(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤。
【請求項２】
プロスタグランジンＤ２又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤。
【請求項３】
ＢＷ２４５Ｃ又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＰ１レセプターを間接的又は直接的に活性化する成分を有効成分とする新規な抗不安作用剤及び該抗不安作用剤を含有する新規な医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレス過剰な現代社会において、不必要な不安感が長期間持続することがあり、多くの人を悩ませている。そして、不安感が原因となって引き起こされる発汗、動機、頭痛、不眠などの症状は、不安障害という一つの精神疾患の症例と考えられている。このような不安障害の患者に対して、従来は、抗不安剤としてベンゾジアゼピン系薬物が処方されている。
しかし、ベンゾジアゼピン系薬物は、運動障害、眠気、長期服用による依存性の発現などの副作用を引き起こすという問題点があった。そこで、ベンゾジアゼピン系薬物に代わる新規な抗不安剤が求められている。
【０００３】
近年、ダイズに含まれるタンパク質の一種であるβ−コングリシニンを酵素分解して得られる分解物中に、抗不安作用を有する五つのアミノ酸残基からなるペプチドが存在することが報告されている（特許文献１参照）。該ペプチドは、オピオイド受容体に結合して鎮痛効果を示す七つのアミノ酸残基からなるオピオイドペプチドと共通のアミノ酸配列を有するが、抗不安作用を発現する作用機序については、明らかにされていない。
【特許文献１】特開２００７−９１６５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
今後、不安障害の患者数がさらに増加することが見込まれ、従来とは全く異なる新規な抗不安作用剤に対する期待が高まっているのが現状である。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、十分な抗不安作用を有する新規な抗不安作用剤及び該不安作用剤を含有する新規な医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、その中枢神経機能に与える影響について検討したところ、該ペプチドが抗不安作用を有することを見出した。さらに、その作用機序について検討した結果、前記ペプチドが、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化することで抗不安作用を示すことを見出した。このことから、ＤＰ１レセプターを間接的又は直接的に活性化する成分が、抗不安作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。ここで、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化する成分とは、ＤＰ１レセプターと直接相互作用することなく、これを活性化させる成分のことを指し、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化する成分とは、ＤＰ１レセプターと直接相互作用して、これを活性化させる成分のことを指す。
【０００６】
すなわち、前記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤である。
請求項２に記載の発明は、プロスタグランジンＤ２又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤である。
請求項３に記載の発明は、ＢＷ２４５Ｃ又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗不安作用剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、経口で簡便に服用でき、十分な抗不安作用を有する新規な抗不安剤及び該不安作用剤を含有する新規な医薬品が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明の抗不安作用剤は、ＤＰ１レセプターを間接的又は直接的に活性化する成分を有効成分とするものである。
ここで、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化する成分とは、ＤＰ１レセプターと直接相互作用することなく、これを活性化させる成分のことを指す。また、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化する成分とは、ＤＰ１レセプターと直接相互作用して、これを活性化させる成分のことを指す。なお、相互作用とは、例えば、分子間で共有結合等により結合を形成することや、水素結合、疎水結合又はイオン結合等の分子間引力により結合を形成することを指す。
従来、ＤＰ１レセプターについては、例えば、プロスタグランジンＤ２が結合することで、炎症やアレルギーの発症に関与することが知られている。これに対し、本発明は、ＤＰ１レセプターを間接的又は直接的に活性化することで、抗不安作用が発現することを初めて見出し、かかる知見に基づいて、全く新規な抗不安作用剤を提供するものである。
【０００９】
