(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルクロン酸に、パエニバチルス（Paenibacillus） sp. TH501b（NITE P-463）株、または同株由来のグルコシド結合加水分解酵素を作用させることによってグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを得ることを特徴とする、グルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンの製造方法。
【請求項２】
前記ポリグルクロン酸がデンプン、アミロースまたはアミロペクチンを酸化することによって得られる、請求項１に記載のグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンの製造方法。
【請求項３】
パエニバチルス sp. TH501b（NITE P-463）株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルクロン酸の新たな製造方法ならびにグルクロン酸生成酵素を生産する微生物に関する。詳細には、グルクロン酸を構成単位として含む多糖類（ポリグルクロン酸）に、そのグルコシド結合を加水分解によって切断する酵素または同酵素を生産する微生物を作用させ、グルクロン酸を得ることを特徴とするグルクロン酸／またはグルクロノラクトンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルクロン酸は水に対し高度に可溶性の物質であり、動物体内においては、しばしば体外への排出のために毒物と結合されたり、輸送しやすくするためにホルモンと結合されたりする。そのため、グルクロン酸は、その分子内エステル化によって得られるグルクロノラクトンまたはその誘導体として、広く医薬品、医薬品原料として利用されている。これらグルクロン酸やグルクロノラクトンの合成方法は種々知られている。
【０００３】
一般的な方法としては、デンプンなどの多糖類を原料として、硝酸などの窒素化合物を用いて酸化した後、強酸で加水分解してグルクロン酸及びグルクロノラクトンを得る方法がある（特許文献１参照）。改良発明もあるが、収率の向上という未解決の問題を抱えている（特許文献２参照）。
また、単糖であるグルコースを原料とし、そのC-１位を保護し、次いでC-６位を酸化した後、強酸で加水分解し、脱保護し、グルクロン酸及びグルクロノラクトンを得る方法がある。この方法は、複雑な脱保護の工程が必要であるという点に問題がある（特許文献３参照）。
【０００４】
特許文献４には酸化デンプンをアミラーゼと強酸で処理してグルクロン酸を得る方法が開示されている。また、特許文献５にはアスペルギルス属に属する微生物を用いてポリグルクロン酸からグルクロン酸を得る方法が開示されている。しかしながら、より高い収率で、強酸などの有毒物質を利用することなく、容易かつ安全にグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを得る方法が望まれていた。
【特許文献１】英国特許第９００９７７号
【特許文献２】特公昭４３−５８８２号公報
【特許文献３】特公昭４４−７３２５号公報
【特許文献４】特公昭３３−５８３０号公報
【特許文献５】特公昭３５−１３８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高収率、容易、かつ安全にグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、グルコースを構成単位とする多糖類を原料として、グルコース単位のC-6位第一級水酸基を選択的に酸化して、グルクロン酸を構成単位とする多糖類であるポリグルクロン酸を調製し、これに、パエニバチルス（Paenibacillus）属細菌由来の、ポリグルクロン酸のグルコシド結合を加水分解する酵素を作用させることによって、強酸などの有毒物質を利用することなく高収率、容易かつ安全にグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ポリグルクロン酸に、パエニバチルス属細菌、または同細菌由来のグルコシド結合加水分解酵素を作用させることによってグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを得ることを特徴とする、グルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンの製造方法。
（２）前記パエニバチルス属細菌がパエニバチルスsp. TH501b（NITE P-463）株である、（１）のグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンの製造方法。
（３）ポリグルクロン酸がデンプン、アミロースまたはアミロペクチンを酸化することによって得られる、（１）または（２）のグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンの製造方法。
