(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において２０個以下のアミノ酸が置換、
挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記相同性は、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７／ネットワーク版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用して求めているポリペプチド。
【請求項２】
アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）属に属する微生物に由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）に由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、又は（ｇ）のＤＮＡ：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において５０個以下の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列表配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、前記相同性が、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７／ネットワーク版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用して求めているＤＮＡ、
（ｇ）配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後に、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４又は５のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換体、または、請求項８に記載のアネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項７に記載の形質転換体、または請求項８に記載のアネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）を、５−置換ヒダントインに作用させ、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生産する新規な５−置換ヒダントインをＤ体選択的に加水分解して対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼと称する）、これをコードするＤＮＡ、及びヒダントイナーゼを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸は、対応する光学活性なＤ−アミノ酸に容易に変換できる化合物であり、また、光学活性なＤ−アミノ酸は医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造方法としては、微生物が生産する酵素を５−置換ヒダントインに作用させることにより、立体選択的に加水分解して対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換する方法が一般に知られている（特許文献１、２、３）。【０００３】
また、ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を導入することにより、ヒダントイナーゼ活性を有する形質転換体を製造する技術としては、高温菌由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献４）、アグロバクテリウム属に属する微生物由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献５）、バチルス属、アグロバクテリウム属、及びシュードモナス属に属する微生物由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献６）等が知られている。
【特許文献１】特開昭５３−９１１８９号
【特許文献２】特開昭５３−４４６９０号
【特許文献３】特開昭５３−１３３６８８号
【特許文献４】特開昭６２−８７０８９号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ９４／００５７７号公報
【特許文献６】国際公開第ＷＯＷＯ９６／２０２７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
背景技術として記載した上記の微生物または形質転換体等によって生産されるヒダントイナーゼは、一般に、基質であるヒダントインの５位の置換基が大きい（または嵩高い側鎖を有する）ほど立体選択性が厳密になる傾向にあることが知られているが、例えば５−メチルヒダントインのように５位の置換基が小さなヒダントインに対しては立体選択性が厳密ではなく、光学純度の高いＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を得ることが困難である場合がある。【０００５】
本発明の目的の一つは、基質である５−置換ヒダントインの置換基の大きさにかかわらず、高い立体選択性を示す新規なヒダントイナーゼを提供することにある。また、本発明の目的の一つは、当該ヒダントイナーゼのアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該ヒダントイナーゼの製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的の一つは、当該ヒダントイナーゼを利用した効率的なＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み、アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）が、各種５-置換ヒダントインに対して活性を示す一方で、５位の置換基が非常に小さなヒダントイン、例えば５−メチルヒダントインのような基質に対しても高い立体選択性を示すヒダントイナーゼを生産することを見出した。【０００７】
さらに、当該ヒダントイナーゼ遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成し、高活性な形質転換体を育種した。本発明で得られたヒダントイナーゼを生産する微生物、または形質転換体を５−置換ヒダントインに作用させることにより、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を効率的に製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７３％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
５）本発明の一つの特徴は、以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のＤＮＡである：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列表配列番号２に示される塩基配列と６９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｇ）配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
６）本発明の一つの特徴は、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドである。
７）本発明の一つの特徴は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
８）本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）属に属する微生物である。
９）本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法である。
１１）本発明の一つの特徴は、前記ヒダントイナーゼ（ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、５−置換ヒダントインに作用させＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸（例えば、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸）を製造する方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は上述の構成からなり、新規なヒダントイナーゼを効率よく製造することができる。また、当該ヒダントイナーゼを生産する微生物、または形質転換体を利用することで、５位の置換基が小さいものを含む各種ヒダントインから、光学純度の高いＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
１．ヒダントイナーゼ活性測定
実施形態において、ポリペプチドのヒダントイナーゼ活性測定は、反応で生成するＮ−カルバモイルアミノ酸を、以下に示すｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いた発色法で定量することができる。【００１１】
