(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（II）：
【化１】
0005228190.tif 000010
（式中、R21はモノカルボキシ基置換C1-4アルコキシ基を示し、R23、R25、R28及びR30はC1-4アルキル基を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
下記一般式（IV）：
【化２】
0005228190.tif 000011
（式中、R61はモノカルボキシ置換C1-4アルコキシ基を示し、R63、R65、R68及びR70はC1-4アルキル基を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項３】
パーオキシナイトライトの測定法であって、下記の工程：
(a)請求項１に記載の一般式(II)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した請求項２に記載の一般式(IV)で表される化合物の蛍光強度を測定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパーオキシナイトライト蛍光プローブに関するものである。より具体的には、それ自体は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトと反応してニトロ化された後に、強い蛍光を発する新規化合物、及びそれを用いたパーオキシナイトライトの測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素(NO)は、血管弛緩因子、神経情報伝達の調節、細胞死の制御、発ガンなど、様々な機能をもつ内在性生理活性物質であることが近年明らかになってきた。一方、一酸化窒素は、それ自身の反応性は比較的弱く、生体内で同時に発生する種々の活性酸素種、金属イオンなどとの反応により、高い反応性を持つ種々の活性窒素種(RNS)に変換されて細胞障害を引き起こすと考えられている。さらに最近では、RNSによるタンパクの修飾により、様々な情報伝達経路の制御が行われているとの報告も多く、また、パーオキシナイトライトをはじめとするRNSがDNA損傷を与えることで、様々な疾患に関与することが示されつつあり、一酸化窒素ばかりでなくRNSにも大きな注目が集まっている。【０００３】
パーオキシナイトライト(ONOO-)はRNSの代表的存在であり、一酸化窒素とスーパーオキサイドが反応することにより生成する。この生成反応速度はほぼ拡散律速であり、NADPH オキシダーゼなどにより生成するスーパーオキサイドと一酸化窒素合成酵素(NOS)により生成する一酸化窒素が共存すると、速やかにパーオキシナイトライトが生成する。パーオキシナイトライトは、芳香環の水酸化も可能であるなど高い酸化能を有し、またチロシンのニトロ化を効率よく行うなど、特徴的な反応性を有する。最近の報告によれば、チロシンがニトロ化されることにより、チロシンのリン酸化が阻害され、MAPK、PI3K/Aktカスケードなどの情報伝達に重要な影響を及ぼすことが指摘されている。【０００４】
これまでに開発されたパーオキシナイトライトの検出方法は、(1) DNA塩基であるグアニンがニトロ化されて生成する8-ニトログアニン、又はチロシンがニトロ化されて生成するニトロチロシンをHPLC や抗体を用いた免疫染色により検出する方法 (2)パーオキシナイトライトが過酸化水素と反応することで生成する一重項酸素を1.3μｍの発光で検出する方法が挙げられる。(1)の方法は特異性が高く汎用されているが、HPLC分析や抗体染色を行うため生細胞系に適用してリアルタイムにパーオキシナイトライトを検出することはできないという問題がある。上記２法に加え、(3)ルミノールを用いた化学発光法、(4)2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)など活性酸素種全般を検出する蛍光プローブを用いた蛍光検出法も用いられる。しかしながら、これらの方法は特異性が全くなく、各種阻害剤を用いたとしても信頼性ある検出は望めない。例えば、(4)の方法ではDCFHが一酸化窒素及びスーパーオキサイドとも反応して蛍光の増大が観測されるため、パーオキシナイトライトを検出しているのか、一酸化窒素又はスーパーオキサイドを検出しているのかを区別することは不可能である。【０００５】
一方、アリール化されたフルオレセイン誘導体が活性酸素測定用蛍光プローブとして有用であることが知られている（国際公開WO 01/64664号パンフレット）。また、該フルオレセイン誘導体がパーオキシナイトライトのプリカーサーである一酸化窒素及びスーパーオキサイドとは反応せず、これらのプリカーサーと区別してパーオキシナイトライトを測定できる蛍光プローブとして有用であることが知られている（国際公開WO 2004/40296号パンフレット）。しかし、該フルオレセイン誘導体は次亜塩素酸イオンやヒドロキシルラジカルのような活性酸素種（ROS）とも反応し、他のROSと区別してパーオキシナイトライトのみを特異的に検出することはできないという問題がある。そこで、パーオキシナイトライトを生きている状態の細胞や組織において高選択的に可視化することが可能な蛍光プローブの開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、パーオキシナイトライトを高選択的に測定可能な蛍光プローブを提供することにある。特に、バイオイメージング法に適応可能なパーオキシナイトライト高選択的蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、インダセン誘導体(特開平10-338695号公報及び特開平11-5796号公報)の蛍光発色団を有する下記一般式(I)で表される実質的に非蛍光性の化合物がパーオキシナイトライトによる代表的な化学反応であるフェノールのニトロ化によってのみ高い蛍光性を有するニトロ化合物を与える一方、該化合物は生理的条件下ではヒドロキシラジカルや次亜塩素酸イオンなどの高い活性を持つ活性酸素種、あるいは過酸化水素や一酸化窒素などの弱い活性を持つ活性酸素種又はパーオキシナイトライト以外の活性窒素種と反応して蛍光性の化合物を与えないことより、パーオキシナイトライトを高選択的に測定するためのプローブとして有用であることを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成された。【０００８】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
【化１】
0005228190.tif 000002
