(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＧＴ−１を阻害する物質を含む、Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤であって、該ＢＧＴ−１を阻害する物質が、以下の、
（１）以下の（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチドからなるＢＧＴ−１遺伝子のｓｉＲＮＡ：
（ａ）  塩基配列５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＧＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号１）からなるヌクレオチド；若しくは
（ｂ）  塩基配列５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＧＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号１）を含み、かつ、配列番号３４のヌクレオチド配列番号１０５−１５９から選択される長さ２５〜４０の塩基配列からなるヌクレオチド；
（２）抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体；
（３）チアガビン；及び
（４）ＮＮＣ０５−２０９０
からなる群から選択される、前記Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤。
【請求項２】
ＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質を更に含む、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤であって、該ＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質が、以下の、
（１）以下の（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチドからなる、ＡＫＲ１Ｃ１遺伝子のｓｉＲＮＡ：
（ａ）  塩基配列５’−ＡＡＧＵＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡ−３’（配列番号１３）からなるヌクレオチド；
（ｂ）  塩基配列５’−ＡＡＧＵＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡ−３’（配列番号１３）を含み、かつ、配列番号３５のヌクレオチド配列番号７８−１３２から選択される長さ２５〜４０の塩基配列からなるヌクレオチド；
（２）抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体；及び
（３）フルフェナム酸
からなる群から選択される、前記Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製に関与する宿主因子ＢＧＴ−１及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害することでＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制するウイルス阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は輸血後の非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因ウイルスであり、このウイルスに起因する肝炎は慢性化率が高い。このウイルスのｃＤＮＡは、１９８９年にＣｈｏｏらによってクローニングされ（Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、３５９−３６２、１９８９）、フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであることが知られている（Ｋａｔｏ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、９５２４−９５２８、１９９０）。又、幾つかのグループにより全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされている。本発明者らは、以前にＨＣＶの完全長遺伝子を発現するベクターを作製している（ＷＯ９９／６７３９４号）。
【０００３】
Ｃ型肝炎の治療手段の発見が急がれているが、その理由の１つとして１００％有効な抗ウイルス効果を示す治療薬が確立していないことが挙げられる。現在最も有効な治療法はペグ化したインターフェロンとリバビリンの併用療法である。しかしながら、この療法でも、日本で抗体陽性者が多くインターフェロンの効果が低いＨＣＶの遺伝子型１ｂの感染者における著効率は５０%程度に止まっており、新規抗ウイルス剤の開発が切望されている。さらにＨＣＶ陽性者は全世界で１億７千万人、日本でも２００万人以上存在するといわれ、Ｃ型肝炎から肝癌・肝硬変に移行する確率も高いことから、早急な治療手段の確立が必要とされている。また、これまでにＨＣＶの複製に関与する非構造タンパク質（ＮＳ３、ＮＳ５）のプロテアーゼ活性阻害等による抗ウイルス薬の開発が試みられてきているが、ウイルス遺伝子に変異が多いことなどから十分な有効性は得られていない。
【０００４】
ＢＧＴ−１（ベタイン／ＧＡＢＡトランスポーター１）は、抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡトランスポーターの４つのサブタイプの中で、唯一ベタインに親和性をもつ。ベタインは細胞内外の浸透圧バランスを回復させるために合成される適合溶質と呼ばれる物質の１つで、狭義にはトリメチルグリシンを意味している。１９９２年にイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞からクローニングされた（Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、６４９−６５２、１９９２）。ＢＧＴ−１は末梢では主に腎臓及び肝臓に発現が見られ、中枢神経系では小脳、大脳皮質、脳幹などのアストログリアに存在する。しかしながら、ＢＧＴ−１の発現は必ずしもＧＡＢＡ作動性ニューロン近傍ではないことから、ＢＧＴ−１の役割はＧＡＢＡ作動性ニューロンの神経伝達終了というよりは、シナプスから流出してきたＧＡＢＡの除去かあるいは浸透圧制御に関与している可能性が高い。ＨＣＶとの関連はこれまで報告されていない。
【０００５】
