(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを基質として導入し、嫌気的環境下で、エタノール生成能を有する、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｍ９（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な微生物に関し、詳しくは一酸化炭素、または二酸化炭素と水素を基質として、エタノールを生成する能力を有する新種の微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
温暖化対策や、化石燃料の消費抑制のため、新たなエネルギーに関する研究が進められている。
【０００３】
産業廃ガスや木質系バイオマスのガス化・改質にともなって排出されるガスに含まれる気体状の二酸化炭素や一酸化炭素などを原料として、微生物による発酵を行い、酢酸やエタノールなどの有用物を回収する技術がある。
【０００４】
特に、エタノールは近年、燃料としての需要が高まっており、有用物としての価値が高い。さらに、二酸化炭素は温暖化ガスのひとつであるので、二酸化炭素を炭素源として利用できる菌が得られれば、温暖化ガスの削減効果が期待できる。
【特許文献１】特開平１−９８４７２号公報  アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属
【特許文献２】米国特許第５１７３４２９号明細書  クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属
【特許文献３】特表２００２−５４３７９３号公報  クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属
【特許文献４】特開２００３−３３９３７１号公報  クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属又はその派生属
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
二酸化炭素や一酸化炭素を基質として酢酸やエタノールなどの有用物を生産する微生物としては、主にクロストリジウム属菌が知られているに過ぎなかった（特許文献１〜４）。
【０００６】
本発明者らは、微生物の単離とスクリーニングを重ね、二酸化炭素や一酸化炭素を基質として、エタノールを生成する能力を有する微生物を選抜し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の課題は、エタノールを生成する能力を有する新規微生物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は以下の各発明によって解決される。
【００１０】
（請求項１）
一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを基質として導入し、嫌気的環境下で、エタノール生成能を有する、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｍ９（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、エタノール生成能を有する新規微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１４】
本発明のバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する新規微生物は、以下、必要に応じて「本菌株」と称する。
【００１５】
本菌株は、福岡市下水処理場のメタン発酵処理分画より単離した菌株であり、二酸化炭素や一酸化炭素を基質として酢酸の他にエタノールを生成する能力を持つ、バイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する新種である。
【００１６】
本菌株は、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  Ｍ９（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、以下のような性質を有する。なお、＋は陽性又は有を示し、−は陰性又は無を示している。
【００１７】
Ａ．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：約０．３μｍの球菌
（２）運動性の有無：−
（３）胞子の有無：−
【００１８】
Ｂ．培養的性質
（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＣＬ）培地寒天平板培養（※１）
３７℃、培養日数２日で直径１〜２ｍｍの円形のコロニーを形成する
ｉ）色：白色
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：半透明
ｉｖ）変異によるコロニー形態の変化：−
ｖ）培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化：−
※１  Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ培地の培地組成を下記に示す。
ＮＨ４Ｃｌ                                                １．００ｇ
ＫＣｌ                                                    ０．１０ｇ
ＭｇＳＯ４                                                ０．２０ｇ
ＮａＣｌ                                                  ０．８０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                ０．１０ｇ
ＣａＣｌ２                                                ０．０２ｇ
Ｎａ２ＷＯ４                                              ０．２０ｍｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ                                １．００ｇ
ＮａＨＣＯ３                                              １．００ｇ
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ                                          ５．００ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ                                  ０．３０ｇ
Ｎａ２Ｓ                                                ０．３０ｇ
Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ）      １０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＩＩ）              １０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                        １０００ｍｌ
Ａｇａｒ                                                  １５ｇ
ｐＨ    ５．９
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
（Ｉ）Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ           １．５ｇ
ＭｇＳＯ４                                            ３．０ｇ
ＭｎＳＯ４                                            ０．５ｇ
ＮａＣｌ                                             １．０ｇ
ＦｅＳＯ４                                            ０．１ｇ
ＣｏＳＯ４                                          ０．１８ｇ
ＣａＣｌ２                                            ０．１ｇ
ＺｎＳＯ４                                          ０．１８ｇ
ＣｕＳＯ４                                          ０．０１ｇ
ＫＡｌ（ＳＯ４）２                                   ０．０２ｇ
Ｈ３ＢＯ３                                           ０．０１ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４                                       ０．０１ｇ
ＮｉＣｌ２                                        ０．０２５ｇ
Ｎａ２ＳｅＯ３                                       ０．３ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                    １０００ｍｌ
