(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
象牙質由来のヘパラン硫酸に反応する抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体であって、受託番号FERM BP-11009で規定されるハイブリドーマによって産生されることを特徴とする、抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体。
【請求項２】
石灰化していない象牙前質部分に特異的に強く反応することを特徴とする、請求項１に記載の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体。
【請求項３】
ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、及びコンドロイチンとは実質的に反応しない、請求項１又は２に記載の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体。
【請求項４】
イムノグロブリンのサブクラスがIgMである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体。
【請求項５】
受託番号FERM BP-11009で規定されるハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体と単離された象牙質由来の試料を反応させ、その反応性から象牙質の発達を評価することを特徴とする、象牙質の評価方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含む、象牙質発達評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、象牙質由来のヘパラン硫酸に特異的な新規モノクローナル抗体、および前記モノクローナル抗体を利用した象牙質発達（再生象牙質）の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、動物の細胞表面および細胞外マトリクスに存在し、細胞分化、形態形成、細胞接着などに関わるなど、生体において様々な役割を果たしていることが知られている。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、コア蛋白質にヘパラン硫酸鎖が結合しており、この糖鎖を介して細胞外マトリクスや細胞増殖因子と結合し、細胞の増殖、分化、および接着などを制御している。ヘパラン硫酸は、グルクロン酸とＮ-アセチルグルコサミンの２糖の繰り返し構造を前駆体として、硫酸化やエピマー化などの修飾を受けて多様な構造になる。多くの場合、生理学的な活性に必要なのはオリゴ糖程度の鎖長で、その糖鎖長と糖鎖配列、および特異的な硫酸基の配置が細胞の機能にとって重要であり、細胞の性質によって特異なパターンを示し、特異なタンパク質と相互作用する。癌などの疾病では糖鎖構造に異常が見られ、ヘパラン硫酸が細胞接着に重要であることから癌の転移にかかわると考えられている。また、実験動物において、ヘパラン硫酸合成酵素の遺伝子変異により重篤な異常がもたらされることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
このように、ヘパラン硫酸がヒトおよび動物にとって重要な構成成分であり、形態形成の段階や疾病などによって変化が見られることから、生体から抽出・単離したヘパラン硫酸の解析は、組織の発達段階などの評価や、癌の診断のために、非常に有効な方法になると考えられる。近年、実用に向けて研究が進められている再生医療においても、再生組織の評価、さらには組織形成の制御などに、ヘパラン硫酸を用いた組織評価技術が役に立つものと考えられる。
【０００４】
組織に存在するヘパラン硫酸を、標識、検出、あるいは単離することによってヘパラン硫酸の性質を解析し、組織評価などを行うためには、目的とする組織に含まれるヘパラン硫酸に効率よく結合するモノクローナル抗体が非常に有用である。
【０００５】
ヘパラン硫酸プロテオグリカンの抗体としては、コアタンパク質に結合する抗体が作製されているが、糖鎖部分に特異的に結合する抗体は少ない。これまでに、ヘパラン硫酸鎖に結合する抗体としては、ヘパラン硫酸を豊富に含む組織や細胞から、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを精製して抗原とすることにより、ヘパラン硫酸を認識する抗体を作製したという報告がある（特許文献１及び２）。また、ファージディスプレイ法を用い、組織から抽出したヘパラン硫酸に対して、特異性の異なる複数の一本鎖抗体がスクリーニングされている（非特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、特に免疫や抗体スクリーニングのために、ヘパラン硫酸、あるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンを精製物として相当量得るためには、多量の生体試料が必要であり、例えば歯の象牙前質などのように単離の難しい組織からヘパラン硫酸を精製して象牙質由来のヘパラン硫酸に特異的な抗体を作製することは困難であった。
【０００７】
一方、前述のとおり、ヘパラン硫酸は、その活性に必要な糖鎖と硫酸基の配置が、組織やその発達段階（非特許文献３及び４）、あるいは特定の状態（病態）に応じて多様に変化するため（非特許文献５） 、ある組織由来のヘパラン硫酸に特異的な抗体が別な組織由来のヘパラン硫酸に対して同様の反応性を示すわけではない。すなわち、ある特定の部位や状態（病態）に特徴的なヘパラン硫酸に対して鋭敏に反応するモノクローナル抗体が得られれば、それはそのような組織や状態（病態）を見分けるためのツールとして有用である。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−５２８８９号（特許第３００６９４３号）
【特許文献２】特開２００７−７８７０５号
【非特許文献１】永井克孝監修「未来を拓く糖鎖科学」(2005)、金芳堂
【非特許文献２】van Kuppevelt, T. H. et al., J Biol Chem 273(21): 12960-6. (1998)
