(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：１記載の塩基配列に１から５０個の塩基の欠失、置換、付加、および／または挿入を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：１記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドの下流に任意の外来ポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含み、任意の外来遺伝子挿入部位を備えたベクター。
【請求項４】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項２記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載のベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項６】
請求項５記載の細胞を含む形質転換植物体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換植物体の子孫または繁殖材料であって、請求項２記載のポリヌクレオチドを含む、前記子孫または繁殖材料。
【請求項８】
下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、根こぶ病抵抗性植物の製造方法：
（ａ）請求項１記載のポリヌクレオチドの下流に抗菌効果を有する物質をコードするポリヌクレオチドを機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程；
（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程。
【請求項９】
下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）の皮層感染時に根特異的に外来遺伝子を発現する植物の製造方法： 
（ａ）請求項１記載のポリヌクレオチドの下流に外来遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程；
（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリラーゼプロモーターおよびその利用に関し、より具体的には、ニトリラーゼプロモーターを用いた根こぶ病抵抗性植物の育種に関する。
【背景技術】
【０００２】
根こぶ病はアブラナ科作物の栽培において収穫量を大幅に減少させ、世界中で深刻な被害を与える重要病害である。根こぶ病の原因となる根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae Woron.、以下において「P. brassicae」とも称す）は、土壌伝播性の絶対的寄生菌で、その生活環は根毛感染と皮層感染の二相からなる。根こぶ病菌は、根毛感染では植物の根毛に限定して感染し、皮層感染では胚軸および根の皮層および中心柱に感染する（非特許文献１）。後者において、根こぶ病菌の多核変形体が宿主細胞および近隣細胞に働きかけ、増殖および分裂を促進し、結果として根こぶ形成が起こる。このこぶ形成は宿主細胞の過剰な分裂と肥大の組み合わせによって引き起こされるため（非特許文献１-２）、サイトカイニンおよびオーキシンなどの植物ホルモンが症状の発生に関与していることが推測された（非特許文献３）。こぶ化した組織ではサイトカイニンのレベルが上昇していることが報告されており（非特許文献４-５）、根こぶ病菌変形体によってサイトカイニン産生が促進され、宿主細胞質中に放出されたサイトカイニンが宿主細胞の分裂を誘導することが示唆されている（非特許文献６-７）。しかし、Devosらは、感染過程の初期では、感染した根における活性サイトカイニンの総含有量が健常根よりも減少していることを報告し、P. brassicaeがサイトカイニンの消費シンクとして作用することを示唆している（非特許文献８）。宿主のサイトカイニン合成および代謝の変化が根こぶ形成と関連していることも示唆されている。宿主イソペンテニルトランスフェラーゼ（推定サイトカイニンシンターゼ）遺伝子の発現は、接種した根において視認しうる根こぶ形成以前に一過的に上昇したが、根こぶ増大時には低下した（非特許文献９）。さらに、Siemensらは、病根ではサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼのmRNAレベルが低下していることを理由に、宿主のサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼによるサイトカイニンの分解がP. brassicae感染によって抑制される可能性を示唆している（非特許文献１０）。
【０００３】
一方、感染した根におけるインドール-3-酢酸（オーキシン。以下において「IAA」と称す。）の増加は、宿主のオーキシン合成および代謝の増大に起因している可能性が提唱されている（非特許文献１１-１４）。多くの研究は、オーキシンが時間経過に伴って複雑に変化するが、病根で増加していることを示している（非特許文献１１、１５-１９）。これに対し、Mousdaleは、感染したナタネ（Brassica napus）におけるオーキシン量が対照植物よりも低いことを報告している（非特許文献２０）。これらの相反する報告は、オーキシン生合成が根こぶ形成時に複雑に影響を受けていることを示唆している。実際、オーキシンの生合成および代謝経路のいくつかは、P. brassicae感染によって影響されることが報告されている（非特許文献１１-１４、２１-２２）。このような経路のうち、インドール-3-アセトアルドキシム（以下において「IAOX」）（非特許文献２３-２４）、インドール-3-メチルグルコシノレート（以下において「IMG」）（非特許文献２５）およびインドール-3-アセトニトリル（以下において「IAN」）（非特許文献２６）の形成を介したインドール-3-酢酸（IAA）生合成の経路は、根こぶ形成との関連で詳細に研究されている。Ludwig-Mullerらは、ハクサイの感受性品種では根こぶ発生時にIMG含有量が劇的に増加するが、P. brassicae感染に対する抵抗性を示すハクサイ品種の根では感染後にIMGが増加しないと報告している（非特許文献２７）。ハクサイでは、IMGをIANへと触媒するミロシナーゼ遺伝子の転写物量が病根で上昇している（非特許文献２８）。
【０００４】
ニトリラーゼ（EC 3.5.5.1）は、IANをIAAへと触媒する酵素と考えられている（非特許文献２９-３３）。ニトリラーゼの4種のアイソフォーム（NIT1、NIT2、NIT3およびNIT4）が、アラビドプシスのゲノム中に見いだされている。NIT1、NIT2およびNIT3はin vitroでIANをIAAに変換する能力があることが示されているが、上記酵素のIANに対する基質選択性は、他のニトリル、例えば、3-フェニルプロピオンニトリルおよびシアン化アリルよりも低い（非特許文献３２）。上記3種のアイソジーンは、NIT2／NIT1／NIT3遺伝子クラスターの形態で第III染色体上に縦列的に配置されており（非特許文献３４）、その存在はアブラナ科に限定される。これに対して、NIT4はIANに対する酵素活性はなく、β-シアノ-L-アラニンに対する強い基質特異性が明らかになっている（非特許文献３５）。NIT4アイソフォームはアブラナ科以外の分類群にも存在する。また、ZmNIT2はトウモロコシにおけるオーキシン生合成に関与することが示唆されている（非特許文献３６）。
【０００５】
根こぶ形成時にニトリラーゼ活性が上昇することが、ハクサイおよびカブで報告されている（非特許文献１９、２８）。アラビドプシスではP. brassicaeの感染後にニトリラーゼの遺伝子発現（NIT1およびNIT2）の増加が報告されている（非特許文献３７）。また、アンチセンスRNAを用いたNIT1およびNIT2の発現抑制によって、アラビドプシス植物体における根こぶ発生が遅れることも報告されている。これらの知見は、IAN経路が根こぶ形成のためのIAA合成に重要な役割を果たすことを示唆する（非特許文献３８）。しかし、ハクサイでは、根こぶ形成時にニトリラーゼ活性が増大しているにもかかわらず、ニトリラーゼ転写物の増加を検出できていない（非特許文献２８、３９）。
【非特許文献１】Ingram, D. S., and Tommerup, I. C. 1972. The life history of Plasmodiophora brassicae Woron. Proc. R. Soc. Lond. B 180:103-112.
【非特許文献２】Mithen, R., and Magrath, R. 1992. A contribution to the life history of Plasmodiophora brassicae: secondary plasmodia development in root galls of Arabidopsis thaliana. Mycol. Res. 96:877-885.
【非特許文献３】Ludwig-Muller, J. 1999. Plasmodiophora brassicae, the causal agent of clubroot disease: a review on molecular and biochemical events in pathogenesis. J. Plant Dis. Protect. 106:109-127.
【非特許文献４】Dekhuijzen, H. M. 1980. The occurrence of free and bound cytokinins in clubroots and Plasmodiophora brassicae infected turnip tissue cultures. Physiol. Plant. 49:169-176.
