(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブスタンスＰを含有する生体試料に糖類（ただし、デキストランを除く）を添加することを特徴とする、生体試料中のサブスタンスＰの安定化方法。
【請求項２】
サブスタンスＰを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料の保存方法。
【請求項３】
サブスタンスＰを含有する生体試料に糖類（ただし、デキストランを除く）を添加してなる試料を測定用試料として使用することを特徴とする、生体試料中のサブスタンスＰの測定方法。
【請求項４】
生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
単糖類が、六炭糖である請求項５記載の方法。
【請求項７】
六炭糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである請求項６記載の方法。
【請求項８】
二糖類が、還元性の二糖類である請求項５記載の方法。
【請求項９】
還元性の二糖類が、マルトースまたはラクトースである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
多糖類が、アミロース、セルロースまたはデンプンである請求項５記載の方法。
【請求項１１】
糖類（ただし、デキストランを除く）を含有することを特徴とする、サブスタンスＰを含有する生体試料中のサブスタンスＰの安定化試薬。
【請求項１２】
糖類を含有することを特徴とする、サブスタンスＰを含有する生体試料の保存用試薬。
【請求項１３】
糖類（ただし、デキストランを除く）を含有することを特徴とする、サブスタンスＰを含有する生体試料中のペプチドの測定用試薬。
【請求項１４】
生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である請求項１１〜１３のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である請求項１１〜１４のいずれかに記載の試薬。
【請求項１６】
単糖類が、六炭糖である請求項１５記載の試薬。
【請求項１７】
六炭糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである請求項１６記載の試薬。
【請求項１８】
二糖類が、還元性の二糖類である請求項１５記載の試薬。
【請求項１９】
還元性の二糖類が、マルトースまたはラクトースである請求項１８記載の試薬。
【請求項２０】
多糖類が、アミロース、セルロースまたはデンプンである請求項１５記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中のペプチドの安定化法として、ペプチドをエチレンジアミン四酢酸を含む溶液中で静置し、難溶性の組成物とする方法（特許文献１参照）、ペプチドに血漿、γ−グロブリンやゼラチン等のタンパクを共存させる方法（非特許文献１参照）等が知られている。
ペプチドの凍結乾燥物の安定化法としては、グルコン酸塩を共存させる方法（特許文献２参照）が知られている。また、スクロース、マルトース、ラクトース等の糖類は、ペプチドの凍結乾燥物の安定化剤として知られている（特許文献３および４参照）。【０００３】
また、免疫測定法において、固相に固定化する抗原または抗体の安定化方法として、トレハロースやスクロース等の糖類を共存させる方法が知られている（特許文献５および６参照）。
一般に生体試料中のペプチドは、種々の要因、例えば生体試料中の蛋白質分解酵素による分解等により、不安定である。生体試料中のペプチドを安定化させる方法として、蛋白質分解酵素の阻害剤、界面活性剤あるいは防腐剤を添加する方法が知られている。例えば、生体試料中のサブスタンスＰの安定化方法として、蛋白質分解酵素阻害剤であるジイソプロピル・フルオロホスフェート、ホスホラミドンおよびバシトラシンを共存させる方法が知られている（非特許文献２参照）。【０００４】
生体試料中のサブスタンスＰの測定としては、血清を酸処理した後、アセトンおよびエーテルで抽出し、さらに逆相カラムによるＨＰＬＣで精製したサブスタンスＰを酵素免疫測定法で測定する方法が知られている（非特許文献３参照）が、本方法は操作が非常に煩雑で、かつ、化学的処理条件が過酷なため、正確な測定値を与えるものではなかった。【０００５】
生体内のペプチドは、種々のマーカーとして重要であり、生体試料中の濃度を正確に測定する必要があるが、採取された生体試料を測定する段階で既に減少していることが多く、正確な測定が出来ないという問題があった。
【特許文献１】特開平９−２０８４８５号公報
【特許文献２】特開平６−３２１８００号公報
【特許文献３】特開平５−３０６２３５号公報
【特許文献４】特開平５−１７０６６４号公報
【特許文献５】特表２００２−５０８８４３号公報
【特許文献６】特開２００３−２１５１２７号公報
【非特許文献１】エクスペリエンティア（Experientia），（スイス），１９６３年，第１９巻，第２号，ｐ．７２−７３
【非特許文献２】バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），（米国），１９８４年，第１２５巻，第２号，ｐ．７２８−７３３
