(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする、硬組織形成促進剤。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項２】
硬組織が、骨である、請求項１に記載の硬組織形成促進剤。
【請求項３】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、請求項１又は２に記載の硬組織形成促進剤。
【請求項４】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする、細胞の硬組織細胞への分化促進剤。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項５】
細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項４に記載の分化促進剤。
【請求項６】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、請求項４または５に記載の分化促進剤。
【請求項７】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項８】
細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項７に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
【請求項９】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、請求項７または８に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
【請求項１０】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、硬組織形成促進剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項１１】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、硬組織形成促進剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項１２】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、細胞の硬組織細胞への分化促進剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項１３】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、細胞の硬組織細胞への分化促進剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項１４】
硫酸基を保持し、ヘパリン、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであって、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【請求項１５】
硫酸基を保持し、かつ、（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩が、ヘパリンにおけるヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの、ヘパリンにおけるグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が脱硫酸化されたもの及びヘパリンにおけるグルコサミン残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたものからなる群から選ばれる１又は２以上のものである、以下の（１）、（２）及び（３）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩の、アルカリフォスファターゼ活性増強剤の製造のための使用。
（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）基本骨格における繰返し構造がヘキスロン酸残基の２位のヒドロキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つの位置に硫酸基を保持していない。
（３）平均重量分子量が５０００〜２００００である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、グリコサミノグリカン又はその塩を含有する硬組織形成促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】  本出願の出願書類では、以下の略号を使用する。
ＡＬＰ：アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）
αＭＥＭ：α最小必須培地（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉｕｍ）
ＢＭＰ−２：骨誘導因子−２（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）
ＢＳＰ：骨シアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）
ＣＯＬＩ：Ｉ型コラーゲン（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）
ＧｌｃＮ：グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）
ＧｌｃＡ：グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
Ｈｅｐ：ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）
ＨｅｘＡ：ヘキスロン酸（ｈｅｘｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＨＳ：ヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）
ＩｄｏＡ：イズロン酸（ｉｄｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）
