(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかを特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、
１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡ、又は、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡであり、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から５、１０から１４、１９から２３のいずれかであり、
前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号６から８、１５から１７、２４から２６のいずれかであり、
Ａｋｔ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から５のいずれかであり、
前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号６から８のいずれかであり、
Ａｋｔ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１０から１４のいずれかであり、
前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号１５から１７のいずれかであり、
Ａｋｔ３遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡは、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１９から２３のいずれかであり、
前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号２４から２６のいずれかである、
二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記３’末端オーバーハング部分の２塩基の配列が、ＴＴである請求項１記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
Ａｋｔ遺伝子特異的阻害剤であって、請求項１又は２に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含み、ＲＮＡ干渉によりＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかの発現を特異的に阻害するＡｋｔ遺伝子特異的阻害剤。
【請求項４】
癌治療用の医薬組成物であって、請求項１又は２に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項５】
さらに、アテロコラーゲンを含む請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が、口腔癌又は前立腺癌である請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｋｔ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術は、生命科学研究に頻繁に利用され、その有用性は広く確認されている。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡによって、その配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象をいう。２００１年に２１塩基の低分子二本鎖ＲＮＡが哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを媒介できることが報告されてより（非特許文献１参照）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｃｅ  ＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現抑制方法として頻用されている。また、より高いＲＮＡｉ効果を得るためのｓｉＲＮＡの配列選択基準についても報告されている（非特許文献２参照）。ＲＮＡｉ技術は、医薬品への応用や、癌を含む種々の難治性疾患の治療への応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、ｓｉＲＮＡを臨床応用する場合、インターフェロン応答の問題がある。すなわち、高濃度の合成ｓｉＲＮＡを細胞内に導入したり、細胞内において高濃度にｓｉＲＮＡを発現させたりすると、インターフェロン応答が誘導され非特異的な発現阻害や非特異的な細胞増殖阻害が起こる。現在では、１０ｎＭ以上の合成ｓｉＲＮＡを細胞内導入するとインターフェロン応答が誘導されることが知られている。
【０００４】
さらに、ｓｉＲＮＡを臨床応用する場合、オフターゲット効果の問題がある。すなわち、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できる優れた技術ではあるが、標的遺伝子以外の類似標的配列を有する遺伝子の発現も抑制することが明らかにされている（非特許文献３参照）。
【０００５】
他方、Ａｋｔ１遺伝子、Ａｋｔ２遺伝子及びＡｋｔ３遺伝子を含むＡｋｔ遺伝子ファミリーは、癌遺伝子としての機能が知られており、種々の癌種においてその発癌、増殖、浸潤、及び転移への関与が示唆されている遺伝子である（非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、これまでに、Ａｋｔ１遺伝子などのＡｋｔ遺伝子ファミリーに特異的なｓｉＲＮＡであって、上述したインターフェロン応答の問題や、オフターゲット効果の問題を回避できる臨床応用可能なｓｉＲＮＡは報告されていない。
【非特許文献１】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら、「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１  （６８３６）：  ４９４−４９８，  ２００１．
【非特許文献２】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ａら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．」  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２  （３）：  ３２６−３３０，  ２００４．
【非特許文献３】Ｊａｃｋｓｏｎ  ＡＬら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ．」  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１  （６）：  ６３５−６３７，  ２００３．
【非特許文献４】Ｖｉｖａｎｃｏ  Ｉら、「Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．」  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２  （７）：  ４８９−５０１，  ２００２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかを特異的に標的とする臨床応用可能なｓｉＲＮＡの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡ、又は、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡであり、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から５、１０から１４、１９から２３のいずれかであり、前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号６から８、１５から１７、２４から２６のいずれかである二本鎖ｓｉＲＮＡである。なお、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、いずれも、Ａｋｔ遺伝子ファミリーに特異的なＲＮＡｉを媒介するという共通の活性を共有し、かつ、この共通の活性に不可欠な重要な構造要素、すなわち、ＲＮＡｉを媒介するためのＡｋｔ遺伝子ファミリーに対応する共通した重要な構造要素を共有する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らは、まず、口腔癌の治療標的分子について鋭意研究を重ね、Ａｋｔ１が口腔癌において、治療標的分子となりうることを見出した。すなわち、ヒト全遺伝子を対象にした網羅的遺伝子発現解析を行い、培養ヒト不死化角化上皮細胞及び正常口腔粘膜組織には発現が認められず、培養ヒト口腔癌細胞及び口腔癌組織においてのみ共通して発現が認められる遺伝子として、Ａｋｔ１遺伝子を同定した。
【００１０】
次に、本発明者らは、Ａｋｔ１遺伝子のｓｉＲＮＡについてさらに鋭意研究を重ね、１ｎＭという使用濃度であっても十分にＲＮＡｉ効果を発揮することにより、インターフェロン応答の誘導回避が可能な二本鎖ｓｉＲＮＡを見出した。そして、本発明者らは、Ａｋｔ１遺伝子のｓｉＲＮＡについて、ＢＬＡＳＴサーチを駆使し、Ａｋｔ１ｍＲＮＡの非翻訳領域を含めた全配列より他の遺伝子にホモロジーを示さない配列を標的配列として選択し、オフターゲット効果を回避できる二本鎖ｓｉＲＮＡを見出し、本発明に到達した。さらに本発明者らは、Ａｋｔ１遺伝子のファミリー遺伝子であるＡｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子についても、１ｎＭという使用濃度であっても十分にＲＮＡｉ効果を発揮し、かつ、オフターゲット効果を回避できる二本鎖ｓｉＲＮＡを見出した。
【００１１】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、例えば、１ｎＭという使用濃度であっても十分にＲＮＡｉ効果を発揮できるから、好ましくは、インターフェロン応答を回避して使用できる。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかに特異的であるから、好ましくは、オフターゲット効果を回避して使用できる。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、臨床応用可能であり、例えば、癌の治療、癌治療の医薬組成物、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３のいずれかに特異的なＡｋｔ遺伝子特異的阻害剤等に利用できる。
【００１２】
