(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、前記疎水性架橋重合体粒子の表面に形成された親水性重合体層とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、以下の構成を有することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
１）前記疎水性架橋重合体粒子の表面に形成された親水性重合体層は、イオン交換基を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体が共重合することにより形成されている
２）該クロマトグラフィー用充填剤の表面の水の接触角が６０°以下である
【請求項２】
イオン交換基が、スルホン酸基である請求項１に記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、以下の工程を有する製造方法。
（ａ）合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子を生成する工程
（ｂ）（ａ）で生成された疎水性架橋重合体粒子に、イオン交換基を有する親水性単量体およびイオン交換基を有さない親水性単量体を添加し、共重合することによって、前記疎水性架橋重合体粒子の表面に親水性重合体層を形成し、前記充填剤を生成する工程
（ｃ）要すれば、前記充填剤最表面にオゾン水による親水化処理を施す工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、イオン性を有する物質の分離に汎用されており、なかでも、糖化ヘモグロビンをはじめ、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法では、分析対象物質や混合物の非特異吸着により測定精度が低下することがあるため、この非特異吸着を抑制する必要があり、また、近年この方法が臨床検査等にも用いられているため高い測定精度が求められている。
この非特異吸着は、疎水性相互作用によって引き起こされると考えられるため、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の表面の親水性をできるだけ高める必要がある。
【０００４】
イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の親水性を高める方法としては、例えば、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の基材部分に親水性単量体を多く含有させる方法等が挙げられる。
しかしながら、親水性単量体の含量を多くすると、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤内部の親水性も高まってしまい、結果として充填剤の機械的強度が弱くなってしまうため、高速分離ができなくなったり、充填剤自体が膨潤・収縮を起こし、測定精度の低下を招いたりするといった問題が生じる。
【０００５】
このような問題を解決する方法として、例えば、特許文献１には、疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性重合体の層が形成された被覆重合体粒子を用いる方法が開示されている。疎水性架橋重合体粒子は、構成する疎水性架橋性単量体によって強度に架橋されているため、機械的強度が高く、膨潤・収縮を防ぐことができる。また、被覆される親水性重合体の層の厚みを１〜３０ｎｍとすることで、分析対象物質等の非特異吸着の防止、及び、親水性重合体の層による膨潤・収縮の防止を実現できるとしている。
【０００６】
しかしながら、現実的には、上記親水性重合体の層の厚みの範囲で、疎水性架橋重合体粒子の露出を防ぐことは難しく、結果的に疎水性相互作用に起因する非特異吸着を充分に防ぐことができなかった。
特に、糖化ヘモグロビンのように臨床検査等に用いられる物質を測定する場合には、一段と高いレベルで測定精度が要求されるため、疎水性相互作用に起因する非特異吸着を可能な限り防止する必要がある。
【０００７】
このような非特異吸着を更に防止する方法として、例えば、特許文献２には、イオン交換基を有する充填剤表面に、タンパク質等の親水基を有する化合物を物理的に吸着させ親水化する方法が開示されている。
しかし、この方法では、使用初期には高い性能を発揮できるものの、長期間使用しているうちに、充填剤表面に吸着させた親水性化合物が脱離してしまい、測定精度が低下するという問題があった。
【０００８】
このような問題に対しては、親水性化合物を充填剤表面に化学的に固定することにより解決できるが、固定化に要する工程が煩雑になるという問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特公平８−７１９７号公報
【特許文献２】特開２００１−９１５０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記現状に鑑み、親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、イオン交換基を有し、水の接触角が６０°以下であって、表面が親水性化合物で被覆されていないイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討の結果、表面を親水性化合物で被覆せずに、充填剤表面に対する水の接触角を一定の範囲にすることにより、疎水性相互作用に起因する非特異吸着を充分に防ぐことができ、結果的に高い測定精度をもつため、各種分離分析に極めて有効な充填剤を得ることができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（以下、単に本発明の充填剤ともいう）は、水の接触角が６０°以下である。
ここで、接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として用いられ、水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断される。
従って、水の接触角を６０°以下とすることで、親水性が大幅に向上し、疎水性相互作用に起因するタンパク質等の測定対象物質の非特異吸着を充分に抑制することができる。好ましくは５０°以下である。
なお、上記水の接触角は、例えば、自動接触角計を用い、液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求める方法（θ／２法）等によって測定することができる。
【００１４】
本発明の充填剤は、表面が親水性化合物で被覆されていない。なお、本明細書において、「表面が親水性化合物で被覆されていない」とは、タンパク質や多糖類をはじめとする生体由来の親水性化合物やポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマー等の合成高分子親水性化合物が、充填剤の基材表面に対して物理吸着、又は、化学結合していないことを意味する。
表面が親水性化合物で被覆されていないことにより、親水性化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。
【００１５】
本発明の充填剤の表面に対する水の接触角を６０°以下にする方法としては特に限定されず、例えば、充填剤の基材にオゾン水処理、オゾンガス処理、プラズマ処理、コロナ処理、過酸化水素水、次亜塩素酸ナトリウム等による表面酸化処理等の親水化処理する方法等が挙げられる。なかでも、オゾン水によって親水化処理することが好ましい。
なお、充填剤の基材が親水化処理を行わなくても水の接触角が６０°以下である場合には特に親水化処理を行う必要がない。
【００１６】
本発明の充填剤の基材としては、特に限定されず、例えば、重合性単量体等を用いた合成高分子微粒子、無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなることが好ましい。また、このような基材を用いる場合には、最表面がオゾン水により親水化処理が施されていることが好ましい。