【非特許文献３】Ledin, J. et al., J Biol Chem 279(41): 42732-41 (2004)
【非特許文献４】van den Born, J. et al., J Biol Chem 280(21): 20516-23 (2005)
【非特許文献５】Nakanishi, H. et al., Biochem J 288: 215-224 (1992)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、組織特異的なヘパラン硫酸糖鎖を解析するために、各組織に含まれる多様なヘパラン硫酸糖鎖に対して、優れた特異性を示すモノクローナル抗体を提供することにある。また、かかるモノクローナル抗体を利用した再生象牙質の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する組織を免疫原として予め免疫感作したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により作製されたハイブリドーマから産生されるサブクラスIgMの抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体が、免疫原とした組織中に存在するヘパラン硫酸に特異的に結合することを見出した。これにより、組織からヘパラン硫酸を抽出および精製することなく、組織に存在するヘパラン硫酸に対して結合する抗体を得た。
【００１１】
すなわち、本発明は、象牙質由来のヘパラン硫酸に強く（特異的に）反応する抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体であって、その反応が象牙質の発達につれて強くなることを特徴とする抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体に関する。
【００１２】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、特に石灰化していない象牙前質部分に強く反応する。また、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、及びコンドロイチンとは実質的に反応しない、抗ヘパラン硫酸鎖に特異的なモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体のイムノグロブリンのサブクラスはIgMである。
【００１４】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体の好適な一例としては、受託番号FERM BP-11009で規定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００１５】
本発明はまた、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を産生する前記ハイブリドーマ（受託番号FERM BP-11009）も提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を用いた象牙質発達の評価方法も提供する。この方法では、単離された象牙質由来の試料と本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を反応させ、その反応性から象牙質の発達を評価する。
【００１７】
さらに本発明は、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を構成要素とする、象牙質発達評価用キットも提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、象牙質由来のヘパラン硫酸に特異的に反応し、しかもその反応性は象牙質の発達につれて強くなるという特徴を有する。したがって、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を用いることにより、象牙質の発達を評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
１．本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、ヘパラン硫酸を含有する象牙質組織で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、象牙質由来のヘパラン硫酸鎖に対して強く反応する。
【００２０】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、ヘパラン硫酸が結合したコアタンパク質には反応せず、ヘパラン硫酸鎖部分にのみ反応する。また、実質的に他の酸性複合糖質とは反応せず、ヘパラン硫酸にのみ強く反応する特異性の高い抗体である。
【００２１】
さらに、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、歯胚において、石灰化していない象牙前質部分に強く反応し、その反応性は象牙質の発達につれて強くなるという特長を有する。また、歯牙においても象牙前質部分に強く反応し、歯髄と象牙質の境界を明瞭に示すことができる。そのため、後述するよう、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、象牙質の発達（再生象牙質）を評価するために利用できる。
【００２２】
２．本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体の作製方法
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体の作成には、これを産生する新規なハイブリドーマの確立が必須である。前記ハイブリドーマは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む組織で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合して作製したハイブリドーマから、目的とする象牙質由来のヘパラン硫酸に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜することにより得ることができる。
【００２３】
免疫原として用いるヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む組織としては、例えば歯胚象牙質、象牙芽細胞などを選ぶことができる [Bai, X. M. et al., J Histochem Cytochem 42(8): 1043-54. (1994)]。
【００２４】
例えば、ヘパラン硫酸を含む生体組織は、まずパラホルムアルデヒドなどの蛋白質架橋作用をもつ薬剤を用いて固定処理したのち、象牙質などの硬組織を含む場合には10 ％ ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, pH 7.4）などを用いて硬組織を脱灰処理する。次に、固定、脱灰処理した組織を粉砕して、アジュバンドと共に、マウスの皮下、腹腔内、あるいは静脈内に投与する。免疫するマウスとしては、BALB/cマウスなどを用いることができる。マウスへの免疫原の投与は、例えば14日ごとに数回行った後、細胞融合前（たとえば、3日前）に、アジュバントと混合していない抗原溶液を腹腔に注射し、最終免疫とする。
【００２５】
最終免疫を行なったマウスの脾臓、あるいはリンパ節を取り出して、得られるリンパ球を細胞融合に供する。融合するミエローマ細胞としては、SP2（Sp2/O-Ag14）、NS1（P3/NSI/1-Ag4-1）などが挙げられる。リンパ球に対してミエローマ細胞を、例えば10:1の割合で混合する。細胞融合には、ポリエチレングリコール法などを用いることができる。
【００２６】
融合操作後の細胞は96穴マルチウェルプレートに分注し、ハイブリドーマを選抜するため、HAT培地で培養する。細胞が増殖して96穴プレートにおいて単一コロニーを形成している穴の培養上清を回収し、免疫染色法で目的の抗原物質を含む組織に強く結合、あるいはELISA法などによって目的の抗原を含む組織の可溶化成分に強く反応する穴を選択し、限界希釈法などによりハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、最低2回行い、例えば1回目のクローニングでは、HT培地を用い、2回目のクローニングでは通常のRPMI1640培地を用いる。細胞融合後の培養、およびクローニングの培養では、マウス脾臓より調製したフィーダー用脾臓細胞を適量（たとえば、1 x 105個/ 穴ずつ）96穴マルチウェルプレートに播種する。2回のクローニングにおいて、ウェルに単一コロニーを形成し、なおかつ目的の抗原を含む組織あるいはその可溶化物に強く反応するハイブリドーマを選択する。
【００２７】
クローニングで樹立したハイブリドーマを、増殖培地で培養し、細胞がサブコンフルエントになった時点で培養上清を回収することにより、抗体溶液を得る。また、樹立したハイブリドーマをマウスに腹腔に接種することにより、抗体を含む腹水として抗体を得る。このようにして得た抗体を、アフィニティカラムなどを用いて精製し、精製IgMを得る。
【００２８】
抗体が結合する抗原を特定する場合には、精製抗体を結合させたアフィニティカラムなどを用いて、免疫原とした組織から抗体が結合する抗原を精製し、その抗原をアミノ酸分析や質量分析などにより同定することにより、抗原がヘパラン硫酸プロテオグリカンであることを決定することができる。
【００２９】
あるいは免疫原とした組織からmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製して培養動物細胞などにライブラリーごと発現させ、抗体を用いて抗原を発現している細胞を検出して抗原蛋白質の遺伝子をクローニングすることにより、抗原がヘパラン硫酸プロテオグリカンであることを決定することができる。
【００３０】
あるいは抗体を用いたELISA法、あるいはドットブロッティング法などにより、精製ヘパラン硫酸、あるいは精製ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する反応を調べ、抗原がヘパラン硫酸あるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンであることを決定することができる。
【００３１】
決定した抗原がヘパラン硫酸プロテオグリカンであった場合、抗原をタンパク質分解酵素で処理した場合に、抗体の免疫反応が消失しないことを、ELISA法、あるいはドットブロッティング法などで確認することによって、抗体がコアタンパク質ではなく、ヘパラン硫酸鎖に結合していることを決定できる。
【００３２】
ヘパラン硫酸あるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンをヘパリチナーゼ処理した場合に、抗体の免疫反応が消失することを、ELISA法、あるいはドットブロッティング法などで確認することによって、抗体がコアタンパク質ではなく、ヘパラン硫酸鎖に結合していることを決定できる。
【００３３】
３．象牙質発達（再生象牙質）の評価方法
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体の象牙質に対する反応は、試料である象牙質の発達段階に応じて強くなるという特長を有している。そのため、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を用いて、象牙質の発達を評価することができる。象牙質の発達は、特に歯科領域における再生医療において重要である。
【００３４】
具体的には、本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体を、象牙質が含まれる組織切片と反応させ、その反応性から象牙質の発達（再生象牙質）を評価する。抗体の反応性は、公知の免疫染色法（例えば、蛍光色素を用いた蛍光抗体法、ペルオキシダーゼ等の酵素を用いた酵素抗体法、放射性同位元素を結合させたオートラジオグラフィー抗体を用いた方法、金コロイド法等）を用いて評価することができる。反応は、試料に直接抗体を作用させる直接法であっても、二次抗体を用いた間接法であってもよい。
【００３５】
