(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005135588.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする延長型アミロイドβ産生抑制剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）中、置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオの置換基が、ニトロ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基、スルフィノ基、スルフェノ基、低級アルキルスルホニル基およびシアノ基からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載の延長型アミロイドβ産生抑制剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２がニトロフェノキシ基であり、Ｒ３が水素原子である、請求項１に記載の延長型アミロイドβ産生抑制剤。
【請求項４】
延長型アミロイドβ関連疾患の予防または治療剤である、請求項１に記載の延長型アミロイドβ産生抑制剤。
【請求項５】
延長型アミロイドβ関連疾患がアルツハイマー症である、請求項４記載の延長型アミロイドβ産生抑制剤。
【請求項６】
式（Ｉ）：
【化２】
0005135588.tif 000011
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物を含む、延長型アミロイドβ産生抑制物質をスクリーニングするための試薬。
【請求項７】
被験物質について延長型アミロイドβ産生抑制作用を調べ、
式（Ｉ）：
【化３】
0005135588.tif 000012
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物が有する延長型アミロイドβ産生抑制作用よりも高い抑制作用を有する被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質として選択する工程を有する、延長型アミロイドβ産生抑制物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
上記延長型アミロイドβ産生抑制物質が、延長型アミロイドβ関連疾患の予防または治療剤の有効成分である、請求項７に記載するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する医薬組成物に関する。また本発明は当該延長型アミロイドβ産生抑制作用に基づいて、延長型アミロイドβが関与する疾患、特にアルツハイマー症の予防または治療に有効に利用できる医薬組成物に関する。さらに本発明は、延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する化合物の、上記医薬品以外の用途（例えば、スクリーニング用試薬や検査薬など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎え、アルツハイマー症などの痴呆患者数が激増している。しかし、その病態発症の分子機構は未だ明らかにされておらず、有効な治療法は見出されていないのが現状である。【０００３】
アルツハイマー症は、神経細胞の顕著な脱落を伴う進行性の神経変性疾患の代表である。アルツハイマー病（ＡＤ）の一部は遺伝子変異のある家族性ＡＤ（ＦＡＤ）であるが、大多数は家族歴のない孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である。いずれも脳内に沈着するアミロイドβペプチド（以下、単に「Ａβ」ともいう）からなる老人斑とタウ蛋白質の異常なリン酸化によって生じる神経原線維変化が特徴的な病理所見である。このため、Ａβの増加がアルツハイマー病の病態に深く関わっていると考えられている（アミロイドカスケード仮説）（非特許文献１）。【０００４】
かかるアルツハイマー症の主要病的決定因子とされるＡβは、β-アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の代謝産物であり、主として40、42または43アミノ酸残基（各々、「Ａβ40」、「Ａβ42」および「Ａβ43」とも称される）から構成される。いずれもβAPPがβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼの作用によって酵素開裂を受けることにより生成される。ＡβのＮ末端は、βAPPのメチオニン残基596とアスパラギン酸塩残基597の間のβセクレターゼ開裂により形成され（例えば、特許文献１または２参照）、またＡβのＣ末端は、βセクレターゼ開裂したβAPP断片が、さらにγセクレターゼによって38番、40番又は43番の位置で開裂することによって形成される（γ-セクレターゼの総説について、例えば特許文献３を参照のこと）。【０００５】
正常な個体では、主要なＡβとしてＡβ40とＡβ42の２つが認められるが、優性なのはＡβ40である。しかし家族性アルツハイマー症の患者ではＡβ42が正常に比べ優位に増加しており、またアルツハイマー症の病変領域で認められる神経炎プラーク中にはＡβ40に比べて非常に高い割合でＡβ42が存在している。また、Ａβ42は柔組織プラーク中に早くかつ優先的に蓄積するのに対し、Ａβ40はアミロイドプラークの早期の沈着と無関係であるという報告もされている。このため、Ａβ42が家族性アルツハイマー病患者のアミロイドプラーク沈着に主要な役割を果たしていると考えられている（例えば、非特許文献２〜５等参照のこと）。【０００６】
