(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
総ポリフェノールに対して少なくとも１０重量％のフロリジン、およびクロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２およびクエルシトリンよりなる群から選択される１またはそれを超えるものを含む少なくとも２０重量％のポリフェノールを含むバラ科（Rosacea）植物の成熟リンゴ果実から得た画分であって、ここに該画分が
（i）粉砕した成熟リンゴで出発し、
（ii）１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついで
（iii）その固形エクストラクトを乾燥させ、その後、さらに有機溶媒での抽出を行ってポリフェノール性画分を得る
ことを含む調製方法によって調製される該画分。
【請求項２】
総ポリフェノールに対して１０ないし７０重量％のフロリジンを含む請求項１記載の画分。
【請求項３】
ｐ−クマル酸を含有する請求項１または２記載の画分。
【請求項４】
フロレチンを含有する請求項１ないし３いずれか１項記載の画分。
【請求項５】
ジヒドロカルコン（フロリジンおよびフロレチン）がヒドロキシケイ皮酸（コーヒー酸、クロロゲン酸およびｐ−クマル酸）に対して４０重量％以上の比率で存在する請求項１ないし３いずれか１項記載の画分。
【請求項６】
総ポリフェノールに対して少なくとも１０重量％のフロリジン、およびクロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２およびクエルシトリンよりなる群から選択される１またはそれを超えるものを含む少なくとも２０重量％のポリフェノールを含むバラ科（Rosacea）植物の成熟リンゴ果実から得た画分であって、ここに該画分が
（i）粉砕した成熟リンゴで出発し、
（ii）１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついで
（iii）その固形エクストラクトを酵素的に液化して液体エクストラクトを得、ついでそれをクロマトグラフィーによって処理してポリフェノール性画分を得る
ことを含む調製方法によって調製される該画分。
【請求項７】
総ポリフェノールに対して１０ないし７０重量％のフロリジンを含む請求項６記載の画分。
【請求項８】
ｐ−クマル酸を含有する請求項６または７記載の画分。
【請求項９】
フロレチンを含有する請求項６ないし８いずれか１項記載の画分。
【請求項１０】
ジヒドロカルコン（フロリジンおよびフロレチン）がヒドロキシケイ皮酸（コーヒー酸、クロロゲン酸およびｐ−クマル酸）に対して４０重量％以上の比率で存在する請求項６ないし９いずれか１項記載の画分。
【請求項１１】
請求項１ないし５いずれか１項記載の画分を含むニュートラシューティカル組成物。
【請求項１２】
請求項６ないし１０いずれか１項記載の画分を含むニュートラシューティカル組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし５いずれか１項記載の画分を含む、紫外線に対する保護用の剤。
【請求項１４】
請求項６ないし１０いずれか１項記載の画分を含む、紫外線に対する保護用の剤。
【請求項１５】
請求項１ないし５いずれか１項記載の画分を含む抗オキシダント組成物。
【請求項１６】
請求項６ないし１０いずれか１項記載の画分を含む抗オキシダント組成物。
【請求項１７】
請求項１ないし５いずれか１項記載の画分を含有する化粧組成物。
【請求項１８】
請求項６ないし１０いずれか１項記載の画分を含有する化粧組成物。
【請求項１９】
総ポリフェノールに対して少なくとも１０重量％のフロリジン、およびクロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２およびクエルシトリンよりなる群から選択される１またはそれを超えるものを含む少なくとも２０重量％のポリフェノールを含むバラ科（Rosacea）植物の成熟リンゴ果実から得た画分を調製する方法であって、粉砕した成熟リンゴで出発し、１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついでその固形エクストラクトを乾燥させ、その後、さらに有機溶媒での抽出を行ってポリフェノール性画分を得ることを特徴とする該方法。
【請求項２０】
総ポリフェノールに対して少なくとも１０重量％のフロリジン、およびクロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２およびクエルシトリンよりなる群から選択される１またはそれを超えるものを含む少なくとも２０重量％のポリフェノールを含むバラ科（Rosacea）植物の成熟リンゴ果実から得た画分を調製する方法であって、粉砕した成熟リンゴで出発し、１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついでその固形エクストラクトを酵素的に液化して液体エクストラクトを得、ついでそれをクロマトグラフィーによって処理してポリフェノール性画分を得ることを特徴とする該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、果物からのフェノール画分およびこの画分を得る方法に関する。このエクストラクトは抗オキシダント化合物、フロリジンに富み、化粧、食餌療法またはニュートラシューティカル調製物として使用し得る。