とりわけ、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を発揮するＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子は口腔癌又は前立腺癌における治療標的分子であるから、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、口腔癌又は前立腺癌の治療や、口腔癌又は前立腺癌の医薬組成物等に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一態様として、Ａｋｔ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から５のいずれかであり、前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号６から８のいずれかである二本鎖ｓｉＲＮＡである。なお、この態様の本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、いずれも、Ａｋｔ１遺伝子に特異的なＲＮＡｉを媒介するという共通の活性を共有し、かつ、この共通の活性に不可欠な重要な構造要素、すなわち、ＲＮＡｉを媒介するためのＡｋｔ１遺伝子に対応する共通した重要な構造要素を共有する。
【００１４】
また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一態様として、Ａｋｔ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１０から１４のいずれかであり、前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号１５から１７のいずれかである二本鎖ｓｉＲＮＡである。なお、この態様の本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、いずれも、Ａｋｔ２遺伝子に特異的なＲＮＡｉを媒介するという共通の活性を共有し、かつ、この共通の活性に不可欠な重要な構造要素、すなわち、ＲＮＡｉを媒介するためのＡｋｔ２遺伝子に対応する共通した重要な構造要素を共有する。
【００１５】
さらにまた、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一態様として、Ａｋｔ３遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１９から２３のいずれかであり、前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号２４から２６のいずれかである二本鎖ｓｉＲＮＡである。なお、この態様の本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、いずれも、Ａｋｔ３遺伝子に特異的なＲＮＡｉを媒介するという共通の活性を共有し、かつ、この共通の活性に不可欠な重要な構造要素、すなわち、ＲＮＡｉを媒介するためのＡｋｔ３遺伝子に対応する共通した重要な構造要素を共有する。
【００１６】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記３’末端オーバーハング部分の２塩基の配列は、ＴＴ（チミン・チミン）であることが好ましい。
【００１７】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、その他の態様として、前記配列表の配列番号１から８、１０から１７、１９から２６の配列において、１又は数個の塩基が修飾され、又は置換、付加若しくは欠失し、かつ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかに特異的なＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００１８】
本発明のＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤は、ＲＮＡ干渉によりＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかの発現を特異的に阻害するＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、癌治療用の医薬組成物であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１つを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、さらに、アテロコラーゲンを含むことが好ましい。本発明の医薬組成物において、治療用途の対象となる癌は、特に制限されないが、例えば、口腔癌、前立腺癌等があげられ、中でも、口腔癌であることが好ましい。
【００２０】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、一態様として、Ａｋｔ１遺伝子のＡｋｔ１ｍＲＮＡ、Ａｋｔ１タンパク質、リン酸化Ａｋｔ１タンパク質、及び、Ａｋｔ１タンパク質に対する自己抗体からなる群から選択される口腔癌の腫瘍マーカーであって、前記Ａｋｔ１ｍＲＮＡが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年１０月３１日付）がＮＭ＿００５１６３、ＮＭ＿００１０１４４３１及びＮＭ＿００１０１４４３２からなる群から選択される塩基配列からなるｍＲＮＡであり、前記Ａｋｔ１タンパク質が、配列表の配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、被検者の口腔由来試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、被検者における口腔癌の存在を示す口腔癌の腫瘍マーカーである。
【００２１】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、一態様として、Ａｋｔ２遺伝子のＡｋｔ２ｍＲＮＡ、Ａｋｔ２タンパク質、リン酸化Ａｋｔ２タンパク質、及び、Ａｋｔ２タンパク質に対する自己抗体からなる群から選択される口腔癌の腫瘍マーカーであって、前記Ａｋｔ２ｍＲＮＡが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００６年８月２０日付）がＮＭ＿００１６２６で表される塩基配列からなるｍＲＮＡであり、前記Ａｋｔ２タンパク質が、配列表の配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、被検者の口腔由来試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、被検者における口腔癌の存在を示す口腔癌の腫瘍マーカーである。
【００２２】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、一態様として、Ａｋｔ３遺伝子のＡｋｔ３ｍＲＮＡ、Ａｋｔ３タンパク質、リン酸化Ａｋｔ３タンパク質、及び、Ａｋｔ３タンパク質に対する自己抗体からなる群から選択される口腔癌の腫瘍マーカーであって、前記Ａｋｔ３ｍＲＮＡが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００６年８月２０日付）がＮＭ＿００５４６５で表される塩基配列からなるｍＲＮＡであり、前記Ａｋｔ３タンパク質が、配列表の配列番号２７のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、被検者の口腔由来試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、被検者における口腔癌の存在を示す口腔癌の腫瘍マーカーである。
【００２３】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法は、被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に本発明の口腔癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法である。
【００２４】
本発明の検出キットは、口腔癌の腫瘍マーカーを検出するための検出キットであって、前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３ｍＲＮＡのいずれかを検出するためのプローブ及びプライマーの少なくとも一方であるポリヌクレオチド、前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質のいずれかを検出するための抗体、並びに、抗Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質抗体のいずれかを検出するための抗原及び抗体からなる群から選択される少なくとも一つを含む検出キットである。
【００２５】
次に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡについて詳しく説明する。
【００２６】
まず、本発明において、「Ａｋｔ遺伝子」又は「Ａｋｔ遺伝子ファミリー」とは、前述のとおり癌遺伝子としての機能が知られており、種々の癌種においてその発癌、増殖、浸潤、及び転移への関与が示唆されている遺伝子又は遺伝子ファミリーである（非特許文献４）。本発明において、「遺伝子ファミリー」とは、ゲノム中に存在する共通の祖先を持つ複数の遺伝子群の総称をいい、「Ａｋｔ遺伝子ファミリー」は、Ａｋｔ１遺伝子、Ａｋｔ２遺伝子及びＡｋｔ３遺伝子を含む。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＡｋｔ１遺伝子としては、好ましくは、ヒトＡｋｔ１遺伝子であって、その配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１６３、ＮＭ＿００１０１４４３１、及び、ＮＭ＿００１０１４４３２等から入手可能である。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＡｋｔ２遺伝子としては、好ましくは、ヒトＡｋｔ２遺伝子であって、その配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６２６等から入手可能である。さらにまた、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＡｋｔ２遺伝子としては、好ましくは、ヒトＡｋｔ２遺伝子であって、その配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４６５等から入手可能である。
【００２７】
本発明者らは、ヒト全遺伝子に対するマイクロアレイを用いた網羅的解析を行い、培養ヒト不死化角化上皮細胞及び正常口腔粘膜組織には発現が認められず、培養ヒト口腔癌細胞及び口腔癌組織においてのみ共通して発現が認められる遺伝子を探索した。その工程のフロー図を図５に示す。これにより、口腔癌の治療標的分子として、Ａｋｔ１遺伝子を見出した。さらに、本発明者らは、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによりＡｋｔ１遺伝子の発現を阻害すると、培養ヒト口腔癌細胞の増殖は阻害されるが培養ヒト不死化角化上皮細胞の増殖には全く影響を及ぼさないことも見出した。さらにまた、Ａｋｔ１遺伝子と同じ遺伝子ファミリーであるＡｋｔ２遺伝子及びＡｋｔ３遺伝子についても、正常口腔粘膜組織に比較して、口腔癌組織において過剰発現する遺伝子であることを見出した。
