(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチル若しくはベンジルのヒアルロン酸エステル、又は該エチル若しくはベンジルのヒアルロン酸エステルの塩、あるいはそれらの組み合わせを硫酸化した硫酸化多糖であって、エステル化度が２５％、５０％、７５％、又は１００％である、該硫酸化多糖。
【請求項２】
１００％ベンジルエステル、２５％ベンジルエステル、５０％ベンジルエステル、７５％ベンジルエステル、１００％エチルエステル、２５％エチルエステル、５０％エチルエステルおよび７５％エチルエステルからなる群から選ばれる、請求項１に記載の硫酸化多糖。
【請求項３】
ヒアルロン酸の硫酸化５０％エチルエステル、ヒアルロン酸の硫酸化７５％ベンジルエステル、ヒアルロン酸の硫酸化５０％ベンジルエステル、およびヒアルロン酸の硫酸化７５％エチルエステルからなる群から選ばれる、請求項１に記載の硫酸化多糖。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖を含む生医学的物体であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、該生医学的物体。
【請求項５】
該物体が硫酸化多糖で被覆されている請求項４に記載の生医学的物体。
【請求項６】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖および医薬的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
組成物がゲル、ハイドロゲル、クリーム、または軟膏である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織またはマイクロスフェアの一つである製品であって、請求項６または７に記載の医薬組成物を含む製品。
【請求項９】
請求項６または７に記載の医薬組成物で被覆した装置または生医学的物体であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、該装置または生医学的物体。
【請求項１０】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、生医学的製品もしくは医薬的製品または医薬組成物の製造における請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の使用。
【請求項１１】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、生医学的物体または装置を被覆するための生体物質もしくは医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の使用であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、該使用。
【請求項１２】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、調節された薬剤放出システム用生体物質もしくは医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の使用。
【請求項１３】
血栓症又は血餅の治療のための、生体物質又は医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの単独での、あるいは他の化学的高分子もしくは塩または医薬的に許容し得る薬剤よりなる群から選択される化合物と組み合わせた使用であって、反復単位あたりの硫酸基の数が、該ヒアルロン酸エステルの場合２．０−３．５の範囲である、該使用。
【請求項１４】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、抗凝固性および非血栓生成性を有する生体物質の製造における、請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の使用。
【請求項１５】
生医学的物体または装置がバイオポリマー透析チューブまたは膜を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
血栓症又は血餅の治療のための生体物質の製造における、抗感染剤と組み合わせた請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の使用。
【請求項１７】
体外循環または血液透析のための生体物質の製造における、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項１８】
生医学物体または装置が血液または血管化組織と接触する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１９】
体外循環または血液透析のための透析チューブまたは膜である生医学的製品を被覆するための医薬の製造における、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項２０】
体外循環または血液透析の治療のための生体物質の製造における、抗感染剤と組み合わせた請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項２１】
硫酸化剤の使用による非プロトン性の溶媒中における多糖を硫酸化することを含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の製造方法であって、硫酸化剤を溶液中で多糖のテトラアルキルアンモニウム塩またはエステルに加え、テトラアルキルアンモニウム塩はテトラブチルアンモニウム塩であり、硫酸化剤は３酸化硫黄およびピリジンの複合体（ＳＯ３−ピリジン）であり、反応を０℃−６０℃で行う方法。
【請求項２２】
硫酸化剤を０℃−６０℃の温度範囲で非プロトン性溶媒中で該多糖のテトラアルキルアンモニウム塩と反応させ、次に該硫酸化多糖を回収することを含み、該多糖の分子量は硫酸基の添加をのぞいては影響されない、請求項１〜３のいずれか１つに記載の硫酸化多糖の製造方法。
【請求項２３】
非プロトン性溶媒がジメチルスルホオキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、またはＮ−メチルピロリドンの一つである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
硫酸化の程度が、用いる硫酸化剤の量を変化させることにより調節される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
硫酸化剤に対するＯＨのモル比が１：１−１：１２である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
硫酸化生成物を、溶液のｐＨを８−１０の間に上げることにより沈澱させる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２７】
ｐＨが８．５−９．５の間である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の硫酸化多糖およびＣｕ（ＩＩ）を含む複合体。
