(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
を用いることを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、シノリゾビウム属に属する菌由来である請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー．９７５０７ ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４３由来である請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項４】
前記タンパク質のソルボースに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性が１０％以上である請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項５】
前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性を１００％した場合、前記タンパク質のＤ−グルコースに対する反応性が１０％以下である請求項４に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項６】
前記タンパク質を、発色基質の存在下で、試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させることにより反応した発色基質の量を測定する請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項７】
前記タンパク質を試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる前に、試料中のＤ−グルコースを予め除去する請求項６に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項８】
前記タンパク質を、発色基質及び電子キャリアーの存在下で、試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる請求項７に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項９】
１，５−アンヒドログルシトールを基質として測定した場合の前記タンパク質の酵素活性を基本単位として、前記試料１ｍＬ当たり、１〜５００単位となるように前記タンパク質を添加する請求項８に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１０】
試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる前に、前記タンパク質を、電子キャリアーを用いて活性化する請求項８に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１１】
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
を含有することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質が、シノリゾビウム属に属する菌由来である請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー．９７５０７ ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４３由来である請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質のソルボースに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性が１０％以上である請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質のＤ−グルコースに対する反応性が１０％以下である請求項１４に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質が、電子キャリアーを用いて活性化されたものである請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１７】
前記電子キャリアーが、フェナジンメトサルフェイト及び１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイトのうち少なくとも一つである請求項１６に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１８】
前記１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物が、さらに、発色基質を含有する請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項１９】
さらに、電子キャリアーを含有する前記１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物であって、前記発色基質が還元性発色基質である請求項１８に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【請求項２０】
請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物を用いて、糖尿病の診断を補助するための方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物の、１，５−アンヒドログルシトールの測定への使用。
【請求項２２】
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
の、１，５−アンヒドログルシトールの測定への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−アンヒドログルシトールの測定方法及び１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物に関する。
本願は、２００６年６月２２日に、日本に出願された特願２００６−１７２６１９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−アンヒドログルシトール（以下、１，５−ＡＧと記す。）は、ブドウ糖の１位における還元体であり、生体内に微量存在している。この１，５−ＡＧは、糖尿病のコントロールマーカーとして有用であることが見出されている（例えば、非特許文献１，２参照。）。
非特許文献１に記載されているように、１，５−ＡＧは、血糖値とヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の中間に位置するマーカーであり、軽症糖尿病患者の自己管理に適していると考えられる。【０００３】
【表１】
0005222139.tif 000002
【０００４】
非特許文献２に開示されている通り、健常人の１，５−ＡＧ値は、血中ではグルコースに次いで多い単糖成分であり、日本人で実施された臨床試験によると、１，５−ＡＧ値の平均値は２４．６±７．２（ｍｅａｎ±ＳＤ）μｇ／ｍｌである。個人の生理的変動幅は小さく、日内および日間変動による影響をほとんど受けない。一般に、男性が女性よりやや高値を示す傾向にある。健常人の９５％が正常と判定されるｃｕｔ  ｏｆｆ値は、約１４．０μｇ／ｍｌとされている。【０００５】
従来、１，５−ＡＧの測定方法としては、非特許文献１に記載されているように、ガスクロマトグラフィー法と酵素法とが知られている。酵素法は、血漿（血清）検体０．２ｍＬを除蛋白後、さらにミニカラムを通して夾雑物を除去する。次いでピラノース酸化酵素（pyranose oxidase；以下、ＰＲＯＤと記す。）を作用させて１，５−ＡＧの２位の水酸基の酸化反応により発生した過酸化水素をホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase；ＨＲＰ）を用いて発色させ、４２０ｎｍで吸光度を測定する方法などが挙げられる。この酵素法に基づく血液専用の測定キットが、開発されている。
【非特許文献１】川合厚生、赤沼安夫、“１,５−アンヒドログルシトール”、臨床検査  ｖｏｌ．３３  ｎｏ．８  １９８９年８月  ９０１〜９０７
【非特許文献２】「Medical Technology」臨時増刊号2002 Vol.30 No.13（臨時増刊号）  糖尿病検査のすべて  スクリーニングから合併症の検査まで  pp. 1498-1499（医歯薬出版株式会社）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の酵素法による１，５−ＡＧ測定において用いられていたＰＲＯＤは、グルコースへの作用性が高いことから、高精度の１，５−ＡＧ測定を行うためには、血中に多量に存在するグルコース（血糖）を消去しなければならない問題がある。
このＰＲＯＤに代えて、グルコースへの作用性が低い１，５−ＡＧ酸化酵素（脱水素酵素）を用いることで、１，５−ＡＧの測定がより簡便になり、測定精度の向上、測定時間の短縮を図ることが可能であるため、このような酵素を用いた１，５−ＡＧの測定方法の提供が切望されていた。【０００７】
本発明は前記事情に鑑みてなされ、検体中の１，５−ＡＧ値を測定する際に、妨害物質の影響が少なく、従来法よりも高精度に１，５−ＡＧ値を測定できる１，５−ＡＧ測定方法及び１，５−ＡＧ測定試薬組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するため、本発明は、以下の態様を提供する。
［１］ （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
を用いることを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［２］ 前記タンパク質が、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する菌由来である［１］に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［３］ 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４３）由来である［１］又は［２］に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［４］ 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性が１０％以上である［１］〜［３］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【０００９】
［５］  前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性を１００％した場合、前記タンパク質のＤ−グルコースに対する反応性が１０％以下である［１］〜［４］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［６］  前記タンパク質を、発色基質の存在下で、試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させることにより反応した発色基質の量を測定する［１］〜［５］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［７］  前記タンパク質を試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる前に、試料中のＤ−グルコースを予め除去する［１］〜［６］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［８］前記タンパク質を、発色基質及び電子キャリアーの存在下で、試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる［１］〜［７］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［９］１，５−アンヒドログルシトールを基質として測定した場合の前記タンパク質の酵素活性を基本単位として、試料１ｍＬ当たり、１〜５００単位となるように前記タンパク質を添加する［１］〜［８］に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
