(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光線および脱励起光線、および／または蛍光を発する試料におけるスイッチング光線による、照明中における部分的空間的重なりによって解像度を高めた顕微鏡であって、
試料光が検出され、
脱励起光線またはスイッチング光線が２つの部分光線経路に分割され、
分割された前記２つの部分光線光路を重ね合わせるためのビーム・カップラが前記脱励起光線または前記スイッチング光線に配置され、
前記２つの部分光線経路の非干渉性重なりをもたらすための光路延長が、前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記部分光線光路のうちの一つに配置され、
らせんマスクが前記２つの部分光線光路のうちの一つに配置され、
径方向マスクまたは径方向マスクとらせんマスクとの組み合わせが前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記２つの部分光線光路の他の部分光線光路に配置されている、顕微鏡。
【請求項２】
前記手段が観察対物レンズの瞳面中またはその近傍に存在する、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
走査指令によって試料が走査される、請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記手段を瞳面中に移送するために瞳レンズが設けられている、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
蛍光を発する試料が時間的に相次いで励起光線および脱励起光線および／またはスイッチング光線によって照明され、これらの光線が部分的に空間的に重ねられる、解像度を高めた顕微鏡のための方法であって、
励起放射および／または脱励起放射および／またはスイッチング放射が、これらの空間位相において同時に円形および径方向に影響を受けるようにすること、
脱励起光線またはスイッチング光線を２つの部分光線経路に分割すること、
前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記２つの部分光線光路のうちの一つに配置された光路延長と、前記２つの部分光線光路のうちの一つに配置されたらせんマスクと、前記脱励起光線または前記スイッチング光線の前記２つの部分光線光路の他の部分光線光路に配置された径方向マスクまたは径方向マスクとらせんマスクとの組み合わせとを用いて、前記脱励起光線または前記スイッチング光線において前記２つの部分光線経路の非干渉性重なりがもたらされるようにすることを特徴とする方法。
【請求項６】
走査指令によって試料が走査される、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
光と試料の非線形相互作用に基づき、遠視野における光学的解像度を回折限界解像度より高くする方法が知られている。これに属するものとして、誘導放出抑制による顕微鏡法（ＳＴＥＤ、例えば、特許文献１参照）、基底状態抑制による顕微鏡法（ＧＳＤ、例えば、非特許文献１参照）、および蛍光物質の光学的改変（スイッチング）（例えば、特許文献２参照）がある。
【０００３】
どちらの場合にも、回折限界光学的光分布（脱励起光）を用いて、非線形相互作用により、回折限界励起分布が、小区域からのみ光の放射が実現できるように改変される。この場合、この小区域（有効点像分布関数：ＰＳＦ）を３つの空間方向のすべてに、または横方向のみに制限することができる。ここでＰＳＦの有意の制限は下記の通りである。
【０００４】
１．励起体積の３Ｄ制限
２．焦点深度が拡大される場合の励起体積の横方向制限
この場合、階調度のコントラストに関して効率が低い現況技術は、径方向の急激な位相変化を有する位相マスクの脱励起光の瞳中での使用によって（例えば、非特許文献２参照）、あるいは象限的な急激な位相変化を有する位相マスクによって（例えば、非特許文献３参照）与えられる。
【０００５】
ＳＴＥＤ顕微鏡法でのらせんマスクの使用は、例えば、非特許文献４で提案されている。確かに、らせんマスクの使用は、上述の文献に記載されているように、すべての空間方向で制限された励起分布をも、以下に記載されるような、拡大された焦点深度を有する励起分布をも生じない。