適宜希釈した酵素溶液０．１ｍＬを、５００ｍＭ  ＤＬ−５−メチルヒダントイン、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．７）からなる基質液４ｍＬと混合し、４５℃で１０分間反応させた後、２Ｎ  塩酸２ｍＬを加えて反応を停止する。この反応液に１０％(ｗ／ｖ)ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド／３５％塩酸溶液１ｍＬを添加して混合後、４４０ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成したＮ−カルバモイルアラニンの量を定量する。
２．微生物
実施形態のポリペプチドは、ヒダントイナーゼ活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例として、好ましくはアネウリニバチルス（Aneurinibacillus）属に属する微生物が挙げられ、なかでもアネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）が好ましい。さらに好ましくは、本発明者らが土壌より新たに分離したアネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株である。なお、本発明で得られたアネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株は平成１８年１１月２０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番１号）に寄託されている。【００１２】
以下に、アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株の菌学的性質を示す。
２−１．形態
１）直径０．８μｍ、長さ２．０〜３．０μｍ程度の桿菌
２）グラム染色：不定
３）運動性：あり
４）胞子形成：あり
２−２．培養的性質
１）ニュートリエントアガー（オキソイド製）培地でのコロニー形態：淡黄色、不規則形、中央隆起、周縁波状、表面スムーズ、不透明
２）生育温度：２０℃生育性有り、３０℃生育性あり、４５℃生育性あり、５５℃生育性なし
３）嫌気条件下での生育性：なし
２−３．生理学的試験
１）カタラーゼ活性：＋
２）オキシダーゼ活性：＋
３）グルコースからの酸/ガス産生：−／−
４）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
５）酸化試験
グリセロール：＋
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：−
リボース：＋
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
β−メチル−Ｄ−キシロース：−
ガラクトース：−
フラクトース：＋
マンノース：−
ソルボース：−
ラムノース：−
ズルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：−
ソルビトール：−
α−メチル−Ｄ−マンノース：−
α−メチル−Ｄ−グルコース：−
Ｎ−アセチルグルコサミン：−
アミグダリン：−
アルブミン：−
エスクリン：−
サリシン：−
セロビオース：−
マルトース：−
乳糖：−
メリビオース：−
白糖：−
トレハロース：−
イヌリン：−
メレチトース：−
ラフィノース：−
澱粉：−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：−
Ｄ−ツラノース：−
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：−
２−ケトグルコン酸：−
５−ケトグルコン酸：−
６）β−ガラクトシダーゼ活性：−
７）アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
８）リシンデカルボキシラーゼ活性：−
９）オルチニンデカルボキシラーゼ活性：−
１０）クエン酸の利用性：−
１１）Ｈ2Ｓ産生：−
１２）ウレアーゼ活性：−
１３）トリプトファンデアミナーゼ活性：−
１４）インドール産生：−
１５）アセトイン産生（ＶＰ）：＋
１６）ゼラチナーゼ活性：−
１７）硝酸塩還元：＋
１８）カゼインの加水分解：−
１９）資化性
Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム：＋
Ｄ−フラクトース：＋
フマル酸ナトリウム：＋
Ｄ−グルコン酸ナトリウム：＋
Ｄ−グルコサミン：−
グルタミン酸ナトリウム：＋
ＤＬ−グリセリン酸ナトリウム：−
グリセロール：＋
ＤＬ−乳酸ナトリウム：＋
ラクトース：−
Ｄ−リンゴ酸ナトリウム：＋
マルトース：−
プトレスシン：＋
Ｌ−ソルボース：−
サッカロース：−
Ｌ−酒石酸ナトリウム：−
Ｄ−トレハロース：−
２−４．１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を決定し、国際塩基配列データベース（GeneBank,DDBJ,EMBL）に対し、検索ソフトとしてＢＬＡＳＴを使用して相同性検索を行なった結果、最も高い相同性を示した菌はアネウリニバチルス・ミグランス（Aneurinibacillus migulanus）ＤＳＭ２８９５株であり、相同率は９９．９％であった。【００１３】
なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。【００１４】
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。【００１５】
更に、ヒダントイナーゼの生産を増強させるような物質、例えば、ウラシル等のピリミジン系代謝産物、塩化マンガン、硫酸マンガン等の金属塩等を少量添加することもできる。これらヒダントイナーゼ生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下である。【００１６】
培養は通常好気的に行い、培養温度としては１０℃以上、６０℃以下が好ましく、さらに好ましくは２０℃以上、５０℃以下である。培養ｐＨは、ｐＨ３以上、１１以下が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５以上、９以下であり、培養時間は１日以上、５日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００１７】
培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
３．アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。【００１８】
また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７３％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、ヒダントイナーゼ活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。なお、実施形態における「相同性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示として遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７／ネットワーク版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用した。【００１９】
また、「ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記「１．ヒダントイナーゼ活性測定」の項目で説明した活性測定条件において活性が検出可能なものであればよいが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上の活性を有していることが好ましく、さらに好ましくは４０％以上、６０％以上、より好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
４．ＤＮＡ
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２で示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがヒダントイナーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０アミノ酸以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。【００２０】
また、配列番号２で示される塩基配列と６９％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。【００２１】
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」は、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。前記ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイゼーションを実施した後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、上記条件でハイブリダイゼーションを実施した後に、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００２２】
