(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に連結された真核生物由来のプロモータ（但し、ｔＲＮＡ遺伝子プロモータを除く）とを含むこと、
前記真核生物由来のプロモータが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列であるか、又は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩ又はタイプＩＩＩプロモータであること
を特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記ｔＲＮＡ遺伝子が、古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ遺伝子及び／又は大腸菌由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子である請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に転写終結配列をさらに結合させた請求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩＩＩプロモータが、Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータである請求項１〜３何れか記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータが、配列番号３に記載の塩基配列、又は該塩基配列と機能的に同等な塩基配列からなり、かつ哺乳動物細胞内においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を誘導する請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記機能的に同等な塩基配列はコンセンサス配列である請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列が、Ｕ１ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータである請求項１〜３何れか記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１〜７何れか記載のＤＮＡ構築物を真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で転写させることを特徴とするサプレッサーｔＲＮＡの合成方法。
【請求項９】
請求項１〜７何れか記載のＤＮＡ構築物により形質転換又はトランスフェクションされたことを特徴とする組換え真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）。
【請求項１０】
請求項１〜７何れか記載のＤＮＡ構築物により転写されるｔＲＮＡと、当該ｔＲＮＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とを真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で発現させることを特徴とするアミノアシルｔＲＮＡの合成方法。
【請求項１１】
（ａ）非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能であり、請求項１〜７の何れかに記載のＤＮＡ構築物から転写されるｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質と、
を前記非天然型アミノ酸の存在下に真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で発現させることを特徴とする非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
前記非天然型アミノ酸がリジン誘導体及び／又はチロシン誘導体である請求項１１に記載の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
前記リジン誘導体が、ピロリジン、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、及びＮε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジンからなる群より選択される１種である請求項１２に記載の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
前記チロシン誘導体が、３−ヨードチロシン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又は４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンである請求項１２に記載の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔＲＮＡの合成方法とそのためのＤＮＡ構築物に関し、特に非天然型アミノ酸に対応するサプレッサーｔＲＮＡの合成方法及びそのためのＤＮＡ構築物並びにそれらを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常のタンパク質合成に関わる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（非天然型アミノ酸）で置換した、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質（以下、「アロタンパク質」ともいう）は、タンパク質の機能・構造解析のための有効な手段となり得る。一方、リジン誘導体の中には、アセチルリジン、メチルリジン等のように、翻訳後修飾により合成されるアミノ酸がある。それらは、特にヒストンによる遺伝子発現調節に関わることで有名であるが、その他多くのタンパク質の転写活性化調節、タンパク質−タンパク質相互作用調節、ユビキチン化の抑制／促進に関わることが知られている。このようなリジン誘導体が、真核生物に部位特異的に導入できれば、リジンのアセチル化、メチル化等について多くの知見が得られると期待される。【０００３】
ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、メタン生成古細菌（Methanosarcina属）から発見された新しいアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）である。その対応するｔＲＮＡ（ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡ）は、サプレッサーｔＲＮＡであり、異常に小さいＤループ等の特異な二次構造を有する。最近、大腸菌内でＰｙｌＲＳとピロリジンｔＲＮＡが、内在性のａａＲＳ及びｔＲＮＡとは相互作用をせず（直交性）、ピロリジンをアンバーコドン特異的にタンパク質に導入し得ることが見出された（非特許文献１）。また、野生型ＰｙｌＲＳが、大腸菌内でＮε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン等の非天然型アミノ酸をピロリジンｔＲＮＡに結合させ得ることが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
一方、哺乳動物の細胞内において、タンパク質中のチロシン残基をリン酸化する酵素（チロシンキナーゼ）は、細胞外からの増殖刺激因子などのシグナルを核内に伝達する重要な役割を果たしている。このチロシンキナーゼは、チロシン誘導体をリン酸化できるものと、リン酸化できないものの両方が存在する。例えば、Ｓｒｃキナーゼはヨードチロシン残基をリン酸化するが、ＥＧＦ受容体はできないことが分かっている。したがって、所望のタンパク質にチロシン誘導体を導入したアロタンパク質を哺乳動物細胞内で合成することができれば、細胞内の種々のチロシンキナーゼとの相互作用を調べるために有用である。例えば、前記所望のタンパク質がどのチロシンキナーゼによってリン酸化されるのかを調べることはシグナル伝達機構を解析する上で重要である。さらに、これらの非天然型アミノ酸組み込みタンパク質は、それ自体でタンパク質機能・構造解析の材料として有用であり、新たな生理活性を有する物質にもなり得る。【０００５】
このような動物細胞内でのアロタンパク質の発現方法としては、（Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、変異ＴｙｒＲＳという）と、（Ｂ）前記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質遺伝子とを動物細胞中で発現させて、上記タンパク質のナンセンス変異又はフレームシフト変異の位置に上記チロシン誘導体を取り込ませる方法が開発されている（特許文献１、非特許文献２）。【０００６】
