(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。
【請求項３】
floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。
【請求項５】
floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。
【請求項７】
floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
floury-2変異イネの製造方法であって、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法によって製造された遺伝子組換え低アレルゲンイネ。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれかに記載の製造方法によって製造されたfloury-2変異イネ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のイネの種子。
【請求項１２】
単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするマーカー。
【請求項１３】
単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。
【請求項１４】
低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするマーカー。
【請求項１９】
単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。
【請求項２０】
floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするキット。
【請求項２５】
低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするキット。
【請求項２６】
floury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によってfloury-2遺伝子産物を検出できる検出器を備えていることを特徴とする請求項２４又は２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え低アレルゲン植物及び低アレルゲン植物マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーはアナフィラキシーやアトピー性皮膚炎等の原因となる。その対策としては、原因となる食品を避けることや薬物投与が挙げられるが、主食であるコメなどに関しては、完全に摂取を絶つことは難しい。そこで、低アレルゲン米の需要が高まっており、その開発が検討されている。
【０００３】
米アレルゲンとしては、グロブリンなどの塩可溶性タンパク質が最もよく知られており、特に分子量１６ｋＤａのタンパク質が強くアレルギーを誘発する（例えば、非特許文献１参照）。塩可溶性タンパク質以外にも、ワキシイタンパク質（例えば、特許文献１参照）などが知られている。
【０００４】
このような米アレルゲンを低減させた低アレルゲン米は、主要な米アレルゲンが塩可溶性であることから、例えば、高圧処理と塩水溶液洗浄でグロブリンなどを低減させたり（Ａカット米）、通常より、精米率を高くし、タンパク質が多く含まれる米粒の周辺部を削り取ったり（高度精白米）することにより作製されている。また、遺伝子組換えなどにより低アレルゲン植物を作製する技術も開発されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
一方、日本型イネ「金南風（キンマゼ）」を化学的突然変異原（ＭＮＵ、ＥＭＳ、ＥＩ）で処理することにより、胚乳が紛質になる表現型を有する変異体flouryが得られた（例えば、非特許文献３参照）。このflouryは、その後、５番染色体上にあるfloury-1(flo1)、４番染色体上にあるfloury-2(flo2)、６番染色体上にあるfloury-3(flo3)などに分類された（例えば、非特許文献４，５参照）。中でも、flo2の表現型が詳細に解析され、未成熟な種子において、ＲＢＥ１（rice branching enzyme 1）をはじめとする、ＲＢＥ３や顆粒結合型デンプン合成酵素（granule-bound starch synthase）などのデンプン生合成酵素の発現が低下していた（例えば、非特許文献６参照）。さらに、flo2変異体において、上記の１６ｋＤａアレルゲンタンパク質の発現が減少していること（例えば、特許文献２参照）から、flo2変異体が低アレルゲン米として有望であることが示されていた（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００１−２０４２８４
【特許文献２】特開２００３−２５９７５０
【非特許文献１】T,Matsuda et al., Agri. Biol. Chem. 52, 1465-1470, 1988
【非特許文献２】Y. Tada et al. FEBS Lett. 391, 341-345, 1996
【非特許文献３】H. Satoh and T. Omura Japan J. Breed. 31, 316-326, 1981
【非特許文献４】R.P.Kaushik and G.S.Khush Theo. Appl. Genet. 83, 146-152, 1991
【非特許文献５】山下和宏、佐藤  光、西  愛子、浅川今日子  日本育種学会２０００年春季講演会  口頭発表タイトル（250番）２０００年４月３日「染色体６に座乗するイネの新たな粉質胚乳変異体遺伝子floury ３について」
