(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を複数の細胞内に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を複数の細胞が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した同一視野中の複数の細胞画像を個別に解析する工程を含むことを特徴とする生物学的相互作用の解析方法。
【請求項２】
前記個別の細胞画像における微弱光の有無および／または量が、相互作用と相関する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の解析方法において、生物学的励起物質が、生物発光をもたらす成分を含んでいる解析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の解析方法において、生物発光をもたらす成分が発光反応のための基質を均一に含んでいる解析方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法において、生物学的励起物質の活性に影響を与える化学的刺激物質との相互作用を評価する工程を含んでいる解析方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の方法において、生物学的励起物質の活性に影響を与える物理学的刺激との相互作用を評価する工程を含んでいる解析方法。
【請求項７】
前記生体試料が、生細胞を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記解析工程が、同一視野中の複数の細胞を統計的に計測する計測工程を含んでいる解析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記計測工程が少なくとも検出可能な発光を生じている細胞数を算出する工程を含んでいる解析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記計数工程が細胞ごとの発光量に応じたグループ別に分別する工程を含んでいる解析方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の方法において、前記計測工程による結果情報を細胞画像上に対応付けて視認可能に表現する工程を含んでいる解析方法。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれかに記載の方法において、前記撮像工程が多数の異なるタイミングで実行されるとともに、計測工程による結果情報を、時間軸に沿ってリアルタイムに出力するか或いは発光反応の活性曲線に沿って同期させて出力する工程を含んでいる解析方法。
【請求項１３】
細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を同一細胞または同一組織の異なる複数部位に対して同時に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した同一細胞ないし同一組織中の複数の部位に関する情報を撮像した画像情報に基づいて解析する工程を含むことを特徴とする生物学的相互作用の解析方法。
【請求項１４】
細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を同一細胞または同一組織の特定の場所ないし分布状態で存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら時系列で撮像し、撮像した同一細胞ないし同一組織中の複数の部位に関する情報を撮像した画像情報に基づいて前記発光物質の場所ないし分布状態の変化を解析する工程を含むことを特徴とする生物学的相互作用の解析方法。
【請求項１５】
細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、相互作用し得る複数種類の相互作用物質を生物学的励起物質としての発光物質を標識した状態で前記細胞または組織内に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した画像情報に基づいて前記相互作用物質ごとに解析する工程を含むことを特徴とする生物学的相互作用の解析方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記複数種類の相互作用物質が光学的に識別可能な異なる光特性を有する発光物質によって別々に標識されている解析方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、前記複数種類の相互作用物質のそれぞれに特異的な化学的ないし物理学的刺激を別々のタイミングで実行する解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の生体に関連する生物学的相互作用の解析方法に関する。本発明は、例えば、細胞内の相互作用に関して生物発光を用いて定量的に検出するレポータアッセイに適用可能な解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ；Green Fluorescent Protein）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識や発光標識を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。
ＧＦＰを用いる観察では、ＧＦＰが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、ＧＦＰを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、標本に損傷を与えやすく、１〜２時間程度の観察が限度であるが、ルシフェラーゼを用いる観察では、ルシフェラーゼが自己発光酵素であり、標本に損傷を与える励起光を必要としないため、５日間程度の観察が可能である。また、蛍光は、複数回の励起光によって退色が進行するので、長期間ないし連続的解析に適さない一面が有る。さらに蛍光強度のばらつきが生じ易いので、たとえ退色の影響を補正ないし回避するような改善を実現できたとしても、蛍光強度に依存した定量的評価は実質的に不可能である。
