(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されている、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母であって、キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子がPichia stipitis由来であり、かつキシルロキナーゼ遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来し、宿主細胞として酵母IR-2株（FERM BP-754号）を用いて作製され、キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が恒常的に発現するPGKプロモーターにより、それぞれ発現される、上記遺伝子組換え酵母。
【請求項２】
キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、補酵素要求性をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)型に改良した改変型キシリトールデヒドロゲナーゼ（配列番号１）をコードする、請求項１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項３】
キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が、まとめて一つの対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれている、または各遺伝子がそれぞれ別々の対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれている、請求項１または２に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え酵母を用いた、リグノセルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。
【請求項６】
順化処理により、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え酵母のキシロース発酵能を向上させる方法。                                                                          
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース発酵速度が速く、かつキシロースからエタノールを高収率生産することに加え、グルコースの存在下でもキシロースが発酵できる遺伝子組換え酵母およびそれを用いたキシロースやキシロースを含む糖化液からエタノールを高効率生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオエタノールは地球温暖化対策や化石資源代替のために諸外国で需要が急増している。バイオエタノール生産の主役は高い発酵効率をもつ酵母（Saccharomyces cerevisiae）であるが、1970年代にエタノール生産菌であるZymomonas mobilisに関する研究が盛んに行われ、1980年代後半からは遺伝子組換え大腸菌（Escherichia coli）によるエタノール生産が報告された。高濃度のエタノール生産菌として知られているS. cerevisiaeやZ. mobilisは、五炭糖であるキシロースやアラビノースを利用することができない。これに対し、E. coliはここに示した全ての糖類を利用できるが、菌体当たりの生産性はS. cerevisiaeやZ. mobilisよりも低い。木質系バイオマスからの効果的なエタノール生産技術の確立のために、五炭糖から効果的にエタノールを生産する微生物の開発は重要な研究課題である。特に、木質系バイオマスの糖化液に多量に含まれるキシロースを高効率にエタノールへ変換する微生物の開発が望まれている。酵母へのキシロース発酵性の付与に関しては、Purdue大学のHo博士やLund大学のグループが成功している（図８を参照）。一方、フロリダ大学のIngram博士はZ. mobilis由来の2種のエタノール合成酵素遺伝子を導入することにより、また米国国立再生可能エネルギー研究所（NREL）のグループは、大腸菌由来の4種のキシロース代謝系酵素遺伝子を導入することにより、キシロース発酵性の付与に成功している（図８を参照）。さらに最近になって、鳥取大学の梁瀬博士のザイモバクター（Zymobacter palmae）や地球環境産業技術研究機構（RITE）の湯川博士のコリネ型細菌などの新規微生物についてもキシロース発酵性を付与することに成功している。しかしながら、いずれの遺伝子組換え微生物も、キシロース発酵能（エタノール収率や発酵速度）の改善など、実用化するには依然として多くの課題が残されている。
【０００３】
キシロースを発酵できる酵母としてPichia stipitisなどが知られているが、エタノール耐性が低く、またキシロース代謝系はグルコースなどの糖類の存在下で抑制されることも多い。そこでキシロースからエタノールを生産するために、S. cerevisiaeにP. stipitis由来のキシロースレダクターゼ（以下XR）及びキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、キシロース代謝能を獲得させる育種が進められている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）（図１を参照）。
【０００４】
しかし、この遺伝子組換え酵母においてキシロースからの嫌気的エタノール発酵効率は依然として低く、満足できるものではない。さらに発酵の過程で中間代謝物キシリトールが蓄積して炭素変換効率を減少させるという問題が存在する。これらの欠点は、木質系バイオマスからの効果的なエタノール生産における持続的・連続的な発酵プロセスをより効率化するための大きな障害となる。
【０００５】
このような低いエタノール変換効率の主な原因として、キシロース代謝酵素（XRとXDH）間の補酵素依存性の違いによる細胞内の酸化還元状態の不均衡が指摘されている（非特許文献４、非特許文献５）。すなわち、XRは、キシロースをキシリトールに変換する際に補酵素として、おもにNADPHを使用してNADP+に変換する一方、XDHは、キシリトールをキシルロースへと変換する際に補酵素として、NAD+を使用してNADHに変換する（図１を参照）。この様に両酵素の補酵素に対する要求性のアンバランスを生じることで、補酵素供給の量的バランスを崩し、その結果、キシリトールからキシルロースへの変換が効率よく進行せず、最終的にキシロースからエタノールへの変換効率が低くなると推定される。
【０００６】
さらに、S. cerevisiaeがもともと保持しているキシルロキナーゼ（以下XK）の活性が弱いことも、このような低いエタノール変換効率の原因の一つとして指摘されている（非特許文献６、非特許文献７）。そこでこの改善策として、XRおよびXDHに加えてS. cerevisiae由来のXKを過剰発現させ、この組換え酵母を用いて、キシロースからのエタノール生産効率を向上させるという方法が報告されている（特許文献１を参照）。その際、XR、XDHおよびXKを酵母内で適切なレベルで発現させることが極めて重要であることが報告されている。例えば、キシロースからのエタノール生産効率を上げるために、XRおよびXDHの最適な発現量の比率については、おおむね理解が進んでいる（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。しかしながら、XKに関しては、その発現量はどのくらいが最適であるのかについて議論が分かれている。すなわち、Purdue大学のHo博士はXKの活性が高いことが重要であると述べており、実際、キシロース代謝能を遺伝子組換えによって付与したSaccharomyces酵母 424A(LNH-ST)株を用いて、キシロースからエタノールを高収率に得ている（非特許文献８）。一方、Lund大学や別のグループらは、XR、XDH、XKをコードする遺伝子をそれぞれ別の染色体上に栄養要求性型発現カセットを用いて組込んだ実験株由来の遺伝子組換え酵母を作製し、XKの活性が過剰であると酵母の増殖阻害を引き起こすので、適度に構成的に発現させるのがよいと報告している（非特許文献７、非特許文献１１）。
【０００７】
また、NAD+要求性からNADP+要求性へと補酵素の特異性を変換したXDH（改変型XDH）を作製し、この改変型XDHをXRと共に発現する遺伝子組換え酵母を作製し、この遺伝子組換え酵母を用いて、キシロースからのエタノールを生産する方法が報告されている（特許文献２を参照）。（図１を参照）。
【０００８】
近年、バイオマス資源を発酵して得られるエタノールなどを液体燃料もしくは化学原料として利用することが、注目、検討されており、その実用化技術開発が促進されている。そのため、バイオマス資源の実用化経済性のために、上記酵母よりもエタノール生産能の高い酵母株が求められている。
【０００９】
【特許文献１】特表2000-509988号公報
【特許文献２】特開2006-6213号公報
【特許文献３】特開昭62-65679号公報
【非特許文献１】Chu BCら、Biotechnology Advances, Vol.25, pp.425-441 (2007)
【非特許文献２】Jeffries TW、Current opinion in Biotechnology, Vol.17, pp.1-7 (2006)
【非特許文献３】Jeffries TWら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.63, pp.495-509 (2004)
【非特許文献４】Bruinenberg PMら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.18, pp.287-292 (1983)
【非特許文献５】Koetter Pら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.38, pp.776-783 (2004)
【非特許文献６】Deng XXら、Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.24/25, pp.193-199 (1990)
【非特許文献７】Johansson Bら、Applied and Environmental Microbiology, Vol.67, pp.4249-4255 (2001)
【非特許文献８】Eliasson Aら、Enzyme and Microbial Technology, Vol.29, pp.288-297 (2001)
【非特許文献９】Jeppsson Mら、FEMS Yeast Research, Vol.3, pp.167-175 (2003)
