(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｃ末端付近にシステイン残基を有する天然ヒトエリスロポエチン分子、および
（ｂ）ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントであって、前記ＦｃフラグメントのＮ末端が前記エリスロポエチン分子のＣ末端に直接結合され、
前記Ｆｃフラグメントは、前記エリスロポエチン分子に最も近い前記ヒンジ領域のシステイン残基が非システイン残基と置換された突然変異を有する以外は天然のＦｃフラグメントと同じであり、前記ヒンジ領域の最初のシステインが前記エリスロポエチン分子の前記システイン残基から少なくとも１７個のアミノ酸だけ離れている、ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを有し、天然または組換えの未変性ヒトエリスロポエチンに比べて長い生体内半減期を有する融合タンパク質であって、
配列番号２のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１の核酸配列を有する組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を各々が有する一対のポリペプチドを含む二量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はヒトエリスロポエチン融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、造血成長因子ファミリーのメンバーであり、血中酸素利用率の低下による組織低酸素症に応じて主として成人の腎臓および胎児の肝臓で合成される［１］。ＥＰＯの主な機能は、骨髄中の特定の赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞および前駆物質に直接作用して、ヘモグロビンおよび成熟ＲＢＣの合成を刺激することである。ＥＰＯはＲＢＣの増殖、分化および成熟も制御する。腎臓の機能不全に関連する貧血、癌および他の病理学的状態を治療するために天然ＥＰＯのアミノ酸配列を有する組換えＥＰＯが生産および承認されている［２］。その赤血球形成の特性に加えて、最近の研究によると、ＥＰＯがニューロン等の非骨髄細胞にも作用することが報告されており［３］、これは中枢神経系（ＣＮＳ）および他の器官／系におけるＥＰＯの他の生理学的／病理学的機能の可能性を示唆している。ＥＰＯ受容体が種々の器官で見出されたため、ＥＰＯは、抗アポトーシス物質として働く等、多くの生物学的効果を有する可能性がある。
【０００３】
ヒトＥＰＯは３０．４キロダルトンの分子量を有する糖タンパク質である。炭水化物はその合計質量の約３９％を占める。ＥＰＯ遺伝子は７ｑ１１−２２染色体上に位置し、５つのエクソンと４つのイントロンを備えた５．４ｋｂの領域に及ぶ［４］。ＥＰＯの前駆物質は１９３個のアミノ酸から成る。翻訳後修飾によるリーダー配列と最後のアミノ酸Ａｒｇとの開裂により、１６５個のアミノ酸を有する成熟ＥＰＯが生じる。糖鎖形成は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３の３つのＮ結合部位と、Ｓｅｒ１２６の１つのＯ結合部位であるが、ＥＰＯの生合成、三次構造および生体内生理活性に重大な役割を果たしている［５］。エリスロポエチン受容体すなわち７２−７８キロダルトンの分子量を有する糖鎖付加されリン酸化された膜貫通ポリペプチドに結合することにより機能する。この結合は、受容体のホモダイマー化を引き起こし、これがＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５系、Ｇ−タンパク質、カルシウムチャネルおよびキナーゼといういくつかのシグナル伝達経路の活性化につながる。ＥＰＯタンパク質の２つの分子は、最適の受容体活性化を達成するためには１つの受容体分子に同時に結合する必要がある［６］。
【０００４】
ヒト治療のために認可された最初の造血生長因子として、組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は慢性腎不全、癌（主として化学療法に関連する貧血）、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、外科手術、骨髄移植および骨髄異形成症候群等に起因する貧血の治療に使用されてきた。面白いことに、最近の研究によると、ｒＨｕＥＰＯは非血液系の機能を有することが観察され、脳虚血、頭部外傷、炎症性疾患および神経変性疾患用の神経保護剤として使用される可能性が示されている。
【０００５】
現在、３種類のｒＨｕＥＰＯまたはｒＨｕＥＰＯのアナログすなわちｒＨｕＥＰＯアルファ、ｒＨｕＥＰＯベータおよびダルベポエチンアルファが市販されている［８］。これら３つの組換えタンパク質は同じエリスロポエチン受容体に結合するが、構造、糖鎖形成の程度、受容体結合能および生体内での代謝は異なっている。１９８０年代にｒＨｕＥＰＯアルファを初めて導入して以来、臨床医は同薬剤の頻繁な投薬／注射の必要性を重大な欠点と素早く認めた。ｒ静脈内または皮下に投与したＨｕＥＰＯアルファとｒＨｕＥＰＯベータの平均生体内半減期はそれぞれわずか８．５時間と１７時間である［９，１０］。したがって、患者は毎日、一週間に２回、または一週間に３回の注射スケジュールを必要とし、これは患者と医療提供者の両方に負担を強いる。したがって、より長い生体内半減
期および／または増強された赤血球形成活性を有する組換えＥＰＯアナログを開発する必要があった。
【０００６】
先行技術では、その生体内代謝を遅延させるかまたはその治療的性質を改善するために、未変性ＥＰＯタンパク質の構造を遺伝子改変するか化学修飾する試みが行われていた。例えば、ＥＰＯ分子中のシアル酸含有炭水化物の量と、その生体内代謝および機能的活性との間には直接相関があるように見える。したがって、ＥＰＯ分子の炭水化物含有量を増加させると、半減期が長くなり、生体内活性も増強された［１１，１２］。Ａｍｇｅｎは、ｒＨｕＥＰＯよりも２個多い５個のＮ結合炭水化物鎖を含むようｒＨｕＥＰＯアナログのダルベポエチンアルファを設計した。ダルベポエチンアルファも新規な赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）として知られており、Ａｒａｎｅｓｐ（商標）として販売されている。ダルベポエチンアルファは５つの位置（Ａｌａ３０Ａｓｎ、Ｈｉｓ３２Ｔｈｒ、Ｐｒｏ８７Ｖａｌ、Ｔｒｐ８８Ａｓｎ、Ｐｒｏ９０Ｔｈｒ）で未変性ヒトＥＰＯと異なり、これによりアスパラギン残基位置３０および８８で２つの追加のＮ結合オリゴ糖を取り付けることが可能となっている。ダルベポエチンアルファは未変性ＥＰＯと同じようにＥＰＯ受容体に結合して、ＪＡＫ−２キナーゼおよび同じ細胞内分子Ｒａｓ／ＭＡＰ−ｋ、Ｐ１３−ｋおよびＳＴＡＴ−５によるチロシンリン酸化を伴う細胞内シグナル伝達を引き起こす。炭水化物含有量の増加により、動物とヒトの両方でのダルベポエチンアルファの半減期はｒＨｕＥＰＯ−アルファの半減期のほぼ３倍の長さになっている（２５．３時間対８．５時間）［９］。ダルベポエチンアルファ（Ａｒａｎｅｓｐ（商標））は、さらに天然または組換えヒトＥＰＯに比べて生体内で増強された生理活性を示すと思われ［１３］、第二代のｒＨｕＥＰＯ薬としてＦＤＡによって認可された。この薬剤はｒＨｕＥＰＯの１週間で２〜３回の注射と同一の治療効果を達成するのに、一週間に１回の投与しか必要としない［１０，１４，１５］。
【０００７】
ＥＰＯの半減期を拡張する他の試みは、ポリエチレングリコールやその同等物との化学共役（ＰＥＧ化）によりＥＰＯタンパク質の分子量を増加させることに焦点が当てられていた。ＰＥＧ化ははるかに大きな分子量を有し、循環からの除去が防がれるためより長い血漿半減期を有する［１６］。しかしながら、ＰＥＧ化はＥＰＯ部分の予期せぬ機能の変化および特異性の変化を生じさせる可能性がある。ＥＰＯ分子を担体タンパク質（ヒトアルブミン）へ結合させるか、またはリンクペプチド（３から１７個のアミノ酸）の使用によりもしくは化学的架橋試薬により２つの完全ＥＰＯ分子のホモダイマーを形成する等のさらに別の方法によりＥＰＯの分子量を増加させる報告も存在する［１７，１８，１９，２０］。これらの方法はすべて半減期の延長およびＥＰＯ活性の増強のある程度の成功を達成しているが、本願に記載するようにＥＰＯ分子をヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃフラグメントと組み合わせて融合タンパク質とすることは、固有の利点を達成する。
【０００８】
ヒト免疫グロブリンＩｇＧは、ジスルフィド結合により共有結合された４つのポリペプチドから構成されている（軽鎖と重鎖の２つの同一コピー）。パパインによるＩｇＧ分子のタンパク質分解によって、２つのＦＡｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントが生じる。Ｆｃフラグメントは、ジスルフィド結合によって共に結合した２つのポリペプチドから成る。各ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される。Ｆｃフラグメント構造はヒト免疫グロブリンのすべてのサブタイプでほぼ同じである。ＩｇＧはヒト血液中に最も豊富にあるタンパク質の１つであり、ヒト血清中の免疫グロブリンの合計の７０〜７５％を占める。循環でのＩｇＧの半減期は免疫グロブリンの５つすべてのタイプのうち最長であり、２１日に達し得る。
