(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子またはナノロッドからなる蛍光標識物質であって、それぞれ表面に生体物質と結合しうる修飾基を有し、かつ、それぞれの表面には修飾基が存在しない領域が設けられており、
上記生体物質と結合しうる修飾基は、ナノ粒子の球面の半面側にのみ存在するか、ナノロッドの円筒面の半面側にのみ存在するか、ナノロッドの片方の底面にのみ存在し、
上記ナノ粒子の平均粒径または上記ナノロッドの平均直径は２〜１０ｎｍであることを特徴とする蛍光標識物質。
【請求項２】
上記修飾基が存在しない領域は、面積がナノ粒子またはナノロッドの表面積の５０％以上であり、ナノ粒子またはナノロッドの表面に連続的に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識物質。
【請求項３】
上記生体物質と結合しうる修飾基は、ナノ粒子またはナノロッドの表面に形成されたアルキル基または未結合手を含むＣを有する物質のカルボキシル化反応を介して導入されたＣＯＯＨ（カルボキシル）基と反応することで導入されたことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光標識物質。
【請求項４】
上記ナノ粒子またはナノロッドの表面に形成されたアルキル基または未結合手を含むＣを有する物質がＳｉＣ、ＳｉＯＣＨ、またはＳｉＣＮＨであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光標識物質。
【請求項５】
上記生体物質と結合しうる修飾基は、ナノ粒子またはナノロッドの表面にＣＯＯＨ（カルボキシル）基またはＮＨ2（アミノ）基を含む物質を形成し、該ＣＯＯＨ基またはＮＨ2基との反応を介して導入されたことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光標識物質。
【請求項６】
上記ＮＨ2（アミノ）基を含む物質がＳｉＮＨまたはＳｉＣＮＨであることを特徴とする請求項５に記載の蛍光標識物質。
【請求項７】
上記生体物質と結合しうる修飾基は、タンパク質、核酸または抗原と特異的に結合しうる修飾基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光標識物質。
【請求項８】
上記ナノ粒子またはナノロッドは、半導体ナノ結晶からなるコアと、該コアよりも大きなバンドギャップを有する物質からなるシェルとを有するコアシェル型であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光標識物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コアシェル型ナノ粒子またはコアシェル型ナノロッドからなる、生体物質を対象とした分析に用いられる蛍光標識物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ粒子は、細胞内の異なる遺伝子やタンパク質を複数の色で染色しその挙動を分析するための蛍光標識物質としてバイオ分野に応用されている（非特許文献１参照）。図１-ａおよび１-ｂは、そのような分野に用いられるコアシェル構造を有する半導体ナノ粒子の例である。この半導体ナノ粒子の表面全体には、がん細胞の表面にある糖鎖を抗原として特異的に認識するレクチンを半導体ナノ粒子に導入するためのカルボキシル基を有する分子からなる、表面修飾層３が形成されている。【０００３】
このような態様の半導体ナノ粒子を用いた場合、レクチンは半導体ナノ粒子の表面全体にわたって導入されるのが一般的である（図２）。この際、実際にがん細胞と結合しない部分に導入されたレクチンは本来の機能を果たさない不要なものである（図３）。また、表面修飾層およびレクチンで表面が覆われることにより、半導体ナノ粒子に入射する励起光（紫外線）や半導体ナノ粒子の発する蛍光が、その表面修飾層およびレクチンに吸収され、実質的な発光効率が低下するという問題がある（図４，５）。【０００４】
また、半導体ナノ粒子の親水性を高め、水溶液中で凝集を起こさない蛍光標識物質とするために、親水性の官能基を有する化合物で表面修飾した半導体ナノ粒子も提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、そのような半導体ナノ粒子においてもやはり表面全体が修飾されているため、上記のような発光効率についての問題がある。