２ＤＳＨ：２−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ（２−Ｏ−ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ）（ＨｅｐにおけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基が脱硫酸化されたもの）
６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ（６−Ｏ−ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ）（ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の６位のヒロドキシル基が脱硫酸化されたもの）
ＮＤＳＨ：Ｎ−脱硫酸化Ｈｅｐ（Ｎ−ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ）（ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基が脱硫酸化されたもの）【０００３】  以下、本発明の背景技術について説明する。
特許文献１には、ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するＧＡＧを有効成分として含有し、該ＧＡＧが、２位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていないＨｅｘＡ残基又は２位アミノ基がスルファミノ化されていないＧｌｃＮ残基を含むことを特徴とする細胞間連絡亢進剤が記載されている。【０００４】  特許文献２には、ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するＧＡＧを有効成分として含有し、該ＧＡＧが、６位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されていないＧｌｃ残基を含むことを特徴とする細胞間連絡抑制剤が記載されている。【０００５】  特許文献３には、ある種の脱硫酸化Ｈｅｐが開示されており、これを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤や、これと塩基性繊維芽細胞増殖因子とを含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物が開示されている。【０００６】  特許文献４には、分子量が２０Ｋダルトンから４０Ｋダルトンである骨誘導活性を有するヒアルロン酸フラクションが開示されている。【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１１３０９０号公報
【特許文献２】特開２００３−１１９１４６号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０１２７８号パンフレット
【特許文献４】特許第３３３３２０５号公報
【０００８】  しかし、硫酸基を保持し、ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とし、基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していないＧＡＧ又はその塩それ自体が、直接硬組織形成を促進したり、細胞の分化を促進したり、細胞のＡＬＰ活性を増強したりする作用を有することについては開示も示唆もない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明は、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進、細胞のＡＬＰ活性の増強を惹起させる剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種のＧＡＧ又はその塩が、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進及び細胞のＡＬＰ活性の増強を惹起させることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１１】  すなわち本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（１）及び（２）の特性を有するＧＡＧ又はその塩を有効成分とする、硬組織形成剤（以下、「本発明形成促進剤」という。）を提供する。
（１）ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）前記（１）の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していない。【００１２】  このＨｅｘＡ残基は、ＧｌｃＡ残基又はＩｄｏＡ残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有するＧＡＧとして、具体的にはＨｅｐ、ＨｅｐにおけるＨｅｘＡ残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであることが好ましい。また、硬組織は骨であることが好ましい。【００１３】  また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（１）及び（２）の特性を有するＧＡＧ又はその塩を有効成分とする、細胞の分化促進剤（以下、「本発明分化促進剤」という。）を提供する。
（１）ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）前記（１）の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していない。【００１４】  このＨｅｘＡ残基は、ＧｌｃＡ残基又はＩｄｏＡ残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有するＧＡＧとして、具体的にはＨｅｐ、ＨｅｐにおけるＨｅｘＡ残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。【００１５】  また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（１）及び（２）の特性を有するＧＡＧ又はその塩を有効成分とする、細胞のＡＬＰ活性増強剤（以下、「本発明活性増強剤」という。）を提供する。