【０００９】
現代の生物工学技術をうまく適用して、サイトカインおよび可溶性受容体等の治療用タンパク質フラグメントとヒトＩｇＧのＦｃフラグメントから成る融合タンパク質が形成された［２１，２２，２３，２４］。これらの融合タンパク質は、それらの生物学的特性お
よび治療特性を保持する間、有意により長い生体内半減期を有する。これまでのところ、Ｆｃフラグメントを含む２つの融合タンパク質がバイオ医薬としての開発に成功しており、慢性関節リウマチおよび慢性尋常性乾癬の治療用にＦＤＡにより認可されている［２５，２６］。
【００１０】
先行技術では、化学的架橋によるかまたはポリペプチドにより結合された２つのＥＰＯ分子からなる二量体が生体内活性の増強および長い半減期を示すことが論証された［１７，１９］。この活性の増強は１つの受容体にＥＰＯ二量体がより効率的に結合するためであり、生体内での半減期の延長は二量体タンパク質のサイズが大きいことによるためであり得る。しかしながら、化学的架橋プロセスは効率的でなく、制御することが難しい。さらに、ＥＰＯの二量体中のリンケージペプチドは、ＥＰＯ分子の三次元構造を変化させる可能性があり、また、ペプチドそのものが生体内での免疫原性反応を刺激する可能性がある。特に腎患者でＥＰＯ置換療法は生涯にわたって続くため、これらの欠点はＥＰＯ二量体の治療可能性を損なう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
有意に長い半減期を有し、生体内での赤血球形成活性が増強されているが、免疫原特性が増加していないＥＰＯアナログが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、免疫グロブリンペプチド部分に結合されたヒトエリスロポエチンペプチド部分を含む組換え融合タンパク質について説明される。該融合タンパク質は、融合タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％相同な配列を有する。融合タンパク質は、天然または組換えの未変性ヒトエリスロポエチンに比べて長い生体内半減期を有する。本発明の１実施形態では、融合タンパク質は未変性ヒトエリスロポエチンよりも少なくとも３倍長い生体内半減期を有する。融合タンパク質はさらに、未変性ヒトエリスロポエチンに比べて増強された赤血球形成の生理活性を示してもよい。本発明の１実施形態では、免疫グロブリンペプチド部分がＩｇＧ１フラグメント等のＦｃフラグメントである。ＦｃフラグメントはＣＨ２領域、ＣＨ３の領域およびヒンジ領域を有する。ＥＰＯペプチド部分はヒンジ領域に直接結合されてもよい。好ましくは、ヒンジ領域は長さが少なくとも９個のアミノ酸である。１実施形態では、ＥＰＯペプチド部分は、そのＣ末端付近にシステイン残基を有し、ヒンジ領域はＥＰＯペプチド部分の最も近くに位置するシステイン残基を有する。好ましくは、これらの２つのシステイン残基は、少なくとも１２個のアミノ酸だけ離れている。１実施形態では、ＥＰＯペプチド部分は、免疫グロブリン部分に直接結合された完全なＥＰＯ分子（すなわちＥＰＯと免疫グロブリン部分の間に外部ペプチドリンカーが介在しない）を有してもよい。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質の複数のユニットを含む多量体タンパク質構築物に関する。例えば、２つの融合タンパク質が、両タンパク質のヒンジ領域がジスルフィド結合によって連結された二量体として組み立てられてもよい。二量体はＩｇＧ分子の一般形状を有し、自由ＥＰＯ分子よりも安定している。
【００１４】
本発明はさらに融合タンパク質をコード化する核酸配列およびアミノ酸配列、形質移入細胞株、および融合タンパク質を生産する方法に関する。本発明はさらに、融合タンパク質を含有する医薬組成物と、例えば治療を必要とする対象の赤血球形成を刺激するために、融合タンパク質および医薬組成物の少なくとも一方を使用する方法とを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図面は、本発明の種々の実施例を示すが、限定的に解釈されることは意図しない。
以下の説明で、本発明のより完全な理解を提供するために特定の詳細を述べるが、本発
明はそのような詳細がなくても実行可能である。別の例では、本発明を不必要に不明瞭にすることを回避するために、周知の要素は図示しないか、詳細な説明を行わないこととした。従って、明細書および図面は限定的な意味ではなく、例示的な意味で捉えられるべきである。
【００１６】
本願は、赤血球形成特性を有する新規な融合タンパク質に関する。本明細書で「ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ」と呼ぶ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃフラグメントに組換えにより結合されたヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）分子を含む。さらに以下に論じるように、融合タンパク質は２つの同一のポリペプチドサブユニットから成る二量体の形をなし得る。図１Ａに概略的に示した実施形態では、各ポリペプチドサブユニットはＮ末端からＣ末端まで、ヒトＥＰＯ分子のポリペプチド配列と、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃフラグメントのヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのポリペプチド配列とから成る。２つのポリペプチドサブユニットは、二量体構造を形成すべくそれぞれのヒンジ領域間のジスルフィド結合によって互いに接続される。このように二量体はＩｇＧ分子と同じ一般的な形をしており、以下に実施例で論じるような自由ＥＰＯ分子よりも良好な安定性を示す。
【００１７】
当業者には明らかなように、インタクトな免疫グロブリンのヒンジ領域は同タンパク質に有効な抗原−抗体結合のための十分な可撓性を与える。同様に本発明では、特にｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質が二量体形式である場合、その可撓性を維持するために同融合タンパク質の設計にヒンジ領域が含まれる。以下に述べるように、これによってｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質のＥＰＯ部分がＥＰＯ受容体に正常に結合し、ＥＰＯの生物学的機能を活性化することが可能となる。ｒＨｕＥＰＯ−ＦＣ融合タンパク質の二量体形式は、２つのＥＰＯ分子を与えることにより、（例えば受容体のクロスリンクにより）ＥＰＯ受容体の最適の活性化を引き起こすことができると考えられている。
【００１８】
以下に述べる実施例で実証するように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質は組換ＤＮＡ技術を使用して合成に成功した。融合タンパク質は、マウス、ラットおよび霊長類の研究で長い生体内半減期と天然組換え未変性ヒトＥＰＯに比べて増強された赤血球形成特性を示すことが判明した。本願で使用する場合、用語「未変性ヒトエリスロポエチン」および「未変性ヒトＥＰＯ」は、修飾していない野生型構造を有するＥＰＯを意味する。当業者には理解されるように、未変性ヒトＥＰＯは天然であってもよいし、組換えにより生産されてもよい（例えばｒＨｕＥＰＯアルファ）。用語「未変性ヒトＥＰＯ」は、ＥＰＯ構造が高度な糖鎖形成によって大幅に修飾されるダルベポエチンアルファのようなｒＨｕＥＰＯアナログは含まない。
【００１９】
本発明のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質の核酸配列は、配列番号１で示される。対応する推定アミノ酸配列は配列番号２で示される。完全ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質は長さ３９９個のアミノ酸である。図１Ｂに示されるように、完全ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＰＯ領域（１６６個のアミノ酸）、ヒンジ領域（１６個のアミノ酸、太字）およびＣＨ２ドメインならびにＣＨ３ドメイン（２１７個のアミノ酸）から成る。２７個のアミノ酸から成るシグナルまたはリーダーペプチド配列も図１Ｂに示される。シグナルペプチドはｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの合成時に開裂する。シグナルまたはリーダーペプチドを有するｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの核酸配列とアミノ酸配列が配列番号３および配列番号４でそれぞれ示される。
【００２０】
図１Ｂおよび配列番号２に最もよく示されているように、ＥＰＯ領域はそのＣ末端付近の１６１番目のアミノ酸にシステイン残基を有する。ヒンジ領域は、図１で枠で囲まれた１７８番目と１８１番目のアミノ酸に２つのシステイン残基を含んでいる。ヒンジ領域システイン残基は、上述したようなホモダイマーのポリペプチドサブユニット間のジスルフ
