(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有する多糖であって、該ガラクトースと、該グルコースと、該ラムノースとを４：２：１のモル比で含み、かつピルビン酸を４〜７質量％含み、ここで該多糖が、以下の式（Ｉ）の構造を含み、かつピルビン酸が糖に結合した、多糖。
【化１】
0005192808.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載の多糖の製造方法であって、該多糖を産生する能力を有するビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程、および該微生物により生産された多糖を回収する工程を含む、方法。
【請求項３】
前記微生物がビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）。
【請求項５】
請求項１に記載の多糖を含有する、食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物。
【請求項６】
前記食品組成物または医薬品組成物が免疫賦活剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記化粧品組成物が保湿剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を含む、製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）の微生物が産生する新規多糖およびそれを含む食品、化粧品、医薬品などの組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム属の微生物は、腸内細菌叢における最優勢菌のひとつである。この微生物は乳酸菌と同様に菌体そのものが摂取され得る。そしてこの微生物を摂取することにより、腸内細菌叢のバランスを整える整腸作用、血清コレステロール値の改善効果、免疫賦活作用などが得られることが報告されている。中でも、免疫機能の増強については、乳酸菌やビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする抗腫瘍剤（特開平７−８２１５８号公報）およびサイトカイン産生促進剤（特開平８−９２１１２号公報）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）微生物を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤（特開２００３−７３２８６号公報）、ビフィドバクテリウム属微生物の細胞壁および／又は細胞壁破砕物を有効成分とする顆粒球誘導剤（特開平７−３３０８０６号公報）、ビフィドバクテリウム属微生物を有効成分とする水溶性免疫賦活物質（特開平９−２４１１７９号公報）などが報告されている。しかしこれらはすべて菌体そのものまたは細胞壁溶解酵素処理や超音波による菌体破砕により得られる多糖画分を有効成分としているものである。
一方、菌体外多糖の免疫機能賦活作用については、ストレプトコッカスラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）もしくはストレプトコッカス  クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）が産生する多糖を有効成分とする抗腫瘍剤（特許第２６７８６７３号公報）、ラクトコッカス  ラクチス  サブスピーシス  クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）やラクトコッカス  ラクチス  サブスピーシス  ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）の粘着性夾膜多糖類の抗腫瘍活性（特開平１−２７７４８４号公報）、ラクトバチルス属微生物の培養液から得られる多糖を有効成分とする抗炎症剤あるいは骨髄細胞増殖促進剤（特開平７−７０２０９号公報）、ラクトバチルス  デルブルエッキー  サブスピーシス  ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が産生するリン含有多糖類の自己免疫疾患予防効果（特許第３０１７４９３号公報）などが報告されている。しかし、これらはいずれもヨーグルトや発酵乳から分離された乳酸菌が産生する多糖に関するものである。
元来、ヒトの腸内細菌叢において、ビフィドバクテリウム属微生物の存在菌数は、乳酸菌の存在菌数より多く、腸内に存在していたビフィドバクテリウム属微生物が産生する多糖は何らかの生体防御機能を有すると思われる。しかしながら、これらビフィドバクテリウム属微生物が産生する多糖については、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）が産生するグルコースのみからなる多糖類（特開平７−２５５４６５号公報）、ビフィドバクテリウム  ロンガムが産生するグルコース、ガラクトース、ウロン酸などからなる多糖類（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３巻、９９５−１０００頁）などが報告されるのみであり、さらにこれらの機能については明確でない。
【発明の開示】
【０００３】
従って、新たな機能を有するビフィドバクテリウムに由来する多糖が求められている。
本発明者らは、ヒトの腸内に存在する高粘性物質を産生するビフィドバクテリウム属微生物について鋭意研究したところ、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）が培養液中に多量の粘性物質を産生すること、この粘性物質が新規多糖であること、そして、この新規多糖が保湿作用、免疫賦活作用などの機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、新規多糖を提供し、この多糖は構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有し、該ガラクトースと、該グルコースと、該ラムノースとを４：２：１のモル比で含み、かつピルビン酸を４〜７質量％含む。
