(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＳＳＩＩ遺伝子を備えるオオムギ植物由来の穀粒であって、前記変異SSII遺伝子はコードされるSSIIの活性を低下させ前記穀粒におけるアミロペクチン含有量を低下させる変異遺伝子であり、全デンプン含有量に対してアミロース含有量が少なくとも６０重量％である前記穀粒。
【請求項２】
前記変異ＳＳＩＩ遺伝子が配列表の配列番号１に示す配列を備えるとともに、変異が短縮型変異、漏出型変異から選ばれるものであるか、または欠失、逆位、重複または点変異を含むものである、請求項１に記載の穀粒。
【請求項３】
前記変異ＳＳＩＩ遺伝子が、前記変異ＳＳＩＩ遺伝子のＣ末端触媒ドメインが翻訳されない短縮型変異体である、請求項２に記載の穀粒。
【請求項４】
前記変異ＳＳＩＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列が配列表の配列番号４に示す配列を備えるものである、請求項１に記載の穀粒。
【請求項５】
前記穀粒から作られた粉（flour）または全麦（wholemeal）の膨潤体積が３．２未満である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項６】
前記穀粒から作製される粉（flour）または全麦（wholemeal）の膨潤体積が少なくとも２である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項７】
外皮を有さない穀粒（non-hulled grain）の全重量の少なくとも６％のβ−グルカンを含む、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項８】
デンプン含有量が裸性穀種の１２％を超えること、容易に粉砕可能であること、紫色の色彩を示さないこと、裸性であること、厚さに対する長さの比率が５．８未満であること、からなる群より選択される特性を有する、請求項１〜請求項７のうちいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項９】
厚さに対する長さの比率が５．５未満である、請求項１〜請求項８のうちいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１０】
厚さに対する長さの比率の範囲が４から５である、請求項９に記載の穀粒。
【請求項１１】
前記穀粒中のデンプンが次のうち少なくとも１つによって特徴付けられる、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の穀粒；
ａ）示差走査熱量測定による第１の糊化ピークの開始（onset）が５３℃未満である、
ｂ）示差走査熱量測定による第１の糊化ピークの頂点が６０℃未満である、および、
ｃ）示差走査熱量測定による第１の糊化ピークのエンタルピー（ΔＨ）が３．５未満である。
【請求項１２】
前記穀粒のデンプンの糊化温度が７５℃以上である、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１３】
結晶性を示すデンプンの割合が２０％未満である、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１４】
前記穀粒のデンプンに含まれ、デンプン−脂質複合体に特徴的な結晶性形状を示す結晶性デンプンの割合が５０％以上である、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１５】
前記穀粒のデンプンに含まれ、３１−６０残基の範囲の長さをもつアミロペクチン鎖の割合が５％以上である、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の穀粒を産生可能なオオムギ植物。
【請求項１７】
粉砕された、挽かれた、粗挽きされた、精白されたかまたは圧延された、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項１８】
オオムギ植物のＳＳＩＩ変異体の、全デンプン含有量に対するアミロース含有量が少なくとも６０重量％であるオオムギ穀粒を産生するための使用であって、前記変異体においてはSSII活性が低下しており、前記穀粒におけるデンプンのアミロペクチン含有量が低下している、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、アミロペクチン含有量の低下したデンプンをもたらす、ＳＳＩＩ酵素活性が低下したオオムギ植物に関する。本発明はまた、この植物から得られるデンプンおよび穀粒ならびに食品に関する。
【０００２】発明の背景
栄養科学における１つの所見は、難消化性デンプンが腸の健康、特に大腸の健康に重要な意味を有することである。難消化性デンプンの有益な効果は栄養素の大腸への供給により生じ、ここで、腸内フローラにエネルギー源が与えられ、このエネルギー源は発酵して特に短鎖脂肪酸を形成する。これらの短鎖脂肪酸は、大腸粘膜細胞に栄養素を供給し、大腸を横切るある種の栄養素の取り込みを増強し、結腸の生理学的活性を促進する。一般に難消化性デンプンまたは他の食物繊維が提供されない場合、結腸は代謝的に比較的不活性である。
【０００３】  近年、腸の健康に取り組むために、様々な供給源由来の難消化性デンプンを提供することに注目する傾向がある。従って、トウモロコシなどのある種の穀粒において、腸の健康を促進するための手段として食物において使用するための高アミロースデンプンが開発されている。
【０００４】  デンプンの物理的構造は、食品のためのデンプンの栄養学的な、および取り扱い上の特性に重要な影響を与え得る。ある種の特性は、アミロペクチン鎖長、結晶化度、およびデンプン結晶のＶ複合形状（V-complex form）のような結晶形状の存在を含むデンプン構造の指標とみなすことができる。また、これらの特性の形態は、これらのデンプンを含有する食物の栄養学的な、および取り扱い上の特性の指標とみなすこともできる。従って、低アミロペクチン鎖長は、低結晶性および低ゼラチン化の指標であり得、また、アミロペクチンの老化の低減に相関性を有すると考えられる。さらに、より短いアミロペクチンの鎖長分布は、有意な量でデンプンが含まれる食物の官能特性（organoleptic properties）に反映すると思われる。デンプンの結晶性の低下はまた、デンプンのゼラチン化温度の低下を示唆し得、さらに、それは官能特性（organoleptic properties）の増強に関連すると思われる。Ｖ複合結晶または他の脂質会合デンプンは、難消化性デンプン、従って食物繊維のレベルを増強する。
【０００５】  高アミロースデンプン含有量を示すオオムギの系統は過去に同定されている。これらの株では、ハイアミロースグレーシャー（Ｈｉｇｈ  Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｇｌａｃｉｅｒ）（ＡＣ３８）として公知であるオオムギ変種などにおいて、最大で全デンプンの約４５％までの比較的中等度のアミロース含有量の増加しかもたらさない。そのタイプのアミロースデンプンの増加は有用であるが、さらに高いアミロース含有量を示すデンプンがやはり好ましく、いくつかの他の種の穀粒が９０パーセンタイル（percentile）の範囲のレベルでより高いアミロース含有デンプンを示すように育種されている。これらは、消化に対し極めて抵抗性であり、より大きな健康上の利益をもたらす。
【０００６】  既知の高アミロースデンプンは高いゼラチン化温度をも有するため、高アミロースデンプンの提供には問題がある。ゼラチン化温度は、そのような食物を加工するのに必要な粉砕エネルギーを反映する。従って、そのような穀粒またはデンプンから食物を製造するために穀粒もしくは粉を加工するためには、通常、より高い温度が必要とされる。従って、一般に、高アミロースデンプンを有する製品はより高価である。同様に、消費者の見地から、製造された食品を調理するか、または高アミロースデンプンを有する粉から食品を調理するには、さらに長い時間および高い温度を必要とするだろう。従って、高アミロースデンプンを食品に提供するには、重要な欠点がある。
【０００７】  穀粒、特にオオムギのもう１つの栄養成分はβ−グルカンである。β−グルカンは、β（１−４）および／またはβ（１−３）グリコシド結合によって結合したグルコース単位から成り、かつヒト消化消化酵素によって分解されないため、食物繊維の供給源として適切である。β−グルカンは内在性大腸細菌によって部分的に消化され得、発酵過程により腸および結腸内膜の粘膜細胞に有益な短鎖脂肪酸（主に、酢酸、プロピオン酸および酪酸）を生じる（ＳａｋａｔａおよびＥｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４ａ：４５９−４６２（１９８３））。
【０００８】  また、β−グルカンの摂取は、総血清コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の減少をもたらす胆汁酸の分泌を増加し、これにより冠動脈疾患の危険性を低減させる。同様に、β−グルカンは、食後に血中グルコース濃度の変動を弱めることによって作用する。これらの効果は、両方とも胃および腸の内容物の粘度の上昇に基づく。
【０００９】  デンプンを含有する食物の組成およびこれらのデンプンと他の栄養または他の成分との間の密接な関係は、それらの食物の栄養価または食物の調理もしくは構造におけるそれらの成分の機能的特性に重要な影響をもたらすことができる。
【００１０】  改変されたデンプンまたはβグルカンは、例えば、改変されていない供給源では通常付与されない機能性を提供する食物に利用することができる一方、そのような加工は、価値のある他の成分を変化させるか、または改変に関与する加工に起因して望ましくないという認識をもたらす傾向を有する。従って、食物において改変されない形態で使用することができる構成分の供給源を提供することが望ましい。
【００１１】  オオムギ変種ＭＫ６８２７は、バーレイガームプラズマコレクション（Ｂａｒｌｅｙ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＵＳＤＡ−ＡＲＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｍａｌｌ  Ｇｒａｉｎ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｉｄａｈｏ  ８３１２９０  ＵＳＡ）より入手することができる。ＭＫ６８２７の穀粒は皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）であり、濃色の包皮および狭長な形状を有し、本発明者らの見解では、本穀粒は加工が極めて困難であり、粉砕に対して極めて抵抗性である。ＭＫ６８２７穀粒の特性については以前に特性化されておらず、また、変異の性質についても確かめられておらず、食品製造に適切であるとみなされていない。
【００１２】発明の概要
本発明は、オオムギ植物のＳＳＩＩ変異体の単離および特性化から生じ、この変異体の穀粒は、アミロペクチン含有量の低下、および、それ故の高い相対レベルのアミロースを有し、それ故に食物繊維のレベルが増大しているデンプンを含有することが見出されている。
【００１３】  変異体の穀粒およびある種の遺伝的背景への交雑から生じる穀粒は、βグルカンのレベルが増大している。本発明者らは、βグルカンレベルの増大と高食物繊維に寄与する難消化性デンプンとの組合わせは、本発明の特色であると考えている。
【００１４】  さらに、少なくともいくつかの遺伝的背景において、そのような変異体由来の穀粒は、高い相対レベルのアミロースを有し、かつ低ゼラチン化温度を有するデンプンを含有することが見出されている。ゼラチン化中および後のそのようなデンプンの低膨潤性はまた、ある種の規定食および食品加工用途において有利である。
【００１５】  さらに、そのような変異体由来の穀粒は、高い相対レベルのアミロースを有するデンプンを含有することが見出され、このアミロースレベルは、デンプン含有量の５０％より高い。このようなレベルは、オオムギ由来の改変されていないデンプンにおいて従来見出されていなかったものである。
【００１６】  変異体および変異体由来の戻し交雑株（戻し交雑が試験されていることを限度として）のデンプンは、難消化性デンプンを示し、その構造の改変は、高い相対アミロース含有量、高β−グルカン含有量であることにより物理的に接近不能であること、顆粒形態の改変、および脂質会合デンプンの存在を含む群のうちの１つまたはそれ以上を含む特定の物理的特性によって示され、また、この構造の改変は、低結晶性、低アミロペクチン鎖長分布および検出可能な脂質会合デンプンの存在を含む群のうちの一つまたはそれ以上から選択される特性によって示される。
【００１７】  さらに、これまでのところ、変異オオムギ植物由来の穀粒は、食品加工工程に容易に使用することができる。
【００１８】  本発明の一態様は、オオムギ植物の穀粒から得られるデンプンにあると言うことができ、このオオムギ植物はＳＳＩＩ活性のレベルが低下しており、前記デンプン顆粒は、アミロペクチン含有量が低下しているために高アミロース含有量を示す。
【００１９】  本発明のもう一つの態様は、オオムギ植物から得られる食品に有用な穀粒にあると概ね言うことができ、このオオムギ植物はＳＳＩＩ活性のレベルが低下しており、前記デンプン顆粒は、アミロペクチン含有量が低下しているために高アミロース含有量を示す。
【００２０】  さらに、他の態様において、本発明は、ＳＳＩＩ活性が低下したオオムギ植物にあると概ね言うことができ、前記オオムギ植物は穀粒を有することが可能であり、前記穀粒のデンプンは、アミロペクチン含有量が低下しているために高アミロース含有量を示し、前記穀粒は食品に適切である。
【００２１】  あるいは、本発明は、オオムギＳＳＩＩタンパク質をコードする単離された核酸分子、ストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１に示されたものとハイブリダイズすることが可能な前記核酸、または前記核酸分子を担持する複製可能な組換えベクターを担持する細胞にあるといえる。さらなる態様において、本発明は、配列表の配列番号１に示されたものに特異的にハイブリダイズすることが可能な単離された核酸分子であってもよい。
【００２２】  よりよい理解のために、多くの実施例を参考にして本発明を説明することにする。
【００２３】発明の詳細な説明
定義
グリセミック指数は、血中グルコース濃度の変動に対する白パンおよびグルコースなどの試験食物の効果の比較である。グリセミック指数は、食後の血清グルコース濃度に関する食物の予想される効果および血中グルコースホメオスタシスのためのインシュリンに対する要求の指標となり得る。
【００２４】  難消化性デンプン。健康なヒトの小腸では吸収されずに大腸に進入するデンプンおよびデンプンの消化産物の合計。従って、難消化性デンプンは、消化され、小腸で吸収される産物を含まない。
【００２５】  難消化性デンプンは４つのグループに分類することができる。
ＲＳ１  物理的に接近不能なデンプン。このデンプンの形態の例は、デンプンがタンパク質または同様なマトリックス内かもしくは植物細胞壁内に補足される場合に生じ、または穀粒の粉砕が部分的であるかもしくは冷却後の豆果中にあるために生じ得る。
ＲＳ２  難消化性顆粒。これらは、一般に、生ポテトまたは青いバナナから生じるデンプンなどの生のデンプン、いくつかの豆果および高アミロースデンプンである。
ＲＳ３  老化デンプン。これらは、デンプンまたはデンプン食物の熱／蒸気処理によって生じ、調理され冷えたポテト、パンおよびコーンフレークにおいて認められる。
ＲＳ４  化学修飾されたもの。これらは、置換または架橋などの化学修飾により生じる。この形態のデンプンは、しばしば加工食品において使用される。
