(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号Ｂ−３０１４５を有するＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株；および
受託番号Ｂ−３０１４５を有するＮＲＲＬに寄託された該株の変異体であって、植物病原性真菌に対して抗真菌活性を有する変異体、から選択される、単離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株。
【請求項２】
受託番号Ｂ−３０１４５を有するＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株である、請求項１に記載の単離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株によって産生される代謝産物であって、植物病原性真菌に対する活性を示し、約２１５ｎｍ〜約２２０ｎｍのＵＶ吸収を示す、代謝産物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株によって産生される代謝産物であって、
（ａ）請求項１または２に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株の全ブロス培養物を非イオン性吸着ポリマー樹脂にローディングする工程；
（ｂ）アルコールで代謝産物を溶出する工程；
（ｃ）抗真菌活性を示す溶出液の画分についてのバイオアッセイを用いて工程（ｂ）の溶出液をスクリーニングする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の抗真菌活性を示す溶出液の画分をＨＰＬＣカラムにローディングする工程；および
（ｅ）有機溶媒でこの代謝産物を溶出する工程
を含む方法によって、得られる代謝産物。
【請求項５】
熱安定性および塩基安定性であり、酸不安定性であり、そして約１０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３又は４に記載の代謝産物。
【請求項６】
約８６５ダルトン〜約９２５ダルトンの分子量［Ｍ＋Ｈ＋］を有する、請求項３又は４に記載の代謝産物。
【請求項７】
前記分子量［Ｍ＋Ｈ＋］が、約８６６．５ダルトン、約８８２．５ダルトン、約８９８．４ダルトン、約８９２．５ダルトン、約９０８．５ダルトンおよび約９２４．５ダルトンからなる群より選択される、請求項６に記載の代謝産物。
【請求項８】
熱安定性および塩基安定性であり、そして酸不安定性である、請求項３又は４に記載の代謝産物。
【請求項９】
請求項３〜８のうちのいずれか１項に記載の代謝産物であって、該代謝産物は、酸素化メチン炭素および糖部分からなる群より選択される１以上の化学的部分を含む、代謝産物。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の単離株および
キャリアを含有する、組成物。
【請求項１１】
請求項３〜９のうちのいずれか１項に記載の代謝産物および
キャリアを含有する、組成物。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の単離株の全ブロス培養物を含有する、組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の全ブロス培養物から分離された上清を含有する、組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの化学的農薬または生物学的農薬をさらに含有する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物は、水和剤、顆粒処方物、水性懸濁物、乳剤濃縮物およびマイクロカプセル化処方物からなる群よりより選択される処方物として処方された、組成物。
【請求項１６】
植物、果実または根を、真菌感染から予防または処置するための方法であって、該方法は、
請求項１もしくは２に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株、請求項３〜９のうちのいずれか１項に記載の代謝産物または請求項１０〜１５のうちのいずれか１項に記載の組成物の有効量を、該植物、果実または根に適用する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記真菌感染が、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐ．およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐ．からなる群より選択される真菌によって引き起こされる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バイオ農薬の分野にある。
【０００２】
（発明の背景）
長年にわたり、種々の微生物が植物の病害を制御するために有用であるような生物学的活性を示すことが知られてきた。耕種学および園芸学において重要な種々の植物の病害を制御するための生物学的農薬を同定および開発する分野において進展が見られているが、使用されている農薬のほとんどは、なお、合成化合物である。これらの化学的抗真菌剤の多くは、ＥＰＡによって発癌物質と分類されており、そして野生生物および他の標的としてない種にとって毒性である。さらに、病原体は、化学的農薬に対して耐性を生じ得る（Ｓｃｈｗｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０００３】
生物学的な制御は、合成化学的抗真菌剤に対する魅力的な代替策を提供する。バイオ農薬（生存する生物およびこれらの生物によって天然に産生される化合物）は、より安全であり得、より生分解性であり得、かつ開発費用がそれほど高価でなくあり得る。
【０００４】
ストレプトミセス属を含む放線菌類は、抗真菌剤代謝産物の生産体であることが知られている（Ｌｅｃｈａｖａｌｉｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｋｓｍａｎ，１９６２；Ｌｅｃｈａｖａｌｉｅｒ，１９８８）。いくつかの放線菌産生抗生物質（たとえば、ストレプトマイシンおよびテラマイシン）は、農業の状況において火傷病の制御のために慣用的に使用されている。
【０００５】