ィド結合を形成する。さらにヒトＩｇＧ１フラグメントの天然のヒンジ領域も、ヒンジ領域部分の（Ｎ末端から測定して）６番目の残基にシステインを有している。本発明では、ヒンジ領域分の６番目のシステイン残基を非システイン残基で置換した。図１Ｂおよび配列番号２の実施形態では、アミノ酸システインをグリシン（ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの１７２番目のアミノ酸残基、これはヒンジ領域の６番目の残基に相当）により置換した。当業者に明らかだが、ジスルフィド結合の形成を避けるためにこの位置でシステインの代わりに他の非システイン残基を用いることが可能である。
【００２１】
１７２番目の残基でアミノ酸を置換した結果、ヒンジ領域（１７８番目の残基）の第１のシステイン残基は、上記のＥＰＯ領域（１６１番目の残基）のシステイン残基から１７個のアミノ酸だけ離間している。発明者は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃのホモダイマーの組立および／またはＥＰＯ受容体結合を成功させるためのＥＰＯ領域の１６１番目システイン残基とヒンジ領域の第１のシステイン残基の間の最小の間隔は、少なくとも１２個のアミノ酸であると考えている。すなわち、１７２番目の残基がシステイン残基である場合、１６１番目のシステイン残基と１７２番目のシステイン残基との間のように、望ましくないジスルフィド結合が生じる恐れがある。これによりＥＰＯ分子の三次元構造が変化し、生物学的に不活性になるか生物活性が減少し得る。
【００２２】
本発明の１実施形態では、ＥＰＯ領域が融合タンパク質のＦｃフラグメント部分に直接結合される。外部リンカーペプチドの提供を避けることにより、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合ペプチドの好ましい三次元構造が維持されると共に、望ましくない免疫原性反応を引き起こす危険性が最小にされる。Ｆｃフラグメントのヒンジ領域は好ましくは長さが少なくとも９個のアミノ酸であり、好ましくは長さが約１０〜２０個のアミノ酸の範囲にある。
【００２３】
実施例
以下の実施例は発明をより詳しく例証するものであるが、本発明が特定の実施例に制限されるわけではない。
【００２４】
１．ＨｕＥＰＯ−Ｆｃの融合タンパク質をコードする組換えプラスミドｐＣｄＥｐｏ−Ｆｃの構築
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列をコードする完全長ＤＮＡ分子を、以下のオリゴプライマー（QIAGEN社、米国）を使用して重複型ＰＣＲ法により生成した。
【００２５】
【表１】
0005222153.tif 000002
上記プライマーの配列は配列番号５−８でそれぞれ列挙している。
【００２６】
ＥＦ５とＥＦ３にＥｃｏＲ  Ｉ部位とＮｏｔ  Ｉ部位をそれぞれ導入した。哺乳動物細胞におけるＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の最適な発現の場合は、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）もＥＦ５に導入した。ＥＦＬ５とＥＦＬ３は、Ｅｐｏの３’末端のＤＮＡ配列（２３ｂｐ）およびＩｇＧ１ヒンジの５’末端のＤＮＡ配列（２２ｂｐ）から成る
相補的配列である。
【００２７】
最初に、０．６ｋｂのＥＰＯ  ＤＮＡ断片を、完全長のヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡと０．７ｋｂのＦｃフラグメントを含むプラスミドｐ９ＥからプライマーＥＦ５およびＥＦＬ３を用いて、および完全長のヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤからプライマーＥＦ３およびＥＦＬ５を用いて、ＰＣＲ（Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity）
によりそれぞれ増幅した（プラスミドｐ９ＥとｐＤは発明者自身の実験室に由来）。その後、２個のフラグメントを精製し等量で混合した。混合物を鋳型として使用して、１．３ｋｂの完全長ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ  ＤＮＡをプライマーＥＦ５およびＥＦ３により増幅した。精製された１．３ｋｂのフラグメントを、ＥｏｃＲ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ（New England Biolab社、米国）で消化し、次にＥｃｏＲ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで消化した哺乳類発現ベクターｐＣＤ１（図２）に入れてクローニングした。得られた組換えベクターをｐＣｄＥｐｏ−Ｆｃと命名し、ＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列をコードする挿入核酸配列をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。
【００２８】
２．ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ発現細胞株の確立
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）欠乏（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−、ＡＴＣＣ  受託番号ＣＲＬ−９０９６）であるチャイニーズハムスター卵巣細胞は、生物活性物質生産用にＦＤＡにより認可されたものであるが、これをｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ発現用の宿主細胞として使用した。
【００２９】
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞を、リポフェクトアミン（Giblo社、カタログ番号１８２９２
−０３７、米国）を使用して組換えベクターｐＣｄＥｐｏ−Ｆｃで形質移入した。選択クローンの培養物からの上清をＥＰＯ活性を求めるためにＥＬＩＳＡ（Roche社、カタログ
番号１−６９４１７、カナダ）により分析した。陽性クローンをメトトレキサート（ＭＴＸ）の増加圧力下でさらにスクリーニングした。最も高くｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質を発現した１つの細胞株を、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞株として選択し、無血清培地（ＣＤ  ＣＨＯ培地、Gibco社、カタログ番号１０７４３−０２９、米国）に徐々に
適合させた。このｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞株をｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の生産用に使用した。
【００３０】
３．ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の精製
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞を浴びようする無血清培地から採集した上清に含まれるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質分子を、まず、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Amersham社、カタログ番号１７−０４０２−０１、カナダ）により分離した。分離されたタンパク質をHiLoad 16/60 Superdex 200pgカラム（Amersham社、カタログ番
号１７−１０６９−０１、カナダ）にてゲルろ過によりさらに精製した。電気泳動での決定によると、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の純度は９８％よりも高かった。
【００３１】
４．精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質のサイズの決定
まず、精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質のサイズを決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。図３に示されるように、約１８０ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが非還元状態の８％Bis-Trisゲルで見られた。これによりジスルフィド結合の存在とタンパク質の全体のサイズが測定された。このことは大半のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質分子が融合タンパク質の設計から予想される通り二量体型として生産されることを示した。ジスルフィド結合を破壊するためＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を還元状態で行ったところ（１００ｍＭ  ジチオスレイトール、ＤＴＴ）、７５ｋＤａの分子量のバンドだけが同定され、これはＨｕＥＰＯヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３の一つのポリペプチド鎖の推定分子量と一致していた。
【００３２】
