(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３から選ばれる１以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６２）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６０）、又はビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロールの吸収抑制作用に優れたビフィドバクテリウム細菌、及びこれらビフィドバクテリウム属細菌を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、多くの細胞に存在し、主な生理的な役割として、リポ蛋白質や生体膜の構成成分として細胞の機能を維持すること、胆汁酸や各種ホルモンの原材料になることなどの役割を担っている。しかしながら、含有量の多い食品を過剰摂取し、血清中のコレステロールが増えると動脈硬化の原因となることが知られており、コレステロールを摂取する機会の多い現代の食生活のもとでは、生体内における濃度を抑制することが求められている。【０００３】
そして、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体に血中脂質改善作用があることが報告されている（特許文献１）。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムについては研究が進んでおり、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ  ２９３３Ｒ（ＦＥＲＭ  Ｐ−８７４３）が優れた効果を有していることが報告され（非特許文献１）、この菌体或いは培養物を血清コレステロール上昇抑制剤として利用することが提案されている（特許文献２）。しかしながら、一般に、ビフィドバクテリウム属細菌は酸素や、体内中の胃酸や胆汁酸に弱いため、この菌体や培養物を経口的に摂取した場合には、消化管での生残性が悪く、十分な効果が得られないことが多いという問題があった。このため、生残性に優れた血清コレステロール上昇抑制作用を有するビフィドバクテリウム属細菌が求められている。【０００４】
しかしながら、このような生残性に優れたビフィドバクテリウム属細菌について知られているのは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ  １０２５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２０）（特許文献３）やビフィドバクテリウム・ロンガム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７８７）（特許文献４）が生残性に優れ血清コレステロール上昇抑制作用を示すことや、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＢ５３６、ビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ  １５７００、ビフィドバクテリウム・アニマリスＡＴＣＣ  ２５５２７（非特許文献２）がコレステロール沈降作用を示すことなどにすぎず、このような生残性に優れかつコレステロール抑制作用を有する微生物についての選択肢は少ないのが現状である。【０００５】
また、これら微生物を用いた薬剤・食品は、しばしば長期保存を余儀なくされることから、高い保存安定性が求められるが、従来知られていた微生物には、長期保存後の生残性が低いものが多く、とりわけ、非嫌気条件下の保存後の生残性が低いものが多かった。
【特許文献１】特開昭６１−２７１２２３号公報
【特許文献２】特公平６−９６５３７号公報
【特許文献３】特許第３３８４９０７号
【特許文献４】特開平２００３−２３８４２３号公報
【非特許文献１】第６回日本ビフィズス菌センター学術集会予稿集，１８頁，１９８７
【非特許文献２】Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，１４９−１５１，１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明は、消化管内での生残性に優れ腸管内でコレステロールの吸収抑制作用を有し、血中コレステロール低下等の脂質代謝改善作用に優れるとともに、保存後の生残性が高いビフィドバクテリウム属細菌、及びこれを用いたコレステロール吸収抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムが、意外にも、コレステロール消失作用に優れ、かつ強い酸耐性及び胆汁酸耐性を示し、腸内においても優れたコレステロール吸収抑制作用を有し、また、保存後の生残性が高く、とりわけ非嫌気条件下の保存後でも高い生残性を示すことを見出し、本発明を完成した。なお、本発明に用いる微生物のうち、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス  ＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム  ＹＩＴ  １０３９２及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３は本発明者らが新規に見出した微生物である。【０００８】
すなわち本発明は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムから選ばれる１以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提供するものである。【０００９】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３及びビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７から選ばれる１以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３から選ばれる１以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提供するものである。【００１１】