ここで、上記非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡは、真核細胞内のＲＮＡポリメラーゼにより転写されなければならない。原核細胞における１種類のＲＮＡポリメラーゼとは異なり、真核細胞では３種類のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ（ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、及びｐｏｌＩＩＩ）が夫々機能分担して働くことが知られている。ＰｏｌＩはリボソームＲＮＡ、ＰｏｌＩＩはｍＲＮＡ、そしてＰｏｌＩＩＩは５ＳｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、Ｕ６低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）等を合成する。従って、真核細胞内のｔＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで転写されることによって合成される。このＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される遺伝子は、そのプロモータ構造の特徴により大きく３つのグループに分類され、夫々代表的な遺伝子として５ＳｒＲＮＡ遺伝子（タイプＩプロモータ）、ｔＲＮＡ遺伝子（タイプＩＩプロモータ）、及びＵ６低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）遺伝子（タイプＩＩＩプロモータ）を含む。ｔＲＮＡを転写するタイプＩＩプロモータは、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの領域から成り立つ内部プロモータであり、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ボックスＡのコンセンサス配列は、８位〜１９位のＴＲＧＣＮＮＡＧＹＮＧＧ（配列番号１）であり、ボックスＢのコンセンサス配列は、５２位〜６２位のＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ（配列番号２）である。このため、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のサプレッサーチロシンｔＲＮＡは、原核生物由来であるものの、そのサプレッサーチロシンｔＲＮＡコーディング配列内には、ボックスＡとボックスＢが存在しているため（例えば、非特許文献３参照）、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができる。【０００７】
また、上記タンパク質のナンセンス変異の位置にアミノ酸を取り込ませることをサプレッションというが、終止コドンは３種類しかないため、１種類のタンパク質に導入できる非天然型アミノ酸の種類は最大３種類である。試験管内の実験では自然に存在する塩基対の他に、人工的な塩基対が開発されており（非特許文献４及び５参照）、このような人工的な塩基を含むＲＮＡは試験管内においてＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼを用いて転写することが可能である。アミノ酸をコードするコドンに人工塩基対を導入することで、現在、４３個であるコドン数を増やし、天然のアミノ酸をコードしないコドンに非天然型アミノ酸をコードさせることで、１種類のタンパク質に複数の非天然型アミノ酸を導入できると期待されている。【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３９９８９号パンフレット
【非特許文献１】Blight, S.K. et al., Nature, 431, 333-335(2004)
【非特許文献２】Sakamoto, K. et al., Nucleic Acids Research 30, 4692-4699(2002)
【非特許文献３】M.Sprinzl et al., Nucleic Acids Research 17, 1-172(1989)
【非特許文献４】Hirao, I. et al.，Nature Biotechnology 20, 177-182(2002)
【非特許文献５】Hirao, I. et al.，Nature Methods 3, 729-735(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述した非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを真核細胞内で発現しようとした場合、ボックスＡとボックスＢに対応する配列が真核生物のコンセンサス配列と大きく異なる場合には内部プロモータとして機能せず、真核細胞内での転写合成量が極めて少ないか、或いはほとんど転写されないことが問題となる。例えば、メタン生成古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡのＤループは、数塩基が欠損した異常に小さいものであり真核細胞内では内部プロモータとして機能しない。また、大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡは配列内にボックスＢコンセンサス配列は有しているがボックスＡコンセンサス配列を含まない。これらのｔＲＮＡにボックスＡとボックスＢを導入すると、ｔＲＮＡとしての機能が失われてしまうため、ボックスＡとボックスＢを導入したピロリジンｔＲＮＡや大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡを用いても、リジン誘導体やチロシン誘導体を組み込んだアロタンパク質を合成することができない。【００１０】
一方、これらの内部プロモータを持たないサプレッサーｔＲＮＡを、外部プロモータを用いて真核細胞内で発現させた場合に、ｔＲＮＡとして機能するかどうかは明らかではない。すなわち、ｔＲＮＡの機能を発揮するためには転写後の塩基修飾及び立体構造形成などが正常に行われることが必要であるが、タイプＩＩプロモータ以外の外部プロモータにより転写されたｔＲＮＡがどのような細胞内局在性を示し、また転写後修飾を受けるか、さらには生物学的機能を示すか否かについては未だ明らかではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明者らは、種々の検討を行った結果、メタン生成古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ遺伝子や大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に、真核生物のｔＲＮＡ核酸配列やＵ１及びＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子のプロモータ配列を結合させることによって動物細胞内で効果的に発現させうることを見出した。また、前記ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端にバクテリオファージ由来のプロモータ配列を結合させ、当該プロモータを転写可能なＲＮＡポリメラーゼと共に動物細胞内に導入することによって、前記ｔＲＮＡを効率的に発現させうることも分かった。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【００１２】
すなわち、本発明は第一の視点において、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に連結された真核生物由来のプロモータとを含むことを特徴とするＤＮＡ構築物を提供する。前記ｔＲＮＡ遺伝子は、古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ遺伝子及び／又は大腸菌由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子であること、並びに前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に転写終結配列をさらに結合させることが好ましい。さらに好ましい実施形態において、前記真核生物由来のプロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩによる転写を誘導する塩基配列である。前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列は、例えば、Ｕ１ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータであることが好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を誘導する塩基配列は、例えば、ヒトバリンｔＲＮＡ核酸配列のような真核生物のｔＲＮＡ遺伝子プロモータ、又はＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータであることが特に好ましい。【００１３】
第二の視点において、本発明は、上記ＤＮＡ構築物を真核細胞内で転写させることを特徴とするサプレッサーｔＲＮＡの合成方法、及び上記ＤＮＡ構築物により形質転換又はトランスフェクションされたことを特徴とする組換え真核細胞を提供する。【００１４】
第三の視点において、本発明は非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法であって、（ａ）非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能であり、上記何れかのＤＮＡ構築物から転写されるｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質と、を前記非天然型アミノ酸の存在下に真核細胞内で発現させることを特徴とする。【００１５】
第四の視点において、本発明は、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に連結されたバクテリオファージ由来のプロモータとを含むことを特徴とするＤＮＡ構築物を提供する。前記ｔＲＮＡ遺伝子は、古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ遺伝子及び／又は大腸菌由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子であること、並びに前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に転写終結配列をさらに結合させることが好ましい。また、バクテリオファージ由来のプロモータは、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ及びＳＰ６プロモータを使用することが好ましいが、これらに限定されない。【００１６】