質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で決定された糖鎖形成された精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質の正確な分子量は１１１０９９ダルトン（１１１．１ＫＤａ）であった。この分析では、タンパク質の一つのピークだけが観察され、精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質がほぼ１００％純粋であることを示した。精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質のＮ末端の１５個のアミノ酸を、タンパク質配列分析によりＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹと決定した。これは、未変性ヒトＥＰＯポリペプチドの最初の１５個のアミノ酸配列と一致し、精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質がｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列により予想された通りの正しい完全なＥＰＯ分子配列を有することを確認した。
【００３３】
５．正常マウスにおけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの赤血球形成活性の増強
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質が赤血球形成活性を保持していることを確認し、かつｒＨｕＥＰＯおよびダルベポエチン−アルファと比較したｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の効力を決定するためにマウスのインビボ（生体内）実験を行なった。比較のために、本発明で説明する動物実験で使用した３つのＥＰＯ（発明者のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯ（つまり未変性ヒトＥＰＯ）およびダルベポエチン−アルファ）の用量はすべて、モルベースでＥＰＯ分子部分のみの量とした。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質に関すると、ＥＰＯ部分は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ分子全体の分子量の合計アミノ酸の重量に対するＥＰＯのアミノ酸の重量の比（３９９ａａ中の１６６ａａ）によって計算される通り、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ全体の分子量の４１．４％に相当する。従って、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃに関するＥＰＯ量は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の合計量の４１．４％として決定した。
【００３４】
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ（ストック濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ、純度９８．６％、および未変性ヒトｒＨｕＥＰＯ（つまり天然ヒトＥＰＯ構造を有する）（６０００ＩＵ／０．５ｍｌ、Kirin Brewery社、日本  製造）を担体溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ  ヒト血清アルブミン
、５．８ｍｇ／ｍｌ  クエン酸水素ナトリウム、０．０６ｍｇ／ｍｌ  クエン酸および５．８ｍｇ／ｍｌ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５−５．６）で希釈した。ｒＨｕＥＰＯの合計用量をその活性／量の比に従って計算した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、体重１８〜２２ｇ、雄と雌の数は同数、Experiment Animal Center, AMMS 中国から購入）を、
各群６匹になるようランダムにグループ化した。マウスの各群を、１回量の一つの組み合わせ（０．１、０．５、２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｋｇ）、１回の注射ルート（尾静脈への静脈内注射または皮下注射）、および１回の注射スケジュール（一週間に３回または一週間に１回）で処理した。マウスの対照群には等量の担体溶液を注射した。処理は３週間続け、合計観察回数は５週間とした。測定用に末梢血液試料（尾静脈）を、毎週、処理前、４日目、および７日目と５週間採取した。Ｈｂを吸光光度法による指標として測定した。各群のデータから平均±ＳＤ（標準偏差）を計算し、種々の群間でｔ−検定を行なった。
【００３５】
一週間に３回マウスへＥＰＯを投与すると、もしＥＰＯが正常な赤血球活性を有すると仮定すれば、赤血球形成の刺激の飽和を引き起こすと予想される。図４に示されるように、一週間に３回皮下処理したどちらの群でも２．５μｇ／ｋｇの用量でも大幅なＨｂレベルの上昇があった。この実験は、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃがｒＨｕＥＰＯと同程度に有効に生体内赤血球形成活性を示すことを実証した。処理群におけるＨｂレベルの上昇は用量依存的であったが、Ｈｂレベルの上昇の飽和は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃでは１２．５μｇ／ｋｇの用量でマウスに起こり、Ｈｂレベルの同様の上昇の飽和は、ｒＨｕＥＰＯでは６２．５μｇ／ｋｇの用量でのみ達成された。さらに、２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃによって引き起こされたＨｂレベルの上昇は、２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯによって引き起こされるＨｂレベルの上昇よりも大きかった。これらの結果はｒＨｕＥＰＯよりもｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃによる赤血球形成刺激がより強力であることを示唆した。
【００３６】
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの赤血球形成の効力を、注射回数を一週間に１回皮下注射へと減らすことによりさらに調査した。図５に示されるように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ処理した群は１２．５μｇ／ｋｇまたは６２．５μｇ／ｋｇの用量でＨｂレベルの用量依存的上昇を示した。ｒＨｕＥＰＯの１２．５μｇ／ｋｇおよび６２．５μｇ／ｋｇのいずれの用量も、同程度のＨｂレベルの上昇を引き起こしたが、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの６２．５μｇ／ｋｇによるそれよりもはるかに低かった。これはｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃが生体内における赤血球形成活性を増強したことを強く示している。これはおそらく、生体内でのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの半減期が長いことか、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質中の二量体ＥＰＯ分子によるＥＰＯ受容体の結合／活性化が改善されたことか、または両方を組み合わせた効果による。
【００３７】
ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯの同じ用量（１２．５μｇ／ｋｇ）を一週間に３回または一週間１回静脈内投与した場合、すべての処理群でＨｂレベルの上昇が観察された（図６）。しかしながら、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの一週間に１回の静脈内投与は、Ｈｂレベルのより大きくより持続性のある上昇を引き起こし、これは治療終了後も長く続いた。このデータは、天然ＥＰＯタンパク質の構造を有するｒＨｕＥＰＯと比べてｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質では赤血球形成特性が増強されていることを一層支持している。
【００３８】
６．６分の５（５／６）の腎摘出ラットにおけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの赤血球形成活性の増強
正常マウスでの実験は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの生体内における赤血球形成活性の増強を証明した。赤血球形成の刺激におけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの効力をさらに観察するために、５／６の腎摘出により作られた実験的腎性貧血を有するラットにて薬力学的研究を行なった。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの効力を、ｒＨｕＥＰＯおよびダルベポエチン−アルファ（６０μｇ／ｍｌ、ロット番号Ｎ０７９、Kirin Brewery社、日本  製造）のそれと比較した
