(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくともステロイド骨格を持つアニオン性界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に、長径が３２μｍ以下であり、その比重が３．０以上であり、その硬度（Ｈｖ１０）が６００以上である無定形ジルコニア粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
前記アニオン性界面活性剤が、コール酸又はその塩であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記界面活性剤の濃度が０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
加熱処理の温度が６０℃〜９０℃である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、（１）前記試料と少なくともコール酸又はその塩を０．１〜５０ｍＭの濃度で含む水溶液を混合する、（２）６０〜９０℃で加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、（３）引き続いて該生物材料に、無定形で長径が２０μｍ以下であり、その比重が４．５〜６．５であり、その硬度（Ｈｖ１０）が８００以上であるジルコニア粉末を含む懸濁液を添加する、（４）超音波処理により前記生物材料を破砕する、（５）該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項６】
前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記生物材料がウィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
前記微生物がマイコバクテリウム属に属するものであることを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
前記生物材料を含む試料が、生物由来試料、組織洗浄液、培地、又は環境材料であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応に供する核酸を、生体試料中の生物材料から簡便かつ迅速に抽出する方法に関するもので、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野などに適用可能である。特に、本発明により、マイコバクテリウム属などの硬い細胞壁を有する生物材料から核酸を簡単かつ効率よく抽出でき、その後の核酸増幅反応を用いた遺伝子診断を行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的試料から核酸を調製する場合、試料の性質に応じて適切な抽出法と、精製法を選択し、抽出、精製の２つの工程を順に行うことが一般的である。
ウィルス、微生物、原虫、植物または動物組織などの生物材料から核酸を抽出する一般的方法として、ホモジェナイザー等による機械的方法、変性剤等による化学的な方法、酵素等による生物学的方法がある。又、凍結した試料に粒子状の固形物を添加し混在させ、試料を攪拌することにより細胞を破砕する方法がある。このうち、塩酸グアニジンや、チオシアン酸グアニジンなどの変性剤を用いて抽出する方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ７．２３〜７．２５（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９年）参照）は抽出物中に変性剤を含み、それ自体が核酸の増幅反応を阻害するため、抽出後、精製過程が必要となる。酵素処理による核酸抽出は時間がかかるため処理効率が悪いという問題があり、特にマイコバクテリウム属の細菌や真菌類であるカビなどの胞子など細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壊れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。
そこで、細胞壁の堅く、菌体破砕が難しいという問題を克服するため、微粒子を添加し、超音波洗浄器を用いて超音波処理を行い、核酸を放出する方法が報告されている。（米国特許５，３７４，５２２号参照）。この核酸放出法は簡便で破砕効率もよいが、喀痰や糞便などの検体から核酸を抽出し、これを遺伝子増幅に使用するためには増幅反応阻害物を除くためにさらに精製工程を加えなければならない。
そこで、多数の検体の処理を迅速に行うために、生物材料中の核酸を簡便かつ効率良く分離し、抽出物をそのまま遺伝子増幅反応に適用可能な核酸抽出法が望まれていた。
【発明の開示】
【０００３】
遺伝子検査に用いられる検体としては、血液、尿、喀痰、膿、血液培養液、スワブ、コロニー等があげられる。これらの検体から抽出した核酸に対し、直接測定を行う場合もあるが、近年の核酸検査では、微量核酸の定性・定量を可能ならしめるために、種々の増幅反応を用いて検体から抽出した核酸を増幅した後、測定を行うことが一般化してきている。このような核酸増幅反応には、一例を示せば、例えば、特許第２６５０１５９号公報に記載されたいわゆるＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法や特表平４−５００７５９号公報に記載されたいわゆるＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、および本実施例の方法である特開２０００−１４４００号公報記載のＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（特願平１０−１８６４３４）等のＲＮＡ増幅法、およびＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等のＤＮＡ増幅法が挙げられる。
前記した従来の核酸抽出法によっても前記した種々の検体から核酸を抽出することが可能である。しかしながら、核酸抽出物を前記のような増幅反応に供する頻度が高まるにつれ、従来の核酸抽出法によって得られた核酸抽出物の中には、前記のような核酸増幅反応で使用される逆転写酵素やＤＮＡポリメレース等の酵素類の活性または反応を阻害する核酸増幅反応阻害物質が存在する可能性が指摘されている。前記された検体のなかでも喀痰は、特に気道粘液や各種核酸、細胞などの生体成分に由来する核酸増幅反応を阻害する物質が存在する可能性が高いことが指摘されているが、それらが核酸抽出物に混入すると核酸増幅反応が阻害され、結果的に正確な検査が行えなくなってしまう。
