(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）の工程を順次備えたことを特徴とする膵臓癌の判定方法。
（１）被検者より採取された血液中の糖タンパクからＮ結合型糖鎖を遊離させる工程；
（２）遊離させた糖鎖を精製する工程；
（３）精製した糖鎖の質量分析を行う工程；
（４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１、２３６２、１３３９、３０４７、２７０３、２０９７、１９５０、１２６６、３１９３、４１７７、２６６３、２６３９、２０５５、２２５９、２５７９、１２０６、２４２８、１９８４、２８１７、１８９３、２２７４、２０７１、２８１４、２２１７、２６９６、１３２４、２２６９、２７４２、２１１２、２０１１、２１７５、２５６３、２１２８、２４２０、２２１４、４０１５、２３１３、１３８１、２６３０、１２０８、１２０３、３３５２、２６８２、３３３８、２６４９、２１２３、２５７４、２３３５、２８８０、１３５１、２６６８、２７２８、４３４０、２４１７、１５０１、１９８９、２７２６、１６７４、１２５９、３３２０、１８２７、１６１９、１８１９、２７２３、及び２１５１のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも１つの糖鎖の検出強度を測定する工程であって、前記検出強度が膵胆道良性疾患患者と比較して低下していることは前記被験者が膵臓癌患者であることを示し、且つ、前記質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、糖鎖補足ビーズ（BlotGlyco（登録商標）for MALDI（住友ベークライト株式会社製））を用いて、遊離させた糖鎖の捕捉及びラベル化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機（Voyager-DETM STR Workstation；Applied Biosystems社製)を用いた場合に得られる値である、工程；
【請求項２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１及び／又は２３６２である請求項１に記載の膵臓癌の判定方法。
【請求項３】
トリプシン及びＮ−グリコシダーゼＦを用いて、Ｎ結合型糖鎖を遊離させることを特徴とする請求項１又は２に記載の膵臓癌の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のＮ結合型糖鎖を膵臓癌診断用マーカーとして利用した膵臓癌の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、胃の裏側にある長さ１５ｃｍ程度の臓器である。その主な疾患としては膵臓癌と膵炎とがあり、特に膵臓癌は、近年日本人の死亡率が上昇してきている癌の一つとして知られている。膵臓癌の原因は完全には明らかにされていないが、食生活の欧米化による動物性脂肪やタンパク質、アルコールなどの過剰摂取、或いは喫煙などがリスクファクターであると考えられている他、慢性膵炎、膵石症、糖尿病、急性膵炎の既往のある人も膵臓癌の高危険群であると考えられている。膵臓癌は、外分泌の働きを持つ細胞、特に膵液が流れる膵管の細胞から発生する癌であり、膵臓癌の９０％以上がこのタイプである。膵臓癌は非常に悪性であり、早い段階で他の臓器（特に、肝臓等）への転移が起きることから、早期に発見することが非常に重要である。しかし、膵臓は、胃や十二指腸、脾臓、小腸、大腸、肝臓、胆嚢など多くの臓器に囲まれているため、初期段階の癌を発見することがきわめて困難であり、多くの場合、遠隔転移を起こし、既に治療切除等の可能性を過ぎた進行期になって発見される。
【０００３】
膵臓癌診断のための血中腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＡ１９−９（非特許文献１）、Ｄｕｐａｎ−２（非特許文献２）、ＣＡ−５０（非特許文献３）、Ｓｐａｎ−１（非特許文献４）等が既に開発されている。しかし、これらの腫瘍マーカーは、慢性膵炎や、慢性肝炎、肝硬変などの膵・肝良性疾患でも陽性となり、その特異性の点で問題がある他、特定の膵臓癌に対しては陰性を示すことがあり、膵臓癌を特異的にかつ確実に検出する腫瘍マーカーとしては問題があった。したがって、従来の方法では、広範囲の膵臓癌に対して、早期に、確実に、癌の存在を検出／確認することは困難とされていた。
【０００４】
また、腫瘍細胞に特異的に発現している遺伝子をマーカーとしてを用いることにより、膵臓癌の検出や診断を行う方法がいくつかの特許公報で開示されている。現在までに、ＰＡＮＣＩＡ及びＰＡＮＣＩＢ（特許文献１）や、ＫＣＣＲ１３Ｌ（特許文献２）が膵臓癌マーカー遺伝子として開示されている。また、膵臓癌の細胞の染色体の特異的な部位にＤＮＡの増幅や欠失があることから、該膵癌に特異的な染色体部位の増幅や欠失を検出することによって、膵癌を診断する方法（特許文献３）も提案されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０２９０２号公報
【特許文献２】特願２００３−０４１８４３号公報
【特許文献３】特開２００１−１７１６９号公報
【非特許文献１】Somatic Cell Genet., 5, 957-972、1979
【非特許文献２】Cancer Res., 42, 601, 1982
【非特許文献３】Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 71, 178-181, 1983
【非特許文献４】日外誌, 87, 236, 1986
