(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、関節リウマチに対する処置剤の有効成分の候補となる物質のスクリーニング方法；
（１）「関節リウマチに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているタンパク質キナーゼ」を、以下の特徴（ｉ）及び（ｉｉ）を有する遺伝子サブトラクション用の担体を用いた遺伝子サブトラクション法によって選択するステップ、
（ｉ）「『遺伝子サブトラクションのターゲットとするタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」が結合している、
（ｉｉ）「『遺伝子サブトラクションのターゲットとするタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の核酸をプライマーとし、関節リウマチに罹患していない動物の細胞の核酸を鋳型としたＰＣＲ反応によって増幅できる、
（Ａ）配列番号１で示される核酸及び配列番号３で示される核酸
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
CCAWAGGACCASACRTC  （配列番号３）
（Ｂ）配列番号１で示される核酸及び配列番号４で示される核酸
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
GCGAATTCCAWAGGACCASACRTC  （配列番号４）
（配列番号中、MはA又はC、YはT又はC、WはA又はT、SはG又はC、RはG又はAであることを意味し、NはA、G、C及びTのいずれか１つであることを意味する。また配列番号中において、TはUであってもよい。）
（２）「関節リウマチに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているタンパク質キナーゼ」の活性を調節する作用を有する物質を選択するステップ。
【請求項２】
タンパク質キナーゼが、チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼからなる群から選ばれる１又は２以上のタンパク質キナーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
「変化」が「増加」であり、かつ、「調節」が「阻害」である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
「関節リウマチに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているタンパク質キナーゼ」が、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮからなる群から選ばれる１又は２以上のタンパク質キナーゼであることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチに対する処置剤の有効成分の候補となる物質の新規なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いた略号について説明する。
ＣＩＡ：コラーゲン誘発関節炎（collagen-induced arthritis）
Ｇ３ＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）
ＨＣＫ：造血細胞キナーゼ（Hemopoietic cell kinase）
ＭＥＴ：肝細胞増殖因子受容体（hepatocyte growth factor receptor、HGF receptor、c-MET）
ＯＡ：変形性関節症（osteoarthritis）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)
ＰＨＡ−６６５７５２：（３Ｚ）−５−［（２，６−ジクロロベンジル）スルフォニル］−３−［（３，５−ジメチル−４−｛［（２Ｒ）−２−（ピロリジン−１−イルメチル）ピロリジン−１−イル］カルボニル｝−１Ｈ−ピロル−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（(3Z)-5-[(2,6-dichlorobenzyl)sulfonyl]-3-[(3,5-dimethyl-4-{[(2R)-2-(pyrrolidin-1-ylmethyl)pyrrolidin-1-yl]carbonyl}-1H-pyrrol-2-yl)methylene]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one）
ＰＫ：タンパク質キナーゼ（protein kinase）
ＲＡ：関節リウマチ（rheumatoid arthritis）
ＲＯＮ：マクロファージ刺激タンパク質受容体（macrophage stimulating protein receptor、Msp receptor）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
また本出願書類においてヌクレオチド配列（塩基配列）を示す場合には、以下の略号を用いる。
Ａ（又はａ）：アデニン
Ｇ（又はｇ）：グアニン
Ｃ（又はｃ）：シトシン
Ｔ（又はｔ）：チミン
Ｕ（又はｕ）：ウラシル
Ｒ（又はｒ）：グアニン又はアデニン
Ｙ（又はｙ）：チミン又はシトシン
Ｍ（又はｍ）：アデニン又はシトシン
Ｓ（又はｓ）：グアニン又はシトシン
Ｗ（又はｗ）：アデニン又はチミン
Ｎ（又はｎ）：アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン
ＲＡは結合組織に炎症をきたす全身的な疾患であり、主に関節の滑膜に非特異的炎症を起こし、全身の多発性関節炎の病像を呈する疾患である。ＲＡに対する治療剤等やそのスクリーニング方法に関する先行技術も存在するが（特許文献１及び特許文献２参照）、ＲＡは複雑な疾患であり、かつその処置も抗炎症剤等による対症療法的なものに止まっているのが実情である。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−１８７８５６号公報
【特許文献２】特開２００３−１８３１７７号公報  そこで、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補物質を種々の観点からなるべく多く見い出し、それをＲＡの処置剤に応用していく必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質を、簡便、迅速、効率的かつ高精度にスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、「ＲＡに罹患している動物の細胞において発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質を選択しすることによって、ＲＡの処置剤の有効成分物質を、簡便、迅速、効率的かつ高精度にスクリーニングできることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のステップを少なくとも含むことを特徴とする、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質のスクリーニング方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する；
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質を選択するステップ。
【０００６】
本発明方法は、前記のステップの前に、さらに以下のステップを含むことが好ましい；
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」を選択するステップ。このステップは、遺伝子サブトラクション法によって行われることが好ましい。またこの「遺伝子サブトラクション法」は、「『遺伝子サブトラクションのターゲットとするＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」が結合している遺伝子サブトラクション用の担体を用いて行われることが好ましい。
また、前記のＰＫは、チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼからなる群から選ばれる１又は２以上のＰＫであることが好ましい。
