(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）および（b）に記載の処理により得られる、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持つ全菌体百日せきワクチン：
（a）アミノ酸、アミン類、および／またはアミド類の存在下における百日せき菌体の無毒化処理
（b）百日せき菌体の溶菌防止処理。
【請求項２】
(a)に記載のアミノ酸が、アスパラギン酸、γ―アミノ酪酸、アラニン、β-アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、およびバリンから選定される少なくとも一つのアミノ酸である、請求項１に記載の全菌体百日せきワクチン。
【請求項３】
(a)に記載のアミン類がエチルアミン、エタノールアミン、およびプロパノールアミンから選定される少なくとも一つのアミン類であり、または(a)に記載のアミド類が尿素、グリシンアミド、およびβ-アラニルアミドから選定される少なくとも一つのアミド類である、請求項１または２に記載の全菌体百日せきワクチン。
【請求項４】
(b)に記載の溶菌防止処理がアセトン処理、加温、γ線照射、電子線照射、およびレーザー光照射から選定される少なくとも一つの処理方法である、請求項１から３のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチン。
【請求項５】
百日せき菌が臨床分離株、その人工変異株、または遺伝子組換え株である請求項１から４のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチン。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチン、および百日せき菌由来の細菌成分ワクチンを含む混合細菌ワクチン。
【請求項７】
全菌体百日せきワクチンおよび／または百日せき菌由来の細菌成分ワクチンが単独では有効量以下であることを特徴とする請求項６に記載の混合細菌ワクチン。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の細菌ワクチン、および他の細菌および／またはウイルス由来のワクチン抗原を少なくとも一種類以上含む混合ワクチン。
【請求項９】
ワクチン抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、肝炎ワクチン、および日本脳炎ワクチンから選定される少なくとも一つの抗原である、請求項８に記載の混合ワクチン。
【請求項１０】
以下の（a）および（b）に記載の処理により得られる、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持つ全菌体百日せきワクチンの製造方法：
（a）アミノ酸、アミン類、および／またはアミド類の存在下における百日せき菌体の無毒化処理
（b）百日せき菌体の溶菌防止処理。
【請求項１１】
(a)に記載のアミノ酸が、アスパラギン酸、γ―アミノ酪酸、アラニン、β-アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、およびバリンから選定される少なくとも一つのアミノ酸である、請求項１０に記載の全菌体百日せきワクチンの製造方法。
【請求項１２】
(a)に記載のアミン類がエチルアミン、エタノールアミン、およびプロパノールアミンから選定される少なくとも一つのアミン類であり、または(a)に記載のアミド類が尿素、グリシンアミド、およびβ-アラニルアミドから選定される少なくとも一つのアミド類である、請求項１０または１１に記載の全菌体百日せきワクチンの製造方法。
【請求項１３】
(b)に記載の溶菌防止処理がアセトン処理、加温、γ線照射、電子線照射、およびレーザー光照射から選定される少なくとも一つの処理方法である、請求項１０から１２のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチンの製造方法。
【請求項１４】
百日せき菌が臨床分離株、その人工変異株、または遺伝子組換え株である請求項１０から１３のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチンの製造方法。
【請求項１５】
請求項１から５のいずれかに記載の全菌体百日せきワクチン、および百日せき菌由来の無細胞細菌ワクチンを混合する工程を含む、混合細菌ワクチンの製造方法。
【請求項１６】
全菌体百日せきワクチンおよび／または百日せき菌由来の無細胞ワクチンが単独では有効量以下であることを特徴とする請求項１５に記載の混合細菌ワクチンの製造方法。
【請求項１７】
請求項１から７のいずれかに記載の細菌ワクチン、および他の細菌および／またはウイルス由来のワクチン抗原を少なくとも一種類以上混合する工程を含む混合ワクチンの製造方法。
【請求項１８】
ワクチン抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、肝炎ワクチン、および日本脳炎ワクチンから選定される少なくとも一つの抗原である、請求項１７に記載の混合ワクチンの製造方法。
【請求項１９】
細菌および／またはウイルスに起因する疾患に対して用いる、請求項１から９のいずれかに記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持った全菌体細菌ワクチン、該全菌体細菌ワクチンと同じ細菌由来の細菌成分ワクチンを混合した混合細菌ワクチン、ならびに該混合細菌ワクチンと他のワクチンとの混合ワクチンに関する。また、それらの製造方法ならびに用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
百日せきは百日せき菌（Bordetella pertussis）の感染により発症し、罹患すると特徴的な咳が長期に続く感染症である。幼児期に罹患すると重篤となり、肺炎や脳症を併発することがある。百日せきは母子免疫による発症防除効果がほとんど期待できないので、生後の早期から罹患しうる。その予防の為には乳児早期からワクチンによる免疫を付与する事が求められる。
百日せきの予防に使用されるワクチンとして全菌体百日せきワクチンと無細胞百日せきワクチンがある。以下に全菌体百日せきワクチンと無細胞百日せきワクチンについて従来の学説を簡単に説明する（KM Edwards, MD Decker, EA Mortimer Jr. Vaccine 3rd ed,  SA Plotkin and WA Orenstein Ed, WB Saunders co,1999 pp.293-344）。【０００３】
全菌体百日せきワクチンは１９３０年代から臨床使用され、１９５０年代からDTP三種混合ワクチンとして世界的に今日まで使用されてきた。全菌体百日せきワクチンの有効性に関しては多数の文献に記載されている（M Kimura, Dev. Bio. Stand. 73: 5-9, 1991 ）。全菌体百日せきワクチンは百日せき菌を培養し、全菌体を無毒化して出来るワクチンである。従って製法が簡便でありかつ、製造費用が安価であるため、現在も世界中で使用されている。しかし、全菌体百日せきワクチンは全菌体を無毒化して製造されるので、ワクチン中に菌体由来のエンドトキシンなど毒性物質が少量混入している。そして無毒化しても長期保存の間に毒性復帰が起こりやすい欠点があった。そのためワクチン接種後の発熱、接種部位の硬結など望ましくない副反応を生じやすく、安全性に関する問題が指摘されてきた。【０００４】
これに対し、無細胞百日せきワクチンは日本で開発され、１９８０年代から今日まで使用されている。無細胞百日せきワクチンを開発した主な目的は全菌体百日せきワクチンの安全性に関する欠点を改善することであった。無細胞百日せきワクチンの有効性に関しては多数の文献に記載されている。無細胞百日せきワクチンは、百日せき菌を培養し、培養液から有効成分を採取、精製し、無毒化して出来るワクチンである。従って製法が複雑であり製造に長時間を要し、製造費用が高価である。しかしながら無細胞百日せきワクチンは上記の通り有効成分を精製し、無毒化して製造されるので、全菌体百日せきワクチンに比較し、ワクチンに含まれる菌体由来のエンドトキシンなど毒性物質が大幅に減少させられている。従って、安全性の高いワクチンであり、ワクチン接種後の発熱、接種部位の硬結などの副反応も少ない。ここ数年、世界的に要望が高まり、日本以外でも先進国、発展途上国を問わず世界的に使用され始めている。【０００５】
上記のように、全菌体百日せきワクチンの欠点であった安全性は、無細胞百日せきワクチンにおいて改善された。しかし、全菌体百日せきワクチンの利点であった製法の簡便性、安価な製造費用の点はかえって損なわれることとなった。このような背景から、全菌体百日せきワクチンの持つ有効性と安価な製造費用を維持しつつ、無細胞百日せきワクチンに匹敵する安全性を兼ね備えた全菌体百日せきワクチンの開発が求められている。
世界保健機構(WHO)は全菌体百日せきワクチンの品質規格を作成し各国政府に準拠するよう求めている。しかし、無細胞百日せきワクチンの製法や品質規格は各国で異なり、世界的な統一規格は確率されていない。
また、百日せきワクチンと同様に、他の細菌由来の全菌体細菌ワクチンにおいても、安価な製造費用を維持しつつ、無細胞細菌ワクチンに匹敵する安全性を兼ね備えた全菌体細菌ワクチンの開発が現在世界中で求められている。【０００６】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】特開平4-230328
【特許文献２】特開平5-503628
【非特許文献１】KM Edwards, MD Decker, et al: "Vaccines", third ed., SA Plotkin and WA Orenstein (ed.), pp.293-344.  WB Saunders Co., 1999.
