(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
30nm〜150nmの粒径を有する高分子ナノ粒子を用いて生理活性成分を含有することにより得られる経皮吸収剤であって、前記高分子はポリメチルメタクリレートであり、前記生理活性成分はレチノール、Co-Q10及びレスベラトロールよりなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記ポリメチルメタクリレートの量は前記生理活性成分の量に対して１〜５倍の重量比であり、前記生理活性成分を含有する高分子の含量は、経皮吸収剤の総重量に対して0.1重量％〜50重量％であり、前記生理活性成分を含有した高分子は、皮膚角質層を通過して真皮層の上部まで浸透した後、前記真皮層の上部で留まりつつ、前記含有された生理活性成分を皮膚に徐々に放出することを特徴とする経皮吸収剤。
【請求項２】
請求項１に記載の経皮吸収剤を用いて製造される外用剤組成物。
【請求項３】
前記経皮吸収剤が組成物の総重量に対して0.0001重量％〜50重量％であることを特徴とする請求項２に記載の外用剤組成物。
【請求項４】
前記外用剤組成物は、その剤型が柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、パック、ゼル、皮膚粘着タイプの化粧料、口紅、メークアップベース、ファンデーション、シャンプー、リンス、ボディクレンザー、石鹸、歯磨き、口腔清浄剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ又は噴霧剤であることを特徴とする請求項２に記載の外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナノメータサイズを有する高分子を用いた経皮吸収剤及びこれを含有する外用剤組成物に関する。より詳しくは、生体親和性に優れる高分子を用いて数乃至数百ナノメータサイズの粒子を製造し、その中に生理活性物質を含有する高分子ナノ粒子を皮膚に塗布して、前記高分子ナノ粒子が角質層の下部に浸透拡散されるが、真皮層までは浸透拡散が行われないように粒径を調節することにより、皮膚構造の中間層（真皮層の上部）に留まりつつ、有効活性成分を徐々に放出するように誘導する２段階薬物伝達メカニズムを応用した経皮吸収剤及びこれを用いた外用剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚は、人体の一次防御膜であって、温度・湿度変化、紫外線、公害物質など外部環境の刺激から体内の諸器官を保護する機能を有する。従来、このような機能を有する皮膚の老化現象を防止すると共に、より健康且つ美しい皮膚を維持するため、各種動物、植物、微生物等から得られた生理活性物質を化粧品に加えて使用することにより、皮膚の固有機能を維持し、皮膚細胞を活性化させて、皮膚老化及びメラニンの沈着を効果的に抑制するための努力がなされてきた。
【０００３】
特に、皮膚から有効活性成分を吸収させて皮膚に直接的に作用するように誘導する経皮吸収技術に対する研究が進んできた。このような経皮吸収に利用された方法は、次のように分類することができる。
【０００４】
まず、生理活性物質を適当な溶剤に溶解させ、周期的に皮膚に塗布することにより、皮膚内に有効活性成分を伝達する非常に基礎的な方法がある。この場合、多い生理活性物質に対して適当な溶剤を選定しなければならないが、このような活性成分を溶解させることができる溶剤を選定することが困難である。また、溶剤により皮膚刺激が発生することもあり、化粧料において使用感の調節が不可能なので、製品化が難しくて、この頃非常に制限的に使用されている。
【０００５】
次いで、使用感を改善し、有効活性成分の経皮吸収を促進するため、乳化物形態の経皮吸収剤が開発された。初期には、マイクロメータサイズの乳化粒子内部に有効活性成分を含有させた方式から、ナノメータサイズの乳化粒子を製造してその中に有効活性成分を含有させる技術にだんだん発展した。特に、最近、油溶性薬物と脂質、グリセロールと水、リン脂質又は水溶性非イオン性界面活性剤を使用して、ナノメータサイズ乃至マイクロメータサイズの乳化粒子を製造する技術が報告されている（米国特許第5,338,761号）。また、電荷を有するリン脂質を乳化剤として使用したナノ粒子を製造する技術が報告されている（米国特許第6,120,751号）。また、乳化剤、オイル及び水よりなる３相が適当な濃度をなす時に形成されるマイクロエマルジョン（micro-emulsion）を用いたナノサイズの乳化粒子の製造に関する技術が報告されている（米国特許第5,152,923号、WO91/06,286、 WO91/06,287）。
【０００６】
しかしながら、上記従来の技術のように、乳化粒子内部に不安定な活性成分を含有させる場合、乳化膜が外界と動的平衡状態に置かれるので、乳化物の内部にある有効活性成分が持続的に水に接し、酸化、分解による変成が生ずるという問題がある。また、乳化膜は、物理化学的に非常に弱くて不安定であるので、塩や電荷を有する有機物又は無機物による汚染により乳化膜が破壊され、熱や光に対しても非常に弱いため、長期間保管時不安定するという不具合がある。このように低分子乳化剤を使用して有効活性成分を含有するナノメータサイズの乳化粒子は、水溶液において不安定な傾向を示す活性成分に使用するには不適当であるだけでなく、活性成分を含有した乳化粒子を剤型化するに非常に大きい制約を受ける。また、高濃度の有効活性成分を含有するためには、それに比例して多量の乳化剤を使用しなければならないので、乳化剤による皮膚刺激等が生ずることができる。
【０００７】
上記問題を解決するため、活性成分を光、水分、空気中の酸素から安定化させるとともに、徐放性を付与するための方法について研究がなされているが、このような方法はカプセル形態の剤型とパッチ形態の剤型に分類することができる。
【０００８】
まず、水溶性又は油溶性活性成分をゲル内に担持させた後、皮膚に長期間接触させることにより、濃度勾配による経皮吸収を誘導する徐放形製剤であるパッチ剤型がある。このようなパッチ剤型においては、高分子マットリクス内に生理活性成分を担持し、高分子マトリックスの内側は皮膚に接し、外部は空気や光を遮断させる１次膜を被覆する方法が開発されたが、この場合、有効活性成分が皮膚内に浸透する速度が遅いため、前記有効活性成分を含有する高分子マトリックスを皮膚表面に長期間密着させるため、接着剤を使用する不便がある。
