(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウィルスの中空カプシドを含む抗原またはこの抗原をコードするｃＤＮＡを含むワクシニアウイルスベクターまたはプラスミドベクターの有効量と獣医学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む口蹄疫に対するワクチンまたは免疫組成物であって、
上記抗原は変性したＰ１領域をコードするｃＤＮＡおよび口蹄疫ウイルスの３Ｃプロテアーゼを真核細胞内で発現させて得られ、上記の変性したＰ１領域は配列番号第３８の１７９番目のアミノ酸に対応する位置がシステインに置換され、天然には無い硫黄−硫黄結合を形成し、上記中空カプシドが熱安定化されていることを特長とするワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２】
Ｐ１領域をコードする上記ｃＤＮＡが２Ａの全部または一部をさらにコードする請求項１に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項３】
３Ｃプロテアーゼをコードする上記ｃＤＮＡがタンパク３Ｂの全部または一部もさらにコードする請求項１または２に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項４】
上記中空カプシドがワクチン中にサブユニットとして有効な量で存在する請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項５】
上記のサブユニット形の中空カプシドが、ウイルス起源の誘発性プロモータまたは後期プロモータの制御下でインビトロ発現ベクターによって真核細胞内でｃＤＮＡを発現させて得られる請求項４に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項６】
上記プロモータがＴ７バクテリオファージプロモータ、熱ショックプロモータまたはウイルス起源の後期プロモータの中から選択される請求項５に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項７】
上記プロモータがＴ７バクテリオファージプロモータであり、サブユニット形の上記中空カプシドがＴ７ポリメラーゼの発現の存在下でｃＤＮＡを発現させて得られる請求項６に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項８】
上記真核細胞がＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、ＭＤＢＫおよびＰＫ１５細胞からなる群の中から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項９】
中空カプシドを保存する培地で作られる請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１１】
アジュバントとして水酸化アルミニウム、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマー、ＧＭ−ＣＳＦを含むか、油中水、水中油または水中油中水エマルションの形をした請求項１０に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１２】
上記ｃＤＮＡがウイルス起源の後期プロモータの制御下でウイルス性ベクターによって発現される請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１３】
上記ｃＤＮＡがウイルス起源または細胞起源の強い早期プロモータの制御下でプラスミドベクターによって発現する請求項１２に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１４】
上記ｃＤＮＡが、ＳＶ４０ウイルスの早期プロモータ、ロウスサルコマ(Rous sarcoma)ウイルスのＬＴＲプロモータおよびサイトスケルトン遺伝子のプロモータの中から選択されるプロモータの制御下で、プラスミドベクターによって発現する請求項１３に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１５】
上記の発現がＣＭＶ−ＩＥの制御下で発現される請求項１３に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１６】
上記サイトスケルトン遺伝子がデスミンプロモータまたはアクチンプロモータである請求項１４に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１７】
1000重量部のＮａＣｌ生理食塩水または燐酸緩衝液に対して９重量部を含む請求項１に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１８】
アジュバントをさらに含む請求項１４に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項１９】
プラスミドベクターを含み、アジュバントが下記式の第四アンモニウム塩を含むカチオンリピドを含む請求項１８に記載のワクチンまたは免疫組成物：
【化１】
0005153984.tif 000050
（ここで、Ｒ1は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、Ｒ2は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
【請求項２０】
アジュバントがＤＭＲＩＥ［（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス（テトラデシルオキシ）-1-プロパンアンモニウム）を含む請求項１９に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２１】
プラスミドベクターを含み、アジュバントがアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーまたは無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマーを含む請求項１８に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２２】
アジュバントがＧＭ−ＣＳＦを含む請求項１８に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２３】
インビボでＧＭ−ＣＳＦを発現するベクターを含む請求項１８に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２４】
ＤＭＲＩＥの他に天然リピドを含む請求項２０に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【請求項２５】
ＤＭＲＩＥとＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン）とを組み合わせたＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを含む請求項２４に記載のワクチンまたは免疫組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は口蹄疫（fievre aphteuse）に対するワクチン、特に熱的な安定性が改良されたワクチンに関するものである。
本発明はさらに、このワクチンの製造方法と、このワクチン製造での抗原の利用と、このワクチンを用いた予防接種法とに関するものである。
本発明は特に、ウイルスの自然な配列と比べて修飾された、ヌクレオチド配列、特にｃＤＮＡおよびアミノ酸配列に関するものである。
本発明はさらに、修飾されたヌクレオチド配列の発現産物と、これらの修飾を組み込んだ口蹄疫抗原およびウイルスとに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
口蹄疫は飼育動物が発症する最も毒性および伝染性の高い病気の１つである。この病気は世界中の多くの国、特にアフリカ、アジアおよび南アメリカの風土病であり、時々、大流行する病気である。この病気が発生した国は、感染群の生産性、重量および乳生産の低下および外国との通商停止によって経済的に極めて深刻な結果に陥ることになる。この病気に対する対策は厳しい輸入規制、衛生管理および検疫の実施、罹患動物の屠殺であり、大流行時には国または地域レベルまたは病気の周辺区域での予防手段としての不活化ワクチンを用いた予防接種プログラムの実施である。
【０００３】
この病気は潜伏期間が短く、感染力が強く、口および足に潰瘍ができ、幼若動物は死ぬこともあるのが特徴である。口蹄疫は多くの動物種、特にウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギで発症する。この病気の原因となる物質はアフタウイルス属ピコルナウイルス科（Cooper達、Interviology、1978、10、165-180）に属するリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである。口蹄疫ウイルスは英語の略語でＦＭＤＶ（foot-and-mouth disease virus）ともよばれる。現在、７種の口蹄疫ウイルスすなわちヨーロッパ型（A、OおよびC）、アフリカ型（SAT1、SAT2、SAT3）およびアジア型（Asia 1）が知られている。さらに、多くの亜型が識別されている（Kleid達、Science、1981、214、1125-1129）。
このウイルスは約8500のヌクレオチドからなる正の極性を有する一本鎖ＲＮＡ分子を含む直径が25nmの裸の正二十面体である。このＲＮＡ分子はタンパクＰ１またはP88として知られるカプシド前駆体を含む単一のポリタンパクをコードする単一の転写解読枠（ＯＲＦ）からなる。このタンパクＰ１のアミノ末端はミリスチル化されている。
【０００４】
タンパクＰ１は成熟過程でプロテアーゼ３ＣによってＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３（または１ＡＢ、１Ｄ、１Ｃ）として知られる3つのタンパクに分れる（Belsham G.J., 生物物理学および分子生物学の進歩、1993、60、241-261）。タンパクＶＰ０はビリオンで２つのタンパクＶＰ４およびＶＰ２（または１Ａおよび１Ｂ）に分裂する。タンパクＶＰ０のＶＰ１およびＶＰ３への変換機構および成熟したビリオンの形成機構は知られていない。タンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は分子量が約26,000Daであるが、タンパクＶＰ４の分子量は小さく、約8,000である。
【０００５】
カプシドタンパクの単純な会合によってプロモータまたは5S分子が形成される。このプロモータが口蹄疫ウイルスカプシドの基本成分である。このプロモータが複合して五量体になって12S分子を形成する。上記ビリオンは12個の12S五量体の会合による146S粒子によってゲノムのＲＮＡ分子をカプシド化して得られる。
ウイルス性カプシドは内部にＲＮＡ分子が存在しない状態で形成されることもある。この場合のカプシドは中空である。この中空カプシドは70S粒子ともよばれる。中空カプシドの形成はウイルス複製中に自然に起きることもあれば、化学処理によって人工的に製造することもできる。
【０００６】
口蹄疫に対するワクチンは一般に多価ワクチンにして効果を上げる必要がある。このワクチンの組成はその地域での優占型が変わったらすぐに新しいものに代える必要がある。さらに、この病気が動物集団で急速に広がるのを防ぐためには免疫が速く誘導され、感染防御性が高いワクチンであるのが望ましい。