［１０］  試料中の１，５−アンヒドログルシトールに作用させる前に、前記タンパク質を、電子キャリアーを用いて活性化する［１］〜［９］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。【００１０】
［１１］ （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
を含有することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１２］ 前記タンパク質が、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する菌由来である［１１］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１３］ 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４３）由来である［１１］又は［１２］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１４］ 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性が１０％以上である［１１］〜［１３］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１５］ 前記タンパク質の１，５−アンヒドログルシトールに対する反応性を１００％とした場合、前記タンパク質のＤ−グルコースに対する反応性が１０％以下である［１１］〜［１４］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１６］ 前記タンパク質が、電子キャリアーを用いて活性化されたものである［１１］〜［１５］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
【００１１】
［１７］  前記電子キャリアーが、フェナジンメトサルフェイト及び１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイトのうち少なくとも一種である［１６］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１８］  前記１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物が、さらに、発色基質を含有する［１１］〜［１７］のいずれかに記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
［１９］  さらに、電子キャリアーを含有する前記１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物であって、前記発色基質が還元性発色基質である［１８］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。【００１２】
［２０］  ［１１］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物を用いて、糖尿病の診断を補助するための方法。
［２１］  ［１１］に記載の１，５−アンヒドログルシトール測定試薬組成物の、１，５−アンヒドログルシトールの測定への使用。
［２２］ （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または
（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質：
の、１，５−アンヒドログルシトールの測定への使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、検体中の１，５−ＡＧ値を測定する際に、妨害物質の影響が少なく、従来法よりも高精度に１，５−ＡＧ値を測定できる１，５−ＡＧ測定方法及び１，５−ＡＧ測定試薬組成物を提供することができる。
さらに、本発明による１，５−ＡＧ測定方法及び１，５−ＡＧ測定試薬組成物によれば、血漿、血清、髄液、尿等の臨床検体に適用することが可能であり、迅速、かつ、簡便に検体中の１，５−ＡＧの定量、検出を可能とできる。また、小スケールによる測定も可能であって、臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置等においても、高精度かつ高感度な１，５−ＡＧの検出、定量を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、ソルボースデヒドロゲナーゼの製造に用いたプラスミドｐＵＣＮＮＴ２の構築手順の前半の工程を示す概略図である。
【図２】図１の構築手順の後半の工程を示す概略図である。
【図３】実施例１において、製造したソルボースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例１において、製造したソルボースデヒドロゲナーゼのｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例１において、製造したソルボースデヒドロゲナーゼの至適温度の測定結果を示すグラフである。
【図６】実施例１において、製造したソルボースデヒドロゲナーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例１で作成した検量線を示すグラフである。
【図８】実施例２において、ソルボースデヒドロゲナーゼの製造に用いたプラスミドｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１の構築手順の工程を示す概略図である。
【図９】実施例２で作成した検量線を示すグラフである。
【図１０】実施例３において、実施例２で製造したソルボースデヒドロゲナーゼを用いた臨床検体の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の１，５−ＡＧの測定方法は、（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする。
以下、上記タンパク質をソルボースデヒドロゲナーゼと表記する。【００１６】
本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）至適ｐＨ：約８．０。ただし６．３−９．１の範囲で５０％以上の活性を示す。
（２）ｐＨ安定性：４０℃、１５分処理後、ｐＨ５．９〜８．６の間で安定である。
（３）至適温度：ｐＨ７．０緩衝液中、至適温度が６０℃付近である。
（４）温度安定性：ｐＨ７．０緩衝液中、４５℃、１０分間処理後でも７７％以上の残存活性を有し、約４５℃以下で安定である。
（５）基質特異性及びＫｍ値：基質として１，５−ＡＧ及びL-ソルボースに強く作用し、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースなどの糖に対して殆ど作用しないか、又は弱く作用する。Ｋｍ値は、１，５−ＡＧに対し８２．５ｍＭ程度、Ｌ−ソルボースに対し６５．６ｍＭ程度である。
（６）分子量及びサブユニット分子量：総分子量は約１５０ｋＤａ及び約６７２ｋＤａ程度、サブユニット分子量約５９．６ｋＤａ程度。
（７）阻害剤特異性：重金属イオン（Ｍｎ２＋，Ｈｇ２＋，Ｃｕ２＋）で強く阻害される。
（８）Ｌ−ソルボースに作用して、Ｌ−ソルボソンを生成する。
（９）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする。【００１７】
本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は特に限定されず、天然のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質のいずれでもよい。特に、本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する菌由来であることが好ましく、さらに好ましくは、シノリゾビウム  エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. ９７５０７）（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２８）又はシノリゾビウム  メリロッティ(Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（好ましくはストレイン  １０２１；Strain 1021)）由来、最も好ましくは、シノリゾビウム  エスピー．９７５０７（Sinorhizobium ｓｐ．９７５０７）（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２８）由来である。
ここで、「由来である」とは、上記の菌が有するソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を意味し、該菌体から直接抽出したもの、遺伝子工学的手法により発現させたもの、化学的に合成したもの等、その製造方法は特に限定されるものではない。【００１８】
本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼの遺伝子工学的手法を用いた製造方法の一例を、以下に説明する。
（ＤＮＡの抽出）
シノリゾビウム  エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２８）の菌体を、超音波処理や溶菌酵素処理で細胞壁の破壊を行った後、フェノール等でDNAを抽出し、塩析及びエタノール沈澱等でDNAの回収を行う。【００１９】
（ＰＣＲ）
前記の通り抽出したシノリゾビウム  エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２８）由来ＤＮＡをテンプレートとし、またソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を元に作成した複数のプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅させる。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動などによって精製し、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを抽出する。【００２０】
（組換えベクターの作製）
組換えベクター作製用の発現ベクターは、発現させるタンパク質がそのままの形で生産されるもの、あるいはそのＮ末端またはＣ末端にヒスチジンのタグが付加された形で生産されるもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にマルトース結合タンパク質やＧＳＴペプチドが融合された形で生産されるものなどから、適宜選択される。組換えベクターは、発現ベクターと、前記ＰＣＲで得られたソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを、例えばNcoI、HindIII等の同じ制限酵素を用いて切断した後、酵素遺伝子ＤＮＡをベクターにライゲーションすることにより作製できる。
なお、発現ベクターは、市販品を用いることができるが、当該市販のプラスミドベクターの特定部位を置換して安定化したものを用いることがより好ましい。【００２１】
また、上述の通り、本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；または（c）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％（６０％〜１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴としているが、その相同性については、好ましくは65%以上（６５％〜１００％）、より好ましくは75%以上（７５％〜１００％）、さらに好ましくは85%以上（８５％〜１００％）である。
