(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物質を定量する方法であって：
対象物質に、対象物質の変換と共にアデノシン三リン酸（ATP）を基質としてピロリン酸を生成しうる酵素を作用させて、ピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、アデノシン一リン酸（AMP）及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいて対象物質量を決定する、対象物質を定量する方法。
【請求項２】
メチオニンに、ATP存在下で、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）を作用させて、アデノシルメチオニン、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定する、メチオニンを定量する方法。
【請求項３】
シトルリンに、アスパラギン酸及びATP存在下で、アルギニノスクシネート合成酵素（ASS）を作用させて、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定する、シトルリンを定量する方法。
【請求項４】
アルギニンに、アルギニンデイミナーゼ（ADI）を作用させて、アンモニア、及びシトルリンを生成させる工程：
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定する、アルギニンを定量する方法。
【請求項５】
ピルビン酸を定量する工程が、
ピルビン酸に、（i）乳酸脱水素酵素、（ii）ピルビン酸酸化酵素、（iii）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素、又は（iv）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる工程を経るものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
試料中の、対象物質、メチオニン、シトルリン、又はアルギニンを定量するための方法であり、試料がATP又はリン酸を含んでいてもよい、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
試料が、血液由来である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項２に記載のメチオニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、AdoMetS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物を含むとして含む、キット。
【請求項９】
請求項３に記載のシトルリンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
【請求項１０】
請求項４に記載のアルギニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、ADI、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロリン酸をピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）によって反応させ、生成物であるピルビン酸を定量することで、アデノシン三リン酸（ATP）や無機リン酸が共存する反応系に適したピロリン酸定量法に関するものである。また本発明は、メチオニンをアデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）、シトルリンをアルギニノスクシネート合成酵素（ASS）、アルギニンをアルギニンデイミナーゼ（ADI）とASSによって反応させ、生成したピロリン酸を上記ピロリン酸定量法で測定することにより、上記アミノ酸を定量する方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、先天性代謝異常症のスクリーニングなどの医療分野、タンパク質加水分解物の分析などの生化学分野、及び食品又は化粧品における成分検査などの食品又は化粧品関連分野等で有用である。
【背景技術】
【０００３】
血中をはじめとする生体試料中のアミノ酸は様々な疾病検出のためのマーカーとなり、その定量法の開発は医療的見地から強く望まれている。また、酵素を用いたアミノ酸の定量法は、選択性が高く、穏和な条件で迅速に行うことができるという優れた特長を有しており、実際の医療現場で多数の試料に対して行うのに適した手法であると考えられている。特に、メチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。また、シトルリンとアルギニンは尿素回路中の代謝物の一つであり、シトルリン尿症やアルギナーゼ欠損症をはじめとする尿素回路代謝異常のバイオマーカーとなる。これらのアミノ酸の簡易・迅速な定量方法は、上記疾病検出のためのマス・スクリーニングへの適用も期待される。
【０００４】
メチオニンの酵素的定量法としては、メチオニンガンマリアーゼを用いた定量法（非特許文献1）が知られており、また機能改変フェニルアラニン脱水素酵素を用いた定量法（特許文献1）がホモシスチン尿症のマス・スクリーニングに有効であることが知られている。しかしながら、メチオニンガンマリアーゼを用いた方法では、アンモニアもメチオニンと同様に検出されてしまう。血中でアンモニアは一般に20〜50μM存在しており、これは血中Met濃度と同等以上のオーダーである。また血中アンモニア濃度は、運動やタンパク質摂取などによっても変動するので、この手法による血液試験は、アンモニアの影響を大きく受けてしまう。またメチオニンガンマリアーゼは、メチオニン以外にもシステイン、ホモシステイン等の含硫アミノ酸に対しても反応性を有する。これら含硫アミノ酸を有するサンプルにおいては、この定量法によりメチオニンを選択的に定量することは困難である。さらに機能改変型フェニルアラニン脱水素酵素は、メチオニン以外に、他の分岐鎖アミノ酸と反応性を有するため、分岐鎖アミノ酸除去の前処理が必要となる。
【０００５】
シトルリンの定量法としては、シトルリンをジアセチルモノオキシムと反応させ、生成物の発色を検出する手法が知られているが（非特許文献2）、尿素やその類縁化合物もシトルリンと同様に反応してしまうため、尿素を多量に含むような生体試料に対しては利用できない。また、酸性・高温でのインキュベーションという煩瑣な操作を要すること、停止法であるため、経時的なシトルリン生成をモニタリングできない等の問題を有している。そして、シトルリンの定量のために酵素を用いる手法は、未だ知られていない。
【０００６】
アルギニンの酵素的定量法としては、アルギナーゼとウレアーゼを用いた定量法（特許文献2）が知られている。この定量法では、尿素やアンモニアもアルギニンと同様に検出されてしまうことから、これらを含む生体試料に対しては利用できない。
【０００７】
一方、ピロリン酸の酵素的定量法として、ピロフォファターゼによってピロリン酸から無機リン酸を生成させ、無機リン酸を各種検出法で定量する手法がある（I-a）。この原理を利用したものとして、Invitrogen社からPiPer Pyrophosphate Assay Kitが、Probe社からEnzChek Pyrophosphate Assay Kitが市販されている。しかしながら、この測定法は、無機リン酸もピロリン酸と同様に検出してしまうため、無機リン酸を夾雑物質として含む試料に対しては利用することができない。また、ピロリン酸の酵素的定量法としては、ATPスルフリラーゼ又はPPDKによってピロリン酸からATPを生成させ、ATPを各種検出法で定量する手法（I-b）がある（特許文献3及び4）。この原理に基づくものとして、Lanza Rockland社からPPiLight Inorganic Pyrophosphate Assay Kitが市販されている。ここでのATPの検出には、ルシフェラーゼによる発光法、又はサイクリングアッセイ法が用いられる。しかしながら、原理上、ATPを夾雑物質として含む試料に対しては実施不可能であり、また発光法での検出は、発光が時間経過と共に急激に減衰するため、高価な発光測定機器を用いて厳密な測定環境で測定を行う必要がある。サイクリングアッセイによる検出は、高感度である一方で、吸光度をモニタリングし、厳密な反応速度を算出する必要がある等、測定は煩瑣になる。なお、この原理に基づく測定には、ATPを含有する試料中でも測定可能なように改良した手法も知られている（特許文献5参照）が、これは前処理としてATP除去を行い、その後ピロリン酸定量を行うという工程を採用するものである。そのため、反応系からATPを除去してしまっても問題のない場合であれば適用できるが、ATPを共存させておきたい反応系では利用することができない。
