(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出する方法であって、
前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記変異構成要素をそれぞれ含んだ特定部分配列に相補的な塩基配列を３’末端に有する第１のクエリ配列と、前記変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列とを有する２種類以上の第１のプローブと、前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な塩基配列を５’末端に有する第２のクエリ配列と、前記第１のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列とを有する１種類又は２種類以上の第２のプローブとを準備し、これらのプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記第１のプローブと前記第２のプローブとを連結して連結分子を取得する連結工程と、
前記連結分子が備える前記識別情報用タグ配列又は検出情報用タグ配列を用いて前記連結分子を所定の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する標識工程と、
前記識別情報及び前記検出情報に基づいて、前記固相担体上で前記キャプチャープローブと前記標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、
ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記識別情報及び前記検出情報に基づく前記所定の標識物質のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、
前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記変異を検出する工程と、
を備え、
前記第１のプローブが、さらに前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記特定部分配列に相補的である前記第１のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び／又は、
前記第２のプローブが、前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記他の変異構成要素を組み合わせた前記部分配列に相補的である前記第２のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定の標識物質を前記連結分子に付加するための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記標識済み連結分子を共通の前記キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を含む、検出方法。
【請求項２】
前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素に関連付けられた前記キャプチャープローブのキャプチャー配列に前記標識済み分子をハイブリダイズさせるための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記連結分子に共通の所定の標識物質を付加するための配列情報を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異及び前記他の変異のうちの少なくとも一つを含んだ複数の変異を検出対象とし、
前記他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、これらの他の変異構成要素の一つを含んだ他の特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記他の変異構成要素に相補的な塩基配列を３’末端に有する他の第１のクエリ配列と、前記他の変異の一つの前記他の変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する他の識別情報を含む他の識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する２種類以上の他の第１のプローブと、
前記他の特定部分配列に隣接する他の部分配列に相補的な塩基配列を５’末端に有する他の第２のクエリ配列と、前記他の第１のプローブが保持する前記他の識別情報に基づいて前記固相担体上で一つの前記他の変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する他の検出情報を含む他の検出情報用タグ配列と、をそれぞれ有する１種類又は２種類以上の他の第２のプローブと、を準備し、
これらの他のプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記他の第１のプローブと前記他の第２のプローブとを連結して他の連結分子を取得する連結工程と、
前記他の連結分子が備える前記他の識別情報用タグ配列又は前記他の検出情報用タグ配列を用いて前記他の連結分子を所定の標識物質で標識して他の標識済み連結分子を取得する標識工程と、
前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づいて前記固相担体上で前記他のキャプチャープローブと前記他の標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、
ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づく前記標識物質の他のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、
前記他のシグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記他の変異を検出する工程と、
を備える、
前記他の第１のプローブが、さらに前記変異の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記他の特定部分配列に相補的である前記他の第１のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び／又は、
前記他の第２のプローブが、前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記異構成要素を組み合わせた前記他の部分配列に相補的である前記他の第２のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記他の識別情報は、前記他の変異構成要素を識別するために前記他の変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定のほかの標識物質を前記他の連結分子に付加するための他の配列情報を含み、
前記他の検出情報は、前記他の標識済み連結分子を共通の前記他のキャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための他の配列情報を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、前記他の第１のプローブ及び前記他の第２のプローブにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程、前記シグナル強度情報取得工程及び検出工程を前記固相担体上において同時に実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固相担体は、前記標的核酸について用いる複数の前記キャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記変異と前記他の変異との間の塩基数は３０塩基以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットであって、
前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、これらの変異構成要素の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基配列を３’末端に有する第１のクエリ配列と、前記変異の前記一つの変異構成要素の識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する２種類以上の第１のプローブと、
前記標的核酸中の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な塩基配列を５’末端に有する第２にクエリ配列と、前記第１のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列と、
をそれぞれ有する１種類又は２種類以上の第２のプローブと、
を備え、
前記第１のプローブが、さらに前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記特定部分配列に相補的である前記第１のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び／又は、
前記第２のプローブが、前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記他の変異構成要素を組み合わせた前記部分配列に相補的である前記第２のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定の標識物質を前記連結分子に付加するための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記標識済み連結分子を共通の前記キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を含む、プローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸中の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を含む遺伝子上の変異を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどにおけるＳＮＰを含む遺伝子変異は体質や遺伝病のみならず、特定疾患についての罹患率、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択等にも関連していることがわかっている。ＳＮＰや遺伝子変異は、通常、複数個が関連しているとともに、個別化医療の促進のためには、できるだけ多くのＳＮＰや変異を網羅的に検出又は定量することが求められている。
