(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物から単離されるＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）。
【請求項２】
ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物から単離されるＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）を、フラジェリンに対して免疫不応答性を示すモデル細胞としてインビトロで使用する方法。
【請求項３】
ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させることによって作製される、腸管粘膜へのサルモネラ菌感染に対して耐性を示す非ヒトモデル動物。
【請求項４】
サルモネラ菌が、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）であることを特徴とする請求項３記載の非ヒトモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌由来フラジェリンを特異的に認識するＴＬＲ５タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた粘膜ワクチンアジュバントのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６参照。）。
【０００３】
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２やＴＬＲ４など現在までに１３つのファミリーが報告されている（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０参照。）。このＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（例えば、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３参照。）。また、哺乳類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptor）として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられている（例えば、非特許文献１４参照。）。
【０００４】
上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ：pathogen-associated molecular pattern）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（例えば、非特許文献１５参照。）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞にＴＮＦα、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性サイトカインを産生させること（例えば、非特許文献１６、非特許文献１７参照。）や、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：LPS-binding protein）により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き渡されることが知られている（例えば、非特許文献１８、非特許文献１９参照。）。本発明者らは、ＴＬＲ４のノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ４ノックアウトウスが上記グラム陰性菌の外膜の主成分であるＬＰＳに不応答性であること（例えば、非特許文献２０参照。）や、ＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であるペプチドグリカンに対する反応性が低下すること（例えば、非特許文献２１参照。）を報告している。
【０００５】
一方、細菌フラジェリンは構造タンパク質であり、鞭毛の大部分を形成し、宿主表面での走化作用、接着及び浸潤を通して病原性に寄与する（例えば、非特許文献２２参照。）が、リステリア培養上清から単離されたＴＬＲ５刺激成分が、フラジェリンであることが明らかにされている（例えば、非特許文献２３参照。）。サルモネラのフラジェリンもまた、ＴＬＲ５の刺激リガンドであることが明らかになっている（例えば、非特許文献２４参照。）。以上のように、ＴＬＲファミリー構成員のうち、タンパク質リガンドを認識すると明らかにされたＴＬＲは、ＴＬＲ５が初めてである（例えば、非特許文献２５参照。）。このようにＴＬＲ５は、グラム陽性菌由来及びグラム陰性菌由来のどちらのフラジェリンも認識し、インビトロでの研究では、ＴＬＲ５がフラジェリンモノマーの保存領域を認識して、獲得免疫応答のみならず炎症性免疫応答を惹起することが明らかにされている（例えば、非特許文献２６参照。）。
【０００６】
さらにＴＬＲ５は、腸管上皮細胞の基底膜側に発現し、粘膜面における有鞭毛細菌の浸潤の認識に、重要な役割を果たすと考えられており（例えば、非特許文献２７参照。）、ヒト腸管上皮細胞株では、フラジェリンに応答してケモカインの産生を誘導し、それが後に未成熟樹状細胞（ＤＣ）の遊走を導くこと（例えば、非特許文献２８参照。）や、ＴＬＲ５がヒトの肺に高度に発現し（例えば、非特許文献２９参照。）、ヒトＴＬＲ５の多形性とレジオネラ症に対する感受性との間には、相関関係があることが明らかになっている（例えば、非特許文献３０参照。）。このような証拠から、ＴＬＲ５が有鞭毛病原体の重要な感知器であることが示唆されるが、ＴＬＲ５のインビボでの役割は未だ解明されていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】Cell 52, 269-279, 1988
【非特許文献２】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献３】Cell 86,973-983, 1996
【非特許文献４】Nature 351, 355-356, 1991
【非特許文献５】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献６】J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998
【非特許文献７】Nature 388, 394-397, 1997
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998
【非特許文献９】Blood 91, 4020-4027, 1998
【非特許文献１０】Gene 231, 59-65, 1999
【非特許文献１１】J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998
【非特許文献１２】Mol. Cell 2, 253-258, 1998
【非特許文献１３】Immunity 11, 115-122, 1999
【非特許文献１４】Cell 91, 295-298, 1997
【非特許文献１５】Cell 91, 295-298, 1997
【非特許文献１６】Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979
【非特許文献１７】Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995
【非特許文献１８】Science 249, 1431-1433, 1990
【非特許文献１９】Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995
【非特許文献２０】J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999
【非特許文献２１】Immunity, 11, 443-451, 1999
【非特許文献２２】Annu Rev Genet 26, 131-58., 1992
【非特許文献２３】Nature 410, 1099-103. , 2001
【非特許文献２４】J Immunol 167, 1882-5, 2001
【非特許文献２５】Nature 410, 1099-103. , 2001
【非特許文献２６】Immunol Lett 101, 117-22., 2005
【非特許文献２７】J Immunol 167, 1882-5., 2001
【非特許文献２８】Proc Natl Acad Sci USA 98, 13722-7., 2001
【非特許文献２９】Genomics 64, 230-40., 2000
【非特許文献３０】J Exp Med 198, 1563-72., 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＴＬＲ５はインビトロで、フラジェリンに対する受容体として同定されたが、そのインビボでの機能は明確になっていない。他のＴＬＲファミリー構成員とは異なり、ＴＬＲ５はマウスの脾臓細胞、腹膜マクロファージ及びＣＭ−ＤＣには発現せず、それが自然免疫におけるＴＬＲ５の機能に対する取り組みを困難にしている。本発明の課題は、経口や経鼻などの粘膜から投与し粘膜免疫を活性化することで粘膜面と生体内の二重のバリア機能が獲得できる粘膜ワクチンのアジュバントのスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、既に同定されているＴＬＲ５のｃＤＮＡを、マウス遺伝子ライブラリーから単離し、このＴＬＲ５遺伝子部位を、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換え、またそれぞれのＣ末端側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入させて、Ｇ４１８とガンシクロビアに対して２重に抵抗力のあるＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、このＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６のマウスの胚盤胞(blastocysts)の中に注入し、その生殖系列をとおして、メンデルの法則に従い出生してくるＴＬＲ５遺伝子機能が染色体上で欠損したＴＬＲ５ノックアウトマウスを作製し、このＴＬＲ５ノックアウトマウスと野生型マウスとを比較・解析することにより、フラジェリンはＴＬＲ５の天然リガンドであることを確認した。