(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマブシタケ由来の活性物質を製造するための方法であって、
（１）  ヤマブシタケの乾燥子実体を９０容量％以上のエタノールで抽出し、エタノール抽出液を得る工程、
（２）  上記エタノール抽出液を濃縮した後、水を添加する工程、
（３）  ４℃以上、１０℃以下の低温下で放置し、液面の浮遊物を収集する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
工程（１）において、９０容量％以上のエタノールを乾燥子実体に対して５質量倍以上、２０質量倍以下用い、５℃以上、５０℃以下の温度で抽出する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
工程（２）において、エタノール抽出液の濃縮を、減圧下、４０℃以上、５０℃以下で行い、得られた濃縮物に対して４容量倍以上、８容量倍以下の水を用いる請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（３）において、放置時間を５時間以上、２０時間以下とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
上記活性物質が抗認知症作用を有するものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤマブシタケ由来の活性物質を製造するための方法、当該方法で得られる活性物質、当該抽出物を含む組成物、および当該抽出物を有効成分とする経口抗認知症剤と経口抗アルツハイマー型認知症剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、社会の高齢化がますます進み、アルツハイマー型認知症や脳血管性認知症などの認知症の患者の急増が、深刻な社会問題として注目されている。中でもアルツハイマー型認知症は、神経細胞の変性などを原因とするものであり、本人の気付かないうちにその症状が徐々に進行することが特徴である。しかも、現在の医学では根本的な治療法はまだ確立されていないので、一旦発症すれば完治は難しい。よって、病状が進行したり或いは発症する前の段階において、何らかの活性物質により神経細胞変性のリスクを低減したり、症状を緩和したりすることが非常に重要であると考えられる。
【０００３】
アルツハイマー型認知症の発症機序の解明や新しい薬品の探索などの研究開発が盛んに進められており、様々な研究結果が報告されている。例えば、アルツハイマー型認知症の患者の脳においては、神経原繊維の変化、神経細胞の萎縮、神経細胞数の減少といった障害が認められ、これらの病態は、記憶や学習能に関連する前脳基底核コリン作動性神経細胞の障害とよく一致している。この前脳基底核コリン作動性神経細胞に対する栄養因子が神経成長因子（Nerve growth factor：ＮＧＦ）であることから、ＮＧＦの欠乏がアルツハイマー型認知症の誘因の一つであると考えられる。しかし、ＮＧＦはタンパク質であり、経口投与では消化過程で分解されたり、また、血液脳関門を通過しないという問題点があるので、薬剤としての利用は難しい。そこで、アルツハイマー型認知症の予防剤や治療剤として、血液脳関門を通過することができ且つ脳内においてＮＧＦの産生を促進する低分子化合物が探索されている。
【０００４】
また、アルツハイマー型認知症患者の脳にはアミロイドβペプチドが蓄積しており、当該ペプチドが脳内の炎症を引き起こしたり神経原繊維化を誘導したりすることで、神経細胞が死に至る。このペプチドも、アルツハイマー型認知症の原因の一つとして有力視されている。従って、アミロイドβペプチドによる神経細胞への毒性を抑制する物質の探索も、アルツハイマー型認知症の予防剤や治療剤の開発のための有力な戦略の一つである。
【０００５】
ＮＧＦの産生を誘導する物質としては、ヤマブシタケの抽出物が知られている（特許文献１〜２，非特許文献１〜２）。かかる抽出物は、エタノールなどの親水性溶媒で抽出した後、クロロホルムなどで抽出し、さらにカラムクロマトグラフィで精製することにより得られる。
【０００６】
また、ヤマブシタケ由来の抽出物であって、小胞体ストレスの抑制活性、即ちアミロイドβペプチドの毒性抑制作用のあるものも報告されている（特許文献３，非特許文献３）。当該抽出物は、ヤマブシタケをエタノール、アセトンおよびクロロホルムで連続的に抽出した上でカラムクロマトグラフィにより精製することで得られている。
【０００７】
その他、ＮＧＦの産生を誘導する物質として、ヤマブシタケを酢酸エチルやヘキサンで抽出したもの（特許文献４）、水溶性成分を除去した後にエタノールなどで抽出したもの（特許文献５）、単なるエタノール抽出物（特許文献６）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平４−２６６８４８号公報
