(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマトコッカス藻を５〜８５体積％エタノール水溶液に懸濁し、スラリーを調製する工程と、
前記スラリーをポンプにより加圧して間隙を通過させることによりヘマトコッカス藻を破砕する工程を備える、
アスタキサンチンの製造方法。
【請求項２】
前記エタノール水溶液が３５〜８５体積％エタノール水溶液である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記エタノール水溶液が６５〜８５体積％エタノール水溶液である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記スラリーがエタノール水溶液１００ｍｌ中にヘマトコッカス藻を１８〜４０ｇ含む、請求項１〜３いずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記スラリーがエタノール水溶液１００ｍｌ中にヘマトコッカス藻を２２〜４０ｇ含む、請求項１〜３いずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ヘマトコッカス藻を破砕する工程において得られたヘマトコッカス藻破砕液をポンプにより加圧して間隙を通過させることによりヘマトコッカス藻をさらに破砕する工程をさらに備える、請求項１〜５いずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ヘマトコッカス藻を破砕する工程及び前記ヘマトコッカス藻をさらに破砕する工程におけるポンプによる印加圧力が異なり、前者の印加圧力よりも後者の印加圧力の方が高い、請求項１〜６いずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ポンプによる印加圧力が４０〜１００ＭＰａである、請求項１〜７いずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ポンプによる印加圧力が６０〜１００ＭＰａである、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは、甲殻類、魚類等の水産生物に含まれる赤色カロチノイド色素で、これらの生物の肉色や体色の発現に深く関与している。アスタキサンチンは高い抗酸化作用を持ち、紫外線や脂質過酸化から生体を防御する因子として働いていると考えられる。
【０００３】
緑藻類、細菌等を粉砕してアスタキサンチン類を製造する方法は、これまでに種々報告されており、これらの細胞を破砕する方法としては、物理的、酵素的、化学的な破砕方法やそれらの組み合わせが知られている。
【０００４】
物理的な細胞破砕方法としては、ガラスビーズが充填された連続式密閉型粉砕機を用いて藻体を摩砕により破砕する方法（特許文献１：特許第２９２３９１９号公報）、攪拌羽根を内蔵し、ガラス球を収容した密閉状容器内において、スラリー中のクロレラ細胞を高圧作用状態から低圧作用状態へと瞬間的に移行させ、その移行の際のクロレラ細胞の急激な膨張によってクロレラ細胞を破砕させる方法（特許文献２：特許第３１４３６３６号公報）、細胞壁を高圧下乱流により破砕する方法（特許文献３：特開平９−１１１１３９号公報）が挙げられる。
【０００５】
【特許文献１】特許第２９２３９１９号公報
【特許文献２】特許第３１４３６３６号公報
【特許文献３】特開平９−１１１１３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の酵素処理、乾燥処理等では高い細胞破砕率が得られないという問題が存在する。また、加熱処理によりアスタキサンチンが失活し、活性型アスタキサンチンの回収率が低下するという問題が存在する。そのため、物理的な細胞破砕によって高い細胞破砕率を得る試みがなされてきた。
【０００７】
しかしながら、従来の物理的な細胞破砕方法においては、ビーズミル等の摩砕による破砕では破砕処理に時間がかかり、また、微細なガラス片等の不純物が混入するという問題が存在する。ビーズミル等を使用しない高圧ホモジナイザを用いる場合、すなわち、細胞を含むスラリーをポンプにより加圧して間隙を通過させる場合は、細胞の導入によりしばしば間隙等の目詰まりが起こり、よって、細胞の破砕率が低下するというという問題が存在する。