また、前記における「変化」の態様が「増加」であり、かつ、「調節」の態様が「阻害」であることが好ましい。この場合、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」は、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮからなる群から選ばれる１又は２以上のＰＫであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質を、簡便、迅速、効率的かつ高精度にスクリーニングする方法が提供されることから、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【０００９】
本発明方法は、以下のステップを少なくとも含むことを特徴とする、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質のスクリーニング方法である；
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質を選択するステップ。
【００１０】
本出願書類における「ＲＡに対する処置剤」の用語は、ＲＡに対する何らかの処置のために用いられる剤である限りにおいて特に限定されない。例えば、ＲＡの予防、維持（悪化防止）、軽減（症状改善）、治療等の処置のために用いられる剤は、いずれも本出願書類における「ＲＡに対する処置剤」の用語に包含される。
【００１１】
また「ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質」とは、ＲＡに対する処置剤の有効成分として利用できる可能性がある物質を意味する。したがって、この物質がＲＡに対する処置剤の有効成分として実際に利用できるものであるか否かは問わない。例えばこの物質について、仮にその後に行われる動物試験や臨床試験等によってＲＡに対する効果が否定されたとしても、本発明方法を実施した時点においてＲＡ処置剤の有効成分として利用できる「可能性」があった限りにおいて、「ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補となる物質」に包含される。
【００１２】
本発明方法は、以下のステップを少なくとも含むことを特徴としている；
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質を選択するステップ。
【００１３】
ここにいう「ＲＡ」は、医学上の厳密な定義におけるＲＡのみならず、ＲＡと同様又は類似の疾患症状を呈するものをも含む趣旨である。
【００１４】
またここにいう「ＲＡに罹患」とは、自然発症的にＲＡに罹患した場合のみならず、人為的にＲＡに罹患させた場合をも含む。例えば、人為的に作製されたＲＡのモデル動物は、「ＲＡに罹患している動物」に含まれる。
【００１５】
また、ここにいう「動物」は、ＲＡに罹患する可能性がある動物である限りにおいて特に限定されない。このような動物としては哺乳動物が例示され、そのなかでもヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット等が例示される。どの動物を選択するかは、スクリーニングの目的や、ＲＡ処置剤の適用対象とする動物等に応じて適宜設定することができる。なかでもヒトが好ましい。
【００１６】
また、ここにいう「細胞」は、ＲＡによって何らかの影響を受けうる組織の細胞である限りにおいて特に限定されない。ＲＡでは、関節の滑膜に炎症が起き、痛みと変形が引き起こされることから、この「細胞」としては、例えば、関節の滑膜の細胞を例示することができる。
また、ここにいう「ＲＡに罹患していない動物の細胞」は、「ＲＡに罹患している動物の細胞」が由来する動物と同種の動物に由来する、同じ組織の細胞であることが好ましい。すなわち、例えば「ＲＡに罹患している動物の細胞」がＲＡモデルマウスの関節滑膜細胞である場合には、「ＲＡに罹患していない動物の細胞」としては、ＲＡに罹患していないマウスの関節滑膜細胞を選択することが好ましい。同様に、例えば「ＲＡに罹患している動物の細胞」がヒトＲＡ患者の関節滑膜細胞である場合には、「ＲＡに罹患していない動物の細胞」としては、ＲＡに罹患していないヒトの関節滑膜細胞を選択することが好ましい。
また、「ＲＡに罹患していない」とは、ＲＡに罹患していない限りにおいて特に限定されず、健常なもの（何らの疾患にも罹患していないもの）はもちろん、ＲＡ以外の疾患には罹患しているがＲＡには罹患していないものをも含む趣旨である。したがって、例えば、ＯＡにのみ罹患している動物は、「ＲＡに罹患していない動物」であるといえる。
【００１７】
また、ここにいう「発現」とは、核酸（ｍＲＮＡ等）の発現であっても、タンパク質レベルの発現であってもよく、目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、後述する遺伝子サブトラクション法によってＰＫの発現を明らかにする場合には、核酸（ｍＲＮＡ等）の発現に注目すればよい。
【００１８】
また「発現が変化」とは、ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比してＰＫの発現レベルが増加又は減少していることを意味する。例えば、前者の細胞において、後者の細胞に比してＰＫの発現の量が増加又は減少しているような場合である。前者の細胞におけるＰＫの発現レベルが後者の細胞に比して増加している（高い）又は減少している（低い）限りにおいて、両者間の発現レベルの差の程度は問わない。両者間の発現レベルの差が小さいものであれば、それだけ多くの候補物質が選択されうる反面、ＲＡに対する処置剤の有効成分として効果を発揮しないものも多く選択されうる。逆に、両者間の発現レベルの差が大きいものであれば、選択される候補物質が少なくなる反面、ＲＡに対する処置剤の有効成分として効果を発揮するものが選択される可能性が高くなる。したがって、どのような程度の発現レベルの差をもって「発現が変化している」と判断するかは、スクリーニングの目的等に応じて当業者が適宜設定すればよい。
また、ＰＫは、チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼからなる群から選ばれる１又は２以上のＰＫであることが好ましい。
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質の選択は、当該「変化」が「増加」である場合には当該ＰＫの酵素活性に対して阻害作用を発揮する物質を、当該「変化」が「減少」である場合には生体に投与することによって当該ＰＫの活性を補いうる物質（例えば、当該ＰＫ分子自体、当該ＰＫ分子をコードするｃＤＮＡなど）を選択することにより行うことができる。この選択は、前者の場合には、当該ＰＫとある物質とを接触させ、この物質が当該ＰＫの酵素活性を消失又は低下させるか否かを判定し、当該ＰＫの酵素活性を消失又は低下させた物質を選択することにより行うことができる。また後者の場合には、当該ＰＫ分子自体や当該ＰＫ分子をコードするｃＤＮＡなどをそのまま選択すれば良い。
ここで、前者の場合において、ＰＫの酵素活性をどの程度低下させた場合に「ＰＫの活性を阻害する作用を有する」と判定するかは、スクリーニングの目的等に応じて当業者が適宜設定すればよい。ＰＫの酵素活性をわずかに低下させたものをも「ＰＫの活性を阻害する作用を有する」として判定する場合には、それだけ多くの候補物質が選択されうる反面、ＲＡに対する処置剤の有効成分として効果を発揮しないものも多く選択されうる。逆に、ＰＫの酵素活性を相当程度低下（又は消失）させたもののみを「ＰＫの活性を阻害する作用を有する」として判定する場合には、選択される候補物質が少なくなる反面、ＲＡに対する処置剤の有効成分として効果を発揮するものが選択される可能性が高くなる。
この「ＰＫの活性を阻害する作用を有する物質」の選択の手法も特に限定されず、例えばハイスループット・スクリーニングのような手法を用いることもできる。
後述の実施例にも示す通り、本発明者らは、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」として、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮを同定することに成功した。したがって本発明方法は、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮからなる群から選ばれる１又は２以上のＰＫの活性を阻害する作用を有する物質を選択するステップを少なくとも含むものが好ましい。
