(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾチームの機能を賦活・回復する方法であって、
１）変性リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ４＋若しくはＮａ＋フォームにしたゼオライトを使用し、上記酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いて、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いて少なくても１０時間を上回る時間インキュベーションすることによりリゾチームのリフォールディングを行い活性リゾチームを回収することでリゾチームの機能を賦活・回復させること、を特徴とするリゾチームの機能賦活・回復方法。
【請求項２】
０．５Ｍ以上で２Ｍ以下の濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、請求項１に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
【請求項３】
リゾチームが、不活性乃至低活性のリゾチームである、請求項１又は２に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のリゾチームの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性リゾチームに適用して機能を賦活・回復させた活性リゾチームを回収することを特徴とする活性リゾチームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なリゾチーム、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活したリゾチームをβ型ゼオライト（ゼオライトベータと記載することがある。）及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせ、該リゾチーム固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性リゾチームの機能賦活・回復方法、及び該方法を利用した活性リゾチームの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。
【０００４】
これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。
【０００５】
ところが、ヒトなど高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。
【０００６】
当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。
【０００７】
従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されている。しかし、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多い。現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００８】
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを、界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例：Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＦｏｌｄＩｔキット）である。
【０００９】
一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを、単に希釈して行くことで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ  Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。
【００１０】
透析と希釈の両方に対し、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｎｄ  ｋａｉｎａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  Ｂ等の、極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められているに過ぎず（非特許文献２参照）、この方法は、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。
【００１１】
リフォールディングに、吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは、必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。
【００１２】
構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それが、ある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。
【００１３】
また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ  、ＤｓｂＡ（大腸菌のｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰＰＩ  （ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  Ｃｎ５を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こることも報告されている（非特許文献５参照）。しかしながら、これについては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  Ｃｎ５等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑で、コスト高となるという問題もある。
【００１４】
カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。該方法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑で、コスト高となることは、前記方法と同じである。
【００１５】
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程で、タンパク質が巻き戻るとの報告もある（非特許文献７〜９参照）。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  Ｂなどで成功しているに過ぎない。しかも、この方法は、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
【００１６】
一方、本発明者らは、これまで、ＺＳＭゼオライトやゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、１１、特許文献１、２参照）等のゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象（非特許文献１２参照）について、研究を続けてきた過程で、ゼオライトベータを用いたタンパク質巻き戻し材料を開発することに成功した（特許文献３）。
【００１７】
前述のように、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現系は、コスト、スケールアップの容易さ等から、医学的、産業的に有用なタンパク質を大量に生産する技術として最も注目される重要技術となっている。しかしながら、外来タンパク質を大量に発現させると、しばしば異常な立体構造を持ち、活性のないタンパク質が封入体として菌体内に蓄積する現象が観察される。そこで、該封入体から正しい立体構造及び活性を持ったタンパク質を得るためのリフォールディング技術の発展が望まれている。
