(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)不活性な抗体、あるいは腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらを含む構築物
(ii) 放射性核種または放射性核種混合物
(iii)葉酸塩
を含む、レセプターに結合する複合体。
【請求項２】
前記複合体が二元的な標的結合能力を有することを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物が、葉酸結合タンパク質とは別の抗原に結合する親和性を有することを特徴とする請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物がモノクローナルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物がポリクローナルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
前記複合体が二元的な標的結合能力を有しないことを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記抗体の各々がIgGクラスまたはIgMクラスであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
前記抗体の各々がIgGクラスであり、かつ前記構築物が二元的な標的結合能力を有しないことを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記放射性核種または放射性核種混合物の各々は、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ線放射体、陽電子放射体およびX線放射体からなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
前記放射性核種または放射性核種混合物が放射線誘導手術に使用できるものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１１】
前記放射性核種または放射性核種混合物の各々が、211At、212Bi、213Bi、212Pb、225Ac、223Ra、224Raおよび227Thからなるアルファ線放射体の群より選ばれることを特徴とする請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
前記放射性核種または放射性核種混合物の各々が、131I、90Yおよび153Smからなるベータ線放射体の群より選ばれることを特徴とする請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
前記放射性核種または放射性核種混合物の各々が、211Atまたは125Iであることを特徴とする請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１４】
以下の工程、
a)  葉酸塩のα−またはγ−カルボニル位置において活性化エステルを形成し、ついで不活性な抗体、あるいは腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらを含む構築物にカップリングさせること
b)  アミンカップリングまたはヨウ素産生物の標識により、放射活性物質を不活性な抗体、あるいは腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらを含む構築物にカップリングさせること
を含み、カップリング工程a)が、カップリング工程b)よりも、前にまたは同時にまたは後に行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体を製造する方法。
【請求項１５】
前記カップリング工程a)が、前記抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物に1〜50単位の葉酸を付加させるように実施され、前記放射活性物質が放射線治療に有効である放射性核種であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程b)のカップリングがリンカーの手段を用いて行われることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程b)のカップリングがリンカーを使用することなく行われることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物への注射または注入に好適な製薬剤溶液の製造のための請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体の使用方法。
【請求項１９】
経静脈、局所および腫瘍内から選ばれる少なくとも１つの投与経路により、前記製薬剤溶液が哺乳動物への注射または注入にとり好適であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記製薬剤溶液がレセプター含有細胞を画像化するために好適である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記製薬剤溶液が少なくとも１つの葉酸結合レセプターを発現している悪性細胞または悪性組織に対し、強力な治療用放射線を照射する目的のために好適である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記悪性組織が、脳、肺、子宮頚管、卵巣または乳房の癌であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記製薬剤溶液が標識された葉酸および放射標識されたIgG、IgMもしくはそれらのフラグメントおよびいくつかの放射免疫複合体の投与、他の形態の放射製剤治療、化学療法、外部光線治療および手術から選択される１以上の治療の併用のために好適である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
