(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更にその突出先端または切欠き端に、前記（ａ）の切欠き端または突出先端に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在する（ａ）の塩基を除去して接合させることを特徴とする、ＤＮＡの塩基置換方法。
【請求項２】
５’突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ’）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更に突出先端に、前記（ａ’）の切欠き端と突き合わされる位置に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在する（ａ’）の塩基を除去して接合させることを特徴とする、ＤＮＡの塩基置換方法。
【請求項３】
ＤＮＡリガーゼがＡＴＰ要求性リガーゼである、請求項１または請求項２に記載の塩基置換方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の方法で作成された塩基置換ＤＮＡを鋳型として増幅することにより、置換された塩基の相補鎖の塩基を前記置換された塩基と相補的な塩基に置換することを特徴とする、塩基置換ＤＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ塩基のリン酸結合を触媒する酵素であるＤＮＡリガーゼを用いた、２本鎖ＤＮＡにおける塩基の置換方法に関し、より詳しくは、突出末端を形成する２本鎖ＤＮＡと、前記突出末端と相補的な突出末端を持ちかつ突出先端または切欠き部に特定の塩基が存在する２本鎖のＤＮＡとの間の結合反応において、配列特異的なエキソヌクレアーゼ活性を有するリガーゼを用いて前者２本鎖ＤＮＡ中の所定の塩基を除去して接合する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の機能や性質の解析において、ＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子情報を利用した分子遺伝学的解析は、極めて有用な手段として様々な場面で用いられている。中でも微生物など種々の生物に由来するポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、制限酵素といった様々な酵素を用いて核酸を人工的に操作する遺伝子工学の手法は、生命現象の解明だけではなく有用遺伝子の単離や作出などに広く産業利用されるようになってきている。
【０００３】
上記の酵素のうちＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の５’末端に存在するリン酸基と３’末端に存在する水酸基を、リン酸結合を介して結合させる酵素である。遺伝子工学分野においては核酸同士のいわゆる「のり付け」用のツールとして広く用いられており、例えばベクターへの遺伝子断片導入の他、ＤＮＡ断片同士の結合、リガーゼを用いた核酸の増幅方法（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ＝ＬＣＲ法）などの利用法が知られている（特許文献１）。
【０００４】
ＤＮＡリガーゼを用いた遺伝子工学関連技術のうち、代表例の一つは制限酵素等で切断した生物由来のＤＮＡ断片と人工的に合成したＤＮＡ断片とを結合させ、これを鋳型にＰＣＲで目的の遺伝子断片を増幅させる手法である。この手法はオリゴカセット法（非特許文献１−３）と呼ばれ、任意のオリゴＤＮＡアダプター（カセット）を切断したゲノムＤＮＡに結合させることから、設計が自由であるため多数の改良がなされている（特許文献２−４）。
しかしながら、オリゴカセット法においては、制限酵素で切断したゲノムＤＮＡ全てに対してアダプターを結合させるため、標的配列を増幅させる際の特異性に大きな問題点があった。突出末端を形成する様に設計されたアダプターは、アダプター同士も相補的な配列を有しているため結合可能であり、アダプター同士の結合が標的配列とアダプターとの結合を著しく低下させるおそれがあるのと同時に、例えばＰＣＲなどで標的配列を増幅させようとする場合に非特異的産物として増幅され、解析を妨げるおそれがあった。この問題点を回避するためには複数の制限酵素による処理や複雑な形状のアダプター設計、多数の工程を経る必要があるなど、未だ十分な正確さと利便性を有しているとは言えないのが現状であった。
【特許文献１】特公平６−３６７６０号  核酸の増幅法
【特許文献２】特開平８−２４２８９７  遺伝子の複製及び増幅方法
【特許文献３】特開平１１−１９６８７４  ＤＮＡ断片分析法
【特許文献４】特開２００１−０６１４８６  選択的な制限断片増幅：一般的なＤＮＡフィンガプリント法
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｔａｌ  Ａ．＆Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｓ．Ｃ．１９９０．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１０）：３０９５−３０９６．
