(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物がネコブセンチュウに感染した後、該植物又は該植物を栽培する土壌に受託番号FERM BP-5825で特定される非病原性フザリウム・オキシスポラム菌株を施用することを含む、ネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法。
【請求項２】
植物又は植物を栽培する土壌に前記非病原性フザリウム・オキシスポラム菌株を施用する前に、弱毒植物ウイルスを植物に接種することを含み、該弱毒植物ウイルスがトマトモザイクウイルスL11A株又はトウガラシマイルドモットルウイルスNo.16株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
受託番号FERM BP-5825で特定される非病原性フザリウム・オキシスポラム菌株を有効成分として含有する、ネコブセンチュウによる植物病害の防除剤であって、植物がネコブセンチュウに感染した後、該植物又は該植物を栽培する土壌に施用するものである、前記防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法に関する。より詳細には、非病原性糸状菌、または弱毒植物ウイルスおよび非病原性糸状菌を用いたネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコブセンチュウは、広い寄主範囲を持ち、露地根菜類から施設果菜類におよぶ広範な作物に著しい減収や枯死を起こすこと、侵入すると根絶が難しいことから、最も有害な病害虫の一つとされている。昭和３４年から１０年間実施された全国土壌検診事業は述べ６，４００ｈａの検診面積の５３％に有害センチュウが高い密度で生息することを明らかにした。不可欠用途を除く土壌消毒用途の臭化メチルの２００５年度以降の全廃によって、これまで意識せずに防除されていたネコブセンチュウ害は顕在化するとともに拡大しつつある。一方、作物防疫においても環境保全型農業技術、有機農業技術の導入が強く求められている。
【０００３】
従来のセンチュウ防除手段の主流は化学合成農薬である。専用、汎用の化学合成農薬が殺センチュウ剤として用いられている。これらは大きく粒剤とくん蒸剤に分けられ、前者では有機リン剤のホスチアゼート剤、後者ではＤ−Ｄ剤が広く普及している。物理的防除手段には、ハウスを密閉し耕土を加温する太陽熱土壌消毒、ハウス土壌に有機物を混和して密閉加温する還元土壌消毒、可動式ボイラーから給湯し直接作土を加熱する熱水土壌消毒、耕土の長期間湛水処理がある。耕種的防除技術には、栽培すると土壌中のセンチュウ密度を低下させるセンチュウ対抗植物やセンチュウ抵抗性品種の栽培が挙げられる。マリーゴールドの「アフリカントール」、野生エンバクの「ヘイオーツ」などが代表的なセンチュウ対抗植物である。また、既登録の生物農薬として出芽細菌のパストリア水和剤（パスツリア・ペネトランス剤）と糸状菌のネマヒトン（モナクロスポリウム・フィマトパガム剤）などが挙げられる。
【０００４】
有機リン酸系化学合成農薬は、作物への残留が社会問題化しており、クロルピクリン剤、Ｄ−Ｄ剤等の土壌くん蒸剤も人の健康に及ぼす影響、土壌微小生物相の破壊と撹乱、地下水汚染など環境負荷を起こす。化学合成農薬と物理的防除技術は、概して劇的な防除効果を示すものの、センチュウは耕土深層に残存しているため、栽培後のセンチュウ密度復活は速やかであり、却ってセンチュウ害を助長する（誘導多発性）。耕種的防除である対抗植物利用では、作物栽培の中断、除草の手間、他の病害虫の多発生などの問題を持つ。一般に抵抗性品種には市場性がないことが多く、センチュウ抵抗性品種がない野菜もある（例えばウリ科野菜）。また、抵抗性品種の連続的利用により、抵抗性品種に寄生するセンチュウ系統（抵抗性打破系統）が出現し、トマトでは抵抗性品種のセンチュウ抵抗性は既に打破されている。生物資材では、パストリア水和剤が産卵抑制作用、ネマヒトンが捕食作用の単独機作によってセンチュウを抑制するが、コストが極めて高く、劇的な防除効果に乏しい。
【０００５】
上述のセンチュウ防除手段は、化学的、物理的、生物的手法を問わず、センチュウの直接致死または不活化を狙ったものであり、センチュウ、またはセンチュウに寄生する植物病原菌（主として病原性糸状菌）に対する植物の防御反応の強化を視点としたものではない。また、フザリウム菌に代表される糸状菌感染による萎ちょう病、立枯病などの種々の植物病害の生物的防除手段として、非病原性のフザリウム菌を、注射等により強制的に植物組織内に導入する方法が報告されているが（特許文献１など）、これは、病原性糸状菌数の減少を目的としたものであって、センチュウに対する防除作用については知られていない。
【特許文献１】特開平９−６７２１８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、生物的防除技術を用いた、ネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、非病原性糸状菌が植物に感染するタイミングによって、ネコブセンチュウによる植物病害の程度を著しく変動させること、具体的には、植物がネコブセンチュウよりも先に非病原性糸状菌に感染した場合、およびネコブセンチュウと非病原性糸状菌に同時に感染した場合には、ネコブセンチュウの増殖と植物病害を促進すること、また、植物がネコブセンチュウよりも遅れて非病原性糸状菌に感染した場合には、ネコブセンチュウの増殖と植物病害を顕著に抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。また、植物が弱毒植物ウイルスと非病原性糸状菌に重複感染すると、ネコブセンチュウの増殖と植物病害をより顕著に抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の概要は以下のとおりである。
〔１〕植物または植物を栽培する土壌に非病原性の糸状菌を施用することを特徴とする、ネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法。
〔２〕植物または植物を栽培する土壌に非病原性の糸状菌を施用する前に、弱毒植物ウイルスを植物に接種することを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔３〕非病原性の糸状菌を有効成分として含有する、ネコブセンチュウによる植物病害の防除剤。
〔４〕非病原性の糸状菌が非病原性フザリウム菌である、〔３〕に記載の防除剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ネコブセンチュウによる植物病害を生物的に防除することができる。非病原性糸状菌の施用、ならびに弱毒植物ウイルスおよび非病原性糸状菌の施用は、化学防除手段であるくん蒸剤に匹敵するセンチュウ防除効果を発現し得る。本発明の方法によれば、従来から行われている化学的防除法と異なり、環境を汚染や人畜あるいは他の作物への影響が軽微であるため、生態系の調和を乱すことなく、また、土壌中に生息している有益な微生物に悪影響を与えることなく、安定かつ持続的に、ネコブセンチュウによる植物病害を防除し得る。また、本発明は、ネコブセンチュウが寄生し、固有のウイルス病やフザリウム病等を持つ植物に広く適用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法は、植物または植物を栽培する土壌に非病原性の糸状菌を施用することを特徴とする。
【００１１】
ネコブセンチュウは、植物に寄生し、植物細胞の原形質から栄養をとる害虫である。メロイドギネ属のネコブセンチュウ（英名root−knot nematode）は、分類上現在約７０の種（Meloidogyne arenaria、M. incognita、M. hapla、M. javanicaなど）が確認されており、様々な作物や雑草に寄生する。種全体では、２０００種を超える植物に影響することが報告されており、その中には重要な作物であるトマト、ピーマン、ウリ、バレイショ、サツマイモ、ナス、ニンジン、ゴボウ、ホウレンソウ、フダンソウ、シュンギク、ネギ類、ショウガ、エンドウ、インゲンマメ、ササゲなどが含まれる。
【００１２】
ネコブセンチュウは単独で植物を加害するばかりでなく、土壌病原菌と複合感染を引き起こす。ネコブセンチュウに感染すると、地上部分では、寄生の診断に有効となるはっきりとした兆候は感染初期には見られないが、地下ではコブ（gallあるいはknot）が形成され始める。コブの大きさは品種により異なるが、多くの場合１〜２ｍｍ程度で肉眼では確認しにくい場合もある。一方、コブの表面や根には卵が産卵され、この卵の固まりは肉眼でも確認ができる。ネコブセンチュウに感染した根には、様々な発達段階のセンチュウが寄生する。ネコブセンチュウの感染は、作物の収量を減少させ、あるいは寄生した塊根などの市場価値を失わせる。また、ネコブセンチュウは、糸状菌、細菌、ウイルスの感染に関与する。例えば、Fusarium属（Fusariumoxysporum f.sp. lycopersici、Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinumなど）、Rhizoctonia属（Rhizoctoniasolaniなど、）Pythium属（Pythium cucurbitacearumなど）に属する糸状菌、Pseudomonas属（Pseudomonassolanacearumなど）に属する細菌、タバコモザイクウイルスなどの感染に関与し、萎ちょう病、青枯病、立枯病、つる割病、腰折病、根こぶ病などの植物病害が植物に生じる。本発明のネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法は、ネコブセンチュウの加害と増殖を抑制し、それらの植物病害を防除することができる。