【０００８】
さらに、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼによりピロリン酸からヒポキサンチンを生成し、ヒポキサンチンを定量する手法（I-c）も知られている（特許文献6）。この手法は反応基質に無機リン酸及びATPを含まず、これら化合物の存在に影響を受けずにピロリン酸を測定することができる。しかしながら、この手法では、ピロリン酸消費と共にATPを再生することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2008-86312, 機能改変フェニルアラニン脱水素酵素を用いた生体試料中のＬ−メチオニンの分析方法
【特許文献２】特開平8-336399, アルギニン検出方法及びアルギニンセンサ
【特許文献３】特開2009-225784, ピロリン酸の測定方法
【特許文献４】特開2007-097471, 塩基配列決定方法と試薬
【特許文献５】特開2006-187251, ピロリン酸の定量方法
【特許文献６】特開2003-174900, ピロリン酸と核酸の定量方法及びその装置
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】平成5年度厚生省心身障害研究「マス・スクリーニングシステムの評価方法に関する研究」pp. 237-240 (1993)
【非特許文献２】Boyde, T. R. & Rahmatullah, M. (1980). Optimization of conditions for the colorimetric determination of citrulline, using diacetyl monoxime. Anal Biochem 107, 424-431.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
血漿をはじめとする生体試料中は、無機リン酸や尿素をはじめとする各種の夾雑物質を多量に含み、対象物質の分析法は、これらの夾雑物質の影響を受けないことが求められる。
【００１２】
一方、測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素は、その基質特異性の高さや、発エルゴン反応であるATP加水分解により高い反応性を有することから、測定用酵素としてきわめて有望である。そして、このようなピロリン酸生成酵素を生体試料分析に適用する前提として、ピロリン酸を定量する必要があり、このピロリン酸定量のための方法には、下記が求められる。
・無機リン酸を多量に含む生体試料でも実施可能であること。
・ATPを基質とするピロリン酸生成酵素と共役させるため、ATPの存在下で実施可能なこと。
・酵素反応の生成物蓄積の回避及び基質再生のため、ピロリン酸からATPを再生できること。
【００１３】
しかしながらこれらの要件を満たすピロリン酸定量法は知られておらず、したがって上記ピロリン酸生成酵素を利用したアミノ酸の測定が実用化されるには至っていない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、PPDKをピロリン酸と反応させ、生成するピルビン酸をピルビン酸脱水素酵素又はピルビン酸酸化酵素と反応させることで、無機リン酸やATPの共存に影響を受けず、またATPを再生可能なピロリン酸定量が可能であることを見出した。
【００１５】
さらに、AdoMetSをメチオニンと反応させ、生成するピロリン酸を上記ピロリン酸定量系で測定することで、メチオニン選択的な定量が前処理なしで可能であることを見出し、メチオニン定量系として完成させた。またASSをシトルリンと反応させ、生成するピロリン酸を上記ピロリン酸定量系で測定することで、シトルリン選択的な定量が穏和な条件で可能であることを見出し、シトルリン定量系として完成させた。さらに、ADIをアルギニンと反応させ、生成するシトルリンを上記シトルリン定量系で測定することで、アルギニン選択的な定量が可能であることを見出し、アルギニン定量系として完成させた。
【００１６】
本発明は、以下を提供する：
[1]  ピロリン酸に、アデノシン一リン酸（AMP）及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を作用させて、アデノシン三リン酸（ATP）リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてピロリン酸量を決定する、ピロリン酸を定量する方法。
[2]  ピルビン酸を定量する工程が、
ピルビン酸に、（i）乳酸脱水素酵素、（ii）ピルビン酸酸化酵素、（iii）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素、又は（iv）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる工程を経るものである、[1]に記載の方法。
[3]  試料中のピロリン酸を定量するための方法であり、試料がATP又はリン酸を含んでいてもよい、[1]に記載の方法。
[4]  試料が、血液由来である、[3]に記載の方法。
[5]  対象物質を定量する方法であって：
対象物質に、対象物質の変換と共にATPを基質としてピロリン酸を生成しうる酵素を作用させて、ピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいて対象物質量を決定する、対象物質を定量する方法。
[6]  メチオニンに、ATP存在下で、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）を作用させて、アデノシルメチオニン、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定する、メチオニンを定量する方法。
[7]  シトルリンに、アスパラギン酸及びATP存在下で、アルギニノスクシネート合成酵素（ASS）を作用させて、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定する、シトルリンを定量する方法。
[8]  アルギニンに、アルギニンデイミナーゼ（ADI）を作用させて、アンモニア、及びシトルリンを生成させる工程：
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定する、アルギニンを定量する方法。
[9]  [6]に記載のメチオニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、AdoMetS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物を含むとして含む、キット。
[10]  [7]に記載のシトルリンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
[11]  [8]に記載のアルギニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、ADI、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のピロリン酸定量法は、無機リン酸又はATPの存在下でも定量能に影響を受けないため、血液のような夾雑物の多い試料中で実施することができる。また、PPDKを用いているため、ATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素との共役系では、ピロリン酸からATPを再生することができる。本発明は、反応終了後、定量のためのシグナル強度の変化が少ない系とすることができ、また吸光度検出による系とすることができるため、簡便に、また発光検出器のような高価な専用機器のない測定環境でも実施することができる。
【００１８】
本発明のメチオニン定量法は、メチオニン以外のアミノ酸又はアンモニアを含む試料と対象として、前処理なしに実施することができる。また停止法ではなく、試料中のほぼすべてのメチオニンをピロリン酸相当量として定量することができるため、経時的にメチオニン生成をモニタリングすることが容易である。
【００１９】
本発明のシトルリン定量法は、シトルリン以外のアミノ酸又は尿素を含む試料を対象として、前処理なしに実施することができる。また、高温でのインキュベーションは不要であり、また経時的にシトルリン生成をモニタリングすることが容易である。
【００２０】
本発明のアルギニン定量法は、アルギニン及びシトルリン以外のアミノ酸、尿素又はアンモニアを含む試料を対象として、前処理なしに実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は、乳酸脱水素酵素使用時のピロリン酸検量線（吸光度計）のグラフである。