このようにＡβ、特にＡβ42を代表とする延長型Ａβは、アルツハイマー症の発病およびその進展に深く関わっており、それ故、これら延長型Ａβの生成を抑制する物質はアルツハイマー症の予防または治療薬となり得ると考えられる。【０００７】
たとえば、特許文献４には、或る種の非ステロイド抗炎症薬(NSAIDS)が、細胞培養物中でβAPPの開裂によって生じるＡβ42の生成および／又はレベルを低下させることが記載されており、かかる薬物がアルツハイマー症の進行を予防、遅延又は改善するのに有効であることが示唆されている。しかし、これらの薬物を用いてＡβ42レベルを有意に低下させるには多量の薬物が必要とされ、このため出血性潰瘍等の重大な胃腸副作用が問題となる（非特許文献６）。【０００８】
従って、非ステロイド抗炎症薬(NSAIDS)とは異なる機序で延長型Ａβの生成を抑制する作用を有する物質が求められている。
【非特許文献１】Hardy, J. A. & Selkoe, D. J., Science, 19, 353-356
【非特許文献２】Roherら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836
【非特許文献３】Iwatasubo, T.ら, 1994 Neuron 13:45
【非特許文献４】Yamaguchiら, 1995, Amyloid Int. J. Clin. Invest. 2:7-16
【非特許文献５】Mannら, 1996 Am. J. Pathol. 148:1257
【非特許文献６】Langmanら, 1994, Lancet 343:1075-1078
【特許文献１】米国特許第6,440,698号
【特許文献２】米国特許第5,744,346号
【特許文献３】米国特許出願、第20020025540号
【特許文献４】米国特許出願、第20020128319A1号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病の原因となる延長型Ａβの産生を抑制する作用を有する化合物について、延長型Ａβ産生抑制剤、および延長型Ａβに起因する疾患（延長型Ａβ関連疾患）、特にアルツハイマー症の予防または治療剤としての新たな用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は延長型Ａβ産生抑制剤、または延長型Ａβ関連疾患予防・治療剤、特にアルツハイマー症の予防または治療剤として有効な医薬組成物を提供することを目的とする。【００１０】
また本発明は、上記延長型Ａβの産生を抑制する作用を有する化合物を標準試薬として用いて、被験物質の中から延長型Ａβ産生抑制剤、特に上記延長型Ａβ関連疾患の予防または治療剤の有効成分として有用な候補化合物を選別する方法（スクリーニング方法）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねていたところ、一般式（Ｉ）で示される3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸およびその類縁体が、優れた延長型Ａβ産生抑制作用を備えていることを見出し、これらの化合物が延長型Ａβ産生抑制剤として、また延長型Ａβの産生に起因して生じる疾患（延長型Ａβ関連疾患）の予防または治療剤、特にアルツハイマー症の予防または治療剤として有効に利用できることを確信した。さらに、本発明者らは、かかる化合物に抗炎作用がないことを確認し、当該化合物がNSAIDSとは異なるメカニズムで延長型Ａβ産生を抑制し、このため、NSAIDSで懸念される出血性潰瘍などの副作用の心配がない、優れた延長型Ａβ関連疾患の予防または治療剤として有用であることを確信した。またこのことから、本発明者らは、上記化合物（Ｉ）を、延長型Ａβ産生抑制作用を有する標準物質（言い換えれば、陽性コントロール物質）として用いることにより、被験物質の中から、延長型Ａβ産生抑制作用を有し延長型Ａβ関連疾患の予防または治療剤の有効成分となり得る物質（延長型Ａβ産生抑制物質）を選別することが可能であると判断した。【００１２】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の態様を有するものである：
項１．式（Ｉ）：【００１３】
【化１】
0005135588.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。【００１５】
項２．延長型アミロイドβ産生抑制剤である、項１記載の医薬組成物。【００１６】
項３．一般式（Ｉ）中、置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオの置換基が、ニトロ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基、スルフィノ基、スルフェノ基、低級アルキルスルホニル基およびシアノ基からなる群から選択されるいずれかである、項１〜２のいずかに記載の医薬組成物。【００１７】
項４．一般式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２がニトロフェノキシ基であり、Ｒ３が水素原子である、項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。【００１８】
項５．延長型アミロイドβ関連疾患の予防または治療剤である、項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。【００１９】
項６．延長型アミロイドβ関連疾患がアルツハイマー症である、項５記載の医薬組成物。【００２０】
項７．項５または６に記載する医薬組成物を、延長型アミロイドβ関連疾患に罹患しているか、罹患するおそれのある被験者に投与することからなる、延長型アミロイドβ関連疾患の治療または予防方法。【００２１】
項８．式（Ｉ）：【００２２】
【化２】
