(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該真空室内部において、該膜が位置する側と該一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と該一次線照射手段とが対向する領域を仕切ることが可能な仕切り部材と、該膜の損傷を検知する検知手段と、大気圧復帰手段とを備え、該検知手段により該膜の損傷を検知したときに、該仕切り部材が該領域を仕切るとともに、該大気圧復帰手段が該一次線照射手段内部及び該真空室内部を大気圧に復帰させることを特徴とする試料検査装置。
【請求項２】
前記検知手段により前記膜の損傷を検知したときに、前記大気圧復帰手段が前記一次線照射手段内部を介して前記真空室内部にガスを供給することにより、前記一次線照射手段内部及び前記真空室内部を大気圧に復帰させることを特徴とする請求項１記載の試料検査装置。
【請求項３】
前記検知手段は、前記真空室内の圧力上昇に基づいて、前記膜の損傷を検知することを特徴とする請求項１又は２記載の試料検査装置。
【請求項４】
前記仕切り部材は、受け皿構造を有することを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の試料検査装置。
【請求項５】
前記信号検出手段は、前記仕切り部材に取付けられていることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の試料検査装置。
【請求項６】
前記膜の第１の面は、外部からアクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料検査装置。
【請求項７】
前記膜の第１の面に保持された試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料と該マニピュレータを観察する光学像取得手段とを備えることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の試料検査装置。
【請求項８】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、前記膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の試料検査装置。
【請求項９】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の試料検査装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９何れか記載の試料検査装置により、試料の検査を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項１１】
膜の第１の面に試料を保持し、該膜の第２の面に接する空間を減圧し、一次線照射手段により該膜を介して試料に一次線を照射し、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出して試料の検査を行う試料検査方法において、該膜の損傷を検知したときに、該空間における該膜が位置する側と該一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と該一次線照射手段とが対向する領域を仕切り部材により仕切るとともに、該一次線照射手段内部及び該空間を大気圧に復帰させることを特徴とする試料検査方法。
【請求項１２】
前記膜の損傷を検知したときに、前記一次線照射手段内部を介して前記空間にガスを供給することにより、前記一次線照射手段内部及び前記空間を大気圧に復帰させることを特徴とする請求項１１記載の試料検査方法。
【請求項１３】
前記空間の圧力上昇に基づいて、前記膜の損傷を検知することを特徴とする請求項１１又は１２記載の試料検査方法。
【請求項１４】
前記仕切り部材は、受け皿構造を有することを特徴とする請求項１１乃至１３何れか記載の試料検査方法。
【請求項１５】
前記膜の第１の面は、外部からアクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１１乃至１４何れか記載の試料検査方法。
【請求項１６】
前記膜の第１の面に保持された試料に対するマニピュレーション及び光学像の取得を行うことを特徴とする請求項１１乃至１５何れか記載の試料検査方法。
【請求項１７】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、前記膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１１乃至１６何れか記載の試料検査方法。
【請求項１８】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１１乃至１７何れか記載の試料検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料や培養された細胞等からなる試料の観察又は検査を良好に行うことのできる試料検査装置及び試料検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々生物は多細胞動物であり、細胞間の情報伝達が正常に行えなくなる事や、ウイルスや化学物質が細胞に取り付く事によって病気が発症する。このようなことから、分子生物学や、製薬分野では、生体から剥離した細胞をシャーレ上で培養し、その細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を細胞レベルで観察することで研究を行っている。
【０００３】
従来、このような観察には光学顕微鏡が、細胞の刺激にはマニピュレータやピペットが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。
【０００４】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００５】
従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル、もしくは密封型サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。