【非特許文献３】クリニカル・アンド・ディアグノスティック・ラボラトリー・イムノロジー（Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology），（米国），１９９８年，第５巻，第３号，ｐ．３０３−３０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法を鋭意研究した結果、生体試料に糖類を添加することにより、ペプチドを安定化できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［２２］に関する。
［１］  ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料中のペプチドの安定化方法。
［２］  ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料の保存方法。
［３］  ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加してなる試料を測定用試料として使用することを特徴とする、生体試料中のペプチドの測定方法。
［４］  生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。【０００８】
［５］  糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  単糖類が、六炭糖である［５］記載の方法。
［７］  六炭糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである［６］記載の方法。
［８］  二糖類が、還元性の二糖類である［５］記載の方法。
［９］  還元性の二糖類が、マルトースまたはラクトースである［８］記載の方法。
［１０］  多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである［５］記載の方法。
［１１］  ペプチドが、サブスタンスＰである［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【０００９】
［１２］  糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料中のペプチドの安定化試薬。
［１３］  糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料の保存用試薬。
［１４］  糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料中のペプチドの測定用試薬。
［１５］  生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である［１２］〜［１４］のいずれかに記載の試薬。【００１０】
［１６］  糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である［１２］〜［１５］のいずれかに記載の試薬。
［１７］  単糖類が、六炭糖である［１６］記載の試薬。
［１８］  六炭糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースである［１７］記載の試薬。
［１９］  二糖類が、還元性の二糖類である［１６］記載の試薬。
［２０］  還元性の二糖類が、マルトースまたはラクトースである［１９］記載の試薬。
［２１］  多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである［１６］記載の試薬。
［２２］  ペプチドが、サブスタンスＰである［１２］〜［２１］のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（１）ペプチド
本発明におけるペプチドは、生体内に存在するものであれば、どのようなペプチドでもよく、またＣ末端のカルボキシ基がアミド化しているものも含まれる。アミノ酸残基数としては、５〜１００個が好ましく、５〜５０個がより好ましく、１０〜３０個が特に好ましい。ペプチドは臨床検査の目的で測定されるペプチドが好ましく、例えば、サブスタンスＰ、カルシトニン、ソマトスタチン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、成長ホルモン放出因子、エンドセリン、エンドルフィン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、バソプレッシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ガストリン、副甲状腺ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、セクレチン、インシュリン、オステオカルシンなどがあげられ、サブスタンスＰが好ましい。【００１３】
（２）生体試料
本発明における生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液、細胞膜などがあげられ、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁が好ましい。【００１４】
（３）糖類
本発明における糖類としては、本発明のペプチドの安定化方法を可能とする糖類であれば特に制限はないが、例えば単糖類、二糖類、多糖類等があげられる。
単糖類としては、例えば五炭糖、六炭糖等があげられ、六炭糖が好ましい。五炭糖としては、例えばアラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、キシルロース等があげられる。六炭糖としては、例えばガラクトース、グルコース、タロース、マンノース、ソルボース、タガトース、フルクトース、プシコース等があげられ、マンノースおよびガラクトースが好ましい。