さらに、近年確立された、生存率の高いＬＰＣの単離方法を用い、ＴＬＲ５がマウスの腸管のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣに特異的に発現することや、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣがＴＬＲ５を特異的に発現させ、フラジェリンに応答して炎症性サイトカインを誘導すること、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは主にＴＬＲ５を通して病原性の有鞭毛細菌を感知し、炎症性応答を誘導すること、ＴＬＲ５は当初は有鞭毛細菌に対する宿主の防御を誘導したが、ＴＬＲ５−／−マウスは、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）の経口感染に対して耐性を生じ、腸管から腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への移行が低下すること等を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物から単離されるＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物から単離されるＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）を、フラジェリンに対して免疫不応答性を示すモデル細胞としてインビトロで使用する方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（３）ＴＬＲ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させることによって作製される、腸管粘膜へのサルモネラ菌感染に対して耐性を示す非ヒトモデル動物に関する。
【００１３】
また本発明は、（４）サルモネラ菌が、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）であることを特徴とする上記（３）記載の非ヒトモデル動物に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法によると、サルモネラ菌等の有鞭毛細菌による全身性感染症などの細菌感染症に対する治療に優れた粘膜ワクチンアジュバントを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法としては、野生型非ヒト動物由来のＣＤ１１ｃ＋腸粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）と、有鞭毛細菌由来のフラジェリン又は有鞭毛細菌由来の鞭毛とを、被検物質の存在下又は非存在下に、インビトロでインキュベーションして接触させ、上清中のＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２ｐ４０の濃度を測定し、被検物質の非存在下に比べて被検物質の存在下におけるＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２ｐ４０の測定濃度の上昇を指標として選択する方法（スクリーニング方法Ｉ）や、野生型非ヒト動物に、有鞭毛細菌と被検物質とを経口的に投与し、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）における有鞭毛細菌数を測定し、有鞭毛細菌のみを経口的に投与した場合に比べて、有鞭毛細菌数の減少を指標として粘膜ワクチンアジュバントを選択する方法（スクリーニング方法II）であれば特に制限されず、また、本発明の使用方法としては、非ヒト動物由来のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを、インビトロで有鞭毛細菌由来のフラジェリン又は有鞭毛細菌由来の鞭毛で刺激することを含む、前記ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを粘膜ワクチンアジュバントのスクリーニングに使用する方法（使用方法Ｉ）や、ＴＬＲ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に有鞭毛細菌を経口投与することを含む、前記非ヒト動物を粘膜ワクチンアジュバントのスクリーニングに使用する方法（使用方法II）であれば特に制限されず、上記粘膜ワクチンアジュバントとしては、腸粘膜ワクチンを活性化するＴＬＲ５のアゴニスト等を例示することができ、アジュバント候補物質（被検物質）としては、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、天然有機化合物、合成有機化合物等を挙げることができる。
【００１６】
上記有鞭毛細菌（グラム陽性細菌やグラム陰性細菌の鞭毛）としては、鞭毛を有する細菌であれば特に制限されず、例えばサルモネラ菌、ボツリヌス菌、リステリア菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、レジオネラ菌、大腸菌、腸炎ビブリオ、枯草菌等のバチルス菌、カンピロバクター菌、コレラ菌、シュードモナス菌、類鼻疽菌、気管支敗血症菌等を挙げることができ、中でもサルモネラ菌を好適に例示することができる。サルモネラ菌としては、サルモネラ・ティフィムリウム（S. typhimurium）、サルモネラ・エンティリティディス（S. enteritidis）、サルモネラ・エンテリカ(S.enterica)、サルモネラ・コレレスイス（S. choleraesuis）、サルモネラ・ダブリン（S. dublin）、サルモネラ・チフィー（S. typhi）、サルモネラ・パラチフィー（S. paratyphi）、サルモネラ・デルビィ（S. derby）、サルモネラ・ハダー（S. hadar）、サルモネラ・ハイデルベルク（S. heidelberg）、サルモネラ・アゴナ（S. agona）、サルモネラ・アリゾナ（S. arizonae）等を挙げることができる。
【００１７】
上記有鞭毛細菌由来のフラジェリンとしては、上記有鞭毛細菌から分離精製したフラジェリンタンパク質や、フラジェリン遺伝子を用いて常法により遺伝子組換え技術により発現させたフラジェリンタンパク質を例示することができ、ＴＬＲ５の生体における機能からして、有鞭毛細菌の種類は特に制限されない。
【００１８】
また、上記細菌由来鞭毛としては、上記有鞭毛細菌から分離した鞭毛自体の他、上記有鞭毛細菌（生菌又は死菌）、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・エンティリティディス等のサルモネラ菌由来のフラジェリン遺伝子を膜表面アンカーリングプラスミドベクターにインテグレートしたフラジェリン発現ベクターで形質転換し、菌体表層にフラジェリンを発現する宿主細菌を挙げることができる。
【００１９】
上記のＴＬＲ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物や、ウサギ目動物等のＴＬＲ５ホモ欠損型（ＴＬＲ５−／−）非ヒト動物を好適に例示することができるが、中でもＴＬＲ５−／−マウスを好適に例示することができる。以下、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物の作製方法を、ＴＬＲ５ノックアウトマウス（ＴＬＲ５−／−マウス）を例にとって説明する。
【００２０】
マウス遺伝子ライブラリーから、ＴＬＲ５遺伝子の配列情報からＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＴＬＲ５をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＴＬＲ５遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このＴＬＲ５をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００２１】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、ＴＬＲ５ノックアウトマウス（ＴＬＲ５−／−マウス）を作製することができる。また、ＴＬＲ５ノックアウトマウスにおいてＴＬＲ５が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＬＲ５の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２２】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、ＴＬＲ５ホモ欠損型非ヒト動物とその同腹の野生型（ＴＬＲ５＋／＋）非ヒト動物とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも同腹の非ヒト動物を、例えば本発明のスクリーニング方法IIに際して併用することが好ましい。
【００２３】
