(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L1レベルが患者サンプルにおいて決定され、L1の存在が卵巣腫瘍もしくは子宮内膜腫瘍の存在の指標またはかかる腫瘍の素因の指標であることを特徴とする、卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の検出方法。
【請求項２】
組織において細胞表面分子としてL1を測定することによりL1レベルを決定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者サンプルとしての体液中の可溶性形態のL1を検出することによりL1レベルを決定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
体液が血清である請求項３記載の方法。
【請求項５】
患者サンプルと抗L1抗体またはそのフラグメントとを接触させ、次に該抗L1抗体またはそのフラグメントがL1に結合しているかどうかを測定することによりL1レベルを決定する、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
ラジオイムノアッセイまたはELISAとして行なう、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載の方法に用いるためのキットであって、抗L1抗体またはそのフラグメント、および対照としてのＬ１またはその結合活性部分をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、L1レベルが患者サンプルにおいて決定され、L1の存在が卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の存在の指標あるいはこのような腫瘍に対する可能性のある素因の指標であることに特徴を有する卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の診断あるいは予後のための方法に関する。この検出は、好ましくはモノクローナル抗L1抗体またはそのフラグメントを介してなされる。本発明はまた、卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍治療に使用するための医薬調製物に関する。さらに、本発明は、卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍を処置する方法に関する。
【０００２】
特異的な腫瘍の診断は、とりわけ細胞質、細胞表面および核に由来し得る特異的腫瘍抗原（TAG ）の検出に基づく。この関連において、区別は、細胞上の分化抗原として生理的に存在もし得る組織、個体、種特異的TAG 間、ならびに腫瘍特異的ネオ抗原と呼ばれるTAG とさらなる分化で再び消滅する細胞型の腫瘍形成の中間産物としてのTAG 間でなされる。上記全ての細胞内抗原（AG）または目的とすべき腫瘍細胞上に表面抗原として（漸増的に）形成される抗原は、腫瘍マーカーとして免疫化学的方法によって検出可能である。診断的に重要なものは、例えば、腫瘍胎児性AG（「OFA 」）、例えば、癌胎児性（carcinoembryonal）AG（結腸癌の場合）、SCC AG（「鱗状細胞癌抗原」）、α1 フェトプロテイン（初期肝臓細胞癌の場合）、イソフェリチンおよび胎児硫糖タンパク質（sulfoglycoprotein ）（胃癌および結腸癌の場合）、α2-H 鉄タンパク質（初期小児期に生じる悪性腫瘍の場合）、γ- フェトプロテイン（肉腫、白血病、乳癌の場合）、さらに「Tennessee AG」（テナゲン（tennagen））、「組織ポリペプチドAG」（TPA ）、腫瘍胎児性膜AG（OFMA）、腫瘍特異的移植AG（TSTA）、膜関連腫瘍AG（MATA）ならびにマイナー抗原（例えば、「A 様」AG、「Forssman」AG、WGL など）である。診断的に使用される別の腫瘍マーカーはこれまで、CA125 （より高い程度まで腫瘍細胞に生じ、そして放出される非常にグリコシル化された細胞性ムチン）である。このマーカーは、ここまでヒト卵巣癌または子宮内膜癌の診断のために、例えば、血清レベルの決定を介して、または操作後に抗CA125 抗体を用いる組織サンプルの免疫組織学的染色を介して使用されている。しかし、CA125 の検出に基づく診断は、多数の重大な欠点を有する。例えば、CA125 の増加した血清レベルはまた、多数の穏やかな疾患（例えば、子宮内膜炎症、骨盤腹膜炎、肝硬変の場合、または月経もしくは妊娠の間もまた）を生じ得る。