葉酸溶液を含むバイアルならびにカップリング活性化剤の溶液を含むバイアルを含み、使用にあたり、不活性な抗体、あるいは腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらを含む構築物を含む溶液に添加する前に、当該２つのバイアルの内容物が結合されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体を調製するためのキット。
【請求項２５】
前記カップリングの活性化剤が、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドであることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
共有結合またはキレート化によって、不活性な抗体、あるいは腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらを含む構築物に結合させ得る物質であって、しかも放射性同位元素、放射性同位元素でプレラベルされるリガンド、または後で放射性同位元素により標識することができるリガンドから選択される該物質を入れたバイアルを上記キットがさらに含む、請求項２４または２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗体、放射性核種および葉酸塩または葉酸塩誘導体からなり、２元的な結合能力を有するかもしくは有しないことを特徴とするレセプターに結合する複合体に関する。本発明は、さらにそのような複合体の製造方法および調製用キットならびにそのような複合体の使用方法に関する。製薬剤溶液の製造のため本発明による複合体の使用についても開示されている。
【０００２】
葉酸塩結合タンパク質（FBP）を発現している標的腫瘍に対する葉酸塩および葉酸塩誘導体の使用、エンドサイトーシスを介して酸化された葉酸塩の細胞内取り込みに関与するグリコシル-ホスファチジル-イノシトール-結合細胞膜タンパク質は、研究者らの注意を惹いてきた（Kranzら1996年;Reddyら1998年;Shinodaら1998年;Trippetら1999年）。ヒトガン細胞のいくつかのタイプには、FBPの発現過剰が見られることから、このレセプターは、葉酸塩と結合した治療用放射性元素を送達するための標的になり得る。低分子量の葉酸塩-キレート-放射性核種複合体のさまざまなタイプが、FBPを発現している標的細胞にインビボおよびインビトロで用いることができることが示されてきた(Mathiasら、1998年)。しかしながら、薬物動態学では小さな分子は一般に好ましくない。小さな分子は、一般に速やかに身体から排泄され、それにより腎臓内での葉酸塩レセプターはより高濃度の放射線医薬品にさらされるからである。しかも、標的組織内の血中濃度が速やかに減少するため、腫瘍への取り込みには限度がある。
【０００３】
最近の研究で、shinodaら(1998年)は、放射性核種インジウム-111で標識した葉酸塩と結合したウシ血清アルブミン(BSA)を評価し、葉酸塩なしのものは葉酸塩標識BSAと比較して、薬物動態および生体分布(biodistribution)において顕著な違いがあることを見出された。高い肝臓での取り込みと速やかな血液からのクリアランスは、葉酸塩標識型の111In-BSAが葉酸塩結合タンパク質を発現しているガン細胞に放射性核種を送達するのに特に適しているわけではないことを示した。
【０００４】
前記葉酸塩−抗体−放射性核種の組合せは、我々の知りうる限り、以前には存在していなかった。しかしながら、葉酸塩と抗体との組合せは、他の用途では評価されていた。Kranzら(1996年)は、（１）葉酸塩-抗体を標的細胞上の葉酸塩結合タンパク質と結合させること、（２）エフェクター細胞と相互作用する、抗体の抗原結合部位に起因して標的細胞の溶解に影響を及ぼすことを意図して、葉酸塩を抗エフェクター細胞抗体と結合させた。しかしながら、前記FBPレセプターシステムを使ってガン細胞が放射性核種の標的となるようにすることはいまだに成功していない。
【０００５】