【特許文献１】米国特許第６，２５１，３０３号明細書
【非特許文献１】馬場、応用物理74巻（2005）p1543-1554
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、半導体ナノ粒子またはナノロッドの発光効率を高めることにより、より好適な標識を実現しうる蛍光標識物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、例えばがん細胞表面に存在する糖鎖などの抗原、タンパク質、核酸といった生体物質と吸着するための修飾基を有する半導体ナノ粒子またはナノロッドのシェルの表面の一部に、そのような修飾基が存在しない領域を設けることにより、半導体ナノ粒子またはナノロッドに対する励起光の入射およびこれらの蛍光発光の効率が高まった蛍光標識物質が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
上記修飾基が存在しない領域の面積は、シェルの表面積の５０％以上であることが好ましい。例えば、生体物質と吸着しうる修飾基を、ナノ粒子の球面の半面側にのみ、ナノロッドの円筒面の半面側にのみ、あるいはナノロッドの上面にのみ、またはロッドの底面にのみに存在させることにより、そのような領域の面積を確保することが可能である。【０００８】
上記生体物質と結合しうる修飾基は、ナノ粒子またはナノロッドの表面に形成されたＳｉＣ、ＳｉＯＣＨ、ＳｉＣＮＨ等に含まれる、例えばＣＨ３基などのアルキル基または未結合手を含むＣのカルボキシル化（ＣＯＯＨ化すること）、あるいは、ナノ粒子またはナノロッドの表面にＳｉＮＨ、ＳｉＣＮＨ等のＣＯＯＨ（カルボキシル）基またはＮＨ２（アミノ）基を含む物質を直接形成することなどで、カルボキシル基またはアミノ基をナノ粒子またはナノロッド表面に形成し、これと修飾基を反応させることで導入することができる。【０００９】
本発明において、上記ナノ粒子またはナノロッドは、半導体ナノ結晶からなるコアと、該コアよりも大きなバンドギャップを有する物質からなるシェルとを有するコアシェル型であること、また、このナノ粒子の平均粒径またはナノロッドの平均直径は２〜５０ｎｍであることが望ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、がん細胞を検出するなどの生体物質を対象とした分野において高精度の分析を行うことが可能となる、蛍光の実質的な発光効率が高まった蛍光標識物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】従来の技術の説明図：コアシェル構造を有する半導体ナノ粒子
【図２】従来の技術の説明図：レクチンが導入された半導体ナノ粒子
【図３】従来の技術の説明図：がん細胞に結合した半導体ナノ粒子
【図４】従来の技術の説明図：がん細胞に結合した半導体ナノ粒子への励起光の入射
【図５】従来の技術の説明図：がん細胞に結合した半導体ナノ粒子からの蛍光発光
【図６】ＳｉＣＯＨを用いた本発明（実施例１）の説明図：ナノ粒子の調製およびカルボキシル基の導入
【図７】ＳｉＣＯＨを用いた本発明（実施例１）の説明図：レクチンの導入およびがん細胞への結合
【図８】ＳｉＣＯＨを用いた本発明（実施例１）の説明図：がん細胞に結合した蛍光標識物質への励起光の照射およびその蛍光の発光
【図９】ＳｉＮＨを用いた本発明（実施例２）の説明図：ナノ粒子の調製およびアミノ基の導入
【図１０】ＳｉＮＨを用いた本発明（実施例２）の説明図：レクチンの導入およびがん細胞への結合
【図１１】ＳｉＮＨを用いた本発明（実施例２）の説明図：がん細胞に結合した蛍光標識物質への励起光の照射およびその蛍光の発光
【図１２】Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノロッドを用いた本発明（実施例４）の説明図：ナノロッドの調製
【図１３】Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノロッドを用いた本発明（実施例４）の説明図：表面修飾基の導入
【図１４】シラノール（シランカップリング剤）を用いた本発明（実施例５）の説明図
【符号の説明】
【００１２】
１  コア（ＣｄＳｅ）
２  シェル（ＺｎＳ）
３  表面修飾層
４  レクチン
５  がん細胞
６  正常細胞
７  観測機器または観察者
１１  Ｓｉ