【０００３】
ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を指標にして発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のDNA断片をつなぐことによって、そのDNA断片の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないで共発現させることによって、その遺伝子産物のレポーター遺伝子の発現に対する影響を調べることができる。さらに、蛍光と異なり、発光反応による発光はばらつきが殆ど無いので、定量的評価に適している。ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などがあるが、それぞれの目的や細胞の種類によって使い分けられている。細胞内に導入され発現しているルシフェラーゼ活性を定量的にモニターする技術としては、多数の細胞を溶解させた溶解液をルシフェリン、ATP、マグネシウムなどを含む基質溶液と反応させ、光電子増倍管を用いた発光用分光装置（以下、ルミノメーターと称する）によって発光量を計測している（特許文献１）。多数の細胞（６００万個）をウェル内で発光反応させた後に細胞を溶解して、その細胞溶液を測定用チューブに入れ替えてルミノメーター内での光量測定を行なうため、ある時点での発現量を細胞全体の平均値として計測していることとなる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２５６５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量を指標にしてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片をつなぐことによって、このＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることによって、その遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現におよぼす影響を調べることができる。ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などがあるが、これらの方法は、導入の目的や細胞の種類に応じて使い分けられる。そして、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量の測定では、細胞溶解液をルシフェリン、ＡＴＰ、マグネシウムなどを含む基質溶液と反応させた後、光電子増倍管を用いたルミノメーターによって発光量が定量される。この測定では、細胞を溶解した後に発光量が測定されるため、ある時点での発現量が細胞全体の平均値として計測される。
【０００６】
また、遺伝子の発現量の経時変化を捉えるためには、生きた細胞からの発光量を時系列に測定する必要がある。たとえば、細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を設け、培養している全細胞集団から発せられる光量を一定時間ごとに測定することによって、一定の周期性をもった発現リズムなどを計測することができる。この場合、多数の細胞その他の成分から発生する発光総量による経時的な発現量の変化が計測される。
【０００７】
一方、遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞での発現量に大きなばらつきが生じる。たとえば、ＨｅＬａ細胞などのクローン化した培養細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばらつくことがある。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも、数個の細胞は応答している場合がある。この場合、細胞全体からではなく個々の細胞での発現量を測定することが重要である。
【０００８】
さらに、ルミノメータは、多数の細胞を含んだ細胞溶液が1回の測定時点にしか使えないので、測定したい時間に応じた回数に相当する数量の細胞ならびに収容容器を最低限必要とする。しかも、異なる測定時点ごとに別々の細胞溶液を準備することにより、同一の細胞を継続して評価することができない。
【０００９】
従って、本発明は、生体試料中の任意の相互作用を直接的かつ低侵襲に検出することを目的とする。また、本発明は、特に蛍光解析では困難であるような安定な定量的解析を、発光解析により精度よく行なう細胞または組織内外の相互作用を解析する方法を提供することをさらなる目的とする。また、本発明は、発光している細胞のみを選択し、確実に遺伝子導入された細胞について、発光量、位置、形態情報等を正確に解析する方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上の課題を解決するために、本発明の解析方法は、細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を複数の細胞内に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を複数の細胞が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した同一視野中の複数の細胞画像を個別に解析する工程を含むことを特徴とする。ここで、前記個別の細胞画像における微弱光の有無および／または量が、相互作用と相関するのが好ましい。また、生物学的励起物質が、生物発光をもたらす成分を含んでいるのが好ましい。生物発光をもたらす成分が発光反応のための基質を均一に含んでいるのがさらに好ましい。
【００１１】
