(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護剤、糖類、ｐＨ調整剤を含む精液希釈保存用組成物であって、血清由来成分を含まない精液希釈保存用組成物であって、保護剤がメチルセルロース（ＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、キサンタンガム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上である精液希釈保存用組成物。
【請求項２】
さらに抗酸化剤を含む請求項１に記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項３】
さらにアミノ酸を含む請求項１に記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項４】
保護剤を０．２〜１０．０重量％含む請求項１〜３のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項５】
糖類がグルコース、トレハロース、シュクロース、ラクトースである請求項１〜４のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項６】
ｐＨ調整剤がクエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び炭酸水素Ｎａを含む請求項１〜５のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項７】
抗酸化剤がアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ビタミンＥである請求項２〜６のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項８】
アミノ酸がＬ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１つ以上である請求項３〜７のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項９】
抗酸化剤又はアミノ酸を０．１〜４．２重量％含む請求項７又は８に記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の成分を含む精液希釈保存用組成物。
（ａ）保護剤として、メチルセルロース（ＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、キサンタンガム、及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上を含み、
（ｂ）糖類として、グルコースを含み、
（ｃ）ｐＨ調整剤として、クエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ及び炭酸水素Ｎａを含み、
（ｄ）抗酸化剤又はアミノ酸として、Ｌ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物、アスコルビン酸、グリシン、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、レシチン、エルゴチオネイン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つ以上を含む。
【請求項１１】
抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む請求項１０に記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項１２】
さらに抗生物質を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物を用いて、精液を希釈又は保存する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精液希釈保存用組成物に関する。さらに詳しくは血清等の天然の動物由来成分を含まず、かつ従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得る精液希釈保存用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、畜産分野において優れた畜肉を産するため、遺伝的に産肉能力、繁殖能力の高い雄の精液を多数の雌に人工的に授精させる方法が行われている。これらの人工授精によって、高能力雄精液の安価利用、精液を介した疾病の予防、繁殖成績の高レベル化、交配にかかる時間短縮・コスト低減等が可能となる。そのため、人工授精の普及が望まれている。
しかし、豚の産肉においては、豚精液は原精液のままでは２日程度しか精液活力（受胎性）が保たれず、３日目以降は急激に受胎率が低下する。また、精子濃度が牛に比べて低く、注入精液量が多く必要で、低温感作に極めて弱いという特徴を持つため、保存が容易ではない。そのため豚の産肉においては、人工授精を利用する農場が極めて少ない状況にある。【０００３】
