(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を透過せず、細胞から分泌される物質を透過可能な透過膜により複数の空間に区画された培養容器内に培地を貯留し、一の空間に前記細胞を収容し、他の空間に、前記物質を吸着する生体親和性の吸着材を収容して前記細胞を培養し、
前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着するインプリンティング処理が施され、
前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されている細胞分泌物質回収方法。
【請求項２】
前記培地が無血清培地である請求項１に記載の細胞分泌物質回収方法。
【請求項３】
前記透過膜が、セルカルチャーインサートまたはポリエステルメンブレンである請求項１または請求項２に記載の細胞分泌物質回収方法。
【請求項４】
前記吸着材が、生分解性を有している請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞分泌物質回収方法。
【請求項５】
前記吸着材が、ゼラチンビーズまたはコラーゲンビーズである請求項４に記載の細胞分泌物質回収方法。
【請求項６】
培地を貯留し、細胞が収容される一の空間と、細胞から分泌される物質を吸着する生体親和性の吸着材が収容される他の空間と、これら空間を、細胞を透過せず、細胞から分泌される物質を透過可能に区画する透過膜とを備え、
前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着するインプリンティング処理が施され、
前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されている細胞分泌物質回収装置。
【請求項７】
前記透過膜が、セルカルチャーインサートまたはポリエステルメンブレンである請求項６に記載の細胞分泌物質回収装置。
【請求項８】
前記吸着材が、生分解性を有している請求項６または請求項７に記載の細胞分泌物質回収装置。
【請求項９】
前記吸着材が、ゼラチンビーズまたはコラーゲンビーズである請求項８に記載の細胞分泌物質回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞から分泌される物質、例えば、成長因子や細胞外マトリクスを回収するための細胞分泌物質回収方法および細胞分泌物質回収装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒトあるいは動物の繊維芽細胞を培養することにより細胞から産生される細胞外マトリクスを取得する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この方法は、繊維芽細胞を無血清培養することにより得られた培養上清を限外濾過により精製することにより細胞外マトリクスの濃縮液を得るものである。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２６９４７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、この方法は、培養上清を採取するステップと、採取された上清を濃縮するステップとを必要とし、煩雑であった。また、細胞外マトリクスは濃縮液として回収されるため、使い勝手が悪いという不都合があった。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞から分泌される物質をさらに簡易に、かつ、使い勝手のよい形態で回収することができる細胞分泌物質回収方法および細胞分泌物質回収装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞を透過せず、細胞から分泌される物質を透過可能な透過膜により複数の空間に区画された培養容器内に培地を貯留し、一の空間に前記細胞を収容し、他の空間に、前記物質を吸着する生体親和性の吸着材を収容して前記細胞を培養し、前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着するインプリンティング処理が施され、前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されている細胞分泌物質回収方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、培養容器内に培地を貯留し、培養容器内の一の空間に収容した細胞を培養すると、細胞が成長する際に、細胞増殖因子や細胞外マトリクス等の物質を分泌する。一の空間と他の空間とを区画する透過膜は細胞を透過せず、分泌された物質を透過するので、細胞から分泌された物質が細胞の収容されている一の空間から他の空間へと移動する。他の空間には吸着材が収容されているので、移動してきた物質が吸着材によって吸着される。吸着材は生体親和性を有しているので、そのままの形態で体内に投与することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記培地が無血清培地であることが好ましい。