ＡＫＲ１Ｃ１（Ａｌｄｏ−Ｋｅｔｏ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  １）はＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを利用してアルデヒドやケトンをアルコールに変換する作用を有し、細胞質に単体（３５ｋＤａ前後）で存在する。ＡＫＲ１Ｃ４とともに、肝臓に多く発現している（Ｓｔｅｃｋｅｌｂｒｏｅｃｋ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１６、１３００−１３０９、２００６）。乳癌などでの欠失も報告されている（Ｊｉ，Ｑら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４、７６１０−７６１７、２００４）。また、ＨＣＶの非構造タンパク質ＮＳ４ＢによってＡＫＲ１Ｃ１の発現が低下するとの報告もある（Ｚｈｅｎｇ，Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８、１５１−１６０、２００５）。
【０００６】
近年、動物の生体内で細胞内の特定の遺伝子の発現を抑制する方法として、標的遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを用いて標的遺伝子の発現を抑制する方法が見い出された（Ｆｉｒｅ  Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１（１９９８））。この方法はＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、タンパク質として発現されなくなる現象を利用するものである。ＲＮＡｉは、新規遺伝子の機能を遺伝子発現阻害により調べる上で有効な方法であり、線虫、ショウジョウバエなどの遺伝子機能解析に盛んに用いられている。しかしながら、ＲＮＡｉが病気の治療、特にＣ型肝炎などのウイルス性疾患の治療に有効であるか否かは不明であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＨＣＶ感染細胞においてウイルス複製を抑制できるＨＣＶ阻害薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまで、抗ＤＨＣＲ２４抗体を作製し（ＷＯ２００５／０１９２６８号）、これがＨＣＶ複製抑制効果をもつことを発見している（ＷＯ２００７／０９７４６１号）。そこで、抗ＤＨＣＲ２４抗体をＨＣＶ複製細胞へ加えた後、発現が低下する分子をマイクロアレイによって解析したところ、ＧＡＢＡトランスポーター（ＢＧＴ−１）及びＡＫＲ１Ｃ１であることがわかった。次に、これら分子の発現をそれぞれｓｉＲＮＡで低下させたところ、ＨＣＶの複製が有意に低下することを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、ＢＧＴ−１を阻害する物質を含む、Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を提供するものである。
また、本発明は、ＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質を含む、Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチドからなるＢＧＴ−１遺伝子のｓｉＲＮＡを提供する：
（ａ）  塩基配列５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＧＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号１）からなるヌクレオチド；
（ｂ）  塩基配列５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＧＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号１）を含む、長さ２５〜４０のヌクレオチド；
（ｃ）  配列番号１の塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつＣ型肝炎ウイルス複製を抑制できるヌクレオチド。
【００１１】
更に、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチドからなる、ＡＫＲ１Ｃ１遺伝子のｓｉＲＮＡを提供する：
（ａ）  塩基配列５’−ＡＡＧＵＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡ−３’（配列番号１３）からなるヌクレオチド；
（ｂ）  塩基配列５’−ＡＡＧＵＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡ−３’（配列番号１３）を含む、長さ２５〜４０のヌクレオチド；
（ｃ）  配列番号１３の塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつＣ型肝炎ウイルス複製を抑制できるヌクレオチド。
【００１２】
また、本発明は、配列番号２２で示される塩基配列からなるヌクレオチドに対応するｍＲＮＡに特異的に作用する、長さ１９〜４０ヌクレオチドからなり、かつＣ型肝炎ウイルス複製を抑制できるＡＫＲ１Ｃ１遺伝子のｓｉＲＮＡを提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＢＧＴ−１を阻害する物質及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質を含むＣ型肝炎ウイルス阻害剤を提供するものである。ＢＧＴ−１を阻害する物質又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質は、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１の発現抑制能又は活性低下能を有していればいかなる物質でもよく、由来や形状などで限定されるものではない。阻害物質としては、ｓｉＲＮＡ、抗体、阻害剤などが挙げられる。なお、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１への作用は、特異的であることが好ましい。
【００１４】
したがって、本明細書において、「阻害物質」とは、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１の遺伝子若しくはタンパク質の発現を抑制する物質、あるいは活性を阻害する物質を意味する。また、「ウイルス阻害剤」とは、ウイルスの複製を抑制し、又はウイルス感染細胞を障害する薬剤を意味する。
【００１５】
