(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
海藻類の培養のための組織培養法であって、
ａ）家庭用液体界面活性剤、ポビジン(povidine)ヨウ素を添加した滅菌海水中における処理を含む藻類材料の処理により組織培養のための生存能力のある藻類の無菌材料を確立し、次いでその処理材料を広スペクトル抗生物質混合物および殺菌剤を含むプロバソリ(Provasoli)富化海水（ＰＥＳ）培地で２４時間〜９６時間インキュベートし、その後、滅菌海水で洗浄することで抗生物質および殺菌剤の痕跡を除去し、滅菌濾紙で吸い取って無菌外植片を得て；
ｂ）カルス誘導のために上記無菌外殖片をＰＥＳ培地を添加した寒天プレート上で２０〜２５℃の範囲の温度にて２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で培養し；
ｃ）分化した濃く着色した卵形または球形の微小胎芽を得るために、少なくとも４０日後外植片からカルスを切り出し、カルスを４０〜６０μｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、新鮮寒天プレートで継代培養し；
ｄ）着色した繊維状カルスにおける体細胞胚形成および微小胎芽形成の増加を達成するために、着色したカルスの薄切片を、植物成長調節剤を含むプロパソリ富化海水（ＰＥＳ）培地の寒天プレートで、４０〜６０μｍｏｌ光量子ｍ-２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、２０〜４０日間継代培養し；
ｅ）体細胞胚を含む繊維状カルスを胎芽からの多シュートを含む幼植物体の形態形成および発達のために振盪条件下液体ＰＥＳ培地に移し；
ｆ）幼植物体を、封じた有孔ポリエチレンバッグ内で成長させることによって藻類バイオマスを大スケールで培養する
工程を含んでなり、
組織培養の材料がEucheuma属に属するものであり、植物成長調節剤がナフタレン酢酸、およびナフタレン酢酸と６‐ベンジルアミノプリンから選択される、方法。
【請求項２】
組織培養の材料がEucheuma striatum, Eucheuma cottonii, Eucheuma denticulatum, Eucheuma spinosum, Eucheuma alvarezii および Eucheuma procrusteanumを含む藻類の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
無菌外植片が、直径３〜４ｍｍを有する長さ１〜６ｍｍの切片であり、藻類の上部もしくは端部から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
藻類材料を、まず０．１〜１％の家庭用液体界面活性剤で５０〜２０分間処理し、次いで０．１〜２％のポビジンヨウ素で２〜７分間処理し、最終的に１〜５％抗生物質の２４〜９６時間混合物を含むプロバソリ富化海水で処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗生物質混合物が、１００ｍｌの蒸留水中にペニシリン、硫酸ストレプトマイシン、カナマイシン、ナイスタチンおよびネオマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
プロバソリ富化海水培地を添加した０．８〜３％の寒天を含有する寒天プレートで２０〜２５℃にて２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ-２ｓ−１の冷白色蛍光光下、２０〜２５℃での１２：１２明暗周期で無菌外植片を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
着色カルスの薄切片を、０．３〜０．６％の寒天を含有しプロバソリ富化海水培地からなる寒天プレート中の包埋培養として、２０〜２５℃にて２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ-２ｓ−１の冷白色蛍光光照射下、１２：１２明暗周期で成長させることによりカルスを継代培養し、各包埋ブロックにおいて旺盛に分枝した繊維状着色カルスを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
植物成長調節剤が０．１〜１．０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸ならびに各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
無菌外植片を工程（ｂ）において寒天プレートで４０〜４５日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
藻類バイオマスを工程（ｆ）において海中のロングフローティングラインに取り付けた６０×４５ｃｍのポリエチレンバッグ内で成長させ、６０日後に収穫物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
幼植物体を工程（ｆ）において２２．５℃〜２８．５℃の範囲の年間海水温度、７．８１〜８．２６のｐＨ、２４．０‰〜３４．０％の塩度、７．８４ｍｌ／ｌ〜１５．６８ｍｌ／ｌの溶存酸素、０．０２μｍｏｌ〜３．２３μｍｏｌのリン酸塩、０．１５μｍｏｌ〜２．５８μｍｏｌの硝酸塩および０．０１μｍｏｌ〜０．８５μｍｏｌの亜硝酸塩を用いて有孔ポリエチレンバッグ内で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
微小胎芽を工程（ｄ）において着色繊維状カルスの体細胞胚形成を介してクローン増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
