(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式(16)を有する少なくとも１つの化合物の有効量を含み、
【化１】
0005192240.tif 000010
Ｘは低級アルキル基からなる群から選択され、
Ｒ1は、水素であり、
Ｒ2は、水素、アルコキシ基、ｎ＝１〜６、但しアルコキシ基の場合、ｎ＝１〜４、からなる群から選択され、
Ｒ3は、メチレン基であり、
Ｒ4は、フェニル基である、腫瘍細胞増殖抑制用組成物。
【請求項２】
化学療法薬剤の有効量を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
化学式(16)の化合物は、Ｘがメチル基である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
化学式(16)の化合物は、(Ｒ2)ｎが３，４，５−トリＯＭｅである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
化学式(16)の化合物は、(Ｒ2)ｎが３−ＯＭｅ及び２−ＯＭｅからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
化学式(16)の化合物は、Ｒ２が水素である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
化学療法薬剤は、パクリタクセル、ドセタクセル、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド、シスプラチン及びノカダゾルからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
化学式(16)の化合物は、適切な医薬キャリアに組み込まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
化学式(16)の化合物及び化学療法薬剤は、適切な医薬キャリアに組み込まれる、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬キャリアは、生理食塩水及び５パーセントのデキストロースからなる群から選択される、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
化学式(16)の化合物は、微小管の重合及び有糸分裂紡錘体の形成を抑制する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１２】
化学式(16)の化合物は、多剤耐性を有する細胞内の有糸分裂を抑制する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１３】
多剤耐性は、P-糖タンパク質による、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
多剤耐性は、MRP1による、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
化学式(16)の化合物は、多剤耐性の逆転を促進する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１６】
多剤耐性は、P-糖タンパク質による、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
化学式(16)の化合物は、(Ｒ2)ｎが２，３，４，５−テトラＯＭｅである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１８】
(Ｒ2)ｎが２−ＯＭｅに等しい化学式(16)の第１化合物、及び(Ｒ2)ｎが３，４，５−トリＯＭｅに等しい化学式(16)の第２化合物を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１９】
化学療法薬剤は、パクリタクセル、ドセタクセル、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド、シスプラチン及びノカダゾルからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
第１化合物及び第２化合物と化学療法薬剤は、適切な医薬キャリアに組み込まれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
医薬キャリアは、生理食塩水及び５パーセントのデキストロースからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
化学式(16)の化合物は、化学療法薬剤の抗有糸分裂効果を高める、請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件は、契約番号ROl AI41743及びROl AI44661の下、一部が米国保健社会福祉省及び国立衛生研究所に支援された。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ピロロ[2,3-d]ピリミジンを使用して、細胞の有糸分裂を抑制することにより癌及び他の病理学上の増殖疾患を治療する方法に関し、特にP-糖タンパク質及びMRPlによって多剤耐性が発生した細胞内の有糸分裂を抑制することにより、これらの疾患を処置し、P-糖タンパク質介在抵抗性の逆転を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