【０００９】
また、固いカプセルの内部に有効活性成分を含有させる方法が多く研究されてきたが、マイクロサイズの粒子のような小さい粒子を使用して生理活性成分を含有する研究が進行されている。例えば、マイクロカプセルが皮膚表面に長期間留りつつ、徐々に薬物を放出させる徐放性製剤に関する研究が報告されている（米国特許第5,286,495号、WO89/08,449号及びWO88/01,213号）。このように、高分子を利用するマイクロ粒子の場合、カプセルの内部に活性成分を含有することにより、安定化を図ったが、マイクロ粒子カプセルの皮膚吸収効率が高くないため、これを利用する経皮吸収剤が皮膚表面に長期間留まることになる。従って、空気、光、水分に対して持続的に露出されるので、カプセルの内部に含有される生理活性成分が不活性化されるか、変成され、皮膚刺激のような問題を引き起こす。また、活性成分の経皮吸収率もあまり高くない。一方、マイクロ粒子は、そのサイズに応じて皮膚で異物感を感じるという不具合がある。
【００１０】
上述したように、従来の経皮吸収方法は、経皮吸収率が低く、皮膚に対する不作用が大きく、有効活性成分の安定化に問題がある。従って、従来の経皮吸収剤とは異なる新たな形態の経皮徐放化剤が必要であることが現状である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記問題点を解決するため、本発明者らは、▲１▼生理活性物質の剤型内安定化、▲２▼高い経皮吸収率、▲３▼皮膚刺激の減少及び使用感の改善、▲４▼多様な活性成分の応用可能性などのような特性を有する経皮吸収剤について研究した。
その結果、本発明者らは、ナノメータサイズの高分子粒子を使用することにより、上記のような問題を解決することができることを知見し、本発明を完成することに至った。
【００１２】
従って、本発明の目的は、生理活性物質が剤型内において安定し且つ高い経皮吸収率を有し、皮膚刺激が小さく、使用感が良好であるだけでなく、多様な活性成分に応用することができる経皮吸収剤を提供することにある。
【００１３】
また、本発明の目的は、前記経皮吸収剤を含有する外用剤組成物を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、30nm〜150nmサイズの高分子ナノ粒子を利用して生理活性成分を含有することにより製造された経皮吸収剤であって、前記高分子はポリメチルメタクリレートであり、前記生理活性成分はレチノール、Co-Q10及びレスベラトロールよりなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記ポリメチルメタクリレートは前記生理活性成分の量に対して１〜５倍の重量比であり、前記生理活性成分を含有する高分子の含量は、経皮吸収剤の総重量に対して0.1重量％〜50重量％であり、前記生理活性成分を含有した高分子は、皮膚角質層を通過して真皮層の上部まで浸透した後、前記真皮層の上部で留まりつつ、前記含有された生理活性成分を皮膚に徐々に放出することを特徴とする経皮吸収剤及びこれを含有する外用剤組成物を提供する。
【００１５】
本発明による経皮吸収剤に使用される高分子のサイズは、30nm〜150nmであることが好ましく、50nmであることがより好ましい。
ここで、ナノ粒子とは、ナノメータ単位のサイズを有する粒子を意味し、粒子サイズは、粒子の直径で示した。
【００１６】
本発明に使用される生理活性成分には、抗生剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤、抗浮腫剤、鎮咳裾痰剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、抗てんかん剤、抗潰瘍剤、抗憂鬱剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、血圧降下剤、糖尿治療剤、恒常性剤、ポリペプチド、ホルモン等の医薬原料、抗酸化剤、育毛剤、養毛剤、歯肉疾患剤（抗菌剤）、美白原料、コラゲン合成促進剤、しわ除去・緩和剤、皮膚障壁強化剤及び皮膚保湿力増強剤を挙げることができる。
【００１７】
本発明に使用される高分子は、生体親和性を有する天然又は合成高分子であって、これらを単独、併用、架橋化物の形態で使用することができ、生分解性を有する高分子と生分解性のない高分子と併行して使用することができる。
【００１８】
前記経皮吸収剤は、ナノメータサイズの粒子が溶媒に分散されている状態を意味し、水溶液のうち、ナノ粒子の含量は、略0.0001重量％〜90重量％であることが好ましく、0.1重量％〜50重量％であることがより好ましく、5重量％であることがさらに好ましい。
【００１９】
本発明の皮膚外用剤組成物は、その剤型において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、パック、ゼル（gel）、皮膚粘着タイプの化粧料、口紅、メークアップベース、ファンデーション（foundation）等の剤型を有する化粧料、シャンプー、リンス、ボディクレンザー（body-cleanser）、石鹸、歯磨き、口腔清浄剤等の洗浄料組成物を挙げることができる。また、ローション、軟膏、ゲル（gel）、クリーム、パッチ又は噴霧剤のような経皮投与型医薬料剤型を挙げることができる。
【００２０】
本発明では、生体親和性に優れる高分子を使用して前記1〜500ナノメータサイズの粒子を製造し、その中に生理活性物質を含有させて、これを皮膚に塗布して、角質層下に浸透、拡散させ、真皮層までは浸透、拡散されないサイズ、好ましくは、30〜150ナノメータのサイズに調節して、皮膚構造の中間層（真皮層の上部）にナノ粒子が留まりつつ、有効活性成分を徐々に放出するように誘導する２段階薬物伝達メカニズムを利用した。皮膚の中間層、すなわち真皮層の上部まで浸透、吸収された高分子ナノ粒子は、内部に含有された生理活性有効活性成分を徐々に放出し、放出される有効活性成分の効能及び効果により皮膚細胞活性化、皮膚美百、しわ除去、抗酸化、皮膚保湿等の皮膚美容及び消炎鎮痛効果を極大化させることができる。
【００２１】
一方、皮膚中間層に留りつつ、有効活性成分を徐々に放出したナノ粒子は、皮膚のターン−オーバ周期と一緒に徐々に皮膚の外層に押し出されて皮膚から剥離される角質層と一緒に除去されるか、酵素等による生分解作用により除去されることにより、皮膚内ナノ粒子の累積現象による不作用を除去することができる。