このような基材を用いた場合、疎水性の粒子を用いることにより充填剤としての機械的強度を保ちつつ、粒子表面を親水性の層により被覆し、更に親水化処理を施すことにより、疎水性相互作用に起因する非特異吸着を充分に防ぐことができ、結果的に高い測定精度をもつため、各種分離分析に極めて有効な充填剤を得ることができる。
【００１７】
本発明の充填剤は、イオン交換基を有する。上記イオン交換基としては、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等が挙げられる。これらのなかでは、スルホン酸基が好ましい。
【００１８】
本発明の充填剤の別の態様として、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、最表面がオゾン水により親水化処理が施されているイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤がある。
【００１９】
別の態様の本発明の充填剤は、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなる。
【００２０】
上記疎水性架橋重合体は、１種の疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体、２種以上の疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
【００２１】
上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル又はテトラ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。
【００２２】
上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル；スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。
【００２３】
上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記疎水性非架橋性単量体との共重合からなる場合には、上記疎水性架橋性単量体が全単量体１００重量部に対して１０重量部以上であることが好ましく、２０重量部以上であることがより好ましい。
【００２４】
上記イオン交換基を有する親水性重合体は、イオン交換基を有する親水性単量体から構成されるものであり、イオン交換基を有する親水性単量体を１種以上含めばよく、すなわち、イオン交換基を有する親水性単量体単独で重合させる、イオン交換基を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体とを共重合させる方法等が挙げられる。
【００２５】
上記イオン交換基を有する親水性単量体としては特に限定されず、水性分散媒中に溶解可能な重合性単量体の中から本発明の充填剤の使用目的に応じて選択すればよく、カチオン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸等のカルボキシル基を有する単量体、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等のスルホン酸基を有する単量体、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート等のリン酸基を有する単量体等が挙げられ、なかでも、スルホン酸基を有する単量体が好適に用いられ、アニオン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミン等のアミノ基を有する単量体等が用いられる。
【００２６】
上記イオン交換基を有さない親水性単量体としては特に限定されず、水性分散媒中に溶解可能な重合性単量体の中から本発明の充填剤の使用目的に応じて選択すればよく、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリドン等が挙げられる。
【００２７】
上記イオン交換基を有する親水性単量体と、上記イオン交換基を有さない親水性単量体とを混合して用いる場合には、混合比率としては特に限定されず、必要なイオン交換基容量に応じて混合比率を決定すればよい。
【００２８】
別の態様の本発明の充填剤は、最表面がオゾン水により親水化処理が施されている。
【００２９】
オゾンは二重結合との反応性が高いことが知られている。二重結合と反応したオゾンは、中間体であるオゾナイドを形成し、その後、カルボキシル基などが形成される。
本発明においては、親水性重合体で被覆した後、表面に露出する疎水性架橋重合体の構造は、未反応のビニル基、すわなち、二重結合であると考えられるため、オゾンによって効果的に酸化処理を施すことができる。
【００３０】
上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾンガスでは、粒子表面を均一に酸化することにより親水化処理を施すことが非常に難しい。
しかし、別の態様の本発明ではオゾン水を用いることにより、オゾン水中に粒子を分散させるだけで粒子表面を簡便に酸化させ親水化処理を施すことができる。親水化処理の結果、疎水性の構造部分が酸化され、親水性基（−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ等）が生成すると考えられる。
【００３１】
上記オゾン水における溶存オゾンガスの濃度としては特に限定されないが、好ましい下限は２０ｐｐｍである。２０ｐｐｍ未満であると、親水化処理に時間がかかったり、充分な親水化処理を施せずに測定対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができなかったりする。より好ましい下限は５０ｐｐｍである。なお、濃度の好ましい上限は特にない。
【００３２】
上記オゾン水の調製方法としては特に限定されず、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。  
【００３３】
別の態様の本発明の充填剤の接触角も上記同様に６０°以下であることが好ましく、５０°以下であることがより好ましい。  
【００３４】
別の態様の本発明の充填剤の製造方法としては特に限定されず、従来公知の方法により上記被覆重合体粒子を製造し、オゾン水中に該被覆重合体粒子を分散させることにより、更に親水化処理を施せばよい。
【００３５】
本発明の充填剤の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎて分離不良を起こすことがある。
【００３６】
本発明の充填剤の粒度分布（ＣＶ値）としては特に限定されないが、好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ、分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。
【００３７】
本発明の充填剤は、糖化ヘモグロビン等のヘモグロビン類（Ｈｂ）の測定に用いることができる。このような糖化ヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。
具体的には、例えば、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定試料を送液することにより、ヘモグロビン類を測定することができる。
【００３８】
上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】評価（２）における、ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるＨｂ回収率の結果をグラフで示した図である。
【図２】評価（６）における、ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるＨｂ回収率の結果をグラフで示した図である。
【図３】評価（７）における、ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動をグラフで示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
