(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に存在する配列番号：１に記載の塩基配列に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA、若しくは、
以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：9、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【請求項２】
二重鎖RNAが、配列番号：１に記載の塩基配列と配列番号：２に記載の塩基配列との対合を含む、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
標的細胞が癌細胞である、請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する細胞死誘導剤。
（ａ）以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【請求項６】
細胞死がミトコンドリアを介して誘導されることを特徴とする、請求項５に記載の細胞死誘導剤。
【請求項７】
標的細胞が癌細胞である、請求項５又は６に記載の細胞死誘導剤。
【請求項８】
標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、請求項５又は６のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
【請求項９】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の抗癌剤に対する感受性を増強させる薬剤。
（ａ）二重鎖RNAが、以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる薬剤。
（ａ）二重鎖RNAが、以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【請求項１１】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞においてミトコンドリア膜電位を消失させる薬剤。
（ａ）二重鎖RNAが、以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【請求項１２】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞質へのチトクロムCの放出を増強する薬剤。
（ａ）二重鎖RNAが、以下の（１）〜（２）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む、WT1遺伝子の発現を抑制する二重鎖RNA；
（１）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、若しくは
（２）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA、又は
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、WT1遺伝子の発現を抑制するsiRNAおよびその利用に関する。特に本発明は、該siRNAを利用した細胞増殖の抑制、または細胞死の誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルムス腫瘍遺伝子（WT1遺伝子）は、ジンクフィンガー型の転写因子をコードする遺伝子である。WT1は、WT1遺伝子に存在する2か所のalternative splicing部位のうちの5’側の部位に挿入された17個のアミノ酸（17AA）の有無とジンクフィンガー3 - 4間の3アミノ酸残基の有無によって区別される、４つのアイソフォームの存在が知られている。【０００３】
ウイルムス腫瘍遺伝子（WT1遺伝子）は、小児腎腫瘍の原因遺伝子として単離された（非特許文献１、２）。ウイルムス腫瘍でこの遺伝子の欠損や突然変異が見つかったこと等から、従来は癌抑制遺伝子と考えられてきた。【０００４】
しかし、本発明者らによる数々の報告は、WT1遺伝子は癌抑制遺伝子というより、むしろ癌遺伝子様の機能を果たしていることを示唆している。変異のない野生型WT1遺伝子がほとんどすべての白血病細胞で高発現され、その発現レベルは白血病患者の予後と逆相関を示すこと（非特許文献３、４）、WT1アンチセンスDNAにより白血病細胞の増殖が特異的に抑制されること（非特許文献５）、マウス正常骨髄系前駆細胞および骨髄系前駆細胞株32D C13はWT1遺伝子の強制発現により好中球への分化が抑制され、増殖するようになること（非特許文献６）、等が明らかとなった。これらの知見は、WT1遺伝子は、造血系細胞の白血病化に関与していることを示すものである。また本発明者らは、野生型WT1遺伝子が種々の固形癌においても高発現していることを報告してきた（非特許文献７-１４）。【０００５】
そこで本発明者らは、WT1遺伝子の発現を効率よく抑制することができれば、腫瘍特異的分子標的療法の開発につながると考えた。これまでに、WT1を標的とした腫瘍特異的分子標的療法の例は知られていない。
【非特許文献１】Call KM, et al : Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus. Cell 60 : 509, 1990
【非特許文献２】Gessler M, et al : Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature 343 '. 774, 1990
【非特許文献３】Inoue K, et al : WTl as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 84 : 3071, 1994
【非特許文献４】Inoue K, et al : Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemia.  Blood 89 : 1405, 1997
【非特許文献５】Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K, Ogawa H, Tatekawa T, Hirata M, Kudoh T, Akiyama T, Murakami A, Maekawa T.   Growth inhibition of human leukemic cells by WT1 (Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis.   Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.
【非特許文献６】Inoue K，et al：Wilms’tumor gene（WTl）competes with differentiation−inducing signal in hematopoietic progenitor cells．Blood 91：2969，1998
【非特許文献７】Oji, Y., Ogawa, H., Tamaki, H., Oka, Y., Tsuboi, A., Kim, E.H., Soma, T., Tatekawa, T., Kawakami, M., Asada, M., Kishimoto, T., and Sugiyama, H. Expression of the Wilms' tumor gene WT1 in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Japanese Journal of Cancer Research, 90: 194-204, 1999.
【非特許文献８】Oji, Y., Miyoshi, S., Maeda, H., Hayashi, S., Tamaki, H., Nakatsuka, S., Yao, M., Takahashi, E., Nakano, Y., Hirabayashi, H., Shintani, Y., Oka, Y., Tsuboi, A., Hosen, N., Asada, M., Fujioka, T., Murakami, M., Kanato, K., Motomura, M., Kim, E.H., Kawakami, M., Ikegame, K., Ogawa, H., Aozasa, K., Kawase, I., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in de novo lung cancers. International Journal of Cancer, 100: 304-308, 2002.
