４０〜７５％）は、クロマト処理して、ＤＦＡ  ＩＩＩ画分を分離する。既述した再溶解液（ＤＦＡ  ＩＩＩ液）と同様の精製度を有するＤＦＡ  ＩＩＩリッチ画分は、ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液として、これを清浄濾過、濃縮、結晶化することにより製品結晶を製造することができ（ルートＡ）、あるいは、これをそのまま結晶化することもできる（ルートＢ）。また、ＤＦＡ  ＩＩＩリッチ画分とは異なりＤＦＡ  ＩＩＩ含量が低いＤＦＡ  ＩＩＩ非リッチ画分については、製造フロー（図１に示すようなＤＦＡ  ＩＩＩ含有液からＤＦＡ  ＩＩＩ製品に至る全精製工程）の適宜個所に戻してやればよい（ルートＣ）。さらに、フラクトオリゴ糖、フラクトースなどの単糖、および酸性物質などを含み、ごく少量しかＤＦＡ  ＩＩＩを含まない非ＤＦＡ  ＩＩＩ画分は、飼料用原料として使用するか、又は廃棄する。
クロマト分離法としては、その分離は固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）、半連続方式（固定床方式と連続方式の組み合わせ）が適用できる。その装置の充填イオン交換樹脂としては、クロマト用のＮａ形、Ｋ形、Ｃａ形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。その樹脂は均一粒径のスチレンジビニルベンゼン系樹脂等が用いられている。イオン交換樹脂のメーカーから種々のクロマト用樹脂が販売されているが、糖液に適用できるものであればいずれも使用できる。クロマト処理は結晶母液のＤＦＡ  ＩＩＩ純度が低い場合、その純度を上げるのにも適宜使用される。
イースト処理は、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液とイーストを接触させればよく、両者を混合し、必要あれば攪拌してインキュベートしてもよいし、通気しながら培養してもよい。イーストとしては、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ブドウ酒酵母その他各種の酵母が適宜使用可能であって、ドライイースト、圧搾酵母その他各種の市販品も充分に使用可能である。イーストによって、フラクトオリゴ糖、ショ糖、単糖類が分解されたり菌体内に取り込まれるので、イースト処理は、主にフラクトオリゴ糖、ショ糖及び／又は単糖類を系外に除去するのに有用である。
本発明は、更に、ＤＦＡ  ＩＩＩ純度が６０％未満のＤＦＡ  ＩＩＩ含有液（結晶化母液）についても、工業的に結晶させることができる。
本発明においては、ＤＦＡ  ＩＩＩ純度が６０％未満のＤＦＡ  ＩＩＩ含有液の精製度を高めるため、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を、イースト処理、清浄濾過処理又はクロマトグラフィー処理の少なくとも一つで処理することによりＤＦＡ含有液のＤＦＡ  ＩＩＩ純度を大幅に上昇させることができる。
本発明における主要な用語について、図１に示したＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造フローを参照しながら、以下に定義する。
（イヌリン）
イヌリンとは、植物由来もしくは酵素合成物由来のイヌリン及びイヌリン含有液のことをいい、例えば、キクイモ、ゴボウ、チコリ等の植物抽出液、及び蔗糖にイヌリン合成酵素を作用させた合成イヌリンを含む液、又はそれらの液を、清浄・濾過した液を指し、更に各液を乾固もしくは結晶化させたイヌリン含有粉末を指す。
ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液の原料の１つとなるイヌリンは、フラクトース重合度が１０から６０であってポリサッカライドの固形分当たりの純度が７０％以上、好ましくは８０％以上のものを使用することにより、ＤＦＡ  ＩＩＩが効率的に生成する。そして、そのＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を使用し、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を製造すると効率的に製造ができる。
（ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成又は化学合成液）
ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成又は化学合成液とは、上記イヌリンに酵素を反応させてＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を生成し必要に応じて酵素を失活させた溶液又はＤＦＡ  ＩＩＩの化学合成液をいう。
（ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液）
ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液とは、上記ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成又は化学合成液それ自体、結晶化工程（粗結晶化、結晶化）で結晶化した母液を固液分離した粗結晶シラップ、結晶シラップ、クロマト分離処理液ＤＦＡ  ＩＩＩ画分の少なくとも１つ以上からなる液をいうが、ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成又は化学合成液に粗結晶シラップ、結晶シラップ、クロマト分離処理液、クロマト分離で得られたＤＦＡ  ＩＩＩ画分の少なくともひとつを混合してなる液も指すものである。