。
【００３９】
Ｗｉｓｔａｒラット（雄雌同数、体重１６０〜１８０ｇ、Vitalriver Experiment Animal社、中国、北京、ライセンス番号ＳＣＸＫ１１−００−０００８より購入）をこの発明で使用して、２つの工程からなる腎摘出［２７］による腎臓機能不全による貧血モデルを生成した。無菌条件下で２つの別の手術によりラットに全身麻酔して５／６の腎摘出を施した。左腎の２／３を切除した後、ラットを２０日間回復させた。その後、右腎を注意深く切除した。感染を防止するため各手術後に抗生物質を投与した。合計で腎臓組織のうち５／６を最終的に切除した。腎摘出ラットは徐々に腎機能の欠如と貧血を発現した。ラットは腎摘出の５０日後に貧血の安定した状態に入り、次にＥＰＯの投与を開始するためにランダムにグループ化された（一群当たり９匹）。ラットの各群を、１回量の一つの組み合わせ（２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｋｇ）、１回の注射ルート（尾静脈への静脈内注射または皮下注射）、および１回の注射スケジュール（一週間に１回または二週間に１回）で処理した。
ラットの対照群およびモデル群に等量の担体溶液を注射した。処理は４週間続け、合計観察回数は６週間とした。
【００４０】
皮下に一週間に１回投与されたｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃのすべての用量（２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｋｇ）で、ＥＰＯ治療を受けなかったモデル対照群と比較してＨｂレベルの用量依存的上昇が起こった。１２．５および６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯまたはダルベポエチンも、一週間に１回皮下投与されると、Ｈｂレベルの上昇を引き起こした。１２．５または６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで処理したいずれの群でのＨｂレベルの上昇も、１２．５または６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯでそれぞれ処理した群のＨｂレベルの上昇よりも有意に高かった。６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで処理した群のＨｂレベルは、６２．５μｇ／ｋｇのダルベポエチンで処理した群のＨ
ｂレベルよりわずかに高かった。治療を中止した後、６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで処理した群のＨｂレベルの減少は、正常対照およびモデル対照群の両方よりはるかに遅く、Ｈｂレベルは観察の終了（治療後２週間）まで正常対照およびモデル対照群の両方よりも高く維持されたが、これは赤血球形成刺激がより強いか長いかの少なくともいずれかであることを示している（図７に概要）。
【００４１】
二週間に１回皮下注射する処理の場合、１２．５または６２．５μｇ／ｋｇの３つのＥＰＯのみを投与した（図８）。１２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯではモデル対照群と比較してわずかにＨｂレベルが上昇した。また、６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯで処理した群では赤血球形成反応が弱く、正常な対照群と比べてＨｂレベルを正常にすることができなかった。１２．５または６２．５μｇ／ｋｇの用量でのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃまたはダルベポエチンのいずれかの処理により、正常対照群より高いＨｂレベルの有意な上昇が起こったが、これはｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃおよびダルベポエチンのいずれによっても貧血状態が有効に修正されることを示している。同じ用量のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃとダルベポエチンの間には効力の点で有意差は観察されなかった。６２．５μｇ／ｋｇの高用量により、観察終了（処理後２週間）まで赤血球形成の持続的な上昇が生じた。これはｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃおよびダルベポエチンが生体内で長期間持続する赤血球形成刺激特性を示すことを示唆したが、これは臨床上、患者への投与回数の減少に転換することが可能である。
【００４２】
ダルベポエチンは患者のコンプライアンス（薬剤服用順守）を高め、医療提供者の仕事の負担を減らす低頻度注射によって臨床への応用に認可されているが、上記実験データは本明細書で開示したｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃが少なくとも同様の潜在的な利点を有することを強く示している。上述したように、ダルベポエチンは、追加の糖化合物（糖鎖形成の増加）を含むヒトＥＰＯ分子の変異型アナログとして、その三次元構造が変化しているために生体内で免疫発生を引き起こす危険性を増大し得る。ダルベポエチンで治療を受けている患者を長期間観察するだけで、ダルベポエチンの免疫原としての危険に対する決定的な答えが得られるだろう。対照的に、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃは、ＥＰＯ分子部分の修飾がなく、未変性ヒトＥＰＯと同一または非常に類似する炭水化物含有量を有している。発明者の純粋ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質中のシアル酸の量は約１０．０ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌ  ＥＰＯであり、これはｒＨｕＥＰＯの報告されたパラメータと一致していた。ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃのＦｃ部分は、外部アミノ酸／結合用ペプチドがなく、ヒトＩｇＧ１の一般的構造を表わし、理論的に免疫原性反応につながらないであろう。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃは、もし臨床的に認可されれば、現在利用可能なｒＨｕＥＰＯおよびＥＰＯアナログより（特に長期間の投与を必要とするもの）よりも、患者にとってのより良い選択肢を提供し得る。
【００４３】
二週間に１回いったん静脈内注射されると、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃとダルベポエチン（６２．５μｇ／ｋｇ）はいずれも、正常対照ラットの正常Ｈｂレベルをはるかに超える腎性貧血ラットのＨｂレベルの同じ増加を引き起こすことができた（図９）。このことは、ダルベポエチンの効力が臨床的に証明されたように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃによって赤血球形成が持続的に刺激されることをさらに実証している。
【００４４】
処理後（一週間に１回または二週間に１回、皮下または静脈内）５／６腎摘出ラットから採集した骨髄細胞の細胞培養実験から得られたデータは、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯおよびダルベポエチンがすべてＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅの形成を刺激したことを示した。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃおよびダルベポエチンの効力は同様であり、ｒＨｕＥＰＯの効力よりも強かった（図１０）。
【００４５】
処理群とモデル対照群で血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびＣｒｅａレベルは同様であった。すべての処理群における血清Ｆｅレベルはモデル対照群のそれよりも高かった。病理学的検査によると、すべてのＥＰＯ治療ラットの骨髄および脾臓の赤血球（ＲＢＣ）に分布
の増加が観察された。
【００４６】
７．アカゲザルにおけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの薬物動態学的研究
上述したように、発明者は、融合タンパク質のＥＰＯ部分が赤血球形成刺激のような天然ＥＰＯの機能特性を保持し、ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントが循環での融合タンパク質の安定した存在を可能にし、それによりｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃのインビボでの半減期が延長するように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃを設計した。上記の動物による研究は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの赤血球形成活性がｒＨｕＥＰＯと比べて増強されることを実証した。発明者はｒＨｕＥＰＯと比べたｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの生体内半減期を決定するために、薬物動態学的研究をさらに行なった。霊長類がヒトに生物学上非常に類似するため、霊長類をデータを生成するために使用した。