口蹄疫に対する有効なワクチンを開発するために多くの仮説、研究法および提案が出されてきたが、現在、市場に出ているワクチンは不活化ウイルスのみである。
化学的不活化処理はウイルスの免疫抗原性を低下させ、中和抗体を生成させることがある。所定の投与量に免疫応答を刺激するためのアジュバントを添加しなければならないことが多いが、アジュバントの組成によっては炎症反応を誘発することがある。不活化ワクチンは長期の免疫を与えるものではないので、ブースター接種は毎年行わなければならず、問題が起きたとき、特に大流行したときにはより頻繁に行わなければならない。さらに、不完全な不活化の危険および／または不活化ワクチン製造中にウイルスが逃げる危険もある（King et al., 1981, Nature, 293, 479-480）。
サブユニットワクチンおよび組換えベクターの製造を可能にする遺伝子工学の技術が開発されてはいるが、多くの試みにもかかわらず、これまでに市場に出たものはない。
【０００７】
本研究より前に自然の中空カプシドに関する研究がされている。Rowlands達（Rowlandset al., J.Gen.Virol.,1975、26、227−238）はA10口蹄疫のビリオンは主として4つのタンパクVＰ１、VP2、VP3、VP4を含むことを開示している。これに対して、自然の中空カプシド（組換えで得られたものではなくA10口蹄疫ウイルスの培地から精製したもの）は基本的に分割されていないタンパクVP0を含む。同一の結果はA-Pando口蹄疫ウイルスを用いてRweyemamu（Rweyemamu al., Archives of Virology、1979、59、69-79）によって示されている。Tris-EDTA存在下での透析後に遠心分離して得た人工的な中空カプシドはタンパクVP4を全く含まない。Rowlands達によればこれらの人工カプシドは免疫原性が低く、自然の中空カプシドはホルムアルデヒド処理によって安定化した後にした免疫原性を示さず、著者が述べているように、モルモットで自然中空カプシドにより誘発される抗体応答は不安定である。天然の中空カプシドの安定化の必要性に関してはRowlands達とRweyemamu達で意見が一致していない。Rweyemamu達の場合、ホルムアルデヒド処理は天然の中空カプシドの抗原性レベルに影響を与えない。免疫原性はモルモットでの中和抗体の誘発だけでテストされただけである。
【０００８】
多くの研究者は中空カプシドに関する上記の考えに賛同しておらず、反対する者もいる。例えばDoel T.R.とChong W.K.T. 達（Doel T.R. al., Archives of Virology、1982、73、185-191）は、中空カプシドは亜型A24の口蹄疫ビリオンよりも安定していないので免疫原性が低いという結論を実験結果から出している。
【０００９】
昆虫の細胞内での組換えバキュロウイルスによるカプシドタンパクの前駆体Ｐ１をコードする遺伝子の発現と、E.coli内での３Ｃプロテアーゼと組み合わされたＰ１をコードする遺伝子の発現とが比較されている（Grubman達、Vaccine、1993,11,825-829、Lewis達、J.Virol.,1991,65,6572-6580）。E.coli内でのＰ１と３Ｃの共発現によって中空カプシド70Sの集合が起こる。これら２つの構築物の発現産物によってモルモットおよびブタで中和抗体が生じる。Ｐ１/バキュロウイルス構築物で得られた抗体価は低い。これと同じ発現産物はブタで部分的な保護を誘発する。しかし、この病気から保護されたブタの中には攻撃ウイルスの複製から保護されないものもいる。
上記著者はさらに、E.coli.発現系がこれらのタンパクをミリスチル化せず、プロテアーゼ３Ｃはこの細胞に対して有毒であることを確認している。Lewis達の結論は、ウイルスの構造および動物を最大限に保護するのに必要なカプシドの構造に関する基本的な問題には答えが出ていないというものである。さらに、Grubman達はワクチン製剤前に中空カプシドを安定化する必要があることを確認しており、さらに、ウイルス性培地から抽出して得た中空カプシドを用いた場合の問題点に関しても認めている（上記参照）。
【００１０】
口蹄疫の中空カプシドA10、A24、O1Kを得るためにワクシニアウイルスからなる発現系も用いられている（Abrams達、J.Gen.Virol.,1995、76、3089-3098）。各亜型ごとに２つの主構築物が作られている。これらはワクシニアウイルスの早期／後期p7.5KプロモータまたはバクテリオファージＴ７プロモータの制御下で前駆体Ｐ１およびプロテアーゼ３Ｃをコードするヌクレオチド配列の断片を含んでいる。ヒト細胞培地での組換えとインビトロ発現の実験のみが行われている。p7.5Kプロモータを含む構築物によって形質転換された細胞培地では組換えワクシニアウイルスを単離できなかった。その理由は不明である。プロモータＴ７を含む構築物によって形質転換された細胞培地では組換えワクシニアウイルスベクターを得ることができ、ウイルス性タンパクVP0、VＰ１、VP3を発現し、さらに中空カプシドを得ることができている。これらの実験は口蹄疫ウイルスの形態研究のためであって、ワクチンの作成および効果の評価を対象とするものではない。
【００１１】
Chinsangaram達はhCMV-IEプロモータに依存するＰ１-２Ａと３Ｃとをコードするカセットを含むプラスミドを試験している（Chinsangaram達、J.Virol.,1998,72（5）、4454-4457）。これらのプラスミドをブタに接種して中和抗体を誘発しているが、ブタのグループによっては2回の接種では保護免疫ができなかったり、4回の接種後に保護免疫ができたものがある。この著者はサイトカインの共発現により誘発される免疫応答を改良するのが好ましいという結論を出している。
【００１２】
上記のアプローチはワクチン製造を目指すものではないが、口蹄疫ウイルスのタンパクVＰ１を単独で使用するか、融合すなわち合成ペプチドとしての使用しようとした著者もいる。
E.coli.のトリプトファンオペロンのタンパクLEと、口蹄疫ウイルスのタンパクVＰ１の断片（モノマー形態におけるアミノ酸131-157）とからなる融合タンパクを用いた研究をブタで行い（Morgan達、Am.J.Vet.Res.,1990、51、40-45）、その結果とA12口蹄疫から構築した同様の融合タンパク（タンデム型でアミノ酸137-168）を用いて得られた結果とが比較されている。Giavedoni達（Giavedoni達、J.,Gen.Virol.,1991,72,967-971）は口蹄疫ウイルスO1のタンパクVＰ１のC末端領域の断片を有する融合タンパクTrpEについて記載している。Huang達はβガラクトシダーゼと、口蹄疫ウイルスOのVＰ１配列の2つのタンデム反復とを含む組換え融合タンパクについて記載している（Huang達、Viral Immunol.,1999,12（1）,1-8）。
【００１３】
タンパクVＰ１の一部または全部を含む融合タンパクはウイルス性ベクターすなわちヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスを使用することも得られる。下記文献にはウシヘルペスウイルスの糖タンパクgpIIIと融合した口蹄疫ウイルスのペプチド配列を含む融合タンパク（VＰ１のアミノ酸200〜213と結合したVＰ１のアミノ酸141〜158）を作るのに用いたウシヘルペスが記載されている。
【特許文献１】
カナダ国特許出願第2,047,585号
【００１４】
さらに、タンパクVＰ１の免疫原性領域（この領域に関してはStrohmaier達、J.Gen.Virol.,1982,59,295-306を参照）をベースにした合成ペプチドを含むワクチンが開発され、試験されている。
Agterberg達（Vaccine、1990、8、438-440）は、形質転換したE.coli.バクテリア中で、口蹄疫A12のタンパクVＰ１の２つの免疫原性決定基（領域141-153および200-207）と、E.coli K-12の膜タンパクとを含む融合タンパクを製造し、この融合タンパク100μgを筋肉内経路でモルモットに投与している。その結果、相同抗原投与後に検出可能なレベルで中和抗体および保護が示されている。
下記文献には（口蹄疫ウイルスA12のVＰ１の領域134-168に対応する）A、OまたはAsia型の口蹄疫ウイルスのVＰ１の抗原部位の共通配列に対応する合成ペプチドが記載されている。
【００１５】
【特許文献２】
国際特許出願第99/66954号
下記文献には口蹄疫ウイルスタンパクの部分配列に対応する少なくとも8個のアミノ酸を含む合成ペプチドが記載されている。
【特許文献３】
国際特許出願第98/12333号
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、口蹄疫に対する有効かつ確実なワクチンを提供することにある。
本発明の他の目的は、口蹄疫に対する安全なワクチンを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、低用量で効果のある抗口蹄疫ワクチンを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の対象は、口蹄疫ウイルスの中空カプシドの有効量を抗原として用いた口蹄疫に対するワクチンにある。この中空カプシドはカプシドをコードする口蹄疫ウイルスのゲノムのＰ１領域の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と、３Ｃプロテアーゼをコードする口蹄疫ウイルスのゲノム領域のｃＤＮＡとを真核細胞内で発現させることによって得られる。本発明ワクチンは獣医学的用途として医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤をさらに含む。定義上、機能Ｌタンパクは発現されないので、構築物はＬをコードするｃＤＮＡを含まず、好ましくはＬの全部または一部をコードするｃＤＮＡは全く含まない。
【００１８】
好ましくはＰ１と少なくとも２Ａの一部、好ましくは２Ａの全部とを発現する。この発現には２Ａを超える領域が含まれていてもよく、例えば実施例に示すように２Ｂの一部を含んでいてもよい。
３Ｃと３Ｂタンパクの一部、例えば2つの隣接した３Ｂタンパクと、例えば実施例のように３Ｄの無機能性部分とを発現するのが好ましい。
［図３］（配列番号３８、SEQ ID N38）は口蹄疫ウイルスのＡ１０株のＰ１（アミノ酸2-737）、２Ａ（アミノ酸738-753）、３Ｃ（アミノ酸913-1126）のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示している。他タイプおよび亜型の配列は実施例に示すようにGenbankから入手できる。
【００１９】
本発明の第1実施例では、中空カプシドがワクチン中にサブユニットとして十分な量で存在する。このサブユニットは１つのプロモータ、好ましくは同じプロモータに依存する領域Ｐ１および３ＣのｃＤＮＡを発現させて得るのが好ましい。このプロモータはウイルス起源の誘発性プロモータまたは後期プロモータにするのが好ましい。
使用可能な発現ベクターはウイルス性ベクター、好ましくはポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのウイルス、ヘルペスウイルスおよびプラスミドベクターからなる。これらの発現ベクターは一次真核細胞または細胞株内で中空カプシドを確実にインビトロ発現させるのに用いられる。変形例では、発現カセットを真核細胞内に組み込むために組込みベクターを用いる。使用可能な真核細胞は細胞株からの細胞、例えばBHK-21、CHO、COS、RK13、Vero、MDBK、PK15細胞であるのが好ましい。
【００２０】