増加したCA125 レベルはまた、非婦人科学悪性腫瘍（例えば、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌または肺癌）の場合に見出される。従って、このことは、疑陽性診断を導き得る。CA125 はまた、結腸腺癌、胃癌、肺癌および子宮内膜の異型肥厚の免疫染色の場合に見出される。卵巣癌または子宮内膜癌の初期検出について、CA125 の測定（超音波と組み合わせた）は、満足のいく確かな結果をいずれも得ない。従って、感受性および特異性の両方に関して、CA125 は、卵巣癌または子宮内膜癌の初期検出に対して適さないが、いやしくもさらに次の段階および再発について、特異性に関する上記問題（すなわち、疑陽性知見の診断的にほとんど受容不可能な発現）が存在する。
【０００３】
従って、本発明は、卵巣癌および子宮内膜癌の改良されかつより特異的な診断を可能にするマーカーを提供する技術的な問題に基づき、種々の腫瘍型間の可能な区別および転移を検出する可能性、従って改良された治療（例えば外科的）測定を含む。さらなる技術的問題は、治療標的としてL1を使用することによって治療的アプローチを提供することである。
【０００４】
この技術的問題に対する解答は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することによって達成される。
【０００５】
驚くことに、L1接着分子は、体液において（例えば、血清、腹水およびダグラス窩由来の液体において）ならびに卵巣腫瘍および子宮内膜腫瘍由来の組織において、とりわけこれらの腫瘍の高度に攻撃的な形態に対して高度に特異的なマーカーを示すことが見出されている。L1は、200 〜230kDaのニューロン接着分子である。L1は、その構造に関して、Igスーパーファミリーに属する。L1は、細胞移動に関連するタンパク質である。L1は、脳において小脳ニューロン移動および神経突起の繊維束形成に関する。L1は、L1自身の中でいくつかの結合パートナー（プロテオグリカンニューロカン（neurocan）および種々のインテグリン）を有する（Kadmonら、Differentiation 61: 143-150, 1997 ）。可溶性L1は、腫瘍細胞の移動を刺激し得、そしてこれ故転移を促進し得る（Mechtersheimerら、JBC 2001, 印刷中）。本発明で生じるスクリーニング実験において、L1が末梢神経および神経節を除いた正常な組織において発現されないことがわかった。穏やかな卵巣腫瘍および子宮内膜腫瘍において、L1発現は、検出され得ず、そして他の悪性腫瘍（乳房、前立腺、子宮頸）のスクリーニングはまた、陰性であった。L1は、卵巣および子宮内膜の高度に攻撃的な血清乳頭腫癌で発現されることを示した。可溶性L1は、腫瘍患者の血清および腹水または胸膜液において検出可能であったが、正常な血清および体液において、あるいは穏やかな腫瘍を有する患者においては検出不可能であった。婦人科学掻爬によって得られた操作前サンプルは、子宮内膜の血清乳頭腫癌および卵巣のかかわる血清乳頭腫癌において陽性であった。従って、血清および体液中の細胞表面分子としてのL1の発現は、攻撃的卵巣腫瘍および子宮内膜腫瘍の初期検出に関して、ならびに予測に関して非常に重要である。従って、L1検出は、攻撃的な卵巣腫瘍および子宮内膜腫瘍の初期検出および正確な診断または予後を可能にする。
【０００６】
従って、本発明の主題は、L1レベルが患者サンプルにおいて検出され、L1の存在が卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の存在の指標あるいはこのような腫瘍に対する素因の指標であることに特徴を有する卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の診断のための、あるいは予後のための方法に関する。
【０００７】
患者サンプルを得る適切な方法は、当業者に公知である。L1接着分子は、一般的な方法を介して検出され得、L1タンパク質の既知のアミノ酸配列または対応する遺伝子の核酸配列が基礎として使用される（Reid, R. A. ら、J. Mol. Neurosci. 3: 127-135, 1992）。この関連において、検出は、転写（一般的方法を介するmRNAの濃度の検出）またはL1タンパク質自体に帰し得、後者が好ましい。語句「卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の存在の指標あるいはこのような腫瘍に対する素因の指標としてのL1の存在」はまた、L1の濃度が対照（例えば、健常なヒトの体液または組織）と比較して増加した状況を含む。
【０００８】