0005135588.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物を含む、被験物質の中から延長型アミロイドβ産生抑制物質をスクリーニングするために用いる試薬。【００２４】
項９．上記試薬が、延長型アミロイドβ産生抑制物質のスクリーニングにおける陽性コントロール試薬である、項８に記載する試薬。【００２５】
項１０．被験物質について延長型アミロイドβ産生抑制作用を調べ、
式（Ｉ）：【００２６】
【化３】
0005135588.tif 000004
【００２７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物が有する延長型Ａβ産生抑制作用よりも高い抑制作用を有する被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質として選択する工程を有する、延長型アミロイドβ産生抑制物質をスクリーニングする方法。【００２８】
項１１．下記の工程を有する、項１０に記載する延長型アミロイドβ産生抑制物質のスクリーニング方法：
（１）β−アミロイド前駆体タンパク質（β-ＡＰＰ）を発現産生し得る細胞に、被験物質を接触させる工程、
（２）上記細胞から産生されるＡβ42の量を測定する工程、
（３）上記Ａβ42の産生量を、被験物質に代えて式（Ｉ）示される化合物若しくはその製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を用いて上記（１）および（２）の工程を行って得られる対照のＡβ42の産生量（陽性コントロール値）と対比して、陽性コントロール値より低いＡβ42の産生量を示した被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質として選別する工程。【００２９】
項１２．さらに下記の工程を有する、項１１に記載するスクリーニング方法：
（４）工程（３）で選別された延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質について、抗炎症作用を調べ、抗炎症作用がないかまたは小さい物質を、非抗炎症型の延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質として選別する工程。【００３０】
項１３．上記延長型アミロイドβ産生抑制物質が、延長型アミロイドβ関連疾患の予防または治療剤の有効成分である、項１０〜１２のいずれかに記載するスクリーニング方法。【００３１】
項１４．式（Ｉ）：【００３２】
【化４】
0005135588.tif 000005
【００３３】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、β−アミロイド前駆体タンパク質またはβ−アミロイド前駆体タンパク質発現細胞に対して適用する、延長型アミロイドβ産生の抑制方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明が提供する、3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸およびその類縁体（Ｉ）は優れた延長型Ａβ産生抑制作用を有している。従って、当該化合物（Ｉ）ならびにこれを有効成分とする組成物は、延長型Ａβ産生抑制剤、特にＡβ42産生抑制剤として、例えば試薬、検査薬または医薬等の各種用途に有効に用いることができる。また前述するように、アルツハイマー症の発症やその進展には、脳内、特に中枢神経細胞内でのＡβ、特にＡβ42を代表とする延長型Ａβの産生およびその沈着が深く関わっていることが知られている。本発明が提供する3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸およびその類縁体（Ｉ）を有効成分とする医薬組成物は、前述するように優れた延長型Ａβ産生抑制作用を有するため、アルツハイマー症の発症やその進展の予防また改善剤として有用である。さらに、これらの化合物（Ｉ）は、NSAIDSとは異なって、少量で優れた効果が得られ、また抗炎作用を有しないため、副作用の少ない有用な医薬組成物であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（１）医薬組成物およびその用法
本発明が提供する医薬組成物は、下式（Ｉ）：【００３６】
【化５】
0005135588.tif 000006
【００３７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して置換基を有していてもよいアリールオキシまたは置換基を有していてもよいアリールチオであり、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である）
で示される化合物、またはその製薬上許容される塩を有効成分とするものである。【００３８】
式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２で定義されるアリールオキシまたはアリールチオにおいて、アリール基としてはフェニル基、ナフチル基、アントリル基およびフェナントリル基を挙げることができる。好ましくはフェニル基である。なお、Ｒ１およびＲ２は、アリールオキシおよびアリールチオのいずれでもよい。好ましくはアリールオキシであり、特に好ましくはフェノキシ基である。【００３９】
