(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるペプチドを含む肝機能障害抑制剤。
【請求項２】
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるペプチドを含む抗酸化剤。
【請求項３】
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるペプチドを医薬品、食品、又は化粧品に添加する工程を含む医薬品、食品、又は化粧品の酸化防止方法。
【請求項４】
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるペプチドを０．００１〜１重量％含む食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なアンギオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」と称することもある。）阻害ペプチド、ＡＣＥ阻害剤、血圧降下剤、肝機能障害抑制剤、抗酸化剤、酸化防止方法、及び食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は高脂血症、糖尿病、肥満とともに動脈硬化を起こしやすい現代成人病のひとつである。高血圧症と診断される人口は、日本でも２０００万人以上と推定され、その予備軍も相当数に上るといわれている。高血圧症を放置しておくと脳卒中や心疾患を引き起こし死をも招く。このように重大な生活習慣病であるにもかかわらず、無症状であるため自覚しにくくサイレントキラーとも呼ばれている。
【０００３】
高血圧症を引き起こすメカニズムはいくつか知られているが、レニン−アンギオテンシン系もそのうちのひとつである。レニン−アンギオテンシン系は血圧や体内の水分量と電解質のバランスを調節している重要な因子である。腎臓から分泌されたレニンは、肝臓で生合成されたアンギオテンシノーゲンに作用してアンギオテンシンIを生成する。次に、アンギオテンシンIはＡＣＥの作用により血圧上昇効果を持つアンギオテンシンIIに変換される。従って、このアンギオテンシンIを作らせないか、ＡＣＥの活性を阻害すれば、アンギオテンシンIIの生成を抑制し血圧の降下が可能となる。
【０００４】
従来から、この高血圧症を改善するために多くの研究機関で降圧剤や血圧調節機能を有する食品成分の研究開発が進められている。天然物由来のＡＣＥ阻害剤としては、大豆タンパク、魚類タンパクなどから得られたペプチドが多く知られている。しかし、天然物由来の大豆タンパクや魚類タンパクからなるＡＣＥ阻害剤は有効ペプチド以外の原料由来成分を多く含むために、経口摂取時の効果が不足していたり、風味が悪く食品として適していない。また、原料由来の不純物を除去しようとすると限外ろ過や吸着除去など、製造工程が煩雑になってしまう。よって、特別な精製工程を要することなく、天然物から高活性のＡＣＥ阻害ペプチドを製造する方法が求められている。
【０００５】
ここで、特許文献１には酒粕を原料とした新規なＡＣＥ阻害剤が開示されている。また特許文献２には米タンパクのタンパク質分解酵素分解物として酒粕を用いたＡＣＥ阻害用経口摂取物が開示されている。しかし、これらの酵素分解物は夾雑物を多く含むペプチド混合物であり、そのＡＣＥ阻害活性は実用的に満足できるものではない。
【特許文献１】特許第３０５４４６２号
【特許文献２】特許第３４１４７６１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、有用な生理活性を有する新規ペプチドを提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドが、ＡＣＥ阻害活性、血圧降下活性、肝機能障害抑制活性、抗酸化活性のような有用な生理活性を併せ持つことを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のペプチド、ＡＣＥ阻害剤、血圧降下剤、肝機能障害抑制剤、抗酸化剤、酸化防止方法、及び食品組成物を提供する。
項１．  Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるペプチド。
項２．  項１に記載のペプチドを含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
項３．  項１に記載のペプチドを含む血圧降下剤。
項４．  項１に記載のペプチドを含む肝機能障害抑制剤。
項５．  項１に記載のペプチドを含む抗酸化剤。
項６．  項１に記載のペプチドを医薬品、食品、又は化粧品に添加する工程を含む医薬品、食品、又は化粧品の酸化防止方法。
項７．  項１に記載のペプチドを０．００１〜１重量％含む食品組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により多様な生理活性を有する新規ペプチドが提供された。このペプチドは、酒粕、米焼酎粕、加熱米、又は糠を酵素処理することにより得ることができる。このように、本発明のペプチドは米由来であるため、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。よって、本発明のペプチドは副作用や過剰摂取を気にすることなく安心して長期間服用できる。また、本発明のペプチドは、清酒製造の副産物である粕や、産業廃棄物となる糠などから製造できる点でも有用である。
本発明のトリペプチドは、ＡＣＥ阻害活性を有することから、血圧降下剤の有効成分として高血圧の予防又は治療に好適に使用できる。
【０００９】
また、本発明のペプチドは、肝機能障害から肝細胞を保護するため、アルコール性肝障害、ウィルス性肝障害、薬物性肝障害、自己免疫低下による肝障害などのあらゆる肝機能障害の抑制剤の有効成分として有用である。具体的には、慢性又は急性肝炎、肝硬変、肝臓癌などのあらゆる肝臓疾患の予防、緩和、又は治療剤の有効成分として有用である。