遺伝子検査では、通常、内部標準が用いられ、偽陰性を防止することはできる。しかしながら、核酸増幅反応を阻害する物質を核酸抽出工程において除去することが最も望ましい解決法であることは明らかである。
そこで本願発明の目的は、核酸を抽出すべき生物材料から核酸増幅反応を阻害する物質を除去した上で、とくにマイコバクテリウム属などの硬い細胞壁を有する細菌から核酸を簡単かつ効率よく抽出する方法及び該方法を実施するためのキットを提供することである。
前記目的を達成するためになされた本願第１の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくとも界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に固形粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする。また、本願第２の発明は前記第１の発明に係り、前記界面活性剤がステロイド骨格を持つアニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤であることを特徴とする。本願第３の発明は、前記第２の発明に係り、前記アニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤が胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）及びそれらの塩から選ばれることを特徴とする。本願第４の発明は、前記界面活性剤の濃度が０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であることを特徴とする。本願第５の発明は、前記加熱処理の温度が６０℃〜９０℃であることを特徴とする。本願第６の発明は、前記固形粉末が無定形であり、その長径が３２μｍ以下であり、その比重が３．５以上であり、その硬度（Ｈｖ１０）が６００以上であることを特徴とする。本願第７の発明は、前記無定形固形粉末がジルコニアであることを特徴とする。本願第８の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、（１）前記試料から生物材料を分離する、（２）該生物材料と少なくともコール酸を０．１〜５０ｍＭの濃度で含む水溶液を混合する、（３）６０〜９０℃で加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、（４）引き続いて該生物材料に、無定形で長径が２０μｍ以下であり、その比重が４．５〜６．５であり、その硬度（Ｈｖ１０）が８００以上であるジルコニア粉末を含む懸濁液を添加する、（５）超音波処理により前記生物材料を破砕する、（６）該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする。本願第９の発明は、前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする。本願第１０の発明は、前記生物材料がウィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする。本願第１１の発明は、前記微生物がマイコバクテリウム属に属するものであることを特徴とする。本願第１２の発明は、前記生物材料を含む試料が、喀痰、胃液、尿、膿、腹水、胸水、心嚢水、血液、組織などの生物由来試料、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などの組織洗浄液、培地、又は土、水、空気、などの環境材料であることを特徴とする。本願第１３の発明は、前記第１〜１２の発明に係る核酸抽出方法を実施するための試薬キットであって、少なくとも、前記界面活性剤を含む試薬、および前記固形粉末を構成成分として含む試薬からなることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は実施例１で行った方法で、喀痰ＮＡＬＣ処理物からの核酸抽出物に各種濃度の結核菌１６ＳｒＲＮＡの標準ＲＮＡを加えてＴＲＣ反応を行った際の結果を示す。
図２は実施例２で行ったＢＣＧ１０菌から１６０菌を２００μＬの結核陰性喀痰ＮＡＬＣ処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてＲＮＡ増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。１０菌／２００μＬまでの検体が検出できた。
図３は実施例３で行ったマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）１０菌から１６０菌を２００μＬの結核陰性喀痰ＮＡＬＣ処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてＲＮＡ増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。１０菌／２００μＬまでの検体が検出できた。
図４は実施例４で行ったマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）１０菌から１６０菌を２００μＬの結核陰性喀痰ＮＡＬＣ処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてＲＮＡ増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフである。１０菌／２００μＬまでの検体が検出できた。
図５は実施例５で行ったマイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）１０菌から１６０菌を２００μＬの模擬喀痰（ムチン２．１ｍｇ／ｍＬ，ペプトン４．２％溶液）に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてＲＮＡ増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。１０菌／２００μＬまでの検体が検出できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明における検体には、喀痰、胃液、尿、気管支洗浄液、膿、肺胞洗浄液、腹水、胸水、心嚢水、糞便、組織、血液、血清、コロニー、スワブ若しくは他の体液等の生体試料の試料懸濁液、食物試料のホモジェナイズ等の試料懸濁液があげられる。試料が喀痰の場合は、ＮＡＬＣ処理等の試料の粘性を落す前処理を行うとより好ましい結果が得られる。また、環境分析等における環境水や排水、土壌の懸濁液等があげられる。