ＨＣＶの複製阻害効果の判定には、ＨＣＶレプリコン細胞を使用することができる（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、２８５（５４２４）：１１０−１１３）。ＨＣＶレプリコン細胞はＨＣＶの複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳ）領域にインディケーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を連結させたものである。ルシフェラーゼアッセイにより、ＨＣＶ複製活性を測定することができる。また、ＨＣＶ感染系（Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５、１１（７）、７９１−７９６）を用いてウイルス阻害活性を検討することもできる。
【００１６】
以下に阻害物質について説明する。
１．  ｓｉＲＮＡ
本発明のｓｉＲＮＡは、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１の発現を抑制することによってＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制できるものであれば合成品でも発現ベクターを用いたものでもよい。
【００１７】
本発明のｓｉＲＮＡは１本鎖でも２本鎖でもよく、さらに２本以上の複数の鎖から形成されていてもよいが、好ましいのは２本鎖である。２本鎖は独立した２本の鎖から形成されていてもよく、自己相補的な１本鎖ＲＮＡ中で形成される２本鎖でもよい。ｓｉＲＮＡが２本鎖の場合、全ての領域において２本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が１本鎖等になっていてもよい。
【００１８】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１のｍＲＮＡへの結合能を有していればよく、その長さは限定されない。本発明のｓｉＲＮＡの長さは、例えば、５〜１０００ヌクレオチド（２本鎖の場合には５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド（２本鎖の場合には１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５ヌクレオチド（２本鎖の場合には１５〜２５ｂｐ）である。
【００１９】
例えば、ＢＧＴ−１のｓｉＲＮＡとしては、配列番号１〜１０のヌクレオチドが挙げられる。配列番号１からなるヌクレオチドが好ましい。配列番号１の塩基配列を含む長さ２５〜４０のヌクレオチドも使用することができる。また、配列番号１の塩基配列に１〜数個の欠失、置換、及び／又は付加を含むヌクレオチドも使用することができる。具体的には、配列番号１の塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制できるヌクレオチドであれば、本発明のｓｉＲＮＡとして使用することができる。以下の表１にＢＧＴ−１遺伝子の例示的ｓｉＲＮＡを記載する。
【００２０】
【表１】
0005283106.tif 000002
【００２１】
ＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１１〜２１のヌクレオチドが挙げられる。配列番号１３からなるヌクレオチドが好ましい。配列番号１３の塩基配列を含む長さ２５〜４０のヌクレオチドも使用することができる。また、配列番号１３の塩基配列に１〜数個の欠失、置換、及び／又は付加を含むヌクレオチドも使用することができる。具体的には、配列番号１３の塩基配列からなるヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制できるヌクレオチドであれば、本発明のｓｉＲＮＡとして使用することができる。あるいは、配列番号２２で示される塩基配列（AAAAGTAAAG CTTTAGAGGC CACCAAATTG GCAATTGAAG CTGGCTTCCG CCATATTGAT TCTGCTCATT TATACAATAA）からなるヌクレオチドに対応するｍＲＮＡに特異的に作用する、長さ１９〜４０のヌクレオチドもＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡとして使用することができる。具体的には、配列番号１３〜１７が挙げられる。以下の表２にＡＫＲ１Ｃ１遺伝子の例示的ｓｉＲＮＡを記載する。
【００２２】
【表２】
0005283106.tif 000003
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、当業者であれば、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｓｈａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９の記載を参照して適宜決定できるものであるが、例として、以下の条件を挙げることができる。０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）中で、４２℃以上、例えば５０℃〜６５℃または６５〜７０℃で４時間〜一晩インキュベーションし、次いで、６×ＳＳＣ中にて室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中にて室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中にて６８℃で２０分間洗浄する条件。
【００２４】
本発明に用いるｓｉＲＮＡは特に限定されず、修飾されていない通常のＲＮＡの他に、リン酸ジエステル部や糖部などを修飾した修飾ＲＮＡなどを用いることも可能である。又、本発明のｓｉＲＮＡは、その一部分にＤＮＡなどのＲＮＡでない分子を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡは当業者に公知の方法で作製することができる。具体的には、本発明に使用するｓｉＲＮＡは、公知の方法で合成することができる。また、細胞内で発現するように、公知の方法でレンチウイルスベクターに組み込んだものも使用できる。その他、ｓｉＲＮＡを生体内に送達して作用させるための公知の各種送達法（ウイルスベクター、リポソーム、アテロコラーゲン等）も利用できる。
【００２６】
本発明のｓｉＲＮＡは、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤などに調製することができる。さらに凍結乾燥剤とすることもできる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡは、例えばリポソームやアテロコラーゲンなどと混合し、患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈注射などが可能である。さらには、持続性、膜透過性を高める封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２８】
