(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、miR‐34b、miR‐132、miR‐137、miR‐193a、又はmiR‐203のうちの少なくとも１以上の遺伝子の発現低下を指標として検体の口腔扁平上皮癌への癌化を検出することを含む、検体の口腔扁平上皮癌への癌化の検出方法。
【請求項２】
遺伝子発現の変化を、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、又はin situ ハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現低下が、ＣｐＧアイランドあるいはその近傍のメチル化による遺伝子の発現の低下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記メチル化を、ＣＯＢＲＡ法、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅａｎｃｅ法、又はサザンブロット法のいずれかの方法を用いて検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検体が口腔由来細胞である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
miR‐137、又はmiR‐193aのうちの少なくとも１以上の遺伝子を含む、口腔扁平上皮癌の抑制剤。
【請求項７】
前記遺伝子が高分子化合物に結合又は封入されている、請求項６に記載の癌抑制剤。
【請求項８】
前記高分子化合物がリポソームである、請求項７に記載の癌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト染色体上に存在するｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子の発現量の変化を利用することにより、口腔扁平上皮癌などの癌を検出する方法、さらには口腔扁平上皮癌などの癌の増殖を抑制する抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔扁平上皮癌［Ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＯＳＣＣ）］は、頭頚部癌に分類され、主として口腔粘膜上皮などから発生する腫瘍である。頭頚部癌の中で３５％程度と発生割合が高く、全世界で毎年約２７万人に発症するとされている（Ｐａｒｋｉｎ，ＤＭ．，  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．５５，７４−１０８，２００２）。また、日本においては、２００３年では５，５００人以上が死亡している。発生部位では舌がもっとも多く、次いで歯肉（歯茎）に発生することが多い。他に頬粘膜、口蓋、口底といったその他の口腔粘膜、さらに顎の骨や唾液腺にも発生することが知られている。
【０００３】
近年、口腔扁平上皮癌のための診断法と治療法は進歩しているにもかかわらず、その予後は改善されていない。このため、口腔扁平上皮癌における原因遺伝子と、その遺伝子に生じている変化を見つけ出し、その機能を解明することは、より効果的な治療法や化学的予防法の開発などの新しい治療戦略の構築に必須である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｉｎ，ＤＭ．，  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．５５，７４−１０８，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
口腔由来、主に口腔粘膜上皮細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける口腔粘膜上皮細胞の癌化の発見や、口腔扁平上皮癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、口腔扁平上皮癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、口腔扁平上皮癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び癌の増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）法は、遺伝子発現により生じる転写産物の量を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌に関与する遺伝子発現の変化を解析するために、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ用いることにより、口腔粘膜上皮細胞の癌化を促進する表１及び表２に示す癌関連ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子を同定することに成功した。また、ＣｐＧアイランドあるいはその近傍に座位する、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３は、ＣｐＧアイランドに存在するシトシンのメチル化により、発現量が低下する。すなわち、これらの遺伝子の発現量低下が口腔扁平上皮癌の増殖を促進する、また、口腔扁平上皮癌において、これらの遺伝子の発現量を増加させると、癌の増殖を著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、検体において、miR-374、miR-340、miR-224、miR-10a、miR-140、miR-213、miR-146a、miR-126、miR-31、miR-9、及びmiR-9*からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現上昇、及び／又はmiR-27a、miR-34b，miR-34c，miR-203、miR-302c*、miR-23a、miR-27b、miR-34a、miR-215、miR-299、miR-330、miR-337、miR-107、miR-133b、miR-138、miR-139、miR-223、miR-204、miR-370、let-7d、miR-95、miR-302a、miR-367、let-7g、miR-23b、miR-128a、miR-148a、miR-155、miR-200c、miR-302b、miR-368、miR-122a、miR-371、let-7a、miR-26b、miR-30e-5p、miR-96、miR-125a、miR-132、miR-200b、miR-199b、miR-296、miR-373*、miR-137、miR-197、miR-193a、let-7e、miR-30d、miR-331、miR-342、miR-338、miR-199a、miR-372、及びmiR-184からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現低下を指標として検体の癌化を検出することを含む、癌の検出方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、遺伝子発現の変化を、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、又はin situ ハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて検出する。