ストレプトミセス属は、植物病原体に対して、インビトロおよびインビボの両方での活性を示してきた。Ａｘｅｌｒｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）は、Ｄｏｕｇｌａｓ−ｆｉｒの根から２９８種類の放線菌を分離した。これらの株の約３０％は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎおよび／またはＰｙｔｈｉｕｍに対して、インビトロで抗真菌活性を示した。Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｃｒａｗｆｏｒｄ（１９９５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｄｉｃｕｓ  ＷＹＥＣ  １０８がマメまたは綿の種子でのポット試験において、強力なインビトロ抗真菌活性およびＰｙｔｈｉｕｍの根の腐敗の阻害の両方を示したことを報告した。Ｒｅｄｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｏ（１９７１）は、トマトにおいてＰｙｔｈｉｕｍ立ち枯れ病およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓでの綿のＦｕｓａｒｉｕｍ萎凋病を制御した。Ｒｈｏｚｏｃｔｏｎｉａの根の腐敗は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｖａｒ．ｇｅｌｄａｎｕｓによって制御された（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，１９８４）。これらの著者は、その制御がこの株によって産生されたインサイチュでのゲルダナマイシン濃度に依存すると報告した。同じ著者はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｅｒｂａｒｉｃｏｌｏｒおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｒｕｌｅｏｆｕｓｃｕｓによる、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ  ｖａｒ．ｓｏｊａｅからのダイズの保護を観察した（１９８４）。Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ａｎｄ  Ｃｒａｗｆｏｒｄ（１９９９）は、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ株ＹＣＥＤ９による芝生の真菌病原体のインビトロおよびインビボでの拮抗作用を観察した。Ｃｒａｗｆｏｒｄ（１９９６）は、米国特許第５，５２７，５２６号において、植物病原体を制御するためのこの株の使用を特許化した。Ｓｕｈ（１９９８）は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉに対して活性である２つのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．を特許化した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．および他の土壌病原体に対する産物は、ＭｙｃｏｓｔｏｐＴＭとして上市されている。
【０００６】
（発明の要旨）
ある特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示す新規抗生物質産生Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．が、提供される。ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の同定特性をすべて有する抗生物質産生Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の有効量を適用することを含む、真菌感染からの植物の処置または保護の方法もまた提供される。本発明はまた、この新規Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株ならびにこの株によって産生される抗生物質および代謝産物を単独または他の化学的または生物学的農薬と組み合わせてのいずれかで含む抗真菌組成物に関する。
【０００７】
抗生物質産生Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．は、全ブロス培養物中の懸濁液として、または抗生物質産生Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ  ｓｐ．の全ブロス培養物から得られる抗生物質含有上清として提供され得る。特定の抗真菌活性を示す新規ブタノール可溶性抗生物質およびこの新規ブタノール可溶性抗生物質を単離するためのプロセスもまた提供される。
【０００８】
（詳細な説明）
本発明は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ，Ｂｏｔｒｙｔｉｓ，ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａのような特定の植物病原体に対してのみの抗真菌活性を伴う、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の新規株またはその改変体を提供する。この新規株は、ＮＲＲＬにより１９９９年７月２０日に、受託番号Ｂ−３０１４５号として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとで寄託された。本発明はまた、このような細菌株またはそのような細菌株から得られた抗生物質含有上清もしくは純粋な抗生物質を用いた、植物における真菌病害を予防および処置する方法を包含する。本発明はまた、塩基および８０℃で１時間での熱処理に対して安定性を有し、酸処理に対して不安定性を有する、１０，０００ダルトン未満の分子量を有するブタノール可溶性抗真菌抗生物質を包含する。
【０００９】
（定義）
単数形の形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうではないと記述しない限り、複数形表示をも包含する。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞（その混合物を含む）を包含する。
【００１０】
用語「含む」（包含する、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）とは、その組成物および方法が言及される要素を含むが、他のものを排除しないと意味することが意図される。「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、組成物および方法を定義するために用いられるとき、その組み合わせに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書において規定される要素から本質的になる組成物は、その単離および精製方法からの微量混合物および農学的に受容可能なキャリアを排除しない。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、本発明の組成物に適用することについて、他の成分の微量要素および実質的な方法工程を超えるものを排除することを意味する。これらの接続用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００１１】
本明細書において使用される「生物学的制御」は、第二の生物の使用による、病原体または昆虫の制御と定義される。生物学的制御の公知機構としては、根の表面における空間について、競合して出る（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）真菌による根の腐敗を制御する腸内細菌を包含する。細菌毒素（例えば、抗生物質）は、病原体を制御するために用いられている。この毒素が単離され得、そしてその植物に直接適用され得るか、またはその細菌種がその毒素をインサイチュで生産するように投与され得る。
【００１２】