（１）ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）前記（１）の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していない。【００１６】  このＨｅｘＡ残基は、ＧｌｃＡ残基又はＩｄｏＡ残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有するＧＡＧとして、具体的にはＨｅｐ、ＨｅｐにおけるＨｅｘＡ残基の２位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群から選ばれる１又は２以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。【００１７】  以下、本発明形成促進剤、本発明分化促進剤及び本発明活性増強剤を、まとめて「本発明の剤」という。
【発明の効果】
【００１８】  本発明の剤は、有効成分であるＧＡＧが、硬組織形成、細胞の分化促進又は細胞のＡＬＰ活性増強に対して直接的に作用して優れた効果を発揮することから、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明の剤の有効成分
本発明の剤は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（１）及び（２）の特性を有するＧＡＧ又はその塩を有効成分とする。
（１）ＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
（２）前記（１）の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していない。【００２０】  ここでＨｅｘＡ残基は特に限定されないが、ＧｌｃＡ残基又はＩｄｏＡ残基であることが好ましい。そのなかでも、ＧｌｃＡ残基はＤ−ＧｌｃＡ残基であることが好ましく、ＩｄｏＡ残基はＬ−ＩｄｏＡ残基であることが好ましい。また、ＧｌｃＮ残基も特に限定されないがＤ−ＧｌｃＮ残基であることが好ましい。
また、ＧｌｃＮ残基のアミノ基はアセチル化されていてもよい。この場合、ＧｌｃＮ残基の部分はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）となる。【００２１】  本発明の剤の有効成分であるＧＡＧは、このようなＨｅｘＡ残基とＧｌｃＮ残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。すなわち、ＨｅｘＡ残基を「ａ」とし、ＧｌｃＮ残基を「ｂ」とすると、本発明の剤の有効成分であるＧＡＧは、「ａ−ｂ−ａ−ｂ−・・・・」又は「ｂ−ａ−ｂ−ａ−・・・・」という基本骨格からなる。なお「−」はグリコシド結合を示す。ａがＧｌｃＡ残基であるときは、ａとｂとの間のグリコシド結合（ａ−ｂ）は、β１→４結合であることが好ましい。またａがＩｄｏＡ残基であるときは、ａとｂとの間のグリコシド結合（ａ−ｂ）はα１→４結合であることが好ましい。またｂとａとの間のグリコシド結合（ｂ−ａ）はα１→４結合であることが好ましい。【００２２】  本発明の剤の有効成分であるこのようなＧＡＧは、硫酸基を保持していることを特徴とする。前記の基本骨格における硫酸基が保持されうる位置は特に限定されないが、ＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基から選ばれる１つ以上の位置であることが好ましい。このような位置に硫酸基が保持されているＧＡＧとしては、例えばＨｅｐやＨＳが例示される。【００２３】  ただし、本発明の剤の有効成分とするためには、前記の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうち、いずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していないことが必要である。したがって、本発明の剤の有効成分としては、例えばＨｅｐ（ＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のいずれにも硫酸基が保持されている）、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ、ＮＤＳＨ等が例示される。【００２４】  なお、ＧＡＧは多糖（ポリマー）であり、あるＧＡＧの画分中に存在する全てのＧＡＧ分子のサイズ、構成糖の組成や配列、硫酸基の位置、硫酸基の数等が完全に同一であることが実質的にありえないことは、当技術分野の技術常識であることは言うまでもない。また、例えばこのようなＧＡＧにおいて「ＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基には硫酸基を保持していない」と言った場合、「ＧＡＧ分子中の全てのＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基が完全に硫酸基を保持していない」ということを意味するものではなく、「ＧＡＧ分子中の大部分のＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基が硫酸基を保持していなければ足り、若干のＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基に硫酸基が保持されているものを排除するものではない」ということを意味することも、同様に当技術分野の技術常識である。したがって本出願書類におけるこれらの記載も、このような当技術分野における技術常識に従って解釈されたい。【００２５】  前記の基本骨格におけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基のうち、いずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していないことが必要である。【００２６��  本発明の剤の有効成分であるＧＡＧの由来も特に限定されず、天然物をそのまま用いてもよく、天然物を化学的手法、酵素的手法その他の手法によって加工したものを用いてもよく、化学的に合成したものを用いてもよい。【００２７】  例えば、本発明の剤の有効成分としてＨｅｐを用いる場合には、天然物等から公知の方法で取得されたＨｅｐをそのまま用いてもよく、既に医薬品や試薬として販売されているＨｅｐを用いても良い。また、公知の化学的手法、酵素的手法その他の手法によってＨＳの硫酸化の度合いを増加させ、Ｈｅｐと同程度としたものを用いてもよい。