｛式中R1、R2、R3、R6、R7及びR8はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示すか、あるいはシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、ただし、R1、R2、R3、R6、R7及びR8のうち2ないし6個の基はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基の電子吸引基を示し、R4及びR5はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示し、Xは下記の式(A)：
【化２】
0005228190.tif 000003
〔式中R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示し、ただしR11、R12、R13、R14及びR15のうち2ないし3個の基は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、全ての基が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない〕で表される基を示し、
ただし、上記の各置換基の組み合わせは、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトとの反応後には式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物は実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩が提供される。【０００９】
上記の発明の好ましい態様によれば、一般式(I)で表される化合物において、
R1、R2、R3、R6、R7及びR8の置換基の組み合わせが、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物が実質的に非蛍光となるように上記インダセン環部分に実質的に低い電子密度を与える組み合わせであり、かつR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせは式(A)で表されるベンゼン環に実質的に高い電子密度を与える組み合わせであり、さらに、
式（A）のR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせが、式(I)で表される化合物とパーオキシナイトライトとの反応後には、式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物が実質的に高い蛍光性となるように上記ベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである
化合物又はその塩が提供される。【００１０】
この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(I)において、R1、R3、R6及びR8がメチル基であり、R2及びR7がシアノ基であり、R4及びR5がフッ素原子であり、Xが上記の式(A)で表される基（式中の置換基は上記定義と同義である）である化合物；並びに上記一般式(I)において、R1、R3、R6及びR8がメチル基であり、R2及びR7がシアノ基であり、R4及びR5がフッ素原子であり、Xが上記の式(A)で表される基（式中、R11が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であり、R12、R14及びR15が水素原子であり、R13が水酸基である）である化合物又はその塩が提供される。R11が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはメトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基が好ましい。特に、カルボキシメトキシ基が好ましい。【００１１】
また、上記発明の別の好ましい様態によれば、下記一般式（II）：
【化３】
0005228190.tif 000004
（式中、R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R21及びR22が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはなく、R23、R25、R28及びR30は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基を示し、R24及びR29はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、R26及びR27はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示す）
で表される化合物又はその塩が提供される。【００１２】
この発明の好ましい態様によれば、上記一般式(II)において、R21及びR22が水酸基及び置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30が置換基を有していてもよいC1-8アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である化合物又はその塩が提供される。さらに好ましい態様によれば、上記一般式(II)において、R21及びR22が水酸基及びC1-4アルコキシ基またはモノカルボキシル基置換C1-4アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30がC1-4アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である化合物又はその塩が提供される。【００１３】
別の観点からは、下記一般式（III）：
【化４】
0005228190.tif 000005
｛式中R41、R42、R43、R46、R47及びR48はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示すか、あるいはシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、ただし、R41、R42、R43、R46、R47及びR48のうち2ないし6個の基はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基の電子吸引基を示し、R44及びR45はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示し、Yは下記の式（B)：
【化５】
0005228190.tif 000006
〔式中、R51、R52、R53及びR54はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R51、R52、R53及びR54のうち2ないし3個は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、全ての基が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない〕で表される基を示し、ただし、上記の各置換基の組み合わせは、上記一般式(III)で表される化合物又はその塩が実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩が提供される。【００１４】
