(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bcl-xLをコードする遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されている遺伝子を含有してなる骨量および骨強度増加剤。
【請求項２】
前記プロモーターがＩ型コラーゲンプロモーターである請求項１記載の増加剤。
【請求項３】
発現ベクターである請求項１または２に記載の増加剤。
【請求項４】
骨芽細胞特異的プロモーターおよびBcl-xLをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
前記プロモーターがＩ型コラーゲンプロモーターである請求項４に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している請求項４または５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて２倍前後に増加している請求項４〜６いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて３〜５倍に増加している請求項４〜６いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて１０倍前後に増加している請求項４〜６いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記動物が実験動物または家畜である請求項４〜９いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記実験動物がマウスである請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記動物が成体であり、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも１種のパラメータが有意差を有する、請求項４〜１１いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして使用される請求項４〜１２いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用される請求項４〜１２いずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項４〜１４いずれか１項に記載の非ヒト動物の子孫動物であって、骨芽細胞特異的プロモーター及びBcl-xL遺伝子を含む発現ベクターが導入されている子孫動物。
【請求項１６】
請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られる、骨芽細胞特異的プロモーター及びBcl-xl遺伝子を含む発現ベクターが導入されている骨疾患モデル動物。
【請求項１７】
前記骨疾患が骨粗鬆症、骨芽細胞のアポトーシスの亢進を来す疾患、骨芽細胞の増殖亢進を来す疾患または早期に老化を来す疾患である請求項１６に記載のモデル動物。
【請求項１８】
請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１６もしくは１７に記載のモデル動物から得られる組織または細胞。
【請求項１９】
請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１６もしくは１７に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
下記工程：
（ａ）請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１６もしくは１７に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
下記工程：
（ａ）請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１６もしくは１７に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および／または骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
下記工程：
（ａ）請求項４〜１５いずれか１項に記載の非ヒト動物または請求項１６もしくは１７に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
（ｄ）工程（ａ）で用いた動物に、工程（ｃ）で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程
を含む、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
下記工程：
（ａ）骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるBcl-xLの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、Bcl-xLの発現を増加させる被験物質を選択する工程
を含む、Bcl-xLの発現増加を介した骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニック動物およびその利用に関する。詳しくは、骨量と骨強度の解明に役立つＢｃｌ−ｘＬの発現系、トランスジェニック動物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量減少が原因で起こる疾患であり、骨折を引き起こす。高齢化社会とともに増加し、日本だけでも約１千万人、全世界では約２億人が罹患していると推定されている。骨減少は、皮質骨よりも海綿骨から始まるので、脆弱性骨折は海綿骨が多く分布する部位で発生する。すなわち、椎体、大腿骨頸部、橈骨遠位端、上腕骨頸部などで多発する。骨粗鬆症に起因する骨折のため、多くの高齢者が寝たきりとなり、社会の活性化が削がれるとともに、医療費、介護費用の膨張を招いている。
骨粗鬆症の治療薬としては、活性化ビタミンＤ３、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビタミンＫ２、ビスフォスフォネート、副甲状腺ホルモン（米国でのみ認可）等がある。これらの治療薬は、破骨細胞の活性化を抑制するものがほとんどであり、骨芽細胞に働きかけて骨形成を促進させるものは少ない。破骨細胞を抑制した場合は、骨は増えるが、骨のリモデリングが低下して骨質の低下を来たし、それにより骨の強度を低下させる可能性がある。前記治療薬の中で、ビスフォスフォネートと副甲状腺ホルモンで骨折頻度の低下が観察されているが、いまだ不十分であり、新たな治療薬の開発が望まれている。
Ｂｃｌ−ｘＬは、Ｂｃｌ−２ファミリーに属し、アポトーシスを抑制する分子である。Ｂｃｌ−２ファミリーは、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ以外に、ＢＣＬ−ｗ、ＢＦＬ−１、Ａ１、ＭＣＬ−１、ＢＯＯ、ＢＲＡＧ−１、ＮＲ−１３、ＣＤＮ−１、ＣＤＮ−２、ＣＤＮ−３、ＢＨＲＦ−１、ＬＭＷ５−ＨＬ、ＣＥＤ−９などが知られている。Ｂｃｌ−ｘＬは、主としてミトコンドリアの外膜上に存在し、少なくとも部分的にチトクロームｃの細胞質への放出を妨げることにより、アポトーシスの一般的な経路を阻害する（非特許文献１〜３）。しかし、Ｂｃｌ−ｘＬの骨形成および骨の維持に関する機能は明らかになっていない。
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｏｒｙ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：ｐ．１３２２−１３２６，１９９８．
【非特許文献２】Ｇｒｏｓｓ，Ａ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３：ｐ．１８９９−１９１１，１９９９．
【非特許文献３】Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  Ｙ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９５：ｐ．１５８−１６７，２００３．
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、骨粗鬆症等の骨量および骨強度の低下を来たす疾患ならびに骨量および骨強度の増加を来たす疾患を解明するのに役立つモデル動物およびその利用等を提供することにある。
本発明者らは、Ｂｃｌファミリーの中でアポトーシス抑制型として主要な役割を果たしているＢｃｌ−ｘＬに注目し、骨芽細胞のアポトーシス抑制により正常の骨量を増加させることができるかを検討するため、骨芽細胞特異的プロモーターを用いて骨芽細胞で強発現するＢｃｌ−ｘＬトランスジェニック動物を作出した。本発明者らは、トランスジェニック動物を解析し、鋭意検討した結果、正常骨の形成および維持とＢｃｌ−ｘＬとの用量依存性を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕Ｂｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子を含有してなる骨量および骨強度増加剤。
〔２〕前記Ｂｃｌ−ｘＬコード遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されている、前記〔１〕記載の増加剤。
〔３〕前記プロモーターがＩ型コラーゲンプロモーターである前記〔２〕記載の増加剤。
〔４〕発現ベクターである前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の増加剤。
〔５〕骨芽細胞特異的プロモーターおよびＢｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入してなるトランスジェニック動物。
〔６〕前記プロモーターがＩ型コラーゲンプロモーターである前記〔５〕に記載の動物。
〔７〕同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している前記〔５〕または〔６〕に記載の動物。
〔８〕骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて２倍前後に増加している前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の動物。
〔９〕骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて約３〜５倍に増加している前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の動物。
〔１０〕骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて１０倍前後に増加している前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の動物。
〔１１〕前記動物が実験動物または家畜である前記〔５〕〜〔１０〕いずれか１項に記載の動物。
〔１２〕前記実験動物がマウスである前記〔１１〕に記載の動物。
〔１３〕前記動物が成体であり、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも１種のパラメータが有意差を有する、前記〔５〕〜〔１２〕いずれか１項に記載の動物。
〔１４〕骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして使用される前記〔５〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の動物。
〔１５〕骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用される前記〔５〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の動物。