【００１３】
本発明の方法に用いる非病原性糸状菌は、植物に対して病原性を持たない糸状菌であれば特に制限されるものではなく、例えば非病原性のフザリウム属、トリコデルマ属などに属する糸状菌が挙げられる。これらのうち、非病原性フザリウム菌が好ましく、非病原性フザリウム・オキシスポラムがより好ましく、フザリウム・オキシスポラムＦ１３が特に好ましい。フザリウム・オキシスポラムＦ１３は、島根大学内土壌より分離され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現経済産業省産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０５７として寄託されている。また、非病原性糸状菌ではないが、例えばPseudomonas属に属する非病原性の細菌類も非病原性糸状菌と同様に用いることができる。
【００１４】
本発明に用いる非病原性糸状菌の培養は、一般微生物における通常の培養方法を用いて行うことが可能であり、ポテト・デキストロース寒天培地、ポテト・シュークロース寒天培地、ツアペック寒天培地などの固形平板培地あるいは斜面培地を用いた固体培養、フスマなどの植物由来の固体成分、糖類や窒素源を含浸させた多孔質体などを用いた固体培養、ポテト・デキストロース液体培地、ポテト・シュークロース液体培地、ツアペック液体培地などの各種液体培地を用いた液体培養等、いずれも可能である。また、培養方法は、振盪培養、ジャーファーメンター培養、あるいは静置培養等をとることができる。また、例えばフザリウム・オキシスポラムＦ１３を培養する場合の培養条件は、好気条件下、温度１５〜３５℃、ｐＨ４〜８で５〜８日間培養することが好ましい。
【００１５】
非病原性糸状菌は、糸状菌の培養物、培養物を培地とともに破砕、細断した形態、または糸状菌を培地から分離した形態等で本発明に用いてもよく、これらを本発明の防除剤として用いることができる。あるいは、常法に従って、担体、固着剤、分散剤、補助剤などを配合し、非病原性の糸状菌を有効成分として含む、粉剤、粒剤、水和剤、液剤、乳剤、懸濁液などの形態にしてもよい。
【００１６】
担体としては、例えば、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、ケイ砂などの固体担体；水溶性高分子化合物（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸など）、水、植物油、液体動物油などの液体担体などが挙げられる。固着剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸などが挙げられる。分散剤としては、例えば、アルコール硫酸エステル類、ポリオキシエチレングリコールエーテルなどが挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デンプン、乳糖などが挙げられる。
【００１７】
本発明の防除剤の製造では、上記担体、固着剤、分散剤および補助剤をそれぞれの目的に応じて、それぞれ単独でまたは適宜組合せて使用することができる。本発明の防除剤における非病原性の糸状菌の含有量は特に限定されないが、粉剤、粒剤などの場合、好ましくは１×１０４〜１×１０８ｃｆｕ／ｇの範囲、より好ましくは１×１０６〜１×１０７ｃｆｕ／ｇの範囲である。また、水和剤（懸濁時）、液剤、乳剤、懸濁液などの場合、施用時に、好ましくは１×１０４〜１×１０８ｃｆｕ／ｍｌの範囲、より好ましくは１×１０６〜１×１０７ｃｆｕ／ｍｌの範囲になるように調製すればよく、製剤時に上記範囲の数倍〜数千倍の濃度で防除剤に含有させることができる。なお、非病原性糸状菌は菌糸体、あるいは胞子でもよく、上記ｃｆｕ／ｇ、ｃｆｕ／ｍｌの単位を胞子／ｇ、胞子／ｍｌと読み替えてもよい。下記の非病原性糸状菌の施用量についても同様である。
【００１８】
非病原性の糸状菌の施用は、植物がネコブセンチュウに感染した後、具体的には、例えばネコブセンチュウを駆除した土壌で育苗した植物を圃場に定植した後（好ましくは定植後１日〜３日）に行う。非病原性糸状菌をネコブセンチュウ感染前に施用して、先に非病原性糸状菌に植物が感染した場合や、苗を圃場に定植するとほぼ同時に非病原性糸状菌を施用した場合、すなわち植物がネコブセンチュウと非病原性糸状菌にほぼ同時に感染した場合には、防除効果はなく、かえってネコブセンチュウの加害と増殖を促進する。
【００１９】
非病原性糸状菌の施用方法は、土壌に混和、または灌注すればよく、植物の根に直接接触するように、あるいは根の周辺の土壌に当該菌が散布されるように土壌接種すればよい。非病原性糸状菌の施用量は、当該菌が増殖可能であれば、特に限定されないが、好ましくは１×１０４〜１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌ土壌の範囲、より好ましくは１×１０６〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ土壌の範囲、あるいは好ましくは１×１０４〜１×１０１２ｃｆｕ／株、より好ましくは１×１０６〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ株の範囲である。
【００２０】
本発明のネコブセンチュウによる植物病害を防除する方法は、植物または植物を栽培する土壌に非病原性の糸状菌を施用する前に、弱毒植物ウイルスを植物に接種すると、防除効果が一層高まる。２種類の微生物（弱毒植物ウイルスと非病原性の糸状菌）が共力作用して、おそらく植物の感染防御機構の強化など複数の機構を通じて、ネコブセンチュウの加害と増殖を強く抑制する。
【００２１】
本発明に用いる弱毒植物ウイルスは、植物に対して病原性を持たない微生物であれば特に限定されるものではなく、例えば弱毒性のトバモウイルス属が挙げられる。弱毒性のトバモウイルス属では、例えば弱毒性のトマトモザイクウイルス、トウガラシマイルドモットルウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどが好ましい。本発明に用いられる非病原性の糸状菌が、非病原性フザリウム・オキシスポラムである場合、弱毒植物ウイルスとして、トマトモザイクウイルスの弱毒株およびトウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒株が好ましく、そのなかでもトマトモザイクウイルスＬ１１Ａ株およびトウガラシマイルドモットルウイルスのＮｏ．１６株が好ましい。トマトモザイクウイルスＬ１１Ａ株は、ＭＡＦＦ  Ｎｏ．２６０００２株もしくはＮｏ．２６０００４株として独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンクに保存されており、配布申込により入手することができる。トウガラシマイルドモットルウイルスのＮｏ．１６株は、トウガラシマイルドモットルウイルスの強毒系統ウイルス株（独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンクにＭＡＦＦ  Ｎｏ．１０４０３２として登録）を選抜することによって、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業研究センターが作出した系統である。Ｎｏ．１６株はウイルスであることから、日本国特許庁長官の指定する寄託機関である、独立法人産業総合研究所の特許生物寄託センターと、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターのいずれにも寄託の受け入れが認められないものであるが、茨城県つくば市観音台３丁目１番地１独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構中央農業総合研究センター内  津田新哉から入手することができる。
【００２２】
弱毒植物ウイルス（植物に感染しても被害を与えないウイルス）は、強毒植物ウイルス（植物に感染して被害を与えるウイルス）からの突然変異（例えば人為的突然変異など）によって作出することもでき、自然界から分離することもできる。
【００２３】
弱毒植物ウイルスは、例えば当該ウイルスを感染させた植物の磨砕液の形態で用いることができる。磨砕液を遠心分離等してウイルスを回収したり、濃縮してもよい。また、弱毒植物ウイルス粒子、あるいはウイルス核酸を単独で用いてもよく、緩衝液などに混合して、液剤、乳剤、懸濁液等の形態にして弱毒植物ウイルス液剤とすることもできる。緩衝液として、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などが挙げられる。液剤等には、例えばトレハロース、ショ糖などの補助剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ポリエチレングリコールなどの安定剤などを含めてもよい。また、磨砕液や液剤等を凍結乾燥品にし、施用時に水、緩衝液などで調製してもよい。
【００２４】
液剤等への弱毒植物ウイルスの含有量は、特に限定されないが、例えばウイルス粒子濃度として、好ましくは０．０００１〜０．５重量％の範囲、より好ましくは０．００１〜０．０１重量％の範囲である。
【００２５】