【非特許文献９】Ueda, T., Oji, Y., Naka, N., Nakano, Y., Takahashi, E., Koga, S., Asada, M., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Hosen, N., Tomita, Y., Aozasa, K., Tamai, N., Myoui, A., Yoshikawa, H., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in human bone and soft-tissue sarcomas. Cancer Science, 94: 271-276, 2003.
【非特許文献１０】Oji, Y., Inohara, H., Nakazawa, M., Nakano, Y., Akahani, S., Nakatusuka, S., Koga, S., Abeno, S., Honjo, Y., Yamamoto, Y., Iwai, S., Yoshida, K., Oka, Y., Ogawa, H., Yoshida, J., Aozasa, K., Kubo, T., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Science, 94: 523-529, 2003.
【非特許文献１１】Oji, Y., Miyoshi, Y., Koga, S., Nakano, Y., Ando, A., Nakatuska, S., Ikeba, A., Takahashi, E., Sakaguchi, N., Yokota, A., Hosen, N., Ikegame, K., Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, Y., Ogawa, H., Aozasa, K., Noguchi, S., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in primary thyroid cancer. Cancer Science, 94: 606-611, 2003.
【非特許文献１２】Oji, Y., Yamamoto, H., Nomura, M., Nakano, Y., Ikeba, A., Nakatsuka, S., Abeno, S., Kiyotoh, E., Jomgeow, T., Sekimoto, M., Nezu, R., Yoshikawa, Y., Inoue, Y., Hosen, N., Kawakami, M., Tsuboi, A., Oka, Y., Ogawa, H., Souda, S., Aozasa, K., Monden, M., and Sugiyama, H. Overexpression of the Wilms’ tumor gene WT1 in colorectal adenocarcinoma. Cancer Science, 94: 712-717, 2003.
【非特許文献１３】Oji, Y., Miyoshi, S., Takahashi, E., Koga, S., Nakano, Y., Shintani, Y., Hirabayashi, H., Matsumura, A., Iuchi, K., Ito, K., Kishimoto, Y., Tsuboi, A., Ikegame, K., Hosen, N., Oka, Y., Ogawa, H., Maeda, H., Hayashi, S., Kawase, I., and Sugiyama, H. Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WT1 in de novo non-small cell lung cancers. Neoplasma, 51:17-20, 2004.
【非特許文献１４】Oji, Y., Miyoshi, Y., Kiyotoh, E., Koga, S., Nakano, Y., Ando, A., Hosen, N., Tsuboi, A., Kawakami, M., Ikegame, K., Oka, Y., Ogawa, H., Noguchi, S., and Sugiyama, H.   Absence of mutations in the Wilms' tumor gene WT1 in primary breast cancer. Jpn J Clin Oncol, 34:74-7, 2004.
【非特許文献１５】Oji Y, Suzuki T, Nakano Y, Maruno M, Nakatsuka S, Jomgeow T, Abeno S, Tatsumi N, Yokota A, Aoyagi S, Nakazawa T, Ito K, Kanato K, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Aozasa K, Yoshimine T, Sugiyama H  Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in primary astrocytic tumors. Cancer Sci. 95:822-7,2004.
【非特許文献１６】Oji Y, Yano M, Nakano Y, Abeno S, Nakatsuka S, Ikeba A, Yasuda T, Fujiwara Y, Takiguchi S, Yamamoto H, Fujita S, Kanato K, Ito K, Jomgeow T, Kawakami M, Tsuboi A, Shirakata T, Nishida S, Hosen N, Oka Y, Aozasa K, Monden M, Sugiyama H.  Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in esophageal cancer. Anticancer Res. 24:3103-8, 2004.
