(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005357368.tif 000003
で表されるＭＸ−ＤＴＰＡの単一のレジオ異性体のみを実質的に含む２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）の組成物の製造方法であって、該組成物は全部の他のレジオ異性体に対し該ＭＸ−ＤＴＰＡレジオ異性体を少なくとも９０％含有し、該製造方法は、
(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）の異性体とモノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護ジアミン（Ｂ′）とをカップリングさせ、Ｎ−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノプロピル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミド（Ｃ′）を生成し；
(b) （Ｃ´）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ−（２−アミノプロピル）−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミドＴＦＡ塩（Ｄ′）を生成し；
(c) （Ｄ´）を還元し、２−メチル−６−（ｐ−ニトロベンジル）ジエチレントリアミン三塩酸塩（Ｅ′）を生成し；
(d) （Ｅ′）をペンタ−アルキル化し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン（Ｆ′）を生成し；
(e) （Ｆ′）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｇ′）を生成し；
(f) （Ｇ′）中に存在するニトロ基を還元し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｈ′）を生成し；次いで
(g) （Ｈ′）中に存在するアミノ基を変換し、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）を生成する；
ことを包含する、上記方法。
【請求項２】
(a) が、カップリング剤としてベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）の使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(a) が、カップリング剤としてビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）の使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
(i) ラクトニトリルを水酸化アンモニウムで処理し、α−アミノニトリル（２）を生成させ；
(ii)（２）を塩酸で処理し、アミン塩酸塩（３）を生成させ；
(iii) このアミンをジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートで保護し、ｂｏｃ保護誘導体（４）を生成させ；
(iv)このニトリルをラネーニッケルを使用し、２気圧の水素の存在下にエタノールの飽和溶液により還元し、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を生成させる；
ことを包含する方法によって、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
(i) シッフ塩基（５）を相転移条件下にアルキル化し、モノ−アルキル化生成物（６）を生成させ；
(ii)（６）を１Ｎ塩酸で脱保護し、次いでジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートにより保護することによって、ｂｏｃ保護アミン（４）を生成させ；次いで
(iii) （４）をラネーニッケルにより還元し、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を生成させる；
ことを包含する方法によってモノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（Ｃ′）に存在するｂｏｃ基を分離し、（Ｄ′）を生成させることを、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（Ｄ′）の還元工程が、（Ｄ′）をボラン−テトラヒドロフラン錯体により処理し、引き続き塩化水素により処理し、トリアミン塩酸塩（Ｅ′）を生成させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
中間体（Ｅ′）のペンタアルキル化を、アセトニトリル及び炭酸カリウムを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
中間体（Ｅ′）のペンタアルキル化を、ジメチルホルムアミド中のブロモ−ｔｅｒｔ−ブチルアセテート及び炭酸ナトリウムを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｆ′）を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフイを用いて精製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｆ′）中に存在するカルボン酸を脱保護し、ペンタ酢酸誘導体（Ｇ′）を生成させることを、トリフルオロ酢酸を用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（Ｇ′）中に存在するニトロ基を還元し、（Ｈ′）を生成させることを、水中で２気圧の水素の存在下にカーボン上のパラジウムを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（Ｈ′）をＭＸ−ＤＴＰＡに変換する工程が、アミン（Ｈ′）をチオホスゲンにより、イソチオシアネート官能基に変換することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（Ｈ′）をＭＸ−ＤＴＰＡに変換する工程が、
(i) クロロホルム及び水中のペンタ酢酸誘導体（Ｈ′）を含有する２相混合物にチオホスゲンを添加し；
(ii)この混合物を、２時間にわたり急速撹拌し；
(iii) 溶媒を減圧下に除去し、残留物を生成し；
(iv)この残留物を、逆相シリカ上で精製し；次いで
(v) １％酢酸を含有する水中の２５％アセトニトリルを用いて溶離する；
ことを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換が、ジクロロメタン及びトリエチルアミンの使用を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
（Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換が、アセトニトリル及び炭酸水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムの使用を包含する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、ＤＴＰＡ誘導体の製造方法に関する。特に、本発明は、放射線免疫治療(radioimmunotherapy)および造影(imaging)における二官能性キレーター(chelator)として有用なＤＴＰＡの高収率レジオ特異的合成方法に関する。
【０００２】２．技術背景
慣用の放射性標識剤が示す種々の欠点を減少する、造影、腫瘍検出および免疫治療用の新規放射性標識剤に対する重要性が増大している。
慣用の標識剤は一般に、放射性ハロ化合物、例えばヨウ素同位体を基材とする放射性化合物に基づいている。しかしながら、これらの試薬には多くの制限が存在する。例えば、ヨウ素同位体の使用は、インビボにおける炭素−ヨウ素結合の高い分解速度により格別に制限される。もう一つの制限は、放射特性およびヨウ素放射性核種の物理的半減期が理想よりも小さいことに関連する。従って、ハロゲン−ベースの放射性標識剤の欠点を克服するために、新規な腫瘍検出剤の開発に努力がなされている。