弱毒植物ウイルスの植物への施用は、磨砕液または液剤等を植物（好ましくは苗の葉、茎など）に散布したり、塗抹接種して行うことができる。その際、カーボランダムなどの研磨剤を併用してもよく、研磨剤を散布した葉に上記磨砕液または液剤等を脱脂綿等で塗抹する。また、磨砕液または液剤等を植物に散布した後、研磨剤を付着させたローラー等を用いて植物の表面を被傷させてもよい。あるいは、噴霧器やスプレーガンを用いて、磨砕液または液剤等およびカーボランダムに圧力をかけて植物に噴霧してもよい。弱毒植物ウイルスの植物への施用量は、特に限定されず、ウイルスが植物に感染すればよい。
【００２６】
本発明の植物病害を防除する方法は、まず、くん蒸、滅菌処理等を行った土壌で育苗し、苗を定植する前に上記施用方法で弱毒植物ウイルスを接種する。次に、当該植物に非病原性糸状菌を重複感染させる。具体的には、非病原性糸状菌を圃場に定植する前の苗（ネコブセンチュウ感染前）に施用してもよいし、苗を圃場に定植するときに施用してもよいが、より好ましくは定植数日後（好ましくは定植後１〜３日）に施用する。非病原性糸状菌は、根に接触するように、あるいは根の周辺の土壌に当該菌が散布されるように施用すればよい。弱毒植物ウイルスと非病原性糸状菌の重複感染により、植物病害をより顕著に防除することができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
〔非病原性フザリウム菌によるサツマイモネコブセンチュウの防除〕
トマトのポット栽培において、非病原性のフザリウム菌をネコブセンチュウの感染時点に相対して早い、同時、遅い時系列で土壌接種した場合のネコブセンチュウ防除効果について実験を行った。
（１）実験に用いたセンチュウと微生物の株
（i）センチュウ
サツマイモネコブセンチュウ：メロイドギネ・インコグニータ（Meloidogyne incognita）（千葉県嚶鳴村（現旭市）に存在した海上試験地のサツマイモ圃場に由来し、農林水産省農事試験場（鴻巣）、次いで農林水産省農業研究センター（つくば）、次いで中央農業総合研究センター（つくば）に移され、中央農業総合研究センターで継代維持されてきた系統、以下、嚶鳴系統と呼ぶ）を用いた。この系統は、センチュウ抵抗性遺伝子（Ｍｉ遺伝子）を組み込んだトマトの品種（ＮＲ品種：Nematode resistant variety）に感染できないが、ＮＲでないトマトには強い病原性を有する。この株は、独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンクにＭＡＦＦ  Ｎｏ．１０８３０２として登録されている。
（ii）非病原性フザリウム
フザリウム・オキシスポラムＦ１３を用いた。
【００２９】
（２）育苗と栽培
土壌蒸気滅菌器にて滅菌処理した砂壌土（砂をおよそ５０％含む）に、化成肥料（ＮＰＫ成分各１４％）と苦土石灰をそれぞれ１３ｇ／１８リットル加えた。この床土を口径９０ｍｍ×高さ８０ｍｍの黒色ビニルポットに充てんして、センチュウ抵抗性（ＮＲ）を持たないトマト（強力米寿２号、タキイ）を播種した。播種、育苗、試験微生物の接種、接種後のトマトの栽培管理は、すべて茨城県つくば市に所在する中央農業総合研究センターのガラス室において実施した。
【００３０】
（３）接種源の調製と接種方法
（i）センチュウ
接種源のサツマイモネコブセンチュウ嚶鳴系統は、第２期幼虫の５００個体を接種し、２５〜３０℃で温度管理した温室で約８０日間栽培したトマト（強力米寿２号）から得た。すなわち、トマトの根より水洗によって土壌を除去し、露出した根の根こぶ上に形成された卵嚢を実体顕微鏡下（６０×）で観察しながら、ピンセットで採集した。１００個の卵嚢を、５ｍｌの水道水を入れたシュラキュース時計皿に移し、水の蒸散を抑制するため別の時計皿をこの上に重ね置いた。これを２５℃で２週間インキュベートした後、孵化した第２期幼虫だけをガラス製の駒込ピペットを用いて水とともに吸い取って集め、メスシリンダーで１ｍｌ中１２５個体の第２期幼虫を含むように調製した。トマト幼植物（６葉期）へのセンチュウの接種は、株元から３０ｍｍ外側に直径１０ｍｍ深さ３０ｍｍの穴をガラス管瓶を用いて４カ所穿ち、調製したセンチュウ懸濁液を各穴に１ｍｌずつ流し込むことにより実施した。
【００３１】
（ii）病原性フザリウム菌
接種源のＦ１３の菌体は、紙製の円形通気孔を持つ、きのこ培養用プラスチックバック（信濃パック）にフスマ培地を２リットル充てんし、オートクレーブにて１２０℃２０分の滅菌を２回行い、これに試験管内のポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）上で継代したＦ１３菌糸体の滅菌水懸濁液を接種することにより、およそ２週間で無菌的に単独培養された。胞子や菌糸は精製しなかった。自然風乾した培養物中のＦ１３の菌密度は、ＭＰ培地を用いて検定し、菌密度５．６７×１０７ｃｆｕ／g乾物であることを確認した。菌は使用するまで１０℃の低温室で保存した。接種の直前に、Ｆ１３のフスマ培養物をブレンダーで破砕し、必要量を量り取って、蒸気滅菌した砂壌土に混和し、小型コンクリートミキサー（マゼラーＰＴ−２Ｎ）で十分に撹拌して、１ｍｌ当たり１×１０５ｃｆｕのＦ１３を含む土壌を調製した。次いで、９０ｍｍ×高さ８０ｍｍのビニルポットからトマトを根と土壌（３００ｍｌ）ごと抜き取り、口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポット（容積６００ｍｌ）に入れ替え、この後、Ｆ１３を混和した３００ｍｌ土壌をポットの隙間に充てんした。したがって、Ｆ１３の接種密度は５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ土壌であった。
【００３２】
（４）試験区
試験区として下記のとおり４区を設けた。
（i）Ｆ１３＋２区
嚶鳴系統センチュウの第２期幼虫を最初（２００６年９月２５日）にトマトの根圏土壌に接種し、２日後（９月２７日）にフザリウム菌のＦ１３培養物を含む土壌と併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのポットに改植したもの。
（ii）Ｆ１３±０区
トマト幼植物を２００６年９月２５日にＦ１３培養物を含む土壌３００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植してＦ１３に接触させ、同日の２時間後に嚶鳴系統センチュウの第２期幼虫をトマトの培土に接種したもの。
（iii）Ｆ１３−２区
トマト幼植物を２００６年９月２５日にＦ１３培養物を含む土壌３００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植してＦ１３に接触させ、２日後（９月２７日）にセンチュウの第２期幼虫をトマトの培土に接種したもの。
（iv）対照区
トマト幼植物を２００６年９月２５日に滅菌砂壌土３００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植し（Ｆ１３には接触しない）、２日後（９月２７日）にセンチュウの第２期幼虫をトマトの培土に接種したもの。
【００３３】
各試験区は３反復であった。ポットはガラス室のベンチに静置し、２５℃〜３０℃で管理した。
【００３４】
（５）評価方法
実施例の試験区にセンチュウを接種して３６日後（２００６年１１月２日）に、各試験区のトマトを地際部から切断し、根から土壌を払い落とし、ポリエチレン袋に取り除けた。根は水道水で丁寧に洗浄した。
（ｉ）全根系の根こぶ数および卵嚢数
トマトの根を解剖鋏で分解し、分解した側根ごとに実体顕微鏡下（４０〜６０倍）で、根こぶと卵嚢を計数カウンターによって計数し、これらを集計して全根系の根こぶ数および卵嚢数を計上した。
【００３５】
（ii）土壌２０ｇ当たりのセンチュウ第２期幼虫数
トマトの根を洗浄するに先立ってポリエチレン袋に取り除けた土壌から２０ｇの土壌を３反復で量り取り、ベルマン漏斗法によって７２時間分離した。分離センチュウを含む水をプランクトン計数スライドに入れ、生物顕微鏡（オリンパスＢＸ−５０）を用いて１５０倍で観察しつつ、ネコブセンチュウの第２期幼虫を計数した。３反復の平均値を土壌２０ｇ当たりの第２期幼虫密度として計上した。同時に、土壌中に生息する非植物病原性センチュウ（糸状菌や細菌を餌とするセンチュウ群）の数も計数した。
【００３６】
（iii）根こぶ指数
根の根こぶの程度に応じてI〜Vの５段階評を与え、下記の式（１）により根こぶ指数を算出した。根こぶ指数は、主観的評価法ではあるが、センチュウ害の評価指標として最も広く用いられている。
根こぶ指数＝((５V＋４VI＋３III＋２II＋１I)/(５×調査株数))×100  …式（１）
I  ： 根の０〜２０％に根こぶが認められた植物体数
II ： 根の２１〜４０％に根こぶが認められた植物体数
III： 根の４１〜６０％に根こぶが認められた植物体数
IV ： 根の６１〜８０％に根こぶが認められた植物体数
V  ： 枯死もしくは維管束全体に褐変が認められた植物体数
【００３７】
（iv）非病原性フザリウム菌による維管束の褐変
実施例の試験区にセンチュウを接種して３５日後に、各試験区のトマトを地際部から切断し、地際部より５ｃｍ上の維管束褐変の程度に応じて０〜IVの５段階評を与え、下記の式（２）により各処理の罹病指数を算出した。
罹病指数＝((４IV＋３III＋２II＋１I)/(４×調査株数))×100  …式（２）
０ ： 維管束褐変なし
I  ： 維管束の１／４に褐変が認められた植物体数
II ： 維管束の１／２に褐変が認められた植物体数
III： 維管束の３／４に褐変が認められた植物体数
IV ： 枯死もしくは維管束全体に褐変が認められた植物体数
【００３８】
（v）統計処理
上記試験区のデータの検定は、検定が可能な場合に、一元配置分散分析による５％水準の有意差検出を行い、試験区間に有意差が検出された場合は、ＨＳＤ  Ｔｕｋｅｙ法による多重比較を行った。図において、「ａ」「ｂ」のアルファベットは、「ａ」が付された試験区と「ｂ」が付された試験区の間に有意差があることを示す。