第五の視点において、本発明は、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に連結されたバクテリオファージ由来のプロモータとを含むことを特徴とするＤＮＡ構築物を真核細胞内で転写させることを特徴とするサプレッサーｔＲＮＡの合成方法、及び前記ＤＮＡ構築物並びに前記バクテリオファージ由来のプロモータに対応するＲＮＡポリメラーゼを発現する遺伝子により形質転換又はトランスフェクションされたことを特徴とする組換え真核細胞を提供する。【００１７】
第六の視点において、本発明は、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法であって、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端領域に機能的に連結されたバクテリオファージ由来のプロモータとを含むＤＮＡ構築物を用意し、ここで、前記サプレッサーｔＲＮＡは、非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下において当該非天然型アミノ酸と結合可能であり、（ａ）前記ＤＮＡ構築物から転写されるｔＲＮＡと、（ｂ）前記非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質と、を前記非天然型アミノ酸の存在下に真核細胞内で発現させることを特徴とする。【００１８】
第七の視点において、本発明は、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法であって、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端領域に機能的に連結されたバクテリオファージ由来のプロモータとを含むＤＮＡ構築物を用意し、ここで、前記サプレッサーｔＲＮＡは、非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下において当該非天然型アミノ酸と結合可能であり、（ａ）前記バクテリオファージ由来のプロモータに対応するＲＮＡポリメラーゼと、（ｂ）前記非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質と、を前記ＤＮＡ構築物及び前記非天然型アミノ酸の存在下に真核細胞内で発現させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の製造方法を用いれば、非真核生物由来のｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡを、真核細胞中で効果的に発現させることができ、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列（ボックスＡ、ボックスＢ）を有さない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、真核細胞中で発現させることが可能である。また、本発明の製造方法を用いれば、人工の非天然型塩基を含むｔＲＮＡを真核細胞内で発現させることが可能になると期待され、４種類以上の非天然型アミノ酸を含むアロタンパク質の合成が期待される。【００２０】
また、本発明の製造方法を用いれば、古細菌由来の野生型のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、特に真核生物に存在するＮε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン、蛍光基を有するＮε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジン等のリジン誘導体が導入されたアロタンパク質を合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を示す。
【図２】実施例１において、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。
【図３】実施例２において、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。
【図４】３種類のプロモータ又はエンハンサーを用いてｔＲＮＡＰｙｌを発現させたときのｌａｃＺアンバーサプレッションの結果を示す。
【図５】Ｕ６プロモータに連結したｔＲＮＡＴｙｒによるｌａｃＺアンバーサプレッションについて３種類の非天然型アミノ酸を添加した場合の結果を示す。
【図６】大腸菌内で、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡの存在下でＮε−Ｂｏｃ−リジンがペプチドに取り込まれたことを示すマススペクトルデータである。
【図７】実施例５において、Ｔ７プロモータを用いてｔＲＮＡＰｙｌを発現させたときの、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）のサプレッションの検出結果を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させない場合（Ｔ７ＲＮＡＰ−）に比べ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させた場合（Ｔ７ＲＮＡＰ＋）は有意に高いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。
【図８】実施例５において、Ｔ７プロモータを用いてｔＲＮＡＴｙｒを発現させたときの、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）のサプレッションの検出結果を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させない場合（Ｔ７ＲＮＡＰ−）に比べ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させた場合（Ｔ７ＲＮＡＰ＋）は有意に高いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。
【図９】実施例６において、Ｕ１ｓｎＲＮＡ型転写プロモータを用いてｔＲＮＡＴｙｌを発現させたときの、細胞染色によるｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）のサプレッションの検出結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（非天然型アミノ酸）
本発明に用いられる非天然型アミノ酸としては、例えばリジン誘導体、又はチロシン誘導体を用いることができる。リジン誘導体は、非天然型のアミノ酸であり、ε位の窒素原子に結合した水素原子が他の原子又は原子団に置換されたものが好ましい。例えば、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン（Ｎε−Ｂｏｃ−リジン）、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、Ｎε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジン（Ｎｍａ−リジン）が挙げられる。また、真核生物に存在する修飾リジンであるメチルリジン、アセチルリジンを部位特異的にタンパク質に導入することにより、リジンのアセチル化、メチル化について多くの知見が得られる可能性がある。また、これらのリジン誘導体が導入されたアロタンパク質は、タンパク質機能・構造解析の材料として有用であり、創薬のターゲットともなる可能性がある。チロシン誘導体としては、チロシンのフェニル基の３位又は４位に置換基を有する３位置換チロシン、４位置換チロシンが挙げられる。３位置換チロシンとしては、３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン等の、３−ハロゲン化チロシンが挙げられる。また、４位置換チロシンとしては、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられる。これらのアミノ酸は公知の方法で作製することができ、あるいは市販のものを利用することができる。【００２３】
（アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素）
本発明で用いられるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、非天然型アミノ酸を認識し、かつサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して、該非天然型アミノ酸が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるｔＲＮＡ合成酵素である。【００２４】
好ましい実施形態において、アミノ酸としてリジン誘導体を認識し、かつｔＲＮＡとして併用するピロリジンｔＲＮＡ（配列番号４）を特異的に認識して、該リジン誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるメタン生成古細菌由来のＰｙｌＲＳがある。メタン生成古細菌としては、メタノサルシーナ・マゼイ（M.mazei）が好ましい。ＰｙｌＲＳは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞中で発現させる。ＰｙｌＲＳを哺乳動物細胞中で発現させるためには、例えばメタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型遺伝子に、Ｎ末端領域にＦＬＡＧタグ等が付加するようにしたＤＮＡ配列をＰＣＲ法を用いて増幅し、これを市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology,3,133(1990)）、ｐＡＧＥ１０３[J.Biochem.101,1307(1987)]などのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで構築したプラスミドを、哺乳動物細胞に導入すればよい。【００２５】