【０００３】  さらに効果的な造影剤および腫瘍検出剤を提供するための前進の一つが、金属放射性核種錯体の形態の有機金属化合物により提供されている。造影剤および腫瘍検出剤のタンパク質へのカップリングは一般に、活性化されたカルボニルを用いるアシル化により、芳香族ジアゾニウムカップリングにより、ブロモアセチルアルキル化により、またはチオ尿素結合を経る当該キレートとタンパク質との間に形成される共有結合により達成される。
しかしながら、現存の有機金属化合物は、放射性標識付けおよび治療に最適な効力を提供しない。例えば、特定の放射性同位体の選択以外に、腫瘍検出および放射性免疫治療の成功はまた、抗体の完全性を保存しながら、特定の抗体に容易に結合し、放射性核種挿入を可能にする効果的なキレートの選択に依存する。
【０００４】  造影および腫瘍検出、および／または免疫治療のための放射性金属−キレート化抗体のデザインについては、数種の因子を考慮しなければならない。例えば、効果的な放射性核種は、それらの物理的、化学的および生物学的性質に従い選択されなければならない。最適核種は、日常的に利用可能でなければならず、ＭＡｂに対して容易にカップリングしなければならず、また正常組織に対しては寛大でありながら、標的新生物組織を選択的に検出しおよび／または排除するのに適する物理的半減期を有していなければならない。
【０００５】  放射性核種を腫瘍標的に運ぶ働きをするＭＡｂは、その抗原標的の分布ならびにその標的に対する抗体の特異性および結合親和性に基づいて選択されなければならない。
効果的な放射性金属−キレート化抗体のデザインの考慮におけるもう一つの重要な観点は、放射性核種を抗体にカップリングさせるために用いられるキレート試薬（ＣＡ）の選択に関連する。一例として、効果的な放射性金属−キレート化抗体は、インビボで安定でなければならない。インビボ安定性は、キレート結合および放射性標識付け方法の両方ともが抗体特異性および生体分布を変えないという条件に依存する。
【０００６】  さらにまた、キレート試薬の選択および合成は、当該キレートと選択された放射性核種およびＭＡｂとの間の適合の最適化に対して臨界的である。特に、キレートの選択および合成は、インビボにおける放射性核種の不適当な放出を回避するものでなければならない。この観点は、慣用のキレート試薬が付随する最も普遍的な問題が抗体に対する結合および安全な保持にかかわるそれらの欠落にあることから、最高に重要な問題である。結果として、腫瘍細胞の表面に対するこれらの試薬の放出に先立つ、ＭＡｂ−ＣＡ錯体からの放射性核種のかなりのインビボ解離が存在するからである。正常組織における有毒放射性核種の蓄積は、腫瘍標識の処置および／または検出にかかわる利益を伴うことなく、正常組織に損傷を与える。もう一つの重要な問題点は、選択されたキレート試薬が、選択されたＭＡｂの特異性によって提供される利益をＭＡｂ−ＣＡ錯体に維持させることが望ましいことに関連する。
【０００７】  従って、選択されたＭＡｂに対する適切なキレートの選択には、数種の臨界条件を考慮しなければならない。一例として、(a)ＣＡの付加は、ＭＡｂの抗原標的に対する特異性および結合親和性を変更してはならない；(b) そのＭＡｂへの付加は、その他の点では抗体に損傷を与えてはならず、従って組織分布のパターンおよび異化率を変更してはならない；(c) 放射性金属に堅く保持され、これによりインビボにおいて放射性同位体がＭＡｂ−ＣＡ錯体から早まって溶離されないようにしなければならない；(d) ＭＡｂに対する結合は、キレートの放射性核種保有能力を変更してはならない；(e) ＭＡｂに対する結合形態は、腫瘍標的の特異的検出および治療、ならびに腫瘍の検出および処置に関連するデータの分析にかかわる計画のデザインを促進するために、できるだけ特異的でなければならない；および(f) キレートは、ＭＡｂ−ＣＡ−放射性核種錯体の異化後に、当該放射性核種を明確に助けることができなければならない。
【０００８】  適当な金属キレート試薬の一群は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびそれらの誘導体により提供される。ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡの化学的に修飾された誘導体は、放射性金属を効果的にキレート化することができる金属リガンドとして研究されており、これらは免疫グロブリンに容易にカップリングさせることができる。しかしながら、これらの試薬は、結合した放射性核種に対して減少した親和性を有するため、従って正常組織に放射性化学化合物が蓄積することになり、最低の効果しか有していない。
【０００９】  ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡ金属錯体をタンパク質にカップリングさせるためには、多くの常習的方法を利用することができる。しかしながら、これらの方法は、効果的な造影および腫瘍検出に要する高い効率を達成させるものではなかった。一例として、常習的方法は多くの欠点を有する。例えば、放射性標識付けに先立って、広範囲にわたる精製を必要とし、また、タンパク質と共有結合を形成する際に金属結合部位を使用するために金属をキレート化するときに欠陥が生じてしまう。従って、新規なタンパク質結合モードが研究されており、また全部の金属結合部位を保護する新しいモードが提案されている。
【００１０】  一例として、抗体と迅速に、かつ効果的に反応し、また造影および治療に有用な放射性核種の半減期に比較して長期間である経過時間にわたり金属を保持する化学的に修飾されたリガンドの詳細な説明は、Brechbiel 等により「ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡの（１−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）誘導体の合成  抗体標識付けおよび腫瘍−造影の研究」(Synthesis of (1-(p-isothiocyanatobenzyl) derivatives of DTPA AND EDTA.Antibody Labeling and Tumor-Imaging Studies.)、Inorg Chem.,1986,25,2772〜2781に提供されており、これらの内容を、それらの全体としてここに引用して組み入れる。
【００１１】  Brechbiel 等は、タンパク質に効果的にカップリングすることができるイソチオシアネート基を有するＥＤＴＡおよびＤＴＰＡの化学的に修飾されたキレートを提案している。このキレートの合成は、「二工程法」として要約することができ、この方法は、エチレンジアミンまたはジエチレントリアミンの生成、引き続くこれらのアミン化合物のアルキル化による対応するポリ酢酸の生成を包含する第一工程、およびベンジル置換基の官能性基への変換によるタンパク質カップリングに有用な反応性分子の生成を包含する第二工程を包含する。
しかしながら、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ同族化合物の合成のための上記「二工程法」は、２％よりも低い総合収率により制限される。この方法は、中間体の長時間にわたる精製を要し、また、この精製はカチオン−アニオン交換クロマトグラフィを包含する。さらに、この合成はＭＸ−ＤＴＰＡの両方のレジオ異性体を生成し、また貧弱な再現性を示す。
【００１２】  従って、ＤＴＰＡ誘導体を高収率をもって製造するための別の合成方法が求められている。新規合成方法は、中間体の分離におけるイオン交換クロマトグラフィの必要性を排除し、従って容易に規模拡大することができる方法を提供することが望まれている。さらに、このような方法は、キレートの単一レジオ異性体を生成し、これにより効果的な放射性標識剤として有用な望ましいキレートのレジオ特異的合成を可能にすることものであることが望まれる。
【００１３】    （発明の要旨）