１２  ＳｉＯ２
１３  ＳｉＣＯＨ層
３３  ＳｉＮＨ層
４０  ポリスチレン球
４１  Ｓｉ基板
４２  Ｓｉロッド
４３  ＳｉＯ２
４４  Ｓｉ
４５  Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノロッド
４６  ＳｉＮＨ
５１  ＣＯＯＨ−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３溶液
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（ナノ粒子およびナノロッド）
ナノ粒子およびナノロッド（以下「ナノ粒子類」ということもある。）は、ナノオーダーの粒子中に空間的に励起子を閉じ込め、いわゆる量子閉じ込め効果により、バルク以上の発光強度が得られる蛍光物質である。【００１４】
本発明において、これらのナノ粒子類は、半導体ナノ結晶からなるコアと、該コアよりも大きなバンドギャップを有する物質からなるシェルを有する、いわゆるコアシェル型であることが望ましい。コアとなる物質よりも大きなバンドギャップを有する物質をシェルとすることにより、量子閉じ込め効果を安定化させ、コアシェル構造をもたないナノ粒子類よりも発光強度を高めることが可能である。なお、このようなコアシェル構造を有するナノ粒子の粒径またはナノロッドの直径については、シェル層を含めた部分の粒径または直径をさす。【００１５】
また、ナノ粒子類またはナノロッドは、その粒径または直径により発光強度や蛍光波長が変化することが知られており、所望の粒径または直径のものを適宜調製することが可能である。本発明においては、がん細胞を検出するなどの分析に好適な蛍光を発色し、さらに対象とする生体物質の動きを妨げにくくするなどの点から、ナノ粒子の平均粒径またはナノロッドの平均直径は２〜５０ｎｍであることが好ましく、２〜１０ｎｍであることがより好ましい。ここで、ナノロッドは一般的には２〜５０ｎｍ程度の長さを有する円柱形であり、この円柱形において底面の直径を本発明におけるナノロッドの直径とする。また、ナノロッドが楕円球形である場合は、その最も短い短径を本発明におけるナノロッドの直径とする。【００１６】
なお、このような平均粒径または平均直径は、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）での観察により測定することが可能であり、少なくとも２００個の粒子像を観察した測定値の平均を用いるものとする。【００１７】
上記ナノ粒子類を構成する物質は特に制限されず、例えば、ＣｕＣｌ等のI-VII族化合
物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のII-VI族化合物半導体、ＩｎＡｓ等のIII-V族化合物半導体またはＳｉ等のIV族半導体もしくはこれらの化合物半導体などの結晶を適宜選択して用いることができる。なかでも、環境汚染や人体に対する毒性が懸念される物質を用いることなく、しかも発光が良好であることから、本発明では、Ｓｉからなる半導体ナノ粒子を用いることが好適である。また、上記コアおよびシェルの構成については、例えば、ＣｄＳｅをコア／ＺｎＳをシェル、Ｓｉをコア／ＳｉＯ2をシェルとするなど、用いる半導体ナノ粒子に応じて好適な組み合わせを適宜選択することができる。【００１８】
本発明の質蛍光標識物質において、上述したようなナノ粒子類の表面（ナノ粒子またはナノロッドにおけるシェルの表面）には、タンパク質、核酸または抗原などの生体物質と特異的に結合するための修飾基が存在する。この修飾基は、タンパク質、核酸または抗原などの生体物質と特異的に直接結合しうる部位（以下「生体物質結合部位」という。）、およびナノ粒子類の表面に直接結合している部位（以下「表面結合部位」という。）を少なくとも有し、これらの生体物質結合部位と表面結合部位とを連結している中間部位（以下「スペーサー」という。）が含まれていてもよい。このような修飾基を介して、本発明の蛍光標識物質は、標識の対象とする生体物質に結合することが可能となる。【００１９】
上記生体物質結合部位としては、対象とする分析における蛍光標識の用途に応じたものを適宜導入することができ、その態様は特に限定されない。例えば、ガン細胞の検出などの際に用いられるレクチンまたは抗体、ハイブリッド形成法によるＤＮＡの検出などの際に用いられるｓｓ（１本鎖）ＤＮＡ、あるいはＥＬＩＳＡ法によるタンパク質の検出などの際に用いられる、ビオチン、アビジンまたは抗体といったタンパク質、などを、本発明の生体物質結合部位とすることができる。【００２０】