【特許文献２】特開平４−２７５２８５号公報
【特許文献３】特許第３９４３３９９号公報
【特許文献４】特開平９−５９１７１号公報
【特許文献５】特開平９−５９１７２号公報
【特許文献６】特開平９−１９２６９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hirokazu Kawagishi，他７名，テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters），第３２巻，第３５号，第４５６１〜４５６４頁（１９９１年）
【非特許文献２】Hirokazu Kawagishi，他８名，フィトケミストリー（Phytochemistry），第３２巻，第１号，第１７５〜１７８頁（１９９３年）
【非特許文献３】Kaoru Nagai，他４名，ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（Journal of Nutritional Biochemistry），第１７巻，第５２５〜５３０頁（２００６年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、これまでにもＮＧＦの産生誘導効果などが示されているヤマブシタケ抽出物は種々知られている。
【００１１】
しかし、従来のヤマブシタケ抽出物は、クロロホルムなど有害な非極性溶媒が抽出のために用いられていたり、クロマトグラフィによる精製が必要であった。それでは工業的な製造は難しい上に、有害な非極性溶媒の残留の問題もある。また、上記抽出物に関する効果はin vitro実験により確認されており、経口投与により血液脳関門を経て脳でその作用効果を発揮できるか不明である。
【００１２】
そこで本発明が解決すべき課題は、工業的な大量生産にも適するものであり、経口投与によっても脳に作用して空間認知力や学習記憶力を向上させることができ、また、アミロイドβペプチドの毒性も軽減できる上に、安全性が高く恒常的な服用も可能な活性物質であり、認知症、特にアルツハイマー型認知症に効果があるヤマブシタケ由来の活性物質、並びにその抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記に鑑み、本発明者らは、利便性に富み、実用性があり、活性物質を安定に生産できる方法を種々検討した。その結果、安全性に富むエタノールで抽出されたものであり、且つ水に対して浮遊性を示す物質であれば上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
本発明に係るヤマブシダケ由来の活性物質の製造方法は、
（１）  ヤマブシタケの乾燥子実体を９０容量％以上のエタノールで抽出し、エタノール抽出液を得る工程、
（２）  上記エタノール抽出液を濃縮した後、水を添加する工程、
（３）  ４℃以上、１０℃以下の低温下で放置し、液面の浮遊物を収集する工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る活性物質は、上記本発明方法によって得られるヤマブシタケ由来の活性物質であって、脂溶性物質を主成分とする。
【００１６】
本発明に係る組成物、経口抗認知症剤および経口抗アルツハイマー型認知症剤は、上記ヤマブシタケ由来の活性物質を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明方法によれば、クロロホルムなど毒性の高い非極性有機溶媒による抽出や、クロマトグラフィによる精製を行う必要無く、活性物質を得ることができる。よって、本発明方法は工業的な大量生産にも適するものである。また、本発明に係る活性物質は、経口投与によっても十分に脳の働きを向上させることが可能であり、空間認知力や学習記憶力を高めることができる。その上、本発明の活性物質は小胞体ストレスを軽減し、認知症との関与が疑われているアミロイドβペプチドの毒性を抑制する。よって本発明は、認知症、特にアルツハイマー型認知症の予防や改善に寄与するものとして、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る活性物質の小胞体ストレス抑制活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、先ず本発明に係る製造方法を、実施の順番に従って説明する。
【００２０】
工程（１）
本発明方法では、原料として、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）の乾燥子実体を用いる。当該子実体は、自然乾燥や減圧乾燥など、成分が変質しない程度の温度で明確な湿気が認められない程度に乾燥したものであれば、特に制限無く使用することができる。また、当該子実体としては、抽出効率を向上するためにチップスや粉末などを用いてもよい。
