(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンがアスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンが、アスパラギン、又はロイシンに置換され、さらに２４９番目以外の１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質
【請求項２】
配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２において、その塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、又はＣＴＧに置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２において、その塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３において、その塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、又はＣＴＧに置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３において、その塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンがアスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンが、アスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターが導入されたアスペルギルス属に属する微生物からなる形質転換体。
【請求項１０】
アスペルギルス属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスであることを特徴とする請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを、アスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡと目的遺伝子とが組み込まれた組換えベクターでアスペルギルス属に属する微生物を形質転換し、得られた形質転換体を酢酸を炭素源とするカルボキシン含有培地で培養し、カルボキシン耐性を指標として前記形質転換体を選抜する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸を炭素源とする培地で、アスペルギルス属に属するカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質や、該タンパク質をコードするカルボキシン耐性マーカー遺伝子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス属は、菌類真菌門に属し、形態的には、無色の分岐した長い菌糸を有することから子のう菌門の糸状菌の一種とされ、有性生殖を行わず無性生殖で無性胞子を作って繁殖する不完全菌類に属する。清酒、味噌、醤油などの発酵食品生産に古くから利用されているアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）といった有益な種がある一方、自然界で最も強力な発ガン性と急性毒性を持つアフラトキシンを産生するアスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus parasiticus）などの有害な種も存在する。アスペルギルス・オリゼに関しては、食品生産のための発酵効率向上のための育種のみならず、高いタンパク質分泌生産能力を有することから、組換えタンパク質生産又は各種有用物質生産の宿主として利用され、そのための研究開発も盛んに行われている。他方、アスペルギルス・パラシチカスに関しては、特に熱帯・亜熱帯地域で収穫される穀物に対するアフラトキシンによる汚染が世界的な問題となっており、その制御のための研究が重要視されている。
【０００３】
遺伝子組換え法は、ある生物から取り出した有用な遺伝子を種の壁を越えて他の生物に導入することができるため、宿主生物の改良の範囲を画期的に拡大できるという利点がある。また生体内において遺伝子を操作できるため、遺伝子機能の研究に必須の技術でもある。上述のとおりアスペルギルス属の菌は有性生殖が見い出されておらず、多くの生物と異なり交雑による遺伝子交換ができないので古典的遺伝学が適用できず、変異遺伝子を別の変異株から移すことができない。そのため、アスペルギルス属の菌の遺伝子の改変による育種、又は遺伝子機能研究については特に遺伝子組換え法の適用が有効な手段である。
【０００４】
遺伝子組換え法による遺伝子導入の効率については、導入処理した細胞のうち数万分の１以下しか導入された遺伝子を保持する組換え細胞になっていないことが多い。大多数の組換えが起こっていない細胞の中から組換え細胞を選抜するためには、選択マーカー遺伝子を同時に導入し、目的の組換え細胞を選抜する方法が現在広く用いられている。すなわち、組換え処理後の細胞を培養する際、選択マーカー遺伝子が導入されていなければ生存できない条件下で培養することで、組換え体だけを選んでくるという方法である。
【０００５】
一般的に、組換え体選択マーカーとして利用される遺伝子は２つに分けられる。一つは栄養要求性相補遺伝子に代表される、変異によりある条件で生育できない変異細胞に対してその変異を相補する変異相補性遺伝子であり、もう一つは通常の細胞に対して生育阻害を示す薬剤に対する薬剤耐性遺伝子である。前者は遺伝子組換え試験を始める前の準備として、宿主となる細胞にあらかじめ選抜に必要な変異を導入しておく必要があるのに対し、後者は通常の細胞のいずれにも利用できるため、適用範囲が広く実用性が高い。アスペルギルス・オリゼで利用されている変異相補性遺伝子としては、アルギニン要求性相補遺伝子argB（非特許文献６参照）、ウラシル要求性相補遺伝子pyrG（非特許文献２参照）、アデニン要求性相補遺伝子adeA, adeB（非特許文献３参照）、硝酸塩資化遺伝子niaD（非特許文献４参照）、硫酸資化遺伝子sC（非特許文献５参照）等がある。しかしながら、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・パラシチカスで現在利用されている薬剤耐性遺伝子は薬剤ピリチアミンに対するptrA（特許文献１及び非特許文献１参照）のみである。
【０００６】
一方、担子菌においても、組換え体選択マーカーとして栄養要求性相補遺伝子が多く使われてきたが、最近、薬剤耐性遺伝子としてカルボキシアミド系の薬剤、特にカルボキシンに対する耐性遺伝子が単離され、選択マーカーとして利用されている。カルボキシン及びその類縁体は主として担子菌が原因となる作物病害に効果を示す農薬である。カルボキシン耐性はコハク酸脱水素酵素複合体（Ｓｄｈ）の中のＩｐサブユニット又は膜サブユニット（ＳｄｈＣ）のいずれかの遺伝子の変異により獲得されることが知られている（特許文献２及び非特許文献７〜１０参照）。また、カルボキシンに感受性が弱いアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）を酢酸を炭素源とする培地で培養すると、カルボキシンに対する感受性が強くなったという報告がある（非特許文献１１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３０８４９１号公報
