(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖を阻害する医薬の製造のための、ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターの使用であって；
該ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、以下：
配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むフラグメントであって、該配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸は、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡおよびＥＡＡＳからなる群より選択され、該フラグメントは、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によって特異的に結合される、フラグメント、あるいは、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号１のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
配列番号４または配列番号５のポリペプチド、あるいは、配列番号４または配列番号５に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号４または配列番号５のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；ならびに
配列番号１のペプチドの配列内のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであって、ここで、該抗体は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体ではない、抗体またはそのフラグメント；
からなる群より選択される、使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むフラグメントであって、該配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸は、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡおよびＥＡＡＳからなる群より選択され、該フラグメントは、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によって特異的に結合される、フラグメント、あるいは、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号１のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号４もしくは配列番号５のポリペプチド、あるいは、配列番号４もしくは配列番号５に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号４または配列番号５のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号１の配列内のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであり、ここで、該抗体は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体ではない、使用。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化されている、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、ヒトの抗体である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体が、二重特異的抗体である、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
請求項４に記載の使用であって、前記抗体またはそのフラグメントが、化学療法剤、放射性同位体、毒素、あるいは細胞溶解性免疫応答または細胞障害性免疫応答を誘導するエフェクターに結合体化される、使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記抗体またはそのフラグメントが、サイトカイン、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗生物質、アルキル化剤、天然由来の毒素、またはＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化される、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載の使用であって、有効量の前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、該ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物として投与される、使用。
【請求項１２】
化学療法剤または放射物の投与をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
癌の処置のために化学療法剤または放射物と組み合わせて使用する医薬の製造のための、ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターの使用であって；
該ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、以下：
配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むフラグメントであって、該配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸は、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡおよびＥＡＡＳからなる群より選択され、該フラグメントは、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によって特異的に結合される、フラグメント、あるいは、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号１のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
配列番号４または配列番号５のポリペプチド、あるいは、配列番号４または配列番号５に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号４または配列番号５のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；ならびに
配列番号１のペプチドの配列内のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであって、ここで、該抗体は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体ではない、抗体またはそのフラグメント；
からなる群より選択される、使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むフラグメントであって、該配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸は、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡおよびＥＡＡＳからなる群より選択され、該フラグメントは、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によって特異的に結合される、フラグメント、あるいは、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号１のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである、使用。
【請求項１５】
請求項１３に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号４もしくは配列番号５のポリペプチド、あるいは、配列番号４もしくは配列番号５に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号４または配列番号５のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである、使用。
【請求項１６】
請求項１３に記載の使用であって、前記ＭＵＣ１細胞外ドメイン結合インヒビターが、配列番号１の配列内のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであり、ここで、該抗体は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体ではない、使用。
【請求項１７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化されている、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、ヒトの抗体である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記抗体が、二重特異的抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１６に記載の使用であって、前記抗体またはそのフラグメントが、化学療法剤、放射性同位体、毒素、あるいは細胞溶解性免疫応答または細胞障害性免疫応答を誘導するエフェクターに結合体化される、使用。
【請求項２２】
請求項２１に記載の使用であって、前記抗体またはそのフラグメントが、サイトカイン、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗生物質、アルキル化剤、天然由来の毒素、またはＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化される、使用。
【請求項２３】
請求項１３に記載の使用であって、前記化学療法剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、抗ホルモン剤、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターおよびチロシンキナーゼインヒビターからなる群から選択される、使用。
【請求項２４】
ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖を阻害するため、または、癌の処置のために化学療法剤もしくは放射物と組み合わせて使用するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むフラグメントであって、該配列番号１の少なくとも４個の連続するアミノ酸は、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡおよびＥＡＡＳからなる群より選択され、該フラグメントは、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によって特異的に結合される、フラグメント、あるいは、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号１のポリペプチドから誘導されるポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチド、あるいは、配列番号５に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号５のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
配列番号４のポリペプチド、あるいは、配列番号４に対して９０％以上の配列同一性を有する、配列番号４のポリペプチドから誘導されるポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖を阻害するため、または、癌の処置のために化学療法剤もしくは放射物と組み合わせて使用するための薬学的組成物。
【請求項２７】
配列番号１のペプチドの配列内のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメント、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、該抗体は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体ではない、ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体が、二重特異的抗体である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項２７に記載の組成物であって、前記抗体またはそのフラグメントが、化学療法剤、放射性同位体、毒素、あるいは細胞溶解性免疫応答または細胞障害性免疫応答を誘導するエフェクターに結合体化される、組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物であって、前記抗体またはそのフラグメントが、サイトカイン、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗生物質、アルキル化剤、天然由来の毒素、またはＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月１１日に提出された、仮申請連続番号第６０／２３１，８４１号に対して優先権を主張する。合衆国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅからの助成金番号Ｒ２１−ＣＡ８７４２１によって、本発明に権利を有し得る。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、一般的には癌治療、そしてより具体的には癌治療における介入点としてＭＵＣ１と相互作用する調節剤または薬剤の使用に関連する。
【０００３】
（本発明の背景）