【０００３】
そこで、ＳＮＰ等を効率的に検出又は定量する方法として、ＤＮＡコンピュータ技術を利用した方法が提案されている（非特許文献１）。この方法では、図７に示すように、標識用タグ配列とＳＮＰの特定塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とを有する２種類の５’クエリプローブと、前記特定部分配列に隣接する共通部分配列に相補的なクエリ配列とキャプチャーに相補的な識別用タグ配列とを有する一つの３’クエリプローブと、を用いる。２種類の５’クエリプローブの各標識用タグ配列１、２は、それぞれのクエリ配列を区別可能に、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５等の異なる標識物質で標識可能に形成されている。
【０００４】
この方法は、これらのプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応及びライゲーション反応によって、５’クエリプローブと３’クエリプローブとを連結させる（エンコード）。次いで、得られた連結分子の標識用タグ配列を利用してＰＣＲでラベリングする。こうした連結及びラベリングにより、ＳＮＰの特定塩基に関連付けた標識物質を備え、かつ一種類の識別用タグ配列を備える連結分子を得る。さらに、ラベリングした連結分子を識別用タグ配列に相補的なキャプチャープローブが固定化されたアレイで検出するというものである。
【０００５】
この方法では、２種類の異なる標識物質を有する連結分子が識別用タグ配列を介して一つのキャプチャープローブにハイブリダイズしたときの、それぞれの標識物質に基づくシグナル強度のプロットに基づいてＳＮＰのタイプ（２種類のホモと１種類のヘテロ）を検出する。
【非特許文献１】Analytical Biochemistry364(2007)78-85
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記非特許文献１に記載の方法は、標的核酸中の特定部分配列に応じたキャプチャープローブを固定化した固相担体を準備することなく、特定塩基を含む部分配列とは無関係に設定した塩基配列を有するキャプチャープローブを固定化したユニバーサルな固相担体を利用できるという利点がある。また、ＳＮＰを構成する２種類の塩基置換を２種類の標識物質を用いて一つのキャプチャープローブで検出するため、網羅的に多数のＳＮＰを検出できるという利点もある。
【０００７】
しかしながら、一つの標的核酸中において検出しようとする変異の近傍に他の変異がある場合、こうした他の変異の存在により、検出対象たる変異の検出ができなくなるおそれがある。すなわち、上記方法では、通常、検出対象たる特定塩基を５’クエリプローブの３’末端に配置するが、特定塩基の５’末端側に他の変異がある場合には、この変異の存在により、クエリ配列の特定部分配列にハイブリダイゼーション効率が変化してしまう。一方、特定塩基の３’末端側に他の変異があった場合には、この変異の存在により３’クエリプローブのクエリ配列が共通ではなくなり、５’クエリプローブと同様、ハイブリダイゼーション効率が変化してしまう。このようなハイブリダイゼーション効率の変化により、標的核酸中の特定塩基の存在比に基づいた連結分子の取得が困難になってしまい、結果として、多型の検出が不可能になってしまう。
【０００８】
そこで、本発明は、標的核酸中において検出対象の変異の近傍の他の変異の存在に関わらず、検出対象たる変異を検出することができる変異の検出方法及びアレイを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、標的核酸中において近接する二つの変異をそれぞれ検出することができる変異の検出方法及びアレイを提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、標的核酸中の変異を検出するのにあたり、５’クエリプローブのクエリ配列や３’クエリプローブのクエリ配列について、検出対象となる変異以外の他の変異の構成変異要素に応じたバリエーションを備えさせる一方、検出対象となる変異の構成変異要素に応じて得られる連結分子を識別し検出することで、確実に検出対象たる変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出する方法であって、前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられ、これらの変異構成要素の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基を３’末端に有する第１のクエリ配列と、前記変異の前記一つの変異構成要素の識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する複数の第１のプローブと、前記標的核酸中の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な第２のクエリ配列と、前記第１のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列と、をそれぞれ有する第２のプローブと、を準備し、これらのプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、前記標的核酸にハイブリダイズした前記第１のプローブと前記第２のプローブとを連結して連結分子を取得する連結工程と、前記連結分子が備える前記識別情報用タグ配列又は検出情報用タグ配列を用いて前記連結分子を所定の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する標識工程と、前記識別情報及び前記検出情報に基づいて、前記固相担体上で前記キャプチャープローブと前記標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記識別情報及び前記検出情報に基づく前記所定の標識物質のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記変異を検出する工程と、を備え、前記第１のプローブ及び／又は前記第２のプローブは、前記変異の変異構成要素と前記変異部位に近接又は隣接して存在する未検出の他の変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、前記第１のプローブにおける特定部分配列に相補的な第１のクエリ配列及び／又は前記第２のプローブにおける前記部分配列に相補的な第２のクエリ配を有する、方法が提供される。
【００１１】
この発明は、前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素に関連付けられた所定の標識物質を前記連結分子に付加するための配列情報を含み、前記検出情報は、前記標識済み連結分子を共通の前記キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を含んでいてもよい。また、前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素に関連付けられた前記キャプチャープローブのキャプチャー配列に前記標識済み分子をハイブリダイズさせるための配列情報を含み、前記検出情報は、前記連結分子に共通の所定の標識物質を付加するための配列情報を含んでいてもよい。
【００１２】
本発明の方法は、前記変異及び前記他の変異のうちの少なくとも一つを含んだ複数の変異を検出対象とし、前記他の変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられ、これらの変異構成要素の一つを含んだ他の特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基を３’末端に有する他の第１のクエリ配列と、前記他の変異の前記一つの変異構成要素の識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する他の識別情報を含む他の識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する２種類以上の他の第１のプローブと、
前記他の特定部分配列に隣接する他の部分配列に相補的な他の第２のクエリ配列と、前記第１のプローブが保持する前記他の識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する他の検出情報を含む他の検出情報用タグ配列と、をそれぞれ有する１種類又は２種類以上の他の第２のプローブと、
を準備し、
これらの他のプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第１の接触工程と、前記標的核酸にハイブリダイズした前記第１のプローブと前記第２のプローブとを連結して他の連結分子を取得する連結工程と、前記他の連結分子が備える前記他の識別情報用タグ配列又は前記他の検出情報用タグ配列を用いて前記他の連結分子を所定の標識物質で標識して他の標識済み連結分子を取得する標識工程と、前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づいて前記固相担体上で前記他のキャプチャープローブと前記他の標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第２の接触工程と、ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づく前記標識物質の他のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、前記他のシグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記他の変異を検出する工程と、を備え、前記他の第１のプローブ及び／又は前記他の第２のプローブは、前記変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、前記他の第１のプローブにおける他の特定部分配列に相補的な他の第１のクエリ配列及び／又は前記他の第２のプローブにおける他の前記部分配列に相補的な他の第２のクエリ配を有していてもよい。
【００１３】
さらに、本発明方法は、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、前記他の第１のプローブ及び前記他の第２のプローブにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程、前記シグナル強度情報取得工程及び検出工程を前記固相担体上において同時に実施するものであってもよい。
【００１４】
さらにまた、本発明方法は、前記固相担体は、前記標的核酸について用いる複数の前記キャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイであってもよい。また、前記変異と前記他の変異との間の塩基数は３０塩基以下であってもよい。
