(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用であって、該ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテイン、ＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰから選択され、かつ該ムテイン、融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰが少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する使用。
【請求項２】
前記医薬がアテローム性プラークの血栓の治療および／または予防用である請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記医薬がアテローム性プラークの潰瘍の治療および／または予防用である請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記医薬がアテローム性プラークの不安定化の治療および／または予防用である請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記医薬がプラークの不安定化による虚血症候群の予防および／または治療用である請求項１記載の使用。
【請求項６】
前記医薬がアテローム性プラーク破裂の治療および／または予防用である請求項１記載の使用。
【請求項７】
前記ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体がヒト化抗体である請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記抗体がヒト抗体である請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８ＢＰ、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテイン、ＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰであり、かつ該ムテイン、融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰが少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記融合タンパク質における免疫グロブリンがＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬がさらに併用、連続使用、または独立使用を目的としてインターフェロンを含有する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記インターフェロンがインターフェロン−βである請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬がさらに併用、連続使用、または独立使用を目的として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストを含有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＴＮＦアンタゴニストがＴＢＰＩおよび／またはＴＢＰＩＩである請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬がさらに併用、連続使用、または独立使用を目的としてＣＯＸ阻害剤を含有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＣＯＸ阻害剤がＣＯＸ−２阻害剤である請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬がさらに併用、連続使用、または独立使用を目的としてトロンボキサン阻害剤を含有する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記トロンボキサン阻害剤がアスピリンである請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記医薬がさらに併用、連続使用、または独立使用を目的として脂質低下剤を含有する請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記脂質低下剤がＨＭＧ  ＣｏＡ阻害剤である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記ＨＭＧ  ＣｏＡ阻害剤がスタチンである請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬が低脂肪食および／または低コレステロール食および／または減塩食との組み合わせにおいて用いられる請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１８阻害剤が、約０．０００１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１から３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１から２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記ＩＬ−１８阻害剤が、約０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１から１００μｇ／ｋｇ体重、または約１０から５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＩＬ−１８阻害剤が皮下に投与される請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１８阻害剤が筋肉内に投与される請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１８阻害剤が毎日投与される請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＩＬ−１８阻害剤が１日おきに投与される請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬の製造のための、ＩＬ−１８阻害剤のコーディング配列からなる発現ベクターの使用であって、該ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、およびＩＬ−１８ＢＰ、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテインまたはＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質から選択され、かつ該ムテインまたは融合タンパク質が少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する使用。
【請求項３１】
前記発現ベクターがエレクトロトランスファーによって投与される請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記発現ベクターが全身に投与される請求項３０または３１記載の使用。
【請求項３３】
前記発現ベクターが筋肉内に投与される請求項３０または３１記載の使用。
【請求項３４】
アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬の製造において、ＩＬ−１８阻害剤を産生するように遺伝的に改変された細胞の使用であって、該ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、およびＩＬ−１８ＢＰ、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテインまたはＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質から選択され、かつ該ムテインまたは融合タンパク質が少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する使用。
【請求項３５】
ＩＬ−１８阻害剤を含むアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬組成物であって、該ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、およびＩＬ−１８ＢＰ、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテイン、ＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰから選択され、かつ該ムテイン、融合タンパク質またはポリエチレングリコール化ＩＬ−１８ＢＰが少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する医薬組成物。
【請求項３６】
ＩＬ−１８阻害剤のコーディング配列からなる発現ベクターを含むアテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用医薬組成物であって、該ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、およびＩＬ−１８ＢＰ、１０以下の保存的アミノ酸置換を含むＩＬ−１８ＢＰのムテインまたはＩＬ−１８ＢＰと免疫グロブリンの重鎖領域との融合タンパク質から選択され、かつ該ムテインまたは融合タンパク質が少なくともＩＬ−１８ＢＰと同じ活性でＩＬ−１８に結合する生物学的活性を保持する医薬組成物。
【請求項３７】
前記発現ベクターが全身に投与される請求項３６記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記発現ベクターが筋肉内注射によって投与される請求項３６記載の医薬組成物。
【請求項３９】
アテローム性動脈硬化症の進行の診断マーカーとしてのＩＬ−１８の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、血管病の分野にある。より詳しくは、本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【０００２】
［本発明の背景］
アテローム性動脈硬化症は、最も一般的かつ最も重要な血管病であるが、ほかにも多くの血管病が認識されている。アテローム性動脈硬化症は主に、サイズの大きなおよび中程度の動脈を冒し、そしてその病巣は、脂肪線条、繊維性プラーク（fobrolytic plaquest）および合併病巣（complicated lesions）からなる。アテローム性動脈硬化症は、コレステロールなどの脂肪、マクロファージ、Ｔリンパ球または平滑筋細胞などの細胞ならびに細胞外マトリックスの累積的な蓄積によって特徴づけられる、動脈壁の慢性的炎症疾患である（１）。より多量の蓄積は、アテロームまたはプラークと呼ばれ、しばしばカルシウムを含有する。脂肪組織は、動脈壁を破壊し、動脈の弾力性を減少させ、そして血流を妨げ得る。結局、プラーク沈積物周辺にクロットが形成してさらに血流を妨げ、血管の全閉塞を誘導し得る。通常、アテローム性動脈硬化症は、ＬＤＬ−コレステロール、Ｌｐ（ａ）フィブリノーゲンおよび第ＶＩＩ因子のレベル増加ならびにＨＤＬ−コレステロールのレベル減少に関連する。危険因子には、加齢、男性、喫煙、糖尿病、肥満、高血中コレステロール、高脂肪の食事および個人または家族の心臓病の病歴があげられる。それは、たとえば、心筋梗塞のような器官虚血の主な原因である。
【０００３】
アテロームは、動脈における最も一般的な病巣であり、血栓閉塞によってさらに悪化され得る。アテローム性プラークは、しばしば動脈の管腔を狭くし、そしてそれは低灌流領域（hypoperfused territory）において虚血や時には組織の退化を引き起こす。深刻な事態としては、心筋虚血によるアンギナの症状、虚血または非虚血事象による心不全、ならびに腎動脈の狭小（renal artery narrowing）およびレニン分泌の増加により生理的に応答する腎臓の低灌流による高血圧があげられる。
【０００４】
時にはアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症は、別の病的症状であると言われており、その場合、アテローム性動脈硬化症はとくにアテロームによる動脈の硬化（硬化症）または弾力性の衰えを意味するように定義されている一方、動脈硬化症はあらゆる原因による動脈の硬化または弾力性の衰えである。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症の合併症または終結として、冠状動脈疾患（冠状動脈の動脈硬化症）、閉塞症による血液供給の欠損症（虚血／アンギナ）、急性ＭＩ（心筋梗塞、心臓発作）一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または脳卒中、および血管、筋肉ならびに身体の器官への損傷が挙げられる。
【０００６】
永久的な血管の異常な膨張である動脈瘤もまた、アテローム性動脈硬化症の主な結果である。初老の患者においては、アテローム硬化性腹大動脈瘤に進行することが一般的である。それらは腹膜後の空間に向かって破裂し得る。アテローム硬化性動脈瘤には、たいてい弾性組織の著しい衰えおよび中膜の線維症が見られる。それらは主に大動脈中膜の筋肉の虚血と、それに続く弾性線維の切断を引き起こすマクロファージ酵素の放出によるものである。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の治療または予防のために勧められる薬剤には、血中脂質／コレステロールの減少が含まれる。とくに、ＬＤＬ−コレステロールを低下させる治療が広く行なわれている。現在のスタチンは、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素の特異的な阻害剤であり、もっとも広く用いられている。さらに脂質低下剤はコレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、プロブコール、ロバスタチンなどを含む。
