(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）イヌまたはネコからαβ型T細胞を含む開始試料を採取する採取工程と、
（2）採取した開始試料中の細胞を少なくとも5〜15μg/mlのコンカナバリンA及び500〜750 U/mlのインターロイキン2を含む培地で増殖・活性化する増殖・活性化工程と、
をこの順番で含むLAK細胞の増殖方法。
【請求項２】
αβ型T細胞を含む開始試料が、末梢血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、脾臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織、胎児組織及びそれらの分画物のうちの少なくとも一つから選択される請求項1に記載のLAK細胞の増殖方法。
【請求項３】
開始試料が、末梢血及びその分画物のうちの少なくとも一つから選択される請求項2に記載のLAK細胞の増殖方法。
【請求項４】
（3）増殖・活性化工程の完了後、培地を取り除いて細胞を洗浄する除去工程と、
（4）洗浄した細胞を適当な溶液に懸濁する調製工程と、
をこの順番で含む請求項1〜3の何れか一つに記載のLAK細胞の増殖方法。
【請求項５】
癌、免疫不全症又は感染症に罹患しているイヌまたはネコの治療方法であって、
前記イヌまたはネコ由来の開始試料から調製した請求項4に記載の増殖方法によってαβ型T細胞が富化された細胞製剤の有効量を前記イヌまたはネコに投与する投与工程、を含むイヌまたはネコの治療方法。
【請求項６】
少なくとも750 U/mlのインターロイキン2と、5〜15μgのコンカナバリンAとを含むイヌまたはネコ由来LAK細胞の増殖用キット。
【請求項７】
細胞培養容器を含む請求項6に記載のLAK細胞の増殖用キット。
【請求項８】
コンカナバリンAが、細胞培養容器に固層化されている請求項6または7に記載のLAK細胞の増殖用キット。
【請求項９】
培地中に含まれるコンカナバリンAが5μg/mlである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のLAK細胞の増殖方法。
【請求項１０】
含まれるコンカナバリンAが5μg/mlである、請求項6〜8のいずれか1項に記載のLAK細胞の増殖用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、LAK細胞の増殖方法、増殖した細胞を含む細胞製剤、細胞製剤を利用する非ヒト動物の癌、免疫疾患、感染症などの治療方法、及びLAK細胞の増殖に使用する培養キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌や腫瘍の治療手段としては、病変部を切除する外科的治療法、抗癌剤を投与する化学的治療法、病変部に放射線を照射する放射線療法などが一般的である。【０００３】
ただ、これらの治療法には患者にとって、肉体的負担が大きい、化学薬品や放射線による副作用がある等の欠点があった。そのため、1980年代頃から、第4の治療法としてLAK(lymphokine-activated killer)療法やCTL(cytotoxic T lymphocyte)療法などの活性化自己リンパ球療法が研究され、ヒトの癌の治療などに利用されるようになってきている（非特許文献1を参照）。【０００４】
ここで、LAK療法とは、体外で増殖・活性化した患者自身のリンパ球が持つ免疫力を利用して患者の癌を治療する方法である。具体的には、（1）癌に罹患した患者から採血して、リンパ球を含む分画物を分離し、（2）その分画物をインターロイキン2及び抗CD3抗体を含む培地で2週間程度培養することにより、リンパ球細胞の数を増やして活性化し、（3）培養の結果得られたリンパ球を多く含む細胞懸濁液を洗浄してインターロイキン2、抗CD3抗体、培地を除去して、リンパ球を適当な溶液、例えばアルブミンを含む輸液用生理食塩水等に懸濁して細胞製剤を調製し、（4）この細胞製剤を点滴して活性化したリンパ球を患者の体に戻す、ことにより患者を治療する方法である。また、CTL療法とは、細胞傷害性Tリンパ球を増殖活性化させ、使用する方法である。【０００５】
さて、活性化自己リンパ球療法も他の治療法と同様に様々な改良がなされている。例えば、抗CD3抗体の代わりにコンカナバリンA等のT細胞マイトゲン及びインターロイキン7等を培地に添加して培養することによって、リンパ球全体を増殖・活性化するのではなく、細胞性免疫に直接関係するγδ型T細胞だけを特異的に増殖・活性化し、より効率的に癌を治療する方法も開発されている（特許文献1及び2を参照）。【０００６】
なお、LAK療法やCTL療法などの活性化自己リンパ球療法は、前記特許文献に記載されているように、癌以外の疾患、例えば免疫疾患や感染症への適用も試みられている。【０００７】
しかし、これらは次に掲げるような問題点があった。まず、抗CD3抗体は、抗原となるCD3蛋白質がその由来となる種、例えば、犬、猫、家畜、ヒトごとに異なるため、治療の対象となる種ごとに抗CD3抗体を準備しなければならない、との問題点があった。また、この抗CD3抗体、特に現在一般的に使用されているヒト用抗CD3抗体は高価でもあった。そのため、LAK療法やCTL療法などの活性化自己リンパ球療法はヒトにはともかく、経済的な面から非ヒト動物には適用し難いとの問題が生じていた。【０００８】
また、γδ型T細胞だけを増殖しても、γδ型T細胞は前記のように抗原特異性やMHC拘束性を示さないため、LAK療法やCTL療法などの活性化自己リンパ球療法にはあまり有効ではないとの問題点があった。
【特許文献１】特表2002-528115号公報
【特許文献２】特表2003-529363号公報
【非特許文献１】［平成18年6月27日検索］、インターネット<URL：http://www.j-immunother.com/treatment/02Treatment.html>
