(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する野生型ＭＭＬＶポリメラーゼドメインのアミノ酸配列において、忠実度を増加または増強するように改変または変異されている変異型ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、
Ｔｙｒ６４、Ａｒｇ１１６、Ｌｙｓ１５２、Ｇｌｎ１９０、Ｔｈｒ１９７、およびＰｈｅ３０９からなる群より選択されるアミノ酸位置での少なくとも1つの変異により修飾され、該少なくとも1つの変異がＧｌｎ１９０である場合には、Ｇｌｎ１９０がフェニルアラニンで置換される前記逆転写酵素。
【請求項２】
前記変異が、Ｔｙｒ６４位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項３】
前記Ｔｙｒ６４が、トリプトファンで置換されている、請求項２に記載の逆転写酵素。
【請求項４】
前記変異が、Ａｒｇ１１６位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項５】
前記Ａｒｇ１１６が、メチオニンで置換されている、請求項４に記載の逆転写酵素。
【請求項６】
前記変異が、Ｌｙｓ１５２位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項７】
前記Ｌｙｓ１５２が、アルギニンで置換されている、請求項６に記載の逆転写酵素。
【請求項８】
前記変異が、Ｇｌｎ１９０位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項９】
前記変異が、Ｔｈｒ１９７位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項１０】
前記Ｔｈｒ１９７が、アラニンで置換されている、請求項９に記載の逆転写酵素。
【請求項１１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する野生型ＭＭＬＶポリメラーゼドメインのアミノ酸配列において、忠実度を増加または増強するように改変または変異されている変異型ＭＭＬＶ逆転写酵素であって、Ｖａｌ２２３からＨｉｓ２２３への置換によって修飾される前記逆転写酵素。
【請求項１２】
前記変異が、Ｐｈｅ３０９位での変異である、請求項１に記載の逆転写酵素。
【請求項１３】
前記Ｐｈｅ３０９が、アスパラギンで置換されている、請求項１２に記載の逆転写酵素。
【請求項１４】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を実質的に減少している、請求項１または１２に記載の逆転写酵素。
【請求項１５】
Ａｓｐ５８３、Ｇｌｕ５６２またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸位置で少なくとも1つの変異を含む、請求項１４に記載の逆転写酵素。
【請求項１６】
前記Ａｓｐ５８３が、アスパラギンで置換されている、請求項１５に記載の逆転写酵素。
【請求項１７】
前記Ｇｌｕ５６２が、グルタミンで置換されている、請求項１５に記載の逆転写酵素。
【請求項１８】
ＲＮａｓｅ  Ｈドメインにおいて少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項１または１２に記載の逆転写酵素。
【請求項１９】
Ａｓｐ５８３、Ｇｌｕ５６２またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項１または１２に記載の逆転写酵素。
【請求項２０】
前記Ａｓｐ５８３が、アスパラギンで置換されている、請求項１９に記載の逆転写酵素。
【請求項２１】
前記Ｇｌｕ５６２が、グルタミンで置換されている、請求項１９に記載の逆転写酵素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の分野）
本発明は分子生物学および細胞生物学の分野である。本発明は概して、核酸分子、特に、メッセンジャーＲＮＡ分子の逆転写のための逆転写酵素および方法に関する。特に、本発明は忠実度を増加し、そして／もしくは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を減少させるために変異され、または改変されている逆転写酵素および、それらの逆転写酵素もしくは組成物を使って、核酸分子（特にｃＤＮＡ分子）を生成し、増幅し、もしくは配列決定する方法に関連する。また、本発明はこれらの方法によって生成された核酸分子および、所望のポリペプチドを生成するためのそのような核酸分子の使用に関連する。また、本発明はそのような酵素または組成物を含むキットに関連する。
【０００２】
（発明の背景）
（ｃＤＮＡおよび、ｃＤＮＡライブラリー）
生物、組織または細胞の構造および生理学の実験において、その遺伝内容を決定することが頻繁に望まれている。生物の遺伝的構成は、生物の体細胞および生殖細胞に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ)の中のヌクレオチド塩基の二本鎖配列にコードされている。ＤＮＡ、すなわち遺伝子の特定のセグメントの遺伝内容は、遺伝子がコードしているタンパク質の生成の際にのみ、明らかになる。タンパク質を生成するために、ＤＮＡ二重へリックス（「コード」鎖）の一本鎖の相補的なコピーは、ポリメラーゼ酵素によって生成され、リボ核酸（ＲＮＡ)の特定配列を結果として生じる。この特定のタイプのＲＮＡは、タンパク質を生成するためのＤＮＡからの遺伝情報を含むので、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ)と呼ばれる。
【０００３】
所定の細胞、組織または生物の中で、ｍＲＮＡの種類が無数に存在し、それぞれ別の、および特定のタンパク質をコードしている。この事実は組織または細胞における遺伝子発現の研究に興味がある研究者に強力なツールを提供する。つまり、ｍＲＮＡ分子は単離され、さらに多様な分子生物学技術によって操作され得る。その結果、細胞、組織または生物の完全に機能的な遺伝内容の解明を可能にしている。
【０００４】
遺伝子発現の研究に対する一つの一般的手段は相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ)クローンの生成である。この技術において、生物からのｍＲＮＡ分子は、生物の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離物は頻繁に、チミジン（Ｔ)のオリゴマーが複合体化された固体のクロマトグラフィーマトリックス（例えばセルロースおよびアガロース）を使用する。たいていの真核生物のｍＲＮＡ分子の３’末端がアデノシン（Ａ）塩基の連なり（ｓｔｒｉｎｇ）を含んでおり、かつ、ＡがＴに結合しているので、ｍＲＮＡ分子は、組織または細胞抽出物における他の分子や基質から敏速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが酵素、逆転写酵素（ＲＴ)を使用して作られ得、そして、一本鎖ｃＤＮＡ分子の生成物を結果的に生じる。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって起源のｍＲＮＡの完全な二本鎖ＤＮＡコピー（つまり二本鎖ｃＤＮＡ)（従って、このｍＲＮＡをコードし、生物のゲノムに含まれる起源の二本鎖ＤＮＡ配列のコピー）に転換し得る。次いで、タンパク質特異的な二本鎖ｃＤＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができ、次いで、これらのプラスミドまたはベクターは宿主のバクテリア、酵母、動物または植物細胞に導入される。その宿主細胞は次いで培養培地で増殖され、目的の遺伝子を含んでいる（あるいは多くの場合、発現している）宿主細胞の集団を結果的に生じる。
【０００５】
ｍＲＮＡの単離から、プラスミドまたはベクターへのｃＤＮＡの挿入、単離された遺伝子を含んでいる宿主細胞集団の増殖までの、この全ての過程は「ｃＤＮＡクローニング」と名づけられる。ｃＤＮＡ群が多くの異なるｍＲＮＡから調製される場合、ｃＤＮＡの結果的に生じたセットは、このｃＤＮＡのセットが元の細胞、組織または生物に存在する機能的な遺伝子情報を含む遺伝子の「集団」を意味するので、「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、適切な用語である。これらのｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型の解析は、ｃＤＮＡライブラリーが由来する生物の構造および機能上の多くの情報を生じ得る。
【０００６】
（レトロウイルス逆転写酵素）
レトロウイルスＲＴの３つの典型的な形は、徹底的に研究されている。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性をもった７８ｋＤａの単一のサブユニットを含む。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉの中で完全な活性型としてクローニングされ、そして発現されている（Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．Ｒ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１３５（１９９３）において概説される）。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ)ＲＴはｐ６６およびｐ５１サブユニットのヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーにおいて、より小さなサブユニットがタンパク質分解的な切断によってより大きなサブユニットから誘導される。ｐ６６サブユニットはＲＮＡ性依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの両方をもち、一方でｐ５１サブユニットはＤＮＡポリメラーゼドメインのみをもつ。活性型ＨＩＶｐ６６/ｐ５１ＲＴは、Ｅ．ｃｏｌｉを含め多くの発現宿主においてうまくクローニングされ、そして発現されている（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１６３（１９９３）において概説される）。ＨＩＶｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーの中で、５１ｋＤのサブユニットは触媒的に不活性であり、そして、６６ｋＤサブユニットはＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性の両方をもつ（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：３９５０（１９９１）；Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３１７９（１９９２））。鳥類肉腫−白血症候群ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ  ＲＴ、鳥類脊髄芽球症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ  ＲＴ、鳥類綱内症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ  ＲＴ、鳥類肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ  ＲＴ、鳥類肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ  ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）  ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴが挙げられるが、これらに限定されない）はまた、２つのサブユニット、すなわちα（約６２ｋＤａ)およびβ（約９４ｋＤａ)のヘテロダイマーであり、その中でαはタンパク質分解的な切断によってβから誘導される。（Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．Ｒ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ｐ．１３５において概説される）。ＡＳＬＶ  ＲＴは２つの付加的な触媒の活性構造型、ββおよびαで存在し得る。（Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ．Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７））。沈殿解析はαβおよびββがダイマーであり、そしてα型がモノマー型およびダイマー型との間において平衡状態で存在することを示唆する（Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔ，Ｄ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０：２３０（１９７３）；Ｈｉｚｉ，Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ．Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２（１９９８））。ＡＳＬＶのαβおよびββＲＴは、同じタンパク質の複合体において３つの異なる活性（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性）を含むレトロウイルスＲＴの唯一の公知の例である（Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），ｐ．１９３において概説される）。α型はインテグラーゼドメインおよびその活性を欠く。
【０００７】
ＡＳＬＶ  ＲＴの個々のサブユニットの多様な型がクローニングされ、そして発現されている。これらとしては、通常的にβにタンパク質分解的に処理される９８-ｋＤａの前駆ポリペプチド、およびβカルボキシ末端から取り除かれた４-ｋＤａのポリペプチド（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５３４（１９８７）および  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．ら，Ｆｏｃｕｓ１７：５３（１９９５））、ならびに成熟したβサブユニット（Ｗｅｉｓ，Ｊ．Ｈ．およびＳａｌｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｓ．，米国特許第４，６６３，２９０号（１９８７）；ならびにＳｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２（１９８８））が挙げられる。ヘテロダイマーのＲＳＶαβＲＴもまたクローニングしたＲＳＶβ遺伝子を発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞から精製されている（Ｃｈｅｒｎｏｖ，Ａ．Ｐ．ら，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２：４９（１９９１））。
【０００８】
逆転写酵素の多様なドメインがまた同定されており、例えば、サム（ｔｈｕｍｂ）、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）およびパーム（ｐａｌｍ）の領域である。そのサム領域は、この領域にある変異がフレームシフトの発生を減少することを示しているという点で、特に重要である。
【０００９】
（逆転写の効率と忠実度）
上記のように、ＲＴ媒介の逆転写によるｍＲＮＡのｃＤＮＡへの転換は、クローニングした遺伝子から発現したタンパク質の研究において必須の工程である。しかしながら、逆転写を触媒するための非改変のＲＴの使用は少なくとも２つの理由のために非効率的である。第１に、主にＲＴに存在する内在性のＲＮａｓｅ  Ｈ活性のために、逆転写が開始されるか、または完了する前に、ＲＴは時々、ＲＮＡテンプレートをコピーされ得ないようにする。第２に、ＲＴは概して低い忠実度である。すなわち、ＲＴはｃＤＮＡ合成の間にミスマッチ塩基を取り込み、このように配列エラーを有するｃＤＮＡ産物を生成する。実際、ＲＴはｃＤＮＡ合成中に、ＨＩＶのＲＴで３０００−６０００ヌクレオチドにつき１塩基、およびＡＭＶのＲＴで１００００分の１のヌクレオチドにつき１塩基のエラーを取り込むことが示されている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２３６５−２３７２（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ  らＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７５：５２３（１９９６））。
【００１０】
ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ活性の除去は第１の問題を排除することができ、逆転写の効率を改良し得る（Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら，ＦＯＣＵＳ  １１（４）：６０（１９８９）；Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら，ＦＯＣＵＳ  １４（３）：９１（１９９２））。しかしながら、そのようなＲＴ(「ＲＮａｓｅ  Ｈ」型）は逆転写の忠実度を改良する２つ目の問題に取り組んでいない。本発明はこの必要性に取り組む。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、逆転写酵素、このような酵素を含む組成物、および逆転写の効率の限界を克服することにおいて有用な方法を提供する。一般的に、本発明は、本発明の逆転写酵素活性を有する１以上のポリペプチドを含む、核酸分子の高い忠実度の逆転写における使用のための組成物を提供する。そのような組成物はさらに、１以上のヌクレオチド、適切な緩衝液、および／または１以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。本発明の組成物はまた、１以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。
【００１２】
本発明の逆転写酵素は、好ましくは、酵素の忠実度が増加または増強するように改変または変異される。本発明のさらなる実施形態は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ)活性を減少または排除させるために改変される逆転写酵素を含む。本発明の逆転写酵素は、好ましくは、一つの連なり（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎｅｄ）（シングルサブユニット）もしくは多数の連なり（ｍａｌｔｉ−ｃｈａｉｎｅｄ）（マルチサブユニット）であり、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ活性を減少もしくは実質的に減少させ、ならびに最も好ましくは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）Ｈ−逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）Ｈ−逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）Ｈ−逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）Ｈ−逆転写酵素、骨髄芽球病随伴ウイルス（ＭＡＶ）Ｈ−逆転写酵素、ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ)Ｈ−逆転写酵素、または他のＡＳＬＶ  Ｈ−逆転写酵素からなる群から選択された酵素である。好ましい組成物において、これらの逆転写酵素は、作業濃度で存在する。
【００１３】
本発明の酵素は、マルチマー（例えば、ダイマー）の形成に基づいて、もしくは個々のタンパク質分子（つまり、モノマー型で）としてのいずれかで逆転写酵素活性を示す逆転写酵素を含む。マルチマーの形成に基づく逆転写酵素活性を示す逆転写酵素の例としては、ＡＭＶ、ＲＳＶおよびＨＩＶの逆転写酵素が挙げられる。別個の、個々のタンパク質として逆転写酵素活性を示す逆転写酵素の例としては、Ｍ−ＭＬＶおよびＲＳＶの逆転写酵素が挙げられる。
【００１４】