【特許文献２】特開２００１−６９９８７号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem.. 64, 1416-1421(2000)
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 284-289,(1983)
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem.. 68, 656-62(2004)
【非特許文献４】Gene, 111, 149-155 (1992)
【非特許文献５】Gene. 84, 329-334(1989)
【非特許文献６】Agric. Biol. Chem. 51, 2549-2555 (1987)
【非特許文献７】Curr. Genet. 19, 475-481(1991)
【非特許文献８】Curr. Genet. 37, 209-212(2000)
【非特許文献９】Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2006-2009 (2003)
【非特許文献１０】Mol.Genet.Genomics 272, 328-335 (2004)
【非特許文献１１】Gunatilleke et. al., Genet. Res. Camb. 26. 297-305 (1976)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、アスペルギルス属においては、遺伝子組換え法が効果的な育種又は研究手法であり、育種・研究の用途において、複数の外来遺伝子を導入するには複数のマーカー遺伝子が必要であるが、実際に利用されている薬剤耐性遺伝子は市販されているピリチアミン耐性遺伝子のみである。他の生物の生育を阻害する薬剤の多くについてアスペルギルス属の菌は耐性を示し、使用できる薬剤が限られていることが新たなマーカー遺伝子の開発の大きな障害となっている。しかし、アスペルギルス・オリゼでは全ゲノム解析が終了し、複雑な生命現象の解析が可能となった今、複数の遺伝子が関わる形質の改変、物質生産経路の導入等の研究開発が今後ますます増加する。また、例えばアスペルギルス・オリゼで自己の遺伝子の改変による組換え体を産業的に利用する場合を考えると、マーカー遺伝子もアスペルギルス・オリゼ由来のものを用いるとセルフクローニングとして法令上の遺伝子組換え生物等の使用には当たらず、産業的な価値が大きい。そのため、新たなマーカー遺伝子の開発が強く求められている。本発明の課題は、アスペルギルス属微生物において有用な新たな薬剤耐性マーカー遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討し、担子菌で利用可能となったカルボキシン耐性（特許文献２参照）について、アスペルギルス属について実験を試みたが、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカスとも通常の培養条件ではカルボキシンに対して感受性が大変弱く、培地に加える薬剤の実用範囲内で菌糸生育を完全に抑えることは不可能であった。また、担子菌のカルボキシン耐性遺伝子はそれぞれの種でのみ機能するらしく、担子菌ヒラタケの変異遺伝子は属が異なるシイタケに耐性を付与することはない。従って担子菌亜門のヒラタケの耐性遺伝子を子嚢菌門（アスペルギルス属は不完全菌だがここに分類されると考えられている）のアスペルギルス属で利用することは不可能だと考えられた。
【００１０】
本発明者らは、アスペルギルス属に属する微生物であるアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカスを、酢酸を炭素源とする培地で培養することにより、該微生物がカルボキシン感受性となり、さらにこれらアスペルギルス属に属する微生物に突然変異誘発処理を行うことにより、カルボキシン耐性微生物が出現し、カルボキシン耐性突然変異遺伝子が生じたことが予測された。そこで、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の全塩基配列から、担子菌のカルボキシン耐性遺伝子として知られているコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子に対応する遺伝子を検索することによって、該遺伝子に変異が生じていることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
すなわち本発明は、［１］（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンがアスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンが、アスパラギン、又はロイシンに置換され、さらに２４９番目以外の１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡに関する。
【００１２】
また本発明は、［２］配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２において、その塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、又はＣＴＧに置換された塩基配列からなる単離されたＤＮＡや、［３］配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２において、その塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡや、［４］配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３において、その塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、又はＣＴＧに置換された塩基配列からなるＤＮＡや、［５］配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３において、その塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡに関する。
【００１３】