二糖類としては、例えば還元性の二糖類や非還元性の二糖類があげられ、還元性の二糖類が好ましい。還元性の二糖類としては、例えばマルトース、ラクトース等があげられ、非還元性の二糖類としては、例えばスクロース、トレハロース等があげられる。
多糖類としては、例えばアミロース、セルロース、デキストラン、デンプン等があげられ、セルロースが好ましい。【００１５】
（４）生体試料中のペプチドの安定化方法、ペプチドを含有する生体試料の保存方法、および生体試料中のペプチドの測定方法
上記の糖類を生体試料に添加することにより、該生体試料中のペプチドを安定化することができる。また上記の糖類を生体試料に添加することにより該生体試料中のペプチドを安定化した状態で、該生体試料を保存することができる。さらに、生体試料に上記の糖類を添加したものを測定試料として用いることにより、該測定試料中のペプチドが安定に保たれるため、生体試料中のペプチドを正確に測定することができる。添加する糖類は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。生体試料は新鮮なものが好ましく、生体試料の採取直後又はなるべく早く糖類を添加するのが好ましい。採取した生体試料を入れる容器にあらかじめ糖類をいれておくのがさらに好ましい。糖類は、固体のまま添加して生体試料に溶解させることもできるが、糖類の溶液を添加する方法が好ましい。【００１６】
本発明の生体試料中のペプチドの安定化方法、ペプチドを含有する生体試料の保存方法および生体試料中のペプチドの測定方法においては、生体試料に添加される糖類は、糖類添加後の該生体試料中に、ペプチドが安定に保存され得る濃度になるような量で添加される。糖類として単糖類を使用する場合には、単糖類添加後の該生体試料中の単糖類の濃度は、例えば５〜６００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｍＬである。糖類として二糖類を使用する場合には、二糖類添加後の該生体試料中の二糖類の濃度は、例えば５〜６００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｍＬである。糖類として多糖類を使用する場合には、多糖類添加後の該生体試料中の多糖類の濃度は、例えば０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍＬである。【００１７】
本発明のペプチドの測定方法において、測定試料、すなわち糖類を添加した生体試料中のペプチドの測定は、例えばペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的方法により測定できる。免疫学的方法としては、例えばサンドイッチ法や競合法があげられる。免疫学的方法を利用した市販の測定用キットも使用できる。【００１８】
（５）生体試料中のペプチドの安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の保存用試薬、および生体試料中のペプチドの測定用試薬
本発明の生体試料中のペプチドの安定化試薬、およびペプチドを含有する生体試料の保存用試薬、および生体試料中のペプチドの測定用試薬は、糖類を含有する。本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬は、凍結乾燥品でも液状品でもよい。また、特に、本発明の測定用試薬は、運搬や保存に適した形態として、キットの形態を取り得る。キットとしては、２試薬系、３試薬系等があげられる。糖類としては、例えば（３）に前述の糖類があげられる。糖類は１種類でもよいし、２種類以上でもよい。【００１９】
本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬の利用の１つの態様としては、例えば本発明の安定化試薬、保存用試薬および測定用試薬を生体試料採取器具中にあらかじめ存在させる態様があげられる。この態様により、採取した生体試料中のペプチドを即座に安定化することができる。このような生体試料採取器具としては、例えば真空採血管等があげられる。この生体試料採取器具中に含有される本発明の測定用試薬に生体試料を添加して得られる試料は、そのまま、または、適宜、緩衝液等の水性媒体で溶解されて、あるいは、濃縮または希釈されて測定用試料として測定に供される。【００２０】
本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬には、必要に応じてキレート剤、防腐剤、界面活性剤、緩衝剤、蛋白質分解酵素阻害剤、塩類等が含有されていてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩、ジフェニルジチオカルバゾン（ＤＺ）、８−キノリノール（ＯＸ）、６−ドデシル−４−（２−チアゾリルアゾ)レゾルシノール（ＤＴＡＲ）などがあげられる。エチレンジアミン四酢酸の塩としては、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）などがあげられる。防腐剤としては、アジ化ナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、パラオキシ安息香酸エステル類、エチレングリコールモノフェニルエーテルがあげられる。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどがあげられる。【００２１】