誘発性プロモータとしてはＴ７バクテリオファージプロモータ、熱ショックプロモータ、メタロチオネインプロモータおよびエクジソンまたはステロイドによって誘発できるプロモータを挙げることができる。Ｔ７バクテリオファージプロモータを用いると、バクテリオファージＴ７のポリメラーゼと中空カプシドとが共発現する。
ベクターとしてポックスウイルスを用いた場合のウイルス起源の後期プロモータとしてはワクシニアウイルスのＰ１1K、ワクシニアウイルスのP28Kおよび牛痘ウイルスのＰ１60K ATIを挙げることができる。
サブユニットは凍結または凍結乾燥させて保存するのが好ましい。
投与量は0.3〜30μg、特に0.5〜20μg、好ましくは1〜10μg、さらに好ましくは1〜5μgにすることができる。一回の投与容積は0.2〜5ml、好ましくは1〜3mlにすることができる。
【００２１】
サブユニットワクチンの摂取培地（賦形剤、キャリア）は中空カプシドを保存することができる培地、例えばＤＭＥＭ型培地にするのが好ましい。
サブユニットワクチンは非経口投与、好ましくは皮下投与または筋肉内投与、特に無針注射装置（加圧流）を用いて皮内投与することができる。
当業者は各予防接種プログラムごとに用いる各ワクチンの接種回数および投与量を正確に規定するのに必要な能力を有している。
本発明ワクチンは一つまたは複数のアジュバントを含むのが好ましい。
本発明のサブユニットワクチン用のアジュバントとしては（1）水酸化アルミニウム、サポニン（例えばQuilA）、アブリジン、DDA、（2）アクリルまたはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマーを用いることができ、あるいは（3）油中水、水中油または水中油中水エマルションの形の製剤にすることができる。
【００２２】
エマルションとしては特に（欧州薬局方型の）軽流動パラフィン油、スクアランまたはスクアレン等のイソプレノイド油、アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化によって得られるオイル、直鎖アルキル基を有する酸またはアルコールのエステル、特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、ジオレイン酸プロピレングリコール、分岐鎖を有する脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルをベースにしたものを挙げることができる。エマルションを形成するのに乳化剤と一緒に油を用いることができる。乳化剤は非イオン系界面活性剤、特にポリオキシエチレン化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニッド(例えば、オレイン酸無水マンニトール)、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコールのエステル、必要に応じてさらにエトキシ化オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシステアリン酸のエステル、脂肪アルコールおよびポリオール（例えばオレインアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、特にプルロニック（Pluronic、登録商標）、特にL121（Hunter達、1995年、「アジュバントの理論および実用」参照（Ed.Steward-Tull,D.E.S）John Wiley and Sons、NY、51-94；Todd達、Vaccine,1997、15、564-570）にするのが好ましい。
【００２３】
アクリルまたはメタクリル酸のポリマーは糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋できる。これらの化合物はカルボマーという名前で知られている（Pharmeuropa vol.8、ｎ。2、6月、1996年）。当業者はさらに下記文献を参照することもできる。この特許の内容は本明細書の一部を成す。
【００２４】
【特許文献４】
米国特許出願2,909,462号
この文献には、少なくとも3個、好ましくは8個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化合物によって架橋された上記の種のアクリルポリマーであって、少なくとも3個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも2個の炭素原子を有する不飽和脂肪ラジカルで置換されたポリマーが記載されている。好ましいラジカルは2〜4個の炭素原子を含むラジカル、例えばビニル、アリル等の不飽和エチレン基である。不飽和ラジカルはそれ自身でメチル等の他の置換基を含むことができる。商品名カルボポル(Carbopol、登録商標)（BF Goodrich,Ohio,USA）で市販の製品が特に適している。これらはアリルサッカロースまたはアリルペンタエリトリトールによって架橋される。その中でも、カルボポル(Carbopol、登録商標）974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。
【００２５】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中で好ましいコポリマーは直鎖または例えばジビニルエーテルで架橋された、無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーであるＥＭＡ（登録商標）（Monsanto）である。このコポリマーに関してはJ.Fields達、Nature、186：778-780、1960年6月4日（この文献の内容は本明細書の一部を成す）を参照されたい。
アクリルまたはメタクリル酸のポリマーとＥＭＡ（登録商標）とは構造の点で下記の式の基本単位から形成されるのが好ましい：
【００２６】
【式２】
0005153984.tif 000002
【００２７】
（ここで、
Ｒ1およびＲ2はHまたはCH3を表し、同一でも異なっていてもよく、
ｘ＝0または1、好ましくはｘ＝１、
ｙ＝１または２、ただし、ｘ＋ｙ＝２）
ＥＭＡ（登録商標）ではｘ＝０およびｙ＝２であり、カルボマーではｘ＝ｙ＝１である。
【００２８】
最終ワクチン組成におけるポリマー濃度は0.01〜1.5％P/V、特に0.05〜1％P/V、好ましくは0.1〜0.4％P/Vになる。
本発明の第2実施例では、ワクチンがインビボで中空カプシドを産成するためにｃＤＮＡを含む発現ベクターを含んでいる。この中空カプシドはプラスミド発現ベクターまたはウイルス性発現ベクターに挿入され且つ１つのプロモータ、好ましくは同じプロモータに依存するように位置されたＰ１および３Ｃ領域のｃＤＮＡのインビボ発現で得るのが好ましい。このプロモータはウイルス起源の強い早期プロモータまたは後期プロモータにするのが好ましい。
ウイルス性ベクターの場合、ウイルス起源の後期プロモータを用いるのが好ましい。ウイルス性ベクターは好ましくはポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、アビポックス（例えば鶏痘、カナリア痘）、アライグマ痘、豚痘、カプリポックス、または複製型アデノウイルス、特にブタアデノウイルスおよびヘルペスウイルスにするのが好ましい。ウイルス起源の後期プロモータは、ポックスウイルスの場合、ワクシニアウイルスのＰ１１Ｋプロモータ、ワクシニアウイルスのP28Kプロモータおよび牛痘ウイルスのＰ１６０ＫＡＴＩプロモータにすることができる。
【００２９】
定義上、プラスミド発現ベクター（またはプラスミド）は、発現すべきｃＤＮＡとそのインビボ発現に必要な要素とを含むポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ転写単位をカバーする。プラスミドの形態は環状、スーパーコイルまたはその他の形であるのが好ましい。直線状のプラスミドも本発明範囲に含まれる。
プラスミドの場合、ウイルス起源または細胞起源の強い早期プロモータ、特にヒトまたはマウス起源、場合によってはラットまたはモルモット等の他の起源のサイトメガロウィルスCMV-IEの早期プロモータを用いるのが好ましい。SV40ウイルスの早期または後期プロモータまたはロウスサルコマ(Rous sarcoma)ウイルスのLTRプロモータを用いることもできる。細胞性プロモータとしてはデスミンプロモータまたはアクチンプロモータのようなサイトスケルトン遺伝子のプロモータを挙げることができる。
【００３０】
組換えワクチンは凍結または凍結乾燥させるか、液状で保存・貯蔵するのが好ましい。
本発明ワクチンに用いられるウイルス性ベクターの量は少なくとも約103pfuである。好ましくは一回の投与量で約104pfu〜約1010pfu、例えば約105pfu〜109pfu、特に約106pfu〜約108pfuである。
本発明ワクチンに用いられるプラスミドベクターの量は投与量で約1μg〜約2mg、好ましくは約50μg〜約1mgである。一回の投与容量は0.2〜5ml、好ましくは1〜3mlにするのが好ましい。
本発明の組換えワクチンは通常の投与経路で周知の方法を用いて投与することができる。本発明の好ましい実施例では筋肉内投与または皮下投与、あるいは無針注射装置を用いて皮内投与される。ウイルス性ベクターでは筋肉内投与または皮下投与が好ましい。ウイルス性またはプラスミドベクターは粘膜投与することもできる（例：経口、経鼻）。
【００３１】
これらのワクチンは一つまたは複数のアジュバントを含むのが好ましい。ウイルス性ベクターの場合には、アクリルまたはメタクリル酸のポリマーまたは無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのポリマー、特にカルボマー、特にカルボポル(Carbopol、登録商標)を用いるのが有利である（これらのアジュバントは既に述べたものである）。
プラスミドベクターは下記一般式の第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質をアジュバントとして加えて作るのが好ましい：
【００３２】
【式３】
0005153984.tif 000003
【００３３】
（ここで、
Ｒ1は12〜18の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
Ｒ2は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
上記脂質はＤＭＲＩＥ（N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2,3− ビス（テトラデシルオキシ）−1−プロパンアンモニウム、WO−A−9634109）であるのが好ましく、さらに好ましくは中性脂質、特にＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン；BehrJ.Ｐ１994,Bioconjugate Chemistry,5,382-389）と組み合わされて、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの形にするのが好ましい。プラスミドを上記アジュバントと使用直前に混合するのが好ましい。動物投与前、好ましくは10〜60分前、特に30分前に混合して錯体にするのが好ましい。ＤＯＰＥが存在するときのＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は95：5〜5：95、特に1:1である。
【００３４】
プラスミド：ＤＭＲＩＥまたはＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥアジュバントの重量比は50：1〜1：10、特に10：1〜1：5、好ましくは1：1〜1:2である。