【非特許文献２】Ｓｉｅｂｅｒｔ  Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（６）：１０８７−１０８８．
【非特許文献３】Ｌａｇｉｎｇ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（２）ｅ８．
【非特許文献４】Ｈｉｗａｔａｓｈｉ  Ｋ．１９６８．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８：３７３−３８６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の現状に鑑み、本発明は、アダプター結合ＤＮＡ断片の製造過程等において、少ない工程と簡単な構成からなりかつ精度の高い未知配列の増幅を可能にするような、ＤＮＡ塩基の除去方法、ならびに前記アダプター結合ＤＮＡ断片の製造において利用可能な、結合反応時に特定の塩基を置換する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題の解決のため、本発明者らは、突出末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）を形成する制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを切断し、この制限酵素が形成する末端と相補的な突出末端を形成する２本鎖のオリゴＤＮＡアダプターを設計し、ＤＮＡリガーゼを用いてアダプター結合ＤＮＡ断片製造の検討を行った。
この過程において、従来の様に制限酵素切断による突出末端とアダプターが形成する末端が「完全に相補的な形状」ではなく、アダプターの突出末端の突出先端または切欠き端に、ゲノムＤＮＡの制限酵素切断断片（以下「制限酵素断片」ともいう）の切欠き端または突出先端に存在する塩基とは異なる塩基が余分に存在するよう設計した場合、リガーゼが条件特異的エキソヌクレアーゼ活性を示して所定の塩基を除去し、突出末端同士の結合を行ってアダプター結合ＤＮＡ断片を形成すること、更にこの様に設計されたアダプター同士はリガーゼによっても結合せず、特異的に標的とする遺伝子断片を増幅可能であるという事実を見いだし、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明の第１の態様は、突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更にその突出先端または切欠き端に、前記（ａ）の切欠き端または突出先端に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在する（ａ）の塩基を除去して接合させることを特徴とする、ＤＮＡ塩基の置換方法を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、５’突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ’）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更に突出先端に、前記（ａ’）の切欠き端と突き合わされる位置に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在する（ａ’）の塩基を除去して接合させることを特徴とする、ＤＮＡ塩基の置換方法を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、ＤＮＡリガーゼがＡＴＰ要求性リガーゼである、第１または第２の態様に記載の塩基置換方法を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載の方法で作成された塩基置換ＤＮＡを鋳型として増幅することにより、置換された塩基の相補鎖の塩基を前記置換された塩基と相補的な塩基に置換することを特徴とする、塩基置換ＤＮＡの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＤＮＡ塩基除去・置換方法を利用することにより、種々の生物のゲノム上に存在する既知配列から、未知の配列を効率よく、しかも簡便に単離することが可能となる。これにより、新しい遺伝子の全長決定、遺伝子の上下流に位置する調節配列の探索、くり返しモチーフなど遺伝子をコードしない領域の探索など、これまで困難であった未知領域の塩基配列の解析を容易にするＤＮＡ断片の製造が可能になると期待される。本発明は、従来ＤＮＡ塩基のリン酸結合を触媒する機能が知られていたＡＴＰ要求性リガーゼの、配列特異的エキソヌクレアーゼ活性を利用するものであり、この活性を利用した塩基の置換、いわゆるＰｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎに応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更にその突出先端または切欠き端に、前記（ａ）の切欠き端または突出先端に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在するする（ａ）の塩基を除去して接合することを特徴とする、ＤＮＡの塩基置換方法を提供する。