【００２２】
すなわち、本発明は、活性成分を含有するナノ粒子が皮膚の真皮層の上層部まで浸透、拡散する高分子ナノ粒子の経皮吸収段階（第1段階）と、前記真皮層の上部まで浸透、拡散されたナノ粒子から生理活性成分が真皮層の内部に徐々に放出されるようにする生理活性成分の徐放化段階（第2段階）とを含む経皮吸収技術を利用することを特徴とする。
【００２３】
このため、数乃至数百ナノメータサイズのナノ粒子を製造して、皮膚の角質層を浸透、拡散することができるサイズを確認、決定し、その内部に生理活性成分を含有して安定化されることができ、皮膚に塗布時、皮膚の真皮層の上層部まで浸透、拡散され、そこに留まりつつ、内部に含有された生理活性物質を放出することができる粒径を確認した。また、皮膚の真皮層の上部に留まりつつ生理活性成分を放出した粒子が外部に排出されずに皮膚の内部に累積される場合は、予想しない不作用を誘発することができるので、内部に含有された生理活性成分を放出した粒子が皮膚のターン−オーバ周期と一緒に皮膚の外部に放出されるか、酵素、加水分解等の作用により生分解されて、低分子有機物に分解、除去されることができる粒子のサイズ及び種類を決定することになった。
【００２４】
その結果、1〜500ナノメータの粒子が上記のような条件を満足させることができることを知見し、粒径を上記のように限定した。粒径が1ナノメータより小さいと、浸透は容易であるが、過度に皮膚に深く浸透して外部への排出が難しく、生理活性物質を含有することが困難である。また、粒径が500ナノメータより大きいと、生理活性物質を含有することは容易であるが、皮膚内への浸透が非効率的であるという不具合がある。
高分子粒子としては、上記のように粒径だけを限定すると、従来の経皮吸収に使用される担体を使用することができる。
【００２５】
本発明において、ナノ粒子の製造に使用される高分子は、特に限定されるものではないが、例えば、天然高分子類として、アカシアガム、イリシガム(Irish moss), カラヤガム(karaya gum), トラガカントガム(gum tragacanth),グアヤクガム (gum guaiac), キサンタンガム(xanthan gum), ロカストビンガム(locust bean gum)とその誘導体が使用可能であり、カゼイン、ゼラチン、コラゲン、アルブミン、グロブリン、フィブリン等の蛋白質とその誘導体、セルロース、デキストリン、ペクチン、澱粉、アガ、マンナン等の天然由来のカーボハイドレート類及びその誘導体、合成高分子としてポリビニル類高分子とその誘導体（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエーテルなど）、ポリカルボキシ酸とその誘導体（例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレートなど）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のハイドロカーボン類とその異性質体、ポリサッカライドとその誘導体（ポリスクロース、ポリグルコース、ポリラクトース及びその塩類）などが使用可能であり、上記高分子が架橋化された形態の高分子も使用可能である。天然由来の高分子は、生体適合性に優れると知られており、前記高分子類は、本発明のナノ粒子に適用可能である。
【００２６】
その他にも、例えば、脂肪酸高分子（例えは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリマレイン酸など）とその誘導体、ポリ−、アルファ−、シアノアクリル酸とその誘導体、ポリ−、ベータ−、ヒドロキシブチル酸、ポリアルキレンオキサレート（例えば、ポリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート等）、ポリオルソエステール類（polyorthoesters）、ポリオルソカーボネート類、ポリカーボネート類（例えば、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレン−プロピレンカーボネート等）、ポリアミノ酸（例えば、ポリガンマベンジルグルタミン酸、ポリアラニン、ポリガンマメチルグルタミン酸）等が使用可能であり、生体適合性は優れるが、生分解性のないポリスチレン、ポリアクリル酸とその誘導体、ポリメタクリル酸とその誘導体、アクリル酸−メタアクリル酸の共重合体、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミノ酸、シリコン高分子類、デキシトランステアレート、エチルセルロース、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリウレタン、無水マレイン酸共重合体、エチレン−ビニルアセテート共重合体、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドのような単一の高分子重合体、２つ以上の共重合体及び上記高分子の混合物が使用可能であり、その誘導体と塩類を使用することもできる。
【００２７】
このような高分子類のうち、ポリメチルメタクリレートが生体適合性に優れ且つ生分解性がないため、１次経皮吸収後に、真皮層の上層部に留まりつつ、活性成分を真皮層の内部に徐々に放出させる効果が優れる。生分解性ある高分子類は、真皮層の上層部に留まりつつ、分解が行われるので、活性成分の徐放化に役に立つ。
【００２８】
高分子ナノ粒子に含有されて使用される生理活性成分は、特に限定されるものではないが、例えば、ゲンタマイシン、ジベカシン、カネンドマイシン、リビドマイシン、トブラマイシン、アミカシン、フラジオマイシン、シソミシン、テトラサイクリンハイドロクロライド、オキシテトラサイクリンハイドロクロライド、ロリテトラサイクリン、オキシサイクリンハイドロクロライド、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、セファロチン、セファロリジン、セフォチアム、セフスロジン、セフメノキシム、セフメタゾール、セファゾリン、セフォタキシム、セフォペラゾン、セフチゾキシム、モキソラクタム、ラクタモセフ、チエナマイシン、スルファゼシン、アズトレオナム等の抗生剤；ブレオマイシンハイドロクロライド、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、ミトマイシンＣ、ビンブラスチンスルフェート、ビンクリスチンスルフェート、ダウノルビシンハイドロクロライド、アドリアマイシンネオカルチノスタチン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、テトラハイドロフリル-5-フルオロウラシル、クレスチン、ピシバニル、レンチナン、レバミゾール、ベスタチン、アジメキソン、グリシルリジン、ポリI:C、ポリA:U、ポリICLC等の抗腫瘍剤；ナトリウムサリチレート、スルピリン、ナトリウムフルフェナメート、ナトリウムジクロフェナク、ナトリウムインドメタシン、モルフィンハイドロクロライド、ペチジンハイドロクロライド、酒石酸レボルファノール（levorphanol