【００２６】  食物繊維は、本明細書では、健康なヒトの小腸では吸収されずに大腸に進入する炭水化物または炭水化物消化産物の合計である。これには、難消化性デンプン、β−グルカンおよび他の可溶性および難溶性炭水化物高分子が含まれる。大腸内において住み付いている微生物によって、少なくとも部分的に発酵可能である一部の炭水化物を含むことが意図される。
【００２７】  ゼラチン化は、顆粒の膨潤、微結晶融解、複屈折の消失、粘度の上昇ならびにデンプンの可溶化などの特性の同時および非可逆的変化を伴うデンプン顆粒内での分子オーダーの崩壊（破壊）である。
【００２８】  本発明は、ＳＳＩＩ変異オオムギ植物の単離および特性化から生じ、その穀粒は、アミロペクチン含有量の低下とそれによる高い相対レベルのアミロースを示し、従って食物繊維のレベルが増大したデンプンを含有することを見出している。
【００２９】  そのような変異体は、多くの極めて望ましい特性を有することが見出されており、他の様々な遺伝的背景への交雑は、これらの少なくともいくつかの特性を維持することが明らかにされている。
【００３０】  変異体の穀粒および特定の遺伝的背景への交雑由来の穀粒は、さらに、βグルカンのレベルが増大している。本発明者らは、βグルカンレベルの増大と高食物繊維との組合わせは本発明の特色であると考えている。
【００３１】  さらに、少なくともいくつかの遺伝的背景において、そのような変異体由来の穀粒は、高い相対レベルのアミロースを有し、かつ低ゼラチン化温度を示すことが見出されていることが明らかにされている。そのようなデンプンのゼラチン化の膨潤特性はまた、低膨潤性であるという利点を有し、そのことはある種の食物および食品加工用途において有益である。
【００３２】  さらに、そのような変異体由来の穀粒は、高い相対レベルのアミロースを有するデンプンを含有することが見出され、このアミロースレベルは、デンプン含有量の５０％より高い。このようなレベルは、オオムギ由来の改変されていないデンプンにおいて従来見出されていなかったものである。
【００３３】  変異体および変異体由来の戻し交雑株（戻し交雑が試験されていることを限度として）のデンプンは、難消化性デンプンを示し、その構造の改変は、高い相対アミロース含有量、高β−グルカン含有量であることにより物理的に接近不能であること、顆粒形態の改変、および脂質会合デンプンの存在を含む群のうちの１つまたはそれ以上を含む特定の物理的特性によって示され、また、この構造の改変は、低結晶性、低アミロペクチン鎖長分布および検出可能な脂質会合デンプンの存在を含む群のうちの一つまたはそれ以上から選択される特性によって示される。
【００３４】  さらに、これまでのところ、変異オオムギ植物由来の穀粒は、食品加工工程に容易に使用することができる。
【００３５】  そのような変異体由来の穀粒の一形態は、好ましくは、高い相対レベルの食物繊維、より詳細にはアミロースおよび高いレベルのβグルカンを有するデンプンを含有する。本発明者らは、βグルカンレベルの増大と高アミロースレベルとの組合わせは、本発明の特色であると考えており、少なくとも本発明のより広範な形態において、βグルカンと可溶性食物繊維とを共に混合することかまたは構成成分の改変を必要としないβ−グルカンと難消化性デンプンとの組合わせによる独自の供給源を提供する。
【００３６】  本発明者らが知る限りにおいて、本発明のオオムギ植物は、アミロースレベルが増大した難消化性デンプンの形態中で相対食物繊維レベルが増大したオオムギ穀粒であって、かつ、βグルカンの典型的なレベルの上限かまたはそのレベルを超える高いレベルに増大したβグルカンを有する上記穀粒が存在することをはじめて示すものである。さらに高いβグルカン含有量を有する穀粒は、モチ性表現型であり、従って、低レベルのアミロースを有する。
【００３７】  オオムギにおけるβーグルカンレベルはオオムギ重量の約４重量％〜約８重量％の範囲で幅広く変化するが、より典型的には４％〜約８％であることが知られている（Ｉｚｙｄｏｒｃｙｋら、（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８，９８２−９８９；Ｚｈｅｎｇら、（２０００）Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７，１４０−１４４；Ｅｌｆｖｅｒｓｏｎら、（１９９９）Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６，４３４−４３８；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ７９，９７９−９８６；Ｏｓｃａｒｓｓｏｎら、（１９９６）Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４，１６１−１７０；Ｆａｓｔｎａｕｇｈｔら、（１９９６）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６，９４１−９４６）。改良されたオオムギ株が開発されており、例えば、プロワショヌパナ（Ｐｒｏｗａｓｈｏｎｕｐａｎａ）は、約１５重量％〜１８重量％のβ−グルカンを有するが、モチ性表現型を有する。これは、ＳｕｓｔａｇｒａｉｎＴＭの名称で市販されている（ＣｏｎＡｇｒａＴＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｇｒａｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｏｍａｈａ，Ｎｅｂ．  ＵＳＡ）。
【００３８】  本発明が意図するβグルカンのレベルは、アミロペクチン合成酵素活性が減少する遺伝的背景に依存するだろう。しかし、アミロペクチン合成活性の減少は、部分的にアミロースの形態を取る食物繊維の相対レベルを上昇させ、同時にβグルカンのレベルを上昇させる効果を有することが提唱されている。相対アミロースレベルとβグルカンとが同時に上昇することに対する１つの説明は、そのような上昇が内乳を減少させる濃度効果の結果であり、デンプン合成からβグルカン合成への炭素の転換によってさらに強められるであろうことである。
【００３９】  従って、オオムギの穀粒は、好ましくは、外皮を有さない穀粒（non-hulled grain）の全重量の６％を超えるか、またはより好ましくは７％を超え、最も好ましくは８％を超えるβグルカン含有量を示す。モチ性変異体のβグルカンのレベルは、１５〜１８％という高い値が測定されるが、本発明はそれと同じかまたはそれより高いレベルを意図することができる。
【００４０】  第２の好適な形態では、オオムギ植物の穀粒は、相対的に高いアミロース含有量に加えて、ゼラチン化温度（示差走査熱量測定によって測定される）の低下を示す。例示したオオムギについて示されたデータにおいて、このゼラチン化温度の低下は、若干高いアミロース含有量を有するオオムギから産生されるデンプンと比較した場合だけではなく、通常のレベルのアミロースを有するデンプンを有するオオムギ由来のデンプンと比較した場合よりも低い。従って、本発明は、対応する高アミロースデンプンに比較してのゼラチン化温度の低下を意図する一方、通常のアミロースレベルを有するデンプンのゼラチン化温度に比較しても低いゼラチン化温度を意図することもできる。
【００４１】  さらに、これまで確認された遺伝的背景において、このデンプンはまた、加熱した過剰の水中において、試験した他のデンプンの膨潤よりも低い膨潤を示すことを特徴とする。
【００４２】  第３の好適な形態では、デンプンは、アミロースレベルがデンプン含有量の５０％より高い。このようなレベルは、オオムギ由来の改変されていないデンプンにおいて従来見出されていなかったものである。
【００４３】  本発明のオオムギ植物のデンプンは、高い相対アミロース含有量を有し、ＳＳＩＩ遺伝子または他のデンプンシンターゼ遺伝子に変異があることが大いに予想され得る。従って、コムギでは、ＳＳＩＩの変異体は相対アミロースレベルがデンプンの約３５％となる。デンプン中のアミロース含有量が、通常のオオムギ穀粒に存在している２５％程度よりも有意に高く、従って全デンプンの約３０％（ｗ／ｗ）を超える場合、デンプンのアミロース含有量は増大しているとみなすことができる。高アミロースであるとみなされる既知のオオムギ植物は、３５〜４５％の含有量を示す。しかし、本発明は、オオムギ由来の改変されていないデンプンにおいて従来見出されていないレベルである、５０％より高いアミロース含有量を示すオオムギを提供する。
【００４４】  相対アミロース含有量は６０％を超え、より好ましくは７０％を超えてもよい。この含有量はより高いレベルであることが望ましく、従って、単一の変異で育種することによって、他の植物においてより高いレベル、例えば９０％に達するようなレベルを達成することが可能である。従って、本発明は、８０％または９０％を超えるアミロースレベルを包含するであろう。
【００４５】  第４の好適な形態では、デンプンはまた、難消化性デンプンを増加させる改変された構造を有する。このことは、高いアミロース含有量から生じるのであろう。難消化性デンプンはまた、おそらくβ−グルカンが高いレベルで存在し、βグルカンとデンプン顆粒との会合によって保護効果を発揮するために生じるであろう。会合が緊密であることは、デンプンの保護効果を潜在的に提供し、それゆえ、消化が若干困難であるＲＳ１型として特性化される難消化性を提供する。同様に、Ｖ−複合結晶（V-complex crystallinity）によって検出されるデンプン−脂質会合の存在も、おそらく難消化性デンプンのレベルに寄与する。この場合、難消化性は、おそらく脂質の存在によりデンプンが物理的に接近不能になるために生じ、従って、これは、ＲＳ１デンプンと認識することができる。Ｖ−複合形状を取る老化デンプンは消化に対して高度に抵抗性であることが既知であり、従って、Ｖ−複合結晶性構造の一部を形成するアミロペクチンも消化に対して抵抗性であることが予想される。例示したオオムギ植物のデンプンは、デンプン顆粒の構造のために消化に対して抵抗性であり、従って、ＲＳ２デンプンであるだろう。これらの特徴のそれぞれは、個別かまたはこれらの特徴の２つ以上の組合わせとして存在してもよい。
【００４６】  増加した食物繊維は、少なくとも部分的に、上記したようなデンプン顆粒の高アミロース含有量によって特性化される難消化性デンプンの形態を取るだろう。
【００４７】  相対アミロース含有量は６０％を超え、より好ましくは７０％を超えてもよい。この含有量はより高いレベルであることが望ましく、従って、単一の変異で育種することによって、他の植物においてより高いレベル、例えば９０％に達するようなレベルを達成することが可能である。従って、本発明は、８０％または９０％を超えるアミロースレベルを包含するであろう。
【００４８】  オオムギ植物は、１つ以上のアミロース合成酵素または他の酵素の改変されたレベルの活性がさらに発現されることにより、アミロースの相対レベルがさらに増強されることが望まれるだろう。従って、オオムギ植物は、アミロペクチンの生合成をさらに減少もしくは改変するもう１つの変異か、またはアミロース生合成を増加する変異もしくは遺伝的背景を担持してもよい。例えば、オオムギ植物は、ａｍｏ１変異を担持するオオムギ植物などの高アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）遺伝子型を示してもよい。そのような植物の例には、ＡＣ３８（ハイアミロースグレーシャー（Ｈｉｇｈ  Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｇｌａｃｉｅｒ）としても公知である）として知られている亜種がある。
【００４９】  上記のアミロースの相対レベルは全デンプン含有量に対するものであり、従って、残りのデンプンは主に中間型のデンプンであってもよく、または主にアミロペクチンもしくは両方の混合物であってもよいことが理解されるであろう。分析したオオムギにおいて、アミロースのレベルの増大は、アミロペクチンレベルの低下から生じ、従って、アミロースの相対レベルは、アミロース合成の増大に由来するものではない。
【００５０】  βグルカンは、単に他の食物成分と共に存在する場合、小腸における消化を遅延させる効果を有することは公知である。同様に、デンプン顆粒に接近して並列する難消化性分子はデンプンを遮蔽し、デンプンを物理的に接近不能にすることによってその難消化性に寄与することが公知である。アミロースおよび脂質との会合から生じる他の形態のデンプンのレベルの増大は、それゆえ、その存在およびデンプン顆粒との物理的並列によってさらに増強されるだろう。従って、難消化性デンプンの効果が有意に増強され、同様に高βグルカンレベルによる他の有益な効果が生じる。
【００５１】  さらに、難消化性デンプンおよびβグルカンの有益な効果という点で用量反応（dose response）が存在することが公知である。従って、難消化性デンプンのレベルの増大と合わせてβグルカンのレベルが増大することにより、健康上の有益性を増大することが提示される。
【００５２】  本発明の少なくとも好ましい形態のβグルカンおよび難消化性デンプンのレベルの組合わせは、何らかの改変および精製を伴わない１つの供給源からは、以前には全く見出されていない。したがって、本発明の形態は、これらの有益性の唯一の実用的な供給源を提供する。
【００５３】  このデンプンのもう１つの好ましい態様は、高い相対アミロース含有量にもかかわらず、示差走査熱量測定で測定される低ゼラチン化温度を示すことである。このことは、高アミロースデンプンが、高アミロースデンプンを利用することができる方法に制限を加えるゼラチン化温度の上昇を引き起こす傾向があるという一般的知見とは対照的である。例示したオオムギについて示されたデータにおいて、このゼラチン化温度の低下は、若干高いアミロース含有量を有する系統から産生されるデンプンと比較した場合だけではなく、通常のレベルのアミロースを有するデンプンを有するオオムギ由来のデンプンと比較した場合よりも低い。従って、本発明の好適な態様は、対応する高アミロースデンプンに比較して低ゼラチン化温度を意図する一方、通常のアミロースレベルを有するデンプンのゼラチン化温度に比較しても低いゼラチン化温度を意図することができる。高アミロースデンプンでは、加工のためにより高い温度が必要とされ、従って、高価であり、かつ他の食物成分の機能性を破壊する可能性のあるより高いエネルギーの入力を本質的に必要とする。同様に、最終消費者の見地から、高アミロースデンプン食品は、調理のためにより高温または長い時間が要求されるため、不便であるだろう。従って、例えば、本発明のこの好適な形態では、カップなどの容器に沸騰水または熱湯を加えることが必要であり、長期間加熱する必要はない麺製品などの製品を提供し、同時に大腸に難消化性デンプンおよび栄養価値のある他の成分を送達することが今や可能である。
【００５４】  これらのデンプンの低ゼラチン化温度の主な効果は、より低い温度要求性であり、従って、食物のより低い粉砕エネルギー要求性である。必然の結果として、室温で混合を行い、次いでこの混合物を加熱するというある種の食品加工工程に典型的なケースにおいても、より低いゼラチン化温度によりゼラチン化を達成するのに必要な時間も減少するだろう。さらに、通常のデンプンの完全ゼラチン化の温度よりも低い温度範囲で、本発明のデンプンは通常のデンプンよりも完全にゼラチン化するだろう。
【００５５】  ゼラチン化能の１つの測定は、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）により測定される熱特性に反映される。ＤＳＣの第１のピーク（ゼラチン化ピーク）の開始（onset）は、５３℃未満、より好ましくは５０℃未満および最も好ましくは約４７℃未満であってもよい。第１のピークの開始は、ゼラチン化の開始と認識することができる。オオムギ穀粒から産生されるデンプンは、約６０℃未満、より好ましくは５５℃未満および最も好ましくは５２℃未満で第１のピークを有してもよい。第１のピークのΔＨ（エンタルピー）は、約３．５未満、より好ましくは約１．０未満および最も好ましくは約０．５未満であってもよい。