用語「真菌」は、クロロフィルを欠いている広範な有核の胞子保有生物を含む。真菌の例としては、酵母、カビ、サビ菌類およびキノコが挙げられる。
【００１３】
用語「細菌」は、明瞭な核を有さない任意の原核生物をいう。
【００１４】
「農薬の」は、植物害虫の死亡率を増加するかまたは増殖速度を阻害する物質の能力を意味する。
【００１５】
「殺真菌性の」は、真菌の死亡率を増加するかまたは増殖速度を阻害する物質の能力を意味する。
【００１６】
「抗生物質」は、微生物を殺し得るかまたは阻害し得る任意の物質を含む。抗生物質は、微生物によってか、または合成プロセスもしくは半合成プロセスによって生成され得る。従って、この用語は、真菌を阻害するかまたは殺す物質（例えば、シクロへキサミドまたはナイスタチン）を含む。
【００１７】
「抗真菌性の」は、真菌を殺すかまたは真菌の増殖を阻害する任意の物質を含む。
【００１８】
用語「培養する（こと）」は、種々の種類の培地上または培地中の微生物の増殖をいう。「全ブロス培養物」は、細胞および培地を含む液体培養物をいう。「上清」は、ブロス中で増殖された細胞が、遠心分離、ろ過、沈降、または当該分野で周知の他の手段によって除去される場合に残った液体ブロスをいう。
【００１９】
「有効量」は、有益な結果または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。処置および保護の点では、「有効量」は、真菌または細菌の病害状態の進行を軽減、安定化、逆転、減速または遅延させるのに十分な量である。
【００２０】
「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られている化合物を意味する。「ポジティブコントロール」としては、市販の化学的農薬を含むがこれらに限定されない。用語「ネガティブコントロール」は、農薬活性を有さないことが知られている化合物を意味する。ネガティブコントロールの例は、水または酢酸エチルである。
【００２１】
用語「溶媒」は、溶液中の別の物質を保持する任意の液体を含む。「溶媒抽出可能な」は、溶媒中に溶解し得、そして溶媒から単離され得る任意の化合物をいう。溶媒の例としては、酢酸エチルのような有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
用語「代謝産物」は、農薬活性を有する微生物の発酵の任意の化合物、物質または副産物をいう。上に定義された抗生物質は、微生物に対して代謝産物特異的に活性である。
【００２３】
用語「変異体」は、親株の改変体ならびに殺菌剤活性が親株によって発現されるよりも大きい変異体または改変体を得るための方法をいう。「親株」は、変異誘発の前の本来のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株として本明細書中に定義される。このような変異体を得るために、親株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホンのような化学薬品で、またはγ照射、ｘ線照射、もしくはＵＶ照射を使用する照射によって、または当業者に周知の他の手段によって、処理され得る。
【００２４】
「組成物」は、活性薬剤および別の化合物、キャリアまたは組成物、不活性（例えば、検出剤または標識もしくは液体キャリア）または活性（例えば、アジュバント）の組み合わせを意味する。農業用キャリアの例は、以下に提供される。
【００２５】
本発明者らは、特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の新規な抗生物質生成株ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５およびその変異体を記載する。培養物から単離された上清ならびに培養物を含む組成物がまた提供される。さらなる局面において、組成物は、少なくとも１つの化学的または生物学的な農薬をさらに含む。
【００２６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株によって生成された代謝産物はまた、本発明によって提供される。この代謝産物は、植物病原性真菌に対する活性を示し、熱安定性および塩基安定性であり、酸に不安定であり、そして１０，０００ダルトン未満の分子量を有する。例として、この代謝産物は、約９２５〜約８６５の間の分子量［Ｍ＋Ｈ＋］を有し得る。
【００２７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株によって生成される１つ以上の代謝産物は、約２１５ｎｍと２００ｎｍとの間でＵＶ吸収を示す。この代謝産物は、プロパルギルアルコールセグメント［Ｃ＝Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）］、酸素化メチン炭素（Ｘ−ＣＨ−Ｙ）または糖部分を含むがこれらに限定されない種々の分子から構成され得る。例として、この代謝産物は、少なくとも２つのプロパルギルセグメント、いくつかの酸素化メチン炭素（例として、例えば、５〜１０）および／または糖部分を含み得る。あるいは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株によって生成される１つ以上の代謝産物は、同じ炭素骨格を共有し得、そして酸素化の程度で異なり得る。
【００２８】
本発明はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによって生成され、以下を包含する方法に従って単離される代謝産物を含む抗真菌性組成物を提供する：
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の同定特徴の全てを有する、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５またはその変異体の全ブロス培養物を非イオン性吸着ポリマー樹脂にローディングする工程；
（ｂ）アルコールで代謝産物を溶出する工程；
（ｃ）抗真菌活性を示す溶出液の画分についてのバイオアッセイを用いて工程（ｂ）の溶出液をスクリーニングする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の抗真菌活性を示す溶出液の画分をＨＰＬＣカラムにローディングする工程；および
（ｅ）有機溶媒でこの代謝産物を溶出する工程。
【００２９】
この方法は、工程（ｂ）の前に樹脂を水で洗浄する工程、および工程（ｅ）の溶出液をバイオアッセイを用いてスクリーニングして、抗真菌活性を示す画分を選択する工程、をさらに包含する。
【００３０】
工程（ａ）の全ブロス培養物は、非イオン性吸着ポリマー樹脂への添加の前に、凍結乾燥され得、そして水溶液（例えば、水）で再懸濁され得る。好ましい実施形態において、樹脂に添加される全ブロス培養物は、ホモジナイズされた無細胞全ブロス培養物である。使用され得る非イオン性吸着ポリマー樹脂の例としては、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｅｐａｂｅａｄ  ＳＰ−２０７またはＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉａｓｏｎ  ＨＰ−２０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