【０００８】
ほかのアプローチは、確立されたアテロームの病巣上に血栓が形成するリスクを最小限にすることである。アスピリンは、血小板凝集を仲介するトロンボキサンＡ２の特異的な阻害剤または抗凝固薬であると示唆されており、クロット形成のリスクを減じさせるために用いられ得る。
【０００９】
経皮的な「バルーン血管形成術」は、プラークを平らにし、閉塞を越えて血流を増加させるために先端にバルーンがあるカテーテルを用いる。この技術は心臓の動脈を開くために用いられる場合と同様であるが、体中のほかの多くの動脈にも適用され得る。冠状動脈狭窄症は、近位の動脈に縫合された伏在静脈の分節（segment）によってバイパス形成されるか、または胸壁から内胸動脈を切断しその末端を心臓の前方表面へ吻合することによってバイパス形成される。
【００１０】
沈着物の外科的除去（動脈内膜切除）はさまざまな場合（例：頚動脈内膜除去）において奨励され得る。
【００１１】
しかしながら、依然として、低脂質、低コレステロールおよび減塩食事を維持するなどの、危険因子を治療または制御することが主に奨励されており、ついで健康維持の王道として高血圧、糖尿病およびほかの疾患の治療ならびに制御、体重の減量ならびに禁煙だけでなく心臓および血行の健康状態を改善するために規則的な運動が奨励されている。
【００１２】
炎症性の過程はアテローム性動脈硬化症のさまざまな段階をとおして伴なわれる（１）。低い剪断ストレス、改変リポタンパク質および前炎症性サイトカインを含むさまざまな因子による内皮の活性化は、アテローム性動脈硬化症の第１段階になると思われ、そして内皮活性化は炎症制御にある（１）。多くの最近の研究によって、血管細胞と炎症細胞間の相互作用がアテローム発生にきわめて重要であることが示されている。とくに、明らかにされた前炎症経路の阻害は、アテローム性動脈硬化症の進行を減じさせる（１）。
【００１３】
また、炎症はアテローム性プラークの破壊および血栓症において主な役割を担っているため（２〜５）、急性虚血性症候群の発生およびそれらの関連する死亡数に影響する（６）。実際、アテローム性動脈硬化症に冒された心臓、脳およびほかの器官の梗塞を含むアテローム性動脈硬化症の深刻な臨床的徴候は、主に破裂したアテローム性プラークの接触面上に形成された血栓による血管の内腔の閉塞によるものである（３、４）。病理学的な研究により傷つきやすいまたは不安定なプラーク、すなわち破裂しやすいまたは破裂しているプラークは、破裂しにくい安定なプラークに比べて細胞およびマトリックス組成において著しく異なる（７）。破裂しやすいプラークには炎症細胞（マクロファージおよびＴリンパ細胞）が豊富に存在し、トロンボゲン形成の脂質コアを含み、細胞外マトリックスの実質的損失を伴う薄い繊維状のキャップによって特徴付けられる（７）。
【００１４】
前炎症性サイトカインＩＦＮγに媒介されたコラーゲン合成の減少、およびマクロファージ由来のマトリックス分解メタロプロテイナーゼ（matrix degrading metalloproteinase）の活性の増加が、繊維状キャップの薄さおよび脆さの原因である（７）。脆い繊維状のキャップの破裂は、トロンボゲン形成の脂質コアを循環血液にさらし、閉塞をもたらす血栓形成を導く（１、７）。したがって、所定のアテローム性動脈硬化症の病巣における炎症細胞の密度は、その不安定性についての良い標識であるとみなしている。
【００１５】
アテローム性動脈硬化症の患者の臨床予後は、ある程度は病巣の大きさに依存している（１９；２０）。現在では病巣の大きさというよりむしろ病巣の質（プラークの性質）が、虚血の発生に関するさらによい予報物質となり得るということが広く認識されている。実際、アテローム性動脈硬化症の深刻な臨床の徴候（心臓および脳の梗塞）は、主に破裂したアテローム性プラークの接触面に形成される血栓による血管の内腔の閉塞によるものである（１９）。病理学的な研究により、破裂しやすいまたは破裂した、傷つきやすいまたは不安定なプラークは炎症細胞に富んでおり、平滑筋細胞およびコラーゲン成分の実質的な損失を示していることが見出された（２０、２１）。さらに、そのようなプラークは、高度なトロンボゲン形成脂質コアの形成を誘導するアポトーシス細胞死の顕著な増加を示す。（１３、２２）。
【００１６】
前炎症性サイトカインは炎症に関係している。サイトカインであるインターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、当初インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子であると評されていた（８）。それはＴリンパ球ヘルパー細胞１型（Ｔｈ１）の応答の発展における初期のシグナルである。ＩＬ−１８はＩＬ−１２、ＩＬ−２、抗原、マイトジェンおよびほかに可能性のある因子とともに作用し、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。ＩＬ−１８もまた、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２の産生を増強し、抗ＣＤ３が誘導するＴ細胞の増殖を強力にし、およびＦａｓが仲介するナチュラルキラー細胞の殺傷能力を高める。成熟ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ、カスパーゼ−１）によってその前駆体から産生される。ＩＬ−１８受容体はリガンドとの結合に協同して作動する、少なくとも２つの成分からなる。ＩＬ−１８に対する高親和性結合部位および低親和性結合部位は、マウスのＩＬ−１２によって刺激されたＴ細胞において見出され（９）、多重鎖受容体複合体（multiple chain receptor complex）であることが示唆される。さらに、２つの受容体サブユニットは、どちらもＩＬ−１受容体ファミリーに属することが同定された（１０）。ＩＬ−１８のシグナル伝達はＮＦ−κＢの活性化に影響する（１１）。
【００１７】
近年、ＩＬ−１８に対し高親和性を有する可溶性タンパク質がヒトの尿から単離され、ヒトおよびマウスのｃＤＮＡだけでなくヒトの遺伝子がクローニングされた（１２；国際公開第９９／０９０６３号パンフレット）。そのタンパク質はＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と称されている。
【００１８】
ＩＬ−１８ＢＰは既知のＩＬ１８受容体の１つの細胞外ドメインではなく、分泌され、通常循環しているタンパク質である。それは分泌タンパク質の新しいファミリーに属し、そのファミリーはさらにいくつかのポックスウイルスをコードするタンパク質を含んでいる（１２）。ＩＬ１８ＢＰは本質的に脾臓において発現される（１２）。尿のＩＬ１８ＢＰだけでなく組換えＩＬ１８ＢＰは、とくに高親和性でＩＬ−１８と結合し、ＩＬ−１８の生物学的な親和性を調節する。
【００１９】
ＩＬ１８ＢＰ遺伝子はヒトの染色体１１ｑ１３に位置しており、膜貫通ドメインをコードするエクソンは８．３ｋｂゲノム配列において見出されなかった。ＩＬ１８ＢＰの４つのスプライス変異体またはアイソフォームがヒトにおいて見出され、ＩＬ１８ＢＰａ、ｂ、ｃおよびｄと称され、それらはすべて同一のＮ末端と異なるＣ末端を有する（１２）。
【００２０】
ｍＲＮＡのスプライシングの結果生じ、さまざまなｃＤＮＡライブラリーにおいて見出され、そして発現された、４つのヒトＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームおよび２つのマウスＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームは、精製され、ついでＩＬ−１８の生物学的活性の結合および中和に関して評価された（２３）。ヒトＩＬ−１８ＢＰアイソフォームａ（ＩＬ−１８ＢＰａ）は、急速な吸着速度、遅い離脱速度および３９９ｐＭの解離定数（Ｋ（ｄ））を有するＩＬ−１８への最も高い親和性を示した。ＩＬ−１８ＢＰｃは、２９のＣ末端アミノ酸を除くＩＬ−１８ＢＰａのＩｇドメインを有し；ＩＬ−１８ＢＰｃのＫ（ｄ）は、１０倍低い（２．９４ｎＭ）。それにもかかわらず、ＩＬ−１８ＢＰａおよびＩＬ−１８ＢＰｃは、２モル過剰で、９５％を超えるＩＬ−１８を中和する。ＩＬ−１８ＢＰｂアイソフォームおよびＩＬ−１８ＢＰｄアイソフォームは、完全Ｉｇドメインを欠き、ＩＬ−１８に対する結合能力または中和能力を欠く。マウスのＩＬ−１８ＢＰｃアイソフォームおよびＩＬ−１８ＢＰｄアイソフォームは同一のＩｇドメインを有し、また、２モル過剰で、９５％を超えるマウスＩＬ−１８を中和する。しかしながら、ヒトＩＬ−１８ＢＰａと共通したＣ末端モチーフを有するマウスＩＬ−１８ＢＰｄは、ヒトＩＬ−１８をも中和する。分子モデルは、ＩＬ−１８ＢＰのＩｇドメインにおいて、多数の混合された静電気性および疎水性の結合部位を同定し、それによりそのリガンドとの結合に対する高い親和性を説明した（２３）。
【００２１】
［本発明の要旨］
本発明は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおいて、ＩＬ−１８阻害剤がプラークの発達、プラークの進行およびプラークの安定性について顕著に有用な効果を有するという発見に基づく。ＩＬ−１８阻害剤は胸大動脈における病巣形成を予防しただけでなく、すでに確立されたアテローム性プラークにおいて安定なプラークの形質への転換を誘導した。
【００２２】
したがって、本発明は、アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療の用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。さらに、本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防の遺伝子治療的アプローチに関する治療方法に関する。
【００２３】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、急性冠状症候群（acute coronary syndromes）の患者における循環ＩＬ−１８レベルの上昇、および脳卒中の原因である不安定な頚動脈のアテローム性プラークにおけるＩＬ−１８産生の上昇を見出したことに基づいている。それらに加えて、インビボにおけるＩＬ−１８ＢＰをコードする発現プラスミドＤＮＡのエレクトロトランスファー（electrotransfer）が、胸大動脈における脂肪線条の発達を予防し、および充分確立されたアテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける大動脈洞の進んだアテローム性プラークの進行を遅くすることが示された。さらに重要なことに、ＩＬ−１８ＢＰプラスミドによるトランスフェクションによって、安定なプラークの形質を導くプラーク組成の充分な変化（マクロファージ、Ｔ細胞、細胞死および脂質成分の減少ならびに平滑筋細胞およびコラーゲン成分の増加）が誘導される。これらの結果は、プラークの発達／進行の減退およびプラークの安定性の促進において、ＩＬ−１８阻害剤が重要な役割を担うことを初めて証明する。
【００２４】
したがって、本発明はアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００２５】
本発明の文脈における用語「予防」は、ある種の作用の完全な予防のみならず、部分的または実質的な予防、疾患の発症前または初期の作用を希釈（attenuation）、減少（reduction）、減退（decrease）または縮小（diminishing）することを言う。
【００２６】
本発明の文脈における用語「治療」は、疾患発症後の病理学的発達の希釈、減少、減退または縮小に対するあらゆる有効な作用を言う。
【００２７】
本発明の文脈における用語「ＩＬ−１８阻害剤」は、ＩＬ−１８の産生および／または作用を希釈、減少、または部分的に、実質的にもしくは完全に予防または妨害するというようにＩＬ−１８の産生および／または作用を調節するあらゆる分子を言う。
【００２８】
産生阻害剤はＩＬ−１８の合成、プロセシングまたは成熟化に否定的に作用するあらゆる分子であり得る。本発明によって考えられる阻害剤は、たとえばインターロイキンＩＬ−１８の遺伝子発現のサプレッサー、ＩＬ−１８ｍＲＮＡの転写を減じさせるまたは阻害する、もしくはｍＲＮＡを分解させるアンチセンスｍＲＮＡｓ、正しい折りたたみを損傷させる、またはＩＬ−１８の成熟化または分泌を部分的にまたは実質的に阻害するタンパク質、いったん合成されたＩＬ−１８を分解するプロテアーゼなどであり得る。産生阻害剤は、たとえばＩＬ−１８の成熟を阻害するカスパーゼ−１阻害剤またはＩＣＥ阻害剤であり得る。
【００２９】
ＩＬ−１８作用の阻害剤は、たとえばＩＬ−１８アンタゴニストであり得る。アンタゴニストは、ＩＬ−１８または、ＩＬ−１８のそのリガンド（たとえばその受容体）への結合を招くＩＬ−１８結合部位を部分的または実質的に中和するために、充分な親和性および特異性でＩＬ−１８分子自身と結合することまたはＩＬ−１８分子自身を隔離することができる。アンタゴニストはまた、ＩＬ−１８／受容体の結合に際して細胞内で活性化するＩＬ−１８シグナル経路をも阻害し得る。
【００３０】
ＩＬ−１８作用の阻害剤はまた、可溶性ＩＬ−１８受容体またはその受容体に似た分子、またはＩＬ−１８受容体を遮断する薬剤、たとえばモノクローナル抗体のようなＩＬ−１８抗体、またはＩＬ−１８とその標的との結合を阻害するその他のあらゆる薬剤または分子であり得、したがって、ＩＬ−１８によって仲介される細胞内または細胞外の反応の誘因を減少または阻害する。