【図２】図2は、乳酸脱水素酵素使用時のピロリン酸検量線（マイクロプレートリーダー）のグラフである。
【図３】図3は、ピルビン酸酸化酵素及び発色色素使用時のピロリン酸検量線のグラフである。
【図４】図4は、ピルビン酸酸化酵素及び蛍光色素使用時のピロリン酸検量線のグラフである。
【図５】図5は、リン酸又はATPが共存する反応液で作成したピロリン酸検量線のグラフである。
【図６】図6は、生体試料中でのピロリン酸添加試験のグラフである。
【図７】図7は、メチオニン検量線のグラフである。
【図８】図8は、シトルリン検量線のグラフである。
【図９】図9は、アルギニン検量線のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、新規なピロリン酸の定量方法を提供し、またそれを利用したメチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法を提供する。
【００２３】
本発明で、対象物質に関し「定量（する）」というときは、特に記載した場合を除き、その対象物質の量を測定することをいい、その量は、絶対量のほか、試料中の濃度として測定されることもある。
【００２４】
＜ピロリン酸の定量方法＞
本発明のピロリン酸の定量方法は：
ピロリン酸に、金属イオン、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させて、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(I-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(I-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてピロリン酸量を決定するものである。
【００２５】
工程(I-A)は、被検試料中のピロリン酸を、PPDK、金属イオン、AMP及びPEPとともに、インキュベーションすることで行なうことができる。PPDKが触媒するこの反応は、以下の反応式で表される。
【００２６】
【化１】
0005303715.tif 000002
【００２７】
なお、本発明で「リン酸」というときは、特に記載した場合を除き、無機リン酸（H3PO4）を指す。リン酸は、オルトリン酸ということもある。
【００２８】
本発明に用いるPPDKは、上記の反応について触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されない。例えば、Propionibacterium属由来のもの、又はThermoproteus属由来のもの、より特定すれば、Propionibacterium freudenreichii（Pf）由来のものか、又はThermoproteus tenax（Tt）由来のものを、好適に用いることができる。Pf由来のPPDKは、バクテリア由来のものとしてよく研究された酵素の一つである。大腸菌発現系での発現量が多く期待でき、またglycerolと混合した状態では4℃で安定に保存でき、また凍結融解を繰り返しても顕著な活性の減少が見られないという点で、優れている。Tt由来のPPDKは、Ttが超好熱性生物であることから、常温での精製が可能であり、かつ高温でも変性せず、使用可能であることが期待できる点で優れている。より具体的には、Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NBRC12426株由来のものか、又はThermoproteus tenax NBRC100435株由来のものを、好適に用いることができる。
【００２９】
使用するPPDKの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、PPDKの純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用するPPDKの量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００３０】
工程(I-A)は、AMPの存在下で実施される。存在するAMPの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
【００３１】
工程(I-A)はまた、PEP等の高エネルギーリン酸化合物の存在下で実施される。存在するPEPの量は、下限は0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
【００３２】
工程(I-A)は、金属イオンの存在下で実施されることが好ましい。金属イオンは、マグネシウムイオン、コバルトイオン、又はマンガンイオンのうちいずれかであることができるが、マグネシウムイオンであることが好ましい。使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限は、AMPの濃度に対して0.1当量以上であることが好ましく、0.2当量以上であることがさらに好ましく、0.4当量以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10当量以下であることが好ましく、5当量以下であることがより好ましく、2.5当量以下であることがさらに好ましい。最も好ましい濃度はリン酸供与体の0.5〜2当量、例えば1当量である。
【００３３】
工程(I-B)では、反応系中のピルビン酸を定量するが、例えば乳酸脱水素酵素反応を利用することにより実施することができる。乳酸脱水素酵素は、広範な生物種に分布する酵素であり、下記の反応を触媒する。
【００３４】
【化２】
0005303715.tif 000003
【００３５】
本発明には、乳酸脱水素酵素としては、各種の生物由来のものを用いることができる。例えば、ウサギ、ブタ、ウシ、トリ、乳酸菌、又は酵母由来の、各種のものが市販されており、これらのいずれかを好適に用いることができる。
【００３６】
使用する乳酸脱水素酵素の量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.002U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることが好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、4U/ml以下であることが好ましく、2U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００３７】
工程(I-B)はまた、NADHの存在下で実施される。NADH濃度は、低過ぎては吸光度の検出が困難であり、また高過ぎては減少量測定値の正確性が低下する等、影響が比較的大きい。存在するNADHの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.02ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、4ｍＭ以下であることが好ましく、2ｍＭ以下であることがより好ましく、1ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
【００３８】
乳酸脱水素酵素を用いる系においては、340 nmの吸光度を測定することで、反応進行に伴うNADH減少量を計測し、ピルビン酸生成量が算出される。
【００３９】
乳酸脱水素酵素を用いる工程(I-B)は、工程(I-A)と同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のピロリン酸をNADHの酸化に用いることができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。同一系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2：  0.5〜50 mM
PEP：  0.05〜5 mM
AMP：  0.05〜5 mM
NADH：  0.05〜1 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。
【００４０】
工程(I-B)は、ピルビン酸酸化酵素による反応を利用し、過酸化水素検出系により実施することもできる。
ピルビン酸酸化酵素は、下記の反応を触媒する。
【００４１】
【化３】
0005303715.tif 000004
【００４２】
本発明に用いることができるピルビン酸酸化酵素としては、特に制限はなく、各種の生物由来のもの、例えばPseudomonas属由来のものを好適に用いることができる。
【００４３】