放射性核種を、特に移動局所性（locoregional）の状況にあるFBP含有腫瘍を標的として向かわしめるためには、注射された領域から急速に拡散しすぎない大きな担体を使用することが有利である。モノクローナル抗体が、FBPに対して産生されたが(Campbellら、1991年)、モノクローナル抗体における問題点は、それらがたいていヒト以外の種からのタンパク質全体またはペプチドの配列を含有していることであり、それゆえヒトに使用した際には様々な程度に免疫原性となることである。このことは繰り返しの注射を要するプロトコルにおいて、ヒトの抗マウス-抗体またはヒトの抗キメラ-抗体が出現するがゆえに、モノクローナル抗体の使用を阻害する。これは免疫複合体形成および放射性免疫複合体の好ましくない生体分布(biodistribution)をひき起こす(Brulandら、1995年；Meredithら、1993年)。さらに、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントは通常、抗原結合部位に関して、１価または２価（すなわち、多価ではない）であるのみである。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、担体分子（すなわち抗体）、前記担体に化学的に結合させた放射性核種および葉酸塩から製造された、有効なレセプター選択性の腫瘍ターゲッティング剤（複合体）を提供することにある。さらに、前記複合体は、同時に本来の抗原に対する著しい抗原結合能力を保持しているべきである；すなわち、前記複合体は２元的結合能力を有している。それゆえ、本発明の目的はそのような複合体を製造し使用する方法を提供することにある。これらの目的は、本発明によって得られ、記載したクレームによって特徴付けられる。
【０００７】
本発明は、新しい種類の葉酸塩誘導体（複合体）、ならびにそのような複合体を製造し使用する方法に関する。前記複合体は、（１）好ましくはIgGまたはIgMクラスの抗体または抗体群、またはそれらのフラグメントもしくはそれらの構築物（たとえば、ミニボディ(minibody)）、（２）放射性核種、（３）葉酸塩からなる。本発明によれば、前記複合体は、ヒトのタンパク質またはペプチドのみを含み、抗体あたり複数の葉酸塩が結合する可能性のために、結合活性が増加しており、それにより前記複合体を標的細胞に結合させる確率が増すだろう。使用される抗体は、不活性な抗体か、腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノクローナル抗体のどちらかである。最初のケースでは、FBP親和性のみを有する複合体が構築される一方、２番目のケースでは、潜在的に２元的レセプター親和性を有する複合体が作られる。前記抗体は、葉酸塩のFBPに対する結合能力ばかりでなく本来の抗原に対して顕著な抗原結合能力を保持しているからである。２元的レセプター親和性の代表的な利点は、複合体に対して少なくとも１つのレセプターすら有しない大量の標的細胞を減らし、首尾よく標的とする機会を増やすことである。我々の知る限りにおいては、腫瘍細胞へ放射線を送達するために葉酸塩-抗体-放射性核種を使うことを提案するのは我々が最初である。
本発明を、図および実施例を参照して、以下により詳細に述べる。
新しい種類の葉酸塩誘導体を開発するために、すなわち、新規な化合物（複合体）、好ましくは、ヒトのタンパク質またはペプチドのみを含有するもの、言い換えれば、FBPに対して多価であり、２元的結合能力を有するかまたは有しないものを作るために、葉酸塩および放射性同位元素で標識された抗体を使用する可能性が明らかにされた。このような複合体において抗体を用いる利点は、２重にある。低分子量の化合物と比較して、抗体の大きなサイズは、複合体の薬物動態に影響する。すなわち、静脈注射した場合に、血液からのクリアランスがより遅くなり、放射性化合物の濃度が維持され、腫瘍へのより高い取り込みが可能になる。つまり、腔内に注射した場合、その領域からの放射性同位元素のクリアランスを遅くする(Larsenら、1995年)。葉酸塩の結合の程度（すなわち、結合活性、またはレセプター結合単位の数）に依存して、該複合体はFBPの合わさった結合部位に関して多価になりうる。しかも、FBPとは異なる抗原に対する抗原結合能力を有する抗体に、葉酸塩を複合化することにより、２つの異なるレセプターと結合しうる（すなわち、２元的結合能力を有する）複合体が作られる。たとえば、ある抗原に対して産生される抗体、たとえば、抗-骨肉腫抗体TP-3は、葉酸塩と放射性同位元素で標識されており、抗原を発現している骨肉腫細胞に、従来の抗体抗原相互作用によって結合しうるが、さらに葉酸塩の官能基を介して、FBPを発現している細胞にも結合できる。この２元的結合能力の原理は、抗原と同様、FBPの細胞発現が標的細胞および系統群によって異なるため重要である。
【０００８】
したがって、前記抗体自体も異なるレセプターを介して腫瘍細胞に結合する場合には、全腫瘍細胞に対して治療に充分な標的となしうる確率が増加する。このように、この原理は、それぞれレセプターのうちの１つのみを有する２つの異なる細胞集団を標的とするのに用いることができる。あるいは、両方のレセプターを発現している細胞を標的とする確率を増加させるのに用いることができる。このタイプの複合体は、多くの様式で用いることができ、ガン細胞に対する、治療または診断用の放射性同位元素のインビボでの標的化が挙げられる。
【０００９】
さらに、前記２元的結合能力の原理は、葉酸塩以外のレセプターに結合する分子に用いることもできる。たとえば、エストロゲン誘導体およびテストステロン誘導体は、乳ガンまたは前立腺ガンに親和性を有する抗体と複合体化でき、乳ガンまたは前立腺ガン細胞に対する２元的結合能力を有する複合体を与える。
さらに、我々は、放射能標識または葉酸塩標識をした場合に、これらの抗体が２元的レセプター親和性（すなわち、FBPおよび骨肉腫に関係する抗原の両方に対する親和性）を有することを示すため、骨肉腫に関係する抗原に対するモノクローナル抗体の使用を研究した。
【００１０】
我々は、葉酸塩で標識され、かつ、アスタチン-211およびヨウ素-125で放射能標識されたヒトIgGを評価した際に、驚くべきことに、葉酸塩標識および放射能標識したIgGと、葉酸塩なしの放射能標識したIgGとの間には、マウス内の生体分布に顕著な違いが見られなかったことを見出した。したがって、我々は、葉酸塩-抗体-放射性核種複合体は、インビボの腫瘍ターゲッティング化に有用であると結論した。