【０００２】
【従来の技術】
ポリフェノール性化合物は植物界に比較的広範にかつ多量に存在することが知られている。特に、バラ科（Rosacea）植物においては、リンゴのポリフェノールの分析により少なくとも３７のフェノール性化合物が同定されており、そのうち最も豊富に存在するものはクロロゲン酸、プロシアニジンＢ１およびＢ２、エピカテキン、フロレチン、フロリジンおよびｐ−クマル酸である。これらの化合物の幾つかのものは、抗オキシダント、抗突然変異、抗アレルギー、抗癌および抗糖尿病特性などのごとき生理学的特性を有する。
【０００３】
多くの他のポリフェノール−リッチな製品が市販されており、最も一般的なものは緑茶、ブドウ種子およびマツ樹皮から抽出されるものである（米国特許第４６９８３６０号、ＥＰ  Ａ３４８７８１号、ＥＰ  Ａ２８３３４９号、ＦＲ  Ａ１４２７１００号、ＦＲ  Ａ２０９２７４３号、ＦＲ  Ａ２６４３０７３号およびＦＲ  Ａ２３７２８２３号）。特許ＥＰ  Ａ０６５７１６９号は、バラ科植物の未熟果実からのポリフェノール画分の抽出をすでに開示している（３ないし１０ｇ計量）。かく定義されるポリフェノール性画分は、多量のヒドロキシケイ皮酸族（クロロゲン酸、コーヒー酸、およびｐ−クマル酸）の誘導体およびフラボノール族（カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン）からの分子の誘導体を含むことによって特徴付けられる。未熟果実の果汁から得たエクストラクトの高速液体クロマトグラフィーによる分析は、フロリジンは総フェノール性化合物の７重量％未満を表し、９％未満のジヒドロカルコン（フロリジンおよびフロレチン）を表すことを示している。
【０００４】
フェノール性化合物の中では、フロレチンおよびそのグリコシル化誘導体、フロリジンがリンゴおよびバラ科植物の他の果実の典型的なものである。特に、フロリジンは種子中に多量に見出されるが、リンゴ果汁および果皮中にも存在する。フロリジンは抗オキシダント活性を有し、エストロゲンに類似する心血管保護を許容する。さらに、フロリジンはチロシナーゼを含む酵素のカスケードを活性化することによってメラニン形成に作用することができ、したがって、紫外線に対する高い保護を許容する。フロリジンは、グルコース、ガラクトースなどのごとき代謝物のナトリウム依存性血液輸送を競合的に阻害することによって、抗糖尿病作用も有する。フロリジンは、プロテインキナーゼＣの活性をブロックすることによって腫瘍細胞の増殖を阻害することにも関与する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、リンゴ（ホモジネートまたは果汁）中には、他のポリフェノールに対してジヒドロカルコン（フロレチンおよびフロリジン）は少量しか存在しない。クロロゲン酸およびプロシアニジンは、ジュース用リンゴであるか生食用リンゴであるかにかかわらず、リンゴ中の主要ポリフェノールであり、フロリジンおよびフロレチンが成熟ジュース用リンゴの総ポリフェノールの５重量％を超えて表されることはない（１５の異なる品種の分析）（図１および２）。
【０００６】
公知のポリフェノール性エクストラクトにおいては、種々の出発物質中に存在する比率と比較して種々のフェノール性分子間の比率が保存されているが、抽出の間に消失するかまたは分解するポリマー性プロシアニジンに関しては例外である。
【０００７】
したがって、ヒドロキシケイ皮酸（コーヒー酸、クロロゲン酸およびクマル酸）およびフラボノール（カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン）には富むが、ジヒドロカルコン（フロリジンおよびフロレチン）に乏しいポリフェノール性エクストラクトが慣用的に得られている（図３を参照されたい）。
【０００８】
【表１】
0005192110.tif 000002
【０００９】
ε＝定量不可能な量
＊＝３回収集した１５品種のジュース用リンゴおよび３品種の生食用リンゴに対する測定から収集した値
【００１０】
Karadeniz F & Ekski A.  Phenolic compounds in apple juice from different varieties.  Report-Scientific Technical Com. Int. Fed. Fruit Juice Producers, (1996), 24, pp. 265-275.
Sanoner P., Guyot S., Marnet N. and Drilleau J. F.  Polyphenolic profiles of French cider apples varieties. In "Polyphenols, wines and health", synposium, Bordeaux (14-16 April, 1999).
Sasoner P., Guyot S., Marnet N. Molle D. and Drilleau J. F.  Polyphenol profiles of French cider apples varieties.  J. Agric. Food Chem. (1999), 47, pp. 4847-4853.