【０００６】
ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００７】
試料検査を行う際には、まずサンプルカプセル内に細胞と共に培地を入れ、該膜上で細胞を培養させる。その後、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内にサンプルカプセルを配置し、サンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線を照射する。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。
【０００８】
しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、マニピュレータやピペットを用いて細胞に刺激を与えること（マニピュレーション）は不可能であった。さらに、サンプルカプセル内に入れられる培地の量は１５μｌ程度なので培地の蒸発にともなう塩濃度上昇により、細胞培養は困難であり、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。
【０００９】
この問題は、サンプルカプセルを大きくし、中に入れられる容量を増加させることで解決可能である。しかし、膜が電子線や機械的な刺激に対し損傷された場合、装置内が大量の培地で汚染されるという新たな問題が発生する。
【００１０】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter 1 Introduction）にも記載されている。
【００１１】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。
【００１２】
さらに、特許文献４には、膜に保持された試料の試料交換を迅速に行うこと及び真空室内の汚染を防止すること等を目的として、真空室内において、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切るための開閉バルブを備える試料検査装置が示されている。
【００１３】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【特許文献４】特開２００７−２９２７０２号公報
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green, Evan Drake Harriman, Ph.D., Stanford University, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
細胞の微小領域を観察するためには光学顕微鏡では分解能不足で、ＳＥＭを用いた観察が必要である。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、シャーレ上で培養していた試料（細胞）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。
【００１５】
しかし、サンプルカプセルは狭く閉じた空間である為、外部からマニピュレータやピペット等を用いて刺激を与えた直後の様子を観察することが不可能であるという課題があった。さらに、サンプルカプセル内では、カプセル内の容量が少ないことから、水分の蒸発に伴う塩濃度上昇により細胞の長時間培養が困難で、細胞の長時間観察には問題があった。
【００１６】
このような問題を解決するために、本発明は、液体を保持したままの細胞等に対して、外部からマニピュレータやピペット等によるマニピュレーションを可能とするとともに、長時間観察を考慮した試料検査装置及び試料検査方法を提供するためのものである。
【００１７】
なお、特許文献４においては、試料交換を行う際には、上記開閉バルブにより、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切り、この状態で該膜側の空間部のみを常圧復帰させる点の記載がある。そして、試料の検査中に該膜が破損したときには、該開閉バルブを閉じることにより、真空室内の空間を仕切り、真空室内の汚染を防止する点の記載がある。
【００１８】
しかしながら、特許文献４における開閉バルブでは、真空室内の空間を気密に仕切ることとなるので、当該開閉バルブの開閉動作に時間がかかることとなる。
【００１９】
ここで、汚染を確実に回避したい箇所は、一次線照射手段（電子線鏡筒）内部であるが、開閉バルブの開閉動作に時間がかかる場合には、一次線照射手段内部の汚染を確実に防止することができなくなる可能性が生じる。
【００２０】
本発明は、このような課題を解決する試料検査装置及び試料検査方法に関し、少なくとも一次線照射手段内部の汚染を確実に防止できるようにすることにより、試料検査装置のメンテナンスを容易に行うことのできる試料検査装置及び試料検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に基づく試料検査装置は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該真空室内部において、該膜が位置する側と該一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と該一次線照射手段とが対向する領域を仕切ることが可能な仕切り部材と、該膜の損傷を検知する検知手段と、大気圧復帰手段とを備え、該検知手段により該膜の損傷を検知したときに、該仕切り部材が該領域を仕切るとともに、該大気圧復帰手段が該一次線照射手段内部及び該真空室内部を大気圧に復帰させることを特徴とする。
【００２２】
この場合、前記膜の損傷を検知したときには、前記仕切り板が前記領域を仕切るようにすることができる。また、これと並行して、前記一次線照射手段内部及び前記真空室内部を大気圧に復帰させるようにすることもできる。この場合、該一次線照射手段内部を介して、真空室内部にガスを供給するようにするとよい。
【００２３】
さらに、該仕切り板は、膜の損傷時に真空室内に流入する試料を受け取ることのできる受け皿構造を有するとよい。また、該第一の面は外部からアクセス可能なように開放状態で試料を保持してもよい。前記試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料と該マニピュレータを観察する光学像取得手段をさらに備えてもよい。
