(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
温度応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。
【請求項２】
第１の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
第２の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
第２の物質が、ポリアニオン又はポリカチオンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５】
ポリアニオンが、核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
ポリカチオンが、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項７】
検体中の検出対象を検出する方法であって、
温度応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、温度応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記温度応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。
【請求項８】
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検体中の検出対象を定量する方法であって、
温度応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を温度応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
【請求項１０】
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象の検出、定量用キット、及び検出、定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、流体と、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスとを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。【０００４】
そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く採用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。【０００５】
これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
【特許文献１】特公昭５８−ｌｌ５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器が必須であり、作業コストが高い。【０００７】
また、図１０に示すように、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程（ＳＴ１１０、ＳＴ１３０）、系を洗浄する工程（ＳＴ１２０）、発光を測定する工程（ＳＴ１４０）等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。【０００８】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検出対象を迅速、安価且つ簡便に検出、定量できる検出、定量用キット、及び検出、定量方法を提供することを課題の一つとし、更には高感度で検出、定量できる検出、定量用キット、及び検出、定量方法を提供することを課題の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、電荷を有する化合物を接近させると、刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。【００１０】
［１］検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。
［２］第１の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする［１］に記載のキット。
［３］第２の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする［１］又は［２］に記載のキット。
［４］第２の物質が、ポリアニオン又はポリカチオンであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか１項に記載のキット。
［５］ポリアニオンが、核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする［４］に記載のキット。
［６］ポリカチオンが、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンであることを特徴とする［４］に記載のキット。
［７］検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。
［８］第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、電荷を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
［１０］第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことを特徴とする［９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、検出対象が存在すると、この結合対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、電荷部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーの凝集が阻害される。従って、この凝集阻害の有無を観察することで、検出対象の存否を検出できる。また、凝集阻害の程度を測定することで、検出対象を定量できる。【００１２】
以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行うことができ、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。また、第２の物質が有する電荷部分が刺激応答性ポリマーの凝集を高度に阻害するので、高感度で検出対象を検出、定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係るキットの概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るキットの使用状態を示す模式図である。
【図３】本発明の一実施例に係る方法における磁力の付加の態様を示す図である。
【図４】本発明の一実施例に係る方法のフローチャートである。
【図５】本発明の一実施例に係る方法における反応時間と濁度との相関性を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグラフである。
【図９】本発明の別の実施例に係る方法における反応時間と濁度との相関性を示すグラフである。
【図１０】従来例に係る方法のフローチャートである。
【符号の説明】
【００１４】
１０  第１の結合物
１１  刺激応答性ポリマー
１３  第１の抗体（第１の親和性物質）
１９  磁性物質
２０  第２の結合物
２１  第２の物質
２３  第２の抗体（第２の親和性物質）
５０  検出対象
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１６】
＜キット＞
本発明のキットは、検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、第１の結合物と、第２の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
【００１７】
〔第１の結合物〕
