(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、
ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、およびＩＧＦＢＰ５から成るグループから選択される成長因子結合タンパク質、および
ビトロネクチン、
からなる単離タンパク質複合体。
【請求項２】
組換え形式で生産される、請求項１に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項３】
インスリン様成長因子結合タンパク質がＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５である、請求項１に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項４】
インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、
ビトロネクチン、および
ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５から選択された非グリコシル化ＩＧＦＢＰ、
からなる単離タンパク質複合体。
【請求項５】
前記非グリコシル化ＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ３である請求項４に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項６】
請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体の形成を防止または妨害するための、欠失または変異したＨＢＤを有する変異型ＩＧＦＢＰの使用方法。
【請求項７】
請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体の形成を防止または妨害するための、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の使用方法。
【請求項８】
ビトロネクチンは多量体である、請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項９】
ビトロネクチンは単量体である、請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項１０】
各ビトロネクチンモノマー単量体が、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、およびＩＧＦＢＰ５から成るグループから選択された同じかまたは異なるＩＧＦＢＰに結合される、請求項９に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項１１】
前記ＩＧＦＢＰはビトロネクチンへのＩＧＦ−Ｉの結合を媒介する請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体。
【請求項１２】
請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体を含む、細胞増殖を刺激する組成物。
【請求項１３】
請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体を含む、外科インプラントまたは補綴。
【請求項１４】
請求項１または４に記載の組換えタンパク質複合体を発現することができる、形質転換細胞。
【請求項１５】
細胞増殖を刺激するための請求項１または４に記載の単離タンパク質複合体のインビトロにおける使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、成長因子結合タンパク質とビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体に関する。詳細には、本発明は、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体に関する。本発明はさらに、成長因子複合体の形成を促進または増強する変異型成長因子および／または成長因子結合タンパク質を含む成長因子複合体も提供する。本発明はさらに、創傷治癒、皮膚修復、美容用の皮膚の手入れ、および組織置換療法の目的で、該タンパク質複合体を投与することにより細胞増殖および／または細胞移動を調節する方法も提供する。反対に、癌、乾癬、アテローム性動脈硬化、および肥大性瘢痕化をもたらす傾向がある傷を治療する目的で、タンパク質複合体がインビボで形成されるを妨害することにより、成長因子が原因で起こる細胞増殖および／または細胞移動を抑制することも可能である。以上の処置は、医学・獣医学への用途を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
皮膚の成長、修復および治癒は、正のシグナルと負のシグナルの両方を介して作用する複雑な生物学的制御機構を受ける。そのようなシグナルは、細胞増殖、分化、および移動を制御するレベルで作用し、一般には成長因子ポリペプチドにより媒介される。これに関する重要な成長因子として、上皮成長因子（ＥＧＦ）とインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩ）が挙げられる。
【０００３】
ヒトＩＧＦ−Ｉは細胞増殖、分化および移動の刺激；タンパク質の分解およびアポトーシスからの保護；ならびに成長ホルモンのような内分泌系因子の調節を始めとする、広範な生物活性を発揮することが報告されている。ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−Ｉと同様の性質を有するが発癌および胎児または胚の発達により関連が深いようであり、ＩＧＦ−Ｉは出生後の発達においてより大きな役割を有する。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩはいずれもＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ）との結合相互作用を介して作用する。そのような相互作用についてのＩＧＦの有効性はインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）によって調節される。ＩＧＦＢＰはＩＧＦ機能を正にも負にも調節し、また、ＩＧＦ非依存的な活性を示すことが知られている。
【０００５】
ＩＧＦ経路の別の機能的成分は、陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸エステル受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）として知られているＩＩ型ＩＧＦＲである。ＩＧＦ−ＩＩと結合する機能的重要性は不明確であるが、ＩＩ型ＩＧＦＲは、ＩＧＦ−ＩＩと同様に、マンノース−６−リン酸エステル部分を備えたリソソーム酵素にも結合する多機能タンパク質である（O'Dell & Day, 1998, Int. J. Biochem. Cell Biol. 30 767; Braulke, 1999, Horm. Metab. Res. 31 242; Nykjaer et al., 1998, J. Cell. Biol. 141 815 ）。
【０００６】
ＩＧＦは、構造的類似性を共有し、かつ結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）ならびにｍａｃ２５遺伝子、ｎｏｖ遺伝子およびｃｙｒ６遺伝子によりコードされた産物を含む、「ＩＧＦＢＰ関連タンパク質」と称される別のタンパク質のグループと結合することも報告されている。それらはＩＧＦＢＰよりもはるかに低い親和性でＩＧＦに結合する。
【０００７】
より最近、ビトロネクチン（ＶＮ）が、構造的にＩＧＦＢＰおよびＩＧＦＢＰ関連タンパク質と無関係な、ＩＧＦ−ＩＩには結合するがＩＧＦ−Ｉには結合しない細胞外基質タンパク質として確認された（lipton et al., 1999, Endocrinol. 140 2928 ）。
【０００８】
ビトロネクチンは血中でも見出される７５ｋＤ以下のグリコシル化した細胞外基質タンパク質であり、癌、骨疾患、血管新生に関する病理学的障害に関与している（Schvartz et al., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31 539 に概説）。血管新生や腫瘍形成のような事象におけるビトロネクチンの役割の少なくとも一部は、ビトロネクチンがインテグリンと結合してウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子系の構成成分（例えばＰＭＩ−１、ｕＰＡＲ、プラスミノゲン）と相互作用し、それにより細胞の増殖、接着、伝播、移動を促進するという能力にある。ビトロネクチンはより詳しくは、薬物処理に応答した腫瘍細胞アポトーシスの防止に関与している（Uhm et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5 1587）。ビトロネクチンは、循環でのＩＧＦ−ＩＩの担体であるようである（McMurtry et al., 1996, J. Endocrinol. 150 149 ）。
【０００９】
（発明の目的）
本発明者は、ＩＧＦＢＰがビトロネクチンと結合し、ＩＧＦ−１がＩＧＦＢＰ結合された時にビトロネクチンと結合できることができるという、驚くべき発見をした。
【００１０】
従って、本発明の目的は、単離ＩＧＦＢＰとビトロネクチンを含む複合体を提供することにある。
（発明の要約）
第１の態様では、本発明は、成長因子結合タンパク質とビトロネクチンを含む単離ポリペプチド複合体を提供する。
【００１１】
好ましくは、単離ポリペプチド複合体は成長因子をさらに含む。
好ましい成長因子はインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）である。
他の成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、オステオポンチン、ＰＡＩ−１、およびトランスフェリンが挙げられる。
本発明のタンパク質複合体を形成可能な他の生物活性タンパク質には、トロンボスポンジン−１、テネイシン−Ｃ、ＰＡＩ−１、プラスミノゲン、フィブリノゲン、フィブリンが含まれる。
【００１２】
好ましい成長因子結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５およびＩＧＦＢＰ６から成るグループから選択されたインスリン様成長因子結合タンパク質である。
【００１３】
より好ましいインスリン様成長因子結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、またはＩＧＦＢＰ５である。
さらに好ましいインスリン様成長因子結合タンパク質はＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５である。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、ＩＧＦＢＰ関連タンパク質とビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体を提供する。
好ましくは、単離ポリペプチド複合体は成長因子、好ましくはＩＧＦ−Ｉをさらに含む。
【００１５】
１実施形態では、ＩＧＦＢＰ関連タンパク質は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ｍａｃ２５遺伝子によりコードされたポリペプチド、ｎｏｖ遺伝子によりコードされたポリペプチド、およびｃｙｒ６１遺伝子によりコードされたポリペプチドから成るグループから選択される。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、ビトロネクチン、変異型成長因子、および変異型成長因子結合タンパク質の少なくともいずれか１つを含む単離タンパク質複合体を提供する。
【００１７】
１実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含むように操作設計された変異型成長因子とを含む。
【００１８】
別の実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、非グリコシル化成長因子結合タンパク質とを含む。
さらに別の実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、ｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩおよびｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉから成るグループから選択された変異型成長因子とを含む。
【００１９】
上述の第１、第２、および第３の態様によれば、本発明の単離タンパク質複合体が、ＩＧＦＢＰと複合体を形成することができるポリペプチドである、以下にＡＬＳと称する酸不安定性サブユニットをさらに含むことも企図される。
【００２０】
