(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応流路に試料を導入して反応流路中の所定位置で試料の反応処理を行なう反応処理方法において、
前記反応流路は少なくとも前記所定位置が外部から光学的に検知できる光透過性になっており、
試料とその試料と混合されない油相とを連続して前記反応流路内に導入する工程と、
前記反応流路内で試料と油相とを移動させ、前記反応流路の前記所定位置に光照射したときの屈折率変化、反射率変化及び透過率変化のうちのいずれかの光学的変化に基づいて試料と油相との界面を検知して試料を前記所定位置に停止させることにより位置決めする工程と、
前記所定位置において試料の反応処理を行なう工程と、を備えたことを特徴とする反応処理方法。
【請求項２】
前記試料は核酸にポリメラーゼ連鎖反応試薬が添加されたものであり、
前記反応処理は前記所定位置に位置決めされた試料の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる複数の温度に調節するものである請求項１に記載の反応処理方法。
【請求項３】
前記試料は核酸にポリメラーゼ連鎖反応試薬が添加されたものであり、
前記反応処理は、前記所定位置として互いに離れた複数の位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための互いに異なる温度にして、試料をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる順で各位置に移動させるものである請求項１に記載の反応処理方法。
【請求項４】
少なくとも試料の反応処理を行なうべき所定位置が外部から光学的に検知できる光透過性になっている反応流路と、
前記反応流路の一端に設けられた試料導入口と、
前記試料導入口から導入された試料を前記反応流路内で移動させるとともに、停止させることにより位置決めするための試料搬送機構と、
反応流路の前記所定位置の温度調節を行なう温度調節部と、
反応流路の前記所定位置に光照射をし、その屈折率変化、反射率変化及び透過率変化のうちのいずれかの光学的変化から、前記試料搬送機構により試料を位置決めすべき試料位置を検知する光測定部と、を備えている反応処理装置。
【請求項５】
前記温度調節部はポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための複数の温度に順に変化させるものであり、前記所定位置でポリメラーゼ連鎖反応が行なわれる請求項４に記載の反応処理装置。
【請求項６】
前記所定位置は反応流路に沿って複数設けられており、前記温度調節部は各所定位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる互いに異なる温度に調節するものであり、
試料が前記試料搬送機構によりポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる順で前記各所定位置へ移動させられることによりポリメラーゼ連鎖反応が行なわれる請求項４に記載の反応処理装置。
【請求項７】
前記温度調節部は各所定位置にそれぞれ設けられた温度調節素子からなる請求項６に記載の反応処理装置。
【請求項８】
前記温度調節部は反応流路に沿った前記所定位置全てを含む範囲に温度勾配を形成して、前記各所定位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる互いに異なる温度にするものである請求項６に記載の反応処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応流路に試料を導入して反応流路中の所定位置で試料の反応処理を行なう反応処理方法及びその方法を実行するための反応処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応など微少量の試料を扱う反応処理はチップ内に形成された微細な流路状の反応容器を用いて行なうことが一般的である（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
図１はポリメラーゼ連鎖反応などの反応処理を行なうための反応流路が形成されたチップを示したものである。重ね合わされた２枚の樹脂基板２ａ，２ｂの間に反応流路４が形成されており、樹脂基板２ａに形成された貫通穴６，８によって反応流路４に試料を導入する試料導入口と試料を排出する試料排出口が確保されている。樹脂基板２ｂ裏面の凹部１０には例えばペルチェ素子などからなる温度調節部が配置される。
【０００４】
試料は蒸発を防止する目的で油相の間に挟まれた状態になるようにオイルと連続して反応流路４に導入されることが一般的であり、試料導入口から所定量のエアーが送り込まれることによって所定の位置に位置決めされて反応処理が行なわれる。ところが、反応流路４の壁面が親油性であったりすると、試料を挟む油相の一部が反応流路４の壁面に吸着して油相と試料（試料）との相対量が変化し、試料導入口から所定量のエアーを送り込んでも試料が所定の位置に位置決めされないことがあった。
【０００５】