有糸分裂は、１つの親細胞から２つの娘細胞を生む、真核細胞中の核分裂のプロセスである。娘細胞及び元の親細胞には同一の染色体及びＤＮＡがある。癌は有糸分裂の疾病である。１つの細胞が標準細胞から癌細胞に変換されるときに、癌が始まる。これは、多くの場合、通常は細胞増殖を制御するために機能する幾つかの遺伝子の１つの機能が変化することによる。標準細胞であれば、複製をわずか２０−５０世代しか経ず、その後に死ぬのとは対照的に、癌細胞は繰り返される制御されない有糸分裂によって増殖する。腫瘍は、制御されない方法で分裂しており増殖している、不健康な細胞の集団である。
【０００４】
微小管は、紡錘体のような或る細胞要素で見つかった中空のチューブ状のフィラメントの１つである。各微小管はそれぞれタンパク質チューブリンのサブユニットの繰り返しから構成される。微小管は集まって、紡錘糸を形成する。有糸分裂中に、細胞は紡錘糸を使って、染色体を作り、それらのコピーを作り、新しい細胞へ分割し、各娘細胞は、染色体の単一のセットを持つ。微小管は、一般に使用される抗有糸分裂剤又は化学療法剤のターゲットであり、抗有糸分裂剤又は化学療法剤は、タキソイド剤(パクリタクセル及びドセタクセル等)、ビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビンデシン等)、コルヒチン、コルセミド及びノカダゾルを含む。
【０００５】
パクリタクセルはタキソルの名前で販売されている。それは、北米西岸イチイの樹皮から抽出されたタキソイド剤であり、卵巣癌、乳癌及びカポジ肉腫癌の治療に使用される。パクリタクセルは、有糸分裂の間、紡錘体を壊す細胞の能力を妨げることによって機能する。パクリタクセルは、微小管のチューブリン・タンパク質に結合し、微小管を適所にロックし、それらの解重合(分子の分解)を抑制する。紡錘体が適所にロックされた状態では、細胞は娘細胞へ分裂することができない。これとは対照的に、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド及びノカダゾルの如き薬剤は、紡錘体が最初の場所に形成されないようにすることにより、有糸分裂を阻止する。これらの薬剤はチューブリンに結合し、重合を抑制し、細胞が分割するにつれ染色体を移動する必要のある紡錘体を細胞が作るのを妨げる。
【０００６】
残念なことだが、多くのヒトの癌は、完全に化学療法に耐性を示すか、或いは単に一時的に応答するかの何れかであり、その後癌は、通常使用される抗有糸分裂剤によってもはや影響されない。この現象は多剤耐性(MDR)として知られており、いくつかの腫瘍タイプによって固有に表現され、その一方、他のものは化学療法に曝された後にMDRを獲得する。MDRlとして知られるP-糖タンパク質(PGP)は、腫瘍のMDRの根本原因として関係していると見なされてきた170kDの膜結合タンパク質である。PGPは、ATP結合カセット(ABC)輸送体タンパク質スーパーファミリーのメンバーである。PGPは、腸、性腺、腎臓、胆道系、脳及び他の器官で見られる排出輸送体であり、それは、有害物質から身体を保護するメカニズムとして発展したように思われる。PGPは、臨床的な治療物質を含む疎水性物質を、腸へ送り、脳から運び出し、尿へ送り、胆汁へ送り、性腺及び他の器官から運び出すよう輸送する。MRPlは腫瘍のMDRに関係している別のABC輸送体タンパク質である。MRPlは、PGPとして同様の目的に役立つ190kDの内在性膜タンパク質である。
【０００７】
従って、MDR、特にPGP-又はMRPl介在MDRとなった細胞を含む種々広範な細胞において有糸分裂を阻害することができる抗有糸分裂剤又は抗腫瘍剤を使用する治療方法を求めるニーズがある。MDRの発症の後に、抗有糸分裂剤に対する腫瘍の感受性を回復させることができる抗有糸分裂剤又は抗腫瘍剤を使用する治療方法を求めるニーズもまた存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、一般的な化学式(16)を有するピロロ[2,3-d]ピリミジンを使用して、有糸分裂を抑制することにより、癌及び他の病理学上の増殖疾患を治療する方法を提供する。
【０００９】
ここで、Ｘは低級アルキル基、ヘテロアルキル基、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、及びヘテロアリルアルキル基からなる群から選択される。
Ｒ1は、水素、低級アルキル基、ヘテロアルキル基、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、及びヘテロアリルアルキル基からなる群から選択される。
Ｒ2は、水素、低級アルキル基、複数の低級アルキル基、ヘテロアルキル基、複数のヘテロアルキル基、アルコキシ基、複数のアルコキシ基、置換又は非置換アリル基、複数の置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、及び複数の置換又は非置換ヘテロアリル基からなる群から選択される。
Ｒ3は、ゼロ、低級アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、及びヘテロアルケニル基からなる群から選択される。
Ｒ4は、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、ヘテロアリルアルキル基及び水素からなる群から選択され、Ｒ3がゼロであればＲ4は水素である。
【００１０】