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、高圧ホモジナイザを用いた場合でも、間隙等の目詰まりを低減し、効率的に細胞を破砕し、効率的にアスタキサンチンを製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、ヘマトコッカス藻を５〜８５体積％エタノール水溶液に懸濁し、スラリーを調製する工程と、前記スラリーをポンプにより加圧して間隙を通過させることによりヘマトコッカス藻を破砕する工程を備える、アスタキサンチンの製造方法を提供する。
【００１０】
本発明のアスタキサンチンの製造方法によれば、ヘマトコッカス藻の導入及び破砕における間隙等の目詰まりを低減し、効率的に細胞を破砕することができる。したがって、効率的にアスタキサンチンを製造することが可能となる。また、スラリー及びヘマトコッカス藻破砕液の腐敗を抑えることができ、保存性及び操作性が向上する。従来よりも短時間で多量のヘマトコッカス藻を破砕することができるため、効率的にアスタキサンチンを製造できると共に、製造中のアスタキサンチンの分解を低減することが可能となる。
【００１１】
本発明のアスタキサンチンの製造方法においては、上記エタノール水溶液が５〜８５体積％エタノール水溶液であることが好ましく、３５〜８５体積％エタノール水溶液であることがより好ましく、６５〜８５体積％エタノール水溶液であることがさらに好ましい。５体積％未満エタノール水溶液を用いた場合、ヘマトコッカス藻破砕液における粘性が高くなるため目詰まりを起こす危険性が高くなる傾向にある。また、８５体積％より高濃度のエタノール水溶液を用いた場合、スラリーにおけるヘマトコッカス藻の沈降性が高くなるため目詰まりを起こす危険性が高くなる傾向にある。
【００１２】
本発明により、スラリーにおけるヘマトコッカス藻の沈降性及び／又はヘマトコッカス藻破砕液の粘性をより効果的に低減することができる。したがって、ヘマトコッカス藻の導入及び破砕における目詰まりをより低減し、効率的に細胞を破砕し、効率的にアスタキサンチンを製造することが可能となる。
【００１３】
また、上記スラリーがエタノール水溶液１００ｍｌ中にヘマトコッカス藻を１８〜４０ｇ含むことが好ましく、２２〜４０ｇ含むことがより好ましい。
【００１４】
本発明のアスタキサンチンの製造方法によれば、エタノール水溶液１００ｍｌ中にヘマトコッカス藻を好ましくは１８ｇ以上、より好ましくは２２ｇ以上含むスラリーを用いて、効率的に細胞を破砕することができる。すなわち、一連の工程において、従来よりも多量のヘマトコッカス藻を破砕することが可能となり、効率的にアスタキサンチンを製造することができる。
【００１５】
また、本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記ヘマトコッカス藻を破砕する工程において得られたヘマトコッカス藻破砕液をポンプにより加圧して間隙を通過させることによりヘマトコッカス藻をさらに破砕する工程をさらに備えることを特徴とする。さらに、本発明のアスタキサンチンの製造方法は、ヘマトコッカス藻を破砕する工程及びヘマトコッカス藻をさらに破砕する工程におけるポンプによる印加圧力が異なり、前者の印加圧力よりも後者の印加圧力の方が高いことを特徴とする。
【００１６】
上記工程を備えることにより、ヘマトコッカス藻破砕液中に一部破砕されずに残っているヘマトコッカス藻を効率的に破砕することができ、効率的にアスタキサンチンを製造することが可能となる。また、１回又は１回以上の破砕工程を経て得られたヘマトコッカス藻破砕液においては、目詰まりが生じる危険性が低減されているため、追加の破砕工程においては、より高い印加圧力を用いて効率的に細胞を破砕することができる。したがって、効率的にアスタキサンチンを製造することが可能となる。
【００１７】
また、上記ポンプによる印加圧力が４０〜１００ＭＰａであることが好ましく、６０〜１００ＭＰａであることがより好ましい。４０ＭＰａ未満の印加圧力では、十分な破砕率が得られない傾向にあり、また、１００ＭＰａより高い印加圧力では、スラリー及び／又はヘマトコッカス藻破砕液の導入の際に目詰まりを起こす危険性が高くなる傾向にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