この発明の好ましい態様によれば、R51、R52、R53及びR54の置換基の組み合わせが一般式(III)で表される化合物が実質的に高い蛍光性となるように式(B)におけるベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである上記化合物又はその塩が提供される。【００１５】
この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(III)において、R41、R43、R46及びR48がメチル基であり、R42及びR47がシアノ基であり、R44及びR45がフッ素原子であり、Yが上記の式(B)で表される基（式(B)中、R51が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であり、R52及びR53が水素原子であり、R54が水酸基である）である化合物又はその塩が提供される。R51が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基が好ましい。特に、カルボキシメトキシ基が好ましい。【００１６】
さらに別の好ましい様態によれば、下記一般式（IV）：
【化６】
0005228190.tif 000007
（式中、R61及びR62はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R61及びR62が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはなく、R63、R65、R68及びR70は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基を示し、R64及びR69はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、R66及びR67はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示す）
で表される化合物又はその塩が提供される。【００１７】
さらに、この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(IV)において、R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基である化合物又はその塩；並びに上記一般式(IV)において、R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62がメトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基である化合物又はその塩が提供される。【００１８】
また、本発明により、パーオキシナイトライトの測定法であって、下記の工程：
(a)上記一般式(I)、好ましくは上記一般式(II)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した上記一般式(III)、好ましくは上記一般式(IV)で表される化合物の蛍光強度を測定する工程
を含む方法が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、上記のパーオキシナイトライトの測定用試薬の製造のための上記一般式(I)で表される化合物の使用が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例の例１で得られた本発明の化合物４ 10 μmol/Lに種々の濃度のパーオキシナイトライト溶液を添加した時の蛍光スペクトル変化を示した図である。
【図２】実施例の例１で得られた本発明の化合物４ 10 μmol/Lに終濃度が0、1、2、5、10、20、50μmol/Lとなるようにパーオキシナイトライト溶液を添加した時の蛍光強度変化（励起波長505nm、蛍光波長518nm）を示した図である。
【図３】実施例の例１で得られた本発明の化合物４ 10 μmol/Lに終濃度が1、2、5、10μmol/Lになるようのパーオキシナイトライト溶液を添加した時の蛍光強度変化（励起波長505nm、蛍光波長518nm）を示した図である。
【図４】実施例の例１で得られた本発明の化合物４ 10 μmol/Lに過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素及びパーオキシナイトライトを添加した際の蛍光スペクトル変化を示した図である。
【図５】実施例の例１で得られた本発明の化合物４ 20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように pH 7.4 の0.1 mol/L リン酸緩衝液に溶解し、パーオキシナイトライト溶液を添加後、HPLC による分析を行った結果を示した図である。
【図６】実施例の例１で得られた本発明の化合物４とパーオキシナイトライトとを反応させた後，1 N 塩酸 によって反応液を酸性にして酢酸エチルで抽出した生成物をLCMSにて分析した結果を示した図である。
【図７】実施例の例１で得られた本発明の化合物４を用いてパーオキシナイトライトをイメージングした図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
上記一般式(I)において、R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としてはメチル基又はエチル基などが好ましく、置換基を有していてもよいアリール基としてはフェニル基が好ましい。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいビニル基に存在する置換基としてはフェニル基、モノアミノフェニル基、又はジアミノフェニル基（例えば3,4-ジアミノフェニル基）などを挙げることができる。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいチエニル基及び置換基を有していてもよいピロリル基としては、それぞれ2-チエニル基及び2-ピロリル基が好ましい。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基がアルキル基以外の基である場合には、化合物の蛍光波長が長波長にシフトすることがある。【００２１】
上記一般式(I)において、R1、R2、R3、R6、R7及びR8の組み合わせとしては、これらのうちの4個が置換基を有していてもよいC1-8アルキル基であり、かつ2個がシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基であることが好ましい。電子吸引基としてはシアノ基が好ましい。2個の電子吸引基が置換する位置としてはR2及びR7が好ましい。R1、R3、R6、及びR8がメチル基であり、かつR2及びR7がシアノ基の組み合わせであることが特に好ましい。【００２２】