一方、上記表面結合部位を形成する化合物としては、例えば、アルキル基の一種であるＣＨ3基または未結合手を含むＣを有する化合物であるＳｉＣ、ＳｉＯＣＨ、ＳｉＣＮＨなど；アミノ基を含む化合物であるＳｉＮＨ、ＳｉＣＮＨなど；カルボキシル基を含む有機化合物であるシランカップリング剤（ＣＯＯＨ）−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３等が挙げられる。本発明において、上記カルボキシル基またはアミノ基は、これらの官能基を有する化合物（例えばシランカップリング剤など）をナノ粒子の表面に結合させるようにして導入してもよく、これらの官能基を持たない化合物をナノ粒子の表面に結合させた後に反応によりカルボキシル基またはアミノ基を作り出してもよい。【００２１】
これらのうち、ＳｉＯＣＨは、ＳｉＯ2のマトリクスの一部がメチル基で置換された化合物であり、このメチル基を酸化しカルボキシル基を作った（カルボキシル化反応）後に、後述するようなアミド結合を用いた方法により、生体物質結合部位を導入することが可能である。ＳｉＣ、ＳｉＣＮＨもこれと同様に、カルボキシル基を介して生体物質結合部位を導入することが可能である。【００２２】
また、ＳｉＮＨは、アモルファスのＳｉ3Ｎ4の一部が水素原子で置換されることによりアミノ基を有する化合物であり、上記と同様、Ｎの未結合手またはアミノ基を介した結合により、生体物質結合部位を導入することが可能である。ＳｉＣＮＨもこれと同様に、アミノ基を介して生体物質結合部位を導入することが可能である。【００２３】
このような化合物は、例えば後述するような光ＣＶＤ法を用いた場合、コアシェル構造を有するナノ粒子類のシェルの表面に、いわゆる島／海構造における島部分を球の半面側に層状に形成する態様で存在する。ＳｉＣ、ＳｉＯＣＨ、ＳｉＮＨまたはＳｉＣＮＨなどの化合物と、シェルを形成する化合物とは、主にＳｉが共有結合することで結合しているので特にＳｉＯ2シェルとはＯを介して強固な結合を形成できると考えられる。【００２４】
なお、本発明の蛍光標識物質は、本発明による効果を阻害しない範囲において、上述した以外のその他の修飾基、例えば親水性を高めるための修飾基などを有することも可能である。【００２５】
（修飾基が存在しない領域）
本発明の蛍光標識物質の表面における修飾基が存在しない領域の面積は、分析時の蛍光の視認性を充分に確保し、また対象とする生体物質との結合性を損なわないようにするなどの点から、ナノ粒子類の表面積の５０％以上であることが望ましい。例えば、患部（がん細胞）と結合した蛍光標識物質を上部から観測することを考えれば、少なくとも球形のナノ粒子の上半分は光を取り出すのみの機能があればよく、修飾基を有する必要がない。【００２６】
本発明における上述のような「修飾基が存在しない領域の面積」は、修飾基を形成する分子が被覆していない領域の面積のことであり、例えばＴＥＭを用いた観察により測定することが可能である。【００２７】
このような修飾基が存在しない領域は、ナノ粒子類の表面に連続的に形成されていることがより好ましい。例えば、後述するような方法などを用いて、ナノ粒子の半面側においてのみ修飾基を導入するための反応を進行させることにより、修飾基が存在しない領域をその反対の半面側に連続的に確保することが可能となる。また、修飾基をナノロッドの円筒面の半面側のみ、あるいはナノロッドの片方の底面のみに形成することによっても同様である。ここで、ナノロッドの円筒面および片方の底面とは、円柱状のナノロッドにおける側面および片方の底面を指す。また、ナノロッドが楕円球形である場合は、これを疑似球形と見なしたときの半球面を「円筒面の半面」とみなし、このようなナノロッドにおいて底面は扱わないものとする。【００２８】
このような態様のナノ粒子類が生体物質に結合した場合（図７-ｂ、１０-ｂ）、ナノ粒子類に入射する励起光は修飾基に遮断されにくく（図８-ａ、１１-ａ）、またナノ粒子類の蛍光は修飾基に遮断されることなく蛍光検出器に到達する（図８-ｂ、１１-ｂ）。したがって、「励起光照射装置から発射された光子の個数に対する、蛍光検出装置が検出した光子の個数の比」として本発明において定義される実質的な発光効率は、従来の全面に修飾基が導入された態様のナノ粒子類と比較して向上し、より良好な検出精度が得られる。このようなことから、上述したような本発明のナノ粒子類は、従来の蛍光標識物質を用いて行われていた分析において好適に利用することが可能である。【００２９】