他の実施形態において、チロシン誘導体を特異的に認識し、チロシン誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡ（配列番号５）を生成させることができる種々の大腸菌由来ＴｙｒＲＳの変異体を用いることができる。例えば、大腸菌由来ＴｙｒＲＳの変異体（Ｖ３７Ｃ１９５）は３−ヨードチロシンを特異的に認識する。一方、大腸菌由来ＴｙｒＲＳの３７位、１２６位、１８２位、１８５位及び１８６位の５つのアミノ酸に変異を導入して、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン及び４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン等の非天然アミノ酸を認識するＴｙｒＲＳの変異体も報告されている(Chin, J.W. Et al., Science, 301, 964-967, 2003)。大腸菌由来のＴｙｒＲＳ（野生型）は真核生物のｔＲＮＡＴｙｒと反応せず、原核生物由来のｔＲＮＡＴｙｒは真核生物のＴｙｒＲＳとは反応しない。【００２６】
（ｔＲＮＡ）
上記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素にのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない(orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真核細胞内で発現しなければならない。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がＰｙｌＲＳである場合、対応するピロリジンｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためのナンセンスコドンに相補的なアンチコドン及び立体構造を保持しており、かつ真核細胞中で発現する非真核細胞由来のｔＲＮＡである。すなわち、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記リジン誘導体に特異的なＰｙｌＲＳにのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（直交性）、という要件を備え、かつ動物細胞中で発現するサプレッサーｔＲＮＡである。【００２７】
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。また、ナンセンスコドンに代えて、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（以下「フレームシフトコドン」という。）を用いることもできる。【００２８】
上記したように、真核細胞でのｔＲＮＡの発現は、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモータを必要とし、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を図１に示す。図１において、左側のループ（Ｄループ）中、○は塩基の欠損を示す。このように、ピロリジンｔＲＮＡは、Ｄループ中３塩基が欠損しており、他のｔＲＮＡのＤループに比べて異常に小さい。動物細胞中でピロリジンｔＲＮＡを発現させるために、ピロリジンｔＲＮＡにボックスＡ、ボックスＢ配列を導入しても、ピロリジンｔＲＮＡのＤループが異常に小さいため、構造が大きく変化してしまい、このためサプレッサー活性を保持することができなかった。【００２９】
（ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡの合成）
本発明のアミノアシルｔＲＮＡの合成方法は、真核細胞内で機能的な内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のｔＲＮＡの５’末端に真核生物由来のプロモータを結合させ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在する真核細胞内、好ましくは動物細胞内、特に好ましくは哺乳動物細胞内で転写させる。このときｔＲＮＡの３’末端に転写終結配列を結合させることが好ましい。より具体的には、まず、メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡの５’末端に真核生物由来のプロモータを結合させ、また３’末端に転写終結配列をそれぞれ結合させた配列をＤＮＡプライマーから合成し、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、及びｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（共にインビトロジェン社製）等に組み込んで構築したプラスミドを、動物細胞に導入して発現させた後、動物細胞内で転写してプロセッシングすることにより得られる。【００３０】
上記真核生物由来のプロモータとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩによる転写を誘導する塩基配列を利用することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列はＵ１ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータが好ましいが、Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータのＴＡＴＡボックス領域を変異させることでもＵ１ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータ型のプロモータになることが報告されているので、このようなプロモータを用いても良い。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータによる転写を誘導する塩基配列は、真核生物由来のｔＲＮＡ遺伝子又はＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータが好ましい。このとき、野生型ピロリジンｔＲＮＡ遺伝子の５’末端と真核生物由来のｔＲＮＡ遺伝子とは、リンカーを介して結合させることが好ましい。リンカーとしては、特に制限はなく、例えば、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ等によって切断されるものが挙げられる。５’末端に結合するｔＲＮＡ遺伝子は、真核生物由来であるが、真核生物としては、特に制限はなく、例えば動物、植物、昆虫等が挙げられる。このうち、ヒト由来のｔＲＮＡ遺伝子が好ましい。ｔＲＮＡが結合するアミノ酸も、通常の２０種類の天然型アミノ酸であれば特に制限はない。このうち、バリンが好ましい。【００３１】
ヒトＵ６低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）は、プレｍＲＮＡがスプライシングする際に形成するスプライソソームに豊富に存在するＲＮＡ種であって、細胞あたり４〜５×１０５コピーに達する。このＵ６プロモータは低分子異種ＲＮＡ(small heterologous RNA)の転写を駆動し、その活性はｔＲＮＡプロモータからの転写よりも高いといわれている。Ｕ６プロモータもｔＲＮＡプロモータも何れもＰｏｌＩＩＩによって転写されるが、Ｕ６プロモータが構造遺伝子の５’上流に位置するのに対し、ｔＲＮＡプロモータは自分自身の構造遺伝子内部に位置する点で相違する。ヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモータはエンハンサー領域（又は遠位プロモータ領域）及びコア領域（又は近位プロモータ領域）として知られる特徴的なプロモータエレメントを有する。好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも３０％、５０％、７０％、８０％、９０％若しくは９５％の相同性を有する塩基配列からなり、かつ哺乳動物細胞内においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写活性を有する塩基配列である。塩基配列の相同性（ホモロジー）の程度は、２つの塩基配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。【００３２】
さらに本発明において、バクテリオファージ由来のプロモータを用いても上記ｔＲＮＡを真核細胞内で効率的に転写することができる。具体的には、大腸菌のファージ由来のＴ７プロモータ、Ｔ３プロモータ及びＳＰ６プロモータを使用することができるがこれらに限定されない。これらのプロモータの挿入位置は、上記ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端領域であれば特に限定されないが、好ましくは、転写開始位置の１０〜５０ｂｐ上流である。また、バクテリオファージ由来のプロモータを用いる場合は、当該プロモータに対応するバクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼを発現している真核細胞を用いる必要がある。具体的には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを使用することができるがこれらに限定されない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、哺乳類動物細胞内で発現させた場合、Ｔ７プロモータ配列を含むＤＮＡからＲＮＡを転写し、転写されたＲＮＡは最大で細胞内の全ＲＮＡの２０%にも達することが報告されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと同様に大量のＲＮＡを調製する目的でＴ３ＲＮＡポリメラーゼとＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが使用され、これらのプロモータはＴ７プロモータ同様２０塩基以下と短く、更に哺乳動物細胞内でいずれのＲＮＡポリメラーゼも同等のＲＮＡ転写能力があると報告されている。バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのプロモータとしては、配列番号１３に示した塩基配列のＴ７プロモータ、又は当該塩基配列と少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の相同性を有する塩基配列からなり、かつ哺乳動物細胞内においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を誘導しうる配列が好ましい。【００３３】
