(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞の細胞死を阻害する阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物につき、以下の（１）及び（２）：
（１）活性化時のミクログリアのグルタミナーゼを阻害する作用
（２）活性化時のミクログリアのギャップ結合を阻害する作用
を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価する、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記各作用は非活性化時のミクログリアにおけるグルタミン酸生産量を維持する範囲での阻害作用である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記活性化時のミクログリアとしてＬＰＳ又はＴＮＦ−αにより活性化したミクログリアを用いる、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
活性化ミクログリアによる炎症性神経疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物つき、活性化時のミクログリアにおいてグルタミナーゼを阻害する作用を指標として前記炎症性神経疾患の予防・治療効果を評価する、スクリーニング方法。
【請求項５】
前記作用は非活性化時のミクログリアにおけるグルタミン酸生産量を維持する範囲で活性化時のミクログリアにおいてグルタミナーゼを阻害する作用である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記活性化時のミクログリアとしてＬＰＳ又はＴＮＦ−αにより活性化したミクログリアを用いる、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記神経疾患は、脳炎後遺症、急性散在性脳脊髄炎、細菌性髄膜炎、結核性髄膜炎、真菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ワクチン性髄膜炎、多発性硬化症、エイズ脳症、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症から選択されるいずれかである、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記神経疾患は、多発性硬化症である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
活性化ミクログリアによる炎症性の神経疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物につき、活性化時のミクログリアのギャップ結合を阻害する作用を指標として前記炎症性神経疾患の予防・治療効果を評価する、スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記作用は非活性化時のミクログリアにおけるグルタミン酸生産量を維持する範囲で活性化時のミクログリアのギャップ結合を阻害する作用である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記活性化時のミクログリアとしてＬＰＳ又はＴＮＦ−αにより活性化したミクログリアを用いる、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記神経疾患は、脳炎後遺症、急性散在性脳脊髄炎、細菌性髄膜炎、結核性髄膜炎、真菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ワクチン性髄膜炎、多発性硬化症、エイズ脳症、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症から選択されるいずれかである、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記神経疾患は、多発性硬化症である、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタミン酸による神経細胞死を抑制又は回避できる細胞死阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、多発性硬化症などに代表される神経変性疾患の予防及び治療について種々の検討が行われてきている。これら神経変性疾患の病態には、活性化ミクログリア由来のグルタミン酸による興奮性神経障害機序も関与していることがわかってきている（Block et al., Prog. Nuerobiol. 76, 77-98 (2005)）。こうしたことから、グルタミン酸による神経細胞障害に着目して、グルタミン酸受容体阻害剤が神経変性疾患の治療剤として使用が試みられている（Parsons et al., Neuropharmacology. 38, 735-767 (1999)）。また、ミクログリアの活性化抑制を意図した阻害剤治療も検討されている（Demercq et al., Trends. Pharmacol. Sci. 25, 609-612 (2004)）。
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、グルタミン酸受容体阻害剤は、過剰な興奮毒性の抑制のみならず正常な生命活動に必須な神経伝導まで抑制してしまうことによる重篤な副作用が報告されている。また、活性化ミクログリアの阻害剤は、活性化ミクログリア全体を抑制するが、活性化ミクログリアは神経障害のみならず神経保護作用を有するものも存在するため、こうした抑制では治療効果に乏しいものとなるおそれがあった。
【０００４】
本発明者らは、グルタミン酸受容体や活性化ミクログリアをターゲットとする阻害剤では、その非特異性ゆえに意図する効果を得ることは困難であると考えた。さらに、神経障害的ミクログリアを特異的に抑制する薬剤又は過剰なグルタミン酸の産生・放出を抑制できる薬剤があれば、神経細胞死を抑制できると考えるに至った。ここで、現在までのところ、ミクログリアからのグルタミン酸の産生・放出の機序の詳細は明らかになっていない。グルタミン酸の産生や放出の阻害によって細胞死を抑制しようとする薬剤は知られていない。
【０００５】
そこで、本発明は、グルタミン酸による神経細胞死を抑制又は回避する薬剤や該薬剤のスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、神経障害的な活性化ミクログリア又はグルタミン酸の産生・放出を抑制する薬剤や該薬剤のスクリーニング方法を提供することを他の一つの目的とする。
【０００６】
本発明者らは、Ｎ-メチル-Ｄ-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（ＮＭＤＡ受容体）の阻害や活性化したミクログリア全体の阻害といった従来の着眼点ではなく、ミクログリアにおけるグルタミン酸産生・放出機序に着目し、ミクログリアのグルタミン酸放出量に関連する要因について種々の検討を行った。また、同時に、グルタミン酸放出と神経突起ビーズ状変性と神経細胞死との関連について種々の検討を行った。その結果、ミクログリアの産生及び／又は放出を阻害すること、すなわち、ミクログリアにおけるグルタミナーゼの阻害、ギャップ結合の阻害、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）等によるミクログリア活性化の阻害のいずれによっても、グルタミン酸の産生の抑制又はその放出量を低下させることができ、かつ有効に神経突起ビーズ状変性や神経細胞死を抑制することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明によれば、ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び／又は放出を阻害する阻害活性を有する化合物を含有する、神経細胞の細胞死阻害剤が提供される。
【０００８】
この細胞死阻害剤においては、前記化合物は、活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び／又は放出の阻害活性を有することが好ましい態様である。前記化合物は、グルタミナーゼ阻害剤とすることができ、例えば、(S)-2-アミノ-6-ジアゾ-5-オキソカプロン酸又はその塩とすることができる。
【０００９】
また、前記化合物は、ギャップ結合阻害剤とすることができ、例えば、カルベノキソロン２ナトリウムとすることができる。
【００１０】
さらに、前記化合物は、腫瘍壊死因子阻害剤又は腫瘍壊死因子受容体阻害剤とすることができる。具体的には、ＴＮＦ−α阻害剤又はＴＮＦＲ阻害剤であり、例えば、前記腫瘍壊死因子阻害剤は抗ＴＮＦ−α抗体又は可溶性ＴＮＦ−α受容体が挙げられ、また、腫瘍壊死因子受容体阻害剤としては、抗ＴＮＦＲ１受容体抗体やＴＮＦ−αアンタゴニストが挙げられる。