【非特許文献２】KM Edwards, BD Meade, et al. Pediatrics 96: 548-557. 1995
【非特許文献３】M Kimura, Dev. Bio. Stand. 73: 5-9. 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持ち、安全性の改善された全菌体細菌ワクチンを提供することにある。また、上記ワクチンに同じ細菌由来の細菌成分ワクチンを混合した混合細菌ワクチンの提供、およびこれらの混合細菌ワクチンと他のワクチン抗原とからなる安全で有効な混合ワクチンを提供することも目的とする。また、それらの製造方法ならびに使用方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは全菌体百日せきワクチンの無毒化処理方法の改良や、複数のワクチンを混合し、製造されたワクチンの安全性の検討を行った。
まず、全菌体百日せきワクチンの無毒化処理方法の改良を行った。その結果、アミノ酸などの存在下で無毒化処理を行うことにより、または百日せき菌体に溶菌防止処理と簡便な精製処理を施す事により、毒性復帰しにくく、かつその他の安全性も改善された全菌体百日せきワクチンを製造出来ることを見いだした。次に、上記の方法で得た安全性の改善された全菌体百日せきワクチンと無細胞百日せきワクチンをそれぞれ有効量以下の濃度で混合し、混合ワクチンの安全性の評価を行った。その結果、無細胞百日せきワクチンに匹敵する安全性を兼ね備えた混合百日せきワクチンを製造出来ることを見いだした。
また、他の細菌由来の菌株においても、百日せきワクチンと同様の製造方法でワクチンの製造を行った所、保存安定性の良好な全菌体細菌ワクチンが製造されることがわかった。【０００９】
即ち、本発明者らは、従来の細菌ワクチンよりも安全性の高いワクチンを、簡便・安価に製造することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔２３〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）および（b）に記載の処理により得られる、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持つ全菌体細菌ワクチン。
（ａ）アミノ酸、アミン類、および／またはアミド類の存在下における菌体の無毒化処理
（ｂ）菌体の溶菌防止処理
〔２〕長期保存の期間が一年以上、好ましくは３年以上、さらに好ましくは５年以上、６年未満である、〔１〕に記載の全菌体細菌ワクチン。
〔３〕(a)に記載のアミノ酸が、アスパラギン酸、γ―アミノ酪酸、アラニン、β-アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、およびバリンから選定される少なくとも一つのアミノ酸である、〔１〕または〔２〕に記載の全菌体細菌ワクチン。
〔４〕(a)に記載のアミン類がエチルアミン、エタノールアミン、およびプロパノールアミンから選定される少なくとも一つのアミン類であり、または(a)に記載のアミド類が尿素、グリシンアミド、およびβ-アラニルアミドから選定される少なくとも一つのアミド類である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチン。
〔５〕(b)に記載の溶菌防止処理がアセトン処理、加温、γ線照射、電子線照射、およびレーザー光照射から選定される少なくとも一つの処理方法である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチン。
〔６〕細菌が臨床分離株、その人工変異株、または遺伝子組換え株である〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチン。
〔７〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチン、およびそれらと同じ細菌由来の細菌成分ワクチンを含む混合細菌ワクチン。
〔８〕全菌体ワクチンおよび／または細菌成分ワクチンが単独では有効量以下であることを特徴とする〔７〕に記載の混合細菌ワクチン。
〔９〕細菌が百日せき菌（Bordetella pertussis）、パラ百日せき菌（Bordetella parapertussis）、チフス菌(Salmonella typhi)、毒素産生大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、黄色ブドー状球菌(Staphylococcus aureus)、または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のいずれかである、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の細菌ワクチン。
〔１０〕少なくとも一種類以上の〔９〕に記載の細菌ワクチン、および他の細菌および／またはウイルス由来のワクチン抗原を少なくとも一種類以上含む混合ワクチン。
〔１１〕ワクチン抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、肝炎ワクチン、および日本脳炎ワクチンから選定される少なくとも一つの抗原である、〔１０〕に記載の混合ワクチン。
〔１２〕以下の（ａ）および（b）に記載の処理により得られる、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持つ全菌体細菌ワクチンの製造方法。
（ａ）アミノ酸、アミン類、および／またはアミド類の存在下における菌体の無毒化処理
（ｂ）菌体の溶菌防止処理
〔１３〕(a)に記載のアミノ酸が、アスパラギン酸、γ―アミノ酪酸、アラニン、β-アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、およびバリンから選定される少なくとも一つのアミノ酸である、〔１２〕に記載の全菌体細菌ワクチンの製造方法。
〔１４〕(a)に記載のアミン類がエチルアミン、エタノールアミン、およびプロパノールアミンから選定される少なくとも一つのアミン類であり、または(a)に記載のアミド類が尿素、グリシンアミド、およびβ-アラニルアミドから選定される少なくとも一つのアミド類である、〔１２〕または〔１３〕に記載の全菌体細菌ワクチンの製造方法。
〔１５〕(b)に記載の溶菌防止処理がアセトン処理、加温、γ線照射、電子線照射、およびレーザー光照射から選定される少なくとも一つの処理方法である、〔１２〕から〔１４〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチンの製造方法。
〔１６〕細菌が臨床分離株、その人工変異株、または遺伝子組換え株である〔１２〕から〔１５〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチンの製造方法。
〔１７〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の全菌体細菌ワクチン、およびそれらと同じ細菌由来の無細胞細菌ワクチンを混合する工程を含む、混合細菌ワクチンの製造方法。
〔１８〕全菌体ワクチンおよび／または無細胞ワクチンが単独では有効量以下であることを特徴とする〔１７〕に記載の混合細菌ワクチンの製造方法。