本発明における生物材料には、ウィルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破砕が難しい真菌、マイコバクテリウム属などの生物材料に有用である。
本発明の核酸抽出法は、検体から核酸を抽出するにあたり、核酸増幅反応阻害物質を界面活性剤で溶出して除去するものであるが、本願発明者らは、核酸増幅反応阻害物質の一つに糖タンパクがあり、界面活性剤によって糖タンパクが可溶化されることによって核酸増幅反応阻害物質を除去する効果を発揮すると考えられる。ここで、このような糖タンパク質の例として、喀痰に含まれる気道粘液糖タンパク質（ムチンと呼ばれる）がある。
本発明に用いる界面活性剤としてステロイド骨格を有するアニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤であれば特に限定されないが、胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ及びそれらの塩等から選ばれた少なくとも１種の界面活性剤が好ましい。コール酸を用いる場合にその濃度は０．１ｍＭから５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２０ｍＭを用いる。また、加熱処理の温度は、特に制限されるわけではないが、好ましくは６０℃〜９０℃、より好ましくは６０℃〜８０℃であり、加熱時間も特に制限されるものではないが、好ましくは２分から２０分、より好ましくは２分から５分である。ここで、加熱処理は静置して行うのが好ましい。さらに界面活性剤処理の回数は、特に制限されるものではないが、１回から５回程度行うことが好ましい。なお、核酸を含有する検体と界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去するには、例えば遠心操作によって実施すれば良い。遠心操作は、特に制限されるものではないが、１６，０００×ｇで５分間行うことで核酸を含有する検体と核酸増幅反応阻害物質含有の界面活性剤溶出物とを分離することができる。本願発明における、界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去する工程は、実際に抽出しようとする核酸や抽出を行う検体を勘案し、予備的な実験を行ったうえで具体的な条件を設定することが重要である。
本発明における固形粉末の材質は特に限定されないが、例えば、ジルコニア、ダイアモンド、アルミナ（酸化アルミニウム）、鉄、合金等が挙げられるが、抽出効率、コストの面から、ジルコニアが好適である。
前記固形粉末は、物理的に生物材料が破砕できればその形状は特に限定されないが、無定形であることが好ましい。該無定形の固形粉末とは、粒子が球形、楕円形等の滑らかな表面を持った形状ではなく、表面に鋭利な凹凸を有する粒子よりなる固形粉末を意味する。前記粒子の大きさはその粒子径の最も長い部分（長径）が平均３２μｍ以下であればよいが、好ましくは平均２０μｍ以下である（測定機器ＣＯＵＬＴＥＲ  ＬＳ１３０）。その比重は、超音波や攪拌による粉末の運動エネルギーを利用して組織を破砕することから、大きい方が好ましく、３．０以上あればよい。抽出された核酸を含む上清と前記固形粉末は、遠心あるいは静置により分離することが可能である。また、固形粉末にあらかじめ磁性体を含有させておくことにより、磁力による分離も可能である。固形粉末の硬さは、硬いほど好ましく、ビッカース硬度（Ｈｖ１０）にして６００以上あることが好ましい。本発明の最適な態様では、長径２０μｍ以下、比重５．７〜６．２、硬度（Ｈｖ１０）９００以上のジルコニアの無定形固形粉末を使用する。ジルコニアの無定形粉末の例としては、電融ジルコニアＺＣＯ−Ｅ６（ＡＳＴＲＯＮ社製、平均長径６μｍ、比重５．８、ビッカース硬度（Ｈｖ１０）１２００）、電融ジルコニアＮＳＴ  ８Ｈ、Ｆ３５０（ＳＡＩＮＴ−ＧＯＢＡＩＮ社製、平均長径２４μｍ、比重６．０、ビッカース硬度（Ｈｖ１０）１２００）、電融ジルコニア＃４００（大平洋ランダム社製、平均長径１８μｍ）等があるが、これに限定されない。試料への固形粉末の添加量は、試料の種類、攪拌方法、攪拌時間によって適宜決められる。固形粉末を添加後、続いて、撹拌及び／又は超音波処理により物理的に菌体を破砕する。
攪拌方法は、試料を入れた容器を手で往復振動させれば良く、振幅の方向は縦でも横でもよいが、好ましくは縦方向に往復振動させるのがよい。あるいは、ボルテックスミキサーで攪拌してもよい。菌体の破砕は、超音波処理による破砕がより好ましく、定常波の影響を除くため、交互または同時に２周波数以上の超音波処理が最も好ましい。超音波処理は試料および粉末固形物を入れた容器を超音波洗浄機の洗浄槽中の液体に浸すか浮かべればよい。攪拌時間または超音波処理時間は、微生物および組織の細胞膜が破壊されるまででよく、具体的には２分間以上でよい。組織が植物の組織の様に、丈夫な細胞壁を持ち硬い場合には、それ以上長くても良い。
本願発明に従えば、核酸増幅反応によって対象生物を同定、検出できる程度に、精製された状態で核酸が細胞から採取できる。また、本願発明は、対象生物として、細胞壁の堅い微生物を含み、さらに核酸阻害物質を多く含む種々の検体に対して有効である。例えば、喀痰に含まれるマイコバクテリウム属の細菌からも効率よく核酸を抽出し、遺伝子の高感度・迅速検査を行うことが可能である。
【実施例】
【０００６】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  喀痰からの核酸抽出試料に存在する阻害物質
