(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ハンチンチン遺伝子のエクソン１にポリグルタミンをコードする遺伝子が挿入された変異ハンチンチン遺伝子を大脳皮質初代培養神経細胞に導入することで、大脳皮質初代培養神経細胞にポリグルタミン数が１００個から１４５個であるポリグルタミン鎖を形成する変異ハンチンチンタンパク質を発現させ、該大脳皮質初代培養神経細胞に被験化合物を接触させ、
（２）ポリグルタミン数が１００個から１４５個であるポリグルタミン鎖を形成する変異ハンチンチンタンパク質を発現させていない大脳皮質初代培養神経細胞に被験化合物を接触させ、
（３）下記（ａ）から（ｃ）のいずれかを指標として、上記（１）および（２）における結果を比べることにより、クロマチンの凝縮が生じない点でアポトーシスとは異なる神経細胞死の抑制を検出することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
（ａ）細胞傷害の度合の抑制
（ｂ）生細胞数の増加
（ｃ）細胞の変形、萎縮、および／または変性の抑制
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞の細胞死（以下、神経細胞死という）を抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハンチントン病は、運動障害、認識喪失および精神医学症状発現を特徴とする進行性の神経変性疾患である［ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（New England Journal of Medicine）第315巻、第1267〜1276頁（1986年）］。ハンチントン病の顕著な特徴は、通常、人生の35年から50年にわたる潜行性の症状を有し、死亡するまでの10年から20年にわたり徐々に悪化していく特有の舞踏運動障害である。ときには、硬直およびより迅速な経過をたどる重篤な症状を伴って若年期に発現される場合がある。本症でみられる知能・精神障害は、大脳皮質の広範な萎縮にもとづくものであり、舞踏運動を起こす病理変化は、線状体（尾状核と被殻）、とりわけ、尾状核の萎縮であると考えられている［ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスパーリメンタル・ニューロロジー（Journal of Neuropathology and Experimental Neurology）第44巻、第559〜577頁（1985年）］。現在までのところ、障害の発現および進行を遅らせる予防法または有効な治療法は存在しない。
【０００３】
ハンチントン病は、ハンチンチンタンパク質におけるポリグルタミン鎖の伸長によって惹起される遺伝性の神経変性疾患であり、脊髄小脳変性症などとともにポリグルタミン病の一つである。ポリグルタミン病では、病因遺伝子内のタンパク質への翻訳領域に存在するCAGリピート数が増加し、CAGリピートは、グルタミンをコードしているため、異常伸長したポリグルタミン鎖を有する変異タンパク質が発現する。ハンチントン病では、ハンチンチンタンパク質のポリグルタミン鎖は、正常では37個以下であるが、ハンチントン病患者では37個から150個以上にまで伸長するという報告がある［カレント・オピニオン・イン・ニューロバイオロジー（Current Opinion in Neurobiology）、第5巻、第656−662頁（1995年）］。異常伸長したポリグルタミン鎖を有する変異ハンチンチンタンパク質は、神経細胞内においてタンパク質の塊（以下、封入体と呼ぶ）となり蓄積する［セル（Cell）、第90巻、第537〜548頁（1997年）；セル（Cell）、第90巻、第549〜558頁（1997年）］。神経細胞に対する障害は、このタンパク質封入体によりもたらされると考えられている［ランセット（Lancet）、第351巻、第131〜133頁（1998年）；ニューロン（Neuron）、第19巻、第1147〜1150頁（1997年）］。タンパク質封入体は、他のポリグルタミン病である歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、脊髄小脳失調症１型（SCA1）、Machado-Joseph病：脊髄小脳失調症３型（SCA3）、脊髄小脳失調症７型（SCA7）においてもみられ、さらに、ポリグルタミン病以外の神経細胞の変性・脱落を伴なう神経変性疾患においても確認されている。たとえば、α−シヌクレインの変異によりレビィー小体（Lewy body）と呼ばれる封入体を形成するパーキンソン病および明らかな封入体は形成しないがタウの変異によって神経原繊維変化をきたすアルツハイマー病などが例として挙げられる。こうしたことから、タンパク質封入体と神経細胞死との関係が注目され精力的な研究が行われているが、現在までに封入体の生理的意義や神経細胞死の機構は、未だ明らかにされていない。