ヒトＭＵＣ１ムチン糖タンパク質は、ほとんどの腺上皮の管腔表面において、分泌上皮細胞の先端境界で発現される（Ｋｕｆｅら、１９８４）。癌において、ＭＵＣ１は細胞膜および細胞質全体で高度に過剰発現される（Ｋｕｆｅら、１９８４；Ｐｅｒｅｙら、１９９２）。そうであるので、癌細胞におけるＭＵＣ１発現の異常パターンは、通常先端膜に見出されるＭＵＣ１に、細胞膜全体の機能を与え得る。ＭＵＣ１ムチンの顕著な特徴は、各分子において２５−１００回タンデムに反復する、糖鎖付加２０アミノ酸細胞外配列を含む外部ドメインである（ＳｔｒｏｕｓｓおよびＤｅｃｋｅｒ、１９９２）。ムチン糖鎖付加レベルは、管上皮組織の正常細胞より、癌細胞においてより低いようである（Ｋｕｆｅ、米国特許第５，５０６，３４３号）。この低糖鎖付加が、完全に糖鎖付加したムチンでは隠された腫瘍特異的エピトープの曝露を引き起こす。
【０００４】
乳癌の９０％以上が、ＭＵＣ１（ムチン、上皮膜抗原、多型上皮ムチン、ヒト乳脂肪球膜抗原、Ｅｐｉｓｉａｌｉｎ、ＤＦ−３等としても知られる、ＢａｒｒｙおよびＳｈａｒｋｅｙ、１９８５を参照のこと）の増加した発現を示す。いくつかの臨床試験が、腫瘍細胞の細胞表面で発現したムチン腫瘍抗原は、様々な型の癌で予後の悪いことと関連していることを示唆した（Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚら、１９９０）。
【０００５】
ＭＵＣ１は膜貫通型および分泌型の療法としても発現される（Ｆｉｎｎら、１９９５）。ＭＵＣ１の反復するシアル化エピトープ（「外部ドメイン」）は、血清中に流れる（Ｒｅｄｄｉｓｈら、１９９６）。ＭＵＣ１のＮ末端外部ドメイン（切断される細胞外ドメイン）は、Ｏ型糖鎖付加に供される様々な数の２０アミノ酸タンデムリピートからなる。このムチンは、細胞表面のはるか上、そしてグリコカリックスを越えて伸び、他の細胞との相互作用に容易に利用可能である。ＭＵＣ１のＣ末端領域は、３７アミノ酸の膜貫通ドメインおよびチロシンリン酸化部位を含む７２アミノ酸の細胞質テールを含む。約４５アミノ酸の細胞外ドメインが、外部ドメインの切断後に残る。現在外部ドメインの切断を担う酵素は知られていない。外部ドメインの切断後に残る細胞外ドメイン、または「ＭＵＣ１／ＥＣＤ」は、典型的には以下のアミノ酸配列を含む：
ＴＩＮＶＨＤＶＥＴＱＦＮＱＹＫＴＥＡＡＳＲＹＮＬＴＩＳＤＶＳＶＳＤＶＰＦＰＦＳＡＱＳＧＡＧ。
【０００６】
ＭＵＣ１の細胞質ドメイン（「ＭＵＣ１／ＣＤ」）は、癌細胞における細胞内シグナル伝達に重要な、複数のサブドメインを含む。β−カテニンは、ＳＡＧＮＧＧＳＳＬモチーフでＭＵＣ１／ＣＤに直接結合する（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７）。哺乳類上皮の接着連結部の構成成分であるβ−カテニンは、形質膜の細胞内表面でカドヘリンと結合し、そしてｗｎｔシグナル伝達経路の終わりから２番目の下流メディエーターとして細胞質内でシグナル伝達の役割を果たす（Ｔａｋｅｉｃｈｉ、１９９０；ＮｏｖａｋおよびＤｅｄｈａｒ、１９９９）。ｗｎｔ経路の最終的なメディエーターは、β−カテニンおよびリンパ球エンハンサー因子／Ｔ細胞因子（Ｌｅｆ／Ｔｃｆ）の核複合体であり、それは様々な標的遺伝子の転写を刺激する（例えばＭｏｌｅｎａａｒら、１９９６；Ｂｒｕｎｎｅｒら、１９９７を参照のこと）。β−カテニン−Ｌｅｆ／Ｔｃｆ経路の欠失は、いくつかの型の癌の発達に関与している（ＮｏｖａｋおよびＤｅｄｈａｒ、１９９９）。
【０００７】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）はまたＭＵＣ１／ＣＤに直接結合し、そしてβ−カテニン結合モチーフに隣接するＤＲＳＰＹ部位のセリンをリン酸化し、それによってＭＵＣ１およびβ−カテニン間の結合を減少させる（Ｌｉら、１９９８）。それに加えて、ｃ−ＳｒｃチロシンキナーゼもＭＵＣ１／ＣＤのＳＰＹＥＫＶモチーフに結合およびリン酸化し、ＭＵＣ１／ＣＤとβ−カテニンとの間の相互作用の増加、およびＭＵＣ１／ＣＤとＧＳＫ３βとの間の相互作用の減少を引き起こす（Ｌｉら、２００１）。
【０００８】
ＭＵＣ１はまた、細胞表面において上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ１）と構成的に結合し、そして活性化ＥＧＦ−ＲはＭＵＣ１／ＣＤのＳＰＹＫＥＶモチーフのリン酸化を誘導する（Ｌｉら、２００１（ａ））。ＭＵＣ１／ＣＤのＥＧＦ−Ｒによるリン酸化は、ＭＵＣ１とｃ−Ｓｒｃおよびβ−カテニンとの相互作用を増加させ、そしてＭＵＣ１とＧＳＫ３βとの間の相互作用を下方制御するようである。これらの結果は、ＭＵＣ１がｃ−Ｓｒｃ、β−カテニン、およびＧＳＫ３β経路のシグナル伝達を統合し、そして癌細胞におけるＭＵＣ１の異常な過剰発現によるこの統合されたシグナル伝達の異常調節（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、形質転換した表現型を促進し得るというモデルを支持する（Ｌｉら、２００１（ａ））。
【０００９】
アルマジロタンパク質ｐ１２０ｃｔｎはまたＭＵＣ１／ＣＤに直接結合し、ｐ１２０の核局在化を引き起こす（ＬｉおよびＫｕｆｅ、２００１）。Ｐ１２０は、細胞の形質転換に関係し、そしてｐ１２０発現の変化したパターンが、癌において観察された（例えばＪａｗｈａｒｉら、１９９９；Ｓｈｉｍａｚｕｉら、１９９６を参照のこと）。ｐ１２０はｖ−Ｓｒｃチロシンキナーゼ基質であり、Ｅ−カドヘリンに結合し、そして転写活性化補助因子として関係する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９８９；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９４；ＤａｎｉｅｌｓおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、１９９９）。ｐ１２０が細胞連結部および核の両方に局在化するという観察は、β−カテニンのような、細胞接着および遺伝子転写両方の調節におけるｐ１２０の役割を支持した。ＭＵＣ１およびｐ１２０の結合による細胞接着の減少は、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞の転移可能性の増加に関与し得る。
【００１０】
従って、入手可能な証拠は、ＭＵＣ１／ＣＤが細胞外ドメインから核へシグナルを伝達するために機能し、そして接着レセプターおよび成長因子シグナル伝達および細胞の形質転換に関係するシグナル伝達メカニズムを利用することを示す。ＭＵＣ１によるシグナル伝達およびその細胞形質転換における推定される役割の調節に関連する組成物および方法を同定することが望ましい。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ＭＵＣ１の細胞外ドメインが内因性リガンドの結合ドメインを提供し、そしてそのような結合がＭＵＣ１の発癌性機能および癌細胞の増殖に関連するという発見に関連する、使用方法および薬学的組成物を包含する。
【００１２】
広範には、本発明は、癌を処置する組成物および方法に関し、これらは、ＭＵＣ１／ＥＣＤ調節性の細胞増殖のアンタゴニストからなるかまたはこのアンタゴニストを含む、薬剤または治療方法を使用する。好ましくは、この方法および組成物は、ＭＵＣ１／ＥＣＤに結合する薬剤、またはＭＵＣ１の発癌性機能を活性化するＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドに結合する薬剤を含む。
【００１３】
従って、本発明の１つの局面は、有効な量のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを投与する工程を包含する、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストは、細胞表面に提示されるＭＵＣ１／ＥＣＤの量をダウンレギュレートもしくは抑制するか、またはＭＵＣ１／ＥＣＤへの結合に利用可能な野生型ＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドのレベルをダウンレギュレートする薬剤であるか、および／あるいは、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターである。「ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビター」とは、ＭＵＣ１／ＥＣＤへのＭＵＣ１野生型リガンド（適切には、これらには、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）２アイソフォーム５（配列番号２）、ニューレグリン２アイソフォーム６（配列番号３）、およびその適切なフラグメントが含まれ得る）の結合を阻害する化合物、またはＭＵＣ１／ＥＣＤへの配列番号４内のエピトープに結合する抗体の結合を阻害する化合物を意味する。ニューレグリン２アイソフォーム５（配列番号２）およびニューレグリン２アイソフォーム６（配列番号３）の適切なフラグメントは、ＭＵＣ１／ＥＣＤに結合するフラグメントである。ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターは、そのような結合を阻害する抗体、ポリペプチド、および小分子を含む。「ＭＵＣ１／ＥＣＤ−Ｐ１結合インヒビター」とは、ＭＵＣ１／ＥＣＤへの配列番号４内のエピトープに結合する抗体の結合の阻害によって同定される、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターを意味する。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤインヒビターは、配列番号１のポリペプチド、または以下のような配列番号１の少なくとも４個連続するアミノ酸を含むフラグメントである：ＴＩＮＶ、ＮＶＨＤ、ＶＨＤＶ、ＤＶＥＴ、ＶＥＴＱ、ＥＴＱＦ、ＴＱＦＮ、ＱＦＮＱ、ＦＮＱＹ、ＮＱＹＫ、ＱＹＫＴ、ＹＫＴＥ、ＫＴＥＡ、ＴＥＡＡ、ＥＡＡＳ、ＡＡＳＲ、ＡＳＲＹ、ＳＲＹＮ、ＲＹＮＬ、ＹＮＬＴ、ＮＬＴＩ、ＬＴＩＳ、ＴＩＳＤ、ＩＳＤＶ、ＳＤＶＳ、ＤＶＳＶ、ＶＳＶＳ、ＳＶＳＤ、ＶＳＤＶ、ＳＤＶＰ、ＤＶＰＦ、ＶＰＦＰ、ＰＦＰＦ、ＦＰＦＳ、ＰＦＳＡ、ＦＳＡＱ、ＳＡＱＳ、ＡＱＳＧ、ＱＳＧＡ、およびＳＧＡＧ。他の実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤインヒビターは、前述のペプチドの保存的改変体である。別の実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターは、配列番号４、配列番号５、またはその保存的改変体のポリペプチドである。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤインヒビターは、ＭＵＣ１／ＥＣＤ配列（配列番号１）の１以上のエピトープに結合する抗体である。本発明の他の実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤインヒビターは、配列番号２または配列番号３内のエピトープに結合する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ヒト化され得るか、またはヒトモノクローナル抗体であり得る。これはまた、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体であり得るか、または抗原結合領域を含むフラグメントであり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、化学療法剤、放射性同位元素、毒素、あるいは細胞溶解または細胞傷害性免疫反応を誘導するエフェクターに結合体化される。そのような結合体は、サイトカイン、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗生物質、アルキル化剤、天然由来の毒素、またはＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を含み得る。
【００１６】
別の実施形態において、この方法はさらに、ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストと組み合わせた、化学療法剤または放射線の投与を包含する。化学療法剤としては、代表的には、アルキル化剤、トポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗物質、チューブリン相互作用因子、抗ホルモン剤、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、およびチロシンキナーゼインヒビターが挙げられる。
【００１７】
種々の実施形態において、癌細胞は、皮膚癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、脳癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、および白血病細胞からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の別の局面は、哺乳動物において腫瘍の増殖を抑制する方法であって、この方法は、治療的な量の化学療法剤または放射線および有効量のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを投与することを包含する。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。１つの実施形態において、その方法は、難治性の腫瘍を治療するための方法であって、この方法は、１以上の化学療法剤での処置の後に、治療的な量の化学療法剤または放射線および有効な量のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを投与することを包含する。種々の実施形態において、腫瘍は、皮膚、前立腺、肺、脳、乳房、卵巣、子宮頸、肝臓、膵臓、結腸、胃、または造血系の腫瘍である。
【００１９】
本発明の他の局面は、ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物に関する。アンタゴニストが、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターである場合、薬学的組成物は、配列番号１のポリペプチド、またはその少なくとも４個連続するアミノ酸を含むフラグメント、あるいはそれらの保存的改変体であり得る、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。いくつかの実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤインヒビターは、配列番号４、配列番号５、またはその保存的改変体のポリペプチドであり得る。他の実施形態において、薬学的組成物は、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビターであって、かつ配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるペプチドの配列内のエピトープに結合する抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００２０】