また、本発明のペプチドは、脂質などの物質の酸化防止や活性酸素の除去などの酸化抑制活性を有することから酸化防止剤の有効成分として好適である。活性酸素の発生はあらゆる疾患の一因となり、また疾患を助長することから本発明のペプチドは各種の医薬品や機能性食品の有効成分として好適に使用できる。さらに、本発明のペプチドは、食品由来の安全なペプチドであることから、医薬品、食品、化粧品などに添加してそれらの酸化を防止する目的でも好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ペプチド
本発明のペプチドは、Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなる新規トリペプチドである。
このペプチドは、化学合成することができる。また、前述したように、酒粕、米焼酎粕、加熱米、又は糠を酵素処理することによっても得ることができる。具体的には、酒粕、米焼酎粕、加熱米、又は糠の原料にセルラーゼを作用させ、次いで、得られる混合物から液体画分を除去し、残る固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させることにより生成させることができる。これらの原料は、夾雑物である糖質が少なくタンパク質が多く含まれるために、好適に使用できる。セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％とすればよい。反応温度は約４０〜６０℃、反応時間は約２〜２０時間、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約３．５〜６とすればよい。
また、セルラーゼに加えて、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどのアミラーゼを使用することができる。アミラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％とすればよい。反応温度は約５０〜６０℃、反応時間は約５〜２０時間、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約５〜６とすればよい。
【００１１】
次いで、糖質分解酵素で処理した処理混合物から圧搾、ろ過、遠心分離などで液体分を除去することにより、米由来のタンパク質を多く含む固形分が得られる。
次いで、この固形分にプロテアーゼ（中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼ）を作用させればよい。プロテアーゼの使用量は、中性プロテアーゼも酸性プロテアーゼも、それぞれ糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜０．８重量％とすればよい。反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約４０〜６０℃、反応時間は約５〜２０時間とすればよい。酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃、反応時間は約５〜２０時間とすればよい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で、約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出されたペプチドのさらなる分解による目的トリペプチドの収率低下が回避され、目的トリペプチドの純度の低下が防止される。反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９とすればよく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５とすればよい。
さらに、この混合物から、各種クロマトグラフィーによりＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏを単離すればよい。
【００１２】
（ＩＩ）ＡＣＥ阻害剤・血圧降下剤・肝機能障害抑制剤・抗酸化剤
本発明のペプチドの用途
本発明のＡＣＥ阻害剤は、上記説明した本発明のペプチドを有効成分として含む。また、このペプチドはＡＣＥ阻害を介して血圧降下させるため、本発明の血圧降下剤は、本発明のペプチドを有効成分として含む。ＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤は医薬品などとして使用できる。
本発明の肝機能障害抑制剤は、上記説明した本発明のペプチドを有効成分として含む。肝機能障害の種類は特に限定されず、アルコール性肝障害、ウィルス性肝障害、薬物性肝障害、自己免疫の低下による肝障害などのあらゆる肝機能障害を対象とすることができる。肝機能の障害は、例えば血中のアスパラギン酸アミノ基転移酵素、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、総ビリルビン、乳酸脱水素酵素の増加、または総蛋白質およびアルブミン量、コリンエステラーゼ活性の変化を指標に知ることができる。本発明のペプチドは、肝機能障害を抑制することから、慢性又は急性肝炎、肝硬変、肝臓癌などのあらゆる肝臓疾患の予防、軽減、又は治療剤の有効成分とすることができる。肝機能障害抑制剤は、医薬品などとして使用できる。
【００１３】
本発明の抗酸化剤は、脂質などの生体成分の酸化抑制活性や、活性酸素を除去する活性を有することから抗酸化剤として好適である。生体成分の酸化、及びそれによる活性酸素の発生はあらゆる疾患の元となったり、疾患を助長したりするため、抗酸化剤は医薬品として使用できる。また、医薬品や化粧品の酸化防止のための抗酸化剤としても使用できる。
【００１４】
医薬品製剤