一つの態様では、本発明の多糖は、以下の式（Ｉ）の構造を含む。
0005192808.tif 000002
また、本発明は、上記多糖の製造方法であって、この多糖を産生する能力を有するビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程、および該微生物により生産された多糖を回収する工程を含む方法を提供する。
一つの実施態様では、上記微生物がビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）である。
また、本発明は、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を提供する。
さらに本発明は、上記多糖を含有する組成物を提供し、一つの実施態様では上記組成物が、食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物である。
別の実施態様では、上記食品組成物または医薬品組成物が免疫賦活剤であり、上記化粧品組成物が保湿剤である。
また、別の本発明は、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を含む製剤を提供する。
本発明により、保湿作用、免疫賦活作用を有する新規多糖が提供される。この多糖は、食品組成物、化粧品組成物、医薬品組成物などの原料として用いられる。また、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）およびこの微生物を含む培養液も製剤化され、免疫賦活剤などの医薬品、あるいは免疫賦活活性を有する食品などとして利用される。さらに、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）およびこの菌体破砕物（破砕液）も製剤化され、化粧品組成物などとして利用される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）の培養時間と培養液の粘度との関係を示すグラフである。
図２は、本発明の多糖のＴＮＦ−α産生促進効果を示すグラフである。
図３は、本発明の多糖の亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）産生促進効果を示すグラフである。
図４は、本発明の多糖のＴＮＦ−α産生促進効果を示すグラフである。
図５は、本発明の多糖の亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）産生促進効果を示すグラフである。
図６は、本発明の多糖の保湿効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の多糖は、構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有し、ガラクトースと、グルコースと、ラムノースとを４：２：１のモル比で含み、かつピルビン酸を４〜７質量％含む。そして、この多糖は以下の式（Ｉ）：
0005192808.tif 000003
で表される反復構造を含んでいる。このような構造を有する多糖は、ヒトの腸内から単離されたビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）から、生産される。
本発明に用いる微生物として、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）が例示されるが、この微生物以外の微生物も使用できる。例えば、腸内細菌を分離し、微生物の周囲に夾膜状の多糖を生産する株を選択し、多糖を分析することにより得られる。このようなスクリーニング方法で得られたビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）の菌学的性質は以下の表１の通りである。
【表１】
0005192808.tif 000004
これらの表現形質による分類学的性質に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ．２（１９８４）よりＪＢＬ０５株は、ビフィドバクテリウム  ロンガムであることが示された。この新規な微生物は、２００５年３月３日（原寄託日）に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）として寄託されている。
本発明の多糖は、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を適切な培地で培養することにより得られる。培地としては、ビフィドバクテリウム属の微生物が利用できる炭素源および窒素源並びに必要に応じて、システイン塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウム、微量の無機塩などを含む培地が使用される。特に、多量の多糖産生には、脱脂乳または乳成分を含む培地を使用することが好ましい。この場合、脱脂乳をプロテアーゼなどの酵素で分解した酵素分解脱脂乳に、カルチベータ（焼津水産化学工業株式会社）、ラクトース、アスコルビン酸ナトリウムなどを加えた培地が好ましく使用できる。
上記培地を用い、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を、培養温度２０〜４０℃、嫌気条件下、撹拌あるいは静置して、１６〜６０時間、ｐＨを４〜７、好ましくは５〜６に制御しながら培養を行うことにより、培養液中に粘性物質が産生される。
得られた培養液からの多糖の回収には、加熱、酵素処理、遠心、ろ過などの、当業者が通常、培養液から目的物質を回収する方法が用いられる。例えば、粘性物質（多糖）および微生物菌体を含む培養液を遠心し、菌体を除去する。培養液の粘度が高い場合は、例えば、水で希釈した後遠心することにより、菌体を除去することができる。次いで、得られた上清に適切な有機溶媒を加えてタンパク質を析出させ、例えば遠心分離によって沈殿を除去し、さらに有機溶媒を添加して多糖を沈殿させ、そして遠心分離などにより、多糖を回収する。詳細には、菌体を除去した上清に、終濃度が２０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行ってタンパク質を含む沈殿物を除去し、さらに終濃度が５０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行って沈殿物を回収することにより、粗精製多糖が得られる。