【００５６】  本発明のデンプンを含有する粉のゼラチン化に関するもう１つの知見は、それらが低膨潤性を示すことである。膨潤体積は、一般的に、デンプンまたは粉のいずれかと過剰の水とを混合し、高温、一般的に９０℃を超えるまで加熱することによって測定する。次いで、サンプルを遠心分離によって回収し、膨潤体積は、沈降した物質の質量をサンプルの乾燥重量で割った値で表す。モチ性および通常のオオムギのデンプン由来の粉の膨潤体積は、約５．５を超えることが見出されている。高アミロース穀粒である穀粒（ＡＣ３８）から作製される粉の膨潤体積は約３．７５である。試験した変異体および交雑種の穀粒は３．２未満、好ましくは３．０未満であるが、一般に約２を超える。
【００５７】  この低い膨潤ゼラチン化特性は、食品の調理物、特に水和した食品の調理物のデンプン含有量を増加することが所望される場合に有用である。現段階においては、食品調理物の送達に制限があるゾルまたは他の液体調製物の食物繊維含有量を増加させることが望まれるかもしれない。
【００５８】  この特性は、本発明のデンプンによって示されるゼラチン化温度の低下と組み合わせて、インスタントスープおよびインスタント麺などの迅速な調理が要求される食物の栄養学的な利益を顕著に増大することが期待される。
【００５９】  ゼラチン化温度の効果は、穀粒の内乳におけるアミロペクチン構造の改変の結果であることを前提としており、この構造の１つの測定法は、イソアミラーゼによる脱分枝後のデンプン分子の鎖長（重合度）分布である。例示したＳＳＩＩ変異体のデンプンのアミロペクチン含有物の鎖長の分析により、脱分枝された場合、それらは、脱分枝された非変異系統から得られるデンプンの分布より短い５〜６０の範囲の鎖長分布を有することが示された。より短い鎖長を有するデンプンはまた、脱分枝の頻度もそれだけ増加する。従って、このデンプンはまた、より短いアミロペクチン鎖長の分布をも有してもよい。６〜１１残基の範囲にある重合度を有するデンプン鎖の割合は、２５％を超え、より好ましくは３０％を超え、最も好ましくは３５％を超えてもよい。１２〜３０残基の範囲にある重合度を有するデンプン鎖の割合は、６５％未満、より好ましくは６０％未満、最も好ましくは５５％未満でもよい。３１〜６０残基の範囲にある重合度を有するデンプン鎖の割合は、約１０％未満、より好ましくは約８％未満かつ好ましくは約５％を超え、より好ましくは約６％を超えてもよい。個々のものとしてみるよりは、３つの鎖長範囲の割合の組み合わせをもって、デンプンが本発明に一致するタイプのデンプンであることの指標と見ることができる。
【００６０】  鎖長分布の減少は、より低いゼラチン化温度を導くだろう。鎖長の低下はまた、特に口あたりにおけるデンプンの官能特性（organoleptic properties）を向上すると思われ、従って、おそらく滑らかな製品に寄与している。さらに、アミロペクチン鎖長の低下がアミロペクチン分解の程度を減少することを前提としており、これは、食物の品質に影響し、例えば、パンの劣化に重要であると思われる。
【００６１】  例示したデンプンのデンプン構造は、さらに、オオムギから単離された通常のデンプンと比較して結晶化度が低下しているという点で異なることが明らかにされている。アミロペクチン鎖長分布の低下と組み合わせた場合、顆粒の結晶性の低下はゼラチン温度が低くなるであろうことを示し得る。デンプンの結晶性の低下はまた、官能特性（organoleptic properties）の向上に関連すると思われ、例えば、よりアミロペクチン鎖長が短いほどより滑らかな口あたりに寄与する。従って、デンプンはさらに、１つ以上のアミロペクチン合成酵素の活性レベルの低下から生じる低結晶性を示すだろう。結晶性を示すデンプンの割合は、約２０％未満、好ましくは約１５％未満であってもよい。
【００６２】  本発明の特性のさらなる測定は、粘度の測定である。ラピッドビスコアナライザー（Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｓｅｒ）を使用して、本発明のデンプンの最高粘度は、通常およびモチ性デンプンならびにオオムギから得られる高アミロースデンプンの最高粘度とは有意に異なることが見出された。これらの測定は全麦に対して行われたが、デンプンの特性は、これらの測定を支配するだろう。通常の、およびモチ性のデンプンは約９００〜約５００ＲＶＡ単位（RVA units）の最高粘度を有し、既知の高アミロースデンプンは２００を超える最高粘度を有する一方、本発明のオオムギ植物は１００未満の最高粘度を有し、大部分は約５０未満であり、いくつかの植物においては１０ＲＶＡ単位と低かった。当業者であれば、実験単位として引用したパラメータおよび引用した結果は、ＲＶＡ装置またはアミログラフなどの類似の装置におけるこれらのデンプンの相対的性能を示すためのものであると理解するだろう。
【００６３】  上記の結晶性の低下に加えて、本発明のデンプンは、デンプンのＶ−複合型の存在を特徴とすることができる。本発明者らは、デンプンのこの形態が、穀粒のデンプン顆粒において検出可能な量で示されるのは初めてであると考えている。デンプンのこの形態は、通常、老化デンプンと関連し、特にそこでは、脂質との接触が存在する。本発明の場合、デンプンの構造は、植物脂質とデンプンとの間の緊密な関係の形成を可能にするものであり、その結果としてＶ−複合構造が生じる。デンプンのこの形態は、消化性を低下させ、従って、難消化性デンプンに寄与し得るため、健康上の利益を有するであろうと考えられる。
【００６４】  構造の他の形態もまた、脂質−デンプン相互作用から生じ、非結晶性の脂質−デンプン複合体を含むことができる。従って、本発明は、１つ以上のアミロペクチン合成酵素の活性のレベルの低下から生じる穀粒の内乳のデンプン含有物において検出可能な量のデンプン−脂質複合体を示すオオムギ植物にあるということもできる。デンプン−脂質複合体を含むデンプンは、それはＶ−複合構造を示すデンプンを含むが、通常消化に対して抵抗性であり、従って、食物繊維レベルに寄与する。おそらく、デンプン−脂質複合体に特徴的な結晶性形状を示す結晶性デンプンの割合は、約５０％を超え、より好ましくは約８０％を超える。
【００６５】  このデンプンではまた、Ｖ−複合型のデンプンの存在に加えて、検出可能な量のＡ複合型のデンプンを示さない。Ａ−複合が不在であることは、本発明のデンプンの存在の指標とみなすことができる。
【００６６】  さらに、本発明の穀粒由来のデンプンおよび本発明の穀粒から作製される製品の糊化温度はかなり上昇することが見出されている。既知のデンプンの糊化温度は７０℃未満であり、これは、通常および高アミロースデンプンの両方についていえる。しかし、本発明のデンプンは、好ましくは、約７５℃を超えるかまたはより好ましくは約８０℃を超える糊化温度を示す。これは実験的な測定値であり、他のデンプンについてのそれらの測定値に対する比較として解釈できることに留意されたい。
【００６７】  例示したオオムギ植物のデンプンは、有意な量の食物繊維および難消化性デンプンを有することが見出されており、おそらくこの増加は、少なくとも部分的には高い相対レベルのアミロースによるものであるが、しかし、Ｖ−複合を含むデンプン／脂質複合による食物繊維も寄与しているだろうし、あるいは、アミロースもしくはアミロペクチンとβグルカンとの緊密な会合によるものであろう。同様に、単にβグルカンのレベルの増大は食物繊維の有意な増大に寄与しているであろう。
【００６８】  例示したオオムギ植物の内乳における高い相対アミロースレベルは、おそらく、ＳＳＩＩ酵素の活性のレベルの減少の結果として改変されたアミロペクチン産生から生じる。
【００６９】  この酵素をコードする遺伝子の変異は、アミロース含有量の増大および／またはアミロペクチンのレベルの減少を示すと予想される。ただアミロペクチン合成のみが減少し、デンプンはアミロースの相対レベルの増大を示す。
【００７０】  アミロペクチン合成酵素の活性の低下は、それぞれの遺伝子またはこの遺伝子の調節塩基配列内の適切な変異によって達成されるだろう。遺伝子が阻害される程度は、作製されるデンプンの特性をある程度決定する。ＳＳＩＩ変異である例示した本発明の変異は短縮型変異であり、これらは、デンプンの性質に重要な影響を及ぼすことが公知であるが、しかし、改変されたアミロペクチン構造はまた、オオムギのデンプンまたは穀粒における目的の特性を提供するためにアミロペクチン合成酵素を有意に減少する漏出変異体から生じる。他の染色体再配列も有効であり得、これらには、欠失、逆位、重複または点変異が含まれてもよい。
【００７１】  そのような変異は、目的の変種を変異誘導することによって、より確実には変異体と所望の遺伝的背景の植物とを交雑し、適切な数の戻し交雑を実施して、本来所望しない親背景を削除することによって、所望の遺伝的背景に導入することができる。変異の単離は、変異誘導した植物をスクリーニングすることによって達成されるだろう。
【００７２】  分子生物学的アプローチは、従来の方法に対する代替的方法とみなすことができる。ＳＳＩＩの配列は、本明細書に示されている。所望の変異および選択マーカーを担持するベクターは、組織培養植物か、またはプロトプラストなどの適切な植物系に導入することができるだろう。変異が染色体に組込まれ、現存の野生型対立遺伝子が置き換えられている植物は、例えば、変異および表現型の観察に適切な核酸プローブを使用することによって、スクリーニングすることができる。オオムギなどの単子葉植物の形質転換およびプロトプラストまたは未成熟植物胚からの植物の再生方法については、当該分野において周知であり、例えば、Ｎｅｈｒａによるカナダ特許出願第２０９２５８８号、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａによるオーストラリア特許出願第６１７８１／９４号、Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｃ．によるオーストラリア特許第６６７９３９号、Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１、米国特許第５５８９６１７号に見ることができる。また、他の方法が特許明細書ＷＯ９９／１４３１４に記されている。
【００７３】  変異を使用する以外に、アミロペクチン合成酵素の活性を改変するための他の公知のアプローチを適応してもよい。従って、これは、例えば、アミロペクチン合成酵素をコードする遺伝子（単数または複数）の転写またはプロセシングを阻害する適切なアンチセンス分子の発現によって可能である。これらは、オオムギＳＳＩＩ遺伝子について本明細書において解明されたＤＮＡ配列を基礎とすることができる。これらのアンチセンス配列は、構造遺伝子かまたは遺伝子発現もしくはスプライシング事象の制御に影響を及ぼす配列に対するものであってもよい。これらの配列については上記で言及している。アンチセンス配列を考案する方法は当該分野において周知であり、これらの例は、例えば、米国特許第５１９０１３１号、欧州特許明細書第０４６７３４９  ＡＩ号、欧州特許第０２２３３９９  ＡＩ号および欧州特許第０２４０２０８号において見出すことができ、上記文献は、アンチセンス技術を行うための方法を提供する目的で本明細書において参考として援用される。そのような配列を植物において導入しおよび維持するための方法についても公開されており、公知である。
【００７４】  アンチセンス技術のバリエーションはリボザイムを利用することである。リボザイムは、アンチセンスによって規定される特異的部位で他のＲＮＡ分子を切断することができる酵素的機能を有するＲＮＡ分子である。ＲＮＡの切断は、標的遺伝子の発現を阻止する。参考として欧州特許明細書第０３２１２０１号および明細書ＷＯ  ９７／４５５４５が挙げられる。
【００７５】  使用することができるもう１つの分子生物学的アプローチは、コサプレッション（cosuppression）のアプローチである。コサプレッションの機構についてはあまり理解されていないが、この機構は、植物に通常の方向で過剰コピーの遺伝子を配置することと関係する。例えば、付加された遺伝子のコピーは、標的植物の遺伝子の発現を阻害する。コサプレッションのアプローチを実行するための方法の参考として特許明細書ＷＯ  ９７／２０９３６および欧州特許明細書第０４６５５７２号が挙げられる。
【００７６】  ＤＮＡ配列を使用して用いることができるさらなる方法は、二重または二本鎖ＲＮＡ仲介遺伝子抑圧（duplex or double stranded RNA mediated gene suppression）である。この方法では、二本鎖ＲＮＡ産物の合成を指令するＤＮＡを使用する。二本鎖分子の存在は、二本鎖ＲＮＡ、さらには標的植物遺伝子由来のＲＮＡの両方を破壊する植物の防御システムからの応答を誘発し、標的遺伝子の活性を効率的に減少または排除する。この技術を実行するための方法の参考として豪州特許明細書９９／２９２５１４−Ａおよび特許明細書ＷＯ  ９９／５３０５０が挙げられる。
【００７７】  本発明は、分子生物学的アプローチを使用して、２つ以上の上記遺伝子の活性のレベルを減少させることにより生まれることが理解されよう。
【００７８】  特に高アミロースおよび高βグルカン含有量の結果として予想され得る１つの重要な生成物は、低いグリセミック指数を有する低カロリー生成物である。低カロリー生成物は、粉砕された穀物から生成される粉を含有することに基づく。しかし、まず穀粒を精白して、おそらく穀粒の１０重量％または２０重量％を取り除き、それによってアリューロン層を取り除き、さらに除去することによって胚をも取り除くことが望まれ得る。精白工程の効果は、脂質含有量を減少し、それにより食物のカロリー値を減少することである。そのような食物は、腸の健康を充足し、増強し、食後の血清グルコースおよび脂質濃度を減少し、ならびに低カロリー食品を提供する効果を有するだろう。精白生産物を使用すれば、アリューロン層および胚から提供される栄養学上の利益が減少する。精白生産物から生成される粉は、おそらく、そのように作製される生産物がより白化する傾向があるため、外観が良くなるだろう。
【００７９】  本発明の態様は、アリューロン層と胚との組合わせにさらに高レベルの食物繊維が組合わせられたものからも生じる。具体的には、これは、例示した穀粒にアリューロン層または胚が若干高い相対レベルで存在していることから生じる。第１に、オオムギは、他の市販の穀粒よりも有意に高いアリューロン層を有し、これは３つの細胞アリューロン層を有する結果である。第２に、例示したオオムギも皺形（shrunken）であり、このことは内乳が低い量で存在することを意味し、その必然的な結果として、アリューロン層および胚が高い相対量で存在する。従って、オオムギは、難消化性デンプン送達系における組合わせにおいて比較的高いレベルの特定の有益な要素またはビタミンを有し、この要素は、生体利用可能なＣａ＋＋などの２価のカチオンならびに葉酸などのビタミンまたはトコフェロールおよびトコトリエノールなどの抗酸化剤を含む。従って、カルシウムは、骨および他の石灰化組織の成長および沈着のための材料の提供ならびに生涯の後半における骨粗鬆症の危険性を低下させることが認められている。葉酸は妊娠前から妊娠早期まで（periconceptually）に摂取していると神経管欠損症を予防すること、循環器系疾患の危険性を減少することが見出されており、それゆえに、難消化性デンプンおよびβ−グルカンの組合わせの効果を増強する。葉酸はまた、特定の癌の危険性を低下する効果を有すると考えられている。トコフェロールおよびトコトリエノールは、抗酸化剤としての利点を持ち、癌および心臓疾患の危険性を低下させると考えられており、かつ酸敗を生じる脂肪酸などの食物の成分の酸化の望ましくない効果を減少する効果も有する。この場合、オオムギ穀粒またはそれから作製される製品のこの好適なこれらの成分は、１つの穀粒による簡便なパッキングを構成する。粉砕生成物の１つの具体的な形態は、粉砕生成物中にアリューロン層が含まれるものである。ある種の粉砕過程は、粉砕生成物中のアリューロン層の量を増強すると評価されるだろう。そのような方法はＦｅｎｅｃｈら、（（１９９９）Ｊ  Ｎｕｔｒ  １２９：１１１４−１１１９）において言及されている。従って、アリューロン層および胚を含むように粉砕または他の加工を施された穀粒に由来するいずれの製品も、個別の供給源からこれらの要素を添加する必要性を伴うことなく、さらなる栄養学上の利点を有するだろう。