【０００４】
ところで、神経変性疾患における神経細胞死を実験で再現する試みは、数多く存在する。ハンチントン病における神経細胞死は、神経細胞内にポリグルタミン鎖を有する変異ハンチンチンを発現させることなどにより試みられており、こうした報告の多くは、変異ハンチンチンタンパク質により生じる神経細胞死がアポトーシスであるとの報告がみられる。しかし、これらの実験の多くは非神経系細胞株を用いたものであり、神経細胞において同様なアポトーシスが起きるかどうかは確実ではない。例外的に神経細胞におけるアポトーシスを示唆した実験結果として、セル（Cell）、第95巻、第55〜66頁（1998年）には、ラット線条体の初代培養神経細胞にマウスの変異ハンチンチンを発現させ、神経細胞死を認めたことの報告がある。この神経細胞死は、神経細胞の突起の減少あるいは崩壊、クロマチンの凝縮および核の萎縮と断片化といったアポトーシスに特徴的な形態変化に加え、TUNEL法によるアポトーシス細胞の検出、Bcl-XLの共発現およびAc-DEVD-CHOの培養液への添加によるアポトーシスの抑制により細胞死が完全に抑制されるなどの試験結果から、アポトーシスであると報告している。
【０００５】
しかしながら、近年、ヒトにおけるハンチントン病などのポリグルタミン病の疾患、さらには、神経変性疾患は、アポトーシスとは異なる神経細胞死が、疾患の原因として重要であると考えられるようになってきた。たとえば、ヒトのハンチントン病において、アポトーシスとは異なる神経細胞死が確認されている。プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第97巻、第14号、第8093〜8097頁（2000年）においては、ハンチントン病患者の剖検脳および変異ハンチンチンのトランスジェニックマウスにみられる神経細胞死が、アポトーシスでもなくネクローシスでもないことが報告されている。
【０００６】
ニューロン（Neuron）、第21巻、第633〜642頁（1999年）においても類似した細胞死が報告されている。この報告では、ショウジョウバエの光受容器神経細胞（Photoreceptor Neurons）にポリグルタミン鎖を有するヒトの変異ハンチンチンを発現させたときに起こる神経細胞死が、一部アポトーシスに類似するものの、典型的なアポトーシスとは異なることが示されている。
こうした報告におけるアポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物は、ハンチントン病などの未だそのメカニズムが定かではない神経細胞死に伴なう神経変性疾患の治療薬として有用である。しかし、トランスジェニックマウスやショウジョウバエを用いたインビボ（in vivo）における実験は、大量に繁殖することによる効率の悪さなどの問題があり、大量の化合物のスクリーニングに用いるには不適当である。
【０００７】
ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience）、第19巻、第705〜715頁（1999年）においては、初代培養小脳顆粒神経細胞にポリグルタミン鎖を導入し、認められる細胞死が一部アポトーシスの特徴を有するものの、アポトーシスとは異なることが報告されている。しかし、通常、中年期（35歳から50歳）に発症するハンチントン病では、神経細胞死は主に線条体および大脳皮質に認められることから、小脳の初代培養神経細胞を使用しているこの報告は、ヒトのハンチントン病における神経細胞死を再現しているとはいえない。さらに、アポトーシスでない細胞死を利用した大脳皮質を用いたハンチントン病のモデルは、今までに知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物の簡便なスクリーニング方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトのハンチントン病にみられる神経細胞死をインビトロ（in vitro）において再現すべく、研究を重ねた。その結果、大脳皮質初代培養神経細胞に、組換えウイルスベクターを用いてポリグルタミン鎖が伸長したハンチンチン変異タンパク質を発現させることで、ハンチントン病に特徴的な核内タンパク質封入体が形成され、ネクローシスとは異なる形態の神経細胞死が生じることを見出した。さらに、この神経細胞死が、アポトーシスとも明らかに異なる形態の細胞死であることを見出した。これらの知見を基に、ハンチントン病などのポリグルタミン病、さらには、神経変性疾患の治療剤となる化合物のスクリーニング方法の発明を完成するに至った。