さらに本発明は、［６］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンがアスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、［７］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、その２４９番目のヒスチジンが、アスパラギン、又はロイシンに置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質や、［８］上記［１］〜［５］のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクターや、［９］上記［８］記載の組換えベクターが導入されたアスペルギルス属に属する微生物からなる形質転換体や、［１０］アスペルギルス属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスであることを特徴とする上記［９］記載の形質転換体や、［１１］上記［１］〜［５］のいずれか記載のＤＮＡを、アスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法や、［１２］上記［１］〜［５］のいずれか記載のＤＮＡと目的遺伝子とが組み込まれた組換えベクターでアスペルギルス属に属する微生物を形質転換し、得られた形質転換体を酢酸を炭素源とするカルボキシン含有培地で培養し、カルボキシン耐性を指標として前記形質転換体を選抜する方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、アスペルギルス属微生物において有用カルボキシン耐性マーカー遺伝子を提供することができ、その結果、カルボキシン感受性のアスペルギルス属に属する微生物を宿主微生物とした遺伝子組換え系において、酢酸を炭素源とする培地でアスペルギルス属微生物を培養することにより、目的とする形質転換体をカルボキシン耐性を指標として効率よく選別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２における塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなるＤＮＡ（配列表の配列番号２における塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＡＣ、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された配列番号２の塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ）や、配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなるＤＮＡ（配列表の配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＣ、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された配列番号３の塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ）や、上記いずれか記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記カルボキシン感受性微生物としては、アスペルギルス属に属する微生物を好適に例示することができ、また、上記「カルボキシン」とは、以下の式(Ｉ)で表される化合物（Carboxin；5,6-dihydro-2-methyl-1,4-oxathiine-3-carboxanilide）を意味し、通常カルボキシンは、担子菌が原因の作物病害に使用される農薬として使用されている。
【００１６】
【化１】
0005257972.tif 000002
【００１７】
上記配列表の配列番号２に示される塩基配列は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）ＤＯＧＡＮのデータベースにその配列が明らかにされているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の遺伝子の全塩基配列(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)から、担子菌のコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子に対応する遺伝子であり、また、上記配列表の配列番号３は、配列表の配列番号２に示される塩基配列からイントロン部分を除いたｃＤＮＡの塩基配列であり、上記配列表の配列番号１は、上記配列番号３に記載の塩基配列より推測されるアミノ酸配列である。
【００１８】
また、上記「配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列」としては、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、例えばアスパラギン、ロイシン又はチロシンに置換されているアミノ酸配列を挙げることができ、中でもロイシン又はアスパラギンに置換されているアミノ酸配列を好適に例示することができる。また、本発明において「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列をいう。
【００１９】
上記配列番号２における塩基番号９４０〜９４２や配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＣ（ヒスチジンコドン）、ＣＡＴ（ヒスチジンコドン）、ＴＡＡ（ストップコドン）、ＴＡＧ（ストップコドン）又はＴＧＡ（ストップコドン）以外のコドンとしては、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＡＴ又はＴＡＣであることがカルボキシン耐性付与の強さの点で好ましく、中でもＣＴＣ又はＡＡＣであることが特に好ましい。
【００２０】
上記「酢酸を炭素源とする培地におけるカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質」とは、炭素源として酢酸のみを含む培地においてカルボキシン感受性微生物に、その発現によりカルボキシン耐性を付与することができ、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンがロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質のカルボキシン耐性付与活性に比べて同程度のカルボキシン耐性付与活性を２倍以下の濃度で奏するタンパク質をいう。例えば、炭素源がグルコースであるＧＹ培地（１％グルコース、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）では、カルボキシンに対して強い感受性を示さず完全な生育阻害が観察されないが、培地の炭素源をグルコースから酢酸に代えたＡＹ培地（１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）で２８℃にて２日間培養することにより、カルボキシンに対する強い感受性を示し、５０μｇ／ｍＬのカルボキシンの濃度で生育を完全に阻害されるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０に、カルボキシン耐性付与機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を、５０μｇ／ｍＬ以上カルボキシンを含有する１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天を含むＡＹ培地にて２８℃で４〜５日間培養後、形質転換株が生存しうる機能を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２１】
