(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）その発現を変調させるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインと；
ｉｉ）第１の核受容体リガンド結合ドメインと
を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット；
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメインと；
ｉｉ）第２の核受容体リガンド結合ドメインと
を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット；および
ｃ）ｉ）ＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメントと；
ｉｉ）トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーターと；
ｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子と
を含む遺伝子発現カセット
を含み、
（１）第１または第２の核受容体リガンド結合ドメインの一方は、エクジソン受容体リガンド結合ドメインであり、および
（２）第１または第２の核受容体リガンド結合ドメインの他方は、コドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされたレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインであり、
前記コドン突然変異が、
ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９の置換突然変異、
ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１および４２９の置換突然変異、
ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８の置換突然変異、
ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１、３２２および３２３の置換突然変異、
ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０、４５１および４５２の置換突然変異、
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５、４５６、４５７および４５８の置換突然変異、
ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０、４７２および４７３の置換突然変異、
ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７６、４７７、４７８および４７９の置換突然変異、あるいは
ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１、４８２および４８３の置換突然変異
をもたらし、前記突然変異を含まない遺伝子発現変調システムと比較して増大したリガンド感受性を示す、遺伝子発現変調システム。
【請求項２】
ａ）置換突然変異が、配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、
ｂ）置換突然変異が、配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、
ｃ）置換突然変異が、配列番号：２のＫ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤまたはＴ４７３Ｅ、
ｄ）置換突然変異が、配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、
ｅ）置換突然変異が、配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、
ｆ）置換突然変異が、配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、
ｇ）置換突然変異が、配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、
ｈ）置換突然変異が、配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、あるいは
ｉ）置換突然変異が、配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐ
である、請求項１記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項３】
該ＤＮＡ−結合ドメインが、エクジソン受容体ＤＮＡ−結合ドメイン、ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン、およびＬｅｘＡ  ＤＮＡ−結合ドメインよりなる群から選択される、請求項１記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項４】
トランス活性化ドメインが、エクジソン受容体トランス活性化ドメイン、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、Ｂ４２酸性アクチベータートランス活性化ドメインおよびｐ６５トランス活性化ドメインよりなる群から選択される、請求項１記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項５】
置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９における置換突然変異、
ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１および４２９における置換突然変異、
ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８における置換突然変異、
ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１、３２２および３２３における置換突然変異、
ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０、４５１および４５２における置換突然変異、
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５、４５６、４５７および４５８における置換突然変異、
ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０、４７２および４７３における置換突然変異、
ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７６、４７７、４７８および４７９における置換突然変異、あるいは
ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１、４８２および４８３における置換突然変異
をもたらすコドン突然変異を含み、前記単離されたポリヌクレオチドを含む遺伝子発現変調システムは、前記突然変異を含まない遺伝子発現変調システムと比較して増大したリガンド感受性を示す、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
該コドン突然変異が、
ａ）配列番号：１のアミノ酸残基Ｅ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓにおける置換突然変異、
ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基Ｅ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓにおける置換突然変異、
ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤまたはＴ４７３Ｅにおける置換突然変異、
ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｇ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖにおける置換突然変異、
ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｄ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒにおける置換突然変異、
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｓ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑにおける置換突然変異、
ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙにおける置換突然変異、
ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｃ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈにおける置換突然変異、あるいは
ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｅ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐにおける置換突然変異
をもたらす、請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
転写調節エレメントに作動可能に連結した、請求項５記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
該転写調節エレメントが宿主細胞中で作動できる、請求項７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項５記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該置換突然変異が、
ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９における置換突然変異、
ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１および４２９における置換突然変異、
ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８における置換突然変異、
ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１、３２２および３２３における置換突然変異、
ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０、４５１および４５２における置換突然変異、
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５、４５６、４５７および４５８における置換突然変異、
ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０、４７２および４７３における置換突然変異、
ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７６、４７７、４７８および４７９における置換突然変異、あるいは
ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１、４８２および４８３における置換突然変異であり、前記単離されたポリヌクレオチドを含む遺伝子発現変調システムは、前記突然変異を含まない遺伝子発現変調システムと比較して増大したリガンド感受性を示す、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
該突然変異が、
ａ）配列番号：１のアミノ酸残基Ｅ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓにおける置換突然変異、
ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基Ｅ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓにおける置換突然変異、
ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤまたはＴ４７３Ｅにおける置換突然変異、
ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｇ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖにおける置換突然変異、
ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｄ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒにおける置換突然変異、
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｓ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑにおける置換突然変異、
ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙにおける置換突然変異、
ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｃ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈにおける置換突然変異、あるいは
ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基Ｅ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐにおける置換突然変異
である、請求項１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
ａ）請求項１記載の遺伝子発現変調システムを単離された宿主細胞に導入し；さらに、
ｂ）該単離された宿主細胞にリガンドを導入する
工程を含む、単離された宿主細胞中で遺伝子の発現を変調する方法。
【請求項１３】
該リガンドが、
ａ）式：
【化１】
0005227758.tif 000011
［式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ３、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になってエチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである］
の化合物；
ｂ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、またはムリステロンＡ；
ｃ）オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビフォスフォネートエステル、または幼若ホルモンＩＩＩ；または
ｄ）９−シス−レチノイン酸、４−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）−エテニル）安息香酸（３−メチル−ＴＴＥＢ）、（（Ｅ）−２）２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフチル）プロペン−１−イル）−４−チオフェンカルボン酸）、２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチル）−２−（カルボキシフェニル）−１，３−ジオキソラン、４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２、５−ヘキサノ）−５−メチル−ジベンゾ（ｂ，ｅ）（１，４）ジアゼピン−１１−イル）−安息香酸（ＨＸ６００）もしくはそのチアジアゼピンアナログ、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデコン酸（フィタン酸）、６−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）シクロプロピル）ニコチン酸、２−（４−カルボキシフェニル）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１，３−ジチアン、または４−（２−メチル）−１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）プロペニル）安息香酸
である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに単離された宿主細胞に第２のリガンドを導入することを含み、該第２のリガンドが９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の遺伝子発現変調システムを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の宿主細胞を含む非−ヒト生物。
【請求項１７】
該宿主細胞が、細菌細胞、真菌類細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞よりなる群から選択される、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１８】
該哺乳動物細胞がネズミ細胞またはヒト細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
該非−ヒト生物が細菌、真菌類、酵母、動物、および哺乳動物よりなる群から選択される、請求項１６記載の非−ヒト生物。
【請求項２０】
該哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サル、およびチンパンジーよりなる群から選択される、請求項１９記載の非−ヒト生物。
【請求項２１】
前記遺伝子発現変調システムが、ジアシルヒドラジンリガンドに対する増大したリガンド感受性を示す、請求項１記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項２２】
該第１のハイブリッドポリペプチドのエクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）が、ハマキガ科のガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）ＬＢＤ、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ（タバコスズメガ）ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）ＬＢＤ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）ＬＢＤ、ユスリカ  Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｔＥｃＲ」）ＬＢＤ、カイコガ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、カ  Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ（「ＬｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ（ヒツジキンバエ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、地中海ミバエ  Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ（チチュウカイミバエ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）ＬＢＤ、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）ＬＢＤ、アブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）ＬＢＤ、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）ＬＢＤ、コナジラミ  Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」）ＬＢＤ、およびヨコバイ  Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」）ＬＢＤよりなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項２３】
前記エクジソン受容体リガンド結合ドメインが、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒシントメハマキ）リガンド結合ドメインである、請求項２２記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項２４】
請求項１記載の遺伝子発現変調システムを含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
前記遺伝子発現変調システムがウイルスベクター内に含まれる、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２７記載の単離された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は置換突然変異を含む新規核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用、ならびにこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の刊行物が本明細書中で引用され、その開示は出典明示によりその全体を本明細書の一部とみなす。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引用も、かかる文献が本出願に対する「先行技術」として利用できることを認めたものと理解されるべきではない。
【０００３】
遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は、発生および他の生理学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値あるツールである。遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が蛋白質合成における最初の工程として必要なＲＮＡを生産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベーターが、遺伝子転写を制御するプロモーターの近くに運ばれなければならない。典型的には、転写アクチベーターそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質に関連する。かくして、遺伝子発現が起こるためには、ＤＮＡ結合ドメインおよび該ＤＮＡ結合ドメインから適当な距離をおいて位置するトランス活性化ドメインを含む蛋白質が遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。
【０００４】
伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用して、設計されたトランスジーンの発現を促進させる。トランスジーンを含有するＤＮＡ構築体が、まず、宿主ゲノムに組み込まれる。転写アクチベーターによってトリガーされると、与えられた細胞型でトランスジーンの発現が起こる。
【０００５】
細胞中での外来性遺伝子の発現を調節する他の手段は誘導性プロモーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例としては、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーターシステム、免疫抑制−イムノフィリンシステム、およびステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムが挙げられ、これは後記する。
【０００６】
病原体の攻撃後の全身獲得抵抗性応答（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の間に、タバコからのＰＲ１−ａプロモーターが誘導される。ＰＲ１−ａの使用は限定されるであろう。何故ならば、それは、しばしば、内因性物質、ならびに病原体、ＵＶ−Ｂ放射線および汚染物のような外来因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属によって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節システムが記載されてきた（Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４−５４１８；Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６２：５１−６１；Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０−２７５６０）。しかしながら、これらのシステムは、非−標的遺伝子の発現に対するその効果のため制限を有する。これらのシステムは遺漏性（ｌｅａｋｙ）でもある。
【０００７】
原核生物リプレッサー−オペレーターシステムは細菌リプレッサー蛋白質およびそれらが結合する独自のオペレーターＤＮＡ配列を利用する。細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサー−オペレーターシステムが、遺伝子発現を制御するために植物および動物で用いられてきた。Ｔｅｔシステムにおいて、テトラサイクリンはＴｅｔＲリプレッサー蛋白質に結合し、立体配座の変化をもたらし、これはオペレーターからリプレッサー蛋白質を放出させ、その結果、転写が起こる。Ｌａｃシステムでは、ラクトース、またはイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドのような合成アナログの存在に応答してｌａｃオペロンが活性化される。あいにく、そのようなシステムの使用は、リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトース、の不安定な化学、それらの毒性、それらの天然の存在、または誘導もしくは抑制に比較的高レベル必要であることよって制限される。同様の理由により、動物へのこのようなシステムの使用も制限される。
【０００８】
ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびシクロスポリンＡのような免疫抑制分子は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用い、単に、ＦＫ５０６を２つの蛋白質の各々の上に置くことによって、またはＦＫ５０６を１つの上に、およびシクロスポリンＡをもう１つの上に置くことによって、任意の２つの蛋白質を一緒に運ぶ一般的戦略が工夫されてきた。次いで、ＦＫ５０６の合成ホモダイマー（ＦＫ１０１２）またはＦＫ５０６−シクロスポリンの融合から得られた化合物（ＦＫＣｓＡ）を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−２４；Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：４６０４−７）。ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン、ならびにＦＫＣｓＡ化合物を用いて、Ｇａｌ４結合部位を含有するプロモーターの制御下でレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化が示された。あいにく、このシステムは、望まない副作用を有しかねない免疫抑制剤を含み、従って、種々の哺乳動物遺伝子のスイッチ適用でのその使用が制限される。
【０００９】
ステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムも使用されてきた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞で見出される。あいにく、特に植物および哺乳動物における遺伝子発現の調節のために受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物における多くの他の元来の生物学的経路におけるその関与のため制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いる代替システムが開発されている。
【００１０】
昆虫における成長、脱皮および発生はエクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンによって調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９）。昆虫におけるエクジソンに対する分子標的は、少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）よりなる。ＥｃＲは、シグニチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７）。ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡのような多数のステロイド化合物に対して応答性である。最近、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非−ステロイド化合物が記載されており、これは、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社によって世界的に販売されている市販の殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含む（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号および米国特許第５，５３０，０２８号参照）。両アナログは他の生物に対して例外的な安全性プロフィールを有する。
【００１１】
昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）はウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、哺乳動物ＲＸＲの昆虫ホモログとでヘテロ二量体化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体応答エレメントに結合し、エクジソン応答遺伝子の転写を活性化させる（Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄら、２０００）。ＥｃＲ／ＵＳＰ／リガンド複合体は、昆虫の発生および生殖の間に重要な役割を演じる。ＥｃＲはステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、５つのモジュールドメイン、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、Ｅ（リガンド結合、へテロ二量体化およびトランス活性化）およびＦ（トランス活性化）ドメインを有する。Ａ／Ｂ、ＣおよびＥのようなこれらのドメインのいくつかは、それらが他の蛋白質に融合された場合にそれらの機能を保持する。
【００１２】
綿密に調節された誘導性遺伝子発現システムまたは「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞における蛋白質の大規模生産、細胞ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック植物および動物における特性の調節のような種々の適用で有用である。
【００１３】