【００１５】
本発明によれば、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットであって、前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられこれらの変異構成要素の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基を３’末端に有するクエリ配列と、前記変異の前記一つの変異構成要素の識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する２種類以上の第１のプローブと、
前記標的核酸中の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な第２にクエリ配列と、前記第１のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列と、
をそれぞれ有する１種類又は２種類以上の第２のプローブと、
を備え、
前記第１のプローブ及び／又は前記第２のプローブは、前記変異の変異構成要素と前記変異部位に近接又は隣り合って存在する未検出の他の変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、前記第１のプローブにおける特定部分配列に相補的な第１のクエリ配列及び／又は前記第２のプローブにおける前記部分配列に相補的な第２のクエリ配を有する、プローブセットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、標的核酸中の変異の検出方法及び標的核酸を検出するためのアレイに関する。本発明の標的核酸の検出方法によれば、上記のとおりの第１のプローブと第２のプローブとを備えるため、検出しようとする変異の近傍に他の変異があった場合でも、その変異構成要素のバリエーションに応じた第１のクエリ配列及び第１のプローブを準備したり、変異構成要素のバリエーションに応じた第２のクエリ配列及び第２のプローブを準備することで、他の変異が存在していても検出しようとする特定の変異構成要素を含んでいれば確実に標的核酸中の特定部分配列又は部分配列にハイブリダイズさせることができる。このため、近傍に存在する他の変異の有無や変異構成要素に関わらず、確実に特定の変異構成要素に対応する連結分子を得ることができる。また、連結分子は、他の変異の変異構成要素ではなく、検出対象とする変異の一つの変異構成要素を固相担体上で識別し検出するための識別情報及び検出情報を保持しているため、クエリ配列のバリエーションに関わらず、正確に検出対象たる変異を検出することができる。
【００１７】
この方法は、他の変異に関わらず検出対象たる変異を確実に検出することができるほか、近傍にある変異の双方を確実に検出することができる方法としても用いることができる。すなわち、他の変異についても検出対象たる変異と同様のコンセプトで第１のプローブ及び第２にプローブを準備し、同様の工程を実施することで他の変異を確実に検出できる。また、この方法は、こうした近接する２種類以上の変異を同時に検出することもできる。近接する２種類以上の変異を確実に及び／又は同時に検出できることは、多数のＳＮＰをくまなく同時に検出するのに極めて都合がよい。特に、平板状のチップを用いたアレイにより多数のＳＮＰをくまなく検出するのに都合がよい。なお、近傍の２種以上の変異の検出にあたっては、第１の接触工程から検出工程までの同時に（同一反応系内で）行ってもよいし、別々に行ってもよい。また、連結工程までの別個に行ってその後同時に行ってもよい。
【００１８】
以下、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の検出方法の原理を模式的に表す図である。
【００１９】
なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ-オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸である。典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。
【００２０】
標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸の全てが増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
【００２１】
本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
【００２２】
本明細書において「変異」とは、遺伝子上の１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれか１種以上を含む変化をいう。「変異」には、一塩基多型及びそれ以外の多型を含む広い意味で使用するものとする。「多型」としては、典型的には一塩基多型が挙げられる。本明細書において「変異構成要素」とは、一つの変異における正常型及び変異型を構成する塩基をいう。本明細書において「特定部分配列」とは、多型や変異を構成する少なくとも１個の変異構成要素（塩基）を含む配列をいう。したがって、例えばＡがＧに置換される一塩基多型にあっては、特定部分配列は２種類存在することになる。
【００２３】
[標的核酸中の変異を検出する方法]
本発明の検出方法は、第１のプローブと、第２のプローブと、標的核酸とを接触させる第１の接触工程と、第１のクエリプローブと第２のクエリプローブとの連結工程と、標識工程と、標識済み連結分子とキャプチャープローブとを接触させる第２の接触工程と、シグナル強度情報取得工程と、検出工程と、を備えている。本発明の検出方法は、１種又２種以上の標的核酸を適用対象とし、これらの標的核酸中の多型又は変異に関する特定部分配列を検出対象とする。以下、一種の標的核酸についての一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。また、以下の工程は、一つの標的核酸の複数の変異を検出する場合において、個々の変異に適用される。
【００２４】
図１には、本発明の検出方法の概要を示し、図２には、本発明に用いるプローブセットの例の概要を示し、図３には、本発明に用いるプローブセットの他の例の概要を示し、図４には、識別情報用タグ配列及びキャプチャープローブの融解温度についての説明図を示す。なお、図１〜図３は、ＳＮＰの１塩基置換を検出するための検出方法及びプローブセットについての一例である。
【００２５】
〈第１の接触工程〉
第１の接触工程は、第１のプローブと第２のクエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。まず、本工程で用いる第１のプローブと第２のプローブについて説明する。第１のプローブは、図１及び図２に示すように、第１のクエリ配列と識別情報用タグ配列とを備えることができる。
【００２６】
（第１のプローブ）
第１のプローブは、２種類以上準備される。第１のプローブは、第１のクエリ配列をその３’側に有しており、識別情報用タグ配列をその５’側に有することができる。
【００２７】
（第１のクエリ配列）
第１のプローブは、検出しようとする変異構成要素の種類の数に応じて準備される。第１のプローブは、存在する可能性のある変異構成要素の種類に応じた第１のクエリ配列を備えることができる。第１のクエリ配列は、標的核酸中の検出対象たる変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられ、これらの変異構成要素（塩基）の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基を３’末端に有することができる。
【００２８】
第１のクエリ配列は、少なくとも、検出対象の変異の変異構成要素の種類に基づいてその数だけ準備される。一つの変異は少なくとも二つの変異構成要素から構成されるため、第１のクエリ配列は２種類以上準備され、この結果、第１のプローブも２種類以上準備される。標的核酸が検出対象変異の５’側に近接して又は隣接して他の変異を備えていない場合には、第１のクエリ配列は、検出対象変異の変異構成要素の種類に応じ、各変異構成要素を含む特定部分配列に相補的な配列であればよい。
【００２９】
一方、検出対象変異の５’側に近接して未検出の他の変異を有する場合には、他の変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、第１のクエリ配列が準備される。すなわち、検出対象の変異の変異構成要素の種類とこの他の変異の変異構成要素の種類からなる組み合わせに応じて準備される。この他の変異のさらに５’側に他の変異を備える場合には、この他の変異における変異構成要素の種類を組み合わせて得られる順列に応じてそれぞれ準備される。
【００３０】
ここで、検出対象変異の５'側に近接して他の変異を備えるとは、例えば、検出対象変異と他の変異（１塩基）との間の塩基数が３０塩基以下であることが好ましい。３０塩基以下であると第１のプローブの第１のクエリ配列中に他の変異塩基が存在するおそれがあるためである。
【００３１】
例えば、検出対象たる変異がＳＮＰｓであり変異構成要素が２種類存在し、５’側にある他の変異もＳＮＰｓであり変異構成要素が２種類存在する場合は、第１のクエリ配列は図２に示すように、３’末端に検出対象たる２種類の変異構成要素をそれぞれ備え、さらにその５’側において他の変異の２種類の変異構成要素に基づく合計４種類のバリエーションを有することになる。検出対象たる変異が正常塩基に対して３種類の塩基置換の可能性のある場合、変異構成要素が４種類存在することになり、このとき他の変異の変異構成要素が２種類存在する場合には、第１のクエリ配列は４種類の変異構成要素を３’末端にそれぞれ備え、さらにその５’側に他の変異の２種類の変異構成要素に基づく合計８種類のバリエーションを有することになる。
【００３２】
第１のプローブは、こうした第１のクエリ配列をそれぞれ１種類有することができる。第１のクエリ配列は、検出対象たる変異又はこの変異に加えた他の変異の各変異構成要素の組み合わせて得られる各種の可能性ある特定部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的に設定される。第１のクエリ配列は、プローブ３’末端を構成するように配置されることが好ましく、例えば、図１及び図２に示すように、変異構成要素に対応する塩基が、そのまま３’末端を形成していることが好ましい。変異構成要素に対応する塩基が３’末端を構成することで、高い選択性で標的核酸とハイブリダイズ及び連結が可能である。
【００３３】
第１のクエリ配列は、例えば、連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。また、クエリ配列の長さは特に限定されないが、たとえば１０塩基長以上であることが好ましい。