【００４７】
研究のデザインは文献の報告に基づき、実験は薬物動態学の一般的ガイドラインに従って行った。各群に５匹のサル（３〜５ｋｇ、Experiment Animal Center, AMMS,中国から
購入）として、２群のアカゲザルに、５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯをそれぞれ静脈内注射した。血液試料を注射前と注射後０．０１７、０．１６７、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、９６、１６８、２４０時間後に採取した。血清を遠心分離で厚め、血清ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯレベルをヒトエリスロポエチン酵素結合免疫吸着測定法
（ＥＬＩＳＡ）キット（R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス所在）の使用により決
定した。静脈内注射されたｒＨｕＥＰＯ−ＦｃおよびｒＨｕＥＰＯ平均半減期（ｔ１／２）はそれぞれ３５．２４＋／−５．１５時間および８．７２＋／−１．６９時間だった（図１１に概要）。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの生体内利用率を観察するために、５ｕｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃを５匹のアカゲザルに皮下注射した。血液試料を注射前と注射後１、２、５、８、１０、１２、１５、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０時間後に採取し、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの血清レベルを上述のR&Dキットにより決定した。生体内利用率
指数は皮下注射で３５．７１＋／５．３７％として計算された。これは慢性腎不全患者におけるダルベポエチン−アルファ（Aranesp（商標））の報告された生体内利用率の数字
と同一である［９，１５］。
【００４８】
このデータは、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃが霊長類で有意に長い半減期を有し、そのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの生体内半減期がKirin Brewery社、日本  製造のｒＨｕＥＰＯの生体内半減
期よりも少なくとも４倍長いことを実証している。長い生体内半減期はｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの赤血球形成活性の増強に寄与し得る。
【００４９】
８．カニクイザル（Macaca fascicularis）におけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの免疫原性
上述のように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性の変化を意図的に回避するかまたは最小限にするために、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質の設計には注意が払われた。発明者は融合タンパク質中に外部アミノ酸や結合用ペプチド配列を含めるか追加することを避けた。図１Ｂの実施形態の発明されたＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質は天然ＥＰＯタンパク質のポリペプチド配列とヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３）のみ含んでおり、理論上、免疫原性反応およびｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質に対する抗体産生を引き起こさないだろう。当業者には理解されるように、代替え構造を有する別の実施形態も本発明に包含される。
【００５０】
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の免疫性を観察するために以下の霊長類研究を行なった。１０匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）（雄／雌＝５／５、約５才齢、平均重
量  雄４．０±０．３ｋｇ、雌２．９±０．４ｋｇ、Laboratory Animal Center, AMMS,
中国から購入）に一週間に３回、４週間の間精製された５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃを皮下注射し、２匹には対照動物として等量の担体溶液を注射した。血清は一週間に１
回、５週間（処理後１週間）採取し、コーティング抗原として精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡにより抗ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ特異抗体に関して試験した。さらに、末梢血中のＲＢＣ数およびＨｂレベルも実験期間中に決定した。得られたデータは、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ治療されたカニクイザルで赤血球形成増強の刺激が観察された（平均ＲＢＣ数は４．７４ｘ１０9／ｍｌから６．６７ｘ１０9／ｍｌまで増加、平均Ｈｂレベルは１２．２ｇ／ｄｌから１３．７ｇ／ｄｌまで増加）が、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃは融合タンパク質に対する検出できる特異抗体を誘導しなかったことを示す。これらの結果は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質が霊長類で免疫原性を引き起こさないことを示す。
【００５１】
９．正常マウスにおけるｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃの急性毒性試験
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質の安全性を評価するために、急性毒性試験を動物にて行なった。
【００５２】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝２０、雄雌同数、５〜６週齢、平均重量  雄１５．８±０．４ｇおよび雌１５．９±０．６ｇ、Chinese Academy of Medicine、中国より購入）の２
つの群に、過剰量の精製ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ（雄＝１３．３ｍｇ／ｋｇ、雌＝１３．２ｍｇ／ｋｇ）または等量の担体溶液をそれらの尾静脈を介して一回静脈内注射した。注射後の即時反応に加えて、一般的行動および状態、活動、摂食および排便パターンを１４日間毎日監視および記録した。すべてのマウスの体重を７日目と１４日目に測定した。注射後１５日目に、マウスの主な臓器の解剖的検査を行った。臓器に何らかの異常な変化または疑わしい変化が観察されれば、病理学的検査を行う。
【００５３】
２つの群中のすべてのマウスで、注射後の明らかな即時反応はなかった。１４日間の間、行動、活動、摂食、および排便パターンの明らかな変化は観察されなかった。さらに、いずれの群のマウスの重量も、試験期間中着実に増加し、注射後７日目でも１４日目でも明らかな差違は見出されなかった。脳、肺、心臓、肝臓および腎臓の組織で異常なまたは病理学的な変化は検出されなかった。これらの結果は、正常な赤血球形成機能を示すのに必要とされるよりもはるかに多くの過剰量のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃを投与しても、安全であり、明らかな有毒効果がなかったことを示す。
【００５４】
１０．野生型および変化させられたＥＰＯ融合タンパク質の比較
ＥＰＯタンパク質の野生型と変異型を比較するための研究も行なった。上述したように、１実施形態では、本発明は１７２番目のアミノ酸残基に一つのアミノ酸突然変異を含んでいる。（Ｃ１７２Ｇ）。比較のために、１７２番目の残基にシステインアミノ酸を有する野生型融合タンパク質も調製した（図１２）。野生型融合タンパク質は、上記の実施例１〜３と同様に調製した。組換えプラスミドの構築に関しては、以下のオリゴプライマー（QIAGEN社、米国）を使用した（実施例１のプライマーに比べてＥＦＬ５ｗおよびＥＦＬ３ｗ中の変化したアミノ酸が太字で示される）。
【００５５】
【表２】
0005222153.tif 000003
プライマーＥＦＬ５ｗおよびＥＦＬ３ｗの配列は配列番号９−１０でそれぞれ列挙している。
【００５６】