上記「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２２】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号２又は３に示される塩基配列情報、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、当該遺伝子が存在することが予測されるゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば上記プローブやプライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によって調製することができる。また、酢酸を炭素源とする培地でのカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を置換、欠失、又は付加して塩基配列を改変することによっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、アスペルギルス属に属する微生物の種、株、変異体、変種から得ることも可能である。
【００２３】
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの一例として、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）を好適に挙げることができ、これらの変異ＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号２又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（以後"モレキュラークローニング第３版"と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２４】
本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質であれば特に制限されず、上記「配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列」としては、ヒスチジンが、例えばアスパラギン、ロイシン、チロシン等に置換されているアミノ酸配列を挙げることができ、中でもロイシン又はアスパラギンに置換されているアミノ酸配列を好適に例示することができる。
【００２５】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来の変異タンパク質として、化学合成したタンパク質として、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質として調製することができる。天然由来の変異タンパク質として取得する場合には、かかるタンパク質を発現している微生物細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなる本発明のＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００２６】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００２７】
本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつ宿主細胞においてカルボキシン耐性遺伝子を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、ベクターの種類としては、例えばプラスミド、コスミド等を挙げることができる。本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡが発現するベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。上記選択マーカー遺伝子としてのカルボキシン耐性遺伝子と、目的遺伝子を組み込むことができるクローニングサイトとを備えた形質転換用発現ベクターとしては、カルボキシン耐性を選択マーカーとして形質転換体のスクリーニングに用いられるものであって、前記クローニングサイトに目的遺伝子を挿入することにより、上記形質転換用組換えベクターとしうるものであればどのようなものでもよく、上記クローニングサイトは、ポリリンカークローニングサイトを有することが好ましい。また、本発明の組換えベクターは、宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターであってもよいし、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの間で組換え可能なゲノム挿入型ベクターであってもよい。具体的には、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐBluescriptII、ｐＳＰ７２、ｐＢＩ１２１(いずれも大腸菌で自律複製)等の一般的なクローニングベクターに、アスペルギルス属菌の遺伝子プロモーター、ターミネーター等の制御配列を含むＤＮＡを組み込むことによりゲノム挿入型ベクターとすることができ、また、ｐＡＵＲ３１６、ｐＰＴＲII等を用いることにより宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターとすることができ、これらのベクターに本発明のＤＮＡを作動可能なように組み込むことにより、アスペルギルス属菌の系に適した本発明の組換えベクターを構築することができる。
【００２８】
上記本発明のアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質を発現するアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体であれば特に制限されず、該形質転換体は、所定の濃度のカルボキシンを含有する酢酸を炭素源とする培地で、カルボキシン耐性株として生存することができる。
【００２９】
上記本発明のアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体を作製するための組換えベクターの宿主への導入方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びモレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができるなどの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム法等により行うことができるが、プロトプラスト−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム法が好ましい。