さらに、本発明は、新規な微生物である、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６２）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６０）、又はビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６１）を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムは、優れたコレステロール消失作用を有するだけでなく、酸耐性及び胆汁酸耐性に優れていることから、腸内においても優れたコレステロール吸収抑制作用を発揮し、血中コレステロールの低下等の脂質代謝改善の目的に利用することができる。また、これらの微生物は、保存後の生残性が高く、特に、非嫌気条件下の保存後でも高い生残性を示すことから、本発明の吸収抑制剤は、長期保存が可能であり、また、非嫌気保存も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いられるビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）としては、例えば、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３が挙げられる。【００１４】
これらビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３、及び本発明で用いられる微生物の一つであるビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ）ＹＩＴ  １０３９４は、コレステロール消失活性が７０％以上、人工胃液での生残率２０％以上、且つ胆汁酸含有培地での増殖性が、クレット値（菌体濁度）で１００以上の性質を有する菌株として本発明者らが単離した新規の菌株である。当該菌株は、以下のような菌学的性質を有する。すなわち、これらの菌の菌学的性質は、いずれも、グラム陽性多形性桿菌、芽胞非形成、非運動性、偏性嫌気性であり、３７℃での生育が可能であり、上に示したコレステロール消失活性、人工胃液での生残率及び胆汁酸含有培地での増殖性以外は、それぞれ順にビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスの有する性質を示した。【００１５】
当該新規菌株についての種の同定は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を用いた菌種同定において、ＹＩＴ  １０３９２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列がビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８６１９４）と９９．６％の相同性を示すこと、ＹＩＴ  １０３９３の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列がビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８６１９４）と９９．６％の相同性を示すこと、及びＹＩＴ  １０３９４の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列がビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８６１８５）と９９．７％の相同性を示すことを根拠とした。ここで、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を用いた菌種同定は、０．５％グルコース添加ＧＡＭ培地を用い３７℃、２４時間、嫌気（炭酸ガス置換）培養した菌液を遠心洗浄した菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の全長をＰＣＲ法によって増幅し、増幅産物の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により決定し、得られた塩基配列をデータベースで検索することにより行った。また、これらの菌株が新規であるとの判断は、基準株と１６ＳｒＤＮＡ塩基配列が異なること、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法による染色体ＤＮＡ多型解析の結果が異なることを根拠として行った。【００１６】
ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４は微生物受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６２として、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２は微生物受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６０として、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３は微生物受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０６６１として、平成１８年８月１４日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに移管した。移管前の寄託先も同じであり、そこへの寄託日は、平成１７年８月１８日である。また、当該寄託センターの住所は、郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６である。【００１７】
また、本発明で用いられるビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ  １２５３及びビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチス  ＪＣＭ  ７１１７は、いずれもＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）及びＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手でき、それぞれのＡＴＣＣナンバーは、ＡＴＣＣ２７５３６及びＡＴＣＣ２７６７４である。【００１８】
これらのうち、本発明で用いられる微生物としては、微生物を用いて発酵乳飲食品を製造し、１０℃で２１日間、非嫌気条件（好気条件）下で保存した後の当該微生物の生残率が５０％以上となる微生物が好ましい。【００１９】