化学式(16)の下でカバーされる化合物は、様々な疾患に関係する細胞の有糸分裂を抑制するために使用され得て、該疾患は黒色腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、脳腫瘍及びカポジ肉腫癌を含むが、これらに限定されない。これらの化合物は、P-糖タンパク質及び／又はMRPlにより多剤耐性を示す細胞の有糸分裂を抑制する際に特に有効である。有糸分裂を抑制することに加えて、化学式(16)の下でカバーされた化合物は、P-糖タンパク質による多剤耐性の逆転を促進することにより、他の治療剤(例えば化学療法薬)の性能を増強し得る。このMDR逆転は、化学療法の治療を感受できるよう癌腫瘍を回復することができる。このようにして、化学式(16)の下でカバーされた化合物は、単独で又は補足治療剤、即ち化学療法薬と共に使用されてもよく、化学療法薬はパクリタクセル、ドセタクセル、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド、シスプラチン及びノカダゾルを含むが、これらに限定されない。
【００１１】
本発明の態様は、癌及び他の病理学上の増殖疾患を治療する方法を提供し、方法は上記の化学式(16)を有する少なくとも１つのピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物の有効量を投与することにより、有糸分裂を抑制する工程を含む。
本発明の別の態様は、癌及び他の病理学上の増殖疾患を治療する方法を提供し、方法は、上記の化学式(16)を有する少なくとも１つのピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物の有効量を投与する工程、及び補足的な化学療法薬の有効量を投与する工程を有する。
本発明の目的は、ピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物を使用して、有糸分裂を抑制することにより癌を治療する新しい方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、抗有糸分裂剤への多剤耐性を示す癌細胞を治療する方法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、MDRの発現の後に、化学療法薬を感受できるよう癌腫瘍を回復する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、化学療法薬とともにピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物を投与することにより、一般に使用される化学療法薬の効能又は有効性を増強する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、化学療法薬と共にピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物を投与することにより相乗効果を達成することである。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の詳細な記載及び添付の請求の範囲からより容易に明白になるだろう。
【００１２】
表
表１は、本発明の実施例に従ったピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物についての腫瘍細胞阻害活性(GI5o)を示す。
表２は、本発明の実施例に従ったピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物についてのNCI COMPARE分析データを示す。
表３は、本発明の実施例に従ったいくつかのピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物についての細胞毒性を示す。
表４は、薬剤感受性に及ぼすP-糖タンパク質及びMRPlの影響を示す。
表５は、NCI腫瘍細胞系の細胞周期分布に及ぼすピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物及び抗微小管薬剤の影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
好ましい実施例の詳細な記載
ここに使用されるように、用語“患者”は人間を含む動物界のメンバーを指すが、人間に限定されない。ここに使用されるように、用語“有効な量”は患者に所望の効果を引き起こすのに必要な本発明の化合物の何れかの量を指す。所望の効果は治療される癌又は病気に依り変わるだろう。最も基礎的なレベルで、有効な量は、有糸分裂を抑制するか、或いは多剤耐性の逆転を促進するために必要とされる量である。多剤耐性の抑制又は逆転の量はどれだけであっても、患者への利益をもたらすので、本発明の範囲内である。
有効量は、治療されるべき癌又は疾患、癌又は疾患の感受性、患者の全体的な健康及び年齢、治療されるべき患者の大きさ、免疫反応を起こす(mount)患者の能力等のような要素に基づいて、患者毎に変わることが理解されるだろう。所定の患者に対する有効量の決定は、当該技術分野で実行する者の熟練度内である。一般的に、有効量は、標準的なエクスビボ細胞システム内の効能を評価した後に、臨床前及び臨床後のインビボ評価により決定されるだろう。
【００１４】
本発明は、一般的な化学式(16)を有するピロロ[2、3-d]ピリミジンを用いて有糸分裂を抑制することにより、癌及び他の病理学上の増殖疾患を治療する方法を提供する。
【化１】
0005192240.tif 000002
ここで、Ｘは低級アルキル基、ヘテロアルキル基、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、及びヘテロアリルアルキル基からなる群から選択される。
Ｒ1は、水素、低級アルキル基、ヘテロアルキル基、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、及びヘテロアリルアルキル基からなる群から選択される。