〔１６〕前記〔５〕〜〔１５〕いずれか１項に記載の動物の子孫動物。
〔１７〕前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られる骨疾患モデル動物。
〔１８〕前記骨疾患が骨粗鬆症、骨芽細胞のアポトーシスの亢進を来す疾患、骨芽細胞の増殖亢進を来す疾患または早期に老化を来す疾患である前記〔１７〕に記載のモデル動物。
〔１９〕前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物または前記〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のモデル動物から得られる組織または細胞。
〔２０〕前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物または前記〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔２１〕下記工程：
（ａ）前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物または前記〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔２２〕下記工程：
（ａ）前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物または前記〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
を含む、骨量および／または骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法。
〔２３〕下記工程：
（ａ）前記〔５〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の動物または前記〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
（ｄ）工程（ａ）で用いた動物に、工程（ｃ）で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程
を含む、骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔２４〕下記工程：
（ａ）骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を増加させる被験物質を選択する工程
を含む、Ｂｃｌ−ｘＬの発現増加を介した骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔２５〕Ｂｃｌ−ｘＬを含有してなる骨量および骨強度増加剤。
本発明の骨量および骨強度増加剤によると、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子またはＢｃｌ−ｘＬを主成分とするものであることから、骨芽細胞に導入し、発現させた場合に、骨量および骨強度の増加を伴った骨、すなわち、質・量ともに優れた海綿骨を有する骨を形成または再生することが可能である。本発明のトランスジェニック動物および疾患モデル動物によると、Ｂｃｌ−ｘＬが骨芽細胞で強発現することにより骨組織での様々な生理学的状態を解明する理想的なモデルとして役立つ。本発明の組織または細胞によると、前記動物から得られるものであることから、ｉｎ  ｖｉｖｏのみならずｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨量と骨強度の研究に利用することが可能である。前記動物を用いる本発明のスクリーニング方法によると、Ｂｃｌ−ｘＬを介した骨形成を促進する薬剤であって、形成される骨の質および強度に優れた薬剤等の開発に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、３系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）および野生型マウス（ＷＴ）におけるＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡ発現をノーザンブロッティングにより調べた結果を示す。
図２は、１０週齢のメストランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２、およびＫ３）および野生型マウス（ＷＴ）の大腿骨のＸ線写真である。
図３は、１０週齢のトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の全身（図３Ａ）、大腿骨（図３Ｂ）および椎骨（図３Ｃ）のＸ線写真である。
図４は、１０週齢、７ヶ月齢および１年齢のトランスジェニックマウスおよび野生型マウス大腿骨遠心部の写真である。
図５は、様々な週齢のトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の皮質骨における様々な組織像の比較を示す図である。上段より、１０週齢雄大腿骨遠心部のＨＥ像、１０週齢雄大腿骨皮質骨のＴＵＮＥＬ染色、４週齢皮質骨透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ）、１０週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による１０週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
図６は、５週齢のトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の骨芽細胞におけるＩ型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ）、オステオポンチン（ＯＰ）およびオステオカルチン（ＯＣ）の発現をノーザンブロッティングにより調べた結果を示す。
図７は、１０週齢のトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の大腿骨におけるＨＥ染色、Ｉ型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルチンの発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す。
図８は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて骨芽細胞におけるＤＮＡの複製を調べた結果を示す。
図９は、ＴＵＮＥＬ法を用いて骨芽細胞におけるアポトーシスの割合を調べた結果を示す。
図１０は、野生型（ＷＴ）およびＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部海綿骨領域における骨形態計測学的検討を行ったグラフである。
図１１は、ｐＱＣＴによる大腿骨骨幹皮質骨の解析結果を示すグラフ（上段、中段）および大腿骨遠心部皮質骨のｐＱＣＴ像（下段）である。
図１２は、μＣＴによる大腿骨骨幹皮質骨の解析結果を示すグラフである。
図１３は、ｐＱＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨の解析結果を示すグラフである。
図１４は、μＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨の解析結果を示すグラフである。
図１５は、トランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の大腿骨遠心部海綿骨（上段）および第２腰椎海綿骨（下段）のμＣＴ像である。
図１６は、１０週齢、７ヶ月齢、１年齢における雄のトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウスの大腿骨遠心部Ｘ線像およびμＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨像を示す。
図１７は、１０週齢、７ヶ月齢、１年齢における雄のトランスジェニックマウス（Ｋ１）と野生型マウスのμＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨骨量（ＢＶ／ＴＶ）の解析結果を示すグラフである（ｍｅａｎ±ＳＤ、＊：ｐ＜０．０５。１０週齢ＷＴ：ｎ＝６、Ｋ１：ｎ＝９；７ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝４、Ｋ１：ｎ＝６；１年齢ＷＴ：ｎ＝３、Ｋ１：ｎ＝８）。
図１８は、トランスジェニックマウスおよび野生型マウスにおけるｍＲＮＡ発現をノーザンブロットにより調べた結果を示す。左：２系統のＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｎ３）および野生型マウス（ＷＴ）におけるＢｃｌ−２のｍＲＮＡ発現；右：２系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２）および野生型マウス（ＷＴ）におけるＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡ発現。
図１９は、トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの１０週齢雄大腿骨遠心部のＸ線像を示す。左：２系統のＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｎ３）および野生型マウス（ＷＴ）のＸ線像；右：２系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２）および野生型マウス（ＷＴ）のＸ線像。
図２０は、ｐＱＣＴによるトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフおよび皮質骨横断像を示す。
左上段：１０週齢雄、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）（黒丸）および野生型マウス（白抜き）の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフ。ＷＴ：ｎ＝４、Ｎ２：ｎ＝５。
左下段：１０週齢雌、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）（黒丸）および野生型マウス（白抜き）の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフ。ＷＴ：ｎ＝５、Ｋ１：ｎ＝５。
右上段：１０週齢雄、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）および野生型マウスの皮質骨横断像。
右下段：１０週齢雌、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）と野生型マウスの皮質骨横断像。
図２１は、μＣＴを用いた１０週齢雄の野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部海綿骨像と第２腰椎海綿骨像を示す。
図２２は、μＣＴを用いた１０週齢雄の野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部海綿骨（骨量、連結性、ＳＭＩ、骨梁数、骨梁幅）および皮質骨（皮質骨幅）の解析結果を示す（ｍｅａｎ±ＳＤ、＊：ｐ＜０．０５。ＷＴ：ｎ＝６、Ｎ２：ｎ＝７、Ｋ１：ｎ＝９）。
図２３は、１０週齢雄、野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部二次海綿骨領域における骨形態計測の結果を示す（ＷＴ：ｎ＝５、Ｎ２：ｎ＝４、Ｋ１：ｎ＝４）。
図２４は、野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の２週齢大腿骨一次海綿骨領域における、ＢｒｄＵおよびＴＵＮＥＬ染色像を示す。それぞれのパネル内に一次海綿骨領域における全骨芽細胞に対する陽性骨芽細胞の割合（％）を示す。また、ＴＵＮＥＬ染色写真には陽性細胞を黒矢印で示す。