（４）パエニバチルスsp. TH501b（NITE P-463）株。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、比較的安価なデンプンやセルロースなどを原料としてグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンが生産できる。しかも、上記の如く、その製造工程において、硝酸や硫酸などの強酸を使用しなくともよいので安全で、かつ環境に与える負荷を少なくして、目的物を製造できる。しかも、設備投資も比較的少ない。したがって、本発明のグルクロン酸及び／又はグルクロノラクトンの製造方法は、従来の方法と比較して、生産効率などに優れた工業的方法を提供しうるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
原料として用いるポリグルクロン酸は、グルクロン酸またはその塩を構成単位として含む多糖類であり、好ましくは、グルコースを構成単位とする多糖類のC-6位第一級水酸基を酸化することによって得られる。
【００１０】
ここで、使用される、グルコースを構成単位とする多糖類には、α-1→4型結合で重合したアミロース、α-1→4型結合とα-1→6型結合とから成るアミロペクチン、それらの混合物であるデンプンなどの他、β-1→4結合によって重合したセルロースなどが含まれるが、C-6位第一級水酸基の酸化反応を効率的に行なうにはアミロース、アミロペクチン、デンプンなどが好適に利用される。なお、これら多糖類の由来などには特に制限はない。
【００１１】
グルコースを構成単位とする多糖類の酸化方法については特に限定はされず、既存の方法が利用できるが、副反応が少なくグルコース残基のC-6位第一級水酸基ができるだけ均一にカルボキシル基に酸化できる方法を利用することが好ましい。
例えば水溶性ラジカル試薬であるTEMPO（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシラジカル）を用いたTEMPO／次亜塩素酸ナトリウム／臭化ナトリウムを用いた酸化系が好ましく利用でき、デンプンからはα-1→4‐ポリグルクロン酸（アミロウロン酸（Kato, Y.,
Matsuo, R., & Isogai, A. (2003). Oxidation process of water-soluble starch in TEMPO-mediated system. Carbohydrate Polymers, 51, 69-75））が、セルロースからはβ-1→4‐ポリグルクロン酸（セロウロン酸（Isogai, A., & Kato, Y. (1998). Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-mediated oxidation. Cellulose, 5, 153-164））がそれぞれ調製できる。
【００１２】
グルクロン酸やグルクロノラクトンを得るためには、得られたポリグルクロン酸に、該ポリグルクロン酸のグルコシド結合を加水分解によって切断する反応を触媒する酵素（α-1→4-グルクロナーゼ及び／またはα-1→4-グルクロニダーゼ、もしくはβ-1→4-グルクロナーゼ及び／またはβ-1→4-グルクロニダーゼ）を作用させればよい。その結果、目的とするグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを得ることができる。なお、グルクロン酸とグルクロノラクトンは水溶液中では平衡状態にあるため、ポリグルクロン酸の加
水分解によりこれらの混合物を得ることができ、また、平衡状態を変化させることでいずれか一方を得ることもできる。
【００１３】
該グルコシド結合の加水分解反応に使用する酵素については、パエニバチルス属細菌由来の酵素を使用する。本発明者らは、鋭意スクリーニングを実施した結果、パエニバチルス属細菌TH501b株の生産する酵素を、α-1→4-ポリグルクロン酸に作用させることがグルクロン酸の産生に有効であることを見出した。
TH501b株は栃木県真岡市の土壌より、α-1→4-ポリグルクロン酸を炭素源とする培地（培地組成；0.82 g/L (NH4)2SO4，1.6 g/L K2HPO4，0.4 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4・7H2O，25 mg/L CaCl2・2H2O，2.3 mg/L FeCl3・6H2O，0.1 g/L yeast extract，5 g/L α-1→4-ポリグルクロン酸，pH 7.0）で繰り返し集積培養を行なうことによってα-1→4-ポリグルクロン酸の分解能を有する菌株として単離されたものであり、下記表１に示す性質を有する。
【００１４】
【表１】
0005219068.tif 000002
【００１５】
また、常法によってTH501b株の16S rDNAの部分塩基配列を調べたところ、配列番号１のとおりであった。これらの結果からこの微生物はパエニバチルス属細菌に分類されると考えられた。本菌株はα-1→4-ポリグルクロン酸分解菌として単離された新規な菌株であり、パエニバチルス sp. TH501bとして独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託されている（受託番号NITE P-463）。
【００１６】
TH501b株からα-1→4-ポリグルクロン酸加水分解酵素を得るためには、例えば以下のような方法が挙げられる。即ち、α-1→4-ポリグルクロン酸を炭素源とした培地（培地組成；0.82 g/L (NH4)2SO4，1.6 g/L K2HPO4，0.4 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4・7H2O，25 mg/L CaCl2・2H2O，2.3 mg/L FeCl3・6H2O， 0.1 g/L yeast extract，5 g/L α-1→4-ポリグルクロン酸，pH 7.0）において、30℃で3日間振とう培養して得られる菌体を、超音波
