(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化インターフェロン−βのインビトロにおける抗増殖力価を増加させるための方法であって、一種以上の合成ポリアルキレングリコールを界面活性剤の存在下で該インターフェロン−βのアミノ末端アミノ酸に選択的に結合させて修飾されたインターフェロン−βを得る工程を包含し、ここで、該アミノ末端アミノ酸が、該インターフェロン−βのレセプター結合ドメインから離れて位置し、前記修飾されたインターフェロン−βの前記インビトロにおける抗増殖力価が、Ｄａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞アッセイで測定した場合、前記結合前のインターフェロン−βに比較して２．５〜５倍、約６倍、又は６〜１０倍高いことを特徴とし、
前記結合が、（ａ）（ｉ）前記インターフェロン−βと前記一種以上のポリアルキレングリコールのアルデヒド誘導体を、シッフ塩基を形成するように混合する工程、及び（ｉｉ）中程度の還元剤を用いて、二級アミン結合が形成される条件で、前記シッフ塩基を還元的にアルキル化する工程、又は（ｂ）前記インターフェロン−βのＮ末端のセリンまたはトレオニン残基を、過ヨウ素酸を用いて、該インターフェロン−βの少なくとも１つの不可欠なメチオニン残基の酸化が最小限に抑えられる条件で、アルデヒドへと酸化的に切断する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記インターフェロン−βが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、前記アミノ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールの前記αアミノ基への共有結合が、第２級アミン連結を介する、方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、前記アミノ末端アミノ酸の化学的に反応性のある側鎖基に結合される、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記反応性のある側鎖が、インターフェロン−βのアミノ末端セリン残基またはアミノ末端トレオニン残基の選択的酸化的切断によって導入されるアルデヒド基である、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、ポリ（エチレングリコール）、モノメトキシポリ（エチレングリコール）およびモノヒドロキシ−ポリ（エチレングリコール）からなる群より選択される、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノメトキシポリ（エチレングリコール）である、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、モノヒドロキシポリ（エチレングリコール）である、方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、１ｋＤａと１００ｋＤａとの間（その両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、８ｋＤａと１４ｋＤａとの間（その両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、１０ｋＤａと３０ｋＤａとの間（その両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、１８ｋＤａと２２ｋＤａとの間（その両端を含む）の分子量を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、２０ｋＤａの平均分子量を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリアルキレングリコールが、３０ｋＤａの平均分子量を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法によって作製された一種以上の結合体と、一種以上の薬学的に許容可能な賦形剤またはキャリアと、を含むインターフェロン−β応答性の身体的障害を予防、診断、又は処置するための薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法によって作製された一種以上の結合体を含む、インターフェロン−β応答性の身体的障害を予防、診断、又は処置するためのキット。
【請求項１９】
請求項１７に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項２０】
インターフェロン−β応答性の身体的障害に罹患しているかまたは該身体的障害の素因がある動物において、該身体的障害を予防するか、診断するか、または処置するための薬学的組成物の製造のための、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法によって作製された結合体の使用。
【請求項２１】
インターフェロン−β応答性身体障害に罹患しているかまたは罹患する素因のある動物（但し、ヒトを除く）において、該身体障害を予防、診断、または処置するための請求項１７に記載の薬学的組成物の有効量の使用。
【請求項２２】
前記動物が、哺乳動物である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記動物が、哺乳動物（但し、ヒトを除く）である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記インターフェロン−β応答性身体障害が、癌、感染性疾患、神経変性障害、自己免疫障害、および遺伝的障害からなる群より選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、消化管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨の癌、神経の癌、頭頸部の癌、皮膚癌、癌腫、肉腫、腺腫、および骨髄腫からなる群より選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記インターフェロン−β応答性感染性疾患が、ウイルス性肝炎、心向性のウイルスによって引き起こされる疾患、およびＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群より選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
前記インターフェロン−β応答性神経変性障害が、多発性硬化症である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記多発性硬化症が、再発−寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および二次性進行型多発性硬化症からなる群より選択される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記インターフェロン−β応答性身体障害が、癌、感染性疾患、神経変性障害、自己免疫障害、および遺伝的障害からなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項３１】
前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、消化管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨の癌、神経の癌、頭頸部の癌、皮膚癌、癌腫、肉腫、腺腫、および骨髄腫からなる群より選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記インターフェロン−β応答性感染性疾患が、ウイルス性肝炎、心向性のウイルスによって引き起こされる疾患、およびＨＩＶ／ＡＩＤＳからなる群より選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記インターフェロン−β応答性神経変性障害が、多発性硬化症である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記多発性硬化症が、再発−寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および二次性進行型多発性硬化症からなる群より選択される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
還元的アルキル化によって合成されるポリアルキレングリコール−インターフェロン−β結合体において、アミノ末端セリン残基またはアミノ末端トレオニン残基を有するインターフェロン−βのアミノ末端に付加されるポリアルキレングリコールの量を決定するための方法であって、
ａ）該結合体と酸化剤とを、該ポリアルキレングリコールを該セリン残基または該トレオニン残基から選択的に切断するために反応させる工程と
ｂ）調製物における未結合インターフェロン−β部分の増加を測定する工程と
を包含する方法。
【請求項３６】
前記酸化剤が、メタペルヨーデートナトリウム、メタペルヨーデートカリウム、メタペルヨーデートリチウム、ペルヨーデートカルシウム、ペルヨーデートバリウム、および過ヨウ素酸からなる群より選択されるペルヨーデートを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記測定する工程が、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、超遠心分離法、限外濾過、光散乱および質量分析計からなる群より選択される一以上の方法によって行われる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質生化学、ならびに薬科学および医科学の分野にある。特に、本発明は、水溶性ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体）とサイトカイン（例えば、インターフェロン−β）との間の結合体の産生のための方法を提供し、ここで、この結合体は、標準的な方法により合成された同じサイトカインのポリマー結合体と比較して増加した能力を有する。本発明はまた、このような方法により産生された結合体、このような結合体を含む組成物、このような結合体および組成物を含むキット、そして、種々の医学的および獣医学的状態の予防、診断および処置における結合体および組成物の使用方法を提供する。本発明はまた、特定の条件下での還元的アルキル化によるポリマーの結合部位を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
以下の関連技術の説明は、本発明自体ではなく、関連技術における、本発明者の解釈を含む。サイトカインは、内分泌、パラクリンまたはオートクライン様式において、細胞の生存、増殖、分化および／またはエフェクター機能を制御する、分泌調節タンパク質である（Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．（１９９４）Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．，編、ｐｐ．１−７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて総説される）。これらの能力、特異性、小さなサイズおよび組換え生物体における産生の相対的容易さに起因して、サイトカインは、治療剤として多くの潜在的な用途を有する。
【０００３】
２つの重要な因子が、特に、サイトカインのそして、一般には、組換えタンパク質の治療剤としての開発を妨害する−循環におけるこれらの一般に短い半減期、ならびにこれらの潜在的な抗原性および免疫原性。本明細書中、および一般に当該分野で用いられる場合、用語「抗原性」とは、分子が既存の抗体に結合する能力を言い、一方で、用語「免疫原性」とは、分子が、インビボで免疫応答を惹起する能力を言い、その応答は、抗体の形成（「体液性応答」）または細胞性免疫応答の刺激のいずれかを含む。
【０００４】
組換え治療用タンパク質の投与について、最も高い循環活性を達成し、そして、バイオアベイラビリティおよび分解の問題を最小限にするために静脈内（ｉ．ｖ．）投与がしばしば望まれる。しかし、ｉ．ｖ．投与後の小さなタンパク質の半減期は、通常、非常に短い（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．，ら（１９９１）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ８：１３５１−１３５９；Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．，ら（１９９５）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １２：１４６６−１４６９を参照のこと）。約３６ÅのＳｔｏｋｅｓ半径および約６６，０００ダルトン（６６ｋＤａ）の分子量を有する、血清アルブミンの水力学的半径を超える半径を有するタンパク質は、一般に、健常な腎臓により血流に保持される。しかし、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターフェロン−α（「ＩＦＮ−α」）およびインターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）のようなサイトカインを含むより小さなタンパク質は、糸球体濾過により血流から迅速に除去される（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｂ．Ｍ．，ら（１９７８）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３４：Ｆ４５５−Ｆ４６０；Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ，Ｍ．Ａ．ら（１９７８）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ４３：３３７−３４７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．，（１９７９）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ７４：４９５−５０９；Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．，ら（１９８８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：１５０６４−１５０７０；Ｋｉｔａ，Ｙ．，ら（１９９０）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｌｉｖ  ６：１５７−１６７；Ｒｏｓｔａｉｎｇ，Ｌ．，ら（１９９８），Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ９：２３４４−２３４８）。結果として、循環中の治療的有効濃度の小さな組換えタンパク質の維持は、注射後に問題となる。従って、より高い濃度のこのようなタンパク質、およびより高頻度での注射が、代表的に投与されなければならない。得られる用量レジメンは、治療費を増加させ、患者のコンプライアンスの可能性を減少させ、そして、有害な事象（例えば、免疫反応）の危険性を増加させる。細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方が、有効用量の投与を不可能にし得るか、または、クリアランスの加速、効力の中和およびアナフィラキシーを含む、治療を制限する事象をもたらし得る程度まで、注射された組換えタンパク質の循環濃度を減少し得る（Ｒａｇｎｈａｍｍａｒ，Ｐ．，ら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：４０７８−４０８７；Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．，ら（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：１３５３−１３６１；Ｈｊｅｌｍ  Ｓｋｏｇ，Ａ．−Ｌ．，ら（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：１１６３−１１７０；Ｌｉ，Ｊ．，ら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：３２４１−３２４８；Ｂａｓｓｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：２５９９−２６０２；Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．，（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  ２４：１７２０−１７４０）。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）の共有結合による組換えタンパク質の改変は、上で議論した欠点に取り組む手段として広範に調査されている（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ら（１９９７）ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ら編、ｐｐ．１５５−１６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，ら（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：４５９−４７６において総説されている）。ＰＥＧのタンパク質への結合は、インビボにおいてタンパク質を安定化させ、そのバイオアベイラビリティを改善し、そして／またはその免疫原性を低下させることが示されている（ＰＥＧのタンパク質もしくは他の物質への共有結合は、本明細書中で、そして、当該分野で公知であるように、「ＰＥＧ化（ペグ化）」と呼ばれる）。さらに、ＰＥＧ化は、タンパク質の水力学的半径を有意に増加させ得る。サイトカインのように小さなタンパク質が、単一のＰＥＧの長鎖（例えば、少なくとも約１８ｋＤａの分子量を有する）に結合される場合、得られる結合体は、血清アルブミンの水力学的半径を超えない半径を有し、腎糸球体を介する循環からのそのクリアランスを劇的に遅延させる。ＰＥＧ化の組み合わせ効果−タンパク質溶解の減少、免疫認識の減少および腎クリアランス速度の減少−は、ＰＥＧ化されたタンパク質に、治療剤としてかなりの利点を与える。
【０００６】
１９７０年代から、ポリマーの共有結合を使用して、薬学的用途のための種々のタンパク質の安全性および性能を改善する試みがなされている（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．，ら、米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。いくつかの例としては、重症複合免疫不全疾患の処置における使用のためのＰＥＧまたはポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）のアデノシンデアミナーゼ（ＥＣ  ３．５．４．４）へのカップリング（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，ら（１９８１）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６：６４９−６５２；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．，ら（１９８７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１６：５８９−５９６）、炎症性状態の処置のためのスーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ  １．１５．１．１）へのカップリング（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．，ら、米国特許第５，００６，３３３号および同第５，０８０，８９１号）、ならびに血液および尿からの過剰の尿酸の排除のための尿酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．７．３．３）へのカップリング（Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｊ．，ら（２００１）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １２：１００１−１００９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ｄ．，ら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／０７６２９  Ａ３および米国特許第６，５７６，２３５号；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，ら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／５９０７８  Ａ２）が挙げられる。
【０００７】
ＰＥＯおよびＰＥＧは、共有結合されたエチレンオキシド単位から構成されるポリマーである。これらのポリマーは、以下の一般構造を有する：
Ｒ１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｒ２
ここで、Ｒ２はヒドロキシル基（またはその反応性誘導体）であり得、そして、Ｒ１は、ジヒドロキシＰＥＧ（「ＰＥＧジオール」）においては水素、モノメトキシＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）においてはメチル基、または、例えば、イソプロポキシＰＥＧもしくはｔ−ブトキシＰＥＧにおいては別の低級アルキル基であり得る。ＰＥＧの一般構造におけるパラメーターｎは、ポリマー中のエチレンオキシド単位の数を示し、そして、本明細書中、および当該分野において、「重合の程度」と呼ばれる。同じ一般構造のポリマー（Ｒ１はＣ１〜７アルキル基である）はまた、オキシラン誘導体と称されている（Ｙａｓｕｋｏｈｃｈｉ，Ｔ．，ら、米国特許第６，４５５，６３９号）。ＰＥＧおよびＰＥＯは、直鎖であっても分枝であっても（Ｆｕｋｅ，Ｉ．，ら（１９９４）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３０：２７−３４）、星型の形状であってもよい（Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ．，（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ５：１−１１）。ＰＥＧおよびＰＥＯは、親水性であり、すなわち、これらは、水および特定の有機溶媒に可溶性であり、かつ、これらは、脂質含有物質（被膜ウイルス、ならびに動物細胞および細菌細胞の膜が挙げられる）に接着し得る。エチレンオキシド（ＯＣＨ２ＣＨ２）およびプロピレンオキシドの、特定のランダムコポリマーもしくはブロックコポリマーもしくは交互性コポリマーは、以下の構造を有し：
【０００８】
【化１】
0005207590.tif 000002
これらのポリマーが、特定の用途においてＰＥＧについての適切な代替品であると考えられるのに十分な、ＰＥＧの特性と類似の特性を有する（例えば、Ｈｉｒａｔａｎｉ，Ｈ．，米国特許第４，６０９，５４６号およびＳａｉｆｅｒ，Ｍ．，ら、米国特許第５，２８３，３１７号を参照のこと）。用語「ポリアルキレンオキシド」および略語「ＰＡＯ」は、本明細書中で、このようなコポリマー、ならびに、ＰＥＧもしくはＰＥＯおよびポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）コポリマーを指すために、本明細書中で使用される（Ｐｉｔｔ，Ｃ．Ｇ．，ら、米国特許第５，４７６，６５３号）。本明細書中で使用される場合、用語「ポリアルキレングリコール」および略語「ＰＡＧ」は、本発明の結合体における用途に適切なポリマー、具体的には、ＰＥＧ、より具体的には、単一の反応基を含有するＰＥＧ（「単官能基の活性型ＰＥＧ」）を一般的に指すために使用される。
【０００９】
ＰＥＧもしくは他のポリアルキレンオキシドのタンパク質への共有結合は、ポリマーの少なくとも１つの端基の反応性官能基内への変換を必要とする。このプロセスは、しばしば「活性化」と呼ばれ、そして、この生成物は、「活性型ＰＥＧ」もしくは活性型ポリアルキレンオキシドと呼ばれる。モノメトキシＰＥＧ（（「メトキシル基」を生じるために）１端における酸素が、不活性の化学的に安定なメチル基でキャッピングされており、他の端が、タンパク質分子のアミノ基に対して反応性である官能基でキャッピングされている）が、このような用途に最も一般的に使用される。いわゆる「分枝の」ｍＰＥＧ（単一の活性型官能基から離れて２つ以上のメトキシル基を含む）は、あまり一般的には使用されない。分枝ＰＥＧの例は、ジ−ｍＰＥＧ−リジンであり、ここで、ＰＥＧは、両方のアミノ基に結合し、リジンのカルボキシル基が、最もしばしば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いるエステル化によって活性化される（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，ら、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．，ら、米国特許第５，９１９，４５５号；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ら、米国特許第５，９３２，４６２号）。
【００１０】
通常、活性型ポリマーは、結合部位として機能する求核性官能基を有する生物活性化合物と反応する。通常結合部位として使用される１つの求核性官能基は、リジン残基のεアミノ基である。溶媒アクセス可能なα−アミノ基、カルボン酸基、グアニジノ基、イミダゾール基、適切に活性化されたカルボニル基、酸化された炭化水素部分、およびチオール基がまた、結合部位として使用されている。
【００１１】
ＰＥＧのヒドロキシル基は、そのタンパク質への結合の前に、塩化シアヌルを用いて活性化される（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ら（１９７７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５２：３５８２−３５８６；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ら（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ６５：１０７７−１０８１）。しかし、この方法の使用は、塩化シアヌルの毒性およびアミン以外の官能基を有するタンパク質に対する非特異的な反応性、ならびに、機能に必須であり得る、溶媒アクセス可能なシステイン残基もしくはチロシン残基のような不利益を有する。これらおよび他の不利益を克服するために、ＰＥＧのコハク酸スクシンイミジル誘導体（「ＳＳ−ＰＥＧ」）（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．，ら（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ７：１７５−１８６）、ＰＡＧの炭酸スクシンイミジル誘導体（「ＳＣ−ＰＡＧ」）（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．，ら、米国特許第５，００６，３３３号）、およびＰＥＧのアルデヒド誘導体（Ｒｏｙｅｒ，Ｇ．Ｐ．，米国特許第４，００２，５３１号）のような代替的な活性型ＰＥＧが導入されている。
【００１２】
通常、１つ以上のＰＡＧ（例えば、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量を有する１つ以上のＰＥＧ）のいくつか（例えば、５〜１０個）の鎖は、第１級アミノ基（リジン残基のεアミノ基、そして、可能であれば、アミノ末端（「Ｎ−末端」）アミノ酸のαアミノ基）を介して標的タンパク質に結合される。より近年、高分子量（例えば、１２ｋＤａ、２０ｋＤａもしくは３０ｋＤａ）のｍＰＥＧの単鎖を含む結合体が合成されている。結合体の血漿半減期と、分子量の増加および／またはカップリングされたＰＥＧの鎖数の増加との間に、直接的な相関性が示されている（Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．，ら、前出；Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．（１９９０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：２０９−２１３；Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２１９６９−２１９７７；Ｂｏｗｅｎ，Ｓ．，ら（１９９９）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２７：４２５−４３２；Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ら（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６−１１９）。一方で、タンパク質の各分子にカップリングされるＰＥＧの鎖数が増加するにつれ、タンパク質の不可欠な領域のアミノ基が改変され、従って、特に、レセプター結合タンパク質の場合、このタンパク質の生物学的機能が損なわれる可能性が増加する。多くのアミノ基を含むより大きなタンパク質について、そして、低分子量の基質を有する酵素について、作用期間の増加と、比活性の減少との間の交換（ｔｒａｄｅｏｆｆ）は、受容可能であり得る。なぜならば、これらは、最終的にインビボにおいてＰＥＧ含有結合体の生物学的活性の増加を生じるからである。しかし、細胞表面レセプターとの相互作用を介して機能するより小さなタンパク質（例えば、サイトカイン）については、比較的高い程度の置換が、血流における半減期の延長という利点をなくす程度まで、機能的活性を減少させると報告されている（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ら、前出）。
【００１３】
従って、ポリマー結合体化は、酵素のような治療用タンパク質の生物活性を延長し、そして、免疫反応性を減少させるための、十分に確立された技術である（例えば、米国仮出願番号６０／４３６，０２０（２００２年１２月２６日出願）、ならびに米国仮出願番号６０／４７９，９１３および同６０／４７９，９１４（両方とも、２００３年６月２０日出願）（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。このような免疫反応性の減少から特に有益な治療用タンパク質のクラスは、インターフェロン−β、特にインターフェロン−β−１ｂ（「ＩＦＮ−β−１ｂ；「配列番号１」）である（Ｔｈｅ  ＩＦＮＢ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４７：８８９−８９４）。しかし、細胞表面レセプターに特異的に結合することによって機能する調節性タンパク質へのポリマーの結合体化は、通常：（１）このような結合と干渉し；（２）サイトカインアゴニストのシグナル伝達効力を顕著に消失し；そして（３）サイトカインアンタゴニストの競合的効力を顕著に消失する。レセプター結合活性が消失したこのような結合体の刊行された例としては、とりわけ、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）のポリマー結合体（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．，ら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９６／１１９５３；Ｂｏｗｅｎ，Ｓ．，ら、前出）；ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ら、前出）；ｈＧＨアンタゴニスト（Ｒｏｓｓ，Ｒ．Ｊ．Ｍ．，ら（２００１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８６：１７１６−１７２３；およびＩＦＮ−α（Ｂａｉｌｏｎ，Ｐ．，ら（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２：１９５−２０２；Ｗｙｌｉｅ，Ｄ．Ｃ．，ら（２００１）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １８：１３５４−１３６０；およびＷａｎｇ，Ｙ．−Ｓ．，ら（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：５４７−５７０）が挙げられる。極端な場合、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）へのポリマーのカップリングは、このＩＬ−２様成長因子を、細胞増殖のインヒビターに変換した（Ｐｅｔｔｉｔ，Ｄ．Ｋ．，ら（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２３１２−２３１８）。理論に束縛されることは意図しないが、このような所望でないＰＥＧ化の効果についての機構は、かさ高いＰＥＧ基によるレセプター相互作用の立体障害、電荷の中性化もしくはこの両方を含み得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、実質的な生物活性（例えば、少なくとも約４０％）、ほとんど完全な生物活性（例えば、少なくとも約８０％）または本質的に完全な生物活性（例えば、少なくとも約９０％）を保存した、ＰＥＧ含有（例えば、ＰＥＧ含有および／またはＰＥＯ含有）結合体、特に、このような水溶性ポリマーとレセプター結合タンパク質との間の結合体を産生するための方法に対する必要性が存在する。このような結合体は、インビボにおける溶解性、安定性およびバイオアベイラビリティが増加したポリマー成分により提供される利益を有し、かつ、この結合体が、予防、治療もしくは診断の目的で導入された動物において、従来のポリマー結合体と比較して、実質的に増加した効力もしくは有用性を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、上で同定された必要性に取り組み、水溶性ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体）の生物活性成分（特に、レセプター結合タンパク質（特に、サイトカインのような治療用もしくは診断用生物活性成分））との結合体の調製のための方法を提供し、このようなサイトカインとしては、インターフェロン−β、そしてより具体的には、インターフェロン−β−１ｂが挙げられる。本発明はまた、このような方法により産生される結合体を提供する。対応する結合体化していない生物活性成分と比較して、本発明の結合体は、安定性が増加している（すなわち、インビボにおいてより長い保存性およびより長い半減期を有する）。さらに、ポリペプチド鎖に沿って、溶媒アクセス可能な部位にランダムに結合されるポリマー鎖との同じ生物活性成分の結合体と比較して、本発明の結合体は、インビトロで測定もしくは採用され得るレセプター結合活性が増加しており、かつ、インビトロもしくはインビボのいずれかにおいて測定され得る効力が増加している。さらに、本発明は、このような結合体を含む組成物、このような結合体および組成物を含むキット、ならびに、種々の治療レジメンおよび診断レジメンにおける、この結合体および組成物の使用方法を提供する。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、サイトカインの効力を増強するための方法を提供する。本発明のこの局面に従う特定の方法は、例えば、１つ以上の合成水溶性ポリマーを、サイトカインのアミノ末端のアミノ酸に選択的にカップリングする工程を包含し、ここで、アミノ末端のアミノ酸は、サイトカインの１つ以上のレセプター結合ドメインから離れて位置している。サイトカインの効力を増強するための、本発明により提供される関連の方法は、例えば、サイトカインの１つ以上のグリコシル化部位において、もしくはその付近に、１つ以上の合成水溶性ポリマーを選択的にカップリングする工程を包含し、ここで、１つ以上のグリコシル化部位は、サイトカインの１つ以上のレセプター結合ドメインから離れて位置している。
