(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボシアニン蛍光色素で染色した組織とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、カルボシアニン蛍光色素で染色した組織への浸透を促進する方法であって、カルボシアニン蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する前および／または間に行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組織が神経を含む組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コレステロール特異的界面活性剤を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、カルボシアニン蛍光色素で染色した組織への浸透を促進するための組成物。
【請求項６】
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
組織が神経を含む組織である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
コレステロール特異的界面活性剤、ならびにカルボシアニン蛍光色素および／または目的物質に特異的に結合するタンパク質を含む、組織を染色するためのキット。
【請求項１０】
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンある、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
組織が神経を含む組織である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織の染色方法に関する。詳細には、本発明は、コレステロール特異的界面活性剤を使用して、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進することを特徴とする方法、ならびにこの方法に使用される組成物、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤｉＩ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート）のような蛍光性長鎖脂質可溶性カルボシアニン色素は、神経経路の逆行性および順行性トレーシングに広く使用されている。ＤｉＩはニューロンの形質膜に容易に取り込まれ、膜内で拡散して、神経経路を順行性および逆行性の両方で標識する。ＤｉＩはニューロン全体およびその突起に拡散し、棘突起および成長円錐を含む詳細な構造の可視化を可能にする。ＤｉＩは能動的軸索輸送ではなく拡散によってニューロンを標識するので、ＤｉＩを使用して、生存組織のみならずアルデヒド固定神経組織におけるニューロン投射をトレースすることができる。このことは、ヒトおよび発生神経解剖学の分野において特に有用である。
【０００３】
ＤｉＩ標識した軸索、樹状突起および細胞体などの特性を検討するために、ＤｉＩ標識を蛍光免疫組織化学と組み合わせることが所望される。しかし、残念ながらＤｉＩ標識と蛍光免疫組織化学は良好には適合しない。なぜなら、組織中へ抗体の浸透を増強するために一般的に使用される界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、ＤｉＩに標識された構造物からＤｉＩの拡散を引き起こすからである。この制限を克服するためにいくつかのプロトコルが報告されている。１つの方法は、単一の切片に対する逐次的な２段階の手順である（非特許文献１）。ＤｉＩの局在を最初に記録し、次いでスライドを免疫組織化学のために、ＤｉＩを犠牲にして処理する。しかし、このプロトコルではＤｉＩと免疫蛍光との微細もしくは正確な共局在を検討することは困難である。２つめの方法は、界面活性剤の非存在下での長時間（例えば、室温で３日間）の脳切片の１次抗体とのインキュベーションが蛍光染色パターンを改善することが報告されているが（非特許文献２）、抗体の組織への浸透は、幼若動物を使用した場合でさえ、なお限定的である。３つめの方法として、いくつかの報告では、低濃度の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）が使用されているが、これらのプロトコルはニューロン細胞体の局在を検出するためのみに使用されており、軸索のような微細構造は検出されていない（非特許文献３、非特許文献４）。４つめの方法として、別の報告は、ＤｉＩ標識の、安定ではあるが非蛍光性のジアミノベンジジン反応生成物への光変換が、免疫組織化学に適合することを示している（非特許文献５、非特許文献６）。しかし、上記のようにこの反応成生物は非蛍光性である。従って、ＤｉＩ標識と免疫蛍光との詳細な共局在を共焦点顕微鏡観察を使用して分析することができる蛍光二重標識を使用することが望まれていた。
【０００４】
ＤｉＩにより染色された神経線維などの構造体が、どのような特徴を持つ構造体であるかを知ることは非常に重要である。そのためには、ＤｉＩで標識された構造体に、どのようなタンパク質が発現されているかを免疫染色法で検討することが必須となる。しかしながら、上記のように、従来ＤｉＩと免疫染色法を組み合わせることが困難であった。
【非特許文献１】Holmqvist, B.I. et al. (1992) J Neurosci Methods 42:45-63
【非特許文献２】Elberger, A.J. et al. (1990) J Histochem Cytochem 38:735-739
【非特許文献３】Lukas, J.R. et al. (1998) J Histochem Cytochem 46:901-910
【非特許文献４】Lee, K.W. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:3399-3404
【非特許文献５】Papadopoulos, G.C. et al. (1993) J Neurosci Methods 46:251-258
【非特許文献６】von Bartheld, C.S. et al. (1990) J Histochem Cytochem 38:725-733