Ｒ2は、水素、低級アルキル基、複数の低級アルキル基、ヘテロアルキル基、複数のヘテロアルキル基、アルコキシ基、複数のアルコキシ基、置換又は非置換アリル基、複数の置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、及び複数の置換又は非置換ヘテロアリル基からなる群から選択される。
Ｒ3は、ゼロ、低級アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、及びヘテロアルケニル基からなる群から選択される。
Ｒ4は、置換又は非置換アリル基、置換又は非置換ヘテロアリル基、アリルアルキル基、ヘテロアリルアルキル基及び水素からなる群から選択され、Ｒ3がゼロであればＲ4は水素である。
【００１５】
化学式(16)によってカバーされる化合物は、種々の疾患に関連した細胞及び腫瘍内の有糸分裂を抑制するのに用いられ、該疾患は黒色腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、脳腫瘍及びカポジ肉腫癌を含むが、これらに限定されない。これらの化合物は、チューブリン又はチューブリン結合タンパク質に結合することにより、及び微小管の重合及び紡錘体の構成を妨害することにより、有糸分裂を抑制してもよい(即ち、ピリミジンはビンカアルカロイドかコルヒチンのように作用してもよい)。化学式(16)の下でカバーされた化合物は、P-糖タンパク質及び／又はMRPlによる多剤耐性を示す細胞の有糸分裂を抑制することに、特に有効である。有糸分裂を抑制することに加えて、化合物は、多剤耐性、特にP-糖タンパク質による多剤耐性の逆転を促進することにより、他の治療剤(例えば、化学療法薬)の性能を増強するだろう。このため、化合物は、化学療法の治療に抵抗する腫瘍の感受性を部分的に又は完全に回復する。このため、化学式(16)の下でカバーされる化合物は、単独で使用されてもよく、又は補足治療、或いは、例えばパクリタクセル、ドセタクセル、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド、シスプラチン、ノカダゾルのような化学療法薬と共に使用されてもよい。
【００１６】
ここに使用されるように、用語“低級アルキル”基は、１つから約６つの炭素原子を持ち、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロプロピルメチル、あるいはシクロブチルメチルの基である低級アルキル基をいう。１つから約６つの炭素原子を共有するアルキル基が好ましい。これらの低級アルキル基は直鎖、分鎖又は環状の構成(脂環式の炭化水素)である。直鎖、分鎖又は環状の構成のアルキル基の炭素原子は、炭素原子に付けられた水素と置き換わった１つ又は２つ以上の置換基を有する。ここに使用されるように、用語“アルケニル”基は少なくとも１つの原子対原子の二重結合を含んでいる不飽和炭化水素の基を指し;例えばＣ＝Ｃである。アルケニル基は、鎖状又は架橋状に生じ得る。
【００１７】
ここに使用されるように、用語“ヘテロアルキル”及び“ヘテロアルケニル”は、１又は２以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄と置換されている、約１から４つの原子のアルキル鎖又はアルケン鎖を指すのに用いられる。このため、当業者には明白なように、“ヘテロアルキル”及び“ヘテロアルケニル”基は、例えば、C-C-N、C-S、S-C、C-O、C-C-O、O-C、N-C-C、N-C=C及び他の様々な組合せを含むだろう。上記のリストは、排他的であることを意味せず、本発明の範囲内のように、多くの組合せが考えられる。
【００１８】
ここで用いられる“アリル”基は、その分子がベンゼンの６炭素環のような芳香環構造、又は他の芳香族派生物の縮合した６炭素環のような融合或いは非融合の多数の環がある化合物を指す。用語“アリル”もまたダイアリル、トリアリル及びポリアリル基を含むように定義され、それらは夫々２つ、３つの或いはそれ以上の環を持つ。このため、適切なアリル基は例えば、フェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントレン、アントラセン基及びアリルオキシアリル基を含む。このリストは、排他的であることを意味せず、他の如何なるアリル基も、これらの用語が上記に定義され、当該技術分野で一般的に理解されるように、本発明の範囲内である。アリル基は、任意の数の置換基と置換され、又は置換されず、置換基は低級アルキル基、置換又は非置換アルコキシ基、置換又は非置換アルコキシアリルロキシ基、ハロゲン、アミノ酸グループ、及びカルボン酸グループを含むが、これらに限定されない。同様に、置換されたダイアリル基及びトリアリル基もまた適切である。
ここで用いられる用語“ヘテロアリル”は、環内に少なくとも１つの原子を有する芳香環構造を指すのに用いられ、原子は炭素ではなく、酸素、窒素或いは硫黄のようなものである。“ヘテロアリル”はまた、大きな環構造の一部である芳香環構造を指し、大きな環構造は融合又は非融合の二員環又は三員環系のようなものであって、環の１つは上記のようなものである。このため“ヘテロアリル”は、１又は２以上の環がヘテロ原子を含み、及び１又は２以上の環がヘテロ原子を含まない環系を指す。このリストは、排他的であることを意味せず、他の如何なるヘテロアリル基も、これらの用語が上記に定義され、当該技術分野で一般的に理解されるように、本発明の範囲内であることが理解されるだろう。例は、ピロール、チオフェン、フラン、イミダゾールなど、及び異なるサイズの環を持つ融合環構造(ベンゾフラン、インドール、プリン等)を含むが、これらに限定されない。ヘテロアリル基は、任意の数の置換基と置換され、又は置換されず、置換基は低級アルキル基、置換又は非置換アルコキシ基、ハロゲン、アミノ酸グループ、カルボン酸グループを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