【００１１】
リンゴには、たとえ存在するとしても非常に少量のコーヒー酸しか天然に存在しない。おそらく、実際は、コーヒー酸はクロロゲン酸の分解産物である（Fiedler, 1954, Arzneimittel-Forsch, 4, 41）。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、本発明の主題をなす新規なフェノール性画分を開発した。
すなわち、本発明は、その第１の態様として、総ポリフェノールに対して少なくとも１０重量％のフロリジンを含む少なくとも２０％のポリフェノールを含むことによって特徴付けられるバラ科の果実から得た画分を提供する。
また、本発明は、その第２の態様として、総ポリフェノールに対して１０ないし７０重量％のフロリジンを含むことによって特徴付けられる第１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第３の態様として、クロロゲン酸を含有することによって特徴付けられる第１または第２の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第４の態様として、クロロゲン酸の重量に対するフロリジンの重量比が１以上である第１ないし第３いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第５の態様として、エピカテキンを含有することによって特徴付けられる第１ないし第４いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第６の態様として、プロシアニジンＢ２を含有することによって特徴付けられる第１ないし第５いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第７の態様として、エピカテキンの重量に対するフロリジンの重量比が９よりも大きいことを特徴とする第１ないし第６いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第８の態様として、クエルシトシンを含有することによって特徴付けられる第１ないし第７いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第９の態様として、ｐ−クマル酸を含有することによって特徴付けられる第１ないし８いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１０の態様として、コーヒー酸の重量に対するフロリジンの重量比が４よりも大きくなるような量のコーヒー酸を含有することによって特徴付けられる第１ないし第９いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１１の態様として、コーヒー酸の重量比が総ポリフェノールの１％未満を表すことによって特徴付けられる第１０の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１２の態様として、フロレチンを含有することによって特徴付けられる第３ないし第１１いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１３の態様として、ジヒドロカルコン（フロリジンおよびフロレチン）がヒドロキシケイ皮酸（コーヒー酸、クロロゲン酸およびｐ−クマル酸）に対して４０重量％よりも大きい比率で存在することによって特徴付けられる第３ないし第１１いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１４の態様として、少なくとも１０％のフロリジン、クロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、クエルシトリン、ｐ−クマル酸およびコーヒー酸を含む少なくとも２０重量％の総ポリフェノールを含有することによって特徴付けられる第１ないし第１３いずれか１の態様の組成物を提供する。
また、本発明は、その第１５の態様として、５０重量％を超える総ポリフェノールを含有することによって特徴付けられる第１ないし第１４いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１６の態様として、粉末化形態であることによって特徴付けられる第１ないし第１５いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１７の態様として、粉末１ｇ当りに少なくとも１０％のフロリジンを含有することによって特徴付けられる第１６の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第１８の態様として、粉末１ｇ当りに１０ないし７０％のフロリジンを含有することによって特徴付けられる第１６の態様の画分。
また、本発明は、その第１９の態様として、粉砕したリンゴで出発し、１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついでその固形エクストラクトを乾燥させ、その後、さらに有機溶媒での抽出を行ってポリフェノール性画分を得ることを特徴とする第１ないし第１８いずれか１の態様の画分を調製する方法を提供する。
