(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質を測定し、測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質に基づいて前記被験者の肝障害を検出する検出方法であって、
前記肝障害は、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来するものであり、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こりにくい機序による肝障害あるいは前記グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こらない程度の肝障害であることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質を測定し、測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質の値と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質の平均値とを比較して、前記被験者の前記ミトコンドリア由来タンパク質の値が前記健常者の前記ミトコンドリア由来タンパク質の平均値より高い場合を、肝障害と判定することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記被験者の肝障害は、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変又は肝臓癌であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ミトコンドリア由来タンパク質は、肝臓に特異的に存在するタンパク質及び／又は前記肝臓に豊富に存在するタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記ミトコンドリア由来タンパク質は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記ミトコンドリア由来タンパク質はそのタンパク質濃度又はタンパク質活性を測定することで決定されることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記ミトコンドリア由来タンパク質は免疫学的手法又は酵素学的手法によって測定されることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被験者の肝障害を検出する方法に関するものである。メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来する肝障害、特に非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等を検出する方法に関する。
また、本発明は、メタボリック症候群若しくは非アルコール性脂肪性肝疾患からの非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展を予測する方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過度のアルコール摂取によらない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＯＮ−ＡＬＣＯＨＯＬＩＣ  ＦＡＴＴＹ  ＬＩＶＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥ：ＮＡＦＬＤ、以後ＮＡＦＬＤと称す）と呼ばれ、後述するメタボリック症候群に起因する脂肪性肝疾患もこれに含まれる。ＮＡＦＬＤの一部がさらに炎症を伴った状態のものは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＯＮ−ＡＬＣＯＨＯＬＩＣ  ＳＴＥＡＴＯＨＥＰＡＴＩＴＩＳ：ＮＡＳＨ、以後ＮＡＳＨと称する）と称される。ＮＡＳＨは、何らかの酸化ストレスなどの要因が加わることにより、肝臓の繊維化、肝硬変、肝臓癌へと徐々に進行する慢性肝疾患である。【０００３】
一方、内臓脂肪型肥満に高血糖、高血圧及び高脂血症のうち２つ以上が併発した状態であるメタボリック症候群は別名代謝症候群とも呼ばれ、一般的には動脈硬化性疾患若しくは脂肪性肝疾患を誘発する危険因子としてその予防・治療が必要とされている。【０００４】
ＮＡＳＨは、メタボリック症候群の肝臓での表現型と考えられている。メタボリック症候群や糖尿病を患う患者においては、これらの症状と共にＮＡＳＨを併発する危険性が高いとされている。【０００５】