従来、精液の保存法には射出精液を希釈液で数倍に希釈した後に液状で保存する方法と、−１９６℃の液体窒素中で凍結保存する方法が知られている。
液状保存の場合、１５℃前後の中温保存法と５℃の低温保存法がある。中温保存法はより一般的な保存法であり受胎率は良いが実用的保存期間が３〜５日と短い。低温保存法は１週間程度使用できるが、受胎率が低下する傾向がある。
凍結保存の場合、凍結法として錠剤法（ペレット法）とストロー法がある。凍結精液を用いる場合、融解後の精液活力が３５＋＋以上の精液を発情良好の雌に適期授精を行えば受胎成績は自然交配に劣らないといわれる。しかし、豚精液の凍結保存は牛に比べて難しく、実用化が遅れている。【０００４】
そこで、精液活力を保ったまま豚精液を保存するために、様々な保護剤や保存用希釈液が開発されている。例えば、デカン等の炭化水素類を用いることで、精子を２〜３℃に急速冷却するコールドショック処理後にも精子の生理的機能を損なわない保護剤（特許文献１）や、ラウリルアルコール等の炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質、さらにウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）を含有することにより、精子と細胞の生理的機能を実質的に保持することができる細胞低温傷害防止液（特許文献２）等である。また、クエン酸ナトリウム、ＢＳＡ、βグリセロリン酸ナトリウム等を含むＡ液と、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含むＢ液と添加混合することにより、５℃及び１５℃の両保存温度で利用できる豚精液保存用希釈液等である（特許文献３）。そして、豚精液保存液の保存性を高めるために、調整された希釈基液と、豚精液を混合する直前に希釈基液に加えるｐＨ調整を行うための添加液とからなる豚精液保存液等も開発されている（特許文献４）。【０００５】
しかし、これらの従来知られる保存用希釈液等においても、豚精液の精液活力が維持できる期間が短かいという問題があった。また、成分として含まれる血清等に各種サイトカインや増殖因子、ホルモン等の由来が不明なタンパク質等が含まれているため、保存精液の性質を変え、悪影響を及ぼす恐れがあるという問題があった。そして、血清等はロットによって含まれる成分が異なるため、均一な精液希釈保存用組成物が得られないという問題もあった。そこで、精液活力が維持され、かつ完全に天然の動物由来成分を含まない、均一な精液保存液の提供が望まれている。
【特許文献１】特開平８−２６９０１号公報
【特許文献２】特開平１０−２７９４０１号公報
【特許文献３】特許３３６４６８０号公報
【特許文献４】特許３６３６６０９号公報
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、血清由来成分等の天然の動物由来成分を含まず、かつ従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得る精液希釈保存用組成物の提供を課題とする。さらにこの精液希釈保存用組成物を用いる精液の保存方法の提供を課題とする。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、血清等の天然の動物由来成分を除き、その他の成分及び濃度を調整することによって、動物由来成分を含まず、従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得る精液希釈保存用組成物を見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明の精液希釈保存用組成物を用いて精液を調整することにより、精液の保存方法を完成するに至った。
本発明の精液希釈保存用組成物は、溶解時、原精液との混合時に泡立ちにくく、精液との混ざりがよいという特徴がある。また、本発明の精液希釈保存用組成物を用いた精液希釈保存液では、精液濃厚部が沈殿しにくく、分散性が良好であるという特徴がある。そのため、従来の保存液で必要とされていた１日１回ないし２回の保存精液の混合の手間を、３日に１回程度の軽減することができる。これらの特徴も、本発明の精液希釈保存用組成物が従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得ることに役立っていると考えられる。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１５）の精液希釈保存用組成物を用いる精液の保存方法に関する。
（１）  保護剤、糖類、ｐＨ調整剤を含む精液希釈保存用組成物であって、天然の動物由来成分を含まない精液希釈保存用組成物。
（２）  さらに抗酸化剤を含む上記（１）に記載の精液希釈保存用組成物。
（３）  さらにアミノ酸を含む上記（１）に記載の精液希釈保存用組成物。