【００３４】
（識別情報用タグ配列）
第１のクエリプローブは、検出しようとする変異の変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報用タグ配列を有している。識別情報用タグ配列は、検出対象変異を構成する１つの変異構成要素に一つずつ設定される。
【００３５】
識別情報用タグ配列の一つの形態は、図２に示すように、変異構成要素を異なる標識物質で検出する場合の識別情報を含んでいる。すなわち、この場合の識別情報は、変異構成要素を識別するために変異構成要素に関連付けられた所定の標識物質を後述する連結分子に付加するための配列情報（以下、標識物質関連配列情報ともいう。）を含んでいる。識別情報としてこうした配列情報を用いることで、結果として、一つの検出対象たる変異の変異構成要素をそれぞれ異なる標識物質に対応させて、同時に一つのキャプチャープローブで検出できるため、極めてハイスループットである。こうした配列情報としては、特に限定しないで標識物質の付加に都合のよい配列を適宜設定し又は公知の配列から選択して用いればよい。
【００３６】
識別情報用タグ配列の一つの形態は、図３に示すように、変異構成要素を異なるキャプチャープローブにハイブリダイズさせて検出するための識別情報を含んでいる。この場合の識別情報は、変異構成要素を識別するために前記変異構成要素に関連付けられた所定のキャプチャープローブのキャプチャー配列に後述する標識済み連結分子をハイブリダイズさせるための配列情報（以下、キャプチャープローブ関連配列情報ともいう。）を含んでいる。識別情報としてこうした配列情報を用いることで、検出対象たる変異の変異構成要素を異なるキャプチャープローブで共通の標識物質により検出するため、異なる標識物質を用いることの誤差等を排除して精度の高い検出が可能となる。また、変異構成要素を異なるキャプチャープローブに割り当てるため、３種類以上の変異構成要素を内包する変異について好ましい。標識物質による識別は３種類以上の変異構成要素を内包する変異について適用が困難な場合があるからである。
【００３７】
キャプチャープローブに関する識別情報用タグに用いる配列情報は、標的核酸の塩基配列、すなわち、特定部分配列と無関係に設定することができる。特定部分配列と無関係に設定することで、配列情報として、検出に都合のよい配列を用いることができるほか、所定の配列情報に予め対応させたキャプチャープローブを用いることでどのような特定部分配列であってもキャプチャープローブと識別情報用タグ配列との組み合わせによって検出することができる。
【００３８】
また、キャプチャープローブ関連識別情報に用いられる配列と、後述する固相担体に固定化されるキャプチャープローブのキャプチャー配列とは相同的又は相補的であり、好ましくは完全に相同な配列又は完全に相補的な配列である。キャプチャー配列に対して相同的とするか相補的とするかは、標識工程におけるプライマーの設計等に応じて適宜決定されればよく、標識工程後にキャプチャー配列に対して選択的にハイブリダイズ可能な相補性を有していればよい。なお、以下の説明において、キャプチャープローブのキャプチャー配列を基準としてこれと相同的な配列を有する識別情報用タグ配列を（＋）を付加して記載し、これと相補的な配列を有する識別情報用タグ配列を（−）を付加して記載するものとする。識別用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列としては、例えば、配列番号：１〜配列番号：１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイゼーションにおいて均質なハイブリダイゼーション結果が得られることが期待される。
【００３９】
２種類以上の第１のプローブの識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列の融解温度は、できるだけ近いことが好ましい。より好ましくは、同時に網羅的に複数の標的核酸の複数の特定部分配列を検出しようとする場合には、一つの標的核酸に対して使用する複数の第１のクエリプローブの複数の識別情報用タグ配列（＋）とキャプチャー配列との融解温度は互いに最も近似するように組み合わされていることが好ましい。例えば、図４に示すように、識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列を融解温度の順に配列したとき、一つの標的核酸に対する２種類以上の第１のクエリプローブにおける識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列は、当該順列において隣り合う２種類以上の塩基配列から選択することができる。また、他の標的核酸に対応する第１のクエリプローブセットの識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列は、図４に示すように、既に選択した塩基配列にすぐ隣の一連の塩基配列から選択してもよいし、離れた一連の塩基配列から選択してもよい。同時に検出しようとする標的核酸に対応する全ての第１のクエリプローブセットで使用される識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列の融解温度が前記融解温度の順列において一連の塩基配列を用いることが好ましい。なお、融解温度は、ＧＣ％法、Ｗａｌｌａｃｅ法、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに準拠した方法(秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲｐ２５に記載)等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるＮｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法によって算出されることが好ましい。Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法による融解温度は、例えば、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）とのソフトウエアや日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo
Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）により容易に取得できる。なお、配列番号：１〜配列番号：１００は、Ｖｉｓｕａｌ
ＯＭＰによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ
Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。
【００４０】
このような識別情報用タグ配列（＋）及びキャプチャー配列（＋）は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイゼーションのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、Ｈ．Ｙｓｈｉｄａ
ａｎｄ Ａ．Ｓｕｙａｍａ，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ３−ＳＡＴ ｂｙ ｂｒｅａｄｔｈ ｆｉｒｓｔ ｓｅａｒｃｈ”，ＤＩＭＡＣＳ Ｖｏｌ．５４ ９−２０（２０００）および特願２００３−１０８１２６に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
【００４１】
第１のプローブを、標的核酸中に存在可能性のある検出対象変異の変異構成要素にそれぞれ対応するとともに、存在可能性のある他の変異の変異構成要素にもそれぞれ対応した第１のクエリ配列とすることで、特定部分配列中に他の変異を有する場合であっても、確実に検出対象変異の変異構成要素を検出することができる。従来法の第１のクエリ配列では、検出対象としない他の変異の変異構成要素には対応付けがなされていなかったため、ハイブリダイゼーション効率が低下していたおそれがあるが、本発明によればそのようなおそれはないものとなっている。
【００４２】
また、本発明によれば、他の変異の変異構成要素に対してこれを識別するための識別情報を第１のクエリ配列にも第１のプローブにも付与しないため、手法等が複雑化されないで再現性を確保できる。なお、こうした他の変異のアッセイには、別に第１のプローブを作製すればよい。
【００４３】
（第２のプローブ）
第２のプローブは、第２のクエリ配列と、検出情報用タグ配列と、をそれぞれ備えることができる。第２のプローブは、その第２のクエリ配列をその５’側に備えることがきる。また、検出情報用タグ配列をその３’側に備えることができる。
【００４４】
（第２のクエリ配列）
第２のクエリ配列は、標的核酸中の特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な配列である。第２のクエリ配列は、第１のクエリプローブが有する第１のクエリ配列に対応する特定部分配列に隣接する部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的な配列とすることができる。好ましくは完全に相補的とすることができる。第２のクエリ配列は、後述する連結工程において、第１のクエリ配列とリガーゼ反応により連結される。このため、クエリ配列の５’末端側はリガーゼ反応可能にリン酸エスエル化されていることが好ましい。
【００４５】
第２のクエリ配列は、検出対象たる変異の３’側に有していない場合には、標的核酸中において特定部分配列の３’側に隣接して保存されている配列に相補的な配列とすることができる。一方、第２のクエリ配列は、標的核酸中の検出対象たる変異の３’側に近接して他の変異を有する可能性がある場合には、当該他の変異の変異構成要素に応じて得られる各種の可能性ある部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的に設定される。
【００４６】
ここで、検出対象変異の３'側に近接して他の変異を備えるとは、例えば、検出対象変異とその３'側の他の変異（１塩基）との間の塩基数が３０塩基以下であることが好ましい。３０塩基以下であると第２のプローブの第２のクエリ配列中に他の変異塩基が存在するおそれがあるためである。
【００４７】
なお、検出対象たる変異の３’側の他の変異は２種類以上あってもよい。２種類以上の場合であっても、これらの他の変異における変異構成要素の種類の組み合わせに基づいて得られる各種の可能性ある部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的、好ましくは完全に相補的に設定すればよい。
【００４８】
このような他の変異の変異構成要素毎に特異的な第２のクエリ配列を備えることで、検出対象たる変異の３’側に変異がある場合であっても標的核酸に確実に第２のプローブをハイブリダイズさせることができるため、第１のプローブと確実に連結させて、変異の存在の有無や比率に応じて正確に連結分子を得ることができる。