【００３１】
アテローム性動脈硬化症は、動脈硬化症または動脈の硬化とも呼ばれる。本発明の文脈で、用語アテローム性動脈硬化症は、通常アテローム性動脈硬化症と記載されるすべての動脈の疾患または病症を含み、それは脂質物質が血管壁に沈着し、ついには血流が狭くまたは悪くなるだけでなく血栓形成による破裂および／または浸潤を引き起こす。
【００３２】
本発明によると、アテローム性動脈硬化症は、アテローム（アテローム性動脈硬化症）およびそのほかのあらゆる原因（動脈硬化症）による動脈の弾力性の硬化または損失のいずれも含むことを意味する。本明細書で用いられる用語「アテローム性動脈硬化症」に含まれることを意図される、アテローム性動脈硬化症の病症ならびにアテローム性動脈硬化症の合併症または終結は、前記「本発明の背景」において詳細に記載されている。
【００３３】
アテローム性動脈硬化症の進行は、アテローム性プラークの形成およびそのますます不安定な形態への発達を含む。したがって、本発明はまた、アテローム性動脈硬化症の進行の減退または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途にも関する。
【００３４】
アテローム性プラーク上に形成された血栓による血管閉塞は、アテローム性動脈硬化症の最も危険な結果である心臓および脳の梗塞における重篤な現象である。したがって、本発明はまた、アテローム性プラークにおける血栓の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途にも関する。
【００３５】
プラークの安定性は、アテローム性プラークの初期血栓になりやすい有害なまたは壊れやすいプラークへの発展に影響する。したがって、本発明はさらに、アテローム性プラークの安定性に関する予防および／または治療用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００３６】
不安定なプラークは破裂しやすく、プラークの破裂は血栓を誘導し得る。したがって、本発明はさらに、アテローム性プラークの浸潤または破裂を予防するための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００３７】
プラークの不安定性および血栓形成は、たとえば高いプロ凝固剤活性を供し、塞栓のみならず浸潤または破壊したアテローム性プラークの血栓を誘導する重要な現象であり得るアポトーシス細胞死によるものであり得る（１３、１４）。酸化リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）が培養物中でマクロファージおよび内皮細胞のアポトーシスを誘導することが示されている（１５）。以下実施例に示したように、今回、ＩＬ−１８阻害剤がｏｘＬＤＬによって誘導される細胞死を大幅に減少させることができるということが明らかにされた。
【００３８】
本発明によると、驚くべきことに、血中のＩＬ−１８レベルが、再来院しなかった患者に比べて、たとえば死、再虚血、再血管新生（re-vascularisation）、アテローム性動脈硬化症の進行または心不全による再入院などの再発に苦しんでいる心不全患者において顕著に上昇していることが明らかにされた。生き延びた患者に比べ、のちにに亡くなった患者において、とくにこのＩＬ−１８レベルの上昇が見られた。血液循環のＩＬ−１８レベルの上昇は虚血の患者だけでなく非虚血患者の双方で観察された。
【００３９】
したがって、本発明はまた、心不全の再発の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途にも関する。再発現象は、死、再虚血、再血管新生、アテローム性動脈硬化症の進行または心不全による再入院など、心不全ののちのあらゆる事象であり得る。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様において、心不全は虚血性すなわち心筋虚血によるものである。
【００４１】
さらに好ましい実施態様において、心不全は、全身性高血圧、弁心臓疾患（valvular heart disease）、またはのちに右うっ血性心不全を引き起こす肺疾患などの非虚血性である。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＣＥ阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体サブユニットに対するあらゆる抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と拮抗およびＩＬ−１８受容体を妨害するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、同等の活性を有するそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片または循環変更（circularly permutated）誘導体から選択される。
【００４３】
本明細書中で使用されるように、用語「ムテイン」は、天然のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換または欠失され、または、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの天然の配列に１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が付加され、野生型のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰと比較して、得られた産物の活性があまり変化していない、ＩＬ−１８ＢＰのアナログまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのアナログを示す。それらのムテインは、既知の合成および／または位置指定突然変異誘発技術、またはこの場合に適した他の既知の技術によって製造される。
【００４４】
これらのムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同様の活性を有するような、ＩＬ−１８ＢＰの配列に充分似た、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰに充分似たアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。ムテインがＩＬ−１８との実質的な結合能力を有するかぎり、アフィニティークロマトグラフィーの方法などによって、ＩＬ−１８の精製において使用することができ、したがって、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同様の活性を有すると考えることができる。したがって、いずれの特定のムテインがＩＬ−１８ＢＰと同じ活性を実質的に有するかどうかは、たとえば、放射線免疫検定法またはＥＬＩＳＡ法などの、適当に標識されたＩＬ−１８にムテインが結合するかどうかを決定するための単純なサンドイッチ競合アッセイに、そのムテインを供することからなるルーチンの実験方法によって、測定することができる。
【００４５】
本発明において使用され得る、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドのムテインまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのムテイン、もしくはそれをコードする核酸は、本明細書中に示された教示および指導に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によって決まりきった手順で得られる置換ペプチドまたはポリペプチドと実質的に一致する限定された組の配列を含む。
【００４６】
本発明におけるムテインの好ましい変更は、「保存的な」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドまたはタンパク質またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓの保存的なアミノ酸置換は、群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであるという、充分に類似した物理化学的な特性を有する群内の同義アミノ酸を含み得る（１６）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸に関するのみであり、機能的構造に重要なアミノ酸、たとえばシステイン残基などの除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列においてなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
【００４７】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｉに表示されているものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表ＩＩに表示されているものであり；そして最も好ましくは、同義アミノ酸群は表ＩＩＩに表示されているものである。
【００４８】
【表１】
0005122053.tif 000002
【００４９】
【表２】
0005122053.tif 000003
【００５０】
【表３】
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【００５１】
本発明における用途のための、ＩＬ−１８ＢＰのポリペプチドもしくはタンパク質のムテイン、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓのムテインを得るために用いられ得る、タンパク質のアミノ酸置換の産生例は、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などの周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書に示されたリジン置換タンパク質（Shaw et al）を含む。
【００５２】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰもしくはそれらのムテインからなるポリペプチドを意味する。ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰは、このようにたとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００５３】
本明細書中で用いられる「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基もしくはＮ末端またはＣ末端基の側鎖として生じる官能基から調製され得るＩＬ−１８ＢＰｓまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの誘導体、ならびに、そのムテインおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓの活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。それらの誘導体は、たとえば、抗原部位を覆い、体液内でＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの滞在を延ばし得るポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一もしくは第二アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、アシル部分と形成される遊離水酸基（たとえばセリルまたはトレオニル残基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００５４】
ＩＬ−１８ＢＰ、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、ムテインおよび融合タンパク質の「活性断片」としては、本発明では、該断片がＩＬ−１８ＢＰと実質的に同様な活性を有するならば、タンパク質分子単独またはそれに結合する関連分子もしくは残基、たとえば糖またはリン酸残基を伴うタンパク質分子、またはタンパク質分子または糖残基それら自身での凝集体のポリペプチド鎖のあらゆる断片または前駆体を含む。
【００５５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤はＩＬ−１８抗体である。抗ＩＬ−１８抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、キメラ、ヒトに適応させた、または完全にヒトのものであり得る。組換え抗体およびその断片は、インビボにおいてＩＬ−１８と結合する高い親和性および低毒性によって特徴付けられる。本発明において用いられ得る抗体は、病的な症状またはあらゆる症状または病的な症状に関連する症状群を極めて軽減または緩和するために充分な期間、患者を治療することができる能力、および低毒性によって特徴付けられる。
【００５６】
中和抗体は、ＩＬ−１８で免疫されたウサギ、ヤギまたはマウスなどの動物によって容易に作製することができる。免疫されたマウスはとくに、ハイブリドーマの製造のためのＢ細胞の供給源を提供するのに有効であり、その結果、ハイブリドーマは大量の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体を産生するために培養される。
【００５７】