用語が当該技術分野で理解される、環状の脂肪族(又は、“脂環式”)基及び複素環基も又、本発明の範囲に含まれる。ここで用いられるように、用語“複素環基”は、非芳香族の環状の置換基を指し、環の１又は２以上の員が、炭素でなく、例えば酸素、硫黄、又は窒素である。
ここで用いられる用語“アリルアルキル”(“アルキアリル”又は“アルカリル”とも言われる)又は“ヘテロアリルアルキル”(“アルキルヘテロアリル”とも言われる)は、アリル又はヘテロアリル環に取り付けられるアルキル部分(moiety)を有する基を指す。アルキル部分は、１つから約６つの炭素原子を有する直鎖アルキル基か、分枝アルキル基か、環状アルキル基であるのが好ましい。このアルキル部分は更に酸素、窒素あるいは硫黄原子を含んでよく、従って、アルコキシ基になりえる。これらの用語は上記の如く、アリルアルキル基のアリル部分又はヘテロアリル部分は、置換又は非置換アリル基又はヘテロアリル基である。置換基は、基のアルキル又はアリル部の何れかに取り付けられる。このようにして、例えば、ベンジル基は用語“アリルアルキル”に包含されるだろう。
【００２０】
アリル基、ヘテロアリル基、アリルアルキル基、ヘテロアリルアルキル基、脂環式基又は複素環基のように、上記された環状化合物のうちのどれでも、上記に挙げられた１又は２以上の置換基と随意置換される。多数の置換基が存在する場合、それらは“複数の”置換基と呼ばれる。１を超える置換基の場合には、各置換基は独立して選択されており、親化合物の環に沿って独自な位置に置かれてもよい。例えば、フェニル基のようなアリル基が、複数の置換基を有する場合、各置換基はフェニル環上の異なる炭素原子に付けられてもよい。複数のメトキシ基(例えば3、4、5-トリOMe)と置き換えられるフェニル基の場合には、１つのメトキシ基が位置3で炭素に付けられており、１つのメトキシ基は位置4で炭素に付けられ、１つのメトキシ基は位置5で炭素に付けられている。環に取り付けられる置換基の数は変わってもよい、しかし通常は１から６まで変動する。置換基は、最大約６員を具えた直鎖か分岐鎖があるアルキル基を含んでいてもよく、それらは置換又は非置換アルコキシ基；ハロゲン基(塩素、臭素、ヨウ素及びフッ素等);上記のような置換又は非置換アリル基及びヘテロアリル基；アミノ酸グループ；安息香酸のようなカルボン酸グループ；又は他の適切な化学物質である。“アシル”置換基は、OHが他のある置換基と取り替えられ、一般にRCOとして指定される有機酸基を指す。ここでＲはＣ1-6のアルキル基、Ｃ2-6のアルキニル基、又はＣ2-6アルキニル直鎖又は分岐鎖の基を指す。
【００２１】
用語P-アロイル-L-グルタミン酸塩に使用されるように、ここに使用される用語“アロイル”又は“ヘテロアロイル”は、ベンゾイル、ナフトイル、チオフェノイル、フロフェノイル、ピロイル、及び他の“アロイル”又は“ヘテロアロイル”を指し、これらの用語は当業者に理解されるだろう。アロイル”及び“ヘテロアロイル”は、当該技術分野で、カルボニル部分がある芳香族化合物かヘテロ芳香族化合物として一般に定義される。“グルタミン酸塩”は、エステル形式(グルタミン酸塩)及び酸形式(グルタミン酸)の両方を表わすものとして理解されるだろう。
隣接した炭素が二重結合を有する側鎖がある化合物を描く一般式は、可能な構造としてcis及びtrans異性体の両方があることは、当業者によって理解されるだろう。化学式(16)に記述された広い一般化学式内の任意のそのような化合物のcisとtransの異性体及びそれらの混合物は、本発明の範囲内として考慮される。
【００２２】
好ましい実施例に於いて、Ｘは低級アルキル基であり、Ｒ1は水素であり、Ｒ2はアルコキシ基及び複数のアルコキシ基から成る群から選ばれ、Ｒ3はメチレン基であり、Ｒ4はフェニル基である(Ｒ3とＲ4の組合せはＮ７部分としてベンジル基を表わす)。以下に記載されるインビトロの研究に従って、Ｒ2が3、4、5-トリOMeであり、Ｒ3がメチレン基であり、Ｒ4がフェニル基であるとき、ピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物は、特に抗有糸分裂感受性細胞、及び耐性細胞に対して、有力な抗有糸分裂剤であるように思われる。
このため、好ましい実施例では、Ｘはメチレン基であり、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は3、4、5-トリOMeであり、Ｒ3はメチレン基であり、Ｒ4はフェニル基である。他の実施例では、Ｒ2は3-OMe及び／又は5-OMeに等しいのが好ましい、何故なら3-OMe及び／又は5-OMe基は、4-OMe基より抗有糸分裂の有効性を持つように思われるからである。Ｒ3及びＲ4(即ち、Ｎ７部分)がピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物から除去されると、腫瘍細胞に対する抗有糸分裂活性が著しく低下する。従って、Ｎ７部分があることが好ましいので、Ｒ3及び／又はＲ4基があることが好ましい。
Ｒ２が2-OMeであり、Ｒ３がメチレン基であり、Ｒ４がフェニル基であるとき、ピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物は、抗有糸分裂剤として、3、4、5-トリOMe類似体よりも、効能は約１０分の１である。しかし、2-OMe類似体は、P-糖タンパク質介在耐性を抗有糸分裂性に逆転するのに有効であるように思われる。このため、別の好ましい実施例では、Ｘはメチレン基であり、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は2-OMeであり、Ｒ3はメチレン基であり、Ｒ4はフェニル基である。