（非天然型アミノ酸を組み込ませるためのタンパク質）
本発明で非天然型アミノ酸を組み込ませるタンパク質の種類は、限定されるものではなく、発現可能な如何なるタンパク質でもよく、異種の組換えタンパク質でもよい。例えば、タンパク質の種類として、いわゆるシグナル伝達関連タンパク質、受容体、増殖因子、細胞周期関連因子、転写因子、翻訳因子、輸送関連タンパク質、分泌タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、酵素、シャペロン又は癌、糖尿病若しくは遺伝病等を含む疾患関連タンパク質などが挙げられる。【００３４】
本発明において、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体やチロシン誘導体を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）又はフレームシフトコドンを導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位又はフレームシフトコドン部位に、特異的に非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組み込むことができる。なお、本明細書においてコーディング配列内の１、２又は４塩基の欠失若しくは挿入により、翻訳されるアミノ酸配列にフレームシフトが起こることをフレームシフト変異といい、このような変異導入部位に生ずる異常なコドンをフレームシフトコドンという。フレームシフトコドンとしては、４塩基又は５塩基からなるコドンが好ましい。種々の宿主細胞内において４塩基コドンを用いて遺伝暗号の拡張が試みられており、例えば、大腸菌ではＡＧＧＡの４塩基は細胞機能をあまり乱すことなく利用できる代替コドンとして利用されている（Anderson, J.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 101, 7566-7571）。【００３５】
タンパク質に部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Gene 152,271-275(1995)、Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。【００３６】
本発明は動物細胞内で発現させることができるので、これまで、大腸菌や無細胞タンパク質系では、発現しない、あるいは発現量が低い、または活性型となるための翻訳後の修飾を受けることができないようなタンパク質へ、非天然型アミノ酸を取りこませることができる。このようなタンパク質としては、当業者には種々のものが知られているが、例えば、ヒトＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ型レセプター（Cell,110,775-787(2002)）、ヒトGroucho/TLE1タンパク質（Structure 10,751-761(2002)）、ラット筋肉特異的キナーゼ（Structure 10.1187-1196(2002)）などについて、アロタンパク質を合成することができるが、これらに限定されるものではない。【００３７】
また、本発明の方法においては、動物細胞内でアロタンパク質を発現させるので、糖鎖と結合した糖タンパク質に非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組みこませることもできる。特に、無細胞タンパク質系における糖鎖付加のパターンが、本来のパターンと異なるようなタイプの糖タンパク質の場合には、本発明の動物細胞内での系は、目的の（本来の）パターンの糖鎖が付加されたアロタンパク質を得るための有効な手段と考えられる。【００３８】
非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組み込ませるためのタンパク質は、例えば所望の蛋白質の所望のアミノ酸の位置に対応するコドンを、ナンセンスコドン又はフレームシフトコドンに置換し、さらにＣ末端に所望のタグを付加するように構築した配列を有する遺伝子を、例えばｐｃＤＮＡ４／ＴＯ等のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込んでプラスミドを構築し、これを動物細胞に導入して発現させることができる。【００３９】
（宿主）
本発明に用いられる、宿主の動物細胞としては、遺伝子組換え系が確立されている、哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。これらの宿主は、各々発現系が確立されており、適切な宿主細胞の選択は、当業者の技術範囲内である。【００４０】
上記宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。これらは、例えば、Molecular Cloning 第３版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)などに記載された方法に準じて行なうことができる。従って、本発明の１つの実施形態として、上記非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡの発現ベクターにより形質導入又はトランスフェクションされた組換え真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞が提供される。【００４１】
（非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法）
すなわち、リジン誘導体が組み込まれたアロタンパク質の発現を例として説明すると、（Ａ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、特にＰｙｌＲＳを動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｂ）上記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、特にＰｙｌＲＳの存在下で、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体と結合可能なメタノサルシーナ・マゼイ由来のピロリジンｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質を発現させる発現ベクターと、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体と、を有する動物細胞を、その動物細胞の増殖に適した培地（例えば、ＣＨＯ細胞の場合、Opti-MEM I (Gibco BRL社)など）で、適当な条件でインキュベートする。例えば、ＣＨＯ細胞の場合は、３７℃程度の温度で、２４時間程度、インキュベートする。【００４２】
一方、バクテリオファージ由来のプロモータを用いて上記ピロリジンｔＲＮＡを発現させる場合は、上記（Ａ）〜（Ｃ）に加えて、（Ｄ）上記バクテリオファージ由来のプロモータを転写可能なＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を動物細胞内で発現するベクターを導入することが好ましい。例えば、前記Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ及びＳＰ６プロモータを効率的に転写するためのＲＮＡポリメラーゼとして、夫々Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが知られている。【００４３】
ここに、本発明の好ましい実施の形態を示す。
（形態１）本発明におけるＤＮＡ構築物は、真核細胞内で機能する内部プロモータ配列を含まない非真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子と、当該ｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に連結された真核生物由来のプロモータ（但し、ｔＲＮＡ遺伝子プロモータを除く）とを含むこと、
前記真核生物由来のプロモータが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列であるか、又は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩ又はタイプＩＩＩプロモータであることが好ましい。
（形態２）上記形態１のＤＮＡ構築物において、前記ｔＲＮＡ遺伝子が、古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡ遺伝子及び／又は大腸菌由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子であることが好ましい。
（形態３）上記形態１又は２のＤＮＡ構築物において、前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に転写終結配列をさらに結合させたことが好ましい。