【００３９】
（６）結果
各試験区における根こぶ数、卵嚢数、第２期幼虫密度を図１、２、３にそれぞれ示す。また、これらに根こぶ指数、微生物食性センチュウ群の密度の算出結果を加えたものを表１に示す。
【００４０】
【表１】
0005168687.tif 000002
【００４１】
図１は、上記試験区ごとの根こぶ数を表す図であるが、Ｆ１３±０区における根こぶの数は、センチュウのみを接種した対照区より有意（ｐ＜０．０５）に多く、センチュウとＦ１３がほぼ同時に感染するタイミングは、ネコブセンチュウの感染後の定着を促進したことが示された。一方、根こぶの数はＦ１３＋２区において最も少なく、Ｆ１３がセンチュウより２日遅れて感染するタイミングは、ネコブセンチュウの根への定着を抑制したことが示された。
【００４２】
図２は、上記試験区ごとの卵嚢数を表す図であるが、卵嚢の数はＦ１３＋２区において最も少なく、Ｆ１３がセンチュウより２日遅れて感染するタイミングが、ネコブセンチュウの産卵を抑制した可能性および／または雌の発達を遅延させた可能性を示した。
【００４３】
図３は、上記試験区ごとの土壌に遊出した次世代の第２期幼虫密度（土２０ｇ当たり）を表す図であるが、Ｆ１３−２区では、センチュウの第２期幼虫の密度が対照区を含む他の区より高く、Ｆ１３がセンチュウより２日早く感染するタイミングがネコブセンチュウの産卵数を増加させた可能性および／または産卵開始期を早めた可能性を示した。一方、次世代の幼虫密度は、Ｆ１３＋２区において他の区よりも極めて低く、Ｆ１３がセンチュウより２日遅れて感染するタイミングが、ネコブセンチュウの産卵数を抑制した可能性および／または産卵開始期を遅延させた可能性を示した。
【００４４】
根こぶ指数は、Ｆ１３＋２区において４３を示して最も低く、次いで対照区とＦ１３−２区において４７の値であり、Ｆ１３±０区では最も高い５３の値であった。根こぶの計数結果と同様に、Ｆ１３がセンチュウより２日遅れて感染するタイミングにおいて、センチュウ防除効果が高いことが示された。
【００４５】
トマトに病原性を有さない細菌食性および糸状菌食性のセンチュウ群の密度は、Ｆ１３＋２区で８６８頭と最も少なく、Ｆ１３±０区の１，７０１頭は対照区の１，４７８頭よりも多かった。このことは試験区間の根こぶ数の多少の傾向と符合していた。ネコブセンチュウが感染した根は壊（え）死を起こしやすい。これら非病原性のセンチュウの餌となる土壌中の微生物は壊死した根を分解して増殖することから、Ｆ１３がセンチュウより２日遅く感染するタイミングでは壊死根が相対的に少なく、一方、Ｆ１３がセンチュウと同時に感染するタイミングでは壊死根が相対的に多かったと考えられる。
【００４６】
すべての試験区のトマトの地際から５ｃｍ上部の茎を切り取り調査した結果（図を省略）では、維管束部の褐変はいずれの試験区のトマトにも認められなかった。このことから、用いたＦ１３は非病原性であり、センチュウと相互作用した場合においてもトマトに悪影響を与えないことが確認された。
【実施例２】
【００４７】
〔非病原性フザリウム菌と弱毒植物ウイルスのサツマイモネコブセンチュウの防除に及ぼす共力作用〕
非病原性フザリウム菌のセンチュウ防除効果をさらに高める可能性がある微生物資材として、トバモウイルス属の弱毒系統を導入し、ガラス室内でポット栽培したトマトに２種の非病原性微生物とセンチュウを接種する実験を行い、センチュウ防除効果を調べた。
【００４８】
（１）実験に用いたセンチュウと微生物の株
（i）センチュウ
上記実施例１と同様の系統を供試した。
（ii）非病原性フザリウム菌
上記実施例１と同様の菌株を供試した。
（iii）トバモウイルス属の弱毒株
トマトモザイクウイルスのＬ１１Ａ株を供試した。
【００４９】
（２）育苗と栽培
トマトの品種は、実施例１と同様に強力米寿２号を供試し、これを実施例１と同様の性状および施肥条件の砂壌土に播種した（２００６年１０月６日）。播種、育苗、試験微生物の接種、接種後のトマトの栽培管理場所も実施例１と同様であった。２００６年１０月２０日に、本葉２葉期のトマト幼植物を滅菌した砂壌土１００ｍｌを充てんした口径６０ｍｍ×高さ５７ｍｍのビニルポットに改植し、２５〜３０℃に温度を管理したガラス室で生育させた。生育したトマト幼植物は、さらに、１１月５日から１１月９日にかけて、口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植した。改植時に蒸気滅菌した川砂を加え、土壌容積を５００ｍｌ／ポットに増量した。
【００５０】
（３）接種源の調製と接種方法
（i）ウイルス弱毒系統の調製と接種
トバモウイルス属のトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）弱毒系統Ｌ１１Ａ株は、この株が感染したタバコＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ幼植物から得た。本植物より約０．１ｇの葉を切り出し、０．０５Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液１００ｍｌ中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。次いで、トマトの子葉に研磨剤を振りかけ、そこに前記の葉の磨砕液を染みこませた脱脂綿を軽くこすりつけた。研磨剤として、４００−６００メッシュのカーボランダムを用いた。本葉２葉期になった１０日後（１１月１日）に、弱毒植物ウイルスを接種した。
【００５１】
（ii）非病原性フザリウム菌の調製と接種
接種源のＦ１３の菌体は実施例１で使用したものと同一であり、菌密度は５．６７×１０７ｃｆｕ／ｇであった。接種の直前に、Ｆ１３のフスマ培養物をブレンダーで破砕し、８．４７ｇを量り取って、蒸気滅菌した川砂４．８Ｌに混和し、小型コンクリートミキサー（マゼラーＰＴ−２Ｎ）で十分に撹拌して、１ｍｌ当たり１×１０５ｃｆｕのＦ１３を含む砂を調製した。次いで、口径６０ｍｍ×高さ５７ｍｍのビニルポットからトマトを根と土壌（３００ｍｌ）ごと抜き取り、口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍ（容積６００ｍｌ）に入れ替え、この後、Ｆ１３菌を混和した４００ｍｌ土壌をポットの隙間に充てんした。したがって、Ｆ１３の接種密度は７．５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ土壌であった。
【００５２】
（iii）センチュウの調製と接種
接種源のサツマイモネコブセンチュウは、実施例１と同様の系統であり、実施例１と同様の方法で増殖し、第２期幼虫を回収した。最後にメスシリンダーを用い水１ｍｌ中に１０００個体の第２期幼虫を含むセンチュウ懸濁液を調製した。トマト幼植物（６葉期）へのセンチュウの接種は、株元から３０ｍｍ外側にガラス管瓶を用いて直径１０ｍｍ深さ３０ｍｍの穴を３カ所穿ち、調製したセンチュウの懸濁液を各穴に１ｍｌずつ流し込むことにより実施した。
【００５３】
（４）試験区
試験区として下記のとおり５区を設けた。
（i）弱Ｖ区
トマトモザイクウイルスのＬ１１Ａ株を２００６年１１月１日にトマト幼植物に接種し、８日後（１１月９日）に無菌砂と併せてトマトを口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのポットに改植し、その直後にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
（ii）弱Ｖ・Ｆ１３−１区
トマトモザイクウイルスのＬ１１Ａ株を２００６年１１月１日にトマト幼植物に接種し、次いで７日後（１１月８日）にＦ１３菌培養物を含む川砂と併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのポットに改植することによってＦ１３に接触させ、さらにその翌日（１１月９日）にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
（iii）Ｆ１３−１区
トマト幼植物を２００６年１１月８日にＦ１３培養物を含む川砂４００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植することによってＦ１３に接触させ、その翌日（１１月９日）にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
（iv）Ｆ１３±０区
トマト幼植物を２００６年１１月９日にＦ１３培養物を含む川砂４００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植することによってＦ１３に接触させ、同日（１１月９日）にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
（v）対照区
トマト幼植物を２００６年１１月９日に滅菌川砂４００ｍｌと併せて口径１２０ｍｍ×高さ１００ｍｍのビニルポットに改植し（Ｆ１３には非接触）、同日（１１月９日）にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
【００５４】
各試験区に４反復を設けた。ポットはガラス室のベンチに静置し、２０〜２５℃で温度を管理し、液肥（ハイポネックス（ＨＹＰＯＮＥＸ）５−１０−５：２ｍｌ／Ｌ）を１週間に１度与えながら肥培管理をしつつ３５日間栽培した。また、乾燥しない程度に灌水した。
【００５５】
（５）評価方法
実施例の試験区にセンチュウを接種して３５日後（２００６年１２月１４日）に、各試験区のトマトを地際部から切断し、根から土壌を払い落とし、ポリエチレン袋に取り除けた。根は水道水で丁寧に洗浄した。
（i）全根系の根こぶ数および卵嚢数
実施例１と同様に計数した。