【００２４】
このように、本発明における試料検査装置は、前記膜の損傷を検知する検知手段を備えており、その検知により該仕切り板を自動的に動作させ、真空室内の空間を部分的に仕切る機能を有する。この検知装置は、前記膜の損傷に伴う前記真空室の気圧上昇を検知する。
【００２５】
ここで、前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていてもよい。前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとすることができる。
【００２６】
本発明に基づく試料検査方法は、膜の第１の面に試料を保持し、該膜の第２の面に接する空間を減圧し、一次線照射手段により該膜を介して試料に一次線を照射し、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出して試料の検査を行う試料検査方法において、該膜の損傷を検知したときに、該空間における該膜が位置する側と該一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と該一次線照射手段とが対向する領域を仕切り部材により仕切るとともに、該一次線照射手段内部及び該空間を大気圧に復帰させることを特徴とする。
【００２７】
この場合、前記膜の損傷を検知したときには、前記仕切り板が前記領域を仕切るようにすることができる。また、これと並行して、前記一次線照射手段内部及び前記真空室内部を大気圧に復帰させるようにすることもできる。この場合、該一次線照射手段内部を介して、真空室内部にガスを供給するようにするとよい。
【００２８】
さらに、該仕切り板は、試料を受け取る受け皿構造を有するとよい。該第一の面はアクセス可能なように開放状態で試料を保持してもよい。また、該試料に対して、マニピュレーション及び光学像の取得を行うようによい。
【００２９】
ここで、該膜の損傷に伴う該真空室の気圧上昇に基づいて、該膜の損傷を検知することができる。また、該膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていても良い。前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとすることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に基づく試料検査装置においては、真空室内部において、膜が位置する側と一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、膜と一次線照射手段とが対向する領域を仕切り板が仕切るとともに、大気圧復帰手段が、一次線照射手段内部及び真空室内部を大気圧に復帰させることとなる。
【００３１】
また、本発明に基づく試料検査方法においては、膜の第２の面に接する空間における膜が位置する側と一次線照射手段が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、膜と一次線照射手段とが対向する領域を仕切り板が仕切るとともに、一次線照射手段内部及び該空間を大気圧に復帰させることとなる。
【００３２】
これにより、膜が破損して破れ、膜に保持された試料が真空室（上記空間）に流入したとしても、膜と一次線照射手段とが対向する領域を仕切り板が速やかに仕切るとともに、一次線照射手段内部及び該空間を大気圧に復帰させることとなるので、少なくとも一次線照射手段内部の汚染を確実に防止することができる。
【００３３】
従って、真空室内部のみを洗浄すればよく、試料検査装置のメンテナンスを容易にすることができる。また、高価な一次線照射手段の損害を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、図面を参照して、本発明における試料検査装置及び試料検査方法について説明する。
【００３５】
図１は、本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、マニピュレータ２６、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）である。この図において、一次線照射手段である電子線鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００３６】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料２０に照射される。この液状試料２０には、本実施例では細胞と培地が含まれている。液状試料２０の上面側は、開放されており、常圧（大気圧）雰囲気に接している。
【００３７】
鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。
【００３８】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる試料も電子線７により走査される。
【００３９】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器４が設けられている。反射電子検出器４は、電子線７が液状試料２０内の試料に照射された際に発生する反射電子を検出するものである。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００４０】
反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。
【００４１】
表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。
【００４２】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、排気手段９により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００４３】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔が形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