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、蛍光色素での染色と免疫染色とを組み合わせた組織の染色方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＤｉＩニューロントレーシングと適合する適切な蛍光免疫染色プロトコルを研究した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００はほぼ無差別に脂質分子を可溶化するので、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が脂質と一緒にＤｉＩも溶出させる可能性がある。その結果、ＤｉＩ標識は免疫組織化学染色の後に消失する。従って、本発明者らは、細胞脂質成分のうちの特定の脂質選択的に作用（例えば、可溶化）する界面活性剤を用いることにより、膜中に十分量のＤｉＩを保持できるであろうと考えた。本発明者らは、ＤｉＩ標識ならびに幼若および成体脳組織への抗体の浸透に対するジギトニンの効果を検討した。ジギトニンは、膜透過処理およびタンパク質抽出のような細胞生物学および生化学アッセイのために使用されているコレステロール特異的界面活性剤である。本発明者らは、ＤｉＩ標識脳切片のジギトニンでの処理が、ニューロン中のＤｉＩ標識を破壊することなく組織への抗体の効率的な浸透を導くことを示した。ＤｉＩ標識と蛍光免疫組織化学とを組み合わせることができれば、神経系の神経回路の詳細な検討が可能になり、有用である。
【０００７】
本発明は、
［１］蛍光色素で染色した組織とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進する方法であって、蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する前および／または間に行われることを特徴とする、方法；
［２］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンである、［１］の方法；
［３］蛍光色素がカルボシアニン蛍光色素である、［１］または［２］の方法；
［４］目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、［１］〜［３］のいずれかの方法；
［５］組織が神経を含む組織である、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］コレステロール特異的界面活性剤を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進するための組成物；
［７］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンである、［６］の組成物；
［８］蛍光色素がカルボシアニン蛍光色素である、［６］または［７］の組成物；
［９］目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、［６］〜［８］のいずれかの組成物；
［１０］組織が神経を含む組織である、［６］〜［９］のいずれかの組成物；
［１１］コレステロール特異的界面活性剤、ならびに蛍光色素および／または目的物質に特異的に結合するタンパク質を含む、組織を染色するためのキット；
［１２］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンまたはキラヤサポニンある、［１１］のキット；
［１３］蛍光色素がカルボシアニン蛍光色素である、［１１］または［１２］のキット；
［１４］目的物質に特異的に結合するタンパク質が抗体である、［１１］〜［１３］のいずれかのキット；
［１５］組織が神経を含む組織である、［１１］〜［１４］のいずれかのキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、コレステロール特異的界面活性剤を使用して、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進することを特徴とする方法、ならびにこの方法に使用される組成物、キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記のように、組織中へ抗体の浸透を増強するために従来から一般に使用されるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような脂質に対して非特異的に作用する界面活性剤を使用すると、事前に組織の染色に使用した蛍光色素（例えば、ＤｉＩ）が拡散・溶出してしまい、その結果、抗体などの目的物質に特異的に結合するタンパク質を使用した二重染色が実施できなかった。
【００１０】
本発明は、細胞膜を構成する特定の脂質（例えば、コレステロール）に対して特異的に作用する界面活性剤（例えば、ジギトニン）を使用すれば、従来技術において見られたような蛍光色素の拡散・溶出を防止することができるという、本発明者らによって得られた知見に基づいている。すなわち、本発明によれば、コレステロールのような細胞膜中の特定の脂質に対して特異的な界面活性剤を使用することによって、組織染色に使用する蛍光色素を細胞内に保持しつつ、抗体などの目的物質に特異的に結合するタンパク質を組織の深部まで十分に浸透させることができる。それゆえ、例えば、ＤｉＩなどの蛍光色素でのトレーシングおよび免疫組織化学の蛍光二重標識を実施することが可能である。
【００１１】
１つの実施態様において、本発明は、蛍光色素で染色した組織とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進する方法であって、蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する前および／または間に行われることを特徴とする、方法を提供する。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、（１）組織を蛍光色素で染色する工程、および（２）蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する工程、を含む、組織の染色方法であって、工程（２）の前および／または間に工程（１）で得られた組織とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させることを特徴とし、これにより目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透が促進される、方法を提供する。