また、Ｒ１およびＲ２で定義される「置換基を有していてもよいアリールオキシ」、「置換基を有していてもよいアリールチオ」でいう置換基としては、ニトロ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基、スルフィノ基、スルフェノ基、低級アルキルスルホニル基、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アシルオキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルアミノ基、低級アルキルチオ基、カルバモイル基、低級アルキルカルバモイル基、アリール等を挙げることができる。好ましくは、ニトロ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基、スルフィノ基、スルフェノ基、低級アルキルスルホニル基およびシアノ基であり、より好ましくはニトロ基である。なお、置換基の位置は、特に制限されない。例えばアリール基がフェニル基の場合は、フェニル基に結合した酸素原子または硫黄原子に対して好ましくはメタまたはパラの位置、より好ましくはパラの位置である。【００４０】
上記において「低級アルキル基」とは、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜３の直鎖または分枝状のアルキル基を意味する。例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ｎ−へプチル基、イソヘプチル基、ｎ−オクチル基、イソオクチル基、ｎ−ノニル基およびｎ−デシル基等を挙げることができる。また「低級アルキルスルホニル基」、「低級アルコキシ基」、「低級アルキルアミノ基」、「低級アルキルチオ基」、「低級アルキルカルバモイル基」および「低級アルコキシカルボニル基」でいう低級アルキル基部分としても、上記「低級アルキル基」と同様の基を挙げることができる。好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基である。【００４１】
また置換基として挙げられる「アシル基」には、炭素数１〜１０の脂肪族アシル基、炭素環カルボニル基および複素環カルボニル基が含まれる。具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、プロピオロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、ベンゾイル基、シクロヘキサンカルボニル基、ピリジンカルボニル基、フランカルボニル基、チオフェンカルボニル基、ベンゾチアゾールカルボニル基、ピラジンカルボニル基、ピペリジンカルボニル等が例示される。「アシルオキシ基」および「アシルアミノ基」のアシル基部分として、上記「アシル基」と同様の基を挙げることができる。【００４２】
さらに置換基として挙げられる「ハロゲン原子」としては、塩素原子、フッ素原子、ヨウ素原子および臭素原子を挙げることができる。【００４３】
なお、Ｒ１およびＲ２は、互いに同一であっても、またそれぞれ異なるものであってもよいが、好ましくは同一の基である。【００４４】
式（Ｉ）において、Ｒ３で定義される「低級アルキル基」もまた、前述と同様に炭素数１〜１０の直鎖または分枝状のアルキル基を意味する。好ましくは炭素数１〜６の直鎖または分枝状のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキル基、具体的にはメチル基、エチル基およびｎ−プロピル基である。【００４５】
式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はいずれもｐ−ニトロフェノキシ基であることが好ましく、この場合、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基であることが好ましい。かかる化合物として、具体的には下式（Ｉ’）で示される3,5-ビス（4-ニトロフェニノキシ）安息香酸〔3,5-bis（4-nitrophenoxy）-benzoic acid〕またはその低級アルキルエステルを挙げることができる。
式（Ｉ’）：【００４６】
【化６】
0005135588.tif 000007
【００４７】
（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である。）
当該化合物（Ｉ’）は、公知の化合物であり、例えばGang Yang らの文献（Macromolecules 1998, 31, 5964; Macromolecules 1999, 32, 2215-2220）および国際公開公報WO 01/02466 A1（実施例４）に記載の方法で製造することができる。【００４８】
化合物（Ｉ）の製造方法の例としては、以下の方法を挙げることができる。【００４９】
【化７】
0005135588.tif 000008
【００５０】
（式中、Ｚは酸素原子または硫黄原子であり、Ａｒは置換基を有していてもよいアリールであり、Ｒ３’は低級アルキル基を意味する。また、Halはハロゲン原子を意味する。）
具体的には、Ｒ３’が低級アルキル基である化合物（Ia）は、3,5-ジヒドロキシ安息香酸または3,5-ジメルカプト安息香酸の低級アルキルエステル(III)を、銅または銅塩の存在下または非存在下に、塩基の存在下でハロゲン化アリール(II)と反応させることによって製造することができる。なお、ここで銅塩としては沃化第一銅や臭化第一銅などの銅のハロゲン化物を、また塩基としては、アルカリ金属の水酸化物または炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムや炭酸カリウムを挙げることができる。また、Ｒ３’が水素に置換された化合物（Ib）は、上記で得られた低級アルキルエステル（Ia）を、水酸化リチウムや水酸化ナトリウム等の塩基存在下、または硫酸や塩酸等の酸存在下で加水分解することによって製造することができる。【００５１】
これらの化合物は、遊離または塩の形態を有するもののいずれであってもよい。ここで塩としては、通常、製薬上許容される塩、たとえば無機塩基または有機塩基との塩を挙げることができる。無機塩基としては、たとえば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウムやアンモニウム等を挙げることができる。有機塩基としては、たとえば、エタノールアミン等の第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン等を挙げることができる。【００５２】