これらアミノ酸配列の相同性を考慮しつつ、かつ、製造される組換え型ソルボースデヒドロゲナーゼが本発明の目的を達成する限りにおいて、前記発現ベクターに挿入したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子コード領域に、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の塩基置換技術を用いる部位特異的突然変異によりアミノ酸の置換、付加、欠失等の操作を行っても良く、またエラープローンＰＣＲ法等の公知の塩基置換技術を用いるランダム変異によりアミノ酸の置換、付加、欠失等の操作を行ってもよい。さらに、複数種のバクテリア等から単離したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子について、ＤＮＡシャッフリング等の公知技術により、より優位な性状を有するソルボースデヒドロゲナーゼを製造することも想定される。
なお、本発明において「相同性」という語は、２以上の遺伝子配列の互いに対する同一性の程度を指す。したがって、ある二つの遺伝子の相同性が高い程、それらの配列の同一性又は類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって、又は核酸の場合にはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって、調べることができる。【００２２】
（形質転換体の作製）
前記ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E. coli、Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２年）、プロトプラスト法（Mol.Gen.Genet.、第１６８巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris等）の場合は、例えばハイネン（Hinnen）らの方法（Proc.Natl.Acad.USA.、第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法（J.Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３年）によって、動物細胞の場合は、例えば、グラハム（Graham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、第４５６頁、１９７３年）によって、昆虫細胞の場合は、例えば、サマーズ（Summers）らの方法（Mol.Cell.Biol.、第３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によってそれぞれ形質転換することができる。なお、形質転換は、前記組換えベクターによって発現させる必要はなく、例えば、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を宿主細胞の染色体ＤＮＡに直接挿入し、発現させる手段を用いてもよい。本発明においては、取り扱いが容易であり、比較的短時間に大量の組換えタンパク質を製造することが可能である点で、細菌及び酵母を宿主とすることが好ましく、エッシェリシア（Escherichia）属に属する微生物を宿主とすることが、より好ましい。【００２３】
（ソルボースデヒドロゲナーゼの発現、採取）
本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、前記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養し、発現したソルボースデヒドロゲナーゼを採取することによって得ることができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、前記ソルボースデヒドロゲナーゼが大量に生産されるように適宜選択される。【００２４】
上記のとおり、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを発現させた微生物等の宿主細胞（形質転換体）は、遠心分離等の操作により培養液から回収することができる。回収した宿主細胞を各種適切な緩衝液に懸濁した後、ソニケーションなどの機械的処理、リゾーチーム処理等の酵素処理を行い、さらに、各種アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の精製技術を目的に応じて組合せ、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを精製することができる。【００２５】
また、前述の通り、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするが、前述のような通常の条件に基づくソルボースデヒドロゲナーゼの製造においては、外因的にＦＡＤの添加をせずとも、該補酵素が結合した状態のソルボースデヒドロゲナーゼを調製することが可能である。
したがって、上述の製造工程において、また、本発明の１，５−ＡＧ測定方法及び１，５−ＡＧ試薬組成物に、人為的にＦＡＤを添加することは必須ではない。【００２６】
（ソルボースデヒドロゲナーゼの活性化法）
本発明のソルボースデヒドロゲナーゼは、電子キャリアーの存在下にインキュベートすると活性化される。このため、本発明の測定方法及び１，５−ＡＧ測定試薬組成物の製造に先立って、予め、該活性化処理を行ってもよい。特に、適用する試料が、血液等の臨床検体である場合には、高感度の１，５−ＡＧの検出を可能とする点で、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを予め活性化処理することが好ましい。
活性化に用いられる電子キャリアーとしては、フェナジンメトサルフェイト（ＰＭＳ）や１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト（１ｍ−ＰＭＳ）等がある。１ｍ−ＰＭＳを用いた場合、前記調製済みのソルボースデヒドロゲナーゼに、最終濃度０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは、０．０１〜１０ｍＭの１ｍ−ＰＭＳを添加し、ｐＨ５〜９、温度４〜４５℃で、３０分〜１日間インキュベートする。活性化処理後、測定試薬を調製するうえで１ｍ−ＰＭＳが過剰な場合には、透析や限外ろ過等によって過剰の１ｍ−ＰＭＳを除去し、本発明の測定方法及び１，５−ＡＧ測定試薬組成物の製造に使用することができる。
上記の処理により、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼを活性化することができるが、下記のとおり、１，５−ＡＧを基質として測定した場合の酵素活性が、活性化処理前と処理後において、好ましくは、２倍以上（２〜２０倍）、さらに、４倍以上（４〜１０倍）活性化されているこがより好ましい。【００２７】
（測定方法）
本発明の１，５−ＡＧの測定方法は、血液や髄液などの検体中の１，５−ＡＧ量を正確に測定することができる。前述したように、血液中の１，５−ＡＧ値は、糖尿病のコントロールマーカーとして有用であることから、本発明の測定方法は、糖尿病の診断において有用である。【００２８】
本発明の１，５−ＡＧの測定方法は、例えば次のような方法で実施できる。１，５−ＡＧの含有が予想される体液試料（検体）に、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼを、試料１ｍＬ当たり、１，５−ＡＧを基質として測定した場合の酵素活性を基本単位として、１〜５００単位となるように添加し、さらに、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼによって直接反応する発色基質の場合にはこの発色基質のみを、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼでは直接反応しない発色基質ではあるが電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質、又は、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼでは僅かにしか発色しない発色基質ではあるが、電子キャリアーが存在すると強く還元発色するような発色基質の場合には、この発色基質の他に電子キャリアーも添加し、好ましくは４〜５０℃、特に好ましくは２５〜４０℃で、好ましくは、１分〜３時間、より好ましくは１〜３０分間、特に好ましくは１〜１０分間、インキュベートしつつ吸光度の変化を計測し、予め作成した検量線から検体中の１，５−ＡＧ濃度を測定する。
なお、本発明において、「発色基質」とは、上述した、デヒドロゲナーゼによって直接反応する発色基質；電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質；及び、電子キャリアーが存在すると強く還元発色する発色基質を含むものとし、さらに、「還元性発色基質」とは、電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質；及び、電子キャリアーが存在すると強く還元発色する発色基質を含むものとする。【００２９】
本発明の１，５−ＡＧ測定方法に用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、少なくとも、実用的な範囲内で１，５−ＡＧと反応するものを用いる必要がある。ソルボースは生体中には存在しない糖であり、ソルボースに対する反応性は特に問題とはならない。しかし、１，５−ＡＧに対する反応性は、供試される検体試料にもよるが、ソルボースに対する反応性を１００％とした場合、好ましくは１０％以上（１０〜２００％）、より好ましくは５０％以上（５０〜２００％）の反応性を有するソルボースデヒドロゲナーゼを用いる。さらに、本発明の１，５−ＡＧ測定方法に用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、Ｄ−グルコースに対しては殆ど作用しないか、又は弱く作用するものを用いる。Ｄ−グルコースは検体中に多量に存在するので、１，５−ＡＧに対する反応性を１００％とした場合、Ｄ−グルコースに対する反応性が１０％以下（０．００１〜１０％）、さらに好ましくは、５％以下（０．００１〜５％）のソルボースデヒドロゲナーゼを選択することによって、検体の前処理、特にＤ−グルコース等の糖類除去処理の必要性及び厳密性を大幅に低減でき、測定の簡易化、測定時間の短縮、測定精度の向上及びコストの削減などを図ることができる。
なお、上記の「反応性」は、反応に使用する酵素量に対して、大過剰の基質、この場合はソルボース、１，５−ＡＧ、Ｄ−グルコースを作用させて、基質との反応を触媒する酵素の最大反応速度で反応性を評価したものである。ソルボースの場合で具体例を示すと、後述するソルボースの［酵素活性測定方法］に示すとおりである。【００３０】
上述の通り、本発明の１，５−ＡＧ測定方法に用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、１，５−ＡＧに対する特異性は高いが、若干、Ｄ−グルコースの影響を受ける場合もある。例えば、Ｄ−グルコースの濃度が１，５−ＡＧの数千倍にもなる糖尿病患者の検体測定に適用する場合には、Ｄ−グルコースの影響を無視できない場合もある。このような検体では、Ｄ−グルコースの影響を完全に回避するために、検体にＤ−グルコース除去剤もしくは消去剤を加え、予めＤ−グルコースの影響を消去してから１，５−ＡＧを測定する必要がある。【００３１】