【００１９】
なお本発明方法は、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」の活性を調節する作用を有する物質を選択するステップを少なくとも含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、このステップと並行して他のスクリーニング方法を実施するステップをさらに含んでいてもよい。またこのステップの後に、選択された物質を他のスクリーニング方法に付するステップをさらに含んでいてもよい。またこのステップの前に、以下のステップをさらに含んでいてもよい；
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」を選択するステップ。
【００２０】
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が変化しているＰＫ」は、種々の方法によって選択することができる。例えば、両者の細胞からタンパク質を抽出し、「ＲＡに罹患している動物の細胞」において「ＲＡに罹患していない動物の細胞」よりもタンパク質量が多い又は少ないＰＫを同定することにより選択してもよい。また、ＰＫ遺伝子ファミリーについて、両者の細胞を用いた遺伝子サブトラクション法を行うことにより、ＲＡに罹患している動物の細胞において発現が変化している「ＰＫをコードする核酸（ｍＲＮＡ等）」を同定することにより選択してもよい。
【００２１】
このステップは、なかでも遺伝子サブトラクション法によって行われることが好ましい。
【００２２】
遺伝子サブトラクション法（差し引きハイブリッド法）は、異なる２種類の細胞や組織間において発現レベルの差がある目的遺伝子を、ハイブリダイゼーションによって差し引きすることにより単離する方法である。例えば、ある目的遺伝子のｍＲＮＡが細胞Ａに較べ細胞Ｂにおいてより高レベルに発現している場合、細胞Ａ及びＢに由来するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ／ｃＲＮＡ等の間でハイブリッドを形成させ、そのハイブリッド形成したもの以外のものを除去することで、細胞Ｂにおいて高レベルに発現している遺伝子を単離することができる。本出願書類では、この場合におけるハイブリッドを形成させる細胞Ａ由来の核酸（対照試料）を「ドライバー」と、細胞Ｂ由来の核酸（目的試料）を「テスター」という。
【００２３】
「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」を、遺伝子サブトラクション法によって選択する場合には、ＲＡに罹患していない動物細胞由来の核酸（ＰＫに関するもの）を「ドライバー」とし、ＲＡに罹患している動物細胞由来の核酸（ＰＫに関するもの）を「テスター」として用いればよい。また、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が減少しているＰＫ」を、遺伝子サブトラクション法によって選択する場合には、ＲＡに罹患していない動物細胞由来の核酸（ＰＫに関するもの）を「テスター」とし、ＲＡに罹患している動物細胞由来の核酸（ＰＫに関するもの）を「ドライバー」として用いればよい。遺伝子サブトラクションの方法は、通常の方法を採用することができる。
例えば、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」を遺伝子サブトラクション法によって選択する場合には、「ドライバー」としては、「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」であってＲＡに罹患していない動物の細胞において発現しているものを、「テスター」としては、「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」であってＲＡに罹患している動物の細胞において発現しているものをそれぞれ採用することが好ましい。
以下、遺伝子サブトラクション法に関する具体的説明をする場合には、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」を選択する場合について説明することとする。「ＲＡに罹患している動物の細胞において、ＲＡに罹患していない動物の細胞に比して発現が減少しているＰＫ」を選択する場合には、テスターとドライバーとを入れ替えて用いればよいことは前記の通りである。
【００２４】
なお、ここで、「ＰＫ遺伝子ファミリー」は、チロシンキナーゼファミリー及びセリン／スレオニンキナーゼファミリーであることが好ましい。また、この「チロシンキナーゼファミリー及びセリン／スレオニンキナーゼファミリー」は、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮからなる群であることが好ましい。
また、ＰＫ遺伝子ファミリーに「共通なヌクレオチド配列」とは、当該ファミリーに共通して存在するヌクレオチド配列である限りにおいて特に限定されない。ここで「共通して存在する」とは、必ずしも当該遺伝子ファミリーに属する全ての遺伝子において存在している必要はなく、当該遺伝子ファミリーに属する多くの遺伝子において存在するものであれば良い。また、「共通なヌクレオチド配列」自体も、必ずしもその遺伝子間において完全に一致している必要はなく、若干のヌクレオチドの差異があってもよい。
ＰＫ遺伝子ファミリーにおいて、具体的にどのようなヌクレオチド配列を「共通なヌクレオチド配列」とするかについては、サブトラクションの目的・精度等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、ＰＫ遺伝子ファミリーに関してある程度幅広く遺伝子サブトラクションを行いたいのであれば、「ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列」として、当該遺伝子ファミリーに属する全ての遺伝子において存在するヌクレオチド配列ではなく、当該遺伝子ファミリーに属する多くの遺伝子において存在するヌクレオチド配列を用いればよい。逆に、ＰＫ遺伝子ファミリーに関して、当該遺伝子ファミリーに属する全ての遺伝子において存在する特定のヌクレオチド配列に厳密に着目して遺伝子サブトラクションを行いたいのであれば、「ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列」として、当該遺伝子ファミリーに属する全ての遺伝子において存在する当該特定のヌクレオチド配列を用いればよい。
ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列としては、配列番号１及び／又は配列番号２で示されるヌクレオチド配列を採用することが好ましい。
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
GAYGTSTGGTCCTWTGG  （配列番号２）
（配列番号中におけるTはUであってもよい。また、Y、W及びNにおけるTも、Uであってもよい。）
そのなかでも、ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列として、配列番号１と配列番号２の両方のヌクレオチド配列を採用することが好ましい。
また、「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列」とは、以上に説明した「ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列」に対して、アニーリングする性質を有するヌクレオチド配列である限りにおいて特に限定されない。ここで「アニーリング」の条件は、相補的にハイブリッドを形成すべき核酸鎖間の水素結合が切断されている温度条件から温度を下げていったときに、当該核酸鎖間で水素結合が再構成され、両者が再結合するような条件である限りにおいて特に限定されない。具体的には、ＰＣＲにおける冷却のステップにおいて、前記核酸鎖間で再結合が形成されるような条件が挙げられる。より具体的には、ExTaq ポリメラーゼ(TaKaRa社：RR001A)に付属のバッファーを用いて、48℃(〜70℃)、1分間で前記核酸鎖間の再結合が形成されるものであることが好ましい。
「ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列」にアニーリングするヌクレオチド配列としては、配列番号１及び／又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列を採用することが好ましい。