【非特許文献５】Dekhuijzen, H. M., and Overeem J. C. 1971. The role of cytokinins in clubroot formation. Physiol. Plant. Pathol. 1:151-161
【非特許文献６】Dekhuijzen, H. M. 1981. The occurrence of free and bound cytokinins in plasmodia of Plasmodiophora brassicae isolated from tissue cultures of clubroots. Plant Cell Rep. 1:18-20.
【非特許文献７】Muller, P., and Hilgenberg, W. 1986. Isomers of zeatin and zeatin riboside in clubroot tissue: evidence for trans-zeatin biosynthesis by Plasmodiophora brassicae. Physiol. Plant. 66:245-250.
【非特許文献８】Devos, S., Vissenberg, K., Verbelen, J. P., and Prinsen, E. 2005. Infection of Chinese cabbage by Plasmodiophora brassicae leads to a stimulation of plant growth: impacts on cell wall metabolism and hormone balance. New Phytol. 166:241-250.
【非特許文献９】Ando, S., Asano, T., Tsushima, S., Kamachi, S., Hagio, T., and Tabei, Y. 2005. Changes in gene expression of putative isopentenyltransferase during clubroot development in Chinese cabbage (Brassica rapa L.). Physiol. Mol. Plant Pathol. 67:59-67.
【非特許文献１０】Siemens, J., Keller, I., Sarx, J., Kunz, S., Schuller, A., Nagel, W., Schmulling, T., Parniske, M., and Ludwig-Muller, J. 2006. Transcriptome analysis of Arabidopsis clubroots indicate a key role for cytokinins in disease development. Mol. Plant-Microbe Interact. 19:480-494.
【非特許文献１１】Butcher, D. N., El-Tigani, S., and Ingram, D. S. 1974. The role of indole glucosinolates in the clubroot disease of the Cruciferae. Physiol. Plant Pathol. 4:127-140.
【非特許文献１２】Rausch, T., Butcher, D. N., and Hilgenberg, W. 1981. Nitrilase activity in clubroot diseased plants. Physiol. Plant. 52:467-470.
【非特許文献１３】Rausch, T., Butcher, D. N., and Hilgenberg, W. 1983. Indole-3-methylglucosinolate biosynthesis and metabolism in clubroot diseased plants. Physiol. Plant. 58:93-100.
【非特許文献１４】Searle, L. M., Chamberlain, K., Rausch, T., and Butcher, D. N. 1982. The conversion of 3-indolylmethylglucosinolate to 3-indolylacetonitrile by myrosinase and its relevance to the clubroot disease of the cruciferae. J. Exp. Bot. 33:935-942.
【非特許文献１５】Devos, S., Laukens, K., Deckers, P., Straeten, D. V. D., Beeckman, T., Inze, D., Onckelen, H. V., Witters, E., and Prinsen, E. 2006. A hormone and proteome approach to picturing the initial metabolic events during Plasmodiophora brassicae infection on Arabidopsis. Mol. Plant-Microbe Interact. 19:1431-1443.
【非特許文献１６】Ludwig-Muller, J., Bendel, U., Thermann, P., Ruppel, M., Epstein, E., and Hilgenberg, W. 1993. Concentrations of indole-3-acetic acid in plants of tolerant and susceptible varieties of Chinese cabbage infected with Plasmodiophora brassicae Woron. New Phytol. 125:763-769.
【非特許文献１７】Ludwig-Muller, J., Pieper, K., Ruppel, M., Cohen, J. D., Epstein, E., Kiddle, G., and Bennett, R. 1999. Indole glucosinolate and auxin biosynthesis in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. glucosinolate mutants and the development of clubroot disease. Planta 208:409-419.
【非特許文献１８】Raa, J. 1971. Indole-3-acetic acid levels and the role of indole-3-acetic acid oxidase in the normal root and club-root of cabbage. Physiol. Plant. 25:130-134.
【非特許文献１９】Ugajin, T., Takita, K., Takahashi, H., Muraoka, S., Tada, T., Mitsui, T., Hayakawa, T., Ohyama, T., and Hori, H. 2003. Increase in indle-3-acetic acid (IAA) level and nitrilase activity in turnips induced by Plasmodiophora brassicae infection. Plant Biotechnol. 20:215-220.
【非特許文献２０】Mousdale, D. M. A. 1981. Endogenous indole-3-acetic acid and pathogen-induced plant growth disorders: distinction between hyperplasia and neoplastic development. Experientia 37:972-973.
【非特許文献２１】Ando, S., Tsushima, S., Tagiri, A., Kamachi, S., Konagaya, K., Hagio, T., and Tabei Y. 2006. Increase in BrAO1 gene expression and aldehyde oxidase activity during clubroot development in Chinese cabbage (Brassica rapa L.). Mol. Plant Pathol. 7:223-234.
【非特許文献２２】Ludwig-Muller, J., Epstein, E., and Hilgenberg, W. 1996. Auxin-conjugate hydrolysis in Chinese cabbage: Characterization of an amidohydrolase and its role during infection with clubroot disease. Physiol. Plant. 97:627-634.
【非特許文献２３】Ludwig-Muller, J., and Hilgenberg, W. 1988. A plasma membrane-bound enzyme oxidizes L-tryptophan to indole-3-acetaldoxime. Physiol. Plant. 74:240-250.
【非特許文献２４】Ludwig-Muller, J., and Hilgenberg, W. 1992. Tryptophan oxidizing enzyme and basic peroxidase isoenzymes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.: Are they identical? Plant Cell Physiol. 33:1115-1125.
【非特許文献２５】Helmlinger, J., Rausch, T., and Hilgenberg, W. 1985. Metabolism of 14C-indole-3-acetaldoxim by hypocotyls of Chinese cabbage. Phytochemistry 24:2497-2502.
【非特許文献２６】Ludwig-Muller, J., and Hilgenberg, W. 1990. Conversion of indole-3-acetaldoxime to indole-3-acetonitrile by plasma membranes from Chinese cabbage. Physiol. Plant. 79:311-318.
【非特許文献２７】Ludwig-Muller, J., Schubert, B., Pieper, K., Ihmig, S., and Hilgenberg, W. 1997. Glucosinolate content in susceptible and resistant Chinese cabbage varieties during development of clubroot disease. Phytochemistry 44:407-414.
【非特許文献２８】Grsic, S., Kirchheim, B., Pieper, K., Fritsch, M., Hilgenberg, W., and Ludwig-Muller, J. 1999. Induction of auxin biosynthetic enzymes by jasmonic acid and in clubroot diseased Chinese cabbage plants. Physiol. Plant. 105:521-531.
【非特許文献２９】Normanly, J., Grisafi, P., Fink, G. R., and Bartel, B. 1997. Arabidopsis mutants resistant to the auxin effects of indole-3-acetonitrile are defective in the nitrilase encoded by the NIT1 gene. Plant Cell 9:1781-1790.
【非特許文献３０】Schmidt, R. C., Muller, A., Hain, R., Bartling, D., and Weiller, E. W. 1996. Transgenic tobacco plants expressing the Arabidopsis thaliana nitrilase II enzyme. Plant J. 9:683-691.
【非特許文献３１】Thimann, K. V., and Mahadevan, S. 1964. Nitrilase. I. Occurrence, preparation, and general properties of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 105:133-141.
【非特許文献３２】Vorwerk, S., Biernacki, S., Hillebrand, H., Janzik, I., Muller, A., Weiler, E. W., and Piotrowski, M. 2001. Enzymatic characterization of the recombinant Arabidopsis thaliana nitrilase subfamily encoded by the NIT2/NIT1/NIT3-gene cluster. Planta 212:508-516.
【非特許文献３３】Woodward, A. W., and Bartel, B. 2005. Auxin: Regulation, Action, and Interaction Ann. Bot. 95: 707-735.