あるいは、有機溶剤とカチオンとを組み合わせて多糖を回収する方法を用いてもよい。例えば、１価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法、２価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５８−５３０１号公報）、３価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５９−１９６０９９号公報）などと同様の方法を用いることもできる。カチオンは、多糖の回収率を高める点から、好ましく用いられる。１価カチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが用いられる。２価カチオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが用いられる。３価カチオンとしては、アルミニウムイオンなどが用いられる。これらのカチオンをエタノールなどの有機溶剤とともに、多糖が含まれる粘性溶液に添加することにより、より多くの多糖を回収することができる。２価あるいは３価のカチオンを用いる方が、１価のカチオンを用いた場合よりも多糖の回収率を高めることが可能である。
得られた粗精製多糖からの多糖の精製は、当業者が通常行う方法、例えば、イオン交換樹脂を用いる分画、ゲルろ過による分画などを単独あるいは組み合わせて行われる。イオン交換樹脂を用いる方法に特に制限はなく、例えば、陰イオン交換樹脂（例えば、商品名ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０（ファルマシア社）など）に多糖を吸着させ、塩化ナトリウムのグラディエントをかけて多糖を溶出させ、ついで、商品名ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ６５Ｓ（東ソー株式会社）などを用いてゲルろ過する方法などが挙げられる。ゲルろ過による精製では、分子量も測定できる。
多糖の構造は以下のような方法で決定される。まず、精製した多糖を、例えば、蟻酸、希塩酸、トリフルオロ酢酸などで酸加水分解し、この加水分解物をＨＰＬＣで分析することにより、多糖を構成する糖（単糖）が決定される。ついで、この酸加水分解物を、常法によりアセチル化し、ガスクロマトグラフィーで分析（ＧＣ分析）することにより、構成糖の組成（構成糖の比率）が求められる。さらに、酸加水分解物を常法によりメチル化してＧＣ−ＭＳ（質量）などで分析することにより、多糖の結合様式が決定される。また、ＮＭＲ分析により、各単糖どうしの結合状態が明らかにされ、アセチル基の存在も検出される。多糖に結合しているピルビン酸は、ＮＡＤＨ存在下、乳酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸の乳酸への還元を測定することにより、定性的かつ定量的に測定できる。
ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）が産生する多糖は、以下の特徴を有する。
（１）多糖の構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有し、ガラクトースと、グルコースと、ラムノースとを４：２：１のモル比で含む。
（２）多糖中のピルビン酸含有率は、４〜７質量％である。
（３）分子量は、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ６５Ｓによるゲルろ過で約２０万〜２５０万である。
（４）比旋光度は、約＋１３０°である。
（５）アセチル基を含有する。
（６）多糖は以下の式（Ｉ）で示される反復構造を含む。
0005192808.tif 000005
なお、本発明の多糖の分子量は、培養条件および回収・精製条件により変化する。培養条件などにより分子量を調整することも可能である。
得られた多糖は、優れた免疫賦活活性および保湿能を有するため、食品組成物、医薬品組成物、化粧品組成物などの組成物として使用できる。医薬品組成物としては、本発明の多糖を含有する医薬部外品組成物、貼布剤、傷保護剤、救急絆創膏などの衛生材料も含まれる。
また、本発明のビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）およびこの微生物を含む培養液自体も製剤化して用いることが可能である。この製剤が腸内に送達されると、微生物が本発明の多糖を生産するので、この製剤は、免疫賦活剤などの医薬品、あるいは免疫賦活活性を有する食品などとして利用される。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に制限されることはない。
［実施例１：微生物の単離］
（培地の調製）
ビフィズス菌を単離する培地として、ＢＬ寒天培地（日水製薬株式会社）およびＢＳ寒天培地を使用した。ＢＬ寒天培地は、オートクレーブで１１５℃、２０分間滅菌し、５％ウマ血液を無菌的に加え、シャーレに分注して平板として使用した。ＢＳ寒天培地は、以下のように調製した。まず、プロピオン酸ナトリウム３０ｇ、硫酸パロモマイシン１００ｍｇ、硫酸ネオマイシン４００ｍｇ、および塩化リチウム６ｇを精製水で溶解し、総量を１００ｍｌとして、ＢＳ寒天培地用添加液を調製した。このＢＳ寒天培地用添加液５０ｍｌをＢＬ寒天培地１０００ｍｌに加え、ＢＳ寒天培地を得た。このＢＳ寒天培地は、シャーレに分注して平板として使用した。
（微生物のスクリーニング）
ヒト糞便を滅菌水で溶解し、上記のＢＬ寒天培地およびＢＳ寒天培地に播種し、３７℃、４８時間、嫌気的に培養した。平板上に生育した菌の集落性状、グラム染色標本の菌形態を観察し、ビフィズス菌と思われる集落を２枚のＢＬ寒天培地にそれぞれ分離した。一方を３７℃、４８時間、嫌気的に培養し、残りの一方を３７℃、４８時間、好気的に培養した。嫌気的に生育したコロニーのうち、粘性物質を生産する株（微生物）を単離した。得られた微生物の生理学的および形態学的特徴は上記の通りであり、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）であると同定した。
