(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図１（配列番号：１）のアミノ酸残基１〜３００を含んでなる天然配列ＤｃＲ３ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＤｃＲ３ポリペプチドに結合し、
（ｂ）（ａ）に記載のＤｃＲ３ポリペプチドへのＦａｓリガンドの結合を阻害する、抗ＤｃＲ３モノクローナル抗体。
【請求項２】
（ａ）図１（配列番号：１）のアミノ酸１〜２１５もしくはアミノ酸１〜３００からなるＤｃＲ３ポリペプチドに結合し、（ｂ）（ａ）に記載のＤｃＲ３ポリペプチドへのＦａｓリガンドの結合を阻害する、抗ＤｃＲ３モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤｃＲ３ポリペプチドのＦａｓリガンド活性に対する阻害作用をアンタゴナイズする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記Ｆａｓリガンド活性が、Ｆａｓに結合すること、アポトーシスを誘導すること、Ｔ細胞ＡＩＣＤを誘導すること、およびＮＫ細胞による細胞殺傷を誘導することの何れか一つである、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記Ｆａｓリガンド活性が、癌細胞においてアポトーシスを誘導することである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ＤｃＲ３を産生する癌を免疫細胞毒性攻撃に感受性にすること、および／または、腫瘍反応性リンパ球の増殖を亢進することのできる、請求項１ないし５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記癌細胞が結腸癌細胞または肺癌細胞である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が単離されたヒト抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１ないし８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がＦａｂ断片を含んでなる、請求項１ないし９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が一価抗体である、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ＣＨＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、または骨髄腫細胞からなる群から選択される組換え宿主細胞にて発現される、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１または２の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
請求項１３のハイブリドーマ細胞株の何れか一つにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項１ないし１２または１４の何れか一項に記載の抗体と、担体とを含む組成物。
【請求項１６】
容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物が請求項１ないし１２または１４の何れか一項に記載の抗体を含む、製造品。
【請求項１７】
インビボ又はエキソビボにおいてＤｃＲ３モノクローナル抗体を使用するための使用説明書をさらに含む、請求項１６に記載の製造品。
【請求項１８】
治療に使用するための、請求項１ないし１２または１４の何れか一項に記載の抗体、または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１ないし１２または１４の何れか一項に記載の抗体、または請求項１５に記載の組成物を含む、癌の治療のための医薬。
【請求項２０】
ＤｃＲ３遺伝子が前記癌の細胞において増幅している、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
前記癌が、肺癌、結腸癌、または胃腸癌である、請求項１９または２０に記載の医薬。
【請求項２２】
前記癌の細胞が、化学療法または放射線療法にも暴露される、請求項１９ないし２１の何れか一項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに、ここに「ＤｃＲ３」と命名する新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子-α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」又は「リンホトキシン」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ｆａｓリガンド(Ａｐｏ−１リガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド（トレイル(TRAIL)とも称される）等の様々な分子が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ｆａｓリガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性細胞死を誘発することが報告されている［Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)； Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼングらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zhengら, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawaら, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
【０００３】
Ｆａｓリガンドは主に３つの型のアポトーシス、即ち（ａ）成熟Ｔリンパ球の活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＩ）；（ｂ）免疫特権的部位からの炎症細胞の除去；及び（ｃ）細胞毒性リンパ球による損傷細胞の殺傷［Nagata, Cell, 88: 355 (1997))］を調節することが明らかになった。Ｔ細胞ＡＩＣＤが、ひとたび感染がクリアされた宿主の免疫反応の停止を助けると報告されている。抗体によるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の繰り返し刺激は、Ｔヘルパー細胞の表面におけるＦａｓリガンド及びＦａｓの発現を誘発し、従って、ＦａｓリガンドはＦａｓに結合し、活性化されたリンパ球のアポトーシスをトリガーして、それらの除去を導く。免疫特権的部位は、炎症性免疫反応が機能を乱す可能性のある眼、脳又は精巣といった組織を含む。免疫特権的部位における細胞は、構成的にＦａｓリガンドを発現し、Ｆａｓ依存性アポトーシスを通してＦａｓを発現する浸潤している白血球を除去する。黒色腫［Hahne等, Science, 274:1363 (1996)］及び肝細胞ガン［Strand等, Nature Med., 2:1361-1366 (1996)］を含むある種のガンは、免疫サーベランス(survaillance)を回避するために類似のＦａｓリガンド依存性機構を用いる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球は、ウイルス又は細菌感染により、又は少なくとも２つの経路での発ガン遺伝子形質転換により損傷を受けた細胞を除去すると報告されている。一方の経路は、パーフォリン及びグランザイムの放出を含み、代替的経路は、標的細胞上のＦａｓの結合によるＦａｓリガンドの発現及びアポトーシスの誘発を含む［Nagata, 上掲；Moretta, Cell, 90:13 (1997)］。
【０００４】
マウスＦａｓ／Ａｐｏ−１又はリガンド遺伝子（各々1pr及びg1dと呼ばれる）における変異は、幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ｆａｓリガンドが末梢における自己反応性リンパ球のクローン欠失の調節において役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994)；Nagata等, Science, 267:1449-1456 (1995)］。また、Ｆａｓリガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球における細胞刺激後アポトーシスを誘発すると報告されており、もはや必要でない場合の活性化されたリンパ球の除去に含まれ得る［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。Ｆａｓレセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yoneharaら, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。
【０００５】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたＥＰ４１７５６３］、双方のレセプターの型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Takaoら, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。更に最近になって、組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングがヘイル(Hale)らにより報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Bannerら, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
【０００６】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekeら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, 上掲、及びItohら, Cell, 66:233-243 (1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合にはほとんど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲは、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に、ＮＧＦ結合に関与しない約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む［Peetre, Cら, Eur. J. Hematol.,41：414-419(1988)；Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
【０００７】
イトーらは、Ｆａｓレセプターが５５-ｋＤａのＴＮＦＲ１によりシグナル化されるものと同様のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itohら, 上掲］。また、Ｆａｓ抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗Ｆａｓのマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦＲ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている［Krammerら, 上掲；Nagataら, 上掲］。従って、Ｆａｓ及びＴＮＦＲ１レセプターの双方を同時発現する株化細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死滅を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
【０００８】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ｆａｓリガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００９】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。これらの新たに同定されたＴＮＦＲファミリーのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテゲリン(osteoprotegerin)（ＯＰＧ）を含む［Brajatsh等, Cell, 87:845-855 (1996)；Montgomery等, Cell, 87:427-436 (1996)；Marsters等, J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997)；Simonet等, Cell, 89:309-319 (1997)］。他の知られたＴＮＦＲ様分子とは異なり、上掲のシモネット(Simonet)等は、ＯＰＧが疎水的膜貫通スパンニング配列を含まないことを報告している。
【００１０】
マースターズ(Marsters)ら、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者等は、細胞外のシステインに富んだ反復についてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ-３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marstersら,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３はＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyanら, Science, 274：990(1996)；Kitsonら, Nature, 384：372(1996)；Bodmerら, Immunity, 6：79(1997)］。
【００１１】
パンらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。パンらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
【００１２】
シェリダン(Sheridan)ら, Science, 277:818-821 (1997)及びパン(Pan)ら, Science, 277: 815-818 (1997)には、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）のレセプターと考えられる他の分子が記載されている。この分子は、ＤＲ５と称される（また、Ａｐｏ-２とも称されていた）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は、細胞質脂肪ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達ができる。
【００１３】
シェリダンら, 上掲には、ＤｃＲ１（またはＡｐｏ-２ＤｃＲ）が、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）のデコイレセプターであると開示されている。シェリダンらは、ＤｃＲ１がインビトロでＡｐｏ-２リガンド機能を阻害することができると報告している。また、ＴＲＩＤと称されるデコイレセプターに関する開示については、パンら,上掲を参照。
ＴＮＦファミリーのサイトカイン及びそれらのレセプターについての概説は、Gruss及びDower, 上掲参照。
【００１４】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担うことができる。多くの個体細胞の運命、例えば増殖、泳動、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受容した情報によって支配される。この情報は、しばしば分泌されたポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド因子、及びホルモン）によって伝達され、一方それらは、多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質によって受容され解読される。これらの膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、それらに限られないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞相互作用に含まれるレセプター、及びセレクチン及びインテグリン等の細胞接着分子を包含する。例えば、細胞成長及び分化を調節する信号の伝達は、部分的には種々の細胞タンパク質のリン酸化によって調節される。タンパク質チロシンキナーゼというこの過程を触媒する酵素も、成長因子レセプターとして作用することができる。例としては、線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【００１５】