本発明はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合インヒビター活性をスクリーニングする方法を包含する。１つの実施形態は、ＭＵＣ１／ＥＣＤへのリガンドの結合を阻害する化合物を同定する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号１または配列番号５を含むポリペプチドを提供する工程；（ｂ）このポリペプチドを、試験化合物およびＭＵＣ１の細胞外ドメインに対するリガンドと接触させる工程であって、このリガンドは、ＭＵＣ１媒介性癌細胞増殖を刺激するＭＵＣ１／ＥＣＤに対する抗体、およびＭＵＣ１／ＥＣＤに結合しそして癌細胞増殖を刺激する野生型リガンドからなる群から選択される、工程；および（ｃ）ＭＵＣ１／ＥＣＤの抗体または野生型リガンドの結合が、適切なコントロールと比較して減少されるか否かを決定する工程。適切なコントロールとしては、試験化合物が除外されたアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ＭＵＣ１媒介性癌細胞増殖を刺激するＭＵＣ１／ＥＣＤ抗体は、配列番号４内のエピトープに結合する抗体である。他の実施形態において、野生型リガンドとしては、適切には、ニューレグリン２アイソフォーム５（配列番号２）およびその適切なフラグメント、およびニューレグリン２アイソフォーム６（配列番号３）およびその適切なフラグメントが挙げられ得、ここで、適切なフラグメントは、配列番号１に結合しかつ適切な増殖刺激活性を有するフラグメントである。
【００２１】
別の実施形態は、ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖を阻害する化合物を同定する方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＭＵＣ１発現癌細胞の集団を提供する工程；（ｂ）このＭＵＣ１発現癌細胞の集団を、試験化合物およびＭＵＣ１の細胞外ドメインに対するリガンドと接触させる工程であって、このリガンドは、ＭＵＣ１媒介性癌細胞増殖を刺激するＭＵＣ１／ＥＣＤに対する抗体、およびＭＵＣ１／ＥＣＤに結合しそして癌細胞増殖を刺激する野生型リガンドからなる群から選択される、工程；および（ｃ）ＭＵＣ１発現癌細胞の集団の増殖が、適切なコントロールと比較して減少されるか否かを決定する工程。適切なコントロールとしては、試験化合物が除外されたアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ＭＵＣ１媒介性癌細胞増殖を刺激するＭＵＣ１／ＥＣＤ抗体は、配列番号４内のエピトープに結合する抗体である。他の実施形態において、野生型リガンドとしては、適切には、ニューレグリン２アイソフォーム５（配列番号２）およびその適切なフラグメント、およびニューレグリン２アイソフォーム６（配列番号３）およびその適切なフラグメントが挙げられ得、ここで、適切なフラグメントは、配列番号１に結合しかつ適切な増殖刺激活性を有するフラグメントである。
【００２２】
本発明はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤの発現をダウンレギュレートする化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＭＵＣ１発現癌細胞の集団を提供する工程；（ｂ）このＭＵＣ１発現癌細胞の集団を試験化合物と接触させる工程；（ｃ）抗ＭＵＣ１／ＥＣＤ抗体を使用して、このＭＵＣ１発現癌細胞においてＭＵＣ１／ＥＣＤを含むポリペプチドを同定する工程；および（ｄ）ＭＵＣ１／ＥＣＤを含むポリペプチドの発現が、試験化合物が排除されたコントロールと比較して減少されるか否かを決定する工程。
【００２３】
本発明はまた、前述の方法によって同定された化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．ポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、合成技術、あるいはゲノムクローニング法またはｃＤＮＡクローニング方法を使用する組換え技術によって作製され得る。ポリペプチドは、固相ペプチド合成または溶液相ペプチド合成を使用して、慣用的に合成され得る。化学的合成によって比較的短いポリペプチド（例えば、Ｐ０（配列番号９）、Ｐ１（配列番号４）、Ｐ２（配列番号６）、およびＰ３（配列番号７））を調製する方法は、当該分野で周知である。このようなポリペプチドは、例えば、市販の装置および試薬（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能な装置および試薬）を使用する、固相ペプチド合成技術によって産生され得る。あるいは、このようなポリペプチドのセグメントを、固相合成によって調製し、そしてＤａｗｓｏｎら（１９９４）によって記載されるようなセグメント縮合方法を使用して共に連結させ得る。このようなポリペプチドの化学的合成中に、置換されるべき残基を異なるアミノ酸モノマーで置き換えることによって、任意のアミノ酸置換が、簡単に達成され得る。
【００２５】
野生型ＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドポリペプチドは、本明細書中実施例３で例示されるように同定され得る。次いで、組換えＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドを、当該分野で公知の方法によって調製し得る。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、改変体ポリペプチドを含む。「改変体」ポリペプチドによって、その配列中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいはその配列中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の置換によって改変されたポリペプチド配列が意図される。本発明によって包含される改変体ポリペプチドは、それらが由来するポリペプチドの所望の生物学的活性を保持する。このような改変体は、それらが由来するポリペプチドのアミノ酸配列に対する、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、好ましくは、約９０％〜９５％またはそれ以上、そしてより好ましくは、約９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。天然ポリペプチド配列と改変体配列と間の配列同一性パーセント（相同性とも呼ばれる）は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）のアルゴリズムを用いる、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて、２つの配列を比較することによって決定され得る。
【００２７】
本発明のポリペプチドにはまた、１以上の保存的置換を有する改変体ポリペプチドが包含される。アミノ酸置換を保存的であると分類するために、アミノ酸を以下のようにグループ化する：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を含む。
【００２８】
ポリペプチドの化学的誘導体も本発明に含まれる。「化学的誘導体」とは、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１以上の残基を有する、対象ポリペプチドをいう。このような誘導体化された残基としては、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導体化された分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他の型のエステル、あるいはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離の水酸基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール基は、Ｎ−インベンジルヒスチジン（Ｎ−ｉｍｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を形成するように誘導体化され得る。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を示し、そして特定の長さの生成物について言及しない。
【００３０】
（ＩＩ．抗体）
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして特に、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体）および抗体フラグメントが含まれる。
【００３１】
ポリクローナル抗体を生成する方法は、当該分野において周知である。簡単には、抗原性組成物で動物を免疫し、そしてその免疫された動物から血清を回収することによって、ポリクローナル抗体が調製される。広範囲の動物種（ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットおよびヤギを含む）が、抗血清の産生のために使用され得る。
【００３２】
当該分野において周知であるように、所定の組成物は、その免疫原性において異なり得る。従って、しばしば、ポリペプチド免疫原をキャリアに結合させることによって達成され得るように、宿主免疫系をブーストする必要がある。例示的かつ好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンも、キャリアとして使用され得る。ポリペプチドをキャリアタンパク質へ結合体化させる手段は、当該分野で周知であり、そしてこれらには、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボジイミド、およびビスジアゾ化ベンジジンが挙げられる。また当該分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知である、免疫反応の非特異的刺激因子の使用によって増強され得る。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（殺菌したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む、免疫反応の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００３３】
免疫された動物の血清は、種々の適用に使用され得るか、または所望の抗体画分を、周知の方法（例えば、固体マトリクスに結合された別の抗体またはペプチドを使用する、アフィニティークロマトグラフィー）によって精製され得る。
【００３４】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、周知の技術（例えば、本明細書中において参考として援用される、米国特許第４，１９６，２６５号において例示される技術）を用いて容易に調製され得る。代表的には、この技術は、選択された免疫原組成物（例えば、精製または部分的に精製された発現ポリペプチド）で適切な動物を免疫する工程を包含する。免疫組成物は、抗体産生細胞を効果的に刺激する様式で投与される。
【００３５】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成する方法は、一般的には、ポリクローナル抗体を調製する手順と同じ手順で開始する。ラットの使用は、特定の利点を提供し得るが（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）、マウスが、好ましい。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般的に、より高いパーセントの安定な融合物を生成する。
【００３６】
免疫後、抗体を産生する能力を有する体細胞（詳細には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））を、ＭＡｂ生成プロトコールにおける使用のために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃またはリンパ節から得られ得るか、または末梢血サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞が、好ましい。しばしば、動物のパネルを免疫して、そして最も高い抗体力価を有する動物の脾臓を取り出し、そしてその脾臓からリンパ球を得る。
【００３７】
次いで、免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球を、不死骨髄腫細胞（一般的には、免疫された動物と同じ種の骨髄腫細胞）の細胞と融合する。ハイブリドーマ産生融合手順で使用するために適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合された細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地において増殖不可能にする、酵素欠損を有する。選択されたハイブリドーマを連続的に希釈し、そして個々の抗体産生細胞株にクローニングし、次いで、これらを無制限に増殖させてＭＡｂを提供する。
【００３８】
本発明に従って、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントを、ペプシンまたはパパインのような酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって、上記で記載したように産生されたモノクローナル抗体から得られ得る。あるいは、本発明によって包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動化合成機を用いて合成され得るか、またはＥ．ｃｏｌｉまたは他の組換え微生物および細胞系における、全長遺伝子または遺伝子フラグメントの発現によって合成され得る。
【００３９】
