(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、
当該プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しており、
２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とであることを特徴とする核酸応答性ゲル。
【請求項２】
上記プローブの一方の端部は、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸のうちの、片方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されているとともに、
上記プローブの他方の端部は、当該一本鎖核酸とハイブリダイズしている他方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されていることによって、
上記プローブは、架橋を形成するように、ゲルの網目構造内に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項３】
上記プローブは、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、１塩基以上のミスマッチを有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項４】
２本の一本鎖核酸のそれぞれは、５’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項５】
２本の一本鎖核酸のそれぞれは、３’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項６】
上記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項７】
上記高分子ゲルは、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含むモノマーを重合させることによって得られる高分子ゲル、
または、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の高分子化合物を架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られる高分子ゲルであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項８】
上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸の塩基数は、２以上１００００以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項９】
核酸に応答して体積および蛍光強度が変化することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項１０】
核酸に応答して架橋密度が減少することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲル。
【請求項１１】
（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含むモノマーと、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてなるプローブとを、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させることにより得られることを特徴とする核酸応答性ゲル。
【請求項１２】
ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の高分子化合物に、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてなるプローブを結合させた後、架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られることを特徴とする核酸応答性ゲル。
【請求項１３】
蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、
得られたプローブを、高分子ゲルを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて核酸応答性ゲルを得る重合工程とを含むことを特徴とする核酸応答性ゲルの製造方法。
【請求項１４】
蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、
得られたプローブを高分子化合物と結合させるプローブ結合工程と、
上記プローブ結合工程によりプローブが結合された高分子化合物を、架橋剤と反応させて網目構造を形成する架橋工程とを含むことを特徴とする核酸応答性ゲルの製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程と、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの体積変化および蛍光強度の変化で検出する工程とを含み、体積変化および蛍光強度の変化により核酸の一塩基の差を認識することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲルを含有する核酸検出キット。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸応答性ゲルを含有する核酸検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用に関し、特に標的核酸を検知して体積変化し、同時に蛍光強度が変化する核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
個人の遺伝情報に基づいて各人に合った病気の予防や治療を可能にするテーラーメード医療を実現するために、疾病に関与するＤＮＡの突然変異をより効果的かつ簡便に検出できる遺伝子診断技術や遺伝子診断材料の開発が盛んに行われている。しかしそれらの殆どが、水溶液中での、溶解したプローブＤＮＡや基板上に固定されたプローブＤＮＡとの二本鎖形成に基づくものである。遺伝子診断材料としては、ｐＨ、温度等の外部環境変化に応答して構造変化する刺激応答性ゲルも有望な材料であるが、これまでに標的ＤＮＡを認識して応答するＤＮＡ応答性ゲルに関する報告は数例しか報告されていない。
【０００３】
これまでに報告されているＤＮＡ応答性ゲルとしては、網目構造体を構成する高分子化合物に、プローブとなる一本鎖ＤＮＡが固定されているゲルが挙げられる（例えば、特許文献１、非特許文献１等参照。）。しかし、かかるＤＮＡ応答性ゲルは、二本鎖ＤＮＡを架橋点として用いるものではなく、競争的な二本鎖形成を利用していないために、標的ＤＮＡの配列認識能を制御することが難しく、感度、体積変化の量においても十分であるとはいえない。
【０００４】
また、ループ状の二本鎖ＤＮＡをプローブとして導入した核酸応答性ゲルも報告されている（例えば、非特許文献２等参照。）。しかし、かかる核酸応答性ゲルは、標的ＤＮＡの存在下で、ループ状の二本鎖ＤＮＡの構造が変化することにより、膨潤または収縮するゲルであるため、大きな体積変化を期待することはできない。
【０００５】
かかる問題を解決する核酸応答性ゲルとして、本願発明者らは、２本の一本鎖核酸からなるプローブがハイブリダイズした状態で、ゲル架橋点として高分子ゲルの網目構造内に固定されている従来とは異なるタイプの核酸応答性ゲルを報告している（例えば、非特許文献３等参照。）。
【特許文献１】特開２００５−１０６５３３号公報（平成１７年４月２１日公開）
【非特許文献１】Y. Murakami, M. Maeda, Macromolecules, 38, 1535-1537(2005)
【非特許文献２】Y. Murakami, M. Maeda, Biomacromolecules, 6, 2927-2929(2005)
【非特許文献３】大川香織、宮田隆志、浦上忠、二本鎖ＤＮＡを架橋点としたＤＮＡ応答性ゲルの合成、高分子ゲル研究討論会講演要旨集、Vol.17,2006.01.18,p39-40
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のいずれの核酸応答性ゲルも標的核酸の存在下で、膨潤又は収縮するゲルであり、標的核酸を検知するためには、体積変化を測定する必要がある。かかる核酸応答性ゲルを、遺伝子診断材料として利用するためには、標的核酸をより簡便に検知可能な材料として開発することが望まれる。
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、標的核酸の存在下で、膨潤又は収縮するだけではなく、簡便な方法で核酸を検知することができる核酸応答性ゲルを実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、近年、分子間相互作用や分子構造変化をリアルタイムで検知する有用な手段として知られている蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に着目した。蛍光共鳴エネルギー移動をＤＮＡ検知に利用するモレキュラービーコンは、蛍光発光するドナーと、該ドナーとの間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こるようなアクセプターとが、一本鎖ＤＮＡに導入されたプローブであり、サンプル溶液中の標的ＤＮＡと、プローブとの２本鎖形成により、蛍光発光するドナーとアクセプターとが離れてＦＲＥＴが阻害されることにより蛍光を発光する。
【０００９】
かかるＦＲＥＴを利用する方法は、従来溶液中における、標的ＤＮＡと同じ溶液中に溶解したプローブまたは基板に固定されたプローブとの２本鎖形成に基づくものに限られている。蛍光発光するドナーとアクセプターとが導入されたプローブを刺激応答性ゲルに固定する場合には、ゲルが水溶液中で膨潤し、網目が広がることによってドナーとアクセプターとの距離が離れ、ＦＲＥＴが阻害される可能性があると考えられることなどから、ＦＲＥＴを利用する方法を刺激応答性ゲルのようなソフトマテリアルに用いるという発想はなかった。本発明者らは、かかる蛍光共鳴エネルギー移動を利用する方法を刺激応答性ゲルにおいても用いることができないかと考えた。そして、本発明者らが開発した、２本の一本鎖核酸からなるプローブがハイブリダイズした状態で、ゲル架橋点として高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルにおいて、２本の一本鎖核酸の片方に、蛍光発光するドナーを、もう片方に当該ドナーとの間でＦＲＥＴが起こるアクセプターを導入したところ、刺激応用性ゲルの膨潤挙動と蛍光の発光・消光とが相互に害されることなく、標的核酸を検知して体積変化し、同時に蛍光強度が変化する核酸応答性ゲルを得ることができることを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
さらに、本発明の核酸応答性ゲルを用いる場合、後述するように、単に、膨潤挙動と、蛍光強度の変化とが一致した結果を示すものではないことが見出された。すなわち、膨潤挙動では差がみられなかった核酸についても、蛍光強度の変化の差でそれらを区別して検知することができることが明らかになり、１の測定でより厳密な診断を行うことが可能となる。
【００１１】
また、本発明にかかる核酸応答性ゲルを用いれば、核酸を簡便に検知することができるだけではなく、核酸応答性ゲルは同時に膨潤・収縮することから、例えば、診断結果に応じた、薬物放出等の制御が可能となり、ドラッグデリバリーシステムやマイクロ流路バルブ等として、診断と制御を同時に行なうことができる新規な材料として用いることが可能となる。
【００１２】
すなわち、本発明に係る核酸応答性ゲルは、上記課題を解決するために、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、当該プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しており、２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とであることを特徴としている。