本発明の第一の実施形態にかかる抗不安作用剤は、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化する成分（以下、活性成分１と略記することがある）を有効成分とするものである。活性成分１は、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化する成分であればいずれでも良い。例えば、生体内において、特定の物質やＤＰ１レセプター以外のレセプターと相互作用することにより、ＤＰ１レセプターと直接相互作用する物質の濃度を高め、該物質とＤＰ１レセプターとの相互作用を促進する成分が挙げられる。
そして、かかる抗不安作用剤は、本発明の効果を妨げない範囲で、前記活性成分１以外に如何なる成分を含んでいても良い。
【００１０】
活性成分１は、生体に由来するもの及び生体に由来しないもののいずれでも良い。生体に由来する活性成分１としては、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ペプチド１と略記することがある）が例示できる。生体に由来しない活性成分１としては、人工的に合成された物質、上記の生体に由来する活性成分１を化学修飾したもの、上記の生体に由来する活性成分１以外の生体由来物質を化学修飾したもの等のうち、ＤＰ１レセプターを間接的に活性化するものが例示できる。ここで化学修飾とは、例えば、化学物質や活性成分１の原子や基を、これらとは異なる原子や基で置換したり、化学物質や活性成分１に新たに原子や基を付加させることを指す。
【００１１】
前記ペプチド１は、化学合成したものでも良いし、生体から分離したものでも良く、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質を分解して得られたものでも良い。
【００１２】
ペプチド１を化学合成する場合、合成方法は特に限定されず、液相合成法及び固相合成法のいずれでも良く、公知の方法から適宜選択すれば良い。具体的には、ペプチド結合の形成時にアミノ基への保護基の導入及び脱保護を伴う方法であれば、保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）を使用するＦｍｏｃ法、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）を使用するＢｏｃ法等が例示できる。
ペプチド１は、合成反応後に適当な後処理や精製を行うことで単離できる。あるいは、ペプチド１の単離を行うことなく混合物のまま使用しても良い。ここで、後処理や精製は公知の方法で行えば良い。具体的には、ｐＨ調整、抽出、洗浄、遠心分離、ろ過、濃縮、乾燥、結晶化及びカラムクロマトグラフィー等、周知の処理を単独で又は必要に応じて複数の処理を組み合わせて行えば良い。例えば、濃縮であれば、常圧濃縮又は減圧濃縮等により溶媒を留去する方法や、逆浸透膜、限外ろ過膜又は精密ろ過膜等のろ過膜を使用して水を除去する方法が例示できる。乾燥であれば、加熱乾燥又は凍結乾燥が例示できる。カラムクロマトグラフィーであれば、シリカゲル又は適当な各種樹脂を充填剤として使用する、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーが例示できる。
取り出されたペプチド１は、例えば、エドマン分解法等の公知の方法で、アミノ酸配列を同定できる。
【００１３】
ペプチド又はタンパク質を分解してペプチド１を得る場合には、該ペプチド又はタンパク質の種類に応じて分解条件を設定すれば良い。なかでも、酵素を使用して加水分解するのが好ましい。加水分解酵素は一種を単独で使用しても良いし、二種以上を併用しても良い。あるいは、異なる種類の酵素を段階的に使用しても良い。好ましい方法として具体的には、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ、以下、ルビスコと略記する）に加水分解酵素を作用させて分解する方法が例示できる。この場合には、加水分解酵素としてペプシンを作用させた後に、さらにパンクレアチンを作用させるのが好ましい。
【００１４】
酵素による加水分解反応の条件は、分解に供するペプチド又はタンパク質あるいは酵素の種類に応じて、適宜調整することが好ましい。特にｐＨや反応温度は、酵素の種類に応じた至適ｐＨ，至適温度に設定することが好ましい。例えば、上記のように、ルビスコをペプシンで、次いでさらにパンクレアチンで加水分解する場合には、ペプシン添加前の反応液のｐＨを１〜３とすることが好ましい。反応温度は２０〜４５℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、２〜１０時間が好ましく、３〜７時間がより好ましい。また、次いでパンクレアチンを作用させる場合には、パンクレアチン添加前の反応液のｐＨを７〜８とすることが好ましい。反応温度及び反応時間は、ペプシンによる加水分解反応時と同様で良い。
【００１５】
ペプチド１は、分解反応終了後に、適当な後処理や精製を行うことで単離できる。あるいは、ペプチド１の単離を行うことなく混合物のまま使用しても良い。ただし、この場合は、加水分解酵素を失活させておくのが好ましい。後処理、精製及びペプチド１の同定は、上記の化学合成の場合と同様に行えば良い。
【００１６】
本発明の第二の実施形態にかかる抗不安作用剤は、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化する成分（以下、活性成分２と略記することがある）を有効成分とするものである。活性成分２は、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化する成分であればいずれでも良い。
そして、かかる抗不安作用剤は、本発明の効果を妨げない範囲で、前記活性成分２以外に如何なる成分を含んでいても良い。
【００１７】