本発明は、放射性免疫治療および造影におけるキレート試薬として有用なＤＴＰＡ誘導体の製造方法に関する。本発明の方法は、ＤＴＰＡ誘導体の高収率合成方法を提供する。特に、本発明は、放射性金属のキレート化および免疫グロブリンへのカップリングに適するＤＴＰＡ誘導体のレジオ選択的合成方法を包含する。この方法は、単保護ジアミンと、アミンおよびＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせることができる分子またはＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせるように変換することができる分子を含有する化合物とのカップリングを包含する。
【００１４】  一態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体の製造方法を提供する：
0005357368.tif 000002
この方法は、(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）と単保護ジアミン（Ｂ）とをカップリングさせ、化合物（Ｃ）を生成し；(b) （Ｃ）中に存在するアミン保護基を分離し、ＴＦＡ−塩（Ｄ）を生成し；(c) （Ｄ）を還元し、（Ｅ）を生成し；(d) （Ｅ）をペンタ−アルキル化し、（Ｆ）を生成し；(e) （Ｆ）中に存在するアミン保護基を分離し、トリフルオロ酢酸塩（Ｇ）を生成し；(f) （Ｇ）中に存在するニトロ基を還元し、トリフルオロ酢酸塩（Ｈ）を生成し；次いで(g) （Ｈ）中に存在するアミノ基を変換し、ＤＴＰＡ誘導体を生成させる；ことを包含する。
【００１５】  本発明による方法は、種々のＤＴＰＡ誘導体の合成を可能にする。本発明による方法によって有利に製造することができるＤＴＰＡ誘導体の例には、本発明の範囲を制限しないものとして、ＭＸ−ＤＴＰＡ、１Ｂ３Ｍ−ＤＴＰＡおよびＣＨｘ−ＤＴＰＡが包含される。
一態様に従い、本発明はＤＴＰＡ誘導体の製造方法を提供し、この方法では、ＤＴＰＡ誘導体の種類が単保護ジアミン（Ｂ）の選択によって決定される。化合物（Ｂ）中に存在するＲ１およびＲ２は、ＤＴＰＡの所望の化学的に修飾された誘導体が得られるように選択する。
【００１６】  もう一つの態様において、本発明は、ＭＸ−ＤＴＰＡの製造方法を提供し、この方法は、(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）とモノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護ジアミン（Ｂ′）とをカップリングさせ、Ｎ−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノプロピル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミド（Ｃ′）を生成し；(b) （Ｃ′）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ−（２−アミノプロピル）−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミドＴＦＡ塩（Ｄ′）を生成し；(C) （Ｄ′）を還元し、２−メチル−６−（ｐ−ニトロベンジル）ジエチレントリアミン三塩酸塩（Ｅ′）を生成し；(d) （Ｅ′）をペンタ−アルキル化し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン（Ｆ′）を生成し；(e) （Ｆ′）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｇ′）を生成し；(f) （Ｇ′）中に存在するニトロ基を還元し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｈ′）を生成し；次いで(g) （Ｈ′）中に存在するアミノ基を変換し、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）を生成させる；ことを包含する。
【００１７】  一態様において、本発明は、工程(a) がカップリング剤としてベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）の使用を包含するＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
もう一つの態様において、本発明は、工程(a) がカップリング剤としてビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（ＢＯＰ−Ｃｌ）の使用を包含するＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
【００１８】  さらにもう一つの態様において、本発明は、(i) ラクトニトリルを水酸化アンモニウムで処理し、α−アミノニトリル（２）を生成し；(ii)（２）を塩酸で処理し、アミン塩酸塩（３）を生成し；(iii) このアミンをジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートで保護し、ｂｏｃ保護誘導体（４）を生成し；(iv)このニトリルをラネーニッケルを使用し、２気圧の水素の存在下にエタノールの飽和溶液により還元し、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を生成させることによってモノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を得ることを包含する、ＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
【００１９】  さらにもう一つの態様において、本発明は、(i) シッフ塩基（５）を相転移条件下にアルキル化し、モノ−アルキル化生成物（６）を生成し；(ii)（６）を１Ｎ塩酸で脱保護し、次いでこのアミンをジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートにより保護し、ｂｏｃ保護アミン（４）を生成し；次いで(iii) （４）をラネーニッケルにより還元し、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を生成させることによってモノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）を得ることを包含する、ＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｃ′）に存在するｂｏｃ基を分離し、（Ｄ′）を生成させる工程を、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いて行うＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
【００２０】  さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｄ′）の還元工程が、（Ｄ′）のボラン−テトラヒドロフラン錯体による処理、引き続く塩化水素による処理を包含し、これによりトリアミン塩酸塩（Ｅ′）を生成させることを包含するＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、中間体（Ｅ′）のペンタアルキル化を、アセトニトリルおよび炭酸カリウムを用いて行うＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、中間体（Ｅ′）のペンタアルキル化を、ジメチルホルムアミド中のブロモ−ｔｅｒｔ−ブチルアセテートおよび炭酸ナトリウムを用いて行うＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
【００２１】  さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｆ′）を、シリカゲル上のクロマトグラフイを用いて精製するＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｆ′）中に存在するカルボン酸を脱保護し、ペンタ酢酸誘導体（Ｇ′）を生成させる工程を、トリフルオロ酢酸を用いて行うＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｇ′）中に存在するニトロ基を還元し、（Ｈ′）を生成させる工程を、水中で２気圧の水素の存在下にカーボン上のパラジウムを用いて行うＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。
