(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚にしわが形成される可能性及び／又はその方向を予測する工程を含んでなる、皮膚しわの評価方法。
【請求項２】
前記の皮膚内部のコラーゲンの配向が、真皮層のコラーゲンの配向である、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
前記しわが、皮膚の伸縮によって生じるしわである、請求項１又は請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記しわが、光老化によって生じるしわである、請求項１〜３の何れか一項に記載の評価方法。
【請求項５】
皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第２高調波発生光（ＳＨＧ光）を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなる、請求項１〜４の何れか一項に記載の評価方法。
【請求項６】
検出されたＳＨＧ光の偏光異方性に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する、請求項５記載の評価方法。
【請求項７】
皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第２高調波発生光（ＳＨＧ光）を検出し、検出されたＳＨＧ光の偏光異方性に基づいて皮膚内部の真皮層のコラーゲンの配向を測定する工程と、
前記真皮層のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程と
を含んでなる、皮膚しわの評価方法。
【請求項８】
前記の皮膚におけるしわの状態が、皮膚の伸縮によって生じるしわの形成である、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記の皮膚におけるしわの状態が、光老化によって生じるしわの形成である、請求項７又は８に記載の評価方法。
【請求項１０】
超短パルス光がフェムト秒モード同期レーザー光である、請求項５〜９の何れか一項に記載の評価方法。
【請求項１１】
超短パルス光が、クロム・フォルステライトレーザー光、チタン・サファイアレーザー光、ファイバーレーザー光、又はネオジウム・ガラスレーザー光である、請求項５〜１０の何れか一項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚しわの状態を評価する方法に関する。具体的には、真皮層等の皮膚内部の変化から生じる皮膚のしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴う皮膚老化現象の１つとしてしわの増加が挙げられるが、美容等の観点から、特に女性においてしわの防止及び改善に対する関心が非常に高まっている。顔など美容的に最も関心の高い部位は日光に曝されている部位であるため、そのような日光露光部で皮膚が伸縮する部位に生じる目尻などのしわについては、ヒトでそのグレードを評価する基準や、動物モデルによる評価モデルが確立されている。しかし、しわ発生のメカニズムの詳細については未だ明らかでない点が多く、しわ形成に密接に関わるパラメーターを定量的に評価する方法も存在していなかった。
【０００３】
従来、非侵襲的に皮膚状態を定量する方法としては、皮膚粘弾性、角質水分量、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）などを測定する方法が用いられてきた。しかし、何れの測定方法も原理的に皮膚表面（最外層）から測定を行なうため、皮膚表面の状態が定量値に大きく影響してしまう。このため、日光に曝されている部位に生じるしわのように、真皮層等の皮膚内部の変化から生じるしわについて、しわの状態を反映した定量的なパラメーターを皮膚内部から非侵襲的且つ直接的に得ることは困難であった。また、近年、超音波エコーのような臨床診断装置や共焦点レーザー生体顕微鏡、皮膚光コヒーレンス断層撮影装置（ＯＣＴ）など、生体の内部構造を画像として観察可能な手段が開発されているが、何れもコラーゲン情報のみを抽出して詳細に評価することは困難であった。
一方、しわ形成には、真皮状態が大きく関与すると考えられるが、真皮状態を非侵襲的に測定する方法として、近年、ＳＨＧ光（第２高調波発生光）が着目されている。これは、超短パルス光（例えばフェムト秒オーダー）を生体組織に照射すると、コラーゲン分子が特異的に有する非線形光学特性によって、照射したレーザー光の一部が波長変換され、照射レーザーの半波長の光が発生することを応用した技術である。（非特許文献４）。
