(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の炭水化物分子を固定する方法であって、
ｉ）１または複数の重合可能な有機化合物を含む重合可能なアリルアミン単量体源を準備し、
ｉｉ）前記重合可能なアリルアミン単量体源のプラズマを生じさせ、
ｉｉｉ）ある表面を前記プラズマで被覆することでプラズマ重合体で被覆された表面を生じさせ、
ｉｖ）前記プラズマ重合体で被覆された表面を未変性形態の少なくとも１種の生物学的に活性な炭水化物分子を含む炭水化物溶液と接触させ、ここで、
前記炭水化物分子は、ヒアルロナン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸またはケラチン硫酸から成る群から選択されるグリコサミノグリカンを含み、
前記プラズマ重合体で被覆された表面は、未変性形態の前記炭水化物分子と接触させる前に、修飾されておらず、そして、
ｖ）前記プラズマ重合体で被覆された表面を前記未変性形態の炭水化物分子を用いてインキュベートさせ、それによって、前記炭水化物分子を前記表面上に受動的に吸着させ、それによって、前記炭水化物分子が未変性形態のままで、かつ、その生物学的活性を保持したままで固定され、ここで、
前記受動的に吸着は、ある表面を炭水化物と一緒に溶液の状態で前記炭水化物が前記表面と結合するようにインキュベートすることを伴うものである、
上記の各段階を含んでなる方法。
【請求項２】
前記表面が窒素含有量が２０％を超える重合体を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記単量体が周囲の室温で少なくとも６．６ｘ１０−２ミリバールの蒸気圧を示す請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記プラズマ重合体をＷ／ＦＭが＜１０９Ｊ／ｋｇのプラズマから付着させる請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記表面がバイオセンサーの一部である請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記表面が治療媒体の一部である請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記表面が生物学的サンプルを動物、好適にはヒトから採集する時に用いられる機器の一部である請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記表面がアフィニティー精製用マトリックスの一部である請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記表面がマイクロアレイの一部である請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項記載の方法で調製された表面を含んで成るバイオセンサー。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項記載の方法で調製された表面を含んで成る治療媒体。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか一項記載の方法で調製された表面を含んで成るサンプル採集用機器。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか一項記載の方法で調製された表面を含んで成るアフィニティー精製用マトリックス。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項記載の方法で調製された表面を含んで成るマイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれか一項記載の方法であって、Ｗ／ＦＭが＜１０８Ｊ／Ｋｇのプラズマから前記プラズマ重合体を付着させる方法。
【請求項１６】
請求項１から３のいずれか一項記載の方法であって、Ｗ／ＦＭが＜１０７Ｊ／Ｋｇのプラズマから前記プラズマ重合体を付着させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭水化物をある表面（基質を包含）に固定する方法および前記表面を含んで成る製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は炭素と水素と酸素から生じた有機化合物であり、それらは炭素の水化物であり、一般的化学式Ｃｘ（Ｈ２Ｏ）ｙで表される。その炭素原子は一般に直鎖であり、それらは鎖長を基準にして呼ばれ、例えば炭素原子数が５の炭水化物はペントースと呼ばれる。糖、澱粉およびセルロースは炭水化物の種類である。糖はしばしば単に炭水化物と呼ばれ、その例にはグリセルアルデヒド（Ｃ３Ｈ６Ｏ３）、グルコース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）およびスクロース（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）が含まれる。
【０００３】