【００１１】
前記葉酸塩-抗体-放射性同位元素複合体の利用は、移動局所性の適用のみならず静脈注射に使用することにより開発することができる。たとえば、短寿命の放射性核種（すなわち、t1/2が数時間）に基づく複合体は、腹腔内に転移した卵巣ガンの治療に有望である。なぜなら、このタイプのガンは、FBPを過剰に発現している確率が高く、この部分からの抗体のクリアランスは比較的遅いため、腫瘍に影響される領域内の放射性化合物の濃度が高く確保される。
【００１２】
前記葉酸塩-抗体-担体分子を、別種の放射性同位元素を輸送するために使うこともできる。たとえば、治療のためのアルファ線および／またはベータ線放射体、ならびに腫瘍のシンチグラフィーおよび陽電子放射-断層撮影法（PET）のためのX線および／またはガンマ線放射体および／または陽電子放射体がそれぞれ挙げられる。実験のセクションで述べるように、金属放射性核種のみならずハロゲンも葉酸塩-抗体に複合体化することができる。前記金属放射性核種は、たとえば、タンパク質中のアミノ基（たとえばリジン）に対するカップリング反応性を有する２官能性キレートの手段による。アルファ線放射体の例としては、211At、212Pb（ジェネレータ核種に結合した化学物質として）、212Bi、213Bi、223Ra、224Ra、225Acおよび227Thが挙げられる。ベータ線放射体の例としては、67Cu、90Y、131I、153Sm、166Hoおよび186Reが挙げられる。X線放射体およびPET核種の例としては、99mTcおよび18Fが挙げられる。放射線誘導手術における特別な用途には、たとえば、125I-標識抗体-葉酸塩複合体が挙げられる。
【００１３】
一般に、葉酸塩は、そのα−またはγ−カルボニル位置で活性化エステルを形成して、アミノ基とリガンド上でカップリングさせることができる。葉酸塩から活性化したカップリング剤を生成させるいくつかの方法がある(Readdyら、1998年)。α−位で複合体化した葉酸塩は、γ−位で複合体化したものと同じレセプター活性を示さないかも知れない。葉酸塩が、EDC法を使用して抗体とカップリングさせ得ることはよく知られている(Reddyら、1998年)。この方法は、葉酸塩のα−またはγ―カルボニル位置に対して選択的ではないが、EDC法を使用する場合には、γ−位置が立体障害的に好ましい。担体分子に１つ当たり複数の葉酸塩の複合体化は、少なくとも1つのγ−位で複合体化した葉酸塩が含まれることを保証する(Reddyら、1998年)。
【００１４】
本明細書で用いられる葉酸塩-抗体-放射性核種複合体を生成する方法は、放射活性カップリング剤によるアミンカップリングおよびチロシンのヨウ素産生物質による標識の両方が、葉酸塩ターゲッティング特性を有する生成物をつくるのに用いることができることを示した。抗体を放射能標識する最も一般的な方法は、おそらく葉酸塩標識と併用できる。もしも抗体が葉酸塩で多量にプレラベルされているならば、利用できるリジンのアミンが減少するため、アミノカップリング剤を用いる場合には、放射能標識の収率は減少するだろう。放射能標識は、主に抗体の葉酸塩標識の前にまたは後に行うことができる。
【００１５】
本発明に係る葉酸塩-抗体-放射性核種複合体は、ヒトを含む哺乳動物へ注射または注入するのに好適な製薬剤溶液を製造するために用いることができる。この溶液は、必要に応じて、公知である全ての全身的な投与経路を介して患者に投与される。たとえば、経静脈、局所的および／または腫瘍内の経路が挙げられる。その結果、本発明による調製物は、活性複合体からなり、所望により、アジュバント、製薬学的に認められている変性剤、溶剤および担体を含み、選択した投与経路に適した注射液および／または注入液を含有してなる。
【００１６】
本発明に係る放射性免疫複合体は、さらに、葉酸塩結合タンパク質を発現しているガンを治療するための他の放射性免疫複合体、葉酸塩-および放射能標識されたIgGおよびIgMまたはそれらのフラグメントおよび／または他の形態の放射性製剤治療、化学療法、外部光線治療または手術と組み合わせて用いられる。
前記葉酸塩-抗体-放射性核種複合体は、さらに、葉酸塩結合タンパク質を発現しているレセプター含有細胞または組織を画像化するため、または葉酸塩結合タンパク質を発現している悪性細胞に強力な治療用放射線を照射するための方法に使用される。ここで、前記悪性組織は、たとえば、脳、肺、子宮頚管、卵巣および乳房のガンからなる群から選択される。
【００１７】
本発明によれば、葉酸溶液を含むバイアルと、カップリング活性化剤（たとえば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）の溶液を含むバイアルとを含んでなり、所望により、放射性同位元素、あるいはプレラベルされているか、後で抗体または抗体フラグメントに共有結合かキレート化によって放射性同位元素で標識されるリガンドを含有する溶液を含む３つ目のバイアルを含んでなり葉酸塩標識の抗体または抗体フラグメントの調製用キットが提供される。
【００１８】
さらに、本発明は、活性成分が、（１）IgM、IgGまたはそれらのフラグメントおよびそれらの構築物であって、（２）放射性核種で標識され、（３）抗体自身のものとは別のレセプター親和性を有する一般の分子（たとえば、エストロゲンまたはその誘導体またはテストステロンまたはその誘導体）からなる複合体である場合に、２元的結合能力の原理に基づいた放射線療法または放射線検出に好適な製薬剤溶液の製法を提供する。