本発明はまた、種々の抗体結合体を包含する。フルオレセインマーカーとの結合体は、当該分野で公知の方法（例えば、結合試薬の存在下での結合体化、またはイソチオシアネートと反応させることによって）によって調製される。金属キレートとの結合体は、同様に産生される。抗体が結合体化され得る他の部分としては、本明細書中で参考として援用される、Ｇａｎｓｏｗ、１９９１において記載されるような、１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、１８８Ｒｅ、１０９Ｐｄ、４７Ｓｃ、２１２Ｐｂおよび１５３Ｓｍなどのような放射性核種が挙げられる。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体はまた、従来の化学療法剤（例えば、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗生物質またはアルキル化剤）に結合され得る。標的化するために抗体に結合され得る薬物としては、ドキソルビシン、シクロホスファミド、シスプラチン、アドリアマイシン、エストラムスチン、フルオロウラシル、エチニルエストラジオール、ミトキサントロン、メトトレキサート、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）、タキソールおよびメゲストロールのような化合物が挙げられる。結合の方法は、共有結合によって直接的であり得るか、または連結分子を介して間接的であり得、そして一般的には、選択された特定の薬物について当該分野で公知であり、そして種々の二官能性タンパク質結合剤を用いて作製される。このような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシニミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド（ｂｉｓａｚｉｄｏ）化合物（例えば、ビス（Ｒ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（Ｒ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート）、ビス活性化（ｂｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）である（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２を参照のこと）。
【００４１】
本発明の抗体はまた、細胞溶解または細胞傷害性免疫反応を誘導する、種々の毒素分子またはエフェクター（例えば、ＩｇＧ１免疫グロブリン）と結合体化され得る。従って、２つの成分は、種々の周知の化学手順のいずれかによって化学的に結合させ得る。例えば、その連結は、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなど）によるものであり得る。毒素分子もまた、組換え手段（単鎖抗体の産生を介する）によって、抗体またはその結合領域に融合され得る。タンパク質鎖をコードする遺伝子は、当業者に公知の任意のクローニング手順によって、ｃＤＮＡ形態またはゲノム形態でクローニングされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。種々の免疫毒素の組換え産生は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２（ａ）、Ｗａｌｄｍａｍ、１９９１、およびＰａｓｔａｎら、１９９２（これら全ては、本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。種々の毒素分子が、本明細書中に記載の抗体結合体または融合タンパク質における、細胞傷害性ドメインとしての使用に適切である。免疫毒素の毒性成分として有用であることが公知の任意の毒素（好ましくは、組換え発現され得るタンパク質毒素）が、使用され得る。細胞傷害性ドメインとして特に有用なのは、細菌毒素（例えば、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、ジフテリア毒素、志賀毒素および志賀様毒素）、ならびに植物および真菌由来のリボソーム不活性化毒素（リシン、α−サルシン、レストリクトトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｔｏｃｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、トリカンソシン（ｔｒｉｃａｎｔｈｏｓｉｎ）、サポリン−Ｇ（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｇ）、サポリン−１、モモリジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、およびＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９２（本明細書中で参考として援用される）に記載される他の毒素）、およびそれらのタンパク質の任意の組換え誘導体である（本明細書中で参考として援用される、Ｏｌｓｎｅｓ、１９８１；米国特許第４，６７５，３８２号；および米国特許第４，８９４，４４３号を参照のこと）。
【００４２】
抗体はまた、二重特異性抗体であり得、これは、ＭＵＣ１／ＥＣＤおよび抗原の両方を認識し、この抗原は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ３Ｌ．Ｃ．、ＣＤ２８）の放出を促進し、次いで、これらが、それぞれ、ＩＦＮγまたはＴＮＦαの放出を活性化する。
【００４３】
本発明のＭＡｂは、非ヒト（例えばマウス）Ｍａｂの「ヒト化」形式を含むキメラＭａｂを含む。ヒト化ＭＡｂは、最低限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そこでレシピエントの超可変領域由来の残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンの枠組み残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾を、抗体の性能をさらに精密にするために行なう。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインを実質上全て含む。ここで全ての、または実質上全ての超可変領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして全ての、または実質上全ての枠組み領域はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、１９９２を参照のこと）。本発明の治療的方法において、完全ヒトＭＡｂが好ましい。
【００４４】
本発明の「一本鎖ＦＶ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。ここでこれらのドメインは１本のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９４を参照のこと）。
【００４５】
（ＩＩＩ．スクリーニングおよび診断アッセイ）
本発明は、様々なリガンドのＭＵＣ１／ＥＣＤへの結合を阻害する化合物を同定する方法を提供する。結合リガンドは、ニューレグリン２アイソフォーム５（配列番号２）、ニューレグリン２アイソフォーム６（配列番号３）およびＭＵＣ１／ＥＣＤに結合するいずれかのアイソフォームの断片、および好ましい実施形態においては、配列番号４中のエピトープに結合する抗体を含む。
【００４６】
１つの実施形態において、スクリーニング方法は、インビトロ競合的結合アッセイを利用する。ここで前述のリガンドの、配列番号１または配列番号５を含むポリペプチドへの結合を阻害する試験化合物の能力を評価する。そのようなアッセイにおいて、ＭＵＣ１／ＥＣＤ由来の配列、配列番号１または配列番号５を含むポリペプチドを、別のタンパク質と結合し得るか、または融合タンパク質、例えば本明細書中において実施例３で例示されるＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤ融合タンパク質として産生し得る。他の適当な結合物および融合タンパク質を、当該分野で公知の手順を利用して、当業者が作製し得る。ポリペプチドまたはＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドを、放射性同位元素または蛍光標識（例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニンのようなフィコビリンタンパク質、フルオレセインおよびテキサスレッド）で標識し得る。あるいは、ペルオキシダーゼのような酵素を使用して、そしてビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンの系によって直接または間接的に結合し得る。試験化合物の導入時に減少した結合が、競合的結合を示す。
【００４７】
リガンドのＭＵＣ１／ＥＣＤへの結合を阻害する化合物が、調節剤、すなわちニューレグリン２アイソフォーム５または６によるＭＵＣ１／ＥＣＤ結合によって開始される生物学的活性のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。例えば、ポリペプチドＰ１（配列番号４）に対して産生された抗体は、野生型リガンドの結合を阻害すると予測されるが、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合部位に関してはアゴニストとして作用する。すなわち、それは癌細胞の増殖を刺激する。対照的に、ＭＵＣ１／ＥＣＤポリペプチド配列番号１のような適当な化合物は、内因性野生型リガンドに結合して、それによってＭＵＣ１／ＥＣＤへの結合を阻害し、そして結果としてアンタゴニストとして作用する。すなわち、そうでなければＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドの結合時に観察される癌細胞の増殖を阻害または減少させる。
【００４８】
代替のスクリーニングアッセイは、ＭＵＣ１発現癌細胞の増殖に関してアンタゴニストおよびアゴニスト活性を示す、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合阻害剤間を区別し得る。その方法は、ＭＵＣ１陽性癌細胞、好ましくはヒト癌細胞の集団を必要とする。これは、ＭＵＣ１を構成的に発現する細胞集団であり得るが、その集団は好ましくはＭＵＣ１を発現するように遺伝子工学的に作成した細胞型である。後者は、適当なコントロール細胞、例えば空のベクターで遺伝子工学的に操作した細胞を提供することに関して、そしてまたＭＵＣ１変異体を発現する細胞の構築を可能にするために、より用途が広い。遺伝子工学的に操作したＭＵＣ１癌細胞の例は、本明細書中で実施例２および４において例示されるような、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞を含むがこれに限らない。ＭＵＣ１／ＥＣＤリガンド誘導細胞増殖の阻害は、アンタゴニスト活性を有する試験化合物を示す。コントロールは、空のベクターで遺伝子工学的に操作した癌細胞（すなわちＭＵＣ１陰性）のインキュベーション、または試験化合物もしくはＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドいずれかの非存在下におけるＭＵＣ１陽性細胞のインキュベーションを含み得る。後者のコントロールの１つは、アゴニストを同定する、すなわち試験化合物が存在し、そしてＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドが存在しないインキュベーションで癌細胞増殖の刺激が観察される。アゴニスト活性の特異性を、操作したＭＵＣ１陰性細胞の使用によって確立する。
【００４９】
さらに別のスクリーニングアッセイは、ＭＵＣ１の細胞内ドメインのＭＵＣ１／ＥＣＤリガンド誘導リン酸化をモニターする。代替のスクリーニング方法論は、ＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドが誘導する、ＭＵＣ１とＥＧＦ−Ｒ、ｓ−Ｓｒｃ、β−カテニン、ＧＳＫ３βまたはｐ１２０との結合のモニタリングを採用する。そのようなリン酸化およびタンパク質結合をモニターする方法は、Ｌｉら（１９９８）、Ｌｉら（２００１）、Ｌｉら（２００１（ａ））ならびにＬｉおよびＫｕｆｅ（２００１）で記載され、これらは全て本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００５０】
本発明はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤの発現をダウンレギュレートする化合物を同定する方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤに対する標識抗体を利用して、当該分野で公知の方法を用いて、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって適当な細胞系統におけるＭＵＣ／ＥＣＤの発現を視覚化する。あるいは、ＭＵＣ１の発現を、免疫ブロッティングによって、または全細胞ＲＮＡを標識ＤＮＡプローブで、例えば本明細書中の実施例７で記載したようにプローブすることによって推定し得る。
【００５１】
ＭＵＣ１／ＥＣＤの発現の推定を、診断方法論にも使用し得る。ここで、ＭＵＣ１／ＥＣＤに対する抗体を利用して、患者由来の細胞上のまたはその中のＭＵＣ１／ＥＣＤの発現を調査する。そのような抗体を、患者における癌細胞を画像化するためにも利用し得る。画像化を、抗ＭＵＣ１／ＥＣＤ抗体を例えば放射性標識で標識すること、およびこの抗体を患者に注入すること、および当該患者の体内でこの抗体の位置をモニターすることによって行なう。
【００５２】
（ＩＶ．化学療法剤との組み合わせ）
本発明は、化学療法剤と組み合わせたＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストの使用を含む。いかなる特定の理論にも制限されないが、ＭＵＣ１はある化学療法剤によって誘導される遺伝子毒性ストレスに対するアポトーシス反応を阻害し、そしてそれによってそのような薬剤に対する抵抗性を誘導する。ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを使用して、化学療法剤に対するＭＵＣ１により媒介されるこの反応を軽減して、それによってそのような薬剤の有効性を増強し得る。これに関して、ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストは、癌化学療法の後に残ったかまたは再発した癌を含む、化学療法剤に抵抗性の癌細胞の治療に有用である。前述の原理はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストおよび電離放射線との組み合わせにも関係する。