【請求項２９】
請求項２８に記載の硫酸化多糖を含む生医学的物体であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、該生医学的物体。
【請求項３０】
該物体は該硫酸化多糖で被覆されている請求項２９に記載の生医学的物体。
【請求項３１】
請求項１に記載の硫酸化多糖のコーティングを有する被覆された生医学的物体または装置であって、反復単位当たりの硫酸基の数が２．０−３．５の範囲である該物体又は装置であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、生医学的物体または装置。
【請求項３２】
硫酸化多糖の硫酸化の程度が反復単位あたり２．５、３．０または３．５である請求項３１に記載の被覆された生医学的物体または装置。
【請求項３３】
請求項１に記載の硫酸化多糖を含む医薬組成物。
【請求項３４】
ゲル、ハイドロゲル、クリームまたは軟膏の一つである請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、生医学的物体または医薬組成物の製造における請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルまたは該ヒアルロン酸エステルの塩の使用。
【請求項３６】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、調節された薬剤放出システム用医薬の製造における請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項３７】
血栓症、血餅、体外循環、又は血液透析の治療のための、抗血栓性または抗凝固性である生体物質の製造における請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項３８】
体外循環のための生体物質の製造における、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項３９】
少なくとも一つの細胞増殖課程が血管生成である請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
血栓症または血餅の治療のための、生医学的物体を被覆するための薬剤の製造における、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸エステルの使用であって、該物体が透析チューブ、ガイドチャンネル、バイパス、人工血管、シャント、ガーゼ、糸、ゲル、ハイドロゲル、フィルム、膜、スポンジ、不織組織、またはマイクロスフェアからなる群から選ばれる、該使用。
【請求項４１】
請求項１に記載の少なくとも１つの硫酸化多糖を含む可溶性生体物質であって、反復単位あたりの硫酸基の数が少なくとも２であって、該ヒアルロン酸エステル、塩、またはそれらの組み合わせがヘパリン様抗凝固活性および血管形成活性を有する、該可溶性生体物質。
【請求項４２】
請求項３記載の硫酸化多糖を含む生体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学、健康管理、および医薬への利用において有用である新規な生体物質の製造のための、多糖類およびその半合成誘導体、特にヒアルロン酸およびそのエステルおよびテトラアルキルアンモニウム塩のようなグリコサミノグリカンの均一な硫酸化、ならびにそのような生体物質自体に関する。トロンビン時間および全血凝固時間の両方の延長によって明示されるように、該硫酸化誘導体は抗トロンビン活性を示す。さらに、該硫酸化誘導体に接触させて置いた内皮細胞の形および増殖および溶血反応がないことは、これらの物質は有望なヘパリン様化合物であることが示される。
【背景技術】
【０００２】
生物学的起源の多くの分子は高分子電解質であり、それらの相互作用は多種多様な生化学反応において非常に重要である。その結果、合成および／または半合成高分子電解質が現在使用されている。これら高分子電解質は天然高分子電解質の生物学的特徴を模倣し、出発物質と比較して幾らかの異なる特徴を有し得る。
【０００３】
生物起源の高分子電解質には硫酸化多糖類、特にヘパリンおよびその誘導体が含まれ［D.A.Lane and U. Lindahl編, Heparin-Chemical and Biological Properties, Clinical Applications, Edward Arnold, London］、これらは細胞−基質相互作用、特にウイルス活性阻害の過程、血液凝固の過程、脂質除去等において重要な役割を果す。
【０００４】
ヘパリンは、硫酸化グリコサミノグリカン群の中で最も生物学的に反応性である。その抗トロンビンおよび抗凝固特性はよく知られている。実際、心臓血管病の管理に広く使用され、開心術の成功の大きな一助となる。それにもかかわらず、ヘパリンの構造は単純でなく、変種の数のために完全には知られていない。市販のヘパリンは、抗凝固活性を変化させる分子量３,０００〜３７,５００の範囲の、２１個のヘパリンから成る［Nader等, (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun. 57:488］。
【０００５】
ヘパリンの抗血液凝固活性は構造的特徴、例えば、硫酸化度、解離度、ＣＯＯ−およびＳＯ３−基の個々の配列、ならびに分子の形および大きさに因るものである。これらの因子は、ヘパリンのイオン結合能において重要であるため、生物学的活性に関係すると思われる［Stivala等, (1967) Arch. Biochem. Biophys. 122:40]。大きく陰性に荷電した性質のため、ヘパリンは陽イオンに強い親和性を有し、その活性はpＨに依存する。
【０００６】
容易に利用できる天然多糖類の殆どは、ヘパリン類似体を得る試みにおいて硫酸化されており［Hoffman等 (982) Carbohydrate Res. 2:115；Kindness等 (1980) Brit. J. Pharmac. 69:675；Horton等 (1973) Carbohydrate Res. 30:349；Okada等 (1979) Makromol. Chem. 180:813；Kikuchi等 (1979) Nippon Kagaku Kaishi 1:127；Manzac等 (1981) Proc. Third M.I.S.A.O. 5:504］、最近では、硫酸基、カルボキシル基、およびスルホン酸基をポリスチレン［Kanmaugue等 (1985) Biomaterials 6:297］およびポリウレタン［Ito等 (1992) Biomaterials 13:131］のような合成高分子に結合させた。これらの物質の抗凝固活性はヘパリンの活性よりもずっと低く、置換基の結合および型、置換度、ならびに配列に依存する。
【０００７】
多糖類の硫酸化を可能にする幾つかの化学反応が知られているが［国際出願ＷＯ 88/00211号；欧州特許第0 340 628号；Nagasawa等 (1986) Carbohydrate Research 158:183-190］、該多糖類特有の化学的および化学物理学的特性の上に、抗凝固活性のような新規な特性をも有する硫酸化多糖類を得ることは未だなお可能ではない。