【００１７】
本発明のこれらの方法における用途に適切なポリマーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１つ以上のポリアルキレングリコール（１つ以上のポリ（エチレングリコール）、１つ以上のモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）および１つ以上のポリ（エチレングリコール）、１つ以上のモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）および１つ以上のモノヒドロキシポリ（エチレングリコール）が挙げられるがこれらに限定されない）、１つ以上のポリアルキレンオキシド、１つ以上のポリオキシラン、１つ以上のポリオレフィンアルコール（例えば、ポリビニルアルコール）、１つ以上のポリカルボキシレート、１つ以上のポリ（ビニルピロリドン）、１つ以上のポリ（オキシエチレン−オキシメチレン）、１つ以上のポリ（アミノ酸）、１つ以上のポリアクリロイル−モルホリン、１つ以上のアミドと１つ以上のアルキレンオキシドとの１つ以上のコポリマー、１つ以上のデキストランおよび１つ以上のヒアルロン酸。本発明の方法における用途に適切なポリマーは、代表的に、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（端を含めて）、より具体的には、約８ｋＤａと約１４ｋＤａとの間（端を含めて）；約１０ｋＤａと約３０ｋＤａとの間（端を含めて）；約１８ｋＤａと約２２ｋＤａとの間（端を含めて）；または約２０ｋＤａもしくは約３０ｋＤａの分子量を有する。
【００１８】
その特異的な細胞表面レセプターにより媒介される、対応するサイトカインの生物学的効果を模倣（すなわち、アゴナイズする）もしくは拮抗する、種々のサイトカインおよびアナログは、本発明の結合体の調製における用途に適切である。これらとしては、４つのヘリックス束構造を有するサイトカイン（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ３リガンド、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）（特に、ＩＦＮ−β−１ｂ）、コンセンサスインターフェロン、ならびにそのムテイン、改変体、アナログおよび誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）、β−シートもしくはβ−バレル構造を有するサイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２（ｐ４０サブユニット）、ＩＬ−１６、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−４およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ；ＦＧＦ−７）、ならびにそのムテイン、改変体、アナログおよび誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。
【００１９】
本発明に従う用途に適切な特に好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２；ＩＦＮ−α；ＩＦＮ−β；ＩＧＦ−１；ＥＧＦおよびｂＦＧＦが挙げられる。また、用途に特に適切なのは、上記のサイトカインの競合的アンタゴニスト、ならびにこれらのサイトカインのムテイン、改変体および誘導体である。
【００２０】
特定の実施形態において、その１以上のポリマーは、（特に、二級アミン結合を介して）、そのサイトカイン上のアミノ末端のアミノ酸のαアミノ基に共有結合される。他の実施形態において、その１以上のポリマーは、そのサイトカインのアミノ末端のアミノ酸の化学的に反応性の側鎖基（例えば、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、グアニジノ基、イミダゾール基、アミノ基、カルボキシル基、またはアルデヒド誘導体）に共有結合される。さらなる実施形態において、アミノ末端のアミノ酸での、または１以上のグリコシル化部位でのもしくはその付近での、そのサイトカインへのそのポリマーの結合は、そのサイトカインのグリコシル化の有益な効果を模倣する。関連する実施形態において、そのサイトカイン上の１以上のグリコシル化部位でのもしくはその付近での、そのサイトカインへのそのポリマーの結合は、そのサイトカインの過剰グリコシル化の有益な効果を模倣し、ここで「過剰グリコシル化」とは、ネイティブな構造に存在する単純な炭水化物部分もしくは複雑な炭水化物部分の共有結合に加えて、単純な炭水化物部分もしくは複雑な炭水化物部分の共有結合を示す。
【００２１】
本発明はまた、本発明の方法によって生成される結合体を提供する。本発明の結合体は、１以上の合成水溶性ポリマー（例えば、上記のもの）に結合された、選択されたサイトカインまたは選択されたそのアンタゴニスト（例えば、上記のもの）を包含する。ここでその１以上のポリマーは、そのサイトカインのアミノ末端のアミノ酸に結合され、そのアミノ末端のアミノ酸は、その選択されたサイトカインの１以上のレセプター結合ドメインから離れて位置する。さらに、本発明の結合体は、１以上の合成水溶性ポリマー（例えば、上記のもの）に結合された、選択されたサイトカインまたはその選択されたアンタゴニスト（例えば、上記のもの）を包含する。ここでその１以上のポリマーは、選択されたサイトカインの１以上のグリコシル化部位に結合され、その１以上のグリコシル化部位は、そのサイトカインの１以上のレセプター結合ドメインから離れて位置する。本発明のアゴニストのポリマー結合体については、ポリマー結合の部位がそのレセプター結合ドメインの全てから離れていることが好ましい。本発明の特定の化合物のポリマー結合体については、ポリマー結合の部位が、結合が生じるのに必須の特定のレセプター結合ドメインから離れていることが好ましいが、アゴニストによるシグナル伝達に必須のレセプター結合ドメインの全てから必ずしも離れていなくてもよい。本発明はまた、１以上の本発明の結合体および１以上のさらなる成分（例えば、１以上の薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤もしくはキャリア）を含む、組成物、特に薬学的組成物を提供する。本発明はまた、１以上の本発明の結合体、組成物、および／または薬学的組成物を含むキットを提供する。
【００２２】
本発明はまた、身体的障害（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に罹患しているか、またはその身体的障害に罹りやすい動物（例えば、ヒトのような哺乳動物）における身体的障害を予防、診断または処置する方法を提供する。このような方法は、例えば、本発明の１以上の結合体、組成物または薬学的組成物の有効量をその動物に投与する工程を包含し得る。このような本発明の方法に従って適切に処置または予防される身体的障害としては、癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、胃腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、骨の癌、神経学的癌、頭部および頸部の癌、皮膚癌、肉腫、腺腫、癌腫および骨髄腫）；感染性疾患（例えば、細菌性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患およびウイルス性疾患（例えば、ウイルス性肝炎、心臓向性ウイルス（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ）により引き起こされる疾患）；ＨＩＶ／ＡＩＤＳ；など））；ならびに遺伝性障害（例えば、貧血、好中球減少症、血小板減少症、血友病、小人症および重症複合免疫不全（「ＳＣＩＤ」）；自己免疫障害（例えば、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチ）ならびに神経変性障害（例えば、種々の形態および段階の多発性硬化症（ＭＳ）（再発性の軽減しているＭＳ、原発性の進行性ＭＳおよび二次的な進行性ＭＳ）；クロイツフェルト−ヤコブ病；アルツハイマー病など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
関連する実施形態において、本発明はまた、還元的アルキル化によって合成されるポリマー−タンパク質結合体において、Ｎ末端セリン残基を有するタンパク質のアミノ末端に結合されるポリマーの量を決定する方法を提供する。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、（ａ）その結合体と、そのタンパク質のセリン残基からポリマーを切断するに十分な量の酸化剤とを十分な時間にわたって反応させる工程；および（ｂ）その調製物中の非結合体化タンパク質の部分の増大を測定する工程、を包含する。このような方法に従う使用に適したタンパク質としては、サイトカイン（インターフェロン−β（特に、インターフェロン−β−１ｂ（これは、好ましくは、配列番号１に特定されるアミノ酸配列を有する））ならびに巨核球増殖因子および巨核球発生因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定のこのような方法において使用される酸化剤は、過ヨウ素酸塩（メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸リチウム、過ヨウ素酸カルシウム、過ヨウ素酸バリウムおよび過ヨウ素酸が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。その調製物中の非結合体化タンパク質の部分の増加を測定するために適した方法は、タンパク質およびペプチド分析の当該分野で公知の任意の種々の方法が挙げられ、これらの方法としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、超遠心分離、限外濾過、光散乱法および質量分析法が挙げられる。
【００２４】
さらに関連する実施形態において、本発明は、生体活性タンパク質の機能的に必須のアミノ酸残基を酸化することなく、その生体活性タンパク質のＮ末端セリン残基を選択的酸化切断するための方法を提供する。本発明の特定のこのような方法は、例えば、（ａ）その生体活性タンパク質の溶液の水素イオン濃度を約５〜１０の間のｐＨ、より好ましくは、約７〜約８の間のｐＨに調節する工程；（ｂ）生体活性タンパク質の溶液を、生体活性タンパク質１モルあたり、約０．１モル〜約１０モル、またはより好ましくは約０．５モル〜約５モルの過ヨウ素酸塩と混合する工程；ならびに（ｃ）その混合物を少なくとも１時間、好ましくは、約２℃〜約４０℃の間の温度でインキュベートする工程、を包含する。このような方法に従う使用に適したタンパク質としては、サイトカイン（インターフェロン−β（特に、インターフェロン−β−１ｂ（これは、好ましくは、配列番号１に特定されるアミノ酸配列を有する））が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、インターフェロン−β（またはインターフェロン−β−１ｂ）調製物の１種以上の阻害性成分の除去を包含する、インターフェロン−βの調製物（特に、インターフェロン−β−１ｂの調製物）の生物学的効力を増大させるための方法を提供する。本発明のこの局面に従って、その１種以上の阻害性成分は、タンパク質およびペプチドプロセシング、精製および／または分析の当該分野で公知の種々の方法によって、その調製物から除去されうる。これらの方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーのような１以上のクロマトグラフィー法が挙げられるが、これらに限定されない。インターフェロン−βの所定の調製物の生物学的効力の決定（すなわち、その効力が、インターフェロン−βのストック溶液に対して、増大されるか、減少されるか、または影響を受けないか）は、当業者に周知の多くのインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって達成されうる。例えば、インターフェロン−βに応答する細胞培養アッセイは、インターフェロン−β調製物の生物学的効力を決定するために使用されうる。適切なこのような細胞培養アッセイの非限定的な例としては、抗増殖アッセイ、抗ウイルスアッセイ、シグナル伝達アッセイ、および遺伝子活性化アッセイが挙げられ、これらの例は、当業者に周知である。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施形態は、本発明の以下の図面および説明、ならびに特許請求の範囲に鑑みて、当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
別段規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料に類似するかまたはこれらに等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用されうるが、好ましい方法および材料が、本明細書以降に記載される。
【００２８】
（定義）
（約：）
本明細書で使用されるように、任意の数値に言及する場合、用語「約」は、その示された値の±１０％の値を意味する（例えば、「約５０℃」とは、４５℃〜５５℃（両端の値を含む）の温度範囲を包含する；同様に、「約１００ｍＭ」とは、９０ｍＭ〜１１０ｍＭ（両端の値を含む）の濃度範囲を包含する）。
【００２９】
（アミノ酸残基：）
本明細書で使用されるように、用語「アミノ酸残基」とは、ポリペプチド骨格または側鎖中の２つのペプチド結合におけるその関与の結果として、しかしそのアミノ酸が、直鎖状ポリペプチド鎖の各々の端部に存在する場合、１つのペプチド結合に関与するときもまた、通常脱水される特定のアミノ酸をいう。そのアミノ酸残基は、当該分野で一般的な３文字表記または１文字表記によって言及される。
【００３０】
（アンタゴニスト：）
本明細書で使用されるように、用語「アンタゴニスト」とは、所定のサイトカインについてのレセプターを介して媒介される細胞、組織または生物に対する、その所定のサイトカインの生物学的効果および／または生理学的効果を減少させるか、実質的に減少させるか、あるいは完全に阻害する化合物、分子、部分または複合体をいう。アンタゴニストは、種々の様式でこのような効果を成し遂げうる。これらの効果としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞表面上の結合部位またはレセプターについてのアゴニストと競合すること；そのアゴニストが細胞表面レセプターに結合する能力を減少するか、実質的に減少するかまたは阻害するような様式で、そのアゴニストと相互作用すること；その細胞表面レセプターに結合し、その細胞表面レセプターおけるコンホメーション変化を誘導し、その結果、その細胞表面レセプターが、そのアゴニストがもはや結合することができない（または減少したかまたは実質的に減少したアフィニティーおよび／もしくは効率でしか結合することができない）構造をとること；細胞、組織または生物における生理学的変化（例えば、細胞内シグナル伝達複合体を増加させる；転写インヒビターを増大させる；細胞表面リガンドレセプター発現の減少など）を誘導し、その結果、そのアゴニストの結合またはその細胞への結合の際に、そのアゴニストにより誘導された生理学的シグナルが、減少されるか、実質的に減少されるか、または完全に阻害されること；ならびにそのアンタゴニストがそれらの活性を成し遂げ得る、当業者に周知の他の機構。当業者に理解されるように、アンタゴニストは、拮抗するリガンドに類似の構造を有していてもよいし（例えば、そのアンタゴニストは、そのアゴニストのムテイン、改変体、フラグメントもしくは誘導体であり得る）、全く関連しない構造を有していてもよい。
【００３１】
（生物活性成分：）
本明細書中で使用される場合、用語「生物活性成分」とは、細胞、組織、器官または生物体において、インビボ、インビトロもしくはエキソビボで特定の生物学的活性を有し、そして一以上のポリアルキレングリコールに結合して本発明の結合体を形成し得る、化合物、分子、部分または複合体をいう。好ましい生物活性成分としては、タンパク質およびポリペプチド（例えば、本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
（結合：）
本明細書中で使用される場合、用語「結合」とは、共有結合性（例えば、化学的カップリング）であり得るかまたは非共有結合性（例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合など）であり得る結合または付着をいう。共有結合は、例えば、エステル結合、エーテル結合、リン酸エステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、アミド結合、アミン結合、ペプチド結合、イミド結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジド結合、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などであり得る。用語「結合した」は、「カップリングした」、「結合体化した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」および「付着した」のような用語よりも広義であり、そしてこれらを包含する。
【００３３】
（結合体／結合体化：）
本明細書中で使用される場合、「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＥＯ）の、生物活性成分（例えば、タンパク質または糖タンパク質）への共有結合性付着の生成物をいう。「結合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」とは、前文で定義されるような結合体の形成をいう。当業者によって通常使用される、生物学的に活性な物質へポリマーを結合体化する任意の方法が、本発明において使用され得る。
（カップリングされた：）
本明細書中で使用される場合、用語「カップリングされた」とは、共有結合または強い非共有結合性相互作用による付着をいい、代表的におよび好ましくは、共有結合による付着をいう。当業者によって通常使用される、生物学的に活性な物質のカップリングのための任意の方法が、本発明において使用され得る。
（サイトカイン：）
本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、内分泌様式、傍分泌様式または自己分泌様式で、細胞の生存、増殖、分化および／またはエフェクター機能を制御する分泌性調節タンパク質として定義される（Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．，上記；Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ．ら，（１９９９）Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：６７−１０８において概説される）。この定義によると、サイトカインとしては、インターロイキン、コロニー刺激因子、成長因子、および種々の細胞によって産生される他のペプチド因子が挙げられ、これらとしては、本明細書において具体的に開示または例示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの近縁物であるポリペプチドホルモンおよび成長因子と同様に、サイトカインは、それらの標的細胞の表面上の特異的レセプタータンパク質に結合することによって、それらの調節機能を開始する。
【００３４】
（疾患、障害、状態：）
本明細書中で使用される場合、用語「疾患」または「障害」とは、ヒトまたは動物のあらゆる有害な状態をいい、この有害な状態としては、腫瘍、癌、
アレルギー、嗜癖、自己免疫、感染、中毒または最適な精神もしくは身体機能の障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「状態」は、疾患および障害を含むが、しかしまた生理学的状態も指す。例えば、受精能は、生理学的状態であるが、疾患でも障害でもない。したがって、受精能を減少させることによって妊娠を予防するのに適切な本発明の組成物は、状態（受精能）の処置として記載され、障害または疾患の処置としては記載されない。他の状態は、当業者によって理解される。
【００３５】
（有効量：）
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な、所定の結合体もしくは組成物の量をいう。本発明の所定の結合体もしくは組成物の有効量は、この選ばれた結果を達成する量であり、そしてこのような量は、当業者による慣習的な事項として、過度な実験の必要なしに、当該分野で公知のアッセイおよび／または本明細書において記載されるアッセイを用いて決定され得る。例えば、免疫系の欠損を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への曝露の際に抗原特異的免疫応答の発生をもたらすのに必要な量であり得る。この用語はまた、「十分な量」と同義である。任意の特定用途のための有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定の組成物、投与経路、被験体の大きさ、および／または疾患もしくは状態の重症度のような因子に依存して変動し得る。当業者は、本発明の特定の結合体または組成物の有効量を、過度な実験の必要なしに、経験的に決定し得る。
【００３６】
（一つ（ｏｎｅ、ａまたはａｎ）：）
本開示において、用語「一つ（ｏｎｅ、ａまたはａｎ）」が使用される場合、それらは、他に示されない限り、「少なくとも一つ」または「一つ以上」を意味する。
【００３７】
（ＰＥＧ：）
本明細書中で使用される場合、「ＰＥＧ」は、直鎖状であるか分枝状であるか多数の腕があるかにかかわらず、そして末端がキャップされているかヒドロキシル末端になっているかにかかわらず、全てのエチレンオキシドポリマーを含む。「ＰＥＧ」は、ポリ（エチレングリコール）、メトキシポリ（エチレングリコール）もしくはｍＰＥＧのような当該分野で公知のポリマーを含むか、またはエチレンオキシドのポリマーについて当該分野で使用される名前の中でもとりわけ、ポリ（エチレングリコール）−モノメチルエーテル、アルコキシポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）もしくはＰＥＯ、α−メチル−ω−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、およびポリオキシランを含む。
【００３８】
（ＰＥＧ化、ＰＥＧ化された、および偽ＰＥＧ化された：）
本明細書中で使用される場合、「ＰＥＧ化」とは、ＰＥＧの、生物活性標的分子（特にレセプター結合タンパク質）への共有結合によるカップリングのための任意のプロセスをいう。ＰＥＧ化によって生成された結合体は、「ＰＥＧ化された」と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、「偽ＰＥＧ化された」とは、ＰＥＧ化反応混合物中の、ＰＥＧが共有結合されていないタンパク質部分をいう。それにもかかわらず、偽ＰＥＧ化された生成物は、（例えば、ＰＥＧ化の間での還元剤への曝露の結果として）還元的アルキル化によって、ならびに／または前述の加工工程および／もしくは精製工程の間に一つ以上阻害剤、化合物等を除去されることによって、反応の間またはその後の精製工程の間に変化され得る。
【００３９】
（ポリペプチド：）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子をいう。これは、アミノ酸の分子鎖を示すが、特定の長さの生成物を言及しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、過グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）の生成物に言及することを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来し得るか、または組み換えＤＮＡ技術によって生成され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、化学合成を含む任意の様式で生成され得る。
【００４０】
（タンパク質および糖タンパク質：）
本明細書中で使用される場合、用語、タンパク質とは、一般的に約１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズのポリペプチドをいう。タンパク質は、一般的に、規定された３次元構造を有するが、それらは必ずしもこのような構造を有さず、そしてしばしば、ペプチドおよびポリペプチド（これらは、しばしば規定された３次元構造を有さないが、むしろより多くの異なる構造をとり得る）とは対照的に、折り畳まれていると称され、そして折り畳まれていないと称される。しかし、ペプチドもまた、規定された３次元構造を有し得る。本明細書中で使用される場合、用語、糖タンパク質とは、少なくとも一つの炭水化物部分にカップリングされたタンパク質をいう。この炭水化物部分は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着される。
【００４１】
（遠隔性：）
本明細書中で使用される場合、用語「遠隔」（「遠隔Ｎ末端アミノ酸」または「遠隔グリコシル化部位」におけるような用語）とは、分子モデル化によって評価されるような、タンパク質上の一つ以上のポリマーに対する一つ以上の付着部位の位置が、そのタンパク質の一つ以上のレセプター結合領域もしくはレセプター結合ドメインから遠位にあるか、または空間的に離れている構造をいう。このような遠隔付着部位（通常、Ｎ末端アミノ酸（レセプター結合タンパク質に関する、したがって「遠隔Ｎ末端」レセプター結合タンパク質もしくは「ＲＮ」レセプター結合タンパク質と称される）、または糖タンパク質上の一つ以上の炭水化物部分もしくはグリコシル化部位（レセプター結合タンパク質に関して、したがって「遠隔グリコシル化」レセプター結合タンパク質もしくは「ＲＧ」レセプター結合タンパク質と称される））におけるポリマーの結合体化は、タンパク質の、そのレセプターに対する結合の実質的な立体障害を引き起こさない。故に、サイトカイン上のアミノ末端アミノ酸またはグリコシル化部位は、このアミノ末端アミノ酸またはグリコシル化部位それぞれへの水溶性ポリマーの結合体化（例えば、共有結合による付着）が、サイトカインのそのレセプター（特に、細胞表面レセプター）に結合する能力を実質的に妨害しない場合、そのサイトカインの「一つ以上のレセプター結合ドメインから離れて配置されている」といわれる。当然ながら、所定のサイトカインが、一つより多くのレセプター結合ドメインを含み得ることが認識される。このような状況において、サイトカインのアミノ末端アミノ酸またはグリコシル化部位は、このようなドメインの一つから、またはこのようなドメインの一つより多くから、離れて配置され得、そしてさらに、このアミノ末端アミノ酸またはグリコシル化部位の結合体化が、サイトカインの、一つ以上のレセプター結合ドメインを介したそのレセプターへの結合を実質的に妨害しない限り、「一つ以上のレセプター結合ドメインから離れて配置されている」とみなされ得る。
【００４２】
結合体化が、タンパク質のそのレセプターに結合する能力を実質的に妨害するか否かは、当該分野で公知の、当業者によく知られたリガンド−レセプター結合アッセイを用いて、容易に決定され得る。
【００４３】
本明細書の図１ｄに示されるように、ＰＥＧは、高度に延長された可撓性ポリマーであり、同様の分子量のタンパク質に対して、溶液中で大きな体積を占める。ＰＥＧが付着されたアミノ酸残基は、一つ以上のレセプター結合部位から離れている可能性があるが、それにもかかわらず、ポリマー部分は、レセプター結合をある程度妨害し得る。このような妨害の可能性は、その分子量にしたがって、故に、溶液中のポリマーによって占められる体積にしたがって、増加する。いずれにせよ、レセプター結合領域から離れた一つ以上の部位を標的とするＰＥＧの付着は、ランダムなＰＥＧ化よりはサイトカインの機能を妨害しない。
【００４４】
リガンド−レセプター結合を評価する方法としては、限定としてではなく、競合的結合アッセイ、放射性レセプター結合アッセイ、細胞ベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴測定法、動的光散乱法、超遠心分離法、および限外濾過が挙げられる。
【００４５】
（実質的な、実質的に：）
本明細書で使用される場合、レセプターに結合体化されたタンパク質の結合の速度および／または量が、結合体化されていない対応するサイトカインの結合の速度および／または量の約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上もしくは約１００％以上である場合、タンパク質の結合体化は、そのレセプターに結合するタンパク質の能力を「実質的に」妨害しないことをいう。
【００４６】
（処置：）
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する」、「処置した」または「処置している」は、予防および／または治療をいう。感染性疾患に関連して使用される場合、例えば、それらの用語は、病原体への感染に対する被験体の耐性を増大させる予防的処置、すなわち、いいかえると、被験体が、病原体に感染することになるか、または感染に原因があり得る疾病の兆候を示す可能性を減少させる処置、ならびに、被験体が感染した後でその感染と戦うため（例えば、感染を減少もしくは排除するためか、またはより悪くなることを防ぐため）の処置を言及し得る。
【００４７】
（概要）
本発明は、同じレセプター結合タンパク質のポリマー結合体と比較して予想外に高いレセプター結合活性を保持するレセプター結合タンパク質のポリマー結合体の合成方法を提供し、この方法において１つ以上のポリマーが無作為に付着される。ｘ線結晶構造分析および核磁気共鳴に基づく構造分析、変異分析ならびに分子モデリングソフトウェアの使用によって、本発明者らは、それらのレセプターへの結合に関連するか、または関連しない、サイトカインのＰＥＧ化標的部位を同定した。タンパク質の分類として、これらのサイトカインは、本明細書においてレセプター結合タンパク質と称される。レセプター相互作用に関連しないレセプター結合タンパク質領域にポリマー付着を標的化する合成ストラテジーの選択によって、特定の望まれない立体障害が回避され、得られるポリマー結合体は著しく高い効力を保持する。１つ以上のレセプター結合領域もしくはレセプター結合ドメインから離れてアミノ末端残基を有するレセプター結合タンパク質は、本明細書において「離れたＮ末端」レセプター結合タンパク質または「ＲＮ」レセプター結合タンパク質として規定される；これらとしては、タンパク質のレセプター結合部位から離れて存在するアミノ末端アミノ酸を有する全てのサイトカインまたはそれらのアンタゴニストが挙げられる。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、１つ以上のレセプター結合領域もしくはレセプター結合ドメインから離れて天然グリコシル化部位を有するサイトカインに共有結合によりカップリングした１つ以上の合成ポリマー（例えば、１つ以上のポリ（エチレングリコール））を含む結合体が生成される。本発明のこの局面にしたがって、結合体の生物活性成分（例えば、サイトカイン）は、合成ポリマーがグリコシル化部位の領域に結合される場合、十分に保存されたレセプター結合活性を提示する。レセプター結合タンパク質のこのサブセットは、本明細書において「ＲＧ」レセプター結合タンパク質という。親水性ポリマーまたは両親媒性ポリマーがこのような「離れたグリコシル化」部位またはその付近において選択的にカップリングされる場合、特に、標的タンパク質が天然にグリコシル化されたタンパク質の非グリコシル化形態である場合、このポリマーは、天然に存在する炭水化物の好都合な効果（例えば、凝集、安定性および／または溶解性）を模倣し得る。従って、グリコシル化部位またはその付近へのポリマーの付着は、本明細書において「偽グリコシル化」と称される。従って、本発明は、合成ポリマーの部位選択的カップリングが、天然に存在する炭水化物部分を効果的に置換する、結合体の合成のための方法を提供する。生じた偽グリコシル化は、このタンパク質の他の非グリコシル化形態と比較して、改善した溶解性、減少した凝集および血流からの遅延したクリアランスに寄与する。従って、このアプローチは、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌）において、組換えＤＮＡ技術によって生成されるタンパク質の結合体および組成物を調製するのに特に好都合である。なぜなら、原核生物は、通常、それらが発現するタンパク質をグリコシル化しないからである。