図２５は、ＢｒｄＵ、ＴＵＮＥＬの陽性骨芽細胞の割合を野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）ごとに算出したグラフを示す（ＢｒｄＵ  ＷＴ：ｎ＝６、Ｎ２：ｎ＝６、Ｋ１：ｎ＝４、ｍｅａｎ±ＳＤ、＊：ｐ＜０．０５；ＴＵＮＥＬ  ＷＴ：ｎ＝１２、Ｎ２：ｎ＝４、Ｋ１：ｎ＝７、ｍｅａｎ±ＳＤ、＊：ｐ＜０．０５）。
図２６は、様々な週齢のトランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｋ１）および野生型マウス（ＷＴ）の皮質骨における様々な組織像の比較を示す図である。上段より、１０週齢雄大腿骨遠心部のＨＥ像、１０週齢雄大腿骨皮質骨のＴＵＮＥＬ染色、４週齢皮質骨透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ）、１０週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による、１０週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
図２７は、４週齢の野生型マウス（ＷＴ）とＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、５週齢の野生型マウスとＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の骨芽細胞におけるＩ型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）およびオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現をノーザンブロッティングにより調べた結果を示す。
図２８は、８週齢野生型マウス（ＷＴ）の脛骨、８週齢Ｎ２マウスの脛骨、１０週齢Ｋ１マウスの脛骨においてＩ型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示される「遺伝子」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：１で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」をあげることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件をあげることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件をあげることができる。
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
本発明においてＢｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子（以下、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子と省略すること場合もある）は、いかなる動物由来の遺伝子であってもよい。トランスジェニック動物の作出の場合、外因性のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を用いるが、ヒトモデルの作出のためにはヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を用いることが好ましい。例えば、ヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、Ｂｏｉｓｅらの文献（Ｂｏｉｓｅ  Ｌ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７４（４），ｐｐ．５９７−６０８）およびＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ２３１１５などで公表されており、自体公知の方法により単離することができる。また、マウスＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ３５０４９などで公表されており、自体公知の方法により単離することができる。
本発明において「Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子」または「Ｂｃｌ−ｘＬのＤＮＡ」とは、特定塩基配列（配列番号：１）で示されるヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＤＮＡ）ならびに、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１に記載のヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子ならびに、そのマウスホモログおよびラットホモログなどが包含される。なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本発明において「タンパク質」または「ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号２）で示される「タンパク質」または「ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。前記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものをあげることができる。前記誘導体には、タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端または側鎖を置換したものが包含される。前記アミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体があげられる。
本発明において「Ｂｃｌ−ｘＬ」という用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトＢｃｌ−ｘＬやその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。
本発明の骨量および骨強度増加剤は、Ｂｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子を含有する。前記増加剤は、骨芽細胞に導入されることによりその作用を発揮するものである。したがって、前記増加剤は、前記Ｂｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されているものを含有することが好ましい。
前記骨芽細胞特異的プロモーターとは、Ｂｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子が当該プロモーターの下流に作動可能に連結された場合、骨芽細胞特異的にＢｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子の転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する塩基配列を有するＤＮＡをいう。前記プロモーターは、骨芽細胞が由来する動物に応じて適宜選択することができる。
前記骨芽細胞特異的プロモーターとしては、Ｉ型コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター等があげられるが、Ｉ型コラーゲンプロモーターが好ましい。Ｉ型コラーゲンプロモーターとしては、例えばヒト由来のプロモーターの場合、Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｓ．Ａ．，Ｖａｒｇａ，Ｊ．，Ｏｌｓｅｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｌ．，Ｄｉａｚ，Ａ．，Ｈｅｒｈａｌ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋｏｃｈ，Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ  １（Ｉ）ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｄ−ｎｏｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１７），１２６８４−１２６９１（１９９４）、マウス由来のプロモーターの場合、Ｒａｖａｚｚｏｌｏ，Ｒ．，Ｋａｒｓｅｎｔｙ，Ｇ．ａｎｄ  ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ，Ｂ．Ａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｌｐｈａ  １（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１２），７３８２−７３８７（１９９１）、Ｒｏｓｓｅｒｔ，Ｊ．，Ｅｂｅｒｓｐａｅｃｈｅｒ，Ｈ．，ａｎｄ  ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ，Ｂ．（１９９５）．Ｓｅｐａｒａｔｅ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏ−ａ１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２９，１４２１−１４３２．などに記載されている。
前記増加剤は、前記プロモーターおよびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を骨芽細胞で機能させるためには発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、公知または市販のものを使用することができ、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが例示される。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルスなどのウイルスベクターがあげられる。前記プロモーターおよび遺伝子を発現ベクターに連結する方法は、自体公知の方法により行うことができる。
前記増加剤は、前記プロモーター、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子、それらを含む発現ベクターが所望の細胞に導入されるために、任意の成分を含有していてもよい。任意成分としては、特に限定されるものではないが、溶媒、緩衝剤、キレート剤、防腐剤などがあげられる。また、細胞への導入効率を上げるため、前記増加剤は、リポソーム製剤の形態であってもよい。
前記増加剤中のプロモーター、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子および／またはそれらを含む発現ベクターの総含有量は、特に限定されるものではないが、通常０．００１重量％〜１００重量％である。
前記増加剤を所望の細胞（好ましくは骨芽細胞）に導入する方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ法またはｅｘ  ｖｉｖｏ法があげられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法は、前記増加剤を、例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、関節内、筋肉内などに投与することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法の場合、前記増加剤を、対象の生体内から取り出した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中に公知の方法によりトランスフェクション、インフェクションまたはインジェクションし、一定期間培養してＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を確認した後、同一対象の体内に戻す方法を採用することができる。
これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、プロモーターおよびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の合計として、患者成人１人当たり約０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは約０．００１−１０ｍｇが数日ないし数カ月に１回投与される量とすればよい。レトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、１日患者体重１ｋｇ当たり約１×１０３ｐｆｕないし１×１０１５ｐｆｕとなる量の範囲から選ぶことができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法で本増加剤を導入した細胞の場合は、１×１０４細胞／ｂｏｄｙないし１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度を投与すればよい。
本発明の骨量および骨強度増加剤は、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を含有するものであってもよい。本発明の増加剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害しない程度において、任意の成分を含有してもよい。任意成分としては、特に限定されるものではないが、溶媒、緩衝剤、防腐剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのＳＨ基保護剤、界面活性剤などがあげられる。また、増加剤中のＢｃｌ−ｘＬタンパク質の含有量は、特に限定されるものではないが、通常０．００１重量％〜１００重量％である。
本発明は、骨芽細胞特異的プロモーターおよびＢｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入したトランスジェニック動物を提供する。
本発明において、「トランスジェニック」とは、外因性のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を骨芽細胞特異的プロモーターの下流に結合させた発現ベクターを染色体遺伝子に導入することをいう。また、導入された動物およびその子孫をトランスジェニック動物と称する。
用いられる動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではないが、骨格が発達した動物が好ましい。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、自体公知の方法により製造できる。次に、本発明のトランスジェニック動物の作出方法について説明する。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により製造できる。
（ａ）ヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子と骨芽細胞特異的プロモーターとを連結した発現ベクターを調製する工程；
（ｂ）前記発現ベクターを受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｃ）前記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程；
（ｄ）前記選別した動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。
前記工程（ａ）において、発現ベクターは、本発明の骨量および骨密度増加剤を発現ベクターとしたものを好適に用いることができる。発現ベクターは、制限酵素等により直鎖状にして工程（ｂ）に供することが好ましい。
前記工程（ｂ）において、前記発現ベクターを受精卵に導入する方法は、例えば、交配後の雌の卵管を洗浄して受精卵を採取し、精子または卵子由来の前核にマイクロインジェクション法により前記発現ベクターを直接注入する方法があげられる。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で移植した動物が出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する方法としては、例えば、注入した発現ベクターが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かについて、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンブロット法またはＰＣＲ法によりスクリーニングする方法があげられる。
前記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で選別した動物（ファウンダー）から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、発現ベクターが組み込まれた動物とＣ５７ＢＬ／６、ＦＶＢなどの近交系の野生型動物とを戻し交配をする方法があげられる。
このようにして得られた本発明のトランスジェニック動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織があげられ、長管骨、頭蓋骨、椎骨などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株があげられ、具体的には骨芽細胞などが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現が調節されている。すなわち、同種野生型動物と比べて、骨芽細胞においてＢｃｌ−ｘＬが過剰発現している。それにより、本発明のトランスジェニック動物は、同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している。本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現量と骨量および骨強度の増加との用量依存性を初めて見出したものであり、本発明により、下記トランスジェニック動物が提供される。
本発明のトランスジェニック動物は、大別して、骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて２倍前後に増加している動物（以下、低発現動物ともいう）、骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて約３〜５倍に増加している動物（以下、中発現動物ともいう）または骨芽細胞における前記Ｂｃｌ−ｘＬの発現が同種野生型動物に比べて１０倍前後に増加している動物（以下、高発現動物ともいう）に分類することができる。
本発明のトランスジェニック動物は、本動物を用いた骨疾患の研究または骨疾患の予防または治療薬のスクリーニングにおいて、前記低発現動物、中発現動物および高発現動物の中から目的に応じて、適する動物を選択して用いることができる。例えば、マウスの場合、様々な程度の骨粗鬆症モデルマウスと低発現、中発現、高発現Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスと交配し、骨量・骨強度を正常レベルに戻すために必要なＢｃｌ−ｘＬのレベルを推測できる。また、後述する、Ｂｃｌ−ｘＬのプロモーターを用いたスクリーニングから得られた物質の野生型動物を用いた効果判定において、低発現、中発現、高発現Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスそれぞれと比較することにより、Ｂｃｌ−ｘＬの発現誘導程度と骨量・骨強度・骨の微細構造の相関を比較検討することができる。すなわち、低発現、中発現、高発現Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスのどれに相当する骨の増加をもたらすことができるか、そして、骨量の増加をもたらした時、その他の負の作用（骨強度の低下、骨微細構造の異常、骨の低回転等）を来していないかを比較検討できる。また、後述するように、低発現マウスは、Ｂｃｌ−ｘＬシグナルの活性化物質のスクリーニングに、中発現、高発現マウスは、抑制物質のスクリーニングに適している。
本発明のトランスジェニック動物は、骨粗鬆症の治療および予防を含む骨疾患の研究に用いる場合、成体を用いることが好ましい。その理由は、前記骨疾患は、通常加齢により発生頻度が高くなることによる。成体とは動物によってその時期が異なるが、少なくとも胎仔および出生直後を除く時期をいい、マウスの場合、６週齢から１２月齢が例示され、加齢とともに野生型との有意差が大きくなることから、加齢により死亡するまで（最長２年くらいまで）であってもよい。１０週齢前後が好適に使用される。
本発明のトランスジェニック動物が成体の場合、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも１種のパラメータが有意差を有することが好ましい。例えば、１０週齢、雄、野生型マウス（ｎ＝６）、トランスジェニックマウス（ｎ＝９）における大腿骨遠心部海綿骨のマイクロＣＴ（μＣＴ）による解析の結果、以下の５項目のパラメータについて有意差を認めることができる。
骨量：ｐ＝０．０１２＜０．０５
連結性：ｐ＝０．００４＜０．０１
ストラクチャーモデルインデックス（ＳＭＩ）：ｐ＝０．０１７＜０．０５
骨梁数：ｐ＝０．００５＜０．０１
骨梁厚：ｐ＝０．０４８＜０．０５
特に、連結性および骨梁数のパラメータは有意差が大きい。
前記計測パラメータは、マイクロＣＴ（μＣＴ）により計測することができ、その詳細は、実施例に記載されている。
本発明のトランスジェニック動物は、同種野生型動物と比べて骨の量および質ともに増加していることから、骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして、または骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用されることが好ましい。
骨疾患研究のモデルとして使用する場合、本発明のトランスジェニック動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られるモデル動物を作出して用いてもよい。本発明は、かかるモデル動物を提供する。
前記他の疾患モデルとしては、骨粗鬆症モデル、骨芽細胞増殖亢進モデル、骨芽細胞アポトーシス亢進モデル、早期老化モデル、骨量減少を来す各種ノックアウト動物等があげられる。例えばマウスの場合、ＣＤＫ６／ＣｙｃｌｉｎＤ１ダブルトランスジェニックマウス、Ｋｌｏｔｈｏマウス、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（例、骨芽細胞特異的に外来性Ｂｃｌ−２を発現するマウス）等が好適に用いられ得る。
本発明は、前記トランスジェニック動物または前記モデル動物を用いることを特徴とする骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供する。この場合、前記低発現動物を用いることが好ましい。
［スクリーニング方法Ｉ］
本発明のスクリーニング方法Ｉは、具体的には、下記工程を含む：
（ａ）本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程。
前記（ａ）において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
前記被験物質を本発明の動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内等の全身投与、あるいは関節内、標的細胞付近への局所投与等があげられる。
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、Ｘ線解析、μＣＴおよびｐＱＣＴなどがあげられる。
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。また、陽性対照として、公知の骨量増加剤を同様に投与することも望ましい。