また、本発明のスクリーニング方法Ｉにおける野生型及び（ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた）ＴＬＲ５欠損型の非ヒト動物由来のＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（ＬＰＣ）は、粘膜固有層に存在する全ての細胞を意味し、文献（J Immunol 176, 803-810, 2006）記載の方法により有利に単離することができる。すなわち、小腸切片を、１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢを含むＰＢＳを用い、３７℃で３０分間処理して上皮細胞を除去し、ＰＢＳで徹底的に洗浄した後、４００Ｍ（１Ｕ／ｍｌ）のコラゲナーゼＤ及び１０μｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉを含むＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ中で、３７℃で４５〜９０分間連続的に攪拌して消化し、ＥＤＴＡを加え（最終は１０ｍＭ）、細胞懸濁液をさらに５分間３７℃でインキュベートして、１５．５％のAccudenz溶液中で細胞を遠心分離し、樹状細胞（ＤＣ）と好酸球を含むＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを濃縮し、その後に抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズを用いてポジティブ選択を行うことにより、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを得ることができる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法ＩにおけるＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２ｐ４０の濃度の測定は、市販の測定キットや測定システムにより行うことができ、具体的にはバイオプレックスシステム（Bio-Rad社）による測定を好適に例示することができる。また、本発明のスクリーニング方法IIにおける腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）における有鞭毛細菌数の測定は、例えば、分離したＭＬＮを０．０１％のトリトン−Ｘ１００で溶解した溶解液の段階希釈液をＬＢ寒天培地にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより行うことができる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法Ｉにおいて、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣと、有鞭毛細菌由来のフラジェリン又は有鞭毛細菌由来の鞭毛（フラジェリン等）とを、被検物質の存在下に、インビトロでインキュベーションして接触させる方法としては、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等と被検物質とを培地に前後して添加してインキュベーションする方法や、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣと被検物質とを培地に添加してインキュベーションした後にフラジェリン等を培地に添加してインキュベーションする方法や、フラジェリン等と被検物質とを培地に添加してインキュベーションした後にＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを培地に添加してインキュベーションする方法や、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等と被検物質とをあらかじめ生理食塩水等の緩衝液中で接触させ、その後培地中でインキュベーションする方法や、フラジェリン等と被検物質をあらかじめ生理食塩水等の緩衝液中で接触させ、その後ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを接種した培地中で共にインキュベーションする方法や、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣと被検物質をあらかじめ生理食塩水等の緩衝液中で接触させ、その後フラジェリン等を添加した培地中で共にインキュベーションする方法を例示することができる他、非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等を培地に添加してインキュベーションする方法を例示することができる。
【００２６】
また、本発明のスクリーニング方法Ｉにおいて、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等とを、被検物質の非存在下に、インビトロでインキュベーションして接触させる方法としては、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等を培地に前後して添加してインキュベーションする方法や、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等をあらかじめ生理食塩水等の緩衝液中で接触させ、その後培地中でインキュベーションする方法を例示することができる。
【００２７】
野生型非ヒト動物由来のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを用いる本発明のスクリーニング方法Ｉにおいては、被検物質の非存在下に比べて被検物質の存在下におけるＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２ｐ４０の測定濃度が有意に上昇した場合、当該被検物質は、粘膜ワクチンアジュバントとして期待できる。そして、上記粘膜ワクチンアジュバントとして期待できる被検物質の存在下、ＴＬＲ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた、前記野生型非ヒト動物と同種の非ヒト動物由来のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等とを、インビトロでインキュベーションして接触させ、上清中のＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２ｐ４０の濃度を測定し、野生型動物の場合における有意な濃度上昇が認められないとき、当該被検物質は、ＴＬＲ５を介した粘膜ワクチンアジュバントとして十分に期待できることになる。
【００２８】
本発明の使用方法ＩにおけるＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの使用の態様としては、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとフラジェリン等を上記のように接触させて、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣをフラジェリン等で刺激する、上記本発明のスクリーニング方法ＩにおけるＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの使用の態様を好適に例示することができる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法IIにおいて、有鞭毛細菌と被検物質とを経口的に投与する方法としては、有鞭毛細菌と被検物質とを同時に経口的に投与する方法や、有鞭毛細菌を先に経口的に投与し、その後被検物質を経口的に投与する方法や、被検物質を先に経口的に投与し、その後有鞭毛細菌を経口的に投与する方法を例示することができる。また、本発明のスクリーニング方法IIにおいては、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物（例えば、ＴＬＲ５ノックアウトマウス）と同種の野生型非ヒト動物（例えば、野生型マウス）、より好ましくは同腹の野生型非ヒト動物（例えば、同腹の野生型マウス）のＭＬＮにおける有鞭毛細菌数の測定値と比較・評価を行うことが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
【００３０】
野生型非ヒト動物を用いる本発明のスクリーニング方法IIにおいては、有鞭毛細菌のみを経口的に投与した場合に比べて、有鞭毛細菌と被検物質とを経口的に投与した場合のＭＬＮにおける有鞭毛細菌数の測定値が有意に減少した場合、当該被検物質は、粘膜ワクチンアジュバントとして期待できる。そして、有意に減少した有鞭毛細菌数の測定値が、上記粘膜ワクチンアジュバントとして期待できる被検物質を、ＴＬＲ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた、前記野生型非ヒト動物と同種の非ヒト動物に経口投与した場合と同程度のとき、当該被検物質は、ＴＬＲ５を介した粘膜ワクチンアジュバントとして十分に期待できることになる。
【００３１】
本発明の使用方法IIにおけるＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物の使用の態様としては、ＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物にフラジェリン等を上記のように経口投与する、上記本発明のスクリーニング方法IIにおける陽性対照としてのＴＬＲ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物の使用の態様を好適に例示することができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、全ての動物実験は、大阪大学微生物病研究所付属実験動物倫理検討委員会に承認された実験プロトコルに基づいて実施した。
【実施例１】
【００３３】
［マウス、試薬、抗体及び細菌］
日本クレア（大阪）からＣ５７ＢＬ／６マウスを購入した。ＴＬＲ４−／−マウスは、Hoshino, K., Takeuchi, O., Kawai, T., Sanjo, H., Ogawa, T., Takeda, Y., Takeda, K. & Akira, S., J Immunol.162, 3749-52. (1999)に記載のものを使用した。リポ多糖（lipopolysaccharide：ＬＰＳ）は、サルモネラ・ミネソタ Ｒｅ５９５（Salmonella minnesota Re595）由来のＬＰＳを、フェノール−クロロホルム−石油エーテル抽出法により調製した。精製フラジェリンはA. Aderem氏（Institute for System Biology）から寄贈された。サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム ＳＲ−１１ ３１８１及び３１８１ ＦｌｉＡ::Ｔｎ１０は、北里生命科学研究所から提供された（Kutsukake, K., Ohya, Y., Yamaguchi, S. & Iino, T. Operon structure of flagellar genes in Salmonella typhimurium. Mol Gen Genet 214, 11-5 (1988)，Gulig, P.A. & Curtiss, R., Infect Immun 55, 2891-901 (1987)）。健康な人間のボランティアからエンテロバクター・クロアカを単離し、国立大学法人大阪大学微生物病研究所で同定した。
【００３４】
［細胞］