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤などがあげられる。【００２２】
陰イオン界面活性剤としては、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウムなどの脂肪酸系陰イオン界面活性剤、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルベンゼン系陰イオン界面活性剤、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウムなどのアルキル硫酸エステル系陰イオン界面活性剤、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどのアルファオレフィン系陰イオン界面活性剤、アルキルスルホン酸ナトリウムなどのアルキルスルホン酸系陰イオン界面活性剤などがあげられる。【００２３】
非イオン界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの脂肪酸系非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなどのアルキルエーテル系非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのアルキルフェノール系非イオン界面活性剤などがあげられる。【００２４】
両性界面活性剤としては、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウムなどのアミノ酸系両性界面活性剤、アルキルベタインなどのベタイン系両性界面活性剤、アルキルアミンオキシドなどのアミンオキシド系両性界面活性剤などがあげられる。
陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩などの第四級アンモニウム塩系陽イオン界面活性剤などがあげられる。【００２５】
緩衝剤としては、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、３，３−ジメチルグルタル酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リジン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。【００２６】
グッド緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］緩衝剤、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝剤、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ［ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］緩衝剤、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸］緩衝剤、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］緩衝剤、ＡＣＥＳ｛２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ｛２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ〈２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸〉緩衝剤、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン］緩衝剤、ＤＩＰＳＯ｛３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＴＡＰＳＯ〈２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸〉緩衝剤、ＰＯＰＳＯ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）］緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、ＴＡＰＳ｛３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＣＨＥＳ［２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳＯ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸］緩衝剤などがあげられる。【００２７】
蛋白質分解酵素阻害剤としては、アプロチニン、ガベキサート、トラネキサム酸、ジイソプロピル・フルオロホスフェート、ホスホラミドン、バシトラシンなどをあげることができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの器具および試薬を使用した。