【００４９】
同様に、糖タンパク質の炭水化物部分の選択的ＰＥＧ化は、糖タンパク質の「擬似過剰グリコシル化（ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」を生じ得る。このプロセスは、例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９６／４０７３１号におけるＣ．Ｂｏｎａら（本明細書においてその全体が参考として援用される）に記載された。従って、このアプローチは、真核生物宿主細胞（例えば、酵母、植物細胞および動物細胞（哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む））において組換えＤＮＡ技術によって生産されたタンパク質の結合体または組成物の調製のために特に有利である。なぜなら、真核生物は、真核生物細胞が発現するタンパク質が天然に生じるグリコシル化シグナルを含むかまたは組換えＤＮＡ技術によって導入されたグリコシル化シグナルを含む場合、そのタンパク質を一般にグリコシル化するからである。そのような擬似グリコシル化および擬似過剰グリコシル化されたＲＧレセプター結合タンパク質は、本発明の範囲内にある。
【００５０】
従って、本発明はまた、実質的にか、ほとんど完全にか、または本質的に完全に、レセプター結合活性を保持する「ＲＮ」レセプター結合タンパク質と、実質的にか、ほとんど完全にか、または本質的に完全に、レセプター結合活性を保持する擬似グリコシル化「ＲＧ」レセプター結合タンパク質または擬似過剰グリコシル化「ＲＧ」レセプター結合タンパク質のポリマー結合体を包含する。本明細書において使用する場合、サイトカインは、本発明に従って１つ以上の水溶性ポリマーと結合体化する場合に、そのタンパク質がそのレセプターに結合する能力をそのサイトカインの結合体化が実質的に妨げないならば（すなわち、結合体化したタンパク質がその対応するレセプターに結合する速度および／または量が、対応するタンパク質の結合体化していない形態の結合速度および／または量の、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、または、約１００％以上、あるいはそれより多いならば）、「実質的にか、ほとんど完全にか、または本質的に完全に、レセプター結合活性を保持する」と言われる。また、本発明の範囲には、「ＲＮ」レセプター結合タンパク質および「ＲＧ」レセプター結合タンパク質の両方に分類されるレセプター結合タンパク質のポリマー結合体が含まれる。後者のタンパク質の２つの例は、インターフェロンβ（特に、インターフェロンβ１ｂ）およびＩＬ−２である。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上のポリマーがランダムに結合した、同一のレセプター結合タンパク質のポリマー結合体と比較して、予想外に高度のレセプター結合活性を保持するレセプター結合タンパク質のポリマー結合体の合成方法を提供する。本発明はまた、そのような方法によって産生された結合体、ならびに、本発明のこれら結合体の１つ以上を含む組成物であって、１つ以上のさらなる成分または試薬（例えば、１つ以上の緩衝塩、１つ以上の炭水化物賦形剤、１つ以上のキャリアタンパク質、１つ以上の酵素、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の核酸分子、１つ以上のポリマー（例えば、結合体化していないＰＥＧまたはポリアルキレングリコール）など）をさらに含み得る組成物を提供する。本発明はまた、本発明の結合体および／または組成物を含むキットを提供する。
【００５２】
本発明はまた、本発明の結合体、および薬学的用途または獣医学的用途に許容可能な少なくとも１つの賦形剤またはキャリアを含む、薬学的組成物または獣医学的組成物を提供する。本発明はまた、そのような組成物を使用して種々の身体的障害を処置または予防するための方法であって、本発明の結合体または組成物の１つ以上の有効量を、身体的障害または状態を罹患しているか、または罹患しやすい動物に対して投与する工程を包含する方法を提供する。
【００５３】
さらに、本発明は、安定化されたレセプター結合タンパク質、および、工業的細胞培養における使用のためのそのタンパク質の産生方法を提供し、これによって、生物学的活性の実質的な保持および工業的使用における作用の持続時間の増加の組合せ効果の結果として、予想外に高い効力が得られる。本発明の結合体の異常に高い効力は、異常に高いバイオマス生産、異常に高レベルの組換えタンパク質の発現、およびバイオプロセシングの効率の他の点での改善に反映され得る。
【００５４】
さらなる実施形態において、本発明は、インターフェロンβ調製物、特にインターフェロンβ１ｂ調製物の生物学的効力を増加する代替的な方法を提供する。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、インターフェロンβ調製物（またはインターフェロンβ１ｂ調製物）から１つ以上の阻害成分を除去することを包含し得る。本発明のこの局面に従って、１つ以上の阻害成分が、タンパク質およびペプチドのプロセシング、精製、および／または分析の当該分野において公知の種々の方法（１つ以上のクロマトグラフィー方法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）が挙げられるが、これらに限定されない）によって、調製物から除去され得る。実際問題として、所与のインターフェロンβ調製物の生物学的効力の決定（すなわち、生物学的効力が、インターフェロンβのようなサイトカインのストック溶液と比較して、増加するか、減少するか、または影響を受けないか）は、当業者が精通している任意のインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって達成され得る。例えば、インターフェロンβに応答する細胞培養アッセイを使用して、インターフェロンβ調製物の生物学的効力を決定し得る。そのような適切な細胞培養アッセイの非限定的な例としては、抗増殖（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）アッセイ、抗ウイルスアッセイ、シグナル伝達アッセイ、および遺伝子活性化アッセイが挙げられ、これらの例は、当業者に周知である。
【００５５】
関連する実施形態において、本発明はまた、還元的アルキル化によって合成されたポリマー−タンパク質結合体中で、Ｎ末端セリン残基を有するタンパク質のアミノ末端に付着するポリマーの量を決定する方法を、提供する。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、（ａ）タンパク質のセリン残基からポリマーを切断するのに十分な時間、十分量の酸化剤と結合体を反応させる工程；および（ｂ）調製物中において、結合体化していないタンパク質の部分の増加を測定する工程、を包含する。そのような方法に従う使用のために適切なタンパク質としては、サイトカイン（インターフェロンβ（特に、好ましくは、配列番号１において特定されるアミノ酸配列を有するインターフェロンβ−１ｂ）およびトロンボポエチン（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）（Ｇｕｅｒｒａ，Ｐ．Ｉ．ら（１９９８）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：１８２２〜１８２７、この開示は、その全体が本明細書において参考として援用される）が挙げられる）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の特定のそのような方法において使用される酸化剤は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸リチウム、過ヨウ素酸カルシウム、過ヨウ素酸バリウム、および過ヨウ素酸が挙げられるが、これらに限定されない過ヨウ素酸塩であり得る。調製物中の結合体化していないタンパク質の部分の増加を測定するための適切な方法としては、当該分野において公知の種々の任意のタンパク質分析方法およびペプチド分析方法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、超遠心、限外ろ過、光散乱および質量分析）が挙げられる。
【００５６】
関連する更なる実施形態では、本発明は、生物活性タンパク質の機能的に必須なアミノ酸残基を酸化せずに、上記生物活性タンパク質のＮ末端セリン残基を選択的に酸化的開裂するための方法を提供する。本発明のそのような特定の方法は、例えば、（ａ）上記生物活性タンパク質の溶液の水素イオン濃度を、ｐＨが約５と約１０との間に、より好ましくはｐＨが約７と約８との間になるように調節すること；（ｂ）生物活性タンパク質１ｍｏｌにつき、生物活性タンパク質の溶液を、約０．１ｍｏｌ〜約１０ｍｏｌ、または、より好ましくは、約０．５ｍｏｌ〜約５ｍｏｌの過ヨウ素酸塩と混合すること；および（ｃ）上記混合物を少なくとも１時間、好ましくは約２℃と約４０℃との間の温度でインキュベートすることを包含する。そのような方法に従った使用に適したタンパク質として、サイトカイン（インターフェロン−β（特に、インターフェロン−β−１ｂ、好ましくは配列番号１において明記されるアミノ酸配列を有するインターフェロン−β−１ｂ）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
（方法）
本発明者は、ポリマーを「ＲＮ」レセプター結合タンパク質のアミノ末端アミノ酸に、または「ＲＧ」レセプター結合タンパク質のグリコシル化部位の近傍に標的化することで、上記ポリマーが、１個以上の上記タンパク質のレセプター結合領域またはレセプター結合ドメインから遠く離れた部位に結合されることが保証され、その結果、結合されたポリマー分子によるレセプター相互作用の立体障害を最小にしているということを発見した。その結果、本発明の方法に従ってタンパク質を結合させることにより、上記ポリマーが、上記分子のレセプターとの結合に関与する部分の内部かまたは近傍に結合した場合に生じるレセプター結合活性よりも高い割合のレセプター−結合活性が保たれ得る。この原理は、予想外に高いレセプター結合活性の保持という結果を招き得るが、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ］または「ＦＧＦ−２」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、インスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）、インターフェロン−α（「ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−ｂｅｔａ−１ｂを含むがこれに限定されない「ＩＦＮ−ｂｅｔａ」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、単球コロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子（「ＳＣＦ」）、インターロイキン２、３、４、６、１０、１２、１３および１５、トランスホーミング増殖因子β（「ＴＧＦ−ｂｅｔａ」）、ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）、プロラクチン、胎盤乳腺刺激ホルモン、毛様体神経栄養因子（「ＣＮＴＦ」）、レプチンおよびこれらのレセプター−結合タンパク質の作用とよく似た作用を持つレセプター結合タンパク質の構造的アナログまたはそれらのレセプター−結合アンタゴニストであるこれらのレセプター結合タンパク質の構造的アナログの間から選択されるレセプター−結合タンパク質として立証され得る。その一方、ＩＦＮ−γのアミノ末端に大きいポリマーを選択的に結合することは、このサイトカインの活性の大部分が保たれないと予想される。なぜなら、そのような連結は、上記活性ダイマーをそれのレポーターに結合することを妨げると予想されるからである（Ｗａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：２３０〜２３５のデーターに基づく）。
【００５８】
本発明の関連するそのような実施形態では、ポリマーは、レセプター結合タンパク質（そのレセプター結合タンパク質は、１個以上の同一レセプターに結合することにより、上記天然タンパク質の競合的アンタゴニスト（シグナル伝達を開始しない）として機能する）のムテインのアミノ末端残基に結合する。例としては、点変異Ｇ１２０ＲｈＧＨアンタゴニスト（Ｓｕｎｄｓｔｏｅｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：３２１９７〜３２２０３）のポリマー結合体および点変異Ｇ１２９Ｒを含むプロラクチンのアゴニストのポリマー結合体（Ｇｏｆｆｉｎ，Ｖ．ら，（１９９７）Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２：７〜１７：Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｙ．ら，（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：３５８３〜３５９３；Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｙ．、ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９９／５８１４２  Ａ１）がある。レセプター結合タンパク質の他のアンタゴニストは、選択的点変異、短縮または欠失により産生され得る（例えば、Ｔｃｈｅｌｅｔ，Ａ．ら，（１９９７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３０：１４１〜１５２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｆ．Ｃ．，（１９９８）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｔｉｆｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｏｒｏｐｉｃ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ，Ｐｈ．Ｄ．  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＭＩ＃９８２２３５７）。
【００５９】
本発明の更なる実施形態では、「ＲＧ」レセプター結合タンパク質に関して、本発明の方法は、糖タンパク質であるそれらのレセプター結合タンパク質の炭水化物部分の天然の結合部位の近傍に１個以上の合成ポリマーの結合を生じる。これは、（例えば、それらが組換えＤＮＡ技術により、翻訳後のグリコシル化を行わないＥ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞において発現される場合）これらのレセプター結合タンパク質の「擬似グリコシル化」が生じるか、または（例えば、天然に産生される糖タンパク質に関して、または真核生物宿主細胞（例えば、実際に翻訳後グリコシル化を行う酵母、植物細胞ならびに（哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む）動物細胞）により産生される糖タンパク質に関して）それらの糖タンパク質形態の「過剰擬似グリコシル化」が生じる。例として、インターフェロンαおよびβ、ならびにエリスロポエチン（「ＥＰＯ」）およびインターロイキン２がある。天然のグリコシル化部位における合成ポリマーの結合または天然のグリコシル化部位の近傍の合成ポリマーの結合は、当該分野で公知の任意の方法（Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄｓｏｎら，（（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３〜３４６）の変異方法およびＲ．Ｓ．Ｌａｒｓｏｎら，（（２００１）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２：８６１〜８６９）の方法を含む）で行われ得、これは、上記炭水化物の先の酸化を伴う；これらの参考文献の開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００６０】
特定のタンパク質のアミノ末端修飾は、以前に開示された（例えば、Ｄｉｘｏｎ，Ｈ．Ｂ．Ｆ．（１９８４）Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３：９９〜１０８を参照のこと）。例えば、タンパク質のＮ末端修飾は、特定のタンパク質をアミノペプチダーゼの作用に対して安定化するか（Ｇｕｅｒｒａ，Ｐ．Ｉ．ら，（前出））、上記タンパク質の溶解性を改善するか（Ｈｉｎｄｓ，Ｋ．，ら、（２０００）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １１：１９５〜２０１）、上記Ｎ−末端アミノ基上の電荷を減少させるか、または上記生じた結合体の同質性を改善する（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら，欧州特許出願番号ＥＰ０８２２１９９Ａ２；Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：４７７〜４８５）ことが特に報告されている。ポリマーを、「ネイティブケミカルライゲーション（ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）」として当該分野で公知の手順を適用させることによりＮ末端システイン残基またはヒスチジン残基のαアミノ基に連結する代替の方法が開示された（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ  ０３／３１５８１Ａ２および米国特許出願公開番号２００３／０１０５２２４  Ａ１、それらの開示は、本明細書中に参考としてその全体が援用される）。しかし、レセプター結合タンパク質の上記「ＲＮ」サブクラスおよび「ＲＧ」サブクラスの存在、それらのクラスのメンバーを選択するのに一般的に適用可能な方法、ならびにそのようなレセプター結合タンパク質の予想外に高い機能的活性を保つための方法としてのポリマー結合体の調製および使用は、以前は認識されもしなかったし、記述されもしなかった。
【００６１】
従って、所定のサイトカインが、上記リガンドのレセプター結合部位から遠く離れたＮ末端および／またはグリコシル化部位を有するか否かを決定することにメリットがある。上記リガンドがポリマーと結合するのに先立って、所定のサイトカインが「ＲＮ」リガンドであるか、または「ＲＧ」リガンドであるかを予測する能力は、ポリマーリガンド結合体（例えば、ポリマー（例えばＰＥＧ）と結合されたそれらのサイトカインまたはアンタゴニスト）を産生するのに必要とされる実験を実質的に減らす。ここで、このポリマーリガンド結合体において、上記結合体の抗原性および免疫原性は、非結合リガンドの抗原性および免疫原性に比較して減少する一方、上記結合リガンドのレセプター結合および生理学的活性は、実質的に減少しない。
【００６２】
従って、更なる実施形態では、本発明は、タンパク質リガンドのレセプター結合部位から遠く離れたＮ末端および／またはグリコシル化部位を有するレセプター結合タンパク質リガンド（例えば、サイトカインおよびそれらのアンタゴニスト）を同定し、そして選択する方法（すなわち、「ＲＮ］タンパク質または「ＲＧ」タンパク質にたいして、同定し、そして選択する方法）を提供する。本発明のそのような特定の実施形態では、１個以上のポリマー（例えば、１個以上のＰＥＧ）の結合化のための最適部位は、分子モデリング（例えば、分子モデリングソフトウェアを用いて上記タンパク質（サイトカインまたはそのアンタゴニスト）の三次元構造を見て、１個以上のポリマーが実質的にそのタンパク質の生物学的活性またはレセプター結合活性を失うことなく上記タンパク質に結合され得る部位を予測すること（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．（前出）もまた参照のこと））を用いて決定され得る。類似のアプローチが、例えば、タンパク質分解的消化に対する耐性を改善する試みにおけるＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合体に関して、立証された（Ｔ．Ｄ．Ｏｓｓｌｕｎｄの公開された米国特許出願番号２００１／００１６１９１  Ａ１（その開示は、本明細書にその全体が参考として援用されている）を参照のこと）。本発明で用いる適切な分子モデリングソフトウェア（例えば、ＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら（前出））およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに巨大分子構造のデータベースを作成する際に用いる他のプログラムは、当該分野において周知であり、そして当業者によく知られている。そのような分子モデリングソフトウェアを用いて、ポリペプチド（例えば、サイトカインまたはそのアンタゴニスト）の三次元構造は、上記リガンドおよびそれらのレセプターの結晶解析に基づく高度の確信をもって推定されるか、または決定される。このようにして、当業者は、どのリガンドが、本発明に基づく使用に適した「ＲＮ」リガンドであるか、または「ＲＧ」リガンドであるかを容易に決定し得る。
【００６３】
本発明を実施するために、水溶性ポリマーをタンパク質のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基に共有結合的に連結するための、一つの便利な経路は、単一のアルデヒド基を有するポリマーを用いて形成されるシッフ塩基の還元的アルキル化による（例えば、Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒにより特許請求されたような方法（米国特許第４，００２，５３１号）であって、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓらにより特許請求された方法（米国特許第５，２５２，７１４号）ではない。なぜなら、後者の発明者達は、両端にアルデヒド基で誘導化されたポリマーのみを請求し、そのポリマーは、架橋剤であり、それゆえ実質的にレセプター結合活性を保持する長期作用のレセプター結合タンパク質の合成に不向きであるからである。
【００６４】
ＰＥＧ−モノアルデヒドのシッフ塩基の還元的アルキル化を、レセプター結合タンパク質のＮ末端アミノ酸のαアミノ基に対して方向付け、そしてレセプター結合タンパク質のリジン残基のεアミノ基から遠ざけることは、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎｓ（（１９４３）、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の４章および５章のＪ．Ｔ．Ｅｄｓａｌｌにおける開示に基づいて、種々の方法で達成され得る。そして、その開示は、本明細書中に参考文献としてそのまま援用される。そして、その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸のαアミノ基の酸解離定数（「ｐＫａ」）は、７．６未満であると予想される一方、ポリペプチドにおけるリジン残基のεアミノ基の上記ｐＫａ値は、およそ９．５であると予想される。Ｅｄｓａｌｌ（１９４３、前出）は、アルデヒドは、「それの等電点のアルカリ側においてのみ」アミノ酸のアミノ基と結合することを明記した。
【００６５】
それゆえ、本開示および当該分野で容易に入手可能である情報に基づいて、当業者は、以下のことを認識する：（１）アルデヒドとタンパク質のαアミノ基との選択的反応は、９．５（およそ、このタンパク質におけるεアミノ基のｐＫａ）未満であるｐＨ範囲が有利である；（２）アルデヒドとεアミノ基との反応速度は、この反応のｐＨが７．６（およそ、このタンパク質のαアミノ基のｐＫａ）に向かって低下すると減少する；（３）アルデヒドとαアミノ基との反応速度は、反応ｐＨが７．６に向かって低下するにつれ、εアミノ基の反応速度未満に減少する、そして（４）アルデヒドとαアミノ基との反応についての選択性は、ｐＨを６．６に向かって低下させることにより、いくらか改善される。後者の値は、αアミノ基のｐＫａよりもおよそ１ｐＨ単位低く、そしてεアミノ基のｐＫａよりも３ｐＨ単位低いので、αアミノ基のおよそ１０％およびεアミノ基のおよそ０．１％は、それらの反応性の非プロトン化状態にある。従って、ｐＨ６．６において、非プロトン化αアミノ基の割合は、非プロトン化εアミノ基の割合よりも１００倍高い。それゆえ、反応のｐＨを例えば５．６までさらに低下させることによって、選択性における極めてわずかな増加が得られる。ここでは、理論的に、αアミノ基の１％およびεアミノ基の０．０１％がそれらの反応性の非プロトン化状態にある。従って、本発明の特定の実施形態では、タンパク質リガンド（特に、サイトカインおよびそれらのアンタゴニストを含め、「ＲＮ」リガンドまたは「ＲＧ」リガンド）は、約５．６〜約７．６のｐＨにおいて；；約５．６〜約７．０のｐＨにおいて；約６．０〜約７．０のｐＨにおいて；約６．５〜約７．０のｐＨにおいて；約６．６〜約７．６のｐＨにおいて；約６．６〜約７．０のｐＨにおいて；または約６．６のｐＨにおいて、リガンドと１以上の反応性ポリマーとの間で混合物を形成することにより、１以上のポリマーに結合体化され得る。従って、本発明の方法は、リガンドのＮ末端アミノ酸残基上のαアミノ基へのポリマーのカップリングが約５のｐＨにおいて実施される（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら，（２００２）前出；ＥＰ  ０  ８２２  １９９  Ａ２；米国特許第５，８２４，７８４号および同第５，９８５，２６５号；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら，（２００２），前出；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ら，米国出願公開第２００２／０１２７２４４号Ａ１）、一方、リガンドポリペプチド骨格におけるリジン残基のεアミノ基へのポリマーのカップリングが８．０のｐＨにおいて実施される（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら，ＥＰ  ０  ８２２  １９９  Ａ２；米国特許第５，８２４，７８４号および同第５，９８５，２６５号）当該分野で公知の方法とは顕著に異なる。同様にして、本発明の方法はまた、７．５のｐＨにおいて実施される、トランスグルタミナーゼを用いてポリ（エチレングリコール）のアルキルアミン誘導体を、特定のタンパク質へとカップリングするために用いられている酵素方法とは有意に区別される（Ｓａｔｏ，Ｈ．（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：４８７−５０４）。
【００６６】
中程度の還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピリジンボラン）での、得られるシッフ塩基の還元（Ｃａｂａｃｕｎｇａｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８２）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２４：２７２−２７８）は、生理学的ｐＨにおいてタンパク質のＮ末端αアミノ基の正の荷電を保持する二級アミン結合を形成する。ネイティブなタンパク質と同じ荷電を保持するこのような結合は、例えばアミド結合（Ｂｕｒｇ，Ｊ．ら，ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０２／４９６７３  Ａ２；Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら，欧州特許出願第ＥＰ  ０  ８２２  １９９号Ａ２；Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．ら（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１３：９９６−１００２；Ｋｉｔａ，Ｙ．ら，前出）またはウレタン結合（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｗ．ら，米国特許第６，０４２，８２２号；Ｇｒａｃｅ，Ｍ．ら，（２００１）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２１：１１０３−１１１５；Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ，Ｓ．ら，（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ８：２１３９−２１５７）の形成によって荷電を中和する代替結合化学よりも、その生物学的活性を保存する可能性がより高い。
【００６７】
Ｎ末端アミノ酸残基へのポリマーの選択的カップリングに対する代替的アプローチは、当業者に公知である。含まれるのは、ヒドラジド、ヒドラジン、セミカルバジドまたは他のアミン含有ポリマーを、過ヨウ素酸塩を用いてアルデヒドへと酸化的に切断されたＮ末端セリン残基またはＮ末端トレオニン残基へとカップリングするための方法である（Ｄｉｘｏｎ，Ｈ．Ｂ．Ｆ．，前出；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．，米国特許第５，３６２，８５２号；Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｆ．ら，（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ７：３８−４４；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｒ．Ｊ．ら，米国特許第６，４２３，６８５号）。
【００６８】
（適切なポリマー）
本発明の特定の実施形態では、ポリマーが生物活性成分へとカップリングされて本発明の結合体を生成する反応の間にＰＥＧのようなポリマーによる分子内架橋および分子間架橋の形成を最少にすることが望ましい。これは、一方のみの末端において活性化されたポリマー（本明細書中では、「一官能性活性化ＰＥＧ」または「一官能性活性化ＰＡＧ」と呼ばれる）または二官能性活性化（直鎖状ＰＥＧの場合、「二活性化ＰＥＧジオール」と呼ばれる）もしくは多官能性活性化ポリマーの百分率が約３０％未満、もしくはより好ましくは約１０％未満もしくは最も好ましくは約２％（ｗ／ｗ）未満であるポリマー調製物を用いることにより、達成され得る。完全にまたはほぼ完全に一官能性である活性化ポリマーの使用は、以下の全ての形成を最少にし得る：個々のタンパク質分子内での分子内架橋、ポリマーの１つの鎖が２つのタンパク質分子を連結する「アレイ」構造、およびより大きな凝集物またはゲル。
【００６９】
本発明の方法および組成物における使用のために適切である活性化形態のポリマーとしては、当該分野で公知の、任意の直鎖状または分枝状の、一官能性活性化形態のポリマーが挙げられ得る。例えば、含まれるのは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲の分子量（活性化基の質量を除く）を有するポリマーである。分子量の適切な範囲としては、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ；約８ｋＤａ〜約１４ｋＤａ；約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ；約１８ｋＤａ〜約６０ｋＤａ；約１８ｋＤａ〜約２２ｋＤａ；約１２ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａまたは約３０ｋＤａが挙げられるがこれらに限定されない。直鎖状ＰＥＧの場合、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａまたは約３０ｋＤａの分子量は、それぞれ、約２３０、約４５０または約６８０という、エチレンオキシドモノマー単位の重合度（ｎ）に相当する。「ＲＮ」クラスおよび「ＲＧ」クラスのレセプター−結合タンパク質の存在が認識される前には長らく、治療用タンパク質を、比較的高分子量（すなわち、＞２０〜３０ｋＤａ）を有するポリマーにカップリングすることの利点が、最初に開示されたことに留意すべきである（Ｓａｉｆｅｒ，Ｍ．ら，ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０１０３３  Ａ１、１９８９年２月９日公開、これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【００７０】