（ii）根こぶ指数
実施例１と同様に算出した。
（iii）土壌２０ｇ当たりのセンチュウ第２期幼虫数
実施例１と同様に計数した。
（iv）統計処理
上記試験区のデータの検定は、検定が可能な場合に、一元配置分散分析による５％水準の有意差検出を行い、試験区間に有意差が検出された場合は、ＨＳＤ  Ｔｕｋｅｙ法による多重比較を行った。図において、「ａ」「ｂ」のアルファベットは、「ａ」が付された試験区と「ｂ」が付された試験区の間に有意差があることを示す。
【００５６】
（６）結果
各試験区における根こぶ数と卵嚢数の算出結果を図４、図５にそれぞれ示す。また、これらに根こぶ指数、第２期幼虫密度の算出結果を加えたものを表２に示す。
【００５７】
【表２】
0005168687.tif 000003
【００５８】
図４は、上記試験区ごとの根こぶ数を表す図であるが、トマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１Ａの単独感染（弱Ｖ区）はネコブセンチュウの根への定着を促進しており、この単独接種はセンチュウ防除に不利であることが示された。一方、根こぶの数は弱Ｖ・Ｆ１３−１区において最も少なく、他の処理区とも有意（ｐ＜０．０５）に異なって少なく、トマトモザイクウイルス弱毒Ｌ１１Ａ株がＦ１３と重複感染した場合に、ネコブセンチュウの根への定着を大きく抑制したことが示された。
【００５９】
根こぶ指数（図を省略）は、弱Ｖ・Ｆ１３−１区において３８を示して最も低く、次いでＦ１３−１区および対照区においてそれぞれ５０および５５の値であり、弱Ｖ区およびＦ１３±０区ではそれぞれ６０および７５の高い指数値を示した。根こぶの計数結果と同様に、Ｆ１３がトマトモザイクウイルスの弱毒系統と重複感染した場合に、被害が大きく軽減されることが示された。
【００６０】
図５は、上記試験区ごとの卵嚢数を表す図であるが、卵嚢の数は弱Ｖ区とＦ１３±０区において最も高く、トマトモザイクウイルス弱毒株とセンチュウ、またはＦ１３とセンチュウが同時に感染する条件はネコブセンチュウの産卵を促進した可能性および／または雌の発達を助長した可能性が示された。一方、弱Ｖ・Ｆ１３−１区の卵嚢数は前記２区より少なかったが、無処理区とも異ならず、Ｆ１３がセンチュウより１日早く感染するタイミングでは、弱毒植物ウイルスと重複感染した場合においても、ネコブセンチュウの産卵を抑制および／または雌の発達の遅延をもたらさないことが示された。
【００６１】
上記試験区ごとの土壌に遊出した土２０ｇ当たりの第２期幼虫密度（図を省略）は、弱Ｖ区において他の区よりも多い孵化数（平均で８６個体）が認められたが、未孵化の反復もあった。その他の区でも平均して３０頭以下の低い孵化幼虫数であり、反復のばらつきが大きく、傾向を比較することは困難であった。この試験の栽培は相対的に低温条件下で行われたため、卵の発生が遅延し、その結果孵化が少なかったと考えられた。
【実施例３】
【００６２】
〔非病原性フザリウム菌とトバモウイルス属の弱毒株のピーマンのサツマイモネコブセンチュウの防除に及ぼす共力作用〕
ポットに栽植したピーマンに、非病原性フザリウム菌をセンチュウの感染に相対して２日遅く感染させるタイミングで接種し、トバモウイルス属弱毒株の接種がセンチュウ防除に及ぼす効果を調べた。
【００６３】
（１）実験に用いたセンチュウと微生物の株
（i）センチュウ
実施例1と同様の系統を供試した。
（ii）非病原性フザリウム菌
実施例１と同様の菌株を供試した。
（iii）トバモウイルス属の弱毒株
トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を供試した。
【００６４】
（２）育苗と栽培
ピーマンの品種は、ニュー土佐ひかり（南国育種研究農場）を用いた。これを実施例１と同様の性状および施肥条件の砂壌土を１００ｍｌ充てんした口径６０ｍｍ×高さ５７ｍｍのビニルポットに播種した（２００７年３月１２日）。接種後のピーマンの栽培管理場所は実施例１と同様であった。播種１１日後（３月２３日）に、双子葉期のピーマン幼植物を滅菌した砂壌土３００ｍｌを充てんした口径９０ｍｍ×高さ８０ｍｍのビニルポットに改植し、２５℃に温度を管理したガラス室で生育させた。播種２５日後（４月６日）に生育したピーマン幼植物の一部にトウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を接種した。センチュウの接種は、播種より５７日後の５月８日または５月９日に実施した。非病原性フザリウム菌Ｆ１３の接種は、５月７日または５月１０日に行った。センチュウ接種より４１日または４２日後（６月１９日）まで、ガラス室内のベンチ上にポットを静置し、２５〜３０℃で栽培した。
【００６５】
（３）接種源の調製と接種方法
（i）弱毒植物ウイルス系統の調製と接種
トバモウイルス属のトウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株が感染したピーマンの葉を、５０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕した。この磨砕液を、本葉１０枚期程度に生育したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの本葉第５−８葉に接種した。当該ウイルスの接種処理は、研磨剤（４００−６００メッシュ程度のカーボランダム）を葉に振りかけ、前記の磨砕液を脱脂綿に染み込ませて軽くこすりつけることにより行った。ウイルス接種より５日後に接種葉を回収し、トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルス（Ｎｏ．１６株）が感染したＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（接種源）として、本実施例のピーマン幼植物に用いた。接種は研磨剤（４００−６００メッシュ程度のカーボランダム）を葉に振りかけ、前記の磨砕液を脱脂綿に染み込ませて軽くこすりつけることにより行った。
【００６６】
（ii）非病原性フザリウム菌の調製と接種
接種源のＦ１３の菌体は、実施例１で使用したものと同一であり、菌密度は５．６７×１０７ｃｆｕ／ｇ乾燥物であった。接種の直前に、Ｆ１３のフスマ培養物をブレンダーで破砕し、１７ｇを量り取り１２８ｍｌ懸濁液としてピペットでポット当たり６ｍｌを接種した。トマト幼植物（６葉期）へのセンチュウの接種は、ガラス管瓶を用いて、株元から３０ｍｍ外側に直径１０ｍｍ深さ３０ｍｍの穴を６カ所穿ち、調製した懸濁液を各穴に１ｍｌずつ流し込むことにより実施した。したがって、Ｆ１３の接種密度は１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ土壌であった。なお、対照区には同量の滅菌したＦ１３のフスマ培養物の懸濁液を接種した。
【００６７】
（iii）センチュウの調製と接種
接種源のサツマイモネコブセンチュウは、実施例１と同様の系統であり、実施例１と同様の方法で増殖し、第２期幼虫を回収した。最後にメスシリンダーを用い水１ｍｌ中に３１０個体の第２期幼虫を含むセンチュウ懸濁液を調製した。トマト幼植物（６葉期）へのセンチュウの接種は、株元から３０ｍｍ外側にガラス管瓶を用いて直径１０ｍｍ深さ３０ｍｍの穴を２カ所穿ち、調製したセンチュウの懸濁液を各穴に１．５ｍｌずつ流し込むことにより実施した。接種個体数はポット当たり９３０頭であった。
【００６８】
（４）試験区
試験区として下記のとおり６区を設けた。
（i）非Ｖ対照区
ネコブセンチュウの第２期幼虫を２００７年５月８日に土壌接種したもの。
（ii）Ｆ１３＋２区
ネコブセンチュウの第２期幼虫を２００７年５月８日に土壌接種し、非病原性フザリウム菌Ｆ１３を２日後（５月１０日）に土壌接種したもの。
（iii）Ｆ１３−２区
非病原性フザリウム菌Ｆ１３を２００７年５月７日に接種し、ネコブセンチュウの第２期幼虫を２日後（５月９日）に土壌接種したもの。
（iv）弱Ｖ対照区
トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を２００７年４月６日にピーマン幼植物に接種し、センチュウの第２期幼虫を５月８日に土壌接種したもの。
（v）弱Ｖ・Ｆ１３＋２区
トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を２００７年４月６日にピーマン幼植物に接種し、次いで５月８日にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種し、その２日後（５月１０日）に非病原性フザリウム菌Ｆ１３を土壌接種したもの。
（vi）弱Ｖ・Ｆ１３−２区
トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を２００７年４月６日にピーマン幼植物に接種し、次いで５月７日に非病原性フザリウム菌Ｆ１３を接種し、その２日後（５月９日）にセンチュウの第２期幼虫を土壌接種したもの。
【００６９】
各試験区に５反復を設けた。ポットはガラス室のベンチに静置し、２７℃で温度を管理し、（ＨＹＰＯＮＥＸ）５−１０−５：２ｍｌ／Ｌ）を適宜与えながら肥培管理をしつつ、４２日間栽培した。
【００７０】
（５）評価方法
実施例の試験区にセンチュウを接種して４１日または４２日後（２００７年６月１９日）に、各試験区のピーマンを地際部から切断し、根から土壌を払い落とし、ポリエチレン袋に取り除けた。根は水道水で丁寧に洗浄した。
（i）全根系の根こぶ数と卵嚢数
実施例１と同様に計数した。
（ii）土壌２０ｇ当たりのセンチュウ第２期幼虫数
実施例１と同様に計数した。
（iii）草丈
地際から切断したピーマンの切断部から生長点先端までの長さを物差しで測った。
【００７１】
（６）結果