幼植物体を、工程（ｆ）においてフローティングロングラインに取り付けて沈めた有孔の透明ポリエチレンバッグ内で、少なくとも６０日間海中での保護培養にて成長させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも６０日の収穫期間が、より高いバイオマスを生じ得るか、またはバイオマス収量を一定に維持でき、かつ培養期間を短縮できる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
着色カルスからの微小胎芽形成により、生成物収量（カラギーナン）およびゲル強度の変化なしに、対照親植物に対して２倍の成長増加（新鮮重量）が達成される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は藻類の培養のための改良法に関する。本発明は大型水生植物の多細胞海藻類（海草類）の分野、より詳しくは海草の海洋栽培に属する。
【０００２】
発明の背景
海草類は寒天、カラゲナンおよびアルギネートなどの藻類コロイドの重要な供給源と考えられている。寒天およびカラゲナンはある種の紅藻類の細胞壁に存在する構造多糖類であり、他方、アルギネートはある種の褐藻類に由来する。海草の藻類コロイドは乳化剤、ゲル化剤、安定剤、増粘剤および沈殿防止剤として種々の産業で広く用いられており、従って、海草類の付加価値製品と考えられている。従来、藻類コロイドは天然資源から収穫した原料から抽出されている。しかしながら、海草の利用の増加は、事実上十分な原料が得られないことと相まって結局は種々の効率的な培養技術の開発の成功ならびに系統の栽培化および選抜をもたらした。
【０００３】
先行技術参考文献
J.R.Waaland(Proc. of the Intl. Seaweed symp. 9, 241-247,1979)は彼の研究で実験的タンク培養において種々の集団から集めた野生植物の成長速度を比較することによりギガルチナ・エクサスパラタ(Gigartina exasporata)において成長の速い系統の選抜を試みた。次いで、コンドラス・クリスプス(Chondrus crispus)、グラシラリア・チクバヒエ(Gracilaria tikvahiae)、グラシラリア・ベルコサ(Gracilaria verucosa)などの野生集団から成長および藻類コロイド収率に関して優れた能力を有する多数の系統を選抜した(D.P Cheney et al., Proc, of the Intl. Seaweed Symp. 10, 559-567,1981; J.H.Ryther et al., Proc. of the Intl. Seaseed Symp. 9, 1-16,1979; I. Levy and M. Friedlander, Botanica Marina, 33, 339-345,1990)。これらの系統に関する主な欠点は、選抜が特定の環境条件に基づいており、従って、最適能力が選抜がなされた培養条件と深く関連していることから能力の予測性に乏しいことである。さらに、かかる選抜はうまくいったとしても、通常、増分利益しかもたらさない。
【０００４】
G.C. Trono(Seaweed cultivation and Marine Ranching, M. Ohno and A.T. Critchley,(eds.). JICA Publication, Japan, 75-88, 1993)はキリンサイ(Eucheuma)およびカッパフィカス(Kappaphycus)の分類学および栽培を記載しており、栽培者は収穫物から最も優れた植物をスクリーニングおよび選抜し、かかる植物を次の収穫のために再度植え付ける供給材料として使用することで、野外農場条件下で粗選抜を実施していることを記載している。かかる系統の栽培の主な欠点は農業条件の季節的変動への適応が不十分なため収量が一様でないことである。
【０００５】
C.J Dawes and E.W.Koch(J. Appl. Phycology, 3, 247-257, 1991)およびC. J. Dawes, G. C. Trono and A. O. Lluisma (Hydrobiologia, 260/261, 379-383, 1993)はマイクロプロパゲーションおよび組織培養を介してキリンサイの種々の栽培種の選抜クローンの維持および増殖のために好適な方法を開発しようとした。彼らの研究は小さな増殖断片を用いた栽培キリンサイのクローン増殖のための好適な実験室培養技術の確立により重点をおいた。微小切片を用いるかかる増殖の主な欠点は子孫は親の特徴を有するにすぎず、所望の形質の発現において親集団に優る明確な利点を持つわけではないということである。
【０００６】
D.P. Cheney, Wang and Le Zhongは１９９６年の米国特許第５，５８５，５４４号で、栄養溶液中で極めて密接して２種の各々に由来する体細胞藻組織を増殖させることによりユーケウマ・コットニー(Eucheuma cottonii)とE.スピノスム(E. spinosum)の間の体細胞雑種形成を引き起こし、より望ましい目的産物の特徴を有する雑種体細胞シュートを単離する方法を示した。藻類における体細胞雑種形成の主な制限は、いずれか一方の親に由来するいくつかの既存の形質を伝えること以外には子孫に新規な形質を導入することにこれまで成功していないということである。
【０００７】