【０００８】
【特許文献１】国際公開 ＷＯ 88/00211号
【特許文献２】欧州特許第0 340 628号
【非特許文献１】D.A.Lane and U. Lindahl編, Heparin-Chemical and Biological Properties, Clinical Applications, Edward Arnold, London
【非特許文献２】Nader等, (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun. 57:488
【非特許文献３】Stivala等, (1967) Arch. Biochem. Biophys. 122:40
【非特許文献４】Hoffman等 (982) Carbohydrate Res. 2:115
【非特許文献５】Kindness等 (1980) Brit. J. Pharmac. 69:675
【非特許文献６】Horton等 (1973) Carbohydrate Res. 30:349
【非特許文献７】Okada等 (1979) Makromol. Chem. 180:813
【非特許文献８】Kikuchi等 (1979) Nippon Kagaku Kaishi 1:127
【非特許文献９】Manzac等 (1981) Proc. Third M.I.S.A.O. 5:504
【非特許文献１０】Kanmaugue等 (1985) Biomaterials 6:297
【非特許文献１１】Ito等 (1992) Biomaterials 13:131
【非特許文献１２】Nagasawa等 (1986) Carbohydrate Research 158:183-190
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
多糖類の抗凝固特性に関連した構造的性質を研究する本試みは、第一に規則的な反復単位からなるよく定義された化学基を有するポリマーを選択すること、第二にそれらの化学構造を修飾することであった。
【００１０】
故に、該分子は：
（１）モノマー単位の規則的な配列を含み、そして
（２）それらの構造を破壊することなく化学的に修飾され得なければならない。
哺乳動物の細胞外マトリックスの主成分であるヒアルロン酸はＮ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸残基の交互単位からなり、故に適当な高分子と思われる。
【００１１】
適当な硫酸化剤の使用による、多糖またはその半合成誘導体のうちの１つの高分子鎖に存在するアルコール性ヒドロキシルの硫酸化によって、出発物質のとは異なる化学物理学的特性および殆ど全ての生物学的特性を有する新規な誘導体を形成し得る。
【００１２】
本発明において基質として用いられ得る高分子電解質多糖類にはグリコサミノグリカン類が含まれる。これらの中で先ず第一のものはヒアルロン酸およびその半合成誘導体である。幾つかの特に重要なヒアルロン酸の半合成誘導体は、脂肪族、アル脂肪族（araliphatic）、複素環式および脂環式系のアルコールとのそれらのエステルであり、米国特許第４,８５１,５２１号、４,９６５,３５３号、および５,２０２,４３１号、ならびに欧州特許第０ ２１６ ４５３号に記載された「ＨＹＡＦＦ」と称されるものである。このような前処理した生体物質の硫酸化は本発明の新規な特徴である。この場合、硫酸化反応は均一相において起こらず、不均一相において生体物質の界面上で起こり、反応溶媒にさらしたヒドロキシル基を活性化する。
【００１３】
生体物質上で直接得ることができる硫酸化度は重要な特性であり、綿密な速度論的調節を必要とする。マトリックスを構成する高分子の親水性を増大させることにより起こる、生体物質の可溶化を避けるために、出発生体物質の親水性度に依存しながらも、二量体単位あたりの−ＳＯ３基の数があるレベルを超えてはならず、通常１.５〜２未満である。例えば、全てのカルボキシルがベンジル基とのエステル結合に関与するＨＹＡＦＦ １１フィルムの場合において、最大硫酸化度は１.５を超えるべきではない。
【００１４】
硫酸化のために通常用いられる試薬には三酸化硫黄とピリジン間のコンプレックス（ＳＯ３−ピリジン）が含まれる。
【００１５】
約０〜６０℃の温度範囲において、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ'−ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリドンのような非プロトン性溶媒中で、溶液中の多糖のテトラブチルアンモニウム塩に、または部分的エステルの場合、テトラブチルアンモニウム塩の形で残存するカルボキシル官能性をもつ多糖エステルの溶液に、硫酸化試薬を加えることによって反応を実施する。
【００１６】
二糖単位あたりの硫酸基の数によって測定する、異なった硫酸化度は、ＳＯ３−ピリジンの量を変化させることによって得られる。ヒドロキシルと硫酸化試薬間のモル比は１：１〜１：１２の間で変化させ得る。
【００１７】
驚いたことに、本発明者は、特殊かつ均一な方法で、高分子の特性（特にその分子量）の損失を引き起こすことなく、ヒアルロン酸およびその半合成誘導体の多糖鎖を硫酸化させ、そしてヒアルロン酸およびその半合成誘導体が以前に有していなかった生物学的および物理化学的特性を有する新規な高分子を得ることに成功した。
【００１８】
この方法により、異なるレベルの硫酸化を有するが、同じ分子量を有する新規な高分子を得ることが可能である。出発物質として、カルボキシ基がテトラブチルアンモニウム塩で塩となっている生体高分子を用いることにより、新規な生物学的特性を有する高分子を得ることができる。該生体高分子は溶血性ではない。
【００１９】
これら硫酸化多糖類の注目すべき特性は血液凝固時間を増加させる能力である。試験物質の存在下でヒト血液の試料にトロンビンを加えた時の、フィブリノーゲンがフィブリンに変わる時間を測定することにより、トロンビン時間試験を行なう。同じ血液試料だが、出発物質として用いた高分子の存在下でのトロンビン時間試験を比較値とする。試験は２４０秒を越えた時点で有意性を失う。試験物質の存在下でヒト血液試料が凝固するのにかかる時間を単に測定することにより、凝固時間を測定する。２時間を超過する時間は考慮に入れない。
【００２０】
本発明の新規な生体高分子を用いて、生物医学、健康管理、および医薬分野における使用のための新規な生体物質を開発することが可能である。得られた生成物は、抗トロンビン活性、抗凝固活性、および抗ウイルス活性のような生体適合的および生物学的特性を有する。例えば、硫酸化ポリアニオンは、ＨＩＶ阻害を含む抗ウイルス活性を示すことが示されている。また、本発明の新規な生体高分子を、細胞増殖過程、薬物放出系調節、さらに一般的には、内手術、体外酸素循環、癒着予防、永久的な生分解可能な移植、および透析において有利に用いることができる。
【００２１】