また本発明が対象とする化合物（Ｉ）は、遊離物またはその塩が、溶媒和してなるものであってもよい。なお、ここで溶媒和物には水和物が含まれる。【００５３】
本明細書中において、「延長型Ａβ」とは、γセクレターゼによる開列箇所がＡβ40よりも１アミノ残基〜８アミノ残基分、好ましくは１アミノ残基〜３アミノ残基分、Ｃ末端側にシフトしているアミロイドβを意味する。具体的にはＡβ42およびＡβ43等が挙げられる。【００５４】
上記化合物（Ｉ）は、延長型Ａβ産生抑制作用、具体的にはβＡＰＰのγ−セクレターゼ分解によるＡβ42の産生を抑制する作用を有している（実施例１参照）。なお、化合物（Ｉ）の延長型Ａβ産生抑制作用は、細胞より分泌される延長型Ａβの量を測定（定量）することに基づいて評価することができる。具体的には、βＡＰＰを発現産生する細胞を、適当な溶媒、例えばDMSOなどの存在下で、化合物（Ｉ）と反応させ、一定時間に細胞外に分泌されるＡβ42の産生量を測定することによって評価することができる。Ａβ42の産生量の測定は、ELISAやウエスタンブロッティングなどの通常の方法により行うことができ、化合物（Ｉ）で処理した細胞（好ましくは、神経細胞）より産生されるＡβ42の量が、未処理の細胞のＡβ42産生量よりも低いことをもって、当該化合物のＡβ42の産生抑制作用を評価することができる。【００５５】
ゆえに化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、延長型Ａβ産生抑制剤として有効に使用することができる。この場合、医薬組成物中に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、延長型Ａβ産生抑制作用を有する限りいかなる量であってもよく、例えば０．１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは１〜６０重量％、さらに好ましくは３〜４０重量％である。【００５６】
さらに化合物（Ｉ）は、延長型Ａβ産生抑制作用に基づいて、延長型Ａβの産生、分泌または沈着に起因して生じる疾患（本発明では「延長型アミロイドβ関連疾患」または「延長型Ａβ関連疾患」という）の発生やその進展を予防し、その病態を緩和することができる。ゆえに化合物（Ｉ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、延長型Ａβ関連疾患の予防または治療剤として有効に使用することができる。【００５７】
かかる延長型Ａβ関連疾患としては、例えばアルツハイマー型痴呆（アルツハイマー症、アルツハイマー型老年痴呆等）、ダウン症、記憶障害、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病等）、軽度認知障害（MCI）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血、脳アミロイド血管障害、他の変性痴呆、例えば血管性変性混合型痴呆、パーキンソン病に随伴する痴呆、進行性核上麻痺に随伴する痴呆、皮質基底核変性症に随伴する痴呆、びまん性レビー小体型アルツハイマー病、加齢黄斑変性症、パーキンソン病、アミロイドアンジオパシーなどを挙げることができる。中でも好ましくはアルツハイマー型痴呆、特にアルツハイマー症である。【００５８】
この場合、医薬組成物中に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、延長型Ａβ産生を抑制する作用を有する限りいかなる量であってもよく、例えば０．１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは１〜６０重量％、さらに好ましくは３〜４０重量％である。【００５９】
本発明の医薬組成物は、通常、延長型Ａβ産生を抑制する有効量の化合物（Ｉ）、具体的にはβＡＰＰの酵素分解による開裂を抑制する有効量の化合物（Ｉ）に加えて、製薬上許容される担体または添加剤を配合して調製される。【００６０】
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与および静脈内投与であり、より好ましくは経口投与である。【００６１】
本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。【００６２】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【００６３】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。【００６４】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択するここができる。また、これらの製剤についても徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。【００６５】