カッパフィカスおよびキリンサイの商業的栽培および加工に関してはいくつかの論文が発表されている(J.R. Lim and H. Porse. Proc. of the Intl. Seaweed Symp. 10, 601-606, 1981; H. Adnan and H. Porse, Hydrobiologia, 151/152, 355-358, 1987; R. Azanza-Corrales and P. Sa-a, Hydrobiologia, 204/205, 521-525, 1990; G. P. B. Samonte, A.Q. Hurtado-Ponce and R. Caturao, Aquaculture, 110, 1-11, 1993)。G.C. Trono(Seaweed cultivation and Mrine Ranching, M. Ohno and A.T. Critchley(eds.), JICA Publication, Japan, 75-88, 1993)は固定オフボトムモノライン法およびフローティングラフトまたはロングライン法などの２種の栽培法を記載しており、これらはキリンサイの栽培に広く用いられている。いずれの方法でも、豊富な分枝を有する選択したキリンサイ先端切片（５０〜１００ｇ）を軟プラスチック固定材料を用いて２５〜３０ｃｍ間隔で栽培ロープにつなぎ（フィリピンではtie-tie法として知られている）、１キログラム以上に成長させた後収穫する。作物は成長速度にもよるが６０〜９０日毎後に収穫する。モノライン法およびフローティングラフトまたはロングライン法双方に共通するいくつかの制限および欠点がある。それらは（ｉ）胎芽／種苗材料が、材料全体を食害して、その後の作物生産に悪影響を及ぼし得る草食動物に直接さらされること、（ii）植え付けたものが保護されていないので、不利な海洋条件によっては材料が栽培ロープから洗い流されてしまう場合があること、（iii）不利な海洋条件の際の着生植物よび異物の付着により目的産物の所望の品質を確保するために煩雑で時間のかかる海草の洗浄が必要となり得ることである。
O.P. Mairh et al. (Indian J. Marine Sciences, 24, 24-31, 1995)は屋外条件における実験規模でのユーケウマ・ストリアツムのバッグ栽培の実行可能性を実証することに成功した。しかしながら、この方法の主な欠点として、ポリエチレンバッグを用いない開放水域においてそれらが成長するのと比較して日間成長率が低下してしまうということがある。本発明はin vitro組織培養技術によって従来の海草からバッグ内でも、開放水域で親植物が成長するのとおよそ同程度の成長能を示す、成長の速い系統を開発することによって、バッグ内で成長が低下するという欠点を克服する。
【０００８】
発明の目的
本発明の主要な目的は、上記で詳説した欠点を未然に防ぐ、藻類、より詳しくはキリンサイ属（Eucheuma）の栽培のための改良法を提供することである。
【０００９】
本発明のもう１つの目的は組織培養を介してキリンサイの成長の速い変種を開発することである。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの目的は、重要な海草類の大規模栽培のために多数の胎芽（苗材料）のクローン生産を可能にする方法を開発することである。
【００１１】
発明の具体的説明
従って、本発明は、
ａ）家庭用液体界面活性剤、ポビジン(povidine)ヨウ素を添加した滅菌海水中における藻類材料の一連の処理により組織培養のための生存能力のある藻類の無菌材料を確立し、最後にその処理材料を広スペクトル抗生物質混合物および殺菌剤を含むプロバソリ(Provasoli)高含有海水（ＰＥＳ）培地で約２４時間〜９６時間インキュベートし、次いで、滅菌海水で洗浄することで抗生物質および殺菌剤の痕跡を除去し、滅菌濾紙で吸い取って無菌外植片を得て；
ｂ）カルス誘導のために無菌外殖片をＰＥＳ培地を添加した寒天プレート上で２０〜２５℃の範囲の温度にて約２０〜３０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で培養し；
ｃ）少なくとも４０日後外植片からカルスを切り出し、カルスを４０〜６０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、新鮮寒天プレートで継代培養し、分化した濃く着色した卵形または球形の微小胎芽を得て；
ｄ）着色したカルスの薄切片をＰＥＳ培地の寒天プレートで、４０〜６０ｍｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、約２０〜４０日間継代培養し、着色繊維状カルスにおける体細胞胚形成および微小胎芽形成の増加を達成し；
ｅ）体細胞胚を含む繊維状カルスを胎芽からの多シュートを含む幼植物体の形態形成および発達のために振盪条件下液体ＰＥＳ培地に移し；
ｆ）幼植物体を、封じた有孔ポリエチレンバッグ内で成長させることによって藻類バイオマスを大スケールで培養する、
工程を含んでなる藻類の培養のための組織培養法を提供する。
【００１２】
１つの具体例では、用いる外植片が海藻の上部に由来する、直径３〜４ｍｍ、長さ１〜６ｍｍの切片である。
【００１３】
もう１つの具体例では、１００ｍｌの蒸留水中に、ペニシリン、硫酸ストレプトマイシン、カナマイシン、ナイスタチンおよびネオマイシンを含有する１〜５％の抗生物質混合物を含むＰＥＳ培地中で海草を処理する。
【００１４】
さらにもう１つの具体例では、ＰＥＳ培地を添加した０．８〜３％の寒天を含有する寒天プレートで２０〜２５℃にて２０〜３０ｍｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１冷白色蛍光光照射下、１２：１２明暗周期で無菌外植片を培養する。
【００１５】
なおもう１つの具体例では、色素カルスの薄切片を０．３〜０．６％の寒天を含有し、ＰＥＳ培地からなる寒天プレート中の包埋培養として、２０〜２５℃にて４０〜６０ｍｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１の冷白色蛍光光照射下、１２：１２明暗周期で成長させることによりカルスを継代培養し、各包埋ブロックにおいて旺盛に分枝した繊維状色素カルスを得る。
【００１６】