インビトロで骨髄由来の樹状細胞（bone marrow dendric cell：ＢＭＤＣ）を調製するため、大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を調製した。次に前記細胞を、１０％のウシ胎仔血清（fetal calf serum：ＦＣＳ：Gibco社製）、１００μＭの２−メルカプトエタノール（2-mercaptoethanol：２−ＭＥ：ナカライ社製）及び１０ｎｇ／ｍｌのマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor：ＧＭ−ＣＳＦ：Pepro Tech社製）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライ社製）で培養した。培地は２日ごとに交換した。６〜８日後、細胞を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＢＭＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦ−ＤＣ）として使用した。
【００３５】
マクロファージ及びＤＣを有する脾臓細胞を調製するため、脾臓を小さな断片に切り、４００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光社製）及び１５μｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素（シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃で２０分間インキュベートした。最後の５分間は５ｍＭのＥＤＴＡを加えた。ＲＢＣ溶解後、単細胞懸濁液を調製し、抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Miltenyi社製）をそれぞれ用いてマクロファージ及びＤＣのポジティブ選択を実施した。
【００３６】
チオグリコレート誘発性腹膜マクロファージを回収するため、２ｍＬの４％チオグリコレート（シグマ社製）をマウスの腹腔内に注射した。３日後、腹腔浸出細胞（Peritoneal exudate cells：ＰＥＣ）を回収した。
【００３７】
腸管リンパ球及び上皮細胞を単離するため、細かい切片に切断したマウスの小腸を、１ｍＭのＥＤＴＡ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びゲンタマイシンと１０％のＦＣＳとを含む予熱したＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃で１０分間攪拌し、その後１５秒間勢いよく振盪した。この過程を２度行い、生成された上清を小型綿−グラスウールカラムに通して細胞片を除去し、パーコール密度勾配法（Pharmacia Fine Chemicals, Pharmacia社製）にかけて分離した。非連続的な密度勾配（２５、４０及び７５％）を使用した。４０％と７５％との間の分画層の細胞を小腸上皮リンパ球（intestinal epithelial cell：ＩＥＬ）として回収し、４０％と２５％との間の界面層の細胞を小腸上皮細胞（intestinal epithelial cell：ＩＥＣ）としてそれぞれ回収した。小腸の腸管粘膜固有層（lamina propria; ＬＰ）及びパイエル板（Peyer’s patches; PP）由来のＣＤ１１ｃ＋細胞製剤を調製するため、小腸切片及びＰＰを、１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ナカライ社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（SIGMA社製）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（SIGMA社製）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ナカライ社製）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ナカライ社製）及び１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（Calbiochem社製）を含むＰＢＳを用い、３７℃で３０分間処理して上皮細胞を除去し、ＰＢＳで徹底的に洗浄した。小腸の切片及びＰＰを、４００Ｍ（１Ｕ／ｍｌ）のコラゲナーゼＤ（Roche社製）、及び１０μｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ（Roche社製）を含むＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ中で、３７℃で４５〜９０分間連続的に攪拌して消化した。ＥＤＴＡを加え（最終は１０ｍＭ）、細胞懸濁液をさらに５分間３７℃でインキュベートした。１５．５％のAccudenz溶液（Accurate Chemical & Scientific社製）中で細胞を遠心分離し、ＤＣを濃縮した。抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Miltenyi社製）を用い、得られた細胞のポジティブ選択を行った。
【００３８】
［炎症性サイトカイン濃度の測定］
ＧＭ−ＤＣ、ＰＥＣ、ＣＤ１１ｂ＋脾臓細胞、ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞及びＣＤ１１ｃ＋腸管粘膜固有層細胞（lamina propria cell ：ＬＰＣ）を９６ウェルのプレート（５×１０４細胞／ウェル）において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で培養した。培養上清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１０の濃度を、バイオプレックスシステム（Bio-Rad社）により、製造者の使用説明書に従って測定した。
【００３９】
［ＲＴ−ＰＣＲ及びｑ−ＰＣＲ］
組織、臓器及び初代細胞由来のＲＮＡを定量し、スーパースクリプト２（Invitrogen社製）を用い、製造元の取扱説明書に従い、ランダムな六量体をプライマーにより１μｇのＲＮＡを逆転写した。ＰＣＲは、ＴＬＲ４用［センス:GCCTCCCTGGCTCCTGGCTAGGAC（配列番号１）、アンチセンス:GGCCAATTTTGTCTCCACAGCCACC（配列番号２）］、ＴＬＲ５用［センス: GGTGTGATCTTCATGGCCAGCCC（配列番号３）、アンチセンス：CGTCGCTTAAGGAATTCAGTTCCCGG（配列番号４）］、及びβ−アクチン用［センス:GACATGGAGAAGATCTGGCACCACA（配列番号５）、アンチセンス:ATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGCAA（配列番号６）］並びにＴａｑポリメラーゼ用（宝酒造株式会社製）プライマー対を用いて実施した。
【００４０】
ＰＣＲの条件は、９７℃、５７℃及び７２℃で２５サイクル３０秒間とし、生成物をアガロースゲル上で解析した。定量的リアルタイムＰＣＲ（quantitative real-time PCR：ｑ−ＰＣＲ）解析は、７７００配列検出器（Applied Biosystem社製）を用いて実施した。ｑ−ＰＣＲは、先に記載のように増幅されたｃＤＮＡ、２×ＰＣＲマスターミックス（Applied Biosystem社製）及び以下のプライマーを含む最終体積２５μｌ中で実施された：内部対照として１８ｓｒＲＮＡ（Applied Biosystem社製）、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５（Assay on Demand社製）。増幅条件は、９５℃（１０分）、９５℃で３５サイクル（１５秒）、６０℃（６０秒）、５０℃（１２０秒）とした。
【００４１】
［マイクロアレイ解析］
ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスから採取したＩＥＣ及びＬＰＣを、フラジェリン（１μｇ／ｍｌ）存在下、あるいは非存在下で４時間処理した。ＴｏｔａｌＲＮＡをＲＮイージーキット（Qiagen社製）で抽出し、その後、オリゴテックスｍＲＮＡキット（Pharmacia社製）でｍＲＮＡを精製した。オベーションビオチンシステム（Nugen社）を用い、製造元の取扱説明書に従って、１００ｎｇの精製ｍＲＮＡからビオチン標識・断片化ｃＤＮＡを合成した。かかるｃＤＮＡ産物を、アフィメトリックスマウスゲノム４３０２．０マイクロアレイチップ（Affymetrix社）に、製造元の取扱説明書に従ってハイブリダイズした。ハイブリダイズしたチップを染色、洗浄し、ジーンアレイスキャナー（Affymetrix社製）でスキャンした。マイクロアレイスイートソフトウェア（バージョン５．０、Affymetrix社製）及びジーンスプリングソフトウェア（Silicon Genetics社製）を用いてデータ解析を実施した。
【００４２】
［小腸の二重免疫蛍光染色］
小腸におけるＴＬＲ５の局在性を確認する際には、ビオチン化抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＴＬＲ５（Abgent社製）モノクローナル抗体を、凍結組織から切断された切片に４℃で一晩反応させた。試料を洗浄し、次にストレプトアビジン−アレキサ５９４（Molecular Probes社製）及びアレキサ−４４８ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（Molecular Probes社製）を用い、室温で２時間インキュベートした。ラジアンス２１００／バイオラド共焦点レーザー顕微鏡（Bio-Rad laboratories社製）を用い、免疫組織化学的染色法で解析した。
【００４３】
［マウスの細菌感染］
サルモネラ・ティフィムリウムを、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地で、３７℃で振盪せずに増殖させた。細菌濃度は、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）を用いて測定した。細菌を８週齢のマウスに経口注入又は腹腔内に注射した。臓器における細菌負荷を確認するために、マウスを様々な時間で屠殺した。肝臓、脾臓、ＬＰＣ、パイエル板細胞（Peyer’s patches cell; ＰＰＣ）及び腸間膜リンパ節（mesenteric lymph node：ＭＬＮ）を０．０１％のトリトン−Ｘ１００で溶解した。溶解液の段階希釈液をＬＢ寒天培地にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした後、コロニー数を数えた。
【００４４】
［統計解析］