また、本発明の微生物としては、コレステロール消失活性が７０％以上であるビフィドバクテリウム属細菌が好ましく、コレステロール消失活性が７０％以上、人工胃液での生残率２０％以上、且つ胆汁酸含有培地での増殖性がクレット値（菌体濁度）で１００以上であるビフィドバクテリウム属細菌がより好ましい。一般的なビフィドバクテリウム属細菌では、人工胃液での生残率は０〜数％程度、胆汁酸含有培地での増殖性はクレット値（菌体濁度）で０〜数十程度である。上記の値によって選抜された高い酸耐性及び胆汁酸耐性を有する細菌は、多数の菌が生きた状態で腸内に到達することができる。【００２０】
ここで、コレステロール消失活性の算出は、例えば、人工脂質ミセルと共に微生物菌体を静置した際に、上清のコレステロールを常法に従って測定し、菌体を含まない上清のコレステロール量と比較して、次式に当てはめることにより行うことができる。
コレステロール消失活性（％）＝１００−（菌体を含む上清のコレステロール量）／（菌体を含まない上清のコレステロール量）×１００【００２１】
また、人工胃液での生残率は、例えば、ｐＨ３．０の人工胃液で３７℃、１時間保存した時の生残率とすることができる。かかる値が高いことは、消化管内での生存率が高いことを示す。【００２２】
また、胆汁酸含有培地での増殖性は、例えば、０．２％胆汁酸含有培地で３７℃、２４時間培養した時の濁度をクレット値（Ｋｌｅｒｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計、Ｎｏ．６６フィルター）で示したものとすることができる。かかる値が高いことは、消化管内での生存率、増殖率が高いことを示す。【００２３】
なお、微生物の属名、種名及び株名は、命名者の違いによって多様であり、また菌の再分類などのために流動的でもあるので、菌族名、菌種名、菌株名が異なっていても、微生物として実質的に同一である微生物は、本発明の微生物に含まれる。すなわち、例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリスとビフィドバクテリウム・ラクチスは別種として扱われることもあったが、これらをＭａｓｃｏらがビフィドバクテリウム・アニマリスとしてまとめ、その下位分類としてビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスとビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスの２亜種とする報告がなされ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｎｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４，１１３７−１１４３，２００４）、現在に至っている。従って、本発明のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス又はビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスの範囲には、それぞれ従前にビフィドバクテリウム・アニマリス又はビフィドバクテリウム・ラクチスと呼称されていた菌も包含される。【００２４】
また、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＡＴＣＣ  ２７５３６は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３と同一であり、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＡＴＣＣ  ２７６７４は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７と同一であり、それぞれ本発明の微生物に含まれる。なお、ＪＣＭ及びＡＴＣＣではいずれの菌株もビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスとして分類されているが、これら２菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチス（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８９５１３）と１００％一致したことから、本発明ではビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスとした。【００２５】
本発明の微生物は、後記実施例で示すように、コレステロール消失活性を有し、コレステロール、特に血中コレステロール濃度を低下させることから、これを有効量含有するものは、コレステロール吸収抑制剤として、とりわけ腸管からのコレステロール吸収抑制剤として有用である。本発明のコレステロール吸収抑制剤は、血中コレステロールの低下、トリグリセライドの低下、ＶＬＤＬやＬＤＬコレステロールの低下、動脈硬化指数の低下、ＨＤＬコレステロールの上昇等の脂質代謝の改善、閉経後の女性ホルモン欠乏により頻発する高脂血症の改善、動脈硬化の発症リスクの低減のために用いることができると期待される。【００２６】
また、本発明の微生物は、後記実施例で示すように、酸耐性及び胆汁酸耐性を示すので、これを有効量含有するものは、経口投与用のコレステロール吸収抑制剤として用いることができる。【００２７】
さらに、本発明の微生物は、後記実施例で示すように、発酵乳飲食品で好気条件下保存（非嫌気保存）した場合でも高い生残性を有するので、これを有効量含有するものは、好気条件下保存（非嫌気保存）するコレステロール吸収抑制剤として用いることができる。保存温度は、例えば、−８０〜１０℃とすることができる。【００２８】
本発明のコレステロール吸収抑制剤に有効成分として含められる微生物は、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムから選ばれる１以上であればよいが、ここで用いられる微生物の組み合わせとしては、例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３及びビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７から選ばれる１以上の組み合わせ、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３から選ばれる１以上の組み合わせが挙げられる。【００２９】