また、本発明は、その第２０の態様として、粉砕したリンゴで出発し、１またはそれを超える固／液抽出を行い、ついでその固形エクストラクトを酵素的に液化して液体エクストラクトを得、ついでそれをクロマトグラフィーによって処理してポリフェノール画分を得ることによって特徴付けられる第１ないし第１８いずれか１の態様の画分を調製する方法を提供する。
また、本発明は、その第２１の態様として、固形エクストラクトに対してからろうを除去する（dewaxing）工程を行うことによって特徴付けられる第１９または２０の態様の画分を調製する方法を提供する。
また、本発明は、その第２２の態様として、最終乾燥を行うことによって特徴付けられる第１９ないし２１いずれか１の態様の画分を調製する方法を提供する。
また、本発明は、その第２３の態様として、成熟リンゴの抽出を行うことによって特徴付けられる第１９ないし第２２いずれか１の態様の画分を調製する方法を提供する。
また、本発明は、その第２４の態様として、マルス・シルベストリス・ミル（Malus sylvestris Mill）リンゴの抽出を行うことによって特徴付けられる第１９ないし２３いずれか１の態様の方法を提供する。
また、本発明は、その第２５の態様として、第１９ないし第２４いずれか１の態様の方法によって得ることができることによって特徴付けられる第１ないし第１８いずれか１の態様の画分を提供する。
また、本発明は、その第２６の態様として、第１ないし第１８および第２５いずれか１の態様の組成物を含む食餌療法またはニュートラシューティカル組成物を提供する。
また、本発明は、その第２７の態様として、紫外線に対する保護剤としての、第１ないし第１８および第２５いずれか１の態様の画分の使用を提供する。
また、本発明は、その第２８の態様として、抗オキシダントとしての、第１ないし第１８および第２５いずれか１の態様の画分の使用を提供する。
さらに、本発明は、その第１ないし第１８および第２５いずれか１の態様の画分を含有することによって特徴付けられる化粧組成物を提供する。
他の目的に関しては、下記の発明の詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によるポリフェノール性画分は、少なくとも２０重量％、好ましくは５０重量％のポリフェノールを含み、そのうちの少なくとも１０重量％、好ましくは１０〜７０重量％はフロリジンからなる。このエクストラクトは、クロロゲン酸、エピカテキン、プロシアニジンＢ２、クエルシトリン（quercitrin）ｐ−クマル酸およびフロレチンをもその組成物中に含み得る。
特に好ましいこのポリフェノール性画分である１の組成物は：重量％で
−２０重量％、好ましくは５０重量％を超える総ポリフェノール
−フロリジンとして少なくとも３０重量％、好ましくは３０〜４０重量％のポリフェノール
−クロロゲン酸として１１重量％以下、好ましくは２〜１１重量％のポリフェノール
−エピカテキンとして４重量％以下のポリフェノール
−プロシアニジンＢ２として２重量％以下のポリフェノール
クエルシトリンとして１.５重量％以下のポリフェノール
−ｐ−クマル酸として０.４重量％以下のポリフェノール、および
−コーヒー酸として０.２重量％未満のポリフェノール
を含む。
【００１４】
本発明のもう１の主題は、コーヒー酸が、存在するフロリジンの２０重量％未満の重量比率で存在するものである。好ましくは、コーヒー酸はエクストラクト中の総ポリフェノールの１重量％未満を表す。フロリジンの比率はカテキンのものよりも重量で９倍大きい。存在するフロリジンの量はクロロゲン酸のものと少なくとも等しい重量である。
【００１５】
本発明のもう１の主題は、それがフロレチンを含有することによって特徴付けられる。酸加水分解を制御することにより、実質的に全てのフロリジンをより水溶性が低いフロレチンに変換し得る。
【００１６】
もう１の主題は、ジヒドロカルコンがヒドロキシケイ皮酸に対して４０重量％以上の比率で存在することによって特徴付けられる。
成熟リンゴからジヒドロカルコン−リッチなポリフェノール性画分を選択的に抽出する抽出方法は、以下の工程を含むことによって特徴付けられる：
・破砕したリンゴを、添加した水の存在または不存在下で、１またはそれを超える固／液抽出に付す。
・ついで、得られた湿固形エクストラクトを乾燥するかまたは酵素的に液化して、液体エクストラクトを得る。
・乾燥固形エクストラクトを、純粋または水との混合液としての極性有機溶媒、好ましくはＣ１−Ｃ４脂肪族アルコールを用いる１０分間ないし２時間にわたるさらなる抽出に付して、有機エクストラクトを得る。
・この有機エクストラクトを、好ましくは減圧下にて、６０℃以下の温度にて蒸発乾固させる。
・ついで、この残渣を水に採り、その後それを、数回、好ましくは４回、水−非混和性溶媒、好ましくは酢酸エチル、酢酸メチルまたは酢酸プロピルを用いて奪う。
・得られた有機溶液を一緒に混合し、６０℃未満、好ましくは５０℃未満の温度にて蒸発乾固させて本発明の主題であるポリフェノール性画分を得る。
・もう１の経路を介して、湿潤固形エクストラクトを酵素混合物の存在下、３０ないし５０℃、好ましくは４０ないし４５℃の温度にて１ないし４時間、水と混合して液体エクストラクトを得る。
・この液体抽出物を遠心または濾過、ついで限外濾過によって清澄化する。
・そのエクストラクトを、スチレン−ジビニルベンゼン型の吸着樹脂を充填したクロマトグラフィー・カラムに負荷する。その樹脂を酸性化した水で洗浄して不純物および残渣糖を除去する。ついで、ポリフェノールを、４０ないし７０重量％、好ましくは５０ないし６０重量％のエタノールを含有するアルコール水溶液で溶出する。メタノールおよびブタノールのごとき他のＣ１−Ｃ４脂肪族アルコールも用い得る。