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
CCAWAGGACCASACRTC  （配列番号３）
（配列番号中におけるTはUであってもよい。また、Y、W及びNにおけるTも、Uであってもよい。）
そのなかでも、配列番号１と配列番号３の両方のヌクレオチド配列を採用することが好ましい。
また「ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列」にアニーリングするヌクレオチド配列としては、配列番号１及び／又は配列番号４で示されるヌクレオチド配列を採用することも好ましい。
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
GCGAATTCCAWAGGACCASACRTC  （配列番号４）
（配列番号中におけるTはUであってもよい。また、Y、W及びNにおけるTも、Uであってもよい。）
そのなかでも、配列番号１と配列番号４の両方のヌクレオチド配列を採用することが好ましい。
【００２５】
このような、「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列」からなる核酸をもとに、当該配列を保持する核酸を製造することができる。なお本出願書類において、あるヌクレオチド配列を「保持する」核酸とは、当該ヌクレオチド配列からなる核酸のみならず、当該ヌクレオチド配列を一部分に含んでいる核酸をも含む趣旨である。
ドライバーとすべきこのような核酸は、前記の「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列」からなる核酸をプライマーとし、ＲＡに罹患していない動物の細胞に存在する核酸（ｍＲＮＡ等）を鋳型としたＰＣＲによって製造し、増幅することができる。例えば、配列番号１及び／又は配列番号３で示される核酸をプライマーとし、ＯＡ患者の関節滑膜から抽出された核酸を鋳型としたＰＣＲによって、ドライバーとすべき核酸を製造・増幅することができる。配列番号３に代えて、配列番号４で示される核酸を用いてもよい。
GTGCACMGNGAYYT  （配列番号１）
CCAWAGGACCASACRTC  （配列番号３）
GCGAATTCCAWAGGACCASACRTC  （配列番号４）
（配列番号中におけるTはUであってもよい。また、Y、W及びNにおけるTも、Uであってもよい。）
このような「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」は、動物種や、用いる細胞や組織等に応じて異なることとなるが、これらに応じて当業者が適宜設定・製造等することができる。
【００２６】
また、この遺伝子サブトラクション法は、このような「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」が結合している遺伝子サブトラクション用の担体を用いて行われることが好ましい。
【００２７】
この「担体」は、核酸を結合させることができ、かつ、水や反応液等に不溶である限りにおいて特に限定されない。その形状も特に限定されず、ビーズ、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。なかでもビーズの形状が好ましい。
また担体の材質も特に限定されず、磁性体、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等の材質が例示される。
【００２８】
これらのなかでも、磁性体のビーズであることが、ハイブリダイゼーション後のドライバーの除去を簡便、迅速かつ確実に行いうることから好ましい。すなわち、担体として磁性体ビーズを用いれば、ハイブリダイゼーション後に、磁石によって当該ビーズ（これに結合している核酸及びこれにハイブリダイズした核酸）を簡便、迅速かつ確実に除去することができる。
【００２９】
また、前記の核酸と担体との間の結合様式も、水や反応液等の中において両者が解離しない強度以上の強度を有するものである限りにおいて特に限定されない。また、核酸と担体とが直接結合しているものはもちろん、両者が別の物質を介して結合していてもよい。
両者間の結合としては、例えば、２個の原子がいくつかの電子を共有してつくる共有結合や、２個の分子間における親和性により形成されるアフィニティー結合等を例示することができる。アフィニティー結合としては、ビオチン−アビジン結合（ビオチンとアビジンとの間の結合）等を例示することができる。なお、本出願書類における「アビジン」の用語には、ストレプトアビジンも当然に包含される。
【００３０】
両者間の結合様式としてビオチン−アビジン結合を採用する場合には、例えば、担体に結合させるべき核酸に公知の方法でビオチンを結合させ、担体（例えば、磁性体ビーズ）にはアビジンを結合させて、両者を接触させてアフィニティー結合させることにより、核酸と担体とがビオチン−アビジン結合によって結合した担体とすることができる。また、アビジン等が結合している担体（例えば、磁性体ビーズ）等も市販されており、これらを用いることもできる。
【００３１】
なお、核酸と担体との結合は、遺伝子サブトラクションの過程で形成させてもよい。例えば、ドライバーとテスターとをハイブリダイズさせた後に、当該ドライバーを担体に結合させる態様であってもよい。例えば、予めドライバーにビオチンを結合させておき、これとテスターとをハイブリダイズさせた後に、ドライバーに結合しているビオチンを担体に結合しているアビジンに結合させてもよい。
【００３２】
なお、以上に示したヌクレオチド配列や核酸は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、遺伝子サブトラクションの目的や方法等によって当業者が適宜選択することができる。例えば、ヌクレオチド配列や核酸としてＲＮＡを採用する場合にはチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に変更すればよく、またｍＲＮＡを用いる場合には、ＤＮＡからの転写を考慮してそのヌクレオチド配列をデザインすればよい。
【００３３】
遺伝子サブトラクションの方法は、通常の方法を採用することができる。具体的には、「ＲＡに罹患していない動物細胞由来の前記核酸（ドライバー）」と「ＲＡに罹患している動物細胞由来の前記核酸を含有する核酸画分（テスター）」とを接触させてハイブリダイゼーション反応させ、その後、両者がハイブリダイズした核酸を除去するステップを含むことが好ましい。
【００３４】
ハイブリダイゼーション反応の条件は、非特異的なハイブリダイゼーションが生じない程度のストリンジェントな条件で行われることが好ましい。このような条件としては、終濃度として0.5〜10xSSC（好ましくは1〜5xSSC、より好ましくは3xSSC）、0.5〜5xDenhardt溶液（好ましくは1〜4xDenhardt溶液、より好ましくは2.5xDenhardt溶液）及び0.01〜0.1％ SDS（好ましくは0.02〜0.08％ SDS、より好ましくは0.05％ SDS）を含有する溶液中で、55℃〜75℃（好ましくは60℃〜70℃、より好ましくは68℃）でインキュベートする条件が例示される。インキュベートの時間としては、例えば6時間〜24時間（好ましくは10時間〜20時間、より好ましくは15時間）程度を例示することができる。
例えば「『ＰＫ遺伝子ファミリーに共通なヌクレオチド配列』にアニーリングするヌクレオチド配列を保持する核酸」が結合している遺伝子サブトラクション用の担体を用い、ＯＡ患者の関節滑膜に比してＲＡ患者の関節滑膜において発現レベルが高いＰＫ遺伝子ファミリーについて遺伝子サブトラクションを行う場合には、ＯＡ患者の関節滑膜から抽出し増幅させたＰＫ遺伝子に関する核酸群（ドライバー）が担体に結合したものを用い、当該担体に結合している核酸（ドライバー）と、ＲＡ患者の関節滑膜から抽出し増幅させたＰＫ遺伝子に関する核酸画分（テスター）とを接触させてハイブリダイゼーション反応させ、その後、前記担体（これに結合している核酸及びこれにハイブリダイズした核酸）を除去すればよい。
特に、「担体」として磁性体ビーズを用いた場合には、担体の除去は、磁石を用いて簡便、迅速かつ確実に行うことができる。
より具体的には、例えば、以下ステップからなる方法を例示することができる。
（１）ヒトＲＡ患者及びヒトＯＡ患者の関節滑膜からＲＮＡを抽出する。
（２）抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する。
