(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、
前記電極上に設けられたシリカ系メソ多孔体と、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定化された酵素と、
を備え、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であり、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素と前記電極との間の電子の受け渡しを行うための電子伝達体が導入されており、
前記シリカ系メソ多孔体は、陽極酸化アルミナ膜のアルミナ細孔内に一次元シリカナノチャネルの集合体が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体であり、前記シリカ系メソ多孔体の細孔とは、前記一次元シリカナノチャネルに設けられた孔のことであることを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素電極において、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素の活性の発現を触媒する補酵素が導入されていることを特徴とする酵素電極。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の酵素電極において、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素の活性の発現に必要な水分子が導入されていることを特徴とする酵素電極。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素電極において、
特定の物質のみを選択的に透過させる膜及び／又は特定の物質を選択的に透過させない膜を備えることを特徴とする酵素電極。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の酵素電極において、
前記酵素は、２種類以上の酵素であることを特徴とする酵素電極。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の酵素電極を用いて電気化学的計測法により標的物質を検出することを特徴とする酵素センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極及び酵素電極を用いた酵素センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素の優れた基質特異性を利用し、環境中や生体試料中のような多成分試料の中から、特定成分（標的物質）の存在量を高精度に定量する方法として酵素センサが知られている。例えば、臨床化学分野においては、グルコース、尿素、尿酸等を選択的に検出可能な酵素センサ用の酵素電極が研究開発されている。酵素は、高い基質特異性を有するため、被測定試料に複雑な前処理を施すことなく、試料中の標的物質（基質）と選択的に反応することができる。
【０００３】
酵素電極は、一般に、電極と酵素固定膜とにより構成されている。そして、酵素電極を用いた酵素センサは、試料中の標的物質と酵素との反応により生じる物質変化を、例えば、電気信号の変化量として電極により電気化学的に検出することによって、酵素が特異的に作用する基質の濃度を測定できるようになっている。
例えば、グルコースオキシダーゼ酵素を膜中に固定化した酵素固定膜を隔膜電極上に装着することによって構成される酵素電極を用いた酵素センサ（グルコースセンサ）では、酵素反応（“基質＋Ｏ２  ―(酵素)→  生成物＋Ｈ２Ｏ２”）によって生成される過酸化水素水や消費される酸素などの電極活性物質を電極でモニタすることによって、生体基質の濃度を測定できるようになっている。
【０００４】
酵素電極を用いた酵素センサにおいて、酵素は、検出感度や検出効率を向上させるために、様々な担体に固定化されてきた。従来、酵素電極への酵素の固定化方法として、酵素を２個以上の官能基を有する試薬と反応させる架橋法、不溶性の担体に酵素（タンパク質）を結合させる担体結合法、酵素をゲルの微細な格子の中に包み込む包括固定法や半透性のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法などの包括法、及び物理吸着法等が知られている。
【０００５】
上記固定化方法の中でも、固定化の操作が簡便であることから架橋法が広く採用されている。架橋法としては、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて、酵素間に架橋を形成して酵素同士を結合することによって固定化させる方法、アルブミン等のマトリクス物質を加えて酵素とマトリクス物質との間に架橋を形成することによって、酵素をマトリクス物質とともに固定化させる方法等が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、これらの架橋法は、共有結合を介して架橋を行うため、酵素の活性の低下が起こりやすく、十分な安定性が得られない場合が多い。また、酵素毎に架橋の仕方が異なり、固定化の操作に多くの反応、精製操作が必要なため、煩雑でコストが高い、汎用性が低い、という問題がある。
また、これらの架橋法を利用した酵素電極においては、架橋によって酵素同士の間隔が密になることによって物質の透過拡散性が不良となりやすく、感度が低い、再現性が悪い、寿命が短い、という問題がある。
【０００７】
また、担体固定法では、酵素を共有結合により直接樹脂等に固定化させるため、酵素が簡単に脱離することはないが、固定化の操作が複雑であり、タンパク質分解酵素により酵素が分解されたり、外部環境の変化によって酵素の立体構造が変化したりするという問題がある。
【０００８】
また、包括固定法やマイクロカプセル法などの包括法では、一般的に、ゲル格子やカプセル内のサイズが酵素サイズに合致していないため、酵素をゲル格子やカプセル内にしっかりと固定できず、酵素が漏出し、失活してしまうという不具合が生じる。さらに、包括法では、ゲル格子やカプセルの構造安定性が不十分であるため、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化を防止する効果も低い。
【０００９】
したがって、これら担体固定法や包括法を利用した酵素電極においては、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化が生じ、固定化された酵素の活性が、測定中であっても時間経過とともに失われていくため、安定性に欠ける。そのため、当該酵素電極を用いた酵素センサにおいても、再現性が悪い、寿命が短い、という問題がある。
【００１０】
また、物理吸着法としては、例えば、２次元平面状の基板上に規則的にメソ多孔体を形成し、そのメソ多孔体に物理的吸着によって酵素を固定化させる方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【００１１】
しかしながら、メソ多孔体に酵素を固定化させる方法では、一般的に、メソ多孔体の細孔のサイズ（細孔の内径）が酵素サイズ（酵素の径）に合致していないため、酵素を細孔内にしっかりと固定できず、酵素の活性が低下してしまう、外部環境の変化に伴って酵素の立体構造が変化してしまう等の問題が生じる。
したがって、メソ多孔体に酵素を固定化させる方法を利用した酵素電極は、安定性に欠け、当該酵素電極を用いた酵素センサにおいても、再現性が悪い、寿命が短い、という問題がある。
【特許文献１】特開２００２−３４６９９９号公報
【特許文献２】特開２００５−０６１９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
すなわち、上記のように、従来の固定化方法を利用した酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサにおいては、酵素が失活する、外部環境の変化に伴って酵素の立体構造に変化が生じる、酵素が漏出する等の理由によって、安定性に欠ける、感度が低い、再現性が悪い、寿命が短い等の問題がある。
【００１３】
さらに、近年においては、安全・安心で快適な社会の実現という観点から、例えば、ホルムアルデヒドやトルエンなどの住環境汚染物質、ＴＮＴ火薬等の爆発物類、コカインやヘロインなどの麻薬類等を、高速且つ高感度で連続的にモニタリングすることを目的とする検出技術やセンサが求められている。これらの物質は、気相や液相中に極低濃度で存在するため、検出にはサブｐｐｂレベルの高い検出感度が要求される。また、連続モニタリングができるよう、安定性が高く、長寿命なセンサであることが望ましい。すなわち、優れた感度、応答速度及び安定性を有し、且つ、長寿命の酵素センサ技術の開発が強く望まれている。
【００１４】
本発明の課題は、優れた感度及び安定性を有し、且つ、長寿命の酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
電極と、
前記電極上に設けられたシリカ系メソ多孔体と、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定化された酵素と、
を備え、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であり、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素と前記電極との間の電子の受け渡しを行うための電子伝達体が導入されており、
前記シリカ系メソ多孔体は、陽極酸化アルミナ膜のアルミナ細孔内に一次元シリカナノチャネルの集合体が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体であり、前記シリカ系メソ多孔体の細孔とは、前記一次元シリカナノチャネルに設けられた孔のことであることを特徴とする。
【００１７】
請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載の酵素電極において、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素の活性の発現を触媒する補酵素が導入されていることを特徴とする。
【００１８】
請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載の酵素電極において、
前記シリカ系メソ多孔体の細孔の内部には、前記酵素の活性の発現に必要な水分子が導入されていることを特徴とする。
【００１９】
請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素電極において、
特定の物質のみを選択的に透過させる膜及び／又は特定の物質を選択的に透過させない膜を備えることを特徴とする。
【００２０】
請求項５に記載の発明は、
請求項１〜４の何れか一項に記載の酵素電極において、
前記酵素は、２種類以上の酵素であることを特徴とする。
【００２２】
請求項６に記載の発明は、
酵素センサにおいて、
請求項１〜５の何れか一項に記載の酵素電極を用いて電気化学的計測法により標的物質を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサにおいて、酵素電極に、電極と、電極上に設けられたシリカ系メソ多孔体と、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定化された酵素と、を備え、シリカ系メソ多孔体の細孔のサイズが、酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されており、シリカ系メソ多孔体は、陽極酸化アルミナ膜のアルミナ細孔内に一次元シリカナノチャネルの集合体が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体である。