【００４４】
また、真空室１１には、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５が設置されている。鏡筒１先端と試料保持膜３２の間には、仕切り板（仕切り部材）１４（図１は開放の状態）が設置されている。この仕切り板１４は、試料保持膜３２が損傷され、真空計１５が所定の圧力上昇を検知した際に、自動的に図２のように移動する。例えば、試料保持膜３２が損傷され液状試料２０が真空室１１内に流入することで真空室が１００Ｐａより高い気圧になった場合、仕切り板１４を図２のように移動させる。
【００４５】
当該移動後の状態では、仕切り板１４は、試料保持膜３２と鏡筒１とが対向する領域を仕切ることとなるが、試料室内部において、試料保持膜３２が位置する側と鏡筒１が位置する側との間を気密に閉鎖しない。
【００４６】
これにより、真空室１１内へ流入した液体試料２０を仕切り板１４で受け止めることができ、鏡筒１や反射電子検出器４の汚染を防止する。仕切り板１４には液状試料を受け取る受け皿が備え付けてあると多量の液体試料の流入に対応できる。
【００４７】
このように、仕切り板１４は、真空室１１内部を上下２つの空間に完全ではなく、部分的に仕切る。その為、構造が簡単で仕切り板の動作も高速にできる。本実施例では真空計１５が圧力上昇を検知して０．１秒で仕切り板を動作（図１の状態から図２の状態にする）可能であった。また、仕切り板の厚みも薄く出来るので、鏡筒１の先端と試料保持膜３２の距離（ＳＥＭでのワーキングディスタンス）を縮め、高分解能を達成することも可能である。
【００４８】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（仕切り板１４と真空計１５も含む）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、試料に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて試料を移動させるマニピュレータ２６と、試料の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。
【００４９】
なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００５０】
本発明における検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００５１】
試料保持体４０は、図３のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。
【００５２】
本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図３の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。
【００５３】
また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
【００５４】
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。
【００５５】
この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。
【００５６】
また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウムや金を蒸着することによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。
【００５７】
膜保持体１８の構成を図４に示す。シリコン基板３４に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図４では下面、図３では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体及び試料（細胞）を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００５８】
また、シリコン基板３４の中央には開口３４ａ（図４では上面、図１および図３では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。また、試料保持膜３２は、その第一の面３２ａが大気圧雰囲気に晒され、第二の面３２ｂが真空雰囲気に晒されるので、この圧力差に絶える為格子３５により支持されて補強されている。
【００５９】
次に、膜保持体１８の作成方法を、図５を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて窒化シリコン膜５０２、５０３を形成する（図５（a））。代表的な厚みは３０ｎｍである。この窒化シリコン膜５０２、５０３上にレジスト５０４、５０５を塗布する（図５（ｂ））。レジスト５０５をフォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５aを残す（図５（ｃ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３を加工し、窒化シリコン膜５０３aを残す（図５（ｄ））。
【００６０】
このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図５（ｅ））。アッシングによりレジスト５０４、５０５aを除去する（図５（ｆ））。格子３５の無い場合の膜保持体１８はこれで完成である。窒化シリコン膜５０２上にレジスト５０６を塗布する（図５（ｇ））。窒化シリコン膜５０２とは反対側に金属５０７（例えばＡｌ、Ｎｉ）を１μｍ成膜する（図５（ｈ））。
【００６１】
金属５０７上にレジスト５０８を塗布し、マスクとフォトリソグラフィー装置を用いてパターンを形成する（図５（ｉ））。レジスト５０８をマスクとして金属層５０７をエッチングする（図５（ｊ））。最後にレジスト５０８をアッシング、もしくは有機洗浄を行い除去する（図５（ｋ））。これにより、開口３４a、および格子３５が形成される。
【００６２】
