(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）〜４）に示す工程を含む標的高分子化合物のアフィニティーラベル化方法であって、
標的高分子化合物が、カルボキシル基を有しているか、又はカルボキシル基で修飾されている化合物であり、
リガンド化合物が、前記標的高分子化合物と相互作用しうる化合物であり、
第３級アミンが、以下の式(II)で表される化合物からなる、標的高分子化合物のアフィニティーラベル化方法：
１）前記リガンド化合物を第３級アミンで修飾する工程；
２）前記標的高分子化合物、及び前記第３級アミンで修飾したリガンド化合物を混合する工程；
３）さらに1,3,5-トリアジン化合物を前記標的高分子化合物へ反応させる工程；
４）さらに標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を反応させる工程。
【化２】
0005219144.tif 000016
[式中、R5、R6及びR7のうち１つ又は２つはメチル基であり、そして残りのR5、R6及びR7は、それぞれ独立して炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルケニル基、-CH2COOR8、CH2CONR9R10（ここで、R8は水素原子又は炭素数1〜6のアルキル基であり、R9は水素原子、炭素数1〜6のアルキル基であり、R10は水素原子、炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルケニル基又は炭素数1〜6のアルキニル基である）]
【請求項２】
1,3,5-トリアジン化合物が、以下の式Ｉで表される化合物である、請求項１に記載のアフィニティーラベル化方法。
【化１】
0005219144.tif 000017
[式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホ基、ホスホ基、又は-R3R4（ここで、R3は、-(CmH2mO)nであり、R4は、水素原子、スルホ基、ホスホ基、又はアミノ基、アンモニオ基、硫酸基若しくはリン酸基を有するアルキル基である。また、mは1〜30の整数であり、nは1〜120の整数である。）からなる群より選ばれる置換基であり、Xは塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基又はN-メチルモルホリン(NMM)で表される。]
【請求項３】
1,3,5-トリアジン化合物が、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン化合物(CMDT)である請求項１に記載のアフィニティーラベル化方法。
【請求項４】
アミン化合物が、R11R12NHで表される請求項１〜３のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法。
[R11及びR12のうち１つ又は２つは、標識性の官能基であり、残りはそれぞれ独立して水素又は炭素数1〜6のアルキル基、アリール基、又はアンモニオ基、スルホ基、硫酸基若しくはリン酸基等を有するアルキル基である。]
【請求項５】
標的高分子化合物が、タンパク質又はペプチド化合物である請求項１〜４のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法を用いた標的高分子化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法を用いた、リガンド化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
1,3,5-トリアジン化合物、以下の式(II)で表される化合物からなる第３級アミンで修飾されたリガンド化合物、及び標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法に使用する標的高分子化合物のアフィニティーラベル用キット。
【化２】
0005219144.tif 000018
[式中、R5、R6及びR7のうち１つ又は２つはメチル基であり、そして残りのR5、R6及びR7は、それぞれ独立して炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルケニル基、-CH2COOR8、CH2CONR9R10（ここで、R8は水素原子又は炭素数1〜6のアルキル基であり、R9は水素原子、炭素数1〜6のアルキル基であり、R10は水素原子、炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルケニル基又は炭素数1〜6のアルキニル基である）]
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的高分子化合物についての新規アフィニティーラベル化方法に関し、標的高分子化合物と相互作用しうる物質が反応した場合に、該高分子化合物をラベル化しうる新規アフィニティーラベル化方法に関する。さらに詳しくは触媒的縮合反応を用いた新規アフィニティーラベル化方法に関する。また、本発明は、該アフィニティーラベル化方法を用いることによる標的高分子化合物及び相互作用しうる物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体や抗体、酵素などの機能性タンパク質などの高分子化合物は、特定の化合物（リガンド化合物）と相互作用し、独自の機能を発揮しうる。特定の化合物が、どのような高分子化合物と相互作用するか、また高分子化合物のどの部位に特定の化合物が結合し、相互作用するかを解析する方法の一つとして、リガンド化合物を標識物質で修飾したリガンド誘導体を用いたアフィニティーラベル化法がある。リガンド誘導体と標的高分子化合物とを化学的に安定な共有結合で架橋させるアフィニティーラベル化方法により、多くの高分子化合物が混在するなかから、標的高分子化合物をスクリーニングすることができる。
【０００３】
リガンド誘導体を用いたラベル化の場合に、リガンド化合物が標的高分子化合物に安定して結合する場合であれば、容易にラベル化することができるが、リガンド化合物が可逆的に相互作用する場合には安定したラベル化を行うことができない。そこで、安定したラベル化を行うために、リガンド誘導体にさらに光反応基を導入した光触媒を用いる場合がある。該光反応基は光照射により標的高分子化合物と安定的に結合することができるので、標的高分子化合物のラベル化も安定的に行うことができる。しかしながら、従来では（Ａ）リガンド化合物と（Ｂ）標識物質と（Ｃ）光反応基は同一分子とする必要があったが、これらを含む化合物の合成は容易ではなかった。また、これらは組合せにより反応性が異なるが、合成が容易でないことから、組合せを変えることも容易に行うことができなかった。そのため、最適な組合せを調べることも容易ではなく、リガンド化合物又は標的高分子化合物をスクリーニングしたり、標的高分子化合物のどの部位にリガンド化合物が結合しうるか、などの解析は決して容易ではなかった。
【０００４】
酵素反応では活性部位の基質結合部位に基質が取り込まれ、触媒基に対して適当な位置に固定される。人工酵素では各種ホスト化合物が基質捕捉のために用いられる。例えばシクロデキストリンに各種官能基を導入したシクロデキストリン誘導体を用いた人工酵素が報告されている（非特許文献１、２）。ここでは、人工酵素としてシクロデキストリン誘導体を用い、シクロデキストリンをジメチルアミノ基で修飾したものに2-クロロ-4,6,-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン(CDMT)を反応させ、脱水縮合反応させたものを人工酵素として使用することが開示されている。作製した人工酵素とカルボキシル基で修飾した基質を反応させ、さらに種々のアミンを人工酵素と反応させることにより、シクロデキストリンに包接されやすい基質のカルボキシル基とアミンの反応が進行する。これにより、基質特異的な人工酵素の反応を確認することができる。しかしながら、上記CDMTをアフィニティーラベル化方法に応用した報告はない。
【０００５】
上述のトリアジン誘導体の一種であるCDMTの塩素をN-メチルモルホリン(NMM)で置換した水溶性の第４級アンモニウム塩4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (DMT-MM)について報告がある（特許文献１、２）。ここでは脂溶性であったCDMTを、DMT-MMの不揮発性の塩にすることによりDMT-MMについて水溶性を獲得させることができ、水中で安定な脱水型縮合剤が得られた。しかしながら、同様に上記CDMTから得られた水中で安定な脱水型縮合剤についても、アフィニティーラベル化方法に応用した報告はない。
【０００６】
上述の如く、従来では、高分子化合物をアフィニティーラベル化する方法は容易ではなく、より簡便な方法が望まれていた。
【特許文献１】国際公開WO2000/053544号パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2005/075442号パンフレット