（形態４）上記形態１〜３の何れかのＤＮＡ構築物において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩＩＩプロモータが、Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータであることが好ましい。
（形態５）上記形態４のＤＮＡ構築物において、前記Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータが、配列番号３に記載の塩基配列、又は該塩基配列と機能的に同等な塩基配列からなり、かつ哺乳動物細胞内においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を誘導することが好ましい。
（形態６）上記形態５のＤＮＡ構築物において、前記機能的に同等な塩基配列はコンセンサス配列であることが好ましい。
（形態７）上記形態１〜３の何れかのＤＮＡ構築物において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を誘導する塩基配列が、Ｕ１ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモータであることが好ましい。
（形態８）本発明におけるサプレッサーｔＲＮＡの合成方法は、上記形態１〜７何れかのＤＮＡ構築物を真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で転写させることが好ましい。
（形態９）本発明における組換え真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）は、上記形態１〜７何れかのＤＮＡ構築物により形質転換又はトランスフェクションされたことが好ましい。
（形態１０）本発明におけるアミノアシルｔＲＮＡの合成方法は、上記形態１〜７何れかのＤＮＡ構築物により転写されるｔＲＮＡと、当該ｔＲＮＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とを真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で発現させることが好ましい。
（形態１１）本発明における非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法は、
（ａ）非天然型アミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記非天然型アミノ酸と結合可能であり、上記形態１〜７の何れかのＤＮＡ構築物から転写されるｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質と、
を前記非天然型アミノ酸の存在下に真核細胞（但しヒト生体内のヒト細胞を除く）内で発現させることが好ましい。
（形態１２）上記形態１１の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法において、前記非天然型アミノ酸がリジン誘導体及び／又はチロシン誘導体であることが好ましい。
（形態１３）上記形態１２の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法において、前記リジン誘導体が、ピロリジン、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、及びＮε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジンからなる群より選択される１種であることが好ましい。
（形態１４）上記形態１２の非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法において、前記チロシン誘導体が、３−ヨードチロシン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又は４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンであることが好ましい。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
本実施例では、ヒトＧｒｂ２の１１１位及びβ−ガラクトシダーゼの９１位にリジン誘導体又はチロシン誘導体を組み込む実験を行った。なお、Ｇｒｂ２は細胞内で上皮成長因子受容体と相互作用して細胞の癌化に関わるタンパク質である。【００４５】
（ＰｙｌＲＳ及びＴｙｒＲＳ発現プラスミドの構築）
ＰｙｌＲＳ発現プラスミドとしては、メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ＰｙｌＲＳ遺伝子に、Ｎ末端領域にＦＬＡＧタグが付加するようにしたＤＮＡ配列（配列番号８）をＰＣＲ法を用いて増幅した。これを、ｐｃＤＮＡ３．１のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んでプラスミドを構築した。【００４６】
一方、大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３−ヨード−Ｌ−チロシン特異的な変異体（ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５））の発現プラスミドｐＥＹＳＭ１はすでに報告されている（上掲、非特許文献２参照）。このプラスミドをサプレッサーｔＲＮＡの発現プラスミドと共に哺乳動物培養細胞にトランスフェクトし、３−ヨード−Ｌ−チロシンを細胞培養液に添加することで、アンバー変異を持つタンパク質遺伝子のアンバーコドン部位に３−ヨード−Ｌ−チロシンを導入することができる。上記発現プラスミドの作成方法は、上掲特許文献１及び非特許文献２に記載されており、その内容は参照により本願明細書に組み込まれる。また、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン及び４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン特異的な変異体についても報告されている（Chinら、上掲）。これらの変異体ＴｙｒＲＳはｐｃＤＮＡ４／ＴＯのマルチクローニング部位にクローン化した。【００４７】
（サプレッサーｔＲＮＡ発現プラスミドの構築）
メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に、リンカー（配列番号１０）を介してヒトバリンｔＲＮＡ遺伝子を結合させ、また、５’末端にリーダー配列を、３’末端に、転写終結配列をそれぞれ結合させた配列（配列番号１１）をＤＮＡプライマーから合成した。これをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに組み込んで、ｔＲＮＡＶＡＬ−ｔＲＮＡＰｙｌタンデム発現プラスミドを構築した。大腸菌由来のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒについても同様の方法でｔＲＮＡＶＡＬ−ｔＲＮＡＴｙｒタンデム発現プラスミドを構築した。【００４８】
Ｕ６プロモータによるｔＲＮＡ発現プラスミドの構築は以下の方法による。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを鋳型にしてＣＭＶエンハンサー領域の５’側にＥｃｏＲＩ部位、３’側にＵ６プロモータの５’側配列の一部を付加したプライマーを用いてＰＣＲを行った。一方、ｓｉＳＴＲＩＫＥを鋳型にしてＵ６プロモータ領域の５’側にＣＭＶエンハンサーの３’側配列の一部を含み、３’側にＸｂａＩ部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲを行った。これら２つのＰＣＲ増幅断片をオーバーラップＰＣＲでつなぎ合わせると、ＥｃｏＲＩ部位／ＣＭＶエンハンサー／Ｕ６プロモータ／ＸｂａＩ部位からなるＤＮＡ断片ができるので、これをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで処理しｐＵＣ１１９にクローン化した。【００４９】
上記プラスミドを調製し、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したのち、先に調製したｔＲＮＡＶＡＬ−ｔＲＮＡＰｙｌタンデム発現プラスミドからＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｔＲＮＡＰｙｌ−ターミネータを含む断片を単離し、これらを連結した。これにより、配列番号６に示した塩基配列のＤＮＡ断片を有する発現プラスミドが得られる。コントロールとして、ｐｃＤＮＡ３．１＋Ｚｅｏのマルチクローニング部位にｔＲＮＡＰｙｌを３つ直列に連結したプラスミドを構築した。【００５０】
同様に、メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡＰｙｌの代わりに大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡを用いてＣＭＶエンハンサー及びヒトＵ６ｓｎＲＮＡのプロモータを連結したＤＮＡ断片（配列番号７）を構築し、上記と同様に発現プラスミドを作製した。なお、ＣＭＶエンハンサーはＵ６プロモータからのＲＮＡ転写を活性化するという報告がある。【００５１】
（リポーター遺伝子発現プラスミドの構築）
ヒトｇｒｂ２の１１１位のロイシンコドンを、Quick Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いて、アンバーコドンに変換した（ｇｒｂ２（１１１ａｍｂｅｒ））。次いで、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が付加するように構築した遺伝子（配列番号１２）を、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込み、サプレッション検出用のプラスミドとした。【００５２】