【非特許文献３４】Bartel, B., and Fink, G. R. 1994. Differential regulation of an auxin-producing nitrilase gene family in Arabidopsis thaliana. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 91:6649-6653.
【非特許文献３５】Piotrowski, M., Schonfelder S., and Weiler, E. W. 2001. The Arabidopsis thaliana isogene NIT4 and its orthologs in tobacco encode β-cyano-L-alanine hydratase/nitrilase. J. Biol. Chem. 276:2616-2621.
【非特許文献３６】Park, W. J., Kriechbaumer, V., Muller, A., Piotrowski, M., Meeley, R. B., Gierl, A., and Glawischnig, E. 2003. The nitrilase ZmNIT2 converts indole-3-acetonitirile to indole-3-acetic acid. Plant Physiol. 133:794-802.
【非特許文献３７】Grsic-Rausch, S., Kobelt, P., Siemens, J. M., Bischoff, M., and Ludwig-Muller, J. 2000. Expression and localization of nitrilase during symptom development of the clubroot disease in Arabidopsis. Plant Physiol. 122:369-378.
【非特許文献３８】Neuhaus, K., Grsic-Rausch, S., Sauerteig, S., and Ludwig-Muller, J. 2000. Arabidopsis plants transformed with nitrilase 1 or 2 in antisense direction are delayed in clubroot development. J. Plant Physiol. 156:756-761.
【非特許文献３９】Bischoff, M., Low, R., Grsic, S., Rausch, T., Hilgenberg, W., and Ludwig-Muller, J. 1995. Infection with the obligate biotroph Plasmodiophora brassicae, the causal agent of the clubroot disease, does not affect expression of NIT1/2-related nitrilases in roots of Chinese cabbage. J. Plant Physiol. 147:341-345.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、根こぶ形成におけるニトリラーゼの関わりを探るとともに、アブラナ科植物の根こぶ病抵抗性植物の育種方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者らはハクサイからニトリラーゼの4種のアイソジーン（BrNIT1, 2, 3, 4）を単離し、その一つであるBrNIT2が病根で強く転写されることを見いだした。さらに、BrNIT2遺伝子の短い転写物（1.1ｋｂ）が根こぶ病感染植物の根で特異的に検出され、この転写物がBrNIT2遺伝子の中途からの選択的転写開始によって生成されることを見いだし、BrNIT2遺伝子の第２イントロンから第３エクソンの一部の配列がプロモーター活性を示すことを確かめた。さらに本発明者らは、該プロモーター領域を抗菌性ペプチド（スカラベシン）遺伝子と機能的に結合してブロッコリーに導入したところ、根こぶ病に対するブロッコリーの抵抗性が増強されることを確認した。今までに根こぶ形成時特異的に機能するプロモーターが報告されたことはなく、本発明者等が見出した上記プロモーターは、根こぶにおいて発現する既報のどのプロモーターよりも根こぶにおける特異性が高い。すなわち、本発明は新規ニトリラーゼプロモーターおよび該プロモーターを利用した根こぶ病抵抗性植物の育種方法に関し、具体的には以下の発明を提供するものである。
（１）プロモーター活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：１記載の塩基配列に１または複数の欠失、置換、付加、および／または挿入を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：１記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドの下流に任意の外来ポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド、
（３）上記（１）記載のポリヌクレオチドを含み、任意の外来遺伝子挿入部位を備えたベクター、
（４）上記（２）記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、
（５）上記（２）記載のポリヌクレオチドまたは上記（４）記載のベクターが導入された形質転換細胞、
（６）上記（５）記載の細胞を含む形質転換植物体、
（７）上記（２）記載のポリヌクレオチドを含む、上記（６）記載の形質転換植物体の子孫または繁殖材料、
（８）下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、根こぶ病抵抗性植物の製造方法：
（ａ）上記（１）記載のポリヌクレオチドの下流に抗菌効果を有する物質をコードするポリヌクレオチドを機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程；
（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程、
（９）下記工程（ａ）から（ｃ）を含む、根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）の皮層感染時に根特異的に外来遺伝子を発現する植物の製造方法： 
（ａ）上記（１）記載のポリヌクレオチドの下流に外来遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程；
（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、新規プロモーターおよび該プロモーターを用いた根こぶ病抵抗性植物の新規育種方法が提供された。根こぶ病はアブラナ科作物の防除が困難な重要病害で、一度大発生した場合には産地が消滅することもあり、抵抗性品種の育成が強く望まれている。
【０００９】
本願発明のプロモーターは、根こぶ病菌による根こぶ形成時特異的に機能し、また、根こぶ部分においてほぼ限定的に機能する。そのため、本発明の新規プロモーターを用いて形質転換植物を作製することにより、感染部以外の組織や非感染時に外来遺伝子が発現することを最小限に抑えることができる。特にアブラナ科植物は、葉等の地上部を食用とすることが多く、食用部位において外来タンパク質が発現しない点は、一般的に、消費者の要請に合致していると考えられる。また植物体全体で不必要に遺伝子を発現することは、光合成により生産されたエネルギーのロスにつながると考えられ、本発明の育種方法は、作物の成長の観点においても望ましい方法であるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、プロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称する。）を提供する。本発明は、本願発明者等が、ハクサイのニトリラーゼ遺伝子の発現解析の結果、根こぶ病非感染時に観察されるBrNIT2遺伝子転写産物は1.4kbであり、地上部、特に花で強く発現するのに対し、根こぶ病感染時には、上記1.4kbの転写産物に加え、根こぶ病非感染時には観察されない1.1kbのBrNIT2遺伝子転写産物が根こぶ形成時に根特異的に産生されること、該1.1kbの転写産物はBrNIT2の中途からの転写開始によって生じることを見出したことに基づく。
【００１１】
本発明のポリヌクレオチドの一つとして、配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号：１に記載の塩基配列（623 bp）は、本発明者等が単離した、ハクサイのニトリラーゼ遺伝子BrNIT2（配列番号：２）の第２イントロンから第３エクソンの一部の配列であり、配列番号：２に記載の塩基配列（4466 bp）において、第2843−3465位に位置する。