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明は、大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させ、該細胞に被験化合物を接触させ、アポトーシスとは異なる神経細胞死に対する抑制作用を検出することにより、神経細胞死抑制効果を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
より具体的には、たとえば、（１）ラット大脳皮質初代培養神経細胞を培養し、（２）初代培養神経細胞に、組換えウイルスベクターを用いてポリグルタミン鎖が伸長したハンチンチン変異タンパク質を発現させ、（３）該細胞に被験化合物を接触させ、（４）認められる神経細胞死に対する抑制作用を検出し、それを指標として化合物を選別する工程よりなる化合物のスクリーニング方法である。
【００１１】
大脳皮質初代培養神経細胞にハンチンチン変異タンパク質を発現させることを特徴とする本発明方法により、該細胞をネクローシスともアポトーシスとも異なった神経細胞死に導くことが可能となった。これは、近年、ハンチントン病などの神経変性疾患の原因として考えられている、アポトーシスとは異なる神経細胞死を適切に反映したインビトロのモデルであり神経変性疾患に対し有効性を示す化合物のスクリーニングに利用可能である。
したがって、本スクリーニングは、上記のアポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物をスクリーニングできる。さらに、スクリーニングで選択された化合物は、神経細胞の細胞死が原因となる疾患、すなわち、神経変性疾患の予防・治療剤として有用である。
本発明における神経変性疾患としては、たとえば、アルツハイマー病、虚血性脳障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病および脊髄小脳変性症などの神経細胞の変性、脱落を伴なう疾患が挙げられ、好ましくは、ハンチントン病などのポリグルタミン病が挙げられ、さらに好ましくは、ハンチントン病が挙げられる。
【００１２】
本発明における大脳皮質初代培養神経細胞は、たとえば、ヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物から得られ、好ましくは、ラット、より好ましくは、ラット胎仔から得られる。
大脳皮質神経細胞の初代培養は、たとえば、公知の方法に準じて行えばよい［実験医学別冊 バイオマニュアルUPシリーズ 分子生物学研究のための新培養細胞実験法、第2版、第81〜87頁］。具体的には、以下の手順で実施すればよい。
ラットは、数日間の馴化飼育を行ってから使用するのが好ましい。健康状態の良好な妊娠ラットの子宮から胎仔を切り離し、胎仔から全脳を摘出する。摘出した全脳は、氷冷した培地に浸漬する。浸漬した全脳から大脳半球を切り離し、さらに海馬および線条体を取り除いて調製した大脳皮質を培地に入れる。その後、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、酵素反応により細胞を分散する。使用する酵素反応溶液としては、トリプシン溶液が好ましく、反応条件としては、30〜40℃、好ましくは、36〜38℃で5〜60分間、好ましくは、15〜25分間の反応を行えばよい。牛胎児血清（FCS）などを添加し、酵素反応を止めた後、たとえば、デオキシリボヌクレアーゼＩ（DNaseＩ）を加えピペットで分散する。これをナイロンメッシュなどで組織片や細胞凝集塊を除去し、細胞を回収する。回収した細胞は、血球計算盤で生細胞密度を算出し、10％FCSを含むDMEM培地などに懸濁して培養プレートあるいは培養ディッシュに捲けばよい。この際、播種する細胞密度は、およそ1.0×105〜2.5×105個／cm2が好ましい。播種後は、5％二酸化炭素、36〜38℃の条件で培養すればよい。
【００１３】
上記の培養で混入するアストロサイト、ミクログリアなどのグリア細胞は、たとえば、アラビノシルシトシンなどの増殖阻害剤の添加により除くことができる。具体的には、アラビノシルシトシンであれば、最終濃度4μmol/Lとなるよう調製して添加すればよい。
【００１４】
変異ハンチンチン遺伝子の取得方法しては、たとえば、以下の方法が挙げられる。
ハンチンチンは、ヒト、マウスなどのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が既に報告されている［ヒトハンチンチン／ジェノミクス（Genomics）、第69巻、第72頁−第85頁（2000年）； GenBank・EMBL登録番号 AB016794］［ヒトハンチンチン・エクソン1／ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Somatic Cell and Molecular Genetics）、第20巻、第27頁−第38頁（1994年）； GenBank・EMBL登録番号 L27350］、［マウスハンチンチン／ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）、第10巻、第104頁−第110頁（1995年）； GenBank・EMBL登録番号 U24233］。