【非特許文献１７】Oji Y, Nakamori S, Fujikawa M, Nakatsuka S, Yokota A, Tatsumi N, Abeno S, Ikeba A, Takashima S, Tsujie M, Yamamoto H, Sakon M, Nezu R, Kawano K, Nishida S, Ikegame K, Kawakami M, Tsuboi A, Oka Y, Yoshikawa K, Aozasa K, Monden M, Sugiyama H. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Sci. 95:583-7,2004.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、WT1遺伝子の発現を効率的に抑制することができる分子を提供すると供に、該分子を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、または細胞死誘導剤を提供することを課題とする。WT1遺伝子の発現を抑制する分子として、特に本発明は、siRNA、該siRNAをコードするDNA、および該DNAを含むベクターを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、近年遺伝子発現抑制の手段として注目されているsiRNAを癌細胞内で発現させるベクターを用いてWT1の発現を抑制することを考えた。試行錯誤の結果、本発明者らはWT1遺伝子の転写産物に相補的なRNA および該RNAの相補鎖からなるsiRNAが、WT1遺伝子の発現を抑制するのみならず、顕著に癌細胞株の細胞増殖抑制効果を示すことを見出した。さらに、該siRNAが、ミトコンドリアを介した細胞死を誘導する効果、および、癌細胞の抗癌剤や細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる効果を有することを見出した。【０００８】
すなわち、本発明者らはWT1を標的とするRNAi効果を利用した細胞増殖抑制剤、および細胞死誘導剤を開発することに成功し、これにより本発明を完成させるに至った。【０００９】
即ち、本発明は、以下の[１]〜[２０]を提供するものである。
[１]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[２]  二重鎖RNAが、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、[１]に記載の細胞増殖抑制剤
[３]  二重鎖RNAが、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に存在する配列番号：１に記載の塩基配列に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む、[１]に記載の細胞増殖抑制剤
[４]  二重鎖RNAが配列番号：１に記載の塩基配列と配列番号：２に記載の塩基配列との対合を含む、[１]に記載の細胞増殖抑制剤
[５]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[１]に記載の細胞増殖抑制剤
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[６]  標的細胞が癌細胞である、[１]〜[５]のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
[７]  標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、[１]〜[５]のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
[８]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する細胞死誘導剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[９]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[８]に記載の細胞死誘導剤。
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[１０]  細胞死がミトコンドリアを介して誘導されることを特徴とする、[８]または[９]に記載の細胞死誘導剤。
[１１]  標的細胞が癌細胞である、[８]〜[１０]のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
[１２]  標的細胞が線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞のいずれかである、[８]〜[１０]のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
[１３]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の抗癌剤に対する感受性を増強させる薬剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[１４]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[１３]に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[１５]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞の細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる薬剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[１６]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[１５]に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[１７]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、癌細胞においてミトコンドリア膜電位を消失させる薬剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[１８]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[１７]に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
[１９]  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞質へのチトクロムCの放出を増強する薬剤。