ＳＨＧ光を用いた生体におけるコラーゲンの構造観察が提案されており、皮膚科学的な診断に有用である（非特許文献５）。また、コラーゲンゲルなどのインビトロでの三次元培養においても、ＳＨＧ光を用いたコラーゲンの構造観察の検討がなされている（非特許文献６）。特許文献１には、コラーゲンゲル培養により得られる培養組織試料に入射光として超短パルス光を照射し、発生したＳＨＧ光を検出することにより、培養組織試料の成育程度を評価することが記載されている。更に、非特許文献７では、ＳＨＧ光発生効率の入射レーザー偏光依存性を利用すると、コラーゲンの配向を解析することができることが報告されている。
しかしながら、今までコラーゲンの配向と、しわとの関連性について評価した報告は存在しておらず、ＳＨＧ光の偏光特性で測定したコラーゲンの配向でしわ状態を評価する技術については存在していなかった。
【０００４】
【非特許文献１】「皮膚の抗老化最前線」、（株）エヌ・ティー・エス発行、２００６年７月
【非特許文献２】「皮膚の測定・評価マニュアル集」、技術情報協会発行、２００３年１１月
【非特許文献３】「現場レベルでの皮膚測定・評価  〜トラブル事例・対策〜」、サイエンス＆テクノロジー株式会社発行、２００７年２月
【非特許文献４】Roth S. et al., Biopolymers. 1981;20(6):1271-90
【非特許文献５】Lin SJ. et al., Eur J Dermatol. 2007 Sep-Oct;17(5):361-6. Review
【非特許文献６】Zoumi A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):11014-9
【非特許文献７】Yasui T. et al., J Biomed Opt. 2004 Mar-Apr;9(2):259-64
【特許文献１】特開２００７-４９９９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、真皮層等の皮膚内部の変化に起因する皮膚のしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、皮膚の表面に観察される、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等の皮膚内部の変化によって生じるしわと、その奥の皮膚内部、特に真皮層におけるコラーゲンの配向とが、密接に関連していることを初めて明らかにした。
【０００７】
真皮層のコラーゲンの観察には、コラーゲン線維構造を非侵襲的かつ選択的に計測可能なＳＨＧ光（第２高調波発生光）顕微鏡を用いる。これは、超短パルス光（例えばフェムト秒オーダー）を生体組織に照射すると、コラーゲン分子が特異的に有する非線形光学特性によって、照射したレーザー光の一部が波長変換され、照射レーザーの半波長の光が発生することを応用した技術である。
【０００８】
このＳＨＧ光発生効率の入射レーザー偏光依存性を利用して、皮膚表面におけるしわの存在と、皮膚内部におけるコラーゲンの配向との関係について解析したところ、これらが相関を有していることを見出した。本発明者等はこの技術を応用して、皮膚内部におけるコラーゲンの配向度合いによって皮膚のしわを評価する方法を新たに確立し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明の主旨は、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程を含んでなる、皮膚しわの評価方法に存する（請求項１）。
ここで、皮膚内部のコラーゲンの配向は、真皮層のコラーゲンの配向であることが好ましい（請求項２）。
また、皮膚におけるしわの状態が、皮膚の伸縮によって生じるしわの形成であることが好ましく（請求項３）、また、光老化によって生じるしわの形成であることも好ましい（請求項４）。
また、前記評価が、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づく、皮膚にしわが形成される可能性及び／又はその方向の予測であることも好ましい（請求項５）。
更に、本発明の評価方法は、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第２高調波発生光（ＳＨＧ光）を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなることが好ましい（請求項６）。
ここで、検出されたＳＨＧ光の偏光異方性に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定することが好ましい（請求項７）。
また、超短パルス光がフェムト秒モード同期レーザー光であることが好ましい（請求項８）。
また、超短パルス光が、クロム・フォルステライトレーザー光、チタン・サファイアレーザー光、ファイバーレーザー光、又はネオジウム・ガラスレーザー光であることが好ましい（請求項９）。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の評価方法によれば、真皮層等の皮膚内部におけるコラーゲンの配向を、皮膚のしわを評価するためのパラメーターとして用いることにより、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等、皮膚内部の変化によって生じるしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。