【００８０】  本発明のオオムギ植物は、好ましくは食物生産、特に商業用食物生産に有用な穀粒を有するオオムギ植物であることが理解されよう。そのような生産は、商業用食物生産の材料であり得る粉または他の生産物の作製を含み得る。有用なデンプン含有量の下限値は、約１２％を超えるかまたは約１５％を超えるだろう。あるいは、同様に、そのような生産は、穀粒を粉砕する可能性を含み得る。従って、精白されたオオムギは、ほとんどの穀粒から生成され得るが、ある種の形状の穀粒は粉砕に対して特に抵抗性である。商業的に使用可能な穀粒を産生する変種に影響を及ぼし得るもう１つの特性は、生成される生成物の脱色である。従って、穀粒の包皮または他の部分が顕著な彩色（例えば、紫色）を示す場合、この彩色が製品上に表れ、商業的用途を、例えば、色彩を有する全粒穀物または粗挽きされた穀粒を含有するパンの成分にするなどの特定の用途に限定する。また、オオムギ穀粒上の包皮の存在は、穀粒の加工をより困難にするため、オオムギ植物は裸性である方が、一般的により簡便である。より価値のあるオオムギ植物を作製し得るもう１つの態様は、穀粒由来のデンプン抽出物に基づくものであり、抽出比率が高いほど有用である。穀粒の形状も植物の商業的有用性に影響を及ぼし得るもう１つの特性であり、従って、穀粒の形状は、穀粒粉砕の容易さその他に影響を及ぼし、従って、例えば、ＭＫ６８２７植物のオオムギ穀粒は、通常、粉砕および加工が困難である極めて狭長な穀粒形態を有する。この狭長な形状および使用可能性の簡便な指標は、２つの形態的特性である穀粒の長さと穀粒の厚さの比率（Ｌ／Ｔ比）である。この比率は、しばしば、デンプンの性質によって決定される。本発明者らは、ＭＫ６８２７が６を超えるＬ／Ｔ比を有することを見出した。このようにしてスクリーニングされた変異ＳＳＩＩ遺伝子を担持するオオムギ植物は、約４〜約５の範囲のＬ／Ｔ比を有するが、この比はより大きな範囲に拡大し、そしてなお有用（おそらく約５．８未満または少なくとも５．５では）であることが予想される。
【００８１】  望ましい遺伝的背景には、商業的収量に関する配慮および他の特性が含まれるだろう。そのような特性は、オオムギが冬または春型であること、芳香性、耐病性および非生物的ストレス耐性（abiotic stress resistance）を望むかどうかという問題を含む。豪州では、スループ（Ｓｌｏｏｐ）、スクーナー（Ｓｃｈｏｏｎｅｒ）、チェベック（Ｃｈｅｂｅｃ）、フランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ）、アラピレス（Ａｒａｐｉｌｅｓ）、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）、ガレオン（Ｇａｌｌｅｏｎ）、ガードナー（Ｇａｉｒｄｎｅｒ）またはピコラ（Ｐｉｃｏｌａ）などのオオムギ品種への交雑を所望することができる。上記の例は、豪州生産地域に固有のものであるが、他の変種も他の栽培地域に適切であろう。
【００８２】  より高い収量の達成という観点からは、より充填された穀粒（a fuller grain）が望ましく、本発明のある種の有益性、例えば、高レベルのアミロースまたは改変された鎖長分布を有する代替的なデンプンの生産を達成することができる。しかし、本発明の他の態様は、あまり充填されていない穀粒によってより良好に達成することができる。従って、アリューロン層または胚のデンプンに対する割合は、あまり充填されていない穀粒においてより高く、それによってアリューロン層の有益な構成分がより高いオオムギ粉または他の生産物が提供される。従って、高アリューロン層生成物は、葉酸などの特定のビタミンがより高く、またはカルシウムなどのある種のミネラルがより高く、より高い難消化性デンプンレベルおよび／またはより高いβグルカンレベルと組み合わされたこの生産物は、大腸におけるミネラルの吸収を増大させるなどの相乗効果を提供することができる。
【００８３】  アミロースの量を最大にするために、オオムギ植物が、１つ以上のアミロペクチン合成酵素の活性の低下に加えて、他の表現型特性をも有することが望ましい。従って、遺伝的背景は、例えば、ＡＣ３８のａｍｏ１変異（原因遺伝子は不明）およびモチ変異（例えば、ワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）変種において見出される）に対する高アミロース表現型をさらに含んでもよい。さらに、原因遺伝子が不明な皺形（shrunken）内乳を有する利用可能な他のオオムギ変異体において二重変異を作製することが望ましい。
【００８４】  さらなる態様において、本発明は、本明細書において言及したオオムギ植物から産生される穀粒にあるということができる。
【００８５】  本発明は、粉砕された穀粒、挽かれた穀粒、粗挽きされた穀粒、精白されたかまたは圧延された穀粒を含む加工された穀粒または粉を含む上記のオオムギ植物の加工された穀粒もしくは全穀粒から得られる生成物を包含するだろう。これらの生成物は、様々な食品、例えば、パン、ケーキ、ビスケットなどの穀粉製品、もしくは増粘剤などの食品添加物において、または麦芽または他のオオムギ飲料、麺類および即席スープを作製するために、使用することができる。
【００８６】  あるいは、本発明は、上記のオオムギ植物の穀粒から単離されるデンプンを包含する。デンプンは、既知の技術によって単離することができる。
【００８７】  本発明の１つの有益性は、本発明がある種の栄養学上の利点を有する１つ以上の生成物を提供すること、さらに、オオムギ穀粒のデンプンまたは他の成分を改変する必要なくそれを行うことであることが理解されよう。
【００８８】  しかし、穀粒のデンプン、βグルカンまたは他の成分に対する改変を所望してもよく、本発明はそのような改変された成分を包含してもよい。
【００８９】  改変方法は公知であり、従来の方法によるデンプンまたはβグルカンまたは他の成分の抽出およびデンプンの所望の難消化性型への改変を含む。
【００９０】  従って、デンプンまたはβグルカンを、加熱および／または蒸気、物理的（例えば、ボール粉砕）、酵素的（例えば、αまたはβアミラーゼ、プララナーゼ（ｐｕｌｌａｌａｎａｓｅ）など）、化学的加水分解（液体またはガス状の試薬を使用する湿潤法または乾燥法）、酸化、二官能性試薬（例えば、トリメタリン酸ナトリウム、オキシ塩化リン）による架橋、またはカルボキシメチル化を含むが、これらに限定されない群から選択される処置を単独で、または組み合わせて使用することによって改変することができる。
【００９１】  例示したオオムギの食物繊維含有物は、ただ相対内乳アミロース含有量の増加だけにより生じるのではない。主な原因の１つは、β−グルカンが高いレベルで存在し、食物繊維のレベルに顕著に寄与することである。また、おそらくβグルカンのデンプン顆粒との会合による保護効果もあり、会合が緊密であることは、消化が若干困難であるＲＳ１型として特性化される難消化性を提供するデンプンの保護効果を潜在的に提供する。同様に、Ｖ−複合結晶（V-complex crystallinity）によって検出されるデンプン−脂質会合の存在も、おそらく難消化性デンプンのレベルに寄与する。この場合、難消化性は、おそらく脂質の存在によりデンプンが物理的に接近不能になるために生じ、従って、これは、ＲＳ１デンプンと認識することができる。Ｖ−複合形状を取る老化デンプンは消化に対して高度に抵抗性であることが既知であり、従って、Ｖ−複合結晶性構造の一部を形成するアミロペクチンも消化に対して抵抗性であることが予想される。例示したオオムギ植物のデンプンは、デンプン顆粒の構造のために消化に対して抵抗性であることができ、従って、ＲＳ２デンプンであるだろう。
【００９２】  本発明の態様について多様な指標が与えられている一方、本発明は、本発明の２つ以上の態様の組合わせにあってもよいことが理解されよう。
【００９３】実施例１
背景
高等植物の内乳でのデンプンの合成は、４つの重要な工程を触媒する１組の酵素によって行われる。第１に、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼは、Ｇ−１−ＰおよびＡＴＰからのＡＤＰグルコースの合成によってデンプンのモノマー前駆体を活性化する。第２に、活性化されたグルコシル供与体であるＡＤＰグルコースは、デンプンシンターゼによって、既存のα−１、４結合の非還元末端に転移される。第３に、デンプン分枝酵素は、α−１，４結合グルカンの領域の切断、続いて、切断された鎖の受容鎖への転移で新たなα−１，６結合を形成することによって、分岐点を導入する。最後に、遺伝研究は、デンプン脱分枝酵素が、高等植物における通常量のデンプンの合成に必須であることを実証しているが、脱分枝酵素が作用する機構については解明されていない（Ｍｙｅｒｓら、２０００）。
【００９４】  少なくともこれらの４つの活性が高等植物における通常のデンプン顆粒合成に必要であることが明らかである一方、４つの活性のそれぞれの複数のイソ型が高等植物の内乳において見出されており、変異分析（Ｗａｎｇら、１９９８、Ｂｕｌｅｏｎら、１９９８）に基づくかまたはトランスジェニックアプローチを使用する遺伝子発現レベルの改変（Ａｂｅｌら、１９９６、Ｊｏｂｌｉｎｇら、１９９９、Ｓｃｗａｌｌら、２０００）により、個々のイソ型についての特定の役割が提唱されている。しかし、デンプンの生合成に対するそれぞれの活性のそれぞれのイソ型の正確な寄与についてはなお不明であり、これらの寄与が種間で顕著に異なるかどうかについても知られていない。穀類の内乳には、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの２つのイソ型が存在し、１つの型はアミロプラスト内にあり、１つの型は細胞質にある（Ｄｅｎｙｅｒら、１９９６、Ｔｈｏｒｂｊｏｒｎｓｅｎら、１９９６）。それぞれの型は２つのサブユニット型から成る。トウモロコシの皺形（ｓｈ２）および脆性（ｂｔ２）変異は、それぞれ大小のサブユニットにおける損傷を意味する（ＧｉｒｏｕｚおよびＨａｎｎａｈ、１９９４）。穀類の内乳では４つのクラスのデンプンシンターゼが見出されており、それらは、顆粒結合型デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）内に排他的に局在化するイソ型、顆粒と可溶性画分との間で分割される２つの形態（ＳＳＩ、Ｌｉら、１９９９ａ、ＳＳＩＩ、Ｌｉら、１９９９ｂ）および可溶性面分であるＳＳＩＩＩに専ら配置される第４の形態（Ｃａｏら、２０００、Ｌｉら、１９９９ｂ、Ｌｉら、２０００）である。ＧＢＳＳは、アミロース合成に必須であることが明らかにされており（Ｓｈｕｒｅら、１９８３）、ＳＳＩＩおよびＳＳＩＩＩの変異はアミロペクチンの構造を改変することが明らかにされている（Ｇａｏら、１９９８、Ｃｒａｉｇら、１９９８）。ＳＳＩ活性の役割を規定する変異については記載されていない。
【００９５】  穀類の内乳では３つの形態の分枝酵素が発現され、それらは、分枝酵素Ｉ（ＢＥＩ）、分枝酵素ＩＩａ（ＢＥＩＩａ）および分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）で、ある（ＨｅｄｍａｎおよびＢｏｙｅｒ、１９８２、ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９７８、Ｍｉｚｕｎｏら、１９９２、Ｓｕｎら、１９９７）。トウモロコシおよびイネでは、高アミロース表現型は、ＢＥＩＩｂ遺伝子の損傷から生じることが明らかにされている（ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９８１、Ｍｉｚｕｎｏら、１９９３）。これらの変異体では、アミロース含有量が顕著に上昇し、残存するアミロペクチンの分枝頻度は減少する。さらに、アミロースとアミロペクチンとの間の「中間型」として規定される材料が大量に存在する（Ｂｏｙｅｒら、１９８０、Ｔａｋｅｄａら、１９９３）。ＢＥＩＩａおよびＢＥＩの役割を規定する変異についてはまだ記載されていないが、ポテトでは、ＢＥＩ単独のダウンレギュレーションは、デンプンの構造に対しごくわずかな影響を引き起こす（Ｆｉｌｐｓｅら、１９９６）。しかし、ポテトでは、ＢＥＩＩおよびＢＥＩのダウンレギュレーションの組合わせは、ＢＥＩＩ単独のダウンレギュレーションよりもはるかに高いアミロース含有量を提供する（Ｓｃｈｗａｌｌら、２０００）。高等植物には２つのタイプの脱分枝酵素が存在し、それらはその基質特異性に基づいて規定される。すなわちイソアミラーゼ型脱分枝酵素、およびプルラナーゼ型脱分枝酵素である（Ｍｙｅｒｓら、２０００）。トウモロコシおよびイネのｓｕｇａｒｙ−１変異は、両脱分枝酵素の欠損に関連する（Ｊａｍｅｓら、１９９５、Ｋｕｂｏら、１９９９）が、原因変異は、イソアミラーゼ型脱分枝酵素の遺伝子と同じ場所に位置する。コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）のｓｔａ−７変異体（Ｍｏｕｉｌｌｅら、１９９６）では、それはトウモロコシのｓｕｇａｒｙ−１変異の類似体であるが、イソアミラーゼ活性のみがダウンレギュレートされる。
【００９６】  オオムギデンプン構造の既知の変種は、トウモロコシにおいて利用可能な変種に比べて限定される。最も高度に特徴的な変異は、モチ性およびＡＣ３８において同定される高アミロース変異である。二重変異体も構築され、分析されている（Ｓｃｈｏｎｄｅｌｍａｉｅｒら、１９９２、Ｆｕｊｉｔａら、１９９９）。デンプンの構造および特性（Ｃｚｕｃｈａｊｏｗｓｋａら、１９９２；Ｓｃｈｏｎｄｅｌｍａｉｅｒら、１９９２；ＶａｓａｎｔｈａｎおよびＢｈａｔｔｙ、１９９５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４；ＧｅｒｒｉｎｇおよびＤｅＨａａｓ、１９７４；Ｂａｎｋｅｓら、１９７１；ＰｅｒｓｓｏｎおよびＣｈｒｉｓｔｅｒｓｏｎ、１９９７；ＶａｓａｎｔｈａｎおよびＢｈａｔｔｙ、１９９８；Ｃｚｕｃｈａｊｏｗｓｋａら、１９９８；ＳｏｎｇおよびＪａｎｅ、２０００；Ａｎｄｒｅｅｖら、１９９９；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、２０００）、ならびに穀粒特性（Ｓｗａｎｔｓｏｎ  １９９２、Ａｈｏｋａｓ  １９７９；Ｏｓｃａｒｓｓｏｎら、１９９７；Ｏｓｃａｒｓｓｏｎら、１９９８；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、１９９９；Ｅｌｆｖｅｒｓｏｎら、１９９９；Ｂｈａｔｔｙ  １９９９；Ｚｈｅｎｇら、２０００；Ｉｚｙｄｏｒｃｚｙｋら、２０００；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、２０００）についての変種の幅広い特性が報告されており、動物給餌試験（Ｘｕｅら、１９９６；Ｎｅｗｍａｎら、１９７８；Ｃａｌｖｅｒｔら、１９７６；Ｗｉｌｓｏｎら、１９７５；Ｓｕｎｄｂｅｒｇら、１９９８；Ｂｅｒｇｈら、１９９９）、ヒト食物（Ｓｗａｎｓｔｏｎら、１９９５；Ｆａｓｔｎａｕｇｈｔら、１９９６；Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９６；Ｐｏｍｅｒａｎｚら、１９７２）およびヒト栄養物（Ｐｏｍｅｒａｎｚ  １９９２；Ｇｒａｎｆｅｌｄｔら、１９９４；Ｏｓｃａｒｓｓｏｎら、１９９６；Ａｋｅｒｂｅｒｇら、１９９８）における変異体の有用性が調べられている。