【００３０】
本発明のアスペルギルス属に属する微生物としては、真菌の子嚢菌門の不完全菌類アスペルギルス属に属するものであれば特に制限されず、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus lutiensismut.kawachi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・パラシチカス、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavas）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）、アスペルギルス・カンジタス（Aspergillus candidus）、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus usutus）等を挙げることができ、さらに、該アスペルギルス属に属する微生物を親株として人為的改変した株、又は天然に存在する変異株なども包含されるが、中でもアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・フラバス等が好ましく、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・パラシチカスがより好ましい。
【００３１】
具体的には、本発明のアスペルギルス属に属する微生物としては、本発明のＤＮＡで形質転換されたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株やアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株を挙げることができる。アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株、及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株はいずれもAmerican Type Culture Collectionより入手可能である。なお、本発明のＤＮＡで形質転換されたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株は、実施例の記載等により再現性をもって作製可能であるが、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所にて保管されており、一定条件下で分譲可能である。
【００３２】
本発明のアスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法としては、炭素源が酢酸である培地で確認されるカルボキシン感受性に対する選択マーカー遺伝子としての使用であれば特に制限されず、例えば、カルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを組み込んだ組換えベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞中において選択マーカー遺伝子としてのカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを発現させることで宿主を形質転換し、カルボキシン耐性を選択マーカーとして形質転換体をスクリーニングすることができる。この場合、組換えベクターは、宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターであっても、染色体組込型ベクターでもよい。
【００３３】
目的遺伝子としては、アスペルギルス属に属する微生物において発現するものであれば特に制限されず、例えば、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ等のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、又はカルボキシペプチダーゼ遺伝子などを挙げることができるが、セルフクローニングをする場合には、宿主と同種の微生物に由来することが必要である。また、目的遺伝子には、上記タンパク質をコードするものに限らず、アンチセンス又はＲＮＡｉのようなジーンサイレンシング機能を有し、産業上不要な酵素や低分子の生産を抑制するポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００３４】
さらに、本発明のアスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法としては、上記組換えベクターにカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを組み込んだ本発明のマーカー遺伝子にさらに既知の他の選択マーカーを組込み、多重選択マーカーとして使用することも可能である。多重選択マーカーの作製方法としては、例えば薬剤耐性マーカーであるピリチアミン耐性遺伝子ptrA、アルギニン要求性相補遺伝子argB、ウラシル要求性相補遺伝子pyrG、アデニン要求性相補遺伝子adeA, adeB、硝酸塩資化遺伝子niaD、硫酸資化遺伝子sC等の栄養要求性マーカー等から選択される１種以上の選択マーカーを作動可能なように組み込み、該組換えベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞中において多重選択マーカーとして使用する方法であれば特に制限されないが、ピリチアミン耐性遺伝子との二重マーカーが、事前に栄養要求変異体の作製が不要である点で好ましい。これら多重マーカーを含むベクターも、本発明の組換えベクターであり、例えば二次代謝産物の遺伝子組換え代謝物の生産において有用であるなどの利点がある。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
（アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスにおけるカルボキシン感受性試験）
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９を通常培養するＧＹ培地（１％グルコース、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）に０、５０、１５０、２５０μｇ／ｍＬのカルボキシン（和光純薬工業株式会社製）を添加し、２８℃にて２日間培養してカルボキシンに対する感受性を確認したが、完全な生育阻害は起こらなかった（表１参照）。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