本発明のペプチドを上記用途の医薬品の有効成分として使用する場合、本発明のペプチドは、そのまま又はジペプチドやアミノ酸にまで分解されて容易に吸収されることから、これらの医薬品は各種の経口投与形態を有する製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。
固形製剤は、有効成分である本発明のペプチドに、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、本発明のペプチドを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
【００１５】
ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤中の本発明のペプチドの含有量は、乾燥重量に換算して、剤全体に対して、約０．０１〜２０重量％が好ましく、約０．１〜１０重量％がより好ましく、約１〜５重量％がさらにより好ましい。
肝機能障害抑制剤中の本発明のペプチドの含有量は、乾燥重量に換算して、剤全体に対して、約０．０１〜２０重量％が好ましく、約０．１〜１０重量％がより好ましく、約１〜５重量％がさらにより好ましい。
抗酸化剤中の本発明のペプチドの含有量は、乾燥重量に換算して、剤全体に対して、約０．０１〜２０重量％が好ましく、約０．１〜１０重量％がより好ましく、約１〜５重量％がさらにより好ましい。
【００１６】
医薬品製剤の使用方法
本発明のＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤の１日使用量は、対象者の症状、体重などによっても異なるが、有効成分であるペプチドの乾燥重量に換算した１日使用量が約０．１〜１ｍｇになるようにすればよい。
本発明のＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、正常高値（収縮期血圧１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧８５〜８９ｍｍＨｇ）、軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇ、拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）のヒトが好適な対象となる。また、これに相当する血圧を示す哺乳動物も好適な対象となる。
【００１７】
本発明の肝機能障害抑制剤の１日使用量は、対象者の症状、体重などによっても異なるが、有効成分であるペプチドの乾燥重量に換算した１日使用量が約０．１〜１ｍｇになるようにすればよい。
本発明の肝機能障害抑制剤は、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝臓癌などの肝臓疾患に罹患している人や、アルコール依存症の人、薬物依存症の人、肝炎ウィルス陽性の人など肝臓疾患になる可能性の高い人も好適な対象となる。
本発明の抗酸化剤の１日使用量は、対象者の症状、体重などによっても異なるが、有効成分であるペプチドの乾燥重量に換算した１日使用量が約０．１〜１ｍｇになるようにすればよい。
本発明の抗酸化剤は、あらゆる疾患の治療剤の補助剤として使用できることから、どのような疾患の人も対象とすることができる。また、未病状態の人の発症予防にも有効であるため、これらの人も好適な対象となる。
【００１８】
（ＩＩＩ）酸化防止方法
さらに、本発明のペプチドは、医薬品、化粧品、食品などに添加することにより、それらの成分の酸化を防止することができる。即ち、本発明は、上記説明した本発明のペプチドを医薬品、化粧品、又は食品に添加する、医薬品、化粧品、又は食品の防止方法も提供する。
ペプチドの使用量は、対象物の組成によって異なるが、乾燥重量に換算して、対象物全体に対して、約０．１〜１０重量％が好ましく、約０．５〜５重量％がより好ましい。
【００１９】
（ＩＶ）食品組成物
本発明の食品組成物は、本発明のペプチドを、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して約０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％、さらにより好ましくは０．０１〜０．０５重量％含む食品組成物である。この食品組成物は、健康食品（サプリメント）として用いるのに適している。また、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）に好適である。この食品組成物は、本発明のペプチドを上記範囲で含むことにより、無理なく摂取できる食品量中に、十分な血圧降下作用、十分な肝機能障害抑制作用、十分な酸化抑制作用を示すペプチドが含まれることになる。
本発明の食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に調製することができる。中でも、ペプチド粉末の劣化を防止できる点で、カプセル剤が好ましい。
【００２０】
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
また、本発明の食品組成物は、汁物（味噌汁、吸い物、コーンスープ、ポテトスープ、コンソメスープ、たまごスープ、野菜スープ、カレー、シチュー）、飲料（スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲料、茶飲料等）、菓子類（クッキー等の焼き菓子、ゼリー、ガム、グミ、飴、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等）を含むものであってもよい。中でも、毎日の食生活で無理なく摂取できる点で汁物食品が好ましく、その中でも食習慣が確立している味噌汁が好ましい。
