(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）薬物担持分子集合体、２）リンカー、ならびに、３）活性化血小板を認識する物質、の結合体である薬物運搬体であって、薬物がアデノシン二リン酸であり、アデノシン二リン酸が、薬物担持分子集合体を構成する脂質１０ｍｇ／ｍＬ中に１〜６ｍＭ内包される、薬物運搬体。
【請求項２】
薬物担持分子集合体が、その内水相に薬物が内包されている脂質二分子膜小胞体である、請求項１に記載の薬物運搬体。
【請求項３】
（薬物担持分子集合体）−（リンカー）−（活性化血小板を認識する物質）で表される、請求項１又は２に記載の薬物運搬体。
【請求項４】
薬物担持分子集合体との結合時に薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子をリンカーが含み、該両親媒性分子を介してリンカーと薬物担持分子集合体が結合している、請求項３に記載の薬物運搬体。
【請求項５】
リンカーが疎水性分子を含み、リンカーと薬物担持分子集合体が、該疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、請求項３に記載の薬物運搬体。
【請求項６】
リンカーがスペーサー部分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項７】
スペーサー部分が、ポリオキシエチレンである、請求項６に記載の薬物運搬体。
【請求項８】
活性化血小板を認識する物質が、活性化血小板に露出しているインテグリン又はセレクチンを認識し、活性化血小板の凝集塊に取り込まれる物質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項９】
活性化血小板を認識する物質が、Ｈ１２及びフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項８に記載の薬物運搬体。
【請求項１０】
脂質二分子膜小胞体が、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で２０〜１００％含有する混合脂質から構成され、リンカーと活性化血小板を認識する物質との結合体が該ホスファチジルコリンに対して０．００１〜２０％含まれている、請求項２に記載の薬物運搬体。
【請求項１１】
脂質二分子膜小胞体の粒子径が５０〜３００ｎｍであり、脂質二分子膜の層数が１〜４枚である、請求項１０に記載の薬物運搬体。
【請求項１２】
細胞又は生体組織に到達した際に細胞又は生体組織から物理的な刺激を受けることにより薬物担持分子集合体から薬物が放出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬物運搬体。
【請求項１３】
細胞が活性化血小板である、請求項１２に記載の薬物運搬体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬物運搬体を含む診断薬。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬物運搬体を含む試薬。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬物運搬体を含む血小板代替剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１）薬物担持分子集合体、２）リンカー、ならびに、３）活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質、の結合体である薬物運搬体に関する。より詳細には、疾患の予防・治療剤、診断薬及び試薬として、特に、血小板代替剤又は抗血小板剤として有用な薬物運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板膜表面には各種糖タンパク質（グリコプロテイン；ＧＰ）が存在しており、血小板機能の発現に関与している。このような血小板糖タンパク質には、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ、ＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩＩＩｂ、ＧＰＩＶ、ＧＰＩＸなどが知られている。これらのうち、ＧＰＩｂはフォンビレブラント因子（ｖＷ因子）の受容体として機能している。ＧＰＩｂはα鎖及びβ鎖がジスルフィド結合した、分子量１６０，０００のヘテロ二量体である。
【０００３】
最近では、ＧＰＩｂ、α鎖の４５ｋＤａの親水性部のリコンビナント体（ｒＧＰＩｂα）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａなどの機能性高分子を何らかの微粒子の表面に結合させた血小板代替物が知られている。これらのうち、ｒＧＰＩｂαを有するものは、ｒＧＰＩｂαとｖＷ因子の相互作用に基づく粘着作用を有することによって血小板代替物として働くことが期待され、一方、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを有するものは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノーゲン及び／又はｖＷ因子の相互作用に基づく凝集作用を有することによって血小板代替物として働くことが期待されている。
【０００４】
また、これらの機能性高分子を結合させる微粒子としては、小胞体などの脂質膜、ヒトアルブミン又はその重合体、あるいはヒト赤血球などが知られており、特許文献１には、小胞体にｒＧＰＩｂαを結合させたものが記載されている。
【０００５】
一方、血小板上の機能性高分子を有することによって血小板代替物として働くのではなく、患者血液中に残存する血小板の活性を補助することにより血液の凝集を誘導するものも知られている。例えば、血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと相互作用を起こすことにより血小板凝集を誘導するものが知られており、具体的には、非特許文献１には、小胞体にフィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチド（Ｈ１２）を含むペプチドを結合させたものが記載されている。
【０００６】
特許文献２及び３には、ＧＰＩｂやドデカペプチドと小胞体との間にリンカーを挿入した結合体が記載されており、血管損傷部位へ集積させることにより生理学的又は薬理学的に有効な薬物の薬物運搬体として、これらの文献に記載の結合体を使用できることが記載されている。
【０００７】
また、非特許文献２には、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を担持させた小胞体が記載されている。ＡＤＰは、血小板凝集や血栓形成を促進することが知られている物質である。この小胞体は、レーザー照射によりＡＤＰを放出して、血小板凝集を起こす。
【０００８】
しかし、上述の文献ではいずれも、所望の場所でのみ、薬物運搬体が自発的に薬物を放出して薬理効果を達成するような薬物運搬体は開示されていなかった。特許文献２及び３では、これらの文献に記載の結合体を薬物運搬体として用いることは記載されているものの、その具体的態様は記載されていない。また、非特許文献２には、ＡＤＰ担持小胞体が記載されているものの、該小胞体はＡＤＰを放出するために、レーザー照射という外部手段を必要としていた。
【特許文献１】特開平９−２０８５９９号公報
【特許文献２】国際公開第０１／６４７４３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０６９８６２号パンフレット
【非特許文献１】Ｔ．Ｎｉｓｈｉｙａら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，  ９１，  １１５８−６７  （２００４）