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。
【００１８】
（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性ポリマーを含有するところ、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激は、特に限定されないが、温度、光、酸、塩基、ｐＨ、電気等の様々な物理的、あるいは化学的信号であってよい。
【００１９】
特に、本発明では、刺激応答性ポリマーは、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーであることが好ましい。また、刺激応答性ポリマーは、電荷を有する分子と結合しても構造変化しないことが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマーが挙げられる。
【００２０】
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
【００２１】
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクロイルグリシンアミド、アクロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００２２】
（微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリジジルメタクリレート重合体のようにエポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
【００２３】
〔第２の結合物〕
第２の結合物は、電荷を有する第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合したものである。
【００２４】
（第２の物質）
電荷を有する第２の物質は、例えば親水性の高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボン酸官能基を含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル基）やポリカチオン（アミノ基）の官能基数は、２５個以上が好ましい。
【００２５】
（第１の親和性物質、第２の親和性物質）
第１の結合物の第１の親和性物質、及び第２の結合物の第２の親和性物質は、検出対象の異なる部位において、同時に検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
【００２６】
ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、異なる抗原認識部位を有する２種類のモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２７】
〔作製方法〕
以上のキットの作成方法を説明する。
【００２８】
［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。
【００２９】
具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開第０１／０９１４１号パンフレットに記載されているように、ビオチン等をメタクリル基やアクリル基等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。
【００３０】
別法として、ポリマーの重合時にカルボン酸、アミノ基又はエポキシ基等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。
【００３１】
あるいは、ポリマーの重合時にカルボン酸、アミノ基又はエポキシ基等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
【００３２】
あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。
【００３３】
第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
【００３４】
微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
【００３５】
次に、電荷を有する第２の物質と、検出対象の抗原に対する第２の抗体とを結合させ第２の結合物を作製する方法について記述する。
【００３６】
［第２の結合物の作製］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
【００３７】
第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、  １、  ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。
【００３８】
第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（同仁化学研究所社製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００３９】
第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００４０】
この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。
【００４１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチオランを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィド基を導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
【００４２】
Ｎｕｌｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド基）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド基等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
【００４３】
核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。
【００４４】
このようにして製造されるキットは、例えば以下のような方法で、検出対象を検出及び／又は定量するために使用できる。
【００４５】
＜検出方法＞
本発明の検出方法は、まず第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下において、刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。
【００４６】
（混合・凝集）
まず、第１の結合物と第２の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合物を得る。続いて、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第２の結合物中の電荷によって凝集阻害されて分散する一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
【００４７】
この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。
【００４８】
図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０は負電荷を有する第２の物質２１を含み、この第２の物質２１は検出対象５０に対する第２の抗体２３に結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。
【００４９】
図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（図２（Ｂ））。
【００５０】
刺激応答性ポリマーを凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。