破砕した後、遠心分離（10000ｇ，30分）し、その上澄みをそのまま粗酵素として、もしくは各種カラムクロマトグラフィによって該活性画分を精製して用いることができる。
なお、ポリグルクロン酸加水分解酵素は、微生物より精製されたものには限定されず、同酵素の配列に基づいて単離される遺伝子を用いた遺伝子組み換えによって得られるものでもよい。
【００１７】
酵素反応活性の測定は既報の種々の方法によって行なえるが、例えばグルコシド結合の切断によって新たに生成する糖の還元末端の増加量を比色法によって測定するソモギ-ネルソン（（somogyi-nelson））法や、薄層クロマトグラフィ（TLC）による生成物分析などを、比較的簡便な方法として挙げることができる。
上記の粗酵素液中には、α-1→4-ポリグルクロン酸をエンド型に分解してオリゴマーを生成するα-1→4-グルクロナーゼ活性と、エクソ型に作用して直接グルクロン酸を生成するα-1→4-グルクロニダーゼ活性の両者が含まれているため、目的に応じて両者を混合またはα-1→4-グルクロナーゼのみを選択的に使用すればよい。なおα-1→4-グルクロナーゼとα-1→4-グルクロニダーゼの分離は、例えば東ソー社製Toyopearl Super-Qのような陰イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィによって容易に行なうことができる。
【００１８】
本発明において使用される酵素はパエニバチルス sp. TH501b株のものには限られず、他のパエニバチルス属細菌由来のポリグルクロン酸加水分解酵素でもよい。他のパエニバチルス属細菌由来のポリグルクロン酸加水分解酵素は、上記と同様の方法によって、種々のパエニバチルス属細菌から精製して得ることができる。また、TH501b株のポリグルクロン酸加水分解酵素との配列相同性に基づいて遺伝子をクローニングし、それを用いて遺伝子組み換えを行って得ることもできる。
また、本発明の方法においては、パエニバチルス属細菌そのものを用いることもできる。すなわち、パエニバチルス属細菌を、ポリグルクロン酸を含む培地で培養する発酵法や、増殖させたパエニバチルス属細菌の菌体をポリグルクロン酸と反応させる方法によってもグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンを得ることができる。
【００１９】
ポリグルクロン酸の加水分解反応は通常、1〜240時間、好ましくは24〜240時間であるが、添加する酵素の活性と目的に応じて自由に設定することができる。なお、既報の方法などによって酵素を固定化して用いて、反応や目的物の回収を効率化することも可能である。
【００２０】
反応が進行し、グルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンが蓄積してきたら、反応系から目的物であるグルクロン酸／またはグルクロノラクトンを単離精製する。得られたグルクロン酸及び／又はグルクロノラクトンを含む反応混合物は通常、塩やタンパク質などを含んでいるので、酸性または塩基性、もしくは両方の性質を持った樹脂を使ってこれらを除くことが好ましい。なお、所望により、活性炭、電気透析装置などを使用してもよい。得られたグルクロン酸及び／又はグルクロノラクトンを含む溶液は、糖または糖誘導体を結晶化する場合の慣用法を用いて目的物を得ればよい。具体的には該溶液を濃縮してから、グルクロノラクトン又はグルクロン酸の結晶を接種して、結晶化すればよい。
【００２１】
本発明の製造方法により得られるグルクロン酸及び／またはグルクロノラクトンは、既知の方法により得られているものと同様に、肝機能回復作用、疲労回復作用、抱合解毒作用、抗リウマチ作用などを有する物質として、広く医薬品工業、食品工業、化粧品工業、化成品工業などの諸分野に用途を有する。
【００２２】
［実施例］
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。なお、以下の実施例等において「％」は「重量％」を意味する。
【実施例１】
【００２３】
可溶性デンプン（トウモロコシ由来，和光純薬社製）を文献（Kato, Y., Matsuo, R., & Isogai, A. (2003). Oxidation process of water-soluble starch in TEMPO-mediated
system. Carbohydrate Polymers, 51, 69-75）に従って、TEMPO酸化し、α-1→4-ポリグルクロン酸（アミロウロン酸）を得た。
【００２４】
TH501b株をα-1→4-ポリグルクロン酸を炭素源とした培地2L（培地組成；0.82 g/L (NH4)2SO4，1.6 g/L K2HPO4，0.4 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4・7H2O，25 mg/L CaCl2・2H2O，2.3 mg/L FeCl3・6H2O， 0.1 g/L yeast extract，5 g/L α-1→4-ポリグルクロン酸，pH 7.0）に植菌し、30℃で3日間振とう培養した。得られた菌体を50ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）で洗浄後、同緩衝液に懸濁し、超音波破砕処理を10分間行なった後、懸濁液を遠心分離（10000ｇ，60分）し、その上澄みを粗酵素とした。粗酵素液を限外ろ過器（Amicon  PM5メンブレン，分画分子量5000）を用いて濃縮・脱塩し、最終的に緩衝液を25ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）に交換した。該粗酵素液をToyopearl Super-Q