［実施例２：多糖の構造解析］
（培地の調製）
９質量％の脱脂乳溶液に、パンクレアチン（天野エンザイム株式会社）およびシリコンをそれぞれ終濃度が０．３６質量％および０．０１質量％となるように加えた。次いで、１０Ｎ  ＮａＯＨで溶液のｐＨを８に調整し、５５℃で４時間反応させて、酵素分解脱脂乳を得た。これに、カルチベータ（焼津水産化学工業株式会社）、ラクトース、およびアスコルビン酸ナトリウムを、それぞれ終濃度で、３．０質量％、２．５質量％、および０．２質量％となるように加え、１２１℃、１５分、オートクレーブで滅菌し、液体培地として使用した。
（多糖の精製）
上記で調製した液体培地を用いて前培養したビフィドバクテリウム  ロンガム  ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）を、１％（ｖ／ｖ）となるように同じ液体培地に接種し、３７℃、４０時間静置嫌気培養を行い、粘性物質を生産させた。培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清に終濃度２０％となるようエタノールを加え、４℃で静置保存した。一晩静置後、遠心によりタンパク質を含む沈澱物を除去し、上清に終濃度５０％となるようエタノールを加え、４℃で静置保存した。一晩静置後、遠心により沈澱物を回収し、粗精製多糖画分を得、凍結乾燥して保存した。
この粗精製多糖画分を、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０充填カラムを用いてさらに分画し、０．０７Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌで溶出された画分を精製多糖画分とした。
（分子量の測定）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ６５Ｓ充填カラムを用いて、この精製多糖画分についてゲルろ過を行ったところ、多糖の分子量は約８０万であった。なお、この分子量は培養条件、回収条件・精製条件により変化し、数回の繰り返し実験で、約２０〜２５０万の間の分子量を有する多糖が得られた。このことから、培養条件、回収条件、精製条件などにより、分子量を調整することも可能であると思われる。
（比旋光度の測定）
日本分光ＤＩＰ−３６０型デジタル旋光計を用いて測定したこの多糖の比旋光度は、約＋１３０°であった。
（成分分析）
次に、得られた多糖に蟻酸を加え、加水分解した。この加水分解液を減圧乾固後、さらにトリフルオロ酢酸を加えて加水分解し、加水分解生成物を得た。ＩＯＮ−３００カラム（東京化成工業株式会社）を用いたＨＰＬＣ分析により、この多糖が、ガラクトース、グルコース、ラムノース、ピルビン酸から構成されることがわかった。
この加水分解生成物を常法により水素化ホウ素ナトリウムで還元し、無水酢酸とピリジンを加えてアセチル化したものを、Ｒ−２２５カラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＧＣ分析した。その結果、この多糖を構成するガラクトースと、グルコースと、ラムノースとのモル比は４：２：１であることがわかった。
上記加水分解生成物に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させたところ、乳酸が生じた。従って、この多糖画分にピルビン酸が存在することが確認された。また、多糖中のピルビン酸含有率は、４〜７質量％であった。
（構造解析）
多糖の結合様式を明らかにするため、メチル化して分析を行った。上記加水分解生成物を常法によりメチル化した。各メチル化単糖をＧＣ−ＭＳ（質量）分析にかけ、解析した。その結果、１，５−ジ−Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−グルシトール、１，５−ジ−Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、１，３，４，５−テトラ−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル−ラムニトール、１，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、１，４，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−グルシトール、１，４，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、および１，４，５，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−メチル−ガラクチトールのメチル化された糖が得られた。
また、ＮＭＲ分析により、結合状態を検討した。これらのデータから、本発明の多糖は、以下の構造Ｉ（反復構造）を有することがわかった。
0005192808.tif 000006
なお、ＮＭＲ解析により、アセチル基が検出された。
［実施例３：多糖の培養生産］
実施例２で調製した酵素分解脱脂乳に、アスコルビン酸ナトリウムを終濃度が０．２質量％となるように加え、１２１℃、１５分間、オートクレーブで殺菌し、液体培地を調製した。これと同じ液体培地で前培養したビフィドバクテリウム  ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８２）の培養液を、１％（ｖ／ｖ）となるように上記調製した液体培地に接種し、微速撹拌下、ｐＨ６．０にコントロールしながら、３７℃にて４０時間、嫌気的に培養を行った。ｐＨのコントロールには、１０Ｎ  ＮａＯＨを使用した。なお、静置嫌気培養を行った場合を比較例とした。
図１に培養時間と培養液の粘度との関係を示す。静置嫌気培養を行った場合と比較すると、ｐＨを調整しつつ培養した場合は、粘度は２０時間以降から急激に増加し、本発明の多糖が効率よく生産された。なお、粘度はＴＶＢ−１０形粘度計（東機産業株式会社）を用い、ローターＴＨＭ１を使用し、１５℃、回転数５０ｒｐｍで測定した時の値である。
［実施例４：粗精製多糖画分の免疫賦活マクロファージ活性化作用］