細菌感染後の対照マウスと変異型マウスとの間の生存率の差を調べるため、カプラン・マイヤー プロット及びログ・ランク テストを実施した。
【実施例２】
【００４５】
［ＴＬＲ５ノックアウトマウスの作製］
ＴＬＲ５の生理学的役割を解明するため、標的遺伝子組み換えによりＴＬＲ５−／−マウスを作製した。ＴＬＲ５ゲノムＤＮＡを１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリーから単離し、制限酵素マッピング及び配列解析により特徴付けを行った。マウスｔｌｒ５遺伝子は、一個のエクソンからなる。我々は、５’末端に単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を有するｐＭＣ−neo（Stratagene社製）をベクターとして用い、ネオマイシン耐性遺伝子カセットをＴｌｒ５遺伝子のエクソンに挿入できるターゲティングベクターを構築した（図１ａ）。前記ターゲティングベクターをＳａｌＩで線状化し、エレクトロポレーション法によってＥ１４．１ＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８及びガンシクロビアに耐性をもつクローンの相同組換えをＰＣＲによりスクリーニングし、図１ａに示されるプローブ（配列番号７）を用いてサザンブロット解析により確認した。
【００４６】
２つの正確に標的化されたＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。キメラマウスを雌のＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、サザンブロット解析により変異型対立遺伝子の伝達を観察した（図１ｂ）。
【００４７】
次に、雄のキメラマウスを雌のＣ５７ＢＬ／６と交配し、ヘテロ接合体マウスを作製した。かかるヘテロ接合体マウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと８回戻し交配した。かかるヘテロ接合体マウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと８回戻し交配した。ヘテロ接合体Ｆ８前駆体をインタークロス（intercross）し、ＴＬＲ５−／−マウスを得た。ＴＬＲ５−／−マウスはメンデル比の想定通りに生まれ、発達異常は何ら観察されなかった。ｔｌｒ５遺伝子の崩壊を確認するため、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−の腸管由来のｔｏｔａｌＲＮＡのノーザンブロット解析を行った。ＴＬＲ５−／−マウスにおいて、ＴＬＲ５の転写物は全く見られなかった（図１ｃ）。
【００４８】
さらに、該マウスのフラジェリンに対する応答について検討するため、炎症性サイトカインの全身的な産生を調べた。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの腹腔内に精製フラジェリンを注射した後、注射後４時間まで、１時間ごとにインターロイキン（ＩＬ）−６及びＩＬ−１２ｐ４０の血清中濃度を測定した。ＴＬＲ５＋／＋マウスでは、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生が注射後２時間後以内に増加したが、ＴＬＲ５−／−マウスでは４時間後でも依然として低いままであった（図１ｄ）。これらの結果によりフラジェリンはＴＬＲ５の天然リガンドであることを確認した。
【実施例３】
【００４９】
次に、マクロファージ及び通常の樹状細胞（conventional dendric cell：ｃＤＣ）における、フラジェリン介在免疫応答について解析した。ＣＤ１１ｂ＋又はＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞、腹膜マクロファージ（ＰＥＣ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）誘導性骨髄由来樹状細胞（ＧＭ−ＤＣ）をマウスから単離し、次にこれらの細胞をフラジェリン又はＴＬＲ４リガンド、リポ多糖（lipopolysaccharide：ＬＰＳ）で刺激し、上清のＩＬ−６を測定した（図２ａ）。
【００５０】
当該細胞はすべてＬＰＳに応答してＩＬ−６を産生したが、フラジェリンの刺激によるＩＬ−６誘導は検出されなかった。同様に、ｑ−ＰＣＲの結果が示しているように、脾臓細胞、ＰＥＣ及びＧＭ−ＤＣはｔｌｒ５ｍＲＮＡではなくｔｌｒ４を高発現していた（図２ｂ）。また、ＴＬＲ５のフラジェリン対する応答において炎症性サイトカイン産生に関与している臓器を明らかにするために、マウス由来の脾臓、肝臓、腎臓、心臓、肺、及び腸管でのＴＬＲ５の発現レベルをｑ−ＰＣＲで解析した（図２ｃ）。他の臓器に比べ、腸管ではｔｌｒ５ｍＲＮＡの高発現が見られた。
【実施例４】
【００５１】
まず、ＩＥＣにおけるＴＬＲ５を介した炎症性応答について調べた。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスからＩＥＣを単離し、それらを培地のみ、あるいはフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いてＴＬＲ５誘導性遺伝子の特性を調べた（図３）。その結果、デフェンシンβ３（Ｄｅｆｂ３）、ＣＤ８６（ＣＤ８６）、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＡ構成員６（ｋｌｒａ６）、補体成分８α（Ｃ８ａ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２７（Ｃｃｌ２７）等の、免疫応答に関与するいくつかの遺伝子は、ＴＬＲ５＋／＋ＩＥＣではフラジェリンの刺激作用により誘導されたが、ＴＬＲ５−／−ＩＥＣでは、これらの遺伝子の発現は低下した。しかし、ＴＬＲ５＋／＋ＩＥＣにおいてでさえ、フラジェリンへの応答としての、大部分のケモカインの誘導がみられなかった。さらに、ＩＥＣはいずれの炎症性サイトカインも誘導しなかった。今回データは示していないが、タンパク質レベルの実験でも、ＩＥＣはフラジェリンの刺激によりいずれの炎症性サイトカインも誘導しなかったことを確認した。
【実施例５】
【００５２】
ＩＥＣにおけるＴＬＲ５の発現を調べた（図４ａ）。ＩＥＣにおけるｔｌｒ５ｍＲＮＡのレベルは、小腸全体に見られたレベルと比較すると、極めて低かった。そこで、ＴＬＲ５は小腸の別のサブコンパートメントに特異的に発現するはずであるとの仮説を立て、更にマウスの小腸からパイエル板細胞（ＰＰＣ）、腸管上皮リンパ球（ＩＥＬ）及び固有層細胞（ＬＰＣ）を単離し、ＴＬＲ５の発現を調べた（図４ａ）。ＴＬＲ５は、ＬＰＣでは高度に発現したが、一方ＩＥＬ及びＰＰＣでの発現は、小腸全体で測定されたレベルに比較すると、相対的に低かった。
【００５３】
最近の報告では、マウスの小腸のＬＰにおいて、ＤＣは主要な抗原提示細胞（antigen presenting cells：ＡＰＣ）であることが明らかになっている（Pavli, P., Woodhams, C.E.,et. al., Immunology 70, 40-7 (1990) ）ことから、ＬＰＣ及びＰＰＣからＤＣ１１ｃ＋を分離し、ｔｌｒ５ｍＲＮＡの発現を調べたところ、ＣＤ１１ｃ−ＬＰＣではなく、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおいてＴＬＲ５の非常に高度な発現が検出された。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣとは対照的に、ＣＤ１１ｃ＋ＰＰＣでは、小腸全体で見られるよりも、ＴＬＲ５の発現が低かった。さらに、免疫組織化学法により、小腸におけるＴＬＲ５の局在について調べた。ＴＬＲ５は、腸管のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣでは、高発現していた（図４ｂ及びｃ）。ｑ−ＰＣＲの結果と一致して、ＰＰではＴＬＲ５の発現は検出されなかった（図４ｄ）。腸管においてＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣはＴＬＲ５を特異的に発現していた。
【実施例６】
【００５４】
フラジェリンのＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣに対する影響を評価するために、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの小腸からＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを単離し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）あるいはフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）を加えて刺激し、上清における炎症性サイトカインの濃度を測定した。ネガティブコントロールとして培地のみを使用した（図５上）。ＴＬＲ５＋／＋のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、フラジェリンに応答してＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を産生したが、ＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣでは、これらのサイトカインの誘導は起こらなかった。また、どちらのＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣも、フラジェリンへの応答におけるＴＮＦ−αの過剰誘導を示さなかった。興味深いことに、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、ＬＰＳへの応答としていずれのサイトカインも誘導しなかった。
【００５５】