〔１９〕細菌が百日せき菌（Bordetella pertussis）、パラ百日せき菌（Bordetella parapertussis）、チフス菌(Salmonella typhi)、毒素産生大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、黄色ブドー状球菌(Staphylococcus aureus)、または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のいずれかである、〔１２〕から〔１８〕のいずれかに記載の混合細菌ワクチンの製造方法。
〔２０〕少なくとも一種類以上の〔９〕に記載の細菌ワクチン、および他の細菌および／またはウイルス由来のワクチン抗原を少なくとも一種類以上含む混合ワクチンの製造方法。
〔２１〕ワクチン抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、肝炎ワクチン、および日本脳炎ワクチンから選定される少なくとも一つの抗原である、〔２０〕に記載の混合ワクチンの製造方法。
〔２２〕細菌および／またはウイルスに起因する疾患に対して用いる、〔１〕から〔１１〕に記載のワクチン。
〔２３〕細菌が百日せき菌（Bordetella pertussis）、パラ百日せき菌（Bordetella parapertussis）、チフス菌(Salmonella typhi)、毒素産生大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、黄色ブドー状球菌(Staphylococcus aureus)、または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のいずれかである〔２２〕に記載のワクチン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、長期保存においても毒性復帰がおこらない特徴を持ち、安全性の改善された全菌体細菌ワクチンを提供する。また本発明は、上記の安全性の改善された全菌体細菌ワクチンの製造方法に関する。
本発明において「毒性復帰」とは、無毒化処理後の保存過程において、病原細菌本来の毒性が再度出現するようになる現象である。病原菌の無毒化処理を行った細菌ワクチンであっても、保存過程においてしばしば毒性復帰を起こすことがこれまでにわかっており、長期間毒性復帰が起こらないことは、ワクチンの安全性を維持する上で非常に重要なことである。本発明において、長期保存の期間としては、好ましくは1年以上の期間であり、より好ましくは３年以上６年未満の期間である。本発明の細菌ワクチンの由来となる病原細菌としては、伝染能力を持った病原細菌を挙げることが出来、好ましくは、百日せき菌（Bordetella pertussis）、パラ百日せき菌（Bordetella parapertussis）、チフス菌(Salmonella typhi)、毒素産生大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、黄色ブドー状球菌(Staphylococcus aureus)、または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）を挙げることができる。これら全菌体細菌ワクチンの製造に使用する菌株は抗原性があれば、臨床分離株、野生株、人口変異株、遺伝子組換え株の何れでも使用できる。【００１１】
ここでは、上記細菌ワクチンの一つである百日せきワクチンに関する発明について詳細な説明をおこなう。
従来の全菌体百日せきワクチン製造法の概略は以下の通りである。まず、百日せき菌（Ｉ相菌）を適当な培地（例  コーエンウイーラー変法液体培地）に接種し、３５℃前後で１日間通気撹拌しながらタンク培養する。培養液を遠心して菌体を集め、菌体画分を適当な緩衝液に懸濁して菌体濃度を調節し、次に、0.5 %（v/v）前後のホルマリン存在下で数週間放置することにより無毒化する。その後、菌体を遠心洗浄してホルマリン除去し、菌体濃度を(10 - 20) x 10sup9/mLに調節して全菌体百日せきワクチンとしていた。【００１２】
上記の通りの従来法で製造して得られる全菌体百日せきワクチンは、有効であり、かつ製造方法が簡便なので大量製造に適している長所があった。しかし、（１）長期保存の間に毒性復復帰が起こりやすい（２）長期保存の間に溶菌が起きるか、または品質が低下しやすい（３）エンドトキシン含量が高く、望ましくない副反応を生じやすい、等の安全上の問題があると指摘されてきた。【００１３】
本発明の全菌体百日せきワクチンではこの主要な問題点が解決される。特に注目されるのは長期保存における毒性復帰現象が顕著に低下することである。本発明の改良全菌体百日せきワクチンの製造方法は、従来法の無毒化処理方法の改良である。本発明で行った改良は下記三つの処理を無毒化の際に行うものである。
本発明における無毒化処理方法における第１の改良点としては、無毒化処理の際にアミノ酸等を存在させることが挙げられる。本発明では百日せき菌体の無毒化処理に際して緩衝液中に無毒化剤（例えばホルマリン）と共にアミノ酸またはアミン類、アミド類を存在させる。これにより長期保存により毒性復帰しにくい全菌体百日せきワクチンを製造することができる。タンパク質トキシンの不活化に際してアミノ酸やアンモニア、アミン類などを存在させて、不活化の進行度を制御する方法は公知である（Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus. Conditions for the preparation of safe vaccine.  SJ Barteling , R. Woortmeyer.  Arch Virol. 1984;80(2-3):103-17.）。【００１４】
リジンなどのアミノ酸はホルマリンと反応して、過剰なホルマリンを捕捉し、ホルマリンの作用を中和し、不活化が過度に進行するのを制御し、ないしは不活化を事実上停止させる効果があることが広く受け入れられてきた。また、ホルマリンとアミノ基との反応でシッフ塩の形成されることが証明されている。
全菌体百日せきワクチン製造においては、毒性を取り除き、毒性復帰を防止するため、無毒化処理は出来るだけ完全に進行すること、すなわちトキシンを完全に不活化させることが望ましい。そのため、これまで全菌体百日せき菌のホルマリンによる無毒化処理の際には、トキシンの不活化を妨げる効果があると考えられていたアミノ酸添加は行われていなかった。【００１５】
本発明者らは、全菌体百日せきワクチンの製造において、ホルマリン濃度や処理時間を変化させ、無毒化の程度との相関を調べた。その中で、無毒化を制御する一つの方法としてアミノ酸を添加したところ、予想外の新規の効果としてトキシンの不活化が進み、無毒化が完全に行われることを見いだし、毒性復帰がおこらない全菌体百日せきワクチンの開発に成功した。
全菌体細菌ワクチンの無毒化に際してアミノ酸またはアミン類、アミド類の添加効果は本発明者らが見いだした新規で有用な知見である。【００１６】