tartrate）、オキシモルホン等の抗炎症剤；解熱剤；鎮痛剤；抗浮腫剤；エフェドリントハイドロクロライド、メチルエフェドリンハイドロクロライド、ノスカピンハイドロクロライド、コデインホスフェート、ジハイドロコデインホスフェート、アロクラマイドハイドロクロライド、クロフェジアノールハイドロクロライド、ピコペリダミンハイドロクロライド、クロペラスチン、プロトキロールハイドロクロライド、イソプロテレノールハイドロクロライド、サルブタモールスルフェート、テルブタリンスルフェート等の鎮咳裾痰剤；クロルプロマジンハイドロクロライド、プロクロルペラジン、トリフロオペラジン、アトロピンスルフェート、スコポラミンメチルブロミド等の鎮静剤；ピリジノールメタンスルホネート、ツボクラリンクロライド、パンクロニウムブロミド等の筋肉弛緩剤；ナトリウムフェニトイン、エトスシミド、ナトリウムアゼタゾラミド、クロルジアゼポキシドハイドロクロライド等の抗てんかん剤；メトクロプラミド、Ｌ−ヒスチジンモノハイドロクロライド等の抗潰瘍剤；イミプラミン、クロミプラミン、ノキシプチリン、フェネルジンスルフェート等の抗憂鬱剤；ジフェンハイドラミンハイドロクロライド、クロルフェニラミンマレート、トリペレナミンハイドロクロライド、メトジラジンハイドロクロライド、クレミゾールハイドロクロライド、ジフェニルピラゾリンハイドロクロライド、メトキシフェナミンハイドロクロライド等の抗アレルギー剤；トランス-p-オキソカンフォル、テオフィロール、アミノフィリン、エチレフリンハイドロクロライド等の強心剤；プロプラノロールハイドロクロライド、アルプレノロールハイドロクロライド、ブフェトロールハイドロクロライド及びオキシプレノロール等の抗不整脈剤；オキシフェドリンハイドロクロライド、ジルチアゼムハイドロクロライド、トラゾリンハイドロクロライド、ヘキソベンジン及びバメタンスルフェート等の血管拡張剤；ヘキサメトニウムブロミド、ペントリニウム、メカミラミンハイドロクロライド、エカラジンハイドロクロライド及びクロニジンハイドロクロライド等の血圧降下剤；ナトリウムグリミジン、グリピジド、フェンホルミンハイドロクロライド、ブホルミンハイドロクロライド及びメトホルミン等の糖尿治療剤；ナトリウムヘパリン及びナトリウムシトレート等の抗沈殿剤；トロンボプラスチン、トロンビン、メナジオンナトリウムビスルフィト、アセトメナフトン、e-アミノカフロン酸、トラネキサム酸、カルバゾクロムナトリウムスルホネート及びアドレノクロムモノアミノグアニジンメタンスルホネート等の恒常性剤；イソニアジド、エタンブトール及びナトリウムp-アミノサリチレート等の抗結核剤；インシュリン、ソマトスタチン、ソマソスタチン誘導体、成長ホルモン、プロラクチン、アドレノコルチコトロピックホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、チロイドホルモン放出ホルモンとその塩形態及び誘導体；チロイド刺激ホルモン、黄体化ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシン、バソプレシン誘導体、オキシトシン、カルシトニン、パラチロイドホルモン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオジミン、コレシストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤乳腺刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エンケファリン、エンケファリン誘導体、エンドルフィン、キオトルフィン、インターフェロンａ、ｂ、ｇ、インターロイキンI、II、III、ツフシン、サイモポイエチン、チモシン、チモスチミュリン、胸腺体液性因子、血清胸腺因子及びその誘導体；腫瘍壊死因子、集団刺激因子、モチリン、ジノルフィン、ポンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、ウロキナーゼ、アスファラギナーゼカリクレイン、物質Ｐ類似体及び拮抗剤、神経成長因子、血液凝固因子VIII、IX、ライソザイムクロライド、ポリミキシンＢ、コリスチン、グリミシジン、バシトラシン、蛋白質合成刺激ペプチド、胃抑制ポリペプチド、血管作用性小腸ポリペプチド、血小板-誘導成長因子、成長ホルモン放出因子、骨形態蛋白質、表皮成長因子等のポリペプチド；コハク酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、デキサメタゾンナトリウムスルフェート、ベタメタゾンナトリウムホスフェート、ヘキセストロールホスフェート、ヘキセストロールアセテート、メチマゾール等のホルモン医薬品；助酵素Ｑ１０、ビネアトロール（レスバラトロール）、ＢＨＴ、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥとその誘導体等の抗酸化剤；トリコロンサン、クロロヘキシジン、セチルピリミジニウムクロライド、天然精油などの抗菌剤；ミノキシジル、ＴＧＦ(tran剤型ing growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)、ＦＧＦ(fibroblast growth factor)、ＩＧＦ(insuline-like growth factor)、テストステロン、アンドロゲン等の育毛剤、養毛剤；美白原料；コラゲン合成促進剤；しわ除去・緩和剤；セラミド、スフィンゴシン等の皮膚障壁強化剤及び皮膚保湿力増強剤などを使用することができ、ナノ粒子の内部に含有された有効活性成分の種類及び含量は、目的及び場合によって調節可能である。
【００２９】