【非特許文献６】T. Kawasaki et al. Plant Physiol. 110, 89-96, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、flo2 変異の原因遺伝子が単離されていなかったため、新たなflo2 対立遺伝子を有する変異体を作製するには、例えば、化学的突然変異原をもちいて膨大な変異体ライブラリーを作製し、その中から数少ないflo2変異体を同定しなければならなかった。また、flo2変異体のマーカーも存在しなかったため、flo2変異体を同定する際にも、例えば、相補性試験などにより、従来のflo2変異体と相補しない変異体を選択しなければならなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、より時間も労力も必要としない、遺伝子組換えを利用したflo2変異植物及び低アレルゲン植物の製造方法並びにflo2変異植物及び低アレルゲン植物を同定するためのマーカーを提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、flo2変異の原因遺伝子のクローニングを目的として鋭意努力した結果、４番染色体のゲノム・ウォーキングによって、flo2遺伝子を同定することができ、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明にかかる遺伝子組換え低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物の製造方法は、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを特徴とする。ここで、「floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させる」とは、突然変異ライブラリーからfloury-2遺伝子の機能が低下した植物を選択するという場合のように、機能を低下させるときに、特定の遺伝子ではなく不特定多数の遺伝子の機能を低下させるのではなく、特定の遺伝子の機能を狙って低下させることを意味する。製造する際、外来性核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。例えば、前記外来性核酸が、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸であることが考えられる。また、floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。また、前記植物がイネであってもよい。
【００１０】
本発明にかかる遺伝子組換え低アレルゲン植物は、上記いずれかに記載の製造方法によって製造されたものである。その植物の種子も本特許の権利の範囲内である。
【００１１】
本発明にかかるfloury-2変異植物の製造方法は、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを特徴とする。「特異的に低下させる」の意味は、上記と同様である。その際、外来性核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。例えば、前記外来性核酸が、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸であることが考えられる。また、floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。また、前記植物がイネであってもよい。
【００１２】
本発明にかかるfloury-2変異植物は、上記いずれかに記載の製造方法によって製造されたものである。その植物の種子も本特許の権利の範囲内である。
【００１３】
本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーは、floury-2遺伝子の遺伝子関連物質である。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。前記植物がイネであってもよい。
【００１４】
本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物の同定方法は、floury-2遺伝子の機能の増減または発現を調べることを特徴とする。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。前記植物がイネであってもよい。
【００１５】
本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物を同定するためのキットは、floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有していることを特徴とする。本キットは、前記floury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によってfloury-2遺伝子産物を検出できる検出器を備えていてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、遺伝子組換えを利用したflo2変異体及び低アレルゲン植物の製造方法並びにflo2変異体及び低アレルゲン植物を同定するためのマーカーを提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝floury-2 (flo2)遺伝子＝＝
実施例で示すように、本発明者らは、イネにおいて、４番染色体上に位置するfloury-2(flo2)変異の原因遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡに含まれることを明らかにした。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを明らかにし、本明細書では、この遺伝子（即ち、ＤＮＡ上で、エクソン、イントロン、５’非コード領域、及び３’非コード領域からなる転写領域、並びにその転写領域の転写を調節するエンハンサー／プロモーター領域からなる領域のことをいう。）をイネfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、他の植物において、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡと相同領域に含まれ、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子の相同遺伝子を、その植物におけるfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対し、１〜数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと同じ機能を有するペプチドをコードする遺伝子も、floury-2遺伝子と呼ぶものとする。
