(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定工程；
前記測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較工程；
前記測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程；
前記正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程；及び
前記第１比較工程及び前記第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する工程であって、前記第１比較工程におけるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値が第１の閾値以上である場合、又は前記第２比較工程における正規化した値が第２の閾値以上である場合に、試料中にがん細胞が存在すると判定する判定工程
を含む、がん細胞の存否を判定する方法。
【請求項２】
患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定工程；
前記測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較工程；
前記測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程；
前記正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程；
前記第１比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第１判定工程；及び
前記第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第２判定工程
を含む、がん細胞の存否を判定する方法。
【請求項３】
前記患者から採取された細胞が、リンパ節組織、血液、又は体腔洗浄液に含まれる細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程において、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値が、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡを核酸増幅法により増幅させて測定される値である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記がんマーカー遺伝子が、サイトケラチン、がん胎児性抗原、ＭＵＣ１ムチン、又はマンマグロブリンの遺伝子である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子又はα−チューブリン遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定手段；
前記測定手段により得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較手段；
前記測定手段により得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量を正規化する正規化手段；
前記正規化手段で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較手段；
第１比較手段及び第２比較手段により得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する判定手段；及び
前記判定手段により得られた判定結果を出力する出力手段
を含む、がん細胞の存否を判定する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者、特にがんの転移が疑われる患者から採取された細胞を含む試料中のがん細胞の存否を判定するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者から採取した試料中のがん細胞の存否を調べることは、例えばその試料が採取された組織や器官へのがん細胞の転移を判定するための指標となり得る。試料中のがん細胞の存否を判定するためには、従来、パパニコロウ染色などの組織細胞診が用いられていたが、この方法は、診断を行う人の経験などにより診断結果が異なること、検査に長時間を要することなどの問題があった。
【０００３】
そこで、最近では、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの分子病理検査の研究が盛んに行われるようになっている。分子病理検査は、組織や細胞などに含まれるがんマーカー遺伝子（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質のｍＲＮＡなど、以下、単にがんマーカーともいう）を検出することにより行うことができる。例えば、乳がんのリンパ節転移を判定するためのがんマーカー遺伝子としては、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のｍＲＮＡが有用であることが知られている。また、胃がんの転移を判定するためのがんマーカーとして、ＣＥＡのｍＲＮＡが有用であることが知られている。これらのがんマーカーは、正常な試料中のがんマーカーの発現量と転移してきたがん細胞が存在する試料中のがんマーカーの発現量との間に有意な差が認められる分子である。
がんマーカーの発現量に基づいて得られるがん細胞の存否の判定結果は、例えば医師が、患者のがん細胞の特定組織への転移を診断する指標とすることができる。
【０００４】
従来、このような分子検査を行う場合、試料毎に含まれる細胞数が異なるので、解析対象とするがんマーカーの量を細胞あたりの量に換算（正規化）して、試料中のがんマーカーの発現量を閾値と比較することにより、判定を行なっている。具体的には、例えば、がんマーカー遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞に一定量発現していると言われている遺伝子)の発現量で除してハウスキーピング遺伝子の発現量あたりのがんマーカーの量に換算することなどによる正規化（標準化）が行われている(非特許文献１)。
【０００５】
特開２００６−２２３３０３号（特許文献１）は、胃がんの再発を予測するための情報を得る方法として、所定の遺伝子のＰＣＲ増幅反応を行い、その増幅産物を測定する方法を記載している。より具体的には、測定結果をβ−アクチンにより正規化し、胃がんの再発判定をおこなった実施例４と、正規化を行わずに再発判定をおこなった実施例５が、それぞれ別の実施例として開示されている。
【特許文献１】２００６−２２３３０３号公報
【非特許文献１】M. Inokuchi et al., British Journal of Cancer (2003) 89, 1750-1756
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、正規化を行った結果に基づく判定方法は、均一系（解析対象である検体中の細胞の全てが実質的に同種の細胞）であることが前提として考えられている。例えば、正常細胞とがん細胞とが混在した試料の場合、がんマーカーの発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量で除して正規化された値は、正常細胞とがん細胞の比率によって変化してしまう。このため、判定結果が試料中の正常細胞とがん細胞との比率により左右されてしまう。