【００１３】
上記構成によれば、標的核酸を検知して体積変化し、同時に蛍光強度が変化する核酸応答性ゲルを得ることができる。また、蛍光強度の変化により標的核酸を簡便に検知することができるだけではなく、核酸応答性ゲルは同時に膨潤・収縮することから、例えば、遺伝子診断結果に応じた、薬物放出等の制御が可能となり、診断と制御を同時に行なうことができる新規な材料として用いることが可能となる。
【００１４】
本発明に係る核酸応答性ゲルにおいては、上記プローブの一方の端部は、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸のうちの、片方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されているとともに、上記プローブの他方の端部は、当該一本鎖核酸とハイブリダイズしている他方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されていることによって、上記プローブは、架橋を形成するように、ゲルの網目構造内に固定されていればよい。
【００１５】
上記プローブが架橋を形成するように、ゲルの網目構造内に固定されていることにより、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸が、解離した（メルトした）場合、蛍光ドナー分子とアクセプター分子とが離れることによって蛍光強度が増加する。また、同時に架橋が切断されることになり、架橋点が減少し、核酸応答性ゲルは膨潤するという効果を奏する。また、これにより、一本鎖をプローブとして用いる場合の体積変化は浸透圧の変化のみによるのに対し、二本鎖をプローブとして用いる場合には浸透圧の変化と架橋点の減少との二つの相乗効果が期待できる。
【００１６】
本発明に係る核酸応答性ゲルにおいては、上記プローブは、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、１塩基以上のミスマッチを有していることが好ましい。
【００１７】
上記の構成によれば、上記プローブは、ハイブリダイズしている部分において、１以上の塩基がミスマッチであるため、完全に相補的である場合と比較して、ハイブリダイズしている部分の二本鎖が不安定となる。それゆえ、上記プローブを形成している２本のうちのいずれかの一本鎖核酸と完全に相補的な核酸が存在すると、より安定な二本鎖が形成されるべくハイブリダイズする核酸の鎖交換が起こるという効果を奏する。
【００１８】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記２本の一本鎖核酸のそれぞれは、５’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることが好ましい。また、本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記２本の一本鎖核酸のそれぞれは、３’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していてもよい。
【００１９】
５’末端や３’末端には高分子化合物に結合させるための基を導入しやすいため、これにより、上記プローブを容易に高分子ゲルの網目構造に結合することができるという効果を奏する。
【００２０】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであればよい。
【００２１】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記高分子ゲルは、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含むモノマーを重合させることによって得られる高分子ゲル、または、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の高分子化合物を架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られる高分子ゲルであることが好ましい。
【００２２】
上記モノマーや高分子を用いることにより、水によって膨潤する高分子ゲルを得ることができるという効果を奏する。
【００２３】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸の塩基数は、２以上１００００以下であることが好ましい。
【００２４】
上記プローブの塩基数が上記範囲内であることにより、十分に安定な二本鎖形成が可能であると共に、１００００以下であるために標的核酸がゲル内に十分に拡散できるという効果を奏する。
【００２５】
本発明に係る核酸応答性ゲルは、核酸に応答して体積および蛍光強度が変化することを特徴としている。
【００２６】
本発明に係る核酸応答性ゲルが、標的核酸を検知して体積変化し、同時に蛍光強度が変化することにより、核酸の塩基配列のわずかな差異を蛍光強度の変化により簡便に検知することができる。また、核酸応答性ゲルは同時に膨潤・収縮することから、例えば、遺伝子診断結果に応じた、薬物放出等の制御が可能となり、診断と制御を同時に行なうことができる新規な材料として用いることが可能となる。
【００２７】
本発明に係る核酸応答性ゲルは、核酸に応答して架橋密度が減少することを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る核酸応答性ゲルが、核酸に応答して架橋密度が減少することにより、ＤＮＡの配列などを認識してゲル体積として取り扱いやすい情報へと変換できるという効果を奏する。
【００２９】
本発明にかかる核酸応答性ゲルは、上記課題を解決するために、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含むモノマーと、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてなるプローブとを、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させることにより得られるものであってもよい。
【００３０】
また、本発明にかかる核酸応答性ゲルは、上記課題を解決するために、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の高分子化合物に、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてなるプローブとを結合させた後、架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られるものであってもよい。
【００３１】
本発明に係る核酸応答性ゲルの製造方法は、上記課題を解決するために、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、得られたプローブを、高分子ゲルを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて核酸応答性ゲルを得る重合工程とを含むことを特徴としている。
【００３２】
また、本発明に係る核酸応答性ゲルの製造方法は、上記課題を解決するために、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、得られたプローブを高分子化合物と結合させるプローブ結合工程と、上記プローブ結合工程によりプローブが結合された高分子化合物を、架橋剤と反応させて網目構造を形成する架橋工程とを含む方法であってもよい。
【００３３】
本発明に係る標的核酸の検出方法は、本発明に係る核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程と、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの体積変化および／または蛍光強度の変化で検出する工程とを含むことを特徴としている。
【００３４】
本発明にかかる核酸検出キット、および、本発明にかかる核酸検出装置は、本発明に係る核酸応答性ゲルを含有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る核酸応答性ゲルは、以上のように、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、当該プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しており、２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とであるので、標的核酸を検知して体積変化し、同時に蛍光強度が変化する核酸応答性ゲルを得ることができる。
【００３６】
また、蛍光強度の変化により標的核酸を簡便に検知することができるだけではなく、核酸応答性ゲルは同時に膨潤・収縮することから、例えば、遺伝子診断結果に応じた、薬物放出等の制御が可能となり、診断と制御を同時に行なうことができる新規な材料として用いることが可能となる。
【００３７】
さらに、膨潤挙動では差がみられない核酸についても、蛍光強度の変化の差でそれらを区別して検知することができるため、１の測定でより厳密な診断を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明について、以下に（Ｉ）本発明に係る核酸応答性ゲル、（ＩＩ）核酸応答性ゲルの製造方法、（ＩＩＩ）核酸応答性ゲルの利用の順に説明する。
【００３９】
（Ｉ）本発明に係る核酸応答性ゲル
本発明に係る核酸応答性ゲルは、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、当該プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しており、２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とである。
【００４０】
ここで、「高分子ゲル」とは、網目構造を有する高分子化合物が液体を吸収して膨潤したものであれば特に限定されるものではない。例えば、網目構造を有する高分子化合物が水で膨潤したヒドロゲルであってもよいし、網目構造を有する高分子化合物が有機溶媒で膨潤したオルガノゲルであってもよい。中でも、上記高分子ゲルは、核酸の安定性の観点からヒドロゲルであることがより好ましい。なお、本発明に係る核酸応答性ゲルは、膨潤した状態で、核酸に対する応答性を示すが、本発明には、膨潤したゲルから、水、有機溶媒等を除いて乾燥状態としたものも含まれる。
【００４１】
本発明に係る核酸応答性ゲルにおいて、上記高分子ゲルの網目構造内に固定されているプローブは、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなる。ここで、２本の一本鎖核酸は、少なくとも一部分がハイブリダイズしていればよく、全体がハイブリダイズしていてもよいし、ハイブリダイズしていない部分を有していてもよい。
【００４２】
なお、ここでハイブリダイズしているとは、２本の相同的な一本鎖の核酸の塩基部分が水素結合によって互いに結合し、比較的安定な二本鎖を形成していることをいう。一般にハイブリダイズは、２本の一本鎖核酸が完全に相補的またはほとんど相補的な場合に起こりうる。本発明では、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、２本の一本鎖核酸は完全に相補的であってもよいし、１または複数の塩基がミスマッチであってもよい。言い換えれば、上記プローブは、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、ミスマッチを有していなくてもよいし、１塩基以上のミスマッチを有していてもよい。なお、ここでミスマッチとは、例えばＤＮＡの場合グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）のような正常な塩基対を形成することができない塩基の組み合わせをいう。