【００２３】
別の好ましい実施例では、化合物は2、3、4、5-テトラOMe類似体であり、3、4、5-トリOMe類似体の抗有糸分裂活性と2-OMe類似体のMDR逆転活性とを組み合わせる。本実施例に於いて、Ｘはメチレン基であり、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は2、3、4、5-テトラOMeであり、Ｒ3はメチレン基であり、Ｒ4はフェニル基である。これに代えて、Ｒ2が3、4、5-トリOMeである化合物が、Ｒ2が2-OMeである化合物とともに投与され、抗有糸分裂活性とMDR逆転とを組み合わせてよい。
化学式(16)の下でカバーされる化合物は、本方法による投与にふさわしい医薬キャリア内に含まれていてもよい。“適切な医薬キャリア”は、本化合物を可溶性にし、適合性の問題を生じないあらゆる医薬キャリアを指し、何れか及び全ての溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬用のそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。これらの媒体又は薬剤の何れかの使用は、本発明によって考慮され、キメラタンパク質に関する適合性の問題はない。好ましいキャリアは、生理食塩水及び５パーセントのデキストロースを含む。
【００２４】
化学式(16)の下でカバーされる化合物は、非経口投与か、経口投与か、局所投与によって搬送され得る。投与のし易さ及び投薬の均一性のため、投薬単位形態で非経口組成物を調製することが特に有利である。ここに使用される投薬単位形態は、治療されている患者のための単投薬として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は所定量又は有効量のピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物を含み、医薬キャリアと連繋して所望の効果を生む。本発明の投薬単位形態の仕様は、特定の化合物、及び達成される特定の効果により決定され、直接的に依存する。
化学式(16)の下でカバーされる化合物はまた、１又は２以上の更なる治療薬、例えば化学療法薬とともに投与され得る。更なる化学療法薬に適した候補は、パクリタクセル、ドセタクセル、ビンカアルカロイド、コルヒチン、コルセミド、シスプラチン、及びノカダゾルを含むが、これらに限定されない。ピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物の存在は、多剤耐性、特にP-糖タンパク質による多剤耐性の逆転を促進することにより、及び抗有糸分裂剤に対する腫瘍の感受性を少なくとも部分的に回復することにより、化学療法薬の有効性を高める。一実施例に於いて、化学式(16)を有する化合物は、更なる化学療法薬と組み合わされて、同じ医薬キャリア中で一緒に、又は別の医薬キャリア中であるが略同時に、投与される。他の実施例に於いて、化学式(16)を有する化合物は、更なる化学療法薬の前に、化学療法薬とは別個に投与されてよく、ピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物に多剤耐性の逆転を達成するのに十分な時間を与える。多剤耐性の逆転を促進するのに加えて、化学式(16)の下でカバーされる化合物は、抗有糸分裂剤として腫瘍に幾らかの影響を及ぼす。
化学式(16)を有する化合物を、更なる化学療法薬とともに投与することは、相乗効果をもたらし得る。２つの化合物が一緒に用いられると、２つの化合物が別個に用いられるときよりも大きな効果を有する相乗効果が生じる。相乗効果が生じると、各化合物の使用量を減らすことができ、それによって各化合物の毒性を減じることができる。
【００２５】
実施例
実施例１
図１は、国立ガン研究所(NCI)の６０のヒト腫瘍細胞系を使用してテストされた９つの化合物を示す。細胞系は、表１に記載され、それらは白血病、黒色腫、肺癌、結腸癌、脳腫瘍、卵巣癌、乳癌、前立腺癌及び腎臓癌を表わす。
化合物１−９は、NCI開発型治療プログラム(DTP)インビトロ細胞系スクリーニングプロジェクト(IVCLSP)によってテストされた。IVCLSPの下でテストするための方法論が、http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.htmlにて提供される。化合物１−５はＮ７ベンジル部分を含んでいた、しかし、化合物６−９はＮ７ベンジル部分を含んでいなかった。
3、4、5-トリOMe類似体である化合物１は、ＮＣＩ  ６０の腫瘍パネルにおいて、殆どの腫瘍を抑制した。表１は化合物１についてＧＩ50(ｎＭ)によって測定された腫瘍細胞阻害活性を示す。示すように、様々な腫瘍細胞系に対するＧＩ50値(ｎＭ)はナノモラーからサブマイクロモラーレベルまで変動した。ＧＩ50は、処理された細胞の増殖を処理していない(即ち、対照群の)細胞の増殖の半分にまで下げるのに必要な化学物質の濃度を表わす。換言すれば、ＧＩ50は、細胞増殖を５０パーセント抑制するのに必要な化学物質の濃度を表わす。
【００２６】
化合物１は、１６の腫瘍細胞系に対するナノモラーレベルの、４０の腫瘍細胞系に対するサブマイクロモラーレベルの、３の腫瘍細胞系に対するマイクロモラーレベルの、１桁又は２桁のＧＩ50値を示した。化合物１と比較して、Ｎ７ベンジル部分を含んでいなかった化合物６は、５６の腫瘍細胞系に対して100〜10,000分の１に減少した活性を示した。これは、ピロロ[2,3-d]ピリミジン化合物が腫瘍細胞増殖を抑制するのに、Ｎ７ベンジル部分が重要であることを示す。