【００１１】
こうした化合物は、ミクログリアの非活性化時におけるグルタミン酸産生量を維持する範囲で活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び／又は放出を阻害する阻害活性を有することが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞死阻害剤は、グルタミン酸による興奮性神経障害による細胞死阻害剤とすることができる。また、本発明の細胞死阻害剤は、神経系疾患の予防・治療剤であることが好ましい態様であり、神経系疾患としては、虚血障害、炎症性神経疾患及び神経変性疾患から選択することができる。前記虚血障害としては、脳卒中、脳出血、脳梗塞及び脳血管性認知症が挙げられ、前記炎症性神経疾患としては、脳炎後遺症、急性散在性脳脊髄炎、細菌性髄膜炎、結核性髄膜炎、真菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎及びワクチン性髄膜炎が挙げられる。さらに、前記神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、多系統萎縮症及び多発性硬化症から選択することができる。
【００１３】
本発明によれば、神経細胞死に関連する疾患の予防・治療用組成物であって、上記いずれかに記載の細胞死阻害剤と、薬学的に許容される製剤成分と、を含有する組成物が提供される。
【００１４】
本発明によれば、神経細胞の細胞死阻害剤のスクリーニング方法であって、ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生・放出経路に対する被験化合物の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価する、スクリーニング方法が提供される。本スクリーニング方法は、神経系疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法とすることができる。
【００１５】
このスクリーニング方法において、前記作用は、活性化されたミクログリアに対する前記被験化合物のグルタミン酸の産生又は放出の阻害作用とすることが好ましい。前記作用は、前記被験化合物のグルタミナーゼ阻害作用、ミクログリアに対する前記被験化合物のギャップ機能阻害作用、ミクログリアに対する前記被験化合物のミクログリア活性化の阻害作用とすることができる。これらのうちいずれかの阻害作用を有していればよいが、好ましくは、グルタミナーゼ阻害作用であり、また、ギャップ結合阻害作用である。このスクリーニング方法は、グルタミンの存在下、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給する工程と、前記ミクログリアに関して前記指標を取得する工程と、前記指標が前記被験化合物の非供給時に比較して前記神経細胞死阻害活性を肯定できる程度に有意に変化したとき、前記被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定する工程と、を備えることができる。
【００１６】
また、このスクリーニング方法は、さらに、活性化されたミクログリア又はその培養上清と被験化合物との存在下の神経細胞における以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）神経突起ビーズ状変性 
（ｂ）細胞死
（ｃ）細胞内ＡＴＰ濃度
（ｄ）ミトコンドリア損傷
から選択される１種又は２種以上に対する被験化合物の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルタミン酸産生・放出経路とその阻害方法の概要を示す図である。
【図２】各種のサイトカイン等により活性化されたミクログリア培養上清とともに培養した神経細胞の神経突起ビーズ状変性陽性神経細胞数（%）を示すグラフである。ただし、白いバーは、サイトカインを神経細胞へ直接刺激した群（直接刺激群）を示し、黒いバーは、サイトカインで活性化したミクログリア培養上清を神経細胞へ投与した群（間接刺激群）を示す（*, p < 0.05対コントロール、**, p < 0.01対コントロール、†, p < 0.01対リポ多糖（ＬＰＳ）又はＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。以下、図３において同じ。）。
【図３】各種のサイトカイン等により活性化されたミクログリア培養上清とともに培養した神経細胞の死細胞数（％）を示す図である。
【図４】位相差顕微鏡像を示す図であり、ａは無刺激ミクログリア、ｂはＬＰＳ刺激ミクログリア、ｃはＴＮＦ−α刺激ミクログリア、ｄは無刺激ミクログリア培養上清を投与された神経細胞、ｅはＬＰＳ刺激ミクログリア培養上清を投与された神経細胞、ｆはＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清を投与された神経細胞を示す（スケールバーは１０μｍである。）。
【図５】各種のサイトカイン等により活性化されたミクログリアの培養上清とともに培養した神経細胞培地中のグルタミン酸濃度の測定結果を示すグラフである。ただし、白いバーは、サイトカインを神経細胞へ直接刺激した群（直接刺激群）を示し、黒いバーは、サイトカイン刺激したミクログリア培養上清を神経細胞へ投与した群（間接刺激群）を示す（*, p < 0.05対コントロール、**, p < 0.01対コントロール、†, p < 0.01対リポ多糖（ＬＰＳ）又はＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。以下、図６及び７について同じ。）。
【図６】各種のサイトカイン等により活性化されたミクログリアの培養上清とともに培養した神経細胞の細胞内ATP濃度の測定結果を示すグラフである。
【図７】各種のサイトカイン等により活性化されたミクログリアの培養上清とともに培養した神経細胞のMTSアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】活性化されたミクログリア培養上清と各種抗体とともに培養した神経細胞培地中のグルタミン酸濃度の測定結果を示すグラフである（*, p < 0.05対コントロール、**, p < 0.01対コントロール、†, p < 0.0５対リポ多糖（ＬＰＳ）又はＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。以下、図９及び図１０において同じ）。
【図９】活性化されたミクログリア培養上清と各種抗体とともに培養した神経細胞の神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１０】活性化されたミクログリア培養上清と各種抗体とともに培養した神経細胞の死細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１１】活性化されたミクログリアの培養上清と各種薬剤とともに培養された神経細胞培地中のグルタミン酸濃度測定結果を示すグラフである（*, p < 0.05対コントロール、†, p < 0.0５対リポ多糖（ＬＰＳ）又はＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。以下図１２及び図１３において同じ。）。
【図１２】活性化されたミクログリアの培養上清と各種薬剤とともに培養された神経細胞の神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１３】活性化されたミクログリアの培養上清と各種薬剤とともに培養された神経細胞の死細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１４】活性化ミクログリアにおけるギャップ結合の主要構成因子であるコネキシン−３２（Ｃｘ３２）の細胞表面発現のフローサイトメーターによる解析結果を示す図である。
【図１５】虚血による遅発性神経細胞死に対するギャップ結合阻害剤であるカルベノキソロン（ＣＢＸ）及びグルタミナーゼ阻害剤である６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）の効果を示す図である。Ａ〜Ｈは、スナネズミ海馬ＣＡ１領域の顕微鏡画像（スケールバー：１００μｍ）を示す。Ａは正常群、ＢはＰＢＳ投与虚血群、ＣはＣＢＸ０．２ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＣＢＸ１／１００）、ＤはＣＢＸ２ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＣＢＸ１／１０）、ＥはＣＢＸ２０ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＣＢＸ１）、ＦはＤＯＮ０．０１６ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＤＯＮ１／１００）、ＧはＤＯＮ０．１６ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＤＯＮ１／１０）、ＨはＤＯＮ１．６ｍｇ／体重ｋｇ投与虚血群（ＤＯＮ１）をそれぞれ示す。