【００１１】
また、皮膚内部に超短パルス光を照射して発生したＳＨＧ光の検出結果を用いることにより、皮膚内部のコラーゲンの配向を非侵襲的且つ直接的に評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、具体的な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施の態様に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない限りにおいて、任意の変更を加えて実施することが可能である。
【００１３】
本発明に係る皮膚しわの評価方法（適宜「本発明の評価方法」という。）は、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程を含んでなる。
ここで「皮膚内部のコラーゲンの配向」は、好ましくは真皮層のコラーゲンの配向である。真皮層の約７０％を占めるコラーゲン線維（真皮コラーゲン線維）は、皮膚の形態や機械的特性（張りや弾性等）を決定する上で重要な役割を果たしており、老化により生じる皮膚のしわの形成や状態に深く関与していると考えられる。
本発明者等は、後述の実施例で示すように、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等の皮膚内部の変化によって生じたしわを有する皮膚では、皮膚のしわに沿って皮膚内部のコラーゲンが配向していることを見出した。この知見を基に、本発明の評価方法では、皮膚内部のコラーゲンの配向の有無及び／又はその方向を測定し、その測定結果に基づいて、皮膚におけるしわの様々な状態の評価を行なう。
具体的に、好適な態様によれば、皮膚におけるしわの状態として、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等の皮膚内部の変化によるしわの形成を評価することができる。即ち、皮膚内部のコラーゲンが皮膚のしわに沿って配向している場合、そのしわが皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等の皮膚内部の変化に起因するしわであると判定することができる。
また、別の好適な態様によれば、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づいて、皮膚にしわが形成される可能性及び／又は方向を予測することもできる。即ち、皮膚にしわが殆ど（或いは全く）存在しない場合でも、皮膚内部においてコラーゲンが一定の方向に配向している場合には、皮膚に今後しわが形成される可能性が高いと判断することができる。また、そのしわの方向は、コラーゲンの配向方向と平行であると予測することができる。
【００１４】
皮膚内部におけるコラーゲンの配向を定量的に測定する手法としては、制限されるものではないが、以下に説明するような、第２高調波発生光（ＳＨＧ（Second Harmonic Generation）光）の検出に基づく手法が挙げられる。
即ち、好適な態様によれば、本発明の評価方法は、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生したＳＨＧ光を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなる。
ＳＨＧ光とは、ピークパワーの高い超短パルス光が非中心対象性物質に照射されることによって発生する二次の非線形光学応答であり、通常の反射や散乱等の線形光学応答では、周波数（ω）が変化しないのに対して、ＳＨＧ光は、周波数が入射光の２倍（２ω）に変換されることが知られている。
皮膚内部に存在するコラーゲン線維の分子は、３重らせん構造の非中心対称性を有するため、特異的にＳＨＧ光を発生する生体構成物質として知られている。発生するＳＨＧ光の強度は、コラーゲンの濃度や配向等に依存する。このＳＨＧ光を検出することにより、皮膚内部におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を取得することができる。皮膚内部のコラーゲンは主に真皮層に局在しているので、図１に示すように、皮膚に超短パルス光を照射し、発生する生体ＳＨＧ光を検出することにより、特に真皮層におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を選択的に計測することが可能になる。