工程（ｂ）における代謝産物を除去するために使用される溶出液は、アルコールまたは水性アルコールの勾配であり得る。例として、メタノールまたは水性メタノールの勾配は、溶出液として使用され得る（例えば、実施例６）。
【００３２】
工程（ｃ）のバイオアッセイは、抗真菌活性を評価する任意のアッセイであり得る。このようなバイオアッセイの例としては、寒天拡散アッセイまたはスライド発芽アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、バイオアッセイは、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａおよび／またはＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを用いる発芽アッセイであり得る。
【００３３】
工程（ｄ）で使用され得るＨＰＬＣカラムの例としては、Ｃ−１８またはＣ−８が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＰＬＣカラムから代謝産物を取り出すために使用され得る有機溶媒の例としては、アセトニトリル−水勾配が挙げられるが、これに限定されない（例えば、実施例６）。
【００３４】
代謝産物はまた、キャリアと共にか、あるいは少なくとも１つの化学的または生物学的な農薬と共に、組成物として処方され得る。
【００３５】
本発明内で、組成物の良好な分散および吸着を達成するために、分散および吸着を補助する成分と共に、全ブロス培養物、上清および／または代謝産物／抗生物質を処方することが有利であり得る。適切な処方物（可溶性になった粉末、顆粒などであり、これらは、適切な培地など（流動可能な水溶液および水性懸濁液、および乳化可能な濃縮物のような液体）の中でマイクロカプセル化され得る）が、当業者に公知である。他の適切な処方物は、当業者に公知である。
【００３６】
株、培養物、上清および単離された代謝産物は、有効量の活性処方物を植物、果実または根に適用することによって、真菌感染から植物、果実、および根を保護または処置するのに有用である。この処方物は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐ．およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐ．からなる群より選択される真菌によって引き起こされる感染を処置または予防するのに特に適している。
【００３７】
本明細書中に引用される全ての特許および刊行物は、参考として援用される。これらについての完全な引用文献の列挙は、図面の簡単な説明の直前の明細書の終わりに見出され得る。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。これらの実施例は、限定することを意図されない。
【００３９】
（実施例）
（実施例１）
（株ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の特徴付け）
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定に基づいて同定した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子データ配列を作成するために使用したプロトコル（Ａｃｃｕｌａｂ  Ｃｕｓｔｏｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｖ．１．０）を、以下のように記載する。
【００４０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、細菌コロニーから単離されゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅のために使用したプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ位置００５および５３１に対応する。増幅産物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００（Ａｍｉｃｏｎ）分子量カットオフ膜を使用して、過剰のプライマーおよびｄＮＴＰから精製し、そしてアガロースゲル上で産物の一部を電気泳動することによって、質および量についてチェックする。
【００４１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物のサイクル配列決定を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ染色ターミネーターを使用して実施する。過剰の色素標識ターミネーターを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを使用して、配列決定反応から除去する。この産物を遠心分離によって回収し、減圧下で乾燥し、ローディングの準備ができるまで−２０℃で凍結する。サンプルを、ホルムアミド／ブルーデキストラン／ＥＤＴＡの溶液中で再懸濁し、そしてローディングの前に変性する。サンプルを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシーケンサーで電気泳動する。データを、ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ  ＤＮＡ編集およびアセンブリソフトウェアを使用して分析する。一旦得られると、配列を、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ配列分析ソフトウェアを使用して、ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ  ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭデータベースに対して比較する。配列をまた、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）に対して比較する。
【００４２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定の結果は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．としてＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５を同定した。この株は、配列決定結果によって示唆されるように、Ｓ．ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ種（以前はＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｓｈｕｅｎｓｅ）または関連した種に属し得る。最高の一致は、９８％一致スコアを有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓであった。
【００４３】
（実施例２：インビトロ培養（ゾーンアッセイ）における植物病原体に対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性）