また、本発明のコレステロール吸収抑制剤には、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７、及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムを単独もしくは組み合わせて用いるほか、これらと他の微生物を併用することもできる。このような微生物としては例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチス、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム、ビフィドバクテリウム・アステロイデス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテニュラータム、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・ガリカム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラータム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・スイス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム等のビフィドバクテリウム属細菌；ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・デルブルッキィ・サブスピーシズ・デルブルッキィ、ラクトバチルス・デルブルッキィ・サブスピーシズ・ブルガリクス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチラス・アミロボラス、ラクトバチラス・アリメンタリウス、ラクトバチラス・ブヒネリ、ラクトバチラス・ブレビス、ラクトバチラス・ガリナラム、ラクトバチラス・ファーメンタム、ラクトバチラス・マルタロミクス、ラクトバチラス・パラカゼイ、ラクトバチラス・ペントサス等のラクトバチルス属細菌；ストレプトコッカス・サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌；ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ラクチス等のラクトコッカス属細菌；ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシズ・クレモリス等のロイコノストック属細菌；ペディオコッカス・セレビシエ等のペディオコッカス属細菌；エンテロコッカス・フェカリス等のエンテロコッカス属細菌；アセトバクター・アセチ等のアセトバクター属細菌；グルコノバクター・オキシダンス等のグルコノバクター属細菌；バチルス・ズブチリス等のバチルス属細菌；サッカロマイセス・セルビシエ等のサッカロマイセス属酵母；トルラスポラ・デルブルエッキー等のトルラスポラ属酵母；キャンジダ・ケフィア等のキャンジダ属酵母；クリベロマイセス・マルキシアヌス等のクルイベロマイセス属の酵母；デバリオマイセス・ハンセニー等のデバリオマイセス属酵母；ピキア・アノマラ等のピキア属酵母；ジゴサッカロマイセス・ロキシ等のジゴサッカロマイセス属酵母；アスペルギルス・オリーゼ、ムコール・ジャポニカス、モナスカス・プルプレウス、ペニシリウム・カマンベリ、リゾムコール・プシラス、リゾプス・アリザス等のアスペルギルス属、ムコール属、モナスカス属、ペニシリウム属、リゾムコール属、リゾプス属のかびなどが挙げられる。【００３０】
また、本発明のコレステロール吸収抑制剤に含められる微生物は、凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら微生物を含む培養物として利用することもできるが、いずれの形態であっても、微生物が生菌の状態であることが好ましい。【００３１】
本発明のコレステロール吸収抑制剤は、前記の微生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００３２】
また、本発明のコレステロール吸収抑制剤は、前記の微生物をそのまま摂取、あるいは食品に直接添加することにより摂取するほか、飲食品の形態で摂取することができる。飲食品の好ましい例としては、本発明の微生物を生菌の状態で含有する発酵乳、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液、発酵米汁、発酵麦汁や動・植物由来素材の発酵飲食品（漬物、味噌、醤油、発酵茶、発酵ソーセージ、発酵マヨネーズ、チーズ、塩辛等）が挙げられ、これら飲食品は通常の方法により製造することができる。例えば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地にビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  ７１１７、及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムのうち少なくとも１つ以上を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる本発明の発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状、凍結状等のいずれの形態の製品とすることもできる。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。発酵乳中の本発明の微生物濃度は、例えば、１０３〜１０１３ｃｆｕ／ｍｌとすることができる。【００３３】
この場合、本発明のコレステロール吸収抑制剤には、通常の飲食品に用いられる食品素材、例えば糖類、タンパク質、ペプチド、脂質、ビタミン類、ミネラル類、野菜、穀物、果実などの植物成分、血液、乳、肝臓、骨、筋肉などの動物成分、細菌、カビ、酵母、キノコなどの微生物成分あるいは培養物成分、ゲル化剤、固化剤、増粘剤、香料、着色料、ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進剤、乳酸菌増殖促進剤等を配合することができる。具体的には、グルコース、シュクロース、フラクトース、マルトース、ブドウ糖果糖液糖、キシロース、パラチノース、蜂蜜、メイプルシロップ、甘酒等の各種甘味料、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の各種糖アルコール、スクラロース、アスパルテーム等の各種高甘味度甘味料、甘草、ステビア、グリチルリチン酸配糖体などの各種天然甘味料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の各種乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の各種増粘（安定）剤が挙げられる。【００３４】