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、骨量および／または骨強度を増加させる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与していないＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬのシグナル伝達経路を活性化しうる作用を有するものであり、骨量および／または骨密度の量および／または質を向上させる候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨粗鬆症、歯周病、重度の骨折、骨欠損、歯槽骨の吸収に対する治療剤である。
［スクリーニング方法ＩＩ］
また、本発明は、下記工程を含むＢｃｌ−ｘＬを介した骨量および骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供する。この場合、前記中発現動物または高発現動物を用いることが好ましい。
（ａ）本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程。
工程（ａ）において、被験物質は、スクリーニング方法Ｉと同様のものがあげられ、投与方法もスクリーニング方法Ｉと同様である。
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、Ｘ線解析、μＣＴおよびｐＱＣＴなどがあげられる。
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与しないトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬのシグナル伝達経路を抑制して骨量および／または骨密度を低下させうる作用を有するものであり、骨量および／または骨密度が異常に増加した疾患を治療または予防する候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨大理石病に対する治療剤である。
［スクリーニング方法ＩＩＩ］
また、本発明は、下記工程を含む骨量および骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ）を提供する。この場合、目的により前記低発現動物、中発現動物および高発現動物のいずれの動物を用いてもよい。
（ａ）本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
（ｄ）工程（ａ）で用いた動物に、工程（ｃ）で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程。
前記工程（ａ）〜（ｃ）は、前記スクリーニング方法ＩＩと同様である。
前記工程（ｄ）において、前記工程（ｃ）で選択された被験物質に対するアンタゴニスト候補物質としては、前記工程（ａ）でスクリーニング対象となる候補物質の中から適宜選択することができる。アンタゴニスト候補物質は、選択された被験物質がタンパク質の場合、当該タンパク質に対する中和抗体が好ましく選択され、選択された被験物質が特定の配列を有する核酸の場合、当該核酸に対するアンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡなどが好ましく選択される。
前記工程（ｄ）において、被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与する方法は、スクリーニング方法Ｉの工程（ｂ）と同様であるが、投与のタイミングは、同時であってもよく、一定の間隔を置いて別々であってもよい。また、投与経路も同一経路または異なる経路であってもよい。
前記工程（ｅ）において、被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、Ｘ線解析、μＣＴおよびｐＱＣＴなどがあげられる。
前記工程（ｅ）において、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、アンタゴニスト候補物質投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
前記工程（ｆ）において、前記工程（ｅ）の比較結果に基づいて、骨量および／または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する。選択する基準は、アンタゴニスト候補物質を投与しないトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択されたアンタゴニスト候補物質は、骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの発現系を介した阻害作用を抑制しうる作用を有するものであり、Ｂｃｌ−ｘＬの発現抑制により骨量および／または骨密度が低下した疾患を治療または予防する候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨粗鬆症やステロイド骨粗鬆症に対する治療剤である。
本発明は、骨芽細胞を用いることを特徴とするＢｃｌ−ｘＬの発現増加を介した骨量および／または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＶ）を提供する。この場合、前記骨芽細胞は、野生型動物由来の細胞を用いることが好ましい。
［スクリーニング方法ＩＶ］
本発明のスクリーニング方法ＩＶは、具体的には、下記工程を含む：
（ａ）骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を増加させる被験物質を選択する工程。
工程（ａ）において、骨芽細胞をＢｃｌ−ｘＬの発現が維持される条件下に置いたものを用いることができる。かかる条件下としては、骨芽細胞を適当な培地中に入れ、約２５〜４０℃のインキュベーター中で生存または培養させることが好ましい。次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。
前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞の感受性等によって適宜設定することができる。
工程（ｂ）において、前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの発現量は、自体公知の方法により調べることができる。内在性のＢｃｌ−ｘＬの発現量は、例えば、細胞からタンパク質を抽出してＢｃｌ−ｘＬを認識する抗体を用いるウェスタンブロッティング等により測定する方法；細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティング等により転写されたＢｃｌ−ｘＬｍＲＮＡを測定する方法；Ｂｃｌ−ｘＬを認識する抗体を用いて、免疫組織化学によりｉｎ  ｓｉｔｕでＢｃｌ−ｘＬを調べる方法等があげられる。内在性のＢｃｌ−ｘＬの発現量は、Ｂｃｌ−ｘＬのプロモーター領域とレポーター遺伝子とを連結した発現ベクターを骨芽細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を測定するレポーターアッセイ等によっても推定できる。レポーターアッセイが好ましく用いられる。レポーター遺伝子は、公知の遺伝子を限定なく使用することができ、例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）などがあげられるが、これに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、用いるレポーター遺伝子に応じて、自体公知の方法により測定することができる。
前記工程（ｂ）において、被験物質を接触させない骨芽細胞も同時にまたは別途調べ、接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。また、陽性対照として、例えば、ＦＧＦまたはＢＭＰ−２等を同様に接触させた骨芽細胞も準備することが好ましい。
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を増加させる被験物質を選択する。選択する基準は、Ｂｃｌ−ｘＬのタンパク質またはｍＲＮＡが増加していることを指標にすればよい。レポーター遺伝子の発現が増加していることを指標にすることが好ましい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるＢｃｌ−ｘＬのアゴニスト作用を有する剤として有用であるとともに、例えば、スクリーニング方法Ｉのようなさらなるスクリーニングや薬理試験を実施することにより、副作用の少ない骨粗鬆症等の骨疾患治療剤の候補薬ともなりうる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスの作出
ヒトＢｃｌ−ｘＬｃＤＮＡ（大阪大学、辻本博士より供与された）をプラスミドｐＵＣ−ＣＡＧＧＳ／Ｘｈｏｌにクローニングした。前記プラスミドを、ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、得られたフラグメントを、マウスＩ型コラーゲンプロモーターを含むプラスミドｐＮＡＳＳβにサブクローニングし、トランスジェニック構築物とした（大阪大学、辻本博士より頂いたｐＣＡＧＧＳ−ｈｂｃｌ−ｘＬについては、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５７３６，２０００を参照のこと）。ＥｃｏＲ  ＩとＳａｌ  Ｉで直鎖状にしたＤＮＡ構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｒ（日本ＳＬＣ）接合体の前核にマイクロインジェクションし、それを、仮親メスに移し、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックファウンダーを作出した。Ｂｃｌ−ｘＬ  ｃＤＮＡ全長をプローブとして用いて、サザンブロット法により遺伝子型を調べた。
前記トランスジェニックファウンダーをＣ５７ＢＬ／６Ｃｒと戻し交配をし、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスを作出した。得られたトランスジェニックマウスの各組織から常法によりＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法によりＢｃｌ−ｘＬの発現を調べたところ、骨芽細胞および歯の象牙細胞にのみ発現していることが確認された。
［実施例２］
Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスからの発現レベルの異なる系統の樹立
実施例１で得られた３系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（４週齢）の大腿骨および脛骨から、ＲＮＡ抽出キットＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を用いて、ＲＮＡを単離した。常法に従って、ノーザンブロットによりＢｃｌ−ｘＬの発現を調べた。結果を図１に示す。
図１より、３系統のトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）は、野生型マウス（ＷＴ）に比べて、Ｂｃｌ−ｘＬの発現レベルが上昇していることがわかった。デンシトメーターで野生型マウスとトランスジェニックマウスとの発現レベルを比較したところ、Ｋ１は約１０倍、Ｋ２は約３倍、Ｋ３は約２倍高いことが明らかになった。以下、Ｋ１を強発現系統、Ｋ２を中発現系統、Ｋ３を弱発現系統に分類し、解析を進めた。
［実施例３］
Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスのＸ線解析
