(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析試料中に含まれる、下記式（II）：
【化１】
0005212687.tif 000009
（式中、ｎは０〜４の整数を表わす。）
で表される化合物の定量方法であって、
式（II）で表される化合物の標準試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝２５５＋３０ｎに該当する陽イオンについての選択イオンモニタリングで行い、マススペクトルピーク面積と前記化合物の量との関係Ａを求める過程、
被分析試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝２５５＋３０ｎに該当する陽イオンについての選択イオンモニタリングで行い、被分析試料についてのマススペクトルピーク面積を得る過程、
被分析試料についてのマススペクトルピーク面積と前記関係Ａとの対比により、被分析試料中の、式（II）で表される化合物の含有率を得る過程、
を有することを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法。
【請求項２】
式（II）で表される化合物が、サラシノール又はコタラノールの脱硫酸塩であることを特徴とする請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法。
【請求項３】
前記被分析試料が、サラキア属植物又はその抽出物であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の定量方法。
【請求項４】
前記被分析試料が、サラキア属植物又はその抽出物を含有する製剤であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の定量方法。
【請求項５】
前記被分析試料が、サラキア属植物又はその抽出物を含有する食品であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の定量方法。
【請求項６】
サラキア属植物の抽出液を、被分析試料として、請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法を行い、その定量値に基づきα−グルコシダーゼ阻害活性を評価することを特徴とするサラキア属植物又はその抽出液のα−グルコシダーゼ阻害活性評価法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サラキア属植物、その抽出物、又はこれらを含有する製剤又は食品等に含まれているα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法、特に、サラシノールやコタラノール等の定量方法に関する。本発明は、又、サラキア属植物やのその抽出液のα−グルコシダーゼ阻害活性を、その中に含有されているα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物を定量して、評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デチンムル科（Ｈｉｐｐｏｃｒａｔｅａｃｅａｅ）のサラキア（Ｓａｌａｃｉａ）属植物は、インド、スリランカ、タイやインドネシア等の東南アジア及びブラジル等の熱帯地域に広く分布しており、その根や幹は、インドやスリランカの伝統医学であるアーユル・ヴェーダやタイ伝統医学等において糖尿病の治療に用いられてきた。
【０００３】
糖尿病の中でもインスリン非依存型のII型糖尿病は、糖質（炭水化物）の過剰摂取や肥満等によるインスリン感受性の低下等により生じ、その治療及び改善には血糖コントロールが重要である。そこで、摂取した炭水化物の消化を抑え食後の過血糖を抑制することは、糖尿病の予防及び改善に繋がる。
【０００４】
食事により摂取した炭水化物は、唾液中のアミラーゼや胃酸等によりショ糖や麦芽糖等の二糖類に分解され、さらに小腸に存在するα−グルコシダーゼにより単糖であるブドウ糖にまで分解された後、血中へ移行する。従って、α−グルコシダーゼの活性を阻害すれば、ブドウ糖の生成を抑制でき、血糖値の上昇を抑制できる。又、エネルギー源である糖質の吸収の抑制により、あらゆる生活習慣病のリスクファクターである肥満の予防にも役立ち、糖尿病予防にも有用である。
【０００５】
サラキア属植物については、α−グルコシダーゼ阻害活性を指標とした活性成分の探索研究が実施されており、サラキア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）やサラキア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）等から単離されるサラシノール（１）（ｓａｌａｃｉｎｏｌ）やコタラノール（２）（ｋｏｔａｌａｎｏｌ）が、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することが判明している（非特許文献１〜４）。サラシノール（１）及びコタラノール（２）は、サラキア属植物からのみ単離されている特有成分であり、又これらが以下に示す化学構造を有することも明らかになっている（非特許文献１〜４）。
【０００６】
【化１】
0005212687.tif 000002
【０００７】
さらに、サラシノール（１）及びコタラノール（２）のα−グルコシダーゼ阻害活性の強度は、市販されているα−グルコシダーゼ阻害薬であるグルコバイ（登録商標、バイエル薬品工業社製）と同程度であり、試験法によってはグルコバイよりも強く血糖値の上昇を抑制することも明らかとなっている（非特許文献１、２）。
【０００８】
しかし、現在流通しているサラキア属植物は全て野生品であり、インドやスリランカ、タイ等に自生しているものを伐採しているため、産地や生育状態等が十分管理されていない。そして、非特許文献５等で報告されているように、抽出エキス等のα−グルコシダーゼ阻害活性の強度は、産地や生育環境によって大きな差異があり、品質の悪いサラキア属植物及びそれから調製した抽出物を原料として用いると、所望の作用が得られない、又は活性成分の抽出が困難もしくは不可能となる等の問題があった。
【０００９】
