(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にプラスチックを含む支持体と、
前記表面上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層と、
前記プライマー層上に配置された、前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結された、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を含む親水性層と
を少なくとも含み、
前記プライマー層が前記支持体の表面に物理吸着により結合している基材。
【請求項２】
前記プラスチックがポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、及びポリエチレンテレフタラートからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項１の基材。
【請求項３】
前記エチレングリコール鎖の一端が前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結されており、前記エチレングリコール鎖の他端が、他の物質と共有結合を形成可能な官能基と連結されている、
請求項１又は２の基材。
【請求項４】
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性層中の窒素濃度が、前記親水性層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
請求項３の基材。
【請求項５】
前記エチレングリコール鎖の一端が前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結されており、前記エチレングリコール鎖の他端がヒドロキシル基で封鎖されている、請求項１又は２の基材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の基材の製造方法であって、
前記支持体の表面上において、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を重合させ、ポリシロキサンを含むプライマー層を形成する、プライマー層形成工程と、
前記プライマー層とエチレングリコール又はポリエチレングリコールとを、エチレングリコール又はポリエチレングリコールのヒドロキシル基と、前記シラノール化合物の前記官能基である、或いは前記シラノール化合物の前記官能基から誘導された、前記ポリシロキサンの側鎖上の官能基との反応により、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖が前記側鎖に共有結合を介して連結されるように反応させる、親水性層形成工程と、を含む方法。
【請求項７】
前記プライマー層形成工程が、
加水分解により前記シラノール化合物を生成するケイ素化合物を加水分解し、前記シラノール化合物を生成する工程と、
前記シラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程と
を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
前記ケイ素化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランである、請求項７の方法。
【請求項９】
前記親水性層形成工程よりも後に、前記エチレングリコール鎖の、ポリシロキサンと連結していない側の末端に、他の物質と共有結合を形成可能な官能基を連結する、官能基連結工程を更に含み、
前記官能基連結工程は、前記エチレングリコール鎖のヒドロキシル基との反応により前記官能基を付与する前駆体化合物が、実質的に無水の、アセトニトリルもしくはジメチルスルホキシド又はこれらの溶媒の混合溶媒中に溶解した溶液と、前記親水性層とを、４〜２５℃にて接触させる工程を含む、
請求項６〜８のいずれか１項の方法。
【請求項１０】
前記官能基が(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基であり、かつ、前記前駆体化合物が１，１’−カルボニルジイミダゾールである、或いは、前記官能基がスクシンイミジルオキシカルボニル基であり、かつ、前記前駆体化合物が炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）である、請求項９の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試験器具等を構成する材料として有用な、表面に親水性層を有する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸収、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高い。しかし、実際には固相担体への生体分子の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおけるノイズの主な原因となっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的と言わざるを得ない。そこで、生体分子の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）に注目が集まっている。すなわち、抗体または抗原の固定化を、ＰＥＧリンカーを介して行うことによって、固相担体への生体分子の非特異吸着を防ぐ試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧリンカーを介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に非イオン性官能基を導入し、ここにヘテロ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に抗体を結合させる、というものである。この方法によって表面プラズモン共鳴法におけるノイズが有意に低減されることが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ＰＥＧリンカーを介して核酸やタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧリンカーを有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧリンカーの末端に核酸やタンパク質を結合させる、というものである。この方法によってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ＰＥＧリンカーを介して核酸をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、シランカップリング剤をガラス表面に適用してアミノ基を導入し、ここにホモ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に核酸を結合させる、というものである。この方法によってバイオセンサの感度が改善されることが記載されている。
【０００６】