粘膜組織においてＰＰのＡＰＣは詳しく調べられてきており、ＰＰが有する独特のＤＣサブセットは、ＩＬ−１０を産生して調節性Ｔ細胞や経口免疫寛容の発生に重要な役割を果たすことや、該ＤＣはＬＰＳ等の炎症性刺激に応答してＩＬ−１０を誘導することが明らかにされている（Niedergang, F. et.al., Trends Microbiol 12, 79-88 (2004)，Ruedl, C., et.al., Eur J Immunol 26, 1801-6 (1996), Wakkach, A., et.al., Immunity 18, 605-17 (2003)）。そこで、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスからＣＤ１１ｃ＋ＰＰＣを単離し、フラジェリン又はＬＰＳで刺激し、上清における炎症性サイトカインの濃度を測定した（図５下）。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＰＰＣはともに、フラジェリンへの応答としていずれのサイトカインも誘導せず、実施例４で示されたＴＬＲ５の発現が低い（図４ａ）という結果と一致していた。また、ＣＤ１１ｃ＋ＰＰＣのどちらもが、ＬＰＳに応答してＩＬ−６及びＩＬ−１０を産生した。一方、前記のように、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウス由来のどちらのＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣも、フラジェリンへの応答としてＩＬ−１０を産生しないという結果は、これらの細胞におけるＴＬＲ５のシグナリングが、免疫寛容ではなく炎症性応答を誘導する傾向があることを示唆している（図５）。
【実施例７】
【００５６】
小腸におけるＴＬＲ５を介した自然免疫応答を総合的に調べるために、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−のＬＰＣをフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で４時間刺激後、ＲＮＡ試料を調製し、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した（図６）。フラジェリンで刺激した４時間後にＴＬＲ５＋／＋のＬＰＣにおいて、際立ってアップレギュレートされた転写物がいくつか同定されたが、ＴＬＲ５−／−の細胞では、これらの遺伝子の発現は誘導されていなかった。該遺伝子としては、サイトカイン（Ｉｌ−６、Ｉｌ−Ｉｆ５、Ｉｌ−Ｉｆ９、Ｉｌ−１ｂ、Ｅｂｉ３及びＩｌｔｉｆｂ）、サイトカイン受容体（Ｔｎｆｒｓｆ５、Ｉｌ１ｒ１及びＩｌ２ｒａ）、いくつかのケモカイン（ＣＫＬＦ及びＣＣＬ４）、シグナリング分子（Ｔｒａｆ６及びｇｐ１３０）、プロスタノイド（Ｐｌａｌａ及びＰｌａ２ｇ２ｄ）、プロスタノイド合成酵素（Ｃｏｘ２）及び分泌抗菌性ペプチド（Ｈａｍｐ，Ｌｃｎ及びＧｚｍｂ）等の前炎症性遺伝子が挙げられる（図６上段）。さらに、細胞接着、細胞骨格組織、細胞内移行、小胞融合、及び転写に関係する遺伝子は、フラジェリンの刺激によりアップレギュレートされていた（図６中段）。他方、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−のどちらのＬＰＣにおいても、フラジェリンに対する応答としてインターフェロン（ＩＦＮ）及びＩＦＮ誘導性遺伝子は誘導されなかった（図６下段）。
【実施例８】
【００５７】
実施例６に示すように、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣはフラジェリンに対する応答としてＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を産生したが、ＬＰＳに対しては産生しなかった。また、データは示していないが、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−のどちらのＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣも、ＴＬＲ２リガンドで刺激すると、同程度のＩＬ−６を産生した。これはＬＰＳのシグナリングが、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣでは特異的に抑制されることを示唆している。そこで、ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞（spleen cells：ＳＰＣ）及びＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣについて、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５の発現レベルを調べた（図７ａ）。ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣではＴＬＲ４の発現は高かったが、一方でＴＬＲ５の発現は低かった。ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣとは対照的に、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣでは、ＴＬＲ４の発現は、ＴＬＲ５の発現と比較すると非常に低かった。
【実施例９】
【００５８】
ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ及びＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣとではＴＬＲ４及びＴＬＲ５の発現特性が異なることから、これらの細胞における共生細菌及び病原性細菌に対する応答を調べた。野生型、ＴＬＲ４−／−及びＴＬＲ５−／−マウスからＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ及びＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣを単離し、熱殺菌された共生細菌エンテロバクター・クロアカ（１０ｍ.ｏ.ｉ.）、熱殺菌された病原性グラム陰性細菌サルモネラ・ティフィムリウム（１０ｍ.ｏ.ｉ.）、熱殺菌サルモネラ・ティフィムリウムΔｆｌｉＡ（１０ｍ.ｏ.ｉ.）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）又はフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）のいずれかを加えた培地で培養し、ＩＬ−６の産生を測定した（図７ｂ）。野生型ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣは、エンテロバクター・クロアカ及びサルモネラ・ティフィムリウムの両方に応答して大量のＩＬ−６を産生した。また、ＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣも、野生型ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣと同様の応答を示した。しかしながら、ＴＬＲ４−／−のＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣにおけるＩＬ−６の産生は、野生型及びＴＬＲ５−／−におけるＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣよりもはるかに低く、ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣが主にＴＬＲ４を通してグラム陰性細菌に対する自然免疫応答を誘導していることが示唆された。
【００５９】
また、野生型ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、サルモネラ・ティフィムリウムに応答して大量のＩＬ−６を誘導した。ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣとは対照的に、ＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおける、サルモネラ・ティフィムリウムによるＩＬ−６の誘導は大幅に低下していたが、ＴＬＲ４−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、野生型ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣと同程度のＩＬ−６を産生していた。さらに、ｆｌｉＡ遺伝子を欠失させ無鞭毛となった変異サルモネラ・ティフィムリウムを用いて、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの応答を調べた（Kutsukake, K., et.al., Mol Gen Genet 214, 11-5 (1988)）。その結果、ＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣのみならず、野生型ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣも、野生型サルモネラ・ティフィムリウムに比べてΔｆｌｉＡ変異体に対して低応答性であった。これは、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣが、サルモネラ・ティフィムリウムのフラジェリンを認識することで免疫応答を誘導することを示唆している。また、ＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣとは異なり、野生型ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、エンテロバクター・クロアカにより、相対的に少量のＩＬ−６しか産生しなかった。これらの結果を総合すると、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣはＴＬＲ５を通して病原性有鞭毛細菌を認識し、自然免疫応答を誘導すると言える。
【実施例１０】
【００６０】
ＴＬＲ−５が腸内の細菌感染に対して特別な役割を果たしているかどうかを検討するため、サルモネラ・ティフィムリウムをＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスに経口感染させた。予想と異なり、ＴＬＲ５−／−マウスはＴＬＲ５＋／＋マウスと比較して、サルモネラ・ティフィムリウムに対して耐性を生じていた（図８ａ）。Ｃ５７／ＢＬ６（図８ａ左）及びＣ５７／ＢＬ６Ｘ１２９Ｓｖ混合背景（図８ａ右）のどちらのマウスにおいても、同様の結果であった。また、腹腔内注射によりマウスをサルモネラ・ティフィムリウムに感染させても、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの間の生存率には顕著な違いは見られなかった（図８ｂ）。さらに経口感染から４日後、ＴＬＲ５−／−マウスでは、肝臓及び脾臓から回収された細菌の数が、ＴＬＲ５＋／＋マウスよりも顕著に少なかった（図８ｃ）。