【００２８】
本発明において、「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉを媒介可能な短鎖のＲＮＡ分子であって、一般には、２１塩基〜２７塩基の二本鎖低分子ＲＮＡをいう。
【００２９】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、２つの態様があり、第１の態様が、１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、第２の態様が、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡである。前記１９塩基対及び前記２７塩基対の配列を、下記表１Ａ〜１Ｃに示す。これらの表において、左欄が、それぞれのｓｉＲＮＡのコードネームであり、右欄が、ＳｅｑＩＤ、すなわち、配列表の配列番号である。下記表１ＡがＡｋｔ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの表であり、下記表１ＢがＡｋｔ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの表であり、下記表１ＣがＡｋｔ３遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの表である。
【００３０】
ここで、「特異的に標的とする」とは、オフターゲット効果がないことをいう。すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子は上述したとおり同じＡｋｔ遺伝子ファミリーに含まれる互いに相同性の高い遺伝子群であるが、標的とするＡｋｔ遺伝子以外のＡｋｔファミリー遺伝子にＲＮＡｉ効果を及ぼすこと無い非常に高い特異性を示すことをいう
。例えば、下記表１ＡのｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１遺伝子の発現に対してのみＲＮＡｉ効果
を発揮し、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子の発現には影響を及ぼさない。下記表１Ｂ及びＣに記載のｓｉＲＮＡも同様に、それぞれ、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子の発現に対してのみＲＮＡｉ効果を発揮する。
【００３１】
【表１Ａ】
0005232990.tif 000002
【００３２】
【表１Ｂ】
0005232990.tif 000003
【００３３】
【表１Ｃ】
0005232990.tif 000004
【００３４】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記３’末端のオーバーハングとは、５’末端から１９ｍｅｒが相補的な配列である２本の２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成したとき１９塩基対の両端から突出する３’末端の２ｍｅｒの部分をいう。前記３’末端オーバーハングの２塩基の配列は、例えば、両端とも、ＴＴ（チミン・チミン）が好ましい。なお、前記３’オーバーハングの２塩基の配列は、これに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、任意の天然核酸塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシシル）、並びに、天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。また、前記３’末端オーバーハング部分のヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。さらに、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要に応じて、前記３’末端オーバーハングに代えて、５’末端オーバーハングとしてもよい。
【００３５】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡの１９塩基対の配列は、Ａｋｔ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ａに記載のとおり、Ａ６、Ａ２２、Ａ３３、Ａ５６及びＡ５８（それぞれ、配列表の配列番号１〜５）の５種類が使用できるが、好ましくは、Ａ２２及びＡ５８であって、より好ましくは、Ａ５８である。また、Ａｋｔ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ｂに記載のとおり、Ｂ３６、Ｂ１７２、Ｂ３９５、Ｂ４３１及びＢ４７７（それぞれ、配列表の配列番号１０〜１４）の５種類が使用できるが、好ましくは、Ｂ３９５及びＢ４３１であって、より好ましくは、Ｂ４３１である。さらにまた、Ａｋｔ３遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ｃに記載のとおり、Ｃ１６９、Ｃ４９８、Ｃ９４１、Ｃ１２２９及びＣ１３２１（それぞれ、配列表の配列番号１９〜２３）の５種類が使用できるが、好ましくは、Ｃ１６９及びＣ９４１であって、より好ましくは、Ｃ１６９である。
【００３６】
本発明の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡは、２７ｍｅｒの相補的な２本のＲＮＡ鎖が対合して形成した二本鎖であるから、その末端は平滑である。本発明の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡの２７塩基対の配列は、Ａｋｔ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ａに記載のとおり、Ａ１３９２、Ａ２２２４及びＡ２２３９（それぞれ、配列表の配列番号６〜８）の３種類が使用できるが、好ましくは、Ａ１３９２及びＡ２２３９であって、より好ましくは、Ａ１３９２である。また、Ａｋｔ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ｂに記載のとおり、Ｂ３３、Ｂ３９０及びＢ４７５（それぞれ、配列表の配列番号１５〜１７）の３種類が使用できるが、好ましくは、Ｂ３３及びＢ３９０であって、より好ましくは、Ｂ３３である。Ａｋｔ３遺伝子を特異的に標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、上記表１Ｃに記載のとおり、Ｃ１６６，Ｃ４９６及びＣ１２２４（それぞれ、配列表の配列番号２４〜２６）の３種類が使用できるが、好ましくは、Ｃ１６６及びＣ４９６であって、より好ましくは、Ｃ４９６である。
【００３７】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの塩基対部分の配列（配列表の配列番号１〜８、１０〜１７、１９〜２６）は、Ａｋｔ１遺伝子特異的なＲＮＡｉを誘導できる範囲において、１又は数個の塩基が修飾され、又は置換、付加若しくは欠失したものであってもよい。前記数個とは、例えば、２、３、４個である。
【００３８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの製造方法は、インビトロで化学的又は酵素的に合成しても、又は、インビボで合成してもよく、その製法は特に制限されないが、なかでも、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、濃度調節が容易となり臨床応用に際してインターフェロン応答の回避が容易となる。また、コンタミネーションの防止が容易であり安全性においても利点がある。例えば、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡのＡ５８を製造する場合、まず、配列表の配列番号５の配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖、及び、前記配列番号５の配列の相補配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖をそれぞれ化学合成する。次に、前記２本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させ、本発明の２１塩基のオーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては、必要に応じて、従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。
【００３９】
したがって、本発明は、その他の態様として、二本鎖ｓｉＲＮＡの製造方法であって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、配列表の配列番号１〜５、１０〜１４、１９〜２３のいずれかの配列及びその相補配列にそれぞれ２塩基のオーバーハングを加えた２本のＲＮＡ鎖、又は、配列表の配列番号６〜８、１５から１７、２４から２６のいずれかの配列及びその相補配列の２本のＲＮＡ鎖を合成する合成工程と、合成した前記２本のＲＮＡ鎖を対合して二本鎖ＲＮＡとする対合工程とを含む製造方法を含む。
【００４０】
次に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用方法について説明する。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、インビトロにおいて細胞や組織に対して使用できることに加えて、ヒトに対して臨床応用可能である。ヒトへの投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。なかでも、例えば、口腔癌等のように、直視直達の可能な部位に対しては、例えば、アテロコラーゲンを用いた局所投与法が好ましい。前記アテロコラーゲンは、例えば、局所止血剤として既に臨床応用されており、また、前記アテロコラーゲンを用いたｓｉＲＮＡの局所投与法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分子標的とした動物実験でその有意性が示されている（Ｔａｋｅｉ  Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４（１０）：３３６５−３３７０、２００４）。
【００４１】