非結核性抗酸菌感染患者から同意を得て取得した喀痰（以降「結核陰性喀痰」と記述する）をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理（商品名；ＢＢＬマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体２００μＬを用いて次の２つの処理を行った。即ち、条件１；１ｍＬのＰＢＳに添加し、撹拌した後に１６，０００×ｇで５分間遠心し、上清を取り除いた。条件２；１ｍＬのｐＨ９に調製した１０ｍＭ  コール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（以降「洗浄液」と記述する）に添加し、８０℃のドライヒートブロック上に２分間静置した後、１６，０００×ｇで５分間遠心し、上清を取り除いた。上記１、２の条件で得られたそれぞれの沈査に０．００５％  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含み、０．５ｇ／ｍＬの電融ジルコニアＺＣＯ−Ｅ６（ＡＳＴＲＯＮ社製、平均粒径６μｍ）を懸濁させたＴＥ溶液（ＷＡＫＯ社製、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）５０μＬ（以降「溶菌試薬」と記述する）を添加し、そのチューブを超音波洗浄器ＷＴ−７０ＳＴ（本多電子製、周波数４０ｋＨｚ、出力７０Ｗ）の洗浄浴中に浮かべ、５分間超音波処理を行った。その後、１６，０００×ｇで３分間遠心し、上清を３０μＬ別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。
（１）複数の結核陰性喀痰から上記のように得られた核酸抽出物を混合し、陰性喀痰抽出試料とした。この陰性喀痰抽出試料４．５μＬと結核菌１６ＳｒＲＮＡの領域を含む標準ＲＮＡ（塩基番号２４３〜１８４３（ＲＮＡの塩基番号はＧｅｎＢａｎｋに登録されているＺ８３８６２に従った）を含む標準ＲＮＡで、結核菌の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡ、１６０１塩基）の各種濃度溶液（１ｍＭ  ＥＤＴＡとＲＮａｓｅインヒビターを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液に標準ＲＮＡを溶解。以降同緩衝液を「ＲＮＡ希釈緩衝液」と記述する）０．５μＬを混合し、特開２００４−１９４５８３号公報に記載した方法に従い、核酸増幅反応に供した。なお、コントロール（Ｎｅｇａ）では、陰性喀痰抽出試料に代えてＲＮＡ希釈緩衝液４．５μＬを混合した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣＲ用チューブ（容量０．５ｍＬ；Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記混合試料を添加した。
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
６０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）
１７ｍＭ    塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
６Ｕ        ＲＮａｓｅ  インヒビター（宝酒造（株）製）
１ｍＭ      ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−１０、配列番号１。３’末端側の水酸基はアミノ化されている。）
１．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−１０、配列番号２。５’末端側第１番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモーターの領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。）
１．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＴ１８、配列番号３）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ２−２−Ｓ−Ｇ、配列番号４。５’末端から７番目の「Ａ」と８番目の「Ｇ」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）  上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μＬにおける濃度）
２．０％    ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ    Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）
６．４Ｕ    ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
容量調整用蒸留水
（４）  引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
（５）  各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を図１に示した。これらの結果、上記の条件１では結核陰性喀痰由来の阻害物により抽出物無添加の立ち上がり時間よりも１０３コピーの標準ＲＮＡで４分以上、１０４コピーで３分、１０５コピーで２分以上遅れた。一方、上記の条件２では１０３コピーで３分、１０４コピーで１分、１０５コピーで１分と改善された。
実施例２  結核陰性喀痰の前処理と核酸抽出−その１
結核陰性喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理（商品名；ＢＢＬマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体２００μＬにそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０菌のＢＣＧ溶液を加え、これを検体とした。
１ｍＬの洗浄液を添加し、７０℃のドライヒートブロック上に３分間静置した後、１６，０００×ｇで５分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を５０μＬ添加し、そのチューブを超音波洗浄器ＶＳ−Ｄ１００（本多電子製、周波数２４、３１ｋＨｚ、出力１１０Ｗ）の洗浄浴中に浮かべ、５分間超音波処理を行った。その後、１６，０００×ｇで３分間遠心し、上清を３０μＬ別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち５μＬを実施例１と同様の核酸増幅反応に供してＢＣＧの１６ＳｒＲＮＡの測定を実施した。
各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を図２に示した。これらの結果本願発明の抽出方法によって喀痰中のＢＣＧ菌を検出することが示された。