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 123, pp.10760-10761 (2001)
【非特許文献２】Angew. Chem. Int. Ed, 45, pp.1252-1255 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、標的高分子化合物についての新規アフィニティーラベル化方法に関し、簡便且つ効果的にラベル化する方法を提供することを課題とする。さらには、該アフィニティーラベル化方法を用いることによる、標的高分子化合物、又は該標的高分子化合物と相互作用しうる物質（以下、単に「リガンド化合物」ともいう。）のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リガンド化合物と標識化合物をトリアジン型脱水縮合剤とともに反応させて、標的高分子化合物に標識物質を脱水縮合反応により結合させることで、標的高分子化合物とリガンド化合物が反応した場合に、標的高分子化合物が効果的にラベル化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．以下の工程を含む標的高分子化合物のアフィニティーラベル化方法：
１）前記標的高分子化合物と相互作用しうる化合物（リガンド化合物）を第３級アミンで修飾する工程；
２）前記標的高分子化合物、及び前記第３級アミンで修飾したリガンド化合物を混合する工程；
３）さらに1,3,5-トリアジン化合物を前記標的高分子化合物へ反応させる工程；
４）さらに標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を反応させる工程。
２．1,3,5-トリアジン化合物が、以下の式Ｉで表される化合物である、前項１に記載のアフィニティーラベル化方法。
【化１】
0005219144.tif 000002
[式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホ基、ホスホ基、又は-R3R4（ここで、R3は、-(CmH2mO)nであり、R4は、水素原子、スルホ基、ホスホ基、又はアミノ基、アンモニオ基、硫酸基若しくはリン酸基を有するアルキル基である。また、mは1〜30の整数であり、nは1〜120の整数である。）からなる群より選ばれる置換基であり、Xは塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基又はN-メチルモルホリン(NMM)で表される。]
３．1,3,5-トリアジン化合物が、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン化合物(CMDT)である前項１に記載のアフィニティーラベル化方法。
４．第３級アミンが、以下の式IIで表される化合物である、前項１〜３のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法。
【化２】
0005219144.tif 000003
[式中、R5、R6及びR7のうち１つ又は２つは標的高分子化合物と相互作用しうる官能基を含む置換基であり、そして残りのR5、R6及びR7は、それぞれ独立してアルキル基、アルケニル基、-CH2COOR8、CH2CONR9R10（ここで、R8は水素原子又はアルキル基であり、R9は水素原子、アルキル基、又は-(CyH2yO)zであり、R10は水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、yは1〜30の整数であり、zは1〜120の整数である）]
５．アミン化合物が、R11R12NHで表される前項１〜４のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法。
[R11及びR12のうち１つ又は２つは、標識性の官能基であり、残りはそれぞれ独立して水素又は炭素数1〜6のアルキル基、アリール基、又はアンモニオ基、スルホ基、硫酸基若しくはリン酸基等を有するアルキル基である。]
６．標的高分子化合物が、カルボキシル基を有しているか、又はカルボキシル基で修飾されている化合物である前項１〜５いずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法。
７．標的高分子化合物が、タンパク質又はペプチド化合物である前項６に記載のアフィニティーラベル化方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法を用いた標的高分子化合物のスクリーニング方法。
９．前項１〜７のいずれか１に記載のアフィニティーラベル化方法を用いた、リガンド化合物のスクリーニング方法。
１０．1,3,5-トリアジン化合物、及び標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を含む、標的高分子化合物のアフィニティーラベル用キット。
１１．さらに、第３級アミンで修飾された、リガンド化合物を含む、前項１０に記載の標的高分子化合物のアフィニティーラベル用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアフィニティーラベル化方法によると、従来のように（Ａ）リガンド化合物、（Ｂ）標識物質及び（Ｃ）光反応部位を含む化合物を合成することなく、容易に標的高分子化合物をラベル化することができる。前記（Ａ）（Ｂ）及び（Ｃ）を含む化合物は、合成が困難であるのみならず、各々の組合せを変えることが困難であり、限られた範囲でしかラベル化することができなかった。本発明のアフィニティーラベル化方法によると、リガンド化合物と標識物質は別の分子で反応させることができ、上記の合成の問題を克服することができる。これにより、リガンド化合物に対して適当な標識物質を各々組み合わせて検討することができ、効果的にラベル化を行うことができる。
【００１１】
本発明の方法により、多種の高分子化合物、例えばタンパク質が混在する試料中から、リガンド化合物と相互作用する標的高分子化合物を容易にスクリーニングすることができる。また、高分子化合物に対して、リガンド化合物として多種の候補化合物が存在する場合は、本発明のアフィニティーラベル化方法により候補のリガンド化合物ごとに個々に反応させることにより、標的高分子化合物と相互作用するリガンド化合物を容易にスクリーニングすることができる。
【００１２】
さらに、本発明の方法により、標的高分子化合物のリガンド結合部位に対して空間的に近傍に位置する酸性アミノ酸残基を特定することができる。また、リガンド化合物の修飾部位を変えることにより、該リガンド化合物の結合に必要な標的高分子化合物の化学構造を知ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、標的高分子化合物と、該標的高分子化合物と相互作用しうる化合物とは、例えばタンパク質とリガンド化合物が挙げられ、より具体的には酵素と基質、受容体とアゴニスト若しくはアンタゴニスト等が挙げられる。本発明は、標的高分子化合物と上記リガンド化合物が相互作用した場合のアフィニティーラベル化方法である。リガンド化合物を第３級アミンで修飾し、標的高分子化合物と修飾したリガンド化合物を混合し、触媒縮合反応させて標識化合物を混合することで、アフィニティーラベル化することができる。
【００１４】
本発明は、以下の１）〜４）の工程を含む標的高分子化合物のアフィニティーラベル化方法に係る発明である。本発明のラベル化方法を実行するための代表例としての模式図を、図１及び２に示す。また、標的高分子化合物が細胞膜表面のタンパク質受容体であり、そのリガンドと相互作用した場合にラベル化した場合の模式図を図３に示す。
【００１５】
１）標的高分子化合物と相互作用しうる化合物（リガンド化合物）を第３級アミンで修飾する工程；
２）前記標的高分子化合物及び前記第３級アミンで修飾したリガンド化合物を混合する工程；
３）1,3,5-トリアジン化合物を前記標的高分子化合物へ反応させる工程；
４）標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を反応させる工程。
【００１６】
本発明のアフィニティーラベル化方法に使用する1,3,5-トリアジン化合物は、自体公知の方法により合成することができ、例えば特許文献１又は２に記載の方法により合成することができる。得られた1,3,5-トリアジン化合物は、当業者が通常用いる手段によって、分離・精製することができる。例えば、反応終了後、反応液に有機溶媒を加え、得られた1,3,5-トリアジン化合物を有機層に抽出したり、自体公知のクロマトグラフなどの分画法により精製することができる。
【００１７】
本発明において、1,3,5-トリアジン化合物は、水溶性であることが好ましいが、両親媒性や脂溶性であってもよい。具体的には、以下の式Ｉで表される化合物である。
【化１】
0005219144.tif 000004