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの第１のバージョンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）およびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）を用い、ステロイド、ポナステロンＡの存在下においてこれらの受容体が哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウス中のレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら、１９９２；Ｎｏら、１９９６）。後に、Ｓｕｈｒら、１９９８は、外因性ヘテロダイマーパートナーの不存在下で、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、非−ステロイドエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【００１４】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）は外因性遺伝子の発現を変調する方法を開示しており、ここに、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築体が、そのためのリガンドの存在下、かつ所望によりサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築体によって活性化される。選択されたエクジソン受容体はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された。典型的には、そのようなシステムは、最適な活性化を提供するためにサイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とでヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）は、カイコガ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が、外因性ダイマーパートナーの必要性なくして哺乳動物系で機能できることを開示する。
【００１５】
米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの種々のメンバーを、遺伝子発現システムにおける使用のために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）または少なくともＵＳＰの二量体化ドメインを含むその断片と組み合わせることができることを開示する。米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質上に位置する植物で使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロダイマーシステムを開示する。あいにく、これらのＵＳＰ−ベースのシステムは動物細胞において構成的であり、従って、レポーター遺伝子発現を調節するのに効果的ではない。
【００１６】
これらの場合の各々において、（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号におけるように天然ＥｃＲとして、または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号におけるように修飾されたＥｃＲとして）トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが単一の分子に組み込まれ、他のヘテロダイマーパートナー（ＵＳＰまたはＲＸＲいずれか）は、その天然状態で用いられた。
【００１７】
前記ＥｃＲ−ベースの遺伝子調節システムの欠点は、リガンドの不存在下におけるかなりのバックグラウンド活性ならびに植物および動物双方において用いるためのこれらのシステムの非−適用性が挙げられる（米国特許第５，８８０，３３３号および第６，２６５，１７３Ｂ１号参照）。
【００１８】
遺伝子発現の変調に頼るほとんどの適用では、これらのＥｃＲ−ベースのシステムは望ましくない。従って、植物および動物双方において外因性遺伝子の発現を正確に変調するための改良されたシステムに対する要望が当該分野に存在する。そのような改良されたシステムは、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における特性（ｔｒａｉｔ）の調節のような適用で有用であろう。単純であり、コンパクトであり、かつ比較的安価で、容易に入手でき、宿主に対して毒性の低いものであるリガンドに依存する改良されたシステムは、生物学的システムを調節するのに有用なことが判明するであろう。
【００１９】
最近、出願人は、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインが、それらを２つの異なる蛋白質上に置くことによって相互に分離されたエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムが結果として、リガンドの不存在下においてバックグラウンド活性を大いに低下させ、リガンドの存在下においてバックグラウンドを越えて活性をかなり増加させたことを示した（ここに出典明示してその全体を本明細書の一部としてみなす係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号）。この２−ハイブリッドシステムは、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号に開示されたシステムと比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現変調システムである。該２−ハイブリッドシステムは、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部位に結合すると、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に活性化するように、トランス活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインに対してより好都合な位置に運び込む一対の相互作用蛋白質の能力を開発する（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号参照）。簡単に述べれば、該２−ハイブリッド遺伝子発現システムは２つの遺伝子発現カセットを含む；第１のカセットは核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ結合ドメインをコードし、第２のカセットは異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。リガンドの存在下において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連結させる。ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子に存在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下する。
【００２０】
また、２−ハイブリッドシステムは、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合、非−ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する改良された感受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較すると、非−ステロイドリガンドはより低い濃度においてより高い活性を提供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化はしばしば細胞系依存性であるので、各適用につき最大トランス活性化能力を得るためにスイッチングシステムを仕立てるのはより容易である。さらに、２−ハイブリッドシステムは、非修飾ＲＸＲがスイッチングパートナーとして用いられた場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。好ましい２−ハイブリッドシステムにおいては、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは排除され、その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスは低く、その結果、副作用は低下する。
【００２１】
出願人は、最近、エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおける脊椎動物ＲＸＲと同様またはそれよりも良好に無脊椎動物ＲＸＲが機能できるという驚くべき発見をなした（ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国出願第６０／２９４，８１４号参照）。
【００２２】
ＲＸＲは核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー２、グループＢに分類される（ここでは、「グループＢ核受容体」という）。各グループのメンバーはＥ（リガンド結合）ドメインにおいて４０−６０％アミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔら、Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９；Ｃｅｌｌ  ９７：１６１−１６３）。レチノイドＸ受容体に加えて、この核受容体サブファミリー２、グループＢの他のメンバーは、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容コレギュレーター１（ＲＣｏＲ−１）、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、２Ｃ１核受容体、および漿膜因子（ｃｈｏｒｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１（ＣＦ−１）を含む。
【００２３】
改良された核受容体リガンド結合ドメインを提供する努力において、出願人は、今回、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいてリガンド感受性および誘導の大きさに影響するグループＢ核受容体内のアミノ酸残基を同定した。出願人は、本明細書において、これらの臨界的残基において置換突然変異を含むグループＢ核受容体（本明細書中では「置換突然変異体」という）の構築、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用である証明を記載する。本明細書中で示されるように、出願人の新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用は、リガンド感受性およびトランス活性化の大きさが適用に応じて所望であれば選択することができる原核生物および真核生物宿主細胞双方における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
【００２４】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３０，０２８号明細書
【特許文献３】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）明細書
【特許文献４】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）明細書
【特許文献５】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）明細書
【特許文献６】米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４−５４１８
【非特許文献２】Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６２：５１−６１
【非特許文献３】Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０−２７５６０）
【非特許文献４】Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−２４
【非特許文献５】Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：４６０４−７
【非特許文献６】Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９
【非特許文献７】Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
出願人は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な核受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。出願人は、そのような置換突然変異の効果がリガンド結合活性またはリガンド感受性を増大させることができ、それは、ステロイドまたは非−ステロイド特異的であり得ることを示した。かくして、出願人の発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現を変調するのに有用なグループＢ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。出願人の新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法におけるその使用は、現在入手できる誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に遺伝子発現を制御するための効果的な手段を提供する。
【００２６】
本発明は、遺伝子発現レベルの制御が望ましい、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、直交リガンドスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、およびトランスジェニック生物における特性の調節のような適用で有用である。出願人の発明の利点は、それが、遺伝子発現を調節し、使用者の要件に適合するように発現レベルを仕立てるための手段を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
定義
本開示においては、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が設けられ、それは、本発明の範囲および実施を理解するのに助けとなるはずである。
【００２８】
特定の実施形態において、用語「約」または「ほぼ」は与えられた値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、なおより好ましくは１％以内を意味する。
【００２９】
用語「実質的に含まない」は、組成物中（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに応じて）少なくとも約７５重量％の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターが「Ａ」である場合に、「Ａ」を含む組成物が（「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞等である）が「Ｂ」（「Ｂ」は１以上の混入蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物においてＡ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９９重量％を含む。また、混入物を実質的に含まない組成物が、注目する種の活性または特徴を有する単一分子量の種のみを含有するのも好ましい。
【００３０】
本発明の目的では、用語「単離された」は、その元来の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生物学的物質（核酸または蛋白質）を示す。例えば、植物または動物中にて天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然で存在する隣接核酸から分離された同一ポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。用語「精製された」は、他の化合物の存在を排除して、物質が絶対的純粋さを呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対的な定義である。
【００３１】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１桁の大きさ、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁の大きさだけ出発物質または天然物質が精製された後に「精製された」状態にあるものである。
【００３２】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合したものを含んでなる高分子化合物である。核酸はポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、共に一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは直鎖状、環状またはスーパーコイルであり得る。
【００３３】
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルのようなそれらの任意のホスホエステルアナログもいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定しない。かくして、この用語は、とりわけ、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論において、本明細書中では、ＤＮＡの非−転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例に従って配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００３４】
用語「断片」は参照核酸に対して減少した長さのヌクレオチド配列を意味し、共通の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むと理解されるであろう。本発明に従うそのような核酸断片は、適切には、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００または１５００の連続的ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むか、あるいはそれよりなる。
【００３５】
本明細書中で用いるように「単離された核酸断片」は、所望により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有してもよい、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含んでなることができる。
【００３６】
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーをいい、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。また、「遺伝子」とは、コーディング配列に先立つ調節配列（５’非−コーディング配列）およびコーディング配列に続く調節配列（３’非−コーディング配列）を含めた、特定の蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片をいう。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を持つ天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見出されない調節配列および／またはコーディング配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一源に由来するが、天然で見出されるものと異なって配列した調節配列およびコーディング配列を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコーディング配列および／または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子をいう。外来性遺伝子は非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」は、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００３７】
「異種」ＤＮＡとは、細胞、または細胞の染色体部位に天然では位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。
【００３８】
用語「ゲノム」は染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３９】
核酸分子は、当該核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズすることができる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、後掲参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（引用によりその全体を本明細書の一部とみなす）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００４０】
ストリンジェンシー条件は、密接に関連する生物から機能性酵素を複製する遺伝子のような高度に同様な断片に対して、余り関連の無い生物からの相同配列のような中程度に同様な断片につきスクリーニングするように調整することができる。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、５５°のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド無し；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最高のＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。
【００４１】
ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基の間の関係を記載するのに用いる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本明細書中で開示するまたは用いる完全な配列ならびにそれらの実質的に同様な核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００４２】
本発明の特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、前記した条件を利用する５５℃のＴｍにおけるハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件を使用することによって検出される。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃である；より好ましい実施形態においては、Ｔｍは６３℃である；なおより好ましい実施形態においては、Ｔｍは６５℃である。
【００４３】
ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄もストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は室温にて１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで出発し、次いで、４５℃にて３０分間  ２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで、５０℃にて３０分間  ０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復する一連の洗浄を用いる。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を用い、そこでは、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させる以外は洗浄は前記のものと同一である。高度にストリンジェントな条件の他の好ましい組は、６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基の間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。
【００４４】
核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さ、相補性の程度、当該分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための方程式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．５０−０．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、１１．７−１１．８参照）。
【００４５】
本発明の特定の実施形態においては、５００ｍＭ未満の塩における、少なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション工程、および２×ＳＳＰＥでの少なくとも６３℃における洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによってポリヌクレオチドが検出される。好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程につき、２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程双方につき２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。
【００４６】
１つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、該長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液塩の濃度は、プローブの長さといったファクターに従って必要に応じて調整することができる。
【００４７】
用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸とで塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子をいう。
【００４８】
本明細書中で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる、一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンのようなラベルが共有結合したヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド（その一方または双方を標識することができる）を、核酸の全長または断片をクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにＰＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ分子とで三重ヘリックスを形成することができる。一般に、好ましくは核酸合成器でオリゴヌクレオチドを合成により調製する。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのような天然に生じないホスホエステルアナログ結合を有するように調製することができる。
【００４９】
「プライマー」は、適当な条件下でＤＮＡ合成のための開始点として機能することができる二本鎖核酸領域を生じさせるために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で用いることができる。
【００５０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略され、酵素により特定の核酸配列を増幅するためのイン・ビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、３つの段階：標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドのプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む各サイクルに伴う一連の繰り返し温度サイクルを含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
【００５１】
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと省略され、ＲＮＡ分子から標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に生産し、続いて、前記したように標的ｃＤＮＡ分子内で特定の核酸配列の酵素的増幅を行うイン・ビトロ方法を意味する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
【００５２】
ＤＮＡの「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下においた場合に、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、細胞中にて転写されて、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非−コーディング配列）、その中、または下流（３’非−コーディング配列）に位置し、かつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含むことができる。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ含むことができる。もしコーディング配列が真核生物細胞における発現を意図するならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コーディング配列に対して３’側に位置するであろう。
【００５３】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと省略され、ＡＴＧまたはＡＵＧのような翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻訳されることができるある長さの核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）を意味する。
【００５４】
本明細書中では、用語「ヘッド−対−ヘッド」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドの５’末端から遠ざかるように進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−ヘッド向きに位置する。用語「ヘッド−対−ヘッド」は、（５’）−対−（５’）と省略でき、また、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。
【００５５】
本明細書中では、用語「テール−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の向きが他方のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、２つのポリヌクレオチドはテール−対−テール向きに位置する。用語「テール−対−テール」は（３’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によって示すこともできる。
【００５６】
本明細書中では、用語「ヘッド−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドのそれと同一向きに進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−テール向きに位置する。用語「ヘッド−対−テール」は（５’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって示すこともできる。