即ち、かかるＳＨＧ光の検出に基づく手法によれば、皮膚内部のコラーゲン線維分子に固有の非線形光学特性を利用するため、組織染色等が不要であり、生体組織のありのままの状態におけるインビボ（in vivo）での測定が可能である。また、このようして得られるＳＨＧ光の強度は皮膚内部のコラーゲンの濃度に依存しているので、その強度情報からコラーゲンの濃度分布を可視化することができる。ＳＨＧ光の検出は非線形光学効果を利用した手法であるため、極めて高い空間分解能での３次元イメージングが可能である。
【００１５】
ＳＨＧ光を得るために照射する超短パルス光としては、例えば、フェムト秒モード同期レーザー光が挙げられる。フェムト秒モード同期レーザー光は、フェムト秒（１０−１５秒）オーダーの超短パルスレーザー光であり、非常に高い瞬時ピークパワーを有する。このようなフェムト秒モード同期レーザー光の照射手段は特に制限されない。例としては、チタン・サファイアレーザー、クロム・フォルステライトレーザー、ファイバーレーザー光、ネオジウム・ガラスレーザー等のレーザー光源等が挙げられる。超短パルス光の具体的なパルス長は、通常３００ｆｓ（フェムト秒）以下、中でも１００ｆｓ以下が好ましい。下限は特に制限されないが、通常は１００ｆｓ以上である。パルス幅が短くなればなるほど、ＳＨＧ光の発生効率は高くなる。
また、超短パルス光としては、近赤外領域の波長を有する超短パルス光を使用することが好ましい。近赤外領域は生体組織における吸収と散乱が少なく、良好な生体透過性を有する波長帯であるため、近赤外超短パルス光を用いれば、レーザー光を皮膚内部に対して表皮越しに入射させて生体ＳＨＧ光を誘起し、その後方散乱ＳＨＧ光を表皮越しに検出することができる。その他にも、近赤外超短パルス光を用いれば、バックグラウンド光（拡散反射光、蛍光）との分離が容易である、低侵襲的・深浸透性である、熱的ダメージが小さい等の利点が得られる。
具体的には、超短パルス光の中心波長が、通常７００ｎｍから１５５０ｎｍ程度、中でも８００ｎｍから１３００ｎｍ程度、更には１２００ｎｍから１３００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。この観点から、超短パルス光の光源としては、クロム・フォルステライトレーザーが好ましい。クロム・フォルステライトレーザーを用いれば、例えば、中心波長１２５０ｎｍ近傍の超短パルス光を得ることが可能となる。
【００１６】
ＳＨＧ光の検出結果からコラーゲンの配向を把握する具体的な手法としては、検出されたＳＨＧ光の偏光異方性に基づいて把握する手法が挙げられる。この手法は、生体におけるＳＨＧ光の発生効率が、入射レーザー光の偏光の方向とコラーゲンの配向の方向との関係に強く依存することを利用するものである。
生体ＳＨＧ光は、コラーゲン線維分子の構造の非中心対称性に起因しているため、コラーゲン線維分子の中心軸、即ち配向状態に敏感である。図２は、生体ＳＨＧ光の発生に関する入射レーザー光の偏光状態と、コラーゲン線維の配向との関係を示している。図２に示すように、レーザー光がコラーゲン線維の断面方向から入射する場合、あらゆる偏光に対してコラーゲン線維の構造が中心対称性配置となるため、ＳＨＧ光は発生しない。一方、それ以外の方向からの入射に対しては、コラーゲン線維の構造の非中心対称性により、生体ＳＨＧ光が発生する。この場合、ＳＨＧ光の発生効率は、入射レーザー光の偏光とコラーゲン線維の配向との関係に強く依存する。例えば、両者が平行な場合には強い生体ＳＨＧ光が発生する一方で、直交した場合には非常に微弱となる。よって、かかるＳＨＧ光の偏光異方性を解析するにより、コラーゲン線維の配向状態を評価することができる。
【００１７】
具体的には、入射レーザー光の偏光方向がコラーゲン線維の配向方向と直交するときに得られるＳＨＧ光強度をＩ⊥、入射レーザー光の偏光方向がコラーゲン線維の配向方向と平行のときに得られるＳＨＧ光信号強度をＩ‖とすると、ＳＨＧ光の偏光異方性は、以下の式（Ｉ）で定義されるα値によって数値化することができる。
【数１】
0005153401.tif 000002
上記式（Ｉ）で求められるαの値が１に近ければ、入射レーザー光の偏光方向に対してコラーゲン線維が垂直に配向しており、逆に−１に近ければ、入射レーザー光の偏光方向に対してコラーゲン線維が平行に配向しているということになる。従って、このα値を算出して解析すれば、コラーゲン線維の配向を把握することが可能となる。
具体的な解析手法の例を挙げると、例えば、所定の皮膚領域について得られたα値を３次元イメージング化し、得られたα値の３次元イメージから、その皮膚領域の皮膚内部におけるコラーゲンの配向状態の分布情報を抽出することができる。更には、このα値の分布を統計学的に処理することにより、詳細なコラーゲン配向分布を得ることができる。例えば、α値のヒストグラムを作成し、そのヒストグラムのピーク位置から測定領域における平均的なコラーゲン配向方位を、またヒストグラムの分布幅（半値全幅）からコラーゲンの配向がどの程度揃っているかを、それぞれ定量的に評価することが可能になる。また、簡易的にα値の平均値からこれらの評価を行うことも可能である。