（ａ）WT1遺伝子の転写産物に相補的なRNAと該RNAに相補的なRNAとを含む二重鎖RNA
（ｂ）（ａ）の二重鎖RNAをコードするDNA
（ｃ）（ｂ）のDNAが挿入されたベクター
[２０]  二重鎖RNAが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAにコードされるRNA、および該RNAに相補的なRNAを含む二重鎖RNAである、[１９]に記載の薬剤。
（ａ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：９、12、14、または16のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｃ）配列番号：11、13、15、または17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ベクター型WT1-siRNAによるHT-1080細胞の増殖抑制を示す図である。
【図２】ベクター型WT1-siRNAによる17AA(+) WT1 mRNAの発現抑制を示す写真である。
【図３】ベクター型WT1-siRNAの標的部位を示す図である。
【図４】ベクター型WT1-siRNAの構造を示す図である。
【図５】ベクター型WT1-siRNAによるWT1タンパク質の発現抑制を示す写真である。
【図６】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞の増殖抑制を示す図である。
【図７】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞の増殖抑制を示す図である。
【図８】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞のアポトーシスの誘導を示す図である。
【図９】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞のアポトーシスの誘導を示す図である。
【図１０】ベクター型WT1-siRNAによるミトコンドリア膜電位の消失を示す図である。
【図１１】ベクター型WT1-siRNAによるミトコンドリア膜電位の消失を示す図である。
【図１２】ベクター型WT1-siRNAと抗癌剤ドキソルビシンの併用による癌細胞の増殖抑制を示す図である。
【図１３】ベクター型WT1-siRNAと抗癌剤エトポシドの併用による癌細胞の増殖抑制を示す図である。
【図１４】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞のドキソルビシン感受性の増強を示す図である。
【図１５】ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞のエトポシド感受性の増強を示す図である。
【図１６】ベクター型WT1-siRNAおよび抗癌剤の併用による、癌細胞におけるチトクロムｃ放出の増強を示す写真である。
【図１７】ベクター型WT1-siRNAおよび抗癌剤の併用による、癌細胞におけるミトコンドリア膜電子の消失の増強を示す図である。
【図１８】ベクター型WT1-siRNAおよび抗癌剤の併用による、癌細胞におけるミトコンドリア膜電子の消失の増強を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のsiRNAは、標的であるWT1遺伝子の転写産物と相補的なRNA（アンチセンスRNA鎖）および該RNAに相補的なRNA（センスRNA鎖）が結合した二重鎖RNAである。本発明のsiRNAの標的となるWT1遺伝子の転写産物の配列としては、siRNAがRNAi効果を示しうる限り特に制限はない。好ましくは、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に存在する配列である。本発明において「17AA 部位」とは、WT1遺伝子の転写産物の配列中、WT1遺伝子に存在する2か所のalternative splicing部位のうちの5’側の部位で17個のアミノ酸に相当する部位をさす。このような標的配列の具体的な例として、配列番号：１の配列を挙げることができる。本実施例において用いた、WT1遺伝子の転写産物の17AA部位に対するsiRNAのセンス鎖の塩基配列を配列番号：１に、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号：２に示した。本発明のsiRNAは、配列番号：１の塩基配列と配列番号：２の塩基配列の対合を含むものであることが特に好ましい。【００１２】
siRNAは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜30塩基対とすることができる。【００１３】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。【００１４】
本発明のsiRNAの末端構造は、WT1遺伝子の発現をRNAi効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、3'末端側が突出している構造だけでなく、上記RNAi効果を誘導し得る限り5'末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、すでに報告がある2，3塩基に限定されず、RNAi効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、1〜8塩基、好適には、2〜4塩基とすることができる。また、この突出している配列部分は、WT1遺伝子の転写産物との特異性が低いため、標的であるWT1遺伝子転写物の配列と相補的（アンチセンス）配列あるいは同じ（センス）配列である必要は必ずしもない。【００１５】
本発明のsiRNAは、WT1遺伝子、好ましくは17AA(+)アイソフォームの塩基配列を基に標的となる配列を選択し、調製することができる。17AA(+)アイソフォームとは、上述の17AAを有するアイソフォームをいう。本発明者らは、WT1の4種のアイソフォームのうち17AA(+)が癌遺伝子様機能を担っていることを明らかにしてきた（非特許文献６、非特許文献７）。調製は例えば、WT1遺伝子塩基配列に基づき、標的配列として転写産物であるmRNAの連続する領域、好ましくは17AA部位の領域の配列を選択する。選択した領域に対応する二重鎖RNAを、化学的in vitro合成系、ファージRNAポリメラーゼを用いたin vitro転写法、クローン化cDNA をもとに転写・会合した長いdsRNAをRNaseIIIまたはDicerによって切断する方法等によって、適宜調製することができる。実施例で使用したヒトWT1遺伝子のｃDNA配列を配列番号６に示す。該WT1遺伝子の17AA 部位は、配列番号６に示した配列の第1137位から第1187位である。該WT1遺伝子は、NCBI GEN BANK NM_024426に登録されている。【００１６】