評価は、適当な標準サンプルとの比較により行なうことができるが、経験的に発達段階と染色強度との関係が確立されれば、そのような関係を利用して評価することもできる。
【００３６】
４．象牙質発達（再生象牙質）評価用キット
本発明の象牙質発達（再生象牙質）評価用キットは、抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体をその必須の構成要件として含む。
【００３７】
前記抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。抗体はまた、適当な支持体に固相化されていてもよいし、あるいは固相化可能なように別個に支持体がキットに含まれていてもよい。そのような支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド等の蛋白を付着可能な合成樹脂、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、及びアガロース製の支持体、あるいはゲル型支持体を使用することができる。支持体の形態は特に限定されないが、極小球あるいはビーズ（例えば“ラテックス”ビーズ）などの微粒子、微量遠心チューブなどのチューブ（内壁）、マイクロタイタープレート（ウェル）等の形態で提供される。
【００３８】
本発明のキットは本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体のほか、必要に応じて、ラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素、基質等、本発明の実施に必要な他の要素を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：抗体産生ハイブリドーマクローンC11C2の作製
（１）抗原の調製
ブタ下顎より摘出した第三臼歯埋伏歯歯胚を、4 ％ パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（phosphate-buffered saline, PBS）に浸漬し、撹拌しながら室温で24時間固定した。PBSで洗浄したのち、10 ％ ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 溶液 (pH 7.4）に一週間浸漬して脱灰処理した。脱灰後の組織より象牙質のみを分離し、液体窒素により凍結・破砕して粉末状にし、プロテアーゼ阻害剤（CompleteTM, Boehringer Mannheim社）を含む10 ％ グリセロール / PBSに懸濁した。この懸濁液を、ホモジナイザー（機械的破砕機）を用いて氷上で5分間処理し、続いてソニケーター（超音波破砕機）を用いて氷上で5分間破砕処理した。こうして得られた懸濁液は可溶画分と不溶画分二層に分離したが、免疫感作には、皮下注射に使用する26Gの注射針を通過できる画分を抗原として用いた。
【００４０】
（２）ハイブリドーマの作製
抗原20μl（1 μg / μl）を等量の完全アジュバンド（Imject（登録商標）Freund’s Complete Adjuvant, PIERCE社）と混合して、BALB/cマウス（メス、5週齢、日本チャールスリバー社）皮下に注射して感作した。2回目以降の免疫感作は14日ごとに、完全アジュバンドを不完全アジュバンド（Imject（登録商標） Freund’s Incomplete Adjuvant, PIERCE社）に替えて、同様に行った。マウス尾静脈から採取した血液から調製した血清を段階希釈し、ELISA法（後述）により、抗原に対して強い陽性反応を示すことを確認した。細胞融合の3日前に、アジュバントと混合していない100 μg / 200 μl/ 匹の抗原溶液を腹腔に注射し、最終免疫とした。3日後にマウスの脾臓を取り出して脾臓細胞を分散し、脾臓細胞に対してマウスの骨髄腫由来の細胞NS1（P3/NSI/1-Ag4-1，大日本製薬）を10:1の割合で混合して、分子量1500のポリエチレングリコール（PEG，Roche社）を用いて細胞融合を行った。まず混合した細胞を1000 rpmで5分間遠心し、培地を完全に除去した後、PEGをゆっくりと滴下して脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させた。ここにHEPES培地 [RPMI 1640培地 （Gibco社), 10 mM HEPES (ICN社)]をゆっくりと滴下して細胞を懸濁し、1000 rpmで5分間遠心し、PEGを含んだHEPES培地を完全に除去した。融合後の細胞は脾臓細胞が2 x 106 cells / mlになるように、増殖培地 [RPMI1640培地，10 % FBS（CELLect（登録商標） GOLD FBS, ICN社）] を加え、8連のマルチチャンネルピペットを用いて、予め腹腔フィーダー細胞が1 x 105個ずつ播種されている96穴マルチウェルプレート（MICROTESTTMTissue Culture Plate, BD Falcon社）に100 μlずつ播種した。１匹のマウスから摘出して融合した細胞懸濁液を、96穴マルチウェルプレート10枚に播種した。1日後、各ウェルにHAT培地 [RPMI1640培地， 50× HAT液(大日本製薬)，10% FBS]を100 μlずつ添加し、脾臓細胞と融合したミエローマ細胞（ハイブリドーマ）のみが成育できるよう、選択培養した。
【００４１】
（３）ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合14日後に、細胞を播種した96穴マルチウェルプレートから単一のコロニーが存在する穴を選択し、各穴より培養上清を採取した。ELISA法（後述）により、抗原と陽性反応を示す抗体を産生しているハイブリドーマを選抜した。続いて、選抜したハイブリドーマの培養上清を用いて、ブタ歯胚組織切片における免疫組織染色法（後述）により、陽性反応を示す抗体を産生する穴を選抜した。２種類のスクリーニングで陽性を示した穴のハイブリドーマについて、２回のクローニングを行った。各クローニングにおける抗体スクリーニングは、細胞融合後と同様に行った。
【００４２】
（４）ELISA法によるスクリーニング