【非特許文献１０】Walfridsson Mら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.48, pp.218-224 (1997)
【非特許文献１１】Sedlak Mら、Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.113-116, pp.403-416 (2004)
【非特許文献１２】Jin Y-Sら、Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.69, pp.495-503 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来法では、木質系バイオマス資源から効率的にエタノールを製造することはできなかったので、木質系バイオマス資源からエタノールを安価に効率的に製造することができる有効な方法が望まれていた。これは、木質系バイオマスの糖化液に多量に含まれるキシロースを利用できる微生物が限られていること、またキシロースを高効率にエタノールへ変換する微生物が開発されていないこと、さらに従来のキシロース発酵性を付与した遺伝子組換え微生物でも、グルコースの存在下では実質的にキシロースを発酵できない（グルコースによって発酵が抑制される）ことが主な原因であった。
【００１１】
そこで、本発明では、キシロースからエタノールを高収率生産でき、かつグルコースの存在下でもキシロースが発酵できる遺伝子組換え酵母およびそれを用いたエタノールの効果的な生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、酵母染色体に効率よく組込めるキシロース代謝系（XR、[野生型あるいは改変型]XDHおよびXK）発現カセットを作製し、この発現カセットを宿主酵母細胞に導入して、キシロースをエタノールへ高効率に生産できる遺伝子組換え酵母を作製した。
【００１３】
さらに本発明では上記キシロース代謝系発現カセットをS. cerevisiaeなどの適当な宿主酵母株に導入する育種に加えて、強力なキシロース発酵性を獲得した宿主酵母株の選定を行った。当該選定は、キシロースからエタノールを効果的に生産させる上で重要である。この理由は以下の通りである。キシロースからエタノールを工業的に高効率生産させる上で重要なファクターとして、エタノール収率とエタノール生産性の向上がある。この二つのファクターは、大容量、低コストの工業操作において非常に重要である。エタノール収率の向上は原料コストに影響を与える。一方、エタノール生産性の向上は、バイオプロセス設備の主要なコストの決定的な要素となる。収率と生産性はときには分けて考えることができるが、プロセス全体の最適化では、収率と生産性の両方を加味して行わなければならない。エタノール生産性は基質（キシロース）の比消費速度に依存しているので、もしキシロース比消費速度の向上がプロセスにおいて実現すれば、エタノール生産性は副生産物（キシリトール、グリセロール等）の生産を最小限に抑えることによってコスト的には容認できるレベルに達せられる。このような状態で、エタノール収率とエタノール生産性は両方とも最適化することが望まれる。すなわち、エタノールを高い収率で生産し、かつキシロースからのエタノール発酵速度が速い酵母株が、最も実用化・工業化するのに適している。さらに、通常のキシロース発酵性を付与した遺伝子組換え酵母は、グルコースの存在下では実質的にキシロースを発酵できないので（グルコースによる発酵の抑制）、この問題を解決することが工業化のための課題である。そのために、グルコース抑制を解除する代謝工学的な手法に加えて、グルコースの発酵速度の速い酵母株の選定も、工業的にキシロースからエタノールを発酵する上で重要になる。
【００１４】
本発明では、優れたキシロース発酵能を保持する酵母株を選別するために、遺伝子組換えの宿主酵母として５種類の酵母株を選んだ。すなわち、実験株のD452-2株およびINVSc1株、工業株のType-II（パン酵母）株、IR-2株（FERM BP-754号）および焼酎3号株（協会系酵母）である（図２を参照）。D452-2株は一倍体であり、他の４種類の酵母（INVSc1株、Type-II株、IR-2株および焼酎3号株）は二倍体である。なお、IR-2株は凝集性酵母であり、連続発酵、繰り返し発酵が可能な、より実用化・工業化に即した酵母株として知られている（特開昭62-65679号公報を参照）。
【００１５】
上記キシロース代謝系発現カセットを、上記５種類の宿主細胞株に導入し、この中から、キシロースをエタノールへ高効率に生産できる遺伝子組換え酵母を選抜した。この遺伝子組換え酵母が、キシロースのみならずキシロースを含む混合糖や糖化液からもエタノールを高効率に生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
さらに、上記キシロース代謝系発現カセットを導入した遺伝子組換え酵母を、一連のキシロースを含む培地で順化処理することによって、当該遺伝子組換え酵母のキシロース発酵能を向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子が染色体組込みにより導入されている、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
［２］  XR遺伝子およびXDH遺伝子が酵母由来である、［１］の遺伝子組換え酵母。
［３］  XR遺伝子およびXDH遺伝子が、Candida Shehatae、Pichia stipitisおよびPachysolen tannophilusからなる群から選択される酵母に由来する、［２］の遺伝子組換え酵母。
【００１８】
［４］  XR遺伝子およびXDH遺伝子が、Pichia stipitisに由来する、［３］の遺伝子組換え酵母。
［５］  XK遺伝子が、酵母または細菌由来である、［１］の遺伝子組換え酵母。
［６］  XK遺伝子が、Candida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccaromyces pombeおよびEscherichia coliからなる群から選択される酵母または細菌由来である、［５］の遺伝子組換え酵母。
【００１９】
［７］  XK遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、［６］の遺伝子組換え酵母。
［８］  XR遺伝子およびXDH遺伝子がPichia stipitisに由来し、かつXK遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、［１］の遺伝子組換え酵母。
［９］  XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子が構成的に発現される、［１］〜［８］のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【００２０】
［１０］  XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子が恒常的に発現するPGKプロモーターにより、それぞれ発現される、［９］の遺伝子組換え酵母。
［１１］  XDH遺伝子が、補酵素要求性をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)型に改良した改変型XDH（配列番号１）をコードする、［１］〜［１０］のいずれかの遺伝子組換え酵母。
［１２］  XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子が、まとめて一つの対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれる、または各遺伝子がそれぞれ別々の対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれる、［１］〜［１１］のいずれかの遺伝子組換え酵母。
【００２１】
［１３］  遺伝子組換え酵母がSaccharomyces cerevisiaeより作製される、［１］〜［１２］のいずれかの遺伝子組換え酵母。
［１４］  ［１］〜［１３］のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。
［１５］  ［１］〜［１３］のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、リグノセルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。
［１６］  順化処理により、［１］〜［１３］のいずれかの遺伝子組換え酵母のキシロース発酵能を向上させる方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子組換え酵母は、高効率でキシロースをエタノールへ変換できる（キシロース発酵速度が速く、かつキシロースからエタノールを高収率生産する）。また、通常はグルコース存在下だとキシロース発酵が阻害を受けるが、本発明の遺伝子組換え酵母は全てグルコースの存在下でもキシロースを同時に発酵でき、特に工業株（IR-2株（FERM BP-754号）およびType-II株）を宿主とする遺伝子組換え酵母は、グルコース存在下でキシロース発酵が促進される。さらに本発明では、キシロース代謝系（XR、XDH、およびXK）遺伝子を効率よく全て染色体組込みにより導入しているので、プラスミドで導入するよりも安定しており、またプラスミドを保持するための栄養要求性の最少培地ではなく、栄養豊富な完全培地や糖化液で直接増殖させることができるので、増殖速度、糖代謝速度も上昇する。実際、本発明の遺伝子組換え酵母を用いて木質系バイオマスから調製した糖化液を発酵させた結果、グルコースなどの六炭糖のみならずキシロースなどの五炭糖も効率よくエタノールに変換することができた。加えて、キシロース発酵能が比較的低い組換え酵母株でも、一連のキシロースを含む培地で選択圧をかけながら継代的に培養する順化処理により、キシロース発酵能を顕著に向上し得る。したがって、本発明により、木質系バイオマスとしてこれまで利用されることが少なかったキシロースを次世代の液体エネルギーとして期待されているエタノールへ高効率で変換できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
XRは、キシロースをキシリトールに変換する反応を触媒する酵素である。XR遺伝子は、かかる酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、Candida Shehatae、Pichia stipitis、およびPachysolen tannophilusなどの酵母に由来する。好ましくは、XR遺伝子は、Pichia stipitisに由来するものである。
【００２４】