そこで、サラキア属植物及びその抽出物を糖尿病の治療等に使用する際には、その品質評価が必要となり、その方法として、α−グルコシダーゼ阻害活性を直接評価する生物活性評価が提案されている。しかし、この方法は煩雑であり、より簡便な評価方法が望まれている。
【００１０】
より簡便な評価方法としては、含有成分の定量分析による品質評価法が提案されている。具体的には、検出が容易なマンギフェリン（３）（ｍａｎｇｉｆｅｒｉｎ）の高速液体クロマトグラフィーによる定量分析法が提案されている（非特許文献６）。しかしながら、マンギフェリン（３）のα−グルコシダーゼ阻害活性は、サラシノール（１）やコタラノール（２）と比べて１／１００程度しかなく、その含有量とα−グルコシダーゼ阻害活性は必ずしも相関しないので、サラキア属植物及びその抽出物の品質の良否を正確に判定する方法として満足できるものではなく、より正確で簡便な評価方法の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Tetrahedron Letters, Vol.38, No.48. pp. 8367-8370 (1997)
【非特許文献２】Bioorg. Med. Chem., Vol.10, pp. 1547−1554 (2002)
【非特許文献３】Chem. Pharm. Bull., Vol.46, pp. 1339−1340 (1998)
【非特許文献４】Chem. Pharm. Bull., Vol.47, pp. 1725−1729 (1999)
【非特許文献５】薬学雑誌, 第123巻, 871−880頁 (2003）
【非特許文献６】薬学雑誌, 第121巻, 371−378頁 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、α−グルコシダーゼ阻害活性を有するサラシノール、コタラノール又はこれらの類縁化合物、具体的には下記式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物を、正確かつ簡便に定量する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【化２】
0005212687.tif 000003
（式中、ｎは０〜４の整数を表す。）
【００１３】
【化３】
0005212687.tif 000004
（式中、ｎは０〜４の整数を表し、Ｘ−は陰イオンを表す。）
【００１４】
本発明は、又、前記の定量方法を使用してサラキア属植物やその抽出物のα−グルコシダーゼ阻害活性を、正確で簡便に評価する方法を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明者は、サラシノール（１）やコタラノール（２）が優れたα−グルコシダーゼ阻害活性を有するとの公知の知見に基づき、さらに、サラシノール（１）やコタラノール（２）に類似の構造を有する所謂類縁化合物もα−グルコシダーゼ阻害活性を有することが報告されており（Matsuda H., et. al., J. Trad. Med., 22(Suppl. 1), pp145−153(2005)）、これらの類縁化合物もサラキア属植物に含有されかつ活性成分として寄与していると考えられることに基づき、鋭意検討した結果、サラキア属植物及びその誘導品のα−グルコシダーゼ阻害活性の評価は、その中に含有されている前記式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物の定量により行うことができると考えた。
【００１６】
しかしながら、サラシノール（１）やコタラノール（２）は、各種発色試薬との反応性が低く、かつ紫外および可視光の波長域に吸収を有さないので、高速液体クロマトグラフィーによる検出の際には、定量性の乏しい視差屈折検出器を用いざるを得ない。さらに、サラシノール（１）及びコタラノール（２）等の有する特異な分子内塩構造のために、誘導体化も困難である等、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー等での定量分析には、種々の問題点があった。
【００１７】
そこで、本発明者は、サラシノール（１）、コタラノール（２）やこれらの類縁化合物の定量法についてさらに検討した結果、これらの化合物のマススペクトル測定を、その擬似分子イオンについての選択イオンモニタリングで行ったとき、マススペクトルのピーク面積と化合物量の間に直線的な関係があることを見出した。そして、被分析試料についての高速液体クロマトグラフ質量分析を、サラシノール（１）、コタラノール（２）やこれらの類縁化合物の擬似分子イオンについての選択イオンモニタリングで行い、その結果得られたスペクトルのピーク面積と前記の直線的な関係を対比することにより、被分析試料中のサラシノール（１）、コタラノール（２）やこれらの類縁化合物を、簡便かつ正確に定量できることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、その第１の態様として、
被分析試料中の、前記式（Ｉ）で表される化合物の定量方法であって、
式（Ｉ）で表される化合物の標準試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝３３３＋３０ｎに該当する陰イオンについての選択イオンモニタリングで行い、マススペクトルピーク面積と前記化合物の量との関係Ａを求める過程、
被分析試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝３３３＋３０ｎに該当する陰イオンについての選択イオンモニタリングで行い、被分析試料についてのマススペクトルピーク面積を得る過程、
被分析試料についてのマススペクトルピーク面積と前記関係Ａとの対比により、被分析試料中の、式（Ｉ）で表される化合物の含有率を得る過程、
を有することを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法（請求項１）を提供する。
【００１９】
サラキア・レティキュラータ及びサラキア・オブロンガ等のデチンムル科サラキア属植物から見出された強力なα−グルコシダーゼ阻害活性成分であるサラシノール（１）及びコタラノール（２）は、前記式（Ｉ）で表される化合物におけるｎ＝０及びｎ＝３の場合に該当する。請求項２に記載の発明は、式（Ｉ）で表される化合物が、このサラシノール又はコタラノールであることを特徴とする請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法である。