細胞を増殖させる際には血清入りの培地が必要であるが、細胞から分泌された物質を吸着材により吸着して回収するには、無血清培地を使用することにより、培地に混入している血清成分が吸着材に吸着されてしまうのを防止することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着する処理が施されているので、細胞から分泌された異なる物質が、それぞれ異なる種類の吸着材に特異的に吸着されるので、物質を分離して回収することができる。したがって、そのようにして回収された物質を、必要な割合で混合して使用することが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記物質を特異的に吸着する処理は、インプリンティング処理であるので、各種吸着材に、別々の物質を簡易に特異的に吸着させることが可能となる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されているので、異なる物質を吸着した異なる種類の吸着材を簡易に識別することができ、回収された物質を簡易に分離することができる。
識別の方法としては、吸着材のサイズを種類ごとに異ならせる方法の他、空間内において吸着材を種類ごとに区画して収容する収容部を設ける方法が挙げられる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記透過膜が、セルカルチャーインサートまたはポリエステルメンブレンであることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記吸着材が、生分解性を有していることとしてもよい。
さらに、上記発明においては、前記吸着材が、ゼラチンビーズまたはコラーゲンビーズであることとしてもよい。
このようにすることで、体内に投与された場合に、経時的に分解されて吸着していた物質を徐放することができる。
【００１３】
また、本発明は、培地を貯留し、細胞が収容される一の空間と、細胞から分泌される物
質を吸着する生体親和性の吸着材が収容される他の空間と、これら空間を、細胞を透過せ
ず、細胞から分泌される物質を透過可能に区画する透過膜とを備え、前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着するインプリンティング処理が施され、前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されている細胞分泌物質回収装置を提供する。
【００１４】
本発明によれば、一の空間内に細胞を収容して培養することにより、細胞から分泌される物質が、透過膜を透過して他の空間に移動し、当該他の空間に収容されている吸着材により吸着される。これにより、培養後に、培養上清を抽出し、細胞から分泌された物質を濃縮する処理を行う手間を省いて、培養と同時に、簡易に細胞から分泌された物質を回収することができる。
【００１５】
上記発明においては、前記吸着材が複数種類備えられ、各種の吸着材は、異なる物質を特異的に吸着する処理が施されている。
また、上記発明においては、前記物質を特異的に吸着する処理は、インプリンティング処理である。
【００１６】
また、上記発明においては、前記複数種類の吸着材は、それらの種類を識別可能に前記培養容器内に収容されている。
また、上記発明においては、前記透過膜が、セルカルチャーインサートまたはポリエステルメンブレンであってもよい。
【００１７】
また、上記発明においては、前記吸着材が、生分解性を有していてもよい。
また、上記発明においては、前記吸着材が、ゼラチンビーズまたはコラーゲンビーズであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞から分泌される物質をさらに簡易に、かつ、使い勝手のよい形態で回収することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の一実施形態に係る細胞分泌物質回収方法および細胞分泌物質回収装置１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分泌物質回収装置１は、図１に示されるように、透過膜２によって上下に区画された培養容器３であって、培地４を貯留し、上部空間（一の空間）５に細胞６を収容するようになっており、下部空間（他の空間）７に吸着材８が収容されているものである。符号１１は、培養容器３の上部開口を閉塞する蓋である。
【００２０】
培地４としては、細胞６の増殖過程においては、血清入りの培地を使用し、細胞６から分泌される物質９を回収する過程においては、無血清培地を使用するようになっている。無血清培地を使用することにより、培地４内の血清成分が吸着材８に吸着されてしまう不都合を防止することができる。
【００２１】
細胞６としては、例えば、幹細胞（間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞）、ヒト正常細胞（表皮細胞、真皮細胞）、株化細胞あるいは動物細胞が使用される。目的に応じて、細胞６は１種類でもよいし、複数種類の細胞６を組み合わせて収容してもよい。
【００２２】
透過膜２としては、例えば、カルチャーインサートあるいはポリエステルメンブレンのような材質のものが使用される。これらの材質からなる透過膜２は、細胞６を透過させることなく、その分泌した物質９、例えば、細胞増殖因子や細胞外マトリクスを透過させることができるようになっている。細胞増殖因子としては、例えば、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＢＭＰ、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ｂ等が分泌される。また、細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲンが分泌される。