上述のように、皮膚のしわ形成に深く関連していると考えられる真皮層のコラーゲン配向を、非接触で高感度に可視化することが可能な手段はこれまで存在しなかったことから、本発明で使用されるＳＨＧ光の検出に基づく手法は、皮膚計測においても革新的な手法であると言える。
【００１８】
次に、本発明の評価方法を達成するための具体的な態様について説明する。なお、本発明の評価方法は、以下の形態に限定されるものではない。
【００１９】
図３は、本発明の評価方法における超短パルス光の照射及びＳＨＧ光の検出に使用可能なＳＨＧ顕微鏡システムの一例を示す構成概略図である。このＳＨＧ顕微鏡システムは、光源１、被検体１０を配置するステージ１１、光検出器（例えば、光電子増倍管）１３、及びコンピューター１４を備えている。光源１と被検体１０との間には、ＮＤフィルター（neutral density filter）２、偏光子３、位相差板４（例えば、１／２波長板、電気光学変調器など）、ミラー５、ダイクロイックミラー６、ガルバノミラー７、第１レンズ１２１、第２レンズ１２２、及び対物レンズ８がこの順序で配置されている。被検体１０と光検出器１３との間には、対物レンズ８、第２レンズ１２２、第１レンズ１２１、ガルバノミラー７、ダイクロイックミラー６、ＳＨＧ光透過フィルター１２がこの順序で配置されている。光検出器１３は、コンピューター１４と接続している。また、対物レンズ８はピエゾステージ９に取り付けられている。なお、実線Ｘは入射レーザー光（超短パルス光）、点線Ｙは反射ＳＨＧ光を示す。
まず、光源１から超短パルス光Ｘが出射され、ＮＤフィルター２で適度なレーザー光強度に調節された後、偏光子３並びに位相差板４を通過する。位相差板の種類に応じて得られる偏光は、ミラー５で反射され、ダイクロイックミラー６を透過した後、ガルバノミラー７で反射される。さらに、第１レンズ１２１と第２レンズ１２２を通過した後、対物レンズ８によりステージ１１上の被検体１０に集光される。被検体１０で発生したＳＨＧ光の後方散乱成分Ｙを対物レンズ８で集め、入射レーザー光Ｘと同一の光路を逆に戻す。ＳＨＧ光Ｙは、第２レンズ１２２と第１レンズ１２１を通過し、ガルバノミラー７で反射される。ダイクロイックミラー６はＳＨＧ光Ｙのみを反射し、ＳＨＧ光透過フィルター１２によってＳＨＧ光Ｙのみが抽出される。抽出されたＳＨＧ光Ｙは、光検出器１３で光検出される。そして検出結果がコンピューター１４に入力され、イメージング処理が行なわれる。
入射レーザー光は、偏光子３で直線偏光にされた後、位相差板４（例えば、１／２波長板）で任意方向の直線偏光に変換することができる。更に、被検体１０上のビームスポットは、ガルバノミラー７、第１レンズ１２１、及び第２レンズ１２２によって、被検体１０の２次元面内を高速走査することができる。あるいは、ステージ１１によって被検体１０を２次元面内で走査することもできる。また、対物レンズ８を取り付けたピエゾステージ９によって、ビームスポットを被検体１０の深さ方向に走査することも可能である。このようにして、ＳＨＧ偏光異方性の２次元又は３次元空間分布を分析することが可能となる。
図３に示すシステムにおいて、例えば、ミラー５は必須の構成要素ではなく、適宜省くことができる。また、面内の２次元分布測定が不要の場合には、ガルバノミラー７，第１レンズ１２１、第１レンズ１２２を、深さ（光軸）方向の分布測定が不要の場合にはピエゾステージ９を適宜省くこともできる。
【００２０】
評価対象となる皮膚は、人間由来のものでもよく、その他の動物由来のものでもよい。また、生体から採取した皮膚組織を測定してもよいが、本発明の測定方法の利点である非侵襲性を生かすためには、生体の皮膚を原位置のまま測定対象とすることが好ましい。
皮膚における測定対象位置も特に制限されず、表皮下の皮膚内部であればよいが、上述のように真皮層のコラーゲンの配向が特にしわと深い関連性を有することから、真皮層を測定対象位置とすることが好ましい。真皮層の深さは生物や身体部位によって大きく異なるが、人間の場合には通常、皮膚表面から０．１ｍｍ〜４ｍｍ程度の深さである。
【００２１】
以上説明した本発明の評価方法によれば、皮膚内部（好ましくは真皮層）におけるコラーゲンの配向を、皮膚のしわを評価するためのパラメーターとして用いることにより、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等の皮膚内部の変化から生じるしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。
具体的には、皮膚内部（好ましくは真皮層）におけるコラーゲンの配向方向と、皮膚のしわの配向方向との関係を調べることにより、皮膚のしわが皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因（ＵＶ等の露光部における皮膚の伸縮）等のによるものか否かを判断するための評価基準とすることができる。