使用するピルビン酸酸化酵素の量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.03U/ml以上であることが好ましく、0.07U/ml以上であることがより好ましく、0.15U/ml以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、60U/ml以下であることが好ましく、30U/ml以下であることがより好ましく、15U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００４４】
ピルビン酸酸化酵素の作用により生じる過酸化水素は、公知の方法で定量でき、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定することができる。使用可能なペルオキシダーゼとしては、過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。
【００４５】
使用するペルオキシダーゼの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.03U/ml以上であることが好ましく、0.07U/ml以上であることがより好ましく、0.15U/ml以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、300U/ml以下であることが好ましく、150U/ml以下であることがより好ましく、75U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００４６】
また、ペルオキシダーゼと反応する電子受容体は、使用するペルオキシダーゼの基質となり得る発色剤又は蛍光剤であれば使用可能である。発色剤としては、例えば4-アミノアンチピリン：フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼにより、過酸化水素と上記発色剤は以下に示すように反応し、生成物であるキノンイミン色素を505 nmの吸光で検出可能である。
【００４７】
【化４】
0005303715.tif 000005
【００４８】
またペルオキシダーゼと反応する蛍光剤としては、10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP)などが挙げられる。洋わさび由来ペルオキシダーゼにより、過酸化水素とADHPの反応により蛍光物質であるresorufinが生成し、590 nmの蛍光（励起光530 nm）で検出可能である。4-アミノアンチピリンやADHP等の発色剤や蛍光剤は、当業者であれば、使用されるペルオキシダーゼの種類に応じて、適宜選択することができる。また検出のための波長も、当業者であれば、使用される発色剤や蛍光剤の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４９】
ピルビン酸酸化酵素を用いる工程(I-B)もまた、工程(I-A)と同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のピロリン酸を過酸化水素の生成に用いることができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。
【００５０】
4-アミノアンチピリン及びフェノールを用い、すべての工程を同一系中で実施する場合、各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl：  2.5〜250 mM
NH4Cl：  1〜100 mM
PEP：  0.05〜5 mM
AMP：  0.05〜5 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
4-アミノアンチピリン：  0.1〜10 mM
フェノール：  0.1〜10 mM
ピルビン酸酸化酵素：  0.15〜15 U/ml 
ペルオキシダーゼ： 0.15〜75 U/ml
4-アミノアンチピリン及びフェノールを用いる態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。
【００５１】
ADHPを用い、すべての工程を同一系中で実施する場合、各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2：  0.5〜50 mM
NH4Cl：  1〜100 mM
PEP：  0.05〜5 mM
AMP：  0.05〜5 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
Na-PO4：  0.05〜5 mM
ADHP：  50 μM
ピルビン酸酸化酵素：  0.15〜15 U/ml
ペルオキシダーゼ：  0.15〜75 U/ml
ADHPを用いる態様では、少なくとも0〜10μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。この態様により、極微量のピロリン酸を測定可能である。
【００５２】
工程(I-B)は、上述の2種類の酵素のほか、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する系として構築してもよい。この系は、ピルビン酸以外の2−オキソ酸でも同様に発色する場合があることに留意するとよい。工程(I-B)はまた、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程として構築してもよい。さらに、ピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。これらの工程を実施するために必要な条件は、当業者であれば、適宜設計することができる。
【００５３】
本発明のピロリン酸の定量方法は、リン酸やATPの共存下でも実施可能である。また、ATPを生成することができるという利点を有する。ピロリン酸の定量のための従来法としては、ピロフォファターゼによってピロリン酸から無機リン酸を生成させ、無機リン酸を各種検出法で定量する手法（I-a）、ATPスルフリラーゼ又はPPDKによってピロリン酸からATPを生成させ、ATPを各種検出法で定量する手法（I-b）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼによりピロリン酸からヒポキサンチンを生成し、ヒポキサンチンを定量する手法（I-c）が存在するが、このような特徴を具備するものではない。
【００５４】
本発明の方法及び従来法について、下表にまとめた。
【００５５】
【表１】
0005303715.tif 000006
【００５６】
本発明のピルビン酸の定量方法は、ATP共存下でも実施することができるので、測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素反応と共役（複数の酵素による、連続反応。「カップリング」と同義。特に、一方の酵素の生成物がもう一方の酵素の基質として使われる連続反応を指す。）させて、対象物質を定量する方法において、用いることができる。測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素は、その基質特異性の高さや、発エルゴン反応であるATP加水分解により高い反応性を有することから、測定用酵素としてきわめて有望である。測定対象物質としては、メチオニン、シトルリン、アルギニンが挙げられる。
【００５７】
ピロリン酸依存的な吸光度減少を測定する本発明においては、ごく弱いながらピロリン酸非依存的な吸光度減少も起こりうる。この非依存的な吸光度減少の速度は、PPDK添加量と比例関係にある。そのため、大過剰量のPPDKを反応液中に添加してしまうと、ピロリン酸非依存的な吸光度減少が大きくなり、誤差の原因となりうる。そのため、本発明においては、併用する酵素（乳酸脱水素酵素、後述するAdoMetS等）に比較し、PPDKの活性量を抑えるとよい。このようにすれば、反応中でPPDKが律速段階となり、上記吸光度減少の影響が抑えられるからである。またPPDKは可逆反応を触媒する酵素であり、単独でピロリン酸存在下で反応させても、ピロリン酸を完全に消費しきる前に平衡に達しうる。しかしながら、本発明の、同じ系内で同時に進行させる態様では、乳酸脱水素酵素（十分量のNADH存在下ではほぼ完全に乳酸生成方向に傾く。）や、ピルビン酸酸化酵素（不可逆反応）といった、反応を実質的に不可逆的に触媒する酵素とカップリングさせることで、ピロリン酸をほぼ完全に変換することができる。また、後述するAdoMetS、ASS、及びADIも、不可逆性の強い酵素であり、基質をほぼ完全に反応させることに寄与していると考えられる。
【００５８】