糖の重合体は糖類と呼ばれる。３個、４個または多数の糖が一緒に連結している場合、それらは三糖、四糖または多糖（グリカン）と呼ばれ、それらが同じ糖で構成されている場合、それらはホモ多糖と呼ばれる。それらが異なる糖で構成されている場合、それらはヘテロ多糖と呼ばれる。
【０００４】
体内に最も豊富に存在するヘテロ多糖はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、それらはまたアニオン性ムコ多糖とも呼ばれる。それらの分子は繰り返す二糖単位を含有する長い非分枝多糖である。その二糖単位は修飾を受けた糖であるガラクトサミン（Ｇａｌ）またはグルコサミン（Ｇｌｃ）のいずれかを２個とウロン酸、例えばグルクロン酸またはイズロン酸などを含有する。ＧＡＧは高度に負に帯電した分子であることに加えて細長い形態を有することから、ＧＡＧが入っている溶液は高い粘度を示す。ＧＡＧは主に細胞表面または細胞外マトリックスの中に存在する。生理学的に重要なＧＡＧはヒアルロナン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはケラタン硫酸である。
【０００５】
ヘパリンおよび構造的に関係したヘパラン硫酸は、抗凝固特性を有する直鎖グリコサミノグリカンの混成群である。ヘパリンに存在する主な糖は（１）α−Ｌ−イズロン酸２−硫酸、（２）２−デオキシ−２−スルファミノ−α−Ｄ−グルコース６−硫酸、（３）β−Ｄ−グルクロン酸、（４）２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコースおよび（５）α−Ｌ−イズロン酸であるが、他の糖も存在し得る。これらの糖の存在量は一般に下記の順で低く（２）＞（１）＞（４）＞（３）＞（５）、それらがグリコシド結合で連結していろいろな大きさの重合体を形成している。
【０００６】
炭水化物を表面に固定する方法は以前に数多く記述されている。
【０００７】
負に帯電している巨大生体分子（ｍａｃｒｏｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などをプラスチックと結合させる方法が特許文献１に開示されている。そのような方法は、そのような巨大分子とプラスチックと塩、好適にはホフマイスター系列の塩（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ）に属する塩が飽和濃度の少なくとも２０％の量で入っている非カオトロピック溶液を接触させることを含んで成る。
【０００８】
１種以上の標識化炭水化物の複合体を固体表面、例えばガラスなどに固定する方法が特許文献２に開示されている。そのような方法では、その標識化炭水化物に通常の誘導化用反応体（ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）、例えばアミノメチルフルオレセインおよび２−アミノ安息香酸（アントラニル酸）などを用いた誘導化を実質的に疎水性の溶媒系中で受けさせる。次に、その標識化複合体を固相と結合させた後、いくらか存在する汚染物、例えば余分な標識化用反応体などを疎水性溶媒、例えばブタノールなどによる洗浄で除去する。
【０００９】
そのような方法は両方とも複数の化学段階を必要とし、それらは時間を消費しかつ高価であり得る。その上、きつい反応体、例えば高い塩濃度、酸および溶媒などが用いられていることから、その結合した炭水化物の構造が損傷を受けている可能性がありかつまた関連した安全性の問題も数多く伴う。１つの表面に結合させることができる炭水化物の数および種類は、その用いる反応体および条件を生じさせるべき複合体の種類に合わせる必要があることから制限される。
【００１０】
蛋白質、ウイルスまたは細胞との特異的な結合によって検出可能なシグナルが発生するようにする目的でバイオセンサーに炭水化物を固定する方法が特許文献３に開示されている。完全な炭水化物またはこれの断片（オリゴ糖と呼ばれる）の還元性末端がＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド的に結合したアグリコン（これは脂肪族もしくは芳香族化合物、アミノ酸、ペプチドもしくは蛋白質分子またはこれらの誘導体であってもよい）による修飾を受けている可能性がある。アグリコンの例にはＯＥｔＳＥｔＣＯＮＨＮＨ２および−ＯｅｔＳＰｈＭＨ２が含まれる。そのアグリコンとバイオセンサー表面の結合は蛋白質、例えばウシ血清アルブミンなどによる影響または前記表面に吸着させたか或は共有結合させた化学的連結による影響を直接受ける可能性がある。そのような化学構造物にはカルボキシル基、スルホネート基、シアネート基、エポキシ基、アルデヒド基、またはアグリコンが有する例えばアミンまたはチオール基などと化学的に結合するに適した他の基が含まれる。結合を補助する目的で追加的化学基による修飾を受けさせておいた炭水化物を用いる場合の重要な１つの考慮は、炭水化物は未変性形態では結合しないことから結果として結合特異性および速度が変わる可能性がある点にある。
【００１１】
炭水化物を固定する現在の方法に関係した問題を克服する目的で、炭水化物種と結合するように修飾を受けた表面がもたらされるようにある化合物をある表面上でプラズマ重合させることを利用して炭水化物を固定することがいくつかの研究で調査された。そのような研究の焦点は、炭水化物を医学機器の表面または外科移植可能材料に固定してそれらの表面への蛋白質の吸着（汚れ）を軽減することにあった。