【非特許文献２】Ｂ．Ｋｈｏｏｂｅｈｉら、Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ  Ｍｅｄ．，  １２（６），  ６０９−１４，  １９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、所望の場所まで薬物を効率的に運搬することができ、運搬中の薬物が所望の場所以外の場所に影響を与えることなく（従って、副作用を起こす可能性が低く）、外部手段を必要とせずに所望の場所でのみ薬物を放出して薬物に効果を発揮させる薬物運搬体を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、薬物を担持する特定の分子集合体と、リンカーならびに活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質とを結合させることによって、所望の細胞（例えば、活性化血小板）及び／又は生体組織（例えば、血管損傷部位、炎症組織）まで薬物を効率的に運搬することができ、これら所望の場所において、細胞及び／又は生体組織と薬物担持分子集合体とが薬物担持分子集合体に結合した活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質を介して相互作用し、これにより、薬物担持分子集合体が細胞及び／又は生体組織から物理的な刺激を受け、これにより薬物が薬物担持分子集合体から放出され、所望の場所でのみ所望の効果を薬物に発揮させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕  １）薬物担持分子集合体、２）リンカー、ならびに、３）活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質、の結合体である薬物運搬体。
〔２〕  薬物担持分子集合体が、その内水相に薬物が内包されている脂質二分子膜小胞体である、〔１〕に記載の薬物運搬体。
〔３〕  （薬物担持分子集合体）−（リンカー）−（活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質）で表される、〔１〕又は〔２〕に記載の薬物運搬体。
〔４〕  薬物担持分子集合体との結合時に薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子をリンカーが含み、該両親媒性分子を介してリンカーと薬物担持分子集合体が結合している、〔３〕に記載の薬物運搬体。
〔５〕  リンカーが疎水性分子を含み、リンカーと薬物担持分子集合体が、該疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、〔３〕に記載の薬物運搬体。
〔６〕  リンカーがスペーサー部分を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔７〕  スペーサー部分が、ポリオキシエチレンである、〔６〕に記載の薬物運搬体。
〔８〕  薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔９〕  薬物が、アデノシン二リン酸、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール及びベラプロストからなる群から選択される、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔１０〕  活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質が、活性化血小板に露出しているインテグリン又はセレクチン、血管損傷部位に露出しているコラーゲン、血管損傷部位に露出しているコラーゲンに結合しているフォンビレブランド因子、炎症組織に露出しているセレクチン及び／又は白血球に露出しているセレクチンリガンドを認識し、活性化血小板及び／又は白血球の凝集塊に取り込まれる物質、及び／又は血管損傷部位及び／又は炎症組織に集積する物質である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔１１〕  活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質が、Ｈ１２、ＧＰＩｂα、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＧＰＶＩ、ＭＡＣ−１、フィブリノーゲン、Ｐ−セレクチン及びＰＳＧＬ−１からなる群から選択される、〔１０〕に記載の薬物運搬体。
〔１２〕  脂質二分子膜小胞体が、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で２０〜１００％含有する混合脂質から構成され、リンカーと活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質との結合体が該ホスファチジルコリンに対して０．００１〜２０％含まれている、〔２〕に記載の薬物運搬体。
〔１３〕  脂質二分子膜小胞体の粒子径が５０〜３００ｎｍであり、脂質二分子膜の層数が１〜４枚である、〔１２〕に記載の薬物運搬体。
〔１４〕  １）薬物担持分子集合体、２）リンカー、ならびに、３）活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質、の結合体である薬物運搬体であって、細胞又は生体組織に到達した際に細胞又は生体組織から物理的な刺激を受けることにより薬物担持分子集合体から薬物が放出される、薬物運搬体。
〔１５〕  細胞が活性化血小板又は白血球であり、薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔１４〕に記載の薬物運搬体。
〔１６〕  生体組織が、血管損傷部位又は炎症組織であり、薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔１４〕に記載の薬物運搬体。
〔１７〕  〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む診断薬。
〔１８〕  〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む試薬。
〔１９〕  〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む血小板代替剤。
〔２０〕  〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む抗血小板剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の薬物運搬体は、所望の細胞及び／又は生体組織に到達する前に、血管中で未活性な血小板などと凝集を起こして不要な血栓の生成や血液の血管内凝固などを誘導することなく、またさらには、該当部位に到達すると、レーザーなどの外部手段を使わなくても所望の場所でのみ薬物担持分子集合体が崩壊して薬物を放出するので、効率的かつ簡便に、薬物を所望の細胞及び／又は生体組織まで運搬することができる。このため、本発明の薬物運搬体は、薬物の吸収効率が高く、副作用を顕著に低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、１）薬物担持分子集合体、２）リンカー、及び３）活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質（認識物質と略記することもある）の結合体である薬物運搬体（本発明の薬物運搬体ともいう）を提供する。本発明の薬物運搬体は、（薬物担持分子集合体）−（リンカー）−（活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質）で表されるもの、すなわちこの順番で各構成要素が配置されているものが好ましい。
【００１４】
本明細書において「薬物担持分子集合体」とは、薬物が担持されている分子集合体であって、リンカー及び認識物質との結合体としたときに、所望の細胞及び／又は生体組織（例えば、活性化血小板、血管損傷部位、炎症組織）においては、担持した薬物を放出するが、その他の場所においては担持した薬物を放出せず、薬物の効果を発揮させ難い分子集合体を意味する。そのような分子集合体としては、生体適合性を有する医療用の非経口投与が可能な担体が挙げられる。分子集合体の好ましい材料としては、小胞体、ミセル、高分子ミセル、マイクロスフェアなどが挙げられる。このうち、小胞体が特に好ましい。
【００１５】
小胞体は、脂質人工膜で構成される粒子であり、リン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロールなどから脂質二分子膜として作製される。本発明においては、リン脂質二分子膜小胞体がより好ましい。脂質二分子膜を構成する炭化水素鎖の炭素原子の数は、１２〜１８が好ましい。炭化水素鎖に１〜３個の不飽和基を導入して膜の強度を調整することも可能である。炭化水素鎖の炭素原子の数があまりにも多くなると、膜の強度が高くなり過ぎるため、薬物を担持させた場合に、薬物の放出が困難になる。