例えば、デキストランのような他の硫酸化高分子の場合と同様に、約１０,０００〜５０,０００Ｄaの範囲内の分子量を有する硫酸化ヒアルロン酸は、炎症性細胞の拡散において主な標的である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生成を阻害する。故に硫酸化ヒアルロン酸を、ヒアルロン酸をベースとした生体物質または組成物の形態で、局所的抗炎症剤として用いることができる。
【００２２】
故に、新規な高分子をゲル、クリーム、または軟膏の形態で製造することができ、意図する治療上用途に従い、糸、スポンジ、ガーゼ、膜、ガイド・チャネル、不織布およびミクロスフェアの形態で生体物質を製造するのに用いることができる。最後に、高分子の硫酸化度および分子量に依存して、抗ウイルス活性を示し、および／または細胞相互作用の種々の段階に介入するために用いることのできる高分子を製造することが可能である。また、これら生体高分子を被覆過程において用い、生物医学物体および装置のような支持物質の表面に新規な生物学的性質を賦与することができる。
【００２３】
そのような硫酸化生体物質を、血液または高血管化組織と接触させることによる利用（例えば、内または外手術用の生体高分子透析チューブまたは膜の使用）において使用することができ、これによって細胞の癒着等を減少させることができる。特に、本発明の新規な可溶性硫酸化ヒアルロン酸誘導体を、ヒアルロン酸をベースとした生体物質の分野において既に周知の多種多様な利用において使用することができる。
【００２４】
例えば、２.５よりも大きい硫酸化度を有するヒアルロン酸誘導体は、良好な抗凝固活性を示すが、出発高分子の分子量もまた、本発明の新規な硫酸化生体高分子の性質に影響を及ぼすことにおいて有意であり得る。
【００２５】
特に、少なくとも４つの硫酸化ヒアルロン酸誘導体が、それらの分子量および硫酸化度のために注目に値する。
１．約１０,０００〜５０,０００Ｄaの範囲の分子量を有し、かつ２.５、３.０、または３.５の硫酸化度を有するヒアルロン酸；
２．約５０,０００〜２５０,０００Ｄaの範囲の分子量を有し、かつ２.５、３.０、または３.５の硫酸化度を有するヒアルロン酸；
３．約２５０,０００〜７５０,０００Ｄaの範囲の分子量を有し、かつ２.５、３.０、または３.５の硫酸化度を有するヒアルロン酸；および
４．約７５０,０００〜１,２５０,０００Ｄaの範囲の分子量を有し、かつ２.５、約３.０、または３.５の硫酸化度を有するヒアルロン酸。
【００２６】
当分野において知られているように、特定の分子量を除去するポイントを有する膜の使用により、上記の分子量を有するヒアルロン酸分画を得ることができる。
【００２７】
ヒアルロン酸の半合成エステル誘導体、１.０および１.５まで硫酸化されたＨＹＡＦＦ １１高分子マトリックス（ヒアルロン酸の１００％ベンジルエステル）、ならびに０.５および１.０まで硫酸化されたＨＹＡＦＦ １１ｐ７５（ヒアルロン酸の７５％ベンジルエステル）が特に興味深い。
【００２８】
本発明のさらなる適用可能範囲は、以下に挙げる詳細な説明および図面から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示の為だけとして提供するということが理解されるべきである。何故なら、この詳細な説明から本発明の真意および範囲内での種々の変化および改良が当業者に明らかになるであろうからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下の本発明の詳細な説明を、本発明の実施において当業者を助けるために提供する。たとえそうでも、本明細書中で議論される態様における改良および変形は、本発明的発見の真意または範囲から外れることなく当業者により為されることができるので、以下の詳細な説明は本発明を不適当に制限すると解釈すべきではない。
【００３０】
本明細書中に引用されている各文献の内容はその全体が本明細書の一部を構成する。
【００３１】
説明の目的のために、本発明による新規な硫酸化高分子の製造の幾つかの実施例を以下に挙げる。これら実施例はヒアルロン酸およびその半合成誘導体（例えば、テトラブチルアンモニウム塩およびエステル）に関するが、同じ方法を他のグリコサミノグリカン、アルギン酸、ゲラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアミド、およびカルボキシメチルキチンのような他の多糖類、ならびにそれらのテトラブチルアンモニウム塩および脂肪族、アル脂肪族、複素環式および脂環式アルコールとの部分的エステルのような半合成誘導体に適用することができる［米国特許第４,８５１,５２１号、５,１２２,５９３号、５,３００,４９３号、５,３３２,８０９号、および５,３３６,６６８号；欧州特許出願第９３９１７６８１.４号；ＥＰ ０ ２１６  ４５３号、ＥＰ ０ ２５１ ９０５号、ＥＰ ０ ３４２ ５５７号、ＥＰ ０ ５１８ ７１０号、ＥＰ ０ ６０３ ２６４号、およびＥＰ ０ ６０５ ４７６号；ならびに国際出願ＷＯ ９３／０６１３６号およびＷＯ ９４／０３４９９号に記載］。
【実施例】
【００３２】
実施例１
ヒアルロン酸ナトリウムの硫酸化（硫酸化度３）
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ＤＭＦ（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（１.３０５g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した精製水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、０〜４℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度を核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。
【００３３】
この実施例および以下の実施例におけるトロンビン時間および凝固時間を国際出願ＷＯ ９２／１１２９４に記載のように測定した。このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４２.２秒のトロンビン時間を有し、対照血液において測定した２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００３４】
実施例２
ヒアルロン酸ナトリウムの硫酸化（硫酸化度３.５）
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ＤＭＦ（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（２.０８８g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水中に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度を核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて無限のトロンビン時間を有する。
【００３５】
実施例３
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（カルボキシ基の７５％がエチルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度３）
