(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体に次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物を反応させて次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する方法において、酸存在下、モノチオアセタール化合物（２）の硫黄原子をハロゲン化するための試薬としてヨウ素を用いることを特徴とする、次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体の製造方法。
【化１】
0005168145.tif 000030
式（１）、（２）及び（３）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し、ＷＧ1は、電子吸引性基を表し、Ｒ3は、アルキル又はアリールを表し、Ａは、次の一般式（４ａ）又は（４ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
【化２】
0005168145.tif 000031
式（４ａ）及び（４ｂ）中、Ｒ6は、アルキルを表す。
【請求項２】
酸がメタンスルホン酸又はトリフルオロメタンスルホン酸とメタンスルホン酸との混合酸である、請求項１記載のリボ核酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
Ｒ3がメチルである、請求項１又は２のいずれかに記載のリボ核酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
ＷＧ1がシアノである、請求項１〜３のいずれかに記載のリボ核酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
下記工程を含む、次の一般式（Ａ）で表されるホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【化３】
0005168145.tif 000032
式（Ａ）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し、Ｒ2a、Ｒ2bは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ2a、Ｒ2bが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ1、ＷＧ2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。Ｒ1は、次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化４】
0005168145.tif 000033
式（５）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
工程：
次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体に次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物を反応させて次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程において、酸存在下、モノチオアセタール化合物（２）の硫黄原子をハロゲン化するための試薬としてヨウ素を用いることによって、次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
【化５】
0005168145.tif 000034
式（１）、（２）及び（３）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し、ＷＧ1は、電子吸引性基を表し、Ｒ3は、アルキル又はアリールを表し、Ａは、次の一般式（４ａ）又は（４ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
【化６】
0005168145.tif 000035
式（４ａ）及び（４ｂ）中、Ｒ6は、アルキルを表す。
【請求項６】
酸がメタンスルホン酸又はトリフルオロメタンスルホン酸とメタンスルホン酸との混合酸である、請求項５記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項７】
Ｒ3がメチルである、請求項５又は６のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項８】
ＷＧ1がシアノである、請求項５〜７のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項９】
下記工程ａ〜ｄを含む、次の一般式（Ａ）で表されるホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【化７】
0005168145.tif 000036
式（Ａ）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し、Ｒ2a、Ｒ2bは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ2a、Ｒ2bが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ1、ＷＧ2は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。Ｒ1は、次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化８】
0005168145.tif 000037
式（５）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
工程ａ：
次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体に次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物を反応させて次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程において、酸存在下、モノチオアセタール化合物（２）の硫黄原子をハロゲン化するための試薬としてヨウ素を用いることによって、次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
【化９】
0005168145.tif 000038
式（１）、（２）及び（３）中、Ｂｚ、ＷＧ1は、前記と同義である。Ｒ3は、アルキル又はアリールを表し、Ａは、次の一般式（４ａ）又は（４ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
【化１０】
0005168145.tif 000039
式（４ａ）及び（４ｂ）中、Ｒ6は、アルキルを表す。
工程ｂ：
工程ａにおいて製造されるリボ核酸誘導体（３）に、ケイ素置換基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
【化１１】
0005168145.tif 000040
式（３）及び（７）中、Ａ、Ｂｚ、ＷＧ1は、前記と同義である。
工程ｃ：
工程ｂにおいて製造されるリボ核酸誘導体（７）の５’位の水酸基に、次の一般式（８）で表されるＲ1Ｘ3を作用させ、酸性条件下において脱離する保護基（Ｒ1）を導入することによって、次の一般式（９）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程、
【化１２】
0005168145.tif 000041
式（７）、（８）及び（９）中、Ｂｚ、Ｒ1、ＷＧ1は、前記と同義である。Ｘ3は、ハロゲンを表す。
工程ｄ：
工程ｃにおいて製造されるリボ核酸誘導体（９）にホスホロアミダイト化試薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、３’位の水酸基がホスホロアミダイト化された、次の一般式（Ａ）で表されるホスホロアミダイト化合物を製造する工程。
【化１３】
0005168145.tif 000042
式（９）及び（Ａ）中、Ｂｚ、Ｒ1、Ｒ2a、Ｒ2b、ＷＧ1、ＷＧ2は、前記と同義である。
【請求項１０】
酸がメタンスルホン酸又はトリフルオロメタンスルホン酸とメタンスルホン酸との混合酸である、請求項９記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項１１】
Ｒ3がメチルである、請求項９又は１０のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項１２】
ＷＧ1がシアノである、請求項９〜１１のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項１３】
ホスホロアミダイト化試薬が、次の一般式（１０ａ）又は（１０ｂ）で表される化合物である、請求項９〜１２のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【化１４】
0005168145.tif 000043
式（１０ａ）及び（１０ｂ）中、Ｒ2a、Ｒ2bは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ2a、Ｒ2bが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ2は、電子吸引性基を表し、Ｘ1は、ハロゲンを表す。
【請求項１４】
工程ｄにおいて使用する活性化剤が、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン又は２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールである、請求項９〜１３のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３’位水酸基と５’位水酸基がケイ素保護基で保護されているリボ核酸誘導体において、リボースの２’位水酸基に下記置換基（Ｉ）を導入する方法に関するものである。
【化１】
0005168145.tif 000002
式（Ｉ）中、ＷＧ１は、電子吸引性基を表す。
ＷＧ１に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シアノ、ニトロ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シアノが好ましい。
ＷＧ１に係る「アルキルスルホニル」の「アルキル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルを挙げることができる。
ＷＧ１に係る「アリールスルホニル」の「アリール」部分としては、例えば、炭素数６〜１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
ＷＧ１に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
ＷＧ１に係る「アリール」の置換基である「ハロゲン」および「アルキル」としては、前記「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。ＷＧ１に係る「アリール」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜４のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。なかでも炭素数１〜３の該アルコキシが好ましい。
【背景技術】
【０００２】
オリゴＲＮＡは、遺伝子解析のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、アプタマーとして有用である。このオリゴＲＮＡの製造過程で使用される試薬として、リボースの２’位水酸基が中性条件において脱離可能な２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基で置換されているホスホロアミダイト化合物が知られている（非特許文献１、特許文献１）。
該ホスホロアミダイト化合物を製造する工程として、リボースの２’位の水酸基に保護基としてＣＥＭを導入する工程があるが、従来、当該工程は、リボースの３’位と５’位の水酸基をケイ素保護基（例えば、テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）で保護されたリボ核酸誘導体（原料化合物）に、トリフルオロメタンスルホン酸やトリフルオロメタンスルホン酸銀等の酸存在下、アルキル化試薬としてメチルチオメチル２−シアノエチルエーテルを、アルキル化試薬の硫黄原子をハロゲン化するための試薬（酸化剤）としてＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）やＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を作用させて実施されていた（特許文献１）。