【００１３】
細胞膜には、リン脂質、糖脂質、ステロイド（例えば、コレステロール）などの脂質が含まれることが知られている。またこれらは、その疎水性部分のアルコール成分がグリセロールであるグリセロ脂質、当該成分がスフィンゴシンであるスフィンゴ脂質に分類される。本明細書ではこれらの細胞膜中の脂質のうち、コレステロールに対して特異的な界面活性剤について記載するが、細胞膜中の他の特定の脂質に対して特異的な界面活性剤を使用した場合も同様な効果が期待される。
【００１４】
本明細書において使用する用語「コレステロール特異的界面活性剤」は、上記細胞膜中の特定の脂質のうち、コレステロールに対して特異的に作用する界面活性剤をいう。コレステロール特異的界面活性剤としては、サポニン、例えば、ジギトニン、キラヤサポニンなど任意の公知のものを使用することができる。本発明には、ジギトニンが好ましく用いられる。サポニンはステロイドやトリテルペノイドを非糖部とする配糖体の総称であり、ジギタリス由来のステロイド配糖体であるジギトニンもサポニンに含まれる。なお、サポニン、ジギトニン、キラヤサポニンなどの誘導体も同様に本発明に使用することができる。従って、本明細書において使用する用語「サポニン」、「ジギトニン」、「キラヤサポニン」はそれらの任意の誘導体を含む。
【００１５】
界面活性剤は、水の表面張力の低下など、界面または表面の性質を変化させる性質（界面活性）を有する物質の総称であり、その作用は多岐にわたるが、本発明の目的のためには、脂質を破壊するように作用する性質を有するものが好ましく用いられる。界面活性剤の脂質に対する「作用」は、結果的に目的物質に特異的に結合するタンパク質の組織への浸透が促進されれば、その機構に限定はない。例えば、キラヤサポニンはミセルを形成することによってコレステロールを水溶液中に可溶化する。一方、ジギトニンは、コレステロールとともにコレステロール−ジギトニンと称する不溶性複合体を形成して沈殿する。本発明者らは、培養細胞の染色においては、ジギトニンおよびキラヤサポニンのいずれもが良好な結果をもたらすが、脳切片の染色においてはジギトニンがキラヤサポニンよりも優れていることを見出している。いずれもコレステロール特異的界面活性剤であるジギトニンとキラヤサポニンとの間のこのような差異は、ジギトニンが形成する不溶性複合体とともにＤｉＩが細胞中に沈殿されて、ＤｉＩの溶出が回避されることに起因するのかもしれない。
【００１６】
蛍光色素で染色した組織と接触させる際に、コレステロール特異的界面活性剤を任意の溶媒に溶解することができる。そのような溶媒は、使用する界面活性剤の種類に応じて適切に選択することができる。例えば、界面活性剤としてジギトニンを使用する場合、溶媒として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を使用することができる。また、界面活性剤としてキラヤサポニンを使用する場合、溶媒としてＰＢＳを使用することができる。
【００１７】
組織と接触させる際のコレステロール特異的界面活性剤の濃度は、例えば、本願の開示に従って行われる組織染色の結果に基づいて適切に決定することができる。コレステロール含量が低い組織や、相対的に堅固な組織（例えば、成体組織）を標的とする場合は、界面活性剤の濃度はより高く調整され得る。界面活性剤としてジギトニンを使用する場合、濃度は、例えば１０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上、かつ例えば５０００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは２０００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０００μｇ／ｍｌ以下である。界面活性剤としてキラヤサポニンを使用する場合、濃度は、例えば０．２％以上、好ましくは０．５％以上、かつ例えば２％以下、好ましくは１％以下である。
【００１８】
組織とコレステロール特異的界面活性剤との接触の温度および時間は、良好な染色結果を指標として適切に決定される。温度は、例えば４〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃である。時間は、例えば１０分〜６０分、好ましくは２０分〜４０分である。１つの態様において、接触は室温で３０分実施される。この後に、組織を、コレステロール特異的界面活性剤の存在下もしくは非存在下で、目的物質に特異的に結合するタンパク質（例えば、抗体）に曝露してもよい。
【００１９】
本明細書において使用する用語「蛍光色素」は、組織（または組織を構成する細胞）を特異的に染色することができる蛍光性の色素をいう。組織に限定はなく、染色が所望される任意の組織を選択することができる。例えば、組織は神経を含む組織であってもよい。神経は全身のほぼ全ての臓器に分布しているので、この場合脳を含む全身の任意の部位がその染色対象となる。目的の組織を特異的に染色する蛍光色素は当該分野において公知であり、当業者は適切な蛍光色素を選択することができる。
【００２０】
蛍光色素の例として、カルボシアニン蛍光色素と呼ばれる一群の蛍光色素が挙げられる。カルボシアニン蛍光色素としては、ＤｉＡ、ＤｉＤ、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＲなど多数のものが市販されており、いずれも本発明に用いることができる（http://probes.invitrogen.com/handbook/print/1304.htlmを参照のこと）。上記の蛍光色素のアナログや誘導体も同様に使用することができる。そのようなアナログや誘導体もまた公知であり、上記ウェブサイトに例示されている。例えば、不飽和アルキルテール（例えば、Δ９−ＤｉＩ、ＦＡＳＴ  ＤｉＯ、ＦＡＳＴ  ＤｉＩの商品名で市販されているもの）やより短いアルキルテール（例えば、ＤｉＩＣ１２（３）、ＤｉＩＣ１６（３）、ＤｉＯＣ１６（３）の商品名で市販されているもの）を有するアナログ、クロロメチルベンズアミド誘導体（例えば、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  ＣＭ−ＤｉＩの商品名で市販されているもの）、ジフェニル誘導体（例えば、５，５’−Ｐｈ２−ＤｉＣ１８（３）の商品名で市販されているもの）、アニオン性スルホフェニル（例えば、Ｓｐ−ＤｉＩＣ１８（３）、Ｓｐ−ＤｉＯＣ１８（３）の商品名で市販されているもの）またはスルホネート（例えば、ＤｉＩＣ１８（３）−ＤＳ、ＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳの商品名で市販されているもの）誘導体などを使用することができる。