キメラ抗体は、さまざまな動物種由来の２つまたはそれ以上の切片または一部によって特徴づけられる免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体のようなヒトではない哺乳動物の抗体由来であり、免疫グロブリンの定常領域はヒト免疫グロブリン分子由来である。好ましくは、両方の領域およびその組み合わせは、決まりきった手順によって決定されるように低い免疫原性を有する（２４）。ヒトに適応させた抗体は、マウスの定常領域をマウスの抗原結合領域は残したままヒトの対応物で置き換えるという、遺伝子工学技術によって創出された免疫グロブリン分子である。得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性が減少し、薬物動態が改善される（２５）。
【００５８】
したがって、さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体はヒトに適応させたＩＬ−１８抗体である。ヒトに適応させた抗ＩＬ−１８抗体の好ましい例は、たとえば欧州特許出願第０９７４６００号明細書に記載されている。
【００５９】
さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体は、完全にヒト由来のものである。ヒトの抗体を産生する技術は、たとえば国際公開第００／７６３１０号パンフレット、国際公開第９９／５３０４９号パンフレット、米国特許第６，１６２，９６３号明細書またはオーストラリア特許第５３３６１００号明細書に詳細に記載されている。完全なヒトの抗体は、好ましくは、全てまたは一部の機能的なヒトのＩｇ座を含み、たとえば異種マウスといったトランスジェニック動物によって産生される組換え抗体である。
【００６０】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片もしくは循環変更誘導体である。それらアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的な誘導体は、ＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性、とくにＩＬ−１８との結合を残し、好ましくは、本質的には少なくともＩＬ−１８ＢＰと同様の活性を有する。理想的には、そのようなタンパク質は、非修飾のＩＬ−１８ＢＰと比較して非常に増大した生物学的活性を有する。好ましい活性断片は、ＩＬ−１８ＢＰの活性よりも優れた活性を有するか、またはより優れた安定性または、より低い毒性または免疫原性などのさらなる利点を有し、または大量に産生することがより容易であるか、もしくは精製がより容易である。
【００６１】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのスプライシング変異体／アイソフォームの配列は、（２３）によるものだけでなく、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたは（１２）によって提供される。
【００６２】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体は、安定性、半減期、生物学的利用能、人体による寛容または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するために、ポリマーと結合されてもよい。これらの目標を達成するために、ＩＬ−１８ＢＰはたとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合されてもよい。ポリエチレングリコール化は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている周知の方法によって実施され得る。
【００６３】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはポリエチレングリコール化される。
【００６４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、免疫グロブリンの全てまたは一部に融合したＩＬ−１８結合タンパク質の全てまたは一部からなる融合タンパク質である。得られる融合タンパク質が、とくにＩＬ−１８への結合といったＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を保持することは、当業者には理解されるだろう。融合は、直接または、１から３アミノ酸残基長、またはより長いたとえば１３アミノ酸残基長の短いリンカーペプチドを介してなるものであってよい。該リンカーは、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＩＬ−１８ＢＰ配列と免疫グロブリン配列との間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液内での長期の滞留時間（半減期）、増大した特異的な活性、上昇した発現レベルまたは融合タンパク質の精製が容易になるなどの改善された性質を有する。
【００６５】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、それは、たとえばヒトのＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合される。ＩＬ−１８ＢＰおよび免疫グロブリンの部分からなる特異的な融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。ＩｇＧ2もしくはＩｇＧ4、またはたとえばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスのアイソフォームなど、Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明における融合タンパク質の産生に適する。融合タンパク質は、モノマーまたはマルチマー、ヘテロまたはホモのマルチマーであり得る。
【００６６】
インターフェロンは、主に、ウイルス複製および細胞増殖に対する阻害効果に関して知られている。たとえば、インターフェロン−γは、免疫および炎症反応を促進するのに重要な役割を果たす。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β、Ｉ型インターフェロン）は、抗炎症的な役割を果たすと言われている。
【００６７】
本発明はまた、アテローム性動脈硬化症の治療用医薬の製造に関するＩＬ−１８とインターフェロンとの組み合わせの用途にも関する。
【００６８】
インターフェロンはまた、タンパク質の安定性を改善するためにポリマーと結合され得る。インターフェロンβとポリオールであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合は、たとえば国際公開第９９／５５３７７号パンフレットに記載されている。
【００６９】
本発明の他の好ましい実施態様において、インターフェロンはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）であり、より好ましくはＩＦＮ−β１ａである。
【００７０】
ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤は、好ましくはインターフェロンとともに、併用して、連続して、または独立して用いられる。
【００７１】
なおさらなる本発明の実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤はＴＮＦアンタゴニストと組み合わせて用いられる。ＴＮＦアンタゴニストは、いくつかの方法でその活性を発揮する。まず、アンタゴニストは、ＴＮＦエピトープまたはＴＮＦ受容体結合能力を有するエピトープを部分的または実質的に中和するために充分な親和性および特異性により、ＴＮＦ分子そのものに結合またはＴＮＦ分子そのものを隔離することができる（以下「隔離アンタゴニスト」と呼ぶ）。隔離アンタゴニストは、たとえば、ＴＮＦに対して誘導される抗体である。
【００７２】
あるいは、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ結合後、細胞表面の受容体によって活性化されるＴＮＦシグナル伝達経路を阻害することができる（以下「シグナリングアンタゴニスト」と呼ぶ）。アンタゴニストの両群は、アテローム性動脈硬化症の治療におけるＩＬ−１８阻害剤との組み合わせにおいて、単独でも併用でもどちらにおいても有益である。
【００７３】
ＴＮＦアンタゴニストは、たとえばＴＮＦによって増殖および免疫グロブリン分泌を引き起こすヒトＢ細胞といった、インビトロでの感受性細胞株における本来のＴＮＦ活性に関する効果に対して、決まりきった手順で候補をスクリーニングすることによって容易に同定、評価される。その分析は、分析で用いられるＴＮＦのモル量をたとえば０．１から１００倍にした候補アンタゴニストの希釈によるＴＮＦ処方、およびＴＮＦなしまたはアンタゴニストのみのコントロールを含む（２６）。
【００７４】
隔離アンタゴニストは、本発明によって用いられる好ましいＴＮＦアンタゴニストである。隔離アンタゴニストの間でも、高い親和性でＴＮＦに結合し、および低い免疫原性を有するポリペプチドが好ましい。可溶性のＴＮＦ受容体分子およびＴＮＦに対する中和抗体が、とくに好ましい。たとえば、可溶性ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩは、本発明において有効である。それらの受容体の細胞外ドメインまたは機能的な部分からなる切断型のそれらの受容体は、本発明によると、よりとくに好ましいアンタゴニストである。切断型の可溶性Ｉ型ＴＮＦ受容体およびＩＩ型ＴＮＦ受容体は、たとえば欧州特許第９１４４３１号明細書に記載されている。
【００７５】
切断型のＴＮＦ受容体は、可溶性であり、尿および血清において３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＴＮＦ阻害結合タンパク質として検出され、それぞれＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩと呼ばれている（２７）。ＴＮＦアンタゴニストおよび／またはインターフェロンを伴うＩＬ−１８阻害剤の、同時的、連続的または別々の用途が、本発明によると好ましい。
【００７６】
本発明によると、ＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩはＩＬ−１８阻害剤と組み合わせて使用されるべき好ましいＴＮＦアンタゴニストである。受容体分子の誘導体、断片、領域および生物学的活性部位は、本発明においても使用することができる受容体分子に機能的に似ている。受容体分子の生物学的に活性な等価物または誘導体は、充分な大きさであって、かつ膜に結合したＴＮＦ受容体との相互作用が阻害または妨害されるような親和性でＴＮＦと結合できる、ポリペプチドの一部または受容体分子をコードする配列の一部をいう。
【００７７】
さらに好ましい実施態様において、ヒトの可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ＴＢＰＩ）は、本発明によって使用されるＴＮＦアンタゴニストである。天然および組換えの可溶性ＴＮＦ受容体分子ならびにその産生の方法は、欧州特許第３０８３７８号明細書、同第３９８３２７号明細書および同第４３３９００号明細書に記載されている。
【００７８】
ＩＬ−１８阻害剤は、ＴＮＦ阻害剤と共に、同時的、連続的または別々に使用され得る。有効的には、ＩＬ−１８抗体または抗血清と、ＴＮＦ阻害活性を有するＴＮＦの可溶性受容体との組み合わせが用いられる。
【００７９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、医薬はさらにＣＯＸ阻害剤、好ましくはＣＯＸ−２阻害剤を含有する。ＣＯＸ阻害剤は、本技術分野において周知である。特異的なＣＯＸ−２阻害剤は、たとえば国際公開第０１／００２２９号パンフレットに記載されている。
【００８０】
トロンボキサン阻害剤、とくにトロンボキサンＡ２は、アテローム性動脈硬化症の治療用に現在広く用いられている。したがって、本発明のさらに好ましい実施態様において、医薬はさらに、同時的、連続的または別々に使用される、トロンボキサン阻害剤、および好ましくはトロンボキサンＡ２阻害剤を含有する。アスピリンは、本発明においてＩＬ−１８阻害剤との組み合わせで用いられることがとくに好ましい。
【００８１】
アテローム性動脈硬化症の原因の１つは血中の高濃度の脂質であると思われる。したがって、さらに好ましい実施態様において、医薬はさらに、同時的、連続的または別々に使用される脂質低下剤を含有する。当業者に周知のあらゆる脂質低下剤は本発明において用いられ得、さらに脂質低下剤は、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、プロブコールなどを含む。とくにＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤が好ましく、いわゆるスタチンが好ましい。多くのスタチンが、シンバスタチンまたはロバスタチンのように当業者に周知である。
【００８２】
より高度にアテローム性動脈硬化症を予防および／または治療するために、本発明の好ましい実施態様は、低脂肪食および／または低コレステロール食および／または減塩食との組み合わせにおけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０００１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重または約０．１から３ｍｇ／ｋｇ体重または約１から２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１から１００μｇ／ｋｇ体重または約１０から５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【００８４】