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新規の膵癌検出用マーカーを利用した膵臓癌の判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、膵胆道良性疾患患者２４例（胆石１６例、膵炎８例）、膵臓癌患者５４例の計７８例の患者より血液を採取し、血漿中のＮ結合型糖鎖に関して質量分析を行った。検出された７４のマススペクトルピークのうち、ＰＡＭ解析の結果から６５の糖鎖を抽出し、これらの６５の糖鎖を用いて膵癌あるいは膵胆道良性疾患の予測を行ったところ、７４％の診断に正答した。さらに、膵胆道良性疾患と膵臓癌との２群間に対してＴ−ｔｅｓｔを行い、有意差（ｐ＜０．０５）を示し、且つ、発現量の差が２倍以上を示す糖鎖として、３０３１ｍ／ｚ及び２３６２ｍ／ｚの２つの糖鎖を特定した。これらの糖鎖を用いた場合の正答率を、６つの分類器により算出した結果、いずれも７０％程度の正答率が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）被検者より採取された血液中の糖タンパクからＮ結合型糖鎖を遊離させる工程と、遊離させた糖鎖を精製する工程と、精製した糖鎖の質量分析を行う工程と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１、２３６２、１３３９、３０４７、２７０３、２０９７、１９５０、１２６６、３１９３、４１７７、２６６３、２６３９、２０５５、２２５９、２５７９、１２０６、２４２８、１９８４、２８１７、１８９３、２２７４、２０７１、２８１４、２２１７、２６９６、１３２４、２２６９、２７４２、２１１２、２０１１、２１７５、２５６３、２１２８、２４２０、２２１４、４０１５、２３１３、１３８１、２６３０、１２０８、１２０３、３３５２、２６８２、３３３８、２６４９、２１２３、２５７４、２３３５、２８８０、１３５１、２６６８、２７２８、４３４０、２４１７、１５０１、１９８９、２７２６、１６７４、１２５９、３３２０、１８２７、１６１９、１８１９、２７２３、及び２１５１のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも１つの糖鎖の検出強度を測定する工程であって、前記検出強度が膵胆道良性疾患患者と比較して低下していることは前記被験者が膵臓癌患者であることを示し、且つ、前記質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、糖鎖補足ビーズ（BlotGlyco（登録商標）for MALDI（住友ベークライト株式会社製））を用いて、遊離させた糖鎖の捕捉及びラベル化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機（Voyager-DETM STR Workstation；Applied Biosystems社製)を用いた場合に得られる値である、工程とを、順次備えたことを特徴とする膵臓癌の判定方法や、（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１及び／又は２３６２である上記（１）に記載の膵臓癌の判定方法や、（３）トリプシン及びＮ-グリコシダーゼＦを用いて、Ｎ結合型糖鎖を遊離させることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の膵臓癌の判定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、血漿中の特定のＮ結合型糖鎖を解析することにより、被検者に大きな負担を掛けることなく、特異性の高い膵臓癌の判定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の膵臓癌の判定方法としては、（１）被検者より採取された血液中の糖タンパクからＮ結合型糖鎖を遊離させる工程；（２）遊離させた糖鎖を精製する工程；（３）精製した糖鎖の質量分析を行う工程；（４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１、２３６２、１３３９、３０４７、２７０３、２０９７、１９５０、１２６６、３１９３、４１７７、２６６３、２６３９、２０５５、２２５９、２５７９、１２０６、２４２８、１９８４、２８１７、１８９３、２２７４、２０７１、２８１４、２２１７、２６９６、１３２４、２２６９、２７４２、２１１２、２０１１、２１７５、２５６３、２１２８、２４２０、２２１４、４０１５、２３１３、１３８１、２６３０、１２０８、１２０３、３３５２、２６８２、３３３８、２６４９、２１２３、２５７４、２３３５、２８８０、１３５１、２６６８、２７２８、４３４０、２４１７、１５０１、１９８９、２７２６、１６７４、１２５９、３３２０、１８２７、１６１９、１８１９、２７２３、及び２１５１のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも１つの糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う工程；とを順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、なかでも、質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１及び／又は２３６２である糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う方法が好ましい。また、本発明の膵臓癌の判定方法に用いるサンプルとしては、被検者より採取された血液由来のサンプルであれば特に制限されるものではなく、血液成分を全て含む全血であっても、血液から分離された血清や血漿等であってもよいが、血清や血漿が好ましく、なかでも、血漿が特に好ましい。
【００１１】