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ                                        ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃ  ａｓｉｄ                                ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ                          １０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ                            ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ                                ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ                        ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ                  ５．０ｍｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ12                                 ０．１ｍｇ
Ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ              ５．０ｍｇ
Ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ                              ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                    １０００ｍｌ
（２）ゼラチン穿刺培養
ｉ）ゼラチン液化：−
（３）リトマス・ミルク
ｉ）反応：リトマス還元
ｉｉ）凝固：＋
（４）Ｂ．Ｃ．Ｐ．ミルク
ｉ）反応：アルカリ性
【００１９】
Ｃ．生理学的性質
（１）グラム染色性：−
（２）硝酸塩の還元：＋ 
（３）インドールの生成：−
（４）硫化水素の生成：−
（５）デンプンの加水分解：−
（６）ウレアーゼ：−
（７）カタラーゼ：−
（８）生育の範囲
ｉ） 至適ｐＨ：７．２
ｉｉ）温度：２０〜４２℃で良好に生育
（９）酸素に対する態度：偏性嫌気性
（１０）Ｏ−Ｆテスト：酸化型
（１１）糖類からの酸及びガスの生成
ｉ）Ｌ−アラビノース：酸（−）／ガス（−）
ｉｉ）Ｄ−キシロース：酸（−）／ガス（−）
ｉｉｉ）グルコース：酸（＋）／ガス（−）
ｉｖ）Ｄ−マンノース：酸（−）／ガス（−）
ｖ）フラクトース：酸（＋）／ガス（−）
ｖｉ）マルトース：酸（−）／ガス（−）
ｖｉｉ）ラクトース：酸（−）／ガス（−）
ｖｉｉｉ）Ｄ−トレハロース：酸（−）／ガス（−）
ｉｘ）Ｄ−ソルビトール：酸（−）／ガス（−）
ｘ）Ｄ−マンニトール：酸（−）／ガス（−）
ｘｉ）グリセリン：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｉ）Ｄ−セロビオース：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｉｉ）エスクリン：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｖ）サリシン：酸（−）／ガス（−）
ｘｖ）Ｄ−メレチトース：酸（−）／ガス（−）
ｘｖｉ）Ｄ−ラフィノース：酸（−）／ガス（−）
ｘｖｉｉ）Ｌ−ラムノース：酸（＋）／ガス（−）
【００２０】
Ｄ．酵素反応
ｉ）アルギニンジヒドロラーゼ：＋
ｉｉ）α−ガラクトシダーゼ：−
ｉｉｉ）β−ガラクトシダーゼ：−
ｉｖ）β−ガラクトシダーゼ−６−フォスフェート：−
ｖ）α−グルコシダーゼ：−
ｖｉ）β−グルコシダーゼ：−
ｖｉｉ）α−アラビノシダーゼ：−
ｖｉｉｉ）Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
ｉｘ）グルタミン酸デカルボキシラーゼ：−
ｘ）α−フッコシダーゼ：−
ｘｉ）アルカリフォスファターゼ：−
ｘｉｉ）アルギニンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｉｉ）ｐ−プロリンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｖ）ロイシルグリシンアリルアミダーゼ：−
ｘｖ）フェニルアラニンアリルアミダーゼ：−
ｘｖｉ）ロイシンアリルアミダーゼ：−
ｘｖｉｉ）ピログルタミン酸アリルアミダーゼ：−
ｘｖｉｉｉ）チロシンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｘ）アラニンアリルアミダーゼ：−
ｘｘ）グリシンアリルアミダーゼ：−
ｘｘｉ）ヒスチジンアリルアミダーゼ：−
ｘｘｉｉ）グルタミルグルタミン酸アリルアミダーゼ：−
ｘｘｉｉｉ）セリンアリルアミダーゼ：−  
【００２１】
Ｅ．１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析
１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）にアクセスし、ＢＲＡＳＴプログラムを用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の相同性検索を行った結果、いずれのＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌とも１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性が９７％未満であった。
【００２２】
Ｆ．分類・同定の結果
本菌株の表現形質による分類学的性質に基づき、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ（ｅｄ），Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８４）およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（９ｔｈ  ｅｄ．），Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ，Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ｅｄ），Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）を参考に分類・同定を行った結果、本菌株はＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属と同定された。
【００２３】
Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属には基準種Ｖ．ｐａｒｖｕｌａの他に、Ｖ．ａｔｙｐｉｃａ、Ｖ．ｄｉｓａｐａｒ、Ｖ．ｃｒｉｃｅｔｉ、Ｖ．ｒａｔｔｉなどが知られている。知られているＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌は、Ｖ．ｃｒｉｃｅｔｉにのみフルクトース発酵能があるが、一般的には糖類を発酵することなく、ピルビン酸や乳酸などの有機酸の発酵能を有するのみである。
【００２４】
一方、本菌株は、フルクトースで生育可能（発酵能有）であり、さらにグルコースに対しても発酵能を有する点で他のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌と分類学的に異なる。
【００２５】
また、一般に、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析では、相同性が９５％以上であれば同属、９７％以上であれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種とみなすことができるとされている。
【００２６】
本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの結果では、他のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属の菌との相同性は９７％未満であったので、公知のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌株とは別の種であることが示された。
【００２７】
本菌株は、グルコース、フラクトースから酢酸の他にエタノールを生成するほか、一酸化炭素、または二酸化炭素と水素を基質として、酢酸の他にエタノールを生成することを特徴とする。
【００２８】
本菌株を用いて、エタノールを生産する方法は、特に限定されない。
【００２９】
一酸化炭素、または二酸化炭素と水素を基質として、エタノールを生産する方法としては、嫌気状態で、微生物に一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを供給して行う方法が挙げられる。
【００３０】
エタノール生成機構は以下の通りである。
【００３１】
図１は本菌株が備えていると考えられているエタノール生成経路の模式図である。
【００３２】
この経路をもつ多くの微生物は、アセチルＣｏＡから、酢酸または細胞を形成する有機物を生成するのみであるが、本菌株は、酢酸の他にエタノールも生成することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００３４】
実施例１
本菌株によるエタノール生成能を確認した。
【００３５】
まず、本菌株を接種した滅菌済ＣＬ培地２０ｍｌを５０ｍｌ耐圧バイアルに入れＣＯ／ＣＯ２ガス（ＣＯ：ＣＯ２＝８：２）を封入し、１５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２４〜４８時間培養し、培養液を作製した。
【００３６】
培養液を、図２に示す実験装置（発酵槽の実効体積１Ｌ）に加圧状態のまま移し、ＣＯ／ＣＯ２ガスを再封入した。ｐＨを７．０、温度３７℃、攪拌を１００ｒｐｍとし、ＣＯ／ＣＯ２ガス循環が０．１ｖｖｍの条件で３日間エタノール生成実験を行った。
【００３７】
微生物の細胞１ｇにつき、１日あたり０．２２ｇのエタノールを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】エタノール生成経路の模式図
【図２】実施例に用いたエタノール生産を行う装置を示す図
【図１】
0005214272.tif 000002
【図２】
0005214272.tif 000003