ELISA法のサンプルとしては、歯胚の象牙質およびエナメル質を、蛋白質可溶化液(4Mグアニジン, 250 mM EDTA, プロテアーゼ阻害剤)で処理し、可溶化液で透析した外液を非コラーゲン画分として回収、濃縮および脱塩して用いた。調製した非コラーゲン画分の蛋白質溶液（総蛋白質濃度100 μg / ml）を100 μlずつ96穴のELISAプレート（MaxiSorpTM Surface, Nunc社）に添加し、4 ℃に一晩置いてプレート底面に固相化した。Block Ace（大日本製薬）により、ブロッキングしたのち、ハイブリドーマ培養上清（または免疫感作したマウスの血清 5000倍希釈）を一次抗体として100μlずつを各穴に添加した。その後、洗浄バッファー（0.05 % Tween 20 / PBS）で洗浄し、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgGM抗体（1/5000希釈、Promega社）を100μlずつ添加して37 ℃で1時間インキュベートした。洗浄バッファーで3回洗浄し、発色基質（pNPP ALKALINE PHOSPHATASE, CHEMICON社）を加え、プレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。吸光度の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
【００４３】
（５）ハイブリドーマ培養上清を用いた免疫組織染色法によるスクリーニング
ブタ下顎より摘出した第3大臼歯の埋伏歯歯胚およびブタ歯胚細胞由来再生組織を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBSに浸漬し、撹拌しながら室温で1日間固定した。PBSで洗浄した後、室温で10％EDTA（pH 7.4）に10日間浸漬して脱灰処理した。水洗した後、エタノール希釈系列およびキシレンを通してパラフィンに包埋し、ミクロトームで厚さ5μmの切片を作製した。脱パラフィンした切片を、抗体の組織への非特異的吸着を阻害するため、ブロッキング剤（DAKO Protein Block，DAKO社）を用いて、室温で1時間処理した。1次抗体となるハイブリドーマの培養上清を滴下し、4 ℃で一晩反応させた。0.05 % Tween 20 を含むPBSで洗浄後、二次抗体としてビオチン標識抗マウスIgG抗体(VECTASTAIN ABC Elite, Vector 社)を１時間処理し、0.05 % Tween 20を含むPBSで洗浄した。内在性のペルオキシダーゼを不活化するため、0.3％H2O2を含むメタノールで30分処理した。0.05 % Tween 20 を含む PBSによる洗浄後、発色酵素となる西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxydase, HRP）で標識したアビジン-ビオチン複合体（VECTASTAIN ABC Elite, Vector 社）と30分反応させた。0.05 % Tween 20 を含むPBSにより洗浄し、ジアミノベンジジン(DAB 発色基質, Vector 社)を加え4分経過後、脱イオン水により発色反応を停止させた。象牙質と象牙芽細胞に強い発色反応を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
【００４４】
（６）ハイブリドーマのクローニング
スクリーニングで選んだマルチウェルプレートの穴において、ほぼコンフルエントになった細胞をパスツールピペットで懸濁し、ピペットの先端約2 cmのところまで細胞液を吸引した。1次クローニングでは、細胞液を20 mlのHT培地 [RPMI1640培地，50× HT液(大日本製薬)，10% FBS]に懸濁した。2次クローニングでは、細胞液を20 mlの増殖培地に懸濁した。この懸濁液をもとに、最大1000倍希釈までの4系列の希釈液を作製した。この希釈液を、脾臓フィーダー細胞が1 x 105個/穴ずつ播種されている96穴マルチウェルプレートに、100 μl/穴ずつ分注した。培養後、96穴マルチウェルプレートにおいて単一のコロニーが存在する穴を選択して培養上清を採取し、前述のスクリーニングに用いた。
【００４５】
上記スクリーニングにより選択されたハイブリドーマクローンをC11C2と命名した。ハイブリドーマクローンC11C2は、2007年8月21日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター 中央第6）に受託番号FERM BP-11009として寄託されている。 
【００４６】
（７）ハイブリドーマクローンC11C2培養上清の調整および細胞の凍結保存
2次クローニングの後のスクリーニングで選んだモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンC11C2を、細胞培養フラスコ（175 cm2）を用いて増殖培地で培養し、サブコンフルエントになった時点で、細胞と培養上清を回収した。細胞を凍結液セルバンカー（日本全薬工業）で2×106cells / mlに懸濁し、1  mlずつ凍結保存した。培養上清中には、ハイブリドーマクローンC11C2が産生した抗体が分泌されており、以下、ハイブリドーマクローンC11C2由来のモノクローナル抗体をC11C2抗体とする。
【００４７】
（８）抗体サブクラスの決定
マウスモノクローナル抗体タイピングキット（IgFast，BIOCYTEX社）を用いて、C11C2抗体のサブクラスをIgMと同定した。
【００４８】
実施例２：精製C11C2抗体の調製
BALB/cマウス（メス、5週齢、日本チャールスリバ社）の腹腔に、ハイブリドーマを接種する1週間から10日前に300 μl/ 匹の2,6,10,14-Tetramethy pentadecane (通称：プリスタン)を注射した。C11C2抗体を産生するハイブリドーマを、増殖培地で培養し、サブコンフルエントになった時点で細胞を回収した。2×106cells / mlになるようにHEPES培地に細胞を懸濁し、予めプリスタンを注射してあるマウスの腹腔内に、500μl/ 匹ずつ細胞懸濁液を注射した。注射から1から2週間程度後に、腹腔内に貯留した腹水を回収した。
【００４９】