本発明では、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンとコレステロールとを含む（好ましくはこれらから本質的になる）混合脂質、より具体的には、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で２０〜１００％含有する混合脂質、から構成されるリン脂質二分子膜小胞体が特に好ましい。
【００１６】
小胞体は、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法など、公知の方法で作製することができる。小胞体の調製の詳細は、特開平９−２０８５９９号公報及びＴ．Ｎｉｓｈｉｙａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２２４，  ２４２−２４５，  １９９６に詳細に記載されている。
【００１７】
リンカー及び認識物質導入後の小胞体の粒子径は、リンカー及び認識物質の導入量とそれらの機能発現及び体内動態の点から、５０〜３００ｎｍが好ましく、１００〜２７０ｎｍがより好ましく、１５０〜２５０ｎｍが最も好ましい。ここで、粒子径とは、リンカー及び認識物質導入後にフィルターを用いて粒径制御した粒子径である。粒子径が５０ｎｍよりも小さくなると、薬物を担持させた場合に、分子集合体からの薬物の放出が困難になる。
【００１８】
小胞体の脂質二分子膜の層数は、二分子膜を１枚として考えると、１〜４枚が好ましく、１〜２枚がより好ましい。層数が４枚よりも多くなると、薬物を担持させた場合に、分子集合体からの薬物の放出が困難になる。
層数は、フィルターの孔径、小胞体の分散媒（ｐＨ、温度、イオン強度）によって制御できる。層数の測定方法としては、凍結割断法、小角Ｘ線散乱法、スピンラベル脂質を用いた電子スピン共鳴（ＥＳＲ）、３１Ｐ−ＮＭＲを用いた測定方法、６−ｐ−トルイジノ−２−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を用いた測定方法などが挙げられる。
【００１９】
薬物担持分子集合体としては、その内水相に薬物が内包されている脂質二分子膜小胞体が最も好ましい。
【００２０】
本明細書において「リンカー」とは、薬物担持分子集合体と、活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質とを架橋可能なものであって、生体適合性があるものであれば特に限定されない。リンカーとしては、薬物担持分子集合体又は認識物質との結合部位となる官能基を有する炭素数２〜１０の飽和もしくは不飽和非環式炭化水素又は脂肪族もしくは芳香族環式炭化水素が好ましく、鎖又は環に、ヘテロ原子（例えば、酸素原子又は窒素原子など）を含んでいてもよい。また、２種以上の異なるリンカーを組み合わせて用いてもよい。リンカーとしては、ＳＨ基、ＯＨ基、ＣＯＯＨ基、ＮＨ２基のいずれかと反応する官能基を有する化合物がより好ましい。リンカーとしては、例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸、マレイミドカルボン酸などを原料として合成されたものが挙げられ、さらに、ＳＨ基、ＯＨ基、ＣＯＯＨ基、ＮＨ２基のいずれかと反応する官能基を有するリンカーとしては、例えば、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミド  エステル、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリシルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、Ｎ−（β−マレイミドプロピオキシ）スクシンイミド  エステル、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）  スクシンイミド  エステル、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）  スクシンイミド  エステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）  ヒドラジド、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプレート）、スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  エステル、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）ブチル酸  ヒドラジドなどを原料として合成されたリンカーが挙げられる。
【００２１】
上記リンカーは、薬物担持分子集合体と認識物質との間にあって、薬物担持分子集合体と認識物質との間の長さを調節できるスペーサー部分を含んでいてもよい。スペーサー部分の配置位置は、薬物担持分子集合体−リンカー−スペーサー−認識物質であってもよいし、薬物担持分子集合体−スペーサー−リンカー−認識物質であってもよい。また、同一又は異なるリンカーの間にスペーサー部分を挿入してもよい。すなわち、薬物担持分子集合体−リンカー−スペーサー−リンカー−認識物質であってもよい。スペーサーは、生体適合性があれば特に限定されないが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン、及び抗体からなる群から選択される物質を使用することができる。アルブミンや抗体は組換体を使用してもよい。本発明におけるスペーサーとしては特にポリオキシエチレン又はその誘導体が好ましい。
【００２２】
好ましい本発明の薬物運搬体としては、リンカーが、薬物担持分子集合体との結合時に薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子を含み、該両親媒性分子を介してリンカー又はスペーサーと薬物担持分子集合体が結合しているもの、及び、リンカーが疎水性分子を含み、リンカー又はスペーサーと薬物担持分子集合体が、該疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合しているものが挙げられる。
【００２３】
両親媒性分子や疎水性分子の例としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。本発明においては、以下の式で示されるＧｌｕ２Ｃ１８が両親媒性分子として特に好ましい。
【００２４】
【化１】
0005216219.tif 000002
【００２５】
ホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で２０〜１００％含有する混合脂質から構成される脂質二分子膜小胞体の場合、リンカーと活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質との結合体が、該ホスファチジルコリンに対して０．００１〜２０％含まれていることが好ましい。
【００２６】
本明細書において、「活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識する物質」とは、活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織を認識して、本発明の薬物運搬体を活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織に指向させ、これらの場所に本発明の薬物運搬体を集積させるように働く物質を意味する。認識物質としては、活性化血小板に露出しているインテグリン又はセレクチン、血管損傷部位に露出しているコラーゲン、血管損傷部位に露出しているコラーゲンに結合しているフォンビレブランド因子、炎症組織に露出しているセレクチン及び／又は白血球に露出しているセレクチンリガンドを認識し、活性化血小板及び／又は白血球の凝集塊に取り込まれる物質及び／又は血管損傷部位及び／又は炎症組織に集積する物質が好ましく用いられる。より具体的には、認識物質としては、Ｈ１２（ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、配列番号１）、ＧＰＩｂα、ＧＰＩａ／ＩＩａ（インテグリンα２β１）、ＧＰＶＩ、ＭＡＣ−１、フィブリノーゲン、Ｐ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１などが好ましい。