【特許文献１】米国特許第５７３１５８８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０２１２７９９号明細書
【特許文献３】米国特許第５８６６９１１号明細書
【非特許文献１】ヘル（Ｈｅｌｌ）およびクルーグ（Ｋｒｏｕｇ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０（１９９５）、４９５〜４９７
【非特許文献２】テー・アー・クラール（Ｔ．Ａ．Ｋｌａｒ）、エス・ヤーコプス（Ｓ．Ｊａｋｏｂｓ）、エム・ディーバ（Ｍ．Ｄｙｂａ）、アー・エーグナー（Ａ．Ｅｇｎｅｒ）、およびエス・ヴェー・ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｌ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．９７、８２０６（２０００）
【非特許文献３】イー・エンジェルら（Ｅ．Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ７７、１１−１７（２００３）
【非特許文献４】ピー・テレク（Ｐ．Ｔｏｒｏｋ）およびピー・アール・ティー・マンロウ（Ｐ．Ｒ．Ｔ．Ｍｕｎｒｏ）、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒ．１２（２００４）、３６０５
【非特許文献５】エス・ヴェー・ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）およびエム・クルーグ（Ｍ．Ｋｒｏｕｇ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０（１９９５）４９５
【非特許文献６】エス・ハブチら（Ｓ．Ｈａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２、９５１１（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、対応する分布を比較的簡単にかつ（分布の階調度のコントラストによって与えられる）より高い効率で生み出す方法を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、独立請求項に記載の特徴によって解決される。好ましいさらなる実施形態は従属請求項の対象である。
多くの点源の重ね合わせによる分布の作成（特許文献３参照）に比べて、下記の解決策は明らかにより簡単である。その上、多くの効率的な３Ｄ制限が可能である。
【０００８】
本発明によって下記のことが実現される。
１．励起：従来のＰＳＦ
脱励起：瞳中にらせん位相を有する分布と瞳中に径方向位相を有する分布の非干渉性重なり
２．励起：従来のＰＳＦと瞳中に径方向位相を有するＰＳＦの非干渉性重なり
脱励起：瞳中にらせん位相を有する分布とらせん位相＋径方向位相を有する分布の重なり
図３は、径方向マスク（ａ）、らせんマスク（ｂ）、および径方向マスクとらせんマスクの組合せ（ｃ）を示し、この組合せは（ａ）と（ｂ）の直列配列、または完成したグレイ値設計と考えることができる。
【０００９】
ここで、位相値はグレイ値符号化される（白＝０、黒＝２π）。
ｒ＜ａ／√２の場合、Ｒ（ｒ）＝ｅｘｐ（−ｊπ）
Ｓ（φ）＝ｅｘｐ（−ｊφ）
ＳＲ（ｒ，φ）＝Ｒ（ｒ）＋Ｓ（φ）
ただし、ｒ：瞳中における径方向座標、φ：瞳中における角座標（α：瞳の半径）
以下の装置は、励起光線と脱励起光線を区別し、例えば短いパルスを使用したＳＴＥＤに関係する。この場合、現況技術から知られているように、まず励起が起こり、その後時間遅延を伴って誘導放出によって脱励起が起こる。励起された状態に留まっている分子は、蛍光を放出しながら緩和し、この蛍光が検出される。
【００１０】