【００１９】
最良の形態
本発明に係るレセプターに結合する複合体は、３つの構成要素；
（１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらのフラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ（minibody））、
（２）放射性核種または放射性核種の混合物、および
（３）葉酸塩からなり、前記複合体が２元的な標的結合能力を有するかまたは有しないことを特徴とし、その放射性核種が211Atまたは125Iから選択できることを特徴としている。
【００２０】
３つの構成要素；
（１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらのフラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ）、
（２）放射性核種または放射性核種混合物、および
（３）葉酸塩からなり、
抗体の放射性核種標識および葉酸塩標識に関する標準的な手順を用いることを含む、レセプターに結合する複合体を製造する方法。
【００２１】
一般に、前記製法条件は、標識される各抗体について、最適化されなければならない。リジン単位の数および局在（たとえば、抗体結合部位または非結合領域）が異なるからである。
IgGの前処理
抗体のバッチは、特定の抗体に関して最適の葉酸塩標識条件を与えるのに用いられるバッファー（たとえば、0.05Mホウ酸塩、pH8.5）で予備-平衡化したSephadex PD-10カラム(Pharmacia)を使用して、バッファー交換される。前記抗体を、カラムから溶離し、必要であれば、バッファーで希釈して、標識工程を行うのに最適な濃度を得る（たとえば、1〜50mg/ml）。
【００２２】
記載した実施例で詳細に述べるプロセスは、明確にするためのものであり、限定されるものではなく、以下の工程からなる。；
葉酸塩標識
全体的な手順は実験のセクションで述べる。最初に、葉酸塩を抗体に複合体化する（典型的には、抗体ごとに1〜20葉酸塩）。抗体をカップリング活性化した葉酸塩の溶液に加える。反応を、10秒未満〜2日超の間放置し進行させる。たとえば、ホウ酸バッファーに過剰のグリシンを加えて、反応を失活させてもよい。得られた複合体をゲルろ過分離（サイズ排除、たとえばSephadex G-25 PD-10カラム）を用いて精製する。次に、葉酸塩標識抗体を放射性核種で放射能標識する。最終的な生成物を、たとえば、Sephadex G-25 PD-10カラムを用いるゲルろ過により精製する。
【００２３】
放射能標識は、葉酸塩複合体化に引き続いて行うことができる。実験のセクションで詳細に述べるように、標準的な放射能標識手順が使用できる。放射能標識された複合体は、1Bq/mg抗体未満から数GBq/mg抗体までの範囲の比活性を有するように調製できる。
【００２４】
【実施例】
【００２５】
【実施例１】
ヒトIgGと葉酸塩の複合体
IgGの前処理
商業的に入手できるヒトIgG（HIgG）（Gammanorm:Pharmacia ＆ Upjohn社製）を、グリシン、NaClおよびNaAcの緩衝液中165mg/ml初期濃度で使用した。
【００２６】
HIgGを、PBSで予備平衡化したSephadex G-25カラム（PD-10、Pharmacia）で混合物を溶離することによって低分子量の成分から分離した。
IgG濃度を、該タンパク質の吸光係数224,000を用いて280nmでの吸光度の示度により求めた。
TSK-G3000SWxlカラム（東ソー  Haas社製）を用いたサイズ排除HPLCでの精製HIgGの溶離プロファイルは、本質的にIgGに対応する1つのピークを示した。
【００２７】
（HPLCシステム：島津社製、LC-10ATポンプ、SPD-M10A  ダイオードアレイ検出器）
葉酸の複合体化
反応性を確保するために、葉酸の保存液を、商業的に入手した葉酸（シグマ社製）を含水率0.05％未満のジメチルスルホキシドに溶解して調製した。保存液を、活性化された4オングストロームのシーブ（Fluka）を含むボトルにカニューレ挿入し、アルゴン雰囲気、暗所で6〜10時間保管した。
【００２８】
3H−葉酸（Amersham Pharmacia Biotech.社製 Buckinghamshire. 英国）を、葉酸調製物にトレーサーとして含有させ、3H−葉酸のカリウム塩水溶液（クエン酸については1％）として添加し、その後8mTorrで3日間乾燥保存した。その後、3H−葉酸を含有する前記葉酸を上述のように処理した。葉酸をHIgGに結合するために、4〜10mol当量の1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボンジイミドを前記葉酸溶液に添加し、30分間、周囲温度でインキュベートすることによって、活性化した。その後、20〜60倍モル過剰の活性化された葉酸をPBS中のHIgG（15mg/ml）に添加し、30〜60分間反応させた。反応をpH8.5のPBS／ホウ酸塩中0.3Mグリシン0.2mlを添加することによって抑制した。葉酸−HIgG複合体（FA-HIgG）を、PBSで予備平衡化したPD-10カラムを用いて未反応物から分離した。サイズ排除HPLCによって、HIgGの凝集体／二量体／フラグメント、あるいは低分子量の成分の存在について個々の分画を分析した。
【００２９】