（４）  天然の動物由来成分が血清由来成分である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（５）  保護剤が高分子有機ポリマーの水溶性高分子化合物である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（６）  保護剤を０．２〜１０．０重量％含む上記（５）に記載の精液希釈保存用組成物。
（７）  糖類がグルコース、トレハロース、シュクロース、ラクトースである上記（１）〜（６）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（８）  ｐＨ調整剤がクエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）及び炭酸水素Ｎａを含む上記（１）〜（７）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（９）  抗酸化剤がアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ビタミンＥである上記（２）〜（８）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（１０）  アミノ酸がＬ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１つ以上である上記（３）〜（９）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（１１）  抗酸化剤又はアミノ酸を０．１〜４．２重量％含む上記（９）又は（１０）に記載の精液希釈保存用組成物。
（１２）  以下の（ａ）〜（ｄ）の成分を含む精液希釈保存用組成物。
（ａ）保護剤として、高分子有機ポリマーの水溶性高分子化合物を含み、
（ｂ）糖類として、グルコースを含み、
（ｃ）ｐＨ調整剤として、クエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ及び炭酸水素Ｎａを含み、
（ｄ）抗酸化剤又はアミノ酸として、Ｌ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物、アスコルビン酸、グリシン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つ以上を含む。
（１３）抗酸化剤として、アスコルビン酸を含む上記（１２）に記載の精液希釈保存用組成物。
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物。
（１５）  上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の精液希釈保存用組成物を用いて、精液を保存する方法。
【０００９】
本発明により確立された精液希釈保存用組成物は血清由来成分等の天然の動物由来成分を含まないため、保存された精液に対する悪影響の恐れがなく、かつ安価に得ることができる。また、本発明の精液希釈保存用組成物は、従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得るため、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】精液希釈保存用組成物の分散性を示した図である（実施例１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の「精液希釈保存用組成物」とは、精液を保存するための組成物であって、保護剤、糖類、ｐＨ調整剤を含み、一方で天然の動物由来成分を含まない組成物のことをいう。さらに本発明の「精液希釈保存用組成物」とは、抗酸化剤又はアミノ酸を含み、一方で天然の動物由来成分を含まない組成物のことをいう。
本発明の精液希釈保存用組成物は室温（２３℃前後に保たれた安定性試験室で保管時の温度）又は４℃で保存した場合、少なくとも６ヶ月間、外観が変わらないものであることが好ましい。さらに本発明の精液希釈保存用組成物は、粉末を精製水１Ｌに溶解した時のｐＨ、浸透圧がほとんど変わることがなく、かつ保存による精液活力も変化しないものであることが好ましい。
本発明の「精液希釈保存用組成物」を用いて精液を保存する対象は特に問わないが、牛、豚、鳥、ヤギ等が好ましく、これらの種類は特に問わない。豚に用いる場合には、豚の種類はいずれでもよいが、種雄豚であることが好ましく、種雄豚の種類は特に問わない。【００１２】
本発明の「天然の動物由来成分を含まない」とは、血清由来成分等の成分を含まないことをいう。これは天然の動物由来成分が保存される精子に与える影響が不明であり、悪影響の恐れがあるためである。本発明の精液希釈保存用組成物はその組成が保存される精液に影響を与えない、由来が明確な成分のみからなることが望ましい。そのため本発明の精液希釈保存用組成物は、天然の動物由来成分は全く含まないことが望ましい。【００１３】
本発明の「保護剤」とは、精子頭部の頭帽にあるアクロソーム中に含まれる受精に必要な各種分解酵素が欠失しないように、その頭部及び頭帽を保護し、頭部が損傷しないようにするためのもののことをいう。