本発明の最も基本的な原理は、制限酵素によって形成された相補的な突出末端同士のＤＮＡリガーゼを用いた結合であって、１塩基過多の（Ｏｎｅ−ｂａｓｅ  ｅｘｃｅｓｓ）２本鎖オリゴＤＮＡアダプター（図１参照）を用いた結合によって示されるものである。従来、ＤＮＡリガーゼは突出末端、平滑末端の両方を、５’側のリン酸基と３’側の水酸基をリン酸結合を介して結合させる酵素として知られている。突出末端同士が相補的な配列からなる場合、ＤＮＡリガーゼによる結合前に相補鎖同士がゆるやかな結合状態（ＡｎｎｅａｌｉｎｇまたはＢａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ）にあると考えられるが、本発明は、ここにＤＮＡリガーゼが結合して末端同士を結合させるとき、余分な塩基がある場合に、ＤＮＡリガーゼがこの余分な塩基と対応する位置にある塩基を除去するという条件特異的なエキソヌクレアーゼ活性を示すという新たな知見を利用するものである。アダプターの配列、制限酵素の種類、ＤＮＡリガーゼの種類やそれぞれの反応溶液、反応条件等は、必要に応じて適宜利用可能なものの中から選択すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば（ａ）として突出末端を形成する制限酵素で切断したゲノムＤＮＡの断片、（ｂ）としては人工的に合成したオリゴＤＮＡからなる図１下段に示すようなアダプターの組合せが好適であり、アダプターは置換した塩基を含むＤＮＡ断片を後に増幅する目的で任意のプライマー配列、例えばユニバーサルプライマーと総称されるプライマー配列を含んでいるのが望ましい。ＤＮＡリガーゼに関しては分子生物学分野で通常用いられているものから適宜選択すれば良く、例えばファージ由来のリガーゼなどが好適である。
【００１３】
上記態様において、より好ましい態様として、５’突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ’）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有し、かつ更に突出先端に、前記（ａ’）の切欠き端と突き合わされる位置に存在する塩基とは異種の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ’）とを、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、前記余分な塩基に対応する位置に存在する（ａ’）の塩基を除去して接合させることを特徴とする第１の態様に記載の塩基置換方法を提供する。図２に本態様の模式図を示す。図２ａは制限酵素で切断したＤＮＡ断片の一方（右側，ａ’）と、これと同じ突出末端を有するオリゴＤＮＡアダプター（左側，ｂ’）を表す。ＤＮＡ鎖の上下流は５’、３’で表している。アダプターには突出末端の更に先端に、制限酵素断片の切欠き部側に存在する塩基（△で表す）と異種の塩基（○で示す）が余分に存在しており、アダプター側の突出末端の塩基はリン酸化（Ｐで表す）されている。５’リン酸化は制限酵素断片、アダプターのどちらであっても良いが、調製の容易さからアダプター側がリン酸化されているのが好ましい。ここにＤＮＡリガーゼが作用することにより、相補鎖同士が結合しつつ、塩基が（△）除去されて末端同士も結合する（図１ｂ）。一方、アダプター同士は、○で示した塩基が合計２つあるため相補的な結合が形成されず、ＤＮＡリガーゼによっても結合しない（図１ｃ）。この様な本発明の提供するＤＮＡ塩基の置換方法を用いて、２本鎖オリゴＤＮＡアダプターと制限酵素断片とを結合させる際に特定の位置にある特定の塩基を置換することが可能となる。
一方、制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡは、両側の末端が同じ突出末端を有しており、ＤＮＡリガーゼはこの両端同士の結合（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにはこの結合が利用される）や切断されたＤＮＡ断片同士の結合も同様に触媒することが可能である。そこで、制限酵素断片同士を結合させず、アダプターと制限酵素断片とを確実に結合するための方法として、制限酵素断片の末端をアルカリフォスファターゼで処理する工程を含むことが有効である。アルカリフォスファターゼはＤＮＡの５’側に露出したリン酸基を切断するため、この処理を受けた断片同士はリガーゼによるリン酸結合を受けなくなり、アダプターの５’側リン酸基と制限酵素断片のみが結合できるようになる。アルカリフォスファターゼ処理工程は、制限酵素断片を得た後に適当な緩衝液中で行っても良いし、また制限酵素に比べて塩類溶液の条件が緩やかであることから、制限酵素処理と同時に制限酵素用反応溶液中で行っても良い。酵素の由来、酵素処理の反応時間、反応条件などは利用可能なものの中から適宜選択すれば良く、本発明を限定するものではない。
【００１４】