【００２２】  さらにもう一つの態様において、本発明は、（Ｈ′）をＭＸ−ＤＴＰＡに変換する工程が、アミン（Ｈ′）をチオホスゲンにより末尾イソチオシアネート官能基に変換することを包含するＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法を提供する。この変換は、数種の方法で行うことができる。一例として、(i) クロロホルムおよび水中のペンタ酢酸誘導体（Ｈ）を含有する２相混合物にチオホスゲンを添加し；(ii)この混合物を、２時間にわたり急速撹拌し；(iii) 溶媒を減圧下に除去し、残留物を生成し；(iv)この残留物を、逆相シリカ上で精製し；次いで(v) １％酢酸を含有する水中の２５％アセトニトリルを用いて溶離することを包含する。この変換はまた、ジクロロメタンおよびトリエチルアミン、またはアセトニトリルおよび重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを使用して行うことができる。
【００２３】  さらにもう一つの態様において、本発明は、改良されたＭＸ−ＤＴＰＡ組成物を提供し、この改良は、キレートの単一レジオ異性体のみを実質的に含有することを包含する。「のみを実質的に含有する」という表現は、本発明における単一レジオ異性体は、全部の他のレジオ異性体に対する単一レジオ異性体のパーセンテージが少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％であることを意味する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、このような改良されたＭＸ−ＤＴＰＡ組成物を、タンパク質または抗体キレート化放射性標識した形態の製造に用いることに関する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、このような改良されたＭＸ−ＤＴＰＡ組成物を、放射性標識したキレートの製造に用いることに関する。
【００２４】  さらにもう一つの態様において、本発明は、ＣＨｘ−ＤＴＰＡの製造方法を提供し、この方法は、(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）とモノ−保護ジアミン（Ｂ″）とをカップリングさせ、化合物（Ｃ″）を生成し；(b) （Ｃ″）中に存在するアミン保護基を分離し、ＴＦＡ塩（Ｄ″）を生成し；(c) （Ｄ″）を還元し、（Ｅ″）を生成し；(d) （Ｅ″）をペンタ−アルキル化し、（Ｆ″）を生成し；(e) （Ｆ″）中に存在するアミン保護基を分離し、トリフルオロ酢酸塩（Ｇ″）を生成し；(f) （Ｇ″）中に存在するニトロ基を還元し、トリフルオロ酢酸塩（Ｈ″）を生成し；次いで(g) （Ｈ″）中に存在するアミノ基を変換し、ＣＨｘ−ＤＴＰＡを生成させる；ことを包含する。単保護ジアミン（Ｂ″）はシス(sys) またはトランス(trans) 異性体として使用することができる。
【００２５】    （図面の簡単な説明）
図１は、式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体の７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
図２は、ＭＸ−ＤＴＰＡの７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
図３は、（Ｂ′）の合成にかかわる４工程反応スキームである。
図４は、（Ｂ′）の合成にかかわる別の反応スキームである。
図５は、図２の反応スキームにおける別の工程１にかかわる反応スキームである。
【００２６】  図６は、メタノール中（ａ）およびトルエン中（ｂ）で４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを用いる（Ｂ′）の不充分な縮合を示す反応スキームである。
図７は、（Ｅ′）をアルキル化して（Ｆ′）を生成させる反応にかかわる２つの別の反応スキーム（ａ）および（ｂ）を示す。
図８は、（Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡヘの変換にかかわる別の反応スキームである。
図９は、ＣＨｘ−ＤＴＰＡの７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
図１０は、本発明の方法により選択的に製造されたＣＨｘ−ＤＴＰＡのレジオ異性体を示す。
図１１は、（Ｂ″）の合成にかかわる２工程反応スキームである。
【００２７】    （好適態様の詳細な説明）
別段の定義がないかぎり、本明細書で用いられている全部の技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者により通常的に理解される意味を有するものとする。本明細書に記載されている方法および材料と類似の、または同等の方法および材料の全部を本発明の実施および試験に使用することができるが、好適方法および材料を説明する。
本発明は、中間体のイオン交換クロマトグラフイ分離の必要性を排除した、化学的に修飾されたＤＴＰＡの高収率レジオ特異的合成方法を提供する。さらにまた、この方法は、キレートの単一レジオ異性体を生成させることから、放射性標識試薬として有用な望ましいキレートのレジオ特異的合成を提供する。
【００２８】  さらに詳細に説明すると、図１は式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体の７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。この態様において、本発明は、(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）と単保護ジアミン（Ｂ）とをカップリングさせ、化合物（Ｃ）を生成し；(b) （Ｃ）中に存在するアミン保護基を分離し、ＴＦＡ塩（Ｄ）を生成し；(c) （Ｄ）を還元し、（Ｅ）を生成し；(d) （Ｅ）をペンタ−アルキル化し、（Ｆ）を生成し；(e) （Ｆ）中に存在するアミン保護基を分離し、トリフルオロ酢酸塩（Ｇ）を生成し；(f) （Ｇ）中に存在するニトロ基を還元し、トリフルオロ酢酸塩（Ｈ）を生成し；次いで(g) （Ｈ）中に存在するアミノ基を変換し、式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体を生成させる工程を包含する、式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体の製造方法を提供する。
【００２９】  本発明の方法は、種々のＤＴＰＡ誘導体の合成を可能にする。本発明の範囲を制限しないものとして、本発明の方法により有利に製造することができるＤＴＰＡ誘導体の例には、ＭＸ−ＤＴＰＡ、１Ｂ３Ｍ−ＤＴＰＡおよびＣＨｘ−ＤＴＰＡが包含される。
一態様に従い、本発明は、ＤＴＰＡ誘導体の種類が単保護ジアミン（Ｂ）の選択によって決定されるＤＴＰＡ誘導体の製造方法を提供する。化合物（Ｂ）中に存在するＲ１およびＲ２は、所望の化学的に修飾されたＤＴＰＡ誘導体が得られるように選択する。