このようにして作成された膜保持体１８は、図４の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜５０２の第１の面３２ａを上面とする。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。
【００６３】
この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図３）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。
【００６４】
また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、試料付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。
【００６５】
ここで、窒化シリコン膜５０２の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。
【００６６】
なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。
【００６７】
次に、本発明における試料検査方法について説明する。まず、図３のように試料保持体４０を用いて、試料となる細胞３８を培地３９中で培養させる。細胞３８をこのように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。
【００６８】
まず、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培地（例えばSigma社  D5796）を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培地を加え、Tripsinの活性を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培地で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培地（液体試料）３９を継ぎ足す。
【００６９】
この状態で、培養室に静置後、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。上記方法は細胞により異なり、一例として示した。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である試料となる細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培地３９を含有する液状試料２０が構成されることとなる。
【００７０】
なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（試料付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。
【００７１】
上述のように試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、仕切り板１４は閉じられており、図２の状態になっている。続いて、排気手段８、９を用いて真空室１１および鏡筒１内を所定の真空にする。例えば、真空室１１内の圧力は、１Ｐａ以下、鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。
【００７２】
次に、光学顕微鏡２７で細胞３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端はガラス微小管（中に微小電極を設置）が設置してあり、微小電極による細胞への電圧の印加や、ガラス微小管による液体の流出及流入が可能になっている（マニピュレーション）。
【００７３】
この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。
【００７４】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損（破壊）させ、真空室１１内に液体試料２０が流入することがあっても、仕切り板１４が閉まっているので、液状試料２０は仕切り板１４で受け止めることができ、鏡筒１が汚染されることは無い。従来技術における仕切り板１４が無い場合では、液体試料２０は鏡筒１内に入り込み、鏡筒の洗浄又は交換が必要で、装置が使用不可能な状態になっていた。
【００７５】
再び、観察の手順に戻る。液状試料２０が載置された試料保持膜３２が損傷されないことを確認した後、仕切り板１４を開ける。これにより、真空室１１内の仕切りが解除される。その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、他の外光の遮蔽（図への記載は略）を行う。この遮蔽は、膜保持体１８や液状試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。
【００７６】
次に、図１のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。
【００７７】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、反射電子検出器４による反射電子の検出を効率的に行うことができる。
【００７８】
反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ画像）を表示する。
【００７９】
これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え（マニピュレーション）、先ほどと同様にＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する細胞３８の応答を確認する。
【００８０】
撮像後は仕切り板１４を閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が損傷される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、仕切り板１４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。
【００８１】