上述の第１、第２、および第３の態様によれば、本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ関連タンパク質、およびビトロネクチンの変異型と生物活性断片を含む単離タンパク質複合体と、そのような複合体の使用方法も企図する。生物活性断片と変異型はその範囲内に、上記成長因子、成長因子結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ関連タンパク質、およびビトロネクチンの類似体、突然変異型、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。
【００２１】
第４の態様では、本発明は、上述の第１、第２、および第３の態様による１または複数の単離タンパク質複合体と、医薬として許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２２】
第５の態様では、本発明は、上述の第１、第２、および第３の態様による１または複数の単離タンパク質複合体をコードする１または複数の核酸を含む発現構築物と、医薬として許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、組換えタンパク質複合体または上述の第１、第２、および第３の態様による複合体を形成可能な組換えタンパク質を発現することができる形質転換細胞を提供する。
【００２４】
第７の態様では、本発明は、動物または該動物からの単離細胞に、上述の第１、第２、および第３の態様による単離タンパク質複合体を投与するステップから成る、細胞増殖および細胞移動の少なくともいずれかを調節する方法を提供する。
【００２５】
好ましくは、単離タンパク質複合体はＩＧＦＢＰとビトロネクチンを含む。
好ましくは、単離タンパク質複合体はＩＧＦ−Ｉをさらに含む。
第８の態様では、本発明は、動物または該動物からの単離細胞に、上述の第１、第２、および第３の態様によるタンパク質複合体の形成を防止または妨害する作用物質を投与するステップから成る、細胞増殖および細胞移動の少なくともいずれかを調節する方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、作用物質はＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の相互作用を防止または妨害する。
より好ましくは、作用物質はＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の相互作用を防止または妨害し、タンパク質複合体はＩＧＦ−Ｉを含む。
【００２７】
例えば、作用物質は、ＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の相互作用またはＩＧＦＢＰ関連タンパク質とビトロネクチンの間の相互作用に対するアンタゴニストである。
【００２８】
ＩＧＦＢＰとビトロネクチンの複合体の形成を阻害する作用物質の例はＩＧＦ−ＩＩである。
以下により詳述されるように、ビトロネクチンとＩＧＦＢＰの間の相互作用の妨害は、腫瘍細胞の増殖を阻害するだけでなく、腫瘍転移も阻害する。それらはいずれも腫瘍病理学の中心となる事象である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、乾癬、アテローム性動脈硬化、胃腸上皮の劣化および上皮乳癌を始めとする上皮細胞に関する疾患の治療的または予防的処置における、および／または創傷治癒、皮膚修復、潰瘍および火傷治癒、自己由来の皮膚移植のようなインビトロでの皮膚再生、骨再生、損傷したニューロン組織の修復の処置における、本発明の上述の態様による単離タンパク質複合体および方法の使用方法を提供する。
【００３０】
従って、本発明は、本発明の単離タンパク質複合体を含む外科インプラントまたは補綴も提供する。外科インプラントまたは補綴は、単離タンパク質複合体により、コーティング、含浸、またはそれ以外の方法で前処理されていてもよい。
【００３１】
本発明により処置される動物は、哺乳動物、好ましくはヒトであることが好ましいが、魚、爬虫類、鳥類のような非哺乳動物である脊椎動物や、それらのいずれかから単離された細胞であってもよい。
【００３２】
本明細書全体にわたって、別段示さない限り、「から成る、含む、備える、有する（comprise）」とその変化形（comprises, comprising ）は、排他的なものではなく包括的なものとして使用される。その結果、１つの明示された整数または複数の整数のグループは、他の明示されていない１または複数の整数や複数の整数のグループを含み得る。
【００３３】
（図面と表の簡単な説明）
表１：成長因子と成長因子結合タンパク質をコードする核酸を示す参考文献のリスト。
表２：ビトロネクチンに結合したＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−５はＨａＣＡＴヒトケラチン生成細胞でのタンパク質合成を刺激する。データは３Ｈ−ロイシン取り込みの測定値から得たものであり、各処理を３連で試験した１回の実験からの、２４時間にわたる対照（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−５またはビトロネクチンなし）を超える刺激（％）として表す。ＩＧＦ−Ｉはビトロネクチン（３００ｎｇ／ウェル）の存在下（＋）またはビトロネクチンの不在下（−）でＩＧＦＢＰ−５（５ｎｇ／ウェル）に加えた。
【００３４】
図１：１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するインスリン（▲）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したＩＧＦ−ＩＩ（１０，０００ｃｐｍ）をＶＮコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はＩＧＦ−ＩＩまたはインスリンを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、３回の実験の代表からの３つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【００３５】
図２：１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したＩＧＦ−ＩＩ（１０，０００ｃｐｍ）をＶＮ（◆）コートしたウェルかＩＧＦＢＰ２コートしたウェル（◆）に加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はＩＧＦを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。
【００３６】
図３：１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するｐｒｏＩＧＦ−ＩＩ（■）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したＩＧＦ−ＩＩ（１０，０００ｃｐｍ）をビトロネクチンコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はＩＧＦ−ＩＩまたはプロＩＧＦ−ＩＩを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、２回の別個の実験からの３つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【００３７】
図４：１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するＰＡＩ−１（■）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したＩＧＦ−ＩＩ（１０，０００ｃｐｍ）をビトロネクチンコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はＩＧＦ−ＩＩまたはＰＡＩ−１を加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、３回の実験の代表からの３つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【００３８】
図５：ビトロネクチンに結合する時の、（Ａ）ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ３と、（Ｂ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ３の、プレインキュベーションの影響を比較する競合結合アッセイ。ＩＧＦＢＰ３はグリコシル化せず、Ｅ．ｃｏｌｉで生産した。ＩＧＦＢＰ３＋１０，０００ｃｐｍ［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩ（Ａ）または［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉ（Ｂ）の増大濃度を４時間プレインキュベートし、ビトロネクチンコートしたウェルに加えた。あるいは、ＩＧＦＢＰ３＋１０，０００ｃｐｍ［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩ（Ａ）または［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉ（Ｂ）を、プレインキュベートせずにビトロネクチンコートしたウェルに加えた。結合は非特異的結合のない状態で得られたｃｐｍとして表す。結果を、３回の別個の実験の代表からの３つのレプリカの平均値として示す。
【００３９】
図６：（Ａ）ＩＧＦＢＰ１、（Ｂ）ＩＧＦＢＰ２、（Ｃ）ＩＧＦＢＰ３、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ４、（Ｅ）ＩＧＦＢＰ５および（Ｆ）ＩＧＦＢＰ６の存在下でのＶＮコートウェルへの標識ＩＧＦ−Ｉの結合。組換えＩＧＦＢＰは哺乳動物細胞で生産した。図示したＩＧＦＢＰの存在下での、結合した標識ＩＧＦ−Ｉ／ＶＮコートウェル（３００ｎｇ／ウェル）の平均ｃｐｍとして表されるデータは、６回の個別の決定から得たものである。１０，０００ｃｐｍの放射標識ＩＧＦ−Ｉを各ウェルに加えた。
【００４０】
図７：「Ｇｌｙ  ＩＧＦＢＰ−３」（グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３）、「ＩＧＦＢＰ−３  ＨＢＤ変異型」（推定ヘパリン結合ドメインが変異したＩＧＦＢＰ−３、および「ｎｏｎ−ｇｌｙ  ＩＧＦＢＰ−３」（非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３）の存在下でのＶＮに対する標識ＩＧＦ−Ｉの結合。
【００４１】
図８：［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉまたは［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩとインキュベートした非グリコシル化ＩＧＦＢＰ３と競合する、ＩＧＦおよびｄｅｓＩＧＦの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。３０ｎｇ（Ａ）または１０ｎｇ（Ｂ）のＩＧＦＢＰ３＋１０，０００ｃｐｍ［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩ（Ａ）またはＩＧＦ−Ｉ（Ｂ）をＶＮコートウェルに加えた。ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（図示せず）およびｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩの増大濃度を加えて、ＶＮへの結合に関して放射標識と競合させた。１０ｎｇ（Ａ）または３０ｎｇ（Ｂ）のＩＧＦＢＰ３のいずれかで処理したＶＮコートした対照ウェルを、ＶＮのみでコートした対照ウェルと共に示す。結合は非特異性結合のない状態で得られたｃｐｍとして表す。結果を、３回の別個の実験の代表からの３つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【００４２】
図９：ヒトケラチン生成細胞におけるタンパク質合成の刺激。２４時間にわたる対照（−ＶＮ、−ＩＧＦ−ＩＩ）を超える刺激（％）として表されるデータは、各処理各処理を３連で試験した３回の反復試験からプールしたものである。白抜きバー（ＶＮのみの効果）と灰色バー（ＩＧＦ−ＩＩのみの効果）を組み合わせて表される理論的相加効果を、ＶＮと予め結合させたＩＧＦ−ＩＩで実際観察される効果（黒色バー）と比較する。試験したＩＧＦ−ＩＩの最低濃度を除くすべての例で、実際に観察された効果は計算した相加効果よりも有意に大きい。（ｐ＜０．０５）。
【００４３】