【００５３】
本発明の方法で有用な化学療法剤は、癌細胞を殺すおよび／または増殖を阻害するのに活性であることが知られている組成物および化合物の全範囲を含む。作用機構によってグループ分けした化学療法剤は、ＤＮＡ相互作用薬剤、代謝拮抗物質、チューブリン相互作用薬剤、抗ホルモン剤、抗ウイルス剤、ＯＤＣ阻害剤およびヒドロキシウレアのような他の細胞毒を含む。これら薬剤のいずれも本発明の方法で使用するのに適当である。
【００５４】
ＤＮＡ相互作用薬剤は、アルキル化剤、例えばシスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン；ブレオマイシンのようなＤＮＡ鎖切断薬剤；インターカレートするトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばダクチノマイシンおよびドキソルビシン；エトポシドおよびテニポシドのようなインターカレートしないトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；およびＤＮＡの浅い溝に結合するプリカマイシンを含む。
【００５５】
アルキル化剤は、細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質分子、およびより小さいアミノ酸、グルタチオンおよび同様の化学物質と共有結合的な化学的付加物を形成する。一般的に、これらのアルキル化剤は、核酸、タンパク質、アミノ酸、またはグルタチオンのアミノ基、カルボキシル基、リン酸基、メルカプト基のような、細胞構成成分の求核性原子と反応する。癌治療におけるこれらアルキル化剤の機構および役割はよく理解されていない。典型的なアルキル化剤は、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；チオテパのようなアジリジン；ブスルファンのようなメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンのようなニトロソウレア；シスプラチン、カルボプラチンのような白金複合体；マイトマイシンおよびプロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミン（ａｌｔｒｅｔｅｍｉｎｅ）のような生物還元性（ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）アルキル化剤；ブレオマイシンを含むＤＮＡ鎖切断薬剤を含む。
【００５６】
トポイソメラーゼは、複製の間に一過性のＤＮＡ鎖切断を始めて、鎖の自由な回転を可能にする、普遍的に存在する細胞酵素である。これら酵素の機能は、ＤＮＡの複製過程に決定的である。それら無しでは、ＤＮＡらせんのねじれたひずみが自由な回転を妨げ、ＤＮＡ鎖は適当に分離することができず、そして細胞は最後には分裂せずに死ぬ。ＴｏｐｏＩはＤＮＡ一本鎖切断の３’末端に結合し、一方ＴｏｐｏＩＩは二本鎖ＤＮＡ切断の５’末端に結合する。ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、以下のものを含む：アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシンおよびミトザントロンのようなインターカレーター；エトポシドおよびテニポシドのようなノンインターカレーター；イリノテカン（ＣＰＴ−ＩＩ）およびトポテカンを含むカンプトテシン（ｃａｍｔｏｔｈｅｃｉｎ）。代表的なＤＮＡの浅い溝に結合する薬剤はプリカマイシンである。
【００５７】
代謝拮抗物質は、一般的には、２つの主要な機構の１つまたは他方によって、核酸の産生を阻害することによって細胞毒性活性を発揮する。いくつかの薬剤は、ＤＮＡ合成の直接の前駆体であるデオキシリボヌクレオシド３リン酸の産生を阻害して、従ってＤＮＡ複製を阻害する。いくつかの化合物は、プリンまたはピリミジンに十分似ているので、同化ヌクレオチド経路においてそれらを置換し得る。これらのアナログを次いで、それらの正常な対応物の代わりに、ＤＮＡおよびＲＮＡへ置換し得る。本明細書中で有用な代謝拮抗物質は以下のものを含む：メトトレキサートおよびトリメトレキサートのような葉酸アンタゴニスト；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジンのようなピリミジンアンタゴニスト；メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンを含むプリンアンタゴニスト；シタラビン、フルダラビンを含む糖修飾アナログ；ヒドロキシウレアを含むリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤。
【００５８】
チューブリン相互作用薬剤は、ポリマー化して細胞微小管を形成するタンパク質であるチューブリンの特定の部位に結合することによって細胞分裂を阻害する。微小管は重要な細胞構造ユニットである。相互作用薬剤がタンパク質に結合すると、細胞は適当に微小管を形成できない。チューブリン相互作用薬剤は、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、アルカロイドおよびタキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ））の両方を含む。
【００５９】
その作用機構は異なるが、タキサンおよびビンカアルカロイドは両方とも、細胞微小管に対してその生物学的効果を発揮する。タキサンは、紡錘形微小管のタンパク質サブユニットであるチューブリンのポリマー化を促進するように作用する。その最終的な結果は、微小管の脱ポリマー化の阻害であり、それは安定な、そして非機能的な微小管の形成を引き起こす。これは、微小管システム内の動的平衡を破壊し、そして細胞周期を後期Ｇ２およびＭ期で停止させて、細胞複製を阻害する。
【００６０】
タキサンと同様に、ビンカアルカロイドも、細胞内の微小管システムに影響を与えるように作用する。タキサンと対照的に、ビンカアルカロイドはチューブリンに結合して、そしてチューブリンサブユニットが微小管へポリマー化するのを阻害または予防する。ビンカアルカロイドはまた、微小管の脱ポリマー化を誘導し、それは微小管の組み立てを阻害して、そして細胞の中期での停止を媒介する。ビンカアルカロイドはまた、核酸およびタンパク質合成；アミノ酸、環状ＡＭＰ、およびグルタチオン合成；細胞呼吸にも効果を発揮し、そしてより高い濃度で免疫抑制活性を発揮する。
【００６１】
抗ホルモン剤は、最終レセプター臓器においてホルモン作用を阻害することによって細胞毒性活性を発揮する。いくつかの異なる型の新生物が、細胞増殖のためにホルモン刺激を必要とする。抗ホルモン剤は、ホルモン作用を阻害することによって、新生物細胞から複製するために必要な刺激を奪う。細胞がそのライフサイクルの最後に達したら、それらは通常分裂およびさらなる悪性細胞を産生することなく死ぬ。抗ホルモン剤は、典型的には天然の供給源由来であり、そしてエストロゲン、結合型エストロゲンおよびエチニルエストラジオールおよびジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｅｒｏｌ）、クロロトリアニセンおよびイデネストロール（ｉｄｅｎｅｓｔｒｏｌ）；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールのようなプロゲスチン；テストステロン、プロピオン酸テストステロンのようなアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロンを含む。
【００６２】
副腎コルチコステロイドは、天然副腎コルチゾールまたはヒドロコルチゾン由来である。それらはその抗炎症性の有用性、およびいくつかの有糸分裂を阻害し、そしてＤＮＡ合成を停止させる能力のために使用される。これらの化合物は、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンを含む。Ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ放出ホルモン薬剤またはゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストは、主に前立腺癌の治療において使用される。これらは、酢酸ロイプロリドおよび酢酸ゴセレリンを含む。それらは、精巣におけるステロイドの生合成を阻害する。
【００６３】
抗ホルモン剤は、タモキシフェンのような抗エストロゲン剤、フルタミドのような抗アンドロゲン剤、およびミトーテンおよびアミノグルテチミドのような抗副腎薬剤を含む。
【００６４】
ＯＤＣ（またはオルニチンデカルボキシラーゼ）阻害剤は、新生物細胞増殖に重要なポリアミン生合成の律速酵素である、ＯＤＣの活性を減少させるまたは他の方法で阻害することによって癌細胞および前癌細胞の増殖を阻害する。特に、オルニチンがポリアミン、プトレシンに変換され、続いてプトレシンがスペルミジンおよびスペルミンに変換される、ポリアミンの生合成は、様々な癌および癌細胞系統において新生物増殖で必要不可欠な生化学的発生であるようであり、そしてそのような新生物細胞におけるＯＤＣ活性の阻害またはＯＤＣの減少は、そのような細胞におけるポリアミンレベルを抑制して細胞増殖の停止；より分化した細胞形態、および細胞老化および死さえ引き起こすことが示された。これに関して、ＯＤＣまたはポリアミン合成阻害剤は、癌の再発または前癌細胞から癌細胞への転換を防ぐように機能する、細胞毒性または細胞溶解薬剤よりも細胞毒性の高い薬剤であると考えられる。適当なＯＤＣ阻害剤は、エフロルニチンまたはα−ジフルオロメチル−オルニチン、経口で利用可能な不可逆性ＯＤＣ阻害剤、ならびに前臨床および臨床研究の様々な段階にある様々なポリアミンアナログである。
【００６５】
他の細胞毒素は、細胞機能の維持または細胞有糸分裂に必要不可欠な様々な細胞過程に干渉または阻害する薬剤、およびアポトーシスを促進する薬剤を含む。これに関して、ヒドロキシウレアは酵素リボヌクレオチドレダクターゼの阻害剤を通して作用するようであり、一方アスパラギナーゼはアスパラギンを非機能的なアスパラギン酸に酵素的に変換して、それによって腫瘍におけるタンパク質合成を阻害する。
【００６６】
本発明のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストの組成物をまた、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈ））のようなＨＥＲ−２に対する抗体と組み合わせて使用し得る。それに加えて、本発明はまた、チロシンキナーゼ阻害剤のような、表皮成長因子受容体相互作用薬剤と組み合わせて、ＭＵＣ１ドメインアンタゴニストを使用することも含む。チロシンキナーゼ阻害剤は、適当にイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ）、ＯＳＩ−７７４（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ）およびＣＰ−７０１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）を含む。
【００６７】
本発明の治療方法において使用される場合、選択された化学療法剤は、現在市販のあらゆる処方で、そして単一薬剤の使用のために認可されたラベルの用法以下または以内に含まれる投与量で、簡便に使用し得ることが企図される。
【００６８】
（Ｖ．電離放射線）
本発明において、「電離放射線」という用語は、電離（電子の獲得または損失）を産生するために、十分なエネルギーを有する、または核相互作用によって十分なエネルギーを発生させ得る粒子または光子を含む放射線を意味する。典型的なおよび好ましい電離放射線は、Ｘ線である。Ｘ線を標的組織または細胞に伝達する手段は、当該分野で周知である。所定の細胞において必要な電離放射線の量は、一般的にはその細胞の性質に依存する。有効な量の放射線を決定する手段は、当該分野で周知である。本明細書中で使用される、電離放射線の「有効な量」という用語は、本発明のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストと組み合せて、任意でさらに化学療法剤と組み合せて与えた時に、細胞の損傷または死を産生する電離放射線の量を意味する。
【００６９】
Ｘ線の投与量範囲は、延長した期間（３から４週間）に５０〜２００レントゲンの１日投与量から、２０００〜６０００レントゲンの単回投与の範囲である。放射性同位体の投与量範囲は広く様々であり、そして同位体の半減期、放出される放射線の強さおよび型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００７０】
外部の手段に加えて、放射線を組織へ伝達するあらゆる適当な手段を本発明において採用し得る。例えば、まず腫瘍の抗原と免疫反応する放射性標識抗体を提供すること、続いて有効な量の放射性標識抗体を腫瘍へ送達することによって、放射線を伝達し得る。それに加えて、放射性同位体を、電離放射線を組織または細胞へ送達するために使用し得る。
【００７１】
（ＶＩ．  ＭＵＣ１／ＥＣＤ発現のダウンレギュレーション）
本発明はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤ発現をダウンレギュレートする化合物を含む。１つのそのような化合物は、イソクマリンＮＭ−３（２−（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル）プロピオン酸）である。ＮＭ−３およびＭＵＣ１／ＥＣＤの発現をダウンレギュレートするのに適当な他のイソクマリンが、米国特許第６，０２０，３６３号において開示され、それは全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。他の適当な化合物は、２−メトキシエストラジオールおよび２−ヒドロキシエストラジオール（ｈｙｄｒｏｘｙｒｅｓｔｒａｄｉｏｌ）のような、２−置換エストラジオール化合物を含む。これらおよび他の適当なエストラジオール誘導体が、米国特許第６，２３９，１２３号において開示され、それは全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。ＭＵＣ１／ＥＣＤ発現をダウンレギュレートするのに適当な他の化合物は、下記で記載するように、ＭＵＣ１をコードする核酸分子を標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
（ＶＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明はまた、ＭＵＣ１ならびにニューレグリン２アイソフォーム５および６のようなＭＵＣ１／ＥＣＤ野生型リガンドをコードする核酸分子の機能を調節するのに使用するために、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを採用する。ＭＵＣ１発現の阻害は、ＭＵＣ１／ＥＣＤリガンドとの結合に利用可能なＭＵＣ１／ＥＣＤのレベルを減少させる。ＭＵＣ１／ＥＣＤの内因性リガンドの発現の阻害は、そのようなリガンドのＭＵＣ１／ＥＣＤへの結合に付随する癌細胞に対する増殖効果を阻害または減少させる。アンチセンス方法論は、核酸は「相補的配列」と対を作る傾向があるという事実を利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン−クリック相補的ルールによって塩基対形成し得るものであることを意味する。本発明のオリゴヌクレオチドは、情報配列、すなわちタンパク質をコードするもの、および５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域およびイントロン／エキソン連結部のような他の関連するリボヌクレオチドに対して完全にまたは部分的に標的化し得る。従って、本発明は、ＭＵＣ１および／またはニューレグリン２アイソフォーム５および６のようなＭＵＣ１／ＥＣＤ野生型リガンドをコードする核酸、好ましくはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。ｍＲＮＡへの干渉の全体効果は、ニューレグリンアイソフォーム５および／または６の発現の調節である。そのような調節を、当該分野で慣習的である方法で測定し得る。それに加えて、癌細胞増殖または腫瘍増殖に対する効果を評価し得る。
【００７３】
オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドの標的に対する結合が標的分子の正常機能に干渉して有用性の損失を引き起こし、そして特異的な結合が望ましい条件下で、すなわちインビボアッセイまたは治療的処理の場合には生理的条件下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。
【００７４】
本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約４から約５０の核塩基を含む。約８から約３０の結合した核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。本発明によって使用されるオリゴヌクレオチドを、固相合成の周知の技術によって簡便におよび慣習的に作成し得る。本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーをさす。この用語は、天然に存在する核塩基、糖および共有結合的な糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）（骨格）結合からなるオリゴヌクレオチド、および同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、増強された標的への結合、およびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような望ましい性質のために、多くの場合天然型よりも好ましい。いくつかの好ましい修飾オリゴヌクレオチドの例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）結合、または短鎖ヘテロ原子または複素環の糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）結合を含むものを含む。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドの、別のさらなるまたは代替の修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強する１つまたはそれ以上の親油性部分へのオリゴヌクレオチドの化学的結合を含む。そのような親油性部分を、オリゴヌクレオチドのいくつかの異なる位置で、オリゴヌクレオチドに結合し得る。いくつかの好ましい位置は、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位、５’末端ヌクレオチドの糖の５’位、およびあらゆるヌクレオチドの糖の２’位を含む。本発明のアンチセンス化合物はまた、薬剤学的に許容可能な塩およびプロドラッグを含む生物学的に同等な化合物を含む。
【００７６】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列の間の安定なおよび特異的な結合を引き起こすのに十分な相補性の程度を示すために使用される。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドの標的への結合が、標的分子の正常機能に干渉して有用性の損失および産物タンパク質の発現の減少を引き起こし、そしてオリゴヌクレオチドの非標的配列に対する非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴヌクレオチドは「特異的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。
【００７７】
ニューレグリン２タンパク質ファミリーは、多くの選択的スプライシングアイソフォームからなる（Ｒｉｎｇら、１９９９）。ニューレグリン２アイソフォーム５および６のコード配列は、各タンパク質の最初の４１６アミノ酸をコードするニューレグリン２遺伝子のエキソン１から６まで同じヌクレオチド配列を共有するが、アイソフォーム５のカルボキシ末端１０アミノ酸およびアイソフォーム６のカルボキシ末端６アミノ酸をコードする配列において異なっている。エキソン１から６までのコードＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１０から配列番号１５までに組み込まれる。アイソフォーム５および６の最初の４１６アミノ酸をコードする配列は、配列番号１０のヌクレオチド３１３から１０１２、配列番号１１のヌクレオチド５１−２２２、配列番号１２のヌクレオチド２３０−３４８、配列番号１３のヌクレオチド１００から２２０、配列番号１４のヌクレオチド１１１から１８７、および配列番号１５のヌクレオチド１２３から１８１である。アイソフォーム５およびアイソフォーム６のカルボキシ末端をコードする配列は、それぞれ配列番号１６のヌクレオチド１３２から１６４、および配列番号１７のヌクレオチド３０から５０である。
【００７８】
配列番号１６および配列番号１７は、明らかに他のニューレグリン遺伝子産物によって共有されないので、好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６のヌクレオチド１３２と１６４との間、または配列番号１７のヌクレオチド３０から５０までの領域に相補的な少なくとも４ヌクレオチドの配列を含む。より好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６のヌクレオチド１３２と１６４との間、または配列番号１７のヌクレオチド３０から５０までの領域に相補的な少なくとも８ヌクレオチドの配列を含む。
【００７９】
他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号第１０番のヌクレオチド３１３から１０１２までの領域、または配列番号第１１番のヌクレオチド５１−２２２の領域、または配列番号第１２番のヌクレオチド２３０−３４８の領域、または配列番号第１３番のヌクレオチド１００から２２０までの領域、または配列番号第１４番のヌクレオチド１１１から１８７までの領域、または配列番号第１５番のヌクレオチド１２３から１８１までの領域に相補的な少なくとも４ヌクレオチドの配列を含む。別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前述のヌクレオチド配列の１つの領域に相補的な少なくとも８ヌクレオチドである。
【００８０】
他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号第１０番から１７番までの非コード領域に相補的な、少なくとも４ヌクレオチドの配列、および好ましくは少なくとも８ヌクレオチドの配列を含む。
【００８１】
本発明の他の実施形態において、ＭＵＣ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号第１８番に相補的な少なくとも４ヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号第１８番に相補的な少なくとも８ヌクレオチドの配列を含む。
【００８２】
本発明はまた、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドの転写物の産生を指示する発現調節システムを含む発現ベクターを含む。それに加えて、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つを提供すること、およびそのようなオリゴヌクレオチドを、標的配列を含む核酸と、オリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることを含む、ハイブリダイゼーション方法を提供する。前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つを提供すること、および標的配列を含むｍＲＮＡを含む細胞を提供すること、およびオリゴヌクレオチドを細胞へ導入することを含む、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法も含まれる。ここでオリゴヌクレオチドは細胞内でｍＲＮＡの翻訳を阻害する。
【００８３】
本発明の別の局面は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬品組成物を提供する。
【００８４】
（ＶＩＩＩ．ワクチン）
本発明はまた、ＭＵＣ１／ＥＣＤペプチド、例えば配列番号１またはその断片の、宿主哺乳類が宿主自身のＭＵＣ１／ＥＣＤに対しても作用するポリペプチドに対する抗体を産生する、ワクチンにおける使用を含む。ここでそのような断片は配列番号１の４つまたはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。ワクチン調製技術は、Ｄｕｆｆｙ（１９８０）およびそこで引用された参考文献によって記載されたように当該分野で一般的に公知である。それらは全て本明細書中で参考として援用される。
【００８５】
ＭＵＣ１／ＥＣＤペプチドを、タンパク質またはＦｉｃｏｌｌのようなキャリア分子に結合し得る。キャリアタンパク質は、好ましくは少なくとも約４０，０００ダルトン、そしてより好ましくは少なくとも約６０，０００ダルトンの分子量を有するものである。ワクチン処方は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得、そしてまた処方の免疫原性を増強するために、水中油型システムまたは当該分野で公知の他のシステムのような、アジュバントシステムを含み得る。ペプチドまたは結合物は胃で分解され得るので、ワクチンは、好ましくは非経口的に投与される（例えば皮下、筋肉内、静脈内、または皮内注射）。投与量は、ワクチンの特異的活性に依存し、そして慣用的な実験によって容易に決定し得る。処方を、単位投与量または複数投与量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルで提供し得、そして使用の直前に滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存し得る。
【００８６】
（ＩＸ．処方）
本発明の組成物および方法で採用される、結合阻害剤またはオリゴヌクレオチドを含むＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを、様々な従来の薬剤学的な処方物に処方し、そして治療の必要がある癌患者に、経口、静脈内、動脈内、非経口、または腹腔内を含む、従来採用された薬剤投与経路のいずれか１つによって投与し得る。
【００８７】
経口投与のために、本発明の組成物を、例えば不活性な希釈剤と、または吸収可能な食べられるキャリアと処方し得る、または硬いまたは軟らかい殻のゼラチンカプセルに封入し得る、または錠剤に圧縮し得る、または食事療法の食物に直接混合し得る。経口治療的投与のために、活性化合物を、賦形剤と混合して、そして摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、オブラート等の形式で使用し得る。そのような組成物および調製物は、もちろん様々であり得、そして簡便に単位重量の約２から約６０％の間であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な投与量が得られるものである。
【００８８】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等はまた、以下のものを含み得る：結合剤、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；リン酸ジカルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、またはサッカリンのような甘味料を加え得る、またはペパーミント、冬緑油、またはチェリー香料のような香料。投与量単位がカプセルのためである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液体キャリアを含み得る。様々なほかの材料が、コーティングとして、または投与量単位の物理的な形式を他の方法で改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルを、セラック、糖、または両方でコートし得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ味のような香料を含み得る。もちろん、投与量単位形式を調製するのに使用されるあらゆる材料は、薬剤学的に純粋および採用される量において実質上無毒性でなければならない。それに加えて、他の化学療法化合物を、徐放性調製物および処方物に混合し得る。
【００８９】