・必要なら、当該方法の間にからろうを除去する工程を導入する。
・抽出によって得た生成物を最後に水に採り、ついで好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させて、少なくとも２０重量％のポリフェノール、好ましくは５０重量％を超えるポリフェノールを含有するベージュ色の粉末を得る。このポリフェノールの１０重量％、好ましくはポリフェノールの１０ないし７０％はジヒドロカルコン、好ましくはフロリジンである。
【００１７】
画分は、上記の方法によって、好ましくはバラ科植物の成熟リンゴ、詳細にはマルス・シルベストリス・ミル（Malus sylvestris Mill）から得る。
前述の特徴を有し、前記の方法に従って得た食用リンゴのこのエクストラクトは、食餌療法またはニュートラシューティカル補助剤として使用し得る。
本発明によるジヒドロキシカルコン−リッチなフェノール性画分は、紫外線に対する保護用の剤としての特性を有する。
本発明によるジヒドロカルコン−リッチなフェノール性画分は抗オキシダント特性を有する。
本発明の主題は、とりわけ前記のジヒドロキシカルコン−リッチなポリフェノール性画分を含む化粧組成物でもある。
本発明による組成物は、摂食するかまたは皮膚に適用し得る。投与の様式に従って、本発明による組成物は化粧品において通常用いられるいずれの形態でも存在し得る。
本発明による組成物は、とりわけ、ゲルカプセル剤、ミルク、ローション、クリーム、ゲルまたは飲料の形態で存在し得る。
【００１８】
本発明のニュートラシューティカル、食餌療法または化粧組成物は、それらが意図する適用に従って慣用的に処方される。
以下の実施例は本発明を説明するものであって、如何なる場合においてもそれを限定するものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１：リンゴのポリフェノール性画分を抽出するためのプロトコールＮｏ.１
種マルス・シルベストリス・ミルのリンゴを以下の抽出処理に付した；
リンゴを粉砕し、そのホモジネートを約２０重量％の水の存在下で攪拌する。
・第２の工程からのいまだ湿潤形態である固形エクストラクトを乾燥させ、ついで９０／１０の重量比率のメタノール／水混合液中で２時間処理する。
・その有機エクストラクトを減圧下、約５０℃の温度にて蒸発乾固する。
・その蒸発残渣を水に採り、ついで得られた水溶液を酢酸エチル、水−非混和性溶媒で４回奪う。
・得られた有機溶液を一緒に混合し、約４５℃の温度にて蒸発させて乾燥エクストラクトを得る。
・乾燥エクストラクトを最後に採集乾燥用の水に採り、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥によって微細なベージュ色の部分水溶性の粉末を得る。
【００２０】
その純粋標準に対する各分子の濃度の高速液体クロマトグラフィーによって得たこのエクストラクトのポリフェノール性組成は以下のとおりである（図４）。
かくして、各エクストラクトにおいて、以下の濃度が測定された：
【００２１】
【表２】
0005192110.tif 000003
【００２２】
この抽出方法によって得たフェノール性画分は特にフロリジンに富むことが判明した。それは、ヒドロキシ桂皮酸族の酸、より詳細にはクロロゲン酸に乏しいという特徴を有する。それは、フラボノール族の酸（カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ１、Ｂ２ほか）にも乏しく、それはリンゴについて記載したものとは全体的に異なる元のフェノール性プロフィールに通じ、成熟リンゴを用いて標準的方法によって得たフェノール性プロフィールとは全体的に異なる。
【００２３】
得られた粉末は、標準としてクロロゲン酸を用いて、フォリン−シオカルト比色定量分析法によって、総ポリフェノールの５５重量％の力価を有する。この方法は、フォリン−シオカルト試薬を用いる（リファレンス９００１、Merck）。簡単には、この試薬はリンタングステン酸およびリンモリブデン酸の混合物よりなり、これはフェノールの酸化の間にタングステンおよびモリブデンの青色酸化物の混合物に還元される。発色は存在するフェノール性化合物の含量に比例する。
【００２４】
クロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィーによって得たプロフィールを統合すると、値をフロリジン等価またはクロロゲン酸等価として表すかに依存して、各々、総ポリフェノールの４９重量％ないし６７重量％の力価を有する。
【００２５】
実施例２：リンゴのポリフェノール性画分を抽出するためのプロトコールＮｏ．２
種マルス・シルベストリス・ミルのリンゴを以下の抽出処理に付した：
・リンゴを破砕し、そのホモジネートを約２０％の水の存在下で攪拌する。
・そのホモジネートを一連の固／液抽出に付して、糖リッチな液体画分を除去する。
・その湿固形エクストラクトを、ペクチン溶解、ヘミセルロース溶解およびセルロース溶解活性に富む酵素混合物の存在下、約４５℃の温度にて約２時間、水と混合して液体エクストラクトを得る。
・その液体エクストラクトを遠心または濾過、ついで限外濾過によって清澄化する。
・ついで、その清澄液体エクストラクトを、スチレン−ジビニルベンゼン型の吸着樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムに負荷する。
