(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄損傷によって神経機能の改善を必要とする適用対象者に投与される神経機能改善剤であって、分化誘導していない表皮幹細胞を有効成分とし、脊髄損傷部位に局所的に投与されることを特徴とする神経機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた神経機能改善効果を有する中枢神経再生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、交通外傷等による脊髄損傷で中枢神経に障害を来たし、半身麻痺として車椅子やベット上での生活を余儀なくされる患者が増加している。これまで長い間、中枢神経は一度破壊されると修復できないものとされ、麻痺の治療は不可能と考えられてきたが、最近、脊髄損傷部位に胚性幹細胞から分化誘導した神経幹細胞を移植することによって中枢神経を再生し、神経機能の改善を図る試みがなされている（非特許文献１）ほか、骨髄幹細胞を利用した方法も試みられており（非特許文献２）、麻痺の治療に明るい兆しが見え始めている。
【非特許文献１】McDonald JW, Howard MJ. Repairing the damaged spinal cord: a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination. Prog. Brain Res., 2002;137:299-309.
【非特許文献２】Ankeny DP, McTigue DM, Jakeman LB. Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats. Exp. Neurol., 2004;190(1):17-31.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、胚性幹細胞から分化誘導した神経幹細胞を利用した方法には倫理的問題があり、骨髄幹細胞を利用した方法は外科的侵襲が大きいという問題がある。
そこで本発明は、高い安全性と低侵襲性のもとで神経機能改善を図ることができる中枢神経再生剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、表皮幹細胞が中枢神経再生作用を有することを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の神経機能改善剤は、請求項１記載の通り、脊髄損傷によって神経機能の改善を必要とする適用対象者に投与される神経機能改善剤であって、分化誘導していない表皮幹細胞を有効成分とし、脊髄損傷部位に局所的に投与されることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、高い安全性と低侵襲性のもとで神経機能改善を図ることができる中枢神経再生剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の中枢神経再生剤は、表皮幹細胞を有効成分とすることを特徴とするものである。本発明の中枢神経再生剤の有効成分として用いる表皮幹細胞は、患者の生体（例えば皮膚組織片）から分離して培養したもの（ヒト表皮幹細胞）が望ましいが、患者の血族両親や兄弟などの生体から分離して培養したものであってもよい。表皮幹細胞の培養は、例えば、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法（Cell, 1975:6;331-343.）やＢｏｙｃｅ＆Ｈａｍ法（J. Invest. Dermatol., 1983:81;33s-40s.）などの自体公知の方法によって行うことができる。
【０００８】
本発明における中枢神経再生剤の有効成分である表皮幹細胞は、例えば、細胞を電解質輸液などに懸濁し、あるいはこれをさらにフィブリンゲルやゼラチンゲルに懸濁し、脊髄損傷部位に局所的に投与（移植）することができる。表皮幹細胞の投与量は、適用対象者の年齢や性別、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切な投与量を投与することにより、その中枢神経再生作用に基づいて、運動機能や脳機能などの神経機能の改善といった効果をもたらすことができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１０】
（１）移植用の表皮幹細胞の調製
局所麻酔下での標準的な手技によってヒト上腕部より採取した皮膚組織片から常法に従って分離して培養し、液体窒素保管したヒト表皮幹細胞を解凍し、１０％ＦＢＳ含有ＦＡＤ培地を用いてＲｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ法（Cell, 1975:6;331-343.）を準用して培養した。セミコンフルエントになった状態で、０．０５％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを添加してフィーダー細胞を完全に剥離し、表皮幹細胞のみとした。その後、０．１％トリプシンと０．１％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを添加して表皮幹細胞をデッシュから剥離し、電解質輸液（ソリタＴ２号：味の素株式会社の商品名）を用いて細胞数を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅに調製した。
【００１１】
（２）外傷性脊髄損傷モデル動物を用いた表皮幹細胞の中枢神経再生作用の評価
（ア）評価方法
落錘法にて、Ｗｉｓｔａｒ雌ラットの胸椎部位（Ｔ９−１０）の脊髄に直接一定重量の負荷（２．５ｃｍの高さから１０ｇの錘を落下）を与えることで後肢運動機能障害を惹起し、外傷性脊髄損傷モデル動物を作製した（Takenaga M, Ohta Y, TokuraY, Hamaguchi A, Suzuki N, Nakamura M, Okano H, Igarashi R. Plasma as a scaffold for regeneration of neural precursor cells after transplantation into rats with spinal cord injury. Cell Transplant., 2007;16(1):57-65.）。脊髄を損傷させてから８日目に、ハミルトンシリンジを装着させたマイクロインジェクター（モデル３１０：室町機械株式会社の商品名）を用い、５×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬの表皮幹細胞を損傷部位に１分間に１ｍＬずつ注入した（移植日を含め４日間は免疫抑制剤であるシクロスポリンを３ｍｇ／ｋｇ皮下投与）。Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコア（Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma., 1995:12:1-21.）に基づいて運動機能評価を経時的に行い、表皮幹細胞の中枢神経再生作用を評価した。
（イ）評価結果
図１に示す（縦軸はＢＢＢスコアの数値を示し横軸は脊髄損傷後の経過日数を示す）。なお、図１には、比較対照として同様に評価したヒト線維芽細胞注入の結果をあわせて示す。図１から明らかなように、表皮幹細胞（ｈｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を移植した場合、線維芽細胞（ｈｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を移植した場合よりも統計学的に有意に運動機能が回復し、明らかな中枢神経再生作用が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
本発明は、高い安全性と低侵襲性のもとで神経機能改善を図ることができる中枢神経再生剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例における表皮幹細胞の中枢神経再生作用を示すグラフである。
【図１】
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