(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養すること、及び培養物からがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞の製造方法。
【請求項２】
がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養することを含む、がん幹細胞の濃縮方法。
【請求項３】
低酸素培養機器及びグルコースを実質的に含有しない培地を含む、がん幹細胞濃縮用システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞を濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん研究はこれまで、腫瘍を均質な細胞集団としてとらえ、その診断法・治療法を見出そうとする傾向にあった。一方近年、そうした腫瘍中には、がん幹細胞と呼ばれる腫瘍の治療抵抗性や転移能に関与している細胞群が存在する事が明らかとなり、注目を集めている。このがん幹細胞は、通常腫瘍中にごく少数しか存在しない。そのため、その重要性にもかかわらず、がん幹細胞の特性の把握や研究が困難な状況にあった。
【０００３】
特許文献１には、腫瘍細胞と血液細胞とをインビトロで細胞融合する工程を含む、がん幹細胞の作成方法が開示されている。しかしながら、該方法は細胞融合を伴うため、得られる細胞が天然に存在するがん幹細胞の特性を完全には反映できていない可能性がある。
【特許文献１】特開２００６−２９６３６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、がん細胞中に存在するがん幹細胞の比率を高め、濃縮する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、がん細胞群に低酸素ストレス及び飢餓ストレスを同時に与えることにより、分化したがん細胞に対するがん幹細胞の割合を高めることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は以下に関する。
[１]がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養すること、及び培養物からがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞の製造方法。
[２]がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養することを含む、がん幹細胞の濃縮方法。
[３]低酸素培養機器及びグルコースを実質的に含有しない培地を含む、がん幹細胞濃縮用システム。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、腫瘍中にごく少数存在し、腫瘍の悪性度と関係があるとされるがん幹細胞のin vitroでの濃縮が可能となる。本発明の方法を用いることにより、がん幹細胞研究が促進される。例えば、がん幹細胞の遺伝子発現解析、タンパク質解析、代謝解析などを行うことが容易となる。また、本発明の方法により濃縮されたがん幹細胞を含む細胞群を用いることにより、効率のよい腫瘍モデルを構築することができる。このような腫瘍モデルは、腫瘍発生・形成過程、治療抵抗性、転移過程などを研究する上で有用である。また、これらの研究を通じて、がん幹細胞およびがんの理解につながるとともに、これを標的とした医薬品開発が可能となる。こうしたことから、本発明はがんに関わる医薬品業界で意義深い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養すること、及び培養物からがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞の製造方法を提供する。がん幹細胞を含有するがん細胞集団を、低酸素雰囲気下、グルコースを実質的に含有しない培地中で培養することにより、がん幹細胞を濃縮することができる。
【０００９】
がん幹細胞とは、継続的に増殖可能な腫瘍の再構築に必要ながん細胞であって、自己複製能、多分化能及び増殖能を有するがん細胞をいう。自己複製能とは、分裂した２つの娘細胞のどちらか１つ、あるいは、両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力および分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。多分化能とは、腫瘍を構成する複数種のがん細胞へ分化できる能力をいう。
【００１０】
がん幹細胞は、一般的にＣＤ１３３を発現しているため、ＣＤ１３３陽性のがん細胞として特定することができる。
【００１１】
本発明において用いられるがん細胞集団は、がん幹細胞、及び幹細胞ではない（即ち上述のがん幹細胞の性質を有していない）がん細胞を含む、がん細胞の混合物である。多くの腫瘍は、腫瘍を構成するがん細胞に不均一性を有しているため、腫瘍を形成する能力を有するがん幹細胞及び腫瘍を形成する能力がないがん細胞（幹細胞ではないがん細胞）から構成されるがん細胞集団として存在する。該がん細胞集団には非がん細胞（即ち正常細胞）が含まれていてもよい。
【００１２】
本発明においては、種々のがん由来のがん細胞集団及びがん幹細胞を用いることが可能である。がんの種類としては、固形がん（例えば、大腸がん（特にカルシノーマ）、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がん等）、血液がん（例えば、骨髄腫、リンパ腫等）等を挙げることができるが、特にこれらに限定されない。本発明においては、好ましくは大腸がん（好ましくはカルシノーマ）由来のがん細胞集団及びがん幹細胞が用いられる。
【００１３】