（粗結晶化母液）
粗結晶化母液とは、上記ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液を必要があれば活性炭、イオン交換樹脂、クロマトグラフィー、イースト等の清浄処理を行い、その後濾過等の固液分離（即ち、清浄・濾過）により希薄液を得る。この希薄液あるいは上記ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液を効用缶等の濃縮装置で適宜濃度に濃縮したものをいう。
（ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液）
ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液とは、粗結晶化で得た粗結晶を適切な濃度に水（湯）で溶解した溶解液もしくはクロマト分離で得られたＤＦＡ  ＩＩＩ画分の少なくとも１つからなる溶液のことをいう。
（結晶化母液）
結晶化母液とは、上記ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液を必要があれば活性炭、イオン交換樹脂、イースト等の清浄処理を行い、その後濾過等の固液分離（即ち、清浄・濾過）により希薄液を得る。この希薄液、あるいは上記ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液、結晶シラップ、ＤＦＡ  ＩＩＩ画分の少なくとも１つを効用缶等の濃縮装置で適宜濃度に濃縮したものをいう。
このように、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する粗結晶化母液、結晶化母液とは、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化のために、冷却方式及び／又は蒸発方式等の結晶機等に専ら供給されるＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液である。
（ＤＦＡ  ＩＩＩの精製・結晶化工程）
ＤＦＡ  ＩＩＩの精製・結晶化工程とは、ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、すべてのＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液を清浄・濾過の後、濃縮して結晶化するまでの工程をいう。
（ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液）
ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液とは、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶製造フローにおいて生成し、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のすべてをいい、例えば、ＤＦＡ  ＩＩＩ粗液、粗結晶化母液、結晶化母液、粗結晶シラップ、結晶シラップ、ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液、クロマト分離処理液、クロマト分離で得られたＤＦＡ  ＩＩＩ画分（ＤＦＡ  ＩＩＩクロマト画分）の少なくともひとつを包含するものである。
本発明を実施するには、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨを５以上としなければならない。ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化を行っていくと、ｐＨが低下して結晶化率が低下することを本発明者らがはじめて見出したものである。ｐＨは５以上であればよいが、好適域は５〜８、更に好ましくは６〜８である。これ以上高いｐＨももちろん可能であるが、ｐＨの調整に使用する苛性ソーダ、苛性カリといったアルカリの量が多くなり、無駄となってコストも高くなるし、作業安全性の面でも問題がでてくる。
ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液としては、上記に定義したものの少なくともひとつ、好適にはそのすべてについて、ｐＨが５以上であることが必要である。また、ＤＦＡ  ＩＩＩの精製・結晶化工程を包含するＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造工程における移送パイプ内におけるｐＨも５以上であると更に好適である。