活性成分２は、生体に由来するもの及び生体に由来しないもののいずれでも良い。生体に由来する活性成分２としては、プロスタグランジンＤ２が例示できる。生体に由来しない活性成分２としては、人工的に合成された物質、上記の生体に由来する活性成分２を化学修飾したもの、上記の生体に由来する活性成分２以外の生体由来物質を化学修飾したもの等のうち、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化するものが例示できる。ここで化学修飾とは、例えば、化学物質や活性成分２の原子や基を、これらとは異なる原子や基で置換したり、化学物質や活性成分２に新たに原子や基を付加させることを指す。生体に由来しない活性成分２としては、ＤＰ１レセプターのアゴニストが例示できる。
【００１８】
ＤＰ１レセプターのアゴニストは特に限定されない。好ましいものとして、具体的には、下記のものが例示できる。
・ＢＷ２４５Ｃ
（3-(3-Cyclohexyl-3-hydroxypropyl)-2,5-dioxo-4-imidazolidineheptanoic acid）（「日本化学物質辞書web：http://nikkajiweb.jst.go.jp/nikkaji_web/pages/top.html」参照）
・ＡＳ７０２２２４
（「Brugger N et al, Pharmacological and Functional Characterization of Novel EP and DP Receptor Agonists: DP1 Receptor Mediates Penile Erection in Multiple Species., J Sex Med. 2008 Feb;5(2):344-56. Epub 2007 Nov 28」参照）
・ＴＳ−０２２
（「Sugimoto M et al, The anti-pruritic efficacy of TS-022, a prostanoid DP1 receptor agonist, is dependent on the endogenous prostaglandin D2 level in the skin of NC/Nga mice., Eur J Pharmacol. 2007 Jun 14;564(1-3):196-203. Epub 2007 Feb 8」参照）
・ＳＱ２７９８６
（[1S-[1B,2B(5Z),3A(1E,3S),4B]]7-[3-(3-cyclohexyl-3-hydroxy-1-propenyl)-7-oxabi-cyclo-[2.2.1]hept-2-yl]5-heptenoic acid）（「Sharif et al, Affinities, selectivities, potencies, and intrinsic activities of natural and synthetic prostanoids using endogenous receptors: focus on DP class prostanoids.,  J Pharmacol Exp Ther. 2000 May;293(2):321-8.」参照）
・ＲＳ９３５２０
（(C3'S,1R,2R,3S,6R)-2-C3'-cyclohexyl-3'hydroxyprop-1-ynyl)-3-hydroxybicyclo[4.2.0]oct-7-ylidene)butyrate）（「Sharif et al, Affinities, selectivities, potencies, and intrinsic activities of natural and synthetic prostanoids using endogenous receptors: focus on DP class prostanoids.,  J Pharmacol Exp Ther. 2000 May;293(2):321-8.」参照）
・ＺＫ１１８１８２
（(5Z,13E)-(9R,11R,15S)-9-chloro-15-cyclohexyl-11,15-dihydroxy-3-oxa-16,17,18,19,20-pentanor-5,13-prostadienoic acid）（「Sharif et al, Affinities, selectivities, potencies, and intrinsic activities of natural and synthetic prostanoids using endogenous receptors: focus on DP class prostanoids.,  J Pharmacol Exp Ther. 2000 May;293(2):321-8.」参照）
・ＺＫ１１０８４１
（(5Z,13E)-(9R,11R,15S)-9-chlor-15-cyclohexyl-11,15-dihydroxy-16,17,18,19,20-pentanor-5,13-prostadienoic acid）（「Sharif et al, Affinities, selectivities, potencies, and intrinsic activities of natural and synthetic prostanoids using endogenous receptors: focus on DP class prostanoids.,  J Pharmacol Exp Ther. 2000 May;293(2):321-8.」参照）
【００１９】