[式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホ基、ホスホ基、又は-R3R4（ここで、R3は、-(CmH2mO)nであり、R4は、水素原子、スルホ基、ホスホ基、又はアミノ基、アンモニオ基、硫酸基若しくはリン酸基を有するアルキル基である。また、mは1〜30の整数であり、nは1〜120の整数である。）からなる群より選ばれる置換基であり、Xは塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基又はN-メチルモルホリン(NMM)で表される。]
【００１８】
上記において、アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基は各々炭素数1〜30とすることができ、より好適には1〜20であり、特に好適には1〜6である。
【００１９】
好ましくは、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、炭素数２〜５のヒドロキシアルキル基、-(CH2CH2O)nR12（ここで、nは1〜120の整数であり、そしてR12は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、スルホ基、又はアミノ基、アンモニオ基、スルホ基、硫酸基若しくはリン酸基等を有するアルキル基である）、-(CH2CH2NR13)nH（ここで、nは1〜120の整数であり、そしてR13は、炭素数が２から５のアルキル基、N,N-ジアルキルアミノエチル基、又は-(CH2CH2N+(CH3)3である)、-CH2CH2SO3-、-CH2CH2N+(CH3)3であり、Xは塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基又はN-メチルモルホリン(NMM)で表される。もっとも好ましくは、1,3,5-トリアジン化合物が、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン化合物(CMDT)又は第４級アンモニウム塩4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (DMT-MM)である。1,3,5-トリアジン化合物は、自体公知の方法により合成することができ、例えば特許文献１又は２に記載の方法により合成することができる。
【００２０】
本発明において第３級アミンは、以下の式IIで表される化合物である。第３級アミンは、リガンド化合物を修飾するために用いられる。修飾は、該リガンド化合物の分子構造の適切な部位に共有結合を介して第３級アミンを導入することによる。リガンド化合物が、標的高分子化合物と相互作用する際に、さらにリガンド化合物中の第３級アミンと結合した1,3,5-トリアジン化合物が近傍に存在する標的高分子化合物と反応することで、1,3,5-トリアジン化合物による標的高分子化合物とアミン化合物の脱水縮合反応が効果的に進められる。
【００２１】
【化２】
0005219144.tif 000005
[式中、R5、R6及びR7のうち１つ又は２つは標的高分子化合物と相互作用しうる官能基を含む置換基であり、そして残りのR5、R6及びR7は、それぞれ独立してアルキル基、アルケニル基、-CH2COOR8、CH2CONR9R10（ここで、R8は水素原子又はアルキル基であり、R9は水素原子、アルキル基、又は-(CyH2yO)zであり、R10は水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、yは1〜30の整数であり、zは1〜120の整数である）]
ここで、アルキル基は、飽和であってもよいし、２重結合や３重結合を幾つか有する不飽和であってもよい。
【００２２】
好ましくはR5、R6及びR7のうち１つ又は２つは標的高分子化合物と相互作用しうる官能基を含む置換基であり、これらは-CH2COOR13又は-CH2CNMeR13の形でアミノ基に結合していることが好ましい。つまりR13がリガンド部位）、そして残りのR5、R6及びR7は各々独立してメチル基、-CH2COOR13、又は-CH2CNR8R13である（ここで、R8は水素原子又はアルキル基である）。例えば、リガンドが-CH2COOR13等の形でアミノ基に結合していない場合は、これらの官能基が入っていることが好ましい。第３級アミンの塩基性を少し下げることによってアンモニウムになり難くし、結果的に1,3,5-トリアジン化合物と反応しやすくするためである。
【００２３】
本発明において、アミン化合物はR11R12NHで表される化合物をいう。
R11及びR12のうち１つ又は２つは、標識性の官能基であり、残りはそれぞれ独立して水素又は炭素数1〜6のアルキル基、アリール基、又はアンモニオ基、スルホ基、硫酸基若しくはリン酸基等を有するアルキル基である。
好ましくは、R11は標識化合物であり、R12は水素であり、標識化合物は感度及び取扱いの観点から蛍光性の化合物であるのが最も好適である。
【００２４】
本発明において、標識化合物はアミン化合物の分子構造中に含まれうる化合物であれば良く、自体公知のものを使用することができる。例えば、蛍光性化合物、発光性化合物や放射性化合物などが挙げられる。蛍光性化合物としては、具体的にはAlexa Fluor、BODIPY FL、Cascade Blue、FITC、Oregon Green、RITC、Texas Red、TRITC、Coumarin Maleimide、Cy Dye、Dansyl Chloride、Dansyl Hydrazineなどが挙げられ、放射性化合物として、3H、14C、11C、123I、201TI、67Gaなどが挙げられる。
【００２５】
本発明において、標的高分子化合物は、カルボキシル基で修飾されているか、又はタンパク質やペプチドのようにアスパラギン酸やグルタミン酸残基のようなカルボキシル基を有する酸性アミノ酸側鎖や、又はカルボキシル末端を有する化合物であることが必要である。本発明において、標的高分子化合物のラベル化は、例えばリガンド化合物を選別するため、あるいはリガンド化合物と相互作用する標的高分子化合物を選別するためにおこなう。
【００２６】
リガンドとなりうる候補化合物が複数種類存在する場合に、候補化合物のいずれかが前記標的高分子化合物に相互作用した場合にラベル化されれば、ラベル化によるシグナルを検出することで、相互作用しうる化合物、いわゆるリガンド化合物を選別することができる。また、リガンド化合物に対して、高分子標的化合物が複数種存在する場合に、リガンド化合物と相互作用しうる高分子標的化合物を検出することもできる。さらに、標的高分子化合物のリガンド化合物結合部位に対して空間的に近傍に位置する酸性アミノ酸残基を特定することができる。そこで、リガンド化合物の修飾部位を変えることによってリガンド化合物の結合に必要な高分子標的化合物の化学構造を知ることができる。
【００２７】
以下、本発明の標的高分子化合物のアフィニティーラベル化方法における、１）〜４）の工程について詳述する。上記において、各工程の前後に、更に必要な処理工程を設けてもよい。また、工程３）及び４）は、必要に応じて順序を逆にしても良いし、同時に行ってもよい。
【００２８】
１）標的高分子化合物とリガンド化合物を第３級アミンで修飾する工程
本発明において、リガンド化合物が標的高分子化合物と相互作用するとは、可逆的で結合性の非共有結合性の相互作用、即ちリガンドとして結合する場合であってもよい。リガンド化合物が標的高分子化合物と相互作用する場合に、効果的に本発明のアフィニティーラベル化が行われる。
【００２９】
本発明において、リガンド化合物を第３級アミンで修飾した化合物を、以下「修飾リガンド化合物」ということとする。リガンド化合物の第３級アミンによる修飾は、化学構造により導入部位、導入方法が適宜決定される。
【００３０】
２）前記標的高分子化合物及び修飾リガンド化合物を混合する工程
本発明において、標的高分子化合物と修飾リガンド化合物を混合する工程は、標的高分子化合物水溶液に修飾リガンド化合物を混ぜ、両化合物が結合又は結合解離の平衡状態になるまでの間、攪拌、放置、インキュベーションなどにより一定時間おくことによる。水溶液の溶媒、標的高分子化合物と修飾リガンド化合物の濃度の割合、温度、及び時間は、各々の化合物について適宜決定することができる。ここにおいて、一つの容器に１種類の修飾リガンド化合物を加えることが好ましい。
【００３１】
例えば、あるリガンド化合物と相互作用しうる標的高分子化合物が、複数種の高分子化合物と混合している場合は、一つの容器中で上記工程により、標的高分子化合物に修飾リガンド化合物を反応させることができる。一方、標的高分子化合物に対して結合可能なリガンド化合物を、複数種の候補リガンド化合物からスクリーニングして選別する場合は、リガンド化合物ごとに個々に修飾し、個々の反応容器中で上記工程により、標的高分子化合物に修飾リガンド化合物を反応させることができる。容器ごとに、ラベル化によるシグナルを測定することで、より効果的なリガンド化合物を選別することができる。