【００９７】  本実施例では、本発明者らは、オオムギから新規のクラスの高アミロース変異体を単離した。変異系統は、典型的なハイアミロースグレーシャー（Ｈｉｇｈ  Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｇｌａｃｉｅｒ）（ＡＣ３８）変異体の充分に特性化されたアミロース含有量（４５〜４８％）（Ｗａｌｋｅｒら、１９６８）を超えるアミロース含有量（６５〜７０％）を含有し、デンプンの分枝度が増大したアミロペクチン構造を有するデンプンを有するが、これは、分枝度の低下がトウモロコシの高アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）変異体に関連すること（Ｔａｋｅｄａら、１９９３）と対照的である。
【００９８】  本発明の穀粒およびデンプン特性については詳細に調べられており、原因変異がマップされている。単離された変異は、オオムギにおける既知の皺形（shrunken）変異、ｓｅｘ６に対立的（allelic）であり、原因変異は、デンプンシンターゼＩＩ遺伝子内に配置されることが明らかにされている。本変異の効果は、デンプン生合成の過程を新たに解明し、特定の遺伝子の変異が、種ごとのデンプン構造に対してどのように異なる影響を有するかについて示す。
【００９９】材料および方法
変異誘発およびスクリーニング
ＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ（１９９５）に従って、アジ化ナトリウムを使用して、外皮を欠くオオムギ変種ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）を変異誘発した。改変された穀粒形態を有する変種の選抜は、Ｇｒｅｅｎら、（１９９７）に従って行った。Ｇｒｅｅｎら、（１９９７）に従って、皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）内乳表現型を有する合計で７５種の系統を同定し、維持した。
【０１００】デンプンの単離
Ｓｃｈｕｌｍａｎら（１９９１）の方法を使用して、オオムギ穀粒からデンプンを単離した。
【０１０１】アミロース決定の方法
脱分枝されたデンプンを分離するためのＨＰＬＣ法によるアミロース／アミロペクチン比の決定、およびヨウ素結合法は、ＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ、（１９９６）による記載の通りに行った。非脱分枝デンプンに関する分析によるアミロース／アミロペクチン比の分析は、Ｃａｓｅら、（１９９８）に従って行った。
【０１０２】デンプン含有量の測定
デンプンは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ，Ｃｏ  Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄ）より供給される全デンプン分析キットを使用して決定した。
【０１０３】タンパク質含有量
窒素はケルダール法によって決定し、タンパク質含有量は係数５．７を使用して算出した。
【０１０４】β−グルカンのレベル
β−グルカンは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ，Ｃｏ  Ｗｉｃｋｌｏｗ，  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄ）より供給されるキットを使用して決定した。
【０１０５】デンプン鎖長分布
デンプンを脱分枝し、Ｍｏｒｅｌｌら（１９９８）に従い、キャピラリー電気泳動を使用する蛍光ラベル糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）を使用して、鎖長分布を分析した。
【０１０６】ＤＳＣ
ゼラチン化は、Ｐｙｒｉｓ  １示差走査熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ  ＣＴ，ＵＳＡ）中で測定した。デンプンを、水２部：デンプン１部の比率で水と混合し、この混合物（４０〜５０ｍｇ、正確に秤量する）をステンレス製天秤皿中に置き、密閉した。サンプルを、空のステンレス製天秤皿を対照として、２０℃から１４０℃まで、１分間当たり１０℃で走査した。Ｐｙｒｉｓソフトウェアを使用して、ゼラチン化温度およびエンタルピーを決定した。
【０１０７】ＲＶＡ分析
粘度は、Ｂａｔｅｙら、１９９７により全麦粉について報告された条件を使用し、ラピッドビスコアナライザー（Ｒａｐｉｄ−Ｖｉｓｃｏ−Ａｎａｌｙｓｅｒ）（ＲＶＡ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ，Ｓｙｄｎｅｙ）で測定した。α−アミラーゼを阻害するために、すべてのアッセイに１２ｍＭの濃度で硝酸銀を含めた。測定したパラメータは、最高粘度（最大熱糊化粘度）、最低粘度、最終粘度および糊化温度であった。さらに、ブレークダウン（最高粘度−最低粘度）およびセットバック（最終粘度−最低粘度）を算出した。
【０１０８】粉膨潤
粉膨潤体積は、Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅら（２００１）に従って決定した。
【０１０９】Ｘ線データ
標準的な技術（Ｂｕｌｅｏｎら、１９９８）を使用して、Ｘ線回折データを回収した。
【０１１０】走査電子顕微鏡観察
Ｊｏｅｌ  ＪＳＭ  ３５Ｃ装置上で走査電子顕微鏡観察を行った。精製したデンプンを金でスパッタコートし、１５ｋＶ、室温で走査した。
【０１１１】半数体倍加の生成
半数体倍加は、Ｄｒ  Ｐ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｗａｉｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａにより、２９２とホルデウム・バルガレのタンタンガラ品種（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｃｖ  Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間、および３４２とＨ．バルガレのタンタンガラ品種（Ｈ．  ｖｕｌｇａｒｅ  ｃｖ  Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間の交雑から誘導されるＦ１植物から生成された。
【０１１２】連結分析
ＭａｐＭａｎａｇｅｒを使用して、遺伝子連結データを算出した。
【０１１３】オオムギｃＤＮＡライブラリーの構築
プロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従い、開花１０、１２および１５日後のオオムギ内乳組織由来の５ｍｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。ＮｏｔＩ−（ｄＴ）１８プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ｃＤＮＡ合成の第１鎖に使用した。二本鎖ｃＤＮＡをＳａｌＩ−ＸｈｏＩアダプター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結させ、ＮｏｔＩによるｃＤＮＡの消化、続いてサイズ分画（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製ＳｉｚｅＳｅｐ  ４００スパンカラム）の後にＺｉｐＬｏｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＳａｌＩ−ＮｏｔＩアームにクローン化した。連結したｃＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄパッケージング抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングした。ライブラリーの力価は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＹ１０９０（ＺＬ）株による試験で２×１０６ｐｆｕであった。
【０１１４】ＰＣＲを使用するオオムギデンプンシンターゼＩＩの特定のｃＤＮＡ領域のクローン化
ｃＤＮＡクローン、ｗＳＳＩＩｐ１を、オオムギのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。ｃＤＮＡクローン、ｗＳＳＩＩｐ１を、プライマーｓｓＩＩａ（ＴＧＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＴＴＣ  配列表の配列番号９）およびｓｓＩＩｂ（ＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧ  配列表の配列番号１０）を使用するＰＣＲにより作製し、ｗＳＳＩＩＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１５５２１７）のヌクレオチド１，４３５位〜１，８３５位の領域を増幅した。
【０１１５】  増幅は、ＦＴＳ−１サーマルシークエンサー（Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３５サイクルおよび２５℃で１分間を１サイクルとして実施した。フラグメントｗＳＳＩＩｐ１をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。
【０１１６】オオムギｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
オオムギヒマラヤｃｖ（ｃｖ  Ｈｉｍａｌａｙａ）品種の内乳由来のＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリーを、先に記載のハイブリダイゼーション条件（Ｒａｈｍａｎら、１９９８）で、３４７ｂｐのｃＤＮＡフラグメントでスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、６×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１．７μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ中で、４２℃、１６時間行い、次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで、６５℃、１回の洗浄あたり１時間で３回洗浄した。
【０１１７】オオムギゲノムライブラリーのスクリーニング
オオムギ（オオムギモレックス（Ｍｏｒｅｘ）品種）ゲノムライブラリーを構築し、プローブとしてオオムギＳＳＩＩ  ｃＤＮＡを使用して、基本的にＧｕｂｌｅｒら（２０００）に記載の通りにスクリーニングした。
【０１１８】ゲノムクローンの配列決定
モレックス（Ｍｏｒｅｘ）ＳＳＩＩ遺伝子をプラスミドベクターにサブクローン化し、配列決定した。２９２およびＭＫ６８２７遺伝子を、モレックス（Ｍｏｒｅｘ）の配列に基づいて設計したプライマーを使用して、遺伝子の重複領域のＰＣＲ増幅によって配列決定した。ＰＣＲフラグメントは、直接配列決定するか、またはサブクローン化して、プラスミドから配列決定した。
【０１１９】発現領域の決定
ｃＤＮＡ中に存在することが推定される２９２およびＭＫ６８２７ゲノム配列の領域を、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）ｃＤＮＡ配列およびモレックス（Ｍｏｒｅｘ）ゲノム配列を参考にして決定した。
【０１２０】ＳＳＩＩ遺伝子のＧ→Ａ変異のＰＣＲ分析
２９２において同定されるＧ→Ａトランジション変異を含有する領域を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。プライマー配列は、ＺＬＳＳ２Ｐ４（ＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＡＣＧ  配列表の配列番号１１）およびＺＬＢＳＳＩＩ５（ＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣ  配列表の配列番号１２）である。増幅は、ＦＴＳ−１サーマルシークエンサー（Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３５サイクルおよび２５℃で１分間を１サイクルとして実施した。
【０１２１】オオムギ内乳タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
オオムギならびにコムギの発育および成熟内乳からデンプンを調製し、記載（Ｒａｈｍａｎら、１９９５）のように、プロテイナーゼＫで表面タンパク質を除去した。５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ６．８、１０％のＳＤＳおよび１０％の２−メルカプトエタノールを含有する０．５ｍｌの抽出緩衝液を使用して、乾燥重量２０ｍｇのデンプンからデンプン顆粒タンパク質を抽出した。１０分間の煮沸によるゼラチン化、および遠心分離によるデンプンの回収後、１５マイクロリットルの上清を各レーンにロードした。
【０１２２】半数体倍加の生成
半数体倍加は、Ｄｒ  Ｐ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｗａｉｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａにより、２９２とホルデウム・バルガレのタンタンガラ品種（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｃｖ  Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間、および３４２とＨ．バルガレのタンタンガラ品種（Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ  ｃｖ  Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間の交雑から誘導されるＦ１植物から生成された。
【０１２３】戻し交雑の戦略
２９２とホルデウム・バルガレのスループ品種（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｃｖ  Ｓｌｏｏｐ）との間で交雑を行い、Ｆ１種子を作製した。Ｆ１種子由来の植物を自殖させて、Ｆ２種子の集団を作製した。これらのＦ２種子から成長する植物を、ＰＣＲアッセイを使用して試験し、２９２変異に対してホモ接合の植物をスループ（Ｓｌｏｏｐ）に戻し交雑させた（ＢＣ１）。ＢＣ１から生じるＦ１植物を再度ＰＣＲで試験し、２９２変異に対してヘテロ接合の植物を選抜し、スループ（Ｓｌｏｏｐ）に戻し交雑させた（ＢＣ２）。ＢＣ２由来のＦ１植物を再度ＰＣＲにより分析し、２９２変異に対してヘテロ接合の植物を選抜した。これらの植物を自殖させてＢＣ２Ｆ２集団を作製するか、または再度スループ（Ｓｌｏｏｐ）に戻し交雑させた（ＢＣ３）。ＢＣ３由来のＦ１植物を再度ＰＣＲにより分析し、２９２変異に対してヘテロ接合の植物を選抜した。これらの植物を自殖させてＢＣ３Ｆ２集団を作製した。これらの種子由来の植物をＰＣＲにより試験し、単粒法および種子増加のために２９２変異に対してホモ接合の植物を選抜した。
【０１２４】結果
変異体の選抜
アジ化ナトリウム処理によって誘導される外皮を欠くかまたは裸性のオオムギの変種“ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）”の多数の変異体の同定については、先にＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ（１９９５）により報告されている。本発明者らは、７５の皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）穀粒変異のグループを同定し、皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）種子由来のデンプンのアミロース含有量をＨＰＬＣにより決定した（図１）。２つの系統２９２および３４２は、それぞれ７１および６２．５％のアミロース含有量を示すことが見出された（表１）。２９２および３４２のアミロース含有量は、従来の良く特性化されたＡＣ３８系統（４７％アミロース、表１を参照のこと）よりも有意に高かった。本研究では、２９２および３４２によって表される新規の高アミロース表現型の遺伝的基礎を規定し、穀粒ならびにデンプンの構造および機能性に対する原因変異の効果について説明する。