本発明に使用されるヘマトコッカス藻は、ヘマトコッカス属に属し、アスタキサンチンを生産する藻体であれば、いかなるものでも使用し得る。具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などであり、より具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリスＮＩＥＳ １４４、ヘマトコッカス・ラキュストリス ＡＴＴＣ ３０４０２，ＡＴＣＣ ３０４５３，ＩＡＭＣ２９６，ＩＡＭ ３９２、ＩＡＭ ３９３、ＩＡＭ ３９４、ＩＡＭ３９９、ヘマトコッカス・カペンシス ＵＴＥＸ １０２３、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス ＵＴＥＸ ５５、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス ＵＴＥＸ １７５８などが挙げられる。
【００２０】
ヘマトコッカス藻類は、栄養細胞から休眠状態であるシスト細胞に形態変化した後に、多量のアスタキサンチンをシスト細胞中に蓄積するものである。ヘマトコッカス藻体によるアスタキサンチン生産には、栄養細胞とシスト細胞を分けて考えた二段階の培養プロセスが最適であると考えられる。
【００２１】
本発明に好適に用いられるヘマトコッカス・プルビアリス藻体の栄養細胞は、暗所で酢酸などの有機物を炭素源として従属栄養的に培養することにより得ることができる。また、明所で炭酸ガスを炭素源として独立栄養的に、あるいは明所で酢酸などの有機物と炭酸ガスの両方を炭素源として混合栄養的にも増殖させることができる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ７４，  １７−２０ （１９９２））。したがって、上記いずれの方法を用いても栄養細胞を製造することができる。
【００２２】
本発明に用いるヘマトコッカス藻体の培養に使用される栄養培地は、緑藻類が資化し得るものであれば、いずれも使用できる。炭素源としては、例えば、従来から知られている酢酸の他、ピルビン酸、エタノール、及びＴＣＡ関連有機酸などが挙げられる。窒素源としては、有機あるいは無機の窒素化合物が挙げられる。例えば、アスパラギン、グリシン、グルタミン等のアミノ酸、酵母エキス、硝酸塩等が挙げられる。これらの炭素源、窒素源を組み合わせた培地が用いられる他、必要に応じて、無機塩を添加した培地が用いられる。好ましい培地は、例えば酵母エキス  ２．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム  １．２ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸  ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ９８５μＭ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３６μＭ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １３６μＭ、ｐＨ６．８である。緑藻類の培養条件は、用いる緑藻によっても異なるが、光照射強度は、一般に０〜４８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、好ましくは６〜２４０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、さらに好ましくは１８〜１２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。生育温度は緑藻類により異なるが、通常、５〜５０℃、好ましくは１０〜３７℃、さらに好ましくは１５〜３０℃である。また、炭酸ガスを用いない場合は、酸素を供給しながら行い得る。
【００２３】