XDHは、キシリトールをキシルロースに変換する反応を触媒する酵素である。XDH遺伝子は、かかる酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されないが、Candida Shehatae、Pichia stipitis、およびPachysolen tannophilusなどの酵母に由来する。好ましくは、XDH遺伝子は、Pichia stipitisに由来するものである。
【００２５】
XKは、キシロースとATPを、キシルロース５リン酸とADPに変換する反応を触媒する酵素である。XK遺伝子は、かかる酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されないが、Candida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccaromyces pombeおよびEscherichia coliなどの酵母または細菌に由来する。好ましくは、XK遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するものである。
【００２６】
これらの遺伝子は、当業者に周知である一般的な方法、例えば、ハイブリダイゼーション法、PCR法等によって得ることができる。
【００２７】
XDHは、補酵素要求性が変化した改変型を用いることが望ましい。野生型XDHは一般に、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を使用する。一方、本願における「改変型XDH」は、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）を使用する。改変型XDHは、NADP+を補酵素として使用することが出来れば、そのアミノ酸配列もしくは塩基配列は、特に制限しないが、XDHのアミノ酸配列の207番目から211番目に対応するアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、セリンまたはスレオニンに置換させたものが好ましい。XDHのアミノ酸配列で207番目のアスパラギン酸をアラニンに置換させたもの、208番目のイソロイシンをアルギニンに置換させたもの、アミノ酸配列の209番目のフェニルアラニンをセリンもしくはスレオニンに置換させたもの、およびアミノ酸配列の211番目のアスパラギンをアルギニンに置換させたものが特に好ましい。さらに好ましくは、XDHのアミノ酸配列の207番目のアスパラギン酸をアラニン、208番目のイソロイシンをアルギニン、209番目のフェニルアラニンをセリン、および211番目のアスパラギンをアルギニンに置換したものである（配列番号１）（Watanabe S.ら、The Journal of Biological Chemistry Vol.280, No.11, pp.10340-10349 (2005)を参照）。改変型XDHは、補酵素としてNADP+を利用してNADPHに変換する。それに対し、XRは補酵素としておもにNADPHを利用してNADP+に変換するために、補酵素供給のバランスが保たれ、両遺伝子を導入した酵母はキシロースからキシルロースまでの変換を効率的に行うことが可能となる（図１を参照）。
【００２８】
改変型酵素の作製は、当該分野において周知である方法、例えば、ランダム変異および部位特異的変異を用いて作製することが可能である。一般的に、ランダム変異法では、遺伝子シャッフリングやエラープローンPCRを用いて酵素変異体プールを構築し、その中から目的の性質に改変された変異体をスクリーニングする。部位特異的変異法では、既知のXDH遺伝子配列を基に設計した、所定の位置に変異を導入したXDHクローニング用プライマーを用いてPCRを行うことによって、クローニングされたXDH遺伝子の所定の位置に変異を導入することができる。
【００２９】
これら3種の酵素をコードする遺伝子を宿主細胞内にて発現させる。その方法は、当業者に公知である一般的な分子生物学的手法を用いて行うことができる（Sambrook J.ら、“Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL /second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。すなわち、当該酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換することにより行うことができる。
【００３０】
ベクターとしては、遺伝子の導入および発現のために当業者に公知である一般的な酵母発現ベクターを用いることができる。酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれも用いることが可能であるが、染色体組み込み型を用いるのが好ましい。
【００３１】
ベクターには、目的の酵素遺伝子の他に、宿主細胞における複製を可能とする複製起点、および形質転換体を同定する選択マーカー、さらに、好ましくは、酵母由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により酵素の遺伝子配列に連結されて含まれ得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。用いることができる転写プロモーターは、宿主細胞内にて遺伝子発現を駆動できる限り、特に限定されず、例えばGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH１プロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができるが、PGKプロモーターを用いるのが好ましい。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やHIS3、TRP1などの栄養要求性遺伝子などが例示される。
【００３２】
宿主細胞として用いることができるものとしては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae、およびSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。さらに好ましくは、実験株のD452-2株およびINVSc1株、工業株のType-II（パン酵母）株、IR-2株（FERM BP-754号）および焼酎3号株（協会系酵母）である（図２を参照）であり、特に好ましくは、工業株として知られているIR-2株（FERM BP-754号）およびType-II株である。
【００３３】
実験株とは実験面での利便性のために使われる酵母株であり、工業株（実用株）とは実用面での有用性のために使われている酵母株である。例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母は工業株である。パン酵母は実験室レベルでも使用されているので、その意味では実験株に入り得る。実験株は遺伝子型が分かっており、多くの場合、栄養要求性の選択マーカー遺伝子をもったプラスミドを導入したり、栄養要求性型の発現カセットを染色体へ組込めるように栄養要求性遺伝子が変異したりしている。一方、工業株は栄養要求性遺伝子が変異していないので、栄養要求性マーカー遺伝子を保持するプラスミドを直接導入したり、栄養要求性型の発現カセットを直接染色体に組込むことができない。さらに、実験株は接合実験や胞子形成実験に使用されることが多いので一倍体が多いが、工業株は二倍体や四倍体などの多倍体が多い。
【００３４】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３５】
本発明のベクターは、栄養要求性型の発現カセットを含んでも、薬剤耐性型の発現カセットを含んでもよいが、好ましくは薬剤耐性型の発現カセットを含んで成る。薬剤耐性型の発現カセットを用いた場合、遺伝子組換え酵母はYPD等の完全培地でも培養することが可能であり、最少培地にアミノ酸等を加えた培地で培養する必要がある栄養要求性型の発現カセットを導入した酵母と比べて、増殖速度を格段に高めることができる。さらに、薬剤耐性型の発現カセットを用いた場合、酵母の栄養要求性遺伝子を破壊する必要がなく、実用株に直接染色体組込みできるという利点を有する。
【００３６】
本発明において好ましくは、XR、XDH、およびXKを構成的に発現させる。例えば、XR、XDH、およびXK遺伝子を染色体組込み型ベクター等に導入した後、酵母染色体上に組込み、シングルまたは数コピーで発現させるのが好ましい。これらの遺伝子は、まとめて一つの対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれても良く、また、各遺伝子がそれぞれ別々の対立遺伝子上に相同組換えによって染色体DNAに組込まれても良い。好ましくは、3種の酵素遺伝子は、まとめて宿主のDNA上の一つの対立遺伝子上に組込まれている。
【００３７】
本発明に係る遺伝子組換え酵母は、発酵反応によりキシロースからエタノールを生産することが可能である。その際、培地に含まれるキシロースの濃度は、0.1〜20 ％、好ましくは0.5 ％〜10 ％、さらに好ましくは、4.5 ％であり、また培地に含まれるグルコースの濃度は、0.1〜20 ％、好ましくは0.5〜10 ％、さらに好ましくは、4.5 ％である。
【００３８】
また、本発明に係る遺伝子組換え酵母は、発酵反応によりリグノセルロース系バイオマスから調整した糖化液からエタノールを生産することが可能である。糖化液は、特に限定するものではないが、木質（特にキシランを多く含む広葉樹）や農産廃棄物等のリグノセルロース系バイオマスを由来するものから調製することが可能である。糖化液を調製するための糖化技術は、当該分野において一般的な手法を用いることができ、酸分解法でも良いし酵素糖化法でも良いが、好ましくは、高効率と低環境負荷が期待できる非硫酸前処理・酵素糖化法である。実際、酵母を用いて発酵させる際には、解毒処理していない糖化液を直接用いても良いし、解毒処理した糖化液を用いても良い。糖化液のpHは未処理の酸性糖化液を用いても良いし、中性付近に調整してから用いても良いが、好ましくは中性付近に調整してから用いる。糖化液にyeast extractやpeptoneなどの栄養源を加えても良いし、加えなくても良いが、好ましくは1 %のyeast extractを加える。
【００３９】
上記発酵反応は、当業者に公知である一般的な方法によって行うことが可能である。培養温度は25 ℃〜38 ℃、好ましくは27 ℃〜33 ℃、さらに好ましくは30 ℃に制御する。培地のｐＨは、3.0〜7.6、好ましくは、5.0〜6.0、さらに好ましくは5.5に制御する。発酵は嫌気条件で進行するので、酸素が存在しない状態が必要であり、そのため、発酵させる前に系内の酸素および培地中の溶存酸素を除去する操作、すなわち、窒素ガスを培地中に吹き込む操作を行うことが好ましい。反応は、連続式で行っても、バッチ式で行っても良い。
【００４０】