攪拌機付き反応器に、３％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃１時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、２−メタアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇ、ポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
得られた被覆重合体粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００４３】
得られた被覆重合体粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００４４】
（実施例２）
ポリエチレングリコールメタアクリレートをメトキシポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）に置き換えたこと以外は、実施例１と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００４５】
（比較例１）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００４６】
（比較例２）
実施例１と同様にして得られた被覆重合体粒子において、オゾン水処理の変わりにタンパク質のコーティング処理を施した。上記充填剤粒子１０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）２００ｍｌを加え、２分間超音波処理し、６０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、そこにリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍｌ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。そこへリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍｌ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるタンパク質コーティングを行ったイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００４７】
＜評価＞
実施例１〜２及び比較例１〜２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について、以下の評価を行った。
【００４８】
（１）接触角測定
実施例１〜２及び比較例１〜２で得られた被覆重合体粒子について、接触角測定を行った。測定は、自動接触角計（協和界面科学社製、Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ５００）を用いて行った。乾燥させた被覆重合体粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に被覆重合体粒子１層分を固定化した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水１μＬの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化した被覆重合体粒子上に着液させ、接触角をθ／２法により算出した。なお、接触角が９０°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後０．５秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。結果を表１に示した。
【００４９】
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるＨｂ回収率の評価
実施例１及び比較例１、２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評価した。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体のヘモグロビンＡ１ｃピークの面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークとの面積値の平均値を測定値とした。
結果を表２、図１に示した。図１は、実施例１で得られたヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計を１００％とし、比較例１、比較例２で得られた各ピーク面積を比較した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００５０】
（３）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例１、比較例１及び比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約１０００検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料１０検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表３に示した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ    試料注入量：１０μＬ
【００５１】
【表１】
0005378623.tif 000002
【００５２】
【表２】
0005378623.tif 000003
【００５３】
【表３】
0005378623.tif 000004
【００５４】
表１に示すように、実施例１、２では、イオン交換基を含む親水性重合体の層を形成し、更に、オゾン水で親水化処理を行うことにより、水の接触角を６０°以下の表面にすることができた。また、比較例２においても、親水性化合物であるタンパク質でコーティングすることにより、水の接触角を６０°以下の表面にすることができた。比較例１では、実施例１と比較して明らかに接触角が大きくなった。
図１に示すように、実施例１と比較して、接触角が大きい比較例１では、ヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計は低下する結果となった。また、接触角が小さい比較例２では、ヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計ともの実施例１と同レベルであった。すなわち、接触角が６０°以上である場合には、ヘモグロビンＡ１ｃや他のヘモグロビン成分が、充填剤粒子表面に吸着していることを示す。
表２に示すように、実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、１０００検体測定の間、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の変動、保持時間の変動ともにが非常に小さく、正確な測定が可能であることがわかった。一方、比較例１の場合には、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動した。これは、ヘモグロビンＡ１ｃや他のヘモグロビン成分が非特異吸着を起こしていることに起因していると考えられる。また、比較例２の場合には、保持時間が変動した。これは、親水性を向上させるためにコーティングしたタンパク質が測定中に脱離していることに起因していると考えられる。
【００５５】
（実施例３）
攪拌機付き反応器に、３％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃１時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、２−メタアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇ、ポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