Ｈ１２、ＧＰＩｂα、ＧＰＩａ／ＩＩａ、ＧＰＶＩ、ＭＡＣ−１、フィブリノーゲン、Ｐ−セレクチン、及びＰＳＧＬ−１の調製方法に特別の制限はなく、血小板膜から抽出・単離する方法、細胞培養による方法、遺伝子工学的に産生する方法等により調製することができる。
本発明で用いられる認識物質は、本発明の目的が達成される限り、そのアミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸に欠失、置換、付加もしくは修飾といった任意の変異を施したものであってもよく、例えば天然の認識物質の置換体、類似体、変異体、修飾体、誘導体、糖鎖付加物なども包含される。
ＧＰＩｂαとしては、ＧＰＩｂα〔Ｈｉｓ（１）〜Ｌｅｕ（６１０）〕、当該α鎖のｖＷＦ結合領域の断片等のＧＰＩｂα断片、さらに膜貫通部位を欠失したＧＰＩｂα断片などが挙げられる。本発明においてより好ましいのは、膜貫通部位を欠失したＧＰＩｂα断片である。
より具体的なＧＰＩｂα鎖断片として、Ｈｉｓ（１）〜Ｃｙｓ（４８５）、Ｈｉｓ（１）〜Ｐｒｏ（３４０）、Ｈｉｓ（１）〜Ｔｈｒ（３０４）、Ｈｉｓ（１）〜Ａｌａ（３０２）、Ｈｉｓ（１）〜Ａｒｇ（２９３）〔特開平１−２２１３９４号公報、ＥＰ０３１７２７８〕、Ａｌａ（１６５）〜Ｌｅｕ（１８４）、Ｇｌｎ（１８０）〜Ｐｈｅ（１９９）、Ｈｉｓ（１９５）〜Ｌｅｕ（２１４）、Ａｓｎ（２１０）〜Ｖａｌ（２２９）、Ｇｌｕ（２２５）〜Ａｌａ（２４４）及びＴｈｒ（２４０）〜Ｔｙｒ（２５９）〔特開平１−１００１９６号公報〕、Ａｓｎ（６１）〜Ｔｈｒ（７５）、Ｇｌｎ（７１）〜Ｓｅｒ（８５）、Ｔｈｒ（８１）〜Ｌｅｕ（９５）、Ｇｌｎ（９７）〜Ａｒｇ（１１１）、Ｌｅｕ（１３６）〜Ｌｅｕ（１５０）、Ａｓｎ（２１０）〜Ａｌａ（２２４）、Ｇｌｎ（２２１）〜Ａｓｐ（２３５）及びＳｅｒ（２４１）〜Ａｓｐ（２５５）〔特表平５−５０３７０８号公報、ＷＯ９１／０９６１４〕などが例示される。また、置換体として、Ｈｉｓ（１）〜Ａｌａ（３０２）からなるＧＰＩｂα鎖断片において、Ｇｌｙ（２３３）またはＭｅｔ（２３９）を各々Ｖａｌに置換したものなどが例示される〔ＷＯ９３／１６７１２〕。これらのＧＰＩｂα鎖断片は全て膜貫通部位を欠失している。膜貫通部位は、ＧＰＩｂα鎖ではＬｅｕ（４８６）〜Ｇｌｙ（５１４）が該当する（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８４巻，５６１５〜５６１９頁，１９８７年）。
【００２７】
本発明の薬物運搬体は、細胞又は生体組織に到達した際に、薬物担持分子集合体が細胞又は生体組織から物理的な刺激を受けることにより薬物担持分子集合体から薬物が放出される。すなわち、薬物運搬体を構成する認識物質が、標的細胞又は標的生体組織に、本発明の薬物運搬体を指向させる。標的細胞又は標的生体組織に、本発明の薬物運搬体が到達すると、本発明の薬物運搬体は、リンカー及び認識物質を介して標的細胞又は標的生体組織と相互作用し、それにより物理的刺激を受け、担持されていた薬物が分子集合体から放出される。より詳細には、認識物質が標的細胞又は標的生体組織に引きつけられ、これらの細胞又は生体組織の形態変化によって、物理的な負荷が薬物担持分子集合体にかかり、それにより薬物担持分子集合体が崩壊し、薬物が放出される。
ここで、標的が細胞である場合には、標的は活性化血小板又は白血球であることが好ましい。この場合、薬物運搬体は活性化血小板や白血球の凝集塊に巻き込まれ、血小板や白血球の形態変化による物理的な刺激によって、分子集合体が崩壊して薬物を遊離させる。また、標的が生体組織である場合には、標的は血管損傷部位又は炎症組織であることが好ましい。
【００２８】
薬物担持分子集合体上に結合される認識物質の分子数は、高密度であることが細胞又は生体組織との結合性の可能性を高め、凝集塊の形成が迅速に進むことから好ましい。その数は、所望の凝集度及び凝集速度に応じて当業者が適宜調整可能である。
【００２９】
薬物担持分子集合体、リンカー、及び認識物質の結合体の調製は、分子集合体の調製後、分子集合体にリンカーを結合させ、次いで、認識物質を反応させることによって調製してもよいし、あるいは、リンカーと認識物質との反応産物を予め調製しておき、その後、その反応産物を分子集合体と結合させてもよい。
リンカーと薬物担持分子集合体が、薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子を介して又は疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、薬物担持分子集合体、リンカー及び認識物質の結合体を調製する場合には、リンカーと、認識物質と、両親媒性分子又は疎水性分子との反応産物を予め調製しておき、その後、その反応産物を分子集合体と結合させてもよい。
薬物は、最初から分子集合体に担持させておいてもよいし、分子集合体と、リンカーと、認識物質との結合体を調製後、最後に分子集合体に担持させてもよい。反応条件は、分子集合体の原料に応じて自体公知の条件を使用することができる。薬物担持分子集合体と認識物質との混合比は、最終的な結合体における認識物質の密度の所望値によって調節される。
【００３０】
リンカーと脂質二分子膜小胞体が、脂質二分子膜の構成成分の一部となる両親媒性分子を介して又は疎水性分子を介して脂質二分子膜小胞体に結合している、脂質二分子膜小胞体、リンカー及び認識物質の結合体を調製する場合には、リンカーと、認識物質と、両親媒性分子又は疎水性分子とを結合させた脂質二分子膜の構成成分となりえる上記両親媒性分子を、小胞体を構成する脂質と有機溶媒中で混合しておき、常法にて小胞体を調製することによって、小胞体表面を認識物質で修飾することができる。
【００３１】
次いで要すれば、上記で作製された結合体を生理的に許容される水溶液で洗浄し、除菌濾過、分注などを行い、本発明の薬物運搬体を、液剤、ペレット、又は懸濁剤とすることができる。製剤化は、医薬品製造の分野において公知の方法に準じて行うことができる。また、液剤を凍結させた後、減圧乾燥し、凍結乾燥製剤とすることもできる。なお、凍結乾燥する場合は、保護剤として、単糖類（例えば、ブドウ糖等）、二糖類（例えば、ショ糖）などを配合してもよい。製剤には、アルブミン、デキストラン、ビニル重合体、ゼラチン及びヒドロキシルエチルデンプンなどの高分子を安定化剤として配合してもよい。安定剤の添加量は脂質１重量部に対して、０．５〜１０重量部が好ましく、１〜５重量部がより好ましい。
【００３２】
薬物担持分子集合体に担持される薬物としては、活性化血小板や白血球等の細胞や、血管損傷部位や炎症組織等の生体組織において、所望の生理活性を奏する薬物であれば特に限定されないが、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤が好ましい。診断薬として用いる場合には、生理活性を有さない蛍光試薬や造影剤などを担持させることもできる。
血小板凝集惹起剤としては、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、エピネフリン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、抗プラスミン剤（例えば、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸）、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、結合型エストロゲン（例えば、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウム）などが挙げられる。
血小板凝集抑制剤としては、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール、ベラプロスト、ヘパリン等のムコ多糖類や、クマリン系抗凝固薬、ヒルジン等の天然抽出物やその誘導体、トロンボモジュリンや活性プロテインＣ等の生理活性物質などが挙げられる。
血管収縮剤としては、ノルアドレナリン、ノルフェネフリン、フェニレフリン、メタラミノール、メトキサミン、プロスタグランジンＦ１α、プロスタグランジンＦ２α、トロンボキサンＡ２などが挙げられる。
血管拡張剤としては、プロスタグランジンＥ、プロスタグランジンＩ２などが挙げられる。
抗炎症剤としては、ステロイド系抗炎症剤（デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメサゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロンなど）、非ステロイド系抗炎症剤（インドメタシン、アセメタシン、フルルビプロフェン、アスピリン、イブプロフェン、フルフェナム酸、ケトプロフェンなど）などが挙げられる。