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、この発明は非ヒト動物にも適用できるほどの費用で、癌、免疫不全症、感染症などに有効な治療方法やそれに関連する細胞の増殖・活性化方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この発明は、開始試料から得た細胞を培養する際に、培地にコンカナバリンAなどの植物レクチンと、インターロイキン2様活性を有する増殖因子とを添加することを最も主要な特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培地中のコンカナバリンA濃度の違いが、αβ型T細胞の増殖に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】培地中のコンカナバリンAの有無が、イヌ末梢リンパ球の表面におけるインターロイキン2レセプターの発現に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図３】培地中の血清濃度の違いが、αβ型T細胞の増殖に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図４】培地中のインターロイキン2濃度の違いが、αβ型T細胞の増殖に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図５】異なるイヌから採取したαβ型T細胞をそれぞれの自己血清で培養した結果を示すグラフである。
【図６】異なるイヌから採取したαβ型T細胞をウシ胎児血清で培養した結果を示すグラフである。
【図７】異なるネコから採取したαβ型T細胞をそれぞれの自己血清又はウシ胎児血清で培養した結果を示すグラフである。
【図８】増殖開始前と増殖後に測定したフローサイトメーターによるヒストグラムである。
【図９】コンカナバリンA及びインターロイキン2を含む培地で培養したイヌ末梢リンパ球が、ヒトメラノーマ細胞に与える細胞障害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】コンカナバリンA及びインターロイキン2を含む培地でイヌ末梢リンパ球を培養することが、グランザイムBのmRNA転写活性に与える影響を調べた結果を示す電気泳動写真である。
【図１１】コンカナバリンA及びインターロイキン2を含む培地で培養したイヌ末梢リンパ球をその採取元であるイヌに移入したのち、移入したイヌから末梢リンパ球を採取して、この末梢リンパ球がヒトメラノーマ細胞に与える細胞障害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】この発明の治療方法を癌に罹患したイヌに施すことにより、その患部に生じた変化を示す写真である。なお、図12（a）は治療前の患部の写真であり、図12（b）は治療後の患部の写真である。
【図１３】この発明の治療方法をアカラス症に罹患したイヌに施すことにより、その患部に生じた変化を示す写真である。なお、図13（a）は治療前の患部の写真であり、図13（b）は治療後の患部の写真である。
【図１４】図13のイヌの他の患部に生じた変化を示す写真である。なお、図14（a）は治療前の患部の写真であり、図14（b）は治療後の患部の写真である。
【符号の説明】
【００１２】
1      腫瘍
2、3  患部
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
1．LAK細胞の増殖方法
この発明のLAK細胞の増殖方法は、（1)動物からαβ型T細胞を含む開始試料を採取する採取工程と、（2）採取した開始試料中の細胞を少なくとも植物レクチン及びインターロイキン2様活性を有する増殖因子を含む培地で培養する増殖・活性化工程等と、を含む方法である。なお、この発明の詳細について以下に各工程に説明する。【００１４】
（1）採取工程
動物からαβ型T細胞を含む開始試料を採取する工程である。【００１５】
（a）動物
動物とは、犬、猫、牛や馬などの家畜及びヒトを含む哺乳動物を意味し、非ヒト動物とは前記動物のうちからヒトを除外した哺乳動物を意味する。【００１６】
（b）開始試料
開始試料は、増殖の元になるαβ型T細胞又はその前駆細胞を含んでいる体液・組織であれば特に限定することなく使用することができる。具体的には、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、脾臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織、胎児組織又はその分画物などを挙げることができる。これらのなかでも、αβ型T細胞の濃度が高いこと、採取が容易なことなどを考慮して末梢血の分画物が好ましい。【００１７】
（c）採取
開始試料の採取は、公知の方法であれば特に限定することなく使用することができる。具体的には、例えば、開始試料が体液である場合には、注射によって抜き取った体液を適当な比重液に重層したのち、密度勾配遠心法によって適当な画分を分取することにより採取することができる。なお、αβ型T細胞と比重が近い赤血球を多く含む開始試料、具体的には末梢血の場合には、NH4Cl緩衝液などを利用して予め赤血球を破壊すれば、αβ型T細胞の濃度をより高めることができる。また、末梢血を利用する場合には、凝固を防ぐためヘパリンやクエン酸などを加えてもよい。【００１８】
また、開始試料が組織である場合には、外科的手術によって摘出した組織片を、トリプシン処理等によって細胞間接着物を消化して、細胞を培地中に分散させて細胞懸濁液としたのち、この細胞懸濁液を適当な比重液に重層し、密度勾配遠心して適当な画分を分取することによって採取することができる。【００１９】
（d）その他
遠心分離法等により採取した開始試料は、公知の方法によってαβ型T細胞を予め濃縮すれば、より効率よくαβ型T細胞を優先的に増殖することができる。公知の方法としては、抗体を固定したアフィニティークロマトグラフィーに細胞懸濁液を流すことによって、αβ型T細胞だけを濃縮することや、反対にγδ型だけを除去することなどが例示できる。【００２０】
（2）増殖・活性化工程
採取した開始試料中の細胞を、少なくとも植物レクチン及びインターロイキン2様活性を有する増殖因子を含む培地で増殖・活性化する工程である。【００２１】
ここで「増殖」とは、インビトロで培養することを意味する。また、「培養」とは、細胞をそれが生きていくのに必要な栄養源等を含む培地中に入れ、細胞を量的に増加させることを意味する。さらに「活性化」とは、細胞を刺激することにより、細胞の有する機能を活発に働くよう制御すること、より具体的には抗腫瘍性、抗免疫疾患性、抗感染症性等を発生・向上させることを意味する。【００２２】
（a）植物レクチン