蛍光色素は、上記で具体的に示した化合物に限定されるものではなく、また将来利用可能になる同様の効果を有する任意のものを使用することができる。本発明には。ＤｉＩが好ましく用いられる。ＤｉＩなどのカルボシアニン蛍光色素の神経回路のトレーサーとしての利点は、これを使用して、生存組織のみならず固定標本における投射をトレースできることである。これにより外科的手順が必要でなくなり、他のトレーサーによって与えられる組織損傷の潜在的な影響を排除することができる。従って、カルボシアニン蛍光色素は生存動物では容易に到達可能でない神経経路のトレーシングに適切である。
【００２１】
蛍光色素は、適当な溶媒に溶解して使用してもよいが、固体（結晶）状態で染色に使用してもよい。
【００２２】
本明細書において使用する用語「目的物質に特異的に結合するタンパク質」は、目的物質に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質をいう。目的物質は、組織に存在するタンパク質、核酸、糖質、脂質など任意の物質であり得る。目的物質に特異的に結合するタンパク質の例としては、抗体、レセプター、リガンドなどが挙げられる。なお、本明細書では主に抗体の使用に関して記載するが、抗体以外の任意のタンパク質も、目的物質に特異的に結合する能力を有している限り本発明に使用することができる。
【００２３】
抗体としては、その検出が所望される任意の抗原に対する抗体が使用される。本発明者らは、コレステロール含量の低い核膜に対してコレステロール特異的界面活性剤であるジギトニンを作用させた場合においても免疫染色が可能であることを示している。従って、本発明によれば、抗体は核膜内の抗原（本明細書において、「核抗原」という）にも結合することができる。
【００２４】
目的物質に特異的に結合するタンパク質を用いた染色には任意の公知の標識を使用することができる。好ましい標識の例としては蛍光標識が挙げられる。目的物質に特異的に結合するタンパク質を直接的に標識してもよく、または標識２次抗体などを使用して間接的に標識することもできる。目的物質の数は１つに限定されるものではなく、例えば、複数の抗体をそれぞれ波長の異なる蛍光で標識すれば、複数の目的物質を同時に検出することができる。
【００２５】
抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、均質な結果を得るためにはモノクローナル抗体がより好ましい。また、抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有する任意の形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖなど）も包含する。
【００２６】
蛍光色素で染色した組織とコレステロール特異的界面活性剤との接触は、蛍光色素での染色が保持され、かつ目的物質に特異的に結合するタンパク質を用いた染色が十分に行われる限り、蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する前に行ってもよく、蛍光色素で染色した組織を目的物質に特異的に結合するタンパク質に曝露する間に行ってもよい。
【００２７】
本発明の方法によって、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透が促進される。浸透の促進は、組織切片の最も深い部分が、目的物質に特異的に結合するタンパク質を用いて十分に染色されることを観察することによって確認することができる。浸透が不十分であれば、目的物質に特異的に結合するタンパク質を用いた染色を表す蛍光強度は切片の表面に比較して深い部分において低下するが、浸透が十分であれば、切片の深い部分におけるこのような蛍光強度の低下は観察されない。
【００２８】
さらに別の実施態様において、本発明は、コレステロール特異的界面活性剤を含む、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進するための組成物を提供する。
【００２９】
本発明の組成物は、上記のような本発明の目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進する方法に使用することができる。本発明の組成物に含まれるコレステロール特異的界面活性剤の種類、溶解のための溶媒、濃度などは上記のとおりである。本発明の組成物は、その他の任意の成分（例えば、安定化剤など）を含んでいてもよい。
【００３０】
さらなる実施態様において、本発明は、コレステロール特異的界面活性剤、ならびに蛍光色素および／または目的物質に特異的に結合するタンパク質を含む、組織を染色するためのキットを提供する。
【００３１】
本発明のキットは、上記のような本発明の組織の染色方法に使用することができる。本発明のキットに含まれるコレステロール特異的界面活性剤、蛍光色素、および目的物質に特異的に結合するタンパク質は上記のとおりである。本発明のキットはその他の任意の成分（例えば、洗浄液など）を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明は、ヒトの疾患脳における神経回路異常の解析、ヒト胎児の先天性異常における神経回路異常の解析、脳への再生医療の基礎実験（すなわち、脳へ移植した神経細胞から、どのような神経軸索がどこへ投射しているかを解析できる）、基礎神経科学における神経回路形成過程の解析などに有用である。
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
材料および方法
動物：ＩＣＲマウスを日本エスエルシーから購入した。
【００３５】