がん細胞集団に含まれるがん幹細胞が由来するがんの種類と、幹細胞ではないがん細胞が由来するがんの種類は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一の種類のがん由来である。
【００１４】
本発明で用いられるがん細胞集団及びがん幹細胞は、通常哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。
【００１５】
本発明の方法においては、がん細胞集団が低酸素雰囲気下で培養される。「低酸素」とは、常酸素濃度（２１％）を下回る酸素濃度をいう。がん幹細胞の濃縮効率を高くする観点から、雰囲気中の酸素濃度が低いほど好ましく、該酸素濃度は、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、更に好ましくは２％以下である。一方、培養対象の細胞の生存を維持するため、雰囲気は、最小限度の酸素を含む必要がある。この観点から、雰囲気中の酸素濃度は通常０．０１％以上、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上、更に好ましくは１．０％以上である。従って、本発明の方法においては、培養時の雰囲気中の酸素濃度は、通常０．０１％以上２１％未満、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．５〜５％、更に好ましくは１．０〜２．０％（例えば１．２％）である。
【００１６】
酸素濃度以外の雰囲気条件は、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用される条件を適用することができる。例えば、雰囲気中のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％である。雰囲気中の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％である。
【００１７】
本発明の方法においては、がん細胞集団がグルコースを実質的に含有しない培地中で培養される。「グルコースを実質的に含有しない」とは、細胞増殖に必要な濃度のグルコースを含有しないことを意味し、具体的には培地中のグルコース濃度が、１ｍＭ以下、好ましくは０．１ｍＭ以下、最も好ましくは実質的に０％であることを意味する。
【００１８】
本発明の方法において用いられる培地の基礎培地としては、グルコースを実質的に含有しないことを条件に、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用されるものを用いることができ、培養対象のがん細胞集団の種類に応じて適宜選択することが可能である。基礎培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
【００１９】
本発明の方法において用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、グルコースを実質的に含有しない限り、特に限定されないが、例えば血清、成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
【００２０】
本発明の方法で用いられる培養温度は、培養対象のがん細胞集団の種類に応じて適宜設定することができる。培養温度は、通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃である。
【００２１】
培養期間は、がん幹細胞の濃縮を達成することが出来る限り特に限定されないが、通常６時間〜７日間、好ましくは１２時間〜２日間の範囲内である。細胞生存にとっては不利な条件（低酸素雰囲気条件及びグルコース飢餓条件）下での培養であることから、培養期間が長すぎると細胞が死滅してしまい、かえってがん幹細胞の収率が低下してしまうおそれがある。一方、培養期間が短すぎると、がん幹細胞の十分な濃縮を達成できないおそれがある。
【００２２】
上記条件での培養の結果、がん細胞集団に含まれるがん幹細胞の比率が培養開始時と比較して上昇し、がん幹細胞を豊富に含有する培養物を得ることができる。「培養物」とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。
【００２３】
所望に応じ、培養後にがん幹細胞が濃縮されたことを確認してもよい。がん幹細胞が濃縮されたか否かは、がん幹細胞のマーカー分子（ＣＤ１３３等）の発現に基づき評価することができる。例えば、培養物中に含まれるがん細胞集団における該マーカー分子の発現量が上昇した場合、あるいは該マーカー分子陽性の細胞の比率が上昇した場合には、がん幹細胞が濃縮されたと判断することが出来る。上記マーカー分子の発現量は、自体公知の方法（ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメーター等）により測定することが出来る。
【００２４】
上記培養物からがん幹細胞を単離することにより、がん幹細胞を得ることができる。「単離」とは目的とする細胞以外の成分（細胞、タンパク質、培地等）の混入を除去する操作を意味する。がん幹細胞の単離は、がん幹細胞のマーカー分子（ＣＤ１３３等）の発現に基づき自体公知の方法により行うことができる。例えば、該マーカー分子を特異的に認識する抗体によりがん幹細胞を処理し、セルソーターや磁性ビーズ等の手段を用いることによりがん幹細胞を単離、精製することが出来る。
【００２５】
本発明の方法により得られたがん幹細胞を、非ヒト哺乳動物（免疫不全動物等）に移入することにより、効率のよい腫瘍モデルを構築することが可能である。また、本発明の方法により得られたがん幹細胞からタンパク質やｍＲＮＡを抽出することにより、がん幹細胞の遺伝子の発現パターンを詳細に解析することが可能となる。
【００２６】
また、本発明は低酸素培養機器及びグルコースを実質的に含有しない培地を含む、がん幹細胞濃縮用システム（キット）を提供する。