培地の炭素源をグルコースから酢酸に代えたＡＹ培地（１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）で２８℃にて２日間培養すると５０μｇ／ｍＬのカルボキシンの濃度で生育を完全に阻害することができた（表１参照）。炭素源をグルコースから酢酸に変更することでカルボキシンに対する感受性が向上することが明らかになったため、以後カルボキシン耐性試験や形質転換実験にはＡＹ培地を使用した。
【００３９】
（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０からのカルボキシン耐性突然変異株の取得）
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０からカルボキシン耐性突然変異株の取得を試みた。変異原導入法として紫外線照射法を採用した。
【００４０】
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を胞子形成斜面培地（ポテトデキストロースアガー：ＤＩＦＣＯ社製）で２８℃にて７日間培養後、胞子を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁し、目開き１６０μｍのナイロンメッシュでろ過した。ろ液を５，０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０に再懸濁した。この作業を３回繰り返し、胞子液を洗浄するとともに濃縮を行った。最終的に胞子濃度１×１０９／ｍＬとなるように再懸濁した。
【００４１】
この胞子液４ｍＬを直径５ｃｍのプラスチックシャーレに入れ、約１５ｃｍ離れた距離から紫外線を１０５秒又は６０秒間照射し、その後３０分間遮光した。紫外線照射した胞子を１５０μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地で２８℃にて４〜５日間培養した。この時の生存率は約８０％だった。各プレート培地に生成したコロニーから胞子を採取し、さらに１００μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地で４日間培養して精製したところ、最終的に１３株のカルボキシン耐性変異株を単離することができた。
【００４２】
（アスペルギルス・オリゼゲノムデータベースからのコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニットをコードする遺伝子の探索）
担子菌ではコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子における変異により、カルボキシン耐性が獲得されることが知られている（Keon et. al., Curr. Genet. 19, 475-481 (1991)、 Honda et. al., Curr. Genet. 37, 209-212 (2000)、及びIrie et. al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2006-2009(2003)）ので、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムデータベース(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)より当該遺伝子と思われる遺伝子を検索した（配列番号２参照）。また、この遺伝子から推測されるアミノ酸配列は配列番号１に示した。
【００４３】
上記カルボキシン耐性変異株１３株について、ゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、プライマー１（フォワード）（5’-CTCCCTTCGACTTCATCTCG-3’；配列番号４）及びプライマー２（リバース）（5’-GACGGCCTCAAGAACCGA-3’；配列番号５）を使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡株式会社製）を用いた。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて２分の後、９４℃にて１５秒、５８℃にて３０秒、６８℃にて１分２０秒を３２サイクルした後、６８℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、約１．３Ｋｂのゲノム遺伝子産物を確認した。得られたＰＣＲ産物をプロメガのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍで精製し、ＤＮＡ塩基配列決定を行った。
【００４４】
プライマー１及び２に加えて、プライマー３（フォワード）（5’- GAACTGCACAGGATCCCAAC -3’; 配列番号６）とプライマー４（リバース）（5’- CCTCACTGTTCCACCAGTAC -3’; 配列番号７）を塩基配列決定に使用した。
【００４５】
上記耐性変異株１３株のうち９株において、コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子にアミノ酸の置換を伴う変異が見つかった（図１参照）。すなわち、５株において、開始コドンから９４０番目のシトシンがチミンに置換され、別の１株で９４０番目と９４２番目のシトシンがそれぞれチミンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンに置換された（以後、チロシン置換株とする）。さらに別の２株で９４１番目のアデニンがチミンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからロイシンに置換された（以後、ロイシン置換株とする）。さらにまた別の１株で９４０番目のシトシンがアデニンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからアスパラギンに置換された（以後、アスパラギン置換株とする）。上記耐性変異株１３株のうち４株ではコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子には変異が見られなかった（以後、ヒスチジン耐性株とする）。
【００４６】
（カルボキシン耐性変異株間のカルボキシン耐性度の比較）
置換されたアミノ酸の相違によりカルボキシン耐性に違いが見られるかを確認するために、カルボキシン耐性試験を行った。カルボキシンの濃度を０、２５、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬとしたＡＹ培地に１４×１０６／ｍＬの各上記耐性変異株の胞子を０．５μＬずつ接種し、２８℃にて２日間培養し、カルボキシン耐性度を試験した。
【００４７】