また、本発明の方法は、前記生物学的励起物質の活性に影響を与える化学的刺激物質との相互作用を評価する工程を含んでいるのが好ましい。また、前記生物学的励起物質の活性に影響を与える物理学的刺激との相互作用を評価する工程を含んでいるのが好ましい。また、前記生体試料が、生細胞を含んでいるのがさらに好ましい。また、前記解析工程が、同一視野中の複数の細胞を統計的に計測する計測工程を含んでいるのが好ましい。ここで、前記計測工程が少なくとも検出可能な発光を生じている細胞数を算出する工程を含んでいるのがさらに好ましい。また、前記計数工程が細胞ごとの発光量に応じたグループ別に分別する工程を含んでいるのがさらに好ましい。いずれにせよ、前記計測工程による結果情報を細胞画像上に対応付けて視認可能に表現する工程を含んでいるのが好ましい。前記表現する工程の代わりに、前記撮像工程が多数の異なるタイミングで実行されるとともに、計測工程による結果情報を、時間軸に沿ってリアルタイムに出力するか或いは発光反応の活性曲線に沿って同期させて出力する工程を含んでいる場合にも好ましい。
【００１２】
また、本発明の解析方法は、細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を同一細胞または同一組織の異なる複数部位に対して同時に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した同一細胞ないし同一組織中の複数の部位に関する情報を撮像した画像情報に基づいて解析する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の解析方法は、細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を同一細胞または同一組織の特定の場所ないし分布状態で存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら時系列で撮像し、撮像した同一細胞ないし同一組織中の複数の部位に関する情報を撮像した画像情報に基づいて前記発光物質の場所ないし分布状態の変化を解析する工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の解析方法は、細胞または組織内外の相互作用を解析する方法において、相互作用し得る複数種類の相互作用物質を生物学的励起物質としての発光物質を標識した状態で前記細胞または組織内に存在せしめ、開口数および投影倍率をそれぞれＮＡおよびβと表した場合に（ＮＡ／β）２の値が０．０１以上である対物レンズを用いて、相互作用による結果としての発光を前記細胞または組織が含まれる撮像視野によって光学的に結像させながら撮像し、撮像した画像情報に基づいて前記相互作用物質ごとに解析する工程を含むことを特徴とする。ここで、前記複数種類の相互作用物質が光学的に識別可能な異なる光特性を有する発光物質によって別々に標識されているのが好ましい。また、前記複数種類の相互作用物質のそれぞれに特異的な化学的ないし物理的刺激を別々のタイミングで実行するのが好ましい。
【００１５】
本発明によれば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞の発光像を、以下の条件を満たす光学系で撮像することが実用面で重要な鍵を握っている。本出願人による光学的実験によれば、対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できることが証明された（特願２００５−２６７５３１号参照）。さらに、本出願人は、検討を進め、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現の変動パターンが異なることも発見した（特願２００５−４４７３７号参照）。さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。これらの発光画像を蓄積型の撮像装置により顕微鏡観察する発光解析システムを発光顕微鏡と呼ぶこととする。発光顕微鏡には、好ましくは遮光のための開閉蓋（ないし開閉窓）を具備する遮光手段を有し、この遮光手段の開閉によって必要な生体試料をセットまたは交換する。目的に応じて、生体試料を収容する容器に対して化学的ないし物理学的刺激を行なう操作を手動ないし自動で行なうようにしてもよい。最良の一形態では、発光顕微鏡は公知または独自の培養装置を搭載いる。培養装置は、長期間のシステム内での解析を可能にするように、温度、湿度、ｐＨ、外気成分、培地成分、培養液成分を最適に維持する機能を備えている。
【００１６】
従って、本発明の解析方法は、細胞内外の相互作用を画像情報に基づいて解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする。
【００１７】
本発明においては、次の適用範囲が含まれる。
（１）アッセイ項目
次の広範なアッセイ項目において、微弱な発光を用いた低浸襲性でかつ直接的な解析を詳細かつ正確に実行し得る。例えば、遺伝子発現異常（例えば遺伝子発現頻度の決定および／または変動のモニタリング）、体内リズム障害関連疾患（例えば睡眠障害、過労症候群、時差ボケ）、時間薬理学的応答（例えば薬物感受性または薬物代謝活性の日内変動）、日照応答リズム（例えば植物生育速度、走光性運動活性）、化学物質応答評価（創薬スクリーニング、抗癌剤効果モニタリング、移植または遺伝子治療後の細胞（ないし生体組織）の術後経過観察、水類（ないし血清）ストレス評価）、物理学的刺激応答評価（熱ショック、電気ショック、圧力ショック）、発生学的生物活性の評価が挙げられる。
【００１８】
（２）アッセイ原理
核内移行、レセプタ受容シグナル伝達、神経細胞成長、生体日概リズムが挙げられる。
このうち、アッセイにおいて、光学的ないし熱的刺激を利用するものについては、従来の蛍光検出は複数回の励起光照射による余分な光刺激または熱上昇をもたらすが、発光においては冷光である故に、過剰な外来ビームや熱上昇による細胞への影響は殆ど無い。
【００１９】
（３）使用可能な機器