ＥＤＴＡ・２Ｎａおよびアプロチニン入り真空採血管（ニプロ社製）、キシロース（特級；和光純薬工業社製）、グルコース（特級；関東化学社製）、マンノース（特級；和光純薬工業社製）、ガラクトース（特級；ナカライテスク社製）マルトース（特級；和光純薬工業社製）、スクロース（特級；関東化学社製）、ラクトース（特級；ナカライテスク社製）、トレハロース（日本食品化工業社製）、アミロース（和光純薬工業社製）、セルロース（ナカライテスク社製）、デキストラン（特級；和光純薬工業社製）、デンプン（溶性；関東化学社製）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）（同仁化学研究所社製）、グルコン酸カリウム（特級；和光純薬工業社製）、グルコン酸ナトリウム（特級；和光純薬工業社製）、グルコン酸マグネシウム水和物（和光純薬工業社製）、ホスホラミドン（ＳＩＧＭＡ社製）、Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＮＥＰ）（ERASTIN PRODUCTS社製）。
【実施例１】
【００２９】
単糖類添加による血漿中のサブスタンスＰの安定化
（１）測定用試料および対照試料の調製
ＥＤＴＡ・２Ｎａおよびアプロチニン入り真空採血管を用いてヒトより採血した採血後３時間以内の新鮮なヒト血漿を用意した。このヒト血漿５０μＬに、２００ｍｇ／ｍＬキシロース水溶液、２００ｍｇ／ｍＬグルコース水溶液、２００ｍｇ／ｍＬマンノース水溶液、２００ｍｇ／ｍＬガラクトース水溶液をそれぞれ１００μＬ添加し混合し、更に２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液（５０μＬ）をそれぞれの混合液に添加し、試料Ａ〜Ｄを調製した。単糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿５０μLに、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液を５０μL添加した試料を対照試料とした。【００３０】
（２）検量線の作成および各試料中のサブスタンスＰ濃度の測定
Substance P EIA Kit（Cayman社製）を用い、キットに付属のマニュアルに従い、以下のようにして試料Ａ〜Ｄおよび対照試料中のサブスタンスＰを２連で測定した。
本キットは、アセチルコリンエステラーゼと結合したサブスタンスＰ（サブスタンスＰ
ＡｃｈＥトレーサー）を競合物質とした、競合法による酵素免疫測定法キットである。本キットの測定は、試料中のサブスタンスＰおよび競合物質を固相の抗サブスタンスＰ抗体と競合的に反応させ、固相の抗サブスタンスＰ抗体と結合した競合物質中のアセチルコリンエステラーゼをエルマン試薬の発色を吸光度測定することにより行われ、予め作成された検量線を基に、試料中のサブスタンスＰ濃度を決定できる。
まず、キット中の試薬を用いて、ＥＩＡバッファー（EIA Buffer）、洗浄バッファー（Wash Buffer）、サブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー（Substance P AchE Tracer）、サブスタンスＰ抗血清（Substance P Antiserum）、エルマン試薬（Ellman's Reagent）、およびサブスタンスＰの濃度がそれぞれ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２、１５．６、７．８、３．９ｐｇ／ｍＬである、標準物質溶液（Standard）１〜８を調製した。ただし、エルマン試薬の調製は、下記の測定方法において、一晩のインキュベーションが終了する直前に行った。これらの測定用試薬を用いて、サブスタンスＰの濃度と以下に述べるような吸光度から求められる固相に結合した競合物質の量に関連した指標（％Ｂ／Ｂ０）との間の関係を表す検量線を作成した。同時に、試料Ａ〜Ｄおよび対照試料の測定を行った。【００３１】
あらかじめ、室温に戻しておいた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、以下の（ａ）〜（ｆ）の反応ウェルを設定し、それぞれの反応ウェルに記載した溶液をそれぞれ入れた。（ａ）ブランク（Blank）：何も入れない、（ｂ）全活性（Total Activity）：何も入れない、（ｃ）非特異結合（Non-Specific Binding）：ＥＩＡバッファー１００μＬ、サブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー５０μＬ、（ｄ）最大結合（Maximun Binding）：ＥＩＡバッファー５０μＬ、サブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー５０μＬ、サブスタンスＰ抗血清５０μＬ、（ｅ）標準物質溶液１〜８：上記の標準物質溶液１〜８をそれぞれ５０μＬ、サブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー５０μＬ、サブスタンスＰ抗血清５０μＬ、（ｆ）試料（Sample）：測定用試料（試料Ａ〜Ｄまたは対照試料）５０μＬ、サブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー５０μＬ、サブスタンスＰ抗血清５０μＬ。【００３２】