本発明による活性成分は、伝達しようとする薬物の種類、物理化学的性質によって、異なる高分子に適用可能である。活性成分に対する高分子の量は、活性成分の量に対して0.1〜100倍の重量比で使用可能であり、1〜5倍重量の高分子を使用することが好ましい。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施例を説明する。本発明の範囲は、下記の実施例により限定されるものではない。
（実施例）
本発明の目的を達成するため、活性成分を含有するナノ粒子の製造方法には特に限定されるものではないが、本実施例で、高分子ナノ粒子は、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を使用して製造した。ＰＭＭＡは、分子量5,000〜1,000,000のものを使用することができ、本実施例では、75,000程度の平均分子量を有するＰＭＭＡを使用した。一方、ナノ粒子の内部に含有される活性成分の種類は特に限定されないが、本実施例では、レチノール、助酵素Ｑ１０(Coenzyme Q10、以下Co-Q10という)及びレスベラトロール(resveratrol)を使用した。
【００３１】
また、本実施例では、ナノ粒子を製造するため、高圧、高せん断力を用いて乳化物を均一のナノサイズの粒子に形成するマイクロフルイダイザ（Microfluidics Corporation, USA）を使用し、圧力は、500bar〜1,500bar、流速は20ml/min〜150ml/minに調整した。油相と水相の乳化のため、界面活性剤を使用することができるが、本実施例では、ＳＬＳ（ソジウルラウリルスルフェート）を使用した。
【００３２】
高分子と活性成分を溶解させる油相として使用される有機溶剤は、水とほとんど混じらなく、沸点があまり高くない特性を有するものを選び、例えば、ハロゲン化アルカン類（クロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロエタン等）、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等のものを使用可能であり、単一又は２つ以上の溶剤を混合して使用することも可能である。１次乳化において使用される有機溶剤の量は、活性成分と高分子の総量に対して3〜50倍の量を使用し、好ましくは7〜12倍の量を使用する。
【００３３】
１次乳化段階及びナノ乳化物の製造段階で界面活性剤を使用することができるが、使用可能な界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤（例えば、ソジウムオレート、ソジウムステアレート、ソジウムラウリルスルフェート等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステール類［Tween 80, Tween 60, products of Atlas powder Co., U.S.A］、ポリオキシエチレンひまし油誘導体［HCO-60, HCO-50, products of Nikko Chemicals, Japan］、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤等を挙げることができ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、低分子アルコール類等の補助界面活性剤と混合して使用することも可能である。このような界面活性剤は、0.01％〜20％の量で使用することができ、好ましくは、0.5％〜5％の範囲で使用する。
【００３４】
以下、高分子と有効活性成分を利用したナノ粒子の製造について具体的に説明する。
【００３５】
（実施例１〜９）
活性成分としてCo-Q10  2.52gとPMMA高分子4.00gをジクロロメタン56mlに均一に溶解させた油相を、界面活性剤(SLS)2gが溶解されている400mlの精製水に入れ、１次乳化を実施した。１次乳化のため、ホモミキサを用いて5000rpmで3分間処理した後、マイクロフルイダイザに入れてナノサイズの乳化物を製造した。マイクロフルイダイザで処理回数を異ならさせて粒径が異なることになったナノ乳化物を硬化させるため、徐々に攪拌しつつ、有機溶媒であるジクロロメタンの溶媒抽出を実施した。高分子と活性成分の溶解のために使用したジクロロメタンは、水相に徐々に拡散されて出る。そして、水相の空気接触面で蒸発、除去された。ジクロロメタンの除去と一緒に、乳化物内のPMMA高分子は、硬化しつつナノ粒子が形成され、硬化されたナノ粒子の精製のため、透析を実施して、界面活性剤を除去し、所定の各々のサイズを有し、内部に活性成分としてCo-Q10を含有したPMMA高分子ナノ粒子を製造した。
【００３６】
透析を経て精製されたナノ粒子は、活性成分の含量を、液体クロマトグラフィを用いて定量分析し、活性成分の定量値に基づいて精製されたナノ粒子を希釈又は濃縮して活性成分の含量を2%になるようにした。逆浸透圧を用いて水分を除去してナノ粒子を濃縮した。希釈は、精製水を用いて体積比で希釈して使用した。レチノール及びレスベラトロールを用いて上記と同様な方法により各々のナノ粒子を製造した。
【００３７】
製造されたナノ粒子の粒径分布は、動的レーザ光散乱法(Dynamic light scattering, Zetasizer 3000HS, Malvern, UK)を用いて測定し、散乱角は、90度に固定し、温度は25度に維持しながら測定した。水力学的粒径と分散度は、コンチン(contin)方法により計算した。
このように製造されたナノ粒子を下記表１に示す。
【００３８】
【表１】
0005153978.tif 000002
【００３９】
上記の実験結果において、平均50nm程度のナノ粒子を製造するためには、マイクロフルイダイザで3回程度繰り返し処理することが好ましい。この場合、ナノ粒子の固形分含量は5.17％で、そのうち、PMMA高分子が3.17％を占め、活性成分であるCo-Q10が2.00％を占める。上記製造物は、以後の経皮吸収実験、安定度確認実験及び剤型化実験に使用した。上記表１において、活性成分の含有率は、ナノ粒子が分散された全体溶液に対する活性成分の量を意味する。
【００４０】
例示的に、上記実施例1〜3について測定した結果を図１に示す。上記の結果から、マイクロフルイダイザで処理回数を増加させることにより、製造されるナノ粒子の平均サイズが減少し、粒径の分布も狭くなることが分かる。ナノ粒子の製造条件によって所望のサイズのナノ粒子の製造が可能であることを確認することができた。
