(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、
該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に該液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導基板上の前記溶媒層中に配列された前記複数の液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
前記熱伝導性基板の下面に設けられる熱源、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記熱源から前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し前記液滴の温度が核酸の一本鎖への変性の温度と、一本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度とに経時的に変化するように、前記熱源を制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項２】
前記熱源が
所定の熱量を有し、核酸の１本鎖への変性の温度に維持されるとともに、前記所定の領域と実質的に同一の面積の面を有する第１の熱源板と、
所定の熱量を有し、１本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度に維持されるとともに、前記所定の領域と実質的に同一の面積の面を有する第２の熱源板と、
を備えるものであるとともに、
前記第１の熱源板と前記第２の熱源板とが、所定のプログラムに従って前記熱伝導性基板の下面に接触させられるものである請求項１記載のリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項３】
前記第１の熱源板が、前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応する位置に熱伝導性の材料の突起を備える請求項２記載のリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項４】
基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の配列された液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導性基板の下面に設けられ、
所定の熱量を有し、核酸の１本鎖への変性の温度に維持されるとともに、前記所定の領域の配列された液滴の列と同等の面積の面を有する第１の熱源板と、
所定の熱量を有し、１本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度に維持されるとともに、前記所定の領域の配列された液滴の列と同等の面積の面を有する第２の熱源板と、
を備える熱源、
前記熱伝導性基板の下面に設けられ、前記熱伝導基板上に配列された前記複数の液滴の列の各液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記第１の熱源板と前記第２の熱源板とから前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように、前記第１の熱源板と前記第２の熱源板と前記液滴列との相対的な位置を制御するとともに、前記光検出手段を前記第１の熱源板と前記第２の熱源板と対応させて位置を制御する制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項５】
前記第１の熱源板が前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応する位置に熱伝導性の材料の突起を備える請求項４記載のリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項６】
複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼとを含むＰＣＲ反応溶液を保持でき、細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペットを保持する手段、
前記溶液をピペット内部から押し出して前記ピペット先端部に一つの細胞を含む液滴を形成する手段、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを確認するための手段、
前記ピペット先端部から滴下される前記液滴を受けるとともに前記液滴を保持する領域を囲むように設けられた側壁を有する熱伝導性基板であって、該側壁と該基板の上面とで規定される漕内に前記液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層を保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導性基板を載置するための基板載置手段、
前記熱伝導性基板載置手段を操作し、前記滴下される液滴を前記熱伝導基板上に所定の間隔で配列する手段、ならびに
前記熱伝導基板を介して前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度が核酸の一本鎖への変性の温度と、一本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度とに経時的に変化するように制御する温度制御手段、
前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
を備えることを特徴とする、リアルタイム核酸増幅装置。
【請求項７】
基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、
該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導基板上に配列された前記複数の液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
前記熱伝導性基板の下面に設けられるレーザー光源、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記レーザー光源から前記液滴に照射されるレーザー光を制御し前記液滴の温度が核酸の一本鎖への変性の温度と、一本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度とに経時的に変化するように、前記レーザー光の照射位置を所定のプログラムに従って制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
【請求項８】
前記レーザー光源から前記液滴に照射されるレーザー光を制御する手段がガルバノミラーとその反射角を制御する手段である請求項７記載のリアルタイム核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅装置、方法および細胞培養の過程からリアルタイム核酸増幅の過程までを同じ装置で実行できる細胞培養・リアルタイム核酸増幅方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
化学反応を極微量で行うマイクロデバイスや、細胞を１個ずつ取り扱い、細胞に対して種々反応を行ったり観測を行ったりするシステムを実現するための新しい技術が種々提案されている。たとえば、本願の発明者らによる特開２００６−１６２２６４号公報では、反応媒体を含む液滴を複数種準備して、これらを選択的に衝突させて反応を行わせる具体案が開示されている。
【０００３】
従来の生化学反応をはじめとする化学反応は、ある大きさを有する容器の中で行うのが一般的であったが、このような液滴による操作ができれば、文字通りの微量反応が実現できる。このような微量反応の実現は、準備する試料の量の低減が可能になるのみならず、反応速度の向上等操作性の面でも有利であるのみならず、反応生成物を最小限にできるので無駄がないと言う点でも有用である。
【特許文献１】特開２００６−１６２２６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、核酸増幅を微量反応として液滴内で実現しようとするものである。すなわち、細胞一つを液滴に収納して細胞単位で細胞が有する核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅装置に関する。さらに、核酸増幅の対象である液滴内に収納した細胞を液滴内で増幅して、増幅された細胞を利用して細胞が有する核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の、核酸増幅装置、核酸増幅方法、核酸増幅用基板、細胞培養・核酸増幅方法、および細胞培養・核酸増幅用基板を提供する。