各上記耐性変異株につきカルボキシンの濃度ごとにコロニー直径を測定し、カルボキシンを添加していない場合の各耐性変異株のコロニー直径を１００％とした場合の割合を計算して、耐性度の評価基準とした（図２−ａ参照）。なお、カルボキシンを添加していない場合のコロニー直径は野生株及び耐性変異株間で大きな差はなかった。同一のアミノ酸が変異した株間ではカルボキシン耐性に差が見られなかったため、各アミノ酸変異株の代表株（アスパラギン置換株＃１４、ロイシン置換株＃９、チロシン置換株＃４）及びヒスチジン耐性株＃３、並びに野生株（ＷＴ）のコロニー形成の様子を図２−ｂに示す。４種の耐性変異株のうちロイシン置換株とアスパラギン置換株のカルボキシン耐性がもっとも強いレベルであった。次にチロシン置換株が強い耐性度を示したが、ヒスチジン耐性株は、野生株に比べ明確な耐性を示すものの、そのレベルは他の耐性変異株の中ではもっとも低かった。この結果、野生株が強く生育阻害を示す５０μｇ／ｍＬカルボキシンが添加された培地を用いれば、変異型コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子をカルボキシン耐性選択マーカーとして利用でき、その際、耐性度がもっとも強かったロイシン又はアスパラギンに置換したタイプの遺伝子の使用がもっとも適切であることが判明した。
【００４８】
（カルボキシン耐性選択マーカーを組み込んだベクターの構築）
上記のロイシン又はアスパラギンに置換したタイプの遺伝子のベクターへの組込みを試みた。まず、２４９番目のヒスチジンがロイシンに置換されたコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子につき、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして、プライマー５（フォワード）（5’-CAGTGGGCTGGCTTATAGTGGA-3’; 配列番号８）とプライマー６（リバース）（5’- CTTGGAGACCACCTTGAGACAACTTA -3’ ; 配列番号９）を使用した。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて２分の後、９４℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、６８℃にて３分を３５サイクルした後、６８℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、約３Ｋｂのゲノム遺伝子産物を得た。
【００４９】
得られたＰＣＲ産物をプロメガのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍで精製し、それを制限酵素EcoRIとBglIIとを用いて３７℃にて１５時間処理した。かかる処理によって得られたＤＮＡ断片に対し、EcoRIとBamHIで処理したｐＳＰ７２ベクター（プロメガ社製）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）を用いて１６℃にて７時間反応した反応液を大腸菌に形質転換した。この組換えプラスミドを持つ大腸菌からプラスミドを精製し、正確にカルボキシン耐性遺伝子を有することを、精製したプラスミドベクターの塩基配列を決定することにより確認した。このプラスミドをｐＣＢＲ−Ｌ（ロイシン置換型プラスミド）とした。
【００５０】
上記と同様の方法で、２４９番目のヒスチジンがアスパラギン置換されたコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子を、ｐＳＰ７２ベクターに組み込み、かかるプラスミドをｐＣＢＲ−Ｎ（アスパラギン置換型プラスミド）とした。
【００５１】
（プロトプラスト−ＰＥＧ法によるアスペルギルス属に属する微生物の形質転換）
上記で得られた２種類のプラスミドをベクターとして、プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９の形質転換を試みた。まず、アスペルギルス・オリゼをＣＤ液体培地（ツアペックドックス液体培地；１％グルコース、０．６％硝酸ナトリウム、０．０５２％塩化カリウム、０．１５２％リン酸二水素カリウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％硫酸鉄、０．８８％硫酸亜鉛、０．０４％硫酸銅、０．０１％ホウ酸ナトリウム、０．００５％モリブデン酸アンモニウム、水酸化カリウムにてｐＨ６．５に調整）で２８℃にて、１８〜２０時間静置培養後、ガラスビーズ（５ｍｍ〜６ｍｍ；三商社製）を加え、３０℃にて２４時間振とう培養した。続いて菌糸をガラスフィルター（１Ｇ）でろ過して回収し、滅菌水と０．８Ｍ食塩水で洗浄した。十分に脱水後、菌体を１０ｍＬプロトプラスト化溶液〔０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５ｍｇ／ｍＬヤタラーゼ（宝酒造株式会社製）、１０ｍｇ／ｍＬセルラーゼ（ヤクルト社製）、１ｍＭ  ＤＴＴ〕に懸濁した。３０℃にて振とうさせながら２時間反応させた後、ミラクロス（２２〜２５μｍ；CALBIOCHEM社製）でろ過し、ろ液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、ソリューション１（０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）を１ｍＬ添加し、再度遠心した。プロトプラストが２×１０8／ｍＬとなるようにソリューション１を加え、０．２容量のソリューション２（４０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）、５０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）と１ｍＭとなるようにＤＴＴを加え、よく混合した。０．１ｍＬプロトプラスト溶液につき５μｇ又は１０μｇのｐＣＢＲ−Ｌ又はｐＣＢＲ−Ｎを加えた。氷上で３０分放置後、０．５ｍＬのソリューション２を加え、室温で２０分放置した。その後、５ｍＬのソリューション１を加えてよく混合後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除いた後、沈殿した細胞を０．１５ｍＬのソリューション１に懸濁した。カルボキシンを濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように添加したＡＹプレート培地（６５６ｍＭ塩化ナトリウムを含む）の中央に５０μＬの細胞懸濁液を置いた。これに、カルボキシンの濃度を５０μｇ／ｍＬとしたＡＹ軟寒天培地（１４４ｍＭ酢酸ｐＨ６．５、０．５%イーストエキストラクト、０．５％軟寒天、６５６ｍＭ塩化ナトリウム）を煮沸により溶解後、約４０℃に冷まし、５ｍＬをＡＹプレート培地上の細胞懸濁液に加え、混合したのち固まるまで静置した。ＡＹ培地とＡＹ軟寒天培地に撒かれた細胞懸濁液を２８℃にて４〜５日間培養した。その結果、アスペルギルス・オリゼのカルボキシン耐性を獲得した転換体を得ることができた。アスペルギルス・パラシチカスについてもプロトプラスト化溶液に２０ｍｇ／ｍＬのヤタラーゼを用い、カルボキシンの濃度を７５μｇ／ｍＬとしたことの他は、上記アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０と同様の方法で、カルボキシン耐性を獲得した転換体を得ることができた。