１０週齢のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、ｍｉｃｒｏ−ＦＸ１０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ，Ｉｎｃ．）を用いて全身像のＸ線撮影を行った。さらにマウスを解剖し、大腿骨・椎骨を採取し、７０％エタノールを用いて固定した後、ｍｉｃｒｏ−ＦＸ１０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ，Ｉｎｃ．）を用いてＸ線撮影を行った。
［結果］
図２：１０週齢  雌  野生型マウスとＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスの大腿骨Ｘ線像
野生型と比較して、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスはその発現レベルに比例して二次海綿骨領域の骨量が増加しており、最も弱発現のライン（Ｋ３）でも野生型と比較して二次海綿骨領域の骨量が多い。
図３（Ａ）：１０週齢  雄  Ｘ線像（全身）野生型（左）とＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス強発現ライン（右）
（Ｂ）：１０週齢  雌  Ｘ線像（大腿骨）野生型（左）とＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス強発現ライン（右）
（Ｃ）：１０週齢  雄  Ｘ線像（椎骨）野生型（左）とＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス強発現ライン（右）
野生型と比較してＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは、長管骨や椎骨の二次海綿骨の増加が認められる。
［実施例４］
Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスの解析
１０週齢、７ヶ月齢および１年齢のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスおよび野生型マウスを用いた。ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）で全身麻酔後、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定を行った。大腿骨を採取し、同固定液にて４℃で一晩浸透固定し、０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄後、１０％ＥＤＴＡ溶液で約１週間脱灰を行った。脱灰終了後、通法に従いパラフィンブロックを作製した。このブロックを３μｍで薄切し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を施した。
［結果］
図４より、野生型マウスと比較してＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは、大腿骨遠心部の二次海綿骨が多く認められ、骨幹部にも多数の二次海綿骨が認められる。そして、１年齢の野生型マウスではほとんどの二次海綿骨が吸収されてしまっているが、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスでは１年齢においても多数の二次海綿骨が認められる。
次に、皮質骨における様々な組織像の比較を行った。４週齢および１０週齢のＢｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）および野生型マウスの皮質骨を、ＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察、鍍銀染色、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により詳細に検討した。
［結果］
図５は、上段より、１０週齢雄大腿骨遠心部のＨＥ像、１０週齢雄大腿骨皮質骨のＴＵＮＥＬ染色、４週齢皮質骨透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ）、１０週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による１０週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。皮質骨の観察によりトランスジェニックマウス（Ｋ１）の骨細胞は透過電子顕微鏡像や鍍銀染色で認められるように、若い形態（細胞質が野生型に比較し豊富に存在）を示していたが、鍍銀染色・走査電子顕微鏡の二次電子像より、野生型と全く変わらない多数の骨細管および骨細胞突起が認められた（一般に骨細胞が幼若な場合、骨細管および骨細胞突起が減少する）。
［実施例５］
ノーザンブロッティング
総ＲＮＡを、５週齢のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスの大腿骨から抽出した。液体窒素で凍結した大腿骨をＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）１ｍｌ中でホモジナイズし、５分間室温で放置したのち、クロロホルム２００μｌを加え、転倒混和後、３分間室温で放置した。４℃冷却、１５，０００  Ｘ  ｇで１５分間遠心したのち、水層（上層）を抽出し、イソプロパノール５００μｌを加え、室温で１０分間放置した。４℃冷却、１５，０００  Ｘ  ｇで１５分間遠心したのち、上清を除去し、ＤＥＰＣ水に懸濁させた。フェノールを加え、１５，０００  Ｘ  ｇで５分間、遠心したのち、上層を抽出し、酢酸ナトリウムと１００％エタノールを加え、１５，０００  Ｘ  ｇで２０分間、遠心した。上清を除去したのち、ＲＮＡ沈殿をＤＥＰＣ水に懸濁させた。２０μｇの総ＲＮＡをホルムアミドで変性させ、１．０％アガロースゲルにて電気泳動した後、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。メンブレンは、ｐｒｏ−α１（１）コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの３２ＰでラベルされたｃＤＮＡプローブと相補鎖結合させた。
図６より、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスとで骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現を検討した結果、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較してＩ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの発現レベルはほとんど変わらなかった。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
脱パラフィン後、切片を０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡ溶液で前固定後、０．１Ｍ  ＰＢにて洗浄し、８μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で３７℃１５分処理したのち、４％ＰＦＡ溶液で後固定を行った。０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍ  トリエタノールアミンでアセチル化処理を１０分間行い、０．１Ｍ  ＰＢによる洗浄後、エタノールにより脱水し、乾燥を行った。その後、ハイブリダイゼーション液で１ｎｇ／ｍｌに希釈したプローブを用いて、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、２×標準クエン酸ナトリウム溶液（以下ＳＳＣと略す）を含む５０％ホルムアミド溶液中で５２℃３０分間洗浄し、１８μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）で３７℃  ３０分間処理した。２×ＳＳＣで５２℃  ２０分間の洗浄を２回繰り返し、０．２×ＳＳＣで５２℃  ２０分間洗浄を行った。室温でＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてブロッキングを１時間行なったのち、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と室温で４５分間反応させた。洗浄後、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を基質として約０．５−２時間発色反応を行い、シグナルを検出した。検出反応終了後、水洗し、水溶性封入剤クリスタルマウント（ｂｉｏｍｅｄａ  ｃｏｒｐ．Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）による封入を行った。
［結果］
Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスにおける骨芽細胞の分化段階を調べるため、１０週齢時の脛骨を用い、骨芽細胞分化のマーカー遺伝子であるＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ（Ｉ））、オステオポンチン遺伝子（ＯＰ）およびオステオカルシン遺伝子（ＯＣ）の発現パターンをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検討した。図７より、野生型マウスでは、Ｉ型コラーゲンは広範な分化段階の骨芽細胞で発現していた。オステオポンチンはおもに未熟骨芽細胞で発現しており、主として海綿骨に存在する骨芽細胞が染色されていた。オステオカルシンは、おもに皮質骨骨内膜に存在する成熟骨芽細胞で発現していた。Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、Ｉ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの発現領域および発現レベルは全く変わらないことから、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスにおいて骨芽細胞は正常に分化していることが示された。
［実施例６］
ＢｒｄＵ
２週齢のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスにＢｒｄＵ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）１００μｇ／ｇを腹腔内投与し、１時間後にネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）で全身麻酔後、左心室に５単位／ｍｌヘパリンを含む生理食塩水を注入し、４％  ＰＦＡで灌流固定を行った。前述に従い、大腿骨の切片を作製し、ＢｒｄＵ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）を用いて、ＢｒｄＵ染色を行った。すなわち、切片をキシレンにて脱パラフィンし、エタノールで洗浄した。切片をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに１０分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害したのち、ＰＢＳで洗浄した。０．０６２５％トリプシンで３７℃５分間タンパク分解処理し、ＤＮＡを露出後、Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを滴下し、室温で２０分間インキュベート、変性させたのち、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを滴下し、室温で１０分間ブロッキングを行った。ビオチン化抗ＢｒｄＵ  Ｒｅａｇｅｎｔで室温６０分間処理し、ＰＢＳで洗浄したのち、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを滴下し、室温で１０分間インキュベートしたのち、ＤＡＢ染色を行った。発色反応後、対比染色として、ヘマトキシリン染色を行った。