本発明の方法の第一に好ましい実施形態において、L1レベルは、組織中の細胞表面分子としてL1を測定することによって決定される。適切な組織は、除去された腫瘍組織および掻爬によって得られた細胞材料であり、婦人科学的な掻爬から得られた組織が好ましい。
【０００９】
本発明の方法の第二の好ましい実施形態において、L1レベルは、体液中の可溶性形態でのL1を測定することによって決定される。適切な体液は、血清、腹水または胸膜液およびダグラス窩由来の液であり、血清が好ましい。
【００１０】
第三の好ましい実施形態は、L1の検出を実施しないが、（組換え）L1によってL1特異的抗体の検出を実施する。この目的について、精製（組換え）L1は、マイクロ滴定プレートの表面に固定され、次いで患者血清と共にインキュベートされる。次いで、結合抗体は、酵素結合体化二次抗体および呈色反応によって検出される。
【００１１】
第四の好ましい実施形態において、L1 mRNA は、体液サンプル中（好ましくは、血清中）で検出される。
【００１２】
L1、L1 mRNA 、およびL1抗体それぞれ、および適切な特異的プローブの適切な検出方法は、当業者に公知であり、特異的抗体を介するL1タンパク質の検出が好ましく、同じかまたは異なる抗体は、可溶性形態および細胞表面上の形態の両方に対して使用可能であった。
【００１３】
本発明の方法の特に好ましい第一および第二の実施形態において、L1レベルは、患者サンプルを抗L1抗体またはそのフラグメントと接触させ、次いで抗L1抗体またはそのフラグメントがL1に結合されているかを測定することによる結果、決定される。これに関して、図6A〜C が参照される。
【００１４】
この目的に適切な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体あるいはそのフラグメントである。この関連において、語句「フラグメント」は、完全抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の全ての部分（例えば、Fab-、Fv- または「一本鎖Fv」フラグメント）をいう。このようなフラグメントの産物は、当業者に公知である。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、標準的な方法によって調製され得る。共にL1形態（可溶性／細胞表面上のアンカー）で存在するL1またはその合成フラグメントは、好ましくは免疫原として役に立つ。このポリペプチドまたはペプチドおよびそのフラグメントはそれぞれ、例えば、対応する遺伝子を得ること、クローニングすることおよび組換え発現によって産生され得る。モノクローナル抗体を得る方法は、当業者に公知である。本発明の診断方法に適切な抗L1抗体は、市販される。これらは、例えば、一次ヒトモノクローナル抗L1抗体15551A（Company of Pharmingen, San Diego, USA ）またはMCA1753 （BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH, Eching, Germany ）である。
【００１５】
本発明の方法のさらにより好ましい実施形態において、L1レベルは、一次モノクローナル抗L1抗体および市販の二次抗体を介して決定される。二次抗体は、検出され得る任意の標識を所有し得る。しかし、この二次抗体がビオチン結合体化され得、そしてストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いることによって検出され得ることが好ましい。当業者は、この実施形態を実施する方法を完全によく知っている。L1の検出（例えば、ELISA を介して）はまた、唯一の（モノクローナル）抗体を用いて達成され得る。なぜならば、血清中のL1は多量体であるからである（実施例3 、図5B参照）。
【００１６】
好ましい実施形態において、患者サンプルは、例えば、パラフィン区画として固定される。患者サンプルはまた、一般的方法によってプラスチック皿の壁へ吸収され得、その結果、L1は、例えば、そこへ添加された特異的抗体に対するその結合特異性を緩めない。
【００１７】
本発明の方法の好ましい代替の実施形態において、抗L1抗体またはそのフラグメントは固定される、すなわち、例えば、L1に対するその結合特異性を緩めずにプラスチック皿の壁へ吸収される。次いで、患者サンプルが添加される。
【００１８】
抗体の結合は、一般的方法（例えば、ウェスタンブロット、ELISA 、放射能免疫アッセイ（RIA ）など）によって検出され得、RIA およびELISA が好ましい。
【００１９】