なお、このような観点からは、同じ系内で実施する場合の本発明においては、PPDK量は、例えば、乳酸脱水素酵素の1/20〜1/2、好ましくは1/10〜1/2とすることができ、またAdoMetS、ASS又はADIの1/10〜1/1.5、好ましくは1/5〜1/1.5とすることができる。
【００５９】
＜メチオニンの定量方法＞
本発明のメチオニンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(II-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(II-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定するが、ピロリン酸は、工程(II-C)、すなわちメチオニンに、ATP存在下で、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）を作用させて、アデノシルメチオニン、及びピロリン酸を生成させる工程により、生成されたものである。
【００６０】
工程(II-C)は、被検試料中のメチオニンを、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）、ATPとともにインキュベーションすることで行なうことができる。このAdoMetSが触媒する反応は、以下の反応式で表される。
【００６１】
【化５】
0005303715.tif 000007
【００６２】
なお、本発明で「メチオニン」というときは、特に記載した場合を除き、L-メチオニンをいう。また「アデノシルメチオニン合成酵素」は、一般には、「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素」又は「メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ」と称されることもある。
【００６３】
本発明には、AdoMetSとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。AdoMetSは比較的広い範囲の微生物に分布している。例えば、大腸菌又は酵母由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。大腸菌を宿主として発現させ、用いる場合には、宿主由来酵素であればより高い発現量が得られると予想されるので、大腸菌由来のものを選択してもよい。
【００６４】
使用するAdoMetSの量は、メチオニンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるメチオニンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００６５】
前掲工程(I-A)及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(II-A)及び工程(II-B)に当てはまる。
【００６６】
工程(II-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。
【００６７】
工程(II-A)、工程(II-B)及び工程（II−C）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のメチオニンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。
【００６８】
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2：  0.5〜50 mM
ATP：  0.1〜10 mM
PEP：  0.04〜4 mM
AMP：  0.04〜4 mM
NADH：  0.025〜2.5 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
AdoMetS：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200μMの範囲で、メチオニンの定量が可能である。
【００６９】
また、本発明のこの方法は、メチオニン以外のタンパク質を構成する19種類のアミノ酸及びアンモニアが夾雑する場合であっても、メチオニンのみを選択的に定量することができる。
【００７０】
＜シトルリンの定量方法＞
本発明のシトルリンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(III-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(III-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定するが、ピロリン酸は、工程(III-C)、すなわちシトルリンに、アスパラギン酸（Asp）及びATP存在下で、アルギニノスクシネート合成酵素（ASS）を作用させて、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程により、生成されたものである。
【００７１】
工程(III-C)は、被検試料中のシトルリンを、ASS、ATP等とともにインキュベーションすることで行なうことができる。このASSが触媒する反応は、以下の反応式で表される。
【００７２】
【化６】
0005303715.tif 000008
【００７３】
ASSとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。ASSは比較的広い範囲の微生物に分布している。例えば、大腸菌又は酵母由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。大腸菌を宿主として発現させ、用いる場合には、宿主由来酵素であればより高い発現量が得られると予想されるので、大腸菌由来のものを選択してもよい。
【００７４】
使用するASSの量は、シトルリンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるシトルリンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００７５】
前掲工程(I-A) 及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(III-A) 及び工程(III-B)に当てはまる。
【００７６】
工程(III-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。
【００７７】
工程(III-A)、工程(III-B)及び工程（III−C）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のシトルリンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。
【００７８】
なお、同一の系内で行う場合、AMPはASSが関与する反応で生産されるので、その添加は理論的には必須ではないが、AMP非添加の場合、以下のような影響が出る可能性が考えられる。AMPを添加しない場合は、添加した場合に比べAMP濃度が低くなる（その時点でのピロリン酸濃度と同濃度となる）ため、PPDK反応の速度が低下しうる。特にこの影響は、反応終了間際に大きくなると考えられる。ピロリン酸が反応により消費し尽くされようとするとき、ピロリン酸濃度だけでなくAMP濃度も同等に低下し、二基質濃度の低下によりPPDK反応は顕著に進行しにくくなる可能性がある。これが原因となり、未反応のピロリン酸が多くなる可能性がある。このとき、未反応のピロリン酸の分だけ定量値が小さく見積もられてしまうので、定量値が不正確になる可能性がある。
【００７９】
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2：  0.5〜50 mM
アスパラギン酸：  0.2〜20 mM
PEP：  0.02〜2 mM
ATP：  0.1〜10 mM
AMP：  0.025〜2.5 mM
NADH：  0.025〜2.5 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
ASS：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素：  U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、シトルリンの定量が可能である。
【００８０】
また、本発明のこの方法は、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸及び尿素が夾雑する場合であっても、シトルリンのみを選択的に定量することができる。なお、被検試料中にアスパラギン酸が夾雑している場合でも、シトルリン選択的な定量は可能である。