・その樹脂を酸性化した水で洗浄して、不純物および残渣糖を除去する。
・ついで、６０重量％のエタノールを含有するアルコール水溶液でポリフェノールを溶出する。
・得られたポリフェノール性溶液を濃縮し、ついで噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させて微細なベージュ色粉末を得る。
【００２６】
その純粋標準に対する各分子の濃度の高速液体クロマトグラフィー測定によって得たこのエクストラクトのポリフェノール組成は以下のとおりである（図５）：
【００２７】
【表３】
0005192110.tif 000004
【００２８】
得られた粉末は、標準としてクロロゲン酸を用いるフォリン−シオカルト比色定量分析法によって、総ポリフェノールの５０重量％の力価を有する。
この抽出方法によって得たフェノール性画分は特にフロリジンに富むことが判明した。実施例１のエクストラクトと同様、この画分は、ヒドロキシ桂皮酸族の酸、より詳細にはクロロゲン酸に乏しいという特徴を有する。それは、フラボノール（カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ１、Ｂ２ほか）にも乏しい特徴も有し、それはリンゴについて記載したものとは全体的に異なる元のフェノール性プロフィールに通じ、成熟リンゴを用いて標準的方法によって得たフェノール性プロフィールとは全体的に異なる。
【００２９】
実施例１に対して、少量のコーヒー酸が存在し、これは存在するフロリジンの量の４重量％のみを表す。
高速液体クロマトグラフィーによって得たプロフィールを統合すると、値をフロリジン等価またはクロロゲン酸等価として表すかに依存して、各々、総ポリフェノールの２９重量％ないし４０重量％の力価を有する。
【００３０】
実施例３：リンゴのポリフェノール性画分を抽出するためのプロトコールＮｏ．３
本発明によるフロリジン−リッチなポリフェノール性エクストラクトは、最終乾燥工程の前に修飾し得る。この方法は、鉱酸（約ｐＨ３まで希釈した）存在下のフロリジン（フロレチン  ２'−β−グルコシド）のフロレチンへの制御された酸加水分解からなる。乾燥後に得られた粉末は、水溶性に乏しい（非常に低溶解性のフロレチン）が、有利な抗オキシダント活性を有する。
【００３１】
実施例４：本発明によるフロリジン−リッチなポリフェノール画分の抗オキシダント（またはフリーラジカル・スキャベンジング）活性
ポリフェノール性エクストラクトのフリーラジカル・スキャベンジング活性の測定は、わずかに修飾したBrand−Williamsら（1995）およびLuおよびFoo（2000）によって記載されたＤＰＰＨ（１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）方法（Brand−Williams W., Cuvelier, M. E. and Berset C.（1995）Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 28, pp. 25-30. Lu Y. and Foo L. Y.（2000）Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace.  Food Chemistry, 68, pp. 81-85.）。
【００３２】
原理は、操作条件下で安定である発色ラジカルであって、標準化した条件下で、抗オキシダント・エクストラクトの存在下のインキュベートの間にその濃度が低下する、ＤＰＰＨ°の残存量を測定するものである。詳細には、抗オキシダント活性を有するエクストラクトはＤＰＰＨ°ラジカルをＤＰＰＨ２に還元する。抗酸化活性は、参考分子、トロロックス（水溶性ビタミンＥアナログ）の活性に対して表す。
【００３３】
６ｍｇのＤＰＰＨ°を７５体積％でメタノール水溶液１００ｍｌに注意深く溶解する。平行して、分析すべき試料の正確な量および１８ｍｇのトロロックスを７５％のメタノール性溶液２５ｍｌに溶解する。２ｍｌのＤＰＰＨ°溶液を測定すべき２５μｌの溶液と、リークタイト・フラスコ中、３７±０.５℃の温度にて６時間インキュベートする。溶液の発色強度の低下は、ｔ＝０分、ｔ＝５分およびｔ＝６時間に、５１５ｎｍの波長で測定する。活性は、６時間インキュベートした後のナノモルのトロロックス等価／生成物ｋｇとして表す。
【００３４】
ＤＰＰＨ法を用いて、以下のの生成物の抗酸化活性を測定した：
・血漿
・赤ワイン
・５％の総ポリフェノールを含有する濃縮赤ワインエクストラクト
・５５％の総ポリフェノールを含有する赤ワイン粉末
・リンゴ果汁
・４０％の総ポリフェノール（ＯＤ２８０ｎｍ）を含有するニワトコの実エクストラクト
・３０％の総ポリフェノール（ＯＤ２８０ｎｍ）を含有するブルーベリーのエクストラクト
・５０％の本発明の製法による総ポリフェノールを含有するフロリジン−リッチなポリフェノール性エクストラクト
・９０％の本発明の製法による総ポリフェノールを含有するフロリジン−リッチなポリフェノール性エクストラクト
・９０％の本発明の製法による総ポリフェノールを含有するフロレチン−リッチなポリフェノール性エクストラクト
【００３５】
【表４】
0005192110.tif 000005
【００３６】