１つの具体例では、用いる植物成長調節物質は０．１〜１．０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸ならびに各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンから選択される。
【００１７】
もう１つの具体例では、無菌外植片を寒天プレートで約４０〜４５日間培養する。
【００１８】
さらにもう１つの具体例では、先端切片を海中のロングフローティングラインに取り付けた６０×４５ｃｍのポリエチレンバッグ内で成長させ、約６０日後に収穫物を得る。
【００１９】
もう１つの具体例では、幼植物体を２２．５℃〜２８．５ｆＣの範囲の年間海水温度、７．８１〜８．２６のｐＨ、２４．０‰〜３４．０％の塩度、７．８４ｍｌ／ｌ〜１５．６８ｍｌ／ｌの溶存酸素、０．２２ｎｍｏｌ〜３．２３ｎｍｏｌのリン酸塩、０．１５ｎｍｏｌ〜２．５８ｎｍｏｌの硝酸塩および０．０１ｎｍｏｌ〜０．８５ｎｍｏｌの亜硝酸塩を含む有孔バッグ内で培養する。
【００２０】
なおもう１つの具体例では、微小胎芽を色素性繊維状カルスの体細胞胚形成を介してクローン増殖させる。
【００２１】
もう１つの具体例では、幼植物体をフローティングロングラインに取り付けて沈めた有孔の透明ポリエチレンバッグ内で、少なくとも６０日間海中での保護培養にて成長させる。
【００２２】
さらにもう１つの具体例では、色素性カルスの体細胞胚形成を介する体細胞胚の形成プロセスをα−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンなどの植物成長調節物質の添加によってさらに促進する。
【００２３】
もう１つの具体例では、少なくとも６０日の収穫期間がより高いバイオマスを生じ得るか、またはバイオマス収量を一定に維持でき、かつ、培養期間を短縮できる。
【００２４】
本発明は組織培養を介して栽培キリンサイ子孫の成長の速い変種を開発し、これによりバッグ内で成長が低下するという欠点を克服する方法を含んでなる、藻類の栽培のための改良法を提供する。この方法では、組織培養のための生存能力のある無菌海草材料は、選択した植物材料を０．１〜１％の家庭用液体界面活性剤（５〜２０分）、０．１〜２％ポビジンヨウ素（０．５％重量／利用できるヨウ素容量）中で２〜７分間、最後に１〜５％の抗生物質混合物（１００ｍｌの蒸留水中のペニシリンＧ１ｇ、硫酸ストレプトマイシン２ｇ、カナマイシン１ｇ、ナイスタチン２５ｍｇおよびネオマイシン２００ｍｇ）を含むＰＥＳ培地中で２４〜９６時間順次処理することによって確立し、２０〜２５ｆＣにて２０〜５０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期下でＰＥＳ培地を添加した寒天プレート（０．８〜３％寒天）で培養したキリンサイの無菌外植片（好ましくは植物の末端部分に由来する長さ５〜６ｍｍの切片）がカルス誘導を示し、これを外植片を含まずに継代培養すると濃い着色の卵形または球形の微小胎芽が得られ、この産生は色素性カルスの薄切片（２ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）をＰＥＳ培地からなる厚さ３ｍｍの寒天プレート中（０．３〜０．６％寒天）で包埋培養として成長させることでさらに促進されるが、植物成長調節物質、特に０．１〜１．０ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸または各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを寒天培地へ添加することにより色素性繊維状カルスにおける体細胞胚形成の形成および微小胎芽産生のプロセスがさらに促進され、体細胞胚を含むかかるカルス塊を振盪条件下液体ＰＥＳ培地に移すことで胎芽からの幼植物体の形態形成および発達が促進され、これらは屋外栽培では海草に由来するカラゲーナンの収率および品質に関して妥協することなく対照親植物よりもバイオマスが２倍以上増加する優れた成長を示し、また、海中で新鮮重１００ｇのキリンサイ先端切片（好ましくは分枝を含む）を両側に１４ｃｍ間隔で３列（各々等距離に位置する１２個の穴を含む）の直径４ｍｍ穴の孔を有する封じた透明ポリエチレンバッグ（径４５０ゲージ；６０ｃｍ×４５ｃｍ）内で成長させ、６０日の成長期間で組織培養子孫について１５９０°３７．４ｇ新鮮重（日間４．６％の成長率）および対照親植物について８４６．６６°３７．９ｇ新鮮重（日間３．５％の成長率）のバイオマスを生じる改良型のフローティングロングライン栽培法も実証する。
【００２５】
具体例では、組織培養のための生存能力のある無菌植物材料を調製する方法論は、選択した植物材料を０．１〜１％の家庭用液体界面活性剤（５〜２０分）、０．１〜２％のポビジンヨウ素（０．５％重量／利用できるヨウ素容量）で２〜７分間、最後に１〜５％の抗生物質混合物（１００ｍｌの蒸留水中のペニシリンＧ１ｇ、硫酸ストレプトマイシン２ｇ、カナマイシン１ｇ、ナイスタチン２５ｍｇおよびネオマイシン２００ｍｇ）を含むＰＥＳ培地中で２４〜９６時間順次処理することによって確立される。上記のように処理した材料の無菌性は２２〜２３℃のインキュベーター中でゾベル(Zobell)２２１６Ｅ寒天プレートへ２週間移すことで確認する。
【００２６】
もう１つの具体例において、組織培養を介する栽培キリンサイの成長の早い変種の開発では、プロバソリ（Provasoli）高含有海水（ＰＥＳ）培地を添加した寒天プレート（０．８〜３．０％寒天）で２０〜２５ｆＣにて１２：１２明暗周期で２０〜５０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で無菌成長させた無菌外植片においてカルス誘導できると認められた。４０日後、増殖したカルスを外植片から切り出し、上記の新鮮寒天培地で個別に継代培養する。寒天プレートで継代培養したカルスの中には、４０日成長させた後に、分化し、濃く着色した球形または卵形の微小胎芽（直径２〜５ｍｍ）を産生するものもあり、これらを液体ＰＥＳ培地に移すとキリンサイの幼植物体に発達した。屋外栽培において多数のクローン化植物を反復試験することにより相当の画分（＞９０％）の植物が生存するだけでなく対照親植物に優る成長促進を示すということが一貫して示された。