ヒアルロン酸の７５％部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ７５）のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（１.３０５g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４５秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００３６】
実施例４
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（カルボキシ基の５０％がエチルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度２.５）
ヒアルロン酸の５０％部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ５０、カルボキシ基の５０％をエタノールでエステル化）のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（１.０４４g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４７秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００３７】
実施例５
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（カルボキシ基の２５％がエチルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度２）
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ２５、カルボキシ基の２５％をエタノールでエステル化）のＴＢＡ塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（０.７８３g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４９秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００３８】
実施例６
ヒアルロン酸の部分的ベンジルエステル（カルボキシ基の７５％がベンジルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度３.５）
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ７５、カルボキシ基の７５％をベンジルアルコールでエステル化）のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（２.０８８g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４４秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００３９】
実施例７
ヒアルロン酸の部分的ベンジルエステル（カルボキシ基の５０％がベンジルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度３）
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ５０、カルボキシ基の５０％をベンジルアルコールでエステル化）のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（１.３０５g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４６秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００４０】
実施例８
ヒアルロン酸の部分的ベンジルエステル（カルボキシ基の２５％がベンジルエステルの形態）の硫酸化（硫酸化度２）
ヒアルロン酸の部分的エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ２５、カルボキシ基の２５％をベンジルアルコールでエステル化）のテトラブチルアンモニウム塩（０.２５０g）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ml）に溶解する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ml）に溶解したＳＯ３−ピリジン（０.５２２g）を窒素流下でこの溶液に加える。この溶液を４〜０℃の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃に冷却した水（約２００ml）を加える。この混合物のpＨを、１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加によって８.５〜９.５の値に合わせる。次いでこの誘導体をエチルアルコール（１２０ml）で沈澱させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、４〜０℃の温度で１〜２４時間沈澱させておく。この沈澱物を遠心によって分離し（例えば、１,５００rpmで１５分間）、精製水に溶解し、次いで全ての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化度をＮＭＲによって測定する。
このようにして得られた生成物は、出発高分子の１１.３秒に比べて４８秒のトロンビン時間を有し、対照血液の２８分に比べて２時間を越える凝固時間を有する。
【００４１】
実施例９
ＨＹＡＦＦ １１フィルムの製造（硫酸化度１.５）
ＨＹＡＦＦ １１のフィルム（０.２５０g）を、比率１：１のクロロホルム：ジメチルホルムアミドの混合物（２５０ml）浴に浸す。次いで、ジメチルホルムアミドにピリジン−ＳＯ３コンプレックス（３.４g）を溶解することによって得られる溶液（５０ml）を加える。
周囲温度で２時間この反応を進行させ、その後フィルムを取り出し、次いで蒸留水（１００ml）浴に浸し、最後に水：エタノール（５０：５０）溶液に浸す。次いで、このフィルムを５５℃で４８時間オーブンで乾燥させる。
【００４２】
実施例１０
ＨＹＡＦＦ １１ｐ７５フィルムの製造（硫酸化度１）
ＨＹＡＦＦ １１ｐ７５のフィルム（０.２５０g）を、比率１：１のクロロホルム：ジメチルホルムアミドの混合物（２５０ml）浴に浸す。次いで、ジメチルホルムアミドにピリジン−ＳＯ３コンプレックス（２.３g）を溶解することによって得られる溶液（５０ml）を加える。
周囲温度で２時間この反応を進行させ、その後フィルムを取り出し、次いで蒸留水（約１００ml）浴に浸し、最後に水：エタノール（５０：５０）溶液に浸す。このフィルムを５５℃で４８時間オーブンで乾燥させる。
【００４３】
実施例１１
可溶性硫酸化ヒアルロン酸およびヒアルロン酸エステルの生物学的特性