植物レクチンとは、植物由来の糖結合性蛋白質のことであり、具体的にはコンカナバリンA、フィトヘムアグルチニン、ポークウイードマイトジェン等を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。これらの中でも価格の安さ、入手し易さなどの点から、コンカナバリンAが好ましい。また、培地中のコンカナバリンAの濃度は、1μg/ml〜15μg/mlが好ましく、5μg/ml〜10μg/mlがより好ましい。【００２３】
（b）インターロイキン2様活性を有する増殖因子
インターロイキン2様活性を有する増殖因子とは、αβ型T細胞の増殖能についてインターロイキン2と同様の活性を有するすべて化合物も意味する。具体的には、インターロイキン2それ自体、インターロイキン2のアミノ酸置換体、インターロイキン2の部分消化物、インターロイキン2模倣体などの機能的同等物をあげることができるが、これに限定されるわけではない。また、前記の条件を満たしていれば、インターロイキン2等の由来は特に限定する必要はなく、例えば、ヒト、犬、猫、家畜由来のものを使用することができる。なお、これらのなかでも、入手し易さからヒト由来のインターロイキン2が好ましい。また、培地中のインターロイキン2様活性を有する増殖因子の濃度は、1 U/ml〜1000 U/mlが好ましく、500 U/ml〜750 U/mlがより好ましい。【００２４】
（c）増殖・活性化
（c1）培地
培地は、植物レクチン及びインターロイキン2様活性を有する増殖因子が添加されていれば、特に限定することなく公知の培地、例えば市販の培地（日水製薬製  RPMI 1640培地など、ただしこれに限定するわけではない。）を使用することができる。また、培地は無血清培地であってもよいが、増殖を促進するため、血清を含んでいるほうが好ましい。血清としては、市販の血清、例えばウシ胎児血清などを使用してもよいが、開始試料を採取した動物と同種の血清又はその自己血清を使用してもよい。なお、血清を添加する場合、その添加量は培地の1重量％〜20重量％が好ましく、2重量％〜5重量％がより好ましい。【００２５】
（c2）培養方法
培養は、動物細胞の一般的な培養方法、すなわち培地の入った培養容器をCO2インキュベータ内に配置すること、によって行うことができる。培養容器としては、例えばプレート、ディッシュ、フラスコ、ローラーボトル、ガス透過性バッグ等の公知のものを使用することができる。【００２６】
また、CO2インキュベータ内のCO2濃度は、1〜10％の範囲が好ましく、3〜7％の範囲がより好ましい。CO2インキュベータ内の温度は、30〜40℃の範囲が好ましく、35〜38℃の範囲がより好ましい。【００２７】
さらに、培養期間は、通常の動物細胞の培養と同様に、特に限定することはないが、細胞の増殖及び活性化のため、2日〜20日程度が好ましく、7日〜14日程度がより好ましい。なお、培養期間の間には顕微鏡下で細胞の状態を観察して細胞数を数えたり、培養状況に応じて培地やその特定成分を追加したり、場合によっては培地を交換したり、細胞を他の容器に入った培地に継代してもよい。【００２８】
2．細胞懸濁液及び細胞製剤
前記1の増殖方法によって開始試料中のαβ型T細胞を増殖・活性化した（富化した）細胞懸濁液は、細胞懸濁液として各種実験に使用することができる。また、この細胞懸濁液から、培地、それに含まれる植物レクチン、インターロイキン2様活性を有する増殖因子を除去（除去工程）したのち、適当な溶液に適当な細胞密度で再懸濁（調製工程）して細胞製剤とすることができる。除去工程及び調整工程の詳細については以下に詳述する。【００２９】
なお、細胞製剤は、この発明のLAK細胞の増殖方法によって増殖された細胞を含み、疾病の治療に利用できる薬剤であれば、その形態、開始試料、開始試料を採取した動物の種類、再懸濁する溶液の種類などについては限定する必要はない。【００３０】
（3）除去工程
増殖・活性化工程が完了したのち、培地、植物レクチン等による不要で有害な免疫反応を防ぐため、培地に含まれている細胞だけを集め、細胞表面に付着している培地を洗浄することができれば、特に限定することなく公知の方法を使用することができる。【００３１】
具体的には、培養容器を遠心分離器に掛けて細胞を沈殿させたのち、培地をデカンテーションによって廃棄して、緩衝液などに細胞を懸濁させることを繰り返す方法、スピンカラムを使用する方法などが挙げられる。また、αβ型T細胞に対する抗体が固定された磁気ビーズやアフィニティクロマトグラフを使用する方法や、αβ型T細胞に対する蛍光抗体とフローサイトメトリーを使用して細胞だけを分離する方法、などが挙げられる。【００３２】
（4）調製工程
培地を除去した後に、適当な溶液に適切な細胞濃度で懸濁できれば、特に限定することなく公知の方法、例えば、細胞が入っている培養フラスコに適当な溶液を加え、これをボルテックスによって解す方法などが使用できる。【００３３】
細胞を懸濁する溶液としては、LAK細胞の活性が維持でき、かつ、この溶液を含む細胞製剤を投与した非ヒト動物が拒絶反応などの免疫反応を引き起こさないのであれば、特に限定することなく使用できる。具体的には、例えば、アルブミン、ビタミン、ブドウ糖など含む輸液など通常の輸液、及び自己血清を含む培養液などを挙げることができる。なお、溶液中の細胞密度は、開始試料、採取した動物の種類、溶液の種類などによって異なるが、1×105 cells/ml〜1×107 cells/mlが好ましく、1×106 cells/ml〜6×106 cells/mlがより好ましい。【００３４】
3．治療方法
細胞製剤のなかでも、非ヒト動物の開始試料に由来する細胞製剤の有効量を、開始試料を採取した非ヒト動物に投与（投与工程）することによって、癌や腫瘍、免疫不全症又は感染症に罹患している非ヒト動物を治療する方法である。なお、前記有効量とは、所望の結果、例えば疾病の完治に必要な細胞製剤の合計量であり、例えば一回に投与する細胞の数、一日あたりの投与回数、1月あたりの投与日数などによって規定できる。【００３５】
（5）投与工程
（a）投与の詳細
投与は、細胞製剤を公知の方法、具体的には点滴・注射などによって、非ヒト動物の体内、特に血管内に入れることができれば特にその方法は特に限定する必要はないが、大量のLAK細胞を体内に送り込むためには点滴が好ましい。【００３６】
なお、点滴を行なう際の投与量は、対象となる動物の種類、疾病の種類等によって異なるものの、体重1 kgあたり、1×106 cells〜5×107 cellsが好ましく、5×106 cells〜1×107 cellsがより好ましい。また、投与頻度も対象となる動物の種類、疾病の種類等によって異なるものの、1回／10日〜1回／14日、又は2回／月〜3回／月が好ましく、1回／7日〜1回／8日、又は4回／月〜5回／月がより好ましい。【００３７】
