(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質と、
以下の（ｉｘ）、（ｘ）、および（ｘｉｉ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；および
（ｘｉｉ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドと
を含んでなり、前記（ｉｘ）、（ｘ）、および（ｘｉｉ）から選択されるポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド、または前記（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、組換えベクター。
【請求項２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９５の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された放線菌から調製される発現ベクターｐＳＧ１１である、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主。
【請求項４】
放線菌である、請求項３に記載の宿主。
【請求項５】
放線菌がStreptomyces hygroscopicusである、請求項４に記載の宿主。
【請求項６】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３株が形質転換されてなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質と、
以下の（ｉｘ）、（ｘ）、および（ｘｉｉ）から選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；および
（ｘｉｉ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドと、
Ｌ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含んでなり、前記（ｉｘ）、（ｘ）、および（ｘｉｉ）から選択されるポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド、または前記（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、組換えベクター。
【請求項８】
Ｌ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択される、請求項７に記載の組換えベクター：
（ｉ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｌ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性を有するタンパク質が、以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択される、請求項７に記載の組換えベクター：
（ｖ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド、または前記（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＬ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが逆方向に連結されている、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド、または前記（ｖ）、（ｖｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＬ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが正方向に連結されている、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９６の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された放線菌から調製される発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主。
【請求項１４】
放線菌である、請求項１３に記載の宿主。
【請求項１５】
放線菌がStreptomyces hygroscopicusである、請求項１４に記載の宿主。
【請求項１６】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３株が形質転換されてなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１７】
式（Ｉ）：
【化１】
0005335413.tif 000012
で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
0005335413.tif 000013
で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、グルタミン酸またはその塩およびアスパラギン酸またはその塩の存在下で、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性およびＬ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌と接触させる工程を含んでなり、使用される放線菌が、請求項３〜６のいずれか一項に記載の宿主であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５〜１：１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５：１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）：
【化３】
0005335413.tif 000014
で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、式（ＩＩ）：
【化４】
0005335413.tif 000015
で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、グルタミン酸またはその塩およびアスパラギン酸またはその塩の存在下で、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性およびＬ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌と接触させる工程を含んでなり、使用される放線菌が、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の宿主であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５〜１：１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５：１である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびその遺伝子、並びにＬ−ホスフィノスリシンの製造方法に関する。本発明はまた、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を発現させるための組換えベクターや該ベクターが導入された宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ホスフィノスリシンは、ビアラホスの構成成分であり、除草活性を有する物質である（Tachibana,K., J. pesticide Sci., 11:27-31,1986）。本発明者らはこれまでに、４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ−酪酸（以下「ＯＭＰＢ」ということがある）をアミノ基供与体の存在下で、微生物の有するアミノトランスフェラーゼの作用を利用することによりＬ−ホスフィノスリシンに変換する技術を構築し（特許第２６３８５４１号公報）、また、Ｌ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子の利用により、使用する微生物の菌体量（培養液量）を削減する技術についても確立している（特開平２−１９５８８９号公報）。【０００３】