本発明において、Ｎ結合型糖鎖とは、糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のアスパラギン残基が持つ側鎖のアミド基の窒素原子に結合している糖鎖であり、Ｎ型糖鎖やアスパラギン結合型糖鎖とも称される。本発明において、血液中の糖タンパクからＮ結合型糖鎖を遊離させる方法としては、例えば、Ｎ−グリコシダーゼＦ（グリコペプチダーゼ、ＰＮ Ｇａｓｅ、グリカナーゼ、グリコアミダーゼなどとも称される）やグリコペプチダーゼＡ等を用いた酵素法や、ヒドラジン分解法を具体的に例示することができるが、なかでも、Ｎ−グリコシダーゼＦによる酵素法を好例として挙げることができる。その際、トリプシン等のプロテアーゼを併用することもできる。また、本発明において、遊離させた糖鎖を精製する方法としては、試料中の混合物から糖鎖を選択的に捕捉し精製する方法であれば特に制限されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでの高感度測定用に最適化された糖鎖補足ビーズであるBlotGlyco（登録商標）for MALDI（住友ベークライト株式会社製）を用いた方法を好例として具体的に挙げることができる。
【００１２】
また、本明細書において、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」とは、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight（Mass Spectrometer）の略語である。ＭＡＬＤＩ法は、試料をプレート上にスポットした後、マトリクス溶液（2, 5-Dihydroxybenzoic acid）を添加、乾固し、結晶状態にし、パルスレーザー照射により大きなエネルギーをマトリクス上に与え、（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋Ｎａ）＋などの試料由来イオンとマトリクス由来イオンとを脱離させる方法で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、ＭＡＬＤＩ法を利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Ｖで加速される場合、イオンの質量をｍ、イオンの速度をｖ、イオンの電荷数をｚ、電気素量をｅ、イオンの飛行時間をｔとしたとき、イオンのｍ／ｚは、『ｍ／ｚ＝２ｅＶｔ２／Ｌ２』で表すことができる。本発明においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機以外の分析機を使用することもでき、イオン源として、例えば、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等を用いることができ、また、分析法としては、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を用いることができる。さらに、上記分析法と、ＨＰＬＣとを組み合わせて用いることもできる。
【００１３】
本発明において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、３０３１である糖鎖とは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機よる質量分析の結果、３０３１ｍ／ｚマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その予想される構造式としては、例えば、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）６（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）６（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）６＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）１（ＮｅｕＡｃ）４（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）２（ＮｅｕＡｃ）３（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）１（ＮｅｕＡｃ）４＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）４（ＮｅｕＡｃ）２（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）２（ＮｅｕＡｃ）４  ＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）２（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）４（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２等を具体的に挙げることができる。また、上記糖鎖に相当する糖鎖とは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機以外の質量分析機を用いた場合における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いたときの３０３１ｍ／ｚマススペクトルピークを呈する糖鎖と相同の糖鎖を意味する。
【００１４】
本発明において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）が、２３６２である糖鎖とは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機よる質量分析の結果、２３６２ｍ／ｚマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その予想される構造式としては、例えば、（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＧｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２や、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２等を具体的に挙げることができる。また、上記糖鎖に相当する糖鎖とは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機以外の質量分析機を用いた場合における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機を用いたときの２３６２ｍ／ｚマススペクトルピークを呈する糖鎖と相同の糖鎖を意味する。