異なる硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸の存在下での全血凝固時間
この試験を、１ドナーからの血液を用い、ヒアルロン酸および硫酸化ヒアルロン酸について行った。対照は血液のみを含有した。
各試験について、各々５mlの血液を含有する３個の試験管を準備した。第一の試験管はブランクであり、第二および第三の試験管には、各々ヒアルロン酸（２５mg）および硫酸化ヒアルロン酸（２５mg）を溶解した。
この結果を図１に示す。図１から、反復単位あたり３.０および３.５個のＳＯ３基を有するヒアルロン酸の全血凝固時間（ＷＢＣＴ）は無限となったことが見られる。全血対照の凝固時間は約１５分であった。ヒアルロン酸存在下の血液は４５分後に凝固した。
【００４４】
異なる硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸存在下でのトロンビン時間
異なる硫酸化度を有するヒアルロン酸のトロンビン時間を、Ｅlvi ８２０ Ｄigiclot（Ｌogos Ｓ.ｐ.Ａ，Ｍilan，Ｉtaly）を用いて測定した。この装置は３７℃の温度にセットされたインキュベーション・プレートを有し、３２個の試験管および４個の試薬バイアル（その内の２個は６００rpmで強力に撹拌することができる）を収容する。それは２個のサーモスタット測定ウェルを含み、３００rpmでのマグネティック・スターラーおよび遮光蓋を備えている。試薬の分配用の適応できる体積（０.１〜０.２ml）を有するマグネティック・ピペットが装置を活動させ、この装置は凝固塊形成に関する光学密度の僅かな変化によってさえ停止する。凝固を光度測定的にモニターする。最初に、ランプからの光線は５２５nmの干渉フィルターを通過し、最後に収容セルを通過する。光ダイオードにより、凝固塊形成についての血漿の光学密度の変化を測定する。光度シグナル・プロセッサーにより、殆ど１／１０秒でデジタル・クロノメーターを停止させる。トロンビン時間試験を、試薬「Ｔrombina」（Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ Ｄiagnostica）を用いて行う。この試験を、数名のドナーからの血液の遠心によって得られる血漿（血漿プール）を用いて、全試料について実行する。この血漿は前以て抗凝固剤（血液９mlにつきクエン酸ナトリウム溶液１ml）で処理しておいた。溶液を、リン酸塩緩衝溶液中１mg／mlのヒアルロン酸および硫酸化ヒアルロン酸の濃度で調製した。
【００４５】
図１に要約するように、反復単位あたり２.５、３.０、および３.５個のＳＯ３基を有するヒアルロン酸はトロンビン時間を延長する。反復単位あたり２.０個のＳＯ３基を有するヒアルロン酸はトロンビン時間を延長しなかった、即ち、該トロンビン時間は対照のトロンビン時間と等しく、従ってこの特定の硫酸化ヒアルロン酸誘導体はヘパリン様抗凝固活性を持たないことが示される。ヒアルロン酸存在下でのトロンビン時間は対照のトロンビン時間と類似している。
また図１において、硫酸化ヒアルロン酸生成物（１mg）に対応するヘパリンの量が示されている（較正曲線によって測定）。
異なる硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸エステル存在下でのトロンビン時間
トロンビン時間を、ヒアルロン酸の硫酸化誘導体（ヒアルロン酸分子量＝
２００,０００Ｄa）、即ち、ＨＹＡＦＦ １１（ヒアルロン酸の１００％ベンジルエステル；硫酸化度２.０）、ＨＹＡＦＦ １１ｐ２５（ヒアルロン酸の２５％ベンジルエステル；硫酸化度３.０）、およびＨＹＡＦＦ １１ｐ７５（ヒアルロン酸の７５％ベンジルエステル；硫酸化度３.５）が溶解している血漿についても測定した。
硫酸化ＨＹＡＦＦ １１の場合、それ自身の濃度およびトロンビン濃度のＴＴへの影響を調べた。
硫酸化ＨＹＡＦＦ １１についての結果を表１に示す。ヒアルロン酸は血漿に溶解するので比較として用いた［ここで、トロンビン濃度は国際単位（ＵＩ）である］。
【表１】
0005165298.tif 000002
【００４６】
これら結果から、ヒアルロン酸存在下よりも硫酸化ＨＹＡＦＦ １１存在下での血漿のトロンビン時間の方がより長いことが開示されている。ヒアルロン酸、硫酸化ヒアルロン酸、およびトロンビンの濃度の影響に注意すべきである。ヒアルロン酸と比較して、トロンビンを６ＵＩまたは０.６ＵＩのいずれかで使用する場合、硫酸化ＨＹＡＦＦ １１（８mg／ml）はトロンビン時間を有意に延長する。少量（２mg／ml）の硫酸化ＨＹＡＦＦ １１のトロンビン時間の変化は有意ではない。
【００４７】
表２において、硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ２５および硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ７５のトロンビン時間についての結果を示す。
【表２】
0005165298.tif 000003
【００４８】
表２のデータから、硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ２５およびＨＹＡＦＦ １１ｐ７５の両方ともトロンビン時間を延長することが証明される。硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ７５のより長いトロンビン時間は約０.１５ＵＩ／mlのヘパリン活性に対応する。硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ２５のより長いトロンビン時間は約０.２５ＵＩ／mlのヘパリン活性に対応する。
【００４９】
レプティラーゼ時間
レプティラーゼは、Ｂothrox atropsの毒において見いだされる酵素であり、そのフィブリノペプチド Ａを分裂させることによってフィブリノーゲンを凝固させる。
レプティラーゼ時間を、硫酸化ヒアルロン酸または硫酸化ヒアルロン酸誘導体を０.１Ｍ リン酸緩衝生理的食塩水（１ml）に溶解し、次いでこの溶液（０.３ml）をヒト血漿（０.３ml）に加えることによって測定する。このレプティラーゼ時間は、硫酸化ヒアルロン酸または誘導体を含有するヒト血漿を３７℃で２分間インキュベートし、次いでレプティラーゼ・リアクイティブ（Ｂothrox atropsの毒からのトロンビン抽出物の分画，Ｈemodiagnostica Ｄiagnostica Ｓtago, Ｂoehringer Ｍannheim）を加え、自動的に凝固時間を測定することによって測定する（Ｅlvi Ｄigiclot ２ Ｃoagulometer, Ｌogos Ｓ.p.Ａ., Ｍilan, Ｉtaly）。
表３において、レプティラーゼ時間への硫酸化ＨＹＡＦＦ １１、硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ２５、および硫酸化ＨＹＡＦＦ １１ｐ７５の影響を示す。
【表３】
0005165298.tif 000004
【００５０】
表３のデータから、硫酸化ヒアルロン酸誘導体はレプティラーゼ時間にどんな有意な影響も及ぼさないことが示される。
【００５１】
実施例１２
溶血試験
溶血検定によって、赤血球の原形質膜と物質の直接相互作用を測定する。
