(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血を試料とし、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である１，５−アンヒドログルシトールの測定方法において、
（１）全血と、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換し、
（２）引続いて、血球分離濾過材を用いて血球の分離を行ない、
（３）次いで、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である１，５−アンヒドログルシトールの測定を行う
ことを特徴とする、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項２】
全血が２０μＬ以下である請求項１記載の血中成分の測定方法。
【請求項３】
血球分離濾過材が、ガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、微多孔性材料、高分子材料またはそれらを組合せた部材である請求項１記載の血中成分の測定方法。
【請求項４】
グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質が、グルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化に使用する物質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法。
【請求項５】
変換する物質が、ホスホエノールピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、アセチルリン酸、ピルビン酸、３−ホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、アデノシン−５'−二リン酸、アデノシン−５'−三リン酸、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸からなる化合物群から選ばれる１つ以上の化合物を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血を使用し、全血と、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質とを接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことを特徴とする血中成分の測定方法、該測定方法に使用するデバイス及び該デバイスを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  血液中の電解質、蛋白、非蛋白性窒素化合物、糖、脂質、酵素等の測定は生化学検査とよばれ、病気の診断・治療・予防のための重要な検査である。検査試料となる血液中には測定対象以外にも極めて多くの物質が内在しており、対象物の測定に干渉しこれを妨害することが多い。このため、妨害の回避剤等で検体を処理した後に検査対象物を測定する手法が取られる。この際、採取した全血を遠心分離機等の使用により、予め血漿または血清とするのが普通であるが、これは、全血を試料として測定干渉成分の消去または変換が必要な血液成分分析を行うと、血球等の細胞成分の影響を受けたり、溶血により血球分離が困難となったり、血球中に多量に存在するペルオキシダーゼ活性を有するヘモグロビン等により測定に支障をきたす等の理由による。【０００３】  近年、食生活が豊かになるのに伴い糖尿病患者が増大している。糖尿病患者の合併症発症を予防するためには血糖値を健常者に近いレベルに保つ必要があり、患者自身が自宅で測定する自己血糖測定装置が普及している。しかし、血糖は食事により変動するため、頻回に測定する必要があり患者の負担が大きく、測定値の的確な解釈も知識の乏しい患者自身では容易ではない。  一方、１，５−アンヒドログルシトールは食事の影響を受けず、糖尿病患者については過去１週間の血糖コントロール状態を把握するのに最も優れたマーカーであり、家庭で「１週間に１回」測定するだけで血糖コントロール状態が正確に把握できる１，５−アンヒドログルシトール自己測定キットができれば患者にとって大きなメリットである。また、集団検診においても有用である。しかしながら、１，５−アンヒドログルシトールの血中濃度は血糖に比べ極めて低く、また、その測定において血糖、即ちグルコースが測定に干渉するため、微量の全血をそのまま試料として用いるものも含めて自己測定キットは実現していない。  また、血球中の細胞内液には高濃度にグルコースが存在し、細胞膜で隔てられた細胞外液と平衡を保っており、細胞外液中のグルコースを測定に干渉しない物質へ変換すると血球中の細胞内液にあるグルコースが細胞膜を通過して放出され、測定を妨害する。【０００４】  測定干渉成分の消去または変換が必要な血液成分分析の例としては以下のような文献がある。特許文献１は全血から血球を分離した後に、アスコルビン酸オキシダーゼにより測定干渉成分であるアスコルビン酸を消去し、クレアチニンを測定している。【０００５】  特許文献２、３及び４には検体として全血ではなく血清を用い、特許文献２はソルビトールを、特許文献３はマンノースを、特許文献４はミオイノシトールを測定している。いずれの場合も測定干渉成分であるグルコースを前処理で消去または変換している。【０００６】  測定対象が１，５−アンヒドログルシトールの場合については特許文献５、６、７及び８等に記載されているが、検体は全血ではなく血清である。特許文献５ではグルコースオキシダーゼによりグルコースを酸化し、更にヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼによりグルコースをリン酸化することにより、特許文献６ではグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼによりグルコースを酸化することにより、特許���献７または８では、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼ、または、グルコースイソメラーゼ、フルクトキナーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼによりグルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換することによりグルコースの変換を行っており、その後で１，５−アンヒドログルシトールの測定を行っている。因みに、これらの文献中でグルコースは、グルコノ−１，５−ラクトン、グルコース−６−リン酸、グルコン酸、フルクトース−６−リン酸やフルクトース等に変換されている。【０００７】  これらの血液成分の測定においては、全血を直接試料としておらず、また、血球分離操作には遠心分離機の使用や大量の血液が必要であり、処理工程数も多くなっている。  また、特許文献１には外部操作によって部材を結合させるデバイスが記載されている。【０００８】