【００２０】
＝＝flo2 変異植物の製造方法＝＝
本発明の一実施態様は、flo2変異植物の新規製造方法である。従来は、植物に変異源を投与して、ランダムに染色体DNAに変異を導入し、以前から知られていたflo2変異植物（例えば、イネの場合ＥＭ３６系統やＥＭ３７系統）と交配させ、相補しない変異体を選ぶという相補性検定によりflo2変異体を選択していた。しかし、本発明の発明者らによりflo2変異体における原因変異、及びflo2変異の原因遺伝子であるfloury-2遺伝子が同定され、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることができるようになった。
【００２１】
すなわち、外来性核酸である組換えfloury-2遺伝子をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させ、flo2変異体を作製することができる。flo2変異体の作製は、常法に従い、相同組換え法、siRNAやmsRNAなどのRNA干渉法、アンチセンスRNA法等に用いるための核酸をゲノムに導入すればよい。これらの方法は、いずれも、floury-2遺伝子の発現を減少させるために用いることができ、その結果として、floury-2遺伝子の機能が低下する。相同組換え法に関しては、変異を導入し機能の低下した組換えfloury-2遺伝子を用いることにより、発現レベルは同じままで、機能を低下させることも可能である。ここで、変異の種類は特に限定されないが、具体的な変異の例としては、実施例に示すように、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換すれば、アンバー突然変異を有するflo2変異体を作製することができ、それ以外にも、プロモーターに変異を導入する、機能ドメインに機能を失わせるような変異を導入する、など、様々な実施形態が可能である。
【００２２】
ここで、対象となる植物は、特に限定されないが、flo2変異の表現型の一つが低アレルゲン種子を生産することなので、種子を食用とするイネ、麦、ソバ等の植物が好ましい。
【００２３】
＝＝遺伝子組換え低アレルゲン植物の製造方法＝＝
本発明の他の実施態様は、遺伝子組換え低アレルゲン植物の新規製造方法である。  
flo2変異イネでは、食物アレルギーの主因である１６ｋＤａアレルゲンタンパク質の発現が減少していることが明らかになっている（上記特許文献２参照）。従って、上記のようにflo2変異植物を製造することにより、遺伝子組換え低アレルゲン植物を製造することができる。
【００２４】
＝＝低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカー＝＝
本発明のさらに別の実施態様は、floury-2遺伝子の遺伝子関連物質である低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーである。ここで、遺伝子関連物質とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部を含み、遺伝子が転写されてから最終産物になるまでの過程に関係する分子であって、さらに、機能の低下を検出するために用いることができる物質のことをいう。  
ここでも、対象となる植物は、特に限定されないが、低アレルゲン植物の開発が期待されている、イネ、麦、ソバ等の植物が好ましい。
【００２５】
例えば、floury-2遺伝子にhypomorphやamorphの変異を有するが、発現は正常であるような植物の場合、floury-2遺伝子を含有するゲノムＤＮＡを抽出し、floury-2遺伝子をPCRで増幅して塩基配列を調べたり、RFLPを検出するために適切な制限酵素で切断したりして、当該変異を検出することができる。floury-2遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを単離し、直接配列を決定してもよい。特定の変異を検出する場合には、その変異を含むプライマーを作製してＰＣＲを行なうことにより、変異を検出してもよい。
【００２６】
また、floury-2遺伝子の発現が低下している植物の場合、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの配列を調べてもよいが、floury-2遺伝子の発現の低下がfloury-2遺伝子内の変異によらない可能性があるため、floury-2遺伝子のｍＲＮＡやタンパク質の量を測定するほうが好ましい。例えば、組織化学的手法（個体や切片を用いて、in situでｍＲＮＡやタンパク質を検出する方法等）や分子生物学的手法（ノーザン・ブロッティング、ウエスタン・ブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等）を用いて、floury-2遺伝子の発現を調べることができる。
【００２７】
この場合、floury-2遺伝子の発現を容易に検出するために、発現検出に必要な試薬（例えば、floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体など）を、反応バッファー等とともにキット化してもよい。また、最近は、インフルエンザウイルス検出キットなどにも広く用いられているように、発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によって検出できる検出器をキットに含めれば、floury-2遺伝子産物を容易に検出できるようになる。
【００２８】
このようにして低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーが検出できれば、例えば、ランダムに変異を導入した植物を大規模に作成し、その中から、floury-2遺伝子の機能や発現が低下している低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物を容易に同定することができる。また、交配によって生じた低アレルゲン植物の候補植物の中から、低アレルゲン植物を容易に検出することができるようになる。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞floury-2 (flo2)遺伝子のクローニング
＝＝flo2遺伝子座の詳細なマッピング＝＝