アジュバントを含むまたは含まない上記本発明のワクチンは、インビボで発現される一種または複数のサイトカインをアジュバントとして含むこともできる。好ましくはＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte macrophage-colonystimulating factor; 顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、Clark S.C. et al. Science 1987. 230. 1229; Grant SM. et al. Drugs 1992. 53. 516）を用いる。これはワクチン組成物にＧＭ−ＣＳＦタンパクを直接組み込むことで実行でき、好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を発現可能な状態で発現ベクター、例えばFMDV抗原をコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたはその他のベクターに挿入することで実行できる。発現ベクタ−としてはプラスミドを使用するのが好ましい。ＧＭ−ＣＳＦは予防注射される動物種に従って選択する。従って、ウシではウシＧＭ−ＣＳＦ（Maliszewski 他 Molec.1988。25.843−850）が使われ、ブタではブタＧＭ−ＣＳＦ（Inumaru S.およびTakamatu H,Immunol.Cell,Biol．、1995、73，474-476）が使われる。
【００３５】
ＧＭ−ＣＳＦを発現するベクターを製造する場合、上記のＧＭ−ＣＳＦ配列はGenBankデータベースからアクセス番号D21074(ブタ)、U22385（ウシ）、X55991(ヒツジ)でアクセスできる。
本発明の他の対象は抗口蹄疫サブユニットワクチンの製造方法にある。この方法ではＰ１領域のｃＤＮＡの発現および３Ｃ領域のｃＤＮＡの発現によってウイルスの中空カプシドを作り、このカプシドを獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくは少なくとも1種のアジュバントの存在下で）配合する。
本発明の他の対象は、本発明でインビトロで製造された中空カプシドの、抗口蹄疫サブユニットワクチンの製造での使用にある。このワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤を（好ましくは少なくとも1種のアジュバントの存在下で）さらに含む。
【００３６】
本発明の他の対象は、本発明のサブユニットワクチンを動物、特に家畜、特にウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ種に投与することを含む口蹄疫の予防接種方法にある。投与法および投与量は上記の通りである。
本発明のサブユニットワクチンに関する上記の種々の特徴はこれらの各目的にも適用される。
本発明の他の対象は、抗口蹄疫用の組換えワクチンの製造方法にある。この製造方法では中空カプシドが作られる条件下でタンパクＰ１とタンパク３Ｃをインビボで発現するウイルス性またはプラスミドベクターを作り、これらのベクターを獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくは少なくとも1種のアジュバントの存在下で）配合する。
【００３７】
本発明の他の対象は、本発明のウイルス性またはプラスミドベクターの、抗口蹄疫用の組換えワクチンの製造での使用にある。このワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤を（好ましくは少なくとも1種のアジュバントの存在下で）さらに含む。
本発明の他の対象は、本発明の組換えワクチンを動物、特に家畜、特にウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ種に投与することからなる口蹄疫の予防接種方法にある。投与法および投与量は上記の通りである。
本発明のウイルス性またはプラスミドベクターを用いる組換えワクチンに関する上記の各種特徴はこれらの目的にも適用される。
【００３８】
本発明の他の対象は、本発明のワクチンと、口蹄疫ウイルスに対する他のタイプ（例えばO, A, C, SAT1, SAT2, SAT３, Ａsia）、他の亜型（例えばA10, A12 Ａ24, O1）またはその他の変種の少なくとも1種の他のワクチンとを組合せた多価ワクチンにある。この多価ワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に(好ましくはアジュバント、特に上記アジュバントと一緒に)配合されるのが好ましい。
本発明の他の対象は、本発明のワクチンと、他の病原体に対する少なくとも1種のワクチン、特に狂犬病ウイルスとを組合せた多価ワクチンにある。この多価ワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に(好ましくはアジュバント、特に上記のアジュバントと一緒に)配合される。
【００３９】
本発明の他の対象は、口蹄疫ウイルスの中空カプシドおよび得られたワクチンの温度安定性を向上させることにある。
中空カプシドの温度安定性はジスルフィド架橋を形成して行うのが有利である。
この温度安定性の向上は、カプシドの構造タンパクのポリペプチド配列、タンパクVP2中の元の配列のアミノ酸をシステインアミノ酸で置換することによって得られる。このアミノ酸はアミノ酸配列番号38（［図３］）の179位置にある。一般に、アミノ酸の位置は他の口蹄疫ウイルスと同一である（特に実施例で用いた株の場合）。他のウイルスの配列ではその位置は極めてわずかに異なっていてもよく、例えば178または180であってもよい。このアミノ酸を含む領域はαヘリックスに対応する。突然変異させるアミノ酸を同定または確認するために、この領域のアミノ酸配列が各種の口蹄疫ウイルスの間で構造内によく維持されることから考えて、この領域のアミノ酸配列を配列番号38の（例えば約10またはそれ以上、例えば10〜20のアミノ酸の）対応する領域と整列させ、特に、株O1, A10, A24, A22, C1, C3, SAT2の配列を比較することによって、この領域は下記のように書くことができる：
【００４０】
X1 Gly X3 X4 Gly X6 Leu X8 X9 Ser X11 X12 Tyr Met
(ここで、
X4およびX11はTyr, HisまたはPhe（疎水性アミノ酸）であり、
X3, X8およびX12はVal,Met,IIe,ThrまたはAlaであり、
X6はHis, Gln, Arg, Lys, SerまたはGlyであり、これはCys突然変異するアミノ酸であり、
X1はHisまたはLys（塩基性アミノ酸）であり、
X9はAsp, GluまたはLys（酸性および塩基性アミノ酸）である）
【００４１】
突然変異するアミノ酸は口蹄疫ウイルスA10のＰ１前駆体の179位置に位置するヒスチジンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスO1のＰ１前駆体の179位置のセリンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスC1のＰ１前駆体の179位置のグリシンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスA24のＰ１前駆体の179位置のヒスチジンである。
慣例に従って、開始コドンに対応するメチオニン（天然の配列では存在しないので加える）に１の番号を付ける。
すなわち、ヌクレオチドレベルでは元のコドンをシステインをコードするコドンすなわちｃＤＮＡではTGTまたはTGCコドン、ＲＮＡではUGUまたはUGCコドンで置換する。
【００４２】
本発明の他の対象は、上記の修飾を組み込んだヌクレオチド配列、特にｃＤＮＡにある。特に、本発明の対象はVP2（またはVP0）をコードする配列、特にこの修飾を組み込んだＰ１、例えばＰ１-２ＡまたはＰ１-２Ａ-２Ｂの一部と、これらを組み込んだ配列、例えばこれらを発現させることができる配列（プロモータ、ATGコドン等）を含む配列を含むｃＤＮＡ配列とそれを組み込んだベクターにある。
本発明の他の対象は、これらのヌクレオチド配列から得られたアミノ酸配列と、中空カプシドと、熱的に安定した（すなわち、熱安定性が向上した）口蹄疫ウイルスにある。これらは天然のカプシドおよびウイルスには存在しないジスルフィド架橋を含むのが好ましい。特に、これらは既に述べたように、天然のアミノ酸の代わりにシステインを含むVP2タンパクを含む。
【００４３】
本発明の好ましい実施例では、上記ワクチンは上記の修飾の使用をベースにしたもるのであり、従って、ｃＤＮＡ配列は結果的に修飾されており、インビトロまたはインビボで得られる中空カプシドはジスルフィド架橋を有する。
同様に、上記の本発明の他の全ての目的（方法、使用、プロセス）でもこれらの特徴を有するのが好ましい。
以下、添付図面を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
本発明の構築物の配列リスト(SEQ ID＝配列番号)
【００４４】
【式４】
0005153984.tif 000004
【００４５】
【式５】
0005153984.tif 000005
【００４６】
【式６】
0005153984.tif 000006
【００４７】
【実施例】
プラスミドの構築は全てSambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)に記載の標準的な分子生物学手法（クローニング、制限酵素による消化、一本鎖相補ＤＮＡの合成、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの延長等）を用いて行った。本発明で使われる全ての制限断片は「Geneclean」キット（BIOlOl社、La Jolla, CA）を用いて単離した。
口蹄疫ウイルスのヌクレオチドおよびポリペプチドの配列はGenBankデ−タベ−スから番号X00429(A10)、X00871(O1K)、AJ251476(A24)、AJ133357(C Spain Olot)で入手可能である。
【００４８】
実施例１
口蹄疫ウイルス株の培養
口蹄疫ウイルス株01K（Forss達、1984、Nucleic Acids Res.,12(16),6587-6601）、A24（Weddell達、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82,2618-2622）、A10（Caroll達、1984、Nucleic Acids Res.,12(5),2461-2472）、C Spain Olot（Toja達、1999、Virus Res.,64(2)、161-171）をBHK-21細胞（American Type Culture Collection（ATCC）寄託番号CCL-10で得られるベビーハムスターの腎臓）で培養して増殖する。
１％の酵母抽出物と1ml当たり約100,000セル含む５％の子ウシ血清とで補ったMEM イーグル培地を入れた25cm2のファルコンフラスコでBHK-21細胞を培養する。この細胞を+37℃で培養する。
3日後、細胞の層が集密状態に達する。次いで、培地を血清ではなく0.4％のラクトアルブミン加水分解物と0.3％のペプトン（pH7.4）とで補ったMEM イーグルに取り替え、口蹄疫ウイルスを1pfu〜約20セルの量で添加する。
細胞変性効果（CPE）が完了したとき（一般に培養開始から24時間後）、ウイルス性懸濁液を回収し、遠心分離し、−70℃で凍結させて清澄化する。１バッチのウイルスを製造するにはこれを３〜４回続けて行う必要がある。このバッチウイルスを−70℃で貯蔵する。
上記操作を各口蹄疫ウイルス株ごとに繰り返す。
【００４９】
実施例２
口蹄疫ウイルス株からのウイルス性ＲＮＡの抽出