ルビスコは、光合成を行なう緑色植物の葉緑素に含まれる酵素であり、光合成の暗反応において、リブロース−１，５−二リン酸と二酸化炭素とから、二分子のグリセリン酸−３−リン酸を生成することにより、二酸化炭素をカルビン回路に取込む機能を有することが知られている。
そしてこれまでに、ルビスコの加水分解物の中には、いくつかの生理活性ペプチドが存在することが開示されている（例えば、特開２００１−２１３８９７号公報、特開２００３−３００９９６号公報参照）。例えば、ホウレンソウ由来のルビスコをペプシン、又はペプシンとパンクレアチンとで段階的に加水分解したものから、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ペプチド１）が単離されている。そして、かかるペプチドは、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を阻害し、血圧降下作用を示すことが知られている（特開２００３−３００９９６号公報参照）。さらに、かかるペプチドについては、プロスタグランジンＤ２依存的に血管弛緩作用を示すことが知られている（「Zhao H  et al, Met-Arg-Trp derived from Rubisco lowers blood pressure via prostaglandin D(2)-dependent vasorelaxation in spontaneously hypertensive rats.,  Peptides, 2008; 29(3): 345-349」参照）。
また、プロスタグランジンは、アラキドン酸などのエイコサポリエン酸から合成される一群の生理活性物質であり、細胞膜に存在するレセプターに結合することで、様々な生理作用を発現することが知られている。そして、プロスタグランジンの一種であるプロスタグランジンＤ２は、血小板凝集抑制作用や睡眠誘導作用を有することが知られている。
また、プロスタグランジンＤ２に特異的なレセプターとしては、ＤＰ１レセプター及びＤＰ２レセプターが知られている。
【００２０】
しかし、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表されるアミノ酸配列を有するペプチド、該アミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ペプチド１）、プロスタグランジンＤ２は、いずれも抗不安作用を有するとは従来一切報告されておらず、ＤＰ１レセプター及びＤＰ２レセプターが抗不安作用に関与しているとも従来一切報告されていない。すなわち、ＤＰ１レセプター又はＤＰ２レセプターの活性化と、抗不安作用の発現との間の関係については、これらレセプターの活性化が間接的及び直接的のいずれであろうとも、従来全く知られていない。
【００２１】
これに対し本発明の抗不安作用剤は、ＤＰ１レセプターを間接的又は直接的に活性化するという作用機序により抗不安作用を発現する、全く新規なものである。
例えば、ペプチド１は、実施例で具体的に説明するように、未知のレセプターに結合することでプロスタグランジンＤ２の合成を高め、ＤＰ１レセプターを活性化することで抗不安作用を示すことが示唆されている。また、上記のように、ペプチド１は、プロスタグランジンＤ２依存的に血管弛緩作用を示し、血圧降下作用を示すことが知られているが、後記する実施例で説明するように、ペプチド１は、血圧降下作用を示す投与量よりも格段に少ない投与量で抗不安作用を示す。すなわち、ペプチド１は、血圧降下作用に非依存的に抗不安作用を示すのであり、これは、ペプチド１の抗不安作用を発現する作用機序が、血圧降下作用を発現する作用機序とは異なる、従来知られていない新規なものであることを支持するものである。
また、例えば、プロスタグランジンＤ２及びＢＷ２４５Ｃは、いずれも互いに異なる骨格を有する有機化合物である。そしてこれらは、実施例で具体的に説明するように、いずれも十分な抗不安作用を示す。一方、これらの有機化合物に共通する特徴は、ＤＰ１レセプターを直接的に活性化することである。したがってこれらの結果は、抗不安作用が、ＤＰ１レセプターの直接的活性化という従来知られていない新規な作用機序により発現することを支持するものである。
【００２２】
本発明の抗不安作用剤においては、活性成分１及び２は、薬学上許容される塩であっても良い。薬学上許容される塩とは、例えば、酸又は塩基との作用で形成される塩であり、特に限定されない。酸との作用で形成される塩としては、好ましいものとして、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩が例示できる。塩基との作用で形成される塩としては、好ましいものとして、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩等の有機アミン塩が例示できる。あるいは、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩；リシン塩、アルギニン塩、ヒスチジン塩等の塩基性アミノ酸塩でも良い。
活性成分の薬学上許容される塩は、一種を単独で使用しても良く、二種以上を組み合わせて併用しても良い。二種以上を併用する場合には、塩の組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に調整し得る。
【００２３】
本発明の医薬品は、上記本発明の抗不安作用剤を含有するものである。
医薬品に含有される抗不安作用剤は、一種でも良く、二種以上でも良い。二種以上である場合、抗不安作用剤の組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に調整し得る。
【００２４】
