(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロース及びジブチリルｃＡＭＰを含有し、且つニトログリセリンを含有しない、肝臓保存液。
【請求項２】
ジブチリルｃＡＭＰの濃度が０．００５〜１０ｍＭの範囲にある、請求項１に記載の保存液。
【請求項３】
トレハロースの濃度が５０〜２４０ｍＭの範囲にある、請求項１又は２に記載の保存液。
【請求項４】
ヒドロキシエチル澱粉を更に含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存液。
【請求項５】
少なくとも下記の成分を下記の範囲内で更に含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の保存液：
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            １２〜  ６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ。
【請求項６】
少なくとも下記の成分を下記の範囲内で含有し、且つニトログリセリンを含有しない、肝臓保存液：
ジブチリルｃＡＭＰ                                  ０．００５〜１０ｍＭ
トレハロース                                            ５０〜２４０ｍＭ
ヒドロキシエチル澱粉                                      １〜８０ｇ／ｌ
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            １２〜  ６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトログリセリンによる毒性が改善された肝臓保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、欧米の脳死肝移植では、通常、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液（ＵＷ液）が使用されている（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐｒｏｃ，ｖｏｌ．３１，ｐ．２０６９−２０７０，１９９９）。これは、ＵＷ液が他の臓器保存液に比較して、より長期間、肝臓の冷疎血保存を可能にするからである。しかし、ＵＷ液は極めて粘性が高いため、肝臓の冷疎血保存を開始する際にあらかじめ、粘性の低いリンゲル液等で血管内の血液を洗い流す必要があるばかりか、ＵＷ液による潅流そのものにも、長時間を要す。また、ＵＷ液は細胞内液型保存液（電解質が細胞内の組成と同等）であり、カリウムの濃度が高い（１２５ｍＭ）。カリウムの濃度が高いことは血管の収縮を招くため、これも臓器の潅流に長時間を要す原因となる。そればかりか、肝を患者に移植し血流を再開する直前に肝内のＵＷ液を一旦、リンゲル液等で置換し、患者体内に高濃度のカリウムが流入しないようにする必要がある。その上、化学的に不安定な活性酸素消去剤（ラジカルスカベンジャー）を成分に含むため、ＵＷ液には冷所保存でも有効期間が短く、また、単価が非常に高い。
これらの、不利益を解決するため、ＵＷ液とはまったく組成の異なる細胞外液であって、カリウム濃度が低く、細胞膜を安定化し細胞傷害を抑制する糖類トレハロースを含有するＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液及びＮｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液が本発明者らにより開発された（特許第３２５３１３１号、Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．６，ｐ．１１０７−１１１４，２００４）。Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液はＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液と類似する組成を有するが、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、ニトログリセリン及びＮアセチルシステインを含有する点で、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液とは異なる。ｄｂ−ｃＡＭＰ及びニトログリセリンの保存液への添加は、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液と比して移植後における臓器機能をさらに高めることが記載されている（Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．６，ｐ．１１０７−１１１４，２００４）。
ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液はすでに、腎臓、肺、筋肉、皮膚の冷疎血保存において、ＵＷ液と同等の効果を発揮することが動物実験のレベルで示されている。しかし、肝臓の保存に対する効果に関しては詳細な報告は未だ成されていなかった。
また、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液に関しては、肺の保存においてＵＷ液に優る効果が示されており、京都大学における臨床、肺移植に導入されている。
そこで、より臓器機能の維持作用に優れ、しかも安全性、操作性及び化学的安定性に優れた肝臓保存液の開発が望まれている。
上記事情に鑑み、臓器機能の維持作用に優れ、しかも安全性、使用の容易さ、化学的安定性に優れた肝臓保存液を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を進めた。