【００５１】
なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物の検出対象への結合の前に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。ただし、温度応答性ポリマーが凝集する条件が、第１の結合物及び第２の結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好ましい。
【００５２】
ここで、下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は例えば以下のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
【００５３】
（判定）
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、５５０ｎｍ）であることが好ましい。
【００５４】
目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値との差に基づいて判定を行ってもよい。
【００５５】
＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度を測定し、検出対象の量と濁度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
【００５６】
（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
【００５７】
ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であってもよい。
【００５８】
（算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
【００５９】
（分離）
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。
【００６０】
磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができる。この磁石の磁力は、用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマグナ社製ネオジ磁石が挙げられる。
【００６１】
また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費やされる時間を短縮化できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁度は、夾雑物が存在していた場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。
【００６２】
なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定することのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラメータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの１点は、例えば、検出対象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出対象の量をより正確に定量できることになる。
【００６３】
（検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。
【００６４】
［キットの構成とその使用方法の例］
以下に、本発明の方法を利用するためのキットの構成とその使用方法の例を、検出対象が抗原の場合について説明する。
【００６５】
試薬キットは、例えば、下記の試薬から構成される。
抗原検出用試薬キット：
試薬Ａ：微粒子状の磁性物質及び検出対象の抗原に特異的に結合する第１の抗体が結合した温度応答性ポリマー
試薬Ｂ：第１の抗体とは異なる部位を認識し、検出対象の抗原に同時に結合しうる第２の抗体が結合した、電荷を有する化合物
試薬Ｃ：被測定物質の標準品（具体例として、精製抗原が挙げられる。）。
試薬Ｄ：希釈用バッファー（上記試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使用可能なバッファーであって、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。）
【００６６】
また、濁度を測定する装置としては、容器内をポリマーが凝集する温度に保温でき、２００ｎｍ〜９００ｎｍの透過光を照射できる従来周知の装置が使用できる。
【００６７】
上記した試薬からなるキットは、例えば、以下の方法で使用できる。
【００６８】
まず、試薬Ａ  ５〜１０００μＬと試薬Ｂ  ５〜１０００μＬとを混合する。試薬Ａと試薬Ｂの入った溶液中に（１）被測定物質の標準品を添加した陽性対照、（２）何も添加しない陰性対照、（３）被検液の５〜１０００μＬを添加したサンプル、を準備し、一定時間、ポリマーが分散する温度（例えば約０〜３０℃）で反応させる。温度応答性ポリマーを用いた場合、反応後、そのポリマーの凝集温度（例えば４２℃）に保温された容器に反応液を入れ、５５０ｎｍの透過光を照射して濁度を測定し、抗原の有無の判定又は抗原の定量を行う。
【００６９】
上記とは別の使用方法として、試薬Ａと上記（１）、（２）、及び（３）を一定時間ポリマーが分散する温度で反応させた後、試薬Ｂを添加し、一定時間反応後、凝集温度に保温された容器に反応液を入れ、５５０ｎｍの透過光を照射して濁度を測定し、抗原の有無の判定又は抗原の定量を行ってもよい。
【実施例】
【００７０】
＜実施例１＞
［キットの作製］
（第１の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第１の親和性物質としての抗体（クローン：１９５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）を、従来周知のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）によりビオチン化し、ビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を調製した。
一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマグナビート株式会社製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここにＴＢＳバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、ＰＢＳバッファー（０．０１Ｍ  リン酸バッファー、０．００２７Ｍ  塩化カリウム、０．１３７Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン標識抗ＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１５分間転倒混和した。マイクロチューブを４２℃に加熱してＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を分離した（Ｂ／Ｆ分離）。ここにＴＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のビオチンを添加して、ストレプトアビジンのビオチン結合部位を被覆した後、余分なビオチンを分離した（Ｂ／Ｆ分離）。更に０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液に分散させることで、第１の結合物を調製した。【００７１】