実施例１で得られた、口蹄疫ウイルス株A24のウイルス性懸濁液100mlに含まれるウイルス性ＲＮＡを解凍後、メーカーの指示に従って「高純度TMウイルス性ＲＮＡキット」（カタログ番号1,858,882号、Roche Molecular Biochemicals）の溶液で抽出する。抽出終了後に得られたＲＮＡ残留物をRNaseを含まない10mlの滅菌蒸留水に再懸濁する。
各口蹄疫ウイルス株のウイルス性ＲＮＡを同じ条件下で抽出する。
実施例３
口蹄疫ウイルスA10の中空カプシド用発現プラスミドの構築
口蹄疫ウイルスA10の相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)を「遺伝子増殖 ＲＮＡ PCRキット」（カタログ番号N 808 0017、Perkin-Elmer、Norwalk、CT 06859、USA）を用いてメーカーの指定した条件下で合成する。第1断片の場合には、口蹄疫ウイルスA10のウイルス性ＲＮＡ懸濁液（実施例２）50μlと下記オリゴヌクレオチドとを用いて逆転写反応および連鎖増殖反応（「TI-ACP」または「RT-PCR」反応法）を行う：
【００５０】
【式７】
0005153984.tif 000007
【００５１】
上記オリゴヌクレオチド対によってEcoRV制限酵素部位およびATG相開始コドンをＰ１をコードするヌクレオチド配列に組み込むことができる。
オリゴヌクレオチドJCA306を延長してこのオリゴヌクレオチドとＲＮＡマトリクスとのハイブリダイゼーションでｃＤＮＡの第1鎖を合成する。
ｃＤＮＡの第1鎖の合成条件は42℃の温度で15分、次いで99℃で5分、最後に4℃で5分である。オリゴヌクレオチド対JCA305およびJCA306の存在下でのPCR反応の条件は95℃の温度で2分、次いで35サイクル（95℃で1分、次いで62℃で1分、次いで72℃で2分）、最後に72℃で7分であり、2583bp断片が得られる。
この断片をEcoRVおよびXhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動で約2550bp EcoRV-XhoI断片を単離した。この断片をＡ断片とよぶ。
第2断片では、口蹄疫ウイルスA10のウイルス性ＲＮＡ懸濁液（実施例２）50μlと下記オリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行う：
【００５２】
【式８】
0005153984.tif 000008
【００５３】
上記オリゴヌクレオチド対によってBgIII制限酵素部位および相終止コドンを３Ｃプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列に組み込むことができる。
オリゴヌクレオチドJCA308を延長してこのオリゴヌクレオチドとＲＮＡマトリクスとのハイブリダイゼーションでｃＤＮＡの第1鎖を合成する。
ｃＤＮＡの第1鎖の合成条件は42℃の温度で15分、次いで99℃で5分、最後に4℃で5分である。オリゴヌクレオチド対JCA307およびJCA308の存在下でのPCR反応の条件は95℃の温度で2分、次いで35サイクル（95℃で1分、次いで62℃で1分、次いで72℃で2分）、最後に72℃で7分であり、936bp断片が得られる。
この断片をBgIIIおよびXhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動で約900bp のBgIII-XhoI断片を単離した。この断片をＢ断片とよぶ。
Ａ断片とＢ断片とを、予めBgIIIとEcoRVで消化した発現プラスミドpVR1012（Hartikka J達、1997、Human Gene Therapy、7、1205-1217）にリゲートして、プラスミドpJCA161（8327bp）を得た。このプラスミドはヒトサイトメガロウィルスの初期プロモータまたはhCMV-IE（即時初期ヒトサイトメガロウィルス）の制御下で、自己組織化可能なカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクの一部をコードする挿入断片を含む。
【００５４】
実施例４
亜型の口蹄疫ウイルス01K、C Spain Olot、A24の中空カプシド用発現プラスミドの構築
亜型の口蹄疫ウイルス01K、C Spain Olot、A24を実施例３と同じ方法で合成する。O1Kでは下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のPCR反応で2583塩基対(bp)断片を作り、消化および単離後、約2550bpのEcoRV-XhoI断片を得た。この断片をＣ断片とよぶ。
【００５５】
【式９】
0005153984.tif 000009
【００５６】
第2のPCR反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて930bp断片を作り、消化および単離後、約900bpのBgIII-XhoI断片を得た。この断片をＤ断片とよぶ。
【００５７】
【式１０】
0005153984.tif 000010
【００５８】
Ｃ断片とＤ断片とを、予めBgIIIとEcoRVで消化した発現プラスミドpVR1012にリゲートして、プラスミドpJCA162（8327bp）を得た。
C Spain Olotでは、下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のPCR反応で2568塩基対(bp)断片を作り、消化および単離後、約2540bpのEcoRV-XhoI断片を得た。この断片をＥ断片とよぶ。
【００５９】
【式１１】
0005153984.tif 000011
【００６０】
第2のPCR反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて947bp断片を作り、消化および単離後、約900bpのBgIII-XhoI断片を得た。この断片をＦ断片とよぶ。
【００６１】
【式１２】
0005153984.tif 000012
【００６２】
Ｅ断片とＦ断片とを、予めBgIIIとEcoRVで消化した発現プラスミドpVR1012にリゲートして、プラスミドpJCA163（8312bp）を得た。
A24の場合には下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のPCR反応で約2630 (bp)断片を作り、消化および単離後、約2580bpのEcoRV-XhoI断片を得た。この断片をＧ断片とよぶ。
【００６３】
【式１３】
0005153984.tif 000013
【００６４】
第2のPCR反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて約950bp断片を作り、消化および単離後、約940bpのBgIII-XhoI断片を得た。この断片をＨ断片とよぶ。
【００６５】
【式１４】
0005153984.tif 000014
【００６６】
Ｇ断片とＨ断片とを、予めBgIIIとEcoRVで消化した発現プラスミドpVR1012にリゲートして、プラスミドpJCA164（大きさ約8400bp）を得た。
実施例５
A24/A10用発現プラスミドの構築
口蹄疫ウイルスA24のｃＤＮＡを実施例3と同じ方法で合成した。
口蹄疫ウイルスA24のＲＮＡ懸濁液(実施例２) 50μlと下記オリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行う：
【００６７】
【式１５】
0005153984.tif 000015
【００６８】
約2300bpの断片が得られる。
この断片をEcoRVおよびHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で約1710〔bp〕の EcoRV- HindIII断片を単離した。この断片をＩ断片とよぶ。
2300bpの断片をHindIIIおよびApalで消化し、アガロースゲル電気泳動で約550bpの HindIII-Apal断片を単離した。この断片をＪ断片とよぶ。
プラスミドpJCA161（実施例３）をApalおよびEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動で約5960bpの Apal-EcoRV断片を単離した。この断片をK断片とよぶ。
断片Ｉ、Ｊ、Ｋを一緒にリゲートしてプラスミドpJCA165（8333bp）を得た。このプラスミドは、自己組織化可能なカプシドタンパクを作るのに十分な、ポリタンパクA24の構造的部分とA10の酵素的部分とをコードする挿入断片を含む。
【００６９】
実施例６
組換えワクシニアウイルスvV100（A10）の構築
プラスミドpJCA161（実施例）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約3462bpの断片を増殖した：
【００７０】
【式１６】
0005153984.tif 000016
【００７１】
上記オリゴヌクレオチド対によってEcoRI制限酵素部位を増殖断片の各末端に組み込むことができる。
上記オリゴヌクレオチド対の存在下でのPCR反応の条件は95℃の温度で2分、次いで35サイクル（95℃で1分、次いで62℃で1分、次いで72℃で2分）、最後に72℃で7分である。
この断片をEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で3448bp のEcoRI- EcoRI断片を単離した。
ワクシニアウイルス（WR株）のゲノムに対するPCR反応は下記オリゴヌクレオチドを用いる：
【００７２】
【式１７】
0005153984.tif 000017
【００７３】
PCR反応条件は上記実施例と同様であり、488bp断片が得られる。この断片をClaIおよびEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で367bpの断片を単離した。この後者の断片を予めClaIとEcoRIで消化したプラスミドpGS20（Mackett達、J;Virol.,1984、49、857-864）に挿入する。こうして得られたプラスミドをEcoRIで直線化し、その中に3448bpのEcoRI EcoRI断片を挿入してベクターpJCA166を得た。
当業者はワクシニアウイルスのＰ１1Kプロモータと、このプロモータの上流とEcoRI部位の下流にそれぞれワクシニアウイルスのTK遺伝子の２つのブランチとを含むプラスミドpvFOHC（Newton達、ワクチン87、1987、Chanock達編、Cold Spring Harbor Laboratory、12-21）を用いることもできるのが有利である。
TK遺伝子以外、特に遺伝子HA、M2L等のワクシニアウイルスの挿入部位を用いてもよい。
【００７４】
プラスミドpJCA166をワクシニアウイルス（WR株、ATCC番号VR-119）に感染させたCOS細胞（American Type Culture Collectionアクセス番号ATCC CRL-1651で得られるアフリカミドリザルの腎臓細胞）にトランスフェクトする。10％のウシ胎児血清、2mMのグルタミン、500UI/μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、12.5μg/mlの真菌帯（fungizone）(全て最終濃度)で補ったＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル培地）培地を入れたペトリ皿で1ml当たり約100,000セル含むCOS細胞を5％のCO2を含む雰囲気中に＋37℃で16時間培養する。セルが集密状態に達したときに、培地を取り除く。次いでCOS細胞をワクチンウイルス（WR株）に３ＤICC50/セルの感染効率（moi）で感染させ、次いで皿を１時間培養する。次いで培養物を無血清ＤＭＥＭ媒体で洗浄する。プラスミド／リポフェクチン／Optimem混合物（８μｌのリポフェクチン、192μｌのOptimem、8μgのプラスミドを含む200μlの蒸留水）を各皿に添加し、このプラスミドはpJCA166である。これらの皿を5％のCO2を含む雰囲気中に＋37℃で30分毎に攪拌しながら4〜6時間培養する。次いで10％のウシ胎児血清で補ったＤＭＥＭ培地を各皿に添加し、これらの皿を5％のCO2を含む雰囲気中に＋37℃で16時間培養する。