【０００６】
（１）基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導基板上の前記溶媒層中に配列された前記複数の液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
前記熱伝導性基板の下面に設けられる熱源、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記熱源から前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように、前記熱源と前記液滴との相対的な位置を制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
（２）前記熱源が
所定の熱量を有し、核酸の１本鎖への変性の温度に維持されるとともに、前記所定の領域と実質的に同一の面積の面を有する第１の熱源板と、
所定の熱量を有し、１本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度に維持されるとともに、前記所定の領域と実質的に同一の面積の面を有する第２の熱源板と、
を備えるものであるとともに、
前記第１の熱源板と前記第２の熱源板とが、所定のプログラムに従って前記熱伝導性基板の下面に接触させられるものである上記（１）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（３）前記第１の熱源板が、前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応する位置に熱伝導性の材料の突起を備える上記（２）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（４）基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の配列された液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導性基板の下面に設けられ、
所定の熱量を有し、核酸の１本鎖への変性の温度に維持されるとともに、前記所定の領域の配列された液滴の列と同等の面積の面を有する第１の熱源板と、
所定の熱量を有し、１本鎖に変性された核酸にプライマーが結合する温度に維持されるとともに、前記所定の領域の配列された液滴の列と同等の面積の面を有する第２の熱源板と、
を備える熱源、
前記熱伝導性基板の下面に設けられ、前記熱伝導基板上に配列された前記複数の液滴の列の各液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記第１の熱源板と前記第２の熱源板とから前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように、前記第１の熱源板と前記第２の熱源板と前記液滴列との相対的な位置を制御するとともに、前記光検出手段を前記第１の熱源板と前記第２の熱源板と対応させて位置を制御する制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
（５）前記第１の熱源板が、前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応する位置に熱伝導性の材料の突起を備える上記（４）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（６）複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼとを含むＰＣＲ反応溶液を保持でき、細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペットを保持する手段、
前記溶液をピペット内部から押し出して前記ピペット先端部に一つの細胞を含む液滴を形成する手段、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを確認するための手段、
前記ピペット先端部から滴下される前記液滴を受けるとともに前記液滴を保持する領域を囲むように設けられた側壁を有する熱伝導性基板であって、該側壁と該基板の上面とで規定される漕内に前記液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層を保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導性基板を載置するための基板載置手段、
前記熱伝導性基板載置手段を操作し、前記滴下される液滴を前記熱伝導基板上に所定の間隔で配列する手段、ならびに
前記熱伝導基板を介して前記液滴に伝播される熱エネルギーを所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように制御する温度制御手段、
前記熱伝導基板上に配列された前記液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
を備えることを特徴とする、リアルタイム核酸増幅装置。
（７）基板の上面の所定の領域を囲むように設けられた側壁を有し、該側壁と該基板上面とで規定される漕内に、細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の液滴と、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層とを保持するための熱伝導性基板、
前記熱伝導基板上に配列された前記複数の液滴に１対１に対応し、該液滴からの光を検出する複数の光検出器を備える光検出手段、
前記熱伝導性基板の下面に設けられるレーザー光源、
ならびに
前記熱伝導基板を介して前記レーザー光源から前記液滴に照射されるレーザー光を制御し前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように、前記レーザー光の照射位置を所定のプログラムに従って制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
（８）前記レーザー光源から前記液滴に照射されるレーザー光を制御する手段がガルバノミラーとその反射角を制御する手段である上記（７）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
【０００７】
本発明では、熱伝導基板上に配列された細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを含有する複数の液滴を、その液滴と熱源との相対的な位置を制御して前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように制御することにより短時間で、液滴単位で独立して液滴内の細胞のＰＣＲによる核酸増幅を実施する。
【０００８】
あらかじめ細胞の特徴に着目して分離された細胞の懸濁液を吸い上げたピペット先端に一つの細胞を含有する適当な大きさの液滴を形成する。この際、細胞の懸濁液は、この細胞が有することが期待されている核酸の増幅のためのプライマー、ＤＮＡ鎖の伸長を行う酵素であるポリメラーゼ、拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素を包含するＰＣＲ溶液とすることができる。あるいは、前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するＰＣＲ溶液としてもよい。ピペットの先端に形成させる液滴は光学系でモニターして液滴の大きさを監視して制御する。
【０００９】
透明な基板上に前記液滴を滴下させ、液滴を適宜配置する。前記透明基板上の液滴の時間に対する温度を所定のパターンに変化させ、液滴単位で独立して液滴内の細胞のＰＣＲによる核酸増幅を実施する。
【００１０】
必要に応じて、上記細胞の核酸増幅に先行して、それぞれの液滴内の溶液を細胞の培養液として、細胞の培養を行う。その後、液滴内の培養液をＰＣＲ溶液に置換した後、培養された細胞の核酸増幅を行う。
【００１１】