【特許文献１】特公平０７−３６７５６号公報
【特許文献２】特開平０８−２９８９９６号公報
【特許文献３】特開２００１−１９７９００号公報
【特許文献４】特開２００１−１９０２９９号公報
【特許文献５】特許第２９８３０１５号公報
【０００９】
【特許文献６】特開２００１−７８７９７号公報
【特許文献７】特許第３１７０３２０号公報
【特許文献８】特許第３２１７１８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  ところが、最近、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇと言われるベッドサイドあるいは診察室での迅速測定や患者自身による家庭での測定が行われるようになってきた。その際には遠心分離機等の使用は難しく、全血をそのまま検査試料として用いることのできる測定方法が望まれている。特に患者自身による家庭での測定においては、穿刺器具を用いて採取される数十マイクロリットル以下の微量な血液が試料であり、遠心分離機を使用して血清を得る測定方法は行うことができない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血を試料として用い遠心分離機等を使用することなく血球の分離を行なう血中成分の測定方法を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】  即ち、本発明は（１）グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血と、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことを特徴とする血中成分の測定方法；（２）全血が２０μＬ以下である上記（１）記載の血中成分の測定方法；（３）血球の分離を血球分離濾過材にて行なうことを特徴とする上記（１）または（２）に記載の血中成分の測定方法；【００１３】（４）血球分離濾過材が、ガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、微多孔性材料、高分子材料またはそれらを組合せた部材であることを特徴とする上記（３）記載の血中成分の測定方法；（５）グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質が、グルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化に使用する物質である上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法；（６）変換する物質が、ホスホエノールピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、アセチルリン酸、ピルビン酸、３−ホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、アデノシン−５'−二リン酸、アデノシン−５'−三リン酸、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸からなる化合物群から選ばれる１つ以上の化合物を含有することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法；【００１４】（７）血中成分が１，５−アンヒドログルシトールである上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法；（８）上記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法に使用し、血球分離部と検出部を有することを特徴とするデバイス；（９）血球分離部と検出部が測定前には非接触状態にあり、両部を接触させて検出定量を行う上記（８）記載のデバイス；（１０）検出部が試薬を塗布した電極を使用する検出部である上記（８）記載のデバイス；（１１）血中成分が１，５−アンヒドログルシトールである上記（８）〜（１０）のいずれか一項に記載のデバイスと、血液採取のための穿刺器具を含む測定キット；に関する。
【発明の効果】
【００１５】  グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血と、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことにより、全血中の血球等の細胞成分の影響を受けず、また測定の支障となる溶血を起すことのない測定が可能で、更に遠心分離機等を使用しないため測定が簡便となり、測定デバイスや測定キットの構成が簡略化されコスト低減も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下、本発明について詳細に説明する。  本発明は、グルコース及び／またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血と、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことを特徴とする血中成分の測定方法である。【００１７】  本発明が適用される全血とは、赤血球を分離していない採血した状態のままの血液であり、採血用の採血管等に含まれるヘパリン、フッ化ナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤等を含んでいてもよい。なお、保存した血液の場合には、フッ化ナトリウムとヘパリンを含有する採血管で採血したものが好ましい。  