以上述べたように、本発明においては、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率を高めるには、ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨが５以上であることが必須であるが、更に研究の結果、全く予期せざることに、蔗糖及びフラクトースの存在がＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化率を低下させることをはじめて見出し、結晶化母液のフラクトースが固形分当たり５％以下、好ましくは１％以下含有することにより、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化率が高まることを見出した。そして、更に、このような糖の抑制もｐＨを５以上にすることで達成されることもはじめて確認した。ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液のｐＨが５以上であり、かつ、粗結晶化母液、結晶化母液のフラクトースの固形分当りの含量が５％以下の条件を同時に満す場合に、最大のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化が相乗的に高まることが判明する。
【発明の効果】  ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨが５以上であること、粗結晶化母液、結晶化母液のフラクトースが５重量％以下に含有することにより、ＤＦＡ  ＩＩＩを工業的に、効率良く結晶化させて製造することができる。
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】  テストプラントを使い、図１に示したフローの一部にしたがって、循環方式によりＤＦＡ  ＩＩＩ結晶製造試験を行った。
尚、本試験で使用するＤＦＡ  ＩＩＩを含有する液の糖類の値は、高速液体クロマトグラフィーによる組成分析値を使用したものである。
（１）酵素反応工程
１日処理量として市販イヌリン（オラフテイー社、商品名ラフィテリンＨＰ）１００ｋｇの溶解液にＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＨＵ１７５３株培養酵素液（酵素力価約５０万Ｕ）を添加し、６０℃１２時間反応させ、ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成液を得た。
（２）脱色、清浄工程
ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成液に脱色処理として固形分あたり０．５％の活性炭（二村化学、商品名  太閤活性炭ＫＷ５０）を添加し、８０℃で３０分インキュベートした後、珪藻土濾過した。
（３）粗結晶化工程
ＤＦＡ  ＩＩＩ酵素合成液の脱色液を固形分濃度７６％に濃縮したものを粗結晶化母液として、それに５０℃で種結晶（シード）を添加し、１２時間かけて１０℃まで冷却しＤＦＡ  ＩＩＩ粗結晶を生成させた。この粗結晶母液（粗結晶マスキットともいう）を遠心分離し、粗結晶と粗結晶シラップに分離した。
（４）精製結晶化工程
粗結晶を再溶解し、固形分濃度７５％まで濃縮したものを結晶化母液として、それに５０℃で種結晶を添加し、１２時間かけて１０℃まで冷却し結晶を生成させた。この結晶マスキットを遠心分離し、結晶と結晶シラップに分離した。
（５）循環工程
ＤＦＡ  ＩＩＩ回収率を高めるために、粗結晶シラップの５割を酵素反応終了液に混合し、残りは飼料用原料に供した。また結晶シラップの５割は、粗結晶化工程の濃縮缶に戻し、残りの５割は結晶化工程の濃縮缶に戻した。
（６）結晶化率の算出
本実施例の粗結晶及び結晶の結晶化率の算出は、下記の式によった。
結晶化率（％）＝（Ｐ／Ｑ）×１００
式中、各記号は以下のことを表す。
Ｐ：Ｍ−Ｎ
Ｑ：（１００−Ｎ）Ｍ／１００
Ｍ：（粗）結晶化母液のＤＦＡ  ＩＩＩ純度
Ｎ：（粗）結晶シラップのＤＦＡ  ＩＩＩ純度
（７）製造試験
上記（１）〜（５）の工程に従い製造作業を行い、試験開始４日目より粗結晶化工程を、試験７日目より結晶化工程を開始した。粗結晶化工程の概要（母液組成および結晶化率）を図３に示した。粗結晶化率は試験１０日目より低下しはじめ、１３日目には３０％以下となったため、粗結晶シラップの戻しを５割から３割に減じた。しかしながら、結晶化率はその後も低下し続け、１７日目には１０％を下回るようになった。粗結晶化母液のＤＦＡ  ＩＩＩ純度は、試験期間中８０％弱で推移し、大きな変動はなかった。一方、不純物組成は、試験の経過とともにフラクトオリゴ糖が減少し、その分解物と思われるフラクトースが増加していた。また粗結晶化母液のｐＨは、開始時の５．１から徐々に低下し、４前後まで低下していた。次に精製結晶工程の概要を図４に示した。期間中の糖組成に大きな変化は認められなかったが、結晶化率は試験期間中、漸減した。また結晶化母液のｐＨも開始時４．８であったが、４前後まで徐々に低下していった。
【実施例２】  実施例１から、循環方式でＤＦＡ  ＩＩＩを製造すると結晶化率が徐々に低下することが明らかとなった。この時、結晶化母液ｐＨが低下し、フラクトオリゴ糖の分解も進んでいたことから、結晶化率の低下と何らかの関係があることが示唆された。そこで本実施例の製造試験では、酵素反応終了液、粗結晶化母液（濃縮前の液）および粗結晶再溶解液に苛性ソーダを添加し、各工程汁のｐＨ低下の防止を図った。それ以外は実施例１と同様の方法で行った。