本発明の他の実施形態では、通常高い百分率の生物活性が保持されているレセプター−結合タンパク質の結合体は、約１ｋＤａ、約２ｋＤａまたは約５ｋＤａの一官能性活性化ポリマーを本発明の方法に従ってカップリングすることにより、インビトロでの（例えば、細胞培養での）使用のために調製され得る。このようなインビトロ適用については、このより低い範囲の分子量が、好適であり得る。
【００７１】
必要に応じて、直鎖状ポリマーは、反応性基を一方の末端または両方の末端に有し得、それにより、「反応性ポリマー」を作製し得る。本発明の特定の実施形態では、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓら，米国特許第５，６７２，６６２号（これは、完全に本明細書中に参考として援用される）に開示される通りのＰＥＧのモノプロピオン酸誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、または他のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＰＥＧ−モノカルボン酸を使用することが所望され得る。特定の他の実施形態では、Ｍ．Ｓａｉｆｅｒら，米国特許第５，００６，３３３号；同第５，０８０，８９１号；同第５，２８３，３１７号および同第５，４６８，４７８号中に記載された通りのＰＥＧのモノスクシンイミジルカルボネート誘導体（「ＳＣ−ＰＥＧ」）、またはＳ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙら，前出；Ｌ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／０７６２９  Ａ２、Ｌ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，米国特許第６，５７６，２３５号およびＭ．Ｒ．Ｓｈｅｒｍａｎら，ＰＣＴ公開番号Ｎｏ．ＷＯ  ０１／５９０７８Ａ２に開示された通りのＰＥＧのモノ−ｐ−ニトロフェニルカルボネート誘導体のいずれかを用いることが所望され得る。さらに、他の型の反応性基を用いて、タンパク質のポリマー結合体を合成し得る。これらの誘導体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＰＥＧのモノアルデヒド誘導体（Ｒｏｙｅｒ，Ｇ．Ｐ．，米国特許第４，００２，５３１号；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら，米国特許第５，２５２，７１４号）、ＰＥＧのモノアミン誘導体、ＰＥＧのモノ−トリブロモフェニルカルボネート誘導体、ＰＥＧのモノカルボニル−イミダゾール誘導体、ＰＥＧのモノ−トリクロロフェニルカルボネート誘導体、ＰＥＧのモノ−トリフルオロフェニルカルボネート誘導体、ＰＥＧのモノヒドラジド誘導体、ＰＥＧのモノヒドラジン誘導体、ＰＥＧのモノセミカルバジド誘導体、ＰＥＧのモノカルバゼート（ｍｏｎｏｃａｒｂａｚａｔｅ）誘導体、ＰＥＧのモノ−チオセミカルバジド誘導体、ＰＥＧのモノヨードアセトアミド誘導体、ＰＥＧのモノマレイミド誘導体、ＰＥＧのモノ−オルトピリジルジスルフィド誘導体、ＰＥＧのモノ−オキシム誘導体、ＰＥＧのモノ−フェニルグリオキサール誘導体、ＰＥＧのモノ−チアゾリジン−２−チオン誘導体、ＰＥＧのモノチオエステル誘導体、ＰＥＧのモノチオール誘導体、ＰＥＧのモノトリアジン誘導体およびＰＥＧのモノビニルスルホン誘導体。さらなる実施形態では、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモンおよびそれらのアンタゴニストは、共有に係る、同時係属中の米国特許出願第１０／６６９，５９７号（この開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、１以上のポリマーにカップリングされ得る。
【００７２】
（生物活性成分）
上記の通り、本発明の結合体は、１つ以上の生物活性成分に共有結合された、１つのＰＡＧまたはＰＡＯ、および特にＰＥＧの１つの鎖を含む。１つ以上のポリマー（またはそれらの鎖）が共有結合されている生物活性成分は、本明細書中で、種々に、そして等価に、「結合体化した生物活性成分」または「改変された生物活性成分」と言われる。これらの用語は、本明細書中で、「未結合の生物活性成分」、「最初の生物活性成分」または「未改変の生物活性成分」とは区別され、これらの用語は全て、ポリマーが共有結合されていない生物活性成分をいう。しかし、「未結合の」、「未改変の」または「最初の」生物学的成分が、野生型分子またはネイティブ分子と比較した場合、他の非ポリマー結合または改変を含み得、そして本発明による「未結合」、「未改変」または「最初」であると依然として考えられることを理解すべきである。なぜなら、生物活性成分は、本明細書中で「偽ＰＥＧ化」と呼ばれる生物活性成分の場合についてと同様に、ポリマーの結合に関して「未結合」、「未改変」または「最初」であるからである。
【００７３】
用語生物活性成分を「安定化させる」（または「安定化の方法」または「安定化された生物活性成分」）とは、生物活性成分が、本発明の方法に従って安定化されたことを示す（すなわち、本発明の方法に従ってポリマーが共有結合した生物活性成分）。このような安定化された生物活性成分は、安定化されていない生物活性成分（すなわち、ポリマーが共有結合していない生物活性成分）と比較される場合に、特定の変化した生化学的特徴および生物理学的特徴を示す。このような変化された生化学的パラメータおよび生物理学的パラメータには特に、レセプター結合タンパク質に関して、タンパク質分解による分解に対する低下した感受性、および特に、特定の厳しい環境条件または厳しい実験条件のもとでのインキュベーションの間のレセプター結合タンパク質の活性の維持が含まれ得る。本発明の特定の実施形態において、変化した生化学的パラメータおよび生物理学的パラメータとしては、例えば、インビボでの循環における増加した半減期、増加したバイオアベイラビリティ、インビトロでの作用の増加した持続時間などが挙げられ得る。
【００７４】
分子のアミノ末端または天然に存在するグリコシル化部位もしくは変異により導入されたグリコシル化部位から離れたその分子の部分に関連する生物学的（すなわち、生理学的、生化学的、または薬学的）活性を有する、任意のレセプター結合タンパク質（代表的に、サイトカイン）は、本発明において、最初の成分として適切に使用され得る。このような生物活性成分としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。生物活性成分としてはまた、このようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質などのフラグメント、ムテインおよび誘導体が挙げられ、特に、生物学的（すなわち、生理学的、生化学的、または薬学的）活性を有するようなフラグメント、ムテイン、および誘導体が挙げられる。
【００７５】
本発明における生物活性成分として有用な、適切なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質などとしては、その生物活性成分のレセプター結合領域から離れている、ポリマーが選択的に付着し得る１つ以上の利用可能なアミノ基、チオール基、または他の基を有する、任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などが挙げられる。このようなペプチド、ポリペプチドタンパク質、糖タンパク質などとしては、サイトカインが挙げられ、これは、任意の種々の構造を有し得る（Ｎｉｃｏｌａ  Ｎ．Ａ．、前出；Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．、前出）。
【００７６】
例えば、目的の適切なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質としては、４つのαヘリックス束（長鎖サブクラスと短鎖サブクラスとの両方）を含む構造を有するサイトカインのクラスが挙げられるが、これらに限定されない（概説については、Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．、前出を参照のこと）。種々のこのような４ヘリックス束タンパク質は、本発明において使用するために適切であり、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７）；コロニー刺激因子（例えば、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｒｏｚｗａｒｓｋｉ、Ｄ．Ａ．ら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２６：３０４−３１３）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β（ＩＦＮ−β−１ｂが挙げられるが、これに限定されない）およびコンセンサスＩＦＮ）；白血病抑止因子（ＬＩＦ）；エリスロポエチン（Ｅｐｏ）；トロンボポエチン（Ｔｐｏ）；巨核球増殖発生因子（ＭＧＤＦ）；幹細胞因子（ＳＣＦ）（当該分野において、ＳＬ因子としてもまた公知（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９４）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：１１８−１３１；ＭｕｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．ら、（１９９５）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ５８：１４−２２））；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）；神経栄養因子；ならびにこれらのペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。プロラクチンおよび成長ホルモンは、古典的なホルモンであるが、これらは、サイトカインとは異なり、体内で広範に循環する。サイトカインは、通常、それらの標的細胞の近くで産生される。プロラクチンおよび成長ホルモンは、４つのαヘリックス束を有するサイトカインと同じ構造的クラスに属し（Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．、前出；Ｇｏｆｆｉｎ，Ｖ．ら、前出）、そしてこれらは、同様に、ポリマーカップリングのため、および本発明に従う本発明の結合体の産生のための、適切な標的である。
【００７７】
長鎖βシートクラスまたはβバレル構造クラスのレセプター結合タンパク質（概説については、Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．、前出を参照のこと）はまた、本発明の結合体および組成物を調製する際に使用するために適切である。これらとしては、サイトカインの腫瘍壊死因子ファミリー（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＦａｓリガンド（これらは、βゼリーロール構造を示す））；ＩＬ−１（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを含む）ならびにＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−４およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ；ＦＧＦ−７）が挙げられる）ファミリー（これらは、β三葉型折り畳みを示す（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．、前出；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ら、前出））；ＩＬ−１２；ＩＬ−１６；上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｌｕ，Ｈ．−Ｓ．ら、前出）；ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（トランスフォーミング増殖因子−αおよびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）が挙げられる）、および神経増殖因子（これらは、シスチンノット（ｃｙｓｔｉｎｅ−ｋｎｏｔ）構造を採用する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明の結合体および組成物において有利に使用されるタンパク質のさらなる構造クラスは、ジスルフィドリッチな混合α／βサイトカインおよび増殖因子のクラスであり（概説については、Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．、前出を参照のこと）、このクラスとしては、ＥＧＦファミリー（これは、β曲折（ｂｅｔａ−ｍｅａｎｄｅｒ）構造を有する）；ＩＬ−８；ＲＡＮＴＥＳ；好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）；間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）；単球化学誘引物質タンパク質（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３）；エオタキシン（例えば、エオタキシン−１、エオタキシン−２およびエオタキシン−３）；骨髄性前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）；ニューロタクチン、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；増殖関連癌遺伝子／黒色腫増殖刺激活性（ＧＲＯ−α／ＭＧＳＡ）；ソマトメジン；ならびにインスリンおよびインスリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合体および組成物において有用な関連する構造クラスのタンパク質は、モザイク構造を有するサイトカインであり、これには、ＩＬ−１２および肝細胞増殖因子のような増殖因子が挙げられる（Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．、前出）。
【００７９】
目的の他のタンパク質としては、成長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；Ｔｃｈｅｌｅｔ，Ａ．ら（１９９７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３０：１４１−１５２を参照のこと）およびそのアンタゴニスト（例えば、Ｓｕｎｄｓｔｒｏｅｍ，Ｍ．ら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：３２１９７−３２２０３を参照のこと）、プロラクチンおよびそのアンタゴニスト、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、色素ホルモン、視床下部ホルモン放出因子、抗利尿ホルモン、ならびに上記構造クラスの全てのサイトカインおよび増殖因子のレセプター結合アンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。多くのこのようなタンパク質は、グリコシル化形態と非グリコシル化形態との両方で存在する。非グリコシル化形態は、原核生物において組換えＤＮＡ技術を使用するそれらの産生から生じ得るか、または化学合成を使用するそれらの産生から生じ得る。このような非グリコシル化産物は、本発明の適切な生物活性成分であるペプチドおよびタンパク質の範囲内である。最後に、いくつかの抗体は、レセプター結合アゴニストまたはレセプター結合アンタゴニストとして機能するが（例えば、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃ．，ら（２０００）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５９（補遺Ｉ）：ｉ１０９−ｉ１１４を参照のこと）、このような免疫グロブリンは、本発明の範囲内のＮ末端ポリマーカップリングのための適切な候補ではない。すなわち、これらは、ＲＮレセプター結合タンパク質ではない。なぜなら、軽鎖と重鎖との両方のアミノ末端領域が、抗原認識に関与するからである。
【００８０】
本発明のポリマー結合体を調製する際に使用するための生物活性成分として特に有用なものは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ｈＧＨ、プロラクチン、インスリン、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）である。特に有用なものはまた、このような生物活性成分のムテインおよびフラグメントであり、特に、対応する野生型ポリペプチドまたはインタクトなポリペプチドについてのレセプターに結合し得るものである（この結合が生物学的効果または生理学的効果を誘導しようとそうでなかろうと）。特定のこのような実施形態において、生物活性成分のムテインおよびフラグメントは、対応するリガンドに対するアンタゴニストとして作用し得、これは、リガンドのそれらのレセプターへの結合を減少させるか、かなり減少させるか、もしくは完全に阻害し、そして／またはそれらの標的細胞、標的組織および／もしくは標的生物のリガンドの活性を減少させるか、かなり減少させるか、もしくは完全に阻害する。他のアンタゴニスト（これは、目的のリガンドの構造的なアナログ、ムテイン、改変体または誘導体であってもそうでなくてもよい）もまた、本発明に従う結合体の調製のために適切である。実際問題として、所定のムテイン、フラグメント、改変体、誘導体またはアンタゴニストが、所定のリガンドの生物学的効果および／または生理学的効果と拮抗するか否かは、過度の実験をすることなく、そのリガンド自体の生物学的効果／生理学的効果についてのアッセイを使用して決定され得、その種々のアッセイは、当該分野において周知であり、そして／または本明細書中に記載される。
【００８１】
本発明に従って有利に使用される、これらおよび他の目的のポリペプチドについての構造（一次構造、二次構造、三次構造、および適用可能な場合、四次構造）は、当該分野において周知であり、そして当業者に馴染み深い。特に、本明細書中および本明細書中に援用される参考文献（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に提供される構造の観点で、そうである。
【００８２】
（結合体）
本発明は、種々の適用において使用するための、生物活性成分（特に、サイトカイン）の安定な結合体を提供する。このような本発明の結合体は、当該分野において公知の結合体の以下の非限定的かつ例示的な比較によって示されるように、当該分野において以前に公知であったものより優れた多数の利点を有する。
【００８３】
Ｈ．Ｈｉｒａｔａｎｉ（欧州特許番号ＥＰ  ０  ０９８  １１０Ｂ１および米国特許第４，６０９，５４６号）は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマー（「ＰＥＧ−ＰＰＧ」、ＰＡＧの一般的なクラスのメンバー）と、タンパク質（インターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる）との結合体を開示し、ここで、レセプター結合に関与するタンパク質の領域の回避に関する優先は、開示されていない。これらの参考文献において、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγは、本発明とは異なり、ＰＡＧの結合のための等価な標的とみなされた。本発明において、インターフェロン−γは、Ｎ末端結合のための適切な標的とみなされない。なぜなら、アミノ末端がサイトカインのレセプター結合領域内にあるからである。さらに、Ｈｉｒａｔａｎｉは、１ｋＤａ〜１０ｋＤａのＰＡＧのみを用いて合成された結合体を開示し、一方で、本発明の方法は、治療適用のために、１０ｋＤａを超える分子量を有する水溶性の合成ポリマーの結合を好む。同様に、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ（（１９９０）前出）は、５ｋＤａのｍＰＥＧのより多数の鎖をヒト組換えインターロイキン−２に結合させることによって、得られる結合体の、マウスおよびウサギの血流における半減期が増加することを開示する。しかし、この参考文献は、本発明によって提供されるような、より少ない数のより長いＰＥＧ鎖の結合の利点も、単一の高分子量のＰＥＧ鎖をＩＬ−２のアミノ末端へと結合する利点も、開示も認識もしなかった。
【００８４】
Ｇ．Ｓｈａｗ（米国特許第４，９０４，５８４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０５８２４Ａ２）は、アミン反応性ポリマーの部位選択的な付着を、標的タンパク質（特に、Ｅｐｏ、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−２）におけるリジン残基の導入、置換または欠失により誘導するための方法を開示する。しかし、本発明の開示とは異なり、これらの参考文献は、アミン反応性ポリマーが、リジン残基のεアミノ基以外の標的タンパク質における任意のアミンと反応し得ることを開示せず、このことは、明らかに、これらの開示を、本発明から区別する。
【００８５】
Ｄ．Ｅ．Ｎｉｔｅｃｋｉら（米国特許第４，９０２，５０２号）は、ＰＥＧの種々のクロロホルメート誘導体（これらは、リジン残基のεアミノ基と反応することが意図された）から調製された、マルチＰＥＧ化ＩＬ−２結合体を開示する。しかし、本発明とは対照的に、この参考文献は、レセプター結合に関与するＩＬ−２タンパク質の領域におけるリジン残基のＰＥＧ化を回避するための方法も、このような部位の回避が有利であることのいかなる意識も、開示しない。
【００８６】
Ｎ．Ｋａｔｒｅら（米国特許第５，２０６，３４４号）は、ＰＥＧが、リジン残基のεアミノ基とか、１２５位（アミノ末端から数える）に天然に存在するシステイン残基の対になっていないスルフヒドリル基とか、またはＩＬ−２のアミノ末端から最初の残基と２０番目の残基との間に変異により導入されたシステイン残基のスルフヒドリル基と結合体化している、ＰＥＧ−ＩＬ−２結合体を開示する。’３４４号特許に開示されるムテインには、「ｄｅｓ−ａｌａ−１」ＩＬ−２（すなわち、アミノ末端のアラニンが欠失され、そしてＰＥＧ化されていないムテイン）が含まれる。しかし、本開示と対照的に、’３４４特許は、レセプターへの結合に関与するアミノ酸残基へのＰＥＧの結合を回避するためのいかなる方法も、このようなアプローチが有利であるといういかなる認識も、開示しない。この概念に一致し、そして本発明とは対照的に、’３４４特許において提唱される広範な付着点は、ＰＥＧをＩＬ−２のアミノ末端に結合体化させることが、特に有利であることを示唆しない。
【００８７】
Ｓ．Ｐ．Ｍｏｎｋａｒｓｈら（１９９７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４７：４３４−４４０およびＳ．Ｐ．Ｍｏｎｋａｒｓｈら（１９９７）Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２０７−２１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．は、インターフェロン−α−２ａを、３倍モル過剰の、５，３００ダルトンの分子量を有する活性化ＰＥＧと反応させることにより、モノＰＥＧ−インターフェロンの１１種の位置異性体（インターフェロン−α−２ａにおける１１個のリジン残基に対応する）が生成されることを開示する。ＰＥＧがインターフェロンのアミノ末端のαアミノ基に結合した、ＰＥＧ−インターフェロンは、報告されなかった。これらの参考文献において報告された１１個の位置異性体は、細胞培養物中で、非改変型インターフェロンの６％〜４０％の範囲の抗ウイルス活性、および細胞培養物中で、非改変型インターフェロンの９％〜２９％の範囲の抗増殖活性を示した。このような結果は、これらの調査者によって実施されたリジン残基のランダムなＰＥＧ化が、本発明の方法によって調製された結合体とは対照的に、そのレセプターによって媒介されるインターフェロン−α−２ａの機能を妨害することを明らかに実証する。さらに、本発明の結合体とは異なり、これらの参考文献において報告される結合体において、Ｎ末端をＰＥＧ化されたインターフェロンは、存在しなかった。
【００８８】
Ｏ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（米国特許法定発明登録番号Ｈ１６６２）は、活性化された「ポリエチレングリコールメチルエーテルアルデヒド」をシアノホウ素化水素ナトリウムによって、ｐＨ７．０（インターフェロン結合体について）またはｐＨ７．１５（ＩＬ−２結合体について）で還元的アルキル化することによって調製された、インターフェロン−α、インターフェロン−γおよびＩＬ−２の結合体を開示する。しかし、このような方法によって調製される結合体は、複数のポリマー付着の部位（これらの全ては、リジン残基のεアミノ基上にあると報告された）の存在に明らかに起因して、非改変型タンパク質の生物活性の９５％までを失ったことが報告されている（本発明の図１および４を参照のこと）。
【００８９】
Ｄ．Ｋ．Ｐｅｔｔｉｔら（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２３１２−２３１８は、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）のポリマー結合体を開示する。しかし、この参考文献において報告される結合体化したＩＬ−１５は、レセプター結合に関与するタンパク質の領域におけるリジン残基にポリマーを結合させることの結果として、そのＩＬ−２様増殖促進能力を失うのみでなく、これはまた、作動よりむしろ拮抗を示した。これらの著者らは、ＩＬ−１５がいくつかの細胞表面レセプターのうちの１つに結合することの選択的阻害が、ポリマー結合体化の結果であり得ること、およびこのような阻害が、レセプター結合を低下させ得るのみでなく、そのタンパク質の生物学的効果を逆転させ得ると結論付ける。レセプター結合タンパク質のレセプターとの相互作用に関与する部分へのポリマーの結合を回避することによって、本発明は、ポリマー結合の望ましくない結果を回避する。
【００９０】
Ｊ．Ｈａｋｉｍｉら（米国特許第５，７９２，８３４号および同第５，８３４，５９４号）は、タンパク質（インターフェロン−α、ＩＬ−２、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）およびＩＬ−１レセプターのアンタゴニストが挙げられる）の、ウレタン連結ＰＥＧ結合体を開示し、これらは、報告によれば、それぞれのタンパク質の免疫原性を低下させ、溶解度を増加させ、そして生物学的半減期を増加させるために調製された。これらの参考文献において、ＰＥＧは、「種々の遊離アミノ基」と結合され、Ｎ末端ＰＥＧ化に関する言及もなく、Ｎ末端αアミノ基がＰＥＧ化され得ることもＰＥＧ化されるべきであることも開示されない。これらの特許はまた、そこに開示される結合体が、出発タンパク質の元々の生物学的活性「の少なくとも一部を有し」、従って、かなりの生物活性の損失の可能性があることを示すことを言及する。この結果は、それらの特許に開示される標的化されないＰＥＧ化方法の使用に一致する。本発明とは対照的に、これらの特許は、その特許に開示されるＰＥＧ化プロセスの選択性を変化させることによって、それらの結合体の生物活性の保持を改善するいかなる試みも開示しない。
【００９１】
Ｏ．Ｂ．Ｋｉｎｓｔｌｅｒら（欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ８２２  １９９  Ａ２）は、ポリ（エチレングリコール）を、ポリペプチド（特に、コンセンサスインターフェロンおよびＧ−ＣＳＦ（これらは、この特許出願の譲受人であるＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって製造されるタンパク質のうちの２つである））のアミノ末端のアミノ酸のαアミノ基と反応させるためのプロセスを開示する。この刊行物は、「上記αアミノ基を選択的に活性化させるために十分に酸性のｐＨ」が、開示されるプロセスの必要な特徴であることを示す。対照的に、本発明によって、ｐＨを低下させることによって、ＰＥＧアルデヒドとのアミノ基の反応性が低下すること、および上記αアミノ基は、プロトン化されない場合に（すなわち、そのｐＫａより高いｐＨにおいて）より反応性であることが発見された。従って、本発明者らは、ｐＨが、本発明のＲＮサイトカイン結合体のいずれの「αアミノ基を選択的に活性化させるためにも十分に酸性で」はないことを見出す。Ｊ．Ｔ．Ｅｄｓａｌｌ（前出）およびＲ．Ｓ．Ｌａｒｓｅｎら（（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２：８６１−８６９）によって与えられる、Ｎ末端αアミノ基の、アルデヒドとの反応性のｐＨ依存性の説明は、本発明者らの経験とより適合性である。さらに、Ｋｉｎｓｔｌｅｒらは、得られる結合体の増加した均一性、およびプロテイナーゼによる分解からのアミノ末端の保護のための、ペプチドのＮ末端ＰＥＧ化の使用を報告するが、Ｎ末端ＰＥＧ化が特定のレセプター結合タンパク質のレセプター結合活性のより大きい部分を保存し得ることを開示しない（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１１９５３；欧州特許番号ＥＰ  ０  ７３３  ０６７  Ｂ１、ならびに米国特許第５，７７０，５７７号、同第５，８２４，７８４号、および同第５，９８５，２６５号（全て、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．Ｂ．ら）を参照のこと）。
【００９２】
Ｋｉｎｓｔｌｅｒらの欧州出願（ＥＰ  ０  ８２２  １９９  Ａ２）はまた、全てのポリペプチドに対するＮ末端ＰＥＧ化の利点を一般化する。これは、本発明者らの経験ではなかった。具体的には、抗体分子のアミノ末端は、抗体タンパク質の抗原結合領域の近くに存在するので（Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：５３１−５４５）、抗体のＮ末端ＰＥＧ化は、Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．Ｓ．ら、前出によって開示されるように、リジン残基のランダムなＰＧＥ化と比較して、生物活性に対して予測不可能に有害である。同様に、「ＲＮ」レセプター結合タンパク質ではないレセプター結合タンパク質（例えば、インターフェロン−γ（図８を参照のこと））のＮ末端ＰＥＧ化は、このようなレセプター結合タンパク質のリジン残基のランダムなＰＥＧ化よりも、レセプターとの相互作用を阻害すると予測される。
【００９３】
従って、上記のように、本発明の方法は、本発明の結合体が、ＲＮレセプター結合タンパク質として選択された１つ以上のサイトカインまたはそのアンタゴニストを、１つ以上のポリマーと、そのリガンドと１つ以上のそのポリマーとの混合物を、約５．６〜約７．６のｐＨ；約５．６〜約７．０のｐＨ；約６．０〜約７．０のｐＨ；約６．５〜約７．０のｐＨ；約６．６〜約７．６のｐＨ；約６．６〜約７．０のｐＨ；または約６．６のｐＨで形成することによって、結合させることによって調製する点で、本明細書中に引用される刊行物においてＫｉｎｓｔｌｅｒらによって開示されたものと区別される。対照的に、Ｋｉｎｓｔｌｅｒらの方法は、５．５未満のｐＨでのリガンドの結合体化に依存する。このｐＨ範囲は、離れたＮ末端アミノ酸および／または離れたグリコシル化部位において、ポリマーと選択的に結合体化したリガンドの調製物の調製のために最適ではないか、または劣っていることを、本発明者らは見出した。
【００９４】
Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｂ．ら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２３１１４および米国特許出願公開番号２００３／００２１７６５  Ａ１）は、抗ウイルスアッセイにおいて非グリコシル化インターフェロン−β−１ｂより活性な、グリコシル化インターフェロン−β−１ａのポリマー結合体を開示する。Ｐｅｐｉｎｓｋｙらが、５ｋＤａまたは２０ｋＤａのｍＰＥＧを、ＩＦＮ−β−１ａのアミノ末端に、還元的アルキル化によって結合体化させると、抗ウイルス効力に対するＰＥＧ化の影響は観察されず、一方で、より高分子量のＰＥＧの結合体化は、この効力を低下または排除した。この参考文献はまた、ポリアルキレングリコールが、グリコシル化タンパク質の種々の部位（アミノ末端、カルボキシル末端および糖質部分が挙げられる）において種々の結合基を介して、インターフェロン−β−１ａに結合され得ることを開示する。しかし、この刊行物に開示される方法は、一般化可能であるとは言及されない：「これらの研究は、インターフェロン−β−１ａとインターフェロン−β−１ｂとの間の配列の保存にもかかわらず、これらが異なる生化学的実体であり、従って、インターフェロン−β−１ｂに関して既知であることの多くが、インターフェロン−β−１ａに対して適用され得ず、そして逆もまたそうであることを示す」。対照的に、本発明は、本明細書中に規定されるような、「ＲＮ」レセプター結合タンパク質および「ＲＧ」レセプター結合タンパク質に現われる共通の特徴を開示する。本発明によれば、インターフェロン−β−１ａとインターフェロン−β−１ｂとの両方が、「ＲＮ」レセプター結合タンパク質である。さらに、インターフェロン−β−１ｂは、「ＲＧ」レセプター結合タンパク質である。したがって、ＷＯ  ００／２３１１４の方法とは対照的に、本発明の方法は、インターフェロン−β−１ｂとインターフェロン−β−１ａとの両方の、安定な生物活性結合体を調製するために有用である。
【００９５】