図８より、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、一次海綿骨領域の骨芽細胞においてＢｒｄＵ取り込みの有意な増加が認められた。
ＴＵＮＥＬ
２週齢のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスから、前述に従って大腿骨の切片を作製し、ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  ｎｉｃｋｅｄ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。ＴＵＮＥＬ染色はＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）システム（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いた。すなわち、切片をキシレンにて脱パラフィンし、エタノールで洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０μｇ／ｍｌ）を加え、室温下で１５分インキュベートし、ＤＮＡを露出させたのち、蒸留水で洗浄後、３％  Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳに室温で５分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。ＰＢＳにて洗浄後、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを切片に滴下し、室温で１０分間インキュベートしたのち、ＴｄＴ／ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｄＵＴＰを加え、３７℃で一時間、反応させた。室温下で３０分間、切片をｓｔｏｐ／ｗａｓｈバッファーに浸し、反応をとめたのち、ＰＢＳにて洗浄し、Ａｎｔｉｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗体を滴下し、室温３０分間インキュベートした。ＰＢＳにて洗浄後、Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）溶液にて発色させた。発色反応後、対比染色として、メチルグリーン染色、またＴＵＮＥＬ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ骨芽細胞をカウントするためにトルイジンブルー染色を行った。
図９より、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、一次海綿骨領域の骨芽細胞においてアポトーシス陽性細胞の有意な減少が認められた（ＴＵＮＥＬ陽性骨芽細胞を、図中矢印で示した）。
［実施例７］
骨形態計測
１０週齢  雄のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスを用いて、静的な骨形態計測を行った。また、動的な骨形態計測を行うため、１０週齢時のマウスにカルセイン（０．１６ｍｇ／１０ｇ体重）を４日間の間隔を空けて、二度、腹腔内に注射し、翌日に屠殺した。大腿骨を摘出し、７０％エタノールで固定したのち、グリコールメタクリレートで包埋した。大腿骨の遠心部より７μｍ厚の縦断切片を作製し、トルイジンブルー染色を行った後、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ，（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｐｐｌｙ，Ｎａｇａｎｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて骨形態計測を行った。
図１０より、１０週齢  雄のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスを比較した結果、静的パラメータについては、骨量（ＢＶ／ＴＶ）のみ有意な差を認めたが、その他のパラメータについては有意差を認めなかった。骨石灰化速度・骨形成速度・骨石灰化面／骨面といった動的パラメータについてもＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと有意差は認められなかったが、骨石灰化面／骨面・骨形成速度の二つのパラメータが野生型よりも亢進している傾向が認められた。
［実施例８］
ｐＱＣＴによる大腿骨骨幹皮質骨の解析
１０週齢  雄のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、７０％ＥｔＯＨを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、動物研究用ｐＱＣＴ骨密度測定装置  ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＱＣＴ解析を行った。海綿骨パラメーターは大腿骨遠位成長板から骨幹部に向かって０．１９ｍｍ間隔で連続的に測定し、皮質骨パラメーターは大腿骨骨幹部で測定した。スライス厚は０．４６ｍｍ、ボクセルサイズは０．０８ｍｍで測定を行なった。
図１１より、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、皮質骨塩量・皮質骨平均厚・皮質骨密度・ＸＳＳＩすべてのパラメータにおいて有意差が認められなかった。また、大腿骨遠心部皮質骨のｐＱＣＴ像を比較しても、トランスジェニックマウスと野生型マウスの皮質骨の性状は全く変わらなかった。
［実施例９］
μＣＴによる大腿骨骨幹皮質骨の解析
１０週齢  雌のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス３系統（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）と野生型マウスに、ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、７０％ＥｔＯＨを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、マイクロ−ＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて５０ｋＶ、０．１ｍＡのＸ線ビームにより、ビーム幅２０μｍ、スライス間隔１２μｍで大腿骨骨幹部より１スライスのボリュームデータを取得した。そして、三次元画像処理プログラム（ＴＲＩ／３Ｄ−Ｂｏｎｅ，ラトックシステムエンジニアリング）にて皮質骨部位の画像抽出と骨パラメータの解析を行った。
図１２より、１０週齢  雌のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス３系統（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）と野生型マウスについて、大腿骨骨幹部皮質骨の、骨面積に対する皮質骨面積・皮質骨幅を検討した結果、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型と比較して有意差を認めなかった。さらに発現レベルの異なるＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス３系統（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）同士についても有意差は認められなかった。
［実施例１０］
ｐＱＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨の解析
１０週齢  雌のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、７０％エタノールを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、動物研究用ｐＱＣＴ  骨密度測定装置  ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＱＣＴ解析を行った。海綿骨パラメーターは大腿骨遠位成長板から骨幹部に向かって０．１９ｍｍ間隔で連続的に測定した。スライス厚は０．４６ｍｍ、ボクセルサイズは０．０８ｍｍで測定を行なった。
図１３より、大腿骨遠心部海綿骨の骨密度についてＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較し、骨密度が有意に大きいことが認められた。
［実施例１１］
μＣＴによる大腿骨遠心部海綿骨の解析
１０週齢  雌のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス３系統（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）と野生型マウスに、ネンブタール（０．７５ｍｇ／１０ｇ体重）を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨および第２腰椎を採取し、７０％ＥｔＯＨを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、マイクロＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて５０ｋＶ、０．１ｍＡのＸ線ビームにより、ビーム幅２０μｍ、スライス間隔１２μｍで遠心部成長板直下より２００スライスのボリュームデータを取得した。そして、三次元画像処理プログラム（ＴＲＩ／３Ｄ−Ｂｏｎｅ，ラトックシステムエンジニアリング）にて海綿骨部位の画像抽出と骨パラメータの解析を行った。採取した第２腰椎も同様に、マイクロＣＴを用いて海綿骨部位の画像抽出を行った。
図１４より、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは３系統とも野生型マウスと比較して、骨量、骨梁数および骨梁間距離については有意差が認められた。骨梁幅については有意差は認められなかったが、Ｃｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスの方が野生型より大きい傾向が認められた。骨強度に関連する連結性およびＳＭＩについてもＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して有意差が認められた。
図１５より、トランスジェニックマウス（Ｋ１）は、野生型マウスと比較して大腿骨海綿骨および椎体海綿骨も増加していた。
１０週齢、７ヶ月齢および１年齢の雄のＣｏｌ  Ｉ−Ｂｃｌ−ＸＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）と野生型マウスの大腿骨遠心部海綿骨骨量（ＢＶ／ＴＶ）のＸ線およびμＣＴでの解析結果を図１６および１７に示す。
図１６および１７より、トランスジェニックマウス（Ｋ１）は１０週齢、７ヶ月齢、１年齢のすべてにおいて野生型マウスと比較して、有意に骨量が増加していた。また、野生型マウスでは１０週齢時の海綿骨骨量は（２２±８％）であったが、７ヶ月齢時点（９±６％）で半分以下に減少していた。トランスジェニックマウス（Ｋ１）では１０週齢時点で、（３４±３％）の骨量であり、７ヶ月齢時点で（１９±４％）の骨量を示し、骨量の減少度合いは野生型マウスよりも小さかった。
［比較例１］
Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスの作出とＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスとの比較
実施例１において、ヒトＢｃｌ−ｘＬｃＤＮＡの代わりにヒトＢｃｌ−２ｃＤＮＡを用いること以外は実施例１と同様の作出方法で、骨芽細胞特異的Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスを樹立した。Ｂｃｌ−２蛋白も抗アポトーシス作用を有し、骨芽細胞におけるその機能と役割を解明するためにＢｃｌ−ｘＬとの比較検討を行った。