【００４１】
（実施例11〜18、参考例1〜3）ナノ粒子の製造のため、PMMA(分子量75,000)を使用し、含有すべき活性成分として、レチノール、Co-Q10及びレスベラトロールを使用した。Co-Q10  0.25gをジクロロメタン56mlに溶解させ、0.5g、1g、2gのPMMAと一緒に、各々溶解させて油相１を製造した。ここに、精製水PEG 60 ハイドロネイティドひまし油4ｇを均一溶解した後、精製水4500mlに徐々に注ぎながら、ナノ粒子の乳化物を製造した。このような方法は、一般的な可溶化現象を利用したもので、自発的なナノ粒子の形成を誘導するという利点がある。別の処理を経ることなく、溶媒抽出方法により油相１のジクロロメタンを除去し、含有された活性成分の量を均一にするため、ナノ粒子内の活性成分の含量を定量し、希釈或いは濃縮してナノ粒子が分散された溶液内の有効活性成分の量を2.0％になるようにした。各々の活性成分を含有するナノ粒子は、同じ過程を経て製造し、その結果を下記の表２に示した。
【００４２】
【表２】
0005153978.tif 000003
【００４３】
（実施例20〜27、参考例4〜6）ナノ粒子の製造のため、PMMA(分子量75,000)を使用し、含有すべき活性成分として、レチノール、Co-Q10及びレスベラトロールを使用した。Co-Q10  0.25gをジクロロメタン56mlに溶解させ、0.5g、1g、2gのPMMAと一緒に、各々溶解させた油相１を容易した。ここに、PEG60ハイドロネイティドひまし油4gを均一溶解した後、精製水4500mlに徐々に注ぎながら、上記実施例と同様にナノ粒子の乳化物を製造し、これを、スプレイドライヤ装置を用いて油相１の有機溶媒を除去し、分散媒である蒸留水を除去した。ここで得られた白色のナノ粒子パウダーに対して含有される活性成分の量を均一にするため、ナノ粒子内の活性成分の量を液体クロマトグラフィで定量し、以後の試験に使用するため、精製水に再分散させて溶液内に分散されたナノ粒子の有効活性成分の量が2.0％になるようにした。
【００４４】
この場合、製造条件によってナノ粒子の生成に非常に大きい差異が示す。本実験に使用した条件は、流速0.5ml/min、乾燥器の温度150度、担体ガス速度100ml/minにし、従来のスプレイドライヤとは異なり、担体ガスと一緒に乾燥器を抜け出たナノ粒子を膜濾過装置でろ過する方法を使用した。各々の活性成分を含有するナノ粒子は、同じ過程を経て製造し、その結果を下記の表３に示す。
【００４５】
【表３】
0005153978.tif 000004
【００４６】
（剤型例）
上記実施例1〜27により製造されたナノ粒子を利用する各種剤型例を説明する。下記の剤型の成分比を示す表において、実施例と示した項目は、その実施例で製造されたナノ粒子を組成成分として含むという意味である。
【００４７】
（剤型例１〜９）クリーム
剤型例１〜９は、クリーム剤型であって、下記表４に示す。
【００４８】
【表４】
0005153978.tif 000005
【００４９】
（剤型例１０〜１８）栄養化粧水
剤型例１０〜１８は、栄養化粧水であって、下記表５に示す。
【００５０】
【表５】
0005153978.tif 000006
【００５１】
（剤型例１９〜２７）柔軟化粧水
剤型例１９〜２７は、柔軟化粧水であって、下記表６に示す。
【００５２】
【表６】
0005153978.tif 000007
【００５３】
（剤型例２８〜３６）ゲル
剤型例２８〜３６は、ゲルであって、下記表７に示す。
【００５４】
【表７】
0005153978.tif 000008
【００５５】
（剤型例３７〜４５）噴霧剤
剤型例３７〜４５は、噴霧剤であって、下記表８に示す。
【００５６】
【表８】
0005153978.tif 000009
【００５７】
（剤型例４６〜５４）軟膏
剤型例４６〜５４は、軟膏であって、下記表９に示す。
【００５８】
【表９】
0005153978.tif 000010
【００５９】
（剤型例５５〜６３）パッチ
剤型例５５〜６３は、パッチであって、下記表１０に示す。
【００６０】
【表１０】
0005153978.tif 000011
【００６１】
（試験例１）透過電子顕微鏡を用いたナノ粒子の観察
製造されたナノ粒子の性状と粒子分布は、透過電子顕微鏡(JEM1010, JEOL, Japan)を用いて確認した。3次蒸留水に分散させた上記ナノ粒子を1％ウラニルアセテートで染色した後、30分間乾燥して観察した。例示的に実施例4〜6のナノ粒子について観察した結果を図2〜図4に示した。上記図2乃至図4は、各々マイクロフルイダイザで1〜3回処理したことを示す。
【００６２】
上記の結果から、動的レーザ光散乱法で測定したナノ粒子のサイズと透過顕微鏡で測定したナノ粒子のサイズが互いに一致することを確認し、処理回数等の条件によりナノ粒子のサイズを調整することができることを確認した。
【００６３】
（試験例２）ナノ粒子内の活性成分の安定度の確認試験
上記実施例によるナノ粒子内の活性成分の長期保管安定性を確認した。上記各実施例によるナノ粒子のサンプルを0度、25度、45度恒温槽で保管しつつ、一定時期毎にサンプルを取り各々の活性成分の含量を定量した。例示的に実施例1〜9について測定した結果を表11に示す。最初の活性成分の量を100にし、経時による残存活性成分の量を相対的に表示した。
【００６４】
一方、有効活性成分を含有するナノ粒子を用いた化粧料、医薬料等の剤型である剤型例1〜3、10〜12、46〜48の場合にも、上記と同様な試験をした結果、ナノ粒子の内部に含有された有効活性成分が安定に維持されることを確認することができた。その結果を表12に示す。
【００６５】
【表１１】
0005153978.tif 000012
【００６６】
【表１２】
0005153978.tif 000013
【００６７】
上記の実験から、ナノ粒子内に含有されたレチノール、Co-Q10及びレスベラトロールの長期保管安定度を確認することができた。ナノ粒子のサイズによる安定度の依存性はほとんどなかった。低温で長期間安定することを確認し、45度恒温条件では、15日が経過した時点から活性成分の含量が低下することを確認することができた。上記試験から見られるナノ粒子内の活性成分の安定性は、疎水性高分子であるPMMAにより水分が内部に浸透することを遮断することにより、内部の活性成分と水分の接触機会を低減したことによる。疎水性高分子の内部に存在する活性成分は、高分子鎖の間に埋められており、ナノ粒子には水が入る通路が遮断されて水との接触が制限される。これに対して、従来のマイクロサイズのカプセルには、水が往来できる大きい孔が存在するので、活性成分の長期安定化に問題があったが、本発明による経皮吸収剤では、そのような問題が解決される。