医薬品の製剤形態は、特に限定されない。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤等の経口剤；あるいは注射剤等の非経口剤とすることができる。
これらは、公知の方法により製造できる。例えば、経口剤の場合には、これら製剤の製造で通常使用される賦形剤、滑沢剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味剤、緩衝剤等を抗不安作用剤に配合し、常法にしたがって製造できる。賦形剤としては、乳糖、結晶セルロース及びデンプンが例示できる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク及び水素添加植物油が例示できる。結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース及びポリビニルピロリドンが例示できる。崩壊剤としては、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースカルシウム塩が例示できる。
また、非経口剤の場合には、例えば、抗不安作用剤を注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はグリセリン等に溶解又は懸濁させて、常法にしたがって製造できる。さらに、必要に応じて緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等を配合しても良い。
【００２５】
本発明の抗不安作用剤又は医薬品の投与方法としては、経口投与、非経口投与のいずれでも良い。
抗不安作用剤又は医薬品の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状等によっても異なるが、ペプチド１等の活性成分１の場合には、成人一人一日あたり、好ましくは０．１〜１５ｍｇ／６０ｋｇであり、プロスタグランジンＤ２やＤＰ１レセプターのアゴニスト等の活性成分２の場合には、成人一人一日あたり、好ましくは０．１〜２０ｎｍｏｌ／６０ｋｇである。かかる範囲となるように、抗不安作用剤又は医薬品を１日に１回または複数回に分けて投与すれば良い。
【００２６】
本発明の抗不安作用剤及び医薬品は、従来とは全く異なる新規なものであり、十分な抗不安作用を有する。また、経口投与も可能であり、簡便に服用できる。抗不安作用剤のうち、例えば、プロスタグランジンＤ２は、異なる用途で既に広範に利用されており、容易に入手又は製造できる。ペプチド１は、例えば、ルビスコを酵素で加水分解することで得られるが、ルビスコは地球上で最も多量に存在する酵素と言われており、ペプチド１も簡便且つ容易に製造できる。また、ペプチド１は、三つのアミノ酸残基からなるペプチドなので、化学合成による製造も簡便且つ容易である。すなわち、いずれの方法でもペプチド１は容易に製造できる。このように、本発明の抗不安作用剤は、入手も製造も容易なので、該抗不安作用剤を含有する本発明の医薬品も、安価且つ簡便に製造できる。したがって、本発明の抗不安作用剤及び医薬品は、大量供給が可能なものである。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を具体的な実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、経口、非経口を問わず、活性成分の「投与量（ｍｇ／ｋｇ）」は、「マウスの体重１ｋｇあたりの投与量（ｍｇ）」を示し、「投与量（ｐｍｏｌ／マウス）」は、「マウス１匹あたりの投与量（ｐｍｏｌ）」を示すものとする。
【００２８】
（実施例１）
＜ペプチド１の腹腔内投与による抗不安活性の評価＞
以下に示す手順で、ペプチド１の抗不安作用について、検討を行った。
（Ａ）材料及び方法
（Ａ−１）動物
５週齢の雄性ｄｄＹマウスを日本エスエルシー株式会社から入手した。全てのマウスを、２３℃に設定された部屋で、午前７時から午後７時までの間にライトを点ける１２時間の明暗サイクルにて飼育した。飼育中、全てのマウスには、餌と水を自由摂取させた。
（Ａ−２）ペプチド１
ペプチド１は、ペプチド合成機（ＰＳ−３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＦｍｏｃ法で化学合成し、脱保護の後、ＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＡＲＩＩ（２０×２５０ｍｍ），Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を装着したＨＰＬＣにより精製後、凍結乾燥することにより得た。
（Ａ−３）高架十字迷路試験
高架十字迷路試験は、下記のように公知の方法に従って行った。
図１に示すように、２本のオープンアーム（Ｌ：２４ｃｍ×Ｗ：５ｃｍ×Ｈ：０．５ｃｍ）、２本のクローズアーム（Ｌ：２４ｃｍ×Ｗ：５ｃｍ×Ｈ：１３ｃｍ）及び中央プラットフォームからなる高架十字迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ：ＥＰＭ）を、その床面が実験台から高さ５０ｃｍに位置するように設置した。
高架十字迷路は、その床面が高い位置にあるが、クローズアームには囲いがあるため、マウスはクローズアーム内を安全に歩行できるようになっている。一方、オープンアームの周囲は開放されていて囲いがないため、マウスはオープンアーム内においては、高い位置から転落するという不安感を感じる。したがって、マウスのオープンアーム内での滞留時間が長いほど、マウスの不安感は緩和されていることになるので、オープンアーム内での滞留時間を、抗不安活性を評価する際の指標とした。