その結果、肺移植片等の保存において優れた効果を有することが確認済みのＮｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液中で肝臓を保存し、肺移植時と同様に、これをリンゲル液等で潅流せずにレシピエント動物に移植したところ、意外なことに、レシピエント動物に対して肺移植時には認められない毒性を示し、当該動物の移植後生存率が低下してしまうという問題点を見出した。そこで、この毒性の原因を更に追究した結果、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液中に含まれるニトログリセリンがこの毒性の原因であり、この含有量を一定値より低くすることで、該毒性を低減することが可能であることを見出した。更に、ニトログリセリンの毒性が発現しない条件下では、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液へのジブチリルｃＡＭＰの添加により、肝臓移植後の生存率（生着率）が飛躍的に向上すること、そしてこのジブチリルｃＡＭＰ添加の効果がＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液に特異的であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］トレハロース及びジブチリルｃＡＭＰを含有する、肝臓保存液。
［２］ニトログリセリンの含有量が０．４４ｍＭを下回る、［１］記載の保存液。
［３］ニトログリセリンの含有量が０．００４４ｍＭ以下である、［１］記載の保存液。
［４］ニトログリセリンを実質的に含有しない、［１］記載の保存液。
［５］ジブチリルｃＡＭＰの濃度が０．００５〜１０ｍＭの範囲にある、［１］記載の保存液。
［６］トレハロースの濃度が５０〜２４０ｍＭの範囲にある、［１］記載の保存液。
［７］ヒドロキシエチル澱粉を更に含有する、［１］記載の保存液。
［８］少なくとも下記の成分を下記の範囲内で更に含有する、［１］記載の保存液：
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            １２〜  ６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ。
［９］少なくとも下記の成分を下記の範囲内で含有する、肝臓保存液：
ジブチリルｃＡＭＰ                                  ０．００５〜１０ｍＭ
トレハロース                                            ５０〜２４０ｍＭ
ヒドロキシエチル澱粉                                      １〜８０ｇ／ｌ
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            １２〜  ６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ。
［１０］ニトログリセリンの含有量が０．４４ｍＭを下回る、［９］記載の保存液。
［１１］トレハロース及びジブチリルｃＡＭＰを含有する、腎臓保存液。
本発明の肝臓保存液は以下のような利点を有する。
（１）本発明の肝臓保存液においては、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液中で肝臓を保存する場合に生じるニトログリセリンによる毒性が改善されている。更に、本発明の肝臓保存液のカリウム濃度はＵＷ液等と比較して低い。従って、保存後に肝臓内の保存液をリンゲル液等により置換せずに、血液を再潅流することが可能である。
（２）本発明の肝臓保存液は粘性が低いので、肝臓の冷疎血を開始する段階で最初にリンゲル液などで潅流を始める必要がない。
（３）本発明の肝臓保存液は粘性が低く、且つカリウム濃度が低いので、肝臓の冷疎血を開始する段階における潅流に要する時間が短い。
（４）本発明の肝臓保存液は組成が化学的に安定であり、室温で長期期間保存可能である。
（５）本発明の肝臓保存液は単価が安い。
（６）本保存液は、既存の臓器保存液ＵＷ液等と比して明らかに優れた肝保存能を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、肝臓移植後の７日間生存率を示すグラフである。
図２は、肝細胞傷害又は類洞内皮細胞傷害を反映する各血清生化学マーカーに対する保存液の効果を示すグラフである。
図３は、肝機能に対する保存液の効果を示すグラフである。
図４は、肝臓移植片の組織学的変化に対する保存液の効果を示す写真である。Ａ及びＣ：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ、Ｂ及びＤ：ＵＷ。Ａ  ｖｓ  Ｂ：類洞の鬱血はＢの方がＡよりも著明である。Ｃ  ｖｓ  Ｄ：空胞変性は、Ｄの方が、Ｃ及びＡよりも著明である。
図５は、肝細胞及び類洞内皮細胞の超構造に対する保存液の効果を示す写真である。Ａ及びＢ：肝細胞、Ｃ及びＤ：類洞内皮細胞、Ａ及びＣ：ＵＷ群、Ｂ及びＤ：改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群。
図６は、ＥＴ−Ｋ液又はｄｂ−ｃＡＭＰが添加されたＥＴ−Ｋ液中で保存された肝臓を移植されたラットの累積生存率を示すグラフである（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）。実線はＥＴ−Ｋ群を、点線はＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群をそれぞれ示す。また、白丸はＥＴ−Ｋ群の発生例を、黒丸はＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群の発生例をそれぞれ示す。
図７は、ＵＷ液又はｄｂ−ｃＡＭＰが添加されたＵＷ液中で保存された肝臓を移植されたラットの累積生存率を示すグラフである（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法）。実線はＵＷ群を、点線はＵＷ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群をそれぞれ示す。また、白丸はＵＷ群の発生例を、黒丸はＵＷ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群の発生例をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、トレハロース及びジブチリルｃＡＭＰを含有する、肝臓保存液を提供するものである。