また、その他のデリバリーシステムとして、生体内での分解を防ぎ、細胞内透過性を高めるための化学修飾（Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２（７０１４）：１５５−１５６、２００４；  Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２（７０１４）：１７３−１７８、２００４）やカチオニックリポソーム（Ｙａｎｏ  Ｊら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０（２２）：７７２１−７７２６、２００４）を用いたデリバリーシステムを利用しても良い。さらに、必要に応じて、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。
【００４２】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、とりわけ、口腔癌の治療や、口腔癌の治療の用途に使用する医薬組成物若しくはそれらの製造に使用することが好ましい。口腔癌とは、一般に、歯肉、舌、頬部、口蓋、口底、唾液腺等の口腔を構成する部位の粘膜により発生する癌をいう。口腔は、摂食、構音等、日常生活を営む上で極めて重要な機能を担っている。手術手技の進歩により進行口腔癌の治療成績は向上しているものの、治療後のＱＯＬ（生活の質）の低下は避けられない。したがって、進行口腔癌に対しては特に手術を用いない根治性の高い新規治療法の開発が急務となっている。マウスの骨肉腫及び肝細胞癌のモデルで単一の癌遺伝子の発現を一時的に抑制するのみで、腫瘍細胞の分化誘導による治癒が観察され、癌遺伝子への依存が癌のアキレス腱であることが示された。また、ヒト癌においても、ＥＧＦＲ，Ｈｅｒ−２、Ｂｃｒ−Ａｂｌ等の単一の癌遺伝子を分子標的とする薬剤が開発され、癌臨床においてその有用性が示されている。本発明においては、Ａｋｔ１遺伝子を分子標的とする。前述したとおり、Ａｋｔ１が、少なくとも口腔癌において分子標的となることは、本発明者らが初めて見出した事実である。
【００４３】
すなわち、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを使用してＲＮＡｉ効果によりＡｋｔ１遺伝子の発現を阻害することで、好ましくは、口腔癌細胞の細胞増殖を抑制できる。これに対し、口腔癌細胞以外の口腔細胞は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの影響を受けない。なお、Ａｋｔ１は、口腔癌のみならず、様々な癌種の癌遺伝子として知られているから、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、口腔癌に限られず、例えば、前立腺癌等の癌治療一般や、癌治療に使用する医薬組成物一般若しくはそれらの製造に使用できる。また、同じ遺伝子ファミリーに属するＡｋｔ２遺伝子及びＡｋｔ３遺伝子も同様に、口腔癌、前立腺癌等の癌治療一般や、癌治療に使用する医薬組成物一般に使用できる。
【００４４】
前述したとおり、従来、ｓｉＲＮＡを臨床応用する上で大きな問題が２つあった。すなわち、インターフェロン応答が誘導される問題と、オフターゲット効果の問題である。前記インターフェロン応答を回避するには、細胞内導入濃度を少なくとも１０ｎＭ未満とする必要があるが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、１ｎＭという超低濃度でＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかに対して十分なＲＮＡｉ効果を発揮することができる。
【００４５】
また、前記オフターゲット効果についても、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的配列は、ＢＬＡＳＴサーチを駆使してＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３ｍＲＮＡのそれぞれの非翻訳領域も含めた全配列により他の遺伝子にホモロジーを示さない配列であるため、オフターゲット効果を回避できる。例えば、Ａｋｔ遺伝子は、Ａｋｔ１からＡｋｔ３まで３種類が知られており、それぞれ、約７５％の相同性がある。そして、Ａｋｔ１からＡｋｔ３のすべてを阻害すると、細胞にとって致死的であることが知られている。しかし、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを正常細胞に使用しても影響がなく、オフターゲット効果は回避される。このように、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、臨床応用における大きな２つの障壁をクリアしており、臨床応用可能である。なお、臨床応用においては、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、合成二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００４６】
したがって、本発明は、その他の態様として、ＲＮＡ干渉によりＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれかの発現を特異的に阻害するＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含むＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤を含む。本発明のＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤は、細胞内のＡｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子のいずれか一種類、二種類、又は、全部の発現を特異的にノックダウンするために、インビトロ及びインビボで使用できる。その剤形は、特に制限されない。本発明のＡｋｔ遺伝子ファミリー特異的阻害剤は、阻害するＡｋｔ遺伝子ファリミーの種類に応じて本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを一種類、二種類、又は、全種類含むことができる。
【００４７】
さらに、本発明は、その他の態様として、癌、好ましくは口腔癌又は前立腺癌、より好ましくは口腔癌の治療方法であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを使用することを含む癌の治療方法を含む。本発明の治療方法は、既存の放射線及び/又は抗癌剤の使用と本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用とを併用することを好ましく含む。また、さらにその他の態様として、本発明は、癌、好ましくは口腔癌又は前立腺癌、より好ましくは口腔癌の治療における二本鎖ｓｉＲＮＡの使用であって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡである使用を含む。同様に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用は、既存の放射線及び/又は抗癌剤の使用との併用を好ましく含む。いずれの態様においても、使用する本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子を標的とする本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのいずれか一種類でもよく、これらを二種類又は三種類を組み合わせて使用してもよい。
【００４８】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、癌治療用の医薬組成物であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含むものである。本発明の組成物に含まれる本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子を標的とする本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのいずれか一種類でもよく、これらの二種類又は三種類を組み合わせて含んでもよい。本発明の医薬組成物は、さらに、アテロコラーゲンを含むことが好ましい。上述のとおり、本発明の医薬組成物の治療用途の対象となる癌は、特に制限されないが、好ましくは口腔癌又は前立腺癌であって、口腔癌であることがより好ましい。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、リポソーム、カチオンリポソーム等があげられる。本発明の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等があげられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等があげられる。
【００５０】
次に、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、Ａｋｔ１遺伝子の発現をマーカーとして利用するものである。本発明において、「口腔癌の腫瘍マーカー」とは、口腔癌細胞の目印（マーカー）になる物質であって、口腔癌の診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称をいう。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる物質は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３遺伝子の転写産物であるＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡ、前記転写産物の翻訳産物であるＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質、リン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質に対する自己抗体の少なくとも一つである。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおいて、前記「被検試料」とは、特に制限されないが、例えば、リンパ節、唾液、血液等である。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが「陽性」であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や良性の腫瘍患者における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や良性の腫瘍患者等の平均の値の３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、及びそれ以上の値があげられる。
【００５１】