上述したように、ＮＡＦＬＤの一部が炎症を伴った状態のものをＮＡＳＨと称したが、ＮＡＳＨの定義は現時点では確定したものではない。例えば、肝臓に炎症性細胞の浸潤が認められなくとも、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展が見られる場合がある。一方では、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展においては、肝臓の炎症化ではなく風船化（バルーニング）と呼ばれる肝臓の肥大化を重要視する考え方もある。また、ＮＡＳＨの大部分は、肝硬変への進展が認められないといった報告もある。そこで、本明細書においては、肝臓が炎症、バルーニング、繊維化、硬変、癌などの肝障害を呈する状態、あるいはこれらの症状を惹起し得る状態のものを総称してＮＡＳＨと称することとし、肝臓に単に脂肪が蓄積した状態で、それ以外の肝障害を呈する状態に移行しない「単純性脂肪肝」と区別して使用するものとする。【０００６】
ＮＡＳＨは、その名が示すとおりアルコールの摂取がないのにも関わらずアルコール性肝炎と類似の所見を示し、先進国においては、ＮＡＳＨは肝疾患のうち最も発症頻度が高く重篤な疾患の一つとされている。そのため、ＮＡＳＨを患う患者には積極的な治療が必要であり、また、診断の場においては単純性脂肪肝とＮＡＳＨとを正確に判別することが極めて重要である。【０００７】
従来のＮＡＳＨの診断は、腹部エコー、コンピュータ断層撮影等の画像診断によるものやグルタミン酸―オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸―ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）等の肝障害マーカーの変動を血液検査によって検査するものである。しかしながら、前述した肝障害マーカー値は、全てのＮＡＳＨ患者において異常値を示すわけではなく、最終的な診断は、肝生検に委ねられている。
【０００８】
肝生検は、患者への侵襲性が高いうえ煩雑であり、その病理結果の判定は、熟練した専門家によってなされる必要があるため日常の一般検査としては不適切である。したがって、前述した検査方法に変わりＮＡＳＨ検査において信頼性が高い検査方法の開発が望まれてきた。【０００９】
これまでに、動物モデルを用いて血液中の肝障害マーカーの変動を調べた研究が数多く報告されている。多くはコリンまたはメチオニン・コリン欠乏飼料を用いて飼育した、あるいはＮＡＳＨに近い症状を誘発する薬剤を用いたラットまたはマウスを使った実験であり、肝障害マーカーとしてはＧＰＴが主に利用されている。これらのモデルでは、肝臓が壊死を起こし、ＧＰＴ値の上昇が観察されている。しかしながら、ヒトのＮＡＳＨにおいては、ＧＰＴ値が上昇していなくてもＮＡＳＨから肝硬変への進展がみられることが知られており、ＧＰＴは必ずしもＮＡＳＨ診断の肝障害マーカーとしては適切なものとは言えなかった。【００１０】
ＧＰＴ以外の肝障害マーカーとしては、例えばラットの実験において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）の濃度値を測定している報告もある（例えば、非特許文献１及び２）。【００１１】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；６５（４）：９３５−９３８
【非特許文献２】Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０００；１１４（１−３）：１６３−１７１
【００１２】
しかし、ＯＣＴはミトコンドリアに局在するため、ＯＣＴの血中への漏出は、細胞膜の他、ミトコンドリアの二重膜を通って漏出してくる必要があるため、細胞質由来のＧＰＴなどと比較して血中への漏出は遅く、ＯＣＴがＧＰＴよりも有効なマーカーとなるとは考えられておらず、そのような有用性を示すデータも報告されていない。これまでの報告では単にＯＣＴの肝臓特異性の高さを利用して肝臓における障害であることを裏付けるために用いられているか、あるいは障害がミトコンドリアまで及ぶ強い障害であるかを示す目的において用いられているにすぎない。したがって、これまでの血中のミトコンドリア由来タンパク質がＧＰＴよりも検出能力の高い優れたマーカーであるとする記述はみられず、ＧＰＴがＮＡＳＨをはじめとする肝臓疾患において肝障害を鋭敏に示すマーカーであると認識されてきた。このため、これまでに報告されている論文等の報告の略全ては、肝障害マーカーとしてＧＰＴ値が用いられているのが現状である。【００１３】
また、他の肝障害マーカーとして、特許文献１には、アルファ２−マクログロブリン、ヒアルロン酸、メタプロテイナーゼ１の阻害剤の有無またはこれらの阻害剤の濃度値に基づいて肝繊維症の有無または重症度を検査する方法が示されている。
また、さらに特許文献２には、末梢血中のリン脂質とその脂肪酸組成を測定しＮＡＳＨを識別する方法が示されている。
また、特許文献３には、肝臓の組織サンプル中のアポリポタンパク質Ａ１、ミトコンドリアＡＴＰアーゼのβサブユニット、ロイコトリエンＡ４ヒドラーゼ、ケラチン１８、グアニジノ酢酸Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、スーパーオキシサイドジスムターゼ、アルブミン、抗酸化タンパク質２（ｉｓｏｆｏｒｍ１）、プロヒビチン、メチオニナデノシルトランスフェラーゼ、長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、セレン結合タンパク質、抗酸化タンパク質２（ｉｓｏｆｏｒｍ２）のいずれかのタンパク質を組み合わせて測定するＮＡＳＨの検査法が示されている。