上記のようなアルキル化試薬の硫黄原子をハロゲン化するための試薬、及び上記のような酸、即ち、ＮＩＳ、ＮＢＳ、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀は、非常に反応性の高い化合物であるので、反応温度を０℃付近に下げてもなお、原料化合物であるリボ核酸誘導体の核酸塩基もハロゲン化されてしまうおそれがある。したがって、当該工程では、核酸塩基のハロゲン化を防ぐべく−５０℃〜−４０℃という極めて低い温度条件において実施する必要がある。但し、原料化合物のリボ核酸誘導体が１００ｍｇ〜２ｇ程度の小量スケールの場合には、反応温度が０℃付近であっても、きれいに反応が進行する場合がある。
また、ＮＩＳやＮＢＳを使用した場合には、スクシンイミド由来の副生成物を生じる。当該副生成物は抽出操作により除去することは困難であり、通常、大量に精製するのに不向きなカラムクロマトグラフィーを使用して除去する必要がある。
さらに、ＮＩＳ、ＮＢＳ、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀は、非常に高価な試薬であり、経済的に不利である。
このようなＮＩＳやＮＢＳ等を用いる従来の製法は、上記ホスホロアミダイト化合物を大量に生産するには適さない。
【特許文献１】国際公報ＷＯ２００６／０２２３２３  Ａ１パンフレット
【非特許文献１】大木ら，ＯＲＧＡＮＩＣ  ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ．７，３４７７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、主として、３’位水酸基と５’位水酸基がケイ素保護基で保護されているリボ核酸誘導体において、リボースの２’位水酸基に下記置換基（Ｉ）（例えば、ＣＥＭ基）を安価に簡便に導入する方法を提供することにある。
【化２】
0005168145.tif 000003
式（Ｉ）中、ＷＧ１は、前記と同義である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
本発明として、例えば、次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体に次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物を反応させて次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する方法において、酸存在下、モノチオアセタール化合物（２）の硫黄原子をハロゲン化するための試薬としてヨウ素を用いることを特徴とする、次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体の製造方法を挙げることができる。
【化３】
0005168145.tif 000004
式（１）、（２）及び（３）中、Ｂｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し、ＷＧ１は、前記と同義であり、Ｒ３は、アルキル又はアリールを表し、Ａは、次の一般式（４ａ）又は（４ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
【化４】
0005168145.tif 000005
式（４ａ）及び（４ｂ）中、Ｒ６は、アルキルを表す。【０００６】
Ｂｚに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基又はそれらの修飾体を挙げることができる。
Ｂｚに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、該アミノ基が保護されているのが好ましい。かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。
Ｂｚの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されているものであり、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されているものをいう。
Ｂｚの「修飾体」に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニルを挙げることができる。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」及び「アルキルスルホニル」の「アルキル」部分は、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜４のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。なかでも炭素数１〜３の該アルコキシが好ましく、とりわけメトキシが好ましい。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アリールアルキル」の「アリール」としては、例えば、炭素数６〜１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
Ｂｚの「修飾体」に係る「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
Ｒ３に係る「アルキル」、「アリール」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」、「アリール」と同じものを挙げることができる。
モノチオアセタール化合物（１１）の具体例としては、２−シアノエチル  メチルチオメチルエーテルを挙げることができる。
Ｒ６に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルを挙げることができる。【０００７】
また、本発明として、次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体に次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物を反応させて次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する方法において、酸存在下、モノチオアセタール化合物（２）の硫黄原子をハロゲン化するための試薬としてヨウ素を用いることによって、次の一般式（３）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程を含む、下記一般式（Ａ）で表されるホスホロアミダイト化合物（以下、「ホスホロアミダイト化合物（Ａ）」という。）の製造方法も挙げることができる。
【化５】
0005168145.tif 000006
式（１）、（２）及び（３）中、Ａ、Ｂｚ、Ｒ３、ＷＧ１は、前記と同義である。
【化６】
0005168145.tif 000007
式（Ａ）中、Ｂｚ、ＷＧ１は、前記と同義である。Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ２は、同一又は異なって、電子吸引性基を表し、Ｒ１は、次の一般式（５）で表される置換基を表す。
【化７】
0005168145.tif 000008
式（５）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素又はアルコキシを表す。
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３に係る「アルコキシ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「アルキル」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「５〜６員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、モルホリン−４−イル又はチオモルホリン−４−イルを挙げることができる。
ＷＧ２に係る「電子吸引性基」としては、前記ＷＧ１に係る「電子吸引性基」と同じものを挙げることができる。【０００８】
ホスホロアミダイト化合物（Ａ）は、リボースの２’位水酸基が下記置換基（Ｉ）で保護されているホスホロアミダイト化合物である。また、２’位の水酸基に導入された基が直鎖状の置換基であり、３’位の水酸基に結合するリン原子の周りにおける立体が混み合っていないため、従来から使用されているホスホロアミダイト化合物と比較して、オリゴＲＮＡを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進行し、縮合収率がよいという特徴を有する。ホスホロアミダイト化合物（Ａ）を使用することにより、オリゴＤＮＡの製造とほぼ同様の手法により、高純度のオリゴＲＮＡの製造することができる。
【化８】
0005168145.tif 000009
式（Ｉ）中、ＷＧ１は、前記と同義である。【０００９】
ここで、本発明において「オリゴＲＮＡ」とは、少なくとも１つはオリゴ核酸の構成モノマーとしてリボ核酸（ＲＮＡ）を含有するオリゴ核酸をいう。また、「オリゴＤＮＡ」とは、オリゴ核酸の構成モノマーとしてリボ核酸（ＲＮＡ）を含有しないオリゴ核酸をいう。【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。【００１２】
Ｉ．リボ核酸誘導体（３）の製法
本製法は、酸及びヨウ素の存在下で、次の一般式（１）で表されるリボ核酸誘導体と次の一般式（２）で表されるモノチオアセタール化合物とを反応させることによって実施することができる。
【化９】
0005168145.tif 000010
式（１）、（２）及び（３）中、Ａ、Ｂｚ、Ｒ３、ＷＧ１は、前記と同義である。
モノチオアセタール化合物（２）は、公知の方法（例えば、国際公開公報ＷＯ２００６／０２２３２３Ａ１パンフレット）により製造することができる。
本製法は、酸存在下、市販品として入手可能な又は文献記載の方法に従い合成可能なリボ核酸誘導体（１）に、モノチオアセタール化合物（２）とヨウ素とを作用させることにより実施することができる。本製法で使用する「ヨウ素」の量は、リボ核酸誘導体（１）に対して、モル比で０．８倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。反応温度は、−２０℃〜２０℃の範囲内が適当であり、好ましくは、−１０℃〜１０℃の範囲内であり、より好ましくは、−５℃〜５℃の範囲内である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分間〜５時間の範囲内が適当である。本製法で使用しうる「モノチオアセタール化合物（２）」の使用量は、リボ核酸誘導体（１）に対して、モル比で０．８倍量〜５倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜３倍量の範囲内である。酸としては、リボースの２’位へのアルキル化反応を活性化することができ、また核酸塩基の部分と塩を形成することができる程度の酸性度を有する有機酸であれば特に限定されない。例えば、このような酸として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸又はそれらの混合物を挙げることができる。特に、メタンスルホン酸又はトリフルオロメタンスルホン酸とメタンスルホン酸との混合酸が好ましい。かかる「酸」の使用量は、リボ核酸誘導体（１）に対して、モル比で０．０１倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．１倍量〜５倍量の範囲内である。トリフルオロメタンスルホン酸とメタンスルホン酸との混合酸の場合、トリフルオロメタンスルホン酸がメタンスルホン酸に対して、モル比で０．０１倍量〜０．９倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．０２倍量〜０．５倍量の範囲内、より好ましくは、０．０５倍量〜０．２倍量の範囲内である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」という。）、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。特に、ＴＨＦが好ましい。
ＩＩ．ホスホロアミダイト化合物（Ａ）の製法
ホスホロアミダイト化合物（Ａ）は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、例えば、次の工程ａ〜工程ｄを実施することにより製造することができる。
以下、詳細に説明する。【００１３】
（１）工程ａ：
本工程は、前述Ｉの製法と同じものである。
【００１４】
（２）工程ｂ：
本工程は、工程ａにおいて製造されるリボ核酸誘導体（３）を適当な溶媒に溶解し、ケイ素置換基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程である。