本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用の医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤をコードする配列からなる発現ベクターの用途に関する。したがって、遺伝子治療的アプローチが、その疾患を治療および／または予防するために用いられる。有利には、ＩＬ−１８阻害剤はその後インサイチュで発現され、その疾患によって冒された組織または細胞内で直接効率的にＩＬ−１８を妨害するであろう。
【００８５】
以下実施例において詳細に説明するように、ＩＬ−１８ＢＰをコードする配列からなる発現ベクターをエレクトロトランスファーしたのち、疾患のモデルマウスにおいてＩＬ−１８ＢＰの有効な発現が見られ得ることが示されている。
【００８６】
したがって、好ましい実施態様において、発現ベクターはエレクトロトランスファーによって、好ましくは筋肉内に投与される。
【００８７】
通常はＩＬ−１８阻害剤が発現されていない細胞、または阻害剤の発現量が充分量ではない細胞において、ＩＬ−１８阻害剤の内因的な産生を誘導および／または増強させるベクターの用途は、本発明においても意図される。そのベクターは、ＩＬ−１８の阻害剤を発現することが所望される細胞において機能的な調節配列からなる。そのような調節配列は、たとえばプロモーターまたはエンハンサーであり得る。その調節配列は、そののち相同組換えによってゲノムの適当な座に導入されてもよく、調節配列と遺伝子とを結合させることにより遺伝子発現が誘導または増強される。その技術は、通常「内性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００８８】
同じ技術、すなわち、たとえばサイレンシング因子のような負の調節因子をＩＬ−１８の遺伝子座に導入することによって、ＩＬ−１８の発現を停止させることができ、したがって、ＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたは妨害を導くことは、当業者によって理解されるであろう。そのようなＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または治療するためのＩＬ−１８阻害剤の用途と同じ効果を有することは、当業者に理解されるであろう。
【００８９】
本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤を産生するために遺伝子的に改変された細胞の用途に関する。
【００９０】
本発明はさらに、治療的に有効量のＩＬ−１８阻害剤および治療的に有効量のインターフェロンからなる、アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療にとくに有効な、医薬組成物に関する。ＩＬ−１８阻害剤として、その組成物はカスパーゼ−１阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、あらゆるＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を妨害するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、同等の活性を有するそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片または循環変更誘導体からなり得る。
【００９１】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片または循環変更誘導体は、医薬組成物の好ましい活性成分である。
【００９２】
医薬組成物に含まれるインターフェロンは、好ましくはＩＦＮ−βである。
【００９３】
さらに他の好ましい実施態様において、医薬組成物は、治療に有効量のＩＬ−１８阻害剤、任意にはインターフェロンおよびＴＮＦアンタゴニストを含有する。ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ活性を中和する抗体、または可溶性の切断型ＴＮＦ受容体の断片であり得、ＴＢＰＩおよびＴＰＢＩＩとも呼ばれる。本発明の医薬組成物は、さらに１つまたはそれ以上のＣＯＸ阻害剤、好ましくはＣＯＸ−２阻害剤を含有する。本発明の医薬組成物は、さらに、アスピリンなどのトロンボキサン阻害剤および／またはスタチンなどの脂質低下剤を含有し得る。
【００９４】
「薬学的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の効果を妨げず、投与される宿主に対する毒性がないあらゆる担体を含有することを意味する。たとえば、非経口投与において、活性タンパク質は、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルで注射用の単位投与形態に処方されてもよい。
【００９５】
本発明の医薬組成物の活性成分は、さまざまな方法で個体に投与されることができる。投与経路は、皮内、経皮的（たとえば、徐放性の処方で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外麻酔、局部および鼻腔内の経路を含む。その他に、たとえば上皮または内皮組織を介した吸収作用、または活性剤をコードするＤＮＡ分子を（ベクターを介して）患者に投与し、インビボでその活性剤を発現および分泌させる遺伝子治療を、治療に有効な投与経路として用いることができる。さらに、本発明におけるタンパク質は、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの、生物学的活性剤の他の構成要素と共に投与することができる。
【００９６】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与において、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、食塩水、デキストロース溶液）および等脹を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）とともに、活性タンパク質は、溶液、懸濁液、乳液または親水性の粉末として処方されることができる。その処方は、通常用いられる技術によって滅菌される。
【００９７】
本発明における活性タンパク質の生物学的利用能もまた、ＰＣＴ特許出願の国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように、たとえば分子をポリエチレングリコールに結合するなど、ヒトの体内での分子の半減期を延ばす接合方法を用いることによって改良されることができる。
【００９８】
活性タンパク質の治療に有効な量は、アンタゴニストのタイプ、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストによって示された未解決の細胞毒性の活性、投与経路、患者の臨床状態（内因性のＩＬ−１８活性を非毒性レベルを維持することの望ましさを含む）を含む、要素の相互関係であるだろう。
【００９９】
「治療に有効な量」とは、投与されると、ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する結果となる量である。単回投与または複数回投与として固体に投与される用量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬学動態特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、同時進行中の治療、治療頻度および望ましい効果を含むさまざまな因子に依存して変化するであろう。確立された投与量範囲の調整および取扱いは、個体においてＩＬ−１８の阻害を測定するインビトロおよびインビボ方法と同様、当業者の能力の範囲内で充分である。
【０１００】
本発明において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０００１から１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重または約０．１から３ｍｇ／ｋｇ体重または約１から２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。さらに好ましいＩＬ−１８阻害剤の量は、約０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重または約１から１００μｇ／ｋｇ体重または約１０から５０μｇ／ｋｇ体重の量である。
【０１０１】
本発明において好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、本発明においてさらに好ましい。
【０１０２】
さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、毎日または１日おきに投与される。
【０１０３】
毎日の投与は、望ましい結果を得るために有効な、間隔をあけた投与または持続的な放出処方で通常与えられる。２回目または継続的な投与は、個体に最初またはあらかじめ投与された用量と同じ、それ以下またはそれ以上の用量で行なうことができる。２回目または継続的な投与は、疾患の発症中またはそれ以前に投与されることができる。
【０１０４】
本発明において、ＩＬ−１８阻害剤は、治療に有効な量で、ほかの治療養生法または薬剤（たとえば多様な薬剤養生法）とともに、あらかじめ、同時的または連続的に、個体に予防的または治療的に投与されることができる。他の治療薬と同時に投与される活性剤は、同じまたは異なる組成物において投与されることができる。
【０１０５】
本発明はさらに、有効な阻害量のＩＬ−１８阻害剤を治療および／または予防が必要な宿主に投与することからなる、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防方法に関する。
【０１０６】
本発明はさらに、ＩＬ−１８阻害剤をコードする配列からなる発現ベクターを治療および／または予防が必要な宿主に投与することからなる、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防方法に関する。
【０１０７】
本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターは全身に投与され、より好ましくは、筋肉内注射によって投与される。
【０１０８】
本発明はさらに、心不全のよくない臨床予後の診断マーカーとしてのＩＬ−１８の用途に関する。よくない臨床予後は、再発現象または死などの、患者の状態のあらゆる悪化、つづく最初の心筋梗塞を含む。
【０１０９】
好ましくは、ＩＬ−１８は最初に起こった心不全後の再発現象の診断マーカーとして用いられる。再発現象は、死、再虚血、再血管新生、アテローム性動脈硬化症の進行または心不全による再入院を含むが、これらに限られるものではない。
【０１１０】
本発明は、今や説明されたが、実例として提供され本発明を制限するものではない以下の実施例を参考にすることによって、より容易に理解されるだろう。
【０１１１】
［実施例］
材料と方法
試料
頚動脈内膜切除術を受けた３６人の患者から除去された、４１のヒトのアテローム性プラークが収集された。コントロールとして、アテローム性動脈硬化症ではない２つの頚動脈および３つの内胸動脈（２つは最小の線維性筋性の厚くなった部分）が検死時または冠状バイパス手術中に入手された。それらはすぐに液体窒素に浸され、−８０℃で保存された。タンパク質およびＲＮＡ抽出に用いられるプラークは、−８０℃で保存される前に、すぐに洗浄され、液体窒素に浸された。免疫組織化学的研究において、プラークは、新しい４％パラホルムアルデヒドに２時間置かれ、ついで、液体窒素を用いた最適の切断温度組織処理培地（optimal cutting temperature tissue processing medium）（Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物、マイルズ社（Miles Inc）製、診断部（diagnostics division））で凍結させ、クリオスタットでの切片作製（cryostat sectioning）のために−８０℃で保存する前に、３０％のスクロース−ＰＢＳ溶液に移された。いくつかの８から１０μｍの切片は、組織学的解析および免疫組織化学的研究のために各試料から入手された。
【０１１２】
患者の特徴
ＩＬ−１８／ＩＬ−１８ＢＰ発現とプラークの不安定性の徴候との間の潜在的な関係を研究するために、我々は、２０００年５月から８月の間に動脈内膜切除術を受けた（３６人以外の）２３人の連続した患者から、有望かつ匿名の（blind）様式で臨床データを収集した。肉眼での試験におけるプラーク内の潰瘍の有無は、動脈内膜切除術を行なった外科医によって系統的に報告された。これらにより、我々はプラークを潰瘍化したプラークまたは非潰瘍化プラークとして分類することができた。さらに、患者は臨床の症状により２つの群に分けて分類された。頚動脈の狭窄症に関する脳虚血発作の臨床症状を示す患者は、症候性として分類された。動脈内膜切除術は、該患者の臨床症状が現れてから２〜６６日（１７．６±５．３日）後に行なった。頚動脈領域に脳虚血の症状が現れなかった患者は、無症候性として分類された。無症候性の頚動脈狭窄症は、冠状または末梢疾患の患者の系統的な臨床試験に基づいて検出され、ついでその重症度は熟達し認可された超音波検査技師による反復ドップラー超音波検査法を用いて決定された。無症候性の患者は、頚動脈の狭窄症の領域において虚血段階がないにもかかわらず、無症候性の頚動脈のアテローム性動脈硬化症研究（ＡＣＡＳ）の研究者によって示されたように、頚動脈内膜切除術はそのような患者にも有効であることが明らかにされた（２８）。
【０１１３】
ウエスタンブロット解析