【００４３】
上記プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合している。すなわち、２本の一本鎖核酸の塩基部分が水素結合によって互いに結合しているが、温度等の条件の変化や他の核酸の存在により、２本鎖が解離する方向に反応が進むことが可能であり、かかる反応は可逆的である。
【００４４】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とからなる。図１の左側に示す円内に、本発明にかかる核酸応答性ゲルを模式的に示す。図中、高分子ゲルの架橋点を示す黒丸で囲まれた範囲は高分子ゲルの網目構造を模式的に示すものである。この高分子ゲルの網目構造内に、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが固定されている。そして、２本の一本鎖核酸のうち、実線で示される一本鎖核酸には蛍光ドナー分子１が導入されており、該一本鎖核酸とハイブリダイズしている、破線で示される一本鎖核酸には、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子２が導入されている。
【００４５】
ここで、蛍光ドナー分子としては、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発する物質であれば特に限定されるものではない。蛍光ドナー分子は、その蛍光スペクトルと重なる励起スペクトルをもつアクセプター分子と近接したときに、蛍光ドナー分子からアクセプター分子にエネルギー移動が起こる。このエネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれる。このＦＲＥＴは、蛍光ドナー分子とアクセプター分子との間の距離に強く依存するため、ＦＲＥＴを利用することによって、標的核酸をセンシングすることが可能となる。すなわち、２本の一本鎖核酸が、ハイブリダイズしている状態では、蛍光ドナー分子１とアクセプター分子２との間の距離が近いために、図１の左側に示すように、蛍光ドナー分子を励起させる波長の光を照射すると、ＦＲＥＴによって、発生した蛍光エネルギーをアクセプター分子が吸収し、蛍光ドナー分子１の発光は消光される。これに対して、図１の右側に示すように、標的核酸の存在下で、鎖交換が起こり、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸が離れると、蛍光ドナー分子１とアクセプター分子２とが離れることによってＦＲＥＴの効果が減少または消失し、蛍光ドナー分子を励起させる波長の光を照射したときの蛍光強度が増加する。
【００４６】
なお、ここで、２本の一本鎖核酸が、ハイブリダイズしている状態では、蛍光ドナー分子１とアクセプター分子２との間の距離が近いために、ＦＲＥＴによって蛍光ドナー分子１の発光は消光されるが、消光によって蛍光ドナー分子は蛍光を全く発光しなくなるとは限られず、蛍光が一部発光している場合もある。いずれの場合も、鎖交換が起こり、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸が離れると、蛍光ドナー分子の蛍光強度は増加する。
【００４７】
また、ここで、蛍光ドナー分子およびアクセプター分子が導入されているとは、それぞれの１本鎖核酸に、蛍光ドナー分子およびアクセプター分子が、化学的または物理的に結合しているものであれば、結合する形式は特に限定されるものではない。例えば、共有結合、イオン結合、配位結合等の化学結合を介して結合されていることが好ましい。中でも、蛍光ドナー分子およびアクセプター分子は、共有結合を介して導入されているものであることがさらに好ましく、例えば、ビニル基、（メタ）アクリロイル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を利用してエステル結合やエーテル結合、アミド結合等により導入されることが好ましい。また、ここで、共有結合を介してとは、スペーサーを介した共有結合をも含む趣旨である。かかるスペーサーとしては、特に限定されるものではないが、例えば炭素数が１〜１５の直鎖アルキルスペーサーを好適に用いることができる。
【００４８】
また、蛍光ドナー分子およびアクセプター分子が導入されている、一本鎖核酸上の位置も２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしたときに、ＦＲＥＴによって蛍光ドナー分子の発光が消光されるように近接していれば、特に限定されるものではない。しかし、ＦＲＥＴによって蛍光ドナー分子の発光が消光されるためには、蛍光ドナー分子とアクセプター分子とが所定の距離以内である必要がある。この所定の距離は、蛍光ドナー分子およびアクセプター分子の種類によって異なるが、５０ｎｍ以下であることが好ましく、３０ｎｍ以下であることがより好ましく、１０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。ここで１０ｎｍの距離は約３塩基の核酸に相当する。
【００４９】
また、ＦＲＥＴによって十分に蛍光ドナー分子の発光が消光されるためには、蛍光ドナー分子とアクセプター分子との一本鎖核酸上での距離は、８塩基以下であることがより好ましく、５塩基以下であることがさらに好ましく、３塩基以下であることが特に好ましい。
【００５０】
本発明で用いられる蛍光ドナー分子としては、蛍光を発光する分子であれば特に限定されるものではないが、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＥＤＡＮＳ、カスケードブルー等を好適に用いることができる。
【００５１】
また、本発明で用いるアクセプター分子としては、上記蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうる分子であれば特に限定されるものではなく、蛍光物質であってもよいし、自身は蛍光を発しない所謂消光剤であってもよい。かかるアクセプター分子としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ等の蛍光物質；ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＤＡＢＣＹＬ、エオシン、マラカイトグリーン等の消光剤を好適に用いることができる。
【００５２】
なお、上記アクセプター分子が蛍光物質である場合、かかるアクセプター分子は、ＦＲＥＴによって、上記蛍光ドナー分子から発生した蛍光エネルギーを吸収し、異なる波長の蛍光を発光する。かかる場合は、アクセプター分子由来の蛍光が観察される。
【００５３】
本発明で用いられる蛍光ドナー分子とアクセプター分子との組み合わせは、蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうる上記蛍光ドナー分子と上記アクセプター分子との組み合わせであればどのような組み合わせであってもよい。例えば、ＦＩＴＣとＢＨＱ１、ＴＡＭＲＡとＢＨＱ２、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬ等の組み合わせをより好適に用いることができる。
【００５４】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記プローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている。ここで、上記プローブの一方の端部は、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸のうちの、片方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されているとともに、上記プローブの他方の端部は、当該一本鎖核酸とハイブリダイズしている他方の一本鎖核酸が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、ゲルの網目構造内に固定されていることによって、上記プローブは、架橋を形成するように、ゲルの網目構造内に固定されている。すなわち、上記プローブは、図１の左側に示す円内に模式的に示すように、ゲルの網目構造内に架橋を形成するように結合されている。ここで架橋は、ハイブリダイズしている２本のうちの実線で表されている一本鎖核酸の一端が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合しているとともに、２本のうちの破線で表される一本鎖核酸の一端が、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることによって形成されている。すなわち、２本の一本鎖核酸のそれぞれは、ゲルの網目構造を形成する高分子化合物と架橋の片方でのみ結合しているが、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしていることによって、架橋が形成されることになる。かかる構成により、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸が、解離した（メルトした）場合、図１の右側に示す円内に模式的に示すように、架橋が切断されることになり、架橋点が減少すると考えられる。一般に高分子ゲルの膨潤率は架橋密度が減少すると増加することが知られているように、架橋点が減少する結果、核酸応答性ゲルは膨潤する。
【００５５】
このように、本発明にかかる核酸応答性ゲルは、架橋点として作用していたハイブリダイズした２本の一本鎖が解離することにより、上述したように、蛍光ドナー分子１とアクセプター分子２とが離れることによって蛍光強度が増加することに加え、架橋密度が減少して膨潤するという機構を利用するため、核酸応答性ゲルの構造設計の状態によっては大きく体積変化させることができる可能性を有する。また、一本鎖核酸が導入された従来の核酸応答性ゲルが浸透圧の変化のみにより体積変化するのに対し、本発明にかかる核酸応答性ゲルは、浸透圧の変化と架橋密度の変化との相乗効果が期待できる。
【００５６】
また、本発明に係る核酸応答性ゲルにおいては、上記プローブは２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しているため、上記プローブを形成している２本のうちのいずれかの一本鎖核酸とより安定な二本鎖を形成する核酸または競争的にハイブリダイズする核酸が存在すると、かかる核酸は、ハイブリダイズしている相手の一本鎖核酸と取って代わり、核酸の鎖交換が起こる。
【００５７】
上記プローブが、ハイブリダイズしている部分において、１以上の塩基がミスマッチである場合は、完全に相補的である場合と比較して、ハイブリダイズしている部分の二本鎖が不安定となる。それゆえ、例えば、上記プローブを形成している２本のうちのいずれかの一本鎖核酸と完全に相補的な核酸のように、より安定な二本鎖を形成できる核酸が存在すると、図１の右側の円内に示すように、より安定な二本鎖が形成されるべくハイブリダイズする核酸の鎖交換が起こる。その結果、蛍光ドナー分子１とアクセプター分子２とが離れることによって蛍光強度が増加すると考えられる。また、上記架橋が切断され架橋点が減少することにより、核酸応答性ゲルが膨潤すると考えられる。すなわち、上記プローブを形成している２本の一本鎖核酸がゲルの網目構造内に結合し、結合箇所に形成している架橋点は可逆的な架橋点となっている。
【００５８】
なお、上述した核酸の鎖交換は、上述したように、より安定な二本鎖を形成できる核酸が存在する場合に起こるが、これに限定されるものではなく、例えば同等に安定な二本鎖を形成できる核酸が存在する場合にも、ハイブリダイズしている一本鎖核酸と競争的に反応することにより核酸の鎖交換は起こる。
【００５９】