また、本発明の全血には採血管等を使用せずに、自己血糖測定に用いられる穿刺器具等により採血した血液等も含まれる。  採血部位も指先のほか、前腕外側や腹壁または上腕外側等特に制限はない。  本発明の測定方法は、少量の全血であっても血中成分の測定が可能であり、例えば、３〜５０μＬ、好ましくは３〜２０μＬあればよい。【００１８】  本発明の測定方法により測定される全血中の血中成分としては、例えば、１，５−アンヒドログルシトール、ソルビトール、マンノースまたはミオイノシトール等が挙げられるが、そのような糖類や糖アルコールでなくとも、全血測定においてグルコース及び／またはその誘導体が測定に干渉するような測定対象物であればよい。【００１９】  本発明におけるグルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質とは、目的とする血中成分の測定に影響を与えなければ特に限定されず、例えば、前記の特許文献２〜特許文献８に記載のグルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質が挙げられ、好ましくはグルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化に使用する物質が挙げられ、例えば、下記のグルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化の説明にある物質でもよい。本発明におけるグルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質は、浸透圧等の作用により血球細胞を収縮や凝集させてヘマトクリット（血液の粘度）を低下させ、全血から血球の分離を促進し、より少ない全血からより多くの血漿や血清が得られるような物質、例えば、ホスホエノールピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、アセチルリン酸、ピルビン酸、３−ホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、アデノシン−５'−二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン−５'−三リン酸（ＡＴＰ）、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ（Ｈ））からなる化合物群から選ばれる１つ以上の化合物を含むものである。【００２０】  上記のグルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化とは、例えば、グルコースオキシダーゼによりグルコースを酸化する方法、グルコースデヒドロゲナーゼにより補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下にグルコースを酸化する方法、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼによりグルコースをリン酸化し、生成し���グルコース−６−リン酸を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、補酵素ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋の存在下に酸化する方法、アデノシン−５'−二リン酸やアデノシン−５'−三リン酸の存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換する方法やヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）やヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の存在下、グルコースイソメラーゼ、フルクトキナーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換する方法等が挙げられる。【００２１】  上記変換に使用する酵素としては、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でグルコースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．４、グルコースデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．４７、ＥＣ１．１．１．１１８、ＥＣ１．１．１．１１９、ＥＣ１．１．９９．１０、ヘキソキナーゼ：ＥＣ２．７．１．１、グルコキナーゼ：ＥＣ２．７．１．２；ホスホヘキソースイソメラーゼとして、グルコース−６−ホスフェートケトールイソメラーゼ：ＥＣ５．３．１．９、グルコースイソメラーゼ：ＥＣ５．３．１．１８、フルクトキナーゼ：ＥＣ２．７．１．４；６−ホスホフルクトキナーゼとしてホスホヘキソキナーゼ：ＥＣ２．７．１．１１と分類されるものであれば特に制限はなく、市販のものも使用し得る。【００２２】  また、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼによりグルコースを酸化する方法においては、生成するグルコノ−１，５−ラクトンを完全にグルコン酸に変換するためグルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）を使用することも可能であり、必要に応じてムタロターゼ（ＥＣ５．１．３．３）と組み合わせてもよい。ヘキソキナーゼは、ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、特にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等であっても何ら問題ない。【００２３】  本発明の測定方法においてグルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化として好ましくは、ヘキソキナーゼによるグルコースをリン酸化する方法であり、特に好ましくは、例えば、マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸キナーゼの存在下でヘキソキナーゼによって行われる酵素サイクリング法による方法である。