好ましくは、遺伝子の発現低下は、ＣｐＧアイランドあるいはその近傍のメチル化による遺伝子の発現の低下である。
好ましくは、前記メチル化を、ＣＯＢＲＡ法、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅａｎｃｅ法、又はサザンブロット法のいずれかの方法を用いて検出する。
【０００９】
好ましくは、miR‐34b、miR‐132、miR‐137、miR‐193a、又はmiR‐203のうちの少なくとも１以上の遺伝子の発現低下を指標として検体の癌化を検出する。
好ましくは、検体は口腔由来細胞である。
好ましくは、癌は口腔扁平上皮癌である。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、miR-27a、miR-34b，miR-34c，miR-203、miR-302c*、miR-23a、miR-27b、miR-34a、miR-215、miR-299、miR-330、miR-337、miR-107、miR-133b、miR-138、miR-139、miR-223、miR-204、miR-370、let-7d、miR-95、miR-302a、miR-367、let-7g、miR-23b、miR-128a、miR-148a、miR-155、miR-200c、miR-302b、miR-368、miR-122a、miR-371、let-7a、miR-26b、miR-30e-5p、miR-96、miR-125a、miR-132、miR-200b、miR-199b、miR-296、miR-373*、miR-137、miR-197、miR-193a、let-7e、miR-30d、miR-331、miR-342、miR-338、miR-199a、miR-372、及びmiR-184からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を含有する、癌抑制剤が提供される。
【００１１】
好ましくは、本発明の癌抑制剤は、miR‐34b、miR‐132、miR‐137、miR‐193a、又はmiR‐203のうちの少なくとも１以上の遺伝子を含む。
好ましくは、前記遺伝子は高分子化合物に結合又は封入されている。
好ましくは、前記高分子化合物はリポソームである。
好ましくは、癌は口腔扁平上皮癌である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、口腔粘膜由来の細胞検体における癌化を的確に把握することが可能となった。また、口腔扁平上皮癌にｍｉｃｒｏＲＮＡの配列を含む合成二本鎖ＲＮＡを遺伝子導入することにより、口腔扁平上皮癌などの癌の増殖を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、表１及び表２に示す遺伝子発現の変化を少なくとも１つ以上を指標として検体の癌化を検出することを特徴とする。遺伝子発現の変化とは、遺伝子発現の上昇又は遺伝子発現の低下の何れかを意味する。特に好ましくは、検体において、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子であるｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の発現量の低下を検出することにより、検体の癌化を検出することができる。特に好ましくは、口腔由来の細胞におけるｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の遺伝子発現の低下を検出することにより、口腔由来細胞の癌化を検出することができる。さらには、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３を高分子化合物に結合、または封入して、口腔扁平上皮癌細胞へ導入することにより、癌の増殖を抑制することができる。
【００１４】
ヒトゲノムプロジェクトの成果などにより、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓを用いることにより、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の転写産物は既に知られており、１１ｑ２３．１、１７ｐ１３．３、１ｐ２１．３、１７ｑ１１．２、１４ｑ３２．３３染色体領域に存在するｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子である。ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子は、詳細な機能は不明であり、このｍｉＲＮＡが、口腔扁平上皮癌の発症に関わる重要な癌関連遺伝子であることは知られていない。
【００１５】
上述したように、本発明の好ましい態様の検出方法は、口腔粘膜由来の細胞や口腔扁平上皮癌におけるｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現の量の低下を検出することを特徴とする方法である。
【００１６】
ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現の量の低下を検出する対象となる口腔粘膜由来の細胞や口腔扁平上皮癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
この検体組織細胞は、健常人の口腔に由来する細胞か、口腔扁平上皮癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、口腔粘膜や舌、歯茎などに癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または口腔扁平上皮癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある口腔扁平上皮癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１７】
本検出方法により、「検査等の結果、口腔に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現の量の低下が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか、あるいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「口腔扁平上皮癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある口腔扁平上皮癌の組織」におけるｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現の量の低下が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された口腔扁平上皮癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或るいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００１８】