したがって、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に、酵素をしっかりと固定することができるため、酵素の立体構造の変化が防止され、優れた安定性を有し、且つ、長寿命の酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサを提供することができる。
また、シリカ系メソ多孔体は多孔質であり、比表面積が非常に大きい。したがって、シリカ系メソ多孔体を担体として用いると、シリカ系メソ多孔体よりも比表面積が小さい担体を用いる場合と比較して、より大きな吸着量でより高濃度に酵素を固定することができる。さらに、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に酵素をしっかりと固定することで、酵素は適度に分散された状態に維持されるため、酵素が凝集を起こして失活する等を避けることができる。すなわち、細孔のサイズが、酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているシリカ系メソ多孔体を担体として用いることで、より大きな吸着量でより高濃度に酵素を固定することができるとともに、酵素が凝集を起こして失活する等を避けることができるため、優れた感度を有する酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサを提供することができる。
また、電子伝達体を利用することにより、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定化された酵素の活性中心と電極との間の電子移動が媒介され、高感度で高速な応答を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図を参照して、本発明にかかる酵素電極及び当該酵素電極を用いた酵素センサの最良の形態を詳細に説明する。なお、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００２５】
本発明にかかる酵素センサ１００は、例えば、酵素電極１を用いて電気化学的計測法により標的物質を検出するセンサである。
【００２６】
本発明にかかる酵素電極１は、例えば、図１に示すように、電極２と、電極２上に設けられたシリカ系メソ多孔体３及びシリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に固定化された酵素４により形成される酵素タンパク質複合体Ｃと、などを備えて構成される。
【００２７】
酵素４は、例えば、酸化還元酵素である。
しかしながら、酵素４は、酸化還元酵素に限定されるものではなく、酵素（酵素タンパク質）であれば任意であり、例えば、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素などであっても良い。
また、酵素４は、例えば、生来の酵素分子であっても、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても、所望によりそれを切断したものであっても、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。
【００２８】
具体的には、酸化還元酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ等を用いることができる。この他に、コレステロールエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、さらにこれら酵素のミュータント等を用いることができる。
【００２９】
加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウレアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ群、ホスファターゼ群等を用いることができる。
転移酵素としては、例えば、各種アシル転移酵素、キナーゼ群、アミノトランスフェラーゼ群等を用いることができる。
異性化酵素としては、例えば、ラセマーゼ群、ホスホグリセリン酸ホスホムターゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ等を用いることができる。
【００３０】
酵素タンパク質複合体Ｃを形成する酵素４は、１種類の酵素であっても、２種類以上の酵素であっても良い。
具体的には、酵素タンパク質複合体Ｃを形成する酵素４は、例えば、１種類の酵素であっても、分子量及び／又はサイズ（径）が略同一の２種類以上の酵素であっても、分子量及び／又はサイズが異なる２種類以上の酵素であっても良い。また、酵素タンパク質複合体Ｃを形成する酵素４が２種類以上である場合、酵素４は、例えば、同種の特定物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても、異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても、同種及び／又は異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
【００３１】
また、酵素タンパク質複合体Ｃを形成する酵素４が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素は、シリカ系メソ多孔体３における別々の細孔の内部に固定されていても、同一の細孔の内部に固定されていても良い。
ここで、特に、酵素タンパク質複合体Ｃを形成する酵素４が２種類以上であって、その２種類以上の酵素が異種の特定物質に作用する場合、酵素センサ１００は、その異種の特定物質（２種類以上の特定物質）を同時に検出することができる。
【００３２】
シリカ系メソ多孔体３は、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるシリカ系メソ多孔体３の作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
【００３３】
具体的には、シリカ系メソ多孔体３は、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出する等して界面活性剤を除去することによって、作製される。これにより、シリカ系メソ多孔体３は、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。
【００３４】
シリカ系メソ多孔体３の作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、シリカ系メソ多孔体３の作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、シリカ系メソ多孔体３に、柱状の細孔が形成されることになる。
【００３５】
シリカ系メソ多孔体３は、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズ（細孔の径）は、固定化する酵素４のサイズ（酵素４の径）に応じて決定される。すなわち、例えば、ミセルのサイズ（ミセルの径）が、酵素４のサイズの０．５〜２．０倍となる界面活性剤を用いてシリカ系メソ多孔体３を作製することによって、細孔のサイズが、固定化する酵素４のサイズの０．５〜２．０倍となるシリカ系メソ多孔体３を得ることができる。
【００３６】
シリカ系メソ多孔体３の形状としては、例えば、粉末状、顆粒状、シート状、バルク状、膜状等がある。
また、シリカ系メソ多孔体３における細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであっても良い。
【００３７】
シリカ系メソ多孔体３の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
さらに、シリカ系メソ多孔体３の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、細孔（チャンネル）の方向が一方向に向いているという特徴を有する、例えば、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等の公知の種類を採用することができる。具体的には、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等は、例えば、円筒形のアルミナ細孔内に界面活性剤を鋳型として作製される、アルミナ細孔の方向と同一のチャンネル方向を有するメソポーラスシリカナノチャンネル集合体（一次元シリカナノチャンネルの集合体）が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体３である。
【００３８】
シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズは、固定化された酵素４の立体構造の変化を防止可能な程度に設定されている。これによって、固定化された酵素４の立体構造を維持することができ、シリカ系メソ多孔体３に固定化された酵素４を安定化することができる。
具体的には、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズは、例えば、固定化される酵素４（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定化される酵素４（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定化される酵素４（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、シリカ系メソ多孔体３における細孔の直径（中心細孔直径）は、固定化される酵素４の直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定化される酵素４の直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定化される酵素４の直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素４の直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
ここで、酵素４が多量体を形成する場合には、固定化される酵素４のサイズ（直径）は、多量体のサイズ（直径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００３９】
シリカ系メソ多孔体３の比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
シリカ系メソ多孔体３の細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１００μｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
シリカ系メソ多孔体３の細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
【００４０】
シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、固定化する酵素４のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、固定化する酵素４の立体構造の維持が容易となるため、シリカ系メソ多孔体３に固定化された酵素４を安定化することができる。
【００４１】