【００２１】
本発明方法では、先ず、ヤマブシタケの乾燥子実体をエタノールまたは９０容量％以上のエタノール水で抽出する。
【００２２】
本発明において９０容量％以上のエタノールとは、無水エタノールまたは９０容量％以上のエタノール水をいうものとする。９０容量％以上のエタノール水としては、９５容量％以上のエタノール水が好ましい。より好適には、無水エタノールを用いる。
【００２３】
エタノールまたはエタノール水の使用量は適宜調整すればよいが、通常、乾燥子実体に対して５質量倍以上、２０質量倍以下程度用いればよい。
【００２４】
抽出時の温度は特に制限されず、５℃以上、５０℃以下程度とすることができ、通常は室温で抽出すればよい。抽出時間も適宜調整すればよいが、一般的に２時間以上、１０時間以下程度とすることができる。また、抽出時には、混合液を攪拌することが好ましい。
【００２５】
抽出後は、エタノール抽出液と固体部分とを分離する。分離手段としては一般的なものを用いればよく、濾過や遠心分離を用いてもよいし、単にデカンテーションするのみでもよい。
【００２６】
工程（２）
次に、上記エタノール抽出液からエタノールを留去して濃縮する。
【００２７】
濃縮時の温度は適宜調整すればよいが、温度を上げすぎると有効成分が分解するおそれもあり得るので、通常、減圧下で４０℃以上、５０℃以下程度とすることが好ましい。この際、固形物が析出する直前まで濃縮することが好ましい。
【００２８】
次いで、得られた濃縮物に水を添加する。
【００２９】
ここで使用される水の種類は特に制限されず、水道水、井戸水、純水、超純水、脱イオン水、蒸留水など特に制限無く使用できるが、好適には脱イオン水または蒸留水を用いる。
【００３０】
水の使用量は適宜調整すればよいが、濃縮物に対して４容量倍以上、８容量倍以下程度とすることができる。
【００３１】
工程（３）
上記濃縮物に水を添加した後は、４℃以上、１０℃以下の低温下で放置し、液面に生じた浮遊物を収集する。温度を１０℃以下にすれば、本発明に係る活性物質を十分に得ることができる。それに対して、温度を低くし過ぎると混合液が凍結し、浮遊物の析出に支障を来たすおそれがあるため、好ましくは４℃以上とする。
【００３２】
放置する時間は適宜決定すればよいが、通常は５時間以上、２０時間以下とする。５時間以上であれば、本発明に係る活性物質を十分に得ることができる一方で、過剰に放置すると生産性が低下するので、２０時間以下とすることが好ましい。より好ましくは、８時間以上、１２時間以下とする。
【００３３】
生じた浮遊物を収集する方法は特に制限されず、例えば、網状の道具などで掬い取ってもよいし、ピペットを使って吸引してもよい。
【００３４】
得られた浮遊物は、乾燥することが好ましい。乾燥方法は適宜選択すればよいが、自然乾燥や減圧乾燥などを用いることができる。
【００３５】
上記本発明方法で得られた活性物質（浮遊物）は、ＮＧＦ産生誘導作用を有し、空間認知力や学習記憶力などの向上効果を有するだけではなく、アミロイドβペプチド毒性の抑制作用をも有するので、抗認知症剤として有用である。また、動物実験で実証されているとおり血液脳関門を通過することができるので、注射投与や局所投与する必要が無く、経口投与が可能である。さらに、水に不溶である一方で、メタノールやエタノールのみならず非極性有機溶媒に可溶であり、比較的脂溶性の高い物質を主成分とするので、腸管吸収性も高いと考えられる。
【００３６】
また、本発明に係る活性物質は、食用であるヤマブシタケ由来のものであることから安全性が高く、毎日の服用も可能であると考えられる。実際、本発明に係る活性物質の安全性は、本発明者らによる実験により確認されている。よって、本発明に係る活性物質は、認知症の症状を改善する治療剤としてのみでなく、恒常的な服用も可能な予防剤としても利用できる。
【００３７】
本発明に係る活性物質は、一般的な添加成分を加えた組成物とした上で、医薬品、保健食品、一般食品などとして利用することが可能である。かかる添加成分としては、賦形剤、安定剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、甘味料などを挙げることができる。その他、ビタミン類、ミネラル類、ハーブ類、キノコ類、不飽和脂肪酸類、リン脂質類、コリン類やその他の栄養素材などを添加してもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００３９】
実施例１  活性物質の製造
乾燥ヤマブシタケ子実体粉末（１０００ｇ）に無水エタノール（１０Ｌ）を加え、室温で５時間抽出した後に濾過することによりエタノール抽出液を得た。得られたエタノール抽出物から、減圧下、４５℃でエタノールを除去することによって、濃縮物を得た。