本発明の方法の上記好ましい第四の実施形態は、RT-PCRによるL1 mRNA の検出に基づく。ヒトL1の異なるアイソフォーム（すなわち、造血L1対ニューロンL1）がL1エキソン27使用に基づいて区別され得る前に示されている。造血細胞は、エキソン27を発現しない（Ebeling ら、Eur J Immunol. 26: 2508-2516, 1996）。このエキソンは、L1の細胞質かす中の4 個のアミノ酸をコードする。L1のこの領域に対して特異的なプライマーを用いるRT-PCRによって、卵巣腫瘍（定着細胞株および腫瘍検体（speciment ））は、12個のヌクレオチドの挿入によって特徴付けられたニューロン形態のL1を発現することが現在見出されている（図4 ）。同じプライマーを使用して、L1特異的mRNAが腫瘍患者血清において検出され得たことが観察されている。ELISA によるタンパク質検出に加えて腫瘍由来mRNA（できるかぎり血液中の腫瘍細胞由来）のRT-PCR検出が、診断のためには感度の高い技術である。
【００２０】
本発明に基づいて、本発明の診断方法に使用し、好ましくは抗L1抗体またはそのフラグメントおよび対照の目的のためさらにL1またはその結合活性部分を含むキットがまた、開発された。語句「結合活性部分」とは、抗体と反応し、全分子が同様に反応するフラグメントをいう。キットの開発に依存して、抗体は、別の単位（例えば、マーカー）に結合体化され得、および／または固体キャリア（基材）に固定化され得る。キットはまた、L1／抗体複合体の検出のために第二の抗体を含み得る。抗体またはそのフラグメントは、遊離形態で存在するか、または固体キャリア（例えば、プラスチック皿、試験管、マイクロ滴定プレート、試験ロッドなど）に固定化され得る。このキットはまた、素因または腫瘍の存在の検出のためのアッセイにおける抗体またはそのフラグメントの使用を記載する使用説明書を含み得る。このキットはまた、標識化物の検出のためまたは陽性および陰性対照の標識化のための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。
【００２１】
上記の抗L1抗体またはそのフラグメントによる卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍の陽性診断検出の場合、腫瘍特異的T リンパ球の高感受性化（sensibilization ）を介する免疫治療がまた、上記抗体またはそのフラグメントを用いるか、またはL1（公知のアミノ酸配列に基づく）由来であり、かつ好ましくは少なくとも9 〜12アミノ酸長を有するペプチドを用いる公知の方法に従って実施され得る。さらに、L1に対する抗体はまた、腫瘍特異的標的抗原としてL1を使用する意図で使用され得る。
【００２２】
従って、本発明はまた、抗L1抗体またはそのフラグメント、あるいはL1由来のペプチド、あるいはL1アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物に関する。
【００２３】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。特に好ましい態様では、前記モノクローナル抗体は、動物（例えば、マウス）に由来する抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはそのフラグメントである。ヒト抗体に類似するキメラ抗体またはヒト化抗体はそれぞれ、減少した潜在的な抗原性を有するが、標的に対するそれらの親和性は低下しない。キメラ抗体およびヒト化抗体ならびにヒト抗体に類似する抗体の産生はそれぞれ、詳細に記載された（例えば、Queen ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86 (1989), 10029、およびVerhoeyan ら、Science 239 (1988), 1534）。ヒト化免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンの名称を有する）に実質的に由来する可変フレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウスの）（ドナー免疫グロブリンの名称を有する）に実質的に由来する相補性決定領域を有する。定常領域もまた、存在する場合、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する。ヒト患者に投与される場合、ヒト化（およびヒト）抗体は、マウスまたは他の種の抗体を超える多数の利点を提供する：（ａ）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を外来として見なさず、それゆえ、かかる注入された抗体に対する抗体応答は、完全な外来のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対する応答よりも小さいはずである；（ｂ）ヒト化抗体のエフェクター領域はヒトであるので、これはヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用する、および（ｃ）注射されたヒト化抗体は、天然に存在するヒト抗体と実質的に等しい半減期を有し、このことは、他の種の抗体と比べてより少量かつ少ない頻度の用量の投与を可能にする。