本発明で用いる表１及び表２に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡの配列情報は、Wellcome Trust Sanger Institute miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)に登録されている。以下にそのAccession番号を示す。
【００１９】
miRNA       miRBase Accessions
miR-374     MIMAT0000727
miR-340     MIMAT0004692
miR-224     MIMAT0000281
miR-10a     MIMAT0000253
miR-140     MIMAT0000431
miR-213     MIMAT0000256
miR-146a    MIMAT0000449
miR-126     MIMAT0000445
miR-31      MIMAT0000089
miR-9       MIMAT0000441
miR-9*      MIMAT0000442
miR-27a     MIMAT0000084
miR-34b     MIMAT0004676
miR-34c     MIMAT0000686
miR-203     MIMAT0000264
miR-302c*   MIMAT0000716
miR-23a     MIMAT0000078
miR-27b     MIMAT0000419
miR-34a     MIMAT0000255
miR-215     MIMAT0000272
miR-299     MIMAT0002890
miR-330     MIMAT0004693
miR-337     MIMAT0004695
miR-107     MIMAT0000104
miR-133b    MIMAT0000770
miR-138     MIMAT0000430
miR-139     MIMAT0000250
miR-223     MIMAT0000280
miR-204     MIMAT0000265
miR-370     MIMAT0000722
let-7d      MIMAT0000065
miR-95      MIMAT0000094
miR-302a    MIMAT0000684
miR-367     MIMAT0000684
let-7g      MIMAT0000414
miR-23b     MIMAT0000078
miR-128a    MIMAT0000424
miR-148a    MIMAT0000243
miR-155     MIMAT0000646
miR-200c    MIMAT0000617
miR-302b    MIMAT0000715
miR-368     MIMAT0000720
miR-122a    MIMAT0000421
miR-371     MIMAT0004687
let-7a      MIMAT0000062
miR-26b     MIMAT0000083
miR-30e-5p  MIMAT0000692
miR-96      MIMAT0000095
miR-125a    MIMAT0000443
miR-132     MIMAT0000426
miR-200b    MIMAT0000318
miR-199b    MIMAT0000263
miR-296     MIMAT0000690
miR-373*    MIMAT0000725
miR-137     MIMAT0000429
miR-197     MIMAT0000227
miR-193a    MIMAT0004614
let-7e      MIMAT0000066
miR-30d     MIMAT0000245
miR-331     MIMAT0004700
miR-342     MIMAT0004694
miR-338     MIMAT0004701
miR-199a    MIMAT0000231
miR-372     MIMAT0000724
miR-184     MIMAT0000454
【００２０】
（２）口腔扁平上皮癌におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化
ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現量の変化を直接的におこなうことができる代表的な方法として、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を挙げることができる。
成熟型ｍｉＲＮＡの本検出方法に関しては、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社）を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。他にノザンブロット法等でも検出は可能であるが、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓの方が簡便且つ高感度である。
【００２１】
（３）口腔扁平上皮癌におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現の低下の検出
ＣｐＧリッチプロモーター領域並びにエキソン領域が密にメチル化されると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ  ＡＰ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域の過剰メチル化は、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。後述するように、実際、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子の周辺にＣｐＧアイランドが存在しており、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の口腔扁平上皮癌でのｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現の抑制と強く相関していた。そして、口腔扁平上皮癌を、脱メチル化試薬である５−アザ２'−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果により、ＣｐＧアイランドの過剰メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が口腔扁平上皮癌における癌抑制ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが判明した。