即ち、正規化を行った結果に基づく判定方法は、研究レベルで培養細胞のように均質な細胞を試料として用いた場合には有効な方法であるが、臨床検体のように患者から採取された試料には、正常細胞が混入することが通常であるため、そのまま適用することには問題があった。特に、がん転移の判定のために採取される試料は、がん細胞が存在するか否かが不明な試料であり、正規化を行った結果に基づく判定方法をそのまま適用することは困難であった。
【０００７】
これに対して、正規化を行わずにがんマーカーの発現量によって判定する方法は、患者から採取される試料中のがんマーカーの発現量が一定レベル以上であれば、がん細胞の検出を行うことができるため、上述した正規化における問題を解決することができる。一方、この方法においては、がんマーカーの発現量の測定に供される試料の量が一定量以上であることが必要となる。しかし、実際に、患者から採取される試料は、常に良好な状態でがんマーカーの発現量の測定に供されるわけではない。例えば、腹腔洗浄液においては、充分な量の細胞を取得することができない場合や、腹腔洗浄液中の細胞が、損傷をうけていたり破壊されていたりすることがある。このため、細胞の量自体は所定量採取できた場合でも、細胞に含まれるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸が分解されていて、測定対象であるがんマーカー遺伝子の絶対量が低下していることがある。
【０００８】
そこで、本発明者らは、試料中に含まれるがんマーカー遺伝子の発現量を閾値と比較して得られる結果と、がんマーカー遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量で正規化して得られる正規化した値を閾値と比較して得られる結果とを組み合わせることにより、がん細胞の存否の判定、ひいてはがんの転移の判定をより正確に行うことができることを見出して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定工程；
前記測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較工程；
前記測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程；
前記正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程；及び
前記第１比較工程及び前記第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する判定工程
を含む、がん細胞の存否を判定する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定工程；
前記測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較工程；
前記測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程；
前記正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程；
前記第１比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第１判定工程；及び
前記第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第２判定工程
を含む、がん細胞の存否を判定する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定工程；
前記測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較工程；
前記第１比較工程において、前記がんマーカー遺伝子の発現量に関する値が第１の閾値よりも低い場合に、前記測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程；
前記正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程；及び
前記第１比較工程又は第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する工程
を含む、がん細胞の存否を判定する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定手段；
前記測定手段により得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較手段；
前記測定手段により得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量を正規化する正規化手段；
前記正規化手段で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較手段；
第１比較手段及び第２比較手段により得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する判定手段；及び
前記判定手段により得られた判定結果を出力する出力手段
を含む、がん細胞の存否を判定する装置も提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のがん細胞の存否を判定する方法及び装置により、患者から採取された細胞を含む試料の状態による影響を最小限にして、より正確ながん細胞の存否の判定を行うことができる。よって、医師が患者のがん転移の判定を行うための、より正確な指標を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法は、患者から採取された細胞を含む試料中のがん細胞の存否を判定する方法である。該患者は、がん細胞の存否の判定を目的とする患者、特にがんの転移の判定を目的とする患者が好ましい。該患者から採取された細胞は、リンパ節組織、血液、体腔洗浄液に含まれる細胞が好ましい。
【００１５】
特に、体腔洗浄液は、上述のように試料の状態が良くないことがある。また、体腔洗浄液は、採取後時間が経過したものを測定に使用する場合も多く、より試料の状態が悪化している場合がある。従って、本発明は、体腔洗浄液に含まれるがん細胞の存否を判定する方法として有用である。
【００１６】
上記の体腔洗浄液とは、一般的に、がんの転移の有無を調べるために、がん病巣の周囲の体腔内を生理食塩水で洗浄することにより得られる液である。患者から得られる体腔洗浄液としては、腹腔洗浄液や胸腔洗浄液等が挙げられる。また、腹腔洗浄液としては、肝下面洗浄液、左横隔膜下洗浄液、ダグラス窩洗浄液などが挙げられる。
【００１７】
上記の試料は、測定に供するための測定用試料を得るために、さらに処理されることが好ましい。
上記の試料がリンパ節組織である場合、上記の測定用試料は、リンパ節組織を処理液により処理して得ることができる。該処理液は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むことが好ましい。該処理液中のＤＭＳＯの濃度は、約５〜３０容量％が好ましく、約１０〜２５容量％がより好ましい。
【００１８】