このような微生物変換（酵素変換）によるＬ−ホスフィノスリシンの製造法においては、ＯＭＰＢと等量（または等モル量）のグルタミン酸とアスパラギン酸を使用することが一般的である。これは、グルタミン酸のみを使用した場合、反応は平衡に達し、理論変換率５０％で終了してしまうが、グルタミン酸とアスパラギン酸を併用した場合、グルタミン酸の脱アミノによって生じたα−ケトグルタル酸にアスパラギン酸のアミノ基が転移し、反応が連続的に進行し、高い変換率が得られるからである。この場合、アスパラギン酸の脱アミノによって生じたオキザロ酢酸は通常の反応温度（例えば３７℃）で容易に脱炭酸され、ピルビン酸となり反応系外に出るため、収率に影響を与えない。【０００４】
一方、Ｌ−ホスフィノスリシンを除草剤として製造、販売する場合において、その製造費用は著しく安価なことが期待される。具体的には、原料ＯＭＰＢからＬ−ホスフィノスリシンへの変換率（少なくとも９０％以上）を高くすることに加え、アミノ基供与体となるグルタミン酸やアスパラギン酸使用量を削減することも重大な課題となる。この課題を解決するための一手段として、特許３０１８２６１号公報の実施例４において、大腸菌Ｋ−１２由来のＬ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼとブタ由来のＧＯＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）を混合して用いることにより、グルタミン酸を低減した基質（ＯＭＰＢ（ＨＭＰＢ）：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：０．２：１）においても、Ｌ−ホスフィノスリシンが合成されることが開示されている。しかしこの技術は、Ｌ−ホスフィノスリシンへの変換率が最高でも８６％であり、工業的な目標収率に満たない上、安価な大量調達が難しいブタ由来の酵素を使用しているため、実質的に実用化が難しい技術であるといえる。別の一手段として、アスパラギン酸を直接のアミノ基供与体とするアミノトランスフェラーゼが開示されている（特表２００３−５２８５７２号公報）。しかしこの技術は、基質としてＯＭＰＢとアスパラギン酸のみを使用するため、グルタミン酸を全く使用しないというメリットを有するものの、最高の変換率は約７５％であり、工業的には不十分な結果であるといえる。【０００５】
したがって現在、微生物（または酵素）によるＬ−ホスフィノスリシンの製造法においては、原料ＯＭＰＢからＬ−ホスフィノスリシンへの変換率をより高くすることに加えて、標準的な基質（すなわち、ＯＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：１：１）からグルタミン酸を削減することが重要な課題であり、その解決が切望されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、Streptomyces hygroscopicusより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下「ＡＡＴ」と呼ぶことがある）をコードする新規の遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターでStreptomyces hygroscopicusを形質転換し、得られた形質転換体のＡＡＴ活性を親株のＡＡＴ活性と比較した結果、約４７倍であることを見出した（実施例３）。該ＡＡＴ活性増強株を用いてＬ−ホスフィノスリシンを製造したところ、９７％と、比較対照株を用いた場合に比べ高い変換率を示し、更に、グルタミン酸を低減した基質（ＯＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：０．２５：１）においても９０．１％という高い変換率を示した（実施例４）。また、Ｌ−ホスフィノスリシンアミノトランスフェラーゼ（以下「ＰＡＴ」と呼ぶことがある）の一種であるＡＴ−ＩＩとＡＡＴをStreptomyces hygroscopicusにおいて共発現させることにより、ＰＡＴ活性とＡＡＴ活性が共に増強された菌株を作出し、得られた形質転換体のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を親株と比較した結果、ＰＡＴ活性は約１６倍、ＡＡＴ活性は約１７０倍であることを見出した（実施例５）。該ＡＡＴ・ＰＡＴ活性増強株を用いてＬ−ホスフィノスリシンを製造したところ、比較対照株を用いた場合に比べ、９５．３％という高い変換率を示し、更に、グルタミン酸を低減した基質（ＯＭＰＢ：グルタミン酸：アスパラギン酸＝１：０．２５：１）においても９５．５％という極めて高い変換率を示した（実施例６）。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明は、ＡＡＴ遺伝子およびＡＡＴタンパク質を提供することをその目的とする。
【０００８】
本発明はまた、目的遺伝子を高発現させることができるプロモーターを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は更に、ＡＡＴ遺伝子を宿主に導入するための組換えベクターおよびＡＡＴ遺伝子が導入された宿主を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は更に、Ｌ−ホスフィノスリシンを高変換率で製造する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明によれば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択される、ポリヌクレオチドが提供される：
（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１で表される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１２】
本発明によれば、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質（以下「本発明によるタンパク質」と呼ぶことがある）が提供される：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＡＴ活性を有するタンパク質。
【００１３】
本発明によればまた、本発明によるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。（このポリヌクレオチドと前述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドを併せて、「本発明によるＡＡＴ遺伝子」と呼ぶことがある。)
本発明によれば、以下の（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）から選択される、ポリヌクレオチド（以下「本発明によるプロモーター」と呼ぶことがある）が提供される：
（ｉｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｘｉ）配列番号：３で表される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；および
（ｘｉｉ）配列番号：３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明によれば、本発明によるＡＡＴ遺伝子を含んでなる、組換えベクター（以下「本発明による第一の態様の組換えベクター」と呼ぶことがある）が提供される。
【００１５】
本発明によれば、本発明による第一の態様の組換えベクターにより形質転換された宿主（以下「本発明による第一の態様の宿主」と呼ぶことがある）が提供される。
【００１６】
本発明によれば、本発明によるＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下「ＰＡＴ遺伝子」と呼ぶことがある）とを含んでなる、組換えベクター（以下「本発明による第二の態様の組換えベクター」と呼ぶことがある）が提供される。