【００２２】
（４）癌の抑制方法、及び癌抑制剤
本発明によればさらに、表１及び表２においてＯＳＣＣ細胞株で発現低下しているものとして挙げられているｍｉＲＮＡ遺伝子（その中でも好ましくは、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子）の転写産物であるｍｉＲＮＡを細胞に導入することを含む、癌を抑制する方法、並びに上記遺伝子を含む癌抑制剤が提供される。
【００２３】
ｍｉＲＮＡは、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。
【００２４】
本発明の癌抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００２５】
有効成分である上記遺伝子を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００２６】
本発明の癌抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、癌抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。即ち、本発明の癌抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の癌抑制剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００２８】
さらに、本発明の癌抑制剤の有効成分であるｍｉＲＮＡは、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｍｉＲＮＡを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｍｉＲＮＡ遺伝子を組込み、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００２９】
本発明の癌抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｍｉＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｍｉＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ｍｉＲＮＡは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：口腔扁平上皮癌におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化
口腔扁平上皮癌でのｍｉＲＮＡ遺伝子発現の変化を検出するために、１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株（Ｃａ９−２２、ＨＯ−１−Ｎ−１、ＨＳＣ−２、ＨＳＣ−３、ＨＳＣ−４、ＫＯＳＣ−２  ｃｌ３−４３、ＨＯＣ−３１３、ＨＯＣ−８１５、ＨＳＣ−５、ＨＳＣ−６、ＨＳＣ−７、ＫＯＮ、ＮＡ、ＯＭ１、ＯＭ２、ＳＫＮ３、ＴＳＵ、ＺＡ）を使用した。また、対象としては、正常口腔粘膜上皮由来不死化細胞株ＲＴ７を用いた。口腔扁平上皮癌細胞株は、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、２ｍＭ  グルタミン、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養をおこなった。また、ＲＴ７細胞株は、ＫＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）で培養をおこなった。これらの細胞株から、ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従って抽出した。
【００３２】
図１Ａに、口腔扁平上皮癌における腫瘍特異的なＤＮＡのメチル化により遺伝子発現が低下した癌抑制ｍｉＲＮＡの単離のための戦略と部分的な結果を示す。
まず、１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株と比較対照としてＲＴ７細胞を用いて、１５７種類の成熟型ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングをおこなった。このＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲに基づいた発現プロファイリングは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｄｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｄｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｄｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｄｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｅｌ  Ｅａｒｌｙ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｄｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてマニュアルに従って実験をおこなった。
【００３３】
１５７種類のｍｉＲＮＡの中から、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９９‐ｓ、ｍｉＲ−１０４は、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓが現在は利用できず、本研究の解析から除外した。また、口腔扁平上皮癌において、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２３の遺伝子発現レベルを判定できなかった。これは、標準化のためのＲＴ７細胞において、これらの遺伝子発現がＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出できなかったためである。
【００３４】
ＲＴ７細胞における各ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現レベルと比較して、１１種類のｍｉＲＮＡ（７．４％）で発現の亢進（ｕｐ‐ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（＞１．５倍発現、口腔扁平上皮癌細胞株の＞６６．７％）また、５４種類のｍｉＲＮＡ（３６．５％）で発現の減少（ｄｏｗｎ‐ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（＜０．５倍発現、口腔扁平上皮癌細胞株の＞６６．７％）を認めた（表１及び表２）。
【００３５】
【表１】
0005116026.tif 000002
【００３６】
【表２】
0005116026.tif 000003
【００３７】
実施例２：口腔扁平上皮癌細胞株における候補ｍｉＲＮＡとメチル化解析
ヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から、１５７種類のｍｉＲＮＡ遺伝子の周辺にＣｐＧアイランドが存在するかを調べ、その結果、２１種類のｍｉＲＮＡがＣｐＧアイランド上または近傍（１０００ｂｐ以内）に座位していることを確認した（表３）。
【００３８】
【表３】
0005116026.tif 000004
【００３９】
２１種類のｍｉＲＮＡの中で、１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株において高頻度に発現が減少している、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子に注目した。これら５つのｍｉＲＮＡ遺伝子、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３は、ＲＴ７細胞と比較して、ほとんどの口腔扁平上皮癌細胞株で有意に遺伝子発現が減少しており、それぞれ、１００％（１８／１８）、７２．２％（１３／１８）、７２．２％（１３／１８）、７２．２％（１３／１８）、１００％（１８／１８）であった（図１Ｂ、Ｃ）。
【００４０】
これら５種類のｍｉＲＮＡ遺伝子発現の抑制の原因が、ＤＮＡのメチル化によるかどうかを調べるため、５種類のｍｉＲＮＡ遺伝子が発現していない口腔扁平上皮癌細胞株を用い、脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを１μＭ、１０μＭで５日間処理をおこなった。それらの細胞株からＲＮＡを抽出し、候補のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現をＲｅａｌ‐ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲで調べた（図１Ｄ）結果、これらの遺伝子は、５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄの処理により発現を回復することがわかった。この結果は、明らかに、これらのｍｉＲＮＡ遺伝子の発現抑制には、ＤＮＡのメチル化が関与していることを示唆している。
【００４１】
１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株とＲＴ７細胞株における、５種類のｍｉＲＮＡ遺伝子のＤＮＡメチル化状態とそれらの遺伝子発現パターンに相関性があるのかを決定するため、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法を用いて各遺伝子のＤＮＡメチル化状態の解析をおこなった。５種類のｍｉＲＮＡ遺伝子におけるＣｐＧアイランドとＣＯＢＲＡ法のためのプライマー位置関係を図２Ａに示す。
【００４２】
具体的には、ＥＺ  ＤＮＡメチレーションキット（Ｚｙｍｏ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、口腔扁平上皮癌細胞株に由来するゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ中５０℃で１晩処理をおこない、目的とする領域を増幅するようにデザインしたプライマー（表４）（配列表の配列番号１から２６）を用いてＰＣＲをおこなった。
【００４３】
【表４】
0005116026.tif 000005
【００４４】
得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、またはＴａｑＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＢｓｔＵＩまたはＴａｑＩはメチル化されないＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾された配列は消化しないが、メチル化されたＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾されない配列を消化する性質を利用して、ＰＣＲ断片を電気泳動後、メチル化された断片のバンドとメチル化されない断片のバンドの濃度比をＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ２．０（富士フイルム株式会社）を用いたデンシトメトリーにより測定し、メチル化された領域のメチル化度を％で表示した。また、これらの配列をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。
【００４５】
その結果、ｍｉＲ‐１３２以外の、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３遺伝子の周辺では、それらの遺伝子発現の低下あるいは消失を確認しているすべての口腔扁平上皮癌細胞株で、ＣｐＧアイランドあるいは近傍の過剰メチル化を確認することができた（図２Ｂ）。また、ＣＯＢＲＡ法の結果と一致して、４種類のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現減少あるいは消失を確認している口腔扁平上皮癌細胞株における過剰メチル化は、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ‐ｓｅｑｕｅｎｃｅでも証明することができた（図２Ｃ）。
【００４６】
これらの結果から、口腔扁平上皮癌患者検体におけるｍｉＲＮＡ遺伝子発現とＤＮＡメチル化の詳細な解析のために、４種類の遺伝子（ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３）を選択することとした。
【００４７】
実施例３：口腔扁平上皮癌患者検体におけるｍｉＲＮＡの発現とメチル化解析
口腔扁平上皮癌患者の腫瘍癌部組織でも、４種類のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化が起きているのかを検討するため、また、口腔扁平上皮癌患者の癌部組織において、４種類のｍｉＲＮＡ遺伝子のＤＮＡメチル化状態と発現パターンとの相関関係を、ＣＯＢＲＡ法とＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ解析を用いて解析した。
【００４８】
口腔扁平上皮癌患者の癌部と非癌部の組織は、東京医科歯科大学倫理委員会で承認後、歯学部付属病院で手術を受けた口腔扁平上皮癌患者から承諾書を得て、１１症例（Ｔ１、０症例；Ｔ２、１０症例；Ｔ３、０症例；Ｔ４、１症例）の凍結サンプルを得ることができた。病期分類は、Ｕｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｅ  ｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ（ＵＩＣＣ）のＴＮＭ分類を用いた。
【００４９】