典型的には、本発明の装置を用いた核酸増幅方法においては、チップ上に構成されたミネラルオイル層に適当な周期でＸＹ方向に試料とＰＣＲ反応溶液を混合した液滴を配置する。さらに、以下の（１）−（３）のように実施する。
（１）ミネラルオイル層をアニーリング温度（５０℃〜７０℃）に維持しながら、変性温度（９０℃〜９５℃）に維持された加熱板をチップ下面から所定の時間周期で接近、離反を繰り返す。一方、チップ上面に液滴に１対１に対応する光検出器（例えば、ＣＣＤ素子）を多数配置する。
（２）チップ下面にＹ軸方向に延伸された、変性温度（９０℃〜９５℃）に維持された加熱板A、アニーリング温度（５０℃〜７０℃）に維持された加熱板BおよびＹ軸方向に配列された液滴に１対１に対応する複数の光検出器をセットにして配列し、加熱板A、加熱板Bを交互にチップ下面から所定の時間周期で接近、離反を繰り返す。
（３）チップ下面に二つのガルバノミラーを配置して、全ての液滴を所定の周期でスキャンして温度制御を行う。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞単位で独立して、短時間での核酸増幅を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、熱伝導性基板の上面に配列された細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液とを保持する複数の液滴を、該液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層内に保持し、前記熱伝導基板の下面に設けた熱源から前記液滴に熱エネルギーを伝播させて、前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように制御するリアルタイム核酸増幅装置を提案するものである。
【００１４】
本発明の実施例のリアルタイム核酸増幅装置を説明する前に、実施例に採用して好適な熱伝導性基板の上面に液滴を配列する具体例を説明する。以下に説明する具体例は、単に本発明の例示としてのみ示されるものであって、本願発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００１５】
図１（ａ）は、熱伝導性基板１と、液滴２１と、液滴２１を保持する領域を規定する壁２の関連を示す平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。ここで、３８は前記液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層、例えば、ミネラルオイルの層である。熱伝導性基板１は、光学的に透明であり、例えば、シリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。壁２は、例えば、シリコン基板で製作され、その厚さは、例えば、１ｍｍ、高さは１０ｍｍである。（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）は、それぞれ、熱伝導性基板１の上面に配列される液滴２１の熱伝導性基板１上での安定な保持のための工夫の例を模式的に示す図である。（ｃ）は熱伝導性基板１上にＳＵ−８による保持用の突起４１1，４１2を形成した例である。図は断面であるので、両側の突起しか表れていないが、熱伝導性基板１の長さ方向にも突起を形成するのが良い。（ｄ）では、熱伝導性基板１上に親水性領域４２を形成した例である。シリコン基板上に親水性領域４２を形成するには、たとえば、交流放電によるプラズマイオンを親水性領域４２に限って熱伝導性基板１上面に軽く打ち込むものとすればよい。（ｅ）は保持用の突起４１1，４１2の形成に代えて凹部４３を形成した例である。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。図では、壁２の内側に設けたが、外側であっても良い。
【００１６】
図１（ｂ）に示すように、熱伝導性基板１上には核酸増幅の対象となる細胞１２およびＰＣＲ溶液１３を含む液滴２１がＸ−Ｙ方向に周期的に配列される。この液滴の配列については、一例を後述する。
【００１７】
図２は、熱伝導性基板１上に核酸増幅の対象となる細胞１２を含む液滴２１を載置するシステム構成の例を説明する概念図である。この例では、熱伝導性基板１上に細胞１２を含む液滴２１を載置するための第１のピペット１１と、液滴２１のサイズを調整するための第２のピペット２０とを備えるもののとして説明される。また、液滴２１を載置する操作に先行して壁２で囲われた領域内に８ｍｍの深さでミネラルオイル３８を張る。なお、ミネラルオイル３８を張る操作は液滴２１を載置する操作の後に、行うものとしてもよい。
【００１８】
核酸増幅の対象となる細胞１２は、あらかじめセルソータ等で分類される。ＤＮＡ複製において核酸増幅の対象となる細胞１２は、細胞１２に期待される核酸の増幅のためのプライマー、ＤＮＡ鎖の伸長を行う酵素であるポリメラーゼ、拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素を包含するＰＣＲ溶液１３、あるいは、前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するＰＣＲ溶液１３に懸濁された状態で準備される。
【００１９】
図２下段部に、分類された細胞ごとに準備された試料を入れた試験管４０1，４０2，４０3および４０4を示す。第１のピペット１１は試験管４０1，４０2，４０3および４０4から試料を吸引して、第１のピペット１１の先端に形成される液滴を光学的にモニターしながらリアルタイム核酸増幅装置用の熱伝導性基板１上に細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の液滴を分配する。この際、細胞ごとに第１のピペット１１とシリンジポンプ３１を接続するチューブ３０も含めて第１のピペット１１を取り替えれば、熱伝導性基板１上に載置される細胞１２を各列ごとに異なったものとする場合にも、これらが混在することは防止できる。
【００２０】
１９はＸＹ方向に駆動される光学的に透明なステージであり、２７はステージ１９の駆動装置である。ステージ１９の上面にはリアルタイム核酸増幅装置用の熱伝導性基板１が載置される。熱伝導性基板１の上部には、分配すべき細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３があらかじめ吸い上げられて保持されている第１のピペット１１が配置される。第１のピペット１１の根元部には、チューブ３０を介してシリンジポンプ３１が設けられ、シリンジポンプ３１には駆動装置３２が取り付けられている。また、シリンジポンプ３１にはあらかじめＰＣＲ溶液１３を吸引しておくものとする。シリンジポンプ３１が駆動装置３２により駆動されると、第１のピペット１１内のＰＣＲ溶液１３が細胞１２とともに押し出される。なお、第１のピペット１１の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、第１のピペット１１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。
【００２１】
一方、第１のピペット１１の先端部に形成される液滴のサイズを調整するために、第１のピペット１１の先端部に形成される液滴に溶液を供給するための第２のピペット２０の先端が配置される。第２のピペット２０の根元部にはチューブ３４を介してシリンジポンプ３５が設けられ、シリンジポンプ３５には駆動装置３６が取り付けられている。また、シリンジポンプ３５にはあらかじめＰＣＲ溶液１３を吸引しておくものとする。シリンジポンプ３５が駆動装置３６により駆動されると、シリンジポンプ３５内のＰＣＲ溶液が第２のピペット２０から押し出される。第１のピペット１１の先端部に形成されている液滴にＰＣＲ溶液を供給して液滴のサイズを大きくすることができる。
【００２２】