反応流路４の所定位置の温度は温度調節部をフィードバック制御するなどすることで高精度な温度制御することが可能である。しかし、ペルチェ素子などの温度調節素子の伝熱面の温度は面内においてばらつきがあり、試料が所定の位置に位置決めされていないと試料を所望の温度にすることができないという問題があった。
【特許文献１】特開平１０−１１７７６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、反応流路に導入された試料の位置決めを正確に行なうことができるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の反応処理方法は、反応流路に試料を導入して反応流路中の所定位置で試料の反応処理を行なう反応処理方法であって、反応流路は少なくとも所定位置が外部から光学的に検知できる光透過性になっており、試料とその試料と混合されない油成分とを連続して反応流路内に導入する工程と、反応流路内で試料と油相とを移動させ、反応流路の所定位置に光照射したときの光学的変化に基づいて試料と油相との界面を検知して試料を所定位置に位置決めする工程と、所定位置において試料の反応処理を行なう工程と、を備えたことを特徴とするものである。
本発明の反応処理方法によれば、反応流路の試料の反応処理を行なうべき所定位置の光学的変化に基づいて試料と油相との界面を検知し、試料を所定位置に位置決めするので、試料の正確な位置決めが可能である。
【０００８】
本発明の反応処理方法は核酸の塩基配列を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応処理方法とすることもできる。その方法の一例は、試料として核酸にポリメラーゼ連鎖反応試薬が添加されたものを用い、所定位置に位置決めされた試料の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる複数の温度に調節する方法である。
【０００９】
また、本発明にかかるポリメラーゼ連鎖反応処理方法の他の例として、所定位置として互いに離れた複数の位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための互いに異なる温度にして、試料をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる順で各位置に移動させる方法が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる温度の複数の位置に試料をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる順で移動させることにより、試料の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる複数の温度に順に調節するができる。
【００１０】
本発明の反応処理装置は、少なくとも試料の反応処理を行なうべき所定位置が外部から光学的に検知できる光透過性になっている反応流路と、反応流路の一端に設けられた試料導入口と、試料導入口から導入された試料を反応流路内で移動させるための試料搬送機構と、反応流路の所定位置の温度調節を行なう温度調節部と、反応流路の所定位置に光照射をしその光学的変化から試料位置を検知する光測定部と、を備えているものである。この構成によれば、反応流路の所定位置に光照射をしその光学的変化から試料位置を検知する光測定部を備えているので、所定位置に試料があるかどうかを正確に知ることができ、所定位置に試料を正確に位置決めすることができる。
【００１１】
本発明の反応処理装置における温度調節部をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための複数の温度に順に変化させるようにすることで、所定位置でポリメラーゼ連鎖反応を行なうことができる。
【００１２】
また、所定位置は反応流路に沿って複数設けられており、温度調節部は各所定位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる互いに異なる温度に調節するものであり、試料が試料搬送機構によりポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる順で各所定位置へ移動させられることにより、ポリメラーゼ連鎖反応が行なわれる。
【００１３】
上記の場合の温度調節部は、各所定位置にそれぞれ設けられた温度調節素子からなるものであってもよいし、反応流路に沿った所定位置全てを含む範囲に温度勾配を形成して、各所定位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための互いに異なる温度にするものであってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の反応処理方法は、反応流路内の試料の反応処理を行なうべき所定位置の光学的変化に基づいて試料と油相との界面を検知して試料を所定位置に位置決めするので、試料と油相の相対量の変化が生じても、正確に試料を所定位置に位置決めすることができる。そして、試料が所定位置に正確に位置決めされるので、反応処理時の試料の温度制御を正確に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１に反応処理を行なう際に用いる反応処理チップを示す。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＸ−Ｘ位置における断面図である。