本発明における異種の余分な塩基を存在させる態様としては、前記の様にアダプターの５’突出末端の更に先に制限酵素断片の切欠き端に存在する塩基と異なる塩基を存在させる態様でも良いし、反対にアダプターの切欠き端に制限酵素断片の突出先端に存在する塩基と異なる塩基を存在させる態様でも良い。
【００１５】
上記各態様における５’突出末端を形成する制限酵素としては、ＡｃｃＩ，ＡｆｌＩＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｓｎＩ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｌａＩ，ＤｄｅＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐａＩＩ，ＭｌｕＩ，ＭｓｅＩ，ＭｓｐＩ，ＭｖａＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｉＩ，ＮｅｏＩ，ＮｄｅＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｃｒＦＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩのうちいずれかより選択される制限酵素が好適である。これらは１〜５塩基の５’突出末端を形成する制限酵素であるが、突出部（Ｏｖｅｒｈａｎｇ）が多い方が相補的結合が強くなることが期待されるため、この中でも特にＡｆｌＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩが好適であり、更に入手のしやすさからＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩが好適であって、特にＥｃｏＲＩは最も一般的な制限酵素の１種であり好適である。
【００１６】
上記に示した制限酵素を用いる際には、その認識する配列（制限酵素サイト）のゲノム中での出現頻度に注意する必要がある。ＥｃｏＲＩなど配列の出現頻度の高い制限酵素で切断した場合、相対的に短い制限酵素断片が多数形成され、逆に出現頻度の低い制限酵素（Ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｅｒ）では相対的に長い制限酵素断片が少数形成される。この点を考慮し、製造しようとするアダプター結合ＤＮＡ断片に合わせて制限酵素は適宜選択すれば良い。
【００１７】
本発明の提供するＤＮＡ塩基の置換方法は、３’突出末端を形成する制限酵素を用いたアダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法にも適用可能であると考えられる。図３にこの場合の模式図を示す。３’突出末端を形成する制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡ制限酵素断片（右側）と、前記突出末端に相補的な突出末端を持つアダプター（左側）とをＤＮＡリガーゼを用いて結合させる反応において、アダプターの５’切欠き端に制限酵素断片の５’先端に存在する塩基（○で表す）と異なる塩基（△で示す）が存在している場合、ＤＮＡリガーゼがエキソヌクレアーゼ活性を示してゲノム側の塩基を除去し、突出末端同士を結合させる。アダプター同士が結合しないのは図１と同様である。
【００１８】
上述の３’突出末端を形成する制限酵素としては、ＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｇｌＩ，ＢｓｍＩ，ＣｆｏＩ，ＨａｅＩＩ，ＨｈａＩ，ＫｐｎＩ，ＫｓｐＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｓｔＩＩから選択される制限酵素があげられる。この中でも、突出末端の突出部が長い制限酵素であるＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＨａｅＩＩ，ＫｐｎＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩが好適であり、入手の容易さなどからＰｓｔＩ，ＳａｃＩなどが好適である。
【００１９】
本発明の提供するＤＮＡ塩基の置換方法に用いられるＤＮＡリガーゼは、突出末端同士のＤＮＡを結合させる能力があればどの様なものでも良く、その由来などが本発明を限定するものではないが、結合にはリガーゼのＡＴＰ要求性リン酸結合反応の逆反応（ＡＭＰ要求性リン酸結合の切断）を利用すると考えられることから、ＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼが好ましく、特に分子生物学分野で広く用いられているＴ４  ＤＮＡリガーゼが好適である。
【００２０】