葉酸複合体化の程度を、分光光度的なタンパク質濃度の決定と組み合わせて、液体シンチレーションカウンティング（Beckmann LS6500）によって測定される精製FA-HIgGの3H−含有量によって求めた。タンパク質濃度は、吸収係数および3H測定から得られる葉酸濃度から算出される、葉酸に帰因する280nmでの吸収への寄与について補正した280nmでの吸収により求めた。
【００３０】
【実施例２】
125I-FA-HIgGおよび211At-FA-HIgGの調製
Iodogen法による放射性ヨウ素標識
PBS中のFA-HIｇG（例えば2〜5mg/ml）を、標準的な方法論（Fraker ら, 1978）を用いてIodogen法によりヨウ素化した。放射標識した生成物は、PD-10により精製し、HPLCサイズ排除カラムで分析した。この研究は、放射標識前あるいは標識後に抗体を葉酸塩で標識しても、放射標識した生成物の収率は同じであることを示した。
【００３１】
N−スクシンイミジル−3−［125I］ヨウ化安息香酸を用いた放射標識（ATE法）
葉酸塩標識した抗体あるいは抗体のみを、例えばホウ酸塩緩衝液（pH8〜9）中濃度1〜10mg/mlで、N−スクシンイミジル−4−［211At］アスタト安息香酸か、あるいはN−スクシンイミジル−3−［125I］ヨウ化安息香酸を入れた乾燥バイアルに添加した。2つの標識化試薬を、記載（Larsen ら, 1994b）のとおりに調製した。バイアルを穏やかに15分間攪拌した後、ホウ酸塩（pH8〜9）中0.2Mのグリシン0.3mlを添加し、バイアルをさらに5分間攪拌した。その後、溶液をSephadex G-25 PD10カラム（Pharmacia社製）に移し、放射標識されたIgGをPBS緩衝液（pH7.4）を用いて溶離した。
結果：全標識収率はこの方法を用いて35〜60％の範囲であった。これらの手順を、TP-1 F(ab-)2と同様に、TP-3、RituximabおよびヒトポリクロナールIgGにも使用し、N−スクシンイミジル−［211At］アスタト安息香酸（Larsen ら, 1994）と同様に実施することができた。
【００３２】
211Atおよび125Iのタンパク質への結合割合を求めるための実験において、精製された生成物をタンパク質のメタノール沈殿を用いて評価した。97％以上の放射能が、125I-FA-HIgG、211At-FA-HIgG、125I-HIgGおよび211At-HIgG調製物として沈殿した。
【００３３】
【実施例３】
125I-FA-HIgGおよび211At-FA-HIgG対125I-HIgGおよび211At-HIgGの体内分布
方法：平均FA／HIgGの比2.3の単一のFA-HIgG調製物を125I-FA-HIgGおよび211At-FA-HIgGの両方の調製物に使用し、比較のために125I-HIgGおよび211At-HIgGも実施例2で記載したように調製した。
【００３４】
体重が16〜20gの範囲の雌性Balb/C白マウスを体内分布実験で使用した。前記化合物を各動物に対して調製物500μlの腹腔内注射により投与した。前記化合物を各動物に対して約100ｋBqの211Atおよび約50ｋBqの125Iを用いて、一対標識配列（211At-FA-HIgG対125I-HIgGおよび125I-FA-HIgG対211At-HIgG）で投与した。動物を頚椎脱臼により犠死せしめ、各時点3匹のマウスのグループを用い、標識対抗体型を（葉酸について）反対にして、2系列の実験を実施し、1時間、6時間および24時間での組織分布を求めた。組織試料の放射能含有量をNaI（Tl）井戸型検出器で測定した。まず、検出器の窓と閾値を125Iからの検出可能な乗り換えがなく、211At崩壊を測定するために調整した。次に、211Atの20半減期に相当する時間の経過後、組織試料を125I含有量の数量化のために再び測定した。単一核種および該核種の混合物による放射標識されたHIgG調製物の試料を対照として使用した。
結果：表1は葉酸塩標識HIgGと葉酸塩化されていない放射標識HIgGとの分布比を示す。前記比率は、いくつかの組織で抗体上の葉酸塩標識の影響として、わずかな分布の変化のみを示したが、すべての点で0.7〜1.9の間で維持された。葉酸塩に結合するレセプターであるために感受性組織と考えられる腎臓について、葉酸塩標識の重大な影響は確認されなかった。一般に、葉酸塩標識は、放射標識された抗体の体内分布に大きな影響はなく、葉酸塩標識された放射性免疫複合体が生体内での利用に有効であるかもしれないことを示している。
結論：葉酸塩標識されたIgGの腎クリアランスは徐々であり、腎臓中の葉酸塩に結合するレセプターでの蓄積を妨げるように思われる。また、葉酸塩標識は他の組織中の放射標識されたHIgGの体内分布に大きな影響はなく、葉酸塩化および放射標識されたIgGを癌治療に対する有効な道具でありうることを示している。
【００３５】
【表１】
0005153044.tif 000002
【００３６】
【実施例４】
葉酸および葉酸複合体の結合アッセイ
固定化された葉酸塩に結合するタンパク質（FBP）を、葉酸複合体の結合特性を検討するために使用した。2.5g／mgタンパク質の葉酸結合能を有するFBP（シグマ社製）を、高タンパク質結合性の96ウェル(well)  EIA／RIAアッセイプレート（Costar Corning Inc. NY, USA）上に固定化した。
葉酸塩に結合するタンパク質の固定化の検討