各試験区における根こぶ数、卵嚢数および草丈の算出結果を図６、図７および図８にそれぞれ示す。また、これらに第２期幼虫密度と果実数の算出結果を加えたものを表３に示す。
【００７２】
【表３】
0005168687.tif 000004
【００７３】
図６は、上記試験区の根こぶ数を表す図であるが、理解の便宜のため、根こぶセンチュウが増殖するＦ１３−２条件を割愛し、非病原性フザリウム菌Ｆ１３がネコブセンチュウ第２期幼虫に相対して２日遅く処理される条件と、ウイルスの弱毒株の接種の有無の条件とを二元配置したグラフとして提示した。根こぶ数は、Ｆ１３＋２区で少なく、弱Ｖ・Ｆ１３＋２区でさらに少なかった。このことから、ウイルスの弱毒株と非病原性フザリウム菌が重複感染した場合に、ネコブセンチュウの根への定着を大きく抑制することが示された。
【００７４】
図７は、上記試験区の卵嚢数を表す図であるが、図６と同様に、二元配置グラフとして提示した。卵嚢数は、Ｆ１３＋２区で少なく、弱Ｖ・Ｆ１３＋２区でさらに少なかった。しかし、この減少傾向は根こぶの減少傾向と一致し、根こぶの減少に比例したものであり、２種微生物の重複感染に、根こぶの減少を上回る産卵抑制作用があることを示すものではなかった。
【００７５】
土壌から検出されたネコブセンチュウ第２期幼虫密度（図を省略）は試験区を通じて極めて少なく、未検出の反復が多かった。平均密度は、Ｆ１３＋２区、非Ｖ・Ｆ１３＋２区、非Ｖ対照区とも同等でほぼ１頭であり、弱Ｖ対照区では４頭であった。一方、Ｆ１３−２区からは２３頭と最も多く検出されたが、弱Ｖ・Ｆ１３−２区の検出密度は９頭であった。Ｆ１３が２日早く感染する条件では幼虫の孵化が促進されたが、ウイルスの弱毒株との重複感染には孵化抑制効果があることが示された。
【００７６】
図８は、上記試験区の草丈を表す図であるが、図６と同様に二元配置グラフとして提示した。弱毒株およびＦ１３が単独で感染した場合（非Ｖ・Ｆ１３＋２区、非Ｖ・Ｆ１３−２区、弱Ｖ対照区）のいずれの試験区でもピーマンの草丈は非Ｖ対照区より低かった。一方、弱Ｖ・Ｆ１３＋２区では、非Ｖ対照区と同程度の草丈であった。このことは、ウイルス弱毒株にセンチュウより２日遅い条件でピーマンに感染するようＦ１３を処理することによりピーマンの生育阻害が回避できることを示している。
【００７７】
（補足）
実施例３において観測された根こぶ数、卵嚢数、土壌中の孵化第２期幼虫数の値は、トマトにおける同様の実験で得られる値と比べて極めて低い。この原因には、供試したピーマン（品種）が供試したネコブセンチュウの好適な寄主ではなかった可能性および／または接種時点のピーマンがセンチュウ感染に適さないほど老化していた可能性も考えられるが、下記の実施例５からも明らかなように、ピーマンはトマトに比べてセンチュウが増殖しにくい作物であることに負うところが大きいと考えられる。
【００７８】
（実施例３の総括）
非病原性フザリウム菌Ｆ１３をセンチュウより２日後に接種することの効果としては、根こぶの減少から判断して、ネコブセンチュウの感染の抑制を挙げることができる。
【００７９】
ウイルス弱毒株接種の効果として、(1)根こぶの減少から判断して、ネコブセンチュウの寄生の抑制、(2)卵嚢の減少から判断して、ネコブセンチュウの産卵の抑制が挙げられる。トマトに供試したウイルスの弱毒株（トマトモザイクウイルス弱毒系特Ｌ１１Ａ株）にはセンチュウ害抑制効果は認められなかった（実施例２の弱Ｖ区）のに対し、ピーマンに供試したウイルス弱毒株（トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株）にはセンチュウ害抑制効果が認められたこと（実施例３の弱Ｖ対照区）は特筆すべきことである。
【００８０】
ウイルス弱毒株接種と非病原性フザリウム菌Ｆ１３をセンチュウより２日後に接種の組み合わせの効果として、(1)根こぶの減少から判断して、ネコブセンチュウの感染を抑制すること、(2)ピーマンの生育阻害を大幅に改善することが挙げられる。
【実施例４】
【００８１】
〔トマトにおけるウイルス弱毒株と非病原性フザリウム菌の重複感染のセンチュウ害抑制効果（圃場試験）〕
トバモウイルス属ウイルスの弱毒株をトマト幼苗に接種することと、センチュウの感染に相対して２日遅く感染するタイミングで非病原性フザリウム菌を接種する条件とを組み合わせることによるセンチュウ防除効果を、無加温ビニルハウス栽培において調べた。
【００８２】
（１）実験に用いたセンチュウと微生物の株
（i）センチュウ
サツマイモネコブセンチュウ：メロイドギネ・インコグニータ（Meloidogyne incognita）（山梨県のトマト（品種：踊り子）栽培圃場に由来し、１９９９年に中央農業総合研究センター（つくば）のＣ４特殊圃場のビニルハウスに導入され、以降トマトを連作することにより、このビニルハウス土壌に定着した系統）を用いた。本系統は、センチュウ抵抗性遺伝子（Ｍｉ遺伝子）を組み込んだトマトの品種（ＮＲ品種：Nematode resistant variety）に対する感染能が、感受性品種に対する感染能と同等である、いわゆる‘抵抗性打破系統’である。この系統は、いずれの公的機関にも寄託されていないが、独立行政法人農業・食品産業技術研究機構中央農業研究センター病害虫検出同定法研究チーム  水久保隆之から無償で入手することができる。
（ii）非病原性の微生物
実施例１と同様に、フザリウム・オキシスポラムＦ１３を用いた。
（iii）トバモウイルス属の弱毒株
実施例２と同様に、トマトモザイクウイルスのＬ１１Ａ株を用いた。
【００８３】
（２）育苗と栽培
トマトの品種は、ＮＲ品種（センチュウ抵抗性）である桃太郎（タキイ）を用いた。育苗床土は、クレハ園芸培土と砂質壌土をそれぞれ５０％混和したものを用いた。この床土を口径６０ｍｍ×高さ５７ｍｍの黒色ビニルポット（容積１００ｍｌ）に充てんし、ポット当たり２粒の種子を２００７年３月１２日に播種した。発芽後に間引いて１本立ちの苗に仕立てた。播種より１１日後（３月２３日）に、総ポット数の半数のポットのトマト幼植物にトマトモザイクウイルスの弱毒株を接種した。播種より１８日後（３月３０日）に口径９０ｍｍ×高さ８０ｍｍの黒色ビニルポット（容積３００ｍｌ）に前記の育苗床土を用いて改埴した。播種、育苗、供試微生物の接種、接種後のトマトの育苗管理のすべては、実施例１と同様に、茨城県つくば市観音台３丁目１番１号に所在する中央農業総合研究センターのガラス室において実施した。苗は、２５℃で管理し、５月８日（播種より５７日後）の定植日まで育苗した。
【００８４】
栽培試験は、茨城県つくば市観音台３丁目１番１号に所在する中央農業総合研究センターのＣ４特殊圃場に設置されたビニルハウス（間口７．２ｍ、奥行２５．０ｍ、高さ３．０ｍ）において実施した。ここに０．５ｍ幅の通路を隔てた幅１．０ｍ、長さ２０．０ｍの畝を４本設けた。各畝に高さ２５ｃｍのポリエチレン製の畦波板を２．５ｍごとに埋設し、併せて３２区のマイクロプロットを設けた。１試験プロットの面積は２．５ｍ2であった。これらから１２プロットをランダムに選定し、相互に隔たった試験プロット３枚を反復する試験区を設計した。
【００８５】
試験に供したプロットは、２００７年４月２０日に鍬で耕起した後、１４化性肥料（ＮＰＫ：１４−１４−１４）、苦土石灰および熔成燐肥をプロットごとにそれぞれ２５０ｇ（１００ｋｇ／１０ａ相当）、２５０ｇ（１００ｋｇ／１０ａ相当）および５０ｇ（２０ｋｇ／１０ａ相当）散布して施肥し、鍬で丁寧に混和した。
【００８６】
第１回採土は、耕起直後（４月２０日）に一度に表層から深さ２０ｃｍまでの土壌１００ｍｌを採収できるオーガーを用い、１プロット当たり４点の土壌コア（サブサンプル）の採取（以下、採土と呼ぶ）を行った。採取した４点のサブサンプルを１２号のポリエチレン袋に収納し、収納直後に混和して１サンプルとした。
【００８７】
４月２３日に、手押し式灌注器（共立）を用いて慣行防除に割り当てた試験プロットにＤ−Ｄくん蒸剤を深さ１５ｃｍに３０ｃｍ間隔で２ｍｌ（２０Ｌ／１０ａ相当量）灌注処理し、黒色ビニール製マルチシートで被覆した。灌注より８日後の５月１日に、鍬を用いて耕起し、土壌中に残存するくん蒸剤成分を除去するガス抜き作業を実施した。
【００８８】
第２回採土および第３回（最終）採土は５月７日および７月３１日に前記第１回採土と同様に実施した。
【００８９】
トマトの定植は、２００７年5月8日に畝を被覆した黒ポリマルチの上から、マルチ穴開け機を用いてつくった直径９ｃｍ、深さ９ｃｍの穴に苗を育苗した土壌ごと挿し込み、土寄せすることによって行った。試験プロットの北半分には４本の苗を、条間に５０ｃｍ、株間に６０ｃｍをとって２条植えした。なお、プロットの南側半分には実施例５に記述するピーマンを定植した。定植後に１８０ｃｍの支柱を立てた。
【００９０】
定植後、２００７年７月３１日まで８４日間栽培した。潅水は、畝を覆う黒ポリマルチの下中央に設置した潅水チューブ（スミサンスイＭ３０）によって週に１、２回の頻度で行った。ハウス内気温は、側窓の開閉、大型換気扇による強制換気によって、３５℃以下に保った。この間、芽かき、支柱への誘引、病害虫防除を適宜実施した。
【００９１】
第一花房は定植時の５月８日頃より分化し、５月２１日までに概ね開花した。第２花房、第３花房、第４花房および第５花房の開花期（概ね３花開花）は、それぞれ６月１日前後、６月１１日、６月２５日前後、７月３日前後であった。３花開花した頃に花成ホルモン（トマトトーン）を霧吹きによって処理した。摘果による果実数の調整は行わなかった。試験終了時の７月３１日までに、第４花房の果実はすべて熟したが、第５花房の果実は成熟に至らなかった。
【００９２】
（３）接種源の調製と接種方法
（i）ウイルス弱毒系統の調製と接種