（b）治療の対象となる疾患
この治療方法の対象となる癌や腫瘍としては、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、膀胱癌、白血病、骨肉腫、脳腫瘍等の癌や腫瘍等を挙げることができるが、これに限定するわけではない。【００３８】
この治療方法の対象となる免疫不全症としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シューグレン症候群、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病、AIDS等を挙げることができるが、これに限定するわけではない。【００３９】
この治療方法の対象となる感染症としては、犬ジステンパーウイルス、狂犬病ウイルス、パルボウイルス、猫エイズなどウイルス感染症、細菌感染症、フィラリア、トキソプラズマなどの原虫感染症、アカラスや耳ヒゼンダニなどのダニによる感染症等を挙げることができるが、これに限定するわけではない。【００４０】
4.増殖キット
この発明のLAK細胞の増殖法で使用する植物レクチン、インターロイキン2様活性を有する増殖因子、培地、細胞培養容器など、増殖に必要な各構成要素は別々に購入して使用してもよい。しかし、これらを組み合わせて予め増殖キットとしておけば、各構成要素を別々に購入する手間を省き、細胞の増殖をより容易に行うことができる。【００４１】
なお、この増殖キットは、例えば、必要な植物レクチン、インターロイキン2様活性を有する増殖因子とからなる簡易なものから、これに培地、細胞培養容器、又はこれ以外の構成要素、例えば他の増殖因子を含むものまで含む幅広い概念である。また、この増殖キットは、前記構成要素を組み合わせるだけでなく、様々な工夫を加えてもよい。【００４２】
例えば、植物レクチンを培養容器に固相化してもよい。これよって、植物レクチンの計量を省略して細胞培養操作をさらに容易にできるとともに、植物レクチンとLAK細胞との接触がよくしてその増殖を促進することもできる。なお、植物レクチンの固相化は、植物レクチンを含む溶液を細胞培養容器加え、そのまま静置することにより固相化することによって行うことができる。【００４３】
また、インターロイキン2様活性を有する増殖因子を例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培地などに溶解し一回分ずつ小型容器に分注・冷凍し、これを使用時に解凍して使用するようにしてもよい。これにより、インターロイキン2様活性を有する増殖因子の計量を省略することができる。【００４４】
さらに、培地、植物レクチンやインターロイキン2様活性を有する増殖因子を含む培地などを培養容器に分注・冷凍し、これを使用時に解凍して使用するようにしてもよい。これにより細胞の増殖・活性化に掛かる殆どすべて作業を省略することができる。【００４５】
以下、この発明を実施例によってより詳細に説明するが、以下の実施例によりこの発明の特許請求の範囲はいかなる意味でも限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例1
植物レクチンとしてコンカナバリンA、インターロイキン2様活性を有する増殖因子としてヒトインターロイキン2を使用して、LAK細胞の最適な増殖条件などを調べた。【００４７】
1.コンカナバリンA濃度の最適化
（1）開始試料の採取
ドギー犬（6才）の頚静脈から注射器により30 mlの全血を採血した（ヘパリンにより凝固防止）。その後遠心し、得られた末梢血ペレットの10倍量の（a）NH4Cl緩衝液（NH4Cl:0.83 g/100 ml蒸留水）、（b）Tris base(20.6 g/1000 ml蒸留水、pH7.2)、（c）前記の（a）と（b）とを9：1となるように混合して濾過滅菌した溶液、を加えて氷中で5分間に放置し（時々攪拌）、血液中に含まれる赤血球を破裂させた。【００４８】
3 mlの比重液（犬リンパ球分離用、Cedarlane社製Lympholyte）を2本の遠心管に均等に入れ、その上に破裂処理を行なった血液を、液面を乱さないようにゆっくりと上に重層した。この遠心管を遠心分離機に掛けて室温で20分間800×gで遠心分離し、リンパ球を含む分画物を注射器又は滅菌パスツールピペットにより採取した。【００４９】
採取した分画物は培地に懸濁して細胞懸濁液とし、この細胞懸濁液を室温、5分間300×gで遠心分離して、デカンテーションにより上清を捨て、細胞の洗浄を行なった。細胞の洗浄を3回行なったのち、洗浄後の細胞を5 mlの培地に懸濁した（細胞密度：4.76×107 cells/ml）。なお、培地にはRPMI 1640培地（日水製薬製、以下、培地と省略する。）を使用した。【００５０】
（2）細胞の増殖
遠心管中の細胞懸濁液を試験管に移し培地を加え、細胞数が1×106 cells/mlになるように調整し、56℃で30分間非働化処理したイヌ血清（輸血用犬から採取）及びウシ胎児血清（JRH Biosciences社製Fetal Bovine Serum）をそれぞれの終濃度が2％、10％になるように添加し、2枚の6ウェルプレートに各ウェルあたり2 mlずつ（2×106 cells/ウェル）となるように播いた。つぎに、コンカナバリンA（Elastin Products社製Concanavalin A）をその終濃度が1、5、10、15μg/mlとなるように各ウェルに添加し、コンカナバリンAの終濃度が異なる4つの組を作った。【００５１】
その後、各プレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を開始した。また、細胞増殖の開始から14日目までの細胞数の増減を測定し、各組ごとの平均値を求めた。なお、細胞数は、細胞懸濁液20μlとトリパンブルー染色液20μlとを混合し、このうち1μlに含まれる細胞数を血球計算板（ERMA社製ビルケルチュルク血球計算版）と顕微鏡とを使用して測定した結果に基づいて算出した。【００５２】
（3）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表1及びそれをグラフ化した図1に示す。表1及び図1からも明らかなように、コンカナバリンAの濃度は5μg/mlが最も適当であることが分かった。【００５３】