これらの配列情報をもとに、常法により、同種または異種由来のハンチンチン遺伝子の相同遺伝子およびその遺伝子産物を取得することができる。具体的には、アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は既知であるので、それらの遺伝子やｃＤＮＡは、既知配列情報をもとに設計した合成プライマーやプローブを用い、適当なＤＮＡライブラリを利用し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcriptase-polymerase chain reaction）、コロニーハイブリダイゼーションおよび／またはプラークハイブリダイゼーションなどにより単離できる。なお、これらは、たとえば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd eds.）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年）などに準じて実施すればよい。
【００１５】
変異ハンチンチン遺伝子は、ハンチンチン遺伝子のエクソン１にポリグルタミンをコードする遺伝子（たとえば、ＣＡＧトリプレットリピート）を挿入したものが望ましい。ポリグルタミンをコードする遺伝子の挿入により発現する変異ハンチンチンタンパク質のポリグルタミン数は、神経細胞死を誘発する数であればよく、好ましくは、ポリグルタミン数として37個から150個が望ましい。また、さらに好ましくは、100〜145個が望ましく、よりさらに好ましくは、105〜115個が望ましい。
【００１６】
神経細胞への遺伝子の導入は、エレクトロポレーションなどの物理的方法やDEAE-デキストラン、リポソームおよびリン酸カルシウムなどを用いる化学的方法、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法などの常法が挙げられるが、好ましくは、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が挙げられる。たとえば、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子導入法において、遺伝子導入に使用するベクターは、特に限定されないが、神経細胞に顕著な毒性がなく、効率よく遺伝子を導入できるものであればよく、たとえば、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよびワクシニアウイルスなどが挙げられ、好ましくは、アデノウイルスが挙げられる。アデノウイルスを用いた感染は、感染多重度（m.o.i）＝100で効率的に感染させることが好ましい。
また、変異ハンチンチンを含むウイルスベクターの調製は、公知の方法に準じて行えばよい。たとえば、「ゲノム解析実験法、中村祐介、ラボ・マニュアル、羊土社、第191−200頁」や市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施できる。
【００１７】
細胞における変異ハンチンチンタンパク質の発現の有無は、変異ハンチンチンタンパク質に対する抗体を用い、ウエスタンブロッティング、他の公知の免疫測定方法などを行うことにより確認することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法において、変異ハンチンチンタンパク質を発現した細胞と被検物質とを接触させる方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記細胞を培養中の培地に、被検物質を添加することにより、あるいは、通常の培地(すなわち、被検物質不含培地)を、予め被検物質を添加した培地に、置き換えることにより、あるいは、予め被検物質を添加した培地に、上記細胞を加えることにより、実施することができる。
【００１９】
アポトーシスとは異なる神経細胞死に対する抑制作用を検出する方法としては、たとえば、細胞傷害の度合あるいは生細胞数などを指標として評価することができる。細胞傷害の度合を指標とする場合、たとえば、一定時間細胞を培養後、培地中に漏出したＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）などの活性を測定することによるＬＤＨ法、膜損傷により溶解した死細胞を定量する51Cr遊離法およびクリスタルバイオレットを用いて接着面より遊離した死細胞を定量する色素抽出法などが挙げられる。