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知技術をもちいて本願明細書の記載にしたがって調製することができる。例えば、実施例に記載のように、既報（Ando, S., Asano, T., Tsushima, S., Kamachi, S., Hagio, T., and Tabei, Y. 2005. Changes in gene expression of putative isopentenyltransferase during clubroot development in Chinese cabbage (Brassica rapa L.). Physiol. Mol. Plant Pathol. 67:59-67.）の方法でハクサイのゲノムDNAを調製し、配列番号：２の第2843−3465位を含む配列を増幅可能なプライマーを配列番号：２に記載の塩基配列をもとに設計し、上記調製したハクサイのゲノムDNAを鋳型としてPCR法等の周知核酸増幅法を行なうことにより、調製することができる。または、配列番号：１に記載の配列に基づき、核酸合成装置を使用して合成してもよい。
【００１３】
また本発明は、プロモーター活性を有する限り、配列番号：１のポリヌクレオチドと構造的に類似するポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドの例として、「配列番号：１記載の塩基配列に１または複数の欠失、置換、付加、および／または挿入を有するポリヌクレオチド」を挙げることができる。「配列番号：１記載の塩基配列に１または複数の欠失、置換、付加、および／または挿入を有するポリヌクレオチド」は、本明細書の記載にもとづいて、当業者によく知られた技術によって調製することができる。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350., Saiki, RK. et al., Science, 1988, 239, 487.）や、あるいは、該DNAに対し、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）により、変異を導入する方法が挙げられる。変異の数は、プロモーター活性を有する限り特に制限はないが、例えば、1から50個、好ましくは1から20個、より好ましくは1から10個または１から数個の範囲である。
【００１４】
さらに、プロモーター活性を有する限り、「配列番号：１記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」も本願発明のポリヌクレオチドに包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、特に制限されるものではないが、例えば42℃、2×SSC（300mM NaCl、30mMクエン酸）、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件である。配列番号：１記載の塩基配列と相同性の高いポリヌクレオチドを得るならば、高ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行なう。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られると期待できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
上述の、プロモーター活性を有し、配列番号：１と構造的に類似する本願ポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号：１記載の塩基配列と高い相同性を示すと考えられ、例えば、当該ポリヌクレオチド配列全体と配列番号：１記載の塩基配列との配列同一性として、少なくとも80％、85％、90％、または95％の配列同一性を有する。
【００１６】
このようにして調製したポリヌクレオチドがプロモーター活性を有するかどうかは、レポーター遺伝子を用いてレポーターアッセイを行なうことによって、確認可能である。該レポーター遺伝子としては、その発現が可能なものであれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）、GFP遺伝子など、当業者が一般的に用いる中から任意の遺伝子を選択することができる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、その下流に任意の外来遺伝子を機能的に連結することにより、該外来遺伝子を植物細胞中で発現させることに用いることができる。ここで「機能的に連結」とは、本発明のポリヌクレオチドが有するプロモーター活性により、下流の遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のポリヌクレオチドと下流の遺伝子とが結合していることを意味する。本発明のポリヌクレオチドを利用して任意遺伝子を導入しうる植物細胞は、本発明のポリヌクレオチドがプロモーター活性を発揮しうる限り、その由来する植物種は問わないが、好ましくはアブラナ科植物である。また、上記植物細胞は、その植物中の部位についても、本発明のポリヌクレオチドがプロモーター活性を発揮しうる限りどの部位であってもよいが、好ましくは根細胞である。本発明のポリヌクレオチドは、アブラナ科植物が根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）に皮層感染した際の根こぶが形成された根において、特異的に転写産物を産生しうる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、根こぶ病菌に皮層感染した植物の根特異的に外来遺伝子を発現させるためのプロモーターとして、特に好適に利用しうる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドに連結する外来遺伝子は特に種類は問わないが、抗菌性物質をコードする遺伝子は、その好ましい例である。より具体的な例としては、例えば、スカラベシン（Scarvaecin）遺伝子（例えば、タイワンカブトムシ由来）、ディフェンシン（defensin）遺伝子 (例えば、アブラナ科植物由来、タイワンカブトムシ由来)、モリシン(moricin)遺伝子（カイコ由来）、セクロピン B (secropin B)遺伝子（カイコ由来）を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを利用して外来遺伝子を植物細胞に導入する場合は、本発明のポリヌクレオチドと外来遺伝子が機能的に連結されたポリヌクレオチドそのままをエレクトロポレーション法やパーティクルガン法等の当業者に周知の方法によって導入してもよいが、ベクターとして導入してもよい。そこで本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する（以下、「本発明のベクター」と称する）。
【００２０】
本発明のベクターの第一の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含み、任意の外来遺伝子挿入部位（マルチクローニングサイト）を備えたベクターである。また本発明のベクターの第二の態様は、本発明のポリヌクレオチドの下流に任意の外来ポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００２１】
本発明のベクターの種類は特に問わないが、好ましくは、植物細胞への外来遺伝子導入に好適に利用しうるベクターである。具体例としては、Tiプラスミドベクター、Riプラスミドベクター、バイナリーベクターを挙げることができるが、これらベクターに限定されず、植物細胞への外来導入に利用しうる限り、本発明のベクターとなりうる。
【００２２】
本発明のベクターは、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の当業者に周知の方法によって植物細胞に導入することができる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドを用いて外来遺伝子を導入した細胞は、当業者に周知の方法により、形質転換植物体として再生することができる（以下、「本発明の形質転換植物体」）。本発明の形質転換植物体は、導入した外来遺伝子を根こぶ病菌皮層感染時に根特異的に発現しうる。導入した外来遺伝子が抗菌性物質である場合は、本発明の形質転換植物体は根こぶ病抵抗性を示しうる。根こぶ病抵抗性を示す本発明の形質転換植物体では抗菌性物質の発現が根こぶ病菌皮層感染した根に限局される。根以外を可食部とする作物を本発明の形質転換植物体とする場合は、可食部に抗菌性物質が発現しない、安全性の高い高付加価値作物となりうる。
【００２４】
本発明は上記形質転換植物体のみならず、その子孫または繁殖材料も提供する。本発明の形質転換植物体の子孫または繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト）は、その細胞に本発明のポリヌクレオチドを保持する限り、本発明の形質転換体と同様の形質を示すことが可能である。
【００２５】
本発明は、根こぶ病菌の皮層感染時に根特異的に外来遺伝子を発現する植物の製造方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）本発明のポリヌクレオチドの下流に抗菌効果を有する物質をコードするポリヌクレオチドを機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程、（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程、および（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程を含む。