本発明のsiRNAは、WT1遺伝子中の任意の部位の塩基配列を基に標的となる配列を選択し、調整を行ってもよい。【００１７】
WT1遺伝子中の好ましい塩基配列としては、WT1ゲノムDNA中第1500位から第1529位（配列番号：９）、第2059位から第2088位（配列番号：１２）、第2928位から第2957位（配列番号：１４）、第3256位から第3285位の塩基配列（配列番号：１６）、またはこれらの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、あらかじめ定められた配列をもつ分子（すなわち第2のポリペプチド）がDNAまたはRNAの試料中に存在する場合、適切にストリンジェントな ハイブリダイゼーション条件の下で、ハイブリダイズする、二本鎖になる、または本質的に互いにのみ結合する核酸分子を指す。ストリンジェントな条件とは、 例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、 65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要 素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。【００１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、より好ましくは配列番号：１１、１３、１５、または１７のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAを挙げることができる。【００１９】
本発明のsiRNAは、上記アンチセンスRNA鎖をコードするDNA（以下、アンチセンスコードDNA）および上記センスRNA鎖をコードするDNA（以下、センスコードDNA）を用いて、細胞内で発現させることもできる（以下、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAを本発明DNAと略称する。）。上記「アンチセンスコードDNA」および「センスコードDNA」は、プロモーターと共にそのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内でアンチセンスRNA、センスRNAを発現させsiRNAを形成させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記siRNA発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型DNA(Zanta M.A. et al., Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5;96(1):91-6)、ヌクレアーゼ耐性を持つような修飾DNA、またはnaked plasmidもまた好適に用いることができる（Liu F, Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature. J. Gene Med. 2001 Nov-Dec;3(6):569-76）【００２０】
本発明のsiRNAをコードするDNAを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。【００２１】
ベクターに挿入する本発明のsiRNAをコードするDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary ‘hairpin’ RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A. et al. Nature, 407:319, 2000、Wesley, S.V. et al. Plant J. 27:581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）を用いることもできる。【００２２】
本発明において、標的配列のインバーテッドリピートの間に挿入される塩基配列は特に限定されないが、好ましくは配列番号：１８に記載の塩基配列（loop1）または配列番号：３中のループ配列AAAACTCGAGAAAA、より好ましくは配列番号：１９に記載の塩基配列（loop2）を挙げることが出来る。【００２３】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。【００２４】
即ち、本発明における「siRNA（二重鎖RNA）をコードするDNA」は、siRNAの双方の鎖をコードする一つのDNAであっても、それぞれの鎖をコードする２つのDNAの組合せであってもよい。また、「siRNA（二重鎖RNA）をコードするDNAが挿入されたベクター」は、siRNAのそれぞれの鎖を２つの転写産物として発現する一つのベクターであっても、siRNAの双方の鎖を１つの転写産物として発現する一つのベクターであってもよく、また、siRNAのそれぞれの鎖を発現する２つのベクターであってもよい。【００２５】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、96,97,98,99％以上）の配列の同一性を有する。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００２６】
本発明のsiRNA、該siRNAをコードするDNA、該DNAが挿入されたベクターは、それぞれ、そのままあるいは適宜配合剤と混合して本発明の薬剤として使用することができる。本発明の薬剤を公知トランスフェクション試薬等を用いて細胞に導入すれば、細胞内でRNAi効果が発揮され、本発明の薬剤の効果が発現される。【００２７】
本発明の「薬剤の効果」としては、細胞増殖抑制効果、細胞死誘導効果、または癌細胞の抗癌剤や細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる効果等を挙げることが出来る。さらに、癌細胞においてミトコンドリア膜電位を失わせる効果や、ミトコンドリアから細胞質へのチトクロムｃの放出を増強する効果も本発明の効果として挙げることが出来る。【００２８】
該効果は、一時的な効果であってもよいし、ある一定期間が経過した際に最終的に効果が発現されるものであってもよい。【００２９】
本発明における、細胞死（アポトーシス）誘導効果としては、好ましくはミトコンドリアを介した細胞死の誘導効果が挙げられるが、特に限定されるものではない。【００３０】
本発明の薬剤を癌細胞に添加し、癌細胞においてミトコンドリア膜電位の消失や、細胞質へのチトクロムCの放出の増強が確認された場合も、細胞死が誘導されたものとみなすことが出来る。【００３１】
本発明において癌細胞の感受性が増強される抗癌剤は、特に限定されないが、好ましくは、ドキソルビシンまたはエトポシドを挙げることが出来る。また、本発明において癌細胞の感受性が増強される細胞死誘導剤は、特に限定されないが、好ましくは、癌細胞特異的細胞死誘導剤TRAILを挙げることが出来る。【００３２】