FBPをIodogen法により125Iで標識し、標識されたタンパク質をPD-10カラムで反応混合物を溶離することによって単離した。精製125I-FBPを、PBS中5〜20g/mlの範囲の濃度で96ウェルアッセイプレートに添加し、4℃で一晩回転式ラック上でインキュベートした。ウェル中の液を除去し（L1）、その後、ウェルをPBSで4回洗浄した（L2）（室温）。このあと、ウェルに2MのNaOHを添加し、約1時間室温で静置した後、液を除去した（L3）。液体シンチレーションカウンティングにより各試料の放射能を測定してから、4連の種々の濃度の125I-FBPの固定化された量をL3/L1+L2の比として求めた。ウェル上に固定化されたFBPが平均1gになるような条件を、3H-FAおよび125I-FA-HIgGの結合アッセイで使用した。
【００３７】
葉酸塩に結合する固定化されたタンパク質への3H-FAの結合
ウェルをFBPのPBS溶液でインキュベートし、インキュベーション混合物を除去した後、PBSでウェルを3回洗浄した。被覆されたウェルの半数に5M葉酸のPBS溶液を添加し、他の半数にPBSのみを添加した。室温で1時間後、液を除去し、その後、3H-FAを含有する0.1から2.8nMの範囲の濃度（6並列）の葉酸を、ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。葉酸が特異的に結合された割合を、125I-FBPについて記載された方法と同様にして求め、葉酸でプレインキュベートされたウェルに保持された3H-FAの割合について補正した。
【００３８】
固定化葉酸塩に結合するタンパク質への125I-FA-HIgGの結合
ウェルをFBPのPBS溶液でインキュベートし、インキュベーション混合物を除去した後、PBSで2回洗浄し、続いてHIgGのPBS溶液（10g/ml）で洗浄した。被覆されたウェルの半数に5Mの葉酸のPBS溶液を添加し、他の半数にPBSのみを添加した。室温で1時間後、液を除去し、ウェルに125I-FA-HIgGを、複合化葉酸について0.2(4)〜13.(3) nMの範囲の濃度（5並列）で添加した。特異的に結合された125I-FA-HIgGを3H-FAについて上述したように求めた。
結合特性の決定
特異的に結合された3H-FAを、スキャッチャードプロットで3H-FAの濃度に対してプロットした（図1）。125I-FA-HIgGについて、少なくとも1つの結合−反応性の葉酸誘導体が各HIgG分子に存在すると仮定して、同様のプロットを実施した。以下の値を結合アッセイから求めた。
【００３９】
Kaは3H-FAについてのプロットから求められ、2×108であった。
Kaは125I-FA-HIgGについてのプロットから求められ、0.5×108であった。（3つの最低濃度の点だけを考えると、かなり高いKa値が得られるので、2成分のプロットもまた可能な解にもなり得ることを記載した。）
結論：放射標識された葉酸塩−IgG複合体は、レセプター（葉酸に結合するタンパク質）に対してかなりの結合親和性を示した。
【００４０】
【実施例５】
OHS-細胞上の葉酸塩化および放射性同位体標識されたTP-3 IgGおよびTP-1 F(ab')2の抗原結合能力
TP-3およびTP-1モノクロナール抗体（Bruland ら, 1986）は、骨肉種細胞に発現される細胞表面抗原の2つの異なったエピトープに結合する（Bruland ら, 1988）。これらの抗体を、インビボで抗原に結合する抗体の能力への葉酸塩複合体化による影響を調べるために使用した。OHS細胞を、13％のウシ胎児血清の代わりに10％のウシ胎児血清を用いた以外は、標準的な方法（Larsen ら, 1994a）に基づいて成長させた。DMSOを添加して細胞を収集し、−80℃で凍結した。
方法：TP-1 F(ab')2およびTP-3 IgGを（上述したように）葉酸塩で標識し、それぞれ2：1および4：1の葉酸塩：抗体比を得た。続いて、TP-3およびTP-1 F(ab')2の葉酸塩化されていないものだけでなく葉酸塩標識されたものも、実施例1に記載したようにN−スクシンイミジル−3−［125I］ヨウ化安息香酸を用いて放射標識した。1細胞当り、平均7.4×105抗原を発現させたOHS骨肉種細胞（Larsen ら, 1994a）の凍結分を溶解し、PBSで2回洗浄、遠心分離してDMSOを除去し、PBS（１％BSA含有）に400万個／mlの細胞濃度で懸濁した。4mlの試験管にこの懸濁液を0.3ml添加した。その後、4つの複合体、125I-TP-1(Fab')2−葉酸塩、125I-TP-1 F(ab')2、125I-TP-3、 IgG−葉酸塩のうちの1つ、0.5ngを前記試験管に添加した。続いて、試料管を3時間インキュベートした。その後、試験管を放射能についてNaIカウンターで計数し、3回洗浄、遠心分離して放射能を結合した細胞ペレットを計数した。保持された細胞結合能力（RCBA）を以下のように求めた。
RCBA＝葉酸塩標識されたRICの細胞に結合する割合／葉酸塩化されていないRICの細胞に結合する割合
（RICとは放射性免疫複合体を意味する）
結果：125I-TP-3 IgG−葉酸塩対125I-TP-3 IgGのRCBAは0.36であり、一方、125I-TP-1 F(ab')2−葉酸塩対125I-TP-1 F(ab')2のRCBAは0.62であった。これは、いくつかの免疫反応性は失われたが、抗体は抗原を結合させた骨肉種との反応性がまだあったことを示す。
結論：葉酸塩で標識された抗体は、原則として抗原と葉酸塩に結合するタンパク質との両方と反応することができる。すなわち、このような複合体は二元的結合能力を有する。
【００４１】
【実施例６】
葉酸塩に結合するタンパク質を発現しているOVCAR-3およびHELA-S3細胞への葉酸塩標識化および放射標識化抗体の結合。OHS細胞を用いた二元的結合能力の実証