本発明のｓｉＲＮＡの投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。ｓｉＲＮＡの安定性を考慮すると有効な期間は投与後一週間が限度であるため、週に１回以上投与することが好ましい。
【００２９】
２．  抗体
ＢＧＴ−１を阻害する物質及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質が抗体である場合、本発明に使用する抗体は、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１の活性を阻害することによってＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制できるものである限り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３０】
また、本発明の抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。
さらに、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよいし、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体、糖鎖改変抗体など、いかなる抗体でもよい。２価抗体を使用することもできる。例えば、抗体の断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、diabodyなどが挙げられる。
【００３１】
本発明で使用される抗ＢＧＴ−１抗体及び抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明に用いる抗ＢＧＴ−１抗体及び抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの、などを含む。このような抗体は、当業者に公知の方法によって得ることが可能である。
【００３２】
抗体の修飾物として、細胞傷害性物質やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＢＧＴ−１抗体又は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、このように他の物質と結合している抗体修飾物も包含される。
【００３３】
さらに、本発明で使用される抗体は、２重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。２重特異性抗体はＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する２重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン、放射性物質等の細胞傷害性物質を認識してもよい。
【００３４】
抗体をウイルス阻害剤として用いる場合、有効投与量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．００１〜１,０００ｍｇの範囲で選択することができる。あるいは、患者あたり０．０１〜１００,０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で選択することができる。しかしながら、抗ＢＧＴ−１抗体及び／又は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体を含有するウイルス阻害剤は、これらの投与量に限定されるものではない。
【００３５】
ウイルス阻害剤の投与時期としては疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず、例えば、１日１〜３回、１週間に１〜７日投与することが可能である。
本発明のウイルス阻害剤は、通常、非経口投与で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）として投与されるが、これらに限定されものではなく、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、経口などで投与してもよい。
【００３６】
抗ＢＧＴ−１抗体及び／又は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体を有効成分として含有する本発明のウイルス阻害剤は、常法にしたがって製剤化することができ（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、米国を参照されたい）、医薬的に許容される担体や添加物を更に含んでいてもよい。
【００３７】
このような担体および医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００３８】
実際には、本発明のウイルス阻害剤の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選択されるが、これらに限定されるものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ＢＧＴ−１抗体及び／又は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体を、溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００３９】
３．  阻害剤
ＢＧＴ−１を阻害する物質及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質が阻害剤である場合、本発明に使用する阻害剤は、ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１の活性を阻害することによってＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制できるものである限り、どのような化合物でもよい。
【００４０】
ＢＧＴ−１の阻害剤としては、例えば、グリシントランスポーター阻害剤の一種である１−（３−（９Ｈ−カルバゾール−９−イル）−１−プロピル）−４−（２−メトキシフェニル）−４−ピペリジノール（ＮＮＶ０５−２０９０）（Ｓｏｕｄｉｊｎ，Ｗ．及びＷｉｎｇａａｒｄｅｎ，Ｉ．ｖａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７、１０６３−１０７９、２０００）、ＮＮＣ０５−２０９０、チアガビンを用いることができる。
【００４１】