本発明は、突出末端同士の結合に関与するＤＮＡリガーゼについて、条件特異的なエキソヌクレアーゼ活性、すなわち、突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有しかつ更にその突出先端または切欠き部に特定の余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）との、突出末端同士の結合反応において、ＤＮＡリガーゼを用いて前記余分に対応する塩基を除去するという今回新たに見出された活性を利用するものである。理論的には突出末端の塩基数には制限はなく、突出末端同士が相補的ならば結合可能であるが、一般的には制限酵素が作り出す範囲付近の突出数、すなわち２塩基以上１０塩基以下の突出末端同士の結合に適用可能であり、より好ましくは３塩基以上５塩基以下の突出末端同士の結合に適用可能である。
【００２１】
上記エキソヌクレアーゼ活性を更に詳しく述べれば、５’突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ’）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有しかつその突出先端に余分な塩基が存在する２本鎖ＤＮＡ（ｂ’）との突出末端同士の結合反応において、ＤＮＡリガーゼを用いて（ａ’）の切欠き部に存在する対応する塩基を除去する活性を有する、エキソヌクレアーゼ活性である。好ましくは５’突出末端にリン酸化された余分な１塩基が存在する場合、これを（ｂ’）にリン酸結合させるために切欠き部の３’末端に存在する塩基を除去し、新たに３’末端となった新末端塩基と余分な塩基の間でリン酸結合をさせるというものである。本発明における余分な塩基とは、制限酵素断片の突出末端または切欠き端に存在する塩基とは異なる塩基をいい、例えばＥｃｏＲＩサイトＧＡＡＴＴＣにおけるＧに対するＡ，Ｔ，Ｃの様な関係にある塩基をいう。図４に、本発明に係るリガーゼのエキソヌクレアーゼ活性を模式化して示す（下記実施例で詳述）。ここでは、ＥｃｏＲＩで切断し５’末端を脱リン酸化したゲノムＤＮＡ（ボックス）と、ＥｃｏＲＩサイトと相補的な配列を有すが５’末端にＧではなくリン酸化Ｔを有したアダプターとのライゲーションを例としている。ライゲーションの際、両者は相補的な配列を介して緩やかに結合しているが（ａ．Ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ）、リン酸化塩基が相補的な相手がおらずいわば宙に浮いた状態となっている。このとき、リガーゼは相手先の切欠き部３’末端の１塩基を除去し、ここにリン酸化Ｔを結合させる（ｂ．Ｌｉｇａｔｉｏｎ）。こうして得られたＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行うと、Ｃ／Ｇであるべき箇所がＡ／Ｔに置換された新たなＤＮＡ断片が合成される（ｃ．ＰＣＲ）。こうしたエキソヌクレアーゼの例としてはＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼがあげられ、代表例はＴ４  ＤＮＡリガーゼである。
【００２２】
上述のエキソヌクレアーゼ活性を用いれば、例えば「突出末端を形成する制限酵素で切断したＤＮＡ断片の切欠き部３’末端の塩基」という特定の塩基を、アダプターとなるＤＮＡとの結合反応の際、異種の塩基に置き換えて導入することが可能である。リガーゼによるアダプターとの結合反応では置換された塩基の相補鎖の塩基は元のままであるが、結合後のＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ等による増幅を行うことによって、当該相補鎖塩基も置換した余分な塩基（相補的）に置き換えることが可能となる。ここで増幅方法は特に限定されないが、最も一般的なＰＣＲ法が好ましい。また、増幅反応における諸条件についても何ら限定は無く、通常の条件の中から目的とする配列の特異性などに応じて決定すればよい。図５に、ＰＣＲ等により、本発明によって置換された塩基の相補鎖の塩基を置き換える方法について、下記実施例の結果を参照に、図４ｃ「ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」の箇所をより詳細に述べた。図５ａはＰＣＲ等の鋳型となるアダプター結合ＤＮＡ断片であり、ゲノムＤＮＡ由来の領域をボックスで示している。このＤＮＡは増幅用のプライマー配列としてＧＬ１配列とｐｃａｔ２−３配列をそれぞれ有している。図上側の鎖は予めアルカリフォスファターゼ処理を行っているため、リガーゼによるライゲーションを受けておらず、その部分を矢印で強調してある。反対に下側の鎖はリガーゼによるライゲーションを受けており、下線にてつながっている部分を強調してある。また白抜きの縦長ボックスは、塩基置換により一時的に非相補的になっている塩基対を示している。ＰＣＲの最初のサイクルにおいて（ｂ）、Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎにより２本鎖ＤＮＡが離れると、下側の鎖にはプライマーＧＬ１とｐｃａｔ２−３で挟まれる領域がありこの部分が増幅され、置換された塩基に相補的な塩基を持つ上側の新たな鎖が形成されるが、上側の鎖は２つに分かれてしまうためＧＬ１／ｐｃａｔ２−３で挟まれる領域ができず増幅が起こらない。結果として（ｃ）、ＰＣＲ反応の進行とともに置換された塩基対（Ｃ／Ｇ→Ａ／Ｔ）を有するＤＮＡ鎖が選択的に増幅される。この様な手法を用いれば、最初に置換した塩基だけでなく、相補鎖の塩基も置き換えることが可能となる。以下に本発明の実施例を述べるが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