前記Ａｋｔ１ｍＲＮＡの塩基配列は、前述のとおり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年１０月３１日付）ＮＭ＿００５１６３、ＮＭ＿００１０１４４３１及びＮＭ＿００１０１４４３２に登録されている。前記Ａｋｔ１タンパク質は、配列表の配列番号９のアミノ酸配列からなるＡｋｔ１タンパク質である。また、前記リン酸化Ａｋｔ１タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号９の第４７３番目のセリン（Ｓｅｒ４７３）である。前記Ａｋｔ２ｍＲＮＡの塩基配列は、前述のとおり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００６年８月２０日付）がＮＭ＿００１６２６に登録されている。前記Ａｋｔ２タンパク質は、配列表の配列番号１８のアミノ酸配列からなるＡｋｔ２タンパク質である。また、前記リン酸化Ａｋｔ２タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号１８の第４７４番目のセリン（Ｓｅｒ４７４）である。前記Ａｋｔ３ｍＲＮＡの塩基配列は、前述のとおり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００６年８月２０日付）がＮＭ＿００５４６５に登録されている。前記Ａｋｔ３タンパク質は、配列表の配列番号２７のアミノ酸配列からなるＡｋｔ３タンパク質である。また、前記リン酸化Ａｋｔ３タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号２７の第４７２番目のセリン（Ｓｅｒ４７２）である。前記塩基配列及びアミノ酸配列において、突然変異や遺伝子多型等に起因した１〜数個の置換・欠失・付加等の相違があるものであっても、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーに含まれる。前記数個とは、例えば、２、３、４個である。また、前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡ及び前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質の一部分も本発明の口腔癌の腫瘍マーカーに含まれる。
【００５２】
次に、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法について説明する。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法としては、特に制限されず、従来公知の腫瘍マーカーと同様の使用方法にて使用できるが、例えば、被検者から被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に本発明の口腔癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む使用方法があげられる。まず、前記準備工程において、被検者から被検試料を準備する。次に、前記検出工程において、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーのマーカー物質であるＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質、リン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質、抗Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３若しくは抗リン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質自己抗体等を、後述するように、それぞれ、例えば、従来公知の方法等を用いて検出し、最後に、前記判定工程において、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する。検出対象は１種類に限られず、例えば、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３のマーカー物質のいずれか２種類又は３種類を組み合わせて使用することも好ましい。
【００５３】
前記判定工程における本発明の口腔癌の腫瘍マーカーが陽性か陰性かの判定は、前述のとおり、例えば、健常者等の値を基準として設定するしきい値と比較して判定することができる。
【００５４】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおける前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡを検出する方法としては、特に制限されないが、前記ＲＮＡを定量できる従来公知の方法があげられ、その方法にも特に制限はないが、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等のほか、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲを利用する方法、前記ＲＮＡを直接測定する方法等の迅速な測定が可能な方法があげられる。前記定量は、前記判定工程において前記しきい値との比較ができる相対的な定量であってもよく、例えば、適当な内部標準や外部標準を利用することができる。
【００５５】
前記マイクロアレイを用いる方法としては、前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡに対応するプローブが配置されたマイクロアレイを準備し、このマイクロアレイに、前記被検試料中の前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡを鋳型として調製した標識化ターゲットをハイブリダイズさせ、前記プローブに結合した前記ターゲットの標識シグナルを測定して前記ＲＮＡ鎖を定量する方法があげられる。前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、被検試料のトータルＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に前記マーカー転写産物領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングして解析する方法があげられる。また、前記ｍＲＮＡを直接測定する方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標：Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）ＲＮＡアッセイ等があげられる。ただし、前記Ａｋｔ１ｍＲＮＡを検出する方法としては、これらの方法に限られず、種々の定量方法を適用できる。
【００５６】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおける前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法があげられる。前記免疫学的測定方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色等があげられる。前記抗体は、前記Ａｋｔ１タンパク質等を用いた従来公知の方法で作製してもよく、市販のものを購入してもよい。前記抗体は、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。
【００５７】
本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおける前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質に対する自己抗体を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記自己抗体の抗原であるＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質を固相に固定化し、前記自己抗体と抗原抗体反応により複合体を形成させ、さらに、前記自己抗体に対する標識抗体により前記複合体を検出する方法等が挙げられる。
【００５８】
次に、本発明の検出キットについて説明する。本発明の検出キットは、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの検出するためのキットである。本発明のキットは、第１の態様として、前記マイクロアレイを含む検出キットが挙げられる。検出前記キットには、さらに、被検試料からトータルＲＮＡを調製するプライマーや試薬、ターゲットを調製するための標識化された本発明のプライマーや試薬等を含んでもよい。前記試薬としては、従来公知の試薬が利用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等があげられる。また、本発明の検出キットは、第２の態様として、前述のＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を用いたＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３ｍＲＮＡ検出／測定方法に使用するプローブやプライマーを含むキットが挙げられる。これらのプローブやプライマーの配列は、特に制限されず、当業者であれば容易に設定可能である。前記検出キットは、例えば、マイクロアレイを製造する場合や、リアルタイムＰＣＲ法により検出する場合に使用できる。さらに、本発明の検出キットは、第３の態様として、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質に対する抗体を含む検出キットが挙げられ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の前記ポリペプチドの免疫学的測定に使用できる。第４の態様として、自己抗体の抗原であるＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質、並びに、前記自己抗体に対する標識化抗体を含む検出キットが挙げられ、例えば、上述したとおり、自己抗体の免疫学的測定に使用できる。前記自己抗体を検出することで、間接的にＡｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３遺伝子の発現を検出できる。前記Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質及び／又はリン酸化Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３タンパク質は、固相に固定化されていることが好ましい。本発明の検出キットは、上述のいずれの態様においても取扱説明書を含んでもよい。
【００５９】
さらに、本発明は、口腔癌の診断方法であって、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーを使用することを含む口腔癌の診断方法を含む。また、本発明は、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用であって、口腔癌の診断における本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用を含む。