上記結果から、本発明の方法によりマルス・シルベストリス・ミル・リンゴから抽出したフェノール性エクストラクトは、参照として試験した、抗オキシダント活性について知られている生成物のフリーラジカル・スキャベンジングまたは抗オキシダント活性よりも遥かに優れた活性を有する。
【００３７】
実施例５：粉末化したポリフェノール性画分のフリーラジカル−スキャベンジング作用
物質の遺伝毒性は、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡに損傷を作成するその能力として定義される。遺伝毒性因子は、外因性のもの（紫外線、電離放射線、化学物質ほか）または内因性のもの（細胞代謝によって生成されるフリーラジカルほか）のものとし得る。
【００３８】
本発明の方法により得たフロリジン−リッチなポリフェノール性画分のフリーラジカル−スキャベンジング作用は、“３Ｄ”試験（Damaged DNA Detection, Analytical Biochemistry, (1995), pp.37-42）によってイン・ビトロ（in vitro)で測定する。
【００３９】
原理はＤＮＡ損傷の修復に基づく、損傷したＤＮＡをフリーＯＨ°ラジカルに関する試験分子の保護的効力のマーカーとして用い：そのＤＮＡに認められる損傷の減少はフリーラジカルの捕捉と相関する。再生工程の間に標識（ビオチン標識したヌクレオチド）をＤＮＡに取込ませ、ついでこの取込み（修復した損傷の数の定量的指標）を化学ルミネセンスによって明らかにする。
【００４０】
プラスミドＤＮＡで行うこの試験により、損傷−突然変異−癌化工程の初期段階で遺伝毒性因子を検出することができる。したがって、抗オキシダントまたはフリーラジカル−スキャベンジング特性を有する、したがって反応性酸化種（ＲＯＳ）によって引き起こされる酸化的損傷からヒト細胞を保護し得る、分子または混合物を検出し得る。
【００４１】
プロトコールは以下のとおりである：
−標的ＤＮＡを感作（sensitized）ウェルに吸着させ、ついで試験すべきポリフェノール性エクストラクト（２％のエタノール溶液またはＤＭＳＯに溶解）の存在下もしくは不存在下で、またはカテキン（対照）の存在下で遺伝毒性因子とインキュベートする。この試験においては、過酸化水素の溶血性切断によって生成したＯＨ°ラジカルをＤＮＡ損傷遺伝毒性因子として用いる。過酸化水素をウェルに添加し、ついでそれをＵＶＢ光（７００Ｊ／ｍ２）で照射する。さらに、紫外線Ｃ線で予め損傷させたプラスミドＤＮＡからなるポジティブ修復対照を加える。
【００４２】
−超純粋ついで超純粋中の２０％のジオキサン溶液で、３０℃にて５分間ゆっくりと攪拌しつつ洗浄する工程により、修復シグナルを妨害し得るタンパク質のごとき巨大分子の存在に起因する、試料および試験の間の非特異的な相互作用を除去することができるようになる。
【００４３】
−修復工程は、精製した細胞エクストラクト（種々のＤＮＡ損傷修復経路の活性酵素を含有する）およびビオチン−結合修飾ヌクレオチド（ｄＵＴＰ）の存在下で行う。損傷の修復には、損傷の切除のフェーズにつづくＤＮＡフラグメントまたは切除した塩基の再合成のフェーズが含まれる。したがって、修復合成工程の間に、修飾ヌクレオチドがＤＮＡに取込まれる。
−ヌクレオチドによって運搬されるビオチンに結合することによってヌクレオチドがＤＮＡに結合する部位を認識する工程（アビジン分子はペルオキシダーゼ分子に結合している）。
【００４４】
−化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質を添加することにより反応を明らかにする工程。ルミノメーターで観察され、判読した光シグナルは、修復された損傷の量に比例する。用量効果は６キロベース当り１ないし１５の損傷の限界で認められ、これは大部分の損傷の場合である。
【００４５】
ＲＯＳの存在下で認められた保護のパーセントは、ＯＨ°種による損傷作用の相対的低下として算出する、すなわち：
ＲＬＵオキシダント−ＲＬＵ（オキシダント＋試料）／ＲＬＵオキシダント
式中、ＲＬＵ＝相対光単位（光の量の任意単位）
【００４６】
保護の比パーセントは、ＵＶＣで予め損傷した試料に対して測定した非特異的阻害のパーセントによって補正する。それは、添加したエクストラクトのみに起因するフリーラジカル−スキャベンジング活性の指標である。
ＩＣ５０は、遺伝毒性因子ＯＨ°に対する５０％の保護活性を与える試験生成物のｍｇ／ｍｌでの濃度である。値が低ければ低いほど、試験生成物の抗オキシダント活性はより大きい。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
３の試料がＯＨ°ラジカルによるＤＮＡに対する損傷の形成に関して保護効果を有する。したがって、それらは、エピカテキンのフリーラジカル−スキャベンジング活性よりも高く、かつカテキンのものよりも遥かに高い、優れたフリーラジカル−スキャベンジング活性を有し、２の参照分子はそれ自体、それらの良好なフリーラジカル−スキャベンジング能が認識された。用量−応答効果は目視可能である。
【００４９】
５０％の保護効果を与える濃度は低く；同レベルの保護に、カテキンのものよりも５倍低い５０％のポリフェノールエクストラクトが必要であり、約５０倍低い９０％のフロリジン−リッチなポリフェノールを含有するエクストラクトが必要である。本発明に記載する低濃度のポリフェノール性エクストラクトで、フリーラジカルの損傷作用における顕著な低下を生じるのに十分である。したがって、本発明によるポリフェノール画分は、ＯＨ°ラジカルの遺伝毒性作用に対してＤＮＡをイン・ビトロ（in vitro)で保護する強力なフリーラジカル−スキャベンジング因子である。