Ｄ−グルコース等の糖類を除去する方法としては、例えば、特公平５−４１２３５号公報のようなイオン交換樹脂を用いる方法がある。また、Ｄ−グルコースを消去する方法としては、例えば、特開平１−３２０９９８号公報、特公平７−７１５１４号公報、特開平６−２３７７９５号公報、特開平３−２７２９９号公報、特開平６−２４５７９６号公報、特公平７−１０２１５４号公報等に示されているような、グルコース６位リン酸化酵素（ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ）を用いて、Ｄ−グルコースをグルコース−６−リン酸に変換する方法が利用できる。好ましくは、生化学検査用の汎用自動測定機にセットできる後者のＤ−グルコース消去法を利用する。ここで用いるグルコース６位リン酸化酵素としては、Ｄ−グルコースに特異性の高いグルコキナーゼを用いるのが好ましい。グルコキナーゼの使用量は、検体中のグルコースの量によって異なるが、１〜２０Ｕ／ｍＬである。また、グルコースのリン酸化に必要なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量は、検体中のグルコースの量によって異なるが、０．５〜２０ｍＭである。さらに、Ｄ−グルコースのリン酸化を促進するために、塩化マグネシウムを２〜５０ｍＭ加える。
さらに、高度なＤ−グルコースの消去が必要な場合、例えば、上記のグルコキナーゼを用いるＤ−グルコースの６位リン酸化系を用いる場合では、さらに酵素サイクリング系、例えば、ピルビン酸キナーゼを用いるＡＴＰサイクリング系などを組み込んで、完全なＤ−グルコースの消去を達成することができる。【００３２】
本発明のソルボースデヒドロゲナーゼによって直接反応する発色基質としては、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）のような電子受容体がある。
また、フェリシアン化カリウムのようなフェリシアン化合物を電子受容体として、ソルボースデヒドロゲナーゼによる酸化還元反応の後に、電子受容体自体の呈色の変化を検出するか、または、硫酸第二鉄‐ドゥパノール・リージェント（ferric sulfate-dupanol reagent）を添加し、プロッシアンブルーとして発色させる方法も適用が可能であるが、簡便性及び検出感度を考慮すると、ＤＣＩＰ等の直接反応して高い感度で測定できる発色基質を使用することが好ましい。【００３３】
本発明の電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質、又は、電子キャリアーが存在すると強く還元発色するような発色基質としては、テトラゾリウム又はその塩類がある。具体例として、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・１ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・１ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・１ナトリウム塩（ＷＳＴ−８）などがあげられる。その使用濃度は０．０５〜４ｍＭで、特に０．１〜２ｍＭの範囲が好ましい。【００３４】
また、本発明のテトラゾリウム又はその塩の発色のために使用される電子キャリアーとしては、フェナジンメトサルフェイト（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト（１ｍ−ＰＭＳ）等がある。１ｍ−ＰＭＳを用いた場合、その使用濃度は０．０１〜５０ｍＭ、特に０．０１〜１０ｍＭの範囲が好ましい。【００３５】
上記の測定方法に使用できる緩衝液としては、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであれば、いずれでも使用できる。【００３６】
（測定試薬組成物）
本発明の１，５−ＡＧ測定試薬組成物は、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを必須成分として含むものであり、糖尿病の診断において有用であるが、目的とする検体試料、使用する発色剤、測定形態等に応じて、その試薬形態を適宜変えることができる。【００３７】
例えば、本発明の１，５−ＡＧ測定試薬組成物は、上述の通り、Ｄ−グルコースの濃度が高い糖尿病患者の検体測定に使用する場合には、Ｄ−グルコースなどの糖類を除去する試薬（糖類除去剤）と組合せてもよい。糖類の除去剤としては、前記公知技術を適用することが可能であり、ホウ酸結合樹脂、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を組合せたものや、強塩基性の陰イオン交換樹脂と陽イオン交換樹脂を組合せたものが好ましい。強塩基性陰イオン交換樹脂又はホウ酸で検体を処理すると、１，５−ＡＧは除去されずに糖類が選択的に除去され、１，５−ＡＧを含む試料が得られる。また、１，５−ＡＧには作用せず、他の糖類には作用する酵素を用いることにより、１，５−ＡＧ以外の糖類を除去することが可能である。このような酵素として、例えば、上述した通り、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼが挙げられ、これらの酵素を用いてグルコースをリン酸化することによって、グルコースを除去することができる。その他にも、グルコースオキシダーゼを用いて、検体中のＤ−グルコースを除去する方法などもある。なお、グルコースオキシダーゼによるＤ−グルコースからの反応生成物は、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンである。【００３８】
本発明の１，５−ＡＧ測定試薬組成物は、全てを混合して単一の試薬としてもよく、相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分を適宜、適切な組み合せとなる様に分割してもよい。また、これらは、溶液状、もしくは粉末状試薬として調製してもよく、さらにこれらを濾紙もしくはフィルムなどの適当な支持体に含有させ試験紙もしくは分析用フィルムとして調製してもよい。なお、過塩素酸などの除タンパク剤や１，５−ＡＧ一定量を含有する標準試薬を添付してもよい。本組成物中の酵素、ソルボースデヒドロゲナーゼの量は、１，５−ＡＧを基質として測定した場合の酵素活性を基本単位として、１試料当りの反応液の中での最終濃度としては、０．１〜５０単位／ｍＬ程度となるように調製するのが好ましい。１，５−ＡＧを定量するための検体は、例えば、血漿、血清、髄液、尿などが挙げられる。【００３９】
本発明の１，５−ＡＧ測定試薬組成物の用途として、最も一般的なものとして、生化学検査用の大型の汎用自動測定機が想定されるが、これ以外にも、これを小型化した専用機や、開業医向けにポータブル化したものが考えられる。
これらの自動測定器用の１，５−ＡＧ測定試薬組成物を調製する場合、例えば、Ｄ−グルコース消去剤、還元性発色剤、還元性発色剤がテトラゾリウムの場合にはテトラゾリウムと電子キャリアー、ソルボースデヒドロゲナーゼの検体への添加は、Ｄ−グルコース消去剤を先にすれば、その他は、全て同時に行ってもよく、すなわち、これらの成分を１つの試薬にまとめて調製することもできる。また、例えば、Ｄ−グルコース消去剤、テトラゾリウム、電子キャリアー、ソルボースデヒドロゲナーゼのうち、相互に干渉するものが存在する場合、これらを分離して別々の試薬として調製すれば、干渉を避けることができる。【００４０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
［使用菌株の同定］
実験に用いた菌株は、アルファルファの根粒から分離した菌株であり、この菌株の菌学的性質は、下記の通りであった。【００４２】
１．形態学的性質
酵母エキス−マンニトール培地で生育した本菌株の形態的性質を以下に記述する。細胞の形態は桿菌で、大きさは０．５〜０．９×１．２〜３．０μｍである。胞子を形成せず、グラム染色性は陰性である。
２．各培地における生育状態
酵母エキス−マンニトール培地で生育した本菌株の生育状態を以下に記述する。コロニーは、クリーム色を呈し、形状は円形、凸状に隆起しており、粘性がある。３０℃で３日間培養後のコロニーは、直径２〜４ｍｍとなる。また、鞭毛があり、運動性を有する。
３．生理学的性質
本菌株は、好気性で、生育の至適温度は２５〜３０℃であり、生育の至適ｐＨは６〜８であった。また、各種糖類の利用性は表２に記した通りであり、オキシダーゼ及びカタラーゼを生産する。【００４３】
【表２】
0005222139.tif 000003
【００４４】
前記の分離源・性質に基づき、本菌株が属する属を、「Bergey’s Manual of DETERMINATIVE BACTERIOLOGY(第9版)」に従って検索し、該菌株が、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物である事が判明し、本菌株をシノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）株と命名した。このシノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）株は、本出願人によって、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００３年７月１０日付で寄託し、特許生物寄託センターより２００３年７月１１日付で通知された受託証において、ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２８の受託番号を得ている。以下、このシノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２８）を寄託菌株と記す。
なお、本出願人は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（国際寄託当局）に２００７年６月２２日付で、上記シノリゾビウム エスピー．９７５０７（Sinorhizobium sp. 97507）（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２８）について国際寄託への移管の申請を行い、同日付で同当局によって本申請が受領された。当該受領書において、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４３が発行された。
【００４５】
［ソルボースデヒドロゲナーゼのクローニング］
前述した寄託菌株から染色体ＤＮＡを抽出し、以下の手順によってソルボースデヒドロゲナーゼのクローニングを行った。【００４６】
１．染色体ＤＮＡの抽出
前記寄託菌株の菌体を、溶菌酵素処理して細菌の細胞壁を破壊した後、フェノールでＤＮＡを抽出し、塩析して染色体ＤＮＡを抽出、回収した。【００４７】
２．ＰＣＲ
下記条件でＰＣＲを行い、約１．６ｋｂｐのソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
テンプレート  ：１．で抽出した寄託菌株由来のＤＮＡ
プライマー  ：配列番号３及び配列番号４で表されるＤＮＡ
（Sinorhizobium meliloti strain 1021 Genome Project（ウェブサイトhttp://sequence.toulouse.inra.fr/meliloti.html）で公開されている塩基配列SMa1414（Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼと推定）を元に、プライマー１，２を合成した。）
ポリメラーゼ  ：TaKaRa LA Taq（タカラバイオ社製）
反応条件  ：
ａ．変性９４℃、１分（１サイクル）
ｂ．変性９４℃、３０秒
ｃ．アニーリング５７℃、１分
ｄ．伸長反応７２℃、２分
ｅ．伸長反応７２℃、５分（１サイクル）
なお、ｂ〜ｄの反応は、３０サイクル行った。【００４８】
３．ゲルからの切り出し精製
２．で取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することで精製し、QIAEXII Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを抽出した。【００４９】
４．制限酵素処理
３．でアガロースゲルから抽出精製したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣＮＮＴ２を、制限酵素NcoI、HindIIIで制限酵素処理した。制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣＮＮＴ２をアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAEXII Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣＮＮＴ２を抽出した。