【００１７】
本発明によれば、本発明による第二の態様の組換えベクターにより形質転換された宿主（以下「本発明による第二の態様の宿主」と呼ぶことがある）が提供される。
【００１８】
本発明によれば、式（Ｉ）：
【化１】
0005335413.tif 000002
で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
0005335413.tif 000003
で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、グルタミン酸またはその塩およびアスパラギン酸またはその塩の存在下で、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌と接触させる工程を含んでなり、使用される放線菌が親株のＡＡＴ活性を超える活性を示すことを特徴とする方法（以下「本発明による第一の態様の方法」と呼ぶことがある）が提供される。
【００１９】
本発明によれば、式（Ｉ）：
【化３】
0005335413.tif 000004
で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、式（ＩＩ）：
【化４】
0005335413.tif 000005
で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、グルタミン酸またはその塩およびアスパラギン酸またはその塩の存在下で、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌と接触させる工程を含んでなり、使用される放線菌が親株のＡＡＴ活性を超える活性を示し、かつ、親株のＰＡＴ活性を超える活性を示すことを特徴とする方法（以下「本発明による第二の態様の方法」と呼ぶことがある）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＡＴ遺伝子を含む約５．８Ｋｂｐの制限酵素地図を示した図である。
【図２】発現ベクターｐＬＧ０４の構築を示した図である。
【図３】発現ベクターｐＳＧ１１の構築を示した図である。
【図４】プラスミドｐＡＴＳＧ０１の構築を示した図である。
【図５】発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１の構築を示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００２１】
［微生物の寄託］
本発明で使用されるStreptomyces hygroscopicus  ＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株は、１９８７年５月２０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８である。
【００２２】
本発明で使用されるStreptomyces hygroscopicus  ＳＦ１２９３株は、１９８２年５月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０である。
【００２３】
プラスミドｐＳＧ１１で形質転換された放線菌（Streptomyces lividans）（実施例３（１））は、２００６年２月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９５である。
【００２４】
プラスミドｐＭＳＢ５１５で形質転換された放線菌（Streptomyces lividans）は、１９８９年６月３０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４９６である。
【００２５】
プラスミドｐＡＨＳＧ７２０１で形質転換された放線菌（Streptomyces lividans）（実施例５（１））は、２００６年２月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９６である。
【００２６】
［ＡＡＴ遺伝子およびＡＡＴタンパク質］
本発明によるＡＡＴ遺伝子は、それによりコードされるタンパク質がＡＡＴ活性を有する限り、その由来は特に限定されないが、好ましくは放線菌由来であり、より好ましくは、Streptomyces hygroscopicus由来である。
【００２７】
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」および「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドあるいはアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）である。
【００２８】
改変された塩基配列の例としては、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、ＡＡＴ活性に影響を与えない変異を有する配列番号：１に記載の塩基配列が挙げられる。
【００２９】
改変されたアミノ酸配列の例としては、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、ＡＡＴ活性に影響を与えない変異を有する配列番号：２に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００３０】
ここで「ＡＡＴ活性」とは、ＡＡＴがＬ−アスパラギン酸のアミノ基をα−ケトグルタル酸に転移し、Ｌ−グルタミン酸とオキザロ酢酸を生じさせる反応（またはその逆反応）を触媒する能力として定義される。より具体的には、ＡＡＴ活性測定用基質（１５０ｍＭ  アスパラギン酸、５０ｍＭ  α−ケトグルタル酸、０．１ｍＭ  ピリドキサルリン酸、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ８．５）とＡＡＴを混合し、３７℃、２０分間インキュベートした後、反応を停止し、生成したグルタミン酸の量をアミノ酸分析用ＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−ＶＰ、島津製作所社製）にて分析することにより求められる酵素力（１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成する能力を１Ｕ（ユニット）とする）として定義される。
【００３１】
本発明において、微生物の産生するＡＡＴ活性を評価する場合、比活性（Ｕ／ｍｇ）を指標として評価することが望ましい。
【００３２】
比活性（Ｕ／ｍｇ）は、ＡＡＴ活性（Ｕ）をタンパク質量（例えば、プロティンアッセイキット（バイオラッド社製））を用いてγ−グロブリンをスタンダードとして測定することができる）で除することにより求められる。
【００３３】
また、「活性に影響を与えない変異」の例としては、保存的置換が挙げられる。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３４】
本願明細書において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．５×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、６０℃、１５分間の洗浄条件、好ましくは０．５×ＳＳＣ濃度、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、を意味する。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３６】
本願明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列についての「同一性」とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基またはアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３７】