【００４９】
こうした第２のクエリ配列は、第１のクエリプローブにおけるクエリ配列と同様にして設計することができる。
【００５０】
（検出情報用タグ配列）
第２のクエリプローブは、第１のプローブが保持する識別情報に基づいて固相担体上で一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャー又は標識物質に関する配列情報を含む検出情報用タグ配列を備えることができる。検出情報用タグ配列の形態は、第１のプローブが保持する識別情報に基づいて決定することができる。
【００５１】
第１のプローブの識別情報用タグ配列が標識物質の付加に関する配列情報を含む場合には、検出情報用タグ配列は、キャプチャーに関する配列情報を含む。すなわち、識別情報が、検出対象たる変異構成要素を異なる所定の標識物質を用いて検出しようとする場合には、最終的にこれらの所定の標識物質で標識された標識済みの連結分子を共通のキャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を検出情報として含んでいる。このような識別情報と検出情報との組み合わせで、連結分子において検出対象たる変異の変異構成要素を異なる標識物質で標識して識別することができる。そして、これらの標識済み連結分子を固相担体上の一つのキャプチャープローブにハイブリダイズさせて標識物質によるシグナル強度情報を取得し、シグナル強度のプロット等から変異を検出できるようになる。
【００５２】
キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報に関して、キャプチャー配列やこの配列にハイブリダイズさせるための配列については第１のプローブのキャプチャー関連配列情報において既に説明した内容をそのまま適用できる。なお、第２のプローブの検出情報用タグ配列に含まれるキャプチャー関連配列情報は、第１のプローブで識別した異なる標識物質によって標識された共通のキャプチャープローブのキャプチャー配列とハイブリダイズさせるものである点において相違している。
【００５３】
また、第１のプローブの識別情報用タグ配列が、キャプチャープローブに関する配列情報を含む場合には、検出情報用タグ配列は、所定の標識物質に関する配列情報を含む。すなわち、識別情報が、変異構成要素を識別するために変異構成要素に関連付けられたキャプチャープローブのキャプチャー配列に前記標識済み連結分子をハイブリダイズさせるための配列情報を含むときには、最終的に標識済み連結分子を得るための連結分子に共通の所定の標識物質を付加するための配列情報を検出情報として含んでいる。このような識別情報と検出情報との組み合わせで、連結分子において検出対象たる変異の変異構成要素を異なるキャプチャープローブに対応付けて識別することができる。そして、連結分子を共通の標識物質で標識した標識済み連結分子を固相担体上の所定の異なるキャプチャープローブにハイブリダイズさせることで、変異構成要素毎に異なるキャプチャープローブ(部位)で共通の標識物質によるシグナル強度情報を取得することで、シグナル強度比や比率等により変異を検出又は変異率を定量できるようになる。
【００５４】
所定の標識物質を付加するための配列情報は、第１のプローブに関して説明したのと同様にして適宜設定することができる。
【００５５】
第１の接触工程によれば、これらの第１及び第２のプローブと標的核酸とを接触させることで、標的核酸中に第１のプローブ及び第２のプローブが相補的配列を有する所定の特定部分配列及び部分配列が存在するときには、特定部分配列に対応する第１のクエリ配列を有する第１のクエリプローブと部分配列に対応する第２のクエリ配列を有する第２のプローブとがコンカテマー状（タンデム状）にそれぞれ標的核酸にハイブリダイズすることになる。
【００５６】
第１のクエリ配列が、他の変異に応じた変異構成要素に応じたバリエーションを有している場合、検出対象変異の変異構成要素に対応する塩基及び他の変異の変異構成要素に応じた塩基を持っているときに選択的に標的核酸にハイブリダイズする。他の変異の変異構成要素の種類に応じたバリエーションの第１のクエリ配列を有していれば、変異構成要素を確実に検出できる。
【００５７】
また、第２のクエリ配列が、他の変異に応じた変異構成要素に応じたバリエーションを有している場合、こうした変異構成要素に相補的な塩基を所定位置に備える場合には選択的に標的核酸にハイブリダイズする。
【００５８】
（連結工程）
連結工程は、標的核酸にハイブリダイズした第１のプローブと第２のプローブとを連結して連結分子を取得する工程である。第１の接触工程において説明したように標的核酸中に検出しようとする所定の変異構成要素を含む特定部分配列が存在するとき、その特定部分配列に対応する第１のクエリ配列を有する第１のプローブと第２のプローブとが標的核酸にハイブリダイズする。図１及び図２に示すように、この状態で第１のプローブの５’末端と第２のプローブの３’末端とを連結する。
【００５９】
これらプローブの連結手法は特に限定しない。ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いる酵素反応を用いることもできるし、化学的な反応を用いることもできる。好ましくは、ＤＮＡリガーゼによりこれらのプローブのライゲーション反応を行う。連結するために使用することができるリガーゼには、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＴａｑＤＮＡリガーゼが含まれるが、これに限定されず、標的核酸やプローブの種類に応じて任意のＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼを使用し得る。
【００６０】
本連結工程によれば、第１のプローブと第２のプローブとを連結することで、標的核酸中に存在する変異構成要素を含む特定部分配列を選択的にかつ網羅的に抽出した連結分子を得ることができる。すなわち、第１のプローブと第２のプローブとを用いることで選択性が高まる。一方、第１のプローブにも第２のプローブにも必要に応じて検出対象変異に近接する５’側の他の変異及び／又は３’側の他の変異をそれぞれ構成する変異構成要素の種類に応じた組み合わせで検出対象変異の変異構成要素以外の他の変異についてバリエーションあるクエリ配列を準備することで、他の変異構成要素に多型や変異がある場合であっても検出対象変異の変異構成要素を有する特定部分配列をもれなく抽出した連結分子を得ることができる。
【００６１】
また、連結分子には、第１のプローブに由来する識別情報用タグ配列と第２のプローブに由来する検出情報用タグ配列とを備えている。これらの２種類のタグ配列によれば、変異構成要素を識別して固相担体上に固定化されたキャプチャープローブとのハイブリダイゼーションによる検出が可能となる。なお、ハイスループット性を重視する場合には、識別情報として標識物質関連配列情報を用い、検出情報としてキャプチャープローブ関連検出情報を用いることができる。また、検出精度や変異率の定量には、識別情報として、キャプチャープローブ関連情報を用い、検出情報としてキャプチャープローブ関連検出情報を用いることができる。
【００６２】
なお、上記第１の接触工程及び本連結工程は、特に連結工程を酵素反応を用いて行う場合など、前記第１の接触工程は、連結工程に先立つハイブリダイゼーション工程として、本連結工程と連続若しくは実質的に一つの工程（エンコード工程ともいう。）として実施することができる。
【００６３】
第１のプローブと第２のプローブとを連結した連結分子は、それのみを回収することなく、次工程へと移行することができる。また、標的核酸とともに適当な方法で回収することができ、例えば、カラム等精製器具等によって連結分子を回収してもよい。また、後段の標識工程に先立って、標的核酸から連結分子を解離させる。解離は、例えば、化学的変性及び熱的変性を含む変性処理によって達成することができる。たとえば、化学的変性によって連結されたオリゴヌクレオチドを解離させる場合には、アルカリ変性などの当業者に周知の処理を行えばよい。熱的変性により連結オリゴヌクレオチドを解離させる場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、当業者であれば、適切な解離方法を選択することができる。
【００６４】
（標識工程）
標記工程は、連結分子が備える識別情報又は検出情報としての標識物質関連配列情報を利用して連結分子を単一の又は２種類以上の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する工程である。
【００６５】
標識工程は、標識物質関連配列情報を用いて標識物質で標識する公知の方法を採用して実施することができる。好ましくは、ＰＣＲ増幅反応を利用する。プライマーは採用するＰＣＲ手法に応じて適宜設計することができる。このとき、通常のＰＣＲによる増幅を行ってもよいし、1本鎖の増幅産物が得られる増幅方法として、アシンメトリックＰＣＲによる増幅を行ってもよい。アシメトリックＰＣＲを用いる場合には、用いるプライマーにより、標識前と同一配列を維持した標識済み連結分子を得ることもできるし、標識前の配列に対して相補的な配列に変換した標識済み連結分子を得ることもできる。いずれにしても、最終的に得られる産物において所定のキャプチャープローブに対してハイブリダイズ可能な程度に相補的なキャプチャープローブ関連配列情報を備えているようにする。
【００６６】
標識物質としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第２成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５５５、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ６４７等の蛍光標識物質を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビイジンＨＰＲとを組み合わせて基質による処理等による発色による検出を用いてもよい。
【００６７】
後段の第２の接触工程に先だって、増幅により標識物質を付与した標識済み連結分子分離し、１本鎖としておくことが好ましい。分離は、ビオチンで被覆した磁気ビーズ等の固相担体を用いること等の公知の方法を採用することができ、１本鎖化は、上述した化学的変性又は熱的変性を施す手法等を採用できる。
【００６８】
（第２の接触工程）
第２の接触工程は、標識済み連結分子中の識別情報又は検出情報としてのキャプチャープローブ関連配列情報（−）に相補的なキャプチャー配列を有する２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。この工程によれば、標識済み連結分子中のキャプチャープローブ関連配列（−）がキャプチャープローブ中のキャプチャー配列と一定条件下において選択的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし固相担体上の所定のキャプチャープローブにおいて二重鎖を形成する。第１の接触工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