薬物担持分子集合体に担持される薬物として特に好ましいものとしては、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール及びベラプロストが挙げられる。
【００３３】
薬物担持分子集合体に担持させる薬物の量は担持させる薬物の種類や使用目的により異なるため、一概に定義することは困難であるが、例えば、リン脂質二分子膜内にＡＤＰを内包させて、所望の場所で血小板を活性化させるために本発明の薬物運搬体を用いる場合、脂質１０ｍｇ／ｍＬ中に、０．１〜２５ｍＭ内包させるのが好ましく、０．５〜１０ｍＭ内包させるのがより好ましく、１〜６ｍＭ内包させるのがさらにより好ましい。
【００３４】
本発明の薬物運搬体を含む製剤の投与量は、担持される薬物の量や、患者の性別、年齢、症状などに応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、１日あたり０．００１〜１０００ｍｇ程度を投与することができる。本発明の薬物運搬体を含む製剤は、好ましくは非経口投与され、具体的には、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与などによって投与することができる。本発明の薬物運搬体を含む製剤は、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤として有用であり、また、血小板代替剤、抗血小板剤、血管障害、血管損傷及び血栓症等の予防・治療剤などの医薬品、あるいは血小板無力症などの血小板機能異常症の診断薬、生物学的又は医学的な試薬、血小板代替剤や抗血小板剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血管形成部位の検査用診断剤又は治療剤などとしても有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中特に明記していない場合、ＡＤＰ又はＣＦ内包濃度は脂質１０ｍｇ／ｍＬ中にＡＤＰ又はＣＦを内包させた濃度（ｍＭ）を示す。
【００３６】
実施例１  ＡＤＰ内包小胞体
１．Ｇｌｕ２Ｃ１８の合成
グルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）をベンゼン１５０ｍＬに溶解し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて１０５℃で生成水を除去しながら１時間還流した。ステアリルアルコール（１１．９ｍｇ、４４ｍｍｏｌ）を加え、１０５℃で生成水を除去しながらさらに１４時間還流した。溶媒を減圧蒸留した後、残分をクロロホルム１５０ｍＬに溶解し、炭酸ナトリウム飽和水溶液１５０ｍＬで２回、水１５０ｍＬで２回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム５ｇで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を６０℃でメタノール４００ｍＬに溶解し不溶成分があればろ過し、４℃で再結晶し、濾過後乾燥して白色粉末Ｇｌｕ２Ｃ１８（１３．３ｇ、収率８５％）を得た。
【００３７】
２．Ｈ１２−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の合成
クロロホルム５ｍＬ中にＧｌｕ２Ｃ１８（１１５．１ｍｇ、１７６μｍｏｌ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（２４．６μＬ、１７６μｍｏｌ）を加えた後にα-マレイミジル
−ω−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール（ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（Ｍｗ＝３４００）（３００ｍｇ、５８．８μｍｏｌ）を溶解し、室温で１２時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル２５０ｍＬに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼン中に溶解し凍結乾燥後、白色粉末ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（２６４．８ｍｇ、収率６４％）を得た。
ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（ｎ＝７１）（１００ｍｇ、２５．３７μｍｏｌ）とＣ末端にシステインを導入したフィブリノーゲンγ鎖Ｃ末端４００〜４１１番目のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｈ１２）（ＣＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、配列番号２）（３２．８ｍｇ、２５．３７μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ｍＬに溶解し、室温で１２時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル２５０ｍＬに滴下し、不溶成分を回収した。水２５０ｍＬを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末Ｈ１２−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（６２．８ｍｇ、収率４７％）を得た。
【００３８】
３．小胞体調製方法
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（１００ｍｇ、１３６μｍｏｌ）、コレステロール（５２．７ｍｇ、１３６μｍｏｌ）、及び、１，５−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメート（ＤＨＳＧ）（１９．０ｍｇ、１３．６μｍｏｌ）の混合脂質（本明細書における脂質濃度の表記では、混合脂質であっても単に脂質と記載している）、ならびに、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、日本油脂製、４．７４ｍｇ、０．８１７μｍｏｌ）又はＨ１２−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（４．３４ｍｇ、０．８１７μｍｏｌ）をベンゼン５ｍＬに溶解し、凍結乾燥を３時間行った。乾燥後、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）溶液（０、１、１０、２５又は１００ｍＭ）８．５ｍＬを加え１２時間撹拌したのち造粒装置を用いてフィルター（３０００ｎｍ→８００ｎｍ→６５０ｎｍ→４５０ｎｍ→３００ｎｍ→２２０ｎｍ×２）を通過させ粒径制御した。超遠心分離（３３０００ｒｐｍ、３０分）を２回行い、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬ中に分散させ小胞体分散液とした。さらに、小胞体分散液をゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）して、外水相に微量に残存するＡＤＰを完全に除去した。
上記手順により、ＡＤＰ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２５０±８０ｎｍ、平均層数１．６；Ｇｌｕ２Ｃ１８は小胞体の構成成分の一部となっている。以下同様）、ＡＤＰ未内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２３０±７０ｎｍ、平均層数１．８）、ＡＤＰ内包ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２４０±９０ｎｍ、平均層数１．５）、ＡＤＰ未内包ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２５０±９０ｎｍ、平均層数１．８）の分散液を得た。
回収した小胞体分散液の脂質濃度の定量（リン脂質Ｃ−テストワコー、和光純薬工業製）を行ったところ、脂質濃度は１８±５ｍｇ／ｍＬであった。後述の動物実験では、ＰＢＳを用いて各小胞体分散液の脂質濃度を０．２５、１．０、２．５、５．０、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したものを４ｍＬ／ｋｇで投与し、１、４、１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）となるように投与した。