そして、マウスを中央プラットフォーム上に置いて、５分間試験を実施した。試験時間中、中央プラットフォームを基点に、４本のアーム内のいずれかに進入した回数（以下、総進入回数と略記する）、オープンアーム内に進入した回数、４本のアーム内のいずれかにおける滞留時間（以下、総進入時間と略記する）及びオープンアーム内における滞留時間を記録した。なお、試験に際しては、マウスの４本の手足がすべてアーム内に入った時に、「マウスがアーム内へ進入した」と定義した。
得られた記録からさらに、（Ｉ）総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合、（ＩＩ）総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合をそれぞれ算出し、（ＩＩＩ）総進入回数とともに、下記の各試験群の間で比較した。なお、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の全ての値は、平均値±標準誤差で示した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）に引き続き、多重比較のためにフィッシャー試験（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｔｅｓｔ）を適用し、いずれにおいてもｐ値０．０５未満である場合に、統計的に有意とみなした。
【００２９】
ペプチド１を生理食塩水に溶解させたペプチド１溶液又はコントロールとして生理食塩水のみを、試験の３０分前にマウスの腹腔内に投与し、１匹ずつ高架十字迷路試験に供した。ペプチド１溶液は、マウスの体重１ｋｇあたりのペプチド１の投与量がそれぞれ０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。試験に供したマウスの数は、０．０３ｍｇ／ｋｇ投与群：１７匹、０．１ｍｇ／ｋｇ投与群：１７匹、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群：１７匹、コントロール：１８匹とした。結果を図２に示す。図２（ａ）中、（  ）内の数値は、各試験群のマウスの数を示す。また、図２（ａ）及び（ｂ）中、フィッシャー試験におけるｐ値に関して、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【００３０】
（Ｂ）評価結果
図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、ペプチド１を０．０３〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与した結果、０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合、（Ｉ）オープンアーム内での滞留時間の割合、及び（ＩＩ）オープンアーム内への進入回数の割合が増加した。
フィッシャー試験を適用した多重比較により、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して、０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、ペプチド１の抗不安作用効果は有意であることが示された。
一方、図２（ｃ）に示すように、総進入回数については、いずれの試験群においても有意な差はなく、総運動量は変化しなかった。
【００３１】
（実施例２）
＜ペプチド１の経口投与による抗不安活性の評価＞
（Ａ）材料及び方法
ペプチド１を生理食塩水に溶解させたペプチド１溶液又はコントロールとして生理食塩水のみを、試験の３０分前にマウスへ経口投与し、１匹ずつ高架十字迷路試験に供した。ペプチド１溶液は、マウスの体重１ｋｇあたりのペプチド１の投与量がそれぞれ１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。試験に供したマウスの数は、１．０ｍｇ／ｋｇ投与群：１０匹、３．０ｍｇ／ｋｇ投与群：１０匹、１０．０ｍｇ／ｋｇ投与群：１０匹、コントロール：１０匹とした。これ以外は、実施例１と同様にペプチド１の抗不安活性を評価した。結果を図３に示す。図３（ａ）中、（  ）内の数値は、各試験群のマウスの数を示す。また、図３（ａ）及び（ｂ）中、フィッシャー試験におけるｐ値に関して、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。
【００３２】
（Ｂ）評価結果
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ペプチド１を１．０〜１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した結果、３．０〜１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合、（Ｉ）オープンアーム内での滞留時間の割合、及び（ＩＩ）オープンアーム内への進入回数の割合が増加した。
フィッシャー試験を適用した多重比較により、前記（Ｉ）に関しては、３．０〜１０．０ｍｇ／ｋｇの用量でペプチド１の抗不安作用効果は有意であり、前記（ＩＩ）に関しては、１．０〜１０．０ｍｇ／ｋｇの用量でペプチド１の抗不安作用効果は有意であることが示された。
一方、図３（ｃ）に示すように、総進入回数については、いずれの試験群においても有意な差はなく、総運動量は変化しなかった。
【００３３】