実施例２で調製した粗精製多糖画分の免疫賦活作用を以下のようにして測定した。１２週齢のｄｄＹ系雄性マウス（紀和実験動物研究所）の腹腔内に４％（ｗ／ｖ）ＴＧＣ培地（日水製薬株式会社）を２ｍｌ注入し、４日後、１２ｍｌの冷ＰＢＳを用いて腹腔内を洗浄し、洗浄液を回収した。この液を、４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を除去して腹腔滲出細胞を得た。上記細胞を、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン株式会社）、ペニシリンＧ、およびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に懸濁し、９６穴プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。培養開始１時間後、培地を除去し、次いで、実施例２で得られた粗精製多糖画分をそれぞれ０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌに添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて４時間または２０時間培養した。４時間培養後の培養上清は、マクロファージ活性化の指標として以下のＴＮＦ−α濃度測定に用い、２０時間培養後の培養上清は、以下の亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）濃度測定に用いた。
ＴＮＦ−α濃度の測定は、ＴＮＦ−α感受性マウス繊維芽細胞（Ｌ９２９細胞、大日本製薬株式会社）を用いて以下のように行った。９６穴プレートの各ウエルにＬ９２９細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて５時間培養した。培養後、培地を除去し、次いで１．５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含むＲＰＭＩ１６４０培地５０μｌを添加し、さらに上記の４時間培養後の培養上清を１００μｌずつ加えた。なお、ＴＮＦ−α標準として、この培養上清の代わりに、ＲＰＭＩ１６４０培地にＴＮＦ−α（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を種々の濃度で溶解した溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌの割合で添加した。次いで、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて２０時間培養し、さらに、終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド（和光純薬工業株式会社）を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて４時間培養した。その後、培地を除去し、０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロパノールを１００μｌ加え、１０分間程度振動させながらホルマザンを溶解した後、５６２ｎｍ（参照波長６６０ｎｍ）の吸光度を測定した。ＴＮＦ−α標準から得られた検量線を用いて、ＴＮＦ−α濃度を算出した。有意差検定は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用い、有意水準をｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１として行った。結果を図２に示す。
亜硝酸塩濃度の測定は、上記２０時間培養後の培養上清を９６穴プレートに５０μｌずつ入れ、これにグリース試薬を５０μｌずつ添加し、暗所にて室温１０分間反応させ、その後、５６２ｎｍ（参照波長６６０ｎｍ）の吸光度を測定することにより行った。なお、検量線は、培養上清の代わりに、ＲＰＭＩ１６４０培地に亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を種々の濃度で溶解した溶液を用いたこと以外は、上記と同様に操作して吸光度を測定することにより作成した。この検量線を用いて、亜硝酸塩の濃度を算出した。有意差検定は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用い、有意水準をｐ＜０．０１として行った。結果を図３に示す。
図２および図３に示すように、実施例２で得られた粗精製多糖画分についてマクロファージの活性化作用が認められた。
［実施例５：精製多糖画分の免疫賦活マクロファージ活性化作用］
凍結乾燥粗精製多糖画分の代わりに、実施例２のカラムで精製した精製多糖画分の凍結乾燥物を用いたこと以外は、実施例４と同様にして、ＴＮＦ−α濃度および亜硝酸塩濃度の測定を行った。その結果、この精製多糖画分についてもマクロファージの活性化作用が認められた。結果を図４および５に示す。
［実施例６：多糖の保湿作用］
実施例２で調製した凍結乾燥粗精製多糖画分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その保湿能力を２０代女性１０名の上腕内側の水分蒸散量変化により確認した。被験部位に２ｃｍの間隔で２×２ｃｍの大きさの印をつけ、サンプル塗布前の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。上記粗精製多糖画分およびコントロールとしての蒸留水を各２０μＬずつガラス棒で広げて塗布し、４５、９０、１５０、２１０分後のＴＥＷＬを測定した。測定には、水分蒸散量測定装置（モバイル  テヴァメーター  ＭＳＣ１００）を使用した。２１０分後のそれぞれの水分蒸散量を、図６に示す。粗精製多糖画分の水分蒸散量は、蒸留水に比べて少なく、保湿効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の多糖は、保湿作用、免疫賦活作用を有する新規多糖である。この多糖はヒトの腸内に生息する微生物から単離されたビフィドバクテリウムロンガムから生産され、食品組成物、化粧品組成物、医薬品組成物などの原料として、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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