生細胞数を指標とする場合は、たとえば、エリスロシンＢやアクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドなどの色素を用いて生細胞と死細胞を染め分ける分染法、トリパンブルーなどを用いた色素排除試験などによる評価、コハク酸脱水素酵素活性を測定するMTT法やXTT法および［3H］チミジンまたは［125I］デオキシウリジンの取り込みによりDNA合成能を定量する生合成能測定法などが挙げられる。その他、顕微鏡などにより、細胞の変形、萎縮および／または変性などを観察し、評価することができる。
【００２０】
スクリーニングに用いる被験化合物としては特に制限はなく、どのような被験化合物であってもよく、精製された被験化合物であっても、混合物であってもかまわないが、たとえば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清などが挙げられる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd eds.）（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））に記載の方法に準じて実施した。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に記載の方法に従って使用した。
【００２２】
実施例１  変異ハンチンチンによる神経細胞死
大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞に、20個または111個のグルタミンをコードするトリプレットリピート（CAGの18回繰り返し配列にCAACAGを付加した配列およびCAGの109回繰り返し配列にCAACAGを付加した配列）を含むヒトハンチンチン遺伝子エクソン１のcDNA（以下、それぞれHtt20 cDNA、Htt111 cDNAと呼ぶ）をアデノウイルスを用いて導入し、免疫染色によるハンチンチンの発現確認および細胞死の評価を行った。詳細は、以下の手順で実施した。
【００２３】
１．コスミドの構築
プラスミド：pTL-1に、Htt20 cDNA、Htt111 cDNAのいずれかを導入したものから、制限酵素（EcoRIおよびNotI）処理により各々のcDNAを切り出した。その後、Htt20 cDNA、Htt111 cDNAは、コスミドベクター：pAxCAwt（宝酒造社製）にサブクローニングした。コスミドベクターに挿入されたインサートの向きは、制限酵素（BamHI）処理後のアガロース電気泳動により分解産物の大きさを確認することで行った。
選択されたクローンは、Gigapack III XL-7（ストラタジーン（STRATAGENE）社製）を用いてλファージにパッケージングし、その後、大腸菌株DH5αに感染させた。DH5αからのコスミドDNAの精製は、QIAGEN Midi Kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を使用して行った。
【００２４】
２．組換えアデノウイルスの調製
組換えアデノウイルスは、Htt20 cDNAを含むアデノウイルス（以下、Ad/Htt20と呼ぶ）、Htt111 cDNAを含むアデノウイルス（以下、Ad/Htt111と呼ぶ）の2種類を調製した。
組換えアデノウイルスの調製は、Adenovirus Expression System Kit（宝酒造社製）を用いて以下の手順で実施した。
8μgのコスミドDNAと10μLのDNA-TPCを293細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクションには、Superfect Transfection Reagent（キアゲン（QIAGEN）社製）あるいはCellPhect Transfection Kit（アマシャム（Amersham）社製）を使用した。組換えアデノウイルスのインサートが入っていることは、制限酵素（Cla I）処理後のアガロース電気泳動により分解産物の大きさを確認することで行った。
【００２５】
３．大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞調製とアデノウイルスベクターの感染
（１）初代培養神経細胞の調製
大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞の調製は、以下の手順で実施した。（１−１）大脳皮質初代培養神経細胞の調製