【００２６】
また本発明は、根こぶ病菌の皮層感染時に根特異的に外来遺伝子を発現する植物の製造方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）本発明のポリヌクレオチドの下流に外来遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを調製する工程、（ｂ）工程（ａ）で調製したポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程、（ｃ）前記植物細胞から植物体を再生する工程を含む。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２８】
［１．材料および方法］
［１-１  植物材料および接種手順］
ハクサイ（B. rapa ssp. pekinensis）を、土を入れた鉢に植え25℃の温室内で生育させた。2種の根こぶ感受性品種、無双（タキイ種苗、京都、日本）および金将二号（タキイ種苗）、ならびに2種の根こぶ抵抗性品種、黄苑 80（日本農林社、東京、日本）およびスーパー CR ひろ黄（トヨハシ種苗、愛知、日本）を用いた。ゲノムサザン分析のための植物材料に関しては、無双の倍加半数体を用いた。この研究に用いた他のアブラナ属種は以下の通りである：コマツナ （B. rapa var. peruviridis）品種：オソメ （タキイ種苗）、ナタネ（B. napus） 品種：農林16号（カネコ種苗、群馬、日本）、キャベツ（B. oleracea var. capitata） 品種：金系201号 （サカタのタネ、神奈川、日本）、ブロッコリー（B. oleracea var. italica） 品種：緑嶺（サカタのタネ）、カラシナ（B. juncea）品種：葉からし菜（サカタのタネ）、アビシニアガラシ（B. carinata）系統番号：102-6およびクロガラシ（B. nigra）系統番号：129。
【００２９】
P. brassicaeの単胞子分離株Ibaraki-1（Kageyama et al. 1995）または分離株Kitamiの接種にはスラリー法（Toxopeus and Janssen 1975）を用いた。断りのある場合を除き、分離株Ibaraki-1を接種に用いた。湿らせた濾紙をペトリ皿に入れ、その上にハクサイの種子を1日おいて発芽させた。1日齢の実生を、1グラム当たり1×107個の休眠胞子を含む汚染土壌（土壌：水＝2：1、w／v）に移した。続いて植物体を温室内で収穫時まで生育させた。対照実験は非汚染土壌を用いて行い、接種実験との相関を明らかにするために接種後日数によって表した。根は各々の試料採取時に実生から切り出し、直ちに液体窒素中で凍結させて-80℃で保存し、その後に核酸の抽出を行った。
【００３０】
アラビドプシス（A. thaliana、生態型Col-0）を形質転換のために用い、プロモーター活性の分析に供試した。植物体を長日条件（明期16時間／暗期8時間）で14日間にわたり土壌にて22℃で生育させ、その後に、各実生の基部へP. brassicaeの休眠胞子懸濁液500μl（休眠胞子5×107個／ml）を接種した。接種植物および非接種植物を試料採取時まで培養した。
【００３１】
［１−２  RNA単離］
トータルRNAを文献に記載された通りにハクサイの根から単離した（Ando et al. 2005）。RNAゲルブロット分析用にはRNAを塩化リチウム沈殿によって精製した。RACEを行うため、PolyATract mRNA単離システムIIIを製造元（Promega, Madison, WI, USA）の指示どおりに使用し、ポリ(A)+ RNAをトータルRNAから精製した。
【００３２】
［１−３  ハクサイからのNIT遺伝子の単離］
ハクサイ（無双）からBrNIT遺伝子を単離するために、P. brassicaeを接種した接種後30日の根に由来するゲノムDNAおよびcDNAをテンプレートとして、縮重PCRを行った。縮重プライマーは、表1に記載した通りのアラビドプシスNIT遺伝子の保存的アミノ酸配列に基づいて設計した。PCR条件は、94℃ 30秒、49℃ 1分および72℃ 1分を40サイクルとした。Bischoffら（1995）に従って、アラビドプシスのNIT1に対する完全一致プライマーを用いて部分的cDNAを増幅した（表1）。
【００３３】
各々のBrNITに対する完全長cDNAを5'-および3'-RACEによって増幅した。反応はMarathon cDNA増幅キット（Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA）を用いて行った。GeneRacerキット（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を製造元の指示に従って用いてBrNIT2遺伝子の転写開始部位を決定した（RLM-RACE）。cDNAは、P. brassicae接種後30日のハクサイ（無双）の根に由来するポリ(A)+ RNAを用いて逆転写させた。表1に列記したプライマーを用いて、5'-および3'-RACE PCRを逐次的に行った。PCR産物はTOPO-TAクローニングベクター（Invitrogen）中にクローニングした。
【００３４】
BrNIT2のプロモーター配列を同定するためには、thermal asymmetric interlaced（TAIL）-PCRを、Liu and Whitteir（1995）による記載の通りに行った。プライマー配列は表1に列記されている。BrNIT2のゲノム配列はプライマーNIT2F3およびNIT2R3（表1）を用いるPCRによって増幅し、配列を決定した。
【００３５】
【表１】
0005164150.tif 000002
【００３６】
［１−４  DNAの配列決定］
TOPO-TAクローニングベクター（Invitrogen）中のcDNA断片の配列を、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1（Applied Biosystems）を用いて、自動DNAシークエンサー（ABI PRISM 3100；Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）により決定した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GENETYX-WINソフトウエア、ver. 4.0（GENETYX、Tokyo, Japan）を用いて解析した。データベースはNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information；Basic Local Alignment Search Tool）を用いて検索した。
【００３７】
クローニングしたcDNAによってコードされる、推定アミノ酸配列に対して系統学的分析を行った。DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のCLUSTAL Wプログラム（ver. 1.8）を用いた1000回のブートストラップ反復の結果から近隣結合法によって系統樹を作成した。この系統樹を、TreeViewソフトウエア、version 1.6（Page 1996）を用いてディスプレイ表示した。
【００３８】
［１−５  cDNAプローブの調製］
cDNAプローブは、表1に列記した遺伝子特異的プライマーを用い、クローニングした断片をテンプレートとしてPCRを行い調製した。増幅断片をゲル電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen KK, Tokyo, Japan）を用いて回収した。cDNAプローブは、Multiprime DNA Labeling System（Amersham Biosciences、Piscataway, NJ, USA）を用いて（ランダムプライミング法）[α-32P]dCTPで標識した。
【００３９】
［１−６  RNAゲルブロット分析］
P. brassicae接種根および非接種根から単離したトータルRNAを、0.66Mホルムアミドを含む1.2％アガロースゲル上での電気泳動に供し、続いてGeneScreen Plus膜（PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA）に、製造元の指示に従って、10×SSC（1×SSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウムである）中で毛管作用により移行させた。ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は、以前の記載の通りに行った（Ando et al. 2005）。洗浄した膜は、Molecular Imager FX（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いるオートラジオグラフィーに供した。その後にプローブを除去するために膜を1×SSC、0.1％SDSの沸騰溶液で洗浄した。続いて、同量のRNAが各レーンにローディングされたことを確かめるために、特異的プローブを用いるrRNAの検出を行った。実験はすべて少なくとも2回ずつ繰り返し、代表的な結果を図に示している。
【００４０】
［１−７  ゲノムのサザンブロット分析］