本発明において、配列番号：２で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするポリヌクレオチドは容易に決まり、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードする種々のポリヌクレオチドを選択することができる。
【００３８】
従って、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：１で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものである。さらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３９】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
［プロモーター配列］
実施例３によれば、Streptomyces hygroscopicusより単離したＡＡＴ遺伝子の全長配列の内、ＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩ断片を含む発現ベクターにより形質転換された宿主についてＡＡＴ活性を調べたところ、親株の４７倍であった。これは、ＰｓｔＩ〜ＸｈｏＩ断片を含む発現ベクターにより形質転換された宿主における活性と比べ顕著に高活性であった。このことから、ＡＡＴ遺伝子のプロモーター領域の内、転写開始点から上流のＢａｍＨＩサイトまでの配列が強力なプロモーターとして働くことが認められた。上流領域を５’上流から切りつめた場合には、その上流領域により制御される構造遺伝子の発現が低下するのが通常であるが、本発明によるプロモーターは、意外にも、強力なプロモーター活性を有する。
【００４１】
本発明によるプロモーターの塩基配列としては、配列番号：３に記載される塩基配列が挙げられるが、この配列のみならず、プロモーター活性を同等程度有するその改変配列も含まれる。
【００４２】
ここで「プロモーター活性」を有するか否かは、例えば、実施例３に記載のようにＡＡＴ遺伝子の発現ベクターを作成し、宿主にて発現させ、ＡＡＴ活性を測定することにより評価することができる。ＡＡＴ活性が認められれば、プロモーター活性を有するといえるが、好ましくは親株の２倍以上、より好ましくは２０倍以上、最も好ましくは４０倍以上のＡＡＴ活性の増強が認められた場合に「プロモーター活性を有する」と評価することができる。
【００４３】
本発明によるプロモーターは、目的遺伝子に作動可能に連結することにより、目的遺伝子を高発現させることができる。本発明によるプロモーターによってより高発現させることができる目的遺伝子としては、放線菌由来の遺伝子が挙げられる。また、目的遺伝子をより高発現させることができる宿主としては、放線菌が挙げられる。
【００４４】
ここで「放線菌」としては、Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces albus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseus、Streptomyces lividans、Streptomyces virginiae、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces pilosus、Streptoverticillium cinnamoneum、Streptomyces morookaensis、Nocardia mediterranei 、Nocardopsis dassonvillei、Saccharopolyspora hirsuta、Kitasatosporia phosalacinea、Micromonospora carbonacae、Streptosporangium pseudovulgareが挙げられ、より好ましくはStreptomyces hygroscopicusである。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるプロモーターを、放線菌（好ましくはStreptomyces hygroscopicus）由来の遺伝子（好ましくはＡＡＴ遺伝子）に作動可能に連結することができる。
【００４６】
本発明の好ましい態様によればまた、本発明によるプロモーターを、放線菌（好ましくはStreptomyces hygroscopicus）由来の遺伝子（好ましくはＡＡＴ遺伝子）に作動可能に連結してなる組換えベクターを放線菌（好ましくはStreptomyces hygroscopicus）に導入することができる。
【００４７】
［ＰＡＴ遺伝子］
本発明による組換えベクターに使用されるＰＡＴ遺伝子は、それによりコードされるタンパク質がＰＡＴ活性を有する限り、その由来は特に限定されないが、好ましくは放線菌由来であり、より好ましくは、Streptomyces hygroscopicus由来である。
【００４８】
ここで、「ＰＡＴ活性」とは、ＰＡＴがＬ−グルタミン酸のアミノ基をＯＭＰＢに転移し、Ｌ−ホスフィノスリシンとα−ケトグルタル酸を生じさせる反応（またはその逆反応）を触媒する能力として定義される。より具体的には、ＰＡＴ活性測定用基質（１５０ｍＭ  グルタミン酸、５０ｍＭ  ＯＭＰＢ、０．１ｍＭ  ピリドキサルリン酸、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ８．５）とＰＡＴを混合し、３７℃、２０分間インキュベートした後、反応を停止し、生成したＬ−ホスフィノスリシンの量をアミノ酸分析用ＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−ＶＰ、島津製作所社製）にて分析することにより求められる酵素力（１分間に１μｍｏｌのＬ−ホスフィノスリシンを生成する能力を１Ｕ（ユニット）とする）として定義される。
【００４９】
本発明において、微生物の産生するＰＡＴ活性を評価する場合、比活性（Ｕ／ｍｇ）を指標として評価することが望ましい。
【００５０】
比活性（Ｕ／ｍｇ）は、ＰＡＴ活性（Ｕ）をタンパク質量（例えば、プロティンアッセイキット（バイオラッド社製））を用いてγ−グロブリンをスタンダードとして測定することができる）で除することにより求められる。
【００５１】
ＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）および（ｖｉ’）から選択されるものを使用することができる。
【００５２】
（ｉ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４で表される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｖｉ’）配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５３】
ＰＡＴ活性を有するタンパク質としては、以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）および（ｖｉｉｉ’）から選択されるものを使用することができる：
（ｖ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＡＴ活性を有するタンパク質。
【００５４】
［組換えベクター］
本発明による組換えベクターは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)等に記載される遺伝子組換え技術の慣行法に従って作製することができる。
【００５５】
本発明による組換えベクターにおいては、各遺伝子の発現に必要な制御配列、例えば、プロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号等の転写調節信号、翻訳調節信号等が、目的遺伝子に作動可能に連結されていてもよい。
【００５６】
本発明による組換えベクターはまた、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含んでいてもよく、使用する宿主に応じて適宜選択マーカーを選択することができる。選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子などが挙げられ、好ましい例としては、宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が、宿主が酵母の場合は、トリプトファン生合成遺伝子（TRP1）、ウラシル生合成遺伝子（URA3）、ロイシン生合成遺伝子（LEU2）等が、放線菌の場合は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が、それぞれ挙げられる。