【００１８】
リフォールディングを行う際には、バッファーｐＨ、温度、添加剤の種類等、タンパク質ごとに条件検討を行う必要がある。また、分泌タンパク質等には、立体構造の安定化にシステイン残基間のＳ−Ｓ結合を必要とするものがあり、その場合、リフォールディングによる正しい立体構造の形成に加え、適切なＳ−Ｓ結合の形成が必要となる。
【００１９】
本発明者らは、これまで、ゼオライトベータを用いて、タンパク質のリフォールディングを効率よく行わせることに成功し、更に、ゼオライトを用いたタンパク質のリフォールディングにおける汎用性の検討の一環として、各種不活性タンパク質の機能賦活・回復化を種々試みてきた。しかし、リフォールディング技術は適用可能なタンパク質が特定のものに限られており、リフォールディング技術が有効か否かは適用対象のタンパク質との関係で好適な条件が設定し得るか否かにかかっている。ゼオライトベータによるリフォールディング技術を含めて、リゾチームについては、従来法では高効率のリフォールディング手法が確立されておらず、当技術分野では、分子内にＳ−Ｓ結合を４個持つ卵白リゾチームのリフォールディングを可能とする新しいリフォールディング手法の開発が強く要請されていた。
【００２０】
【特許文献１】特開平６−１２７９３７号公報
【特許文献２】特開平８−３１９１１２号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／００５４５９  Ａ１
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２１０（１９９３）１７９−１８７
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８（１９９９）：１４７５−１４８３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１
【非特許文献４】Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７）  ３５７６−３５７８
【非特許文献５】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１７（１９９９）１８７−１９１
【非特許文献６】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ  Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７
【非特許文献７】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７
【非特許文献９】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５
【非特許文献１０】Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）８４２−８４５
【非特許文献１１】Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，Ｖｏｌ．８（１９９６）５１７−５２０
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７（２００１）１５５５−１５６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法として有用な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを用いた新しい不活性リゾチームの機能賦活・回復方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法及び該方法を用いた活性リゾチームの製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）リゾチームの機能を賦活・回復する方法であって、
１）変性リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ４＋若しくはＮａ＋フォームにしたゼオライトを使用し、上記酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いて、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いて少なくても１０時間を上回る時間インキュベーションすることによりリゾチームのリフォールディングを行い活性リゾチームを回収することでリゾチームの機能を賦活・回復させること、を特徴とするリゾチームの機能賦活・回復方法。
（２）０．５Ｍ以上で２Ｍ以下の濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
（３）リゾチームが、不活性乃至低活性のリゾチームである、前記（１）又は（２）に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載のリゾチームの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性リゾチームに適用して機能を賦活・回復させた活性リゾチームを回収することを特徴とする活性リゾチームの製造方法。
【００２３】
本発明は、リゾチームの機能を賦活・回復する方法であって、リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いること、β型ゼオライトが、Ｎａ＋フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。
【００２４】
また、本発明では、所定濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）の入ったリフォールディングバッファーを用いること、アルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いること、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記のリゾチームの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性リゾチームに適用して機能を賦活・回復させた活性リゾチームを回収することからなる活性リゾチームの製造方法の点に特徴を有するものである。
【００２５】
本発明では、機能賦活の対象として、例えば、不活性乃至低活性のリゾチーム、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したリゾチームが用いられる。本発明では、これらのリゾチームをゼオライトベータ（β型ゼオライト）で処理して該リゾチームの立体構造をリフォールディングすることにより、該リゾチーム固有の本来機能の賦活・回復を行う。
【００２６】
賦活操作は、通常、該リゾチームを、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該リゾチームをゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。
【００２７】
本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び、例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。
【００２８】
ゼオライトベータに吸着前のリゾチームの分散溶媒としては、好適には、例えば、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該リゾチームと反応を起こさないもの、及び、該リゾチームの立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールを挙げることができる。