（第２の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗体（クローン：１７６マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに２−メルカプトエタノール６ｍｇを加え、３７℃で１２０分反応させた。反応後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商品名）  透析カセット、１０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＰＢＳバッファー５００ｍＬに対して透析し、過剰の２−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量１００００の限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製［Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０ｋ］）を用いて０．５ｍＬに濃縮し、マウス抗ＴＳＨα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体０．５ｍＬと１００μＬマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウム（３３ｍｇをＰＢＳバッファー１ｍＬに溶解したもの）とを４℃で１晩反応させ、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を作成した。この標識抗体（この抗体は、ポリアクリル酸抗ＴＳＨα抗体結合物ともいう。）を０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの水溶液でタンパク質濃度４μｇ／ｍＬに希釈することで、第２の結合物を調製した。
【００７２】
なお、上記マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムは、次のように調製した。
まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した１００ｍＬの三口フラスコ内で、アクリル酸（和光純薬工業社製）２ｇ、２−アミノエタンチオール（和光純薬工業社製）０．０２１ｇ、及びアゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．０２３ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解し、１時間窒素置換を行った。その後、７０℃で７時間重合反応を行った。得られた反応液を、１０ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠状の物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、更に真空乾燥機で１晩乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た（収量１．５ｇ）。次にアミノ基末端ポリアクリル酸をマレイミド化した。窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付した５０ｍＬのナスフラスコに、アミノ基末端ポリアクリル酸０．５ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬを入れ、溶解した。そこにＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド）（同仁化学研究所社製）３ｍｇを加え、一晩反応した。得られた反応液を、１ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、更に真空乾燥機で、１晩乾燥しマレイミド基末端ポリアクリル酸を得た。分子量は約１３００００（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷ３０００、６ｍｍ  ＩＤ．×１５０ｍｍ、移動相０．１Ｍ  硝酸ナトリウム）であり、収量は０．４ｇであった。【００７３】
（試料の調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製、活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に３０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液をビトロスＴＳＨキャリブレータ１（ＴＳＨ：０ｍＩＵ／Ｌ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製）で０．０６ｍＩＵ／Ｌ、０．００１２ｍＩＵ／Ｌとなるよう希釈したものを、それぞれ試料とした。【００７４】
［定量］
図３に示されるように、従来汎用されている分光光度計用セミミクロセル７１の光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石７３（西興産業社製）を取り付けた。このセル７１を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計ＵＶ−３１０１ＰＣ（島津製作所製）内に設置し、３７℃のもと１０分間以上保持した。
【００７５】
図４は、実施例に係る定量方法の手順を示すフローチャートである。定量方法は、上記の第１の結合物、第２の結合物及び試料を混合する工程（ＳＴ１０）と、混合物の濁度を測定する工程（ＳＴ２０）とを含む。【００７６】
（混合）
第１の結合物１５０μＬ及び第２の結合物１２０μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に各試料７５０μＬを添加し、再びボルテックスミキサで６０秒間撹拌した。【００７７】
（相関式の作製）
この撹拌液をセル７１内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直ちにスリット幅１０ｍｍで、１２００秒間にわたって連続して測定した。この結果を図５に示す。【００７８】
図５に示されるように、約６００秒までは、ＴＳＨの量が高い程、濁度が低いことが分かった。これは、ＴＳＨを中心に近接して配置されるため、刺激応答性ポリマーが第２の結合物の電荷によって凝集阻害されて分散したためである。一方、約６００秒付近から、ＴＳＨの量と濁度との関係が反転し始め、時間の経過とともに濁度が初期値よりも低下する。これは、凝集した磁性物質が磁石に吸着されて分離されるからであると推測される。【００７９】
次に、各試料について、０秒、６００秒、１０００秒の３点での測定値の差異を表した。この結果を図６〜図８に示す。【００８０】
図６〜図８に示されるように、０秒、６００秒、１０００秒のうちの２点間の測定値の差異は、いずれもＴＳＨの量に依存するものであった。とりわけ、６００秒での測定値と１０００秒での測定値との差異は最も大きく、最も高感度に検出又は定量できることが分かった。これにより、陰性対照（つまり、ＴＳＨ量がゼロ）に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍（６００秒）を測定時点の１つとして選択することが好ましいことが確認された。【００８１】
［再現性評価］
上記の第１の結合物、第２の結合物及び試料を４℃の暗所内で保存し、１日１回ずつ３日間、同様の手順で濁度の測定を行った。この結果を表１に示す。【００８２】
【表１】
0005276980.tif 000002
【００８３】
表１に示されるように、３日間にわたるいずれの時点間でも、ＣＶ（変動係数）は５．８以下という低い値であった。よって、実施例の系によれば高い再現性が得られることが確認された。【００８４】
＜実施例２＞
分光光度計用セミミクロセル７１の光路外に、ネオジム永久磁石７３（西興産業社製）を取り付けなかったことを除き、実施例１と同様の手順で、ＴＳＨ量がゼロの試料の濁度を測定した。この結果を、実施例１におけるＴＳＨ量がゼロの試料の濁度と併せて図９に示す。【００８５】
図９に示されるように、約６００秒まで実施例１及び２での濁度は略等しく、実施例２での濁度は約６００秒以降では飽和していた。この結果は、約６００秒までの時間では、磁力を付加しなくとも一定の高感度で検出又は定量でき、更なる高感度で検出又は定量する場合には磁力を付加して約６００秒での測定値と、それ以後の時点での測定値との差異を利用すべきであることを示唆するものである。【００８６】
［比較例］
上記の試料について、種々の系を用いてＴＳＨ量を測定した。この結果から推定される各系の検出限界値を表２に示す。【００８７】
【表２】