いずれにせよ、電子線７を液状試料２０に照射させない時は仕切り板１４を閉じ、検査中における仕切り板１４の開放時間を短縮することで、装置内部の汚染確立を低減させることができる。
【００８２】
刺激に対する細胞３８の反応速度が遅い場合、一旦仕切り板１４を閉じ、反応した頃合を見計らって再度仕切り板１４を開放し、電子線７による撮像を行っても良い。反応の確認は光学顕微鏡２７で行うことができる。
【００８３】
また、マニピュレータ２６には、化学物質や薬物を液状試料２０中に散布可能な機構を有すことができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した物質の回収を行うことや、培地のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。
【００８４】
上記において、像を形成する電子には反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。
【００８５】
そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００８６】
上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００８７】
なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていたが、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３７ａに配置し、試料保持体４０内で当該細胞の培養をするようにしてもよい。
【００８８】
以上のように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中試料のＳＥＭ観察が可能となる。特に開放された試料室を用いているため、マニピュレータにより外部から試料へのアクセスが可能で細胞に容易に刺激を与えることができる（マニピュレーション）。
【００８９】
また、ＳＥＭで観察中（仕切り板１４は図１のように開放）に試料保持膜３２が破れた場合には、液体試料２０が真空室１１に流入し圧力は上昇する。その圧力上昇を真空計１５で、例えば１００Ｐａより高い圧力を検知した場合、その情報が電子線制御部２４に送られ、仕切り板１４に仕切り板１４を閉鎖する命令が送られる。
【００９０】
その結果、図２のように仕切り板１４は移動し、液体試料２０は仕切り板１４で受け止められることとなる。液体試料２０の量が多い場合、仕切り板１４には受け皿を用意することも可能である。圧力上昇を検知して、仕切り板１４を閉鎖するまでに要した時間は０．１秒であり、鏡体１の汚染を洗浄不要な程度にまで低減させることができる。
【００９１】
このように、本発明により装置の使い勝手を向上することができる。培地の量を多くすることも可能で、細胞を長時間生存させることもでき、長時間のＳＥＭ観察が可能となる。
【００９２】
本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、試料によっては密封型サンプルカプセル（背景技術参照）を用いた通常の正立型ＳＥＭでも問題は無い。ただし、この場合でも仕切り板１４は密封型サンプルカプセルと鏡筒１の先端の間にあることが必要である。
【００９３】
なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。
【００９４】
また、上記実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞（試料）３８への吸収電流を検出することにより、細胞３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００９５】
本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含むものを用いることができる。
【００９６】
なお、上記の実施例においては、仕切り板１４と反射電子検出器４は別々の構成になっているが、変形例として、図６のようにこれらが一体化されていても良い。すなわち、図６の例では、仕切り板１４の先端に反射電子検出器１４が取付けられている。この場合、仕切り板１４が開放の場合、反射電子検出器１４が鏡筒１の直上に位置し、反射電子の検出効率が最大となる。
【００９７】
次に、図７を参照して、本発明における試料検査装置の第２実施例を説明する。図７に示す試料検査装置は、試料保持膜１５０に保持された細胞１１０に、試料保持膜１５０を介して下側から電子線を照射して試料検査を行う装置である。
【００９８】
試料保持膜１５０は、シャーレ１３０に備えられている。シャーレ１３０内には、液体（培地）及び細胞１１０からなる試料１４０が保持されている。この状態で、シャーレ１３０は、Ｏリング１６０を介して真空室２３０上に載置されている。真空室２３０の上部には、シャーレ１３０の試料保持膜１５０と対向するように、開口が形成されている。
【００９９】
また、真空室２３０の下部には、一次線照射手段としての電子線鏡筒２００の先端部が接続されている。この鏡筒２００は、ＳＥＭ制御回路２０５により制御される。これに応じて、鏡筒２００に配置された電子銃２５００から、電子線が試料１４０に向けて照射される。
【０１００】
当該電子線が試料保持膜１５０を介して細胞１１０に照射されると、細胞１１０からは反射電子が発生する。この反射電子は、反射電子検出器２１０により検出される。反射電子検出器２１０で検出された反射電子に基づく信号は、プリアンプ２１５で増幅され、ＳＥＭ制御回路２０５を経由して、制御コンピュータ１３００に取り込まれる。
【０１０１】
表示モニター１４００は、制御コンピュータ１３００からの信号に基づく二次元画像を試料像として表示する。なお、本装置においては、電子線照射に基づく試料近傍から発生するＸ線が装置外部に漏れることがないように、Ｘ線遮断用カバー２５０が備えられている。このＸ線遮蔽用カバー２５０内外の雰囲気は、常圧（大気圧）となっている。
【０１０２】
真空室２３０内部は、配管２３１を介して、真空ポンプ２１００により排気されるようになっている。この配管２３１は、図示するごとく、真空室２３０内部の底面に接続されている。真空ポンプ２１００は、バルブ２１０５を介して、配管２３１に接続されている。
【０１０３】