【００３２】
３）1,3,5-トリアジン化合物を反応させる工程
本発明において、1,3,5-トリアジン化合物を反応させる工程により、1,3,5-トリアジン化合物が該修飾リガンド化合物中の第３級アミンに結合して脱水縮合剤となる。標的化合物中のカルボン酸がこの1,3,5-トリアジンの近傍に存在することでトリアジン環を攻撃し、トリジンが第３級アミンからカルボン酸へ移る。その結果カルボン酸が活性エステル（アシルオキシトリアジン、トリアジノエステル又はトリアジニルエステルという。）の形で活性化され、最後に標識部位を分子構造中に含むアミン化合物がこの活性エステルを攻撃し、カルボン酸とアミド結合により結合する。
【００３３】
本工程は、上記２）又は下記４）の工程により得られた水溶液にトリアジン化合物水溶液又はトリアジン化合物を含むメタノール溶液を加えることによる。トリアジン化合物の濃度、反応温度、及び反応時間は、適宜決定することができる。本工程は、必要に応じて下記４）の工程の後に行ってもよいし、４）の工程と本工程を同時に行ってもよい。
【００３４】
４）標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を反応させる工程。
本発明において、標識部位を分子構造中に含むアミン化合物を反応させる工程は、上記２）又は３）の工程により得られた水溶液に、前記アミン化合物水溶液を加えることによる。アミン化合物の濃度、反応温度、及び反応時間は、適宜決定することができる。本工程は、必要に応じて上記２）の工程の後に行ってもよいし、３）の工程と本工程を同時に行ってもよい。
【００３５】
前記標的高分子化合物は、上記修飾リガンド化合物が相互作用した場合に、標的高分子化合物上のカルボキシル基、修飾リガンド化合物上のアミン及び標識物質を含むアミン化合物を、1,3,5-トリアジン化合物を用いて脱水縮合反応させることで、標的高分子化合物上のカルボキシル基と標識物質を含むアミン化合物が結合し、標的高分子化合物がラベル化される。上記一連の反応により、本発明の標的高分子化合物のアフィニティーラベル化が達成される。
【００３６】
本発明において、ラベル化した標的高分子化合物の検出方法は特に限定されないが、例えば反応容器毎に、シグナル（例えば、蛍光標識の場合は蛍光強度）を測定することにより、検出することができる。また、同一試料中に複数種の標的高分子化合物が存在する場合は、標的高分子化合物を自体公知の手段、例えばゲルろ過などの方法により分析し、得られた各画分のシグナルを測定することにより、検出することができる。
【００３７】
本発明は、標的高分子化合物のアフィニティーラベル方法に使用するキットも含まれる。具体的には、1,3,5-トリアジン化合物を含む試薬及び標識物質部位を分子構造中に含むアミン化合物を含む標的高分子化合物のアフィニティーラベル用キットが挙げられる。該キットには、リガンド化合物を第３級アミンで修飾するための試薬を含んでいても良い。さらには、第３級アミンで修飾されたリガンド化合物を含んでいても良い。本発明のキットには、その他ラベル化に必要な試薬、器具などを含めることもできる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）修飾リガンド化合物（修飾触媒リガンド）の合成スキーム
標的高分子化合物のアフィニティーラベル化を行うためのリガンド化合物の第３級アミンの修飾について、具体的に例示して説明する。ここで、標的高分子化合物はアビジン、リガンド化合物はビオチン、第３級アミンはジメチルグリシンである。
【００４０】
以下の方法により、化合物１を出発原料として、1-(N,N-ジメチルアミノ)酢酸 5-アミノペンチル（化合物３）を合成した。次にビオチンを修飾し、ビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミド（化合物５）を合成した。化合物３と５をアミド化して修飾リガンド化合物を合成した（化合物６）。
【００４１】
１）化合物１の合成
化合物１として、以下の方法によりN-t-ブトキシカルボニル-5-アミノ-1-ペンタノール(N-t-Butoxycarbonyl-5-amino-1-pentanol)を合成した。
【００４２】
【化４】
0005219144.tif 000006
【００４３】
5-アミノ-1-ペンタノール(5-Amino-1-pentanol)(東京化成製)(3.0 g, 29.1 mmol)のCH2Cl2 (29 mL) 溶液に、0℃で炭酸ジ-tert-ブチル(di-tert-butyl dicarbonate) (7.6 g, 34.9 mmol)を滴下した。室温で１時間撹拌後、反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2溶液のままのせ、ヘキサン(hexane:AcOEt＝1:1)で溶出）により分離し、さらに減圧蒸留（2 mmHg、220℃）により精製し、化合物１を得た。無色油状 (5.9 g, 収率60 %)。
【００４４】
1H NMR (CDCl3): δ1.33-1.63 (m, 6H), 1.44 (s, 9H), 3.12 (td, 2H, J=6.2, 6.4Hz), 3.64 (t, 2H, J=6.4Hz), 4.64 (s, 1H).
LRMS (ESI): 204 (M+H)+，226 (M+Na)+
IR: ν 3469, 2932, 1678, 1644, 1536, 1169 cm-1
【００４５】
２）化合物２の合成
化合物２として、以下の方法により1-(N,N-ジメチルアミノ)酢酸 N-t-ブトキシカルボニル-5-アミノペンチル(N-t-Butoxycarbonyl-5-aminopentyl 1-(N,N-dimethylamino)acetate)を合成した。
【００４６】
【化５】
0005219144.tif 000007
【００４７】
化合物１ (2.2 g, 10.8 mmol)、N,N-ジメチルグリシン塩酸塩(N,N-dimethylglycine hydrochloride)(東京化成製) (1.5 g, 10.8 mmol)、N-メチルモルホリン(N-methylmorpholine) (1.1 g , 10.8 mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(4-dimethylaminopyridine)(WAKO製) (0.7 g, 5.37 mmol) のCH2Cl2 (32 mL) 溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド 塩酸塩(1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)(東京化成製) (EDC-HCl; 3.1 g, 16.2 mmol)を加え、0℃で反応させた。氷浴を取り除いて一晩撹拌し、反応混合物をCH2Cl2で抽出し、有機層を飽和炭酸ナトリウム(Na2CO3)、次いで飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（AcOEt）により精製し、化合物２を得た。無色油状 (2.4 g, 収率78 %)。
【００４８】
1H NMR (CDCl3): δ1.33-1.56 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.62-1.72 (m, 2H), 2.35 (s, 6H), 3.12 (q, 2H, J=6.4Hz), 3.16 (s, 2H), 4.13 (t, 2H, J=6.8Hz).
LRMS (ESI): 289 (M+H)+, 311 (M+Na)+
IR:ν 3441, 2938, 1692, 1641, 1166 cm-1
【００４９】
３）化合物３の合成
化合物３として、以下の方法により1-(N,N-ジメチルアミノ)酢酸 5-アミノペンチル(5-Aminopentyl 1-(N,N-dimethylamino)acetate)を合成した。
【００５０】
【化６】
0005219144.tif 000008
【００５１】
化合物２ (1.0 g, 3.47 mmol) のCH2Cl2 (6.3 mL) 溶液に、トリフルオロ酢酸(TFA)(3.9 g , 34.7 mmol)を窒素雰囲気下で加え、室温で３時間撹拌した。CH2Cl2を減圧留去し、残渣にCH2Cl2 (約6 mL)を加え、再び減圧留去した。この操作を更に２回繰り返した。ポンプで一晩減圧乾燥後、得られた油状物質をドライアイスで冷却しながらAcOEt-Et2Oで傾瀉した。得られた油状物質を減圧乾燥して目的物を得た。無色結晶 (1.4 g, 収率100 % TFAの塩)
【００５２】
b.p.: 51-55℃
1H NMR (methanol-d4): δ1.42-1.54 (m, 2H), 1.63-1.82 (m, 4H), 2.93 (t, 2H, J=7.7Hz), 2.97 (s, 6H), 4.15 (s, 2H), 4.28 (t, 2H, J=6.6Hz).