なお、前記プラスミドｐＵＣＮＮＴ２は、市販のプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に、NcoIリンカー及び、プラスミドの安定化に寄与するｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Biotech社製）由来のrrnB ribosomal terminatorを付加したプラスミドであり、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼを発現させるのに特に適している。図１及び図２は、本実施例で用いたプラスミドｐＵＣＮＮＴ２を構築するフロー図である。図１、図２に示したように、このプラスミドｐＵＣＮＮＴ２は、以下の工程１〜５を経て構築した。
工程１：市販のプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に、ＮｄｅＩリンカーを付加したｐＵＣＮｄｅを作製。
工程２：ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Biotech社製）のＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩ領域をＰＣＲにて増幅。その際、ＮｄｅＩリンカーを付加（PCR product NdeI-SspI断片）。
なお、図１中に示されるＰＣＲproduct NdeI-SspI断片におけるｒｒｎＢＴ１Ｔ２は、プラスミドの安定化に寄与するものである。
工程３：ｐＵＣＮｄｅのＮｄｅＩ−ＳｓｐＩ領域を、前記PCR product NdeI-SspI断片と置換したプラスミドｐＵＣＮＮＴを作製する。
工程４：前記ｐＵＣＮＮＴのＣｆｒ１０Ｉ−ＢａｍＨＩ領域をＰＣＲにて増幅。その際、ＮｄｅＩリンカーをＮｃｏＩリンカーに変換。
工程５：前記増幅断片を、ｐＵＣＮＮＴのＣｆｒ１０Ｉ−ＢａｍＨＩと置換してプラスミドｐＵＣＮＮＴ２を作製する。【００５０】
５．ライゲーション
４．で制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣＮＮＴ２を、DNA Ligation Kit Ver2.1（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションさせ、プラスミドｐＵＣＮＮＴ２＿ＡＧＤ１を構築した。【００５１】
６．トランスフォーメーション
５．で構築したプラスミドｐＵＣＮＮＴ２＿ＡＧＤ１を用いて、E.coli JM109 Competent Cell（タカラバイオ社製）を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。ダイレクトＰＣＲにて、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに生育したコロニー２０個に、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含んだプラスミドが導入されているか確認した。ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅が確認できた７株を、アンピシリンナトリウム含有のＬＢプレートに播種し、純化した。【００５２】
７．活性確認
(1)純化した遺伝子組換え体大腸菌７株を、下記の条件で液体培養した。
培地：
ＬＢ培地  １０ｍＬ
Bacto Tryptone（Bectone,Dickinson and Co.製）１．００％（ｗ／ｖ）
Bacto Yeast Extract（Bectone,Dickinson and Co.製）０．５０％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）１．００％（ｗ／ｖ）
アンピシリンナトリウム（和光純薬社製）０．００５％（ｗ／ｖ）
培養容器  ：試験管（直径２．５×長さ２０ｃｍ）
培養条件  ：３７℃、１５時間、１２１ｒｐｍ
(2)培養液１０ｍＬ分の菌体を集菌（１０００×ｇ、１０分、室温）。
(3)上清を除去し、破砕バッファー（50mM KPB(pH7.5)、0.25％(w/v) BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.01％(w/v) フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD））１ｍＬで、菌体を懸濁。
(4)チップ式超音波破砕装置で、菌体を破砕（氷浴、５分）。
(5)菌体破砕液を遠心分離（１３０００×ｇ  ４℃  ５分）し、上清（無細胞抽出液）を回収し、これを活性測定用サンプルとした。
(6)活性発現の確認は、後述する［酵素活性測定方法］に基づいて行い、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性が最も強い株を、E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1とした。なお、培地当りのソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、０．０８０Ｕ／ｍＬ培地であった。
また、E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1の培養菌体から抽出したプラスミドpUCNNT2_AGD1について塩基配列の決定を行ったところ、ソルボースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片が挿入されていることが確認された。その塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
なお、本実施例において決定した塩基配列を、上記のSinorhizobium meliloti strain 1021 のゲノム・プロジェクトに公開されている、ソルボースデヒドロゲナーゼ推定コード領域（Locus tag：SMa1414）と比較した。その結果、第160番目の塩基がＳＭａ1414ではアデニン（Ａ）であるのに対し、本実施例のものではシトシン（Ｃ）であった。この塩基の置換により、第５４番目のアミノ酸について、SMａ1414（ACCESSION No.: NP_436019）ではメチオニン（Ｍｅｔ）であるのに対し、本実施例のものではロイシン（Ｌｅｕ）となっている。【００５３】
［ソルボースデヒドロゲナーゼ製造］
前述した通り作製した、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を持つ遺伝子組み換え体（E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1）を培養し、得られた菌体からソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。
なお、この遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1は、本出願人によって、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００６年３月２８日付で寄託し、特許生物寄託センターより２００６年３月２８日付で通知された受託証において、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５４の受託番号を得ている。【００５４】
１．培養
菌株：遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1
１．１  種培養
２．０Ｌ容の坂口フラスコに、ＬＢ培地１．０Ｌを加え、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）となるように使用直前に添加した。このＬＢ培地に遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1を白金耳で植菌し、３７℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。培養開始１３時間後の培養液を、本培養時の種菌とした。
ＬＢ培地組成：
Bacto Tryptone（Bectone,Dickinson and Co.製）１．００％（ｗ／ｖ）
Bacto Yeast Extract（Bectone,Dickinson and Co.製）０．５０％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）１．００％（ｗ／ｖ）
アンピシリンナトリウム（和光純薬社製）０．００５％（ｗ／ｖ）【００５５】
１．２  本培養
３０Ｌ容培養装置に、ＧＹＣ培地２１Ｌを加え、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウム（和光純薬社製）及びイソプロピル-β-Ｄ-１-チオガラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を、それぞれ終濃度０．００５、０．０２４％（ｗ／ｖ）となるように使用直前に添加した。
GYC培地組成：（１５ＮのＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）
グリセロール（阪本薬品工業社製）４．０％（ｗ／ｖ）
酵母エキス（味の素社製）２．０％（ｗ／ｖ）
コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）４．５％（ｗ／ｖ）
前記培地に、前記１．１で準備した種菌１Ｌを植菌し、下記条件で１５時間培養した。
なお、培養中は、１５ＮのＮａＯＨでｐＨを７．０に制御した。
培養温度：３７℃
通気量：１ｖ／ｖ／ｍ
回転数：３５０ｒｐｍ
培養開始１５時間後に、遠心分離機を用いて、菌体９５５．０６ｇを回収した。【００５６】
２．  精製
前記培養によって得られた菌体から、以下の各精製工程を経て、ソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。主な精製工程におけるソルボースデヒドロゲナーゼの全活性、比活性、回収率、比活性倍数（fold）を測定した。その結果を表３に示す。
なお、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、後述する［酵素活性測定方法］に基づいて測定した。【００５７】
【表３】
0005222139.tif 000004
【００５８】
２．１  無細胞抽出液（ＣＦＥ）の調製
前記１．２の本培養で取得した菌体９５５．０６ｇのうち２００ｇを用いて精製を行った。菌体２００ｇに対し、１Ｌの破砕バッファー（50mM KPB(pH7.5)、0.25％(w/v) BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM ＦＡＤ）を加え、菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液に、セリンプロテアーゼの阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、チップ式超音波破砕装置で破砕した。この菌体破砕液を、遠心分離（１３０００×ｇ、４℃、１５分）し上清を回収した。この上清をＣＦＥとした。【００５９】
２．２  硫安分画
前記２．１で回収したＣＦＥ １０９５ｍＬに対し、終濃度４０％（ｗ／ｖ）となるように硫酸アンモニウムを氷浴下で加えた。この際、ｐＨが７．５となるようにアンモニアで調整した。硫酸アンモニウムが溶解して後、４℃で一晩静置した。【００６０】
２．３  透析
遠心分離（13,000×g、4℃、15分）により、硫安沈殿を回収した。回収した硫安沈殿は、透析チューブ（シームレスセルロースチューブ小サイズ18 和光純薬社製）に入れ、透析バッファー（5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)   BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM FAD）を用いて透析を行った。【００６１】