培養開始から0〜192時間、好ましくは0〜96時間、さらに好ましくは、48時間後の培地を回収してエタノールを分離する。培地よりエタノールを分離する方法は、蒸留、浸透気化膜等の公知の方法が用いられるが、蒸留による方法が好ましい。次いで、分離したエタノールをさらに精製（エタノール精製法としては、公知の方法、例えば蒸留等を用いることができる）することによって、エタノールを得ることができる。
【００４１】
本発明に係る遺伝子組換え酵母は、キシロース発酵能の順化処理により、そのキシロース発酵能を顕著に向上し得る。キシロース発酵能の順化処理はキシロースを含んだ最少培地で、選択圧をかけながら継代的に培養することによって行う。その際、培地に含まれるキシロースの濃度は、0.1 ％〜20 ％、好ましくは0.5 ％〜10 ％、さらに好ましくは、3 ％であり、また培地に含まれるグルコースの濃度は、0.01 ％〜20 ％、好ましくは0.05 ％〜10 ％、さらに好ましくは0.1 ％である。培養温度は25 ℃〜38 ℃、好ましくは27 ℃〜33 ℃、さらに好ましくは30 ℃に制御する。培地のｐＨは、3.0〜7.6、好ましくは、5.0〜6.0、さらに好ましくは5.5に制御する。一回の培養時間は24時間〜120時間、好ましくは48時間〜94時間、さらに好ましくは、72時間である。継代数は1継代〜20継代、好ましくは5継代〜15継代、さらに好ましくは10継代培養する。培養は嫌気的に行っても良いし、微好気的に行っても良いが、好ましくは嫌気的に行う。嫌気条件の場合は、上記のように窒素ガスを培地中に吹き込む操作を行うことが好ましい。反応は、連続式で行っても、バッチ式で行っても良い。
【実施例】
【００４２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：pBS-PGK-XR-PGKの作製
野生型XR遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているPichia stipitis XR遺伝子（登録番号XM_001385144）（配列番号２）を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、XR遺伝子の5’末端にHind III切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-GCATaagcttATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGG-3’(配列番号３)
5’-TAAggatccTTAGACGAAGGATAGGAATCTTGTCC-3’ (配列番号４)
PCRは、Blend Taq DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて行った。10 pmolの各プライマーと100 ngのP. stipitis ゲノムDNAを用い、変性反応を94℃で30秒間、アニーリング反応を55℃で30秒間、伸長反応を72℃で1分間の条件でXR遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpBluescript II KS(+)（ストラタジーン社）のHind IIIおよびBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpBS-XRと名付けた。続いてXR遺伝子の上流にPGKプロモーターを連結するために、pPGKをXho IおよびHind IIIで切断して得られたPGKプロモーター断片をpBS-XRのXho IおよびHind III制限酵素切断部位に導入し、これをpBS-PGK-XRと名付けた。さらにXR遺伝子の下流に連結するPGKターミネーターの3’末端にXho IおよびSpe I切断部位を認識する配列を付加するために、下記の二つのプライマーを設計した。尚、PGKターミネーター遺伝子の5’末端にBamH I切断部位、3’末端にXho IおよびSpe I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-CCCggatccGGGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCG-3’(配列番号５)
5’-GACactagtctcgagCAGCTTTAACGAACGCAGAATTTTCG-3’ (配列番号６)
PCRは、Blend Taq DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて行った。10 pmolの各プライマーと100 ngのpPGKプラスミドDNAを用い、変性反応を94℃で30秒間、アニーリング反応を55℃で30秒間、伸長反応を72℃で1分間の条件でPGKターミネーター遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、pBS-PGK-XRのBamH IおよびSpe I制限酵素切断部位に導入し、これをpBS-PGK-XR-PGKと名付けた。
【００４３】
実施例２：pPGK-XDH(WT)の作製
野生型XDH遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているPichia stipitis XDH遺伝子（登録番号AF127801もしくはX55392）（配列番号７）を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、XDH遺伝子の5’末端にEcoR I切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-CATgaattcATGACTGCTAACCCTTCCTTGGTG-3’(配列番号８)
5’-TAAggatccTTACTCAGGGCCGTCAATGAGAC-3’ (配列番号９)
PCRは、Blend Taq DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて行った。10 pmolの各プライマーと100 ngのP. stipitis ゲノムDNAを用い、変性反応を94℃で30秒間、アニーリング反応を60℃で30秒間、伸長反応を72℃で1分30秒間の条件でXDH遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR IおよびBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-XDH(WT)と名付けた。
【００４４】
実施例３：pPGK-XKの作製
野生型XK遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae XK遺伝子（NC_001139.7）（配列番号１０）を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、XK遺伝子の5’末端にEcoR I切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-CATgaattcATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAGAC-3’(配列番号１１)
5’-TAAggatccTTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTCGC-3’ (配列番号１２)
PCRは、Blend Taq DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて行った。10 pmolの各プライマーと100 ngのS. cerevisiae ゲノムDNAを用い、変性反応を94℃で30秒間、アニーリング反応を54℃で30秒間、伸長反応を72℃で2分間の条件でXK遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpPGKのEcoR IおよびBamH I制限酵素切断部位に導入し、これをpPGK-XKと名付けた。
【００４５】
実施例４：pAURXKの作製
PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXK断片を染色体組込み型プラスミドpAUR101（タカラバイオ株式会社）に導入するため、実施例３で作製したプラスミドpPGK-XKをXho I及びSal Iで切断し、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXK断片をpAUR101のSal I部位に導入した。そのためにSal Iで切断したpAUR101はアルカリホスファターゼ処理して切断面のリン酸基を取り除いた。得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動パターンを調べることで、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXK断片のpAUR101に組み込まれた方向を確認し、AUR1-C遺伝子の方向と順向きの方向に導入されたプラスミドをpAURXKと名付けた。
【００４６】
実施例５：pAURXKXDH(WT)の作製
PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの野生型XDH断片を実施例４で作製したプラスミドpAURXKに導入するため、実施例２で作製したプラスミドpPGK-XDH(WT)をXho IおよびSal Iで切断し、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの野生型XDH断片をpAURXKのSal I部位に導入した。そのためにSal Iで切断したpAURXKはアルカリホスファターゼ処理して切断面のリン酸基を取り除いた。得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動パターンを調べることで、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの野生型XDH断片のpAURXKに組み込まれた方向を確認し、AUR1-C遺伝子の方向と順向きの方向に導入されたプラスミドをpAURXKXDH(WT)と名付けた。
【００４７】
実施例６：pAURXKXDH(ARSdR)の作製
PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの改変型XDH断片を実施例４で作製したプラスミドpAURXKに導入するため、酵素工学的手法により作製された改変型XDHをpPGKに導入したプラスミドpPGK-XDH(ARSdR) (京都大学エネルギー理工学研究所 生体エネルギー研究分野の牧野圭祐教授から分与)をXho IおよびSal Iで切断し、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの改変型XDH断片をpAURXKのSal I部位に導入した。そのためにSal Iで切断したpAURXKはアルカリホスファターゼ処理して切断面のリン酸基を取り除いた。得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動パターンを調べることで、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きの改変型XDH断片のpAURXKに組み込まれた方向を確認し、AUR1-C遺伝子の方向と順向きの方向に導入されたプラスミドをpAURXKXDH(ARSdR)と名付けた。