一方、免疫アッセイ等の各種生化学試験では、プラスチック製の実験器具が利用されることが多い。ただしプラスチックは疎水性であるため、親水性が求められる用途に用いるために、プラスチック基材の表面を親水性に改質する処理が行われる場合がある。そのような処理としてはコロナ放電処理、プラズマ処理、ＵＶオゾン処理、電子線照射、レーザー処理等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１６４３４８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０９２０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般的に、プラスチックは成型し易く、輸送上、廃棄上の問題が小さいという利点がある。このためＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイ用担体等の生化学試験用器具の材料としてプラスチックは好ましい。しかしながら、免疫アッセイにおける被固定化物質を連結するためのＰＥＧリンカーや、器具表面に親水性を付与するためのエチレングリコール（以下「ＥＧ」という）又はＰＥＧを含む親水性層を、プラスチックを含む支持体表面に導入することは従来困難であった。例えばＰＥＧリンカーを有する従来の免疫アッセイ用担体は、支持体としてガラス、金等の無機材料を支持体とせざるを得なかった。その理由として、プラスチックを含む表面に、ＰＥＧ鎖を連結するための起点となる官能基を高密度に導入することが困難であること、大部分のプラスチックは化学薬品に対する耐性が低いことが挙げられる。
【０００９】
そこで本発明は、プラスチックを含む支持体の表面に、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（以下「ＥＧ鎖」という）を含む親水性層が導入された基材、及び該基材の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、表面にプラスチックを含む支持体上にポリシロキサンを含むプライマー層を配置し、該プライマー層上に、ＰＥＧ又はＥＧをポリシロキサンの側鎖と共有結合により連結させてＥＧ鎖を含む親水性層を形成する方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）表面にプラスチックを含む支持体と、
前記表面上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層と、
前記プライマー層上に配置された、前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結された、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を含む親水性層と
を少なくとも含む基材。
（２）前記プライマー層が前記支持体の表面に物理吸着により結合している、（１）の基材。
（３）前記プラスチックがポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、及びポリエチレンテレフタラートからなる群から選択される少なくとも1種である、（２）の基材。
（４）前記エチレングリコール鎖の一端が前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結されており、前記エチレングリコール鎖の他端が、他の物質と共有結合を形成可能な官能基と連結されている、
（１）〜（３）のいずれかの基材。
（５）前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性層中の窒素濃度が、前記親水性層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下ある、
（４）の基材。
（６）前記エチレングリコール鎖の一端が前記プライマー層のポリシロキサンの側鎖と共有結合を介して連結されており、前記エチレングリコール鎖の他端がヒドロキシル基で封鎖されている、（１）〜（３）のいずれかの基材。
（７）（１）〜（６）のいずれかの基材の製造方法であって、
前記支持体の表面上において、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を重合させ、ポリシロキサンを含むプライマー層を形成する、プライマー層形成工程と、
前記プライマー層とエチレングリコール又はポリエチレングリコールとを、エチレングリコール又はポリエチレングリコールのヒドロキシル基と、前記シラノール化合物の前記官能基である、或いは前記シラノール化合物の前記官能基から誘導された、前記ポリシロキサンの側鎖上の官能基との反応により、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖が前記側鎖に共有結合を介して連結されるように反応させる、親水性層形成工程と、を含む方法。
（８）前記プライマー層形成工程が、
加水分解により前記シラノール化合物を生成するケイ素化合物を加水分解し、前記シラノール化合物を生成する工程と、
前記シラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程と
を含む、（７）の方法。
（９）前記ケイ素化合物が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランである、（８）の方法。
（１０）前記親水性層形成工程よりも後に、前記エチレングリコール鎖の、ポリシロキサンと連結していない側の末端に、他の物質と共有結合を形成可能な官能基を連結する、官能基連結工程を更に含み、
前記官能基連結工程は、前記エチレングリコール鎖のヒドロキシル基との反応により前記官能基を付与する前駆体化合物が、実質的に無水の、アセトニトリルもしくはジメチルスルホキシド又はこれらの溶媒の混合溶媒中に溶解した溶液と、前記親水性層とを、４〜２５℃にて接触させる工程を含む、
（７）〜（９）のいずれかの方法。
（１１）前記官能基が(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基であり、かつ、前記前駆体化合物が１，１’−カルボニルジイミダゾールである、或いは、前記官能基がスクシンイミジルオキシカルボニル基であり、かつ、前記前駆体化合物が炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）である、（１０）の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、プラスチックを含む支持体の表面にＥＧ鎖を含む親水性層を導入することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を示す。
【図２】図２は、物質固定化用担体の製造方法に関する本発明の一実施形態を示す。
【図３】図３は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の一実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の検量線を示す。
【図５】図５は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の一実施形態を示す。
【図６】図６は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７】図７は、本発明の基材の一実施形態を示す。
【図８】図８は、本発明の基材の一実施形態を示す。
【図９】図９は、プライマー層の形成方法の一実施形態の手順を示す。
【図１０】図１０は、本発明の基材の形成方法の一実施形態の手順を示す。
【図１１】図１１は、実施例６における試験結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例７における試験結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例７における試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（本発明の基材）