本発明の食品組成物の摂取量は、摂取者の健康状態、体重などによって異なるが、1日あたりの摂取量が、本発明のペプチドの乾燥重量に換算して、約０．１〜１ｍｇとなる量とすればよい。本発明のペプチドは、米由来であるため、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。
【００２１】
実施例
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）酒粕分解ペプチド混合物の製造
酒粕６０ｋｇ（湿重量、固形分５８．４％）に水１２０Ｌを添加し十分に攪拌した。この混合物を５０℃に保温した状態でセルラーゼ（セルロイシンＴ２；エイチビィアイ社製）３０ｇとβ−アミラーゼ（ビオザイムＭ；天野エンザイム社製）３０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）、ＯＮＳ自動圧濾圧搾機500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、タンパク高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、固形分５６．８％）を得た。
【００２２】
次いで、得られたタンパク高含有酒粕４１．９ｋｇに水１８０Ｌを加え、ＫＯＨでｐＨ６．８に調製し、よく攪拌した。５０℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ（バチルス属細菌由来、プロテアーゼＮアマノＧ；天野エンザイム社製）２１０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。さらに、ＨＣｌでｐＨ４．２に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス属菌由来、スミチームＡＰ；新日本化学工業社製）２５０ｇを添加して６０℃で２２時間さらに分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）、ＯＮＳ自動圧濾圧搾機500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合液２００Ｌを得た。
得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター（日本ビュッヒ株式会社製  RE121  Rotavapor：湯浴温度50℃、100rpm）とアスピレーター（ヤマト科学製  Neocool  Aspirator BP-51：冷却温度5℃）を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機（EYELA 東京理化器械株式会社製  FDU-2100）を用いてマイナス８０℃、真空度０．４Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
【００２３】
（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏの単離
上記のペプチド混合物から、以下のようにして、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により本発明のペプチドを単離した。酒粕ペプチド100mgを1mlの超純水に溶解し、超純水で平衡化したProtein KW-802.5（Shodex製）によるゲル濾過クロマトグラフィーで分離を行った。流速は１．０ｍｌ／分とし、移動相には超純水を使用し、280nmにおける吸光度を測定した。溶出画分をフラクションに分け、凍結乾燥した。各フラクションの凍結乾燥標品を0.1mlの純水に溶かし、後述する方法でACE阻害活性を測定し、ゲル濾過クロマトグラフィーで強いACE阻害活性及び高い収量が認められた画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品を1mlの純水に溶解し、フィルター（0.45μm）を用いて濾過した後、ＵＫ−Ｃ18（Imtakt製、カラムサイズ4.6×75mm）を用いて、逆相での高速液体クロマトグラフィー (Waters製)で精製を行った。流速は1.0 ｍｌ／分とし、移動相には0.1％ギ酸から50％アセトニトリルへのリニアグラジエント(10分間）を採用し、フラクションサイズは1mlとし、溶出液の280nmにおける吸光度を測定し、ペプチドを分取した。280nmに吸収を示すペプチド画分が１個検出された。
【００２４】
（３）アミノ酸配列分析
ＨＰＬＣにより分取したペプチドのアミノ酸配列を分析するため、このペプチドをプロテインシークエンサー（島津製作所製、PPSQ-21型） によってアミノ酸配列分析を行った。アミノ酸配列分析の結果、ペプチドのN末端より一番目のアミノ酸の候補が、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙであり、二番目のアミノ酸はＧｌｎ、三番目のアミノ酸はＰｒｏであった。ペプチド製造に用いた酒粕に含有する主要なタンパク質、プロラミン、グロブリン、グルテリン（タイプＡおよびＢも含む）とその前駆体のそれぞれアミノ酸配列からペプチド配列を検索した結果、ペプチドのアミノ酸配列はＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏであると決定した。
【００２５】
（４）ペプチドの定量
上記ペプチド画分中に含まれるペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
＜ペプチド標準試料の測定＞
(i)ペプチド標準溶液の調製
各種ペプチド（Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ；東レリサーチセンター社製）１０ｍｇを量り取り、水を加え完全に溶解させ、１ｍｌに定容した。
(ii)内部標準物質溶液の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍｌで完全に溶解させ、内部標準原液とした。