【００３０】  図２は、本発明の一態様に従うＭＸ−ＤＴＰＡの７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームを包含する。この態様において、ＭＸ−ＤＴＰＡの７工程レジオ選択的合成は、次の工程で行う：(a) Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）とモノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護ジアミン（Ｂ′）とをカップリングさせ、Ｎ−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノプロピル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミド（Ｃ′）を生成し；(b) （Ｃ′）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ−（２−アミノプロピル）−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミドＴＦＡ塩（Ｄ′）を生成し；(c) （Ｄ′）を還元し、２−メチル−６−（ｐ−ニトロベンジル）ジエチレントリアミン三塩酸塩（Ｅ′）を生成し；(d) （Ｅ′）をペンタ−アルキル化し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン（Ｆ′）を生成し；(e) （Ｆ′）中に存在するｂｏｃ基を分離し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｇ′）を生成させ；(f) （Ｇ′）中に存在するニトロ基を還元し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｈ′）を生成し；次いで(g) （Ｈ′）中に存在するアミノ基を変換し、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）を生成させる。
【００３１】  このＭＸ−ＤＴＰＡのレジオ特異的合成方法は、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン
（Ｂ′）およびｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）から出発して、約２０％の総合収率を有し、また規模拡大することができる。従って、本発明によるＭＸ−ＤＴＰＡの合成は、従来法を用いて得られる総合収率（２％以下）に比較して、約１桁高い総合合成収率を可能にする。さらに、従来の合成方法は、冗長なアニオン−カチオンイオン交換クロマトグラフイを必要とする。これに対して、本発明の方法は、この費用を要する精製処理を排除し、目標化合物を高純度で提供する。例えば、本発明の方法において、順相カラムクロマトグラフイおよび逆相カラムクロマトグラフイの一方のみが最終生成物の精製に必要である。
【００３２】  図３は、モノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）の合成にかかわる４工程反応スキームである。この（Ｂ′）の合成は、市販のラクトニトリルを水酸化アンモニウムで処理し、α−アミノニトリル（２）を生成させ、この（２）を塩酸で処理し、アミン塩酸塩（３）を生成させることによって達成される。アミンをジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートにより保護すると、ｂｏｃ保護誘導体（４）が生成される。このニトリルを、ラネーニッケルを使用して２気圧の水素の存在下にエタノールの飽和溶液により還元すると、必要なモノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）が生成される。この反応順序は、再現性があり、また容易に規模拡大することができることから、経済的観点で特に魅力的である。
【００３３】  （Ｂ′）を製造するための数種の別の条件がまた、研究された。一例として、図４は、（Ｂ′）の合成にかかわる別の反応スキームが示されている。この方法では、シッフ塩基（５）を相転移条件下にアルキル化し、モノ−アルキル化生成物（６）を中程度の収率で生成させることによって、（Ｂ′）を製造する。（６）を１Ｎ塩酸で脱保護し、次いでジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートにより保護すると、ｂｏｃ保護アミン（４）が生成され、（４）をラネーニッケルにより還元すると、必要なモノ−ｂｏｃ保護ジアミン（Ｂ′）が生成される。
【００３４】  図１に示されている態様において、この合成では、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（Ａ）を使用し、この化合物をモノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護ジアミン（Ｂ′）とカップリングさせる。この工程の実施に好適なカップリング剤は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）である。これらの条件は、７２〜８３％の範囲の分離収率による化合物（Ｃ′）の合成を可能にする。（Ｃ′）の精製は、酸／塩基洗浄、引き続くヘキサンによる処理によって達成することができる。
図５は、図２の反応スキームにおける別の工程１を示す反応スキームである。図５に示されているように、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（ＢＯＰ−Ｃｌ）はまた、所望の生成物（Ｃ′）の生成をもたらす；しかしながら、この反応の収率は、図２による工程１によって達成することができる８３％の収率に比較して２３％である。
【００３５】  （Ｃ′）を合成するためのその他の反応経路は不充分である。例えば、図６に図解式に示されているように、(a) メタノール中で撹拌するか、または(b) トルエン中で加熱還流させることによる、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（１）を用いる（Ｂ′）の直接縮合を経る（Ｃ′）の関連誘導体の生成にかかわる研究は成功しなかった。
化合物（Ｃ′）の発展可能な合成を達成するには、ｂｏｃ保護基を次いで、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いて分離し、ジアミン（Ｄ′）を生成させることができる。この方法では、（Ｄ′）は定量的収率（１００％）で固形物として生成される。
【００３６】  図２に示されているように、ジアミン（Ｄ′）のボラン−テトラヒドロフラン錯体を用いる還元、引き続く塩化水素による処理は、トリアミン塩酸塩（Ｅ′）を生成させる。図２に示されているアルキル化工程に加えて、別の反応経路を使用することもできる。一例として、図７は、（Ｅ′）をアルキル化し、（Ｆ′）を生成させる２反応スキーム(a) および(b) を示している。中間体（Ｅ′）のペンタ−アルキル化は、ジメチルホルムアミド中のブロモ−ｔｅｒｔ−ブチルアセテートおよび塩基としての炭酸ナトリウムを使用し、または別法として、溶媒としてのアセトニトリルおよび炭酸カリウムを使用し、達成することができる。後者の条件は、規模拡大して行うことができ、また分離が一般に困難であるジメチルホルムアミドの使用を排除する。この工程の分離収率は、反応を７６〜９６時間にわたり進行させた場合、６０％の範囲にある。（Ｆ′）の精製は、シリカゲル上のカラムクロマトグラフイにより行うと好ましい。
【００３７】  図２に図解式に示されているように、ペンタ−酢酸誘導体（Ｇ′）はカルボン酸を、好ましくはトリフルオロ酢酸を用いて脱保護することにより得ることができる。ニトロ基の還元は、水中で２気圧の水素下にカーボン上のパラジウムを用いて行う。本発明が従来公知の合成方法の欠点を回避した方法であることに留意されるべきである。例えば、本発明は、分離が困難であり、チオ尿素副生成物の生成のためイソチオシアネートの生成工程を要することによって当該合成方法を複雑にする、水酸化アンモニウムの使用を回避する。
図２の反応スキームの最終工程は、アミンをチオホスゲンにより末尾イソチオシアネート官能基に変換する工程である。この点に関して、本発明者等は種々の操作条件について検討した。
【００３８】  （Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換にかかわる好適条件は、図２のスキームの最終工程に示されている。これらの条件は、クロロホルムおよび水中にペンタ−酢酸誘導体（Ｈ′）を含有する２相混合物へのチオホスゲンの添加およびこの混合物の２時間にわたる急速撹拌を包含する。溶媒を減圧下に除去し、次いで残留物を逆相シリカ上で精製し、１％酢酸を含有する水中の２５％アセトニトリルを用いる溶離により、目的化合物ＭＸ−ＤＴＰＡが良好な収率で得られた。