このように培養液中のヘマトコッカス藻類の増殖工程を経た後に、アスタキサンチンの生成及び蓄積工程を行い、シスト細胞を得る。この工程は細胞の成長を抑制するようなストレスが加わる環境下となるよう、環境ストレス条件を制御することによって行う。すなわち、栄養源枯渇（Ｋａｋｉｚｏｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ７４，  ４０３−４０５（１９９２））、強光（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ７４，  ６１−６３（１９９２））、活性酸素（特開平５−６８５８５号公報）、高温（特開平７−３９３８９号公報）、乾燥（特開平８−１０３２８８号公報）等の環境ストレスを単独又は組み合わせて付加することにより、栄養細胞を休眠状態であるシスト細胞に速やかに形態変化させることができる。この形態変化に伴いアスタキサンチン合成系が誘導され、シスト細胞中にアスタキサンチンが多量蓄積される。アスタキサンチンは強力な抗酸化能を有しており、様々な環境ストレスに対する生体防御物質の一つとして機能している。
【００２４】
このようにして培養したヘマトコッカス藻体のシスト細胞は、遠心分離等により容易に回収される。本発明に使用されるヘマトコッカス藻は、アスタキサンチンを蓄積しているシスト細胞であれば、天然物、あるいは有機物を炭素源として培養されたもののいずれでも良く、また、それらを乾燥させたものでも良い。シスト細胞は強固な細胞壁を持つため、アスタキサンチンを抽出するためには、細胞壁を破砕する必要がある。
【００２５】
本実施形態であるアスタキサンチンの製造方法について説明する。本実施形態の工程は、スラリー調製工程、破砕工程及び抽出工程からなる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００２６】
スラリー調製工程において、ヘマトコッカス藻を５〜８５体積％エタノール水溶液に懸濁し、スラリーを調製する。エタノール水溶液は、好ましくは５体積％以上、より好ましくは３５体積％以上、さらに好ましくは６５体積％以上のエタノール水溶液である。また、エタノール水溶液は、好ましくは８５体積％以下のエタノール水溶液である。
【００２７】
また、スラリーは、エタノール水溶液１００ｍｌ中にヘマトコッカス藻を１８ｇ以上、２０ｇ以上、２２ｇ以上及び２５ｇ以上含むことが好ましい。また、４０ｇ以下及び３３ｇ以下であることが好ましい。なお、溶媒（エタノール水溶液）１００ｍＬ当たり、固体成分（ヘマトコッカス藻）ｘｇを懸濁したものを、重量体積比ｘ％と表記する。
【００２８】
次に、破砕工程について説明する。本実施形態の破砕工程は、ヘマトコッカス藻を破砕する工程であり、スラリー調製工程において得られたスラリーを、ポンプにより加圧して間隙を通過させることにより行う。具体的には、例えば、図１に示すチャンバー１を備える高圧ホモジナイザを用いて行う。図１に示すチャンバー１は、バルブシート２とバルブ３とから構成され、バルブシート２とバルブ３との間に、間隙４と、間隙４よりも広い内径を有する背圧調整管５とが形成される。また、バルブシート２は、間隙４よりも広い内径を有する導入管６を備える。間隙４と導入管６、及び、間隙４と背圧調整管５は、それぞれ互いに好ましくは３０〜１２０°の角度で、例えば直角に、接続されている。ポンプ７により加圧されたスラリーは、導入管６を経て間隙４に導入され、好ましくは音速（秒速３４３ｍ）を超える流速で間隙を通過した後、背圧調整管５を経て、例えば、常圧まで減圧される。
【００２９】
これにより、細胞同士や細胞と装置内の壁との衝突における衝撃、せん断力、キャビテーション（高速で流れる液体の中の圧力の低い部分が気化し、非常に短い時間に泡が発生して崩壊する現象、減圧による発泡現象）によりスラリー中のヘマトコッカス藻の細胞壁が破砕され、細胞内に存在していたアスタキサンチンがスラリー内に懸濁・溶解されたヘマトコッカス藻破砕液を得ることができる。
【００３０】
本実施形態の破砕工程に使用される装置としては、間隙４を備え、試料を高圧・高速で間隙を通過させ、衝撃、せん断力、キャビテーションにより試料を破砕することができる高圧ホモジナイザであれば良く、具体的には、ＰＡＮＤＡ  ２Ｋ型（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（みづほ工業株式会社）等が挙げられる。バルブ３は可動式であることが好ましく、間隙４の内径がバルブ３により調節可能であり、これによって、間隙４内の圧力を調節できるものであることが好ましい。間隙４の内径（幅）は特に限定されないが、一般的には２０μｍ〜８０μｍ程度である。間隙４前後の流路が折れ曲がっていなくても、本発明の実施は可能である。また、複数の間隙４が合流するものでも構わない。ポンプ７は、所定の圧力を印加できるものであれば良く、例えば、プランジャーポンプが挙げられる。ポンプ７による印加圧力は、用いる装置によっても異なるが、好ましくは４０ＭＰａ以上、より好ましくは６０ＭＰａ以上であり、好ましくは１００ＭＰａ以下である。