欠く結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬等を含む様々な工業的用途を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療薬として用いることができる。また、膜結合タンパク質は、潜在的ペプチド又は関連するレセプター／リガンド相互作用の分子阻害剤のスクリーニングにも用いることができる。
【００１６】
新たな天然レセプタータンパク質を同定するために、工業的にも学術的にも努力がなされてきた。多くの努力は、新たなレセプタータンパク質をコードする配列を同定するための、哺乳動物組み換えＤＮＡライブラリのスクリーニングに集中している。
【００１７】
（発明の概要）
本出願人は、本出願において「ＤｃＲ３」と命名される新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。ここで用いられる「ＤｃＲ３」なる語は、本出願人が既に「ＤＮＡ３０９４２」と呼んでいるものと同じポリペプチドを指す。
【００１８】
一実施態様において、本発明は、ＤｃＲ３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。一態様において、単離された核酸分子は、図１（配列番号：１(SEQ ID NO:1)）のアミノ酸残基１〜３００；図１（配列番号：１）のアミノ酸残基１〜２１５；又はｘが図１（配列番号：１）の残基２１５〜３００のいずれかである場合の残基１〜ｘを有するＤｃＲ３ポリぺプチドをコードするＤＮＡを含むか、又はこのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高いストリンジェント条件下でそれに安定して結合したままである。
【００１９】
他の実施態様において、本発明はＤｃＲ３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。また、このようなベクターを含有する宿主細胞も提供する。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。ＤｃＲ３ポリペプチドの生産方法もさらに提供され、宿主細胞を、ＤｃＲ３の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤｃＲ３を回収することを含んでいる。
【００２０】
他の実施態様では、本発明は単離されたＤｃＲ３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、一実施態様においては図１（配列番号：１）の残基１〜３００又は図１（配列番号：１）の残基１〜２１５又はｘが図１（配列番号：１）の残基２１５〜３００のいずれかである場合の残基１〜ｘを含んでなるアミノ酸配列を含む、単離された天然配列ＤｃＲ３ポリペプチドを提供する。
【００２１】
他の実施態様においては、本発明は単離されたＤｃＲ３変異体を提供する。ＤｃＲ３変異体は、図１（配列番号：１）の推定アミノ酸配列又はここで同定されるドメイン配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは天然又は天然発生ＤｃＲ３の活性を有する。
【００２２】
他の実施態様において、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＤｃＲ３ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例には、エピトープタグ配列又は免疫グロブリン配列のＦｃ領域と融合したＤｃＲ３が含まれる。
【００２３】
他の実施態様において、本発明はＤｃＲ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体は、ＤｃＲ３に結合してそのＦａｓリガンド及び／又はＤｃＲ３によって認識される他のリガンドへの結合を阻止するモノクローナル抗体である。
【００２４】
さらなる実施態様において、本発明はＤｃＲ３ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また、治療及び診断方法も提供される。
他の実施態様において、本発明は図３（配列番号：３）の核酸配列を含む発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【００２５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＤｃＲ３ポリペプチド」及び「ＤｃＲ３」という用語には、天然配列ＤｃＲ３及びＤｃＲ３変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。ＤｃＲ３は種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
【００２６】
「天然配列ＤｃＲ３」は、天然由来のＤｃＲ３と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＤｃＲ３は、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＤｃＲ３」という用語には、特に、ＤｃＲ３の自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた型)及びＤｃＲ３の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＤｃＲ３は、図１(配列番号：１)のアミノ酸１〜３００を含有する成熟又は全長天然配列ＤｃＲ３である。あるいは、ＤｃＲ３は図１（配列番号：１）のアミノ酸１〜２１５を含む。
【００２７】
「ＤｃＲ３変異体」とは、全長天然配列ヒトＤｃＲ３に対して図１（配列番号）：１）に示されている推定アミノ酸配列又はここで同定されるドメイン配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義するＤｃＲ３を意味する。このようなＤｃＲ３変異体には、例えば、図１の配列(配列番号：１)あるいはここで同定されるドメイン配列のＮ又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたＤｃＲ３ポリペプチドが含まれる。通常、ＤｃＲ３変異体は、図１のアミノ酸配列(配列番号：１)と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００２８】
ここで同定されるＤｃＲ３配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＤｃＲ３配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００２９】
ここで同定されるＤｃＲ３配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＤｃＲ３配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００３０】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＤｃＲ３、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さはＤｃＲ３の活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００３１】
「単離された」とは、ここで開示される種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。ＤｃＲ３の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインシトゥーのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３２】
「単離された」ＤｃＲ３核酸分子は、同定され、ＤｃＲ３核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＤｃＲ３核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＤｃＲ３核酸分子は、天然の細胞中に存在するＤｃＲ３核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたＤｃＲ３核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＤｃＲ３を通常発現する細胞に含まれるＤｃＲ３核酸分子を含む。
【００３３】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に関連付けられたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３４】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に関連付けられ」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に関連付けられている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に関連付けられている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に関連付けられている。一般的に、「作用可能に関連付けられる」とは、関連付けられたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。関連づけは簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３５】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗ＤｃＲ３モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体または阻止抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗ＤｃＲ３抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００３６】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＤｃＲ３の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＤｃＲ３の形態を意味する。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法等、全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。
【００３７】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００３８】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び予防的療法を称する。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
本発明は、本出願においてＤｃＲ３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＤｃＲ３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し、分離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＤｃＲ３（図１及び配列番号：１に示す）が、ヒトＴＮＦＲ２と約２８％のアミノ酸同一性を有することを見いだした。従って、現在では、本出願で開示されたＤｃＲ３がＴＮＦＲファミリーの新たなメンバーであり、ＴＮＦＲタンパク質ファミリーの典型的な活性又は特性を持つであろうと考えられる。ＯＰＧのように、他のＴＮＦＲファミリーメンバー[Simonet等, 上掲]であるＤｃＲ３分子は、今では、膜貫通領域を欠き、分泌されたタンパク質であることが分かっている。
【００４０】
ＤｃＲ３は、Ｆａｓリガンドに結合でき及び／又はＦａｓリガンドによって誘発されるアポトーシスの阻害を含むＦａｓリガンド活性の阻害ができる可溶性デコイレセプターであり得ると今日では考えられている。以下の実施例に示すように、遺伝子増幅実験は、ＤｃＲ３遺伝子がかなりの数の原発性の肺及び大腸癌において増幅されることを明らかにし、ある種の癌は、Ｆａｓリガンド誘発性アポトーシスを阻止するＤｃＲ３の様なデコイレセプターの発現により免疫細胞毒性攻撃を回避できることを示唆している。また、実施例は、ＤｃＲ３が免疫阻害活性であり得ることを示し、例えばＴ細胞媒介疾患におけるその用途を示唆している。ＤｃＲ３に対する抗体は、ＤｃＲ３生産性癌の免疫細胞毒性攻撃に対する感受性化及び腫瘍反応性リンパ球の増殖の促進に用いることができる。
【００４１】
Ｂ．  ＤｃＲ３の修飾
ＤｃＲ３の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＤｃＲ３の標的とするアミノ酸残基を、ＤｃＲ３の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＤｃＲ３を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＤｃＲ３抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジル）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００４２】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００４３】
本発明の範囲内に含まれるＤｃＲ３ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＤｃＲ３に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列ＤｃＲ３に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００４４】
ＤｃＲ３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更を伴う。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＤｃＲ３（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＤｃＲ３アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＤｃＲ３ポリペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを精製させることを通して変更されてもよい。
【００４５】
ＤｃＲ３ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００４６】
ＤｃＲ３ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００４７】
ＤｃＲ３の共有結合的修飾の他の型は、ＤｃＲ３ポリぺプチドの、種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００４８】
また、本発明のＤｃＲ３は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤｃＲ３を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＤｃＲ３との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＤｃＲ３のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＤｃＲ３のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＤｃＲ３を容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はＤｃＲ３の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。特に、キメラ分子は、ＩｇＧ分子に融合した図１（配列番号：１）のアミノ酸残基１〜２１５を含むＤｃＲ３のＥＣＤを含んでもよい。キメラ分子の二価の形態には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
【００４９】