市販品の希釈液ではウシ血清アルブミン及び各研究機関では鶏卵黄等が保護剤として用いられている。しかし、本発明の「保護剤」は、これらの天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればよい。例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。また、高分子有機ポリマーの水溶性化合物等が挙げられる。
これらは精液希釈保存用組成物に０．２〜１０．０重量％含まれることが好ましく、０．２〜８．１重量％含まれることが望ましい。この範囲内で添加しないと、性能が維持されない場合があるためである。また１０．０重量％を超える添加では、溶解性の問題が生じるためである。【００１４】
本発明の「糖類」は、天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればいずれも用いることができる。例えば、トレハロース、シュクロース、ラクトース、グルコース等が挙げられる。これらは精液希釈保存用組成物に５０．４〜５９．９重量％含まれることが好ましく、５２．５〜５９．５重量％、特に５３．０〜５９．５重量％含まれることが望ましい。【００１５】
本発明の「ｐＨ調整剤」は、天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればいずれも用いることができる。例えば、クエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ及び炭酸水素Ｎａを含むことが好ましい。また、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含んでも良い。これらは精液希釈保存用組成物に、クエン酸三Ｎａ二水和物１３．３〜１５．４重量％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１１．２〜１２．８重量％、無水クエン酸５．１〜６．６重量％、ＥＤＴＡ４．１〜６．５重量％、炭酸水素Ｎａ１．０〜２．２重量％含まれることが好ましい。特に、クエン酸三Ｎａ二水和物１４．０〜１５．２重量％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１１．５〜１２．５重量％、無水クエン酸５．９〜６．４重量％、ＥＤＴＡ４．８〜５．２重量％、炭酸水素Ｎａ１．５〜１．７重量％含むことが好ましい。【００１６】
本発明の「抗酸化剤」は、天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればいずれも用いることができる。例えば、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ビタミンＥ等であることが好ましい。
また、本発明の「アミノ酸」も同様に、天然の動物由来成分を全く用いない場合においても、精液を十分に保護できる成分であればいずれも用いることができる。例えば、Ｌ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物、グリシン、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、レシチン、エルゴチオネイン及びアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つ以上であることが好ましい。
これらは本発明の精液希釈保存用組成物にＬ−システイン０．１〜４．２重量％、グルタチオン（還元型）０．１〜４．２重量％、シスチン０．１〜４．２重量％、Ｌ（＋）グルタミン酸Ｎａ一水和物０．１〜４．２重量％、アスコルビン酸０．１〜４．２重量％、グリシン０．１〜４．２重量％、Ｌシステイン塩酸塩一水和物０．１〜４．２重量％レシチン０．１〜４．２重量％、エルゴチオネイン０．１〜４．２重量％、及びアルギニン０．１〜４．２重量％からなる群より選択される少なくとも１つ以上含むことが好ましい。特に抗酸化剤として、アスコルビン酸を０．２〜０．２２重量％含むことが好ましく、またアミノ酸として、Ｌ（＋）グルタミン酸Ｎａ一水和物０．２〜０．２２重量％含むことが好ましい。
抗酸化剤またはアミノ酸は、この範囲内で添加しないと、性能が維持されない場合があり、また、０．２２重量％を超える添加では、溶解時のｐＨ及び浸透圧に影響を及ぼす場合がある。【００１７】
本発明の「精液を保存する方法」とは、必要時において本発明の精液希釈保存用組成物を精製水に溶解して調整した水溶液と、精液を混合し、一定温度で保存することをいう。本発明において、精液希釈保存用組成物の水溶液と精液を混合したものを「精液希釈保存液」という。
精液と精液希釈保存用組成物の水溶液との混合比率は、精液に含まれる精子数によって異なるが、「精液希釈保存液」に含まれる精子が０．４〜１億個／ｍＬとなるように混合することが好ましい。人工授精に用いる場合には、このように調製した「精液希釈保存液」を６０〜１００ｍｌ用いることが好ましい。「精液希釈保存液」の保存温度は、精液活力を保てる温度であればいずれの温度でもよいが、４℃〜中温（１５〜１８℃）、特に中温（１５℃）が好ましく、恒温器等で恒常的に中温（１５℃）に保たれた状態であることが最も好ましい。また、必要に応じて抗生物質を添加して保存することもできる。【００１８】