これまでに、flo2遺伝子座は、４番染色体上にあることが明らかになっていた。そこで、ＤＮＡマーカーを用い、flo2遺伝子座の詳細なマッピングを行った。
【００３０】
まず、イネ日本型品種Japonica（flo2変異型ＥＭ３７）とインド型品種Indica (野生型カサラス)を交配し、得られたＦ１を自家受粉させることにより、約４０００個体のＦ２を得た。このうちのflo2の表現型を示す劣性ホモ系統の種子を選抜し、これらflo2変異体のうちの約８００個体からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを用い、以下のようにflo2遺伝子座のマッピングを行った。
【００３１】
まず、Rice genome Integrated Map database(ＩＮＥ)(http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html)を利用して、JaponicaとIndicaの４番染色体の塩基配列を比較し、多型を検索してＳＮＩＰ（single nucleotide polimorphism）を同定し、その位置にプライマーを作成した。ここでは、７２．４ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、９４℃で５分変性した後、９４℃  ３０秒-５５℃  ３０秒-７２℃  ３０秒のサイクルを３０サイクル行った後、７２℃  ７分処理する、という条件（条件１）で、３００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が３３％であったので、flo2遺伝子座は３９．４ｃＭまたは１０５．４ｃＭの付近にあることが明らかになった。  
72.4-5-1(In): ＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号３）
72.4-3-1(In): ＴＴＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣ（配列番号４）
72.4-5-1(Jp): ＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣ（配列番号５）
72.4-3-1(Jp): ＴＴＣＴＣＧＴＡＣＧＣＧＡＴＴＧＣＧＡＣ（配列番号６）
【００３２】
次に、８５ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、アニーリングを６０秒にする以外は上記と同じ条件（条件２）で、同様に３００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が２２％であったので、flo2遺伝子座は６２．５ｃＭまたは１０６．５ｃＭの付近にあることが明らかになった。  
85-5-1(In):ＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＣＡ（配列番号７）
85-3-4(In):ＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣ（配列番号８）
85-5-1(Jp):ＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡ（配列番号９）
85-3-4(Jp):ＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＧＴＣＧＣ（配列番号１０）
これらの結果より、flo2遺伝子座は１０５ｃＭ付近にあることが示唆されたので、その近傍でＰＣＲを行うことにより、より詳細なマッピングを行った。
【００３３】
まず、１０６ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、条件２で、同様に５００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が３．８７％であったので、flo2遺伝子座は１０２ｃＭまたは１０９．７ｃＭの付近にあることが明らかになった。  
106-5-3(In):ＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＣＡ（配列番号１１）
106-3-2(In):ＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＴ（配列番号１２）
106-5-3(Jp):ＡＣＣＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＡ（配列番号１３）
106-3-2(Jp):ＣＣＧＴＧＣＴＡＡＣＧＴＴＴＧＡＣＴＧＴ（配列番号１４）
【００３４】
さらに、１０５ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、条件２で、同様に２７０サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が４．６６％であったので、flo2遺伝子座は１００．１ｃＭまたは１０９．５ｃＭの付近にあることが明らかになった。  
105-5-3(In):ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＣＴ（配列番号１５）
105-3-1(In):ＣＣＴＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴ（配列番号１６）
105-5-3(Jp):ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ（配列番号１７）
105-3-1(Jp):ＣＣＴＴＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＴ（配列番号１８）
【００３５】
これらの結果より、flo2遺伝子座は１０９．６ｃＭ付近にあることが示唆された。
【００３６】
さらに、１１０ｃＭ近傍のＳＳＲ（マイクロサテライト）マーカーを用いてより精密なマッピングを行った。多数のflo2の表現型を示すＦ２個体に対し、１０９．６ｃＭ付近にあるＳＳＲマーカー（２１７９５１、２１８０４２、２１８３４５、ＲＭ８２１７、２１８７６７、２１８７８７、２１８８０１）（詳細は表１に示す）を調べたところ、図１に示すように（白抜きの領域がJaponica由来であり、斜線の部分がIndica由来である。）、２１８０４２〜２１８７８７のＤＮＡ領域の由来と表現型が常に一致し、この結果、flo2遺伝子座はこの領域の約３７ｋｂの範囲に存在することが明らかになった。