腹水を12000 rpmで10分間遠心し、細胞などの沈査をとらないようにして上清を回収した。20 μlの上清を3.5 mlの 結合緩衝液［300 mM塩化ナトリウム/10 mM リン酸緩衝液（pH 6.8）］で希釈し、0.45μmのシリンジフィルターでろ過し、1 gのImmuno Assist MG-PP (関東化学)を充填して結合緩衝液で平衡化したカラムに載せた。2 mlの結合緩衝液を8回流して、結合していない蛋白質を洗浄した。続いて、1 mlの溶出緩衝液［300 mMリン酸緩衝液（pH 6.8）］を6回流して、2から4回目の溶出液を回収することにより、精製IgMを得た。精製IgM回収画分については、カラムからの流出、洗浄、溶出の各回の液を回収し、SDS-PAGE電気泳動による精製モニタリング、および抗IgM抗体（ICN/ CAPPEL 社）を用いたドットブロット法によるIgM含量の比較により決定した。溶出2,3および4回目の画分において、SDS-PAGEゲルで精製されたIgMのバンドが見られ、ドットブロットでIgMが多く含まれていることを確認した。その結果を図1に示す。
【００５０】
SDS-PAGE電気泳動では、各液20μlをサンプルバッファー（3 % β-メルカプトエタノール, 3 % SDS, 10 % グリセロール, 0.3 % ブロモフェノールブルー）と混ぜて95℃で5分間熱変性したのち、7.5％アクリルアミドゲルにローディングして泳動した。泳動後のゲルをゲルコード（PIERCE社）で染色した。
【００５１】
ドットブロット法では、PBSに浸漬したPVDFメンブレンを96穴ブロッターに装着し、カラムから回収した各液を10 μlずつ各穴に分注し、2時間おいてメンブレンに吸着させた。残液を排出した後にBlock Ace（大日本製薬）を用いてブロッキング処理し、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgM抗体（1/1000希釈、ICN/ CAPPEL社）を50分間処理し、0.05 ％ Tween20を含むPBSで洗浄した。ブロッターからはずしたメンブレンを10％Block Aceを含むPBSで30分間ブロッキング処理した後、Western Blue（Promega社）で10分間発色反応をした。
【００５２】
回収した溶出2, 3および4の画分をまとめて、濃縮カラムセントリプラスYM-100（MILLIPORE社）にのせ、４℃、3000gで遠心濃縮した後、PD-10カラム（GE Healthcare社）を用いて、10％グリセロールを含むPBSにバッファー置換し、蛋白濃度 1 mg/ mlに調製した。
【００５３】
実施例３：C11C2によるヘパラン硫酸結合活性および結合特異性の検証
（１）ELISA法によるC11C2のヘパラン硫酸に対する結合活性の測定
精製ヘパラン硫酸（生化学工業）を0.1M Sodium Acetate バッファー（pH 7.0）に溶解し、希釈系列を作製して100 μlずつ96穴のELISAプレート（MediSorpTM Surface, Nunc社）に分注した。ヘパラン硫酸の希釈系列は、96穴のELISAプレートに100 μlずつ分注したときに、１穴あたり0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μgとなるように調製した。ヘパラン硫酸溶液を分注したプレートを4 ℃に一晩置いてプレート底面にヘパラン硫酸を固相化した後、Block Ace（大日本製薬）を用いてブロッキング処理し、精製抗体溶液（1 mg/ ml）を10％Block Ace をふくむPBSで1/100に希釈して100 μlずつ各ウェルに添加し、2時間処理した。その後、洗浄バッファー（0.05 % Tween 20 / PBS）で洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgM 抗体(1000倍希釈, ICN/CAPPEL社)溶液を２次抗体として100 μlずつ添加して2時間処理した。洗浄バッファーで3回洗浄し、発色基質（pNPP ALKALINE PHOSPHATASE, CHEMICON社）を100μlずつ加え、3時間反応させた後、プレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。これにより、抗体C11C2のヘパラン硫酸に対する結合活性を測定した。その結果を図２に示す。ヘパラン硫酸の濃度が高くなると吸光度が高くなることから、C11C2は、ヘパラン硫酸に結合する抗体であることが示された。
【００５４】
（２）精製ヘパラン硫酸に対するヘパリチナーゼ消化の影響
精製ヘパラン硫酸（生化学工業）を0.1M Sodium Acetate バッファー（pH 7.0）で0.1 μg/ μlの濃度になるように溶解し、100 μlずつ96穴のELISAプレート（MediSorpTMSurface, Nunc社）に分注することにより各穴あたり10μgずつヘパラン硫酸を入れ、プレートを4 ℃に一晩置いてプレート底面にヘパラン硫酸を固相化した。10 mM Calcium Acetate を各穴に100 μlずつ加えて軽くピペッティングした後、ヘパリチナーゼ（生化学工業）を0.1M Sodium Acetate バッファーで各濃度に希釈して20 μlずつ加え、軽くピペッティングした後に37℃で2時間処理した。ヘパリチナーゼの量は、プレートの各穴あたり、0, 0.0025, 0.01, 0.04, 0.16, 0.645, 2.58 ミリ unitとなるようにした。洗浄バッファー（0.05 % Tween 20 / PBS）で洗浄し、Block Ace（大日本製薬）を用いてブロッキング処理し、精製抗体溶液（1 mg/ ml）を10％Block Ace をふくむPBSで1/100に希釈して100 μlずつ各ウェルに添加し、2時間処理した。洗浄バッファーで洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgM 抗体(1000倍希釈, ICN/CAPPEL社)溶液を2次抗体として100 μlずつ添加して2時間処理した。洗浄バッファーで3回洗浄し、発色基質（pNPP ALKALINE PHOSPHATASE, CHEMICON社）を100μlずつ加え、4時間反応させた後、プレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。C11C2抗体のほかに、ヘパラン硫酸をヘパリチナーゼで消化した時に生じる新しいエピトープを認識する抗体3G10（生化学工業）を対照に用いた。その結果を図３に示す。C11C2抗体は、ヘパリチナーゼの濃度が高くなり、ヘパラン硫酸が消化されることによって反応を示さなくなることから、ヘパラン硫酸に結合する抗体であることが確かめられた。