はじめに、本発明の基材の全体構成の概要を、図７及び８を参照して説明する。
【００１４】
基材１０，１０’は、表面Ｓにプラスチックを含む支持体１１と、表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層１２と、プライマー層１２上に配置された、エチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を含む親水性層１３，１３’とを備える。
【００１５】
親水性層１３のＥＧ鎖  −（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−  （式中、ｍは１以上の整数である）はプライマー層１２を構成するポリシロキサンの側鎖Ａと共有結合を介して連結されている。ここで側鎖Ａは、後述する式１のシラノール化合物が有する、Ｒ１に由来する基であり、Ｒ１上の官能基又は該官能基から誘導された官能基がＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基と共有結合を形成して形成された二価の基を指す。ケイ素原子に結合する基Ｘは式１のシラノール化合物のＲ１（ｐ＝２の場合）、Ｒ２（ｐ＋ｑ＝３の場合）、又はヒドロキシル基（ｑ＝３の場合）に由来する基である。プライマー層１２中のポリシロキサンは直鎖状であってもよいし、分岐鎖状又は網目状の構造を有していてもよいが、好ましくは分岐鎖状又は網目状の構造を有する。ポリシロキサンが分岐鎖状又は網目状の構造を有するとき、Ｘは、他の繰り返し単位（図示していない）のケイ素原子と結合する架橋基である。架橋基としてのＸとしては、式１のシラノール化合物のヒドロキシル基に由来するエーテル基（−Ｏ−）が挙げられる。ポリシロキサンが直鎖状の構造を有するとき、Ｘは、式１に定義するＲ１又はＲ２、未反応のヒドロキシル基、加水分解されずに残存した式２に定義する基Ｙ等の一価の基である。ＥＧ鎖の両端のうち、ポリシロキサンと連結されていない側の端部には、他の物質と共有結合を形成可能な官能基Ｒ３が、直接的に、或いは必要に応じてリンカーを介して間接的に連結されていてもよいし、図８に示すように、ポリシロキサンと連結されていない側の端部がヒドロキシル基により封鎖されていてもよい。図７においてＱは結合、又はリンカーを示す。
【００１６】
ＥＧ鎖の末端に官能基Ｒ３が導入された基材１０は、免疫アッセイ用固相担体などの、所望の物質を固定化するための物質固定化担体として用いることができる。ＥＧ鎖の末端がヒドロキシル基である基材１０’は表面が親水化された基材として種々の用途に用いることができる。基材１０’は、例えば、細胞を接着させずに培養するための細胞培養基材や、各種ホモジニアスアッセイ（例えば蛍光偏光法や蛍光共鳴エネルギー移動法など）のための基材として用いることができる。
【００１７】
支持体１１は、少なくとも表面Ｓにプラスチックを含む。ポリシロキサンを含むプライマー層１２は支持体１１の表面Ｓに物理吸着により結合することができる。物理吸着はファンデルワールス力または疎水性相互作用により生じると考えられる。プライマー層１２と支持体１１の表面Ｓとの間には共有結合等の化学結合が形成される必要はないため、表面Ｓがポリスチレン等の、反応性官能基を含まないプラスチックからなる場合であっても、プライマー層１２を結合させることができる。
【００１８】
プライマー層１２中におけるポリシロキサンの状態は必ずしも明らかではないが、図２に示すように複数のポリシロキサン分子の主鎖部分同士が会合し、側鎖である有機基が支持体表面及び親水性層の側に面した二層構造を形成している可能性がある。このような二重構造が形成される機構は以下のように推定される。まず、シラノールのポリマー化によってファンデルワールス力が増大したポリシロキサンがプラスチック表面に物理吸着する。このとき、プラスチック表面とシラノール化合物の有機基との間に働く疎水性相互作用によりシラノール化合物の有機基はプラスチック側に配向する。ポリシロキサンの一層目が形成された後、溶媒側に配向したシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に別のポリシロキサンが結合する。このとき、シラノール基同士の水素結合によりシラノール化合物の有機基は溶媒側に配向する。その結果、ポリシロキサンは図２に示すような二層構造となると考えられる。溶媒側に配向した有機基は親水性層との共有結合を形成することができる。
【００１９】
本発明の基材は、免疫アッセイ用固相担体、アフィニティー担体、μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）用担体、バイオチップ用担体、バイオセンサー用担体、細胞培養基材、各種ホモジニアスアッセイ等の種々の用途において、物質固定化用担体や、表面が親水化処理された基材として利用することができる。
【００２０】
（支持体）
本発明における支持体の材料及び形状は特に限定されない。
支持体は、少なくともプライマー層が形成される表面にプラスチックを含み、より好ましくは、全体がプラスチックからなる。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。予め支持体表面にプラズマ処理やコロナ処理などの物理的な処理が施されていてもよい。支持体は、プライマー層が形成可能な表面を有している支持体であればよく、全体の形状は特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は、免疫アッセイ用担体や細胞培養基材等の生化学試験の用途において有用である。
【００２１】
（プライマー層）
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。支持体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と支持体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物及び形成されたポリシロキサンは支持体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。この点は、ガラスを支持体とする場合とは大きく異なる。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。
図９には、支持体表面にプライマー層を形成する手順の概要を示す。
【００２２】
（シラノール化合物）
本発明で用いられるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は典型的には式１で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（ＯＨ）ｑ  ・・・・（式１）
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。