本発明の保存液に用いられるトレハロースにはα，α−トレハロース、α，β−トレハロース及びβ，β−トレハロースの３種が存在するが、好ましくは天然に存在するα，α−トレハロースが用いられる。本発明の保存液中のトレハロースの含有量の範囲は、本発明の保存液の有する肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例えば５０〜２４０ｍＭ、好ましくは１００〜２１０ｍＭ、より好ましくは１００〜１４０ｍＭ、更に好ましくは１１０〜１３０ｍＭ（例えば１２０ｍＭ）である。
本発明の保存液中に含まれるジブチリルｃＡＭＰの含有量の範囲は、本発明の保存液が有する肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例えば０．００５〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜５ｍＭ、より好ましくは０．５〜４ｍＭ、更に好ましくは１．５〜３ｍＭ（例えば２ｍＭ）である。本発明の保存液にジブチリルｃＡＭＰが含まれることにより、肝臓移植後の生存率（生着率）が飛躍的に向上する。
本発明の保存液のニトログリセリン含有量は、好ましくは、０．４４ｍＭを下回る。ニトログリセリンによる毒性を考慮すると、ニトログリセリン含有量は低いほど好ましく、例えば０．４ｍＭ以下、好ましくは０．３ｍＭ以下、より好ましくは０．２ｍＭ以下、更に好ましくは０．１ｍＭ以下（例えば、実質的に０ｍＭ（ニトログリセリンを実質的に含有しない））である。とりわけ、ニトログリセリンの含有量が０．００４４ｍＭ以下では、ニトログリセリンによる毒性がほとんど発現せず、肝臓移植後のレシピエントの生存率が向上するため、好ましい。
本発明の保存液は、該保存液の浸透圧を調節するために、ヒドロキシエチル澱粉（以下、「ＨＥＳ」ともいう）を含有していてもよい。ヒドロキシエチル澱粉は、置換度が０．４〜０．８の範囲のもので、平均分子量２０００００〜９０００００のものが好ましく、更に好ましくは平均分子量３５００００〜８０００００のものである。ヒドロキシエチル澱粉の含有量は、本発明の保存液の肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例えば１〜８０ｇ／ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／ｌ、より好ましくは２５〜３５ｇ／ｌ（例えば３０ｇ／ｌ）である。
本発明の保存液は、該保存液の浸透圧やｐＨを調節するために、種々の電解質を含有してもよい。該電解質としては、有機酸のナトリウム塩若しくはカリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムを例示することが出来る。また有機酸としては、グルコン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、β−ヒドロキシ酪酸及びクエン酸等を例示することが出来る。
本発明の保存液は、電解質として、少なくとも下記の成分を、好適には下記の範囲内で更に含有することが好ましい。
Ｎａ＋は、通常１０〜１４０ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭ、より好ましくは９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）含有される。
Ｋ＋は、通常４〜１４０ｍＭ、好ましくは２０〜１３０ｍＭ、より好ましくは４０〜５０ｍＭ（例えば４４ｍＭ）含有される。
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−は、通常１２〜６５ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭ、より好ましくは２０〜３０ｍＭ（例えば２５ｍＭ）含有される。
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから選ばれる少なくとも１種は各々、通常１５〜１５０ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭ、より好ましくは９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）含有される。
本発明の保存液が含有し得る電解質の好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                              １２〜６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ
本発明の保存液が含有し得る電解質のより好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。
Ｎａ＋                                                  ２０〜１２０ｍＭ
Ｋ＋                                                    ２０〜１３０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                              ２０〜６０ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  ２０〜１２０ｍＭ
本発明の保存液が含有し得る電解質の更に好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。
Ｎａ＋                                ９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）
Ｋ＋                                  ４０〜  ５０ｍＭ（例えば４４ｍＭ）
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−          ２０〜  ３０ｍＭ（例えば２５ｍＭ）
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                ９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）
本発明の保存液は、細胞又は組織が保存中に膨張又は収縮するのを防ぐために、浸透圧が２７０〜４５０ｍＯｓｍ／ｌの範囲にあることが好ましく、２７０〜３８０ｍＯｓｍ／ｌの範囲にあることがより好ましい。また、細胞の酸性分解を防止するために、ｐＨが７〜８の範囲にあることが好ましい。