【０１２５】穀粒の特性
穀粒のサイズおよび形態：
穀粒の重量および形態に対する変異の効果について記す（表２）。穀粒の重量は、親系統ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の５１ｍｇから２９２の３２ｍｇおよび３４２の３５ｍｇに減少する。変異体は、野生型の長さおよび幅を保持するが、比較すると（ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の平均２．８２ｍｍの厚さから、２９２および３４２のそれぞれ１．５８および１．７５ｍｍへ）平坦になっており、基本的に非充填の中心領域を有する。図２は、変異体および野生型穀粒の写真を示す。穀粒の寸法については、図２に宗すように穀粒の長さ（Ｌ）、最も幅が広い点での穀粒の幅（Ｗ）、および厚さ（Ｔ）を定期的に測定した。穀粒の長さ（Ｌ）対厚さ（Ｔ）の比は、変異の診断に有用であり、２９２または３４２変異をもつ種子では典型的に＞３．５の値が見出され、非変異オオムギでは＜３．５の値が見出される。
【０１２６】穀粒の組成：
変異系統のデンプン含有量は、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の４９．０％から２９２および３４２のそれぞれ１７．７および２１．９％に減少する（表１を参照のこと）。穀粒の全重量からデンプンの重量を差し引いて穀粒の非デンプン分の全量を求めたところ、非デンプン重量は、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）、２９２および３４２でそれぞれ２６．０、２６．３および２７．３であり、穀粒重量の消失の原因がデンプン含有量の消失であることが示された。
【０１２７】  ２９２および３４２のタンパク質含有量は、親系統ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）に比較して増加するが（表１）、この効果は、穀粒からデンプンが消失したことによるものであり、穎果あたりのタンパク質合成の増加によるものではない。
【０１２８】  ２９２および３４２変異体のβ−グルカンレベルも増加しており、これはデンプン含有量の減少の効果から期待されるレベルよりも高い（表１）。いずれの場合においても、β−グルカン含有量は穎果あたり約２０％増加しており、これはおそらく、デンプン合成からβ−グルカン合成へ僅かな割合で入ってくる炭素の転用の存在を示している。
【０１２９】デンプンの組成および機能性
アミロースおよびアミロペクチン含有量
２つの技術、第１に、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中でのサイズ排除ＨＰＬＣ、および、第２に、ヨード呈色度（iodine blue value）を使用して、アミロース含有量を決定した。それぞれの方法によって決定されたアミロース含有量は同様であったが、ＨＰＬＣのデータを表１に示す。
【０１３０】  変異体および野生型系統の穀粒重量およびアミロース含有量から、穀粒あたりに蓄積されたアミロース量を算出することができる。この分析では、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の６．２ｍｇ／穎果から、２９２の４．０ｍｇ／穎果および３４２の４．８ｍｇ／穎果へのアミロース量の減少が認められる。対照的に、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の１８．７ｍｇから、２９２の１．６ｍｇおよび３４２の２．９ｍｇへの穎果あたりのアミロペクチン合成の劇的な減少が認められる。
【０１３１】鎖長分布
イソアミラーゼ脱分枝後のデンプンの鎖長分布を、蛍光ラベル糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）を使用して行った。２９２および３４２変異体、ならびにヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の鎖長分布を図３ａに示す。図３ｂは、２９２および３４２変異体について正規化した鎖長分布をヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の正規化した分布から差し引いた差分プロットを示す。ＤＰ６〜１１、ＤＰ１２〜３０およびＤＰ３１〜６５からの鎖長の百分率（percentages）を算出し、表３に示す。鎖長分布において２９２および３４２では顕著なシフトが認められ、例えば、ＤＰ１２〜３０と比較して、ＤＰ６〜１１由来の領域のほうが、鎖の百分率が高い。
【０１３２】示差走査熱量測定
示差走査熱量測定を使用して、変異体のゼラチン化温度について調べたが、そのデータを表４に示す。２９２および３４２の両方とも、ゼラチン化ピーク開始（onset）、ピークおよび最終温度に関し、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）デンプンより顕著に低いゼラチン化温度を有するデンプンを生じる。２９２および３４２変異体のゼラチン化ピークのエンタルピーも、野生型と比較して劇的に減少している。アミロース／脂質ピークの開始温度（onset temperature）も２９２および３４２では減少するが、しかし、変異体のアミロース含有量の増加にあわせて、エンタルピーは増加する。
【０１３３】ＲＶＡによるデンプンの粘度
オオムギ全麦サンプルの糊化粘度を検討するために、オオムギ全麦サンプルのＲＶＡ分析を行った。従来の研究では、全麦サンプルの分析は、単離されたデンプンの分析と強く相関することが明らかにされている（Ｂａｔｅｙら、１９９７）。分析は、研究したオオムギ遺伝子型の間に大きな差異があることを示した（表５および図４を参照のこと）。野生型デンプンであるヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）およびナモイ（Ｎａｍｏｉ）を含有する２つのオオムギ変種は、顕著な最高粘度、これに続く最低粘度への粘度の低下、これに続く冷却時の最終粘度への粘度の増加が認められる典型的なＲＶＡプロフィールを示した。オオムギデンプンについて一般に観察されるように、野生型の最終粘度は、最高粘度に等しいか、またはそれ未満であった（表５）。ＡＣ３８では、はっきりした最高粘度が観察されたが、この系統はアミロース含有量が高いため、観察された最終粘度は最高粘度よりも高かった。しかし、２９２、３４２およびＭＫ６８２７では、極めて異なるプロフィールが観察された。他のオオムギデンプンで示されたような最高粘度に対応する初期の粘度の顕著な増加は観察されず、従って、ブレークダウンの値は算出されなかった。２９２、３４２およびＭＫ６８２７については、表５に示す最高粘度の値は、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）において最高粘度を示した時間に記録された粘度であり、粘度は、分析全体を通して、他の全麦サンプルに匹敵する最終粘度に到達するまで増加した。デンプン含有量に基づいて正規化した場合、２９２および３４２デンプンは、極めて高い最終粘度を有した（表５を参照のこと）。
【０１３４】  膨潤体積は、粉およびデンプンの特性を測定する方法であって、熱および過剰の水に暴露されたときの材料の挙動を探査する。規定の温度で水中にサンプルを混合し、続いてゼラチン化した材料を回収する前後にサンプルを秤量することによって、水の取り込みの増加を測定する。分析は、対照サンプルであるヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）およびタンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）が乾燥重量の６倍〜８倍に膨潤するのとは対照的に、２９２および３４２は乾燥重量のただ２〜３倍だけ膨潤することを示した（表９）。
【０１３５】結晶性
Ｘ線結晶解析を使用して、デンプンの構造をさらに調べた（表６および図５を参照のこと）。ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）は、主として「Ａ」型結晶を有する穀類デンプンの予想されるパターンを示し、ＡＣ３８およびワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）は互いに極めて類似なＸ線回折パターンを示したが、結晶性のレベルは、ＡＣ３８のほうが低く、ワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）の方が高かった。２９２および３４２変異体では、Ｘ線回折パターンはＶおよびＢパターンの混合型にシフトした。回折パターンのシフトに加えて、結晶の量は、２９２および３４２において、それぞれ９および１２％まで急激に低下した。との結果は、２９２および３４２の低いアミロペクチン含有量に一致する。
【０１３６】顆粒の形態
走査電子顕微鏡を使用して、デンプンの顆粒形態について調べた（図６）。ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）（図６、パネルＡ）、モチ性オオムギ（ワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）、図６、パネルｂ）、ならびにＡＣ３８（図６、パネルｃ）由来の顆粒のサイズおよび形状は、通常のオオムギ系統のデンプン顆粒について従来公開されている観察と一致した。変異系統である２９２（図６、パネルｄ）、３４２（図６、パネルｅ）、およびＭＫ６８２７（図６、パネルｆ）の「Ａ」型デンプン顆粒の形態は、通常のオオムギの平滑なレンズ状形状と比較して、回旋状の表面を有する顆粒に明らかに改変されている。
【０１３７】食物繊維
ＡＯＡＣの手順に従って食物繊維分析を行ったところ、２９２および３４２に食物繊維の増加があることが示され、食物繊維のこの増加は、可溶性食物繊維よりもむしろ不溶性食物繊維の増加によるものであることが示され（表１）、これは食物繊維の成分が難消化性デンプンおよびβ−グルカンであることと一致した。食物繊維のこの測定は化学的に決定されるものであって、栄養学的な見地に関連する生理学的測定とはかなり異なることに留意すべきである。
【０１３８】変異の遺伝的基礎
分離比
２９２または３４２の皺形（shrunken）内乳表現型を示さないオオムギ変種への変異の交雑により、この変異は、他殖集団のＦ２種子において通常３：皺形（shrunken）１の比および単一の他殖後に発育した半数体倍加集団の種子において通常１：皺形（shrunken）１の比を示す明白な劣性変異であることが実証された（表６を参照のこと）。通常種子を＜３．５のＬ／Ｔ比を有する種子と規定し、皺形（shrunken）種子を＞３．５のＬ／Ｔ比を有する種子と規定する。
【０１３９】変異体の対立的性質
２９２および３４２変異は、２９２および３４２の交雑由来の子孫の分析により、対立的（allelic）であることを明らかにした。相反交雑由来のすべてのＦ１種子は、親２９２および３４２系統について観察されるサイズならびに形状の範囲内であり、かつ親ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）系統について見いだされる種子サイズならびに形状の範囲外である穀粒重量および穀粒形態表現型を示した。さらに、２９２×３４２Ｆ１植物由来のすべてのＦ２種子は、２９２および３４２変異体に典型的な皺形（shrunken）種子表現型を示した。
【０１４０】  バーレイガームプラズマコレクション（Ｂａｒｌｅｙ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＵＳＤＡ−ＡＲＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｍａｌｌ  Ｇｒａｉｎｓ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｉｄａｈｏ  ８３１２０  ＵＳＡ）より入手可能な一連の皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）穀粒変異体の穀粒形態およびデンプン特性の分析より、ｓｅｘ６変異を担持するＭＫ６８２７系統（ＢＧＳ３１、またＧＳＨＯ２４７６とも言う）は、２９２および３４２変異に高度に類似する一組のデンプンおよび穀粒の特性を示すことが示唆された。交雑は、２９２およびＭＫ６８２７の間で樹立され、すべてのＦ１穀粒は、穀粒重量および皺形（shrunken）種子表現型に関して典型的な２９２表現型を示した。２９２×ＭＫ６８２７Ｆ１植物由来のＦ２種子はすべて、＞４のＬ／Ｔ比を有する皺形（shrunken）内乳表現型を示した。対照的に、２９２と市販のオオムギスループ（Ｓｌｏｏｐ）品種の間の交雑由来のＦ２種子は、皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）および充填型種子間で３：１の分離比を示す２峰性分布を生じた（表６）。２９２と皺形（shrunken）内乳表現型を有する他の５つの系統（ＢＧＳ３８０、皺形（shrunken）内乳４、７ＨＬ（Ｊａｒｖｉら、１９７５）；ＢＧＳ３８１、皺形（shrunken）内乳５、７ＨＳ（Ｊａｒｖｉら１９７５）；ＢＧＳ３８２、ｓｅｘ１、６ＨＬ（ＥｓｌｉｃｋおよびＲｉｅｓ  １９７６）；ＢＧＳ３９６、皺形（shrunken）内乳６、３ＨＬ（ＲａｍａｇｅおよびＥｓｌｉｃｋ  １９７５）；ＢＧＳ３９７、皺形（shrunken）内乳７、マップされず（ＲａｍａｇｅおよびＥｓｌｉｃｋ  １９７５））との交雑から作製されるＦ１種子はすべて、充填型種子形態を有する穀粒を生じた。このことに基づいて、２９２、３４２およびＭＫ６８２７変異は、対立的（allelic）であると考えられ、ｓｅｘ６座の位置について従来公開されている地図上の位置に基づき、２９２および３４２変異は、オオムギの染色体７Ｈの短腕（セントロメアから約４ｃＭ）にマップされることが推定される（Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ  １９９０、ＮｅｔｓｖｅｔａｅｖおよびＫｒｅｓｔｉｎｋｏｖ、１９９３、Ｂｉｙａｓｈｅｖら、１９８６、Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ、１９９２）。
【０１４１】連結分析
２９２と市販の醸造用オオムギ変種、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間の交雑から半数体倍加集団を作製し、９０子孫系統を継代させた（表８）。
【０１４２】  種子形態（充填型（filled）対皺形（shrunken）種子）、ＦＡＣＥによる鎖長分布（ＤＰ６〜１１の鎖の百分率）、種子の被覆（裸性（naked）または皮性（husked））、およびＰＣＲマーカー（以下を参照のこと）について、系統を評価した。データを表８に示す。皺形（shrunken）種子の特質および２９２ＦＡＣＥ分布は、この集団において正確に共分離した。これは、改変された穀粒サイズおよび形状が改変されたデンプン蓄積の結果であるならば、予想され得ることである。特質の共分離については図８に示している。パネルＡは、デンプン鎖長（ＤＰ６〜１１の鎖の百分率によって示されている）と長さ対厚さの比との間の関係を示す。白丸印は、２９２変異に対するＰＣＲマーカーを有する系統を指し、十字印は、野生型ＰＣＲマーカーを担持する系統を指す。系統の２つのグループの間には明確な定義が存在する。図８パネルＢは、デンプン鎖長と種子重量との間の関係を示し、種子重量は、変異について長さ対厚さの比ほどには診断的ではないことを示す。