ＣＯＢＲＡにおいて、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の癌特異的なＤＮＡ過剰メチル化は、それぞれ、３６．４％（４／１１）、６３．６％（７／１１）、７２．７％（８／１１）、４５．５％（５／１１）の頻度で、口腔扁平上皮癌患者の癌部組織で確認することができた（図３Ａ）。ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの癌特異的過剰メチル化陽性の症例では、癌特異的にメチル化されたアレル由来の明白な断片を示した。
【００５０】
一方、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐２０３の癌特異的過剰メチル化陽性症例の多くは、メチル化されたアレル由来の断片は微量であり、この結果は癌細胞においてｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐２０３周辺の癌特異的過剰メチル化の頻度がとても低いことを示している。
【００５１】
ＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ解析において、正常な口腔粘膜と癌部を比較したとき、ｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の発現レベルは、口腔扁平上皮癌症例の２７．２％（３／１１）、５４．５％（６／１１）、４５．５％（５／１１）、７２．７％（８／１１）で有意に減少していた（図３Ｂ）。癌特異的なＤＮＡ過剰メチル化とｍｉＲ‐３４ｂ、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ、ｍｉＲ‐２０３の発現の減少あるいは消失の両方が確認された口腔扁平上皮癌症例は、それぞれ、２５％（１／４）、７１．４％（５／７）、６２．５％（５／８）、４０％（２／５）であった。これらの結果から、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａは、口腔扁平上皮癌において、癌特異的な過剰メチル化により発現が抑制されることを強く示唆している。また、口腔扁平上皮癌症例における、それらのｍｉＲＮＡのｂｉｓｕｌｆｉｔｅ‐ｓｅｑｕｅｎｃｅは、明らかにＣＯＢＲＡの結果を裏付けている（図３Ｃ）。
【００５２】
実施例４：口腔扁平上皮癌細胞株の増殖でのｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの癌抑制効果
ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの発現の減少あるいは消失を確認している口腔扁平上皮癌細胞株へ、それぞれｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの配列を含む合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を一過的に遺伝子導入することにより、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの細胞増殖抑制効果を検討した。
【００５３】
具体的には、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの配列を含む合成二本鎖ＲＮＡ１０ｎＭのＰｒｅ−ｍｉＲTMｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）、または、コントロールとした非特異的なｍｉＲＮＡ「Ｐｒｅ−ｍｉＲTMＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（Ａｍｂｉｏｎ社）」を口腔扁平上皮癌細胞株へＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてマニュアルに従ってトランスフェクションをおこなった。トランスフェクション後、２４‐７２時間の生存細胞数はＷＳＴアッセイにより評価した。結果は、非特異的なｍｉＲＮＡを導入したコントロール細胞の細胞数により標準化した。
【００５４】
上記の解析で、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａ遺伝子導入によって、口腔扁平上皮癌細胞株の細胞増殖は有意に抑制された（図４Ａ）。このことは、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａが、癌抑制機能を持っていることを示唆している。また、ＴＵＮＥＬ解析により、ｍｉＲ‐１９３ａの遺伝子導入による細胞増殖能の低下はアポトーシスが原因であることを明らかにした（図４Ｂ）。ＴＵＮＥＬ解析は、トランスフェクション後、２４時間経過した細胞におけるＤＮＡ鎖切断を酵素学的に標識して検出することができるＴＵＮＥＬ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＭＥＢＳＴＡＩＮ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ  Ｄｉｒｅｃｔ；ＭＢＬ社）を用いて、マニュアルに従いおこなった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本研究の戦略と口腔扁平上皮癌細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現解析を示す。図Ａは、口腔扁平上皮癌細胞株において、エピジェネティックに発現抑制されている癌抑制ｍｉＲＮＡの単離のための戦略図を示す。図Ｂは、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｅｌ  Ｅａｒｌｙ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｋｉｔによる１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株とＲＴ７細胞における１５７種類のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを示す。ＳＳ、販売が停止されたＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ。Ｕ、ＲＴ７細胞において発現が検出されなかったｍｉＲＮＡ。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、ＲＮＵ６Ｂの発現レベルを内部コントロールとした相対値で比較した。星印は、ＣｐＧアイランド上もしくは近傍に座位している２１種類のｍｉＲＮＡ。図Ｃは、１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株でのＣｐＧアイランド上または近傍に座位している候補ｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。各細胞株における棒グラフは、ＲＴ７細胞と各細胞株での発現レベルの比で示す。アスタリスク（＊）は、ＲＴ７細胞と比較して、候補ｍｉＲＮＡの発現の減少（＜０．５倍発現）が観察された口腔扁平上皮癌細胞株の頻度を表している。Ｄ、１０μＭ  ５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを用いて処理した後の候補ｍｉＲＮＡ遺伝子発現の回復。各細胞株における棒グラフは、未処理の細胞と処理した細胞での発現レベルの比で示す。星印は、ＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ解析（図１Ｃ）で遺伝子発現の顕著な現象が確認できなかった細胞株。アスタリスク（＊）は、未処理の細胞と１０μＭ  ５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄで処理した細胞を比較して、候補ｍｉＲＮＡの発現の回復（＞１．５倍発現）が検出された口腔扁平上皮癌細胞株の頻度を表している。