【００５７】
本発明による組換えベクターは、使用する宿主の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２系、ｐＵＣ系のベクター、枯草菌の場合はｐＵＢ１１０系、ｐＰＬ６０３系、ｐＣ１９４系ベクター、酵母の場合はｐＹＣ系、ｐＹＥ系ベクター、放線菌の場合はｐＩＪ７０２系、ｐＩＪ６８０系、ｐＡＫ１１４系ベクターが挙げられる。
【００５８】
本発明による第一の態様の組換えベクターは、好ましくは、本発明によるプロモーターを更に含んでいてもよい。この場合、本発明によるプロモーターは、本発明によるＡＡＴ遺伝子に作動可能に連結することができる。この組換えベクターは宿主（特に放線菌）においてＡＡＴ遺伝子を高発現させることができる点で有利である。
【００５９】
本発明による第二の態様の組換えベクターは、好ましくは、本発明によるプロモーターを更に含んでいてもよい。この場合、本発明によるプロモーターは、本発明によるＡＡＴ遺伝子に作動可能に連結することができる。この組換えベクターは宿主（特に放線菌）においてＡＡＴ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子を高発現させることができる点で有利である。
【００６０】
本発明による第二の態様の組換えベクターはまた、ＰＡＴ遺伝子の発現を誘導するプロモーターを更に含んでいてもよく、そのプロモーターはＰＡＴ遺伝子に作動可能に連結することができる。
【００６１】
ＰＡＴ遺伝子のプロモーターについては、当業者であれば適宜選択することができ、好ましくは、特開平２−１９５８８９号公報に記載のプラスミドｐＭＳＢ５１５中のＡＴ−ＩＩ遺伝子プロモーターを使用することができる。
【００６２】
本発明によるプロモーターへの連結は、例えば、常法に従い、目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）の翻訳領域をプロモーターの下流に順方向に挿入することによって行うことができる。この場合、目的遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させることもできる。
【００６３】
本発明による第二の態様の組換えベクターにおいては、本発明によるＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子とは逆方向に連結されていても、順方向に連結されていてもよいが、ＡＡＴ活性を増強する観点から、好ましくは、逆方向に連結することができる。
【００６４】
本発明によるプロモーターには、本発明によるＡＡＴ遺伝子以外の目的遺伝子を連結することができる。
【００６５】
［形質転換体］
形質転換される宿主は、使用される組換えベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、その他の微生物の中から適宜選択されてよい。宿主として使用できる放線菌としては、Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces albus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseus、Streptomyces lividans、Streptomyces virginiae、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces pilosus、Streptoverticillium cinnamoneum、Streptomyces morookaensis、Nocardia mediterranei 、Nocardopsis dassonvillei、Saccharopolyspora hirsuta、Kitasatosporia phosalacinea、Micromonospora carbonacae、Streptosporangium pseudovulgareが挙げられ、好ましくはStreptomyces hygroscopicusであり、より好ましくは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＳＦ１２９３株が挙げられる。
【００６６】
組換えベクターを宿主に導入する方法は周知であり、宿主やベクターの種類によって最も効率のよい方法が選択される。放線菌を形質転換する場合には、大腸菌との接合による伝達、放線菌ファージによる感染、宿主菌のプロトプラストへの導入等が実施できる。形質転換によって得られた組換え体の選別には、用いるベクターの保有する遺伝的指標、例えば、抗生物質耐性、ポック形成、メラニン生合成等が利用できる。
【００６７】
形質転換された宿主の培養は、常法に従って、当該分野で通常用いられる培地、培養条件を使用することができる。
【００６８】
培地については、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコースおよびその他の糖類、並びに澱粉等が使用できる。また、窒素源としては、肉エキスおよびペプトン、並びにコーン、小麦、大豆、微生物などの各種抽出物が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸などの無機塩類や各種ビタミンを添加することもできる。培養中の発砲を抑えるため、市販の消泡剤を添加することもできる。
【００６９】
培地の殺菌方法については、蒸気殺菌やフィルター殺菌などの方法を使用することができる。
【００７０】
培養条件については、ロータリーシェーカーを用いたフラスコ培養や、ジャーファーメンター装置やタンク設備を用いた通気攪拌培養などにより行うことができる。培地のｐＨ、培養温度、培養日数は、形質転換体に応じて適宜決定することができる。
【００７１】
本発明による第一の態様の形質転換体の好ましい例としては、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結された第一の態様の組換えベクターにより形質転換された放線菌（特に、Streptomyces hygroscopicus）が挙げられる。この形質転換体は、親株の放線菌のＡＡＴ活性を超える活性を示す点で有利である。
【００７２】
本発明による第一の態様の形質転換体のより好ましい例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９５の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託された形質転換体から調製される発現ベクターｐＳＧ１１で形質転換されたStreptomyces hygroscopicusが挙げられ、最も好ましくは、該発現ベクターｐＳＧ１１で形質転換されたＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株が挙げられる。この形質転換体は、親株と比較して、非常に高いＡＡＴ活性を示す点で極めて有利である。
【００７３】
本発明による第二の態様の形質転換体の好ましい例としては、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結された第二の態様の組換えベクターにより形質転換された放線菌（特に、Streptomyces hygroscopicus）が挙げられる。この形質転換体は、親株の放線菌のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性のいずれをも超える活性を示す点で有利である。
【００７４】
本発明による第二の態様の形質転換体のより好ましい例としては、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結され、かつ本発明によるＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子とが逆方向に連結された第二の態様の組換えベクターにより形質転換された放線菌（特に、Streptomyces hygroscopicus）が挙げられる。この形質転換体は、親株の放線菌のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を示す点で有利である。