上記ハイブリダイズしている部分において、１以上の塩基がミスマッチである場合は、ミスマッチである塩基は１以上で、上限は２本の一本鎖核酸がハイブリダイズすることを妨げない範囲であれば特に限定されるものではなく、導入する各一本鎖核酸の長さ、核酸応答性ゲルの膨潤に用いる溶媒の種類、核酸応答性ゲルの含溶媒率、塩の濃度や種類、温度、ＧＣとＡＴの比率等塩基組成、ｐＨ等に応じて変化する数である。具体的には、ミスマッチの数は、例えば、１、２、３、４、５等である。例えば、２塩基がミスマッチである場合は、１塩基がミスマッチである場合より、２本の一本鎖核酸の結合力は弱くなる。このようにミスマッチの数を変えることで、２本の一本鎖核酸の結合力を変えることができる。それゆえ、ミスマッチの数を変えることで、得られる核酸応答性ゲルの認識能を任意に変えることが可能となる。さらに、２本の一本鎖核酸の結合力は、温度を変化させることによっても変えることができるため、温度を調節することによってさらに認識能を増幅することが可能となる。
【００６０】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、当該プローブを形成する２本の一本鎖核酸が網目構造を形成する高分子化合物に結合する形式は特に限定されるものではないが、例えば、共有結合、イオン結合、配位結合等の化学結合を介して結合されていることが好ましい。これにより、上記プローブが、高分子ゲルの網目構造内に安定して固定される。中でも、当該プローブを形成する２本の一本鎖核酸は、網目構造を形成する高分子化合物に、共有結合を介して結合されていることがより好ましく、例えば、ビニル基、（メタ）アクリロイル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を利用してエステル結合やエーテル結合、アミド結合等により結合されていることが好ましい。また、ここで、共有結合を介してとは、スペーサーを介した共有結合をも含む趣旨である。かかるスペーサーとしては、特に限定されるものではないが、例えば炭素数が１〜１５の直鎖アルキルスペーサーを好適に用いることができる。
【００６１】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸のそれぞれが、上述したように、網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、上記プローブが架橋を形成するようにゲルの網目構造内に固定されていれば、それぞれの一本鎖核酸が高分子化合物に結合している位置は特に限定されるものではない。例えば、２本の一本鎖核酸のそれぞれは、ともに、５’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していてもよい。また、２本の一本鎖核酸のそれぞれは、ともに、３’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していてもよい。５’末端や３’末端には高分子化合物に結合させるための基を導入しやすいため、これにより、上記プローブを容易に高分子ゲルの網目構造に結合することができる。
【００６２】
上記プローブを形成する上記一本鎖核酸は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＰＮＡであってもよい。また、２本の一本鎖核酸は、ＤＮＡ同士、ＲＮＡ同士、またはＰＮＡ同士であってもよいし、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡから選択される２種類の組み合わせであってもよい。
【００６３】
また、上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸の長さは特に限定されるものではなく、いかなる長さのものであってもよいが、例えば、塩基数が２以上１００００以下であることが好ましく、５以上５００以下であることがより好ましく、５以上２００以下であることがさらに好ましい。塩基数が２以上であることにより、ハイブリダイズした二本鎖の結合力が適度な状態になるため好ましい。また、塩基数が１００００以下であることにより、ゲル網目内に標的核酸が拡散しやすいサイズになるので好ましい。
【００６４】
上記高分子ゲルとして用いることができる高分子化合物は、網目構造を有し、水や有機溶媒により膨潤する高分子化合物であれば特に限定されるものではないが、中でも、上記高分子ゲルは、水によって膨潤する高分子ゲルであることがより好ましく、親水性のモノマーを重合、架橋することにより得られる高分子化合物であることがより好ましい。かかるモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸；アルキル（メタ）アクリレート；マレイン酸；ビニルスルホン酸；ビニルベンゼンスルホン酸；（メタ）アクリルアミド；アクリルアミドアルキルスルホン酸；（メタ）アクリロニトリル；ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等のアミノ置換（メタ）アクリルアミド；ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸アミノ置換アルキルエステル；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシエチルメタクリレート；スチレン；ビニルピリジン；ビニルカルバゾール；ジメチルアミノスチレン；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド等のアルキル置換（メタ）アクリルアミド；酢酸ビニル；アリルアミン等を単独または２種以上組み合わせて使用することができる。中でも、上記モノマーは、（メタ）アクリルアミド；（メタ）アクリル酸；アルキル（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシエチルメタクリレート；Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド；酢酸ビニル；アリルアミン等であることがより好ましい。また、得られる核酸応答性ゲルの性能に悪影響を与えるものでなければ、さらに他のモノマーを組み合わせてもよい。なお、本明細書において、「アクリル」または「メタアクリル」のいずれをも意味する場合「（メタ）アクリル」と表記する。
【００６５】
また、上記高分子化合物は、一分子中に２個以上の反応性官能基を有する架橋剤を共重合または反応させることによって架橋されているものであることが好ましい。上記架橋剤としては、従来公知のものを適宜選択して用いればよいが、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、トリレンジイソシアネート、ジビニルベンゼン、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の重合性官能基を有する架橋性モノマー；グルタールアルデヒド；多価アルコール；多価アミン；多価カルボン酸；金属イオン等を好適に用いることができる。これらの架橋剤は単独で用いてもよく、また２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、上記高分子化合物は、上記架橋剤を用いずに、本発明で用いる上記プローブと共重合させることによって、当該プローブのみにより架橋されているものであってもよい。
【００６６】
上記高分子ゲルとして用いることができる高分子化合物としては、具体的には、例えば、ポリ（メタ）アクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド；ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリマレイン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルベンゼンスルホン酸、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これらと（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステル等との共重合体；ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドとポリビニルアルコールとの複合体；ポリビニルアルコールとポリ（メタ）アクリル酸との複合体；カルボキシアルキルセルロース金属塩；ポリ（メタ）アクリロニトリル；アルギン酸；キトサン；ポリアリルアミン；セルロースまたはこれらの誘導体や架橋物、金属塩を挙げることができる。これらの中でも、上記高分子化合物としては、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸、これらの誘導体であることが好ましい。上記高分子化合物の分子量は、１０００以上１００００００以下であることが好ましい。分子量がかかる範囲となっていることにより、適度な架橋剤によって高分子ゲルを合成しやすいので好ましい。
【００６７】
本発明にかかる核酸応答性ゲルは、膨潤している状態で核酸の検出に用いる。また、本発明にかかる核酸応答性ゲルは、核酸に応答して、さらに液体を吸収して、膨潤し体積変化を起こす。本発明の核酸応答性ゲルにおいて、これらの膨潤の際に、吸収される液体は、特に限定されるものではなく、水や水系の緩衝液であってもよいし有機溶媒であってもよい。かかる液体としては、具体的には、例えば、水；リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液等の水系の緩衝液；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、イソペンチルアルコール等のアルコール；アセトン、２−ブタノン、３−ペンタノン、メチルイソプロピルケトン、メチルｎ−プロピルケトン、３−ヘキサノン、メチルｎ−ブチルケトン等のケトン；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等のエーテル；酢酸エチルエステル等のエステル；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル等の二トリル；プロピレンカーボネート；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン等の低級飽和炭化水素；キシレン；トルエン；またはこれらの２種以上の混合物等を挙げることができる。中でも、上記液体は核酸の安定性の観点から水または水系の緩衝液であることがより好ましい。本発明に係る核酸応答性ゲルを平衡に達するまで膨潤させたときに含まれる上記液体の割合は、高分子ゲルの架橋密度、高分子や溶媒の種類、温度、ｐＨ、イオン強度等によって変化するが、核酸応答性ゲルと核酸応答性ゲルに含まれる上記液体の合計重量に対して、３０重量％以上９９．９重量％以下であることが好ましく、７０重量％以上９９重量％以下であることがより好ましい。本発明に係る核酸応答性ゲルを平衡に達するまで膨潤させたときに含まれる上記液体の割合が上記範囲であることにより、適度な強度を有するゲルが得られ、標的核酸がゲル内に拡散することができる高分子網目構造となるので好ましい。
【００６８】
また、本発明に係る核酸応答性ゲルの架橋密度は、０．０１（ｍｏｌ／ｍ３）以上１０００（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることが好ましく、０．０１（ｍｏｌ／ｍ３）以上５００（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることがより好ましい。核酸応答性ゲルの架橋密度が上記範囲であることにより、核酸応答性ゲルは、標的核酸を検知して蛍光強度が変化すると同時に体積変化する。なお、本明細書において、架橋密度は、圧縮試験機を用いて圧縮弾性率を測定し、次式によって算出することができる。
Ｇ＝Ｒ・Ｔ・νｅ・ｖ２１／３
ここでＧは圧縮弾性率（Ｐａ）、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、νｅは架橋密度（ｍｏｌ／ｍ３）、ｖ２は核酸応答性ゲルにおける、核酸応答性ゲル全体（プローブが固定されている高分子化合物＋溶媒）に対するプローブが固定されている高分子化合物の体積分率である。
【００６９】