上記一般式(I)においてR4及びR5が示すハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましく、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としてはメチル基が好ましく、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。R4及びR5が示す置換基としてはフッ素原子であることが特に好ましい。【００２３】
式(A)で表される基において、R11、R12、R13、R14及びR15が示す置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としては、例えば、カルボキシ置換C1-8アルキル基、アルコキシカルボニル置換C1-8アルキル基、スルホン酸置換C1-8アルキル基、又はアルキルスルホネート置換C1-8アルキル基などを例示することができる。カルボキシ置換C1-8アルキル基としては、モノカルボキシ置換C1-8アルキル基であることが好ましく、カルボキシメチル基などが好ましい。アルコキシカルボニル置換C1-8アルキル基としては上記のモノカルボキシ置換C1-8アルキル基のC1-8アルキルエステルを例示することができる。好ましくはエトキシカルボニル置換C1-8アルキル基などである。スルホン酸置換C1-8アルキル基としてはモノスルホン酸置換C1-8アルキル基であることが好ましい。アルキルスルホネート置換C1-8アルキル基としてはモノアルキルスルホネート置換C1-8アルキル基が好ましい。アルキルスルホネート置換C1-8アルキル基のアルキルスルホネート基としてはC1-8アルキルスルホネート基（C1-8アルキル-O-SO2-）が好ましい。【００２４】
R11、R12、R13、R14及びR15が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基及びモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基のC1-8アルキルエステル基であることが好ましい。それぞれカルボキシメトキシ基及びメトキシカルボニルメトキシ基などを例示することができる。置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基がモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基である場合には水溶性が著しく高まり、優れた効果が得られることがある。また、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基がモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基のC1-8アルキルエステル基（メトキシカルボニルメトキシ基やアセトキシメトキシカルボニルメトキシ基など）である場合には細胞膜透過性が高まり、かつ細胞内に取り込まれた後に細胞内のエステラーゼによりC1-8アルキルエステル基が加水分解されると水溶性の高いモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基に変換され細胞内に留まる性質を付与できるなど優れた効果が得られることがある。【００２５】
R11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、これらのうちの2ないし3個が水素原子であり、かつ2ないし3個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であることが好ましい。これらのうち3個が水素原子であり、かつ2個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であることが特に好ましい。特に好ましいR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、これらのうちの3個が水素原子であり、1個が水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であり、１個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基である組み合わせである。最も好ましいR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、R11がカルボキシメトキシ基であり、R12、R14及びR15が水素原子であり、かつR13が水酸基である組み合わせである。【００２６】
上記一般式(II)において、R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基又は水酸基であることが好ましく（ただしR21及びR22が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない）、R23、R25、R28及びR30は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、好ましくはメチル基又はエチル基、さらに好ましくはメチル基であり、R24及びR29はシアノ基であることが好ましく、R26及びR27はフッ素原子であることが好ましい。【００２７】
上記一般式(I)又は上記一般式(II)で表される化合物の塩の種類は特に限定されないが、例えば塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の測定用試薬及び測定方法に好適に使用できる。また、遊離形態の一般式(I)で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、水和物又は溶媒和物を本発明の測定用試薬として用いてもよい。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。【００２８】
一般式(I)で表される化合物は、その置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを本発明の測定用試薬として用いてもよい。【００２９】
上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、緩和な条件下、例えば生理的条件下でパーオキシナイトライトと反応して、式(A)におけるベンゼン環の一つの水素原子がニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩を与える性質を有している。一般式(I)で表される化合物又はその塩は実質的に非蛍光性であり、一方、ニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記式(I)で表される化合物又はその塩をパーオキシナイトライトと反応させた後、ニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩の蛍光を測定することによって、パーオキシナイトライトを高感度に測定することが可能である。【００３０】