Ｚ．Ｗｅｉら（米国特許第６，０７７，９３９号）は、水溶性ポリマー（特に、ＰＥＧ）を、ポリペプチド（特に、エリスロポエチン）のＮ末端α炭素原子に結合するための方法を開示し、ここで、Ｎ末端アミノ酸のα炭素のアミンが、まずαカルボニル基にアミノ交換され、これが次いで、ＰＥＧ誘導体と反応されて、オキシム結合またはヒドラゾン結合を形成する。この参考文献の開示される目的は、タンパク質に一般的に適用可能な方法を開発することであったので、特定のレセプター結合タンパク質のＰＥＧ化部位としてのアミノ末端の選択から生じ得る、レセプター結合活性の保存に対して、何も考慮はなされなかった。従って、Ｗｅｉらの開示とは対照的に、本発明は、Ｎ末端αアミノ基の除去を必要とせず、逆に、Ｎ末端αアミノ基の電荷を、そのタンパク質とポリマーとの間の二次アミン結合の形成の間中、中性のｐＨで維持し得る。
【００９６】
Ｃ．Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔら（米国特許第６，０４２，８２２号；欧州特許番号ＥＰ  １  ０３９  ９２２  Ｂ１）は、ＰＥＧ−インターフェロン−α−２ｂの位置異性体の混合物の望ましさを開示し、ここで、特に望ましい異性体は、インターフェロン−α−２ｂのヒスチジン残基（特に、ヒスチジン−３４）に結合したＰＥＧを有し、そしてヒスチジン−３４へのＰＥＧ結合が不安定であることを実証する。ヒスチジン−３４は、シグナル伝達を誘発する目的でインターフェロンレセプターと密接に接触しなければならない領域において、インターフェロン−α−２ｂの表面に存在するので（本明細書の図１ｂを参照のこと）、これらの参考文献に開示される、ＰＥＧとヒスチジン−３４との間の結合の不安定性は、そこに開示されるＰＥＧ−インターフェロン結合体の機能のために重要であるようである。実質的に純粋なヒスチジン結合タンパク質ポリマー結合体が、Ｓ．Ｌｅｅら、米国特許第５，９８５，２６３号によって記載された。対照的に、本発明は、１つの好ましい結合体が、ＰＥＧが、インターフェロン成分のレセプター結合ドメインから離れた部位で安定に結合している、ＰＥＧ−インターフェロン結合体であることを実証する。
【００９７】
Ｐ．Ｂａｉｌｏｎら（（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２：１９５−２０２）は、インターフェロン１分子あたり１分子の４０−ｋＤａジ−ｍペグ−リジンでペグ化されるインターフェロン−α−２ａが４つの主要な位置異性体からなることを開示している。この参考文献は、このペグのほとんど全てが、アミド結合によってリジン３１、１２１、１３１または１３４に付着され、これらリジンの各々は、インターフェロン−α−２ａのレセプター結合領域内またはレセプター結合領域（Ｂａｉｌｏｎらによると、残基２９−３５および１２３−１４０；本明細書の図１ａ参照のこと）に隣接することを開示している。Ｎ−末端のペグ化は、Ｂａｉｌｏｎらに報告されていない。インビトロでのＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシの腎臓細胞の水疱性口炎ウイルス感染に対する単離された混合物の位置異性体のペグ−インターフェロンの抗ウイルス活性は、試験された、結合体化されていないインターフェロン−α−２ａのものの７％であると報告された。Ｎ−末端にペグ化されたインターフェロンを含まないこれらのペグ−インターフェロン結合体について観察された生物活性の実質的な減少は、Ｂａｉｌｏｎらの結合体と本発明の結合体とをこのようにはっきりと区別している。
【００９８】
Ｒ．Ｂ．Ｐｅｐｉｎｓｋｙら（（２００１）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９７：１０５９−１０６６）は、（１）Ｎ−末端のメチオニン残基を有するグリコシル化されたインターフェロン−β−１ａおよび（２）２０−ｋＤａペグ−アルデヒド由来の結合体の合成を開示している。その参考文献において、Ｎ−末端のメチオニンでモノペグ化されると称される結合体は、抗ウイルスアッセイにおいて十分な生物活性を保持すると言われている。これらの著者は、グリコシル化されたインターフェロン−β−１ａのペグ化のためのＮ−末端部位の選択が、部位選択ペグ化試薬および分子モデリングの利用によって決定されることを開示しているが、彼らは「いくつかの効果が生成物に特異的である」と認識している。さらに、本発明とは対照的に、その中に報告されている所見は、本明細書中で「ＲＮ」レセプター結合タンパク質として定義されるクラスのレセプター結合タンパク質を含むことを一般化していなかった。
【００９９】
Ｊ．Ｂｕｒｇら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０２０１７Ａ２）は、エリスロポエチン糖タンパク質のアルコキシペグ結合体の生成を開示しており、ここで、メトキシペグの１〜３本の鎖は、この糖タンパク質の表面上のリジン残基のεアミノ基の改変によって化学的に導入されたスルフヒドリル基で反応された。しかしながら、本発明とは対照的に、この参考文献は、ペグとエリスロポイエチンのＮ末端のアミノ酸の遊離αアミノ基とを結合しようとするいかなる試みも、エリスロポイエチンレセプターとの相互作用に必要不可欠であるエリスロポイエチン糖タンパク質の領域のリジン残基を改変することを避けようとするいかなる試みも開示していない。
【０１００】
Ｊ．Ｂｕｒｇら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／４９６７３Ａ２）は、ペグ化前および糖タンパク質のリジン残基の全てのεアミノ基の可逆的なシトラコニル化後に開裂される選択的に開裂可能なＮ末端のペプチド伸長を使用するプロセスによる天然および変異のエリスロポイエチン糖タンパク質のＮ末端にアミド連結されたペグ結合体の合成を開示している。この参考文献において開示された多段階プロセスについての原理は、同質のモノペグ化された結合体を生成するためにそのペグ化プロセスをＮ末端アミノ酸の遊離αアミノ基についての選択的として、それによって、多数のペグ化された誘導体からモノペグ化された結合体を分離する必要性を避けることであった。この方法は以下：（１）Ｂｕｒｇらのアプローチは、アミド結合によってアルコキシペグが連結されるエリスロポイエチン糖タンパク質に限定されるが、他方本発明は、種々の合成ポリマーを使用して結合される種々の生物活性成分に適用可能であり；（２）本発明は、グリコシル化ならびに非グリコシル化の「ＲＮ」および「ＲＧ」レセプター結合タンパク質の両方に適用するが、他方、Ｂｕｒｇらは、糖タンパク質の結合体化のみを開示しており；（３）本発明は、アルコキシペグ（例えば、ｍペグ）、および単官能基が活性化されるヒドロキシペグの両方を包含するが、他方、Ｂｕｒｇらは、アルコキシペグの使用のみを開示しており；および（４）本発明において、ポリマーとこのタンパク質との間の第２級アミン結合が、Ｂｕｒｇらによって使用されるアミド結合より好ましい（なぜなら本発明は、より安定で、アミノ基上の正電荷を保存しているからである）、に限定されないが、これらを含む多くの重要な点で、本発明の方法とは異なる。同じグループからの類似の研究において、Ｊ．Ｂｕｒｇら（米国特許第６，３４０，７４２号）は、エリスロポイエチン糖タンパク質のアミド結合された結合体の生成を開示しており、ここで、アルコキシペグの１〜３本の鎖は、タンパク質の１〜３個のアミノ基に結合される。しかしながら、本発明とは対照的に、この参考文献は、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基についての優先性もレセプターとの相互作用に関与する領域でないアミノ基についての優先性も報告していない。
【０１０１】
Ｃ．Ｄｅｌｇａｄｏら（米国特許第６，３８４，１９５号）は、トレシルモノメトキシペグとして表され、その明細書中で「ＴＭペグ」と称される反応性ポリマーを使用して調整される顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の結合体を開示している。この参考文献は、ＴＭペグが組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦと接触する場合、「改変された物質は、活性を有さない種および改変されていない物質より高い活性を有する種を含むことを示す」。当業者が容易に理解するように、活性を有さない種は、生物活性ポリマー成分の結合体の混合物（特にそのような結合体を含む治療上の使用についての組成物）において好ましくないので、それらは有益な効果に寄与せずに、そのような投与を必要とする患者に結合体を投与することの危険性の原因となり得る。本明細書中で記されているように、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦおよびレセプター結合活性に関与するタンパク質上の部位での他のレセプター結合タンパク質の改変を避けることによって、少なくとも部分的に当該分野におけるこの制限を克服し、それによって、活性を有さない種の合成を減少または除去する。本発明はまた、ポリマーによるタンパク質の異なるサイズ、異なる電荷および／または異なる電荷の遮蔽の範囲を有する結合体の分画および精製のための方法を提供する（図９〜１２参照のこと）。
【０１０２】
米国特許第６，３８４，１９５号は、ＧＭ−ＣＳＦのＮ末端のペグ化について述べておらず、それによって、本発明の方法の利点を認識していないことは特筆すべきである。最終的に、米国特許第６，３８４，１９５号は、ＧＭ−ＣＳＦ分子上のペグ分子が付着される（リジン残基に結合される以外の）場所を考慮せずに、１つより多くのペグがＧＭ−ＣＳＦの各々の分子に結合される結合体についての優先性を示す。ＧＭ−ＣＳＦ一つにつき６個までのペグ分子を有する結合体についての優先性を述べることによって、その参考文献は、ペグが全ての可能なリジン残基に付着され得、それによって、ペグが細胞表面レセプターへのタンパク質の接近したアプローチを立体的に阻害する位置に付着され得ることを確実にする結合体についての優先性を述べている（本明細書の図３参照のこと）。対照的に、本発明はリジン残基が、レセプターとの相互作用およびそれによって、シグナル伝達に必要不可欠であるレセプター結合タンパク質の領域から離れているか（アゴニストの場合において）、またはシグナル伝達を競合的に阻害する（アンタゴニストの場合において）場合を除いて、リジン残基に結合するペグが望ましくないことを示す。
【０１０３】
Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／３２９５７Ａ１）は、エリスロポイエチンレセプターのための結合体の親和性を減少させるが、エリスロポイエチン糖タンパク質の５２位でのリジン残基のεアミノ基に結合されるペグの分子量の増加は、インビボでの結合体のエリスロポイエチン効果を増加させることを開示している。しかしながら、本発明とは対照的に、この参考文献は、アミノ末端または近接したグリコシル化部位でのペグの結合を開示しておらず、そのようにすることのいかなる利点も認識していない。
【０１０４】
従って、本発明は、以前に開示されたものと別の構造および機能的利点を有する合成ポリマーに結合される生物活性成分の結合体を提供する。
【０１０５】
（組成物）
本発明は、１個以上の生物活性成分、適切に１個以上のより安定化ポリマー（例えば、１個以上のペグ）に結合される、１個以上のサイトカインを含む結合体または複合体を提供する。代表的に、そのような結合体は、本明細書中に記載された本発明の方法によって生成され；しかしながら、本明細書中に記載された構造および活性を有する結合体は、そのような結合体を生成するために使用される方法にかかわらず、本方法によって生成されたものに相当するとみなされるので、本発明に包含される。関連した局面において、本発明はまた、１個以上のそのような結合体または複合体を含む組成物を提供する。本発明のこの局面による組成物は、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個など）の上記の本発明の結合体または複合体を含む。特定のそのような局面において、組成物は１個以上のさらなる成分（例えば、１個以上の緩衝塩、１個以上のカオトロピック剤、１個以上の界面活性剤、１個以上のタンパク質（例えば、アルブミンまたは１個以上の酵素）、１個以上の非結合性ポリマー、１個以上の浸透活性剤など）を含み得る。本発明のこの局面の組成物は、固体（例えば、乾燥粉末）または溶液（特に本発明の１個以上の結合体を含む生理的に適合する緩衝された塩溶液の形態）を含む、任意の形態であり得る。
【０１０６】
（Ａ．薬学的組成物）
本発明の特定の組成物は、予防、診断または治療の適用における使用のための薬学的組成物としての使用のために特に処方される。そのような組成物は、代表的に、本発明の１個以上の結合体、複合体または組成物および１個以上の薬学的に受容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含む。本明細書中で使用される「薬学的に受容可能なキャリヤーまたは賦形剤」という用語は、添加の結果生じる有害作用を有さずに、薬学的組成物が取り込まれるヒトまたは他の哺乳動物を含む、レシピエント動物に許容され得る、非毒性の固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈液、カプセル化物質または任意のタイプの補助的な処方物を言う。
本発明の薬学的組成物は、任意の適切な投与方法（例えば、経口、直腸、非経口、全身内部、経膣、腹腔、局所（粉末、軟膏、点滴または経皮貼布によって）、経口または鼻腔用スプレーまたは吸入によって頬側）によって受容体に投与され得る。本明細書中で使用される「非経口」という用語は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、大槽内、皮下ならびに間接内注射および注入を含む投与の方法を言う。
【０１０７】
非経口のための本発明によって提供される薬学的組成物は、薬学的に受容可能な無菌水溶液もしくは非水溶液、分散、懸濁液または乳濁液、ならびに、使用する前に無菌注射剤または分散に水を加えてもとに戻すための無菌粉末を含み得る。適切な水溶液および非水溶液キャリヤー、希釈剤、溶剤またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロールなど、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール））、カルボキシメチルセルロースおよびその適切な混合物、植物性油脂（例えば、オリーブオイル）、ならびに注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性が、例えば、コーティング物質（例えば、レシチン）の使用、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、保持され得る。
そのような本発明の薬学的組成物はまた、アジュバント（例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）を含み得る。微生物の作用の防止は、種々の殺菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含によって確実にされ得る。それはまた、浸透圧物質（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）含むことを所望され得る。注射可能な薬学的形態の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレート、ヒドロゲルおよびゼラチン）の包含によって、引き起こされ得る。
【０１０８】
いくつかの場合において、薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉注射からの吸収を遅延させることが所望される。これは、水溶性の体液中で低い溶解度を有する結晶質または非晶質の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収の速度は、その溶解の速度に依存し、次に、その物理的形状に依存し得る。代替的に、非経口的に投与された薬物形態の遅らせた吸収は、油ビヒクル中で薬物を溶解または懸濁することによって達成され得る。
【０１０９】
蓄積注射形態は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）においてマイクロカプセルに入れた薬物のマトリックスを形成することによって作製される。使用されるキャリヤーポリマーおよび天然の特定のキャリヤーポリマーの薬物の割合に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、生体適合性ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。蓄積注射製剤はまた、体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を閉じ込めることによって調整される。
【０１１０】
注射用の製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用する前に滅菌水中もしくは他の無菌注射剤媒体中で溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り込むことによって滅菌され得る。
【０１１１】
経口投与のための固体投薬形態は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒を含む。そのような固体投薬形態において、活性成分は、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリヤー（例えば、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムおよび／またはａ）充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアゴム
）、ｃ）湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）（例えば、グリセロール）、ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、ｅ）溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、ｆ）吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物）、ｇ）湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）、ｈ）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレー）、およびｉ）滑択剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ペグ、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物））と混合される。カプセル、錠剤、丸剤の場合において、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。
【０１１２】
類似のタイプの固体組成物もまた、ラクトース（乳糖）のような賦形剤、ならびに高分子量ＰＥＧなどを使用して、軟らかい充填ゼラチンカプセルおよび硬い充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用され得る。
【０１１３】
錠剤、糖剤、カプセル、丸剤ならびに顆粒の固体投薬形態は、コーティングおよび殻（例えば、腸またはクロノモジュレート（ｃｈｒｏｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）コーティングおよび薬学的処方の分野において周知である他のコーティング）を用いて調製され得る。それらは必要に応じて、不透明の薬剤を含み得、また、それらは活性成分のみを放出するか、または必要に応じて、遅延様式において胃腸管のある特定の部分に優先的に放出するような組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、重合体物質およびワックスが挙げられる。活性成分はまた、適切な場合、１つ以上の上記賦形剤を有するマイクロカプセルに入れた形態であり得る。
【０１１４】
経口投与についての液体の投薬形態としては、薬学的に受容可能な乳濁液、水溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体の投薬形態は、当該分野において一般的に使用される不活性な希釈剤（例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ＰＥＧおよびソルビタン脂肪酸エステル、ならびにその混合物））を含み得る。
【０１１５】
不活性な希釈剤に加えて、経口組成物はまた、アジュバント（例えば、界面活性剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味料および香料）を含み得る。
【０１１６】
活性成分に加えて、懸濁液は、懸濁化剤（例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、トラガカント、およびその混合物）を含み得る。
【０１１７】
局所投与は、肺および眼の表面を含む、皮膚または粘膜への投与を含む。吸入のための投与を含む、局所投与についての組成物は、加圧され得るか、または加圧され得ない乾燥粉末として調整され得る。加圧されない粉末組成物において、細かく分けられた形態の活性成分は、例えば、直径で１００ミクロメートルまでのサイズを有する粒子を含む、より大きなサイズの薬学的に受容可能な不活性なキャリヤーを有する混合物中で使用され得る。適切な不活性なキャリヤーは、糖（例えば、ラクトースおよびスクロース）を含む。好ましくは、活性成分の粒子の少なくとも９５重量％は、０．０１〜１０ミクロメートルの範囲における効果的な粒子サイズを有する。
【０１１８】
代替として、薬学的組成物は、加圧され得、圧縮ガス（例えば、窒素または液化ガス噴霧剤）を含み得る。液化性の噴霧剤媒体および実際には全組成物は、活性成分が任意の十分な程度まで、その中に溶解しないことが好まれ得る。加圧された組成物はまた、界面活性剤を含み得る。界面活性剤は、液体もしくは固体の非イオン性界面活性剤であり得るか、または固体の陰イオン性界面活性剤であり得る。ナトリウム塩の形態において、固体の陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
【０１１９】
さらに局所投与の形態は眼への投与である。この投与の方法において、本発明の結合体または組成物は、薬学的に受容可能な眼のビヒクルにおいて送達されるので、活性成分は、成分を粘膜または角膜および眼の内部の領域（例えば、前房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜および強膜）に浸透することを可能にするために、十分な時間の間、成分を眼の表面と接触することを保持される。薬学的に受容可能な眼のビヒクルは、例えば、軟膏剤、植物油またはカプセル化している物質である。
【０１２０】
直腸投与または膣投与のための組成物は、好ましくは、適切な非刺激性の賦形剤またはキャリヤー（例えば、カカオ脂、ペグまたは坐薬ワックス）を有する本発明の結合体または組成物を混合することによって調整され得る坐薬であり、それは室温で固体であるが、体温で液体であるので、それによって、直腸または膣の窩で溶け、薬物を放出する。
【０１２１】
本発明の治療方法で使用される薬学的組成物はまた、リポソームの形態で投与され得る。当該分野において公知であるように、リポソームは一般的に、リン脂質または他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水溶性の培地中で分散される単一層状の水和結晶または多層状の水和結晶によって形成される。任意の非毒性で、リポソームを形成し得る薬学的に受容可能および代謝可能な脂質が使用され得る。本発明の１つ以上の結合体または組成物に加えて、リポソーム形態における本薬学的組成物はまた、１つ以上の安定剤、防腐剤、賦形剤などを含み得る。好ましい脂質は、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソーム形態の方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓら，米国特許第５，３９５，６１９号参照のこと）。ペグに結合されるリン脂質を含むリポソーム、通常、モノメトキシペグに結合されるホスファチジルエタノールアミンは、哺乳類の血液循環において寿命を延長させることを含む、有益な特性を有する（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ，米国特許第６，１３２，７６３号）。
【０１２２】
（Ｂ．使用）
本明細書中の他の場所に記載されたように、本発明の方法、結合体および組成物は、それらのレセプターに結合するための生物学的成分の能力を妨げずに、生物学的成分の生物活性を保持または高めるための方法において有利に使用される。本発明の特定のそのような方法は、１つ以上の結合体および組成物を細胞、組織、器官または生物体に送達することを必要とし得る。特に、本発明は、細胞、組織、器官または生物体に結合体、複合体または組成物の１つ以上の制御された送達を提供し、それによって、細胞、組織、器官または生物体に活性を放出される特定の成分の量を、時間的および空間的に、規制するための能力を有する使用者に提供する。
【０１２３】
一般に、本発明のそのような方法は、１つ以上の活性を含む。例えば、本発明のそのような１つの方法は、以下：（ａ）本明細書中で述べられたような、本発明の１つ以上の結合体または組成物を調整する工程；および（ｂ）細胞、組織、器官または生物体への本発明の１つ以上の結合体または組成物の結合を有利にする条件下で、１つ以上の細胞、組織、器官または生物体を１つ以上の結合体または組成物に接触する工程を含む。いったん、本発明の結合体および／または組成物の生物活性成分が、細胞、組織、器官または生物体に結合される（または、いくつかの場合において、内在化される）と、その成分は、それらの意図された生物学的機能の実行へ進む。例えば、ペプチド成分は細胞、組織、器官または生物体上もしくは内で、レセプターまたは他の成分に結合し得；細胞、組織、器官または生物体内の代謝反応に関係し；細胞、組織、器官または生物体内の１つ以上の酵素活性を増加もしくは活性化、または減少もしくは阻害することを実行し；細胞、組織、器官または生物体に失っている構造上の成分を提供し；細胞、組織、器官または生物体に１つ以上の栄養性の必要物を提供し；疾患または身体疾患の１つ以上の進行または兆候を阻害、処置、転換または改善し；その他同様のことをする。
【０１２４】
さらなる実施形態において、本発明の結合体および組成物は、産業用の細胞培養に使用され得、それらの生物活性の十分な保持の組み合わされた効力の結果として取得される結合体の生物活性成分の予想外に高い効力に起因し、産業用の使用の条件下でさえ、作用の持続時間を増加させる。本結合体のこれらの予想外に高い効力は、著しく高い生物体生成物、著しく高いレベルの組み換えタンパク質の発現、およびバイオプロセスの有効性における他の改良をもたらし得る。
【０１２５】
（Ｃ．用量レジメン）
本発明の結合体、複合体または組成物は、それに１つ以上の生物活性成分（すなわち、１つ以上のサイトカインまたはそのアンタゴニスト）を送達するために、細胞、組織、器官もしくは生物体にインビトロ、エキソビボまたはインビボで投与され得る。当業者は、与えられた活性化合物、結合体、複合体または組成物の有効な量は、経験的に決定され得、また純粋な形態で使用され得、または、ここでそのような形態は、薬学的に受容可能な処方物もしくはプロドラッグの形態で存在する。本発明の化合物、結合体、複合体もしくは組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて獣医学または薬学的組成物としてその必要とする動物（哺乳類（例えばヒト）を含む）患者に投与され得る。任意の特定の患者についての治療的に有効量のレベルは、達成されるための細胞の反応のタイプおよび度合いを含む種々の要因；使用される特定の化合物、結合体、複合体もしくは組成物の同一性および／または活性；患者の年齢、体重または表面積、身体全体の健康、性別および食事；投与時間、投与経路、および活性化合物の排出の割合；処置の期間；特定の化合物、結合体、複合体または組成物と組み合わせてもしくは同時に使用される他の薬物；ならびに薬学的および医学的分野における当業者に周知であるような要因次第である。例えば、本発明の与えられた化合物、結合体、複合体または組成物の投与量を、所望される治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで始めて、所望される効果が達成されるまで、投薬量を除々に増加させることは当業者に周知である。
【０１２６】
用法はまた、当該分野において認容および慣例の技術（例えば、サイズ排除、イオン交換もしくは逆相高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、バイオアッセイまたは免疫学的アッセイ）によって決定された、血液中の与えられた活性化合物の所定の濃度を提供するために、患者特定の様式において調整され得る。このように、患者の用量レジメンは、医学、薬学および／または薬理学分野における当業者に慣用されもしくは周知の方法に従って、ＨＰＬＣまたは免疫学的検定によって測定された、比較的一定の血中濃度を達成するために調整され得る。
【０１２７】
（Ｄ．診断的使用および治療的使用）
本発明の結合体の診断的使用は、動物（特に、ヒト）の身体内において、サイトカインに対する異常に高い結合能を有する細胞または組織（例えば、癌）を、本発明の結合体または組成物の投与によって位置付けるためであり得、その結合体（または１つ以上の成分（すなわち、生理活性成分および／または合成ポリマー））は、標識されているか、あるいは当該分野で公知の方法に従う検出（例えば、光学的検出、放射測定検出、蛍光検出、または共鳴検出による）を可能にするような１種以上の検出可能な標識を含む。例えば、非小細胞肺癌の大部分は、異常に高濃度の上皮増殖因子レセプターを発現する（Ｂｕｎｎ，Ｐ．Ａ．ら（２００２）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９（Ｓｕｐｐｌ  １４）：３８〜４４）。従って、本発明の別の局面において、本発明の結合体および組成物は、診断方法または治療方法において、例えば、種々の身体的障害に対する素因を有するかまたはそのような障害に罹患している動物（特に、哺乳動物（例えば、ヒト））においてそのような障害を診断、処置、または予防する際に、使用され得る。そのようなアプローチにおいて、治療の目的は、上記障害の発症を遅延または予防すること、および／あるいは上記障害を治癒すること、上記障害の寛解を誘導すること、または上記障害の寛解を維持すること、および／あるいは他の治療レジメンの副作用を減少もしくは最小にすることである。
【０１２８】
従って、本発明の結合体、複合体、および組成物は、身体的障害（例えば、感染症または疾患）の防御、抑制、または処置のために使用され得る。身体的障害からの「防御」という用語は、本明細書中で使用される場合、「予防」、「抑制」および「処置」を包含する。「予防」とは、上記疾患または身体的障害を誘導する前に本発明の複合体または組成物を投与することを包含し、一方、「抑制」とは、上記疾患の臨床的出現の前に上記結合体または組成物を投与することを包含する。従って、身体的障害の「予防」および「抑制」は、代表的には、上記障害の素因があるかまたは上記障害に対して感受性であるが未だ上記障害に罹患はしていない、動物において行われる。しかし、身体的障害の「処置」とは、上記疾患の出現後に本発明の治療結合体または治療組成物を投与することを包含する。ヒトおよび脊椎動物の医療において、身体的障害を「予防すること」と「抑制すること」とを区別することが常に可能であるわけではないことが、理解される。多くの場合、最終的誘導事象は、未知または潜在的であり得、患者も医師も、その誘導事象が出現した充分に後になるまで、その誘導事象に気づかないかもしれない。従って、本明細書中で定義される「予防すること」および「抑制すること」の両方を包含するために、「処置」とは別個に用語「予防」を使用することが、一般的である。従って、本発明の方法に従って使用される用語「防御」とは、「予防」を包含することになる。本発明のこの局面に従う方法は、医師が上記の治療目標を達成するのを可能にする、１つ以上の工程を包含し得る。本発明のそのような一方法は、例えば、（ａ）身体的障害に罹患しているかまたはそのような障害に対する素因がある動物（好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト））を同定する工程；および（ｂ）その動物に、有効量の本明細書中に記載される本発明の一つ以上の結合体、複合体または組成物を投与し、その結合体、複合体、または組成物の投与によって、その動物における身体的障害の発症が予防、遅延もしくは診断されるか、またはその身体的障害が治癒されるかもしくはその身体的障害の寛解が誘導されるようにする工程を包含し得る。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、身体的障害に「対する素因がある」動物とは、その障害の複数の明白な身体的症状を示さないが、遺伝的、精神的、または他の様式でその障害を発症する危険がある動物として、定義される。本方法において、所定の身体的障害の素因があるかまたはその障害の危険があるかまたはその障害に罹患している動物の同定は、当業者が精通している標準的な当該分野で公知の方法（例えば、放射線学的アッセイ、生化学的アッセイ（例えば、動物から得たサンプルにおける、特定のペプチド、タンパク質、電解質などの相対レベルのアッセイ）、外科的方法、遺伝的スクリーニング、家族歴、身体触診、病理試験または組織学的試験（例えば、組織もしくは体液のサンプルもしくは塗抹の顕微鏡評価、免疫学的アッセイなど）、体液（例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、精液など）の試験、画像化（例えば、放射線画像化、蛍光画像化、光学的画像化、共鳴画像化（例えば、核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）または電子スピン共鳴（「ＥＳＲ」）を使用する）などが挙げられる）に従って達成され得る。一旦、動物がこのような１種以上の方法によって同定されると、その動物は、上記身体的障害を予防、抑制、遅延、または治癒するために、積極的および／または前向きに処置され得る。