（蛍光標識物質の製造方法）
＜ナノ粒子類の調製＞
本発明で用いられる無機蛍光ナノ粒子は、公知の方法に従って製造することができる。その製造方法は特に制限されないが、例えば、ＣＶＤ法、レーザーアブレーション法、シラン分解法、Ｓｉ電極蒸発法などの気相法や、電気分解法、逆ミセル法などの液相法が挙げられる。これらの方法により製造された無機蛍光ナノ粒子は、液体中に懸濁分散した状態、プレート上に固定化された状態などの態様で存在する場合があるが、後述するような修飾基の導入が行える態様であればとくに限定されるものではない。【００３０】
＜修飾基の導入＞
本発明の修飾基は、例えば、ナノ粒子類の表面に表面結合部位を形成する化合物を導入し、この化合物に生体物質結合部位を形成する物質を結合させることにより、ナノ粒子類に導入することが可能である。また、表面結合部位を形成する化合物に、スペーサーを形成する化合物を結合させた後、これに生体物質結合部位を形成する物質を結合させてもよい。【００３１】
表面結合部位の導入方法は特に限定されるものではなく、適宜好適な手法を用いることができるが、選択的な領域に修飾基を導入しやすいことから、下記のような光ＣＶＤ法を用いる方法が本発明の好ましい態様の例として挙げられる。【００３２】
（態様１）Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノ粒子を製造し、得られたナノ粒子を、平面上に固定する。続いて、ＳｉＨ(ＣＨ3)およびＮ2Ｏの雰囲気下に一方向から光を照射してナノ粒子の片側表面に当てて、光ＣＶＤ法により反応させる。これにより、ＳｉＯ2のマトリックスの一部がアルキル基、例えばＣＨ3（メチル基）で置換されたものであるＳｉＯＣＨからなる層を、ＳｉＯ2のシェルの半球面を覆うよう形成させる。さらに、ＣＯ2の雰囲気下でＣＨ3を酸化することで、上記メチル基をカルボキシル基に変換させる。【００３３】
（態様２）Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノ粒子を用いて、ＳｉＨ4およびＮＨ3雰囲気下に光を一方から照射し光ＣＶＤ法により反応させる。これにより、水素原子を多く含むアモルファスのＳｉ3Ｎ4、すなわちＮＨ2（アミノ基）を有するＳｉＮＨからなる層を、ＳｉＯ2のシェル表面を部分的に覆うよう形成させる。【００３４】
（態様３）Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノ粒子を用いて、Ｃ4Ｆ8−Ｃ2Ｈ2などのガス系の雰囲気下に光を一方から照射し、光ＣＶＤ法により反応させる。これにより、アモルファスのＣ−Ｈ膜、すなわちＣＨ3（メチル基）を有する層を、ＳｉＯ2のシェルの一部の面を覆うよう形成させる。さらに、上記態様１と同様、ＣＯ2の雰囲気下でＣＨ3を酸化することで、上記メチル基をカルボキシル基に変換させる。【００３５】
（態様４）Ｓｉをコア、ＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノロッドを製造する。
このときＳｉ基板上に微細加工にて、Ｓｉナノロッドを立てて形成し、Ｏ2で酸化することで、Ｓｉ/ＳｉＯ2ナノロッドを形成する。その後でＳｉ基板側をエッチングすることでナノロッドを基板から離し、続いてＮＨ3雰囲気中で加熱することで底面のＳｉ部分のみをＳｉＮＨ化する。これにより底面にのみＮＨ2（アミノ基）を有するＳｉＮＨからなる層を形成することができる。【００３６】
本発明では、上述のような表面結合部位を形成する化合物に、スペーサーとして、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（maleimidomethylcyclohexanecalboxylic acid sulfohydroxysuccinimide ester sodium salt）などのビファンクショナルクロスリンカーと呼ばれる有機分子をさらに結合させてもよい。【００３７】