第１のピペット１１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴２１の大きさをモニターするための光学系を構成する光源１６、集光レンズ１７が設けられ、これに対向する位置で熱伝導性基板１の下部にコリメートレンズ１８およびモニター２５が設けられる。したがって、熱伝導性基板１およびステージ１９は、光学的に透明である必要がある。２６は、いわゆる、パソコンであり、モニター２５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて駆動装置２７，３２，３６および３７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター２５の検出している画面と同一の表示をパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター２５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号２８は、パソコン２６の入力装置を介して与えられるものである。また、図１（ｃ）および（ｅ）に例示したように、液滴の位置を安定に維持するために、熱伝導性基板１上に突起４１1，４１2を形成し、あるいは、これに代えて凹部４３を形成することは、液滴２１の位置決めの情報として利用できる効果がある。
【００２３】
ここで、第１のピペット１１のサイズについて考えると以下のようである。第１のピペット１１は、その先端に、一つの細胞のみを含有する適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。第１のピペット１１は、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３をピペットで吸い上げてから使用するが、液滴２１を構成するときに、第１のピペット１１の先端を通過する細胞がモニター２５で誤り無く検出できることが必要である。したがって、第１のピペット１１の先端部の直径は細胞１個が通過するのを許すが、一度に二つ以上の細胞が通過できないものとする。すなわち、透明で、先端部の直径が、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良い。
【００２４】
第１のピペット１１の先端部に形成された液滴２１を熱伝導性基板１上に移すためのピペットの上下動駆動装置３７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置３７は第１のピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、第１のピペット１１を下げる操作信号２８が与えられると、第１のピペット１１は下に動き、第１のピペット１１の先端部に形成された液滴を熱伝導性基板１の所定の位置に移す。上下動駆動装置３７に、使用者により、第１のピペット１１を復旧させる操作信号２８が与えられると、第１のピペット１１は図に示す位置に戻る。第１のピペット１１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン２６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線３９は上下動駆動装置３７と第１のピペット１１との連係を意味する。
【００２５】
熱伝導性基板１上に細胞１２を分配する全体的な操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１（ａ）で説明したマーカー５に着目して熱伝導性基板１が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、液滴２１の最初の分配位置を第１のピペット１１および第２のピペット２０の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号２８に応じて、駆動装置２７によりステージ１９を操作する。熱伝導性基板１が液滴２１の最初の分配位置まで来ると、第１のピペット１１内部の細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３を細胞１２とともに排出する操作を行う。この位置決めには、前述した、熱伝導性基板１上に形成した突起４１1，４１2、あるいは、これに代わる凹部４３の位置情報が補助情報として利用できる。この際、第１のピペット１１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源１６とモニター２５からなる光学系で監視する。モニター２５の出力をパソコン２６に取り込み、パソコン２６の画像演算結果をもとに駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１の送液を制御することができる。
【００２６】
モニター２５で第１のピペット１１の先端を監視しながら、駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１を動かし、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３を第１のピペット１１の先端から排出して、ピペット先端に液滴２１を形成する。このとき、液滴２１中に一つの細胞が挿入されたことをモニター２５を通してパソコン２６が認識し、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させる。
【００２７】
細胞１２の認識は、第１のピペット１１の先端部の液滴２１中に存在する細胞１２を直接検出することでも良いが、より効率的には、第１のピペット１１の内部を移動する細胞１２をモニター２５で監視し、パソコン２６で細胞のピペット内での位置と移動速度を計算し、第１のピペット１１の先端から液滴２１内に排出される時を予測してシリンジポンプ３１を制御してもよい。後者の認識方法を用いれば、たとえば短い間隔で複数の細胞がピペット１１内を移動している場合などに細胞を１個だけ液滴の中に入れる場合に有利となる。
【００２８】
ここで、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の細胞濃度が低いときは、細胞が第１のピペット１１の先端から出る直前に液滴２１を形成し始め、所定時間後に液滴形成を停止すれば、液滴２１の大きさを一定にすることができる。液滴を形成したくないときは、たとえばブロアーで第１のピペット１１の先端から出てくる液を吹き飛ばせばよい。あるいは、基板１の外にドレインを設け、そこに排出してもよい。
【００２９】
一方、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の細胞濃度が高いと、第１のピペット１１から排出される液量がまちまちとなる。すなわち、第１のピペット１１から排出される細胞１２の排出の頻度が上がるから、液を排出させる時間を所定の時間に固定していると、その時間内に次の細胞１２が液滴２１の中に入ってしまう可能性がある。このようなケースでは、第２のピペット２０を用いる。第２のピペット２０とこれに連結されたシリンジポンプ３５には、ＰＣＲ溶液が入れられている。すなわち、モニター２５を通して細胞１２が液滴２１に入るのをパソコン２６が確認したとき、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させるとともに、このときまでに液滴２１を形成するのに駆動されたシリンジポンプ３１の繰り出し量から、その時点の液滴２１の体積を割り出す。この体積と液滴２１の所望の体積との差をパソコン２６で計算する。この計算結果に応じて、その時点に出来ている液滴２１に第２のピペット２０で溶液を加えるように、パソコン２６から駆動装置３６に動作信号を送り、シリンジポンプ３５を駆動して、第２のピペット２０を用いて液滴２１の体積が所定の値になるまでＰＣＲ溶液を加える。
【００３０】
第２のピペット２０を用いて液滴２１にＰＣＲ溶液１３を加えるとき、第２のピペット２０に液滴中の細胞１２が逆流しないように、第２のピペット２０の先端は細胞が通らない大きさ、たとえば０．２μｍφとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有するものとするのが良い。
【００３１】
このようにして作成した細胞が１個含まれる液滴２１は、第１のピペット１１の上下動駆動装置３７により、ステージ１９の上に置かれた熱伝導性基板１に接触させられ、液滴２１は熱伝導性基板１上に移動する。細胞１２を含む液滴２１が熱伝導性基板１上の所定の位置に移動したことが確認されると、使用者は操作信号２８を与えて、ステージ駆動装置２７を動かし、次の液滴を置く位置にピペット先端が位置するように、熱伝導性基板１を移動させる。この移動は、熱伝導性基板１に対する液滴の配列の情報をパソコン２６に与えておけば、パソコン２６によって自動的に行うことができる。そして、この新しい位置で、上述のようにして第１のピペット１１の先端に新たな液滴を形成し、熱伝導性基板１上に移動させる。これを繰り返して、熱伝導性基板１の必要な部位に液滴を置く。
【００３２】