【００８１】
＜アルギニンの定量方法＞
本発明のアルギニンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(IV-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(IV-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定するが、ピロリン酸は、アルギニンに、アルギニンデイミナーゼ（ADI）を作用させて、アンモニア、及びシトルリンを生成させる工程(IV-D)：及び
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程(IV-C)により、生成されたものである。
【００８２】
工程(IV-D)は、被検試料中のアルギニンを、アルギニンデイミナーゼ（ADI）とともにインキュベーションすることで行なうことができる。このADIが触媒する反応は、以下の反応式で表される。
【００８３】
【化７】
0005303715.tif 000009
【００８４】
なお、本発明で「アルギニン」というときは、特に記載した場合を除き、L-アルギニンをいう。
【００８５】
本発明には、ADIとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。例えば、Pseudomonas aeruginosa又は乳酸菌由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。また、ADI遺伝子を保持しており、その遺伝子産物が生理学的にも機能していると考えられているP. aeruginosa由来のものを、調製してもちいてもよい。
【００８６】
使用するADIの量は、アルギニンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるアルギニンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。
【００８７】
前掲工程(I-A) 及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(IV-A) 及び工程(IV-B)に当てはまる。また前掲工程(III-C)に関する説明は、特に記載した場合を除き、工程(IV-C) に当てはまる。
【００８８】
工程(IV-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。
【００８９】
工程(IV-A)、工程(IV-B)、工程（IV−C）及び工程（IV−D）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のアルギニンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。
【００９０】
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2：  0.5〜50 mM
アスパラギン酸：  0.2〜20 mM
PEP：  0.02〜2 mM
ATP：  0.1〜10 mM
AMP：  0.025〜2.5 mM
NADH：  0.025〜2.5 mM
PPDK：  0.01〜1 U/ml
ASS：  0.01〜1 U/ml
ADI：  0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素：  U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、アルギニンの定量が可能である。
【００９１】
また、本発明のこの方法は、アルギニン以外のタンパク質を構成する19種類のアミノ酸、尿素及びアンモニアが夾雑する場合であっても、アルギニンをのみを選択的に定量することができる。なお、被検試料中にアスパラギン酸が夾雑している場合でも、シトルリン選択的な定量は可能である。
【００９２】
＜本発明の用途等＞
メチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。また、シトルリンは体内に存在するアミノ酸の一種であり、血流促進や免疫活性化などに寄与している。その効能から、サプリメントなどの食品や医薬品で広く用いられている。また尿素回路中の代謝物の一つでもあり、シトルリン尿症をはじめとして、人体の尿素回路代謝異常を検出するバイオマーカーとしても重要視されている。そして、アルギニンはタンパク質構成アミノ酸の一種であり、食品や医薬品に含まれる重要な構成成分の一つである。また尿素回路中の代謝物の一つでもあり、アルギナーゼ欠損症をはじめとして、人体の尿素回路代謝異常を検出するバイオマーカーとしても重要視されている。本発明は、このような目的で対象物質を定量するために、用いることができる。
【００９３】
本発明のピロリン酸の定量方法、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法は、各種の生体由来の夾雑物質の共存下でも、適切に対象物質を定量することができる。したがって、本発明の各方法は、生体由来試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、汗に対して適用することができる。本発明は特に、血液由来の試料に対して実施するのに適している。なお、本発明を、ピロリン酸の定量方法を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法にも当てはまる。
【００９４】
本発明の方法は、比較的少量の対象物質の特定又は定量のために用いることができる。本発明の方法は、容量数十〜数百μlの系として実施することができる。本発明の方法を血液試料を対象に実施しようとする場合は、血液試料は、血漿や血清、乾燥ろ紙血液であることができる。乾燥ろ紙血液を用いる方法は、例えば、新生児の踵から採取した血液を専用の採血ろ紙に十分量染み込ませたものとすることができ、新生児のマス・スクリーニングにおいて、特に有用である。乾燥ろ紙血液を対象とする具体的な条件は、当業者であれば、既存のマス・スクリーニングのための方法のための条件を参考に、適宜設計できる。
【００９５】
本発明はまた、ピロリン酸の定量方法、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法のためのキット、又はコマーシャル・パッケージ（commercial package）を提供する。本発明のキット又はパッケージは、上述したような濃度範囲の各成分を、単独で又はいずれかの二以上の混合物として包含する各ユニットと、好ましくはキットの用途や使用方法が記載されたもの（箱、包装、ラベル、使用説明書等）を含む。
【００９６】
本発明により、少なくとも、メチオニン、シトルリン及びアルギニンの、簡易で迅速な定量方法が提供される。複数種類のアミノ酸の濃度の多変量解析は、病気の有無や健康状態の検査・診断のために注目されている。本発明の定量方法は、このような解析のためにも用いることができる。
【００９７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００９８】
1. 各酵素の調製例
1-1. PPDK発現プラスミドの構築
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NBRC12426株由来PPDK（PfPPDK）及びThermoproteus tenax NBRC100435株由来PPDK（TtPPDK）の発現用プラスミドを構築した。各菌体からゲノムDNAを調製した。
【００９９】
PfPPDKについて、上記ゲノムDNAを鋳型とし、データベース上のPPDK遺伝子配列（配列番号1）を元に設計したプライマー（配列番号2、3）を用いてPCRを行い、遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、PfPPDK発現用プラスミドとした。TtPPDKについて、上記ゲノムDNAを鋳型とし、データベース上のPPDK遺伝子配列（配列番号4）を元に設計したプライマー（配列番号5、6）を用いてPCRを行い、遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、TtPPDK発現用プラスミドとした。
【０１００】
各発現プラスミドをシークエンシングし、塩基配列を確認した。データベース上の遺伝子と比較して非同義置換が起きている箇所についてはQuikGeneキットによって修正し、データベース上と同じ配列の翻訳産物が得られるようにした。
【０１０１】
1-2. AdoMetS発現プラスミドの構築