本願の出願書類における「Ｈｅｐ」の用語には、純然たるＨｅｐのみならず、このようにＨｅｐと実質的に同一の物と認識されるものも包含される。【００２８】  また、例えば本発明の剤の有効成分として２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨを用いる場合にも、前記の特許文献１や特許文献２に記載されている方法によって製造することができる。【００２９】  本発明の剤の有効成分とすることができるＧＡＧのサイズ（重量平均分子量）は、当技術分野における当業者において「多糖」として認識されるものである限りにおいて特に限定されないが、例えば重量平均分子量が５０００〜２００００程度のものが好ましく、１００００〜１５０００程度のものがより好ましい。なお重量平均分子量は、ＷＯ００／０６６０８に記載された方法に従って測定することができる。【００３０】  また、本発明の剤の有効成分とするＧＡＧの純度も特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。
例えば、生体内の組織や、無菌条件下で培養された細胞等、高度の無菌性や清浄性等が求められる対象に本発明の剤を適用する場合には、高純度に精製され、医学的や培養学的に許容されない物質（例えばエンドトキシンや微生物等）を実質的に含有しないものを用いることが望ましい。また、それほどの無菌性や清浄性等が求められていない対象に本発明の剤を適用する場合には、その場面や目的に応じて、適宜精製度を低減させてもよい。【００３１】  また「ＧＡＧの塩」についても特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。例えば、生体内の組織に適用する場合には、医学的に許容される塩を選定すればよい。ＧＡＧの塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩等が例示される。なかでもナトリウム塩が好ましい。【００３２】  本発明の剤は、１種類の前記ＧＡＧ又はその塩のみを有効成分として含有していてもよく、複数種類の前記ＧＡＧ又はその塩を有効成分として含有していてもよい。
このようなＧＡＧ又はその塩を用いることにより、極めて優れた効果を有する本発明形成促進剤、本発明分化促進剤、本発明活性増強剤とすることができる。【００３３】＜２＞本発明の剤の剤形等
本発明の剤の剤形等は、前記のＧＡＧ又はその塩を含有しており、かつこれによる硬組織形成の促進作用や、細胞の分化促進作用や、細胞のＡＬＰ活性増強作用が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。【００３４】  例えば本発明の剤を、前記のＧＡＧ又はその塩を含有する溶液状態の剤としてもよく、粉末、顆粒その他の固形剤等としても良い。また、例えば溶液状態の剤として提供する場合には、凍結状態で提供してもよく、溶液のまま提供してもよく、用時溶解用の剤等として提供してもよい。【００３５】  本発明の剤中の前記ＧＡＧ又はその塩の濃度も特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。【００３６】  本発明の剤の製剤化は、公知の方法により行うことができる。また製剤化にあたり、前記のＧＡＧ又はその塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の薬物除去成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、矯味剤、保存剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等の他の成分を配合することができる。【００３７】＜３＞本発明の剤の用途、使用方法等
本発明の剤は、硬組織形成の促進剤、細胞の分化促進剤又は細胞のＡＬＰ活性増強剤とすることができる。硬組織形成の促進剤（本発明形成促進剤）とする場合、その「硬組織」は骨であることが好ましい。なお「硬組織形成の促進」には、石灰化の促進の意義も包含される。また細胞の分化促進剤（本発明分化促進剤）や細胞のＡＬＰ活性増強剤（本発明活性増強剤）とする場合、その「細胞」は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。また本発明の剤は、これらの用途の１つを目的とする１つの剤としてもよく、これらの複数の用途を目的とする１つの剤としてもよい。【００３８】  本発明の剤は、その有効成分である前記のＧＡＧ又はその塩の分子と、適用される対象となる生体組織や細胞等が接触する状態となる限りにおいて、その投与や適用の方法は限定されない。【００３９】  本発明の剤は、例えば硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞のＡＬＰ活性増強を目的とする医薬や試薬等として利用することができる。本発明の剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）または治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、体重、投与部位、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、前記のＧＡＧ又はその塩として０．０３ｍｇ／投与部位〜３ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。【００４０】  本発明の剤を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。この場合、それぞれの用途に応じて、例えば以下のような動物に投与することができる。【００４１】  硬組織形成促進剤として用いる場合には、硬組織の形成の促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。このような状態としては、例えば骨折、骨欠損、骨粗鬆症等に罹患している場合や、歯科治療、整形外科治療、骨補填等が施された直後の状態等が例示される。【００４２】  細胞の分化促進剤として用いる場合には、細胞の分化が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨髄由来間葉系幹細胞や骨芽細胞等の分化が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の硬組織形成促進剤における場合と同様である。