このほかにも、タガトース、ラクトース、トレハロース、トレハルロース、アガロオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラフィノース、スタキオース、ラクチュロース、マルトトリオース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン等の各種糖質、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、フコイダン、サルガッサン、フルセラン、フノラン、ポルフィラン、アミナラン、プルラン、タラガム、コンニャクマンナン、イヌリン、キチン、キトサン、ポリデキストロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、β−グルカン、マンナン、ガラクタン、フルクタン、キシラン、アラビナン、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ビートファイバー、オート麦ファイバー、小麦ファイバー、大豆ファイバー、米ファイバー、大麦ファイバー、キサンタンガム、コーンファイバー、リンゴファイバー、シトラスファイバー、サイリュームファイバー、パインファイバー、プルーンファイバー、エンドウ豆ファイバー、バナナファイバー、酢酸菌バクテリアセルロース、乳酸菌菌体細胞壁、ビフィドバクテリウム属細菌菌体細胞壁、酵母菌体細胞壁、納豆フラクタン、コラーゲン、納豆ポリグルタミン酸等の各種食物繊維あるいはそれら食物繊維の各種加水分解物、小麦フスマ、大麦フスマ、米フスマ、カラス麦フスマ、オーツ麦フスマ、ライ麦フスマ、サイリュウム、米糠、玄米、チッコリー、大豆おから、アップルパルプ、レジスタントスターチ、大麦麦芽、トウモロコシ種子外皮、乳酸菌菌体、ビフィドバクテリウム属細菌菌体、ビール酵母菌体、ワイン酵母菌体、ワイン粕、酒粕、しょうゆ粕、ビール粕、米麹、麦麹、豆麹、紅麹、黄麹、納豆粘質物、ブドウ種子抽出物、ローヤルゼリー、プロポリス、クロレラ、スピルリナ、ユーグレナ、ワカメ、コンブ、ホンダワラ、アラメ、カジメ、アサクサノリ、アオノリ、ヒジキ、アオサ、モズク等の難消化性の食物繊維を多く含む各種素材が挙げられる。【００３５】
さらに、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン、ヨウ素、セレン、銅、コバルト、ドロマイト等の各種ミネラル類あるいはそれらミネラルの各種塩類、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、ピルビン酸、グルコン酸、コハク酸、フマル酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リン酸、クレアチン、メチオニン、システイン、グルタミン酸などのアミノ酸等の各種酸類あるいはそれらの酸類の各種塩類、グルタチオン、フィチン、フィチン酸、リグニン、ポリ−γ−グルタミン酸およびその分解物、サポニン、フェルラ酸、γ−アミノ酪酸、γ−オリザノール、カルコン、フラバノン、フラボン、フラボノール、イソフラボン、アントシアン、カテキン、プロアントシアニジン、茶葉ポリフェノール、クルクミド、カプサイシノイド、セサミノール、ゴマリグナン、テアフラビン、βジケトン類、カロチノイド類、アリルイオウ化合物、イソチオシアナート類、テルペン類、クロロフィル類、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、ｎ−３多価不飽和脂肪酸類、ｎ−６多価不飽和脂肪酸類、共役リノール酸類、リン脂質類、植物ステロール類等の各種成分、グリシニン、コングリシニン等の大豆タンパク、オボアルブミン、オボムコイド等の卵タンパク、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトフェリン等の乳タンパクおよび乳清タンパク、カゼインホスホペプチド、オリゼニン等の米タンパク、グルテニン、グリアジン等の小麦タンパク、魚肉タンパク等の各種タンパク類およびそれらの酵素分解ペプチドおよび酸分解ペプチド類、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、βカロチン、レチノイン酸、葉酸等の各種ビタミン類、ブラックコホッシュ、セイヨウカボチャ種子、ザクロ種子、セイヨウオトギリソウ、パッションフラワー、バレリアン、プエラリア・ミリフィカ、ローズマリー、ペパーミント、パセリ、マリーゴールド、レモンバーム、ヨモギ、サフラワー、ダイコン種子、コーヒーノキ、ウコギ、ユウガオ果実、ミカン科果皮、イチョウ葉、ナツメ、クコシ、甘草、霊芝、高麗ニンジン、ガラナ等の各種エキス類、緑茶、紅茶、ウーロン茶、ギムネマ茶、グァバ葉等の各種植物抽出物、コショウ、サンショウ、シナモン、ターメリック、セイジ、タイム、バジル、トウガラシ、ナツメグ等の各種香辛料が挙げられる。【００３６】
また、米、玄米、大麦、小麦、オーツ麦、ライ麦、ハトムギ、アマランサス、アワ、キビ、ソバ、モロコシ、トウモロコシ等の各種穀物の成分あるいはそれら穀物の種子の各種発芽物成分、アズキ、シロアズキ、キントキマメ、インゲンマメ、エンドウマメ、ムラサキハナマメ、チャナマメ、クロダイズ、アオダイズ、リョクトウ、ソラマメ、ダイフクマメ、アシタバ、ケール、ウコン、ジャガイモ、サツマイモ、紫サツマイモ、ヤマイモ、カボチャ、ナス、トマト、ニガウリ、ピーマン、ゴマ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、レタス、エダマメ、ショウガ、ゴボウ、セロリ、ダイコン、ワサビ、アボカド、ニンジン、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ユリ、ラッキョウ、シソ、ネギ、ニラ、パースニップ、ワラビ、タケノコ、シイタケ、マッシュルーム等の各種野菜成分、レモン、リンゴ、ブドウ、イチゴ、オレンジ、カキ、グァバ、バナナ、ブルーベリー、ブラックベリー、クランベリー、キイチゴ、コケモモ、ヤマモモ、フェイジョア、タマリロ、アセロラ、ライム、シークワーサー、メロン、モモ、マンゴー、ユズ、パパイア、パインアップル、ナシ、プラム、グレープフルーツ、カリン、アンズ、ミカン、ザクロ、スイカ、プルーン、キウイ等の果実成分、ピーナッツ、アーモンド、ココナッツ、カシューナッツ、マカデミアナッツ、カカオ、クリ、ギンナン、クルミ等の各種ナッツ成分、牛乳、脱脂乳、乳清、クリーム、発酵乳、ヨーグルト、乳タンパク、カゼイン、乳清タンパク等の各種乳製品およびそれらの成分、清酒、ブドウ酒、紹興酒、ビール等の醸造酒類、ウィスキー、ブランデー、ウォッカ等の蒸留酒類等が挙げられる。【００３７】