【００２０】
本発明は、又、その第２の態様として、
被分析試料中に含まれる、式（II）で表される化合物の定量方法であって、
式（II）で表される化合物の標準試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝２５５＋３０ｎに該当する陽イオンについての選択イオンモニタリングで行い、マススペクトルピーク面積と前記化合物の量との関係Ａを求める過程、
被分析試料について、高速液体クロマトグラフ質量分析を、ｍ／ｚ＝２５５＋３０ｎに該当する陽イオンについての選択イオンモニタリングで行い、被分析試料についてのマススペクトルピーク面積を得る過程、
被分析試料についてのマススペクトルピーク面積と前記関係Ａとの対比により、被分析試料中の、式（II）で表される化合物の含有率を得る過程、
を有することを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法（請求項３）を提供する。
【００２１】
式（II）中の、Ｘ−で表される陰イオンとしては、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−などのハロゲンイオン、ＢＦ４−などのルイス酸イオン、Ｒ１−ＳＯ３−、Ｒ１−ＣＯ２−、（式中、Ｒ１は炭素数１から４のアルキル基またはハロゲン化アルキル基を表す。）やＲ２−ＯＳＯ３−、（式中、Ｒ２は炭素数１から４のアルキル基を表す。）、リン酸イオンおよびＣｌＯ４−等を挙げることができる。式（II）で表される化合物は、Tanabe G., et. al., Bioorg. Med. Chem., 15, pp3926−3937 (2007)に記載の方法等により式（Ｉ）の化合物を脱硫酸して製造することができる。具体的には、式（II）で表される化合物を、メタノール等の溶媒に溶解し、塩酸等の酸を加えて脱硫酸反応を行い、反応後溶媒を除去する方法により製造することができる。そして、式（II）で表される化合物も、α−グルコシダーゼ阻害活性を有すると考えられる。
【００２２】
サラシノール（１）及びコタラノール（２）の脱硫酸塩は、前記式（II）で表される化合物におけるｎ＝０及びｎ＝３の場合に該当し、それぞれ以下に示す式（１ａ）、式（２ａ）で表されるものである。請求項４に記載の発明は、式（II）で表される化合物が、このサラシノールの脱硫酸塩又はコタラノールの脱硫酸塩であることを特徴とする請求項３に記載のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法である。
【００２３】
【化４】
0005212687.tif 000005
（式中、Ｘ−は前記のとおりであり、陰イオンを表す。）
【００２４】
このように請求項１〜４の方法により定量されるα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物とは、サラシノール（１）及びコタラノール（２）等の式（Ｉ）で表される化合物、並びに式（１ａ）、式（２ａ）で表される化合物等の式（II）で表される化合物である。なお、前記「サラシノール、コタラノール又はこれらの類縁化合物」とは、この式（Ｉ）で表される化合物及び式（II）で表される化合物を意味し、これらの化合物は、１−デオキシ４−チオアラビノフラノース（１−ｄｅｏｘｙ−４−ｔｈｉｏａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｅ）構造を有することを特徴とする。
【００２５】
請求項１〜４の定量方法では、式（Ｉ）又は式（II）で表されるそれぞれの化合物、すなわち式中のｎが異なる化合物のそれぞれについて標準試料の作製が行われる。標準試料とは、式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物のいずれかを含み、その含有率が明らかであり、高速液体クロマトグラフ質量分析に供するための試料である。
【００２６】
作製された標準試料は、高速液体クロマトグラフ質量分析に供せられる。高速液体クロマトグラフ質量分析とは、高速液体クロマトグラフと質量分析器を、インターフェイスを介して結合したものであり、試料中の成分を、高速液体クロマトグラフにより分離し、分離された成分について、質量分析を行うものである。質量分析は、式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物のそれぞれについて、以下に示すように対応するイオン（擬似分子イオン）についての選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モード、すなわち当該イオンのみを検出するモードで行われ、そのイオンについてのマススペクトル強度（ピーク面積）が得られる。
【００２７】
式（Ｉ）で表され、
ｎ＝０の化合物：  ｍ／ｚ＝３３３の陰イオン（サラシノール）
ｎ＝１の化合物：  ｍ／ｚ＝３６３の陰イオン
ｎ＝２の化合物：  ｍ／ｚ＝３９３の陰イオン
ｎ＝３の化合物：  ｍ／ｚ＝４２３の陰イオン（コタラノール）
ｎ＝４の化合物：  ｍ／ｚ＝４５３の陰イオン
式（II）で表され、
ｎ＝０の化合物：  ｍ／ｚ＝２５５の陽イオン（サラシノールの脱硫酸塩）
ｎ＝１の化合物：  ｍ／ｚ＝２８５の陽イオン
ｎ＝２の化合物：  ｍ／ｚ＝３１５の陽イオン
ｎ＝３の化合物：  ｍ／ｚ＝３４５の陽イオン（コタラノールの脱硫酸塩）
ｎ＝４の化合物：  ｍ／ｚ＝３７５の陽イオン
【００２８】
この標準試料の高速液体クロマトグラフ質量分析は、それぞれの化合物毎に、試料の濃度又は試料の量を変えて数点行ない、それぞれの化合物毎に、化合物量とマススペクトルピーク面積との関係（請求項１又は３中のＡ）を求める。本発明者は、関係Ａは所定の範囲内では、直線関係になることを見出した。すなわち、それぞれの化合物毎に、化合物量とマススペクトルピーク面積の関係Ａを示す検量線が得られる。
【００２９】