【００６８】
（試験例３）ナノ粒子のサイズ別経皮吸収測定
化学結合により蛍光物質を付加させたPMMA高分子を用いて各々50nm、80nm、 120nm、 500nmのサイズを有するナノ粒子を別途に製造し、動物（雌性無毛ギニア豚）の皮膚に塗布した後、一定時間が経過した後、皮膚の断面を切って、経皮吸収されたナノ粒子から放出される蛍光を測定した。
【００６９】
（１）蛍光PMMA高分子ナノ粒子の製造
ポリメチルメタクリレート-co-メタクリル酸（メチルメタクリレートとメタクリル酸のモル比は、84:16）のメタクリル酸のカルボキシル基に蛍光分子を共有結合した。その製造法を簡略に説明すると次の通りである。34gのポリメチルメタクリレート-co-メタクリル酸を150mlの無水メチレンクロライドに溶解した後、132mgのジシクロヘキシルカルボジイミドと74mgのN-ハイドロキシスクシンイミドを添加して、カルボキシル基を活性化させる。１時間攪拌した後、222mgのフルオレシンアミンを添加してフルオレシンアミンの１次アミンと活性化されたカルボキシル基とが反応してアミド結合を形成させることにより、高分子鎖に蛍光分子が共有結合した。反応は、常温、暗室条件で5時間進行した。反応後に形成される副産物であるジシクロヘキシルウレアは、0.45μmナイロンフィルタを通じて除去した後、ジエチルエーテルに沈殿させて反応試薬及び未反応残留物を一次的に除去し、過量の３次蒸留水で一日放置して、残りの残留物を除去した後、40度で真空オブンを用いて乾燥した。その結果、蛍光物質が付加された50nm、80nm、120nm、500nmのサイズを有するPMMAナノ粒子を製造した。
【００７０】
（２）サイズ別ナノ粒子の経皮吸収試験
経皮吸収試験のため、８週程度の雌性無毛ギニア豚(strain IAF/HA-hrBR)を使用した。ギニア豚の腹部部位の皮膚を切り出して、フランズタイプジフジョンセル(Franz-type diffusion cells(Lab Fine Instruments, Korea))に装着して実験した。フランズタイプジフジョンセルの収容容器（5ml）には、50mMリン酸塩緩衝液(pH7.4, 0.1M NaCl)を入れた。ジフジョンセルは、32℃を維持しつつ、600rpmで混合、分散し、各サイズ別に製造された蛍光PMMAナノ粒子が10%(w/v)分散された溶液50μlを各々のドナー容器に入れた。予め予定した時間（平均12時間）により吸収拡散し、吸収拡散が生ずる皮膚の面積は、0.64cm2になるようにした。ナノ粒子の吸収拡散が終わった後には、乾燥されたKimwipes又はエタノール10mlで皮膚上に残存する未吸収のナノ粒子を洗い、皮膚の断面を切り開いて皮膚断面に吸収された蛍光PMMAナノ粒子の分布を測定した。
【００７１】
（３）共焦点レーザスキャニング顕微鏡検査
蛍光PMMAナノ粒子の経皮吸収を確認するため、共焦点レーザスキャニング顕微鏡（CLSM:Radiance 2000/MP, Bio-rad, UK）を使用して観察した。使用されたCLSMは、Ar/Kr laser sourceを装着し、Nikkon eclips TE300をoil-immersed Plan apo 60×1.4NA objective lensと一緒に使用した。各々の測定サンプルは、ｚ軸で測定した。
【００７２】
（４）結果
ナノ粒子の皮膚内分布測定結果を下記の表13に示す。
【００７３】
【表１３】
0005153978.tif 000014
【００７４】
50nm及び80nmサイズのナノ粒子に対する分布写真を図5及び図6に各々示す。
【００７５】
上記実験から、ナノ粒子の経皮吸収は平均粒径に大きく依存することが確認できた。平均直径が50nmのサイズを有するナノ粒子は、表皮を通過して真皮層の上端まで吸収拡散されることを確認できた。粒子のサイズが500nmを超える場合は、ナノ粒子は、皮膚表面に留まり、これ以上皮膚内部への吸収が生じなかった。平均直径50nm程度のナノ粒子の皮膚吸収は、皮膚の細胞間脂質の間に拡散され、高分子の疎水性は、このような経皮吸収を促進する効果があると判断される。また、経皮吸収されにくいか、不安定な有効活性成分を、平均粒径が50nm程度のナノ粒子に含有させる場合、高分子による皮膚内部への伝達により活性成分の経皮吸収伝達が可能である。
【００７６】
（試験例４）レチノールの経皮吸収率測定実験
上記の実施例1〜3、11〜12、20〜21、参考例1及び4、剤型例1、10、19、28及び46のレチノールを含有したナノ粒子に対して経皮吸収試験を実施して、レチノールを含有したナノ粒子の経皮吸収率を確認した。
【００７７】
（１）試験方法
レチノールの経皮吸収試験のため、８週程度の雌性無毛ギニア豚(strain IAF/HA-hrBR)を利用した。ギニア豚の腹部部位の皮膚を切り出してフランズタイプジフジョンセルに装着して実験した。フランズタイプジフジョンセルの収容容器(5ml)には、50mMのリン酸塩緩衝液(pH7.4, 0.1M NaCl)を入れた。ジフジョンセルは、32℃を維持しつつ、600rpmで混合、分散し、レチノールを含有したPMMAナノ粒子が10%(w/v)分散された溶液50μlを供給容器に入れた。
【００７８】
予め予定された時間により吸収拡散し、吸収拡散が生ずる皮膚が0.64cm2になるようにした。ナノ粒子の吸収拡散が終えた後は、乾燥したKimwipes又はエタノール10mlで皮膚部位に残存する未吸収のナノ粒子を洗浄した。チップ型(tip-type)ホモジナイザ(PolytronPT2100, Switzerland)を用いて、ナノ粒子が吸収拡散されている皮膚を磨いた後、皮膚内部に吸収されたナノ粒子内部のレチノールを4mlのジクロロメタンを用いて抽出した。以後、抽出液を0.45μmナイロン濾過膜を用いてろ過し、次のような条件のHPLC方法で含量を測定した。
対照群としてODO(カフリック/カフリリックトリグリセリド)にレチノールが2％含有されたものと0.1％含有されたものを使用した。
【００７９】
（２）分析条件
カラム：C18(4.6×250mm, 5m)