【００２４】  本発明の測定方法において血球の分離とは、主に赤血球の分離であるが、好ましくは前述のＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ等のベッドサイドあるいは診察室での迅速測定や患者自身による家庭での測定に適しており、極めて微量の全血測定において特に有効である血球分離濾過材を使用する血球分離方法が挙げられる。血球分離濾過材としては、血球を分離できれば特に限定されず、公知の濾過材を用いることができ、例えば、ガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、微多孔性材料、高分子材料等やそれらを組合せた部材が挙げられる。  ガラス繊維濾紙は密度が０．０２〜０．０９程度で、保留粒子径が１〜５μｍ程度が好ましい。ガラス繊維の表面を、親水性高分子、糖結合タンパク質のレクチンや両親媒性脂質のレシチンやフォスファチジルコリン等で処理して用いてもよい。【００２５】  セルロース濾紙とは特に限定されず、通常使用されている濾紙が挙げられる。  微多孔性材料としては、微多孔性膜や微多孔性担体等が挙げられ、高非対称構造のそれらも使用可能である。微多孔性膜としては、例えば、ポリスルホン膜、フッ素含有ポリマー膜等がある。微多孔性担体としては、例えば、ナノ・マイクロ粒径のゲルやマイクロスフィア（ビーズやラッテクス等）等があり、それらのベース基材は、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（ヒドロキシメタクリレート）、ポリビニルアルコール等のポリマーやシリカ等である。微多孔性材料は、酸素プラズマ処理等の活性処理を表面に施すことにより親水化して使用してもよい。【００２６】  高分子材料とは、好ましくは親水性の高分子材料であり、例えば、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アガロース、ポリアクリル酸、無水マレイン酸の重合体、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリリジン、ポリスチレンスルホン酸等が挙げられ、上記のガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、微多孔性材料に含ませて表面を親水化したり、ポリイオン複合膜のようにそれ自身で膜を形成させて用いてもよい。【００２７】  上記血球分離濾過材は単独で使用してもそれらを組合せた部材として用いてもよい。  また、上記血球分離濾過材は、穿刺器具内に充填して用いても、下記の検出に使用する電極等に直接あるいは検出に使用される電極上の酵素等の層を挟んで塗布して形成される膜状部材として用いてもよい。【００２８】  本発明におけるグルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質と全血の接触は、血球の分離前に両者を混合することによって行っても、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を血球分離濾過材に担持させて行ってもよい。また、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質の一部が担持されており、添加される試料に含まれる物質とともに、グルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換される場合も本発明に含まれる。【００２９】  本発明の血中成分の測定方法において、血中成分を検出する方法としては特に制限はなく、通常の生化学検査で行われている吸光度法や電極等を用いる電気化学検出法等が挙げられるし、免疫化学検査で行われている化学発光法や電気化学発光法等も挙げられる。【００３０】  本発明の測定方法を適用する血中成分が１，５−アンヒドログルシトールである場合について、更に説明する。１，５−アンヒドログルシトールを測定する方法としては公知の方法が挙げられ、例えば、電子受容体の存在下、１，５−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素を作用させ、反応後の酸素の消費量や電子受容体の還元体若しくは反応生成物を定量する方法；電子受容体の非存在下、還元性発色剤を直接還元する反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを用いて定量する方法等がある。また、１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸化酵素によって１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換し、酸化型補酵素の存在下、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド���ゲナーゼによって脱水素し、その反応で生成した成分または減少した成分を定量する方法であってもよい。【００３１】  １，５−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素としては、例えば、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法で、ピラノースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１０、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１１と分類される酵素等が挙げられる。具体的には例えば、特開昭６３−１８５３９７号等に記載のポリポラス  オブツサス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２６７３３の産生するピラノースオキシダーゼ、トラメテス  サングイネア（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅａ）ＩＦＯ４９２３の産生するＬ−ソルボースオキシダーゼ、特開昭６２−７９７８０号公報に記載のシュードモナス属ｓｐ．ＮＫ−８５００１の産生する酸化酵素、特開平２−２６８６７９号公報に記載のオイペニシリウム  クルスタセウム  ＩＦＯ−８９３８等の真菌の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許２８７２９８３号公報記載の電子受容体を介さずに１，５−アンヒドログルシトールを脱水素化できるアグロバクテリウム  ツメファシエンスＮＴ１１３０株の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。