オリゴヌクレオチドを含む処方物に関して、コロイド分散システムを、オリゴヌクレオチドのインビボでの安定性を増強するために、および／またはオリゴヌクレオチドを特定の臓器、組織、または細胞型に標的化するために、伝達媒体として使用し得る。コロイド分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズおよび水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび特徴的でない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質に基づくシステムを含むがこれに限らない。
【００９０】
注射可能な使用に適当な、本発明の組成物の医薬品組成物は、滅菌水性溶液または分散、および滅菌注射可能溶液または分散を即座に調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において、その形式は無菌でなければならず、そしてそれぞれ注入力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度流動的でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えばレシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、含む溶媒または分散媒であり得る。微生物作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の延長した吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物の使用によって達成され得る。
【００９１】
滅菌注射可能溶液を、本発明の組成物を必要な量で適当な溶媒に、必要であるように上記で列挙した様々な他の成分と共に混合し、続いてろ過滅菌することによって調製する。一般的に、分散を、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒を含む滅菌媒体および上記で列挙した必要な他の成分と混合することによって調製する。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは活性成分プラス前に滅菌ろ過したその溶液からのさらなる望ましい成分の粉末を産生する。
【００９２】
本明細書中で使用される「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。薬剤学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を使用することは、当該分野で周知である。あらゆる従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である以外は、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も、組成物に混合し得る。
【００９３】
（Ｘ．治療方法）
本発明の方法によって適当に治療し得る腫瘍は、脳（神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、血液細胞、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭部および頸部、食道、骨髄、血液および他の組織の腫瘍を含むがこれに限らない。腫瘍は、転移性および非転移性として区別し得る。前悪性病変も、本発明の方法で適当に治療し得る。
【００９４】
本発明のＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストによる治療は、数秒から数週の範囲の間隔で照射および／または化学療法の前または後に行ない得る、および／またはそのような治療と同時に投与し得る。ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストおよび照射および／または化学療法が細胞に別々に適用される実施形態において、有意な時間が各伝達の間に終了せず、２つまたは３つの処置の組み合わせが依然として細胞に対して有利な組み合わせた効果を発揮し得ることを保証するために工程を行なわなければならない。そのような場合、細胞を治療薬剤または様相と、お互いの０．１から２５時間以内に、より好ましくはお互いの１から４時間以内に、接触させることが企図される。約１時間から約２時間の遅延時間が最も好ましい。しかし、ある状況において、治療期間を有意に延長することが望ましい。ここで各投与の間に数日（２、３、４、５、６、または７）または数週（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する。あらゆる場合において、本発明は、ＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストを、電離放射線および／または化学療法剤の前に、後に、または同時に与え得ることを企図する。
【００９５】
いくつかの化学療法剤は、癌細胞と化学療法剤の接触の０．５から１２時間後に、癌細胞におけるＭＵＣ１の発現を誘導する。従って、いくつかの実施形態において、ＭＵＣ１／ＥＣＤ結合阻害剤、特に任意で毒素または放射性核種に結合したＭＵＣ１／ＥＣＤ配列（配列番号１）に対する抗体の投与は、癌細胞における増加したＭＵＣ１の発現と調和する。他の実施形態において、化学療法剤以外の薬剤を使用して、ＭＵＣ１結合阻害剤、特に任意で毒素または放射性核種に結合したＭＵＣ／ＥＣＤ配列（配列番号１）に対する抗体による治療の前にＭＵＣ１の発現を増加させ得る。
【００９６】
本発明の方法において、採用されるＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストの実際の投与量は、治療される癌の型および重症度、およびＭＵＣ１／ＥＣＤアンタゴニストおよび選択された他の治療様相または複数の様相の相加的または相乗的治療効果を含む、様々な因子に依存する。
【００９７】
（本発明の実施例）
（実施例１：ペプチド）
ＭＵＣ１発現細胞において典型的に見出される、ＭＵＣ１／ＥＣＤポリペプチド配列を、配列番号１で提供する。多くのポリペプチド配列が、標準的な技術によって合成された。これらは、ＭＵＣ１／ＥＣＤのポリペプチド断片である、ペプチドＰ１（配列番号２）、Ｐ２（配列番号５）、およびＰ３（配列番号６）を含む。Ｐ１（配列番号２）は、カルボキシル末端に付加したシステインを有する、ＭＵＣ１／ＥＣＤ（配列番号１）のアミノ酸５から２０に相当する。Ｐ２（配列番号５）は、カルボキシル末端に付加したシステインを有する、ＭＵＣ１／ＥＣＤ（配列番号１）のアミノ酸１３から２８に相当する。Ｐ３（配列番号６）は、カルボキシル末端にシステインを有する、ＭＵＣ１／ＥＣＤ（配列番号１）のアミノ酸２７から４４に相当する。それに加えて、合成ポリペプチド配列、配列番号７は、カルボキシル末端に付加したシステインを有する、ＭＵＣ１／ＥＣＤ（配列番号１）のアミノ酸６から２４を組み込む。合成ポリペプチドＰ０（配列番号８）は、ＭＵＣタンパク質でＭＵＣ１／ＥＣＤのアミノ末端のすぐ前に存在する１９アミノ酸配列を組み込み、そして潜在的な切断部位を提示する。システインを、ＭＵＣ１配列で存在するように、配列のカルボキシル末端に再び付加した。
【００９８】
（実施例２：抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体）
（Ａ．抗体の産生）
ポリペプチドＰ１（配列番号４）は、ＱＹＫモチーフおよびサイトカイン受容体のリガンド結合ドメインに対する他の配列ホモログを含む（Ｚｒｉｈａｎ−Ｌｉｃｈｔら、１９９４）。ポリクローナル抗体を、ウサギにおいて、ＫＬＨに結合体化したポリペプチドＰ１（配列番号４）に対して産生した。血清を、標準的な方法によって調製した。
【００９９】
ポリクローナル抗体を、ポリペプチド配列番号７に対しても産生した。ここで免疫原は、ポリペプチド配列番号７をＫＬＨに結合することによって形成した。抗体を、３４０２−１および３４０２−２と呼ばれる２匹のウサギから得た。血清およびアフィニティー精製抗体調製物を両方とも標準的な方法論によって調製した。
【０１００】
（Ｂ．抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体によるヒト癌細胞の刺激）
ヒトＺＲ−７５−１癌細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で８０％のコンフルエンスまで増殖させ、そして６穴プレートにウェルあたり１×１０４細胞で移した。０．１％ＦＢＳを含む培地で一晩の飢餓状態の後、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体を、図１に示した量で各ウェルに加え、そして４８時間インキュベートした。０．１％ＦＢＳの存在下でさらに３日間インキュベートした後、細胞数を定量した。図１に示すように、抗ＭＵＣ１−Ｐ１は、用量依存的な様式で、ＺＲ−７５−１細胞の増殖を刺激する。
【０１０１】
抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体刺激の特異性を評価するために、ヒトＭＵＣ１−陰性ＳＷ４８０結腸癌細胞を安定にトランスフェクトして、空のベクター（ＳＷ４８０／Ｖ）またはＭＵＣ１（ＳＷ４８０／ＭＵＣ１）を発現させた。ＳＷ４８０結腸癌細胞を、リポフェクタミド（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｄｅ）を用いて、ｐＣＭＶ−ＩＥ−ａｋ１−ｄｈｆｒベクターまたはｐＣＭＶ−ＩＥ−ａｋ１−ｄｈｆｒ−ＭＵＣ１のいずれかでトランスフェクトした（Ｌｉｇｔｅｎｂｕｒｇｅｒら、１９９２）。細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ネオマイシン）の存在下で増殖させ、そして単一細胞集団まで連続的に希釈した。ＭＵＣ１（ＳＷ４８０／ＭＵＣ１）を発現する単一細胞クローンを選択した。両方のＳＷ４８０細胞型を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で８０％コンフルエンスまで増殖させ、そして６穴プレートにウェルあたり５×１０４細胞をまいた。０．１％のＦＢＳを含む培地中で一晩飢餓状態にした後、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体を示した濃度で加え、そして４８時間インキュベートした。さらに１日インキュベートした後細胞数を定量した（全体で３日間）。図２で示すように、抗ＭＵＣ１−Ｐ１はＳＷ４８０／ＭＵＣ１細胞の増殖を刺激するが、ＳＷ４８０／Ｖ細胞は刺激しない。これらの発見は、抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体は、ＭＵＣ１と特異的に相互作用することによって、ヒト癌細胞の増殖を刺激することを確認する。
【０１０２】
（実施例３：内因性ＭＵＣ１  ＥＣＤリガンド）
抗ＭＵＣ１−Ｐ１はヒト癌細胞の増殖を刺激するという発見は、天然ＭＵＣ１  ＥＣＤリガンドの潜在的な存在を示唆する。この可能性を調査するために、ＺＲ−７５−１細胞を、ＭＵＣ１リガンドの潜在的な供給源としてスクリーニングした。ＺＲ−７５−１細胞を０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間培養し、そして次いで上清を調製することによって馴化培地を調製した。馴化培地を、以前に記載したように０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥで増殖停止させたＳＷ４８０／ＶおよびＳＷ４８０／ＭＵＣ１細胞に加えた。馴化培地を、図３に示した濃度で加え、そして細胞を３日間維持してから細胞数を定量した。図３に示すように、ＺＲ−７５−１細胞は、ＭＵＣ１への結合によって癌細胞増殖を刺激する、可溶性リガンドを発現する。
【０１０３】
可溶性ＭＵＣ１リガンドを同定するために、ＭＵＣ１／ＥＣＤ（配列番号１）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質を調製した。ＧＳＴを以下のようなプライマーのセットを用いてＰＣＲによって増幅した：
５’−ＡＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡ−３’、および５’−ＣＡＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧ−３’。そしてｐＥＴ−１１ｄのＮｈｅ１およびＢａｍＨ１部位の間に挿入した（「ｐＥＴ−１１ｄ−ＧＳＴベクター」）。ＭＵＣ１／ＥＣＤを、以下のようなプライマーのセットを用いてＰＣＲによって増幅した：
５’−ＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴ−３’、および
５’−ＡＧＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣ−３’、そしてｐＥＴ１１ｄ−ＧＳＴベクターのＮｃｏ１およびＮｈｅ１部位の間に挿入した（「ｐＥＴ１１ｄ−ＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤ」ベクター）。
【０１０４】
ｐＥＴ１１ｄ−ＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤまたはｐＥＴ１１ｄ−ＧＳＴで形質転換した、対数増殖するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｄ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドと、２５℃で６時間インキュベートすることによって、ＧＳＴ融合タンパク質を調製した。細胞をペレット化して、２０％のスクロース、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％のＮＰ−４０を含むＰＢＳに再懸濁して、次いで超音波処理した。１０，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心することによって破片を除去した。上清をバルク（ｂｕｌｋ）グルタチオンセファロース４Ｂにかけて、そして４℃で４時間インキュベートして、その後洗浄およびカラムに充填した。融合タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５中１０ｍＭのグルタチオンで溶出した。精製融合タンパク質を、ＰＢＳで透析した。
【０１０５】
培養細胞の細胞質ゾル画分を、４０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中にＺＲ−７５−１細胞を回収することによって調製した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を氷冷ホモジナイズ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁して、そして氷上に１５分間置いた。懸濁液をＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、１，００×ｇで５分間、４℃で遠心した。上清を細胞質ゾル画分として回収し、そして０℃で保存した。