ビフィドバクテリウム属細菌を利用した発酵乳飲食品において、保存時の生残性を高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された容器が主に用いられてきたが、後記実施例に示すとおり、本発明の微生物は、高い酸素耐性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、本発明のコレステロール吸収抑制剤の容器素材には、酸素透過性の高い樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等）も使用できる。これらの樹脂を用いた容器は、酸素不透過性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低く、成型の自由度が高い等のメリットを有する。【００３８】
本発明のコレステロール吸収抑制剤の有効成分である微生物は、後記実施例に示すとおり、優れた酸耐性を示すことから、本発明のコレステロール吸収抑制剤は、酸性とすることができ、例えば、２５℃におけるｐＨを２〜７、特に３〜６とすることができる。【００３９】
本発明のコレステロール吸収抑制剤の有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌は、従来より食品として利用され、その安全性も確認されているものであることから、これをコレステロール吸収抑制剤として使用する場合の投与量に厳格な制限はないが、その好適な投与量は生菌数として１日当たり１０５ｃｆｕ〜１０１３ｃｆｕであり、特に１０８ｃｆｕ〜１０１２ｃｆｕが好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
〔試験例１〕
（１）コレステロール消失活性
ｍ−ＩＬＳ培地（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１．１３１−１３６  ２００３）で２４時間３７℃にて嫌気培養した培養液を１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、菌体をｐＨ５．５の１５０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した。遠心洗浄は３回繰り返したのち濁度（６６０ｎｍでの吸光度）が３（菌数として１０８〜１０９ｃｆｕ／ｍｌ）になるように１５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。また菌体懸濁液を１２１℃で１５分オートクレーブ処理を行い、死菌体懸濁液を調製した。
牛胆汁粉末２ｇ、コレステロール９２１ｍｇ、リゾフォスファチジルコリン１３５ｍｇ、モノオレイン酸９０．２ｍｇ、オレイン酸７０２．２ｍｇを１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理を１２分間行ったのち、１００，０００Ｇで１８時間２５℃にて超遠心し、ミセル層を回収し、人工脂質ミセルを調製した。菌体懸濁液１ｍｌ（菌数として１０８〜１０９ｃｆｕ）に対して人工脂質ミセルを１５０μｌ加え、３７℃に静置した。１８時間後、１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した上清のコレステロールをデタミナＴＣ５５５（協和メディックス）で測定した。対照として、菌体を含まないリン酸緩衝液も同様の操作を行い、下式によりコレステロール消失活性を算出した。また、死菌体懸濁液についても同様にコレステロール消失活性を算出した。
コレステロール消失活性（％）＝１００−（菌体を含む上清のコレステロール量）／（菌体を含まない上清のコレステロール量）×１００【００４１】
（２）酸耐性
塩酸でｐＨ３に調製した５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液１０ｍｌにＧＡＭ培地（日水）で定常期まで培養した菌液０．１ｍｌを加え、３７℃で１時間処理し、下式により生残率を算出した。
生残率（％）＝（酸処理後の生菌数）／（酸処理前の生菌数）×１００【００４２】
（３）胆汁酸耐性
ＧＡＭ培地で定常期まで培養した菌液３０μｌを、０．２％の胆汁酸を添加した３ｍｌのＧＡＭ培地に接種し、３７℃で嫌気的に培養した。２４時間後に菌体濁度をＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計（Ｎｏ．６６フィルター）で測定した。【００４３】
上記（１）〜（３）の試験結果を表１に示した。【００４４】
【表１】
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【００４５】
表１に示すように、本発明のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチス及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムは高いコレステロール消失活性を示し、酸耐性、胆汁酸耐性に優れていた。また、死菌体ではコレステロール消失活性を有さなかったことから、これらの菌は生菌の状態で活性を示すことが分かった。【００４６】
次に、上清からのコレステロールの消失が、沈殿によるものか、変換や分解によるものかを知る目的で、沈殿部分のコレステロールを測定したところ、上清から消失したコレステロールは、変換や分解されずに沈殿物中に存在していることが明らかとなった。以上のことから、上清中のコレステロールは菌体に取り込まれて沈殿したか、或いは、菌体が有する胆汁酸の脱抱合作用等により、脂質ミセルが崩壊して沈殿した可能性が示唆された。【００４７】
〔試験例２〕  動物の血中脂質及び肝臓脂質に及ぼす影響