【化１０】
0005168145.tif 000011
式（３）及び（７）中、Ａ、Ｂｚ、ＷＧ１は、前記と同義である。  
本工程で使用しうる「ケイ素置換基を脱離するための試薬」としては、テトラブチルアンモニウムフロリド、アミンとフッ化水素酸との塩又は適当な溶媒中においてアミンとフッ化水素酸とを任意の比で混合したものを挙げることができる。
また、場合によっては、アミンとフッ化水素酸との塩又は適当な溶媒中においてアミンとフッ化水素酸とを任意の比で混合したものに、さらに適当な酸を添加した混合試薬を使用して本工程を実施することもできる。その時に使用することができる酸としては、例えば、酢酸、塩酸、硫酸を挙げることができる。かかる酸の使用量としては、アミンに対して、モル比で０．０１倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．１倍量〜５倍量の範囲内である。
使用する溶媒としては、例えば、ＴＨＦ、アセトニトリル、メタノール、イソプロパール、トルエン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。特に、ＴＨＦ、メタノールが好ましい。
リボ核酸誘導体（３）の種類、用いるケイ素置換基を脱離するための試薬、使用する溶媒等によって異なるが、本工程で使用しうる「ケイ素置換基を脱離するための試薬」の使用量としては、リボ核酸誘導体（３）に対して、モル比で等倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１．２倍量〜１．５倍量の範囲内である。反応温度は、０℃〜８０℃の範囲内が適当である。反応時間は、リボ核酸誘導体の種類、用いるケイ素置換基を脱離するための試薬、使用する溶媒等によって異なるが、反応温度等によって異なるが、通常３０分間〜１０時間の範囲内が適当である。
反応終了後、そのまま又は反応混合物に適量の水を加えて冷却することにより、リボ核酸誘導体（７）を析出物として得ることができる。添加する水の使用量としては、使用する溶媒に対して、容量比で０．０５倍量〜５倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．０６倍量〜等倍量の範囲内であり、より好ましくは０．０７倍量〜０．１倍量の範囲内である。
本工程で使用しうる「アミンとフッ化水素酸との塩」としては、具体的には、アンモニウムフロリド、トリメチルアミンヒドロフロリド、トリメチルアミンジヒドロフロリド、トリメチルアミントリスヒドロフロリド、トリメチルアミンテトラヒドロフロリド、トリメチルアミンペンタヒドロフロリド、トリメチルアミンヘキサヒドロフロリド、トリエチルアミンヒドロフロリド、トリエチルアミンジヒドロフロリド、トリエチルアミントリスヒドロフロリド、トリエチルアミンテトラヒドロフロリド、トリエチルアミン２６ヒドロフロリド、キヌクリジントリスヒドロフロリド、トリエチレンジアミンテトラヒドロフロリド等を挙げることができる（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９３，２４７（１９８９）、Ｐｏｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ，６７（２），２８１（１９９３）、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．，４（６），１０４３（１９９８）、Ｊ．Ｆｌｕｏｒｉｎｅ．Ｃｈｅｍ．，１１８（１−２），１２３，（２００２）を参照）。とりわけ、アンモニウムフロリド、トリエチルアミントリスヒドロフロリドが好ましい。
また、本工程で使用しうる「適当な溶媒中においてアミンとフッ化水素酸とを任意の比で混合したもの」としては、例えば、アンモニア、トリエチルアミン、トリエチルアミン、キヌクリジン、トリエチレンジアミン等のアミンとフッ化水素酸とを、適当な溶媒中（例えば、ＴＨＦ、アセトニトリル、メタノール、イソプロパール、トルエン）、例えば、１：１〜１：３０（アミン：フッ化水素酸）の混合比（モル比）で混合したものを挙げることができる。【００１５】
（３）工程ｃ：
本工程は、工程ｂにおいて製造されるリボ核酸誘導体（７）に、公知の方法に従い、次の一般式（８）で表されるＲ１Ｘ３を作用させ、リボ核酸案誘導体（７）の５’位の水酸基に酸性条件下において脱離する保護基（Ｒ１）を導入することによって、次の一般式（９）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程である。
【化１１】
0005168145.tif 000012
式（７）、（８）及び（９）中、Ｂｚ、Ｒ１、ＷＧ１は、前記と同義である。Ｘ３は、ハロゲンを表す。
Ｘ３に係る「ハロゲン」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
Ｒ１Ｘ３（８）の使用量は、リボ核酸誘導体（７）に対して、モル比で０．８倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦ等を挙げることができる。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。かかる「塩基」の使用量は、リボ核酸誘導体（７）に対して、モル比で０．８倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。反応温度は、０℃〜１２０℃の範囲内が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分間〜２４時間の範囲内が適当である。【００１６】
（４）工程ｄ：
本工程は、工程ｃにおいて製造されるリボ核酸誘導体（９）にホスホロアミダイト化試薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させ、３’位の水酸基がホスホロアミダイト化させることによって、ホスホロアミダイト化合物（Ａ）を製造する工程である。
【化１２】
0005168145.tif 000013
式（９）及び（Ａ）中、Ｂｚ、Ｒ１、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、ＷＧ１、ＷＧ２は、前記と同義である。    
「ホスホロアミダイト化試薬」としては、例えば、次の一般式（１０ａ）、（１０ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
【化１３】
0005168145.tif 000014
式（１０ａ）及び（１０ｂ）中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、ＷＧ２は、前記と同義である。Ｘ１は、ハロゲンを表す。
Ｘ１に係る「ハロゲン」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦ等を挙げることができる。
本工程で使用しうる「ホスホロアミダイト化試薬」の使用量は、リボ核酸誘導体（９）に対して、モル比で０．８倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールを挙げることができる。かかる「活性化剤」の使用量は、リボ核酸誘導体（９）に対して、モル比で０．８倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。反応温度は、０℃〜１２０℃の範囲内が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分間〜２４時間の範囲内が適当である。
このようにして、製造されるホスホロアミダイト化合物（Ａ）は、それ自体公知の手段、例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィー等により分離精製することができる。【００１７】
ＩＩＩ．オリゴＲＮＡの製法
上記製法により製造されるホスホロアミダイト化合物（Ａ）を使用することによって、次の一般式（Ｂ）で表されるオリゴＲＮＡ（以下、「オリゴＲＮＡ（Ｂ）」という。）を製造することができる。
以下に詳述する。
【化１４】
0005168145.tif 000015
式（Ｂ）中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基又はその修飾体を表す。各Ｑは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表す。各Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ又はアルコキシアルキルオキシを表すが、少なくとも１つは水酸基を表す。各Ｙはアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、Ｏ−、Ｓ−、ＮＲ２ａＲ２ｂ（Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、前記と同義である。）を表す。但し、オリゴＲＮＡ（Ｂ）を構成する核酸モノマーユニットのＲが水酸基である場合、ＹはＯ−を表す。Ｚは、Ｈ、リン酸基又はチオリン酸基を表す。ｎは、１〜２００の範囲内にある整数を表す。【００１８】
ｎは、１０〜１００の範囲内にある整数が好ましく、また、より好ましくは、１５〜５０の範囲内にある整数である。
Ｂで表される核酸塩基としては特に限定されるものではなく、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基又はそれらの修飾体を挙げることができる。
Ｂの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている化合物であり、Ｂの修飾体に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アミノ」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｙに係る「アルキル」、「アルコキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」又は「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜６のアルケニルを挙げることができる。具体的には、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニルを挙げることができる。
Ｒに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜４のアルキニルを挙げることができる。具体的には、例えば、エチニル、２−プロピニル、１−ブチニルを挙げることができる。【００１９】
ここで、本発明において「核酸モノマーユニット」とは、オリゴＲＮＡ（Ｂ）及び各（オリゴ）核酸誘導体を構成する各核酸モノマーの部分をいう。【００２０】
ホスホロアミダイト化合物（Ａ）を用いるオリゴＲＮＡ（Ｂ）の製法は、公知の方法に従い行うことができるが、例えば、次に示す工程Ａ〜工程Ｇを繰り返し実施することにより、段階的に３’から５’の方向へ核酸モノマー化合物を縮合させていくことができる。
オリゴＲＮＡの製法において、各Ｒのうち少なくとも１つが水酸基であるオリゴＲＮＡ（Ｂ）を製造することができる。例えば、下記工程Ｂにおいて、核酸モノマー化合物として全てホスホロアミダイト化合物（Ａ）を使用することにより、各Ｒが全て水酸基であるオリゴＲＮＡ（Ｂ）を製造することができる。【００２１】
下記各工程で使用される化合物及び試薬のうち、ホスホロアミダイト化合物（Ａ）以外については、オリゴＲＮＡ又はオリゴＤＮＡの合成に一般的に使用されているものを特に限定することなく用いることができる。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、すべての工程をマニュアルで又は市販のＤＮＡ自動合成機を用いて製造することができる。操作法の簡便化、また合成の正確性の点から自動合成機を用いるのが望ましい。【００２２】
（１）工程Ａ：
本工程は、次の一般式（１１）で表される（オリゴ）核酸誘導体にＲ１を脱離するための酸を作用させ、５’位の水酸基の保護基を脱離することによって、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程である。
【化１５】
0005168145.tif 000016
式（１１）及び（１２）中、ｎ、各Ｑ、Ｒ１はそれぞれ前記と同義である。各Ｂｘは、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、保護されていてもよいアルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、保護されていてもよいアルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（１３）で表される置換基を表すが、少なくとも１つは次の一般式（１３）で表される置換基を表す。
【化１６】