また、配管２３１には、圧力ゲージ（圧力検知手段）２０１０が接続され、さらにバルブ２２１０を介してリーク用ガス供給源２２２０が接続されている。圧力ゲージ２０１０は、配管２３１を介して、真空室２３０内部の圧力を検知することができる。
【０１０４】
これら圧力ゲージ２０１０、真空ポンプ２１００及びバルブ２１０５，２２１０は、真空制御システム２０００により、各動作が制御される。
【０１０５】
一方、鏡筒２００内部は、配管２３２を介して、真空ポンプ２５０４により排気されるようになっている。この配管２３２は、図示のように、鏡筒２００内部に接続されている。真空ポンプ２５０４は、バルブ２５０３を介して、配管２３２に接続されている。さらに、配管２３２には、バルブ２５０１を介して、リーク用ガス供給源２５０２が接続されている。
【０１０６】
これら真空ポンプ２５０４及びバルブ２５０１，２５０３も、真空制御システム２０００により、各動作が制御される。
【０１０７】
また、反射電子検出器２１０は、仕切り板（仕切り部材）２６０の先端に取付けられている。仕切り板２６０は、仕切り駆動手段２６５により駆動される。仕切り駆動手段２６５は、真空制御システム２０００により、その動作が制御される。なお、反射電子検出器２１０には、鏡筒２００からの電子線が通過するための開口が形成されている。
【０１０８】
以上の構成からなる試料検査装置において、細胞１１０を観察対象として観察（検査）する際には、真空室２３０内部及び鏡筒２００内部は、それぞれ設定された真空度まで減圧される。
【０１０９】
すなわち、真空制御システム２０００がバルブ２２１０を閉状態とするとともに、バルブ２１０５を開状態とする。これにより、真空室２３０内部が、配管２３１を介して真空ポンプ２１００により真空引きされる。
【０１１０】
また、真空制御システム２０００がバルブ２５０１を閉状態とするとともに、バルブ２５０３を開状態とする。これにより、鏡筒２００内部が、配管２３２を介して真空ポンプ２５０４により真空引きされる。
【０１１１】
この状態で、鏡筒２００の電子銃２５００から、真空室２３０を通じて、細胞（試料）１１０に向けて電子線が照射される。この電子線は、試料保持膜１５０を介して、細胞１１０に到達する。このとき、細胞１１０から発生した反射電子は、試料保持膜１５０を通過して、反射電子検出器２１０に到達し、反射電子検出器２１０により検出される。この結果、試料像が形成されることとなる。
【０１１２】
このような試料観察（試料検査）を行っているときに、上記液体及び細胞１１０を含む試料１４０を保持している試料保持膜１５０の損傷（破壊）が生じた場合、膜損傷部を通じての大気の侵入により、真空室２３０の内部雰囲気の真空劣化（例えば、内部圧力を１Ｐａに設定しているときに、内部圧力が３０Ｐａ以上となる急激な圧力上昇）が発生することとなる。この場合、当該真空劣化は、圧力ゲージ２０１０により検知され、真空システム２０００にその情報が送られる。
【０１１３】
真空システム２０００は、当該情報を検知すると、仕切り駆動手段２６５の動作を行う。これにより、真空室２３０内において、仕切り板２６０が移動して、試料保持膜１５０と鏡筒２００との間に仕切り板２６０が位置する。このとき、真空室２３０内において、仕切り板２６０は、試料保持膜１５０が位置する側と鏡筒２００が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、試料保持膜１５０と鏡筒２００とが対向する領域を仕切ることとなる。
【０１１４】
これにより、仕切り板２６０が即座に高速で移動することができ、試料保持膜１５０の損傷により液体を含む試料１４０が真空室２３０内に侵入しても、その殆どは仕切り板２６０により受け止められることとなる。
【０１１５】
また、上記の動作と同時に、真空制御システム２０００は、配管２３１側のバルブ２１０５及び配管２３２側のバルブ２５０３を閉じるとともに、配管２３２側のバルブ２５０１を開ける。これにより、配管２３１を介する真空排気及び配管２３２を介する真空排気が停止するとともに、配管２３２を介してガス供給源２５０２から窒素等のリーク用ガスが鏡筒２００内部に供給される。
【０１１６】
鏡筒２００内部に供給されたリーク用ガスは、真空室２３０内部に到達し、鏡筒２００内部及び真空室２３０内部（配管２３１内を含む）が大気圧に復帰する。このとき、鏡筒２００内部から、鏡筒２００の先端を介して真空室２３０内部にリーク用ガスが流れ込むので、試料保持膜１５０の損傷により液体を含む試料１４０が真空室２３０内に侵入しても、鏡筒２００内部に、当該試料１４０が入り込むことがなく汚染が生じない。
【０１１７】
なお、試料室２３０の大気圧復帰を迅速に行いたい場合には、配管２３１側のバルブ２２１０を開けることにより、真空室２３０内部に、配管２３１を介して、ガス供給源２２２０からリーク用ガスを供給することも可能である。この場合には、上述したガス供給源２５０２から鏡筒２００に供給されるリーク用ガスの流量に対して、ガス供給源２２２０から供給されるリーク用ガスの流量を小さく設定することが望ましい。この理由は、鏡筒２００内部から真空室２３０内部へのリーク用ガスの流れを維持するためである。
【０１１８】
また、上記によるリーク用ガスの供給により、真空室２３０内部が、大気圧に対して加圧状態（逆圧）となることを避けるために、真空室２３０内が大気圧より若干低い程度の圧力に達したのを圧力ゲージ２０１０により検知したときに、真空制御システム２０００がバルブ２５０１（及びバルブ２２１０）を閉じるようにしてもよい。
【０１１９】
このように、本発明における試料検査装置は、第１の面に試料が保持される試料保持膜３２，１５０と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室１１，２３０と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段１，２００と、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４，２１０と、該真空室内部において、該膜が位置する側と一次線照射手段１，２００が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と一次線照射手段１，２００とが対向する領域を仕切ることが可能な仕切り部材１４，２６０とを備える。