【００２９】
該リゾチームの吸脱着は、一般には、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、で行われる。
【００３０】
この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００やＦｉｃｏｌ１４００等を挙げることができる。
【００３１】
また、該リゾチームの脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には該リゾチームの脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該リゾチームの脱着を促す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤やハロゲン化アルカリ等の塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィーでの溶離に用いられるもの等、種々のものが使用可能である。
【００３２】
以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２．参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータが挙げられる。
【００３３】
該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該ゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。
【００３４】
該ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性リゾチームの活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。
【００３５】
該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性リゾチームのリフォールディング剤となり得ることは同様である。
【００３６】
本発明では、リフォールディング剤は、ＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータ単味、又はゼオライトベータとそれを支持する基材（支持体）とから構成することができる。前者は、支持体無しで、後者は、支持体付きである。一般的に言って、ゼオライトという物質は、自己焼結性が乏しいため、単味単独では成形しにくいことが多いので、リフォールディング剤の作製、すなわち形態・形状の設計・制御に関しては、前者に比べ後者が、予め形が整えられた支持体上にゼオライトベータを固定・被覆すること等が可能なため、自由度が高く、有利である。
【００３７】
該ゼオライトベータの形態・形状につては、例えば、チップ状、膜状、ペレット状、ビーズ状等、該ゼオライトベータの利用方法・使用形態に応じて、適宜選定される。特に、支持体付き該ゼオライトベータでは、ゼオライトベータの固定・被覆を種々の形状、例えば、板、球、円筒、チューブ、カラム、溝、Ｕ字路等の支持体上に、前記方法等で行うことができるので、該ゼオライトベータの形状を如何様にも所望の形にすることができるという利点がある。この場合の支持体については、ガラス、石英、アルミナ、シリカ、コージェライトやムライト等の種々のセラミックス、濾紙等のセルロース、テフロン（登録商標）、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ペット）等、種々の有機ポリマーを挙げることができる。
【００３８】
本発明において、変性還元リゾチームは、ゼオライトと混ぜると、急速に吸着される。また、６Ｍの高濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）存在下においても変性還元リゾチームは強く吸着される。また、リゾチームの活性回復に酸化還元剤の存在は必須である。酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収されるが、このことは、まず、リゾチームが凝集しない正しい立体構造を持った状態で溶出され、次に、酸化還元剤によってＳ−Ｓ結合が形成されることを示唆している。
【００３９】
また、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度の上昇とともにリゾチームの回収率が増加することから、リゾチームのリフォールディングは、ゼオライトから脱着後に起きるものと考えられる。Ｇｄｎ−ＨＣｌが２Ｍを超えると、活性回収率が急速に低下していることから、回収率と回復率のバランスを考えると、２Ｍ前後のＧｄｎ−ＨＣｌの入ったリフォールディングバッファーが好適である。
【００４０】
リゾチームの吸着量について調べたところ、リゾチームの回収率は、ゼオライトとリフォールディングバッファーの比率に比例していることが示唆された。活性回復は、低回収率のサンプルでは高く、その後、下がって一定になることから、活性回復については、溶出されたタンパク質においては一定であるものと考えられる。リフォールディング時間については、タンパク質の溶出と活性回復がパラレルでないこと、ゼオライトを除いた後にインキュベーションしても徐々に活性回復が増加することから、正しいＳ−Ｓ結合が形成されるのに時間が掛かる可能性があることが示唆される。
【００４１】
アルギニン添加により、リゾチームの回収率が増加し、また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を示す。このことから、アルギニンは、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、リゾチームの凝集防止に有効であり、Ｇｄｎ−ＨＣｌと組み合わせることにより、更に、多くのリゾチームを回収することができる。ゼオライトに飽和吸着量に近い量の変性還元リゾチームを吸着させ、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーでリフォールディングを行って、活性リゾチームの最大回収濃度について調べたところ、リフォールディングバッファー量が０．７５ｍｌの時、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性リゾチームが回収され、希釈法では０．１ｍｇ／ｍｌ程度が限界であることを考えると、本発明のリフォールディング法は、希釈法と比べて優れた方法であることが分かる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）β型ゼオライトを用いた変性リゾチームの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
（２）変性リゾチームの活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
（３）活性リゾチームの回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
（４）アルギニン及びＧｄｎ−ＨＣｌとを組み合わせて、活性リゾチームの回収率を向上させたリゾチームのリフォールディング方法を提供することができる。
（５）封入体としての活性のないリゾチームから正しい立体構造及び活性を持った活性リゾチームを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
（６）他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性リゾチームのリフォールディング技術を提供することができる。