Escherichia coli W3110株菌体からゲノムDNAを調製した。これを鋳型として、データベース上のAdoMetS遺伝子配列（配列番号7）を元に設計したプライマー（配列番号8、9）を用いてPCRを行い、AdoMetS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、AdoMetS発現用プラスミドとした。
【０１０２】
1-3. ASS発現プラスミドの構築
上記のE. coli W3110株ゲノムDNAを鋳型として、データベース上のASS遺伝子配列（配列番号10）を元に設計したプライマー（配列番号11、12）を用いてPCRを行い、ASS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、ASS発現用プラスミドとした。
【０１０３】
1-4. ADI発現プラスミドの構築
Pseudomonas aeruginosa PAO1株菌体からゲノムDNAを調製した。これを鋳型として、データベース上のADI遺伝子配列（配列番号13）を元に設計したプライマー（配列番号14、15）を用いてPCRを行い、AdoMetS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、AdoMetS発現用プラスミドとした。
【０１０４】
1-5. 各酵素の発現、精製
各発現用プラスミドで大腸菌BL21 (DE3)株を形質転換し、大量発現株として用いた。
各発現株を37℃の振盪培養でOD600が0.6〜0.8に達するまで培養し、IPTGを終濃度0.5 mMになるように添加することで発現誘導をかけた。発現誘導後、PPDK及びADI発現株は30℃、AdoMetS及びASS発現株は37℃で4時間振盪培養を行い、集菌した。菌体を超音波破砕し、可溶性画分に目的酵素が得られた。
【０１０５】
各発現株破砕液上清をGEヘルスケア社製Ni Sepharoseカラムにロードし、20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole溶液で洗浄後、20 mM Tris-HCl, 500 mM imidazole溶液で溶出させることによって目的酵素を精製・回収した。上記の酵素液は必要に応じて、透析や限外濾過によりimidazoleの除去及びバッファーの交換を行ってから使用した。
【０１０６】
各酵素精製液は、glycerolを終濃度20%となるように混合して-80℃で凍結保存したとき、安定に長期保存が可能であった。
【実施例２】
【０１０７】
2. ピロリン酸定量例
2-1. ピロリン酸定量の反応条件例1
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液を30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量を測定した。混合液の液量は1 ml又は200μlになるようにし、前者の場合は光路長1 cmのキュベットと吸光光度計で、後者の場合はマイクロプレート（光路長不定）とマイクロプレートリーダーで吸光度測定を行った。なお図面においては、光路長1 cmのキュベットで測定した際の吸光度をAbs、マイクロプレートで測定した際の吸光度をAUと表記した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素（ウサギ筋肉由来、オリエンタル酵母株式会社製）（濃度は検体との混合後の終濃度）
【０１０８】
2-2. ピロリン酸定量の反応条件例2
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、505 nmの吸光度の増加量をマイクロプレートリーダーで測定した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 10 mM NH4Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 mM Na-PO4, 1 mM 4-アミノアンチピリン, 1 mM フェノール, 1.5 U/ml ピルビン酸酸化酵素（PYRUVATE OXIDASE from Microorganism (Diagnostic Reagent Grade) TOYOBO ENZYMES）, 7.5 U/ml ペルオキシダーゼ（濃度は検体との混合後の終濃度）
【０１０９】
2-3. ピロリン酸定量の反応条件例3
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、590 nmの蛍光（励起光530 nm）の増加量をマイクロプレートリーダーで測定した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 10 mM NH4Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 mM Na-PO4,50μM ADHP , 1.5 U/ml ピルビン酸酸化酵素, 7.5 U/ml ペルオキシダーゼ（濃度は検体との混合後の終濃度）
【０１１０】
2-4. ピロリン酸定量の検量線作成例
各種濃度のピロリン酸標準溶液を検体として用い、検量線が作成可能か検証した。
反応条件を実施例2-1に記載のようにし、光路長1 cmのキュベットと吸光光度計で測定を行った。反応は混合後10分後には終了しており、PfPPDKを用いた系では図1(A)、TtPPDKを用いた系では図1(B)のような検量線が得られた。検量線の直線性は高く、本手法により少なくとも0〜200μMの範囲においてピロリン酸の定量が可能であることが示された。また検量線の傾きは、PfPPDKを用いたとき6.0 mM-1・cm-1、TtPPDKを用いたとき6.4 mM-1・cm-1であり、これはNADHのモル吸光係数（6.2 mM-1・cm-1）と同等な値であることから、検体中のピロリン酸のほぼ全量がNADH酸化に用いられたことが示された。
【０１１１】
反応条件を実施例2-1に記載のようにし、PfPPDKを用い、マイクロプレートとマイクロプレートリーダーで測定を行った場合の結果は図2のようになった。吸光度計を用いた場合と同様に直線性の高い検量線が得られ、本系によるピロリン酸定量がマイクロプレートリーダーでも使用可能であることが示された。
【０１１２】
実施例2-2のような反応条件でPfPPDKを用いて測定を行った結果、図3のような検量線が得られた。実施例2-1と同様に直線性の高い検量線が得られ、本系が4-アミノアンチピリンを用いた発色系でも使用可能であることが示された。
実施例2-3のような反応条件でPfPPDKを用いて測定を行った結果、図4のような検量線が得られた。0〜10μMの範囲のピロリン酸濃度で高い直線性が得られ、ADHPなどの蛍光色素を用いることで、低濃度のピロリン酸でも高感度に定量可能であることが示された。
【０１１３】
2-5. リン酸又はATP共存下におけるピロリン酸定量
本定量系がリン酸又はATP共存下でも使用可能かどうかを検証するため、下記の三種類のうちいずれかを検体として用い、ピロリン酸の検量線が作成可能かを検証した。
・各種濃度のピロリン酸標準溶液
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と0.3 mMリン酸標準溶液（濃度は反応液との混合後終濃度）
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と0.3 mM ATP標準溶液（濃度は反応液との混合後終濃度）
【０１１４】
反応条件は実施例2-1のようにし、PPDKにはPfPPDKを用いた。上記三種類のサンプルでそれぞれ測定を行った結果、図5のような検量線が得られた。各ピロリン酸濃度における吸光度や、3条件での検量線の傾きについて、リン酸又はATPの共存による顕著な差は見られなかった。よって、本ピロリン酸定量系が、リン酸又はATPの共存下でも影響を受けず、定量が可能であることが示された。
【０１１５】
2-6. 生体試料におけるピロリン酸添加回収実験例
本定量系が実際に生体試料共存下でも使用可能かどうかを検証するため、下記2種類のうちいずれかを検体として用い、ピロリン酸の検量線が作成可能かを検証した。
・各種濃度のピロリン酸標準溶液
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と50%ヒト血漿（濃度は反応液との混合後終濃度）
【０１１６】
反応条件は実施例2-1のようにし、PPDKにはPfPPDKを用いた。上記二種類のサンプルでそれぞれ測定を行った結果、図6のような検量線が得られた。各ピロリン酸濃度における吸光度や、2条件での検量線の傾きについて、ヒト血漿の共存による顕著な差は見られなかった。よって、本ピロリン酸定量系が、ヒト血漿共存下でも影響を受けず、生体試料においても定量が可能であることが示された。
【実施例３】
【０１１７】
3. メチオニン定量例