抗体および試薬：抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｋ−２３）をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗カルビンディンＤ−２８ｋ抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎから購入した。抗ニューロフィラメントＭ（ＮＦＭ）抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎから購入した。抗Ｉｓｌｅｔ−１／２（Ｉｓｌ−１／２）モノクローナル抗体（３９．４Ｄ５）をＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから得た。Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧ抗体をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。４．５ｇ／ｌグルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という）およびペニシリン−ストレプトマイシン溶液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。カナマイシン溶液およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａから購入した。ジギトニンをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し（カタログ番号３００４１１）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）中５０ｍｇ／ｍｌの濃度でストック溶液を作製した。キラヤサポニンをＳｉｇｍａから得（カタログ番号４７０３６）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（水（ＭｉｌｌｉＱ水）１Ｌ当たりＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ３．６３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２４ｇ）中２０％（ｗ／ｖ）の濃度でストック溶液を作製した。使用時に、ストック溶液を１０〜５００倍希釈した。ＤｉＩをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
【００３６】
細胞培養および免疫細胞化学：以前に記載された細胞培養プロトコル（Matsubayashi, Y. et al. (2004) Curr Biol 14:731-735）を改変した。ＣＯＳ７細胞を１０％ウシ胎仔血清および抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシン）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。染色の２４時間前に、ＣＯＳ７細胞をカバーグラスを含む３５ｍｍディッシュ中に２×１０５細胞／ディッシュの密度で播種した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し（３７℃、１５分）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いでＤｉＩで染色した（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ、３７℃、１０分）。細胞をＰＢＳで洗浄し、以下のように種々の試薬で透過処理した。透過処理のネガティブコントロールのためには、細胞を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で３０分間室温（ＲＴ）で処理した。メタノールでの透過処理のために、細胞をメタノール中２０分間−２０℃でインキュベートした。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはジギトニンでの透過処理のために、細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に溶解したこれらの界面活性剤で処理した（ＲＴ、３０分）。キラヤサポニンでの処理のために、細胞をキラヤサポニン含有ＰＢＳ中でインキュベートした（ＲＴ、３０分）。予備的な実験においてキラヤサポニンは３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で十分には作用しなかったので、キラヤサポニンを使用する場合にはＢＳＡを含めなかった。次いで、細胞を一晩３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗ＥＲＫ１／２抗体（１：１００希釈）とともに４℃でインキュベートした。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはジギトニンで処理した細胞については、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはジギトニンを１次抗体溶液に添加した。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（終濃度１μｇ／ｍｌ）とともに３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１時間ＲＴでインキュベートした。
【００３７】
神経軸索のＤｉＩ標識：マウスを深く麻酔し、４％ＰＦＡ含有ＰＢＳ（４％ＰＦＡ／ＰＢＳ）で経心的に灌流した。脳を切開し、一晩４％ＰＦＡ／ＰＢＳで後固定した。ＤｉＩ結晶を脳に挿入し、これを固定液に戻して、３７℃で２週間貯蔵した。次いで、脳をビブラトームを用いて切片化し（厚さ３０μｍ）、使用時まで固定液中で貯蔵した。
【００３８】
ＤｉＩ標識脳切片の経時的画像化：ＤｉＩ標識切片をＰＢＳで洗浄し、顕微鏡スライドガラス上に置き、カバーグラスをのせた。次いで、界面活性剤処理前の切片の画像を取った。次いで、切片を各透過処理溶液（すなわち、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．２もしくは０．５％）またはジギトニン（１００もしくは１０００μｇ／ｍｌ）を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、あるいはキラヤサポニン含有ＰＢＳ（０．５もしくは１％））に移した。３０分間ＲＴでインキュベートした後、各切片を新たな顕微鏡スライドガラス上の各溶液の新鮮な液滴に移した。過剰の溶液を除去し、カバーグラスをのせた。次いで、ＤｉＩ標識神経突起の経時的な画像を撮影した。撮影の間以外は、切片を暗所にて４℃で貯蔵した。