（７）希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
本実施例では、卵白リゾチーム（ＭＷ  １４０００）を５０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌで変性還元させた後に、β型ゼオライトに吸着させた。５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＰＥＧ２００００、酸化還元剤としてシステイン及びシスチンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行わせた。遠心によりゼオライトを分離した後、上清中のリゾチーム活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００４５】
酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収された。しかしながら、酸化還元剤を含むバッファーを添加した時のみ、リゾチーム活性の回復がみられた。このことから、酸化還元剤は、リゾチームの活性回復に必須であることが分かった。次に、リフォールディングのタイムコースを調べたところ、反応開始後２時間で吸着させたリゾチームの７０％が溶出された。更に、活性回復を調べたところ、反応開始から徐々に活性回復率が増加していき、１６時間でプラトーに達した。一般的に、タンパク質のフォールディングは、非常に早い反応であるので、ゼオライトによるリゾチームのリフォールディング反応は、早い反応であるゼオライトからのリゾチームの脱離とそれに続く立体構造の回復、及び遅い反応である分子内Ｓ−Ｓ結合の構築の２つの段階からなることが示唆された。以下に、実験法方法とその結果を具体的に説明する。
【００４６】
１．実験
（１）実験材料と方法
β型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）は、Ｚｅｏｌｙｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＳＡ）より購入した。卵白リゾチーム、グアニジン塩酸塩（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、アルギニン、システイン塩酸塩一水和物、シスチンは、和光純薬工業株式会社より購入した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ乾燥菌体は、シグマアルドリッチ株式会社より購入した。その他の薬品は、特級グレードを使用した。
【００４７】
（２）ゼオライトのＮａ＋フォームへのイオン交換
β型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）を５５０℃で１２時間焼成後、５０ｇを８００ｍｌの１Ｍ  ＮａＮＯ３溶液に懸濁し、約１６時間スターラーで撹拌した。吸引ロート（桐山）でろ過後、新しい１Ｍ  ＮａＮＯ３溶液に再懸濁し、約１６時間スターラーで撹拌した。この操作を３回繰り返した。吸引ろ過したゼオライトを１Ｌの超純水で１時間撹拌後、ろ過することを４回繰り返して洗浄した後に、６０℃で一晩乾燥させた。本実施例においては、すべて、Ｎａ＋フォームにしたゼオライトを使用した。
【００４８】
（３）リゾチームの変性還元
卵白リゾチームを、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む変性バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ）約２０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、室温で１６時間インキュベーションした。０．４５μｍフィルター（ミリポア）でろ過し、タンパク質濃度を測定した後に、１ｍｌずつ１．５ｍｌチューブに分注した。液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【００４９】
（４）リゾチームの活性測定
２０μｌのリゾーチームサンプルを９６穴プレートに加え、２００μｌの基質溶液（１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ乾燥菌体）を分注した。直ちに、モデル６８０マイクロプレートリーダー（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）でＯＤ４５０の減少を３０秒ごとに２０回測定した。なお、各測定の前に５秒間撹拌を行った。活性は、測定開始から３０秒後から２５０秒後までの傾きで表し、活性回復率は、同じ濃度のネイティブなリゾチームの活性を１００％とて算出した。
【００５０】
（５）タンパク質定量
サンプルをトリクロロ酢酸で沈殿させた後に、ＳＤＳ−Ｒｅａｇｅｎｔ（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）に溶解した。このサンプル溶液をＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてマニュアルに従って測定した。なお、スタンダードとして、リゾチームを使用した。
【００５１】
（６）変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着
ゼオライト２０ｍｇを２ｍｌチューブに分注した。５００μｌの変性バッファーを加え、室温、１０分間ローテーターＲＴ−５０（タイテック）でインキュベートした。次に、５００μｌの４ｍｇ／ｍｌ変性還元リゾチームを加え、更に、室温で一定時間インキュベートした。マイクロ遠心機（ベックマン）で１４０００ｒｐｍ、室温、５分間遠心してゼオライトを沈殿させ、上清に残ったタンパク質濃度を測定した。吸着したたんぱく質量は、最初に加えた量から上清に残った量を引くことによって算出した。
【００５２】
（７）リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果
ゼオライト５０ｍｇを１０ｍｌチューブに分注した。５００μｌの変性バッファーを加え、室温、１０分間ローテーターＲＴ−５０（タイテック）でインキュベートした。次に、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌ変性還元リゾチームを加え、更に、室温で１時間インキュベートした。ＣＦ１２ＲＸ遠心機（日立）で３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心して上清を除いた後、５．５ｍｌの洗浄バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、懸濁した。
【００５３】
更に、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心して上清を除くという作業を計４回行い、ゼオライトを洗浄した。２ｍｌのリフォールディングバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％（ｗ／ｖ）ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）２００００，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  システイン，１ｍＭ  シスチン）又はシステイン及びシスチンを含まないリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を２ｍｌチューブに移した。更に、１４０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心してサンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００５４】
（８）リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果