【００５７】
用語「下流」とは参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
【００５８】
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コーディング配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始点の上流に位置する。
【００５９】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列内に結合し、それを切断する酵素をいう。
【００６０】
「相同組換え」とは、他のＤＮＡ分子への外来性ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入をいう。好ましくは、ベクターは相同組換え用の特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えでは、ベクターは、染色体の配列に対して相同性である十分に長い領域を含有して、相補的結合および染色体へのベクターの組み込みを可能とするであろう。相同性であるより長い領域、および配列同様性のより大きな程度は、相同組換えの効率を増加させることができる。
【００６１】
当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを増幅させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増幅させ、定量的に調製することができる。本明細書中に記載するように、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが、少数の名前を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含む。
【００６２】
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のためのいずれかの手段である。ベクターは、他のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、イン・ビボでＤＮＡ複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の両方を含む。当該分野で知られた非常に多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどすることができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体といったバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体といったプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどの、例えばプラスミドまたは修飾ウイルスを含む。例えば、適当なベクターへの応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。別法として、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾することができるか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによっていずれの部位も生じさせることができる。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を供する選択マーカー遺伝子を含有するように作成することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされた蛋白質を組み込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。
【００６３】
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きた動物対象における広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスベクターを含む。非−ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−蛋白質複合体、およびバイオポリマーを含む。核酸に加え、ベクターは、１以上の調節領域、および／または核酸導入の結果（いずれの組織への導入、発現の持続など）を選択し、測定し、およびモニターするのに有用な選択マーカーを含むこともできる。
【００６４】
用語「プラスミド」とは、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、遺伝子をしばしば運ぶ染色体外エレメントをいう。そのようなエレメントは任意の源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（直鎖状、環状またはスーパーコイル）であってよく、ここに、多数のヌクレオチド配列が、適当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのＤＮＡ配列を細胞に導入することができる独自の構築物に合体または組み換えられている。
【００６５】
「クローニングベクター」は、他の核酸セグメントを結合させて、結合されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドのような、順次複製する核酸、好ましくは、ＤＮＡの単位長さであって、複製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは１つの細胞型で複製することができ、もう１つにおいて発現することができる（「シャトルベクター」）。
【００６６】
ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞に導入されることができる（例えば、Ｗｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日に出願されたカナダ国特許出願第２，０１２，３１１号参照）。
【００６７】
また、本発明によるポリヌクレオチドはリポフェクションによってイン・ビボによって導入することもできる。過去１０年間、イン・ビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソーム−媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３；Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１；およびＵｌｍｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４８）。カチオン脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、また、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７−３８８）。核酸の導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３号およびＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用はある現実的な利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は利点の１つの領域を表す。トランスフェクションを特定の細胞型に向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞異種性を持つ組織において特に好ましいであろうことが明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる（Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、前掲）。標的化されたペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のような蛋白質、または非−ペプチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。
【００６８】
また、カチオンオリゴペプチド（例えばＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合蛋白質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオンポリマー（例えばＷＯ９５／２１９３１号）のような他の分子も、イン・ビボにて核酸のトランスフェクションを容易とするのに有用である。
【００６９】
また、裸のＤＮＡプラスミドとしてイン・ビボにてベクターに導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号参照）。また、受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチも用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４；ならびにＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）。
【００７０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを意味する。外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクトされている」。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡは染色体ＤＮＡに（共有結合的に）組み込まれ、細胞のゲノムを形成する。
【００７１】
「形質転換」とは、宿主の生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物という。
【００７２】
用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。
【００７３】
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主における複製用の１以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。
【００７４】
用語「選択マーカー」は、同定因子、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択することができる因子を意味し、通常は、抗生物質または化学的抵抗性遺伝子であり、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、および／または注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。当該分野で知られ、用いられる選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００７５】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定し、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定する。当該分野で知られ、用いられるレポーター遺伝子の例はルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択マーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考えることもできる。
【００７６】
「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列をいう。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然遺伝子からその全体が由来してもよく、あるいは天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは当業者に理解される。遺伝子をほとんどの機会、ほとんどの細胞型で発現させるプロモーターは、通常「構成的プロモーター」といわれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモーターは、通常、「細胞−特異的プロモーター」または「組織−特異的プロモーター」といわれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、通常、「発生−特異的プロモーター」または「細胞分化−特異的プロモーター」といわれる。当該プロモーターを誘導する物質、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などでの細胞の暴露または処理に続いて誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」といわれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することができることはさらに認識されている。
【００７７】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端において境があり、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを越えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって便宜に画定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
【００７８】
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それが（もしコーディング配列がイントロンを含むならば）トランス−ＲＮＡスプライシングされ、コーディング配列によってコードされた蛋白質に翻訳される場合、細胞中での転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００７９】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列である。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００８０】
用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ−結合ドメインとの相互作用を介して媒介されたプロモーターに対する応答性を付与する１以上のシス−作用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはその配列が回文構造（完全または不完全）であるか、あるいは可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフ部位よりなることからできる。該ハーフ部位は同様または同一であり、直接または逆転反復いずれかとして、あるいは単一ハーフ部位またはタンデムな隣接ハーフ部位のマルチマーとして配列できる。応答エレメントは、当該応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて異なる生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または不存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントについてのＤＮＡ配列の例としてはＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ  Ｌ．ら、（１９９１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５、１２０−１３１参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（Ｎ（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであり得る）（Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ＰＰ．ら、（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１３、１−９）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．ら、（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４、４４６５−４４７４）が挙げられる。
【００８１】
用語「作動可能に連結した」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片に対する核酸配列の関連をいう。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響できる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス向きに調節配列に作動可能に連結することができる。
【００８２】
本明細書中で用いるように、用語「発現」とは、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積をいう。また、発現はｍＲＮＡの蛋白質またはポリペプチドへの翻訳もいうこともできる。
【００８３】
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位において、あるいは相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易とするエレメントを有する特定のベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能とするエレメントも含むことができる。これらのエレメントは、限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含むことができる。
【００８４】
本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと関連した応答エレメント、および１以上のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を変調するＥｃＲベースのシステムの組合せをいう。
【００８５】
用語「変調する」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、減少させ、または阻害し、その結果、蛋白質またはポリペプチド生産をそれぞれ誘導し、減少させまたは阻害することを意味する。
【００８６】
本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するのに適当な少なくとも１つのプロモーターを含むことができる。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどのような制御エレメントの制御下におかれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適当であり、限定されるものではないが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現で有用な）アルカリホスファターゼプロモーター；（Ｐｉｃｈｉａにおける発現で有用な）ＡＯＸ１プロモーター；（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける発現で有用な）β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター；光調節−、種子特異的−、花粉特異的−、子房特異的−、病原または病気関連−、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ  ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質、リブロース１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ、茎−特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロバシリフォームウイルス、植物スーパー−プロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、ニトレートレダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現で有用）；を含み；当該分野で知られた動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれたプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａのプロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまた���第ＶＩＩＩ型因子などの）治療遺伝子のプロモーター、病因または病気関連−プロモーター、および組織特異性を呈しトランスジェニック動物で利用されてきたプロモーターで；例えば膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域；肝臓で活性な、アルブミン遺伝子、Ａｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なアルファ−フェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域；ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーターなどを含む。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修飾することもできる。
【００８７】
本発明の実施形態で用いることができるエンハンサーは、限定されるものではないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどを含む。
【００８８】
終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列もまた好ましい宿主本来の種々の遺伝子に由来することができる。所望により、終止部位は必要ではないが、もし含まれれば最も好ましい。本発明の好ましい実施形態において、終止制御領域は合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含むことができるか、またはそれに由来することができる。
【００８９】
用語「３’非−コーディング配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コーディング配列の下流（３’側）に位置するＤＮＡ配列をいい、それは、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することによって特徴付けられる。
【００９０】
「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸（相同領域）を発現することを天然で担う配列を含むことをできるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質（異種領域）でさえ発現することを担う異なる起源の配列を含むことができる。特に、該配列が原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列であり得るか、または特異的もしくは非特異的に、かつ誘導または非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと向かわせるシグナル配列を含む。
【００９１】
「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域である。異種調節領域内には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列および天然では生じないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。
【００９２】
「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写に由来する産物をいう。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写体といい、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってよく、これは成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが無く、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡをいう「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、それに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写体をいう。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写体またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写体をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写体のいずれかの部分、すなわち、５’非−コーディング配列、３’非−コーディング配列、またはコーディング配列におけるものであり得る。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有する他のＲＮＡをいう。
【００９３】
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基を含んでなるポリマー化合物である。アミノ酸は以下の構造式を有する。
【００９４】
【化１】
0005227758.tif 000002
【００９５】
アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸、プロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【００９６】
「蛋白質」は、生きた細胞において構造的または機能的役割を行うポリペプチドである。
【００９７】
「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」とは、通常はその天然状態においてそれと関連する化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的または合成的混合物、または生物学的活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定化剤の添加、または医薬上許容される製剤への調合のため存在し得る不純物の存在を排除することを意味しない。
【００９８】
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」は、野生型または天然に生じるポリペプチドに対して異なるアミノ酸を持つ少なくとも１つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む突然変異体ポリペプチドを意味すると理解されるであろう。置換突然変異体ポリペプチドは、１つの野生型または天然に生じるアミノ酸置換のみを含むことができ、これは、「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドということができる。あるいは、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然に生じるポリペプチドに対する２以上のアミノ酸による、２以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含むことができる。本発明によれば、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然に生じるグループＢ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに対して異なるアミノ酸による、少なくとも１つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む。
【００９９】
置換突然変異体ポリペプチドが、２以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換につき欠失されたのと同等数の野生型または天然に生じるアミノ酸、すなわち、２つの非−野生型または非−天然に生じるアミノ酸で置換された２つの野生型または天然に生じるアミノ酸、または置換につき欠失された非−同等数の野生型アミノ酸、すなわち、１つの非−野生型アミノ酸で置換された２つの野生型アミノ酸（置換＋欠失突然変異）、または、３つの非−野生型アミノ酸で置換された２つの野生型アミノ酸（置換＋挿入突然変異）のいずれかを含むことができる。
【０１００】
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内で置換されたアミノ酸の残基および数ならびに置換された新しいアミノ酸残基を示す省略命名システムを用いて記載することができる。例えば、ポリペプチドの２０番目のアミノ酸残基が置換された置換突然変異体は、「ｘ２０ｚ」と略することができ、ここに、「ｘ」は置換されるべきアミノ酸であり、「２０」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または数であって、「ｚ」は新しい置換されたアミノ酸である。従って、相互交換可能に「Ｅ２０Ａ」または「Ｇｌｕ２０Ａｌａ」と略された置換突然変異体は、当該突然変異体が、ポリペプチドの位置２０において（当該分野において通常は「Ｅ」または「Ｇｌｕ」と略される）グルタミン酸の代わりに（当該分野では通常「Ａ」または「Ａｌａ」と略される）アラニン残基を含むことを示す。
【０１０１】
置換突然変異は、限定されるものではないが、イン・ビトロ部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８４、ＤＮＡ  ３：４７９−４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片欠失および置換、ＰＣＲ−媒介／オリゴヌクレオチド特異的変異誘発等を含めた、当該分野で知られた突然変異誘発についてのいずれかの技術によってなすことができる。ＰＣＲ−ベースの技術は部位特異的変異誘発について好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９、「Ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ＤＮＡ」、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、第６章、ページ６１−７０参照）。
【０１０２】
本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたり、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切には、それらがその一部であるより大きなポリペプチドに含まれることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０または３００のアミノ酸の長さを有することができる。
【０１０３】
ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し、かつ当該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する全てのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の異なる変種は天然に存在することができる。これらの変種は、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であってもよく、あるいはディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）または翻訳後修飾を含むことができる。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を生じさせることができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非−保存的アミノ酸で置き換えられた変種、（ｂ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が血清アルブミンのような他のポリペプチドと融合した変種を含むことができる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的および酵素的技術を含めた、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【０１０４】