【００１２】
プラズマ重合は、制御可能な化学官能性を有する極めて薄い（例えば約２００ｎｍ）架橋した重合体膜を複雑な形状の基質に付着させることを可能にする技術である。その結果として、その材料の表面の化学的性質をそのようにして処理した基質の大部分の特性に影響を与えることなく変えることができる。通常は電場を用いてプラズマまたはイオン化した気体を励起させる。それらはイオン、電子、中性物（ラジカル、準安定物、基底状態および励起状態の種）および電磁放射線を含んで成る高反応性化学環境である。減圧をかけることで電子の温度がイオンおよび中性物のそれとは実質的に異なる形態を達成することができる。そのようなプラズマは「冷」または「非平衡」プラズマと呼ばれる。そのような環境にするといろいろな揮発性有機化合物［例えば揮発性アルコール含有化合物、揮発性酸含有化合物、揮発性アミン含有化合物または揮発性炭化水素（混ぜ物無しにか或は他の気体、例えばＡｒなどと一緒に）］が重合を起こしてプラズマと接触している表面および放電の下流に位置する表面の両方を覆うことが分かっている（非特許文献１）。そのような有機化合物はしばしば「単量体」と呼ばれる。その付着物はしばしば「プラズマ重合体」と呼ばれる。そのような重合様式の利点には、潜在的に、ピンホールの無い極めて薄い膜が付着すること、プラズマ重合体を幅広い範囲の基質に付着させることができること、その過程は無溶媒であること、そしてプラズマ重合体が汚染物を含まないことが含まれる。
【００１３】
電力が低い条件を用いると、元々の単量体が有する化学的性質を実質的な度合で保持しているプラズマ重合体膜を生じさせることができる。例えば、アクリル酸がプラズマ重合した膜はカルボキシル基を含有する（非特許文献２）。連続波力を下げるか或は電力をオンとオフで波動させることでそのように電力が低い形態を達成することができる（非特許文献３）。
【００１４】
官能基を有する１種以上の化合物を炭化水素と一緒に共重合させると、結果として生じるプラズマ共重合体（ＰＣＰ）が有する官能基の表面濃度をある程度制御することができる（非特許文献４）。そのような単量体は適切にはエチレン系不飽和単量体である。そのような官能基を有する化合物は例えば不飽和カルボン酸、アルコールまたはアミンなどであってもよい一方、前記炭化水素は適切にはアルケンである。プラズマ共重合の一例は、アクリル酸とオクタジエンを１００（アクリル酸）：０（オクタジエン）、９０：１０、８０：２０など、そして最終的に０：１００に至るいろいろな比率で混合する例である。別法として、前記官能基を有する単量体はアリルアミンであってもよい。また、エチレンオキサイドの種類の分子（例えばテトラエチレングリコールのモノアリルエーテル）をプラズマ重合で付着させることで「汚れの無い」表面を生じさせることも可能である（非特許文献５）。官能基を有する単量体（例えばアクリル酸）を少量添加することで次に行う化学／結合などに適した官能基を本質的に汚れの無い表面に導入することが行われている。また、パーフルオロ化合物（即ちパーフルオロヘキサン、ヘキサフルオロプロピレンオキサイド）を付着させることで疎水性／超疎水性表面を生じさせることも可能である（非特許文献６）。そのような技術は表面が特殊な化学的および物理的特性を示すようにすることから有利である。その上、当該基質の表面湿潤性、接着性および摩耗性を制御可能かつ予測可能な様式で変えることも可能である。
【００１５】
揮発性有機化合物のプラズマを用いて薄い重合体膜を得ることができる（１−１０−３ミリバールの減圧下で理想的には１００℃未満）。付着したプラズマ重合体の中には一般に出発化合物またはイオン化した気体の断片が広範に存在しかつ結果として生じた幅広い範囲の断片または官能基がその付着物の中に望ましくなく入り込む。低いプラズマ入力を用いる（プラズマ電力／単量体流量比を低くする）ことによって、官能基が高い度合で保持されている膜を生じさせることができる。プラズマ重合体の中に官能基が保持されるようにする目的で、典型的には、Ｗ／ＦＭの複合比（非特許文献７に記述されている如き）を利用して、電力負荷（ｐｏｗｅｒ  ｌｏａｄｉｎｇ）を＜１０９Ｊ／ｋｇにすべきである［Ｗ＝電力（Ｊ／分）、Ｆ＝流量（モル／分）、Ｍ＝平均分子質量（ｋｇ／モル）］。より典型的には、官能基が高い度合で保持されるように、前記比率を約１ｘ１０７Ｊ／ｋｇまたはそれ以下にする。しかしながら、比較的低い他の比率を用いることも可能であり、それらは本分野の技術者に公知である。別法として、プラズマまたはイオン化した気体を波動させることでプラズマ重合体付着物を生じさせることも可能である。単一種の単量体または他の有機分子との組み合わせのいずれかを用いてプラズマを生じさせる。
【００１６】
プラズマ重合で処理しておいた表面に炭水化物を固定することがいくつかの研究で調査されてきたが、それらは炭水化物を未変性形態で固定することを立証することができなかった。特許文献４、特許文献５および特許文献６に示されている炭水化物の固定は、プラズマ重合で処理しておいた表面に炭水化物を結合させる目的で化学的アダプタ（ａｄａｐｔｏｒ）、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を用いることが基になっている。このように、炭水化物を未変性形態で表面に結合させるものではなく、むしろ、それを結合させる前にそれに化学的修飾を受けさせており、その結果として、恐らくは、炭水化物分子の構造または結合特異性または官能性が変化してしまっているであろう。