【００５０】
実施例６：粉末ポリフェノール性画分の抗オキシダント作用
本発明の方法により得たフロリジン−リッチなポリフェノール性画分の抗オキシダント作用は、先に記載した“３Ｄ”試験原理に従ってプラスミドＤＮＡで測定する。方法は同一であり、唯一異なる点は、この試験においてはＤＮＡを損傷する遺伝毒性因子がメチレンブルーを照射することによって生成した一重項酸素１Ｏ２であることである。
【００５１】
原理はＤＮＡ損傷を修復することに基づき、損傷したＤＮＡを一重項酸素１Ｏ２に関する種々の分子の保護効力のマーカーとして用いる。
したがって、照射し、超純粋中で４ｎｇ／ｍｌまで希釈したメチレンブルーをウェルに導入し、ついでこれを白色光（２×７５Ｗ）で２０分間照射する。用いた参照分子はシリマリンまたはシリビニン（Sigma）であり、これは酸素に関するその解毒活性についてよく知られているシリブム・マリアナム（Silybum marianum）から抽出し精製した抗肝細胞毒性フラボノ−リグナンの混合物である。
結果は以下のとおりである：
【００５２】
【表６】
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【００５３】
本発明により得たエクストラクトは、リンゴ果汁濃縮物（それ自体で相当な活性を有する）よりも約１００倍高い抗オキシダント活性を有する。
その活性は、本発明の方法による５０重量％の総ポリフェノールを含有するフロリジン−リッチなフェノール性エクストラクトに対するシリマリンの活性に匹敵し、本発明の方法による９０重量％の総ポリフェノールを含有するフロリジン−リッチなフェノール性エクストラクトに対するシリマリンの活性よりも１０倍高い。
【００５４】
したがって、本発明によるポリフェノール性画分は、細胞代謝によって形成された反応性酸化種の作用に付される身体を保護することに重要な役割を果たす強力なフリーラジカル・スキャベンジャーである。
【００５５】
実施例８：粉末化ポリフェノール性画分の光−遺伝保護作用
本発明によるフロリジン−リッチなポリフェノール性画分の抗−紫外線保護役割は、先に記載したイン・ビトロ（in vitro)“３Ｄ”試験の原理に従ってプラスミドＤＮＡで測定する。
【００５６】
原理はＤＮＡが被った損傷の量を測定することに基づき、損傷ＤＮＡを紫外線に対する試験分子の保護効力のマーカーとして用いる。
試験すべき潜在的に光−保護性の生成物は純粋なエタノールまたは超純粋水に希釈し、ついで紫外線−透過性のプレート上に沈澱させる。ついで、このプレートを吸着したプラスミドＤＮＡを含有するものに重ねる。そのアセンブリーを５０ＫＪ／ｍ２の出力の紫外線Ｂ光で照射する。用いた参照生成物は、紫外線に対するその保護作用が認められている市販物、Roche社からのParsol MCXである。（紫外線の不存在下の）修復シグナルの非特異的阻害はこの試験においては可能でない。なぜなら、試験生成物は吸着したＤＮＡと常に直接接触していないからである。
【００５７】
ＩＣ５０とは、紫外線Ｂ光に対して５０％保護活性を与える試験生成物のｍｇ／ｍｌの濃度である。この値が低ければ低いほど、試験生成物の抗オキシダント活性は高い。
結果は以下のとおりである：
【００５８】
【表７】
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【００５９】
Paesolよりも光保護は小さいが、それにもかかわらず、ポリフェノール性エクストラクトは高い抗−紫外線Ｂ活性を示す。
したがって、本発明において記載するポリフェノール性エクストラクトは紫外線Ｂ光に関する相当な光−遺伝保護作用を有し、それは公知の工業的濃縮リンゴ果汁の効果よりも３０ないし８０倍高いと結論付け得る。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、抗オキシダント化合物、フロリジンに富み、化粧、食餌療法またはニュートラシューティカル調製物として使用し得る、果物からのフェノール画分およびこの画分を得る方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ジュース用リンゴ試料の各種ポリフェノール性画分のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図２】  図２は、生食用リンゴ試料の各種ポリフェノール性画分のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図３】  図３は、従来のポリフェノール性エクストラクト試料の各種ポリフェノール性画分のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図４】  図４は、本発明の実施例１によるエクストラクト試料の各種ポリフェノール性画分のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図５】  図５は、本発明の実施例２によるエクストラクト試料の各種ポリフェノール性画分のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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