【００７５】
本発明による第二の態様の形質転換体のより好ましい例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９６の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託された形質転換体から調製される発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１で形質転換されたStreptomyces hygroscopicusが挙げられ、最も好ましくは、該発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１で形質転換されたＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株が挙げられる。この形質転換体は、親株と比較して、非常に高いＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示す点で極めて有利である。
【００７６】
［Ｌ−ホスフィノスリシンの製造方法］
酵素反応
本発明による製造方法において使用する放線菌は、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造に関与する。具体的には、この放線菌は、ＯＭＰＢ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸の存在下で、以下の酵素反応の進行に関与する。
【００７７】
（１）ＰＡＴがＬ−グルタミン酸とＯＭＰＢに作用することにより、Ｌ−グルタミン酸のアミノ基がＯＭＰＢに転移し、Ｌ−ホスフィノスリシンとα−ケトグルタル酸が生じる。
【００７８】
（２）ＡＡＴがＬ−アスパラギン酸とα−ケトグルタル酸に作用することにより、Ｌ−アスパラギン酸のアミノ基がα−ケトグルタル酸に転移し、Ｌ−グルタミン酸とオキザロ酢酸を生じる。
【００７９】
（３）（２）で生じたＬ−グルタミン酸が（１）において再び利用され、反応が継続する。
【００８０】
変換率の定義
本発明による製造法において、「変換率」とは、基質としてのＯＭＰＢのうち、Ｌ−ホスフィノスリシンに変換された割合を意味し、下記の式により算出することができる。
【数１】
0005335413.tif 000006
【００８１】
第一の態様の製造方法
本発明による第一の態様の製造方法によれば、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌のうち、親株のＡＡＴ活性を超えるＡＡＴ活性を有する放線菌をＬ−ホスフィノスリシンの製造に用いることにより、これまでに達成できなかった高効率でＬ−ホスフィノスリシンを製造することができる。特に、本発明による第一の態様の製造方法では、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造原料であるグルタミン酸を削減してもなお、Ｌ−ホスフィノスリシンを高効率で製造できることから、コスト削減の観点から極めて有利である。
【００８２】
すなわち、実施例４によれば、親株のＡＡＴ活性を超えるＡＡＴ活性を有する形質転換体を使用してＬ−ホスフィノスリシンを製造した場合、変換率は９７％であった。親株の変換率が９３．２％であり、またＰＡＴ遺伝子のみを高発現させた株の変換率が９２．６％であることを考慮すると、ＡＡＴ活性の増強により、Ｌ−ホスフィノスリシンの変換率が向上すると考えられる。
【００８３】
実施例４によればまた、親株のＡＡＴ活性を超えるＡＡＴ活性を有する形質転換体を使用して、グルタミン酸を減量した基質からＬ−ホスフィノスリシンを製造した場合、変換率は９０．１％であった。親株の変換率が７６．２％であり、またＰＡＴ遺伝子のみを高発現させた株の変換率が８２．７％であることを考慮すると、グルタミン酸減量基質を使用した場合にも、ＡＡＴ活性の増強により、Ｌ−ホスフィノスリシンの変換率が向上すると考えられる。
【００８４】
これまで、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造においては、Ｌ−ホスフィノスリシンへの変換工程に直接作用するＰＡＴに着目して、放線菌のＰＡＴ活性を増強する試みがなされたが、満足できる高効率での製造は達成できなかった。また、仮にＡＡＴ活性を増強してもＰＡＴ活性が律速になり、結局、Ｌ−ホスフィノスリシンの高効率での製造は達成できないと考えられてきた。
【００８５】
以下の理論に拘束される訳ではないが、Ｌ−ホスフィノスリシンを産生する放線菌においてＡＡＴ活性が増強されると、Ｌ−ホスフィノスリシンとともに生じたα−ケトグルタル酸が増強されたＡＡＴにより速やかにＬ−グルタミン酸に戻されるため、α−ケトグルタル酸による生成物阻害がかからなくなり、反応が円滑に進行するようになったと考えられる。
【００８６】
本発明による第一の態様の製造方法は、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌であって、親株のＡＡＴ活性を超える活性を示す放線菌を使用することを特徴とする。本発明による第一の態様の製造法では、使用される放線菌のＡＡＴ活性が親株の活性を超えるものであればよいが、好ましくは２倍以上、より好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上、最も好ましくは４０倍以上である。
【００８７】
ここで、「使用される放線菌が親株のＡＡＴ活性を超える活性を示す」か否かは、使用される放線菌が産生するＡＡＴの比活性を測定し、親株の比活性と比較することにより確認することができる。
【００８８】
本発明による第一の態様の製造方法で使用できる放線菌としては、親株のＡＡＴ活性を超える活性を示す放線菌であればよく、例えば、ＡＡＴ遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られた放線菌や、変異処理（ニトロソグアニジン処理、ＵＶ処理等）により育種されたＡＡＴ活性が増強された放線菌株を使用することができる。好ましくは、ＡＡＴ活性が親株よりも２０倍以上増強された放線菌を用いることができ、具体的には、本発明による第一の態様の宿主（放線菌）、より好ましくは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９５の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託された形質転換体から調製される発現ベクターｐＳＧ１１で形質転換されたStreptomyces hygroscopicus、最も好ましくは、該発現ベクターｐＳＧ１１で形質転換されたＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株、を使用することができる。
【００８９】
本発明による第一の態様の製造方法において使用される基質については、式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５〜１：１とすることができるが、経済的な観点からは、好ましくは、約１：約０．２５：約１である。
【００９０】
本発明による第一の態様の製造法の好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第一の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法が挙げられる。
【００９１】
本発明による第一の態様の製造法のより好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第一の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、その宿主に導入された組換えベクターが本発明によるプロモーターを更に含んでなり、かつ本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結されている方法が挙げられる。