粗結晶化工程、結晶化工程の概要を図５、６に示した。苛性ソーダの添加により各結晶化母液のｐＨは、各々５．１〜５．６、５．４〜５．７の範囲で推移し、フラクトオリゴ糖の分解も抑制されていた。また各結晶化率も高水準で維持することができた。
【実施例３】  ＤＦＡ  ＩＩＩ自体は、他の糖類に比べて熱、酸に強い物質である。図１に示すようなＤＦＡ  ＩＩＩの工業的な製造法において、製造工程液のｐＨが低いと、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の不純物が分解して、他の物質が生じ、また、結晶化に使用されるＤＦＡ  ＩＩＩ含有液は、循環して使用されるためｐＨが益々低下するのみならず、ＤＦＡ  ＩＩＩ以外の他の物質が蓄積すると考えられる。実際に実施例１の試験製造では、工程液のｐＨが徐々に低下し、フラクトオリゴ糖の割合が低下しフラクトースが蓄積することが確認された。
そこで、本発明者らは、ｐＨ（３〜７）と熱（７０、８０℃）によって、実施例１で調製した酵素反応終了液の糖組成がどのように変化するか、テーブル試験を実施した。その結果、７０℃、ｐＨ５以上の条件下では、２４時間経過迄含有糖類の組成変化はほとんど認められなかったが、ｐＨ４にすると８時間経過時点で４糖類以上の糖類の分解とフラクトースの増加が見られ、ｐＨ３でさらにその傾向が強まった。また、７０℃で観察された各ｐＨ条件における上記の糖組成の変化は、８０℃にするとさらに加速された。８０℃では、ｐＨ５以上の条件でも、１２時間経過迄は７０℃と同様にほとんど変化がなかったが、２４時間経過時点では、４糖類以上の糖類の分解とフラクトースの増加傾向が見られた。
さらに、本発明者らは、実施例１でｐＨ４にまで低下した粗結晶化母液の酸性物質を調べたところ、有機酸（乳酸や酢酸、蟻酸等）が３０〜４０ｍｇ／１００ｇ試料の濃度で含有していることが分かった。さらにテーブル試験で、フラクトース水溶液を８０℃環境下で長時間放置すると、徐々に有機酸が増加し、ｐＨが低下することが分かった。
そこで実施例１〜３の分析値の結果から、変動の大きかったフラクトオリゴ糖、有機酸、フラクトース、蔗糖、ｐＨが結晶化率にどのように影響するか、さらに実施例４〜７にてテーブル試験を行った。なお、実施例４〜７で使用する結晶化率の算出は下記の式によった。
結晶化率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各記号は以下のことを表す。
Ａ：結晶化によって得られたＤＦＡ  ＩＩＩ結晶重量（ｇ）
Ｂ：結晶化母液中のＤＦＡ  ＩＩＩ含量（ｇ）
【実施例４】（純度９９．９％ＤＦＡ  ＩＩＩの水溶液にスクロース、フラクトース溶液を添加したときの結晶化率）
固形分濃度７１％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇに固形分濃度７１％のスクロース溶液又は固形分濃度７１％のフラクトース溶液をそれぞれ３ｇ、１５ｇ、３０ｇ（固形分当たりのスクロース（フラクトース）量として、１．０、４．８、９．１％）添加し、無添加のものと併せて結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は１０℃までとした。また、スクロース（フラクトース）溶液を３０ｇ添加した試験では５０℃でシード時にシードした結晶が溶解したため、４５℃で再びシードを行なった。その試験結果を図７に示した。結晶化に用いる母液の固形分濃度及びＤＦＡ  ＩＩＩの量を統一し、スクロース、フラクトースの添加量を増加させて生成する結晶の量を測定した結果、両者とも添加量の増加に伴いＤＦＡ  ＩＩＩの結晶生成量は減少した。
【実施例５】（ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液に混在する不純物が結晶生成に与える影響）
（１）母液の固形分濃度及びＤＦＡ  ＩＩＩの量を統一して試験を行なった結果、スクロース、フラクトースの添加量の増加に伴いＤＦＡ  ＩＩＩの結晶生成量は減少したが、この結果は単にＤＦＡ  ＩＩＩの純度が低下したため起こったこととも考えられたため、次に混在する不純物の違いが結晶生成に与える影響について試験を行なった。
固形分濃度７１％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇに固形分濃度７１％のフラクトオリゴ糖（明治製菓製メイオリゴＰ：４糖類、３糖類、２糖類、フラクトース含量がそれぞれ固形分当たり６５．２％、３２．８％、１．２％、０．８％の混合物）溶液、スクロース溶液、フラクトース溶液をそれぞれ３０ｇ（固形分あたり９．１％）添加し、無添加のものと併せて結晶化を行った。尚この時の育晶温度は１０℃までとし、シード温度は４５℃とした。その試験結果を図８に示した。
図８より、不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、フラクトオリゴ糖をスクロース、フラクトースに置き換えた場合は生成するＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の量が少なく、同じＤＦＡ  ＩＩＩ純度でもフラクトオリゴ糖が分解してスクロース、フラクトースが生成するとＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化が抑制されるという結果が確認された。