本発明の無毒化処理の際に使用するアミノ酸の種類は入手可能なアミノ酸なら何れでも良く、中でもタンパク質構成アミノ酸が好ましい。また、塩基性アミノ酸がより好ましい。しばしば、水溶性アミノ酸が好ましいが、バリンなど非水溶性アミノ酸が効果的な場合もある。天然型（Ｌ−型）、非天然型（D−型）何れも使用可能である。より好ましいアミノ酸としては、アスパラギン酸、γ―アミノ酪酸、アラニン、β-アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、セリン、スレオニン、バリン、これらを含むペプチド、アミノ酸オリゴマー、等が上げられるが、これらに限定されるものではない。また、好適なアミン類、アミド類としては、エチルアミン、エタノールアミン、プロパノールアミンなどのアルキルアミン類、尿素、グリシンアミド、β-アラニルアミドなどのアミド類、アンモニア、上記物質の無機塩類、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００１７】
本発明で使用するアミノ酸またはアミン類、アミド類の濃度は、0.005 M-0.5 Mの範囲が実用的に使用可能であり、好ましくは0.02 M-0.2 Mの範囲である。ただし、最適の濃度は全菌体百日せき菌の濃度、緩衝液のｐＨ、無毒化反応液の温度などにより異なるが、ワクチン従事者には最適濃度を決定する方法は公知である。
本処理におけるアミノ酸またはアミン類、アミド類の添加方法は、最初から一度に添加して良いし、あるいは一週間に１−２回程度の間隔で分割添加しても良い。
本発明の百日せきワクチンを製造するのに適した百日せき菌はとくに制限されない。すなわち、ワクチン製造に使用した場合に抗原性を示す能力があれば、臨床分離株（すなわち野生株）、人工変異株、遺伝子組換え株の何れでも使用可能である。
本発明で製造された百日せきワクチンの毒性（無毒化後なら、復帰毒性）は生物製剤基準に規定されている方法（マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、ヒスタミン増感試験、および異常毒性否定試験など）により調べることができる。この中でヒスタミン増感試験法の検出感度が相対的に高く、このことはワクチンを取り扱う専門家にとって公知である。【００１８】
本処理方法において、リジンを使用した場合を例にアミノ酸またはアミン類、アミド類の毒性復帰抑制効果のメカニズムを考察すると以下の通りである。百日せき菌体表面には蛋白トキシンとともに、エンドトキシンなどの大きな多糖構造物やその他の高分子量の酸性分子が入り組んで存在するので、トキシンの一部は覆い隠されていると考えられる。また、ホルマリン分子は多糖にも親和性があるので、ここに捕捉されてトキシンの遊離アミノ基の一部に到達しにくい。従って、アミノ酸非存在下、従来法による無毒化において、ホルマリンは菌体表面に露出した部分のトキシンを不活化するものの、隠れた部分のトキシンを不活化することができず、一部トキシンは活性を保持したまま隠れて残存するものと考えられる。これは毒性復帰の起こりやすい半無毒化製品である。遊離の蛋白トキシンを不活化する場合と比較し、全菌体を処理する場合には一部トキシンが活性を保持したまま残存する可能性が高い。ここで本発明のとおり、リジンなどの塩基性アミノ酸を添加した場合、リジンが酸性物質と塩を形成する性質があり、また一部の多糖にも親和性があるので、塩基性アミノ酸が細胞表面のエンドトキシンやその他の大きな構造物のどこかと結合しうる。この際、それまで結合していた一部のホルマリンと塩基性アミノ酸が入れ替わる事が容易に想像される。事実、本発明者らは、百日せき菌体懸濁液にホルマリン添加し、一週間後にリジンを添加するとホルマリンの一部が遊離するのを観察した。リジンが新たにどこかに結合すると菌体表面上の入り組んだ多糖分子に構造変化がおこり、これまで隠れていた部分のトキシンが露出する。この時、近傍に存在する遊離ホルマリンが新たに露出した部分に結合する。つまり、ホルマリンによる無毒化がより完全になるものと想像される。このように考えると、アミノ酸などの存在下で処理することにより、毒性復帰しにくい全菌体百日せきワクチンが製造できる事を説明できる。【００１９】
本発明における無毒化処理方法における第２の改良点としては、菌体に溶菌防止処理を施すことが挙げられる。すなわち本発明の全菌体百日せきワクチンの製造においてホルマリンなどによる無毒化処理以外の溶菌防止処理を施す。
溶菌防止処理は化学品処理と物理化学的処理、ならびにこれらを組み合わせても良い。後述する通り、溶菌防止処理の具体的な方法は実質的に無毒化処理と区別できない場合がある。従って、第２無毒化処理と呼ぶことができる。しかし、本発明者らは無毒化処理とは別に溶菌防止を目的に上記の処理を実施し、溶菌防止効果を確認したので、溶菌防止処理と呼ぶことにする。【００２０】
従来、百日菌の無毒化処理においては物理化学的処理法および化学処理法が使用されてきた。しかし、ホルマリンやグルタルアルデヒドによる化学的無毒化処理、またはγ線処理や紫外線処理などの物理化学的手段による無毒化処理においても、ただ１種類の処理のみ実施し、複数の方法を組み合わせて無毒化が行われることはなかった。これまでは、全菌体の無毒化処理の場合は細胞死とトキシンの不活化を確認できれば、また、遊離タンパク質の不活化においては機能活性の消失を確認できれば、不活化が完了すると理解されてきた。従って、複数の無毒化処理を組み合わせて実施するのは無駄であると考えられ、あえて試みられることは無かった。本発明者らは化学的手段の無毒化で製造した全菌体百日せきワクチンが毒性復帰を起こす原因の一つは溶菌にあると考え、その防止方法を検討した。その結果化学的無毒化処理に加えて物理化学的手段による溶菌防止処理を追加実施することがワクチンの品質安定化に有効であることを見いだした。【００２１】
溶菌防止処理は種々の化学品処理と、物理化学的処理の方法で実施できる。溶菌防止処理を目的として菌体を処理するのに用いる化学処理物質として以下の薬品と、使用可能な濃度例を合わせて以下に示すが、これらに限定されるものではない。
<化学処理物質およびその濃度>
ホルマリン(0.1-10 v/v % )、フェノール(0.1-5 v/v %)、クロロホルム
(10-60 v/v %)、アセトン(10-80 v/v %)、ＳＨ試薬 (1-100 mM)、
過酸化水素 (0.1-5 %)、過酢酸(0.5-10 w/v %)、二酸化炭素 (5-90 v/v %)、
オゾン(0.1-10 v/v %)、界面活性剤（0.01-5 w/v %）、【００２２】
また、物理化学的処理法には下記の手段を使用できる。使用可能な条件の一例を合わせて示すが、これらに限定されるものではない。
<物理化学的処理法およびその条件>
加温処理（温度：30-70 ℃；加温時間：10-120 分）、γ線照射(線源：コバルト60；5-50 kGy (キログレー))、レーザー光照射(光源：各種レーザー照射装置；波長500-700 mn；光量：0.01-1 J(ジュール)/cm2)、電子線照射(電子レンジ)、超音波照射
また、全菌体をマイクロカプセル化することにより見かけ上溶菌を防止することも可能である。これらの１種または複数の方法を組み合わせて用いることができる。同じ方法を複数回繰り返し実施してもよい。【００２３】
処理条件は固定的ではなく、菌体量、温度、緩衝液のｐH、処理時間、などを変化させて、好適な条件を設定することができる。通常、無菌条件下で操作する。
溶菌防止処理条件によっては、処理の結果、抗原タンパク質が過度に変性して抗原性を失う場合がある。そのため、処理後に免疫原性、その他の性質を調べ、最適の手段と最適の処理条件を総合的に考慮して選択する。