【００６１】
経口感染から２４時間後のＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスのＭＬＮ、ＰＰ及びＬＰＣから回収した細菌数を調べたところ、ＰＰ及びＬＰＣ中のサルモネラ・ティフィムリウムの数は、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの間でほとんど差がなかった。しかしながら、ＭＬＮから回収された細菌数は、ＴＬＲ５＋／＋よりもＴＬＲ５−／−マウスの方が顕著に少なかったことから（図８ｄ）、ＴＬＲ５−／−マウスでは、腸管からＭＬＮへのサルモネラ・ティフィムリウムの移行が障害された結果、感染が全身に至るのを遅延させる可能性がある。
【００６２】
＜考察＞
ＴＬＲ５はインビトロで、フラジェリンに対する受容体として同定されたが、そのインビボでの機能は明確になっていない。他のＴＬＲファミリー構成員とは異なり、ＴＬＲ５はマウスの脾臓細胞、腹膜マクロファージ及びＣＭ−ＤＣには発現せず、それが自然免疫におけるＴＬＲ５の機能に対する取り組みを困難にしている。そこで、近年確立された、生存率の高いＬＰＣの単離方法を用い、ＴＬＲ５がマウスの腸管のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣに特異的に発現することを見出した（図４）。
【００６３】
ＤＣはＬＰでは絨毛上皮の下部にあり、腸から抗原を吸収することが知られてから長い年月がたつ（Mayrhofer, G., et. Al., Eur J Immunol 13, 112-22 (1983)）が、腸内におけるそれらの役割及び特性は知られていない。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、フラジェリンに対する応答として、炎症性サイトカイン、ケモカイン、抗菌ペプチド及び組織修復キナーゼを含む種々の介在物質の分泌を誘発した。そこで初めて、ＴＬＲ５を通してＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣで免疫応答が誘導されたことを示すものである。
【００６４】
本発明における分析の結果、ＴＬＲ５を通じたＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの機能について、２つの興味深い点が明らかになった。１つは、フラジェリンで刺激した際のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣのサイトカイン特性である。腸は食物抗原及び多数の片利共生細菌に絶え間なくさらされている。有益な抗原に対する寛容は、粘膜ＤＣにより制御されているようである（Mowat, A.M. Nat Rev Immunol 3, 331-41 (2003)）。これらのＤＣは調節性Ｔ細胞の活性を刺激し、Ｔ細胞応答の強力な抑制因子となっている。近年、ＣＤ１１ｃlowＣＤ４５ＲＢhighを発現しＩＬ−１０を産生するＤＣサブセットが、調節性Ｔ細胞における抑制機能を促進することが明らかになった（Wakkach, A., et al., Immunity 18, 605-17 (2003)）。ＰＰはこれらのＤＣサブセットを有し、炎症性刺激によりＩＬ−１０を産生し、経口寛容を発生させる（Niedergang, F. et al., Trends Microbiol 12, 79-88 (2004)， Ruedl, C., et al. , Eur J Immunol 26, 1801-6 (1996)）。ＣＤ１１ｃ＋ＰＰＣはＬＰＳに応答してＩＬ−１０を誘導したが、フラジェリンに刺激されたＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣはＩＬ−１０ではなくＩＬ−６及びＩＬ−１２を産生した（図５）。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、フラジェリンで刺激されると、免疫寛容ではなく炎症性応答を誘導する傾向がある。しかし、最近の報告において、ＬＰのＤＣは経口寛容誘導に関与することが明らかになっている（Chirdo, F.G., et al., Eur J Immunol 35, 1831-40 (2005))， Worbs, T., et al., J Exp Med 203, 519-27 (2006)）。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、細菌感染症において炎症性介在物質としての役割を果たしている可能性がある。より詳細な研究を行えば、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣによる免疫寛容と宿主防御との間の免疫機能の制御を理解するのに役立つであろう。
【００６５】
もう１つの興味深い点は、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおいてＴＬＲ４の発現が顕著に低いことである。腸内の大部分の共生細菌はグラム陰性嫌気性桿菌であり、その細胞壁中にＬＰＳを有している。最近の報告では、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは樹状突起を伸長させ、管腔から細菌を貪食することが明らかになっている（Niess, J.H., et al., Science 307, 254-8 (2005)）。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣによる細菌貪食機構は完全に解析されているが、宿主の腸管粘膜がどのように共生細菌に対する免疫寛容を獲得し、共生細菌と病原性細菌とを区別しているのかは、まだ明らかになっていない。ＴＬＲ４の低発現は、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣが共生細菌に対して過剰な免疫応答の誘導を避ける一因になっている可能性がある。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣは、ＴＬＲ４ではなく、主にＴＬＲ５を通して病原性有鞭毛細菌に対する炎症性応答を誘導する。共生細菌の中には鞭毛を有するものもあるが、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣはエンテロバクター・クロアカに対して強い応答を示さなかった。最近の研究では、α及びεプロテオバクテリア等の共生細菌の中には、鞭毛の運動性を損なうことなくＴＬＲ５のフラジェリン認識部位を変えるものがあると報告されている（Andersen-Nissen, E., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9247-52 (2005）)。さらに、共生細菌の中には、宿主環境が安定状態であると、フラジェリン発現を抑制するものがある（Niedergang, F., et al., Trends Microbiol 12, 79-88 (2004)）。病原性細菌とは異なり、共生細菌はＴＬＲ５の感知を免れる機構を有している可能性がある。
【００６６】
ＴＬＲ２及びＴＬＲ４のような他のＴＬＲファミリー構成員は、細菌成分を認識する。種々の細菌に対する宿主の防御においてＴＬＲ２及びＴＬＲ４が重要であることは、ＴＬＲ２−／−マウス及びＴＬＲ４−／−マウスを用いて実証されている。特に、ＴＬＲ４変異型Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、サルモネラ・ティフィムリウムによる腹腔内感染に対して非常に感受性が高い（Akira, S., et al., Cell 124, 783-801 (2006)）。しかしながら、ＴＬＲ５は腸管以外では高発現しないことから、腹腔内感染症の場合には、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの間に生存率の顕著な差が見られないと予想された。また、サルモネラ・ティフィムリウムの経口感染に対しては、むしろ、ＴＬＲ５−／−マウスの方がより感受性が高くなると思われた。というのも、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ上のＴＬＲ５は、有鞭毛細菌を感知して宿主の防御を誘導するからである。したがって、ＴＬＲ５−／−マウスがサルモネラ・ティフィムリウムの経口感染に耐性を有することは、予測していなかった（図８ａ）。また、ＴＬＲ５−／−マウスでは、腸管から肝臓又は脾臓へのサルモネラ・ティフィムリウムの移行が低下したため、ＴＬＲ５＋／＋よりも長く生存した（図８ｂ）。この予測し得なかった結果は、サルモネラ特有の病原性に密接に関係すると考えられる。
【００６７】
大部分の報告では、サルモネラ・ティフィムリウムはＰＰのＭ細胞を通じて移行した後（Hopkins, S.A., et al., Cell Microbiol 2, 59-68 (2000)）、上皮下ＤＣ又は小腸の管腔に突起を出している上皮内ＤＣに取り込まれることが示されている（Rescigno, M., et al., Nat Immunol 2, 361-7 (2001）。取り込まれた後、サルモネラ・ティフィムリウムは活発に宿主の小胞輸送経路を調整し、リソソームへの輸送を回避して複製に適した体制を確立する（Patel, J.C., et al., Trends Pharmacol Sci 26, 564-70 (2005)）。細菌を抱えたＤＣは成熟しＰＰのＴ細胞領域又は排出ＭＬＮに遊走する（Niedergang, F., et al., Trends Microbiol 12, 79-88 (2004)）。また、これらの成熟ＤＣは、血流を通じたサルモネラ・ティフィムリウムの肝臓及び脾臓への播種に関与すると考えられている（Niedergang, F., et al.,  Trends Microbiol 12, 79-88 (2004)， Vazquez-Torres, et al., Nature 401, 804-8 (1999)）。サルモネラ・ティフィムリウムのＰＰ及びＬＰＣへの取り込みは、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスでは差がなかった（図８ｄ）。さらに、インビトロでは、ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの間には、取り込みの差がなかった（データ表示なし）。