（２）ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、スクロース、フラクトースが単独で存在する場合と両者が混在する場合の影響について調査を行なった。
固形分濃度７１％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇに固形分濃度７１％のスクロース溶液、フラクトース溶液をそれぞれ３０ｇ（固形分あたり９．１％）添加したもの及びスクロース溶液１５ｇとフラクトース溶液１５ｇ（スクロースとフラクトースの合計で固形分当たり９．１％）を同時に添加したものを無添加のものと併せて結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は１０℃までとし、シード温度は４５℃とした。その試験結果を図９に示した。
図９より、ＤＦＡ  ＩＩＩ純度は同じでも、スクロースとフラクトースを半量ずつ添加したときより、単独で添加した時の方が阻害の度合いが高いという結果となった。そのため、ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化は不純物として存在するスクロース、フラクトースの内、どちらか含量が多い方に影響されると考えられた。但し、実際の製造現場では生成するスクロースの量がフラクトースの量を上回ることはないため、結晶生成量はフラクトースの量に影響されると思われる。
以上より、不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、スクロース、フラクトースが存在する場合は生成するＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の量が少なく、その度合いは存在するスクロース、フラクトースの内、どちらか含量が多い方に影響されると考えられた。しかし、同じ不純物純度でもＤＦＡ  ＩＩＩ溶液にスクロース、フラクトースを固形物で添加したときは結晶の生成量が無添加のものよりも多いことから、スクロース、フラクトースが存在しても、その分、母液の濃度を上げると、両者が存在しない時並に結晶の回収ができると考えられた。
（３）ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、工程汁分析でその存在が確認された有機酸の影響について調査を行なった。工程汁中に存在の確認された有機酸は、乳酸、酢酸、蟻酸、その他（複数の未知ピーク）であったが、ここではフラクトースの熱分解で生成する酢酸、蟻酸について試験を行なった。工程汁の分析結果よりＤＦＡ  ＩＩＩ粗液の清浄・濾過した液の濃縮液中に検出された各有機酸含量は３０〜４０ｍｇ／１００ｇサンプル程度であるため、有機酸塩の添加量はそれぞれ０〜１００ｍｇ／１００ｇ  ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液とした。
固形分濃度７１％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇに酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウムの溶液をそれぞれの含量が１０ｍｇ＋１０ｍｇ、５０ｍｇ＋５０ｍｇ、１００ｍｇ＋１００ｍｇ／１００ｇ  ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液となるように添加し、無添加のものも含め濃度が同じとなるように純水で固形分濃度を調整後（最終固形分濃度７０．３％）、結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は１０℃までとし、シード温度は５０℃とした。その試験結果を図１０に示した。
図１０より、結晶生成量に多少の変動はあるものの、有機酸塩はＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化を阻害していないと考えられた。但しこの時、無添加のものと酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウムをそれぞれ１０ｍｇ／１００ｇとなるように添加したものでは固形分濃度が７０．３％とこれまでの試験より多少薄かったせいもあり、シード直後の結晶生成が遅かったのに比べ、それぞれを５０ｍｇ／１００ｇとなるように添加したものと１００ｍｇ／１００ｇになるように添加したものではシード直後の結晶生成が速いという現象が見られた。この差は何に起因するのか考察したところ、試験に用いた酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウム混液のｐＨが８．６と高く、そのため、後者ではそれを添加後の母液のｐＨが７前後になっていたということが原因ではないかと考えられた。そこで、製造工程で有機酸が生成し、工程汁のｐＨが変わるとＤＦＡ  ＩＩＩの結晶生成に何らかの影響を与えるのではないかと考えた。
【実施例６】（ＤＦＡ  ＩＩＩの結晶化に与えるｐＨの影響について）
（１）結晶化に用いる母液のｐＨがＤＦＡ  ＩＩＩの結晶生成に与える影響を確認するため、有機酸塩（酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウム）が存在する状態でｐＨを変動させた時の結晶生成量の変化を調査した。