本発明のマルチマーの逆転写酵素は、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーを形成し得る。言い換えると、マルチマーのタンパク質複合体のサブユニットは同一であってもよいし、異ってもよい。ヘテロダイマーの逆転写酵素の１つの例はＡＭＶ逆転写酵素であり、それは一次アミノ酸配列が異なる２つのサブユニットから構成される。さらに具体的には、すでに議論したように、ＡＭＶの逆転写酵素は２つのサブユニットから構成され得、その中でこれらのサブユニットの１つは、もう１つのサブユニットのタンパク質分解プロセシングによって発生する。このように、ダイマーのＡＭＶの逆転写酵素はアミノ酸配列同一性の領域を共有した異なるサイズのサブユニットから構成され得る。
【００１５】
本発明は、特に変異もしくは改変された逆転写酵素に関連し、その中で１以上のアミノ酸変化が行われ、これらの変化により、核酸合成において、酵素がより忠実な（高い忠実度）酵素になる。高い忠実度のポリメラーゼを産生するための、変異もしくは改変のための好ましい部位は、表１でいくつかの逆転写酵素について列挙される。他の逆転写酵素の中の類似もしくは等価の部位、また対応する部位は高い忠実度の逆転写酵素を産生するために変異され得る。
【００１６】
（表１：）
ＲＴ        アミノ酸
Ｍ−ＭＬＶ  Ｙ６４、Ｒ１１６、Ｋ１５２、Ｑ１９０、Ｔ１９７、Ｖ２２３、Ｄ
１２４、Ｈ１２６、Ｙ１３３
ＡＭＶ      Ｗ２５、Ｒ７６、Ｋ１１０、Ｑ１４９、Ｔ１５６、Ｍ１８２
ＲＳＶ      Ｗ２５、Ｒ７６、Ｋ１１０、Ｑ１４９、Ｔ１５６、Ｍ１８２
ＨＩＶ      Ｗ２４、Ｒ７８、Ｇ１１２、Ｑ１５１、Ａ１５８、Ｍ１８４
本発明はさらに、以下の変異を有するＭ−ＭＬＶ  ＲＴを含む：Ｖ２２３Ｈ、Ｑ１９０Ｆ、Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｅ、Ｙ６４Ｗ、Ｒ１１６ＭおよびＫ１５２Ｒならびに対応する変異もしくは改変を有する他のＲＴ。
【００１７】
本発明はまた、変異もしくは改変された逆転写酵素に関し、その中で１以上のアミノ酸変化が行われ、これらのアミノ酸変化は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を減少または排除する。これらの変異のための好ましい部位としては、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴのＦ３０９、Ｔ１９７およびＹ１３３が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴの特定の変異もしくは特定の改変は、本明細書中に記載されたアッセイ方法によって検出できないレベルにＴｄＴ活性を減少させるＴ１９７Ｅ、ならびにＴｄＴ活性を、より低い度合いまで減少させるＴ１９７Ａが挙げられる。他の逆転写酵素において、類似もしくは等価の部位、または対応した部位は、ＴｄＴ活性の減少、実質的な減少、もしくは排除を伴う逆転写酵素を生成するために変異され得る。このような等価の部位の例としては、ＨＩＶ  ＲＴのＷ２６６およびＩ９４、ＡＭＶ  ＲＴのＷ２６７およびＡ９５ならびにＲＳＶ  ＲＴのＷ２６７およびＡ９５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ、ＨＩＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴまたはＲＳＶ  ＲＴを含まなくてもよい。このように、例えば、ある実施形態において、本発明は、ＨＩＶ  ＲＴではない、増加した忠実度を伴うＲＴを含む。
【００１９】
本発明はまた、変異または改変された本発明の逆転写酵素をコードしている遺伝子または核酸分子を含むＤＮＡ分子（好ましくはベクター）、ならびにこのようなＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。原核生物細胞および真核生物細胞を含め、多くの宿主は、目的の遺伝子もしくは核酸分子を発現するために使用され得る。好ましくは、原核生物細胞が本発明のポリメラーゼを発現するために使用される。本発明に従う好ましい原核生物の宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【００２０】
本発明はまた、本発明の逆転写酵素を生成する方法に関連し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）本発明の逆転写酵素をコードしている遺伝子もしくは核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程(好ましくは、このようなＲＴ遺伝子は宿主細胞の中のベクターによって含まれる）；
（ｂ）この遺伝子もしくは核酸分子を発現する工程；ならびに
（ｃ）この宿主細胞から、この逆転写酵素を単離する工程。
【００２１】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子を作る方法に関し、この方法は、１以上の核酸テンプレート（好ましくは１以上のＲＮＡテンプレート、そして最も好ましくは、１以上のメッセンジャーＲＮＡテンプレート）と本発明の１以上の逆転写酵素とを混合する工程、ならびにこの１以上の核酸テンプレートの全てもしくは一部に相補的な第一の核酸分子を作るために十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程を包含する。好ましい実施形態において、第１の核酸分子は一本鎖のｃＤＮＡである。本発明のこの局面に従って、逆転写のための適切な核酸テンプレートは、任意の核酸分子もしくは核酸分子の集団（好ましくはＲＮＡ、および最も好ましくはｍＲＮＡ）、特に、細胞または組織に由来するものを含む。好ましい局面において、本発明に従って、ｍＲＮＡ分子の集団（代表的に細胞または組織から得られた多くの異なるｍＲＮＡ分子）はｃＤＮＡライブラリーを作るために使われる。核酸テンプレートの好ましい細胞供給源としては、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、１以上の二本鎖の核酸分子を作るための方法に関連する。このような方法は、（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくはＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、そしてさらに好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集団）と、本発明の１以上の逆転写酵素とを混合する工程；（ｂ）１以上のテンプレートの全てもしくは一部に相補的な第１核酸分子を作るために十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程；ならびに（ｃ）第１核酸分子の全てもしくは一部に相補的な第２核酸分子を作るために十分な条件下で、第１核酸分子をインキュベートし、それによって、第１および第２の核酸分子を含んでいる１以上の二本鎖の核酸分子を形成する工程、を包含する。このような方法は、１以上の二本鎖の核酸分子を作るための過程の一部として、１以上のＤＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。本発明はまた、これらの二本鎖の核酸分子を作るために有用な組成物に関連する。このような組成物としては、本発明の１以上の逆転写酵素、および必要に応じて１以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１以上のプライマー、および／または１以上のヌクレオチドが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、核酸分子を増幅するための方法に関連する。このような増幅の方法は、上記に述べたように生成された二本鎖の核酸分子と、１以上のＤＮＡポリメラーゼとを混合する工程、ならびに二本鎖の核酸分子を増幅するために十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程、を包含する。第１の好ましい実施形態においては、本発明は核酸分子を増幅するための方法に関連し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは１以上のＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡテンプレート、そしてより好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集団）と、本発明の１以上の逆転写酵素および１以上のＤＮＡポリメラーゼとを混合する工程、ならびに（ｂ）１以上のテンプレートの全ておよび一部に相補的な核酸分子を増幅するために十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程。好ましくは、逆転写酵素はＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少または実質的に減少され、そしてＤＮＡポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１のＤＮＡポリメラーゼ、および実質的に減少された３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明はまた、本発明の１以上の逆転写酵素、および増幅反応において使用するための１以上のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物に関連する。このような組成物はさらに、１以上のヌクレオチドおよび／または増幅に適切した緩衝液を含み得る。本発明の組成物はまた、１以上のオリゴヌクレオチドのプライマーを含み得る。
【００２４】
本発明はまた、核酸分子（特に、一本もしくは二本鎖のｃＤＮＡ分子）または上記に述べた方法に従って生成されて増幅された核酸分子、およびこれらの核酸分子もしくは増幅された核酸分子を含んでいるベクター（特に、発現ベクター）に関する。
【００２５】
本発明はまた、上記に述べられた核酸分子、増幅された核酸分子もしくはベクターを含んでいる組換え宿主細胞に関する。好ましいこのような宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞（昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の方法によって生成される核酸分子によってコードされたポリペプチドを生成する方法に関する。このような方法は、上記に述べられた組換え宿主細胞を培養する工程、およびコードされたポリペプチドを単離する工程、を包含する。そして本発明は、このような方法によって産生されたポリペプチドに関する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の組成物または酵素を使用し、１以上の核酸分子を配列決定するための方法に関連する。具体的な実施形態において、このような方法は、（ａ）配列決定される核酸分子（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子）と１以上のプライマー、本発明の１以上の逆転写酵素、１以上のヌクレオチドおよび１以上の終結因子（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば１つ以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸）とを混合する工程；（ｂ）配列決定される１以上の核酸分子の全てもしくは一部に相補的な核酸分子の集団を合成するために十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）配列決定される１以上の核酸分子の全てもしくは一部のヌクレオチド配列を決定するために、核酸分子の集団のメンバーを分離する工程、を包含する。
【００２８】
他の実施形態において、このような方法は、（ａ）配列決定される核酸分子（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子）と１以上のプライマー、本発明の１以上の逆転写酵素、１以上のヌクレオチド、および１以上の終結因子（例えば、１以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸）とを混合する工程；（ｂ）配列決定される核酸分子の全てもしくは一部に相補的な核酸分子の集団を合成するために十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）配列決定される核酸分子の全てもしくは一部のヌクレオチド配列を決定するために、核酸分子の集団を分離する工程、を包含する。
【００２９】
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットに関する。そのようなキットは、核酸分子（一本、または二本鎖）を作製し、配列決定し、または増幅するために使われ得る。本発明のキットは、バイアル、管、ボトルなどのような、１以上の容器を有する、緊密に拘束する箱またはカートンようなキャリアを含む。本発明のキットにおいて、第１の容器は、本発明の１以上の逆転写酵素を含む。本発明のキットはまた、同じ、もしくは異なる容器の中に、１以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ）、核酸合成のための１以上の適切な緩衝液、および１以上のヌクレオチドを含み得る。あるいは、このキットの構成要素は、別個の容器の中に分割され得る（例えば、酵素および／または組成物の各々に対して１つの容器）。本発明のキットはまた、本発明の方法を実行するための取扱説明書およびプロトコールを含み得る。本発明の好ましいキットにおいては、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成の忠実度が増加および／または増強されるように、改変もしくは変異され、その逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性において、減少または実質的に減少され、そして最も好ましくは、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、およびＨＩＶ  Ｈ−逆転写酵素からなる群から選択される。本発明のさらに好ましいキットにおいて、その容器の中の酵素（逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）は作業濃度で存在する。
【００３０】
本発明の逆転写酵素は、（１）増強された忠実度、または（２）減少もしくは排除された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性をもっている任意の逆転写酵素を含む。逆転写酵素は、単鎖、または複鎖であり得る。そのような逆転写酵素としては、レトロウイルスの逆転写酵素、細菌の逆転写酵素、レトロトランスポゾンの逆転写酵素、および逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。本発明の好ましい逆転写酵素としては、シングルサブユニットの逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ）、およびマルチサブユニットの逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ  ＲＴ）、ならびに好ましくは、レトロウイルスのＲＴが挙げられる。特に、本発明はＭ−ＭＬＶ  ＲＴ、およびＡＳＬＶ  ＲＴ（ＡＭＶ−ＲＴおよびＲＳＶ−ＲＴのような）に関連する。本発明のこのような逆転写酵素は、好ましくは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を減少または実質的に減少している。
【００３１】
本発明の他の好ましい実施形態は、本発明の以下の図面および説明、および特許請求の範囲に鑑みて、当業者に明らかである。
【００３２】
（詳細な説明）
以下の説明において、組換えＤＮＡ、ウイルス学および免疫学に使用される多くの用語が、広く利用される。このような用語により与えられる範囲を含む、明確かつ矛盾のない明細書および特許請求の範囲の理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００３３】
クローニングベクター。プラスミド、コスミドもしくはファージＤＮＡもしくは他のＤＮＡ分子であり、これは、これらは、宿主細胞の中で、自己複製することが可能であり、そしてこれは、１つもしくは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（この部位でこのようなＤＮＡ配列は、ベクターの必須な生物的機能の損失なしに決定できる様式で切断され得る）によって特徴づけられ、そしてこれらのＤＮＡ分子のなかで、ＤＮＡの複製およびクローニングをもたらすためにベクター中にスプライシングされ得る。そのクローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定において使用するための適切なマーカーを含み得る。例えば、マーカーはテトラサイクリン耐性、またはアンピシリン耐性である。
【００３４】
発現ベクター。このベクターは、クローニングベクターに類似しているが、宿主に形質転換された後、ベクターにクローン化されている遺伝子または核酸分子の発現を増強することが可能である。そのクローン化された遺伝子または核酸分子は、プロモーター配列のような、特定の制御配列の制御下（すなわち、作動可能にそれに連結した）で、通常、配置される。
【００３５】
組換え宿主。発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子において、所望のクローン化された遺伝子または核酸分子を含む任意の原核生物または真核生物または微生物。「組換え宿主」という用語はまた、宿主の染色体またはゲノム上の所望された遺伝子または核酸分子を含むように遺伝子操作されているこれらの宿主細胞を含むことを意味している。
【００３６】
宿主。複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子のレシピエントである任意の原核生物または真核生物微生物。そのＤＮＡ分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製の起点を含み得るが、これらに限定されない。
【００３７】
プロモーター。一般的に、遺伝子の５’領域として記載され、開始コドンの近位に位置されるＤＮＡ配列。プロモーター領域では、隣接する遺伝子の転写が開始される。
【００３８】
遺伝子。ポリペプチドもしくはタンパク質の発現のために必要な情報を含むＤＮＡ配列。それは、プロモーターおよび構造遺伝子ならびにタンパク質の発現に関連する他の配列を含む。
【００３９】
構造遺伝子。メッセンジャーＲＮＡに転写され、次いで特定のポリペプチドに特有なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。
【００４０】
作動可能に連結される。本明細書中で使用される場合、プロモーターが、構造遺伝子または他の核酸分子によってコードされたポリペプチドの発現の開始を制御するように位置づけられることを意味する。
【００４１】
発現。発現は、遺伝子または他の核酸分子が、発現によりポリペプチドを生成するプロセスである。それは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子または核酸分子の転写、およびポリペプチドへのそのようなｍＲＮＡの翻訳を含む。
【００４２】
実質的に純粋。本明細書中で使用される「実質的に純粋」とは、所望の、精製されたタンパク質が、天然で必要とされるタンパク質に関連する細胞の夾雑物の混入が、本質的にないことを意味する。汚染細胞成分としては、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、もしくは所望でないＤＮＡポリメラーゼ酵素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい逆転写酵素は、実質的に純粋である。
【００４３】
プライマー。本明細書中で使用される「プライマー」とは、ＤＮＡ分子の増幅または重合中に、ヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖のオリゴヌクレオチドをいう。
【００４４】
テンプレート。本明細書中で使用される「テンプレート」という用語は、増幅、コピーまたは配列決定される二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう。二本鎖ＤＮＡ分子の場合において、一本鎖化した第１および第２の鎖を形成するための二本鎖の解離は、それらの分子が増幅、コピーまたは配列決定され得る前に、実行される。核酸テンプレートの部分に相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、そして本発明の逆転写酵素は、次いで、上記のテンプレートまたはそのテンプレートの一部分に相補的なＤＮＡ分子を合成し得る。本発明に従うと、新たに合成されたＤＮＡ分子は、長さにおいては、オリジナルのテンプレートと同等、もしくはこのテンプレートより短くなり得る。新たに合成されたＤＮＡ分子の合成および伸長中でのミスマッチの取り込みは、１以上のミスマッチした塩基対という結果になり得る。このように、合成されたＤＮＡ分子は、テンプレートに対し、正確に、相補的になる必要はない。