別の操作条件も検討された。一例として、図８は、溶媒としてジクロロメタンおよび塩基としてトリエチルアミンを用いる（Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換に関する反応スキームを示している。しかしながら、この反応は、ＭＸ−ＤＴＰＡに加えて、容易に分離できない副生成物としてトリエチルアミン塩酸塩を生成する。
（Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換はまた、溶媒としてアセトニトリルおよび塩基として重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムを用いて行うことができる。この反応はまた、別種の夾雑物をもたらす。
【００３９】  本発明により合成されるＭＸ−ＤＴＰＡは、キレーターを要する多くの用途に効果的に使用することができる。一例として、本発明の方法により得られるＭＸ−ＤＴＰＡは、効果的に放射性標識したキレーター、抗体キレーターおよびタンパク質キレーターを提供する。放射性標識されたＭＸ−ＤＴＰＡは、シンチグラフイ、放射線治療および放射免疫分析などの多くの用途に対する有効な道具を提供する。
この点に関して、本発明によるＭＸ−ＤＴＰＡの合成方法は、多くの利益を提供する。例えば、この方法は、中間体の冗長な精製に要するカチオン−アニオン交換クロマトグラフィを必要としない。カチオン−アニオン交換クロマトグラフイの必要性が回避されることから、容易に規模拡大することができる方法が提供される。
【００４０】  もう一つの利点は、本発明の方法により得られる高収率にある。上記したように、放射免疫分析における使用に効果的なキレートは、潜在的に高い需要を満すのに充分な量で容易に入手できなければならない。本発明の方法は、ＭＸ−ＤＴＰＡを２０％ほどの高収率で提供することができ、この収率は現存するＭＸ−ＤＴＰＡ合成方法に比較して、１桁の大きさで高い。
本発明の方法によって合成されるＭＸ−ＤＴＰＡキレートは、高純度を有する。このキレートを純粋な形態で提供することによって、多くの利点が得られ、例えばキレート化ＭＡｂの製造およびコンディショニングを容易にする。また、望ましくない副生成物の存在を最小にすることができる。合成されたキレート中の夾雑物が最小であるということは、生物学的用途におけるキレートの容易なコンディショニングを可能にする。
【００４１】  さらにもう一つの利点は、本発明の方法によって得られるレジオ特異性にある。本発明は、ＭＸ−ＤＴＰＡのレジオ特異的合成のための新規経路を提供する。
いずれかの理論に拘束されることを望むものではないが、本発明によるＭＸ−ＤＴＰＡのレジオ特異的合成は、化合物（Ａ）を単一異性体の形態で用いることによって得ることができる。化合物（Ａ）の特定の異性体が当該合成方法の出発に用いられたならば、化合物（Ａ）に存在するキラル炭素の周囲の立体配置は、当該合成方法の全体を通して維持される。
ＭＸ−ＤＴＰＡを単一のレジオ異性体の形態で使用すると、数種の利益が得られる。例えば、ＭＸ−ＤＴＰＡを単一異性体として使用すると、良好なシンチグラフイ結果が得られ、またラセミ混合物の使用に付随する光学信号の損失を回避できる。また、単一異性体の使用は、高度の特異性を有するＭＡｂ−ＣＡ錯体のデザインを可能にする。この点に関して、単一異性体の使用は、全部のキレート分子を実質的に同一様相でＭＡｂに結合させることを可能にする。
【００４２】  ＭＸ−ＤＴＰＡの単一レジオ異性体を特異的に合成するもう一つの利点は、ＭＡｂに対する、さらに最終的に標的腫瘍に対して用意されるキレート化放射性核種の位置の制御に関連する。この放射性核種の位置の制御が、単一レジオ異性体の形態のＭＸ−ＤＴＰＡを用いることによって可能になる。単一異性体の使用による単一の結合形式により提供される利点には、ＭＡｂ−ＣＡ錯体を用いて得られる造影および免疫治療の結果に対する強力な改善が包含される。
本発明により合成されるＭＸ−ＤＴＰＡキレートは、種々の放射性核種にキレートするのに適している。このキレートはまた、種々のＭＡｂおよびタンパク質の錯体化にも適している。従って、本発明のレジオ特異的合成により生成されるＭＸ−ＤＴＰＡは、ＭＸ−ＤＴＰＡと組合せるのに適する放射性核種またはＭＡｂのいずれかと組合せた場合、均等に有効な放射性標識試薬および治療剤を提供する。
【００４３】  一態様において、ＭＸ−ＤＴＰＡは２Ｂ８抗体に結合させ、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを形成させる。２Ｂ８はリンパ腫患者に対する投薬に際するＢ細胞枯渇に影響することが示されている抗ＣＤ２０抗体である。２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの形成にかかわる詳細な方法は、米国特許第5,736,137 号に詳細に記載されており、この刊行物全体を引用してその内容をここに組入れる。
しかしながら、本発明により合成されるＭＸ−ＤＴＰＡキレーターが他の抗ＣＤ２０抗体、またはＤＴＰＡまたはその他の多価キレーターに結合されているいずれかその他の抗体の放射性標識付けに使用することができることは当業者にとって明白であるべきである。また、本発明に従い製造されるＭＸ−ＤＴＰＡキレートは、別種のタンパク質およびペプチド、例えばレセプター、ホルモン、成長因子（例えば、ソマトスタチンペプチド）に結合させることができる。
【００４４】  上記詳細な説明は、ＭＸ−ＤＴＰＡの合成に焦点を合わせたものであるが、本発明の方法はそに他の化学的に修飾されたＤＴＰＡ誘導体の合成にも等しく適用することができる。この点に関して、本発明の方法は、放射性金属のキレート化および免疫グロブリンへのカップリングに適する種々のＤＴＰＡ誘導体のレジオ選択的合成に有利に使用することができる。この方法は、単保護ジアミンと、アミンおよびＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせることができる分子またはＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせるように変換することができる分子とのカップリングを包含する。当業者が容易に認識できるように、本発明の方法は、種々の単保護ジアミン化合物を、アミンおよびＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせることができる分子またはＤＴＰＡ誘導体を免疫グロブリンに効果的にカップリングさせるように変換することができる分子を含有する種々の化合物とカップリングさせることができるという利点を特に有する。このようなＤＴＰＡ誘導体の合成は、本発明の範囲内にある。
【００４５】  一例として、本発明の一態様において、図２の反応スキームと同様の反応スキームに従い、１Ｂ３Ｍ−ＤＴＰＡを製造することができる。１Ｂ３Ｍ−ＤＴＰＡは、Ｒ1（すなわち、Ｈ）とＲ2（すなわち、ＣＨ3）との位置が交換されている（Ｂ′）の異性体を使用することによって製造される。
ＣＨｘ−ＤＴＰＡは、本発明の方法に従い製造することができるＤＴＰＡ誘導体のもう一つの例である。図９は、このＣＨｘ−ＤＴＰＡの合成方法をまとめて示す反応スキームである。図９のスキームの工程(a) において、モノ−Ｂｏｃ保護ジアミノシクロヘキサン（Ｂ″）を、化合物（Ａ）と縮合させ、化合物（Ｃ″）を生成させる。化合物（Ｃ″）を生成させた後、ＣＨｘ−ＤＴＰＡの合成は図２の工程と同様の工程で進行させる。
【００４６】  このジアミン（Ｂ″）は、シスまたはトランス形態で使用することができ、対応するＣＨｘ−ＤＴＰＡ異性体を生成させることができる。図１０には、選択された異性体形態の化合物（Ａ）と（Ｂ″）とを組合せることによって製造することができるレジオ異性体形態のＣＨｘ−ＤＴＰＡが示されている。
単保護ジアミン（Ｂ″）は、種々の方法で製造することができる。（Ｂ″）製造にかかわる好適方法は、図１１の２工程反応スキームに示されている。
【００４７】実施例
市販の試薬およびＨＰＬＣグレードまたは無水溶媒は、さらに精製することなく使用した。順相カラムクロマトグラフィおよびＴＬＣは、ＩＣＮシリカゲル
（63-200、60A ）およびメルク(Merck) シリカゲル（60A ）をそれぞれ、蛍光指示薬とともに使用して行った。逆相カラムクロマトグラフイおよびＴＬＣは、EM Science LiChroprep RP-18(40〜63μm）およびTechware RPS-F逆相炭化水素浸漬シリカゲルをそれぞれ、蛍光指示薬とともに使用して行った。