さらにまた、特許文献４には、ＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ末端ペプチドの濃度値を測定するＮＡＳＨの検査方法が示されている。【００１４】
【特許文献１】特表２００５−５１９２７１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／１０９００６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／５５５２０号公報
【特許文献４】特開２００６−２９９１９号公報
【発明の開示】
【００１５】
上述したように、肝障害マーカーであるＧＯＴ値あるいはＧＰＴ値を指標とした血液検査は、これらの肝障害マーカーが示す指標が陰性または弱陽性であった場合に、ＮＡＳＨが見逃される場合があり満足できるものではなかった。
【００１６】
また、肝障害マーカーであるＧＯＴ値あるいはＧＰＴ値以外のマーカーを用いたＮＡＳＨに対する検査法も報告されているが、これらの検査法は、測定方法が面倒である。また、検査法によっては複数のマーカーを同時に測定する必要があるため必ずしも簡便な検査方法ではなかった。
【００１７】
さらに、これらの肝障害マーカーが異常値を示し肝生検に踏み切った場合においても、肝生検は患者への侵襲性が高いうえ煩雑であり、その病理結果の判定は、熟練した専門家によってなされる必要がある。そのため日常の一般検査としては不適切であり、ＮＡＳＨの疑いがあっても検査自体が敬遠される場合があった。
【００１８】
したがって、本発明は血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被験者が肝障害、特にＮＡＳＨであるか否かを判定する方法を提供することである。
【００１９】
上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者は、
（イ）コリン欠乏食またはメチオニン・コリン欠乏食を摂取しＮＡＳＨに近い症状を発症したげっ歯類の動物モデルにおいては、これらの動物モデルが示すＧＰＴ値はコントロール郡に比べ有意に上昇していないこと、
（ロ）ヒトのＮＡＳＨにおいては、ＧＰＴ値が正常な例が度々観察されていること、
（ハ）ＮＡＳＨ、特に肝障害が軽く、ＧＰＴ値が上昇しないか、あっても軽度の上昇であるＮＡＳＨにおいて、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）等のミトコンドリア由来タンパク質の血中濃度値の上昇が有意に検出されること、
（ニ）ＮＡＳＨのみならず糖尿病を含めたメタボリック症候群の検出にもミトコンドリア由来タンパク質の測定が有用である
等の知見を見出した。このＧＰＴ値の上昇がそれほど見られないＮＡＳＨにおいて、ミトコンドリア由来タンパク質の血中への漏出量が増加することは、本発明者が初めて見出したことである。このため、本発明者は、ミトコンドリア由来タンパク質の血中濃度値を測定することで、肝障害の一例であるＮＡＳＨを検査することが可能であることを見出しこの知見を発展させ本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りである。
【００２０】
（１）被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被験者の肝障害を検出することを特徴とする検出方法。
（２）被験者の肝障害は、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こりにくい機序による障害あるいはグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こらない程度の肝障害であることを特徴とする（１）に記載の検出方法。
（３）被験者の肝障害は、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来することを特徴とする（１）に記載の検出方法。
（４）被験者の肝障害は、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変又は肝臓癌であることを特徴とする（１）に記載の検出方法。
（５）被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の平均値とを比較して、被験者のミトコンドリア由来タンパク質量が健常者のミトコンドリア由来タンパク質量の平均値より高い場合を、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来する肝障害であると判定することを特徴とする判定方法。
（６）メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝障害を予測するためにミトコンドリア由来のタンパク質を肝障害マーカーとして利用することを特徴とする方法。