3-1. メチオニン定量の反応条件例
メチオニンを含む検体と、下記の組成のメチオニン定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
メチオニン定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.5 mM PEP, 0.4 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml AdoMetS（濃度は検体との混合後の終濃度）
【０１１８】
3-2. メチオニン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜100 μMとなるような標準メチオニン溶液又は標準ピロリン酸溶液を用いた。各サンプルのメチオニン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図7に示す。メチオニン添加サンプルでもピロリン酸添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でメチオニン定量が可能であることが示された。またメチオニン検量線とピロリン酸検量線の傾きはほぼ一致しており、反応液中のメチオニンのほぼ全てがピロリン酸に変換され反応に用いられたことが示された。
【０１１９】
3-3. 各種アミノ酸及びアンモニアとの反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200 μMとなるような各種アミノ酸及びNH4Clを用いた。なおアミノ酸としては、メチオニン以外の19種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
【０１２０】
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がメチオニン以外のタンパク質構成アミノ酸やアンモニアと反応性を有さず、選択性の高いメチオニン定量が可能であることが示された。
【実施例４】
【０１２１】
4. シトルリン定量例
4-1. シトルリン定量の反応条件例
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 2 mM アスパラギン酸, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml ASS, 0-200μMシトルリンを終濃度で含むような反応液を調製した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１２２】
4-2. シトルリン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜200 μMとなるような標準シトルリン溶液又は標準ピロリン酸溶液を用いた。各サンプルのシトルリン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図8に示す。シトルリン添加サンプルでもピロリン酸添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でシトルリン定量が可能であることが示された。またシトルリン検量線とピロリン酸検量線の傾きはほぼ一致しており、反応液中のシトルリンのほぼ全てがピロリン酸に変換され反応に用いられたことが示された。
【０１２３】
4-3. 各種アミノ酸及び尿素との反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200μMとなるような各種アミノ酸及び尿素を用いた。なおアミノ酸としては、アスパラギン酸以外の19種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
【０１２４】
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がシトルリン以外のタンパク質構成アミノ酸や尿素と反応性を有さず、選択性の高いシトルリン定量が可能であることが示された。
【実施例５】
【０１２５】
5. アルギニン定量例
5-1. アルギニン定量の反応条件例
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 2 mM アスパラギン酸, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml ASS, 0.2 U/ml ADI, 0-200μMアルギニンを終濃度で含むような反応液を調製した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１２６】
5-2. アルギニン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜200μMとなるような標準アルギニン溶液又は標準シトルリン溶液を用いた。各サンプルのアルギニン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図9に示す。アルギニン添加サンプルでもシトルリン添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でアルギニン定量が可能であることが示された。またアルギニン検量線とシトルリン検量線の傾きの差は10%程度にとどまり、反応液中のアルギニンのほぼ全てがシトルリンに変換され反応に用いられたことが示された。
【０１２７】
5-3. 各種アミノ酸、尿素及びアンモニアとの反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200μMとなるような各種アミノ酸、アンモニア、及び尿素を用いた。なおアミノ酸としては、アルギニンとアスパラギン酸以外の18種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
【０１２８】
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がアルギニンやシトルリン以外のタンパク質構成アミノ酸や尿素と反応性を有さず、選択性の高いアルギニン定量が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
メチオニンやシトルリン、アルギニンは生体内の主要なアミノ酸の一種であり、食品や医薬品に含まれる重要な構成成分の一つである。メチオニンは必須アミノ酸の一つであり、血液中コレステロールやヒスタミンの軽減、活性酸素除去といった効果が知られている一方で、大量投与は脂肪肝の原因にもなる。シトルリンは血流促進や免疫活性化などに寄与することが知られ、その効能から、サプリメントなどの食品や医薬品で広く用いられている。アルギニンは成長期に接種が必要な準必須アミノ酸であり、免疫力向上や疲労回復のため食品や医薬品に用いられている。このためこれらのアミノ酸の定量は、食品分析、医薬品・サプリメントの品質管理、過剰症・欠乏症時の血液検査及び酵素センサーとして利用が考えられる。
【０１３０】
またメチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。シトルリンとアルギニンは尿素回路中の代謝物の一つであり、シトルリン尿症やアルギナーゼ欠損症をはじめとする尿素回路代謝異常のバイオマーカーとなる。このためこれらのアミノ酸の定量は、上記疾病検出の簡便なマス・スクリーニングとしての利用も期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
配列番号1：PfPPDK遺伝子配列
配列番号2：プライマー配列
配列番号3：プライマー配列
配列番号4：TtPPDK遺伝子配列
配列番号5：プライマー配列
配列番号6：プライマー配列
配列番号7：AdoMetS遺伝子配列
配列番号8：プライマー配列
配列番号9：プライマー配列
配列番号10：ASS遺伝子配列
配列番号11：プライマー配列
配列番号12：プライマー配列
配列番号13：ADI遺伝子配列
配列番号14：プライマー配列
配列番号15：プライマー配列
【図１】
0005303715.tif 000010
【図２】
0005303715.tif 000011
【図４】
0005303715.tif 000012
【図５】
0005303715.tif 000013
【図６】
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【図７】
0005303715.tif 000015
【図８】
0005303715.tif 000016
【図９】
0005303715.tif 000017
【図３】
0005303715.tif 000018
【配列表】
0005303715000001.app