【００２７】
さらにもう１つの具体例では、色素性カルス細胞の体細胞胚形成を介する微小胎芽のin vitroクローン生産および増殖を実証する。微小胎芽の産生を促進するためには、継代培養した色素性カルスをいくつかの薄いブロック（２ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）に切り分けて寒天プレート（０．３〜０．６％）中の包埋培養として２０〜２５ｆＣにて１２：１２明暗周期で２０〜５０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で成長させる。各包埋ブロックから、最初の３週間のうちに分枝した繊維状色素性カルスの旺盛な成長が認められ、その後いくつかの繊維状の分枝上の暗褐色部において体細胞胚に類似した濃い色素を有する微小コロニーの再生が認められる。かかる体細胞胚を含む繊維状カルスを海水培地（ＰＥＳ）を高添加した液体に移すことにより微小胎芽の迅速な成長および形態形成を促進する。
【００２８】
さらにもう１つの具体例では、色素性繊維状カルスにおける体細胞胚の形成プロセスを植物成長調節物質、特に０．１〜１．０ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸または各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを寒天培地へ添加することによってさらに促進する。
【００２９】
さらにもう１つの具体例では、約１００ｇ新鮮重の最初に植え付けたもの、好ましくは豊富な枝を含む先端切片を有孔の透明ポリエチレンバッグ（４５０ゲージ；６０ｃｍ×４５ｃｍ）内に入れ、バッグを海中のフローティングロングラインに取り付けることで成長させる。切片を上記のように保護バッグ内で一年を通じて成長させ、作物を６０〜７５日間毎に収穫した。切片は３０日において３９４．６°２０．８ｇ新鮮重（日間４．７％の成長率）、６０日の栽培期間にわたっては８４６．６６°３７．９ｇ新鮮重（日間３．５％の成長率）のバイオマスまで成長した。
【００３０】
さらにもう１つの具体例では、屋外条件において本発明で開発した成長の早い系統と対照親植物の産生力の比較をバッグ栽培法に従って実施した。６０日の栽培期間において開放水域について得られた１７２６ｇ（日間４．７％の成長率）に対して、成長の速い変種は１５９０°３７ｇ（日間４．６％の成長率）の新鮮バイオマスを生じ、他方、対照親植物は８４６°３８ｇ（日間３．６％の成長率）を生じた。
【００３１】
組織培養から成長の速い変種の開発、体細胞胚形成を介する微小胎芽（植付け用種）の大量生産および増殖ならびに海のマクロ藻類を成長させるための改良栽培法を含む藻類の栽培のための改良法について発明的技術を以下に詳説する。所望の藻生物は光合成するものであり、かつ、種々の海洋生息条件に耐えられるものであるべきである。本発明で用いるのに好適な藻類は繊維状でなく、かつ、解剖学的に複雑な葉状植物の紅色（紅藻類）および褐色（褐藻類）海藻であり、これらは直立性または匍匐性の軟骨性葉状体を有し、円筒状または扁平な枝からなり、大きなバイオマスを形成する。好適な藻は紅藻から、好ましくはスギノリ目から選択すればよい。スギノリ目内では好ましい属にはキリンサイ（Eucheuma）属、例えば、Ｅ．ストリアツム、Ｅ．コットニー、Ｅ．デンチクラツム(E. denticulatum)、Ｅ．スピノスム(E. spinosum)、Ｅ．アルバレッジおよびＥ．プロクルステアナム(E. procrusteanum)、スギノリ属(Gigartina)、例えば、Ｇ．インターメディア(G. intermedia)、Ｇ．エキサスパラタ(G. exasparata)、およびツノマタ属(Chondrus)、例えば、Ｃ．クリスプス(C. crispus)がある。好適な褐藻属にはコンブ(Laminaria)、ワカメ(Undaria)、カジメ(Ecklonia)、アラメ(Eisenia)、マクロシスチス(Macrosystis)、ホンダワラ(Sargassum)およびラッパモク(Turbinaria)がある。
【００３２】
無菌材料を得るためには、選択した植物材料を２０〜２５ｆＣにて１２：１２明暗周期で２５〜３０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光灯下で０．１〜１％の家庭用液体界面活性剤（５〜２０分）、２〜７分間の０．１〜２％のポビジンヨウ素（０．５％重量／利用できるヨウ素容量）を含むオートクレーブ処理し濾過した海水（滅菌海水）中で、最後に１〜５％の抗生物質混合物（１００ｍｌの蒸留水中のペニシリンＧ１ｇ、硫酸ストレプトマイシン２ｇ、カナマイシン１ｇ、ナイスタチン２５ｍｇおよびネオマイシン２００ｍｇ）を含むＰＥＳ培地中で２４〜９６時間順次処理する。しかしながら、０．１％液体界面活性剤、次いで１％ポビジンヨウ素および３％の広スペクトル抗生物質で２日間処理した植物材料は汚染物質を含まなくなり、３週間培養した後でさえゾベル培地上で細菌増殖を全く示さなかった。
【００３３】