しかし、これらの装置は、ａ）基底状態抑制（例えば、非特許文献５参照）、またはｂ）色素のスイッチング（特許文献２参照）にも高解像度のための他の方法にも使用される。ａ）では、まず励起の繰返しによって色素は三重項状態になり、そのために脱励起光線が利用される。次いで、色素の基底状態に留まっている部分が脱励起光線によって励起され、蛍光が検出される。ｂ）では、脱励起光線によって分子がスイッチングされ、これによって蛍光を発しない状態に移行する。続いて、励起光線によって分子の励起が起こり、その際、蛍光を発する状態に留まっている分子は蛍光を発することができ、その蛍光が検出される。どちらの場合も、励起光線および脱励起光線に（ＳＴＥＤの場合のように）パルス光を使用する必要はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図１において、励起ＡＮは、通常のＰＳＦ、例えば点像スキャナにより、瞳レンズＰＯ、スキャナＳＣ、および対物レンズＯを経て試料ＰＲの方向に生じる。
脱励起光線経路ＡＢは、ビーム・スプリッタＳＴによって２つの光線に分割される。遅延ＤＬを有する一方の脱励起光線経路（この場合、延長の長さは、場合によっては光伝送ファイバを介し、使用されるレーザのコヒーレンス長を上回る）は、らせんマスクＳＭを含み、他方の脱励起光線経路は、径方向マスクＲＭを含む。この場合、遅延ＤＬは、ビーム・カップラＳＶの背後で両部分光線の非干渉性重なりをもたらす。瞳レンズＰＯを介して、マスクが対物レンズの瞳中またはその近傍に結像される。
【００１２】
図２には、図１と同様の脱励起光線経路ＡＢが示されており、この場合、径方向マスクＲＭが組合せマスクＲＭ／ＳＭで置き換えられている。励起光線経路ＡＮもまたビーム・スプリッタＳＴ２によって２つの光線経路に分割される。光路延長による遅延ＤＬを有する部分光線経路には径方向マスクＲＭがあり、このマスクは対物レンズの瞳中またはその近傍に結像される。この遅延ＤＬは、ビーム・カップラＳＶ２の背後で部分光線の非干渉性重なりをもたらす。
【００１３】
遅延はレーザ源のコヒーレンス長よりも大きくなるはずであり、これは高干渉性レーザの場合にはファイバによって達成することだけが有意義である。非干渉性重なりの別の可能な達成方法は、（蛍光（ＧＳＤ）／スイッチング用励起スペクトル内、あるいは放出スペクトル（ＳＴＥＤ）内で）波長が僅かに異なる光を使用することにある。これは特にＣＷレーザの場合に好ましい実施形態である。すなわち、例えばタンパク質ドロンパのスイッチングおよび励起のために、４８８ｎｍの光も４７７ｎｍの光も利用することができる。したがって、装置１における脱励起光線経路ＡＢでは、４８８ｎｍの光をらせんマスクＳＭによって、４７７ｎｍの光を径方向マスクＲＭによって形成することができ、適切な二色性ビーム・スプリッタを使用してこれらを組み合わせることができる。装置２における励起光線経路ＡＮおよび脱励起光線経路ＡＢについても同様なことが言える。
【００１４】
瞳の結像は、対物レンズの瞳面中に静止した位相分布を作り出すはずである。
試料相互作用の種類とは無関係に、励起光線と脱励起光線は通例、時間的に相次いで試料に当たる。脱励起光線によって試料が「準備され」、続いて準備された状態が励起光線によって「感知され」（ＧＳＤおよびスイッチング）、あるいは時間的に遅延した脱励起光線によって励起が改変される（ＳＴＥＤ）。これによって、励起光線と検出光線の非干渉性重なりが保証される。
【００１５】
さらに、横座標（水平）に沿った断面および軸座標（垂直）に沿った断面がそれぞれ図示され、その際、分布は軸方向（光学）軸に関して回転対称である。
図４は、図１の第１の例示的実施形態による脱励起およびその実施例において生じる分布を示す。
【００１６】
脱励起放射が存在しない領域の三次元制限が焦点（図１における対物面ＰＲ）（図４ｃの中央）に出現することに注目されたい。
図５は、図２による脱励起の場合に生じる分布を示す。
【００１７】
対物面ＰＲ（５ｃ）において、軸方向に延び横方向に制限された領域が出現し、そこでは脱励起放射は存在しないことに注目されたい。
図６は、図２における励起の分布を示す。
【００１８】
図６ｃ）では、対物面ＰＲにおいて通常のＰＳＦ（図６ｂ）に比べて長く延びる励起光分布が生じることに注目されたい。
シミュレーション結果
スイッチオフのために使用されるＰＳＦｓ（式（１）では１に正規化されていると仮定する）は、次式に対応する色素の励起可能性（または励起）の低減を招く。
【００１９】
Ａ（ｘ，ｙ，ｚ）＝ｅｘｐ｛−σ・Ｄ・ＰＳＦｓ（ｘ，ｙ，ｚ）｝          （１）
ただし、σはスイッチング（または脱励起）の作用断面積であり、Ｄは面積あたりの照射エネルギーを表す。したがって、励起からＰＳＦａによって生じる全ＰＳＦは以下のようになる。