小胞体の層数（平均層数）は以下のようにして算出した。
ＡＤＰ未内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体の分散液（０．５ｗｔ％、０、２０、３０、５０、７０、９０μＬ）をＰＢＳにて希釈し３ｍＬに定容した。ＴＮＳ水溶液（７０μＭ）又は純水を１００μＬずつ添加し、室温で１２時間振とうした。蛍光測定し（λｅｘ＝３２１ｎｍ、λｅｍ＝４４５ｎｍ）、脂質濃度と蛍光強度の比例式を算出し、傾きＫ１とした。孔径０．０５μｍのフィルターを通過させたＰＥＧ小胞体の分散液（０．５ｗｔ％、０、２０、３０、５０、７０、９０μＬ）でも、同様に、ＴＮＳ水溶液（７０μＭ）又は純水を添加し、室温で１２時間振とうした後、傾きＫ２を算出し、平均層数Ｎ＝Ｋ１／Ｋ２を算出した。ＡＤＰ未内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体、ＡＤＰ内包ＰＥＧ小胞体、ＡＤＰ未内内包ＰＥＧ小胞体についても同様に平均層数を算出した。
以下、Ｈ１２−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を用いて作製したＡＤＰ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体とＡＤＰ未内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体をそれぞれＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体と表記する。また、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を用いて作製したＡＤＰ内包ＰＥＧ小胞体とＡＤＰ未内包ＰＥＧ小胞体をそれぞれＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、ＰＥＧ小胞体と表記する。
【００３９】
４．ＨＰＬＣを用いたＡＤＰ内包濃度の定量
Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（１ｍｇ／ｍＬ）を２％ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）で可溶化し、ＨＰＬＣ（Ａｂｓ．  ２６０ｎｍ）にてＡＤＰの定量を行った。
水和時（調製時）のＡＤＰ濃度（０、１０、２５、１００ｍＭ）に対する脂質１０ｍｇ／ｍＬ中に内包されたＡＤＰ濃度の関係を図２に示す。内包されたＡＤＰ濃度は水和時のＡＤＰ濃度に比例し、内包濃度を制御できることを確認した。また、粒径（２５０±８０ｎｍ）から内水相のＡＤＰ濃度を算出すると、水和時のＡＤＰ濃度とほぼ同等であった。
【００４０】
５．フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による相互作用解析
全血（１／１０（ｖ／ｖ）  ３．８％クエン酸ナトリウム）を遠心分離し（６００ｒｐｍ、１５分）、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。沈殿成分を更に遠心分離して（２５００ｒｐｍ、１０分）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。ＰＰＰにて血小板数を調整したＰＲＰ（［血小板］＝１．０×１０５／μＬ、５０μＬ）にＡＤＰ内包濃度の異なるＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体を添加し（［脂質］＝１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）、３７℃、１０分間撹拌した。血小板活性化マーカーであるＦＩＴＣ標識ＰＡＣ−１（２０μＬ）を添加後、３７℃で１０分間振とうし、ホルムアルデヒド（ｆ．ｃ．  １％）にて固定した。サンプルをフローサイトメトリーにより試験した。ポジティブコントロール群はＡＤＰ刺激時とし、ネガティブコントロール群はＰＥＧ小胞体とした。
ＡＤＰの内包濃度が１．５ｍＭ以下のＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体あるいはＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体を血小板に添加した系では、ＡＤＰ未内包小胞体添加系と比較してＰＡＣ−１結合率はほぼ同等であり、血小板を活性化させないことを確認した（図３）。一方、内包濃度のもっとも高いＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（６ｍＭ）を血小板に添加した系では血小板の活性化を引き起こすことが判明した。
【００４１】
６．血小板凝集計による機能評価
以下の実験では、ＦＡＣＳ測定により血小板を活性化させないことが明らかとなったＡＤＰ内包濃度が１．５ｍＭであるＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体及びＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、ならびに、ＰＥＧ小胞体及びＨ１２−ＰＥＧ小胞体を用いた。ＰＰＰにて血小板数を調整したＰＲＰ（［血小板］＝２．０×１０５／μＬ、１８０μＬ）に小胞体分散液（１０μＬ）を添加した後、コラーゲン（ｆ．ｃ．  ０．４μｇ／ｍＬ、１０μＬ）にて血小板凝集を惹起させ、透過度変化を計測した（図４）。
ＰＥＧ小胞体（ａ）を添加したところ、ＰＢＳ添加系と比較して血小板凝集に何ら影響を与えないことを確認した。ＰＥＧ小胞体（ａ）の代わりにＨ１２−ＰＥＧ小胞体（ｂ）を添加したところ、透過度が増大し血小板凝集促進効果が確認できた。これは、Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体が血小板と多点結合し、血小板凝集を促進したためと考えられる。ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（ｃ）では（ｂ）と比較して凝集が亢進し、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（ｄ）では（ｃ）の促進効果以上であった。他方、（ｄ）を存在させただけ（すなわちコラーゲン非存在下、（ｅ））では血小板の凝集は惹起されないことも確認した。従って、コラーゲンによって血小板の凝集が惹起され、直ちに小胞体が物理的にその凝集塊に巻き込まれ小胞体が変形してＡＤＰが放出されたと考えられる。（ｄ）の効果は、Ｈ１２を担持させたことによる多点結合とＡＤＰ放出との相乗効果によるものと考えられる。
さらに、コラーゲン添加から約１分後に、コラーゲン刺激による血小板形状変化に伴う緩やかな透過度の減少が見られる（（ａ）及び（ｂ））。しかしながら、ＡＤＰ内包系（ｃ）及び（ｄ）では、コラーゲン添加後、直ちに透過度の上昇が見られ、これはＡＤＰ刺激に特有の現象である。これにより、血小板凝集によってＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（ｄ）からのＡＤＰの放出が惹起されたことが示唆された。
【００４２】
７．血小板減少症モデルラットを用いた、Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体及びＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体の尾出血時間に与える影響の評価
ウィスター系雄性ラット（８週齢，２５０〜２７０ｇ）にブスルファン（２０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、投与後１０日目を血小板減少症モデルラット（［血小板］＝２０×１０４／μＬ）とした。セボフラン麻酔後、サンプルを投与し、投与５分後に尾先端から１ｃｍの部位に長さ２．５ｍｍ、深さ１ｍｍの傷をつけ、その部分を生理食塩水中に浸し、出血時間を測定した。