（ミドリゾウリムシからのゲノムＤＮＡの抽出）本実施例の材料として、淡水中に生息し細胞内にクロレラ属藻類を共生させる原生動物の一種、ミドリゾウリムシＰａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａを用い、ゲノムＤＮＡの抽出には、共生藻のゲノムの混入を防ぐため、暗所培養により細胞内から共生藻を取り除いた株であるＭｉｗ２ｗ株（採集地：宮城県亘理町）を用いた。Ｈｉｗａｔａｓｈｉの方法（非特許文献４）により試験管培養されたミドリゾウリムシ約数万細胞を、手回し遠心器で集めて１．５ｍｌチューブに移し、これを更に１００００ｒｐｍ、１分間遠心して上清を除き、ＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＳＤＳ）を４００μｌ加えて静かに懸濁させ、細胞を溶解した。ここに４００μｌのフェノール−クロロホルム（１：１）を加えて５分間静かに混合し、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心し、水相を新しい１．５ｍｌチューブに移して前記フェノール−クロロホルムを加え、更に５分間静かに混合して遠心（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。水相を新しい１．５ｍｌチューブに移し、エタノール沈澱を行ってＤＮＡペレットを得、これを乾燥させた後、３０μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶かして１０℃にて保存した。十分にＤＮＡが溶解した後、溶液中のＤＮＡ濃度を分光光度計を用いて測定した。
【００２４】
（ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ処理）およそ５μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を１−５Ｕ用い、用法に従って１０μｌの系で切断（３７℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）した。処理後、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ってＤＮＡの制限酵素断片をペレットにし、５μｌのＴＥを加えて溶解させた。
【００２５】
（アダプターの調製）ＥｃｏＲＩサイトを持ったオリゴＤＮＡアダプターとして、配列番号１及び配列番号２の配列を持つよう設計された合成オリゴＤＮＡ（Ｆａｓｍａｃ，ＪＰＮ）を用い、１００μＭとなるようＴＥで溶解した。これを原液とし、両溶液２０μｌずつを混合し、ＴＥを加えて５０μｌとし、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を用い、［９５℃，５ｍｉｎ；６５℃，５ｍｉｎ］のプログラムで１本鎖のオリゴＤＮＡ２つを２本鎖化した。
【００２６】
（カタラーゼ遺伝子の保存領域の探索）ミドリゾウリムシのゲノムＤＮＡからカタラーゼ遺伝子を単離するため、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用い、既に塩基配列及びアミノ酸配列が明らかな複数種の生物、すなわちヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｌｕｓ）、ノルウェーラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、線虫の一種（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、イネ（Ｏｌｉｚａ  ｓａｔｉｖａ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のアミノ酸配列情報を参照し、保存性の高い領域としてヒトカタラーゼの第６８−７９アミノ酸配列及び第３６３−３７１アミノ酸からプライマーを設計した（配列番号３，４）このプライマー及びゲノムＤＮＡ（未切断）、増幅用としてＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用い、表１ａの組成の反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いて表２ｂのプログラムでＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応溶液を１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動し、臭化エチジウムで染色してトランスイルミネーターでバンドを確認した。以後塩基配列情報の解析には、ＤＮＡｓｙｓ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔ）、ＤＮＡｄｙｎａｍｏ（ＢｌｕｅＴｒａｃｔｏｒＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｔｄ）、ＳｅｑＣｏｎｖ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｓｕｎ）を適宜用いた。