本発明の保存液の好ましい組成は次の通りである。
ジブチリルｃＡＭＰ                                  ０．００５〜１０ｍＭ
トレハロース                                            ５０〜２４０ｍＭ
ヒドロキシエチル澱粉                                      １〜８０ｇ／ｌ
Ｎａ＋                                                  １０〜１４０ｍＭ
Ｋ＋                                                      ４〜１４０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            １２〜  ６５ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸又は有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  １５〜１５０ｍＭ
本発明の保存液のより好ましい組成は次の通りである。
ジブチリルｃＡＭＰ                                      ０．０５〜５ｍＭ
トレハロース                                          １００〜２１０ｍＭ
ヒドロキシエチル澱粉                                    ２０〜４０ｇ／ｌ
Ｎａ＋                                                  ２０〜１２０ｍＭ
Ｋ＋                                                  ２０〜１３０ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−                            ２０〜  ６０ｍＭ
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                                  ２０〜１２０ｍＭ
本発明の保存液の更に好ましい組成は次の通りである。
ジブチリルｃＡＭＰ                        １．５〜３ｍＭ（例えば２ｍＭ）
トレハロース                          １１０〜１３０ｍＭ（例えば１２０ｍＭ）
ヒドロキシエチル澱粉                    ２５〜３５ｇ／ｌ（例えば３０ｇ／ｌ）
Ｎａ＋                                  ９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）
Ｋ＋                                    ４０〜  ５０ｍＭ（例えば４４ｍＭ）
Ｈ２ＰＯ４−又はＨＰＯ４−−            ２０〜  ３０ｍＭ（例えば２５ｍＭ）
Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３−−、有機酸及び有機酸アニオンから
選ばれる少なくとも１種                ９０〜１１０ｍＭ（例えば１００ｍＭ）
本発明の保存液は、上記以外にも、例えばＭｇ＋＋及び／又はＣａ＋＋を１〜１０ｍＭの範囲で含むことができる。更に、本発明の保存液は他の添加物、例えばＮアセチルシステイン等の活性酸素消去剤、ＡＴＰ等の細胞賦活剤、抗生物質等を含むことが出来る。
本発明の保存液は、自体公知の輸液剤の製造方法に準拠して容易に製造することができる。
本発明の保存液の使用方法については、特に限定はされないが、例えば生体から摘出された肝臓組織中の血液を本発明の保存液で置換し、これを本発明の保存液中に浸漬して、そのまま低温（例えば０〜１０℃、好ましくは１〜６℃）にて保存する。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
〔１〕材料及び方法
（動物）
８週齢の近交系雄Ｌｅｗｉｓラット（ＳＬＣ）が、チップを敷いたケージ中で室温にて、１２時間明暗サイクル下で飼育され、手術前に、標準的な食餌及び水が自由に摂取された。
（保存液）
約５０℃の蒸留水８００ｍｌにα，α−トレハロース４１ｇ（１２０ｍｍｏｌ）、ヒドロキシエチル澱粉（平均分子量４２９０００、置換度０．５５）３０ｇ、グルコン酸ナトリウム２１．８１ｇ（１００ｍｍｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．８８５ｇ（６．５ｍｍｏｌ）、及びリン酸水素二カリウム３．２２２ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）を溶解した後、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌとした。これを直ちに濾過し、ガラス瓶に充填、密栓後、蒸気滅菌して、浸透圧３６６ｍＯｓｍ／ｌ、ｐＨ７．３５のＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液（以下、ＥＴ−Ｋ液）を得た。
上記ＥＴ−Ｋ液に、ｄｂ−ｃＡＭＰ（第一製薬社製）、ニトログリセリン（三菱ウェルファーマ社製）、及びＮアセチルシステインを添加し、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液（以下、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液）を得た。
更に、上記ＥＴ−Ｋ液に、ｄｂ−ｃＡＭＰ（第一製薬社製）を添加し、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液（以下、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液）を得た。
ＵＷ液は藤沢薬品工業株式会社より購入した。
ＥＴ−Ｋ液、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液及び改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液の組成は以下の通りである。
【表１】