【００２４】
その好ましい態様では、L1 mAbは、イメージングのために(123)Iで標識されて、記載（vanZanten-Przybysz, I. Int.J.Cancer 92:106-114, 2001）されるようにi.p.またはi.v.注射される。L1に対するMab は、腫瘍細胞を死滅するために細胞傷害性薬物との安定な連結の後に注射される。かかる細胞傷害性化合物の例は、放射性核種、毒性タンパク質（例えば、サポリン）、化学療法剤または他の特異性を有するさらなる抗体（例えば、Ｔ細胞、例えばCD3 に対する）であり、それゆえ細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅を奏する二機能性抗体が形成される。
【００２５】
別の好ましい態様では、卵巣腫瘍および子宮内膜腫瘍におけるL1の過剰発現は、インサイチュで腫瘍細胞を死滅させるために細胞傷害性Ｔリンパ球を初回刺激するのに使用されうる。
Ａ）配列L1に由来するペプチドは、腫瘍患者をワクチン接種するために使用されうる。好ましくは、GM-CSFおよびMontanide ISA-54アジュバント（Seppic, Fairfield, NJ, USA) を有するエマルジョン中でHLA-A1（ATEGWFIGF およびGSDDSLADY ）、HLA-A2（LLANAYIYV およびWLDEDGTTV ）およびHLA-A3（VLTGYVLSY ）により制限されたL1- ペプチドの混合物が使用される。患者に、5 つのL1ペプチド（50〜200 μg 、好ましくは各々100 μg ）および150 〜200 μg （好ましくは190 μg ）のHLA-DR- 制限テタヌスヘルパーペプチドAQYIKANSKFIGITELを含むワクチンを与える。このペプチドは、テタヌストキソイドのペプチドp2（残基830-844 ）＋アミノ末端アラニン残基を示し、Ｎ末端グルタミン残基からのピログルタミン酸塩の形成を防止する。テタヌスペプチドp2は、HLA-DR分子に対する乱交雑バインダーである。ワクチンは、Montanide ISA-51アジュバント中の150 〜250mg （好ましくは225 μg ）GM-CSFとともに投与される。各患者は、好ましくは、Yamshchikov ら、Int.J.Cancer 92:703 (2001)に記載されるように合計６回の免疫で０、７、14、28、35および42日目に免疫される。個々の時間枠、用量および免疫の総数は、腫瘍の種類、腫瘍増殖、転移のあり／なし、および患者のデータ（体重、年齢等）に応じて医師により決定されうる。
Ｂ）腫瘍患者に由来する樹状細胞は、Lau ら、J.Immunother 24:66-78 （2001）により記載される上記L1ペプチドでパルスされ得る。樹状細胞は、好ましくは、無血清培地中で腫瘍患者由来のプラスチック接着性末梢血単核細胞の８日間のIL-4およびGM-CSFを用いたインキュベーションにより得られる。次いで、樹状細胞は、L1ペプチド（各約50μg/ml）で一晩パルスし、次いで（静脈内）注入のために使用される。
【００２６】
さらに好ましい態様では、卵巣腫瘍または子宮内膜腫瘍におけるL1の過剰発現は、L1アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞遊走は腫瘍細胞播種に必須であるので、腫瘍細胞からL1を排除することは望ましい。これは、確立されたアンチセンス技術により達成されうる。L1アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞においてL1発現をダウンレギュレートするために使用される。これは、好ましくは配列AGGCTGTCGTCACTGCCCA に対応し、ヒトL1の配列のヌクレオチド+3593/3611の逆補体である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、好ましくは、有意な濃度のオリゴヌクレオチドを達成するために１〜12mg/kg の間の用量で腫瘍患者の腹膜に注射される。個々の時間枠、用量および投与の総数は、腫瘍の種類、腫瘍増殖、転移のあり／なしおよび患者のデータ（体重、年齢など）に応じて医師により決定されうる。