図１０：（Ａ）ＩＧＦＢＰ１、（Ｂ）ＩＧＦＢＰ２、（Ｃ）ＩＧＦＢＰ３、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ４、（Ｅ）ＩＧＦＢＰ５および（Ｆ）ＩＧＦＢＰ６の存在下でのＶＮコートウェルへの標識ＩＧＦ−ＩＩの結合。組換えＩＧＦＢＰは哺乳動物細胞で生産した。図示したＩＧＦＢＰの存在下での、結合した標識ＩＧＦ−ＩＩ／ＶＮコートウェル（３００ｎｇ／ウェル）の平均ｃｐｍとして表されるデータは、６回の個別の決定から得たものである。１０，０００ｃｐｍの放射標識ＩＧＦ−ＩＩを各ウェルに加えた。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明の少なくとも一部は、ＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の結合相互作用によりＩＧＦ−Ｉがビトロネクチンと結合するという本発明者による発見から生じたものである。更に、本発明は、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰおよびビトロネクチンの間の結合を増大または減小させるのに使用可能な変異型ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰについても説明する。これらの発見により、本発明者は、細胞の成長、増殖および移動に関連する付随のインビボでの生物学的事象を操作する目的で、インビトロのそれらの物質の相互作用を操作することとなった。従って、本発明は、医学と獣医学の両方の領域において、創傷治癒、皮膚の修復と手入れ、骨再生、アテローム性動脈硬化、および癌療法のような、医療処置に有用性を有する。
【００４５】
本発明の目的において、「単離」とは、自然状態から除去されるか、他の方法で人の操作を受けることを意味する。単離物質は、自然状態で通常該物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含んでいないか、自然状態で通常該物質に付随する成分と共に人工的な状態にあるように操作設計される。
【００４６】
「ポリペプチド」とは「タンパク質」をも意味し、いずれの用語もアミノ酸のポリマーを指す。
成長因子、成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチンタンパク質を包含するタンパク質およびペプチドは、天然の形式で、化学合成の形式で、または組換え合成形式で単離され得る。
【００４７】
「ペプチド」とは、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
「生物活性断片」とは、タンパク質の生物活性の少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％を示す、タンパク質の断片、部分またはセグメントである。
【００４８】
ペプチドは、組換技術または化学合成法により容易に合成することができる。例えば、Blackwell Scientific Publications より出版されたNicholson 編、題目「合成ワクチン（Synthetic Vaccines）」の刊行物に含まれている、AthertonとShephardの「ペプチド合成（Peptide Synthesis ）」の第９章に例えば記載されているような、溶液合成や固相合成を参照することができる。ペプチド合成法は、引用により本明細書に組み込まれるColigan et al.編、「タンパク質科学における最新プロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE）」  (John Wiley & Sons NY, 1997)の第１８章にも記載されている。代替的に、ペプチドは、エンドＬｙｓ−Ｃ、エンドＡｒｇ−Ｃ、エンドＧｌｕ−ＣおよびスタフィロコッカスＶ８プロテアーゼのようなプロテイナーゼで本発明のポリペプチドを消化することによっても生成することができる。消化された断片は、例えば高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法により精製することができる。
【００４９】
好ましい形式では、本発明は、ビトロネクチン、成長因子および成長因子結合タンパク質を含む単離タンパク質複合体を提供する。
「成長因子」とは、生物体の成長または該生物体の細胞の成長を刺激または促進する分子のことを意味する。好ましい成長因子は、細胞分裂、特に哺乳動物細胞の分裂を刺激するタンパク質またはペプチドである。
【００５０】
好ましくは、本発明の単離タンパク質複合体は成長因子ＩＧＦ−Ｉを含む。
単離ＩＧＦポリペプチドやＩＧＦＢＰポリペプチドは、ＧｒｏＰｅｐ社（オーストラリア国アデレード）のような供給先から市販されており、ＶＮポリペプチドはＰｒｏｍｅｇａ社（アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン）のような供給先から市販されている。以下により詳述するように、組換えＩＧＦ、ＩＧＦＢＰおよびＶＮは当業者には容易に作製することができる。
【００５１】
当業者に理解されるように、本発明はＩＧＦの前駆物質形式もさらに包含する。プロＩＧＦ−Ｉタンパク質の例は、シグナルペプチドが除去されているが、Ｅドメインの開裂により完全にはプロセシングされていないＩＧＦ−Ｉタンパク質である。ＩＧＦ−Ｉは、異なるｍＲＮＡスプライシングによって生じる３つの異なるＥドメインを有しており。それらの前駆体タンパク質は本発明の単離タンパク質複合体中に存在し得る。
【００５２】
しかしながら、本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ；Heldin et al., 1981, Science 4 1122-1123）繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；Nurcombe et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018 ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；Taraboletti et al., 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479）、オステオポンチン（Nam et al., 2000, Endocrinol. 141 1100）、トロンボスポンジン−１（Nam et al., 2000, 前掲）、テネイシン−Ｃ（Arai et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 6099）、ＰＡＩ−１（Nam et al., 1997, Endocrinol. 138 2972）、プラスミノゲン（Campbell et al., 1998, Am. J. Physiol. 275 E321 ）、フィブリノゲン（Campbell et al., 1999, J. Biol. Chem 274 30215）、フィブリン（Campbell et al., 1999,  前掲）、またはトランスフェリン（Weinzimer et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806 ）のような成長因子を含む単離タンパク質複合体も企図する。
【００５３】
好ましくは、オステオポンチン、トロンボスポンジン−１、テネイシン−ＣまたはＰＡＩ−１を含む単離タンパク質複合体は、ＩＧＦＢＰ−５をさらに含む。
好ましくは、プラスミノゲン、フィブリノゲン、フィブリンまたはトランスフェリンを含む単離タンパク質複合体は、ＩＧＦＢＰ−３をさらに含む。
【００５４】
本発明は、ビトロネクチンが単量体または多量体の状態で存在することができるので、単量体および多量体のビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体を企図する。詳しくは、多量体ＶＮは血管損傷領域に蓄積し、組織でのＶＮの支配的形式である。従って、ＶＮの多量体形式は、２種類以上の成長因子または成長因子結合タンパク質が同時に送達されるＶＮ複合体を形成する機会を与える。
【００５５】
本発明の単離タンパク質複合体は、当業者によく理解されている「天然の」、「変性した」、または「延長した」状態のビトロネクチンを含み得ることも、当業者には理解されよう。
【００５６】
本発明は、アミノ酸レベルでＶＮと６０％の相同性を示す細胞外基質タンパク質であるネクチネプシン（neptinepsin ）（Blanchert et al., 1996, 1. Biol. Chem. 271 26220-26226）。を含む、単離成長因子複合体も企図する
【００５７】
本発明の単離タンパク質複合体を形成するためには、成長因子、成長因子結合タンパク質および／またはビトロネクチンの変異型を使用してもよく、それらが本明細書で述べた使用方法において有用であり得ることもさらに理解されよう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、本発明の「変異型」タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸に置き換えられたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドである。
【００５９】
いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変えずに広く同様の特性を有する他のアミノ酸に変え得ること（保存的置換）は、当該技術分野では周知である。
【００６０】
より保存性の少ない置換を選択すると、機能の本質的な変化が起こり得る。他の置換としては非保存的置換があるが、それらは比較的ほとんど許容されないであろう。一般に、ポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じさせる置換は、（ａ）親水性残基（例えばＳｅｒまたはＴｈｒ）から／への疎水性残基（例えばＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）置換；（ｂ）システインまたはプロリンから／への任意の他の残基の置換；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）から／への電気陰性残基（例えばＧｌｕまたはＡｓｐ）の置換；または（ｄ）嵩張った側鎖を有する残基（例えばＰｈｅまたｈＴｒｐ）から／へのより小さい側鎖を有する（例えばＡｌａ、Ｓｅｒ）または側鎖を持たない（例えばＧｌｙ）残基の置換；である。
【００６１】
変異型はさらに、例えば他の化学的部分との共役または複合体生成によりまたは当該技術分野で理解されているような翻訳後修飾技術により変えられた、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドも包含する。そのような誘導体にはアミノ酸欠失および／または付加が含まれる。
【００６２】
本発明によって企図される他のポリペプチドおよびペプチドの変異型には、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および／または該アミノ酸誘導体の組み込み、ならびに本発明のポリペプチドおよびペプチドの変異型に立体配座の制約を課する架橋剤または他の化学物質の使用が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明によって企図される側鎖修飾の例には、無水酢酸によるアシル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；アセチルイミド酸メチルによるアミジン化；シアン酸によるアミノ基のカルバミル化；ピリドキサール−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化後のＮａＢＨ４での還元；アルデヒドとの反応による還元アルキル化後のＮａＢＨ４での還元；および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸によるアミノ基のトリニトリベンジル化；ようなアミノ基の修飾が含まれる。
【００６３】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成を介するカルボジイミド活性化後に、例えば対応アミドに誘導体化することにより、修飾することができる。
【００６４】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールのような試薬による複素環縮合生成物の形成により、修飾することができる。
【００６５】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸の酸化；４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、４−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；ならびにアルカリｐＨでのシアン酸塩によるカルバミル化；のような方法により修飾することができる。
【００６６】
トリプトファン残基は、例えば、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化により、またはＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化により、修飾することができる。
【００６７】
チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することにより、修飾することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化により、またはヨード酢酸誘導体でのアルキル化により、修飾することができる。