本発明の「精液活力」とは、原精液に含まれる精子の生存率及び運動性を次の活力判断基準に従って判断したもののことをいう。一般に、精液活力が６０＋＋以上の精液を発情良好の雌に適期授精を行えば受胎成績は自然交配に劣らないといわれるが、従来の保存用希釈液と同程度又はそれ以上に高い生存率及び運動性を有していることが好ましい。ウシ等の精液判定において、専用の機械があるものはそれを用いて行い、豚等の専用の機械がないものは精液性検査板に精液を乗せ顕微鏡で目視により判定することができる。【００１９】
活力判定基準
１．生存率は％で表示した（概ね５％きざみ）。
２．運動性は＋＋＋、＋＋、＋、±、−の５段階で表示した。
＋＋＋：極めて活発な前進運動を行うもの
＋＋：活発な前進運動を行うもの
＋：緩慢前進運動を行うもの
±：旋回又は振子運動を行うもの
−：運動しないもの
以下、本発明において、精液活力は全てこの基準に従って判断した。【００２０】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はなんらこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
＜精液希釈保存用組成物の調整＞
精液希釈保存用組成物として表１に記載の「開発組成物１」、「開発組成物２」を用いた。比較として豚精液希釈液として処方が開示されている「希釈用組成物１」、「希釈用組成物２」を用いた。各組成物の調整には、次の成分を用いた。
１．成分
１）保護剤として、ＢＳＡ（和光純薬）、ＭＣ（和光純薬）又はＣＭＣ−Ｎａ（和光純薬）を用いた。
２）糖類として、グルコースを用いた。
３）ｐＨ調整剤として、クエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ、炭酸水素Ｎａ及びＨＥＰＥＳを用いた。
４）抗酸化剤、アミノ酸として、アスコルビン酸を用いた。【００２２】
２．調整
上記１の成分を、表１に記載の組成となるように各重量用いて混合することで各組成物を調整した。得られた開発組成物を精液希釈保存用組成物としてアルミ製の袋（１包）に充填し、高温、多湿を避け室温（２３℃）で保管した。
使用時に精製水１Ｌに１包を加え、完全に溶解し調整して用いた。溶解後の精液希釈保存用組成物の水溶液は速やかに使用した。【００２３】
【表１】
0005238501.tif 000002
【００２４】
＜精液希釈保存用組成物の保存性能試験（精液活力測定）＞
表１の各組成物の水溶液に飼育豚（ランドレース）の精液を含まれる精子が０．５億個／ｍＬになるように加え精液希釈保存液を調整した。それぞれの精液希釈保存液にアミカシンを１００ｍｇ／Ｌになるように添加して、中温（１５℃）において保存した。精液活力を開始時〜７日後までを経時的に調べ、得られた結果を表２に示した。精液活力の判定は精液性状検査板を用い、上記の基準に従って行った。【００２５】
【表２】
0005238501.tif 000003
【００２６】
結果
「開発組成物１」、「開発組成物２」において、保護剤としてＢＳＡの代わりにＭＣを用いた場合でもｐＨ、浸透圧の測定値に変化は無く、１５℃保存下で１週間保存しても安定であると考えられた。精液活力においても１５℃条件下で７日間の保存に対して従来の保存用組成物と比較して最も良い活力を維持することが確認された。従って本発明の精液希釈保存用組成物はＢＳＡ等の動物由来成分を含まなくても、従来の保存用希釈液等と同程度の精液活力を維持し得ることが示された。【００２７】
＜精液希釈保存用組成物の経時的濁度変化の測定＞
上記において調製した「開発組成物１」を用いた精液希釈保存液の精液の保存状態を確認した。比較として「希釈組成物１」を用いた。図１に示したように、「開発組成物１」を用いた精液希釈保存液は「希釈組成物１」を用いた精液希釈保存液よりも分散性が良いことが示された。
また、これらの分散性の維持度合いについて希釈時〜１０日後までの経時的な濁度の変化を吸光度（５５０ｎｍ）によって調べ、得られた結果を表３に示した。その結果、表３に示すように、希釈後３日経過程度であれば、「開発組成物１」を用いた精液希釈保存液の分散性が維持されていることが示された。従って、「開発組成物１」を用いた精液希釈保存液においては、本発明の従来の保存液で必要とされていた１日１回ないし２回の保存精液の混合の手間を、３日に１回程度に軽減することができることが示唆された。【００２８】
【表３】
0005238501.tif 000004
【実施例２】
【００２９】
＜精液希釈保存用組成物の調整＞
１．成分
精液希釈保存用組成物の調整において、実施例１において使用する成分に代えて、次の成分を用いた。
１）保護剤：ＰＶＰ、キサンタンガム、アルギン酸等、高分子ポリマーからなる群より選択される少なくとも１つ以上を選択した。
２）ｐＨ調整剤：クエン酸三Ｎａ二水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、無水クエン酸、ＥＤＴＡ及び炭酸水素Ｎａからなる群より選択される少なくとも１つ以上を用いた。