【００４５】
取り込み。本明細書中で使用される「取り込む」という用語は、ＤＮＡ分子もしくはプライマーの一部になることを意味する。
【００４６】
オリゴヌクレオチド。「オリゴヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位とその隣接したヌクレオチドのペントースの５’位との間のホスホジエステル結合によって連結される、共有的に結合したヌクレオチドの配列を含んでいる合成もしくは天然の分子という。
【００４７】
ヌクレオチド。本明細書中で使用される「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせをいう。ヌクレオチドは核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマーの単位であり、そしてデオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡに「取り込まれる」。そのヌクレオチドという用語は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、もしくはその誘導体のようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。例えば、そのような誘導体としては［ａＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、および７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。本明細書中で使用されるヌクレオチドという用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、およびそれらの誘導体をいう。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の明らかにされた例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従うと、「ヌクレオチド」は、周知の技術によって、標識されなくても、検出可能に標識されてもよい。例えば、検出可能な標識としては、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【００４８】
ハイブリダイゼーション。「ハイブリダイゼ−ション」および「ハイブリダイズする」という用語は、二本鎖の核酸分子を与える２つの相補的な一本鎖の核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）が対形成することをいう。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、ハイブリダイズされ得るとはいえ、塩基対形成は、完全に相補的ではない。従って、ミスマッチした塩基は、当該分野で周知の、適切な状態が用いられるならば、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【００４９】
末端伸長。本明細書中で使用される場合、末端伸長は、ｍＲＮＡテンプレートの５’末端を越えて、新たに合成されたｃＤＮＡ鎖の３’末端上に、さらなる塩基を付加するための逆転写酵素（ＲＴ）の能力をいう。その活性は、特異的に（ヌクレオチドの偏りをともない）、もしくはランダムに塩基を付加し得る。
【００５０】
末端伸長活性はまた、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性として公知である。ＴｄＴ活性を減少もしくは排除している逆転写酵素は、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性より低いＴｄＴの活性をもっている任意の逆転写酵素として定義され、特に、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約７５％より少なく、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約５０％より少なく、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約２５％より少なく、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約１５％より少なく、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約１０％より少なく、対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約５％より少なく、あるいは対応している未成熟の、非改変の、または野生型の酵素の比活性の約１％より少ない。排除されたＴｄＴ活性は、実施例３において利用されたアッセイ方法によって検出できない活性のレベルとして定義される。
【００５１】
ストランドジャンピング（Ｓｔｒａｎｄ  ｊｕｍｐｉｎｇ）。本明細書中で使われるストランドジャンピングとは、ｃＤＮＡを結果として生じることにおいて、対応しているヌクレオチドの欠失として生じる、ｍＲＮＡ上の１より多い（例えば、２、５、１０、５０、１００等）ヌクレオチドのＲＴ「スキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）」によって引き起こされる１つのランダム変異の型をいう。
【００５２】
ハンドドメイン。本明細書中で使われるハンドドメインとは、テンプレート、プライマー、もしくは逆転写酵素のヌクレオチド相互作用を制御する領域に存在するこれらのアミノ酸をいう。このドメインはさらに、逆転写酵素における二次構造の３つの領域（サム、フィンガー、およびパーム領域）の群によって特徴づけられる。サムのドメインは、ＨＩＶ  ＲＴのアミノ酸２４０−３１５の間、もしくはＭ−ＭＬＶ  ＲＴのアミノ酸２８０−３５５の間に存在するものとして定義される。フィンガーのドメインは、ＨＩＶ  ＲＴのアミノ酸１−８５および１２０−１５４の間、もしくはＭ−ＭＬＶ  ＲＴのアミノ酸１−１２４および１６１−１９３の間に存在するものとして定義される。パーム領域は、ＨＩＶ  ＲＴのアミノ酸８６−１９９および１５５−２３９の間、もしくはＭ−ＭＬＶ  ＲＴのアミノ酸１２５−１６０および１９３−２７９の間に存在するものとして定義される。概して、これらの領域は定義され、そしてＮ末端およびＣ末端を規定するアミノ酸は隣接する。対応した領域はまた、他の逆転写酵素に関して定義され得る。
【００５３】
忠実度。忠実度は、ポリメライゼーションの忠実度、もしくはテンプレートに相補的な核酸分子を合成しているときに、不正確な基質（例えば、ヌクレオチド）から正確な基質を識別するための逆転写酵素の能力をいう。核酸合成中に鎖を伸ばすことにおいて、逆転写酵素の忠実度が高くなるにつれて、逆転写酵素はヌクレオチドの誤取り込みを少なくする；すなわち、忠実度における増加または増強は、エラー比率を減らし、もしくは誤取り込み比率を減らす、より忠実な逆転写酵素を生じる。
【００５４】
増加した／増強した／より高い忠実度をもっている逆転写酵素は、忠実度において、任意の増加をもっているポリメラーゼとして定義され、好ましくは、コントロールの逆転写酵素と比較して与えられた長さの任意の与えられた核酸分子の合成中に、誤取り込みされたヌクレオチドの数において、約１．５から約１０，０００倍、約２から約５０００倍、もしくは約２から約２０００倍（好ましくは、約５倍より多く、さらに好ましくは、約１０倍より多く、いっそう、さらに好ましくは、約５０倍より多く、いっそう、さらに好ましくは、約１００倍より多く、いっそう、さらに好ましくは、約５００倍より多く、ならびに最も好ましくは、約１００倍より多い）の減少である。好ましくは、本発明の変異ＲＴもしくは改変されたＲＴは、忠実度において相対的増強または増加を決定するための、対応している非改変もしくは野生型のＲＴと比較される。例えば、変異された逆転写酵素は、１０００塩基の核酸分子セグメント合成において、１０のヌクレオチドを誤取り込みする変異していない逆転写酵素と比較して、同じ大きさのセグメントの合成において、１のヌクレオチドを誤取り込みし得る。このような変異逆転写酵素は、１０倍の忠実度の増加をもつと言われる。
【００５５】
忠実度はまた、実施例５で説明されるように、フレームシフトの発生率の減少によって測定され得る。増加された忠実度をもつ逆転写酵素は、コントロールの逆転写酵素（例えば、野生型ＲＴ）と比較して、フレームシフトに関する忠実度の任意の増加をもつポリメラーゼまたは逆転写酵素（例えば、フレームシフトに関して約１．５倍より大きい増加された忠実度、フレームシフトに関して約５倍より大きい増加された忠実度、フレームシフトに関して約１０倍より大きい増加された忠実度、フレームシフトに関して約２０倍より大きい増加された忠実度、フレームシフトに関して約３０倍より大きい増加された忠実度、もしくはフレームシフトに関して約４０倍より大きい増加された忠実度をもつ逆転写酵素）として定義される。
【００５６】
増加した／増強した／高い正確度を有する逆転写酵素はまた、フレームシフティングの観点から、例えば約１．５倍から約１０，０００倍、約２倍から約５，０００倍、約２倍から約２，０００倍、約１．５倍から約４０倍、約５倍から約４０倍、約１０倍から約４０倍、約２０倍から約４０倍、約３０倍から約４０倍、約５倍から約３０倍、約１０倍から約３０倍、約１５倍から約３０倍、約２０から約３０倍、約５倍から約２０倍、約１０倍から約２０倍、約１５倍から約２０倍約１０倍から約１００倍、約１５倍から約１００倍、約２０倍から約１００倍、約１０倍から約１００倍、約３０倍から約１００倍、または約５０倍から約１００倍などの、正確度における任意の増加を有する逆転写酵素またはポリメラーゼとして規定され得る。
【００５７】
減少した誤った取り込みを有する逆転写酵素は、対応する未変異酵素、未改変酵素または野生型酵素と比較して、約５０％もしくは５０％未満、または好ましくは約２５％もしくは２５％未満、より好ましくは、約１０％もしくは１０％未満、そして最も好ましくは、約１％もしくは１％未満の相対的な誤った取り込みを好ましくは有する変異または改変された逆転写酵素のいずれかとして、本明細書中で規定される。
【００５８】
逆転写酵素の忠実度または誤った取り込みの速度は、配列決定法または当該分野において公知の他の方法によって決定され得る（ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ、１９９０、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３７３９〜３７４４）。一つの例において、未変異の逆転写酵素および変異した逆転写酵素によって合成されたＤＮＡ分子の配列は、予測された（既知の）配列と比較され得る。このようにして、誤りの数（誤った取り込みまたはフレームシフト）が、各々の酵素について決定され得、そして比較され得る。別の例において、この未変異の逆転写酵素および変異した逆転写酵素を使用して、既知の配列を有するＤＮＡ分子を配列決定し得る。配列決定の誤り（誤った取り込みまたはフレームシフト）の数は、比較されて、この酵素の忠実度または誤った取り込みの速度を決定し得る。忠実度または誤った取り込みの速度を決定する他の手段は、以下およびＢｏｙｅｒ  Ｊ．Ｃ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７５：５２３（１９９６）において以前に記載されるようなＲＮＡテンプレートを用いた急進的な相補性アッセイを含み、そして本実施例に示される。忠実度または誤った取り込みの速度を決定する他の方法は、当業者によって認識される。
【００５９】
一般に、本発明は、逆転写酵素をより効率的にする（すなわち、より高い忠実度を有する）１つ以上の変異または改変を有する逆転写酵素を含む核酸分子の逆転写における使用についての組成物を提供する。本発明はまた、ＴｄＴ活性を減少する１つ以上の変異または改変を有する逆転写酵素を含む核酸分子の逆転写における使用についての組成物を提供する。
【００６０】
これらの組成物における酵素は、好ましくは、作用濃度で存在し、そしてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を減少するかまたは実質的に減少する。あるいは、本発明の組成物において使用されるこの逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有し得る。好ましく変異または改変された逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、およびＭＡＶ逆転写酵素または他のＡＳＬＶ逆転写酵素、あるいはそれらの対応するＲＮａｓｅ  Ｈ−誘導体に由来する。
【００６１】
本発明に従って、任意の数の変異が、ＲＴに作製され得、そして好ましい局面において、複数の変異が作製されて、さらなる忠実度の増大をもたらし得る。このような変異としては、点突然変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が挙げられ、１つ以上の点突然変異が好ましい。好ましくは、オリゴヌクレオチドフィンガー向性変異誘発が用いられて、変異体ポリメラーゼを作製し、このポリメラーゼは、コードＤＮＡ分子に沿った任意の所定の部位で、あらゆる可能なクラスの塩基対変化を可能にする。一般に、この技術は、オリゴヌクレオチド相補体（１つ以上のミスマッチを除く）の、目的のＲＴについてコードする一本鎖のヌクレオチド配列へのアニーリングを含む。次いで、このミスマッチのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、１つの鎖において、所望の配列変化を含む二本鎖ＤＮＡ分子を作製する。この配列変化は、もちろん、アミノ酸の欠失、置換または挿入をもたらし得る。次いで、この二本鎖ポリヌクレオチドが、適切な発現ベクターに挿入され得、それ故、変異体または改変ポリペプチドが産生され得る。上記のオリゴヌクレオチドフィンガー向性変異誘発は、もちろん、ＰＣＲを介して行われ得る。
【００６２】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子の逆転写についての方法に関し、これは、１つ以上の核酸テンプレート（これは、好ましくは、ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、そしてより好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団である）を、本発明の変異体逆転写酵素と混合する工程、およびこの混合物を、核酸分子または１つ以上のテンプレートのすべてもしくは一部分に相補的な分子を作製するに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。核酸分子または１つ以上のテンプレートに相補的な分子を作製するために、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）および１つ以上のヌクレオチドを、３’から５’方向における核酸合成について使用する。本発明のこの局面に従った逆転写に適切な核酸分子は、任意の核酸分子、特に、原核生物細胞または真核生物細胞由来の核酸分子を含む。このような細胞は、正常細胞、罹病細胞、形質転換細胞、確立された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）細胞、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、胎児細胞、胚性細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）、トリ細胞、植物細胞など、または植物もしくは動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥、魚、昆虫など）から単離された組織を含み得る。このような核酸分子はまた、ウイルスから単離され得る。
【００６３】
本発明は、さらに、核酸分子の増幅または配列決定についての方法を提供し、これは、この核酸分子を本発明の逆転写酵素と接触させる工程を包含する。好ましいこのような方法は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
【００６４】
（逆転写酵素の供給源）
本発明の組成物、方法およびキットにおける使用についての酵素は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を含む。このような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌性逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）およびそれらの変異体、フラグメント、改変体または誘導体が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、共有に係わる米国特許第５，９４８，６１４号および同第６，０１５，６６８号（これらは、本明細書中でそれらの全体において参考として援用される）を参照のこと）。本発明における使用についての好ましい逆転写酵素としては、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴ、ＲＡＶ  ＲＴ、ＭＡＶ  ＲＴおよび一般にＡＳＬＶ逆転写酵素が挙げられる。当業者によって理解されるように、改変された逆転写酵素は、当該分野において慣用的および周知の組換え技術または遺伝子操作技術によって得られ得る。変異体逆転写酵素は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはランダム変異誘発によって、目的の逆転写酵素をコードする遺伝子を変異することによって得られ得る。このような変異は、点突然変異、欠失変異および挿入変異を含み得る。好ましくは、１つ以上の点突然変異（例えば、１つ以上の異なるアミノ酸での１つ以上のアミノ酸の置換）を用いて、本発明の変異体逆転写酵素を構築する。逆転写酵素のフラグメントは、当該分野において慣用的および周知の組換え技術による欠失変異、または任意の多くの周知のタンパク質分解酵素を用いた、目的の逆転写酵素の酵素的消化によって得られ得る。
【００６５】
本発明における使用についての好ましい酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少または実質的に減少される酵素を含む。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少または実質的に減少されるような酵素は、目的の逆転写酵素内部のＲＮａｓｅ  Ｈドメインを変異させることによってか、好ましくは、上記のような１つ以上の点突然変異、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によって得られ得る。「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が実質的に減少した」酵素によって、酵素が、対応する野生型またはＲＮａｓｅ  Ｈ＋酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の逆転写酵素）の約３０％未満、約２５％、２０％未満、より好ましくは、約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％未満、そして最も好ましくは、約５％未満または約２％未満のＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有するか、あるいはこのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く酵素が意味される。減少または実質的に減少したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有するＲＴは、以前に記載されている（米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号；ならびにＷＯ９８／４７９１２を参照のこと）。任意の酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号；Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；ならびにＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）において記載されるような種々のアッセイによって決定され得、これらのすべての開示は、本明細書中において参考として完全に援用される。
【００６６】