【００４８】
実施例７：pAURXKXDH(WT)XRの作製
PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片を実施例５で作製したプラスミドpAURXKXDH(WT)に導入するため、実施例１で作製したプラスミドpBS-PGK-XR-PGKをXho Iで切断し、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片をpAURXKXDH(WT)のSal I部位にした。そのためにSal Iで切断したpAURXKXDH(WT)はアルカリホスファターゼ処理して切断面のリン酸基を取り除いた。得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動パターンを調べることで、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片のpAURXKXDH(WT)に組み込まれた方向を確認し、AUR1-C遺伝子の方向と順向きの方向に導入されたプラスミドをpAURXKXDH(WT)XRと名付けた（図２を参照）。
【００４９】
実施例８：pAURXKXDH(ARSdR)XRの作製
PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片を実施例６で作製したプラスミドpAURXKXDH(ARSdR)に導入するため、実施例１で作製したプラスミドpBS-PGK-XR-PGKをXho Iで切断し、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片をpAURXKXDH(ARSdR)のSal I部位にした。そのためにSal Iで切断したpAURXKXDH(ARSdR)はアルカリホスファターゼ処理して切断面のリン酸基を取り除いた。得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動パターンを調べることで、PGKプロモーターおよびPGKターミネーター付きのXR断片のpAURXKXDH(ARSdR)に組み込まれた方向を確認し、AUR1-C遺伝子の方向と順向きの方向に導入されたプラスミドをpAURXKXDH(ARSdR)XRと名付けた（図２を参照）。
【００５０】
実施例９：遺伝子組換え酵母株の作製
宿主細胞株として、実験株であるD452-2株、INVSc1株および工業株であるType-II株、IR-2株、焼酎3号を用いた。D452-2株は京都大学エネルギー理工学研究所 生体エネルギー研究分野の牧野圭祐教授のグループから分与され、INVSc1はInvitrogenから購入し、Type-II株はSIGMAから購入し、IR-2（FERM BP-754号）は産総研の寄託センターから入手し、焼酎3号は日本醸造協会から入手した。実施例７で作製したプラスミドpAURXKXDH(WT)XRをYEASTMAKER yeast transformation system 2（クロンテック社）を用いてリチウム酢酸法によりD452-2株、INVSc1株、Type-II株、IR-2株、および焼酎3号株に形質転換して、それぞれ遺伝子組換え酵母D-WT株、N-WT株、T-WT株、R-WT株、およびS-WT株を作製した。また、実施例８で作製したプラスミドpAURXKXDH(ARSdR)XRをYEASTMAKER yeast transformation system 2（クロンテック社）を用いてリチウム酢酸法により実験酵母株であるD452-2株、INVSc1株および工業株であるType-II株、IR-2株に形質転換して、それぞれ遺伝子組換え酵母D-ARSdR株、N-ARSdR株、T-ARSdR株、およびR-ARSdR株を作製した。一方、酵素遺伝子を含まないベクタープラスミドpAUR101を用いてD452-2株、INVSc1株、Type-II株、およびIR-2株に形質転換して、それぞれD-Control株、N-Control株、T-Control株、およびR-Control株を作製し、コントロール株として用いた。なお、これら酵母株の染色体に、pAURXKXDH(WT)XR、pAURXKXDH(ARSdR)XR、およびpAUR101をそれぞれ組込むために、これらプラスミドは全てBsiW Iで切断して直鎖状プラスミドにした後、これら酵母株に形質転換した。
【００５１】
実施例１０：酵素比活性の測定
XRの活性測定は、反応によって生成されるNAD(P)Hの特異的な340 nmの吸収度の減少を30℃でモニターすることによって行った。200 mMのキシロース、および100μlの1.5 mM NAD(P)Hを含む50 mMリン酸バッファー（900μl）中において、1μmolのNAD(P) ＋を1分間に生成するために必要な量を、XRの1ユニットと定義した。
【００５２】
XDHの活性測定は、反応によって生成されるNAD(P)＋の特異的な340 nmの吸収度の増加を35℃でモニターすることによって行った。50 mM MgCl2、300 mMのキシリトールおよび100μlの10 mM NAD(P)+を含む50 mM Tris-HClバッファー（900μl）中において、1μmolのNAD(P)Hを1分間に生成するために必要な量を、XDHの1ユニットと定義した。
【００５３】
XKの活性測定は、キシルロースからキシルロース５リン酸に変換されるときに生じるADPを利用してピルピン酸キナーゼ（PK）と乳酸脱水素酵素（LDH）が組み合わさった反応によって生成されるNADHの特異的な340 nmの吸収度の減少をモニターすることによって行った。2 mM MgCl2、8 mM NaF、2 mM ATP、0.2 mM ホスホエノールピルビン酸、3 mM 還元グルタチオン、10 U LDH、10 U PK、0.2 mM NADH、および8.5 mM キシルロースを含む100 mM Tris-HClバッファー（900μl）中において、1μmolのNAD+を1分間に生成するために必要な量を、XKの1ユニットと定義した。
【００５４】
酵素活性測定のために、キシロース発酵酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、N-ARSdR株、T-WT株、T-ARSdR株、R-WT株、およびR-ARSdR株）とコントロール酵母（D-Control株、N-Control株、T-Control株、およびR-Control株）を、20 g/lグルコースを含む完全培地（20 g/l ポリペプトン、 10 g/l yeast extract : YPD培地）において30℃で48時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、適量の酵母タンパク質抽出試薬Y-PER（Pierce社）に懸濁した。細胞懸濁液を20分間voltex mixerで撹拌した後、遠心分離し、その上清を酵母無細胞（タンパク質）抽出液として酵素活性測定に用いた。
【００５５】
タンパク濃度はMicro-BCA kit（Pierce社）を用いて決定した。図３に酵素比活性の結果を示した。キシロース発酵酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、N-ARSdR株、T-WT株、T-ARSdR株、R-WT株、およびR-ARSdR株）におけるXRの比活性は、コントロール酵母（D-Control株、N-Control株、T-Control株、およびR-Control株）におけるよりも、いずれも極めて高かった。また、野生型XDHを発現する酵母（D-WT株、N-WT株、T-WT株およびR-WT株）におけるXDHの比活性は、NAD+に極めて高い特異性を示した。一方、改変型XDHを発現する酵母（D-ARSdR株、N-ARSdR株、T-ARSdR株およびR-ARSdR株）におけるXDHの比活性は、逆にNADP+に高い特異性を示した。さらにキシロース発酵酵母におけるXKの比活性は、コントロール酵母におけるよりも約２倍高かった。
【００５６】
また、XRの比活性は、D-WT株およびN-WT株と比較して、T-WT株では1.5倍以上、R-WT株では5.5倍以上高く、またD-ARSdR株およびN-ARSdR株と比較しても、T-ARSdR株では1.3倍以上、R-ARSdR株では6.9倍以上高かった。XRの比活性は、全体的にWT株よりもARSdR株の方が高くなる傾向が確認できた。
【００５７】
一方、NAD+に特異的なXDHの比活性は、D-WT株およびT-WT株と比較して、N-WT株では約1.5倍、R-WT株では約2.0倍高く、逆にNADP+に特異的なXDHの比活性は、T-ARSdR株では低く、D-ARSdR株およびR-WT株と比較して、N-WT株では約1.7倍高かった。野生型XDHを発現する酵母におけるNAD+に特異的なXDHの比活性に比べて、改変型XDHを発現する酵母におけるNADP+に特異的なXDHの比活性はそれほど高くなかったが、グルコースの代わりに20 g/lキシロースを含む完全培地（20 g/l ポリペプトン、 10 g/l yeast extract : YPX培地）において培養した酵母株から抽出した酵母無細胞（タンパク質）抽出液を用いた場合は、NADP+に特異的なXDHの比活性がより高くなることを確認した。
【００５８】
XKの比活性はキシロース発酵酵母株の間でそれほど違いはみられなかった。いずれにしても、本酵母株において、キシロース代謝系酵素遺伝子群が適切に酵母内で高発現していることが示唆された。
【００５９】
実施例１１：遺伝子組換え酵母の培養
エタノール発酵実験のために、キシロース発酵酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、N-ARSdR株、T-WT株、T-ARSdR株、R-WT株、およびR-ARSdR株）を、20 g/lグルコースあるいは20 g/lキシロースを含む完全培地（20 g/l ポリペプトン、 10 g/l yeast extract : YPD培地あるいはYPX培地）において30℃で48時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、20 mlの発酵培地（45 g/lキシロースを含む完全培地[YPX培地]あるいは45 g/lグルコースと45 g/lキシロースを含む完全培地[YPDX培地]または25 g/lグルコースと15 g/lキシロースを含む完全培地[YPDX2培地]）に適量を接種した（菌体量を統一）。発酵液は攪拌棒を入れた50 mlの密封型のバイヤルにおいて、緩やかに攪拌しながら30℃で嫌気的に培養した。