３）抗酸化剤、アミノ酸等：Ｌ−システイン、グルタチオン（還元型）、シスチン、Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物、アスコルビン酸及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１つ以上を用いた。【００３０】
２．調整
上記１の成分を組み合わせ、次に記載の処方１〜６の精液希釈保存用組成物となるようにそれぞれ混合することで調整した。得られた精液希釈保存用組成物をアルミ製の袋（１包）に充填し、高温、多湿を避け室温（２３℃）で保管した。使用時に精製水１Ｌに１包を加え、完全に溶解して精液希釈保存用組成物の水溶液に調整して用いた。【００３１】
次の保護剤、糖類、ｐＨ調整剤と、各処方における種々の抗酸化剤、アミノ酸等を添加することで、処方１〜６の精液希釈時保存用組成物を調整した。
保護剤：ＣＭＣ−Ｎａ  ０．１〜４．０ｇ
糖類：グルコース  ２３．０〜２８．０ｇ
ｐＨ調整剤：クエン酸三Ｎａ二水和物  ６．９ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ５．６５ｇ、無水クエン酸  ２．９ｇ、ＥＤＴＡ  ２．３５ｇ、炭酸水素Ｎａ  ０．７５ｇ
各処方における抗酸化剤、アミノ酸等：
処方１；グルタチオン（還元型）  ０．１ｇ
処方２；Ｌ（＋）−グルタミン酸Ｎａ一水和物  ０．１ｇ
処方３；アスコルビン酸  ０．１ｇ
処方４；シスチン  ０．１ｇ
処方５；Ｌ−システイン０．１ｇ
処方６；グリシン  ０．１ｇ
【実施例３】
【００３２】
＜精液希釈保存用組成物の経時安定性試験＞
１．性状及び規格試験
実施例２で作成した精液希釈保存用組成物のうち、処方６の精液希釈保存用組成物をアルミ製の袋に充填し、高温、多湿を避け室温（２３℃）又は４℃で６ヶ月間保存した。この保存期間における精液希釈保存用組成物の経時安定性を、精液希釈保存用組成物の外観における性状と、用時調整した水溶液におけるｐＨ及び浸透圧の性状の規格試験によって調べた。【００３３】
２．１５℃保存性能試験（精液活力測定）
処方２の精液希釈保存用組成物を用いて、実施例１、２と同様に精製水に溶解した精液希釈保存用組成物の水溶液に飼育豚（ランドレース）の精液を０．５億個／ｍＬになるように加え、精液希釈保存液を得た。精液希釈保存液の調製にあたり、精子が１０億個／ｍｌの原精液５ｍｌに精液希釈保存用組成物の水溶液５ｍｌをゆっくり加え、さらに１０分後精液希釈保存用組成物の水溶液を９０ｍｌ加えることで調製した。この精液希釈水溶液を中温（１５℃）において７日間保存した後、精液活力を判定した。性状及び規格試験と保存性能試験の結果を表４に示した。【００３４】
【表４】
0005238501.tif 000005
【００３５】
表４に示すように、この結果より精液希釈保存用組成物は、６ヶ月間の保存でも性状及び規格に変化がほとんど見られず、精液活力も衰えないことが確認できた。これによって、本発明の精液希釈保存用組成物は少なくとも６ヶ月間は保存が可能であり、必要に応じて調整して用いることができることが示された。
【実施例４】
【００３６】
＜精液希釈保存用組成物の保存性能試験＞
実施例２で調整した処方１〜６の精液希釈保存用組成物の精液活力の保存性能を調べた。比較として保護剤としてＢＳＡを用いた組成物を調製して用いた。比較として用いた組成物の組成を次に示した。
比較組成物
保護剤：ＢＳＡ  ２．０ｇ
糖類：グルコース  ２６．５ｇ
ｐＨ調整剤：クエン酸三Ｎａ二水和物  ６．９ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ５．６５ｇ、無水クエン酸  ２．９ｇ、ＥＤＴＡ  ２．３５ｇ、炭酸水素Ｎａ  ０．７５ｇ
抗酸化剤、アミノ酸等：アスコルビン酸  ０．１ｇ【００３７】
各精液希釈保存用組成物の精液活力の保存性能は、実施例１に記載の保存性能試験（精液活力測定）と同様に行った。精液の希釈時の活力及び中温（１５℃）において７日間保存後の活力を調べた。【００３８】
結果
処方１〜６及び比較組成物を用いた精液希釈保存液に含まれる、精液の希釈時活力はいずれも８０＋＋＋〜９０＋＋＋であった。これらの７日間保存後の精液の活力は、処方１〜６の精液希釈保存用組成物を用いたものはほぼ６０＋＋以上で、活力が高いもので７０＋＋であった。一方、比較組成物を用いたものは４５＋＋〜５５＋＋であった。従って、本発明の精液希釈保存用組成物は、動物由来成分を含まなくても、従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得ることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の精液希釈保存用組成物は安全かつ安価であって、従来の保存用希釈液等と同程度又はそれ以上の精液活力を維持し得ることから、広く畜産動物の人工授精業者や養豚家において利用することができる。
【図１】
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