【００２０】
ＰＳＦ（ｘ，ｙ，ｚ）＝Ａ（ｘ，ｙ，ｚ）・ＰＳＦａ（ｘ，ｙ，ｚ）        （２）
以下に、スイッチング可能なタンパク質ドロンパの場合のＰＳＦを通るｘ−ｚ断面を示す（横方向＝水平、軸方向＝垂直）。この場合、スイッチオフの作用断面積は０．０７ｃｍ２／ｍＷ／ｓと仮定する（非特許文献６参照）。そうすると、３Ｗ／ｃｍ２ｓ（すなわち、例えば１μｍ２の上に１０μｓの間に３ｍＷが集束する）の照射エネルギーの場合、従来のＰＳＦ（図７ｃ）に比べて、実施例２（図５ｃに対応する脱励起および図６ｃに対応する励起を有する）では図７ａの分布が、実施例１（図４ｃに対応する脱励起および図６ｂに対応する励起を有する）では図７ｂの分布が生じる。
【００２１】
さらに、比較のために、現況技術による、すなわち脱励起光線経路に径方向の急激な位相変化を有するマスク（図８ａ）を、あるいは、らせんマスク（図８ｂ）を有する場合に同じ状況で得られる分布を示す。８ａの場合には、ＰＳＦの軸方向の制限はあるが受入れ可能な横方向の制限が得られないことが、明らかに認められる。その結果、解像度は軸方向でのみ有意に改善される。８ｂの場合も、解像度がもっぱら横方向でのみ改善されることに関して同様なことが言える。図７ａの場合とは対照的に、この場合も焦点深度の適用可能で重要な拡大は存在しない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】励起光線経路および脱励起光線経路を示す図。
【図２】組合せマスクを含む励起光線経路および脱励起光線経路を示す図。
【図３】径方向マスク、らせんマスク、および組合せマスクを示す図。
【図４】ａは脱励起の第１の例示的実施形態における径方向マスクによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｂは脱励起の第１の例示的実施形態におけるらせんマスクによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｃは脱励起の第１の例示的実施形態における図４ａと図４ｂの非干渉性重なりによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図。
【図５】ａは脱励起の第２の例示的実施形態における径方向マスクによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｂは脱励起の第２の例示的実施形態におけるらせんマスクによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｃは脱励起の第２の例示的実施形態における図５ａと図５ｂの非干渉性重なりによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図。
【図６】ａは励起の第２の例示的実施形態における径方向マスクによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｂは励起の第２の例示的実施形態におけるマスクのない対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図、ｃは励起の第２の例示的実施形態における図４ａと図４ｂの非干渉性重なりによる対物レンズ面での有効点像分布関数を示す図。
【図７】ａはタンパク質ドロンパを使用した場合の、実施形態２の図５ｃに対応する脱励起および図６ｃに対応する励起を有する分布を示す図、ｂは実施形態１の図４ｃに対応する脱励起および図６ｂに対応する励起を有する分布を示す図、ｃは従来の分布を示す図。
【図８】ａは脱励起光線経路中に径方向の急激な位相変化を有するマスクがある、現況技術による分布を示す図、ｂは脱励起光線経路中にらせんマスクがある、現況技術による分布を示す図。
【符号の説明】
【００２３】
ＡＮ：励起光線経路、ＡＢ：脱励起光線経路、ＤＥ：検出器、ＳＣ：スキャナ、Ｏ：対物レンズ、ＳＴ：ビーム・スプリッタ、ＳＶ：ビーム・カップラ、ＰＯ：瞳レンズ、ＤＬ：光路延長による遅延、ＳＭ：らせんマスク、ＲＭ：径方向マスク、ＰＲ：試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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