【００４８】  １−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−メチル−エチレンジアミン（Ｂ′）の合成
a.２−アミノプロパンニトリル塩酸塩（３）：
ラクトニトリル２３．１ｇ（３２４．９９ｍｍｏｌ）（テクニカルグレード、純度９０％）、塩化アンモニウム７．１ｇ（１３２．７４ｍｍｏｌ）および水酸化アンモニウム８６ｍｌ（２２０８．３ｍｍｏｌ）を含有する混合物を、室温で２時間にわたり撹拌した。この反応混合物をジクロロメタン（２×５００ｍｌ）で抽出し、この有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この混合物を濾過し、次いで溶媒を減圧で除去し、黄色油状物（２）２４ｇを生成した。この黄色油状物を無水ジエチルエーテル２５０ｍｌで稀釈し、次いで氷浴中で冷却させた。次いで、エーテル中１Ｎ塩酸３５０ｍｌ（３５０ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間にわたり撹拌した後、生成した固形物を濾別し、エーテルで洗浄し、次いで減圧で乾燥させ、生成物２８．７９ｇを、出発ラクトニトリルの純度に基づき９２．８３％の収率で生成した。
【００４９】  b.Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アミノプロパンニトリル（４）：
無水ジクロロメタン３００ｍｌ中に２−アミノプロパンニトリル塩酸塩２８．５ｇ（２６８．７９ｍｍｏｌ）を含有する混合物に、トリエチルアミン１０４ｍｌ（７４６．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を氷浴中で冷却させ、次いで無水ジクロロメタン１００ｍｌ中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート６４．５ｇ（２９５．５３ｍｍｏｌ）を３０分かけて添加した。この反応混合物を４８時間かけて撹拌しながら室温まで温めた。この反応混合物をガラス焼結ロートに通して濾過し、この濾液を減圧で濃縮した。ジエチルエーテル１Ｌを添加し、この混合物を１５分間にわたり撹拌した。この混合物を再度、ガラス焼結ロートに通して濾過し、残留するトリエチルアミン塩酸塩を除去した。この濾液を減圧で濃縮した。この残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフイに付し、３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離し、生成物１８．５０ｇを４０．４４％の収率で生成した。
【００５０】  c.１−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−メチル−エチレンジアミン
（Ｂ′）：
５００ｍｌパール(Parr)フラスコに、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アミノプロパンニトリル１８．４ｇ（１０８．１０ｍｍｏｌ）およびアンモニアで飽和された無水エタノール２００ｍｌを入れた。次いで、ラネーニッケル
（水中の５０％スラリイ１０ｇ）を添加し、このフラスコを次いで、５０ｐｓｉ水素気体まで加圧し、排気した。このフラスコを再度、５０ｐｓｉ水素気体まで加圧し、次いで排気した。このフラスコを次いで、５０ｐｓｉ水素気体まで加圧し、水素吸収がもはや生じなくなるまで振り混ぜた。これは一夜で達成された。このフラスコを排気させ、混合物をセライト521 のパッドに通して濾過した。この濾液を減圧で濃縮し、生成物１９．２ｇを定量的収率（１００％）で無色油状物として生成した。
【００５１】  別法として、２−アミノプロパンニトリル塩酸塩（３）は、下記のとおりにしてＮ−（ジフェニルメチレン）アミノアセトニトリルから製造することもできる：
a.Ｎ−（ジフェニルメチレン）−２−メチル−アミノアセトニトリル（６）：
トルエン２５０ｍｌ中にＮ−（ジフェニルメチレン）アミノアセトニトリル５０ｇ（２２６．９８ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、ベンジルトリエチルアンモニウムクロライド（ＢＴＥＡＣ）４．５ｇ（１９．７６ｍｍｏｌ）を、次いで水５０ｍｌ中の水酸化ナトリウム２８．３ｇ（７０７．５０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を氷浴中で冷却させ、次いで硫酸メチル２２ｍｌ（２３２．５１ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下添加した。この反応混合物を２４時間かけて室温まで温めた。この反応混合物をジクロロメタン１リットルで稀釈し、次いで水（２×１Ｌ）で洗浄した。この有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過し、溶媒を分離し、次いで残留物をシリカゲル上でカラムクロマトグラフイに付し、２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離し、生成物４６．２ｇを６２．０５％の収率で生成した。
【００５２】  b.２−アミノプロパンニトリル塩酸塩（３）：
ヘキサン３００ｍｌおよび１Ｎ水性塩酸２５ｍｌ（２５ｍｍｏｌ）中にＮ−
（ジフェニルメチレン）−２−メチル−アミノアセトニトリル３．０ｇ（１２．８０ｍｍｏｌ）を含有する混合物を、室温で７２時間にわたり撹拌した。この水性相を分離し、ヘキサンで洗浄した。この水性相を減圧で濃縮し、生成物１．２５ｇを９２．１０％の収率で生成した。
【００５３】  Ｎ−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノプロピル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミド（Ｃ′）：
無水ジクロロメタン３００ｍｌ中にＮ−ｔ−ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン２５ｇ（８０．５７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、トリエチルアミン１２．５ｍ１（８９．６８ｍｍｏｌ）を添加し、次いでベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサラルオロホスフェート（ＢＯＰ）３７ｇ（８３．６６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間にわたり撹拌した後、無水ジクロロメタン４０ｍｌ中の１−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−メチル−エチレンジアミン１５．１ｇ（８６．６６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、室温で２０時間にわたり撹拌した。この反応混合物をジクロロメタン３００ｍｌで稀釈し、次いで１Ｎ水性塩酸（２×５００ｍｌ）、飽和水性重炭酸ナトリウム（２×５００ｍｌ）および水（１×５００ｍｌ）で洗浄した。この有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過し、次いで溶媒を減圧で除去し、黄色固形物を得た。次いで、ヘキサン（６００ｍｌ）を添加し、この混合物を２０時間にわたり撹拌した。固形物を濾別し、次いで乾燥させ、生成物２７．０ｇ（７１．８３％）を白色固形物として生成した。
【００５４】  Ｎ−（２−アミノプロピル）−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミドＴＦＡ塩
（Ｄ′）：