【００１７】
ｎ−ヘプチルアミンのプラズマ重合体の表面に多糖の被膜を共有結合的に固定することが特許文献７に記述されている。その資料は、蛋白質による汚染度合が低い被膜（生物医学機器、特にコンタクトレンズ用）を生じさせることで不利な生物医学的結果の度合を低くすることを取り扱うものである。従って、生物医学機器が長期の効力を示すようにするには多糖を表面に共有結合させることが必須であると思われる。そのように多糖を共有結合させるには、最初に二官能の連結用分子をプラズマ重合体表面と共有結合させた後にその連結用分子の結合していない「遊離」末端を多糖と共有結合させる必要がある。その多糖は前記表面の単一点と結合しないで、数多くの点と結合し、従って、未変性形態（例えば溶液の状態）で確認するアプローチに採用するのは不可能である。このように、炭水化物の特性、例えばそれの結合官能性／活性などが影響を受けている可能性が高い。
【特許文献１】米国特許第６，１８０，７６９号
【特許文献２】米国特許第５，６４１，３９０号
【特許文献３】米国特許第２００１０１７２７０号
【特許文献４】ＷＯ９４／１０９３８（Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）
【特許文献５】ＷＯ９０／００３４３（Ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）
【特許文献６】ＷＯ０１／４５８６２（Ｉｎｎｅｒｄｙｎｅ  Ｉｎｃ．）
【特許文献７】ＥＰ１０４８３０４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
【非特許文献１】Ｈ．Ｋ．Ｙａｓｕｄａ、Ｐｌａｓｍａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８５
【非特許文献２】Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ｌ、Ｂｅｃｋ  Ａ．Ｊ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｒ．Ｄ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９６、２９、５１７２−５１７７
【非特許文献３】Ｆｒａｓｅｒ  Ｓ．、Ｂａｒｔｏｎ  Ｄ．、Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ．Ｗ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．、２００２、２２（１０６）、５５９６−５６０８
【非特許文献４】Ｂｅｃｋ  Ａ．Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ  Ｆ．Ｒ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｒ．Ｄ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ、１９９６、３７（２４）、５５３７−５５３９
【非特許文献５】Ｌｏｐｅｚ  Ｇ．Ｐ．、Ｒａｔｎｅｒ  Ｂ．Ｄ．、Ｔｉｄｗｅｌｌ  Ｃ．Ｄ．、Ｈａｙｃｏｘ  Ｃ．Ｌ．、Ｒａｐｏｚａ  Ｒ．Ｊ．、Ｈｏｒｂｅｔｔ  Ｔ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１９９２、２６、４２５−４３９
【非特許文献６】Ｈａｑｕｅ  Ｙ．、Ｒａｔｎｅｒ  Ｂ．Ｄ．、Ｊ．Ａｐｐｌｅ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、１９８６、３２、４３６９−４３８１
【非特許文献７】Ｙａｓｕｄａ、Ｐｌａｓｍａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５
【発明の開示】
【００１８】
我々は本明細書に炭水化物を固定する現在の方法に関連した問題を克服する方法を記述する。
【００１９】
本発明の１番目の面に従い、少なくとも１種の炭水化物分子を固定する方法を提供し、この方法は、ある表面を少なくとも１種の単量体のプラズマと接触させることでプラズマ重合体で被覆された表面を生じさせそして前記重合体表面を炭水化物分子（この炭水化物分子は未変性形態である）と接触させることを含んで成る。
【００２０】
「未変性形態」は、これに物理的にも化学的にも修飾を受けていない炭水化物または修飾を受けているとしても官能性、例えば基質特異性も結合特異性も生物学的活性も影響を受けない度合の修飾を受けている炭水化物を包含させることを意図する。本分野の技術者は、炭水化物分子の物理的特性が変化しないならば炭水化物に若干の修飾を受けさせることは可能であることを理解するであろう。しかしながら、炭水化物分子に如何なる修飾も受けさせないで未変性形態でプラズマ重合体表面と結合させるのが好適である。
【００２１】
プラズマ重合体で処理しておいた表面に未変性形態の炭水化物が受動的に吸着され得るようにするのが好適である。
【００２２】