化合物２(4-OMe類似体)は、化合物６と同様の濃度で腫瘍細胞を抑制し、3-OMe基及び／又は5-OMe基の重要性を示した。しかし、化合物３(3-OMe類似体)は、５６の腫瘍細胞系の８について、マイクロモラー範囲のＧＩ50値を示し、腎臓癌A498細胞に対して２桁のナノモラーレベルのＧＩ50値を示した。化合物４(2-OMe類似体)は化合物３に似ており、ＧＩ50値はマイクロモラーからミリモラーの範囲であった。
【００２７】
フェニル基非置換類似体である化合物５は、５２の腫瘍細胞系について、ミリモラー又はそれ以下の範囲のＧＩ50値を有し、３の腫瘍細胞系について、マイクロモラーのＧＩ50値を有した。任意の化合物からＮ７ベンジル基を除去すると、NCI 60腫瘍パネルに対する活性は実質的に減退した。化合物１−９の構造-活性関係は、Ｎ７-ベンジル部分が存在する3、4、5-トリOMe置換基は、培養中の腫瘍細胞に対する強力な阻害活性に重要であることを示した。
NCI COMPARE分析は、化合物１について実行され、既知の微小管ターゲット薬剤に対する６０の細胞系の応答を比較することにより、考えられる作用機構を解明した。表２は、その細胞タイプ選択性プロフィールが、化合物１と類似したピアソンの相関係数(PCC)を示した５つの薬剤を挙げている。微小管特異的化合物について、腫瘍増殖阻害(TGI)レベルに於ける細胞タイプ選択性プロフィールは、化合物の活性機構の高度な指標となる。微小管ターゲット薬剤として分類される化合物は、次の必要条件を満たすべきである:1) ＰＣＣ値は少なくとも０.６であるべきである。2)平均ＧＩ50は、1μM以下であるべきである。化合物１は、これらの必要条件を両方とも満たし、抗チューブリン機構作用を示した。
【００２８】
実施例２
化合物１−５も、表３に識別されたヒト腫瘍細胞系のパネルへの細胞毒性について評価された。これらの細胞系は、輸送体タンパク質P-糖タンパク質、即ちMRPlの過剰発現により抗癌剤に耐性である。非置換フェニルエチル化合物5は、11から18μMまでの範囲のＩＣ50を示した(ＩＣ50は、細胞増殖を５０パーセント抑制するのに必要な抑制濃度である)。P-糖タンパク質を過剰表現するNCI/ADR細胞及びMRPlを過剰表現するMCF-7VP細胞は、薬剤感受性のMCF-7細胞よりわずかに高いＩＣ50であった。5-フェニルエチル部分(化合物２)の4-OMe置換基は、T24ヒト膀胱癌細胞に対する細胞毒性効能を減退させたが、他の細胞系に対する効能に影響が殆どなかった。逆に、3-OMe置換基(化合物３)は、NCI/ADR細胞への効能を高め、2-OMe置換基(化合物４)は、テストされた全ての細胞系に対する効能を増加させ、P-糖タンパク質又はMRPlの何れかの過剰発現によるあらゆる耐性を除去した。サブマイクロモラーの細胞毒性効能はまた、細胞の輸送体の状況に拘わらず、3、4、5-トリOMe化合物１について観察された。予備的な構造活性研究は、3、4、5-トリOMe置換基は強力な活性にとって重要であることを明白に示す。モノ-OMe類似体の中で、2-OMeは3-OMe及び4-OMeより良い。しかし、非置換フェニル基類似体は、モノ3-OMe又は4-OMe置換基より良い。
このため、トリOMe類似体である化合物１は、化合物４(2-OMe)よりも１０倍良く、同様に、化合物４は3-OMe又は4-OMeより１０倍良く、非置換フェニル基類似体である化合物５よりも５倍良い。
【００２９】
微小管への化合物の影響(以下に記載される)故に、化合物１の細胞毒性活性は、表４に示すように、微小管ターゲット薬剤であるタキソル、ビンブラスチン及びビンクリスチンと比較された。これらの天然産出薬剤の各々は、感受性細胞系において化合物１よりも強力であったが、各々はP-糖タンパク質の過剰発現による腫瘍細胞耐性に曝した。更に、MRPlの過剰発現はまた、ビンクリスチンに対する実質的な耐性を与える。これに対し、P-糖タンパク質及びMRPlの何れも、化合物１に対する細胞感受性に影響を及ぼさないとの観察が確認された。化合物１は、定着した抗癌剤シスプラチンより３５〜４０倍強力であり、それは腫瘍細胞による輸送体発現に感応しない。
【００３０】
実施例３
培養細胞に及ぼす化合物１の形態学的影響、及び上記のNCI COMPARE分析結果故に、微小管構造に及ぼすビンブラスチン、タキソル及び化合物１の影響が調べられた。これらの研究については、A-10ラット平滑筋細胞が使用された、なぜなら、それらはイメージングし易い(amenable)平坦な単層として増殖するからである。A-IO細胞は、EtOH(対照群)、625ｎＭタキソル、167ｎＭビンブラスチン及び900ｎＭの化合物１で２４時間処理された。その後、微小管は、β−チューブリン抗体を用いて、間接的免疫蛍光染色(immunofluorescence)によって視覚化された。図２(a)−(d)は夫々、対照群、タキソル、ビンブラスチン及び化合物１(“149”)の代表的なフィールドを示す。これらの化合物は何れも、微小繊維から構成されるストレスファイバーの形態に影響を与えなかった。対照群の細胞は、核周辺に組織中心(perinuclear organizing centers)を有する広範囲に及ぶ微小管系を示した。タキソルを用いた処理は、これらの細胞内の微小管クラスタの染色の増加を促進した。その一方でビンブラスチンは、細胞の微小管の著しい枯渇をもたらした。同様に、化合物１は、細胞の微小管の、投与量に依存する損失をもたらした。タキソルのように、異常な核を有する多くの細胞が化合物１で処理された培養体中で観察された。同様の微小管の損失が、化合物１で処理されたNIH/3T3及びMCF-7細胞の培養体中で観察された。
【００３１】
実施例４