撮像装置（例えば光学顕微鏡、フォトマルチプライヤー型イメージャー（フォトマル）、イメージサイトメーター）、分光測定装置（例えばルミノメータ、積分球光度計、フォトンカウンター）が挙げられる。このうち、撮像装置は、フォトマルによる画像生成よりも、ＣＣＤカメラ（培養装置と一体化しているシステムにおいてインキュベーター温度による感度低下が問題になる場合には、冷却性能に優れるＣＣＤである方が好ましい）による画像生成の方が鮮明な画質を短時間で得易い点で好ましい。但し、生物学的活性を計測する上では、上記の撮像装置、分光測定装置のいずれであってもデータが得られる。例えば、上記撮像装置において画像が生成されるより前に生物学的活性を示すに充分な発光量（ないし発光強度）が蓄積できる。従って、上記撮像手段にいずれかを用いて発光画像を取得した場合には、同じ発光画像を用いて高感度な発光データを得ることが可能である。連続的ないし経時的（ないし時系列）な解析を行う場合には、複数回の異なる時間のうち、最少１回（好ましくは初回）の発光シグナルの取得時において画像生成を行い、それ以外は画像生成することなく、好ましくは指定された部位または部分領域について、発光データのみを繰返し得るようにすれば、評価ないし解析時間のさらなる効率化が図れる。なお、本発明において、分光測定装置を使用する場合には、生物学的試料の特定部位ないし部分領域に限定した計測が可能な手段（例えば光学的絞り）と組み合わせることにより特定の単一細胞を含む若干大きめの小フレームまたは或る程度の広がりを持った細胞集団を含む大フレームによって、受光可能な最大面積よりも小さく且つ余分な領域がなるべく含まれないような受光データを連続的ないし経時的（好ましくは時系列的）に繰返し測光するようにすればよい。
【００２０】
（４）アッセイ対象（試料）
真核動物、シアノバクテリア由来の細胞または組織が挙げられる。医学用途において、哺乳類、とくひヒトにおける検査すべき部位からバイオプシーにより切除した細胞を含む試料がとくに例示される。再生医療においては、少なくとも一部が人工的に改良ないし合成された生体試料であって、生物学的活性を良好に維持するかどうかを検査する目的に利用できる。他の一面において、本発明のアッセイ対象は、動物由来の細胞または生体組織に限らず、植物や昆虫由来の細胞または生体組織であったもよい。菌、ウイルスにおいては、従来のルミノメータでは実行されなかった容器内の部分ごとの解析が対象となり得る。ルミノメータではウエルまたはシャーレ等の容器内に無数の試料（例えば１ウェル当り１００万個以上）を重積することで強大な発光量を得るようにしている。本発明では、個々の細胞が識別できる程度の密度で容器内に収容することで、個別の細胞ないし生体組織を解析できる。個別の解析には、発光している細胞だけの個数を計算する工程を含めることができるので、細胞１個当りの正確な相互作用に関する評価が行なえる。
【００２１】
（５）本発明によって得られる進歩性有る情報
個々の細胞のそれぞれから発生する1種または複数種類の発光データである。一例として、細胞のそれぞれが異なる発光量または発光分布を示すことを統計的に解明する方法および装置を提供する。別の例として、同一の細胞から異なる種類の発光が同一または異なる時機に発生するかどうかを解明するマルチアッセイのための方法および装置を提供する。多色の発光解析を画像で実行できる点については、出願人による特願２００５−１２２７６８を引用することで、本発明に取り込んだこととし、詳しい説明は省略する。上述した特開２００５−１９２５６５号には、多数の細胞（１ウェル当り６００万個）を収容するウェル内で、２種類の生物由来が異なる発光蛋白遺伝子を同時に発光反応させる実験手法を開示している参照してもよい。
【００２２】
また、別な例として、同一の撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。また、別な例として、同一の細胞（ないし組織）の特定部位ないし一定の拡がりの有る領域についての各種変化を安定的に高精度で解析する方法および装置を提供する。分布状態撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
発光画像を用いて相互作用を評価することにより、蛍光解析では困難であった安定した定量解析を行なうことができる。また、撮像した同一視野中の複数の細胞画像を個別に解析することにより、発光解析を精度よく行なうことができる。また、同一細胞または同一組織の異なる部位における相互作用物質を発光解析により行なうことにより、より詳細な微小部分の相互作用を直接的かつ低浸襲に評価できる。また、同一の細胞（または生体組織）の異なる複数部位、もしくは特定の場所（ないし分布状態）複数種類の相互作用物質を画像情報に基づいて前記相互作用物質ごとに解析する
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下の説明において、光学条件の詳細については出願人による特願２００５−２６７５３１および特願２００５−４４７３７を参照できる。
【００２５】
実施例１  テトラサイクリンによる遺伝子発現誘導
単一細胞での経時的なレポーターアッセイの例を説明する。
このレポーターアッセイでは、まず、テトラサイクリン・リプレッサー（ＴｅｔＲ）を恒常的に発現させるベクター「pcDNA6/TR（インビトロジェン社製）」と、テトラサイクリン・オペレータ（ＴｅｔＯ２）をもつ発現ベクター「pcDNA4/TO（インビトロジェン社製）」にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとをＨｅＬａ細胞に共発現させて標本を作製する。この状態では、図１に示すように、ＴｅｔＲホモダイマーがＴｅｔＯ２領域に結合しているため、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。つぎに、図２に示すように、培養液中にテトラサイクリンを添加してＴｅｔＲホモダイマーに結合させ、ＴｅｔＲホモダイマーの立体構造を変化させることによって、ＴｅｔＯ２からＴｅｔＲホモダイマーを分離させ、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。なお、培養液は１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＤ−ＭＥＭ培地であり、１ｍＭのルシフェリンを含む。