【０１４３】  オオムギでは、包皮の有無は、染色体７Ｈ上のｎｕｄ座によって制御され、例えば、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）は皮性（husked）オオムギであり、２９２は裸性（naked）型であり、この特質は半数体倍加子孫に記録され得る。裸性／皮性（naked/husked）特性間の連結の分析およびＦＡＣＥデータは、この交雑において２９２変異がｎｕｄ座の１６．３ｃＭでマップされることを示した。この位置は、対立遺伝子ｓｅｘ６変異についての従来のマッピングデータと一致する（Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ、１９９０、ＮｅｔｓｖｅｔａｅｖおよびＫｒｅｓｔｉｎｋｏｖ、１９９３、Ｂｉｙａｓｈｅｖら、１９８６、Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ、１９９２）。
【０１４４】原因遺伝子の同定
ｎｕｄ遺伝子は、オオムギ染色体７Ｈ上に位置することが実証されている（図８、Ｆｅｄａｋら、１９７２）。コムギでは、３つのデンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ、ＳＳＩおよびＳＳＩＩ）、ならびにイソアミラーゼ型脱分枝酵素（Ｓ．Ｒａｈｍａｎより個人的に入手）は、相同染色体である染色体７の短腕上に位置する（ＹａｍａｍｏｒｉおよびＥｎｄｏ、１９９６、Ｌｉら、１９９９ａ、Ｌｉら、１９９９ｂ、Ｌｉら、２０００））。ｎｕｄ座への密接な連結により、最も可能性の高い候補遺伝子はＳＳＩＩ遺伝子であることが示唆された。コムギＳＳＩＩ遺伝子は、ｃＤＮＡレベル（Ｌｉら、１９９９ｂ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１５５２１７）およびゲノムレベル（Ｌｉらより個人的に入手）でクローン化されており、オオムギｃＤＮＡは、単離され、クローン化されている（図９）。オオムギおよびコムギＳＳＩＩゲノム配列の配列決定は、遺伝子が極めて類似のエキソン／イントロン構造を有するが、イントロン領域の長さは、配列間で異なることを示している（図１０）。モレックス（Ｍｏｒｅｘ）のゲノム配列とヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）由来のｃＤＮＡの配列（図９）とを比較することにより、モレックス（Ｍｏｒｅｘ）、２９２およびＭＫ２８２７由来の推定ｃＤＮＡ配列が同定される。
【０１４５】  ２９２由来のＳＳＩＩ遺伝子において、図１１に示すアラインメントの１８２９位に相当する位置でＧ→Ａトランジション変異体が見出された。この変異は、２９２ＳＳＩＩオープンリーディングフレーム（図１２）に終止コドンを導入する。タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）およびヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）の配列分析は、両野生型遺伝子がこの領域で同定され、２９２および３４２はともに同じＧ→Ａトランジション変異を含有することが示された。導入された終止コドンは、デンプンシンターゼＩＩ遺伝子の全Ｃ末端触媒ドメインが翻訳されないように遺伝子産物を短縮し、従って、おそらくＳＳＩＩ活性がこの変異によって廃されるだろう。
【０１４６】  Ｇ→Ａトランジション変異はまた、ＭＫ６８２７にも図１１に示すアラインメントの２４２位に存在し、図９のヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）ｃＤＮＡ配列にも存在した。この変異も２９２ＳＳＩＩオープンリーディングフレーム（図１２）に終止コドンを導入し、ＳＳＩＩ遺伝子の９０％を超えて翻訳を阻害し、この遺伝子によってコードされるＳＳＩＩ活性を止める。
【０１４７】  ２９２のＧ→Ａトランジション変異は、オオムギＳＳＩＩ遺伝子の制限酵素認識部位（ＮｌａＩＶ）を破壊した。診断的ＮｌａＩＶサイトの位置を図１４に示す（パネル（ａ）および（ｂ））。図１４ｃは、オオムギ由来のＮｌａＩＶ消化産物のアガロースゲル電気泳動を示す。これは、２９２変異の診断パターンが２９２おタび３４２内に存在し、ＭＫ６８２７、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）またはタンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）には存在しないことを示している。
【０１４８】  Ｇ→Ａトランジション変異のＰＣＲマーカーは、２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）半数体倍加集団のうち９０系統に記録され、皺形（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）種子およびＦＡＣＥ鎖長分布表現型によって正確に共分離されることが見出されたが、このことは、２９２変異が完全にこのデンプン表現型に結び付けられ、この変異がおそらく２９２表現型の基礎になる原因変異であることを示す。図１４ｄは、２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）半数体倍加集団由来の系統の分析を示す。
【０１４９】ＳＳＩＩ活性の消失の生化学的証拠
ゲル電気泳動技術の範囲で、変異体および通常のオオムギ系統におけるデンプン生合成酵素の組成について調べた。発育中の内乳の可溶性画分の分析により、すべての系統がＢＥＩ、ＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ、ＳＳＩおよびＳＳＩＩＩを含有すること、ならびにＢＥおよびＳＳにおけるこれらのイソ型の内容物のそれぞれは、本質的に改変されていないことが実証された。しかし、デンプン顆粒の分析により、いくつかのバンドが失われていることが示された。第１に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１６、パネルＢ）は、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）およびＡＣ３８には存在する９０ｋＤのバンドが２９２、３４２またはＭＫ６８２７には存在しないことを示した。このバンドは、インムノブロッティングによってＳＳＩＩ（図１６、パネルＢ）ならびにＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂを含有することが明らかにされた。ＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂが可溶性画分に存在し、顆粒には存在しないという知見は、発現を止める変異があるのではなく、むしろ２９２、３４２およびＭＫ６８２７変異体におけるこれらの酵素の分布に改変があることを示す。対照的に、可溶性または顆粒画分のいずれかにＳＳＩＩ発現が認められるという証拠はなく（図１６、パネルＡおよびＢ）、このことは、２９２、３４２およびＭＫ６８２７において観察される表現型にＳＳＩＩ変異を直接結び付ける遺伝的証拠と一致する。
【０１５０】２９２変異を担持する系統の育種
２つの戦略を使用して、２９２変異を代替のオオムギ遺伝子型に伝達した。
【０１５１】  第１の例では、２９２とタンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）との間の交雑から半数体倍加系統を作製した。種子被覆のためのデータ、種子重量、Ｌ：Ｔ比、鎖長分布およびＳＳＩＩのＤＮＡマーカーの状態を表８に示す。これらの系統の構成のさらに包括的な分析（ＲＶＡ分析、β−グルカン含有量および粉膨潤体積を含む）を表９に示す。データは、２９２変異を担持する系統が有意に異なるＲＶＡパラメータ（最高／最終粘度比によって例示される）、より高いβ−グルカン含有量、および改変された粉膨潤体積を有することを示す。
【０１５２】  第２の例では、２９２から通常のデンプン特性を有する品種（スループ品種（ｃｖ  Ｓｌｏｏｐ））への２つの戻し交雑を実施することによって、変異を伝達した。３つの戻し交雑２Ｆ１植物の由来のＦ２種子を分析のために回収した。Ｆ２種子を、＞３．５のＬ：Ｔ比および＜３．５のＬ：Ｔ比を有する種子に分類した。これらのクラス間の種子の分布は、単一劣性遺伝子についての予想と一致した。それぞれの植物由来の種子の範疇に対する粉膨潤体積データを図１０に示した。これらのデータは、平均で７５％のスループ（Ｓｌｏｏｐ）背景を有する系統への育種過程を通して、デンプン膨潤形質が明らかに伝達されたことを示す。
【０１５３】考察
本発明者らは、皺形（shrunken）内乳表現型を有するオオムギの新規の変異体、２９２および３４２の単離について述べる。穀粒組成の分析により、皺形（shrunken）表現型はデンプン含有量の有意な減少によるものであることが実証され、デンプン組成の分析により、この減少は、アミロペクチン合成の減少のために生じる高アミロース表現型として出現することが示されている。
【０１５４】  ２９２および３４２変異体は、穀粒ならびにデンプン特性の独特な組合わせを有し、β−グルカンレベルおよび難消化性デンプンの双方の増大を示す。この系統のβ−グルカンレベルは、デンプン含有量の減少の効果によって期待されるレベルよりも約１５％超増加するが、これは、デンプンへ転換することができない炭素がβ−グルカンの合成に転用されることを示唆している。食物繊維レベルの決定により、変異体由来の穀粒は食物繊維のレベルが上昇し、この上昇は不溶性食物繊維の上昇によることが実証されている。
【０１５５】  特性のこのような組合わせは、これらの変異体が、ヒト食餌の成分として極めて興味深い能力を有することを示す。第１に、β−グルカンのレベルの増大は、コレステロールレベルの減少における既知のβ−グルカンの作用を介して、コレステロールを低下させるのにこの系統が有用であることを示唆する。第２に、難消化性デンプンの存在は、結腸での発酵を促進する難消化性デンプンの既知の能力により、腸の健康の見地からこの系統が有益であることを示す（Ｔｏｐｐｉｎｇら、１９９７、Ｔｏｐｐｉｎｇ  １９９９）。第３に、穀粒成分は、この系統が低エネルギー密度を有し、それらは緩徐に消化されることを示し、そのことはこの系統が低いグリセミック指数を有する食物の設計に寄与することを示す。
【０１５６】  例示したこの系統のデンプン特性も、それらが低ゼラチン化温度をも有する高アミロースデンプンを組み合わせる点で独特である。これは、トウモロコシの高アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）変異のような、ゼラチン化温度が典型的に増加する分枝酵素ＩＩｂの変異から生じる高アミロース変異とは対照的である（Ｎｇら、１９９７、Ｋａｔｚら、１９９３、Ｋｒｕｅｇｅｒら、１９８７、Ｆｕｗａら、１９９９）。２９２のアミロース含有量は、高アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）系統に匹敵するが、デンプンのアミロペクチン成分の構成は劇的に異なる（Ｗａｎｇら、１９９３）。２９２および３４２では、アミロペクチンの鎖長分布はより低い重合度にシフトするのに対し、高アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）では、鎖長分布は高い重合度にシフトする。このことは、アミロース含有量ではなく、アミロペクチンがゼラチン化温度の主要な決定因子であり、この効果はアミロペクチン分子の外部鎖間の相互作用の強さによって仲介されることを示唆する。同様の効果は、多数のデンプンについてＪａｎｅら、１９９９によって報告されている。
【０１５７】  ＲＶＡ分析の粘度データは、ＳＳＩＩ変異体系統由来のデンプンが通常のオオムギおよびＡＣ３８とは顕著に異なることを示す。ＳＳＩＩ変異オオムギは、ＲＶＡ温度プロファイルのはじめに温度が９５℃まで上昇する際に典型的に認められる最高粘度を本質的に示さない。その代わりこれらの変異体では、もし存在するならば最終粘度まで、粘度が安定的に増加する。これらのデータは、顆粒の低アミロペクチン含有量、顆粒における低レベルのアミロペクチン結晶性、ならびに示差走査熱量測定において観察される低ゼラチン化温度およびエンタルピーに一致する。過剰の水中で加熱し、撹拌することによって、一旦、アミロースが顆粒から放出されると、高い最終粘度に達する。これらのＲＶＡ特性は、穀類のデンプンに独特であり、低い糊化粘度にもかかわらず高い最終粘度が要求される食物および産業用途に新規のデンプンの供給源を提供する。
【０１５８】  ＤＳＣにおけるゼラチン化温度の観察は、Ｘ線回折研究の結果に反映される。２９２および３４２の顆粒は、低いレベルの結晶性を有し、結晶形態は、穀類デンプンに典型的なＡ型からＶおよびＢの混合型にシフトする。Ｖ型はアミロースに典型的であり、脂肪酸と複合したデンプンのアミロース成分に反映するが、Ｂ形態はアミロペクチンから誘導され、おそらくデンプンの残りのアミロペクチン含有物に反映する（Ｂｕｌｅｏｎら、１９９８）。
【０１５９】  ２９２および３４２変異の遺伝的基礎の分析により、この変異は、他殖実験で典型的なメンデル比を生じる単純な劣性変異であることが実証されている。交雑研究では、２９２および３４２は対立的（allelic）であることが実証された。交雑実験における２９２と他の皺形（shrunken）内乳変異との間の相互作用のさらなる分析により、２９２／３４２変異もＭＫ６８２７系統のＳｅｘ６変異に対立的であることが実証された。この変異は従来マップされており、染色体７Ｈの短腕上のセントロメアの３ｃＭ内に位置することが明らかにされている（Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ，１９９０、ＮｅｔｓｖｅｔａｅｖおよびＫｒｅｓｔｉｎｋｏｖ，１９９３、Ｂｉｙａｓｈｅｖら１９８６、Ｎｅｔｓｖｅｔａｅｖ，１９９２）。
【０１６０】  皮麦（husked barley）であるタンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）と裸性（naked）の２９２変異体との間の半数体倍加集団が樹立され、皺形（shrunken）内乳変異が染色体７ＨＳの短腕に対しｎｕｄ遺伝子の１６ｃＭ内にマップされ、位置はＳｅｘ６変異の地図上の位置に一致する。
【０１６１】  染色体７Ｈの短腕上のセントロメア付近の領域に遺伝子が位置決定されたことは、原因変異（ｓｅｘ６）が染色体１ＨにマップされているＡＣ３８（ａｍｏ１）において高アミロース表現型を生じる変異とは異なる遺伝子にあることを実証する（Ｓｃｈｏｎｄｅｌｍｅｉｅｒら  １９９２）。地図の位置は、ｓｅｘ６／２９２変異において破壊された遺伝子の１つの候補が、コムギにおいて染色体の同じ領域に位置決定されるデンプンシンターゼＩＩであることを示唆するものであった（ＹａｍａｍｏｒｉおよびＥｎｄｏ  １９９６、Ｌｉら、１９９９ｂ）。２９２および３４２変異体の配列分析は、酵素の活性部位を含有するＣ末端領域が翻訳されず、おそらく完全に不活性なタンパク質の合成が生じるような遺伝子の短縮を引き起こす遺伝子中のＧ→Ａトランジション変異が存在することを示した。さらに、ＭＫ６８２７のＳＳＩＩ遺伝子の配列決定により、２４２位で遺伝子の短縮も生じるＧ→Ａトランジション変異が示された。この結果により、２９２およびＭＫ６８２７変異の対立的性質が確認される。
【０１６２】  ＳＳＩＩ遺伝子の変異の同定は、２９２の変異のためのＰＣＲマーカー診断の開発をもたらす。このＰＣＲマーカーは２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）集団のうち９１の子孫にわたって記録され、皺形（shrunken）内乳表現型およびデンプンの短鎖長分布表現型との１００％共分離が示された。同様な表現型を生じる多様なバックグラウンドのオオムギ（２９２およびＭＫ６８２７）由来のＳＳＩＩ遺伝子に対立的変異が発見され、かつ変異が雛形（shrunken）穀粒表現型に完全連鎖していれば、２９２、３４２およびＭＫ６８２７のＳＳＩＩ遺伝子に存在する変異は、皺形（shrunken）内乳の特性を生じる原因変異である確実性が高い。