本発明のワクチン製造工程において、溶菌処理の時期として、好ましくは無毒化の前が良い。しかし、無毒化の後でも実施することができる。【００２４】
本発明の溶菌防止処理は、化学的無毒化処理と物理化学的無毒化処理の少なくとも一つの処理を行うものである。両方の処理を組み合わせて無毒化を行う場合は、化学的無毒化処理の後、物理化学的無毒化処理を行ってもよいし、物理化学的無毒化処理の後、化学的無毒化処理を行ってもよい。
本発明により製造された全菌体百日せきワクチン製品の保存中に溶菌が起こるかどうかは、製品の濁度を計測して判定することができる。この方法は微生物を扱う専門家にとって公知である。【００２５】
本発明の溶菌防止処理効果のメカニズムを考察すると以下の通りである
全菌体の化学的無毒化処理では細胞表層の機能蛋白質が失活して、細胞は死亡するが、細胞膜近傍の自己溶解活性は未処理菌体より低下するものの一部活性を保持したまま残存する場合がある。残存する自己溶解活性はワクチンが保存される低温条件下では十分活性を発現しないが、数ヶ月ないし数年にわたる長期保存の間に少しずつ作用し、ついには死菌体を溶菌させる。これに対し、化学的無毒化処理の後、物理化学的方法で追加処理を行った場合、残存自己溶解活性がさらに低下する結果、長期に渡って溶菌を起こさなくなると考えられる。この推定を支持する事実としては、処理効果の認められた加温処理、γ線処理、PCMB処理は何れも、酵素タンパク質に不可逆的変化を起こさせる作用のある点で共通している。【００２６】
本発明における第３の無毒化処理方法における改良点としては、菌体に精製純化処理を施すことが挙げられる。すなわち本発明の全菌体百日せきワクチンの製造において無毒化の前または後に精製純化処理を施す。【００２７】
本発明は、上記の改良全菌体ワクチンと同じ細菌由来の細菌成分ワクチンを混合した、混合細菌ワクチンを提供する。また本発明は、上記の混合細菌ワクチンの製造方法に関する。
ここでは、上記細菌ワクチンの一つである百日せきワクチンに関する発明について詳細な説明をおこなう。
以下の記述においてしばしば省略記号を使用するが、その意味は以下の通りとする。全菌体百日せきワクチンを「wP」と記す。無細胞百日せきワクチンを「aP」 と記す。また本発明の全菌体百日せきワクチンと無細胞百日せきワクチンの混合百日せきワクチンを「awP」と記す。
本発明の混合百日せきワクチン(awP)について説明する。本発明のawPは有効量以下の全菌体百日せきワクチン（wP）と有効量以下の無細胞百日せきワクチン（aP）を混合して製造される。実施例４および５において説明している通り、awPは全菌体百日せきワクチンと同等の有効性と無細胞百日せきワクチンに匹敵する安全性を兼ね備えている。【００２８】
本発明のawPの製造に用いるwPは、上記に述べた無毒化法を改良した改良全菌体百日せきワクチンが好適である。しかし従来法で製造された全菌体百日せきワクチンも使用することが出来る。
本発明のawPの製造に用いるaPの製造方法は公知の文献に記載されている方法を利用できる。従来の製法の一例として本発明者らの採用した方法の概略を以下に示す。
百日せき菌（Ｉ相菌）を適当な培地（例  コーエンウイーラー変法液体培地）に接種し、35℃前後で4-5日間静置培養する。培養液を遠心し、遠心上清に塩析剤を加える。すなわち硫酸アンモニウムなら約50 %飽和になるように添加し、またはアルコールなら約60 % (v/v)になる量を添加し、生じた沈殿を10,000 rpm程度の速度で、約30分遠心して集め、この沈殿を塩化ナトリウム添加緩衝液で抽出し、その抽出画分を蔗糖密度勾配遠心にかけて、百日せきトキシンその他をふくむ蛋白画分を回収する。次に回収した蛋白画分をホルマリンで無毒化して、無細胞百日せきワクチンとする。必要に応じてアルミゲルに吸着させることができる。【００２９】
本発明のawPの製造に用いるｗPとaPの量について説明する。認可されているwPは、通常およそ20 x 10 sup 9個細胞/mLの菌体を含む。WHO基準によれば、wPは、１mLに20 x 10 sup 9個以下の菌体を含み、力価は８国際単位/mL以上でなければならない。これに対し本発明のワクチンは(1 - 20) x 10 sup 9細胞/mLの細菌細胞を含む。すなわち、認可されているワクチン中の細胞数以下でよい。これにより、このままでは有効性が低下するが、全菌体ワクチンであることに付随するエンドトキシンなどによる毒性を軽減できる。特に本発明の改良全菌体百日せきワクチンを使用すれば、その改善効果は顕著である。【００３０】
一方、認可されているaPはトキシンを含むタンパク質を通常15 mcgPN/mL  程度（蛋白質窒素含量として）含んでいる。日本の生物製剤基準によれば、aPはタンパク質窒素 (PNと表記する)として20 mcg/mL  以下を含み、力価は８国際単位/mL以上でなければならない。これに対し本発明のワクチン（awP）は、apを0.1 - 20 mcgPN/mL 含む様に混合する。すなわち日本生物製剤基準に従い認可されたワクチンに含まれる量以下を用いることができる。これにより、aPの有効性を保持しつつ、安全性が確保される。【００３１】
wPとaPの混合比率はワクチンとして有効性が保持される限り、自由に変えられる。こうして製造される本発明のawPは、wPと同等の有効性とaPに匹敵する安全性を兼ね備えている。またwPを含むので製造費用は安価である。製造費用を考慮した場合、aPの含量が少ない場合により安価である。
本発明において、wPとaPの混合方法は特に限定されない。通常は各々のバルク溶液を製造し、その後、所望の比率となるように、物理的に混合する。その後、分注、栓締してワクチンが完成する。ワクチンの性状は溶液でも良いし、必要なら凍結乾燥などにより粉末にしても良い。新規百日せきワクチンawPの品質に関しては、監督官庁の認定する品質基準に適合しなければならない。【００３２】
本発明のワクチンに使用するwPとaPは、単独では有効量以下の量であってもよい。本発明において、有効量とはwPにおいては1- 20 x 10 sup 9細胞/mL、aPにおいては0.1-20 mcg PN/mLの範囲を示す。それにもかかわらず、本発明のawPは従来の濃度のワクチンと同じ程度の免疫原性を示す。その理由は以下のように説明される。本ワクチンは百日せき菌体と百日せきトキシンを含むため、被接種者にとって自然感染により近い状態を生じると考えられる。また、トキシン蛋白濃度とトキシン活性との関係からも説明できる。トキシンタンパク質の用量作用曲線は多くの場合直線関係ではない。百日せきトキシンの場合、その変化はS字型である。ある範囲では用量の減少に係わらず抗原性は実質的に維持され、それ以上減少すると幾何級数的に減少する。wPに含まれるエンドトキシンの用量作用曲線は用量の低下と共に幾何級数的に減少する。wPの用量作用曲線も幾何級数的に変化する。aPを少量増加させれば、抗原作用が幾何級数的に増加する範囲が存在する。さてwP とaP二種類のワクチンを少量ずつ混合する場合、ある適当な濃度範囲内では、wPの減少で免疫原生と毒性は低下する。しかしaPの添加で免疫原生は回復し、一方低下した毒性はそのまま維持される。本発明のawPワクチンにおいて、wPに相当する有効性を有し、しかも、wPに伴う毒性は低下することは、上記のように考えれば説明される。【００３３】