接種源のトバモウイルス属のトマトモザイクウイルス弱毒系統株は、実施例２と同様のＬ１１Ａ株を用いた。接種源は、実施例２と同様に調整し、実施例２と同様の方法を用いて、播種より１１日後（３月２３日）のトマト幼植物に接種した。
【００９３】
（ii）非病原性フザリウム菌の調製と接種
接種源の非病原性フザリウム菌は、実施例１、２、３と同様にＦ１３株を用いた。圃場に処理する接種源は以下のように調整した。すなわち、フスマ２Ｌ、圃場の黒ボク土壌０．８Ｌ、バーミキュライト０．８Ｌ、水道水０．８Ｌを混和し、実施例１に前記のきのこ培養用プラスチックパック（信濃パック）の２つの袋に２Ｌずつ入れた。各パックには、それらの上端の開放口に加熱密封機（シーラー）よる密閉を施した後に、オートクレーブ１２１℃１時間による滅菌を施した。滅菌終了後、直ちに培地のパックをクリンベンチに移して放冷した。続いて、滅菌済の１０ｍｌ注射針を用いて、フザリウムの菌液を１０ｍｌ注入した。注射針が開けたパックの細孔はビニルテープを貼ることによって塞いだ。フザリウムの菌液は、ＰＳ液体培地で培養したものを用いることが望ましいが、本実施例では、直径６ｍｍのプラスチックシャーレに分注した１％ＰＤＡ培地で約２週間培養した培養物を培地とともに５ｍｍ片に細断し、滅菌済み１００ｍｌ三角フラスコに滅菌水３０ｍｌと共に入れ、震盪機を用いて約１時間浸透したものの上澄みを用いた。菌を接種したパックは、恒温器に入れ、２５℃で２週間培養した。培養終了後、２つのパック内の培養物の菌密度をＭＰ培地で検定し、２．４７×１０９ｃｆｕ／ｇ乾燥培養物、１．７４×１０８ｃｆｕ／ｇ乾燥培養物を算出した。トマトの株の移植穴周辺に沿って採土用オーガーで７ｃｍの深さに穴を３か所うがち、穴当たり５ｇ（計１５ｇ）の培養物を入れることにより、１．２×１０１０ｃｆｕ／株を接種した。
【００９４】
（４）試験区
（i）慣行区
センチュウ専用防除剤であるＤ−Ｄくん蒸剤を１０ａ当たり２０Ｌ処理したもの。
（ii）Ｆ１３区
ウイルス無処理苗を定植し、非病原性フザリウム菌Ｆ１３を定植の２日後に株元に混和したもの。
（iii）弱Ｖ区
ウイルスの弱毒株を接種した苗を定植したもの。
（iv）弱Ｖ・Ｆ１３区
ウイルスの弱毒株を接種した苗を定植し、定植の２日後にこの株元に非病原性フザリウム菌Ｆ１３を接種したもの。
【００９５】
試験圃場は、２００６年にヨウ化メチルを処理し、トマトを栽培した跡地であった。したがって、有害、有益の土壌微生物密度が低い土壌であったと考えられた。
【００９６】
（５）評価方法
実施例の試験区に苗を定植して８４日後（２００７年７月３１日）に、各試験区のトマトの茎葉を刈取り、株の中心から半径２０ｃｍの位置に深くシャベルを入れ、直径４０ｃｍ、深さ２５ｃｍの根系を土壌とともに掘り上げた。その場で根から土壌を払い落とし、目視観察により、根こぶ被害度を判定した。また、オーガーを用いて株元から２０ｃｍ外側の位置の土壌を４点採取し、ポリエチレン袋に収納した。
【００９７】
（i）０−１０段階根こぶ階級値
Zeck(Zeck,W.M.(1971):Pflanzenschutz-Nachichten. Bayer AG, 24, 141-144.）の方法に従い、以下の階級値によって根こぶ着生程度を評価した。
０：根こぶが全く認められない。
１：注意深い観察によって、数個の小さな根こぶを認めることができる。
２：１と同様の数個の小さな根こぶがが容易に確認できる。
３：多くの小さな根こぶがあり、そのいくつかは融合している。根の機能はほとんど損なわれていない。
４：多数の小さな根こぶがあり、大きな根こぶもいくつかある。根の多くは機能している。
５：根の２５％に著しく根こぶが着生し、機能していない。
６：根の５０％に著しく根こぶが着生し、機能していない。
７：根の７５％に著しく根こぶが着生し、根の再生能力も失われている。
８：健全な根は皆無であり、植物の養分吸収は阻害されている。茎葉部はまだ青い。
９：完全に根こぶに被われた根系が腐敗しつつある。植物は枯死しつつある。
１０：植物も根も枯死。
【００９８】
（ii）土壌２０ｇ当たりのセンチュウ第２期幼虫数
実施例１と同様の方法によって、計数した。
【００９９】
（iii）収量調査
毎週２回成熟した果実を試験プロットごとに区別して収穫し、果実１個ごとに重量を計量し、第４花房までの総個数を計上した。また、栽培終了後、栽培期間を通じた総個数、総重量、規格別個数を計上した。
【０１００】
（iv）規格基準
ＬＬＬ：２７５ｇ以上
ＬＬ：２５０〜２７４ｇ
Ｌ：２００〜２４９ｇ
Ｍ：１５０〜１９９ｇ
Ｓ：１２５〜１４９ｇ
ＳＳ：１００〜１２４ｇ
ＳＳＳ：８８〜９９ｇ
【０１０１】
（６）結果
各試験区における幼虫密度、根こぶ階級値、株当り総果実重、および果実規格構成率の算出結果を図９、図１０、図１１および図１２にそれぞれ示す。また、これらに果実数の算出結果を加えたものを表４に示す。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
図９は、上記試験区ごとの試験終了時のセンチュウ第２期幼虫の土壌中密度（土２０ｇ当たり）を示すものであるが、弱Ｖ区において密度が著しく高く、ポット試験による実施例２の結果と一致しており、センチュウの増殖を抑制できなかったことが示唆された。本試験では無防除対照区を設けなかったため、弱毒植物ウイルス単独のセンチュウ防除効果の程度は判定できなかった。一方、Ｆ１３区および弱Ｖ・Ｆ１３における密度は低く、Ｆ１３処理がセンチュウの増殖を抑制したことが示された。
【０１０４】
図１０は、上記試験区ごとの根の被害程度（根こぶ階級値）を表す図であるが、弱Ｖ区において被害程度が高く、トマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１Ａの単独感染はネコブセンチュウの根への定着を抑制していないことが示された。一方、Ｆ１３区の被害度は弱Ｖ区より低く、弱Ｖ・Ｆ１３における被害度はさらに低くなった。このことから、トバモウイルスの弱毒株が非病原性フザリウム菌のもつセンチュウ定着阻害機能をさらに高めたことが示された。
【０１０５】
図１１は、試験区ごとの果実総重量（収量）を表す図であるが、Ｆ１３区と弱Ｖ区において収量が低いのに対し、弱Ｖ・Ｆ１３区では慣行防除と同等の収量が確保されており、トバモウイルスの弱毒株が非病原性フザリウム菌のもつセンチュウ定着阻害機能をさらに高めた結果、健全な根が維持され、それが慣行防除（Ｄ−Ｄ剤）と同等の果実総重量をもたらしたと考えられた。
【０１０６】
また、試験区ごとの果実総個数は、慣行防除区において６７、Ｆ１３区において５５、弱毒Ｖ区において５６個、弱Ｖ・Ｆ１３区において７２個であり、前記図１１の総果実重と同様の傾向を示した。このことから、センチュウ加害の負の影響は着果歩留りまたは着花数の減少であることが示された。
【０１０７】
図１２は、試験区ごとの果実規格構成率を表す図である。規格のＳＳＳ，ＳＳおよびＳを小玉として、規格のＭとＬを中玉として、規格のＬＬとＬＬＬを大玉として分類した。すべての試験区に共通して、小玉個数が２５％前後、中玉個数は６０％弱、大玉個数は２０％弱であって、区間の規格構成率には相違がなかった。このことからも、弱Ｖ・Ｆ１３区のセンチュウ防除効果は果実の肥大増進によるものでなく、着花数の増加または結実歩留り向上の効果であると考えることができる。
【実施例５】
【０１０８】
〔ピーマンにおけるウイルス弱毒株と非病原性フザリウム菌の重複感染のセンチュウ害抑制効果（圃場試験）〕
ピーマンに接種したトバモウイルス属ウイルスの弱毒株とセンチュウの感染に相対して２日遅く感染するタイミングで非病原性フザリウム菌を接種することによるセンチュウ防除効果を、無加温ビニルハウス栽培において調べた。
（１）実験に用いたセンチュウと微生物の株
（i）センチュウ
実施例４と同様のサツマイモネコブセンチュウ：メロイドギネ・インコグニータ（Meloidogyne incognita）の‘抵抗性打破系統’を用いた。
（ii）非病原性の微生物
実施例１と同様に、フザリウム・オキシスポラムＦ１３を用いた。
（iii）トバモウイルス属の弱毒株
実施例３と同様に、トウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒系統ウイルスＮｏ．１６株を用いた。
【０１０９】
（２）育苗と栽培
ピーマンの品種は、みおぎ（日本園芸生産研究所育成１９９８年）を用いた。本品種は青枯病、トウガラシマイルドモットルウイルス（Ｐ１．２）に抵抗性の中型品種である。育苗床土は、クレハ園芸培土と砂質壌土をそれぞれ５０％混和したものを用いた。この床土を口径６０ｍｍ×高さ５７ｍｍの黒色ビニルポット（容積１００ｍｌ）に充てんし、ポット当たり２粒の種子を２００７年３月１２日に播種した。発芽後に間引いて１本立ちの苗に仕立てた。播種より１５日後（３月２７日）に、総ポットの半数のピーマン幼植物にトウガラシマイルドモットルウイルスの弱毒株を接種した。播種より２５日後（４月６日）に口径９０ｍｍ×高さ８０ｍｍの黒色ビニルポット（容積３００ｍｌ）に前記の育苗床土を用いて改埴した。播種、育苗、供試微生物の接種、接種後のトマトの育苗管理のすべては、実施例１と同様に、茨城県つくば市観音台に所在する中央農業総合研究センターのガラス室において実施した。苗は、５月８日（播種より５７日後）の定植日まで毎日灌水しながら、２５℃で管理した。
【０１１０】
栽培試験場所は、実施例４と同一であり、試験プロットも実施例４と同一であった。施肥、土壌サンプルの採取法と採取時期、慣行防除区の消毒薬剤、消毒時期のすべては実施例４と共通であった。
【０１１１】
ピーマンの定植は、実施例４で設定したトマトの試験プロットの南側半分の面積に、実施例４のトマトと同様の条間５０ｃｍ、株間６０ｃｍの間隔で２条植えした。栽培、灌水、温度に関する管理は実施例４のトマトと同様に実施した。
【０１１２】
（３）接種源の調製と接種方法