【００３２】  更に、１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換する際の方法や酵素は、グルコースを消去または変換する際に先に挙げたヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼによりグルコースをリン酸化するための方法や試薬がそのまま使用できる。具体的に使用される酵素は、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼである。ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとしては、特開２００２−１８６４９７号公報記載のピロコッカス  フリオサス  ＤＳＭ３６３８菌株が産生する酵素が挙げられる。１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとしては、特開平１０−１９１９９８号公報記載のエッシェリヒア  コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）が産生する酵素が好ましい。  また、市販の１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール測定用試薬（ラナ１，５ＡＧオートリキッド；日本化薬（株）製）の酵素を使用することもできる。【００３３】  更に、１，５−アンヒドログルシトールを定量するために検出する方法は特に制限されず、吸光度法、電気化学検出法、化学発光法や電気化学発光法等を使用し得る。  例えば、吸光度検出に使用する発色基質は酸化型発色基質の場合、単独で用いられる色源体にはＮ−カルボキシメチルアミノカルボニル−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ６４）、１０−カルボキシメチルアミノカルボニル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ６７）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−カルボキシエチルアミノフェニル］アミン、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン  ヘキサナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられ、カップリング色源体には、カップラーに４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）やアミノジフェニル系化合物（ＮＣＰ）、トリンダー試薬にＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）等が挙げられる。また、還元型発色基質の場合、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、３，３'−［３，３'−ジメトキシ−（１，１'−ビフェニル）−４，４'−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ＮＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  １ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  １ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。【００３４】  電気化学検出法に使用する電極は、例えば、金、白金、カーボン、パラジウムまたは銀等が挙げられ、測定方法についてもアンペロメトリー法（電流測定方法）、クーロメトリー法（電量測定方法）、電位スイープ法やサイクリックボルタンメトリー法等が挙げられる。また、当然のことながら電子の授受の仲立ちを担う電子メディエータを使用してもよく、酸化型メディエータ、還元型メディエータどちらも使用できる。中でも好ましくは酸化型メディエータであり公知の化合物を使用できるが、例えば、フェリシアン化物、キノン化合物、オスミウム（III）錯体またはそのポリマー体等が好ましい。【００３５】  更に、ＡＤＰの存在下、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、グルコースをグルコース−６−リン酸に、１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換し、グルコース−６−リン酸はホスホグルコイソメラーゼ（ホスホヘキソースイソメラーゼ）及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させ、フルクトース−１，６−二リン酸に変換し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸は、補酵素ＮＡＤ＋あるいはＮＡＤＰ＋の存在下、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて測定する方法も本発明の測定方法に使用可能である。【００３６】  本発明には前記血中成分の測定方法に使用し得る、血球分離部と検出部を有するデバイスも含まれる。前記の血球分離を行うのが血球分離部であり、前記の血中成分の検出を行うのが検出部である。デバイス中のそれらの配置は垂直であっても水平であってもよく、それらは接していても接していなくてもよい。接していない場合��検出時に接触できる形態であればその形態や配置には特に制限はなく、例えば、両部の全面が接触していなければ、血球分離部と検出部が完全に分離していても、一部片端若しくは両端が接続されていてもよい。検出時に接触できるとは、試料添加後、グルコース及び／またはその誘導体の該測定に干渉しない物質への変換や血球分離に要する時間の後で検出定量を行うために、自動でも手動でも接触させればよい。簡便な測定においては試料添加後、数秒から数分が望ましい。血球分離部と検出部との接触は全面でもあってもその一部であってもよい。  また、血球分離部と検出部が接している場合には、予め血球分離前に全血とグルコース及び／またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させてもよい。【００３７】  検出部は前記のように吸光度法、電極等を用いる電気化学検出法、化学発光法や電気化学発光法等による各検出方法に基づく構成であればよい。【００３８】  本発明のデバイスの一例示として図１、図２に簡略図を示す。【００３９】  本発明には前記デバイスと血液採取のための穿刺器具を含む１，５−アンヒドログルシトール用測定キットも含まれる。  穿刺器具としては数十μＬ以下程度の全血を採取できれば特に限定されず、自己血糖測定装置に付けられている穿刺器具と同じであってもよい。