【００４３】  細胞のＡＬＰ活性増強剤として用いる場合には、細胞のＡＬＰ活性の増強が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。このような状態の例示は、前記における硬組織形成促進剤や細胞の分化促進剤における場合と同様である。【００４４】  例えば本発明の剤を試薬とする場合、その適用対象も特に限定されないが、例えば生体から採取された組織や培養細胞等を例示することができる。【００４５】  また、本発明の剤の有効成分である前記のＧＡＧ又はその塩を、適当な不溶性担体の表面に固着させたり、適当な素材と混合したりすることによって、硬組織形成の促進や、細胞の分化の促進や、細胞のＡＬＰ活性の増強等を目的とする素材としてもよい。このような不溶性担体（素材）としては、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメント、��織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸、ハイドロキシアパタイト等をはじめとする種々の形状のものを使用できる。具体的には、医用複合材料としてインプラント、骨セメント、骨補填剤、根管充填剤、骨折プレート、人工関節等に用いることができる。また本発明の剤は、再生医療分野における素材として応用することもできる。
【実施例】
【００４６】  以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
１．細胞株
マウス骨髄由来間葉系細胞株であるＳＴ２細胞株と、より分化度の高いマウス骨芽細胞様細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株（いずれもＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）を用いた。以下、これらの細胞の培養は全て３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。またこれらの細胞の培養に用いる培地には、全て抗生物質（終濃度１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、終濃度１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び終濃度２５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）を共存させた。【００４７】２．被験サンプル
被験サンプルとして以下のものを用いた。サンプルは全て生化学工業株式会社より提供されたものを用いた。なお括弧内の記号は、図１中に示す記号を意味する。
・重量平均分子量１万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  １万）
・重量平均分子量６万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  ６万）
・重量平均分子量３５万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  ３５万）
・重量平均分子量１００万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  １００万）
・重量平均分子量１５０万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  １５０万）
・重量平均分子量２５０万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸  ２５０万）
・Ｈｅｐ
・２ＤＳＨ
・６ＤＳＨ
・ＮＤＳＨ
・ＮＳＨ（ＨｅｐにおけるＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基が硫酸化され、ＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基とＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基には硫酸基を保持しないもの）
・６ＳＨ（６−Ｏ−硫酸化Ｈｅｐ；６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ；ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化され、ＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基とＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基には硫酸基を保持しないもの）
・２ＳＨ（２−Ｏ−硫酸化Ｈｅｐ；２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ；ＨｅｐにおけるＨｅｘＡ残基の２位のヒロドキシル基が硫酸化され、ＧｌｃＮ残基の６位のヒドロキシル基とＧｌｃＮ残基の２位のアミノ基には硫酸基を保持しないもの）
・ＤＳＨ（脱硫酸化Ｈｅｐ；ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ；Ｈｅｐを完全に脱硫酸化したもの）
・ＮＡＨ（Ｎ−アセチルヘパロザン；Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  ｈｅｐａｒｏｓａｎ）
・ＣＤＳ（デルマタン硫酸；ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）
・６ＯＳＣＤＳ（デルマタン硫酸におけるガラクトサミン残基の６位を硫酸化したもの）【００４８】  これらの糖は、全て生化学工業株式会社より入手可能である。Ｈｅｐは同社から試薬として販売されているものを用いた。なお２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、Ｈｅｐを原料として、特開２００３−１１３０９０号公報及び特開２００３−１１９１４６号公報に記載された方法に従って製造されたものである。【００４９】  ここで用いたＨｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨを、ＷＯ００／０６６０８に記載された「ＧＡＧ分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖分析法」により分析した（表１）。表中ΔＤｉＨＳ−０Ｓは２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ＮＳは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−６Ｓは２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ＵＳは２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓは２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースを、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースをそれぞれ示す。【００５０】