（キャプチャープローブが固定化された固相担体）
第２の接触工程では、２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体を用いることができる。こうした固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のキャプチャープローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のキャプチャープローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよい。
【００７０】
また、好ましい固相担体は、２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである。例えば、こうしたアレイを用いて、このキャプチャープローブの順序に沿って、各標的核酸に対応する２種類以上のキャプチャープローブを割り当てることで、キャプチャー配列の融解温度の差に由来するハイブリダイゼーションのバラツキを抑制して、精度よく標的核酸中の変異構成要素を含む特定部分配列を検出することができる。好ましいアレイの一例を図３に示す。
【００７１】
第２の接触工程で用いる固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャーが互いに隣接する配置状態を備えるアレイであることが好ましい。これらが隣接していることにより、アレイ上におけるハイブリダイゼーションのキャプチャープローブの固定化位置に由来するバラツキを抑制して、精度よく変異構成要素を含む標的核酸中の特定部分配列を検出することができる。
【００７２】
さらに好ましい固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差（絶対値）が５℃以下好ましくは０．２℃以下となるように配置されているアレイである。こうしたアレイを用いることで、アレイ上でキャプチャープローブの固定化位置及びキャプチャープローブの融解温度の差に基づくハイブリダイゼーションのバラツキを抑制できる。典型的には、多数のキャプチャープローブを融解温度に基づく順序で配列したとき連続して配列されているキャプチャープローブを一つの標的核酸の特定部分配列を検出するための２種類以上のキャプチャープローブとして採用すればよい。
【００７３】
固相担体に固定化される複数のキャプチャープローブは、それぞれ配列番号：１〜配列番号：１００から選択されるキャプチャー配列を有することができる。なお、これらの塩基配列は既に説明したように、一定条件で設計された正規直交化配列である。
【００７４】
キャプチャープローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。キャプチャープローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくはキャプチャープローブ間において同一塩基長で同一配列とする。
【００７５】
（シグナル強度情報取得工程）
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の固相担体上の標識物質に基づく標的核酸についてのシグナル強度情報を取得する工程である。本件シグナル強度情報取得工程によれば、標識済み連結分子の識別情報又は検出情報としてのキャプチャープローブ配列情報（−）がキャプチャープローブとハイブリダイズすることで当該キャプチャープローブに関連付けされた状態で所定の標識物質に基づきシグナル強度情報を得ることができる。
【００７６】
こうしたキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報は、標的核酸中に存在する変異構成要素の数だけ得ることができる。すなわち、変異要素酵素が異なる標識物質で識別され標識されていても、変異構成要素が異なるキャプチャープローブで識別され同じ標識物質で検出されていても同様である。また、異なる標識物質で標識された標識済み連結分子が一つのキャプチャープローブにハイブリダイズしても同様である。
【００７７】
標的核酸中の変異構成要素は、所定の標識物質及び所定のキャプチャープローブに予め関連付けされているので、所定の標識物質の所定のキャプチャープローブの位置で検出することにより、所定のキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報を取得することで、標的核酸中の特定部分配列の有無やその量等を定量することができる。
【００７８】
シグナル強度情報取得工程は、用いた固相担体の形態や標識物質の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、固相担体からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。固相担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。
【００７９】
（検出工程）
検出工程は、識別情報及び検出情報に基づいて所定の標識物質及び所定のキャプチャープローブに関連付けられた変異構成要素についてのシグナル強度情報に基づいて、変異構成要素の有無や比率等を検出する工程である。すなわち、変異の有無、多型のタイプ及び変異率を検出することができる。本発明方法によれば、検出対象変異の変異構成要素に近接して他の変異があっても、確実に検出対象変異を検出することができる。他の変異に基づくバリエーションを採用しつつも検出対象の変異構成要素固有の識別情報及び検出情報を維持することで、こうした確実な検出が可能となっている。
【００８０】
標的核酸中の多型又は変異を検出するには、例えば、一つの変異を構成する変異構成要素を異なる標識物質で識別し、共通のキャプチャープローブで検出した場合には、共通の一つのキャプチャープローブから検出される変異構成要素毎、すなわち、標識物質毎のシグナル強度をプロットし、その分布により多型のタイプ（メジャーホモ、マイナーホモ及びヘテロ）を検出することができる。この検出工程によれば、特に、ＳＮＰｓを効率的にハイスループットで検出するのに適している。
【００８１】
また、一つの変異を構成する変異構成要素を異なるキャプチャープローブで識別し、同一標識物質で異なるキャプチャープローブで検出した場合には、異なるキャプチャープローブから検出される同一標識物質によるシグナル強度の比に基づいて、検出しようとする多型又は変異の有無を検出する工程としてもよい。この検出工程によれば、上記のように、本検出方法によれば、一つの多型や変異に対応する各キャプチャープローブ間の単なるシグナル強度の比に基づいても多型の有無（タイプ）や変異の有無を精度よく検出することができる。
【００８２】
さらに、２種以上のキャプチャープローブに対応して得られる一つのシグナル強度に対する２種以上のキャプチャープローブに対応して得られる全てのシグナル強度の和の割合に基づいて、前記一つの標的核酸中の前記多型のタイプ判別又は前記変異の比率を求めるようにしてもよい。すなわち、式：一つの特定部分配列に対応するキャプチャープローブに関して得られるシグナル強度／（標的核酸に存在する可能性のある変異構成要素にそれぞれ対応する２種類以上のキャプチャープローブに関して得られるシグナル強度の和）を用いることで、標的核酸中の前記一つの変異の変異構成要素の存在比率を求めることができる。この存在比率により、多型の有無及びタイプ並びに変異の有無及び変異率を得ることができる。こうした検出工程によれば、精度よく変異のタイプや変異率を求めることができる。しかも、一つの標的核酸中の存在可能性のある変異構成要素が３種類以上であっても、その数に応じて識別情報用タグ配列を備える第１のプローブを設定すれば、容易に同時にこれらの特定部分配列を検出しその比率を定量できる。
【００８３】
また、必要に応じて、標識物質に基づく誤差を補正するために、固相担体上に準備されたコントロールキャプチャープローブに対して相補的な補正用のオリゴヌクレオチドであって異なる標識物質を備える参照用オリゴヌクレオチドを１種又は複数種の同一濃度で供給して、一点補正又は各標識物質毎に検量線を作成してもよい。
【００８４】
なお、補正にあたっては、標的核酸の識別及び検出に用いたのと同様の標識物質とキャプチャープローブとの関係を選択すればよい。例えば、標的核酸につき、一つのコントロールキャプチャープローブに異なる標識物質を備える標識済み連結分子をハイブリダイズさせるときには、同様の形態で補正を行うことが好ましい。以下の補正用オリゴヌクレオチド及び参照用オリゴヌクレオチドの使用にあたっても同様とする。
【００８５】
さらに、遺伝子変異を検出及び変異率を定量するときには、例えば、標的核酸に替えて準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率を備える１種又は２種以上の参照用オリゴヌクレオチドにつき、前記第１の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第２の接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することができる。好ましくは、２種類以上の前記参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づいて検量線を作製し、この検量線を利用して試料中の標的核酸中の多型や変異などを検出し変異率を定量することができる。検量線を用いることで精度の高い検出及び定量が可能となる。なお、参照用シグナル強度情報の取得及び検量線の作製は予め行っておいてもよいし、標的核酸の検出時に同時に行ってもよい。
【００８６】
また、標的核酸中の変異構成要素を異なるキャプチャープローブで検出する場合、キャプチャープローブは融解温度が近いものを採用しているものの融解温度及びその他の事情によりキャプチャープローブ間におけるハイブリダイズ量にバイアスが生じる可能性があるが、以下のように各工程を実施することでこれを抑制又は回避することができる。
【００８７】
例えば、第２の接触工程で、標識済み連結分子とともに、第１のプローブローブの各識別情報用タグ配列（−）と標的核酸について用いたのとは異なる標識物質とを備え相互に同一濃度で準備した２種類以上の補正用オリゴヌクレオチドとを、固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させるようにし、シグナル強度情報取得工程で標的核酸についてのシグナル強度情報を取得する。同時に、補正用オリゴヌクレオチドについての他の標識物質に基づく補正用シグナル強度情報を取得し、検出工程で、補正用シグナル強度情報を利用するようにしてもよい。こうした補正で、他の標識物質を同一濃度で用いたとき、キャプチャープローブ間で得られたシグナル強度に差が生じた場合には、そのようなシグナル強度の差が連結分子にも存在するとして補正する。こうした補正用シグナル強度情報を利用した補正は、多型の有無（タイプ）並びに変異の有無及び変異率のいずれを得る場合にも適用できるとともに、既に説明した参照用シグナル強度情報に基づく補正と併用することができる。