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は、この分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００５０】
Ｃ．  ＤｃＲ３の調製
以下の説明は、主として、ＤｃＲ３核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養してＤｃＲ３を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤｃＲ３を調製することはできると考えられる。例えば、ＤｃＲ３配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＤｃＲ３の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＤｃＲ３を生産してもよい。
【００５１】
１．  ＤｃＲ３をコードするＤＮＡの単離
ＤｃＲ３をコードするＤＮＡは、ＤｃＲ３ｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＤｃＲ３ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＤｃＲ３コード遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００５２】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(ＤｃＲ３に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準的な手順を使用して実施することができる。ＤｃＲ３をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら,PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００５３】
以下の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド化時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高厳密性を含むハイブリッド化条件は、Sambrookら,上掲に提供されている。
【００５４】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長にわたっての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、同一性を測定するのに様々なアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
【００５５】
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００５６】
ＤｃＲ３変異体はＤｃＲ３ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＤｃＲ３ポリペプチドを合成することにより調製することができる。アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のように、ＤｃＲ３の翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば理解されることである。
【００５７】
ここで記載されている天然全長配列ＤｃＲ３又はＤｃＲ３の種々のドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して発生させることができる。変異は、ＤｃＲ３をコードしている一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であり、天然配列ＤｃＲ３に対してＤｃＲ３のアミノ酸配列に変化が生じている。場合によっては、変異は、ＤｃＲ３分子の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids. Res., 13：4331(1986)；Zollerら, Nucl. Acids. Res., 10：6487(1987)］、カセット突然変異［Wellsら, Gene, 34：315(1985)］、制限選択的突然変異誘発［Wellら, Philos. Trans. R. Soc. London. SerA, 317：415(1986)］又は他の既知の技術をクローンＤＮＡに実施してＤｃＲ３変異体のＤＮＡを生産することができる。
【００５８】
また、特定のリガンド又はレセプターとの相互作用に関与する、近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることも好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 105：１(1976)］。アラニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【００５９】
選択されたＤｃＲ３変異体がひとたび生産されると、それらを、例えばＦａｓリガンドと接触させることができ、相互作用があれば測定することができる。ＤｃＲ３変異体とＦａｓとの相互作用は、例えば以下の実施例に記載したようなインビトロアッセイにより測定することができる。天然配列ＤｃＲ３とＤｃＲ３変異体の活性と性質を比較するため任意の数の分析的測定法を使用することができ、結合性に対して簡便なものは、天然配列ＤｃＲ３の解離定数Ｋｄと比較したＤｃＲ３変異体とＦａｓとの間に形成された複合体の解離定数Ｋｄである。
【００６０】
場合によっては、突然変異(例えば一又は複数のアミノ酸の欠失)に好適なＤｃＲ３配列中の代表的な部位には、一又は複数のシステインリッチドメイン内の部位が含まれる。このような変異は上述の方法を使用することにより達成される。
【００６１】
２．  宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＤｃＲ３生成のための発現又はクローニングベクターでトランスフェクト又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば媒質、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。  一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
【００６２】
トランスフェクションの方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawほか, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際特許出願第ＷＯ８９／０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６３】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。
【００６４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＤｃＲ３をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
【００６５】
グリコシル化ＤｃＲ３の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６６】
３．  複製可能なベクターの選択及び使用
ＤｃＲ３をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの形成には、当業者に知られた標準的な連結技術を用いる。
【００６７】
ＤｃＲ３は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。
一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＤｃＲ３ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際特許出願第ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６８】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【００６９】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００７０】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＤｃＲ３核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００７１】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＤｃＲ３核酸配列に作用可能に関連付けられ、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。多種の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＤｃＲ３をコードするＤＮＡと作用可能に関連付けられたシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００７２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ほか, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ほか, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７３】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母での発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【００７４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＤｃＲ３転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターは宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００７５】
より高等の真核生物による本発明のＤｃＲ３をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤｃＲ３コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００７６】
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ＤｃＲ３をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＤｃＲ３の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiほか, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号; 及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【００７７】
４．  遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインシトゥハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００７８】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＤｃＲ３ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤｃＲ３ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７９】
５．  ＤｃＲ３ポリペプチドの精製
ＤｃＲ３の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。ＤｃＲ３が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＤｃＲ３の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【００８０】
ＤｃＲ３を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＤｃＲ３のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＤｃＲ３の性質に依存する。
【００８１】
Ｄ．  ＤｃＲ３の用途
ＤｃＲ３をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド化プローブとして、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成においての使用を含む、分子生物学における種々の用途を有している。また、ＤｃＲ３核酸は、ここに記載される組み換え技術によるＤｃＲ３ポリペプチドの調製にも有用であろう。
【００８２】
全長天然配列ＤｃＲ３（図２；配列番号：２）遺伝子、又はその一部は、全長ＤｃＲ３遺伝子の単離又は図２（配列番号：２）に開示されたＤｃＲ３配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＤｃＲ３の天然発生変異体又は他の種からのＤｃＲ３をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリのためのハイブリッド化プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド化プローブは、配列番号２の核酸配列又は天然配列ＤｃＲ３のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＤｃＲ３遺伝子のコード領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド化プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＤｃＲ３遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定するのに使用できる。ハイブリッド化技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００８３】
本出願に記載し特許請求しているＥＳＴは、ここに記載した方法を用いて、同様にプローブとして用いることができる。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＤｃＲ３配列の同定のための配列のプールを生成することができる。
【００８４】
また、ＤｃＲ３をコードする核酸配列は、そのＤｃＲ３をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド化プローブの形成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インシトゥハイブリッド形成、既知の染色体標識に対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド化スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。以下の実施例１２は、選択された染色体マッピング技術を更に記載し、ＤｃＲ３遺伝子がヒト染色体２０にマッピングされたことを決定する。
【００８５】
ここに開示されたように、ＤｃＲ３遺伝子はガン細胞及び組織中で増幅される。例えば以下の実施例１３は、ＤｃＲ３遺伝子が異なる肺及び大腸癌中で増幅されることが見いだされたことを記載している。従って、本発明の分子は、組織をＤｃＲ３遺伝子の増幅について分析することにより、癌の存在又は癌に罹患する危険性を検知する診断薬として使用することができる。患者組織におけるＤｃＲ３遺伝子増幅の検出は、患者に対する抗ＤｃＲ３抗体治療の様式を決定するといった、患者に望ましい治療様式を選択するに当たり熟練医師によっても用いられる。このような診断方法又はアッセイは、この分野で知られたＰＣＲ又はＦＩＳＨ技術を含む種々の技術を用いて実施できる。また、組織は、ＤｃＲ３遺伝子増幅の決定について実施例１３で記載した技術を用いて分析してもよい。
【００８６】
ＤｃＲ３のコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＤｃＲ３がレセプターである場合）、ＤｃＲ３は、結合性相互作用に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法によって、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＤｃＲ３は、関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＤｃＲ３又はＤｃＲ３のリガンド又はレセプターの生物学的活性ににたリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００８７】