「異種蛋白質」とは、細胞中で天然では生じない蛋白質をいう。
【０１０５】
「成熟蛋白質」とは、翻訳後に加工されたポリペプチド；すなわち、それから、一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されたものをいう。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいう；すなわち、プレおよびプロペプチドが依然として存在する。プレおよびプロペプチドは、限定されるものではないが、細胞内局在シグナル（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）であり得る。
【０１０６】
用語「シグナルペプチド」とは分泌される成熟蛋白質に先行するアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは切断され、従って、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは、分泌された蛋白質を細胞膜を横切るように向け、移動させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋白質ともいう。
【０１０７】
「シグナル配列」は、細胞の表面に発現されるべき蛋白質のコーディング配列の始めに含まれる。この配列は成熟ポリペプチドに対してＮ−末端側にあり、宿主細胞に指令してポリペプチドを移動させるシグナルペプチドをコードする。用語「移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）シグナル配列」は、ここでは、この種類のシグナル配列をいうのに用いられる。移動シグナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と関連することが分かっており、しばしば、双方のタイプの生物で機能できる。
【０１０８】
用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。１つの部分からの配列およびもう１つからの配列の間の対応性は、当該分野で知られた技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、かつ容易に入手できるコンピュータプログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリライゼーション、続いての、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサイズ測定によって決定することができる。
【０１０９】
本明細書中で用いるように、全てのその文法の形式およびスペリングの変化における用語「相同な」とは、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７）。そのような蛋白質（およびそのコーディング遺伝子）は、その高い配列同様性の程度によって反映される配列相同性を有する。しかしながら、通常の用法および本出願においては、用語「相同な」は、「高度に」のような副詞で修飾された場合、配列同様性を言うことができ、共通の進化起源をいわない。
【０１１０】
従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性」とは、共通の進化起源を有しても有さなくてもよい蛋白質の核酸もしくはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７参照）。
【０１１１】
特定の実施形態においては、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の画定された長さにわたってマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手できる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、その特定のシステムにつき定義された、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の画定は当業者の技量内のものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲参照。
【０１１２】
本明細書中で用いるように「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化の結果、１以上のアミノ酸が置換されるが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能的特性には影響しない核酸断片をいう。また、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られる転写体の機能的特性に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような本発明の核酸断片の修飾もいう。従って、本発明は特定の具体的配列以上のものを含むことが理解される。提案された修飾の各々は、コードされた産物の生物学的活性の保持の測定と同様に、十分に当業者のルーチン的技量内のものである。
【０１１３】
さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および洗浄２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いての０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、本明細書中に例示した配列にハイブリダイズするそれらの能力によって、画定されることを認識するであろう。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書に報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるものである。本発明の実質的に好ましい核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、本明細書に報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、本明細書に報告する核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９０％同一である。なおより好ましいのは、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも９５％同一である核酸断片である。
【０１１４】
約４０％を超えるアミノ酸が同一であるか、あるいは６０％を超えて同様である（機能的に同一である）場合に、２つのアミノ酸配列は「実施的に相同」または「実質的に同様」である。好ましくは、同様または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
【０１１５】
用語「に対応する」は、ここでは、正確な位置が同様性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なるかを問わず、同様なまたは相同な配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含むことができる。かくして、用語「に対応する」とは、配列同様性をいい、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。
【０１１６】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；またｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）のようなアルゴリズムを用いるコンピュータ−自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０以上の連続アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が、ポリペプチドまたは核酸配列が既知の蛋白質または遺伝子に相同であるかを推定的に同定するのに必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０−３０の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、１２−１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含む。
【０１１７】
当該分野で知られたように、用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定されるように、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」とは、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味し、この場合には、かかる配列のストリングの間のマッチによって決定され得る。「同一性」および「同様性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されたものを含めた公知の方法によって容易に計算することができるが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、テストする配列の間で最良のマッチを与えるように設計される。同一性および同様性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに編修されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲ  ＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行うことができる。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を備えたアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を用いて行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を用いる対様式のアラインメントについてのデフォルトパラメーターを選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【０１１８】
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムもいう。「配列分析ソフトウェア」は、市販で入手できるか、あるいは独立して開発することができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）を含むであろう。本出願の文脈内では配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に断りのない限り、分析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろう。本明細書中で用いる「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に最初にソフトウェアにロードされた値またはパラメーターのいずれの組も意味するであろう。
【０１１９】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結し、アニールして、遺伝子セグメントを形成させ、次いで、これを酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができるか、あるいは多数の市販で入手可能なマシーンのうちの１つを用いて自動化学合成を行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づく最適遺伝子発現となるように仕立てることができる。もし、コドン利用が宿主に好都合なコドンに偏るならば、当業者であれば首尾よい遺伝子発現の確率を認識するであろう。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手可能な場合には、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１２０】
本明細書で用いるように、２以上の個々に作動できる遺伝子調節システムは、ａ）選択された濃度において、その各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさが測定可能に変化し、およびｂ）該変化が、現実の変調の同時性または順次性に関わらず、細胞、組織または生物において同時に作動することができる全ての他のシステムの発現の変化とは統計学的に有意に異なる場合、「直交している」と言われる。好ましくは、各々が独自で作動できる遺伝子調節システムの変調は、細胞、組織または生物における全ての他の作動可能なシステムよりも少なくとも２倍より大きく遺伝子発現の変化に影響する。より好ましくは、該変化は少なくとも５倍大きい。なおより好ましくは、該変化は少なくとも１０倍大きい。さらにより好ましくは、該変化は少なくとも１００倍大きい。さらになおより好ましくは、該変化は少なくとも５００倍大きい。理想的には、選択された濃度におけるその各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化が起こり、細胞、組織または生物において作動できる全ての他のシステムの発現の測定可能な変化は起きない。そのような場合、多重誘導性遺伝子調節システムは「十分に直交している」と言われる。本発明は、ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国出願第６０／２３７，４４６号に記載されたもののような直交リガンドおよび直交受容体−ベースの遺伝子発現システムにつきサーチするのに有用である。
【０１２１】
本発明の遺伝子発現変調システム
かくして、出願人らは、グループＢ−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるリガンド感受性および誘導の大きさに影響するアミノ酸残基をここに同定した。出願人らは、ここに、これらの臨界的残基における置換突然変異を含むグループＢ核受容体（ここでは、「置換突然変異体」という）の構築、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用であるという証明を記載する。本明細書中で提示するように、出願人らの新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用は、適用に応じてリガンド感受性およびトランス活性化の大きさを所望により選択することができる、原核生物および真核生物両宿主細胞における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
【０１２２】
かくして、本発明は、新規な置換突然変異体グループＢ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのような突然変異したグループＢ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システム、およびそのような核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。
【０１２３】
特に、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現変調システムに関する。好ましくは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、レチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体β、レチノイドＸ受容体γ、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、ウルトラスピラクル蛋白質、２Ｃ１核受容体、および漿膜因子１（ＣＦ−１）からのものである。より好ましくは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、脊椎動物レチノイドＸ受容体α、脊椎動物レチノイドＸ受容体β、脊椎動物レチノイドＸ受容体γ、または無脊椎動物レチノイドＸ受容体からのものである。
【０１２４】
特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、ａ）トランス活性化ドメイン、その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、およびｂ）核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットを含む。該遺伝子発現変調システムは、さらに、ｉ）第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメント；ｉｉ）第１のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む第３の遺伝子発現カセットを含むことができる。
【０１２５】
好ましい実施形態においては、第２のポリペプチドは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ＮＥＲ−１、受容体相互作用蛋白質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体−様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネゾール受容体（ＨＲＲ−１）リガンド結合ドメインよりなる群から選択されるグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む。
【０１２６】
他の特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよび第１の核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、およびトランス活性化ドメインおよび第２の核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットを含み、ここに、核受容体リガンド結合ドメインのうちの１つは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインである。好ましい実施形態においては、第１のポリペプチドはトランス活性化ドメインを実質的に含まず、第２のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実施的に含まない」とは、問題の蛋白質が、活性化または結合活性を供するのに十分な問題のドメインの配列を含まないことを意味する。遺伝子発現変調システムは、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインによって認識される応答エレメント；ｉｉ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む第３の遺伝子発現カセットを含むことができる。
【０１２７】
好ましい実施形態においては、ただ１つの核受容体リガンド結合ドメインが置換突然変異を含むグループＢリガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むグループＢリガンド結合ドメインとでダイマーを形成するいずれかの他の核受容体からのものであってよい。特定の実施形態においては置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインであり、他の核受容体リガンド結合ドメイン（「パートナー」）はグループＨ核受容体からのものである。好ましい実施形態においては、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ＮＥＲ−１、受容体相互作用蛋白質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体−様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネゾール受容体（ＨＲＲ−１）、リガンド結合ドメインよりなる群から選択される。
【０１２８】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、無脊椎動物ＥｃＲからのものであってよく、好ましくは節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ）網ＥｃＲから選択される。好ましくは、ＥｃＲは鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲ、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲ、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａｎ  ＥｃＲ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲおよび半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲよりなる群から選択される。より好ましくは、本発明で用いるＥｃＲリガンド結合ドメインは、ハマキガ科のガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ（タバコスズメガ）ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、ユスリカ  Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｔＥｃＲ」）、カイコガ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ヤブニラミブッシュブラウン  Ｂｉｃｙｃｌｕｓ  ａｎｙｎａｎａ  ＥｃＲ（「ＢａｎＥｃＲ」）、トチノキ  Ｊｕｎｏｎｉａ  ｃｏｅｎｉａ（アメリカタテハモドキ）ＥｃＲ（「ＪｃＥｃＲ」）、ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、カ  Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ（「ＬｃＥｃＲ」）、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ（ヒツジキンバエ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）、クロバエ  Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎｉａ（ホホアカクロバエ）ＥｃＲ（「ＣｖＥｃＲ」）、地中海ミバエ  Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ（チチュウカイミバエ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）、コナジラミ  Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」、配列番号：７４）、ヨコバイ  Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ（ツマグロヨコバイ）ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」、配列番号：７５）またはマダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）からのものである。より好ましくは、ＬＢＤはＣｆＥｃＲ、ＤｍＥｃＲまたはＡｍａＥｃＲからのものである。
【０１２９】
「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、さらに、トランケーション突然変異、欠失突然変異、第２の置換突然変異、または他の修飾を含むことができる。
【０１３０】
特定の実施形態においては、ＬＢＤはトランケートされたＥｃＲポリペプチドからのものである。ＥｃＲポリペプチドトランケーションの結果、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５のアミノ酸の欠失をもたらす。好ましくは、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。より好ましくは、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。特定の実施形態においてはＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、Ａ／Ｂ−ドメイン、Ｃ−ドメイン、Ｄ−ドメイン、Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン、部分的Ｅドメイン、または部分的Ｆドメインの欠失をもたらす。いくつかの完全なおよび／または部分的なドメイン欠失の組み合わせがなされ得る。
【０１３１】
特定の実施形態においてその発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して相同な遺伝子である。他の特定の実施形態において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。
【０１３２】
後記する本発明で用いるリガンドは、核受容体のリガンド結合ドメインと一緒になった場合、次いで核受容体が遺伝子に連結した応答エレメントに結合し、遺伝子の発現の外部一時的調節のための手段を提供する。例えば、リガンドとリガンド結合ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメインと応答エレメント、トランス活性化ドメインとプロモーターのように、本発明の種々の構成要素が相互に結合する結合メカニズムまたは順序は臨界的ではない。
【０１３３】
特定の例においては、グループＢ核受容体および、所望により、その核受容体リガンド結合ドメインパートナーのリガンド結合ドメインへの該リガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、グループＢ核受容体（ＧＢＮＲ）またはそのパートナーへのリガンド結合に対するポテンシャル、および活性ホモダイマー複合体（例えば、ＧＢＮＲ＋ＧＢＮＲまたはパートナー＋パートナー）の形成が得られることを排除しない。好ましくは、受容体ドメインの１以上は変化し、ハイブリッド遺伝子スイッチを生じる。典型的には、３つのドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）およびトランス活性化ドメイン（ＡＤ）のうちの１以上は、ハイブリッド遺伝子およびその結果としてのハイブリッド蛋白質がトランス活性化の活性、リガンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識につき選択された宿主細胞または生物において最適化されるように、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメントそれ自体は、酵母からのＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３５：５６３−５６４参照）もしくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５）、Ｃｅｌｌ、４３：７２９−７３６）をはじめとする他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで、または特定の相互作用（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：３６１６−３６２０参照）のために設計され、修飾されおよび選択された蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントで、修飾または置換されることができ、ハイブリッド受容体を適応させる。２−ハイブリッドシステムの他の利点は、所望の最終目的に従い遺伝子発現を駆動させるのに用いるプロモーターの選択が可能であることである。そのような二重制御は遺伝子治療の領域で重要であり得、特に細胞毒性蛋白質が生産される場合に、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞を共に制御できるために重要であり得る。適当なプロモーターに作動可能に連結した遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは構成的にまたは誘導的に調節することができるか、組織−特異的（すなわち、特定のタイプの細胞でのみ発現される）、または生物のある発生段階に特異的であってよい。
【０１３４】
レチノイドＸ受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであって、サブファミリー２、グループＢ（ここでは「グループＢ核受容体」という）に分類される。各グループのメンバーはＥ（リガンド結合）ドメインにおいて４０−６０％アミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔら、Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９：Ｃｅｌｌ  ９７：１６１−１６３）。レチノイドＸ受容体に加え、この核受容体サブファミリー２、グループＢの他のメンバーは、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、ウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）、２Ｃ１核受容体、および漿膜因子１（ＣＦ−１）を含む。
【０１３５】
出願人らは、以前に、エクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムと一緒になった脊椎動物ＲＸＲが、増大したリガンド感受性およびトランス活性化の大きさによって特徴付けられる酵母および哺乳動物細胞における誘導性遺伝子発現システムを提供することを証明した（係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号参照）。最近、出願人らは、遺伝子発現システムの遺伝子トランス活性化およびリガンド感受性を増加させることによってエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムにおいて、無脊椎動物ＲＸＲが脊椎動物ＲＸＲと同様に、またはそれよりも良好に機能できることを示した（係属中の出願ＵＳ第６０／２９４、８１４号参照）。
【０１３６】
本明細書中で記載するように、出願人らは、今回、核受容体−ベースの発現システムのトランス活性化およびリガンド感受性に影響するＲＸＲのリガンド結合ドメイン内の臨界的なアミノ酸残基を同定した。後記実施例２−４において、出願人らは、脊椎動物ＲＸＲのアミノ酸とは異なる無脊椎動物レチノイドＸ受容体（実施例２および３参照）および無脊椎動物ウルトラスピラクル蛋白質（実施例４参照）リガンド結合ドメインからアミノ酸を同定した。出願人らは、それらの類似の位置において、野生型脊椎動物ＲＸＲアミノ酸を無脊椎動物ＲＸＲまたはＵＳＰのアミノ酸に置き換えることによって、脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメイン内で置換突然変異をなし、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいて遺伝子発現をトランス活性化するその能力につきこれらの置換突然変異体をテストした。本明細書中の実施例に提示するように、出願人らは、今回、トランス活性化活性および／またはリガンド感受性の予期せぬかつ驚くべきレベルを呈するいくつかの新規なレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン置換突然変異体を同定した。