【図１６】図１５のＡ〜Ｈのスナネズミ海馬ＣＡ１領域１００μｍ当たりの残存ニューロン数を比較したグラフ図である。*, p < 0.001対PBS投与群、†, p < 0.001。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、3個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。
【図１７】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対するカルベノキソロン（ＣＢＸ）および６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）の効果を示す図である。Ａは、ＣＢＸ投与群のＥＡＥ臨床スコア経過を示すグラフ図であり、Ｂは、ＤＯＮ投与群のＥＡＥ臨床スコア経過を示すグラフ図である。
【図１８】図１７のＡ及びＢに示すＥＡＥ臨床スコア経過から得られる各投与群の発症日を示すグラフ図である。
【図１９】図１７のＡ及びＢに示すＥＡＥ臨床スコア経過から得られる各投与群の重症日（臨床スコアが４以上）の日数を示すグラフ図である。
【図２０】図１７のＡ及びＢに示すＥＡＥ臨床スコア経過から得られる各投与群の最重症スコアを示すグラフ図である。*, p < 0.05対PBS投与群。これらのデータは、一元配置分散解析及びTukey-Kramerポストホックテストによって解析された。各バーは、5個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。
【発明を実施するための最良の実施形態】
【００１８】
本発明は、ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び／又は放出を阻害する阻害活性を有する化合物を含有する、神経細胞の細胞死阻害剤に関している。本発明者らは、ＴＮＦ−αによって活性化されたミクログリアの培養上清による死細胞数の増大等は、同様に活性化されたミクログリアからのグルタミン酸放出量の増大、神経細胞のミトコンドリア障害の増大に関連付けられること、ＴＮＦ中和抗体やＴＮＦ受容体中和抗体によりミクログリアのグルタミン酸放出量及び神経細胞の死細胞数等が抑制されること並びに培地中におけるグルタミン欠乏、グルタミナーゼ阻害剤及びギャップ結合阻害剤により活性化ミクログリアのグルタミン酸放出量及び細胞死数等が抑制されるという知見を得ている。さらに、ＴＮＦ−α等によって活性化されたミクログリアにおいてはギャップ結合が多く発現されるとともに遊走性が増大し細胞間接着が希薄化されることでギャップ結合の露出が増大するという知見も得ている。
【００１９】
こうした知見によれば、図１に示すような活性化されたミクログリアによるグルタミン酸産生・放出のスキーム及びこのスキームの阻害方法を想定することができる。すなわち、ＴＮＦ−αやＬＰＳによってミクログリア内のグルタミナーゼが活性化され、それによってミクログリア外のグルタミンを基質としてグルタミン酸が産生され、このグルタミン酸は、ギャップ結合を介してミクログリア外へと放出される、グルタミン酸産生・放出経路が誘導され、こうして放出されたグルタミン酸は、神経細胞のＮＭＤＡ受容体に結合して神経細胞内のミトコンドリア阻害によるＡＴＰ枯渇を介して神経細胞死を誘導するものと推論される。また、ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−αの放出を促進するように作用することも推定できる。
【００２０】
本発明者らによれば、こうしたグルタミン酸産生・放出経路を阻害することにより、活性化ミクログリアにおける過剰なグルタミン酸産生・放出を選択的に阻害できることがわかっている。こうした選択的な阻害によれば、定常的なグルタミン酸産生を阻害しないため、正常なグルタミン酸作用を妨げることなく細胞死を抑制できることが期待できる。
【００２１】
以下、本発明の実施形態である、神経細胞の細胞死阻害剤、その用途及び細胞死阻害剤のスクリーニング方法について説明する。
【００２２】
（神経細胞の細胞死阻害剤）
本発明の細胞死阻害剤は、ミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び／又は放出を阻害する阻害活性を有する化合物（以下、単にグルタミン酸放出阻害剤という。）を含有している。
【００２３】
本発明における「神経細胞死」には、ネクローシスとアポトーシスの双方を含んでいる。ネクローシスとは、虚血などのように病的状態で一団の細胞に生じる死を意味しており、様々な外的要因により細胞の崩壊及び自己融解が挙げられる。また、アポトーシスとは、動物の健常組織における細胞のターンオーバーや種々の臓器の発生段階において不要な細胞を除去する際など、様々な原因により細胞が自発的に自分自身を殺す機構を活性化して死んでいく状態を意味している。
【００２４】
本発明におけるグルタミン酸放出阻害剤としては、好ましくは活性化されたミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び／又は放出を阻害できるものであることが好ましく、こうした態様の化合物としては、少なくとも、グルタミナーゼ阻害剤、ギャップ結合阻害剤及びミクログリア活性化阻害剤が挙げられる。これらのグルタミン酸放出阻害剤によれば、ミクログリアの非活性化時におけるグルタミン酸産生量を維持する範囲で活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び／又は放出を阻害することができる。本発明の細胞死阻害剤は、こうした各種のグルタミン酸放出阻害剤を１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。
【００２５】
（１）グルタミナーゼ阻害剤
グルタミナーゼ阻害剤は、グルタミンからグルタミン酸を生成する酵素であるグルタミナーゼを阻害する化合物であればよい。阻害態様は特に限定されない。グルタミナーゼ阻害剤としては、特に限定されないで公知のグルタミナーゼ阻害剤を使用できる。例えば、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン ((S)-2-アミノ-6-ジアゾ-5-オキソカプロン酸又はその塩(DON))や特開平７−１８８１８１号等に記載のある種のイミダゾール誘導体が挙げられる。グルタミナーゼ阻害剤は、活性化されたミクログリアにおける過剰なグルタミン酸の産生を抑制できることから本発明のグルタミン酸放出阻害剤として好ましい。
【００２６】
（２）ギャップ結合阻害剤
ギャップ結合阻害剤は、ギャップ結合のチャンネルの小孔を介した低分子化合物などの移動・交換など細胞間連絡を阻害する化合物であればよい。ギャップ結合阻害剤としては、公知のギャップ結合阻害剤を利用できる。例えば、オレアミド、アラキドンアミドなどの各種の脂肪酸第１級アミド化合物、ある種のオレアミドアゴニスト（例えば、特表２００１−５２３６９５号）、カルベノキソロン又はカルベノキソロン２ナトリウムなどの塩、１８α−グリチルリチン酸又はその塩、１２−Ｏ−テトラデカノイルフォボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）、オクタノール、リンダンが挙げられる。また、４３ＧＡＰ２７ペプチド（ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ）、４０ＧＡＰ２７ペプチド（ＳＲＰＴＥＫＮＶＦＩＶ）などのコネキシン４０、４３のアゴニスト、特表２００５−５０９６２１号に記載のある種のｃＡＭＰ及び／又はｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、特開２００４−２１７５９４号に記載のある種のグリコサミノグリカンなども挙げられる。ギャップ結合阻害剤は、活性化されたミクログリアにおける過剰なグルタミン酸の産生時におけるグルタミン酸放出を抑制できることから本発明のグルタミン酸放出阻害剤として好ましい。
【００２７】
（３）ミクログリア活性化阻害剤