２．４  遠心分離
透析チューブ内に不溶物が生じた為、遠心分離（１３０００×ｇ、４℃、１５分）により、これを除去し、上清を回収した。【００６２】
２．５  強陰イオン交換クロマトグラフィー（TOYOPEARL SuperQ650M）
平衡化バッファー（5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v)   BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM FAD）で平衡化した強陰イオン交換樹脂TOYOPEARL SuperQ650M（東ソー社製） ３５０ｍＬ（カラムサイズ：φ６．２ｃｍ×高さ２７cm）に、前記２．３で回収した上清をチャージした。チャージ終了後、樹脂のbed volumeの５倍量の洗浄バッファー（5mM KPB(pH8.0)、0.25％ (w/v)  BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM FAD）で洗浄後、樹脂のbed volumeの２．５倍量の２種の溶出バッファー（1： 5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v) BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM FAD、2：5mM KPB(pH8.0)、0.25％(w/v) BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.001mM FAD、1M NaCl）を用いて、目的タンパクをグラジエント溶出させ、活性画分を回収した。【００６３】
２．６  脱塩濃縮
限外濾過装置ビバセル２５０（ビバサイエンス社製、分画分子量１万）を用いて、前記２．５の強陰イオン交換クロマトグラフィー（TOYOPEARL SuperQ650M）で回収した活性画分の脱塩濃縮を行い、最終的に酵素が溶解しているバッファーを50mM KPB(pH7.5)、0.25％(w/v) BL-9EX（日光ケミカルズ社製）、0.01mM FADに置換し、ソルボースデヒドロゲナーゼを得た。【００６４】
［酵素活性測定方法］
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬ、１．０Ｍ Ｌ−ソルボース１．０ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）０．１４ｍＬ、３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト０．２ｍＬ、水０．６１ｍＬを３ｍＬ石英セルに添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で１０分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加後、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ６００／ｍｉｎ）を３７℃で測定する。ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数を１６．３ｍＭ−１とし、1分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素量を１単位（ｕｎｉｔ）として、酵素活性濃度を次式に従って求めた。
酵素活性濃度（ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）＝
（−ΔＡＢＳ６００／ｍｉｎ×３．０×希釈倍率）／（１６．３×１．０×０．０５）
光路長：１．０ｃｍ【００６５】
［ソルボースデヒドロゲナーゼの性質試験］
前記［酵素活性測定方法］における測定条件を適宜変更し、前記２．６で得られたソルボースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、基質特異性、Ｋｍ値、総分子量、サブユニット分子量、阻害剤、酵素反応生成物の同定について、以下の通り試験し、本酵素の性質を調べた。【００６６】
（１）至適ｐＨ：
前記［酵素活性測定方法］における緩衝液を、酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.71〜5.36）、クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液（pH5.55〜5.95）、リン酸カリウム緩衝液（pH6.25〜7.35）、トリス・塩酸緩衝液（pH7.52〜8.34）、グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.68〜9.11）（各緩衝液とも終濃度で33.3mM）に代え、精製酵素の酵素活性濃度を測定した。なお、酵素活性濃度算出の際には、予め求めておいた各ｐＨにおけるＤＣＩＰのモル吸光係数を用いた。その結果を図３に示す。図３に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼの至適ｐＨは、８．０であった。【００６７】
（２）ｐＨ安定性：
ソルボースデヒドロゲナーゼを、５０ｍＭ濃度の緩衝液、すなわち酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.14〜5.91）、クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液（pH5.91〜6.30）、リン酸カリウム緩衝液（pH6.59〜7.47）、トリス・塩酸緩衝液（pH7.53〜8.39）、グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.61〜10.30）の各々に溶解し、４０℃で１５分間保持した後の酵素活性を前記［酵素活性測定方法］により測定した。その結果を図４に示す。図４に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼはｐＨ５．９〜８．６の領域で安定であった。【００６８】
（３）至適温度：
ソルボースデヒドロゲナーゼを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、前記［酵素活性測定方法］における温度を３５℃〜７０℃までの範囲で変化させ、酵素活性を測定した。その結果を図５に示す。図５に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼの至適温度は６０℃付近であった。【００６９】
（４）温度安定性：
ソルボースデヒドロゲナーゼを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、０．２５％ ＢＬ−９ＥＸ（日光ケミカルズ社製）、０．０１ｍＭ ＦＡＤに溶解し、３０℃〜７０℃までの各温度で１０分間保持したのち、前記［酵素活性測定方法］により測定し、酵素活性の残存率を求めた。その結果を図６に示す。図６に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼは、４５℃においても７７％の酵素活性が保持され、約４５℃以下で安定であった。【００７０】
（５）基質特異性およびＫｍ値：
前記［酵素活性測定方法］における活性測定用反応液の基質として、１，５−ＡＧ、Ｌ−ソルボースおよび表４中に示す他の各基質（いずれも終濃度３３３ｍＭ、ラクトースは１６７ｍＭ）を使用した場合の活性を、［酵素活性測定方法］に従って測定し、相対反応性を求めた。結果は、Ｌ−ソルボースの活性値を基準とし、それぞれの基質における相対値として示した。【００７１】
【表４】
0005222139.tif 000005
【００７２】
表４の結果からわかるように、このソルボースデヒドロゲナーゼは、１，５−ＡＧ及びＬ−ソルボースに強く作用し、アリルアルコール、Ｄ−ソルボース、２−メチル−１−プロパノール、Ｄ−ガラクトース、１−ブタノール、Ｄ−グルコースには弱く作用した。また、キシリトール、１−プロパノール、ラクトース、２−プロパノール、２，３−ブタンジオール、Ｄ−マンノース、エタノール、グリセロール、マルトース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−セロビオース、スクロース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−ラフィノース、イノシトール、ｍｅｓｏ−エリトリトール、２−ブタノール、２−ペンタノール、プロピレングリコール、メタノールにはほとんど作用しなかった。
また、このソルボースデヒドロゲナーゼのＫｍ値は、１，５−ＡＧに対し８２．５ｍＭ、Ｌ−ソルボースに対し６５．６ｍＭであった。【００７３】
（６）総分子量およびサブユニット分子量：
このソルボースデヒドロゲナーゼの総分子量を、移動相に０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を用いて、ＴＳＫｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｇ４ＳＷＸＬカラム（直径０．７８ｃｍ×長さ３０ｃｍ、東ソー社製）にて流速０．５ｍＬ／分の条件で分析した。分子量マーカー（オリエンタル酵母社製）、分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社製）及びＩｇＭ（シグマ社製）との比較により、このソルボースデヒドロゲナーゼは総分子量約１５０ｋＤａと約６７２ｋＤａの形態で存在すると推定された。
１０％ポリアクリルアミドゲルを用い、Laemmliらの方法に従い、このソルボースデヒドロゲナーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、移動度を分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社製）のそれと比較した結果、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼのサブユニット分子量は約５９．６ｋＤａと推定された。【００７４】
（７）阻害剤：
前記［酵素活性測定方法］における活性測定用反応液に、終濃度が１ｍＭになるように表５中に示す各種添加物をそれぞれ加え、ソルボースデヒドロゲナーゼの活性を測定した。コントロールは、添加物を加えない以外は［酵素活性測定方法］に従った。コントロールの活性値を１００（％）とし、１）〜３９）の各種阻害剤を添加した場合に得られた活性値を相対活性（％）として求め、結果を表５に記した。【００７５】
【表５】
0005222139.tif 000006
【００７６】
表５の結果から、このソルボースデヒドロゲナーゼは、重金属イオン（Ｍｎ２＋，Ｈｇ２＋，Ｃｕ２＋）で強く阻害された。また、アクリフラビンでは相対活性が６６％となった。【００７７】
（８）酵素反応生成物の同定：
前記２．６で得られたソルボースデヒドロゲナーゼ３．８７Ｕを添加し、３００ｍＭ Ｌ−ソルボース、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト、４９８Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（和光純薬社製）となるように調整した酵素反応溶液１．５ｍＬを、攪拌しながら２時間室温にて反応させた。遠心限外濾過器マイクロコンＹＭ−１０（アミコン社製、分画分子量１万）にて酵素を除去した酵素反応溶液を、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、リテンションタイムの標品との比較から、酵素反応生成物はＬ−ソルボソンであると同定された。ここで、標品として使用したＬ−ソルボソンは予め化学合成したものである。
なお、高速液体クロマトグラフィーの分析条件は、以下の通りである。
カラム：High Performance Carbohydrate Column (ウォーターズ社製)
検出：ＲＩ
溶離液：  アセトニトリル：蒸留水＝６：４（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