このようにして、図１（ｂ）で説明したように、熱伝導性基板１上に細胞１２およびＰＣＲ溶液１３よりなる液滴２１が熱伝導性基板１上に分配される。シリコン基板１上の壁２で囲われた領域内に細胞１２およびＰＣＲ溶液１３を包み込む形の液滴２１が配置されている。壁２で囲われた領域内全てにミネラルオイル３８が張られている。液滴２１は０．２から２μｌ程度なので、１０ｍｍの高さの壁２の内側に、ミネラルオイル３８を入れると、液滴２１は核酸増幅中の温度上昇による蒸発から保護される。
【００３３】
ここで、ミネラルオイルを使用する理由は、ミネラルオイル３８の比重が０．９程度と小さいので、液滴２１の安定度がよい点にある。これにより、核酸増幅中、常に液滴２１は安定して熱伝導性基板１上にとどまっている。ミネラルオイルは蒸発の防止が主体であるので、液滴２１がミネラルオイルに十分に埋まる程度が良く、たとえば深さ８ｍｍになるようにミネラルオイル３８を静かに流し込む。
【００３４】
次に、本発明の実施例によるリアルタイム核酸増幅について説明する。ＰＣＲは（１）ＤＮＡの１本鎖への変性（たとえば、９４℃）、（２）プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成（たとえば、６０℃）、という温度サイクルを何回も繰返すことにより核酸増幅を行うものである。この例では、まず、液滴２１の温度を９４℃に上げてＤＮＡの１本鎖への変性を行わせることになるが、最初の段階では、細胞１２が、この高温により破砕されて、内部の核酸が液滴内に分散し、鋳型としての核酸となる。次いで、液滴２１の温度を６０℃に下げて鋳型としての核酸にプライマーを結合させるとともに、ポリメラーゼにより鋳型としての核酸の相補鎖の合成を行う。この際、ＰＣＲ溶液が通常のＤＮＡ鎖の伸長を行うポリメラーゼである場合には、相補鎖の合成に併せて拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素が二本鎖に取り込まれる。一方、ＰＣＲ溶液が前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するものとされている場合には、レポーターフラグメント（プローブ）が二本鎖に取り込まれる。
【００３５】
図３は、液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う実施例を模式的示す斜視図である。この実施例では、熱源は所定の温度に維持されている十分に大きい熱量を保持している２つの熱源板４５および熱源板４６を熱伝導性基板１の下面に交互に実質的に接触させて液滴に熱を加える。この場合、液滴２１の温度が熱源板４５および熱源板４６の温度になるのみならず、ミネラルオイル３８も同時に熱源板４５および熱源板４６の温度になる。したがって、たとえば、９４℃に維持されている熱源板４５と、たとえば、６０℃に維持されている熱源板４６とを備えて、ＤＮＡの１本鎖への変性の期間は９４℃に維持されている熱源板４５を熱伝導性基板１の下面に接触させる。一方、プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成の期間は６０℃に維持されている熱源板４６を熱伝導性基板１の下面に接触させる。パソコン４８により所定のプログラムにより制御することにより、熱源板４５および熱源板４６を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させる。液滴２１およびミネラルオイル３８の熱量は熱源板４５および熱源板４６のそれぞれの熱量に比し、十分に小さいから、きわめて短い時間で熱伝導性基板１の上面に配列された液滴２１の温度は熱伝導性基板１の下面に接触した熱源板４５および熱源板４６のそれぞれの温度に到達する。熱源板４５および熱源板４６の素材としては、比熱の大きい銅（Ｃｕ）が実用的に有利である。
【００３６】
熱源板４５および熱源板４６は、使用者がパソコン４８の表示画面を見ながら与える操作入力信号５０に応じてパソコン４８が駆動装置４７に与える信号に応じて、熱伝導性基板１の下面に交互に接触させられる。これについては、後で図４を参照しながら、より詳細に説明する。
【００３７】
４９はＣＣＤ保持板であり、壁２の上端に載せた形で設けられる。ＣＣＤ保持板４９の下面には、壁２の領域内に配置される液滴２１と１対１に対応する位置に区分されたＣＣＤ素子が設けられる。ＣＣＤ素子５１11，５１12，---，５１17は壁２の領域内で、図の表示の最上段に配置されているＸ軸方向の液滴２１に対応するように設けられている。図が煩雑になるので参照符号の表示を適宜省略したが、ＣＣＤ素子５１21，５１22，---，５１27が図の表示の最上段の一つ手前の段に配置されているＸ軸方向の液滴２１に対応するように設けられている。以下、ＣＣＤ素子５１31，５１32，---，５１37、ＣＣＤ素子５１41，５１42，---，５１47ＣＣＤ素子５１51，５１52，---，５１57についても同様である。これらのＣＣＤ素子が検出する信号は、参照符号５６で代表して表示する連絡線５６を介してパソコン４８に伝送され、利用される。
【００３８】
また、蛍光観察のために、壁２の領域の両側に設けられた光源５７，５７’からの光を、それぞれ、バンドパスフィルタ５８，５８’によって励起光波長のみ透過させ、観察するときのみシャッター５９，５９’によって、励起光が、破線に示すように、液滴２１に照射される。シャッター５９，５９’は熱源板４５、熱源板４６の制御と同期してパソコン４８で制御される。図の左側のシャッター５９’には、図が煩雑になるので、パソコン４８からの制御用の信号の線の表示は省略した。
【００３９】
図４（ａ）−（ｃ）は、図３に示す実施例の下で、熱源板４５および熱源板４６を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させる手順を説明する概念図である。図４（ａ）は初期段階であり、液滴２１の配列された熱伝導性基板１から離れた位置に熱源板４５および熱源板４６が待機している状態を示す。この状態では、熱源板４５が熱伝導性基板１の下面から熱源板４６の厚さ相当の距離を隔てて熱伝導性基板１の下方（Ｚ軸方向）に配置され、熱源板４６が熱伝導性基板１の下面で左方向（Ｘ軸方向）に移動させられれば、熱伝導性基板１の下面に接触する位置で、熱伝導性基板１の右側にずらせて配置されている。なお、熱源板４５および熱源板４６はＹ軸方向では熱伝導性基板１と一致した位置に配置されるものとする。図４（ｂ）はＤＮＡの１本鎖への変性段階における熱源板４５および熱源板４６の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。たとえば、９４℃に保持されている熱源板４５は熱伝導性基板１の下面に実質的に接触する位置まで上方（Ｚ軸方向）に移動させられているが、熱源板４６は熱伝導性基板１から離れた当初位置に待機している。図４（ｃ）はプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階における熱源板４５および熱源板４６の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。熱源板４５は熱伝導性基板１から下方（Ｚ軸方向）に退避させられて当初位置に待機している。一方、たとえば、６０℃に保持されている熱源板４６は熱伝導性基板１の左方（Ｘ軸方向）に移動させられ、熱伝導性基板１の下面に実質的に接触させられている。このように、熱源板４５の上下動（Ｚ軸方向）、熱源板４６の左右動（Ｘ軸方向）が、図４（ｂ）および図４（ｃ）に示すように所定の時間間隔で繰り返されることにより、温度サイクルを何回も繰返すことができ、液滴２１内で核酸増幅を行うものである。
【００４０】
なお、熱源板の移動に代えて、熱伝導性基板１を左右動（Ｘ軸方向）させても良い。すなわち、熱源板４５および熱源板４６を熱伝導性基板１の下面位置で同じ位置（Ｚ軸方向）に並べて配置しておき、熱伝導性基板１を左右動（Ｘ軸方向）させることで温度サイクルを何回も繰返すことができ、液滴２１内で核酸増幅を行わせることができる。
【００４１】
ここで、熱源板４５および熱源板４６の保持している熱量を熱伝導性基板１上の液滴およびミネラルオイルのそれに比し、十分に大きくしておけば、液滴２１の核酸増幅を実行するための必要な温度サイクルを熱源板４５および熱源板４６の温度制御なしでも実行可能である。熱源板４５および熱源板４６の温度制御が必要なら、熱源板４５および熱源板４６内にヒーターと温度センサーを埋め込んでおき、温度センサーの信号をパソコン４８に取り込んで、ヒーターの温度制御をすることとすればよい。
【００４２】