請求項１〜４の定量方法では、被分析試料についても、前記の標準試料についての場合と、同条件で、高速液体クロマトグラフ質量分析が行われる。ここでの質量分析も、ｍ／ｚ＝３３３、３６３、３９３、４２３若しくは４５３の陰イオン、又はｍ／ｚ＝２５５、２８５、３１５、３４５若しくは３７５の陽イオンについての選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードで行われ、そのイオンに対応する化合物についてマススペクトルピーク面積（請求項１又は３中の被分析試料についてのマススペクトルピーク面積）が得られる。そして、このマススペクトルピーク面積と、前記で得られた当該化合物についての関係Ａ（検量線）から、被分析試料中の当該化合物の含有率を求めることができ、定量を行うことができる。
【００３０】
なお、式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルを、陰イオンモードで測定したとき、ｍ／ｚ＝３３３＋３０ｎに相当する擬似分子イオンピーク（Ｍ−Ｈ）−とともに、擬似分子イオンとの差Δｍ／ｚが１５０であるフラグメントイオンピークが観測される。例えば、サラシノール（１）では、ｍ／ｚ＝３３３のピークとともにｍ／ｚ＝１８３のピークが観測され、コタラノール（２）では、ｍ／ｚ＝４２３のピークとともにｍ／ｚ＝２７３のピークが観測される。このフラグメントイオンピークは、式（Ｉ）で表される化合物の１−デオキシー４−チオアラビノフラノース部分（Ｃ５Ｈ１０Ｏ３Ｓ）が開裂することにより生じたものと考えられ、式（Ｉ）で表される化合物に特徴的なものであるため、この化合物であるか否かの判定に適用することができる。
【００３１】
請求項５に記載の発明は、前記被分析試料が、サラキア属植物又はその抽出物であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の定量方法である。本発明の、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法における被分析試料としては、サラキア属植物、その抽出物を挙げることができる。
【００３２】
本発明の、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法における被分析試料としては、サラキア属植物、その抽出物を挙げることができる。サラキア属植物を被分析試料とする場合は、当該サラキア属植物を溶媒で抽出して、その抽出液又は抽出エキス（一般に抽出液は溶媒を留去していない抽出溶液を、抽出エキスは溶媒を一部あるいは全部留去した抽出溶液を言うが、以下本明細書においては、抽出エキスも含めて抽出液と言う。）について、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の定量方法が行われる。
【００３３】
α−グルコシダーゼ阻害活性を有する薬剤等の原料として使用されるサラキア属植物としては、所望の作用や活性を発揮し得る成分であるサラシノール（１）やコタラノール（２）を含むものであれは、植物の種類や部位（例えば、葉、樹皮、幹、根、根皮等）に限定されない。
【００３４】
抽出液の調製は、サラキア属植物をそのままの形態で、又は粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行った後、あるいは乾燥等を行った後、抽出溶媒に加えることにより行う。抽出効率の面からは、原料のサラキア属植物を、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行った後用いる方法が好ましい。
【００３５】
抽出溶媒としては、水あるいは有機溶媒が挙げられる。有機溶媒の例としては、アルコール類（例えば、メタノール。エタノール、イソプロパノール、ブタノール等）、エステル類（例えば、醋酸エチル等）、ケトン類（例えば、アセトン等）、エーテル類（例えばジエチルエーテル等）を用いることができる。これらの水又は有機溶媒は、２種類以上組み合わせて使用してもよい。特に好ましい抽出溶媒は水又はエタノールである。
【００３６】
本発明の、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法における被分析試料としては、前記のサラキア属植物又はその抽出物に加えて、これらを含有する製剤（請求項６）やこれらを含有する食品（請求項７）を挙げることができる。
【００３７】
被分析試料の製剤又は食品が固形の場合は、これらを溶媒に溶解又は溶媒により抽出し、液状にした後、本発明の定量方法に供せられる。抽出の方法としては、前記のサラキア属植物の抽出と同様にして行うことができる。被分析試料の製剤又は食品が液状の場合は、そのまま定量方法に供せられる場合もあるが、これらを溶媒に溶解又は溶媒により抽出した後本発明の定量方法に供せられる場合もあり、製剤や食品の種類により最適な形態が選ばれる。
【００３８】
本発明は、さらに、その第３の態様として、
サラキア属植物の抽出液を、被分析試料として、前記第１の態様又は第２の態様のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法を実行し、その定量値に基づきα−グルコシダーゼ阻害活性を評価することを特徴とするサラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性評価法（請求項８）を提供するものである。
【００３９】
すなわち、サラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性を、サラキア属植物の抽出液を被分析試料として、請求項１〜４に記載の定量方法を、式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物について行うことにより、評価する方法である。サラキア属植物に含有されているサラシノール（１）やコタラノール（２）、これらの脱硫酸塩等、式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物は、強力なα−グルコシダーゼ阻害活性を有するものであり、その含有量は、サラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性と強い相関がある。そこで、これらの化合物の含有量、少なくともサラシノール（１）及びコタラノール（２）の含有量、より好ましくは、サラシノール（１）、コタラノール（２）及びこれらの脱硫酸塩の含有量、さらに好ましくは、式（Ｉ）又は式（II）で表される全ての化合物の含有量を、前記の方法により定量することにより、サラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性を正確に判定することができる。