また、ＤｃＲ３又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＤｃＲ３をコードするｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＤｃＲ３をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＤｃＲ３をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＤｃＲ３導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＤｃＲ３をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＤｃＲ３をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過度のアポトーシスを伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【００８８】
あるいは、ＤｃＲ３の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＤｃＲ３をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＤｃＲ３をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＤｃＲ３をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＤｃＲ３「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＤｃＲ３をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＤｃＲ３をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＤｃＲ３をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Liほか, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、ＤｃＲ３ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００８９】
本出願で開示したように、ＤｃＲ３は、Ｆａｓリガンド又は哺乳動物細胞でＤｃＲ３が結合する他のリガンドによるアポトーシスを調節し、並びにＦａｓリガンドの他の機能を変化させるために治療的に使用することができる。この治療は、例えば、インビボ又はエキソビボ遺伝子治療技術を用いて行うことができる。ＤｃＲ３をコードする核酸を遺伝子治療に用いることもできる。遺伝子治療の応用に置いて、遺伝子は細胞中に導入され、治療的に有効な遺伝子産物、例えば検出可能な遺伝子置換体のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」とは、１回の処理によって長期間の効果が達成される従来の遺伝子治療、及び治療的に有効なＤＮＡ又はｍＤＮＡの１回又は繰り返しの投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を包含する。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止するための治療薬として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に移入され、細胞膜による取り込みが制限されていることにより、低い細胞内濃度にもかかわらず阻害剤として作用することが既に示されている［Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:4143-4146 (1986)］。オリゴヌクレオチドは、修飾して、例えば元の荷電したリン酸ジエステル取基を非荷電基で置換することにより、取り込み性を向上させることができる。
【００９０】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が対象とする宿主に、インビトロあるいはインビボのいずれで培養細胞中に移入されるかに依る。哺乳動物にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。現在インビボ遺伝子移入技術に好ましいのは、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルスコートのタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクション［Dzau等, Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)］を含む。幾つかの状況では、核酸源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等の標的細胞を標的とする試薬とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型指向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルで内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞間局在化を標的とし、細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。
【００９１】
ＤｃＲ３ポリペプチド及びＤｃＲ３の修飾形態（並びに以下に述べるＤｃＲ３抗体）は、アゴニスト又はアンタゴニスト分子として治療的に用いられる。例えば、アンタゴニストとして作用できるＤｃＲ３分子は、Ｆａｓリガンド又はＦａｓリガンド誘発活性、あるいはＤｃＲ３が結合する他のリガンドの活性の阻害又は阻止に用いられる。ＤｃＲ３のこのような形態の例は、ＤｃＲ３と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む上記のキメラ分子を含んでいる。これは、ＤｃＲ３と免疫グロブリンの細胞外ドメインを含むキメラ分子を含んでいる。ここに記載したこれらのＤｃＲ３分子は、Ｆａｓリガンド誘発性アポトーシス又はＦａｓリガンド誘発性リンパ球活性などのＦａｓリガンド活性を阻害することができ、並びに抗原性刺激に対する反応におけるリンパ球の増殖を抑制する。実施例に記載する混合されたリンパ球反応アッセイデータに基づいて、油発された免疫反応は排他的にＦａｓリガンドに媒介される必要はないと考えられる。
【００９２】
従って、この阻害又はアンタゴニスト活性は、免疫に媒介された及び少なくともそれらの誘発及び機構の要素としてＴリンパ球の活性化を含み、従って哺乳動物に有害なこれらの疾患における細胞内及び細胞間事象と共同する疾患における応用も有する。Ｔ細胞の活性化を含む又は依存すると考えられているこのような免疫媒介された疾患は、それらに限られないが、喘息又は他のアレルギー疾患を含み、それらは、例えばアレルギー性鼻炎及びアトピー性疾患、慢性関節リウマチ及び若年性慢性関節炎、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、グルテン−感受性腸炎、ホウィップル病、多発性硬化症及び他の免疫媒介脱髄ＣＮＳ疾患、及び移植拒絶及び対宿主性移植片病を含む移植関連疾患を包含する。
【００９３】
これらの疾患は、例えば哺乳動物における免疫抑制療法の目に見える回復によって示されるように直接に、あるいは例えば疾患を持つ患者の患部におけるＴ又はＢリンパ球又は自己免疫あるいはヒト疾患の動物モデルの実験的使用を介して得られたデータ通した推測によって示されるように間接的に免疫媒介されると考えられている。［一般的に、Samter's Immunological Diseases, 5th Ed., Vols. I及びII, Little Brown and Company (1995)参照］。
【００９４】
担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液のようなバッファーが含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７．４〜約７．８である。さらなる担体は、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放製剤を含み、そのマトリクスは、成形物品、例えばフィルム、リポソームまたはマイクロパーティクルの形状である。例えば投与経路又は投与されるＤｃＲ３分子の濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【００９５】
哺乳動物への投与は、注射(例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内)、又は点滴のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法によりなすことができる。
投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。
【００９６】
Ｅ．  抗ＤｃＲ３抗体
本発明は、さらに抗ＤｃＲ３抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【００９７】
１．  ポリクローナル抗体
ＤｃＲ３抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＤｃＲ３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物における免疫原性が知られているタンパク質に包合させるのが有用である。このような適切な免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９８】
２．  モノクローナル抗体
あるいは、ＤｃＲ３抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【００９９】
免疫化剤は、典型的にはＤｃＲ３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１００】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurほか, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１０１】
次いでハイブリドーマ細胞を培養する培地を、ＤｃＲ３に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【０１０３】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１０４】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4816567；Morrisonほか, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
【０１０５】
以下の実施例に記載するようにして、抗ＤｃＲ３モノクローナル抗体を調製した。これらの抗体のいくらかは、４Ｃ４.１．４；５Ｃ４．１４．７；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；及び４Ｂ７．１．１と命名され、ＡＴＣＣに寄託され、寄託受入番号    、    、    、    、及び    がそれぞれ付与された。一実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、受入番号    、    、    、    、及び    で寄託されたハイブリドーマ株化細胞により分泌される抗体の一又は複数と同じ生物学的特徴を有する。「生物学的特徴」という用語は、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボの活性又は性質、例えばＤｃＲ３に結合する能力又はＦａｓリガンド／ＤｃＲ３結合を実質的に阻止する能力を指すために使用される。場合によっては、モノクローナル抗体はここで特に言及された抗体の少なくとも１つと同じエピトープに結合する。そのようなエピトープ結合は、例えばここや実施例において記載したように、種々のアッセイを行うことにより測定することができる。
【０１０６】
本発明の抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１０７】
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０８】
３．  ヒト化抗体
本発明のＤｃＲ３抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１０９】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法を使用して行える。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(U.S. Patent No.4,816,567)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１１０】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksほか, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【０１１１】
４．  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＤｃＲ３に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【０１１２】
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えたため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際特許出願第９３／０８８２９号、及びTrauneckerほか, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１１３】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSureshほか,Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１１４】
５．  ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療のために(ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１１５】
Ｄ．  ＤｃＲ３抗体の用途
本発明のＤｃＲ３抗体は様々な有用性を有している。例えば、ＤｃＲ３抗体は、ＤｃＲ３の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、血清又は腫瘍での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体を検出可能な部位に包合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む。
【０１１６】
また、ＤｃＲ３抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＤｃＲ３のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＤｃＲ３に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製するＤｃＲ３を含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＤｃＲ３以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＤｃＲ３を抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１１７】