好適には、炭水化物がプラズマ重合体表面に受動的に吸着されるようにする。受動的吸着は、これに例えば炭水化物とプラズマ重合体表面の間の非共有結合的、静電的、親水性もしくは疎水性相互作用などを包含させることを意図する。
【００２３】
本発明のさらなる面に従い、炭水化物分子を固定する方法を提供し、この方法は、
ｉ）単量体源を準備し、
ｉｉ）前記単量体のプラズマを生じさせ、
ｉｉｉ）ある表面を前記プラズマで被覆することでプラズマ重合体で被覆された表面を生じさせ、そして
ｉｖ）前記重合体で被覆された表面を少なくとも１種の炭水化物分子と接触させることで、前記重合体で被覆された表面に前記炭水化物分子を受動的に吸着させる、
段階を含んで成る。
【００２４】
本発明の好適な方法では、前記炭水化物を少なくとも１種の炭水化物分子が入っている溶液として供給する。
【００２５】
好適な方法では、前記炭水化物を生理学的ｐＨ、例えば６から８のｐＨの溶液の状態で提供する。より好適には、ｐＨを６．８から７．４の範囲にする。
【００２６】
本発明の別の好適な方法では、炭水化物分子を負に帯電させる。炭水化物は酸性条件、例えばｐＨが２．０、３．０、４．０、５．０または６．０の条件にすると負に帯電し得る。
【００２７】
本発明の好適な方法における前記単量体は揮発性アルコールである。
【００２８】
本発明の好適なさらなる方法における前記単量体は揮発性アミンである。
【００２９】
本発明の好適なさらなる方法における前記単量体は揮発性炭化水素である。
【００３０】
本発明の好適なさらなる方法における前記単量体は揮発性酸である。
【００３１】
本発明の好適な方法における前記表面は窒素含有量が少なくとも２％の重合体を含んで成る。前記窒素含有量は好適には２−２０％である。別法として、前記窒素含有量は２０％を超える。前記パーセントは表面の中の窒素原子のパーセントを指す。例えば、窒素が２０％であることは、プラズマ重合体の中の原子１００個当たり２０個が窒素であることを意味する。
【００３２】
ある表面の窒素含有量は、本明細書に開示しかつ本技術分野で公知の方法を用いて測定した窒素含有量である。窒素パーセントは例えばｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定可能である。
【００３３】
本発明の実施で使用可能な重合性単量体には、好適には、不飽和有機化合物、例えばオレフィンアミン、ハロゲン置換オレフィン、オレフィンカルボン酸およびカルボキシレート、オレフィンニトリル化合物、酸素化オレフィンおよびオレフィン炭化水素などが含まれる。そのようなオレフィンにはビニル形態およびアリル形態が含まれる。しかしながら、そのような単量体は必ずしも重合し得るオレフィンでなくてもよい。環状化合物、例えばシクロヘキサン、シクロペンタンおよびシクロプロパンなども通常はグロー放電法によってガスプラズマの状態で重合し得る。また、そのような環状化合物の誘導体、例えば１，２−ジアミノシクロヘキサンなども通常はガスプラズマの状態で重合し得る。
【００３４】
特に、ヒドロキシル、アミノまたはカルボン酸基を含有する重合性単量体が好適である。これらの中でアリルアミンを用いると特に有利な結果を得られた。重合性単量体の混合物を用いることも可能である。加うるに、重合性単量体を一般にはそれ自身は重合しないと見なされる他の気体と混合することも可能であり、その例はアルゴン、窒素および水素である。そのような重合性単量体を好適には蒸気の形態で真空槽の中に導入する。一般に、蒸気圧が５ｘ１０−３ミリバール未満の重合性単量体は本発明の実施で用いるに適切ではない。当該単量体を加熱することによって単量体の蒸気圧を高くすることができる。
【００３５】
周囲の室温で少なくとも６．６ｘ１０−２ミリバールの蒸気圧を示す重合性単量体が好適である。プラズマ重合体付着物にグラフト化する（ｇｒａｆｔｉｎｇ）単量体を用いる場合には、周囲条件下で少なくとも５ｘ１０−３ミリバールの蒸気圧を示す重合性単量体が特に好適である。
【００３６】
特に単量体がプラズマ重合工程で消費された後の圧力を所望度合に維持する目的で、単量体蒸気をプラズマゾーンに連続的に流し込むことが通常実施されている。真空口を通って真空源に至るポンプ輸送を同時に実施することで余分な気体の連続的除去を達成する。本発明の方法ではしばしばグロー放電ガスプラズマから重合しない気体がいくらか発生することから、ガスプラズマの圧力を、少なくともある程度ではあるが、基質にプラズマ重合体を付着させている時に真空ポンプ輸送を同時に行うことで制御するのが有利である。
【００３７】
典型的な単量体の例には、炭素原子数が２０以下、より典型的には炭素数が２−８の完全飽和および不飽和アミン化合物が含まれる。エチレン系不飽和化合物（特に第一級、第二級もしくは第三級アミン）にはアリルアミンが含まれる。飽和単量体にはメチルアミン、プロピルアミン、ヘプチルアミンおよびジアミノプロパンが含まれる。
【００３８】
本発明の好適なさらなる方法における前記重合体はアミン共重合体を含んで成る。有機アミンを飽和（アルカン）または不飽和（アルケン、ジエンまたはアルキン）炭化水素と一緒にプラズマ重合させることで、そのような共重合体を生じさせる。前記炭化水素の炭素数は２０以下（より通常は４−８）であり得る。アルカンの例はブタン、ペンタンおよびヘキサンである。アルケンの例はブテンおよびペンテンである。ジエンの例は１−７オクタジエンである。そのような共重合用単量体はまた芳香含有単量体、例えばスチレンなどであってもよい。