キット付属品のプラスティックフィルムで９６ウェルプレートをカバーし、４℃、１８時間インキュベートした。インキュベート後、プレートウォッシャー〔モデル１５７５イムノウォッシュ（ImmunoWash）、バイオラッド（BIO-RAD）社製〕にて１反応ウェル当たり２５０μＬの洗浄バッファーで５回洗浄した。反応ウェル内に洗浄バッファー残液が無いことを確認した後、エルマン試薬２００μＬを入れ、全活性の反応ウェルにのみ、さらにサブスタンスＰ  ＡｃｈＥトレーサー５μＬを入れ、遮光して、２５℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（ＭＴＰ−１２０マイクロプレートリーダー、コロナ社製）にて、測定波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。【００３３】
「標準物質溶液１〜８」のそれぞれの反応ウェルでの各標準溶液における吸光度の平均値をＢ、「最大結合」の反応ウェルの吸光度の平均値をＢ０、「非特異結合」の反応ウェルの吸光度の平均値をＮＳＢとしたときに、以下の式で表される値（％Ｂ／Ｂ０）を標準溶液１〜８それぞれについて計算し、サブスタンスＰの濃度と％Ｂ／Ｂ０の値をプロットして検量線を作成した。
％Ｂ／Ｂ０＝[（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）]×１００
各試料についても、吸光度から同様に％Ｂ／Ｂ０の値を求めた。ただし、Ｂは２連の平均でなく、ウェルごとの吸光度を用いた。上記で得られた検量線から、試料の％Ｂ／Ｂ０の値に基づいて算出したサブスタンスＰの濃度を、各試料の測定値とした。【００３４】
（３）測定用試料中のサブスタンスＰの安定化
上記の測定用試料の作製に用いた、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液とヒト血漿それぞれを測定用試料とし、それぞれの試料中のサブスタンスＰを、Substance P EIA Kit（Cayman社製）を用いて上記の方法で測定した。その結果、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液中、ヒト血漿中のサブスタンスＰの濃度は、それぞれ２２６．１６ｐｇ／ｍＬ、７．７０ｐｇ／ｍＬと決定された。それぞれの測定値から、対照試料および試料Ａ〜ＤのサブスタンスＰの理論値を下記式により計算した。
対照試料中のサブスタンスＰ濃度の理論値
＝（サブスタンスＰ水溶液の測定値×５０＋ヒト血漿の測定値×５０）／１００
試料Ａ〜Ｄ中のサブスタンスＰ濃度の理論値
＝（サブスタンスＰ水溶液の測定値×５０＋ヒト血漿の測定値×５０）／２００
各試料の理論値と測定値から、以下の式により残存率を計算し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標とした。
残存率＝（サブスタンスＰの測定値の平均値／サブスタンスＰの理論値）×１００
第１表に各試料の理論値および測定値と残存率を示した。【００３５】
【表１】
0005357424.tif 000002
【００３６】
２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液をヒト血漿と混合しないで、４℃で１８時間のインキュベーション時間を含む本測定条件下で測定した場合、２２６．１６ｐｇ／ｍＬの値を得たことから、該サブスタンスＰ水溶液中のサブスタンスＰは安定して存在することが判る。一方、対照区の試験で示される様に、サブスタンスＰの初期濃度が１１６．９３ｐｇ／ｍＬである試料を、４℃で１８時間のインキュベーション時間を含む本測定条件下で測定した場合、サブスタンスＰ濃度が平均６０．５７ｐｇ／ｍＬと測定されたことから、血漿と共存させたサブスタンスＰは不安定であることが判る。【００３７】
各試料のサブスタンスＰの残存率は、対照５１．８％に対し単糖類を添加したそれぞれの試料では、試料Ａ（キシロース添加）６０．３％、試料Ｂ（グルコース添加）６８．５％、試料Ｃ（マンノース添加）８３．９％、試料Ｄ（ガラクトース添加）７８．２％であり、血漿に単糖類を添加することにより、血漿中のサブスタンスＰが安定化されることが示された。特に、六炭糖であるグルコース、マンノース、ガラクトースを添加した試料で、対照と比較し有意に（Ｐ＜０．０５）サブスタンスＰが安定化されており、六炭糖が血漿中のサブスタンスＰの安定化により有用であった。六炭糖としては、マンノースとガラクトースにより、高いサブスタンスＰ安定化効果が認められた。
【実施例２】
【００３８】
二糖類添加による血漿中のサブスタンスＰの安定化
実施例１と同様に調製したヒト血漿５０μＬに、１００ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液、１００ｍｇ／ｍＬスクロース水溶液、１００ｍｇ／ｍＬラクトース水溶液、１００ｍｇ／ｍＬトレハロース水溶液をそれぞれ１００μＬ添加し混合し、更に２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液５０μＬをそれぞれの混合液に添加し、試料Ｅ〜Ｈを調製した。二糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿５０μＬに、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液を５０μＬ添加した試料を対照試料とした。【００３９】
調製直後の試料Ｅ、試料Ｆ、試料Ｇ、試料Ｈおよび対照試料のそれぞれについて、実施例１と同様の方法により、それぞれの試料中のサブスタンスＰ濃度を測定し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第２表に示す。【００４０】
【表２】
0005357424.tif 000003
【００４１】