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５を、２つの異なるインビトロアッセイを利用して、一連の異なる植物病原体に対して試験した。寒天拡散（ゾーン）アッセイは、寒天培地の表面にいずれかの植物病原体芽胞を塗布して、増殖が完全にない部分（ｅｎｔｉｒｅ  ｌａｗｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ）を生成する工程、またはペトリ皿（ここで増殖し、寒天にコロニー形成する）の中心に配置した菌糸体の寒天プラグを利用する工程からなる。吸引ポンプに取り付けたピペットを用いて、直径約７．０ｍｍの円形状に寒天を取り除いた。ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の醗酵サンプルを、既知の標準物チェックおよび水チェックとともに各穴に添加する。プレートを、各病原体の助けとなる環境条件下で３〜４日間インキュベートする。結果は、穴の周りの病原体増殖のないゾーンまたは穴の周りの病原体増殖の量が非常に減少したゾーン、または影響なしからなる。ゾーンのサイズおよび型を各サンプルについて記録する。ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の寒天拡散アッセイにおける結果を表１に示す。寒天拡散における結果は、変動性であった；寒天の中を通る拡散は、阻害され得る。
【００４４】
（表１：寒天拡散（ゾーン）アッセイにおける選択された植物病原体に対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性）
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ    ゾーンなし／弱い活性
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ                  弱い活性
Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ          ゾーンなし
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ          中程度の活性
Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．                            弱い活性
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ    ゾーンなし
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ              ゾーンなし
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  ゾーンなし。
【００４５】
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の病原体スペクトルを試験するために行ったインビトロアッセイの第２の型は、スライド発芽アッセイであった。種々の希釈度のＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の醗酵サンプルを、ガラスの凹型スライド（直径１８ｍｍ、深さ１．７５ｍｍのくぼみ付きの２５ｍｍ×７５ｍｍ）に添加し、等量の病原体芽胞をサンプルと混合した。スライドを、密閉したプラスチック箱の中で、湿らせた紙タオルの上で一晩室温にてインキュベートした。結果を、複合顕微鏡を用いて１００倍で、醗酵サンプル／芽胞懸濁サンプルを観察することにより決定する。代表的な結果は、病原体の芽の発芽の欠除、または非常に減少した発芽および／もしくは増殖からなる。さらに、病原体芽胞からの最初の増殖の種々の型の異常が生じ得る。ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性のスペクトルを表２に示す。芽胞発芽の完全な阻害が、低濃度の醗酵サンプルで生じた。
【００４６】
（表２：スライド発芽アッセイにおける選択された植物病原体に対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性）
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ    発芽なし
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｄａｕｃｉ                  発芽なし
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ                  発芽なし
Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ          発芽なし。
【００４７】
（実施例３：植物バイオアッセイ試験における植物病原体に対するＮＲＲＬの活性）
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性を、トマト葉枯れ病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、トマトべと病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、灰色カビ病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、芝生  ｂｒｏｗｎ  ｐａｔｃｈ病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、および落花生白絹病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｍｉｎｏｒ）に対して試験した。全ての試験を、代表的な企業規模の温室条件下で種子から生長した植物材料を用いて、実験室において制御された環境下で行った。
【００４８】
（トマト葉枯れ病−Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）
この病原体を、遮光して、１６℃にて標準的ペトリ皿においてライ麦寒天上で増殖させる。胞子嚢を、水をプレートからあふれさせ、菌糸体を掻き取って胞子嚢を除くことにより回収する。胞子嚢懸濁液をチーズクロスに通し、定量し、１．０×１０４に調節する。美術用エアブラシを用いて４０ｐｓｉでＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の醗酵サンプルを、流出するように、３葉期から５葉期におけるトマト実生に噴霧する。処理した実生を室温で少なくとも２時間風乾し、次いで、携帯型噴霧器を用いてこのトマト実生の上表面に軽く噴霧することにより、胞子嚢懸濁液を接種する。接種した実生を、水を満たしたソリッドボトム平箱に配置し、次いで、葉の湿気を維持するためにプラスチックドームで覆う。平箱を、プラスチックドームで覆ったまま連続して４日間、１４時間の光周期の下で２０℃にてインキュベートする。次いで、実生を、０〜５までの病害等級付け尺度（０は症状なし、そして５は、７５％以上の葉に病原体がコロニー形成した）に基づいて、等級付けする。葉枯れ病試験の代表的な例を、表３に示す。