ミクログリア活性化阻害剤としては、ミクログリアによるグルタミン酸産生・放出を活性化するサイトカインによる刺激伝達を抑制する化合物が好ましい。例えば、ＴＮＦ−αの阻害剤又はこの受容体におけるＴＮＦ−αの結合を阻害する受容体阻害剤が挙げられる。こうした阻害剤としては、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−α１型レセプター（ＴＮＦＲ１）をターゲットとしてＴＮＦ−αとレセプターとの結合を阻害する化合物が挙げられる。具体的には、抗ＴＮＦ−α抗体、可溶性のＴＮＦＲ１受容体、抗ＴＮＦＲ１抗体、ＷＰ９ＱＹなどのＴＮＦ−αアンタゴニスト、など各種の公知の化合物が挙げられる。なお、これらの阻害剤は、ＴＮＦ−αによるミクログリア活性化のみならずＬＰＳによる活性化も阻害することができる。
【００２８】
また、ＬＰＳ阻害剤であるＬＰＳ受容体であるToll-Like-Receptor４（TLR4）の拮抗阻害剤（E5531、E5564）やＴＬＲ４中和抗体を用いることもできる。
【００２９】
こうした各種グルタミン酸放出阻害剤は、その化合物の酸性基や塩基性基の形態により、必要に応じ各種の塩の形態とすることができる。こうした塩の形態は、医薬分野等において通常用いられる塩酸や塩基を用いて構成することができる。
【００３０】
本発明の細胞死阻害剤は、グルタミン酸産生放出阻害剤を含むことから、グルタミン酸による興奮性神経障害による細胞死阻害剤として用いることが好ましい。また、こうした興奮性神経障害による神経細胞死が関連するヒト及び家畜やペットなどの非ヒト動物の神経系疾患の予防・治療剤として用いることが好ましい。神経系疾患としては、例えば、虚血障害、炎症性神経疾患及び神経変性疾患等が挙げられる。
【００３１】
虚血傷害としては、例えば、脳卒中、脳出血、脳梗塞及び脳血管性認知症が挙げられる。炎症性神経疾患としては、例えば、脳炎後遺症、急性散在性脳脊髄炎、細菌性髄膜炎、結核性髄膜炎、真菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、ワクチン性髄膜炎等の中枢神経系炎症性神経疾患が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、頭部外傷、脳性麻痺、ハンチントン病、ピック病、ダウン症、パーキンソン病、エイズ脳症、多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症等が挙げられる。
【００３２】
本発明の細胞死阻害剤をヒト及び非ヒト動物の神経細胞死が関連する上記のような神経系疾患の予防・治療剤として用いる場合には、それ自体あるいは適宜の薬学的に許容される、賦形剤、希釈剤等などの製剤成分と混合し、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等の組成物（製剤）とすることができる。すなわち、本発明の神経細胞死の阻害剤を有効成分とする神経系疾患の予防・治療用組成物が提供される。本組成物は、得ようとする製剤形態に応じて、有効成分のほか薬学的に許容される製剤成分を含有することができる。本発明の予防・治療用組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００３３】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤：及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；脂肪酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００３４】
その使用量は、症状、年齢等により異なり、適宜決定される。たとえば、経口投与の場合には、１回当り１日下限０．１ｍｇ（好ましくは、１ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好ましくは、５００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１回当り１日下限０．０１ｍｇ（好ましくは、０．１ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好ましくは、２００ｍｇ）を成人に対して、１日当り１または数回に分けて、症状に応じて投与することができる。
【００３５】
（スクリーニング方法） 
本発明の神経細胞の細胞死阻害剤のスクリーニング方法は、ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生・放出経路に対する被験化合物の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価するものである。既に説明したように、神経細胞の細胞死は、グルタミン酸放出阻害剤により有効に阻害できることがわかっている。本発明のスクリーニング方法によれば、グルタミン酸放出阻害剤の意図する各種作用を指標として、結果として細胞死阻害剤としての効果を評価することができる。
【００３６】
細胞死阻害剤としての効果の指標となる作用としては、活性化されたミクログリアに対する前記被験化合物のグルタミン酸の産生又は放出の阻害作用が挙げられ、具体的には、被験化合物のグルタミナーゼ阻害作用、ミクログリアに対する被験化合物のギャップ機能阻害作用、ミクログリアに対する被験化合物のミクログリア活性化の阻害作用が挙げられる。
【００３７】
グルタミナーゼ阻害作用は、例えば、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給したときミクログリアの培養上清に放出されるグルタミン酸濃度を測定することによって取得することができる。培養上清のグルタミン酸濃度は、公知のグルタミン酸の比色法やセンサ等にて測定することができる。被験化合物は、特に限定されないが公知のグルタミナーゼ阻害剤の類似体などを用いることができる。
【００３８】
ギャップ機能阻害作用は、例えば、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給したとき、培養上清のグルタミン酸濃度を測定したり、あるいはミクログリアにおけるギャップ結合の構成タンパク質であるコネキシン量をフローサイトメーターによって測定することにより取得できる。被験化合物は特に限定されないが、公知のギャップ結合阻害剤の類似体を用いることができる。
【００３９】
ミクログリアの活性化阻害作用は、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給したときのミクログリアの形態観察（ミクログリアの活性化程度の観察）や、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給したときの培養上清のグルタミン酸濃度を測定することにより取得できる。被験化合物は特に限定されないが、公知のＴＮＦ−αアンタゴニスト、抗ＴＮＦ−α抗体、可溶性ＴＮＦ受容体などの類似体を用いることができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法を実施するには、培地中にグルタミンの存在下、活性化されたミクログリアに被験化合物を供給し、ミクログリアに関して上記したいずれかあるいは２種類以上の指標を取得する。そして、取得した指標が被験化合物の非供給時に比較して神経細胞死阻害活性を肯定できる程度に有意に変化したとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定すればよい。例えば、ミクログリア培養上清のグルタミン酸濃度の有意な低下及び形態観察によるミクログリアの活性化程度の有意な低下が得られたとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定することができる。
【００４１】
また、本発明のスクリーニング方法においては、ミクログリアに関する指標のほか、ミクログリアを介して得られる神経細胞に関する被験化合物の作用を指標としてもよい。すなわち、活性化され被験化合物が供給されたミクログリアの培養上清の存在下における神経細胞又はこうしたミクログリアと共培養した神経細胞における神経細胞死に対する被験化合物の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価することができる。すなわち、得られた指標が被験化合物の非供給時に比較して神経細胞死阻害活性を肯定できる程度に有意に変化したとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定できる。
【００４２】
神経細胞における細胞死阻害剤としての効果の指標としては、神経突起ビーズ状変性、細胞死、細胞内ＡＴＰ濃度及びミトコンドリア損傷などの神経細胞傷害が挙げられる。指標としてはこれらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
【００４３】
神経突起ビーズ状変性は、活性化されたミクログリアによって引き起こされる細胞死の初期の徴候であり、N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（NMDA受容体）によって媒介される（H. Takeuchi et al., J.