【表１】
0005301994.tif 000002
2．コンカナバリンAによるリンパ球の変化
コンカナバリンAが、リンパ球に与える影響、具体的にはリンパ球表面におけるインターロイキン2レセプターαの発現に与える影響、についてフローサイトメーターにより調べた。【００５４】
（1）実験方法
実施例1と同様の方法によって、3匹のイヌ（6才）から、3系統（case）の5 ml細胞懸濁液（細胞密度：2〜4×107 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を5×105 cells/mlに調整した。これを6ウエルプレートの各ウエルに、各ウエル当たり2 ml（1×106 cells/ウエル）となるように加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、イヌ血清（輸血用犬）の終濃度が2％、ウシ胎児血清の終濃度が10％になるようにそれぞれ添加し、37℃で5日間培養した（Stimulated cPBL）。なお、実験対照としては、コンカナバリンAのみを添加せず培養したものを使用した（Non-stimulated cPBL）。【００５５】
培養後、遠心分離により培養細胞を回収してPBSで3回洗浄し、そのうちの1×106個の細胞を採って試験管に入れ、FITCでラベルしたマウス抗ヒトインターロイキン2 レセプター抗体を10μl加え、4℃、暗所で30分間インキュベートした。なお、マウス抗ヒトインターロイキン2 レセプター抗体は、American Research Products社から購入したものを使用した。【００５６】
インキュベートしたのち、細胞をPBSで3回洗浄してPBSに懸濁し、フローサイトメーター（BECTON DICKINSON社製FACSCalibur）で細胞表面におけるインターロイキン2 レセプターα (IL-2Rα)の発現している細胞の割合を測定した。その結果を図2に示す。なお、図中のデータは平均値±標準誤差で示してある。【００５７】
（2）実験結果
図2からも明らかなように、培地にコンカナバリンAを添加して培養する（Stimulated cPBL）ことにより、コンカナバリンAを添加せずに培養する（Non-stimulated cPBL）よりも、表面にインターロイキン2レセプターが発現しているリンパ球の割合が高いことが分かった（有意差あり、P < 0.05）。このことは、コンカナバリンAの添加が、インターロイキン2レセプターの発現を増加させることを意味している。【００５８】
3.血清濃度の最適化
（1）実験方法
前記1と同様の方法によって、5 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.38×107 cells/ml）を得た。この細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を5×105 cells/mlに調整し、コンカナバリンAの終濃度が5μg/mlとなるように添加し、6ウェルプレートに各ウェルあたり1 mlずつ（5×106 cells/ウェル）となるように播いた。つぎに、56℃で30分間非働化処理したイヌ血清（輸血用犬から採取）をそれぞれの終濃度が、2％、5％、10％となるように添加し各ウェルに添加し、血清の終濃度が異なる3つの組を作った。【００５９】
その後、プレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を開始した。なお、細胞増殖の開始から13日目までの間の細胞数の増減を前記1と同様にして算出した。【００６０】
（2）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表2及びそれをグラフ化した図3に示す。表2及び図3からも明らかなように、血清の濃度は5％が最も適当であることが分かった。【００６１】
【表２】
0005301994.tif 000003
4.インターロイキン2濃度の最適化
（1）実験方法
前記1と同様の方法によって、5 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.68×107 cells/ml）を得た。この細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を5×105 cells/mlに調整し、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、イヌ血清（輸血用犬より採取）の終濃度が2％、ウシ胎児血清の終濃度が10％にとなるようにこれらを添加し、24ウェルプレートに各ウェルあたり1 mlずつ（5×105 cells/ml）となるように播いた。つぎに、インターロイキン2をその終濃度が250 U、500 U、750 U、1000 U、0 U/mlとなるように各ウェルに添加し、インターロイキン2の終濃度が異なる5組を得た。【００６２】
その後、プレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を開始した。なお、細胞増殖の開始から5日目に、インターロイキン2とコンカナバリンAをそれぞれの終濃度が500 U、5μg/mlとなるように添加した。また、細胞増殖の開始日から12日までの間の細胞数の増減を前記1と同様にして算出した。【００６３】
（2）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表3及びそれをグラフ化した図4に示す。表3及び図4からも明らかなように、インターロイキン2の濃度は750 U/mlが最も適当であることが分かった。【００６４】
【表３】
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実施例2
使用する血清の違いが、LAK細胞の増殖に与える影響について、使用する血清を自己血清、ウシ胎児血清、ネコ血清と変えて調べた。具体的には、以下のような手順で調べた。【００６５】
1.自己血清を使用した場合
（1）実験方法