【００８８】
なお、補正に関して用いる参照用オリゴヌクレオチド及び補正用オリゴヌクレオチドは、必ずしも1本鎖で準備される必要はなく、２本鎖であってもよい。
【００８９】
（標的核酸中の近接する２種類以上の変異を検出する方法）
本発明の検出方法は、近接する他の変異に関わらず検出対象たる変異を検出できることから、標的核酸中の近接する１種類又は２種類以上の他の変異を検出するのに適している。変異が近接するというとき、既に説明したように、検出対象変異と他の変異（１塩基）との間の塩基数が３０塩基以下であることが好ましい。
【００９０】
他の変異を検出するには、既に説明した検出対象たる変異と同様にして第１のプローブ及び第２のプローブを準備すればよい。近接する他の変異を新たな検出対象とするとき、既に説明した検出対象変異は、新たな検出対象からみて他の変異に相当することになる。
【００９１】
近接する２種類以上の変異を検出対象とするとき、それぞれの変異の変異構成要素を識別し検出するのに用いる識別情報及び検出情報は、それぞれ個別に設定することができる。例えば、１つの変異につき、識別情報としてキャプチャープローブ関連配列情報を用い、検出情報として標識物質関連配列情報を用い、他の変異についても、同様の組み合わせとしてもよい、識別情報として標識物質関連配列情報を用い、検出情報としてキャプチャープローブ関連配列情報を用いてもよい。精度等の向上の観点からは、同時に検出する２種類以上の変異については、同様の組み合わせの識別情報及び検出情報を用いることが好ましい。
【００９２】
どのような組み合わせによるにしろ、プローブの設計にあたっては、標識物質関連配列情報は、変異間で一部又は全部共通化することができ、キャプチャープローブ関連配列情報は、変異毎あるいは変異構成要素毎に異なるものを用いる。例えば、２種類以上の変異について、識別情報として標識物質関連配列情報を用い、検出情報としてキャプチャープローブ関連配列情報を用いるとき、図２に示すように、各変異につき、一部又は全部共通の標識物質を用いるが、異なるキャプチャープローブを用いることになる。また、識別情報としてキャプチャープローブ関連配列情報を用い、検出情報として標識物質関連配列情報を用いるとき、図３に示すように、各変異につき、異なるキャプチャープローブを使用するが、一部又は全部共通する標識を用いることになる。なお、一つの標的核酸中の３種類以上の検出対象変異を検出するのにあたっても同様に識別情報及び検出情報を用いることでそれぞれに必要なプローブを設計することができる。
【００９３】
また、近接する２種類以上の変異を検出対象とするとき、それぞれの変異に対して第１のプローブ及び第２のプローブを準備する。これらのプローブは、標的核酸の二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖うち一方をターゲットとしてもよいが、一部をセンス鎖をターゲットとし、他の一部をアンチセンス鎖をターゲットとしてもよい。２種類以上の変異を検出対象とするときには、少なくとも１種類の変異について、他の変異と異なる鎖をターゲットとするのが好ましい。近接する２つの変異について、一方の変異につき、センス鎖をターゲットとしてプローブセットを準備し、他方の変異につき、アンチセンス鎖をターゲットとしてプローブセットを準備することで、多種類のプローブを一つの鎖に対してハイブリダイズさせる際の問題を回避又は抑制できる。より好ましくは、２種類以上の変異中、好ましくはより近接する２種類の変異について、標的核酸の異なる鎖をターゲットとして第１及び第２のプローブを準備する。
【００９４】
こうした標識物質関連配列情報及びキャプチャープローブ関連配列情報の構成によれば、２種類以上の変異について得られる連結分子の構成が、標識工程、第２の接触工程、シグナル強度情報取得工程及び検出工程の実施を妨げることはなく、２種類以上の変異につきこれらの工程を同時に実施することができる。
【００９５】
また、２種類以上の変異を検出対象とするとき、効率性の観点からは、これらの変異につき準備した全てのプローブを用いて同時に第１の接触工程及び連結工程を実施することが好ましいが、独立して第１の接触工程及び連結工程を実施してもよい。最も好ましくは、全ての工程を同時に実施することが好ましい。
【００９６】
（プローブセット）
本発明のプローブセットは、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットである。本発明のプローブセットは、既に説明した２種類以上の第１のプローブと１種又は２種類以上の第２のプローブとを含んでいる。こうしたプローブを用いることで、検出対象変異に近接して未検出の他の変異（変異自体は既知）があるときであっても、これらの他の変異に関わらず検出対象変異を確実に検出することができる。このプローブセットは、標的核酸中の近接する他の変異を検出対象変異とする第１のプローブ及び第２のプローブを含めることもできる。こうしたプローブセットは、一つの標的核酸中の２種類以上の近接する変異を検出する（好ましくは同時に）のに用いることができる。２種類以上の変異を対象とするとき、異なる変異を対象とするプローブセットは、標的核酸の同一の鎖を異なる鎖をターゲットとしていてもよい。
【００９７】
本発明のプローブセットは、既に説明したキャプチャープローブが固定化されたアレイなどの固相担体とキット化されていてもよい。固相担体には、第１のプローブ又は第２のプローブに含まれるキャプチャープローブ関連配列情報を介して関連付けられたキャプチャープローブを予め固定化されている。
【００９８】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。  以下の実施例では、本発明の検出方法による遺伝子変異（ＳＮＰ）の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（１）変異遺伝子検出用ＤＮＡマイクロアレイの作製
（２）サンプル遺伝子の増幅
（３）ハイブリダイズ及び連結（エンコード反応）
（４）ラベル化反応
（５）ＤＮＡマイクロアレイを用いた検出
（６）データ解析
【実施例１】
【００９９】
（１）遺伝子変異（ＳＮＰ）検出用ＤＮＡマイクロアレイの作製
東洋鋼鈑社製ｇｅｎｅ
ｓｌｉｄｅガラス基板に、５’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液をキャプチャープローブとして、日本ガイシ株式会社にてＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標である）スポッターを用いてスポットした。表１に示すように、使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary
Table1記載のD1_1からD1_100のうちＴｍが高い順に、D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41,の５種とした。スポットの後、８０℃、１時間のベークを行った。なお、これらのＴｍは、Ｖｉｓｕａｌ
ＯＭＰによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ
Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。
【表１】
0005165936.tif 000002
【０１００】
さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴDNAの固定化を行った。すなわち、2×SSC/0.2％SDSで１５分洗浄後、95℃の 2×SSC/0.2％SDSで５分洗浄し、その後、滅菌水で洗浄（10回上下振とう）を３回繰り返した。その後、遠心（1000rpm×3分)により脱水した。
【実施例２】
【０１０１】
（２）遺伝子変異を有する標的核酸の調製と増幅
検出対象とする遺伝子変異を含む塩基配列は、以下の表２に示す変異の周辺配列である１５０ｂｐ程度とし、これらの塩基配列からなる人工遺伝子を標的核酸とした。合計４組の標的核酸を合成した。
【表２】
0005165936.tif 000003
【０１０２】
次に、これらのサンプルを以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＴａＫａＲａ
Ｂｉｏ社のＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（カタログ＃ＲＲ００１Ｂ）を使用した。サーマルサイクラーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。なお、用いたＰＣＲプライマーについてはＴｍ＝５８．９０±０．７５℃の範囲となるよう設計を行った。各プライマー配列を表３に示す。なお、Ｔｍは、日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo
Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）を利用して以下の式に基づいて算出した。
Ｔｍ＝（（ΔＨ＊１０００／（ΔＳ＋４１．３））−２７３．１５−２１．５９７１）（ただし、塩濃度：０．０５Ｍ、プライマー濃度：２５０ｐｍｏｌであり、ΔＳはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(cal/mol・K)を表し、ΔＨはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(kcal/mol)を表す。）
【表３】
0005165936.tif 000004
【０１０３】
まず、以下に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。なお、サンプルＤＮＡは、ＳＮＰのタイプごとに、メジャー：マイナー比を１：０（メジャーホモ）、０．５：０．５（ヘテロ）及び０：１（マイナーホモ）の３通りとした。
（試薬調製）
プライマーミックス：F,R混合(20 μM, each) ０．５μｌ
Ex Taq バッファ (10×)             1.0μｌ
Ex Taq ポリメラーゼ(5 Unit/μｌ)   0.1μｌ
dNTP mix （2.5 nM）                0.8μｌ
dH2O                               7.1μｌ
小計                               9.5μｌ
サンプルDNA(10ng/μｌ)             0.5μｌ