【０１２０】
このとき、膜３２，１５０の損傷を検知する検知手段１５，２０１０を設けることにより、該検知手段により該膜の損傷を検知したときに、仕切り部材１４，２６０が当該領域を仕切るようにすることができる。
【０１２１】
さらに、検知手段１５，２０１０により該膜の損傷を検知したときに、一次線照射手段１，２００内部及び真空室１１，２３０内部を大気圧に復帰させる大気圧復帰手段２２２０，２５０２が設けられている。
【０１２２】
この場合、検知手段１５，２０１０により該膜の損傷を検知したときに、大気圧復帰手段２５０２が一次線照射手段２００内部を介して真空室２３０内部にリーク用ガスを供給することにより、一次線照射手段２００内部及び真空室２３０内部を大気圧に復帰させることができる。なお、検知手段１５，２０１０は、真空室１１，２３０内の圧力上昇に基づいて、該膜の損傷を検知することができる。
【０１２３】
ここで、仕切り部材１４，２６０は、受け皿構造を備えることができる。また、信号検出手段４，２１０は、仕切り部材１４，２６０に取付けることができる。
【０１２４】
試料保持膜の第１の面は、マニピュレータにより外部からアクセス可能なように開放状態で試料を保持することができる。ここで、該膜の第１の面に保持された試料に接近又は接触可能な先端部を具備するマニピュレータと、該試料と該マニピュレータを観察する光学像取得手段とを備えることができる。
【０１２５】
ここで、試料保持膜の第１の面を該膜の上面とし、試料保持膜の第２の面を該膜の下面とすることができる。また、一次線照射手段１，２００から放出される一次線を、荷電粒子線又は電子線とし、二次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとすることができる。
【０１２６】
本発明における試料検査方法は、上記試料検査装置により、試料の検査を行うことにより実行される。
【０１２７】
すなわち、本発明における試料検査方法は、試料保持膜３２，１５０の第１の面に試料を保持し、該膜の第２の面に接する空間を減圧し、一次線照射手段１，２００により該膜を介して試料に一次線を照射し、該一次線の照射により試料から発生する二次的信号を検出して試料の検査を行う試料検査方法において、該膜の損傷を検知したときに、該空間における該膜が位置する側と一次線照射手段１，２００が位置する側との間を気密に閉鎖することなく、該膜と一次線照射手段１，２００とが対向する領域を仕切り部材１４，２６０により仕切ることができる。
【０１２８】
このとき、該膜の損傷を検知したときに、一次線照射手段１，２００内部及び当該空間を大気圧に復帰させることができる。また、該膜の損傷を検知したときに、一次線照射手段１，２００内部を介して当該空間にリーク用ガスを供給することにより、一次線照射手段１，２００内部及び当該空間を大気圧に復帰させることができる。なお、当該空間の圧力上昇に基づいて、該膜の損傷を検知することができる。
【０１２９】
さらに、該膜の第１の面に保持された試料に対するマニピュレーション及び光学像の取得を行うことができる。
【０１３０】
最後に、実施例２の変形例を図８に示す。図８に示す試料検査装置と、図７に示す装置との相違点は、仕切り板２６０の下面が、図７に示すものより若干下方に位置しており、当該下面にＯリング１６１が備えられている点である。
【０１３１】
この変形例では、仕切り板駆動手段２６５の動作時には、仕切り板２６０が当該Ｏリング１６１を介して鏡筒２００の先端を閉じることとなる。これにより、鏡筒２００内部は、真空室２３０内部から気密に閉鎖される。
【０１３２】
この構成では、仕切り板２６０の上記閉動作の後に、配管２３１を介して、真空室２３０の底部側からリーク用ガスを供給する。このような構成によっても、鏡筒２００内部への汚染を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図２】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図３】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図４】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。
【図５】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【図６】本発明における試料検査装置の第１実施例の変形例を示す概略構成図である。
【図７】本発明における試料検査装置の第２実施例を示す概略構成図である。
【図８】本発明における試料検査装置の第２実施例の変形例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【０１３４】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器（信号検出手段）、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…仕切り板、１５…真空計、１８…膜保持体（枠状部材）、１９…空間、２０…液状試料、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３５…格子、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（試料）、３９…培地、４０…試料保持体、４１…閉塞物質、４１ａ…閉塞物質、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２…窒化シリコン膜、５０３…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５０６…レジスト、５０７…金属、５０８…レジスト、５１０…開口、
【図１】
0005215701.tif 000002
【図２】
0005215701.tif 000003
【図３】
0005215701.tif 000004
【図４】
0005215701.tif 000005
【図５】
0005215701.tif 000006
【図６】
0005215701.tif 000007
【図７】
0005215701.tif 000008
【図８】
0005215701.tif 000009