実施例1と同様の方法によって、4匹のイヌ（ミニチュアピンシャー、2才；雑種、1才；ポメラニアン、10才；雑種、3才）から、4系統の1 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.5×106 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を1×105 cells/mlに調整し、6ウェルプレートの各ウェルに3 ml（3×105 cells/ウエル）を加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、自己血清の終濃度が5％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるように添加した。また、細胞増殖の開始日の細胞数を実施例1と同様に血球計算板で測定した。なお、自己血清は末梢血をクリーンベンチ内で一夜放置して凝固させ、遠心分離機（室温、10分間1,500×g）にかけ、得られた上澄み液を56℃で30分間非働化処理し、使用した。【００６６】
その後、6ウェルプレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を開始した。なお、細胞増殖の開始から15日目までの間の細胞数の増減を血球計算板により測定した。【００６７】
（2）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表4及びそれをグラフ化した図5に示す。表4及び図5からも明らかなように、増殖終了時の細胞数は系統ごとにバラツキがあり、3.9〜5.4×107 cells/mlであった。【００６８】
【表４】
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2.ウシ胎児血清を使用した場合
（1）実験方法
実施例1と同様の方法によって、4匹のイヌ（ミニチュアピンシャー、2才；雑種、1才；ポメラニアン、10才；雑種、3才）から、4系統の1 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.5×106 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を1×105 cells/mlに調整し、6ウェルプレートの各ウェルに3 ml（3×105 cells/ウエル）を加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、ウシ胎児血清（JRH Biosciences社製Fetal Bovine Serum）の終濃度が5％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるように添加した。また、細胞増殖の開始日の細胞数を血球計算板で測定した。【００６９】
（2）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表5及びそれをグラフ化した図6に示す。表5及び図6からも明らかなように、増殖終了時の細胞数は系統ごとにバラツキがあり、3.0〜5.0×107 cells/mlであった。【００７０】
【表５】
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3.ネコの自己血清を使用した場合
（1）実験方法
実施例1と同様の方法によって、2匹のネコ（雑種、2才）の末梢血から、2系統の1 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.5×106 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を1×105 cells/mlに調整し、それぞれを2枚の6ウェルプレートの各ウェルに3 ml（3×105 cells/ウエル）を加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、血清の終濃度が5％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるように添加した。なお、各系統の一方にはウシ胎児血清を使用し、他の一方にはネコの自己血清を使用した。また、細胞増殖の開始日の細胞数を血球計算板により測定した。なお、ネコの自己血清は、ネコの末梢血を室温で一夜クリーンベンチ内に放置して凝固させ、遠心分離機（室温、10分間1,500×g）にかけ、得られた上澄み液を使用した。【００７１】
その後、プレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を開始した。なお、細胞増殖の開始から15日目までの間の細胞数の増減を血球計算板により測定した。【００７２】
（2）実験結果
このようにして測定した細胞数変化を表6及びそれをグラフ化した図7に示す。表6及び図7からも明らかなように、増殖終了時の細胞数はイヌと比べて系統ごとのバラツキがすくなく、1.9〜2.2×107 cells/mlであった。【００７３】
【表６】
0005301994.tif 000007
さて、1と2とを比較した結果から、イヌの自己血清を使用した場合とウシ胎児血清を使用した場合との間で、イヌのαβ型T細胞の増殖に系統間の違いほどの差はなかった。また、3ではネコの自己血清を使用した場合とウシ胎児血清を使用した場合との間で、ネコのαβ型T細胞の増殖にそれほどの差はなかった。以上のことから、イヌ、ネコのαβ型T細胞の増殖は使用する血清の由来にあまり依存していないことが分かった。【００７４】
実施例3
増殖による細胞プロファイルの変化をフローサイトメーターにより調べた。具体的には、この発明の増殖方法によって、αβ型T細胞であり、細胞性免疫に関係しているCD8+細胞と体液性免疫に関係するCD4+細胞との細胞数とその割合の変化を以下のようにして調べた。【００７５】
（1）実験方法
実施例1と同様の方法によって、3匹のイヌ（6才）から、3系統（case）の5 ml細胞懸濁液（細胞密度：2〜4×107 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を1×106 cells/mlに調整し、それぞれを6ウェルプレートの各ウェルに2 mlづつ（2×106 cells/ウェル）加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、イヌ血清（輸血用犬より採取）の終濃度が5％、ウシ胎児血清の終濃度が10％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるようにそれぞれ添加した。【００７６】