本発明における使用についての特に好ましい変異または改変された酵素としては、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ−逆転写酵素およびＨＩＶ  Ｈ−逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、当業者によって、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少または実質的に減少された、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を産生し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が、本発明の組成物、方法およびキットにおいて等しく使用され得ることが理解される。
【００６７】
本発明における使用についての逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知の天然のタンパク質の単離および精製についての標準的な手順に従って、天然のウイルスまたは細菌供給源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６；２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。
【００６８】
本発明の好ましい局面において、変異体または改変された逆転写酵素は、組換え技術によって作製される。多くのクローニングされた逆転写酵素遺伝子は、入手可能であるか、または標準的な組換え技術を用いて得られ得る（米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号；ならびにＷＯ９８／４７９１２を参照のこと）。
【００６９】
本発明に従って改変された逆転写酵素をコードする遺伝子をクローニングするために、逆転写酵素遺伝子を含む単離されたＤＮＡを用いて、ベクターにおいて組換えＤＮＡライブラリーを構築する。当該分野で周知の任意のベクターを使用して、目的の逆転写酵素をクローニングし得る。しかし、用いるベクターは、組換えＤＮＡライブラリーが形質転換される宿主に適合しなければならない。
【００７０】
プラスミドライブラリーの構築についての原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ−ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））のような）において複製可能であるようなプラスミドが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇｌｙｃｚａｎ，Ｔ．：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｙｏｒｋ（１９８２）、３０７−３２９によって開示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：４１７７−４１８３（１９８７）が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドは、Ｊｏｈｎら（Ｒａｄ．Ｉｎｓｅｃ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））およびＩｇａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８））によって概説される。広範な宿主範囲のプラスミドまたはコスミド（例えば、ｐＣＰ１３（ＤａｒｚｉｎｓおよびＣｈａｋｒａｂａｒｂａｒｙ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：９−１８、１９８４）もまた、本発明について使用され得る。本発明の遺伝子のクローニングについての好ましいベクターは、原核生物ベクターである。好ましくは、ｐＣＰ１３およびｐＵＣベクターを用いて、本発明の遺伝子をクローニングする。
【００７１】
目的の逆転写酵素遺伝子のクローニングについての好ましい宿主は、原核生物宿主である。最も好ましい原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。しかし、本発明の所望の逆転写酵素遺伝子は、他の原核生物宿主（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＰｒｏｔｅｕｓを含むが、これらに限定されない）においてクローニングされ得る。特定の目的の細菌宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂが挙げられ、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得られ得る。
【００７２】
目的の逆転写酵素のクローニングおよび発現についての真核生物宿主としては、酵母、真菌および哺乳動物細胞が挙げられる。このような真核生物細胞における所望の逆転写酵素の発現は、真核生物の制御領域（真核生物のプロモーターを含む）の使用を必要とし得る。真核生物細胞における逆転写酵素遺伝子のクローニングおよび発現は、周知の真核生物のベクター系を用いた周知技術によって達成され得る。
【００７３】
一旦、ＤＮＡライブラリーが、特定のベクター中に構築されると、適切な宿主が、周知技術によって形質転換される。形質転換されたコロニーを、１ペトリ皿当たり約２００〜３００コロニーの密度でプレーティングする。次いで、逆転写酵素の選択について、コロニーを、以下の実施例に記載されるように、逆転写酵素の発現についてスクリーニングする。手短に言えば、個々の形質転換細胞コロニーの一晩の培養物を、標識されたデオキシヌクレオチドを用いてＲＴについて直接アッセイし、そして標識された産物の存在について分析する。ＲＴ活性が検出されると、この変異体が配列決定されて、どのアミノ酸が、検出可能なＲＴ活性を維持したかを決定する。本発明の逆転写酵素をコードする遺伝子は、当業者に公知の技術を用いてクローニングされ得る。
【００７４】
（ポリメラーゼの改変または変異）
好ましくは、ポリメラーゼドメイン（すなわち、本明細書中に規定されるようなフィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）領域、パーム（ｐａｌｍ）領域、サム（ｔｈｕｍｂ）領域）、特に、目的の逆転写酵素のテンプレート、プライマーまたはヌクレオチド相互作用を制御する領域に存在するアミノ酸を、増大または増強された忠実度（減少した誤った取り込みの速度）および／または減少したＴｄＴ活性を有する、変異または改変された逆転写酵素を産生するような様式において、改変または変異する。改変または変異はまた、本発明に従って、他の領域に作製され得る。１つ以上の変異が、本発明に従って、忠実度を増大するかまたは酵素のＴｄＴ活性を減少するために、任意の逆転写酵素において作製され得る。このような変異は、点突然変異、フレームシフト変異、欠失および挿入を含む。好ましくは、１つ以上の点突然変異（１つ以上のアミノ酸置換をもたらす）が使用されて、増強または増大された忠実度、あるいは減少または排除されたＴｄＴ活性を有する逆転写酵素を産生する。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素におけるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドに基づき、このペプチドにおいて、Ｎ末端メチオニンは、タンパク質分解的に除去されている。本発明の好ましい局面において、Ｍ−ＭＬＶのＹ６４位、Ｒ１１６位、Ｄ１５２位、Ｑ１９０位、Ｔ１９７位、Ｄ１２４位、Ｈ１２６位、Ｙ１３３位およびＶ２２３位に等しいかまたは対応する位置での１つ以上の変異が作製されて、増大した忠実度を有するＲＴを産生し得る。最も好ましくは、ポリメラーゼのパームドメイン内部のＴ１９７位での変異は、増大した忠実度および／または減少した誤った取り込みの速度を有する逆転写酵素をもたらす。本発明の別の局面において、Ｆ３０９、Ｔ１９７またはＹ１３３に等しいかまたは対応する位置での１つ以上の変異が作製されて、減少または排除されたＴｄＴ活性を有するＲＴを産生し得る。この好ましい局面において、アミノ酸置換は、１つ以上の上記の同定された位置で作製される。従って、これらの位置のアミノ酸は、任意の他のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌを含む）で置換され得る。
【００７５】
上記で同定されたＭ−ＭＬＶ  ＲＴの対応する位置は、当業者によって、他の逆転写酵素について容易に同定され得る。従って、本出願に記載される規定された領域およびアッセイを与えれば、当業者は、１または多くの改変を作製し得、この改変は、目的の任意の逆転写酵素の増大した忠実度をもたらす。以下の表は、公知の逆転写酵素についての目的の同定された領域を例示する。
【００７６】
（表１）
逆転写酵素      高い忠実度の変異体の配列位置
Ｍ−ＭＬＶ      Ｙ６４、Ｒ１１６、Ｋ１５２、Ｑ１９０、Ｔ１９７、
Ｖ２２３、Ｄ１２４、Ｈ１２６、Ｙ１３３
ＡＭＶ          Ｗ２５、Ｒ７６、Ｋ１１０、Ｑ１４９、Ｔ１５６、Ｍ１８２
ＲＳＶ          Ｗ２５、Ｒ７６、Ｋ１１０、Ｑ１４９、Ｔ１５６、Ｍ１８２
ＨＩＶ          Ｗ２４、Ｒ７８、Ｇ１１２、Ｑ１５１、Ａ１５８、Ｍ１８４。
【００７７】
Ｍ−ＭＬＶ（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：５４３（１９８１））、ＡＭＶ（Ｊｏｌｉｏｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９５：８１２（１９９３））、ＲＳＶ（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：９８９（１９７７））およびＨＩＶ（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：２７７（１９８５））についてのヌクレオチド配列は公知である。
【００７８】
本発明はまた、逆転者酵素の変異体に関し、ここで、変異または置換は、逆転写酵素の認識された領域において作製されている。このような領域としては、フィンガー、パームおよび／サム領域（またはこれらの組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、変異または置換は、サム領域において作製され、これは、フレームシフトの発生率を減少することが示されている変異である。フレームシフトの速度測定についての方法は、実施例に記載される。
【００７９】
Ｔｙｒについて置換され得るアミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。Ａｒｇについて置換され得るアミノ酸としては、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。Ｌｙｓについて置換され得るアミノ酸としては、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。Ｇｌｕについて置換され得るアミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。Ｔｈｒについて置換され得るアミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。Ｖａｌについて置換され得るアミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎが挙げられる。このような変異体は、部位特異的突然変異誘発および本明細書中に記載されるような周知の方法によって調製され得る。
【００８０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドフィンガー向性変異誘発が使用されて、変異体逆転写酵素が作製され、これは、コードＤＮＡ分子に沿った任意の所定の部位で、あらゆる可能なクラスの塩基対変化を可能にする。一般に、この技術は、目的の逆転写酵素についてコードする一本鎖ヌクレオチド配列と相補的な（１つ以上のミスマッチを除く）オリゴヌクレオチドのアニーリングを含む。次いで、このミスマッチのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、二本鎖ＤＮＡ分子を作製し、このＤＮＡ分子は、１つの鎖上の配列において、所望の変化を含む。この配列変化は、もちろん、アミノ酸の欠失、置換または挿入をもたらし得る。次いで、この二本鎖ポリヌクレオチドが、適切な発現ベクターに挿入され得、それ故、変異体ポリペプチドが産生され得る。上記のオリゴヌクレオチドフィンガー向性変異誘発は、もちろん、ＰＣＲを介して行われ得る。
【００８１】
（逆転写酵素の発現の増強）
本発明の逆転写酵素の発現を最適化するために、誘導可能プロモーターまたは構成的プロモーターが周知であり、そしてこのようなプロモーターが使用されて、組換え宿主において、高レベルの逆転写酵素の構造遺伝子が発現し得る。同様に、当該分野で周知の高コピー数ベクターが使用されて、高レベルの発現を達成し得る。誘導可能な高コピー数を有するベクターはまた、組換え宿主における本発明の逆転写酵素の発現の増強に有用であり得る。
【００８２】
原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）において所望の構造遺伝子を発現するために、所望の構造遺伝子を、機能的な原核生物プロモーターに作動可能に連結することが必要である。しかし、逆転写酵素遺伝子の天然のプロモーターは、逆転写酵素遺伝子の発現を可能にする原核生物宿主において機能し得る。従って、この天然のプロモーターまたは他のプロモーターを使用して、逆転写酵素遺伝子を発現し得る。発現を増強するために使用され得るような他のプロモーターは、構成的プロモーターまたは制御可能（すなわち、誘導可能または抑制解除可能（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ））プロモーターを含む。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージ１のｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが挙げられる。誘導可能な原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージ１の主要な右および左プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）（ＰＲおよびＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｌプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびｔａｃプロモーターが挙げられる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターとしては、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６２：１７６−１８２（１９８５））およびＢａｃｉｌｌｕｓバクテリオファージプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターは、Ｗａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８４７８（１９８６）によって記載される。原核生物プロモーターはまた、Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．、Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６（１９８６）；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）によって概説される。原核生物細胞における発現はまた、遺伝子コード配列上流のリボソーム結合部位の存在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５４０４（１９８１）によって開示される。
【００８３】
真核生物細胞における本発明のポリメラーゼの発現を増強するために、周知の真核生物プロモーターおよび宿主を使用し得る。しかし、好ましくは、このポリメラーゼの増強された発現は、原核生物宿主において達成される。この酵素の過剰発現についての好ましい原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００８４】
（逆転写酵素の単離および精製）
本発明の酵素は、好ましくは、所望の逆転写酵素遺伝子を含みかつこの遺伝子を発現する組換え宿主の発酵によって産生される。しかし、本発明の逆転写酵素は、本発明の逆転写酵素を産生する任意の系統から単離され得る。逆転写酵素のフラグメントはまた、本発明に含まれる。このようなフラグメントは、タンパク質分解性フラグメントおよび逆転写酵素活性を有するフラグメントを含む。
【００８５】
クローニングされた逆転写酵素遺伝子を含む宿主によって吸収され得る任意の栄養素が、培養培地に添加され得る。最適の培養条件は、使用される系統および培養培地の組成に従って、その場その場で選択されるべきである。抗生物質もまた、増殖培地に添加されて、発現されるべき所望の遺伝子を含むベクターＤＮＡの維持を安全にし得る。培地処方物は、ＤＳＭまたはＡＴＣＣカタログおよびＳａｍｂｒｏｏｋら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）において記載されている。
【００８６】
本発明の逆転写酵素を産生する組換え宿主細胞は、例えば、遠心分離によって液体培地から分離され得る。一般に、この収集された微生物細胞を、適切な緩衝液中に分散し、次いで、超音波処理または他の周知の手順によって分解して、緩衝溶液によって、この酵素を抽出する。超遠心分離または遠心分離による細胞破片の除去後、この逆転写酵素は、標準的なタンパク質精製技術（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など）によって精製され得る。精製の間に逆転写酵素の存在を検出するためのアッセイは、当該分野で周知であり、そして従来の生化学的精製方法の間に使用されて、これらの酵素の存在を決定し得る。
【００８７】
本発明の逆転写酵素は、好ましくは、約５単位／ｍｇを超える、より好ましくは、約５０単位／ｍｇを超える、なおより好ましくは、約１００単位／ｍｇ、２５０単位／ｍｇ、５００単位／ｍｇ、１０００単位／ｍｇ、５０００単位／ｍｇまたは１０，０００単位／ｍｇを超える、そして最も好ましくは、約１５，０００単位／ｍｇを超える、約１６，０００単位／ｍｇを超える、約１７，０００単位／ｍｇを超える、約１８，０００単位／ｍｇを超える、約１９，０００単位／ｍｇを超える、および約２０，０００単位／ｍｇを超えるＤＮＡポリメラーゼの比活性を有する。本発明のＲＴについての比活性の好ましい範囲は、約５単位／ｍｇ〜約１４０，０００単位／ｍｇの比活性、約５単位／ｍｇ〜約１２５，０００単位／ｍｇの比活性、約５０単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約１００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約２５０単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約５００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約１０００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約５０００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約１０，０００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約７５，０００単位／ｍｇの比活性を含む。比活性の他の好ましい範囲は、約２０，０００単位／ｍｇ〜約１４０，０００単位／ｍｇの比活性、約２０，０００単位／ｍｇ〜約１３０，０００単位／ｍｇの比活性、約２０，０００単位／ｍｇ〜約１２０，０００単位／ｍｇの比活性、約２０，０００単位／ｍｇ〜約１１０，０００単位／ｍｇの比活性、約２０，０００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、約２０，０００単位／ｍｇ〜約９０，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約１４０，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約１３０，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約１２０，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約１１０，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約１００，０００単位／ｍｇの比活性、および約２５，０００単位／ｍｇ〜約９０，０００単位／ｍｇの比活性を含む。好ましくは、この比活性範囲の下限は、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００および８０，０００単位／ｍｇから変化し得るが、一方、この範囲の上限は、１５０，０００、１４０，０００、１３０，０００、１２０，０００、１１０，０００、１００，０００および９０，０００単位／ｍｇから変化し得る。本発明に従って、比活性は、反応において使用されるタンパク質または酵素の総量に比例したタンパク質または酵素の酵素活性（単位での）の測定である。比活性の測定は、当業者に周知の標準的な技術によって決定され得る。