【図２】図２は、口腔扁平上皮癌細胞株における５種類の候補ｍｉＲＮＡのメチル化状態と発現の相関解析を示す。図Ａは、ｍｉＲＮＡ、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧ部位、ＣＯＢＲＡとｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのために使用したＰＣＲ産物のゲノム上での物理的な位置関係を示した地図である。ダークグレイボックスはＣｐＧアイランド；ライトグレイボックスはｍｉＲＮＡ遺伝子；垂直線はＣｐＧ部位；矢印水平線はＰＣＲ産物；垂直の矢印は制限酵素部位。ＰＣＲ産物のサイズは、ｍｉＲ‐３４ｂ領域１は、４２８ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐３４ｂ領域２は、５４９ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）；ｍｉＲ‐１３２領域１は、４５３ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐１３２領域２は、５９９ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐１３２領域３は、４４２ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐１３２領域４は、４０８ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）；ｍｉＲ‐１３７領域１は、４４４ｂｐ（ＴａｑＩにより切断）；ｍｉＲ‐１９３ａ領域１は、５２４ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐１９３ａ領域２は、５２２ｂｐ（ＴａｑＩにより切断）、ｍｉＲ‐１９３ａ領域３は、４５８ｂｐ（ＴａｑＩにより切断）；ｍｉＲ‐２０３領域１は、４０５ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐２０３領域２は、６５５ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）、ｍｉＲ‐２０３領域３は、２８７ｂｐ（ＢｓｔＵＩにより切断）。図Ｂは、口腔扁平上皮癌細胞株とＲＴ７細胞におけるＣＯＢＲＡの結果を示す。１８種類の口腔扁平上皮癌細胞株における候補ｍｉＲＮＡの発現パターンは、ＣＯＢＲＡの結果の上に示す。矢印は、非メチル化アレル；矢頭は、メチル化アレル；星印は、メチル化アレル由来の制限酵素断片を検出したサンプル；アスタリスク（＊）は、各候補ｍｉＲＮＡのＤＮＡメチル化が発現の減少が一致した口腔扁平上皮癌細胞株の頻度を表している。図Ｃは、ＲＴ７と候補ｍｉＲＮＡの発現陽性の細胞株（＋）と陰性の細胞株（−）のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの結果を示す。ｍｉＲＮＡ、ＣｐＧ部位、ＣＯＢＲＡとｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのために使用したＰＣＲ産物のゲノム上での物理的な位置関係を示した地図をｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの結果の上記に示す。ライトグレイボックスは、ｍｉＲＮＡ；垂直線はＣｐＧ部位；矢印水平線はＰＣＲ産物；垂直の矢印は制限酵素部位。各白と黒の四角は非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位を示し、各列は１種類のクローン由来である。
【図３】図３は、口腔扁平上皮癌患者１１症例の癌部・非癌部組織でのメチル化解析と発現解析を示す。図Ａは、外科的に切除した口腔扁平上皮癌患者１１症例の癌部（Ｔ）と対応する非癌部組織（Ｎ）における候補ｍｉＲＮＡ遺伝子のＣＯＢＲＡを示す。制限酵素処理の有無は、ＣＯＢＲＡの結果の上に＋または−で表す。星印は、癌特異的過剰メチル化が検出された症例。アスタリスク（＊）は、ＣＯＢＲＡにより決定した候補ｍｉＲＮＡの癌特異的過剰メチル化の頻度を表す。図Ｂは、口腔扁平上皮癌患者１１症例の癌部・非癌部組織における候補ｍｉＲＮＡ発現の定量ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＲＴ‐ＰＣＲによる解析を示す。星印は、癌特異的過剰メチル化が検出された症例。アスタリスク（＊）は、ＣＯＢＲＡにより癌特異的過剰メチル化を検出された症例で、非癌部組織と比較して、癌部組織で候補ｍｉＲＮＡの発現の減少（＜０．５倍発現）が観察された症例の頻度を表している。図Ｃは、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ‐ｓｅｑｕｅｎｃｅの結果の代表例を示す。矢印水平線はＰＣＲ産物；垂直の矢印は制限酵素部位。各白と黒の四角は非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位を示し、各列は１種類のクローン由来である。
【図４】図４は、口腔扁平上皮癌細胞株におけるｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１９３ａの癌抑制効果を示す。図Ａは、１０ｎＭのＰｒｅ−ｍｉＲTMｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、または、コントロールとして非特異的なｍｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクションした口腔扁平上皮癌細胞株の増殖曲線と位相差顕微鏡像を示す。トランスフェクション後２４‐７２時間の生存細胞数はＷＳＴアッセイにより計測した。これらの実験は、各データポイントで３回測定した結果の平均（バー、ＳＥ）を示す。位相差顕微鏡像は、トランスフェクション後７２時間培養した細胞を示している。図Ｂは、蛍光顕微鏡下でｍｉＲ‐１９３ａまたはコントロールの非特異的ｄｓＲＮＡのトランスフェクション後２４時間においてのＨＳＣ‐２細胞のＴＵＮＥＬ染色像を示す。図Ｃは、ｍｉＲ‐１９３ａまたはコントロールである非特異的ｄｓＲＮＡのトランスフェクション後２４時間におけるＨＳＣ‐２細胞でのアポトーシス誘導を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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