【００６８】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸や誘導体を組み込む例としては、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ異性体の使用が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００６９】
修飾の範囲には、Ｏ−およびＮ−結合グリコシル化変異型や、自然状態ではグリコシル化しているタンパク質の非グリコシル化形式も含まれる。
変異型に関して、これらは、ランダム突然変異誘発や部位特異的変異誘発のような、ポリペプチドの突然変異誘発やコードしている核酸の突然変異誘発により作成することができる。核酸の突然変異誘発の例は、Ausubel ら「分子生物学の最新プロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）」、前掲の第９章、で与えられ、これは引用により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
生物活性に寄与するアミノ酸残基の知識が利用可能である場合には部位特異的変異誘発が最もよく行なわれることが当業者には理解されよう。多くの場合、その情報は利用可能でないか、あるいは例えば分子モデル化近似により推論できるにすぎない。
【００７１】
そのような場合には、ランダム突然変異誘発が企図される。ランダム突然変異誘発には、ヒドロキシアミンによるタンパク質の化学的修飾（Ruan et al., 1997, Gene 188 35）、核酸へのｄＮＴＰ類似体の組み込み（Zaccolo et al., 1996, J. Mol. Biol. 255 589 ）、およびStemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747またはShafikhani et al., 1997, Biotechniques 23 304 に記載されているようなＰＣＲに基づくランダム突然変異誘発が含まれ、それらの各参考文献は本明細書に組み込まれる。DiversifyTM キット（Clontech社）などのＰＣＲに基づくランダム突然変異誘発キットが市販されていることにも留意する。
【００７２】
本発明はさらに、本発明の単離タンパク質複合体を形成するためのｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩおよびｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉを始めとする成長因子変異型の使用も企図している。
【００７３】
アゴニストまたはアンタゴニストとして有用な他の変異型ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰが以下に詳述される。
・組換え成長因子複合体
コード核酸を当該技術分野で周知の適切な宿主細胞中か無細胞発現系中で発現することにより、組換え成長因子、成長因子結合タンパク質および／またはビトロネクチンを使用して単離タンパク質複合体を生産できることは理解されよう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）のことを指す。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」は８０個以上の隣接ヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の隣接ヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えばノーザンブロッティングやサザンブロッティングで相補的配列を検出する目的で適切に標識された、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってよい。
【００７６】
「プライマー」は通常、相補的核酸鋳型にアニールすることができ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ、またはSequenaseTM のようなＤＮＡポリメラーゼの作用により鋳型依存的様式で伸長できる、一本鎖オリゴヌクレオチド、好ましくは１５−５０個の隣接ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００７７】
ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ、ＡＬＳおよびＶＮをコードする核酸は当該技術分野で周知であり、多年にわたって利用可能である。しかしながら、そのような核酸配列の例を提供する参考文献を列挙した表１が当業者に参照される。表１の参考文献はすべて引用により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明による有用な核酸は、以下の方法により調製することができる：
（ｉ）各々が標的核酸の各部分を有する、任意で縮重しているプライマーを作製すること；および
（ｉｉ）該プライマーを核酸増幅技術と組み合わせて使用して、核酸抽出物から１または複数の増幅産物を増幅すること。
【００７９】
適切な核酸増幅技術は当業者にはよく知られており、例えば引用により本明細書に組み込まれるAusubel ら、前掲の第１５章に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；例えば引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えば引用により本明細書に組み込まれるLiu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587、国際出願ＷＯ第９２／０１８１３号、および国際出願ＷＯ第９７／１９１９３号に記載されているようなローリングサークル複製（ＲＣＲ）；例えば引用により本明細書に組み込まれるSooknanan et al.,1994, Biotechniques 17 1077に記載されている核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；例えば引用により本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ第８９／０９３８５号に記載されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；ならびに例えば引用により本明細書に組み込まれるTyagi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395に記載されているＱ−βレプリカーゼ増幅；が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「増幅産物」とは、核酸増幅技術によって生成された核酸生成物のことを指す。
組換えタンパク質は、当業者に周知の任意の適当な方法によって調製することができる。
【００８１】
例えば、組換えタンパク質は、以下のステップを含む方法により調製することができる：
（ｉ）１または複数の調節ヌクレオチド配列と機能的に結合した核酸を含む発現構築物を調製すること；
（ｉｉ）適切な宿主細胞を発現構築物でトランスフェクトまたは形質転換すること；および
（ｉｉｉ）宿主細胞中でポリペプチドを発現すること。
【００８２】
宿主細胞での発現のため、組換え核酸は、発現ベクター中の１または複数の調節配列に機能的に結合される。
「発現ベクター」は、プラスミドのような自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい。
【００８３】
「機能的に結合される」とは、調節ヌクレオチド配列が本発明の組換え核酸に対して転写を開始、調節、または別の方法で制御するように配置されていることを意味する。
【００８４】
調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適している。様々な宿主細胞に対する、多くの種類の適当な発現ベクターや適当な調節配列が当該技術分野で知られている。
【００８５】
一般に、１または複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、またはエンハンサーもしくはアクチベーター配列が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８６】
本発明により、当該技術技術で知られている構成プロモーターまたは誘導プロモーターが企図される。プロモーターは、天然プロモーターか、２以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。
【００８７】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を許容する選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞に応じて変わる。
【００８８】
本発明の組換えポリペプチドが融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現されるように、発現ベクターはさらに融合パートナー（通常発現ベクターにより提供される）を含んでもよい。融合パートナーの主な利点は、融合ポリペプチドの同定および／または精製を支援し、タンパク質の発現レベルと全体的な収率を増大させることである。
【００８９】
融合ポリペプチドを発現するためには、融合パートナーの翻訳の読取枠と本発明のヌクレオチド配列が一致するように、発現ベクターに本発明のヌクレオチド配列をライゲートする必要がある。
【００９０】
融合パートナーのよく知られている例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が挙げられ、これらはアフィニティクロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離に特に有効であるが、これらに限定されるわけではない。アフィニティクロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製に関するアフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスは、それぞれグルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−共役樹脂である。多くのそのようなマトリクスが（ＨＩＳ６）融合パートナーに関して有用なQIAexpressTMシステム（Qiagen社）やPharmacia GST 精製システムのような、「キット」の形式で利用可能である。
【００９１】
当該技術分野で周知のもう１つの融合パートナーに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドが蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーにより同定されることを可能にする、蛍光性の「タグ」として機能する。ＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞レベル以下での局在性を評価するときに、あるいは、本発明の融合ポリペプチドを発現している細胞を分離するのに有用である。蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）のようなフローサイトメトリー法は、後者の用途に特に有用である。
【００９２】
場合によっては、融合パートナーは、Ｘａ因子やトロンビンに対するプロテアーゼ切断部位のような、プロテアーゼ切断部位もさらに有する。これは、関連プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化することにより、そこから本発明の組換えポリペプチドを遊離可能にする。その後、遊離したポリペプチドは、後続のクロマトグラフィーでの分離により、融合パートナーから分離することができる。
【００９３】
本発明の融合パートナーは、その範囲内に、さらに「エピトープタグ」を含む。これは、対応する特異的抗体が利用できる、通常は短いペプチド配列である。対応する特異的なモノクローナル抗体を容易に利用できるエピトープタグのよく知られている例としては、ｃ−ｍｙｃタグ、インフルエンザウィルスヘマグルチニンタグおよびＦＬＡＧタグが含まれる。
【００９４】
組換えタンパク質は、例えば引用により本明細書に組み込まれるSambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) 、特に第１６章と１７章；引用により本明細書に組み込まれるCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel et al. 編, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999) 、特に第１０章と１６章；引用により本明細書に組み込まれるCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan et al. 編, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999) 、特に第１章、５章、および６章；に記載されている標準プロトコルを使用して当業者は都合よく調製することができる。