LRMS(ESI): 189 (M+H)+, 95 (M + 2H) 2+/2
IR(KBr): ν 3452, 2955,1742, 1676, 1468, 1425, 1202, 1136 cm-1
【００５３】
４）化合物４の合成
化合物４として、以下の方法によりビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミド(Biotinyl-N-hydroxysuccinimide)を合成した。
【００５４】
【化７】
0005219144.tif 000009
【００５５】
(+)-ビオチン(WAKO製) (1.0 g, 4.1 mmol)を窒素雰囲気下、N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)(20 mL) に加え、80℃に加熱し溶かした。N,N'-カルボニルジイミダゾール(N,N'-carbonyldiimidazole) (0.67 g, 4.1 mmol)を同温で加えて攪拌し、CO2の発生が止まった後に加熱を終了し、室温で更に２時間撹拌した。得られた白色の懸濁液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)(WAKO製) を加えると白沈が消え、そのまま２４時間反応させた。溶媒を減圧留去して得られた固体を2-プロパノールで再結晶させ、化合物４を得た。無色結晶 (985 mg, 収率70 %)。化合物４は既知であり、市販物、例えばSigma社より販売されているものを用いてもよい。
【００５６】
m.p.: 138-140℃
1H NMR (DMSO-d6): δ1.35-1.75 (m, 6H), 2.58 (d, 1H, J=12.4Hz), 2.67 (t, 2H, J=7.3Hz), 2.81 (s, 4H), 2.83 (dd, 1H, J=5.0, 12.4Hz), 3.06-3.15 (m, 1H), 4.11-4.19 (m, 1H), 4.31 (dd, 1H, J=5.0, 7.4Hz), 6.35(s, 1H), 6.41(s, 1H)
LRMS (ESI): 
IR (KBr):ν 3223, 2943, 2912, 2876, 1820, 1789, 1746, 1695 cm-1
【００５７】
５）化合物５の合成
化合物５として、以下の方法によりN-ビオチニル-6-アミノヘキサン酸(N-Biotinyl-6-aminohexanoic acid)を合成した。
【００５８】
【化８】
0005219144.tif 000010
【００５９】
化合物４ (980 mg, 2.87 mmol)のDMF (9mL) 懸濁液に、0.1M NaHCO3 (12mL) に6-アミノヘキサン酸 (376 mg, 2.87 mmol)を溶かした水溶液を加え、４時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、得られた結晶にクエン酸 (100 g/L)を加えて撹拌し、吸引ろ過により集めた結晶を冷水で４〜５回洗浄した。結晶は十酸化四リン (P4O10) を入れたデシケーター中で乾燥させ（45℃，１日）、目的物を得た。無色結晶 (937 mg，収率91 %)。化合物５は既知であり、市販物、例えばSigma社より販売されているものを用いてもよい。
【００６０】
m.p.: 218-220℃
1H NMR (DMSO-d6): δ1.18-1.68 (m, 12H), 2.04 (t, 2H, J=7.4Hz), 2.19 (t, 2H, J=7.4Hz), 2.58 (d, 1H, J=12.4Hz), 2.82 (dd, 1H, J=5.1, 12.4Hz), 3.00 (td, 2H, J=6.0, 6.7Hz), 3.05-3.15 (m, 1H), 4.09-4.17 (m, 1H), 4.30 (dd, 1H, J=5.2, 7.4Hz), 6.34(s, 1H), 6.40(s, 1H), 7.73 (m, 1H).
LRMS (ESI): 358 (M+H)+, 380 (M+Na)+
IR (KBr):ν 3417, 3377, 3287, 2938, 2877, 1711, 1698, 1633, 1541 cm-1
【００６１】
６）化合物３及び５のアミド化による修飾リガンド化合物の合成（化合物６）
化合物３及び５をアミド化して、以下の方法によりN,N-ジメチル-15-(ビオチニルアミド)-2,10-ジオキソ-3-オキサ-9-アザペンタデカナミン(N,N-dimethyl-15-(Biotinylamido)-2,10-dioxo-3-oxa-9-azapentadecanamine)（化合物６） を合成し、修飾リガンド化合物とした。
化合物３ （346 mg, 0.83 mmol）、化合物５ （300 mg, 0.83 mmol）、及びN-メチルモルホリン（NMM: 252 mg, 2.49 mmol）のMeOH (21 mL) 溶液に、第４級アンモニウム塩 4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM: 574 mg, 2.07 mmol）を加え、室温で一晩攪拌した。
【００６２】
【化９】
0005219144.tif 000011
【００６３】
溶媒のメタノール(MeOH)を一部減圧留去した後、 エーテル(Et2O)を加え、結晶を析出させた。結晶を吸引ろ過によって集めEt2Oで洗浄した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（MeOH→MeOH 1%Et3Nで溶出）により分離し、トリフルオロ酢酸塩(TFA塩)として目的物を得た。得られた塩をMeOHに溶解し、0.05M KOHで中和し、溶媒を減圧留去した後CHCl3に溶解し、不溶物をろ過により取り除いた。ろ液より得られた固体を再結晶（MeOH-Et2O）した。無色結晶（262.8 mg, 収率60%）。
【００６４】
b.p.: 124-133℃
1H NMR (MeOH-d4): δ1.25-1.80 (m, 18H), 2.18 (t, 2H, J=7.4Hz), 2.19 (t, 2H, J=7.3Hz), 2.33 (s, 6H), 2.70 (d, 1H, J=12.7Hz), 2.93 (dd, 1H, J=4.9, 12.7Hz), 3.11-3.24 (m, 7H), 4.13 (t, 2H, J=6.6Hz), 4.30 (dd, 1H, J=4.5, 7.8Hz), 4.49 (dd, 1H, J=4.9, 7.8Hz).
13C NMR (MeOH-d4):δ23.3, 25.7, 25.9, 26.6, 28.3, 28.5, 28.8, 29.0, 29.1, 35.8, 36.0, 39.1, 39.2, 40.0(CH2-S), 44.2(2CH3), 56.0(CH-S), 59.3(CH2-N), 60.6(CH-N), 62.4(CH-N), 64.9(CH2-O), 165.1(N-CO-N), 170.1(CO-O), 174.9(CO-NH), 175.0(CO-NH)
LRMS (ESI): 528 (M+H)+, 550 (M+Na)+
HRMS (ESI-TOF): calcd for C25H46N5O5S (M+H)+ 528.3214; found 528.3211.