（７）メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで肝障害の進展を予測することを特徴とする予測方法。
（８）メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて肝障害の治療効果を判定することを特徴とする判定方法。
（９）ミトコンドリア由来タンパク質は、肝臓に特異的に存在するタンパク質及び／又は肝臓に豊富に存在するタンパク質であることを特徴とする（１）乃至（８）の何れかに記載の方法。
（１０）ミトコンドリア由来タンパク質は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法。
（１１）ミトコンドリア由来タンパク質量はそのタンパク質濃度又はタンパク質活性を測定することで決定されることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法。
（１２）ミトコンドリア由来タンパク質量は免疫学的手法又は酵素学的手法によって測定されることを特徴とする（１）乃至（８）の何れかに記載の方法。
【００２１】
本発明により、ＮＡＦＬＤ由来の肝障害の検出はもとより、ＮＡＳＨと単純性脂肪肝とを的確に区別することが可能となる。さらに、本発明は、ＮＡＳＨの確定診断または肝生検などの確定診断を行うか否かの判定根拠としての補助的検査に有用である。
【００２２】
さらに、本発明によれば、ＮＡＦＬＤ患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで、肝臓の炎症、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等のＮＡＳＨの進展を予測することができる。さらに、本発明によれば、肝障害の治療効果を判定することにも応用可能である。
【００２３】
さらにまた、本発明によれば、ＮＡＦＬＤ由来の肝障害だけでなく、メタボリック症候群における肝障害を検出することも可能である。したがって、メタボリック症候群自体の検出、あるいはメタボリック症候群に由来する肝障害、具体的には肝臓の炎症、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等のＮＡＳＨを予測することにも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】テトラサイクリンの投与後の経過時間とＴＢＡＲＳ濃度値の関係を示すグラフである。
【図２】テトラサイクリンの投与後の経過時間と肝障害マーカー濃度値の関係を示すグラフである。
【図３】雄のｏｂ／ｏｂマウスの週齢における血中におけるＯＣＴ値及びＧＰＴ値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
測定対象の被験サンプルとしては、血液、血清、血漿などの血液由来サンプルであれば、特に限定されない。【００２６】
本発明の方法は、ＮＡＳＨをはじめとする肝障害を検出するに際し、ミトコンドリア由来タンパク質量を測定することを特徴とするものである。このようなミトコンドリア由来のタンパク質としては、ＯＣＴ及び／又はＧＤＨを例示することができる。【００２７】
血液サンプル中のＯＣＴ値あるいはＧＤＨ値の測定は、そのタンパク質の濃度値あるいはその活性値を指標とすることができ、測定法自体は公知の方法を採用することができる。例えば、ＯＣＴ値あるいはＧＤＨ値をＥＬＩＳＡ法などの免疫学的測定法で測定する場合には、本発明者が開発した高感度のＯＣＴ測定法（特許文献５：ＷＯ２００６／７３０７３号公報）又は公知の方法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（１９９４−９５）４８：１０−１７）等を用いて測定することができる。【００２８】
また、ＯＣＴ値あるいはＧＤＨ値を酵素学的手法で測定する場合も、市販のキット（例えば、和光純薬工業、ＯＣＴテスト−ワコー）あるいは公知の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９７６）６７：１４５−１５２、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９３）２６：４７５−４８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）３０：４９３−５０２）等に準じて測定することができる。【００２９】
上記した方法あるいは市販のキットを用いて測定した被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の測定値と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量平均値とを比較して、被験者の測定値が健常者の測定平均値よりも高い場合、肝臓の障害、具体的にはメタボリック症候群及び／又はＮＡＦＬＤに由来するＮＡＳＨ等の肝障害の疑いありと判断することができる。また、被験者の測定値が健常者の測定平均値と同等あるいはそれよりも低い場合は、ＮＡＳＨ等の肝障害ではないと判定することができる。【００３０】
ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的手法によって、ＯＣＴあるいはＧＤＨの濃度値を決定する場合に用いるＯＣＴあるいはＧＤＨに対する抗体は、常法、例えば特許文献５などの文献を参照することにより調整することができ、その抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。あるいは、ＯＣＴあるいはＧＤＨとの結合性を有するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体の断片を用いてもかまわない。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。【００３２】
実施例１：コリン欠乏症ＳＤラットモデルにおける血中の各種肝障害マーカーの測定
雄のＳＤラット８週齢、１６匹を２群に分け、１つの群のＳＤラットにはコリン欠乏（ＣＤ）食を与え、他の群のＳＤラットにはコリン添加（ＣＳ）食を摂取させた。４週間後、麻酔下にて採血を行った。また、ＳＤラットの肝臓を一部採取し、ホルマリンによる固定を行った後、ヘマトキシリン・エオジン染色して肝障害の程度を病理組織学的に調べた。また、ＣＤ食を８週間摂取させたラットについても同様に処理した。【００３３】
ミトコンドリア由来タンパク質（ＯＣＴ、ＧＤＨ）及び細胞質由来タンパク質（ＧＰＴ、ＧＯＴ、グアナーゼ（ＧＵ）、イソシアネートデヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ））のラット血清中における濃度値あるいは活性値を測定した結果を表１及び２に示した。なお、ＧＰＴ、ＧＯＴ、ＧＵ、ＩＣＤ、ＳＤＨ、ＬＤＨ、ＧＤＨは酵素法により測定し、ＯＣＴはＥＬＩＳＡ法により測定した。【００３４】
測定の結果、表１に示すように、ＣＤ食群おいてミトコンドリア由来タンパク質であるＯＣＴ値、ＧＤＨ値が有意に上昇した。一方、表２に示すように細胞質由来タンパク質においては、ＣＤ食群とＣＳ食群との間に有意差は認められなかった。この結果は、ＮＡＳＨの検出において、血中に含まれるミトコンドリア由来タンパク質量を指標とすることが有効であることを示している。【００３５】
【表１】
0005227168.tif 000002
【００３６】
【表２】
0005227168.tif 000003
【００３７】
なお、病理組織検査の結果、ＣＤ食摂取開始から４週間後において、ＣＤ食群に属するラットの肝臓には脂肪の蓄積が認められたが、顕著な肝障害は認められなかった。しかしながら、ＣＤ食摂取開始から８週間後において、ＣＤ食群に属するラットには肝臓の繊維化が認められた。この結果は、ＣＤ食摂取はＳＤラットの肝臓にダメージを与えることを明示しており、ミトコンドリア由来タンパク質（ＯＣＴ、ＧＤＨ）の上昇は、肝障害マーカーとして有用であることを示している。【００３８】
実施例２：テトラサイクリン投与ラットにおける血中の各種肝障害マーカーの測定
ＮＡＳＨの発症機序には、ミトコンドリア障害やそれに伴う酸化ストレスが関与しているとされている。ヒトにおいてもミトコンドリア障害を惹起する薬剤によりＮＡＳＨと類似した病変を起こすことが知られており、これは薬剤起因性ＮＡＳＨとも呼ばれている。そこで、テトラサイクリン投与による急性肝障害における血中の各種肝障害マーカーと酸化ストレスの指標とされるチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）の肝臓組織中含量を経時的に測定した。【００３９】
雄のＷｉｓｔａｒラット８週齢にテトラサイクリン塩酸塩（１９２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、麻酔下にて採血後肝臓を摘出した。肝臓組織１ｇに対して２０ｍＭリン酸緩衝液４ｍｌを加えてホモジナイズしたものを肝臓組織サンプルとして、ＴＢＡＲＳの測定に供した。肝臓組織中のＴＢＡＲＳ濃度値の変動を図１に、テトラサイクリン投与後の血中の各種肝障害マーカーの変動を図２に示した。なお、各時間経緯の測定ポイント毎にＷｉｓｔａｒラット８週齢を６匹使用した。【００４０】
測定の結果、図１に示すように、肝臓組織中のＴＢＡＲＳ濃度値の上昇はテトラサイクリンの投与２４時間後から始まり、４８時間後にピークに達した。一方、図２に示すように血中の細胞質由来タンパク質であるＧＰＴ、ＧＯＴの値の上昇は８時間後にピークに達し、その後は徐々にＧＰＴ値、ＧＯＴ値は低下した。これに対し、血中のミトコンドリア由来タンパク質であるＯＣＴの血中濃度値は、テトラサイクリン投与後４時間と２４時間後にピークを示した。また、ＧＤＨの血中濃度値は、テトラサイクリン投与後４８時間後にピークを示した。ＯＣＴ値の２つ目のピークとＧＤＨ値のピークは、肝臓中の酸化ストレスの増加を示すＴＢＡＲＳ濃度値の上昇ピークとも対応している。これは、ミトコンドリア障害に伴う酸化ストレスを反映してＯＣＴ、ＧＤＨの血中濃度値が上昇したものであると考えられる。これに対して、ＧＰＴ、ＧＯＴは、ＴＢＡＲＳ濃度値の上昇ピークに対応したピークは見受けられなかった。【００４１】