また、本発明の核酸応答性ゲルの架橋密度のさらに好ましい範囲は用いる目的によって異なり、より大きな体積変化が望まれる場合には、本発明に係る核酸応答性ゲルの架橋密度は、０．１（ｍｏｌ／ｍ３）以上１００（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることがより好ましく、１（ｍｏｌ／ｍ３）以上３０（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることがさらに好ましい。核酸応答性ゲルの架橋密度が上記範囲であることにより、核酸応答性ゲルが大きな体積変化を示すことが期待でき、さらに適度な強度を持つので好ましい。
【００７０】
本発明の核酸応答性ゲルにおける、上記プローブの含有量は、核酸応答性ゲルが核酸に応答して膨潤することができる範囲であれば、特に限定されるものではないが、乾燥状態の核酸応答性ゲルを１００重量％としたときに、０．０１重量％以上であることが好ましい。本発明の核酸応答性ゲルにおける、上記プローブの含有量が、上記範囲であることにより、核酸応答性ゲルは、標的核酸を検知して蛍光強度が変化すると同時に体積変化する。
【００７１】
また、上記プローブの含有量のより好ましい範囲は用いる目的によって異なり、より大きな体積変化が望まれる場合には、本発明の核酸応答性ゲルにおける、上記プローブの含有量は、０．１重量％以上であることがより好ましく、１重量％以上であることがさらに好ましい。上記プローブの含有量が大きければそれだけ核酸応答性ゲルが核酸に応答したときの架橋密度の変化が大きくなる。それゆえ、体積変化により標的とする核酸を認識する認識能を向上することができる。プローブをたくさん入れるほど体積変化に基づく認識能の性能がよいため、上記プローブの含有量の上限はない。また、蛍光強度の変化による検知と同時に、体積変化による制御を行う場合において、大きな体積変化が望まれる場合もプローブの含有量は大きいことが好ましい。なお、核酸が高価であることより、価格の観点からは、上記プローブの含有量は、乾燥状態の核酸応答性ゲルを１００重量％としたときに、５０重量％以下であることが好ましい。
【００７２】
上記プローブの含有量が高い核酸応答性ゲルでは、上記プローブの含有量が低い核酸応答性ゲルに比べて、多くの架橋構造が形成されている。そのため、上記プローブの含有量が高い核酸応答性ゲルの方が、標的核酸が供されたときに切断される架橋構造が多い。よって、上記プローブの含有量が高い核酸応答性ゲルの方が、上記プローブの含有量が低い核酸応答性ゲルに比べて、標的核酸が供されたときの架橋密度の変化が大きくなると考えられる。
【００７３】
また、本発明にかかる核酸応答性ゲルの形状は特に限定されるものではなく、どのような形状のものであってもよく、用途に応じて好ましい形状を適宜選択すればよい。かかる形状としては、例えば、円柱状、板状、フィルム状、粒子状、球状、直方体状等を挙げることができる。例えばセンサーチップ等に用いる場合には、薄膜状やフィルム状等であることが好ましく、診断試薬等に用いる場合には、粒子状等であることが好ましい。
【００７４】
本発明にかかる核酸応答性ゲルを所望の形状とするためには、例えば、核酸応答性ゲルの原料となるモノマー組成物等を重合前に所望の型に注入し、重合を行う方法等を用いることができる。
【００７５】
また、核酸応答性ゲルの大きさも特に限定されるものではなく、用途に応じて好ましい大きさを適宜選択すればよい。例えば、センサー等に用いる場合には、サイズが小さいゲルを用いることが好ましく、例えば球状である場合には、その直径が０．０１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。核酸応答性ゲルのサイズが小さいほど、応答速度が速くなるため、センサー等に好適に用いることができる。
【００７６】
本発明にかかる核酸応答性ゲルは、特定の核酸に応答して体積および蛍光強度が変化するゲルである。より具体的には、特定の核酸を認識すると、液体を吸収して膨潤するとともに、ＦＲＥＴが阻害されて蛍光強度が増加するゲルである。ここで、本発明の核酸応答性ゲルの体積変化および蛍光強度の変化は、可逆的であることにより核酸応答性ゲルを繰り返し使用が可能であり、さらに再現性よいセンサー材料、マイクロ流路バルブ材料等として利用することが可能となる。
【００７７】
本発明にかかる核酸応答性ゲルの蛍光ドナー分子に由来する蛍光強度が、標的核酸の存在下で、増加するときの、蛍光強度の変化は、蛍光ドナー分子とアクセプター分子との距離が所定の大きさを超えた時点で、急にＦＲＥＴが阻害されることから、体積変化に比較して急激である。そのため、標的核酸を、高い感度で、簡便に検知することができる。
【００７８】
標的核酸の存在下での蛍光強度の増加は、増加後の蛍光強度が、標的核酸不存在下での蛍光強度の１．１倍以上であることが好ましく、２．０倍以上であることがより好ましく、５．０倍以上であることがさらに好ましい。
【００７９】
なお、蛍光ドナー分子に由来する蛍光強度の変化は、裸眼で視覚的に、又は、測定器を用いて観察することができる。
【００８０】
本発明にかかる核酸応答性ゲルが核酸を認識して体積変化を起こすときの、体積変化量は特に限定されるものではないが、体積変化後の体積を体積変化前の体積で除した値である膨潤率が、１．０２以上であることが好ましく、１．１以上であることがより好ましい。本発明の核酸応答性ゲルの使用目的に応じて、好ましい膨潤率となるよう、網目構造内に導入されている架橋の量、高分子化合物や溶媒の種類、高分子鎖にある解離基の状態等を選択すればよい。また、本発明にかかる核酸応答性ゲルにおいて、上記膨潤率の上限は、網目構造内に導入されている架橋の量、高分子化合物や溶媒の種類、高分子鎖にある解離基の状態等により異なるが、通常２程度である。なお、膨潤率は、核酸応答性ゲルが円柱状の場合は、後述する実施例に記載の方法により得られる値をいう。後述する実施例では円柱状の核酸応答性ゲルの膨潤率を求める方法が記載されているが、核酸応答性ゲルが例えば球状である場合は、実施例の「円柱の直径」の代わりに球の直径を用いて計算すればよい。
【００８１】
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、上記プローブを形成している２本のうちのいずれかの一本鎖核酸とより安定な二本鎖を形成する核酸または競争的にハイブリダイズする核酸が存在すると、かかる核酸は、ハイブリダイズしている相手の一本鎖核酸と取って代わり、核酸の鎖交換が起こる。２本の一本鎖核酸が、ハイブリダイズしている状態では、それぞれの一本鎖核酸に導入されている蛍光ドナー分子とアクセプター分子との間の距離が近いために、ＦＲＥＴによって蛍光ドナー分子の発光が消光される。これに対して、鎖交換が起こり、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸が離れると、蛍光ドナー分子とアクセプター分子とが離れることによって、蛍光強度が増加する。また、同時に、架橋密度の減少が起こるため核酸応答性ゲルは膨潤する。それゆえ、本発明に係る核酸応答性ゲルは、標的核酸の検出に利用することができる。その際に、高分子ゲルの網目構造を構成する高分子化合物に結合した２本の一本鎖核酸における水素結合の強さと鎖交換した標的核酸における水素結合の強さとのバランスによって鎖交換のしやすさが決まる。したがって、１塩基以上のミスマッチを有する場合にはわずかに水素結合の強さが異なるため、蛍光強度の変化や膨潤挙動に違いが出ると考えられる。さらに、高分子化合物に結合する２本の一本鎖核酸の組み合わせによっても、架橋点を形成しているプローブの水素結合の強さを変化させることができ、鎖交換のしやすさをコントロールすることができる。それゆえ、本発明の核酸応答性ゲルの核酸認識応答挙動を任意に設計することができる。
【００８２】
（ＩＩ）核酸応答性ゲルの製造方法
本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法は、特に限定されるものではなく、上記プローブを、ハイブリダイズした状態で、ゲルの網目構造に、架橋を形成するように結合できる方法であればいかなる方法であってもよい。
【００８３】
本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法としては、例えば、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、得られたプローブを、高分子ゲルを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて核酸応答性ゲルを得る重合工程とを含む製造方法を挙げることができる。
【００８４】
また、本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法は、さらに、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とを製造する工程を含んでいてもよい。
【００８５】
蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とを製造する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８６】
例えば、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸、及び、アクセプター分子が導入された一本鎖核酸に、それぞれ、反応性官能基を導入する方法を好適に用いることができる。かかる場合、蛍光ドナー分子又はアクセプター分子が導入された一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子又はアクセプター分子で標識された一本鎖核酸を得るための従来公知の方法を用いればよい。かかる方法は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の固相合成時にドナー分子とアクセプター分子を導入する方法であってもよいし、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の合成後に例えばリン酸との反応などによってドナー分子とアクセプター分子を導入する方法であってもよい。
【００８７】
なお、一本鎖核酸に、上記蛍光ドナー分子または上記アクセプター分子と、反応性官能基とを導入する順序は、上記順序に限定されるものではなく、反応性官能基を導入した後に上記蛍光ドナー分子または上記アクセプター分子を導入してもよい。
【００８８】
ここで、用いる上記蛍光ドナー分子または上記アクセプター分子については、上記（Ｉ）で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【００８９】
また、上記蛍光ドナー分子または上記アクセプター分子を導入する各一本鎖核酸上の位置は、上記（Ｉ）で説明したように、これらがハイブリダイズしたときに、蛍光ドナー分子とアクセプター分子とがＦＲＥＴによって蛍光ドナー分子の発光が消光される距離以内に位置するように選択すればよい。
【００９０】
上記反応性官能基としては、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物と化学的に結合可能な基であれば、特に限定されるものではなく、例えば、ビニル基、（メタ）アクリロイル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を挙げることができる。また、かかる反応性官能基を導入する各一本鎖核酸の位置も特に限定されるものではないが、反応性官能基導入の容易性の観点からハイブリダイズさせる両方の一本鎖核酸ともに５’末端に導入するか、または、両方の一本鎖核酸ともに３’末端に導入することが好ましい。これによって、２本の一本鎖核酸をハイブリダイズしたときに、形成された上記プローブの両端に反応性官能基が導入されていることになる。なお、上記反応性官能基は、５’末端または３’末端に導入することが好ましいが、これに限定されるものではなく、２本の一本鎖核酸をハイブリダイズしたときに、形成された上記プローブが高分子ゲルの網目構造に固定されたときに、二本鎖が架橋を形成するようになっていれば、どの位置であってもよい。
【００９１】
上記反応性官能基を導入する方法も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。例えば、アクリロイル基を導入する場合の一例として、末端がアミノ化された一本鎖核酸をＮ−スクシンイミジルアクリレートと反応させる方法を挙げることができる。