【００９５】
１実施形態では、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンの組換え発現は、別々に行なわれ、そこから複合体は形成される。
別の実施形態では、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンの組換え発現は、同じ細胞で行われ、そこから複合体が形成される。
【００９６】
上述のように、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド同族体をコードする核酸を含む発現構築物で形質転換した宿主細胞を培養することにより生産することができる。タンパク質発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて変わるだろう。これは日常的な実験を通じて当業者に容易に確認される。
【００９７】
組換え発現に適した宿主細胞には、E.coli、Clostridium 種、 Pseudomonas 種、 酵母、植物細胞、昆虫細胞（例Sf9 ）、ならびに繊維芽細胞やケラチン生成細胞のような哺乳動物細胞が含まれる。
【００９８】
好ましい宿主細胞はヒトケラチン生成細胞である。
誘導および非誘導発現ベクターが企図される。安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞では、いずれも本発明により企図される、メタロチオネイン（ＭＴ）誘導可能およびテトラサイクリン抑制可能（ｔｅｔＲ）なものを含む、多くの誘導可能および抑制可能な系が創作されている。
【００９９】
適当な発現ベクターの特定の例と組換えＩＧＦＢＰ発現の方法を、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７３，１１５号に見出すことができる。
【０１００】
・ミメティック、アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンを含むタンパク質複合体の形成を促進、防止、または妨害可能な作用物質を企図している。そのような因子はミメティックであってもよい。用語「ミメティック」とは、タンパク質またはペプチドの特定の機能領域に似るように設計された分子のことを指し、その範囲内に、用語「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」を含んでいる。
【０１０１】
関連することに、国際公開ＷＯ第００／２３４６９号に記載されるような、ＩＧＦとＩＧＦＢＰの結合の原因となっているＩＧＦとＩＧＦＢＰの部分の解明がある。更に、国際公開ＷＯ第００／４０６１２号に記載されるように、ＩＧＦＢＰ−１またはＩＧＦＢＰ−３に選択的に結合するＩＧＦ−Ｉのアゴニスト変異型が作製されている。
【０１０２】
従って、ＩＧＦＢＰとＶＮの間のポリペプチド複合体の形成を妨害または防止する作用物質を操作設計できることが企図される。例として、ＶＮまたはＩＧＦＢＰ上の結合部位に似せることによる、ＶＮに対するＩＧＦＢＰの結合と競合するペプチドが挙げられる。
【０１０３】
以下により詳述するように、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の結合を阻害できる作用物質である。ＩＧＦ−ＩＩのＣドメインの３４−４０位置のＲＶＳＲＲＳＲ配列のＶ３５またはＳ３６残基をＳ３９残基と共に欠失させ、それによってＩＧＦＢＰ３のＨＢＤ（Ｂが塩基性アミノ酸残基であるＢＸＢＢＢ）に似せることも提案される。これによりＩＧＦＢＰとビトロネクチンの間の複合体の形成をより強く阻害できる作用物質が作成される。
【０１０４】
本発明により企図されるアゴニストの例は、ビトロネクチンに直接結合するようＩＧＦＢＰのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含むように操作設計したＩＧＦ−１である。例えば、ＩＧＦ−ＩのＣドメインのＳＳＳＲＲＡＰＱＴ配列は、ＢＸＢＢＢモチーフを有するように操作設計され得る。好ましいＢＸＢＢＢモチーフはＩＧＦＢＰ−３のＫＧＲＫＲ配列（残基２２８−２３２）である。
【０１０５】
代わりに、ＩＧＦ−ＩＩの推定ビトロネクチン結合ドメイン：ＲＶＳＲＲＳＲ（残基３４−４０）をＩＧＦ−Ｉに導入してもよい。
本発明のアンタゴニストの例は、ビトロネクチンへのＩＧＦＢＰの結合を減小または防止するようにＨＢＤ（上述）の塩基性残基を変異するように操作設計されたＩＧＦＢＰである。
【０１０６】
適切には、操作設計されたＩＧＦＢＰはＩＧＦ−Ｉに結合することができる。
好ましくは、操作設計されたＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−５である。
【０１０７】
さらには、ＩＧＦＢＰ類似体とＶＮの間の複合体の形成を可能にする、ＩＧＦＢＰの類似体を操作設計することも企図される。適切には、類似体はＩＧＦにも結合する。そのような類似体の考えられる利点は、それがＩＧＦＢＰよりもより容易に合成または単離され、特定の所望の生物学的半減期を有し、また、おそらくＩＧＦ−Ｉに特異的に結合するように操作設計されるということである。
【０１０８】
上述のミメティックは、所望の生物活性と半減期を有するペプチド、ポリペプチド、または他の有機分子、好ましくは小さな有機分子であってよい。
コンピュータ支援の構造データベース検索は、ミメティックを同定するための方法としてますます頻繁に利用されるようになっている。ミメティックの同定に原則的に適したデータベース検索法を、引用によりそれぞれが本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ第９４／１８２３２号（ＨＩＶ抗原ミメティックの生産に関する）、米国特許第５，７５２，０１９号、および国際公開ＷＯ第９７／４  １５２６号（ＥＰＯミメティックの同定に関する）に見出すことができる。
【０１０９】
他の方法には、分子の相互作用を同定する様々な生物物理学的技術が含まれる。これらにより、例えば候補分子がＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−ＶＮ複合体の形成に影響を及ぼすか否かによる候補分子のスクリーニングが可能となる。競合放射リガンド結合アッセイ（関連する方法についてはUpton et al., 1999前掲を参照）、分析超遠心法、微量熱量測定法、表面プラスモン共鳴、および光学バイオセンサに基づく方法のような、潜在的に有用な技術に適用できる方法が、 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan et al.編, (John Wiley & Sons, 1997) の第２０章に与えられている。
【０１１０】
・医薬組成物
本発明は、医薬組成物の形式での本発明のタンパク質複合体の投与を包含している。本発明の医薬組成物は、上述のように変異型ＩＧＦおよび／またはＩＧＦＢＰ、または単離タンパク質複合体の形成を妨害または防止する作用物質を含む単離タンパク質複合体を含んでよい。
【０１１１】
適切には、医薬組成物は医薬として許容される担体を含む。医薬組成物はさらに、上述のように定義したポリペプチド変異型、断片またはミメティックを含んでよい。
【０１１２】
「医薬として許容される担体」とは、全身性投与に安全に使用することができる固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当該技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。そのような担体は、糖、デンプン、セルロースとその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水、および発熱物質を含まない水から選択することができる。
【０１１３】
いかなる適切な投与経路を、本発明の組成物を患者に提供するために使用してもよい。例えば口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮、および同様な経路を使用することができる。免疫原組成物、ワクチンおよびＤＮＡワクチンの投与用には、例えば筋肉内注射や皮下注射が適している。
【０１１４】
投与形態としては、タブレット、分散剤、懸濁液、注射液、溶液、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐薬、エアゾール剤、経皮パッチ、および同様な投与形態が挙げられる。これらの投与形態には、さらに特にその目的のために設計された注射用または埋設用の制御放出デバイスや、そのような様式でさらに作用するように改変された他の形式のインプラントも含まれる。治療薬の制御放出は、該治療薬を、例えばアクリル樹脂のような疎水性ポリマー、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースを始めとするセルロース誘導体でコーティングにより達成することができる。さらに制御放出は、他のポリマーマトリクス、リポソーム、および／またはミクロスフェアの使用によっても達成することができる。
【０１１５】
経口または非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、粉末または顆粒として、あるいは、溶液としてまたは水性溶液、非水性溶液、水中油滴型エマルジョン、または油中水滴型エマルジョン中の懸濁物として、１または複数の所定量の治療薬を各々が含む、カプセル、サシェ、または錠剤のような個別のユニットとして与えられる。
【０１１６】
ＩＧＦとＩＧＦＢＰを含む医薬組成物に関しては、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９３６，０６４号および国際公開ＷＯ第９９／６２５３６号およびＷＯ第９９／５４３５９号が特に参照される。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、ワクシニアなどのウイルスベクターや遺伝子治療に有用なウイルスベクターを始めとする発現ベクターをさらに含んでもよい。後者のウイルスベクターには、Braun-Falco et al.,1999, Gene Ther. 6 432 に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、Buchshacher et al., 2000, Blood 95 2499 に記載されているようなレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、および単純性疱疹ウイルスやサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。内分泌系の遺伝子治療に有用なウイルスベクターの概説は、Stone et al., 2000, J. Endocrinol. 164 103に提供される。
【０１１８】
本発明は、米国特許第５，９５８，７６４号に記載されているような上皮細胞への遺伝子発現をターゲットとする特定の発現ベクターや、米国特許第５，９６２，４２７号に記載されているようなインビボの創傷治癒の用途のための特定の発現ベクターも使用することができる。
上述の刊行物はいずれも引用により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
・治療のための使用方法
本発明は、発明のポリペプチド複合体を使用する処置方法を提供する。そのような方法は、哺乳動物、特にヒトの治療的処置を目的とする。
そのような方法は、上述で定義した医薬組成物の投与から成り、米国特許第６，０９０，７９０号に記載されているような特定の組織部位への極微針注射、米国特許第６，０５４，１２２号に記載されているような創傷、火傷または潰瘍に適用される局所クリーム、ローションまたは封止剤ドレッシング、または国際公開ＷＯ第９９／４７０７０号に記載されているような組成物を放出するインプラントによるものであってよい。
【０１２０】
この点に関して、米国特許第５，９２９，０４０号や米国特許第５，９６２，４２７号に記載されている方法によるような、遺伝子治療も適用可能である。
所望の成長因子の発現を遺伝子操作するというように、皮膚代替物を形成するために皮膚の細胞を遺伝子操作する方法も存在する（Supp et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5 ）。この分野の概説の例が、Bevan et al., Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231 で与えられている。
【０１２１】
さらには、国際公開ＷＯ第９９／１１７８９号に記載されているように、トランスフェクト細胞または形質転換細胞をレシピエントに「接種」することも企図される。
【０１２２】
これらの方法は、細胞増殖を刺激することにより、創傷や火傷の治癒；潰瘍などの皮膚病変の修復；自己由来の皮膚のインビトロ培養のような組織置換法または移植；腎臓や肺のような内臓の再上皮化；ならびに損傷した神経組織の修復；を促進または進行させるために使用することができる。
【０１２３】