含まれる毒素タンパク質の性質から説明する。本発明に用いるaPの中に含まれる百日せきトキシンは標的細胞においてアデニル酸シクラーゼ活性を活性化する作用を有するタンパク質であり、アジュバント作用が強い。この点を考えれば少量の添加により有効性が顕著に回復することが説明される。
上記の混合細菌ワクチンの製造方法は、他の細菌由来の細菌ワクチンについても適用できる。
本発明は、上記に記載の少なくとも一種類以上の混合細菌ワクチンと、他の少なくとも一種類以上のワクチン抗原とからなる、安全で有効な混合ワクチンを提供する。また本発明は、上記の混合ワクチンの製造方法に関する。【００３４】
本発明の改良全菌体細菌ワクチンと本発明の混合細菌ワクチンは、何れも別のワクチン抗原と混合して混合ワクチンとして使用できる。
例えば従来百日せきワクチンは破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドと混合したＤＴＰ三種混合ワクチンとして使用される場合がある。本発明のwPならびにawPも同様に破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドと混合した後、ＤＴawＰワクチンとして利用可能である。また、そのＤＴＰワクチンが第４の抗原と混合使用することが可能である。第４のワクチン抗原として、インフルエンザ菌ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、肝炎ワクチン、および日本脳炎ワクチン等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。【００３５】
有効なアジュバントをワクチンに添加してワクチンの効果を増強させることは公知である。従って本発明のワクチン（混合ワクチンを含む）にも適切なアジュバントを添加しうる。本発明のワクチンに用いられるアジュバントとしては、水酸化アルミとその無機塩類、スクワレンやオイルなどの炭化水素類、コレラトキシンなど細菌トキシン類、サポニン類、等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一般にあるワクチン抗原の免疫作用を増強させるのに有効なアジュバントの種類に規則性は見いだせない。また、有効なアジュバントの種類は投与方法によっても異なる。しかし、当業者にとって公知の試行錯誤法により、ワクチンに有効なワクチンの種類と濃度を決定できる。【００３６】
無細胞百日せきワクチン（aP）は通常アルミゲルに結合している。本発明のワクチンawPに使用するaPはアルミアジュバントと結合していても良い。本発明のawPは、アルミゲルがawP中に存在するが、認可されたワクチンの抗原量より減量したaPを含むのでそれに比例してアルミ量も減量される。また、本発明のワクチンawPに使用するaPは、遊離型でも良い。遊離型aPを使用した場合にはawPにはアルミは存在しない。アルミ含量の減量されたワクチンはアルミに基づくと考えられる望ましくない副反応が減少する効果が期待される。例えば、接種部位のしこりが少ない、アルミニウムによると言われることのある向神経作用の可能性が少ない、などである。
ワクチンの通例として、本発明のワクチン製品には抗原の他に、安定剤（ゲラチン）、保存剤（チメロサール、フェノキシエタノール、）、着色剤（フェノールレッド）などを存在させる事が出来る。【００３７】
本発明の細菌ワクチンの接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。すなわち全菌体細菌ワクチンも無細胞細菌ワクチンも皮下注射、筋肉注射で接種されるので、本発明のワクチンも皮下注射、筋肉注射で接種することが可能である。さらに適切な剤型を選べば、経鼻接種、経口接種、経皮接種も可能である。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕  アミノ酸などの存在下で無毒化した全菌体百日せきワクチンの製造
アミノ酸などの存在下の無毒化により得られる改良全菌体百日せきワクチンを長期保存し、この間に毒性復帰が起こるかどうかを調べた。試験実施の方法は以下の通りである。
菌株  ボルデテラ・パタシス（Bordetella pertussis）（Ｉ相菌）
培地: コーエンウイーラー  変法液体培地
培養：試験菌株を培地に接種し、３５℃前後で１日間 通気撹拌しながらタンク培養した。
得られた菌体を遠心法で洗浄し、塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(PBS)（0.01M, pH 7）に650 nmの濁度が 20となるように懸濁した。この１００ｍＬを５００ｍＬのガラス容器に移した。（液面の高さ約２ｃｍ）。ここに0.05 Mの濃度の各種アミノ酸または他の試験物質を、各々一種類添加した。その後、全菌体百日せきワクチンの製造方法の通り0.5 %（v/v）ホルマリンで5週間放置することにより無毒化した。次に、遠心法によりホルマリンと添加物質を除去した後、PBS中で菌数を20 x 10sup9/mLに調整した。その後、チメロサール（0.01 w/v %）を添加し、1.3 ｍＬずつバイアルに分注して全菌体百日せきワクチンを作成した。
各バイアルを2-10℃の冷所に保存した。半年後と２年後にバイアルを開封し、同一条件で作成した試料のバイアル5本分を合わせて１検体とした。5検体を使用し、日本生物製剤基準に従い品質管理試験を実施した。試験のうち、毒性復帰を検出できるヒスタミン増感試験の結果（37℃加温後の測定値）を表１に示す。【００３９】
【表１】
0005207380.tif 000002
【００４０】
ヒスタミン増感試験結果で表示する数字は以下の範囲を示し、単位はHSU/mLである。
０：0.1 以下
１：0.1-0.2
２：0.2-0.4
３：0.4 以上
以上の結果から、グリシン、リジンまたはスレオニンなどのアミノ酸の存在下でホルマリンにより無毒化した製剤が保存中に安定であることが明らかとなった（表１：２年後）。アミノ酸無添加で無毒化処理した製品（対照）では毒性復帰が認められた。アミン類、アミド類、あるいは他のアミノ酸（アラニン、γ―アミノ酪酸、アルギニン、 グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、またはセリン）の存在下で無毒化した場合も、毒性復帰がわずかに認められる程度であった。しかし、無処理対象では毒性復帰が顕著であった。【００４１】
〔実施例２〕  百日せき菌の溶菌防止処理
百日せき菌に無毒化処理と溶菌防止処理を施した製品の長期保存中の溶菌を調べた。試験の方法は以下の通りである。
実施例１の場合と同様に培養して得られた菌体を全菌体百日せきワクチン製造の場合と同様に洗浄し、0.01M PBS(pH 7)に濁度２０となるように懸濁した。この１００ｍＬを５００ｍＬのガラス容器に移した。（液面の高さ約２ｃｍ）。表２処理法１では記載の化学薬品を記載通りの最終濃度になるよう添加した。処理法２では二酸化炭素インキュベーター中に放置した。処理法３−６ではそのまま処理した。何れの場合も処理途中で適宜、軽く撹拌した。処理終了後、処理菌体は緩衝液で２回洗浄して同じ緩衝液に再度懸濁した。その後、表に記載の通り0.05M リジンの存在下、ホルマリンで無毒化した。各処理の菌懸濁液をワクチン製造法に従い、ホルマリンを除去してから1.3 ｍＬずつバイアルに分注した。こうして１−７の処理を加えた全菌体百日せきワクチンを作成した。【００４２】