ゼオライト５０ｍｇに１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、２ｍｌのそれぞれの濃度のＧｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００５５】
（９）リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果
ゼオライト５０ｍｇに、０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇの変性還元リゾチームを吸着させ、洗浄後に、それぞれの量の２Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００５６】
（１０）リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果
ゼオライト５０ｍｇに、１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、２ｍｌの２Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃でそれぞれの時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００５７】
（１１）リゾチームのリフォールディングのアルギニンの効果
ゼオライト５０ｍｇに、１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、１ｍｌの０Ｍ、１Ｍ、２Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ及びそれぞれの量のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
【００５８】
（１２）最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度
ゼオライト５０ｍｇに１．６ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、それぞれの量の２Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ及び０．５Ｍアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。活性リゾチームの濃度は、回収濃度に活性回復率掛けることにより算出した。
【００５９】
２．結果
（１）変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着
変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着を図１（Ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｏｎ  ｚｅｏｌｉｔｅ）に示す。図１に示すように、変性還元リゾチームは、ゼオライトと混ぜた後、急速に吸着し、２０分でグラフの傾きは緩やかになった。反応開始後１時間で３５ｍｇ／ｇゼオライトのリゾチームが吸着した。このことより、ゼオライトは、６Ｍという高濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ存在下においても、変性タンパク質を強く吸着することが示唆された。
【００６０】
（２）リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果
リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果を図２（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｄｏｘ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｏｎ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。リゾチームは、分子内にＳ−Ｓ結合を４個持つため、変性剤を抜いただけでは活性が回復せず、活性を回復するためには、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、酸化還元剤が必要であるか調べた。
【００６１】
その結果、図２に示すように、酸化還元剤を含むバッファーを添加した時のみ、リゾチーム活性の回復がみられた。このことから、酸化還元剤は、リゾチームの活性回復に必須であることが分かった。また、酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収されたが、これは、まずリゾチームが凝集しない状態、おそらく正しい立体構造を持った状態で溶出され、次に、酸化還元剤によってＳ−Ｓ結合が形成されることが示唆された。
【００６２】
（３）リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果
リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果を図３（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ，  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ（■），  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｙｉｅｌｄ（●））に示す。図３に示すように、Ｇｄｎ−ＨＣｌの入っていないリフォールディングバッファーでは、タンパク質の回収率が５％以下であった。ある種のタンパク質では、少量のＧｄｎ−ＨＣｌなどの変性剤が、ミスフォールドを抑制してリフォールディング効率を上昇させるので、ゼオライトによるリフォールディングにおいてもＧｄｎ−ＨＣｌの添加が有効であるか調べた。
【００６３】
その結果、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度の上昇と共に回収率が増加した。このことは、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度が低い条件では、ゼオライトから脱着したリゾチームは、ミスフォールドして凝集していることを示している。つまり、リゾチームのリフォールディングは、ゼオライトから脱着後に起きると考えられた。また、Ｇｄｎ−ＨＣｌが２Ｍを超えると、活性回復率が急速に低下していった。これらのことから、回収率と活性回復率のバランスを考えると、約２ＭのＧｄｎ−ＨＣｌの入ったリフォールディングバッファーが好適であると判断される。
【００６４】
（４）リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果
リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果を図４（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｙｉｅｌｄ（Ａ）  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｂ）  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。図４Ａに示すように、すべてのタンパク質吸着量について、リフォールディングバッファー量が２ｍｌで回収率がプラトーに達した。また、吸着量が１ｍｇ及び２ｍｇで、は回収率が同じであった。この結果より、タンパク質の回収率は、ゼオライトとリフォールディングバッファーの比率に比例していることが示唆された。
【００６５】