また、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、上記の条件下では他の活性酸素種であるヒドロキシラジカル、一重項酸素、次亜塩素酸イオン、パーオキシナイトライトのプリカーサーである一酸化窒素又はスーパーオキサイドと反応して蛍光性の化合物を与えないという特徴がある。従って、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を用いることにより、生理的条件下で他の活性酸素種の影響なしにパーオキシナイトライトのみを特異的に測定することが可能である。例えば、一般式(I)で表される化合物又はその塩を測定用試薬として用いることにより、個々の細胞や特定の組織中に局在するパーオキシナイトライトを正確にかつ簡便に測定できる。【００３１】
上記一般式(III)及び上記一般式(IV)におけるそれぞれの置換基は、上記一般式(I)及び上記一般式(II)について説明した対応位置における置換基と同様である。また、上記一般式(III)及び上記一般式(IV)の塩、並びにそれらの異性体などについても上記一般式(I)及び上記一般式(II)について説明したものと同様である。一般式(III)で表される化合物の(B)で表される基においてニトロ基の位置並びにR51、R52、R53、及びR54の位置はそれぞれ特に限定されず、ベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。また、一般式(IV)で表される化合物においてベンゼン環上に置換するニトロ基の位置、並びにR61及びR62の位置は特に限定されず、ベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。【００３２】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明のパーオキシナイトライトの測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトライトとを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した一般式(III)で表されるニトロ化合物又はその塩の蛍光を測定する工程を含んでいる。【００３３】
一般式(III)で表されるニトロ化された化合物又はその塩の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。本発明の測定用試薬は細胞内に容易に取り込まれる性質を有しており、個々の細胞内に局在するパーオキシナイトライトをバイオイメージング手法により高感度に測定できる。【００３４】
本発明の測定用試薬としては、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。【００３５】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式（I）で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。インダセン骨格については、例えば、特開平10-338695号公報及び特開平11-5796号公報のほか、New J. Chem., 25, pp.289-292, 2001; Tetrahedron Letters, 42, pp.6711-6713, 2001; Angew. Chem. Int. Ed., 40, pp.385-387, 2001；及び特開2003-277385号明細書などに合成方法が示されているので、これらの刊行物を参照することにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可能である。上記の刊行物の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：パーオキシナイトライト蛍光プローブの合成
化合物4の合成スキームを以下に示した。
【化７】
0005228190.tif 000008
【００３７】
(a) 3-シアノ-2,4-ジメチルピロールの合成
既知文献（Australian Journal of Chemistry, 17, pp.1013-1021, 1965)に記載の方法で合成した。【００３８】
(b) 化合物1（4-ベンジルオキシ-2-ベンジルオキシカルボニルメトキシベンズアルデヒド）の合成
4-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシベンズアルデヒド (1 g, 4.39 mmol) を 蒸留した ジメチルホルムアミド（DMF） 8 mL に溶解し、ブロモ酢酸ベンジル (1.1 g, 4.82 mmol)、炭酸セシウム(1.57 g, 4.83 mmol) を加え、アルゴン雰気下、終夜室温で撹拌した。反応溶液に水 150 mL を加え，酢酸エチル 100 mL で 3 回抽出した。抽出した有機層を水 50 mL で 5 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体をカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）により精製し、ヘキサンより再結晶を行い、93 % の収率で白色固体の目的化合物１を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.73 (s, 2H), 5.03 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 6.35 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.66 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H) , 7.33-7.40 (m, 10H) , 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 10.38 (s, 1H).  13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ65.4, 67.1, 70.3, 99.6, 107.6, 119.4, 127.5, 128.3, 128.4, 128.6, 128.7, 130.7, 134.8, 135.6, 161.6, 164.9, 167.8, 188.0.  MS (ESI+): 399 [M+Na]+. 