P. brassicaeおよびハクサイからのゲノムDNAを、以前の記載の通りに単離した（Ando et al. 2005）。3μgのDNAをHindIIIおよびXbaIで別々に消化した。消化物を0.9％アガロースゲルで分画し、GeneScreen Plus膜（PerkinElmer Life and Analytical Sciences）に製造元の指示に従って移行させた。ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は以前の報告に記載した通りに行った（Ando et al. 2005）。
【００４１】
［１−８  ベクターの構築およびアラビドプシスの形質転換］
BrNIT2の第2イントロンを含む配列（Pnit2int1およびPnit2int2）を、制限酵素部位（HindIIIおよびXbaI）を含むプライマー（表1参照）を用いたハクサイ（無双）ゲノムDNAからのPCR増幅によって調製した。これらの断片を制限酵素によって消化し、pSMAH628中のGUS遺伝子の5'末端の上流に挿入した（Pnit2int1::GUSおよびPnit2int2::GUS）。これらのベクターをアグロバクテリウム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV3101::pMP90株に導入し、続いてfloral dip法（Clough and Bent 1998）を用いてアラビドプシス（A. thaliana、生態型Col-0）に導入した。これらの導入遺伝子を保有する形質転換植物を、ペトリ皿の中にて1％スクロース、0.25％ゲルライトおよび20μg ml-1のハイグロマイシンを含む1／2MS培地上で、22℃の長日条件（明期16時間／暗期8時間）下で2週間培養することで選抜した。
【００４２】
［１−９  GUS活性の組織化学的位置決定］
GUSアッセイは、Jeffersonら（1987）の方法にいくつか変更を加えたものに従って行った。すなわち、試料を氷上の90％アセトン中に20分間浸し、50mMリン酸ナトリウム（pH 7.2）で洗浄した後に、50mMリン酸ナトリウム（pH 7.2）、10mM EDTA、0.5Mフェリシアン化物、0.5Mフェロシアン化物、0.1％Triton X-100および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニドシクロヘキシルアミンを含む染色溶液中に試料を浸漬して37℃で一晩インキュベートした。試料を2.5％gグルタルアルデヒドで固定し、エタノールシリーズ（30％、50％および70％）に浸すことによって脱色した。いくつかの試料をTechnovit 7100（Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Hanau, Germany）中に包埋し、8-μm厚の切片を作製して顕微鏡下で観察した。
【００４３】
［２．ハクサイからのNIT遺伝子の単離および配列解析］
PCR法によって、ハクサイ（cv. Muso）からNIT遺伝子の4種の部分配列を単離し、BrNIT1（B. rapaニトリラーゼ）、BrNIT2、BrNIT3およびBrNIT4と命名した。BrNIT1（1302bp）、BrNIT2（1315bp）およびBrNIT3（1075bp）の完全長配列を、cDNA末端の5'-および3'- RACEによって決定したが、決定されたBrNIT3配列は5'領域を欠くように思われた。著者らは、単離したBrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3、ならびにナタネ（B. napus）、ハクサイ、アラビドプシスおよびトウモロコシのニトリラーゼの推定されるアミノ酸配列を用いて系統学的分析を行った（図1）。BrNIT2、BrNIT1およびBrNIT4は、最近、Ishikawaら（2007）によってカブ（B. rapa cv. Natsumaki 13-gou kokabu）から単離された、BrNIT-T1（GenBankアクセッション番号EF014463）、BrNIT-T2（EF014464）およびBrNIT-T4（EF014465）と非常に類似しており、特に、BrNIT4（部分配列）はBrNIT-T4（完全長配列）とアミノ酸配列の点で同一であった。そこで、BrNIT4の代わりにBrNIT-T4を用い系統学的分析を行った。この系統学的分析により、BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3はアラビドプシスNIT1およびNIT2の同じクラスター内に含まれることが示され、このことからそれらがオーキシン生合成に関与する可能性が高いことが示唆された（Normanly et al. 1997；Schmidt et al. 1996；Vorwerk et al. 2001；Woodward and Bartel 2005）。BrNIT1およびBrNIT2は互いに最も類似性が高く、B. napusのBnNIT2と非常に似ている。さらに、BrNIT1およびBrNIT2は、ハクサイで以前に報告されている、BcNIT1およびBcNIT2を含む遺伝子クラスターには属さなかったが（Bischoff et al. 1995；Grsic et al. 1999）、BrNIT3はそのクラスターに含まれた。BrNIT-T4（BrNIT4）はNIT4クラスターに含まれ、BcNIT4と最も類似性が高かった。Piotrowskiら（2001）は、アラビドプシスNIT4が基質としてのインドール-3-アセトニトリル（IAN）に対しては活性がないことを示し、それがシアン化物の解毒に関与し、β-シアノ-L-アラニンに対する強い基質特異性を有することを示唆した。このため、著者らはBrNIT4を以後の分析から除外した。Ishikawaら（2007）による最近の研究によって、同様の基質特異性がカブニトリラーゼにおいても確かめられている。
【００４４】
［３．  BrNIT遺伝子のゲノム構成］
ハクサイ 無双（倍加半数体植物）およびP. brassicaeのゲノムDNAを用いてゲノムのサザンブロット法を行った。BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の3'非翻訳領域をプローブとして用いたところ、B. rapaゲノムの各レーンに単一の主要バンドが異なるハイブリダイゼーションパターンで検出されたが、P. brassicaeゲノムのレーンには全くバンドが検出されなかった（図2）。これらの結果は、これらが倍加半数体ハクサイのゲノム中の単一コピー遺伝子であることを示唆する。また、これらの結果により、この実験に用いたプローブが各遺伝子に対して高度に特異的であることも示された。
【００４５】
［４．  さまざまな組織におけるBrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の発現プロファイル］
BrNIT1遺伝子、BrNIT2遺伝子およびBrNIT3遺伝子の組織依存的発現を、それらの遺伝子発現の特徴を調べるために検討した。倍加半数体ハクサイ（無双）の根、ロゼット葉、茎葉、花茎、花および花房からノーザンブロット法のためにトータルRNAを単離した（図3）。BrNIT1の約1.4 kbの転写物は根で最も強く検出され、茎葉、茎、花および花房では弱いシグナルとして検出された。これに対して、BrNIT2は地上部分、特に花で高度に発現された。BrNIT2の転写物の蓄積は他の植物部分と比較して根では低レベルであった。BrNIT3のシグナルは根で検出され、花房ではわずかに検出された。これらの知見は、BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の発現が、植物発生中に差異を伴って調節されることを示唆する。
【００４６】
［５．  根こぶ発生時のBrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の発現プロファイル］
BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の遺伝子発現の変化を調べるために、いくつかの発生段階においてP. brassicae接種根、あるいは非接種根の全体からの全RNAを用いたノーザンブロット解析を行った。5日おきの観察では視認しうる根こぶは接種20日後（dpi）に最初に確かめられ、その後激しく発達した（図4A）。図4Bに示すように、BrNIT1の発現は植物の齢数とともに低下し、P. brassicaeの接種によってはほとんど影響を受けなかったが、接種後40日では病根における発現の方が非感染根におけるよりも幾分高かった。BrNIT2の遺伝子特異的プローブをハイブリダイズさせたところ、健常根における1.4-kb mRNAの転写は日によって変動した。接種した根では、BrNIT2発現は接種後10日から接種後20日までは対応する対照と同様に変動し、接種25日以後は根こぶの発達に伴って増加した。さらに、短い転写物（約1.1 kb）の蓄積は、接種後25日から接種後40日まで病根のみに検出された。1.1 kb転写物は完全なタンパク質をコードするには短かすぎるため、1.4kb転写物がBrNIT2の完全長mRNAであると考えられる。BrNIT3は、発現は接種後10日および接種後20日にのみ検出された。BrNIT3 mRNAの蓄積は、接種後20日では接種した根の方が健常根よりも少なかった。ハクサイではニトリラーゼの活性がP. brassicae感染によって上昇することが報告されている（Grsic et al. 1999）。このため、これらの結果は、BrNIT2がハクサイにおける根こぶ発生時のニトリラーゼ活性の上昇と関連していることを示唆する。以後、著者らは、根こぶ病の進行過程におけるニトリラーゼ遺伝子の関与を明らかにするために、BrNIT2遺伝子の分析を進めた。