【００９２】
本発明による第一の態様の製造法の特に好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第一の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、その宿主に導入された組換えベクターが本発明によるプロモーターを更に含んでなり、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結され、かつその宿主がStreptomyces hygroscopicus由来である方法が挙げられる。
【００９３】
第二の態様の製造方法
本発明による第二の態様の製造方法によれば、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌のうち、親株のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を有する放線菌をＬ−ホスフィノスリシンの製造に用いることにより、これまでに達成できなかった極めて高い効率でＬ−ホスフィノスリシンを製造することができる。特に、本発明による第二の態様の製造方法では、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造原料であるグルタミン酸を削減してもなお、Ｌ−ホスフィノスリシンを高効率で製造できることから、コスト削減の観点から極めて有利である。
【００９４】
すなわち、実施例６によれば、親株のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を有する形質転換体を使用してＬ−ホスフィノスリシンを製造した場合、変換率は９５．３％であった。親株の変換率が９３．２％であり、またＰＡＴ遺伝子のみを高発現させた株の変換率が９２．６％であることを考慮すると、ＡＡＴ活性に加えてＰＡＴ活性を増強することにより、Ｌ−ホスフィノスリシンの変換率が更に向上すると考えられる。
【００９５】
実施例６によればまた、親株のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を有する形質転換体を使用して、グルタミン酸を減量した基質からＬ−ホスフィノスリシンを製造した場合、変換率は９５．５％であった。親株の変換率が７６．２％であり、またＰＡＴ遺伝子のみを高発現させた株の変換率が８２．７％であることを考慮すると、グルタミン酸減量基質を使用した場合にも、ＡＡＴ活性に加えてＰＡＴ活性を増強することにより、Ｌ−ホスフィノスリシンの変換率が向上すると考えられる。
【００９６】
前述のように、放線菌のＰＡＴ活性のみを増強してもＬ−ホスフィノスリシンの変換率を向上させることができなかった。また、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造においてＡＡＴ活性のみならずＰＡＴ活性を増強することは報告されていなかった。
【００９７】
本発明による第二の態様の製造方法は、ＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を示し、かつＬ−ホスフィノスリシンを産生することができる放線菌であって、親株のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を示す放線菌を使用することを特徴とする。本発明による第二の態様の製造法では、使用される放線菌のＡＡＴ活性が親株の活性を超えるものであればよいが、好ましくは約２倍以上、より好ましくは約２０倍以上、さらに好ましくは約４０倍以上、特に好ましくは約１００倍以上、最も好ましくは約１７０倍以上である。本発明による第二の態様の製造法ではまた、使用される放線菌のＰＡＴ活性が親株の活性を超えるものであればよいが、好ましくは約２倍以上、より好ましくは約１０倍以上、最も好ましくは約１６倍以上である。
【００９８】
実施例６によれば、増強されたＡＡＴ活性が、増強されたＰＡＴ活性よりも相対的に強い場合に、Ｌ−ホスフィノスリシンの極めて高い製造効率が達成された。以下の理論に拘束される訳ではないが、生成物阻害を起こすと考えられるα−ケトグルタル酸が相対的に増強されたＡＡＴにより速やかにグルタミン酸に変換されるためであると考えられる。従って、本発明による第二の態様の製造方法では、使用する放線菌において、ＡＡＴ活性の方がＰＡＴ活性よりも相対的に強いことが好ましい。
【００９９】
ここで、「使用される放線菌が親株のＡＡＴ活性を超える活性を示す」か否かは、使用される放線菌が産生するＡＡＴの比活性を測定し、親株の比活性と比較することにより確認することができる。また、「使用される放線菌が親株のＰＡＴ活性を超える活性を示す」か否かは、使用される放線菌が産生するＰＡＴの比活性を測定し、親株の比活性と比較することにより確認することができる。
【０１００】
本発明による第二の態様の製造方法で使用できる放線菌としては、親株のＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性を超える活性を示す放線菌であればよく、例えば、ＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られた放線菌や、変異処理（ニトロソグアニジン処理、ＵＶ処理等）により育種されたＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性が増強された放線菌株を使用することができる。好ましくは、ＡＡＴ活性が親株よりも４０倍以上増強されるとともに、ＰＡＴ活性が１０倍以上増強された放線菌を用いることができ、具体的には、本発明による第二の態様の宿主（放線菌）、より好ましくは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４９６の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託された形質転換体から調製される発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１で形質転換されたStreptomyces hygroscopicus、最も好ましくは、該発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１で形質転換されたＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８の受託番号のもと独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されたＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株、を使用することができる。
【０１０１】
本発明による第二の態様の製造方法において使用される基質については、式（ＩＩ）の化合物またはその塩：グルタミン酸またはその塩：アスパラギン酸またはその塩＝１：０．２５〜１：１とすることができるが、経済的な観点からは、好ましくは、約１：約０．２５：約１である。
【０１０２】
本発明による第二の態様の製造法の好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第二の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法が挙げられる。
【０１０３】
本発明による第二の態様の製造法のより好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第二の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、その宿主に導入された組換えベクターが本発明によるプロモーターを更に含んでなり、かつ本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結されている方法が挙げられる。
【０１０４】