Anal. Calcd for C23H20O5: N, 0; C, 73.39; H, 5.36. Found: N, 0; C; 73.18; H, 5.62. Mp: 84.4 - 85.7 °C.【００３９】
(c) 化合物３〔8-(4-ベンジルオキシ-2-ベンジルオキシカルボニルメトキシフェニル)-2,6-ジシアノ-1,3,5,7-テトラメチル-4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン〕の合成
化合物１ (400 mg, 1.06 mmol) と 3-シアノ-2,4-ジメチルピロール(262 mg, 2.18 mmol) をジクロロメタン 200 mL に溶解させ、トリフルオロ酢酸 2 mL を滴下し加えた。終夜室温で撹拌した後、2,3-ジクロロ5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン(314 mg, 1.38 mmol) を加え、30 分室温で撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗浄した後、溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を濃縮した。得られた固体をジクロロメタンを溶媒としアルミニウムオキサイドを通して濾過した。減圧下溶媒を留去し固体として粗製の化合物２を得た。得られた固体の化合物２を脱水トルエン 120 mL に溶解させた。この溶液に ジイソプロピルエチルアミン 3 mL を加え、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体 2.5 mL を滴下し、室温で 5 分間撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 50 mL で 1 回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで溶媒を乾燥した。溶媒を減圧下留去し、カラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）で精製し、目的化合物３を 245 mg、36 %収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)：  1.54 (s, 6H), 2.70 (s, 6H) , 4.61 (s, 2H) , 5.05 (s, 2H) , 5.17 (s, 2H) , 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.78 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H) , 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.31-7.43 (m, 10H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3)： d 13.4, 13.8, 64.7, 67.4, 70.4, 100.6, 106.0, 108.0, 113.8, 113.9, 127.7, 128.5, 128.6, 128.7, 128.8, 129.4, 132.1, 134.6, 135.7, 144.1, 149.4, 155.0, 159.1, 161.8, 167.7.  HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 643.2328; Found, 643.2334.  Anal. Calcd for C37H31BF2N4O4: N, 8.69; C, 68.95; H, 4.85. Found: N, 8.39; C, 68.71; H, 5.02.【００４０】
(d) 化合物４〔2,6-ジシアノ-8-(4-ヒドロキシ-2-カルボキシメトキシフェニル)-1,3,5,7-テトラメチル-4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン〕の合成
化合物３ 35 mgをクロロホルム 10 mL に溶解し、これをエタノール 40 mL で希釈した。この溶液に 10 % Pd-C を少量加え、水素雰気下、終夜激しく撹拌した。反応液を濾過し、減圧下溶媒を留去した後にカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 , 溶媒：9 % メタノール／ジクロロメタン）により精製し、目的化合物４を 15 mg、59 % 収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.75 (s, 6H) ,  2.71 (s, 6H) ,  4.61 (s, 2H) , 6.44 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 6.68 (dd, J = 1.6, 8.2 Hz, 1H) , 6.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H).  HRMS HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 463.1389; found 463.1342【００４１】
例２：化合物４とパーオキシナイトライトの反応
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液
（ｐH7.4）に溶解した。 2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/Lおよび 80 mmol/Lのパーオキシナイトライト 溶液を、終濃度が 1、2、4、5、10、20、50μmol/Lとなるように撹拌しながら加え、60秒後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長505nm）。結果を図１、図２、及び図３に示す。図１、図２、及び図３から明らかなように、パーオキシナイトライトの添加量に依存した蛍光強度の増加が認められることから（極大蛍光波長518nm）、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトとの反応によって濃度依存的に発蛍光することが示された。【００４２】
例３：化合物４と種々の活性酸素との反応
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液（ｐH7.4）で希釈した溶液を調製し試験に使用した。調製した溶液を以下の条件：