無菌材料を得る手順を確立した後、キリンサイの外植片（好ましくは植物の末端部分に由来する長さ５ｍｍの切片）をＰＥＳ培地を添加した寒天プレート（０．８〜３％寒天）で２０〜２５ｆＣにて１２：１２明暗周期で２０〜５０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２Ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で約１ヶ月無菌培養した。カルス誘導は培養の最初の２週間の間に認められた。４０日後、増殖した繊維状分枝カルスを外植片から切り出し、光（これは５０ｎｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射まで高めた）を除いては同様の条件下で新鮮寒天プレートで個々に継代培養し、カルスの形態形成および分化を誘導した。継代培養カルスの中には寒天プレートで約４０〜５０日培養した後に形態形成が起こり、濃い色素を有する球形または卵形の微小胎芽（直径２〜５ｍｍ）を産生するものもあり、これらを液体ＰＥＳ培地に移してキリンサイの幼植物体に発達させた。これらの植物の屋外での生存度および成長能をトニツライ(Thoniturai)（マンナル湾、インド）の実験用屋外栽培場に移すことで繰り返し調べた。屋外で上記のように調べた植物の総てが一貫して低い致死率を示し、いくつかの植物は同一の栽培期間にわたって対照親植物の２倍より多い新鮮重増加を示した。この傾向は無視できるほどの変動を含むものの第３世代の海草でも続いた。
【００３４】
色素性カルスの体細胞胚形成を介する微小胎芽のクローン生産を確立した。体細胞胚形成および微小胎芽産生は色素性繊維状カルスブロックの切片（２ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）を厚さ３ｍｍのＰＥＳ培地を含む寒天プレート（０．３〜０．６％寒天）中で包埋培養として継代培養することでさらに促進できる。寒天培地中に植え付けカルスブロックは１ヶ月で迅速に成長し、寒天中に盛んに成長する分枝した繊維状色素性カルスを含む着色スポットを形成した。ブロックから新しく再生した繊維状カルスは最終的に形質転換して、いくつかの繊維状の枝に体細胞胚に類似した濃い色素を有する（暗褐色）微小コロニーを産生した。植物成長調節物質、特に０．１〜１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸または各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを寒天培地へ添加することで体細胞胚形成の形成がさらに促進された。かかる体細胞胚を含む繊維状カルスを固体（寒天プレート）培地から液体ＰＥＳ培地へ移すことで微小胎芽の迅速な成長および形態形成が促進された。
【００３５】
本発明で、種子材料として選択したキリンサイ切片（好ましくは枝を有する）は閉じた保護バッグ、より好ましくは有孔（４ｍｍ直径）の透明なものの中で完全に成長する（これによりこれらの持続的成長に必要とされる光透過および海水循環が可能となり、他方、同時に損傷される可能性および異物の付着が排除される）。しかしながら、異物が付着するバッグの表面は毎週あるいは必要な時に洗浄した。栽培期間の間、農場の年間海水温度は２２．５℃〜２８．５ｆＣ、ｐＨは７．８１〜８．２６、塩度は２４．０‰〜３４．０‰、溶存酸素は７．８４ｍｌ／ｌ〜１５．６８ｍｌ／ｌ、リン酸塩は０．０２ｎｍｏｌ〜３．２３ｎｍｏｌ、硝酸塩は０．１５ｎｍｏｌ〜２．５８ｎｍｏｌおよび亜硝酸塩は０．０１ｎｍｏｌ〜０．８５ｎｍｏｌの範囲であった。１００ｇ新鮮重量中の最初の種子材料で出発して６０日後、組織培養により生じた植物から１５９０°３７．４ｇ新鮮重、対照親植物からは８４６．６°３７．９ｇ新鮮重の収量を得た。
【００３６】
本発明はin vitro条件下での成長の速い系統の最初の開発ならびに解剖学的に複雑な葉状植物の紅藻の色素性カルスの体細胞胚形成を介して微小胎芽を大スケールでクローン生産する方法を最初に示すものである。海草の組織培養に関する初期の研究はカルスを液体培地に移すことでde novoでの完全植物の再生を実証した。しかしながら、本発明では、寒天プレートそれ自体の上で３００〜数百程度の少ない細胞からなる色素性微小コロニーのような体細胞胚の産生に初めて成功した。本発明者らは薄暗い光条件下の寒天プレート上の色素性微小コロニーは必要になるまで長期間理想的に生存させられるということを見出した。組織培養から生じ、屋外で成長する植物の日間成長が同様の条件下の対照植物を超えて４０％より高い増加を示す場合もあった。６０日の最後には、対照を超えてバイオマスで２倍増になり、これは開放水域について得られるものとほぼ同等である。乾燥させた組織培養で生じた植物からの半精製カラゲナン収率は４３％であり、ゲル強度は５４０ｇ．ｃｍ−２であり、他方、対照親植物についてはカラゲナンの収率は４３％、ゲル強度は５５０ｇ．ｃｍ−２である。本発明に採用された発明の工程は（ｉ）組織培養のための洗浄な、かつ、無菌の植物材料を得るための方法論を開発すること、（ii）着色カルスの微小胎芽を介して、カラゲナン収率および品質には変化がなく成長が２倍増加する、成長の速い変種を開発すること、（iii）寒天プレート内での包埋培養として成長させることにより色素性カルスの体細胞胚形成を介した微小胎芽をin vitroでクローン増殖させること、（iv）ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンなどの植物成長調節物質を用いて色素性カルスにおける体細胞胚の形成プロセスを刺激すること、ならびに（v）封じた有孔透明プラスチックバッグ内で藻類を栽培すること（これにより損傷が防がれ、最終加工製品に悪影響を及ぼすような汚染物質を含まない純粋な原材料が提供される）である。
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
より詳しくは、本改良栽培法は組織培養を介する、特性の改良された、すなわち、成長の速いクローンの開発ならびに小孔のある透明ポリエチレンバッグを用いるロングラインフローティング法による栽培（これにより損傷が防がれ、最終加工製品カッパカラゲナン（ｋ−カラゲナン）に悪影響を及ぼすような汚染物質を含まない純粋な原材料が提供される）のための方法論を含む。
【００３９】