【００３９】
免疫組織化学：免疫組織化学を以前に記載した方法（Kawasaki, H., et al. (2000) Neuron 28:31-40）を改変して実施した。すなわち、脳切片を２％ＤＭＳＯ、ジギトニン（１００〜１０００μｇ／ｍｌ）または０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する３％ＢＳＡ／ＰＢＳでＲＴで３０分間前処理し、１次抗体とともに各前処理溶液中で１２時間４℃でインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（終濃度１μｇ／ｍｌ）とともに３時間ＲＴでインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。ＤｉＩ標識なしの切片については、切片を顕微鏡スライドガラス上で乾燥させ、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してカバーグラスをのせた。ＤｉＩでの二重標識に使用した切片は乾燥させることなしにＰＢＳ中でカバーグラスをのせた（乾燥はＤｉＩ標識をかなり妨害する）。抗体希釈は以下のとおりであった：抗カルビンディンＤ−２８ｋ、１：２００〜５００；抗ＮＦＭ、１：３００〜６００；抗Ｉｓｌ−１／２、１：３０００〜１００００；２次抗体、１：５００。
【００４０】
顕微鏡観察：落射蛍光顕微鏡観察をＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ａ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。共焦点顕微鏡観察をＬＳＭ５１０顕微鏡および４０×／０．７５ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して実施した。Ｚスタック画像（光学的厚さ２．４μｍ）を２μｍ毎に収集し、ＺＥＮ  ２００７およびＺＥＮ  ２００７  ＬＥソフトウエア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して３次元（３Ｄ）的に再構築した。画像をＸＹ、ＸＺまたはＹＺ光学的断面図として、または最大投射画像として示し、ここで、投射軸に沿って最高強度の画素のみを示すことによって、データの３Ｄ図を算出し表示した。
【００４１】
蛍光強度の定量：蛍光強度をＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインソフトウエア、http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用して定量した。皮質軸索のＤｉＩ蛍光の経時的解析のために、画像をまず、測定すべき軸索がＹ軸に平行になるように回転させた。目的の矩形関心領域（ＲＯＩ）を軸索を横切って引き、ＲＯＩにおける垂直平均画素強度Ｉを「列平均プロット」を使用して測定した。次いで、相対蛍光強度ＩＲおよび標準化強度ＩＮを以下のように算出した：
ＩＲ（ｔ）＝Ｉ（ｔ）×１００／Ｉｍａｘ（０）
ＩＮ（ｔ）＝（Ｉ（ｔ）−Ｉｍｉｎ（ｔ））×１００／（Ｉｍａｘ（ｔ）−Ｉｍｉｎ（ｔ））
式中、Ｉ（ｔ）、ＩＲ（ｔ）およびＩＮ（ｔ）はそれぞれ各試薬の添加後ｔ時間におけるＩ、ＩＲおよびＩＮを表し；Ｉｍａｘ（ｔ）およびＩｍｉｎ（ｔ）は添加後ｔ時間におけるＩの最大値および最小値を表す（すなわち、Ｉｍａｘ（０）はｔ＝０におけるＩの最大値を表す）。
【００４２】
脳切片を横断する免疫蛍光強度の定量のために、矩形ＲＯＩをＸＺ画像において引き、水平平均画素強度を測定した。強度を範囲［０、１００］内の値をとるように線形標準化し、深さに対してプロットした。
【００４３】
実施例１：培養細胞を使用した膜透過試薬の迅速スクリーニング法
ＤｉＩ標識を形質膜上に保持する膜透過試薬を探索するために、初期スクリーニング用の、培養細胞を使用する迅速スクリーニング法をまず構築した。この方法により、ＤｉＩ標識に対する種々の界面活性剤の効果を迅速に検討し、界面活性剤が免疫染色パターンに悪影響を有するかどうかを検討することが可能になった。固定したＣＯＳ７細胞をＤｉＩで標識し、種々の試薬を用いて透過処理し、次いで抗ＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼ（以下、「ＥＲＫ１／２」という）抗体を使用した免疫組織化学に供した（上記「材料および方法」参照）。
【００４４】
細胞を３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）のみで処理した場合、細胞はＤｉＩで染色されたままであったが、ＥＲＫ１／２免疫反応性は不明瞭であった。この結果は、透過処理なしでは細胞への抗体の浸透が不十分であることを示唆する。逆に、細胞をメタノール、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）で処理した場合、免疫反応性は、以前の報告のように、細胞質、核および核小体において明らかになったが（Adachi, M. et al., (1999) EMBO J 18:5347-5358; Formstecher, E. et al. (2001) Dev Cell 1:239-250）、ＤｉＩ標識はほぼ完全に消失した。ＤｉＩ標識の消失は、メタノール、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＮＰ−４０によるＤｉＩおよび細胞脂質の非選択的可溶化の結果であると思われる。これらの結果は、ＤｉＩ標識が、免疫組織化学に一般に使用される透過試薬とは適合しないという以前の報告と一致している（非特許文献１）。
【００４５】