推定胎齢15日齢の胎仔を有するウィスター（Wistar/ST）雌性ラット（日本クレア社または日本SLC社）を2日間馴化飼育し、胎齢17日で健康状態の良好な妊娠ラットを実験に使用した。妊娠ラットの子宮から胎仔を切り離した後、全脳を摘出し、氷冷したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地とリン酸緩衝食塩水（PBS）の等量混和液に浸漬した。その後、浸漬した全脳から大脳半球を切り離し、さらに大脳半球から海馬および線条体を取り除き大脳皮質を切り離した。大脳皮質は氷冷したDMEMに浸漬した。その後、PBSで洗浄し、0.25％トリプシン（ライフ・テクノロジー（Life Technologies）社製）を含むPBS溶液中で、37℃、20分間の酵素反応を行った。牛胎児血清（FCS）（大日本製薬社製）を50％含むDMEMを等量加えることでトリプシン処理を止めた後、0.1mg/mLデオキシリボヌクレアーゼＩ（DNaseＩ）（ベーリンガー・マンハイム（Boeringer Mannheim）社製）を添加しピペッティングにより細胞を分散した。分散後の液は、70μmのナイロンメッシュに通すことで組織片や細胞凝集塊を除去し、その後遠心操作（1000rpm、10分間）により細胞を回収した。回収した細胞は、10％FCSを含むDMEMに懸濁後遠心操作（1000rpm、10分間）を行い、10％FCSを含むDMEMで再び懸濁した。調製した細胞懸濁液の生細胞密度（細胞懸濁液1mLあたりの生細胞数）は、Neubauer血球計算盤（エルマー（Erma）社製）を用いて算出した。細胞は、組織培養100mmディッシュ（コーニング（Corning）社製）1枚あたり1×107個となる様に、また6穴の組織培養プレート（コーニング（Corning）社製）1穴当たり1.7×106個となる様に、10％FCSを含むDMEM培地で希釈して播種した。組織培養100mmディッシュおよび6穴の組織培養プレートは、使用前に10μg/mLのポリ−L−リジン（poly-L-lysine）を含む0.15Mホウ酸緩衝液（pH8.4）を用い、一晩、室温でコーティング処理を行った。培養は、5％二酸化炭素、37℃の条件下で行った。
（１−２）小脳初代培養神経細胞の調製
方法は、大脳皮質初代培養神経細胞の調製方法に準ずるが、ラットは生後7日目のウィスター（Wistar/ST）ラット（日本クレア社または日本SLC社）を用いた。また、DMEMに代えて、25mM KClを含むDMEMを使用した。
上記、（１−１）および（１−２）において培養で混入するアストロサイト、ミクログリアなどのグリア細胞は、播種24時間後にアラビノシルシトシン（シグマ（Sigma）社製）を最終濃度4μM（mol/L）となるよう培養液に添加することで除去した。
【００２６】
（２）アデノウイルスの感染
アデノウイルスの感染は、培養3日後あるいは4日後に行った。初代培養神経細胞に組換えアデノウイルスAd/Htt20、Ad/Htt111を感染多重度（m.o.i）=100になるように添加し、5％二酸化炭素、37℃の条件下で培養した。m.o.iは、アデノウイルスの力価［プラーク形成単位：plaque forming unit（p.f.u）］／細胞数で算出した。対照として、アデノウイルス非感染細胞を調製した。
【００２７】
４．初代培養神経細胞における変異ハンチンチンタンパク質の発現
Ad/Htt111を感染させた大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質が発現していることを、抗ハンチンチン抗体を用いた免疫染色により確認した。
変異ハンチンチンタンパク質の免疫染色は、以下の手順で実施した。
初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを0.1M PBSで洗浄した後、4％パラホルムアルデヒドを含む0.1M PBS（pH7.4）を加え、4℃で30分間、固定処理を行った。その後、PBSで4回洗浄した後、一次抗体と反応させた。
一次抗体は、0.5％スキムミルクを含むPBSで100倍希釈した抗ハンチンチン抗体N18（サンタクルズ（Santa Cruz）社製）を用い、室温で1時間反応させた。
二次抗体は、PBSで1000倍希釈したAlexa Fluor(R) 488 rabbit anti-goat IgG（モレキュラー・プローブ（Molecular Probe）社製）を用い、室温で30分間反応させた。ついで、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２８】
結果を図１に示す。
変異ハンチンチンタンパク質は、非感染細胞に発現せず（図１ａ、ｃ）、Ad/Htt111感染細胞において発現していた（図１ｂ、ｄ）。さらに、変異ハンチンチンタンパク質は核に特異的に発現し、核内部には変異ハンチンチンタンパク質の封入体が観察された（図１ｂ）。この変異ハンチンチンの核内封入体は、ハンチントン病患者の神経細胞にも認められることから、本実施例のアデノウイルスが感染した大脳皮質初代培養神経細胞は、ヒトのハンチントン病と類似した病理変化を有することが示された。