【０１３７】
他のグループＢ核受容体に対するレチノイドＸ受容体の密接な関連性を仮定すれば、出願人らの同定したレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインの置換突然変異は、他のグループＢ核受容体のリガンド結合ドメインの類似の位置に導入して、グループＢ核受容体−ベースの遺伝子発現システムにおいてリガンド結合またはリガンド感受性を修飾した場合に働くと予測される。出願人らの新規な置換突然変異したグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産、および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用につき、核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。
【０１３８】
特に、出願人らは、本明細書中において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な遺伝子発現変調システムを記載する。この遺伝子発現システムは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが１つのコードされたポリペプチド上にある「単一スイッチ」−ベースの遺伝子発現システムであり得る。別法として、該遺伝子発現変調システムは、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメインが２つの異なるコードされたポリペプチド上に位置する「デュアルスイッチ」−または「２−ハイブリッド」−ベースの遺伝子発現変調システムであり得る。出願人らは、置換突然変異した核受容体が、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムの構成要素として用いることができ、原核生物および真核生物細胞双方においてリガンド結合活性および／またはリガンド特異性を修飾することができることを初めて証明した。本明細書中で議論するように出願人らの知見は予測せぬかつ驚くべきことである。
【０１３９】
好ましくは、本発明のグループＢ核受容体−ベースの遺伝子発現変調システムは、ヘテロダイマーまたはホモダイマーいずれかであってよい。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインとヘテロ二量体化して、機能的ＥｃＲ複合体を形成する。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの２つのメンバー、種々の昆虫から得られたエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）蛋白質またはＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体蛋白質よりなるヘテロダイマー蛋白質複合体をいう（Ｙａｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６、４７６−４７９；Ｙａｏら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１、６３−７２参照）。しかしながら、複合体は後に詳細に記載するように、ホモダイマーであってもよい。また、機能的エクジステロイド受容体複合体はイムノフィリンのようなさらなる蛋白質を含むこともできる。（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１のような）転写因子として知られた蛋白質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーもまた、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲにつきリガンド依存的または非依存的パートナーであり得る。加えて、（アダプターまたはメディエーターともいう）一般にコアクチベーターとして知られた蛋白質のような他の補因子も必要であろう。これらの蛋白質はＤＮＡに配列−特異的に結合せず、基礎転写に関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベーターのＤＮＡ−結合の刺激を含めた種々のメカニズムを介して転写活性化にそれらの影響を及ぼし得る。そのようなコアクチベーターの例としては、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ）コアクチべーターＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００が挙げられる（レビューについては、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２２２−２３２、１９９７参照）。また、（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られた）一般にコリプレッサーとして知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下において転写活性化を効果的に阻害するのに必要であろう。これらのコリプレッサーは、非リガンド化エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおける活性をサイレントとすることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コリプレッサーの放出、および前記したコアクチベーターの動員をもたらし、それにより、そのサイレンシング活性をなくすることを示唆する。コリプレッサーの例としては、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが挙げられる（レビューには、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７−１１７７、１９９６参照）。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であってよいか、あるいは、調節または非調節いずれかの様式にて発現されるべきトランスジーンとして外因的に添加することができる。エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲのホモダイマー複合体もまたある状況下で機能的であり得る。
【０１４０】
エクジソン受容体複合体は、典型的には、全てのメンバーが、一般に、アミノ−末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含む。本明細書中で用いるように、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限り、ＤＮＡ結合蛋白質の全長までのＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列を含む。また、核受容体スーパーファミリーのメンバーは４または５ドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびあるメンバーではＦの存在によって特徴付けられる（米国特許第４，９８１，７８４号およびＥｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８８９−８９５（１９８８））。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、および「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。また、ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ−末端側にもう１つのトランス活性化ドメインを有することもできる。
【０１４１】
ＤＢＤは、その間に、エクジソン応答エレメントについての特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスがある２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然であり、修飾されており、あるいは異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであり得る。ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様にＥｃＲ受容体は、へテロ二量体化特性を担うあまりよくは画定されていない領域も保有する。核受容体のドメインは本来モジュールであるので、ＬＢＤ、ＤＢＤおよびトランス活性化ドメインを相互に交換することができる。
【０１４２】
エクジソン受容体複合体からの構成要素を組み込む遺伝子スイッチシステムは知られている。しかしながら、これらの既知のシステムにおいては、ＥｃＲが用いられる場合は常に、ＥｃＲは、同一分子上の天然もしくは修飾されたＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインと関連する。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的には、サイレントパートナーとして用いられる。出願人らは、以前に、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一分子の上にあると、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は高く、そのような活性は、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子の上、すなわち、ヘテロダイマーまたはホモダイマー複合体の２つのパートナーの各々の上にあると、劇的に低下することを示した（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号参照）。
【０１４３】
本発明の遺伝子発現カセット
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、宿主細胞において発現させることができる少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含み、ここに、遺伝子発現カセットは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。かくして、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現システムで用いることができる新規な遺伝子発現カセットも提供する。
【０１４４】
特定の実施形態において、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセットは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメインおよび置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１４５】
他の特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットを提供し、該遺伝子発現カセットは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメインおよび置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明によるハイブリッドポリペプチドは少なくとも２つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源、すなわち、異なる核受容体、異なる種などからのものである。本発明によるハイブリッドポリペプチドは少なくとも２つのポリペプチドドメインを含むことができ、ここに、各ポリペプチドドメインは異なる源からのものである。
【０１４６】
特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体β（ＲＸＲβ）、レチノイドＸ受容体γ（ＲＸＲγ）、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、ウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）、２Ｃ１核受容体、または漿膜因子１（ＣＦ−１）からのものである。好ましい実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは脊椎動物レチノイドＸ受容体α、脊椎動物レチノイドＸ受容体β、脊椎動物レチノイドＸ受容体γ、または無脊椎動物レチノイドＸ受容体からのものである。
【０１４７】
かくして、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットも提供する。好ましくは、該遺伝子発現カセットは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み；ここに、コードされたハイブリッドポリペプチドは少なくとも２つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源からのものである。
【０１４８】
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は無脊椎動物または脊椎動物ＲＸＲからのものであってよい。好ましくは、本発明で用いるＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒト  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＨｓＲＸＲ）、マウス  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ハツカネズミ）（ＭｍＲＸＲ）、ラット  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）（ＲｎＲＸＲ）、ニワトリ  Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（チャボ）（ＧｇＲＸＲ）、家畜ブタ  Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ブタ）（ＳｓＲＸＲ）、カエル  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）（ＸｌＲＸＲ）、ゼブラフィッシュ  Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ（ゼブラダニオ）（ＤｒＲＸＲ）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ＵＳＰ／ＲＸＲホモログ（「ＬｍＵＳＰ」または「ＬｍＲＸＲ」ともいう）、アブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、ミツバチ  Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ（ヨーロッパミツバチ）ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＲＸＲホモログ（ＣｐＲＸＲ）、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、ホヤ  Ｐｏｌｙａｎｄｒｏｃａｒｐａ  ｍｉｓａｋｉｅｎｓｉｓ（ミサキマメイタボヤ）（ＰｍＲＸＲ）、またはクラゲ  Ｔｒｉｐｅｄａｌｉａ  ｃｙｓｔｏｐｈｏｒａ  ＲＸＲ（ＴｃＲＸＲ）からのものである。より好ましくはＬＢＤはＭｍＲＸＲまたはＨｓＲＸＲからのものである。
【０１４９】
特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ここにアミノ酸残基は、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置にある。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１５０】
他の特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、４９５、５００または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５または５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１または４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基５１６のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン酸残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｑ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７および４７８のアミノ酸と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９のアミノ酸と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはｒ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１５１】
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｄ３４４Ｎ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７１Ｄ、Ｔ４７３Ｅ、Ａ４９５Ｓ、Ｅ５００Ｓ、Ｋ５１１Ｒ、Ｔ５１６Ｖ、またはＡ５２８Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２Ｒ、およびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインである。
【０１５２】
他の特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３のアミノ酸残基と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１５３】
好ましくは、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、４９５、５００または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５または５１１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１または４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基５１６のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６のアミノ酸と同等または類似の位置にセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｑ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７および４７８のアミノ酸と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９のアミノ酸と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはｒ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３のアミノ酸と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１５４】
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインであり、ここに、置換突然変異は、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｄ３４４Ｎ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７１Ｄ、Ｔ４７３Ｅ、Ａ４９５Ｓ、Ｅ５００Ｓ、Ｋ５１１Ｒ、Ｔ５１６Ｖ、またはＡ５２８Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２Ｒ、およびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される。
【０１５５】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、合成およびキメラＤＮＡ結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体を含めた、既知の応答エレメントを持ついずれのＤＮＡ結合ドメインでもあり得る。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＢ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、またはＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはエクジソン受容体（ＥｃＲ）ＤＢＤ［配列番号；３（ポリヌクレオチド）または配列番号：４（ポリペプチド）］、ＧＡＬ４  ＤＢＤ［配列番号：５（ポリヌクレオチド）または配列番号：６（ポリペプチド）］、またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ［配列番号：７（ポリヌクレオチド）または配列番号：８（ポリペプチド）］である。
【０１５６】
（「ＡＤ」または「ＴＡ」と省略される）トランス活性化ドメインはいずれのグループＢ核受容体メンバーＡＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、ＧＡＬ４  ＡＤ、ＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、Ｐ６５活性化ドメイン（Ｐ６５ＡＤ）、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体であってもよい。
【０１５７】
特定の実施形態において、ＡＤは合成もしくはキメラＡＤであるか、あるいはエクジソン受容体、グルココルチコイド受容体、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢ、またはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤはＥｃＲ  ＡＤ［配列番号：９（ポリヌクレオチド）または配列番号：１０（ポリペプチド）］、ＶＰ１６  ＡＤ［配列番号：１１（ポリヌクレオチド）または配列番号：１２（ポリペプチド）］、Ｂ４２  ＡＤ［配列番号：１３（ポリヌクレオチド）または配列番号：１４（ポリペプチド）］、またはｐ６５  ＡＤ［配列番号：１５（ポリヌクレオチド）または配列番号：１６（ポリペプチド）］である。
【０１５８】
特定の実施形態は、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイン；配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３または配列番号：１５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメイン；および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメイン；ｂ）配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメイン、またはｃ）配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３または配列番号：１５の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメイン；および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメイン；を含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。
【０１５９】
他の特定の実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列を含むＤＮＡ−結合ドメイン；配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４または配列番号：１６のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン；および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメイン、ｂ）配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列を含むＤＮＡ−結合ドメイン；および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメイン、またはｃ）配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４または配列番号：１６のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン；および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、本発明による置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。
【０１６０】
応答エレメント（「ＲＥ」）は、既知のＤＮＡ結合ドメインを持ついずれの応答エレメント、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体であってもよい。単一のＲＥを使用することができるか、あるいは複数ＲＥ（同一ＲＥの複数コピーまたは２以上の異なるＲＥ）を本発明で用いることができる。特定の実施形態において、ＲＥは、ＧＡＬ４からのＲＥ（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡからのＲＥ、グループＢ核受容体ＲＥ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥである。好ましくは、ＲＥは、配列番号：１７のポリヌクレオチド配列を含むエクジソンＲＥ（ＥｃＲＥ）、配列番号：１８のポリヌクレオチド配列を含むＧＡＬ４ＲＥ、または配列番号：１９のポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡ  ＲＥ（オペロン、「ｏｐ」）（「２ＸＬｅｘＡｏｐＲＥ」）である。
【０１６１】
本発明によるステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインまたは応答エレメントは、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）、甲状腺受容体１（ｃ−ｅｒｂＡ−１）、甲状腺ホルモン受容体β（ＴＲβ）、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）、レチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ、ＨＡＰ）、レチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）、レチノイン酸受容体ガンマ−様（ＲＡＲＤ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体β（ＰＰＡＲβ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体δ（ＰＰＡＲδ、ＮＵＣ−１）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化関連受容体（ＦＦＡＲ）、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、甲状腺ホルモン受容体αの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢα）、ｖ−ｅｒｂ  Ａ関連受容体（ＥＡＲ−１）、ｖ−ｅｒｂ関連受容体（ＥＡＲ−１Ａ）、γ）、甲状腺ホルモン受容体βの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢβ）、ｖ−ｅｒｂ関連受容体（ＥＡＲ−１β）、オーファン核受容体ＢＤ７３（ＢＤ７３）、ｒｅｖ−ｅｒｂＡ−関連受容体（ＲＶＲ）、亜鉛フィンガー蛋白質１２６（ＨＺＦ２）、エクジソン−誘導性蛋白質Ｅ７５（Ｅ７５）、エクジソン−誘導性蛋白質Ｅ７８（Ｅ７８）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ受容体７８（ＤＲ−７８）、レチノイド−関連オーファン受容体α（ＲＯＲα）、レチノイドＺ受容体α（ＲＺＲα）、レチノイド関連オーファン受容体β（ＲＯＲβ）、レチノイドＺ受容体β（ＲＺＲβ）、レチノイド−関連オーファン受容体γ（ＲＯＲγ）、レチノイドＺ受容体γ（ＲＺＲγ）、レチノイド−関連オーファン受容体（ＴＯＲ）、ホルモン受容体３（ＨＲ−３）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体３（ＤＨＲ−３）、ｍａｎｄｕｃａホルモン受容体（ＭＨＲ−３）、Ｇａｌｌｅｒｉａホルモン受容体３（ＧＨＲ−３）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体３（ＣＮＲ−３）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａホルモン受容体３（ＣＨＲ−３）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体１４（ＣＮＲ−１４）、エクジソン受容体（ＥＣＲ）、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン核受容体（ＯＲ−１）、ＮＥＲ−１、受容体−相互作用蛋白質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体−相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、ＨＲＲ−１、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、オーファン核受容体（ＯＮＲ−１）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ステロイドおよび生体内異物受容体（ＳＸＲ）、ベンゾエートＸ受容体（ＢＸＲ）、核受容体（ＭＢ−６７）、構成的アンドロスタン受容体１（ＣＡＲ−１）、構成的アンドロスタン受容体α（ＣＡＲα）、構成的アンドロスタン受容体２（ＣＡＲ−２）、構成的アンドロスタン受容体β（ＣＡＲβ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体９６（ＤＨＲ−９６）、核ホルモン受容体１（ＮＨＲ−１）、肝細胞核因子４（ＨＮＦ−４）、肝細胞核因子４Ｇ（ＨＮＦ−４Ｇ）、肝細胞核因子４Ｂ（ＨＮＦ−４Ｂ）、肝細胞核因子４Ｄ（ＨＮＦ−４Ｄ、ＤＨＮＦ−４）、レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体β（ＲＸＲβ）、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、レチノイドＸ受容体γ（ＲＸＲγ）、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、２Ｃ１核受容体、漿膜因子１（ＣＦ−１）、精巣受容体２（ＴＲ２）、精巣受容体２−１１（ＴＲ２−１１）、精巣受容体４（ＴＲ４）、ＴＡＫ−１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体（ＤＨＲ７８）、テールレス（ＴＬＬ）、テールレスホモログ（ＴＬＸ）、ＸＴＬＬ、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｉ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ａ（ＣＯＵＰ−ＴＦＡ）、ＥＡＲ−３、ＳＶＰ−４４、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子ＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｂ（ＣＯＵＰ−ＴＦＢ）、ＡＲＰ−１、ＳＶＰ−４０、ＳＶＰ、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子ＩＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子Ｇ（ＣＯＵＰ−ＴＦＧ）、ＳＶＰ−４６、ＥＡＲ−２、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、エストロゲン関連受容体１（ＥＲＲ１）、エストロゲン関連受容体α（ＥＲＲα）、エストロゲン関連受容体２（ＥＲＲ２）、エストロゲン関連受容体β（ＥＲＲβ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、神経成長因子誘導遺伝子Ｂ（ＮＧＦＩ−Ｂ）、Ｎｕｒ−７７と同様の核受容体（ＴＲＳ）、Ｎ１０、オーファン受容体（ＮＵＲ−７７）、ヒト初期応答遺伝子（ＮＡＫ−１）、Ｎｕｒｒ関連因子１（ＮＵＲＲ−１）、ヒト即時型−初期応答遺伝子（ＮＯＴ）、再生肝臓核受容体１（ＲＮＲ−１）、造血亜鉛フィンガー３（ＨＺＦ−３）、Ｎｕｒ関連蛋白質−１（ＴＩＮＯＲ）、核オーファン受容体１（ＮＯＲ−１）、ＮＯＲ１関連受容体（ＭＩＮＯＲ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａホルモン受容体３８（ＤＨＲ−３８）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ核受容体８（ＣＮＲ−８）、Ｃ４８Ｄ５、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）、エンドゼピン−様ペプチド（ＥＬＰ）、ｆｕｓｈｉ  ｔａｒａｚｕ因子１（ＦＴＺ−Ｆ１）、副腎４結合蛋白質（ＡＤ４ＢＰ）、肝臓受容体ホモログ（ＬＲＨ−１）、Ｆｔｚ−Ｆ１−関連オーファン受容体Ａ（ｘＦＦｒＡ）、Ｆｔｚ−Ｆ１−関連オーファン受容体Ｂ（ｘＦＦｒＢ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＦＦＬＲ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＰＨＲ）、フェト蛋白質転写因子（ＦＴＦ）、胚細胞核因子（ＧＣＮＦＭ）、レチノイド受容体−関連精巣−関連受容体（ＲＴＲ）、ｋｎｉｒｐｓ（ＫＮＩ）、ｋｎｉｒｐｓ関連（ＫＮＲＬ）、胚性生殖腺（ＥＧＯＮ）、リガンド依存性核受容体についてのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子（ＥＡＧＬＥ）、トリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）と同様な核受容体（ＯＤＲ７）、トリソラックス、用量感受性性逆転副腎発育不全先天性臨界領域染色体Ｘ遺伝子（ＤＡＸ−１）、副腎発育不全先天性および下垂体性機能不全生殖機能不全（ＡＨＣＨ）、および短いヘテロダイマーパートナー（ＳＨＰ）よりなる群から選択されるステロイド／甲状腺ホルモン核受容体から得ることができる。