0005168145.tif 000017
式（１３）中、ＷＧ１は、前記と同義である。【００２３】
各Ｙ１はアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ＮＲ２ａＲ２ｂ（Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、前記と同義である。）又は次の一般式（１４）で表される置換基を表す。
【化１７】
0005168145.tif 000018
式（１４）中、ＷＧ２は、前記と同義である。
但し、（オリゴ）核酸誘導体（１１）及び（１２）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、Ｙ１は上記一般式（１４）で表される置換基を表す。【００２４】
Ｅは、アシル又は次の一般式（１５）で表される置換基を表す。
【化１８】
0005168145.tif 000019
式（１５）中、Ｅ１は、単結合又は次の一般式（１６）で表される置換基を表す。
【化１９】
0005168145.tif 000020
式（１６）中、Ｑ、Ｙ１は、前記と同義である。【００２５】
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、保護されていてもよいアルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、保護されていてもよいアルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（１３）で表される置換基又は上記一般式（１５）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（１５）を表す。【００２６】
Ｂｘに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基又はそれらの修飾体を挙げることができる。
Ｂｘに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。
かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。
Ｂｘの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている化合物であり、Ｂｘの「修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂｘの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アミノ」、「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。
Ｅに係る「アシル」としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アシルオキシ」の「アシル」部分は、前記Ｂｚの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｙ１に係る「アルキル」、「アルコキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
【００２７】
本工程は、固相担体に担持された次の一般式（１７ａ）、（１７ｂ）で表される核酸誘導体（ｎ＝１である核酸誘導体（１１）に相当）、又は、工程Ａ〜工程Ｄの操作を行うことにより製造される固相担体に担持されたオリゴＲＮＡ若しくはオリゴＤＮＡ（ｎ＝２〜１００であるオリゴ核酸誘導体（１１）に相当）（以下、「固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体」という。）に酸を作用させることにより実施することができる。
【化２０】
0005168145.tif 000021
式（１７ａ）及び（１７ｂ）中、ＢＸ、Ｒ１は、前記と同義である。Ｒ２Ｌ、Ｒ４Ｌは、置換基（１５）を表す。Ｒ２は、アシルオキシを表す。Ｒ４ａは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、保護されていてもよいアルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、保護されていてもよいアルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は置換基（１３）を表す。
Ｒ２、Ｒ４ａの「アシルオキシ」に係る「アシル」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記Ｂｚの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒに係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アミノ」、「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。【００２８】
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。【００２９】
核酸誘導体（１７ａ）、核酸誘導体（１７ｂ）は、公知の方法に従い製造される化合物又は市販品として入手できる固相担体に担持された化合物であり、好ましい態様としては、例えば、次の一般式（１８）、（１９）で表される核酸誘導体を挙げることができる。
【化２１】
0005168145.tif 000022
式（１８）及び（１９）中、ＢＸ、Ｑ、Ｒ１、Ｒ４、ＷＧ２は、前記と同義である。
Ｒ４が置換基（１３）である核酸誘導体（１９）は、ホスホロアミダイト化合物（Ａ）から公知の方法に従い製造することができる。【００３０】
本工程で使用しうる「Ｒ１を脱離するための酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸を挙げることができる。かかる「酸」は、１〜５％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、トルエン、アセトニトリル、メタノール、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程で使用しうる「酸」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、（オリゴ）核酸誘導体（１１）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間〜１時間の範囲内が適当である。【００３１】
（２）工程Ｂ：
本工程は、工程Ａにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１２）に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を縮合させることによって、次の一般式（２０）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程である。
【化２２】
0005168145.tif 000023
式（１２）及び（２０）中、各ＢＸ、Ｅ、ｎ、各Ｑ、Ｒ１、各Ｒ４、Ｔ、各Ｙ１は、前記と同義である。但し、（オリゴ）核酸誘導体（１２）及び（２０）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、Ｙ１は上記一般式（１４）で表される置換基を表す。
「核酸モノマー化合物」としては、ホスホロアミダイト化合物（Ａ）又は次の一般式（２１）で表される核酸誘導体を挙げることができる。
【化２３】
0005168145.tif 000024
式（２１）中、Ｒ１、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ４ａ、Ｙ１は、前記と同義である。ＢＹは、保護基を有していてもよい核酸塩基又はその修飾体を表す。
ＢＹに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基又はそれらの修飾体を挙げることができる。
ＢＹに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。
かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。
ＢＹの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている化合物であり、ＢＹの「修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
ＢＹの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｚの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
核酸誘導体（２１）としては、市販品として入手可能な核酸化合物又は文献公知（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄｓ．：Ｈｕｍａｎｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３．）の方法に従い合成可能な核酸化合物を挙げることができる。【００３２】
「活性化剤」としては、前記と同じものを挙げることができる。かかる「活性化剤」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦを挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１２）の種類、使用する活性化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間〜１時間の範囲内が適当である。【００３３】
（３）工程Ｃ：
本工程は、工程Ｂにおいて未反応であるオリゴ核酸誘導体（１２）の５’位の水酸基を保護するために、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（１２）にキャップ化剤を作用させる工程である。
【化２４】
0005168145.tif 000025
式（１２）及び（２２）中、各ＢＸ、Ｅ、ｎ、各Ｑ、各Ｒ４、Ｔ、各Ｙ１は、前記と同義である。Ｒ５は、メチル、フェノキシメチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシメチルを表す。但し、（オリゴ）核酸誘導体（１２）及び（２２）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、Ｙ１は上記一般式（１４）で表される置換基を表す。
「キャップ化剤」としては、例えば、無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物又は４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。キャップ化剤は、０．０５〜１Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ルチジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程で使用しうる「キャップ化剤」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。また、本工程において必要に応じて、例えば、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、２−ジメチルアミノピリジンのような「反応促進剤」を使用することができる。かかる「反応促進剤」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．０１倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．１倍量〜１０倍量の範囲内である。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１２）の種類、使用するキャップ化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間〜３０分間の範囲内が適当である。【００３４】
（４）工程Ｄ：
本工程は、工程Ｂにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２０）に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基（３価のリン）をリン酸基又はチオリン酸基（５価のリン）に変換する工程である。
【化２５】
0005168145.tif 000026
式（２０）及び（２３）中、各ＢＸ、Ｅ、ｎ、各Ｑ、Ｒ１、各Ｒ４、Ｔ、各Ｙ１は、前記と同義である。但し、オリゴ核酸誘導体（２０）及び（２３）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、Ｙ１は上記一般式（１４）で表される置換基を表す。