【００２７】
「低酸素培養機器」とは、低酸素での細胞培養を可能にする機器を意味する。該機器としては、低酸素雰囲気下での細胞培養が可能なインキュベーター、酸素吸着剤、低酸素パック等を挙げることができる。「低酸素」の定義は上述の通りである。
【００２８】
「グルコースを実質的に含有しない培地」の定義は上述の通りである。
【００２９】
本発明のシステムは、上記以外の試薬を更に含むことが出来る。該試薬としては、がん幹細胞のマーカー分子を特異的に認識する抗体、該マーカー分子のｍＲＮＡ発現を特異的に検出可能な核酸プローブ又は核酸プライマーセット、磁性ビーズ、標識二次抗体、培養容器等を挙げることが出来る。
【００３０】
本発明のシステムを用いることにより、上記本発明の方法により容易にがん幹細胞を濃縮することが可能となる。
【００３１】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
[培養環境]
マウス由来がん細胞（結腸カルシノーマ、Colon-26 (Colon)）を用いて、実験を行った。培養培地には、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（１０％胎仔ウシ血清及び抗生物質を添加）を用いた。また、飢餓実験のために、同様の培地組成を有するグルコース不含培地（グルコース以外の組成は上記培地と同一）を用いた。常酸素条件は、ＣＯ２培養庫を用い、５％  ＣＯ２（空気中）、３７℃とした。また、低酸素条件は、Personal Multi Gas Incubator [Astec]を用い、１．２％  Ｏ２、９３．８％  Ｎ２、５％  ＣＯ２、３７℃とした。
まず、２４ウェルプレートを用い、１ウェルあたり５×１０４個の細胞をＤＭＥ培地（１ｍｌ）中で、常酸素条件下２４時間前培養した。その後、培地を新たなＤＭＥ培地又はグルコース不含培地に入れ替え、常酸素条件下又は低酸素条件下で細胞を更に２４時間培養した。実験群として、(1)常酸素、(2)常酸素且つ飢餓、(3)低酸素、(4)低酸素且つ飢餓、の４群を設けた。
【００３３】
［ｑＲＴ−ＰＣＲ］
上記の手順で培養した(1)−(4)の実験群の細胞を回収し、Micro-to-Midi total RNA purification system (Invitrogen Life Technology)を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを用い、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法により、がん幹細胞マーカーとして汎用されているＣＤ１３３ ｍＲＮＡの発現を解析した。解析には、comparative CT methodを用い、内部標準にはbeta-actinを用いた。また、反応は、ABI PRISM 7000 sequence detection system (Applied Biosystems)を用いて行い、反応試薬にはReverTra Ace qPCR RT Kit及びRealtime PCR Master Mix (TOYOBO)を用いた。
【００３４】
結果を図１に示す。ＣＤ１３３の発現は、(4)低酸素且つ飢餓＞(3)低酸素＞(2)常酸素且つ飢餓＞(1)常酸素の順に高かった。
【００３５】
[フローサイトメトリー]
上記の手順と同様に培養した(1)−(4)の実験群の細胞について、フローサイトメトリー（EPICS XL, Coulter）を用いて、ＣＤ１３３陽性（ＣＤ１３３＋）細胞の検出を行った。抗ＣＤ１３３抗体(abcam)を一次抗体として、Alexa Fluor 488 Goat Anti-rabbit IgG（Molecular probes）を二次抗体として用いた。
【００３６】
結果を添付の図２に示す。ＣＤ１３３＋細胞は、(1)の通常条件で培養した細胞群及び(2)の飢餓細胞群では、１．２％程度であった。これに対し、(3)の低酸素処理を施した細胞群では、１．９％とＣＤ１３３＋細胞の比率が上昇していた。さらに、(4)の様に、低酸素飢餓細胞群では、３．８７％とさらにＣＤ１３３＋細胞の比率が向上した。
【００３７】
以上の結果から、癌細胞群に低酸素ストレスと飢餓ストレスを同時に与えることにより、がん幹細胞（ＣＤ１３３＋細胞）の比率を高めることができることが立証された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、腫瘍中にごく少数存在し、腫瘍の悪性度と関係があるとされるがん幹細胞のin vitroでの濃縮が可能となる。本発明の方法を用いることにより、がん幹細胞研究が促進される。例えば、がん幹細胞の遺伝子発現解析、タンパク質解析、代謝解析などを行うことが容易となる。また、本発明の方法により濃縮されたがん幹細胞を含む細胞群を用いることにより、効率のよい腫瘍モデルを構築することができる。このような腫瘍モデルは、腫瘍発生・形成過程、治療抵抗性、転移過程などを研究する上で有用である。また、これらの研究を通じて、がん幹細胞およびがんの理解につながるとともに、これを標的とした医薬品開発が可能となる。こうしたことから、本発明はがんに関わる医薬品業界で意義深い。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】種々の条件下での培養後のColon-26細胞のＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図２】種々の条件下での培養後のColon-26細胞上のＣＤ１３３発現レベルを示す。横軸がＣＤ１３３発現に相当する蛍光強度を示す。
【図１】
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【図２】
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