IR(KBr): ν 3302, 2924, 2853, 1738, 1701, 1638, 1560 cm-1
【００６５】
（実施例２）アビジン特異的アフィニティーラベル（蛍光標識）
本実施例では、アビジン及びγ-グロブリンを含む溶液から、リガンド化合物としてのビオチンを、アフィニティーラベル化方法により検出した。リガンド化合物としてのビオチンを実施例１に記載の方法より第３級アミンで修飾し、修飾リガンド化合物を得た。これらについて、以下の方法でアフィニティーラベル化を行った。
【００６６】
１．材料
本実験例で使用するアビジン、γ-グロブリン、修飾リガンド化合物、蛍光剤及びCMDTの各々を50 mMリン酸緩衝液(pH 8.0) で溶解した。リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム二水和物(39.0 g, 0.25 mol)を適量の水に溶かし、そこへ2.5 M NaOH溶液を少しずつ加え、pH 8.0に調整したものを用いた。この溶液をメスフラスコに移し、水を加えて全量を500 mLとしたものを用いた。
【００６７】
a)アビジン溶液：卵白由来アビジン（SIGMA社）1 mgを50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解した。
b)γ-グロブリン溶液：γ-グロブリン（SIGMA社） 21 mgを50 mMリン酸緩衝液 1 mL (pH 8.0)で溶解した。
c)修飾リガンド化合物溶液： 実施例１で調製した修飾リガンド化合物1.2 mgを50 mMリン酸緩衝液 2 mL（pH 8.0）で溶解した。
d)標識化剤（蛍光剤）溶液：蛍光性アミン（カスケードブルー(R)(Invitrogen社)) 3.5 mgを50 mMリン酸緩衝液 1 mL（pH 8.0）で溶解した。
e)CDMT溶液： CDMT 2.0 mgを50 mMリン酸緩衝液 1 mL（pH 8.0）で溶解した。
【００６８】
２．実験操作
１）アビジン溶液 40 μL、γ-グロブリン溶液 40 μL、修飾リガンド化合物溶液 20 μLを試験管（エッペンドルフTMチューブ）に加え、室温で２時間放置した。
２）その後、蛍光剤溶液 40 μL及びCDMT溶液 20 μLを加え、室温で２４時間放置した。
３）その後、以下の条件でゲルろ過分析し、２種のタンパク質を分離し、各画分の蛍光とUV（波長280nm）での吸光度を測定した。
４）ゲルろ過条件
ゲル：Sephadex(R) G-100 superfine （GE Healthcare社）
移動相：50 mMリン酸緩衝液 (pH 8.0、0.1 M NaCl)
カラムサイズ：1.5×40cm
流速：2 mL/hr
フラクションボリューム：1.0 mL
蛍光：励起極大波長399 nm、蛍光極大波長423 nm で定量測定
UV：280 nm で固定波長測定
【００６９】
３．結果
γ-グロブリンとアビジンのゲルろ過分析結果を図４及び図５に示した。UV吸光度により、溶出した各タンパク質が定量され（図４）、各ピークでの蛍光強度が測定された（図５）。その結果、γ-グロブリンとアビジンのフラクションの蛍光強度には有意な差があり、アビジンが選択的にラベル化されたといえる。即ち、本発明のアフィニティーラベル化法により、γ-グロブリンとアビジンのうち、アビジンがスクリーニングされ、ビオチンと相互作用しうる物質であることが確認された。上記のアビジンとビオチンによるラベル化の検出方法に係る反応模式図を図６に示した。
【００７０】
（実施例３）アビジン特異的アフィニティーラベルとラベル化率の定量
本実施例では、アビジン又はγ-グロブリンを含む溶液と実施例１の方法により合成した修飾リガンド化合物（修飾ビオチン）を混合し、以下の方法によりアフィニティーラベル化し、ラベル化率の定量を行った。
【００７１】
１．実験操作：
本実験例で使用するアビジン、γ-グロブリン、修飾リガンド化合物、蛍光剤及びCMDTの各々を50 mMリン酸緩衝液(pH 8.0) で溶解した。リン酸緩衝液は、実施例２に記載のものと同様、リン酸二水素ナトリウム二水和物(39.0 g, 0.25 mol)を適量の水に溶かし、そこへ2.5 M NaOH溶液を少しずつ加え、pH 8.0に調整したものを用いた。この溶液をメスフラスコに移し、水を加えて全量を500 mLとしたものを用いた。
【００７２】
a)アビジン溶液：卵白由来アビジン（SIGMA社）を50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解し、0.15 mM アビジン溶液とした。
b)γ-グロブリン溶液：γ-グロブリン（SIGMA社）を50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解し、0.15 mM γ-グロブリン溶液とした。
c)修飾リガンド化合物溶液： 実施例１で調製した修飾リガンド化合物を50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解し、1.2 mM 修飾リガンド化合物溶液とした。
d)標識化剤（蛍光剤）溶液：カスケードブルー(R)(Invitrogen社)を50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解し、6.0 mM 標識化剤溶液とした。
e)CDMT溶液：CDMTを50 mMリン酸緩衝液 100 μL (pH 8.0)で溶解し、12 mM CDMT溶液とした。
【００７３】
0.15 mMアビジン溶液又は0.15 mMγ-グロブリン溶液に、1.2 mM 修飾リガンド化合物溶液 5 μLを加え、ボルテックス(R)で攪拌した後、室温で３０分放置した。
【００７４】
次に50 mMリン酸緩衝液(pH 8.0) 30 μL、6.0 mM 標識化剤溶液 20 μL、12 mM CDMT溶液 10 μL を加え、ボルテックス(R)で攪拌した後、室温で８時間放置した。反応溶液をゲルろ過クロマトグラフィー (Sephadex(R) G-50（GE Healthcare社）、50mMリン酸緩衝液(pH 8.0)、0.1 M NaClで溶出) により分離し、UVスペクトルからラベル化率を求めた。
【００７５】
反応溶液(75 μL)中のそれぞれの化合物の初期濃度は、アビジン: 20 μM; 修飾リガンド化合物: 80 μM; 標識化剤: 1.6 mM; CDMT: 1.6 mMであった。また、アビジン系におけるコントロール実験には、修飾リガンド化合物のかわりに、触媒としてビオチンを持たないN,N-ジメチルグリシンエチルエステル(N,N-Dimethylglycine ethyl ester)を用いた。アビジン特異性の評価は、等モル量のγ-グロブリンを用いて行った。ビオチンの特異性の評価は、触媒能をもたない天然ビオチンを触媒に対して25当量添加共存させて行った。
【００７６】
２．UV測定とラベル化率の計算
アビジン及びカスケ−ドブルー(R)の特異的吸収波長におけるモル吸光係数は以下のとおりであった。
【００７７】
a)カスケ−ドブルー(R)モル吸光係数：ε(399 nm) = 26400 M-1cm-1、 ε(280 nm) = 18792 M-1cm-1
b)アビジンモル吸光係数：ε(280 nm) = 93960 M-1cm-1
各UVスペクトルは図７〜９に示した。以下の計算式からそれぞれの濃度を算出した。なお、セル長は1cmなので計算式から省略した。
カスケードブルー(R)（cb）の濃度  Ccb (M)：399 nmの吸光度Acb399（実測値）から、
Ccb = Acb399/26400
アビジンのタンパク濃度  Cav (M)：280 nmの 吸光度A280（実測値）は、アビジンとカスケードブルーの同波長における吸収の和（Aav280 ＋ Acb280）なので、
Aav280 = A280 − Acb280  = A280 − 18792×Ccb
従って、
Cav = (A280 − 18792×Ccb) /93960
よってラベル化率  Lav (%)は、下記式に上記の値を代入して求めた。
Lav = 100×Ccb / Cav (%)
【００７８】
３）結果
上記の結果を表１及び図１０に示した。
【００７９】
【表１】
0005219144.tif 000012
【００８０】
以上の結果より、以下のことが考察できる。
（１）アビジンは同一モノマーサブユニットの四量体なので、単純に１分子あたり４か所での標識が可能であり、本条件ではそのうちの約半分弱が標識されたことを示した。
（２）ビオチンを有する修飾リガンド化合物を触媒として用いた結果、アビジンに対して特異的にラベル化され、γ-グロブリン、アビジンコントロール（ビオチンを有さない触媒を用いた系）ではラベル化されなかった。
（３）本条件下での非特異的な反応により、10％程度のラベル化が認められた。
（４）過剰量のビオチンの添加により、特異的反応が完全に阻害されたことから、ラベル化はアビジンとビオチンとの相互作用に基づいていることが確認された。アビジンと特異的に結合するビオチンによって阻害されたので，ビオチンを有する修飾リガンド化合物による反応はアビジン／ビオチンの結合に基づく特異的反応といえる。
【００８１】
（実施例４）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分析