上記の試料が体腔洗浄液である場合、体腔洗浄液中の細胞を濃縮した細胞の懸濁液から得られる核酸抽出物を測定用試料として用いることができる。細胞の懸濁液は、体腔洗浄液中の細胞を遠心分離などにより濃縮して得ることができる。核酸抽出物は、当該技術において公知の核酸抽出法により、細胞の懸濁液を処理して得ることができる。さらに、細胞の懸濁液を、処理液により処理したものを測定用試料として用いることもできる。なお、体腔洗浄液は、試料中の核酸が破壊されている場合が多い。従って、核酸抽出物を測定用試料として用いることが好ましい。
【００１９】
上記の処理液は、ＤＭＳＯの他に必要に応じて緩衝剤、界面活性剤などを含むことができる。
該緩衝剤は、該処理液のｐＨを２．５〜５．０程度に保つことができるものであればよく、例えばグリシン−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤の濃度は、該処理液のｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
上記の界面活性剤は、当該分野で通常用いられる界面活性剤であれば特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がより好ましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ
（ここで、Ｒ１は、炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はイソオクチル基であり；Ｒ２は、−Ｏ−又は−（Ｃ6Ｈ4）−Ｏ−であり；ｎは、８〜１２０の整数である）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、その例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。界面活性剤の濃度は、当該分野で通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば処理液の０．１〜６容量％が好ましく、より好ましくは１〜５容量％である。
【００２０】
上記の処理液とリンパ節組織や細胞の懸濁液との混合割合は、特に限定されない。例えば、リンパ節組織１ｍｇに対して０．０００１〜０．００５ｍＬ程度の処理液を添加して混合することができる。上記の混合は、特に限定されないが、例えば室温でリンパ節組織と処理液とが充分に混合される程度の時間行うことができる。
【００２１】
上記のＤＭＳＯを含む処理液とリンパ節組織との混合の後に、リンパ節組織を破砕するのが好ましい。破砕する方法としては、注射器の吸引・吐出を繰り返すことによるホモジナイズ、ホモジナイザーによるホモジナイズ、凍結融解などが挙げられる。ホモジナイザーとしては、当該分野において通常用いられるものを用いることができ、例えばワーリングブレンダー、ポッター・エルベージェム型ホモジナイザー、ポリトロン型ホモジナイザー、ダウンス型ホモジナイザー、フレンチプレス、超音波破砕機などが挙げられる。破砕の条件は、用いる方法及び装置に応じて適宜設定され、当該分野において通常用いられるものであってよい。
【００２２】
上記の方法により破砕された破砕液は、遠心分離、フィルターろ過、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製方法を用いて粗精製することができる。検出するがんマーカー遺伝子の種類に応じて、核酸抽出法などの方法によりさらに精製してもよい。
【００２３】
本発明の方法の測定工程では、試料中のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子のそれぞれの発現量に関する値を測定する。
本明細書において、「がんマーカー遺伝子」とは、がん細胞に発現する量が正常な細胞で発現する量よりも有意に多い分子マーカー遺伝子を意味する。よって、がんマーカー遺伝子はｍＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸であるのが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。
上記のがんマーカー遺伝子は、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０などのサイトケラチン(ＣＫ)、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ１ムチン、マンマグロビン(ＭＭＧ)などのタンパク質の遺伝子が好ましい。
【００２４】
上記のハウスキーピング遺伝子は、多くの細胞で一定量発現していることが知られている遺伝子であれば特に限定されない。上記のハウスキーピング遺伝子は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子又はα−チューブリン遺伝子が好ましい。
【００２５】
上記の測定工程で測定されるがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子のそれぞれの発現量に関する値は、各遺伝子の発現量の測定法に応じて適宜選択される値である。上記のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値は、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡの量に関する値であることが好ましい。上記のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値は、該ｍＲＮＡを核酸増幅法により増幅させて測定される値が好ましい。この場合、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値は、所定のプライマーを用いてｍＲＮＡ若しくは対応するｃＤＮＡを一定時間増幅することにより測定される蛍光強度、濁度、吸光度など、又は所定のプライマーを用いてｍＲＮＡ若しくは対応するｃＤＮＡを増幅する際に蛍光強度、濁度、吸光度などがある一定の値に達するまでの時間又はＰＣＲサイクル数などのような、光学的に測定される値であり得る。
【００２６】
上記の核酸増幅法は、当該分野で通常用いられる方法に従って行うことができる。特に、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などに基づく核酸増幅法が好ましい。がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを核酸増幅法により増幅させる場合には、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法など）を用いることができる。
上記の核酸増幅法は、具体的には、上記の試料に、がんマーカー遺伝子又はハウスキーピング遺伝子に対応するｃＤＮＡを増幅させるためのプライマー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単にＤＮＡポリメラーゼともいう）などを添加して反応液を調製して核酸増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡに関する値を測定することができる。
【００２７】
上記の逆転写反応及び核酸増幅反応は、鋳型であるがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の配列及びプライマーの配列に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応及び核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