本発明の医薬組成物にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【００６６】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。【００６７】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。【００６８】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。【００６９】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。【００７０】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。【００７１】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。【００７２】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。【００７３】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。【００７４】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。【００７５】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。【００７６】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。【００７７】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。【００７８】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。【００７９】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。【００８０】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。【００８１】
本発明の医薬組成物は、延長型Ａβ産生に起因する疾患（延長型Ａβ関連疾患）（好ましくはアルツハイマー型痴呆、特にアルツハイマー症）に罹患しているか、罹患するおそれのある被験者に投与することにより、当該被験者の延長型Ａβ関連疾患の発病や進行を予防、遅延または改善することが可能である。【００８２】
本発明の医薬組成物を、延長型Ａβ産生に起因する疾患（延長型Ａβ関連疾患）の予防または治療剤（例えば、アルツハイマー症の予防または治療剤）として用いる場合、その経口投与量は、化合物（Ｉ）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、より好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。静脈内投与をする場合、化合物（Ｉ）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。【００８３】
なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。【００８４】
（２）延長型Ａβ産生抑制物質のスクリーニング方法およびそれに用いる標準試薬
本発明はまた、上記一般式（Ｉ）で示される3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸およびその類縁体（化合物（Ｉ））もしくはこれらの塩、またはこれらの溶媒和物を延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する標準物質（陽性コントロール試薬）として用いて、被験物質の中から延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する延長型Ａβ産生抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。また、本発明は、化合物（Ｉ）もしくはこの塩、またはこれらの溶媒和物について、上記スクリーニング方法における標準試薬（陽性コントロール試薬）としての用途を提供する。【００８５】
ここで対象とする化合物（Ｉ）には、上記（１）で説明したすべての化合物（Ｉ）が含まれる。好ましくは、下式（Ｉ’）で示される3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸の低級アルキルエステルであり、より好ましくは3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸である。【００８６】
【化８】
0005135588.tif 000009
【００８７】
（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基である。）
ここで低級アルキル基は、前述の通り、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜３の直鎖または分枝状のアルキル基を意味する。好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基である。【００８８】
化合物（Ｉ）の塩としては、化合物（Ｉ）と塩を形成するものであれば特に制限されない。好ましくは前述する製薬上許容される塩、たとえば無機塩基または有機塩基との塩を挙げることができる。また、化合物（Ｉ）またはその塩の溶媒和物には、水和物が含まれる。【００８９】
本発明が提供するスクリーニングする方法は、被験物質の中から延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する物質を選別する方法である。当該方法は、延長型アミロイドβ関連疾患（特にアルツハイマー症）の予防または治療剤の有効成分となり得る候補物質を選別する方法としても使用することができる。【００９０】
当該方法は、具体的には、被験物質について延長型Ａβ産生抑制作用を調べ、その中から、上記化合物（Ｉ）若しくは塩、またはそれらの溶媒和物が有する延長型Ａβ産生抑制作用よりも高い抑制作用を有する被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質として選択することによって行うことができる。より具体的には、当該方法は、下記の工程（１）〜（３）を有する方法により行うことができる：