インジェクションボリューム：１０μＬ【００７８】
［検量線作成］
前記［酵素活性測定方法］における基質を、Ｌ−ソルボースから１，５−ＡＧに変え、その終濃度を、１．５〜４０．６ｍＭの範囲で変化させ、吸光度変化を測定し、１，５−ＡＧ濃度と吸光度変化（ΔＡＢＳ６００／ｍｉｎ）との関係をプロットし、図７に示す検量線を作成した。図７に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼは、終濃度１．５〜４０．６ｍＭの１，５−ＡＧを定量できることがわかった。【００７９】
［補酵素］
ソルボースデヒドロゲナーゼに酸処理を施し、酸処理によりソルボースデヒドロゲナーゼのタンパクから遊離させたフラビン化合物を、高速液体クロマトグラフィーで分析した。ソルボースデヒドロゲナーゼから遊離したフラビン化合物は、ＦＡＤの標準品とリテンションタイムが一致したことから、このソルボースデヒドロゲナーゼの補酵素はＦＡＤであることがわかった。【００８０】
（実施例２）
次に、置換型高発現プラスミド（以下、ｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１とする。）を用いた組換えソルボースデヒドロゲナーゼの製造、及び、該ソルボースデヒドロゲナーゼを活性化することにより、高感度に１，５−ＡＧを検出する例を示す。
なお、ｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１においては、下記の通り、そのソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンの直後に、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をコードするコドンが付加されている点で、前記ｐＵＣＮＮＴ２＿ＡＧＤ１とは異なっている。
以下、図８に概略示される手順に沿って、プラスミドｐＴｒｃＡＧＤ１の構築方法について詳しく説明する。【００８１】
［１］プラスミドｐＴｒｃＡＧＤ１の構築
１．  ＰＣＲ（図８中、工程１）
下記条件でＰＣＲを行い、約１．６ｋｂｐの置換型ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
テンプレート：ｐＵＣＮＮＴ２＿ＡＧＤ１
プライマー：配列番号７及び８で表されるＤＮＡ
ポリメラーゼ：Takara LA Taq（タカラバイオ社製）
なお、配列番号７で示されるプライマーは制限酵素NcoIサイト、及び、上記グルタミン酸（gaa）、フェニルアラニン（ttc）の付加配列を含み、配列番号８で示されるプライマーは制限酵素BamHIサイトを含んでいる。各プライマーの位置関係は、図８の工程１に示す。
反応条件：
ａ、変性９４℃、２分（１サイクル）
ｂ、変性９４℃、４０秒
ｃ、アニーリング５８℃、３０秒
ｄ、伸長反応７２℃、２分
ｅ、伸長反応７２℃、５分（１サイクル）
なお、ｂ〜ｄの反応は、３５サイクル行った。【００８２】
２．  ＰＣＲ産物の精製（図８中、工程１）
１．で取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することで増幅を確認し、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用いて、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡを精製した。【００８３】
３．  制限酵素処理（図８中、工程１）
２．で精製したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡを、制限酵素NcoI、BamHIで制限酵素処理した。制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡを抽出した。
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）は、制限酵素NcoI、BamHIで制限酵素処理したのち、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用いて精製した。【００８４】
４．  ライゲーション（図８中、工程２）
３．で制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡ、及びｐＴｒｃ９９Ａを、Ligation high（東洋紡社製）を用いてライゲーションさせ、プラスミドｐＴｒｃＡＧＤ１を構築した。ｐＴｒｃＡＧＤ１のプラスミド模式図については図８の工程２に示す。【００８５】
５．  トランスフォーメーション
４．で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＧＤ１を用いて、E. coli JM109 Competent Cell（タカラバイオ社製）を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。生育したコロニーを下記の条件で培養した。
培地：ＬＢ培地  １０ｍｌ
培養容器：試験管（直径２．５×長さ２０ｃｍ）
培養条件：３０℃、２０時間、２１０ｒｐｍ
培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限酵素NcoIもしくはBamHIで処理し、この処理されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動することで、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されているか確認した。【００８６】
なお、置換型ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子は配列番号５に、そのアミノ酸配列は配列番号６に示すとおりである。
［２］プラスミドｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１の構築
１．  ＰＣＲ（図８中、工程３）
下記条件でＰＣＲを行い、約２．２ｋｂｐのｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
テンプレート：ｐＴｒｃＡＧＤ１
プライマー：配列番号９及び１０で表されるＤＮＡ
ポリメラーゼ：Takara Ex Taq（タカラバイオ社製）
なお、配列番号９及び配列番号１０で示されるプライマーは、それぞれ、ＢｇｌIIサイトをアダプター配列として含んでいる。
反応条件：
ａ、変性９６℃、５分（１サイクル）
ｂ、変性９６℃、４０秒
ｃ、アニーリング５８℃、４０秒
ｄ、伸長反応７２℃、２分
ｅ、伸長反応７２℃、５分（１サイクル）
なお、ｂ〜ｄの反応は、２５サイクル行った。【００８７】
２．  ゲルからの切り出し精製（図８中、工程３）
１．で取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することで精製し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて、アガロースゲルからｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡを抽出した。【００８８】
３．  制限酵素処理（図８中、工程３、４）
２．でアガロースゲルから抽出精製したｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡを、制限酵素BglIIで制限酵素処理した。制限酵素処理したｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて、アガロースゲルからｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡを抽出した。
プラスミドｐＵＣ１９は、制限酵素BamHIで制限酵素処理したのち、脱リン酸化処理した。【００８９】
４．  ライゲーション（図８中、工程４）
３．で制限酵素処理したｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ、及びｐＵＣ１９を、Ligation high（東洋紡社製）を用いてライゲーションさせ、プラスミドｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１を構築した。ｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１のプラスミド模式図については図８の工程４に示す。【００９０】
５．  トランスフォーメーション
４．で構築したプラスミドｐＵＣｐＴｒｃＡＧＤ１を用いて、E. coli JM109 Competent Cell（タカラバイオ社製）を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。生育したコロニーを下記の条件で培養した。
培地：ＬＢ培地  １０ｍｌ
培養容器：試験管（直径２．５×長さ２０ｃｍ）
培養条件：３０℃、２０時間、２００ｒｐｍ
培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRIもしくはPstIで処理し、この処理されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動することで、ｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されているか確認した。【００９１】
ｔｒｃプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入が確認された上記E. coliクローンの１つ（以下、E. coli JM109/pUCpTrcAGD1とする。）を以下に示す「置換型ソルボースデヒドロゲナーゼの製造」に供試した。
なお、該E. coli JM109/pUCpTrcAGD1から抽出したプラスミドについて、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子部位の塩基配列を決定した。その塩基配列は配列番号５に、アミノ酸配列は配列番号６に示すとおりである。
塩基配列を確認した結果、pUCpTrcAGD1においては、挿入されているソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンの直後に、gaa(グルタミン酸)、ttc(フェニルアラニン)が順にイン・フレームで付加されていることが確認された。
また、前記プラスミドpUCNNT2_AGD1のソルボースデヒドロゲナーゼのコード領域における第５１番目の塩基シトシン（Ｃ）、第１０８番目の塩基グアニン（Ｇ）、及び第１６８番目の塩基グアニン（Ｇ）について、pUCpTrcAGD1においては、これらに相当する塩基が、それぞれ順に、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、及びアデニン（Ａ）に置換されていることが確認された。しかし、上記二つのアミノ酸が付加されている以外には、前記の塩基置換によって、これにコードされるソルボースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に置換等の変異は生じていない。【００９２】
［３]置換型ソルボースデヒドロゲナーゼの製造
１．  培養
菌株：遺伝子組み換え体E. coli JM109/pUCpTrcAGD1
１．１  種培養
５００ｍＬ容の三角フラスコに、ＬＢ培地１００ｍＬを加え、オートクレーブ滅菌し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるように使用直前に添加した。このＬＢ培地に遺伝子組み換え体E. coli JM109/pUCpTrcAGD1を白金耳で植菌し、２５℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。培養開始２１時間後の培養液を、本培養時の種菌とした。【００９３】
１．２  本培養