【００２８】
上記のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子に対応するｃＤＮＡを増幅するためのプライマーの配列は、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の配列に応じて適宜選択できる。プライマーの長さは、５〜１００ヌクレオチドが好ましく、１０〜５０ヌクレオチドがより好ましい。プライマーは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
【００２９】
上記のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子に対応するｃＤＮＡを増幅するためのプライマーの好ましい例を、以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
0005303132.tif 000002
【００３１】
なお、上記のプライマーの配列は、表１に示すものに限定されず、当業者は、これらの遺伝子全体の既知の配列から適切なプライマーを選択できる。
【００３２】
上記のプライマーは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマーの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H又は125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素及び放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
【００３３】
逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３４】
上記の核酸増幅法により生成した核酸増幅産物に関する値を測定することにより、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定することができる。がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値が、該遺伝子のｍＲＮＡの量である場合は、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Quantitative Reverse Transcription-PCR）や定量ＲＴ−ＬＡＭＰ(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等が好ましく用いられる。これらの方法によると、核酸（ｃＤＮＡ）増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化するため、これをリアルタイムに測定することにより、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値の測定を行うことができる。
【００３５】
定量ＲＴ−ＰＣＲの具体例としては、核酸増幅反応前の反応液にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを予め添加しておき、増幅反応中にｃＤＮＡの増幅に伴って増加する蛍光強度をリアルタイムに測定するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを添加して増幅反応を行い、ｃＤＮＡの増幅に伴って増加する蛍光強度をリアルタイムに測定するＴａｑＭａｎ（登録商標）法など、公知のものを用いることができる。がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値は、反応液の蛍光強度が所定の値に達するまでのサイクル数として測定することもできる。
【００３６】
また、定量ＲＴ−ＬＡＭＰを用いる場合、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定することもできる。また、ＲＴ−ＬＡＭＰ法においても、上記ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を用いることができる。がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値は、反応液の濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間として測定することもできる。
【００３７】
本発明の方法は、上記の測定工程で得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値を、第１の閾値と比較する第１比較工程を含む。該第１の閾値は、がんマーカー遺伝子の種類及び測定工程で用いられる方法、特に核酸増幅法の種類に応じて適宜設定され得る値である。該第１の閾値は、がん細胞を含むことが確認された試料、特にがんの転移が確認された試料(陽性試料)に含まれるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値以下であって、がん細胞を含まないことが確認された試料、特にがんの転移がないことが確認された試料(陰性試料)に含まれるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値よりも高い値に設定することができる。該第１の閾値は、複数の陽性試料のがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、複数の陰性試料のがんマーカー遺伝子の発現量に関する値とを測定し、最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値に設定することが好ましい。
【００３８】
本発明の方法のある態様は、上記の測定工程で得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化する正規化工程を含む。
本明細書において「正規化」とは、ハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を基準として、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を、相対的な値に変換することを意味する。より具体的な例としては、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を、ハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値で除することが挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、上記の正規化工程で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較工程を含む。