【０１３０】
本発明の結合体、複合体、組成物、および方法を用いて予防、診断、または処置され得る身体的障害としては、上記結合体または組成物の生理活性成分（代表的には、そのサイトカインまたはそのアンタゴニスト）が上記の予防、診断、または処置において使用され得る、任意の身体的障害が挙げられる。そのような障害としては、種々の癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、白血病、リンパ腫、肺癌、神経学的癌、皮膚癌、頭部および頚部の癌、骨の癌、結腸癌および他の胃腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、ならびに他の癌腫、肉腫、腺腫、および骨髄腫）；医原性疾患；感染性疾患（例えば、細菌疾患、真菌疾患、ウイルス疾患（肝炎、心臓向性ウイルスにより引き起こされる疾患、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどを含む）、寄生生物疾患など）；遺伝的障害（例えば、嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ポーンプ病、重症複合型免疫不全障害、小人症など）、貧血、好中球減少症、血小板減少症、血友病、および他の血液障害；神経変性障害（例えば、多発性硬化症（「ＭＳ」（再発性弛張性ＭＳ、原発性進行性ＭＳ、続発性進行性ＭＳなどが挙げられるが、これらに限定されない）、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病など）；酵素障害（例えば、痛風、尿毒症、高コレステロール血症など）；不特定病因または多病巣性病因の障害（例えば、心血管疾患、高血圧、炎症性腸疾患など）；自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、乾癬など）、ならびに当業者が容易に精通している医学的に重要な他の障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合体、複合体、組成物、および方法はまた、疾患の進行の予防において、例えば、前悪性病変から悪性病変への進行の化学的予防において、使用され得る。
【０１３１】
従って、本発明の治療方法は、必要とされる動物に種々の投与経路によって投与され得る本発明の１種以上の結合体、複合体、または組成物、あるいは本発明の薬学的組成物のうちの１種以上を使用し、上記投与経路としては、経口投与、直腸投与、非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、槽内投与、皮下投与、ならびに関節内注射および関節内注入を包含する）、全身内投与、膣内投与、腹腔内投与、局所投与（粉末、軟膏、点滴、または経皮パッチによる）、口腔内投与、口腔スプレーまたは経鼻スプレー、または吸入による投与が挙げられる。本発明によって、有効量の上記結合体、複合体、または組成物が、特定の障害に罹患しているかまたはその障害に対する素因がある細胞または動物に、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで投与され得、それによって、その動物においてその障害が予防、遅延、診断、または処置される。本明細書中で使用される場合、「有効量の結合体（または複合体または組成物）」とは、その結合体（または複合体または組成物）が、その結合体、複合体、または組成物の生理活性成分（すなわち、サイトカインまたはそのアンタゴニスト）の生物学的活性を実行し、それによって、本発明の結合体、複合体、または組成物が投与された動物においてその身体的障害を予防、遅延、診断、処置、もしくは治癒する、量を指す。当業者は、有効量の本発明の結合体、複合体、または組成物は、薬学および医学の分野において当業者にとって周知である標準的方法に従って、経験的に決定され得ることを認識する。例えば、Ｂｅｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら編（１９９９）Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，第１７版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．ら編（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｔ．Ｍ．ら編（１９９７）Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，第４版，Ａｄｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．Ｇ．（２０００）Ｂａｓｉｃ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．第８版，Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これらの参考文献およびその中に引用された参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１３２】
ヒト患者に対して投与される場合、本発明の結合体、複合体、および組成物の全一日投与量、全一週間投与量、または全一ヶ月間投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解される。例えば、満足のいく結果が、使用される具体的な生理活性化合物に依存する適切な投与量にて特定の本発明の結合体、複合体、または組成物を投与することによって得られ、その投与量は、当業者が容易に精通しているか、または慣用的な実験のみを使用して経験的に容易に決定され得る。本発明のこの局面によると、上記結合体、複合体、または組成物は、１回で、または分割投与で（例えば、１日当たり１回もしくは２回、または１週間当たり１回もしくは２回、または１ヶ月間当たり１回もしくは２回など）投与され得る。種々の投与経路（例えば、非経口経路、皮下経路、筋肉内経路、眼内経路、鼻内経路など）についての適切な投与レジメンもまた、慣用的実験のみを使用して経験的に容易に決定され得るか、または当業者にとって容易に明らかであり、それは、上記結合体、複合体、または組成物の生理活性成分（すなわち、サイトカインもしくはそのアンタゴニスト）の正体に依存する。
【０１３３】
さらなる適用において、本発明の結合体、複合体、および組成物は、診断剤または治療剤を、上記結合体、複合体、または組成物の生理活性成分（すなわち、サイトカインまたはそのアンタゴニスト）のレセプターを発現するか、その生理活性成分を結合するか、その生理活性成分を組み込むか、またはその生理活性成分を取り込み得る、細胞、組織、器官、または生物に特異的に標的化するために使用され得る。本発明のこの局面に従う方法は、例えば、上記細胞、組織、器官、または生物を、本発明の１種以上の結合体、複合体、または組成物（これらは、１種以上の診断剤または治療剤をさらに含む）と接触し、その結果、上記結合体、複合体、または組成物が、上記細胞、組織、器官、または生物によって結合されるかもしくは取り込まれ、それによって上記診断剤または治療剤が上記細胞、組織、器官、または生物に送達される、工程を包含し得る。本発明のこの局面に従って使用される診断剤または治療剤は、核酸、有機化合物、タンパク質もしくはペプチド、抗体、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、元素、脂質、糖質、同位体、炭化水素、画像化剤、検出プローブ、またはこれらの任意の組み合わせ（これらは、本明細書中に記載されるように検出可能に標識され得る）から選択される少なくとも１種の因子であり得るが、これらに限定はされない。本発明のこの局面において使用される治療剤は、上記標的細胞（または組織、器官、もしくは生物）に対する治療効果を有し得、この効果は、欠損遺伝子もしくは欠損タンパク質の修正、薬物作用、毒性効果、増殖刺激効果、増殖阻害効果、代謝効果、異化効果、同化効果、抗ウイルス効果、抗真菌効果、抗細菌効果、ホルモン効果、神経液効果、細胞分化刺激効果、細胞分化阻害効果、神経調節効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インスリン刺激効果もしくはインスリン阻害効果、骨髄刺激効果、多能性肝細胞刺激効果、免疫系刺激効果、および本発明のこの局面に従う送達系を介して細胞（または組織、器官、もしくは生物）に送達される治療剤により提供され得る他の公知の任意の治療効果から選択されるが、これらに限定されない。
【０１３４】
そのようなさらなる治療剤は、公知および新規な化合物および組成物（抗生物質、ステロイド類、細胞傷害剤、血管作用剤、抗体および他の治療剤を包含する）から選択され得るが、これらに限定されない。そのような因子の非限定的例としては、抗生物質、および細菌性ショックの処置において使用される他の薬物（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ナフシリン、非経口セファロスポリンなど）；副腎皮質ステロイドおよびそのアナログ（例えば、デキサメタゾン）（これは、エンドトキシンにより引き起こされる細胞傷害を緩和する）；血管作用性薬物（例えば、αアドレナリン作用性レセプター遮断剤（例えば、フェノキシベンズアミン）、βアドレナリン作用性レセプターアゴニスト（例えば、イソプロテレノール）、およびドーパミンが、挙げられる。
【０１３５】
本発明の結合体、複合体、および組成物はまた、疾患の診断のため、および治療応答をモニターするために、使用され得る。特定のこのような方法において、本発明の結合体、複合体、または組成物は、１種以上の検出可能な標識（例えば、本明細書中の他の場所に記載される標識）を含み得る。具体的なそのような方法において、本発明の検出可能に標識されたこれらの結合体、複合体、または組成物は、上記結合体、複合体、または組成物の生理活性成分（すなわち、サイトカインまたはそのアンタゴニスト）のレセプターを発現するかもしくはその生理活性成分を取り込む、細胞、組織、器官、もしくは生物を検出するために使用され得る。そのような方法の一例において、上記細胞、組織、器官、または生物は、本発明の結合体、複合体、または組成物のうちの１つ以上と、上記細胞、組織、または生物による（例えば、上記結合体の細胞表面レセプターへの結合によるか、または上記細胞中への上記結合体のピノサイトーシスもしくは拡散による）上記結合体の結合もしくは取り込みを支持する条件下で接触され、その後、使用される標識に特異的な検出手段（例えば、経口標識された結合体についての蛍光検出；磁気標識された結合体についての磁気共鳴画像化；放射標識結合体についての放射性画像化など）を使用して、上記細胞に結合したかまたは取り込まれた結合体が、検出される。検出可能に標識されたそのような結合体の他の用途としては、例えば、有効量の本発明の結合体の１つ以上の標識形態を投与してその細胞、組織、器官、または生物（もしくは動物）に関係する検出可能な放射線を測定することによる、細胞、組織、器官、もしくは生物の画像化、または動物（ヒトを含む）の内部構造の画像化が挙げられ得る。診断画像化剤および治療画像化剤における種々の型の標識を検出する方法およびその使用は、当業者にとって周知であり、本明細書中の他の場所に記載されている。
【０１３６】
別の局面において、本発明の結合体および組成物は、上記結合体の生理活性成分の特異的なレセプターの濃度または活性を、そのようなレセプターを発現する細胞表面上で調節するための方法において、使用され得る。所定のレセプターの活性を「調節すること」によって、上記結合体は、上記レセプターに結合した際に、そのレセプターを介して媒介される生理学的活性（例えば、細胞内シグナル伝達カスケード）を活性化または阻害のいずれかを行うことが、意味される。本発明の結合体の調節活性についてのいかなる特定の機構的説明によっても拘束されることは意図しないが、そのような結合体は、細胞レセプターの生理学的活性を、上記結合体の生理活性成分を介して上記レセプターに結合することによってアンタゴナイズし得、それにより、天然のアゴニスト（例えば、非結合型生理活性成分）の結合をブロックし、そしてその天然のアゴニストによるそのレセプターの活性化を妨げると同時に、そのレセプター自体の生理学的活性の実質的な活性化は誘導しない。本発明のこの局面に従う方法は、１つ以上の工程（例えば、上記細胞を（これは、インビトロで行っても、インビボで行ってもよい）本発明の結合体のうちの１つ以上と、その結合体（すなわち、上記結合体の生理活性成分部分）が、上記細胞表面上の生理活性成分のレセプターには結合するがそのレセプターを実質的には活性化しない条件下で、接触させる工程）を包含し得る。そのような方法は、当業者が容易に認識するように、種々の診断適用および治療適用において有用である。
【０１３７】
（キット）
本発明はまた、本発明の結合体および／または組成物を含むキットを提供する。そのようなキットは、代表的には、密に閉じ込められた状態で、１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、シリンジなど）を有するキャリア（例えば、箱、ボール紙、チューブなど）を備え、第一容器は、本発明の結合体および／または組成物のうちの１つ以上を含む。本発明のこの局面によって包含されるキットは、本発明の結合体および組成物の１種以上の特定の適用を実行するために必要な１種以上のさらなる成分（例えば、試薬および化合物）（例えば、特定の疾患または身体的障害のために有用な１種以上の成分（例えば、１種以上のさらなる治療化合物もしくは治療組成物、１種以上の診断試薬、１種以上のキャリアもしくは賦形剤など）、本発明の１種以上のさらなる結合体または組成物など）をさらに含み得る。
【０１３８】
本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合が、本発明の範囲からもそのいかなる実施形態からも逸脱することなくなされ得ることが、当業者にとって容易に明らかである。ここに本発明が詳細に記載されているが、本発明は、以下の実施例に対する参照によってより明確に理解される。以下の実施例は、例示のためだけに本明細書中に包含され、本発明の限定であることは意図されない。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１：ＰＥＧ−インターフェロンα結合体）
インターフェロンαは、２００１年に２億米ドルを超える世界市場を有する、主にＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染を有する患者の処置のための商業的に重要な医療タンパク質である。米国において、３００万人〜４００万人の人々が、慢性Ｃ型肝炎に罹患し、約１０，０００件のＨＣＶ関連死が毎年生じる（Ｃｈａｎｄｅｒ，Ｇ．ら（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６：５１３５〜５１４４）。ＩＦＮ−αの有用性を改善する試みにおいて、その開発および市販を主に担う会社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ．およびＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ）の両方が、モノメトキシプロピル（エチレングリコール）すなわち「ｍＰＥＧ」とＩＦＮ−αとの結合体を開発して市販した。各場合において、ｍＰＥＧは、唯一の結合点においてインターフェロンαの各分子に連結される。各場合において、その製品は、非改変型インターフェロンと比較して顕著に減少したレセプター結合活性を有する、位置異性体の混合物を含む。各場合において、その結合体の増加したバイオアベイライビリティおよび作用期間は、１週間当たり１回のその結合体の注射の改善された臨床的有効性によって測定した場合、１週間当たり３回のその非改変型タンパク質の注射と比較して、慢性ＨＣＶ感染症の処置について、ＰＥＧ結合体化から生じるインビトロでの減少した生理活性をインビボではより補償する（Ｍａｎｎｓ，Ｍ．Ｐ．ら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：９５８〜９６５）。
【０１４０】
Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  ＲｏｃｈｅのＰＥＧ−インターフェロンα２ａ結合体において、２本の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ鎖が、１つのリジンリンカーに結合しており（いわゆる、「分枝型ＰＥＧ」）、このリンカーは、主に、Ｌｙｓ３１、Ｌｙｓ１２１、Ｌｙｓ１３１またはＬｙｓ１３４のうちの１つに連結される（Ｂａｉｌｏｎ，Ｐ．ら（前出））。これらはすべて、インターフェロンα２ａのレセプター結合ドメイン内にあるかまたはそのドメインに近接する（図１ａの結合部位１を参照のこと）。
【０１４１】
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ．のＰＥＧ−インターフェロンα２ｂ結合体において、一本の１２ｋＤａ  ｍＰＥＧ鎖が、３４位のヒスチジン残基に優先的に結合している（Ｈｉｓ３４；Ｗｙｌｉｅ，Ｄ．Ｃ．ら（前出）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｗ．ら、米国特許第６，０４２，８２２号；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ら（前出））。このヒスチジン残基は、レセプターへの結合のために重要な領域中にある（図１ｂ参照）。Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈの製品における他のＰＥＧ結合部位（Ｌｙｓ１２１、Ｔｙｒ１２９およびＬｙｓ１３１）もまた、結合部位１（図１ｂ）内またはその付近にあることが観察されている。
【０１４２】
これらの２つの商業製品とは対照的に、本発明の結合体は、Ｎ末端アミノ酸残基に結合した一本の水溶性合成ポリマー（好ましくは、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）鎖を有し、このＮ末端残基は、このタンパク質のレセプター結合領域とは離れている（図１ｃおよび１ｄにおけるＣｙｔｓ−１と結合部位との間の空間的関係を参照のこと）。このことは、インターフェロンαが、「ＲＮ」サイトカインであることを示す。図９および図１０は、本発明の例示的ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の、それぞれ、カチオン交換クロマトグラムおよびサイズ排除クロマトグラムを示す。この反応混合物は、さらなるメチオニン残基がアミの末端のＣｙｓ−１（これは、天然配列の最初の残基である）の前に存在する、インターフェロンα２ｂを含んだ。この反応性ＰＥＧは、２０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒドであった。これは、０．２ｍＭ濃度で存在した。還元剤は、最終濃度１４ｍＭのナトリウムシアノボロヒドリドであった。この反応の進行を、４℃でインキュベーションする間にサイズ排除クロマトグラフィーによって定期的にモニターした。ＩＦＮ−αは、記載された条件下でＰＥＧ化されるために充分に可溶性であったが、他のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−β）は、より可溶性が低い。他のサイトカインは、Ｃ．Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔら（米国特許第５，７１１，９４４号）によってＩＮＦ−αについて記載され、Ｒ．Ｂ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（米国特許第５，７３８，８４６号）によってインターフェロンαおよびインターフェロンβについて記載されるように、界面活性剤の存在下でＰＥＧ化される必要があり得る。
【０１４３】
図９に示される分画のために使用したカチオン交換カラムは、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＭＤ−Ｇ  ＳＰ（１×６．８ｃｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｅ，ＰＡ）であり、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中の０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配を用いて、流量０．５ｍＬ／分で展開させた。図１０におけるデータを得るために使用したサイズ排除カラムは、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００（ＨＲ  １０／３０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であり、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中で０．５ｍＬ／分にて溶出させた。他の適切なイオン交換クロマトグラフ媒体およびサイズ排除クロマトグラフ媒体ならびに分画条件は、当業者にとって公知である。本発明の精製モノＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂの自動Ｅｄｍａｎ分解によるアミノ末端アミノ酸分析は、このＰＥＧのうちの＞９０％がそのＮ末端残基に結合していることを示した。この分析は、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）によって実施された。
【０１４４】
（実施例２：ＰＥＧ−インターロイキン２結合体）
インターロイキン２（「ＩＬ−２」）は、特定の癌（腎細胞癌腫および悪性黒色腫を含む）に対する免疫調節活性を示すサイトカインである。しかし、臨床的効力は乏しく、わずかな割合の患者しか部分的応答も完全応答も経験しないという結果である（Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ，Ｄ．Ｍ．ら（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２５：１８５〜１８７）。ＩＬ−２は、血流中での短い半減期を有し、これは、癌患者における寛解の低い誘導速度に関係付けられる。リジン残基のランダムＰＥＧ化によってＩＬ−２をより有用にある試みは、最適ではなかった（Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ａ．ら（２０００）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９３：２４８〜２５９）。ＰＥＧをそのグリコシル化部位（Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ら（前出））または非必須システイン（Ｃｙｓ  １２５）にてＩＬ−２に選択的に結合する試み、またはＰＥＧを残基１と残基２０との間にシステインを含むＩＬ−２のムテイン（Ｋａｒｔｅ，Ｎ．ら、米国特許第５，２０６，３４４号）に選択的に結合する試みは、臨床的に有用な生成物をもたらさなかった。
【０１４５】
図４は、ＩＬ−２のレセプター−結合領域に対するリジン残基の分布を示し、これは表面にアクセス可能なリジン残基が多く、レセプター結合に関与する領域内にあることを示している。実際、Ｌｙｓ−３５およびＬｙｓ−４３は、ＩＬ−２についてα−レセプターと相互作用するのに必要とされるものとして同定されており、これはリジン残基のＰＥＧ化によるＩＬ−２の不活性化のための機構を示唆している。図４はまた、ＩＬ−２のＮ−末端領域が、このタンパク質のレセプター結合領域から離れていることも示し、これはＩＬ−２が、「ＲＮ」サイトカインの構造を有することを示す。ＩＬ−２は、「ＲＮ」サイトカインであるという発明者らの結論は、Ｈ．Ｓａｔｏら（（２０００）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １１  ：  ５０２−５０９）の観察と矛盾しない。Ｓａｔｏらは、酵素学的なグルタミン転移を用いて１０−ｋＤａ  ｍＰＥＧの一本鎖または二本鎖を、これらの著作者らが、Ｎ−末端の伸長の際、ＩＬ−２変異タンパク質へ導入したＡＱＱＩＶＭ配列中の、一個または二個のグルタミン残基（「Ｑ」）に対して結合させた。Ｓａｔｏらは、そのムテインのトランスグルタミネーションによってアミノ末端付近でＰＥＧ化したそれらの結合体が、ＩＬ−２ムテイン中リジンのランダムなＰＥＧ化によって調製した結合体よりもより多く生理活性を保持することを報告した。他のタンパク質をＰＥＧ化する類似するアプローチの概説については、Ｓａｔｏ，Ｈ．（２００２）（前出）を参照のこと。図４に示すように、タンパク質のレセプター結合領域からＩＬ−２のアミノ末端の空間的な分離に基づいて、Ｔｈｒ−３残基におけるグリコシル化部位（示さず）が、本明細書中に定義するように、ＩＬ−２を「ＲＧ」レセプター−結合タンパク質にすることが理解され得る。従って、ＩＬ−２は、ＲＮサイトカインおよびＲＧサイトカインの両方である。
【０１４６】
図１１および図１２は、実施例１のようにＮ−末端の選択的な還元性アルキル化によって、ＰＥＧ化した、本発明の例示的なＰＥＧ−ＩＬ−２結合体のカチオン交換クロマトグラムおよびサイズ−排除クロマトグラムをそれぞれ示す。分画のために用いた条件は、図９および図１０について記載した条件とそれぞれ同一であった。図１３は、図１１に示すように、イオン交換クロマトグラフィーによって精製する前後の、同一結合体のドデシル硫酸ナトリウム存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動  （「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）分析を示す。このゲルは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（カタログ番号ＮＰ０３３５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）における４％〜１２％の全アクリルアミドの勾配を含んだ。それぞれ約１ｍｃｇ〜２ｍｃｇのタンパク質を含むサンプルを、分析前に９０℃で１０分間加熱した。このゲルを、冷却しながら約１３５分間、１１７〜１２０の定電圧で電気泳動した。このゲルの一部を、Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて染色し、そして他のタンパク質部分を、Ｃ．Ｅ．Ｃｈｉｌｄｓの方法（（１９７５）Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０：１９０−１９２）およびＢ．Ｓｋｏｏｇ（（１９７９）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ３７：３４５−３４９）の適用によってＰＥＧについて染色した。図１１の二つのピークの各々における精製したモノＰＥＧ−ＩＬ−２の自動化エドマン分解によるアミノ末端のアミノ酸分析は、９０％を越えるＰＥＧが、Ｎ−末端残基に結合したことを示した。この分析は、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）によって実施された。
【０１４７】
（実施例３：「ＲＮ」レセプター−結合タンパク質クラスのメンバーおよび非メンバー）
図２、図３および図５〜図８は、そのレセプター結合領域に対するレセプター−結合タンパク質のインターフェロン−β、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、上皮細胞増殖因子（「ＥＧＦ」）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」、また「ＦＧＦ−２」として当該分野において公知）、インスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）およびインターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）のリジン残基の表面分布を示し、ならびにこれらタンパク質は、「ＲＮ」サイトカインおよび増殖因子であることを示す。さらに、図２は、インターフェロン−βが、「ＲＧ」サイトカインであることを示す。
【０１４８】
図２は、インターフェロン−βの結合部位１および結合部位２の領域全体に分布したリジン残基を示す。それに対してポリペプチド鎖のアミノ末端は、そのタンパク質のレセプター結合領域から離れており、これはＩＦＮ−βが、ＲＮサイトカインであることを示す。
【０１４９】
図３は、ＧＭ−ＣＳＦのαレセプターに結合する結合部位１およびβレセプターに結合する結合部位２の領域全体に分布するリジン残基を示す。それに対してポリペプチド鎖のアミノ末端は、そのタンパク質のレセプター結合領域から離れており、これはＧＭ−ＣＳＦが、ＲＮサイトカインであることを示す。
【０１５０】
図５は、上皮細胞増殖因子（「ＥＧＦ」）のポリペプチド鎖に沿って分布したリジン残基を示し、これは、このタンパク質のレセプター結合領域中またはその付近のリジン残基を含む。それに対して、このポリペプチド鎖のアミノ末端は、このタンパク質のレセプター結合領域からより離れている。
【０１５１】
図６は、レセプターまたはヘパリンに対する結合に関係する塩基性繊維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）のいくつかのリジン残基を示す。レセプターまたはヘパリンの両方は、ｂＦＧＦによるシグナル伝達に必要である。（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ら、前出）。ｂＦＧＦのアミノ末端は、ｂＦＧＦのヘパリン−結合領域から離れており、ｂＦＧＦをＲＮ増殖因子にするためにレセプター結合部位から十分に離れ得る。
【０１５２】
図７は、インスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）のいくつかのリジン残基が、ポリペプチドのレセプター結合領域内であるか、またはそれに隣接することを示す。それに対してＩＧＦ−１のアミノ末端は、レセプター結合ドメインから離れており、これはＩＧＦ−１が、ＲＮ増殖因子であることを示す。
【０１５３】
図８は、インターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）が、二つのポリペプチド鎖が、広範な相互作用を有する二量体として存在することを示す。各ポリペプチドのいくつかのリジン残基は、レセプターに対する結合に関係しているＩＦＮ−γのアミノ酸残基に隣接するか、または二量体化境界にある。アミノ酸残基Ｇｌｎ−１の「球および棒（ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ）」型は、このＮ−末端残基の機能的重要性についての証拠を示すことを意図する。（この図が基づく結晶構造は、天然のタンパク質には存在しない「Ｍｅｔ０」と標識した包含される付加的なメチオニン残基を含む。ＩＦＮ−γのＮ−末端残基が、二量体化境界面から離れているために、Ｎ−末端のＰＥＧ化は、ＩＦＮ−γのホモ二量体化におけるリジンのＰＥＧ化の抑制効果を回避し得る。一方、そのレセプターとの二量体の相互作用は、特にポリマーの長い鎖が、結合される場合、おそらくアミノ末端へのポリマーのカップリングによって阻害される。
【０１５４】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０および幹細胞因子は、ホモ二量体として機能するサイトカインの例である（Ｗａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、前出；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ｋ．ら、（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１３５５２−１３５５７；ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．ら、前出）。レセプター結合タンパク質の二量体化は、そのＮ−末端のモノＰＥＧ化結合体の特徴づけに対する特有の問題点を示す。それは、異なる可能な分子構造は、類似のまたは同一の大きさおよび形状を有する結合体の調製に存在し得るためである。例えば、一つのジＰＥＧ化単量体および一つの非ＰＥＧ化単量体から成る二量体（ＰＥＧ２−タンパク質１＋タンパク質１）は、二量体の結合体の最大の大きさに基づく分析（例えば、サイズ−排除クロマトグラフィーまたは沈殿係数、光散乱計数もしくは拡散係数の評価）によって二つのＮ−末端ＰＥＧ化単量体（ＰＥＧ１−タンパク質１）２から成る二量体と区別することは困難であるかまたは不可能であるが、タンパク質単量体あたり平均１ＰＥＧをそれぞれ含有するこれら二つの結合体のレセプター結合能力は、全く異なり得る。
【０１５５】
ホモ三量体（例えば、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」））を形成する長鎖βシートレセプター結合タンパク質について、ＰＥＧ３−タンパク質３三量体のアイソマーの数は、ホモ二量体として溶液中に生じるレセプター結合タンパク質についての数よりもさらに多い。アミノ末端に近接するＴＮＦの化学的改変が、このサイトカインを非活性化することを示しているため（Ｕｔｓｕｍｉ，Ｔ．ら、（１９９２）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：７７−８１）、ＴＮＦ−αは、試薬を用いてＰＥＧ化した場合、およびＮ−末端残基について選択的である条件化において、実質的な活性を保持しないようである。
【０１５６】