本発明の薬剤の効果が期待される細胞は、WT1遺伝子を発現する細胞である。一例として、癌細胞を挙げることができる。より具体的には、白血病、大腸癌、肺癌、乳癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、胃癌、甲状腺癌、骨および軟部肉腫、卵巣癌、子宮癌、腎癌、膵癌、またはグリオブラストーマにおける癌細胞を例示することができる。本発明における癌細胞は特に限定されないが、好ましくは、線維肉腫細胞、大腸癌細胞、白血病細胞、または胃癌細胞、より好ましくは、HT-1080、HL-60、SW620、またはAZ-521を挙げることが出来る。したがって、本発明の薬剤は、学術研究用としてのみならず、癌治療用医薬品、特に上記に列挙した癌を対象とする癌治療用医薬品として有効と考えられる。【００３３】
本発明の薬剤を癌治療用医薬品として使用する場合は、適宜製剤化することができる。製剤化においては、薬学上許容される配合剤を混合することができる。薬学上許容される配合剤として、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。上記製剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。また、本発明のDNAを生体内に投与する場合、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、例えばin vivo法およびex vivo法を挙げることができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
<実施例に用いた細胞>【００３５】
以下の実施例では、4種のWT1発現細胞株、線維肉腫細胞 HT-1080、胃癌細胞 AZ-521、大腸癌細胞SW620および前骨髄球性白血病細胞 HL-60と、1種のWT1非発現細胞株である肺癌細胞 PC-14を用いた。HT-1080、AZ-521およびPC-14はDMEM 10%FBS含有培地、SW620およびHL-60はRPMI 10%FBS含有培地で、37℃、5%CO2下で培養した。【００３６】
［実施例１］WT1遺伝子mRNA 17AA部位を標的とするsiRNA発現ベクターの作製
WT1遺伝子mRNA 17AA部位を標的とするsiRNA発現ベクター作製のため、挿入するDNAを作製した。該標的部位の具体的位置は、配列番号６に示したWT1遺伝子配列の第150位から第179位である。作製した配列を下記に示す（配列番号：３）。
5'- C CCT TCT GTC CAT TTC ACT GAG CTG GAG CT
（標的RNAのアンチセンス鎖-30mer-をコードするDNA）-
-AAAACTCGAGAAAA （ループシークエンスXhoIサイトを含む）-
-AG CTC CAG CTC AGT GAA ATG GAC AGA AGG G
（標的RNAのセンス鎖-30mer-をコードするDNA）-
-GGTACCCCGGATATCTTTTTTT-3'【００３７】
上記DNAをsiRNA発現ベクターのクローニング部位に挿入し、WRI4ベクターを作製した。siRNA発現ベクターは、東京大学大学院工学系研究科  川崎広明先生から供与をうけたsiRNA発現ベクター(pPuro-tRNA-SKE vector)を使用した。pPuro-tRNA-SKE vectorの代わりに、piGENEtRNA Pur Vector （クローンテック社）を使用することも可能である。【００３８】
また、WT1遺伝子ｍRNAの４種のアイソフォームの共通配列を標的とするsiRNA発現ベクターとして、WRI3ベクターを作製した。WRI3ベクターは、
aag gtg gct cct aag ttc atc tga ttc cag（アンチセンスRNA鎖をコードするDNA、配列番号４）
ctg gaa tca gat gaa ctt agg agc cac ctt（センスRNA鎖をコードするDNA、配列番号５）
を含む。WRI3による標的部位は、配列番号６に示したWT1遺伝子配列の第1101位から1130位である。【００３９】
［実施例２］細胞培養およびsiRNA発現ベクターの導入
WT1遺伝子を高発現するFibrosarcoma cell line HT-1080細胞を10％含Dulbecco’s Modified Medium(DMEM)  中で培養した。トリプシナイズしたHT-1080細胞2ｘ104 cells/2mlを6 well plateにまき、24時間後にFugene 6 (ROCHE)を用いてWRI4ベクターあるいは空ベクター2μgをHT-1080細胞へ導入した。【００４０】
［実施例３］siRNA発現ベクターによるHT-1080細胞の増殖抑制
WRI4ベクターによる細胞増殖抑制効果を検討した。ベクターを導入したHT-1080細胞を、24h、48h、または72h培養し、細胞数を算定した。細胞数の算定は、トリプシナイズした後算定板を用いて算定した。【００４１】
HT-1080細胞にWT1に対するsiRNA発現ベクターを導入するとコントロールの空ベクターを導入したときに比べ有意にHT-1080細胞の増殖を抑制した。結果を図１に示す。【００４２】
また、WRI3発現ベクターをHT-1080細胞に導入し、細胞増殖抑制効果を検討したところ、WRI4発現ベクターより弱いが、一定の細胞増殖抑制効果を確認できた。【００４３】
［実施例４］siRNA発現ベクターによるWT117AA mRNAの発現抑制
WRI4ベクターによるWT117AA mRNAの発現抑制効果をRT-PCR法により検討した。【００４４】
HT-1080細胞2ｘ104細胞に対しWT1 17AA部位に対するRNAi発現ベクターWRI-4または空ベクター2μgをFugene6 (Roche)を用いてLipofectionにより細胞内に導入した。導入後96Hrで細胞を回収した。細胞をトリプシナイズしPBSにて2回洗浄後、Trizolを用いてtotal RNAを抽出し、2μgのtotal RNAを鋳型とし、dT primerを用いMMLV reverse transcriptase存在下でcDNAを合成した。次に、WT1の17AA部位をはさむように設計したフォワードプライマー  5’- gac ctg gaa tca gat gaa ctt ag -3’（配列番号７）及びリバースプライマー  5’- gag aac ttt cgc tga caa gtt -3’（配列番号８）を用いてPCRを行い、そのPCR産物をアガロースゲル中で電気泳動を行って、WT1 17AA(+)および17AA(-) mRNAの発現について解析した。【００４５】
結果を図２に示す。WRI-4発現ベクターを導入した細胞で17AA(+) WT1 mRNAの発現の低下が認められた。【００４６】
[実施例５] siRNA vectorsの構築