(a)パーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(b)過酸化水素を終濃度1mmol/Lとなるよう添加
(c)過酸化水素及び次亜塩素酸イオンをそれぞれ終濃度１mmol/L、100μmol/Lとなるよう添加
(d)過酸化水素及び硫酸鉄(II)をそれぞれ終濃度１mmol/L、50μmol/Lとなるよう添加
(e)次亜塩素酸イオンをを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(f)NOC-13（一酸化窒素放出剤：同仁化学研究所製）を終濃度100μmol/Lとなるよう添加
で3分（(f)のみ30分）処理し、それぞれ反応後の蛍光スペクトル変化を測定することで、(a)パーオキシナイトライト、(b)過酸化水素、(c)一重項酸素、(d)ヒドロキシルラジカル、(e)次亜塩素酸イオン、(f)一酸化窒素との反応性を比較した。結果を図4に示す。図４から明らかなように、本発明の化合物４は過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素の添加では蛍光を全く発しないが、パーオキシナイトライトの添加によって強い蛍光を発することが確認された。すなわち、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトに対して高い選択性を有していることが示された。【００４３】
例４：化合物４とパーオキシナイトライトとの反応生成物の確認
例１で得られた本発明の化合物20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように pH 7.4 の0.1 mol/L リン酸緩衝液に溶解し、パーオキシナイトライト溶液を添加後、HPLC による分析を行った。結果を図５に示す。それぞれ(A)反応前、(B)終濃度10μmol/L のパーオキシナイトライト添加後、(C)終濃度50 μmol/L パーオキシナイトライト添加後のHPLC分析結果を示す。図中、下段のラインは 500 nm における吸光度によって分析した結果であり、上段のラインは520 nm における蛍光強度（500 nm 励起）によって分析した結果である。
分析条件
カラム: GL Science Inc.  Inertsil ODS-3, 5 μm 4.6 x 250 mm
流速： 1 mL/min
溶出液A:：0.1 % トリフルオロ酢酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 分)【００４４】
パーオキシナイトライトを添加せずにHPLC分析を行うと11.1分に500 nmの吸収を持つ無蛍光の化合物４のピークのみが観察されるが（A）、パーオキシナイトライトを添加した後のHPLC分析では、11.9分にパーオキシナイトライトとの反応生成物と考えられる蛍光性を有するピークが生成していることが観察された（B、C）。また、キュベット中で化合物４とパーオキシナイトライトを反応させた後，1 N 塩酸 によって反応液を酸性にして酢酸エチルで抽出した生成物をLCMSにて分析した。
分析条件
カラム: GL Science Inc.  Inertsil ODS-3, 5 μm 2.1 x 150 mm
流速： 0.2 mL/min.
溶出液A:：0.1 % ギ酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 min.)【００４５】
結果を図６に示す。この結果、13.1分に化合物４の質量463（[M-H]-）のピークが観察され、15.1分に質量508のピークが観察された。15.1分の質量508のピークは、下記スキームで別途合成したニトロ化体のHRMS [M-H]-の分析結果（calcd for [M-H]-, 508.1239;Found, 508.1214.）に測定誤差範囲内で一致していた。以上のことから、本発明の化合物４は、パーオキシナイトライトと反応して、ベンゼン環上の水素原子がニトロ基で置換された化合物となることが示された。
【化８】
0005228190.tif 000009
【００４６】
例５：化合物４を用いたパーオキシナイトライトのイメージング
HeLa細胞を5% CO2インキュベーター中、10%(v/v)ウシ胎児血清、ペニシリン(100 units/mL)、ストレプロマイシン(100 μg/mL)を添加したDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)中で前培養した。このHeLa細胞を35 mm径ガラス底ディッシュ(MatTek Corporation)に播き、DMEM中でさらに一晩培養した。24時間後に培地を除去し、HeLa細胞をハンクス液（HBSS）で洗浄(2×1 mL)した。化合物4の2 μmol/L  HBSS溶液(補助溶媒として0.01% DMFおよび0.01% Cremophor EL(SIGMA)を含有)を2 mL添加し、HeLa細胞を室温で20分間インキュベートした。続いてHeLa細胞をHBSSで洗浄(2×1 mL)した。パーオキシナイトライト添加前およびパーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるように添加後の蛍光像を、励起波長470-490 nm、蛍光波長510-550 nmで撮影した。【００４７】
結果を図７に示す。図中、（A)は化合物4をロードしたHeLa細胞の微分干渉顕微鏡像、（B)はパーオキシナイトライト添加前の蛍光強度を擬似カラーで示した蛍光像、（C)はパーオキシナイトライト添加後の蛍光強度を擬似カラーで示した蛍光像、（D)は（A)と（B）の融合像である。（B)及び（C)から明らかなように、本発明の化合物を使用してパーオキシナイトライトの蛍光イメージングが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の化合物はパーオキシナイトライトを高選択的に測定可能な蛍光プローブとして有用であり、特にバイオイメージング法に適応可能なパーオキシナイトライト高選択的蛍光プローブとして有用である。
【図１】
0005228190.tif 000012
【図２】
0005228190.tif 000013
【図３】
0005228190.tif 000014
【図４】
0005228190.tif 000015
【図５】
0005228190.tif 000016
【図６】
0005228190.tif 000017
【図７】
0005228190.tif 000018