重ね合わされた２枚の透明基板２ａ，２ｂの間に反応流路４が形成されている。透明基板２ａに貫通穴６，８が形成されており、反応流路４に試料を導入するための試料導入口及び試料を排出するための試料排出口を構成している。この実施例では、貫通穴６を試料導入口とし、貫通穴８を試料排出口とする。透明基板２ｂ裏面には、例えばペルチェ素子からなる温度調節部が配置される凹部１０が設けられている。
【００１６】
図１の反応処理チップを用いた反応処理方法及び反応処理装置を図２を用いて説明する。
試料の温度調節を行なうための例えばペルチェ素子からなる温度調節部１２、発光部と光検出器からなる光測定部１４、光測定部１４からの光が通る位置に貫通穴からなる窓１７をもつ遮光部材１６、及びエアーの供給及び吸引を行なうノズル１８が設けられている。温度調節部１２は透明基板２ｂ裏面の凹部１０に配置されており、遮光部材１６は透明基板２ａ上に配置されている。ノズル１８は試料導入口６から試料と油成分が導入された後の試料導入口６上に配置される。
【００１７】
試料３は反応流路４において油相５ａ−試料３−油相５ｂの多相液となるように試料導入口６から油相とともに連続して導入される。ノズル１８は試料を反応流路４中で移動させるための試料搬送機構を構成しており、ノズル１８によるエアーの吐出と吸引によって試料３の位置を調整することができる。図示は省略されているが、光測定部１４は光を発する光源部と光を検出する光検出器とを備えており、光源部から窓１７を介して反応流路４の所定の位置に光照射し、そのときの反射光、透過光又は散乱光を光検出器で測定してその変化を検出するものである。
【００１８】
ところで、温度調節部１２として用いられるペルチェ素子の伝熱面においてその温度に面内ばらつきがあるため、試料が正確に所定の位置に位置決めされていないと試料を所望温度にすることができない。そこで、光測定部１４で検出される光学的変化を利用して試料を所定の位置に位置決めする。油相と試料からなる多相液が光測定部１４の光源部からの光照射位置を通過するように移動させると、油相と試料で光学的な特性（屈折率、反射率、透過率）が異なるために油相と試料の界面でその光学的特性に変化を生じる。したがって、その光学的変化を検出することにより、油相と試料との界面の位置を検知することができ、試料３の位置が検出できる。光測定部１４による光学的変化の測定位置を試料を位置決めしたい所定位置に設定しておくことで、試料を所定位置に正確に位置決めすることができる。また、試料中に気泡が発生した場合にも反射率や透過率が変化するため、反応処理中に光測定部１４でその光学的変化を測定しておくことによって気泡の発生もモニタすることができる。
【００１９】
上記の位置決め動作は、分析者が光測定部１４による測定データを観察しながらノズル１８からのエアーの吐出量又は吸引量を調節することで実行することもできるが、図３に示されているように、反応処理装置に設けられた制御部２０が光測定部１４からの信号に基づいて試料３を所定の位置に位置決めするようにノズル１８を制御するように構成してもよい。このような制御部２０を装置が備えていることにより、分析者による手作業での試料の位置決め工程を省略することができるので、反応処理にかかる時間の短縮が図れる。
【００２０】
試料としては、複数種類の核酸（例えばＤＮＡ）を含む混合物にポリメラーゼ連鎖反応試薬として２種類以上のプライマー、熱安定性酵素及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を添加したものが挙げられる。この試料を反応流路４の所定の位置に位置決めして温度調節部１２でポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる複数の温度に調節することで、試料中に含まれる特定の核酸を増幅させることができる。
【００２１】
ポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる複数の温度とは具体的には、例えば、（１）鋳型ＤＮＡに熱変形を起こさせる温度（９２〜９７℃）、（２）プライマーのアニーリングを行なうための温度（５０〜７２℃）、（３）ＤＮＡの合成（伸長）を行なうための温度（７２℃）である。（１）〜（３）の順の温度変化を１つのサイクルとし、試料をこのサイクルで複数回温度変化させることで、ＤＮＡを増幅させることができる。
【００２２】
次に、反応処理方法及び反応処理装置の他の例を図４を参照しながら説明する。
この例では、反応流路４に導入した試料を２箇所で位置決めできるように、２箇所に光測定部１４ａ，１４ｂが配置され、それに対応した２箇所に窓１７ａ，１７ｂをもつ遮光部材１６’が透明基板２ａ上に配置されている。透明基板２ｂの裏面側には反応流路４上の光測定部１４ａ，１４ｂで位置決めされる位置とその間の位置をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせる互いに異なる温度に調節することができる温度調節部１２’が配置されている。
【００２３】