タンパク質は、１２のアテローム性プラークおよび５のコントロールの正常な動脈から抽出された。凍結試料は液体窒素下で粉末にされた。その粉末は、氷冷した溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  グリセロールリン酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  オルトバナジン酸ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１μｇ／ｍＬ  アプロチニン、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン塩化メチルケトン（ＴＰＣＫ）、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ（ａ）−ｐ−トシル−Ｌ−リジン塩化メチルケトン（ＴＬＣＫ））に、０．３ｍＬ／１０ｍｇ生重量の割合で再懸濁された。抽出物は、氷上で１５分間インキュベーションされ、ついで遠心分離された（１２０００ｇ、１５分、４℃）。洗剤に可溶な上清分画は保存され、ついで試料中のタンパク質濃度をバイオ−ラッドタンパク質解析（Bio-Lad protein assay）を用いて均一化した。
【０１１４】
ＩＬ−１８およびＩＬ−１８Ｒのウエスタンブロット解析を行なうために、タンパク質抽出物は、５分間煮沸され、７．５％または１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動した。大腸菌（セロノ  ファーマシューティカル  リサーチ  インスティチュート（Serono Pharmaceutical Reseach Institute）、ジュネーブ）から精製されたＩＬ−１８ＢＰ、ｒｈＩＬ−１８は、１ｍｇ／ｍｌの樹脂でアフィゲル１５（Affigel 15）（バイオラッド社（Biorad）製）に、その製品の取扱い説明書にしたがって結合させた。タンパク質抽出物（６０μｇ）は、５００μｌのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎで調整した２０μｌの樹脂とともに、ローラー上で一晩４℃でインキュベーションした。あらゆる非特異的結合を取り除くために、樹脂は遠心分離され、ついで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（フルカ社（Fluka）製、０．５％  デオキシコール酸塩で洗浄し、ついで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＴＸ１００、０．０５％  ノニデットＰ４０（nonidet P40）（フルカ社製）、２ｍＭ  ＣＨＡＰＳ（ベーリンガー社（Boehringer）製、マンハイム）で洗浄し、最後に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で洗浄した。樹脂をその後遠心分離し、還元条件下で試料用緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸し、ついで最後に１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド  ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロゲン社（Invitrogen）製）で泳動した。
【０１１５】
試料は電気泳動でポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース上に移された。ニトロセルロースメンブレンは２時間室温で５％の脱脂ドライミルクを含有するＴＢＳＴ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  食塩水）に充分に浸された。メンブレンはついで、ヤギ抗ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１８Ｒ（α鎖）ポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R & D Systems）製）、マウス抗ヒトＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌのＭａｂ  ６５７．２７）（コバルズ（Corbaz）ら、２０００  提出された原稿）、ウサギ抗ヒトカスパーゼ−１ポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ａ−１９、サンタクルーズ）とともにインキュベーションされた。Ｍａｂ６５７．２７の特異性は、１時間、５μｇ／ｍｌのＭａｂ６５７．２７とともにインキュベーションされた２００培モル過剰のｒｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓ（チャイニーズハムスター卵巣細胞から精製したもの、セロノ  ファーマシューティカル  リサーチ  インスティチュート）を用いる競合によって、細片にされたメンブレンで解析された。ＨＲＰを接合した対応する抗体とのインキュベーションの後、化学発光基質（ＥＣＬ、ウエスタンブロッティング；アマシャム社（Amersham Corp）製）をその製品の取扱い説明書にしたがって、陽性のバンドを示すために用い、ついでバンドはハイパーフィルムＥＣＬ（アマシャム社製）を感光させることによって視覚化した。
【０１１６】
免疫組織化学
６つのアテローム性プラークの凍結切片は、１：１０の正常ウマ血清または１：１０の正常ヤギ血清を用いて３０分間室温でインキュベーションし、ＰＢＳで１回洗浄し、ついでマクロファージ同定用のＣＤ６８に対する１次マウスモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ−ＣＤ６８、ＫＰ１）、または平滑筋細胞同定用のヒト平滑筋α−アクチンに対する１次マウスモノクローナル抗体（１Ａ４、ＤＡＫＯ）のいずれかとともにインキュベーションした。アテローム性プラーク内のＩＬ−１８およびＩＬ−１８受容体を同定するために、特異的なヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）は、５μｇ／ｍＬの希釈で用いられた。ＩＬ−１８ＢＰは、組換えヒトＩＬ−１８ＢＰアイソフォームａ（Ｈ２０）に対する特異的なモノクローナル抗体を用いることによって決定された（コバルズら、２０００  提出された原稿）。ＰＢＳで洗浄した後、そのスライドは以下のビオチン標識化２次抗体とともにインキュベーションされた：ＣＤ６８、平滑筋α−アクチンおよびＩＬ−１８ＢＰに対する抗体に関する染色検出のためには１：２００で希釈されたビオチン標識化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Inc）製）、ならびに抗ＩＬ−１８および抗ＩＬ−１８受容体抗体の検出には１：２００に希釈されたビオチン標識化ウマ抗ヤギＩｇＧ（ベクター社（Vector）製）。免疫染色はアビジン−ビオチンＨＲＰ可視システム（ベクタステイン  ＡＢＣ  キット  ＰＫ−６１００（Vectastain ABC kit PK-6100）ベクター社製）を用いて可視化した。陰性コントロールとして、１次抗体の代わりに、アイソタイプとは合致するが無関係の抗体を用いて、近傍の切片を染色した。
【０１１７】
ＲＮＡ調製
全ＲＮＡは２９のアテローム性プラークからチオシアン酸グアニジウム溶液（acid guanidium thiocyanate solution）で抽出され、ついでチョムジンスキ（Chomczynski）とサッチ（Sacchi）の方法（２９）にしたがってフェノールおよびクロロホルムを用いて抽出した。精製されたＲＮＡを水で溶かし、ついで２６０ｎｍの吸光度でその濃度を測定した。ＲＮＡの完全性は１％のアガロースゲル電気泳動法によって評価された。１μｇの全ＲＮＡから、プロメガ逆転写システムを用いて、その製品の取扱い説明書にしたがってｃＤＮＡは合成された。
【０１１８】
ヒトのアテローム性プラークにおけるヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰに関する半定量的リアルタイムＰＣＲ（semi-quantitative and Real-time PCR）
半定量的ＰＣＲ反応は、１Ｕのアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）製、ロシュ社（Roche）製、アメリカ合衆国）、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（アマシャム社（Amersham）製、アメリカ合衆国）、および５０ｐｍｏｌのフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーが存在する、全量５０μｌで行なった。反応では、ＰＴＣ−２００  ペルチアーエフェクトサーマルサイクラー（PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler）（エムジェーリサ−チ社（MJ Reaseach）製、アメリカ合衆国）を用いて以下の条件でインキュベーションした：変性１分間９４℃、アニーリング１分間５５℃および伸長１分間７２℃。ＰＣＲ反応のリニアー期（linear phase）でＰＣＲ産物の量の比較を保証するために、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８およびβ−アクチンは、２５、２８および３１回のサイクルのあとに解析された。バンドが飽和する前のＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８およびβ−アクチンの最適なサイクル数は、決定された（それぞれ、３１、２８および２５回）。ＰＣＲプライマーは、公表された配列（ＡＦ１１０７９９、Ｄ４９９５０、Ｘ００３５１）をもとに、以下のように設計された：ＩＬ−１８、リバース  ５′−ＧＣＧＴＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴＡＡ−３′；フォワード  ５′−ＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡ−３′；ＩＬ−１８ＢＰ、フォワード  ５′−ＡＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡ−３′；リバース  ５′−ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧ−３′；β−アクチン、リバース  ５′−ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣ−３′；フォワード  ５′−ＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣ−３′。試料に混在している可能性があるゲノムＤＮＡの増幅を除外するために、ＰＣＲ反応はｃＤＮＡ鋳型の不在下で行なった。ＰＣＲ産物（１０μｌ）は、１×ＴＡＥ緩衝液における１％のアガロースゲル電気泳動法によって解析された。ＰＣＲ産物のサイズは、ゲルの染色後１ｋｂラダー（ギブコ社（Gibco）製）との比較によって確かめられた。エチジウム−ブロマイドによって染色されたバンドの相対的な定量は、コダック  デジタル  サイエンス解析ソフトウェア（Kodak Digital Sciences analytical software）を用いてＵＶ照射下で行ない、標的遺伝子（ｈＩＬ−１８ＢＰ、ｈＩＬ−１８）とハウスキーピング遺伝子（ｈβ−アクチン）との比率として報告された。
【０１１９】
ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰおよびＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）用のＳＹＢＲ  グリーン  リアルタイム  ＰＣＲプライマーは、公表された配列（ＡＦ１１０７９９、Ｄ４９９５０、ＮＭ００２０４６）をもとに、ＰＥ  バイオシステムズ社（PE Biosystems）製のプライマーエクスプレスソフトウェアを用いて、以下のように設計された：ＩＬ−１８、リバース  ５′−ＣＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡ−３′；フォワード  ５′−ＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣ−３′；ＩＬ−１８ＢＰ、リバース  ５′−ＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＣＧＴＴＣＣ−３′；フォワード  ５′−ＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＴＣ−３′；ＧＡＰＤＨ、リバース  ５′−ＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡ−３′；フォワード  ５′−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣ−３′；イントロン−ＧＡＰＤＨ、リバース  ５′−ＣＣＴＡＧＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴ−３′；フォワード  ５′−ＣＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣ−３′。特異性および最適なプライマー濃度は検査された。混合している可能性のあるゲノムＤＮＡは、特異的なイントロン−ＧＡＰＤＨプライマーを用いたＰＣＲ反応を行なうことによって除外された。非特異的増幅がないことは３．５％のアガロースゲル電気泳動法によるＰＣＲ産物の解析によって証明された。ＳＹＢＲ  グリーン  リアルタイムＰＣＲは、アンプイレース（AmpErase）ウラシルＮ−グリコシレース（Glycosylase）（ＵＮＧ）（０．５ユニット／ウェル）および２０μｌのプライマー（３００ｎＭ）とともに５μｌ／ウェルのＲＴ−産物（０．５ｎｇの全ＲＮＡ）、２５μｌ／ウェルのＳＹＢＲ  グリーンＰＣＲマスターミックス（SYBR Green PCR master mix）（ＰＥバイオシステム社（PE Biosystem）製、カルフォルニア州、アメリカ合衆国）で行なった。ＰＣＲは５０℃で２分間（ｃＤＮＡに取り込まれたあらゆるウラシルを除去するためのアンプイレースＵＮＧインキュベーション）、９５℃で１０分間（アンプリタックゴールドの活性化のため）、ついで９５℃を１５秒、６０℃を１分間のサイクルを４０回、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００検出システム（ABI PRISM 7700 Detection system）で行なった。このように、逆転写されたｃＤＮＡ試料は増幅され、Ｃｔ（サイクル閾）値は決定された。すべてのＣｔ値はハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨによって標準化された。ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰおよびＧＡＰＤＨに対する特異的な単ＤＮＡバンドが電気泳動法解析を用いて観察された。