loop1配列(40nt、配列番号：１８)を含むWT1mRNAに特異的な配列 ( センス鎖(30nt) ‐ loop1(40nt、配列番号：１８) - アンチセンス鎖(30nt) )のオリゴヌクレオチドを1種類、およびloop2配列(10nt : human pre-miR-23のloop配列、配列番号：１９)を含むWT1mRNAに特異的な配列( センス鎖(30nt) - loop2(10nt、配列番号：１９) - アンチセンス鎖(30nt) )のオリゴヌクレオチドを5種類合成した(Japan Bio Service)。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングした後piGENEtRNA Pur Vector (Clonetech)のtRNAValpromoterの下流に挿入し、loop1(40nt、配列番号：１８)を含むdsRNAを転写するloop1-WRI-4、および、loop2(10nt)を含むdsRNAを転写するWRI-4、WRI-4ｍ、WRI-16m、WRI-17m、およびWRI-18mの計6種類のsiRNA vectorを作製した。これらのうちmと表示されているものはベクター型WT-siRNAの効果を高めるためにセンス鎖に変異を挿入した配列をもつベクターである。それぞれのsiRNA vectorの標的部位および配列を図３、図４および表1に示す。【００４７】
【表１】
0005165890.tif 000002
a:sense sequenceの下線は変異の挿入を示す。
b:loop1の配列はAAAACTCGAGAAAAAAGGGAGCACAACCATCTGCATTTGAGAGG(配列番号:18)、loop2の配列はCTTCCTGTCA(配列番号:19)である。【００４８】
[実施例６] ベクター型WT1-siRNA によるWT1遺伝子の発現抑制
WT1mRNAの様々な部位を標的とする6種類のベクター型WT1-siRNA ：loop1-WRI4, WRI-4, WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mまたはWRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mの混合物 (図３、図４および表1 )の線維肉腫細胞HT-1080におけるWT1遺伝子発現抑制効率について検討した。【００４９】
HT-1080細胞を6種類のベクター型WT1-siRNA、あるいはMockベクターで処理後72時間後にWT1タンパクの発現レベルをウェスタンブロットにて解析した。【００５０】
siRNA vectorsおよびMockベクターによる処理は以下の工程で行った。前日に6 well plateに細胞を蒔き、翌日WT1-siRNA expression vector、およびMockベクターをFuGENE6 ( Roche ) を用いてリポフェクション法によりトランジェントに発現させ、3日後トリプシナイズした後、細胞数を算定し、ウェスタンブロット解析にてこれらの細胞におけるWT1タンパクの発現レベルを解析した。【００５１】
ウェスタンブロット解析は以下の工程で行った。siRNA発現ベクター、およびMock ベクターをトランジェントに発現させた細胞をSDSサンプルバッファーに溶解し、タンパク質をSDS-PAGEにて分離後、PVDFメンブレンに転写した。１次抗体に抗WT1抗体C-19（Santa Cruz Biotechnology）、抗チトクロムC抗体( Pharmingen )、または抗GAPDH抗体(Chemicon)を、2次抗体にALP conjugated antirabbitまたはantimouse 抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いてBCIP-NBT キットにて発色した。【００５２】
上記のウェスタンブロット解析の結果、ＷＴ1を標的としたすべてのベクター型ＷＴ1-siRNAによってＷＴ1タンパクの発現が低下していることが明らかとなった。これらのうち、WRI-4、WRI-4m、WRI-16m、WRI-18m 、およびWRI-4m+16m+17m+1m8で処理した場合、mockベクターを導入したものに比べタンパクの発現レベルは10〜20％のレベルにまで低下したが、loop1-WRI-4、WRI-17により処理した場合WT1タンパクの発現の低下の程度は少なかった（図５）。【００５３】
[実施例７]ベクター型ＷＴ1-siRNAによる腫瘍細胞のＷＴ1特異的増殖抑制
ベクター型WT1-siRNAの細胞増殖に及ぼす影響を解析するために6種類のベクター型WT1-siRNA である、loop1-WRI4, WRI-4, WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, WRI-18mまたは、WRI-4m, WRI-16m,WRI17m, およびWRI-18mの混合物導入後72時間における細胞数をカウントした。WT1発現細胞株HT-1080線維肉腫細胞においてすべてのWT1-siRNA処理はMockベクターでの処理に比べ有意に細胞増殖を抑制した。なかでもWRI-4mは90%以上増殖を抑制した。それに対してWT1非発現細胞株PC-14肺癌細胞においては6種類のベクター型WT1-siRNAのいずれの処理によっても細胞増殖は抑制されなかった（図６）。【００５４】
さらに２種類のベクター型WT1-siRNA ( WRI-4mおよびWRI-16m )が種々のWT1発現癌細胞の増殖を抑制できるかを調べるために、これらのベクターを3種のWT1発現細胞株、AZ-521胃癌細胞、SW620大腸癌細胞およびHL-60白血病細胞に導入し72時間後において細胞数をカウントした。【００５５】
以上の結果、3種すべてのWT1発現癌細胞においてWRI-4m および WRI-16ｍ での処理はMock vectorでの処理に比べ有意に増殖を抑制した（図７）。【００５６】
[実施例８] ベクター型WT1-siRNAによるアポトーシスの誘導
ベクター型WT1-siRNAによる癌細胞の増殖抑制の機序を明らかにするために、ベクター型WT1-siRNA処理後の細胞におけるアポトーシスの誘導について解析した。2種のWT1発現細胞株HT-1080、AZ-521およびWT1非発現細胞株PC-14においてWRI-4m処理後AnnexinV-FITCおよびPIで二重染色し、フローサイトメトリーにて解析した。【００５７】
フローサイトメトリーによるアポトーシス解析は以下の工程により行った。まず、アポトーシス細胞を検出するために、1.0×105個の細胞をPBSで洗浄した後MEBCYTO Apoptosis kit (Medical and Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japan)を用いてAnnexin V-FITC、およびPIにより室温で15分間反応させ染色した。これらの細胞をFACScan flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) で解析し、Annexin V-FITC陽性細胞をアポトーシス細胞として定義した。【００５８】