【００５５】
（３）C11C2抗体の特異性
C11C2抗体の各種酸性ムコ多糖に対する反応を調べるために、精製酸性ムコ多糖に対する反応をドットブロッティング法により比較した。ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸（すべて生化学工業）を超純水で2 μg/ μlの濃度で溶解した。PBSに浸漬したPVDFメンブレンを96穴ブロッターに装着し、各種酸性ムコ多糖溶液を10 μlずつ各穴に分注し、陰性コントロールとしてPBSを10 μl のせ、2時間おいてメンブレンに吸着させた。残液を排出した後にBlock Ace（大日本製薬）を用いてブロッキング処理し、精製抗体溶液（1 mg/ ml）を10％Block Ace をふくむPBSで1/100に希釈して90μlずつ各ウェルに添加し、2時間処理した。0.05 ％ Tween20 を含むPBSで洗浄後、二次抗体としてビオチン標識抗マウスIgG抗体(VECTASTAIN ABC Elite, Vector 社)を50分間処理し、0.05 ％ Tween20を含むPBSで洗浄した。ペルオキシダーゼ標識アビジン-ビオチン複合体(VECTASTAIN ABC Elite)で30分処理し、0.05 ％ Tween20を含むPBSで洗浄した。ブロッターからはずしたメンブレンを10％ Block Aceを含むPBSで30分間ブロッキング処理した後、ジアミノベンジジン(DAB 発色基質, Vector 社)で10分間発色反応をした。その結果を図４に示す。
【００５６】
その結果、C11C2抗体は、各種酸性ムコ多糖をブロッティングしたドットのうち、コンドロイチン、コンドロイチン-6-硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、ヘパリンに対しては反応せず、ヒアルロン酸とは非常に弱く反応し、実質的にヘパラン硫酸のドットにのみ明らかな陽性反応を示した。すなわち、C11C2抗体は、ヘパラン硫酸に特異的に強く反応することが確認された。
【００５７】
実施例４：歯胚組織に含まれるヘパラン硫酸に対するヘパリチナーゼ消化の影響
実施例１と同様にブタ歯胚のパラフィン切片を作製し、脱パラフィンした後に、ヘパリチナーゼ（生化学工業）を濃度0.005 ミリ unit/ μlにした溶液（50 mM sodium acetate bunffer (pH 7.0), 5 mM calcium acetate）で37℃、2時間処理した。PBSで洗浄した後、抗体の組織への非特異的吸着を防ぐためにブロッキング剤（DAKO Protein Block，DAKO社）で30分間処理した。精製抗体溶液（1 mg/ ml）をPBSで1/100に希釈して切片に処理し、4℃で1晩反応させた。0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄後、二次抗体としてビオチン標識抗マウスIgG抗体(VECTASTAIN ABC Elite, Vector 社)を30分間処理し、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄した。内在性のペルオキシダーゼを不活化させるため、0.3 ％過酸化水素水を含むメタノールで30分間処理した後、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識アビジン-ビオチン複合体(VECTASTAIN ABC Elite, , Vector 社)で30分処理、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄した。ジアミノベンジジン(DAB 発色基質, , Vector 社)で2分間発色反応をした後に水洗し、ヘマトキシリンで対比染色をした。その結果を図５に示す。ヘパリチナーゼ処理で組織に含まれるヘパラン硫酸が消化されることによって、組織切片におけるC11C2抗体の反応が失われることから、組織切片に結合するC11C2抗体は、組織に含まれるヘパラン硫酸に特異的に反応していることが明らかとなった。
【００５８】
市販の抗ヘパラン硫酸抗体10E4（生化学工業）を用いて、上記と同様の試験を行なったところ、石灰化していない象牙前質を含めて象牙質に対する特異的反応は検出されなかった。象牙芽細胞周辺の染色が、ヘパリチナーゼ処理によって消失したことから、10E4が組織に含まれるヘパラン硫酸に反応していることは示されたが、象牙質との反応については、C11C2とは異なることが明らかとなった。
【００５９】
実施例５：ヘパラン硫酸の検出による歯胚における象牙質発達の評価
実施例１と同様にブタ歯胚のパラフィン切片を作製し、脱パラフィンした後に、免疫染色前の抗原賦活処理として、Proteinase K（2546, Ambion社）を濃度100 μg/ mlでPBSに溶かした酵素液をスライドグラス上の切片に載せて10分間処理し、PBSで洗浄した。次に、抗体の組織への非特異的吸着を防ぐために、ブロッキング剤（DAKO Protein Block，DAKO社）を用いて、10分間処理した。精製抗体をPBSで1/ 100に希釈して切片に処理して4℃で一晩反応させ、0.075 ％ Brij35 (Sigma-Aldrich社) を含むPBSで洗浄した。二次抗体として、1/ 20に希釈したfluorescein isothiocyanate （FITC）標識抗マウスIgG抗体（GE Healthcare Bio-Sciences社）を2時間処理し、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄した。Bisbenzimide Hoechst33258（和光純薬）で核を染色した後、蛍光封入剤Perma Fluor（Thermo Shandon社）で封入した。発達段階の異なる象牙質におけるC11C2抗体による免疫蛍光染色の結果を図６に示す。C11C2抗体は、象牙質の石灰化していない象牙前質部分に強く反応しており、特に発達が進むにつれて反応が強くなる傾向が見られた。