本発明者らは細胞脂質の限定されたセットを選択的に作用する界面活性剤が膜中に十分なＤｉＩを保持するであろうと仮定し、次いでジギトニンおよびキラヤサポニンのようなコレステロール特異的界面活性剤がＤｉＩ標識に影響を及ぼすかどうかについて試験した。コレステロールは細胞膜中の脂質分子の３０％以下を占めるので（Ikonen, E. (2008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:125-138; van Meer, G. et al. (2008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:112-124）、ジギトニンおよび／またはキラヤサポニンでの透過処理が膜中のＤｉＩ標識の大部分を保持するであろうと予想した。この着想どおり、かなりの量のＤｉＩ標識が、１０００μｇ／ｍｌのジギトニンでの処理の後でも細胞中に留まった。さらに、１０〜１０００μｇ／ｍｌのジギトニンでの処理は、抗ＥＲＫ１／２抗体の細胞への浸透を顕著に増強した。これらの結果は、ジギトニンを使用した透過処理がＤｉＩ標識に適合することを示唆する。核小体中のＥＲＫ１／２免疫反応性が１０μｇ／ｍｌのジギトニンでの処理の後に不明瞭であったが、１００〜１０００μｇ／ｍｌのジギトニンを使用すると、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合と同様に明瞭になったことに留意すべきである。これは、低濃度のジギトニンは形質膜を優先的に破壊するが、核膜をインタクトに保持するという事実に起因し得る（Adam, SA et al. (1990) J Cell Biol 111:807-816）。核内の抗原を効率的に検出するために、１００〜１０００μｇ／ｍｌのジギトニンを以後の実験に使用した。また、別のコレステロール特異的界面活性剤であるキラヤサポニンも試験した。１％未満の濃度のキラヤサポニンでの処理もまたＤｉＩ標識を保持し、抗ＥＲＫ１／２染色を可能にした。総合すると、これらの結果は、ジギトニンおよびキラヤサポニンが、ＤｉＩ標識組織の免疫染色を可能にする透過試薬の良好な候補であることを示唆する。
【００４６】
さらに、蛍光色素としてＣＭ−ＤｉＩを使用して同様の実験を行った。すなわち、ＨＥＫ２９３細胞をＣＭ−ＤｉＩで標識し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．２〜０．５％）またはジギトニン（１０００μｇ／ｍｌ）で処理をした。その結果、上記のＤｉＩの場合と同様に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合はＣＭ−ＤｉＩ標識は消失したが、ジギトニンを使用した場合はＣＭ−ＤｉＩ標識は残存した。このことは、ジギトニンのようなコレステロール特異的界面活性剤がＣＭ−ＤｉＩのようなＤｉＩ以外の蛍光色素についても有効であることを示唆する。
【００４７】
実施例２：脳切片中のＤｉＩシグナルに対するジギトニンおよびキラヤサポニンの効果
次に、ジギトニンおよびキラヤサポニンが脳切片中のＤｉＩシグナルも保持するかどうかを検討した。ＤｉＩ結晶をマウスの大脳皮質に挿入して、皮質および脳梁における神経軸索を標識した。標識した脳切片を種々の濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ジギトニンまたはキラヤサポニンの存在下または非存在下でインキュベートし、経時的に画像化およびＤｉＩシグナルの定量を実施した。界面活性剤の非存在下では、軸索におけるＤｉＩシグナルのコントラストは２４時間後でも保持された。ピーク蛍光強度およびバックグラウンド蛍光は幾分低下した。これは反復した画像化の間のＤｉＩのフォトブリーチングに起因するものと思われる。これと一致して、各時点での最大値および最小値がそれぞれ「１００」および「０」に変換されるように蛍光強度を標準化すると、２４時間以内では標準化した強度プロフィールの形状に変化はほとんど観察されなかった。切片をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とともにインキュベートした場合、ＤｉＩシグナルは１時間以内に迅速に消失し、従って強度プロフィールはフラットになった。この結果は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＤｉＩ標識との間の不適合性に関する以前の報告と一致する。対照的に、本発明者らはジギトニン処理した切片においてＤｉＩシグナルが良好に保たれることを見出した。２４時間の１０００μｇ／ｍｌジギトニンでの処理後でさえ、ＤｉＩ染色した軸索の微細構造を、ぼやけることなしに明確に見ることができた。このことは標準化した強度プロフィールがほとんど変化しなかったことと一致する。この結果は、ジギトニン処理が脳切片におけるＤｉＩ神経標識に適合することを示唆する。ジギトニンとキラヤサポニンは両方ともコレステロールに特異的であるが、興味深いことに、切片をキラヤサポニンとともにインキュベートした場合、ＤｉＩシグナルは２４時間以内に顕著にぼやけるかまたは不明瞭になった。この蛍光の曇りを反映して、標準化強度プロフィールはインキュベーションの間に横幅が広まった。従って、これらの結果は、ＤｉＩ標識を保持するために、ジギトニンがキラヤサポニンより好ましいことを示唆する。
【００４８】
さらに、蛍光色素としてＣＭ−ＤｉＩを使用して同様の実験を行った。すなわち、ＣＭ−ＤｉＩで標識した脳組織切片を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．２〜０．５％）またはジギトニン（１０００μｇ／ｍｌ）で処理をし、ＣＭ−ＤｉＩの流出を経時的に観察した。その結果、上記のＤｉＩの場合と同様に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合はＣＭ−ＤｉＩ標識は１時間で消失したが、ジギトニンを使用した場合はＣＭ−ＤｉＩ標識は２４時間後も残存した。また、ＤｉＡで標識した脳組織切片をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはジギトニンで同様に処理をしたところ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の場合はＤｉＡ標識は消失したが、ジギトニンの場合はＤｉＡ標識は残存した。これらの結果は、ジギトニンのようなコレステロール特異的界面活性剤がＣＭ−ＤｉＩやＤｉＡのようなＤｉＩ以外の蛍光色素についても有効であることを示唆する。
【００４９】
実施例３：ジギトニンによる脳切片への抗体の浸透の増強