［比較例２］
ノーザンブロット
実施例５と同様の方法により、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスでの遺伝子発現をノーザンブロットにより調べた。結果を図１８に示す。
図１８左：２系統のＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｎ３）および野生型マウス（ＷＴ）におけるＢｃｌ−２のｍＲＮＡ発現の結果を示す。Ｎ２を強発現系統のライン、Ｎ３を弱発現系統のラインとし、以降のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウスとの比較は強発現のＮ２マウスを用いた。
図１８右：２系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２）および野生型マウス（ＷＴ）におけるＢｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡ発現を調べた結果を示す。
［比較例３］
Ｘ線解析
実施例３に記載の方法と同様にして、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスの大腿骨遠心部のＸ線撮影を行った。結果を図１９に示す。
図１９左：２系統のＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｎ３）および野生型マウス（ＷＴ）の１０週齢雄大腿骨遠心部のＸ線像を示す。Ｎ２、Ｎ３マウスとも野生型マウスと比較して骨幹部領域まで二次海綿骨が認められ、大腿骨全体でみると骨量が増加していたが、成長板直下の一次海綿骨領域においてはむしろ骨量が減少している像を示した。
図１９右：２系統のＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１、Ｋ２）および野生型マウス（ＷＴ）の１０週齢雄大腿骨遠心部のＸ線像を示す。Ｋ１、Ｋ２マウスとも野生型マウスと比較して、骨量が増加していた。また、Ｎ２、Ｎ３マウスと違い、成長板直下においても、骨量が増加していた。
［比較例４］
ｐＱＣＴ解析
実施例８および１０に記載の方法と同様にして、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスの海綿骨および皮質骨をｐＱＣＴ解析した。結果を図２０に示す。
図２０左上段：１０週齢雄、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）（黒丸）と野生型マウス（白抜き）の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフを示す。
図２０左下段：１０週齢雌、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）（黒丸）と野生型マウス（白抜き）の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフを示す。
図２０右上段：１０週齢雄、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）と野生型マウスの皮質骨横断像を示す。
図２０右下段：１０週齢雌、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）と野生型マウスの皮質骨横断像を示す。
骨塩量のグラフより、Ｎ２マウスは野生型マウスと比較して、海綿骨の骨密度は変わらないが、皮質骨の骨密度が有意に低くなっており、皮質骨横断像においても骨密度の低い黄色の部位（赤−黄色−青−白の順に骨密度が高くなる）が多く認められた。Ｋ１マウスは野生型マウスと比較して海綿骨骨密度が有意に増加しており、皮質骨密度は変わらなかった。
［比較例５］
μＣＴを用いた１０週齢雄マウス海綿骨像
実施例９および１１に記載の方法と同様にして、１０週齢雄の野生型マウス、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部海綿骨と第２腰椎海綿骨をμＣＴにより解析した。結果を図２１に示す。
図２１より、Ｎ２マウスは野生型マウスと比較して、大腿骨遠心部、第２腰椎とも骨量が少なく細い骨梁を示した。Ｋ１マウスは野生型マウスと比較して、大腿骨遠心部、第２腰椎とも骨量が増加している像を示した。
［比較例６］
μＣＴを用いた１０週齢雄大腿骨遠心部海綿骨および皮質骨の解析
実施例１１に記載の方法と同様にして、１０週齢雄の野生型マウス、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）およびＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部海綿骨（骨量、連結性、ＳＭＩ、骨梁数、骨梁幅）および皮質骨（皮質骨幅）をμＣＴにより解析した。結果を図２２に示す。
図２２より、Ｋ１マウスは海綿骨の骨量、連結性、骨梁数および骨梁幅が有意に増加しているのに対し、Ｎ２マウスは野生型マウスと比較して海綿骨骨量が有意に少なく、連結性が悪いというまったく正反対の表現型を示した。
［比較例７］
１０週齢雄大腿骨遠心部二次海綿骨領域における形態計測
実施例７に記載の方法と同様にして、１０週齢雄、野生型マウス、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の大腿骨遠心部二次海綿骨領域における骨形態を計測した。結果を図２３に示す。
図２３より、Ｎ２マウスは野生型マウスと比較して、骨芽細胞面（Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ）および骨芽細胞数（Ｎ．Ｏｂ／ＢＰｍ）が有意に増加しているにもかかわらず、骨量（ＢＶ／ＴＶ）が有意に減少していた。そして、骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳ）や石灰化速度（ＭＡＲ）は野生型と変わらなかった。すなわち、Ｎ２マウスでは野生型マウスに比較して骨芽細胞一個あたりの機能が低下しているものと思われた。また、Ｎ２マウスは皮質骨中に非常に多くの骨細胞が存在していた。これに対し、Ｋ１マウスでは、骨量（ＢＶ／ＴＶ）、石灰化面（ＭＳ／ＢＳ）および骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳ）が増加し、骨芽細胞は正常の機能を保持していた。またＮ２マウスと異なり、骨細胞密度は正常であった。
［比較例８］
２週齢大腿骨一次海綿骨領域ＢｒｄＵおよびＴＵＮＥＬ染色像
実施例６に記載の方法と同様にして、野生型マウス（ＷＴ）、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）およびＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の２週齢大腿骨一次海綿骨領域における、ＢｒｄＵおよびＴＵＮＥＬ染色を行った。結果を図２４に示す。
図２４より、各パネル内に一次海綿骨領域における全骨芽細胞に対する陽性骨芽細胞の割合（％）を示した。また、ＴＵＮＥＬ染色写真には陽性細胞を黒矢印で示した。
図２４で示したＢｒｄＵおよびＴＵＮＥＬの陽性骨芽細胞の割合をそれぞれのマウスごとに算出し、グラフに示した。結果を図２５に示す。図２５より、Ｎ２およびＫ１マウスのＢｒｄＵ染色における陽性骨芽細胞の割合は、野生型マウスに比較して有意に高く、一次海綿骨領域の骨芽細胞の増殖が亢進していることが示された。ＴＵＮＥＬ染色ではＫ１マウスが野生型マウスに比較して有意に低く、アポトーシスが抑制されていることが示された。一方Ｎ２マウスでは、アポトーシスの有意な抑制を認めなかった。しかし、Ｎ２マウスでも、骨芽細胞の増殖が亢進しているため、アポトーシスの抑制はある程度起こっていると考えられる。しかし、その程度はＫ１マウスに比較して軽度である。
［比較例９］
皮質骨における様々な組織像の比較
実施例４に記載の方法と同様にして、様々な週齢のトランスジェニックマウス（Ｎ２、Ｋ１）と野生型マウスの皮質骨を詳細に検討した。結果を図２６に示す。図２６の上段より、１０週齢雄大腿骨遠心部のＨＥ像、１０週齢雄大腿骨皮質骨のＴＵＮＥＬ染色、４週齢皮質骨透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ）、１０週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による、１０週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
皮質骨の観察により、Ｋ１マウスの骨細胞は透過電子顕微鏡像や鍍銀染色で認められるように、若い形態を示していたが、鍍銀染色・走査電子顕微鏡の二次電子像より、野生型と全く変わらない多数の骨細管が認められた。
しかしながら、Ｎ２マウスの皮質骨では、大部分の骨細胞が死滅しており（ＨＥ）、残存する骨細胞や死滅した骨小腔はＴＵＮＥＬ陽性を示すことからＮ２マウスの骨細胞はアポトーシスで死滅しているものと考えられ、透過電子顕微鏡像においても凝縮した核が認められた。鍍銀染色および走査電子顕微鏡を用いて骨細管・骨細胞突起を観察すると、野生型マウスと比較して非常に骨細管・骨細胞突起が少ない像が観察され、骨細胞の増加と骨細管・骨細胞突起の減少が骨細胞のアポトーシスの原因として考えられた。
［比較例１０］
ノーザンブロッティング
実施例５に記載の方法と同様にして、４週齢の野生型マウスとＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｎ２）、５週齢の野生型マウスとＢｃｌ−ｘＬトランスジェニックマウス（Ｋ１）の骨芽細胞におけるＩ型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）およびオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現をノーザンブロッティングにより調べた。結果を図２７に示す。
図２７より、前記発現レベルは、Ｋ１マウスと野生型で同レベルであったが、Ｎ２マウスでは野生型マウスと比較してオステオポンチンの発現が強く、オステオカルシンの発現が低下していた。
［比較例１１］
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
実施例５に記載の方法と同様にして、８週齢野生型マウスの脛骨、８週齢Ｎ２マウスの脛骨、１０週齢Ｋ１マウスの脛骨においてＩ型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた。結果を図２８に示す。
図２８より、Ｋ１マウスでは成長板直下や内骨膜におけるこれらの遺伝子の発現パターンは野生型マウスと変わらなかったが、Ｎ２マウスでは野生型マウスと比較して成長板直下や内骨膜でのオステオポンチンの発現が強く、オステオカルシンの発現が低下している像が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、骨疾患の解明およびそれに対する治療剤の開発に適するトランスジェニック動物が提供される。当該動物を用いるスクリーニング方法は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現系に特異的に作用し、副作用の少ない薬剤の開発に貢献することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００６−１３８２８７（出願日：２００６年５月１７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
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0005207137.tif 000005
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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