ＡＫＲ１Ｃ１の阻害剤としては、例えば、フルフェナム酸（Ｓｔｅｃｋｅｌｂｒｏｅｃｋ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ、３１６、１３００−１３０９、２００６）を用いることができる。
【００４２】
ＢＧＴ−１阻害剤及び／又はＡＫＲ１Ｃ１阻害剤を本発明のウイルス阻害剤に使用する場合、錠剤で経口投与される。１日あたりの投与量は成人で３２〜５６mgであり、これを２〜４等分して投与し、効果が得られるまで継続する。
【００４３】
また、本発明は、ＢＧＴ−１遺伝子のｓｉＲＮＡ及びＡＫＲ１Ｃ１遺伝子のｓｉＲＮＡを提供するものである。ｓｉＲＮＡの配列、長さ、構造などについては上に記載している。
【００４４】
更に、本発明は、ＢＧＴ−１を阻害する物質及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質をＣ型肝炎ウイルス感染者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染に由来する疾患を予防又は治療するための方法に関するものである。ＢＧＴ−１を阻害する物質と、ＡＫＲ１Ｃ１を阻害する物質とを併用することが好ましい。阻害物質としては、上記ｓｉＲＮＡ、抗体、阻害剤などを用いることができる。
【実施例】
【００４５】
１．  ＨＣＶ複製に関連する遺伝子の特定
本研究では、レプリコン細胞Ｈｕｈ−７（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、２８５（５４２４）：１１０−３）に、ルシフェラーゼ遺伝子とネオ遺伝子を融合させたユニットと、３種のＨＣＶの非構造タンパク質領域（ＮＳ３−ＮＳ５ｂ）とを組み込み、Ｇ４１８で選択して樹立したＨＣＶ複製細胞（ＦＬＲ３−１及びＲ６ＦＬＲ−Ｎ）を用いた。この細胞を用いることにより、ＨＣＶ複製活性をルシフェラーゼアッセイで測定することができる。また、ＨＣＶ複製細胞（ＦＬＲ３−１又はＲ６ＦＬＲ−Ｎ）にインターフェロンα（１００ＩＵ／ｍｌ）を７２時間以上処理してＨＣＶ複製レベルを低下させた回復細胞を対照として用いた（Ｇｕｏ  ＪＴ，Ｂｉｃｈｋｏ  ＶＶ，Ｓｅｅｇｅｒ  Ｃ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１、７５（１８）：８５１６−２３を参照されたい）。細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＧｌｕｔａＭａｘ  Ｉにペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＣＳ（ＳＩＧＭＡ）を加えて培養した。
【００４６】
ＨＣＶ複製細胞（ＦＬＲ３−１及びＲ６ＦＬＲ−Ｎ）（Ｎａｋａｇａｗａ、Ｓ．ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．３５３、８８２−８８８、２００６）および回復細胞に抗ＤＨＣＲ２４抗体（ＷＯ２００７／０９７４６１号）又は正常マウスＩｇＧ１抗体（対照、ミリポア社）を投与し、これらの細胞からｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  オリゴＤＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により、抗ＤＨＣＲ２４抗体処理／対照抗体処理のシグナル比を測定した。回復細胞でシグナル比が低く、ＦＬＲ３−１及びＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞で共通して高いシグナル比を示す配列を解析したところ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ベタイン／ＧＡＢＡトランスポーター；ＢＧＴ−１），ｍｅｍｂｅｒ  １２（ＳＬＣ６Ａ１２  ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号；ＮＭ＿００３０４４）、及びＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１  ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号；ＮＭ＿０００１３５３）であった。
【００４７】
すなわち、ＨＣＶ複製細胞を抗ＤＨＣＲ２４抗体で処理すると、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１の発現が低下することがわかった。
２．  ｓｉＲＮＡによるＨＣＶ複製抑制活性
ＢＧＴ−１又はＡＫＲ１Ｃ１を特異的にサイレンシングするｓｉＲＮＡをそれぞれ作製し、Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にリバーストランスフェクションした。用いたｓｉＲＮＡの配列は以下の通りである。
ＢＧＴ−１遺伝子：
ｓｉＲＮＡ：  5’-CAACAAGAUGGAGUUUGUGCUGUCA-3’（配列番号１）
対照ｓｉＲＮＡ：  5’-CAAAGAGGUUGAGUUCGUGUCAUCA-3’（配列番号２３）
ＡＫＲ１Ｃ１遺伝子：
ｓｉＲＮＡ：  5’-AAGUAAAGCUUUAGAGGCCACCAAA-3’（配列番号１３）
対照ｓｉＲＮＡ：  5’-AAGAACGUUAUAGGGCCCACAUAAA-3’（配列番号２４）
ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクションは以下のようにして行った。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地の入った９６ウェルプレート（ファルコン）のウェル中に終濃度４．２、１２．６、及び２５．２ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを加えて穏やかに混合した。リポフェクタミンＴＭＲＮＡｉＭＡＸを使用前に混合してウェルに加え（０．１μｌ／ウェル）、穏やかに混合し、１０〜２０分間室温にて静置した。１ウェルあたり５×１０３個のＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で５時間培養した。培地を１０％ＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘに交換し、３７℃、５％ＣＯ２で更に培養した。対照として、培地にｓｉＲＮＡを添加せずリポフェクタミンのみを加えた（「Ｌｉｐｏ」）プレートと、培地のみ（「Ｎｏ」）のプレートを用いた。
【００４８】