オリゴマーとして機能するサイトカインの結合体の特徴付けのために、分析方法の併用を、必要とする。アミノ末端配列分析は、遊離Ｎ−末端αアミノ基を有する単量体の存在を検出し得、そして解離単量体の電気泳動分析（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはキャピラリー電気泳動）は、レセプター結合タンパク質の非ＰＥＧ化単量体よび複数のＰＥＧ化単量体の存在を示し得る。このような証拠がない場合、このようなホモ二量体形成タンパク質およびホモ三量体形成タンパク質のようなモノＰＥＧ化結合体の合成が、明白に示され得る。
【０１５７】
これらの例は、特に図１〜８に図のモノペグ化結合体の合成を用いて例証するように、これらの生物学活性構成要素のレセプター結合ドメイン内またはこのドメインに隣接するレセプター結合タンパク質のＰＥＧ化によるタンパク質−レセプター相互作用の立体障害の潜在的な役割を理解するために簡単に可視化した基本を提供する。高度に伸長しかつ可撓性のあるＰＥＧ鎖（図１ｄを参照のこと）によって占められる大きな体積はまた、ＰＥＧが、単量体間の相互作用のために必要とされることが報告されている領域内に結合している場合、機能的ホモ二量体または機能的ホモ三量体への特定のレセプター結合タンパク質の単量体の結合を立体的に妨げた。従って、レセプター結合タンパク質のレセプター結合領域から離れている部位に対するＰＥＧ化の標的化は、ＰＥＧ化が、分子間相互作用の機能に必要とされる分子間相互作用に干渉する可能性を減少させる。本発明の方法による処置によって、レセプター結合タンパク質のＰＥＧ化から予期されるさらなる利点を、実現し得る。生じた結合体は、改善した溶解性、増加したバイオアベイラビリティー、より大きな安定性および減少した免疫原性の予期される利点を予想外に高い生物活性の保持と結びつける。
【０１５８】
（実施例４：還元性アルキル化によるインターフェロン−β−１ｂのＰＥＧ化）
一連の実施形態において、モノメトキシＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を有するインターフェロン−β−１ｂ（「ＩＦＮ−β−１ｂ」、配列番号１）の結合体を、還元試薬としてボラン−ピリジン複合体を使用して２０ｋＤａまたは３０ｋＤａのｍＰＥＧ−アルデヒドを用いる還元性アルキル化によって合成した（Ｃａｂａｃｕｎｇａｎ，Ｊ．Ｃ．ら、前出）。インターフェロン−β−１ｂ（キャリアタンパク質が無くかつ約３ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する溶液中約１．９ｍｇ／ｍＬの濃度において）を、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）より入手した。このタンパク質は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇによって直接に販売される処方物中の「ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）」と同じように、Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ａ  Ｕ．Ｓ．  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧによって販売される処方物中で「ＢＥＴＡＦＥＲＯＮ（登録商標）」と称される。ボラン−ピリジン複合体（Ａｌｄｒｉｃｈ  １７，９７５−２，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を、６０％（ｖ／ｖ）の水溶性アセトニトリル中に４５０ｍＭ  ボランまで希釈した。２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒド（「ＰＥＧ−アルデヒド」；ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）を、３０ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＭ  ＨＣｌ中に溶解した。溶解後、０．１ｍＬのＰＥＧ−アルデヒド溶液を、０．７ｍＬのＩＦＮ−β−１ｂ溶液へ添加し、そして混合した。０．０５ｍＬの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）の添加は、最終ｐＨ５の反応混合物を生じた。０．１ｍＬのＰＥＧ−アルデヒド溶液および０．７ｍＬのＩＦＮ−β−１ｂ溶液を含有する別の反応混合物へ、２００ｍＭ酢酸、２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および６８ｍＭ  ＮａＯＨの混合物の０．０５ｍＬを、添加し最終ｐＨ６．４を生じた。これら混合物の各々の０．８５ｍＬの三つのアリコートへ、水、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、または１０ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳのいずれかを０．１ｍＬ添加した。希釈したボラン−ピリジン複合体を次いで各反応混合物へ添加し、終濃度２３ｍＭのボランを生じた。生じた反応混合物の各々を、４℃または室温のいずれかで２日間インキュベートした二つのチューブへ分けた。この反応混合物のアリコートを、０．３ｍｇ／ｍＬのＳＤＳを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）中、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ  １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＨＲ  １０／３０；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上０．５ｍＬ／分の流速でサイズ−排除ＨＰＬＣによって分析した。この溶出液の吸光度を、２１４ｎｍでモニタリングした。タンパク質１モルあたり約２モルのＰＥＧの投入比率により、優性種は、モノＰＥＧ化インターフェロンβ−１ｂ（ＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂ）であった。ＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂの収率は、全ての試験インキュベーション条件下（ｐＨ  ５またはｐＨ  ６．４において；４℃または室温において；ＮａＣｌまたは付加的なＳＤＳの有り無しで）において６５％と７２％との間であった。
【０１５９】
他の実験において、ＮａＢＨ３ＣＮを、還元試薬として用いて、そしてこのサンプルを、１ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する１０ｍＭ  酢酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．６）中、０．５ｍＬ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  ３０／１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でサイズ−排除ＨＰＬＣによって分析した。このような実験の一つの結果を、図１４に示す。２０ｋＤａ  ｍＰＥＧの入力濃度は、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭおよび約０．４ｍＭであった（図１４においてそれぞれ「１×」、「２×」、および「４×」と示す）。そしてこの反応混合物を、室温で３日間インキュベートした。コントロールのサンプル（下部の写図）を、還元試薬のみと共にインキュベートした。この同一サンプルを、溶出緩衝液からＳＤＳを省くこと以外は同一条件の下、クロマトグラフした場合、非ＰＥＧ化ＩＦＮ−β−１ｂを、溶出液中に検出されなかった。本実施例４の方法の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒドを、３０ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒドに変えた場合、同様の結果を得た。また２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒドを１０ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒドに変えた場合にも、同様の結果を得た。あるいは、ｍＰＥＧ−アセトアルデヒドまたはブチルアルデヒドを、使用し得る。ＩＦＮ−β−１ｂにおいてＮ−末端のアミノ酸がセリンであろうがなかろうが、ＩＦＮ−β−１ａにおいてＮ末端のアミノ酸がメチオニン、または別のアミノ酸であろうがなかろうが、本実施例の方法によるＩＦＮ−βの選択的なＮ−末端ＰＥＧ化は、増強した生物活性を有する結合体を産生する。
【０１６０】
（実施例５：酸化的開裂によるＮ−末端のＰＥＧ化の程度の決定）
アクセス可能なリジン残基のεアミノ基よりも、タンパク質のＮ−末端セリン残基のαアミノ基へ結合したＰＥＧの分画を、アルキル化セリン残基の酸化的開裂を包含する新規の方法によって評価した。ＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂが、優性種である（全タンパク質の約７０％）反応混合物を、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中１ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳに対して透析した。次いで、このｐＨを、１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４の添加によってｐＨ７．４に調整した。この溶液の一部を、過ヨウ素酸ナトリウムの非存在下または終濃度０．１ｍＭから１０ｍＭのＮａＩＯ４と共に４℃で２０時間までインキュベートした。インキュベーションの後、この反応混合物を、１ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する、１０ｍＭ酢酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．６）中のＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ  ６カラムでクロマトグラフした。モノＰＥＧ化ＩＦＮ−β−１ｂの回収に関する同様の結果を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムで得た。有利なことにＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムは、「塩ピーク（ｓａｌｔ  ｐｅａｋ）」から非改変ＩＦＮ−β−１ｂの分離を可能とした。ＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂ対過ヨウ素酸塩の濃度に対応する２１４  ｎｍでの吸光度のピーク未満のグラフの領域は、約１  ｍＭ過ヨウ素酸塩ならびに約１  ｍＭ過ヨウ素酸塩と１０  ｍＭ過ヨウ素酸塩との間の残留ＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂの定常レベル付近までこの領域における急激な減少を示した。３  ｍＭ以上の過ヨウ素酸塩を用いて０．２時間、２時間または７時間の処置後の同様の分析は、セリン結合化ＰＥＧの酸化的開裂が実質的に二時間以内に完了したことを示した。残留するＰＥＧ結合体は、少なくとも１０  ｍＭ過ヨウ素酸塩までを用いた処置に対して安定した結合であるリジン結合化ＰＥＧのみを含んだ。過ヨウ素酸塩を用いた酸化が残った結合体の分画は、アミノ末端以外の部位でＰＥＧ化されるとエドマン分解によって推測した分画と類似した。本実施例に記載した酸化手順に対して安定または不安定である結合体の分布を、種々の分析方法（逆相クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、超遠心分離、質量分光学、光分散また限外濾過を含むが、限定されない）によって調べた場合、同様の結果を得る。
【０１６１】
インターフェロン−β−１ｂを、実施例４に記載するように、種々の条件の下還元試薬としてボラン−ピリジン複合体を用いて２０ｋＤａのＰＥＧ−アルデヒドへ結合させた。モノＰＥＧ化ＩＦＮ−β−１ｂを、０．５  ｍＬ／分の流速で０．３  ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する２０  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）中、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム上にクロマトグラフィーによって精製した。精製したＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂ結合体の一部を、３  ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムの非存在または存在下において室温で二時間インキュベートした。図１５は、０．５  ｍＬ／分で流した、０．３ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、（ｐＨ  ８．３）中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムでのＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂの未処置のサンプルおよび参加的に開裂したサンプルのクロマトグラムを示す。これらのデータは、ｐＨ  ６．４で合成したおよそ９０％のＰＥＧ１−ＩＦＮ−β−１ｂが、Ｎ−末端セリンへ結合したことを示す。この結果は、反応混合物へ１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（下の曲線）または１  ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳ（上の曲線）のいずれかの添加後のカップリングを行うことによってまたはｐＨ  ５でカップリング反応を行うことによって（結果を示さない）顕著に変化しなかった。モノヒドロキシＰＥＧ  ｎ−プロピオンアルデヒドを、ｍＰＥＧ  ｎ−プロピオン−アルデヒドに置換した場合、またはｎ−プロピオン−アルデヒド以外のＰＥＧアルデヒドを使用した場合、同様の結果を得る。同様に、本実施例の方法は、ＩＦＮ−β−１ｂ以外のＮ−末端の還元性アルキル化タンパク質の程度を測定し、ここでこのようなタンパク質は、Ｎ−末端のセリン残基またはスレオニン残基を有する。同様に、Ｎ−末端のセリン残基またはスレオニン残基へ還元性アルキル化によって結合したポリマーの酸化的開裂を、過ヨウ素酸ナトリウム以外の過ヨウ素酸塩（メタ過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素酸ナトリウムとして本明細書中のいずれかで参考するまたは当該分野で公知）、メタ過ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸リチウム、過ヨウ素酸カルシウム、過ヨウ素酸バリウムおよび過ヨウ素酸を含むが限定されない）を用いて達成する。
【０１６２】
本実施例５の方法による他のサイトイカインの還元性アルカリ化によって合成したポリマーが適用可能であり、インターフェロン−１−α（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，  Ｋ．  Ｆ．  ら、前出）ならびにｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈおよびｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒを含む（Ｇｕｅｒｒａ，  Ｐ．  Ｉ．ら、前出）。
【０１６３】
（実施例６：逆相クロマトグラフィーによる結合体の精製ならびに遊離ＰＥＧおよびＳＤＳの除去）
逆相（「ＲＰ」）クロマトグラフィーを、Ｓ．  Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎら  （Ｕ．  Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，８９４，  ３３０）のように使用し、細菌細胞培養中におけるＩＦＮ−β−１ｂ発現の後、ＩＦＮ−β−１ｂを精製した。本発明を、Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎらの方法に適合させ、非改変タンパク質から実施例４に記載したように合成した個々のＰＥＧ化種を分離した。本手順はまた遊離ＰＥＧおよびタンパク質ピークに由来する大半のＳＤＳも分解した。図１６は、０．０４％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えた８０％アセトニトリルから０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を加えた８０％アセトニトリルの勾配を有するＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４３００Ａカラム（１５  ｃｍ  ｘ  ４．６  ｍｍ；  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）での分析的クロマトグラムを示す。
【０１６４】
１０分の１ミリリットルの反応混合物を、ロードし、そして０．５  ｍＬ分画を、１  ｍＬ／分の流速で回収した。ＩＦＮ−β−１ｂのピークは、ＰＥＧ化試薬へ曝す場合を除いて非改変であり（「Ｍｏｃｋ  ＰＥＧ化」）そして１タンパク質分子あたり一以上のＰＥＧ鎖を含有するＰＥＧ結合体のピークを、２８０  ｎｍ（ｓｏｌｉｄ  ｃｕｒｖｅ）での吸光度をモニタリングすることによって検出した。本実験において、上記カラムを、４０℃に維持した。異なる保持期間を有するが量的に同一の結果を、室温でのクロマトグラフィーによって得た。
【０１６５】
回収した画分におけるＳＤＳのアッセイの結果は、白抜きの三角形により示されている。ＳＤＳアッセイ試薬のストック溶液は、５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール水溶液中に１ｍｇ／ｍＬのカルボシアニン色素であるＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ、番号Ｅ−９３７９；３，３’−ジエチル−９−メチル−４，５，４’，５’−ジベンゾチアカルボシアニン）を含有した（Ｒｕｓｃｏｎｉ，Ｆ．ら、（２００１）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２９５：３１〜３７）。作用試薬を、２ｍＬのストック溶液＋２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび４１ｍＬの水を混合することにより、使用のすぐ前に調製した。この試薬へのＳＤＳの添加は、ＳＤＳに特異的であるスペクトルの変化を引き起こし、そして、５１０〜５１５ｎｍにおける吸光度ピークにおける減少を生じ、そして、４３９ｎｍにおける吸光度ピークを生じる。ＲＰクロマトグラフィーカラム由来の２ｍｃＬの各画分の、９６ウェルプレート中の２５０ｍｃＬの作用試薬への添加時の４３９ｎｍでの吸光度における変化を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０  プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）においてモニタリングした。
【０１６６】
回収した画分中でのペグに対するアッセイの結果は、図１６中の塗り潰した円によって示されている。１％（ｗ／ｖ）ヨウ化カリウム中の４体積の４ｍｇ／ｍＬヨウ素と１Ｎ  ＨＣｌ中の１体積の２０％（ｗ／ｖ）塩化バリウムを混合することにより、ペグアッセイ試薬を、使用の直前に調製した。ＲＰクロマトグラフィーカラムの各画分（およびペグ基準）から１０ｍｃＬのアリコートを、９６ウェルプレートのウェルのウェル中の９０ｍｃＬの水に添加し、その後、１００ｍｃＬのペグアッセイ試薬を添加した。サンプルおよび試薬を混合した後、室温で１５分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーにおいて、５０８ｎｍでの吸光度を測定した。図１６中のグラフは、これらの条件下で、ＲＰクロマトグラフィーが２０ｋＤａのペグの１つ以上の鎖を含む結合体からＭｏｃｋペグ化タンパク質を分離し、それに対して、結合体から非結合のペグおよびＳＤＳを分離したことを示している。同様の結果は、他の分子量のペグ（例えば、１０ｋＤａまたは３０ｋＤａのペグ）およびペグとＩＦＮ−β−１ｂとの他の酸安定な結合を含む結合体を用いて得られた。
【０１６７】
（実施例７  分取用逆相ＨＰＬＣ由来の精製された画分のクロマトグラフィーによる分析および電気泳動による分析）
実施例６に記載した条件と類似した条件下での逆相クロマトグラフィーを、改変した勾配を用いた同一のＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム上で、ペグ化反応混合物のより多量のサンプル（０．３ｍＬまたは０．５ｍＬ）に対して行なった。より多量のサンプルをロードする場合、種々の形態のインターフェロン（Ｍｏｃｋ  ペグ化、ペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂまたは一本鎖より多くのペグとの結合物）間の分解能は、図１６に示されるほど明確ではなかった。それにも関わらず、同一のＲＰカラム上で部分的に精製した画分の小アリコートの再クロマトグラフィーによって示される（図１７）ように、Ｍｏｃｋペグ化タンパク質またはモノペグ化タンパク質のどちらかにおいて高度に富化した画分を得た。クロマトグラムを、ＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて分析した。この分析から、上の曲線に示される調製物（分取用ＲＰカラム由来の画分５３）は、約７０〜８０％のＭｏｃｋペグ化ＩＦＮ−β−１ｂを含んでいたが、真ん中の曲線（画分５１）に示される調製物は、約９９％のペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂを含んでいた。図１７における下の曲線は、その画分が由来する反応混合物のクロマトグラムを示し、その吸光度の約１９％が、Ｍｏｃｋペグ化タンパク質と関連していて、約６１％が、ペグ１−ＩＦＮのピークと関連していて、約１２％が、標識したペグ２−ＩＦＮのピークと関連していて、約５〜６％が、ペグ２−ＩＦＮより早く溶出した形態と関連していた。他の製造者由来の逆相カラムを使用する場合、質的に類似した結果が得られる。
【０１６８】
同一の反応混合物（図１７におけるＲＰクロマトグラフィーによって分析された）およびＲＰクロマトグラフィーによって精製したペグインターフェロンの２つの画分を、ＳＤＳの存在下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）によって分析した。その結果を図１８および図１９に示す。複製サンプルを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００４；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに、または還元剤を含まずに、１０分間、周囲温度または１０２℃のいずれかでインキュベートし、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２１Ｂ）を通して１２０Ｖで１４０分間電気泳動した。図１８および図１９に示される透写図は、還元も加熱もしなかったサンプル由来であった。ゲル中のタンパク質を、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  カタログ番号Ｓ−１２０００、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、３０２ｎｍで照射し、そしてオレンジ／赤可視光フィルター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５５）を用いて写真を撮った（図１８）。デジタル画像をＫｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）からの１Ｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析した。水平軸は、色素の先端（１００ユニット）に対する移動距離を表し、垂直軸は、蛍光タンパク質染色の相対強度を表す。種々のレーンに対するベースラインの値は、結果の描写を明らかにするために、垂直に移動させた。下の写図は、標準タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来のＭａｒｋ１２ＴＭ、カタログ番号ＬＣ５６７７）の混合物を表し、１〜９と番号付けされたピークを、以下の分子量（全て、ｋＤａ）：２００、１１６、９７．１、６６．３、５５．４、３６．５、３１．０、２１．５および１４．４を有するタンパク質として同定した。一番下から二番目の写図は、反応混合物の電気泳動分析を示す。この混合物において、ＩＦＮ−β−１ｂの各形態と関連するタンパク質染色の割合は：１４％のＭｏｃｋ  ペグ化；６４％のペグ１−ＩＦＮ；２０％のペグ２−ＩＦＮおよび約２％のペグ２−ＩＦＮより大きい形態であった。一番下から三番目の写図は、３３±１％のペグ１−ＩＦＮ；６４±１％のペグ２−ＩＦＮおよび約６％のペグ２−ＩＦＮより大きい形態を含んだＲＰクロマトグラフィーからの画分を示す。一番上の曲線は、９５±１％のペグ１−ＩＦＮ、約２％のＭｏｃｋペグ化ＩＦＮおよび約２％のペグ２−ＩＦＮより大きい形態を含む画分を示す。上記のパーセンテージは、各サンプルの４回の繰り返し分析の結果の平均および標準偏差である。１０ｋＤａおよび３０ｋＤａのペグを用いて、質的に類似した結果を得た。
【０１６９】
図１９は、１％（ｗ／ｖ）ＫＩ中４ｍｇ／ｍＬのＩ２の４体積と合わせた１Ｎ  ＨＣｌ中２０％（ｗ／ｖ）のＢａＣｌ２を用いてペグに対してゲルを染色したことを除いては、図１８に記載したようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの結果を示す。一番下の写図は、予め染色した標準タンパク質（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２ＴＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＬＣ５６２５）の混合物を表し、その中で、１〜９と番号付けされたピークは、以下の見かけの分子量（ｋＤａ）を有するタンパク質を同定する：２０４、１１１、６８．８、５１．５、４０．２、２８．９、２０．７、１４．９およびｃ．６。ペグ染色したゲルの定量分析は、ＲＰカラム由来の画分５１における約９９％のペグ（一番上の曲線）が、ペグ１−ＩＦＮと関連しているのに対して、ジペグ結合体（上から二番目の曲線）中の富化された画分は、約７１％のペグ２−ＩＦＮに加えて、２５±１％のペグ１−ＩＦＮおよび約３％のペグ２−ＩＦＮより大きい形態を含んでいた。ペグに対して染色したＩＦＮ−β−１ｂの種々の形態の相対量を推定して、ペグ２−ＩＦＮピークより下の面積を２で割った。反応混合物（一番下から二番目の曲線）において、約５０％のペグ染色は、非結合型ペグと関連していて、約３５％は、ペグ１−ＩＦＮと関連していて、約１４％は、ペグ２−ＩＦＮと関連していて、約１％は、ペグ２−ＩＦＮより大きい形態と関連していた。
【０１７０】
（実施例８  インターフェロン−β−１ｂの選択的Ｎ末端酸化および低分子量カルバゼートへの結合）
ｍペグをＩＦＮ−β−１ｂのアミノ末端への結合の代替的な方法を用いて、この結合に対する明確な選択性を、実施例４および５に記載した還元アルキル化により得た約９０％の値から約１００％へ増加させた。ペグ化のこの方法における第一の工程は、実施例５に記載した還元的にアルキル化したペグ−ＩＦＮ−β−１ｂの酸化的切断に類似した原則に基づく。このアプローチは、Ｈ．Ｂ．Ｆ．Ｄｉｘｏｎ（前出）およびＫ．Ｆ．Ｇｅｏｇｈｅｇａｎら（（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ３：１３８〜１４６；Ｇｅｏｒｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．、米国特許第５，３６２，８５２号；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｒ．Ｊ．ら、米国特許第６，４２３，６８５号によって報告されるように、過ヨウ素酸塩によってアルデヒドに切断されるＮ末端のセリン残基またはスレオニン残基の固有の感受性を利用する。ＩＦＮ−β−１ｂのＮ末端セリン残基が、最大限酸化された場合（例えば、３ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いた室温で２時間の処理後）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム上の予備的なサイズ排除クロマトグラフィーでは、生じるタンパク質吸光度のピークは、ブロードであるようであった。１０ｍＭ  アセテート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．６、０．３ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳ含有中のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上の後の分析は、酸化されたタンパク質を、タンパク質のモノマーおよびダイマーであると推測される二つの形態に、明確に分離した。これらの二つのピークの同定を、実施例７に記載されるようにして行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１７１】
逆相クロマトグラフィーによる分析はさらに、Ｎ末端セリンの優先的な酸化が、少なくとも１つの不可欠なメチオニン残基の最小限の酸化によって達成されたという発見を立証した。Ｌ．Ｓ．Ｌｉｎら（（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：２７５〜３０１）およびＬ．Ｌｉｎ（（１９９８）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  ９６：９７〜１０４）は、ＲＰクロマトグラフィーが、ＩＦＮ−β−１ｂの調製物を主要成分（「ピークＢ」）および初期に溶出される微量成分（「ピークＡ」）に分離したことを示す。Ｌｉｎ（（１９９８）前出）はさらに、ピークＡが、機能的に活性なメチオニン（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮのＭｅｔ６１）が酸化されてスルホキシドになったＩＦＮ−β−１ｂを含むことを示した。本発明者らは、Ｎ末端セリンのほぼ完全な酸化が、ＲＰクロマトグラフィーのピークＡの割合を反映して、最小限のＭｅｔ６１の酸化により達成され得る条件を発見した。ＲＰクロマトグラフィーによって測定されたＭｅｔ６１の酸化を、ＩＦＮ−β−１ｂの他のメチオニン残基（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮのＭｅｔ３５およびＭｅｔ１１６）の酸化に対する代理マーカーとして使用した。
【０１７２】
ｐＨおよび４℃で０．２５ｍＭ  ＮａＩＯ４とインキュベーションした時間の関数としてのＭｅｔ６１の酸化の程度の研究を、表１に要約する。
【０１７３】
（表１：逆相クロマトグラフィー後のピークＡの面積により測定したメチオニン酸化の程度に対するｐＨおよび過ヨウ素酸塩に曝露した時間の効果）
【０１７４】
【表１】
0005207590.tif 000003
ＩＦＮ−β−１ｂのＮ末端酸化によるアルデヒド形成の提示は、ＩＦＮ−β−１ｂの９フルオレニルメチルカルバゼート（「Ｆｍｏｃ−ヒドラジド」という分野においは、「Ｆｍｏｃ−カルバゼート」としても公知である）への結合によって促進された（Ｆｌｕｋａ  ４６９１７；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．−Ｅ．ら、（１９９１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９５：１６０〜１６７）。ＩＦＮ−β−１ｂのＦｍｏｃ−カルバゼート付加物の特有の吸光スペクトルは、蛍光検出器を使用することなく、タンパク質の相当する非結合形態からのそれらの区別を可能にした。インターフェロンβ−１ｂを、種々の時間、ｐＨ７．８で、種々のＮａＩＯ４の濃度で処理することによって酸化した（室温で０．５〜２時間または冷却して数日間まで）。図２０に示す実験において、タンパク質を、０．５ｍＭ  ＮａＩＯ４とともに、室温で、１時間インキュベートした。グリセロールを添加することによりこの反応を終結させた。室温で３０分後、酢酸を最終濃度１９ｍＭまで添加することによって、ｐＨを低下させた。生じた数ｍＬの混合物に、メタノール中１５ｍＭのＦｍｏｃカルバゼートを１８２ｍｃＬ添加し、最終濃度２．３ｍＭのＦｍｏｃ−カルバゼートを得た。この反応混合物を、逆相クロマトグラフィーによる分析の前に、４〜８℃で、一晩インキュベートした。
【０１７５】
図２０は、室温で１時間の０．５ｍＭ  ＮａＩＯ４とのＩＦＮ−β−１ｂのインキュベーションおよびＦｍｏｃ−カルバゼートへの酸化生成物の結合の、ＲＰクロマトグラフィー挙動に対する効果を示している。酸化されたサンプル（白抜きの円を有する真ん中の曲線）の結果に対するコントロールサンプル（上の曲線）の結果の比較は、主要成分およびピークＡ（酸化されたメチオニン残基を有する約５％のＩＦＮ−β−１ｂの存在を反映する）の両方の保持時間は、酸化により０．２分間〜０．３分間増加したことを示す。ピークＡのパーセンテージにより測定される場合、ピークＡ’に比較して、これらの条件下では、ＮａＩＯ４とのインキュベーション後、メチオニンの酸化は、１％未満しか検出されなかった。
【０１７６】