【表１】
0005153324.tif 000002
【００５１】  またこれらの重量平均分子量をＷＯ００／０６６０８に記載された方法により測定したところ、Ｈｅｐが１４０００、２ＤＳＨが１２０００、６ＤＳＨが１２５００、ＮＤＳＨが１１０００であった。【００５２】３．その他の試薬
ＦＢＳは、ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製のものを用いた。【００５３】＜２＞方法と結果
１．細胞分化に対する作用（１）
細胞の分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性を測定した。２４ウエルの培養プレートに、５×１０３細胞／ウエルの割合で細胞を播種し、２％ＦＢＳを含有するαＭＥＭに被験サンプルをを終濃度５０μｇ／ｍｌで添加して培養した。細胞がコンフルエントに達した時点から１週間目に以下の酵素化学的方法（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法）によってＡＬＰ活性を測定した。【００５４】（ＡＬＰ活性の測定方法）
培養細胞をＰＢＳで洗浄後、超音波ホモジナイザー（Ｈａｎｄｙ  Ｓｏｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ＵＲ−２０Ｐ；トミー工業製）を用いて１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００μｌ）中で４０秒間細胞を破砕し撹拌した。次いで、このサンプル液２５μｌをＡＬＰ緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．８、６．７ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１２５μｌに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした．０．２Ｎ  ＮａＯＨを１２５μｌを添加することによって反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。算出されたＡＬＰ活性は、細胞数あたりの単位（ユニット）で示した。また被験サンプルを添加しないものをコントロールとした。【００５５】  ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に対して各種被験サンプルを添加した結果を図１に、別途ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に対して被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ）を添加した結果を図２に、ＳＴ２細胞株に対して被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ）を添加した結果を図３にそれぞれ示す。【００５６】  図１及び図２より、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のＡＬＰ活性を増強させた。なかでも、Ｈｅｐは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のＡＬＰ活性の増強に対して特に有効であることが示された。【００５７】  また図３より、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれもＳＴ２細胞株のＡＬＰ活性を増強させた。なかでもＮＤＳＨは、ＳＴ２細胞株のＡＬＰ活性の増強に対して特に有効であることが示された。【００５８】  これらの結果から、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれも骨髄由来間葉系細胞及び骨芽細胞のＡＬＰ活性を増強させることが示された。このことは、Ｈｅｐ骨格中において２位、６位及びＮ位からなる群から選択されるいずれか２つ以上の位置に硫酸基が保持されていることが、これらの細胞のＡＬＰ活性の増強に必要であることを示すものである。【００５９】  なかでもＨｅｐは骨芽細胞のＡＬＰ活性を特に効果的に増強させ、ＮＤＳＨは骨髄由来間葉系細胞のＡＬＰ活性を特に効果的に増強させることが示された。【００６０】２．細胞分化に対する作用（２）
前記の「細胞分化に対する作用（１）」における培地を、血清を含有しない培地（無血清培地）に換えて同様にＡＬＰ活性を測定した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に対して被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ）を添加した結果を図４に、ＳＴ２細胞株に対して被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ）を添加した結果を図５にそれぞれ示す。なお算出されたＡＬＰ活性は、細胞のＤＮＡ重量あたりの数値で示した。【００６１】  図４より、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれも無血清条件下でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のＡＬＰ活性を増強させた。なかでも、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のＡＬＰ活性の増強に対して特に有効であることが示された。