(iii)標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、ペプチドと内部標準物質が各0.0１ｍｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう標準溶液を調製した。下記のＬＣ／ＭＳ分析条件により、ペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム： Imtakt UK-C18 75×4.6mm
移動相：A液：0.05% HCOOH/水、B液：アセトニトリル（0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分）
注入量：10 μｌ
流速：1mｌ/分
カラム温度：35℃
検出条件：UV  190-300 nm
MS  エレクトロスプレーイオン（ESI）法  positive ＳＩＲモード
【表１】
0005128983.tif 000002
【００２６】
＜ペプチドの測定＞
(i)上記（１）で得られた酒粕ペプチド混合物１０ｍｇを純水1ｍｌに溶解し、酒粕ペプチド混合物水溶液とした。
(ii)酒粕ペプチド混合物水溶液と内部標準原液と混合し、酒粕ペプチド混合物と内部標準物質が各0.002ｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様にペプチドのMSピーク面積を測定した。
(iii)得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従ってペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量（ｍｇ/g）＝［標準溶液のペプチド濃度（mｇ/ml）×（試料溶液のペプチドピーク面積/試料のＩＳピーク面積）/（標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のＩＳピーク面積）/試料のペプチド濃度（ｇ/ml）］
＜結果＞
新規ペプチドＩｌｅ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏの分子量は356.4であり、「（１）酒粕分解ペプチド混合物の製造」の項目で得られた酒粕ペプチド混合物中のペプチドの含有量は0.043（mg/g）であった。
【００２７】
（５）ＡＣＥ阻害活性測定
また、上記ペプチドのＡＣＥ阻害活性を、ＪＯＵＲＮＡＬ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２３３（１９８２）１２３−１３０に記載の方法に準じて測定した。具体的には以下の手順で測定した。
＜試薬＞
基質溶液：６．５ｍＭ  Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所製）、５２０ｍＭ  ＮａＣｌ、を０．２Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したものを使用した。
酵素液：ウサギ肺由来ＡＣＥ酵素（ＳＩＧＭＡ製）１Ｕ／ｍｌを０．２Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したもの（最終濃度０．１Ｕ／ｍｌ）を使用した。
反応停止液：３％w/vメタ燐酸溶液を使用した。
【００２８】
＜測定手順＞
(i)実施例（２）で調製した標品溶液、または２５０〜１０００ｐｐｍに調製したペプチド（Ｉlｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ；東レリサーチセンター社製）（コントロールの場合は蒸留水）６０μｌと酵素液３０μｌを３７℃で保温した。
(ii)３分後に基質溶液３００μｌを添加して３７℃で３０分間反応させた。
(iii)３０分後、反応停止液５００μｌを添加して反応を停止させた。
(iv)ＨＰＬＣにて馬尿酸濃度を測定した。測定条件を以下に示す。
使用機種  SHIMADZU  LC10AVP
カラム  Waters SunFire C18  4.6mm×150mm
移動相  A液：20ｍM リン酸バッファーｐH3.0、B液：メタノール  A:B=55：45
注入量  20μl  流速  1ml/分
カラム温度  40℃
(v)以下の式に従い、ＡＣＥ阻害活性を算出した。
ＡＣＥ阻害活性＝[(コントロールの馬尿酸濃度−テストサンプルの馬尿酸濃度）/コントロールの馬尿酸濃度]×100（％）
(vi)また、ＡＣＥ阻害活性が５０％となるときのサンプル濃度（ＩＣ５０）を算出した。
この結果、本発明のペプチドのＩＣ５０は、７．７μＭであった。
【００２９】
（６）肝機能障害抑制活性
＜細胞の前培養＞
ヒト肝臓細胞HepG2（HS研究資源バンク製）を、10％FBS入りのDMEM培地（大日本製薬製）に懸濁して、細胞密度2.0×105個／mlに調製した。これを24穴培養プレートに1ウェルあたり500μｌずつ播種して、5％CO2気流下37℃で、コンフルエントになるまで７日間培養した。
＜肝障害モデルの作製＞
肝障害モデルを作製するため、イソアミルアルコールを添加することによって、細胞死を誘発させた。具体的には、まず、細胞を懸濁している培地をDMEM培地（FBS無し、フェノールレッド無し；大日本製薬製）500μｌに交換後、イソアミルアルコールを2.5μｌずつ、90分間隔で2回に分けて添加した。培地中のアルコール濃度を合計1.0％としてから（即ち、２回目のイソアミルアルコール添加直後から）１２０分間、細胞生存率を測定した。またアルコールを添加しない群をブランクとした。
【００３０】
＜生細胞数の測定＞
市販の細胞数測定キット；Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所製）を用いて、生細胞数を測定した。アルコール濃度を1.0％にしたのと同時に、本試薬溶液を1ウェルあたり5μｌ添加して、そのまま培養を続けた。120分後に細胞内酵素反応による試薬の発色を測定し、生細胞数の指標とした。吸光度の測定は、培地上清を100μｌずつマイクロプレートに採取し、プレートリーダーを用いて、450nmと600nmの２波長で行った。