実施例２に準じて行ったラベル化実験についてSDS-PAGEにより標識されたタンパク質の分析を行った。常法に従い4%濃縮ゲル及び12%分離ゲルを使用し、200V定電圧で泳動 (泳動用緩衝液:0.025 M Tris-HCI, pH 8.3, 0.192 M glycine, 0.1 % SDS)した。試料は1 μg/μL 溶液10μLに試料用緩衝液 (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 4 % SDS, 20 % グリセロール, 10 % 2-Mercaptethanol, 0.02 % ブロモフェノールブルー) 10μLを加え、ボルテックス(R)にて攪拌した後、水浴で100 ℃ 30分加熱し、変性させた。泳動後、ゲルの蛍光検出を行い、さらにCBB (Coommassie Brilliant Blue) により染色した。その結果、修飾リガンドを用いたときにのみアビジンが共有結合を介して蛍光標識されていることが明らかとなった（図１１：レーン１，４）。
【００８２】
図１１の符号の説明は以下のとおりである。
レーン１：アビジン＋化合物６
レーン２：アビジン＋化合物６＋ビオチン(25eq)
レーン３：アビジン＋+ N,N-ジメチルグリシンエチルエステル
レーン４：アビジン＋化合物６＋γ-グロブリン
レーン５：アビジン＋γ-グロブリン+ N,N-ジメチルグリシンエチルエステル
レーン６：分子マーカー
a:アビジンのサブユニットモノマー
b:γ-グロブリンの軽鎖
c:アビジンのサブユニットダイマー
d:γ-グロブリンの重鎖
【００８３】
（実施例５）質量分析（マス）解析による標識アミノ酸の特定
実施例４のSDS-PAGEによる電気泳動の分析結果より、アビジンのモノマーサブユニットのゲルを切り出し、常法に従ってゲル内トリプシン消化した。得られたペプチドフラグメントの混合物を、逆相 HPLC とエレクトロスプレーイオン化質量分析法(HPLC-ESI-MS)により解析した。
【００８４】
１．実験操作：
標識化剤：カスケードブルー(R)はアニオン性のスルホ基を３個有しており、その電離のためにマス解析が困難となる。そのため本実験のためのラベル化には4-ブロモベンジルアミンを用いた。該ラベル化化合物は、第１級アミノ基を有するためラベル化はカスケードブルー(R)と同等に進行すると期待される。この化合物は、それ自身は電荷を持たず、臭素の同位体（79と81がほぼ同数）がマススペクトルにおいて特徴的なピークパターンを与えるので解析が容易になると考えられる。
ラベル化実験操作は、実施例２及び３と同様に行った。
【００８５】
２．HPLC-ESI-MS条件
(1)HPLC: HP1100 nanoLCTM（Bruker Daltonics社）
カラム：キャピラリーHPLCカラム、MonoCap(R) for fast flow（GL Science社）
カラムサイズ 0.05x150mm；、
HPLCカラム（ZorbaxTM 30SB C18（Agilent社）
カラムサイズ 0.3x5cm
移動相：溶媒 A: 0.1%ギ酸水溶液；溶媒 B: 0.1%ギ酸アセトニトリル溶液
流速：0.3μL/min
勾配：0 min/溶媒A:B =95:5, 40 min/溶媒A:B =10:90
(2)ESI-MS：micrOTOF-QTM II w/ online nanosprayer（Bruker Daltonics社）
【００８６】
３．結果
128個のアミノ酸からなるモノマーサブユニットの中で、Asp-108（108番目のアスパラギン酸）が特異的にラベル化されていることが明らかとなった。興味深いことに一次構造では近傍の105番と109番にもAspが存在しているがそれらのカルボキシル基は修飾されていないことがわかった。
【００８７】
NCBI  (National Center for Biotechnology Information)よりダウンロードしたアビジンとビオチン誘導体（N-Biotinyl-6-aminohexanoic acid）の複合体のX線データに基づくと、結合部位周辺の表面のアミノ酸（カルボキシル基を有するAsp又はGlu）のうち、修飾リガンド化合物の反応部位に最も近い位置に存在すると考えられるものがAsp-108であることが確認された。一方、105番と109番のAspではそれらのカルボキシル基は触媒に対して反対側を向いているようにみえる（図１２） 。これにより、アビジンとビオチン誘導体の反応部位がラベル化されることが確認された。
【００８８】
（実施例６）アセチルコリン受容体の特異的ラベル化 
ニコチン様アセチルコリン受容体の拮抗阻害薬であるヘキサメトニウムに着目し、その片方のメチル基の側鎖を伸ばして末端に触媒部位となるジメチルグリシンを導入した。第４級アンモニウムが一つ又は二つ存在し、その距離が適切に保たれていれば受容体への結合能は維持できると期待される。結合部位は膜内在性の受容体の親水性部に存在するので、その近傍である親水性タンパク表面には標的となるアスパラギン酸やグルタミン酸が十分に存在すると考えられる。
【００８９】
１．修飾リガンド化合物の設計：
実際に図のような修飾リガンド化合物を合成して、アメリカ産シビレエイの電気器官から得られた膜画分に対してラベル化反応を検討した。
【００９０】
１）ヨウ化[6-(ジメチルアミノ)ヘキシル]トリメチルアンモニウム（[6-(Dimethylamino)hexyl]trimethylammonium iodide）の合成
【化１０】
0005219144.tif 000013
【００９１】
N,N,N',N'-テトラメチル-1,6-ヘキサンジアミン（N,N,N',N'-tetramethyl-1,6-hexanediamine） (1.72 g, 10 mmol) の CH3CN (40 mL) 溶液にヨウ化メチル (1.42 g, 10 mmol)の CH3CN (10 mL) 溶液を窒素下、室温で滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、生じた沈殿をろ過で除きろ液を濃縮した。得られた固体を２-プロパノール／エチルエーテルで再結晶し白色固体を得た。
【００９２】
1.74 g, 収率55.4%。 m.p. 142-144℃. 
1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 1.41 (m, 4H), 1.53 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 2.24 (s, 6H), 2.32 (t, J = 7.62 Hz, 2H), 3.13 (s, 9H), 3.35 (m, 2H).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 22.0, 25.6, 26.3, 26.8, 45.2, 52.2, 58.9, 65.3. IR (KBr) cm-1: 3493, 2934, 2811, 2775, 1482. HRESI-MS m/z: Calcd for C11H27N2+ [M]+ 187.2169, found 187.2169.
【００９３】
２）2-(ジメチルアミノ)酢酸 6-ブロモヘキシル（6-Bromohexyl 2-(dimethylamino)acetate）の合成
【化１１】
0005219144.tif 000014
【００９４】
N,N-ジメチルグリシン塩酸塩（N,N-Dimethylglycine hydrochloride）(1.39 g, 10 mmol) のCH2Cl2 (40 mL)溶液に、4-(ジメチルアミノ)ピリジン（4-(dimethylamino)pyridine)(DMAP; 1.46 g, 12 mmol) 及び EDC・HCl (2.30 g, 12 mmol)を窒素下 0°Cで加え、同温で１時間攪拌した。反応温度を室温まで上昇させた後、6-ブロモ-1-ヘキサノール（6-bromo-1-hexanol）(1.81 g, 10 mmol) の CH2Cl2 (10 mL)を滴下し、更に室温で３時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2 で抽出し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[EtOAc-Hexand (1:1)]で精製し、目的物を無色油状物質として得た。 
【００９５】
2.01 g, 収率76%。 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.32-1.52 (m, 4H), 1.62-1.71 (quint J = 6.72 Hz, 2H), 1.83-1.91 (quint J = 6.78 Hz, 2H), 2.35 (s, 6H), 3.16 (s, 2H), 3.53 (t, J = 6.78 Hz, 2H), 4.13 (t, J = 6.72 Hz, 2H). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 25.0, 27.7, 28.4, 32.5, 33.6, 45.2, 60.4, 64.3, 170.6. IR (neat) cm-1: 2937, 1747. HRESI-MS m/z: Calcd for C10H20BrNO2 [M+H]+ 266.0750, found 266.0741.