Biol. Chem. Vol. 280, No.11, pp.10444-10454, 2005）。したがって、神経細胞死の好適な指標となりうる。具体的には、神経細胞を顕微鏡又は位相差顕微鏡下において観察して、神経突起ビーズ状変性を示す陽性細胞数又は全細胞数に対する比率を求めればよい。例えば、被験化合物によって活性化されたミクログリアにより神経突起ビーズ状変性細胞が有意な増加を示すとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定できる。
【００４４】
また、細胞死は、従来公知の方法によって測定することができる。例えば、顕微鏡下における観察やさらに各種の染色法、例えば、ヨウ化プロピディウムなどを用いて死細胞を染色する方法、ＩＮＳＴ(in situ nick translation)法、ＴＵＮＥＬ（terminal
deoxynucleotidyltransferase -mediated UTP end labeling）法などを適宜用いることができる。例えば、被験化合物によって活性化されたミクログリアにより神経細胞の死細胞数が有意な増加を示すとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定できる。
【００４５】
神経細胞内のＡＴＰ濃度は、例えば、AposSENSOR Cell Viability Assay Kit（Bio
Vision社製）などによる光学的方法など従来公知の方法によって測定することができる。また、ミトコンドリア損傷は、ミトコンドリアの膜電位に比例した呈色を示すMitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes社製)を用いた染色法や3-（4,5-dimetylthiazol-2-yl）-5-(3-carboxymethoxylphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)を用いた染色法
などを用いることができる。例えば、被験化合物によって活性化されたミクログリアにより神経細胞内のＡＴＰ濃度の有意な低下やミトコンドリア損傷レベルの有意な増加を示すとき、被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定できる。
【００４６】
こうした本発明のスクリーニング方法は、神経細胞の細胞死阻害剤をスクリーニングするが、特に神経系疾患の予防・治療剤をスクリーニングするのに好ましい方法であり、上記した各種神経系疾患の予防・治療剤、特に、神経傷害的なミクログリアに選択性が高い神経系疾患の予防・治療剤をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４８】
（実施例１：サイトカインによるミクログリアの活性化を介した神経突起ビーズ状変性及び神経細胞死の誘導）
本実施例では、各種サイトカインを投与したミクログリアの培養上清を神経細胞に投与したときの神経細胞における神経突起ビーズ状変性及び神経細胞死を観察した。実験方法は以下の通りであった。【００４９】
(１)ミクログリアの調製
マウス初代培養ミクログリアは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス新生仔大脳から作成した初代混合グリア細胞より培養１４日目以降に振盪法によって分離した（Suzumura, A.et al. MHC antigen expression on bulk isolated
macrophage-microglia from newborn mouse brain: induction of Ia antigen
expression by gamma-interferon. J. Neuroimmunol.15, 263-278 (1987)）【００５０】
（２）神経細胞の調製 
また、マウス大脳皮質初代神経細胞は、C57BL/6マウス第17日胎仔大脳皮質より作成し、ポリエチレンイミン（poly-ethyleneimine, PEI）コートのカバーガラス上で培養後１０日から１３日において使用した（Takeuchi, H. et al. Neuritic beading induced by activated microglia
is an early feature of neuronal dysfunction toward neuronal death by inhibition
of mitochondrial respiration and axonal transport. J. Biol. Chem. 280,
10444-10454 (2005)）。【００５１】
（３）各種サイトカインによるミクログリアの活性化
各種サイトカイン等（ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）を、ミクログリアの培養液（約５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、神経細胞培地（住友ベークライト株式会社製）に対して、それぞれ、ＬＰＳは１μｇ／ｍｌ、その他のサイトカインは１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で２４時間インキュベートした。なお、対照としてサイトカインを添加しない以外は同様にしてミクログリアを培養した。【００５２】
（４）神経細胞への刺激伝達
（ａ）活性化されたミクログリアの培養上清の神経細胞への投与（間接刺激群）
活性化したミクログリアの培養上清の５００μｌを２４穴プレート中の神経細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に投与した。また、活性化していないミクログリアの培養上清も同様に神経細胞に投与して間接刺激群のコントロールとした。さらに、神経細胞の一部には、ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストであるＭＫ８０１を最終濃度が１０μＭとなるように添加した。こうして調製した神経細胞を湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で培養した。【００５３】
（ｂ）サイトカインの神経細胞への投与（直接刺激群）
上記各種サイトカインＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）をそれぞれ、ＬＰＳは１μｇ／ｍｌ、その他のサイトカインは１００ｎｇ／ｍｌ含有する神経細胞培地５００μｌを、２４穴プレート中の神経細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に投与した。また、培地５００μｌのみを同様に神経細胞に投与して直接刺激群のコントロールとした。こうして調製した神経細胞を湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で培養した。【００５４】
（５）神経突起ビーズ状変性陽性細胞数と死細胞数の評価
得られた各種の神経細胞を２４時間培養後、各ウェル中の神経細胞について神経突起ビーズ状変性陽性細胞数と死細胞数とを計測した。神経突起ビーズ状変性陽性細胞数は、位相差顕微鏡を用いて、全神経細胞中における神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の比率を計測した。なお、それぞれの培養上清が投与された２つの神経細胞ウェルについての計測を３回反復して行った。また、死細胞数は、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を用いる色素排除法を利用し、培養後に２ｍｇ／ｍｌＰＩ含有培地で１５分間３７℃で培養して死細胞に特徴的な蛍光を蛍光顕微鏡にて検出し、死細胞数を計測した。また、死細胞数は、the terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UTP end labeling
(TUNEL) 染色でも評価した。【００５５】