各試料のサブスタンスＰの残存率は、対照５１．８％に対し、二糖類を添加したそれぞれの試料では、試料Ｅ（マルトース添加）８３．６％、試料Ｆ（スクロース添加）７３．６％、試料Ｇ（ラクトース添加）８１．４％、試料Ｈ（トレハロース添加）７１．６％であった。これらの試料では、対照試料と比較し有意に（Ｐ＜０．０５）サブスタンスＰが安定化されており、血漿に二糖類を添加することにより、血漿中のサブスタンスＰが安定化されることが示された。特に、マルトース、ラクトースが、血漿中のサブスタンスＰの安定化により有用であった。
【実施例３】
【００４２】
多糖類添加による血漿中のサブスタンスＰの安定化
実施例１と同様に調製したヒト血漿５０μＬに、１０ｍｇ／ｍＬアミロース水溶液、１０ｍｇ／ｍＬセルロース水溶液、１０ｍｇ／ｍＬデキストラン水溶液、１０ｍｇ／ｍＬデンプン水溶液をそれぞれ１００μＬ添加し混合し、更に２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液（５０μＬ）をそれぞれの混合液に添加し、試料Ｉ〜Ｌを調製した。多糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿５０μＬに、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液を５０μＬ添加した試料を対照試料とした。【００４３】
調製直後の試料Ｉ、試料Ｊ、試料Ｋ、試料Ｌおよび対照試料のそれぞれについて、実施例１と同様の方法により、それぞれの試料中のサブスタンスＰを測定し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第３表に示す。【００４４】
【表３】
0005357424.tif 000004
【００４５】
各試料のサブスタンスＰの残存率は、対照５１．８％に対し、多糖類を添加したそれぞれの試料では、試料Ｉ（アミロース添加）６９．３％、試料Ｊ（セルロース添加）７２．３％、試料Ｋ（デキストラン添加）７１．０％、試料Ｌ（デンプン添加）６０．３％であった。これらの試料では、対照と比較し有意に（Ｐ＜０．０５）サブスタンスＰが安定化されており、多糖類が血漿中のサブスタンスＰの安定化に有用であることが示された。
【実施例４】
【００４６】
糖類添加による血漿中のサブスタンスＰの４℃での安定化
実施例１と同様に調製したヒト血漿５０μＬに、精製水で調製した４００ｍｇ／ｍＬグルコース（特級；関東化学社製）水溶液１００μＬを添加し混合し、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液５０μＬを添加して調製した試料Ｍを３本作製した。ヒト血漿５０μＬに、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液を５０μＬ添加した試料も３本作製し、対照試料とした。【００４７】
それぞれの試料、ならびに試料の作製に用いたヒト血漿および２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液中のサブスタンスＰ濃度を実施例１と同様の方法で測定し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。なお、実施例１では、４℃でのインキュベーション時間は１８時間であるが、本試験では、それぞれ１６時間、２４時間、４８時間と変更した。
インキュベーション時間が１６時間、２４時間、および４８時間の試料の調製に用いたヒト血漿中のサブスタンスＰ濃度は、それぞれ１５．０２ｐｇ／ｍＬ、４．９５ｐｇ／ｍＬ、および５．７１ｐｇ／ｍＬと決定された。また、インキュベーション時間が１６時間、２４時間および４８時間の試料の調製に用いたサブスタンスＰ溶液の濃度は、それぞれ２１１．１ｐｇ／ｍＬ、２０８．４ｐｇ／ｍＬ、および１９７．８ｐｇ／ｍＬと決定された。これらの測定値から、実施例１と同様にして、試料中のサブスタンスＰの濃度の理論値を求め、理論値と測定値から残存率を計算した。結果を第４表に示す。【００４８】
【表４】
0005357424.tif 000005
【００４９】
対照試料では、試料の４℃でのインキュベーション時間が１６時間から２４時間、４８時間と長くなるにつれ、試料中のサブスタンスＰの残存率が低下するのに対し、グルコースを添加した試料では、インキュベーション時間が１６時間、２４時間、４８時間で全て１００％以上であり、残存率の低下はみられなかった。したがって、糖類は、４℃における血漿中のサブスタンスＰの安定化に有用であった。
【実施例５】
【００５０】
糖類添加による血漿中のサブスタンスＰの凍結時の安定化（その１）
実施例１と同様に調製したヒト血漿５０μＬに、精製水で調製した４００ｍｇ／ｍＬグルコース（特級；関東化学社製）水溶液１００μＬを添加し混合し、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液５０μＬを添加して調製した試料Ｎを３本作製し、それぞれの試料を−８０℃で凍結した。試料Ｎについて、凍結０日後（調製直後）、７日後、１５日後の各試料を室温にて融解後、融解された試料Ｎ中のサブスタンスＰ濃度を実施例１と同様の方法により測定し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第５表に示す。【００５１】
【表５】
0005357424.tif 000006
【００５２】