光測定部１４ａ，１４ｂそれぞれで反応流路４内の光学的変化を検出することにより、試料（試料）３と油相５ａ又は５ｂとの界面を検知して、それぞれの位置に試料３を正確に位置決めすることができる。この位置決め動作も、分析者が光測定部１４ａ及び１４ｂによる測定データを観察しながらノズル１８からのエアーの吐出量又は吸引量を調節することで実行することができるが、図５に示されているように、反応処理装置に設けられた制御部２０’が光測定部１４ａ及び１４ｂからの信号に基づいて試料３を所定の位置に位置決めするようにノズル１８を制御するように構成してもよい。このような制御部２０’を装置が備えていることにより、分析者による手作業での試料の位置決め工程を省略することができる。
【００２４】
この反応処理装置でポリメラーゼ連鎖反応処理を行なうには、試料３として核酸（ＤＮＡ）にポリメラーゼ連鎖反応試薬を添加したものを用い、例えば、光測定部１４ａで位置決めされる位置を（１）鋳型ＤＮＡに熱変形を起こさせる温度（９２〜９７℃）にし、光測定部１４ｂで位置決めされる位置を（２）プライマーのアニーリングを行なうための温度（５０〜７２℃）にし、その間の位置を（３）ＤＮＡの合成を行なうための温度（７２℃）にする。試料３を光測定部１４ａ，１４ｂのそれぞれで位置決めされる位置の間で交互に移動させる。これにより、試料３が各位置へ移動にするに伴なってその温度が（１）鋳型ＤＮＡに熱変形を起こさせる温度（９２〜９７℃）、（２）プライマーのアニーリングを行なうための温度（５０〜７２℃）、（３）ＤＮＡの合成を行なうための温度（７２℃）のサイクルで順に変化するため、試料３に含まれるＤＮＡを増幅させることができる。このポリメラーゼ連鎖反応処理は、図５に示したように制御部２０’による自動的な試料の位置決めを利用することで自動化することができる。
【００２５】
なお、この実施例のように、反応流路４上の複数の位置の温度をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための互いに異なる温度に調節する温度調節部１２’としては、上記（１）〜（３）の温度にする各位置にそれぞれ別個のペルチェ素子等の温度調節素子が設けられたものであってもよいし、光測定部１４ａによって位置決めされる位置の温度を上記（１）の温度にし、光測定部１４ｂによって位置決めされる位置の温度を上記（２）の温度にして、それらの位置の間の位置が上記（３）の温度となるように温度勾配を形成するものであってもよい。温度勾配を形成する温度調節部１２’の例として、それぞれ異なる温度に設定された複数の温度調節素子からなるものや、伝熱面と反応流路４との間に反応流路４に沿って熱伝導率勾配を形成するように熱伝導率を調整する層が介在した１つの温度調節素子からなるものを挙げることができる。
【００２６】
図４及び図５に示した実施例では、反応流路４内の光学的変化を測定する位置が２箇所設定されているが、３箇所以上の位置で光学的変化を測定するようになっていてもよい。上述のようにポリメラーゼ連鎖反応では試料の温度を３段階で変化させることが一般的であるため、反応流路４上の３つの位置をポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるための互いに異なる温度にして、光学的変化の検出によってそれぞれの位置に試料を正確に位置決めできるようにしてもよい。
【００２７】
以上の実施例では、透明基板２ａ，２ｂからなる反応処理チップ２を用いているが、３層以上の構造体からなるものであってもよい。また、反応処理チップとしては全体的に透明である必要はなく、少なくとも光測定部１４，１４ａ，１４ｂで光学的変化を測定する位置が透明であればよい。
また、図１（Ａ）では、反応処理チップ２に反応流路４、試料導入口６及び試料排出口８のみが示されているが、同一チップ２内に反応処理終了後の試料を用いて分析を行なうための反応容器等が形成されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】反応処理チップの一例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ−Ｘ位置における断面図である。
【図２】図１の反応処理チップを用いた反応処理方法及び反応処理装置の一例を説明するための断面図である。
【図３】図１の反応処理チップを用いた反応処理方法及び反応処理装置の他の例を説明するための断面図である。
【図４】図１の反応処理チップを用いた反応処理方法及び反応処理装置のさらに他の例を説明するための断面図である。
【図５】図１の反応処理チップを用いた反応処理方法及び反応処理装置のさらに他の例を説明するための断面図である。
【符号の説明】
【００２９】
２  反応処理チップ
３  試料（試料）
４  反応流路
５ａ，５ｂ  オイル（油相）
６  試料導入口
８  試料排出口
１０  凹部
１２  温度調節部
１４，１４ａ，１４ｂ  光測定部
１６，１６’  遮光部材
１７，１７ａ，１７ｂ  窓
１８  ノズル
２０，２０’  制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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