対物レンズおよび結像レンズとして用いたレンズは、それぞれ「Ｏｉｌ、２０倍、ＮＡ０．８」および「５倍、ＮＡ０．１３」の仕様である市販の顕微鏡用対物レンズであり、倍率Ｍgに対応する総合倍率は４倍である。カメラＣ１として用いたカメラは、５℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「DP30BW（オリンパス株式会社製）」であり、ＣＣＤ３としてのＣＣＤ素子は、２／３インチ型、画素数１３６０×１０２４、画素サイズ６μｍ角である。
【００２６】
図３はテトラサイクリンを添加してから９時間後の標本の自己発光による像を１分間露光して撮像した画像である。テトラサイクリン添加後、0時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間経過後の観察画像を示してある。なお、これらの観察は、標本がインキュベーター内に載置されるため、３７℃の環境で観察を行っている。
【００２７】
図４に画像上で指定した４つの部分領域ＲＯＩ−１，ＲＯＩ−２、ＲＯＩ−３、ＲＯＩ−４について、それぞれ拡大フレームで連番表示した状態を示している。図５は、これら４つの領域ごとに、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を測定した結果を示す図である。図５に示すように、テトラサイクリンを添加した２時間後から発光が捉えられ、６〜７時間後でプラトーに達したことを示している。このように、この実施の形態にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、発光するルシフェラーゼ遺伝子の位置を特定して時系列に追跡し、発光現象の経時変化を測定することができる。
【００２８】
実施例２  HSP70B遺伝子プロモーターアッセイ
HSP70B（Heat shock Protein70B）は、熱、毒性物質、酸素不足などの環境因子によって発現が誘導されるストレスタンパク質であり、HSPは分子シャペロンとして細胞の機能調節に寄与するだけではなく、細胞内情報伝達物質としても注目されている。そこで、この実施例においてレポーターアッセイに用いたのは、pGL3-Basic Vector（プロメガ社）にHSP70Bプロモーター配列を導入したベクターである（図６）。このベクターを導入した細胞に、熱ショックなどのストレスを与えると、熱ショック因子がHSP70Bプロモーター部分に結合し、転写が開始される（図７）。ガラスボトムディッシュにて培養したHeLa細胞に前記ベクターをリポフェクション法によりトランスフェクションを行った。一晩培養後、1mM Luciferinを加え、熱刺激（43℃60分）後にて、発光顕微鏡内にて30分ごと20時間タイムラプス計測を行った。培地は、D-MEM5%FCS-10mM HEPESを用いた。はじめに明視野観察にて、細胞の形状および位置情報を得た後、発光画像を取得した。対物レンズは20倍レンズを用いて、露出時間は5分であった。
発光画像と明視野画像の重ね合わせ画像の一部を図８に示す。発光している細胞を黄色の擬似カラーで示してある。
【００２９】
1細胞が入る領域（ROI）を5箇所設定して（図９）、データ数値化・平均値のプロットを行った（図１０）。Heat shock後、10−15時間の時点でプロモーター活性が最も高かったが、5細胞間においてプロモーター活性の上昇率や活性上昇まで要する時間にかなりの開きがあった。図１０Aには、プロモーター活性が刺激後14時間前後で最大となった細胞群、図１０Bには刺激後10時間前後で最大となった細胞群を示した。  従来のルミノメーターでの観察においては、ある一定の細胞数をまとめて解析しているため、トランスフェクション効率および細胞間の違いなどは平均化されている。しかし、実際には図８に示すように、トランスフェクションされていない細胞も多く混在しており、また細胞によって発現の強弱などの違いも見られる。発光顕微鏡で、1細胞毎のデータを測定する事が可能となれば、トランスフェクション効率の違い、細胞周期による影響を考慮し解析を行うことができる。
【００３０】
実施例３  細胞内局在の観察
細胞内でのオルガネラへの局在の観察を行った結果を図１１に示す。HeLa細胞に、核、小胞体、細胞膜へ局在させるためのシグナル配列を導入したpGL3ベクターをトランスフェクションし、一晩培養後、1mM LuciferinをD-MEM5%FCS-10mM HEPES培地に加えて発光顕微鏡により観察を行った。明視野画像、発光画像、明視野と発光画像の重ね合わせを行った画像を示してある。核、小胞体、細胞膜、それぞれにおいて、目的の場所への局在が観察された。細胞内局在を検出可能であると、例えば、細胞に何らかの刺激を与えた際に細胞質から核への移行を観察することが可能となる（図１２）。例えば、核内レセプターであるグルココルチコイドレセプターを発現させ、グルココルチコイドホルモンを処理した際の核移行などの検出などがあげられる。
【００３１】
実施例４  異なる細胞間の相互作用の解析
従来行われてきた発光検出では、ルミノメーターにより平均化された発光量を計測していたが、発光顕微鏡によりイメージングを行うことで、異なる細胞間での相互作用の解析も可能となる。一例として、神経細胞とグリア細胞の解析が挙げられる。神経系は、主に神経細胞とグリア細胞の２種類の細胞で構成されており、神経細胞は電気的活動とシナプス結合を介して脳の情報処理に対して中心的な役割を果たしているが、グリア細胞にはそのような電気的活動性はなく、神経細胞の周囲を取り巻いて神経細胞の活動をサポートする役割をしていると考えられている。神経細胞の周囲にあるグリア細胞の果たす役割にはまだ解明されてない部分も多い。
【００３２】
実施例５  組織における発光レポーターアッセイ
細胞での発光レポーターアッセイだけではなく、対象として組織サンプルが挙げられる。例えば脳スライス組織を利用する事で、生物時計の座であり生物に昼と夜の違いをもたらす場所である視交叉上核において、細胞毎に異なる周期・位相などを捕らえる事が可能となる。