【００６０】
実施例１２：エタノール濃度の測定
エタノール、グルコース、キシロース、キシリトール、他の副産物の濃度は高速液体クロマトグラフィー（HPLC; 日本分光株式会社）を用いて測定した。分離カラムはHPX-87Hカラム（Bio-Rad社）を用い、HPLC装置は5 mM H2SO4で0.6 ml/minの流速で流し、65℃で運転した。酵母の増殖は分光光度計U-3000（日立）を用いて600 nmでの波長を測定した。
【００６１】
解析の結果、D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、N-ARSdR株、T-WT株、およびT-ARSdR株の間ではそれほど増殖速度の違いはみられなかったのに対し、R-WT株およびR-ARSdR株はこれら酵母株よりも増殖速度が極めて速くなり、細胞収量も増加した（約1.5倍）。また培地にグルコースが存在した場合（YPDX培地）、D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、およびN-ARSdR株に比べて、R-WT株およびR-ARSdR株には及ばないが、T-WT株およびT-ARSdR株も増殖速度がやや速くなり、細胞収量もやや増加した。
【００６２】
図４は、INVSc1を宿主とする遺伝子組換え酵母（N-WT株およびN-ARSdR株）を用いて、キシロース単独培地（YPX培地）（図４のAとBを参照）およびグルコースとキシロースの混合糖培地（YPDX培地）（図４のCとDを参照）において嫌気培養した結果、N-WT株およびN-ARSdR株のキシロース消費量（図４のAを参照）、キシロース消費量とグルコース消費量（図4のCを参照）とエタノール生産量（図４のBとDを参照）を経時的に示した図である。YPX培地において、N-WT株は72時間後に全キシロースの68 %を消費したのに対し、N-ARSdR株は72時間後に全キシロースの95 %を消費し、N-WT株に比べてN-ARSdR株はキシロース消費速度が顕著に速かった（図４のAを参照）。さらに、YPX培地において、N-WT株は72時間後にエタノールを9.5 g/l生産したのに対し、N-ARSdR株は72時間後にエタノールを14.9 g/l生産し、N-WT株に比べてN-ARSdR株はエタノール生産速度が顕著に速かった（図４のBを参照）。全キシロース消費量からのエタノール収率は、N-WT株が65 %、N-ARSdR株が69 %で、N-ARSdR株はN-WT株よりもエタノール収率が高かった。一方、YPDX培地において、N-WT株およびN-ARSdR株はいずれも、グルコースを24時間以内に全て消費した（図４のCを参照）。また、N-WT株は72時間後に全キシロースの72 %を消費したのに対し、N-ARSdR株は72時間後に全キシロースの78 %を消費し、N-WT株に比べてN-ARSdR株はキシロース消費速度がやや速かった（図４のCを参照）。このように、グルコース存在下（YPDX培地）よりも、キシロース単独培地（YPX培地）における方が、N-ARSdR株でキシロース消費速度が速くなる傾向が確認できたが、N-WT株ではほとんど変化しなかった（図４のAとCを比較）。そのために、YPDX培地において、エタノール生産速度に関しても、N-WT株とN-ARSdR株の間で差が縮小されたが、それでもN-WT株と比べて、N-ARSdR株の方がエタノール生産速度は速かった（図４のBとDを比較）。すなわち、YPDX培地において、N-WT株は72時間後にエタノールを30.3 g/l生産したのに対し、N-ARSdR株は72時間後にエタノールを32.0 g/l生産した（図４のDを参照）。全糖（グルコース＋キシロース）消費量からのエタノール収率は、N-WT株が75 %、N-ARSdR株が77 %で、N-ARSdR株はN-WT株よりもエタノール収率が高かった。さらに、いずれの酵母株のエタノール収率も、YPX培地におけるよりエタノール収率が高くなった。さらに驚くべきことに、キシロース消費速度はグルコース消費速度よりは遅いものの、グルコースを消費している間（0〜24時間）もキシロースが消費されており（図４のCを参照）、グルコース抑制の影響をほとんど受けていないことが示唆された。同様の結果がD-WT株とD-ARSdR株においても得られた。
【００６３】
図５は、IR-2を宿主とする遺伝子組換え酵母（R-WT株およびR-ARSdR株）を用いて、キシロース単独培地（YPX培地）（図５のAとBを参照）およびグルコースとキシロースの混合糖培地（YPDX培地）（図５のCとDを参照）において嫌気培養した結果、R-WT株およびR-ARSdR株のキシロース消費量（図５のAを参照）、キシロース消費量とグルコース消費量（図５のCを参照）とエタノール生産量（図５のBとDを参照）を経時的に示した図である。YPX培地において、R-WT株は33時間後に全キシロースの82 %を消費したのに対し、R-ARSdR株は33時間後に全キシロースの96 %を消費し、図４のAのN-WT株およびN-ARSdR株における結果と同様に、R-WT株に比べてR-ARSdR株はキシロース消費速度が顕著に速かった（図５のAを参照）。R-WT株およびR-ARSdR株はいずれも、キシロースを48時間以内にほぼ全て消費した。さらに、YPX培地において、R-WT株は33時間後にエタノールを12.4 g/l生産したのに対し、R-ARSdR株は33時間後にエタノールを14.9 g/lを生産した（図５のBを参照）。このように初期段階ではR-WT株に比べてR-ARSdR株はエタノール生産量が顕著に高かったが、R-WT株およびR-ARSdR株はいずれも、エタノールを48時間後に16.0 g/l近くまで生産することができた。全キシロース消費量からのエタノール収率は、R-WT株が67 %、R-ARSdR株が72 %で、R-ARSdR株は、R-WT株よりもエタノール収率が高かった。一方、YPDX培地において、R-WT株およびR-ARSdR株はいずれも、グルコースを9時間以内に全て消費し（図５のCを参照）、実験酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、N-ARSdR株）よりもグルコース消費速度が顕著に速かった（図４のCと図５のCを比較）。また、R-WT株は24時間後に全キシロースの96 %を消費したのに対し、R-ARSdR株は72時間後に全キシロースの92 %を消費し、R-ARSdR株に比べてR-WT株はキシロース消費速度がわずかに速かった（図５のCを参照）。R-WT株およびR-ARSdR株はいずれも、キシロースを32時間以内にほぼ全て消費した。このように、キシロース単独培地（YPX培地）よりも、グルコース存在下（YPDX培地）における方が、R-WT株およびR-ARSdR株でキシロース消費速度が速くなる傾向が確認でき、特にR-WT株では顕著にキシロース消費速度が速くなった（図５のAとCを比較）。この結果は、実験酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、およびN-ARSdR株）とは対照的であり、工業株であるR-WT株およびR-ARSdR株は、木質系バイオマスからの（グルコースとキシロースを含む混合糖組成からなる）糖化液を発酵させるのにより適合していることが示唆された。YPDX培地において、キシロース消費速度と同様に、エタノール生産速度に関しても、R-WT株とR-ARSdR株の間で差が縮小され、R-ARSdR株と比べてN-WT株の方がエタノール生産速度がわずかに速かった（図５のBとDを比較）。すなわち、YPDX培地において、R-WT株は24時間後にエタノールを35.3 g/l生産したのに対し、R-ARSdR株は24時間後にエタノールを33.7 g/l生産したが、R-WT株およびR-ARSdR株はいずれも、エタノールを32時間後に36.0 g/l近くまで生産することができた（図５のDを参照）。全糖（グルコース＋キシロース）消費量からのエタノール収率は、R-WT株が82 %、R-ARSdR株が76 %で、R-WTは、R-ARSdR株よりもエタノール収率がわずかに高くなった。YPDX培地において、キシロース消費速度、エタノール生産速度およびエタノール収率が、R-WT株の方がR-ARSdR株よりもわずかによかった理由は明らかではないが、おそらくR-ARSdR株においてNADP+依存的活性が比較的低かったことが影響していることが示唆される（図３を参照）。また図４の結果と同様に、YPX培地よりもYPDX培地においてエタノール収率が高くなった。さらに驚くべきことに、図４の結果と同様に、キシロース消費速度はグルコース消費速度よりは遅いものの、グルコースを消費している間（0〜9時間）もキシロースが消費されており（図５のCを参照）、グルコース抑制の影響をほとんど受けていないことが示唆された。しかも、実験酵母（D-WT株、D-ARSdR株、N-WT株、およびN-ARSdR株）よりも速いスピードでR-WT株およびR-ARSdR株によるキシロース発酵が進行しているが、これはR-WT株およびR-ARSdR株によるグルコース発酵が実験酵母株におけるよりも速いことが原因であることが示唆される。同様の結果がT-WT株とT-ARSdR株においても得られた。ただし、YPX培地においても、T-WT株はT-ARSdR株よりもキシロース消費速度が速く、またエタノール生産速度が速く、エタノール収量も高かった。これはT-ARSdR株においてNADP+依存的活性が低かったことが影響していることが示唆される（図３を参照）。いずれにしても、工業化のための長年の課題であった、キシロース発酵性を付与した遺伝子組換え酵母によるグルコース・キシロース同時発酵が、これら本酵母株を用いることで実現できることが示唆された。
【００６４】