【００４７】
［６．  根こぶ抵抗性および根こぶ感受性の品種におけるBrNIT2の発現］
根こぶ抵抗性品種（黄苑80およびスーパー CR ひろ黄）にP. brassicaeの単胞子分離株Ibaraki-1を接種したところ、重度の症状は観察されなかったが、小さなこぶが接種後35日に時折形成された（図5A）。BrNIT2の1.4 kbおよび1.1 kbの転写物は両方とも、根こぶ感受性品種（無双および金将二号）の病根に蓄積した。しかし、根こぶ抵抗性品種では、P. brassicae（分離株Ibaraki-1）を接種しても1.4 kb転写物のレベルが幾分高くなるかほとんど変化しないかであり、1.1 kb転写物は検出できなかった（図5A）。これに対して、P. brassicae分離株Kitamiを接種した場合には、黄苑 80における根こぶ抵抗性の破綻が起こり、BrNIT2転写物の蓄積は、無双だけでなく黄苑 80でも接種後35日に増強された（図5B）。これらの結果は、BrNIT2転写物の蓄積が、品種の感受性とは関係なく、根こぶ形成とよく相関することを示唆する。
【００４８】
［７．  アブラナ科植物におけるBrNIT2の1.1 kb mRNAの普遍性］
次に著者らは、さまざまなアブラナ科植物における1.1 kb転写物蓄積と根こぶ形成との相関について検討した（図6）。この実験では、すべてのアブラナ科植物はP. brassicae（分離株Ibaraki-1）に対して感受性であり、典型的な根こぶを生じた。BrNIT2特異的プローブを用いたところ、ハクサイ（無双）、コマツナ（オソメ）、ナタネ（農林16号）およびカラシナ（葉からし菜）では1.1 kb転写物が検出されたが、キャベツ（金系 201号）、ブロッコリー（緑嶺）およびアビシニアガラシ（B. carinata）（系統番号102-6）では検出できなかった。これらの植物では、1.4-kb転写物の蓄積がP. brassicae感染によって増強された。一方、クロガラシ（B. nigra）（系統番号129）では、BrNIT2特異的プローブでは全くシグナルが検出されなかったものの、BrNIT2完全長cDNAプローブを用いると1.4-kbバンドのみが検出され、これは感染によって強まった。さらに、1.1-kb転写物はアラビドプシス（A. thaliana）では観察されなかった（図７）。
【００４９】
［８．  病根におけるBrNIT2遺伝子の中途からの選択的転写開始］
BrNIT2の1.1-kb転写物は病根に高度に特異的であったため、この転写物の生成機構を分析した。上記の通り、BrNIT2の完全長mRNAは1.4-kb長であると推定された。さらに、ゲノムのサザン分析により、BrNIT2プローブがB. rapaゲノムの単一の座位に対して特異的であることが示された。このため、1.1 kb転写物は選択的スプライシング、転写の早期終結、mRNAの特異的分解、または選択的転写開始によってBrNIT2遺伝子から生成される可能性がある。第1に、用いたプローブが3'-UTRの231 bp配列を有していたため（図8）、1.1 kb転写物は少なくとも3'-UTR配列を含んでおり、このことは1.1 kb転写物が早期に転写終結したmRNAや3'末端が特異的に分解されたmRNAではないことを意味する。第2に、著者らは、完全長cDNAの増幅用のプライマーを用いるRT-PCRによって選択的スプライシングの関与について評価した（表1）。1.1 kb転写物が選択的スプライシングによって生じるならば、PCR産物の電気泳動おいて複数のバンドとして現れるはずである。しかし、この実験では完全長mRNA（1.4kb）に対応する単一のバンドのみが検出された（図9）。このため、選択的スプライシングによって1.1 kb mRNAの蓄積を説明できなかった。次に著者らは、RNAリガーゼを介したcDNA末端の迅速増幅法（RLM-RACE；Maruyama and Sugano 1994；Schaefer 1995；Volloch et al. 1994）を利用して、1.1 kb転写物が5'キャップ構造を有するか否かを検討した。RLM-RACEを用いると、分解されたmRNAはcDNA増幅から除外され、得られたcDNAは必ず転写開始部位を含む。その結果、位置+833〜+1005の間に複数の転写開始点が存在することが明らかとなり（図8）、このことから1.1 kb転写物がBrNIT2遺伝子の中途での転写開始によって生成されることが示された。
【００５０】
［９.  病根におけるBrNIT2遺伝子内部のプロモーター活性の同定］
選択的転写開始部位の上流配列が、根こぶ発生時にプロモーター活性を有するか否かを評価した。アラビドプシスを用いたプロモーター-GUSアッセイ．図10 Aに示されたようにBrNIT2配列を有する2種類の融合構築物（Pnit2int1::GUSおよびPnit2int2::GUS）を、アラビドプシス植物体の形質転換に用いた。Pnit2int1::GUSはBrNIT2の+2〜+1037（配列番号：２の2430-3465位）を含み、Pnit2int2::GUSはBrNIT2の+415〜+1037（配列番号：１。配列番号：２の2843-3465位に相当する。）を含む。それぞれ6系統および7系統の独立したトランスジェニック植物（T1世代またはT2世代）でプロモーター活性を分析した。図10 E、GおよびIに示されているように、Pnit2int2::GUS構築物を有するトランスジェニック植物の根こぶ中にGUS染色が検出され、このことからBrNIT2の+415〜+1037の間の配列が根こぶにおいてプロモーターとして作用することが示された。根の染色は最初はドット状に観察され（図10 E）、その後は腫大した根に広がっていった。Pnit2int1::GUS構築物を有するトランスジェニック植物でも同じ結果が得られた。接種していない根（図10 B、D、FおよびH）、接種を受けたがこぶ形成を伴わないトランスジェニック植物の根（図10 C）および野生型植物（図10 JおよびK）では、GUS染色が検出されなかった。横断面像によって、GUS染色がP. brassicaeの侵入性変形体に付随することが判明したが（図10 L-P）、症状が軽度の根では変形体を保有する細胞でシグナルが観察されないことも時折あった（図10 O）。以上を総合すると、これらの結果は、この病原体が宿主遺伝子の選択的転写開始を誘発することを示唆している。健常植物では、GUS染色は葯の基部を除いて検出されなかった（図10 Q）。
【００５１】
［１０．  抗菌性ペプチドを利用した根こぶ病抵抗性付与の検討］
上記Pnit2int1の下流に抗菌性ペプチド（タイワンカブトムシ由来スカラベシン）遺伝子を連結した導入カセットを作製し、該カセットをブロッコリーに導入した。形質転換ブロッコリーに根こぶ病菌を接種して根こぶの発生を観察し、根こぶ病抵抗性を評価した。対照として、CaMV 35ＳプロモーターにE12 Ωエンハンサーを連結した配列の下流に、スカラベシン遺伝子またはレポーター遺伝子（GUS）を連結し、同様にブロッコリーに導入した。発病指数は、既報（Kuginuki et al. (1999) Eur. J. Plant Pathol 105:327-332）にしたがって求めた。
【００５２】
結果を表２および図１１に示す。表２において、「０」は「根こぶなし」、「１」は「根系の25％未満に根こぶあり」、「２」は「根系の50％未満に肥大した根こぶあり」、「３」は「根系の50％以上に肥大した根こぶあり」を意味する。Pnit2int1の下流にスカラベシン遺伝子を連結したカセットを導入された形質転換ブロッコリーでは根こぶの発生が著しく抑制されており、Pnit2int1による根こぶ病抵抗性付与が示された。
【００５３】
【表２】
0005164150.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】各種植物のニトリラーゼの系統学的関係を示す図である。NIT遺伝子の推定アミノ酸配列を用いて近隣結合法によって系統樹を構築した。N末端配列を欠くBrNIT3、及びGrsicら（1999）によって報告されているBcNIT1、BcNIT2およびBcNIT4の部分配列を例外として、アミノ酸の完全長配列を用いた。枝の数字は、1000回のリサンプリングによって決定されたブートストラップ確率（％）を示す。目盛は1残基当たり0.1個の置換を表している。配列データのアクセッション番号は以下の通りである：NIT1、NM_180680；NIT2、NM_114298；NIT3、NM_114300；NIT4、NM_122135；BrNIT-T4、EF014465；BnNIT2、AF380304；ZmNIT1、AY156979；ZmNIT2、AY156978。
【図２】BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3のサザンブロット分析の結果を示す写真である。ハクサイのゲノムDNA（3μg）またはPlasmodiophora brassicaeのゲノムDNA（3μg）をHindIIIおよびXbaIで消化し、0.9％アガロースゲルで分画した後、ナイロン膜に移行させた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、図中に示したプローブを用いて行った。