具体的には、酵素４として、例えば、図２に示すホルムアルデヒド脱水素酵素を採用した場合、ホルムアルデヒド脱水素酵素の直径は約８ｎｍであるため、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくは、例えば、図３に示すように、ホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定される。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、例えば、図４に示すように、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内壁に吸着して固定化されて、酵素タンパク質複合体Ｃを形成することになる。
【００４２】
また、例えば、シリカ系メソ多孔体３として、例えば、図５に示すような、一次元シリカナノチャンネルの集合体が充填された膜状のものを用いる場合にも、細孔のサイズは、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定される。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体３の細孔（チャンネル）の内壁に吸着して固定化されて、酵素タンパク質複合体Ｃを形成することになる。
【００４３】
ここで、酵素４は、細孔のサイズが酵素４のサイズの０．５〜２．０倍程度の、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に安定的に固定化されているため、生成物が直接電極２で酸化又は還元される場合を除き、酵素分子内の活性中心が電極２と電子移動を行うことが難しい。また、酵素４が、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたアスペクト比の大きな細孔を有するシリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に固定化されている場合には、生成物が直接電極２で酸化又は還元される場合においても応答が非常に遅くなる。
【００４４】
そこで、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に、例えば、酵素４と電極２との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を導入するのが好ましい。
また、電極２として酸素電極、過酸化水素電極等を利用した場合、反応が溶存酸素濃度に律速されて低濃度の試料しか測定できない、アスコルビン酸等の酸化物質の影響を受けやすく選択性が悪い等の問題が生じる。この場合にも、検出範囲の拡大、選択性の向上を目的として酵素４とともに電子伝達体を使用することが効果的である。
具体的には、電子伝達体としては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体等を用いることができる。
【００４５】
また、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に、例えば、酵素４の活性の発現を触媒する補酵素や補助因子としての各種金属原子及び色素（例えば、ＮＡＤ＋やＺｎ２＋、ＦＡＤ等）を導入するのも好ましい。
例えば、不安的中間体を経由する反応等、酵素４のアミノ酸側鎖の触媒作用では容易に進まない反応の場合、適当な構造を有し、酵素反応の発現に関与する低分子量の有機化合物である補酵素を使用することが多い。特に、酵素４として、補酵素依存型酵素を用いた場合、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に補酵素を導入することによって、酵素反応を効率よく行わせることができる。
補酵素は、酵素４（補酵素依存型酵素）の種類に応じて、適宜選択することができる。具体的には、補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、補酵素Ｉ、補酵素ＩＩ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、リポ酸、補酵素Ｑ等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
【００４６】
本発明の酵素電極１では、酵素伝達体及び補酵素の何れか一方、好ましくは両方が、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に導入されて、電極２上に積層、接触していることが望ましい。或いは、電子伝達体及び／又は補酵素を電解液中に溶解・分散させて、それを、酵素電極１の使用時に電極２の分析窓上に滴下等して配置しても良いし、電子伝達体のみを電極２の表面に薄膜状に塗布して、その上に酵素４及び補酵素を細孔の内部に固定化したシリカ系メソ多孔体３を固定しても良い。
【００４７】
さらに、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に、例えば、酵素４の活性の発現に必要な水分子を導入するのも好ましい。
シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に水分子を導入して吸着させると、シリカへの吸着水はなかなか蒸発しないため、酵素４の乾燥を防止することができ、酵素４を失活の原因から保護することができる。これにより、酵素電極１の乾燥に対する耐性が向上するため、酵素電極１及び酵素センサ１００の長期安定性の向上が図れる。
【００４８】
加えて、酵素電極１に、選択透過膜を備えるのも好ましい。
ここで、選択透過膜とは、例えば、特定の物質のみを選択的に透過させる膜、或いは、特定の物質を選択的に透過させない膜のことである。
【００４９】
選択透過膜を用いることにより、酵素４として、例えば、基質特異性が広い酵素を用いた場合であっても、酵素センサ１００の選択性を向上させることができる。すなわち、酵素４として、例えば、基質特異性が広いアルコールオキシダーゼを用いると、アルコールオキシダーゼはアルコールとホルムアルデヒドの両方に応答するが、選択透過膜としてアルコールを透過させない膜（例えば、ポリアリルアミン（ＰＡＡＭ）膜）を用いることで、液体中や気体中にアルコールと標的物質であるホルムアルデヒドとが存在している場合であっても、アルコールを酵素電極１側に透過せずに、ホルムアルデヒドを酵素電極１側に透過するため、酵素センサ１００の選択性を向上させることができる。この場合、選択透過膜は、酵素タンパク質複合体Ｃを覆うように設けると良い。
【００５０】
また、例えば、酵素反応“グルコース＋酸素  ―(グルコースオキシターゼ)→  グルコン酸＋過酸化水素”によって、白金電極等を利用して、生成した過酸化水素の量からグルコース濃度を測定する場合、アスコルビン酸等の酸化物質の影響を受けやすいため、過酸化水素は透過し、アスコルビン酸等の酸化物質を透過しにくい選択透過膜を用いることで、酵素センサ１００の選択性を向上させることができる。具体的には、過酸化水素を選択に透過する選択透過膜としては、例えば、酢酸セルロース膜、ポリピロール膜、さらには、イオン交換樹脂膜等を用いることができる。この場合、選択透過膜は、酵素タンパク質複合体Ｃと電極２との間に設けると良い。
【００５１】
選択透過膜は、分子量の大きな物質を選択濾過する、例えば、セラミック製の多孔質膜でも良いし、実質的な孔を有さないジルコニア、ぺロブスカイト等のイオン導電性膜、さらには、錯体化反応を利用したキャリア輸送膜のようなものでも良い。
材質としては、例えば、高分子膜、金属膜、セラミック膜、イオン導電性膜等を用いることができる。金属膜としては、例えば、パラジウム膜等を用いることができる。セラミック膜としては、例えば、ゼオライト膜、シリカ膜等を用いることができる。高分子膜としては、例えば、ポリジメチルシロキサン膜、ポリトリメチルシリルプロピン膜、含フッ素アクリル樹脂膜、酢酸セルロース膜、ポリエステル膜、ポリイミド膜、フッ素系ポリマー膜、ポリエチレン膜、ポリスチレン膜、ポリエチレンテレフタート膜、塩化ビニリデン膜、ポリエチレンオキシド膜、ポリホスファゼン膜、ポリアセチレン膜、ポリアニリン膜、ポリビニルアルコール膜、エチレン-ビニルアルコール共重合体、炭素膜、促進輸送膜
等やこれらの組み合わせを用いることができる。
なお、酵素電極１には、１種類の選択透過膜を備えるようにしても良いし、２種類以上の選択透過膜を備えるようにしても良い。
【００５２】
ここで、選択透過膜の酵素電極１への装着方法は、例えば、Ｏリング等を利用して機械的機構で装着しても良いし、ディップコート法、スピンコート法、ポッティング法、さらには、蒸着法やスパッタリング法、プラズマ処理等の手法により直接電極２や酵素タンパク質複合体Ｃの表面に装着しても良い。これらの方法は必要に応じて、適宜、選ぶことができる。
また、これらの方法を用いて、必要に応じて複数の選択透過膜を順次積層して多層膜とすることもできる。この多層膜には、酵素固定化膜（酵素タンパク質複合体Ｃ）が含まれていても良い。具体的には、例えば、複数の酵素タンパク質複合体Ｃを、選択透過膜を挟んで層構造にすることもできる。
さらに、選択透過膜の密着性及びセンサ安定性を確保するために選択透過膜の上部に保護膜を付けたり、上部に設けた所定の膜によって選択透過膜を物理的に押え込む等の方法を採ることもできる。
【００５３】
シリカ系メソ多孔体３の電極２への固定方法としては、例えば、ディップコート法、スピンコート法、ポッティング法、さらには、蒸着法やスパッタリング法、プラズマ処理等によって直接電極２上にシリカ系メソ多孔体３を形成しても、合成樹脂や光架橋性樹脂などによって電極２上にシリカ系メソ多孔体３を接着しても、ポリエチレングリコール等をバインダーとして用いることによって電極２上にシリカ系メソ多孔体３を固定しても良い。
また、例えば、溶液中の測定であっても酵素４が固定化されたシリカ系メソ多孔体３（酵素タンパク質複合体Ｃ）の漏出等を防ぐための、数ミクロン程度の網目構造を持つナイロンネットフィルター１ａ等を利用することによって、電極２上にシリカ系メソ多孔体３を固定しても良い。
【００５４】
酵素センサ１００の電極方式は、作用電極と対電極との二極方式、作用電極と対電極と参照電極との三極方式の何れを採用しても良い。
作用電極である電極２としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対電極としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
【００５５】
作用電極（電極２）、対電極及び参照電極の一例として、例えば、図１や図８、図９に示すように、電解セルで使用する電極を挙げることができるが、これらの電極は、その大きさ、形状、構成に特に制限されるものではない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。
【００５６】
また、これらの電極は、所定の絶縁性基板上に設けることもできる。
具体的には、絶縁性基板上に、各電極を、公知の方法、例えば、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することができる。なお、各電極は、全て同一基板上に形成して一体型の酵素センサ１００として作製しても良いし、複数の基板上に形成して酵素センサ１００を構成しても良いし、別々の電極として作製して酵素センサ１００を構成しても良い。
絶縁性基板としては、例えば、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等を用いることができる。
【００５７】
酵素電極１の作成方法としては、例えば、シリカ系メソ多孔体３に酵素４を含む溶液を滴下するディップ法、酵素４を含む溶液にシリカ系メソ多孔体３を漬侵する漬侵法等により酵素４をシリカ系メソ多孔体３に固定化することによって酵素タンパク質複合体Ｃを形成した後、酵素タンパク質複合体Ｃを電極２上に固定して作成しても良いし、電極２にシリカ系メソ多孔体３を固定した後、ディップ法、漬侵法等により酵素４をシリカ系メソ多孔体３に固定化することによって作成しても良く、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素４をシリカ系メソ多孔体３に固定化することができる。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。