図６はキシロース単独培地（YPX培地）（図６のAとBを参照）およびグルコースとキシロースの混合糖培地（YPDX培地）（図６のCとDを参照）において嫌気培養した結果、D-ARSdR株、N-ARSdR株、T-WT株およびR-ARSdR株のキシロース消費量（図６のAを参照）とエタノール生産量（図６のBを参照）を、またD-ARSdR株、N-ARSdR株、T-WT株およびR-WT株のキシロース消費量（図６のCを参照）とエタノール生産量（図６のDを参照）を経時的に示した図である。これら酵母株は、YPX培地およびYPDX培地において、WT株とARSdR株を各宿主酵母でそれぞれ比較した結果、キシロース発酵能（キシロース消費速度、エタノール生産速度、エタノール収量等）のよかった方の酵母株として選定した。すなわち、YPX培地における場合、宿主酵母株がD452-2株ではD-ARSdR株、INVSc1株ではN-ARSdR株、Type-II株ではT-WT株、IR-2株ではR-ARSdR株を選定した。またYPDX培地における場合、宿主酵母株がD452-2株ではD-ARSdR株、INVSc1株ではN-ARSdR株、Type-II株ではT-WT株、IR-2株ではR-WT株を選定した。これら酵母株間におけるキシロース消費量とエタノール生産量を比較することで、YPX培地およびYPDX培地それぞれにおいて、キシロースからのエタノール発酵能が最も優れた酵母株を調べることにした。YPX培地において、最もキシロース消費速度とエタノール生産速度が速かったのはR-ARSdR株で、次いで、N-ARSdR株、T-WT株であった一方、D-ARSdR株はやや遅れた（図６のAとBを参照）。R-ARSdR株は33時間後に全キシロースの96 %を消費したのに対し、N-ARSdR株およびT-WT株はいずれも、72時間後に全キシロースの95 %を消費し、D-ARSdR株は72時間後に全キシロースの79 %を消費した(図６のAを参照)。他の酵母株に比べてR-ARSdR株はキシロース消費速度が顕著に速く、キシロースを48時間以内にほぼ全て消費した。さらに、YPX培地において、R-ARSdR株は33時間後にエタノールを14.9 g/lを生産したのに対し、N-ARSdR株およびT-WT株はいずれも、72時間後にエタノールを14.8 g/lを生産し、D-ARSdR株は72時間後にエタノールを12.7 g/lを生産した（図６のBを参照）。このように初期段階では他の酵母株に比べてR-ARSdR株はエタノール生産量が顕著に高かったが、N-ARSdR株およびT-WT株はいずれも、エタノールを72時間後にR-ARSdR株と同様のレベルまで生産することができた。全キシロース消費量からのエタノール収率は、R-ARSdR株が72 %、N-ARSdR株およびT-WT株はいずれも69 %、D-ARSdR株が70 %で、R-ARSdR株が最もエタノール収率が高かった。またエタノール収率の点では、D-ARSdR株はR-ARSdR株に次いで高収率だった。一方、YPDX培地において、T-WT株およびR-WT株はいずれも、グルコースを9時間以内に全て消費した一方、D-ARSdR株およびN-ARSdR株はいずれも、グルコースを24時間以内に全て消費した。また、YPDX培地において、最もキシロース消費速度とエタノール生産速度が速かったのはR-WT株およびT-WT株で、D-ARSdR株およびN-ARSdR株は遅れた（図６のCとDを参照）。R-WT株およびT-WT株はいずれも、24時間後に全キシロースの96 %を消費したのに対し、D-ARSdR株およびN-ARSdR株は72時間後に全キシロースのそれぞれ78 %および76 %を消費した（図６のCを参照）。D-ARSdR株およびN-ARSdR株に比べて、R-WT株およびT-WT株はキシロース消費速度が顕著に速く、キシロースを32時間以内にほぼ全て消費した。さらに、YPDX培地において、R-WT株およびT-WT株は24時間後にエタノールをそれぞれ35.3 g/lおよび33.5 g/l生産したのに対し、D-ARSdR株およびN-ARSdR株は72時間後にエタノールをそれぞれ32.5 g/lおよび32.0 g/l生産した（図６のDを参照）。このように初期段階ではD-ARSdR株およびN-ARSdR株に比べてR-WT株およびT-WT株はエタノール生産量が顕著に高かったが、D-ARSdR株およびN-ARSdR株はいずれも、エタノールを72時間後にR-WT株およびT-WT株と同様のレベルまで生産することができた。全キシロース消費量からのエタノール収率は、R-WT株が82 %、D-ARSdR株およびT-WT株はいずれも80 %、N-ARSdR株が77 %で、R-WT株が最もエタノール収率が高かった。以上の結果から、キシロース単独培地（YPX培地）では、キシロースからのエタノール発酵能（キシロース消費速度、エタノール生産速度、エタノール収量等）に関して、R-ARSdR株が最も優れた酵母株であることが分かった。一方、グルコース存在下（YPDX培地）では、キシロースからのエタノール発酵能に関して、R-WT株が最も優れた酵母株であるが、T-WT株もキシロース消費速度、エタノール生産速度の点で優れていることが分かった。
【００６５】
これまでにPurdue大学のHo博士らはキシロースからエタノールを高収率に生産することができるSaccharomyces酵母 424A(LNH-ST)株を用いて、グルコース存在下においてキシロースからエタノールを高収率に得ている。本実施例の結果から、グルコース存在下でキシロース発酵能の最もよかったのはR-WT株であったが、この酵母株とHo博士らの424A(LNH-ST)株についてキシロース発酵能を比較することにした。そのために、Ho博士らが実施した発酵実験におけるのとほぼ同じ糖組成（25.0 g/lグルコースおよび15.0 g/lキシロース）の完全培地（YPDX2培地）で、R-WT株を嫌気培養し、キシロース発酵能を調べた（図７を参照）。Ho博士らによると、424A(LNH-ST)株を用いて25.5 g/lグルコースおよび17.0 g/lキシロースを含む混合糖を発酵させたところ、グルコースは3時間以内に全て消費し、キシロースは48時間後に全キシロースの80 %を消費した。その結果、48時間後に15.1 g/lのエタノールが生産し、全糖消費量からのエタノール収量は75.7 %であった。また、中間代謝物であるグリセロールは少量生産されたが、酢酸はほとんど生産されず、キシリトールは全く生産されなかった。そこで図７においてR-WTについて調べたところ、グルコースは6時間以内に全て消費し、424A(LNH-ST)株よりもやや時間がかかったものの、キシロースは424A(LNH-ST)株の半分の時間である24時間後にほとんどのキシロース（全キシロースの98 %）を消費した。その結果、24時間後に16.5 g/lのエタノールが生産し、全糖消費量からのエタノール収量は77.9 %にまで達した（全キシロース消費量からのエタノール収率は76.1 %）。また、中間代謝物であるグリセロールとキシリトールは少量生産されたが（1.7 g/l以下）、酢酸はほとんど生産されなかった。よって、キシロース消費速度、エタノール生産速度、エタノール収量の全ての点で、これまで最もキシロース発酵能が優れていると報告されている組換え酵母の一つである424A(LNH-ST)株よりも、R-WT株の方が優れていることが示唆された。すなわちR-WT株は、これまでに報告されているキシロース発酵酵母の中で、グルコース存在下におけるキシロース発酵能が格段に優れていることが示唆された。
【００６６】
以上の結果より、本願発明に係る遺伝子組換え酵母を用いることによって、キシロースからエタノールを高効率に生産することができることが示された。特に、R-ARSdR株は、これまでに報告されているキシロース発酵酵母よりも、キシロース単独糖におけるキシロース発酵能が格段に優れた酵母である。さらに、R-WT株は、これまでに報告されているキシロース発酵酵母よりも、グルコース存在下でのキシロース発酵能が格段に優れた酵母である。R-ARSdR株およびT-WT株もグルコース存在下でのキシロース発酵能はこれまでに報告されている組換え酵母よりも格段に優れているが、R-WT株に比べてやや劣る。
【００６７】
そこで、本発明のR-ARSdR株およびR-WT株におけるキシロース発酵能（図５、図６、図７を参照）を、これまでに報告されているキシロース発酵能を付与した遺伝子組換え酵母および遺伝子組換え微生物（大腸菌、ザイモモナス、ザイモバクター）におけるキシロース発酵能と比較してみた（図８を参照）。なお、これまでに様々な組換え微生物を用いて、キシロースからのエタノール生産の報告がなされているが、培地組成や糖組成、接種菌体量などが異なるために単純には比較することは難しい。しかしながら、キシロースおよびキシロースを含む混合糖を用いたバッチ発酵実験の結果に絞って、キシロースからのエタノール変換効率が比較的良かったものを図８にピックアップした。その結果、本発明のR-ARSdR株およびR-WT株は、既知の優れたキシロース発酵酵母・微生物と同レベルもしくはそれ以上にキシロース発酵能が優れていることが示唆された。すなわち、R-ARSdR株は、キシロース単独培地においてキシロースからのエタノール発酵速度が最も速かった。また、R-WT株はグルコース共存下においてキシロースからのエタノール収率が比較的高く、かつキシロース発酵速度が最も速かった。またT-WT株については記していないが、R-WT株には及ばないものの、図８のいずれのキシロース発酵酵母・微生物よりもキシロース発酵能（特に発酵速度）が優れていたことを報告しておく。
【００６８】
次に、本発明の遺伝子組換え酵母が、リグノセルロース系バイオマスから調製した糖化液に含まれるグルコースやキシロースからエタノールを生産する効率を調べた。広葉樹であるユーカリから調製した糖化液を、上記混合糖からの発酵実験で最も優れた発酵能を示したR-WT株を用いて発酵させた。ユーカリ糖化液は以下のように調製した：ユーカリの木材チップ（王子製紙から供与）をボールミル（BM）で粉砕し、20 gの前処理した木粉に50 mM 酢酸緩衝液（pH5.0）に酵素カクテル（40 FPU/g 基質）を加えた100 mlの液を添加した。得られた糖化液はNaOHを用いてpH5.5に調整し、1 %のyeast extractを添加した。このユーカリ糖化液における糖組成をHPLC解析により調べたところ、62.5 g/lのグルコース、1.1 g/lのマンノース、1.2 g/lのガラクトース、13.2 g/lのキシロース、0.7 g/lのアラビノースを含んでいた。そこでこのユーカリ糖化液におけるR-WT株の嫌気的発酵能を調べたところ、グルコースは9時間以内にほぼ全て消費し、キシロースは48時間後に全て消費した（図９参照）。また、R-WT株はマンノースを4時間以内に、ガラクトースを24時間以内に、さらに驚いたことにアラビノースを48時間以内に全て消費した（図示せず）。その結果、48時間後に38.9 g/lのエタノールが生産され、全糖消費量からのエタノール収量は97.6 %にまで達した。この値は、上記の合成培地におけるキシロース単独糖やグルコースとキシロースを含む混合糖からのエタノール収率よりも顕著に高く、本発明の酵母株がリグノセルロース系バイオマスから調製した糖化液の発酵にも使用可能であり、実用レベルでも通用する酵母株であることが明らかとなった。また、中間代謝物であるグリセロールは主にグルコース発酵時に少量生産されたが（2.3 g/l以下）、キシリトールはほとんど生産されなかった。さらに、上記の合成培地における混合糖の発酵実験の結果（図４〜７）と同様に、キシロース消費速度はグルコース消費速度よりは遅いものの、グルコースを消費している間（０〜９時間）もキシロースが消費されており、グルコース抑制の影響をほとんど受けていないことが示された。これらの結果から、本発明の遺伝子組換え酵母（R-WT株）は、合成培地中のキシロースやグルコースとキシロースの混合糖のみならず、リグノセルロース系バイオマスから調製した糖化液に含まれるグルコースやキシロースなどの糖も効率よく発酵できることが明らかとなった。
【００６９】
実施例１３：キシロース発酵能のさらなる改良化