リンを酸素で酸化する場合の「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用することができる。かかる「酸化剤」は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン―ＴＨＦあるいはヨウ素／ピリジン―酢酸や過酸化剤（ｔ−ブチルヒドロパーオキシド／ジクロロメタンなど）を用いることができる。
また、リンを硫黄で酸化する場合の「酸化剤」として、例えば、硫黄、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）を使用することができる。該酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
本工程で使用しうる「酸化剤」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１０倍量〜５０倍量の範囲内である。反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２０）の種類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間〜３０分間の範囲内が適当である。【００３５】
（５）工程Ｅ：
本工程は、工程Ｄにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２３）を固相担体から切り出し、各核酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程である。
【化２６】
0005168145.tif 000027
式（２３）及び（２４）中、各Ｂ、各ＢＸ、Ｅ、各Ｑ、Ｒ、Ｒ１、各Ｒ４、ｎ、Ｔ、各Ｙ、各Ｙ１、Ｚは、前記と同義である。但し、オリゴ核酸誘導体（２３）及び（２４）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、Ｙ１又はＹは、それぞれ上記一般式（１４）で表される置換基又はＯ−を表す。
切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴＲＮＡを切り出し剤によって、固相担体及びリンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴＲＮＡが担持された固体担体に切り出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基部の保護基を脱離することができる。
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程で使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護に使用される溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、２０重量％〜３０重量％の範囲内が適当であり、好ましくは２５重量％〜３０重量％の範囲内であり、より好ましくは２８重量％〜３０重量％の範囲内である。
本工程で使用しうる「切り出し剤」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１０倍量〜５０倍量の範囲内である。反応温度は、１５℃〜７５℃の範囲内が適当であり、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内であり、より好ましくは１８℃〜２５℃の範囲内である。脱保護反応時間は、１０分間〜３０時間の範囲内が適当であり、好ましくは３０分間〜２４時間の範囲内であり、より好ましくは１〜４時間の範囲内である。【００３６】
（６）工程Ｆ：
本工程は、工程Ｅにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２４）に、各リボースの２’位水酸基の保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（２５）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程である。
【化２７】
0005168145.tif 000028
式（２４）及び（２５）中、各Ｂ、ｎ、各Ｑ、各Ｙ、各Ｒ、Ｒ１、各Ｒ４、Ｚは、前記と同義である。但し、オリゴ核酸誘導体（２４）及び（２５）を構成する核酸モノマーユニットのＲ４が上記一般式（１３）で表される置換基である場合、ＹはＯ−を表す。
「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」として、例えば、ＴＢＡＦ、トリエチルアミントリヒドロフロリドを挙げることができる。かかる「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」の使用量は、除去される保護基に対して、モル比で等倍量〜５００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは５倍量〜１０倍量の範囲内である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ＴＨＦ、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、ジメチルスルホキシド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応溶媒の使用量は、「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。反応温度は、２０℃〜８０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２４）の種類、使用する２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、通常１時間〜１００時間の範囲内が適当である。
必要であれば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを捕捉するため、アクリロニトリルの捕捉剤として、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれら任意の混合物を添加することができる。「ニトロアルカン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のニトロアルカンを挙げることができる。具体的には、例えば、ニトロメタンを挙げることができる。「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のアルキルアミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、ホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１−プロパンチオール、１−ブタンチオール、１−ペンタンチオール、１−ヘキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１〜６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、２−メルカプトエタノール、４−メルカプト−１−ブタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２−メルカプトエチルエーテル、３−メルカプトプロピルエーテル、４−メルカプトブチルエーテル、５−メルカプトペンチルエーテル、６−メルカプトヘキシルエーテルを挙げることができる。かかる「アクリロニトリルの捕捉剤」の使用量としては、オリゴ核酸誘導体（２４）の種類等によって異なるが、オリゴ核酸誘導体（２４）の各リボースの２’位水酸基を保護している２−シアノエトキシメチルに対して、モル比で０．８〜５００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１〜１０倍量の範囲内である。【００３７】
上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆層ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を用いることにより、５’位が保護されたオリゴＲＮＡを単離精製することができる。【００３８】
（７）工程Ｇ：
本工程は、工程Ｆにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２５）に酸を作用させることにより、５’位の水酸基を脱離する工程である。
【化２８】
0005168145.tif 000029
式（２５）及び（Ｂ）中、各Ｂ、ｎ、各Ｑ、各Ｙ、各Ｒ、Ｒ１、Ｚは、前記と同義である。但し、オリゴ核酸誘導体（２５）及びオリゴＲＮＡ（Ｂ）を構成する核酸モノマーユニットのＲが水酸基である場合、ＹはＯ−を表す。
本工程で使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸を挙げることができる。本工程で使用しうる「酸」は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水、ｐＨが２〜５の緩衝液又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。本工程で使用しうる「酸」の使用量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して、モル比で０．８倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは等倍量〜１０倍量の範囲内である。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲内が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２５）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間〜５時間の範囲内が適当である。【００３９】
（７）工程Ｈ：
本工程は、工程Ｇにおいて製造されるオリゴＲＮＡ（Ｂ）を分離精製する工程である。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８からＣ１８逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所望のオリゴＲＮＡ（Ｂ）を単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。この場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス塩酸、エチレンジアミン四酢酸を１ｍＭ〜２Ｍの範囲の濃度で添加し、溶液のｐＨを１〜９の範囲で調整することもできる。【００４０】
工程Ａ〜工程Ｄの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴＲＮＡ（Ｂ）を製造することができる。なお、本製法においてオリゴＲＮＡ（Ｂ）を製造するための出発原料として、Ｒ４ａが置換基（１３）である核酸誘導体（１７ａ）、Ｒ４ａがＨ若しくはアシルオキシである核酸誘導体（１７ａ）、又はＲ２がアシルである核酸誘導体（１７ｂ）等を使用することができる。但し、出発原料として、Ｒ４ａがＨ若しくはアシルオキシである核酸誘導体（１７ａ）、又はＲ２がアシルである核酸誘導体（１７ｂ）を使用した場合、核酸モノマー化合物として、少なくとも１つは本発明ホスホロアミダイト化合物を使用する必要がある。
また、本製法において、工程Ｅの操作を行う前に工程Ｇの操作を行い、その後工程Ｅの操作を行い、次いで工程Ｆ及び工程Ｈの操作を行うことによりオリゴＲＮＡ（Ｂ）を単離精製することもできる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されない。【００４２】
参考例１  メチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル
３２ｇの３−ヒドロキシプロピオニトリル（４５０ｍｍｏｌ）を４５０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、３２４ｍＬの無水酢酸、２３１ｍＬの酢酸を加え室温で２４時間攪拌した。９９０ｇの炭酸水素ナトリウムを４．５Ｌの水に溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下した。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸エチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色油状物の目的化合物を４１ｇ得た（収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．１８（ｓ，３Ｈ）；２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．６９（ｓ，２Ｈ）