本改良栽培法の主な用法／有用性としては以下のものが例として挙げられる：（ｉ）組織培養を介する、特性の改良された、すなわち、成長の速い体細胞クローンの開発のための方法論、（ii）カルス細胞の体細胞胚形成を介する海草のin vitroクローン増殖、（iii）海草の実用的養殖のための、カルス培養物のin vitro体細胞胚形成を介する、植付用種（微小胎芽）の大規模生産および供給、（iv）生殖細胞質の長期保存のための供給源としてのカルスの利用、ならびに（v）小孔を有する透明ポリエチレンバッグ内での栽培（これにより損傷が防がれ、加工製品、ｋ−カラゲナンに有害な汚染物質を含まない純粋な原材料が提供される）。
【００４０】
実施例１
無菌外植片の調製：組織培養のための、無菌の、生存能力のある藻類の個体材料を開発するために、栽培農場から集めたユーケウマ・ストリアツム（＝カッパフィカス・アルバレッジ(Kappaphycus alvarezzi)）の葉状体から長さ約５ｃｍの選択断片（茎の直径が４〜５ｍｍの先端部分の真下）を選択した。実験を開始する前に、１２：１２明暗周期で２０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光ランプ下、通気フラスコ中でＰＥＳを添加した海水培地中にて１０日間成長させることによって植物を実験室条件に順応させた。順応期間の間、フラスコ中の培地を５日目に２倍に補充した。順応後、まず、断片を顕微鏡下、オートクレーブ処理し濾過した海水（滅菌海水）中でブラシを用いて十分に洗浄して表面汚染物質を除去し、次いで、０．１％の家庭用液体界面活性剤を含む滅菌海水で１０分間、１％ポリジンヨウ素（利用できる用度０．５％ｗ／ｖ）で２分間で順に処理し、最後に３％の濾過滅菌広域抗生物質混合物（１００ｍｌの蒸留水中のペニシリンＧ１ｇ、硫酸ストレプトマイシン２ｇ、カナマイシン１ｇ、ナイスタチン２５ｍｇおよびネオマイシン２００ｍｇ）を添加したＰＥＳ培地中で２３℃にて１２：１２明暗周期で２５ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光ランプ下で４８時間インキュベートした。各工程において、次の処理に進む前に、藻片を滅菌海水ですすいで化学物質の相互汚染を避けた。抗生物質中での材料のインキュベーションを除く上記の作業総てはバイオクリーンベンチで実施した。上記のように処理した植物材料は汚染物質を含まなくなり、２週間後でさえゾベル寒天プレート上で微生物増殖を全く示さなかった。
【００４１】
実施例２
無菌外植片のカルス誘導：実施例１に記載の方法に従って得た無菌材料でカルス誘導を行った。まず、カルス誘導に用いる植物材料を滅菌海水で十分に洗浄して抗生物質の痕跡を除去し、長さ５ｍｍの外植片に切り分け、滅菌濾紙で吸い取って水分ならびに切断末端からにじみ出た粘液を除去した。この粘液は外植片培養の１ヶ月後であっても微生物汚染の供給源になる場合がある。総ての外植片をＰＥＳ培地を用いて調製した１．５％寒天プレートで２３℃にて１２：１２明暗周期で２５ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で約１ヶ月間増殖させた。カルス誘導は培養の最初の２週間の培養の間に認められた。５０日後、増殖した繊維状分枝カルス（図１）を植物から切り出して、光を除いては（これはカルスの増殖を促進するために５０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射に高めた）同様の条件下で新鮮寒天プレートで個別に継代培養した。継代カルス（図２）の中には寒天プレートで５０日培養した後に形態形成が起こり、直径２〜５ｍｍの濃い色素を有する球形または卵形の微小胎芽（図３）をカルス全体に産生するものもあった。さらに、これらの胎芽は振盪条件下液体ＰＥＳ培地中で個別に培養することで幼胎芽に成長し（図４）、これらは３週間のうちに最終的に多芽を含む幼植物体（図５）に発達した。
【００４２】
実施例３
体細胞胚形成およびクローン増殖：キリンサイの色素性カルスの体細胞胚形成を介する微小胎芽のクローン生産を実施した。体細胞胚形成および微小胎芽産生はＰＥＳ培地を含む厚さ３ｍｍの寒天プレート（０．４％寒天）中で包埋培養として色素性繊維状カルスブロックの薄切片（２ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）を２３℃にて１２：１２明暗周期で５０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で継代培養することで促進できる。寒天培地中に埋め込んだカルスブロックは１ヶ月で迅速に増殖して、旺盛に増殖する分枝した色素性繊維状カルスを含む着色点を寒天中に形成した。ブロックから新たに再生した繊維状カルスは最終的に形質転換していくつかの色素性繊維状カルスの枝上に体細胞胚に類似した濃い色素を有する（暗褐色）微小コロニー（図６）を産生した。
【００４３】
実施例４
植物成長調節物質による体細胞胚形成の促進：キリンサイの色素性繊維状カルスにおける微小胎芽の産生プロセスを増殖培地にナフタレン酢酸（オーキシン）および６−ベンジルアミノプリン（サイトカイニン）などの植物成長調節物質を添加することによってさらに促進した。色素性カルスブロックの切片（２ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）を０．１、１．０ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸を添加した、または各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを添加したＰＥＳ培地で作製した厚さ３ｍｍの寒天プレート（０．４％寒天）中で包埋培養として増殖させた。包埋カルスを含む総てのペトリ皿を２３℃にて１２：１２明暗周期で５０ｍｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下で維持した。寒天培地中に埋め込んだカルスブロックは１ヶ月で迅速に増殖し、寒天培地中に体細胞胚に類似した濃い色素を有する微小コロニーを形成した。かかる色素性カルス塊を固体（寒天プレート）培地から液体ＰＥＳ培地に移すことで微小胎芽の迅速な増殖および形態形成を促進した。微小胎芽の迅速な形態形成を達成するためには振盪培養が好ましかった。