【００３１】
他の実施形態において、破砕工程を複数回行う。すなわち、１回又は１回以上の破砕工程により得られたヘマトコッカス破砕液を用いて再度、破砕工程を行う。
【００３２】
続いて、抽出工程について説明する。本実施形態の抽出工程は、先の破砕工程で得られたヘマトコッカス藻破砕液から、アスタキサンチンを抽出する工程であり、公知の抽出方法を用いることができる。公知の抽出方法としては、ヘマトコッカス藻破砕液を分画して得られたアスタキサンチン含有画分を乾燥させる方法、又は、有機溶媒を用いて抽出する方法が挙げられる。有機溶媒としては、アセトンやイソブチルケトン等のケトン、ヘキサンや石油エーテル等の脂肪族炭化水素、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素、酢酸エチル等のエステル、エタノールやｎ−プロパノールやイソプロパノール等のアルコール、食用油等、或いはこれらの混合物が挙げられる。
【００３３】
なお、他の実施形態において、抽出工程を行わず、破砕工程後のヘマトコッカス破砕液そのもの、又は、乾燥、凍結等の処理を行ったものを、アスタキサンチンを含有する溶液又は加工物としてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限するものではない。
【００３５】
＜実施例１：ヘマトコッカス藻懸濁液の沈降性試験＞
以下の方法により、スラリー中のヘマトコッカス藻の沈降性を調べ、高圧ホモジナイザへの導入及び破砕に適したヘマトコッカス藻懸濁液の溶媒条件を検討した。
【００３６】
ヘマトコッカス藻懸濁液（スラリー）として、エタノール水溶液に対するヘマトコッカス藻の重量体積比が１０％となるように両者を懸濁して調製したものを用いた。ヘマトコッカス藻として、ヘマトコッカス藻の乾燥粉末を用いた。エタノール水溶液には、エタノール濃度が０，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０及び１００体積％のものをそれぞれ使用した。
【００３７】
まず、スラリーを手動にて均一に懸濁した後に、一斉に振とう攪拌を開始した。振とう攪拌には、試験管ミキサー（ＮＳ−８０、アズワン株式会社）を用いた。次に、振とう攪拌開始１分後のヘマトコッカス藻の沈降状態を確認し、３段階の評価（−、±、＋）を行った。なお、“−”はスラリーが均一に懸濁された状態であることを示し、“±”は一部に沈降が見られるが概ねスラリーが懸濁された状態であることを示し、“＋”は懸濁液中のヘマトコッカス藻が沈降していることを示す。
【００３８】
沈降性試験の結果、表１に示すように、溶媒として１０〜８０体積％エタノール水溶液を用いた場合に、沈降性が低いことが判明した。スラリーが高圧ホモジナイザ内へ導入された後、破砕部に到達するまでに１分程度の時間を要する。このため、１０〜８０体積％エタノール水溶液を用いた場合には、ヘマトコッカス藻の沈殿が形成されず、効率的にスラリーを高圧ホモジナイザへ導入できることが分かった。
【００３９】
＜実施例２：ヘマトコッカス藻破砕液の粘性試験＞
以下の方法により、ヘマトコッカス藻破砕液の粘性を調べ、破砕に適したヘマトコッカス藻懸濁液の溶媒条件を検討した。
【００４０】
まず、ヘマトコッカス藻破砕後の破砕液中に含まれるアスタキサンチン含有量を想定し、１０％アスタキサンチンオイル０．５ｇに各濃度のエタノール水溶液を総重量５ｇとなるように添加して混合液を調製した。なお、１０％アスタキサンチンオイルは、ヘマトコッカス藻より抽出・精製処理によって得られた高級脂肪酸をベースとするオイル状物質であり、１０％アスタキサンチン及び１％程度の他のカロテノイド類（β−カロテノイド、カンタキサンチン等）を含有する。次に、６５℃の湯浴にて、試験管ミキサー（ＮＳ−８０、アズワン株式会社）を用いて各混合液を１分間混合させた。温度条件として、実施例３〜５で用いた高圧ホモジナイザにおける破砕時の温度条件を採用した。混合後、再度６５℃の湯浴で加温した状態において、試験管内の混合液の粘性を確認し、４段階の評価（−、＋、＋＋、＋＋＋）を行った。なお、“−”は反応後の混合液の粘性が低いことを示し、“＋＋＋”は反応後の混合液の粘性が高いことを示す。結果を表１に示した。
【００４１】