【０１０６】
ＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤ融合タンパク質（１．８ｍｇ）を、４００μｌのグルタチオン−セファロース４Ｂに固定化し、それをカラムに充填して、そして緩衝液Ａ（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのジチオトレイトール）で平衡化した。細胞質ゾル画分を、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムを通すことによってまず予備清澄化（ｐｒｅｃｌｅａｒ）し、そしてついでＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤアフィニティーカラムにかけて、それを次いで２×１０ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、２ｍｌの緩衝液Ｂ（０．１５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）を加えることによって溶出し、そしてそれぞれ０．４ｍｌの画分を回収した。２番目および３番目の画分を混合して、そしてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。コントロールとして、ＧＳＴタンパク質（１．５ｍｇ）を４００μｌのグルタチオン−セファロース４Ｂに固定化し、そして実験を上記で記載したように行なった。その結果は、ＭＵＣ１／ＥＣＤは４５ｋＤａのタンパク質に結合することを示した。同様の実験をヒトＭＣＦ−７乳癌細胞の溶解物で行い、ＭＵＣ１／ＥＣＤの４５ｋＤａタンパク質との結合を確認した。
【０１０７】
ＧＳＴ−ＭＵＣ１／ＥＣＤ吸着質からの４５ｋＤａをゲルから摘出し、アセトニトリルで脱水し、そして次いで１００ｍＭの重炭酸アンモニウムで再水和した。次いでゲルの断片を、１２．５ｎｇ／μｌのトリプシン／５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに懸濁した。消化を３７℃で１０−１２時間行なった。トリプシン消化ペプチドの塊を、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を用いて、マトリクス補助レーザー脱離／電離−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析した。ＭＬ−１およびＭＬ−２と呼ばれる２つの関連するペプチドが、マスフィンガープリンティングによって同定された。ＭＬ−１（配列番号３）およびＭＬ−２（配列番号４）の配列は、２つのニューレグリンアイソフォーム、それぞれＮＲＧ２スプライスアイソフォーム５およびＮＲＧ２スプライスアイソフォーム６に関して以前に開示されたものである。
【０１０８】
（実施例４：癌遺伝子としてのＭＵＣ１）
（Ａ．ＭＵＣ１は軟寒天において増殖を支持する）
ＭＵＣ１の発現は、悪性表現型の発現に関して機能的に有意であることが示された。ＭＵＣ１を安定に発現する細胞系統を産生した。ＨＣＴ１１６結腸癌細胞を、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ２ベクターまたはｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ２−ＭＵＣ１で、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）によってトンラスフェクトし、ピューロマイシン抵抗性に関して選択した。空のベクター（ＨＣＴ１１６／Ｖ）またはＭＵＣ１（ＨＣＴ１１６／ＭＵＣ１）のいずれかを安定に発現する単一クローンを有する、ヒトＭＵＣ１−陰性ＨＣＴ１１６結腸癌細胞で研究を行なった。ＨＣＴ  １１６／ＶおよびＨＣＴ１１６／ＭＵＣ１細胞を、軟寒天における足場独立性増殖に関してアッセイした。細胞（１×１０５／６０ｍｍ皿）を、１０％のＦＢＳを添加した０．３３％のアガロースを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、そしてアガロースプラグ（１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中０．５％のアガロース）上に重ねた。細胞を４週間インキュベートし、その間新しい培地を毎週プレートに加えた。直径が７０μｍより大きなコロニーを４週間後に計測した。野生型ＭＵＣ１の発現は、ＨＣＴ／１１６／Ｖ細胞で得られるものと比較して、コロニーのサイズおよび数の著しい増加と関連していた。これらの発見は、ＳＷ４８０／ＶおよびＳＷ４８０／ＭＵＣ１細胞で行なった同様の研究によって確認された。ここでＭＵＣ１の発現は再びＳＷ４８０細胞の足場独立性増殖を支持することが示された。
【０１０９】
（Ｂ．ＭＵＣ１はヌードマウスにおけるヒト腫瘍形成を支持する）
インビボにおけるヒト腫瘍増殖に対するＭＵＣ１の効果を評価するために、５から６週齢の無胸腺Ｂａｌｂｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）の右脇腹に、１×１０６のＨＣＴ１１６／ＶまたはＨＣＴ１１６／ＭＵＣ１細胞を皮下注射した。腫瘍（４匹のマウス／グループ）を１週間に２回測定した。腫瘍体積を、以下の式によって計算した：１／２（長さ×巾２）。腫瘍体積が２ｃｍ３を超えた時、実験を終了した。時間中の腫瘍体積の測定は、ＨＣＴ１１６／Ｖ細胞増殖を少ししか示さなかった。対照的に、ＨＣＴ１１６／ＭＵＣ１腫瘍の増殖は著しく増加した。
【０１１０】
（実施例５：ＭＵＣ１の発現は酸化および遺伝子毒性ストレスによって誘導される）
ＭＵＣ１が酸化ストレスに反応して誘導されるかどうかを決定するために、ＭＣＦ−７細胞を過酸化水素で処理した。細胞溶解物を、抗ＤＦ３／ＭＵＣ１抗体を用いて免疫ブロッティングによって分析した。ＭＣＦ−７細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、３ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤を含む１ｍＭのＤＴＴ、および１％のＮＰ−４０または１％のＢｒｉｊ−９６のいずれか）に、３０分間氷上で懸濁することによって、溶解物を調製した。溶解物を遠心によって透明にし、そして等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。次いでタンパク質をニトロセルロースフィルターに移し、そして０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中５％の無脂肪粉乳中でインキュベートすることによってブロックし、そして抗ＭＵＣ１抗体でプローブした（Ｐａｎｄｅｙら、１９９５）。抗アクチンをコントロールとして使用した。その結果は、アクチン発現のレベルに対しては過酸化水素の影響はなかったが、ＭＵＣ１は酸化ストレスに反応して迅速におよび一過性に誘導されることを示した。
【０１１１】
同様の研究を、遺伝子毒性薬剤を用いて行なった。その結果は、ＭＣＦ−７細胞のダウノルビシンによる処理は、ＭＵＣ１の迅速および一過性の誘導と関連し、そしてアクチンの発現とは関連しないことを示した。入手可能な証拠は、ＭＵＣ１は、タキソール、シスプラチン、および電離放射線を含む様々な細胞毒性薬剤によって誘導されることを示す。
【０１１２】
（実施例６：ＭＵＣ１は、酸化および遺伝子毒性ストレスに対するアポトーシス反応を阻害する）
ＭＵＣ１が酸化ストレスに対するアポトーシス反応を阻害するかどうかを決定するために、空のベクターまたはＭＵＣ１を安定に発現するＨｅＬａ細胞を、１ｍＭの過酸化水素で１時間処理した。ＤＮＡ内容を、エタノール固定細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）によってモニターすることによって評価した。サブＧ１ＤＮＡ内容を有する細胞の数を、ＭＯＤＦＩＴ  ＬＴプログラム（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ）で決定した（Ｙｕａｎら、１９９７）。細胞を、フローサイトメトリーによって、アポトーシスのマーカーとしてサブＧ１ＤＮＡの誘導に関して分析した。図４に示すように、その結果は、ＭＵＣ１は酸化ストレスに対するアポトーシス反応を阻害することを示す。
【０１１３】
０．０１ｍＭのタキソールで２０時間処理した細胞におけるアポトーシスの誘導を、空のベクターまたはＭＵＣ１を発現するＨｅＬａ細胞のサブＧ１ＤＮＡ内容を測定することによって評価した。図４に示すように、酸化ストレスと同様、タキソール誘導アポトーシスはＭＵＣ１の発現によって阻害された。
【０１１４】
（実施例７：ＭＵＣ１発現に対するＮＭ−３の効果）
ＭＣＦ−７細胞を、１００〜４００μｇ／ｍｌのＮＭ−３（２−（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル）プロピオン酸）で４８時間処理した。ＤＦ３抗原レベルを、ＤＦ３ＭＡｂを用いてイムノブロット分析によって視覚化した（Ｋｕｆｅ、米国特許第５，５０６，３４３号、本明細書中で参考として援用される）。
【０１１５】
未処理細胞に比べて、ＮＭ−３処理細胞におけるＤＦ３抗原の細胞内レベルの減少が観察された。ＺＲ−７５−１およびＢＴ−２０細胞系統において同様の結果が見出された。細胞内ＤＦ３抗原のＮＭ−３による減少は、用量および時間依存的であることが示された。ＮＭ−３がＭＵＣ１  ＤＦ３抗原の細胞外局在化を損傷したかどうかを決定するために、ＮＭ−３処理後の細胞培養培地上清中およびＭＣＦ−７細胞上の抗原レベルを調査した。ＤＦ３抗原のレベルは、両方の局在において抑制された。これらの発見は、ＮＭ−３はＭＵＣ１タンパク質の発現を阻害することを示唆する。
【０１１６】
ＮＭ−３のＭＵＣ１発現に対する効果は転写レベルで検出可能かどうかを決定するために、ハイブリダイゼーション研究を行なった。３２Ｐ標識ＤＦ３  ＤＮＡプローブは、ＭＣＦ−７細胞に対する４８時間のＮＭ−３処理の後、全細胞ＲＮＡにおいて４．５および７．０ｋｂの２つの転写物にハイブリダイズした。両方のｍＲＮＡのレベルは、ＭＣＦ−７細胞をＮＭ−３の非存在下でインキュベートしたコントロールと比較して減少した。ＺＲ−７５−１およびＢＴ−２０細胞系統を用いて同じ結果が観察された。これらの発見は、ＤＦ３の発現は、それらの細胞系統に対するＮＭ−３処理の後、転写レベルで調節されることを示唆する。
【０１１７】
ＮＭ−３が細胞表面タンパク質の発現も阻害するのかどうかを決定するために、ＮＭ−３処理後の表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）発現のレベルを、ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−１、およびＢＴ−２０細胞系統で試験した。細胞をＮＭ−３の非存在下でインキュベートしたコントロールと比較して、ＮＭ−３処理後にＥＧＦ−Ｒ発現に検出可能な変化はなかった。これらの結果は、表面分子発現の阻害なしに、ＮＭ−３のＭＵＣ１発現に対する選択的な効果を示す。
【０１１８】
本発明は、詳細な説明および実施例によって示している。実施例は例のみであり、そして本発明の範囲を制限すると解釈され得ない。当業者は、添付の特許請求の範囲によって記載される本願発明のプロセスの等価物を認識し、これらは、特許請求の範囲に記載される発明の範囲および意図に含まれる。
【０１１９】
（参考文献）
以下の参考文献は、例示的な手順または他の詳細な捕捉を提供する範囲で、本明細書中で参考として具体的に援用される。
【０１２０】
【表１】
0005165175.tif 000002
0005165175.tif 000003
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書中で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの１以上の図面を参照することによってより良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＺＲ−７５−１乳癌細胞の増殖に対する抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体の効果を示す。
【図２】  図２は、空のベクター（ＳＷ４８０／Ｖ）またはＭＵＣ１（ＳＷ４８０／ＭＵＣ１）を安定に発現するＳＷ４８０細胞の増殖に対する抗ＭＵＣ１−Ｐ１抗体の効果を示す。
【図３】  図３は、空のベクター（ＳＷ４８０／Ｖ）またはＭＵＣ１（ＳＷ４８０／ＭＵＣ１）を安定に発現するＳＷ４８０細胞の増殖に対するＺＲ−７５−１馴化培地の効果を示す。
【図４】  図４は、空のベクター（ＨｅＬａ／Ｖ）またはＭＵＣ１（ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１）を安定に発現するＨｅＬａ細胞のＨ２Ｏ２およびタキソール誘導アポトーシスに対するＭＵＣ１の効果を示す。結果を、３つの別々の実験のアポトーシス％（平均±ＳＥ）として表す。
【配列表】
0005165175.tif 000004
0005165175.tif 000005
0005165175.tif 000006
0005165175.tif 000007
0005165175.tif 000008
0005165175.tif 000009
0005165175.tif 000010
0005165175.tif 000011
0005165175.tif 000012
0005165175.tif 000013
0005165175.tif 000014
0005165175.tif 000015
0005165175.tif 000016
0005165175.tif 000017
0005165175.tif 000018
0005165175.tif 000019
0005165175.tif 000020
0005165175.tif 000021
0005165175.tif 000022
0005165175.tif 000023
0005165175.tif 000024
0005165175.tif 000025
0005165175.tif 000026
【図１】
0005165175.tif 000027
【図２】
0005165175.tif 000028
【図３】
0005165175.tif 000029
【図４】
0005165175.tif 000030