【実施例】
【００４０】  以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４１】実施例１１）グルコース変換試薬  ２５．０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．５）に、７．３８ｍＭのＭｇＣｌ２、４９．６ｍＭのＫＣｌ、２４．０ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１．０ｍＭのＡＴＰ、１０Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、８Ｕ／ｍＬのグルコースリン酸化酵素、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジオキシ四酢酸２ナトリウム塩）、０．１％のＮａＮ３、０．６ｇ／ＬのＢＳＡ（牛血清アルブミン）、０．０５％のノニオンＨＳ２１０（界面活性剤；日本油脂（株）製）、０．１ｍＭのフェロシアン化カリウム、５Ｕ／ｍＬのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の組成となるように各成分を溶解した後、ｐＨ７．５に調整してグルコース変換試薬を調製した。【００４２】２）発色試薬  ８ｍＭのＮＣＰ−０４（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン）、８ｍＭのＴＯＯＳの組成となるように各成分を７０％（ｖ／ｗ）エタノールに溶解して、発色試薬を調製した。【００４３】３）酵素試薬  ５００Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素、５００Ｕ／ｍＬのＨＲＰの組成となるように各成分を１．０Ｍのリン酸緩衝液に溶解した後、ｐＨ７．５に調整して酵素試薬を調製した。【００４４】４）酵素発色試験紙  上記の２）発色試薬に、バイオダインＡメンブレン（ＰＡＬＬ製）１０ｍｍｘ４５ｍｍを室温で１０分間浸して、５０℃で２０分乾燥した。次に、上記の３）酵素試薬に、そのメンブレンを冷蔵で１晩浸して、同様に５０℃で２０分乾燥した。  ５ｍｍｘ５ｍｍ片に裁断して酵素発色試験紙を得た。【００４５】５）デバイス  図１に示すように、支持体４（白色ＰＥＴ５ｍｍｘ５０ｍｍ）の接着面に、その左端に合わせて血球分離部３（血球分離用のＰＡＬＬ製ヘマセップＬ５ｍｍｘ１６ｍｍ）を貼り合わせた。一方、上記の酵素発色試験紙を検出部１として検出部支持体２（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．製ＡＲｃａｒｅ８１９２透明ＰＥＴ５ｍｍｘ４０ｍｍ）の接着面に、その左端に合わせて貼り合わせた。最後に検出部１の全面と血球分離部３の右端が重なるように、支持体４（白色ＰＥＴ５ｍｍｘ５０ｍｍ）の接着面に検出部支持体２を貼り付けることで、デバイスを作製した。【００４６】６）検量線作成  １，５−アンヒドログルシトール検量線作成用に濃度既知の全血３検体（後記の参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は８．９、１８．５、２８．５μｇ／ｍＬであった）各１５μＬとグルコース変換試薬１５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、図１の血球分離部３の検体添加位置部分に反応液１５μＬを滴下し、血球分離した血漿が、検出部１（酵素発色試験紙）が接触できる血球分離部３の部位に届いたら検出部１を押し付け、６０秒後に反射光度計（測色色差計ＳＵＰＥＲ  ＣＯＬＯＲ  ＳＰ−８０；（有）東京電色製）で吸光度を測定した。吸光度と１，５−アンヒドロ���ルシトール濃度から検量線を作成した。【００４７】７）測定操作  １，５−アンヒドログルシトールを測定する健常人６名の全血１５μＬをそれぞれグルコース変換試薬１５μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、図１の血球分離部３の検体添加位置部分に反応液１５μＬを滴下し、血球分離した血漿が、検出部１（酵素発色試験紙）が接触できる血球分離部３の部位に届いたら検出部１を押し付け、６０秒後に反射光度計で吸光度を測定した。検量線を用い、６検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた結果を表１に示す。【００４８】  参考例１  実施例１の７）で測定したのと同じ健常人６名の全血検体を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、その上清を常法である１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール測定用試薬（ラナ１，５ＡＧオートリキッド；日本化薬（株）製）と自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）にて、以下のパラメータで１，５−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表１に示す。