各バイアルを2-10℃の冷所に保存した。２年後にバイアルを開封し、同一処理条件で作成したバイアル５本分の試料を合わせて１検体とした。１−７の７種類おのおの３検体の試料を適当に稀釈した後、波長650 nm で濁度を測定した。その値と製造直後の対照２の濁度と比較した。結果を表２に示す。【００４３】
【表２】
0005207380.tif 000003
【００４４】
波長650 nmにおける濁度は以下の通りである
＋＋＋：０．８−１．０
＋＋：０．５−０．８、
＋：０．２−０．５，
±：０．２以下、
―：無色透明を示す。
以上の結果から、アセトン処理、加温処理などを施した場合に、２年後の濁度の低下が少なくなることが明らかとなった。無処理（対照１）の場合は溶菌が著しかった。処理法３と４、ならびに処理法５と６の比較から、溶菌防止処理と無毒化処理の両方を施した場合に溶菌が少なくなることが明らかとなった。【００４５】
〔実施例３〕  コレラワクチンの製造
全菌体コレラワクチンを製造し、品質を調べた。
試験菌株：ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）小川株（S型菌）、稲葉株（S型菌）
培地：普通寒天培地
培養：37℃、20時間培養
得られた菌体を全菌体コレラワクチン製造の場合と同様に洗浄し、0.015M PBS(pH 7)に濁度10になるように懸濁した。この１００ｍＬを５００ｍＬのガラス容器に移した。（液面の高さ約２ｃｍ）。そのまま処理法1-11で処理した。何れの場合も処理中のガラス容器を適宜、軽く撹拌した。処理終了後、遠心法により菌体を洗浄し、PBSに再懸濁した。全菌体コレラワクチンの製造方法の通り、0.5% (v/v)ホルマリンを添加し、無毒化した。３週間後、遠心法でホルマリンを除去した。各処理の菌懸濁液をコレラワクチン製造法に従い、フェノールを添加し、続いて１０ｍＬずつバイアルに分注し、1-11の処理済み全菌体コレラワクチンを作成した。
各バイアルを５℃前後の冷所に保存した。２年後にバイアルを開封し、同一条件で作成した試料を検体として用いた。２検体を各処理法について用い、適宜稀釈して、波長650 nm で濁度を測定した。その値と製造直後の対照の濁度と比較した結果を表3に示す。【００４６】
【表３】
0005207380.tif 000004
【００４７】
ＰＣＭＢの説明：p-choloro-mercuribenzoate  の略称。ＳＨ試薬（すなわち、タンパク質のＳＨ基に強く反応する試薬）の一種である。
濁度欄の記号は以下の通りの意味である。波長650 nmにおける濁度が
＋＋＋：０．８−１．２；＋＋：０．５−０．８；＋：０．２−０．５，
±：０．２以下；―：無色透明を示す。
以上の結果から、アセトン処理、加温処理などを施した場合に、無処理（対照１）に比べて２年後の濁度の低下が少なくなることが明らかとなった（表３）。無処理（対照１）の場合は溶菌が著しかった。【００４８】
次に、表３の処理法4の方法でワクチンを作成し、人に投与した。両者を比較した結果を表4にまとめて示す。【００４９】
【表４】
0005207380.tif 000005
【００５０】
以上の結果から、本発明のコレラワクチンの安全性が改良されていることが明らかとなった（表４）。【００５１】
〔実施例４〕  新規百日せきワクチンawPの製造
全菌体百日せきワクチンwPと無細胞百日せきワクチンaPを混合して本発明の新規百日せきワクチンawPを製造し、その有効性と安全性を調べた結果を示す。
全菌体百日せきワクチンwPは実施例２（表２，試験番号３）で作成したリジン存在下のホルマリン無毒化処理により製造した改良全菌体百日せきワクチンを使用した。無細胞百日せきワクチンaPは北里研究所（日本）製のアルミ吸着製品を使用した。
wPとaPを種々の量比で混合し、新規百日せきワクチンawPを製造した。そのワクチンの有効性と安全性を調べるため、2004年の日本生物製剤基準に規定される方法で品質管理試験を実施した。結果は表5の通りであった。表中#印と * 印は無細胞百日せきワクチンの日本生物製剤基準（一部自家基準）に比較して、各測定値が適合（#）するか、不適合（*）であるかを示す。【００５２】
【表５】
0005207380.tif 000006
ワクチン A1-A3：  無細胞百日せきワクチン、使用量は蛋白チッソ量（mcg PN/mL）  で示す。
ワクチンW1-W2：  全菌体百日せきワクチン、使用量は細胞数(単位はビリオン(billion), 10sup9)で示す。
ワクチン AW1-AW2:：無細胞百日せきワクチンと全菌体百日せきワクチンを混合した百日せきワクチンawPを示す。
ＤＴｗＰ：ジフテリアー破傷風―全菌体百日せき  三種混合ワクチン（市販品）。【００５３】
試験結果を示す略号の意味は以下の通りである。
毒性の指標
ＢＷＤ（マウス体重減少毒性）  日本生物製剤
LP    （マウス白血球増加毒性）日本生物製剤
HS  （マウスヒスタミン感受性毒性）日本生物製剤
Tox  （モルモット異常毒性否定試験）日本生物製剤、体重値を示す。
有効性の指標
Ａｂ    （抗体価）自家基準
Ｐ（マウス脳内攻撃法による百日せきワクチンの力価）日本生物製剤【００５４】
本発明の新規百日せきワクチンAW1は、wPに関してＷＨＯ生物製剤基準で許容される最大菌数量20 x 10 sup 9/ｍLの半量と、aPに関して認可されたワクチン中の毒素タンパク窒素量の1/5量を含むワクチンである。表５から明らかなとおり、AW1は毒性の指標であるLP（マウス白血球増加毒性）、HS（マウスヒスタミン感受性毒性）、Tox（モルモット異常毒性否定試験）において、無細胞百日せきワクチンの日本生物製剤基準に適合する測定値を示した。また力価（マウス脳内攻撃法）も適合することがわかる。ただし、エンドトキシンなどによる毒性を反映するとされるＢＷＤ（マウス体重減少毒性）においては適合しなかった。対照として使用した市販品のDTwPは無細胞百日せきワクチンの品質に関するいくつかの日本生物製剤基準（2004年版）に適合しないことが分かる。【００５５】
〔実施例５〕  噴霧感染法によるawPの有効性の測定
実施例４と同様の方法でawPを作成した。噴霧感染法でawPの有効性を調べた。
本awPの有効性を調べるために噴霧感染法を採用した。実施例４で力価を調べるのに使用した脳内攻撃法は、日本生物製剤基準において全菌体と無細胞療法の百日せきワクチンの力価測定の標準法に採用されているが、欧米諸国では使用されていない。欧米諸国やＷＨＯ生物製剤基準に於いて標準化された力価測定法はないが、しかし、噴霧感染法は標準測定法の候補の１つである。そこで本方法を採用した。【００５６】
噴霧感染による力価測定法の概略は以下の通りである。方法の詳細は文献に記載されている（１）Watanabe M, Komatsu E, Abe K, Iyama S, Sato T, Nagai M.  Efficacy of pertussis components in an acellular vaccine, as assessed in a murine model of respiratory infection and a murine model of intracerebral infection.  Vaccine 2002;  20:1429-1434.