図５は、図４で説明した温度サイクルによる液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。Ｔ1は熱源板４５によるＤＮＡの１本鎖への変性段階の期間であり、Ｔ2は熱源板４６によるプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の期間である。Ｔ3は温度サイクルの１周期である。ここでは、Ｔ1は１秒、Ｔ2は３秒、Ｔ3は４秒である。変性段階の１秒間の内、０．４秒ほどで変性段階に必要な９４℃に到達し、プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の３秒の内、最初の０．４秒ほどでプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階に必要な６０℃に到達することがわかる。
【００４３】
プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の３秒の内、９４℃から６０℃に移行する時間（０．４秒）の後の２秒では相補鎖の合成が進むから、この段階で、ＰＣＲ溶液が通常のＤＮＡ鎖の伸長を行うポリメラーゼである場合には、相補鎖の合成に併せて拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素が二本鎖に取り込まれる。一方、ＰＣＲ溶液が前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するものとされている場合には、レポーターフラグメント（プローブ）が二本鎖に取り込まれる。
【００４４】
光源５７，５７’からの光はバンドパスフィルタ５８，５８’によって励起光波長のみが透過させられ、蛍光観察するときのみシャッター５９，５９’によって励起光が液滴２１に照射される。シャッター５９，５９’は熱源板４５、熱源板４６の制御と同期してパソコン４８で制御される。この結果、液滴２１内のＰＣＲの進行速度に応じて、光源５７，５７’からの励起光によって、二本鎖に取り込まれたインターカレータ蛍光色素あるいはレポーターフラグメントによる蛍光が、ＣＣＤ保持板４９の下面に設けられたＣＣＤ素子で検出され、信号線５６を介してパソコン４８に送られる。
【００４５】
この励起光の照射およびＣＣＤによる検出のタイミングを図５に記入すると、プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の３秒の最後の１秒の前半部分のＴ4のタイミングが良い。この時点では、インターカレータ蛍光色素あるいはレポーターフラグメント（プローブ）の二本鎖への取り込みがほぼ完了している状態であり、１温度サイクルでのＰＣＲの結果を正しく検出できる。
【００４６】
図６は、液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う他の実施例を模式的示す斜視図である。図３の実施例と比べると、熱伝導性基板１の下面に２つの熱源板と液滴２１のＰＣＲの結果を検出するＣＣＤ素子がセットにして配置されるとともに、液滴２１に対して励起光を照射する光源５７、バンドパスフィルタ５８およびシャッター５９が壁２の領域の上部の中央に設けられている点において異なる。また、液滴２１のＰＣＲの結果を検出するＣＣＤ素子が熱伝導性基板１の下面に配置される結果、液滴２１の蛍光観察のための光源５７、バンドパスフィルタ５８およびシャッター５９を壁２の領域の直上に設けることが出来る。
【００４７】
６１1，６１2，６１3はそれぞれ温度が９４℃に維持されている熱源板であり、壁２の領域の熱量に比し、十分に大きな熱量を有する。６２1，６２2，６２3はそれぞれ温度が６０℃に維持されている熱源板であり、壁２の領域の熱量に比し、十分に大きな熱量を有する。熱源板６１1，６１2，６１3は図３に示す実施例の熱源板４５に対応する。熱源板６２1，６２2，６２3は図３に示す実施例の熱源板４６に対応する。６３1，６３2，６３3はそれぞれＣＣＤ保持板であり、上面に、壁２の領域内のＹ軸方向に配置される液滴２１の１列とそれぞれ１対１に対応する位置に、区分されたＣＣＤ素子が設けられる。図が煩雑になるので、参照符号は省略するが、例えば、ＣＣＤ保持板６３1には、図３に示す実施例のＣＣＤ素子５１11，５１21，５１31，５１41および５１51に対応するＣＣＤ素子が一体構造的に設けられる。図６のその他の参照符号で図３に示すものと同じものは、同一、または対応する機能を持つものである。
【００４８】
熱源板６１1，６１2，６１3および熱源板６２1，６２2，６２3は、使用者がパソコン４８の表示画面を見ながら与える操作入力信号５０に応じてパソコン４８が駆動装置４７に与える信号に応じて、熱伝導性基板１の下面に交互に接触させられる。さらに、ＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3に保持されているＣＣＤ素子が熱伝導性基板１の下面に接触させられる。これについては、図７を参照しながら、より詳細に説明する。なお、熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3はそれぞれ一体的に移動するようにリンクされている。
【００４９】
図７（ａ）−（ｄ）は、図６に示す実施例の下で、熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させるとともに、液滴２１内のＰＣＲの結果を検出する手順を説明する概念図である。
【００５０】
図７（ａ）は初期段階であり、液滴２１の配列された熱伝導性基板１から離れた位置に熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3が熱伝導性基板１の下面から適当な距離を隔てて待機している状態を示す。この状態では、熱源板６１1，６１2，６１3のそれぞれが熱伝導性基板１の上面の壁２の領域内に配列されている液滴２１のＹ軸方向のそれぞれの列に対応する位置となるようにされている。図７（ｂ）はＤＮＡの１本鎖への変性段階における熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。たとえば、９４℃に保持されている熱源板６１1，６１2，６１3は熱伝導性基板１の下面に実質的に接触する位置まで上方（Ｚ軸方向）に移動させられているが、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3は熱伝導性基板１から離れた待機位置に保持されている。図７（ｃ）はプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階における熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。熱源板６１1，６１2，６１3は熱伝導性基板１の左方（Ｘ軸方向）に移動させられるとともに熱伝導性基板１から下方（Ｚ軸方向）に退避させられている。同時に、たとえば、６０℃に保持されている熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3も熱伝導性基板１の左方（Ｘ軸方向）に移動させられるとともに、熱源板６２1，６２2，６２3は上方（Ｚ軸方向）に移動させられ、熱伝導性基板１の下面に実質的に接触させられている。図７（ｄ）は液滴２１のＰＣＲの結果を検出する段階における熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。熱源板６１1，６１2，６１3および熱源板６２1，６２2，６２3は、ともに、熱伝導性基板１の左方（Ｘ軸方向）に移動させられるとともに熱伝導性基板１から下方（Ｚ軸方向）に退避させられている。ＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3は熱伝導性基板１の下面に実質的に接触させられている。すなわち、液滴２１内のＰＣＲの進行速度に応じて、光源５７からの励起光によって、二本鎖に取り込まれたインターカレータ蛍光色素あるいはレポーターフラグメントによる蛍光が、ＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3の上面に設けられたＣＣＤ素子で検出され、信号線５６を介してパソコン４８に送られる。
【００５１】