【００９２】
また、上記二本鎖形成工程は、前記導入工程で得られたそれぞれの一本鎖核酸の溶液を、例えば、二本鎖核酸が解離する温度より低い温度で混合することにより行うことができる。
【００９３】
上記重合工程では、得られた上記プローブをモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて核酸応答性ゲルを得る。かかるモノマーについては、上記（Ｉ）で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。また、ここで用いられる架橋剤についても上記（Ｉ）で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。なお、重合工程は架橋剤の存在下で行うことが好ましいが、架橋剤の不存在下で行ってもよい。かかる場合は、上記プローブのみによって架橋された核酸応答性ゲルを得ることができる。
【００９４】
さらに、重合工程では、上記プローブを、上記モノマーおよび必要に応じて上記架橋剤に加えて、さらに他のモノマーと共重合させてもよい。かかる他のモノマーとしては、得られる核酸応答性ゲルの性能に悪影響を与えるものでなければ特に限定されるものではない。
【００９５】
ここで、重合方法としては、特に限定されるものではなく、ラジカル重合、イオン重合、重縮合、開環重合等を好適に用いることができる。また、重合に用いられる溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、メタノール、エタノール等を好適に用いることができる。
【００９６】
また、重合開始剤としても、特に限定されるものではなく、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩；過酸化水素；ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド等のパーオキシド類、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等を好適に使用することができる。これらの重合開始剤の中でも、特に、過硫酸塩やパーオキシド類等のような酸化性を示す開始剤は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン等とのレドックス開始剤としても用いることができる。
【００９７】
また、重合温度は特に限定されるものではないが、プローブとして導入する二本鎖核酸が解離しない温度であることが好ましい。重合温度がかかる範囲であることにより、安定な二本鎖状態で核酸をゲル網目に結合することができるため好ましい。また、重合時間も、特に限定されるものではないが、通常４時間〜４８時間である。
【００９８】
重合の際の、モノマー、架橋剤等の濃度は、高分子ゲルが得られる濃度であれば特に限定されるものではない。また、上記重合開始剤の濃度も特に限定されるものではなく適宜選択すればよい。
【００９９】
本発明にかかる核酸応答性ゲルは、上記重合工程で得られた反応混合物から、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去することにより得られる。なお、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、中性付近の緩衝液中で得られた核酸応答性ゲルを洗浄する方法を挙げることができる。なお、本発明にかかる核酸応答性ゲルは、ヒドロゲルまたはオルガノゲルであることが好ましいが、乾燥状態としたものであってもよい。乾燥状態とした本発明の核酸応答性ゲルは、例えば、洗浄後の核酸応答性ゲルを凍結乾燥することにより得ることができる。
【０１００】
本発明にかかる核酸応答性ゲルの他の製造方法としては、例えば、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、得られたプローブを高分子化合物と結合させるプローブ結合工程と、上記プローブ結合工程によりプローブが結合された高分子化合物を、架橋剤と反応させて網目構造を形成する架橋工程とを含む方法を挙げることができる。
【０１０１】
また、かかる製造方法も、さらに、上述した、蛍光ドナー分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子および反応性官能基が導入された一本鎖核酸とを製造する工程を含んでいてもよい。
【０１０２】
上記プローブ結合工程では、上記二本鎖形成工程で得られたプローブを高分子化合物と結合させる。ここで、プローブを結合させる高分子化合物は、架橋することによって高分子ゲルが得られるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、上記（Ｉ）で述べた高分子化合物を好適に用いることができる。なお、かかる高分子化合物は、網目構造を有している必要はなく、直鎖状、枝分かれ状等であればよいが、上記プローブを結合させることができるかぎりにおいて網目構造を有しているものであってもよい。また、上記プローブを上記高分子化合物と結合させる方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
【０１０３】
上記架橋工程では、プローブが結合された高分子化合物を、架橋剤と反応させて網目構造を形成する。ここで、架橋剤としては、上記（Ｉ）で説明した架橋剤を好適に用いることができる。また、架橋反応の条件も、高分子化合物や架橋剤の種類等に応じて適宜選択すればよい。
【０１０４】
本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法としては、上述したような方法を好適に用いることができる。したがって、本発明にかかる核酸応答性ゲルには、（ａ）上記モノマーと、反応性官能基が導入された２本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてなるプローブとを、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させることにより得られる核酸応答性ゲル、および、（ｂ）上記高分子化合物に、反応性官能基が導入された２本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてなるプローブとを結合させた後、架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られる核酸応答性ゲルも含まれる。なお、（ａ）の上記モノマーは、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含むモノマーであることがより好ましい。また、（ｂ）の上記高分子化合物は、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の高分子化合物であることがより好ましい。
【０１０５】
本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法としては、上述したような方法を好適に用いることができるが、さらに、例えば、先にモノマーを重合して高分子ゲルを合成した後ハイブリダイズした２本の一本鎖核酸を高分子ゲルの網目構造に結合させる方法等であってもよい。
【０１０６】
さらに、本発明に係る核酸応答性ゲルの製造方法は、上記プローブを設計する工程を含んでいてもよい。かかる工程では、検出することを目的とする核酸に基づいてプローブを形成する２本の一本鎖核酸を決めればよい。例えば、一塩基多型を検出したいときは、その塩基配列と完全相補な一本鎖核酸と、当該一本鎖核酸とハイブリダイズするが１塩基以上のミスマッチを有する一本鎖核酸を用いて上記プローブを形成すればよい。
【０１０７】
（ＩＩＩ）核酸応答性ゲルの利用
（ＩＩＩ−１）核酸応答性ゲルを用いた核酸の検出方法
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、高分子ゲルの網目構造内に固定されている２本の一本鎖核酸の一方に対して、ハイブリダイズし核酸の鎖交換を起こす標的核酸が存在すると、核酸応答性ゲルは膨潤するとともに蛍光強度が増加する。それゆえ、本発明に係る核酸応答性ゲルは、標的核酸の検出に利用することができる。したがって、本発明に係る核酸応答性ゲルを用いた核酸の検出方法も本発明に含まれる。なお、標的核酸は２本の一本鎖核酸の一方に対して完全相補となる場合、他の一本鎖核酸より相同性が高い場合のように、より安定な二本鎖を形成する場合に限られず、同等に安定な二本鎖を形成する場合にも体積変化は起こるので、検出することを目的とする核酸に応じて、プローブを設計すればよい。なお、本明細書において、標的核酸とは、本発明の核酸応答性ゲルが応答して体積変化を起こす核酸をいう。
【０１０８】
本発明に係る核酸の検出方法は、本発明に係る核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程と、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの蛍光強度の変化および／または体積変化で検出する工程とを含んでいればよい。
【０１０９】
上記検体に含まれる核酸および標的核酸は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＰＮＡであってもよい。また、これらの核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。上記核酸を含有する検体は、本発明の核酸応答性ゲルを用いた標的核酸の検出が可能であれば、核酸の水や緩衝液等の溶液に限定されるものではない。かかる検体としては、血液やその他の遺伝子を含む体液等を挙げることができる。
【０１１０】
また、本発明に係る核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程において、当該接触を行うときの温度としては、特に限定されるものではなく、目的の検出精度に応じて調整した温度で当該接触を行えばよい。
【０１１１】
なお、本明細書において「検出精度」とは、検出感度、及び、検出される核酸の塩基配列の選択性を意図する。
【０１１２】
つまり、上記核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程を行う温度を調整することによって、検出感度及び／又は検出される核酸の塩基配列の選択性を制御することができる。
【０１１３】
これは、本発明に係る核酸応答性ゲルを標的核酸に接触させたときの膨潤率や、上記プローブによって形成されている水素結合及び標的核酸と上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸のうち１本の一本鎖核酸との水素結合のバランスが、温度による影響を受けることを利用したものである。
【０１１４】
すなわち、上記核酸応答性ゲルと検体とを接触させるときの温度は、上記プローブを形成する２本の一本鎖核酸、即ち、架橋点として導入した一本鎖核酸同士が形成している水素結合の安定性（融点）と、標的核酸及び当該一本鎖核酸によって形成される水素結合の安定性（融点）とのバランスに密接に関係しており、また、膨潤率変化にも密接に関係している。
【０１１５】
設定する温度の範囲は特に限定されるものではないが、０℃以上６０℃以下であれば、本発明に係る核酸応答性ゲルは標的核酸と接触したとき好適に膨潤することができる。
【０１１６】
標的核酸による鎖交換の有無は、蛍光ドナー分子を励起させる波長の光を照射して発する蛍光の強度変化を測定器により、または、視覚的に観察することによって検出することができる。かかる場合標的核酸による鎖交換により蛍光ドナー分子に由来する蛍光強度は増加する。なお、波長は、用いる蛍光ドナー分子に応じて適宜選択すればよい。
【０１１７】
また、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの体積変化で検出する方法としては、従来公知の刺激応答性ゲルの体積変化を検出する方法を用いればよく、特に限定されるものではない。かかる方法としては、例えば、体積変化を顕微鏡で観察する方法を挙げることができる。