同様に、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の９１位のチロシンコドンをアンバーコドンに変換し、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｚｅｏ耐性）のマルチクローニング部位にクローン化した（ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ））。【００５３】
（遺伝子の細胞への導入とサプレッション反応）
［実施例１］ヒトバリンｔＲＮＡ遺伝子プロモータに連結したｔＲＮＡＰｙｌによるＧｒｂ２アンバーサプレッション
ＰｙｌＲＳ、ヒトバリンｔＲＮＡ遺伝子プロモータに連結したｔＲＮＡＰｙｌ及びｇｒｂ２（１１１ａｍｂｅｒ）の３種類の発現プラスミドを２．０ｍｌ培養スケール６ウェルプレートで培養されたチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞、継代時の培養液はＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ギブコ）、１０％ＦＢＳ（ＩＣＮ）、１／１００ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ）を使用））の１ウェルあたりに０．５μｇずつ、様々な組み合わせで（結果参照）、９０％コンフルエント時に形質導入を行った。形質導入は，リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いる方法をとり，そのマニュアルに沿って行った。形質導入時は培養液としてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ）を使用した。形質導入を行った細胞培養液を、１ｍＭのＮε−Ｂｏｃ−リジン（Ｂａｃｈｅｍ）が存在するか、又は存在しないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ギブコ）で置換し，１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの添加により発現誘導し、２０時間ほどＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養を続けた。【００５４】
上記培養細胞から細胞培養液を除き、緩衝液で洗浄後、細胞を溶解させ、タンパク質を回収した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、分子量でタンパク質を分離した後、メンブレンにエレクトロブロット（１００Ｖ、１時間）を行った。抗体は抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を一次抗体、ヒツジ由来のマウスＩｇＧワサビパーオキシダーゼ結合全抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を二次抗体として用いた。検出試薬は、ＥＣＬウェスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた．測定は冷却ＣＣＤカメラＬＡＳ１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いて行った。【００５５】
図２に、Ｇｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションのウェスタンブロットによる検出結果を示す。左端の１レーンは、Ｇｒｂ２全長のバンドの位置を示すための対照である。野生型Ｇｒｂ２のＣ末端にはＦＬＡＧタグが付加されており、Ｃ末端まで合成された場合にＧｒｂ２の矢印の部分にバンドが検出される。２〜４レーンは、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンのいずれかがない場合である。これらの場合、Ｇｒｂ２の全長が合成されていない。一方、レーン５は、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ及びＮε−Ｂｏｃ−リジンのすべてが細胞内に導入された場合であり、Ｇｒｂ２の全長が合成されている。このことから、Ｇｒｂ２の１１１位に導入したアンバーコドンに、ＰｙｌＲＳ及びピロリジンｔＲＮＡによって、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンが導入されたことがわかる。【００５６】
［実施例２］Ｕ６プロモータに連結したｔＲＮＡＴｙｒ及びｔＲＮＡＰｙｌによるＧｒｂ２アンバーサプレッション
続いて、同様の方法を用いて上記で作製したヒトＧｒｂ２遺伝子、野生型ＴｙｒＲＳ及びＰｙｌＲＳを発現させ、Ｕ６プロモータを有するメタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡＰｙｌ、又は大腸菌サプレッサーｔＲＮＡＴｙｒでサプレッションした。図３は、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。右端のレーンは野生型Ｇｒｂ２のバンドの位置を示すための対照である。左の２つのレーンは、Ｕ６プロモータを有する大腸菌のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒを発現させたときの結果である。ＴｒｙＲＳの発現に依存してＧｒｂ２のバンドが検出されることからＧｒｂ２のアンバーコドンにチロシンが導入されたことが分かる。真中の２つのレーンは、Ｕ６プロモータを有するピロリジンｔＲＮＡＰｙｌを発現させたときの結果である。培地中にＮε−Ｂｏｃ−リジンを添加することによってＧｒｂ２のバンドが検出されることからＧｒｂ２のアンバーコドンにＮε−Ｂｏｃ−リジンが導入されたことが分かる。これらの結果より、５’末端にＵ６プロモータを連結したｔＲＮＡ遺伝子が哺乳動物細胞内で転写されることが示された。なお、チロシンｔＲＮＡを発現させた場合に、培地中にチロシンを添加しない対照実験を行わなかったのは、チロシン非存在下では細胞が成育しないからである。【００５７】
［実施例３］ｔＲＮＡＰｙｌによるｌａｃＺアンバーサプレッション
チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ−ＴＲｅｘ細胞)を、１ウェルあたり１．２×１０５個ずつ２４ウェルプレートに播種し、１０％牛胎児血清（ＩＣＮ）、１／１００ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ギブコ）で培養した。翌日、９５％コンフルエント時に、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）を０．４μｇ、ＰｙｌＲＳ発現プラスミドを０．２μｇ、及び上記で作成した３種類のサプレッサーｔＲＮＡＰｙｌ発現プラスミド（夫々、ヒトバリンｔＲＮＡ、Ｕ６プロモータ、及びＣＭＶエンハンサーを含む）を用いて形質導入を行った。形質導入は、２μｌのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用い、そのマニュアルに沿って行った。形質導入時は培養液としてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ）を使用した。【００５８】
形質導入を行った細胞培養液を、１ｍＭのＢｏｃ−リジン（Ｂａｃｈｅｍ）が存在するか、又は存在しないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ギブコ）で置換し、１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの添加により発現誘導し、２０時間ほどＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養を続けた。翌日、細胞からタンパク質を回収し、レポーターアッセイキットβ−Ｇａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｌａｃＺ酵素活性を調べた。その結果を図４に示す。ヒトバリンｔＲＮＡプロモータ及びＵ６プロモータを用いたいずれの場合も、培地中にＢｏｃ−リジンを添加することによってβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。一方、これらのプロモータを含まないＣＭＶプロモータを用いたｔＲＮＡ発現ベクターではＢｏｃ−リジンの添加の有無に関わらずβ−ガラクトシダーゼ活性が検出されないことからサプレッションされていない。なお、ヒトバリンｔＲＮＡプロモータと比較してＵ６プロモータによるサプレッサーｔＲＮＡの発現は有意に高いことが推測される。【００５９】
［実施例４］Ｕ６プロモータに連結したｔＲＮＡＴｙｒによるｌａｃＺアンバーサプレッション
実施例３と同様の方法により、Ｕ６プロモータに連結した大腸菌サプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子及び３種類の変異体ＴｙｒＲＳ発現プラスミドを発現させ、ヨードチロシン（ＩＹ）、アジドフェニルアラニン（ＡｚＰｈｅ）及びパラベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）の３種類のチロシン誘導体を添加してｌａｃＺアンバーサプレッションを行った。その結果を図５に示す。いずれのアミノ酸を添加した場合も無添加の場合と比べて有意に高いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。なお、ヨードチロシン無添加の場合でもβ−ガラクトシダーゼ活性が検出されているのは、ＩＹ特異的な変異体ＴｙｒＲＳはヨードチロシンのみならず、チロシンをも取り込むのでＩＹ非添加でもサプレッションが起こっているためと考えられる。【００６０】
（参考例１）