血小板減少症モデルラットに生理食塩水を投与したところ（４ｍＬ／ｋｇ）、出血時間は６８２±１９８秒であり、正常ラット（［血小板］＝８０×１０４／μＬ）の出血時間（１７８±５６秒）と比較して、約３．８倍延長した（図５）。脂質濃度を２．５、１０ｍｇ／ｍＬに調整したＨ１２−ＰＥＧ小胞体分散液を投与したところ（４ｍＬ／ｋｇ）、投与量依存的に出血時間は短縮し、１０、４０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）における出血時間は、それぞれ５７３±１２７、３３５±９６秒となった。そこで、脂質濃度０．２５、１、２．５ｍｇ／ｍＬに調整したＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体分散液（ＡＤＰ内包濃度１ｍＭ）を投与したところ（４ｍＬ／ｋｇ）、１、４、１０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）における出血時間は、それぞれ５４３±１３４、５２１±８８、３４９±４９秒となり、Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体にて短縮効果の確認できた１／４の投与濃度で短縮できることが判明した。以上より、ＡＤＰ内包によるＨ１２−ＰＥＧ小胞体の止血効果向上がｉｎ  ｖｉｖｏにて確認された。
【００４３】
８．重篤な血小板減少症モデルウサギを用いた、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体の耳出血時間に与える影響の評価
ニュージーランドホワイトウサギ（１１週齢、２．５ｋｇ）にブスルファン（３０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、投与後１５日目を血小板減少症モデルウサギ（［血小板］＝２．６×１０４／μＬ）とした。ケタミン／セラクタール麻酔後、０．５ｍＬ／分の速度でサンプルを投与し、投与３０分後に耳介周囲静脈に長さ６ｍｍの傷をつけ、その部分を生理食塩水中に浸し出血時間を測定した。
血小板減少症モデルウサギに生理食塩水を投与したところ（４ｍＬ／ｋｇ）、出血時間は１６９５±１９７秒であり、正常ウサギ（［血小板］＝４１×１０４／μＬ）の出血時間（１１２±２４秒）と比較して、約１５倍延長した（図６）。陽性対照群としてウサギ血小板を０．４×１０９、２．０×１０９、４．０×１０９／ｋｇで投与したところ、血小板数依存的に出血時間を短縮させた（それぞれ１５０５±４１０、８６３±４４０、５０５±２５７秒）。そこで、脂質濃度を２．５、５．０ｍｇ／ｍＬに調整したＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体分散液（４ｍＬ／ｋｇ）を投与したところ、出血時間はそれぞれ８８１±３０３、４３３±５２秒であり、生理食塩水群と比較して投与量依存的に有意に出血時間を短縮させ、血小板投与群のそれに匹敵した。従って、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体は血小板減少モデルウサギの出血時間を効率よく短縮させることが確認された。
【００４４】
９．ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体とＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体との出血時間に与える影響の比較
ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体又はＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体の分散液（１０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）、ＡＤＰ内包濃度０、１、１０ｍＭ）を投与した際の出血時間を測定した。出血時間の測定は、正常ラット及び血小板減少症モデルラットを用いて７．と同様に行った。結果を図７に示す。Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体（すなわち、ＡＤＰ内包濃度０）投与系では出血時間短縮効果は見られないが、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体では血小板減少症モデルラットの生理食塩水投与系と比較して出血時間の有意な短縮がみられ、ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体にて短縮効果の確認できた１／１０の投与濃度で同程度の短縮が得られた。以上から、ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体よりもＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体の方が優れた止血効果を有することが確認された。
【００４５】
１０．血小板凝集計を用いたＡＤＰ内包効果測定
ＰＥＧ小胞体、Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体についてＡＤＰ内包量の異なる小胞体（ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体）を調製した。ＡＤＰ内包濃度の算出は小胞体を２％ラウリルエーテルで可溶化させＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）にて行った。ＡＤＰ内包の効果を血小板凝集計により評価した。ＰＰＰにて血小板数を調整した血小板減少血漿（ＰＬＴ）（［血小板］＝１０×１０４／μＬ、１８０μＬ）を調製し、小胞体分散液を１０μＬ添加後、ＡＤＰ（３０〜４５μＭ、１０μＬ）を添加し、透過率を計測した。添加小胞体はＡＤＰ内包濃度が０、０．１、０．５、１．０、２．０もしくは１０．０ｍＭであるＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体又はＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体を用いた。評価はＰＥＧ小胞体添加時の透過率との差により行った。ＡＤＰを用いて血小板凝集を惹起させた時の結果を図８に示す。Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体添加系はＡＤＰ内包濃度１ｍＭ以上で内包効果が確認でき、それ以上の高濃度内包小胞体においてもその内包効果はほぼ同等であった。また、ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体添加系についてはその内包効果は確認できなかった。
【００４６】
１１．Ｂｉｏ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の合成
Ｎ−［６−（ビオチンアミド）ヘキシル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（Ｂｉｏ−ＨＰＤＰ、１０ｍｇ、１８．５μｍｏｌ）をＤＭＦ５ｍＬに溶解し、ジチオスレイトール水溶液（１Ｍ）を２０μＬ添加し、室温で３０分攪拌後、ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（７３．０ｍｇ、１８．５μｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル２５０ｍＬに滴下し、不溶成分を回収した。水２５０ｍＬを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末Ｂｉｏ−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を得た（Ｂｉｏ：ビオチン）。
【００４７】
１２．血小板凝集塊に巻込まれたＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体の電子顕微鏡観察
Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体添加系中の小胞体観察を目的とし、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体にＢｉｏ−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を導入し、その凝集塊を凍結超薄切し透過型電子顕微鏡にて免疫電子顕微鏡観察した（図９）。血小板間に小胞体が巻き込まれていることが確認され、また血小板の各部位にＢｉｏ−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８が点在することから、小胞体が凝集塊中で崩壊していることが示唆された。