【００５８】
酵素電極１を用いた酵素センサ１００によるセンシング方法としては、例えば、電気化学的計測法を用いることができる。すなわち、酸化電流又は還元電流を測定するクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法等の公知の計測法を適用することが可能である。測定方式としては、デスポーザブル方式、バッチ方式、フローインジェクション方式等、何れあっても良い。
【００５９】
また、電気化学的計測法において、色源体を酸化又は還元した色変化を検出する光検出測定法を適用することも可能である。
具体的には、例えば、グルコースセンサでは、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの２種類の酵素を固定化して、酵素反応（“グルコース＋Ｏ２  ―(グルコースオキ
シダーゼ)→  グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２”、“Ｈ２Ｏ２＋色源体  ―(ペルオキシダーゼ)→
赤紫色素”）により生成又は消費される過酸化水素と色源体（例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとの混合物）がペルオキシダーゼを触媒として赤紫色になる色変化を検出することによって、グルコース濃度を測定することができる。
【００６０】
測定の際に本発明の酵素電極１を用いた酵素センサ１００を取り付ける測定器本体は、例えば、データをパソコンに有線又は無線で送信できる機能を有し、リアルタイムで測定値を確認できることが好ましい。また、複数種類の酵素センサ１００を取り付け可能に構成され、複数種類の酵素センサ１００による検出結果を同時に計測して、データを相互比較したり検討したりできる機能を有することが望ましい。
【００６１】
次に、本発明の酵素電極１を用いた酵素センサ１００によって、電気化学的計測法により試料中の標的物質の濃度を高速且つ高感度に測定する原理について、図６を参照して説明する。
【００６２】
図６においては、例えば、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に酸化型酵素（酵素４）が固定化されている。固定化されている酸化型酵素は、選択的触媒作用により試料中の標的物質である基質を酸化して、還元型酵素となる。次いで、作用電極（電極２）を正にして、作用電極と参照電極との間に電圧を印加すると、還元型酵素は、直接的又は電子伝達体を介して間接的に電子（ｅ−）を作用電極に渡して、酸化型酵素に戻る。この際、作用電極と参照電極との間には、還元型酵素又は還元型電子伝達体を再酸化する電流が流れる。この電流の値は、酵素反応速度の大きさ、すなわち、試料中に含まれる基質濃度に比例するため、この電流の値を測定すると、その測定された値から試料中に含まれる標的物質の濃度を算出することができる。
【００６３】
以下、具体的な実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【００６４】
（１）シリカ系メソ多孔体３の合成
実施例１では、まず、シリカ系メソ多孔体３の合成を行った。
具体的には、水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合した後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＤＴＭＡ−Ｃｌ）８０ｇを７０℃の水１リットルに添加し、完全透明液になってから、トリイソピルベンゼン７０ｍＬを更に添加し、ホモミキサーで３０分間激しく攪拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に５分間攪拌した。これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間攪拌した。これを吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返した。これを４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃の電気炉で６時間焼成することにより、白色粉末状のシリカ系メソ多孔体３を得た。
この白色粉末の構造を粉末Ｘ線回折装置（理学ＲＡＤ−Ｂ装置）を用いて測定し、細孔径や表面積及び細孔総容積を窒素吸着装置を用いて測定した結果、白色粉末が平均細孔直径約８．２ｎｍの２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するメソポーラスシリカ多孔体の粉末であることを確認した。得られたシリカ系メソ多孔体３を、以下「大口径ＦＳＭ」という場合もある。
【００６５】
（２）酵素タンパク質複合体Ｃの形成
次に、シリカ系メソ多孔体３に酵素４を固定化することによって、酵素タンパク質複合体Ｃを形成した。ここで、酵素４として、例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた。
具体的には、大口径ＦＳＭの粉末５０ｍｇと、ホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬ（ホルムアルデヒド脱水素酵素のモル濃度：４．２ｍｇ／ｍＬ）とを混合し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で２４時間緩やかに攪拌した。その後、この混合液を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離して固形分を回収して、脱イオン水５ｍＬによる洗浄と、同上の条件での遠心分離とを３回繰り返した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素と大口径ＦＳＭとにより形成された酵素タンパク質複合体Ｃを得た。
さらに、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて酵素タンパク質複合体Ｃにおけるホルムアルデヒド脱水素酵素の吸着量を測定したところ、大口径ＦＳＭに対する吸着量は８８ｍｇ／ｇであった。
【００６６】
（３)固定化酵素の活性試験
次に、シリカ系メソ多孔体３に固定化された酵素４の酵素活性を測定した。
具体的には、リン酸緩衝液２．７ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、酵素タンパク質複合体Ｃを１０ｍｇ加え、補酵素としてＮＡＤ＋を１．２ｍｇ加え、基質であるホルムアルデヒド水溶液３００μＬ（濃度：０．３％）を添加し、２５℃で反応させた。ホルムアルデヒドが酸化されると同時に生成するＮＡＤＨに特徴的な３４０ｎｍに吸収が現れることから、それを指標とした。比較のために、遊離酵素（遊離ホルムアルデヒド脱水素酵素）と、グルタルアルデヒドで架橋された酵素（グルタルアルデヒドで架橋されたホルムアルデヒド脱水素酵素）と、に対しても同様の測定を行った。なお、測定に使用した、大口径ＦＳＭに固定化された酵素４と、遊離酵素と、グルタルアルデヒドで架橋された酵素と、の酵素量は同一に設定した。その結果を図７に示す。
【００６７】
図７においては、横軸に反応時間、縦軸にＮＡＤＨが生成したときに現れる吸収である３４０ｎｍの吸光度を示している。実線は大口径ＦＳＭに固定化された酵素４、破線は遊離酵素、一点鎖線はグルタルアルデヒドで架橋された酵素を示している。
図７によれば、グルタルアルデヒドで架橋された酵素は、遊離酵素よりも酵素活性が大幅に低下していることが分かった。それに対し、大口径ＦＳＭに固定化された酵素４は、遊離酵素と同程度に反応が進行することが分かった。これにより、大口径ＦＳＭの細孔の内部に固定化された酵素４が変性せずに活性を維持していることが分かった。
【００６８】
（４）酵素電極１の作成
次に、酵素タンパク質複合体Ｃを用いて酵素電極１を作成した。
具体的には、電極２（作用電極）として、直径３．２ｍｍ、面積０．１ｃｍ２の円柱状のグラッシカーボン電極を準備した。カーボン電極表面に酵素タンパク質複合体Ｃを５ｍｇ採取して塗布・固定した。さらに、酵素タンパク質複合体Ｃの漏出等を防ぐために、例えば、図８に示すように、ナイロンネットフィルター１ａ（孔径１１μｍ）及びＯリング１ｂを用いて、酵素タンパク質複合体Ｃを作用電極上に密着固定化した。このようにして、電極２と、シリカ系メソ多孔体３（大口径ＦＳＭ）及び酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）により形成される酵素タンパク質複合体Ｃと、を備えて構成される酵素電極１を作成した。なお、酵素電極１は使用時まで４℃で保存した。
【００６９】
（５）電気化学的測定
次に、酵素電極１を用いた酵素センサ１００を使用して、電気化学的計測法により標的物質を検出した。
具体的には、酵素電極１を用いて、例えば、図９に示すように、酵素センサ１００を作成した。酵素センサ１００は、例えば、反応器２００内に、リードに接続された作用電極（酵素電極１）と、リードに接続された対電極３００と、リードに接続された参照電極４００と、を有し、電解液２００ａとして、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、１ｍＭキノンを溶解させたリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４１）１０．０ｍＬを収容している。また、作用電極（酵素電極１）と対電極３００と参照電極４００に接続されたリードには、酵素電極１において発生した電流値を測定するためのポテンショスタット５００が接続されている。ポテンショスタット５００は、例えば、定電圧計５００ａと、電流計測器５００ｂと、などを有している。
【００７０】
酵素センサ１００の作用電極（酵素電極１）に、参照電極４００を基準として＋３５０ｍＶの電位を印加した状態で、電解液２００ａ中に基質を添加すると、その基質と酵素４及び補酵素等が反応する。この際、電極２と酵素４との間で電子伝達体を介して電子の授受が行われるため、酵素電極１に電流が流れる。この電流を酸化電流として、ポテンショスタット５００で測定することによって、標的物質の濃度を検出することができる。
【００７１】
酵素センサ１００において、作用電極（酵素電極１）に参照電極４００を基準として＋３５０ｍＶの電位を印加してエージングを行った。次いで、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に基質としてホルムアルデヒド水溶液（濃度：０．６μＭ〜１２００μＭ）を添加し、出力された応答電流を測定した。その結果を図１０に示す。
【００７２】
図１０においては、横軸に添加したホルムアルデヒド水溶液の濃度、縦軸に出力された応答電流を示している。
図１０によれば、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が０〜１２００μＭの範囲で、基質濃度の増加とともに流れる電流が略直線的に増加し、低濃度領域で高い出力と良好な直線性を示すことが分かった。これにより、酵素が失活することなく、酵素反応が良好に行われていることが分かった。特に、酵素センサ１００は、検出感度が非常に高く、検出限界は１．２μＭであり、気液平衡状態を仮定すると、サブｐｐｂに相当する高感度検出が実現できることが確認できた。
【００７３】
また、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に電子伝達体を導入することの有効性について調べた。その結果を図１１に示す。