実施例１及び２の結果より、ペプチド１は、運動量を変化させることなく、抗不安作用を示すことが示された。特に、実施例２の結果より、１．０ｍｇ／ｋｇという少ない用量での経口投与でも、ペプチド１は抗不安作用を示した。一方、ペプチド１が血圧降下活性を示すためには、５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で経口投与する必要があった。
以上より、ペプチド１の抗不安作用は、血圧降下作用に非依存的であると判断された。
また、ペプチド１は、腹腔内投与及び経口投与のいずれにおいても、特開２００７−９１６５６号公報に記載の五つのアミノ酸残基からなる抗不安作用を有するペプチドよりも、低用量で抗不安作用を示すことが示された。
【００３４】
（実施例３）
＜ペプチド１による抗不安作用の作用機序の推定＞
これまでにペプチド１は、高血圧自然発症ラットに対して、プロスタグランジンＤ２依存的な血管弛緩を介して、血圧降下作用を示すことが知られている。そこで、ぺプチド１による抗不安作用の作用機序に、プロスタグランジンＤ２が関与しているか否かを考察するために、ＤＰ１レセプターのアンタゴニストであるＢＷ  Ａ８６８Ｃの抗不安作用に対する効果を評価した。
【００３５】
（Ａ）材料及び方法
実施例１と同様のペプチド１を生理食塩水に溶解させたペプチド１溶液、ＢＷ  Ａ８６８Ｃ（Ｃａｙｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を生理食塩水に溶解させたＢＷ  Ａ８６８Ｃ溶液をそれぞれ調製した。そして、（ｉ）ペプチド１溶液のみ、（ｉｉ）ＢＷ  Ａ８６８Ｃ溶液のみ、（ｉｉｉ）ペプチド１溶液及びＢＷ  Ａ８６８Ｃ溶液、並びに（ｉｖ）コントロールとして生理食塩水のみを、それぞれ試験の３０分前にマウスの腹腔内に投与した。ペプチド１溶液は、ペプチド１の投与量が０．１ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。ＢＷ  Ａ８６８Ｃ溶液は、ＢＷ  Ａ８６８Ｃの投与量が６０μｇ／ｋｇとなるように投与した。試験に供したマウスの数は、（ｉ）投与群：７匹、（ｉｉ）投与群：９匹、（ｉｉｉ）投与群：９匹、（ｉｖ）投与群：８匹とした。これ以外は、実施例１と同様に抗不安活性を評価した。結果を図４に示す。図４（ａ）中、（  ）内の数値は、各試験群のマウスの数を示す。また、図４（ａ）及び（ｂ）中、フィッシャー試験におけるｐ値に関して、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。
【００３６】
（Ｂ）評価結果
図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、フィッシャー試験を適用した多重比較により、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して、ペプチド１によって誘導された抗不安作用を抑制するＢＷ  Ａ８６８Ｃの効果は有意であることが示された。
さらに、ＢＷ  Ａ８６８Ｃ自体は、抗不安作用を引き起こさないことが示された。
一方、図４（ｃ）に示すように、総進入回数については、いずれの試験群においても有意な差はなく、総運動量は変化しなかった。
以上より、ペプチド１の抗不安作用は、ＤＰ１レセプターを介して、血圧降下作用を示す場合とは異なる作用機序で引き起こされることが示された。
また、ペプチド１は、ＤＰ１レセプターには直接結合しない（「Zhao H  et al, Met-Arg-Trp derived from Rubisco lowers blood pressure via prostaglandin D(2)-dependent vasorelaxation in spontaneously hypertensive rats.,  Peptides, 2008; 29(3): 345-349」参照）ため、ペプチド１は、未知のレセプターに結合することでプロスタグランジンＤ２の合成を高め、ＤＰ１レセプターを活性化することで抗不安作用を示すことが示唆された。
【００３７】
（実施例４）
＜プロスタグランジンＤ２の脳室内投与による抗不安活性の評価＞
上記のように、ペプチド１の抗不安作用は、ＤＰ１レセプターを介して引き起こされることが示されたので、さらに抗不安作用がプロスタグランジンＤ２によって示されるか否かを確認した。
【００３８】
（Ａ）材料及び方法
プロスタグランジンＤ２（Ｃａｙｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を人工脳脊髄液（１３８．９ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、４．０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、 ｐＨ  ７．４）に溶解させたプロスタグランジンＤ２溶液又はコントロールとして人工脳脊髄液のみを、試験の１０分前にマウスの脳室内へ投与し、１匹ずつ高架十字迷路試験に供した。プロスタグランジンＤ２溶液は、マウス１匹あたりのプロスタグランジンＤ２の投与量がそれぞれ１ｐｍｏｌ／マウス、１０ｐｍｏｌ／マウス、１００ｐｍｏｌ／マウスとなるように投与した。試験に供したマウスの数は、１ｐｍｏｌ／マウス投与群：６匹、１０ｐｍｏｌ／マウス投与群：５匹、１００ｐｍｏｌ／マウス投与群：６匹、コントロール：６匹とした。これ以外は、実施例１と同様にプロスタグランジンＤ２の抗不安活性を評価した。結果を図５に示す。図５（ａ）中、（  ）内の数値は、各試験群のマウスの数を示す。また、図５（ａ）及び（ｂ）中、フィッシャー試験におけるｐ値に関して、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。さらに、図５（ｃ）中、「ＰＧＤ２」は、プロスタグランジンＤ２を示す。