皮膚置換療法は当該技術分野でよく知られるようになってきており、例えばKehe et al., 1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600 に記載されているような同時培養上皮／ケラチン生成細胞の細胞系統や、初代（通常自己由来）上皮、真皮、および／またはケラチン生成細胞のインビトロ培養の使用を採用することができる。これらの技術では、操作設計された生体材料や合成ポリマー「足場」をさらに利用することもできる。
【０１２４】
この分野の概説の例は、一般に、Terskikh & Vasiliev, 1999, Int. Rev. Cytol. 188 41およびEaglestein & Falanga, 1998, Cutis 62 1で与えられている。
【０１２５】
より詳しくは、頭蓋顔面外科手術に有用な置換口腔粘膜の生産が、Izumi et al., 2000, J. Dent. Res. 79 798に記載されている。胎児のケラチン生成細胞および真皮の繊維芽細胞は、Fauza et al., J. Pediatr. Surg. 33 357に記載されているように、皮膚病変を治療するグラフトのための皮膚を生産するためインビトロで拡張することができる。また、ヒアルロン酸から誘導した生体材料上でインビトロ培養した真皮および上皮皮膚成分からの皮膚代替物が、火傷の処置に潜在的に有用であることが示されている（Zacchi et al., 1998, J. Biomed. Mater. Res, 40 187）。
【０１２６】
上皮細胞治療の別の態様は、胃腸管の障害を治療または予防するための胃腸上皮裏層の治癒に関する。
例えばSheridan et al., 2000, J. Control Release 14 91 やFauza et al., 1998, 前掲に記載されているような置換皮膚の操作設計を容易にするためのポリマー足場や、皮膚細胞を創傷や火傷に運ぶ作用物質としてのミクロスフェア（LaFrance & Armstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153 ）も企図される。
【０１２７】
上述の技術は、組織置換の目的および美容用の皮膚の処置の目的で皮膚細胞の増殖を促進するために本発明の単離タンパク質複合体を使用することにより、本発明に従って容易に利用することができる。
【０１２８】
骨再生に関しては、本発明は、本発明の単離タンパク質複合体でコーティング、含浸、またはそれ以外の方法で前処理した外科用または補綴用インプラントを提供する。
【０１２９】
反対に、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−ＶＮ複合体の形成を防止または妨害することにより細胞増殖および細胞移動の阻害または抑制は、乾癬や、乳癌のような上皮癌を始めとする悪性腫瘍の予防または治療のための処置を構成し得る。
【０１３０】
本発明はさらに、幹細胞または前駆細胞に本発明の単離タンパク質複合体を投与することにより、幹細胞または前駆細胞を分化させる方法も企図する。変異型成長因子とＩＧＦＢＰを含む単離タンパク質複合体もこの方法に適用可能である。
【０１３１】
この方法に従って生産された分化細胞は、上述したような治療方法に有用であり得る。
例えば、平滑筋細胞は「間充織幹細胞」であると考えられており、繊維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、骨または脂肪細胞に分化するように駆動することができる。
【０１３２】
本発明が容易に理解され実際の効果をもたらすように、ここで特定の好ましい実施形態を、非限定的な以下の実施例により説明する。
ここで説明するすべての競合放射リガンド結合アッセイは、本質的にUpton et al.,1999 、前掲に説明されている通りに実行した。
【０１３３】
（実施例１）
ビトロネクチンとの結合に関してインスリン、ｐｒｏＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩがＩＧＦ−ＩＩと競合する能力を評価する競合結合アッセイ
ＩＧＦとインスリンとの間で共有される構造類似性のため、ビトロネクチンへのインスリンの結合について調べた。Upton et al.,1999、前掲によって行なわれた架橋実験は、ビトロネクチンとの結合に関してインスリンがＩＧＦ−ＩＩと競合する可能性は、ＩＧＦ−Ｉの場合と同様に低いことを示していた。結果として、ビトロネクチンとの結合に関してインスリンが放射標識ＩＧＦ−ＩＩと競合するかどうかを確かめるために、高濃度のインスリンが調べられた。図１に示した結果は、ＩＧＦ−Ｉ（Upton et al.,1999、前掲）で本来観察された状況では、インスリンがビトロネクチンとの結合に関して［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩとあまり競合しないことを示した。
【０１３４】
ビトロネクチンに結合するＩＧＦ−ＩＩの競合物質としてのＩＧＦ−Ｉの調査によると、ＩＧＦ−Ｉがビトロネクチンに対する［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩの結合と競合し得ることが明らかになった。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉはビトロネクチンとの結合に関する放射標識ＩＧＦ−ＩＩとの競合においてＩＧＦ−ＩＩよりは明らかに有効性が低く、同じ効果を達成するのにＩＧＦ−ＩＩを超える約３０００倍のＩＧＦ−Ｉ濃度の増加を必要とした。
【０１３５】
同様の研究により、ｐｒｏＩＧＥ−ＩＩがビトロネクチンとの結合に関して［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合し得ることが実証された（図３）。ｐｒｏＩＧＥ−ＩＩはビトロネクチンとの結合に関して［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合する際にＩＧＦ−ＩＩほどには有効でなく、ＩＣ５０値はそれぞれ６５．６ｎＭ、９．６ｎＭであった。従って、ｐｒｏＩＧＦ−ＩＩ内のＥドメインの存在は、ビトロネクチンへの結合を変更する構造的改変を表わす。これはｐｒｏＩＧＦ−ＩＩではＩＧＦ−ＩＩと比較して追加ドメインによる立体障害があることによるか、またはビトロネクチンに対するｐｒｏＩＧＦ−ＩＩの親和性を変更するｐｒｏＩＧＦ−ＩＩ分子の構造の変化の結果である可能性がある。
【０１３６】
（参考例２）
ビトロネクチンに対するＩＧＦ−ＩＩ結合のための競合物質としてのＰＡＩ−１とｕＰＡＲの検討
ＰＡＩ−１とｓｕＰＡＲはビトロネクチンに結合することが報告されているため（Declerck et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 15454; Wei et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 32380; Kanse et al., 1996, Exp. Cell Res. 224 344 ）、これらのタンパク質をビトロネクチンとの結合に関してＩＧＦ−ＩＩと競合する可能性がある分子として検討した。２０００ｎＭまでの濃度で、ビトロネクチンとの結合に関する［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩとのＰＡＩ−１の競合は、約５２４ｎＭのＩＣ５０値で観察された（図４）。この濃度はＩＣ５０値の点では比較的高い値であるが、そのような濃度は腫瘍に関してインビボで見出すことができる（Grondahi-Hansen et al., 1993, Cancer Res. 53 2513）。実際、Kjoller et al., 1997, Exp. Cell Res. 232 420 は、ＰＡＩ−１がＷＩＳＨ細胞の細胞移動を阻止する能力を評価するアッセイで最大の半分の効果を達成するためには、３７０ｎＭのＰＡＩ−１が必要とされることを見出した。この阻害は、ビトロネクチンとの結合に関してインテグリンおよびｕＰＡＲと競合するＰＡＩ−１を介して生じると仮定された。従って、ＰＡＩ−１、ＩＧＦ−ＩＩおよびビトロネクチン間で観察される相互作用は、特に腫瘍でしばしば見出されるようにＩＧＦ−ＩＩとＰＡＩ−１が高レベルで発現している時には、実際にインビボのいくつかの機能的結果を有する可能性がある。
【０１３７】
ＰＡＩ−１はビトロネクチンのＮ末端ソマトメジンＢドメインに結合することが知られているが、ビトロネクチンとの結合に関してＩＧＦ−ＩＩと有効に競合するには高濃度のＰＡＩ−１が必要であることは、そのような研究がビトロネクチン上の結合部位に対するＩＧＦ−ＩＩの位置決定に関する何の明確な情報も提供していないことを示唆した。しかしながら、結果は２通りに解釈することが可能である。第１の可能性は、ＩＧＦ−ＩＩとＰＡＩ−１間に観察される競争が、立体障害によるソマトメジンＢドメイン内のビトロネクチン上の高親和性部位での部分的競争によるということである。代わりに、競争は、ＰＡＩ−１が低い親和性で結合するビトロネクチン上の部位への結合に関する、ＩＧＦ−ＩＩとＰＡＩ−１間の直接的な競争によるという可能性もある。この問題を明らかにするにはさらなる実験的研究が必要である。
【０１３８】
本発明者は、可溶性ｓｕＰＡＲがＶＮに対するＩＧＦ−ＩＩの結合に競合することを示すことができなかったが、これは凍結乾燥ｓｕＰＡＲが国際的輸送後に使用されたという事実によるものである可能性がある。再構成ｓｕＰＡＲが再構成後に生物活性である証拠はないが、［１２５Ｉ］−ｓｕＰＡＲがＶＮに結合しなかった（データ非図示）という観察は、これらの研究で使用したｓｕＰＡＲが不活性であったことを支持している。
【０１３９】
ビトロネクチン上のＰＡＩ−１結合部位が４４個のＮ末端アミノ酸を含むビトロネクチンの断片内にあることを同定したのと同様な技術を使用すると（Deng et al., 1995, Thromb. Haemost. 74 66 ）、ビトロネクチンに対するＰＡＩ−１とＩＧＦ−ＩＩ間で観察される競争が上述のいずれの可能性の結果によるものかを確認することができる。
【０１４０】
可溶形式のウロキナーゼ受容体（ｓｕＰＡＲ）が固定化ビトロネクチンに結合可能であることは以前に示されている（Wei et al., 1994, 前掲）。しかしながら、本明細書で報告した研究では、３００ｎＭまでの濃度でさえ、ビトロネクチンとの結合に関するｓｕＰＡＲと［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩの間の競争は観察されなかった。
【０１４１】
（実施例３）
非グリコシル化組換えＩＧＦＢＰ−３の存在下でのビトロネクチンへのＩＧＥ−ＩおよびＩＧＥ−ＩＩの結合
ＩＧＦＢＰがビトロネクチンへのＩＧＦの結合を媒介可能であるかどうかを調べるために、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉまたは［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩの存在下でのＩＧＦＢＰ−３の増大濃度の効果を評価した。その結果を図５に示す。
【０１４２】
試験した濃度では、１ウェル当たり１０ｎｇのＩＧＦＢＰ−３がビトロネクチンコートしたウェルへの大量の［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉの結合を引き起こし、３０ｎｇのＩＧＦＢＰ−３がビトロネクチンコートしたウェルへの大量の［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩの結合を引き起こした。この効果は［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉの場合に最も顕著であった。というのは、低カウントの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉがビトロネクチンに結合し、最も低いＩＧＦＢＰ−３濃度（３．７ｎｇ）でさえも、この結合は増大したからである（図５Ａ）。反対に［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩは、１１ｎｇ／１００μＬ〜３３ｎｇ／１００μＬの濃度に達するまで、ビトロネクチンコートしたウェルのみで得られる結合に対する増加は示さなかった（図５Ｂ）。
【０１４３】
［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉまたは［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩのいずれかとＩＧＦＢＰ−３をプレインキュベーションしても、ＩＧＦＢＰ−３と［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉまたは［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩとの非プレインキュベーション濃度に比較して、ビトロネクチンへの結合は変わらなかった。
【０１４４】
（実施例４）
哺乳動物細胞中で生産された組換えＩＧＦＢＰの存在下でのビトロネクチンへのＩＧＦ−Ｉの結合