【０１６３】  オオムギのＳＳＩＩ変異についてここで観察される表現型は、いくつかの点で他の植物におけるＳＳＩＩ変異の表現型に類似するが、ＳＳＩＩ変異は、２９２／３４２において見出されるほどの高いアミロース含有量を生じない。ＳＳＩＩ変異は、エンドウ（ｒｕｇ５、Ｃｒａｉｇら、１９９８）およびコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９３）において公知であり、ここで観察されるように、鎖長分布の低下したアミロペクチンを生じる。ＳＳＩＩ遺伝子の変異を介してトウモロコシのＳｈｒｕｎｋｅｎ−２変異が生じることを示唆する証拠もあるが、これはまだ最終的に実証されていない（Ｈａｒｎら、１９９８、Ｋｎｉｇｈｔら、１９９８）。トウモロコシでは、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ−２変異はゼラチン化温度の低下したデンプンを生じる（Ｃａｍｂｅｌｌら、１９９４）。コムギでは、Ｙａｍａｍｏｒｉが、Ｌｉら（Ｌｉら、１９９９ｂ）によってＳＳＩＩ遺伝子の産物であることが明らかにされているＳｇｐ−１タンパク質を欠く三重ヌル系統（triple null line）（Ｙａｍａｍｏｒｉ、１９９８）を開発している。コムギでは、アミロース含有量が約３５％に増加し、異常デンプン顆粒、結晶性の変化、ゼラチン化温度の変化が観察される（Ｙａｍａｍｏｒｉ、１９９８）。オオムギＳＳＩＩ変異と他の種由来のＳＳＩＩ変異との間に特性の差があることはまったく予想外である。
【０１６４】  ＳＳＩＩ変異は、１つの遺伝子背景から別の遺伝子背景へ育種することによって転移することができ、本来の２９２、３４２およびＭＫ６８２７において典型的な診断的穀粒形態、および組成を生じる。表（９）において、Ｌ／Ｔ比、βグルカン含有量、鎖長分布、ＲＶＡ、および粉膨潤体積パラメータに関する２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）半数体倍加系統のデータは、２９２変異を担持する系統が、２９２親株に典型的な表現型を表すことを実証している。さらなる実証により、２９２のスループ（Ｓｌｏｏｐ）への戻し交雑第２代の自殖子孫から種子を分離したところ、正常（Ｌ／Ｔ比＜３．５の７４種子）および皺形（shrunken）表現型（２１種子、Ｌ／Ｔ比＞３．５）の３：１の分離に一致する分離比が示された。
【０１６５】  ＳＳＩＩ遺伝子およびオオムギの形質転換系の利用可能性は、ＳＳＩＩ変異により見出される表現型に匹敵する表現型を生成するために、遺伝子抑圧技術を使用してＳＳＩＩ遺伝子をノックアウトするのに必要なツールを提供する。最近開発された高度に効果的な戦略は、内因性ＳＳＩＩ活性を抑制する二本鎖ＲＮＡを生成するために設計されたヘアピン構築物を生成することである。ここに記載した変異体に類似の完全ノックアウト変異は興味深いものであるが、多様なプロモーターを有するＤＮＡ構築物を使用すること、および多様なレベルのヘアピン構築物発現を有する導入遺伝子を回収することにより、通常のレベルから完全なノックダウンレベルまで遺伝子の発現を調整する効果を評価することが可能である。
【０１６６】  この変異は、オリジナルの２９２変異の本質的な特性を保持しながら、２９２から別のオオムギ遺伝的背景に転移させることができることが明らかにされた。表９および１０に、２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）半数体倍加子孫、およびスループ（Ｓｌｏｏｐ）への戻し交雑第２代由来の種子の表現型データを示す。これらのデータは、表現型が育種過程を通して転移されることを示す。
【０１６７】
【表１】
0005283814.tif 000002
【０１６８】
【表２】
0005283814.tif 000003
【０１６９】
【表３】
0005283814.tif 000004
【０１７０】
【表４】
0005283814.tif 000005
【０１７１】
【表５】
0005283814.tif 000006
【０１７２】
【表６】
0005283814.tif 000007
【０１７３】
【表７】
0005283814.tif 000008
【０１７４】
【表８】
0005283814.tif 000009
0005283814.tif 000010
0005283814.tif 000011
【０１７５】
【表９】
0005283814.tif 000012
【０１７６】
【表１０】
0005283814.tif 000013
【０１７７】実施例２
ベクターの設計および構築
オオムギＳＳＩＩ遺伝子の領域（図１５において規定される）を、形質転換のためのベクターにクローン化した。各標的に対し３つの構築物を調製し、遺伝抑圧戦略に取り組んだ：（１）センスコサプレッション（sense cosuppression）、（２）アンチセンスおよび（３）二重鎖仲介抑制（duplex-mediated suppression）。
【０１７８】  図１６には、内因性標的遺伝子の発現を抑圧するために構築したＤＮＡ構築物の配列の構成を示す。プロモーターは、内乳に特異的な（例えば、高分子量グラテニン（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｇｌｕｔｅｎｉｎ）プロモーター、コムギＳＳＩプロモーター、コムギＢＥＩＩプロモーター）または内乳に非特異的なプロモーター（例えば、ユビキチンもしくは３５Ｓ）のいずれかから選択することができる。また、構築物は、ＯＣＳのｎｏｓ３因子などの転写を増強する他の因子を含有してもよい。
示したＤＮＡの領域は、適切な選択マーカー遺伝子配列および他の因子を含有するベクターか、またはこれらの配列を含有するベクターで同時形質転換されるベクターに組み入れられてもよい。
【０１７９】穀類の形質転換
オオムギ（Ｔｉｎｇａｙら、１９９７；Ｗａｎら、１９９４）、エンバク（Ｓｏｍｅｒｓら、１９９２、１９９４；Ｇｌｅｓｓら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、１９９９，Ｃｈｏら、１９９９）およびライムギ（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、、１９９４；Ｐｅｎａら、１９８４）の形質転換方法については記載されており、これらを使用してＤＮＡ構築物を転移し、トランスジェニック植物を作製することができる。
【０１８０】トランスジェニク体の分析
トランスジェニック植物の同定は、ＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによるＤＮＡ構築物のＤＮＡの同定によって行われる。個々のオオムギデンプン生合成遺伝子の発現のレベルは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で、それぞれノーザンハイブリダイゼーションおよびウエスタンブロッティングなどの標準的な技術によって測定される。デンプンならびに穀粒の含有量および組成は、実施例１で例示した技術などの標準的な技術を使用して測定される。
【０１８１】参考文献
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【０１８２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ９０％ＤＭＳＯ中のデンプンのＨＰＬＣ分離によって決定されるデンプンの分子サイズの分析を示す。（ａ）ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）、（ｂ）ＡＣ３８、（ｃ）３４２、（ｄ）２９２。
【図２】  変異体および親系統の穀粒形態を示す写真を示す。（ａ）ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）、（ｂ）ＡＣ３８、（ｃ）２９２、（ｄ）ワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）、（ｅ）３４２、（ｆ）タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）、（ｇ）ＭＫ６８２７、（ｈ）スループ（Ｓｌｏｏｐ）。穀粒の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および厚さ（Ｔ）の寸法をパネル（ａ）に示す。
【図３】  ＦＡＣＥを使用した様々な変異および野生型デンプンの鎖長分布の分析を示す。（ａ）正規化された鎖長分布、（ｂ）差分プロットによる鎖長分布の比較。サンプルは、３４２（■）、２９２（●）、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）（ｓ）、ＡＣ３８（°）、ＭＫ６８２７（◆）およびヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）（＋）であった。
【図４】  オオムギデンプンサンプルのＲＶＡ分析。サンプルは、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）（°）、ナモイ（Ｎａｍｏｉ）（△）、ＡＣ３８（○）、３４２（▽）、２９２（▲）およびＭＫ６８２７（■）であった。プロフィール中に使用した温度プロフィールを実線で示す。
【図５】  変異および野生型系統のＸ線回折データを示す。
【図６】  単離されたオオムギデンプンの走査電子顕微鏡写真を示す。（ａ）ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）、（ｂ）ワキシロ（Ｗａｘｉｒｏ）、（ｃ）ＡＣ３８、（ｄ）２９２、（ｅ）３４２、（ｆ）ＭＫ６８２７。
【図７】  ｎｕｄ１およびｓｅｘ６座の近傍を示すオオムギ染色体７Ｈの遺伝子座を示す。ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｈｅａｔ．ｐｗ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／）Ｂａｒｌｅｙ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｅｎｅｓ，７Ｈ  ｍａｐ，著者；Ｆｒａｎｃｋｏｗｉａｋ  ＪＤに従った図。
【図８】  ２９２×タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）半数体倍加系統の種子の寸法とデンプン鎖長分布との間の関係を示す。（＋）で示した系統はヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）のＰＣＲパターンを生じ、（○）で示した系統は２９２のＰＣＲ結果を生じた。パネル（Ａ）、６〜１１のＤＰを有するデンプン鎖の百分率に対してプロットした種子の長さ対厚さの比；パネル（Ｂ）、６〜１１のＤＰを有するデンプン鎖の百分率に対してプロットした種子重量。
【図９】  ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）品種由来のオオムギＳＳＩＩｃＤＮＡ（配列表の配列番号１）の配列を示す。
【図１０】  （１）Ｔ．タウシイ（Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉ）（二倍体コムギ）、（２）オオムギモレックス（Ｍｏｒｅｘ）品種由来のＳＳＩＩ遺伝子の構造を示す。太い線はエキソンを表し、細い線はイントロンを表す。それぞれの例の直ぐ下の直線は、遺伝子配列の領域を示す。点線は、配列は決定されていないが、ＰＣＲ分析によって長さ鎖が約３ｋｂであると決定されているイントロン７由来のオオムギＳＳＩＩ遺伝子の領域を表す。
【図１１】  ＭＫ６８２７（配列表の配列番号２）、モレックス（Ｍｏｒｅｘ）（配列表の配列番号３）および２９２（配列表の配列番号４）、ならびにヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）（配列表の配列番号１）のｃＤＮＡ配列由来の推定されたＳＳＩＩｃＤＮＡの比較を示す。推定された配列は、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）ＳＳＩＩｃＤＮＡに存在するゲノム配列の領域を同定することによって作製した。ＡＴＧ開始コドンおよび野生型終止コドンを示し、それぞれＭＫ６８２７（＃）および２９２（＆）に存在するさらなる終止コドンである。
【図１２】  オオムギ系統２９２（配列表の配列番号７）、モレックス（Ｍｏｒｅｘ）（配列表の配列番号５）、ＭＫ６８２７（配列表の配列番号８）、ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）（配列表の配列番号８）由来のＳＳＩＩをコードする遺伝子から推定されるアミノ酸配列の比較を示す。２９２およびＭＫ６８２７におけるさらなる終止コドンを、それぞれ記号（＆）および（＃）で示す。
【図１３】  オオムギＳＳＩＩ遺伝子におけるＭＫ６８２７（配列表の配列番号２）および２９２（配列表の配列番号４）の変異の位置を示す。
【図１４】  ２９２変異に対するＰＣＲアッセイの開発および使用を示す。（ａ）プライマーＺＬＳＳ２Ｐ４およびＺＬＢＳＳＩＩＰ５によって増幅されたヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）由来のＳＳＩＩ領域の概略図、（ｂ）ＺＬＳＳ２Ｐ４およびＺＬＢＳＳＩＩＰ５を使用して２９２由来のＳＳＩＩ遺伝子から増幅された領域（ＮｌａＩＶ部位の１つが欠けている）の図。（ｃ）オオムギ由来のＮｌａＩＶ消化産物のアガロースゲル電気泳動；レーンＭ；ＤＮＡマーカーラダー、レーン１：ＭＫ６８２７、レーン２：ヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）；レーン３、タンタンガラ（Ｔａｎｔａｎｇａｒａ）；レーン４、２９２；レーン５、３４２。
【図１５】  デンプン顆粒タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す。パネル（Ａ）コムギ由来の精製された顆粒−結合ＳＳＩＩタンパク質に対して産生されたＳＳＩＩ抗体によってエレクトロブロットおよびプロービングされた８％アクリルアミド（３７．５：１アクリル／ビス）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（Ｂ）銀染色された１２．５％アクリルアミド（３０：０．１３５アクリル／ビス）。規定された質量（単位はｋｄである）の分子量標準の泳動は、各数値の側に示している。
【図１６】  オオムギの安定な形質転換後のＳＳＩＩ発現をダウンレギュレートするように設計されたＤＮＡ構築物の概略図を示す。（１）ヌクレオチド１〜２９７２（配列のための図９を参照のこと）由来のＳＳＩＩ遺伝子はセンス方向でプロモーターとターミネーターとの間に挿入されている。（２）ＳＳＩＩ遺伝子は、ヌクレオチド２９７２〜１（配列のための図９を参照のこと）由来のアンチセンス方向でプロモーターとターミネーターとの間に挿入されている。（３）モレックス（Ｍｏｒｅｘ）ＳＳＩＩゲノム配列のオオムギＳＳＩＩ遺伝子（ヌクレオチド１５５９と２８５１との間）のイントロン３がヒマラヤ（Ｈｉｍａｌａｙａ）由来のオオムギＳＳＩＩｃＤＮＡ由来のエキソン２および３（図９のヌクレオチド３６３〜１１５７）の間に挿入されている二重構造。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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