図１１においては、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に濃度がそれぞれ異なる７種類のホルムアルデヒド水溶液（濃度が０．６μＭ、１．２μＭ、６μＭ、１２μＭ、６０μＭ、１２０μＭ、６００μＭ及び１２００μＭのホルムアルデヒド水溶液）を順次添加し、出力された応答電流を測定した。横軸に応答時間、縦軸に応答電流を示している。実線は電子伝達体を導入した場合、破線は電子伝達体を導入しなかった場合を示す。
図１１によれば、電子伝達体を導入しなかった場合は、応答電流が全く出力されなかった。これに対し、電子伝達体を導入した場合は、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が低濃度であっても、十分な応答電流が出力され、また、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が増加するにつれて、出力される応答電流が大きくなることが分かった。これにより、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に電子伝達体を導入することは有効であることが分かった。
【００７４】
また、酵素センサ１００の電極に電位を印加した状態で、緩衝液にホルムアルデヒド水溶液（濃度：６００μＭ）を添加したときの、応答時間を測定した。その結果を図１２にしめす。
図１２においては、横軸に応答時間、縦軸に応答電流を示している。
図１２によれば、９０％応答時間は約１２０秒であることが分かった。これにより、酵素センサ１００の応答速度は高速であることが分かった。
ここで、９０％応答時間とは、基質（ホルムアルデヒド水溶液）を添加した時刻から電流値が最終的な定常電流値の９０％の値になる時刻までの時間のことである。
【００７５】
また、酵素センサ１００の選択性を調べた。その結果を図１３に示す。
ホルムアルデヒドの他に、他の物質として、アセトアルデヒド、エタノール、メタノール、ベンゼン及びアセトンを採用した。図１３においては、横軸はホルムアルデヒド水溶液（濃度：６．２μＭ）の出力を１００％とした場合の、他の物質溶液（濃度：６．２μＭ）の応答出力を示す。
図１３によれば、酵素センサ１００は、酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）の基質特異性に基づく、極めて高い選択性を有することが分かった。
【００７６】
また、酵素センサ１００の再現性を調べた。その結果を図１４に示す。
具体的には、酵素電極１を４℃の冷蔵庫において緩衝液中で保存し、１０日、２３日、４０日及び６６日後に、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に基質としてホルムアルデヒド水溶液（濃度：０．６μＭ〜１２００μＭ）を添加し、出力された応答電流を測定した。
図１４においては、横軸に添加したホルムアルデヒド水溶液の濃度、縦軸に応答電流を示している。菱型（◇）プロットは初日（０日）、四角（□）プロットは１０日後、三角（△）プロットは２３日後、ばつ（×）プロットは４０日後、丸（○）プロットは６６日後を示す。
図１４によれば、酵素センサ１００は、１０日、２３日、４０日及び６６日後には、初日と比較してわずかに出力が低下したが、初日とほぼ同等の結果が得られ、良好な再現性と優れた直線性を示していることが分かった。これにより、酵素センサ１００は、酵素４の活性の低下は少なく、再現性の良い、長寿命測定が可能であることが分かった。
【００７７】
また、酵素４をシリカ系メソ多孔体３に固定化することの有効性について調べた。その結果を図１５に示す。
具体的には、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極と、遊離酵素と、について、図１４で結果を示す測定と同様の測定を行った。遊離酵素については、電極にホルムアルデヒド脱水素酵素を備えず、反応器２００内の電解液２００ａ中にホルムアルデヒド脱水素酵素を含有させて測定した。
図１５においては、横軸に反応時間、縦軸に相対応答（すなわち、初日の応答電流を１００％とした場合の応答電流）を示す。三角（△）プロットは酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）固定化したシリカ系メソ多孔体３を備える電極、四角（□）プロットはホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極、丸（○）プロットは遊離酵素を示す。すなわち、三角（△）プロットは、図１４で示した濃度１２００μＭのホルムアルデヒド水溶液で得られた結果から求めたものである。
図１５によれば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極と、遊離酵素と、では、応答電流が経時的に低下し、４０日以降では、ほとんど応答電流が変化せず、酵素の活性が失われていることが分かった。これに対し、本発明の酵素電極１では、１０日、２３日及び４０日後では、初日とほぼ同等の応答電流が出力され、６６日後では、初日と比較して約８０％の応答となったものの、アガロースゲルに固定化された酵素４及び遊離酵素と比較して、十分に大きな応答電流が出力されることが分かった。
【００７８】
（６）電気化学的測定原理
実施例１における電気化学的測定方法の原理について、以下に説明する。
電極２上のシリカ系メソ多孔体３（大口径ＦＳＭ）の細孔の内部に固定化された酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）は、試料中の標的物質（基質）であるホルムアルデヒドを酸化して、還元酵素となる。補酵素依存型酵素であるホルムアルデヒド脱水素酵素が基質であるホルムアルデヒドと反応してギ酸を生成する際、酸化型補酵素であるＮＡＤ＋が水素を受け取ることで還元型補酵素（ＮＡＤＨ）に変換される。続いて、作用電極（酵素電極１）を正にして、作用電極と参照電極との間に電圧を印加すると、ＮＡＤＨが水素を移動させ、生じた電子の授受を電子伝達体を介して作用電極（電極２）まで伝達させ、還元型酵素は元の酸化型酵素に戻る。この際、作用電極と参照電極との間には還元型酵素又は還元型電子伝達体を再酸化する電流が流れるので、この電流値を測定する。
【００７９】
なお、実施例１では、酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素（直径：約８ｎｍ））は、細孔のサイズが酵素４のサイズとほぼ同等の、シリカ系メソ多孔体３（大口径ＦＳＭ（平均細孔直径：約８．２ｎｍ））の細孔の内部に固定化されているが、電子伝達体を介して電極２と電子の授受を行なうことで高速応答を実現している。
また、酵素４は多孔質で表面積の非常に大きいシリカ系メソ多孔体３に吸着されていると同時に、酵素４は適度に分散された状態に維持されることにより物質の透過拡散性が良好となり、また、シリカ系メソ多孔体３の有する標的物質を濃縮する作用を利用することで、高感度検出を実現している。
さらに、酵素４の立体構造をシリカ系メソ多孔体３の細孔内壁によって保持することによって、酵素４の固定化と著しい安定化を実現させている。
これらの作用により、電気化学的計測法による極めて高速・高感度な標的物質の検出が可能となり、高速・高感度で長寿命な、再現性・安定性に優れた酵素センサ１００を構成することができた。
【実施例２】
【００８０】
（１）シリカ系メソ多孔体３の合成
実施例２では、まず、一次元シリカナノチャンネルの集合体が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体３の合成を行った。
具体的には、ＰＥＧ−Ｐ１２３共重合体１．０ｇをエタノール２０ｍＬ、水２ｍＬ、濃塩酸１００μＬと混合した後、攪拌しながら６０℃で１時間還流した。さらに、オルトけい酸テトラエチル(ＴＥＯＳ)を２．１ｇ添加し、６０℃で２時間還流した。この溶液を多孔性の陽極酸化アルミナ膜（直径４７ｍｍ、厚み０．６μｍ、細孔径０．１μｍ）に４ｍＬ採取して滴下し、吸引濾過を行った後、２０分間デシケータ中で常温乾燥させた。これを５００℃の電気炉で５時間焼成することによって、膜状のシリカ系メソ多孔体３を得た。
この膜状のシリカ系メソ多孔体３を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ)を用いて測定した結果、細孔径１００ｎｍのアルミナ細孔内に、アルミナ細孔壁に沿って平均細孔直径約８．２ｎｍのシリカナノチャンネルが充填されていることを確認した。得られた膜状のシリカ系メソ多孔体３を、以下「大口径メソポーラス膜」という場合がある。
【００８１】
（２）酵素タンパク質複合体Ｃの形成
次に、シリカ系メソ多孔体３に酵素４を固定化することによって、酵素タンパク質複合体Ｃを形成した。ここで、酵素４として、例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた。
具体的には、大口径メソポーラス膜５０ｍｇにホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ７．４）２．５ｍＬ（ホルムアルデヒド脱水素酵素のモル濃度：１．２ｍｇ／ｍＬ）を滴下し、冷蔵庫内（３℃）にて一晩静置した。その後、この大口径メソポーラス膜を脱イオン水５ｍＬにより連続的に３回洗浄して、表面の酵素を洗い流した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素と大口径メソポーラス膜とにより形成された酵素タンパク質複合体Ｃを得た。
さらに、熱質量分析計（ＴＧ−ＤＴＡ）を用いて酵素タンパク質複合体Ｃにおけるホルムアルデヒド脱水素酵素の吸着量を測定したところ、大口径メソポーラス膜に対する吸着量は２．７ｍｇ／ｇであった。
【００８２】
(３)固定化酵素の活性試験
次に、シリカ系メソ多孔体３に固定化された酵素４の酵素活性を測定した。
具体的には、リン酸緩衝液３．０ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、酵素タンパク質複合体Ｃを粉砕したものを加え、補酵素としてＮＡＤ＋を１２ｍｇ加え、基質であるホルムアルデヒド水溶液３００μＬ（濃度：０．３％）を添加し、２５℃で反応させた。この反応溶液の上澄みを６００μＬ採取し、リン酸緩衝液４００μＬと混合した溶液の３４０ｎｍにおける吸収を測定した。比較のために、遊離酵素（遊離ホルムアルデヒド脱水素酵素）と、グルタルアルデヒドで架橋された酵素（グルタルアルデヒドで架橋されたホルムアルデヒド脱水素酵素）と、に対しても同様の測定を行った。なお、測定に使用した、大口径メソポーラス膜に固定化された酵素４と、遊離酵素と、グルタルアルデヒドで架橋された酵素と、の酵素量は同一に設定した。その結果を図１６に示す。
【００８３】
図１６においては、横軸に反応時間、縦軸にＮＡＤＨが生成したときに現れる吸収である３４０ｎｍの吸光度を示している。実線は大口径メソポーラス膜に固定化された酵素４、破線は遊離酵素、一点鎖線はグルタルアルデヒドで架橋された酵素を示している。
図１６によれば、グルタルアルデヒドで架橋された酵素は、遊離酵素よりも酵素活性が大幅に低下していることが分かった。それに対し、大口径メソポーラス膜に固定化された酵素４は、アスペクト比の大きい柱状の細孔内に固定化された酵素４への補酵素の拡散が制限されているため反応速度が遅いが、遊離酵素と同程度の活性を保持していることが分かった。これにより、大口径メソポーラス膜の細孔の内部に固定化された酵素４が変性せずに活性を維持していることが分かった。
【００８４】
（４）酵素電極１の作成
次に、酵素タンパク質複合体Ｃを用いて酵素電極１を作成した。
具体的には、電極２（作用電極）として、直径３．２ｍｍ、面積０．１ｃｍ２の円柱状のグラッシカーボン電極を準備した。カーボン電極表面に酵素タンパク質複合体Ｃを３ｍｍ角に切断加工したものを、例えば、図８に示すように、ナイロンネットフィルター１ａ（孔径１１μｍ）及びＯリング１ｂを用いて、作用電極上に密着固定化した。これにより、電極２と、電極２にほぼ垂直な複数の柱状の孔（チャンネル）を有する膜状のシリカ系メソ多孔体３（大口径メソポーラス膜）及び酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）により形成される酵素タンパク質複合体Ｃと、を備えて構成される酵素電極１を作成した。なお、酵素電極１は使用時まで４℃で保存した。