本発明のＤＮＡ（ヒダントイナーゼ遺伝子）は、前述したようなヒダントイナーゼ活性をもつ微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。【００２３】
まず、ヒダントイナーゼ活性を有する微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡは、培養された細胞から、Ｍａｒｍｕｒ法（J.Mol.Biol.,3,208(1961)参照）等の方法を用いて得られる。次に染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ等で部分分解した後に、適当なベクタープラスミド、例えば制限酵素ＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより、種々の染色体ＤＮＡの断片を持つ遺伝子ライブラリーとして得ることができる。そして、この遺伝子ライブラリーから目的とするヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドを選択するには、形質転換体が生産するタンパク質を酵素活性等の指標として検出する方法（後述の実施例１参照）、あるいは目的ヒダントイナーゼを精製し、そのＮ末端又は内部アミノ酸配列を解析し、それに対応するＤＮＡプライマーを合成し、コロニー・ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法によって遺伝子の存在を検出する方法等が挙げられる。【００２４】
選択されたプラスミドに挿入された染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、断片中に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を決定する。このＯＲＦの中より既知ヒダントイナーゼの塩基配列と相同性の高いものを選ぶことにより、目的とするヒダントイナーゼ遺伝子の全長塩基配列を得ることができる。
５．形質転換体・ベクター
上記方法によって取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。【００２５】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属またはストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物を用いることができる。【００２６】
ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物として、例えば、菌学的性質が当業者に周知であって、形質転換用に提供されているエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは市販されているｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社）、ｐＡＣＹＣ１８４（株式会社 ニッポンジーン）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＣ１０１（フナコシ株式会社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（タカラバイオ株式会社）、又は国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造しうるｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。【００２７】
形質転換体の一例として、アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株から上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＮＴに組み込んだ組換えプラスミドｐＡＬＨ１０１を用いてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）を得ることができる。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS  FOR  LIFE  SCIENCE」（東洋紡績株式会社、1993年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１と同様の菌学的性質を有する。【００２８】
本発明の実施形態として得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）は平成１７年１１月１５日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７１２として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番１号）に寄託されている。【００２９】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
６．形質転換体等の培養
本発明のヒダントイナーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造に利用することができる。【００３０】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マンガン塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。【００３１】
培養温度は２５℃以上、４０℃以下が好ましく、２５℃以上、３７℃以下がさらに好ましい。また、培養ｐＨはｐＨ４以上、９以下が好ましく、ｐＨ５以上、８以下がさらに好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００３２】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
７．Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造方法
実施形態で得られるヒダントイナーゼを使用することによる、効率的なＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の製造方法について説明する。Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸は５−置換ヒダントインにヒダントイナーゼを作用させ、立体選択的に加水分解することにより得ることができる。５−置換ヒダントインはラセミ体であってもよく、また、Ｌ体あるいはＤ体のような光学活性体であってもよい。ヒダントイナーゼによる立体選択的加水分解反応と、基質の化学的なラセミ化が同時に進行することにより、ラセミ体、Ｌ体、またはＤ体のいずれの５−置換ヒダントインを基質とした場合からでも、すべて対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換されうる。【００３３】
本反応の基質である下記の一般式（１）【００３４】
【化１】
0005159319.tif 000002
【００３５】
で表される５−置換ヒダントインは本酵素により加水分解されるものであれば特に限定されないが、Ｒで示される置換基としては、例えば、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を挙げることができる。上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基、などが挙げられる。【００３６】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、または４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。【００３７】
また、５位の置換基が小さいヒダントインとしては、例えば前記式（１）で表される５−置換ヒダントインにおいて、Ｒで示される置換基が置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基であるものを挙げることができる。置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、３−グアニジノプロピル基等が挙げられる。【００３８】
実施形態としての本反応は、上記基質に前述のヒダントイナーゼを作用させ、水性溶媒中で反応を行なう。本反応の基質仕込み濃度は好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下である。基質は溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は好ましくは１０℃以上、８０℃以下、さらに好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、反応ｐＨは好ましくはｐＨ４以上、１２以下、さらに好ましくはｐＨ６以上、１０以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。また本反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。【００３９】