【００４０】
又、請求項１〜４に記載の定量方法では、前処理としてはサラキア属植物の抽出を要するのみであり、又、定量性が高い方法であり、簡便、正確な定量分析を行うことができる。そこで、サラキア属植物について、請求項１〜４に記載の定量方法を行い、その中に含まれている式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物の含有量を求めることにより、当該サラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性を、簡便、正確に評価することができ、品質の良否、使用の可否等を判定することができる。なお、この方法における被分析試料であるサラキア属植物の抽出液は、前記と同様な方法により得ることができる。
【００４１】
又、請求項１〜４に記載の定量方法は、さらに、サラキア属植物及び／又はその抽出物が処方された製剤や食品のα−グルコシダーゼ阻害活性の評価、その品質の判定に適用することができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物に定量方法によれば、式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物を、正確かつ簡便に定量することができる。従って、サラキア属植物の抽出液について、この定量方法を適用することにより、当該サラキア属植物のα−グルコシダーゼ阻害活性を、簡便、正確に評価することができ、従来よりも正確な、品質の良否の判定、使用の可否の判定等を行うことができる。さらに、本発明のα−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物の定量方法は、サラキア属植物及び／又はその抽出物が処方された製剤や食品のα−グルコシダーゼ阻害活性の評価等にも適用することができ、それらの製剤や食品の良否判定にも十分適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明の定量方法において使用される高速液体クロマトグラフ質量分析計は、高速液体クロマトグラフと質量分析計から構成され、これらをインターフェイスでつないだものである。式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物は、高極性化合物なので、高速液体クロマトグラフとしては、高極性化合物について適用される装置や条件が好ましく採用される。
【００４４】
質量分析器は、イオン化部、質量分析部及び検出部からなるが、本発明の定量方法では、選択イオンモニタリングでの測定が行われるので、このモードに適したものが好ましく採用される。具体的には、イオン化部では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）が好ましく採用される。又、質量分析部としては、選択イオンモニタリングに適し、比較的安価な四重極型が好ましく採用される。
【００４５】
サラキア属植物から抽出液を得る方法の一例を示すと次の通りである。サラキア属植物の所望の部位、例えば根や茎を乾燥した後、溶媒、例えば、水やアルコールを加え、２〜４時間、沸点近くまで加温して、抽出した後、抽出液を濾過し、必要あれば、濾液を４０℃以下の減圧下で溶媒を除去して濃縮又は乾燥することにより、目的の抽出物を得ることが出来る。抽出物としては、上記抽出後の濾液のままで、濃縮液として、又は濾液を乾燥させて得た粉末の形態で、あるいはそれらの混合物のいずれの形態でも使用することができる。
【００４６】
本発明の定量方法が適用可能な製剤又は食品は、前記サラキア属植物及びその抽出物が処方されているものであれば、その種類や形態等は特に限定されない。又、抽出物（乾燥品を含む）をそのまま製剤として用いることも考えられる。
【００４７】
例えば、製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の医薬品の形態のものを挙げることができる。これらは医薬品等の製造分野における公知の方法により製造することができるものである。
【００４８】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００４９】
錠剤は、通常の製薬の実際に周知の方法でコートしてもよい。液体製剤は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、使用前に水又は他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５０】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂）、乳化剤（例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート又はアラビアゴム）、（食用脂を含んでもよい）、非水性賦形剤（例えばアーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコール又はエチレングリコールのような油性エステル）、保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル又はソルビン酸）、および所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５１】
食品としては、前記サラキア属植物及びその抽出物を単独で又は混合物として含有する食品及び／又は健康食品を挙げることができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等を目的とした食品を意味し、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、上記の抽出物及び／又は化合物等を混合又は塗布、噴霧等により添加することにより、健康食品とすることができる。
【００５２】