【００１５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
［血液の採取］
インフォームド・コンセントの得られた、膵胆道良性疾患患者２４例（胆石１６例、膵炎８例）、膵臓癌患者５４例の計７８例の患者より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体（血漿）は連結可能匿名化を行った後、−８０℃で凍結保存した。
【００１７】
［血液サンプルの作製］
タンパク質と修飾糖鎖を遊離させる目的で、血漿をＮ−グリコシダーゼＦ及びトリプシンにより処理した。具体的には、１００μＬの血漿に、純水（１６５μＬ）、１Ｍ重炭酸アンモニウム（２５μＬ）、及び１２０ｍＭ  ジチオスレイトール（２５μＬ）を加え、６０℃で３０分間静置した後、１２３ｍＭ  ヨードアセトアミド（５０μＬ）を加え、室温、遮光下で１時間静置した。続いて、トリプシン（２０００ｕｎｉｔ、２５μＬ）を加え、３７℃で１時間静置した後、８０℃で１５分間加熱することによりトリプシンを変性させた。室温まで冷却させた後に、Ｎ−グリコシダーゼＦ（１０ｕｎｉｔ、１０μＬ）を加え、３７℃でオーバーナイト静置した。８０℃で１５分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量４００μＬの酵素処理血漿サンプルを得た。また、内部標準グルコースオリゴマー（１−２０）（生化学工業  ＃８００１１１）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。上記酵素処理血漿サンプル９５μＬに対し、内部標準糖鎖溶液５μＬ（＝５０μｇ相当）を添加し、全量１００μＬの溶液を調製した。このうち、２０μＬを糖鎖補足ビーズ（BlotGlyco（登録商標）for MALDI（住友ベークライト株式会社製））により処理し、遊離した糖鎖の捕捉、及びラベル化を行った。
【００１８】
[糖鎖分析の結果解析]
ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型分析機（Voyager-DETM STR Workstation；Applied Biosystems社製)により質量分析を行い、得られたマススペクトルから４５４のピークを同定した。このうち、２５％の症例で確認された１０８糖鎖から、内部標準糖鎖などを除外した７４糖鎖を解析対象とし、内部標準と比較することにより各糖鎖の定量化を行った。次に、ＰＡＭ解析（Prediction Analysis for Microarrays）を行い、表１に示す６５の糖鎖を抽出した。これらの６５の糖鎖を用いて、クロスバリデーションを行った結果、７８症例中５８症例（７４％）の診断に正答した（図１）。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
また、表２に示すように、６５の糖鎖を用いたＰＡＭ解析の膵臓癌診断の感度は０．９０７、特異性は０．３７５であった。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
さらに、膵胆道良性疾患と膵臓癌との２群間に対してＴ−ｔｅｓｔを行い、有意差（ｐ＜０．０５）を示し、且つ、発現量の差が２倍以上を示す糖鎖として、３０３１ｍ／ｚ糖鎖、及び２３６２ｍ／ｚ糖鎖の２つの糖鎖を特定した。これら２つの糖鎖の検出強度を、コントロールを基準（１００％）として数値化（％）した結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
また、３０３１ｍ／ｚ糖鎖、及び２３６２ｍ／ｚ糖鎖を用いた場合の正答率を、６つの分類器により算出した結果、いずれも７０％程度の正答率が得られた。下記に、用いた６つの分類器と算出されたそれぞれの正答率を示す。
Compound Covariate Predictor：７３％
Diagonal Linear Discriminant Analysis：７４％
1-Nearest Neighbor Predictor：６７％
3-Nearest Neighbor Predictor：７１％
Nearest Centroid Predictor：７２％
Support Vector Machine Predictor：６７％
また、質量分析の結果得られたシグナルから、GlycoSuite on line database（Proteome Systems）を用いて、糖鎖の構造式を予測した（図３及び４）。以上の結果から、血漿中の３０３１ｍ／ｚ及び２３６２ｍ／ｚ糖鎖を指標として、膵臓癌診断が可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＰＡＭ解析により抽出された６５の糖鎖を用いた場合の正答率を示す図である。
【図２】３０３１ｍ／ｚ及び２３６２ｍ／ｚ糖鎖の正答率を示す図である。
【図３】３０３１ｍ／ｚ糖鎖の予測構造式を示す図である。＊は最も可能性のある構造式を示す。
【図４】２３６２ｍ／ｚ糖鎖の予測構造式を示す図である。＊は最も可能性のある構造式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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