ＴＬＲ５−／−のＭＬＮにおける細菌数はＴＬＲ５＋／＋マウスよりも顕著に低く、ＬＰからＭＬＮへサルモネラ・ティフィムリウムの移送が低下したことを示唆している。サルモネラ・ティフィムリウムは、完全に活性化してＴＬＲ５−／−のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを成熟させることができなかったので、サルモネラ・ティフィムリウムを抱えたＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣの末梢から循環系への遊走が、ＴＬＲ５−／−マウスにおいては不十分である可能性がある。ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ上のＴＬＲ５は、当初は有鞭毛病原性細菌を感知して宿主の防御を誘導するが、通性細胞内病原体であるサルモネラ・ティフィムリウムが全身性感染症に至る際、逆にＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣをキャリアとして利用している可能性がある。将来的に全身性サルモネラ・ティフィムリウム感染症の感染機構を明らかにするには、ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ特異的マーカを作製するか、またはこれらの細胞を枯渇させる技術を生み出す研究を行うことが必要である。また、本発明によるＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ上のＴＬＲ５を標的とした新規方法の開発は、全身性サルモネラ・ティフィムリウム感染症の新しい治療法の可能性を開くものであり、粘膜アジュバント免疫療法に役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＴＬＲ５−／−マウスの作製に関する図である。（ａ）ｔｌｒ５遺伝子、ターゲティングベクター及び予測される崩壊遺伝子の構造。四角に囲んだ部分は、コードするエクソンを表す。制限酵素：ＮｃｏＩ（ｂ）ヘテロ接合体異系交配による子孫のサザンブロット解析。ゲノムＤＮＡをマウス尾部から抽出し、ＮｃｏＩで消化し、電気泳動にかけ、（ａ）に示した放射標識プローブとハイブリダイズさせた。サザンブロッティングの結果、野生型マウス（＋／＋）では７．５ｋｂのバンド１本が認められ、ホモ接合体マウス（−／−）では６．２ｋｂのバンドが認められ、ヘテロ接合型マウス（＋／−）では両方のバンドが認められた。（ｃ）肝臓のノーザンブロット解析。小腸から抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡ（１０ｍｇ）を電気泳動にかけ、ナイロン膜上に移し、ＴＬＲ５をプローブに用いてハイブリダイズさせた。同じ膜を、β−アクチンプローブと再ハイブリダイズさせた。（ｄ）ＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝５）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝５）マウスの腹腔内に３０μｇの精製フラジェリンを注射した。表示された時点で、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の血清レベルを測定した。
【図２】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の各種細胞のＬＰＳ又はフラジェリン刺激後のサイトカインレベル及びｑ−ＰＣＲを示す図である。データは、独立した３回の実験から得られた結果の平均値±ＳＤである。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＧＭ−ＤＣ及びＰＥＣを、ＬＰＳ（１００ｎｍ／ｍｌ）又はフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）、あるいは培地のみで培養し、培養上清のサイトカインレベルを測定した結果である。（ｂ，ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の細胞又は臓器からＴｏｔａｌ ＲＮＡ（２μｇ）を抽出し、ｑ−ＰＣＲによりＴＬＲ５ｍＲＮＡレベルを測定した結果である。
【図３】ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−のＩＥＣを、培地のみ、あるいはフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ｃＤＮＡマイクロアレイを実施した結果を示す図である。
【図４】ＴＬＲ５のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおける発現に関する図である。データは、独立した３回の実験から得られた結果の平均値±ＳＤである。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの各種細胞からＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ｑ−ＰＣＲにより、ＴＬＲ５ｍＲＮＡレベルを測定した。（ｂ〜ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の小腸の凍結切片を固定し、抗ＣＤ１１ｃ抗体（赤）及び抗ＴＬＲ５抗体（緑）で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。（ｂ）腸：倍率４００倍、（ｃ）腸：倍率１６００倍、（ｄ）パイエル板：倍率４００倍。
【図５】ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおけるＴＬＲ５を介した自然免疫応答に関する図である。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣ及びＰＰＣを、培地のみ、あるいはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で培養し、培養上清中のサイトカインレベルを測定した。データは、独立した３回の実験から得られた結果の平均値±ＳＤである。
【図６】ＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおけるフラジェリンを介した遺伝子誘導に関する図である。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣをフラジェリン（１μｇ／ｍｌ）で刺激したもの、あるいはしなかったサンプルについて、ｃＤＮＡマイクロアレイを実施した。
【図７】ＴＬＲ５を介したＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣにおける病原性細菌に関する図である。データは、独立した３回の実験から得られた結果の平均値±ＳＤである。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣ及びＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣからＴｏｔａｌ ＲＮＡ（２μｇ）を抽出し、ＴＬＲ５の発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した（左図）。ｑ−ＰＣＲにより、ＴＬＲ５ｍＲＮＡの量を測定した（右図）。（ｂ）野生型、ＴＬＲ４−／−及びＴＬＲ５−／−マウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＳＰＣ及びＣＤ１１ｃ＋ＬＰＣを、熱殺菌エンテロバクター・クロアカ、熱殺菌サルモネラ・ティフィムリウム、熱殺菌サルモネラ・ティフィムリウムΔｆｌｉＡ、ＬＰＳ又はフラジェリンのいずれかの培地で培養し、培養上清中のサイトカインレベルを測定した。
【図８】サルモネラ・ティフィムリウムのＴＬＲ５を介した全身性感染に関する図である。（ａ）Ｃ５７／ＢＬ６背景であるＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝５）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝５）マウスに、５×１０８のサルモネラ・ティフィムリウムを経口感染させたマウスの生存率（左図）及びＣ５７／ＢＬ６×１２９Ｓｖ混合背景のＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝５）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝５）マウスに１×１０７のサルモネラ・ティフィムリウムを経口感染させたマウスの生存率（右図）。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの差について一般化ウィルコクソン検定を実施（Ｐ＜０．００１）。（ｂ）Ｃ５７／ＢＬ６背景のＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝５）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝５）マウスに１×１０６のサルモネラ・ティフィムリウムを腹腔内感染させた場合のマウスの生存率。ＴＬＲ５＋／＋及びＴＬＲ５−／−マウスの差について一般化ウィルコクソン検定を実施（Ｐ＝０．２６７）。（ｃ）Ｃ５７／ＢＬ６背景のＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝３）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝３）マウスに５×１０８のサルモネラ・ティフィムリウムを経口感染させ、９６時間後の肝臓及び脾臓における細菌数。（ｄ）Ｃ５７／ＢＬ６背景のＴＬＲ５＋／＋（ｎ＝５）及びＴＬＲ５−／−（ｎ＝５）マウスに５×１０８のサルモネラ・ティフィムリウムを経口感染させ、４８時間後のＭＬＮ、ＰＰＣ及びＬＰＣにおける細菌数。
【図１】
0005164034.tif 000002
【図２】
0005164034.tif 000003
【図３】
0005164034.tif 000004
【図４】
0005164034.tif 000005
【図５】
0005164034.tif 000006
【図６】
0005164034.tif 000007
【図７】
0005164034.tif 000008
【図８】
0005164034.tif 000009
【配列表】
0005164034000001.app