例えば、上記ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、アミノ基またはチオール基に対する指向性を有する反応部位を２つ有するので、その片方を例えばＳｉＮＨに結合させ、他方を生体物質結合部位を形成するための化合物との結合に用いることができる。また、ビファンクショナルクロスリンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのオキシアルキレンの両端に、表面結合部位を形成する物質と、生体物質結合部位を形成する物質とに結合しうる機能性官能基が導入された構造のものを用いることもできる。【００３８】
一方、生体物質結合部位は、前述したようなレクチン、ｓｓＤＮＡ、アビジン、ビオチン、抗体等の一部に、上記表面結合部位を形成する化合物またはビファンクショナルクロスリンカーが有する官能基と結合しうる官能基をあらかじめ公知の手法に従って導入することにより、修飾基に導入することが可能である。例えば、カルボキシル基が導入されたナノ粒子と、アミノ基が導入されたレクチンとを反応させた場合、ペプチド結合により、修飾基にビオチンが導入される。また、アミノ基が導入されたナノ粒子と、カルボキシル基が導入されたレクチンとを反応させた場合も同様に、ペプチド結合により修飾基にビオチンが導入される。
【実施例】
【００３９】
次に、本発明について実施例を示して説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００４０】
（実施例１）
まず、既知の方法（特開平5-224261号参照）によりSiH4ガスのマイクロ波プラズマ分解法＋強アルカリ処理による酸化処理により、2nm径のＳｉをコア、1.5nm厚さのＳｉＯ2を
シェルとするコアシェル型ナノ粒子を製造した（図６-ａ）。得られたナノ粒子を、水中で超音波をかけることにより、基板より分離し、このとき、ナノ粒子は疎水性が強い為、水表面に単粒子膜をつくった。これを乾燥させることにより、平面（基板）上にナノ粒子を並べた。なお、本実施例の方法に代えて、ナノ粒子をガスキャリアで運び、静電気を用いて静電チャック上に吸着することも可能である。続いてCVD装置中で、ＳｉＨ(ＣＨ3)およびＮ2Ｏを流量比１：１、圧力666Pa、温度350℃での雰囲気下に一方向からエキシマレーザー光を照射してナノ粒子の片側表面に当てて（図６-ｂ）、光ＣＶＤ法により反応させた。これにより、ＳｉＯ2のマトリックスの一部がＣＨ3（メチル基）で置換されたものであるＳｉＯＣＨからなる層を、ＳｉＯ2のシェルの半球面を覆うよう形成させた（図６-ｃ）。さらに、ＣＯ2の雰囲気下にし（図６-ｄ）、900℃程度の高温に加熱することにより上記メチル基をカルボキシル基に変換させた（図６-ｅ）。次に、このカルボキシル基をLECTINのアミノ基とペプチド結合させ、LECTINがナノ粒子の半球面にのみ結合した蛍光標識物質を得た（図７-ａ）。このようにして半球面のみ修飾基を形成した本発明の蛍光標識物質は紫外光250nmを照射した際、600nm付近にピークを持つ蛍光を発し、その効率は、全球面に修飾基を形成した蛍光標識物質の約1.4倍に増加した。【００４１】
（実施例２）
まず、既知の方法（特開平5-224261）によりＳｉＨ４ガスのマイクロ波プラズマ分解法＋強アルカリ処理による酸化処理により、2nm径のＳｉをコア、1.5nm厚さのＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノ粒子を製造した（図９-ａ）。得られたナノ粒子を、表面に親水性を与えるための活性剤Tween80の溶液に浸し、超音波により微小液滴化した。そこに不活性ガスＨｅを通し、気化器中で気化を行った。これによりTween80でくるまれたＳｉ／ＳｉＯ２ナノ粒子がＨｅガスをキャリアとしてCVD装置中に導入された。図９-ｂに示すように、このCVD装置中で、ＳｉＨ４とＮＨ３を流量比で1:3、温度400℃、400Wの電力を印加したプラズマCVD装置で3sec程度処理した。これによりプラズマCVD法によるＮＨ２、ＮＨ等のＮの未結合手やアミノ基を有するＳｉＮＨ膜がナノ粒子の半分以下の表面を覆うように成膜された（図９-ｃ）。
次に、このアミノ基やＮの未結合手をLECTINのカルボキシル基とペプチド結合させ、LECTINがナノ粒子の球面の一部のみに結合した蛍光標識物質を得た（図１０-a）。このようにして球面の半分以下の面積のみ修飾基を形成した本発明の蛍光標識物質は紫外光250nmを照射した際、600nm付近にピークを持つ蛍光を発し、その効率は、全球面に修飾基を形成した蛍光標識物質の約1.2倍に増加した。【００４２】
（実施例３）