合計                              10.0μｌ
【０１０４】
次に、サーマルサイクル反応（９４℃で３０秒後；９４℃で４０秒、６６℃で４０秒、７２℃で２分を４０サイクル；その後４℃に下げる）を行った。そして、個々に増幅した産物を各３．０μｌずつ（計４変異種）を変異遺伝子割合ごとにチューブに混ぜ、ＰＣＲ産物とした。結果として、ＳＮＰの各タイプ（メジャーホモ、ヘテロ及びマイナーホモ）につき５サンプルのＰＣＲ産物を調製した。
【実施例３】
【０１０５】
（３）エンコード反応
実施例２で得たＰＣＲ産物についてのエンコード反応を以下のようにして行った。エンコード反応にはNew England Biolabs社のTaq DNA Ligase(Catalog
# M0208S)を使用した。加熱にはサーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、サンプルＤＮＡの５’側に相補的なクエリ配列（検出塩基を含む）と識別情報用タグ配列とを備える５’クエリプローブ（本発明方法における第１のプローブ）の配列を表４に示す。５’クエリプローブは、その５’側に標識物質を付加するための識別情報用タグ配列を備えており、その３’側にクエリ配列を備えている。また、サンプルＤＮＡの３’側に相補的なクエリ配列（検出塩基を含まない）と検出情報用タグ配列とを備える３’クエリプローブ（本発明方法における第２のプローブ）の配列を表５に示す。３’クエリプローブは、その５'側に５’クエリプローブのクエリ配列に隣接するクエリ配列を有し、３’側に表１に示すキャプチャープローブ配列と相同である検出情報用タグ配列を有している。なお、３’クエリプローブの５’末端はリン酸化されている。
【表４】
0005165936.tif 000005
【表５】
0005165936.tif 000006
【０１０６】
エンコード反応では、まず、以下の試薬を調製した。試薬は、実施例２で調製した各ＳＮＰタイプ別に３種類調製した（各５サンプル）。次に、加熱を行うことでエンコード反応を行った。エンコード反応では、９５℃で５分、５０℃で１分及び５８℃で６０分加熱し、その後１０℃に下げた。最終的に１５サンプルの５種類のライゲーション産物を得た。
（試薬調製）
５’クエリプローブ２種/３’クエリプローブＭｉｘ（2.5μM,each）
0.300μｌ
Taq DNA リガーゼバッファ (10×)                    1.500μｌ
dH2O                                               1.075μｌ
Taq DNA リガーゼ(40 Units/μｌ)                    0.125μｌ
小計                                               3.000μｌ
ＰＣＲ産物(変異遺伝子割合ごとに調製)              12.000μｌ
合計                                             15.000μｌ
【実施例４】
【０１０７】
（４）ラベル化反応
実施例３で得たライゲーション産物のラベル化反応を以下のとおり行った。ラベル化反応には、ＴａＫａＲａ
Ｂｉｏ社のＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＲＲ００１Ｂ）を使用した。サーマルサイクラーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を使用した。ラベル化にはアシメトリーＰＣＲを用い、表１に示す配列と同一配列の各種Ｄ１プライマーと、識別情報用タグ配列に相補的であり、５’側がＡｌｅｘａ５５５又はＡｌｅｘａ６４７で標識されたプライマーとを用いた（表６）。
【表６】
0005165936.tif 000007
【０１０８】
ラベル化反応は、まず、以下の試薬をＳＮＰタイプあたり５種類のライゲーション産物につき調製した。次いで、調製した試薬につきサーマルサイクル反応を行った。すなわち、９５℃で１分後；９５℃で３０秒、５５℃で６分、７２℃で３０秒を３０サイクル行い；その後１０℃に下げた。３つの変異種あたり５種類のラベル化済み産物を得た。
【０１０９】
（試薬調製）
D1_プライマーMix (50 μM, each)   0.12μｌ
Alexa555-ED-1(200M)               0.24μｌ
Alexa647-ED-2(200M)               0.24μｌ
Ex Taqバッファ (10×)             1.20μｌ
dNTP ix (2.5 nM)                  0.96μｌ
Ex aq リメラーゼ(5 Unit/μｌ)     0.12μｌ
ミリQ水                          8.12μｌ
小計                             11.00μｌ
ライゲーション産物                1.00μｌ
合計                             12.00μｌ
【実施例５】
【０１１０】
（5）DNAマイクロアレイを用いた検出
ラベル化済み産物を用いたＤＮＡマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。
【０１１１】
（ハイブリダイズ用標識サンプル溶液の調製）
まず、ハイブリダイズ補正用液及びハイブリダイズ用液を以下の組成で調製した。
【０１１２】
（ハイブリダイズ用標識サンプル溶液の組成）
ハイブリダイズ補正用液             1.5μｌ
ハイブリダイズ用液                 9.0μｌ
小計                              10.5μｌ
ラベル化済み産物                   7.5μｌ
合計                              18.0μｌ
【０１１３】
（ハイブリダイズ参照用液組成（2.5nM, each））
Alexa555-rD1_41(100nM)              10μｌ
Alexa647-rD1_71(100nM)              10μｌ
TE(ｐH8.0)                         380μｌ
400μｌ
【０１１４】
なお、ハイブリダイズ参照用液に使用したAlexa555及び647標識オリゴDNAは、表1のキャプチャープローブ配列（D1_41）に相補な配列の5’末端にそれぞれAlexa555及び647で標識したものである。
【０１１５】
（ハイブリダイズ用液組成（×２））
20×SSC                             2.0mｌ
10％SDS                              0.8ml
100％ Formamide                     12.0ml
100
mM EDTA                          0.8ml
ミリQ水                           24.4mｌ
合計                               40.0mｌ
【０１１６】
（ハイブリダイズ）
次いで、調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱した後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N）を使用し80℃で1分加熱した。上記サンプル溶液を各９μｌずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーモブロックスライド（エッペンドルフ社製）を使用し、３７℃で６０分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。
【０１１７】
（洗浄）
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、５分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、１分間上下振とうし、２０００ｒｐｍで１分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。
（洗浄液の組成）
ミリ Q水                          188.0mｌ
20×SSC                             10.0ml
10％SDS                             2.0mｌ
合計                              200.0mｌ
【０１１８】
（スキャナーによる蛍光検出）
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。
【実施例６】
【０１１９】
（６）データ解析
各ＳＮＰについて数値化した結果のうちＳＮＰ３の結果を表７にＳＮＰ４の結果を表８に示す。また、表７及び表８の結果に基づいて横軸をＡｌｅｘａ５５５のシグナル強度とし、縦軸にＡｌｅｘａ６４７のシグナル強度をプロットした。これらの結果を、図５及び図６に示す。
【表７】
0005165936.tif 000008
【表８】
0005165936.tif 000009
【０１２０】
表７及び表８並びに図５及び図６に示すように、ＳＮＰ３及びＳＮＰ４の各変異に着目すると、近接する変異があっても、変異のタイプ（メジャーホモ、ヘテロ、マイナーホモ）を正確に検出することができることがわかった。また、二つの変異であるＳＮＰ３及びＳＮＰ４に着目すると、変異が近接していても、各ＳＮＰにつき、全てのタイプを正確に検出できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明の検出方法の一例の概要を模式的に示す図である。
【図２】本発明に用いる第１のプローブ及び第２のプローブの一例を説明する図である。
【図３】本発明に用いる第１のプローブ及び第２のプローブの他の一例を説明する図である。
【図４】本発明において用いる識別用タグ配列及びキャプチャー配列の一例を示す図である。
【図５】実施例６で作成したプロット（ＳＮＰ３）を示す図である。
【図６】実施例６で作成したプロット（ＳＮＰ４）を示す図である。
【図７】従来の変異検出方法の一例を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号１〜１０５：キャプチャープローブ、配列番号１０６〜１０９:人工合成遺伝子、配列番号１１０〜１１３：プライマー、配列番号１１４〜１２３：５’クエリプローブ、配列番号１２４〜１２９：３’クエリプローブ、配列番号１３０、１３１：プライマー
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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