【００４９】
（表３：葉枯れ病病原体Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５で処理したトマト実生の結果）
【００５０】
【表１】
0005148802.tif 000002
サンプルは、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の異なる醗酵物である。
Ｄ．Ｉ．は、病害指数である。
【００５１】
（トマトべと病−Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）
この病原体を、まず、プレート全体が覆われるまで、１４時間の光の下で２２〜２５℃にて、市販のＤｉｆｃｏ  ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）上で増殖させる。次いで、真菌および寒天培地を約１０ｍｍ２の小さな正方形に切り、真菌の面を上にして特殊な胞子形成培地（Ｓ培地：１リットルあたり、２０ｇ  スクロース、２０ｇ  炭酸カルシウム、２０ｇ  Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）に置いた。このＳ培地プレートに薄い水の層を張って、病原体の完全な胞子形成が生じるまで１４時間の光の下で２２〜２５℃にて２〜３日インキュベートする。次いで、プレートから水をあふれさせ、正方形状の寒天をプレートから掻き取る。懸濁液をチーズクロスに通し、芽胞を定量し、１．０×１０５に調節する。次いで、先に記載のように、美術用エアブラシを用いて、流出するまで、３葉期から５葉期に、トマト実生に噴霧する。処理した実生を乾燥させ、次いで、胞子嚢懸濁液を接種する。実生を、先に記載したように平箱に配置し、覆い、１４時間の光周期の下で２５℃にてインキュベートする。実生を、先に記載のように、０〜５までの尺度に基づいて等級付けする。代表的試験の結果を、表４に示す。
【００５２】
（表４．べと病病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉに対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性）
【００５３】
【表２】
0005148802.tif 000003
Ｄ．Ｉ．は病害指数である。
【００５４】
（コショウ灰色カビ病−Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）
この病原体を、真菌増殖によりプレートが完全に覆われるまで（７〜９日間）、２２℃にて１４時間の光周期の下で標準的ＰＤＡ上で増殖させる。芽胞を、プレートから水をあふれさせ、次いで、スパチュラで穏やかに掻き取って芽胞を除くことにより回収する。この芽胞懸濁液をチーズクロスに通し、定量し、１．５×１０６に調節する。コショウ実生を、４葉期から６葉期まで生長させ、醗酵サンプルを、先に記載のように、美術用エアブラシを用いて葉の上面に噴霧する。処理した実生に接種し、平箱に配置し、プラスチックドームで覆う。平箱を２．５日間遮光して２０℃に置く。実生を、先に記載のように、０〜５までの尺度に対して等級付けする。表５は、２回の代表的試験の結果を示す。
【００５５】
（表５．Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａに対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性）
【００５６】
【表３】
0005148802.tif 000004
Ｄ．Ｉ．は病害指数である。
【００５７】
（芝生  ｂｒｏｗｎ  ｐａｔｃｈ−Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）
２ｍｌの醗酵サンプルを、１ヶ月齢の芝生実生（コヌカグサ）の６セルポットの各セルに添加した。Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．の２〜３日齢培養物の４ｍｍの菌糸体プラグを土壌表面に置いた。各処理を６回反復した。接種したポットをプラスチック平箱に置き、プラスチックドームで覆った。この平箱を光の棚（ｌｉｇｈｔ  ｒａｃｋ）に置き（１６時間／日）、室温でインキュベートした。病害の重篤度を、接種して５〜６日後に評価し、水処理コントロールと比較した。この結果は、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５がＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａに対して抑制活性を有することを示した（表６）。
【００５８】
（表６．Ｒｈｉｚｏｃｔｉｎｉａ  ｓｐ．によって生じる芝生病に対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の効力）
【００５９】
【表４】
0005148802.tif 000005
＊「＋」＝軽度の症状、「＋＋＋」＝重度の症状。
【００６０】
（ピーナッツ白絹病（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｉｇｈｔ）−Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｍｉｎｏｒ）
最初の２葉段階のピーナッツ実生を、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５で処理し、そして４ｍｍの菌糸体プラグを、その処理した植物を乾かした後に、各茎の基部に配置する。播種された植物を、結露チャンバ中で２日間インキュベートし、その後、カバードームで封をしたプラスチックフラット中に配置した。このフラットを、室温にて１０日間、光ラック（１６Ｈｒ／日）上でインキュベートした。病害の重篤度を、水で処理したコントロールと比較して評価した。結果（表７）は、１×でのＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５全ブロスが、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｍｉｎｏｒに対するいくらかの制御活性を有することを示した。
【００６１】
（表７．ピーナッツ白絹病に対するＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の効力）
【００６２】
【表５】
0005148802.tif 000006
＊「＋／−」は、強い抑制を示し、０は、感染を示さず、「＋」＝軽度の症状であり、「＋＋＋」＝重度の症状である。
【００６３】
（実施例５）
（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５によって生成される抗真菌代謝産物）