＜細胞生存率の算出＞
まずアルコール無添加群（ブランク）では死滅が起こっていないとみなし、その生細胞数を各群共通の総細胞数と近似した。各群の生細胞数を、ブランクの総細胞数で割った値をもって、各群の細胞生存率とした。
細胞生存率（％）＝100×（被験区の吸光度450nm−被験区の吸光度600nm）
÷（ブランクの吸光度450nm−ブランクの吸光度600nm）
【００３１】
＜被験物質の添加＞
1.0％被験物質水溶液を調製し、アルコール添加の30分前に、無色無血清培地500μｌに対して10μｌ添加することによって、被験物質を最終濃度200ppmの添加とした。これによりアルコールによる生存率の低下がいかに抑制されるかを検討した。コントロールでは、被験物の代わりに水のみを10μｌ添加した。尚、いずれの被験物とも本濃度において、Cell Counting Kit-8の着色反応そのものに影響しないことを事前に確認した。
＜被験物質＞
酒粕ペプチドから単離同定されたＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、及びポジティブコントロールとしてグルタチオンを用いた。
また、特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物も試験に供した。酒粕ペプチド混合物は以下の方法で調製した。即ち、液化液による清酒醸造法により米から清酒を醸造したときの酒粕（水分３６％）１０ｇを０．２ｌの水に懸濁し、蛋白分解酵素（サモアーゼ；大和化成製）０．２ｇを加え、３７℃で反応させた。その後沸騰水浴中で１０分間加熱した後５０００回転１０分間の遠心分離により溶解物を得、凍結乾燥によりペプチド画分を得た。
＜結果＞
細胞生存率は、サンプル無添加のコントロールが２８％まで低下したのに対し、Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏで８８％、特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物で４３％、グルタチオンで６９％であった。本発明のＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏは極めて強い肝機能障害抑制活性を有することが分る。
【００３２】
（７）抗酸化活性測定
（7-1）リノール酸自動酸化抑制活性
＜測定原理＞  リノール酸過酸化物が、β-カロテンの二重結合と反応することによって、β-カロテンの色（470nm）が消失する。被験物添加時の470nm退色抑制をもって、抗酸化活性と評価する（津志田ら；日食工誌、41(9)、611-618、1994）。
＜操作手順＞
(i)リノール酸-β-カロテンエマルジョンの調製
15ml遠心チューブに、リノール酸（1％溶液/クロロホルム）80μｌ、Ｔｗｅｅｎ40（20％溶液/クロロホルム）40μｌ、β−カロテン（1％溶液/クロロホルム）20μｌを入れ、遠心エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に蒸留水4mlを加え、0.2M PBS（pH7.0）400μｌを添加し、必要最小限度の強さで撹拌して、リノール酸-β-カロテンエマルジョンを調製した。
(ii)退色反応
96穴マイクロプレートに、被験物溶液10μｌ、上記調製したエマルジョン190μｌ、470nm−600nmの2波長の吸光度を45℃で30分間自動計測し、反応速度を自動印字し、コントロールと被験区の反応速度から阻害活性％を計算した。
【００３３】
＜被験物＞
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物、ポジティブコントロールとして、フェルラ酸、グルタチオン、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを試験に供した。
＜結果＞
結果を以下の表２に示す。
【表２】
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Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、及び特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物には抗酸化活性が認められた。
【００３４】
(7-2)SOD様活性
＜測定原理＞
SODテストワコーキット（和光純薬工業製）とプレートリーダーを用いることによりスケールダウンと自動化を計り、XOD（キサンチンオキシダーゼ）阻害活性を測定する。
＜操作手順＞
各被験物質は，１．０％濃度で被験物溶液とした。被験物溶液10μｌ（コントロールは溶媒のみ）、 XOD酵素溶液45μｌ、基質溶液45μｌの合計100μｌを攪拌することで呈色する。これをマイクロプレートリーダーのkineticモードで、560nmにおける吸光度を37℃で30分間測定し、反応速度Vを自動計算する。数式（1−V(被験物質)／V（コントロール））×100を阻害活性（％）とする。
＜被験物質＞
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物、Ｈｉｓ、及びＴｒｐを試験に供した。
＜結果＞
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏでは阻害活性は２６％であり、抗酸化活性が認められた。また、特許文献２の実施例１と同じ方法で得た酒粕ペプチド混合物では阻害活性は４８％であり、抗酸化活性が認められた。Ｈｉｓでは阻害活性は２６％、Ｔｒｐでは阻害活性は２０％であり、それぞれ抗酸化活性が認められた。