放射標識として同時添加するＩＧＦＢＰの存在下でＶＮコートしたディッシュに［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉが結合する能力を調べる結合アッセイを、Upton et al.,1999 、前掲に記載の通りに行った。そのデータを図６に示す。ＩＧＦＢＰ−２、−４、−５の量を増大させると、ビトロネクチンをコートしたウェルへのＩＧＦ−Ｉの結合が増大した。試験した最大量である５ｎｇでは、ＶＮは存在するがＩＧＦＢＰは存在しない対照ウェルと比較して、標識ＩＧＦ−Ｉの結合がＩＧＦＢＰ−２、−４、−５についてそれぞれ約２．８倍、約３．８倍、および約８倍増大した。
【０１４５】
０．０５、０．２および０．５ｎｇ／ウェルでのＩＧＦＢＰ−３の存在も、ＶＮへの標識ＩＧＦ−Ｉの結合を増加させ、２ｎｇおよび５ｎｇのＩＧＦＢＰ−３／ウェルは放射標識の結合を阻害するように思われた。試験したすべてのＩＧＦＢＰ−１および−６の濃度も阻害的であった。
【０１４６】
これらの結果は、ＩＧＦ−ＩＩについての状況と異なり、ＶＮへのＩＧＦ−Ｉの最小の直接的結合が観察されることを実証している。しかしながら、ＩＧＦＢＰ、特にＩＧＦＢＰ−２、−３、−４および−５の存在は、ＶＮコートウェルへのＩＧＦの結合を高め、これはＩＧＦＢＰがこの状況でＶＮへのＩＧＦ−Ｉの結合を媒介することを示唆している。さらにデータは、ａ）存在するＩＧＦＢＰの種類、ｂ）ＩＧＦＢＰの量に依存して、ＶＮへのＩＧＦ−Ｉの結合を増強および阻害する潜在能力を有すること示唆している。
【０１４７】
（実施例５）
ＩＧＦＢＰ−３変異型の存在下でのＶＮへの標識ＩＧＦ−Ｉの結合
推定「ヘパリン結合ドメイン」が変異されたＩＧＦＢＰ−３変異型（ＩＧＦＢＰ−３  ＨＢＤ）とグリコシル部位が変異された変異型（Ｎｏｎ−ｇｌｙ  ＩＧＦＢＰ−３）の存在下でのＶＮコートディッシュへの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉの結合能力を調べる結合アッセイを、上述の通りに行った。そのデータを図７に示す。
【０１４８】
この結合研究に使用したＩＧＦＢＰ−３グリコシル化変異型は、位置Ａｓｎ８９、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１７２にＡｌａに変異された３つのＯ−グリコシル化部位を有していた。
【０１４９】
ＩＧＦＢＰ−３  ＨＢＤ変異型はＶＮコートディッシュへの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉの結合を増強しなかったが、これはＩＧＦＢＰ−３のヘパリン結合ドメインがＶＮへのＩＧＦＢＰ−３の結合に関与することを示唆している。他の研究が、推定「ヘパリン結合ドメイン」の外側のアミノ酸残基がＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−Ｉの結合の原因であることを突きとめられている。従って、結果は、ＩＧＦＢＰ−３への標識ＩＧＦ−Ｉの結合の減少ではなく、ＶＮへのＩＧＦＢＰ−３の結合の減小を表す可能性が非常に高い（Imai et al., 2000, J Biol Chem 275:18188-18194）。
【０１５０】
興味深いことに、非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３変異型はＶＮコートディッシュへの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉの結合を有意に増大した。２ｎｇの変異型ＩＧＦＢＰ−３の存在下でのＶＮコートディッシュへの標識ＩＧＦ−Ｉの結合の著しい２０倍の増加は、興味をそそるものであり、ＩＧＦＢＰ−３のグリコシル化がａ）ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉまたはｂ）ＶＮとのＩＧＦＢＰ−３のいずれかの相互作用を阻害することを示唆している。あるいは、いずれの相互作用も炭水化物の存在により阻害される可能性がある。
【０１５１】
非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３がインビボで機能的に重要であるかどうかはまだ確定していない。しかしながら、上記の発見は、ＶＮに結合した非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３が、細胞増殖の刺激のような細胞機能を強めるためにＩＧＦ−Ｉが要求される部位にＩＧＦ−Ｉを送達する有用な方法であり得る。あるいは、ＶＮに結合した非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉを過剰発現している腫瘍のように細胞増殖が要求されない状況での過剰ＩＧＦ−Ｉを隔離する機構を提供する可能性がある。
【０１５２】
（実施例６）
非グリコシル化組換えＩＧＦＢＰ−３の存在下でＶＮへの結合に関して標識ＩＧＦと競合するＩＧＦ変異型の能力を評価する競合結合アッセイ
ＩＧＦとｄｅｓＩＧＦの増大濃度がＩＧＦＢＰ３の存在下でのビトロネクチンへの結合に関して放射標識ＩＧＦと競合できるかどうかを決定するために、図５で示した放射標識ＩＧＦの最大結合を生じさせたＩＧＦＢＰ３の濃度を使用した。結果は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩ、また、恐らく同様にｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（図示しない）が高濃度で、１０ｎｇのＩＧＦＢＰ３の存在下でビトロネクチンへの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩの結合と競争できることを示している（図８）。これらの実験結果は、ＩＧＦ−Ｉ、−ＩＩおよびｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩが、３０ｎｇのＩＧＦＢＰ３の存在下でのみ、ビトロネクチンコートウェルへの結合に関してＩＧＦ−ＩＩと競合できることを示した。
【０１５３】
（実施例７）
ＩＧＥ−ＩＩとビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体による細胞増殖の刺激
ＶＮにＩＧＦ−ＩＩを予め結合させるストラテジーをこの研究で使用して、インビボで細胞外環境をより正確に反映しようと試みた。ほとんどの細胞培養法は、溶液相に外因性の基質を加えるため、細胞は絶えず処理に曝されている。組織中の細胞はインビボではこのような「絶え間ない溶液相」の環境には遭遇していない。従って、この研究のために採用した方法は、ＶＮにＩＧＦを予め結合させること、つまり、インビボの状態をより正確に反映する状況であった。
【０１５４】
培養皿でＶＮにＩＧＦを予め結合させた後、細胞をウェルに接種し、タンパク質合成を刺激するためにＶＮに対してＩＧＦが複合体形成する能力を既に確立された方法により検討した（Francis et al., 1986, Biochem J. 233:207-2 13 ）。タンパク質合成の増大は、細胞数の増加と相関しており、従って細胞増殖を反映している。ＶＮまたはＩＧＦが存在しない対照ウェルを超えるパーセントで表される応答により、４８時間にわたって新たに合成されたタンパク質への［３Ｈ］−ロイシンの取り込みを測定した。
【０１５５】
図９のデータを参照すると、３、１０、３０、１００、３００および１０００ｎｇのＩＧＦ−ＩＩをＶＮの不在下でウェルと予め結合させると、対照ウェル（−ＶＮ、−ＩＧＦ）を超える８、１２、１０、１６、２４および４３％の応答がそれぞれ観察された。さらに、ＶＮコートウェルに予め結合させた同じ濃度のＩＧＦ−ＩＩは、それぞれ１９、２９、３９、５１、７０および１０１％の効果でタンパク質への［３Ｈ］−ロイシンの取り込みを刺激した。ＶＮのみで得られた応答（１２％）をＩＧＦ−ＩＩのみで得られた応答（上記を参照）と組み合わせると、３、１０、３０、１００、３００および１０００ｎｇのＩＧＦ−ＩＩに対して、それぞれ２０、２４、２２、２８、３６および５５％の予想された相加効果が生じる。これらの値は、試験した２つの最小量のＩＧＦ−ＩＩ（３ｎｇと１０ｎｇ）を除くすべての適用量でＩＧＦ−ＩＩをＶＮと予め結合させた時に観察される実際の効果とは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。従って、ＶＮへのＩＧＦ−ＩＩの事前結合は、計算された相加効果よりも５〜４６％大きい範囲にわたってタンパク質合成の相乗効果を刺激する。これらの応答は、ＶＮへのＩＧＦ−ＩＩの直接的結合の結果であり得、ＩＧＦＢＰを介したＶＮへのＩＧＦ−ＩＩの間接的結合からも生じ得る。ＨａＣＡＴケラチン生成細胞は大量のＩＧＦＢＰ−３を生産する（Wraight et al., 1994, J. Invest. Dermatol 103:627-631 ）。
【０１５６】
（実施例８）
哺乳動物細胞中で生産された組換えＩＧＦＢＰの存在下でのＶＮへの標識ＩＧＥ−ＩＩの結合
放射標識として同時添加するＩＧＦＢＰの存在下でＶＮコートしたディッシュに［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩが結合する能力を調べる結合アッセイを、Upton et al.,1999 、前掲に記載の通りに行った。この研究に使用するＩＧＦＢＰは哺乳動物細胞で生産し、グリコシル化した。図１０に示すように、ＩＧＦＢＰ−１、−３および−６の量を増加させると、用量依存的な様式でビトロネクチンコートウェルへの標識ＩＧＦ−ＩＩの結合の減小が生じた。ＩＧＦＢＰ−２も、ＩＧＦＢＰ−１、−３および−６よりは効果は低いが、ＶＮへの標識ＩＧＦ−ＩＩの結合に競合するように思われた。他方、ＩＧＦＢＰ−４はＶＮへのＩＧＦ−ＩＩの結合にほとんど効果がなく、ＩＧＦＢＰ−５はわずかな程度にＩＧＦ−ＩＩの結合を増強するように思われた。ＩＧＦＢＰ−３の阻害効果は、ＶＮ上の同じ結合領域へのＩＧＦ−ＩＩの結合に、ＩＧＦＢＰ−３が競合することから生じている可能性がある。あるいはまたはさらには、ＩＧＦＢＰ−３の阻害効果は、ＩＧＦＢＰ−１および−６と同様、ＶＮに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性がそれらのＩＧＦＢＰに対するＩＧＦ−ＩＩの結合親和性よりも小さいことから生じている可能性がある。従って、それらのＩＧＦＢＰはＩＧＦ−ＩＩを隔離し、複合体はＶＮに結合しない。
【０１５７】
（実施例９）
ＩＧＥ−Ｉ、ＩＧＥＢＰ−５およびビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体による細胞増殖の刺激
表２を参照すると、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦＢＰ−５およびビトロネクチンと共に、試験したすべての濃度でケラチン生成細胞の増殖を刺激し（新しく合成されたタンパク質への３Ｈ−ロイシンの取り込みにより測定）、試験した最大量で相乗効果が観察された。
【０１５８】
細胞増殖時の単離タンパク質複合体の効果は、表２に記載された比較的低量よりも高いＩＧＦＢＰ−５濃度ではさらに大きいことが、本発明者により提唱される。
【０１５９】
（実施例１０）
ＩＧＦとＩＧＥＢＰ変異型の操作設計
ＥＣＭとの会合に重要で、推定「ヘパリン結合ドメイン」として定義された、ＩＧＦＢＰ−３中のアミノ酸残基は、２２８−２３２位置のＫＧＲＫＲ残基である。同様の残基がＩＧＦＢＰ−５の対応する領域に見出される。本明細書で報告した結合研究で使用したＩＧＦＢＰ−３  ＨＢＤ変異型は、ＩＧＦＢＰ−１の対応位置に見出されるアミノ酸に基づいてＭＤＧＥＡに変化したＫＧＲＫＲ残基を有していた。このような変化により、タンパク質のこの一部に電荷の逆転が生じる。この変異型はまだＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと高い親和性で結合するが、酸不安定性サブユニットおよび細胞表面とはあまり結合しない（Firth et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 263 1-2638 ）。
【０１６０】
多様なタンパク質中のヘパリン結合モチーフが、もともとCardin et al., 1989, Arteriosclerosis 9 2 1-32に記述されている。
【０１６１】
ヒトＩＧＦ−ＩＩのＣ−ドメインは、多くの正電荷アミノ酸残基を含んでおり、特に３４−４０位置にアミノ酸ＲＶＳＲＲＳＲを含んでいる。正電荷アミノ酸が細胞表面へおよびＶＮへのＩＧＦＢＰの結合を媒介するのに重要であると仮定すると、ＩＧＦ−ＩＩ中のこれらのアミノ酸はＶＮにＩＧＦ−ＩＩを直接結合させるのに重要であり得る。にもかかわらず、Ｓ３９と共にＶ３５またはＳ３６の欠失を備えたＩＧＦ−ＩＩ変異型を作成することにより、ＩＧＦＢＰ−３（ＢＸＢＢＢ、Ｂは塩基性アミノ酸）で見出されるのと同様な「ヘパリン結合モチーフ」を導入することは、比較的単純な方法であろう。ＶＮへのＩＧＦ−ＩＩの結合を媒介する際の正の残基の重要性は、ＶＮへのニワトリＩＧＦ−ＩＩ変異型である（ｄｅｓＲ４０）−ＩＧＦ−ＩＩの結合が減小するという本発明者の証拠によりさらに示される。
【０１６２】
他方、ＩＧＦ−ＩのＣ−ドメインは、ＩＧＦ−ＩＩに対して上述したタンパク質の対応領域に、アミノ酸の比較的非荷電の延長部を含んでいる。このことは、なぜＩＧＦ−ＩがＶＮに直接結合しないかを説明するかもしれない。さらにインスリンは、やはりＶＮ（またはＩＧＦＢＰ）に結合しないが、成熟タンパク質に開裂した時に対応するＣ−ドメインを有しない。