硫酸化ヒアルロン酸（２５mg）をクエン酸ナトリウム（０.５ml）に溶解した。次いで、この試験管を新鮮なヒト血液（５ml）で充たした。対照は全クエン酸化血液のみを含有した。溶血試験をＡlbanese等が記載したように行った［Biomaterials 15:129 (1994)］。
硫酸化ヒアルロン酸で得られた結果から、この物質はいかなる溶血活性も示さないことが示される。
【００５２】
実施例１３
不溶性硫酸化ヒアルロン酸誘導体の生物学的特性
異なる硫酸度を有する硫酸化ヒアルロン酸エステルの不溶性フィルム存在下でのトロンビン時間
トロンビン時間試験を、実質的に実施例１１において異なる硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸について記載したように、直線キュベットに用いる硫酸化ヒアルロン酸エステルの不溶性フィルムの円について行った。血漿（１.２ml）を各キュベットに加え、次いでこれをフィルムの円と共に１０分間インキュベートした。次いで、トロンビン試薬（０.２ml）を加え、凝固時間をモニターした。ヒアルロン酸の分子量およびエステルの硫酸化度を実施例１１に示した。
この結果を表４に示す。
【表４】
0005165298.tif 000005
【００５３】
実施例１４
硫酸化ヒアルロン細胞の存在下での培養ヒト臍静脈内皮細胞の増殖
ヒト臍静脈内皮細胞を、標準プロトコールに従い、コラーゲナーゼ分解によって臍索状組織から単離した。この細胞を、２０％仔ウシ血清、Ｌ−グルタミン、およびゲンタマイシンを有するＭedium １９９（ＧＩＢＣＯ Ｌaboratories）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で維持した。
この内皮細胞を多角形態によってのみ同定した。増殖実験については、培養物が集密状態に達した時に細胞を用いた。５mg／mlの濃度が得られるまで、ヒアルロン酸をＭedium １９９に溶解した。この検定を、物質と細胞の間で２４、４８、および７２時間接触させるよう計画した。毎２４時間、培地をウェルから除去し、滅菌ＰＢＳ溶液でフィルムを濯いで非付着細胞を除去した。この細胞を倒立顕微鏡（ＤＩＡＰＨＯＴ ＴＭＤ Ｎikon）で分析し、Ｎikon カメラで写真を取った。次いで、この細胞をトリプシンで分離し、Ｂurker chamber中で計数した。Ｔrypan Ｂlueを用いて死亡および生存細胞間を区別した。
図２はヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖曲線を示す。
硫酸化ヒアルロン酸含有培地中の内皮細胞の数は時間がたつにつれて増加し、ヒアルロン酸含有培地中または純粋培地対照中よりも良好な増殖を示す。
【００５４】
内皮細胞の形態を倒立顕微鏡を用いて調べた。硫酸化ヒアルロン酸含有培地中の内皮細胞は、形態的変化もなく、細胞組織における構造的変化もなく、よく広がっていた。
ヒアルロン酸存在下での内皮細胞および対照について、同じ形態が認められた。唯一の注目すべき相違は細胞増殖にあった。実際、１日後、硫酸化ヒアルロン酸含有培地中の細胞は殆ど集密的細胞単層であるが、ヒアルロン酸含有培地または純粋培地中の細胞は３日後にやっと集密状態に達した。
【００５５】
実施例１５
インビトロにおける血管形成誘導の評価
硫酸化ヒアルロン酸はヘパリンと同様にＣu(II)イオンとコンプレックスを形成し、Ｃu(ＯＨ)２Ｌ（Ｌ＝「リガンド」）という化学量論的組成を有する［Barbucci等 (1995) Gazetta Chimica Italiana, 印刷中］。文献から知られているように、Ｃu(II)−ヘパリンコンプレックスは血管形成作用を示す［Alessandri等 (1983) Cancer Research 43:1790-1797］。
【００５６】
故に、細胞移動法［Alessandri等 (1983) Cancer Research 43:1790-1797］を用いて、インビトロでの血管形成を誘導する硫酸化ヒアルロン酸の能力を調べた。
寒天での内皮細胞の移動を観察した。該方法を模式的に図３に示す。インビトロでの血管形成を誘導する試験試料の能力を、対照試料の方へよりもむしろ試験試料の方へ優先的に移動する内皮細胞の数によって測定することができる。
Alessandri等が記載した、Ｃu(II)−ヘパリンコンプレックスによって誘導される血管形成を評価するための細胞移動試験を０.１Ｍ トリス（pＨ７.５）緩衝溶液中で行った。しかし、トリス存在下において、形成されたコンプレックスは実際Ｃu(II)−トリスであって、Ｃu(II)−ヘパリンではないので、観察された血管形成作用はヘパリン存在下でのＣu(II)−トリスコンプレックスに関係する。
本試験を０.１Ｍ ＰＢＳ（pＨ７.４）緩衝溶液を用いて行った。このpＨで、コンプレックス中にないＣu(II)は水酸化物の形態で沈澱する。故に、Ｃu(II)−生物学的分子の溶液を、大きさが０.２ミクロンの孔を有するセルロース・フィルターで濾過して、試験に溶液を用いる前に水酸化銅沈澱を除去した。
反復単位あたり、１つは２.０個のＳＯ３基を有し、もう１つは３.５個のＳＯ３基を有する、２個の硫酸化ヒアルロン酸の試料を分析した。実験を折り返し行い、Ｃu(II)−ヘパリンコンプレックスおよびＣu(II)−トリスコンプレックスを含有する試料もまた分析した。各実験において、Ｃu(II)−生物学的分子コンプレックスの血管形成作用を生物学的分子のみの血管形成作用と比較して評価した。特に、Ｃu(II)−硫酸化ヒアルロン酸を硫酸化ヒアルロン酸と比較し、Ｃu(II)−ヘパリンをヘパリンと比較した。Ｃu(II)−トリスの場合、対照試料は培地のみを含有した。
【００５７】
図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂで示されるように、Ｃu(II)−硫酸化ヒアルロン酸（反復単位あたり３.５個のＳＯ３基）コンプレックスは、Ｃu(II)−ヘパリンコンプレックスと同じ程度、インビトロでの血管形成を誘導できることを証明した。
図４Ａおよび４Ｂで示されるように、硫酸化ヒアルロン酸のみの方へよりもむしろＣu(II)−硫酸化ヒアルロン酸の方への内皮細胞による優先的な移動がある。ヘパリンの場合、内皮細胞はヘパリンのみの方へよりもむしろＣu(II)-ヘパリンコンプレックスの方へ優先的に移動する（図５Ａおよび５Ｂ）。
この効果はヘパリンよりも硫酸化ヒアルロン酸の場合より芳しい（図４Ａ、５Ａおよび４Ｂ、５Ｂの比較）。
一方、Ｃu(II)−トリスコンプレックスの場合（図６Ａおよび６Ｂ）、培地のみの方へよりもむしろコンプレックスの方への細胞の優先的移動は見られない。
Ｃu(II)−硫酸化ヒアルロン酸含有試料（反復単位あたり２.０個のＳＯ３基）の効果はＣu(II)−ヘパリンコンプレックスの効果よりもむしろＣu(II)−トリスコンプレックスの効果に匹敵した。これから、反復単位あたりのＳＯ３基の数は、インビトロでの血管形成の誘導におけるヘパリン様活性を得るのに有意な影響を及ぼすことが証明される。
【００５８】
実施例１６
医薬組成物