以上の結果、WRI-4m処理はWT1発現細胞株HT-1080細胞の71.1%、AZ-521細胞の40.6%の細胞においてアポトーシスを誘導した。これに対してWT1非発現細胞株PC-14においては、WRI-4m処理はアポトーシスを誘導しなかった( 図８および図９ )。【００５９】
[実施例９] ベクター型WT1-siRNAによるミトコンドリア膜電位消失
ベクター型WT1-siRNAによるアポトーシス誘導がミトコンドリアを介する経路によるものかどうかを明らかにするために、WT1発現細胞株HT-1080細胞、WT1非発現細胞株PC-14細胞をWRI-4mあるいはMockベクターで処理し72時間後においてミトコンドリア膜電位の状態をMitoLight染色後フローサイトメトリーにて解析した。【００６０】
アポトーシス誘導によるミトコンドリア膜電位の変化（ΔΨm）の解析は、MitoLight apoptosis detection kit (Chemicon)を用いて行った。アポトーシス誘導後の細胞をミトコンドリア染色色素であるMitoLightを含むバッファーにて37℃、15分インキュベーションし、FACScanのFL2チャンネルにて解析した。【００６１】
以上の結果、WT1発現細胞株であるHT-1080においてWRI-4m処理はMock ベクター処理に比べて有意にミトコンドリア膜電位の消失を誘導した。しかしWT1非発現細胞株であるPC-14においてはWRI-4m処理はミトコンドリア膜電位の消失を誘導しなかった(図１０および図１１)。これらの結果はベクター型WT1-siRNAによるアポトーシス誘導がミトコンドリアを介する経路によるものであることを示す。【００６２】
[実施例１０] ベクター型WT1-siRNAと抗がん剤の併用による細胞増殖抑制の増強
抗がん剤の多くはミトコンドリアを介する経路を通じて癌細胞にアポトーシスを誘導する。そこでミトコンドリアの膜電位を消失させるベクター型WT1-siRNAを化学療法剤と併用することにより、癌細胞の抗がん剤に対する感受性を増強することができるのではないかと考えた。そこでベクター型WT1-siRNA （WRI-4mあるいはWRI-16m）処理を行った細胞と行わなかった細胞に対する抗がん剤ドキソルビシンおよびエトポシドの細胞増殖抑制を解析した。【００６３】
siRNAベクターと化学療法剤、death ligandとの併用は以下の工程により行った。前日に6 well plateに細胞を蒔き、翌日ベクター型WT1-siRNA、およびMockベクターをFuGENE6 ( Roche ) を用いてリポフェクション法によりtransientに発現させ、48時間後25μMのエトポシド( WAKO )、0.2μMのドキソルビシン( Sigma )または50mg/mlのTNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) (Peprotech)でさらに24時間処理した。【００６４】
その結果、ベクター型WT1-siRNAとドキソルビシンあるいはエトポシドの併用によりＨＴ−1080細胞はドキソルビシンあるいはエトポシド単独にくらべ細胞増殖を抑制することが明らかとなった（図１２および図１３）。【００６５】
さらにベクター型WT1-siRNA処理後の抗がん剤に対する感受性を解析するために併用処理した場合の細胞数とベクター単独処理した場合の細胞数の差のベクター単独処理した場合の細胞数に対する割合を求めた。その結果、図１４および図１５に示すようにＨＴ−1080細胞においてベクター型WT1-siRNA処理によりドキソルビシンおよびエトポシドに対する感受性が増強されることが明らかとなった。【００６６】
[実施例１１] ベクター型WT1-siRNAと抗がん剤の併用によるミトコンドリアを介するアポトーシスの誘導の増強【００６７】
ベクター型WT1-siRNAと抗がん剤の併用による細胞増殖抑制の増強がミトコンドリアを介するアポトーシスの誘導の増強によるものであることを明らかにするために、ベクター型WT1-siRNAとドキソルビシンまたはエトポシドの併用処理後におけるミトコンドリアから細胞質へのチトクロムＣの放出を解析した。【００６８】
ミトコンドリアから細胞質へのチトクロムC放出の解析は以下の工程で行った。細胞をPBSで洗浄し、氷冷したSTEバッファー(250mM sucrose, 25mM Tris, and 1mM EDTA, pH6.8)で溶解し、15,000回転15分遠心した。上清を等量の2x Laemieli’s SDSサンプルバッファーと混合しウェスタンブロット解析に使用するまで-20℃で保存した。【００６９】
以上の解析の結果、図１６に示すようにWRI-4mとそれぞれの薬剤との併用処理後、細胞質へのチトクロムCの放出が増強することが明らかとなった。【００７０】
ベクター型WT1-siRNAとドキソルビシン、エトポシドあるいはTRAILのそれぞれとの併用処理後のミトコンドリア膜電位をフローサイトメトリーにより評価した。WRI-4mとドキソルビシン、WRI-4mとエトポシドを併用処理することで、抗がん剤単独処理に比べ、ミトコンドリア膜電位の消失が有意に増強された（図１７および図１８）。【００７１】
さらに癌特異的なアポトーシス誘導剤として注目されているＴＲＡＩＬとベクター型WT1-siRNAの併用効果について解析したところ、ドキソルビシンやエトポシドとの併用と同様に、併用処理後チトクロムCの放出の増強（図１６）およびミトコンドリア膜電位の消失の増強（図１７および図１８）がみられた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によって、WT1遺伝子の発現を効率的に抑制することができるsiRNA、および該siRNAを有効成分とする細胞増殖抑制剤が提供された。また、該siRNAを有効成分とする細胞死誘導剤、および癌細胞の抗癌剤や細胞死誘導剤に対する感受性を増強させる薬剤が提供された。【００７３】
WT1遺伝子は、癌細胞に高発現することが知られていることから、本発明の薬剤は、新規抗癌剤として特に有用である。また、本発明のsiRNAを有効成分とする薬剤は、従来の抗癌剤の効果を増強させる働きがあり、従来の抗癌剤治療をより改善するものと考えられる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図５】
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【図１６】
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【配列表】
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