【００３９】
プラズマ共重合を実施する時に使用可能なアミン：炭化水素の比率は任意であるが、典型的に用いるアミン：炭化水素の比率は１００（アミン）：０（炭化水素）から２０（アミン）：８０（炭化水素）の範囲およびこれらの範囲の間のいずれかの比率である。
【００４０】
当該気体または気体混合物を真空槽の中に入れて起こさせるグロー放電の開始は、可聴周波数、マイクロ波周波数または高周波の場を前記真空槽の中の１ゾーンにか或は前記ゾーンの中に伝達することで実施可能である。特に好適には高周波（ＲＦ）放電を用い、これを、ＲＦ信号発生器につなげた電極によって前記真空槽の中の空間ゾーンの中に伝達する。単量体蒸気の中にグロー放電を生じさせかつ維持しようとする時、５０ｋＨｚの如き低い周波数で開始してかなり幅広い範囲のＲＦ信号周波数を用いてもよい。ＲＦプラズマ重合を商業的規模で用いる場合には、以下の実施例に示す如く、電磁場障害問題が起こらないように高周波を１３．５６ＭＨｚに指定するのが好適であり得る。
【００４１】
プラズマ重合体を付着させている間、グロー放電を連続的に行う必要はなく、現実に断続的であってもよい。即ち、連続的グロー放電を用いることも可能であるが、重合体を付着させている過程全体に渡ってガスプラズマへの基質表面の接触を断続的にしてもよい。または、用いる付着時間全体を所望時間にするならばグロー放電を連続的に行ないかつ結果として生じるガスプラズマへの基質表面の接触を連続的に行うことも可能である。当該基質に付着したプラズマ重合体が有する元素組成は一般に入ってくる重合性単量体１種または２種以上のそれと同じではない。プラズマ重合中に特定の元素もしくは元素群の断片化および損失が自然にいくらか起こる。このように、アリルアミンのプラズマ重合では、典型的に、プラズマ重合体の窒素含有量の方が高純度ポリアリルアミンに相当する窒素含有量よりも低い。アクリル酸のプラズマ重合でも同様に典型的にはプラズマ重合体のカルボキシル含有量の方が高純度ポリアクリル酸の相当するそれよりも低い。グロー放電への暴露を断続的にすると、そのような未反応単量体のいずれかがガスプラズマの存在無しに接触する時間の間にその単量体がプラズマ重合体にグラフト化することで、最終的付着物の中に存在する官能基（アミンまたはカルボン酸）の濃度がいくらか高くなる。プラズマ暴露とグラフト化暴露（ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）の間の時間的間隔をほんの一瞬から数分に及んで変えることができる。
【００４２】
本発明の好適な方法では、Ｗ／ＦＭが＜１０９Ｊ／ｋｇ、理想的には＜１０８Ｊ／ｋｇ、より理想的には＜１０７Ｊ／ｋｇのプラズマからプラズマ重合体を付着させる。
【００４３】
本発明の好適な方法における前記炭水化物はホモ多糖である。
【００４４】
本発明の別の好適な方法における前記炭水化物はヘテロ多糖である。前記ヘテロ多糖は好適にはグリコサミノグリカンである。
【００４５】
本発明の好適な方法における前記炭水化物は硫酸化した生体分子（ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）、好適には高度に硫酸化した生体分子である。
【００４６】
本発明の好適なさらなる方法では、前記グリコサミノグリカンをヒアルロナン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはケラタン硫酸から成る群から選択する。
【００４７】
受動的吸着は、ある表面を炭水化物と一緒に溶液の状態で前記炭水化物が前記表面と結合するようにインキュベートすることを伴う。その結合は、前記多糖が前記表面にそれが洗浄でも生化学または化学検定で実施される典型的な過程でも脱離し得ない度合で固定されるに充分なほど強くあるべきである。その固定された多糖は、標的分子との結合がそれが溶液の状態で正常に結合すると言った結合であることで示されるように、それがそれの（未変性）生物学的活性を維持するような様式で結合しているべきである。
【００４８】
プラズマ重合体表面への受動的吸着は、多糖が入っている溶液を用いてある範囲のｐＨに渡って実施可能である。そのｐＨは好適には３から１１、例えば４から１０、５から９、６から８または７のｐＨである。
【００４９】
プラズマ重合体表面への受動的吸着は、多糖が１ｎｇ／ｍｌ−１０ｎｇ／ｍｌ、１０−１００ｎｇ／ｍｌ、１００−１０００ｎｇ／ｍｌまたは１ｍｌ当たりミクログラムの量（１−１０μｇ／ｍｌ）の濃度で入っている溶液の状態で実施可能である。吸着は温度が２０−３７．５℃の範囲の時に最も起こり易い（排他的ではないが）。
【００５０】
吸着は燐酸塩緩衝食塩水または生理学的イオン濃度の溶液を用いて実施可能である。
【００５１】
特定の多糖、例えば持つ正味の負電荷が高い多糖（例えば硫酸化ＧＡＧ、例えばヘパリン）をプラスチックの表面に吸着させるのは達成が困難であることが本分野の技術者に良く知られている。生化学および化学検定で利用されるプラスチック品（例えば培養皿、９６穴ミクロタイタープレートなど）は典型的にポリスチレンで作られている（結合特性を向上させる目的で表面が処理されている可能性はあるが）。表面処理にはコロナ、プラズマ、酸もしくはアルカリ濯ぎおよび炎が含まれ得る。そのような処理を受けさせると、プラスチックの表面にある範囲の新しい官能性、主に酸素（アルコール、エーテル、カルボニルおよびカルボキシルばかりでなくパーオキサイド）が導入される。しかしながら、負に帯電している分子の受動的吸着はそのような官能性単独では助長されない。