【００６０】
以下に、本発明を実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００６１】
前記表１Ａの５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ａ６、Ａ２２、Ａ３３、Ａ５６及びＡ５８；それぞれ、配列表の配列番号１〜５）と、３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ａ１３９２、Ａ２２２４及びＡ２２３９；それぞれ、配列表の配列番号６〜８）の８種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、それぞれの合成二本鎖ｓｉＲＮＡについて、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ１遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。具体的には、以下のようにして行った。
【００６２】
合成二本鎖ｓｉＲＮＡの調製
前記５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ａ６、Ａ２２、Ａ３３、Ａ５６及びＡ５８）は、配列表の配列番号１〜５の１９塩基の配列及びその相補配列それぞれの３’末端にＴＴ配列からなる２塩基オーバーハング部分を加えたＲＮＡ鎖を、定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。また、前記３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号６〜８の配列及びその相補配列のＲＮＡ鎖を定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。以下のＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果の確認に際しては、適宜、ＨＰＬＣ等で精製したものを使用した。
【００６３】
細胞及び培養法
ＲＮＡｉ効果の確認には、ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株ＳＡＳに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を導入して分離したＧＦＰ安定発現株ＧＦＰ−ＳＡＳ細胞を用いた。前記細胞の培養には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を増殖培養液として用い、空気中に５％の割合で炭酸ガスを含む培養器内で、３７℃で行った。
【００６４】
合成二本鎖ｓｉＲＮＡの細胞内導入
６０ｍｍ径プラスチックペトリ皿（商標：Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、８×１０5個の前記ＧＦＰ−ＳＡＳ細胞を植え込み、２４時間培養後ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて２回洗浄し、１ｎＭの合成二本鎖ｓｉＲＮＡを含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）溶液を加えた。５時間後１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに培地交換した。
【００６５】
ウエスタンブロッティング法
上述のとおり、合成二本鎖ｓｉＲＮＡを導入後４８時間培養した後に、細胞をＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて可溶化した。前記可溶化試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動）にて展開し、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、２時間ＰＤＶＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｕｏｅｉｄｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。転写後は、５％スキムミルク（和光純薬社製）を含むＴ−ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて４℃、１晩ブロッキングした。さらに、一次抗体をブロッキング溶液にて希釈し、室温にて１時間反応させ、前記Ｔ−ＴＢＳ溶液にて３回洗浄後、二次抗体を同様に１時間反応させた。ＥＣＬｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて発色させた後、ＬＡＳ３０００（富士フィルム社製）を用いてデジタル画像化した。
【００６６】
細胞増殖評価法
前記ＧＦＰ−ＳＡＳ細胞に前記合成二本鎖ｓｉＲＮＡを導入した細胞を、６ウェルマイクロプレート（商標：Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に５×１０4個植え込み、４日間培養した後、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて細胞を回収し、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて細胞数を計測した。
【００６７】
ＲＮＡｉ効果についての結果
前記８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡを前記培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞株ＧＦＰ−ＳＡＳに導入し、上述のとおり、ＲＮＡｉ効果をＡｋｔ１タンパク質の発現レベルで評価した。その結果、前記８種類の全ての合成二本鎖ｓｉＲＮＡが、１ｎＭの濃度で標的遺伝子Ａｋｔ１の発現を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図１に示す。同図において、上段が、Ａｋｔ１タンパク質に対するウエスタンブロッティングの結果を示し、下段が、内部対照マーカーであるβ−チューブリンに対するウエスタンブロッティングの結果を示す。また、同図において、一番左のレーンは、ＧＦＰ遺伝子に対する合成二本鎖ｓｉＲＮＡ（２１塩基オーバーハング）を導入した場合のコントロールである。同図に示すとおり、前記８種類の中でも、Ａ５８、Ａ１３９２、及びＡ２２３９の３種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、８０％以上の顕著なＲＮＡｉ効果を示した。
【００６８】
細胞増殖抑制効果についての結果
前記８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡを前記培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞株ＧＦＰ−ＳＡＳに導入し、上述のとおり、細胞増殖抑制効果を評価した。その結果、前記８種類の全ての合成二本鎖ｓｉＲＮＡが、１ｎＭの濃度で前記口腔癌細胞の増殖を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図２に示す。同図において、左３レーンは、左から、それぞれ、ｓｉＲＮＡを導入しなかった場合、ＧＦＰを標的とした２１塩基オーバーハングｓｉＲＮＡを導入した場合、及び、ＧＦＰを標的とした２７塩基ブラントエンドｓｉＲＮＡを導入した場合のコントロールである。また、同図において、縦軸は、前記ｓｉＲＮＡを導入しなかった場合の細胞数を１とした場合の相対的な細胞数を示す。同図に示すとおり、前記８種類の中でも、Ａ５６、Ａ５８、及びＡ１３９２の３種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、７０％以上の顕著な口腔癌細胞の増殖抑制効果を示した。
【００６９】
上述のとおり、前記８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、１ｎＭという超低濃度でも、有意なＡｋｔ１遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果及び口腔癌細胞の増殖抑制効果を示した。そのなかでも、Ａ５８及びＡ１３９２は、とりわけ優れたＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を示した。
【実施例２】
【００７０】
Ａｋｔ１遺伝子が口腔癌に共通して発現しており、Ａｋｔ１タンパク質が口腔癌の腫瘍マーカーとなることを確認した。
【００７１】
Ａｋｔ１タンパク質の検出
１０種類の口腔癌細胞株におけるＡｋｔ１タンパク質を、ウェスタンブロットにより検出した。その結果の一例を図３に示す。前記ウェスタンブロットは、定法により行った。同図において、第１レーンは、不死化ヒト角化上皮細胞を使用した非口腔癌細胞のコントロールであり、第２〜１１レーンは、培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞株由来の試料である。同図に示すとおり、Ａｋｔ１タンパク質は、口腔癌細胞にのみ共通して発現していた。
【００７２】
口腔癌組織におけるＡｋｔ１タンパク質の免疫組織化学染色
抗Ａｋｔ１タンパク質抗体を用いて、６３症例の口腔扁平上皮癌組織について定法により免疫組織化学染色し、前記口腔癌組織におけるＡｋｔ１の陽性率を確認した。前記免疫化学染色の一例を図４に示す。同図において左図は、正常口腔粘膜を使用したコントロールである。前記口腔癌組織におけるＡｋｔ１陽性率の結果を下記表２に示す。同表のとおり、免疫組織化学染色によるＡｋｔ１の陽性率は９０％を超えており、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、極めて有用であることが確認された。
【００７３】
【表２】
0005232990.tif 000005
【実施例３】
【００７４】
上記表１Ａに示すＡｋｔ１遺伝子を標的とした８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡの口腔癌細胞浸潤増殖抑制効果を確認した。すなわち、５×１０4個のＧＦＰ-ＳＡＳ細胞を０．５ｍｌのコラーゲンゲルに封入したのち、１ｎＭの濃度で合成ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した。４日間培養したのち、コラゲナーゼでコラーゲンゲルを分解し、細胞を回収し、細胞数を計測した。その結果を図６に示す。同図に示すとおり、前記８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡはすべて有意に口腔癌細胞の浸潤増殖を抑制できることが示された。
【実施例４】
【００７５】