【００８５】
（５）電気化学的測定
次に、酵素電極１を用いた酵素センサ１００を使用して、電気化学的計測法により標的物質を検出した。
具体的には、酵素電極１を用いて、例えば、図９に示すように、酵素センサ１００を作成した。酵素センサ１００の作用電極（酵素電極１）に、参照電極４００を基準として＋３５０ｍＶの電位を印加することにより、作用電極に流れる電流をポテンショスタット５００で測定した。
【００８６】
酵素センサ１００において、作用電極（酵素電極１）に参照電極４００を基準として＋３５０ｍＶの電位を印加してエージングを行った。次いで、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に基質としてホルムアルデヒド水溶液（濃度：０．６μＭ〜１２００μＭ）を添加し、出力された応答電流を測定した。その結果を図１７に示す。
【００８７】
図１７においては、横軸に添加したホルムアルデヒド水溶液の濃度、縦軸に出力された応答電流を示している。
図１７によれば、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が０〜１２００μＭの範囲で高い出力と良好な直線性を示すことが分かった。これにより、酵素が失活することなく、酵素反応が良好に行われていることが分かった。また、酵素センサ１００は、検出感度が非常に高く、検出限界は１．２μＭであり、気液平衡状態を仮定すると、サブｐｐｂに相当する高感度検出が実現できることが確認できた。
【００８８】
また、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に電子伝達体を導入することの有効性について調べた。その結果を図１８に示す。
図１８においては、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に濃度がそれぞれ異なる７種類のホルムアルデヒド水溶液（濃度が０．６μＭ、１．２μＭ、６μＭ、１２μＭ、６０μＭ、１２０μＭ、６００μＭ及び１２００μＭのホルムアルデヒド水溶液）を順次添加し、出力された応答電流を測定した。横軸に応答時間、縦軸に応答電流を示している。実線は電子伝達体を導入した場合、破線は電子伝達体を導入しなかった場合を示す。
図１８によれば、電子伝達体を導入しなかった場合は、応答電流が全く出力されなかった。これに対し、電子伝達体を導入した場合は、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が低濃度であっても、十分な応答電流が出力され、また、ホルムアルデヒド水溶液の濃度が増加するにつれて、出力される応答電流が大きくなることが分かった。これにより、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に電子伝達体を導入することは有効であることが分かった。
【００８９】
また、酵素センサ１００の電極に電位を印加した状態で、緩衝液にホルムアルデヒド水溶液（濃度：６００μＭ）を添加したときの、応答時間を測定した。その結果を図１９にしめす。
図１９においては、横軸に応答時間、縦軸に応答電流を示している。
図１９によれば、基質（ホルムアルデヒド水溶液）を添加した時刻から電流値が最終的な定常電流値の９０％の値になる時刻までの時間である９０％応答時間は、約１２０秒であることが分かった。これにより、酵素センサ１００の応答速度は高速であることが分かった。
【００９０】
さらに、繰り返し測定により、酵素センサ１００は、応答速度の安定性・再現性が非常に高いことが確認できた。これは、応答速度は膜厚の二乗に反比例するが、大口径メソポーラス膜のナノチャンネルの長さが、鋳型となる陽極酸化アルミナ膜の厚みで既定されているため、シリカ系メソ多孔体３の膜厚が極めて正確に制御されているためである。
【００９１】
また、酵素センサ１００の選択性を調べた。その結果を図２０に示す。
ホルムアルデヒドの他に、他の物質として、アセトアルデヒド、エタノール、メタノール、ベンゼン及びアセトンを採用した。図２０においては、横軸はホルムアルデヒド水溶液（濃度：６．２μＭ）の出力を１００％とした場合の、他の物質溶液（濃度：６．２μＭ）の応答出力を示す。
図２０によれば、酵素センサ１００は、酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）の基質特異性に基づく、極めて高い選択性を有することが分かった。
【００９２】
また、酵素センサ１００の再現性を調べた。その結果を図２１に示す。
具体的には、酵素電極１を４℃の冷蔵庫において緩衝液中で保存し、１０日、２８日、４５日及び７３日後に、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に基質としてホルムアルデヒド水溶液（濃度：０．６μＭ〜１２００μＭ）を添加し、出力された応答電流を測定した。
図２１においては、横軸に添加したホルムアルデヒド水溶液の濃度、縦軸に応答電流を示している。菱型（◇）プロットは初日（０日）、四角（□）プロットは１０日後、三角（△）プロットは２８日後、ばつ（×）プロットは４５日後、丸（○）プロットは７３日後を示す。
図２１によれば、酵素センサ１００は、１０日、２８日、４５日及び７３日後には、初日と比較してわずかに出力が低下したが、初日とほぼ同等の結果が得られ、良好な再現性と優れた直線性を示していることが分かった。これにより、酵素センサ１００は、酵素４の活性の低下は少なく、再現性の良い、長寿命測定が可能であることが分かった。
【００９３】
また、酵素４をシリカ系メソ多孔体３に固定化することの有効性について調べた。その結果を図２２に示す。
具体的には、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極と、遊離酵素と、について、図２１で結果を示す測定と同様の測定を行った。遊離酵素については、電極にホルムアルデヒド脱水素酵素を備えず、ホルムアルデヒド脱水素酵素を反応器２００内の電解液２００ａ中にホルムアルデヒド脱水素酵素含有させて測定した。
図２２においては、横軸に反応時間、縦軸に相対応答（すなわち、初日の応答電流を１００％とした場合の応答電流）を示す。菱形（◇）プロットは酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）固定化したシリカ系メソ多孔体３を備える電極、四角（□）プロットはホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極、丸（○）プロットは遊離酵素を示す。すなわち、菱形（◇）プロットは、図２１で示した濃度１２００μＭのホルムアルデヒド水溶液で得られた結果から求めたものである。
図２１によれば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極と、遊離酵素と、では、応答電流が経時的に低下し、４５日以降では、ほとんど応答電流が変化せず、酵素の活性が失われていることが分かった。これに対し、本発明の酵素電極１では、１０日後では、初日とほぼ同等の応答電流が出力され、２８日、４５日、７３日後では、初日と比較して約８０％の応答となったものの、アガロースゲルに固定化された酵素４及び遊離酵素と比較して、十分に大きな応答電流が出力されることが分かった。
【００９４】
（６）電気化学的測定原理
実施例２における電気化学的測定方法の原理については、実施例１と同様である。
【００９５】
なお、実施例２では、電極２の表面に対して垂直方向にシリカナノチャンネルが形成されているため物質透過性が良好となる。また、シリカナノチャンネルのアスペクト比は約１０００〜１００００であり、アスペクト比が大きいので拡散速度が制限されるが、電子伝達体を介して酵素４の活性中心と電極２との間の電子の授受を行うことで、高速且つ高感度な応答を実現している。
【００９６】
上記の結果から、電気化学的計測法による極めて高速・高感度な標的物質の検出が可能となり、高速・高感度で長寿命な、再現性・安定性に優れた酵素センサ１００を構成することができた。
【実施例３】
【００９７】
（１）シリカ系メソ多孔体３の合成
実施例３では、まず、シリカ系メソ多孔体３の合成及び一次元シリカナノチャンネルの集合体が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体３の合成を行った。
具体的には、例えば、実施例１と略同様の方法によって、平均細孔直径が約２．７ｎｍ、約４．２ｎｍ、約６．２ｎｍ及び約８．２ｎｍの白色粉末状のシリカ系メソ多孔体３を得た。得られたシリカ系メソ多孔体３を、以下「ＦＳＭ」という場合もある。
また、例えば、実施例２と略同様の方法によって、平均細孔直径が約８．２ｎｍ、約１２．２ｎｍ、約１７．８ｎｍ及び約９８．４ｎｍの膜状のシリカ系メソ多孔体３を得た。得られた膜状のシリカ系メソ多孔体３を、以下「メソポーラス膜」という場合がある。
【００９８】
（２）酵素タンパク質複合体Ｃの形成
次に、シリカ系メソ多孔体３に酵素４を固定化することによって、酵素タンパク質複合体Ｃを形成した。ここで、酵素４として、例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた。
具体的には、例えば、実施例１と略同様の方法によって、ホルムアルデヒド脱水素酵素とＦＳＭとにより形成された酵素タンパク質複合体Ｃを得た。
また、例えば、実施例２と略同様の方法によって、ホルムアルデヒド脱水素酵素とメソポーラス膜とにより形成された酵素タンパク質複合体Ｃを得た。
ここで、平均細孔直径が約２．７ｎｍ、約４．２ｎｍ、約６．２ｎｍ及び約８．２ｎｍのＦＳＭの細孔のサイズは、それぞれホルムアルデヒド脱水素酵素のサイズの約０．３倍、約０．５倍、約０．７倍及び約１．０倍である。また、平均細孔直径が約８．２ｎｍ、約１２．２ｎｍ、約１７．８ｎｍ及び約９８．４ｎｍのメソポーラス膜の細孔のサイズは、それぞれホルムアルデヒド脱水素酵素のサイズの約１．０倍、約１．５倍、約２．２倍及び約１２．３倍である。
【００９９】
そして、例えば、実施例１及び２と略同様の方法によって、酵素タンパク質複合体Ｃにおける酵素４の吸着量を測定した。その結果を図２３に示す。
図２３においては、平均細孔直径が約２．７ｎｍのＦＳＭ、平均細孔直径が約４．２ｎｍのＦＳＭ、平均細孔直径が約６．２ｎｍのＦＳＭ及び平均細孔直径が約８．２ｎｍのＦＳＭに対するホルムアルデヒド脱水素酵素の吸着量を示す。
図２３によれば、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１．０倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約８．２ｎｍの場合）、吸着量が最大になることが分かった。以下、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１．０倍の場合の吸着量を「最大吸着量」という場合もある。
シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．７倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約６．２ｎｍの場合）、吸着量は、最大吸着量よりも小さいが、最大吸着量とほぼ同等であることが分かった。また、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．５倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約４．２ｎｍの場合）、吸着量は、最大吸着量の約７０％であることが分かった。これは、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズと、酵素４のサイズと、の多少の相違は、酵素４のフレキシビリティにより許容されていることを示している。