【００５２】
（簡便な組換え体の検出方法）
遺伝子組換えによってカルボキシン耐性を獲得した、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９について、カルボキシン耐性遺伝子が導入されたかどうかの確認を試みた。
【００５３】
変異遺伝子が導入されたかどうかを確認するためにＤＮＡの解析が必要である場合がある。なぜならば、内在の遺伝子が組換え処理中に突然変異を起こし、カルボキシン耐性を獲得することも大変低いが可能性があるためである。しかし、変異遺伝子はもともと内在の遺伝子の１塩基置換であるため、通常のＰＣＲ法では区別をつけることは困難であり、時間がかかり作業が煩雑なサザン解析でしかその確認ができない。そこで迅速に組換え法で導入した遺伝子を検出するために、カルボキシン耐性遺伝子がコードするアミノ酸配列を代えず、１塩基を置換することにより制限酵素MspI認識部位の導入を試みた（図３参照）。
【００５４】
ｐＣＢＲ−Ｌを制限酵素StyI（EcoT14Ｉ）を用いて３７℃にて１１時間処理し、６３塩基を除いたＤＮＡ断片を作製した。この除いた部分に相当するＤＮＡ配列に対して１塩基置換によりMspI認識部位を創出したＤＮＡ断片を合成するために、センスオリゴヌクレオチド（5’-ACGCCTTGGATAACAGCATGAGCGTCTACCGGTGCCTCACCATTCTTA-3’配列番号１０）（図４に示されるように、配列の下線部は左からStyI、MspI、及び変異が入った塩基配列でコードされるアミノ酸のロイシン（ＣＴＣ）を含む）と、アンチセンスオリゴヌクレオチド
（5’-GACCCTTGGGGCAAGTCCGCGAGCAGTTAAGAATGGT-3’; 配列番号１２）を作製し、これらを混合した後、プロメガのＰＣＲマスターミックスを用いて下記の反応により二本鎖ＤＮＡを合成した（図４参照）。反応条件は、９４℃にて３０秒の後、３７℃にて３分、７２℃にて１分であった。得られた断片をStyIを用いて３７℃にて１３時間処理し、エタノール沈殿して精製した。これをStyIで処理したｐＣＢＲ−ＬにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃にて、４時間処理してライゲーションし、この反応液を大腸菌に形質転換した。この組換えプラスミドを持つ大腸菌からプラスミドを精製し、正確に置き換えたＤＮＡ断片を有することを精製したプラスミドの塩基配列を決定することにより確認した。このプラスミドをロイシン置換型のｐＣＢＲ−ＬＭとした。また、センスオリゴヌクレオチド（5’-ACGCCTTGGATAACAGCATGAGCGTCTACCGGTGCAACACCATTCTTA-3’;配列番号１１）（配列番号１０と同様に、左からStyI、MspIを含む。また、変異が入った塩基配列でコードされるアミノ酸のアスパラギン（ＡＡＣ）を含む）を用いたことのほかは上記と同様の方法で、アスパラギン置換型のｐＣＢＲ−ＮＭを作製した。アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９に対しｐＣＢＲ−ＬＭ又はｐＣＢＲ−ＮＭを上記プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて形質転換を行った。選択培地上に増殖した耐性コロニーから菌体を取って５０μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地上で２８℃にて２日間培養して、安定した耐性が得られた株を選抜した。増殖した菌体から簡便な核酸抽出法（Wen et al., Appl. Environ. Microbiol., 71,3192-3198 (2005)）を用い、ゲノムＤＮＡを抽出した。野生型株のゲノムＤＮＡも同様に抽出を行った。抽出したゲノムＤＮＡに対しプロメガのＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲを行い、コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子の増幅を試みた。ＰＣＲのプライマーは、プライマー７（フォワード）（配列番号１３）（5’- CTGGTGCCCGATCTGAC -3’）とプライマー８（リバース）（5’-GCCGATCCATAACCTTCA -3’; 配列番号１４）を使用した。ＰＣＲサイクルの条件は、９５℃にて４分の後、９５℃にて３０秒、５６℃にて３０秒、７２℃にて５０秒を３０サイクルした後、７２℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、野生型株、形質転換株とも約０．８３Ｋｂのゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素MspIを用いて３７℃にて１８時間ほど処理し、それをアガロースゲルで電気泳動した（図５参照）。その結果、試験した全てのカルボキシン耐性株において、約０．４６Ｋｂと約０．３７Ｋｂのバンドが得られた一方で、野生型株ではこれらの切断断片は生じなかった。この結果から、カルボキシン耐性株はすべて組換え体であることが確認された（表２参照）。アスペルギルス・オリゼの形質転換効率は表３に、アスペルギルス・パラシチカスの形質転換効率は表４に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明のカルボキシン耐性変異株１３株のうち９株におけるコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子におけるアミノ酸の置換を伴う変異の箇所を示す図である。
【図２】４種の耐性変異株のコロニーの直径の割合（％）を図２−ａに示す。各アミノ酸変異株の代表株（アスパラギン置換株＃１４、ロイシン置換株＃９、チロシン置換株＃４）及びヒスチジン耐性株＃３、並びに野生株（ＷＴ）のコロニー形成の様子を図２−ｂに示す。
【図３】カルボキシン耐性遺伝子へ導入した制限酵素認識部位を示す図である。カルボキシン耐性遺伝子に対して、さらに遺伝子操作を行い制限酵素MspIによって切断できる部位を導入した。これによるコードするアミノ酸（アルギニン）に変化はない。
【図４】カルボキシン耐性ベクターへMspIサイトの導入の様子を示す図である。
【図５】制限酵素認識部位導入カルボキシン耐性遺伝子による遺伝子組換え検出の様子を示した図である。図３に示した制限酵素認識部位導入カルボキシン耐性遺伝子を用いて組換え処理を行い、得られた耐性株について、簡便法でＤＮＡ抽出、ＰＣＲ処理、制限酵素MspI処理を行い電気泳動により結果を確認した。試験したいずれの株も、明確に組換え遺伝子が導入されていることが確認できた。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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