培養２４、４８、及び７２時間後、ルシフェラーゼアッセイにてＨＣＶ複製活性を測定した。複製活性は、対照ｓｉＲＮＡ処理群（「Ｃｔｒｌ」）の発光強度を１００％として表す。なお、実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。また、統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定にて行った。
【００４９】
ＢＧＴ−１のｓｉＲＮＡで処理したＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞（「ＢＧＴ−１」）では、処理後７２時間において、４．２ｎＭ  ｓｉＲＮＡでもＨＣＶの複製が１０±４％以下に抑制された（図１Ａ、Ｃｔｒｌ対ＢＧＴ−１、ｐ＜０．０５）。
【００５０】
同様に、ＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡで処理したＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞（「ＡＫＲ１Ｃ１」）では、処理後７２時間において、４．２ｎＭ  ｓｉＲＮＡでもＨＣＶの複製が４０±１％まで低下し、有意な抑制作用を示すことが明らかとなった（図２Ａ、Ｃｔｒｌ対ＡＫＲ１Ｃ１、ｐ＜０．０５）。
【００５１】
次に、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡのＨＣＶ複製抑制効果がｓｉＲＮＡの人工的な阻害作用によるものでないことを確認するため、ＤＨＣＲ２４の発現を抑制するｓｉＲＮＡを２種類作製し、Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞（図３Ａ）又はＦＬＲ３−１細胞（図３Ｂ）に加えて７２時間培養後、ＨＣＶ複製抑制活性を同様に測定した。ｓｉＲＮＡは、ＤＨＣＲ２４遺伝子のヌクレオチド４１７−４３５番に対するｓｉＲＮＡ（「ＤＨＣＲ２４＿４１７」）及び１０２４−１０４２番に対するｓｉＲＮＡ（「ＤＨＣＲ２４＿１０２４」）を作製した。陰性対照として変異体ｐ５３遺伝子（ｐ５３ｍ２）に対するｓｉＲＮＡを、陽性対照としてＨＣＶに対するｓｉＲＮＡを用いた。ＨＣＶ（Ｒ５）のｓｉＲＮＡはＨＣＶ−１ｂ型に、ＨＣＶ（Ｒ７）のｓｉＲＮＡはＨＣＶ−２ａ型に用いた。用いたｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
ｐ５３ｍ２のｓｉＲＮＡ：5'-GACUCCAGUGAUAAUCUGCUU-3'（配列番号２５）
ＨＣＶ（Ｒ５）のｓｉＲＮＡ：5’-GUCUCGUAGACCGUGCAUCAUU-3’（配列番号２６）
ＨＣＶ（Ｒ７）のｓｉＲＮＡ：5’-GUCUCGUAGACCGUGCACCATT-3’（配列番号２７）
ＤＨＣＲ２４（４１７−４３５）のｓｉＲＮＡ：5'-GUACAAGAAGACACACAAAUU-3'（配列番号２８）
ＤＨＣＲ２４（１０２４−１０４２）のｓｉＲＮＡ：5'-GAGAACUAUCUGAAGACAAUU-3'（配列番号２９）
その結果、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡが対照ｓｉＲＮＡよりも有意なＨＣＶ複製抑制効果を示す最小有効濃度は０．５ｎＭであったのに対し（データは示していない）、ＨＣＶ（Ｒ５又はＲ７）のｓｉＲＮＡは０．１ｎＭで有意なＨＣＶ複製抑制効果を発揮したが、ＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡが有意なＨＣＶ複製抑制効果を発揮するには１．０ｎＭ以上必要であった（図３Ａ及び３Ｂ）。したがって、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡは、ＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡよりもＨＣＶの複製を有効に抑制し、ｓｉＲＮＡの人工的な阻害作用による影響でないことが確認された。
【００５２】
３．  ｓｉＲＮＡによるＨＣＶ複製細胞障害活性
上記と同様にして、９６ウェルプレート（ファルコン）中でｓｉＲＮＡをＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にリバーストランスフェクションした。培養２４、４８、及び７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、３７℃で１時間呈色反応を行い、生細胞数を測定した。結果は、対照ｓｉＲＮＡ処理群の細胞生存率を１００％として表す。なお、実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。また、統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定にて行った。
【００５３】
その結果、ＢＧＴ−１のｓｉＲＮＡで処理した細胞では、調べたいずれのｓｉＲＮＡ濃度でも有意な細胞障害活性は見られなかった（図１Ｂ）。
ＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡで処理した細胞では、処理後７２時間において、４．２ｎＭ  ｓｉＲＮＡでも細胞生存率が５３±１８％まで低下し、有意な細胞障害活性を示すことが明らかとなった（図２Ｂ、ｐ＜０．０５）。
【００５４】
次に、上記のＨＣＶ又はＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡをＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞又はＦＬＲ３−１細胞に加えて７２時間培養し、ＨＣＶ複製細胞障害活性を同様に測定した。
その結果、ＨＣＶ（Ｒ５）のｓｉＲＮＡを１．０ｎＭ濃度で添加したとき細胞生存率は６０％まで低下し、細胞障害活性を示したが、ＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡは１．０ｎＭでも細胞生存率が８２〜９８％であり、ほとんど細胞障害活性を示さなかった（図３Ｃ及びＤ）。したがって、ＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡは、ＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡよりもＨＣＶ複製細胞を有意に障害することがわかった。
【００５５】
４．  ウェスタンブロット法及びＰＣＲ法によるｓｉＲＮＡ発現抑制作用の確認
ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１の発現、並びにｓｉＲＮＡによる発現抑制はウェスタンブロット法とＰＣＲ法で解析した。
【００５６】