細胞懸濁液から1×106 cellsを採って試験管に入れ、FITCでラベルした抗イヌCD8+抗体及び抗イヌCD4+抗体を10μl加え、4℃、暗所で30分間インキュベートした。インキュベートののち、細胞をPBSで3回洗浄してPBSに懸濁し、フローサイトメーター（BECTON DICKINSON社製FACSCalibur）で細胞のプロファイルを調べた。なお、抗イヌCD8+抗体及び抗イヌCD4+抗体は、UK-Serotec社から購入し、使用した。【００７７】
その後、プレートを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して、7日間細胞の増殖を行なったのち、前記の方法により細胞プロファイルを調べた。【００７８】
（2）実験結果
培養開始前と培養後に測定したフローサイトメーターのヒストグラムを図8に、これに基づく細胞数の比を表7に示す。なお、表7中のDNはCD8-及びCD4-細胞、CD8 SPはCD8+細胞、CD4 SPはCD4+細胞、DPはCD8+及びCD4+細胞をそれぞれ意味している。【００７９】
【表７】
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図8及び表7から明らかなように、全てのcaseにおいてCD8+細胞(CD8 SP)の細胞数及びその割合は大幅に増加していることが分かった。また、CD8+及びCD4+細胞（DP）も細胞数及びその割合が増加していることが分かった。これとは対照的に、CD4+細胞(CD4 SP)については、細胞数こそは増えてはいるものの、全体に占める割合は減っている。以上の結果から、この発明の増殖方法では、αβ型CD8+T細胞が優先的に増殖していることが分かった。また、CD8+細胞(CD8 SP)のみならずCD8+及びCD4+細胞（DP）も合わせて増殖しており、これはγδT細胞、NK T細胞のようなMHC非拘束性のリンパ球の何れかの増殖を示唆するものではある。しかし、試料が末梢血に由来することを考慮すれば、NK T細胞が増殖した可能性が高い。【００８０】
実施例4
増殖した細胞が腫瘍細胞に与える細胞障害活性について調べた。具体的には、コンカナバリンAとインターロイキン2を含む培地でリンパ球を培養したのち、このリンパ球とヒトメラノーマ細胞とを共培養することにより、ヒトメラノーマ細胞の増殖抑制効果やそのメカニズムの一端について調べた。【００８１】
1.  増殖した細胞による細胞障害活性
（1）実験方法
それぞれ3匹のイヌ（6才）から採取した3系統（case）から、実施例1と同様の方法によって、5 ml細胞懸濁液（細胞密度：2〜4×107 cells/ml）を得た。得られた各系統の細胞懸濁液に培地を加え、細胞数を5×105 cells/mlに調整した。これを6ウエルプレートの各ウエルに、各ウエル当たり2 ml（1×106 cells/ウエル）となるように加え、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、イヌ血清（輸血用犬から実施例2と同様の方法で調整）の終濃度が2％、ウシ胎児血清の終濃度が10％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるようにそれぞれ添加し、37℃で7日又は11日間培養した。【００８２】
得られたリンパ球をエフェクター細胞、ヒトメラノーマ細胞（MeWo細胞）をターゲット細胞として培地中で共培養し、エフェクター細胞がターゲット細胞に与える細胞障害活性を調べた。具体的には、以下のとおりに行った。【００８３】
まず、エフェクター細胞とターゲット細胞の比が33（4.95×106個/ウェル）対1（1.5×105/ウェル）になるように、24ウェルプレートの各ウェルに入れ、37℃で16時間培養した。ここで、共培養する際には、イヌ血清（輸血用犬から実施例2と同様の方法で調整）の終濃度が2％、ウシ胎児血清の終濃度が10％となるように添加した培地を使用した。つぎに、ターゲット細胞（MeWo細胞）の生細胞数を血球計算板により測定し、その生存率を計算した。その結果を図9に示す。【００８４】
なお、実験対照には、MeWo細胞のみを培養したもの、MeWo細胞を未刺激イヌ末梢リンパ球と共培養したものを使用した。また、図9中の1はMeWo細胞のみを培養した実験対照の実験結果、2はMeWo細胞を未刺激イヌ末梢リンパ球と共培養した実験対照の実験結果、3はMeWo細胞をコンカナバリンAとインターロイキン2で7日間刺激培養したイヌ末梢リンパ球と共培養した実験結果、4はMeWo細胞をコンカナバリンAとインターロイキン2で11日間刺激培養したイヌ末梢リンパ球と共培養した実験結果をそれぞれ示している。【００８５】
図9からも明らかなように、1の共培養しない場合はもちろん、2の未刺激のイヌ末梢リンパ球と共培養した場合と比べても、3及び4に示す刺激後のリンパ球と共培養した場合のほうが、ターゲット細胞であるMeWo細胞の生存率を大きく低下させることが分かった（有意差あり、P < 0.05）。このことは刺激したリンパ球が癌の治療に利用できる可能性を示唆している。【００８６】
2.グランザイムB（GrB）のmRNA転写活性に与える影響
コンカナバリンAとインターロイキン2を培地に添加することが、細胞障害活性の指標であるGrBのmRNA転写活性に与える影響について調べた。具体的には、以下の手順で行った。【００８７】
（1）実験方法
まず、1と同様の方法で7日間刺激培養したイヌ末梢リンパ球（Stimulated cPBL）からTrizol reagent (Life Technologies社製)を使用して全RNAを抽出した。【００８８】
つぎに、TaKaRa RNA PCR Kit (TAKARA BIO 社)を使用して、抽出した全RNAからcDNAを合成し、これを鋳型とするPCR反応を行った（RT-PCR法）。ここで、PCR反応条件ならびにイヌGrB遺伝子を増幅するためのプライマー、内部標準であるイヌβ-actin遺伝子を増幅するためのプライマーの合成は、文献（Ito H., et al., Neuromuscul. Disord. 8, 95-110 (1998)）に記載された方法に従って行った。【００８９】
最後に得られたPCR産物を電気泳動して実験対象と比較した。その結果を図10に示す。なお、実験対照には、コンカナバリンAとインターロイキン2を培地に添加せずに4日間培養したイヌ末梢リンパ球（Non-stimulated cPBL）を使用した。【００９０】
（2）実験結果