前記製剤や食品における、サラキア属植物及びその抽出物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宜調整されるものである。例えば、抽出液としては、成人１回につき、精製度や水分含量等に応じて、１ｍｇ〜２０ｇ程度が挙げられる。又、使用量を化合物に換算すると、成人１回につき、１ｍｇ〜１ｇ程度が挙げられる。
【００５３】
又、健康食品としての使用時には、食品の味が外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対して、前記サラキア属植物及びその抽出物を、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で添加することが好ましい。
【実施例】
【００５４】
以下本発明を、実施例を用いてより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【００５５】
製造例１  サラシノール（１）及びコタラノール（２）標準品の単離
サラシノール（１）及びコタラノール（２）は、非特許文献１−３に記載の分離方法に準じて、サラキア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）根および幹部から単離した。得られたサラシノール（１）及びコタラノール（２）は、１Ｈ−および１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル及び質量分析により、それぞれ前記式（１）、式（２）の構造を有するものであると同定した。これを用いて、以下の実施例における標準品とした。
【００５６】
製造例２  サラシノールの脱硫酸エステル体（１ａ）、コタラノールの脱硫酸エステル体（２ａ）の調製
サラシノールの脱硫酸エステル化合物（１ａ）は、Tanabe G., et. al., Bioorg. Med. Chem., 15, pp3926−3937 (2007)に記載の方法によりサラシノール（１）（ｓａｌａｃｉｎｏｌ）から調製した。すなわち、サラシノール（１）２８ｍｇを５％（ｗ／ｗ）塩酸メタノール溶液（０．６ｍＬ）に溶解させ、４５℃で３時間攪拌した。その後溶媒を減圧下溶媒留去し、サラシノールの脱硫酸エステル化合物（１ａ）、２６．５ｍｇを得た。
【００５７】
同様に、コタラノール（２）５．０ｍｇを５％（ｗ／ｗ）塩酸メタノール溶液（０．６ｍＬ）に溶解させ、４５℃で１時間攪拌した。その後溶媒を減圧下濃縮し、コタラノールの脱硫酸エステル化合物（２ａ）、５．０ｍｇを得た。このようにして得られたコタラノールの脱硫酸エステル化合物（２ａ）について、旋光度及び核磁気共鳴スペクトルを測定したところ、以下に示す測定値が得られ、前記式（２ａ）で表される化合物であることが確認された。
【００５８】
［α］Ｄ２３  ＋１３．１°  （ｃ＝０．６０，ＭｅＯＨ）
核磁気共鳴スペクトル：
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ：３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，９．４Ｈｚ，４’−Ｈ），  ３．６６（２Ｈ，ｄ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，７’−Ｈ２），  ３．７１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＯＳＯ３），  （３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１，１３．４Ｈｚ），  ３．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１３．４Ｈｚ），１’−Ｈ２），  ３．８６（１Ｈ，ｄ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，３’−Ｈ），  （３．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５，１２．７Ｈｚ），３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，１２．７Ｈｚ），１−Ｈ２），  ３．８７（１Ｈ，ｄ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，５’−Ｈ），  （３．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０．５Ｈｚ），４．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１０．５Ｈｚ），５−Ｈ２），  ３．９４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．０，６．４Ｈｚ，６’−Ｈ），  ４．０７−４．１０（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ），  ４．２２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．１，９．１，９．６Ｈｚ，２’−Ｈ），  ４．４３（１Ｈ，ｔ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，３−Ｈ），４．７２−４．７５（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δＣ：５０．８（Ｃ−１），７９．７（Ｃ−２），８０．２（Ｃ−３），７２．６６（Ｃ−４），６１．９（Ｃ−５），５３．１（Ｃ−１’），７０．１（Ｃ−２’），７０．７（Ｃ−３’），７１．８（Ｃ−４’），７４．３（Ｃ−５’），７２．７２（Ｃ−６’），６５．９（Ｃ−７’），５８．１（ＣＨ３ＯＳＯ３−）
【００５９】
製造例３  サラキア・レティキュラータ根及び幹部の熱水抽出液（ＳＲＨ）の製造
サラキア・レティキュラータ根及び幹部の粉砕物４５０ｇに１０倍容の水を加え、約９０℃の水浴中、２時間抽出した。得られた抽出物を濾紙を用いて熱時濾過し、抽出残査を濾別した。濾別した抽出残査に更に１０倍容の水を加え、同様の抽出操作を合計３回行なった。濾別した抽出物をあわせ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下溶媒留去し、熱水抽出液（ＳＲＨ、５０ｇ）を得た。