0005274017.tif 000002
（実験群）
グループＩ：ＵＷ液群（ｎ＝８）、グループＩＩ：Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液群（ｎ＝６）、グループＩＩＩ：改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液群（ｎ＝８）。各保存液中で肝臓を２４時間冷却保存した後、同種同系肝臓移植が行われた。ラットは、無作為に各群に割り当てられた。
（移植手順）
ＵＷ群においては、最初に１０ｍｌのリンゲル液でドナー肝臓門脈血管内の血液が置換され、引き続き１０ｍｌのＵＷ液により血管内が潅流された。Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群及び改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群においては、ドナー肝臓門脈血管内の血液が直接２０ｍｌの各保存液により置換された。全ての群において保存液の潅流は、１５ｃｍＨ２Ｏの圧力で行われた。次に肝臓移植片がそれぞれの保存液中で４℃にて２４時間保存された。ＵＷ群においては、移植前に、移植片の門脈血管内が最後に１０ｍｌのリンゲル液でリンスされ、ＵＷ液が置換された。Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群及び改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群においては、肝臓は最終リンス無しで移植された。保存後に、肝移植片が、同所的に（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）レシピエントラット中へ移植された。肝上大静脈及び肝下大静脈の両方が、手術用縫合糸により縫合された。門脈はポリエチレン・カフ（微小チューブ）を用いた半自動吻合法により連結された。全ての移植において、麻酔時間は１４分を下回り、大静脈を遮断する時間は２５分を下回った。
（術後評価）
移植後４時間で、移植を施されたレシピエントラットが、ケタミンの腹腔内注入により再麻酔された。胆汁が１５分間に亘り採集され、胆汁排泄速度及び胆汁量が測定された。血液試料が、血清アンモニア、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ（いずれも最も一般的な肝機能評価指標）及びヒアルロン酸（ＨＡ）（肝血管内皮細胞の機能の指標）の測定のために、下大静脈から採取された。最後に、移植片が２０ｍｌのリンゲル液により、１０ｍｌ／分の速度で、門脈経由で潅流された。電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）のための標本は、２０ｍｌの１．４４％グルタルアルデヒド（ＧＬＡ）液により潅流された。残りは、１０％ホルムアルデヒド中に浸漬され、パラフィンワックス中に包埋された。切片を、通常のヘマトキシリン・エオジン染色に処した。ＴＥＭが超構造の変化の解析のために行われた。
〔２〕結果
（生存率）
２４時間保存された肝臓移植片の移植後、７日間生存率は、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において８６％（７／８）であり、ＵＷ群において２５％（２／８）であった。改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において、生存率は有意によかった（フィッシャー正確検定：Ｐ＜０．０５；図１）。Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において７日間生存率は０％（０／６）であり、Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液は７日間生存率を向上させなかった。
以上の結果より、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液を用いれば、ＵＷ液又はＮｅｗ  ＥＴ−Ｋ液を用いた場合と比較して肝臓移植後の生存率が大きく上昇することが示された。また、ニトログリセリンを含有するＮｅｗ  ＥＴ−Ｋ液を用いると、極めて生存率が低いことから、保存液中のニトログリセリンの含有量を減じることにより、肝臓移植後の生存率が大きく上昇することが示された。
（血清生化学）
血清ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＬＤＨ及びＨＡが移植後４時間において測定された。ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＬＤＨレベルにより評価された肝細胞障害は、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において、ＵＷ群のそれよりも有意に低かった（改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ／ＵＷ：ＡＬＴ，５２７±８８／１７２８±３８０  ＩＵ／ｌ，ｐ＜０．０１；ＡＳＴ，６８１±９０／１６５２±２９２  ＩＵ／ｌ，ｐ＜０．０１；ＬＤＨ，１１０５±３５２／４７９６±１０５９  ＩＵ／ｌ，ｐ＜０．０１；図２Ａ、Ｂ及びＣ）。ＨＡレベルは類洞内皮細胞（ＳＥＣ）の傷害を反映した。ＨＡレベルは、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において、ＵＷ群と比較して有意に低かった（１９８８±７９１／２８０９±６７３ｎｇ／ｍｌ，ｐ＜０．０５；図２Ｄ）。
以上の結果から、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液はＵＷ液と比較して、肝細胞及び類洞内皮細胞の保存効果が優れていることが示された。
（血液アンモニア及び胆汁産生）
アンモニア及び胆汁排泄が肝機能の指標として評価された。この時点においてアンモニアについては、２群間で有意差はなかったが（２５５±２０／２５２±２２μｇ／ｄｌ，ｐ＞０．０５；図３Ａ）、胆汁排泄は改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において有意に高かった（改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ／ＵＷ：７０２±１２５／４８９±１０８μｌ／ｋｇ／ｍｉｎ，ｐ＜０．０５；図３Ｂ）。