【００９６】
３）ジメチル[6-(2-ジメチルアミノアセトキシ)ヘキシル]（dimethyl[6-(2-dimethylaminoacetoxy)hexyl]）の合成
【化１２】
0005219144.tif 000015
【００９７】
臭化ヨウ化6-(トリメチルアンモニオ)ヘキシルアンモニウム（[6-(trimethylammonio)hexylammonium bromide iodide）上で合成したヨウ化[6-(ジメチルアミノ)ヘキシル]トリメチルアンモニウム（6-(dimethylamino)hexyl]trimethylammonium iodide）(314 mg, 1mmol) の CH3CN (10 mL) 溶液に 2-(ジメチルアミノ)酢酸 6-ブロモヘキシル（6-bromohexyl 2-(dimethylamino)acetate） (400 mg, 1.5 mmol) の CH3CN (5 mL) 溶液を室温で滴下し、室温で72時間攪拌した。反応溶液にエチルエーテル (50 mL)を加え目的物を白色沈殿として析出させ、上澄みを取り除いた。得られた固体を再結晶（CH3CN／エチルエーテル）で再結晶し目的物を白色固体として得た。
【００９８】
280 mg, 収率48% m.p. 98-103℃.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.40-1.50 (m, 8H), 1.65-1.92 (m, 8H), 2.34 (s, 6H), 3.11 (s, 6H), 3.17 (s, 9H)< 3.22 (s, 2H), 3.25-3.45 (m, 6H), 4.10-4.18 (t, J = 6.35 Hz, 2H). 
13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 23.4, 23.5, 23.7, 26.5, 26.66, 26.67, 27.0, 29.5, 45.4, 51.3, 53.73, 60.7, 65.3, 65.5, 67.6, 171.7. IR (KBr) cm-1: 3470, 2945, 1740, 1482, 1203. HRESI-MS m/z: Calcd for C21H47N3O2+2 [M]+2 186.6828, found 186.6898.
【００９９】
２．アセチルコチリン受容体を含む膜画分に対するアフィニティーラベル化反応
膜画分はアメリカ産シビレエイ（Torpedo californica）の電気器官から文献公知の方法に準じて調製した(J. Elliott, S. G. Blanchard, W. Wu, J. Miller, C. D. Strader, P. Hartig, H.-P. Moore, J. Racs, M. A. Raftery, Biochem. J., 1980, 185, 667)。
217mgのタンパク質を含む受容体画分にヘキサメトニウム構造を有する修飾リガンド化合物(0.44 mM)、カスケードブルー(R)(1.1 mM)，およびCDMT(1.1 mM)を加え、（0.1 M NaCを含む50 mMリン酸緩衝液pH8.0；全量0.20 mL；括弧内は反応濃度）、ボルテックス(R)で攪拌後４℃で24時間攪拌した。反応液を遠心分離後、上澄みを除去し、沈殿に再び同緩衝液を加えて遠心し、上澄みを除いた。この操作を５回繰り返した後、沈殿を実施例４と同手法にてSDS-PAGEを行い、CBB (Coomasie Brilliant Blue) 及び本発明のラベル化による蛍光検出を行った。その結果を、図１３に示した。
【０１００】
図１３の符号の説明は以下のとおりである。
レーン１：分子マーカー
レーン２：ARM
レーン３：alkali M
レーン４：ARM（アフィニティーラベル化）
レーン５：alkali M（アフィニティーラベル化）
ARM（アセチルコリンが豊富な膜、AChR-ruch membrane)
alkali M（アルカリ処理ARM)
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
以上詳述したように、本発明の方法により、標的高分子化合物を効果的にラベル化することができる。
例えば、リガンド化合物となりうる候補化合物が複数種類存在する場合に、候補化合物が標的高分子化合物と相互作用した場合にラベル化されれば、ラベル化によるシグナルを検出することでリガンド化合物を選別し、スクリーニングすることができる。また、高分子標的化合物が複数種存在する場合に、リガンド化合物と相互作用しうる高分子標的化合物を検出することもでき、スクリーニングすることができる。これにより、酵素と基質の反応や、受容体とアゴニスト若しくはアンタゴニストの相互作用を容易に確認することができ、例えば可逆的反応などにより従来では容易にラベル化できず、検出が容易でなかった場合でも、本発明の方法によると容易に相互作用しうる物質を検出することができる。
さらに、本発明の方法は、標的高分子化合物のリガンド結合部位に対して空間的に近傍に位置する酸性アミノ酸残基を特定することができ、リガンド化合物の修飾部位を変えることによってリガンド化合物の結合に必要な標的高分子化合物の化学構造を知ることができる。
【０１０２】
以上により、例えば新規医薬品の開発において、標的高分子化合物と候補物質の相互作用に関し、従来ではスクリーニングすることができなかったものについても、本発明のアフィニティーラベル化方法を適用することにより、容易にスクリーニングすることができる。さらには、標的高分子化合物について、リガンド化合物の結合に必要な化学構造を知ることで、最も効果的な候補物質を設計することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明のアフィニティーラベル化方法の反応の一例を示す模式図である。
【図２】本発明のアフィニティーラベル化方法の反応の一例を示す模式図である。
【図３】本発明のアフィニティーラベル化方法の反応の一例を示す模式図である。
【図４】試料中のアビジン及びγグロブリンのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。（実施例２）
【図５】試料中のアビジン及びγグロブリンのＨＰＬＣ分析画分についてのラベル強度（蛍光強度）の測定結果を示す図である。（実施例２）
【図６】実施例２におけるアフィニティーラベル化方法の反応模式図である。
【図７】アビジンのUVスペクトルを示す図である。（実施例３）
【図８】カスケードブルー(R)のUVスペクトルを示す図である。（実施例３）
【図９】ラベル化アビジンのUVスペクトルを示す図である。（実施例３）
【図１０】アビジン、アビジンコントロール、γ-グロブリン及びビオチンの標識化（ラベル化）率を示す図である。（実施例３）
【図１１】アビジン特異的ラベル化による蛍光検出とCBB染色の結果を示す図である。（実施例４）
【図１２】アビジンモノマーのX線構造において、ビオチンとの反応部位及びアビジン中のアスパラギン酸(Asp)の位置を示す図である。（実施例５）
【図１３】アセチルコリン特異的ラベル化による蛍光検出とCBB染色の結果を示す図である。（実施例６）
【図７】
0005219144.tif 000019
【図８】
0005219144.tif 000020
【図９】
0005219144.tif 000021
【図１０】
0005219144.tif 000022
【図１】
0005219144.tif 000023
【図２】
0005219144.tif 000024
【図３】
0005219144.tif 000025
【図４】
0005219144.tif 000026
【図５】
0005219144.tif 000027
【図６】
0005219144.tif 000028
【図１１】
0005219144.tif 000029
【図１２】
0005219144.tif 000030
【図１３】
0005219144.tif 000031