【００６０】
実施例
（１）標準試料の作成
製造例１で単離されたサラシノール（１）及びコタラノール（２）の標準品を秤量し、メタノール−水（５０：５０，ｖ／ｖ）にて溶解して１０ｍＬ容積とした後、メンブランフィルター（孔経０．４５μｍ）で濾過して試料溶液を得た。同様にして、製造例２で調整されたサラシノールの脱硫酸塩（１ａ）及びコタラノールの脱硫酸塩（２ａ）の標準品についても標準試料を得た。標準品の量は、標準試料中の各化合物の濃度が、それぞれ、０．３２μｇ／ｍＬ、０．６４μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、３．２μｇ／ｍＬ、８．０μｇ／ｍＬ、１６．０μｇ／ｍＬとなる量とした。
【００６１】
（２）検量線の作成
これらの標準試料について、以下に示す条件で、選択イオンモニタリングモードで、高速液体クロマトグラフ質量分析を行い、マススペクトルピーク面積と標準試料中の化合物濃度との関係を求めた。
【００６２】
装置
高速液体クロマトグラフ質量分析計：ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ（島津製作所社製）
【００６３】
分析条件
注入量：標準試料各１．０μＬ
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｓｕｇａｒ−Ｄ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，ｉ．ｄ．＋ガードカラム４．６ｍｍ×１０ｍｍ，ｉ．ｄ．）（ナカライテスク社製）
移動相：アセトニトリル−水（８０：２０，ｖ／ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
イオン化法：ＥＳＩ
霧化ガス流量：１．５Ｌ／ｍｉｎ
ガス圧：０．１５ＭＰａ
ＣＤＬ温度：２５０℃
ブロックヒーター温度：２００℃
質量分析法：四重極型
【００６４】
各標準試料の分析においてモニタリングした選択イオン
サラシノール（１）：  ｍ／ｚ＝３３３のＮｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ
コタラノール（２）：  ｍ／ｚ＝４２３のＮｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ
サラシノールの脱硫酸塩（１ａ）：  ｍ／ｚ＝２５５のＰｏｓｉｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ
コタラノールの脱硫酸塩（２ａ）：  ｍ／ｚ＝３４５のＰｏｓｉｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ
【００６５】
前記のようにして得られたマススペクトルピーク面積と化合物濃度との関係から、サラシノール（１）、コタラノール（２）、サラシノールの脱硫酸塩（１ａ）、コタラノールの脱硫酸塩（２ａ）のそれぞれについて、検量線式を算出した。図１はサラシノール（１）についての、各濃度でのマススペクトルピーク（検出器を選択イオンモニタリングの質量分析器とした、サラシノールについての高速液体クロマトグラム）を示す。図２は、この濃度と、マススペクトルピーク面積とをプロットしたグラフである。図２より明らかなように、濃度とマススペクトルピーク面積は、０．３２−８．０μｇ／ｍＬの濃度範囲において良好な相関性を示し、両者の関係は、ｙ＝２１８５１１．８ｘ＋１６７７９．１（ｙ：ピーク面積、ｘ：濃度（μｇ／ｍＬ）、相関係数ｒ＝０．９９９）の検量線式で表される。
【００６６】
（３）抽出液（ＳＲＨ）中のサラシノール（１）及びコタラノール（２）の定量
製造例３で製造された抽出液（ＳＲＨ）５１．５ｍｇを正確に秤量し、メタノール−水（５０：５０，ｖ／ｖ）にて溶解して１０ｍＬ容積とした後、メンブランフィルター（孔経０．４５μｍ）で濾過して試料溶液を得た。前記の標準試料の高速液体クロマトグラフ質量分析の場合と同じ条件で、この試料溶液について、高速液体クロマトグラフ質量分析を行い、ｍ／ｚ＝３３３の選択イオンモニタリング、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ、及び、ｍ／ｚ＝４２３の選択イオンモニタリング、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅでのマススペクトルピーク面積（前記ｙと同一基準で表した面積）を求めた。なお、試料溶液の注入量は、サラシノール（１）が検量線式の適用範囲内になるため、０．１μＬとした。合計３回分析した結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
0005212687.tif 000006
【００６８】
得られたマススペクトルピーク面積から、前記検量線との対比により、抽出液（ＳＲＨ）中のサラシノール（１）及びコタラノール（２）を定量した。具体的には、ｍ／ｚ＝３３３の選択イオンモニタリング、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅのマススペクトルピーク面積から、前記検量線式を用い、抽出液（ＳＲＨ）中のサラシノール（１）の濃度を計算し、ｍ／ｚ＝４２３の選択イオンモニタリング、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅのマススペクトルピーク面積から、前記検量線式を用い、抽出液（ＳＲＨ）中のコタラノール（２）の濃度を計算した。この結果、前記サラシア熱水抽出液（ＳＲＨ）中には、サラシノール（１）が０．７６％、コタラノール（２）が０．１１％含有されることが判明した。
【００６９】
このように、本発明の定量方法を用いることにより、デチンムル科サラキア属植物及びその抽出物中のサラシノール（１）及びコタラノール（２）の含量を定量的に分析することが可能であることが、示された。
【００７０】
参考例１
上記にて調製した標準試料の高速液体クロマトグラム（検出器：ＵＶ，２００ｎｍ、他の条件は、前記実施例での高速液体クロマトグラフの場合と同じ。）を図３に示す。サラシノール（１）、コタラノール（２）、サラシノールの脱硫酸塩（１ａ）、コタラノールの脱硫酸塩（２ａ）のピークは観測されず、これらの化合物は検出器をＵＶとした高速液体クロマトグラフでは検出されないことが示された。