（３）ＲＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＫ遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＫ遺伝子ファミリーの断片を特異的に増幅する。これにより得られたＤＮＡを「テスターＤＮＡ」という。
（４）ＯＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＫ遺伝子ファミリーに特異的な配列の5'端にビオチンを付加したプライマーを用いてＰＣＲを行い、両端にビオチンが修飾されたＰＫ遺伝子ファミリーの断片を特異的に増幅する。これより得られたＤＮＡを「ドライバーＤＮＡ」という。
（５）テスターＤＮＡとドライバーＤＮＡを混合し、水溶液中で加熱（好ましくは80℃〜100℃、より好ましくは90℃〜100℃、特に好ましくは100℃程度）することによって変性させる。次いで、終濃度として0.5〜10xSSC（好ましくは1〜5xSSC、より好ましくは3xSSC）、0.5〜5xDenhardt溶液（好ましくは1〜4xDenhardt溶液、より好ましくは2.5xDenhardt溶液）及び0.01〜0.1％ SDS（好ましくは0.02〜0.08％ SDS、より好ましくは0.05％ SDS）を含有する溶液中、55℃〜75℃（好ましくは60℃〜70℃、より好ましくは68℃）で6時間〜24時間（好ましくは10時間〜20時間、より好ましくは15時間）インキュベートすることによりテスターＤＮＡとドライバーＤＮＡの間に二本鎖を形成させる。
（６）この反応液に磁気ビーズを添加し、ドライバーＤＮＡ中のビオチンと磁気ビーズに結合しているストレプトアビジンとを結合させる。
（７）ドライバーＤＮＡと磁気ビーズとの複合体を磁石を用いて除去する。これによってドライバーＤＮＡのみならず、テスターＤＮＡとドライバーＤＮＡに共通して存在する遺伝子断片も除去される。その結果、ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加しているＤＮＡが溶液中に残ることになる。このＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＰＫの同定その他の諸解析に用いる。また遺伝子サブトラクションの感度及び精度をより高めるために、磁気ビーズ（担体）を除去した後の溶液について、上記ステップをさらに繰り返して実施してもよい。これにより、簡便、迅速かつ高精度な遺伝子サブトラクション法を行うことができる。
本発明方法によって選択された物質は、ＲＡに対する処置剤の有効成分の候補として、更なる動物試験や臨床試験等に付することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜実施例１＞  「ヒトＲＡ患者の細胞において、ヒトＯＡ患者の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」の選択（遺伝子サブトラクション法）
（１）ヒトＲＡ患者（６例）及びヒトＯＡ患者（３例）の手術時に膝関節滑膜を摘出し、この滑膜からISOGEN（NIPPON GENE社）法によってＲＮＡを抽出した。
（２）抽出したＲＮＡを鋳型にして、SuperSript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを合成した。操作方法は同製品のマニュアルに従って行った。
（３）ＲＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＫ遺伝子ファミリーに特異的なプライマー（TAGAACTAGTGGATCCGTGCACMGNGAYYT（配列番号５）及びGGTCGACGGTATCGATCCAWAGGACCASACRTC（配列番号６））を用いてＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（1分）-48℃（1分）-72℃（1分）]x 30回 - 72℃（5分））を行い、ＰＫ遺伝子ファミリーの断片を特異的に増幅した。以下、この増幅により得られたＤＮＡを「テスターＤＮＡ」という。
（４）ＯＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＫ遺伝子ファミリーに特異的な配列の5'端にビオチンを付加したプライマー（GTGCACMGNGAYYT（配列番号１）及びGCGAATTCCAWAGGACCASACRTC（配列番号４））を用いてＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（1分）-48℃（1分）-72℃（1分）]x 30回 - 72℃（5分））を行い、両端にビオチンが修飾されたＰＫ遺伝子ファミリーの断片を特異的に増幅した。以下、この増幅により得られたＤＮＡを「ドライバーＤＮＡ」という。
（５）６患者分のテスターＤＮＡ ２μgと、３患者分のドライバーＤＮＡ ４μgを混合し、１００℃で５分間処理して変性させた。この溶液に等量のハイブリダイゼーションバッファー（6xSSC、5xDenhardt溶液、0.1％SDS）を添加し、６８℃で一晩保温することによってテスターＤＮＡとドライバーＤＮＡの間に二本鎖を形成させた。
（６）この反応液に５００μgの磁気ビーズ（Dynal Biotech社; M-270 Streptavidin）を添加し、１時間攪拌することによって、ドライバーＤＮＡ中のビオチンと磁気ビーズに結合しているストレプトアビジンとを結合させた。
（７）ドライバーＤＮＡと磁気ビーズとの複合体を、ビーズ分離用磁石（Dynal Biotech社; MPC-S）を用いて除去した。これによってドライバーＤＮＡのみならず、テスターＤＮＡとドライバーＤＮＡに共通して存在する遺伝子断片も除去される。その結果、ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加している遺伝子が溶液中に残ることになる。
（８）前記（７）の操作後の溶液に、新たにドライバーＤＮＡを添加し、前記（５）から（７）の操作を２回繰り返した。
（９）前記（８）の操作後の溶液に含まれるＤＮＡを増幅するために、テスターＤＮＡ増幅用プライマー（TAGAACTAGTGGATCC（配列番号７）及びTCGACGGTATCGAT（配列番号８））を用いてＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（1分）-62℃（1分）-72℃（1分）]x 10〜16回 - 72℃（5分））を行った。
（１０）上記ＰＣＲの産物から、ＰＫ遺伝子ファミリーの断片サイズである約240bpの断片を切り出し、TOPO-TA Cloning Kit for Sequence（Invitrogen社）を用いて、断片をプラスミドベクターにサブクローニングした。
（１１）サブクローニングしたプラスミドＤＮＡの挿入配列を解析し、GeneBank等のデータベースで検索した。その結果、ＨＣＫ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＲＯＮ遺伝子等のＰＫ遺伝子が同定された。従って、これらの遺伝子はＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加していることが示された。
＜実施例２＞  ＲＡ患者及びＯＡ患者滑膜における発現解析
（１）前記のサブトラクション法によって同定されたＰＫ遺伝子が、ＯＡ患者と比較してＲＡ患者において発現が増加していることを確認するために、６例のＲＡ患者及び３例のＯＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（30秒）-60℃（30秒）-72℃（1分）]x 27回 - 72℃（5分））を行った。各ＰＫ遺伝子の増幅には、ＨＣＫ遺伝子（GCAGGCTCTGAGGACATCATC（配列番号９）及びTTGGTACTGGCTCTCTGTGGC（配列番号１０））、ＭＥＴ遺伝子（CATGCCGACAAGTGCAGTA（配列番号１１）及びTCTTGCCATCATTGTCCAAC（配列番号１２））又はＲＯＮ遺伝子（GTCAAGGATGTGCTGATTCCC（配列番号１３）及びTCTGTGGAGTGAGGTACCTAATG（配列番号１４））をプライマーとして用いた。