リフォールディングバッファー中の成分のうち、ポリエチレングリコールは、ゼオライトに吸着するので（図示せず）、おそらくポリエチレングリコール量とゼオライトの表面積の比が、回収率を決定するものと考えられる。活性回復は、図４Ｂに示すように、低回収率のサンプルでは高く、その後、下がって一定になった。ただし、タンパク質濃度が低い時は、見かけ上活性が高く出る傾向があることを考慮すると、活性回復については、溶出されたタンパク質においては、一定であると考えられた。
【００６６】
（５）リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果
リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果を図５（Ｔｉｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ（■），ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｙｉｅｌｄ（●））に示す。リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果を調べたところ、図５に示したように、リゾチームは、リフォールディングバッファー添加後、直ちにゼオライトから脱着され、反応開始後２時間で吸着させたリゾチームの７０％が溶出された。しかしながら、活性回復は、反応開始から徐々に増加していき、１６時間でプラトーに達した。このことから、リゾチームでは、リフォールディングが完了し、活性のあるタンパク質が形成されるのに１６時間必要であることが分かった。
【００６７】
タンパク質の溶出と活性回復がパラレルでない理由としては、ゼオライを除いた後にインキュベーションしても、徐々に活性回復が増加することから（図示せず）、正しいＳ−Ｓ結合が形成されるのに時間が掛かる可能性が示唆された。また、４時間後から１０時間後の間に、一旦、活性回復率が緩やかになり、その後上昇したが、この現象は、リゾチームに特有であるのか、又はゼオライトによるリフォールディングでは共通の現象であるかは定かでない。
【００６８】
（６）リゾチームのリフォールディングにおけるアルギニンの効果
リゾチームのリフォールディングにおけるアルギニンの効果を図６（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｙｉｅｌｄ（Ａ）  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｂ）  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。アルギニンは、タンパク質の凝集を抑制させる作用を持ち、また、側鎖にグアニジル基を持つので、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を持つことが予測される。そこで、ゼオライトによるリフォールディングにおけるアルギニンの効果及びＧｄｎ−ＨＣｌの影響について調べた。なお、図４の結果より、回収率が低かったリフォールディングバッファー量が１ｍｌの条件で実験を行った。
【００６９】
図６Ａに示すように、アルギニン添加により、リゾチームの回収率が増加した。また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を示した。活性回復については、図６Ｂに示すように、タンパク質が回収される限りは、アルギニン濃度によらず、ほぼ一定であり、Ｇｄｎ−ＨＣｌと違い、リゾチームの活性を阻害しなかった。これらのことより、アルギニンは、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、タンパク質の凝集防止に有効であり、また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと組み合わせることにより、更に、多くのタンパク質が回収できることが示された。
【００７０】
（７）最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度
最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度を図７（Ａｃｔｉｖｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｙｉｅｌｄ  ｂｙ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に示す。産業スケールでは、コストや設備の問題から、どれだけタンパク質濃度を濃くできるかが重要になってくる。そこで、ゼオライトに飽和吸着量に近い量の変性還元リゾチームを吸着させ、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーでリフォールディングを行わせた時の、活性リゾチームの最大回収濃度について調べた。
【００７１】
その結果、図７に示したように、リフォールディングバッファー量が０．７５ｍｌの時、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性リゾチームが回収された。一般的に、希釈法では０．１ｍｇ／ｍｌ程度が限界であるので、ゼオライトによるリフォールディング法は、希釈法と比べて、優れた方法であると考えられる。
【００７２】
以上の結果より、リゾチームにおいては、Ｎａ＋フォームのβ−型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）１ｇあたり最大約３５ｍｇ吸着し、５０ｍｇのゼオライトに１．６ｍｇの変性還元リゾチームを吸着させた場合、２Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ及び０．５Ｍアルギニンを含むリフォールディングバッファー０．７５ｍｌで、４℃、１６時間リフォールディングを行わせることによって、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性タンパク質が回収された。また、ゼオライトによるリフォールディング法は、酸化還元剤が存在するバッファーでも適応可能であり、汎用性があることが示された。また、ゼオライトによるリフォールディング法により、比較的高濃度の活性タンパク質が回収できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上詳述したように、本発明は、リゾチームの機能賦活・回復方法に係るものであり、本発明により、β型ゼオライトを用いた変性リゾチームの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。本発明により、封入体としての活性のないリゾチームから正しい立体構造及び活性を持った活性リゾチームを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性リゾチームのリフォールディング技術を提供することを可能にするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着を示す。
【図２】リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果を示す。
【図３】リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果を示す。
【図４】リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果を示す。
【図５】リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果を示す。
【図６】リゾチームのリフォールディングのアルギニンの効果を示す。
【図７】活性リゾチームの最大回収濃度を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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