【００４０】
得られた濃縮物に６倍容量の脱イオン水を添加し、４℃の低温室で１０時間放置した。次いで、液面の浮遊物をピペットにより吸引収集した。さらに、収集した浮遊物を減圧乾燥して約１９．５ｇの活性物質を得た。
【００４１】
実施例２  活性物質の分析
上記実施例１で得られた活性物質は褐色であり、水に不溶であり、メタノール、エタノールおよび非極性有機溶媒に可溶であった。
【００４２】
また、得られた活性物質を９５％エタノールに完全溶解した後、減圧下でエタノールを除去し、得られた残液にクロロホルムを添加し、分配抽出を行うことによって、クロロホルム可溶成分を分取した。
【００４３】
シリカゲルカラムを用いる高速液体クロマトグラフィによって、上記クロロホルム可溶成分を分画精製し、得られた精製物を質量分析、核磁気共鳴分析、ＩＲスペクトルなどにて分析した。その結果、本発明の活性物質には、ヘリセノンＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨなどのベンジルアルコール誘導物またはクロマン誘導物、並びにホスファチジルエタノールアミン誘導物が含まれることが確認された。
【００４４】
実施例３  モリス水迷路試験
アミロイドβペプチド（シグマ社製，Ａβ1-40）によりアルツハイマー型認知症を誘発されたアルツハイマー型認知症モデルラット（ＡＤラット)を用いて、上記実施例１で得た活性物質の空間認知力や学習記憶力の向上作用、並びにＮＧＦ産生誘導活性を調べた。
【００４５】
１２０匹の健康な１１週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットを、偽手術群、無治療群、ドネペジル（アルツハイマー型認知症治療剤，商品名：アリセプト）投与群、本発明活性物質の高用量投与群、中用量投与群および低用量投与群の６群に２０匹ずつ任意に分けた。偽手術群以外のラット脳内両側の海馬区に２μｇ／μＬのＡβ1-40を５μＬ注入し、ＡＤラットを調製した。一方、偽手術群のラットの脳内海馬区には５μＬの生理的食塩水を注入した。３日後、陽性対照としたドネペジル投与群にはドネペジルを１ｍｇ／ｋｇ／日（臨床上使用量である５ｍｇ／６０ｋｇ／日の約２倍）、本発明活性物質の高、中、低用量投与群には、上記実施例１で得た活性物質をそれぞれ２４ｍｇ／ｋｇ／日、１２ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日、偽手術群と無治療群に同容量の生理的食塩水を、胃ゾンデで毎日１回、連続４週間投与した。投与後第４週目から、各群より任意に１０匹ずつを選んで、モリス水迷路試験を毎日１回、連続１週間行った。当該試験では、初日から６日目まで踏み台に到達する時間を測定し、７日目で踏み台を外し、規定の時間内に踏み台の位置を通過する回数を計測した。結果を表１〜２に示す。なお、表１中の値はｎ＝１０の平均値±標準偏差であり、また、表１〜２中の＊＊は偽手術群に対してｐ＜０．０１で有意差がある場合を示し、＃と＃＃は無治療群に対してそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１で有意差がある場合を示す。
【００４６】
【表１】
0005208036.tif 000002
【００４７】
【表２】
0005208036.tif 000003
【００４８】
上記結果のとおり、モリス水迷路試験において、無治療群は、偽手術群と比較して初日から６日目まで踏み台に到達する時間は有意に長く（p＜０．０１）、７日目で２分間以内に踏み台の位置を通過する回数も有意に減少した（p＜０．０１）。かかる結果より、Ａβ1-40の注入によってラットに記憶障害が誘発されたことが示唆される。一方、無治療群と比較して、ドネペジル投与群と本発明活性物質の高用量投与群および中用量投与群では、初日から６日目まで踏み台に到達する時間が短縮し、中でも４〜６日目ではいずれも有意差があった（p＜０．０１）。また、７日目で２分間以内に踏み台の位置を通過する回数は、ドネペジル投与群と本発明活性物質の高用量投与群および中用量投与群で、無治療群よりも有意に増加した（p＜０．０１またはp＜０．０５）。さらに、無治療群と比較して、本発明活性物質の低用量投与群は、２日目から６日目まで踏み台に到達する時間が短縮するという傾向を示し、７日目で２分間内に踏み台の位置を通過する回数も増加した。これらの結果から、本発明活性物質の投与によって、ＡＤラットの空間認知力や学習記憶力が向上することが示された。
【００４９】
実施例４  ＮＧＦ産生誘導活性の測定