【００３３】
本発明は上述した実施の形態に限定されず、次のような変更または改良が可能である。例えば、発光物質として遺伝子として機能する発光蛋白を用いたが、遺伝子機能を持たない他の生物発光物質であってもよい。本発明では、好適には、生体試料（例えば細胞または組織）の生物学的活性にとって最小限の光マーカー物質を蓄積型の撮像装置により蓄積しながら画像化する工程を有する。この撮像工程により、蛍光解析のような、従来の走査型（スキャニング式）の高輝度解析では撮像不可能な微弱光による試料画像を取得するので、長期間、生体試料への光毒性ないし光ダメージを与えずに発光解析できる。ここにおいて、発光とは別な目的で、発光と同程度ないし半分未満の極低濃度の蛍光物質または化学発光物質を併用するようにしてもよい。また、単一の試料当りの総量を発光物質と蛍光物質とで所望の比率で分配するようにして、その発光総量が蓄積型の撮像にとって必要最小限であるように調整してもよい。
【００３４】
また、本発明で使用可能な生物発光（または化学発光）の例として、特定の関心ある遺伝子領域のプロモーターの下流に連結したレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むDNAが導入された細胞または組織が挙げられる。ルシフェラーゼをレポーターとして発現させた細胞または組織を用いることにより、所望の発現部位におけるルシフェラーゼ活性を検出することによって、転写の経時的変化を実時間で検出することが可能である。
【００３５】
好ましい態様は、導入した発光遺伝子が末梢組織中でリズムを有するように発現される脊椎動物由来の細胞または組織である。末梢組織には、肝臓、肺、および骨格筋が含まれるが、これらに限定されることはない。これらの末梢組織は、7〜12時間の位相差でもって概日リズムを刻んでいることが報告されている。概日リズムの遅延パターンを示したことは、多器官から構成される複雑な哺乳動物の生物リズムの正常な協調性を反映したものと考えられる。
【００３６】
これによれば、本発明により解析した情報が、概日リズムと関係のある時差ぼけまたは睡眠障害の機序を解明するため、ならびに概日リズム障害の治療に有用な化合物のスクリーニングおよび試験を目的として用いる哺乳動物モデルを開発するために有用であるといえる。
【００３７】
また、レポーター遺伝子を発現する本発明のDNAを含む形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用ると、種々の試験またはスクリーニングを行うことができる。さまざまな任意の条件下でこれらの組織または細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を調節する刺激もしくは化合物の効果を評価すること、またはこれらをスクリーニングすることが可能である。刺激には温度、光、運動、および他のショックが含まれる。使用する化合物に制限はない。本発明は特に、本発明の形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物に導入された時計遺伝子（例えばPeriod 1）のプロモーターによって誘導される発現を改変する化合物を、その形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて試験またはスクリーニングする方法に適用可能である。
【００３８】
本発明の試験またはスクリーニングの方法としては、以下の方法が挙げられる。
方法（１）：本発明の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、（a）前記形質転換体を前記化合物で処理する段階；および（b）処理した形質転換体における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
方法（２）：本発明の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、（a）前記哺乳動物を前記化合物で処理する段階；および（b）処理した哺乳動物における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００３９】
本発明の方法は、Period 1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングするために有用である。本方法はまた、概日リズム障害に対する医薬品をスクリーニングするためにも有用である。従って、上記の方法（１）、（２）に加えて、以下に挙げるスクリーニング法も本発明によって可能となる。
方法（３）： 概日リズム睡眠障害の治療に有用な医薬品の試験またはスクリーニングの方法であって、（a）本発明の形質転換体またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその医薬品で処置する段階；および （b）処置した形質転換体または哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００４０】
本発明の試験またはスクリーニングの方法に使用する化合物に特に制限はない。その例には、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成性の低分子化合物、天然または合成性の高分子化合物、組織または細胞の抽出物、微生物の培養上清、植物または海洋生物に由来する天然成分などが含まれるが、これらに限定されることはない。遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡ発現ライブラリーなどの発現産物を使用してもよい。化合物による処置の方法に特に制限はない。インビトロでの処置は、例えば化合物を培養液に添加して細胞を化合物と接触させたり、微量注入またはトランスフェクション試薬を用いて化合物を細胞内に導入することなどにより実施しうる。インビボでの治療の方法には、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または腹腔内注射；経口投与、経腸投与、筋肉内投与、または鼻腔内投与；眼への投与；注射もしくはカテーテルを介した脳内投与、脳室内投与、または末梢器官内投与などの、当業者に公知の方法が含まれる。化合物は適宜組成物として投与する。例えば、それを水、生理食塩水、緩衝液、塩、安定剤、保存剤、懸濁剤などと混合することができる。