0005276980.tif 000003
【００８８】
表２に示されるように、従来の系では、検出限界値が０．００２５〜０．００５ｍＩＵ／Ｌであった。これにより、０．００１２ｍＩＵ／Ｌでも検出できた実施例は、従来の系に比べ格段に検出感度が高いことが確認された。【００８９】
しかも、どの時点においてもＴＳＨの量に依存して、濁度に差異が存在することから、検体中のＴＳＨの検出に使用できた。１０００秒以内という検出時間は、約３８分間費やす従来技術（図１０参照）に比べて、かなり短いものである。また、以上のＳＴ１０及びＳＴ２０という操作を、実際の検体について行うだけで検出物質を検出又は定量できるので、手順が簡便である。【００９０】
つまり、本発明は、酵素基質反応を利用せずに濁度を測定する系であるため、手順が簡便でありつつ、従来の系に比べて格段に高い検出感度を有し、しかも短時間で検出・定量を完了できるという画期的な効果を有することが示された。【００９１】
＜実施例３＞
（ビオチン含有ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成）
窒素ガス導入管、温度計及び撹拌装置を付した２００ｍＬの三口フラスコ内で、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１３．６ｇ、ビオチンモノマー〔Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド〕０．４２ｇ、２−アミノエタンチオール（和光純薬工業社製）０．２ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．２ｇをメタノール１００ｍＬに溶解し、３０分間窒素置換を行った。その後、７０℃で７時間重合反応を行った。得られた反応液を減圧濃縮し、得られた固体をアセトンに溶かし、ジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿を濾過し、更に真空乾燥機で１晩乾燥することで、ビオチン含有ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．８４ｇ得た。得られたビオチン含有ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の分子量は約２９０００（Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＬＦ−８０４、８ｍｍ  ＩＤ．×３００ｍｍ、移動相ＴＨＦ）であった。
なお、ビオチンモノマー〔Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド〕の調製は、特開２００５−８２５３８号公報に記載の方法を用いて、以下の通り行った。
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩１８ｇ、ビオチン２４ｇ及びトリエチルアミン３０ｇを３００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、０℃に冷却した。ジフェニルホスフォニルアジド２８ｇを５０ｍｌのＤＭＦに溶解させた溶液を１時間かけて、この混合物中に滴下した。滴下終了後、０℃で３時間攪拌し、更に室温（２０℃）で１２時間攪拌した。この後、減圧下で、溶媒を留去し、クロロホルム−メタノール混合溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミドを得た。【００９２】
（ストレプトアビジン結合Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの調製）
ビオチン含有ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）１００ｍｇをＴＢＳバッファー１０ｍＬに溶解し、０．１％（ｗ／ｖ）とした。０．１％（ｗ／ｖ）ビオチン含有ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬになるように精製水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製  Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ（商品名）で精製した水）に溶解したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）１５μＬを添加し、３０分間氷上で静置して反応させることで、ストレプトアビジン結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のＴＢＳ溶液を得た。【００９３】
（マウス抗ＴＳＨα抗体結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の調製）
ストレプトアビジン結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のＴＢＳ溶液６２５μＬに、ビオチン標識マウス抗ＴＳＨα抗体（コスモバイオ社（商品コード  Ｔ１０３）より購入したマウス抗ＴＳＨα抗体（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）をｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）でビオチン化したもの）１００μＬを添加し、３０分間氷上で静置して反応させ、マウス抗ＴＳＨα抗体結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のＴＢＳ溶液を得た。【００９４】
（ポリアクリル酸抗ＴＳＨβ抗体結合物の調製）
マウス抗ＴＳＨα抗体の代わりにマウス抗ＴＳＨβ抗体を用いた点を除き、実施例２と同様の手順でポリアクリル酸抗ＴＳＨβ抗体結合物を調製した。【００９５】
（抗ＴＳＨα抗体結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ポリアクリル酸抗ＴＳＨβ抗体結合物によるＴＳＨの検出）
マウス抗ＴＳＨα抗体結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ＴＢＳ溶液２５μＬの入った１．５ｍＬのチューブを４本（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）用意した。各チューブにビトロスＴＳＨキャリブレーター１（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、商品コード  ０６５００２）５μＬと、各濃度のＴＳＨのＴＢＳ溶液  １０μＬ（ａはＴＳＨ濃度０、ｂはＴＳＨ濃度０．００１μｇ／μＬ、ｃはＴＳＨ濃度０．０１μｇ／μＬ、ｄはＴＳＨ濃度０．１μｇ／μＬ）との混合物を添加し、更にＴＢＳバッファー１６５μＬを加え、５分間、氷上にて静置した。その後、各チューブにポリアクリル酸抗ＴＳＨβ抗体結合物５μＬを添加し、３０分間氷上にて静置したものを測定サンプルとした。【００９６】
恒温槽で分光光度計ＵＶｍｉｎｉ（島津製作所社製）のセルホルダを３１．５℃に保温した。サンプルの入っていない石英セル（ＱＳ，Ｈｅｌｌａ，光路長１０ｍｍ）をセルホルダに置き、５分間静置した。その後、石英セル内にチューブａ中の測定サンプル２００μＬを添加し、その６分後に吸光度を測定した。チューブｂ〜ｄ中のサンプルについても、同様の手順で吸光度を測定した。その結果、吸光度は、ａが０．２１６、ｂが０．１９９、ｃが０．１７６、ｄが０．１６８であった。【００９７】
以上の結果により、ＴＳＨの濃度に応じて吸光度が変化すること、換言すれば、吸光度を測定することでＴＳＨの濃度を定量できることが示された。つまり、本発明に係る方法は、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器を必要とせず、検出対象を迅速、安価且つ簡便に検出、定量できる新規な方法であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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