図７（ｂ）−（ｄ）の操作を何回も繰返すことにより核酸増幅に必要な温度サイクルを実現できる。この例でも、熱源板６１1，６１2，６１3および熱源板６２1，６２2，６２3の保持している熱量を熱伝導性基板１上の液滴２１およびミネラルオイル３８のそれに比し、十分に大きくしておけば、液滴２１の核酸増幅を実行するための必要な温度サイクルを熱源板６１1，６１2，６１3および熱源板６２1，６２2，６２3の温度制御なしでも実行可能である。熱源板６１1，６１2，６１3および熱源板６２1，６２2，６２3の温度制御が必要なら、それぞれの熱源板内にヒーターと温度センサーを埋め込んでおき、温度センサーの信号をパソコン４８に取り込んで、ヒーターの温度制御をすることとすればよい。
【００５２】
図８は、図７で説明した温度サイクルによる液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。本質的に図５を参照して説明した温度変化のパターンと同じである。Ｔ1は熱源板６１1，６１2，６１3によるＤＮＡの１本鎖への変性段階の期間であり、Ｔ2は熱源板６２1，６２2，６２3によるプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の期間である。Ｔ3は温度サイクルの１周期である。ここでは、Ｔ1は１秒、Ｔ2は２秒＋α、Ｔ3は４秒である。変性段階の１秒間の内、０．４秒ほどで変性段階に必要な９４℃に到達し、プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の２秒＋α秒の内、最初の０．４秒ほどでプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階に必要な６０℃に到達することがわかる。図７で説明した温度サイクルでは、温度サイクルの１周期Ｔ3の後半部分のＴ4の期間で、熱源板６２1，６２2，６２3を退避させてＣＣＤ素子によるＰＣＲ計測を行う点において、図５で説明した温度サイクルと異なる。このＴ4の期間は、熱源板６２1，６２2，６２3が退避させられるので、液滴２１の温度がやや低下するが、実質的に影響を与えることはない。
【００５３】
図９は、液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う他の実施例を模式的示す斜視図である。この実施例では、前記２つの実施例が所定の温度に維持されている十分に大きい熱量を保持している２つの熱源板を熱伝導性基板１の下面に交互に実質的に接触させて液滴に熱を加えるものとされていたのに対して、液滴内の水に吸収の大きい１４８０ｎｍの波長の単色レーザー光線をスキャンしながら加えることとした点において大きく異なる。この場合、液滴２１の温度はレーザー光線のスキャンにより上昇するが、ミネラルオイル３８は、基本的にレーザー光を吸収しないので温度が上がらない。したがって、ミネラルオイル３８は、予め、プライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階の温度、例えば、６０度に制御、維持されているものとする。
【００５４】
図９において、６５1，６５2はガルバノミラーであり、単色光レーザー源６６の照射するレーザー光線をＸ−Ｙ平面でスキャンして、光学的に透明な熱伝導性基板１上の液滴２１に照射する。パソコン４８は、あらかじめ検討され入力されているレーザー光線のパワーと照射時間のデータに応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムによって単色光レーザー源６６への制御信号を制御して、レーザー光線を制御する。また、ガルバノミラー６５1，６５2も前記所定のプログラムに対応してパソコン４８により制御される。この実施例では、個々の液滴２１のそれぞれを個別にスキャンして制御することになるので、上述の２つの実施例のような熱原板の機械的な移動の制御は不要である。なお、図９において、図３と同じ参照符号を付したものは同一物または同等の機能を果たすものである。
【００５５】
図１０は、図９に示す実施例により制御した場合について、図５で説明した温度サイクルの１周期に着目した液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3およびＴ4は図５で説明したのと同じである。図１０と図５とを対比してみると明らかなように、図９に示す実施例では、液滴２１はＤＮＡの１本鎖への変性段階の期間Ｔ1の期間のみレーザー光線を照射されるが、連続照射ではなくスキャンによる（１／液滴の数）ごとの照射であるから、温度の上昇は段階的になる。点線で示すのは、この段階的温度の上昇を包絡線で示したものである。
【００５６】
図１１は、図９に示す実施例のガルバノミラー６５1，６５2をポリゴンミラー６７1，６７2に変更した例について、ポリゴンミラー６７1，６７2と単色光レーザー源６６の構成の例を示した模式図である。ここで、ポリゴンミラーは正８角形とした。ポリゴンミラー６７1はＺ軸を中心としてＸＹ平面を図に示す回転矢印の方向に回るものとした。ポリゴンミラー６７2はＹ軸を中心としてＸＺ平面を図に示す回転矢印の方向に回るものとした。それぞれのポリゴンミラーと回転速度を適当に設定すれば、壁２の領域内を繰り返しスキャンすることが出来る。ポリゴンミラーによれば、ガルバノミラーによるスキャンに比し、レーザー光線がミラー面に対して大きく移動するので、レーザー光線によるミラー面の損傷を低減できる。
【００５７】
図１２は、上述の実施例におけるＣＣＤ素子を液滴２１の下に配置した例について、熱伝導性基板１と液滴２１について示す断面図である。熱伝導性基板１の上面には、壁２の領域内にＣＣＤ保持板４９と、この保持板４９に支持されたＣＣＤ素子５１が設けられ、それぞれのＣＣＤ素子５１の上に液滴２１が配置されている。この例では、ＣＣＤ素子５１は、ミネラルオイル３８の中におかれることになるので、図示されていないが、ＣＣＤ保持板４９も含めてＣＣＤ素子５１全体を、例えば、ポリジメチルシロサキン（ＰＤＭＳ）による薄い層で全面を覆って、保護することが必要である。
【００５８】
図１３（ａ）−（ｃ）は、図３に示す実施例の下で、図４（ａ）−（ｃ）を参照して説明した、熱源板４５および熱源板４６を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させる手順と同じ手順による制御を説明する概念図である。図１３（ａ）−（ｃ）では、図４（ａ）−（ｃ）と異なり、熱源板４５が熱伝導性基板１の液滴２１に対応する位置に突起４５’を備えたものとしている点においてのみ図４（ａ）−（ｃ）と異なる。ここで、突起４５’は熱源板４５の熱を液滴２１に伝える目的のものであるから、熱伝導の良いものであることは当然である。熱源板４５と同じ材料で構成されても良い。
【００５９】
図１３（ａ）は初期段階であり、液滴２１の配列された熱伝導性基板１から離れた位置に熱源板４５および熱源板４６が待機している状態を示す。この状態では、熱源板４５が熱伝導性基板１の下面から熱源板４６の厚さ相当の距離を隔てて熱伝導性基板１の下方（Ｚ軸方向）に配置され、熱源板４６が熱伝導性基板１の下面で左方向（Ｘ軸方向）に移動させられれば、熱伝導性基板１の下面に接触する位置で、熱伝導性基板１の右側にずらせて配置されている。なお、熱源板４５および熱源板４６はＹ軸方向では熱伝導性基板１と一致した位置に配置されるものとする。ここで、熱源板４５の上面には、熱伝導性基板１上に配置されている液滴２１と１対１に対応する突起４５’が形成されている。図１３（ｂ）はＤＮＡの１本鎖への変性段階における熱源板４５および熱源板４６の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。たとえば、９４℃に保持されている熱源板４５は、突起４５’が熱伝導性基板１の下面に実質的に接触する位置まで上方（Ｚ軸方向）に移動させられているが、熱源板４６は熱伝導性基板１から離れた当初位置に待機している。図１３（ｃ）はプライマーの結合および耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成段階における熱源板４５および熱源板４６の熱伝導性基板１との位置関係を示す図である。熱源板４５は熱伝導性基板１から下方（Ｚ軸方向）に退避させられて当初位置に待機している。一方、たとえば、６０℃に保持されている熱源板４６は熱伝導性基板１の左方（Ｘ軸方向）に移動させられ、熱伝導性基板１の下面に実質的に接触させられている。このように、熱源板４５の上下動（Ｚ軸方向）、熱源板４６の左右動（Ｘ軸方向）が、図４（ｂ）および図４（ｃ）に示すように所定の時間間隔で繰り返されることにより、温度サイクルを何回も繰返すことができ、液滴２１内で核酸増幅を行うものである。
【００６０】