酵母エキス０．０３％を含んだ１０％脱脂粉乳培地を１２１℃で１５分滅菌し、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３を１％接種し２４時間嫌気的に培養した。この培養液を同培地に２％接種し、３７℃で４６〜５４時間嫌気的に培養した。かくして調製された発酵乳中に含まれる生菌数は３．７×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。この発酵乳を凍結乾燥し、表２に示した組成で餌を調製した。ここで、餌における生菌数は１．０×１０６ｃｆｕ／ｇであった。一方、対照として、酵母エキス０．０３％を含んだ１０％脱脂粉乳培地を１２１℃で１５分滅菌後、菌は接種せずに凍結乾燥したものを未発酵乳とし、表２に示した組成で餌を調製した。【００４８】
【表２】
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【００４９】
次に、８週齢で購入したＷｉｓｔａｒ系の卵巣摘出ラット（日本ＳＬＣ）または偽手術ラットを、１週間の予備飼育後、１週間ＡＩＮ−９３Ｇ精製飼料に馴化させ、体重によって、表３に示す実験群に群分けした。【００５０】
【表３】
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【００５１】
かくして群分けされたラットを、室温２４±１℃、湿度５５±５℃で、それぞれの群に対応する餌及び水の自由摂取可能条件下、個別ブラケットケージにて３４日間試験飼料にて飼育した。１日あたりの生菌数摂取量は約１０７ｃｆｕ／匹であった。
次に給餌器を取り除き、４時間後に、ネンブタール麻酔をし、腹大動脈血の採取、及びかん流して肝臓の採取を行った。肝臓は分析まで−２０℃で保存し、血液は３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、血漿を分離した。肝臓は凍結乾燥後Ｆｏｌｃｈの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６，４９７−５０９，１９５７）により抽出した。
かくして得られた血漿及び肝臓抽出物に含まれる総コレステロール、トリグリセライドの量を、それぞれデタミナＴＣ５５５（協和メディックス）、トリグリセライドＥテストワコー（和光純薬）を使用して求めた。また、血漿に含まれるＨＤＬコレステロールの量を、ＨＤＬ−コレステロールＥテストワコー（和光純薬）を用いて求めた。さらに、血漿に含まれるＶＬＤＬ＋ＬＤＬ−コレステロールの量を、総コレステロール量からＨＤＬコレステロール量を差し引くことにより求めた。
得られた結果をもとに、卵巣摘出群について２元配置の分散分析を行い、ｐを求めた。また、偽手術群と同様の餌を投与した卵巣摘出群についてｔ検定を行った。得られた結果を表４〜６に示す。値は平均値±ＳＤで表した。なお、表４〜６において交互作用とは、発酵乳とガラクトオリゴ糖の間における交互作用を示す。【００５２】
【表４】
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表４に示すとおり、卵巣摘出ラットは偽手術群と比較して、既報通り（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｃｏｌ  ８８：１８３−１９３、１９７５）体重や摂食量が多くなったが、卵巣摘出群の中ではオリゴ糖の有無や発酵乳投与の影響は認められず、良好に成長した。【００５３】
【表５】
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【００５４】
また、表５に示すとおり、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３で調製した発酵乳の効果は、血中のコレステロール、トリグリセライド、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ−コレステロール、動脈硬化指数に認められ、いずれの項目も低下させた。特にＶＬＤＬ＋ＬＤＬ−コレステロールの低下は著しかった。また、これらの項目に対するオリゴ糖の効果や発酵乳とオリゴ糖の交互作用は統計学的には観察されなかったが、オリゴ糖と発酵乳の併用投与群の血中総コレステロール、トリグリセライド、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ−コレステロール、動脈硬化指数の値が最も低い値を示した。ガラクトオリゴ糖はビフィドバクテリウム属細菌に特異的に利用されることが知られている。したがって、ガラクトオリゴ糖を含む発酵乳を投与することにより、腸管内でビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３が増殖し、血中脂質を効果的に低下させることが示された。なお、卵巣を摘出することにより、血中総コレステロールが上昇し、閉経後高脂血症モデルとして有用であることが知られている。卵巣摘出・未発酵乳・オリゴ糖なし群と偽手術群とのデータの比較から、今回の試験における卵巣摘出手術が成功したことが示された。【００５５】
【表６】
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【００５６】
表６に示すように、オリゴ糖の有無や発酵乳投与の有無による肝臓コレステロール含量への影響はなく、肝臓への脂質の蓄積はなかった。トリグリセライドの場合、発酵乳の投与により肝臓当たりでは統計学的な有意差は観察されなかったが、肝臓１ｇ当たりのトリグリセライド含量が低下した。
以上のように、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３で調製した発酵乳は、血中の総コレステロール、トリグリセライド、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ−コレステロール、動脈硬化指数を低下させたことから、コレステロールのみではなく、各種血中脂質に対する脂質代謝改善能を有し、動脈硬化の発症リスクを低減する効果を有することが明らかとなった。【００５７】
〔試験例３〕  発酵乳中での生残性の検討
１０％の脱脂乳に０．０３％の酵母エキスを添加して殺菌し、本発明の細菌（ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ＪＣＭ  ７１１７、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２、ＹＩＴ  １０３９３）をそれぞれ２％接種して、３７℃でｐＨ５．１±１．０まで培養し、５種類の発酵乳を製造した。また、対照としてビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  １５７０７を用いて同様に発酵乳を製造した。