【００４１】
レポーター遺伝子の発現は、哺乳動物または細胞が生きたまま測定することもでき、細胞を可溶化した後に測定することもできる。例えば、生組織におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定するために、実施例に示すように光電子増倍管により、または本明細書に参照として組み入れられるヤマザキ（Yamazaki、 S.）ら（Science、2000、288、682〜685）に記載された他の類似の検出器により、生物発光を連続的に測定することが可能である。可溶化した組織または細胞におけるルシフェラーゼ活性は、例えば、ルシフェラーゼレポーター二重アッセイ系（Dual-Luciferase Reporter Assay System）（Promega）などを使用して測定することができる。レポーター遺伝子の発現は、時間的または空間的に測定することができる。発現リズムの位相、振幅、および／または周期を検出することによって発現を分析することもできる。本発明の方法により、化合物の即時的または長期的な効果（位相変化を含む）の評価が可能となる。化合物の投与によってこれらの発現が改変されれば、その化合物はPeriod 1遺伝子の発現を調節する薬剤候補となる。このような化合物は、睡眠障害を含むさまざまな概日リズム障害に対する医薬品として適用されることが期待される。例えば、レポーター遺伝子の発現の振動をリセットまたは開始する薬剤は、ペースメーカの位相を後退または前進させると期待される。したがって、これらの薬剤は脱同調した発現パターンを正常な同調に導くために使用することができる。本発明によってスクリーニングされる医薬品は、薬剤の治療効果を評価するために、概日リズム障害モデルとなるように誘導した本発明のトランスジェニック哺乳動物に投与される。
【００４２】
トランスジェニック哺乳動物における遺伝子の発現を検出する場合、測定する器官に特に制限はなく、これには視床下部のSCNを含む中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）、ならびに肝臓、肺、および骨格筋を非制限的に含む他の末梢組織が含まれる。本発明で開示する系は、SCNおよび末梢組織におけるPeriod 1発現の位相関係および同調機構を評価するために有用である。
【００４３】
本発明の系は、Period 1の発現を調節すると推定される多くの因子を同定するために使用され得る。概日リズムと関係のある新規なインビボ因子および遺伝子が本発明の系を用いて同定されれば、これらの因子および遺伝子の発現のインビボでの振動を評価することができる。それにより、SCNおよび末梢組織の振動位相を制御する因子を単離することが可能である。これらは概日リズムに関与する新規な遺伝子および蛋白質であると考えられ、これらを標的として用いることにより、新規薬剤のスクリーニングが可能になると考えられる。このようなスクリーニングはインビボおよびインビトロのどちらでも行える。
【００４４】
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いるインビボでのスクリーニング方法は以下の段階を含む方法（４）により達成される。
方法（４）：（a）概日リズムが既に決定されているトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与する段階；（b）トランスジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出し、発現リズムを検証する段階； （c）化合物の投与後のレポーター遺伝子の発現リズムを投与前のものと比較する段階；および（d）発現リズムの位相、周期、または振幅を改変する化合物を選択する段階。
【００４５】
レポーター遺伝子の発現リズムは、生きた動物の体内でのレポーター遺伝子の発現リズムを検出する方法；切り出した組織を培養することによって発現の変動を連続的に観察する方法；または動物組織の抽出物を定期的に調製して、各時点での発現レベルを検出する方法によって検出可能である。例えば、適した方法（例えば、静脈内注射、腹腔内投与、脳室内投与など）により、適切なタイミングでトランスジェニック動物にルシフェリンを投与する。続いてこの動物を麻酔し、CCDカメラによってルシフェラーゼ発光を計測することにより、レポーター遺伝子の発現部位および発現レベルを決定する。個々の動物の発現リズムを確認するために、この測定を数時間毎に数回ずつ行う（Sweeney TJら、「生きた動物における腫瘍細胞クリアランスの可視化（Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals）」、PNAS、1999、96、12044〜12049；およびContag PRら、「生きた哺乳動物における生物発光標識（Bioluminescent indicators in living mammals）」、Nature Medicine、1998、4、245〜247を参照のこと）。
【００４６】
前記の通り、インビトロでも本発明を用いて新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。このようなインビトロスクリーニング法は以下の段階を含む方法（５）により達成できる。
方法（５）： （a）本発明の形質転換体、または本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織もしくは細胞を培養する段階；  （b）形質転換体または組織もしくは細胞を適切な期間にわたって化合物で処理し、さらに培養を続ける段階；  （c）レポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出する段階；および（d）（b）の処理後にレポーター遺伝子の発現リズム（位相、周期、および振幅）を改変する化合物を選択する段階。