【００３７】
0005252519.tif 000002
【００３８】
＝＝flo2遺伝子の同定＝＝
３７kbのＤＮＡに対し、ＯＲＦの検索を行ったところ、（Ａ）OSJNBa0033G05.19（２９７）、（Ｂ）OSJNBa0033G05.20（８０２）、（Ｃ）OSJNBa0033G05.21（５７５）、（Ｄ）OSJNBa0070011.2（１７２１）の４つの遺伝子（Ａ）〜（Ｄ）が３７kb 内に存在し、flo2遺伝子の候補になった（カッコ内はアミノ酸数）。そこで、flo2変異型ＥＭ３７変異体の塩基配列を決定したところ、（Ｄ）OSJNBa0070011.2遺伝子において、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧがＡに置換し、その結果、本来８２８番目のトリプトファンをコードするコドンが、ストップコドンに変異していた（図２）。一方、他の３つの遺伝子には、変異は無かった。
【００３９】
また、野生型イネとＥＭ３７変異体において、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの４つの遺伝子の発現を調べた（図３）。逆転写酵素はReverTraAce（TOYOBO社）を用い、条件は添付のプロトコールに従った。プライマーペアは、それぞれ、
Ａ：ＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧ（配列番号３１）
ＧＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＡＣ（配列番号３２）
Ｂ：ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴ（配列番号３３）
ＴＧＧＧＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣ（配列番号３４）
Ｃ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）
ＧＣＧＡＡＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧ（配列番号３６）
Ｄ−１：ＣＴＣＡＡＴＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＴＴ（配列番号３７）
ＴＡＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣ（配列番号３８）
Ｄ−２：ＴＴＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡＧＡＧ（配列番号３９）
ＧＧＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＡＣＡ（配列番号４０）
を用い、９４℃で３０秒−５５℃で３０秒−７２℃で３分のサイクルを３０サイクル行なった。図３に示すように、野生型と比べ、ＥＭ３７においては、OSJNBa0070011.2遺伝子（Ｄ）の発現は低下していた。他の遺伝子に関しては、遺伝子ＡはＥＭ３７の方が発現量が高く、遺伝子Ｂは両者とも発現が極めて低く、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃともに発現量に変化がなかった。
【００４０】
これらの結果より、OSJNBa0070011.2遺伝子が目的のflo2変異の原因遺伝子（floury-2遺伝子）であることが明らかになった。従って、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧがＡに置換した変異植物や、floury-2遺伝子の機能を低下させた変異植物を作製すれば、低アレルゲン性イネであるflo2変異体を作製することができる。また、上記floury-2遺伝子の遺伝子関連物質は、低アレルゲン植物やflo2変異体のマーカーとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の実施例において、ＳＳＲマーカーを用いて作製されたマップを表す図である。Ｉ（斜線）はIndica由来のＤＮＡ、ＪはJaponica由来のＤＮＡを表す。
【図２Ａ】本発明の実施例において、OSJNBa0070011.2遺伝子近傍の塩基配列と、OSJNBa0070011.2遺伝子がコードするアミノ酸配列を並列させた図である。白抜きで表したＧは、ＥＭ３７変異体において、Ａに置換している塩基である。ここでは、連続した配列を図２Ａ〜図２Ｊに分けて示した。
【図２Ｂ】図２Ａに示した配列の続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂに示した配列の続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃに示した配列の続きである。
【図２Ｅ】図２Ｄに示した配列の続きである。
【図２Ｆ】図２Ｅに示した配列の続きである。
【図２Ｇ】図２Ｆに示した配列の続きである。
【図２Ｈ】図２Ｇに示した配列の続きである。
【図２Ｉ】図２Ｈに示した配列の続きである。
【図２Ｊ】図２Ｉに示した配列の続きである。
【図３】本発明の実施例において、ＳＳＲマーカーを用いて行なったマッピングで特定された３７ｋｂの領域内に存在する４つの遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで検出した結果を示す図である。ＷＴは野生型のイネ、ＥＭはＥＭ３７のイネにおける発現を示す。矢印は、ＥＭ３７変異体において、野生型イネで検出されるバンドが検出されないことを示している。
【図１】
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【図２Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３】
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【配列表】
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