【０１１８】
（ＩＩＩ−２）核酸検出キット
核酸応答性ゲルの利用に関する本発明には、上述した核酸の検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための核酸検出キットが含まれる。本発明の核酸検出キットは、具体的には、少なくとも本発明の核酸応答性ゲルを含む構成であればよい。
【０１１９】
また、上記検出キットには、さらに、コントロールとなる比較用の標本（核酸等）類や、各種バッファー等が含まれていてもよい。
【０１２０】
上記核酸検出キットを用いることで、本発明にかかる核酸の検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１２１】
また、本発明を用いれば、標的核酸を高感度でかつ簡便に検出または同定することができる。そのため、本発明は、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断、あるいは科学技術研究におけるDNA配列分析等に応用することも可能である。
【０１２２】
（ＩＩＩ−３）核酸検出装置
本発明にかかる核酸応答性ゲルを、蛍光強度の変化を検知可能なセンサー、及び／又は、ゲルの膨潤に伴う体積変化を検知可能なセンサーに固定化した場合、このセンサーを利用して、簡便かつ確実に標的核酸を検出することができる核酸検出装置を製造することができる。
【０１２３】
例えば、標的核酸の検出を、体積変化と蛍光強度変化とを両方測定して、より厳密な検出を行うことを目的とする場合には、本発明にかかる核酸応答性ゲルを、蛍光強度の変化を検知可能な測定装置、及び、ゲルの膨潤に伴う体積変化を検知可能な測定装置に固定化すればよい。これにより厳密に核酸を検出することができる。
【０１２４】
また、例えば、標的核酸の検出は、蛍光強度の変化を視覚的に観察することにより行い、本発明にかかる核酸応答性ゲルを、ゲルの膨潤に伴う体積変化を検知可能な測定装置に固定化して体積変化をセンサーや測定装置で検知してもよい。
【０１２５】
または、例えば、本発明にかかる核酸応答性ゲルを蛍光強度の変化を検知可能な測定装置に固定化するか、或いは、蛍光強度の変化を視覚的に観察することにより行うとともに、体積変化を利用して、診断と制御を同時に行なうことも可能である。
【０１２６】
上記核酸検出装置としては、より具体的には、例えば、本発明にかかる核酸応答性ゲルを、微細なセンサーチップ表面に固定化した核酸検出装置であって、上記センサーチップが、所定の波長の光を照射したときの蛍光強度の変化を測定して表示する測定装置、及び／又は、核酸応答性ゲルの膨潤による体積変化を測定して表示する測定装置と連結されているものを挙げることができる。かかる核酸検出装置を用いることにより、標的核酸を含有する検体を検出用チップの表面に接触させるだけで、標的核酸の有無を特異的に検出することが可能となる。
【０１２７】
上記センサーチップが連結されている測定装置としては特に限定されるものではなく、従来公知の装置を好適に用いることができる。かかる装置としては、例えば、蛍光強度を測定するための、蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡観察等を挙げることができる。
【０１２８】
また上記装置としては、例えば、体積変化を測定するための膜厚測定装置を挙げることができる。この場合には、検体中の標的核酸に応答した核酸応答性ゲルの体積変化を膜厚変化として検知することにより、標的核酸を検出することができる。
【０１２９】
また、上記測定装置は重量計であってもよい。この場合、標的核酸を含有する検体を検出用チップの表面に接触させると、核酸応答性ゲル内に標的核酸が取り込まれるために核酸応答性ゲルの重量が増加する一方で核酸応答性ゲルは膨潤する。そして核酸応答性ゲルの膨潤による体積変化は、取り込んだ標的核酸の量および標的核酸の取り込みに伴う核酸応答性ゲルの重量に依存する。したがって、標的核酸の取り込みによる核酸応答性ゲルの重量変化を測定することにより、標的核酸を検出することができる。
【実施例】
【０１３０】
〔実施例１：核酸応答性ゲルの製造〕
＜蛍光ドナー分子またはアクセプター分子と反応性官能基とが導入されたオリゴＤＮＡの合成＞
図２の反応式に示すように、蛍光ドナー分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）と、アクセプター分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）とに、それぞれアクリロイル基を導入した。
【０１３１】
蛍光ドナー分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）として、図４の（ａ）に示すＦＩＴＣ−ｄＴが、５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（3’-CCGGTCGCG-5’-(CH２)６NH２）の９ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡの中央に位置するＴの位置に導入されているもの（つくばオリゴサービス（株）社製）を用いた。
【０１３２】
また、アクセプター分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）として、図４の（ｂ）に示すＢＨＱ１−ｄＴが、５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（3’-CGCGTCCGG-5’-(CH２)６NH２）の９ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡの中央に位置するＴに導入されているもの（つくばオリゴサービス（株）社製）を用いた。
【０１３３】
まず、蛍光ドナー分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）１．０７ｍｇ（０．３５μｍｏｌ）を５００μｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。この溶液に、５０μlジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮ−スクシンイミジルアクリレート（N-succinimidyl acrylate （ＮＳＡ））５ｍｇ（３０μｍｏｌ）と１０μｌ ＤＭＦに溶解したヒドロキノン１．５ｍｇ（１４μｍｏｌ）とを加え、さらに純水４００ｍｌを加えて室温で１２時間撹拌した。得られた反応液をゲルろ過クロマトグラフィー(Sephadex G-25)により分画し、未反応ＮＳＡとＦＩＴＣ−ＤＮＡとを分離した。さらに得られたＦＩＴＣ−ＤＮＡフラクションを濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（Wakosil-DNA）により分取することによってアクリロイル基導入ＦＩＴＣ−ＤＮＡと未反応ＦＩＴＣ−ＤＮＡとを分離した。得られたアクリロイル基導入ＦＩＴＣ−ＤＮＡフラクションを濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィー(Sephadex G-25)により純水置換し、濃縮後凍結乾燥してアクリロイル基導入ＦＩＴＣ−ＤＮＡ（acryloyl ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）を得た。
【０１３４】
アクセプター分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）についても、同様にしてアクリロイル基を導入して、アクリロイル基導入ＢＨＱ1−ＤＮＡ（acryloylＢＨＱ1−ＤＮＡ）を得た。
【０１３５】
＜核酸応答性ゲルの製造＞
続いて、図３の反応式に示すように、ハイブリダイズしている２本の上記一本鎖アクリロイル基導入オリゴＤＮＡからなるプローブが高分子ゲルの網目構造に固定されている核酸応答性ゲルを製造した。なお、２本の一本鎖アクリロイル基導入オリゴＤＮＡは、ハイブリダイズしているが真ん中の「Ｔ−Ｔ」がミスマッチとなっている。
【０１３６】
１０ｍＭ Tris-１５０ｍＭ ＨＣｌ緩衝液（Tris緩衝液）(ｐＨ７．４)に、合成した２種類のアクリロイル基導入ＤＮＡ、すなわち、アクリロイル基導入ＦＩＴＣ−ＤＮＡとアクリロイル基導入ＢＨＱ1−ＤＮＡとの各０．１μｍｏｌを５℃で溶解して二本鎖を形成させた。その後、この溶液に、アクリルアミド（ＡＡｍ）１５ｍｇ（２１１μｍｏｌ）、５ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ’-メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ） ３μｌ、並びにレドックス開始剤として０．１Ｍ過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）２μｌおよび０．８Ｍ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）２μlを加えて内径１ｍｍのガラス管に流し込み、５℃で２４時間重合することにより核酸応答性ゲルを合成した。その後、得られた核酸応答性ゲルをガラス管から取り出し、Tris緩衝液中に浸漬して十分に洗浄することで、未反応モノマー等を除去した。洗浄後の核酸応答性ゲルをカッターナイフで約２ｍｍ程度の長さに切り出すことによって円柱状の核酸応答性ゲルを得た。
【０１３７】
得られた本発明に係る核酸応答性ゲルを位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて観察した。得られた核酸応答性ゲルは、ＢＨＱ１に基づく赤色を呈しており、さらに４９０ｎｍの光を照射すると、ＦＩＴＣに基づく蛍光を発光することがわかった。このＦＩＴＣに基づく蛍光は、ＦＲＥＴにより蛍光ドナー分子の発光が消光されている状態で発光されている蛍光である。
【０１３８】
〔実施例２：核酸応答性ゲルの膨潤率測定〕
実施例１で製造した核酸応答性ゲルをTris緩衝液中で十分に平衡膨潤させた後、１５℃で、核酸応答性ゲルに結合されているオリゴＤＮＡの一方の一本鎖ＤＮＡに完全相補であるＤＮＡ、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ、及び、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡをそれぞれ溶解した３種類の溶液に浸漬し、核酸応答性ゲルの膨潤率を測定した。なお、各ＤＮＡ溶液は、Tris緩衝液にＤＮＡを０．２ｍＭとなるように溶解して調製した。円柱状である核酸応答性ゲルの直径変化を光学顕微鏡（オリンパス（株）製：BX51）を用いて測定し、膨潤変化を次式に示す膨潤率によって評価した。
膨潤率（Swelling ratio）＝（ｄ／ｄ０）３    ・・・      （１）
ここで、ｄ０はＤＮＡ溶液に浸漬する前のTris緩衝液中での核酸応答性ゲル（以下、「Tris緩衝液中での核酸応答性ゲル」と称する。）の円柱の直径（ｃｍ）、ｄはＤＮＡ溶液に浸漬した後のＤＮＡ溶液中での核酸応答性ゲル（以下、「ＤＮＡ溶液中での核酸応答性ゲル」と称する。）の円柱の直径（ｃｍ）である。なお、対照として、アクリロイル基導入オリゴＤＮＡを結合しない以外は実施例１と同様にして合成したポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルを用いて同様の測定を行った。また、円柱の直径は、円柱状の核酸応答性ゲルの側面の幅を光学顕微鏡で測定することにより得られた値である。
【０１３９】