【００２３】
吸着材８としては、例えば、各種分泌物質９を特異的に吸着するためのインプリンティング処理が施されたゼラチンビーズあるいはコラーゲンビーズにより構成されている。異なる物質９を特異的に吸着可能な複数種類の吸着材８は培養容器３の底面に形成された仕切壁１０により区画された複数の収容部内にそれぞれ区画されて収容されている。
【００２４】
細胞６からは、複数種類の細胞増殖因子や細胞外マトリクス等の物質９が分泌される。培養容器３内は透過膜２によって、細胞６が収容されている上部空間５と、吸着材８が収容されている下部空間７とに区画されているので、細胞６は透過膜２を透過することができずに上部空間５に保持され、分泌された細胞増殖因子や細胞外マトリクス等の物質９が透過膜２を透過して下部空間７に移動する。
【００２５】
下部空間７には吸着材８が収容されており、各吸着材８は、特定の種類の細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９を吸着するインプリンティング処理が施されているので、透過膜２を透過してきた物質９の内、対応する種類の物質９を吸着する。これにより、細胞６から分泌された物質９を種類ごとに分離して効率的に回収することができる。
物質９を吸着した後の吸着材８は、洗浄後、冷蔵、冷凍あるいは真空乾燥されて、使用時まで保存される。
【００２６】
すなわち、本実施形態に係る細胞分泌物質回収装置１および細胞分泌物質回収方法によれば、従来、培養後に行っていた培養上清を採取ステップと、採取した上清を濃縮するステップとを別個に行うことなく、培養工程中に吸着材８によって分離回収することができる。したがって、回収作業を大幅に簡略化して、細胞増殖因子または細胞外マトリクスのような細胞６から分泌される物質９を容易に回収することができる。
【００２７】
さらに、本実施形態に係る細胞分泌物質回収装置１および細胞分泌物質回収方法によれば、異なる種類の細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９を別個の吸着材８に別々に吸着させて回収できる。したがって、使用時に特定の細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９のみを使用したり、複数の細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９の混合比率を任意に調整して使用したりすることができる。すなわち、用途に合わせて、適正な細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９の種類または混合比率を選択して使用することが可能となる。
【００２８】
また、本実施形態に係る細胞分泌物質回収装置１および細胞分泌物質回収方法によれば、吸着材８が生体親和性のコラーゲンビーズまたはゼラチンビーズにより構成されているので、細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９を吸着した状態の吸着材８をそのまま、患者の体内に投与することができる。また、コラーゲンビーズまたはゼラチンビーズのような吸着材８は、生分解性を有しているので、患者の体内に投与された後には、経時的に分解されて消滅する。したがって、吸着していた細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９を一気に放出することなく、時間をかけて徐々に放出するＤＤＳとして使用することも可能となる。
【００２９】
なお、本実施形態においては、吸着材８として、生分解性材料からなるものを採用したが、これに代えて、生分解性はないが生体親和性を有する材料からなるものを採用してもよい。
また、本実施形態においては、異なる物質９を特異的に吸着する複数種の吸着材８を下部空間７に収容することとしたが、単一の種類からなる吸着材８を収容することとしてもよい。
【００３０】
また、本実施形態においては、下部空間７に仕切壁１０を設けることにより、複数種の吸着材８を分離した状態に収容し、吸着材８の種類の識別を可能とすることとしたが、これに代えて、吸着材８の粒径あるいは形状を異ならせることにより、吸着材８の種類や吸着されている細胞増殖因子あるいは細胞外マトリクス等の物質９の種類を識別可能とすることとしてもよい。
【００３１】
また、本実施形態においては、細胞６の培養中に、所定の方法により特定の刺激を与えることにより、特定の細胞増殖因子または細胞外マトリクス等の物質９を分泌させることにしてもよい。刺激方法としては、例えば、低酸素状態とすること等を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分泌物質回収装置を示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００３３】
１  細胞分泌物質回収装置
２  透過膜
３  培養容器
４  培地
５  上部空間（一の空間）
６  細胞
７  下部空間（他の空間）
８  吸着材
９  物質
【図１】
0005196885.tif 000002