【００５２】
検定では、当該多糖を純粋に吸着させるのが好適である。その上、その多糖が汚染される（例えばアルブミンまたは塩によって）ことも固定用表面に修飾を受けさせる［例えば１番目の生体分子（例えばアルブミン）（これを次に多糖と結合させる）を結合させることなどによる］こともないのが好適である。
【００５３】
本発明の好適なさらなる方法における前記表面はバイオセンサーの一部である。
【００５４】
バイオセンサーはあるサンプルに存在する生体分子がバイオセンサーの表面に存在する炭水化物分子と直接または間接的に結合することでそれを検出することができるように炭水化物で被覆された表面を生じさせることで加工可能であることは明らかであろう。プラズマ重合方法を用いることで、あるサンプルの中に存在する分子を感度良く検出することができるように固定された炭水化物が未変性形態で存在する均一な表面を生じさせることができる。
【００５５】
本発明の好適なさらなる方法における前記表面は治療媒体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖｅｈｉｃｌｅ）の一部である。
【００５６】
治療媒体には、細胞を創傷に送達する手段が含まれ、それには、例として、弁（例えば心臓弁）、人工器官、移植片、マトリックス、ステント、生分解性マトリックス、重合体フィルム、創傷包帯、例えば包帯、ガーゼ、テープまたはギブスなどが含まれる。移植可能な機器をグリコサミノグリカンと結合させておくと一体性と安定性が向上することが分かっている（ＷＯ００／６４３７１を参照）。本発明は、プラズマ重合体がグリコサミノグリカンで被覆されている表面を含んで成る媒体を記述し、これは、従来技術の媒体に比べて向上した特性を有する。その上、創傷包帯をグリコサミノグリカンで被覆しておくと、それは組織修復に関与していて治癒を向上させる細胞（例えば線維芽細胞、内皮細胞）を引き寄せる化学走性を示すようになる（米国特許第４８３７０２４号を参照）。包帯をグリコサミノグリカン、特にヘパリン、ヘパラン硫酸またはアルギネートで被覆しておく。
【００５７】
本発明の好適なさらなる方法における前記表面は細胞培養表面である。
【００５８】
本発明の好適なさらなる方法における前記表面は、生物学的サンプルを動物、好適にはヒトから採集する時に用いられる機器の一部である。
【００５９】
例えば血液または血清サンプルを採集する時に用いられる機器には、シリンジ、血液採集用バッグ、プラスチック製ボトルなどが含まれ、それらに入れる血液が凝固しないようにそれらをヘパリンで被覆しておく。また、腎臓透析で用いられる機器、例えば透析用管類なども含まれる。
【００６０】
本発明のさらなる方法における前記表面は、アフィニティー精製用マトリックスの一部である。
【００６１】
アフィニティー精製は、不活性なマトリックスに固定しておいた分子と結合する生物学的分子を単離する良く知られた方法である。その固定しておく分子は蛋白質（例えばリガンド、受容体、抗体）であり、それは複雑なしばしば分別されていないサンプルに入っている標的分子に親和性を示す。本発明に従う方法で入手可能な表面は、その固定した炭水化物がこれの未変性構造を維持する確率が高いことで個々のグリコサミノグリカンに特異性を示す蛋白質の結合を助長することから、その点で特に有用な特性を有するであろう。
【００６２】
本発明の好適なさらなる方法における前記表面はマイクロアレイの一部である。
【００６３】
ゲノミクス分析は、典型的にはゲノム配列決定プロジェクトから得られた配列情報（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質）の分析を伴う。この目的で固定しておいた生体分子は、典型的に、アレイまたはマイクロアレイと呼ばれる。アレイは二次元のシートであり、このシート上のいろいろな部分にいろいろな生体分子を付着させておく。それによって、生体分子の選別を並列して実施することが容易になりかつ通常の固相検定に比べてずっと小さい規模で実施することが容易になる。
【００６４】
典型的には、生体分子を化学結合または吸着で固定することが行われている。現在では、当該分子がアレイ表面と結合するか或は拘束され得る条件下で一定分量のサンプルを付着させることで生体分子のアレイを生じさせることが行われている。
【００６５】
別法としてか或は追加的に、生体分子をアレイ表面上で合成して直接または間接的に固定することも可能である。単一のアレイに付着させるいろいろなサンプルの数は数千に到達することもあり得る。
【００６６】