フローサイトメトリック分析は、HL-60ヒト前骨髄球白血病細胞の細胞周期分布に及ぼす化合物１及び様々な抗微小管薬剤の影響を評価するために使用された。表５は、この実験結果を要約する。Ｇ2/Ｍ期の細胞のパーセンテージは、タキソル、ビンブラスチン、コルヒチン又は化合物１の何れかを用いて、２４時間細胞を処理することによってほぼ２倍に増加した。インキュベーション時間を４８時間に増やしても、何れかの化合物について、Ｇ2/Ｍ期に停止された(arrested)細胞のパーセンテージを十分には増加させなかった。しかし、サブ二倍体細胞のパーセンテージは各サンプル中で増加し、これらの化合物によるアポトーシスの誘導を示す。
更に、ヒト腫瘍細胞に及ぼす化合物１の細胞周期効果を特徴づけるために、MCF-7細胞が種々の濃度の化合物1、ビンブラスチン又はタキソルで２４時間処理された。その後、細胞は収穫され、溶解され、ウェスタンブロット分析によってp53とWAFlの発現レベルについて分析された。p53とWAFlのウェスタンブロット分析は、図３(a)及び図３(b)に夫々表示される。化合物１はこれらの図中の“149”として識別される。抗微小管薬剤によるＧ2/Ｍ期へのこれらの細胞の停止は、これらのタンパク質の発現の増加と関連することを以前に実証した。予測されるように、タキソル又はビンブラスチンを用いた処理は、p53及びWAFlの両方の発現レベルの著しい増加をもたらした。同様に、化合物１を用いた処理は、これらの両方のタンパク質の発現を引き起こした。これらの処理は何れも、MCF-7細胞のbcl-2又はP-チューブリンの発現に影響しなかった。
【００３２】
実施例５
上記の研究は、P-糖タンパク質又はMRPlの発現が、化合物の細胞毒性効果に対する耐性を与えないことを示した。これがこれらのタンパク質による薬剤輸送活性の抑制によるかを決定すべく、P-糖タンパク質に及ぼすこれらの化合物の影響が更に特徴付けられた。ビンブラスチンへのNCI/ADR細胞の感受性、及びビンクリスチンへのMCF-7 TVP細胞の感受性に及ぼす化合物の影響は、P-糖タンパク質及びMRPlの拮抗作用を夫々評価するために調べられた。図４(a)−図４(b)は、夫々P-糖タンパク質及びMRPlの拮抗スコア対濃度を示すグラフである。
【００３３】
図４(a)に示されるように、NCI/ADR細胞は、５０nMのビンブラスチンの不在又は存在下で、化合物５(■)、化合物２(▲)、化合物３(▼)、化合物４(◆)、又は化合物１(●)の示された濃度で処理された。Pgp拮抗スコアは、ビンブラスチンが無い状態に於ける生存細胞のパーセンテージ/ビンブラスチンがある状態に於ける生存細胞のパーセンテージとして計算される。図４(b)に示されるように、MCF-7/VP細胞は、上記の如く、１nMのビンブラスチンの不在又は存在下で処理された。MRPl拮抗スコアは、ビンブラスチンが無い状態に於ける生存細胞のパーセンテージ/ビンブラスチンがある状態に於ける生存細胞のパーセンテージとして計算される。両方の場合では、１の値は、化合物が薬剤感受性に影響が無いことを示し、その一方、値が増加すると輸送体タンパク質の拮抗作用が増大することを示す。MCF-7細胞に対するIC50を上回る化合物1-5の濃度は示されていない。３つの同様の実験のうちの１つについてデータが示される。
図４(a)に示されるように、化合物２、３、４又は５の何れかの服用量の増加は、P-糖タンパク質の抑制を示すビンブラスチンに対するNCI/ADE細胞の用量依存的な感受性をもたらした。化合物４は、P-糖タンパク質介在抵抗性を逆転する際、他のものより略１０倍強力であった。化合物の大量服用によるこの活性の明らかな減少は、化合物の直接的な細胞毒性に起因し、それによって、ビンブラスチンがある状態で生存している細胞に対する、ビンブラスチンがない状態で生存している細胞の比率を低下させる。
化合物１は、シリーズ中の他のものより細胞毒性が著しく高かったが、そのＩＣ50未満の服用量でP-糖タンパク質に影響を及ぼさなかった。P-糖タンパク質介在抵抗性に及ぼす著しい効果と対照的に、何れの化合物も、ビンクリスチンがMCF-7/VP細胞を殺す能力に影響を与えず、それらがMRPlの作用を阻むことに効果がないことを示した。
【００３４】
全体として、これらのデータは、このシリーズの5-フェネチル部分のオルト-OMeの置換基がP-糖タンパク質を抑制する能力を大きく増強することを実証する一方、更なる置換基がこの効果を否定するが、直接細胞毒性を増強し得る。このため、2-OMe置換化合物４は、ビンブラスチンに対するP-糖タンパク質介在抵抗性を逆転するP-糖タンパク質の抑制に最大限に導く。化合物１もこの属性を有するかどうかは、その高い細胞毒性故に、決定することができない。しかし、ＩＣ50未満の濃度の化合物１は、P-糖タンパク質介在抵抗性に影響を及ぼさないから、Pgpの基質ではないが、化合物２−５の様にPgpを抑制しないことは可能である。
本発明の特定の実施例が実例の目的のために上記されたが、添付の請求の範囲にて規定される発明から離れることなく、本発明の詳細の種々の変更が為されても良いことは、当業者に明らかであろう。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施例に従ったピロロ[2、3-d]ピリミジン化合物の種々の類似体を示す。
【図２】(a)−(d)は、抗有糸分裂剤による処理後の腫瘍細胞系の微小管構造の図である。
【図３】(a)-(b)は夫々、腫瘍細胞系に於けるｐ５３及びWaf-1の発現に関するウェスタンブロット分析を示す。
【図４】(a)-(b)は、夫々P-糖タンパク質及びMRPlの拮抗スコア対濃度のグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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