参考例２  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン
工程１  ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
アルゴン雰囲気下、１５０ｍｇの３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（０．３ｍｍｏｌ）を７ｍＬのＴＨＦに溶解し、５４ｍｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（０．４ｍｍｏｌ）、１００ｍｇのモレキュラーシーブス４Ａを加え１０分間攪拌した。反応液を０℃に冷却し、１０ｍｇのトリフルオロメタンスルホン酸（０．０６ｍｍｏｌ）を含有する２ｍＬのＴＨＦ溶液を加え攪拌した後、９２ｍｇのＮ−ヨードスクシンイミド（０．４ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、ジクロロメタンにて洗浄した後、有機層を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィーにて精製し、３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（１５０ｍｇ；収率８５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９７−１．１２（ｍ，２８Ｈ）；２．６８−２．７３（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８６（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０５（ｍ，２Ｈ）；４．１２−４．３０（ｍ，４Ｈ）；５．０−５．０４（ｍ，２Ｈ）；５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；５．７５（ｓ，１Ｈ）；７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；９．６２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５７０［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
工程１で得た３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン２００ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）を２ｍＬのメタノールに溶解し、６５ｍｇのアンモニウムフロリド（１．７６ｍｍｏｌ）を加え５０℃にて５時間加熱攪拌した。放冷後、アセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１０８ｍｇ；収率９４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ２．７２−２．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；３．６８−３．９２（ｍ，４Ｈ）；４．００−４．０３（ｍ，１Ｈ）；４．２６−４．３２（ｍ，２Ｈ）；４．８１−４．９５（ｍ，２Ｈ）；５．７１（ｄ，１Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ）；６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋
参考例３  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン
工程１  ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
アルゴン雰囲気下、５０．２ｇの３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（１０３ｍｍｏｌ）を４００ｍＬのＴＨＦに溶解し、２１．０ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１６０ｍｍｏｌ）、４０ｇのモレキュラーシーブス４Ａを加え乾燥した。反応液を−４５℃に冷却し、２４．０ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（１６０ｍｍｏｌ）を加え攪拌した後、３６．１ｇのＮ−ヨードスクシンイミド（１６１ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＴＨＦに溶解して加え１５分間攪拌した。冷却下、トリエチルアミンを加えて中和し、室温にて反応液をろ過し、ジクロロメタンにて希釈し、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、溶媒留去した。得られた反応混合物を酢酸エチルに溶解し、水とチオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和食塩水にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を留去し、３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（６４．２ｇ；収率  定量的）
工程２  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
工程２で得た３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン６４．２ｇ（１０３ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのメタノールに溶解し、１５．３ｇのアンモニウムフロリド（４１３ｍｍｏｌ）を加え５０℃にて５時間加熱攪拌した。放冷後、溶媒を留去した。残渣にアセトニトリルを加え攪拌した後ろ過した。ろ液をヘキサンにて洗浄した後、濃縮し、目的化合物を得た（４０．５ｇ；収率  定量的）。
参考例４  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン
工程１  Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
１．００ｇのＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）シチジン（１．８９ｍｍｏｌ）と５００ｍｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（３．７９ｍｍｏｌ）を混合し、１０ｍＬのトルエンと１０ｍＬのＴＨＦの混合溶媒に溶解した。次いで、９７５ｍｇのトリフルオロメタンスルホン酸銀（３．７９ｍｍｏｌ）を加え、モレキュラーシーブス４Ａを加え、乾燥した。氷冷下、３７０ｍｇのＮ−ブロモスクシンイミド（２．０８ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を遮光し、１０分間撹拌した。さらに７０ｍｇのＮ−ブロモスクシンイミド（０．３９ｍｍｏｌ）を追加し、２５分間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンを得た（９３６ｍｇ；収率８１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９０−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２８（ｓ，３Ｈ）；２．６２−２．７９（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８９（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０４（ｍ，２Ｈ）；４．１９−４．２３（ｍ，３Ｈ）；４．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．７７（ｓ，１Ｈ）；７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；１０．１３（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６１１［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
工程１で得たＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン５００ｍｇ（０．８１９ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＴＨＦとメタノール２．５ｍＬの混合溶媒に溶解し、１５０ｍｇのアンモニウムフロリド（４．１０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で４時間反応させた。反応終了後、アセトニトリルにて希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２１０ｍｇ；収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  ２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．６６−２．７１（ｍ，２Ｈ）；３．７２−３．７８（ｍ，３Ｈ）；３．９０（ｄｄ，１Ｈ，１３．０，２．６Ｈｚ）；４．０６−４．１１（ｍ，１Ｈ）；４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，５．２Ｈｚ）；４．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，２．９Ｈｚ）；４．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ）；７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）；８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３９１［Ｍ＋Ｎａ］＋
参考例５  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン
アルゴン雰囲気下、５０ｇのＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）シチジン（９５ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのＴＨＦに溶解し、１８．６４ｇのメチルチオメチル２−シアノエチルエーテル（１４２ｍｍｏｌ）、４０ｇのモレキュラーシーブス４Ａを加え、−４５℃で３０分間攪拌した。２１．４１ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（１４２ｍｍｏｌ）を滴下した後、３１．９７ｇのＮ−ヨードスクシンイミド（１４２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。反応液にトリエチルアミン８０ｍＬを加え、ろ過後酢酸エチルにて抽出、有機層を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去した。
得られた残渣を３００ｍＬのＴＨＦに溶解し、１８．３ｇのトリエチルアミントリスヒドロフロリド（１１０ｍｍｏｌ）を加え４５℃で２時間攪拌した。生じた沈殿をろ過し、冷却したＴＨＦで洗浄、乾燥し目的化合物を得た。（２７ｇ；収率７８％）。
参考例６  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
工程１  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