また本発明のＤｃＲ３抗体は治療的有用性も有する。例えば、ＤｃＲ３抗体は、Ｆａｓリガンド誘発性アポトーシスを阻止するか、潜在的な自己免疫／炎症効果を阻止するＤｃＲ３の活性をアンタゴナイズするために使用することができる。ＤｃＲ３アンタゴニストは、癌治療において、例えばＤｃＲ３が癌細胞の免疫細胞毒性殺傷を阻害するのを防止することにより作用することができる。それらは、例えば、Ｆａｓリガンド−ＤｃＲ３結合の阻止又はＤｃＲ３消滅又は除去の増強又は促進によって達成される。当業者は、免疫反応の活性化又は刺激を抑制でき、従ってあるレベルの免疫抑制が可能であり、それにより哺乳類の免疫サーベイランスシステム及び反応の回避において癌細胞を助ける能力を持つ分子が存在することを知っている。免疫系の天然阻害剤の例は、Ｔリンパ球の同時刺激機構の阻害によりＴリンパ球活性化を阻害することのできるＣＴＬＡ４である。この阻害のインビボでのアンタゴナイズは、哺乳動物が免疫学的に癌を拒絶する能力を向上させることが示された。インビボでの抗体によるＣＴＬＡ４の阻止が、確立された癌に対する免疫反応を向上させ、その後この癌を拒絶させることが報告されている。［Kwon等, Proc. Nat. Acad. Sci., 94:8099-8103 (1997)；Leach等, Science, 271:1734-1736 (1996)］。
【０１１８】
治療的組成物及び投与手法（ＤｃＲ３について上述したような）が用いられ得る。アンタゴニストの投与のための有効投与量及びスケジュールは、経験的に決定され、そのような決定をするのも技術常識の範囲内である。当業者は、投与されるべきアンタゴニストの投与量が、例えば、アンタゴニストを受容する哺乳動物、投与経路、特に用いられるアンタゴニストの型及び哺乳動物に投与される他の薬剤によって変化することを理解するであろう。抗体アンタゴニストについての適当な投与量の選択の助言は抗体の治療的使用に関する文献、例えばHandbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone等, 編, Noges 発行, Park Ridge, N.J., (1985)ch. 22,及びpp.303-357；Smith等, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber等編, Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見いだされる。アンタゴニスト単独で用いられる典型的な日々の投与量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり、上記の要因に応じて変化する。
【０１１９】
ここに記載したＤｃＲ３アンタゴニストを用いた癌の治療法においては、他の付加的な治療法を哺乳動物に施すことが考えられ、そのようなものには、限定されるものではないが、化学療法及び放射線療法、イムノアジュバント、サイトカイン、及び抗体ベース療法が含まれる。例としては、インターロイキン(例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-６)、白血病阻害因子、インターフェロン、ＴＧＦ-β、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ＨＥＲ-２抗体及び抗ＣＤ２０抗体が含まれる。哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発することが知られている他の薬剤を用いてもよく、そのような薬剤にはＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β(リンホトキシン-α)、ＣＤ３０リガンド、及び４-１ＢＢリガンドが含まれる。
【０１２０】
本発明において考慮される化学療法には、当該分野において既知であって市販されている化学物質又は薬物、例えばドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンが含まれる。このような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまた化学療法サービス,M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、上述されたもののような、製薬的に許容可能な担体で好ましく投与される。アンタゴニストは、一又はそれ以上の他の治療薬に続いて又は同時に投与してもよい。アンタゴニスト及び治療薬の量は、例えば、用いられる薬剤の型、治療される癌、及び投与のスケジュール及び経路に依存するが、一般的には各々が個々に用いられる場合より少ない。
【０１２１】
哺乳動物へのアンタゴニストの投与に続いて、哺乳動物の癌及び生理学的状態は、熟練した実務者に良く知られた種々の方法で監視できる。例えば、腫瘍の大きさは、物理的又は標準的なＸ線画像化技術によって観察できる。
【０１２２】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１２３】
実施例
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受入番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Mannasas,Virginia)である。
【０１２４】
実施例１
ヒトＤｃＲ３をコードしているｃＤＮＡクローンの単離
スイス-プロット公的データベースからの約９５０の周知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（分泌シグナル配列を含む場合もある）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータデー素は、公的なＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）、個人的ＥＳＴデータベース（LIFESEQＴＭ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）、及びジェネンテクからのＥＳＴ商品を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)］を用いて、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳物に対するＥＣＤタンパク質配列の比較として行なった。BLASTスコアが７０（９０の場合もある）又はそれ以上となり、周知のタンパク質をコードしない比較物をクラスター分析し、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で共通ＤＮＡ配列に組み立てた。
【０１２５】
種々のＥＳＴを用い、共通ＤＮＡ配列を組み立てた。ＥＳＴは、ジェネンテクのＥＳＴ商品（配列番号：３、図３及び４参照）、個人データベースからの６つのＥＳＴ（配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８及び配列番号：９、図４参照）及び公的データベースからのＥＳＴ（配列番号：１０）を含む。
【０１２６】
共通配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定して、ＤｃＲ３の全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして用いた。
【０１２７】
ＰＣＲプライマーの対（前方及び後方）を合成した：
CACGCTGGTTTCTGCTTGGAG
（配列番号：１１）
AGCTGGTGCACAGGGTGTCATG
（配列番号：１２）
また、プローブも合成した：
CCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCC
（配列番号：１３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一つを用いてＤｃＲ３遺伝子をコードするクローンを単離した。
【０１２８】
ｃＤＮＡライブラリーの形成のためのＲＮＡは、胎児肺組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いるｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢなど；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
【０１２９】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＤｃＲ３の全長ＤＮＡ（図２；配列番号：２）及びＤｃＲ３の誘導されたタンパク質配列（図１；配列番号：１）を与えた。
【０１３０】
ＤｃＲ３の全核酸配列を図２（配列番号：２）に示す。クローンＤＮＡ３０９４２は、単一の読み取り枠を含み、ヌクレオチド位置１０１−１０３に見かけの翻訳開始部位を有する［Kozak等, 上掲］（図２；配列番号：２）。予測されたポリペプチド前駆体は３００アミノ酸長である。配列のＮ末端は典型的な分泌シグナル（図１；配列番号：１のアミノ酸１−２３）を含む。ＤｃＲ３アミノ酸配列の分析により、図５及び６に示すように４つのＣＲＤの存在が明らかとなった。ＤｃＲ３は膜貫通領域を含まない。また、図１（配列番号：１）のアミノ酸１〜２１５は、４つのＣＲＤを含むＥＣＤを表すと考えられる（図５）。ＤｃＲ３は、図１の残基１７３に１つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する。クローンＤＮＡ３０９４２は、ＡＴＣＣに寄託され（ＤＮＡ３０９４２−１１３４と特定されている）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２５４が付与された。
【０１３１】
全長配列のＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、ＤｃＲ３は、ＴＮＦＲ２（２８．７％）及びＯＰＧ（３１％）に対して幾分のアミノ酸配列同一性を示した。図５及び６参照。ＤｃＲ３及びＯＰＧの４つのＣＲＤにおける全てのシステインは保持されたが；ＤｃＲ３のＣ末端部分は、約１００残基分短かった。
【０１３２】
実施例２
ノーザンブロット分析
ヒト組織及びヒト癌株化細胞におけるＤｃＲ３ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した。ヒトＲＮＡブロットを、全長ＤｃＲ３ｃＤＮＡをベースにした３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(クローンテック)、ヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-II(クローンテック)及びヒト癌株化細胞ＲＮＡブロット(クローンテック)をＤＮＡプローブと共にインキュベートした。次いでブロットをハイブリダイゼーション用バッファー(５Ｘ ＳＳＰＥ；２Ｘ デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ)に入ったプローブと共に、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳを用い、室温で１時間、数回洗浄し、ついで０．１Ｘ ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳを用い、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、リン光体イメージャー分析(Fuji)により展開させた。
【０１３３】
約１．２ｋＢの優勢なＤｃＲ３翻訳物を、胎児肺、脳、及び肝臓、及び成人脾臓、大腸、及び肺に検出した（図７）。さらに、比較的高いＤｃＲ３ｍＲＮＡレベルがヒト大腸癌株化細胞、ＳＷ４８０で検出された（図７参照）。
【０１３４】
ハイブリダイゼーションプローブとしてのＤｃＲ３の使用
以下の方法は、ＤｃＲ３をコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
ＤｃＲ３のコード配列（図２、配列番号：２に示す）を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種ＤＮＡ（ＤｃＲ３の天然発生変異体など）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
【０１３５】
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射標識ＤｃＲ３誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＤｃＲ３をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１３６】
実施例４
大腸菌におけるＤｃＲ３の発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による、ＤｃＲ３の調製を例示する。
ＤｃＲ３をコードするＤＮＡ配列（配列番号：２）は、最初に選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で設計され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、polyhisリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＤｃＲ３コード領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
【０１３７】
ライゲーション混合物は、次いで、選択した大腸菌のSambrook等, 上掲に記載された方法を用いた形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される
プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離した。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＤｃＲ３タンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１３８】
実施例５
哺乳動物細胞におけるＤｃＲ３の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による、ＤｃＲ３の調製を例示する。
Ａ．発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７参照）を用いた。場合によっては、ＤｃＲ３ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてＤｃＲ３ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＤｃＲ３と呼ばれる。
【０１３９】
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化し、約１０μｇのｐＲＫ５−ＤｃＲ３ＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養媒質を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０分間添加した。２９３細胞は、次いで血清無し媒質で洗浄し、新鮮な媒質を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１４０】
トランスフェクションの約２４時間後、培養媒質を除去し、培養媒質（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養媒質で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件媒質を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＤｃＲ３ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（血清無し媒質）、媒質を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１４１】
それに換わる技術において、ＤｃＲ３は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に過渡的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＤｃＲ３ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０分間処理し、組織培養媒質で洗浄し、組織培養媒質、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件媒質を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。発現されたＤｃＲ３を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
【０１４２】
Ｂ．他の実施態様では、エピトープタグＤｃＲ３をＣＨＯ細胞で発現させた。ＤｃＲ３はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のpoly-hisタグを持つ枠に融合させた。poly-hisタグＤｃＲ３挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のための選択マーカーＤＨＦＲを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングした。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導細胞で（上記のように）トランスフェクトした。発現されたpoly-hisタグＤｃＲ３を含む培養媒質は、濃縮して、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、分泌されたタンパク質が約３５ｋＤａの分子量を有していることが明らかとなった。