【００８８】
本発明のＲＴを使用して、１つ以上のテンプレートから核酸分子を作製し得る。このような方法は、１つ以上の核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡおよびより好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団）を１つ以上の本発明のＲＴと混合する工程、ならびにこの混合物を、１つ以上の核酸テンプレートのすべてまたは一部分と相補的な１つ以上の核酸分子を作製するに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
【００８９】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子の増幅についての方法に関し、これは、１つ以上の核酸テンプレートを本発明のＲＴのうちの１つと混合する工程、およびこの混合物を、１つ以上の核酸テンプレートのすべてまたは一部分と相補的な１つ以上の核酸分子を増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
【００９０】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子の配列決定についての方法に関し、これは、（ａ）配列決定されるべき１つ以上の核酸分子を、１つ以上のプライマー核酸分子、１つ以上の本発明のＲＴ、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結因子と混合する工程；（ｂ）この混合物を、配列決定されるべき１つ以上の核酸分子のすべてまたは一部分に相補的な核酸分子の集団を合成するに十分な条件下でインキュベートする工程；ならびに（ｃ）核酸分子の集団を分離して、配列決定されるべき１つ以上の核酸分子のすべてまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程を包含する。
【００９１】
本発明はまた、このような方法によって産生される核酸分子（これは、全長ｃＤＮＡ分子であり得る）、これらの核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれらのベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００９２】
（ＤＮＡポリメラーゼの供給源）
種々のＤＮＡポリメラーゼは、本発明に従って有用である。このようなポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
本発明に従って使用されるＤＮＡポリメラーゼは、核酸テンプレートから、代表的には５’から３’方向にＤＮＡ分子を合成し得る任意の酵素であり得る。このようなポリメラーゼは、中温性または好熱性であり得るが、好ましくは、好熱性である。中温性ポリメラーゼとしては、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどが挙げられる。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴＴＭ、ＤＥＥＰＶＥＮＴＴＭ、Ｔｔｈならびにそれらの変異体、改変体および誘導体（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ９２／０６１８８；ＷＯ９２／０６２００；ＷＯ９６／１０６４０；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４）））である。長い核酸分子（例えば、約３〜５Ｋｂ長を超える核酸分子）の増幅について、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ（一方は、実質的に３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し、そしてもう一方は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）が、代表的には使用される。米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；ならびに共有に係わる同時係属中の米国特許出願第０９／７４１，６６４号（２０００年１２月２１日に提出）、および対応する欧州出願０９４２９１７（これらのすべての開示は、本明細書中でその全体において援用される）を参照のこと。３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠失するＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ−）、Ｔｍａ、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）、ＰｗｏおよびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴＴＭおよびＴｌｉ／ＶＥＮＴＴＭならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられる。
【００９４】
（酵素組成物の処方）
本発明の組成物を形成するために、１つ以上の逆転写酵素が、好ましくは、緩衝塩溶液において混合される。１つ以上のＤＮＡポリメラーゼおよび／または１つ以上のヌクレオチド、ならびに／あるいは１つ以上のプライマーが、必要に応じて添加されて、本発明の組成物を作製し得る。より好ましくは、この酵素は、安定な緩衝塩溶液において、作用濃度で提供される。本明細書中で使用されるような用語「安定な」および「安定性」は、一般的に、酵素または酵素を含む組成物が、約４℃の温度で約一週間、約−２０℃の温度で約２〜６ヶ月、そして約−８０℃の温度で約６ヶ月以上保管された後の本来の酵素活性（単位での）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の組成物（例えば、酵素組成物）による保持を意味する。本明細書中で使用されるように、用語「作用濃度」は、特定の機能（例えば、核酸の逆転写）を果たすために、溶液中で使用される最適濃度か、またはその最適濃度の近傍にある酵素濃度を意味する。
【００９５】
本発明の組成物の形成において使用される水は、好ましくは、蒸留され、イオン除去され、そして滅菌濾過され（０．１〜０．２マイクロメートルフィルターを通す）、そしてＤＮａｓｅ酵素およびＲＮａｓｅ酵素によって不純物を除かれる。このような水は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から市販されるか、または当業者に周知の方法に従って、必要であれば作製され得る。
【００９６】
酵素成分に加えて、本組成物は、好ましくは、核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）の合成について必要な１つ以上の緩衝液および補助因子を含む。本発明の組成物の形成における使用についての特定の好ましい緩衝液は、酢酸塩、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩またはトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の遊離酸形態であるが、ＴＲＩＳ（登録商標）とイオン強度およびｐＫａがほぼ等しい代替の緩衝液が、等しい結果で使用され得る。緩衝塩に加えて、補助因子塩（例えば、カリウム塩（好ましくは、塩化カリウムまたは酢酸カリウム）およびマグネシウム塩（好ましくは、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム））が、この組成物に含まれる。この組成物および／または合成反応混合物への１つ以上の炭水化物および／または糖の添加はまた、保管の際に、この組成物および／または反応混合物の安定性の増強を支持するのに有利であり得る。本発明の組成物および／または合成反応混合物への包含についての好ましいこのような炭水化物または糖としては、スクロース、トレハロースなどが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、このような炭水化物および／または糖は、本発明の酵素組成物およびキットの産生において使用される酵素についての保管緩衝液に添加され得る。このような炭水化物および／または糖は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む多くの供給源から市販される。
【００９７】
緩衝塩、補助因子塩および炭水化物または糖を、水中に作用濃度で第一に溶解し、そして酵素の添加前に、溶液のｐＨを調整することがしばしば好ましい。このようにして、このｐＨ感受性酵素は、本発明の組成物の処方の間に、酸またはアルカリ媒介性不活性化により供されない。
【００９８】
緩衝塩溶液を処方するために、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の塩、そして最も好ましくは、その塩酸塩である緩衝塩は、十分な量の水と合わされて、５〜１５０ミリモル、好ましくは、１０〜６０ミリモル、そして最も好ましくは、約２０〜６０ミリモルのＴＲＩＳ（登録商標）濃度を有する溶液を生ずる。この溶液に対して、マグネシウム塩（好ましくは、その塩化物または酢酸塩のいずれか）が添加されて、１〜１０ミリモル、好ましくは、１．５〜８．０ミリモル、そして最も好ましくは、約３〜７．５ミリモルのその作用濃度を提供し得る。カリウム塩（好ましくは、カリウムの塩化物または酢酸塩）がまた、１０〜１００ミリモル、および最も好ましくは、約７５ミリモルの作用濃度でこの溶液に添加され得る。還元剤（例えば、ジチオトレイトール）が、好ましくは、約１〜１００ｍＭの終濃度、より好ましくは、約５〜５０ｍＭまたは約７．５〜２０ｍＭの濃度、そして最も好ましくは、約１０ｍＭの濃度でこの溶液に添加され得る。本発明の組成物への包含についての炭水化物および／または糖の好ましい濃度は、約５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約７．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、そして好ましくは、約１０％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）の範囲に渡る。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の少量の塩（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム）がまた、添加され得るが（好ましくは、約０．１ミリモル）、ＥＤＴＡの包含は、本発明の組成物の機能または安定性に不可欠ではないようである。すべての緩衝液および塩の添加後、この緩衝塩溶液を、すべての塩が溶解するまで十分に混合し、そしてｐＨを、当該分野で公知の方法を用いて、７．４〜９．２のｐＨ値、好ましくは、８．０〜９．０のｐＨ値、そして最も好ましくは、約８．４のｐＨ値に調整する。
【００９９】
これらの緩衝塩溶液に対して、酵素（逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）を添加して、本発明の組成物を産生する。Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを、好ましくは、１ミリリットル当たり約１，０００〜約５０，０００単位、１ミリリットル当たり約２，０００〜約３０，０００単位、１ミリリットル当たり約２，５００〜約２５，０００単位、１ミリリットル当たり約３，０００〜約２２，５００単位、１ミリリットル当たり約４，０００〜約２０，０００単位の溶液において、作用濃度で添加し、そして最も好ましくは、１ミリリットル当たり約５，０００〜約２０，０００単位の作用濃度で添加する。ＡＭＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴおよびＨＩＶ  ＲＴ（上記の本発明のＲＴを含む）は、好ましくは、１ミリリットル当たり約１００〜約５０００単位、１ミリリットル当たり約１２５〜約４０００単位、１ミリリットル当たり約１５０〜約３０００単位、１ミリリットル当たり約２００〜約２５００単位、１ミリリットル当たり約２２５〜約２０００単位の溶液において、作用濃度で添加し、そして最も好ましくは、１ミリリットル当たり約２５０〜約１０００単位の作用濃度で添加する。好熱性ＤＮＡポリメラーゼ群における酵素（Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｔｔｈならびにそれらの変異体、改変体および誘導体）は、好ましくは、１ミリリットル当たり約１００〜約１０００単位、１ミリリットル当たり約１２５〜約７５０単位、１ミリリットル当たり約１５０〜約７００単位、１ミリリットル当たり約２００〜約６５０単位、１ミリリットル当たり約２２５〜約５５０単位の溶液において、作用濃度で添加し、そして最も好ましくは、１ミリリットル当たり約２５０〜約５００単位の作用濃度で添加する。この酵素は、任意の順序で溶液に添加され得るか、または同時に添加され得る。
【０１００】
本発明の組成物は、さらに、１つ以上のヌクレオチドを含み得、これは、好ましくは、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である。本組成物のｄＮＴＰ成分は、新規に合成された核酸についての「建築用ブロック」として役立ち、これは、ポリメラーゼの作用によってこれに取り込まれ、そしてこのｄｄＮＴＰは、本発明に従った配列決定法において使用され得る。本組成物における使用に適切なヌクレオチドの例としては、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＡＴＰ、α−チオ−ｄｄＴＴＰ、α−チオ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＣＴＰまたはこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されず、これらのすべては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）およびＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含む供給源から市販される。このヌクレオチドは、未標識であり得るか、または当該分野で公知の方法によって、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐまたは３５Ｓ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄまたはフィコエリトリン）、化学発光標識（例えば、ＰＨＯＴＯ−ＧＥＮＥＴＭまたはＡＣＥＳＴＭ化学発光系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから市販される）を用いて）、ジオキシゲニンなどとこのヌクレオチドを結合することによって、検出可能に標識され得る。標識されたヌクレオチドはまた、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から商業的に得られ得る。本組成物において、このヌクレオチドが添加されて、約１０〜４０００マイクロモル、約５０〜２０００マイクロモル、約１００〜１５００マイクロモル、または約２００〜１２００マイクロモルの各々のヌクレオチドの作用濃度が与えられ、そして最も好ましくは、約１０００マイクロモルの濃度が与えられる。
【０１０１】
成分の劣化を減少するために、試薬組成物の保管は、好ましくは、約４℃で１日まで、または最も好ましくは、−２０℃で１年までである。
【０１０２】
別の局面において、本発明の組成物および逆転写酵素は、１つ以上の炭水化物、糖または合成ポリマーの存在下で、乾燥形態において調製および保管され得る。乾燥した組成物または逆転写酵素の調製についての好ましい炭水化物、糖またはポリマーとしては、スクロース、トレハロースおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第５，０９８，８９３号、同第４，８９１，３１９号および同第５，５５６，７７１号（これらの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される）を参照のこと。このような乾燥した組成物および酵素は、本発明の組成物の酵素または成分の有意な劣化を伴わずに、長期間種々の温度で保管され得る。好ましくは、この乾燥した逆転写酵素または組成物は、４℃または−２０℃で保管される。
【０１０３】
（ｃＤＮＡ分子の産生）
（核酸分子の供給源）
本発明に従って、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を、種々の核酸テンプレート分子から調製し得る。本発明における使用についての好ましい核酸分子としては、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ分子、ならびに二本鎖のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。より好ましい核酸分子としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子が挙げられるが、ｍＲＮＡ分子が、本発明に従った好ましいテンプレートである。
【０１０４】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子を調製するために使用される核酸分子は、当業者によく知られている標準的な有機化学合成法に従って、合成的に調製され得る。より好ましくは、この核酸分子は、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官または生物）から得られ得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物細胞（細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種の細胞を含むがこれらに限定されない））または真核生物細胞（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物および他の寄生虫、ならびに動物（昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．細胞）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ細胞）および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む））であり得る。
【０１０５】
核酸の供給源として使用され得る哺乳動物の体細胞としては、血液細胞（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋または心筋由来の筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞を含む）ならびに他のストローマ細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物の生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）がまた、上記の体細胞および生殖細胞を生じる前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）および幹細胞として、本発明における使用についての核酸の供給源として使用され得る。また、核酸供給源としての使用に適切なものは、哺乳動物組織または器官（例えば、脳供給源、腎臓供給源、肝臓供給源、膵臓供給源、血液供給源、骨髄供給源、筋肉供給源、神経供給源、皮膚供給源、泌尿生殖器供給源、循環器供給源、リンパ供給源、胃腸供給源および結合組織供給源由来の組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児由来の組織または器官）である。
【０１０６】