２４５ｍｇのＮ−ヨードスクシンイミド（１．０９ｍｍｏｌ）と２８０ｍｇのトリフルオロメタンスルホン酸銀（１．０９ｍｍｏｌ）を８ｍＬのジクロロメタンに懸濁させ、モレキュラーシーブス４Ａを加え乾燥した。ここに、４００ｍｇのＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（０．７３ｍｍｏｌ）と１４５ｍｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１．１１ｍｍｏｌ）を４ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下で加えた。そのまま３時間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンを加えて希釈し、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た（２０１ｍｇ；収率４５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９８−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．６２（ｓ，３Ｈ）；２．６９（ｔｄ，２Ｈ，６．５，Ｊ＝１．５Ｈｚ）；３．８１−３．８９（ｍ，１Ｈ）；４．０２−４．０９（ｍ，２Ｈ）；４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）；４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，４．５Ｈｚ）；５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；６．１０（ｓ，１Ｈ）；８．３４（ｓ，１Ｈ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３６［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程１で得たＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン３００ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）を、０．１ｍＬの酢酸と２ｍＬの０．５ＭテトラブチルアンモニウムフロリドのＴＨＦ溶液に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１６０ｍｇ；収率８６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２．２５（ｓ，３Ｈ）；２．５３−２．６８（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．４６（ｍ，１Ｈ）；３．５６−３．６４（ｍ，２Ｈ）；３．６９−３．７３（ｍ，１Ｈ）；４．００−４．０１（ｍ，１Ｈ）；４．３６−４．３７（ｍ，１Ｈ）；４．７２−４．７８（ｍ，３Ｈ）；５．２０（ｂｔ，２Ｈ）；５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；６．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．７２（ｓ，１Ｈ）；１０．７２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：４１５［Ｍ＋Ｎａ］＋
参考例７  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン 
工程１  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンの製造
１５ｇのＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（２７．４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジメチルスルホキシド、８０ｍＬの無水酢酸、８０ｍＬの酢酸の混合溶液に溶解し、室温で終夜撹拌した。１５０ｇの炭酸水素ナトリウムを１Ｌの水に懸濁したものを調製し、ここに反応混合物を注いだ後、酢酸エチルにて抽出を行い、溶媒留去した。残渣を再度酢酸エチルに溶解し、水にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、濃縮した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンを得た。（７．２ｇ；収率５２％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９６−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２０（ｓ，３Ｈ）；２．６１（ｓ，３Ｈ）；４．０３（ｄｄ，１Ｈ，１３．４，２．４Ｈｚ）；４．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）；４．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．６３−４．７１（ｍ，２Ｈ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；６．０９（ｓ，１Ｈ）；８．３１（ｓ，１Ｈ）；８．６５（ｓ，１Ｈ）；８．６９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３４［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
４９．０ｇの工程１で得たＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン（８０．１ｍｍｏｌ）と１４２ｇの３−ヒドロキシプロピオニトリル（２．００ｍｏｌ）とを混合し、５００ｍＬのＴＨＦに溶解した。モレキュラーシーブス４Ａを加えて乾燥し、−４５℃に冷却した。２１．６ｇのＮ−ヨードスクシンイミド（９６．１ｍｍｏｌ）を加え、次いで２４．２ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（１６１ｍｍｏｌ）を加えた後、−４５℃で２０分間撹拌した。反応終了後、冷却したままトリエチルアミンを加えて中和し、ジクロロメタンにて希釈、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、溶媒留去した。得られた反応混合物を酢酸エチルに溶解し、水と飽和食塩水にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、ヘキサンと酢酸エチルを用いた再結晶、及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た。（４５．６ｇ；収率９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９８−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．６２（ｓ，３Ｈ）；２．６９（ｔｄ，２Ｈ，６．５，１．５Ｈｚ）；３．８１−３．８９（ｍ，１Ｈ）；４．０２−４．０９（ｍ，２Ｈ）；４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）；４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，４．５Ｈｚ）；５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；６．１０（ｓ，１Ｈ）；８．３４（ｓ，１Ｈ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３５．５［Ｍ＋Ｈ］＋
工程３  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
４４ｇの工程２で得たＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン（６９ｍｍｏｌ）を、１５０ｍＬのＴＨＦに溶解し、１３．４ｇのトリエチルアミントリスヒドロフロリド（８３ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＴＨＦに溶解したものを調製し、これを加え、４５℃で１時間撹拌した。反応終了後、５０ｍＬのヘキサンを加えて氷冷下で撹拌し、析出した物を吸引ろ過し、目的化合物を得た。（２９ｇ；収率  定量的）。
参考例８  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン
工程１  Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
アルゴン雰囲気下、２．０ｇのＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）グアノシン（３．０ｍｍｏｌ）を１６ｍＬのＴＨＦに溶解し、０．９９ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（７．６ｍｍｏｌ）、１．０ｇのモレキュラーシーブス４Ａを加え、−４５℃で１０分間攪拌した。０．６８ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（４．５ｍｍｏｌ）の５ｍＬのＴＨＦ溶液を加え攪拌した後、１．０２ｇのＮ−ヨードスクシンイミド（４．５ｍｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ろ過後酢酸エチルにて抽出、有機層を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（２．０ｇ；収率８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９９−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．５９−２．７７（ｍ，２Ｈ）；３．８２−４．０５（ｍ，３Ｈ）；４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；４．２５−４．３５（ｍ，２Ｈ）；４．５２−４．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，４．３Ｈｚ）；５．００，５．０７（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｓ，１Ｈ）６．９９−７．１２（ｍ，３Ｈ）；７．３５−７．４０（ｍ，２Ｈ）；８．０９（ｓ，１Ｈ）；９．３８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１１．８５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：７６６［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
２．８３ｍＬの１ＭテトラブチルアンモニウムフロリドのＴＨＦ溶液（２．８３ｍｍｏｌ）に０．１４ｍＬの酢酸（０．１４ｍｍｏｌ）を加え、ケイ素置換基を脱離するための試薬を調整した。工程１で得たＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン１．０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）を２．８３ｍＬのＴＨＦに溶解し、調整したケイ素置換基を脱離するための試薬を加え、アルゴン雰囲気下室温で１時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、ジクロロメタンに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、目的化合物を得た（０．６７ｇ；収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２．５９−２．６６（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．６３（ｍ，４Ｈ）；３．９８（ｍ，１Ｈ）；４．３２（ｍ，１Ｈ）；４．５８−４．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；４．７１−４．７８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．１，６．８Ｈｚ）；４．８７（ｓ，２Ｈ）；５．１２（ｓ，１Ｈ）５．３７（ｓ，１Ｈ）；５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）６．９６−６．９９（ｍ，３Ｈ）；７．２８−７．３４（ｍ，２Ｈ）；８．３０（ｓ，１Ｈ）；１１．７８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５００［Ｍ−Ｈ］−
参考例９  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン
工程１  Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
アルゴン雰囲気下、３６ｇのＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）グアノシン（５５ｍｍｏｌ）を３８０ｍＬのＴＨＦに溶解し、１７．２ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１３１ｍｍｏｌ）、３６ｇのモレキュラーシーブス４Ａを加え、−４５℃で１０分間攪拌した。１２．３ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（８２ｍｍｏｌ）を滴下した後、１８．４ｇのＮ−ヨードスクシンイミド（８２ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ろ過後酢酸エチルにて抽出、有機層を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（３２ｇ；収率７９％）。