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の全ブロスを、酢酸エチル画分、ブタノール画分および水画分に分画した。各画分を、胞子発芽アッセイにおいて、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａに対して試験した。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ胞子を、各サンプル中の存在下で、４０μｌのサンプルおよび２０μｌの病原胞子を含有する凹型顕微鏡スライドにおいて発芽させた。約１６時間後、胞子を顕微鏡下で観察し、それらが発芽したか否かを確認する。水コントロール（１００％の発芽および増殖＝スコア５）と比較して発芽がないこと（スコア０）が、その試験したサンプルの活性を示す。種々のＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５画分でのＡｌｔｅｒｎａｒｉａ発芽アッセイの結果を、以下に示す（上記の０〜５評点でのスコア）。
【００６４】
【表６】
0005148802.tif 000007
この代謝産物は、ブタノール可溶性画分において明らかであり、そして酢酸エチル中には容易に抽出され得ない。この代謝産物の他の特徴を決定した。この分子は、１０，０００分子量カットオフのフィルターを通過することが示され、これは、この代謝産物が、１０，０００ダルトン未満であることを示す。この活性は、塩基で処理した場合にも、８０℃にて１時間加熱した場合にも失われなかった。この活性は、酸で処理した場合に失われた（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａに対するスコアが、０〜５に増加した）。
【００６５】
０．０１％  トルフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル（ＡＣＮ）／水勾配を使用する、オクタデシルシラン結合化シリカゲル（ＯＤＳ）フラッシュクロマトグラフィーでのこのブタノール抽出物の分画により、０．０１％  ＴＦＡを含む５０％  アセトニトリル／水で溶出する活性画分を得た。画分を、活性について、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ発芽アッセイ（０〜５評点スケール）において試験した。
【００６６】
【表７】
0005148802.tif 000008
ＯＤＳ  ＨＰＬＣによるさらなる精製によって、０．０２％  ＴＦＡを含む３１％  アセトニトリル／水での無勾配溶出から、２つの活性成分（画分６および７）が得られた。
【００６７】
【表８】
0005148802.tif 000009
０．０１％  ＴＦＡを含む５０％  アセトニトリル／水でのフラッシュクロマトグラフィーによる活性画分のＨＰＬＣクロマトグラムならびに活性画分６および７のＨＰＬＣクロマトグラム（活性素因のＵＶスペクトルを含む）を、図１および２に示す。
【００６８】
ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５は、１６Ｓ  ＲＮＡ配列決定によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓに最も近縁に適合した。Ｓ．ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓに一般的に関連する抗細菌代謝産物とは異なり、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の抗真菌活性は、ブタノールで抽出可能であった。Ｓ．ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓは、ストレプトマイシンを生成することが公知であり、ストレプトマイシンは、水溶性の抗細菌化合物である。Ｓ．ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓによって生成される別の抗生物質であるモナゾマイシン（Ａｋａｓａｋｉら、１９６３）は、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の抗真菌活性画分が示すような、２１５〜２２０ｎｍでのショルダーを示さない。
【００６９】
抗真菌化合物はまた、近縁のおそらく同種のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に見出された。これらには、ポリフィロマイシン（Ｃｌａｒｉｄｇｅら、１９８６）（これは、紫色の化合物であり、その対応するＵＶスペクトルは、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性画分に見られない）、ならびにＨｅｐｔａｅｎｅｓトリコマイシン（ＫｏｍｏｒｉおよびＭｏｒｉｍｏｔｏ、１９８９）およびグリセオカルニン（Ｃａｍｐｏｓら、１９７４）（これらの対応するＵＶスペクトルもまた、活性画分に存在しない）が挙げられる。この殺真菌活性は、ニュートラマイシン（酢酸エチルで抽出可能である）（ＭｉｔｓｃｈｅｒおよびＫｕｎｓｔｍａｎｎ、１９６９）にも存在しない。
【００７０】
（実施例６）
（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の抗真菌代謝産物のさらなる精製のためのさらなる方法）
（方法Ａ）
凍結乾燥した全ブロス培養物を、水（２．０Ｌ）に再懸濁し、そして水で平衡化した非イオン性ポリマー樹脂を含むカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｅｐａｂｅａｄ  ＳＰ−２０７；２６×３．０ｃｍ）にロードした。カラムを水（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで、以下のような水性メタノールの勾配で洗浄した：（１）２０：８０  メタノール／水（２００ｍＬ）、（２）４０：６０  メタノール／水（２００ｍＬ）、（３）６０：４０  メタノール／水（２００ｍＬ）、（４）８０：２０  メタノール／水（２００ｍＬ）、および（５）メタノール（２００ｍＬ）。
【００７１】
バイオアッセイ結果（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａおよび／またはＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａでの発芽アッセイ）は、全ての画分が活性であることを示した。各画分を、アセトニトリル／メタノール／水を使用する、オクタデシルシラン結合化シリカゲル（ＯＤＳ）ＨＰＬＣ（ＴＯＳＯＨＡＳＳ  ＯＤＳ−８０ＴＳ；１０μｍ、２１．５×３０ｃｍ）で個々に分画した。溶媒系：溶媒Ａ：アセトニトリル／メタノール／水  ２５：５：６５、溶媒Ｂ：アセトニトリル／メタノール／水  ６５：５：３０。勾配：溶媒Ａで０分で開始し、２５分間維持する。次いで、溶媒Ｂを５０分間にわたって３５％にまで増加させる。流速＝６．０ｍＬ／分）。全ての画分は、ほぼ同じＨＰＬＣプロフィールを生じ、活性は、以下の２つの領域で得られた：ピークＡ（時間約５５〜６３分）およびピークＢ（時間約６５〜７０分）。
【００７２】
ピークＢを、別の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｈｅｘｙｌ；５μｍ、２５０×１０ｍｍ）でさらに分画した。溶媒系：溶媒Ａ：アセトニトリル／メタノール／水  ２５：５：６５、溶媒Ｂ：アセトニトリル／メタノール／水  ６５：５：３０。勾配：溶媒Ａで０分で開始し、１５分間維持する。次いで、溶媒Ｂを２５分間にわたって２５％にまで増加させる。流速＝２．０ｍＬ／分）。１つの大きい成分が単離された；しかし、分析用ＨＰＬＣ分析は、活性な代謝産物と共に溶出された、高ＵＶ吸収混入物を示した。従って、代替的な精製方法を使用した（方法Ｂ）。