ウサギ抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）及びマウス抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は、それぞれ３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：５０００及び１：２５００に希釈して用いた。ＨＲＰ標識２次抗体（抗マウス抗体（インビトロジェン）、抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ））は３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１：５０００に希釈して用いた。ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１の発現を検出し、ｓｉＲＮＡによるサイレンシングを確認した（データは示していない）。
【００５７】
また、ＢＧＴ−１遺伝子及びＡＫＲ１Ｃ１遺伝子のｓｉＲＮＡによる発現抑制については、下記のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法でも確認した（データは示していない）。
ＢＧＴ−１
Forward：  5'-ATGGACGGGAAGGTGGCAGTGCAAGAG-3'（配列番号３０）
Reverse：  5'-CAAATGGGTCTCCTTCTCCCCGGCTAT-3'（配列番号３１）
ＡＫＲ１Ｃ１
Forward：  5'-ATGGATTCGAAATATCAGTGTGTGAAG-3'（配列番号３２）
Reverse：  5'-ATATTCATCAGAAAATGGATAATTAG-3'（配列番号３３）
５．  抗体によるＨＣＶ複製抑制活性
ＦＬＲ３−１細胞及びＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞に、ウサギ抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）又はマウス抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を加えて７２時間培養した。培養後、ルシフェラーゼアッセイを行い、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定してＨＣＶ複製抑制活性を調べた。抗ＢＧＴ−１抗体の対照として正常ウサギ血清を、抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体の対照として正常マウス血清を用いた。いずれの抗体も３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００〜１００００倍に希釈した。実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
【００５８】
その結果、ＦＬＲ３−１細胞に１００倍希釈した抗体を添加したとき、正常マウス血清ではＲＬＵが１．２×１０４であったのに対し、抗ＢＧＴ−１抗体では６×１０３まで低下した（図４Ａ、ｐ＜０．０５）。Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞に１００倍希釈した抗体を添加した場合は、正常マウス血清が５７×１０３であったのに対し、抗ＢＧＴ−１抗体では８×１０３まで低下した（図４Ｂ、ｐ＜０．０５）。したがって、抗ＢＧＴ−１抗体はＨＣＶの複製を有意に抑制することがわかった。
【００５９】
６．  抗体によるＨＣＶ複製細胞障害活性
ＦＬＲ３−１細胞及びＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞に、上記のウサギ抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体又はマウス抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体を加えて７２時間培養した。培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、３７℃で１時間呈色反応を行い、ＯＤ４５０／６５０を測定した。抗ＢＧＴ−１抗体の対照として正常ウサギ血清を、抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体の対照として正常マウス血清を用いた。いずれの抗体も３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００〜１００００倍に希釈した。実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
【００６０】
その結果、ＦＬＲ３−１細胞では、抗ＢＧＴ−１抗体を１０００倍希釈して添加したときＯＤ４５０／６５０は約１．３であったが、１００倍希釈では０．６まで低下した（図５Ａ、ｐ＜０．０５）。Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞では、抗ＢＧＴ−１抗体を１０００倍希釈して添加したときＯＤ４５０／６５０は１．２であったが、１００倍希釈では０．３まで低下した（図５Ｂ、ｐ＜０．０５）。したがって、抗ＢＧＴ−１抗体はＨＣＶ複製細胞を有意に障害することがわかった。
【００６１】
７．  阻害剤によるＨＣＶ複製抑制活性
ＨＣＶ複製細胞に、ＢＧＴ−１阻害剤であるチアガビン又はＡＫＲ１Ｃ１阻害剤であるフルフェナム酸を加えて培養し、ＨＣＶ複製抑制作用をルシフェラーゼアッセイにて検討した。チアガビンは滅菌蒸留水に溶解して最終濃度１ｍＭとし、フルフェナム酸は１％ＥｔＯＨに溶解して最終濃度１μＭ〜１ｍＭとした。阻害剤の作用は迅速であることが予測されたため、反応時間は２４時間で検討した。ＨＣＶ複製細胞はＦＬＲ３−１、Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ（以上遺伝子型１ｂ型）及びＪＦＨ１（遺伝子型２ａ：Ｋａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３、１２５（６）：１８０８−１７）を用いた。また、培地のみを「対照」とした。実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
【００６２】
また、他のＢＧＴ−１阻害剤であるＮＮＣ０５−２０９０をＲ６ＦＬＲ−Ｎ細胞へ加えて２４〜７２時間培養後、同様にルシフェラーゼアッセイを行った。ＮＮＣ０５−２０９０はＤＭＳＯに溶解して最終濃度０．１〜１０μＭとした（図７）。
【００６３】
その結果、チアガビンはいずれのＨＣＶ複製細胞でも対照の１２．６±１．５〜３６±１．２％までＲＬＵを低下させ、有意なＨＣＶ複製抑制活性を示した（図６Ａ、ｐ＜０．０５）。ＮＮＣ０５−２０９０は１０μＭで処理したとき、２４時間培養でも溶媒処理群（「ＤＭＳＯ」）と比較してＲＬＵが３０％に低下し、有意なＨＣＶ複製抑制活性を示した（図７Ａ、ｐ＜０．０５）。フルフェナム酸は１００μＭで処理したときＲＬＵが０μＭの４０±１０〜８５．２±６％に低下し、有意なＨＣＶ複製抑制活性を示した（図８Ａ、ｐ＜０．０５）。