方法：OVCAR-3細胞（ヒト卵巣癌）、HELA-S3（ヒト頚癌）を、葉酸塩を発現する細胞として使用した。該細胞を10％のウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充したRPMI1640培地で満たされた75cm2のプラスチックフラスコで培養した。回収10日前に、培養培地を10％の胎児血清で補充された葉酸塩のないRPMI1640培地で置換し、細胞を収集するまえに葉酸塩に結合するタンパク質の発現を確実にした。収集された細胞にDMSOを添加し、−80℃で凍結した。結合アッセイで使用する前に、凍結細胞を溶解し、すぐに1％BSAを含有するPBSを添加し、2回洗浄、遠心分離してDMSOを除去した。1％BSAを含むPBSの細胞懸濁液を、複合体でインキュベートする間、氷上に保持した。結合アッセイを以下のように実施した。100万個／mlのOVCAR-3およびHELA-S3保存細胞懸濁液を調製し、0.5mlを2ml容量試験管に添加した。試験管に種々の量の葉酸塩−抗体−125Iを添加した。非特異的な結合を決定するために、同様の試験管に非葉酸塩化抗体−125Iを同じ濃度で添加した。これらの試験管を振盪機で3時間インキュベートし、放射能を計数し、洗浄した。最後に、放射能を結合させた細胞ペレットを計数した。以下の複合体を評価した。
【００４２】
葉酸塩−TP-1 F(ab')2-125I（1抗体分子当り約2個の葉酸塩、SIBで標識化（SIB=N−スクシンイミジル−3−［125I］ヨウ化安息香酸）、50MBq/mg）、TP-1 F(ab')2-125I（SIB標識化、90MBq/mg）、葉酸塩−TP-3-IgG-125I（1抗体分子当り約4個の葉酸塩、SIB標識化、70MBq/mg）、TP-3-IgG-125I（SIB標識化、120MBq/mg）、葉酸塩−HIgG-125I（ヨウ化物標識化、400MBq/mg）。
【００４３】
非特異性の対照として、HELA-S3を用いてインキュベートされたTP-3-IgG-125Iについてのデータを用いて、OHS細胞で葉酸塩−TP-3-IgG-125IおよびTP-3-IgG-125Iをインキュベートすることにより補足実験を実施した。
結果：予備データは、葉酸塩に結合するタンパク質との少なくとも2種の相互作用があることを示す。1つは高い親和性を有し、低濃度（例えば50ng/ml未満）で飽和する。Kaは、1010〜1012の範囲で、これら低濃度で利用できる限られたデータの点により求めた（図2〜4）。1点のアッセイでは、0.1ng/ml濃度の葉酸塩−TP-3-IgG-125I（および非特異的な結合の対照として0.1ngのTP-3-IgG-125I）および0.5ml中の5×105個のOVCAR-3細胞を用いたところ、67％の葉酸塩−抗体−放射性核種が前記細胞に特異的に結合したことがわかった。より高濃度では、親和性の低い結合が生じるようであった（図5）。結合の飽和は、μg／mlの範囲の複合体濃度については起こらないように思われた。細胞への結合は、葉酸塩−抗体−放射性核種複合体の培地濃度での増加とともに直線的に増加するようであった。注目すべきは、非特異的な結合について補正した場合、OHSの葉酸塩−TP-3-IgG-125Iの特異的な取り込みは、HELA-S3およびOVCAR-3のそれと同様であったことである（図5）。葉酸塩−TP-3-IgG-125I（1抗体当り4つの葉酸塩）の親和性を、非葉酸塩化TP-3-IgG-125Iのそれと比較した（図6）。両方のTP-3型は、OHS細胞に対してかなりの親和性を有していた。データは、TP-3 IgG抗体の非葉酸塩化型と比較して、葉酸塩化型についてKaが約5減少したことを示す。これは、恐らく抗原に結合する部位でのリジンの修飾による。
結論：葉酸塩−抗体−放射性核種複合体は、細胞中の葉酸塩に結合するタンパク質（FBP）に著しい結合を示し、これらの複合体を、インビボでFBP−発現腫瘍細胞を標的とするために使用することができることを示す。また、FBP−陽性のHELA-S3およびOVCAR-3細胞ばかりでなく、抗原−陽性OHS細胞に対する葉酸塩−TP-3-IgG-125Iの特異的な結合により示されたように、葉酸塩−抗体−放射性核種複合体は、二次元的結合能力を有する。
【表２】
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【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、トリチウム標識葉酸塩（3H-FA;上のグラフ）についての結合アッセイおよびヨウ素-125で標識されたポリクローナルヒトIgG（125I-FA-HIgG；下のグラフ）についての結合アッセイを示す。
【図２】  図２は、10〜50ng/mlの範囲における、HELA-S3細胞への葉酸塩-TPIgG-125Iの結合を示す。
【図３】  図３は、1〜10ng/mlの範囲における、HELA-S3細胞について葉酸塩-HIgG-125Iの結合アッセイを示す。
【図４】  図４は、0、1〜20ng/mlの範囲における、OVCAR-3細胞への葉酸塩-TP-3IgG-125Iの結合を示す。
【図５】  図５は、細胞への特異的な複合体の結合を示す。
【図６】  図６は、OHS細胞上での、葉酸で標識されたVs非葉酸塩化TP-3IgGモノクローナル抗体の結合アッセイを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005153044.tif 000009
【図６】
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