固形分濃度７３％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇに酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウムの溶液を１００ｍｇ＋１００ｍｇ／１００ｇ  ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液となるように添加し、５Ｎ塩酸でｐＨをそれぞれ７、５、４、３に調整後、純水で固形分濃度を７１％に調製し、結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は２５℃までとし、シード温度は５０℃とした。その試験結果を図１１に示した。
図１１より、生成する結晶量はｐＨにより影響を受け、ｐＨ７が一番結晶の生成量が多く、ｐＨ４で極小値となり、ｐＨ３とｐＨ５が同程度の結晶生成量であるという結果が得られた。
（２）次に、この現象がｐＨのみに依存するもので、有機酸塩の存在なしでも起こるものかを検証するため、ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液を塩酸と苛性ソーダでｐＨ調製し、生成する結晶の量が変化するか試験を行なった。固形分濃度を７１．５％に調製したＤＦＡ  ＩＩＩ溶液３００ｇを１Ｎ塩酸及び１Ｎ苛性ソーダでｐＨ７、５、４、３に調製後純水を加えて固形分濃度を７１％に調製し、結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は２５℃までとし、シード温度は５０℃とした。その試験結果を図１２に示した。
試験結果は有機酸塩の存在時と多少異なり、ｐＨ５での結晶生成量が少ないが、ｐＨ７が一番結晶の生成量が多く、ｐＨ４に極小値があることは同じであった。更にこの結果が無機塩の濃度の違いによるものではないことを確認するため、１％の食塩存在下で同様にｐＨ調整をし、結晶化を行ったが、結果は有機酸塩の存在下でｐＨ調整をして結晶化したときと同じ傾向であった。このことから、塩類の存在によりｐＨ５での結晶化阻害作用は緩和されると考えられた。
（３）そこで、実工程の粗結晶母液を用い、以上のことを検証した。
採取した粗結晶母液（ＤＦＡ  ＩＩＩ固形分純度７５．９％）に析出していた結晶を完全に溶解後、固形分濃度７６％程度まで濃縮し、５Ｎ塩酸又は５Ｎ苛性ソーダを用いてＰＨを７、５、４、３に調製後、純水を加えて固形分濃度を７５（又は７３）％に調製し、結晶化を行った。尚、この時の育晶温度は固形分濃度を７５％とした時は２５℃まで、固形分濃度を７３％とした時は１０℃までとし、シード温度は５０℃（固形分濃度７５％）又は４５℃（固形分濃度７３％）とした。その試験結果を図１３に示した。いずれの固形分濃度においても、ｐＨ４でＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率が最も低下することが分かった。
【実施例７】（（粗）結晶化母液ｐＨと過飽和度がＤＦＡ  ＩＩＩに与える影響）
ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化阻害要因であるｐＨ変化に対して、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化母液の最適な濃縮度を決定するための検討を行った。
これに先立ち、図１４に示すように、各温度におけるＤＦＡ  ＩＩＩの溶解度（飽和固形分濃度％）を調査し、その実測値より次式で表される溶解度曲線近似式（相関係数Ｒ２＝０．９９９）を新たに算出した。
溶解度（飽和固形分濃度％）Ｚ＝−０．０００５８Ｘ２＋０．３９Ｘ＋４８．８
ただしＸ：温度（℃）
次に、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化母液の結晶化に必要な濃縮度を表す数値として、冷却結晶化終点温度Ｘ℃のＤＦＡ  ＩＩＩ溶解度に対する純度Ｐ％のＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化母液の過飽和度Ｓを次式のように定義した。
過飽和度Ｓ＝［Ｙ×Ｐ／（１００−Ｙ）］／［Ｚ／（１００−Ｚ）×１００］
ただしＹ：ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化母液の固形分濃度（％）
Ｐ：ＤＦＡＩＩＩ結晶化母液のＤＦＡＩＩＩ固形分純度（％）
Ｚ：溶解度（Ｘ：冷却結晶化終点温度℃）
次に、ここで定義した過飽和度ＳがＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化に与える影響について、実際のＤＦＡ  ＩＩＩ工程汁を使い、結晶化阻害要因である結晶母液ｐＨを変えてテーブル試験を行った。ｐＨ調整は、ＤＦＡ  ＩＩＩ工程汁に５Ｎ  ＨＣｌまたは、５Ｎ  ＮａＯＨを添加して行った。これらを様々な濃度に濃縮した後、得らえた各濃縮液を結晶化母液として５０℃でシードし、１０℃まで冷却して育晶した。過飽和度Ｓは上記式に従い、冷却結晶化終点温度１０℃として算出した。