【００２７】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００２８】
実施例１：掻爬組織の試験は、L1の発現と腫瘍の臨床段階および病理学上の程度のそれぞれとの間で高い相関を示す
腫瘍組織を標準法によりパラフィン中に包埋し、連続切片を作製する。1mmol のEDTA(pH8.0) の存在下で電子レンジ中で切片を処理（10分、92℃）した後、組織の免疫染色をMCA1753 抗体(Biozol Diagnostica Vertiebs GmbH)により行なった。結合した第１抗体を酵素結合第２抗体により検出する(Vector ABC Kit; www.vectorlabs. com) 。いくつかの典型的な染色を図１に示す。臨床データを、表１および表２に挙げる。
【００２９】
図２は、L1がまた、掻爬組織により検出されうることを示す。上記手順を用いて、腫瘍切片と同様の染色パターンを得る。掻爬材料によるL1の測定は、表１および表２の趣意内で、腫瘍の早期の手術前の分類を可能にする。
【００３０】
実施例２：ELISA は腫瘍患者の血清および腹水液における可溶性L1の存在を示し、L1の存在と腫瘍型（卵巣および子宮内膜腫瘍) との間の相関が観察される。
「捕獲」ELISA を用いて、体液（腹水、血清）のサンプルを可溶性L1の存在に対して試験した。この目的のために、マイクロ滴定プレートを実施例１に記載のヒト抗L1抗体（濃度:1μg/ml) を用いて被覆し、次に３％BSA 含有PBS を用いてブロック工程を行ない(45 分、室温) 、プレートへの非特異的結合を排除した。異なる濃度(3％BSA 含有PBS 中において1:2 および1:10の液) で体液を加え、インキュベーションを室温で１時間行なった。したがって、４つの洗浄工程をTris−緩衝食塩溶液中(TBS、pH8.0 、0.02％ Tween20の存在下) で続けた。結合した可溶性L1をヒトビオチン結合抗L1抗体の添加により測定した。この目的のために、マイクロ滴定プレートに１時間ビオチン標識抗体MCA1753 を添加する。前記のように４つの洗浄工程をこれに続ける。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Dianova Hamburg, Germany)を用いるさらなるインキュベーションを室温で１時間続ける。最後にさらなる４つの洗浄工程を行う。
【００３１】
以後、基質溶液をマイクロ滴定プレートに添加し、呈色反応の発現に関して、結果をELISA リーダーにより評価する。結果を表３に示す。
【００３２】
実施例３：可溶性L1の検出のための新規ELISA フォーマット
実施例２における上記ELISA は、L1 mAb 1（モノクローナル抗体を捕捉する）を用いるマイクロタイタープレートの被覆、およびビオチン標識（または別の標識）L1 mAb 2（モノクローナル抗体を検出する）を用いる可溶性L1の検出を使用した。ELISA のこの型は、G/K フォーマットと呼ばれる。本発明者らは、今回別のフォーマットを開発し、そこでは本発明者らは、L1に対する同じmAb を捕捉および検出の両方のために使用する(K/Kフォーマット) 。図5Aおよび5Bにおいて、ELISA の両方の型の比較を、陽性血清（CA526 、卵巣腫瘍患者）および関連しない腫瘍由来のいくつかの対照血清を用いて示す。図5Bにおける新規ELISA フォーマットが、図5Aに示される以前のフォーマットよりノイズ比に関してより良好なシグナル（約５〜８倍）を与えることが明らかである。K/K フォーマットは、検出のための抗体エピトープが捕捉に使用される抗体によりブロックされない場合のみに作動しうるので、これらの結果は、血清サンプルにおいて可溶性L1が二量体または多量体であることを意味する。単量体および二量体L1(L1-Fc融合タンパク質は二量体である) を用いる両方の型のELISA で行なわれる図５における対照データは、この概念を支持する。
【００３３】
実施例４：腫瘍サンプルにおけるL1 mRNA を検出するためのPCR 解析