【０１４３】
実施例６
酵母菌でのＤｃＲ３の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＤｃＲ３の組み換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＤｃＲ３の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを形成する。ＤｃＲ３をコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＲ３の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＤｃＲ３をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＤｃＲ３の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【０１４４】
酵母菌株ＡＢ１１０などの酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵媒質中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析でき、次いでクマシーブルー染色で染色することができる。
続いて組み換えＤｃＲ３は、発酵媒質から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、選択されたカートリッジフィルターを用いて媒質を濃縮することによって単離及び精製される。ＤｃＲ３を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１４５】
実施例７
バキュロウイルスでのＤｃＲ３の発現
以下の方法は、バキュロウイルス中でのＤｃＲ３の組み換え発現を記載する。
ＤｃＲ３は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、poly-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＤｃＲ３又はＤｃＲ３の所定部位（細胞外ドメインをコードする配列、例えば図１（配列番号：１）のアミノ酸１〜２１５等）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
【０１４６】
組み換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて共トランスフェクトすることにより生成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１４７】
次に、発現されたpoly-hisタグＤｃＲ３は、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞は、洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を添加バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの添加バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに添加した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで添加バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄場ファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）へのＮｉ２＋−ＮＴＡ−複合体でのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＤｃＲ３を含む分画をプールし、添加バッファーで透析した。
【０１４８】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＤｃＲ３の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む周知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１４９】
実施例８
ＤｃＲ３に結合する抗体の調製
この実施例は、ＤｃＲ３に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられる免疫原は、精製ＤｃＲ３、ＤｃＲ３を含む融合タンパク質、細胞表面に組み換えＤｃＲ３を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１５０】
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化し、皮下又は腹膜内に１−１００マイクログラムで注入したＤｃＲ３免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。ＤｃＲ３抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１５１】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＤｃＲ３静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等のマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）媒質を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、皮融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０１５２】
ハイブリドーマ細胞は、ＤｃＲ３に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＤｃＲ３に対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内注入し、抗ＤｃＲ３モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１５３】
実施例９
ＤｃＲ３とＦａｓとの相互作用を測定するインビトロアッセイ
Ａ．ＦＡＣＳ分析
アッセイは、ＤｃＲ３が各ＴＮＦファミリーリガンドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞に結合するか否かを測定するために行った。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）は、空のｐＲＫ５ベクター（実施例５参照）又は全長ＴＮＦ−アルファをコードするｐＲＫ５［Pennica等, Nature, 312:724-729 (1984)］、Ｆａｓリガンド［Suda等, Cell, 75:1169-1178 (1993)］、ＬＩＧＨＴ［Mauri等, Immunity, 8:21 (1998)，Ａｐｏ−２リガンド［１９９７年７月１７日発行のＷＯ９７／２５４２８］、Ａｐｏ−３（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）［Marsters等, Current Biology, 8:525 (1998); Chicheportiche等, J. biol. Chem., 272:32401 (1997)］、又はＯＰＧ（ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫＬとも呼ばれる）［Wong等, J. Biol. Chem., 272:25190 (1997); Anderson等, Nature, 390:175 (1997); Lacey等, Cell, 93:165 (1998)］で一過性トランスフェクトされた。次いで、細胞を、組み換えビオチン化ＦｃタグＤｃＲ３（上記実施例７に記載したように発現され、プロテインＡクロマトグラフィーで精製されたもの［Ashkenazi等, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 8:104 (1995)］）、ＴＮＦＲ１のＦｃタグ外部ドメイン（対照）、又はＰＢＳバッファー（対照）とともに３７℃で１時間インキュベートした。さらに、細胞をフィコエリトリン複合ストレプトアビディン（Gibco BRl）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、次いで蛍光標示式細胞分取器で分析した。
【０１５４】
結果は、ＤｃＲ３がＦａｓリガンドトランスフェクトされた細胞に特異的に結合するが、ＴＮＦ−アルファでトランスフェクトされた細胞には結合しないことを示した（図８Ａ参照）。また、ＤｃＲ３はＬＩＧＨＴに有意な結合性を示すが、Ａｐｏ−２リガンド、Ａｐｏ−３リガンド、又はＯＰＧには結合しない（データは示さず）。
【０１５５】
Ｂ．共免疫沈降アッセイ
また、ＤｃＲ３が可溶性Ｆａｓリガンドに結合するか否化を測定するために、共免疫沈降アッセイも行った。
精製した、可溶性Ｆａｓリガンド（Alexis Biochemicals）（１マイクログラム）を、ＦｃタグＤｃＲ３（上記）、ＴＮＦＲ１、又はＦａｓ外部ドメイン（５マイクログラム）とともに室温で１時間インキュベートし、プロテインＡ−セファロース（Repligen）で免疫沈降させた。沈殿物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（４−２０％勾配）により、還元条件（２５ｍＭジチオトレイトール）で溶解させ、免疫ブロットで可視化し、次いで２マイクログラム／ｍｌのウサギポリクローナル抗Ｆａｓリガンド抗体（Oncogene Research Products）での強化化学発光検出（Amersham）を行った。また、可溶性Ｆａｓリガンド自体も、比較のために直接添加した。
【０１５６】
結果を図８Ｂに示す。ＦｃタグＤｃＲ３は、ＦｃタグＦａｓと同様に、精製された可溶性Ｆａｓリガンドに結合したが、ＴＮＦＲ１にはしなかった。この結果は、ＤｃＲ３がＦａｓリガンドに結合できる他のＴＮＦＲファミリーのメンバー（Ｆａｓ以外）であることを示唆している。
【０１５７】
実施例１０
ＤｃＲ３のＦａｓリガンド活性を阻害する能力を測定するインビトロアッセイ
Ａ．トランスフェクトされたＦａｓリガンドに誘発されたアポトーシスの阻害
Ｆａｓを発現するＨｅｌａ細胞における全長Ｆａｓリガンドの一過性トランスフェクションによるアポトーシス誘発に対するＤｃＲ３の影響を試験した。
ヒトＨｅｌａＳ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２２）に、ｐＲＫ５（実施例５参照）、又はｐＲＫ５コード全長Ｆａｓリガンド［Suda等, 上掲］（１マイクログラム／１０６細胞）で一過性トランスフェクトをした。トランスフェクトした細胞を、ＰＢＳバッファー、ＦｃタグＴＮＦＲ１、ＦｃタグＦａｓ、又はＦｃタグＤｃＲ３(実施例９参照)(５０マイクログラム／ｍｌ)の存在下で、３７℃／５％ＣＯ２において１８時間インキュベートした。次いで、Marsters等, Curr. Biol., 6:1669-1676 (1996)に既に記載されているように、アネキシン結合についてのＦＡＣＳによりアポトーシスを分析した。
【０１５８】
結果を図９Ａに示す。データは、３回の平均＋−ＳＥＭである。Ｆａｓリガンドは、約２５％のＨｅｌａ細胞においてアポトーシスを誘発した。ＦｃタグＦａｓ又はＦｃタグＤｃＲ３は、この効果を有意に阻害したが、ＦｃタグＴＮＦＲ１はしなかった。
【０１５９】
Ｂ．Ｔ細胞ＡＩＣＤの阻害
内因性Ｆａｓリガンド（Nagata, 上掲）の機能を含むＴ細胞ＡＩＣＤに対するＤｃＲ３の影響を測定するためにアッセイを行った。
ＣＤ３＋リンパ球を各ヒトドナーの末梢血から単離し、植物性凝集素（２マイクログラム／ｍｌ）で２４時間刺激し、そして（Marsters等, Curr. Biol., 上掲 (1996)に既に記載されているように）ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で５日間培養した。次いで、細胞をＰＢＳバッファー又は抗ＣＤ３抗体（Ortho Pharmaceuticals）で被覆したウェルに蒔き、ＰＢＳバッファー、対照用ＩｇＧ、ＦｃタグＦａｓ又はＦｃタグＤｃＲ３（１０マイクログラム／ｍｌ）の存在下、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。１８時間後、ＣＤ４＋細胞のアポトーシスを、上記Ａ欄に記載したようにＦＡＣＳで測定した。
【０１６０】
結果を図９Ｂに示す。結果は、５人のドナーについての結果の平均＋−ＳＥＭである。抗ＣＤ３抗体でのＴＣＲ結合は、ＩＬ−２刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアポトーシスレベルの約２倍増加させた。図９Ｂ参照。以前の報告［Dhein等, Nature, 373:438 (1995)］に一致して、ＦｃタグＦａｓは実質的に効果を阻止し、ＦｃタグＤｃＲ３はアポトーシスの誘発を同程度に阻止した。
【０１６１】
Ｃ．ＮＫ細胞によるジャーカット細胞死滅の阻害
末梢血ＮＫ細胞によるＦａｓ発現標的細胞に死滅、Ｆａｓリガンド機能を含むプロセスに対するＤｃＲ３の影響を測定するためにアッセイを行った［Arase等, J. Exp. Med., 181:1235 (1995); Medvedev等, Cytokine, 9:394 (1997)］。
ＮＫ細胞は、各ドナーの末梢血から、抗ＣＤ５６磁気マイクロビーズ（Myltenyi Biotech）を豊富化することにより調製し、ＰＲＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ媒質中で、３７℃／５％ＣＯ２において２４時間、５１Ｃｒ添加ジャーカットＴ白血病細胞とともに、エフェクター対標的比率１：１から１：５で、ＰＢＳバッファー、対照用ＩｇＧ、又はＦｃタグＦａｓ又はＦｃタグＤｃＲ３（１０マイクログラム／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。次いで、標的細胞死滅のレベルを、エフェクターー標的共培養における５１Ｃｒの放出量を、同数のジャーカット細胞の洗浄剤溶解による５１Ｃｒ放出量と比較して測定した。
【０１６２】
結果を図９Ｃに示す。データは、２人のドナーについての３回のアッセイの平均＋−ＳＥＭである。ＮＫ細胞は、ジャーカットＴ細胞においてかなりの細胞死滅をトリガーする。ＦｃタグＦａｓ及びＤｃＲ３は、標的細胞死滅を実質的に阻害するが、対照用ＩｇＧはしなかった。結果は、ＤｃＲ３の結合がＦａｓリガンド活性を阻害することを示した。
【０１６３】
実施例１２
染色体マッピング
ヒトＤｃＲ３遺伝子の染色体局在化を、放射性ハイブリッド（ＲＨ）パネル分析によって試験した。ＲＨマッピングを、ヒト-マウス細胞の放射線ハイブリッドパネル(Research Genetics)とＤｃＲ３ ｃＤＮＡのコード領域に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより実施した［Gelbら,Hum. Genet., 98：141(1996)］。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したＰＣＲデータの解析では、ＤｃＲ３はマーカーＡＦＭ２１８ｘｅ７に結合し、５．４のＬＯＤを持ち、ヒト染色体２０（２０ｑ１３）の長手の離間帯にマッピングされることを示した。
【０１６４】
実施例１３
遺伝子増幅アッセイ
この実施例は、ＤｃＲ３コード遺伝子は、肺及び大腸癌のゲノムにおいて増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ＤｃＲ３ポリペプチドがある種の癌における治療的処置のための有用な標的であることを示している。このような治療薬は、ＤｃＲ３コード遺伝子のアンタゴニスト、例えば、ＤｃＲ３に対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
【０１６５】
スクリーニングの出発材料は、肺及び大腸癌及び癌株化細胞の一次腫瘍組織から（Qiagen試薬を用いて）単離したゲノムＤＮＡであった。ＤＮＡはヘキスト線量３２５８挿入蛍光測定を用いた蛍光測定法で定量した。規格化対照として、１０人の正常で健康な個体からの末梢血からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ用対照として用いた（「ＮｏｒＨｕ」）。
【０１６６】