結晶母液ｐＨと過飽和度Ｓの関係について、結果を表１に示す。結晶化母液ｐＨ５〜７の時、過飽和度Ｓが４．４以上条件では、いずれの純度のＤＦＡ  ＩＩＩ含有結晶化母液においても、マスキットの流動性が著しく低下し、分蜜作業が困難と判断された。一方、過飽和度Ｓが４．１以下の条件では、マスキットは適度に流動性があり、分蜜作業は支障なく実施可能であった。従って、結晶化母液ｐＨが５以上であるＤＦＡ  ＩＩＩの工業的な結晶製造条件は、結晶化終点温度を基準とする過飽和度Ｓが４．１以下であることが分かった。過飽和度Ｓが１．３未満では結晶化率が２０％以下となることから、好ましくは、結晶化率の観点から過飽和度Ｓは１．３以上４．１以下、さらに好ましくは１．５以上４．１以下、またさらに好ましくは、２．３以上４．１以下が良いことが分かった。
【表１】
0005367948.tif 000002
0005367948.tif 000003
Ａ液の固形分組成：ＤＦＡ  ＩＩＩ９９．５％、灰分０．１％、フラクトオリゴ糖０．４％
Ｂ液の固形分組成：ＤＦＡ  ＩＩＩ７９．７％、灰分０．３％、フラクトオリゴ糖１８．３％、蔗糖０．２％、フラクトース１．０％
表中×は、マスキットの流動性低下により、分蜜作業が困難であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液の精製・結晶化工程を包含するＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造フローの一例を示す。
【図２】クロマト処理による精製フローの一例を示す。
【図３】粗結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。なお、図中、−■−はＤＦＡ  ＩＩＩ固形分純度（％）、−●−はＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率（％）、−□−フラクトオリゴ糖の固形分純度（％）、−◇−は蔗糖の固形分純度（％）−△−はフラクトースの固形分純度（％）をそれぞれ示し、−〇−はｐＨを示す。以下、図４、５、６についても、上記記号は同様な意味を表す。
【図４】結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。
【図５】苛性ソーダの添加により精製・結晶化工程のｐＨを５以上に維持したときの粗結晶化母液組成および結晶化率を示す。
【図６】苛性ソーダの添加により精製・結晶化工程のｐＨを５以上に維持したときの結晶化母液組成および結晶化率を示す。
【図７】ＤＦＡ  ＩＩＩ溶液にスクロース、フラクトース溶液を添加した場合におけるＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率の変化を示す。
【図８】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液中に内在するフラクトオリゴ糖、スクロース、フラクトースがＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響（１）を示す。なお、図中、ＦＯＳはフラクトオリゴ糖、Ｓｕｃはスクロース、Ｆｒｕはフラクトース、Ｂｌａｎｋは対照をそれぞれ示す。
【図９】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液中に存在するスクロース（Ｓｕｃ）、フラクトース（Ｆｒｕ）、スクロースとフラクトースの合量（Ｓｕｃ＋Ｆｒｕ）がＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響（２）を示す。
【図１０】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液中に存在する有機酸塩（酢酸Ｎａ＋蟻酸Ｎａ）がＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響を示す。
【図１１】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨがＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響（１）を示す。
【図１２】ＤＦＡ  ＩＩＩを含有する溶液のｐＨがＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響（２）を示す。
【図１３】粗結晶化母液のｐＨがＤＦＡ  ＩＩＩ結晶化率に与える影響を示す。
【図１４】ＤＦＡ  ＩＩＩの溶解度および溶解度の近似曲線を示す。なお、図中、○はＤＦＡ  ＩＩＩの溶解度（実測値）、−はＤＦＡ  ＩＩＩ溶解度の近似曲線を示す。
【図１】
0005367948.tif 000004
【図２】
0005367948.tif 000005
【図３】
0005367948.tif 000006
【図４】
0005367948.tif 000007
【図５】
0005367948.tif 000008
【図６】
0005367948.tif 000009
【図７】
0005367948.tif 000010
【図８】
0005367948.tif 000011
【図９】
0005367948.tif 000012
【図１０】
0005367948.tif 000013
【図１１】
0005367948.tif 000014
【図１２】
0005367948.tif 000015
【図１３】
0005367948.tif 000016
【図１４】
0005367948.tif 000017