また図５より、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれも無血清条件下でＳＴ２細胞株のＡＬＰ活性を増強させた。なかでも２ＤＳＨは、ＳＴ２細胞株のＡＬＰ活性の増強に対して特に有効であることが示された。【００６２】  これらの結果から、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、いずれも無血清条件下で骨髄由来間葉系細胞及び骨芽細胞のＡＬＰ活性を増強させることが示された。このことは、Ｈｅｐ骨格中において２位、６位及びＮ位からなる群から選択されるいずれか２つ以上の位置に硫酸基が保持されているＨｅｐは、血清中に含まれる種々の因子を介さずに直接これらの細胞に作用して、ＡＬＰ活性を増強させる作用を有していることを示すものである。【００６３】  なかでもＨｅｐ、２ＤＳＨ及びＮＤＳＨは骨芽細胞のＡＬＰ活性を特に効果的に増強させ、２ＤＳＨは骨髄由来間葉系細胞のＡＬＰ活性を特に効果的に増強させることが示された。【００６４】３．細胞分化に対する作用（３）
前記の「細胞分化に対する作用（１）」において、被験サンプルの添加後１週間目及び２週間目にそれぞれ細胞を回収して全ＲＮＡを抽出し、ＣＯＬＩ、ＡＬＰ、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、ＢＳＰ、及びＢＭＰ−２のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した。【００６５】  その結果、ＳＴ２細胞株では、ＲＴ−ＰＣＲによる解析によってもＡＬＰ  ｍＲＮＡの高い誘導が確認された。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株では、ＡＬＰに加えてＣＯＬＩ及びＢＳＰ  ｍＲＮＡの発現の誘導も観察された。【００６６】４．細胞分化に対する作用（４）
細胞の石灰化能を検討するため、前記の「細胞分化に対する作用（１）」において、細胞がコンフルエントに達した時点から１週間目に、常法に従ってアリザリン染色（ＡＬＺ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；赤く染色されるほど石灰化が促進されている）を行った。細胞をＰＢＳで洗浄後、１０中性緩衝ホルマリンにて固定し、０．０１アリザリンレッドＳ（和光純薬）にて染色した。【００６７】  その結果、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、ＳＴ２細胞株及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のいずれに対しても石灰化物の形成を促進した。特にＳＴ２細胞株では、Ｈｅｐ、２ＤＳＨ及びＮＤＳＨが強い促進を示した。【００６８】５．細胞分化に対する作用（５）
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラットを、体重１００ｇ当たり０．５ｍｌ量のカルバミル酸エチル２０溶液で全身麻酔した後、前頭部の皮膚及び骨膜を切開し、頭蓋骨膜下に、ＰＢＳで濃度３ｍｇ／ｍｌに希釈した被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ；それぞれ１００μｌ）を移植した。その際、ハイドロキシアパタイトを担体として用いた。【００６９】  具体的には、濃度３ｍｇ／ｍｌの被験サンプルにハイドロキシアパタイトのブロック（サイズ：縦３ｍｍ  ｘ  横２ｍｍ  ｘ  高さ２ｍｍ；約０．１ｍｌの溶液を吸収する）を３０分間浸し、これを移植に用いた。
被験サンプルを含有しないＰＢＳを用いたものをコントロールとした。【００７０】  被験サンプルの移植後４週間目と８週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成し、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ染色）して光学顕微鏡で観察することにより、硬組織（骨）の形成の程度を評価した。【００７１】  その結果、コントロール群では血管や線維性結合組織のみが観察され、骨形成は観察されなかった。一方、Ｈｅｐ群、２ＤＳＨ群、６ＤＳＨ群又はＮＤＳＨ群では、いずれも骨形成が観察された。なかでも２ＤＳＨ群では、顕著な骨の形成が認められた。【００７２】６．細胞分化に対する作用（６）
前記の「５．細胞分化に対する作用（５）」と同様に被験サンプルを移植後、４週間目と６週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した（各群ともｎ＝２）。当該切片の画像中に観察されるハイドロキシアパタイト領域の面積に対する、形成された骨（硬組織）の面積の割合を画像解析ソフト（Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ；Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解析した。結果を図６に示す。なお図６中の灰色の棒は４週間目における結果を、黒色の棒は６週間目における結果をそれぞれ示す。【００７３】  図６より、Ｈｅｐ群、２ＤＳＨ群、６ＤＳＨ群又はＮＤＳＨ群では、４週間目及び６週間目ともに広い範囲で骨（硬組織）の形成が認められたが、コントロール群においてはほとんど認められないことが示された。なかでも、２ＤＳＨとＮＤＳＨにおいてその効果が顕著であった。【００７４】７．細胞分化に対する作用（７）
前記の「５．細胞分化に対する作用（５）」と同様に被験サンプルを移植後、４週間目、８週間目及び１２週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した（各群ともｎ＝５）。移植領域の切片画像中に観察される全組織の面積に対する、骨組織の面積の割合を、画像解析ソフト（Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ；Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解析した。結果を図７に示す。なお図７中の各週における棒は、いずれも左からコントロール群、２ＤＳＨ群、６ＤＳＨ群、ＮＤＳＨ群、Ｈｅｐ群における結果をそれぞれ示す。【００７５】  図７より、Ｈｅｐ群、２ＤＳＨ群、６ＤＳＨ群又はＮＤＳＨ群では、４週間目、８週間目及び１２週間目のいずれにおいても広い範囲で骨（硬組織）の形成が認められたが、コントロール群においてはほとんど認められないことが示された。なかでも、２ＤＳＨ、Ｈｅｐ及びＮＤＳＨにおいてその効果が顕著であった。これらの結果は、別個独立に行った「５．細胞分化に対する作用（５）」及び「６．細胞分化に対する作用（６）」の結果とも整合することから、再現性あるものであることが示された。【００７６】８．細胞増殖に対する作用