【００２９】
５．細胞死の評価
細胞死の評価は、アデノウイルス感染2日後および4日後の感染細胞ならびに感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順で実施した。
ラット大脳皮質または小脳由来の初代培養神経細胞が接着しているプレートは、PBSで1回洗浄後、0.4％トリパンブルー（ギブコ（GIBCO）社製）を加えて室温で５分間放置した。その後、PBSで3回洗浄し、位相差顕微鏡を用い、トリパンブルー陽生細胞（生存する神経細胞）およびトリパンブルー陰性細胞（死滅した神経細胞）の計数を行った。計数は、プレート１穴あたり10から20視野を観察し700個以上の細胞を数えることで行った。また、統計処理（student's t-test）により、非感染細胞群、Ad/Htt20感染群およびAd/Htt111感染群それぞれの各群間における有意差（有意水準：5％）を検討した。
【００３０】
結果を図２および図３に示す。
大脳皮質初代培養神経細胞にAd/Htt111を感染させた場合では、感染後の経過日数とともに計数した全細胞に対する死細胞の割合が増加し、感染4日後ではAd/Htt111感染群と非感染群間およびAd/Htt111感染群とAd/Htt20感染群間に有意な差が認められた。しかし、Ad/Htt20感染群と非感染群における死細胞の割合は同程度であった（図２）。
大脳皮質初代培養神経細胞にAd/Htt111を感染させた場合では、死細胞の割合は非感染細胞と比べて1.6倍増加しており有意な差が認められたが、小脳由来の初代培養神経細胞にAd/Htt111を感染させた場合では、死細胞の割合は非感染細胞と比べて有意な差は認められなかった（図３）。
ヒトのハンチントン病においても、アポトーシスと異なる神経細胞死は小脳よりも大脳皮質において顕著に観察されることから、図２の結果は、本実施例がヒトのハンチントン病における神経細胞死を再現していることを示している。
以上より、アデノウイルスを用いて大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させることで、ヒトのハンチントン病に類似したアポトーシスと異なる神経細胞死が生じることが判明した。
【００３１】
６．核の電子顕微鏡観察
核の電子顕微鏡観察は、アデノウイルス感染3日後の感染細胞および感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順で実施した。
大脳皮質初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを0.1M PBS（pH7.4）で洗浄後、遠心操作（1700×g、3分間）により細胞を回収した。回収した細胞を1％ホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含む0.1M PBS（pH7.4）溶液に懸濁し、室温で1時間処理した。その後、0.1M PBS（pH7.4）溶液で洗浄し、1％四酸化オスミウムを含む0.1M PBS（pH7.4）溶液で4℃、1時間処理した。その後、1％アガーでペレットを保持し、包埋用サイズに細切した後、エタノール系列（50％、70％、80％、90％および100％を各10分間、100％は3回処理）での脱水を行った。15分間のプロピレンオキサイド処理を２回行った後、50％ Quetol812（日新EM社製）／50％プロピレンオキサイドで30分間、100％ Quetol812で60分間処理し、脱気後に100％ Quetol812で48時間包埋した。包埋物より厚さ70nmの超薄切片を作製し、ホルムバール支持膜メッシュに貼り付けた。これを飽和酢酸ウランで25分間、0.3％クエン酸鉛で3分間の処理を行い電子染色した。調製した試料は、電子顕微鏡により観察した。
【００３２】
結果を図４に示す。
Ad/Htt111感染細胞の核（図右（ｂ））は、非感染細胞（正常細胞）の核（図左（ａ））にみられるクロマチンの網状構造が観察されず、変性していることが確認された。さらに、アポトーシスの特徴であるクロマチンの凝縮は、観察されなかった。これは、変異ハンチンチンによる神経細胞死はアポトーシスとは異なることを示している。
【００３３】
７．アポトーシス細胞の計数
アポトーシス細胞は、アデノウイルス感染4日後の感染細胞および感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順のアネキシン（annexin）Ｖを用いた染色により確認した。