上記の第２の閾値は、がんマーカー遺伝子の種類、ハウスキーピング遺伝子の種類及び測定工程で用いられる方法、特に核酸増幅法の種類に応じて適宜設定され得る値である。該第２の閾値は、がん細胞を含むことが確認された試料、特にがんの転移が確認された試料(陽性試料)に含まれるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値を、該陽性試料中のハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて正規化した正規化値以下であって、がん細胞を含まないことが確認された試料、特にがんの転移がないことが確認された試料(陰性試料)に含まれるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値を、該陰性試料中のハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて正規化した値よりも高い値に設定することができる。該第２の閾値は、複数の陽性試料のがんマーカー遺伝子の発現量に関する値の正規化した値と、複数の陰性試料のがんマーカー遺伝子の発現量に関する値の正規化した値とを測定し、最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値に設定することが好ましい。
【００４０】
本発明の方法は、上記の第１比較工程及び第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する判定工程を含む。
該判定工程は、第１比較工程におけるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値が第１の閾値以上である場合、及び／又は前記第２比較工程における正規化した値が第２の閾値以上である場合に、試料中にがん細胞が存在すると判定することが好ましい。
【００４１】
すなわち、
（Ａ）第１比較工程の比較結果が
（がんマーカー遺伝子の発現量に関する値）≧（第１の閾値）
であるが、第２比較工程の比較結果が
（正規化した値）＜（第２の閾値）
である場合、
（Ｂ）第１比較工程の比較結果が
（がんマーカー遺伝子の発現量に関する値）＜（第1の閾値）
であるが、第２比較工程の比較結果が
（正規化した値）≧（第２の閾値）
である場合、
（Ｃ）第１比較工程の比較結果が
（がんマーカー遺伝子の発現量に関する値）≧（第１の閾値）
であり、第２比較工程の比較結果が
（正規化した値）≧（第２の閾値）
である場合
のいずれも、試料中にがん細胞が存在すると判定されることが好ましい。
【００４２】
本発明の別のある態様においては、上記の判定工程は、第１比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第１判定工程と、第２比較工程で得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する第２判定工程とを含む。
上記の第１判定工程は、第１比較工程におけるがんマーカー遺伝子の発現量に関する値が第１の閾値以上である場合に、試料中にがん細胞が存在すると判定する。
上記の第２判定工程は、第２比較工程における正規化した値が第２の閾値以上である場合に、試料中にがん細胞が存在すると判定する。
【００４３】
本発明のさらに別のある態様においては、上記の第１比較工程において、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値が第１の閾値よりも低い場合に、上記の正規化工程及び第２比較工程を行う。この態様では、上記の第１比較工程において、がんマーカー遺伝子の発現量が第１の閾値よりも高い場合は、試料中にがん細胞が存在すると判定できるので、正規化工程及び正規化した値を用いる第２比較工程を行わない。
【００４４】
上記のがん細胞の存否を判定する方法を行うためのがん細胞の存否を判定する装置も、本発明の一つである。図４は、本発明の装置を示すブロック図である。
本発明の装置は、図４に示すように、患者から採取された細胞を含む試料中の、がんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する測定手段１００；
前記測定手段により得られたがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値とを比較する第１比較手段２００；
前記測定手段により得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量を正規化する正規化手段３００；
前記正規化手段で得られた正規化した値と、第２の閾値とを比較する第２比較手段４００；
第１比較手段及び第２比較手段により得られた比較結果に基づいて、試料中のがん細胞の存否を判定する判定手段５００；及び
前記判定手段により得られた判定結果を出力する出力手段６００
を含む。
【００４５】
上記の測定手段１００は、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定することができるものであれば特に限定されないが、上記のような核酸増幅法、例えばＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法などにより増幅された核酸を測定し得る核酸増幅測定装置が好ましい。該核酸増幅測定装置は、試料中のがんマーカー遺伝子及びハウスキーピング遺伝子をプライマーと核酸増幅酵素とにより増幅して得られる核酸増幅産物を光学的に測定する測定部を備えることが好ましい。
【００４６】
第１比較手段２００、正規化手段３００、第２比較手段４００及び判定手段５００は、測定手段１００に接続されたコンピュータで構成することが可能である。その場合、コンピュータは測定手段１００を制御すると共に、測定手段１００により得られたがんマーカー遺伝子の発現量と第１の閾値とを比較し、測定手段により得られたハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいてがんマーカー遺伝子の発現量を正規化し、得られた正規化した値と第２の閾値とを比較し、これらの比較結果に基づいて試料中のがん細胞の存否を判定することができる。
【００４７】
出力手段６００は、判定手段５００から得られる判定結果を出力できる手段であれば特に限定されず、印刷手段、表示手段、音声出力手段などが挙げられる。具体的には、出力手段は、判定手段と接続されたモニタ、プリンタ、スピーカなどのいずれであってもよいが、好ましくはコンピュータに接続されたモニタである。
【００４８】
本発明の装置は、上記の測定用試料を調製するための測定用試料調製手段をさらに備えていてもよい。該測定用試料調製手段としては、試料中の細胞を濃縮するための細胞濃縮部、例えば遠心分離部、細胞から核酸を抽出するための核酸抽出部、得られた核酸を濃縮するための核酸濃縮部などを備えるものが好ましい。
【００４９】
本発明のがんの転移の判定装置の一実施形態を、図１〜３に示す。図１は、本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。図２は、図１に示した測定手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【００５０】
本発明のある実施形態の判定装置１は、図１に示すように、核酸増幅測定装置１０１と、該核酸増幅測定装置と有線又は無線による通信ができるように接続されたパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成され得る。パーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２は、第１比較手段２００、第２比較手段４００、正規化手段３００及び判定手段５００として機能する。
【００５１】