分析法                          ２ポイントエンド測定ポイント                    ２４−５０検体量                              ８μＬラナ１，５ＡＧオートリキッドの前処理液（Ｒ１）                ２４０μＬラナ１，５ＡＧオートリキッドの発色液（Ｒ２）                  １２０μＬ温度                            ３７℃測定波長（副／正）              ７００／５４６ｎｍ【００４９】  ［表１］                    １，５−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）                            参考例１              実施例１  全血検体１                １５．１              １５．７  全血検体２                １９．９              ２０．２  全血検体３                ２５．１              ２６．０  全血検体４                １５．４              １４．７  全血検体５                ２１．３              ２０．４  全血検体６                １７．５              １７．３【００５０】  全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離し、更に検出試薬と接触させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値は公知の測定方法による参考例１の測定値とよい一致を示し、本発明により１，５−アンヒドログルシトールの測定ができることを示している。【００５１】実施例２１）グルコース変換試薬  １０．０ｍＭの２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液に、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、９７Ｕ／ｍＬのヘキソキナーゼ、２０Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素の組成となるように各成分を溶解した後、ｐＨ７．０に調整してグルコース変換試薬を調製した。【００５２】２）電極試薬  １６ｍｇ／ｍＬのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）２Ｃｌ］Ｃｌ２）、４６５．２Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素の組成となるように各成分を精製水に溶解して、電極試薬を調製した。【００５３】３）センサーチップ  上記の２）電極試薬４μＬをカーボン電極の検出部１に塗布して、５０℃で１３分乾燥して、センサー���ップを作製した。【００５４】４）デバイス  図２に示すように、センサーチップの検出部１に血球分離部３（血球分離用のＰＡＬＬ製ヘマセップＬ５ｍｍｘ１５ｍｍ）の最端部が覆うように貼り付けることで、デバイスを作製した。【００５５】５）検量線作成  １，５−アンヒドログルシトール検量線作成用に濃度既知の全血３検体（前記の参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は９．４、１８．６、４２．６μｇ／ｍＬであった）各２０μＬとグルコース変換試薬１０μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、図２の血球分離部３の検体添加位置部分に反応液２０μＬを滴下し、血球分離した血漿が検出部１（電極試薬）に到達してから８０秒後に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器（ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定した。電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。【００５６】６）測定操作  １，５−アンヒドログルシトールを測定する健常人４名の全血２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、図２の血球分離部３の検体添加位置部分に反応液２０μＬを滴下し、血球分離した血漿が検出部１（電極試薬）に到達してから８０秒後に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。検量線を用い、４検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた結果を表２に示す。【００５７】  参考例２  実施例２の６）で測定した時と同じ全血検体を参考例１と同様の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表２に示す。【００５８】  ［表２］                    １，５−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）                            参考例２              実施例２  全血検体７                １７．５              １８．２  全血検体８                ２４．４              ２４．５  全血検体９                ２８．２              ２６．８  全血検体１０              ３１．５              ３２．５【００５９】  全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離し、更に電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値は公知の測定方法による参考例２の測定値とよい一致を示し、本発明により１，５−アンヒドログルシトールの測定ができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１で使用したデバイスを簡略化して示した図である。
【００６１】
【図２】実施例２で使用したデバイスを簡略化して示した図である。
【符号の説明】
【００６２】  １  検出部  ２  検出部支持体  ３  血球分離部  ４  支持体
【図１】
0005301156.tif 000002
【図２】
0005301156.tif 000003