【００２３】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子が１つ以上（好ましくは１つ）の官能基により、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換されている、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６の炭化水素基である（ただし、前記炭化水素基の全部又は一部がビニル基である場合のように、前記炭化水素基自体が官能基である場合は官能基により置換されている必要はない）。前記炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖或いは環構造を有する、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（アルキル基、炭素数２以上のアルケニル基、又は炭素数２以上のアルキニル基）であってもよいし、単環又は多環の炭素数６以上の芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記脂肪族炭化水素基によって置換された前記芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記芳香族炭化水素基によって置換され前記脂肪族炭化水素基であってもよい。前記炭化水素基では、炭素−炭素結合が、１又は２個の、酸素、窒素及び硫黄から選択される同一又は異なる原子により中断されていてもよい。炭化水素基の例としては好ましくはプロピル基、エチル基が挙げられる。
【００２４】
Ｒ１における、前記炭化水素基の１つ以上の水素を、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換する官能基としては、ＥＧ又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、或いは、ＥＧ又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換可能な官能基であれば特に限定されないが、典型的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。グリシジル基又はエポキシ基は、それ自体がＥＧ又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成可能であるが、特開２００９−１５６８６４号公報に記載されている方法に従って、グリシジル基又はエポキシ基をアルデヒド基に変換し、形成されたアルデヒド基と、ＥＧ又はＰＥＧが有するヒドロキシル基とを反応させてもよい。これらの官能基は、前記炭化水素基の水素原子を直接置換してもよいし、適切なリンカー構造を介して置換してもよい。リンカー構造としては、例えば炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられ、例えば、炭化水素基が左側に、官能基が右側にそれぞれ結合するとしたとき、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−、−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−（Ｎ＝Ｃ＝Ｎ）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）−で表される構造が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１の特に好ましい態様としては３−グリシドキシプロピル基、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。
【００２６】
Ｒ２は、好ましくは、置換基により置換されていないという点を除いてＲ１について上述したものと同様の（ただしＲ１とは独立して選択される）炭化水素基であり、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
【００２７】
（加水分解によりシラノール化合物を生成するケイ素化合物）
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基(Si-OH)を生成可能な基を有するケイ素化合物を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は式２で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ  ・・・・（式２）
（Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれシラノール化合物に関して定義したとおりである）。
【００２８】
Ｙとしては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基等が好ましい。Ｙとしては特に、炭素数１〜６のアルコキシ基（特にメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、塩素原子が好ましい。
【００２９】
式２のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。
【００３０】
（プライマー層の形成方法）
プライマー層を形成する際、式２のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式１のシラノール化合物を生成することができる（Ｓ９０１）。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、式２のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式１のシラノール化合物が生成する。
【００３１】
次いでシラノール化合物を支持体表面に適用し（Ｓ９０２）、縮合重合によりポリシロキサンを形成する（Ｓ９０３）。式１のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を支持体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。プライマー層の被覆密度は、シラノールや塩基の濃度、あるいはシラノール溶液をプラスチック表面に接触させる時間によって制御可能である。プライマー層の被覆密度が高ければ高いほど、次の工程で共有結合させるＥＧ鎖の結合密度も高くなる。
【００３２】
形成されたポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を誘導体化して他の官能基に変換する場合には、プライマー層形成後に引き続き、ポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を、ＥＧ又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換する誘導体化工程（Ｓ９０４）を行う。
【００３３】
（親水性層）
プライマー層上に配置される親水性層は、1つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含む。「エチレングリコール鎖（又はＥＧ鎖）」は次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。本明細書では重合度ｍが２以上であるＥＧ鎖を「ポリエチレングリコール鎖（又はＰＥＧ鎖）」と称することがある。
【００３４】
ＥＧ鎖の分子量は特に限定されず、基材の用途に応じて適宜設定することができる。本発明の基材を免疫アッセイのための物質固定化用担体として場合には、ＥＧ鎖の数平均分子量は４４以上（ｍが１以上）であり、１７６以上（ｍが４以上）であることが好ましい。ＥＧ鎖の数平均分子量の上限は特に限定されないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しいこと、及び、ＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、ＥＧ鎖の数平均分子量は２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。