（２）Watanabe M, Nagai M.  Reciprocal protective immunity against Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in a murine model of respiratory infection.  Infect Immun 2001;  69:6981-6986.）【００５７】
マウス（3.5週令）にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した試験ワクチンをマウス１匹あたり0.5 mL腹腔内接種した。その3週間後、以下の方法で噴霧感染させた。マウスを網ケージに入れ、安全キャビネット内に設置したアクリル製噴霧噴霧箱中に吊した。一方、37℃で30時間培養した百日せき菌（18-232株）を氷冷したPBSに懸濁し、10×10 sup 9 cells/mLに調製した。調製した菌懸濁液をネブライザーに入れ、噴霧感染箱に接続したのち、ろ過滅菌空気を通じて（3.5〜4.0 L/min）エアゾルを発生させた。このエアゾルを噴霧感染箱に導入しマウスに吸入させた。菌液のエアゾルをマウスが均一に吸い込むように、ケージの位置を5分に一回、90度ずつ回転させた。噴霧終了後、ろ過滅菌空気を30分間導入し噴霧感染箱内のエアゾルを除き、マウスを取りだした。マウスを２週間無菌的に飼育した後、頚椎脱臼したマウスから肺を無菌的に摘出し、10 mLの氷冷したPBS中でホモジナイズした。この液を10sup(-1)希釈液として、以下10倍段階希釈を行った。希釈液をボルデ・ジャング培地に塗沫後、37℃で4日間培養し、生じた集落数から肺内生菌数を算定した。肺内生菌数は集落形成単位（colony-forming unit, CFU）で表記した。
結果を表6に示す。【００５８】
【表６】
0005207380.tif 000007
【００５９】
試験番号３(W20)は認可されている全菌体百日せきワクチンと同等量を含む。
試験番号８（A15）は認可されている無細胞百日せきワクチンと同等量を含む。この２つを接種した場合、何れも非接種対照（試験番号９）より生菌数が約２log低下した。これを有効レベルとした場合、試験番号５（W10+A3）は有効であると判断できる。【００６０】
〔実施例６〕  DTwP三種混合ワクチン
北里研究所（日本）製DTaPの製法に準じ、aPの代わりに実施例２（表２，処理法３）の方法で製造したwPを使用した。本発明の百日せきワクチンwPとジフテリアトキソイド(D)、破傷風トキソイド(T)を含む三種混合ワクチンDTwPを作成した。それぞれの成分抗原の力価を日本生物製剤基準の方法で測定した。結果を表7に示す。【００６１】
【表７】
0005207380.tif 000008
【００６２】
結果は試験した力価試験において何れも日本生物製剤基準に適合した。【００６３】
〔実施例７〕  DTawPと 日本脳炎ワクチン(ccJE)の混合ワクチン
実施例4（表5，試験記号ＡＷ１）の方法でawPを製造した。DTwP製造方法に準じ、wPの代わりに上記のawPを用い、awPとジフテリアトキソイド(D)、破傷風トキソイド(T)を含む三種混合ワクチンDTawPを作成した。さらにこれと細胞培養法で製造された日本脳炎ワクチン（ccJE）を混合した混合ワクチン（DtawP-ccJE）を作成した。日本脳炎ワクチン（ccJE）は北里研究所（日本）製の試作品を使用した。それぞれの抗原成分の力価を日本生物製剤基準の方法で測定した。結果を表８に示す。【００６４】
【表８】
0005207380.tif 000009
【００６５】
以上の結果より、試験した力価試験において何れもDTaPの日本生物製剤基準に適合することが明らかとなった。混合後の日本脳炎ワクチン（ccJE）の力価は混合前に比べて実質的に変わらないか、もしくは幾分高かった。【００６６】
〔実施例９〕  全菌体細菌ワクチンの製造
供試菌：百日せき菌、コレラ菌はワクチン製造株を使用した。他の菌株は実験室保存株を使用した。
培養法：百日せき菌、パラ百日せき菌は実施例１の通り培養して得た。コレラ菌は実施例３の通り培養してえた。他の細菌は普通栄養寒天培地に塗抹して３３℃、16-24時間培養した菌体を用いた。それぞれ得られた菌体を遠心法で洗浄し、塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(PBS)（0.001M, pH 7）に650 nmの濁度が１０（およそ1x10 sup 9 細胞/ｍＬ）となるように懸濁した。この１００ｍＬを５００ｍＬのガラス容器に移した。これを以下の処理法で処理して、全菌体細菌ワクチン液とした。
処理法：加温処理は55℃、３０分加温した。アセトン処理は等量のアセトンを加え、撹拌しながら室温で12時間処理し、これを２回繰り返した。ホルマリン処理はホルマリンを最終濃度0.5%(v/v)に添加し、室温で３週間放置した。何れの場合も、処理後、洗浄法と遠心法で処理剤を除去し、処理菌体を塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液(PBS)（0.001M, pH 7）に650 nmに再度、懸濁した。各々バイアルに1.3 mLずつ分注し、冷所に保存した。【００６７】
安定性の測定法：各バイアルを2-10℃の冷所に保存した。１年後にバイアルを開封し、同一処理条件で作成した試料のバイアル５本分の試料を合わせて１検体とした。検体の試料を各々稀釈した後、波長650 nm で濁度を測定した。その値と製造直後の対照の濁度と比較した。結果を表９に示す。
マウスの免疫：各種の処理を施した菌体の懸濁液（保存開始直後）1 mLをマウスに腹腔投与し、３週間隔で合計３回接種した。最後の接種から１ヶ月後にマウスから採血し、抗血清を得た。
抗体検出法：抗血清をとり、ＰＢＳで稀釈系列を作成し、0.05 mLを96穴マイクロプレートに分注した。ここに抗原として使用した無毒化細菌（細胞数  約10 sup 8/mL）0.05 mLを添加し、沈降反応を観察し、抗血清の稀釈率から抗体価を算出した。抗体価を表９に示す【００６８】
【表９】
0005207380.tif 000010
【００６９】
処理記号の意味：H 加温処理；A. アセトン処理; F ホルマリン不活化
溶菌みとめず：波長650 nmにおける濁度が０．８−１．２であり、対照の濁度が１．０であることを示す。
表９の結果から、試験した何れの菌株に置いても、保存安定性の良好な全菌体細菌ワクチンが製造されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
病原細菌を無毒化処理して製造した細菌ワクチンであっても、保存過程においてしばしば毒性復帰を起こすことがこれまでにわかっており、長期間の保存において毒性復帰が起こらないことは、ワクチンの安全性を維持する上で非常に重要なことであった。本発明の全菌体細菌ワクチンは、従来製造されてきたワクチンよりも、長期保存しても安全性が確保されやすい性質を持っており、医療・製薬分野で非常に有益なものである。長期保存が可能なため、世界中で本発明のワクチンの使用が可能となる。長期にわたって猛威を奮う病原菌の場合、時間の経過につれて病原菌が変異を起こす場合があり、それらの病原菌の感染防止をワクチンで対処するためには、様々な種類のワクチンを長期保存しておく必要がある。本発明のワクチンの製造方法は、そのような長期保存の必要性がある場合に非常に有効であるといえる。
また、本発明の混合細菌ワクチンは従来製造されてきた全菌体細菌ワクチンと同等もしくはそれ以上の有効性をもち、安価に製造でき、大量生産に好適であり、かつ無細胞細菌ワクチンに匹敵する安全性を有するワクチンであると期待される。