各々における相対的ＤｃＲ３遺伝子コピー数、及びＤｃＲ３をコードするＤＮＡがスクリーニングされる肺及び大腸癌において過剰発現されるか否かの測定に、５’ヌクレアーゼアッセイ（TaqManＴＭ）及び現実時間定量的ＰＣＲ（Gelmini等, Clin. Chem., 43:752-758 (1997); ABI  Prizm 7700 Sequence Detection SystemTM, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, Ca）を用いた。一次肺腫瘍外科試料は、アイオワ大学から提供され、一次大腸腫瘍試料はリーズ大学から提供された。肺腫瘍組織のパネルは、８つの腺癌、７つの扁平上皮細胞癌、、１つの非小細胞癌、１つの小細胞癌、及び１つの気管支腺癌を含んでいた。大腸腫瘍組織のパネルは、１７の腺癌を含んでいた。癌株化細胞は、ＡＴＣＣ：ＳＷ４８０大腸腺癌（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２２８）；ＣＯＬＯ３２０ＤＭ腺癌（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２２０）；ＳＫ−ＣＯ−１腺癌（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３９）；ＳＷ４０３腺癌（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２３０）；及びＨＴ２９大腸腺癌から得た。
【０１６７】
結果は、デルタＣｔ単位から決定した相対的遺伝子コピー数として報告する。１デルタＣｔ単位は、１ＰＣＲサイクル又は平常に対して約２倍増幅に相当し、２単位は４倍に相当し、３単位は６倍に相当する。定量化は、ＤｃＲ３コード遺伝子から誘導したプライマー及びＴａｑＭａｎＴＭ蛍光プローブを用いて得た。独特な核酸配列を含む可能性が最も高く、イントロンのスプライスアウトを持つ可能性が最も低いＤｃＲ３の領域、例えば、３’−非翻訳領域がプライマー誘導に好ましい。ＤｃＲ３遺伝子増幅に用いたプライマー及びプローブの配列は次の通りである：
hu.DcR3.TMP （プローブ） ACACGATGCGTGCTCCAAGCAGAA（配列番号：１４）
hu.DcR3.TMP （前方プライマー） CTTCTTCGCGCACGCTG（配列番号：１５）
a.DcR3.TMP （後方プライマー） ATCACGCCGGCACCAG（配列番号：１６）
【０１６８】
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光ＰＣＲ−ベース技術であり、現実の時間における増幅の監視にＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応の単位複製配列典型を精製するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのプライマー間に局在化したヌクレオチド配列の検出に用いた。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素で延長不可能であり、リポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。リポーター染料からの任意のレーザー励起放出は、それらがプローブ上にあるように２つの染料が接近している場合には消光染料で消光される。増幅反応の間、プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素でテンプレート依存的に切断される。得られたプローブ断片は、溶液中で分解し、リポーター染料放出からのシグナルは第２のフルオロフォアの消光効果を受けない。リポーター染料の１分子が、合成された新たな分子のために遊離され、消光されないリポーター染料がデータの定量的解釈の基礎とされる。
【０１６９】
５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prizm 7700TM Sequence Detection Systemのような現実時間定量的ＰＣＲ装置で行われる。系は、温度サイクル器、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、及びコンピュータからなる。系は、温度サイクル器において９６ウェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザー励起された蛍光シグナルが、９６ウェル全てについての光ファイバーケーブルを通して実時間で回収され、ＣＣＤカメラで検出される。系は、器具を作動させデータを分析するソフトウェアを備えている。
【０１７０】
５’ヌクレオチドアッセイデータは、最初にＣｔ又は閾値サイクルとして表現される。これは、リポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルより上まで蓄積されるサイクルとして定義される。Ｃｔ値は、核酸試料における特定標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として用いられる。
【０１７１】
結果を図１０に示す。１８の肺腫瘍のうちの８つ、及び１７の大腸腫瘍のうちの９つが、２から１８倍のＤｃＲ３の遺伝子増幅を示した（図１０参照）。結果を確認するために、ＤｃＲ３ベースのプライマー及びプローブのさらに３つの独立した組での大腸腫瘍ＤＮＡを定量的ＰＣＲで分析した。本質的に同様の増幅が観察された（データは示さず）。
ヒト大腸腫瘍株化細胞の遺伝子増幅分析は、５細胞のうち３つがＤｃＲ３の有意な遺伝子増幅を示し（図１０）、一次腫瘍組織におけるＤｃＲ３の増幅に一致することを明らかにした。
【０１７２】
ＤｃＲ３隣接領域の増幅レベルも分析した。ＤｃＲ３を持つヒト遺伝子クローンは、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリー（Genome Systems）から単離した。ＢＡＣ（68374rev及び68374fwd）からの隣接領域の増幅は、大腸腫瘍パネルにおける２つの最も近い利用可能な遺伝子マーカー、ＡＦＭ２１８ｘｅ７（Ｔ１６０）及びＳＨＧＣ−３６２６８（Ｔ１５９）（ＡＦＭ２１８ｘｅ７から約５００ｋｂにマッピングされる）に沿って測定した。
ＤｃＲ３は、最も高い増幅を示し、次いで68374rev、さらに68374fwd及びＴ１６０が続き、これらはほぼ同じ増幅程度を示したが、Ｔ１５９は増幅を示さなかった（図１０）。結果は、ＤｃＲ３が、癌において増幅された染色体２０領域のエピセンターにあり、ＤｃＲ３が腫瘍生存を促進する可能性と一致する。
【０１７３】
実施例１４
ＤｃＲ３による阻害活性を測定するための
混合リンパ球培養反応 （ＭＬＲ）アッセイ
Ｔリンパ球のアロ抗原の提示に対して増殖する能力を試験することにより、ＣＤ４＋Ｔリンパ球機能を評価するためにＭＬＲアッセイを実施した。「一方向」ＭＬＲアッセイにおいて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のドナー集団が、ＰＢＭＣの放射線刺激集団に暴露される。ＭＬＲプロトコールは、Coligan等, Current Protocols in Immunology, publ. John Wiley & Sons, Inc. (1994)に記載されている。次いで、アッセイ結果により、提示されたアロ抗原での刺激に対するレスポンダーＴリンパ球の増殖を促進又は阻害できる分子が同定される。
【０１７４】
Ａ．ヒトＰＢＭＣのＭＬＲアッセイ
ＰＢＭＣは、標準的なロイコホレーシス(leukophoresis)法を用いて２人のヒトドナーから単離した。一方のドナーは、刺激剤ＰＢＭＣ供給源として用い、他のドナー細胞はレスポンダーＰＢＭＣの提供に用いた。次いで、各細胞調製物を、アッセイを行うまで５０％ウシ胎児血清及び５０％ＤＭＳＯ中で凍結した。
次に、細胞を、アッセイ媒質中において３７℃／５％ＣＯ２で終夜解凍した。アッセイ媒質は、ＲＰＭＩ媒質；１０％ウシ胎児血清；１％ペニシリン／ストレプトマイシン；１％グルタミン；１％ＨＥＰＥＳ；１％非必須アミノ酸及び１％ピルビン酸塩を含む。洗浄の後、細胞をアッセイ媒質中に、３ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。刺激剤細胞として用いたドナー細胞は、約３０００Ｒａｄｓを用いて放射した。
【０１７５】
ＰＢＭＣ細胞を次のように培養プレートウェルに蒔いた（３回）：１００マイクロリットルの１％又は０．１％に希釈した試験試料（ＦｃタグＤｃＲ３、上記実施例９に記載、Ｏ．Ｄ．で測定して２、４０、１０００及び２５，０００ｎｇ／ｍｌの濃度）；５０マイクロリットルの放射刺激剤細胞；５０マイクロリットルのレスポンダーＰＢＭＣ細胞。１００マイクロリットルの細胞培養媒質又は１００マイクロリットルのＣＤ４−ＩｇＧを対照として用いた。次いで、培養プレートを３７℃／５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。５日目に、各ウェルをトリチウム化チミジン（１マイクロキュリー／ウェル；Amersham）でパルスした。６時間後、細胞を３回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカウントにより評価した。
【０１７６】
結果を図１１Ａに例示した。図１１Ａのデータは、ＤｃＲ３−ＩｇＧのヒトＭＬＲにおけるＴリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害活性があることを示している。反応媒質中でＤｃＲ３−ＩｇＧのレベルが２ｎｇ／ｍｌから２５，０００ｎｇ／ｍｌに増加すると、Ｔリンパ球増殖の有意な減少があり、ＤｃＲ３−ＩｇＧが４０、１０００又は２５，０００ｎｇ／ｍｌのいずれかで添加された場合にトリチル化チミジン標識の取り込みの減少によって示された。このＭＬＲの阻害は用量依存的であり、陽性対照及びＭＬＲに影響を持たない対照ＩｇＧ融合タンパク質（ＣＤ４−ＩｇＧ）の効果に比較して有意であった。
【０１７７】
Ｂ．ネズミＰＢＭＣのＭＬＲアッセイ
ＰＢＭＣは、マウスの２つの異なる系統、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７Ｂ６の脾臓から単離した。細胞は、新たに取り出した脾臓から回収し、（上記Ａ欄に記載されたように）アッセイ媒質中に配置した。次いで、ＰＢＭＣを、細胞をLympholyteＴＭ（Organon Teknika）上にかぶせることにより単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。一分子細胞層を回収し、アッセイ媒質で洗浄し、アッセイ媒質中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。一方のドナーは、刺激剤ＰＢＭＣを提供するのに用い、他方のドナー細胞はレスポンダーＰＢＭＣを提供するのに用いた。
【０１７８】
刺激剤細胞として用いたドナー細胞は、約３０００Ｒａｄｓを用いて放射した。ＰＢＭＣ細胞を次のように培養プレートウェルに蒔いた（３回）：１００マイクロリットルの１％又は０．１％に希釈した試験試料（ＦｃタグＤｃＲ３、Ｏ．Ｄ．で測定して２５、２５０、２５００及び２５，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた）；５０マイクロリットルの放射刺激剤細胞；５０マイクロリットルのレスポンダーＰＢＭＣ細胞。１００マイクロリットルの細胞培養媒質又は１００マイクロリットルのＣＤ４−ＩｇＧを対照として用いた。次いで、培養プレートを３７℃／５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。５日目に、各ウェルをトリチウム化チミジン（１マイクロキュリー／ウェル；Amersham）でパルスした。６時間後、細胞を３回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカウントにより評価した。
【０１７９】
結果を図１１Ｂに例示した。図１１Ｂのデータは、ＤｃＲ３−ＩｇＧのネズミＭＬＲにおけるＴリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害活性があることを示している。反応媒質中でＤｃＲ３−ＩｇＧのレベルが２５ｎｇ／ｍｌから２５，０００ｎｇ／ｍｌに増加すると、Ｔリンパ球増殖の有意な減少があり、トリチル化チミジン標識の取り込みの減少によって示された。このＭＬＲの阻害は用量依存的であり、陽性対照及びＭＬＲに影響を持たない対照ＩｇＧ融合タンパク質（ＣＤ４−ＩｇＧ）の効果に比較して有意であった。
【０１８０】
Ｃ．同時刺激アッセイ
ＰＢＬは、標準的なロイコホレーシス(leukophoresis)法を用いてヒトドナーから単離した。次いで、細胞調製物を、アッセイを行うまで５０％ウシ胎児血清及び５０％ＤＭＳＯ中で凍結した。
次に、細胞を、アッセイ媒質中において３７℃／５％ＣＯ２で終夜解凍した。アッセイ媒質は、ＲＰＭＩ媒質；１０％ウシ胎児血清；１％ペニシリン／ストレプトマイシン；１％グルタミン；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；及び５０マイクログラム／ｍｌゲンタマイシンを含む。洗浄の後、細胞をアッセイ媒質中に再懸濁させ、３７℃／５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。
【０１８１】
培養プレートを調製するために、９６ウェルの平底プレート(Nunc)をマウス抗ヒトＣＤ３（Amacから購入）又はマウス抗ヒトＣＤ２８（Biodesignから購入）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の両方で被覆した。両方の抗体は、カルシウム及びマグネシウム無しのハイクローンＤ(Hyclone D)-ＰＢＳで希釈した。抗ＣＤ３抗体を１０ｎｇ／ウェルの濃度で添加し、抗ＣＤ２８抗体を２５ｎｇ／ウェルで添加し、全容量を１００マイクロリットル／ウェルとした。プレートを、ＰＢＳ中４℃で終夜インキュベートした。
【０１８２】
次に、被覆プレートをＰＢＳで洗浄した。洗浄したＰＢＬを、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で媒質中に再懸濁し、プレートに１００マイクロリットル／ウェルで添加した。次いで、１００マイクロリットルの試験試料（ＦｃタグＤｃＲ３、Ｏ．Ｄ．で測定して２５、２５０、２５００及び２５，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた）又は対照物を各ウェルに添加し、各ウェルの全容量を２００マイクロリットルとした。１００マイクロリットルの細胞培養媒質又は１００マイクロリットルのＣＤ４−ＩｇＧを対照として用いた。次いで、培養プレートを３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。続いて、各ウェルをトリチウム化チミジン（１マイクロキュリー／ウェル；Amersham）でパルスした。６時間後、細胞を３回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカウントにより評価した。
【０１８３】
結果を図１１Ｃに例示した。図１１Ｃのデータは、ＤｃＲ３−ＩｇＧのヒト同時刺激アッセイにおけるＴリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害効果があることを示している。反応媒質中でＤｃＲ３−ＩｇＧのレベルが２５ｎｇ／ｍｌから２５，０００ｎｇ／ｍｌに増加すると、Ｔリンパ球増殖の有意な減少があり、トリチル化チミジン標識の取り込みの減少によって示されている。このヒト同時刺激アッセイの阻害は用量依存的であり、陽性対照及びヒト同時刺激アッセイに影響を持たない対照ＩｇＧ融合タンパク質（ＣＤ４−ＩｇＧ）の効果に比較して有意であった。
【０１８４】
実施例１５
ＤｃＲ３に対するモノクローナル抗体の調製
０．５μｇ／５０μｌのＤｃＲ３イムノアドヘシンタンパク質(Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MTから購入したＭＰＬ-ＴＤＭアジュバントで希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、１週間の日間隔で１１回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫化した。既に開示されたように［Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88：10535-10539(1991)］、ｐＲＫ５においてヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のヒンジ及びＦｃ領域に、ＤｃＲ３（図１）のアミノ酸残基１−３００を融合させることによりＤｃＲ３イムノアドヘシンタンパク質を産生した。イムノアドヘシンタンパク質を、昆虫細胞で発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたようにして、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１８５】