（１）β−アミロイド前駆体タンパク質（β-ＡＰＰ）または当該タンパク質を発現産生し得る細胞に、被験物質を接触させる工程、
（２）上記β-ＡＰＰもしくは上記細胞から産生されるＡβ42の量を測定する工程、
（３）上記Ａβ42の産生量を、被験物質に代えて化合物（Ｉ）若しくは塩、またはそれらの溶媒和物を用いて上記（１）および（２）の工程を行って得られる対照のＡβ42の産生量（陽性コントロール値）と対比して、陽性コントロール値より低いＡβ42の産生量を示した被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質として選別する工程。【００９１】
ここで被験物質としては、合成化合物、天然物（動植物、微生物、土壌など）またはそれから得られる組成物または単離物、遺伝子工学的手法によって得られるものなどを、特に制限することなく広く用いることができる。    【００９２】
またβ-ＡＰＰを発現産生し得る細胞としては、βAPP swedish変異と野生型PS1の恒常発現HEK293細胞、βAPP swedish変異とPS1 L166P変異の恒常発現HEK293細胞、βAPP swedish変異の恒常発現HEK293細胞、野生型βAPP の恒常発現HEK293細胞、または野生型βAPPもしくはβAPP swedish変異を一過性に発現させたHEK293細胞、CHO細胞もしくはHeLa細胞等を用いることができる。好ましくはβAPP swedish変異と野生型PS1の恒常発現HEK293細胞、βAPP swedish変異とPS1 L166P変異の恒常発現HEK293細胞である。【００９３】
工程（１）において、β-ＡＰＰまたはβ-ＡＰＰを発現産生し得る細胞に被験物質を接触させる方法としては、特に制限されないが、β-ＡＰＰ発現細胞を用いる場合は少なくとも当該細胞がβ-ＡＰＰを発現産生し得る条件下で、当該細胞と被験物質とを共存させることが必要である。例えば、メチオニン枯渇MEMで当該細胞を処理した後、細胞を一晩かけて450μCi [35S] メチオニン/システイン（Redivue Promix ; Amersham）、5％透析FCS（アミノ酸を含まない）含有培地等を用いてでメタボリック標識し、それと同時に被験物質を、pulse期間中培養液に適切な濃度で添加処理する方法等を挙げることができる。【００９４】
工程（２）において、β-ＡＰＰまたはβ-ＡＰＰ発現細胞から産生されるＡβ42の量を測定する方法としては、Ａβ42に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティングを行う方法を挙げることができる。【００９５】
なお、当該工程（１）と（２）を、被験物質に代えて、延長型アミロイドβ産生抑制作用を有する化合物（Ｉ）若しくは塩、またはそれらの溶媒和物を用いて行うことによって得られたＡβ42産生量は、工程（３）において、被験物質の延長型アミロイドβ産生抑制作用を評価するための対照のＡβ42産生量（陽性コントロール値）として用いられる。【００９６】
具体的には工程（３）は、被験物質を用いて上記（１）と（２）で得られたＡβ42産生量を、上記の対照のＡβ42産生量（陽性コントロール値）と対比して、当該陽性コントロール値より低いＡβ42の産生量を示した被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質として選別することによって行われる。すなわち、工程（３）は、化合物（Ｉ）若しくは塩、またはそれらの溶媒和物を陽性の標準試薬として用いて、これよりも高い延長型アミロイドβ抑制作用を示す被験物質を、延長型アミロイドβ産生抑制物質の候補物質として選別する工程である。ここで、陽性の標準試薬として好ましくは3,5-ビス（4-ニトロフェニノキシ）安息香酸である。【００９７】
化合物（Ｉ）若しくはこの塩またはこれらの溶媒和物は、上述のとおり、その延長型Ａβ産生抑制作用を利用して、延長型Ａβ産生抑制物質をスクリーニングする方法において陽性の標準試薬などとして研究分野または医薬開発における基礎分野で、好適に用いることができる。【００９８】
本発明の試薬は、化合物（Ｉ）若しくはこの塩またはこれらの溶媒和物からなるものであってもよいし、また使用用途に応じて、これらの化合物（Ｉ）等に加えて種々の担体や添加剤が配合されてなる組成物の形態を有するものであってもよい。この場合、かかる組成物に含まれる化合物（Ｉ）の割合としては、延長型Ａβ産生を抑制する作用を有する限りいかなる量であってもよく、例えば０.１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。【００９９】
化合物（Ｉ）若しくはこの塩またはこれらの溶媒和物は、例えばβＡＰＰから生成される延長型Ａβ、好ましくはＡβ42の産生を抑制する目的で、β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）またはこれを発現する細胞に対して用いることができる。ここでβＡＰＰを発現する細胞としては、神経細胞、特に脳における神経細胞、並びに遺伝子操作などによって人為的にβＡＰＰを発現するように構築された細胞を挙げることができる。【０１００】
よって本発明には、化合物（Ｉ）若しくはこの塩またはこれらの溶媒和物を、βＡＰＰまたはその発現細胞に適用して、延長型Ａβ、好ましくはＡβ42の産生を抑制する方法が含まれる。
【実施例】
【０１０１】
以下、本発明を実験例により説明するが、本発明は、かかる実験例に限定されるものではない。【０１０２】
実験例１
１．抗体および試験化合物