神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数の計測にあたっては、同一の培養上清が投与された２つの神経細胞ウェルについて３回反復して行った。なお、死細胞率は、全細胞数に対する死細胞数の比率である。神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の測定結果を図２に示し、細胞死数を図３に示す。また、神経細胞に投与した時点の各種ミクログリアと細胞死数等の計測した時点での神経細胞との位相差顕微鏡像を図４に示す。【００５６】
（６）結果
図２に示すように、ＬＰＳとＴＮＦ−αにより活性化ミクログリアが投与された神経細胞（間接投与群）はほぼ１００％の神経突起ビーズ状変性陽性細胞比率（％）を示し、コントロールに対して有意（ｐ＜０．０１）に低下した。また、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＭＫ８０１の併存下では変性は著しく抑制されていた。これに対し、他のサイトカインの間接投与群及び全ての直接投与群は、コントロールとほぼ同程度の陽性率であった。また、図３に示すように、神経細胞死率についても神経突起ビーズ状変性陽性細胞率と同様の傾向が認められた（ｐ＜０．０１対コントロール）。【００５７】
図４に示すように、ＬＰＳ及びＴＮＦ−α（図４（ｂ）及び（ｃ））が添加されたミクログリアは無刺激のミクログリア（図４（ａ））に比較して、より大きなアメーバ状の形態をとり、遊走性も活発で、極めて活性化された状態であった。また、ＬＰＳ及びＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清が投与された神経細胞（図４（ｅ）及び（ｆ））は、無刺激ミクログリア培養上清が投与された神経細胞（図４（ｄ））に比較して多数のビーズが観察された。なお、TUNEL陽性細胞は観察されず、アポトーシスによる細胞死ではないことが確認された。【００５８】
以上のことから、各種サイトカインのうちLPSまたはＴＮＦ−αにより、直接的でなくミクログリアの活性化を介した間接的刺激によって、神経突起ビーズ状変性neuritic beadingおよび神経細胞死が生じることがわかった。また、こうした現象がＭＫ８０１によって阻害されることから、ＮＭＤＡ受容体を介したグルタミン酸刺激によるものであることがわかった。【００５９】
（実施例２：各種サイトカインの活性化を介したグルタミン酸放出量の増加、神経細胞内ＡＴＰ濃度の増加、ミトコンドリア損傷の増加の誘導）
本実施例では、各種サイトカインを投与したミクログリアのグルタミン酸放出量、培養上清を神経細胞に投与したときの神経細胞における細胞内ＡＴＰ濃度、ミトコンドリア損傷を計測した。実験方法は、ミクログリアの調製、神経細胞の調製、ミクログリアの活性化及び神経細胞への刺激伝達（ＭＫ８０１を使用しない点を除いては）は、実施例１と同様にして行い、評価のみ以下の方法で行った。【００６０】
（１）グルタミン酸濃度の測定
得られた各種の神経細胞を２４時間培養後、活性化されたミクログリアから放出されて各ウェル中の培地に存在するグルタミン酸濃度を測定した。グルタミン酸の定量は、グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社製）を用い、そのプロトコールに従い、マルチプレートリーダーにおいて６００ｎｍの吸光度を測定することにより行った。なお、測定は６回反復して行った。結果を図５に示す。【００６１】
（２）神経細胞内ＡＴＰ濃度の測定
得られた各種の神経細胞を２４時間培養後、各ウェル中の神経細胞内のＡＴＰの定量は、ApoSENSOR細胞活性測定キット(BioVisions社製)を用い、そのプロトコールに従って、発色法によって行った。ＡＴＰ濃度は、コントロールに対する％で表示した。結果を図６に示す。【００６２】
（３）ミトコンドリア損傷の測定
得られた各種の神経細胞を２４時間培養後、各ウェル中の神経細胞内のミトコンドリアの損傷程度の定量は、CellTiter96 Aqueous one solution assay (Promega社製)を用い、プロトコールに従って、ＭＴＳ法を実施し、マルチプレートリーダーにおいて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。なお、測定は６回反復して行った。結果を図７に示す。【００６３】
（４）結果
図５に示すように、ＬＰＳ又はＴＮＦ−αにより活性化されたミクログリアの培養上清を含む神経細胞ウェルでのみグルタミン酸が有意に（ｐ＜０．０１対ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞）高濃度であった。これは、活性化ミクログリア培養上清に含まれていたグルタミン酸濃度を反映しているものと考えられた。すなわち、ＬＰＳ等によって活性化されたミクログリアによるグルタミン酸産生及び放出が促進された結果、培養上清中のグルタミン酸濃度が上昇し、該グルタミン酸濃度が神経細胞培養液に反映されたと考えられた。また、図６に示すように、神経細胞の細胞内ＡＴＰ濃度は、ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリアの培養上清が投与された神経細胞ウェルにおいてのみ有意に（ｐ＜０．０１対ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞）低かった。さらに、図７に示すように、ミトコンドリアの損傷程度は、ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリアの培養上清が投与された神経細胞ウェルにおいてのみ有意に（ｐ＜０．０１対ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞）低かった。【００６４】
以上のように、本実施例では、ＬＰＳ又はＴＮＦ−αによるミクログリアによるグルタミン酸放出量の増加、細胞内ＡＴＰ濃度およびＭＴＳレベルの減少が誘導されることがわかった。また、実施例１と実施例２との結果から、ＬＰＳ又はＴＮＦ−αによるミクログリアを介した間接的刺激、すなわち、活性化されたミクログリアが放出するグルタミン酸によって、神経細胞死又はそれに関連する各種シグナルが誘導されることがわかった。【００６５】
（実施例３：ＴＮＦ−α中和抗体、ＴＮＦ−α1型受容体中和抗体によるグルタミン酸放出の阻害）
本実施例では、ＴＮＦ−α中和抗体、ＴＮＦ−α1型受容体中和抗体の存在下、活性化されたミクログリア培養上清が投与されたときの神経細胞における神経突起ビーズ状変性及び神経細胞死を観察した。実験方法は、ミクログリアの調製、神経細胞の調製については実施例１と同様にして行い、ミクログリアの活性化、神経細胞への刺激伝達及び評価は以下の通りとした。【００６６】
（１）ＬＰＳ又はＴＮＦ−αによるミクログリアの活性化
ＬＰＳ又はＴＮＦ−αを、ミクログリアの培養液（約５×１０４ｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、神経細胞培地（住友ベークライト株式会社製）に対して、ＬＰＳは１μｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αは１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で２４時間インキュベートした。【００６７】
（２）神経細胞への刺激伝達
活性化したミクログリアの培養上清の５００μｌを２４穴プレート中の神経細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に投与した。また、活性化したミクログリアの培養上清の５００μｌ（ＴＮＦ−αについては１００μｇ／ｍｌ投与群のみ）と以下の表に示す中和抗体を表記載の最終濃度となるように２４穴プレート中の神経細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に投与した。なお、活性化していないミクログリアの培養上清も同様に神経細胞に投与してコントロールとした。こうして調製した神経細胞を湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で培養した。【００６８】