上述の原核生物細胞または真核生物細胞、組織および器官のいずれかは、正常なもの、病的なもの、形質転換されたもの、樹立されたもの、前駆細胞、前駆体、胎児または胚性のものであり得る。例えば，病的細胞は、感染性疾患（細菌、真菌または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）もしくは寄生生物によって引き起こされるもの）、遺伝的または生化学的病理状態（例えば，嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症）、あるいはガン性プロセスに関与する細胞を含む。形質転換または樹立された動物細胞株としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などが挙げられ得る。本発明における使用のための核酸の供給源として適する他の細胞、細胞株、組織、器官および生物は、当業者に明白である。
【０１０７】
ひとたび開始細胞、組織、器官、または他のサンプルが入手されると、これらのサンプルから（ｍＲＮＡといった）核酸分子が、当該分野で周知の方法によって単離され得る（例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＴらＣｅｌｌ  １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照のこと）。次いで、こうして単離された核酸分子は、本発明に従ってｃＤＮＡ分子の調製およびｃＤＮＡライブラリーの調製に使用され得る。
【０１０８】
本発明の実施に当たって、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーは、上述のように獲得された一以上の核酸分子（これらの核酸は、好ましくはｍＲＮＡ分子の集団といった一以上のｍＲＮＡである）と、本発明の逆転写酵素活性を有するポリペプチドまたは本発明品の一以上の組成物とを、酵素の作用による核酸分子の逆転写または（一本鎖または二本鎖の）ｃＤＮＡ分子を形成する組成物に好都合な条件下において混合することによって産生される。従って、本発明の方法は、（ａ）一以上の核酸テンプレート（好ましくは、一以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡテンプレート、例えば、ｍＲＮＡ分子の集団）を、本発明の一以上の逆転写酵素と共に混合する工程、および（ｂ）この混合物を、一以上のテンプレートの全てまたは一部に対して相補的な核酸を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。このような方法は、一以上のＤＮＡポリメラーゼ、一以上のヌクレオチド、一以上のプライマー、一以上の緩衝液等の使用を含み得る。本発明は、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを産生するためにｃＤＮＡの合成方法（例えば、以下の実施例に記載される方法、または当該分野で周知の他の方法（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，８．６０−８．６３頁（１９８９）；ＷＯ９９／１５７０２；ＷＯ９８／４７９１２ならびにＷＯ９８／５１６９９を参照のこと））と共に使用され得る。
【０１０９】
本発明を有利に使用し得るｃＤＮＡ合成に関する他の方法も、当業者に容易に明らかである。
【０１１０】
本方法に従ってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを獲得し、これらのｃＤＮＡは、さらなる分析または操作のために単離し得る。ｃＤＮＡを精製するための詳細な方法論は、ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲＴＭの手引書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に教示されており、その全体が本明細書中に参考として援用される。しかし、当該分野で公知の代替の標準的なｃＤＮＡの単離技術（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，８．６０−８．６３頁（１９８９）を参照のこと）もまた使用され得る。
【０１１１】
本発明の他の局面において、本発明は、核酸分子を増幅および配列決定するための方法に用いられ得る。本発明のこの局面に従う核酸増幅方法は、一段階反応（例えば，一段階ＲＴ−ＰＣＲ）または二段階反応（例えば，二段階ＰＴ−ＰＣＲ）であり得る。本発明に従って、一段階ＲＴ−ＰＣＲタイプの反応は、一つの試験管内で達成され、それにより混入物の可能性は減少し得る。このような一段階反応は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）を、本発明の一以上の逆転写酵素および一以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、および（ｂ）この混合物を、このテンプレートの全てまたは一部に対して相補的な核酸分子を増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。これらの増幅は、逆転写酵素活性のみによって、またはＤＮＡポリメラーゼ活性と組合わせて達成され得る。二段階ＰＴ−ＰＣＲ反応は、二つの別々の工程で達成され得る。このような方法は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）を本発明の逆転写酵素と混合する工程、（ｂ）この混合物を、テンプレートの全てまたは一部に対して相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程、（ｃ）この核酸分子を一以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、および（ｄ）この核酸分子を増幅するのに十分な条件下で工程（ｃ）の混合物をインキュベートする工程を包含する。長い核酸分子（即ち、約３〜５ｋｂより長い）の増幅反応には、ＤＮＡポリメラーゼの組合わせ（例えば、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する１つのＤＮＡポリメラーゼおよび３’エクソヌクレアーゼ活性が実質的に減少している別のＤＮＡポリメラーゼ）が使用され得る。
【０１１２】
本発明のこの局面に従った核酸の配列決定方法は、サイクル配列決定反応（増幅を伴う配列決定）および標準的な配列決定反応の両方を包含し得る。従って、本発明の配列決定方法は、（ａ）配列決定されるべき核酸分子を、一以上のプライマー、一以上の本発明の逆転写酵素、一以上のヌクレオチド、および一以上の停止試薬と混合する工程、（ｂ）この混合物を、配列決定されるべき分子の全てまたは一部に対して相補的な核酸分子の集団を合成するに十分な条件下でインキュベートする工程、ならびに、（ｃ）配列決定されるべき分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定するために上記の集団を分離する工程を包含する。本発明に従って、一以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定型ＤＮＡポリメラーゼ）は、本発明の逆転写酵素と共に使用され得るか、あるいは別々に使用され得る。
【０１１３】
本発明に従って使用され得る増幅方法としては、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号；ＥＰ  ０  ６８４  ３１５）、および核酸配列に基づいた増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ  ０  ３２９  ８２２）、ならびに、より複雑なＰＣＲに基づいた核酸フィンガープリント技術、例えば、無作為に増幅した多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）（ＲＡＰＤ）分析（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．Ｋ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２２）：６５３１−６５３５，１９９０）、任意にプライムしたＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）（ＡＰ−ＰＣＲ；Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２４）：７２１３−７２１８，１９９０）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（ＤＡＦ；  Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５５３−５５７，１９９１）、マイクロサテライトＰＣＲまたはミニサテライト領域ＤＮＡの特異的増幅（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ＤＮＡ）（ＤＡＭＤ；Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（２４）：５７８２−５７８５（１９９３））、ならびに、増幅フラグメント長多型（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＡＦＬＰ）分析（ＥＰ  ０  ５３４  ８５８；Ｖｏｓ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（２１）：４４０７−４４１４（１９９５）；Ｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．およびＫｕｏ，Ｊ．ＦＯＣＵＳ  １７（２）：６６−７０（１９９５））が挙げられる。本組成物を使用し得る核酸配列決定技術としては、例えば，米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号で開示されているもののようなジデオキシ配列決定方法が挙げられる。特に好ましい局面において、本発明は、上述のＰＣＲ方法のいずれかのような１以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、核酸分子の増幅または配列決定の方法に使用され得る。
【０１１４】
（キット）
別の実施形態では、本発明は、核酸分子の逆転写もしくは増幅時に使用されるキットまたは核酸分子の配列決定時に使用されるキットに組み立てられ得る。本発明のこの局面に従うキットは、箱、カートン、チューブなどのようなキャリア手段を含み、このキャリア手段は、その内部にバイアル、チューブ、アンプル，ビンなどのような１個以上の容器手段を緊密に拘束して有する。そこで第１番目の容器手段は、逆転写酵素活性を有する本発明の一以上のポリペプチドを含有する。逆転写活性を持つ１種を超えるポリペプチドが使用される場合、それらは２種以上のポリペプチドの混合物として単一または別々の容器に収納され得る。本発明のキットは（同一のまたは別々の容器に）一以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、一以上のヌクレオチド、およびまたは一以上のプライマーをも含有し得る。
【０１１５】
本発明の特定の局面において、この逆転写および増幅キットは、一以上の成分を（混合物として、または別々に）含み得る。これらの成分としては、本発明の逆転写酵素活性を有する一以上のポリペプチド、核酸分子の合成に必要とされる一以上のヌクレオチド、および／または一以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（ｄＴ））が挙げられる。このような逆転写および増幅キットはさらに、一以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。本発明の配列決定キットは、本発明の逆転写酵素活性を有する一以上のポリペプチド、ならびに必要に応じて一以上のＤＮＡポリメラ一ゼ、核酸分子の配列決定に必要とされる一以上の反応停止薬（例えば、ジデオキシヌクレオシド三リン酸分子）、一以上のヌクレオチドおよび／または一以上のプライマーを含み得る。逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ，ヌクレオチド、プライマー、ならびに本発明の逆転写、増幅および配列決定キットの使用に適する他の成分としては、上述のものが挙げられる。本発明のこの局面に含まれる本キットはさらに、標準的な核酸逆転写、増幅または配列決定方法を実施するために必要なさらなる試薬および化合物を含み得る。本発明の逆転写酵素活性を有するこのようなペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマーならびにさらなる試薬、成分または化合物が、１個以上の容器に含有され得、そして上述の成分の２以上の混合物でこのような容器に含まれ得るか、または別々の容器において本発明のキットに含まれ得る。
【０１１６】
（核酸分子の利用）
本発明の方法によって調製される核酸分子またはＤＮＡライブラリーは、例えば、クローニングおよび配列決定（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列の決定）により、本発明の配列決定方法により、または当該分野で標準的な他の方法（例えば、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号（これらはＤＮＡ配列決定に関する）によりさらに特徴付けられ得る。あるいはこれらの核酸分子は、工業過程の多様な材料、例えば、ハイブリダイゼーションプローブを当該分野で周知の方法により製造する際に使用され得る。ｃＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションプローブの生成は、例えば，医療分野の人々が、患者の細胞または組織を特定の遺伝子マーカー（例えば、癌のマーカー）の存在、感染性または遺伝子疾患の存在、あるいは胚性発生のマーカーの存在について検査する能力を提供する。さらに特徴付けするために、このようなハイブリダイゼーションプローブを用いて、異なる細胞、組織、または生物から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーに由来するＤＮＡ断片を単離し得る。
【０１１７】
本発明の核酸分子は、組換えＤＮＡの方法論に適用される組成物を調製するためにも用いられ得る。それゆえに本発明は、ｃＤＮＡまたは本発明によって増幅された核酸分子を含む組換えベクター、組換えベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、これらのベクターおよび宿主細胞を用いて組換えポリペプチドを産生するための方法、ならびにこれらの方法を用いて産生される組換えポリペプチドに関する。
【０１１８】
本発明のこの局面に従い、組換えベクターは、当該分野で周知の方法を使用して、本方法に従って調製された一以上のｃＤＮＡ分子または増幅された核酸分子をベクターに挿入することで産生され得る。本発明のこの局面で使用されるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドであり得るが、好ましくはプラスミドである。目的のポリペプチドをコードしている核酸に対してシス作用性制御領域を含むベクターが、好ましい。適切なトランス作用性因子が、宿主細胞によって、補完的なベクターによって、または宿主細胞に導入する際にベクター自体によって供給され得る。
【０１１９】
この観点で特定の好ましい実施形態では、ベクターは特異的な発現（したがって「発現ベクター」と名付けられるている）を提供し、この発現は誘導的または／あるいは細胞特異的であり得る。このようなベクターの中で特に好ましいものは、操作が簡単な、例えば、温度または添加栄養素のような、環境因子によって誘導し得るベクターである。
【０１２０】
本発明で有用な発現ベクターとしては、染色体性、染色体外性およびウイルス由来のベクター（例えば、細菌性プラスミドまたはバクテリオファージ由来のベクター）およびこれらの組合わせ（例えば、コスミドおよびファージミド）から得られるベクターが挙げられ、そして好ましくは、細菌性の宿主細胞で培養するための少なくとも一以上の選択マーカー（例えば、テトラサイクリンまたはアンピシリンの耐性遺伝子）を含む。このような発現ベクターを挿入する前に、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸分子は、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ．ｌａｃ．ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の好ましいプロモーターは、当業者に公知である。
【０１２１】
本発明を使用するにあたって好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（これらはＱｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｅｕｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）；ｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（これらはＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；およびｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１（これらはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１２２】
本発明は、ｃＤＮＡ分子、増幅された核酸分子または本発明の組換えベクターを含む組換え宿主細胞を産生する方法、およびこのような方法により産生される宿主細胞をも提供する。本発明に従って産生され得る代表的な宿主細胞（原核生物細胞または真核生物細胞）としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい細菌性宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞（最も詳細には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株およびＳｔｂｌ２株（これらは市販されている）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．細胞、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞が挙げられる。好ましい動物性宿主細胞としては，昆虫細胞（最も詳細には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞、ならびにＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）および哺乳動物細胞（最も詳細には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞）が挙げられる。このような宿主細胞は当業者が精通した周知の形質転換技術、エレクトロポーレション技術、またはトランスフェクション技術によって調製され得る。
【０１２３】
さらに、本発明は、組換えポリペプチドを産生するための方法、およびこの方法によって産生されたポリペプチドを提供する。本発明のこの局面に従って、ある組換えポリペプチドは、任意の上述の組換え宿主細胞をこの宿主細胞からのポリペプチドの産生およびそのペプチドにとって好ましい条件下で培養することによって産生され得る。組換え宿主細胞の培養、およびこの組換え細胞からのポリペプチドの産生と単離の方法は当業者に周知である。
【０１２４】
本明細書に記載されている方法と応用への他の適切な改変および適用が明白でかつ、本発明およびこのいかなる実施形態の範囲内から逸脱することなしになされ得ることは、当業者にとって容易に明白である。詳細に本発明を明細書に記載してきたが、本発明は、以下に続く実施例を参照することによって、さらに理解される。以下の実施例は、例示のためにのみ含有され、本発明を限定することは意図されていない。
【０１２５】
（実施例）
以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【０１２６】
（ＲＮＡテンプレートを用いたｌａｃＺフォワードアッセイ）
このアッセイを、以下の例外を伴って、Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら、Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７５：５２３（１９９６）の文献に記載されたように行った。
【０１２７】
ＲＮＡテンプレートの調製。ヌクレオチド１１２および１１３の間に挿入されたＴ７  ＲＮＡプロモーターを備えるｐＵＣ１９（ｌａｃＺ領域のＭ１３ｍｐ１９との相同物）のクローンを、ＲＮＡテンプレートとして使用した。
【０１２８】