また、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づいて、皮膚にしわが形成される可能性及び／又は方向を予測することもできる。即ち、皮膚にしわが殆ど（或いは全く）存在しない場合でも、皮膚内部においてコラーゲンが一定の方向に配向している場合には、皮膚に今後しわが形成される可能性が高いと判断することができる。また、そのしわの方向は、コラーゲンの配向方向と平行であると予測することができる。
また、超短パルス光（好ましくはクロム・フォルステライトレーザー光）を皮膚内部に照射して、発生したＳＨＧ光の検出結果（特に、ＳＨＧ光の偏光異方性）を用いることにより、皮膚内部のコラーゲンの配向を非侵襲的且つ直接的に評価することが可能である。
【００２２】
本発明の評価方法は、しわ抑制剤（抗しわ剤）の臨床的評価に用いることができる。即ち、光老化によるしわを抑制するために、例えば酸化チタン、酸化亜鉛、パラメトキシ桂皮酸エステル、パラアミノ安息香酸エステル等の各種の紫外線吸収、散乱、遮蔽物質をしわ抑制剤として配合した化粧料（サンスクリーン、サンプロテクト化粧品）や、紫外線によって生じるフリーラジカルによる悪影響を軽減する酸化防止剤等をしわ抑制剤として配合した化粧料等が提案されているが、本発明の評価方法を用いれば、これらのしわ抑制剤がどの程度の効力を有するかを、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。
また、本発明の評価方法は、しわ抑制剤（抗しわ剤）となる物質のスクリーニングにも用いることができる。即ち、しわ抑制剤の候補となる物質について、それらが実際にしわを抑制する効果を有するか否かを、本発明の評価方法を用いて評価すれば、生体の皮膚を評価系として使用することが可能となり、しわ抑制剤をより確実且つ効率的に選定することが可能となる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
６週齢の雄のヘアレスマウスに、１０週間に亘って断続的に紫外線ＵＶ−Ｂを照射した。照射開始時のＵＶ−Ｂ強度は４０ｍＪ／ｃｍ２とし、徐々にＵＶ−Ｂ強度を上昇させて、照射終了時のＵＶ−Ｂ強度は２００ｍＪ／ｃｍ２とした。ＵＶ−Ｂ照射終了後の１６週齢雄ヘアレスマウスの背中皮膚を、光老化マウスの皮膚サンプルとして用いた。また、ＵＶ−Ｂ照射処理を行なわなかった１６週齢雄ヘアレスマウスの背中皮膚を、コントロールマウスの皮膚サンプルとして用いた。
まず、光老化マウス及びコントロールマウスの各皮膚サンプルを目視で観察したところ、コントロールマウスの皮膚サンプルには、目視されるしわは殆ど形成されていないが、光老化マウスの皮膚サンプルには、体の左右方向（頭尾方向に直交する方向）に、特徴的な深いしわが見られた。
【００２５】
次に、これらの光老化マウス及びコントロールマウスの各皮膚サンプルを用いて、ＳＨＧ光に関するデータの測定を行なった。
測定装置としては、図３に示す測定装置を用いた。光源としてはクロム・フォルステライトレーザーを用い、照射する超短パルス光の波長は１２５０ｎｍ、周波数は７５ＭＨｚ、パルス長は９０ｆｓ（フェムト秒）とした。
各皮膚サンプルの皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置に超短パルス光を照射し、ＳＨＧ光の検出を行なった。また、各測定部位に対して入射超短パルスレーザー光の偏光方向を変化させてＳＨＧ光の信号強度を検出し、超短パルス光の偏光方向が垂直方向で各皮膚サンプルのしわ走行方向と直交な場合（マウスの頭尾方向と平行な場合）に得られたＳＨＧ光の信号強度をＩ⊥、超短パルス光の偏光方向が水平方向で各皮膚サンプルのしわの走行方向と平行な場合（マウスの頭尾方向と直交な場合）に得られたＳＨＧ光の信号強度をＩ‖として、上述の式（Ｉ）を用いてα値を算出した。
【００２６】
コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置から得られたＳＨＧ光のイメージを図４に示す。また、そのＳＨＧ光の偏光異方性を表わすα値のイメージ及びヒストグラムを、それぞれ図５及び図６に示す。
【００２７】
なお、図４及び図５の何れも、上列の４枚の画像はコントロールマウスの皮膚サンプルから得られたイメージを表わし、下列の４枚の画像は光老化マウスの皮膚サンプルから得られたイメージを表わす。また、各列は左から順に、それぞれ皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置から得られたイメージを表わす。図４及び図５の各画像は何れも、皮膚サンプル上の４００μｍ×４００μｍの領域に対応する。また、図４及び図５の各画像において、上下方向がマウスの頭尾方向に相当し、左右方向がマウスの頭尾方向に直交する方向、即ちしわの方向に相当する。
【００２８】
図４はＳＨＧイメージで、コントロールマウスの皮膚サンプルと光老化マウスの皮膚サンプルのコラーゲン像を検出している。さらに偏光解析を行うことにより同位置のコラーゲンの配向を示した（図５）。