工程２  Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
４７ｇの工程１で得たＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン（６３ｍ０．５６３ｍｏｌ）を２８０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１５．３ｇのトリエチルアミントリスヒドロフロリド（９５ｍ０．５６３ｍｏｌ）を加え、３５℃で２時間攪拌した。反応液を１００ｍＬのヘキサンにて抽出し、残ったアセトニトリル層に３０ｍＬの水を加え、室温で５分間攪拌した。生じた沈殿をろ過し、冷却した水とアセトニトリルとの混合溶媒（１：１）で洗浄、乾燥し目的化合物を得た（２２ｇ；収率６９％）。
【００４３】
実施例１  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン
５０．６ｇの３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（１０４ｍｍｏｌ）を１０４ｍＬのＴＨＦに溶解し、アルゴン雰囲気下０℃で、０．７６ｍＬのメタンスルホン酸（１０．４ｍｍｏｌ）、１５８ｇのヨウ素（６２４ｍｍｏｌ）、１６．４ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１２５ｍｍｏｌ）を加えた。４５分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶媒に反応溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を得た。
得られた粗生成物に３００ｍＬのメタノールを加え、アルゴンガス雰囲気下、室温で撹拌しながら、１１．６ｇのアンモニウムフロリドを加えた。５０℃に昇温し、７．５時間撹拌した。反応終了後、アセトニトリルを加えて不溶物をろ去した。ろ液をヘキサンで洗浄した後、減圧濃縮し、目的化合物を得た（２１．５ｇ；収率６３％）。
実施例２  Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン
７０ｇのＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）シチジン（１３３ｍｍｏｌ）を１３３ｍＬのＴＨＦに溶解し、アルゴン雰囲気下０℃で、１０．３ｍＬのメタンスルホン酸（１６０ｍｍｏｌ）、２０１ｇのヨウ素（７９８ｍｍｏｌ）、１９．９ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（２００ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶媒に反応溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を得た。
得られた粗生成物に２６６ｍＬのＴＨＦを加え、アルゴンガス雰囲気下、室温で撹拌しながら、２５．９ｍＬのトリエチルアミントリスヒドロフロリドを加えた。４５℃に昇温し、１時間撹拌した。反応終了後、室温まで放冷して析出した沈殿物をＴＨＦで洗浄し、目的化合物を得た（４２．０ｇ；収率８６％）。
実施例３  Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
６０ｇのＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（１０９ｍｍｏｌ）を１０９ｍＬのＴＨＦに溶解し、アルゴン雰囲気下０℃で、撹拌しながら１．０４ｇのメタンスルホン酸（１０．９ｍｍｏｌ）、１６５．６ｇのヨウ素（６５４ｍｍｏｌ）、２１．３ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１６４ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶媒に反応溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。集めた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を得た。
得られた粗生成物に２１８ｍＬのＴＨＦを加え、アルゴンガス雰囲気下室温で撹拌しながら、２１．３ｍＬのトリエチルアミントリスヒドロフロリドを加えた。４５℃に昇温し、３時間撹拌した。反応終了後、室温まで放冷して析出した沈殿物をろ取し、ＴＨＦおよびメタノールと酢酸エチルとの混合溶媒（１：９）で洗浄し、目的化合物を得た（２８．４ｇ；収率６７％）。
実施例４  Ｎ2−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン
５２．８ｇのＮ2−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）グアノシン（８０ｍｍｏｌ）を１８０ｍＬのＴＨＦに溶解し、アルゴン雰囲気下０℃で、撹拌しながら７．６９ｇのメタンスルホン酸（８０ｍｍｏｌ）、１．２０ｇのトリフルオロメタンスルホン酸（８ｍｍｏｌ）、２０３．０ｇのヨウ素（８００ｍｍｏｌ）、３１．５ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（２４０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶媒に反応溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。集めた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を得た。
得られた粗生成物に１７０ｍＬのＴＨＦを加え、アルゴンガス雰囲気下室温で撹拌しながら、１５．６ｍＬのトリエチルアミントリスヒドロフロリドを加えた。３５℃に昇温し、２時間撹拌した。反応終了後、室温まで放冷して水１７ｍＬを加え、析出した沈殿物をろ取し、目的化合物を得た（１６．７ｇ；収率４２％）。
実施例５  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１  ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−５−メチルウリジンの製造
２７ｇの５−メチルウリジン（１０５ｍｍｏｌ）に３００ｍｌのピリジンを加え、氷冷下３５ｇの１，３−ジクロロテトライソプロピルジシロキサン（１１０ｍｍｏｌ）を滴下し室温で４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチルで抽出し飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物の３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−５−メチルウリジンを５４．６ｇ得た。
工程２  ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジンの製造
アルゴン雰囲気下、４５ｇの工程１で得た粗生成物（８９．９ｍｍｏｌ）を９０ｍＬのＴＨＦに溶解し、０℃で０．５８ｍＬのメタンスルホン酸（８．９９ｍｍｏｌ）、１３７ｇのヨウ素（５３９ｍｍｏｌ）、１４．１ｇのメチルチオメチル  ２−シアノエチルエーテル（１０７．８ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶媒に反応溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗生成物を得た。
得られた粗生成物に２５０ｍＬのメタノールを加え、アルゴンガス雰囲気下、室温で撹拌しながら、１０．０ｇのアンモニウムフロリドを加えた。５０℃に昇温し、１１時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣にアセトニトリル（３００ｍｌ）とメタノール（９０ｍｌ）を加えて不溶物をろ去した。ろ液をヘキサンで洗浄した後、減圧濃縮しエタノール（１５０ｍｌ）を用いて、２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジンを析出した（２３．３ｇ；収率７６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  １．７９（ｓ，３Ｈ）；２．５８−２．７４（ｍ，２Ｈ）；３．６８−３．８４（ｍ，４Ｈ）；３．９９−４．０３（ｍ，１Ｈ）；４．２３−４．３２（ｍ，２Ｈ）；４．７４−４．８３（ｍ，２Ｈ）；５．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ）；７．６２（ｓ，１Ｈ）
工程３  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジンの製造
工程２で得た２０．７ｇの２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジン（６０．６ｍｍｏｌ）に脱水テトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）、脱水ピリジン（１５０ｍｌ）を加えた後、活性化したモレキュラーシーブス４Ａ（５０ｇ）、４、４’−ジメトキシトリチルクロリド（２２．６ｇ、６６．７ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール（５ｍｌ）を加え、１５分間攪拌した後、反応液を吸引ろ過し、酢酸エチルで洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジンを得た（３５．６ｇ；収率９１．２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．０５（ｓ，１Ｈ）；２．６２−２．６８（ｍ，３Ｈ）；３．４１−３．５８（ｍ，２Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；３．８４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）；４．０３−４．１３（ｍ，２Ｈ）；４．３８−４．４１（ｍ，１Ｈ）；４．４８−４．５４（ｍ，１Ｈ）；４．９１，５．０５（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ）；６．８３−６．８６（ｍ，４Ｈ）；７．２２−７．４２（ｍ，１０Ｈ）；７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）；８．９６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
工程４    ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジン  ３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程３で得た３８ｇの５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−５−メチルウリジン（５９ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（３５０ｍｌ）に溶解し、活性化したモレキュラーシーブス４Ａ（１５ｇ）、ジイソプロピルアミノテトラゾリド（１１．１ｇ、６４．９ｍｍｏｌ）、ビス（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイト（１９．６ｇ、６４．９ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で３時間攪拌した。反応液をろ過し、ろ液を濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（４４ｇ；収率８８％）。
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １５２．０７２；１５３．１０８  
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、安価に簡便に大量に種々リボ核酸誘導体を製造するための中間体として有用なリボ核酸誘導体（３）を製造することができる。また、従来法よりも高濃度において反応を実施することが可能であるので、反応溶媒の使用量を減らすことができる。
したがって、本発明によれば、遺伝子解析のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、アプタマーとして有用なオリゴＲＮＡ（Ｂ）の製造に使用することができるホスホロアミダイト化合物（Ａ）を安価に製造することができる。