【図３】BrNIT1、BrNIT2およびBrNIT3の組織依存的発現を示す写真である。根およびロゼット葉は、四葉期の倍加半数体ハクサイ（無双）から収集した。茎葉、花茎、花および花房は、開花期の倍加半数体ハクサイ（無双）から収集した。トータルRNA（20μg）を各試料から抽出し、変性アガロースゲルで分画した上で、ナイロン膜に移し、図中に示したプローブとハイブリダイズさせた。最下段の臭化エチジウム染色されたRNAゲルはRNAローディングを示している。
【図４】根こぶ形成時におけるBrNIT1遺伝子、BrNIT2遺伝子およびBrNIT3遺伝子の発現を示す写真である。A、根こぶの発達の様子を示す写真である。実生（無双）の根に対して、スラリー法を用いてPlasmodiophora brassicaeを接種した。P. brassicaeを接種していない植物体を対照とした。バーは2cmを表す。B、それぞれの試料採取日（dpi、接種後日数）に収集した全根を用いたノーザンブロット法の結果を示す写真である。トータルRNA（20μg）を根から抽出し、変性アガロースゲルで分画した上で、ナイロン膜に移し、図中に示したプローブとハイブリダイズさせた。その後にブロットを剥がし、rRNAプローブと再びハイブリダイズさせた。
【図５】根こぶ抵抗性品種および感受性品種でのBrNIT2の発現を示す写真である。A、根こぶ抵抗性品種（黄苑 80およびスーパー CR ひろ黄）および感受性品種（無双および金将２号）に対して、Plasmodiophora brassicae（分離株Ibaraki-1）を接種した。B、実生（無双および黄苑80）の根に対して、P. brassicae（分離株Kitami）を接種した。接種35日後（dpi）の病根（接種、I；根の基部から4cmの箇所）および非接種根の対応する部分（対照、C）を用いてノーザンブロット法を行った。トータルRNA（20μg）を根から抽出し、変性アガロースゲルで分画した上で、ナイロン膜に移し、BrNIT2に対して特異的なプローブおよびローディング対照としてのrRNAプローブとハイブリダイズさせた。接種した根の写真をそれぞれの下に示している。バーは4cmを表す。
【図６】様々なアブラナ科植物におけるBrNIT2の1.1-kb転写物の蓄積を示す写真である。アブラナ属種の実生の根に、スラリー法を用いてPlasmodiophora brassicaeを接種した。P. brassicaeを接種していない植物体を対照として用いた。接種35日後（dpi）の病根（接種、I；根の基部から4cmの箇所）および非接種根の対応する部分（対照、C）を用いてノーザンブロット法を行った。トータルRNA（20μg）を根から抽出し、変性アガロースゲルで分画した上で、ナイロン膜に移し、BrNIT2特異的プローブ（S）およびBrNIT2完全長cDNAプローブ（F）とハイブリダイズさせた。その後にブロットを剥がし、rRNAプローブと再びハイブリダイズさせた。接種した根および接種していない根の写真を下に示している。バーは4cmを表す。1、ハクサイ（B. rapa var. pekinensis） 品種 無双； 2、コマツナ（B. rapa var. peruviridis） 品種 オソメ； 3、ナタネ（B. napus） 品種 農林１６号； 4、キャベツ（B. oleracea var. capitata） 品種 金系 201号； 5、ブロッコリー（B. oleracea var. italica） 品種 緑嶺； 6、アビシニアガラシ（B. carinata） 系統番号102-6； 7、クロガラシ（B. nigra） 系統番号129 ；8、カラシ菜（B. juncea） 品種 葉からし菜。
【図７】アラビドプシスのNIT1遺伝子、NIT2遺伝子およびNIT3遺伝子の根こぶ発生時における発現を示す写真である。A、アラビドプシス（A. thaliana）（Col-0）における根こぶの発生を示す写真である。植物体を土壌で14日間生育させ、続いてそれらにPlasmodiophora brassicaeを接種するか、水で処置した（非接種対照）。これらの植物体を接種42日後（dpi）に収集した。バーは1cmを表す。B、42dpiに収集した全根を用いたノーザンブロット法の結果を示す写真である。トータルRNA（20μg）を根から抽出し、変性アガロースゲルで分画した上で、ナイロン膜に移し、図中に示したプローブのそれぞれとハイブリダイズさせた。遺伝子特異的cDNAプローブは、補足表S1に列記したプライマーを用いたPCRによって調製した。その後、ブロットを剥がし、rRNAプローブと再びハイブリダイズさせた。
【図８】BrNIT2遺伝子のゲノム配列を示す図である。ヌクレオチド残基には、白抜き矢印で示した完全長cDNA（1.4kb）の転写開始部位（+1）（配列番号：２の第2429位）を基準として5'から3'への向きに番号を付けている。推定TATAボックスに下線を施している。選択的転写開始の部位を塗りつぶした矢印で示す。塗りつぶした矢印の中の数字は、RLM-RACE（番号がないものは単一のクローンを示す）によって得られたクローンの数を表す。コンセンサスGT／AGスプライス部位は白抜きボックスで描かれている。特異的プローブ用に用いた配列は太字で表されている。ｃDNAの推定アミノ酸配列は一文字記号として示されている。グレーのボックスは想定の触媒活性システインである。
【図９】BrNIT2遺伝子の逆転写PCRの写真である。Plasmodiophora brassicaeに感染させたか、または接種していないまま（対照）のハクサイ（無双）の根から接種30日後（dpi）にトータルRNA（5μg）を抽出し、T18プライマー（総容積20μl）とともに、Superscript II（Invitrogen）を製造元の指示に従って用いて逆転写させた。RT-PCRは、20μlの反応混合物中に、NIT2F3およびNIT2R3プライマー（表1）とともに、接種していない根（C）および接種した根（I）からのRT混合物を5分の1に希釈したもの1μlを含むものを用いて行った。反応パラメーターは、94℃ 30秒、60℃ 1分および72℃ 2分を35サイクルとした。ハクサイ（無双）のゲノムDNA（G）もPCR反応の鋳型として利用した。続いて増幅産物を1.5％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【図１０】Pnit2int1::GUSおよびPnit2int2::GUSを導入したアラビドプシスにおけるGUS遺伝子発現プロファイルを示す写真である。A、BrNIT2遺伝子におけるPnit2int1およびPnit2int2配列の概略図である。塗りつぶされたボックスおよび実線はそれぞれエクソンおよびイントロンを示している。白抜きボックスで示されたPnit2int1およびPnit2int2はGUS遺伝子と連結されている。Pnit2int1::GUS（M-O）およびPnit2int2::GUS（B-I、L、PおよびQ）のコンストラクトが導入された植物体、ならびに野生型植物（JおよびK）を14日間生育させ、続いてそれらにPlasmodiophora brassicaeを接種するか、水で処置した（非接種対照）。接種7日後、14日後、21日後および28日後（dpi）にこれらの植物体を収集してGUSアッセイに用いた。B、接種していない7dpiの植物体の写真である。C、接種した7dpiの植物体の写真である。D、接種していない14dpiの植物体の写真である。E、接種した14dpiの植物体の写真である。パネルEの挿入図は、GUS染色の部分に関する拡大像である。F、接種していない21dpiの植物体の写真である。G、接種した21dpiの植物体の写真である。H、接種していない28dpiの植物体の写真である。I、接種した28dpiの植物体の写真である。J、接種していない28dpiの野生型植物体の写真である。K、接種した28dpiの野生型植物体の写真である。L、21dpiのPnit2int2::GUS植物体の根こぶの断面の写真である。M、接種したPnit2int1::GUS植物体（21dpi）の根の、GUS染色が乏しい部分の断面写真である（パネルEの挿入図の場合と同じ）。NおよびO、パネルMの拡大像（パネルM中に四角によって表されている）。矢印はP. brassicaeの変形体を表す。P、21dpiのPnit2int2::GUS植物体の接種していない根の断面図の写真である。Q、Pnit2int2::GUS植物体の花の写真である。GUS染色は矢印によって表されている。スケールバーは、パネルB〜Kでは2mm；パネルEの挿入図では0.5mm；パネルL、MおよびPでは10μm；パネルNおよびOでは5μm；パネルHでは1mmを表す。
【図１１】根こぶ病菌を接種した形質転換ブロッコリーの根の病徴を示す写真である。左は「35SΩ::GUS」、中央は「35SΩ::スカルベシン」、右は「Pnit2int1::スカルベシン」。バーは3cmを表す。
【図１】
0005164150.tif 000004
【図８】
0005164150.tif 000005
【図２】
0005164150.tif 000006
【図３】
0005164150.tif 000007
【図４】
0005164150.tif 000008
【図５】
0005164150.tif 000009
【図６】
0005164150.tif 000010
【図７】
0005164150.tif 000011
【図９】
0005164150.tif 000012
【図１０】
0005164150.tif 000013
【図１１】
0005164150.tif 000014
【配列表】
0005164150000001.app