【００７１】
参考例２
上記にて調製したサラシノール（１）、コタラノール（２）の標準試料の高速液体クロマトグラフ質量分析を、全イオンモードで行った（他の条件は、前記実施例での高速液体クロマトグラフの場合と同じ。）。これは、ＵＶの代わりに質量分析器を検出器とした高速液体クロマトグラフに該当する。その結果、図４に示すように、サラシノール（１）及びコタラノール（２）のピークが、それぞれ保持時間８．９５及び１５．３７分に観察された。
【００７２】
参考例３
製造例１にて得られたサラシノール（１）及びコタラノール（２）の標準試料について、イオン化法ＥＳＩ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ）における質量分析を行った（他の条件は、前記実施例での質量分析器と同じ。）。得られたマススペクトルを図５及び図６に示す。図５及び図６に示されるように、サラシノール（１）では、ｍ／ｚ＝３３３とともにｍ／ｚ＝１８３にピークが観測され、コタラノール（２）では、ｍ／ｚ＝４２３とともにｍ／ｚ＝２７３にピークが観測されている。それぞれ、擬似分子イオン（Ｍ−Ｈ）−及びフラグメントイオンのピークであり、以下に示す構造が推定される。
【００７３】
【化５】
0005212687.tif 000007
【００７４】
このように、サラシノール（１）及びコタラノール（２）の構造上の特徴部位である１−デオキシー４−チオ−Ｄ−アラビノフラノース部分が開裂した側鎖部のフラグメントイオンピークであるｍ／ｚ＝１８３及びｍ／ｚ＝２７３が、擬似イオンピークと同時に観測される。このフラグメントイオンピークが観測されることにより、他の成分のピークとの判別を容易にする。すなわち、上述した擬似分子イオンピークとフラグメントイオンピークの差Δｍ／ｚ  １５０の観測は、１−デオキシ−４−チオ−Ｄ−アラビノフラノース部分を有するサラシノール（１）及びコタラノール（２）の類縁化合物に特徴のあるものであるため、高速液体クロマトグラフ質量分析におけるピークが、これらの化合物のピークであるか否かの判明に適用することができる。従って、本発明の定量方法において、この質量分析をさらに行うことにより、より確実にサラシノール（１）及びコタラノール（２）、さらには前記式（Ｉ）の化合物の定量、さらにはサラキア属植物等の品質評価を行うことができる。
【００７５】
参考例４  サラシノール及びコタラノールの脱硫酸エステル化合物（１ａ）、（２ａ）のラット小腸由来α−グルコシダーゼ阻害活性試験
【００７６】
［酵素液の調製］
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（体重約１５０〜３５０ｇ）の空腸から得られた刷子縁膜を粗酵素として用いた。刷子縁膜は、０．１Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、上記の反応条件で、ｓｕｃｒａｓｅ阻害試験においては約５ｍｇ／ｄＬ、ｍａｌｔａｓｅ阻害試験においては約１０ｍｇ／ｄＬのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅが生成する濃度に希釈して用いた。
【００７７】
［酵素活性の測定］
基質としてｓｕｃｒｏｓｅ（７４ｍＭ）及びｍａｌｔｏｓｅ（７４ｍＭ）溶液５０μＬに被験サンプル溶液２５μＬを加え、３７℃で５分間予備加温した。前記で調整した酵素液２５μＬを加えて３０分間反応させ、水４００μＬを加え、沸騰水浴中で５分間加熱し、酵素を失活させた。別に、各サンプルにつき酵素液を加えた後、直ちに水を加えて沸騰水浴中で５分間加熱し、酵素を失活させたものをブランクとした。生成したＤ−ｇｌｕｃｏｓｅの量をグルコースオキシダーゼ法（グルコースＣＩＩテストワコー）により測定した。基質は０．１Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、被験物質はＤＭＳＯに溶解した液をマレイン酸緩衝液に添加（ＤＭＳＯの終濃度２．５％）して用いた。得られた値より５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。その結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
0005212687.tif 000008
【００７９】
非特許文献１〜５に記載されているサラシノール（１）及びコタラノール（２）（ｋｏｔａｌａｎｏｌ）のα−グルコシダーゼ阻害活性値（ＩＣ５０μｇ／ｍＬ）は、サラシノール（１、ｓｕｃｒａｓｅ阻害＝０．８４、ｍａｌｔａｓｅ阻害＝３．２）及びコタラノール（２、ｓｕｃｒａｓｅ阻害＝０．５８、ｍａｌｔａｓｅ阻害＝２．８）である。表２の結果は、サラシノール（１）及びコタラノール（２）の脱硫酸エステル化合物（１ａ）、（２ａ）の活性強度はサラシノール及びコタラノールと同程度であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】検出器を選択イオンモニタリングの質量分析器とした、サラシノールについての高速液体クロマトグラムである。
【図２】試料濃度と、マススペクトルピーク面積とをプロットしたグラフ（検量線）である。
【図３】製造例３で得られた抽出液（ＳＲＨ）についての高速液体クロマトグラフ質量分析計での高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）（検出：ＵＶ、２００ｎｍ）である。
【図４】サラシノール（１）、コタラノール（２）の標準試料の高速液体クロマトグラム（検出：質量分析器、全イオンモード）である。
【図５】サラシノール（１）の標準試料についてのマススペクトル（イオン化法ＥＳＩ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ）である。
【図６】コタラノール（２）の標準試料についてのマススペクトル（イオン化法ＥＳＩ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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