上記実施例３において、モリス水迷路試験を行わなかった残りのラットから、脳内の神経核団である嗅球、海馬、青斑および大脳皮質をそれぞれ摘出し、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、その中の神経成長因子（ＮＧＦ）の含有量を測定した。結果を表３に示す。なお、表３中の値はｎ＝１０の平均値±標準偏差であり、また、＊と＊＊は無治療群に対してそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１で有意差がある場合を示す。
【００５０】
【表３】
0005208036.tif 000004
【００５１】
上記結果のとおり、無治療群と比較して、ドネペジル投与群と本発明活性物質の高、中、低用量投与群では、各神経核団の中のＮＧＦ含有量がいずれも増加する傾向が見られ、中でもドネペジル投与群と本発明活性物質の高用量投与群および中用量投与群においては、海馬と大脳皮質のＮＧＦ含有量が有意に増加した（p＜０．０１またはp＜０．０５）。
【００５２】
実施例５  小胞体ストレス抑制活性の測定
近年、アミロイドβペプチドの細胞毒性の発現には、酸化ストレスと小胞体ストレスが大きく関与していることが示唆されている。小胞体ストレスを惹起する物質として知られるツニカマイシンで処理したマウス神経芽細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に対して、本発明活性物質が小胞体ストレスによる細胞死の抑制活性を有するかどうかについて検討した。
【００５３】
９６ウェルプレートにダルベッコＭＥＭ培地を入れ、マウス神経芽細胞を５０００個／ウェルとなるように接種した。３７℃で２４時間培養後、ツニカマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）と上記実施例１で得た活性物質（１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ）を加え、さらに２４時間培養した。その後ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を計測した。結果を図１に示す。
【００５４】
図１に示した細胞生存率は、陰性対照群の１１．６％に対して、本発明活性物質は１μｇ／ｍＬで２３．３％、１０μｇ／ｍＬで４４．８％となった。即ち、本発明活性物質はツニカマイシンの毒性に防御作用を示した。この結果から、本発明活性物質は、小胞体ストレスの軽減を通じて、アミロイドβペプチドによる神経細胞毒性を抑制することが考えられる。
【００５５】
上記実施例３〜５の結果から、本発明に係る活性物質は、認知症、特にアルツハイマー型認知症の予防と治療に有用であることが実証された。
【００５６】
実施例６  安全性試験
本発明物質の安全性を調べるため、マウスを用いた単回経口投与毒性試験と、ラットを用いた反復経口投与毒性試験を行った。
【００５７】
（１）  マウスを用いた単回経口投与毒性試験
健康な５週齢のＩＣＲ系マウスを雄雌それぞれ５匹用い、単回経口投与毒性試験を行った。絶食４時間後に体重を測定し、試験群には３００ｍｇ／ｋｇの本発明活性物質を、対照群には同容量の生理的食塩水を、胃ゾンデで強制単回投与した。観察期間は１４日とし、観察期間終了後すべて解剖検査した。
【００５８】
その結果、雄雌ともに観察期間中に死亡例はなく、一般状態と体重にも異常は見られなかった。解剖検査では、すべての試験マウスの主要臓器にも異常は見られなかった。従って、本発明物質のマウスにおける単回経口投与によるＬＤ50値は、雄雌ともに３００ｍｇ／ｋｇ体重以上であると考えられる。
【００５９】
（２）  ラットを用いた反復経口投与毒性試験
健康な９週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの雄雌それぞれ４０匹を、雄雌それぞれ１０匹ずつ、対照群、本発明活性物質の高、中、低用量試験群の４群へ任意に分けた。本発明活性物質の高、中、低用量試験群には、それぞれ１２０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇの本発明活性物質を、対照群には同容量の０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を、１日１回、週６回、連続１３週間、胃ゾンデを用いて投与した。ラットの体重は週１回測り、その変化によって投与量を調整した。１３週投与終了の２４時間後に、各群から雄雌５匹ずつ計１０匹を任意に選び、採血と解剖検査を行った。残りのラットでは本発明活性物質の投与を中止し、従来通りに飼育し、４週間観察した。その後、採血と解剖検査を行った。
【００６０】
その結果、投与期間中と観察期間中の両方において雄雌ともに死亡例はなく、一般状態と体重に有意な差は見られなかった。また、すべての試験群ラットの血液学検査、血液生化学検査、主要臓器の病理的検査にも異常は認められなかった。以上から、本発明物質は、反復投与においても安全性が高いことが示された。
【図１】
0005208036.tif 000005