本反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２相系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。金属としては、特に限定されないが、マンガン、コバルト、ニッケル、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、または、銅等、あるいはそれらの塩が挙げられ、好ましくは、マンガン、またはコバルトの金属あるいはそれらの塩が挙げられる。これらの金属は単独で用いてもよいし、２種類以上の金属を組み合わせて用いてもよい。
８．生成物の単離
生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。また、上記記載の方法にて得られたＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸は、化学的、または脱カルバモイル活性を有する酵素の作用により、容易に対応するＤ−アミノ酸に変換することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４１】
（実施例１）ヒダントイナーゼ遺伝子の単離
アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３５）を５００ｍＬ坂口フラスコ内で滅菌した１００ｍＬの培地Ａ（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、滅菌前ｐＨ７．５）に植菌して３７℃で３０時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、Ｍａｒｍｕｒ法を用いて染色体ＤＮＡを調製した。【００４２】
得られた染色体ＤＮＡ１００μｇに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１０Ｕ添加し、３７℃にて３０分間作用させて、部分分解を行なった。次いで、部分分解した染色体ＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動し、約４〜９Ｋｂｐと推定される大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。一方、別にプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩを用いて完全分解したものと、先にアガロースゲルから回収したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、多種の染色体ＤＮＡ断片をもつプラスミドの混合液を得た。このプラスミド混合液をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地Ｂ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、塩化マンガン２０ｍｇ、イソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）２４ｍｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１Lにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリン及びＩＰＴＧは滅菌後に添加した。）にプレーティングして、種々の染色体ＤＮＡ断片を含有する形質転換体をコロニーとして取得した。【００４３】
得られた形質転換体のコロニーをろ紙にレプリカし、反応液（０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５−メチルヒダントイン１．０％、フェノール０．１％、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）１．４Ｕ／ｍＬ、デカルバモイラーゼ粗酵素液（後述の参考例１参照）５０％（ｖ／ｖ）、パーオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）０．０７Ｕ／ｍＬ、０．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン）に浸して、３７℃で５時間静置した。赤色を呈したコロニーを選択し、試験管内にて滅菌した培地Ｃ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１Ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌して、３７℃にて２４時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、プラスミドを取得した後、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトに挿入された約４．４Ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。この染色体ＤＮＡ断片に含まれていたヒダントイナーゼ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。上記形質転換体の菌体を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の粗酵素液を取得した。得られた粗酵素液を用いてヒダントイナーゼ活性を測定したところ、活性が確認され、本ＯＲＦが目的とするヒダントイナーゼ遺伝子であることを確認した。なお、ヒダントイナーゼの活性は、以下の方法に従って測定した。適宜希釈した酵素溶液０．１ｍＬを、５００ｍＭ  ＤＬ−５−メチルヒダントイン、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．７）からなる基質液４ｍＬと混合し、４５℃で１０分間反応させた後、２Ｎ  塩酸２ｍＬを加えて反応を停止した。この反応液に１０％(ｗ／ｖ)ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド／３５％塩酸溶液１ｍＬを添加して混合後、４４０ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成したＮ−カルバモイルアラニンの量を定量した。【００４４】
（実施例２）ヒダントイナーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
実施例１で得られたヒダントイナーゼ遺伝子を有するプラスミドを鋳型として、ヒダントイナーゼ遺伝子のＮ末端に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号３）及び、ヒダントイナーゼ遺伝子の１２２８塩基目に存在するＮｄｅＩの切断部位をアミノ酸置換が起こらないように変更したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約１．２ＫｂｐのＮ末側ＤＮＡ断片を得た。同様にヒダントイナーゼのＣ末端部分に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号５）及び、ヒダントイナーゼ遺伝子の１２２８塩基目に存在するＮｄｅＩの切断部位をアミノ酸置換が起こらないように変更したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号６）を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約０．２ＫｂｐのＣ末側ＤＮＡ断片を得た。上記Ｎ末側ＤＮＡ断片とＣ末側ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ−１及びＰｒｉｍｅｒ−３を用いたＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、配列表の配列番号７に示されるＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、ヒダントイナーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計されたプラスミドｐＡＬＨ１０１を取得した。【００４５】
（実施例３）ヒダントイナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例２で得られたプラスミドｐＡＬＨ１０１をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地Ｃ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１Ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加した。）にプレーティングして、ヒダントイナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７１２）をコロニーとして取得した。【００４６】