蒸留水（０体積％エタノール溶液）に懸濁したヘマトコッカス藻を破砕した場合、得られた破砕液の粘性は破砕前と比べ著しく上昇する。したがって、破砕装置の配管内への付着が大きくなり、配管の目詰まりの要因となる。表１に示す粘性試験の結果から、溶媒として５〜１００体積％、好ましくは３５〜１００体積％、より好ましくは６５〜１００体積％エタノール水溶液を用いた場合に、混合液の粘性を低減できることがわかった。
【００４２】
【表１】
0005219477.tif 000002
【００４３】
さらに、沈降性試験及び粘性試験の総合評価を４段階の評価（−、＋、＋＋、＋＋＋）により示した（表１）。沈降性“＋”又は粘性“＋＋＋”のいずれか一方に該当する場合は、破砕工程での目詰まりを生じるため、総合評価を“−”とした。また、破砕前及び初回の破砕における目詰まりを回避できれば、破砕後及び２回目以降の破砕に影響する因子は粘性となるため、５〜８５体積％、好ましくは３５〜８５体積％、より好ましくは６５〜８５体積％エタノール水溶液がヘマトコッカス藻の破砕に適した溶媒条件であると言える。中でも、特に低い粘性を示す６５〜８５体積％エタノール水溶液を総合評価“＋＋＋”とした。
【００４４】
＜実施例３：エタノール濃度の検討＞
エタノール濃度が異なる条件におけるヘマトコッカス藻の破砕のしやすさを、以下の方法により検討した。
【００４５】
エタノール水溶液には、エタノール濃度が７０，８０，９０及び１００体積％のものをそれぞれ使用した。スラリーにはヘマトコッカス藻の重量体積比が２５％のものを用い、高圧ホモジナイザ（ＰＡＮＤＡ  ２Ｋ型、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）を用いてヘマトコッカス藻を破砕した。なお、破砕工程は１回であり、印加圧力条件を６０ＭＰａに設定した。破砕のしやすさについて、３段階の評価（−、±、＋、＋＋）を行った。“−”は目詰まりすることを示し、“±”は目詰まりしやすいことを示し、“＋”は多少目詰まりするが破砕できることを示し、“＋＋”はほとんど目詰まりせずに破砕できることを示す。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
0005219477.tif 000003
【００４７】
その結果、エタノール濃度が６５〜８５体積％であればヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。また、実施例１及び２の結果で得られたエタノール濃度６５〜８５体積％条件（総合評価“＋＋＋”）において、確かに、ヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。
【００４８】
＜実施例４：ヘマトコッカス藻とエタノール水溶液との混合比の検討＞
エタノール水溶液に対するヘマトコッカス藻の重量体積比が異なる条件におけるヘマトコッカス藻の破砕のしやすさを、以下の方法により検討した。
【００４９】
ヘマトコッカス藻の重量体積比が、それぞれ表２の比率となるようにヘマトコッカス藻を７０体積％エタノール水溶液に懸濁してヘマトコッカス藻懸濁液（スラリー）を調製し、高圧ホモジナイザ（ＰＡＮＤＡ  ２Ｋ型、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）を用いてヘマトコッカス藻を破砕した。なお、破砕工程は１回であり、印加圧力条件をそれぞれ６０、７０及び８０ＭＰａに設定した。破砕のしやすさについて、３段階の評価（±、＋、＋＋）を行った。“±”は目詰まりしやすいことを示し、“＋”は多少目詰まりするが破砕できることを示し、“＋＋”はほとんど目詰まりせずに破砕できることを示す。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
0005219477.tif 000004
【００５１】
その結果、重量体積比が４０％以下であれば破砕できることが分かった。また、重量体積比が３３％以下であればほとんど目詰まりせずに破砕できることが分かった。
【００５２】
次に、エタノール水溶液に対するヘマトコッカス藻の重量体積比が異なる条件におけるヘマトコッカス藻の破砕率を、以下の方法により検討した。
【００５３】