【００３５】
ＥＧ鎖は、次式：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す整数である）
で表されるエチレングリコール（ＥＧ，ｍ＝１）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ，ｍは２以上）を用いて形成することができる。
【００３６】
ＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＥＧ又はＰＥＧ、或いは、担体から解離させたＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００３７】
ＥＧ又はＰＥＧの一端のヒドロキシル基と、前記ポリシロキサンの側鎖上の官能基又は該官能基から誘導された官能基との反応により形成された共有結合を介して、ＥＧ鎖がプライマー層に結合される。
【００３８】
ＥＧ鎖の他端は、ヒドロキシル基が図８に示すように誘導体化されておらずヒドロキシル基で封鎖された状態であってもよいし、図７に示すように、他の物質と共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基Ｒ３が直接的（Ｑ＝結合）又は間接的（Ｑ＝リンカー）に連結された状態であってもよい。
【００３９】
ＥＧ鎖の他端に導入される官能基Ｒ３としては、他の物質と共有結合を形成することが可能な官能基であれば特に限定されないが、代表的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。他の物質との反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの官能基は他の物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー構造としては、炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられる。
【００４０】
本発明によれば、プライマー層の被覆密度を制御することにより、ＥＧ鎖の結合密度を制御することができる。そして、ＥＧ鎖の結合密度も免疫アッセイの検出感度に影響する。ＥＧ鎖の結合密度はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いてある程度推定することができる。エチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）は（ＸＰＳ）においてＣ（１ｓ）シグナルのＣ−Ｏ成分を与え、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基等の窒素原子含有官能基はＸＰＳにおいてＮ（１ｓ）シグナルを与える。元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−ＯはＥＧ鎖の結合密度と明確な相関がある。免疫アッセイでの高い検出感度を実現するためには、官能基がｎ個の窒素原子を含有する場合、元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏが０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下であることが好ましい。「０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下」とは、例えば、ｎ＝１の場合は「０．０１０以上、０．０５０以下」を意味し、ｎ＝２の場合は「０．０１０以上、０．１００以下」を意味し、ｎ＝３の場合は「０．０１０以上、０．１５０以下」を意味し、ｎ＝４の場合は「０．０１０以上、０．２００以下」を意味する。本発明におけるＸＰＳは、アルバック・ファイ社製のＸ線分光分析装置「ＥＳＣＡ５６００」を用い、光電子取り込み角度を４５°に設定して測定される。ｎ個の窒素原子を含有する官能基としては、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（ｎ＝２）及びスクシンイミジルオキシカルボニル基（ｎ＝１）以外にイソシアネート基（ｎ＝１）、アジドカルボニル基（ｎ＝３）、カルボジイミド基（ｎ＝２）、マレイミジル基（ｎ＝１）、アジリジン−２−イル基（ｎ＝１）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝３）、１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝４）が挙げられる。これらの官能基についても、ＸＰＳにより求められる、親水性層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたときの窒素濃度（Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏ）が上記と同様の数値範囲であることが好ましい。
親水性層には他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００４１】
（親水性層の形成方法）
本発明の基材は、図１０に概略を示すとおりプライマー層を形成する工程Ｓ１００１と、プライマー層のポリシロキサンにＥＧ鎖を連結させる工程Ｓ１００２とを少なくとも含む方法により製造することができる。図７に示すようにＥＧ鎖末端に官能基を導入する場合は、ＥＧ鎖末端へ官能基を連結する工程Ｓ１００３を更に含む。
【００４２】
親水性層は、プライマー層のポリシロキサンの側鎖上の官能基（シラノール化合物の官能基に対応する官能基、或いは、該官能基から誘導された官能基）とＥＧ又はＰＥＧのヒドロキシル基とを反応させることにより形成することができる。このとき触媒量の濃硫酸を含むＥＧ又はＰＥＧをプライマー層と接触させる。ここで、数平均分子量が１０００を超えるＰＥＧはあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＥＧ又はＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＥＧ溶液又はＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜１００℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は１０分〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
【００４３】
必要に応じて、ＥＧ鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層、シランカップリング剤等を介して支持体表面に固定されたＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００４４】
【化１】
0005252036.tif 000002
【００４５】
上記の反応は、水分をほとんど含まない実質的に無水の有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、支持体がプラスチックを含む場合には、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１重量％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体表面のプラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは１０分〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、官能基が共有結合されたＥＧ鎖を含む親水性層が形成される。