核酸増幅測定装置１０１は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００５２】
また、分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００５３】
また、図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマー試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００５４】
また、本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予めリンパ節組織、腹腔洗浄液などの試料を処理して作製された測定用試料が収容された試料容器２２がセットされるとともに、正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した測定用試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００５５】
また、試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールを収容した容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００５６】
また、酵素試薬容器セット孔２１ｋには、核酸を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６がセットされている。プライマー試薬容器セット孔２１ｌには、がん胎児性抗原（以下、単にＣＥＡともいう）のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅するためのプライマー試薬が収容されたプライマー試薬容器２７がセットされている。プライマー試薬容器セット孔２１ｍには、β−アクチンのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅するためのプライマー試薬が収容されたプライマー試薬容器２８がセットされている。
【００５７】
また、反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図２参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００５８】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００５９】
また、検出セル５４は、測定用試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００６０】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００６１】
パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、入力機器のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂと、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を比較、正規化及び判定するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
【００６２】
図５は、本実施形態による判定装置１の動作を示すフローチャートである。図５に基づいて、判定装置１の動作について説明する。ここでは、１）胃がん手術で患者の腹腔内を洗浄することにより得られた腹腔洗浄液中に存在するがんマーカー遺伝子（ＣＥＡ）及びハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅させ、２）増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムによる白濁による濁度の変化を測定することにより、ＣＥＡ及びβ−アクチンの発現量に関する値を測定し、３）これを閾値と比較して、腹腔洗浄液中のがん細胞の存否を判定し、４）胃がんの転移の判定を支援する情報を提供できる装置について説明する。なお、以下の記載において、主にがんマーカー遺伝子の発現量に関する値を測定する機構の動作について説明するが、ハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値を測定する機構の動作も、同様である。
【００６３】
まず、図２及び図３に示すように、予め腹腔洗浄液を処理（濃縮、核酸抽出など）して調製された測定用試料が収容された試料容器２２を試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする（ステップＳ１）。また、陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする（ステップＳ２）。また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ、プライマー試薬容器セット孔２１ｌ及びプライマー試薬容器セット孔２１ｌに、それぞれ、核酸増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＥＡの増幅のためのプライマー試薬（ＣＥＡのプライマー試薬）が収容されたプライマー試薬容器２７と、β−アクチンの増幅のためのプライマー試薬（β−アクチンのプライマー試薬）が収容されたプライマー試薬容器２８とをセットする（ステップＳ３）。また、チップセット部３０に、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する（ステップＳ４）。
【００６４】
核酸増幅測定装置１０１の動作がスタートすると（ステップＳ５）、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動された後、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される（ステップＳ６）。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、ＣＥＡのプライマー試薬が収容されたプライマー試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマー試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてＣＥＡのプライマー試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される（ステップＳ７）。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマー試薬容器２７の上方に位置するように、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマー試薬容器２７からＣＥＡのプライマー試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される（ステップＳ８）。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１によりプライマー試薬容器２７内のＣＥＡのプライマー試薬が吸引される。
【００６５】
ＣＥＡのプライマー試薬の吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、ＣＥＡのプライマー試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される（ステップＳ９）。