【０１２０】
「ＳＹＢＲ  グリーンＰＣＲマスターミックス」を用いたリアルタイム検出の原理は、二本鎖ＤＮＡへのＳＹＢＲグリーン色素の結合によって生じる蛍光の増加を測定することによってＰＣＲ産物を直接検出するという原理に基づいている。
【０１２１】
統計解析
データは平均±ＳＥＭとして表される。ＩＬ−１８レベルはマン−ウイットニーテスト（Mann-Whitney test）を用いて群間で比較された。ｐ  ０．０５の値は統計的に有意であることが考えられた。
【０１２２】
実施例１：酸化リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）によって誘導される内皮細胞死のＩＬ−１８阻害剤による保護
培養されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は、ＩＬ−１８結合タンパク質または抗ＩＬ−１８抗体の存在または不在下で、１６時間ｏｘＬＤＬにさらした。図１に示したように、ｏｘＬＤＬにさらした後、８３％のＨＵＶＥＣｓは死滅した。ＩＬ−１８ＢＰまたは抗ＩＬ−１８抗体とともに行なったインキュベーションでは、ほとんどすべての細胞が死を免れた。ＩＬ−１８ＢＰを用いたものでは死滅は観察されなかった。抗ＩＬ−１８抗体を用いたものでは、８９％の細胞が生き残った。
【０１２３】
この実験は、明らかに、アテローム性プラーク内部のアポトーシスが原因の細胞死に対する、２つの異なるＩＬ−１８阻害剤の保護効果を示すものである。
【０１２４】
実施例２：アテローム性プラークにおけるＩＬ−１８タンパク質およびその内因性ＩＬ−１８ＢＰ阻害剤の発現
１２の頚動脈のアテローム性動脈硬化症の動脈および５つの正常なコントロールから得られたタンパク質抽出物で、ウエスタンブロット解析を行なった。ＩＬ−１８タンパク質は、活性型を含め、すべてのアテローム性プラークにおいて高度に発現されているが、正常の動脈ではほとんどまたは全く検出されなかった（図２）。レーン１から４は、アテローム性プラーク由来の試料を含有し、レーン５から７は正常の動脈由来のものである。興味深いことに、ＩＬ−１８の活性型の検出は、ＩＬ−１８のプロセシングに関連するカスパーゼ−１の活性型の発現と相関関係があるように思われる（図２、４列）。すべてのアテローム性プラークにおいて、ＩＬ−１８受容体タンパク質（そのα鎖）の顕著な発現が検出されたのに比べて、正常の動脈における発現は非常に低レベルであった（図２、２列）。さらに、発現レベルは不均一のものであったが、大多数のアテローム性プラークはＩＬ−１８ＢＰを発現した（図２、１列）。
【０１２５】
実施例３：アテローム性プラークにおけるＩＬ−１８タンパク質およびその内因性ＩＬ−１８ＢＰ阻害剤の細胞局在
ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰの細胞局在を決定するために、６つの頚動脈のアテローム性プラークについて免疫組織化学的研究を行なった。図２に示したように、ＩＬ−１８は主にマクロファージにおいて発現されていたことから、おそらくその細胞がプラーク内のＩＬ−１８の主要な発生源であろう（示していない）。それらの領域はまた、ＣＤ３−陽性リンパ球が豊富でもある。しかしながら、Ｔリンパ球はＩＬ−１８産生には直接関わりがあるとは思えない。ＩＬ−１８はまた、内膜の平滑筋細胞においても発現され、偶発的に内皮細胞においても発現される。対照的に、ＩＬ−１８ＢＰの顕著な発現が、プラーク微小血管（microvessels）の内皮細胞およびその管腔表面において検出されたが、すべての血管において発現が見られたわけではなかった。また、主に細胞外のいくつかのマクロファージが豊富な領域において、比較的低く、より不均一なＩＬ−１８ＢＰの発現が検出された。
【０１２６】
実施例４：アテローム性プラークにおけるＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡ転写物の発現、ならびにプラークの不安定性との関係
ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡがヒト頚動脈のアテローム性プラークにおいて発現されるのかどうかを決定するために、６つのアテローム性プラークにおいて半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（図３）。ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡ量は不均一なものであったが、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡは、すべてのアテローム性プラークにおいて検出された。したがって、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡ発現レベルを正確に定量化するために、２３のアテローム性プラークはさらに、ＳＹＢＲ  グリーン  リアルタイムＰＣＲ法で解析された（図４）。プラークは、臨床および病理学的検査によって、肉眼で見える潰瘍の有無を含む、症候性（不安定な）または無症候性（安定な）プラークとして特徴づけられた。患者の臨床的な特徴は表４において要約した。頚動脈の直径縮小の割合（６０％〜９５％）、ならびに年齢、糖尿病、高コレステロール血症、高血圧およびタバコの喫煙を含む危険因子は、２つの群間で違いはなかった。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
症候性プラークでは、無症候性のアテローム性プラークと比較して、ＩＬ−１８の量がアップレギュレーションされていることが見出された（それぞれ２．０３±０．５対０．６７±０．１７）（図４Ａ）。症候性プラークにおいて観察されたＩＬ−１８産生の増加は非常に有意であり（ｐ＜０．００７４）、一方症候性プラークで観察されたＩＬ−１８ＢＰの増加量は、無症候性プラークに対して有意ではない（それぞれ４．６４±０．９８対２．５±０．９２）ことが証明された（図４Ｂ）。他の条件において、症候性群と無症候性群のいずれもＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡの間の正の相関関係が示されたが、その傾きは２群間で有意に異なった（症候性群：傾き１．１６［０．１９−２．１４］、ｒ2＝０．３６  対  無症候性群：傾き４．７９[２．３９−７．２０]、ｒ2＝０．７６；ｐ＜０．０５）。したがって、無症候性群におけるＩＬ−１８ＢＰの相対的な増加はＩＬ−１８発現の増加の埋め合わせをするのには充分でないと思われる。さらに、潰瘍の存在はプラークの不安定性の特徴として考えられるので、プラーク内に潰瘍がないまたはあるプラークについてさらに統計解析を行ない、潰瘍を示すプラークにおいてＩＬ−１８の顕著なアップレギュレーションが証明された（ｐ＜０．０１８）（図４Ｃ）。
【０１２９】
それらのデータより、アテローム性プラークにおいて見られるＩＬ−１８発現の増加はプラークの不安定性との相関関係があることが示唆された。
【０１３０】
実施例５：ＩＬ−１８ＢＰは、疾患のインビボモデルにおいて、アテローム性動脈硬化症の病巣の進行および安定性を調節する
方法
患者の特徴
血漿試料は症状が現れてから７日以内の急性虚血冠症候群（acute ischemic coronary syndromes）（不安定狭心症および心筋梗塞）の患者から入手した。不安定狭心症は、心電図上での虚血の変化または冠状動脈疾患の存在のどちらかを伴う典型的な胸痛という意味として定義される。心筋梗塞は、循環血液中の心筋の酵素（クレアチンホスホキナーゼおよびトロポニンＩ）の顕著な増加とともに心電図上での典型的な虚血の変化に基づいて診断された。非虚血性の患者は同じ心臓学部に入れられ、完全に虚血の徴候がなかった。ヒトＩＬ−１８の血漿レベルは商業的に利用できるキット（ＭＢＬ社（MBL）製、日本）を用いて決定した。
【０１３１】
マウスＩＬ−１８ＢＰ発現プラスミドのインビボ筋肉内エレクトロトランスファー
１４週齢の１４匹のオスのＣ５７ＢＬ／６  ａｐｏＥ  ＫＯマウスは、３週間間隔でＩＬ−１８ＢＰ発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３−ＩＬ１８ＢＰを３回注射された。コントロールマウス（ｎ＝１９）はコントロールの空のプラスミドを注射された。記載されたように単離された、マウスＩＬ−１８ＢＰアイソフォームｄのｃＤＮＡ（付属番号＃Ｑ９ＺＯＭ９）（２３）は、サイトメガロウイルスプロモーター（インビトロゲン社製）の制御下に、哺乳動物細胞の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲ１／Ｎｏｔ１部位にサブクローニングされた。３３４．ｙｈと称した構築物は図５に示す。コントロールプラスミドは、治療力のあるｃＤＮＡを欠く同様の構築物である。ＩＬ−１８ＢＰまたはコントロールの発現プラスミド（６０μｇ）は、先に述べたように（１３）麻酔されたマウスの両方の頭蓋骨の脛骨筋に注射された。つまり、経皮電気的パルス（２００Ｖ／ｃｍの８方形波電気的パルス、２Ｈｚで２０ｍｓｅｃ持続）は、４．２から５．３ｍｍ離れて位置する２つのステンレススチールプレート電極を用いるＰＳ−１５ エレクトロパルセーター（ジェネトロニクス社（Genetronics）製、フランス）によって足の両側に送った。
【０１３２】
Ｅｌｉｓａ  ｍＩＬ−１８ＢＰ
プレートはｒ−ｍＩＬ−１８ＢＰｄアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体（５μｇ／ウェル）でコートされた。可溶性ｍＩＬ−１８ＢＰは、大腸菌のｒ−ｍＩＬ−１８ＢＰに対するビオチン標識化ウサギポリクローナル抗体（０．３μｇ／ｍｌ）（ペプロテック社（Peprotec）製）、ついでエキストラビジン（extravidin）ペルオキシダーゼ（１／１０００）（シグマ社（Sigma）製）を用いて検出した。捕捉ウサギポリクローナル抗体は、ｍＩＬ−１８ＢＰ特異性を確かめるためにウエスタンブロットによって検査された。ＨＥＫ２９３細胞から産生された組換えｍＩＬ−１８ＢＰｄは、標準として用いられた。ＥＬＩＳＡの感度は５ｎｇ／ｍｌである。
【０１３３】
マウスの解析
凍結切片（８μｍ）は大動脈洞から入手され、前述したように、オイルレッドを用いる脂質沈着検出、シリウスレッドを用いるコラーゲン検出および免疫組織化学的解析に用いた（１３）。切片は、特異的な１次抗体で染色された（１３）：前述したように、抗マウスマクロファージ、クローンＭＯＭＡ２（バイオソース社（BioSource）製）、平滑筋細胞に対するアルカリホスファターゼに結合された抗α−アクチンおよびＴリンパ球に対する抗ＣＤ３（ダコ社（Dako）製）。細胞死の検出は、ＴＵＮＥＬ技術を用いて行なった（１３）。ＣＤ３陽性細胞は、匿名の様式で微視的に数えられた。大動脈洞、ならびにマクロファージ、平滑筋細胞、コラーゲンまたはＴＵＮＥＬに関して陽性染色された領域に存在するアテローム性プラークは、以前記載したように、コンピュータによる画像定量（ＮＳ１５０００、マイクロビジョン社（Microvision）製）を用いて測定された（１３）。非免疫性でアイソタイプは合致する免疫グロブリンでの染色によって免疫染色の特異性を評価した。ＴＵＮＥＬの特異性はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの酵素脱落によって評価された。左鎖骨下動脈から腎動脈へ及ぶ胸大動脈は、１０％の緩衝ホルマリンで固定され、ついでオイルレッドで脂質沈着を染色した。それらはついで、縦方向に開かれ、脂質沈着の割合をコンピュータによる画像定量（ＮＳ１５０００、マイクロビジョン社製）を用いて算出した。
【０１３４】
結果
本研究において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１８ＢＰ調節がアテローム性動脈硬化症およびプラーク安定性のどちらについても重要な役割を担うという仮説を調べた。急性冠症候群の患者（３０人の男性、１８人の女性、平均年齢６６．２±１．８歳、そのうち不安定狭心症の患者１４人および心筋梗塞の患者３４人）および同じ心臓学部において補充非虚血性のコントロール患者（１０人の男性、３人の女性、平均年齢６０．０±５．２歳）の血漿のＩＬ−１８のレベルを測定した。ＩＬ−１８の血漿レベルは、急性冠動脈の患者ではコントロールに比べて、有意に上昇しており（それぞれ１４６．９±１７．１対７３．０±１２．２ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）、対照的に、ＩＬ−１８ＢＰの循環レベルにおいては、わずかに上昇していた（それぞれ２０．１±２．７対７．５±２．５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６）。さらに、深刻な虚血性心不全および肺水腫の臨床の徴候がある患者において、疾患の重症度と相関関係のあるＩＬ−１８レベルが最高レベルで観察された（２２４．０３±３９．１ｐｇ／ｍｌ、コントロールと比較した場合ｐ＜０．００１）。急性冠状疾患の患者から得られた結果、および脳卒中の患者由来のアテローム性プラークにおいてＩＬ−１８が上昇しているとの以前の情報（マラット（Mallat）、２００１）により、アテローム性動脈硬化症の過程においてＩＬ−１８／ＩＬ−１８ＢＰ調節が重要な役割を果たすことが示唆される。