実施例３
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理（商品名；ＢＢＬマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体２００μＬにそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０菌のマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を加え、これを検体とした。
この検体に１ｍＬの洗浄液を添加し、混合した後、７０℃のドライヒートブロック上に３分間静置し、１６，０００×ｇで５分間遠心して、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を５０μＬ添加し、そのチューブを超音波洗浄器ＶＳ−Ｄ１００（本多電子製、周波数２４、３１ｋＨｚ、出力１１０Ｗ）の洗浄槽中に浮かべ、５分間超音波処理を行った。その後、１６，０００×ｇで３分間遠心し、上清を３０μＬ別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち５μＬを実施例１と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）の１６ＳｒＲＮＡの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−４０、配列番号５）
第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−４０、配列番号６）
第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＡ１６−４、配列番号７）
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ５−Ｓ−Ｇ、配列番号８）
各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を図３に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を検出することが示された。
実施例４
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理（商品名；ＢＢＬマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体２００μＬにそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０菌のマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）を加え、これを検体とした。
この検体に１ｍＬの洗浄液を添加し、実施例３と同様に核酸抽出物を得た。そのうち５μＬを実施例３と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）の１６ＳｒＲＮＡの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−４０、配列番号５）
第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−４０、配列番号６）
第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＩ１８、配列番号９）
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ５−Ｓ−Ｇ、配列番号８）
各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を図４に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）を検出することが示された。
実施例５
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理物の代用物としてムチン溶液（ムチン２．１ｍｇ／ｍＬ、ペプトン４．２％、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）２００μＬにそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０菌のマイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）を加え、これを検体とした。
この検体に１ｍＬの洗浄液を添加し、実施例３と同様に核酸抽出物を得た。そのうち５μＬを実施例３と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）の１６ＳｒＲＮＡの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第１オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−４０、配列番号５）
第２オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−４０、配列番号６）
第３オリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＫ１６−４、配列番号１０）
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ４−Ｓ−Ｇ、配列番号１１）
各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値の１．２倍になるまでの時間）の結果を図５に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）を検出することが示された。
［配列表］
0005212099.tif 000002
0005212099.tif 000003
0005212099.tif 000004
0005212099.tif 000005
【図１】
0005212099.tif 000006
【図２】
0005212099.tif 000007
【図３】
0005212099.tif 000008
【図４】
0005212099.tif 000009
【図５】
0005212099.tif 000010