【００６６】
ＣＥＡのプライマー試薬の吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる（ステップＳ１０）。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００６７】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され（ステップＳ１１）、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される（ステップＳ１２）。
【００６８】
そして、上記のセル部５４ａ内へのＣＥＡのプライマー試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる（ステップＳ１３）。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりがんマーカー遺伝子であるＣＥＡのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する（ステップＳ１４）。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度データＡの検出を行う（ステップＳ１５）。
【００６９】
上記の動作と同様の動作により、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの発現量に関する濁度データＢの検出も行う（ステップＳ１６）。
【００７０】
得られた濁度データは、核酸増幅測定装置１０１からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、がんマーカー遺伝子の濁度データＡを予め決められた第１の閾値Ｃ１と比較し（ステップＳ１７）、がんマーカー遺伝子の濁度データＡをハウスキーピング遺伝子の濁度データＢに基づいて正規化し（ステップＳ１８）、得られた正規化した値Ｄを予め決められた第２の閾値Ｃ２と比較し（ステップＳ１９）、得られた比較結果に基づいて、がん細胞の存否を判定し（ステップＳ２０）、判定結果を出力する（ステップＳ２０）。この出力結果に基づいて、例えば医師は、がんの転移の判定を行うことができる。
【００７１】
図７は、図１に示す表示部１０２ｃの表示例である。図７において、１１１はヘルプ機能など種々の機能を実行するボタンが表示されるツールバーを、１１２は測定用試料の各種情報を表示する測定用試料情報表示部を、１１３は測定用試料情報表示部１１２に表示される測定用試料試料の測定結果を示す測定結果表示部をそれぞれ示す表示領域である。
【００７２】
測定用試料情報表示部１１２には、検体番号表示欄１１２ａ、検体種表示欄１１２ｂ、部位表示欄１１２ｃ、コメント表示欄１１２ｄ、測定日表示欄１１２ｅ、及び測定時刻表示欄１１２ｆが設けられている。検体番号示欄１１２ａには、測定用試料に用いられた検体番号が表示される。検体種表示欄１１２ｂには、患者から採取された試料の種類が表示される。患者から採取された試料の種類としては、例えば、リンパ節組織、血液、腹腔洗浄液、又は胸腔洗浄液等が挙げられる。部位表示欄１１２ｃには、患者から採取された試料の、採取された部位についての情報が表示される。例えば、図７では、部位表示欄１１２ｃに左横隔膜下と表示されている。このことから、この測定用試料は、左横隔膜下の腹腔洗浄液から調製されたものであることが分かる。コメント表示欄１１２ｄには、がん転移の診断に利用可能な、その他の測定用試料に関する情報が表示される。測定日表示欄１１２ｅおよび測定時刻表示欄１１２ｆには、それぞれ、測定用試料が測定された日（画面中では、「２００５／０９／２６」）および時刻（画面中では、「１２：５３：０６」）が表示される。
【００７３】
また、測定結果表示部１１３には、グラフ１１３ａ、第１測定結果表示欄１１３ｂ、第２測定結果表示欄１１３ｃ、正規化値表示欄１１３ｄ、第１判定結果表示欄１１３ｅ、第２判定結果表示欄１１３ｆ、及び総合判定結果表示欄１１３ｇが設けられている。グラフ１１３ａには、測定用試料情報表示部１１２に表示されている測定用試料の、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値と第１閾値、及びハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値に基づいて、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値を正規化した値（正規化値）と第２閾値との関係を示したグラフが表示される。図７のグラフ１１３ａでは、横軸にがんマーカー遺伝子の発現量に関する値と第１閾値の関係が示され、縦軸に正規化値と第２閾値との関係が示されている。第１測定結果表示欄１１３ｂには、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値が表示される。図７では、第１測定結果表示欄１１３ｂに、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値として、ＣＥＡのｍ−ＲＮＡの量（ｃｏｐｙ／μＬ）が表示されている。第２測定結果表示欄１１３ｃには、ハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値が表示される。図７では、第２測定結果表示欄１１３ｃに、ハウスキーピング遺伝子の発現量に関する値として、β−アクチンのｍ−ＲＮＡの量（ｃｏｐｙ／μＬ）が表示されている。正規化値表示欄表示欄１１３ｄには、正規化値が表示される。図７では、１１３ｄに、正規化値として、ＣＥＡのｍ−ＲＮＡの量をβ−アクチンのｍ−ＲＮＡの量で除した値が表示されている。第１判定結果表示欄１１３ｅには、がんマーカー遺伝子の発現量に関する値と、第１の閾値を比較した結果に基づく、測定用試料中のがん細胞の存否に関する判定結果（第１判定結果）の情報が表示される。図７では、第１判定結果表示欄１１３ｅに、第１判定結果の情報として、「−」が表示されている。ここで「−」は測定用試料中にがん細胞が存在しないことを示す。第２判定結果表示欄１１３ｆには、正規化値と第２の閾値を比較した結果に基づく、測定用試料中のがん細胞の存否に関する判定結果（第２判定結果）の情報が表示される。図７では、第２判定結果表示欄１１３ｆに、第２判定結果の情報として、「＋」が表示されている。ここで「＋」は測定用試料中にがん細胞が存在することを示す。総合判定結果表示欄１１３ｇには、上記の第１判定結果と第２判定結果に基づく、総合的な測定用試料中のがん細胞の存否に関する判定結果の情報が表示される。図７では、総合判定結果表示欄１１３ｇに、総合判定の結果の情報として「＋」が表示されている。
【実施例】
【００７４】
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
（１）腹腔洗浄液の採取及び試料の調製
５０名の胃がんの患者の手術の際に、胃がんの転移の検査のために腹腔洗浄液を採取した。具体的には、開腹後、生理食塩水１００ｍＬを腹腔内（肝下面、左横隔膜下及び／又はダグラス窩）に注入して洗浄し、この液を回収した。回収した腹腔洗浄液を約３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去し、約５０〜１００μＬの試料を得た。