【００７５】
次いでこの細胞を回収して−20℃で凍結貯蔵することができる。
5mlのＤＭＥＭ培地を入れた6cm皿で5％のCO2を含む雰囲気中に＋37℃で16時間培養した143TK-ヒト細胞培養物（American Type Culture Collectionアクセス番号CRL-8303で得られる）に対する組換えワクシニアウイルスを選択する。
前回得られたトランスフェクション懸濁液を添加する。37℃で1時間培養した後、組換えワクシニアウイルスTK-を選択するために1ml当たり25μｇの5-ブロモデソキシウリジン（BUdR）を添加する。培養を48時間延長して組換え細胞を発生させることができる。3回の連続した組換えワクシニアウイルスの選択／精製サイクルを実施する。
【００７６】
24個のウェルプレートに1ml当たり25μgのBUdRを含むＤＭＥＭ培地を有する143TK-細胞を播種する。＋37℃で2時間培養した後、2μｌのPBS緩衝液にそれぞれ取った約10のスポットを10個のウェルにトランスファーさせる。次いでこれらのスポットを48〜72時間培養する。
培養後、各ウェルの培養物の上澄みに対し、オリゴヌクレオチドJCA305およびJCA308に関して「Gene Releaser」法（Cambio）を用いてPCR反応を行う。
ポジティブと判明したウェルで組換えウイルスに新たに精製サイクルを行う。vV100ｒとして知られる組換えウイルスを増殖させ、−70℃またはマイナス20℃で貯蔵する。
【００７７】
実施例７
O、CおよびAタイプの場合のワクチンの組換えウイルスの構築
口蹄疫ウイルスのＯ、ＣおよびＡタイプ用の組換えワクシニアウイルスの構築は実施例６と同じ方法で達成される。
タイプＯの場合：
プラスミドpJCA162（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約3470bpの断片を増殖した：
【００７８】
【式１８】
0005153984.tif 000018
【００７９】
消化および単離後、3448bpのEcoRI-EcoRI断片を予めEcoRIで消化したプラスミドpvFOHCに挿入して、プラスミドpJCA167を得た。
実施例6に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドJCA309およびJCA312におけるPCR反応によって陽性領域が選択される。１つの領域を増殖させ、得られた組換えウイルス株をvV101とよぶ。
タイプCの場合：
プラスミドpJCA163（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約3460bpの断片を増殖した：
【００８０】
【式１９】
0005153984.tif 000019
【００８１】
消化および単離後、3439bpのEcoRI-EcoRI断片を予めEcoRIで消化したプラスミドpvFOHCに挿入して、プラスミドpJCA168を得た。
実施例6に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドJCA313およびJCA316におけるPCR反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をvV102とよぶ。
タイプAの場合：
プラスミドpJCA164（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約3550bpの断片を増殖した：
【００８２】
【式２０】
0005153984.tif 000020
【００８３】
消化および単離後、約3530bpのEcoRI-EcoRI断片を予めEcoRIで消化したプラスミドpvFOHCに挿入して、プラスミドpJCA169を得た。
実施例6に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドJCA317およびJCA320におけるPCR反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をvV103とよぶ。
タイプAの変異体の場合：
プラスミドpJCA165（実施例５）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約3480bpの断片を増殖した：
【００８４】
【式２１】
0005153984.tif 000021
【００８５】
消化および単離後、約3463bpのEcoRI-EcoRI断片を予めEcoRIで消化したプラスミドpvFOHCに挿入して、プラスミドpJCA170を得た。
実施例6に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドJCA317およびJCA312におけるPCR反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をvV104とよぶ。
【００８６】
実施例８
インビトロ発現用のワクチン（A10）の組換えウイルスの構築
pJCA161プラスミド（実施例３）を制限酵素EcoRVとBGIIIで消化する。アガロースゲル電気泳動で寸法が約3450bpの EcoRV-BGIII断片を単離した。この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めBamHIで消化してクレノウポリメラーゼで処理したpBG200プラスミド（Abrams達、1995、J.Gen.Virol,76,3089-3098）にリゲートしてドナープラスミドpJCA171を得た。
プラスミドpBG200はＴ７バクテリオファージプロモータと、Ｔ７転写終結因子と、このプロモータの上流とターミネータの下流にそれぞれワクシニアウイルスのTK遺伝子の２つのブランチとを含む（pBG200の構築に関してFuerst達の分子および細胞の生物学、1987、7、2538-2544を参照）。プラスミドpBG200上のBamHI挿入部位はプロモータとＴ７のターミネータとの間である。
実施例6に記載の方法を用いて組換えを行う。オリゴヌクレオチドJCA305およびJCA308におけるPCR反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をvV105とよぶ。
組換えウイルス株を−20℃または−70℃で保存する。
【００８７】
実施例９
O、CおよびAタイプのインビトロ発現用組換えワクシニアウイルスの構築
口蹄疫ウイルスのＯ、ＣおよびＡタイプ用の組換えワクシニアウイルスの構築は実施例８と同じ方法で達成される。
タイプOの場合：
pJCA162プラスミド（実施例４）を制限酵素EcoRVとBGIIIで消化する。寸法が約3450bpの EcoRV-BGIII断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めBamHIで消化してクレノウポリメラーゼで処理したpBG200プラスミドにリゲートしてドナープラスミドpJCA172を得た。
オリゴヌクレオチドJCA309およびJCA312におけるPCR反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をvV106とよぶ。
【００８８】
タイプCの場合：
pJCA163プラスミド（実施例４)を制限酵素EcoRVとBGIIIで消化する。大きさが約3440bpの EcoRV-BGIII断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めBamHIで消化してクレノウポリメラーゼで処理したpBG200プラスミドにリゲートしてドナープラスミドpJCA173を得た。
オリゴヌクレオチドJCA309およびJCA312におけるPCR反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をvV106とよぶ。
【００８９】
タイプAの場合：
pJCA164プラスミド（実施例４）を制限酵素EcoRVとBGIIIで消化する。寸法が約3520bpの EcoRV-BGIII断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めBamHIで消化してクレノウポリメラーゼで処理したpBG200プラスミドにリゲートしてドナープラスミドpJCA174を得た。
オリゴヌクレオチドJCA317およびJCA320におけるPCR反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をvV108とよぶ。
タイプAの変異体の場合：
pJCA165プラスミド（実施例５）を制限酵素EcoRVとBGIIIで消化する。寸法が約3450bpの EcoRV-BGIII断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めBamHIで消化してクレノウポリメラーゼで処理したpBG200プラスミドにリゲートしてドナープラスミドpJCA175を得た。
オリゴヌクレオチドJCA317およびJCA312におけるPCR反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をvV109とよぶ。
【００９０】
実施例10
中空ウイルス性カプシドの製造および精製
ウサギ腎臓細胞RK13（American Type Culture Collectionからアクセス番号CCL-37で得られる）を、10％のウシ胎児血清、2mMのグルタミン、500UI/μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、12.5μg/mlの真菌帯で補った20mlのＤＭＥＭ培地を入れた175cm2の20個のファルコンフラスコ（各ファルコンフラスコは集密状態で約2×107セル含む）で＋37℃で培養する。
次いで、各ファルコンフラスコに組換えワクシニアウイルスvTF7-3およびvV108（実施例９）をそれぞれ10 DICC50/セルの感染効率（moi）で添加する。このウイルス性培養物を100％の細胞変成効果が得られるように37℃で約24時間保持する。
組換えワクシニアウイルスvTF7-3（ATCC番号VR-2153で得られる）は、ワクシニアウイルスのp7.5Kプロモータの制御下でＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを含む（Fuerst達、1986年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83、8122-8126）。
【００９１】
ＲＮＡポリメラーゼＴ７の生成はＴ７プロモータの制御下で挿入断片の発現を誘発させる。このようにして口蹄疫ウイルスのＰ１前駆体と３Ｃプロテアーゼは製造され、中空カプシドは自己組織化する。
ウイルス性懸濁液を回収して遠心分離によって清澄化する（4,000回転/分で30分間、4℃）。
残留物を0.5％のNonidet P40（Roche,Cat.No.1 754 599）を含む0℃の30mlの燐酸緩衝液（40mMの燐酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、pH7.6）で再懸濁する。細胞を0℃の氷上で20分間溶解させる。