【００２９】
一方、図５では、各列右側のグラフに示すように、α値が０の場合を白として、α値が正の値（１に近い値）を取る部分を青色で示し、α値が負の値（−１に近い値）を取る部分を赤色で示すことにより、α値をイメージ化している。
図５のα値イメージから、コントロールマウスの皮膚サンプルが、赤と青が混在した比較的等方的なコラーゲン配向を示しているのに対し、光老化マウスの皮膚サンプルでは全体的に赤く表示されており、水平方向のコラーゲン配向が優位であることが分かる。水平方向のコラーゲン配向はしわの走行方向と一致している。
【００３０】
また、図６は、図５の各画像におけるα値のデータを、縦軸をピクセル数、横軸をα値としてヒストグラム化したものである。図６のα値のヒストグラムによれば、コントロールマウスの皮膚サンプルでは、何れの深さにおいてもヒストグラムの中心がゼロ付近に存在するのに対し、光老化マウスの皮膚サンプルでは、ヒストグラムの中心が負の方向（しわの走行方向）にずれていることが分かる。また、光老化マウスの皮膚サンプルにおけるヒストグラムの幅は、コントロールマウスの皮膚サンプルのものと比較すると何れの深さにおいても狭くなっており、光老化マウスの皮膚サンプルの方がコラーゲン配向がよく揃っていることが分かる。
【００３１】
以上の結果から、皮膚内部のコラーゲンの配向と、皮膚の伸縮によって皮膚の露光部に生じたしわの方向との間には相関があること、ひいては、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて皮膚のしわの状態を評価することが可能であることが分かる。
また、皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する上で、ＳＨＧ光の検出に基づく手法が有効であることが分かる。
更には、検出されたＳＨＧ光の偏光異方性をα値で表わし、このα値を統計的に処理したヒストグラムが、皮膚内部のコラーゲンの配向を表わす定量的な指標となり、ひいては皮膚におけるしわの状態を表わす定量的な指標としても使用できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の評価方法によって最も直接的な効果を期待できるのは皮膚美容分野であり、特に皮膚老化診断が興味深い。皮膚老化診断は、近年のアンチエイジングや皮膚美容に対する意識の高まりと共に、今後大きな進展が予想される分野である。特に、本発明の評価方法を化粧品関連分野（例えば、抗しわ化粧品）と有機的に融合することができれば、極めて大きな市場（例えば、加齢や日焼けに伴う皮膚のしわや弾力性低下の評価、化粧品・塗薬の効用テストほか）が生成されると期待される。また、今後日本が直面する高齢化社会において老化問題は切実な問題であり、社会ニーズという観点からも皮膚老化診断の需要は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＨＧ光の検出に基づく皮膚内部のコラーゲンの配向の測定を説明するための模式図である。
【図２】生体ＳＨＧ光の発生に関する入射レーザー光の偏光状態と、コラーゲン線維の配向との関係を示す図である。
【図３】本発明の評価方法における超短パルス光の照射及びＳＨＧ光の検出に使用可能なＳＨＧ顕微測光システムの一例を示す構成概略図である。
【図４】コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置から得られた、ＳＨＧ光のイメージである。
【図５】コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置から得られた、ＳＨＧ光の偏光異方性から求めたα値のイメージである。
【図６】コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、及び２５０μｍの深さの位置から得られた、ＳＨＧ光の偏光異方性から求めたα値のヒストグラムである。
【符号の説明】
【００３４】
１    光源
２    ＮＤフィルター
３    偏光子
４    位相差板
５    ミラー
６    ダイクロイックミラー
７    ガルバノミラー
８    対物レンズ
９    ピエゾステージ
１０    被検体
１１    ステージ
１２    ＳＨＧ光透過フィルター
１３    光検出器
１４    コンピューター
１２１    第１レンズ
１２２    第２レンズ
Ｘ    入射レーザー光
Ｙ    ＳＨＧ光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図４】
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【図５】
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