実施例３：高脂肪食ＫＫ−Ａｙマウスモデルにおける血中の肝障害マーカーの測定
ＫＫ−Ａｙマウスは、糖尿病を発症しやすい遺伝背景をもつＫＫマウスに肥満遺伝子であるＡｙを導入することにより得られた肥満・糖尿病マウスである。ＫＫ−Ａｙマウスに高脂肪食を摂取させることにより善玉アディポカインであるアディポネクチンが低下し、悪玉アディポカインであるＴＮＦ−αが増加することが報告されていることから、高脂肪食ＫＫ−Ａｙマウスは、メタボリック症候群のモデル動物であると考えられる。
そこで、高脂肪食を摂取させたＫＫ−Ａｙマウスにおける血中ミトコンドリア由来タンパク質量を測定した。【００４２】
雄のＫＫ−Ａｙマウス１０匹を５匹ずつの２群に分け、それぞれの群に対してコントロール飼料と高脂肪食飼料を３週間与えた後、血中のＯＣＴ値及びＧＰＴ値を測定した。【００４３】
その結果、表３に示した通り、高脂肪食群においてＯＣＴ値のみが有意に上昇した。メタボリック症候群に関連した肝障害、すなわちＮＡＳＨの検出においては、ＧＰＴよりもＯＣＴの方が優れていることが示された。また、メタボリック症候群のモデルである高脂肪食ＫＫ−ＡｙマウスにおけるＯＣＴ値の上昇は、メタボリック症候群とＮＡＳＨとの関連性を裏付けるものである。したがって、ＮＡＳＨの検査のみならず、メタボリック症候群の検査においても血中ミトコンドリア由来タンパク質が有効であることが示された。【００４４】
【表３】
0005227168.tif 000004
【００４５】
これらの結果より、ＯＣＴ、ＧＤＨ等のミトコンドリア由来タンパク質を肝障害マーカーとして用いた方法は、ＧＰＴ、ＧＯＴ等の細胞質由来タンパク質よりも鋭敏にＮＡＳＨの発症機序とされるミトコンドリア障害やそれに伴う酸化ストレスを検出することが可能であることを示しており、ＮＡＳＨの診断に有効であることが示された。【００４６】
実施例４：ｏｂ／ｏｂマウスにおける血中の肝障害マーカーの測定
ＮＡＳＨは、メタボリック症候群の肝臓における発現型と考えられており、ＮＡＳＨ患者の８０〜９０％は内臓型肥満を呈しているとされる。また、糖尿病患者の多くは脂肪肝であり、ＮＡＳＨのリスクも健常者よりも高いとされている。２型糖尿病のモデルマウスであるｏｂ／ｏｂマウスは、高度の肥満と脂肪肝とを伴い、リポポリサッカライドやアルコール摂取などの肝毒性に対して感受性を示すことからＮＡＳＨのモデルとして用いられている。そこで、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血中でのミトコンドリア由来タンパク質量について検討を行った。【００４７】
雄のｏｂ／ｏｂマウスとコントロールマウス各５匹の血中におけるＯＣＴ値及びＧＰＴ値を４週齢から８週齢まで測定した。測定した結果、図３に示すように、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血中のＯＣＴ値は肥満が顕著になる４週齢で既にコントロールマウスの約６倍上昇しており、ＯＣＴ値の上昇割合はＧＰＴ値の上昇割合よりも２倍以上高くなった。さらに、６週齢、８週齢と肥満が著しくなるのに伴いＯＣＴ値の上昇割合はさらに増加した。【００４８】
高度に肥満を伴った糖尿病モデルマウスであるｏｂ／ｏｂマウスにおいては、糖尿病の指標である血糖値の上昇があまり見られないことが知られている。一方、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血中の肝障害マーカーの上昇は、肥満や脂肪肝を伴うメタボリック症候群では糖尿病の症状が軽度であっても肝障害が起き得ることを示している。このため、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血中ミトコンドリア由来蛋白濃度値測定は、ＮＡＳＨのみならず糖尿病を含めたメタボリック症候群の検出においても有効であることが示された。【００４９】
通常、肝障害マーカーとして多用されているＧＰＴよりもミトコンドリア由来タンパク質であるＯＣＴの方が、内臓型肥満を呈するｏｂ／ｏｂマウスの週齢経過に対する血中レベルの上昇は顕著である。したがって、ＯＣＴはＧＰＴよりもＮＡＳＨの診断に有効であることが示唆された。【００５０】
本発明によれば、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝障害を予測するためにミトコンドリア由来タンパク質を肝障害マーカーとして初めて利用することができる。【００５１】
また、本発明によれば、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで肝障害の進展を予測することも可能である。【００５２】
さらにまた、本発明によれば、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて肝障害の治療効果を判定することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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