最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り除き、単一細胞懸濁液を、１％のペニシリン-ストレプトマイシンが補填されたＤＭＥＭ培地(Biowhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。ついで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１(ATCC CRL 1597)と融合させ、９６ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培地の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＤｃＲ３イムノアドヘシンタンパク質又はＣＤ４−ＩｇＧタンパク質に結合するモノクローナル抗体の存在を試験した。
【０１８６】
捕獲ＥＬＩＳＡにおいて、各々のウェルに、ＰＢＳに２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)が入ったものを５０μｌ添加して、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb；Nunc, Kamstrup, Denmark)をコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ついでプレートを洗浄バッファー(０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳに２．０％のウシ血清アルブミンが入ったもの２００μｌで阻止し、室温で１時間インキュベートした。ついでプレートを、洗浄バッファーで、再度３回洗浄した。
【０１８７】
洗浄工程後、アッセイ用バッファー(０．５％のＢＳＡ及び０．５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳ)に０．４μｇ／ｍｌのＤｃＲ３イムノアドヘシンタンパク質(上述のもの)が入ったもの５０μｌを各々のウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
【０１８８】
洗浄工程に続き、１００μｌのハイブリドーマ上清又は精製した抗体(プロテインＧ-セファロースカラムを使用)を、アッセイ用バッファーの所定ウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ.１骨髄腫細胞の条件培地を、対照として他の所定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
【０１８９】
次に、アッセイ用バッファーで１：１０００に希釈されたＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)の５０μｌを各ウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ついで各ウェルに５０μｌの基質(ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ１-成分終止溶液(ジエチレングリコール, Kirkegaard & Perry)を各ウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取った。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡによりスクリーニングされたハイブリドーマ上清の内、１７の上清が陽性であると判断された(バックグラウンドのおよそ４倍高いと算出)。選択したハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ（後述）において、ＤｃＲ３のＦａｓリガンドへの結合を阻害するそれらの能力について試験した。潜在的な阻止又は非阻止分泌ハイブリドーマを、限定希釈によって２回クローニングした。
【０１９１】
実施例１６
ＤｃＲ３抗体の特異性を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
実施例１５に記載したモノクローナル抗体が、ＤｃＲ３以外の他の知られたレセプターに結合できるか否かを測定するためにＥＬＩＳＡを実施した。特に、４Ｃ４．１．４；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；５Ｃ４．１４．７；及び４Ｂ７．１．１抗体は、各々、ここに記載したＤｃＲ３及びＤＲ４［Panら,上掲］、ＤＲ５［Sheridan等, 上掲及びPan等, 上掲］、ＤｃＲ１［Sheridan等, 上掲］、及びＯＰＧ［Simonet等, 上掲］に対する結合性を試験した。ＥＬＩＳＡは、本質的に上述の実施例１５に記載したようにして実施した。抗原特異性は、１０マイクログラム／ｍｌのＤｃＲ３抗体を用いて測定した。
結果を図１２に示す。ＤｃＲ３の５つの抗体全ては、ＤｃＲ３に特異的に結合した（図１３も参照）。５つのＤｃＲ３抗体のいずれも、アッセイにおける他のレセプターへの交差反応性を示さなかった。
【０１９２】
実施例１７
ＤｃＲ３抗体の阻止活性を測定するためのＥＬＩＳＡ試験
ＥＬＩＳＡにおいて、９６-ウェルのマイクロタイタープレート(Maxisorb；Nunc, Kamstrup, Denmark)を、各ウェルに５０μｌの炭酸塩バッファー中の２μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)を添加することによりコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ついでプレートを洗浄バッファー(０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳに２．０％のウシ血清アルブミンが入ったもの２００μｌで阻止し、室温で１時間インキュベートした。ついでプレートを、洗浄バッファーで、再度３回洗浄した。
【０１９３】
洗浄工程後、アッセイ用バッファー(０．５％のＢＳＡ及び０．５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳ)に０．５μｇ／ｍｌのＤｃＲ３イムノアドヘシンタンパク質(上述の実施例１５に記載したもの)又はＦａｓ−ＩｇＧが入ったもの１００μｌを各々のウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
洗浄工程に続き、１００μｌの精製した抗体４Ｃ４．１．４；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；５Ｃ４．１４．７；又は４Ｂ７．１．１を、アッセイ用バッファー中の所定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
【０１９４】
次に、１００μｌのフラッグタグＦａｓリガンド（Alexis Pharmaceuticals）（３５ｎｇ／ｍｌの濃度）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、続いて１：２０００希釈のＨＲＰ−ストレプトアビディン（Zymed）１００μｌをウェルに添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回再度洗浄した。次いで各ウェルに５０μｌの基質(ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温で５分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ１-成分終止溶液(ジエチルグリコール, Kirkegaard & Perry)を各ウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取った。
結果を図１２に示す。％阻止活性は、Ｆａｓリガンドに対してＤｃＲ３抗体の１００倍過剰において決定した。３つの抗体、４Ｂ７．１．１；１１Ｃ５．２．８；及び５Ｃ４．１４．７は、有意な阻止活性を示した（図１４も参照）。
【０１９５】
実施例１８
抗体のアイソタイピング
ＤｃＲ３抗体(実施例１５−１７において上述したもの)のアイソタイプを、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇ(Fisher Biotech, Pittsburgh, PA)で、マイクロタイタープレートを４℃で一晩かけてコーティングすることにより決定した。ついでプレートを洗浄バッファー(上述の実施例１５に記載したもの)で洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを２００μｌの２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で阻止し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、再度洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、１００μｌのハイブリドーマ培養上清又は５μｇ／ｍｌの精製抗体を所定ウェルに加えた。プレートを室温で３０分インキュベートし、ついで５０μｌのＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ(実施例１５において上述したもの)を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分インキュベートした。プレートに結合したＨＲＰのレベルを、上述のＨＲＰ基質を使用して検出した。
【０１９６】
アイソタイピング分析により、８Ｄ３．１．５；１１Ｃ５．２．８及び４Ｂ７．１．１抗体がＩｇＧ１抗体であることが示された。またこの分析により、５Ｃ４．１４．７抗体がＩｇＧ２ｂ抗体であり、４Ｃ４．１．４抗体がＩｇＧ２ａ抗体であることが示された。これらの結果も図１２に示す。
【０１９７】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA(ATCC)に寄託した：
材料              ATCC寄託番号         寄託日
DNA30942-1134     209254              1997年9月16日
4C4.1.4           ＿＿＿              1998年9月 日
5C4.14.7          ＿＿＿              1998年9月 日
11C5.2.8          ＿＿＿              1998年9月 日
8D3.1.5           ＿＿＿              1998年9月 日
4B7.1.1           ＿＿＿              1998年9月 日
【０１９８】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０１９９】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２００】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【０２０１】
出願人又は代理人の                      国際出願番号
ファイル整理場号      11669.31WO01
寄託した微生物に関する表示
（ＰＣＴ規則１３の２）
A.以下の表示は明細書中第    頁    行目に言及した寄託に関する。
B.寄託の表示
寄託機関の名称
アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション
寄託機関の住所
10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA
寄託の日付                              寄託番号
1997年9月16日；1998年9月  日
C.追加表示（不要の場合は空欄とすること）
D.寄託がなされる指定国（寄託が全ての指定国についてでない場合）
E.表示の別の提供（不要の場合は空欄とすること）
以下に列挙する表示は後に国際事務局に提出される（表示の一般的性質、例えば寄託の受託番号を特定すること）
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】天然配列ＤｃＲ３の誘導アミノ酸配列を示す図である。
【図２】天然配列ＤｃＲ３ｃＤＮＡの核酸配列を示す図である。
【図３】ＥＳＴ核酸配列（配列番号：３）を示す図である。
【図４】共通配列の組み立てに用いた種々のＥＳＴ（配列番号：３−１０）を示す図である。
【図５】ＤｃＲ３とヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）のアラインメントを示す図である。４つのシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３及びＣＲＤ４として示した。
【図６】ＤｃＲ３とヒトＯＰＧのアラインメントを示す図である。４つのシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３及びＣＲＤ４として特定した。
【図７】ノーザンブロットハイブリッド化分析で測定したときのヒト組織及びヒト癌株化細胞におけるＤｃＲ３ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図８Ａ】ＤｃＲ３のＦａｓリガンドに対する特異的結合性を測定するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図８Ｂ】ＤｃＲ３の可溶性Ｆａｓリガンドに対する特異的結合性を測定するための共免疫沈降アッセイの結果を示す図である
【図９Ａ】ＤｃＲ３によるＦａｓリガンド活性の阻害を測定するためのインビトロアッセイの結果を示す図である。
【図９Ｂ】ＤｃＲ３によるＦａｓリガンド活性の阻害を測定するためのインビトロアッセイの結果を示す図である。
【図９Ｃ】ＤｃＲ３によるＦａｓリガンド活性の阻害を測定するためのインビトロアッセイの結果を示す図である。
【図１０Ａ】種々の肺及び大腸腫瘍及び種々の大腸腫瘍株化細胞におけるＤｃＲ３遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
【図１０Ｂ】種々の肺及び大腸腫瘍及び種々の大腸腫瘍株化細胞におけるＤｃＲ３遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
【図１０ＣＤ】種々の肺及び大腸腫瘍及び種々の大腸腫瘍株化細胞におけるＤｃＲ３遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
【図１１Ａ】ＤｃＲ３の、混合リンパ球培養反応 （ＭＬＲ）又は同時刺激アッセイにおけるリンパ球増殖に与える影響を測定するアッセイの結果を示す図である。
【図１１Ｂ】ＤｃＲ３の、混合リンパ球培養反応 （ＭＬＲ）又は同時刺激アッセイにおけるリンパ球増殖に与える影響を測定するアッセイの結果を示す図である。
【図１１Ｃ】ＤｃＲ３の、混合リンパ球培養反応 （ＭＬＲ）又は同時刺激アッセイにおけるリンパ球増殖に与える影響を測定するアッセイの結果を示す図である。
【図１２】４Ｃ４．１．４；５Ｃ４．１４．７；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；及び４Ｂ７．１．１抗体と呼ばれるある種のＤｃＲ３抗体の抗原特異性及び阻止活性を示す表である。
【図１３】４Ｃ４．１．４；５Ｃ４．１４．７；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；及び４Ｂ７．１．１抗体と呼ばれるある種のＤｃＲ３抗体の抗原特異性を示す図である。
【図１４】４Ｃ４．１．４；５Ｃ４．１４．７；１１Ｃ５．２．８；８Ｄ３．１．５；及び４Ｂ７．１．１抗体と呼ばれるある種のＤｃＲ３抗体の阻止活性を測定するためのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１】
0005153679.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
0005153679.tif 000014
【図１０Ｂ】
0005153679.tif 000015
【図１０ＣＤ】
0005153679.tif 000016
【図１１Ａ】
0005153679.tif 000017
【図１１Ｂ】
0005153679.tif 000018
【図１１Ｃ】
0005153679.tif 000019
【図１２】
0005153679.tif 000020
【図１３】
0005153679.tif 000021
【図１４】
0005153679.tif 000022
【配列表】
0005153679000001.app