【０１６２】
かくして、本発明は、ｉ）ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）トランス活性化ドメインを含むポリペプチドによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットも提供する。
【０１６３】
出願人らの遺伝子発現カセットで用いられる注目する遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子であり得る。所望の遺伝子もしくは蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列情報は、多くの公共アクセスデータベースの１つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、あるいは多くの生物学関連雑誌刊行物で突き止めることができる。かくして、当業者であれば、実質的にすべての既知の遺伝子につき核酸配列情報にアクセスできる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中で記載した出願人らの方法に用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。
【０１６４】
出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子の例としては、限定されるものではないが、疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに使用され得る；例えば、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子もしくは成分、遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス、薬物発見用の、機能的ゲノミクス用の、ならびにプロテオミクスの分析用および適用用の標的などをはじめとする治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１６５】
本発明の目的では、核受容体およびグループＢ核受容体もまた合成およびキメラ核受容体およびグループＢ核受容体およびそれらのホモログを含む。
【０１６６】
本発明のポリヌクレオチド
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む。これらの遺伝子発現カセット、それらが含むポリヌクレオチド、およびそれらがコードするポリペプチドは、宿主細胞内で遺伝子の発現を変調するための核受容体−ベースの遺伝子発現システムの構成要素として有用である。かくして、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【０１６７】
特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ここに、該アミノ酸残基は、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号；１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８、ｄ）配列番号２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるものである。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１６８】
他の特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、４９５、５００または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５または５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１または４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基５１６と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｑ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはｒ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインドはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１６９】
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｄ３４４Ｎ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７１Ｄ、Ｔ４７３Ｅ、Ａ４９５Ｓ、Ｅ５００Ｓ、Ｋ５１１Ｒ、Ｔ５１６ＶまたはＡ５２８Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２Ｒ、およびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインである。
【０１７０】
また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【０１７１】
特定の実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１７２】
また、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する。
【０１７３】
特に、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。
【０１７４】
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含み、ここに、該アミノ酸残基はａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９、またはｂ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４、４３１、４４２、４９５、５１１または５２８と同等または類似の位置におけるものである。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４９５または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはｇ）配列番号：２のアミノ酸残基５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、およびｂ）配列番号：２のＤ３４４Ｎ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ａ４９５Ｓ、Ｋ５１１ＲまたはＡ５２８Ｓよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。
【０１７５】
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイドリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含み、ここに、該アミノ酸残基はａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９、またはｂ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４、４３１、４４２、４９５、５１１または５２８と同等または類似の位置におけるものである。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４９５または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはｇ）配列番号：２のアミノ酸残基５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、およびｂ）配列番号：２のＤ３４４Ｎ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ａ４９５Ｓ、Ｋ５１１ＲまたはＡ５２８Ｓよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。
【０１７６】
加えて、本発明はまた置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強する。
【０１７７】
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３５５、３８５、４６２、４７０、４７２、４７３または５００、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７または５００と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２Ｄ、Ｔ４７３Ｅ、またはＥ５００Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含む。
【０１７８】
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３５５、３８５、４６２、４７０、４７２、４７３または５００、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７または５００と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、ｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２Ｄ、Ｔ４７３ＥまたはＥ５００Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含む。
【０１７９】
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性双方を増強させる。
【０１８０】
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させる。特定の実施形態において、該二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。他の特定の実施形態において該二量体化パートナーはトランケートされたＥｃＲポリペプチドである。
【０１８１】
加えて、本発明は、転写調節エレメントに作動可能に連結した、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくは、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、発現能力の有る宿主細胞において核受容体リガンド結合ドメインの発現を可能とする発現制御配列と作動可能に連結している。該発現制御配列は、発現が望まれる宿主細胞中で機能するプロモーターを含むことができる。該ベクターはプラスミドＤＮＡ分子またはウィルスベクターであり得る。好ましいウィルスベクターはレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ−随伴ウイルス、ヘルペスウィルスおよびワクシニアウィスルを含む。本発明は、さらに、そのゲノム中に前記した置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む複製欠陥組換えウィルスに関する。かくして、本発明はそのような発現ベクターを含む単離された宿主細胞にも関し、ここに、転写調節エレメントは宿主細胞中で作動できる。
【０１８２】
また、本発明は本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた単離されたポリペプチドに関する。
【０１８３】
本発明のポリペプチド
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む。かくして、本発明は本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドも提供する。
【０１８４】
他の特定の実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３４４、３５５、３８５、４３１、４４２、４６２、４７０、４７２、４７３、４９５、５００、５１１、５１６または５２８、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。
【０１８５】
好ましくは、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７、４９５、５００、または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５または５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１または４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基５１６と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｐ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｑ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７、および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基またはｒ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。好ましい実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１８６】
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインであり、ここに、該置換突然変異は、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｄ３４４Ｎ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２Ｄ、Ｔ４７３Ｅ、Ａ４９５Ｓ、Ｅ５００Ｓ、Ｋ５１１Ｒ、Ｔ５１６ＶまたはＡ５２８Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される。
【０１８７】
また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドよりなる群から選択される単離されたポリペプチドを提供する。好ましい実施形態においては、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１８８】
また、本発明は、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択される単離されたハイブリッドポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドＸ受容体からのものである。
【０１８９】
また、本発明は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０１９０】
特に、本発明は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む単離されたグループＢ核受容体ポリペプチドに関する。
【０１９１】
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９、またはｂ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４、４３１、４４２、４９５、５１１または５２８と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４９５または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはｇ）配列番号：２のアミノ酸残基５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、およびｂ）配列番号：２のＤ３４４Ｎ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ａ４９５Ｓ、Ｋ５１１ＲまたはＡ５２８Ｓよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
【０１９２】
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイドリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１または４２９、またはｂ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４、４３１、４４２、４９５、５１１、または５２８と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基３４４と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基４３１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基４４２と同等または類似の位置におけるリジン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基４９５または５２８と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはｇ）配列番号：２のアミノ酸残基５１１と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、およびｂ）配列番号：２のＤ３４４Ｎ、Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、Ａ４９５Ｓ、Ｋ５１１ＲまたはＡ５２８Ｓよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
【０１９３】
加えて、本発明は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
【０１９４】
特定の実施形態において、本発明は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３５５、３８５、４６２、４７０、４７２、４７３または５００、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７または５００と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７、および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基またはｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２Ｄ、Ｔ４７３ＥまたはＥ５００Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
【０１９５】
他の特定の実施形態において、本発明は、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１の４０１または４２９、ｂ）配列番号：１の４０１および４２９、ｃ）配列番号：２の３３７、３５５、３８５、４６２、４７０、４７２、４７３または５００、ｄ）配列番号：２の３２１、３２２および３２３、ｅ）配列番号：２の４５０、４５１および４５２、ｆ）配列番号：２の４５５、４５６、４５７および４５８、ｇ）配列番号：２の４７０、４７２および４７３、ｈ）配列番号：２の４７５、４７６、４７７、４７８および４７９、ならびにｉ）配列番号：２の４８１、４８２および４８３よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基４０１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：１のアミノ酸残基４２９と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｄ）配列番号：２のアミノ酸残基３３７または５００と同等または類似の位置におけるセリン残基、ｅ）配列番号：２のアミノ酸残基３５５と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基３８５または４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、ｇ）配列番号：２のアミノ酸残基４６２と同等または類似の位置におけるロイシン残基、ｈ）配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、ｉ）配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、ｊ）配列番号：２のアミノ酸残基３２１と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号：２のアミノ酸残基３２２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基３２３と同等または類似の位置におけるバリン残基、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基４５０と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５１と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５２と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、ｌ）配列番号：２のアミノ酸残基４５５と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５６と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４５７と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４５８と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、ｍ）配列番号：２のアミノ酸残基４７０と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７２と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７３と同等または類似の位置におけるチロシン残基、ｎ）配列番号：２のアミノ酸残基４７５、４７７、および４７８と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号：２のアミノ酸残基４７６と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４７９と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはｏ）配列番号：２のアミノ酸残基４８１と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号：２のアミノ酸残基４８２と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号：２のアミノ酸残基４８３と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは該単離されたポリペプチドは、ａ）配列番号：１のＥ４０１ＤまたはＧ４２９Ｓ、ｂ）配列番号：１のＥ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ、ｃ）配列番号：２のＴ３３７Ｓ、Ｋ３５５Ｒ、Ｓ３８５Ａ、Ｖ４６２Ｌ、Ｓ４７０Ａ、Ｅ４７２Ｄ、Ｔ４７３ＥまたはＥ５００Ｓ、ｄ）配列番号：２のＧ３２１Ｌ、Ｐ３２２ＲおよびＧ３２３Ｖ、ｅ）配列番号：２のＤ４５０Ｅ、Ａ４５１ＶおよびＫ４５２Ｒ、ｆ）配列番号：２のＳ４５５Ｋ、Ｎ４５６Ｓ、Ｐ４５７ＡおよびＳ４５８Ｑ、ｇ）配列番号：２のＳ４７０Ａ、Ｅ４７２ＤおよびＴ４７３Ｙ、ｈ）配列番号：２のＣ４７５Ｔ、Ｋ４７６Ｒ、Ｑ４７７Ｔ、Ｋ４７８ＴおよびＹ４７９Ｈ、ならびにｉ）配列番号：２のＥ４８１Ｄ、Ｑ４８２ＥおよびＱ４８３Ｐよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
【０１９６】
他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループＢ核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性双方を増強させる。
【０１９７】
他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異は置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させる。特定の実施形態において、該二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。他の特定の実施形態において、該二量体化パートナーはトランケートされたＥｃＲポリペプチドである。
【０１９８】
また、本発明は、本発明による単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１９９】
本発明の遺伝子発現の変調方法
また、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法に関する。具体的には、出願人らの発明は、ａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；さらに、ｂ）該宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、ここに、変調すべき遺伝子は、ｉ）該遺伝子発現システムのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
【０２００】
また、本発明は、ａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、ｂ）本発明の遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入し、ここに、該遺伝子発現カセットはｉ）該遺伝子発現システムからのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含み；さらに、ｃ）宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
【０２０１】
また、出願人らの発明は、それに対して遺伝子発現変調システムの第１のハイブリッドポリペプチドからのＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント；遺伝子発現変調システムの第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびその発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法であって、該方法がａ）本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；さらに、ｂ）宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする該方法を提供する。
【０２０２】
出願人らの方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子であってもよい。所望の遺伝子もしくは蛋白質についての核酸もしくはアミノ酸配列の情報は多くの公のアクセスデータベースのうちの１つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、あるいは多くの生物学関連雑誌刊行物に見出すことができる。かくして、当業者は、実質的に全ての公知の遺伝子につき核酸配列の情報にアクセスできる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中に記載する出願人らの方法で用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。
【０２０３】
出願人らの方法を用いる宿主細胞における発現用の注目する遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ワクチンとして植物で生産される抗原、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウイルス、および無生物ストレス、栄養補給食品、抗原、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性を修飾する遺伝子；疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに用いることができる、例えばモノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子または構成成分、遺伝子治療用のウィルスベクター、ワクチン用のウィルス、薬物発見用、機能的ゲノミクス用、およびプロテオミクスの分析および適用等の標的のような、治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子を含む。