【００３９】
（Ｂ）評価結果
図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、プロスタグランジンＤ２を１〜１００ｐｍｏｌ／マウスの用量で脳室内へ投与した結果、１０〜１００ｐｍｏｌ／マウスの用量で投与した場合、（Ｉ）オープンアーム内での滞留時間の割合、及び（ＩＩ）オープンアーム内への進入回数の割合が増加した。
フィッシャー試験を適用した多重比較により、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して、１０〜１００ｐｍｏｌ／マウスの用量で、プロスタグランジンＤ２の抗不安作用効果は有意であることが示された。
一方、図５（ｃ）に示すように、総進入回数については、いずれの試験群においても有意な差はなく、総運動量は変化しなかった。
以上より、プロスタグランジンＤ２は、運動量を変化させることなく、抗不安作用を引き起こすことが示された。
【００４０】
（実施例５）
＜ＢＷ２４５Ｃの脳室内投与による抗不安活性の評価＞
抗不安作用が、ＤＰ１レセプターアゴニストによって示されるか否かを確認するために、ＢＷ２４５Ｃの抗不安作用に対する効果を評価した。
（Ａ）材料及び方法
ＤＰ１レセプターアゴニストであるＢＷ２４５Ｃ（Ｃａｙｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を人工脳脊髄液に溶解させたＢＷ２４５Ｃ溶液又はコントロールとして人工脳脊髄液のみを、試験の１０分前にマウスの脳室内へ投与し、１匹ずつ高架十字迷路試験に供した。人工脳脊髄液は、実施例４と同様のものを使用した。ＢＷ２４５Ｃ溶液は、マウス１匹あたりのＢＷ２４５Ｃの投与量がそれぞれ０．１ｐｍｏｌ／マウス、１ｐｍｏｌ／マウスとなるように投与した。試験に供したマウスの数は、０．１ｐｍｏｌ／マウス投与群：８匹、１ｐｍｏｌ／マウス投与群：８匹、コントロール：８匹とした。これ以外は、実施例１と同様にＢＷ２４５Ｃの抗不安活性を評価した。結果を図６に示す。図６（ａ）中、（  ）内の数値は、各試験群のマウスの数を示す。また、図６（ａ）及び（ｂ）中、フィッシャー試験におけるｐ値に関して、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。
【００４１】
（Ｂ）評価結果
図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＢＷ２４５Ｃを０．１〜１ｐｍｏｌ／マウスの用量で脳室内へ投与した結果、１ｐｍｏｌ／マウスの用量で投与した場合、（Ｉ）オープンアーム内での滞留時間の割合、及び（ＩＩ）オープンアーム内への進入回数の割合が増加した。
フィッシャー試験を適用した多重比較により、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して、１ｐｍｏｌ／マウスの用量でＢＷ２４５Ｃの抗不安作用効果は有意であることが示された。
一方、図６（ｃ）に示すように、総進入回数については、いずれの試験群においても有意な差はなく、総運動量は変化しなかった。
以上より、ＢＷ２４５Ｃは、プロスタグランジンＤ２と同様に、運動量を変化させることなく、抗不安作用を引き起こすことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、不安障害患者のための治療薬に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例で使用した高架十字迷路を説明する図である。
【図２】実施例１における（ａ）「総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合」を示すグラフ、（ｂ）「総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合」を示すグラフ、（ｃ）「総進入回数」を示すグラフである。
【図３】実施例２における（ａ）「総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合」を示すグラフ、（ｂ）「総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合」を示すグラフ、（ｃ）「総進入回数」を示すグラフである。
【図４】実施例３における（ａ）「総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合」を示すグラフ、（ｂ）「総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合」を示すグラフ、（ｃ）「総進入回数」を示すグラフである。
【図５】実施例４における（ａ）「総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合」を示すグラフ、（ｂ）「総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合」を示すグラフ、（ｃ）「総進入回数」を示すグラフである。
【図６】実施例５における（ａ）「総進入時間に対するオープンアーム内での滞留時間の割合」を示すグラフ、（ｂ）「総進入回数に対するオープンアーム内への進入回数の割合」を示すグラフ、（ｃ）「総進入回数」を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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