PCR 解析のためのプライマー配列は、ヒトL1 cDNA 配列（EMBLアクセッション番号M74387）に由来する。腫瘍組織または患者の血清サンプル中のL1をコードするヒトmRNAの検出のために、市販のキット(Roche Molecular Biochemicals)を用いてmRNAを単離し、cDNAに転写した。繰り込まれたPCR アプローチを以下のプライマーの組み合わせを用いて使用する。第１増幅プライマー１：ACTGAGGGCTGGTTCATC（センス）、プライマー２：CTTGCACTGTACTGGCCA（アンチセンス）（94℃、45秒で１サイクル、94℃で１分、56℃で１分、72℃で１分の30サイクル）。第２PCR のために、プライマー１：ACTCAGTGAAGGATAAGGAG（センス）、プライマー２：TTGAGCGATGGCTGCTGCT と共に1 μl の第１PCR 反応物を用いる。代替的なプロトコルにおいて、以下のプライマーを使用する。プライマー１：AGGTCCCTGGAGAGTG（センス）、プライマー２：TTGAGCGATGGCTGCTGCT （アンチセンス）。PCR 反応に対する温度プロフィールは、上記のようである。好ましくは、0.5 μg/mlの臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上でPCR 産物を分離する。代替的には、感度を増加するために、標識L1オリゴヌクレオチドプローブ(TCTGAGGCCCGACCGATGAAAGATGAGACCTTC) を用いてサザンブロットによりゲルをブロットし、ハイブリダイズする。
【００３４】
【表１】
0005165827.tif 000002
【００３５】
【表２】
0005165827.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ａ：管状腺からなり、非ムチン分泌重層上皮が並んだ類内膜(endometroid) 卵巣腺癌。抗L1抗体での免疫組織化学的な染色は、強い不均一な膜染色を示す。
Ｂ：間質において固体腫瘍集団を有する乳頭およびスリット様形状を示す卵巣の漿液癌腫。抗L1での強い陽性免疫組織化学染色。
Ｃ：汎発性腫瘍状腺および線維形成性反応を伴う網。抗L1抗体による腫瘍状細胞の強い均一な免疫染色。
Ｄ：卵巣癌腫細胞により浸潤された付属器（appendical）壁。抗L1抗体による腫瘍状細胞の強い均一な染色。正常な粘膜腺およびリンパ組織は染色されない。小さな末梢性神経束は強い陽性の染色を示す。
Ｅ：粘膜固有層において小さな腫瘍状集団および拡張したリンパ管において小さな腫瘍塞栓を示す膣壁。抗L1での免疫染色は強い均一な染色を示す。
Ｆ：抗L1による腫瘍状細胞の異質な(hetergeneous)膜染色を示す子宮筋層のリンパ管における卵巣癌腫塞栓。
【図２】  掻爬物質からのL1の検出。
Ａ：掻爬から得られた組織。
Ｂ：卵巣腺癌からの対照薄切。
【図３】  ELISA による体液（1F〜14F ）および血清（1S〜32S ）における可溶性L1の検出。サンプル4F、5F、8F、12F および23F は、女性卵巣癌患者に由来する。
【図４】  エキソン27用法のPCR 解析の後の１％−アガロースゲル。
卵巣腫瘍標本(speciment) または既知の腫瘍細胞株（AR、OAW 、Mel163）由来のmRNAを単離し、cDNAに転写した。これらのcDNAをエキソン27用法のPCR 解析のテンプレートとして使用し、両方の形態をコードするプラスミドを対照として使用した（-RSLE/+RLSE ）。
【図５】  ２つの異なるELISA 形式の比較。
Ａ：マイクロタイタープレートを、L1 mAB 1でコートし、続いて３％BSA/TBS でブロッキングし、実施例２に記載されるように患者血清とともにインキュベートした。結合した可溶性L1を、ビオチン標識L1 mAB、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した。このELISA 形式は、二量体（多量体）および単量体のL1を検出しうる。
Ｂ：結合した可溶性L1をL1 mAB 1、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて検出した以外は、Ａに記載のようにしてELISA を行った。このELISA 形式は、二量体（多量体）L1のみを検出しうる。
【図６】  Ａ：卵巣腫瘍標本を、溶解し、SDS-PAGEおよびL1の細胞質部分に対する抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した。
Ｂ：腫瘍患者由来の血清を、セファロースに結合したL1抗体とともに免疫沈降し、SDS-PAGEにより分離し、同じ抗L1抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した。
Ｃ：腫瘍患者および正常な個体の血清を、可溶性L1の存在についてELISA により解析した。各グループからの患者数を括弧内に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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