（２）ＲＡ及びＯＡ患者由来のｃＤＮＡを鋳型として、サーマルサイクラー（TaKaRa社; TP3000）を用いてＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（30秒）-60℃（30秒）-72℃（1分）]x 27回 - 72℃（5分））を行った後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、対応するバンドの濃さをイメージアナライザ（Bio-Rad社; MOLECULAR IMAGER FX）を用いて定量した。
（３）各遺伝子のバンドの定量値は、内在性コントロールであるＧ３ＰＤＨの定量値に対する比として算出し、ＲＡ、ＯＡそれぞれの平均値＋標準偏差を求めた。ＨＣＫ遺伝子の定量値（発現量）を図１に、ＭＥＴ遺伝子の定量値（発現量）を図２に、ＲＯＮ遺伝子の定量値（発現量）を図３にそれぞれ示す。
【００３６】
その結果、ＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮ遺伝子の発現量は、ＯＡ患者と比較してＲＡ患者において高かった。このことから、前記サブトラクション法によって同定されたＰＫ遺伝子は、ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加していることが確認された。
＜実施例３＞  マウスＣＩＡモデルの滑膜組織における遺伝子発現解析
（１）ヒトＲＡ患者において発現が増加していることが確認されたＰＫ遺伝子が、マウスＣＩＡモデルにおいても発現が増加しているか調べるため、以下の試験を行った。マウスＣＩＡモデルは、ヒトのＲＡに類似した関節炎を発症することが知られており、ＲＡ評価のモデルとして最も一般的に用いられている。 
（２）マウスＣＩＡモデルは、６〜７週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャールズリバー社）の尾根部皮内に、ウシ由来のII型コラーゲン（3mg/ml、0.01Ｍ酢酸で溶解したもの）と完全フロインドアジュバントとを等量混和したエマルジョンを150μg/0.1ml注入することによって感作し、さらに初回感作から２１日目に追加感作することによって作成した。追加感作の方法は、初回感作と同様である。マウスＣＩＡモデルでは、追加感作後４〜５日目に四肢における炎症が惹起され、追加感作後１０〜２０日目に炎症がピークになることが知られている。
（３）初回感作の直前（０日）並びに初回感作後２０日、２３日、２７日及び３０日目にマウスの足根関節滑膜及び滑膜周辺組織を採取し（各時点においてｎ＝５）、両足分から採取されたサンプルを合わせた後、前記のISOGEN（NIPPON GENE社）法によってＲＮＡを抽出した。
（４）抽出したＲＮＡを鋳型として、SuperSript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
（５）各ＰＫ遺伝子の増幅には、ＨＣＫ遺伝子（GCTGCCAACATCTTAGTCTCTG（配列番号１５）及びAGCTGTCCACTTGATGGGGAAC（配列番号１６））又はＭＥＴ遺伝子（CATGCAGACAAGTGCAATATC（配列番号１７）及びTTCTTTCCGTCATTGTCCAGC（配列番号１８））をプライマーとして用いた。
（６）マウス滑膜及び滑膜周辺組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、Smart Cycler（TaKaRa社）を用いて、SYBR Green法で定量ＰＣＲを行った。酵素としてはSYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）（TaKaRa社;  RR041A）を用い、ＰＣＲの反応条件は９５℃（３０秒）、次いで［９５℃（５秒）−６０℃（１０秒）−７２℃（１５秒）］からなるサイクルを４０回とした。
（７）初回感作の直前（０日）並びに初回感作後２０日、２３日、２７日及び３０日目の各時点における各遺伝子の定量値は、内在性コントロールであるＧ３ＰＤＨの定量値に対する比として算出し、平均値±標準偏差を求め、グラフにプロットした。ＨＣＫ遺伝子の定量値（発現量）を図４に、ＭＥＴ遺伝子の定量値（発現量）を図５にそれぞれ示す。図４及び図５中における直線は、各時点における平均値を結んだものである。
その結果、ＨＣＫ遺伝子は初回感作後２７日目以降、ＭＥＴ遺伝子は初回感作後３０日目以降で顕著に発現量が増加していた。
（８）以上の結果から、ＲＡ患者からサブトラクションにより同定されたＨＣＫ及びＭＥＴの各遺伝子は、マウスＣＩＡモデルにおいても発現量が増加していることが確認された。また、これら各ＰＫ遺伝子の発現時期は、マウスＣＩＡモデルにおける炎症が惹起される時期と相関していたことから、これら各ＰＫ遺伝子はＲＡの病態にも深く関与していると考えられる。
＜実施例４＞  ラットアジュバントモデルの滑膜組織における遺伝子発現解析
（１）ＲＡ患者で発現が増加していることが確認されたＰＫ遺伝子が、ラットアジュバントモデルにおいても発現が増加しているか調べるため、以下の試験を行った。ラットアジュバントモデルは、ヒトのＲＡに類似した関節炎を発症することが知られており、アジュバント投与後２〜７日目にアジュバントを投与した足で一次炎症が惹起され、投与後１４日目以降に両足で二次炎症が惹起されることが知られている。
（２）ラットアジュバントモデルは、６週齢の雄性Lewis系ラット（日本チャールズリバー社）の右後肢足蹠皮下に、完全フロインドアジュバント（6mg/mlの結核（Mycobacterium Butyricum）死菌（DIFCO社）の流動パラフィン懸濁物）0.05mlを注射することによって作成した。
（３）アジュバント投与の直前（０日）並びに注射後２日、７日、１０日、１５日、２８日及び４４日目に膝関節滑膜組織を採取し（各時点においてｎ＝３）、前記のISOGEN（NIPPON GENE社）法によってＲＮＡを抽出した。
（４）抽出したＲＮＡを鋳型として、SuperSript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
（５）各ＰＫ遺伝子の増幅には、ＨＣＫ遺伝子（CGTGAAGACCTCAGCTTCCAG（配列番号１９）及びGGTCTCGGTGGATGTAGTTCC（配列番号２０））、ＭＥＴ遺伝子（CCTGCAGACAAGTGCAGTAT（配列番号２１）及びGTTGGACAGTGACGGAAAGA（配列番号２２））及びＲＯＮ遺伝子（GGTCAAGGATGTACTGATTCCC（配列番号２３）及びCCAAAGTCAGCCACCTTGACTG（配列番号２４））をプライマーとして用いた。
（６）ラット滑膜由来のｃＤＮＡを鋳型として、サーマルサイクラー（TaKaRa社; TP3000）を用いて、ＰＣＲ（反応条件：ExTaq ポリメラーゼ（TaKaRa社：RR001A）とそれに付属のバッファーを用いて、94℃（3分）-[94℃（1分）-60℃（1分）-72℃（1分）]x 28回 - 72℃（5分））を行った後、ＰＣＲ産物のバンドの濃さをイメージアナライザ（Bio-Rad社; MOLECULAR IMAGER FX）を用いて定量した。
（７）アジュバント投与の直前（０日）並びに注射後２日、７日、１０日、１５日、２８日及び４４日目の各時点における各遺伝子の定量値は、内在性コントロールであるＧ３ＰＤＨの定量値に対する比として算出し、平均値±標準偏差を求め、グラフにプロットした。ＨＣＫ遺伝子の定量値（発現量）を図６に、ＭＥＴ遺伝子の定量値（発現量）を図７に、ＲＯＮ遺伝子の定量値（発現量）を図８にそれぞれ示す。図６〜図８中における直線は、各時点における平均値を結んだものである。
その結果、ＨＣＫは、アジュバント投与足においては注射後７日目と１５日目に、アジュバント非投与足においては注射後１５日目に顕著に発現量が増加していた。またＭＥＴ遺伝子及びＲＯＮ遺伝子は、アジュバント非投与足において注射後１５日目で顕著に発現量が増加していた。
（８）以上の結果から、ＲＡ患者からサブトラクションにより同定されたＨＣＫ、ＭＥＴ及びＲＯＮの各遺伝子は、ラットアジュバントモデルにおいても発現量が増加していることが確認された。また、これら各ＰＫ遺伝子の発現時期は、ラットアジュバントモデルにおいて急性及び慢性の炎症が惹起される時期と相関していたことから、これら各ＰＫ遺伝子はＲＡの病態にも深く関与していると考えられる。
＜実施例５＞  ラットアジュバントモデルの滑膜組織におけるＰＫ遺伝子の局在性解析
（１）ＲＡ患者及びＲＡモデル動物で発現が増加していたＰＫ遺伝子のうち、ＨＣＫ遺伝子及びＭＥＴ遺伝子について、ＲＡモデル動物の滑膜組織における発現局在性を確認するために、In situ Hybridizationを行った。