【００７３】
（方法Ｂ）
代替的に、ホモジナイズした無細胞全ブロス培養物を、非イオン性ポリマー樹脂（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０）中に通し、水で洗浄し、次いでメタノールで洗浄した。メタノール溶出物を、逆相ＨＰＬＣ（ＨＰ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８；５μｍ、１５０×４．６ｍｍ。溶媒系：溶媒Ａ：アセトニトリル／メタノール／水  ２５：５：６５、溶媒Ｂ：アセトニトリル／メタノール／水  ６５：５：３０。勾配：溶媒Ａで０分で開始し、溶媒Ｂを２０分間で３％にまで増加させる。流速＝０．８ｍＬ／分）でさらに分離し、方法Ａで観察された同じ活性ピーク（ピークＡおよびＢ）を得て、そしてＵＶおよびＭＳ検出を使用する分析用ＨＰＬＣによって確かめた。ＨＰＬＣトレースを、図３に示す。
【００７４】
（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１４５の活性代謝産物の特徴付け）
方法Ａから得られた不純画分は、活性代謝産物の性質についてのいくつかの初期情報を提供した。ＬＣ  ＭＳは、分子量［Ｍ＋Ｈ＋］＝８９２．６を示し、ＵＶスペクトルは、２１５〜２２０ｎｍのショルダーを示した。１Ｄ  ＮＭＲおよび２Ｄ  ＮＭＲは、少なくとも２つのプロパルギルアルコールセグメント［Ｃ＝Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）］、いくつかの酸素化メチル炭素（Ｘ−ＣＨ−Ｙ）、および可能性のある糖部分を示した。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲを、それぞれ、図４および５に示す。
【００７５】
方法Ｂは、ＮＭＲ分析のために十分な量を提供しなかったが、この方法によって、ＵＶおよびＭＳ検出法を使用するＨＰＬＣ（オクチル結合化シリカゲル）による分析に十分な量の、よりきれいなピークが得られた。２つの大きなピーク（ピークＡおよびＢ）が得られ、これらは、方法Ａを使用して活性代謝産物として同定された同じ化合物（図３を参照）と一致する。全ての化合物のＵＶスペクトルが、２１５〜２２０ｎｍでショルダーを示した。ピークＡのＬＣ  ＭＳは、以下の分子量を有する少なくとも３つの化合物の存在を示した：［Ｍ＋Ｈ＋］＝８６６．５、８８２．５および８９８．４（図６を参照）。同様に、ピークＢは、以下の分子量を有する少なくとも３つの化合物を示した：［Ｍ＋Ｈ＋］＝８９２．５、９０８．５および９２４．５（図７を参照）。
【００７６】
上記の本発明が、理解の明確化のために例示および実施例として幾分詳細に記載されているが、特定の変化および改変が実施されることが当業者に明らかである。従って、これらの説明および実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００７７】
（参考文献）
【００７８】
【表９】
0005148802.tif 000010
0005148802.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、活性画分６の分析ＨＰＬＣクロマトグラムである。（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８，１０ｃｍ×４．６ｍｍ，１００Å、流速１ｍＬ／分、２２０ｎｍでのＵＶ検出、アセトニトリル＋０．０５％  ＴＦＡ／水＋０．０５％勾配は以下のとおり：０〜３０分、５〜６５％；３０〜４０分、６５〜１００％；４０〜４５分、１００％）。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、図１Ａに記載されるクロマトグラムにおいて１４．７５５分で溶出される活性ピークのＵＶスペクトルである。
【図２Ａ】  図２Ａは、図１Ａにおいて記載されるものと同じ条件下での活性画分７の分析ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、図２Ａに記載されるクロマトグラムにおいて１６．１４６分に溶出される活性ピークのＵＶスペクトルである。
【図３】  図３は、方法Ｂにおいて記載されるＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂工程からのメタノール溶離液のＣ−８ＨＰＬＣクロマトグラムである。（ＨＰ  Ｚｏｒｖａｘ  Ｅｃｌｉｐｓ  ＸＤＢ−Ｃ８カラム、５μｍ、１５０×４．６ｍｍ、流速０．８ｍＬ  分、２２０ｎｍでのＵＶ検出、チャート速度２ｍｍ／分。溶媒Ａ，２５：５：７０アセトニトリル／メタノール／水。溶媒Ｂ，６５：５：３０アセトニトリル／メタノール／水。勾配：０分において１００％Ａは、２０分かけて３％Ｂに増加した）。
【図４】  図４は、精製方法Ａから得られた半純粋活性代謝産物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）である。
【図５】  図５は、精製方法Ａから得られた半純粋活性代謝産物の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）である。
【図６】  図６は、精製方法Ｂから得られるピークＡのＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳ（液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー衝撃−質量スペクトル）である。（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８，１０ｃｍ×４．６ｍｍ、１００Å、流速１ｍＬ／分、アセトニトリル＋０．０２％  ＴＦＡ／水＋０．０２％勾配は以下のとおり：０〜３０分、５〜６５％；３０〜４０分、６５〜１００％；４０〜４５分、１００％）。
【図７】  図７は、精製方法Ｂから得られるピークＢのＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳ（液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー衝撃−質量スペクトル）である。（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８，１０ｃｍ×４．６ｍｍ、１００Å、流速１ｍＬ／分、アセトニトリル＋０．０２％  ＴＦＡ／水＋０．０２％勾配は以下のとおり：０〜３０分、５〜６５％；３０〜４０分、６５〜１００％；４０〜４５分、１００％）。
【図１Ａ】
0005148802.tif 000012
【図１Ｂ】
0005148802.tif 000013
【図２Ａ】
0005148802.tif 000014
【図２Ｂ】
0005148802.tif 000015
【図３】
0005148802.tif 000016
【図４】
0005148802.tif 000017
【図５】
0005148802.tif 000018
【図６】
0005148802.tif 000019
【図７】
0005148802.tif 000020