【００４４】
実施例５
フローティングロングライン法によるキリンサイの栽培：開始時に、開放水域における従来のフローティングロングライン法による栽培キリンサイの収量データを明らかにした。この方法では、植え付けのための最初の種苗材料として約１００新鮮重の選択したキリンサイ切片、好ましくは旺盛に分枝する先端のものを３０ｃｍ間隔でポリプロピレンロープ（直径８ｍｍ、長さ３０メートル）に１０個直接つなぎ、これを下部で固定した２本の竹の棒（長さ約５ｍ）の間に吊るした。竹の棒は１ｍ間隔でいく列にも並べ、等距離にして区画を形成した。地面からのロープの距離は干潮の際には約０．５メートル、満潮の際には１．０〜１．５メートルである。植物の成長は３０日間隔で個々の新鮮な植物を計量することによって求め、日間成長率は式：ｒ＝（Ｗｔ／Ｗ０）１／ｔ−１×１００（ここで、ｒはパーセントでの日間成長率を表し、Ｗｔはｔ日での湿潤重量であり、Ｗ０は最初の湿潤重量である）を用いて算出した。平均バイオマスおよび日間成長率は開放水域での植物の成長について３０日にわたってそれぞれ４５０ｇ新鮮重および７．３％、６０日間ではそれぞれ１７２６ｇ新鮮重および４．７％であった。
【００４５】
実施例６
フローティングロングライン法によるポリエチレンバッグ内でのキリンサイの栽培：この方法では、植え付けのための最初の種苗材料としての約１００ｇ新鮮重の選択したキリンサイ切片、好ましくは旺盛に分枝する先端のもの１０個を有孔の（海水循環のために）閉じた透明ポリエチレンバッグ（４５０ゲージ；６０ｃｍ×４５ｃｍ）内で収穫まで成長させた。バッグの開放末端から１８ｃｍを残して、両側に１４ｃｍの間隔で３列（各々等距離に位置する１２個の穴を含む）で直径４ｍｍの穴をあけた。従って、各バッグは両側合わせて７２個の穴（すなわち片側３６個の穴）からなっていた。バッグをナイロン糸で縫いフローティングロープ（図７）に取り付けた。約１０ｃｍ間隔で全部で５０個のバッグを上記の１本のロープにつないだ。６０日後に作物を収穫し、実施例５に記載の式を用いて成長率を算出するために計量した。
【００４６】
実施例７
組織培養子孫および対照親の成長、カラゲナン収率およびゲル特性の比較研究：組織培養子孫から生じ、屋外で成長した植物および対照親植物の成長（図８）、乾燥海草重ベースのカラゲナン（半精製）収率およびカラゲナンゲル強度についての比較研究を実施した。両種の植物を実施例６にすでに記載したようにフローティングロングライン法によって閉じた透明ポリエチレンバッグ内で１０個成長させた。３０日間について３９４．５８＋２０．８ｇ新鮮重（日間４．７％の成長率）、６０日間について８４６．６＋３８ｇ新鮮重（日間３．５％の成長率）の平均バイオマスが得られ、他方、組織培養植物は３０日間について７１１．６＋１３ｇ新鮮重（日間６．８％の成長率）および６０日間について１５９０＋３７ｇ新鮮重（日間４．６％の成長率）があった。半精製カラゲナン含量はまず１０ｇの前処理海草を２００ｍｌの８％ＫＯＨ溶液中で１．５時間煮、濾液をデカントし残った材料を中性化して蒸留水で洗浄することで得た。水中での洗浄後に、材料を４０℃にて完全に乾燥させ、計量して収率を評価した。ゲル強度は１％ＫＣｌ溶液中で煮沸して１％カラゲナンのゲルを調製することでゲル強度試験装置(Nikkansui, Co. Japan)を用いて測定した。対照親植物、また微小胎芽から成長した植物の収率は乾燥海草ベースで４３％で同等であった。対応するゲル強度はそれぞれ５５０ｇｃｍ−２および５４０ｇｃｍ−２であった。
【００４７】
効果
本発明の主な効果は以下のとおりである：
１．成長が速い等の改良された形質を導入するために親植物を改良する新規な方法である。
２．所望の系統から多数の微小胎芽（種子材料）を迅速に生産する方法である。
３．生存能のある形態、すなわち、体細胞胚のような生殖質の寒天プレート上で貯蔵する方法である。
４．強い水流などの自然の予測できない変化の悪影響ならびに草食動物および着生植物による作物の損傷を軽減し、開放水域において親植物で実現されるものと同様またはよりよい成長率を可能にする海草の栽培の改良法である。
５．最終加工した目的産物の品質に有害ないずれの汚染物質も含まない高純度の材料を提供する栽培の改良法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に記載されるキリンサイのカルスを含む外殖片を示す。
【図２】  外植片から切り出した継代培養キリンサイカルスの旺盛な増殖を示す。
【図３】  切り出したカルス上の球形または卵形の小さい微小胎芽を示す。
【図４】  成長の速い系統を開発するための本発明の方法の具体例の１つに記載される小さい微小胎芽から発達した幼胎芽を示す。
【図５】  胎芽から再生したキリンサイの複数分枝した幼植物体を示す。
【図６】  植付け用種子の大量生産の開発のための本発明の方法の具体例の１つに記載されるカルスからの体細胞胚のin vitro発達を示す。
【図７】  栽培のための改良法の具体例の１つにおいて用いられるポリエチレンバッグ内でのキリンサイのフローティングロングライン栽培系を示す。
【図８】  対照親植物およびそれに由来する組織培養植物の比較成長を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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