実施例１１に記載したバイオアッセイの結果は、０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの過ヨウ素酸塩を用いた制御された酸化（例えば、冷却下で２時間まで）が、生物学的活性に対して不可欠であるタンパク質のアミノ酸残基の完全性を保存するというさらなる証拠を提供する。
【０１７７】
図２０の塗り潰した三角形を有する下の曲線に示されるように、Ｆｍｏｃ付加物の形成に対する証拠が、主要成分およびピークＡ’（ピークＡのＮ末端アルデヒド誘導体）の両方のより長い保持時間へのシフトによって提供される。さらに、シフトしたピークに対する２１４ｎｍでの吸光度に対する２７８ｎｍでの吸光度の割合における５０％の増加が存在した。タンパク質の両方の形態について、相当するＮ末端アルデヒドの形成に起因する保持時間の増加（０．２〜０．３分間）は、相当するＦｍｏｃ誘導体の形成から生じる増加（１．０〜１．２分間）よりかなり小さかった。
【０１７８】
（実施例９：Ｎ末端酸化インターフェロン−β−１ｂのペグ−カルバゼート付加物の合成）
実施例８に記載されるようにアミノ末端で選択的に酸化されたインターフェロンβ−１ｂを、Ｒ．Ｊ．Ｄｒｕｍｍｏｎｄら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４５０２６；米国特許第６，４２３，６８５号）によって記載される方法およびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙら、（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１６５５５  Ａ１およびＨａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら編（１９９７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ｐｐ３１８〜３４１、Ｗａｃｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）に記載される方法の適用によって、ペグのカルバゼート誘導体へ結合させた。ペグ−カルバゼートを、ヒドラジンと、２０ｋＤａのペグのｐ−ニトロフェニルカーボネート誘導体（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの「ＮＰＣ−ペグ」）との反応によって、合成した。過ヨウ素酸塩の非存在下または０．１２５ｍＭ  ＮａＩＯ４の存在下での室温での０．５時間、１時間または２時間のタンパク質のインキュベーションの後、サンプルを、１ｍｇ／ｍＬのＳＤＳを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ４．６中の２０ｋＤａのペグ−カルバゼートの４体積で希釈し、室温で１日間インキュベートした。サンプルを、０．３ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＳを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図２１に示すように、ペグ−カルバゼートとの反応の２時間前までのタンパク質の酸化は、未改変タンパク質（約２５分間の保持時間で溶出した）の濃度における進行性の減少、およびペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂ（約２０分間の保持時間で溶出した）に関連する吸光度の割合の進行性の増加を生じた。８０％を超えるペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂの収率は、この方法によって得られた。１０ｋＤａまたは３０ｋＤａのペグのモノカルバゼート誘導体を用いて類似した結果を得た。
【０１７９】
（実施例１０  逆相ＨＰＬＣによって精製したモノペグ化インターフェロン−β−１ｂのバイオアッセイ）
インターフェロン−β−１ａおよび種々のムテインの抗増殖性アッセイに対するヒトＤａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２３１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の使用は、Ｌ．Ｒｕｎｋｅｌら（（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：２５３８〜２５５１）によって記載された。図２２は、未処理のＩＦＮ−β−１ｂおよびＲＰクロマトグラフィーによって部分的に精製されたＮ末端モノペグ化結合体のＤａｕｄｉ細胞に対する抗増殖性活性のアッセイの結果を示す。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号３０００、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１１８７５−０９３、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させた。１０万の細胞を、４８ウェルプレートの各ウェル中の２５０ｍｃＬの培地に播種し、等体積の予め加温した培地または培地中のＩＦＮ−β−１ｂもしくはペグ結合体の希釈物と混合する前に、５％ＣＯ２とともに、３７℃で４時間増殖させた。３日間の間、細胞の数を、０時点での数の５９０±２４％（ｓ．ｄ．）（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ１、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）による細胞数に基づいて）まで増加した培地のみ希釈した。ＩＦＮ−β−１ｂまたはそのペグ結合体による最大増殖阻害の条件下で、細胞の数は、０時点の数の２８３±８％まで増加した。従って、この実験において観察された増殖阻害の最大パーセントは、４８％であった。図２２中の種々の濃度のＩＦＮ−β−１ｂの二つの調製物に対するデータを、阻害可能細胞増殖のパーセントとして表す。
【０１８０】
図２２は、ＩＦＮ−β−１ｂおよび実施例７に記載される分取用逆相クロマトグラフィー実験由来の画分のストック溶液の希釈物を使用する研究の結果を示し、この分取用逆相クロマトグラフィー実験由来の画分は、図１７〜１９に示されるように、ほぼ純粋なモノペグ結合体（画分５１）、またはほぼ純粋なＭｏｃｋペグ化ＩＦＮ−β−１ｂ（図１７に示されるカラムの画分５３）のどちらかを含んでいる。サンプルを３回希釈し、ウシ胎仔血清を補充し、０．２μｍフィルターを通してろ過滅菌した培地中で１ｍｃｇ／ｍＬにした。最初の希釈物のそれぞれから３２ｎｇ／ｍＬ希釈物およびその後の連続する希釈物を作製した。図２２のデータから、阻害可能細胞増殖（「ＩＣ５０」）の５０％の阻害に必要な各調製物の濃度を計算した。結果は、モノペグ化ＩＦＮ−β−１ｂ（ＩＣ５０＝ｃ．４０ｐｇ／ｍＬ）が非改変ＩＦＮ−β−１ｂ（ＩＣ５０＝ｃ．２５０ｐｇ／ｍＬ）の約６倍の強さであることを示した。図２２に示した一連の実験と類似した一連の実験において試験した、種々の大きさのペグとの結合体の抗増殖力価における平均の増加は、約２．５倍（１０ｋＤａのペグ）〜約５倍（３０ｋＤａのペグ）の範囲であった。
【０１８１】
驚くべきことに、図２２に示されるＭｏｃｋペグ化調製物は、約８０ｐｇ／ｍＬのＩＣ５０を有していて、これは、ＩＦＮ−β−１ｂのストック溶液のＩＣ５０とモノペグ化調製物のＩＣ５０との中間であった。理論および任意の特定の機構的な説明に拘束されることを意図しないが、Ｍｏｃｋペグ化調製物の増強された抗増殖力価は、逆相クロマトグラフィーの間に、ストックＩＦＮ−β−１ｂ溶液中に存在するなんらかの阻害物質の除去を反映していることもあり得る。この解釈は、ＳＤＳを含有する緩衝液中でのＳｕｐｅｒｏｓｅ６のカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーの結果（実施例４に記載した通りである）と一致していて、ＩＦＮ−β−１ｂの溶出位置と「塩のピーク」の溶出位置との間に溶出する２１４ｎｍおよび２８０ｎｍの両方における吸光度のピークを明らかにした。図２２に示されるバイオアッセイ実験に類似したバイオアッセイ実験を、ＲＰカラム由来の画分４９に対して行なった。この画分は、ペグ２−ＩＦＮ−β−１ｂおよびペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂの混合物を含んでいた（図１８および図１９を参照のこと）。Ｍｏｃｋペグ化サンプルの場合におけるように、多重にペグ化したサンプルは、ＩＦＮ−β−１ｂのストック溶液の抗増殖力価より大きい抗増殖力価を有していたが、モノペグ化結合体の抗増殖力価よりは、小さかった。他の実験において、モノペグ化ＩＦＮ−１β−１ｂで観察された力価の増加は、６倍〜１０倍の範囲であった。力価における同様の増加が、実施例９に記載した、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび３０ｋＤａのペグを使用するカルバゼート付加物で観察された。
【０１８２】
Ｄａｕｄｉ細胞に対する、本発明の結合体を用いて得た抗増殖能力を、抗ウイルスアッセイにおいて測定したインターフェロン−βの三つの薬学的形態の、報告されている特定の活性と比較し得る。それぞれのパッケージング挿入物に従って、活性は、ＢｅｒｌｅｘのＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）（ＩＦＮ−β−１ｂ）については、３２×１０６ＩＵ／ｍｇ、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）（ＢｉｏｇｅｎのＩＦＮ−β−１ａの処方物）については、２００×１０６ＩＵ／ｍｇ、ＲＥＢＩＦ（登録商標）（ＳｅｒｏｎｏのＩＦＮ−β−１ａの処方物）については、２７０×１０６ＩＵ／ｍｇである。従って、図２２に示される抗増殖アッセイにおけるモノペグ化ＢＥＴＡＳＥＲＯＮの力価の少なくとも６倍の増加は、本発明の方法によるＢＥＴＡＳＥＲＯＮのＮ末端ペグ化が、その力価を、市販されるグリコシル化調製物であるＡＶＯＮＥＸおよびＲＥＢＩＦについて予測される範囲まで増加させたことを示唆している。
【０１８３】
これまでに、非グリコシル化インターフェロン−β（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で発現させた）の溶解度は、酸性溶液の使用によって（Ｈａｎｉｓｃｈ，Ｗ．Ｈ．ら、米国特許第４，４６２，９４０号）またはＳＤＳの添加によって（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．、米国特許第４，８１６，４４０号）増強されてきた。理論に束縛されることを意図することなく、ペグ化がインビトロで測定したＩＦＮ−β−１ｂの抗増殖効率を増加させ得る機構は、培養培地中で自己会合する傾向を減少させることによる。従って、ペグ２−ＩＦＮ−β−１ｂが富化されたサンプルが、ペグ１−ＩＦＮ−β−１ｂに比べてあまり効果がないという観察は、会合が減少するポジティブな効果が、このサイトカインのそのレセプターに結合する能力および／またはその抗増殖活性に対して応答可能なシグナル伝達を惹起する能力に対する過剰なペグ化のネガティブな効果により打ち負かされ得ることを示唆している。
【０１８４】
（実施例１１  選択的に酸化されたインターフェロン−β−１ｂのバイオアッセイ）
種々の程度に酸化されたＩＦＮ−β−１ｂのＤａｕｄｉ細胞に対する抗増殖活性のアッセイを、実施例１０に記載されるとおりに行なった。試験したサンプルは、ＩＦＮ−β−１ｂのストック溶液および０．１ｍＭ過ヨウ素酸塩、０．３ｍＭ過ヨウ素酸塩または３ｍＭ過ヨウ素酸塩で、４℃で数日間処理したサンプルを含んだ。サンプルを、実施例１０に記載されるとおりに希釈し、細胞の播種の４時間後に、等体積のＤａｕｄｉ細胞懸濁液と混合した。細胞を、５％ＣＯ２とともに、３７℃で、２日間増殖させ、次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数した。ＩＦＮ−β−１ｂの抗増殖活性は、試験した条件下では、０．０７５ｍＭ〜０．５ｍＭのＮａＩＯ４による処理では、影響されないか、または増加した。類似した結果は、実施例１０に記載されるような、３日間の抗増殖アッセイにおいて得られた。抗増殖力価は、実施例９に記載するように選択的に酸化したＩＦＮ−β−１ｂのペグカルバゼートとの結合によってさらに増強された。ペグカルバゼートを用いて得た結果と類似した結果を、選択的に酸化されたＩＦＮ−β−１ｂのペグ−ヒドラジドへの結合の産物を用いて得る。対照的に、より高い濃度（例えば、１〜３ｍＭ）の過ヨウ素酸塩を含むＩＦＮ−β−１ｂの処理によって、Ｄａｕｄｉ細胞に対する抗増殖効果は、抑制されるかまたは完全に消滅した。これらの高濃度のＮａＩＯ４は、タンパク質のダイマー化を誘導し、それは、実施例５に記載されるように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上のサイズ排除ＨＰＬＣにより検出され、メチオニンの酸化は、実施例６に示されるように逆相クロマトグラフィーにより検出される（結果は示さず）。
【０１８５】
本発明の結合体の生物活性は、種々の細胞株または初期培養に基づく当該分野で公知の抗増殖アッセイおよび抗ウイルスアッセイによって測定され得、ここで、それらの細胞は、ＩＦＮ−βに対する細胞表面レセプターを有する。あるいは、ネオプテリン（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．ら、前出）、β２−ミクログロブリン（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．ら、前出）または２’−５’−オリゴアデニレート合成酵素（Ｂｒｕｃｈｅｌｔ，Ｇ．ら、（１９９２）Ｅｕｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３０：５２１〜５２８）またはＩＦＮ−βによって誘導され得るタンパク質のプロモーターに作動可能に連結したレポータータンパク質の誘導を含むＩＦＮ−βに対する反応をモニタリングし得る。ＩＦＮ−βのポリマー結合体の生物活性をアッセイするためのさらなる方法としては、シグナル伝達アッセイおよび遺伝子活性化アッセイ（例えば、Ｐｕｎｇｏｒ，Ｅ．ら、（１９９８）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １８：１０２５〜１０３０）が挙げられる。
【０１８６】
本発明は、特定の実施形態およびその特定の実施例を参照して記載される。本発明の方法は、特定のレセプター結合ペプチドおよびサイトカイン以外のタンパク質またはこれらのアンタゴニストならびに他の結合試薬に対して同様に適用可能である。従って、本発明の範囲は、記載した実施形態に限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。当業者は、他の実施形態が、本発明の範囲を逸脱することなく実施され得ることを容易に理解し得る。全てのこのような変化は、本発明の一部であると考えられる。
【０１８７】
本明細書中で言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明の属する分野における当業者の技術のレベルを示し、それぞれの個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されるように示されるのと同一程度まで参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
図１〜８は、結晶学的データに基づいて、ＲａｓＭｏｌソフトウェア（Ｓａｙｌｅ，Ｒ．Ａ．ら，（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０：３７４−３７６）で作成される、種々のサイトカインおよび増殖因子の分子モデルを示す。これらのモデルの各々は、特に目的の特定の残基（これらは、「ボールとスティック」形式で示される）を除いて、「リボン」または「コンピューター画像プリントアウト（ｃａｒｔｏｏｎ）」形式で示される。これらの形式は、ＲａｓＭｏｌソフトウェアを使用して選択される選択肢である。そのリボンの暗い部分は、それらのレセプターへの結合に関与すると報告されている、サイトカインおよび増殖因子のドメインを示す。各構造について、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（「ＰＤＢ」）における取得コードが示される（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：２２１−２２２；Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，（２００２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：９３４−９３８；Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ８：２１１３−２１２９を参照のこと）。
【図１ａ】図１ａは、インターフェロン−α−２ａのモデルを示し、このモデルにおいて、ＲｏｃｈｅのＰＥＧ−インターフェロン製品（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））におけるＰＥＧ化の主な部位であると報告されているその４つのリジン残基（Ｌｙｓ３１、Ｌｙｓ１２１、Ｌｙｓ１３１およびＬｙｓ１３４）は、「ボールとスティック」形式で示される（Ｂａｉｌｏｎ，Ｐ．ら，前出のデータに基づく）。そのレセプターへの結合に関与する領域（「結合部位１および結合部位２」）が同定される。ＰＥＧＡＳＹＳにおいてＰＥＧ化されていると報告されたそのリジン残基の４つ全ては、結合部位１の領域に存在する。（ＰＤＢコード１ＩＴＦ）。
【図１ｂ】図１ｂは、インターフェロン−α−２ｂのモデルを示し、このモデルにおいて、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈのＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）におけるＰＥＧ化の主な部位であると報告されている残基（Ｈｉｓ３４、Ｌｙｓ３１、Ｌｙｓ１２１、Ｔｙｒ１２９およびＬｙｓ１３１）は、「ボールとスティック」形式で示される（Ｗｙｌｉｅ，Ｄ．Ｃ．ら，前出のデータに基づく）。これらのアミノ酸残基は、結合部位１の領域に存在する。
【図１ｃ】図１ｃは、インターフェロン−α−２ｂのモデルを示し、このモデルにおいて、そのアミノ末端のシステイン残基（「Ｃｙｓ１」）（本発明に従うＰＥＧ化の標的）は、「ボールとスティック」形式で示される。Ｃｙｓ１は、結合部位１および結合部位２から離れている。
【図１ｄ】図１ｄは、インターフェロン−α−２ｂの、図１ｃに示されるモデルと同じモデルを示す。図１ｃのモデルに対して、２０ｋＤａ  ＰＥＧの一本鎖が、そのＮ末端システイン残基（「Ｃｙｓ１」）において結合されている。ＰＥＧの構造を、Ｌｅｅ，Ｌ．Ｓ．ら，（（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：９７３−９８１）によって記載されるプログラムの適合を用いて生成した。その構造は、そのタンパク質と同じスケールにされる。
【図２】図２は、ヒトインターフェロン−β−１ａ（配列番号２を参照のこと）の分子モデルを示し、このモデルにおいて、そのレセプター結合ドメイン内に存在するかまたはそのレセプター結合ドメインに隣接するいくつかのリジン残基（Ｌｙｓ１９、Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ９９およびＬｙｓ１３４）が、示される。さらに、そのグリコシル化部位（Ａｓｎ８０）およびそのＮ末端メチオニン残基（「Ｍｅｔ１」）は、（Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら，（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１１８１３−１１８１８；Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら，（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５４：１２０３−１２１６；Ｒｕｎｋｅｌ，Ｌ．ら，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：２５３８−２５５１のデータに基づいて）「ボールとスティック」形式で示される。Ｍｅｔ１は、結合部位１および結合部位２から離れているのに対して、いくつかのリジン残基は、そのレセプター結合ドメイン内に位置する。（ＰＤＢコード１ＡＵＩ）。インターフェロン−β−１ｂ（配列番号１を参照のこと）の構造は、Ｎ末端メチオニン残基および炭水化物部分を欠き、対形成しないシステイン残基（配列番号２のＣｙｓ１７）で置換されるセリン残基を有することにおいて、インターフェロン−β−１ａの構造とは異なる。
【図３】図３は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）の分子モデルを示し、このモデルにおいて、そのレセプター結合ドメイン内に存在する３つのリジン残基（Ｌｙｓ７２、Ｌｙｓ１０７およびＬｙｓ１１１）および結晶構造において可視化されるそのアミノ末端近くにある最初のアミノ酸残基（「Ａｒｇ４」）は、（Ｒｏｚｗａｒｓｋｉ，Ｄ．Ａ．ら，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２６：３０４−３１３のデータに基づいて）「ボールとスティック」形式で示される。ＧＭ−ＣＳＦのアミノ末端領域は、結合部位１および結合部位２から離れている。（ＰＤＢコード２ＧＭＦ）。
【図４】図４は、ヒトインターロイキン−２の分子モデルを示し、このモデルにおいて、３つのレセプター（α、βおよびγ）の各々に関与すると報告されているアミノ酸残基は、そのレセプター結合ドメイン内またはその近くに存在するいくつかのリジン残基と同様に、「ボールとスティック」形式で示される。その結晶構造において可視化されるアミノ末端に最も近いアミノ酸残基は、セリン６（「Ｓｅｒ６」）である。このセリン６は、（Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈ，Ｐ．ら，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：８３９−８５１；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｄ．Ｋ．ら，前出のデータに基づいて）そのレセプター結合ドメインから離れている。（ＰＤＢコード３ＩＮＫ）。
【図５】図５は、ヒト上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）の分子モデルを、レセプター結合に関連している残基およびレセプター結合領域に隣接している２つのリジン残基（Ｌｙｓ２８およびＬｙｓ４８）を除いて、「コンピューター画像プリントアウト」形式で示す。その鎖内ジスルフィド結合は、破線として示される。このモデルが基づく結晶構造において可視化されるアミノ末端に最も近いアミノ酸残基は、（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：７７０９−７７１２；Ｌｕ，Ｈ．−Ｓ．ら，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：３４９１３−３４９１７に基づいて）システイン６（「Ｃｙｓ６」）である。結晶構造において可視化されていないそのＥＧＦのアミノ末端の可撓性部分（残基１〜５）は、レセプター結合領域中に存在しないようである。（ＰＤＢコード１ＪＬ９）。
【図６】図６は、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）の分子モデルを、「コンピューター画像プリントアウト」形式で示し、この形式において、そのレセプターへ、およびヘパリンへの結合に関与する残基は、（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ら，（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：７４３−７５０のデータに基づいて）「ボールとスティック」形式で示すことによって同定される。そのアミノ末端からの最初の１２個のアミノ酸残基は、レセプター結合に関与していない。（ＰＤＢコード１ＦＱ９）。
【図７】図７は、インスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）の分子モデルを、レセプター結合に関与する残基（２３〜２５および２８〜３７）、ならびに結晶構造において可視化されるアミノ末端に最も近いアミノ酸残基であるグルタミン酸残基３（「Ｇｌｕ３」）を除いて、「コンピューター画像プリントアウト」形式で示す。そのリジン残基のうちの２つが同定され、（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｍ．ら，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：９３８９−９３９７のデータに基づいて）そのうちの一方（Ｌｙｓ２７）は、レセプター結合ドメインに隣接し、その他方は、レセプター結合ドメインから離れている。ＩＧＦ−１のアミノ末端は、そのレセプター結合ドメインから離れている。（ＰＤＢコード１ＧＺＲ）。
【図８】図８は、インターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）の分子モデルを示し、これは、ホモダイマーである。その２つのポリペプチド鎖の間の相互作用を明らかにするために、そのモノマーのうちの一方（「鎖Ａ」）を、「リボン」形式で示し、他方（「鎖Ｂ」）を、「骨格」形式で示す。リジン残基（明色の「ボールとスティック」形式で示される）は、ポリペプチド鎖（そのモノマー間の界面に含まれる領域を含む）に沿って存在するか、またはレセプター結合に関与するアミノ酸残基に隣接する。ＩＦＮ−γのアミノ末端領域は、その二量体化界面から離れているが、グルタミン１（Ｇｌｎ１）は、レセプター結合に関与する（Ｔｈｉｅｌ，Ｄ．Ｊ．ら，（２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８  ：９２７−９３６；ＰＤＢコード１ＦＧ９）
【図９】図９は、ＩＦＮ、２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ−アルデヒドおよび還元剤を含む反応混合物のカチオン交換クロマトグラフィーによる、非ＰＥＧ化インターフェロン−α−２ｂ（「ＩＦＮ」）、モノＰＥＧ化インターフェロン−α−２ｂ（「ＰＥＧ１−ＩＦＮ」）およびジＰＥＧ化インターフェロン−α−２ｂ（「ＰＥＧ２−ＩＦＮ」）の分画を示す。
【図１０】図１０は、図９に示されるように分画した反応混合物、および結果が図９に示されるイオン交換カラムから収集した、選択された画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図１１】図１１は、ヒトＩＬ−２、２０−ｋＤａ  ｍＰＥＧ−アルデヒドおよび還元剤を含む反応混合物のカチオン交換クロマトグラフィーによる分画を示す。示された溶出条件下で、その残りの非ＰＥＧ化ＩＬ−２は、図９に示されるインターフェロン−α−２ｂについての結果とは異なって、そのカラムから溶出しなかった。
【図１２】図１２は、図１１に示されるように分画した反応混合物、およびそのカラムから溶出した、選択された画分のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図１３】図１３は、ＰＥＧ化インターロイキン−２（「ＰＥＧ−ＩＬ−２」）の反応混合物、およびそのクロマトグラムが図１１に示されるカチオン交換カラムからの画分の電気泳動分析を示す。
【図１４】図１４は、種々の投入濃度（「１×」、「２×」または「４×」）の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒドと、還元剤としてのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）とともに、還元的アルキル化によって形成されたその結合体からインターフェロン−β−１ｂ（「ＩＦＮ」）のサイズ排除ＨＰＬＣによる分離を示す。ＰＥＧの一本の鎖（「ＰＥＧ１−ＩＦＮ」）または二本の鎖（「ＰＥＧ２−ＩＦＮ」）を含む結合体は、これらの条件下でＰＥＧが結合していないＩＦＮ（「モックＰＥＧ化ＩＦＮ」）から分離される。
【図１５】図１５は、種々の条件下での還元的アルキル化により合成されるＰＥＧ１−ＩＦＮ−βの約９０％が、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化切断されることを示す。ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）の存在下でのサイズ排除ＨＰＬＣは、残りのＰＥＧ１−ＩＦＮ−βをその切断産物（ホルムアルデヒドおよびＩＦＮを含み、そのＮ末端セリンがアルデヒドに開裂する（ＩＦＮアルデヒド））から分離した。
【図１６】図１６は、反応混合物のモックＰＥＧ化ＩＦＮ−β、非結合ＰＥＧ、非結合ＳＤＳおよび微量成分からの、ＰＥＧ１−ＩＦＮ−βの逆相クロマトグラフィーによる分離を示す。
【図１７】図１７は、それぞれ、ＰＥＧ化反応混合物の、およびＰＥＧ１−ＩＦＮ−β（画分５１）もしくはモックＰＥＧ化ＩＦＮ−β（画分５３）が富化された、分取用ＲＰカラムからの画分の分析用逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１８】図１８は、ＰＥＧ化反応混合物の、およびＰＥＧ１−ＩＦＮ−β（画分５１）もしくはＰＥＧの一本以上の鎖を含む結合体（画分４９）のいずれかが富化された分取用ＲＰカラムからの画分の電気泳動分析の結果を示す。ゲルを、蛍光色素でタンパク質について標識し、紫外線照射によって撮影した。その染色の強度を、Ｋｏｄａｋ  １Ｄ画像化ソフトウェアで測定した。
【図１９】図１９は、ＢａＣｌ２、Ｉ２およびＫＩを含む試薬でＰＥＧについてゲルを染色したことを除いて、図１８に示されるサンプルと同じサンプルの電気泳動分析の結果を示す。ゲルの写真における染色の強度を、図１８のように測定した。残りの遊離の２０ｋＤａ  ＰＥＧのピークは、反応混合物中で検出可能である。
【図２０】図２０は、未処理（上の曲線）か、または０．５ｍＭ  ＮａＩＯ４（ＮａＩＯ４は、主要成分または微量成分の両方のＮ末端セリン残基を、アルデヒド誘導体に切断した）とともにインキュベートした（中央部の曲線）か、またはＮａＩＯ４で酸化して、９−フルオレニルメチルカルバゼート（Ｆｍｏｃ−カルバゼート）と反応させたかのいずれかであるＩＦＮ−β−１ｂのサンプルの逆相クロマトグラムを示す。その微量成分（「ピークＡ」）は、酸化メチオニン残基を含む。酸化後の、ピークＡおよび主要成分両方の保持時間の同様の増大は、各ピークにおけるＮ末端セリン残基がアルデヒドへ切断されたことを示す。これらの条件下で、ＮａＩＯ４とともにインキュベートした後に、ピークＡのパーセンテージに増大がないことが、検出された。ピークＡおよび主要成分の酸化形態からのＦｍｏｃ結合体の形成は、Ｆｍｏｃ−カルバゼートと反応させた後のそれらの保持時間および吸光度における増大によって示される。
【図２１】図２１は、２０ｋＤａ  ＰＥＧ−カルバゼート誘導体とＩＦＮ−βのアルデヒド誘導体との反応によるＰＥＧ１−ＩＦＮ−βの合成を示す。室温で０．５時間、１時間または２時間にわたる０．１２５ｍＭ  ＮａＩＯ４とのタンパク質のインキュベーション後に検出される結合体の増大部分は、Ｎ末端セリンをアルデヒドに完全に変換することが、これらの反応条件下で１時間より長い時間を要することを示す。ＰＥＧ１−ＩＦＮ−βは、このサイズ排除カラムで、２０ｋＤａ  ＰＥＧ−カルバゼートから不完全にしか分離されなかった。
【図２２】図２２は、ＩＦＮ−βのストック溶液の希釈液の効力よりも、ヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）に対するＰＥＧ１−ＩＦＮ−β希釈液（これは、逆相クロマトグラフィーにより精製された（図１７〜１９において特徴づけられる画分５１））のより大きな抗増殖効力を示す。これらの細胞の阻害可能な増殖の５０％を阻害するために要した精製ＰＥＧ１−ＩＦＮ−βの濃度は、約４０ｐｇ／ｍＬであった。これは、ＩＦＮ−βのストック溶液について要した濃度の約６分の１であった。これらの細胞の霜害可能な増殖の５０％を阻害するために要した精製モックＰＥＧ化ＩＦＮ−β（図１７において示される逆相クロマトグラムからの画分５３）の濃度は、約８０ｐｇ／ｍＬであった。これは、ＩＦＮ−βのストック溶液について要した濃度の約３分の１であった。
【図１ａ】
0005207590.tif 000004
【図１ｂ】
0005207590.tif 000005
【図１ｃ】
0005207590.tif 000006
【図１ｄ】
0005207590.tif 000007
【図２】
0005207590.tif 000008
【図３】
0005207590.tif 000009
【図４】
0005207590.tif 000010
【図５】
0005207590.tif 000011
【図６】
0005207590.tif 000012
【図７】
0005207590.tif 000013
【図８】
0005207590.tif 000014
【図９】
0005207590.tif 000015
【図１０】
0005207590.tif 000016
【図１１】
0005207590.tif 000017
【図１２】
0005207590.tif 000018
【図１３】
0005207590.tif 000019
【図１４】
0005207590.tif 000020
【図１５】
0005207590.tif 000021
【図１６】
0005207590.tif 000022
【図１７】
0005207590.tif 000023
【図１８】
0005207590.tif 000024
【図１９】
0005207590.tif 000025
【図２０】
0005207590.tif 000026
【図２１】
0005207590.tif 000027
【図２２】
0005207590.tif 000028
【配列表】
0005207590000001.app
0005207590000002.xml