ヘマトコッカス藻の重量体積比が、それぞれ表４の比率となるようにヘマトコッカス藻を７０体積％エタノール水溶液に懸濁してヘマトコッカス藻懸濁液（スラリー）を調製し、高圧ホモジナイザ（ＰＡＮＤＡ  ２Ｋ型、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）を用いてヘマトコッカス藻を破砕した。なお、破砕工程は３回であり、印加圧力条件を破砕工程ごとにそれぞれ６０−１００−１００ＭＰａに設定した。各ヘマトコッカス藻破砕液の一部を分取し、破砕前のヘマトコッカス藻の重量が一定となるように希釈液を調整した。希釈液を２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により分画し、得られた上清の４７５ｎｍの吸光度を基にアスタキサンチン濃度を測定した。乳鉢を用いて完全に破砕したヘマトコッカス藻破砕液中に含まれるアスタキサンチン濃度を基準（破砕率１００％）として、得られた破砕液のアスタキサンチン濃度からヘマトコッカス藻の破砕率を算出した。結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
その結果、重量体積比２０％、２５％及び３３％いずれの条件においても、目詰まりを生じることなく、９３％以上という高い破砕率でヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。これまでに、ヘマトコッカス藻の９５％超が破砕されることが報告されているが（特許文献３）、これは３．６重量％のスラリーを用い、５回の破砕工程を行ったものである。また、８．５重量％のスラリーでは、詰まりが生じたことが報告されている。したがって、従来よりも高い濃度のスラリーを用いて効率的にヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。中でも、重量体積比２５％及び３３％の場合には、破砕率はそれぞれ９７．２％及び９８．６％であった。
【００５６】
＜実施例５：印加圧力条件の検討＞
【００５７】
破砕工程における印加圧力が異なる条件におけるヘマトコッカス藻の破砕率を検討した。なお、以下に説明する条件以外は実施例３と同様の方法を用いた。
【００５８】
印加圧力条件をそれぞれ２０、４０、６０、８０及び１００ＭＰａに設定し、それぞれの条件において同じ印加圧力で破砕工程を３回行った。破砕工程ごとにヘマトコッカス藻の破砕率を算出した。なお、スラリーにはヘマトコッカス藻の重量体積比が２５％のものを用いた。結果を表５及び図２に示す。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
その結果、４０ＭＰａ及び破砕工程１回の条件において、６０％以上のヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。６０ＭＰａ及び破砕工程１回の条件において、７０％以上のヘマトコッカス藻を破砕できることが分かった。また、破砕工程を複数回繰り返すことによって、破砕効率が上昇することが分かった。
【００６１】
次に、破砕工程ごとに印加圧力条件を変え、それぞれ６０−６０−６０ＭＰａ（条件１）、６０−８０−１００ＭＰａ（条件２）、及び、６０−１００−１００ＭＰａ（条件３）の条件において破砕工程を３回行った。得られた破砕液からヘマトコッカス藻の破砕率を算出した。なお、スラリーにはヘマトコッカス藻の重量体積比が２５％のものを用いた。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
その結果、段階的に印加圧力を増加させることによって、９７％以上（条件３）及び９９％以上（条件２）の破砕率が得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本実施形態におけるチャンバーの一例を示す断面図である。
【図２】破砕工程における印加圧力と破砕工程の回数を変化させた際の破砕率を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６５】
１  チャンバー、２  バルブシート、３  バルブ、４  間隙、５  背圧調整管、６  導入管、７  ポンプ。
【図１】
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【図２】
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