【０２０４】
許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの本発明の遺伝子発現システムのＤＮＡ結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現の活性化または抑制がもたらされる場合に、遺伝子の発現を変調する、任意のものである。好ましいリガンドはエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ等のようなエクジステロイド、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号、第５，５３０，０２８号および第５，３７８，７２６号に開示されたもののようなＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；欧州出願第４６１，８０９号に開示されたもののようなジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたもののようなＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号に開示されたもののようなＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号に記載されたもののようなＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン（その各々、ここに引用して本明細書の一部とみなす）；ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビフォスフォネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ、９−シス−レチノイン酸、４−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル）安息香酸（３−メチル−ＴＴＥＢ）、（（Ｅ）−２）２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフチル）プロペン−１−イル）−４−チオフェンカルボン酸）、２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチル）−２−（カルボキシフェニル）−１，３−ジオキソラン、４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−ジベンゾ（ｂ，ｅ）（１，４）ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（ＨＸ６００）もしくはそのチアジアゼピンアナログ、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデコン酸（フィタン酸）、６−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）シクロプロピル）ニコチン酸、２−（４−カルボキシフェニル）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５、５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１，３−ジチアン、または４−（２−メチル）−１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）プロペニル）安息香酸等を含めた他の同様の物質を含む。
【０２０５】
好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは式：
【化２】
0005227758.tif 000003
の化合物である。
【０２０６】
式中、
Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ３、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである。
【０２０７】
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドはエクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡまたはムリステロンＡである。
【０２０８】
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは９−シス−レチノイン酸、４−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）−エテニル）安息香酸（３−メチル−ＴＴＥＢ）、（（Ｅ）−２）２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフチル）プロペン−１−イル）−４−チオフェンカルボン酸）、２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチル）−２−（カルボキシフェニル）−１，３−ジオキソラン、４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−ジベンゾ（ｂ，ｅ）（１，４）ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（ＨＸ６００）またはそのチアジアゼピンアナログ、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデコン酸（フィタン酸）、６−（１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）シクロプロピル）ニコチン酸、２−（４−カルボキシフェニル）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１，３−ジチアン、または４−（２−メチル）−１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）プロペニル）安息香酸である。
【０２０９】
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法において前記で議論した第１のリガンドに加えて第２のリガンドを用いることができる。好ましくは、この第２のリガンドは９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである。
【０２１０】
本発明の宿主細胞および非−ヒト生物
前記したように、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて、宿主細胞において遺伝子発現を変調することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、注目する種々の遺伝子の発現で有用であり得る。出願人らの発明は、原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現の変調を提供する。トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、ワクチンとして植物で生産される抗原、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウィルスおよび無生物ストレス、栄養補給食品、抗原、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性、治療ポリペプチド、経路中間体を修飾する遺伝子を含めた注目する種々のポリペプチドの発現に有用であり；宿主を用いて以前には可能でなかった新しい産物の合成のための、宿主に既に存在する経路の変調；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ、バイオ治療蛋白質生産、プロテオミクスアッセイ等の変調に有用である。加えて、遺伝子産物は、宿主のより高い増殖量を付与するのに、あるいは利用すべき別の増殖様式を可能とするのに有用であり得る。
【０２１１】
かくして、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現システムを含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞を提供する。また、出願人らの発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明による発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞または哺乳動物細胞であり得る。なおさらなる実施形態において、本発明は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインの生産方法に関し、ここに、該方法は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で、培地中で前記宿主細胞を培養し、さらに、該培養から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを単離することを含む。
【０２１２】
特定の実施形態において、単離された宿主細胞は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。他の特定の実施形態において単離された宿主細胞は無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メスウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。
【０２１３】
好ましい宿主細胞としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａのような真菌類または酵母種、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属におけるもののような細菌種、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物種、動物および哺乳動物宿主細胞が挙げられる。
【０２１４】
特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である。
【０２１５】
他の特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｌｅｇａｎｓ線虫細胞である。  
【０２１６】
他の特定の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。
【０２１７】
他の特定の実施形態において、宿主細胞はリンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦細胞よりなる群から選択される植物細胞である。
【０２１８】
他の特定の実施形態において、宿主細胞はゼブラフィッシュ細胞である。
【０２１９】
他の特定の実施形態において、宿主細胞はニワトリ細胞である。
【０２２０】
他の特定の実施形態において、宿主細胞はハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される哺乳動物細胞である。
【０２２１】
宿主細胞の形質転換は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非−ウィルスベクター媒介トランスフェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換、パーティクル衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養し、形質転換遺伝子の発現を誘導することを含む。原核生物および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている（実施例の一般的方法セクション参照）。遺伝子産物に特異的なプロトコルに従い、細胞を回収し、遺伝子産物を単離することができる。
【０２２２】
加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を変調するか、または所望の特定の様式にてポリペプチド産物を修飾および加工する宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後のプロセッシングおよび修飾［例えば、グリコシル化、（例えば、シグナル配列の）切断］についての特徴的かつ特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主システムを選択して、発現される外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを確実とすることができる。例えば、細菌システムにおける発現を用いて、非−グリコシル化コア蛋白質産物を生産することができる。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれていないであろう。酵母における発現はグリコシル化産物を生じさせることができる。真核生物細胞における発現は、「天然」グリコシル化の確立および異種蛋白質の折り畳みを増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現はポリペプチドの活性を復元または構成するためのツールを提供することができる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、蛋白質分解切断のようなプロセッシング反応に異なる程度影響し得る。
【０２２３】
出願人らの発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非−ヒト生物にも関する。特定の実施形態において、非−ヒト生物は原核細胞生物または真核生物である。他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は無脊椎動物生物または脊椎動物生物である。
【０２２４】
好ましくは、非−ヒト生物は細菌、真菌類、酵母、線虫、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物および哺乳動物よりなる群から選択される。より好ましくは、非−ヒト生物は酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、メウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サルまたはチンパンジーよりなる群から選択される。
【０２２５】
特定の実施形態において、非−ヒト生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａよりなる群から選択される酵母である。
【０２２６】
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｌｅｇａｎｓ線虫である。
【０２２７】
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物である。
【０２２８】
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓマウスである。
【０２２９】
遺伝子発現／転写の測定
本発明の出願人らの方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および存在量を含めた細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの現存する遺伝子発現技術のうちのいずれかによってｃＤＮＡの存在量を測定することによって簡便に行われる。
【０２３０】
核酸アレイ技術は異なるｍＲＮＡ発現を決定するための有用な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイを含む。これらの技術は、固体支持体に固定化し、細胞、組織または生物全体から抽出された全ｍＲＮＡプールから調製され、ｃＤＮＡに変換されたプローブにハイブリダイズする異なる遺伝子またはｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドに頼る。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００までの遺伝子につき分析することができるチップが製造されている。ＤＮＡマイクロアレイは、機械的に顕微鏡スライドグラスにプリントされるＤＮＡ試料、典型的には、ＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部分長の標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００までの遺伝子を持つマイクロアレイは、今日、ルーチン的に商業生産される。これらの２つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いＤＮＡ分子の分画を可能とする２５−量体オリゴヌクレオチドを利用するのに対し、マイクロアレイのより大きなＤＮＡ標的（ほぼ１０００塩基対）は複雑なＤＮＡ混合物を分画する際により大きな感受性を提供できることである。
【０２３１】
本発明の出願人らの方法の他の有用な測定は、当該分野でよく知られたプロセスを用いて、細胞に存在する構成蛋白質種の存在量を測定することによって細胞の翻訳状態を決定するものである。
【０２３２】
種々の生理学的機能に関連する遺伝子の同定が望まれる場合、アッセイを使用することができ、ここに、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、他の細胞への結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋発生、神経発生および／または造血のような機能の変化が測定される。
【０２３３】
加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人らの発明を用いた遺伝子発現変調を測定することができる。
【０２３４】
遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）、ウェスタンブロット（ポリペプチド検出）、およびＥＬＩＳＡ（ポリペプチド）分析を含む。余り好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それにハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
【０２３５】
いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ鎖反応（「ＬＣＲ」）、ストランド置換増幅（「ＳＤＡ」）、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方法のうちの１以上を用いて行なうことができる。ＰＣＲは公知の技術に従って行われ、ここに、例えば、ハイブリダイズする条件下で、熱安定ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、核酸試料をオリゴヌクレオチドプライマーの１つの対で処理し、１つのプライマーは検出すべき特定の配列の１つのストランド（鋳型）にハイブリダイズする。プライマーは、それにハイブリダイズする特定の配列の各鋳型ストランドに対して十分に相補的である。各プライマーの伸長産物を合成し、それは、それにハイブリダイズする核酸鋳型ストランドに対して相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同一プライマーを用いる伸長産物のさらなる合成のための鋳型としても機能することができる。十分な数のラウンドの伸長産物の合成に続き、前記したように試料を分析して、検出すべき配列が存在するか否かを分析することができる。
【０２３６】
リガンドスクリーニングアッセイ
また、本発明は、核受容体リガンド結合ドメインを候補分子と接触させ、リガンドの存在下でレポーター遺伝子の活性を検出することによる、細胞において置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインのトランス活性化を誘導または抑制する化合物につきスクリーニングする方法に関する。候補化合物は、核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましい実施形態においては、核受容体リガンド結合ドメインは細胞中のポリヌクレオチドから発現され、トランス活性化活性（すなわち、レポーター遺伝子の発現または抑制）または化合物の結合活性が測定される。
【０２３７】
従って、核受容体リガンド結合ドメインの構造に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計に加え、本発明では、当該分野で知られた種々のスクリーニングアッセイを用いて核受容体リガンド結合ドメインの特異的リガンドを同定するための別法が考えられる。
【０２３８】
当該分野で知られたいずれものスクリーニング技術を用いて、グループＢ核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストにつきスクリーニングすることができる。例えば、本発明による核受容体−ベースの遺伝子発現システムを含む適当な細胞系を、誘導性または抑制性プロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子をコードする遺伝子発現カセットでトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトされた細胞を、候補アゴニストまたはアンタゴニスト化合物を含むテスト溶液に暴露し、次いで、マーカー遺伝子の発現または抑制につきアッセイする。テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより多くのマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアゴニスト化合物の存在の指標である。逆に、テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより少ないマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアンタゴニスト化合物の存在指標である。
【０２３９】
本発明では、小さな分子リガンドまたはリガンドアナログおよびミミックについてのスクリーニング、ならびにイン・ビボにおける本発明によるグループＢ核受容体リガンド結合ドメインに結合し、かつ作動もしくは拮抗する天然リガンドについてのスクリーニングが考えられる。例えば、天然産物ライブラリーは、核受容体−ベースの遺伝子発現システムの活性に作動または拮抗する分子につき、本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２４０】
アンタゴニストの同定およびスクリーニングは、例えば、Ｘ−線結晶回析、中性子回折、核磁気共鳴分光分析、および構造決定のための他の技術を用いて蛋白質の構造特徴を決定することによってさらに容易とされる。これらの技術はアゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または同定を提供する。
【０２４１】
他のアプローチは、大きなライブラリーを生産するために組換えバクテリオファージを用いる。「ファージ方法」［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６（１９９０）］を用い、非常に大きなライブラリーを構築することができる（１０６−１０８化学存在）。第２のアプローチは主として化学的方法を用い、そのうち、Ｇｅｙｓｅｎ方法［Ｇｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  １０２：２５９−２７４（１９８７）］およびＦｏｄｏｒらの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３（１９９１）］がその例である。Ｆｕｒｋａら［１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ５、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＦＲ：０１３（１９８８）；Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）］、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ［１９８６年１２月に発行された米国特許第４，６３１，２１１号］およびＲｕｔｔｅｒら［１９９１年４月２３日に発行された米国特許第５，０１０，１７５号］は、アゴニストまたはアンタゴニストとしてテストすることができるペプチドの混合物を製造する方法を記載する。
【０２４２】
他の態様において、合成ライブラリー［Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０７００−４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）；Ｌａｍら、国際特許出願公開第ＷＯ９２／００２５２号；Ｋｏｃｉｓら、国際特許出願公開第ＷＯ９４２８０２８号（その各々を、ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす）］等を用いて、本発明に従って候補リガンドにつきスクリーニングすることができる。
【０２４３】
該スクリーニングは、本発明に従い核受容体リガンド結合ドメインを発現する組換え細胞で、あるいは別法として、例えば、前記したように組換えにより製造された精製蛋白質を用いて、行うことができる。例えば、標識された可溶性核受容体リガンド結合ドメインを用いて、これまでの引例に記載されたように、ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０２４４】
１つの実施形態において、本発明によるグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを直接的に標識することができる。他の実施形態において、標識された二次試薬を用いて、注目する分子、例えば、固相支持体に結合した分子、への本発明の核受容体リガンド結合ドメインの結合を検出することができる。結合は、酵素標識による発色団のイン・サイチュ形成によって検出することができる。適当な酵素は、限定されるものではないが、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。さらなる実施形態において、注目する異なるアクセプター分子上に２つの酵素標識を持つ２つの発色性基材を用いる２色アッセイを用いることができる。交差−反応性および単一−反応性リガンドを２色アッセイで同定することができる。
【０２４５】
本発明で用いられる他の標識は、着色ラテックスビーズ、磁性ビーズ、蛍光標識（例えば、数個のフルオロフォアの名前を挙げれば、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド族塩、特にＥｕ３＋）、ケミルミネセント分子、放射性同位体、または磁気共鳴イメージング標識を含む。２色アッセイは、２以上の着色ラテックスビーズ、または異なる波長において発光するフルオロフォアで行うことができる。標識された分子または細胞は、視覚により、または機械的／光学的手段によって検出することができる。機械的／光学的手段は、ＦＡＣＳに類似の蛍光活性化ソーティング、およびミクロマニピュレーター除去手段を含む。
【０２４６】
以下の非限定的実施例によって本発明はより良好に理解でき、これは本発明の例示として提供する。
【０２４７】
実施例
出願人らは、置換突然変異を含むグループＢ核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。出願人らは、そのような置換突然変異の効果はリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加させることができ、それはステロイドまたは非−ステロイド特異的であることを示した。かくして、出願人らの発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現の変調に有用なグループＢ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。出願人らの新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法におけるその使用は、現在入手可能な誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に、遺伝子発現を制御するための効果的な手段を提供する。
【０２４８】
出願人らの新規な置換突然変異した核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、限定されるものではないが、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用のための核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。
【０２４９】
一般的方法
ここに用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によって記載されている。
【０２５０】
細菌培養の維持および増殖に適当な材料および方法は当該分野でよく知られている。以下の実施例で用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）に記載されているのを見出すことができる。宿主細胞の増殖および維持で用いる全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０２５１】
遺伝子配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手できるプログラムのスイートを用いて達成することができる。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いる場合、１２のギャップ創生デフォルト値、および４のギャップ伸長デフォルト値を用いることができる。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いる場合、５０のデフォルトギャップ創生ペナルティおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティを用いることができる。いずれの場合にも、ＧＣＧプログラムパラメーターを指令しない場合、これらまたはいずれかの他のＧＣＧプログラムにおいては、デフォルト値を用いることができる。
【０２５２】
略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモラーを意味し、「ｍＭ」はミリモラーを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力の倍数を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意味する。
【実施例１】
【０２５３】