実施例７で作製したプラスミドpAURXKXDH(WT)XRを実用株である焼酎3号（協会系酵母）に導入してS-WT株を作製し、XR、XDH、XKの各活性を測定した。その結果、T-WT株やR-WT株のものとほぼ同等のレベルで発現していることを確認した。次に、キシロースからの嫌気的なエタノール発酵実験を行ったところ、グルコースとキシロース存在下（YPDX培地）での発酵能はType-IIのものとほとんど変わらなかった。しかし、キシロースのみの培地（YPX培地）においては、S-WT株はほとんど増殖が認められなかった（図１０のAを参照）。さらにS-WT株ではキシロース消費もほとんど進まず（図１０のBを参照）、その結果エタノール生産量は、上記した他の遺伝子組換え酵母に比べて少なかった（図１０のCを参照）。YPX培地において、S-WT株は72時間後に全キシロースの52 %しか消費せず、実験株であるD-WT株やN-WT株よりもキシロース消費速度が小さかった（図４のAを参照）。さらに、YPX培地において、S-WT株は72時間後にエタノールを6.3 g/lしか生産せず、実験株であるD-WT株やN-WT株よりもエタノール生産速度が小さかった（図４のBを参照）。S-WT株における、全キシロース消費量からのエタノール収率は54 %と、上記した他の遺伝子組換え酵母に比べて低かった。YPX培地におけるS-WT株のこのような低レベルのキシロース発酵能の原因は明らかではないが、宿主酵母の焼酎3号株の代謝能力に依存しているためと考えられる。
【００７０】
そこでS-WT株の、他の遺伝子組換え酵母と比較して低レベルのキシロース発酵能を改善するために、S-WT株を、よりキシロース発酵できる環境に適応できるように選択圧をかけて継代培養することによる順化処理に供した。S-WT株を、キシロースと少量のグルコースを含む最少培地（6.7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、30 g/l キシロース、1 g/l グルコース、2 g/l全てのアミノ酸を加えたdrop out mix : SCDX培地）において30℃で72時間、嫌気的に培養した。培地にグルコースを加えた理由は次の2つである。ひとつは染色体に組み込んだ3種類の遺伝子の上流につないだPGKプロモーターがグルコースによって発現が促進されるので、よりキシロース代謝が進むと考えたことによる。もうひとつは、もしキシロースだけの培地で継代培養した後にグルコース存在下の培地に戻すと、グルコース抑制の影響を受ける可能性があるが、培地にグルコースを加えておけば、グルコース抑制の影響をそれほど受けずにキシロースを代謝できると考えたことによる。72時間後、この培養液から少量取り出したS-WT株をさらに新しいSCDX培地に植え継ぎ、同様に嫌気的に培養した。これを10継代繰り返し、10継代後のS-WT株ををS-WT(C1)株と命名した。
【００７１】
S-WT(C1)株は、グルコースとキシロース存在下（YPDX培地）での発酵能は順化処理前のS-WT株のものとほとんど変わらなかったが、キシロースのみの培地（YPX培地）においては、S-WT(C1)株は順化処理前のS-WT株よりも著しくキシロース発酵能が向上していることが確認された（図１０参照）。すなわちS-WT(C1)株は、YPX培地において増殖が認められ（図１０のAを参照）、順化処理前のS-WT株と比較してキシロース消費が促進され（図１０のBを参照）、その結果エタノール生産量は顕著に増加した（図１０のCを参照）。YPX培地において、S-WT株は72時間後に全キシロースの96 %を消費し、実験株であるD-WT株やN-WT株よりもキシロース消費が促進した（図４のAおよび図１０のBを参照）。さらに、YPX培地において、S-WT(C1)株は72時間後にエタノールを14.6 g/l生産し、全キシロース消費量からのエタノール収率は65 %で、順化処理前のS-WT株と比べてキシロース発酵能が向上していることが示された。また、S-WT株とS-WT(C1)株のXR、XDH、XKの各活性を比較した結果、全体的にS-WT(C1)株の方がやや活性の低下が認められたが、それほど顕著な違いはなかった。このことから、S-WT株のキシロース発酵能が改善されたのは、順化処理後にキシロース代謝系酵素の活性が高くなったためではなく、キシロースの取り込みに関連する遺伝子やXK下流のペントースリン酸経路における酵素遺伝子に変異が入って活性が増大されたなど、キシロース代謝のバイパスが強化されたためであると推測される。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の遺伝子組換え酵母を用いた嫌気的な培養によって、高効率でキシロースをエタノールへ変換できる（キシロース発酵速度が速く、かつキシロースからエタノールを高収率生産する）ので、木質系バイオマスに含まれるキシロースを次世代の液体エネルギーとして期待されているエタノールへの高効率での変換を実現できる。また、キシロース代謝系（XR、XDHおよびXK）遺伝子を効率よく全て染色体組込みにより導入しているので、非常に安定しており、選択培地で培養する必要がなく、糖化液で直接増殖させることができるので、安価である上に、増殖速度および糖代謝速度の増加が期待できる。さらに、本発明で最もキシロース発酵能が優れたR-ARSdR株およびR-WT株（宿主酵母 : IR-2株）は凝集性酵母であるので、連続発酵、繰り返し発酵が可能であり、酵母のリサイクルによって高い酵母濃度を維持でき、より高いエタノール生産性が得られる。さらに、通常はグルコース存在下だとキシロース発酵が抑制を受けるが、本発明の遺伝子組換え酵母は全てグルコースの存在下でもキシロースを同時に発酵でき、特に工業株（IR-2株およびType-II株）を宿主とする遺伝子組換え酵母は、グルコース存在下でもキシロース発酵が遅延することがなく、むしろキシロース発酵が促進されるという極めて望ましい特徴をもっているので、木質や農産廃棄物等のリグノセルロース系バイオマスから調整した糖化液からエタノールを高効率に生産できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え酵母は、これまで工業化を阻んできたグルコース抑制の問題が解決された六炭糖・五炭糖同時発酵酵母であり、長年待ち望まれていた実用化・工業化に即したキシロース発酵酵母といえる。それに加えて、本発明において使用されるキシロース代謝系発現カセットは、あらゆる宿主酵母株の染色体に組込み可能であるので、本発明の実施例に示したIR-2やType-II、焼酎3号以外の他の工業酵母株の染色体にも導入することができ、さらに産業上の利用に即した強力なキシロース発酵能をもつ六炭糖・五炭糖同時発酵酵母を作製することも可能である。加えて、組換え酵母株のキシロース発酵能は、一連のキシロースを含む培地で選択圧をかけながら継代培養する順化処理方法により、当該組換え酵母株のキシロース発酵能を向上し得る。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】酵母内のキシロース代謝経路を示す説明図である。図中、XRはキシロース還元酵素、XDHはキシリトール脱水素酵素、XKはキシルロキナーゼをそれぞれ意味する。従来法では、Pichia stipitis由来のXRおよびXDHならびにSaccharomyces cerevisiae由来のXKのそれぞれをコードする遺伝子を酵母に導入することによりキシロース発酵酵母が作製される。この従来法によって得られる遺伝子組換え酵母は、相当量のキシリトールが蓄積するためにキシロースからエタノールへの変換効率がそれほど良くないことに加えて、グルコースの存在下でキシロース発酵が抑制される。一方、本願発明の一実施形態では、XR、野生型または変異型XDHおよびXKの発現カセットを酵母染色体に組込み、これら遺伝子群を適切に酵母内で発現させることにより、六炭糖・五炭糖同時発酵酵母を複数作製する。さらにその酵母株の中から、キシロース発酵速度が速く、かつキシロースからエタノールを高収率生産できる酵母株を選定する。それによって、本願発明による六炭糖・五炭糖同時発酵酵母は高いキシロース発酵能を有し、エタノールを高効率的に生産することが可能である。
【図２】遺伝子組換え酵母を作製するための、キシロース代謝用の酵母染色体組込型プラスミド（pAURXKXDH(WT)XRおよびpAURXKXDH(ARSdR)XR）と宿主酵母（D452-2株、INVSc1株、Type-II株、IR-2株、および焼酎3号）を示す図である。
【図３】作製した遺伝子組換え酵母において発現させた酵素（XR、XDH、XK）の比活性を示す図である。
【図４】INVSc1株を宿主として作製した遺伝子組換え酵母（N-WT株およびN-ARSdR株）による、YPX培地における嫌気的エタノール発酵能（キシロース消費量およびエタノール濃度）とYPDX培地における嫌気的エタノール発酵能（キシロース、グルコース消費量およびエタノール生産量）を示す図である。
【図５】IR-2株を宿主として作製した遺伝子組換え酵母（R-WT株およびR-ARSdR株）による、YPX培地における嫌気的エタノール発酵能（キシロース消費量およびエタノール濃度）とYPDX培地における嫌気的エタノール発酵能（キシロース、グルコース消費量およびエタノール生産量）を示す図である。
【図６】YPX培地およびYPDX培地において、WT株とARSdR株を各宿主酵母でそれぞれ比較した結果、キシロース発酵能のよかった方の遺伝子組換え酵母（YPX培地ではD-ARSdR株、N-ARSdR株、T-WT株およびR-ARSdR株、YPDX培地ではD-ARSdR株、N-ARSdR株、T-WT株およびR-WT株）による、YPX培地およびYPDX培地における嫌気的エタノール発酵能（キシロース消費量およびエタノール生産量）を示す図である。
【図７】IR-2株を宿主酵母として作製した遺伝子組換え酵母（R-WT株）による、YPDX2培地における嫌気的エタノール発酵能（グルコース、キシロース消費量およびエタノール、グリセロール、キシリトール生産量）を示す図である。
【図８】キシロースおよびキシロースを含む混合糖を用いたバッチ発酵実験において、これまでに報告されているキシロース発酵性が比較的優れた遺伝子組換え酵母・微生物のキシロース発酵能と、本願発明によるR-ARSdR株およびR-WT株のキシロース発酵能を比較した図である。
【図９】IR-2株を宿主酵母として作製した遺伝子組換え酵母（R-WT株）による、ユーカリから調製した糖化液における嫌気的エタノール発酵能（グルコース、キシロース消費量およびエタノール、グリセロール生産量）を示す図である。
【図１０】焼酎3号株を宿主酵母として作製した遺伝子組換え酵母（S-WT株）とS-WT株を順化処理することにより得たS-WT(C1)株による、YPX培地における嫌気的エタノール発酵能（増殖、キシロース消費量、およびエタノール生産量）を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号３〜６、８、９、１１、１２は、合成オリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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