(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性含水有機溶媒中で卵殻膜を加水分解処理した後、陰イオン交換樹脂と接触せしめる、可溶性卵殻膜の製造方法。
【請求項２】
陰イオン交換樹脂の使用量が、卵殻膜固形物１質量部に対して１〜１０容量倍量である、請求項１記載の可溶性卵殻膜の製造方法。
【請求項３】
陰イオン交換樹脂との接触時間が１〜５０時間である、請求項１又は２記載の可溶性卵殻膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する、新規な可溶性卵殻膜の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵殻膜は、繊維芽細胞増殖効果を有することが知られており、荒れ肌を改善する効果を期待して、従来から化粧品原料として広く利用されてきた（例えば、特許文献１、特許文献２など）。そこで、化粧品や食品の原料として配合しやすくするために、古くから可溶化方法についても種々検討されている。例えば出願人は、卵殻膜をアルカリ性含水有機溶媒中で分解後、得られた分解液を中和、濾過することを特徴とする異臭や着色の少ない可溶化卵殻膜の製法を見出し、特許を取得している（特許文献３）。また、卵殻膜を蛋白分解酵素で処理することを特徴とする水溶性卵殻膜の製造法も検討されている（特許文献４）。
【０００３】
しかしながら、繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する可溶性卵殻膜を得るための製造方法については、これまで検討されていなかった。
【特許文献１】特公平６−４７５２７号
【特許文献２】特公平６−４７５２８号
【特許文献３】特公平６−２１０４７号公報
【特許文献４】特公平７−１１０２１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、特に繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する可溶性卵殻膜を得る、新規な製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、可溶性卵殻膜の製造方法について鋭意研究を重ねた結果、製造工程において、卵殻膜を加水分解処理した後に、得られた加水分解物と陰イオン交換樹脂とを接触せしめることにより、意外にも、繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する可溶性卵殻膜が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）アルカリ性含水有機溶媒中で卵殻膜を加水分解処理した後、陰イオン交換樹脂と接触せしめる、可溶性卵殻膜の製造方法、
（２）陰イオン交換樹脂の使用量が、卵殻膜固形物１質量部に対して１〜１０容量倍量である、（１）の可溶性卵殻膜の製造方法、
（３）陰イオン交換樹脂との接触時間が１〜５０時間である、（１）又は（２）の可溶性卵殻膜の製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法によれば、繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する可溶性卵殻膜を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明に係る可溶性卵殻膜の製造方法を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【０００９】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法は、卵殻膜に加水分解処理を施した後に、得られた加水分解物と陰イオン交換樹脂とを接触せしめることを特徴とする。それにより、繊維芽細胞の接着および増殖を効果的に促進する可溶性卵殻膜を得ることができる。
【００１０】
本発明の卵殻膜は、鳥類、特に鶏の卵殻膜をいう。可溶性卵殻膜とは、水に溶解可能な卵殻膜成分をいう。
【００１１】
卵殻膜の加水分解処理は、酸（塩酸、硫酸等）、アルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、蛋白分解酵素（微生物起源の酵素、植物起源の酵素、動物起源の酵素）等により行うことができ、特にアルカリによって行うことが好ましく、アルカリ性含水有機溶媒中で行われることがさらに好ましい。加水分解処理をアルカリ性含水有機溶媒中で行うことにより、特許文献３に記載されているように異臭や着色の少ない可溶性卵殻膜を得ることができるばかりでなく、繊維芽細胞の接着および増殖効果が高い可溶性卵殻膜が得られる。
【００１２】