図５に、この測定結果を示す。図５中、グラフの縦軸は膨潤率、横軸は浸漬時間（単位：時間）を示し、白丸は完全相補であるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGC-5’、図５中Fullmatch DNAと表示）を用いた結果を、白四角は５’側末端で一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ（3’-TGCCAGCGC-5’、図５中5’mismatchと表示）を用いた結果を、黒丸は３’側末端で一塩基ミスマッチであるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGT-5’、図５中3’mismatchと表示）を用いた結果を示す。図５に示すように、本発明の核酸応答性ゲルは、完全相補であるＤＮＡの存在下で最も大きく膨潤し、一塩基ミスマッチＤＮＡの存在下では僅かしか膨潤しなかった。すなわち、本発明の核酸応答性ゲルは、様々な一塩基多型（ＳＮＰ）を認識して異なる膨潤挙動を示した。この結果より、本発明で合成した核酸応答性ゲルは、一塩基の違いにより生じるゲルの体積変化を観察するだけで標的ＤＮＡを識別できることが示された。
【０１４０】
また、本実施例より、本発明の核酸応答性ゲルは、膨潤率測定によっては、完全相補であるＤＮＡと、一塩基ミスマッチＤＮＡとを区別して検知することができるが、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡと、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡとでは、膨潤率に殆ど差はなく、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡと、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡとを区別して検出することはできないことが判る。
【０１４１】
なお、図５には示していないが、対照としてのポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルの膨潤率はほとんど変化しなかった。
【０１４２】
〔実施例３：導入した蛍光ドナー分子の発光スペクトルおよびアクセプター分子の励起スペクトルの測定〕
実施例１で用いた、蛍光ドナー分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）を用いてＦＩＴＣの発光スペクトルを、アクセプター分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）を用いてＢＨＱ１の励起スペクトルを測定した。
【０１４３】
図６に測定結果を示す。図６中、縦軸は蛍光強度と吸収強度を、横軸は波長（単位：ｎｍ）を示す。図６に示すように、ＦＩＴＣの発光スペクトル（図６中、ＦＩＴＣ  fluorescence spectrumと表示）と、ＢＨＱ１の励起スペクトル（図６中、ＢＨＱ１  excitation spectrumと表示）とは、５００〜５５０ｎｍ付近で大きく重なっており、ＦＩＴＣとＢＨＱ１とが接近すると、それらがそれぞれ蛍光ドナーおよびアクセプターとして作用し、ＦＩＴＣからＢＨＱ１へのＦＲＥＴが起こる可能性が示唆された。
【０１４４】
〔実施例４：核酸応答性ゲルの蛍光強度変化の測定〕
実施例１で製造した核酸応答性ゲルをTris緩衝液中で十分に平衡膨潤させた後、１５℃で、核酸応答性ゲルに結合されているオリゴＤＮＡの一方の一本鎖ＤＮＡに完全相補であるＤＮＡ、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ、及び、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡを、それぞれ溶解した３種類の溶液に浸漬し、核酸応答性ゲルの蛍光強度変化を測定した。なお、各ＤＮＡ溶液は、Tris緩衝液にＤＮＡを０．２ｍＭとなるように溶解して調製した。
【０１４５】
まず、実施例１で製造した核酸応答性ゲルを３種類のＤＮＡ溶液に浸漬したときの蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所製、ＲＦ−５３００ＰＣ）を用いて測定した。
【０１４６】
図７に、実施例１で製造した核酸応答性ゲルを３種類のＤＮＡ溶液に浸漬したときの蛍光スペクトルを示す。図７中、グラフの縦軸は蛍光強度（単位：無次元）、横軸は波長（単位：ｎｍ）を示し、実線で示すスペクトルは完全相補であるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGC-5’、図７中Fullmatch DNAと表示）を用いた場合の蛍光スペクトルを、破線は５’側末端で一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ（3’-TGCCAGCGC-5’、図７中5’mismatchと表示）を用いた場合の蛍光スペクトルを、一点鎖線は３’側末端で一塩基ミスマッチであるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGT-5’、図７中3’mismatchと表示）を用いた場合の蛍光スペクトルを示す。図７に示すように、いずれの場合も５２０ｎｍ付近にＦＩＴＣに基づく蛍光発光が観察され、その強度は溶液中のＤＮＡの種類によって異なっていた。完全相補となるＤＮＡの存在下で、本発明の核酸応答性ゲルの蛍光強度は最も増加し、ＦＩＴＣからＢＨＱ１へのＦＲＥＴが、標的ＤＮＡ下でのプローブの解離により阻害されていることがわかる。
【０１４７】
そこで、さらに、３種類のＤＮＡ溶液に浸漬したときの、実施例１で製造した刺激応答性ゲルの蛍光強度の経時変化を、蛍光分光光度計（島津製作所製、ＲＦ−５３００ＰＣ））を用い、４９０ｎｍの光を照射して測定した。図８に測定結果を示す。図８中、グラフの縦軸は増加した蛍光強度（単位：無次元）、横軸は浸漬時間（単位：時間）を示し、白丸は完全相補であるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGC-5’、図８中Fullmatch DNAと表示）を用いた結果を、白四角は５’側末端で一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ（3’-TGCCAGCGC-5’、図５中5’mismatchと表示）を用いた結果を、黒丸は３’側末端で一塩基ミスマッチであるＤＮＡ（3’-GGCCAGCGT-5’、図５中3’mismatchと表示）を用いた結果を示す。図８に示すように、本発明の核酸応答性ゲルは、完全相補であるＤＮＡの存在下で蛍光強度が最も大きく増加し、一塩基ミスマッチＤＮＡの存在下では、完全相補であるＤＮＡの存在下よりも蛍光強度の増加量は小さかった。すなわち、本発明の核酸応答性ゲルは、様々な一塩基多型（ＳＮＰ）を認識して異なる蛍光強度の変化を示した。この結果より、本発明で合成した核酸応答性ゲルは、一塩基の違いにより生じるゲルの蛍光強度変化を観察するだけで標的ＤＮＡを識別できることが示された。
【０１４８】
なお、図８において、増加して一定値となった後の蛍光強度は、完全相補であるＤＮＡを用いた場合、標的核酸不存在下での蛍光強度の約１．３倍であり、５’側末端で一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡを用いた場合、標的核酸不存在下での蛍光強度の約１．２倍であった。
【０１４９】
さらに、本発明の核酸応答性ゲルは、蛍光強度変化の測定では、３’側末端で一塩基ミスマッチであるＤＮＡの存在下での蛍光強度の増加量と、５’側末端で一塩基ミスマッチであるＤＮＡの存在下での蛍光強度の増加量とに差が認められた。これにより、膨潤率測定のみでは、検知できなかった、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡと、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡとの区別が、蛍光強度変化の測定を加えることにより検出できることが判る。
【０１５０】
このように、本発明の核酸応答性ゲルを用いることにより、蛍光強度変化より簡便に核酸を検知するとともに、体積変化が同時におこるという予想された効果のみならず、膨潤率の測定では検知されない情報をさらに得ることができ、より厳密な診断が可能となるという効果を得ることができることが見出された。
【０１５１】
また、図５及び図８から、蛍光強度の変化は、膨潤率の変化に比べて速やかに起こっていることがわかる。すなわち、本発明の核酸応答性ゲルを用いることにより、従来の膨潤率変化のみによる場合と比較して、速やかに診断を行うことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明にかかる核酸応答性ゲルは、以上のように、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、２本の一本鎖核酸は、蛍光ドナー分子が導入された一本鎖核酸と、該蛍光ドナー分子との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるアクセプター分子が導入された一本鎖核酸とであるとともに、当該プローブは、２本の一本鎖核酸が可逆的に結合しているので、体積変化および蛍光強度の変化により核酸の一塩基の差を認識できる。それゆえ、従来技術のように特殊な装置や試薬を必要とせず簡単にＳＮＰを診断できる材料としての利用が期待できる。
【０１５３】
また、蛍光強度の変化により標的核酸を簡便に検知することができるだけではなく、核酸応答性ゲルは同時に膨潤・収縮することから、例えば、遺伝子診断結果に応じた、薬物放出等の制御が可能となり、診断と制御を同時に行なうことができる新規な材料として用いることが可能となる。これにより、ドラッグデリバリーシステムや、マイクロチップ内のマイクロ流路を制御するためのバルブとセンサーとしての利用も考えられ、新しい医療用センサーや医療用チップとして幅広い応用が見込まれる。
【０１５４】
それゆえ、本発明は、医薬品製造業、工業薬品製造業等の各種化学工業、さらには医療産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】核酸応答性ゲルが標的核酸を認識して膨潤するとともに蛍光強度が変化する様子を模式的に示す図である。
【図２】実施例において、蛍光ドナー分子が導入されたオリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）と、アクセプター分子が導入されたオリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）とに、それぞれアクリロイル基を導入したオリゴＤＮＡを合成する反応式を示す図である。
【図３】実施例において、核酸応答性ゲルを製造するための反応式を示す図である。
【図４】実施例において、オリゴＤＮＡに導入される蛍光ドナー分子およびアクセプター分子を示す図である。
【図５】実施例において、核酸応答性ゲルを、完全相補であるＤＮＡ、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ、及び、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡの溶液に浸漬したときの膨潤率変化を示すグラフである。
【図６】実施例において用いた、蛍光ドナー分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＦＩＴＣ−ＤＮＡ）の発光スペクトルと、アクセプター分子が導入された５’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（ＢＨＱ1−ＤＮＡ）の励起スペクトルを示す図である。
【図７】実施例において、核酸応答性ゲルを、完全相補であるＤＮＡ、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ、及び、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡの溶液に浸漬したときの蛍光スペクトルを示す図である。
【図８】実施例において、核酸応答性ゲルを、完全相補であるＤＮＡ、５´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡ、及び、３´部位が一塩基ミスマッチとなっているＤＮＡの溶液に浸漬したときの蛍光強度の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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