【表１】
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【００２７】
ＰＣＲの結果、９００−１０００ｂｐのシングルバンドが確認されたため、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いてクローニングし、ＡＢＩ３１００，ＡＢＩ３７７，ＡＢＩ３１０ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてその塩基配列を決定した。ここで明らかになった配列から、下流向きプライマー（配列番号５）を設計した。
【００２８】
（アダプターのライゲーション）上述の方法で作製したアダプター及びＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ（制限酵素断片）を用いて、アダプターのライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は５μｌの系で行い、約１μｇの制限酵素断片、１．５ＵのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を含むよう調製した。アダプターの濃度の最適化を行うため、アダプターの終濃度が４μＭ、４００ｎＭ、４０ｎＭ、４ｎＭとなる４種類の反応溶液を調製し、またアダプター４０ｎＭのみを含むライゲーション溶液も合わせて調製した。ライゲーションは１０℃、一晩（８ｈ〜）行った。
【００２９】
（カタラーゼ３’下流領域の増幅）ライゲーション反応後のアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型とし、上述のＰＣＲと同じ系（鋳型のみ異なる）を用い、ユニバーサルプライマーＧＬ１（配列番号６）と配列番号５のプライマーを用いて、カタラーゼの３’側既知配列とアダプターとで挟まれた領域のＰＣＲを行った。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＥｃｏＲＩ未切断ゲノムを鋳型としたものも調製した。ＰＣＲのプログラムとしては、下記表２のプログラムを適用した。ＰＣＲ後の反応溶液は１．５％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色してトランスイルミネーターでバンドを確認した。
【表２】
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【００３０】
ＰＣＲの結果、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ及びアダプターのみライゲーションのサンプルではバンドが見られなかったのに対し、アダプター濃度が４，４０ｎＭのとき８００ｂｐの付近にシングルバンドが確認され、４００ｎＭ，４μＭではスメアーなバンドが見られた。４０ｎＭのＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンスを行って塩基配列を決定した。
【００３１】
下記表４に、配列番号７に示すシークエンスの結果を示した。本配列は設計したアダプターの配列を持っており、またＥｃｏＲＩサイトを有していることから、この配列が確かにＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ断片とアダプターの結合による配列を増幅したものである事が示された。更に、ＥｃｏＲＩサイトであるＧＡＡＴＴＣのＣの部分に重複が見られないことから、アダプターの突出先端にある余分なＧがゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩサイトのＧに隣り合って結合されるのではなく、ライゲーション時には両者のどちらかが削られていることが示された。
【表３】
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【００３２】
（アルカリフォスファターゼの効果）制限酵素切断ゲノムＤＮＡ断片とアダプターとのライゲーション反応において、両者の反応の特異性を高める目的で、制限酵素断片のアルカリフォスファターゼ処理を行った。上記カタラーゼ３’下流配列を決定するための実験系において、制限酵素ＥｃｏＲＩ処理後の反応溶液に１  ｕｎｉｔのウシ胎児アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＣＩＡＰ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃において２時間以上処理して制限酵素断片における５’突出末端のリン酸基を除去した。処理後のＤＮＡ断片は、上記同様フェノール−クロロホルム抽出／エタノール沈澱を行った上でアダプターとライゲーション反応を行い、これを鋳型にプライマーＧＬ１と３’下流向きプライマーとを用いたＰＣＲ反応を、表２の条件にて行った。ＰＣＲの結果を図６に示す。