ギャップを入れた（ｇａｐｐｅｄ）Ｍ１３基質の構築。Ｍ１３ｍｍ１９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、Ｍ１３ｍｐ２の代わりに使用した。
【０１２９】
コンピテント細胞の調製。Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ  ＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を，ＭＣ１０６１の代わりに使用した。
【０１３０】
変異誘発。変異体を、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５（１９９１）に記載されたようにオリゴ−特異的変異誘発（ｏｌｉｇｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって作製した。要約すると、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ遺伝子（ＲＮａｓｅ  Ｈドメインに点変異を含有するＭ−ＭＬＶＲＴ遺伝子、以下を参照のこと）を、ｐＢＡＤｈｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ベクターに挿入し、ｐＢＡＤ−ＳＳＩＩと命名した。このプラスミドを、ＤＨ１１Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に形質転換し、一本鎖ＤＮＡが単離されるＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させた。オリゴを、それぞれの変異に応じて作製した：Ｙ６４Ｗ、Ｒ１１６Ｍ、Ｋ１５２Ｒ、Ｑ１９０Ｆ、Ｔ１９７ＡおよびＶ２２３Ｈ。１００μＭの各オリゴを、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｒｘｎ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で３２Ｐ標識した。このオリゴを、１本鎖ｐＢＡＤ−ＳＳＩＩにアニールさせた。ネイティブのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、合成緩衝液（０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、１７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＡＴＰ）と共に氷上でアニール反応物に加えた。反応物を３７℃で３０分インキュベートし、次いで０．５ＭのＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を１μｌ加えて停止した。反応物を、ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、平板培養した。コロニーを取り、変異を制限酵素分解解析によって決定し、次いで確認のためにＡＢＩ３７７およびＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。
【０１３１】
変異体のタンパク質精製。誘導したＲＴを含有する細胞ペレットを、２ｍｌの溶解緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）と１ｇの細胞ペレットの割合で懸濁した。この懸濁液を氷上で超音波処理し、次いで２７０００×ｇで３０分間遠心分離した。無細胞抽出液を０．４５μのシリンジフィルターを介して濾過した。無細胞抽出液を、緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１Ｍ  ＫＣｌ）に溶解した５ｍＭのイミダゾ−ルを流速１ｍＬ／分でカラムの５倍容を流して前平衡化した５ｍＬのＮｉ２＋  ＨＩ−ＴＲＡＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、緩衝液Ａに溶解した１０倍容の５ｍＭのイミダゾ−ル溶液で洗浄した。ＲＴの溶出を、緩衝液Ａ中、５ｍＭから１Ｍまでのイミダゾ−ルの２０倍容の濃度勾配を用いて洗浄することによって行った。ＲＴタンパク質を含有する溶出液を、緩衝液Ｂ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解した５０ｍＭ  ＫＣｌ（１０倍容）を流速１．０ｍＬ／分で前平衡化した１ｍＬのＭｏｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。このカラムを、緩衝液Ｂに溶解した５０ｍＭのＫＣｌ溶液（１０倍容）で洗浄した。ＲＴは、緩衝液ＢにおいてＫＣｌの５０ｍＭから１Ｍの濃度勾配（２０倍容）で溶出した。個々の画分を，ＲＴ活性に対して分析した。ＲＴ活性のピークを含有する画分を、貯蔵緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｍ  ＫＣｌ）に対して透析した。単離したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定から９５％を超える純度であった。タンパク質の濃度を、ＢＳＡを標準タンパク質にしたＢｉｏｒａｄ社の比色キットを使用して決定した。
【０１３２】
（実施例１：Ｍ−ＭＬＶ高忠実度変異体の変異頻度）
変異頻度データおよびエラー率の算出。変異頻度（ＭＦ）を、変異プラーク（薄い青または白）の数を全プラーク数で割り、さらに出発ＤＮＡのバックグラウンド変異頻度を差し引くことによって決定する。
【０１３３】
試験された全ての変異逆転写酵素も、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＳＩＩ，米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号）と同様に、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を除外するための点変異を含有した。点変異を、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を除外するためにＭ−ＭＬＶ  ＲＴ遺伝子において行った。点変異は、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３ＮおよびＥ５６２Ｑを含む。簡潔には、ｐＲＴ６０１由来のＲＴ遺伝子をｐＵＣプラスミドに挿入し，次いで、上述の点変異を、ＲＴ遺伝子のＲＮａｓｅ  Ｈドメインで行った。ｐＲＴ６０１は、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号に記載されており、受託番号６７００７でＡＴＣＣに寄託された（米国特許第５，０１７，４９２号を参照のこと）。このＲＮａｓｅＨ−変異は、本明細書中においてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ遺伝子として言及される。
【０１３４】
【表１】
0005148799.tif 000002
ｌａｃＺαアッセイは、ｌａｃＺα  ＲＮＡをｃＤＮＡにコピーするために提供されたＲＴを用いる。このｃＤＮＡのコピーは、Ｍ１３にアニールされ、トランスフェクトされ、発現されると、濃い青のプラークをともなう正常な野生型の表現型であるか、ＲＴがコピー中に過ちを犯した場合に、薄い青または透明なプラークをともなう変異表現型を有するかのいずれかである。この過ちは、挿入、欠質またはミス取り込みの形態をとり得る。変異ＲＴによるＭ−ＭＬＶ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ）の変異頻度の何らかの減少は、忠実度の増加を示す。表２に示されるように、選択した変異体は、変異頻度において１．５〜２．３倍の減少を示す。変異体Ｖ２２３Ｆは、ＳＳＩＩより２．２倍高い変異頻度を有し、従って低下した忠実度を有する。
【０１３５】
（実施例２：ＤＮＡテンプレートを用いたミス挿入アッセイ）
ＤＮＡテンプレートを用いたＹ６４Ｗ、Ｒ１１６Ｍ、Ｋ１５２Ｒ、Ｑ１９０Ｆ、Ｔ１９７Ａ、Ｖ２２３Ｈ  Ｍ−ＭＬＶ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−ＲＴのミス挿入アッセイ。このアッセイを、変異体のミス取り込みの能力をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−ＲＴ）と比較するために用いた。このアッセイは、合成されたＤＮＡテンプレート−プライマーと４種のｄＮＴＰのうち３種のみを含有する偏ったｄＮＴＰプールとを用いるプライマー伸長アッセイである。反応は、図１〜３のゲル上に示されている。このアッセイでは、あるｄＮＴＰの非存在下におけるプライマー伸長がより高い効率になるにつれて、より低い忠実度が与えられる。図１〜３に示されるように、全ての４種類のｄＮＴＰの存在下でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩと全ての選択した変異体は、プライマーの末端へのテンプレートでないヌクレオチドの添加においてある程度の変動をともなって、適切に等しくプライマーを伸長し得る。しかし、ヌクレオチドの偏ったプールとともにインキュベートした場合、ＳＳＩＩは、ある相補的なｄＮＴＰが欠損しているテンプレートヌクレオチドを過ぎて、実質的な伸長を触媒し得た。このことは、不正確なヌクレオチドの使用と低い忠実度を示している。図１では、（レーン２に位置している）Ｖ２２３Ｈ変異体は、３種のｄＮＴＰの各々の偏ったプールにおいてＳＳＩＩよりも短い伸長産物を示し、このことは、不正確なヌクレオチドを取りこむ能力の低下、つまり高い忠実度を示している。これは、Ｖ２２３Ｈ変異がＳＳＩＩよりも低い変異頻度、それぞれ４４×１０−４に対して２１×１０−４であったｌａｃＺαアッセイの結果に対応している。他方、Ｖ２２３Ｆ（レーン３）（ｌａｃＺαアッセイにおいてＳＳＩＩ（４４×１０−４）よりも高い変異頻度（９７×１０−４）を有した）もまた、各々の偏ったプールにおいてＳＳＩＩと同等のサイズ、または、さらに長い伸長産物を有し、このことは、Ｖ２３３Ｆが低い忠実度を有することを示している。これらのデータから、ＤＮＡにおけるミス挿入アッセイとＲＮＡにおけるｌａｃＺアッセイとの間の相関が示され、そこで高い忠実度変異体から、偏ったｄＮＴＰプールを利用したより短い伸長産物とｌａｃＺアッセイにおける低い変異頻度を有した。図２および図３は、Ｒ１１６Ｍ、Ｑ１９０Ｆ、Ｋ１５２Ｒ、Ｔ１９７ＡおよびＹ６４Ｗ変異に対して同様の結果を示している。つまり、それぞれが、偏ったヌクレオチドプールにおいてＳＳＩＩよりも短いプライマーの伸長産物を有していた。
【０１３６】
（実施例３：ＴｄＴ逆転写酵素変異）
３種のｄＮＴＰのアッセイにおける誤った伸長について逆転写酵素（ＲＴ）の忠実度変異体を検査する場合、ＳＳＩＩ  ＲＴは３種および４種のｄＮＴＰの存在下でテンプレートの末端を過ぎて２、３の塩基伸長したことが観察された。この非テンプレート特異的伸長またはＴｄＴ活性は、多くの変異体で減少しているが、Ｆ３０９ＮおよびＴ１９７Ｅのような少数の変異体において、この活性がかなり減少または除去されていると思われる。ＨＩＶ逆転写酵素との相同性および結合したテンプレート−プライマーの結晶構造から決定されるように、これらの変異体はおそらく、テンプレート−プライマーへ緊密に接近または接触した状態にある。
【０１３７】
（方法）
（変異誘発）
（Ｆ３０９Ｎに関して）
アミノ酸位置３１０〜３１１においてＮｇｏＭＩＶ制限酵素認識部位のサイレント挿入を有する変異位置Ｆ３０９に対応するプライマーを設計した。このプライマーは、Ｆ３０９変異体の無作為ライブラリーを産生するこの部位の代わりに、無作為にＮＮＫをコードした。ここにおけるＮは、４種の塩基のいずれかであり、Ｋはシトシンまたはグアニンである。このプライマーは、２本のＰＣＲフラグメントを産生するために、上流のＳｓｔＩの制限酵素認識部位および下流のＳａｌＩの制限酵素認識部位に内在するＳＳＩＩ  ＲＴプライマーと一緒に、標準的なＰＣＲ反応（ＳＳＩＩ  ＲＴのテンプレート１０ｎｇ、２μＭの各々のプライマー、４８μｌのＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）：これらを、９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間の２０サイクル）に使用した。これらは、２４０ｂｐのＳｓｔＩ−ＮｇｏＭＩＶフラグメントおよび２００ｂｐのＮｇｏＭＩＶ−ＳａｌＩフラグメントであった。このフラグメントを単離し、消化し、そしてライゲートした後、ＳｓｔＩおよびＳａｌＩによって切断されたオリジナルのＳＳＩＩ  ＲＴクローンへ挿入した。得られた連結産物を、Ｆ３０９部位での変異体のライブラリーを作製するために、Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）コンピテント細胞に形質転換した。次いで、このライブラリーを、選択のためにプレートに一晩播いた。
【０１３８】
（Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａに関して）
変異Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａを、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５（１９９１）に記載されたようにオリゴ特異的変異誘発によって作製した。簡潔には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ遺伝子をｐＢＡＤｈｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ベクターに挿入し、ｐＢＡＤ−ＳＳＩＩと名付けた。このプラスミドを、ＤＨ１１Ｓ細胞に形質転換し、次いで、これらの細胞を、一本鎖ＤＮＡが単離されるＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させた。オリゴは、各々の変異：Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａ、に対応するように設計された。各々のオリゴ（１００μＭ）が、Ｆｏｗａｒｄ  Ｒｘｎ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、Ｔ４  ＤＮＡキナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってリン酸化した（ｋｉｎａｓｅｄ）。このオリゴを、一本鎖のｐＢＡＤ−ＳＳＩＩ  ＤＮＡにアニールさせた。ネイティブのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を氷上でアニールした反応物に、合成緩衝液（０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、１７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  ２．５ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＡＴＰ）とともに加えた。反応物を、３７℃において３０分インキュベートし、次いで、１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて停止した。この反応物をＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、平板培養した。コロニーを取り、変異を制限酵素解析によって決定し、次いで、ＡＢＩ  ３７７装置およびＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  キットを用いて確認のために配列決定した。
【０１３９】
活性型ＲＴを含有するコロニーの選択。個々の形質転換体コロニーを、９６ウェル培養プレートのそれぞれのウェルに接種した。各々のウェルは、０．２％のアラビノースを含有する１２０μｌの培地（ＥＧ−Ａｐ）を含んだ。好ましくは、まず９６ウェルプレートに誘発物質を含まない選択培地とともに接種し、この主プレートを一晩増殖させ、次いで主プレートの複製を誘発物質を含む９６ウェルプレートに作製し、このプレートを一晩培養する。この培養物を、振盪せずに３７℃で一晩培養した。一晩培養した培養物を室温で同容量の２×ＰＬＤ（１．８％  グルコース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍｇ／ｍｌ  ライソゾーム）と混和した。１０μｌの抽出液を４０μｌの１．２５×ＲＴ反応混合液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、６２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２．５ｍＭ  ＤＴＴ、１．２５ｍＭ  ｄＧＴＰ、ポリＣ／オリゴｄＧ（ヌクレオチドとして、３．７５ｍＭ／１．５ｍＭ）、「３２Ｐ」ｄＧＴＰ）と混和することにより、これらの抽出物を、直ちにＲＴ活性のアッセイに供した。この反応系を、１０分、３７℃の湯浴中に置いた。反応混合物の少量（５μｌ）を、電荷を帯びたナイロン膜（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ＋，ＮＥＮ）にスポットした。この膜を、１０％のＴＣＡおよび１％のピロリン酸ナトリウムの混合液で２回洗浄し、エタノールでリンスし、風乾し、フォスファスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に隣接して置いた。フィルターによって獲得した放射活性産物をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、フォスフォイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）でスクリーンを分析することで検出した。ＲＴ活性（放射活性）を示した場合、候補を選択した。これらの候補を、表現型の確認のために２回スクリーニングした。次いで、確認した候補を、検出し得るＲＴ活性をどのアミノ酸が保持しているのかを決定するために配列決定した。
【０１４０】
（ＲＴ変異体の精製）
誘発されたＲＴを含有する細胞ペレットを、２ｍＬの溶解緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）と１グラムの細胞ペレットの比率で懸濁した。懸濁液を、氷上で超音波処理し、次いで、２７，０００ｇで３０分間遠心分離した。無細胞抽出液を、０．４５μのシリンジフィルターを介して濾過した。緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８．０）、１０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍ  ＫＣｌ）に溶解した５ｍＭのイミダゾ−ルを流速１ｍＬ／分でカラムの５倍容で前平衡化した５ｍＬのＮｉ２＋ＨＩ−ＴＲＡＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、無細胞抽出物をアプライした。カラムを、緩衝液Ａに溶解した５ｍＭのイミダゾ−ル溶液１０倍容で洗浄した。ＲＴの溶出は、緩衝液Ａ中、５ｍＭから１Ｍまでのイミダゾール濃度勾配２０倍容を用いて洗浄することによって行った。緩衝液Ｂ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解した５０ｍＭ  ＫＣｌ１０倍容を流速１．０ｍＬ／分で前平衡化された１ｍＬのＭｏｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、ＲＴタンパク質を含有する溶出液をアプライした。このカラムを、緩衝液Ｂに溶解した５０ｍＭのＫＣｌ１０倍容で洗浄した。ＲＴを、緩衝液Ｂに溶解したＫＣｌの５０ｍＭから１Ｍの濃度勾配２０倍容によって溶出した。個々の溶出画分を、ＲＴ活性について分析した。ＲＴ活性のピークを有する画分を、貯蔵緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０％  グリセロール、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｍ  ＫＣｌ）に対して透析した。精製したＲＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定では、９５％を超える純度であった。タンパク質の濃度を、Ｂｉｏｒａｄ社の比色キットを使用して決定した。
【０１４１】