上記表１Ａに示すＡｋｔ１遺伝子を標的とした８種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡのインビボにおける抗腫瘍活性の効果をヌードマウス背部皮下腫瘍モデルを用いて確認した。すなわち、ＧＦＰ−ＳＡＳ細胞１×１０6個を６週齢雄のＢａｌｂ／Ｃヌードマウス背部皮下に移植して腫瘍形成を確認した後、合成二本鎖ｓｉＲＮＡをアテロコラーゲン（商品名：ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ、高研社製）と混合して投与した。前記投与は、腫瘍周囲に注入する局所投与（６日間隔、３回）と静脈内投与（４日間隔、３回）の２つの方法で行った。腫瘍体積を長径×短径×高さ×０．５２３６の計算式を用いて算出し、合成二本鎖ｓｉＲＮＡの抗腫瘍活性を評価した。
【００７６】
Ａｋｔ１遺伝子を標的とした合成二本鎖ｓｉＲＮＡとしてＡ２２及びＡ５８を用い、対照としてｓｉＲＮＡを導入しない偽処理（−）及びＧＦＰを標的とした２１塩基オーバーハングｓｉＲＮＡをコントロールとして用いた場合の結果を図７及び図８に示す。図７は局所投与の結果であり、図８は全身投与（静脈投与）の結果である。図７（Ａ）に示すとおり、Ａ２２及びＡ５８を局所投与した場合、ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞の腫瘍形成を著しく抑制できることが確認された。図７（Ｂ）は、ヌードマウスの背部の脊椎を挟んで左右に腫瘍を形成させ、左側にＡ５８、右側にコントロールを局所投与した結果の一例を示す写真である。図７（Ｂ）に示すとおり、Ａｋｔ１遺伝子を標的とした本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡの抗腫瘍活性は視覚的にも明らかであった。図８（Ａ）に示す全身投与の結果も同様にＡ２２及びＡ５８が腫瘍形成を著しく抑制できたことを示す。図８（Ｂ）は形成された腫瘍を取り出して大きさを計測した写真であって、上段は光学写真、下段はＧＦＰの蛍光を撮影した写真である。このように局所投与及び全身投与のいずれの場合もＡｋｔ１遺伝子を標的とした本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、優れた抗腫瘍活性を示した。これらの結果は、本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡの癌治療への臨床応用が可能であることを示す。
【実施例５】
【００７７】
前記表１Ｂの５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｂ３６、Ｂ１７２、Ｂ４３１、Ｂ４７７；それぞれ、配列表の配列番号１０〜１４）と、３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｂ３３、Ｂ３９０、Ｂ４７５；それぞれ、配列表の配列番号１５〜１７）の８種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、それぞれの合成二本鎖ｓｉＲＮＡについて、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ２遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を２種類のヒト口腔癌細胞株（ＧＦＰ−ＡＣＣ２及びＧＦＰ−ＡＣＣＭ）において確認した。
【００７８】
使用したいずれの口腔癌細胞株も実施例１のＧＦＰ−ＳＡＳ株と同様に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を導入して分離したＧＦＰ安定発現株である。これらの細胞における１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ２遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果の結果の一例を図９（ＧＦＰ−ＡＣＣ２細胞株）及び図１０（ＧＦＰ−ＡＣＣＭ細胞株）に示す。なお、これらの図には、Ｂ３６、Ｂ１７２、Ｂ３９５、Ｂ４３１及びＢ４７７についての結果のみを示す。両図において上段の棒グラフは前記口腔癌細胞株の肝細胞増殖因子依存性浸潤増殖に対する本発明のＡｋｔ２標的ｓｉＲＮＡによる細胞増殖抑制効果を示し、下段の写真はＡｋｔ２タンパク質のウェスタンブロットの結果であってＲＮＡｉ効果を示す。これらの結果が示すとおり、本発明のＡｋｔ２遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡは、口腔癌細胞においてＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を発揮しうることが示さ
れた。
【実施例６】
【００７９】
前記表１Ｃの５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｃ１６９、Ｃ４９８、Ｃ９４１、Ｃ１２２９、Ｃ１３２１；それぞれ、配列表の配列番号１９〜２３）と、３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｃ１６６、Ｃ４９６、Ｃ１２２４；それぞれ、配列表の配列番号２４〜２６）の８種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、実施例５と同様にして、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ３遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。
【００８０】
１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ３遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果の結果の一例を図１１（ＧＦＰ−ＡＣＣ２細胞株）及び図１２（ＧＦＰ−ＡＣＣＭ細胞株）に示す。なお、これらの図には、Ｃ１６９、Ｃ４９８、Ｃ９４１、Ｃ１２９９及びＣ１３２１についての結果のみを示す。両図において上段の棒グラフは前記口腔癌細胞株の肝細胞増殖因子依存性浸潤増殖に対する本発明のＡｋｔ３標的ｓｉＲＮＡによる細胞増殖抑制効果を示し、下段の写真はＡｋｔ３タンパク質のウェスタンブロットの結果であってＲＮＡｉ効果を示す。これらの結果が示すとおり、本発明のＡｋｔ３遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡは、口腔癌細胞においてＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を発揮しうるこ
とが示された。
【実施例７】
【００８１】
Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子が口腔癌に共通して発現又は過剰発現しており、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質が口腔癌の腫瘍マーカーとなりうることを確認した。
【００８２】
その結果を図１３に示す。図１３（Ａ）は、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質のウェスタンブロットの結果であって、唾液腺の正常組織及び正常上皮細胞ではＡｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質が検出されないのに対し、ヒト口腔癌細胞株（ヒト唾液腺癌細胞株）であるＧＦＰ−ＡＣＣ２及びＧＦＰ−ＡＣＣＭ細胞ではＡｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質が過剰発現されていることを示す。また、図１３（Ｂ）は、実際に６症例の口腔癌患者の正常粘膜部（Ｎ）及び患部（Ｔ）試料を用いてそれぞれＡｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質の過剰発現をウェスタンブロットで検出した結果の一例を示す。この６症例においては、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質の（過剰）発現は、それぞれ、１００％及び５０％の陽性率を示した。
【実施例８】
【００８３】
前記表１Ｂの５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｂ３６、Ｂ１７２、Ｂ４３１、Ｂ４７７；それぞれ、配列表の配列番号１０〜１４）と、３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｂ３３、Ｂ３９０、Ｂ４７５；それぞれ、配列表の配列番号１５〜１７）の８種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）の細胞について、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ２遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。培地としてダルベッコ改変イーグル培地に換えてＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた他は実施例１と同様にして行った。
【００８４】
その結果の一例を図１４に示す。図１４（Ａ）は、ＰＣ−３細胞内のＡｋｔ２タンパク質をウェスタンブロットで確認した結果の一例を示す図である。なお、実施例1と同様に内部対照マーカーとしてβ−チューブリンを使用したが図示していない。図１４（Ｂ）は、Ｂ３３、Ｂ３６、Ｂ１７２について前立腺癌細胞増殖抑制効果を定量化したグラフである。これらの図に示すとおり、Ａｋｔ２遺伝子を標的とした本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡはすべて８０％以上の顕著なＲＮＡｉ効果と十分な前立腺癌細胞増殖抑制効果を示した。
【実施例９】
【００８５】
前記表１Ｃの５種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｃ１６９、Ｃ４９８、Ｃ９４１、Ｃ１２２９、Ｃ１３２１；それぞれ、配列表の配列番号１９〜２３）と、３種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｃ１６６、Ｃ４９６、Ｃ１２２４；それぞれ、配列表の配列番号２４〜２６）の８種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）の細胞について、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡｋｔ３遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。培地としてダルベッコ改変イーグル培地に換えてＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた他は実施例１と同様にして行った。
【００８６】