一方、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．３倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約２．７ｎｍの場合）、吸着量は、最大吸着量の２５％以下であることが分かった。
以上の結果から、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、固定化する酵素４のサイズの０．５倍程度以上（より好ましくは０．７倍程度以上、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、大きな吸着量が得られるため、高感度の酵素センサ１００を構成できることが分かった。
【０１００】
（３）酵素電極１の作成
次に、酵素タンパク質複合体Ｃを用いて酵素電極１を作成した。
具体的には、例えば、実施例１と略同様の方法によって、電極２と、シリカ系メソ多孔体３（ＦＳＭ）及び酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）により形成される酵素タンパク質複合体Ｃと、を備えて構成される酵素電極１を作成した。
また、例えば、実施例２と略同様の方法によって、電極２と、電極２にほぼ垂直な複数の柱状の孔（チャンネル）を有する膜状のシリカ系メソ多孔体３（メソポーラス膜）及び酵素４（ホルムアルデヒド脱水素酵素）により形成される酵素タンパク質複合体Ｃと、を備えて構成される酵素電極１を作成した。
なお、酵素電極１は使用時まで４℃で保存した。
【０１０１】
（４）電気化学的測定
次に、酵素電極１を用いた酵素センサ１００を使用して、電気化学的計測法により標的物質を検出した。
【０１０２】
まず、酵素センサ１００の繰り返し測定安定性を調べた。その結果を図２４に示す。
具体的には、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した平均細孔直径が約８．２ｎｍ、約１２．２ｎｍ、約１７．８ｎｍ及び約９８．４ｎｍのシリカ系メソ多孔体３（メソポーラス膜）を備える酵素電極１と、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化したアガロースゲルを備える酵素電極と、について、電極に電位を印加した状態で、緩衝液に基質としてホルムアルデヒド水溶液（濃度：６００μＭ）を添加し、出力された応答電流を測定した。そして、この測定を繰り返し行った。なお、各測定の後には、酵素固定化電極を蒸留水によって３回洗浄し、基質や生成物などを取り除いて、次の測定に移った。
【０１０３】
図２４においては、横軸に測定回数、縦軸に相対応答（すなわち、初回の応答電流を１００％とした場合の応答電流）を示す。黒三角（▲）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約８．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒四角（■）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約１２．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒菱型（◆）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約１７．８ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒丸（●）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約９８．４ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、白丸（○）プロットは酵素４を固定化したアガロースゲルを備える電極を示す。
【０１０４】
図２４によれば、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１．０倍（すなわち、平均細孔直径が約８．２ｎｍの場合）、測定を繰り返す回数が増加しても応答の低下は見られないことが分かった。また、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１．５倍（すなわち、平均細孔直径が約１２．２ｎｍの場合）、測定を繰り返す回数が増加しても応答の低下はほとんど見られず、応答の低下の度合いは、約１．０倍の場合よりも大きいが、約１．０倍の場合とほぼ同等であることが分かった。シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約２．２倍（すなわち、平均細孔直径が約１７．８ｎｍの場合）、測定を繰り返す回数が増加しても応答の低下はほとんど見られず、測定回数が２０回の時点で、初回と比較して８０％以上の応答になることが分かった。すなわち、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１．０倍、約１．５倍、約２．２倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約８．２ｎｍ、約１２．２ｎｍ及び約１７．８ｎｍの場合）、測定を繰り返す回数が増加しても応答の低下はほとんど見られないことが分かった。これは、酵素４が、そのサイズに合致した形でシリカ系メソ多孔体３の細孔にしっかりと固定されているため、その立体構造の変化が防止され、安定化されていることを示している。
一方、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約１２．３倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約９８．４ｎｍの場合）、測定を繰り返す回数が増加するにつれて出力される応答電流が低下し、測定回数が１０回以上で、初回と比較して４０％以下の応答になることが分かった。また、細孔のサイズが酵素４のサイズの１００倍程度の場合（すなわち、アガロースゲルの場合）、測定を繰り返す回数が増加するにつれて出力される応答電流が低下し、測定回数が６回以上で、応答電流が出力されなくなることが分かった。これは、酵素４が、そのサイズに合致した形でシリカ系メソ多孔体３の細孔にしっかりと固定されなかったため、洗浄操作によって溶出してしまったことなどが原因であると考えられる。
以上の結果から、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、固定化する酵素４のサイズの２．０倍程度以下（より好ましくは１．４倍程度以下、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、優れた安定性・再現性を有する酵素センサ１００を構成できることが分かった。
【０１０５】
次いで、例えば、実施例１と略同様の方法によって、酵素センサ１００の再現性を調べた。その結果を図２５に示す。
具体的には、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した平均細孔直径が約２．７ｎｍ、約４．２ｎｍ、約６．２ｎｍ及び約８．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３（ＦＳＭ）を備える酵素電極１と、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した平均細孔直径が約１２．２ｎｍ、約１７．８ｎｍ及び約９８．４ｎｍのシリカ系メソ多孔体３（メソポーラス膜）を備える酵素電極１と、遊離酵素と、について、図１４で結果を示す測定と同様の測定を行った。遊離酵素については、電極にホルムアルデヒド脱水素酵素を備えず、反応器２００内の電解液２００ａ中にホルムアルデヒド脱水素酵素を含有させて測定した。
【０１０６】
図２５においては、横軸に反応時間、縦軸に相対応答（すなわち、初日の応答電流を１００％とした場合の応答電流）を示す。白四角（□）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約２．７ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、白菱型（◇）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約４．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、白丸（○）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約６．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、白三角（△）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約８．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒四角（■）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約１２．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒菱型（◆）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約１７．８ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒丸（●）プロットは酵素４を固定化した平均細孔直径が約９８．４ｎｍのシリカ系メソ多孔体３を備える電極、黒三角（▲）プロットは遊離酵素を示す。すなわち、白三角（△）プロットは、図１４で示した濃度１２００μＭのホルムアルデヒド水溶液で得られた結果から求めたものである。
【０１０７】
図２５によれば、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．７倍、約１．０倍及び約１．５倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約６．２ｎｍ、約８．２ｎｍ及び約１２．２ｎｍの場合）、時間が経過しても応答の低下はほとんど見られず、６６日後で、初日と比較して８０％以上の応答になることが分かった。また、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．５倍及び約２．２倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約４．２ｎｍ及び約１７．８ｎｍの場合）、時間が経過するにつれて出力される応答電流が低下したが、６６日後で、初日と比較して６０％以上の応答になることが分かった。これは、酵素４が、そのサイズに合致した形でシリカ系メソ多孔体３の細孔にしっかりと固定されているため、その立体構造の変化が防止され、安定化されていることを示している。また、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズと、酵素４のサイズと、の多少の相違は、酵素４のフレキシビリティにより許容されていることを示している。
一方、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズが酵素４のサイズの約０．３倍及び約１２．３倍の場合（すなわち、平均細孔直径が約２．７ｎｍ及び約９８．４ｎｍの場合）、時間が経過するにつれて出力される応答電流が低下し、６６日後で、初日と比較して４０％以下の応答になることが分かった。これは、酵素４が、そのサイズに合致した形でシリカ系メソ多孔体３の細孔にしっかりと固定されなかったため、その立体構造が変化し、失活してしまったことなどが原因であると考えられる。