得られた被覆重合体粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００５６】
得られた被覆重合体粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００５７】
（実施例４）
ポリエチレングリコールメタアクリレートをメトキシポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）に置き換えたこと以外は、実施例３と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００５８】
（実施例５）
ポリエチレングリコールメタアクリレートをグリセリロールメタアクリレート（日本油脂社製）に置き換えたこと以外は、実施例３と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００５９】
（実施例６）
ポリエチレングリコールメタアクリレートを添加しなかったこと以外は、実施例３と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００６０】
（比較例３）オゾン水処理を行わなかったこと以外は、実施例３と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００６１】
（比較例４）
オゾン水処理の代わりに過酸化水素水を用いて酸化処理を施したこと以外は、実施例３と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。過酸化水素水を用いた酸化処理方法を以下に示す。
被覆重合体粒子１０ｇに１％過酸化水素水３００ｍＬを浸漬し、３０分攪拌した。なお、１％過酸化水素水は、３０％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を用いて調製した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００６２】
＜評価＞
実施例３〜６及び比較例３〜４で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について、以下の評価を行った。
【００６３】
（４）親水性重合体からなる層の厚さの測定
実施例３〜６及び比較例３〜４で作製されたイオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子について、親水性重合体からなる層の厚さを、特公平８−７１９７に開示されている「被覆層の平均厚さの測定方法」に従い測定した。その結果、得られた被覆重合体粒子の被覆層の厚さは５〜１０ｎｍであり、好ましい範囲とされる１〜３０ｎｍの範囲内であることを確認した。
【００６４】
（５）接触角測定
実施例３〜６及び比較例３〜４で得られた被覆重合体粒子について、接触角測定を行った。測定は、協和界面科学社製Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ５００を用いて行った。乾燥させた被覆重合体粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に被覆重合体粒子１層分を固定化した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水１μＬの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化した被覆重合体粒子上に着液させ、接触角をθ／２法により算出した。なお、接触角が９０°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後０．５秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表４に示した。
【００６５】
（６）ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるＨｂ回収率の評価
実施例３及び比較例３、４で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評価した。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体のヘモグロビンＡ１ｃピークの面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークとの面積値の平均値を測定値とした。
結果を表５、図２に示した。図２は、実施例３で得られたヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計を１００％とし、比較例３、４で得られた各ピーク面積を比較した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）              オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００６６】
（７）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例３及び比較例３、４で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約１０００検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料１０検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。
結果を表６、図３に示した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００６７】
【表４】
0005378623.tif 000005
【００６８】
【表５】
0005378623.tif 000006
【００６９】
【表６】
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【００７０】
表４に示すように、実施例３〜６では、イオン交換基を含む親水性重合体の層を形成し、更に、オゾン水で親水化処理を行うことにより、水の接触角を６０°以下の表面にすることができた。実施例６はイオン交換基を含まない親水性単量体を添加しないことで、疎水性重合体の露出面が大きくなっていることにより、接触角が若干大きくなっているものと考えられる。比較例３、４は、実施例３と比較して、明らかに接触角が大きくなった。比較例４の結果から、過酸化水素水を用いた酸化処理方法では、不充分であることがわかった。
表５、図２より、実施例３と比較して、比較例３、４ともにヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計は低下する結果となった。すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃや他のヘモグロビン成分が、充填剤粒子表面に吸着していることを示す。
表６、図３より、実施例３で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、１０００検体測定の間、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の変動が非常に小さく、正確な測定が可能であることがわかった。一方、比較例３、４で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、初期３００検体測定までヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が大きく変動することがわかった。これは、評価（６）で見られたヘモグロビンＡ１ｃや他のヘモグロビン成分が非特異吸着を起こしていることに起因していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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