本実施例は、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムで用いる本発明の新規な置換突然変異したグループＢ核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むいくつかの遺伝子発現カセットの構築を記載する。出願人らは、ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ「ＣｆＥｃＲ」）、マウス  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓレチノイドＸ受容体α（「ＭｍＲＸＲα」）、ヒト  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅレチノイドＸ受容体β（「ＨｓＲＸＲβ」）、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質（ここでは相互交換的に「ＬｍＵＳＰ」または「ＬｍＲＸＲ」とも言う）（これは、脊椎動物ＲＸＲの無脊椎動物ＲＸＲホモログである）、およびＣ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＵＳＰ（「ＣｆＵＳＰ」）に基づくいくつかの遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築体は、ＥｃＲ、無脊椎動物ＵＳＰ、脊椎動物ＲＸＲ、または無脊椎動物ＲＸＲのいずれかのリガンド結合ドメイン；およびＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。レポーター構築体は、Ｇａｌ４  ＤＢＤが結合するＧＡＬ４応答エレメントを含む合成プロモーター構築体に作動可能に連結した、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）を含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組合せを、後記実施例２−４に記載したように、哺乳動物細胞に共トランスフェクトした。
遺伝子発現カセット：遺伝子発現カセット（スイッチ）は、当該分野で入手できる標準的なクローニング方法を用いて以下のように構築した。以下に、本明細書中に記載する実施例で用いる各スイッチの調製および組成を簡単に記載する。
【０２５４】
１．１−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲからの野生型Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号：２０）をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：５）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２１）の制御下に置いた。バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクル蛋白質からのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号：２２）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：１１）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：２１）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（配列番号：１８を含むＧＡＬ４ＲＥの５つのコピーを含む「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：２３）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：２４）の上流に置いた。
【０２５５】
１．２−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：ＬｍＵＳＰ−ＥＦをＭｍＲＸＲαのＥおよびＦドメイン（「ＭｍＲＸＲα−ＥＦ」；配列番号：２５）で置き換えた以外は、前記スイッチ１．１と同様にこの構築体を調製した。
【０２５６】
１．３−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６突然変異体ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：野生型ＭｍＲＸＲα−ＥＦを、後記表１から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＭｍＲＸＲα−ＥＦで置き換えた以外は、前記スイッチ１．２と同様にしてこの構築体を調製した。
【０２５７】
【表１】
0005227758.tif 000004
【０２５８】
１．４−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲαＨ１−７−ＬｍＵＳＰ−Ｈ８−１２キメラ：ＬｍＵＳＰ−ＥＦを、ＭｍＲＸＲα−ＥＦのヘリックス（Ｈ）１−７およびＬｍＵＳＰ−ＥＦのヘリックス８−１２を含むキメラリガンド結合ドメイン（配列番号：２６）で置き換える以外は、前記スイッチ１．１と同様にしてこの構築体を調製した。
【０２５９】
１．５−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ：ＬｍＵＳＰ−ＥＦを、ＨｓＲＸＲβのＥおよびＦドメイン（「ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ」：配列番号：２７）で置き換える以外は、前記スイッチ１．１と同様にしてこの構築体を調製した。
【０２６０】
１．６−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６突然変異体ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ：野生型ＨｓＲＸＲβ−ＥＦを、後記表２から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体ＨｓＲＸＲβ−ＥＦで置き換える以外は、前記スイッチ１．５と同様にしてこの構築体を調製した。
【０２６１】
【表２】
0005227758.tif 000005
【０２６２】
【表３】
0005227758.tif 000006
【０２６３】
置換突然変異を含むレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインの構築
ＲＸＲトランス活性化の活性を修飾する努力において、配列比較に基づいて重要であると予測されたＲＸＲリガンド結合ドメイン内の残基を、２つの異なる生物からのＲＸＲにおいて突然変異させた。表１および２は、突然変異させ、トランス活性化能力の修飾につき調べた、ＭｍＲＸＲαおよびＨｓＲＸＲβのリガンド結合ドメイン内の各々のアミノ酸残基を示す。
【０２６４】
表１および２にリストしたアミノ酸置換突然変異の各々の１つは、ＰＣＲ媒介部位特異的変異誘発によってＲＸＲ  ｃＤＮＡにおいて構築した。１つの二重点突然変異体ＲＸＲ  ＬＢＤ（表１参照）、４つの異なる三重点突然変異体ＲＸＲ  ＬＢＤ（表２参照）、１つの四重点突然変異体ＲＸＲ  ＬＢＤ（表２参照）、および１つの五重点突然変異体ＲＸＲ  ＬＢＤ（表２参照）も構築した。
【０２６５】
ＰＣＲ部位特異的変異誘発は、以下のように、反応条件およびサイクリングパラメーターを用い、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ部位特異的変異誘発は、５０μＬの最終反応容量中の１×反応緩衝液（製造業者によって供給された）、５０ｎｇのｄｓＤＮＡ鋳型、１２５ｎｇの順方向プライマー（ＦＰ）、１２５ｎｇの逆方向相補的プライマー（ＲＣＰ）、および１μｌのｄＮＴＰミックス（製造業者によって供給された）を用いて行った。各ＲＸＲ置換突然変異を生じさせるのに用いる順方向プライマーおよび逆方向相補的プライマー対を表３および４に提示する。用いたサイクリングパラメーターは、１サイクルの３０秒間の９５℃における変性、続いて１６サイクルの３０秒間の９５℃における変性、１分間の５５℃におけるアニーリング、および２２分間の６８℃の伸長よりなるものであった。
【０２６６】
【表４】
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【０２６７】
【表５】
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【０２６８】
【表６】
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【０２６９】
【表７】
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【０２７０】
突然変異体ＲＸＲリガンド結合ドメインをコードする得られたＰＣＲ核酸産物を、次いで、各々前記実施例１．３および１．６に記載したようにＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合させた。ＶＰ１６／突然変異体ＲＸＲ受容体構築体を、非−ステロイドリガンドの存在下でＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびｐＦＲＬｕｃと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトすることによって、活性につきテストした。
【０２７１】
リガンド：非−ステロイドリガンドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（商標）−Ｅ）はＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙで合成された合成安定エクジステロイドリガンドである。該リガンドをＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度を対照および処理双方において０．１％に維持した。
【０２７２】
トランスフェクション：実施例１．１−１．６に概説した種々のスイッチ構築体に対応するＤＮＡを以下のようにマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りであった。細胞が５０％密集に到達するとそれを回収し、各々、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する増殖培地２．５、１．０または０．５ｍｌ中に各々、１２５，０００、５０，０００または２５，０００細胞にて６−、１２−または２４−ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）をトランスフェクション試薬として用いた。１２−ウェルプレートでは、４μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）を１００μｌの増殖培地と混合した。１μｇのレポーター構築体および分析すべき受容体対の０．２５μｇの各受容体構築体を該トランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターに作動可能に連結し、かつその制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｇ／トランスフェクションミックス］、標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を撹拌ミキサー中で混合し、室温にて３０分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、４００μｌの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２に４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）もしくは非−ステロイドリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を６ウェルプレートで２倍にし、２４−ウェルプレートで半分にした以外は、同一手法を６および２４ウェルプレートでも行った。
【０２７３】
レポーターアッセイ：リガンドを添加した４０時間後に細胞を回収した。１２５μｌの受動の溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムの一部）を、２４−ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを１５分間ロータリーシェーカー上に置いた。２０μｌの溶解物をアッセイした。製造業者の指示に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。製造業者の指示に従い、ＴＲＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用い、β−ガラクトシダーゼを測定した。標準としてのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用い、全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を標準化した。リガンド処理細胞中の標準化された相対的光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）中の標準化されたＲＬＵで除することによって、活性倍数を計算した。
【実施例２】
【０２７４】
哺乳動物細胞において、昆虫（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体（ＣｆＥｃＲ）はウルトラスピラクル（ＵＳＰ）またはそのホモログレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化し、同族応答エレメントの制御下に置かれた遺伝子をトランス活性化する。このＥｃＲ−ベースのトランス活性化のリガンド誘導性はそのヘテロ二量体化パートナーに依存する。出願人らによって以前示されたように、昆虫ＵＳＰと一緒になってＣｆＥｃＲを介するトランス活性化はリガンド非依存性であるのに対し、無脊椎動物または脊椎動物ＲＸＲと一緒になってＣｆＥｃＲを介するトランス活性化はリガンド依存性である（ここに引用してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国特許出願第６０／２９４，８１４号参照）。出願人らは、今回、リガンド結合ドメインの置換突然変異によってＲＸＲの配列を修飾して、トランス活性化の大きさならびにＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムのリガンド感受性に影響させることができることを見出した。
【０２７５】
本実施例は、非−ステロイドリガンドに応答する改良されたリガンド感受性を呈する３つのＭｍＲＸＲαリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。簡単に述べれば、出願人らは３つのマウスＲＸＲアイソフォームαリガンド結合ドメイン置換突然変異体を構築し、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲ−媒介部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて前記実施例１に記載したようにＶＰ１６／突然変異体ＭｍＲＸＲα−ＥＦ  ｃＤＮＡ遺伝子発現カセットを創製した。突然変異したｃＤＮＡを、ＧＡＬ４−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦと共にテストし、結果を、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞における野生型ＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＬｍＵＳＰキメラ−ＥＦスイッチと比較した。
【０２７６】
トランスフェクション：実施例１に概説した種々のスイッチ構築体、具体的にはスイッチ１．１−１．４に対応するＤＮＡを以下のようにマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。細胞が５０％密集に到達すると、それを回収し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する０．５ｍｌの増殖培地中で１２，５００細胞／ウェルにて２４ウェルプレート中で平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は３Ｔ３細胞についての最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。２μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）を１００μｌの増殖培地と混合し、５０ｎｇのＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦカセット、５０ｎｇの：ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ＶＰ１６／野生型ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、ＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＬｍＵＳＰキメラ−ＥＦまたはＶＰ１６／突然変異体ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、および２００ｎｇのｐＦＲＬｕｃをトランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターと作動可能に連結し、その制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０５μｇ／トランスフェクションミックス］、これを標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温で３０分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、２００μｌの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）または０．２、１もしくは１０μＭのＧＳ（商標）−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非−ステロイドリガンドのＤＭＳＯ溶液のいずれかを含有する２５０μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４０時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性を前記したようにアッセイした。リガンド処理細胞における標準化相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞における標準化ＲＬＵ（未処理対象）で割ることによって、活性倍数を計算した。
【０２７７】
前記したように、出願人らは、以前、非−鱗翅目／非−双翅目無脊椎動物ＲＸＲおよびＲＸＲホモログ（ＵＳＰ）（ここでは集合的に無脊椎動物ＲＸＲという）が、哺乳動物細胞において脊椎動物ＲＸＲによって達成されるよりも高いレベルにてＥｃＲおよびトランス活性レポーターに結合することを示した。しかしながら、脊椎動物ＲＸＲはリガンドの不存在下でより低いバックグラウンドレベルを供する。出願人らは、脊椎動物ＲＸＲおよび無脊椎動物ＲＸＲのリガンド結合ドメインからのアミノ酸配列を比較し、全ての脊椎動物ＲＸＲで保存されているが、無脊椎動物ＲＸＲでは異なる２つの特定のアミノ酸を同定した。出願人らは、脊椎動物ＲＸＲのアミノ酸を無脊椎動物ＲＸＲアミノ酸で置き換える結果、誘導に際してより高い活性をもたらすが、リガンドの不存在下では低いバックグラウンドを依然として供するか否かを判断した。
【０２７８】
出願人らは、今回、置換した場合に、非−ステロイドリガンドに対して増大した感受性を呈する突然変異体ＲＸＲを生じる脊椎動物マウスＲＸＲ、アイソフォームαのＥＦドメイン（「ＭｍＲＸＲα−ＥＦ」）内で２つのアミノ酸残基を同定した。突然変異したＭｍＲＸＲα−ＥＦ受容体の活性に対するこれらの２つの置換突然変異：配列番号：１のアミノ酸残基４０１におけるアスパラギン酸置換（Ｅ４０１Ｄ突然変異体）および配列番号：１のアミノ酸残基４２９におけるセリン置換（Ｇ４２９Ｓ突然変異体）の効果を図１に示す。
【０２７９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるトランス活性化アッセイにおいて、Ｅ４０１Ｄ突然変異体は、より高いバックグラウンドおよび、より高い誘導レベル双方によって証明することによって、脊椎動物ＲＸＲよりも無脊椎動物ＲＸＲのように挙動した（図１参照）。Ｇ４２９Ｓ突然変異体は、より無脊椎動物ＲＸＲのように挙動し、これは、リガンドに対する増大した感受性を示すが、より低いバックグラウンドを示す（図１参照）。かくして、出願人らは、リガンドの存在下および不存在下において、単一のアミノ酸変化がＭｍＲＸＲα−ＥＦの挙動を劇的に改変することができるという驚くべきかつ予期せぬ結果を示した。
【０２８０】
これらの２つの突然変異の組合せがいずれかの単一点突然変異単独よりもさらに改良されたＲＸＲを供するかを判断するために、出願人らは、Ｅ４０１ＤおよびＧ４２９Ｓ双方の位置において点突然変異を含む二重置換突然変異体ＭｍＲＸＭα−ＥＦを作成した。これらの二重突然変異体（ＤＭ）の３つの独立したクローンをＮＩＨ３Ｔ３細胞において分析し、各単一点突然変異体単独、ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、およびキメラ脊椎動物ＲＸＲ／無脊椎動物ＲＸＲと比較した（図２参照）。出願人らの結果は、これらの二重突然変異体がキメラＲＸＲと同程度働くことを示し、これは、リガンドの不存在下における低バックグラウンドレベルならびに増大した誘導レベルおよびリガンド感受性を証明する。これらの新規な二重置換突然変異体は、イン・ビボ適用で用いる有利なＲＸＲを提供する。
【０２８１】
また、出願人らは、これらのＭｍＲＸＲα−ＥＦ置換突然変異体が、図１および図２に提示するＧＳ（商標）−Ｅに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で野生型ＨｓＲＸＲβ−ＥＦよりも応答することを測定した（データは示さず）。
【実施例３】
【０２８２】
前記したように、ＣｆＥｃＲに対するヘテロダイマーパートナーとしての無脊椎動物ＲＸＲ、ＬｍＵＳＰ（ここではＬｍＲＸＲともいう）の使用は、ＣｆＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムの感受性および誘導の大きさ双方を改良した。出願人らは、ＬｍＲＸＲおよびＨｓＲＸＲβリガンド結合ドメイン（ドメインＥＦ）のポリペプチド配列を整列させ、これらの２つの蛋白質の間で異なるアミノ酸残基を同定した。この実施例は、ＨｓＲＸＲβにおける野生型残基の代わりにＬｍＲＸＲアミノ酸を置き換えるＨｓＲＸＲβ置換突然変異体の出願人らの分析を記載する。出願人らは、今回、哺乳動物細胞におけるＣｆＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムの感受性および誘導の大きさを共に修飾するいくつかの置換突然変異体を同定した。
【０２８３】
簡単に述べれば、出願人らはヒトＲＸＲアイソフォームβ−ＥＦ（ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ）における置換突然変異体を構築し、分析し、ここに、無脊椎動物ＲＸＲホモログＬｍＵＳＰ−ＥＦと比較してＨｓＲＸＲβ−ＥＦにおいて異なるアミノ酸をＬｍＵＳＰ−ＥＦのアミノ酸残基に突然変異させ、０、０．０４、０．２、１、５または２５μＭのＧＳ（商標）−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３’５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非−ステロイドリガンドの存在下にて、前記実施例２に記載したようにＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるトランス活性化の活性に対するそれらの効果につきアッセイした。細胞を回収し、前記したようにレポーター活性をアッセイした。リガンド処理細胞における標準化された相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）における標準化ＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。
【０２８４】
図３に示すように、ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体Ｔ／Ｓ、ＤＡＫ／ＥＶＲ、ＳＮＰＳ／ＫＳＡＱ、Ｖ／Ｌ、Ｓ／Ａ、Ｔ／Ｅ、ＣＫＱＫＹ／ＴＲＴＴＨおよびＥＱＱ／ＤＥＰは誘導倍数および誘導の大きさを改良した。出願人らのＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体ＤＡＫ／ＥＶＲ、ＳＮＰＳ／ＫＳＡＱ、Ｖ／Ｌ、Ｓ／Ａ、Ｔ／Ｅ、ＣＫＱＫＹ／ＴＲＴＴＨおよびＥＱＱ／ＤＥＰは非−ステロイドリガンドの感受性も改良した（図３参照）。
【０２８５】
また、図３に提示した結果は、ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体Ｄ３４４Ｎ、Ａ４９５Ｓ（３０の誘導倍数を持つＡ／Ｓとして標識）、およびＡ５２８Ｓ（２１の誘導倍数を持つＡ／Ｓとして標識）は、野生型と比較して低下した誘導倍数、誘導の大きさおよび／またはリガンド感受性を呈する。
【０２８６】
また、出願人らは、図３に提示したＧＳ（商標）−Ｅに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にて、これらのＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体が野生型ＨｓＲＸＲβ−ＥＦよりも良好に応答することを測定した（データは示さず）。
【実施例４】
【０２８７】
前記したように、ＣｆＥｃＲ−ベースの遺伝子調節システムは、ＲＸＲをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合にはリガンド依存性であり、ＵＳＰをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合にはリガンド非依存性である。しかしながら、ＣｆＵＳＰをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合には、レポーター遺伝子発現は非常に高いレベルで誘導される。ヘテロダイマーパートナーとしてＲＸＲを改良するために、出願人らは、いくつかのＵＳＰおよびＲＸＲリガンド結合ドメイン（ドメインＥＦ）のポリペプチド配列を整列させ、これらの２つの核受容体ファミリーメンバーの間で異なるアミノ酸残基を同定した。特に、出願人らは、全てのＵＳＰにおいて保存されているが、ＲＸＲにおいて異なる残基を同定し、ＨｓＲＸＲβにおいてこれら残基を突然変異させた。０、０．０４、０．２、１、５または２５μＭのＧＳ（商標）−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非−ステロイドリガンドの存在下で、前記実施例２に記載したように、これらの置換突然変異体をＮＩＨ３Ｔ３細胞において分析した。細胞を回収し、前記したようにレポーターの活性をアッセイした。リガンド処理細胞における標準化相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）における標準化ＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。
【０２８８】
簡単に述べれば、本実施例は、ヒトＲＸＲアイソフォームβ−ＥＦ（ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ）における置換突然変異体の構築および分析を記載し、ここに、ウルトラスピラクル蛋白質の保存された残基と比較してＨｓＲＸＲβ−ＥＦにおいて異なるアミノ酸をＵＳＰアミノ酸残基に突然変異させ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるトランス活性化の活性に対するそれらの効果につきアッセイした。
【０２８９】
図４に示されるように、ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体ＧＰＧ／ＬＲＶ、Ｋ／Ｒ、Ｓ／Ａ、およびＧ／Ｓは、ＥｃＲベースの遺伝子調節システムの、誘導倍数および誘導の大きさを向上させた。ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体ＧＰＧ／ＬＲＶ、Ｓ／Ａ、Ｅ／Ｄ、ＳＥＴ／ＡＤＹ、およびＧ／Ｓは、ＥｃＲベースの遺伝子調節システムのリガンド感受性を向上させた（図４参照）。
【０２９０】
また、図４に示される結果は、ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体Ｍ４３１Ｌ、Ｒ４４２Ｋ、およびＫ５５１Ｒが、野生型に対して低減された、誘導倍数、誘導の大きさおよび／またはリガンド感受性を示したことを示す。ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体Ｍ／Ｌは、トランス活性化活性を本質的に取り除いた（図４参照）。このＭ／Ｌ突然変異体は直交リガンドスクリーニングアッセイに有用である。
【０２９１】
また、出願人らは、図４に提示したＧＳ（商標）−Ｅに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にて、これらのＨｓＲＸＲβ−ＥＦ置換突然変異体が野生型ＨｓＲＸＲβ−ＥＦよりも良好に応答することを測定した（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】図１は、ＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびｐＦＲＬｕｃと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、またはＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＥＦ突然変異体Ｅ２６５Ｄ（ＲＸＲｍｕｔＥ／Ｄ）またはＧ２９３Ｓ（ＲＸＲｍｕｔＧ／Ｓ）のレポーター遺伝子トランス活性化を示す。０、０．２、１および１０μＭ  ＧＳ（商標）−Ｅの存在下で細胞を４８時間増殖させ、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。
【図２】図２は、ＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびｐＦＲＬｕｃと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＥＦ（ＲＸＲ−Ｅ）、ＶＰ１６／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（ＬｍＵＳＰ−Ｅ）、ＶＰ１６／キメラ脊椎動物ＲＸＲ／無脊椎動物ＲＸＲ（キメラ）、またはＶＰ１６／ＭｍＲＸＲα−ＥＦ突然変異体Ｅ４０１Ｄ（ＭｕｔＥ２６５Ｄ）、Ｇ４２９Ｓ（ＭｕｔＧ２９３Ｓ）、または二重突然変異体Ｅ４０１Ｄ＋Ｇ４２９Ｓ（ＤＭ１、ＤＭ２およびＤＭ４）の３つの独立したクローンのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。０、０．２、１および１０μＭ  ＧＳ（商標）−Ｅの存在下で細胞を４８時間増殖させ、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。
【図３】図３は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵＣおよびＶＰ１６ＨｓＲＸＲＥＦβまたはその突然変異体バージョンＤＮＡのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ中の０．０４、０．２、１、５もしくは２５μＭのＧＳ（商標）−Ｅを含有する培地の存在下で、トランスフェクトされた細胞を増殖させた。リガンドを添加した４８時間後、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。
【図４】図４は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬＵＣおよびＶＰ１６ＨｓＲＸＲＥＦβまたはその突然変異体バージョンＤＮＡのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ中の０．０４、０．２、１、５もしくは２５μＭのＧＳ（商標）−Ｅを含有する培地の存在下で、トランスフェクトされた細胞を増殖させた。リガンドを添加した４８時間後、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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