なお、これらの５０名の患者は、細胞組織診により胃がんの転移が認められた患者１７名、及び転移が認められない患者３３名からなる。
【００７５】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
（１）で調製した試料を、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を製造業者の使用説明に従って処理して精製ＲＮＡ溶液５０μＬを得た。
得られた精製ＲＮＡ溶液について、以下のプライマーを用い、下記の組成で反応液を調製し、がんマーカー遺伝子としてのＣＥＡ及びハウスキーピング遺伝子としてのβ−アクチンのｍＲＮＡ量をそれぞれ定量ＲＴ−ＰＣＲ法（TaqMan（登録商標）RT-PCR）により測定した。
【００７６】
ＣＥＡのｍＲＮＡ増幅のためのプライマー：
フォワードプライマー：5'-agacaatcacagtctctgcgga-3'（配列番号１）
リバースプライマー：5'-atccttgtcctccacgggtt-3'（配列番号２）
TaqManプローブ：5'-FAM-agctgcccaagccct-TAMRA-3'（配列番号１７）
【００７７】
β−アクチンのｍＲＮＡ増幅のためのプライマー：
フォワードプライマー：5'-ccacactgtgcccatctacg-3'（配列番号１３）
リバースプライマー：5'-aggatcttcatgaggtagtcagtcag-3'（配列番号１４）
TaqManプローブ：5'-FAM-atgccctcccccatgccatcctgcgt-TAMRA-3'（配列番号１８）
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲの反応液組成：
1×One-step TaqMan（登録商標）RT-PCR Master mix（アプライドバイオシステムズ社製）
フォワードプライマー：３００ｎＭ
リバースプライマー：３００ｎＭ
TaqManプローブ：２５０ｎＭ
精製ＲＮＡ溶液：１μＬ
合計：２５μＬ
【００７９】
上記の反応液を、ＰＲＩＳＭ７７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間逆転写を行いｃＤＮＡを増幅させた後に、ＰＣＲ反応（９５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクル）を４０回繰り返し、蛍光強度を測定した。
予め、培養細胞から各遺伝子をクローニングし、インビトロ転写により調製した既知量のｍＲＮＡ溶液をスタンダードとして蛍光強度に対して標準曲線を作成しておき、該標準曲線に基づいて、試料中のＣＥＡ及びβ−アクチンのｍＲＮＡの量を定量した。単位は、ｍＲＮＡのコピー数／μＬである。
【００８０】
得られたＣＥＡのｍＲＮＡの量を、「ＣＥＡ絶対値」として表２に示す。この値を、閾値（第１の閾値）を２０コピー／μＬとして、閾値と比較した。閾値以上のｍＲＮＡの量を有する試料について陽性「＋」と判定し、閾値より少ないｍＲＮＡの量を有する試料について陰性「−」と判定し、表２に「絶対値判定」として判定結果を示す。
【００８１】
得られたＣＥＡのｍＲＮＡの量を、β−アクチンのｍＲＮＡの量で除した値（正規化した値）を求め、これを「ＣＥＡ／アクチン正規化値」として表２に示す。この値を、閾値（第２の閾値）を１×１０-5として、閾値と比較した。閾値以上の正規化した値を有する試料について陽性「＋」と判定し、閾値より少ない正規化した値を有する試料について陰性「−」と判定し、表２に「正規化値判定」として判定結果を示す。
【００８２】
上記の絶対値判定及び正規化値判定の少なくとも一方が陽性である試料について、試料中のがん細胞の存在を陽性「＋」と判定して、表２に「総合判定」として示す。
また、表２の結果を、横軸を「ＣＥＡ絶対値」とし、縦軸を「ＣＥＡ／アクチン正規化値」としてグラフに表した結果を、図８に示す。
【００８３】
【表２】
0005303132.tif 000003
【００８４】
表２の結果から、組織診によりがん細胞の存在について陰性と判定された試料のうち、試料番号２０、２１、２８、３１、３５、４９及び５０の試料は、本発明の方法により、がん細胞が存在すると判定された。これらの試料のうち、試料番号３１を除く６検体は、試料として用いた腹腔洗浄液以外の部位から採取された別の腹腔洗浄液において、がん細胞の存在が陽性と判定されたか、胃がんの胃壁進達度が高いか、又は腹膜においてがんが再発したかのいずれかの患者からの検体であった。すなわち、組織診ではがん細胞が存在しない、すなわち胃がんの転移が陰性と判断された検体であっても、本発明の方法を用いることにより、微量のがん細胞の存在を検出して、より正確ながん細胞の存否の判定を行うことができ、ひいては胃がんの転移の判定に有効な情報を提供できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図２】図１に示した判定装置の測定手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図３】図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【図４】本発明の一実施形態による判定装置を示すブロック図である。
【図５】本発明の一実施形態による判定装置の動作を示すフローチャートである。
【図６】本発明の一実施形態による判定装置の動作を示すフローチャートである。
【図７】本発明の判定装置の表示部の表示例を示す図である。
【図８】実施例の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８６】
１      がん細胞の存否の判定装置
１０    分注機構部
１１    アーム部
１２    シリンジ部
２０    試料セット部
２１ａ〜ｊ    試料容器セット孔
２１ｋ  酵素試薬容器セット孔
２１ｌ  ＣＥＡのプライマー試薬容器セット孔
２１ｍ  β−アクチンのプライマー試薬容器セット孔
２４    陽性コントロールを収容した容器
２５    陰性コントロールを収容した容器
２６    酵素試薬容器
２７    ＣＥＡのプライマー試薬容器
２８    β−アクチンのプライマー試薬容器
３０    チップセット部
４０    チップ廃棄部
５０    反応検出部
５０ａ  反応検出ブロック
５１    反応部
５２    濁度検出部
５２ａ  ＬＥＤ光源部
５２ｂ  フォトダイオード受光部
５３    蓋閉機構部
５４    検出セル
５５ａ、５５ｂ  基板
６０    移送部
６１、６４  直動ガイド
６２、６５  ボールネジ
６３、６６  ステッピングモータ
１００    測定手段
１０１    核酸増幅測定装置
１０２    パーソナルコンピュータ
１０２ｃ  表示部
１０２ｄ  ＣＰＵ
１１１    ツールバー
１１２    測定用試料情報表示部
１１３    測定結果表示部
２００    第１比較手段
３００    正規化手段
４００    第２比較手段
５００    判定手段
６００    出力手段
【図１】
0005303132.tif 000004
【図２】
0005303132.tif 000005
【図３】
0005303132.tif 000006
【図４】
0005303132.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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