次いで、ジギトニンでの処理が脳組織への抗体の浸透を増強し、その結果、免疫組織化学的染色を改善するかどうかを検討した。幼若（出生後９日目、Ｐ９）および成体マウスを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流し、３０μｍの厚さのビブラトーム切片を作製した。抗体の組織への透過性が異なると思われたので、Ｐ９および成体両方の小脳を調べた。切片をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または種々の濃度のジギトニンで処理し、次いでプルキンエ細胞のマーカーであるカルビンディンＤ−２８ｋに対する抗体を用いて染色した（Kawasaki, H. et al. (1999) J Biol Chem 274:13498-13502）。抗体の切片への透過性に対するジギトニン処理の効果を共焦点顕微鏡観察によって評価した。
【００５０】
透過処理なしでも、おそらくビブラトーム切片の作製中に生じた膜の破損に起因して、切片の表面上にある程度の免疫反応性が観察された。それゆえ、切片の深部における染色パターンを検討した。コントロールのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理組織において、切片の深部における免疫反応性は非常にかすかであった。これと一致して、免疫蛍光強度を各画像平面の深さに対してプロットすると、強度プロフィールは切片の深部において深い谷を示した。対照的に、ジギトニン処理サンプルにおいて、切片の深部における染色は、ジギトニン濃度依存的に顕著に増強された。Ｐ９切片において、１００μｇ／ｍｌのジギトニンを使用した免疫染色の質および強度は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用したものに概ね匹敵した。成体切片については、おそらく成体組織は幼若組織よりもずっと堅固であるという理由で、より高濃度（５００μｇ／ｍｌ以上）のジギトニンが、切片の深部における免疫染色の効率的な増強のために必要とされた。さらに、ジギトニン濃度の１０００μｇ／ｍｌまでの増加によっては免疫染色の質は損なわれず、染色パターンはＰ９マウスおよび成体マウス両方の切片においてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて得られたものと類似していることに留意すべきである。これらの結果は、ジギトニン処理が、Ｐ９マウスおよび成体マウス両方の脳切片への抗体の浸透を有意に増強することを示唆する。以下の実験にはジギトニンを１０００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００５１】
実施例４：ジギトニンを用いる透過処理によるＤｉＩトレーシングおよび免疫組織化学での蛍光二重標識
本発明者らは、ジギトニン処理がＤｉＩ標識に適合し、そして免疫組織化学用の界面活性剤として作用することを示した。次に、ジギトニンを使用したＤｉＩおよび免疫組織化学での蛍光二重標識の実施可能性を検討した。ＤｉＩ標識されたＰ９および成体マウス大脳皮質の切片をジギトニンで処理し、次いで抗ニューロフィラメントＭ（ＮＦＭ）免疫組織化学に供した。ＮＦＭが皮質ニューロンの細胞体および神経突起において発現しているという以前の報告と一致して（Kim, O.J. et al. (2002) J Neurosci 22:5920-5930; Voelker, C.C. et al. (2004) Cereb Cortex 14:1276-1286）、本発明者らは幼若マウスおよび成体マウス由来のジギトニン処理切片におけるＮＦＭ免疫反応性の検出に成功した。重要なことに、ジギトニン処理切片において、ＮＦＭ陽性軸索を切片の表層から深部まで明確に見ることができた。ＤｉＩ標識はジギトニン処理切片において良好に保持されていたので、ＮＦＭ陽性軸索とＤｉＩ標識軸索との間の位置関係を切片の深さ全体を通して可視化することに成功した。また、軸索が抗体およびＤｉＩの両方で染色されることを見出すことができた。対照的に、ＤＭＳＯ処理切片においては、切片の深部における軸索は抗体で十分に染色されなかったので、ＮＦＭ陽性神経回路のトレースは困難であった。これらの結果は、ジギトニンを透過試薬として使用することによって、ＤｉＩ標識を蛍光免疫組織化学と首尾よく組み合わせることができることを示す。
【００５２】
実施例５：核膜の透過処理
細胞の核膜は少量のコレステロールしか含有しないので、ジギトニンに対して比較的耐性であることが報告されている（Adam, SA et al. (1990) J Cell Biol 111:807-816；van Meer, G. et al. (2008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:112-124）。従って、本発明の方法には、それが核内抗原の免疫染色に適用できないという制限が存在する可能性があった。この可能性を検討するために、ジギトニンまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した切片を転写因子Ｉｓｌｅｔ−１／２（Ｉｓｌ−１／２）に対する抗体を用いて染色した。Ｉｓｌ−１／２は中隔核およびカエハ島（ＩＣＪ）において発現していることが報告されている（Wang, H.F. et al. (2001) Neuroscience 103:999-1016）。これと一致して、Ｉｓｌ−１／２の発現が、それぞれ幼若および成体マウス脳切片中のＩＣＪおよび中隔核において検出された。共焦点顕微鏡観察により、Ｉｓｌ−１／２免疫反応性が、ジギトニンで透過処理した切片の深部およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した切片に存在する細胞の核内において首尾よく検出されることが実証された。対照的に、Ｉｓｌ−１／２はＤＭＳＯで処理したコントロール切片の深部ではほとんど標識されなかった。このことは、Ｉｓｌ−１／２の効率的な検出のために膜透過処理が必要であることを示す。これらの結果は、細胞の核内の抗原でさえ、本発明の方法を用いて首尾よく検出できることを実証する。これはおそらく、形質膜のみならず核膜も破壊し得る高濃度でのジギトニンの使用のためである（Adam, S.A. et al. (1992) Methods Enzymol 219:97-110）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、コレステロール特異的界面活性剤を使用して、目的物質に特異的に結合するタンパク質の、蛍光色素で染色した組織への浸透を促進することを特徴とする方法、ならびにこの方法に使用される組成物、キットが提供される。