グルコースを添加した試料ＮでのサブスタンスＰの残存率は、調製直後（０日後）８５．８％と比較して、７日後８５．８％、１５日後８６．４％であり、残存率の低下は見られなかった。したがって、糖類は、凍結時においても血漿中のサブスタンスＰの安定化に有用であった。
【実施例６】
【００５３】
糖類添加による血漿中サブスタンスＰの凍結時の安定化（その２）
実施例１と同様に調製したヒト血漿５０μＬに２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液を５０μＬ添加して調製した試料を６本用意し、当該試料の各々に、４００ｍｇ／ｍＬのグルコース水溶液、２．５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ水溶液、６０ｍｇ／ｍＬのグルコン酸カリウム水溶液、４０ｍｇ／ｍＬのグルコン酸ナトリウム水溶液、５０ｍｇ／ｍＬのグルコン酸マグネシウム水溶液、１０ｍｍｏｌ／Ｌのホスホラミドン水溶液をそれぞれ１００μＬ添加混合し、試料Ｏ〜Ｔを調製した。尚、ＥＤＴＡ・２Ｎａは特許文献１に、各種グルコン酸塩は特許文献２に記載されたペプチド安定化剤である。
調製後、それぞれの試料を−８０℃で凍結した。凍結０日後、３日後、１３日後の各試料を室温にて融解後、融解された各試料中のサブスタンスＰ濃度をSubstance P  EIA  Kit（Cayman社製）を用い、実施例１と同様の方法により測定し、サブスタンスＰの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第６表に示す。
【表６】
0005357424.tif 000007
第６表から、血漿中に存在するサブスタンスＰは、凍結状態で、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、各種グルコン酸塩（グルコン酸カリウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム）、ホスホラミドンを添加した場合に比較して、グルコースを添加した場合に有意に安定化されており、本発明の安定化方法が血漿中に存在するサブスタンスＰの凍結状態での安定化にも有用な方法であることが判明した。
【実施例７】
【実施例７】
【００５４】
Neutral Endopeptidase（ＮＥＰ）によるサブスタンスＰの分解に及ぼす糖類添加の影響
実施例１と同様に調製したヒト血漿１５０μＬ、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液１５０μＬ並びに、ＮＥＰがそれぞれ０Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬおよび１０．０Ｕ／ｍＬの濃度である酵素液を５０μＬ添加した試料をそれぞれ調製した。
同様にして、ヒト血漿１５０μＬ、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液１５０μＬ、４００ｍｇ／ｍＬグルコース水溶液を３００μＬ並びに、ＮＥＰがそれぞれ０Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬおよび１０．０Ｕ／ｍＬの濃度である酵素液を５０μＬ添加した試料をそれぞれ調製した。
また、同様にして、ヒト血漿１５０μＬ、２００ｐｇ／ｍＬのサブスタンスＰ水溶液１５０μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌホスホラミドン水溶液を３００μＬ並びに、ＮＥＰがそれぞれ０Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬおよび１０．０Ｕ／ｍＬの濃度である酵素液を５０μＬ添加した試料をそれぞれ調製した。
各試料中のサブスタンスＰ濃度をSubstance P  EIA  Kit（Cayman社製）を用い、実施例１と同様の方法により測定し、サブスタンスＰの残存率を求めた。結果を第７表に示す。
【表７】
0005357424.tif 000008
第７表から、サブスタンスＰはＮＥＰにより分解され、分解はＮＥＰ濃度に依存的に進行するが、グルコースまたはホスホラミドンが添加された状態では、サブスタンスＰのＮＥＰによる分解は抑制されることが判明した。
【実施例８】
【実施例８】
【００５５】
サブスタンスＰの安定化試薬
リン酸緩衝液                             ８１．５  ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                            ８０．０  ｇ／Ｌ
塩化カリウム                              ０．２  ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ                            ０．０９  ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム                          １．０  ｇ／Ｌ
グルコース                                ４００．０  ｇ／Ｌ
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、生体試料中のペプチドの安定化方法が提供される。該安定化方法は、例えば、臨床検査で採取される生体試料中のペプチドを安定化することができるので、臨床検査において、生体試料中のマーカーとなるペプチドを正確に測定することができる。