２４ウエルの培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、細胞を５×１０３細胞／ウエルの割合で播種した。播種後１日目から、被験サンプル（Ｈｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ又はＮＤＳＨ）を終濃度５０μｇ／ｍｌで培養液（２％ＦＢＳを含有するαＭＥＭ）に添加した。被験サンプルを添加してから０日目、１日目、３日目及び６日目に、コールターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲ  Ｚ１，Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社製）を用いて細胞数を計測した。被験サンプルを添加しないものをコントロールとした。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の結果を図８に、ＳＴ２細胞株の結果を図９に示す。図８及び図９における横軸は被験サンプル添加後の日数を、縦軸は細胞数を示す。【００７７】  図８より、いずれの被験サンプルもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の増殖を抑制したが、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨの増殖抑制効果は、いずれもＨｅｐに比して小さかった。また図９より、２ＤＳＨはＳＴ２細胞株の増殖を促進したが、Ｈｅｐは逆に抑制した。【００７８】  この結果から、２ＤＳＨは、骨髄由来間葉系細胞の増殖を促進する効果を発揮することが示された。また、Ｈｅｐは骨髄由来間葉系細胞の増殖を抑制する効果を発揮することが示された。【００７９】  またＨｅｐ、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ及びＮＤＳＨのいずれも、骨芽細胞の増殖を抑制する効果を発揮することが示された。【００８０】  以上の結果を総合的に勘案すると、２ＤＳＨ及びＮＤＳＨは、骨髄由来間葉系細胞や骨芽細胞におけるＡＬＰ活性の増加や、骨（硬組織）の形成に対して特に有効であることが示された。【００８１】９．製剤例
以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の剤形がこれらに限定されるものではない。【００８２】（１）軟膏剤
Ｈｅｐ  １０ｍｇ
モノステアリン酸ソルビタン  ７ｍｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン  ７ｍｇ
パルミチン酸イソプロピル  ３７ｍｇ
ワセリン  ３７ｍｇ
流動パラフィン  ３７ｍｇ
セタノール  ５０ｍｇ
グリセリン  ７０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
上記成分に精製水を加えて、１ｇのクリームとした。【００８３】（２）錠剤
２ＤＳＨ  １００ｍｇ
乳糖  ６７０ｍｇ
バレイショデンプン  １５０ｍｇ
結晶セルロース  ６０ｍｇ
軽質無水ケイ酸  ５０ｍｇ
上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース１０重量％）を加えて混練したのち造粒した。これを径０．８ｍｍのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５ｍｇを加え２００ｍｇづつ打錠して錠剤を得た。【００８４】（３）カプセル剤
６ＤＳＨ  １００ｍｇ
乳糖  ８０ｍｇ
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。【００８５】（４）注射剤
ＮＤＳＨ  ３０ｍｇ
上記成分を５％マンニトール水溶液２ｍＬに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。【００８６】（５）用時溶解用注射剤
（Ａ）２ＤＳＨ（凍結乾燥体）３０ｍｇ（アンプル封入した）
（Ｂ）無菌濾過したＰＢＳ  ２ｍＬ（アンプル封入した）
上記（Ａ）および（Ｂ）を１セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には（Ａ）を（Ｂ）で溶解して用いることができる。【００８７】  なお本発明の剤の有効成分は、前記の薬効薬理試験において細胞や動物の状態を毎日観察したが、特段の変化は認められなかった。これらのことから、本発明の剤の安全性が十分に推定される。【００８８】  本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００５年３月１４日出願の日本特許出願（特願２００５−０７１０２３）及び２００５年６月１６日出願の日本特許出願（特願２００５−１７６３１１）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】本発明の剤は、硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞のＡＬＰ活性増強などを目的とする医薬や試薬などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＡＬＰ活性の増強を示す図である。
【図２】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＡＬＰ活性の増強を示す図である。
【図３】ＳＴ２細胞におけるＡＬＰ活性の増強を示す図である。
【図４】無血清条件下での、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＡＬＰ活性の増強を示す図である。
【図５】無血清条件下での、ＳＴ２細胞におけるＡＬＰ活性の増強を示す図である。
【図６】骨（硬組織）が形成された部分の面積の割合を示す図である。
【図７】骨（硬組織）が形成された部分の面積の割合を示す図である。
【図８】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖に対する影響を示す図である。
【図９】ＳＴ２細胞の増殖に対する影響を示す図である。
【図１】
0005153324.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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