（i）ウイルス弱毒系統の調製と接種
接種源のトバモウイルス属のトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒系統株は、実施例３と同様のＮｏ．１６株を用いた。接種源は、実施例３と同様に調整し、実施例３と同様の方法を用いて、播種より１５日後（３月２７日）のピーマン幼植物に接種した。
（ii）非病原性フザリウム菌の調製と接種
接種源の非病原性フザリウム菌は、実施例１、２、３および４と同一のＦ１３株を用いた。圃場に処理する接種源の調整は実施例４に記載した方法と同様に行った。接種は実施例４に記載された方法と同様に行った。
【０１１３】
（４）試験区
（i）慣行区
センチュウ防除用くん蒸剤であるＤ−Ｄくん蒸剤を１０ａ当たり２０Ｌ処理したもの。
（ii）弱毒Ｖ区
ウイルスの弱毒株を接種した苗を定植したもの。
（iii）Ｆ１３区
ウイルス弱毒株を処理しない苗を定植し、非病原性フザリウム菌Ｆ１３を定植の２日後に株元に混和したもの。
（iv）弱Ｖ・Ｆ１３区
ウイルスの弱毒株を接種した苗を定植し、定植の２日後にこの株元に非病原性フザリウム菌Ｆ１３を接種したもの。
【０１１４】
（５）評価方法
実施例の試験区に苗を定植して８４日後（２００７年７月３１日）に、各試験区のピーマンの茎葉を刈取り、株の中心から半径２０ｃｍの位置に深くシャベルを入れ、直径４０ｃｍ、深さ２５ｃｍの根系を土壌とともに掘り上げた。その場で根から土壌を払い落とし、目視観察により、根こぶ被害度を判定した。また、実施例４と同様にオーガーを用いて株本から２０ｃｍ外側の位置の土壌を採取し、ポリエチレン袋に収納した。
（i）０−１０段階根こぶ階級値
実施例４に記載した方法により評価した。
（ii）土壌２０ｇ当たりのセンチュウ第２期幼虫数
実施例１と同様の方法によって計数した。
（iii）収量調査
成熟した果実を毎週２回試験プロットごとに区別して収穫し、果実１個ごとに計量し、総個数を計上した。７月１２日から７月３０日までの１８日間の収穫を集計して総果実個数、総重量を計上した。
【０１１５】
（６）結果
各試験区における幼虫密度、根こぶ階級値および株当り総果実重の算出結果を、図１３、図１４および図１５にそれぞれ示す。また、これらに果実数の算出結果を加えたものを表５に示す。
【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
図１３は、上記試験区ごとの試験終了時のセンチュウ第２期幼虫の土壌中密度（土２０ｇ当たり）を示すものであるが、トマトを用いた実施例４の結果と同様に、弱毒Ｖ区において密度が最も高かった。本試験では無防除対照区を設けなかったため、弱毒植物ウイルス単独のセンチュウ防除効果の程度は不明である。Ｆ１３区における密度は弱Ｖ区より低く、Ｆ１３処理がセンチュウの増殖を抑制したことが示された。弱Ｖ・Ｆ１３区の密度は弱毒Ｖ区より低い傾向があるものの、両区間に有意な差はなかった。生物資材微生物感染処理３区（Ｆ１３区、弱毒区、弱毒Ｖ・Ｆ１３区）でのすべてでセンチュウ害が抑制されており、これら３区の幼虫密度には大差がないと見なすことができる。
【０１１８】
図１４は、上記試験区ごとの根の被害度（根こぶ階級値）を表す図であるが、微生物を用いた３区（Ｆ１３区、弱毒区、弱毒Ｖ・Ｆ１３区）を通じて、注意して探さなければならないほどの極めてわずかな根こぶの着生量であった。幼虫密度と同様に、微生物が感染した３区のすべてで根こぶが大きく抑制されており、これら３区の根こぶ発生量には差がないと考えられた。このような低い被害度においても、弱Ｖ・Ｆ１３における根こぶ階級値は、弱Ｖ区およびＦ１３区より低い傾向が認められ、トバモウイルスの弱毒株と非病原性フザリウム菌のセンチュウ定着阻害に及ぼす共力作用が示された。
【０１１９】
図１５は、試験区ごとの果実総重量（収量）を表す図であるが、Ｆ１３区と弱Ｖ区において収量が低いのに対し、弱Ｖ・Ｆ１３区ではやや収量が回復する傾向があり、トバモウイルスの弱毒株と非病原性フザリウム菌の重複感染によるセンチュウ防除共力作用が示された。
【０１２０】
また、試験区ごとの果実総個数の平均値は、慣行防除区において１１１、Ｆ１３区において８１、弱毒Ｖ区において９６個、弱毒Ｖ・Ｆ１３区において９６個であり、Ｆ１３単独感染でもっとも着果数が少なかったが、さらに弱Ｖが重複感染すると回復することが示された。
【０１２１】
以上、本発明の実施例は、系統発生上隔たった２種の感染力を有する微生物（非病原性糸状菌（フザリウム菌）と弱毒植物ウイルス）が第３者の感染者たるネコブセンチュウの増殖を抑制し、センチュウ害の表象たる根こぶの形成を阻害する現象の存在を明示するとともに、農業生産者が作物を栽培する農業生産の場に積極的意思を持ってこの現象を発現させる方策を講じるならば、作物のネコブセンチュウ害の大幅な軽減に実効ある応用技術が成立する可能性を示す。この可能性は上記実施例４および５によって実証された。すなわち、ビニルハウス圃場に栽培する２種ナス科作物（トマトとピーマン）に非病原性フザリウム菌と弱毒植物ウイルスを実施例３において明示された感染条件に準じて施し、営利的農業で行われる栽培期間に準じた長期栽培条件において、ネコブセンチュウの被害の直接的表象たる根こぶの被害度（根こぶ指数）、ネコブセンチュウ被害の経済的表象たる果実収量（具体的には果実重量）、土壌中のセンチュウ幼虫密度を、感染条件が満たされない試験区と比較し、非病原性フザリウム菌と弱毒植物ウイルスの共力作用によるネコブセンチュウの生物的防除の実効性を明示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、ネコブセンチュウが寄生し、固有のウイルス病やフザリウム病を持つ植物に広く適用可能である。本発明により、非病原性糸状菌および弱毒植物ウイルスの需要が創出され、市場化に道が拓けて、これらの製造・流通に係る経済活動が大きく展開すると期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】トマトポット栽培におけるＦ１３感染タイミングのネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の根こぶの数により示す。
【図２】トマトポット栽培におけるＦ１３感染タイミングのネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の卵嚢数により示す。
【図３】トマトポット栽培におけるＦ１３感染タイミングのネコブセンチュウに対する防除効果を第２期幼虫の土壌中密度により示す。
【図４】トマトポット栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の単独ならびに重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の根こぶの数により示す。
【図５】トマトポット栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の単独ならびに重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の卵嚢数により示す。
【図６】ピーマンポット栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の単独ならびに重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の根こぶの数により示す。
【図７】ピーマンポット栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の単独ならびに重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を全根系の卵嚢数により示す。
【図８】ピーマンポット栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の単独ならびに重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を草丈により示す。
【図９】トマトビニルハウス栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を第２期幼虫の土壌中密度により示す。
【図１０】トマトビニルハウス栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を０−１０段階根こぶ階級値により示す。
【図１１】トマトビニルハウス栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を総果実重により示す。
【図１２】トマトビニルハウス栽培におけるトマトモザイクウイルス弱毒株Ｌ１１ＡとＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を果実サイズ規格の分布頻度により示す。
【図１３】ピーマンビニルハウス栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を第２期幼虫の土壌中密度により示す。
【図１４】ピーマンビニルハウス栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を０−１０段階根こぶ階級値により示す。
【図１５】ピーマンビニルハウス栽培におけるトウガラシマイルドモットルウイルス弱毒株Ｎｏ．１６とＦ１３の重複接種のネコブセンチュウに対する防除効果を総果実重により示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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