図中レーン１−４はライゲーション時のアダプター濃度をそれぞれ４００，４０，４，０．４ｎＭとしたものの結果を、レーン５はアダプターのみをライゲーションさせたものを、レーン６はＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌをそれぞれ泳動したものであり、右端の数字は分子量（ｂｐ）を表している。４００ｎＭのアダプターを結合させたものではスメアーな泳動パターンが見られたが、４０−０．４ｎＭのアダプターを結合させたものではメインのバンドが８００ｂｐ付近に観察され、ＣＩＡＰ未処理のものと比べてバンドが明瞭であった。この結果は、ＣＩＡＰ処理によってゲノムＤＮＡ同士のライゲーションがおこらず、ゲノムとアダプターが選択的に結合することによってＰＣＲ増幅の精度が向上したことを示している。またこのＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列を決定したところ、配列番号７のカタラーゼ３’下流配列と一致することが確認された。
【００３３】
（アダプター５’突出先端塩基のライゲーションの検討）本発明の塩基除去方法を応用した一塩基過多アダプターとゲノムＤＮＡ制限酵素断片とのライゲーション反応において、アダプターの５’突出末端に存在する塩基が削られるのか、それともゲノム断片の３’切り欠き末端の塩基が削られるのかを検証するために、配列番号２のオリゴヌクレオチドが配列番号８に記載のオリゴヌクレオチドに置き代えられた新たなアダプターＡＤＰ−ＥｃｏＴを調整し、ゲノムＤＮＡ制限酵素断片とライゲーションを行って、その配列を明らかにした。アダプターＡＤＰ−ＥｃｏＴの基本的な構成は図３に記載のアダプターと同様であるが、５’突出末端のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）で置き換えられている。すなわち、ＡＤＰ−ＥｃｏＴとゲノムＤＮＡ制限酵素断片との間のライゲーションが起こり、これを鋳型としたＰＣＲ産物の結合部分の配列がＧＡＡＴＴＣであれば突出先端のＴが削られる事を示し、反対に配列がＧＡＡＴＴＡであればゲノム側の３’切り欠き末端のＧが削られることを示す。ＧＬ１／ｐｃａｔ３−５’プライマーを用いたＰＣＲの結果、３’下流配列決定で見られた約８００ｂｐの産物が増幅された。これをクローニングして塩基配列を決定したところ、配列番号９及び下記表４で示す配列が明らかとなった（上流部１５０ｂｐのみを記す）。またこの配列のＡＢＩ３１００シークエンサーによるシークエンスデータの一部（Ｃｈｒｏｍａｓ  Ｌｉｔｅ  ２．０１，Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）を図７に示す。この配列は、表４で示した３’下流配列とほぼ一致していたが、ＥｃｏＲＩサイトである３１番目のＣだけがＡに置き換わっていた（図６，下線部）。この結果から、本発明のリガーゼによる塩基除去反応では、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが配列特異的なエキソヌクレアーゼ活性を示し、３’切り欠き末端の１塩基という特定の塩基を除去して５’突出末端のライゲーションを触媒することが示された。
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明を利用することにより、分子遺伝学分野において有用な解析手段を提供することが可能となる。有用な新規生物からの遺伝子の単離、遺伝子の調節領域の解析、くり返しモチーフなどの探索などに、広く応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明のＤＮＡ塩基除去方法によるアダプター結合ＤＮＡ断片製造に用いられるオリゴＤＮＡアダプター（ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＴ）の模式図を示す。
【図２】本発明におけるリガーゼを用いたＤＮＡ塩基の除去方法の模式図、並びにこの除去方法を用いたアダプター結合ＤＮＡ断片の製造法の模式図を示す。
【図３】本発明におけるリガーゼを用いたＤＮＡ塩基の除去方法の、３’突出末端を形成する制限酵素を用いた場合の模式図を示す。
【図４】本発明におけるＤＮＡリガーゼによる塩基除去及び置換方法の原理を、ＡＤＰ−ＥｃｏＴアダプターの例から模式的に表す。
【図５】ＡＤＰ−ＥｃｏＴアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型にしたＰＣＲ反応を模式的に表す。
【図６】本発明のＤＮＡ塩基除去方法を応用したアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型にしたＰＣＲの結果を示す。
【図７】ＡＤＰ−ＥｃｏＴアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型にしたＰＣＲ産物のシークエンス結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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