【表１】
0005211321.tif 000002
【００６９】
（３）評価
調製した各種の神経細胞を２４時間培養後、各ウェル中の神経細胞についてグルタミン酸濃度、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数を計測した。グルタミン酸の定量は実施例２と同様に行い、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数の計測は実施例１と同様に行った。グルタミン酸についての結果を図８に示し、神経突起ビーズ状変性についての結果を図９に示し、細胞死についての結果を図１０に示す。【００７０】
（４）結果
図８に示すように、ＴＮＦ−α中和抗体及びＴＮＦ−α１型受容体中和抗体が活性化ミクログリアとともに神経細胞培地中に存在する場合にはグルタミン酸が他の神経細胞培地よりも有意に（ｐ＜０．０５対ＬＰＳ又はＴＮＦ−α活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞）少なかった。これは、ミクログリア培養上清に含まれていたグルタミン酸濃度を反映しているものと考えられた。すなわち、中和抗体の存在下でＴＮＦ−αによるミクログリアの活性化が抑制された結果、ミクログリアによるグルタミン酸産生が抑制され培養上清中のグルタミン酸濃度が低下し、該グルタミン酸濃度が神経細胞培養液に反映されたと考えられた。図９及び図１０に示すように、グルタミン酸量についてと同様に、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数についても有意な抑制作用が確認された（ｐ＜０．０５対ＬＰＳ又はＴＮＦ−α刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞）。【００７１】
以上のことから、活性化されたミクログリアからのグルタミン酸放出は、ＴＮＦ−α中和抗体もしくはＴＮＦ−α1型受容体中和抗体により阻害されるとともに、神経突起ビーズ状変性や細胞死も阻害されることがわかった。【００７２】
（実施例４：培地からのグルタミン除去、グルタミナーゼ阻害剤及びギャップ結合阻害剤によるＴＮＦ−αに誘導されたグルタミン酸産生の阻害）
本実施例では、活性化されたミクログリアと種々の薬剤とを神経細胞に投与したときのミクログリアからのグルタミン酸放出を測定し、神経突起ビーズ状変性及び細胞死を観察した。実験方法は、ミクログリアの調製、神経細胞の調製については、実施例１と同様に行い、他は以下のとおりであった。【００７３】
（１）ミクログリアの活性化には、ミクログリアの培養液（約５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、神経細胞培地（住友ベークライト株式会社製））に対して、最終濃度で１μｇ／ｍｌＬＰＳ又は１００ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αを用い、湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で２４時間インキュベートして行った。なお、対照としてサイトカインを添加しない以外は同様にしてミクログリアを培養した。【００７４】
（２）神経細胞への刺激伝達
刺激後２４時間培養後のミクログリア培養上清５００μｌを以下の表に示す各種薬剤（最終濃度で記載）とともに２４穴ウェルプレートに準備した神経細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に投与した。また、活性化ミクログリア培養上清を含むがグルタミンを培地中に含有しない神経細胞（Ｇｌｎ−ｆｒｅｅ）も用意した。さらに、ＴＮＦ−αで活性化したミクログリア培養上清単独が投与された神経細胞及び活性化していないミクログリアの培養上清が投与された神経細胞を、それぞれＴＮＦ及びコントロールとした。これらの神経細胞を湿度１００％かつ５％ＣＯ２下３７℃で培養した。【００７５】
【表２】
0005211321.tif 000003
【００７６】
（３）評価
２４時間培養後、培地中のグルタミン酸濃度を測定し、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数、死細胞数を計測した。測定方法等は、実施例１及び実施例２に記載の方法を用いた。グルタミン酸濃度の測定結果を図１１に示し、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を図１２に示し、死細胞数の計測結果を図１３に示す。【００７７】
（４）結果
図１１に示すように、活性化されたグリア細胞培養上清とともにギャップ結合阻害剤（ＣＢＸ）及びグルタミナーゼ阻害剤（ＤＯＮ）が投与されて培養された神経細胞及びグルタミン不含の培地で培養された神経細胞のグルタミン酸濃度は、コントロールと同程度であって薬剤が添加されていない神経細胞（ＴＮＦ）よりも有意に（ｐ＜０．０５）少なかった。グルタミナーゼ阻害剤及びギャップ結合阻害剤については、これらの存在下ではミクログリアによるグルタミン酸産生やその放出が抑制されグルタミン酸濃度が低下し、該グルタミン酸濃度が神経細胞培養液に反映されたと考えられた。また、図１２及び図１３に示すように、グルタミン酸量についてと同様に、神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数についても有意な（ｐ＜０．０５）抑制作用が確認された。【００７８】
以上のことから、培地からのグルタミン除去、グルタミナーゼ阻害剤及びギャップ結合阻害剤は、定常レベルの細胞内グルタミン酸産生を阻害することなく、ＴＮＦ−αに誘導された余剰分のグルタミン酸産生のみを完全に阻害することがわかった。【００７９】
（実施例５：ギャップ結合の発現解析）
本実施例では、ミクログリアをＴＮＦ−α又はＬＰＳで活性化したときのギャップ結合の主要構成因子であるコネキシン−３２（Ｃｘ３２）の細胞表面発現のフローサイトメーターによる解析を行った。ミクログリアの調製は実施例１と同様に行い、ミクログリア活性化は実施例４と同様に行った。Ｃｘ３２の検出は、抗マウスＣｘ３２抗体（Chemicon社製）を用いた。結果を図１４に示す。【００８０】
図１４に示すように、ＬＰＳ又はＴＮＦ−αによってミクログリアの細胞表面へのギャップ結合の発現が増大することがわかった。【００８１】
（実施例６）
本実施例では、虚血による遅発性神経細胞死モデルを構築してギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の神経細胞死に対する効果を評価した。なお、以下の実験は、名古屋大学動物実験委員会の承認を得て施行された。なお、本実施例における動物モデルは、神経疾患の一種である虚血障害のモデルに相当する。【００８２】
今井らの文献（Imai F, Sawada M, Suzuki H,
Zlokovic BV, Kojima J, Kuno S, Nagatsu T, Nitatori T, Uchiyama Y, Kanno T.,
Exogenous microglia enter the brain and migrate into ischaemic hippocampal
lesions. Neuroscience Letter. 272(2):127-130. 1999）に基づいて、１０〜１２週齢の雄のスナネズミ（体重約７０ｇ）をハロセン吸入麻酔下かつ直腸温３７℃維持下に、総頸動脈を動脈瘤用クリップにて５分間阻血した。【００８３】