ここで、アルカリ性含水有機溶媒とは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ剤を溶解した水溶液と、メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の水溶性有機溶媒を混合したものをいう。上記水溶液と有機溶媒の混合割合は、全量に対する有機溶媒の量が１０〜８０％であることが好ましく、３０〜６０％であることがより好ましい。また、このアルカリ性含水有機溶媒中のアルカリの濃度は、０．２〜３．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。アルカリの濃度が低すぎると、卵殻膜を分解しにくく作業性が悪くなり、逆にアルカリの濃度が高すぎると繊維芽細胞の接着および増殖効果が高い可溶性卵殻膜が得にくくなる傾向があるためである。卵殻膜の加水分解をアルカリ性含水有機溶媒中で行う場合の分解処理条件は、用いるアルカリ剤や有機溶媒の種類によって異なるが、アルカリ剤として水酸化ナトリウムを、また有機溶媒としてエタノールを用いた場合には、１０〜８０℃、より好ましくは３０〜６０℃で３〜１５時間処理するとよい。卵殻膜をアルカリ性有機溶媒中で加水分解する場合は、得られた加水分解液とイオン交換樹理とを接触せしめる前に、中和工程を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法で使用する陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＡ１０Ａ、ダウエックスマラソンＡ、デュオライトＡ１１３など）、弱塩基性陰イオン交換樹脂（ダウエックスマラソンＡ２、アンバーライトＩＲＡ６７、デュオライトＡ３６８Ｓなど）が挙げられる。また、これらの陰イオン交換樹脂を単独で、あるいは２種以上を混合して使用することもできる。卵殻膜の加水分解物と陰イオン交換樹脂とを接触せしめることによって繊維芽細胞の接着および増殖効果が高まる理由は必ずしも明らかではないが、加水分解後の卵殻膜中に含まれる何らかの細胞増殖効果の抑制因子が、陰イオン交換樹脂により吸着、除去されているものと推察される。
【００１４】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法において、陰イオン交換樹脂の使用量は、卵殻膜の固形物一質量部に対して１容量倍量以上が好ましく、３容量倍量以上がより好ましい。陰イオン交換樹脂の量が卵殻膜の量に対して１容量倍量未満であると、繊維芽細胞の接着および増殖効果がほとんど促進されないため、好ましくない。また、陰イオン交換樹脂が卵殻膜の量に対して１０容量倍量超の場合は、それ以上陰イオン交換樹脂の量を増やしても得られる可溶性卵殻膜の繊維芽細胞の接着および増殖効果が高まらないため、経済的でない。
【００１５】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法において、卵殻膜の加水分解物と陰イオン交換樹脂との接触は、所定量の陰イオン交換樹脂を充填したカラムに該加水分解物を流すか、あるいは該加水分解物中に所定量の陰イオン交換樹脂を加えて、攪拌下懸濁させることにより実施すればよい。
【００１６】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法において、卵殻膜の加水分解物と陰イオン交換樹脂との接触時間は、１時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。該加水分解物と陰イオン交換樹脂との接触時間が１時間未満であると、繊維芽細胞の接着および増殖効果が充分促進されないため、好ましくない。また、該加水分解物と陰イオン交換樹脂との接触を５０時間以上行っても、得られる可溶性卵殻膜の繊維芽細胞の接着および増殖効果はそれ以上高まらない。
【００１７】
本発明の可溶性卵殻膜の製造方法においては、陰イオン交換樹脂との接触により、得られる可溶性卵殻膜のｐＨが高くなりすぎ化粧品原料等として用いるには適当でない場合があるので、卵殻膜の加水分解物を陰イオン交換樹脂とを接触せしめた後に、ｐＨ調整工程を含んでも良い。その他、本発明の効果を損なわない範囲で、濾過工程、脱塩工程、乾燥工程等を含んでもよい。
【００１８】
以下、本発明の可溶性卵殻膜の製造方法について、実施例等に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定するものではない。
【実施例】
【００１９】
〔実施例１〕
乾燥卵殻膜５２０ｇ（固形物９６％）を１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１０Ｌ中に分散し、４０℃で５時間加水分解反応を行った。次いで２ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨを８に調整し、濾過により不溶物を除去した。得られた濾液に陰イオン交換樹脂デュオライトＡ３６８Ｓ（ローム・アンド・ハース社製）を４Ｌ投入し、４０時間攪拌した。攪拌終了後、濾過にて陰イオン交換樹脂を除き、得られた濾液に２ｍｏｌ／Ｌの塩酸を添加してｐＨを８に調整した。その後孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター濾過を行った。得られた濾液を電気透析処理して脱塩し、その後凍結乾燥することにより、粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２０】