細胞片を10,000回転/分で20分間4℃で遠心分離して回収する。上澄みを0℃の氷上で保持する。細胞片は6mlの燐酸緩衝液で再懸濁する。抽出は（等量の）クロロホルムを用いて行う。この抽出で得られた水相は前回得られた上澄みと合わさって15％のショ糖クッション(2ml)に堆積し、これをベックマンSW28ロータで遠心分離する（28,000回転/分、5時間、4℃）。残留物を1mlの燐酸緩衝液にそ取り、4℃で貯蔵する。
【００９２】
得られた残留物を再懸濁し、次いで20μlのRNase（10mg/ml）で氷上で10分間処理する。次いで10μlの10％Nonidet P40を添加し、全体を氷上に10分置く。次いで懸濁液を等量のクロロホルムで抽出する。水相(1ml)を回収し、15−45％ショ糖勾配（約12ml）上でベックマンSW40ロータで遠心分離する（40,000回転／分、5時間、12℃または18,000回転／分、16時間、12℃）。
【００９３】
次いで上記勾配を0.8mlの14個の画分に分割する。吸光度を220nmで測定する。吸光度にピークに対応する画分を回収する。これらの画分はウイルス性中空カプシドA24を含む。回収されたタンパクの特殊性をウエスタンブロット法で検証する。
亜型01K、C Spain Olot、A24/A10のウイルス性中空カプシドはこの実施例に記載の方法と全く同じ方法で得られるが、組換えワクシニアウイルスvV108の代わりにvV106（実施例9）vV105（実施例8）、vV107（実施例9）およびvV109（実施例9）を用いる。
こうして得られたタンパク画分はワクチンに用いられるまで4℃で保存する。
【００９４】
実施例11
サブユニットワクチンの製造
実施例10で得られた合計165μgの中空口蹄疫ウイルスカプシドを含むショ糖勾配の13.2mlの画分を、27.5mlの1.5％水酸化アルミニウム（Al（OH）3）と0.29mlのサポニンとを含む14.01mlのＤＭＥＭで製剤にする。
こうして得られた55mlを次いで２つのフラスコに、第1のフラスコには30ml、第2のフラスコには25mlになるように分ける。5mlの投与量にはサポニンの360個の溶血性単位を有する15μgのウイルス性中空カプシドが含まれる。
中空粒子の量は220nmでの吸光度を測定してウシ血清アルブミン溶液（BSA）を標準として用いて分光光度法によって求める。
【００９５】
実施例12
組換えワクチンの製造
ワクチンを製造するために組換えワクシニアウイルスvV100〜vV105（実施例６および７）をカルボマー溶液と組み合わせる。好ましいカルボマーはBF Goodrich社、オハイオ州、USAで作られたCarbopolTM 974P（分子量約3,000,000）である。
最初に、カルボポル（Carbopol、登録商標）974P の1.5％株溶液を1g/lの塩化ナトリウムを含む蒸留水を用いて調製する。次いでこの株溶液を用いて、生理食塩水によって調製した4mg/mlのカルボポル（Carbopol、登録商標）974P の溶液を製造する。この株溶液を適量の生理食塩水と、一回または連続した複数回で混合し、1N（またはより濃度の高い）水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを各段階で調節して最終pHを7.3〜7.4にする。
こうして得られた直ちに使用できる状態のカルボポル（Carbopol、登録商標）974P溶液は、凍結乾燥した組換えウイルスに加えたり、組換えウイルスの濃縮株溶液を希釈したりするのに用いることができる。例えば、投与量1ml当たり108pfuを含むウイルス性懸濁液を得るためには、ウイルス性株溶液を108.3pfu/mlの抗体価を得るように希釈し、次いで同部の上記使用可能状態の4mg/mlのカルボポル（Carbopol、登録商標）974P溶液で希釈する。
【００９６】
実施例13
ＤＮＡワクチンの製造
一つまたは複数のプラスミドpJCA161〜pJCA165を含んだＤＮＡ溶液をSambrook et al. (1989)に記載の方法でエタノ−ル沈殿で濃縮する。ＤＮＡ残留物は、1mg/mlの濃度になるように0.9% NaCl溶液に取る。適量の無菌のH20を用いたＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの生理食塩水で取り、0.75mM  ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を調製する（ＤＭＲＩは（N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2,3− ビス（テトラデシルオキシ）−1−プロパンアンモニウム（WO−A−9634109）であり、ＤＯＰＥはジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン（BehrJ.Ｐ１994,Bioconjugate Chemistry,5,382-389）である）。
プラスミドＤＮＡ-脂質錯体製剤は、0.75mM ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を0.9% NaClの1mg/mlのＤＮＡ溶液とを同部に希釈して作る。気泡を避けるために、カチオン脂質溶液を含む小びんの内壁に沿って26G針を用いてＤＮＡ溶液を少しずつ導入する。二つの溶液が混合したら穏やかに振盪をする。0.375mMのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥおよび500μg/mlのプラスミドから成る最終組成物を得る。
上記の全ての操作で使う全ての溶液は室温であるのが望ましい。ＤＮＡ/ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ錯体生成は動物を免疫する30分前に室温で行う。
【００９７】
実施例14
ウシでの実験
ウイルス性中空カプシドから実施例11で得られた口蹄疫ウイルスA24に対するワクチンvV109を6頭のウシに投与する。
注射は肩部側の頚部の各側に皮下経路で行う。最初の5頭のウシには5ml（2×2.5ml）を投与し、6頭目のウシには4ml（2×2.0ml）を投与する。この6頭目のウシには「UC10」を耳に針で投与する。
1回目の予防接種の31日後に、各ウシの頚部両側に皮下経路で2回目の注射を行う（最初の5頭のウシには4ml（2×2.0ml）を投与し、6頭目のウシには0.5ml（2×0.25ml）を投与する）。
（最初の予防接種から）0日後に予防接種したウシから血液サンプルd6、d13、d20、d31、d38、d42、d52を取り出し、屠殺する。
予防接種したウシと2頭の予防接種していない対照ウシの全てのウシに、104.4感染性用量/mlの抗体価（ウシ甲状腺細胞での抗体価）のA24口蹄疫ウイルスを舌皮内経路（１頭につき10×0.10ml）で投与する。この投与は一回目の予防接種の42日後に行う。
各ウシの体温（表２）と舌、口および足における口蹄疫の徴候（［表１］）を毎日検査する。抗口蹄疫ウイルスA24中和抗体のレベルをモニターする（［図１］）。
【００９８】
病原投与後のウシの口蹄疫臨床徴候
【表１】
0005153984.tif 000022
【００９９】
略記号の説明：
T0：健康な舌、ウイルス複製の徴候なし、注射部位に痕跡なし
T1：健康な舌、ウイルス複製の徴候なし、注射部位に外傷のみ
T2：舌に一次病巣あり
T3：舌または口の他の部分に一次および二次病巣あり
4F0：4足全てに口蹄疫の徴候なし
4F+：4足全てに小胞あり
ND：  臨床試験なし
【０１００】
以上の結果から、予防接種したウシは全て、接種部位が局部的であっても、口蹄疫ウイルスA24の感染から守られることがわかる。他のウシよりも弱い追加免疫を注射したウシUC10も保護される。逆に、ウイルスが感染しやすい対照ウシは抗原投与の2日後に口に、5日後に足に目立って発症する。
【０１０１】
病原投与後のウシの体温（℃）のモニタリング
【表２】
0005153984.tif 000023
【０１０２】
以上の結果から、他のウシよりも弱いブースターを注射したウシUC10でも、予防接種したウシは高熱を出さない。逆に、対照ウシは高熱を出し、熱は抗原投与の2日後にピークに達し、その後、通常の体温に戻る。
［図1］から、予防接種したウシは抗抗蹄疫ウイルスA24中和抗体が強い反応を示し、1回目の予防接種から約13日後に第1のピークがくることがわかる。ブースター接種後、中和抗体の強い反応が認められる。この反応は他のウシよりも弱いブースターを接種したウシUC10にも認められる。抗原投与後、抗体レベルは上昇しないが、これはFDMV A24ウイルスが抗体反応を刺激する程には十分に複製していないことを示す。
結論として、組換えワクシニアウイルス発現ベクターから得られたウイルス性中空カプシドから製造した口蹄疫A24ウイルス用ワクチンはウシにおいて一次および二次免疫反応を誘発する。抗原投与後、ウシは全て口蹄疫およびウイルスの複製から守られる。
【０１０３】
実施例15
A10構築における突然変異誘発
ヒスチジン179（実施例3のプラスミドpJCA161によってコードされるポリタンパクの位置、メチオニンイニシエータを1とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、A10構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとPCR反応とを用いて行う。
プラスミドpJCA161マトリクスとし、下記オリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行って559bpの断片を増殖した。この断片をＬ断片とよぶ。
【０１０４】
【式２２】
0005153984.tif 000024
【０１０５】
PCR反応の第1サイクルの条件は95℃で2分、次いで62℃で2分、72℃で3分である。
続くPCR反応の35サイクルは実施例6に記載の条件と同じである。
プラスミドpJCA161マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、約1012bpの断片を増殖した。この断片をＭ断片とよぶ。
【０１０６】
【式２３】
0005153984.tif 000025
【０１０７】
PCR反応の条件は実施例6に記載の条件と同じである。
Ｌ断片およびＭ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドJCA309（SEQ ID NO5）およびJCA332（SEQ ID NO28）とを用いてPCR反応を行い、1552bpの断片を増殖した。PCR反応の条件は実施例6に記載の条件と同じである。
この断片をEcoRVおよびNheIで消化し、アガロースゲル電気泳動で1527bp EcoRV- NheI断片を単離した。この断片をＮ断片とよぶ。
プラスミドpJCA161をNheI、次いでEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動で1527bp NheI - EcoRV断片を単離した。この断片とＮ断片とをリゲートしてプラスミドpJCA176（8327bp）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクA10の一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドpJCA176を用いて実施例8に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片EcoRV-BgIIIをプラスミドpJCA161ではなく、プラスミドpJCA176から得る。こうして得られた組換えウイルスをvV110とよぶ。
【０１０８】
実施例16
０１Ｋ構築における突然変異誘発
セリン179（実施例4のプラスミドpJCA162によってコードされるポリタンパク内の位置であり、メチオニンイニシエータを1とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、０１Ｋ構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとPCR反応とを用いて行う。