実施例１における光CVDによる処理条件（図６-ｂ参照）について、ＳｉＨ(ＣＨ3)およびＮ2Ｏの代わりにＣ4Ｆ8とＣ2Ｈ2を流量比１：3で用い、圧力400Pa、温度400℃での雰囲気下に一方向からエキシマレーザー光を照射してナノ粒子の片側表面に当てて、光ＣＶＤ法により反応させるようにした。これにより、ＣＨ3（メチル基）や未結合のCH基等を有するアモルファスカーボン膜が図６-ｃにおけるＳｉＣＯＨ層の代わりに形成された。さらに、ＣＯ2の雰囲気下にし、900℃程度の高温に加熱することにより上記メチル基ないしは未結合のCH基をカルボキシル基に変換させた。次に、このカルボキシル基をLECTINのアミノ基とペプチド結合させ、LECTINがナノ粒子の半球面にのみ結合した蛍光標識物質を得た。このようにして半球面のみ修飾基を形成した本発明の蛍光標識物質は紫外光250nmを照射した際、600nm付近にピークを持つ蛍光を発し、その効率は、全球面に修飾基を形成した蛍光標識物質の約1.4倍に増加した。【００４３】
（実施例４）
既知の方法（J.Rose etal., Mat. Res. Symp. Proc. Vol.832 (2005), F7.14.1）でSiナノロッドを形成した。まず、Ｓｉ(111)基板４１上に、水とメタノール１：400の液中に活性剤Triton X-100を添加しポリスチレンの300nm径の球を溶かした液を塗布し、1日デシケータにて放置することで乾燥した。これにより、図１２-ａのようにSi基板がポリスチレン球単層で覆われた構造が形成できた。次にＡｒ＋によるエッチングを圧力10.7Paで行い、ポリスチレンの球を小さくし、次ステップで用いるためのマスクを形成した。次に図１２-ｂのようにＳＦ６とＨｅを1:3のガス比率で50Wの電力で反応性イオンエッチングを行い、Ｓｉのロッド構造を形成した（図１２-ｃ）。メタノールでクリーニングを行った後、図１２-ｄに示すように約900℃、1000sccmのO2中で酸化を行い、Ｓｉ／ＳｉＯ２のコア／シェル型ナノロッドを形成した。次に、ＫＯＨの水溶液中で超音波をかけることにより、ナノロッドの根元のＳｉ部分をエッチングし、Ｓｉ／ＳｉＯ２ナノロッドを基板から分離した（図１２-ｅ）。これにより、径50nm、長さ200nmのナノロッドが形成できた。【００４４】
図１３-ａに示すようにこの構造は根元部分はＳｉが露出している。図１３-ｂに示すように1気圧のＮＨ３雰囲気中で700℃に加熱するとこのSi部のみを窒素化し、ＳｉＮＨ４６を形成し、ＮＨ２結合をナノロッドの片方の底面のみに形成した（図１３-ｃ）。こうして形成したナノロッドに対し、図１３-ｄに示すようにこのアミノ基をLECTINのカルボキシル基とペプチド結合させ、LECTINがナノ粒子の球面の一部のみに結合した蛍光標識物質を得た。このようにしてロッドの片側の底面の面積のみ修飾基を形成した本発明の蛍光標識物質は紫外光250nmを照射した際、600nm付近にピークを持つ蛍光を発し、その効率は、ロッドの全表面に修飾基を形成した蛍光標識物質の約2倍に増加した。【００４５】
（実施例５）
まず、既知の方法（特開平5-224261）によりＳｉＨ４ガスのマイクロ波プラズマ分解法＋強アルカリ処理による酸化処理により、2nm径のＳｉをコア、1.5nm厚さのＳｉＯ2をシェルとするコアシェル型ナノ粒子を製造した（図５-ａ）。得られたナノ粒子を、水中で超音波をかけることにより、基板より分離させたが、このとき、ナノ粒子は疎水性が強い為、水表面に単粒子膜をつくる。これを乾燥させることにより、平面（基板）上にナノ粒子を並べた。続いてシランカップリング剤としてＣＯＯＨ−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３を溶かした溶液をスプレーし（図１４-ａ）、120℃で加熱することで、コアシェル型ナノ粒子の片面のみにＳｉで架橋してＣＯＯＨ−Ｓｉ（ＯＣＨ３）  ２を結合させた（図１４-ｂ）。最後に図１４-ｃに示すように、このカルボキシル基をLECTINのアミノ基とペプチド結合させ、LECTINがナノ粒子の半球面にのみ結合した蛍光標識物質を得る。このようにして半球面のみ修飾基を形成した本発明の蛍光標識物質は紫外光250nmを照射した際、600nm付近にピークを持つ蛍光を発し、その効率は全球面に修飾基を形成した蛍光標識物質の約1.4倍に増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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