ギャップ結合阻害剤のカルベノキソロン（ＣＢＸ）の投与は、以下の３群で行った。すなわち、投与量は２０ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１）、２ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１／１０）及び０．２ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１／１００）とし、投与方法は阻血当日から隔日腹腔内投与とした。また、グルタミナーゼ阻害剤６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌノルロイシン（ＤＯＮ）の投与は、以下の３群で行った。すなわち、投与量は１．６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１）、０．１６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１／１０）及び０．０１６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１／１００）とし、投与方法は阻血当日から隔日腹腔内投与とした。なお、コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同様に投与した。【００８４】
阻血７日後に、スナネズミを麻酔下に４％パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、大脳を取り出し、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテック社製）へ包埋後に液体窒素にて凍結した。クリオスタットにて凍結切片を作成し（８μｍ厚）、スライドグラスへ貼付後にＨＥ染色を行った。各投与群における顕微鏡像を図１５に示す。また、薬剤効果の判定については、顕微鏡下で海馬ＣＡ１領域の１００μｍ当たりの残存ニューロン数をカウントした。各投与群についてのカウント結果を図１６に示す。【００８５】
図１５に示すように、虚血による遅発性神経細胞死モデルにおいては、ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の投与によって遅発性の神経細胞死が抑制されることが明らかであった。また、図１６に示すように、スナネズミ海馬ＣＡＩ領域の単位面積当たりの残存ニューロン数は、ＣＢＸ及びＤＯＮの全ての投与群においてコントロールに対して有意に（ｐ＜０．００１）神経細胞死を抑制していることが明らかであった。また、それぞれの薬剤について濃度依存的に神経細胞死抑制効果が認められた。【００８６】
以上のことから、ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤はいずれも神経細胞死、特に中枢神経系の神経細胞死を抑制できることがわかった。また、本発明の神経細胞死阻害剤は、脳出血や脳梗塞などの虚血障害や脳血管性認知症などの虚血障害の後遺症の予防・治療に有効であることがわかった。【００８７】
（実施例７）
本実施例では、ミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導性の実験的自己免疫性能脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを構築し、ＥＡＥ臨床経過におけるギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の効果を評価した。なお、以下の実験は、名古屋大学動物実験委員会の承認を得て施行された。なお、本実施例の動物モデルは、神経疾患の一種である炎症性神経疾患のモデルに相当する。【００８８】
実験動物としては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ社）を用いた。また、試薬としては、ＭＯＧ３５−５５ぺプチド（オペロン社製）、不完全フロインドアジュバント（シグマ社）、結核菌死菌Ｈ３７Ｒａ（ディフコ社）、百日咳毒素（リスト社）、ギャップ結合阻害剤カルベノキソロン（ＣＢＸ）（シグマ社）、グルタミナーゼ阻害剤６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシン（ＤＯＮ）（シグマ社）を用いた。【００８９】
ＭＯＧ誘導性のＥＡＥは、加藤らの文献(Kato,H.,Ito,A.,Kawanokuchi,J.,Jin,S.,Mizuno,T.,Ojika,K.,Ueda,R.,Suzumura
A.,Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) ameliorates
experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing the functions of
antigen presenting cells. Multiple Sclerosis. 10, 651-659. 2004)に基づき、以下のように作製した。まず、２００μｇのＭＯＧ３５−５５  ペプチドを１００μｌの生理食塩水へ溶解した。また、３００μｇの結核菌死菌Ｈ３７Ｒａを１００μｌの不完全フロインドアジュバントへ懸濁した。次いで、両者を混合して角が立つまで泡立てることでエマルジョン化させた後、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背尾部に数カ所に分けて皮下注射した（２００μｌ／マウス）。さらに、２００ｎｇの百日咳毒素を初日、２日目に腹腔内注射した。【００９０】
ギャップ結合阻害剤のカルベノキソロン（ＣＢＸ）の投与は、以下の３群で行った。すなわち、投与量は２０ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１）、２ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１／１０）及び０．２ｍｇ／体重ｋｇ（ＣＢＸ１／１００）とし、投与方法は免疫初日から隔日腹腔内投与とした。また、グルタミナーゼ阻害剤６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌノルロイシン（ＤＯＮ）の投与は、以下の３群で行った。すなわち、投与量は１．６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１）、０．１６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１／１０）及び０．０１６ｍｇ／体重ｋｇ（ＤＯＮ１／１００）とし、投与方法は免疫初日から隔日腹腔内投与とした。なお、コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同様に投与した。コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同様に投与した。【００９１】
マウスは、国際的に使用されている以下のEAE臨床評価スコアに基づいて毎日評価した。各投与群のＥＡＥ臨床経過を図１７に示し、発症、重症病日数及び最重症スコアについてまとめた結果を図１８〜図２０に示す。
ＥＡＥ臨床評価スコア
０：正常
１：尾の引きずり又は軽い後肢の脱力
２：中程度の後肢の脱力又は中程度の運動失調
３：中程度から重症の後肢の脱力
４：重症の後肢の脱力、中程度の前肢の脱力又は中程度の運動失調
５：中程度の前肢の脱力を伴う対麻痺
６：重症の前肢の脱力、重症の運動失調を伴う対麻痺又は瀕死【００９２】
図１７に示すように、ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の投与によってＥＡＥ臨床評価スコアが抑制されることがわかった。また、図１８に示すように、図１７に示す臨床経過によれば、ＥＡＥの発症日（臨床評価スコアが１以上となるとき）は、投与群ＣＢＸ１／１０及び投与群ＤＯＮ１において、有意に（ｐ＜０．０５）発症日が遅延することがわかった。また、図１９に示すように、ＥＡＥ臨床評価スコアが４以上の重症病日が投与群ＣＢＸ１／１０及び投与群ＤＯＮ１において有意に（ｐ＜０．０５）減少していることがわかった。さらにまた、図２０に示すように、最重症スコアが投与群において低下していることがわかった。以上の結果から、ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤はいずれも神経細胞死、特に中枢神経系の神経細胞死を抑制できることがわかった。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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