ヒトＩＧＦ−Ｉ        ＳＳＳＲＲＡＰＱＴ
ヒトＩＧＦ−ＩＩ      ＲＶＳＲＲＳ−−Ｒ
ＩＧＦ−ＩへのＩＧＦ−ＩＩのＲＶＳＲＲＳＲ配列またはＩＧＦＢＰ３のＫＧＲＫＲ配列の導入により、ＩＧＦ−ＩをＶＮに直接結合することができた。
【０１６３】
（実施例１１）
単離タンパク質複合体、細胞増殖および生存
細胞生存経路の重大な要素であるｂｃｌ−２転写は、αｖ−β３インテグリンを介してＶＮに付着した細胞で上昇する（Matter & Ruoslahti, 2001, J. Biol. Chem. 276 27757-27763）。さらにＩＧＦ−Ｉは、ＡＫＴ依存的様式でｂｃｌ−２転写を上昇することにより、細胞をアポトーシスから保護する（Pugazhenthi et al.,1999,. J Biol. Chem. 274 27529-35）。ＩＧＦ受容体は、細胞増殖への相乗効果に関して、αｖ−β３インテグリンと物理的に結合している（Schneller et al.,1997, EMBO J 16 5600-5607）。従って、本発明の単離タンパク質複合体は、インテグリンと成長因子受容体との療法により媒介される細胞生存シグナルを開始するための組み込みの細胞外の地点を提供するかもしれない。
【０１６４】
ＩＧＦＢＰ−５は前立腺癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉの抗アポトーシスおよび細胞分裂促進の効果を強めることが実証されている（Miyake et al., 2000, Endocrinol. 141 2257-2265）。さらに、神経膠腫細胞および結腸直腸腺癌によるインビボでのＶＮの合成は腫瘍のグレードと相関する（Uhm et al., 1999, Clin Cancer Res. 5 1587-1594; Tomasini-Johansson et al., 1994, Exp Cell Res. 214 303-312; Gladson et al., 1995, J. Cell Sci. 108 947-56; Gladson & Cheresh, 1991, J. Clin. Invest. 88 1924-32 ）。
【０１６５】
従って、本発明によれば、インビボで形成されるＩＧＦ：ＩＧＦＢＰ：ＶＮ複合体は、腫瘍細胞の生存と進行を促進し得ることが提案される。従って、本発明はインビボでの複合体形成を妨害する治療薬を企図する。
【０１６６】
ＶＮのヘパリン結合ドメインは、フィブロネクチンマトリックスの組み立てを阻害することが報告されている（Hocking et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 27257-27264）。フィブロネクチン堆積の減少は、細胞移動速度の減小が重合したフィブロネクチンの増加レベルと関係しているため、腫瘍細胞の侵入に関係している（Morla et al., 1994, Nature 367 193-196）。従って、ＶＮのヘパリン結合ドメインに結合したＩＧＦ：ＩＧＦＢＰ複合体は、フィブロネクチンマトリックスの組み立てを阻止、局所結合組織の腫瘍侵入を促進する。従って、本発明は、腫瘍侵入性を減少するためにそれらのインビボ複合体を妨害する治療薬を企図する。
【０１６７】
単離タンパク質複合体と創傷治癒
逆の議論が、創傷修復のように細胞移動が必要とされる状況での複合体の使用を支援するために使用することができる。ＩＧＦ系は創傷治癒に重要な役割を果たしており、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の両方が創傷流体中にかなりの濃度で存在する（Skottner et al., 1990, Acta Scand. Suppl. 367 63-66; Clark R (ed) 1996, Molecular and Cell Biology of Wound Repair, pp 3-50, Plenum Press, New York; Robertson et al., 1996, Endocrinol. 137 2774-2784; Vogt et al.,1998, Growth Horm. IGF Res. 8 Suppl B:107-9.）。
【０１６８】
ＩＧＦＢＰは創傷からのＩＧＦクリアランスの速度を減小させることが実証されている。（Robertson et al., 1999,. Am J Physiol. 276 E663-71）。ＩＧＦＢＰ−３：ＩＧＦ−Ｉ複合体はインビトロでフィブリン塊に結合する。これは、この現象がインビボでも起こり、創傷部位でのＩＧＦ−Ｉの集中を生じさせることを示唆している（Campbell et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 30215-30221 ）。同様に、ビトロネクチンはフィブリンに結合する（Podor et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 19788-19794）。ビトロネクチン無効マウスでは創傷フィブリン溶解が増大し、微小血管の血管新生が減少することにも留意する（Jang et al., 2000, Surgery 127 696-704）。
【０１６９】
本発明によれば、ＩＧＦＢＰに結合したＩＧＦがＶＮに結合でき、ＶＮが次にフィブリン塊と結合し、創傷部位でのＩＧＦの蓄積が起こることが提案される。従って、修復プロセスを加速するために、本発明の単離タンパク質複合体を創傷に投与することが可能である。
【０１７０】
本発明によって企図される創傷治癒の特定の態様は、糖尿病性の足の潰瘍を治療することに関する。糖尿病患者では創傷の治癒が遅れる。成長因子は治癒プロセスに影響を及ぼすが、特に、ＩＧＦはケラチン生成細胞増殖を刺激することが示されている。しかしながら、糖尿病患者の皮膚と足の潰瘍から得た組織の分析から、非糖尿病患者からの組織切片と比較して、基底層と繊維芽細胞でのＩＧＦ−Ｉの発現が欠如することが明らかとなっている。（Blakytny et al., 2000, J. Pathol. 190 589-594 ）。本発明の単離タンパク質複合体は、これらの種類の創傷へＩＧＦ−Ｉを送達するのに有用であり得る。
【０１７１】
単離タンパク質複合体と骨の設計
ＩＧＦＢＰ−５は、ＩＧＦ受容体とは無関係のメカニズムにより、骨への標識ＩＧＦ−Ｉの結合を促進し（Mohan et al.,1995,. J. Biol. Chem 270 20424-20431 ）、ＩＧＦ刺激される骨芽細胞の機能を増強する（Andress, 1995, J. Biol. Chem. 270 28289-28296 ）。
【０１７２】
インプラント材料であるヒドロキシルアパタイトは多くの研究において、既存の骨との非常に高い生体適合性を有し、既存の骨によく取り込まれることが示されている。最近の証拠によると、ヒドロキシルアパタイトは、チタンやステンレス鋼のような他の一般に用いられているインプラント材料よりもより多くのＶＮを、血清から吸収するであろうことが見出されている。ＶＮの吸収には骨芽細胞前駆細胞のより大きな結合が伴う（Kilpadi et al., 2001, J. Biomed. Mater. Res. 57 258-267 ）。
【０１７３】
ナノフェーズアルミナ対従来のアルミナに対するＶＮの影響が最近調べられ、ＶＮは骨芽細胞の接着を増強することがわかった（Webster et al., 2001, Tissue Eng 7 29 1-301 ）。
【０１７４】
本発明者は、本発明の単離タンパク質複合体が上記材料に施すコーティングとして有用であり、そのために股関節置換術のような整形外科的応用での骨細胞の接着、成長および取り込みを加速することを提唱する。
【０１７５】
ＶＮはウサギ骨細胞培養物中のＩＧＦ−Ｉ刺激された破骨細胞の再吸収およびプロテイナーゼ活性を増強し（Rousselle et al., 2001, Histology & Histopathology 16 727-734 ）、ＩＧＦＢＰ−５はＩＧＦ刺激された骨芽細胞の有糸分裂誘発を増強する（Andress & Birubaum, 1992, J. Biol. Chem. 267 22467-22472）。
【０１７６】
本発明者は、骨細胞により生産される主なＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−５であるため、ＶＮによるＩＧＦ効果の増強がＩＧＦＢＰ−５にも関与することを提唱する。
【０１７７】
単離タンパク質複合体とアテローム性動脈硬化の治療
ＩＧＦ−Ｉは以前から、実験的アテローム性動脈硬化病変の発達に関与していた。さらに、αｖ−β３阻害剤は、アテローム性動脈硬化病変を減少させることが実証された。これはＩＧＦ−Ｉ媒介シグナル伝達の阻害に関与する（Nichols et al., 1999, Circ. Res. 851040-1045）。
【０１７８】
以下のことを仮定すると、
（ｉ）ＩＧＦＢＰ−５とＶＮは動脈平滑筋細胞によって合成かつ分泌され、血管壁中に存在する；
（ｉｉ）ＩＧＦ：ＩＧＦＢＰ−５：ＶＮ複合体は血管の平滑筋細胞の有糸分裂誘発と移動を促進する（Nam & Clemmons, 2000, Growth Horm. IGF Res. 1 O:A2 3）；
本発明者により、ＩＧＦ：ＩＧＦＢＰ−５：ＶＮ複合体がアテローム性動脈硬化病変の形成に関与することが提唱される。従って、複合体形成を妨害する治療薬はアテローム性動脈硬化の治療の可能性を有し得る。
【０１７９】
明細書全体にわたり、本発明を任意の１つの実施形態や特定の特徴のまとまりに限定せずに、本発明の好ましい実施形態を説明することを目的とした。従って、当業者には、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱せずに例証した特定の実施形態に様々な改変や変更を行えることが理解されるだろう。
【０１８０】
言及したすべての特許、科学文献、コンピュータプログラムが引用により本明細書に組み込まれることがさらに理解される。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するインスリン（▲）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図２】１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図３】１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するｐｒｏＩＧＦ−ＩＩ（■）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図４】１ウェル当たり３００ｎｇのビトロネクチン（ＶＮ）への結合に関する、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩと競合するＰＡＩ−１（■）またはＩＧＦ−ＩＩ（◆）の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図５】ビトロネクチンに結合する時の、（Ａ）ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ３と、（Ｂ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ３の、プレインキュベーションの影響を比較する競合結合アッセイ。
【図６】：（Ａ）ＩＧＦＢＰ１、（Ｂ）ＩＧＦＢＰ２、（Ｃ）ＩＧＦＢＰ３、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ４、（Ｅ）ＩＧＦＢＰ５および（Ｆ）ＩＧＦＢＰ６の存在下でのＶＮコートウェルへの標識ＩＧＦ−Ｉの結合。
【図７】「Ｇｌｙ  ＩＧＦＢＰ−３」（グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３）、「ＩＧＦＢＰ−３  ＨＢＤ変異型」（推定ヘパリン結合ドメインが変異したＩＧＦＢＰ−３、および「ｎｏｎ−ｇｌｙ  ＩＧＦＢＰ−３」（非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３）の存在下でのＶＮに対する標識ＩＧＦ−Ｉの結合。
【図８】［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−Ｉまたは［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−ＩＩとインキュベートした非グリコシル化ＩＧＦＢＰ３と競合する、ＩＧＦおよびｄｅｓＩＧＦの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図９】ヒトケラチン生成細胞におけるタンパク質合成の刺激。
【図１０】（Ａ）ＩＧＦＢＰ１、（Ｂ）ＩＧＦＢＰ２、（Ｃ）ＩＧＦＢＰ３、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ４、（Ｅ）ＩＧＦＢＰ５および（Ｆ）ＩＧＦＢＰ６の存在下でのＶＮコートウェルへの標識ＩＧＦ−ＩＩの結合。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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