図６は、大腸菌内で、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡの存在下でＮε−Ｂｏｃ−リジンがペプチドに取り込まれたことを示すマススペクトルデータである。図中、分子量（ＭＷ）が１３２７．６７のピークは、配列がＮＳＹＳＰＩＬＧＹＷＫであるペプチドを示している。分子量が１３９２．７６のピークは、左から１１番目のチロシンがＮε−Ｂｏｃ−リジンに置換された（＊で示す）ペプチドを示している。【００６１】
［実施例５］Ｔ７プロモータによるサプレッサーｔＲＮＡの発現系の構築とｌａｃＺアンバーサプレッション
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯのＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間にクローン化することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを作成した。Ｔ７−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子の作成については、まず、Ｕ６−ｔＲＮＡＴｙｒ（配列番号７）を鋳型にしてＰＣＲを行ってＴ７プロモーターをｔＲＮＡＴｙｒ配列に付加した後、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングした。その後、ＥｃｏＲＩで処理してＴ７−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子を切り出し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。このようして作成したＴ７−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子とプラスミド配列の一部（配列番号１５）をＰＣＲによって増幅し、得られたＤＮＡを精製して細胞の形質転換に用いた。ｔＲＮＡＰｙｌ発現プラスミドの構築については、上記のようにＴ７−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子をクローニングしたｐＢＲ３２２をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したのち、Ｕ６プロモータによるｔＲＮＡ発現プラスミドからＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｔＲＮＡＰｙｌ−ターミネータを含む断片を単離し、これらを連結した。このようして作成したＴ７−ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子とプラスミド配列の一部（配列番号１４）をＰＣＲによって増幅し、得られたＤＮＡを精製して細胞の形質転換に用いた。【００６２】
実施例３と同様の方法でＴ７−ｔＲＮＡＰｙｌ発現プラスミドを０．２μｇ、ＰｙｌＲＳ発現プラスミドを０．１μｇ、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）発現プラスミドを０．４μｇ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド０．３μｇを用いて形質導入を行ってｌａｃＺアンバーサプレッションを行った。ただし１／１００ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ）を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ギブコ）で培養した。その結果を図７に示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させない場合に比べ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させた場合は有意に高いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。【００６３】
実施例３と同様に、Ｔ７−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子ＤＮＡを０．１８μｇ、ＴｙｒＲＳ発現プラスミドを０．１μｇ、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）発現プラスミドを０．４μｇ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド０．３μｇを用いて形質導入を行ってｌａｃＺアンバーサプレッションを行った。ただし１／１００ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ）を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ギブコ）で培養した。その結果を図８に示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させない場合に比べ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させた場合は有意に高いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、ｌａｃＺ遺伝子のアンバーコドンがサプレッションされていることが分かる。【００６４】
［実施例６］Ｕ１ｓｎＲＮＡ型転写プロモータによるサプレッサーｔＲＮＡの発現系の構築とｌａｃＺアンバーサプレッション
Ｕ１ｓｎＲＮＡ型プロモーターによるｔＲＮＡ発現プラスミドの構築は以下の方法による。先に調製したＵ６−ｔＲＮＡＴｒｙ（配列番号７）を鋳型として、Ｕ６プロモーター転写開始位置の１９８塩基上流からＴＡＴＡボックス上流までを下記プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
5'-ATGATATCAGAGGGCCTATTTCCCAT-3'（配列番号１６）
5'-TGCTCGAGAAGCCAAGAATCGAAATAC-3'（配列番号１７）【００６５】
この領域は転写エレメントＰＳＥを含んでおり、増幅されたＤＮＡ断片の５’側にＥｃｏＲＶサイト、３’側にＸｈｏＩサイトが付加されている。このＰＣＲ産物を一度プラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋のＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ部位に組み込んだ。ＸｈｏＩサイトの下流にはベクター由来のＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＮｏｔＩサイトが存在する。このＸｈｏＩとＥｃｏＯ１０９Ｉ間にＵ６プロモーターのＴＡＴＡボックスの下流の配列とポリメラーゼＩＩＩによる転写を止めるためのターミネーターを挿入した。ＥｃｏＯ１０９ＩサイトにｔＲＮＡＴｙｒ配列を挿入した後、さらに、ＮｏｔＩサイトにポリメラーゼＩＩのターミネーターである３’ボックスを挿入した。ＥｃｏＲＶから３’ボックスまでの全領域がＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子（配列番号１８）となる。この遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしたプラスミドが、ＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ発現プラスミドである。このようにして作成したＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子においては，Ｕ６プロモーターからＴＡＴＡ配列が除かれており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写が起きるようになる(Das et al., Nature 1995, Vol.374, pp.657-660)。また、Ｕ６プロモーターと同様のＣＭＶエンハンサーを２つのプライマー：
5'-ATCGAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'（配列番号１９）及び
5'-AGCCTTGTATCGTATATGC-3'（配列番号２０）
を用いてＰＣＲ増幅し、更に５’リン酸化してＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、ＣＭＶ−ＤＳＥ−ＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒを作製した。【００６６】
実施例３と同様の方法でＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ発現プラスミド、又はＣＭＶ−ＰＳＥ−ｔＲＮＡＴｙｒ発現プラスミドを０．２μｇ、ＴｙｒＲＳ発現プラスミドを０．２μｇ、ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ）発現プラスミドを０．４μｇ用いて形質導入を行った。形質導入の翌日に細胞をβ−Galactosidase Staining Kit（Mirus社）を用いて染色し、ｌａｃＺのアンバーサプレッションが起きるか調べた。サプレッションが起きている細胞は青く染まると期待される。細胞を染色した写真を図９に示す（図中、染色細胞は矢印で示されている）。エンハンサーの有無で特に大きな差は見られないが、いずれも、低いながらもサプレッション活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、リジン誘導体やチロシン誘導体等の非天然アミノ酸を導入したアロタンパク質を有効に製造することができる。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図９】
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【配列表】
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