【００４８】
実施例２  ＣＦ内包小胞体
１．ＣＦ内包ＰＥＧ小胞体及びＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体の製造
実施例１の１．〜３．に記載の手順に準じて、１０ｍＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を内包させたＰＥＧ小胞体及びＨ１２−ＰＥＧ小胞体を作製した。ＣＦ内包量は、実施例１の４．と同様にして定量した。
ＣＦ内包ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２３０±８０ｎｍ、平均層数１．８）
ＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体（平均粒子径２４０±５０ｎｍ、平均層数１．６）
２．血小板凝集に伴う小胞体内包物放出量の定量
ＣＦ（１０ｍＭ）内包ＰＥＧ小胞体又はＣＦ（１０ｍＭ）内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体をＰＲＰ（［血小板］＝２．０×１０５／μＬ、［ｖｅｓｉｃｌｅ］＝ｆ．ｃ．  ０．０５ｍｇ／ｍＬ）に添加後、ＡＤＰにより血小板凝集を惹起し（［ＡＤＰ］＝ｆ．ｃ．  ２μＭ）、血小板凝集計にて透過度変化を測定した。測定終了後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）にて凝集塊を除去した。この時、ＡＤＰ未添加系において、血小板のみを除去し、２％ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）にて小胞体を可溶化した際の蛍光強度（Ａ）を測定し、１００％と定義した。この上清中（小胞体分散液）の蛍光強度（Ｂ）を測定し、血小板凝集塊への小胞体取込み率を算出した。さらに、この上清を遠心分離（３３０００ｒｐｍ、４５分）して小胞体を除去し、その上清の蛍光強度（Ｃ）を測定し、血小板凝集塊に取込まれた小胞体からのＣＦ放出率を算出した。
【００４９】
【数１】
0005216219.tif 000003
【００５０】
ＣＦ内包ＰＥＧ小胞体を添加したところ、ＰＢＳ添加系と比較して血小板凝集に何ら影響を与えないことを確認した。ＣＦ内包ＰＥＧ小胞体の代わりにＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体を添加したところ、２次凝集が亢進し、透過度が増大し血小板凝集促進効果が確認できた（図１０）。これはＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体が血小板と多点結合し、血小板凝集を促進したためと考えられる。
血小板凝集塊へのＣＦ内包ＰＥＧ−小胞体、ＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体の取込み率は、それぞれ１３±５、１７±５％であり、両者ともほぼ同等であった。そこで、取込まれた小胞体からのＣＦ放出率を測定したところ、それぞれ０．６±０．５、１０±１％となった（表１）。これは、小胞体にＨ１２を担持させたことにより、小胞体と血小板との結合が強固となり、小胞体が血小板凝集に巻込まれた際の物理的な刺激に伴ってＣＦ放出率が増大したためと考えられる。
【００５１】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の薬物運搬体は、活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織と選択的な結合性を示し、これらの場所でのみ担持された薬物を放出するため、所望の場所以外に悪影響を及ぼすことなく、担持薬物の効果を活性化血小板、血管損傷部位及び／又は炎症組織でのみ発現させることが可能である。従って、本発明の薬物運搬体を含む製剤は、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤として有用であり、また、血小板代替剤、抗血小板剤、血管障害、血管損傷及び血栓症等の予防・治療剤などの医薬品、あるいは血小板無力症などの血小板機能異常症の診断薬、生物学的又は医学的な試薬、血小板代替剤や抗血小板剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血管形成部位の検査用診断剤又は治療剤などとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例１に記載のＧｌｕ２Ｃ１８、Ｈ１２−ＭＡＬ−ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の合成スキームである。
【図２】水和時ＡＤＰ濃度（０、１０、２５、１００ｍＭ）に対する脂質１０ｍｇ／ｍＬ中に内包されたＡＤＰ濃度の関係を示すグラフである。
【図３】Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（黒）又はＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体（白）の存在下での、血小板へのＰＡＣ−１の結合比を示すグラフである。
【図４】Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体によるコラーゲン惹起血小板凝集の促進効果を示す透過度の変化である。［コラーゲン］：ｆ．ｃ．  ０．４μｇ／ｍＬ、［血小板］：２．０×１０５／μＬ、［脂質］：０．０５ｍｇ／ｍＬ。（ａ）ＰＥＧ小胞体、（ｂ）Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体、（ｃ）ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、（ｄ）Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体、（ｅ）コラーゲン非存在下のＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体。
【図５】尾出血時間に対する、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体投与の止血効果を示すグラフである。Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体投与量：１、４、１０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）。○：血小板数（Ｎ＝１０）。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】耳出血時間に対する、Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体投与及びＰＲＰの止血効果を示すグラフである。Ｈ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体投与量：１０、２０ｍｇ／ｋｇ（脂質量換算）。ウサギ血小板投与量：０．４、２．０、４．０×１０９／ｋｇ。○：血小板数（Ｎ＝５〜６）。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  生理食塩水群。
【図７】尾出血時間に対する、ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体とＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体との止血効果を比較したグラフである。小胞体投与量：１０ｍｇ／ｋｇ。○：血小板数（Ｎ＝６〜１０）。
【図８】ＰＥＧ小胞体及びＨ１２−ＰＥＧ小胞体へのＡＤＰ内包効果を示すグラフである。
【図９】血小板凝集の透過型電子顕微鏡像である。矢印で示したものがＨ１２−ＰＥＧ（ＡＤＰ）小胞体である。
【図１０】ＣＦ内包Ｈ１２−ＰＥＧ小胞体によるＡＤＰ惹起血小板凝集の促進効果を示す透過度の変化である。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１：デザインペプチド
配列番号２：デザインペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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【配列表】
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