【０１３５】
したがって、我々は、ヒトに似たアテローム性動脈硬化症の病巣が自然発生的に発達しているａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）マウスを用いて、この仮説について調べた。１４匹の１４週齢のオスのマウスは、マウスＩＬ−１８ＢＰｄをコードする発現プラスミドＤＮＡのインビボ筋肉内エレクトロトランスファーを介してＩＬ−１８ＢＰを補充され、１９匹の同週齢のコントロールは空のプラスミドが補充された。プラスミドのエレクトロトランスファーは３週間毎に繰り返し行ない、それらのマウスは、９週間処理されたあと２３週齢で犠牲死された。マウスＩＬ−１８ＢＰの血漿レベルは、空のプラスミドを注入されたａｐｏＥ  ＫＯマウスにおける検出限界（５ｎｇ／ｍｌ）より低かった。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰプラスミドの単独注入によって、高レベルの血中ＩＬ−１８ＢＰが生じ、注入から２日後に最大上昇し（３２３．５±１００．９ｎｇ／ｍｌ）、２週間後には１２７．４±３５．４ｎｇ／ｍｌと測定された。ＩＬ−１８ＢＰまたは空のプラスミドのどちらかによる９週間の処理の結果、全コレステロール（それぞれ４８９．４±３４．６対４８０．８±３６．３ｍｇ／ｄｌ）および高密度リポタンパク質血清レベル（それぞれ５２．３±９．４対４８．８±５．１ｍｇ／ｄｌ）は、２群間で違いは見られなかった。動物の重さにおいては、ＩＬ−１８ＢＰ処理された群では、コントロール群に比べて、わずかではあるが有意な増加が観察された（それぞれ３１．８±０．９対２８．６±０．８ｇ、ｐ＜０．０５）。
【０１３６】
アテローム性動脈硬化症に関するＩＬ−１８ＢＰ補充の結果は、２つの異なる位置、下行性胸大動脈および大動脈洞、において検査された。ＩＬ−１８ＢＰトランスフェクションが開始された１４週齢時には胸部アテローム性動脈硬化症の病巣はほとんど存在しなかったので（データは示さない）、胸大動脈が脂肪線条の発達（アテローム発生）におけるＩＬ−１８ＢＰの役割を決定するために選択された。１４週齢時にアテローム性動脈硬化症の病巣がすでに存在する大動脈洞は（データは示さない）、進行したプラークの発達およびプラークの安定性の重要な決定要素である進行したプラークの成分について検査された。ａｐｏＥ  ＫＯマウスに対するＩＬ−１８ＢＰ処理はアテローム性動脈硬化症の病巣の発達および進行に対して顕著に影響を及ぼした。胸大動脈の検査から、空のプラスミドと比較してＩＬ−１８ＢＰプラスミドで処理されたマウスにおいて脂質の沈着が著しく減少していることが見出された（図６）。コンピュータによる定量的画像解析によって、アテローム性動脈硬化症の病巣の範囲内において６９％の減少が見出され（ｐ＜０．０００１）（図６）、アテローム発生においてＩＬ−１８に対する重要な許容的役割が示された。さらに、９週間のみのＩＬ−１８ＢＰプラスミドでの処理は、空のプラスミドでの処理と比較して、大動脈洞における進行したアテローム性プラークの発達を顕著に制限した（プラークの大きさで２４％の減少、ｐ＝０．０１）（図７）。
【０１３７】
さらに重要なことに、プラーク不安定性の主な決定要素である進行した病巣の成分は、ＩＬ−１８ＢＰ処理によって大いに影響を受けた。ＩＬ−１８ＢＰプラスミドで処理されたマウスのアテローム性動脈硬化症の病巣は、マクロファージの浸潤において非常に顕著な５０％の減少（ｐ＜０．０００１）（図８）を示し、６７％少ないＴリンパ球（ｐ＜０．００５）（図８）を含み、平滑筋細胞の堆積において２倍の増加を示した（ｐ＜０．０５）（図９）。さらに、病巣の細胞成分における重要な変化は、シリウスレッド染色によって検査されたようにコラーゲンの容量の顕著な８５％の増加（ｐ＜０．０００５）および全脂質の容量の減少に関連していた。
【０１３８】
したがって、ＩＬ−１８ＢＰ処理はアテローム性動脈硬化症の病巣内の炎症作用を顕著に弱め、安定なアテローム性プラークの治癒作用特性を誘導した。さらに、ＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおける病巣の炎症成分の著しい減少は、プラーク内の細胞死の発生の実質的減少に関連しており（ＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスの２．９±０．９％に対し、コントロールの１０．５±３．６％、ｐ＜０．０５）、つまり無細胞性の脂質コアの拡大およびトロンボゲン形成を制限することを意味している（マラット、１９９９）。
【０１３９】
考察
充分に立証されたヒトに似たアテローム性動脈硬化症のモデルマウスを用いて、先に報告した結果より、アテローム性プラークの発達、進行および安定性におけるＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰ調節の予期し得ない、かつ極めて重大な役割が明らかに立証される。胸大動脈における初期の病巣形成を予防する一方、ＩＬ−１８ＢＰ補充によるＩＬ−１８活性の阻害は、大動脈洞における進行した病巣の成分に大いに影響するのと同時に、安定なプラークの形質への転換を誘導する。
【０１４０】
アテローム性動脈硬化症の患者の臨床予後は、いくぶんかのみ、病巣の大きさに依存する。現在では、病巣の大きさというよりむしろ質（プラークの性質）が、虚血症状の発生のさらによい予報物質となりうることが広く認識されている。実際、アテローム性動脈硬化症の深刻な臨床の徴候（心臓および脳の梗塞）は、主に破裂したアテローム性プラークの接触面に形成される血栓による血管の内腔の閉塞によるものである（１９）。病理学的な研究により、破裂しやすいまたは破裂した、傷つきやすいまたは不安定なプラークは、炎症細胞に富み、平滑筋細胞およびコラーゲン成分の実質的な減量を示す（２０、２１）。さらに、そのようなプラークでは、高度にトロンボゲン形成の脂質コアの形成を導くアポトーシスによる細胞死の顕著な増加が見られる（１３、２２）。ＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおいて、上昇したプラークの不安定性のすべての徴候が著しく弱まったことは注目すべきことであり、ＩＬ−１８シグナリングはプラークの不安定性に関する主要な決定要素であることが示された。
【０１４１】
ａｐｏＥ  ＫＯマウスから得られた結果とヒトの疾患との関連性は、急性冠症候群の患者における循環ＩＬ−１８のレベル上昇、および脳卒中の原因である不安定な頚動脈のアテローム性プラークにおけるＩＬ−１８産生の増加という、我々の発見によって強化された。総合すると、これら発見は、アテローム性プラークの発達を予防および治療するための、およびプラーク合併症を制限するための新しい重要な治療手段として、ＩＬ−１８活性の阻害剤を同定する。
【０１４２】
実施例６：高レベルのＩＬ−１８は心不全患者における再発現象と相関関係にある
ＩＬ−１８レベルは、ＩＬ−１８に特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡによって、患者の血液血清において測定された。
【０１４３】
合計すると、心不全を伴うまたは伴わない虚血性または非虚血性の５６人の患者について検査した。
【０１４４】
のちに亡くなった患者のＩＬ−１８レベルは、死という結果を免れた患者のレベルである１１２．２±１２．２ｐｇ／ｍｌに対して、２１６．０±４１．５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４５】
死、再虚血、再血管新生、アテローム性動脈硬化症の進行または心不全による再入院などのあらゆる再発現象の患者において、以下のＩＬ−１８レベルが測定された：１６５．８±２３．８対あらゆる再発現象のない患者の場合の１０７．７±１４．６（ｐ＝０．０３）。
【０１４６】
それらの結果により、再発現象または死などのよくない臨床予後を有する患者において、ＩＬ−１８レベルは顕著に上昇されていることが明らかになった。
【０１４７】
心不全を伴うまたは伴わない１６人の非虚血性の患者における血液試料は、そのＩＬ−１８レベルについて測定された。その中でのちに亡くなった患者のレベルは、生存している患者のレベルである９５．３±２０．４ｐｇ／ｍｌに対して、１９９．０±３４．８ｐｇ／ｍｌであった（ｐ＝０．０９）。
【０１４８】
何らかの再発現象を伴う患者：１４６．６±３４．４ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１８に対し、再発現象を伴わない患者の場合９５．４±２３．９ｐｇ／ｍｌ（ｐ＝０．０３）。患者の数が少数であるため、ＩＬ−１８レベルの違いは統計的な有意差には届かなかったが、ＩＬ−１８レベルの上昇への明らかな方向性が観察された。
【０１４９】
虚血患者のＩＬ−１８レベルは、生存している患者の１１８．４±１２．８ｐｇ／ｍｌに対して、２１４．２±４５．９ｐｇ／ｍｌであった（ｐ＝０．００７）。
【０１５０】
何らかの再発現象を有する患者において、ＩＬ−１８は、あらゆる再発現象を伴わない患者のレベルである１１６．２±１６．０ｐｇ／ｍｌに対して、１６２．８±２４．７ｐｇ／ｍｌと測定された。
【０１５１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、それぞれ酸化リポタンパク質のみを用いるインキュベーション、または酸化リポタンパク質とＩＬ−１８抗体またはＩＬ１８ＢＰとの組合わせを用いてインキュベーションの後の、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の生存率を表すヒストグラムを示す。
【図２】  図２は、コントロールの動脈と比較した、アテローム性動脈硬化症の動脈由来のタンパク質抽出物で行なったウエスタンブロットを示す。ウエスタンブロットにおいて、ＩＬ−１８ＢＰ（ｈＩＬ１８ＢＰ）、ＩＬ−１８受容体αサブユニット（ｈＩＬ１８Ｒα）、ＩＬ−１８（ｈＩＬ１８）およびカスパーゼ−１（カスパーゼ−１ｐ１０）に対する抗体を用いた。
【図３】  図３は、アテローム性プラークの細胞における、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示すエチジウムブロマイド染色されたアガロースゲルを示す。
【図４】  図４は、症候性および無症候性プラークにおけるｈα−アクチン（コントロール）発現と比較された、アテローム性プラークにおけるＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。
【図５】  図５は、マウスにおいて筋肉内エレクトロトランスファーに用いた発現ベクターのマップを示す。
【図６】  図６は、アテローム性動脈硬化症の動脈において脂質染色される面積を表すヒストグラムを示す。脂質沈着のコンピュータによる定量的画像解析。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．を表す（空のプラスミドはｎ＝１９、ＩＬ−１８ＢＰのプラスミドはｎ＝１４）。４つのアステリスクはＰ＜０．０００１を示す。
【図７】  図７は、コントロール（空のプラスミド）と比較された、ＩＬ−１８ＢＰ治療の後の大動脈洞の病巣面積を表すヒストグラムを示す。病巣の面積のコンピュータによる定量的画像解析。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．を表す（空のプラスミドはｎ＝１９、ＩＬ−１８ＢＰのプラスミドはｎ＝１４）。２つのアステリスクはＰ＜０．０１を示す。
【図８】  図８は、病巣の炎症細胞内容物におけるＩＬ−１８ＢＰ処理の効果を示す。コンピュータによる定量的画像解析は、コントロールのマウス（マクロファージ染色に関してｎ＝１２、Ｔリンパ球染色に関してｎ＝１５）またはＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウス（マクロファージ染色に関してｎ＝１３、Ｔリンパ球染色に関してｎ＝１２）の大動脈洞の病巣における、マクロファージ陽性面積の割合（黒のバー）およびｍｍ2あたりの浸潤しているＴリンパ球の数（灰色のバー）を決定するために用いられた。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．を表す。３つのアステリスクはＰ＜０．００５を示し、４つのアステリスクはＰ＜０．０００１を示す。
【図９】  図９は、病巣の平滑筋細胞およびコラーゲン容量におけるＩＬ−１８ＢＰ治療の効果を示す。コンピュータによる定量的画像解析は、コントロールのマウス（平滑筋細胞に関してｎ＝６、コラーゲンに関してｎ＝１１）およびＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウス（平滑筋細胞に関してｎ＝６、コラーゲンに関してｎ＝１３）の大動脈洞の病巣における、平滑筋細胞陽性面積の割合（黒のバー）およびコラーゲン堆積（灰色のバー）を決定するために用いられた。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．を表す。１つのアステリスクはＰ＜０．０５を示し；２つのアステリスクはＰ＜０．０１を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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