カラム（カラムサイズ；2.2cm×10cm）に供した。カラムは予め25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化しておいた。カラムに粗酵素を添加後、同緩衝液を流速1.5mL／分で約150ｍL流した後、同緩衝液に1M NaCl を含む緩衝液で直線グラジェント（0〜90％，900ｍL）をかけて、タンパク質を溶出させた。各フラクションは9mLずつ分画し、それぞれの酵素活性をソモギ-ネルソン法で測定した。その結果、酵素活性は、カラムに吸着せずに溶出されたフラクションと約0.2MのNaClで溶出されたフラクションの2つのピークとして回収された（図１）。それぞれのフラクションの酵素をα-1→4-ポリグルクロン酸を基質として反応させ、その生成物をTLCで分析したところ、前者のフラクションでは、数種のオリゴマーが生成（図２）するα-1→4-グルクロナーゼ活性を含んでいるのに対し、後者のフラクションは、生成物としてモノマーであるグルクロン酸のみを生成（図３）するα-1→4-グルクロニダーゼ活性であった。本菌が生産するα-1→4-グルクロニダーゼは、pH
4〜9で活性を示し、至適pHは 6付近であった。また基質特異性を調べたところ、アルギン酸、デンプン，ペクチンにはほとんど活性を示さず、調べた範囲で強い活性を示したのはα-1→4-ポリグルクロン酸のみであった。
【００２５】
かくして得られた該α-1→4-グルクロニダーゼを用いてグルクロン酸の製造を実施した。25ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）に1％濃度となるようにα-1→4-ポリグルクロン酸を溶解し、3.5U/mL（1Uは1分間に1μｇのグルクロン酸相当の還元末端を増加させる量と定義）の酵素を添加して25℃で攪拌しながら所定時間反応させた。生成したグルクロン酸はサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）のグルクロン酸ピーク面積増加量から定量した。その結果、反応時間の経過にともないグルクロン酸生成量が増加し、72時間後は約41％の収率でグルクロン酸が生成していた（図４）。
【実施例２】
【００２６】
実施例１において調製した粗酵素液を使用してグルクロン酸の製造を実施した。25ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）に1％濃度となるようにα-1→4-ポリグルクロン酸を溶解し、9.7Uの酵素を添加して25℃で攪拌しながら19及び27時間反応させた。グルクロン酸の生成はTLCで確認した。図5に示すように、反応時間の増大に従ってグルクロン酸の生成量が増加することが確認されるとともに、同時に複数のオリゴマーの生成も認められた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Toyopearl Super-Q陰イオンクロマトグラフィによるα-1→4-グルクロニナーゼ活性の分離を示す図。
【図２】α-1→4-グルクロナーゼ活性を示すTLCの図（写真）。酵素4.3U/mL，α-1→4-ポリグルクロン酸1％，25ｍMリン酸緩衝液（pH 7.0），25℃で0時間（Lane 2），17時間（Lane 3），24時間（Lane 4）反応させた。Lane 1はグルクロン酸標品を示す。展開溶媒はn-ブタノール／酢酸／水＝3／2／2（容積比）を用いた。
【図３】α-1→4-グルクロニナーゼ活性を示すTLCの図（写真）。酵素3.5U/mL，α-1→4-ポリグルクロン酸1％，25ｍMリン酸緩衝液（pH 7.0），25℃で0時間（Lane 2），17時間（Lane 3），24時間（Lane 4）反応させた。Lane 1はグルクロン酸標品を示す。展開溶媒はn-ブタノール／酢酸／水＝3／2／2（容積比）を用いた。
【図４】グルクロン酸収率の経時変化を示すグラフ。酵素3.5U/ｍL，α-1→4-ポリグルクロン酸1％，25ｍMリン酸緩衝液（pH 7.0），25℃で反応させた。
【図５】TH501ｂ株の粗酵素によるグルクロン酸生成を示すTLCの図（写真）。酵素9.7U/ｍL，α-1→4-ポリグルクロン酸1％，25ｍMリン酸緩衝液（pH 7.0），25℃で19時間（Lane2），27時間（Lane3），0時間（Lane4）反応させた。Lane1はグルクロン酸標品を示す。展開溶媒はn-ブタノール／酢酸／水＝3／2／2（容積比）を用いた。
【図１】
0005219068.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005219068.tif 000005
【図４】
0005219068.tif 000006
【図５】
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【配列表】
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