〔実施例２〕
実施例１の製造方法において、陰イオン交換樹脂量を１Ｌとする以外は、実施例１と同様の方法により、実施例２の粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２１】
〔実施例３〕
実施例１の製造方法において、卵殻膜加水分解液と陰イオン交換樹脂との接触時間を１６時間とする以外は、実施例１と同様の方法により、実施例３の粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２２】
〔実施例４〕
実施例１の製造方法において、卵殻膜加水分解液と陰イオン交換樹脂との接触時間を１時間とする以外は、実施例１と同様の方法により、実施例４の粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２３】
〔実施例５〕
実施例１の製造方法において、アルカリ加水分解工程を２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液・エタノール混合液（１：１）１０Ｌ中で行う以外は実施例１と同様の方法により、実施例５の粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２４】
〔比較例１〕
実施例１の製造方法において、陰イオン交換樹脂を使用しない以外は、実施例１と同様の方法により、比較例１の粉末状の可溶性卵殻膜を得た。
【００２５】
実施例および比較例の陰イオン交換樹脂の量および処理時間を表１にまとめた。
【００２６】
【表１】
0005179847.tif 000002
【００２７】
〔試験例〕
実施例および比較例にて得られた粉末状可溶性卵殻膜を使用して、繊維芽細胞の接着および増殖試験を行った。
【００２８】
まず、ポリスチレン製２４穴プレート（１．８ｃｍ２／ウェル）の各ウェルに、１０μｇ／ｃｍ２となるように濃度調整した実施例および比較例の可溶性卵殻膜溶液を、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター濾過した後に添加し、クリーンベンチ内で無菌的に風乾させ、可溶性卵殻膜をウェル表面にコーティングした。
【００２９】
次いで、ヒト真皮繊維芽細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈後、細胞数を１×１０４となるように、可溶性卵殻膜をコーティングしたポリスチレン製２４穴プレートの各ウェルに添加した。
【００３０】
上記２４穴プレートを５％ＣＯ２、３７℃の雰囲気下で培養した。培養後５日目に、各ウェルをトリプシン（０．１％ｗ／ｖ）とＥＤＴＡ（０．０２％ｗ／ｖ）を含有する水溶液で処理して細胞をウェルから剥離後、血球計算盤にて細胞数をカウントした。各サンプルの培養はｎ＝２で行い、細胞数のカウントは１ウェルにつき、２回実施した。また、対照として、可溶性卵殻膜をコーティングしないウェルについても同様に繊維芽細胞を添加し、培養を行った。さらに、陽性対照として、組織培養用２４穴プレート（１．８ｃｍ２／ウェル）のウェルについても同様に繊維芽細胞を添加し、培養を行った。
【００３１】
表２に、各種可溶性卵殻膜をコーティングしたウェルの培養細胞数の変化を示す。
【００３２】
【表２】
0005179847.tif 000003
【００３３】
表２の対照の結果からわかるように、通常、繊維芽細胞は、ポリスチレン製プレートには接着することができないため、そのまま培養を行っても増殖はみられない。一方、実施例および比較例に示すように、可溶性卵殻膜をコーティングしたポリスチレン製プレートには細胞の接着および増殖が確認された。
培養５日目には、陰イオン交換樹脂を使用せずに得られた可溶性卵殻膜を使用した比較例１に対し、卵殻膜の加水分解液を陰イオン交換樹脂と接触せしめて得られた可溶性卵殻膜をコーティングした実施例１〜５では、ウェル中の生細胞数が多かった。したがって、卵殻膜の加水分解液と陰イオン交換樹脂とを接触せしめて得られた可溶化卵殻膜は、陰イオン交換樹脂を使用せずに得られた可溶化卵殻膜に対し、繊維芽細胞の接着および増殖に対する促進効果が高いことが示唆された。さらに、実施例１と３、４の比較により、わずかではあるが、卵殻膜の加水分解液と陰イオン交換樹脂との接触時間が長いほど可溶性卵殻膜の繊維芽細胞増殖効果が高くなることが理解される。また、卵殻膜の加水分解工程において、アルカリ含水有機溶媒中で加水分解を行った実施例５は、アルカリ水溶液中（有機溶媒を含まない）で加水分解を行った実施例１〜４に対して培養後５日目の生細胞数が多いことから、繊維芽細胞の接着および増殖に特に効果が高いことがわかった。