３種のｄＮＴＰのアッセイの方法。手順を、Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１１６８（１９８８）のものから改変した。ＤＮＡテンプレート−プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’末端が［３２Ｐ］で標識された４７マーのテンプレート（５’−ＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＴＧＴＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＧ−３’）（配列番号１）と１８マーのプライマー（５’−ＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣ−３’）（配列番号２）を（テンプレート：プライマーを３：１の比で）アニールすることによって調製した。アッセイ混合物（１０μｌ）は、５ｎＭ  テンプレート−プライマー、図中の説明で特定されるように、５０〜２００ｎＭ  ＲＴ、３〜４種のｄＮＴＰ（各２５０μＭ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ、ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。反応物を、３７℃で３０分間インキュベートし，次いで、９９％のホルムアミドに溶かされた４０ｍＭ  ＥＤＴＡを５μｌ加えることで停止した。反応産物を、９５℃で５分間のインキュベートによって変性させ、尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分析した。
【０１４２】
いくらかのＴｄＴ活性が、３種類のｄＮＴＰのアッセイの対照反応中に存在しているかを決定するために、全ての４種類のｄＮＴＰを使用する対照反応を、酵素量を６００ユニット未満から２０ユニットに変えて、３７℃で３０分間の条件で、繰り返し実施した。ＳＳＩＩ、Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａに対しては、２００、１００、５０、および２０ユニットを用いた。Ｆ３０９Ｎに対しては、６４６、２００、５０、２０ユニットを用いた。
【０１４３】
（結果）
本発明者らは、ＤＮＡテンプレートを用いたＦ３０９Ｎ（Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋ）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（本明細書中、以下、Ｆ３０９Ｎとして参照する）のミス挿入アッセイを実施した。変異体のミス取り込み能力をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩと比較するために、このアッセイを用いた。このアッセイは、合成ＤＮＡテンプレート−プライマーならびに４種のｄＮＴＰのうち３種類のみを含む偏ったＮＴＰプールを用いた、プライマーを伸長させるアッセイである。この反応物を、図４のゲルに示す。誤った挿入／誤った伸長の低い割合を持つ変異体をスクリーニングするためにこの工程を実施する間に、ＳＳＩＩ  ＲＴはテンプレートの末端を過ぎて２、３のヌクレオチドを伸長し、ならびにいくつかの変異はこの非テンプレート特異的伸長またはＴｄＴ活性を減少または排除するようであることを観察した。図４で示されているように、４種類全てのｄＮＴＰの存在下では、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴおよび変異Ｆ３０９Ｎは、おおよそ同等にプライマーを伸長し得た。すなわち、ＳＳＩＩ  ＲＴでは、テンプレートを過ぎて２個のヌクレオチドを加え、一方、Ｆ３０９Ｎでは、テンプレートの末端より先には全く加えなかった。この非テンプレート特異的伸長反応をさらに評価するために、３種のｄＮＴＰのミス伸長アッセイ（４種全てのｄＮＴＰを含む）についての対照反応を、様々な酵素量を用い３０分間にわたりＳＳＩＩ、Ｆ３０９Ｎ、Ｔ１９７Ｅ、およびＹ１３３Ａ  ＲＴに関して実施した。先のスクリーニングでは、これら３つの変異体は、非常に減少したレベルのＴｄＴ活性を示した。２０ユニットの酵素での５分間はプライマー伸長が完全になるために十分な時間を超えることが観察されていたので、３０分間のインキュベーションおよび２００ユニットから６４６ユニットのＲＴは、二つとも反応が完全であるために必要とされる条件を大幅に超えていた。図５に示されるように、試験された最低量での全てのＲＴ反応は、最大ユニットの濃度での反応に対する類似の伸長産物を有し、このことは、反応が完全に終了したことを証明する。ＳＳＩＩ  ＲＴは２個のヌクレオチドがテンプレートの末端を過ぎて付加し、Ｆ３０９ＮおよびＴ１９７Ｅはテンプレートの末端を過ぎて伸長せず、そしてＹ１３３Ａは、テンプレートの末端を過ぎて１個のヌクレオチドという少量の産物を有するようである。
【０１４４】
（実施例４：二重熱安定性およびＴｄＴ変異）
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）におけるアミノ酸位置Ｆ３０９を、ＨＩＶ逆転写酵素のＷ２６６部位とならべる。この位置は、親指ドメインの基部に位置し、テンプレート−プライマーの副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）と相互作用する副溝の結合トラクト（ｔｒａｃｔ）の一部と考えられている。これまでに、変異Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋは、酵素の熱安定性を増加することが示された。これらの変異は、米国特許出願番号第６０／２０７，１９７号（２０００年５月２６日出願）に記載され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。Ｈ２０４Ｒ／Ｔ３０６ＫクローンにおけるＦ３０９Ｎ変異は、ＲＮＡテンプレートではｌａｃＺフォワードアッセイ（表３）において２．３倍低い変異頻度を示し、そして３種類のｄＮＴＰを用いた伸長アッセイにおいて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴにおけるＨ２０４Ｒ／Ｔ３０６Ｋより短い伸長産物を示す。両知見は、高い忠実度を有する酵素の主張を支持する。
【０１４５】
【表２】
0005148799.tif 000003
表３、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴおよび点変異の変異頻度。
変異頻度（ＭＦ）は変異プラーク（明るい青，または白）の数を全プラークの数で割って決定した。出発ＤＮＡのバックグラウンドの変異頻度は、始めの３個の構築物では１７×１０−４、最後の１個の構築物では２０×１０−４であった。
【０１４６】
【表３】
0005148799.tif 000004
（方法）
変異誘発。標準的な部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）プロトコールを用いて，実施例３に記載されているように、Ｖ２２３Ｈ変異を含むプライマーを、以下の変異：Ｈ２０４Ｒ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎを有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩの一本鎖ＤＮＡとアニールさせた。このコロニーを、Ｖ２２３Ｈ、Ｈ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、およびＦ３０９Ｎの新しい組合わせを確認するために配列決定した。
【０１４７】
活性型ＲＴを含有するコロニーの選択。コロニーの選択を、実施例３のように行った。
【０１４８】
ＲＴ変異体の精製。精製を、実施例３のように行った。
【０１４９】
プラークの配列決定。ｌａｃＺファワードアッセイからのプラークを、軟寒天プレートからＷｈａｔｍａｎｎ３ＭＭ紙に転写し、これを少なくとも１時間乾燥させる。次いで、プラークを切りとり、次にプラーク／紙のディスクを、４−８μｌのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、１μｌのプライマー（ＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣ）（配列番号３）および総量２０μｌになるまで蒸留水を含有する配列決定反応混合液に直接加えた。ＡＢＩサイクル配列決定プロトコールでは、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間を２５サイクルが用いられた。紙のディスクを除去し、反応物を沈降し、次いで附加色素（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ）に再懸濁し、ＡＢＩ  ３７７配列決定機に入れた。
【０１５０】
配列を、野生型ｌａｃＺα配列と比較し、次いで、フレームシフト（１個のヌクレオチドの挿入または欠失のいずれか）、ミスマッチまたは鎖ジャンプ（繰り返し配列間の挿入または欠失）と分類した。各分類での全エラー頻度は、検出可能な部位（すなわち、表現型の変化を生じる改変の部位）の数（１１６）に（最初の一本鎖の寄与を排除するために）０．５で乗じたもので変異頻度を割り、次いで、各分類に存在することが観察された変異のパーセンテージを乗じることで決定した。ＥＲ＝ＭＦ／（検出可能な部位＊０．５）＊（各分類％）
３ｄＮＴＰアッセイ方法。３ｄＮＴＰアッセイを、実施例３のように行った。
【０１５１】
（結果）
本発明者らは、ＤＮＡテンプレートを用いた、Ｆ３０９Ｎ（Ｈ２０４Ｒ  Ｔ３０６Ｋ）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（本明細書中以下、Ｆ３０９Ｎという）およびＶ２２３Ｈ  Ｆ３０９Ｎ（Ｈ２０４Ｒ  Ｔ３０６Ｋ）（本明細書中以下、Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎという）のミス挿入アッセイを行った。本アッセイを、変異のミス取り込み能力をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩと比較するために用いた。このアッセイは、合成ＤＮＡ  テンプレート−プライマーおよび４種類のｄＮＴＰのうち３種類だけを含む偏ったｄＮＴＰのプールを用いたプライマーの伸長アッセイである。反応物を、図６および図７のゲルに示す。本アッセイにおいて、プライマー伸長の高効率は低い忠実度を意味する。図６および図７で示されるように、４種類のｄＮＴＰ全ての存在下では、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴおよびＦ３０９Ｎ変異体およびＶ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ変異体は、プライマーの末端に非テンプレート特異的ヌクレオチドの付加におけるいくらかの変動を伴って、おおよそ同等にプライマーを伸長し得た。しかし、ヌクレオチドの偏ったプールでインキュベートすると、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴは、ある相補的なｄＮＴＰが欠けているテンプレートのヌクレオチドを過ぎた実質的な伸長を触媒し得、このことは不正確なヌクレオチドの使用および低忠実度を示している。図６において、Ｆ３０９Ｎ（２）変異体は、３種のｄＮＴＰの偏ったプールのそれぞれにおいて、ＳＳＩＩ  ＲＴよりも短い伸長産物を示し、このことは、不正確なクレオチドを取り込む低い能力、従って高忠実度を示している。図７において、Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ変異体をｄＡＴＰおよびｄＣＴＰプールのみで伸長した。各々の場合、Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩよりも少ない伸長産物を有した。これは、Ｆ３０９ＮおよびＶ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ変異がＳＳＩＩ  ＲＴよりも低い変異頻度（１７×１０−４および１４×１０−４〜３９×１０−４）を有したｌａｃＺαアッセイの結果と一致する。Ｆ３０９ＮがなくＨ２０４Ｒ  Ｔ３０６Ｋの変異のみを有するＲＴは、ＳＳＩＩ  ＲＴと類似の変異頻度を有し（４１×１０−４〜３９×１０−４）、このことは、これらの変異が忠実度に影響しないことを示唆している。このデータは、高忠実度の変異がｄＮＴＰの偏ったプールを用いたより短い進展産物およびｌａｃＺαアッセイにおいて低い変異頻度の両方を有するような、ＤＮＡに対するミス挿入アッセイとＲＮＡに対するｌａｃＺαアッセイとの間の相関を示す。
【０１５２】
（実施例５：エラー頻度の決定）
エラー頻度の決定のために、ｌａｃＺフォワードアッセイからの変異プラークを公知の方法で配列決定した。次いで、変異を、以下のカテゴリーのうちの１つに分類した：ミス挿入によるミスマッチ、単一ヌクレオチドの挿入または欠失によるフレームシフトまたは、類似配列間のジャンプによって引き起こされる大きな挿入または欠失によるジャンプ。次いで、全てのエラー頻度を、ｌａｃＺαペプチドをコードする核酸に対して以下の式を用いて決定した：ＥＲ（エラー頻度）＝ＭＦ（変異頻度）／（検出し得る部位数×０．５）、ここで検出し得る部位数は１１６である。
【０１５３】
ｌａｃＺフォワードアッセイにおいて変異された全ての塩基が、結果的に検出し得る表現型を示すとは限らない。ミスマッチ、フレームシフトおよびジャンプの特定のエラー頻度を決定するために、変異頻度を、それぞれの変異カテゴリーの全てのパーセンテージを乗じることで改変し、次いで、特定のエラー頻度の決定のために用いた。以下は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴおよび高忠実度ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｈ２０３Ｒ  Ｔ３０６Ｋ  Ｆ３０９Ｎ逆転写酵素アッセイ由来のＭ１３ｍｐ１９中のｌａｃＺαペプチドの配列マップである。下線は欠失を示し、「＾」は上部に見える塩基Ａ、Ｔ、ＧまたはＣの挿入を示し、完全配列上に見えるＡ、Ｔ、ＧまたはＣはミスマッチを示す。
【０１５４】
【化１】
0005148799.tif 000005
【０１５５】
【表４】
0005148799.tif 000006
【０１５６】
【表５】
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この明細書で述べられた全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する当業者の技術レベルの指標であり、そしてそれぞれの刊行物、特許または特許出願が参照として援用されていることを具体的ににかつ個々に示したのと同じ程度に本明細書に参考として援用される。
【０１５７】
以上、理解を明白にする目的で図表および例によっていくらか詳細に本発明を十分に記載してきたが、本発明の範囲または明細書の任意の特定の実施形態をも損ねることなく、条件、組成および他のパラメーターを広範および同等の範囲内で本発明を改変または変更することによって本発明が実施され得、そして、このような改変または変更が特許請求の範囲内に包含されることが意図されていることは、当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、スキャンしたリン酸画像（ｐｈｓｐｈｏｉｍａｇｅ）を示し、これは、ＤＮＡテンプレートを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（１）、ならびに変異タンパク質のＶ２２３Ｈ（２）、Ｖ２２３Ｆ（３）、およびＲ１１０Ｍ（４）のミス挿入アッセイを示す。４７マーのＤＮＡテンプレート（５ｎＭ）にアニーリングした３２Ｐ標識された１８マーのプライマーは、４つのヌクレオチド全てを用いた伸長反応でみられるように、３０分間３７℃で、ＲＴタンパク質の同単位によって伸長された。その伸長反応はまた、３つの相補的なｄＮＴＰのみ；マイナスｄＣＴＰ、マイナスｄＡＴＰ、マイナスｄＴＴＰ、およびマイナスｄＧＴＰの存在下で実行された。その伸長反応物は、６％の変性ゲル電気泳動によって解析された。このアッセイにおいては、３つのヌクレオチドのみを用いて、末端化されたプライマーの伸長のより高い効率は、アッセイされるＭ−ＭＬＶ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−タンパク質の低い忠実度を反映する。Ｔ、完全に伸長されたプライマー。Ｐ、伸長されなかったプライマー。
【図２】  図２は、スキャンしたリン酸画像を示し、これは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（１）、および変異体Ｒ１１６Ｍ（７）のミス挿入アッセイを示す。ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭＩ（２）、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩの変異体Ｆ１５５Ｙ（３）、Ｋ１９３Ｔ（４）、Ｆ１５６Ｈ（５）、Ｄ１５３Ｎ（６）、およびＶ２２３Ｒ（８）がまた示される。反応条件は、図１と同じである。
【図３】  図３は、スキャンしたリン酸画像を示し、これは、変異体Ｖ２２３Ｉ（３）、およびＫ１９３Ｃ（６）に加えて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（１）、変異Ｖ２２３Ｈ（２）、Ｑ１９０Ｆ（４）、Ｋ１５２Ｒ（５）、Ｔ１９７Ａ（７）、およびＹ６４Ｗ（８）のミス挿入アッセイを示す。反応条件は、図１と同じである。
【図４】  図４は、（１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ、および（２）Ｆ３９０Ｎを使用する伸長アッセイのスキャンしたリン酸画像を示す。４７マーのＤＮＡテンプレート（５ｎＭ）にアニーリングした[３２Ｐ]標識された１８マーのプライマーは、４つのヌクレオチド全てを用いた伸長反応でみられるように、３０分間３７℃で、ＲＴの同単位によって伸長された。その伸長反応物は、６％の変性ゲル電気泳動によって解析された。Ｐ、伸長されなかったプライマー。
【図５】  図５は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（ＳＳＩＩ）  ＲＴ、および変異体Ｆ３０９Ｎ、Ｔ１９７Ｅ、およびＹ１３３ＡのＴｄＴ伸長アッセイを示しているスキャンしたリン酸画像を示す。４７マーのＤＮＡテンプレート（５ｎＭ）にアニーリングした[３２Ｐ]標識された１８マーのプライマーは、４つのヌクレオチドすべてを用いて、３０分間３７℃で、ＲＴの減少ユニット（方法を参照のこと）で伸長された。その伸長反応物は、６％の変性ゲル電気泳動によって解析された。このアッセイにおいて、４７ヌクレオチドのテンプレートを越える伸長は、非テンプレート特異的付加、もしくはＴｄＴ活性と考えられる。Ｐ、伸長されなかったプライマー。
【図６】  図６は、ＤＮＡテンプレートを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（１）、および変異タンパク質Ｆ３９０Ｎ  ＲＴ（２）のミス挿入アッセイを示しているスキャンしたリン酸画像を示す。４７マーのＤＮＡテンプレート（５ｎＭ）にアニーリングした[３２Ｐ]標識された１８マーのプライマーは、４つのヌクレオチド全てを用いた伸長反応でみられるように、３０分間３７℃で、ＲＴタンパク質の同単位によって伸長された。その伸長反応はまた、３つの相補的なｄＮＴＰのみ；マイナスｄＣＴＰ、マイナスｄＡＴＰ、マイナスｄＴＴＰ、およびマイナスｄＧＴＰの存在下で実行された。その伸長反応物は、６％の変性ゲル電気泳動によって解析された。このアッセイにおいては、３つのヌクレオチドのみを用いて末端化されたプライマーの伸長のより高い効率は、アッセイされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴの低い忠実度を反映する。Ｐ、伸長されなかったプライマー。
【図７】  図７は、ＤＮＡテンプレートを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（１）、ならびに変異タンパク質Ｔ１９７Ａ／Ｆ３０９Ｎ  ＲＴ（２）、およびＶ２２３Ｈ／Ｆ３９０Ｎのミス挿入アッセイを示すスキャンしたリン酸画像を示す。４７マーのＤＮＡテンプレート（５ｎＭ）にアニーリングした[３２Ｐ]標識された１８マーのプライマーは、４つのヌクレオチド全てを用いた伸長反応でみられるように、３０分間３７℃で、ＲＴタンパク質の同単位によって伸長された。この伸長反応はまた、３つの相補的なｄＮＴＰのみ；マイナスｄＡＴＰ、マイナスｄＣＴＰの存在下で実行された。この伸長反応物は、６％の変性ゲル電気泳動によって解析された。このアッセイにおいては、３つのヌクレオチドのみを用いて末端化されたプライマーの伸長のより高い効率は、アッセイされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴの低い忠実度を反映する。Ｐ、伸長されなかったプライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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