５００ｍＬ容の三角フラスコに、ＬＢ培地１００ｍＬを加え、オートクレーブ滅菌し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるように使用直前に添加したフラスコ培地４０本を調製した。各々の培地に、前記１．１で準備した種菌２ｍＬずつを植菌し、２５℃で３時間、振盪培養（１２０ｒｐｍ）した培養液にフィルター滅菌したイソプロピル―β―Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを０．００２４％（ｗ／ｖ）となるように添加し、更に、２５℃で２１時間、振盪培養した。培養終了後に、遠心分離機を用いて菌体を回収した。【００９４】
２．  精製
前記培養によって得られた菌体から、以下の各精製工程を経て、置換型ソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。その結果を表６に示す。
なお、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、実施例１に記載の［酵素活性測定方法］に基づいて測定した。【００９５】
【表６】
0005222139.tif 000007
【００９６】
２．１  無細胞抽出液（ＣＦＥ）の調製
前記１．２の本培養で回収した菌体に３６０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５を加え、菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液を４分割し、それぞれにつき超音波破砕装置（ＫＵＢＯＴＡ社製ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ）を用いて出力１８０Ｗ、３０分間で破砕した。これらの菌体破砕液を合わせて、遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、３０分）し、ＣＦＥ３５５ｍＬを回収した。【００９７】
２．２  硫安分画
前記２．１で回収したＣＦＥに、氷浴下、終濃度０．２５％（ｖ／ｖ）となるようにＢＬ−９ＥＸを加え３０分間攪拌溶解した。更に、飽和濃度２５％となるように硫酸アンモニウム５１．１２ｇを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウムが溶解して後、更に３０分間攪拌した。この溶解液を遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、３０分）し、上清３７０ｍＬを回収した。次に、この上清に、氷浴下、飽和濃度４０％となるように硫酸アンモニウム３４．４１ｇを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウムが溶解して後、更に３０分間攪拌した後、４℃で一晩静置した。【００９８】
２．３  透析
遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、３０分）により、硫安沈殿を回収した。回収した硫安沈殿は、１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５に溶解し、透析チューブに入れ、透析バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％グリセリン）を用いて透析を行った。【００９９】
２．４  遠心分離
透析チューブ内に不溶物が生じた為、遠心分離（２７，０００×ｇ、４℃、１５分）により、これを除去し、上清２１ｍＬを回収した。【０１００】
２．５  弱陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）
平衡化バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％グリセリン）で平衡化した弱陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）３２０ｍＬ（カラムサイズ：ｆ２．６ｃｍ×高さ６０ｃｍ）に、前記２．４で回収した上清をチャージした。チャージ終了後、樹脂のｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅの３倍量の洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％グリセリン）で洗浄後、樹脂のｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅの５倍量の溶出バッファー（１：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％グリセリン、２：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０％グリセリン，１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて、目的タンパクをグラジエント溶出させ、活性画分２６２ｍＬを回収した。【０１０１】
２．６  脱塩濃縮
限外濾過装置モデル８２００（アミコン社製、限外ろ過メンブレン分画分子量１０万）を用いて、前記２．５の活性画分を２１．５ｍＬに濃縮した。この濃縮液を透析チューブに入れ、透析バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）を用いて透析を行い、バッファーの置換を行った。更に、遠心濃縮器ビバスピン２０（ビバサイエンス社製、分画分子量１０万）を用いて遠心分離（２，７００×ｇ、４℃、３時間）により２．７ｍＬに濃縮し、置換型ソルボースデヒドロゲナーゼ３２２Ｕを得た。【０１０２】
［４］置換型ソルボースデヒドロゲナーゼの活性化
前記［３］（「置換型ソルボースデヒドロゲナーゼの製造」）で製造したソルボースデヒドロゲナーゼ（以下置換型酵素と略す）を、以下のような方法で１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト（１ｍ−ＰＭＳ）で処理し、置換型酵素を活性化した。
前記［３］で製造した１１９U／ｍL濃度の置換型酵素の溶液０．１１５ｍＬに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）１．７６５ｍＬと２０ｍＭの１ｍ−ＰＭＳ水溶液０．１２ｍＬを加えて攪拌後、冷蔵庫内で1晩保存して活性化を行った。活性化終了後、遠心濃縮器ビバスピン２０（ビバサイエンス社製、分画分子量5万）に、この活性化酵素液の全量を添加し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）１０ｍＬで希釈してから遠心分離機にセットして４，５００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、約０．３ｍＬまで濃縮した。さらに、この濃縮液に５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加えて希釈後、再度遠心分離して濃縮し、１ｍ−ＰＭＳを除去した。さらに同様の操作を２回繰り返して、ほぼ完全に１ｍ−ＰＭＳを除去した。最後に、この濃縮液に５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）を加えて総液量を４ｍＬとし、活性化した置換型酵素の濃度を３．４Ｕ／ｍＬに調整した。【０１０３】
［５］活性化効果の確認
１ｍ−ＰＭＳで活性化した酵素と未処理の酵素を用いて、それぞれ、実施例３（臨床的な１，５−ＡＧの測定法）のＲ２試薬を調製した。これらのＲ試薬を用いて、０と５０μｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ標準液を測定し、それぞれの発色強度を比較した。５０μｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ標準液による吸光度の増加は、活性化前の酵素では０．０６４であったのに対し、活性化処理後の酵素では約４倍の０．２４８となり、酵素が約４倍に活性化されていることが分かった。【０１０４】
（実施例３）
［１］臨床的な１，５−ＡＧの測定法
臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置への対応を考え、最小スケールの測定法を組み立てた。
あらかじめ、以下のような組成の測定試薬、Ｒ１−１試薬（グルコース消去剤）、Ｒ１−２試薬（１ｍ−ＰＭＳ水溶液）、Ｒ２試薬（１，５−ＡＧ検出剤）を調製した。
試験管に、サンプルとして１，５−ＡＧ標準液または臨床検体を９μＬ、Ｒ１−１試薬を２００μＬ加えて撹拌し、３７℃の恒温水槽で５分間反応した。反応後、さらに、Ｒ１−２試薬１０μＬと、Ｒ２試薬１００μＬを加えて撹拌し、直ちに、この反応液を分光光度計用のセルに移し換え、３７℃に加温されたセルホルダーにセットして、４５０ｎｍにおける吸光度の変化を５分間測定した。
なお、本実施例に使用した臨床検体は、健常者と糖尿病患者から採取した血清である。【０１０５】
・試薬組成
Ｒ１−１試薬（グルコース消去剤）
塩化カリウム                       ４９．６ｍＭ
塩化ナトリウム                       １００ｍＭ
ＥＤＴＡ・２ナトリウム                ０．１ｍＭ
フォスフォエノールピルビン酸       ８．０１ｍＭ
ＡＴＰ                             ０．９９ｍＭ
塩化マグネシウム                   ７．３８ｍＭ
ピルビン酸キナーゼ（東洋紡製）        ５Ｕ／ｍＬ
グルコキナーゼ（ユニチカ製）          ４Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ-１                            ０．９５ｍＭ
ＨＥＰＥＳバッファー                    ５０ｍＭ（ｐＨ ７．５）
Ｒ１−２試薬（１ｍ−ＰＭＳ水溶液）
１ｍ−ＰＭＳ                            ０．４ｍＭ
Ｒ２試薬（１，５−ＡＧ検出剤）
置換型酵素    ３．４Ｕ／ｍＬ
ＨＥＰＥＳバッファー                    ５０ｍＭ（ｐＨ ７．５）【０１０６】
［２］検量線の作成
血清ベースのマトリックスを用いて、１，５−ＡＧの標準液、０、５、１２．５、２５、５０μｇ/ｍＬを調製した。この標準液を上記の臨床的な１，５−ＡＧの測定法で測定し、図９の検量線を作成した。なお、各標準液について吸光度増加の値を表７に示す。【０１０７】
【表７】
0005222139.tif 000008
【０１０８】
［３］臨床検体の測定
健常者と糖尿病患者からなる２０個の血清検体を、上記の臨床的な１，５−ＡＧの測定法（本法）に従って測定し、既に、確立されている１，５−ＡＧ測定キット、「ラナ１，５ＡＧオートリキッド」で測定した結果と比較した。その結果を、表８、図１０に示す。【０１０９】
【表８】
0005222139.tif 000009
【０１１０】
図１０のグラフに示される通り、両者の測定値の間には、相関式：ｙ（本法）＝１．０１２４ｘ（ラナ１，５ＡＧオートリキッド）＋３．３１９９、相関係数（ｒ）：０．９６４と、良好な相関関係が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明による１，５−ＡＧの測定方法、及び、１，５−ＡＧ測定試薬組成物によれば、糖尿病のコントロールマーカーである１，５−ＡＧを高精度に定量することが可能であって、血漿、血清、髄液、尿等の臨床検体に適用することにより、迅速、かつ、簡便に糖尿病の診断をすることができる。
よって、本発明は、極めて高い産業上の利用可能性を有する。
【図１】
0005222139.tif 000010
【図２】
0005222139.tif 000011
【図３】
0005222139.tif 000012
【図４】
0005222139.tif 000013
【図５】
0005222139.tif 000014
【図６】
0005222139.tif 000015
【図７】
0005222139.tif 000016
【図８】
0005222139.tif 000017
【図９】
0005222139.tif 000018
【図１０】
0005222139.tif 000019
【配列表】
0005222139000001.app