（２）ＲＡモデルとして、前記の方法で作成したラットアジュバントモデルを用いた（アジュバント群）。また対照群として、同じ週齢の正常ラットを用いた（正常群）。
（３）アジュバントの投与後１４日目（慢性炎症初期）のラット膝及び足根関節滑膜組織を採取し、ホルマリン溶液で固定した。
（４）固定した組織をトリミングし、常法により骨組織の脱灰処理した後に、パラフィン包埋ブロックを作成した。
（５）アジュバント群及び正常群における、膝及び足根関節滑膜組織の各パラフィンブロックを4μmの厚さで薄切し、スライドグラス上に固定した。
（６）各ＰＫ遺伝子のプローブとして以下のものを用い、in vitro transcription法によってＲＮＡを合成した後に、これをDIG RNA Labeling Mix（Roche社）を用いてジゴキシゲニン標識した。
ＨＣＫ遺伝子：AGCACAGCCAGAAGCCCCATCAGGGCCTTGACATGCTCGACCTGCTGGGCCCACTCTCAGACGCCCCCTCCCCCACATTCCAGCTGTCGAGTGGAGGGAGAGGACTTCACAATCTCTTTTTGACTCTAGTCATCTGCAATCTGCCATTCTCAGGGCCTCCAAGTTAGTGTTTC（配列番号２５）
ＭＥＴ遺伝子：TATCCTCCAAGCCGCGTATGTCAGTAAACCAGGGGCCAATCTTGCTAAGCAAATAGGGGCCAGCCCGTATGATGACATTCTCTACGGGGTGTTTGCACAAAGCAAGCCAGATTCTGCTGAGCCCATGAACCGATCAGCGGTCTGTGCATTCCCCATCAAATATGTCAATGACTTCTTCAACAAGATTGTCAACAAAAACAACGTACGGTGTCTCCAGCATTTTTATGGACCCAACCACGAGCACTGTTTCAATAGGACCCTGCTGAGAAATTCATCGGGCTGCGAAGTGCGCAGTGACGAGTACCGGACGGAGTTTACCACAGCGCTGCAGGCTGTGGATTTATTCATGGGCCGGCTCAACCATGTACTCTTGACGTCTATCTCTACCTTCATCAAAGGTGACCTCACCATTGCTAATCTAGGGACATCAGAAGGTCGCTTCATGCAGGTGGTGCTCTCTCGCACAGCACATTTCACCCCCCA（配列番号２６）
（７）前記（５）で作製した各組織切片と、前記（６）で作製したジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いてIn situ Hybridizationを行った。このプローブの検出は、アルカリホスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体と、酵素基質としてニトロブルーテトラゾリウム（nitro blue tetrazolium；ＮＢＴ）及びブロモクロロインドイルフォスフェート（bromochloroindoyl phosphate）を用いて行った。
また、ジゴキシゲニン染色後、ケルネヒトロート液（武藤化学薬品株式会社）を用いて核染色した。
（８）その結果、ＨＣＫ遺伝子及びＭＥＴ遺伝子のいずれもが、アジュバント群の膝及び足根関節滑膜組織における滑膜細胞、繊維芽細胞のみならず、マクロファージ、リンパ球、顆粒球といった炎症性細胞で発現していることが示された。
（９）滑膜細胞や炎症性細胞は、ＲＡの発症や病態進行に深く関与していることが知られている。ＲＡモデルにおけるこれらの細胞でＨＣＫ遺伝子及びＭＥＴ遺伝子が発現していることからみても、これらのＰＫ遺伝子はＲＡに深く関与していると考えられる。
＜実施例６＞  「ＲＡにおいて発現が増加しているＰＫ」の活性を阻害する作用を有する物質の選択１
前記の通り、ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加しているＰＫとして、ＨＣＫ、ＭＥＴ、ＲＯＮが同定された。この中でＨＣＫに着目し、その活性を阻害する作用を有する物質としてＰＰ２（4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4,d] pyrimidine）を選択し、以下の試験を行った。
（１）ＲＡモデル動物において遺伝子発現が増加しているＨＣＫを阻害することで、モデル動物の病態が改善されるか調べるため、このモデルにＰＰ２（ＨＣＫ阻害剤）を投与する試験を行った。ＰＰ２は、CALBIOCHEM社のもの（HCK IC50＝5 nM）を用いた。このＰＰ２はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解されているため、生理食塩水で希釈して投与に用いた（ＰＰ２の終濃度：10μg/ml、ＤＭＳＯ終濃度１％）。
（２）ＲＡモデルとして、前記の方法で作成されたラットアジュバントモデルを用いた。アジュバントを投与後、ＰＰ２を40μg/4ml/匹（約200μg/kg体重）で腹腔内に連日投与した（ＰＰ２群；ｎ＝５）。
陽性対照は、アジュバントを投与後、酢酸メチルプレドニソロン（Pfizer社；デポメドロール（登録商標））を2mg/4ml/匹（約10mg/kg体重）で腹腔内に連日投与したものとした（Pred群、ｎ＝３）。
また陰性対照は、アジュバントを投与後、１％ＤＭＳＯを4ml/匹で腹腔内に連日投与したものとした（DMSO群、ｎ＝５）。
また対照群は、前記のラットアジュバントモデルと同じ週齢の正常ラットを用い、１％ＤＭＳＯを4ml/匹で腹腔内に連日投与したものとした（正常群、ｎ＝３）。
（３）ラットアジュバントモデルでは炎症に伴って足蹠に浮腫が観察されるため、ラット後肢の足蹠浮腫容積を週３回測定して、病態の改善度の指標とした。各群ともに、各時点における足蹠容積の平均値±標準偏差を、アジュバント非投与足（左足）、アジュバント投与足（右足）別にグラフ化した。アジュバント非投与足（左足）の結果を図９に、アジュバント投与足（右足）の結果を図１０にそれぞれ示す。
【００３７】
その結果、ＰＰ２群では、DMSO群（陰性対照）に比して足蹠浮腫容積が減少していることが示された。
（４）またアジュバント投与後３０日目に、ラット後肢（両足）のレントゲン写真を撮影して、足根骨、距踵骨、中足骨及び頸骨における足根骨側の４箇所の骨変性の程度を観察した。骨の変性の程度に応じて、０（無変化）、１（軽度の変性）、２（中度の変性）、３（重度の変性）としたスコア（１匹あたりのスコアの最高は２４点となる。）をつけ、両後肢の骨変性の程度を評価し、各群における平均値＋標準偏差をグラフ化した。結果を図１１に示す。
【００３８】
その結果、ＰＰ２群では、DMSO群（陰性対照）に比して骨変性スコアが改善していることが示された。
この結果から、ＲＡモデル等において発現量が増加しているＰＫに対する阻害剤を投与することによって、ＲＡの病態が改善されることが示された。
＜実施例７＞  「ＲＡにおいて発現が増加しているＰＫ」の活性を阻害する作用を有する物質の選択２
前記の通り、ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加しているＰＫとして、ＨＣＫ、ＭＥＴ、ＲＯＮ等が同定された。この中でＨＣＫ及びＭＥＴに着目し、前者の活性を阻害する作用を有する物質としてＰＰ２を、後者の活性を阻害する作用を有する物質としてＭＥＴを中和する活性を有する抗体をそれぞれ選択し、以下の試験を行った。
（１）ＲＡモデル動物において遺伝子発現が増加しているＰＫを阻害することで、モデル動物の病態が改善されるか調べるため、このモデルにＰＰ２（ＨＣＫ阻害剤）又は抗ＭＥＴ中和抗体（ＭＥＴ阻害剤）を投与する試験を行った。ＰＰ２は前記と同じものを用いた。また、抗ＭＥＴ中和抗体は、マウスＭＥＴを中和する活性を有する抗体（R&D systems社; AF527）を用いた。この抗ＭＥＴ中和抗体は、生理食塩水で終濃度2mg/mlとしたものを用いた。
（２）ＲＡモデルとして、前記の方法で作成されたマウスＣＩＡモデルを用いた。
初回感作後２４日目から３９日目の間に、ＰＰ２を40μg/0.4ml/匹（約2mg/kg体重）で腹腔内に連日投与した（ＰＰ２群；ｎ＝１０）。またＰＰ２の陰性対照は、初回感作後２４日目から３９日目の間に３％ＤＭＳＯを0.4ml/匹で腹腔内に連日投与したものとした（DMSO群、ｎ＝１０）。