プラスミドpJCA162マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、559bpの断片を増殖した。この断片をＯ断片とよぶ。
【０１０９】
【式２４】
0005153984.tif 000026
【０１１０】
第2のPCR反応をプラスミドpJCA162マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、1147bpの断片を増殖した。この断片をＰ断片とよぶ。
【０１１１】
【式２５】
0005153984.tif 000027
【０１１２】
第3のPCR反応をＯ断片およびＰ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドJCA305（配列番号１）およびJCA335（配列番号31）とを用いて行い、1679bpの断片を増殖した。
この断片をEcoRVおよびNarlで消化し、アガロースゲル電気泳動で1654bp EcoRV- Narl断片を単離した。この断片をＱ断片とよぶ。
プラスミドpJCA162をNarl、次いでEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動で約6670bp Narl-EcoRV断片を単離した。この断片とＱ断片とをリゲートしてプラスミドpJCA177（8327bp）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクO1Kの一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドpJCA177を用いて実施例9に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片EcoRV-BgIIIをプラスミドpJCA162ではなく、プラスミドpJCA177から得る。こうして得られた組換えウイルスをvV111とよぶ。
【０１１３】
実施例17
C Spain Olot構築における突然変異誘発
グリシン179（実施例4のプラスミドpJCA163によってコードされるポリタンパク内の位置、メチオニンイニシエータを1とする）をコードするコドンをシステインをコードするコドンに代える目的で、C Spain Olot構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとPCR反応とを用いて行う。
プラスミドpJCA163マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、559bpの断片を増殖した。この断片をR断片とよぶ。
【０１１４】
【式２６】
0005153984.tif 000028
【０１１５】
第2のPCR反応をプラスミドpJCA163マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、681bpの断片を増殖した。この断片をＳ断片とよぶ。
【０１１６】
【式２７】
0005153984.tif 000029
【０１１７】
第3のPCR反応をＲ断片およびＳ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドJCA313（配列番号９）およびJCA338（配列番号34）とを用いて行い、1213bpの断片を増殖した。
この断片をEcoRVおよびNaelで消化し、アガロースゲル電気泳動で1654bp EcoRV- Nael断片を単離した。この断片をＴ断片とよぶ。
プラスミドpJCA163をNael、次いでEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動で約7120bp Nael- EcoRV断片を単離した。この断片とＴ断片とをリゲートしてプラスミドpJCA178（8312bp）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクC Spain Olotの一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドpJCA178を用いて実施例9に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片EcoRV-BgIIIをプラスミドpJCA163ではなく、プラスミドpJCA178から得る。こうして得られた組換えウイルスをvV112とよぶ。
【０１１８】
実施例18
Ａ２４構築における突然変異誘発
ヒスチジン179（実施例4のプラスミドpJCA164によってコードされるポリタンパク内の位置であり、メチオニンイニシエータを1とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、Ａ２４構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとPCR反応とを用いて行う。
プラスミドpJCA164マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてPCR反応を行い、559bpの断片を増殖した。この断片をＵ断片とよぶ。
【０１１９】
【式２８】
0005153984.tif 000030
【０１２０】
第2のPCR反応をプラスミドpJCA164マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、507bpの断片を増殖した。この断片をＶ断片とよぶ。
【０１２１】
【式２９】
0005153984.tif 000031
【０１２２】
第3PCR反応をＵ断片およびＶ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドJCA317（配列番号13）およびJCA334（配列番号37）とを用いて行い、1039bpの断片を増殖した。
この断片をEcoRVおよびBInIで消化し、アガロースゲル電気泳動で1654bp EcoRV- BInI断片を単離した。この断片をＷ断片とよぶ。
プラスミドpJCA164をBInI、次いでEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動で約7360bp BInI- EcoRV断片を単離した。この断片とＷ断片とをリゲートしてプラスミドpJCA179（約8400bp）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクA24の一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドpJCA179を用いて実施例9に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片EcoRV-BgIIIをプラスミドpJCA164ではなく、プラスミドpJCA179から得る。こうして得られた組換えウイルスをvV113とよぶ。
【０１２３】
実施例19
熱的に安定化したウイルス性中空カプシドの製造および精製
実施例10と全く同じ方法で、組換えワクシニアウイルスvV108をそれぞれvV110（実施例15）、vV111（実施例16）、vV112（実施例17）およびvV113（実施例18）に代えて、修飾されたウイルス性中空カプシドの亜型A10、O1K、C Spain OlotおよびA24を得た。
【０１２４】
実施例20
熱安定性のモニタリング
口蹄疫ウイルスA10の修飾されたウイルス性中空カプシド（実施例19）を入れた10本の管を用意して数量化する。各管には0.8μgのカプシドを0.5mlの燐酸緩衝液で調製したもの（pH7.6）を入れた。
これらの10本の管を50℃の水浴に1時間放置し、次いで冷却した。カプシドの各サンプルをショ糖勾配（15〜35％）上で12℃で2.5時間遠心分離する（ベックマンSW40ロータで40,000回転／分）。得られた各勾配を1mlの12個の画分に分割する。各画分の0.5mlを1mlの無水エタノールの存在下で-20℃で16時間沈殿させる。
残留物を回収し、乾燥し、充填緩衝液中で再懸濁し（Maniatis達、1982年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,USA）、次いで、SDS-PAGE10％アクリルアミド電気泳動ゲルに載せる。基本的にタンパクVＰ１と反応する抗140S A10ポリクローナルモルモット抗体によって、移動後のタンパク帯が現れる。
中空カプシドは画分７および８の勾配に移行するが、分解された中空カプシドは画分11の勾配上部近くに留まる。
ウエスタンブロット法（［図2］）から、変異体に対応する中空カプシドは常に50℃で1時間後に結合する（ゲルＡ）が、変異していない中空カプシドは予想通り熱処理に耐えることができないことがわかる。
【０１２５】
実施例21
口蹄疫ウイルスの熱安定性中空カプシドを含むサブユニットワクチンの製造
実施例11と同様な方法を、修飾されていないウイルス性中空カプシドを修飾されたウイルス性中空カプシド（実施例19）に代えて行い、亜型A10、O1K、C Spain OlotおよびA24の修飾されたウイルス性中空カプシド得た。
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発明の精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。
【０１２６】
【表３】
【配列表】
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【０１２７】
【表４】
0005153984.tif 000033
【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
【表６】
0005153984.tif 000035
【０１３０】
【表７】
0005153984.tif 000036
【０１３１】
【表８】
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【０１３２】
【表９】
0005153984.tif 000038
【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
【表１４】
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【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
【表１６】
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【０１４０】
【表１７】
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【０１４１】
【表１８】
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【０１４２】
【表１９】
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【０１４３】
【表２０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ウシで測定した抗口蹄疫A24の中和抗体の抗体価グラフ（log表記）
【図２】  得られたゲルの写真。
【図３】  口蹄疫ウイルスA10株のＰ１（アミノ酸2〜737）、２Ａ(アミノ酸738〜753)、３Ｃ(アミノ酸913〜1126)に対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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