図10からも明らかなように、コンカナバリンAとインターロイキン2を培地に添加して刺激したリンパ球（Stimulated cPBL）は、実験対象（Non-stimulated cPBL）と比較してGrBの転写量が増大していることが分かった。このことは、コンカナバリンAとインターロイキン2を培地に添加してリンパ球を刺激ながら培養することが、GrBのmRNAの転写量、GrBの発現量を増大させ、リンパ球の細胞障害活性を向上することを示唆している。【００９１】
3.リンパ球移入が細胞障害活性に与える影響
コンカナバリンAとインターロイキン2で刺激したリンパ球を、そのリンパ球の採取元に移入したのち、採取元からリンパ球を再度採取してこのリンパ球の細胞障害活性を測定することにより、刺激したリンパ球の移入が採取元のリンパ球の細胞障害活性に与える影響について調べた。【００９２】
（1）実験方法
それぞれ3匹のイヌ（6才）から採取した3系統（case）から、実施例1と同様の方法によって、イヌ末梢リンパ球を採取した。そして、このイヌ末梢リンパ球を、前記1と同様の方法で7日間刺激培養した。【００９３】
刺激済みイヌ末梢リンパ球を室温、5分間300×gで遠心分離して、デカンテーションにより上清を捨て、細胞の洗浄を行なった。細胞の洗浄を3回行なったのち、洗浄後の細胞を5 mlの生理食塩水に懸濁して細胞製剤を調製した。なお、コンカナバリンAとインターロイキン2で刺激培養していないリンパ球（未刺激イヌ末梢リンパ球）を同様の方法で懸濁した細胞製剤を調製した。【００９４】
前記の細胞製剤をそのリンパ球の採取元であるイヌに移入したのち、その末梢血からリンパ球を採取した。具体的には、第1のグループの場合、採取元のイヌに前記細胞製剤を4週連続（1×108個/頭）で移入し、最終の移入日から2日後に末梢血からリンパ球を採取した。また、第2のグループの場合、採取元のイヌに前記細胞製剤を5週連続（1×108個/頭）で移入し、最終の移入日から2日後に末梢血からリンパ球を採取した。【００９５】
採取したリンパ球をエフェクター細胞とし、ヒトメラノーマ細胞（MeWo細胞）をターゲット細胞として、前記1と同様の方法により共培養して、エフェクター細胞がターゲット細胞に与える細胞障害活性を調べた。その結果を図11に示す。【００９６】
なお、実験対照には、MeWo細胞のみを培養したもの、MeWo細胞を未刺激イヌ末梢リンパ球と共培養したものを使用した。また、図11中の1はMeWo細胞のみを培養した実験対照の実験結果、2はMeWo細胞を未刺激イヌ末梢リンパ球と共培養した実験対照の実験結果、3はMeWo細胞を第1のグループ（4週連続で移入）の刺激済みイヌ末梢リンパ球と共培養した実験結果、4はMeWo細胞を第2のグループ（5週連続で移入）の刺激済みイヌ末梢リンパ球と共培養した実験結果をそれぞれ示している。【００９７】
（2）実験結果
図11からも明らかなように、1の共培養しない場合はもちろん、2の未刺激のイヌ末梢リンパ球と共培養した場合と比べても、3及び4に示す移入したイヌから採取したリンパ球と共培養することによって、ターゲット細胞であるMeWo細胞の生存率を大きく低下させることが分かった（有意差あり、P < 0.05）。このことは、刺激したリンパ球の細胞障害活性が移入後も生体内で維持されていること、を示唆している。【００９８】
実施例5
増殖した細胞による治療効果を調べた。具体的には、この発明の増殖方法によって増殖したαβ型T細胞が含まれる細胞製剤を癌やアカラス症（皮膚病）に罹患した実験動物に投与してその治療効果を調べた。【００９９】
1.癌に対する治療効果
頚部に腫瘍（組織球腫）のできたイヌ（雑種、14才、体重17 kg）から、実施例1と同様の方法によって1 ml細胞懸濁液（細胞密度：1.5×106 cells/ml）を得た。得られた細胞懸濁液を培養ボトル（25 cm2）に移して9 mlの培地を加え（計10 ml）、コンカナバリンAの終濃度が5μg/ml、自己血清の終濃度が5％、インターロイキン2の終濃度が750 U/mlになるように添加した。なお、自己血清は実施例2と同様の方法で調整したものを使用した。【０１００】
その後、培養ボトルを37℃、炭酸ガス濃度5％のCO2インキュベータに配置して細胞の増殖を10日間行なった。この細胞懸濁液を室温、5分間300×gで遠心分離して、デカンテーションにより培地を捨てたのち、細胞ペレットに生理食塩水を加えて細胞を再懸濁し、再度遠心分離して細胞の洗浄を行なった。細胞の洗浄を3回行なったのち、洗浄後の細胞を30 mlの輸液用生理食塩水（大塚製薬社製生理食塩水）に懸濁し、輸血用バッグに詰めて細胞製剤とした。なお、その細胞密度は1.67×106 cells/mlであった。【０１０１】
この細胞製剤を前記腫瘍のできたイヌに対して点滴により1回投与した。その結果を図12に示す。図12（a）は治療前の腫瘍1の写真であり、図12（b）は治療後の腫瘍1の写真である。これらの写真から、腫瘍1が明らかに縮退しており、この発明の治療方法に効果のあることが分かった。【０１０２】
2.アカラス症に対する治療効果
アカラス症に罹患したイヌ（フレンチブルドック、2才、体重12 kg）から、前記1に記載した方法と同様の方法により、細胞製剤を調製した。なお、その細胞密度は1.5×106 cells/mlであった。この細胞製剤を前記のアカラス症に罹患したイヌに対して点滴により1回投与した。その結果を図13及び図14に示す。なお、図13及び図14は同一のイヌの異なる患部の写真である。また、図13（a）及び図14（a）は治療前の患部2、3の写真であり、図13（b）及び図14（b）は治療後の患部2、3の写真である。これらの写真から、治療によって脱毛していた患部2、3が発毛しており、この発明の治療方法に効果のあることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
この発明のLAK細胞の増殖方法は、抗原特異性やMHC拘束性を示すαβ型T細胞を優先的に増殖・活性化することができる。そして、得られたLAK細胞は、MHC拘束性を有するαβ型T細胞の比率が高いため、より効果的な活性化自己リンパ球療法をおこなうことができ、これによって動物の癌、免疫不全症、感染症などの治療にかかる患者の肉体的・経済的負担を少なくすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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