また、初回感作後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、抗ＭＥＴ中和抗体を200μg/0.1ml/匹（約10mg/kg体重）で腹腔内に投与した（抗ＭＥＴ群；ｎ＝１０）。また抗ＭＥＴ中和抗体の陰性対照は、初回感作後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、抗ＭＥＴ中和抗体のアイソタイプコントロールである正常ヤギIgG（Cappel社; 55926）を200μg/0.1ml/匹（約10mg/kg体重）で腹腔内に投与したものとした（Isotype群、ｎ＝１０）。
陽性対照は、初回感作後２１日目から４０日目の間に、酢酸メチルプレドニソロン（Pfizer社；デポメドロール（登録商標））を100μg/0.1ml/匹（約5mg/kg体重）で腹腔内に連日投与したものとした（Pred群、ｎ＝５）。
また対照群は、前記のマウスＣＩＡモデルと同じ週齢の正常マウスを用い、試験開始後２４日目、２７日目、３０日目及び３３日目に（計４回）、生理食塩水を0.1ml/匹で腹腔内に投与したものとした（正常群、ｎ＝３）。
（３）関節炎の病態改善は、四肢における炎症スコア（両足の親指を除く指、甲及び踵並びに両手の親指を除く指及び甲（計２２箇所）を観察し、浮腫、発赤の見られた個所に１点をつける。従って、スコアの最高は２２点/匹となる。）によって評価した（追加感作の後、週３回評価した。）。
各群及び各時点における炎症スコアの平均値±標準偏差を、ＨＣＫ評価群（ＰＰ２群、DMSO群及びPred群）と、ＭＥＴ評価群（抗ＭＥＴ群、Isotype群及びPred群）に分けてグラフ化した。ＨＣＫ評価群の結果を図１２に、ＭＥＴ評価群の結果を図１３にそれぞれ示す。
【００３９】
その結果、ＨＣＫ評価群におけるＰＰ２群では、DMSO群（陰性対照）に比して炎症スコアが改善していることが示された（図１２）。またＭＥＴ評価群における抗ＭＥＴ群でも、Isotype群（陰性対照）に比して炎症スコアが改善していることが示された（図１３）。
（４）また初回感作後４１日目に、マウス後肢（両足）のレントゲン写真を撮影して、足根骨、距踵骨、中足骨及び頸骨における足根骨側の４箇所の骨変性の程度を観察した。骨の変性の程度に応じて、０（無変化）、１（軽度の変性）、２（中度の変性）、３（重度の変性）としたスコア（１匹あたりのスコアの最高は２４点となる。）をつけ、両後肢の骨変性の程度を評価し、各群における平均値＋標準偏差をグラフ化した。結果を図１４に示す。
【００４０】
その結果、ＨＣＫ評価群におけるＰＰ２群、及び、ＭＥＴ評価群における抗ＭＥＴ群のいずれにおいても、陰性対照（DMSO群又はIsotype群）に比して骨変性スコアが改善していることが示された。
この結果からも、ＲＡモデル等において発現量が増加しているＰＫに対する阻害剤を投与することによって、ＲＡの病態が改善されることが示された。
＜実施例８＞  「ＲＡにおいて発現が増加しているＰＫ」の活性を阻害する作用を有する物質の選択３
ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加しているＰＫとして同定されたＭＥＴに着目し、抗ＭＥＴ中和抗体以外にＭＥＴの活性を阻害する作用を有する物質として、PHA-665752（低分子阻害剤）を選択し、以下の試験を行った。
（１）PHA-665752は、in vitro及びin vivoにおいて、ＭＥＴを特異的かつ強力に阻害することが知られている（Cancer Res., 63(21), 7345-7355（2003）、国際公開第ＷＯ０２／０９６３６１号パンフレット、米国特許第６５９９９０２号明細書）。PHA-665752を、これらの文献に記載の方法に従って合成した後、ＤＭＳＯとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−４００に溶解し、さらにリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を添加して、終濃度1mg/mlの溶液として用いた。
（２）ＲＡモデルとして、前記の方法で作成されたマウスＣＩＡモデルを用いた。
初回感作後２１日目から４２日目の間に、PHA-665752を30 mg/kg（体重）で腹腔内に連日投与した（PHA-665752群；ｎ＝１０）。陰性対照は、初回感作後２１日目から４２日目の間に1.5％ ＤＭＳＯ／1.5％ PEG-400／PBSを30 ml/kg（体重）で腹腔内に連日投与したものとした（Control群；ｎ＝１０）。
陽性対照は、初回感作後２１日目から４２日目の間に、酢酸メチルプレドニソロン（Pfizer社；デポメドロール（登録商標））を5 mg/kg（体重）で腹腔内に連日投与したものとした（Pred群；ｎ＝５）。
正常群として、前記のマウスＣＩＡモデルと同じ週齢の正常マウスを用い、初回感作後２１日目から４２日目の間に1.5％ ＤＭＳＯ／1.5％ PEG-400／PBSを30 ml/kg（体重）で腹腔内に連日投与したものとした（正常群；  ｎ＝５）。
（３）関節炎及び骨変性の改善は、初回感作後４２日目に、前記＜実施例７＞に記載の方法で評価し、各群におけるスコアの平均値と標準偏差をグラフ化した。関節炎に関する結果（平均値±標準偏差）を図１５に、骨変性に関する結果（平均値＋標準偏差）を図１６にそれぞれ示す。
その結果、PHA-665752群では、四肢における関節炎のスコアがControl群に比して改善していることが示された（図１５）。また骨変性についても、PHA-665752群はControl群に比して改善していることが示された（図１６）。
この結果からも、ＲＡモデル等において発現量が増加しているＰＫに対する阻害剤を投与することによって、ＲＡの病態が改善されることが示された。またこの結果は、中和抗体、低分子阻害剤といった異なる機序でＭＥＴを阻害する複数の物質が、いずれもＲＡの病態改善に対して効果を発揮することを示すものでもある。このことから、ＭＥＴをはじめとする「ＯＡ患者に比してＲＡ患者において発現が増加しているＰＫ」の阻害剤は、その種類を問わず、ＲＡの病態改善に有効であることが示された。
以上の結果から、「ＲＡに罹患している動物の細胞において、これに罹患していない動物の細胞に比して発現が増加しているＰＫ」の活性を阻害する作用を有する物質を選択することにより、当該物質をＲＡに対する処置剤の有効成分の候補とすることができることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＨＣＫ遺伝子の発現量（ＲＡ、ＯＡ患者滑膜）を示す図である。
【図２】ＭＥＴ遺伝子の発現量（ＲＡ、ＯＡ患者滑膜）を示す図である。
【図３】ＲＯＮ遺伝子の発現量（ＲＡ、ＯＡ患者滑膜）を示す図である。
【図４】ＨＣＫ遺伝子の発現の変化（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図５】ＭＥＴ遺伝子の発現の変化（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図６】ＨＣＫ遺伝子の発現の変化（ラットアジュバントモデル）を示す図である。
【図７】ＭＥＴ遺伝子の発現の変化（ラットアジュバントモデル）を示す図である。
【図８】ＲＯＮ遺伝子の発現の変化（ラットアジュバントモデル）を示す図である。
【図９】ＨＣＫ阻害剤（ＰＰ２）投与による足蹠容積（ラットアジュバントモデル；アジュバント非投与足（左足））を示す図である。
【図１０】ＨＣＫ阻害剤（ＰＰ２）投与による足蹠容積（ラットアジュバントモデル；アジュバント投与足（右足））を示す図である。
【図１１】ＨＣＫ阻害剤（ＰＰ２）投与による骨変性スコア（ラットアジュバントモデル）を示す図である。
【図１２】ＨＣＫ阻害剤（ＰＰ２）投与による炎症スコア（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図１３】抗ＭＥＴ中和抗体投与による炎症スコア（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図１４】ＨＣＫ阻害剤（ＰＰ２）又は抗ＭＥＴ中和抗体投与による骨変性スコア（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図１５】ＭＥＴ阻害剤（PHA-665752）投与による炎症スコア（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図１６】ＭＥＴ阻害剤（PHA-665752）投与による骨変性スコア（マウスＣＩＡモデル）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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