【００６０】
市販の抗ヘパラン硫酸抗体10E4（生化学工業）を用いて、上記と同様の試験を行なったところ、石灰化していない象牙前質を含めて象牙質に対する特異的反応は検出されず、よって発達段階の違いによる染色強度の差は示されなかった。このように、象牙質との反応については、C11C2とは異なることが明らかとなった。
【００６１】
以上のことから、C11C2抗体のヘパラン硫酸に対する反応は歯胚における象牙質の発達を鋭敏に反映し、それゆえ再生象牙質等の評価に利用可能であると考えられた。
【００６２】
実施例６：歯牙組織におけるヘパラン硫酸の検出による歯髄-象牙質境の評価
ブタ下顎より顎骨ごと歯牙を切り出し、4％パラフォルムアルデヒドを含むPBSに浸漬し、撹拌しながら室温で3日間固定した。PBSで洗浄した後、室温で10％クエン酸ナトリウム・22.5％ギ酸混合溶液に30日間浸漬して脱灰処理した。水洗した後、エタノール希釈系列およびキシレンを通してパラフィンに包埋し、ミクロトームで厚さ5μmの切片を作製した。脱パラフィンした後に、抗体の組織への非特異的吸着を防ぐためにブロッキング剤（DAKO Protein Block，DAKO社）で30分間処理した。精製抗体溶液（1 mg/ ml）をPBSで1/100に希釈して切片に処理し、4℃で1晩反応させた。0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄後、二次抗体としてビオチン標識抗マウスIgG抗体(VECTASTAIN ABC Elite, Vector 社)を30分間処理し、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄した。内在性のペルオキシダーゼを不活化させるため、0.3 ％過酸化水素水を含むメタノールで30分間処理した後、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識アビジン-ビオチン複合体(VECTASTAIN ABC Elite, , Vector 社)で30分処理、0.075 ％ Brij35 を含むPBSで洗浄した。ジアミノベンジジン(DAB 発色基質, , Vector 社)で2分間発色反応をした後に水洗し、ヘマトキシリンで対比染色をした。その結果を図７に示す。歯牙において、C11C2は象牙芽細胞の象牙質側、および象牙前質に強く反応することから、歯髄-象前質境界を明瞭に示し、歯髄の外形を示すことができる。これにより、例えば、再生医療における歯牙の部分再生等の評価に利用可能であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体は、象牙質由来のヘパラン硫酸に特異的に反応し、しかもその反応性は象牙質の発達につれて強くなるという特徴を有する。したがって、本発明は象牙質発達（再生象牙質）の評価など、歯科領域において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、実施例２のC11C2抗体精製におけるImmunoPure MG-PPカラムとの結合画分を、SDS-PAGEゲル電気泳動（図1A）および抗マウスIgMμ鎖抗体を用いたドットブロット法（図1B）により調べたものである。SDS-PAGEゲル電気泳動では、ゲルコードにより青色に染まったバンドが見られ、ドットブロット法では、青色に濃く染まったドットの画分に、高い濃度のIgMが存在する。２つのデータより、精製IgMを回収する画分を溶出の2, 3および4（E2 , E3, E4）と決定した。
【図２】図２は、実施例３のELISA法による精製ヘパラン硫酸に対する反応性を示したものである。縦軸は、ELISAで標識に用いたアルカリフォスファターゼに反応する基質の発色を405nmの吸光度で示しており、横軸は、ヘパラン硫酸の濃度を示している。
【図３】図３は、実施例３の精製ヘパラン硫酸をヘパリチナーゼで消化した時のELISA法による反応性を示したものである。縦軸は、ELISAで標識に用いたアルカリフォスファターゼに反応する基質の発色を405nmの吸光度で示しており、横軸は、ヘパリチナーゼの濃度を示している。図3Aは、C11C2抗体の反応を示しており、図3Bは、ヘパラン硫酸をヘパリチナーゼ処理した時に生じるエピトープに反応する3G10抗体（生化学工業）の反応を示している。
【図４】図４は、実施例３のドットブロット法による精製酸性ムコ多糖に対する反応性を示したものである。各ドットに、各酸性ムコ多糖をブロッティングしており、茶色に発色したヘパラン硫酸のドットが陽性である。
【図５】図５は、実施例４の象牙質を含む歯胚組織のパラフィン切片をヘパリチナーゼ処理した場合の、免疫染色法による反応性を示した顕微鏡画像である。（-）はヘパリチナーゼを処理していない組織切片の免疫染色像であり、（+）はヘパリチナーゼを処理した組織切片の免疫染色像である。上段がC11C2抗体の反応であり、下段が市販の抗ヘパラン硫酸抗体10E4（生化学工業）の反応を示している。茶色に発色した部分が、免疫染色の陽性反応である。青色は、ヘマトキシリンによる対比染色の発色である。C11C2および10E4ともにヘパリチナーゼ処理により、組織切片における免疫染色反応が消失した。C11C2にのみ、ヘパリチナーゼ処理しない場合に象牙前質（pd）にもっとも強い反応が見られ、ヘパリチナーゼ処理により反応が消失した。
【図６】図６は、実施例５の、発達段階の異なる象牙質及び象牙芽細胞を含む組織切片を、C11C2あるいは市販の抗ヘパラン硫酸抗体10E4（生化学工業）を用いて免疫蛍光染色した顕微鏡画像である。A-1およびB-1の緑色に発色した部分が、C11C2を用いた免疫染色による陽性反応を示している。
【図７】図７は、実施例６の、歯牙組織切片を、C11C2を用いて免疫染色した顕微鏡画像である。茶色に発色した部分が、免疫染色の陽性反応である。青色は、ヘマトキシリンによる対比染色の発色である。歯髄と象牙質の境界に沿って、強い発色が見られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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