【００６４】
８．  阻害剤によるＨＣＶ複製細胞障害活性
上記と同様にして、チアガビン（１ｍＭ）、ＮＮＣ０５−２０９０（０．１〜１０μＭ）、及びフルフェナム酸（１μＭ〜１ｍＭ）によるＨＣＶ複製細胞障害活性をＷＳＴアッセイで検討した。実験は３重にて行い、平均±標準誤差をグラフに示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
【００６５】
その結果、チアガビンは、ＦＬＲ３−１細胞でのみＨＣＶ複製細胞を有意に障害した（図６Ｂ、ｐ＜０．０５）。ＮＮＣ０５−２０９０は、処理後２４時間では１０μＭにおいてＯＤ値が溶媒処理群の約２３％に低下し（図７Ｄ、ｐ＜０．０５）、処理後４８時間では３μＭにおいて溶媒処理群の約２６％に低下し（図７Ｅ、ｐ＜０．０５）、有意なＨＣＶ複製細胞障害活性を示した。フルフェナム酸は、１００μＭで処理したとき、いずれのＨＣＶ複製細胞でもＯＤ値が０μＭの８０％以下に低下し、有意な細胞障害活性を示した（図８Ｂ、ｐ＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
ＢＧＴ−１及び／又はＡＫＲ１Ｃ１を阻害することにより、ＨＣＶの複製を高度に特異的に抑制することが可能であり、また、ＨＣＶ感染細胞を特異的に障害することによってＣ型肝炎の治療が可能である。特に、ＢＧＴ−１及びＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡは、ＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡよりも低濃度でＨＣＶ複製を抑制することでき、またＢＧＴ−１のｓｉＲＮＡは細胞毒性が少ないことなどから、ＨＣＶ感染の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にＢＧＴ−１のｓｉＲＮＡを加えて（「ＢＧＴ−１」）７２時間培養後、（Ａ）ＨＣＶ複製抑制活性及び（Ｂ）ＨＣＶ複製細胞障害活性を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図中、「Ｃｔｒｌ」は対照ｓｉＲＮＡ処理群、「Ｌｉｐｏ」はｓｉＲＮＡを添加せずリポフェクタミンのみを添加、「Ｎｏ」は培地のみを表す。対照ｓｉＲＮＡ処理群の値を１００％として表す。
【図２】Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にＡＫＲ１Ｃ１のｓｉＲＮＡを加えて（「ＡＫＲ１Ｃ１」）７２時間培養後、（Ａ）ＨＣＶ複製抑制活性及び（Ｂ）ＨＣＶ複製細胞障害活性を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図中、「Ｃｔｒｌ」は対照ｓｉＲＮＡ処理群、「Ｌｉｐｏ」はｓｉＲＮＡを添加せずリポフェクタミンのみを添加、「Ｎｏ」は培地のみを表す。対照ｓｉＲＮＡ処理群の値を１００％として表す。
【図３】Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞（Ａ及びＣ）又はＦＬＲ３−１細胞（Ｂ及びＤ）に、ＨＣＶ（Ｒ５又はＲ７）及びＤＨＣＲ２４のｓｉＲＮＡを処理して７２時間培養後、ＨＣＶ複製抑制活性（Ａ及びＢ）及びＨＣＶ複製細胞障害活性（Ｃ及びＤ）を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。数値は変異体ｐ５３遺伝子（ｐ５３ｍ２）に対するｓｉＲＮＡの値を１００％として表す。
【図４】（Ａ）ＦＬＲ３−１細胞及び（Ｂ）Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にウサギ抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体又はマウス抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体を加え、培養後７２時間にＨＣＶ複製抑制活性を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。「−」は抗体非添加を表し、正常マウス血清は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体の対照として、正常ウサギ血清は抗ＢＧＴ−１抗体の対照として用いた。
【図５】（Ａ）ＦＬＲ３−１細胞及び（Ｂ）Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にウサギ抗ＢＧＴ−１ポリクローナル抗体又はマウス抗ＡＫＲ１Ｃ１ポリクローナル抗体を加え、培養後７２時間にＨＣＶ複製細胞障害活性測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。「−」は抗体非添加を表し、正常マウス血清は抗ＡＫＲ１Ｃ１抗体の対照として、抗ウサギ血清は抗ＢＧＴ−１抗体の対照として用いた。
【図６】ＦＬＲ３−１、Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ、及びＪＦＨ１細胞に、ＢＧＴ−１阻害剤チアガビンを最終濃度０又は１ｍＭで加えて２４時間培養後、（Ａ）ＨＣＶ複製抑制活性及び（Ｂ）ＨＣＶ複製細胞障害活性を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。「対照」は培地のみを表す。
【図７】Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ細胞にＢＧＴ−１阻害剤ＮＮＣ０５−２０９０を最終濃度０．１〜１０μＭで加えて培養後、２４時間（Ａ及びＤ）、４８時間（Ｂ及びＥ）、及び７２時間（Ｃ及びＦ）に、ＨＣＶ複製抑制活性（Ａ〜Ｃ）及びＨＣＶ複製細胞障害活性（Ｄ〜Ｆ）を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。「ＤＭＳＯ」は溶媒添加、「Ｎｏ」は培地のみを表す。
【図８】ＦＬＲ３−１、Ｒ６ＦＬＲ−Ｎ、及びＪＦＨ１細胞にＡＫＲ１Ｃ１阻害剤フルフェナム酸を最終濃度１ｍＭで加えて２４時間培養後、（Ａ）ＨＣＶ複製抑制活性及び（Ｂ）ＨＣＶ複製細胞障害活性を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。「対照」は培地のみを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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