【００４６】
（他の物質）
本発明の基材は、一実施形態において、ＥＧ鎖末端に導入された官能基を利用して「他の物質」をＥＧ鎖末端に固定化することができる。すなわちこの実施形態において、本発明の基材は物質固定化用担体として機能し、「他の物質」は被固定化物質に相当する。以下、「他の物質」を「被固定化物質」と呼ぶことがある。
【００４７】
被固定化物質は、ＥＧ鎖末端に導入された官能基と共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基であってもよい。また、被固定化物質としては更に、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、グリニャール試薬、有機リチウム化合物、カルバニオン等も包含される。被固定化物質は生体関連物質が好ましい。生体関連物質としては、DNA、RNA、ペプチド、ホルモン、酵素、抗原、抗体、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。なお、固定化しようとする生体関連物質に、アミノ基等の、ＥＧ鎖末端に導入された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより、固定化に供することができる。
【００４８】
本発明の基材を免疫アッセイ用固相担体として用いる場合には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（サンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００４９】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（DNA、RNA）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００５０】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００５１】
本発明の基材のＥＧ鎖末端に、標的物質と結合する抗原又は抗体や標的物質が被固定化物質として固定化された物質固定化担体を用いて標的物質を測定することにより、免疫アッセイを実施することができる。本発明の基材を用いた免疫アッセイは公知の方法で実施することができ、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。
【００５２】
本発明の基材を用いた免疫アッセイにおいて抗原又は抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的又は間接的に標識された抗原又は抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノPCR）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。免疫アッセイは、安全性及び簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。
【００５３】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００５４】
［実施例１］
図１は本発明の基材（物質固定化用担体）の一実施形態を表す。ポリスチレンからなる支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成されている。プライマー層にはＥＧ鎖の片末端が共有結合している。ＥＧ鎖の別の片末端には（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニルが存在する。
【００５５】
［実施例２］
図２に示した方法で物質固定化用担体を製造した。具体的な手順を以下に記す。
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに４ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で７５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ４０００（数平均分子量２７００〜３４００、関東化学）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま９０℃で３０分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＰＥＧを含む親水性層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに１０μｌずつ分注した。そのまま室温で２０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性層に含まれるＰＥＧの末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＰＥＧ誘導体が形成された。
【００５６】
［実施例３］
実施例２の物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法、抗原-抗体-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００５７】
以下、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００および０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を実施例２の９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で１０分間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．０３ｎｇ／ｍｌであった。
【００５８】
（比較例１）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン性９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００５９】
以下、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳを洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳをブロッキングバッファーおよび希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに２００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を調製し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はいずれも３．９ｎｇ／ｍｌであった。
【００６０】
［実施例４］
実施例２で得られた９６穴マイクロプレートを用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００６１】
５％トレハロース（和光純薬）及び０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファーとする。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を実施例２で得られた９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で２時間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．１５ｐｇ／ｍｌであった。