【００４７】
本明細書において、本発明の撮像すべき組織または細胞は、初代培養物または樹立細胞系の細胞であってもよい。本明細書で用いる組織、細胞などに制限はないが、脊椎動物におけるSCN、視床下辺縁細胞、末梢神経などが好ましい。化合物による処理は、例えば、化合物を添加しておいた溶媒中に組織、細胞などを一定期間、浸漬することによって行ってもよい。レポーター遺伝子の発現リズムの変化を測定する場合には、発現リズムがあらかじめ決定された同一の組織もしくは細胞、または化合物による処理を受けていない対照組織または細胞を用いた比較を行ってもよい。
【００４８】
上記のインビボおよびインビトロのスクリーニング方法において、光刺激などの刺激処理を、化合物の投与または処理とともに行ってもよい。
【００４９】
本発明の試験またはスクリーニングの方法により同定された化合物は、所望の概日リズム疾患または障害に対する医薬品として用いることができる。これらの薬剤は、適宜薬学的に許容される担体、溶質、および溶媒と組み合わせることによって医薬組成物として製剤化することができる。本薬剤は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの疾患または障害に対して適用することができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング法によって単離された化合物を医薬品として用いる場合には、それを患者に直接的に投与することもでき、またはそれを公知の医薬品製剤法によって医薬組成物の形態に製剤化することもできる。例えば、それを薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせた後に投与することができる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、吸入液などの形態でありうる。化合物の含有量は適宜決定してよい。これらは例えば、通常は動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または経口投与によって患者に投与することができ、このような方法は当業者に公知である。投与量は患者の体重、年齢、投与方法、および症状により変動するが、当業者であれば投与量を適宜選択することができる。一般に、投与量は薬剤の有効血中濃度および代謝時間により異なるが、1日当たりの維持用量は約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜1ｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。投与は1日当たり1回から複数回であってもよい。化合物がDNAによってコードされうる場合には、遺伝子治療を行うためにＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み入れることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１についてテトラサイクリン・オペレータ（TetO2）をもつ発現ベクターにルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドの模式図である。
【図２】テトラサイクリンの作用でTetO2からTetRホモダイマーが分離した状態を示す模式図である。
【図３】実施例１のルシフェラーゼ遺伝子を導入したHeLa細胞に対してテトラサイクリンを添加後に得られる経過時間ごとの発光画像である。
【図４】実施例１において、２０倍の対物レンズにより得られる観察用発光画像の全視野に対して測定すべき４箇所の領域を指定した状態を示す図である。
【図５】図４に示した領域ＲＯＩ−１、ＲＯＩ−２、ＲＯＩ−３、ＲＯＩ−４について、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を測定した結果を示す図である。
【図６】熱ショック蛋白であるHSP70B配列を、ＴＡＴＡボックスを介してルシフェラーゼ遺伝子配列に対してつなげた模式図である。
【図７】熱ショック因子の作用でHSP70Bプロモーター部分から転写が開始される状態を示す模式図である。
【図８】実施例２において熱刺激後６０経過した細胞の照明画像および発光画像を重ね合わせた画像を示す図である（トランスフェクションされた細胞は発光し図では白く表現されているが、それ以外の殆どの細胞はトランスフェクションされていない）。
【図９】実施例２において、２０倍の対物レンズにより得られる観察用発光画像の全視野に対して測定すべき５箇所の領域（実線で囲んだ領域）と図８で示した重ね合わせ画像の領域（点線で囲んだ領域）を指定した状態を示す図である。
【図１０】実施例２において指定した５箇所の領域ごとにタイプラプス撮像した発光画像に基づく発光量の経時的データをグラフィック表現した図である。各領域ごとの個々の細胞について、ヒートショックによるプロモータ活性が細胞群（ＲＯＩ１、ＲＯＩ２）では１４時間前後で最大となり（図１０Ａ）、細胞群（ＲＯＩ３、ＲＯＩ４、ＲＯＩ５）では１０時間前後で最大となった（図１０Ｂ）。
【図１１】オルガネラ（核、小胞体、細胞膜）ごとに細胞内で局在させた発光画像を示す図（左から順に明視野画像、発光画像、明視野と発光の重ね合わせ画像）である。
【図１２】核内レセプターを発現した細胞において核内移行を誘発する刺激処理によって移行する様子を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005153068.tif 000008
【図８】
0005153068.tif 000009
【図９】
0005153068.tif 000010
【図１０】
0005153068.tif 000011
【図１１】
0005153068.tif 000012
【図１２】
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