得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した６ｍＬの培地Ｄ（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、塩化マンガン４００ｍｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１Ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２２時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の粗酵素液を取得した。得られた粗酵素液を用いて、実施例１と同様の方法に従ってヒダントイナーゼ活性を測定したところ、活性が確認された。【００４７】
（実施例４）アネウリニバチルス属細菌を利用したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの合成
アネウリニバチルス・エスピー（Aneurinibacillus sp.）ＫＮＫ４９１Ｃ株を５００ｍＬ坂口フラスコ内で滅菌した培地Ｅ（肉エキス２．０％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．３％、ウラシル０．５％、塩化マンガン４水和物０．００２％、滅菌前ｐＨ７．５）に植菌して３７℃で２０時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液に５−メチルヒダントイン１０．０ｇを添加し、６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを８．７に保ちつつ、５５℃にて２０時間攪拌した。生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの変換率をＨＰＬＣを用いて分析したところ、９６．３％であった。また、得られたＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したＤ−アラニンの光学純度をＨＰＬＣを用いて分析したところ、９６．１％ｅ．ｅ．であった。ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。
（変換率分析）カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８ＡＲＩＩ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、移動相：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．、カラム温度：２０℃、検出：２１０ｎｍ
（光学純度分析）カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、住化分析センター社製）、移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ．、カラム温度：１０℃、検出：２５４ｎｍ
（実施例５）ヒダントイナーゼ遺伝子形質転換体を利用したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの合成
実施例３で得たヒダントイナーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）を坂口フラスコ内にて滅菌した１００ｍＬの培地Ｄに植菌し、３７℃にて２４時間、好気的に振とう培養した。培養液１０ｍＬから遠心分離により菌体を集菌し、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１０ｍＬに懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液４０μＬに、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）１．９６ｍＬ、５−メチルヒダントイン４００ｍｇを添加して、１０Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを８．７に保ちつつ、５０℃にて２９時間攪拌した。生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの変換率を実施例４と同様の方法で分析したところ、９７．０％であった。また、得られたＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したＤ−アラニンの光学純度を実施例４と同様の方法で分析したところ、８９．９％ｅ．ｅ．であり、後述の比較例１に記述したバチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来ヒダントイナーゼ遺伝子形質転換体を利用した場合の反応と比較して、高い光学純度のＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンが得られた。【００４８】
（実施例６）遺伝子形質転換体の生産するヒダントイナーゼの基質特異性
実施例５で得たエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＡＬＨ１０１）の粗酵素液を用いて、各種ヒダントインに対する活性を測定した。ヒダントイナーゼの活性測定は、次のように実施した。基質溶液４ｍＬ（３０ｍＭ  各種ヒダントイン（ただし５−ベンジルヒダントインのみ１５ｍＭ）、０．１ｍＭ  塩化マンガン、５０ｍＭ  炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．７））と、適宜希釈した粗酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃で１５分間反応させた後、５Ｎ  ＨＣｌを２ｍＬ添加して反応を停止した。次いで、１０％（ｗ／ｖ）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド／３５％塩酸溶液１ｍＬを混合し、遠心分離して得られた上清の４４０ｎｍにおける吸光度を測定した。予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成したＮ−カルバモイルアミノ酸を定量した。表１は、５−メチルヒダントインを基質とした場合の活性を１００％としたときの相対活性値を示す。【００４９】
【表１】
0005159319.tif 000003
【００５０】
（比較例１）バチルス・エスピーＫＮＫ２４５株由来ヒダントイナーゼ遺伝子形質転換体を利用したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの合成
バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）を坂口フラスコ内にて滅菌した１００ｍＬの培地Ｄに植菌し、３７℃にて２４時間、好気的に振とう培養した。培養液から遠心分離により集菌し、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１０ｍＬに懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１６０μＬに、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）１．８４ｍＬ、５−メチルヒダントイン４００ｍｇを添加して、１０Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを８．７に保ちつつ、５０℃にて２９時間攪拌した。生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンの変換率を実施例４と同様の方法で分析したところ、９７．５％であった。また、得られたＮ−カルバモイル−Ｄ−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したＤ−アラニンの光学純度を実施例４と同様の方法で分析したところ、６９．７％ｅ．ｅ．であった。
（参考例１）形質転換微生物エシェリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）を用いたデカルバモイラーゼ粗酵素液の調製
実施例１で説明したコロニーの選択において使用するデカルバモイラーゼ粗酵素液の調製は、以下の方法で行った。遺伝子改変により耐熱性の向上したアグロバクテリウム・エスピー（Agrobacterium sp.）ＫＮＫ７１２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）を試験管内で滅菌した１０ｍＬの培地Ｆ（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１Ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌し、３７℃にて１２時間、好気的に振とう培養した。この培養液３．５ｍＬを、坂口フラスコ内で滅菌した３５０ｍＬの培地Ｃに植菌し、３７℃にて３０時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液を超音波処理にかけて菌体を破砕し、５０℃にて３０分間保温後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明の実施形態としてのヒダントイナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＡＬＨ１０１の構成を示す図である。
【図１】
0005159319.tif 000004
【配列表】
0005159319000001.app