大脳皮質初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを氷冷したPBSで洗浄した後、Annexin-Binding Buffer（10mM HEPES（pH7.4）、140mM NaCl、2.5mM CaCl2）で洗浄した。その後、Annexin-Binding Bufferで20倍希釈したアネキシンＶおよびAlexa Fluor 488R conjugate（モレキュラー・プローブ（Molecular Probe）社製）を加え、室温で15分間放置した。再度、Annexin-Binding Bufferで洗浄後、トリパンブルー（最終濃度0.4％）で染色し、蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡を用いて観察した。
【００３４】
結果を図５に示す。
大脳皮質初代培養神経細胞にAd/Htt111を感染させた場合では、図３の結果と同様にトリパンブルー陽性の死細胞が非感染群およびAd/Htt20感染群に比べ増加した。しかし、アネキシン陽性およびトリパンブルー陰性のアポトーシス細胞を計数したところ、Ad/Htt111感染群、Ad/Htt20感染群および非感染群のアポトーシス細胞の割合は同程度であった。このことは、非感染群、Ad/Htt20感染群およびAd/Htt111感染群それぞれにおいてアポトーシス細胞は存在するが、変異ハンチンチンタンパク質により生じる神経細胞死はアポトーシスとは異なることを示している。
【００３５】
以上より、本実施例で示されるアデノウイルスを用いた変異ハンチンチンタンパク質の発現による大脳皮質初代培養神経細胞の神経細胞死は、アポトーシスとは明らかに異なることが確認された。
この大脳皮質初代培養神経細胞の神経細胞死は、ヒトのハンチントン病における神経細胞死を反映したモデルであり、被験化合物の存在下に本実験を実施することで、目的とする神経細胞死を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、アポトーシスと異なる神経細胞死を抑制する化合物を、的確に効率よくスクリーニングすることができる。また、本発明の方法によってスクリーニングされる化合物は、ハンチントン病における神経細胞死に対する治療・予防効果および他の神経変性疾患に対し、治療・予防効果が期待される。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】大脳皮質初代培養神経細胞の蛍光顕微鏡像（図１ａ、図１ｂ）および位相差顕微鏡像（図１ｃ、図１ｄ）。
図１ａおよび図１ｃは非感染細胞、図１ｂおよび図１ｄはAd/Htt111感染4日後の細胞を示す。
【図２】トリパンブルー染色により全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果のグラフ。
感染２日後および４日後の大脳皮質初代培養神経細胞において、全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果である。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。アスタリスク（＊）は、有意差検定により有意差（p<0.05）が認められた場合を示す。
【図３】トリパンブルー染色により全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果のグラフ。
感染４日後の大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞において、全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果を示す。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。アスタリスク（＊）は、有意差検定により有意差（p<0.05）が認められた場合を示す。
【図４】アデノウイルス感染３日後における大脳皮質初代培養神経細胞の核の電子顕微鏡像。
図中の（ａ）は、非感染細胞（正常細胞）の核を；（ｂ）は、Ad/Htt111が感染した大脳皮質初代培養神経細胞の核を示す。
【図５】アポトーシス細胞を計数した結果のグラフ。
黒いカラムはトリパンブルー陽性細胞、斜線のカラムはアネキシン陽性およびトリパンブルー陰性細胞の全細胞数に対する存在比率を示す。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。＊は、有意差検定により有意差（p<0.05）が認められた場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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