ジクロロメタン３００ｍｌ中にＮ−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノプロピル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミド２６．５０ｇ（５６．８０ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、トリフルオロ酢酸６５ｍｌ（８４３．７７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１時間にわたり撹拌した。溶媒を減圧で除去し、次いで無水ジエルエーテル５００ｍｌを添加した。生成した固形物をガラス焼結ロートに通して濾過し、次いでジエチルエーテル４００ｍｌで洗浄した。この固形物を減圧で乾燥させ、若干の残留トリフルオロ酢酸およびジエチルエーテルを含有する生成物３２．０ｇ（１００％）を得た。この物質は、さらに精製することなく使用する。
【００５５】  ２−メチル−６−（ｐ−ニトロベンジル）ジエチレントリアミン三塩酸塩（Ｅ′）：
無水テトラヒドロフラン５００ｍｌ中にＮ−（２−アミノプロピル）−ｐ−ニトロフェニルアラニンアミドＴＦＡ塩３５ｇ（７０．８０ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、１Ｍボラン−テトラヒドロフラン錯体５００ｍｌを３０分かけて添加した。この反応混合物を１６時間にわたり加熱還流させた。この反応混合物を氷浴中で冷却後、メタノール１２２ｍｌをゆっくりと添加し、過剰のボラン試薬を鎮静化した。気体の発生が完了した後、溶媒を減圧で除去した。この残留物を無水エタノール２６５ｍｌ中に取り入れ、この溶液を氷浴中で冷却しながら、塩酸
（ｇ）で飽和した。この混合物を無水ジエチルエーテル２００ｍｌで稀釈し、生成した固形物を濾別し、次いで減圧で乾燥させ、生成物１９．３９ｇを７５．７２％の収率で生成した。
【００５６】  Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン（Ｆ′）：
無水アセトニトリル５５０ｍｌ中に２−メチル−６−（４−ｐ−ニトロベンジル）ジエチレントリアミン三塩酸塩１９．０ｇ（５２．５３ｍｍｏｌ）を含有する混合物に、炭酸カリウム８６．６０ｇ（６２６．５８ｍｍｏｌ）を、次いでｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート４２ｍｌ（２８４．４４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で９０時間にわたり撹拌した後、反応混合物を水５００ｍｌで稀釈し、次いで酢酸エチル（２×５００ｍｌ）で抽出した。この有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過し、次いで溶媒を減圧で除去し、黄色油状物を得た。この油状物をシリカゲル上でカラムクロマトクラフイに付し、３０％酢酸エチル／ヘキサンにより溶離し、生成物２６．３７ｇを６０．９９％の収率で生成した。
【００５７】  Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｇ′）：
トリフルオロ酢酸３５ｍｌ中にＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン５．０ｇ（６．０８ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、室温で４８時間にわたり撹拌した。溶媒を減圧で除去し、生成した固形物を減圧で乾燥させ、生成物４．０２ｇを淡黄色固形物として７４．７５％の収率で生成した。
【００５８】  Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩（Ｈ′）：
パールフラスコに、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−ニトロフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩３．４０ｇ（３．８４ｍｍｏｌ）および水５０ｍｌを添加し、次いでカーボン上５％パラジウム０．３ｇを添加した。このフラスコを３０ｐｓｉ水素に加圧し、次いで２回、排気した。この容器を４５ｐｓｉ水素に加圧し、次いで振り混ぜた。水素吸収が止まったならば、代表的には２〜４時間後、フラスコを排気し、この混合物をセライトパッドに通して濾過した。このセライトは水２０ｍｌで洗浄した。この濾液を減圧で濃縮し、生成物３．０２ｇを９２．０３％の収率で生成した。この生成物で得られたスペクトルデータは、対照標準のスペクトルデータと一致する。
【００５９】  ２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）：
磁気撹拌機を備えた１Ｌ丸底フラスコにおいて、水１５０ｍｌおよびクロロホルム３００ｍｌを含有する混合物に、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタキス
（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミントリフルオロ酢酸塩７．０ｇ（７．２３ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いて炭酸ナトリウム４．６７ｇ（４４．０６ｍｍｏｌ）を添加した。生成する溶液は、約９．０のｐＨを有していた。この２相混合物に、チオホスゲン０．６４ｍｌ（８．３９ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を室温で２時間にわたり撹拌した。溶媒を減圧で除去し、残留物を生成した。この残留物を水中１％酢酸１５ｍｌ中に溶解し、逆相シリカゲルカラムに入れ、１％酢酸で、次いで１％酢酸を含有する２５％アセトニトリル／水により溶離した。生成物を含有するフラクションを集め、溶媒を減圧で除去し、生成物２．４７ｇを淡黄色固形物として６１．６０％の収率で生成した。
【００６０】  本発明を好適態様について説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の修正、置き換え、省略および変更をなしうることは、当業者に認識されるものと見倣される。従って、本発明の範囲はその均等態様を包含する上記特許請求の範囲の範囲によってのみ制限されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  式（Ｉ）で表わされるＤＴＰＡ誘導体の７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
【図２】  ＭＸ−ＤＴＰＡの７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
【図３】  （Ｂ′）の合成にかかわる４工程反応スキームである。
【図４】  （Ｂ′）の合成にかかわる別の反応スキームである。
【図５】  図２の反応スキームにおける別の工程１にかかわる反応スキームである。
【図６】  メタノール中（ａ）およびトルエン中（ｂ）で４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを用いる（Ｂ′）の不充分な縮合を示す反応スキームである。
【図７】  （Ｅ′）をアルキル化して（Ｆ′）を生成させる反応にかかわる２種の別の反応スキーム（ａ）および（ｂ）を示す。
【図８】  （Ｈ′）のＭＸ−ＤＴＰＡへの変換にかかわる別の反応スキームである。
【図９】  ＣＨｘ−ＤＴＰＡの７工程レジオ特異的合成方法をまとめて示す反応スキームである。
【図１０】  本発明の方法により選択的に製造されたＣＨｘ−ＤＴＰＡのレジオ異性体を示すスキームである。
【図１１】  （Ｂ″）の合成にかかわる２工程反応スキームを示す。
【図１】
0005357368.tif 000004
【図２】
0005357368.tif 000005
【図３】
0005357368.tif 000006
【図４】
0005357368.tif 000007
【図５】
0005357368.tif 000008
【図６】
0005357368.tif 000009
【図７】
0005357368.tif 000010
【図８】
0005357368.tif 000011
【図９】
0005357368.tif 000012
【図１０】
0005357368.tif 000013
【図１１】
0005357368.tif 000014