本発明の新規な硫酸化ヒアルロン酸誘導体および他の硫酸化多糖類を含む医薬調製物および生体物質を、単独でかまたは他の化学高分子、例えばポリウレタン、ポリ乳酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデンプン、および架橋高分子、またはヒアルロン酸エステル、塩、誘導体、コンプレックス、フラグメント、サブユニット、および／または薬理学的に許容し得る薬物と組み合わせて、生物医学、健康管理、および医薬分野における助けとして、ヒトに投与することができる。
【００５９】
抗トロンビン活性および抗凝固活性のために、本発明の生体高分子は、ガイド・チャネル、バイパス、人工静脈、またはシャントのような生体物質を製造するのに用いて、血液透析、心臓病学、体外循環、およびさらに一般には、心臓血管系において使用するのに有利である。
Ｃu(II)−硫酸化ヒアルロン酸コンプレックスの血管形成活性を、毛細血管成長を刺激するのに使用することができる。
硫酸化ヒアルロン酸は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびＴＮＦ−βの強力な阻害物質であることが最近証明された［Chang等 (1994) Journal of Leukocyte Biology 55:778-784］。従って、本発明の硫酸化ヒアルロン酸およびヒアルロン酸エステル生成物の、ＴＮＦ介在炎症、全身毒性、および関連病理の治療における抗炎症剤としての治療使用もまた見いだすことができる。
【００６０】
さらに、硫酸化ヒアルロン酸誘導体を、体外循環適用に用いる装置を製造するための血漿被覆のような技術を用いて、物質の表面の被覆として使用することができる。
また、本発明の硫酸化ヒアルロン酸誘導体を、ケラチノサイト増殖のような細胞増殖過程を促進するためにか、床ずれ、傷、熱傷、および皮膚潰瘍に罹患した患者の治癒を促進するためにか、または外科手術における抗癒着剤として、意図された治療使用に従い、ガーゼ、糸、ゲル、ヒドロゲル、スポンジ、膜、不織布、およびミクロスフェアの形態で用いることができる。
【００６１】
高分子の硫酸化度および分子量に依存して、本発明の新規な硫酸化多糖類はまた、単独でか、または上記したもののような他の化学高分子と共にか、または架橋高分子またはヒアルロン酸エステル、塩、誘導体、コンプレックス、フラグメント、サブユニット、および／もしくは薬理学的に許容し得る薬物と共に、例えば、皮膚科学、眼科学、耳鼻咽喉科学、歯科学、婦人科学、泌尿器科学において、および細菌、真菌、またはウイルス感染の治療におけるドラッグ・デリバリー・システムとして用いることができる。
【００６２】
本発明による、医薬物の組み合わせの例には以下のものが含まれる：
硫酸化ヒアルロン酸およびヒアルロン酸エステル（例えば、ベンジルまたはエチルエステル）の組み合わせ；
硫酸化ヒアルロン酸および架橋ヒアルロン酸エステルの組み合わせ；
硫酸化ヒアルロン酸および上記のような化学高分子の組み合わせ；
硫酸化ヒアルロン酸およびＣu(II)イオンの組み合わせ；
硫酸化ヒアルロン酸および金属イオン（例えば、カルシウムまたは銀）の組み合わせ；
塩基性または非塩基性抗生物質、スルファミド系、抗ウイルス（例えば、アシクロビル）、ステロイド系抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾンまたはプレドニソロン）、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、インドメタシン）、傷治癒物質（例えば、上皮増殖因子）、抗微生物、抗細菌、または消毒剤のような抗感染剤を伴う、硫酸化ヒアルロン酸およびヒアルロン酸エステルの組み合わせ；
塩基性または非塩基性抗生物質、スルファミド系、抗ウイルス（例えば、アシクロビル）、ステロイド系抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾンまたはプレドニソロン）、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、インドメタシン）、傷治癒物質（例えば、上皮増殖因子）、抗微生物、抗細菌、または消毒剤のような抗感染剤を伴う、硫酸化ヒアルロン酸および架橋ヒアルロン酸の組み合わせ。
【００６３】
本発明を以上のように記載したが、これらの方法は幾通りにも改良され得ることは明白である。これら改良法は本発明の真意および範囲から逸脱すると見なすべきではなく、当業者にとって明白と見なされる全改良法は以下の請求項の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】全血凝固時間（ＷＢＣＴ）およびトロンビン時間（ＴＴ）に及ぼす反復単位あたり、２.０、２.５、３.０、および３.５個のＳＯ３基で硫酸化されたヒアルロン酸の影響を示す。
【図２】、実施例１４に記載のように、対照培地（◆）、硫酸化ヒアルロン酸含有培地（■）、およびヒアルロン酸含有培地（▲）中のヒト臍静脈内皮細胞の増殖を示す。
【図３】実施例１５に記載のゼラチン−アガロース試験用に調製した皿の概要表示である。上図：中央のウェルおよび２mm離れて位置した隣接する２個のウェルを示す断面図。ＢＡＣＥを中央のウェルに置き、試験物質および対照を隣接するウェルに置く。下図：試験の準備をした皿。ＢＡＣＥを含有する第４のウェルを、３個の一列に並べたウェルから約２cm離して置く（図中、距離の割合を保守していない）。第４のウェルを試験物質の影響から遠くに移し、対照として利用して、ウェル外でのＢＡＣＥの移動が未処理の場合均一なハロ−として起こることを確認する。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂは実施例１５に記載のインビトロでの血管形成の誘導の評価の結果を示す。図４Ａおよび４Ｂは、内皮細胞の、硫酸化ヒアルロン酸単独の方へよりもむしろＣu(II)−硫酸化ヒアルロン酸の方への優先的移動を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、内皮細胞の、硫酸化ヒアルロン酸単独の方へよりもむしろＣu(II)−硫酸化ヒアルロン酸の方への優先的移動を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、内皮細胞の、ヘパリン単独の方へよりもむしろＣu(II)−ヘパリンの方への優先的移動を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、内皮細胞の、ヘパリン単独の方へよりもむしろＣu(II)−ヘパリンの方への優先的移動を示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、内皮細胞の、培地単独の方へよりもむしろＣu(II)−トリスコンプレックスの方への優先的移動がないことを示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、内皮細胞の、培地単独の方へよりもむしろＣu(II)−トリスコンプレックスの方への優先的移動がないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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