野生型融合タンパク質（本明細書でｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣと呼ぶ）の赤血球形成活性を、変異融合タンパク質（つまり上述の本発明のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質）および組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）と比較するためにマウスの生体内実験を行なった。比較のために、本実施例で使用する３つのタンパク質（すなわちｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ、ｒＨｕＥＰＯ）の用量はすべて、モルベースでＥＰＯ分子部分のみの量とした。ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃおよびｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣタンパク質に関すると、ＥＰＯ部分は、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ分子およびｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ分子全体の分子量の合計アミノ酸の重量に対するＥＰＯのアミノ酸の重量比（すなわち３９９ａａ中の１６６ａａ）によって計算される通り、合計分子量の４１．４％に相当する。
【００５７】
ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ（ストック濃度：３００μｇ／ｍｌ）、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ（ストック濃度：９０μｇ／ｍｌ）、および天然ヒトＥＰＯ構造を有するｒＨｕＥＰＯ（６０００ＩＵ／０．５ｍｌ、Kirin Brewery社、日本  製造）を担体溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ
ヒト血清アルブミン、５．８ｍｇ／ｍｌ  クエン酸水素ナトリウム、０．０６ｍｇ／ｍｌ  クエン酸および５．８ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５−５．６）で希釈した。ｒＨｕＥＰＯの合計用量をその活性／量の比に従って計算した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週齢、体重１８〜２２ｇ、雄と雌の数は同数、Experiment Animal Center, AMMS 中
国から購入）各群８匹となるようランダムにグループ化された。マウスの各群を、１回量の一つの組み合わせ（２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｋｇ）、１回の注射ルート（皮下）および１回の注射スケジュール（一週間に３回または一週間に１回）で処理した。マウスの対照群には等量の担体溶液を注射した。処理は２６日間続いた。測定用に末梢血試料（尾静脈）を、処理前、処理の２日目、６日目、９日目、１３日目、１６日目、１９日目、２２日目および治療の２６日目に採取した。Ｈｂを吸光光度法による指標として測定した。各群のデータから平均±ＳＤを計算し、種々の群間でｔ−検定を行った。
【００５８】
図１３に示されるように、一週間に３回の間隔での３つのＥＰＯタンパク質のすべての投与は赤血球形成を刺激した。２．５μｇ／ｋｇまたは１２．５μｇ／ｋｇの用量のいずれかでは、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃはｒＨｕＥＰＯよりもＨｂレベルの高い増加を引き起こした。Ｈｂレベルの最も高い上昇が１２．５μｇ／ｋｇの用量のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで達成された。２．５μｇ／ｋｇと１２．５μｇ／ｋｇのいずれのｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣも、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ処理した群におけるＨｂレベルの有意に低い上昇によって示されるよりもずっと弱い赤血球形成を引き起こした。実際、１２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣは、２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯよりＨｂレベルの上昇が小さく、これらの結果は、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣが天然ＥＰＯの分子の配列を有するｒＨｕＥＰＯに比べ生体内赤血球形成活性を損なっていることと示唆する。対照的に、本発明のｒＨｕＥＰＯ−Ｆ
ｃ融合タンパク質はより有力なｅ赤血球形成機能を示した。一週間に３回の間隔の３つのＥＰＯタンパク質の投与は、タンパク質の半減期の差の３影響を大幅に除外した。
【００５９】
ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃおよびｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣの赤血球形成の効力を、注射回数を一週間に１回の皮下注射へと減らすことによりさらに調査した。図１４に示されるように、ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ−処理した群は１２．５μｇ／ｋｇまたは６２．５μｇ／ｋｇの用量でｒＨｕＥＰＯで処理したものよりＨｂレベルの高い上昇を示した。対照的に、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣは、ｒＨｕＥＰＯによって引き起こされるよりはるかに弱いＨｂレベルの上昇を引き起こした。例えば、１２．５μｇｋｇのｒＨｕＥＰＯはほとんどの時間地点で、６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣによって引き起こされるよりＨｂレベルの高い上昇を引き起こした。これは、半減期の影響を含むよう投与回数を減少させることによって、天然ＥＰＯ分子の配列を有するｒＨｕＥＰＯに比べて、および本発明のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質に比べて、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣが生体内ではるかに弱い赤血球形成機能を示すことをさらに示す。
【００６０】
要約すると、これらの結果は、天然ＥＰＯの分子の配列を有するｒＨｕＥＰＯに比べて、ヒトＥＰＯおよびヒトＦｃフラグメント（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）の両方の天然分子の配列の融合によって形成されたｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣがはるかに弱い生体内赤血球形成機能を示すことを実証している。詳細には、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ融合タンパク質の赤血球形成活性は天然ＥＰＯ分子の１／５未満である。これは、ＥＰＯ分子とヒトＦｃフラグメントの天然配列との間の融合がＥＰＯ分子の機能特性を損なうことを示す。Ｆｃフラグメントのヒンジ領域中の第１のシステイン残基の一つのアミノ酸の置換によって、天然ＥＰＯ分子配列および変異型Ｆｃフラグメントを含む本発明のｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質は、天然ＥＰＯ分子と比べて、より有力な生体内赤血球形成機能を示す。このデータは、野生型Ｆｃフラグメントのヒンジ領域中の第１のシステイン残基が、ＥＰＯ分子に構造変化をもたらす等により、ＥＰＯ分子になんらかの形で干渉し、これによって赤血球形成刺激の際にＥＰＯ分子の機能特性が損なわれることを示唆している。
【００６１】
上記開示に照らすと当業者には明らかなように、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに本発明の実施において多くの変更および修正が可能である。
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】本発明の組換えヒトＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質（ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ）の一般的構造を示す略図。