【００６２】
（比較例２）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン性９６穴マイクロプレート）を用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００６３】
比較例１と同様の各種バッファーを用いた。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はそれぞれ９．８ｐｇ／ｍｌと２．４ｐｇ／ｍｌであった。
【００６４】
【表１】
0005252036.tif 000003
【００６５】
［実施例５］
シラノール処理時間およびＥＧ鎖の数平均分子量がＥＬＩＳＡ（間接法）の感度に及ぼす影響を調べた。具体的な手順を以下に記す。
【００６６】
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で６０〜１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＥＧ又はＰＥＧ（１３種）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＥＧ鎖を含む親水性層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに２０μｌずつ分注した。そのまま室温で３０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性層に含まれるＥＧ鎖の末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＥＧ又はＰＥＧ誘導体が形成された。以上の操作により、ＥＧ鎖の結合密度やＥＧ鎖の数平均分子量の異なる物質固定化用担体が得られた。これらの物質固定化用担体を用いて実施例３に記載の方法でＥＬＩＳＡの感度を測定した。その結果、表２に示すようにＥＧ鎖の数平均分子量が１７６以上で従来よりも顕著に高い感度が得られることがわかった。また、ＥＧ鎖の分子量が大きい場合は比較的低密度であっても高い感度が実現できることがわかった。
【００６７】
【表２】
0005252036.tif 000004
【００６８】
表２に示す各原料の数平均分子量は以下の通りである。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
［実施例６］
ＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量がタンパク質吸着量に及ぼす影響を調べた。
まず、ＥＧ又はＰＥＧからなる親水性層を有する９６穴マイクロプレート（活性化していない）を以下の手順で製造した。
【００７１】
まず、１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＥＧ又はＰＥＧ（１０種）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＥＧ又はＰＥＧからなる親水性層が形成された。
【００７２】
次に、親水性層を有する９６穴マイクロプレートへのタンパク質（ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体）吸着量を以下の手順で測定した。
【００７３】
まず、ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識２次抗体を調製した。これを各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間静置した。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に、ＰＢＳを用いて５ｍＭ  ＳＡＴ−３（同仁化学）および０．５ｍＭ過酸化水素（関東化学）を含む発色反応溶液を調整した。これを各ウェルに１００μｌずつ分注し、室温で１５分間静置した。その後、１規定の硫酸を各ウェルに１００μｌずつ加え、発色反応を停止させた。最後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ（モレキュラーデバイス）を用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した（図１１）。ここで、未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭ）の値を１００％とした。その結果、本発明はＰＥＧの数平均分子量にほとんど依存せずに高い吸着抑制効果を示すこと、ＥＧを使用しても吸着抑制効果は奏されることがわかった。
【００７４】
（比較例３）
タンパク質吸着量を従来技術（市販品３種）と比較した。従来技術（１）および従来技術（２）はＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマー層を有するポリスチレン製９６穴マイクロレート、従来技術（３）はＰＥＧ層を有するがプライマー層をもたないポリスチレン製９６穴マイクロレートである。具体的な手順は実施例６と同一とした。その結果、本発明は従来技術よりも高い吸着抑制効果を示すことがわかった（図１１）。これは、ＥＧ又はＰＥＧからなる親水性層がＭＰＣポリマー層よりも高い吸着抑制効果をもち、なおかつプライマー層がＥＧ又はＰＥＧの結合密度を高めたためと考えられる。
【００７５】
［実施例７］
実施例６のＰＥＧ層を有する９６穴マイクロプレートへの細胞非接着性を以下の手順で調べた。なお、ＰＥＧは数平均分子量が２７００〜３４００のものを用いた。
【００７６】
まず、マウス線維芽細胞ＣＣＬ１６３を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、各ウェルに１×１０４個ずつ播種した。インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で８日間培養後、位相差顕微鏡を用いて細胞の様子を観察した。その結果、ＰＥＧ層を有する基材表面への細胞の接着や伸展は認められず、完全に浮遊した状態で凝集塊を形成していた（図１２左）。同条件で培養を行った未処理品では、細胞の接着や伸展、増殖が明らかに認められた（図１２右）。
【００７７】
次に、細胞非接着性を定量的に評価するため、ＭＴＳアッセイを以下の手順で実施した。まず、同細胞を同条件で培養した後、培地を吸引して未接着の細胞を除去した。同培地で各ウェルを１回洗浄した後、同培地を各ウェルに１００μｌずつ分注した。その後、ＭＴＳ試薬Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６Ｒ  ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに２０μｌずつ加えた。プレートを前後左右にゆすって攪拌した後、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間放置し、呈色させた。最後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ（モレキュラーデバイス）を用いて各ウェルの吸光度を測定した。未処理品の吸光度を１００％にしたとき、ＰＥＧ層を有する基材の値は約１．３％であった（図１３）。以上より、本発明による基材は細胞の接着・伸展・増殖を顕著に抑制することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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