移動相:メタノール又はエタノール93％
流速:0.8ml/min
検出器:UV325nm
【００８０】
（３）結果
結果は表14に示す。下記表において、ODOは、カフリック/カフリリックトリグリセリドを示す。
【００８１】
【表１４】
0005153978.tif 000015
【００８２】
上記実験結果から明らかなように、ナノ粒子にレチノールを含有する実施例1〜3に対する経皮吸収増加率において、平均粒径120nmの実施例1の場合にも、対照群に比べて経皮吸収率の増加を示した。また、平均粒径80nmの実施例２の場合にも、上記対照群に比べて優れた経皮吸収率を示した。一方、平均粒径が50nmの実施例3では、対照群に比べて5.7倍の経皮吸収増加率を示し、実施例3を含有した前記剤型例において、ナノ粒子の直径に反比例してレチノールの経皮吸収が増加することを確認することができた。
【００８３】
（試験例５）Co-Q10の経皮吸収率の測定実験
上記の実施例4〜6、14〜15、23〜24、参考例2及び5、剤型例2、11、20、29及び47のCo-Q10を含有したナノ粒子に対して経皮吸収試験を実施して、Co-Q10を含有したナノ粒子の経皮吸収率を確認した。
【００８４】
（１）試験方法
生理活性成分としてCo-Q10を含有するナノ粒子を使用することを除いて、上記試験例4と同様の方法で試験した。また、上記試験例4と同様の対照群を使用した。
【００８５】
（２）分析条件
カラム：Ubondapak C18(3.9×150mm)
移動相:メタノール/エタノール(40/60)
流速:1ml/min
検出器:UV275nm
【００８６】
（３）結果
結果は下記表15に示す。
【００８７】
【表１５】
0005153978.tif 000016
【００８８】
上記試験結果は、上記試験例4に対する試験結果とほぼ同一であり、類似な傾向を示す。
【００８９】
（試験例６）レスベラトロールの経皮吸収率の測定実験
上記の実施例7〜9、17〜18、26〜27、参考例3及び6、剤型例3、9、21、30及び48のレスベラトロールを含有したナノ粒子に対して経皮吸収試験を実施して、レスベラトロールを含有したナノ粒子の経皮吸収率を確認した。
【００９０】
（１）試験方法
生理活性成分としてレスベラトロールを含有するナノ粒子を使用することを除いて、上記試験例4と同様の方法で試験した。また、上記試験例4と同様の対照群を使用した。
【００９１】
（２）分析条件
カラム：MightySil ODS(4.6×250mm, 5m)
移動相:アセトニトリル/10mMリン酸緩衝液(35/65)
流速:1ml/min
検出器:UV 254nm
【００９２】
（３）試験結果
結果は下記表16に示す。
【００９３】
【表１６】
0005153978.tif 000017
【００９４】
上記試験結果は、上記試験例4及び5に対する試験結果とほぼ同一であり、類似な傾向を示す。
【００９５】
（試験例７）皮膚刺激度の測定
健康な男女実験者50人の腕の下膊部に、上記各実施例の試料を閉鎖貼付試験方法により、一日１回ずつ塗布した後、外部との遮断のため、プラスチックカップを覆った後、１日後、３日後、７日後に次の判定方法により刺激程度を観察した。刺激程度の判断基準は、下記表17に示す。
【００９６】
【表１７】
0005153978.tif 000018
【００９７】
各被験者の刺激程度を測定した後、被験者の数に分けてその平均刺激程度を計算した。下記表１８に示した結果は、上記判定方法により算出した刺激の平均値である。
【００９８】
【表１８】
0005153978.tif 000019
【００９９】
上記実施例1〜9のすべての試料において皮膚刺激がないことがわかる。製造方法を異ならせた実施例12、15、18及び実施例21、24、27の場合にも、皮膚刺激がないことを確認することができた。また、実施例1〜27の各々の有効活性成分を含有したナノ粒子を含有した化粧料、医薬料等の組成物においても、皮膚刺激がほとんどないことを確認することができた。このような結果は、本発明で提供される有効活性成分を含有したナノ粒子の皮膚適合性及び含有される内部有効活性成分を皮膚刺激がほとんどない状態で経皮吸収が可能であることを確認させる結果である。
【０１００】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明により提供される高分子ナノ粒子を用いた経皮吸収剤は、従来の経皮吸収剤とは根本的に概念が異なる新規の経皮吸収メカニズムを利用したもので、本発明は、活性成分を含有する所定の粒径のナノ粒子を皮膚構造のうち真皮層の上部まで吸収させる１次伝達段階と、真皮層の上端に留まりつつ、含有している活性成分を真皮層以下の体内に放出させる２次伝達段階とが結合されている。高分子ナノ粒子に含有された活性成分は、高分子自体の疎水性反発力により周囲の水分がナノ粒子内部に拡散されることを防ぐことにより、活性成分の安定化を誘導することができる。生体親和性に優れる高分子ナノ粒子を製造し、活性成分を含有させる技術は、現段階ではあまり難しいことではない。しかしながら、高濃度の有効活性成分を高分子ナノ粒子内部に含有し、皮膚内部に吸収拡散されるナノ粒子のサイズを決定し、皮膚内部に伝達されたナノ粒子が含有する活性成分を皮膚の真皮層の下部の体内に伝達する２段階経皮吸収メカニズムを利用した経皮吸収剤は、従来の経皮吸収剤とは明らかに区分される独創で且つ優秀なものであることを確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例１〜３により製造されたナノ粒子の粒径分布を示す図である。
【図２】  図２は、実施例４によるナノ粒子の粒子分布を透過電子顕微鏡を用いて観察した写真である。
【図３】  図３は、実施例５によるナノ粒子の粒子分布を透過電子顕微鏡を用いて観察した写真である。
【図４】  図４は、実施例６によるナノ粒子の粒子分布を透過電子顕微鏡を用いて観察した写真である。
【図５】  図５は、５０ｎｍの粒径を有する蛍光ＰＭＭＡ高分子ナノ粒子が経皮に吸収された様子を示す写真である。
【図６】  図６は、８０ｎｍの粒径を有する蛍光ＰＭＭＡ高分子ナノ粒子が経皮に吸収された様子を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005153978.tif 000024
【図６】
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