【図１Ｂ】ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸（ａａ）配列を示す配列表。ＤＮＡの合計長は１２８１ｂｐである。推定タンパク質配列の４２６個のアミノ酸はシグナルペプチドの２７個のａａと完全ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の３９９個のａａとを含んでいる。完全ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質はヒトＥＰＯ領域（１６６ａａ）、ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントのヒンジ領域（１６ａａ、太字）およびＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（２１７ａａ）から成る。成熟ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチドの計算された分子量は４４．６ｋＤａであり、ＥＰＯフラグメントの１８．５ｋＤａ（４１．４％）およびＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの２６．１ｋＤａ（５８．６％）から構成されている。ホモダイマーはヒンジ領域内に２つのシステイン残基（枠で囲んでいる）を介して２つのジスルフィド結合により形成されている。成熟融合タンパク質の１７２番目の残基（すなわちヒンジ領域の６番目のアミノ酸）では、未変性システイン残基がグリシン（太字）により置換されている。
【図２】ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を挿入し、かつｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を形質移入させるために使用される、哺乳類の発現プラスミドｐＣＤ１の構造および特徴を示す略図。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による非還元状態の純粋なｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の二量体型および還元状態中の純粋なｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質の単量体型のサイズを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。ｒＨｕＥＰＯ−ＦＣを発現している培養ＣＨＯ細胞株の上清から精製されたｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃタンパク質は、主として二量体型として存在し、非還元状態で８％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で約１８０ｋＤａの分子量を有している。ジスルフィド結合を破壊する還元状態（１００ｍＭジチオスレイトール、ＤＴＴ）では、二量体は７５ｋＤａの分子量を有する２つの同じ単量体ユニットへ分離される。
【図４】一週間に３回のｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯの皮下注射で処理した正常マウスのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点はその群（６匹のマウス）の平均Ｈｂレベルに相当する。０日目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。Ａ：マウスをｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで処理。Ｂ：マウスを未変性ｒＨｕＥＰＯで処理。
【図５】一週間に１回のｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯで処理した正常マウスのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点はその群（６匹のマウス）の平均Ｈｂレベルに相当する。０日目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。Ａ：マウスをｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃで処理。Ｂ：マウスを未変性ｒＨｕＥＰＯで処理。
【図６】１２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯの静脈内注射で処理した正常マウスのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの増加を示すグラフ。各点はその群（６匹のマウス）の平均Ｈｂレベルに相当する。０日目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。Ａ：週に１回治療を受けたマウス。Ｂ：週に３回治療を受けたマウス。
【図７】一週間に１回ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯまたはダルベポエチン−アルファ（略してDarbe.）で処理した５／６の腎摘出ラットのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点は、その群の平均Ｈｂレベルに相当する。正常対照は担体溶液を注射された正常ラットとした。モデル対照は担体溶液を注射された５／６の腎摘出ラットとした。０週目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。＊処理後の週数。
【図８】二週間ごとに１回ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯまたはダルベポエチン−アルファ（略してDarbe.）で処理した５／６の腎摘出ラットのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点は、その群の平均Ｈｂレベルに相当する。正常対照は担体溶液を注射された正常ラットとした。モデル対照は担体溶液を注射された５／６の腎摘出ラットとした。０週目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。＊処理後の週数。
【図９】二週間ごとに１回６２．５μｇ／ｋｇのｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃまたはダルベポエチン−アルファ（略してDarbe.）で静脈内処理した５／６の腎摘出ラットのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点は、その群の平均Ｈｂレベルに相当する。正常対照は担体溶液を注射された正常ラットとした。モデル対照は担体溶液を注射された５／６の腎摘出ラットとした。０週目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。＊処理後の週数。
【図１０Ａ】異なる用量およびスケジュールで処理した５／６の腎摘出ラットにおけるＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅのコロニー形成刺激に対するｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯおよびダルベポエチン−アルファの効力比較を示す。ｒＨｕＥＰＯ−Ｆｃおよびダルベポエチン−アルファ（略してDarbe.）治療はＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅコロニー形成刺激に対して同様の用量依存的効力を示したが、ｒＨｕＥＰＯの効力は低かった。処理は皮下に一週間ごとに１回とした。
【図１０Ｂ】図１０Ａと同じ。処理は皮下に２週間ごとに１回とした。
【図１０Ｃ】図１０Ａと同じ。処理は静脈内に２週間ごとに１回とした。
【図１１】アカゲザルへの５μｇ／ｋｇ  ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃまたはｒＨｕＥＰＯ静脈内注射後のｒＨｕＥＰＯ−ＦｃおよびｒＨｕＥＰＯの血清レベル（５匹のサルの平均レベル）を示すグラフ。
【図１２】野生型ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸（ａａ）を示す配列表。配列の詳細は、未変性野生型システイン残が成熟融合タンパク質の１７２番目の残基（つまりヒンジ領域の６番目のアミノ酸）に存在するという点を除いて図１に示したのと同じである。
【図１３】ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣ（野生型融合タンパク質）およびｒＨｕＥＰＯで一週間に３回皮下注射処理した正常マウスにおけるヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点は、その群（８匹）の平均Ｈｂレベルに相当する。正常対照は担体溶液を注射された正常マウスとした。０日目のレベルは治療前のＨｂレベルに相当する。
【図１４】ＨｕＥＰＯ−Ｆｃ、ｒＨｕＥＰＯ−ＦｃＣおよびｒＨｕＥＰＯで一週間に１回皮下注射処理した正常マウスのヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの用量依存的増加を示すグラフ。各点は、その群（８匹）の平均Ｈｂレベルに相当する。正常対照は担体溶液を注射された正常とした。０日目のレベルは処理前のＨｂレベルに相当する。
【図１Ｂ】
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【図３】
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【図１２】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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