以上の結果から、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、固定化する酵素４のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度）にすることによって、優れた安定性・再現性を有する酵素センサ１００を構成できることが分かった。
【０１０８】
以上の酵素４の吸着量の結果、酵素センサ１００の繰り返し測定安定性の結果及び酵素センサ１００の再現性の結果から、シリカ系メソ多孔体３の細孔のサイズを、固定化する酵素４のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、高感度で、優れた安定性・再現性を有する酵素センサ１００を構成できることが分かった。
【０１０９】
以上説明した本発明の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、酵素電極１に、電極２と、電極２上に設けられたシリカ系メソ多孔体３と、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に固定化された酵素４と、を備え、シリカ系メソ多孔体２の細孔のサイズが、酵素４のサイズの０．５〜２．０倍に設定されている。
したがって、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に、酵素４をしっかりと固定することができるとともに、酵素４を高い自由度をもって固定することができるため、酵素４の立体構造の変化が防止され、優れた安定性を有し、且つ、長寿命の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００を提供することができる。
また、シリカ系メソ多孔体３は多孔質であり、比表面積が非常に大きい。したがって、シリカ系メソ多孔体３を担体として用いると、シリカ系メソ多孔体３よりも比表面積が小さい担体を用いる場合と比較して、より大きな吸着量でより高濃度に酵素４を固定することができる。さらに、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に酵素４をしっかりと固定することで、酵素４は適度に分散された状態に維持されるため、酵素４が凝集を起こして失活する等を避けることができる。すなわち、細孔のサイズが、酵素４のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているシリカ系メソ多孔体３を担体として用いることで、より大きな吸着量でより高濃度に酵素４を固定することができるとともに、酵素４が凝集を起こして失活する等を避けることができるため、優れた感度を有する酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００を提供することができる。
また、酵素４は、適度に分散された状態に固定化されることになるため、物質の透過拡散性が良好となり、酵素反応が効率的に進行する。
【０１１０】
また、本発明の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、シリカ系メソ多孔体３は、細孔の内部に水分子が導入されることで乾燥防止をすることができるとともに、細孔がその直径よりも大きな分子、不純物、生体分子等を遮断した状態でセンシング可能とするフォルターの役割を担うため、酵素４を失活の原因（不純物等）から保護することができることとなって、酵素センサ１００の乾燥、不純物等に対する耐性を向上させることができる。
【０１１１】
また、本発明の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、シリカ系メソ多孔体３が、酵素４の標的物質の濃縮作用を有するため、気相又は液相中の微量な標的物質を極めて高感度に検出することができる。また、電子伝達体を利用することにより、シリカ系メソ多孔体３の細孔の内部に固定化された酵素４の活性中心と電極２との間の電子移動が媒介・促進され、高感度で高速な応答を得ることが可能となる。これらの作用により、電気化学的計測による極めて高速且つ高感度な標的物質の検出が可能となり、高速且つ高感度で、長寿命な、安定性に優れた酵素センサ１００を構成することができる。
【０１１２】
また、本発明の酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、気相又は液相中の微量な標的物質を極めて高感度に検出することにより、特定の匂い、又は、ガスを検出するためのセンサとして使用することができる。また、液相中での特定の味を検出するためのセンサや、バイオリアクター中で特定物質の生成及び／又は生成量を検出するために用いることもできる。
【０１１３】
また、本発明の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、測定に際しては、参照電極４００に対する作用電極（酵素電極１）の電圧を特定の電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、標的物質を高感度かつ選択的に測定することができる。特に、電子伝達体を利用することにより、この設定電圧を下げることができ、選択性を向上することが可能となる。
【０１１４】
また、本発明の酵素電極１及び酵素電極１を用いた酵素センサ１００によれば、標的物質によって分子識別素子としての酵素４の種類を変えることが必要である。例えば、酵素４として、標的物質（測定対象）がグルコースの場合にはグルコースオキシターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを、測定対象がエタノールの場合にはアルコールオキシターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼを、測定対象がホルムアルデヒドの場合にはホルムアルデヒドオキシターゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを、測定対象が総コレステロールの場合にはコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物等を用いることができる。
【０１１５】
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【０１１６】
酵素センサ１００にポテンショスタット５００を含むよう構成したが、これに限ることはなく、酵素センサ１００とポテンショスタット５００とは別体であっても良い。
【０１１７】
酵素センサ１００による電気化学的計測は、一つの基板上に形成した二極構造（作用電極と対電極）又は三極構造（作用電極と対電極と参照電極）の電極を用いても良いし、独立した各電極（作用電極、対電極、参照電極）を組み合わせて用いても良い。
【０１１８】
酵素電極１において、酵素タンパク質複合体Ｃは、作用電極（電極２）上（例えば、ディスク電極の場合はディスク部上）に固定されていても良いし、複数の電極２（例えば、２電極や３電極）上にまたがって固定されていても良いし、電極２の周辺部に固定されていても良いし、電極２から離れた電解液中の一部に固定されていても良い。
【０１１９】
また、実施例においては、酵素センサ１００によって液相中の標的物質の濃度を検出するようにしたが、無論、酵素センサ１００は、気相中の標的物質の濃度を検出することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明の酵素電極を模式的に示す斜視図である。
【図２】ホルムアルデヒド脱水素酵素の構造を示す図である。
【図３】シリカ系メソ多孔体のＴＥＭ画像である。
【図４】シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に酵素を固定化して形成した酵素タンパク質複合体の要部を模式的に示す斜視図である。
【図５】シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に酵素を固定化して形成した酵素タンパク質複合体の一例と、当該酵素タンパク質複合体の要部と、を模式的に示す斜視図である。
【図６】酵素電極を用いた酵素センサによって、電気化学的計測法により試料中の標的物質の濃度を高速且つ高感度に測定する原理について説明するための図である。
【図７】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（シリカ系メソ多孔体に固定化された酵素の酵素活性）を示す図である。
【図８】酵素電極の作成方法について説明するための図である。
【図９】本発明の酵素センサを模式的に示す図である。
【図１０】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（ホルムアルデヒド水溶液の濃度と応答電流との関係）を示す図である。
【図１１】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に電子伝達体を導入することの有効性）を示す図である。
【図１２】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの応答時間）を示す図である。
【図１３】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの選択性）を示す図である。
【図１４】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの再現性）を示す図である。
【図１５】実施例１の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化することの有効性）を示す図である。
【図１６】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（シリカ系メソ多孔体に固定化された酵素の酵素活性）を示す図である。
【図１７】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（ホルムアルデヒド水溶液の濃度と応答電流との関係）を示す図である。
【図１８】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に電子伝達体を導入することの有効性）を示す図である。
【図１９】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの応答時間）を示す図である。
【図２０】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの選択性）を示す図である。
【図２１】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの再現性）を示す図である。
【図２２】実施例２の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化することの有効性）を示す図である。
【図２３】実施例３のシリカ系メソ多孔体を用いて測定して得た結果（酵素の吸着量）を示す図である。
【図２４】実施例３の酵素センサを用いて測定した得た結果（酵素センサの繰り返し測定安定性）を示す図である。
【図２５】実施例３の酵素センサを用いて測定して得た結果（酵素センサの再現性）を示す図である。
【符号の説明】
【０１２１】
１  酵素電極
２  電極
３  シリカ系メソ多孔体
４  酵素
１００  酵素センサ
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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