その結果の一例を図１５に示す。図１５（Ａ）は、ＰＣ−３細胞内のＡｋｔ３タンパク質をウェスタンブロットで確認した結果の一例を示す図である。なお、実施例1と同様に内部対照マーカーとしてβ−チューブリンを使用したが図示していない。図１５（Ｂ）は、Ｃ１６９、Ｃ１２２４、Ｃ１３２１について前立腺癌細胞増殖抑制効果を定量化したグラフである。これらの図に示すとおり、Ａｋｔ３遺伝子を標的とした本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡはすべて８０％以上の顕著なＲＮＡｉ効果と十分な前立腺癌細胞増殖抑制効果を示
した。
【実施例１０】
【００８７】
Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、及び、Ａｋｔ３標的ｓｉＲＮＡの前立腺癌に対する併用効果
本発明のＡｋｔ１、Ａｋｔ２、及び、Ａｋｔ３を標的としたｓｉＲＮＡのうち少なくとも２種類を併用すると、それぞれ単独で使用する場合よりも効率的に前立腺癌の細胞増殖を抑制できることを確認した。Ａｋｔ１を標的としたｓｉＲＮＡとして上記表１ＡのＡ２２３９のｓｉＲＮＡを使用し、Ａｋｔ２を標的としたｓｉＲＮＡとして上記表１ＢのＢ４７７のｓｉＲＮＡを使用し、Ａｋｔ３を標的としたｓｉＲＮＡとして上記表１ＣのＣ１３２１のｓｉＲＮＡを使用した場合の結果の一例を図１６に示す。同図の結果ではＡｋｔ２を標的としたｓｉＲＮＡが著しい細胞増殖抑制効果を示すが、例えば、これとともにＡｋｔ１及び/又はＡｋｔ３を標的としたｓｉＲＮＡを用いれば、単独で得られる効果よりも一層優れた細胞増殖抑制効果が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上説明したとおり、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果及びインターフェロン応答を回避しつつ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３遺伝子特異的なＲＮＡｉを媒介できるから、例えば、臨床応用が可能であり、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２又はＡｋｔ３を標的分子とした医療や医薬組成物の分野、例えば、口腔癌を含む癌治療に関する治療や医薬組成物の分野で有用である。その他、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、例えば、学術及び基礎医学的研究開発分野においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ１遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果をウエスタンブロッティングで確認した結果の一例である。
【図２】図２は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの口腔癌細胞増殖抑制効果を確認した結果の一例である。
【図３】図３は、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株におけるＡｋｔ１タンパク質を検出したウェスタンブロットの結果の一例である。
【図４】図４は、正常口腔粘膜（左図）及び口腔扁平上皮癌（右図）について、抗Ａｋｔ１抗体を用いて免疫組織化学染色をした写真の一例である。
【図５】図５は、口腔癌における治療標的分子としてＡｋｔ１遺伝子を同定した工程を説明するフロー図である。
【図６】図６は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの口腔癌細胞浸潤増殖抑制効果を確認した結果の一例である。
【図７】図７は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの局所投与による抗腫瘍活性を確認した結果の一例である。
【図８】図８は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの全身（静脈）投与による抗腫瘍活性を確認した結果の一例である。
【図９】図９は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ２遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果及び口腔癌細胞増殖抑制効果を確認した結果の一例である。
【図１０】図１０は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ２遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果及び口腔癌細胞増殖抑制効果を確認した結果のその他の例である。
【図１１】図１１は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ３遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果及び口腔癌細胞増殖抑制効果を確認した結果の一例である。
【図１２】図１２は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ３遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果及び口腔癌細胞増殖抑制効果を確認した結果のその他の例である。
【図１３】図１３は、正常細胞及び口腔癌細胞におけるＡｋｔ２及びＡｋｔ３タンパク質の発現を確認した結果の一例である。
【図１４】図１４は、本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ２遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果（Ａ）及び前立腺癌細胞増殖抑制効果（Ｂ）を確認した結果の一例である。
【図１５】図１５は、本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡのＡｋｔ３遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果（Ａ）及び前立腺癌細胞増殖抑制効果（Ｂ）を確認した結果の一例である。
【図１６】図１６は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３遺伝子を標的とした本発明の合成二本鎖ｓｉＲＮＡの前立腺癌細胞増殖抑制における併用効果を確認した結果の一例である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ａ６
配列番号２  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ａ２２
配列番号３  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ａ３３
配列番号４  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ａ５６
配列番号５  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ａ５８
配列番号６  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ａ１３９２
配列番号７  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ａ２２２４
配列番号８  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ａ２２３９
配列番号１０  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｂ３６
配列番号１１  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｂ１７２
配列番号１２  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｂ３９５
配列番号１３  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｂ４３１
配列番号１４  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｂ４７７
配列番号１５  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｂ３３
配列番号１６  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｂ３９０
配列番号１７  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｂ４７５
配列番号１９  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｃ１６９
配列番号２０  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｃ４９８
配列番号２１  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｃ９４１
配列番号２２  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｃ１２２９
配列番号２３  オーバーハングｓｉＲＮＡ  Ｃ１３２１
配列番号２４  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｃ１６６
配列番号２５  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｃ４９６
配列番号２６  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  Ｃ１２２４
【図１】
0005232990.tif 000006
【図２】
0005232990.tif 000007
【図３】
0005232990.tif 000008
【図４】
0005232990.tif 000009
【図５】
0005232990.tif 000010
【図６】
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【図７】
0005232990.tif 000012
【図８】
0005232990.tif 000013
【図９】
0005232990.tif 000014
【図１０】
0005232990.tif 000015
【図１１】
0005232990.tif 000016
【図１２】
0005232990.tif 000017
【図１３】
0005232990.tif 000018
【図１４】
0005232990.tif 000019
【図１５】
0005232990.tif 000020
【図１６】
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【配列表】
0005232990000001.app