図１４は、熱源板４５と突起４５’との関係を説明する斜視図である。突起４５’は熱源板４５の上面に、熱伝導性基板１の液滴２１に１対１に対応する位置に設けられる。したがって、図１３（ｂ）に示すように、熱源板４５を熱伝導性基板１の下面に近づけると、突起４５’が、あたかも、液滴２１に直接接触したかのように、熱源板４５の９４℃の熱を液滴２１に伝える。その結果、ミネラルオイル３８への伝熱は、熱源板４５が熱伝導性基板１に全面で直接接触する場合と比べると、小さいものとなる。このことは、図１３（ｃ）に示すように、熱源板４６を熱伝導性基板１の下面に近づけて、相補鎖の合成段階の温度６０℃に移行させる場合に、ミネラルオイル３８の温度上昇が小さく抑えられていることを意味し、より短時間で、ミネラルオイル３８の温度を６０℃に回復できることを意味する。
【００６１】
図１３、図１４を参照して、熱源板４５に突起４５’を設けることの意味について説明した。一方、熱源板４６については、熱源板４５と同様に突起を設けることが構成としては可能であるが、必ずしも有効とはいえない。と言うのは、ミネラルオイル３８の温度は相補鎖の合成段階の温度６０℃に維持するのが熱サイクルとしては有利であるので、熱源板４６に突起を設けて液滴２１の温度を早く６０℃に移すと言うより、液滴２１とミネラルオイル３８を一緒に６０℃に移すほうがよいと言えるからである。
【００６２】
上述の実施例では、液滴の中の細胞の核酸を増幅するものであるが、細胞の核酸増幅に先行して、細胞を含む液滴内に細胞の培養液を入れて、細胞の培養をした後、培養された細胞の核酸増幅をすることにより、効果的に核酸増幅をすることができる。図１５（ａ）はこのような用途に好都合な、細胞培養中の液滴２１の中の培養液の交換に好適なピペットの例を示す斜視図、図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に示すピペットを使用して培養液の交換を行う状態を模式的に示す断面図である。７１はピペットであり、先端の開口部に細胞阻止片７２が取り付け部７３，７４により取り付けられている。ピペット７１の先端の開口部周辺と細胞阻止片７２の間には細胞が通過できない隙間が設けられている。図１５（ｂ）に示すように、ピペット７１とピペット２０とを液滴２１に挿入してピペット７１から液滴２１内の培養液を吸引しながらピペット２０により新しい培養液を注入すれば、液滴２１内の細胞を誤って吸引して失ってしまうことなく培養液が交換できる。図２に示す構成において、ピペット１１に代えてピペット７１を取り付けてシリンジポンプ３１で液滴２１内の培養液を吸引することにし、ピペット２０から培養液を供給することとすれば、図１５（ｂ）に示す構成での培養液の交換ができる。このような形で培養が進められた後、核酸増幅に移行することになるが、この段階で、液滴２１内の培養液を取り除きＰＣＲ用の溶液に置き換える必要がある。このときも、図１５（ａ）に示すピペットを使用して液の交換を行うことにすればよい。
【００６３】
なお、上述の実施例についてのマイナーな変形について簡単に言及すると以下のようである。
【００６４】
図３に示す実施例では、光源５７、バンドパスフィルタ５８およびシャッター５９をＣＣＤ保持板４９のＣＣＤ素子の周辺に配置することが可能である。また、図３に示す実施例では、液滴２１に対する励起光の強度は、壁２に近い両側の位置の液滴と、中心位置の液滴とでは異なる。このため、ＰＣＲの結果に応じて液滴が発する蛍光強度が異なる。したがって、あらかじめ両側の位置の液滴が発する蛍光強度と中心位置の液滴が発する蛍光強度とを比較して、中心位置の強度補正をするための係数を決定しておくのが良い。これを使用した補正はパソコン４８で、簡単に行うことが出来る。
【００６５】
図６の実施例では、図３に示す実施例と比較して、同じ大きさの熱伝導性基板１と比較して、処理できる液滴の数が少ない。したがって、スループットをあげるためには、図６に示す構成を複数個併設することが一つの解決策となる。
【００６６】
以上、本発明をある程度詳細に、その最も好ましい実施形態について説明したが、本発明は、その本質的特性から逸脱することなく多数の形態のものとして具体化できるものである。上記の好適な実施形態は専ら説明上のものであり制約的なものではない。また本発明の範囲は、発明の詳細な説明によってではなく、特許請求の範囲によって規定されるものであるから、特許請求の範囲の要件内のあらゆる変更、またはその要件に対する均等物は特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】（ａ）は、熱伝導性基板１と、液滴２１と、液滴２１を保持する領域を規定する壁２の関連を示す平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。
【図２】熱伝導性基板１上に核酸増幅の対象となる細胞１２を含む液滴２１を載置するシステム構成の例を説明する概念図である。
【図３】液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う実施例を模式的示す斜視図である。
【図４】（ａ）−（ｃ）は、図３に示す実施例の下で、熱源板４５および熱源板４６を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させる手順を説明する概念図である。
【図５】図４で説明した温度サイクルによる液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。
【図６】液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う他の実施例を模式的示す斜視図である。
【図７】（ａ）−（ｄ）は、図６に示す実施例の下で、熱源板６１1，６１2，６１3、熱源板６２1，６２2，６２3およびＣＣＤ保持板６３1，６３2，６３3を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させるとともに、液滴２１内のＰＣＲの結果を検出する手順を説明する概念図である。
【図８】図７で説明した温度サイクルによる液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。
【図９】液滴２１の温度制御（温度サイクル）を、熱伝導性基板１の下面から、熱伝導性基板１の上面に配列された全ての液滴２１に、熱源の熱エネルギーを作用させて行う他の実施例を模式的示す斜視図である。
【図１０】図９に示す実施例により制御した場合について、図５で説明した温度サイクルの１周期に着目した液滴２１の温度変化のパターンを示す図である。
【図１１】図９に示す実施例のガルバノミラー６５1，６５2をポリゴンミラー６７1，６７2に変更した例について、ポリゴンミラー６７1，６７2と単色光レーザー源６６の構成の例を示した模式図である。
【図１２】上述の実施例におけるＣＣＤ素子を液滴２１の下に配置した例について、熱伝導性基板１と液滴２１について示す断面図である
【図１３】（ａ）−（ｃ）は、図３に示す実施例の下で、図４（ａ）−（ｃ）を参照して説明した、熱源板４５および熱源板４６を交互に熱伝導性基板１の下面に接触させ、液滴２１の温度サイクルを完成させる手順と同じ手順による制御を説明する概念図である。
【図１４】熱源板４５と突起４５’との関係を説明する斜視図である。
【図１５】（ａ）は、細胞培養中の液滴２１の中の培養液の交換に好適なピペットの例を示す斜視図、（ｂ）は、図１５（ａ）に示すピペットを使用して培養液の交換を行う状態を模式的に示す断面図である。
【符号の説明】
【００６８】
１…熱伝導性基板、２…壁、５…位置決め用のマーカー、１２…細胞、１１，２０…ピペット、１３…細胞１２を含むＰＣＲ溶液、１６…光源、１７…集光レンズ、１８…コリメートレンズ、１９…ステージ、２１…液滴、２５…モニター、２６…パソコン、２７，３２，３６，３７…駆動装置、２８…操作入力信号、３０，３４…チューブ、３１，３５…シリンジポンプ、３８…ミネラルオイル、３９…駆動装置とピペットとの連係を示す線、４０…試験管、４５，４６…熱源板、突起４５’…熱源板４５の上面の突起、４７…駆動装置、４８…パソコン、４９…ＣＣＤ保持板、５０…操作入力信号、５１…ＣＣＤ素子、５６…連絡線、５７，５７’…光源、５８，５８’… バンドパスフィルタ、５９，５９’…シャッター、６１1，６１2，６１3…熱源板、６２1，６２2，６２3…熱源板、６３1，６３2，６３3…ＣＣＤ保持板、６５…ガルバノミラー、６６…単色光レーザー源、６７…ポリゴンミラー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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