アレイを形成するサンプルの付着を「アレイプリンター」を用いて助長することができる（例えばＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ａｒｒａｙｓ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＩＢＣ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｅｒｉｅｓ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ，ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ：Ａｎａｌｙｓｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２：１１０−５、１９９６を参照）。市販の「アレイ読み取り装置」（例えば米国特許第５，５４５，５３１号に開示されているようにアレイから生じさせたデータを補間する目的で用いられる）を用いてマイクロアレイの分析を行う。アレイを典型的には個々別々に作成しそして１回のみ使用した後に処分する。従って、作成されたアレイの再現性の度合が高くかつ誤差が最小限であるようにそれを生じさせるのが非常に望ましい。
【００６７】
本発明の方法を用いて得られる表面を含んで成るアレイを用いると、例えばグリコサミノグリカンと結合する蛋白質を結合させることが可能になるであろう。特定のグリコサミノグリカンまたはグリコサミノグリカン組み合わせに特定の特異性および／または親和性を示す蛋白質を複雑な混合物から同定するのが容易になるように、いろいろな種類のグリコサミノグリカンを含有するアレイを生じさせることができる。
【００６８】
本発明の１つの面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成るバイオセンサーを提供する。
【００６９】
本発明のさらなる面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成る治療媒体を提供する。
【００７０】
本発明のさらなる面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成るサンプル採集用機器を提供する。
【００７１】
本発明のさらなる面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成るアフィニティー精製用マトリックスを提供する。
【００７２】
本発明のさらなる面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成るマイクロアレイを提供する。
【００７３】
本発明のさらなる面に従い、本発明に従う方法で入手可能な表面を含んで成る細胞培養装置を提供する。
【００７４】
本発明の態様をここに下記の材料、方法および図を参照することで単に例として記述する。
【実施例１】
【００７５】
材料および方法
プラズマ重合
アリルアミンを単量体として用いたプラズマ重合を９６穴ミクロタイター上で実施した。流量を１−５ｃｍ３ｓｔｐ分−１にしかつ反応槽の圧力を約２ｘ１０−２ミリバールにして１０Ｗ未満のＲＦ（１３．５６ＭＨｚ）電力を用いた。付着させた膜の化学的性質をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）で分析した。そのプラズマ装置の図式図を図１に示す。
ヘパリンの吸着
ＰＢＳに由来するヘパリンを室温でアリルアミン被覆部分および未被覆部分（製造業者独自の処理）の両方に一晩吸着させた。標準的ＥＬＩＳＡ方法に従って、結合しなかったヘパリンを表面から洗い流した後、結合している残りの分子をビオチニル化検出用分子（即ちヒトＴＳＧ−６に由来するリンクモジュール）［Ｍａｈｏｎｅｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、２２７６４−２２７７１（２００１）；Ｐａｒｋａｒ  ＆  Ｄａｙ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１０、４１３−４１７（１９９７）］を用いて検出した。
【００７６】
色が発生し、プレート読み取り装置を用いてそれを通常様式で測定した。アリルアミンで処理しておいたプレートおよび未処理プレートへの吸着を図２に示した濃度範囲に渡って個別に４回測定した結果の平均を図２に示す。図３に、同じ検出装置を用いた時の異なる３種類のヘパリン調合物［即ち高Ｍｒ（ＨＭｗ  Ｈｐ；また以前の検定でも用いた）、低Ｍｒ（ＬＭｗ  Ｈｐ）および限定した十糖（Ｈｐ  １０−ｍｅｒ）］の比較を示す。図４に、ＨＭｗ  Ｈｐを５００ｎｇ／穴で被覆して、いろいろな検出用蛋白質（マウスケモカインＫＣ；この場合にはビオチニル化抗体を用いて結合を測定した）をある範囲の濃度で用いた時の検定を示す。図２および３に示した結合検定は６．０のｐＨで実施した検定である一方、図４に示した実験は７．２のｐＨで実施した実験である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、プラズマ装置の図式図である。
【図２】アリルアミンのプラズマ重合体で被覆しておいたプレートへのヘパリン結合。
【図３】アリルアミンのプラズマ重合体で被覆しておいたプレートへのいろいろなヘパリン調合物の結合。
【図４】アリルアミンのプラズマ重合体で被覆しておいたプレートに付着させたヘパリンへのＫＣの結合。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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