抗Ａβ抗体である4G8抗体はSignet Laboratories (Dedham, MA)より購入した。試験化合物のうち、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDS）(sulindac sulfide、indomethacin、naproxen)、peroxisome proliferator activated receptor α アゴニスト(fenofibrate)、farnesyl pyrophosphate ammonium salt (FPP)、およびgeranylgeranyl pyrophosphate ammonium salt (GGPP)は、Sigma社より購入し、また3,5-ビス（4-ニトロフェノキシ）安息香酸（以下、「Compound W」または「CW」と記載する）は、東京化成工業（株）より購入した。【０１０３】
２．細胞培養と細胞種
βAPP swedish変異と野生型PS1の恒常発現HEK293細胞、およびβAPP swedish変異とPS1 L166P変異の恒常発現HEK293細胞は、公知論文（Okochi, M., Steiner, H., Fukumori, A., Tanii, H., Tomita, T., Tanaka, T., Iwatsubo, T., Kudo, T., Takeda, M., and Haass, C. (2002) Embo J 21(20), 5408-5416；およびSteiner, H., Romig, H., Grim, M. G., Philipp, U., Pesold, B., Citron, M., Baumeister, R., and Haass, C. (1999) J Biol Chem 274(12), 7615-7618）に従って培養した。これら２種類の恒常発現細胞は、200μg/mlのG418と200μg/mlのzeocinを補った培養液で培養した。【０１０４】
３．Pulse-chase実験
βAPP swedish変異と野生型PS1の恒常発現HEK293細胞はメチオニン枯渇MEMで処理した後、細胞を一晩かけて450μCi [35S] メチオニン/システイン（Redivue Promix ; Amersham）、5％透析FCS（アミノ酸を含まない）含有培地でメタボリック標識し、それと同時にCompound W（100μM）、fenofibrate（100μM）、farnesyl pyrophosphate ammonium salt（FPP）（100μM）、geranylgeranyl pyrophosphate ammonium salt（GGPP）（100μM）、naproxen（100μM）、indomethacin（100μM）およびsulfindac sulfide（100μM）を、pulse期間中培養液にそれぞれの濃度で添加処理した。コントロールとして、これら化合物の適用DMSO濃度と同じ0.1％ DMSOを使用した。【０１０５】
４．免疫沈降/オートラジオグラフィー
採取した培養上清を、最終濃度50 mM Tris HCl (pH 7.4)、1 : 1000量のprotease inhibitor カクテル (Sigma)、5 mM EDTA (pH 8.0)になるように希釈を行った。培養上清は4G8抗体を用いて免疫沈降を行った。蛋白質はTris-tricine gelもしくはTris-bicine SDS-PAGE により分離を行った。ゲルは50％ メタノール／10％酢酸で固定を行った。オートラジオグラフィーは、ゲルを乾燥させた後に、フルオログラフィー解析を行うことによって実施した。【０１０６】
５．免疫沈降/MALDI-TOF MS解析
免疫沈降した蛋白質は、α-cyano-4-hydroxy cinnamic acidで飽和させたトリフルオロ酢酸/アセトン/水混合液 (混合比1:20:20)を用いて沈降用担体より溶出し、遠心分離により可溶性画分を取得した。これをMALDI-TOF MS分析用のステンレス製チャンバー上で乾燥させて、MALDI-TOF MSによる質量分析を行った。質量分析により得られたピークの高さと分子量は、アンジオテンシンとインスリンβ鎖（Sigma社）を標品として用いて、補正を行った。【０１０７】
結果を図１および図２に示す。【０１０８】
その結果、試験化合物のうち、sulindac sulfide（100μM）、indomethacin（100μM）、およびCompound W（100μM）は、内在性PS発現細胞におけるＡβ42の産生分泌を有意に減少させた。これらの化合物のうち、Compound WはもっともＡβ42産生抑制効果が高く、Ａβ42の分泌量を顕著に減少させた。また図２からわかるように、Compound WはＡβ42産生抑制作用に加え、Ａβ43産生抑制作用も示した。【０１０９】
尚、Compound Wは、10μMにおいてCOX-1及びCOX-2酵素に対する阻害活性が、それぞれ０％及び１１％であることを確認した。従って、Compound W は、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDS）などの抗炎症剤とは異なるメカニズムで、Ａβ産生抑制作用を示すと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】内在性PSの発現細胞を、各種の試験化合物で処理した場合に分泌されるＡβ42の相対比（Ａβ42量／全Ａβ量）を示す図である。＊は、当該相対比がコントロール（試験化合物に代えてDMSOを使用）に比して有意差（P<0.001）があることを示す。
【図２】PS1 L166P変異の恒常発現HEK293細胞を、Compound W（100μM）で処理した場合に分泌される各種Ａβの変化を免疫沈降/MALDI-TOF MS法により解析した図である。上向き及び下向き矢印は、それぞれコントロール（試験化合物に代えてDMSOを使用）に比して、明らかに増加および減少したことを示す。
【図１】
0005135588.tif 000013
【図２】
0005135588.tif 000014