調製した発酵乳を嫌気保存の場合にはガラス試験管に、非嫌気保存（好気保存）の場合にはポリプロピレンチューブに１０ｍｌずつ分注し、１０℃で１２週間保存した。嫌気保存の場合はＮ２気流下ブチルゴム栓で密栓し、非嫌気保存の場合はポリプロピレンチューブのふたをゆるく締めた。表７に培養終了時のｐＨ及び生菌数、表８に非嫌気保存下の菌数の推移、表９に嫌気保存下の菌数の推移を示した。【００５８】
【表７】
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【００５９】
【表８】
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【００６０】
【表９】
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【００６１】
表８に示すように、非嫌気条件（好気条件）保存では、対照に用いたビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  １５７０７は３週間後には９．２×１０３ｃｆｕ／ｍｌまで減少し、８週間後以降は検出されなかった。それに対して本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、いずれの菌株についても３週間保存しても１×１０８ｃｆｕ／ｍｌを下回ることはなく、培養終了時と比較した時の生残率は５０％以上となった。また、１２週間保存してもビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ＪＣＭ  ７１１７では１×１０８ｃｆｕ／ｍｌを下回ることはなく、残りの３菌株（ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２、ＹＩＴ  １０３９３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４）も１〜２オーダー程度の減少に留まった。
表９に示すように、嫌気条件保存では、３週間保存後、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  １５７０７は１／１０程度まで菌数が低下したが、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は培養終了時の菌数をほぼ維持した。ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９２、ＹＩＴ  １０３９３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４は１２週間保存しても１／２〜１／６程度にしか菌数は減らず、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ  １２５３、ＪＣＭ  ７１１７は１２週間後も菌数はほとんど同じであった。【００６２】
〔処方例１〕錠剤の製造
下記の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方）                                    （ｍｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物１）               ２０
微結晶セルロース                            １００
乳糖                                              ８０
ステアリン酸マグネシウム                       ０．５
メチルセルロース                               １２
１）：ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ１０３９２の生菌体を凍結乾燥して得た。【００６３】
〔処方例２〕発酵乳飲料の製造
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加して殺菌し、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムＹＩＴ  １０３９３を１％接種し、３５℃で２４時間嫌気培養して発酵乳ベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、乳化鉄０．２ｇを水に溶解し、全量を７９０ｇとして殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られた発酵乳ベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳飲料を得た。得られた発酵乳飲料は外観・風味ともに良好で、製造直後の生菌数は、２．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。また、１０℃で２１日間保存した後の生菌数は１．４×１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、保存安定性も良好であった。【００６４】
〔処方例３〕清涼飲料の製造
下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。得られた清涼飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
（処方）                                    （ｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物１）          ５
香料                                           ０．８
水                                          １００
還元澱粉糖化物                          ２４
果糖                                         １８
１）：ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ  １０３９４の生菌体を凍結乾燥して得た。