以上の結果から、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液はＵＷ液と比較して、肝機能の維持効果が高いことが示された。
（ＨＥ染色）
組織学的には、ＵＷ液中で保存された肝臓移植片は、ＥＴ−Ｋ液中でのそれよりも、より再潅流障害を受けやすかった。ＵＷ群と比較して、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群において、空胞変性（ｖａｃｕｏｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、類洞鬱血（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）及び出血が少なかった（図４）。
以上の結果から、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液はＵＷ液と比較して、より強力に肝臓を再潅流障害から保護することが示された。
（電子顕微鏡所見）
ＳＥＣ及び肝細胞の形態学的変化の更なる評価のために、移植４時間後における、２４時間保存された肝臓移植片の超構造を解析するためＴＥＭが行われた。ＵＷ群においては、肝細胞の細胞死、すなわちアポトーシス性変化（核濃縮（ｐｙｋｎｏｓｉｓ）、エネルギー代謝に関係するミトコンドリア浮腫及び空胞変性）が、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群におけるそれよりも、頻繁に認められた（図５Ａ、Ｂ）。更に、ＵＷ群においては、幾つかのＳＥＣは、脱離、不連続性、水疱形成、核凝集及びアポトーシス小体などのアポトーシスの特徴を示した（図５Ｃ）。一方、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ群においては、そのような変化は穏やかであり、ＳＥＣはしばしばよく保存されていた（図５Ｄ）。
以上の結果から、改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液は、肝細胞及びＳＥＣの超構造を維持する作用に優れていることが示された。
［実施例２］
〔１〕材料及び方法
実施例１と同様に、８週齢の近交系雄Ｌｅｗｉｓラット（ＳＬＣ）を用た同種同系肝臓移植を行い、種々の濃度のニトログリセリン（ＮＴＧ）を含む保存液を用いて保存された肝臓を移植した後の生存率が評価された。
試験に使用された保存液は以下の通りである：
・ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）＋１／４ＮＴＧ（０．１１ｍＭ）
・ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）＋１／８ＮＴＧ（０．０５５ｍＭ）
・ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）＋１／１００ＮＴＧ（０．００４４ｍＭ）
・ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）（コントロール：改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液）
肝臓移植の条件は保存液の種類が異なることを除き、実施例１と同一である。
〔２〕結果
結果を表２に示す。
【表２】
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肝臓移植後の７日間生存率は、コントロール（改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ）群において６６％（２／３）であった。ニトログリセリン含有量をＮｅｗ  ＥＴ−Ｋ液の１／８〜１／４倍量（０．０５５〜０．１１ｍＭ）にまで減じても、７日間生存率は０％であり、この濃度範囲においては、ニトログリセリンによる毒性が十分には改善されていないことが示唆された。一方、ニトログリセリン含有量をＮｅｗ  ＥＴ−Ｋ液の１／１００倍量（０．００４４ｍＭ）にまで減じると、７日間生存率は５０％（１／２）となり、コントロール群とほぼ同等であった。従って、ニトログリセリンの含有量が０．００４４ｍＭ以下であれば、ニトログリセリンによる毒性がほとんど発現せず、肝臓移植後のレシピエントの生存率が向上することが示された。
［実施例３］
〔１〕材料及び方法
実施例１と同様に、８週齢の近交系雄Ｌｅｗｉｓラット（ＳＬＣ）を用いた同種同系肝臓移植を行い、ＥＴ−Ｋ液へのｄｂ−ｃＡＭＰ添加による肝臓移植後生存率の上昇が、他の保存液でも観察されるか否か調べた。
試験に使用された保存液は以下の通りである：
・ＥＴ−Ｋ
・ＵＷ
・ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）（改変Ｎｅｗ  ＥＴ−Ｋ液）
・ＵＷ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ（２ｍＭ）
肝臓移植の条件は保存液の種類が異なることを除き、実施例１と同一である。
〔２〕結果
肝臓移植後の７日間生存率は、ＥＴ−Ｋ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群では８６％（７／８）、ＥＴ−Ｋ群では０％（０／１０）であり、ｄｂ−ｃＡＭＰの添加により生存率が顕著に上昇した（図６）。
一方、ＵＷ＋ｄｂ−ｃＡＭＰ群では３８％（３／８）、ＵＷ群では２５％（２／８）であり、ｄｂ−ｃＡＭＰの添加によりわずかに生存率は上昇したものの、ＥＴ−Ｋ液で観察されたような顕著な効果は認められなかった（図７）。
従って、ｄｂ−ｃＡＭＰの添加による移植後生存率の著しい上昇は、ＥＴ−Ｋ液に特異的な効果であることが示唆された。
また、ｄｂ−ｃＡＭＰを添加したＥＴ−Ｋ液の優れた臓器保存効果が、肝臓と同様に腎臓においても確認されたことから、上記本発明の保存液は、腎臓の保存にも有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の肝臓保存液は、優れた肝保存能を有しており、移植医療の分野において有用である。
本出願は日本で出願された特願２００５−２９９３１４（出願日：２００５年１０月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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