本発明による第二の態様の製造法の特に好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第二の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、その宿主に導入された組換えベクターが本発明によるプロモーターを更に含んでなり、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結され、かつその宿主がStreptomyces hygroscopicus由来である方法が挙げられる。
【０１０５】
本発明による第二の態様の製造法の最も好ましい態様としては、式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシメチルホスフィニル−２−オキソ−酪酸またはその塩を、本発明による第二の態様の宿主（放線菌）と接触させる工程を含んでなる、式（Ｉ）で示されるＬ−ホスフィノスリシンまたはその塩を製造する方法であって、その宿主に導入された組換えベクターが本発明によるプロモーターを更に含んでなり、本発明によるＡＡＴ遺伝子と本発明によるプロモーターとが作動可能に連結され、その宿主がStreptomyces hygroscopicus由来であり、かつ、ＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子とが逆方向に連結されている方法が挙げられる。
【０１０６】
製造条件
本発明による製造方法は、特許第２６３８５４１号公報の記載に従って行うことができる。例えば、３％ＯＭＰＢまたはその塩と０．７５％〜３％グルタミン酸またはその塩と３％アスパラギン酸またはその塩との混合液を基質として、これを水酸化ナトリウムにより中和し、ｐＨ７．０〜９．５、好ましくは、ｐＨ約８．５、温度３０〜４５℃、好ましくは、３７℃の条件で、０．５〜５日間、ＡＡＴ活性が増強された放線菌あるいはＡＡＴ活性およびＰＡＴ活性が増強された放線菌を作用させることにより行うことができる。また、変換反応時に、微量のピリドキサルリン酸またはその塩を添加することも可能である。
【０１０７】
更に本発明においては、得られたＬ−ホスフィノスリシンを含む混合液より、精製工程を経て、Ｌ−ホスフィノスリシンを純化することが可能である。この場合の精製方法は、当該分野で通常用いられている方法は全て適用可能であるが、イオン交換クロマトグラフィーや溶媒（例えばメタノールなど）による沈澱法を使用することが望ましい。本発明で得られる変換液はこれらの精製法により容易に純化可能であるため、変換液に微量のアラニンが存在しても特に問題とはならない。
【０１０８】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、グルタミン酸、およびアスパラギン酸はそれぞれ塩として存在することができる。
【０１０９】
式（Ｉ）の化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩の他、有機塩基、無機酸、有機酸との塩が挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。
【０１１０】
式（ＩＩ）の化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩の他、有機塩基との塩が挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。
【０１１１】
グルタミン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩の他、有機塩基、無機酸、有機酸との塩が挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。
【０１１２】
アスパラギン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩の他、有機塩基、無機酸、有機酸との塩が挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。
【実施例】
【０１１３】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１１４】
実施例１：Streptomyces hygroscopicus由来のＡＡＴ遺伝子のクローニング
（１）ＰＣＲ法による長鎖プローブの作製
ａ）Streptomyces hygroscopicus のゲノムＤＮＡの調製
Streptomyces hygroscopicus（ＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８）をＳＰＹ培地（２％でんぷん、１％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４：ｐＨ７．０）に植菌し、２８℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、凍結乾燥した。この凍結乾燥菌体をＷＯ００／２４８７９号公報の実施例Ｂ２記載の方法により処理することにより、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１１５】
ｂ）ＰＣＲ法によるＡＡＴ遺伝子部分断片の増幅
公知のデータベース（ＤＤＢＪホームページ http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html で利用可能な公共データベース）より得られる２種類の放線菌（Streptomyces virginiaeおよびStreptomyces coelicolor）由来のＡＡＴのアミノ酸配列を比較し、ホモロジーのある領域を検索した。その結果、相同性のある２ヶ所のアミノ酸配列（ＧＥＰＤＦＰＴＰおよびＫＴＹＡＭＴＧＷＲＶＧ）を特定し、この部分に対応する２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。
ＳＶ−ＧＯＴ−Ｎ：
５’−ＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧ−３’（配列番号：６）
５’−ＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＴＡＣＧＴＣＴＴ−３’（配列番号：７）【０１１６】
このプライマーを使用して、上述のStreptomyces hygroscopicusのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）を使用し、９４℃・１分間の熱変性の後、９８℃・３０秒間、６０℃・３０秒間、７２℃・１分１５秒間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で更に１０分間インキュベートした。反応終了後、サンプルを０．８％アガロース電気泳動に供し解析したところ、約０．６ｋｂｐの特異的なバンドの増幅が確認された。【０１１７】
ｃ）増幅した遺伝子断片のサブクローニング
実施例１（１）ｂ）で得られた約０．６ｋｂｐの遺伝子バンドをゲルから回収した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）によりＤＮＡを精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）およびＥ．ｃｏｌｉ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を使用してサブクローンした。得られたプラスミドをｐＳＨ−ＡＡＴとした。プラスミドｐＳＨ−ＡＡＴの挿入断片の塩基配列を解析したところ、Streptomyces virginiae由来のＡＡＴをコードするＤＮＡ配列との相同性が確認された（塩基配列の解析装置は、アプライドバイオシステム社製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した。シーケンス反応は、同社のＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  であるｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎを用いた。解析用のプライマーは、キット添付のＭ１３プライマーを使用した）。よって、本挿入断片をStreptomyces hygroscopicus由来のＡＡＴ遺伝子の部分断片であると判断し、以後の実験のプローブとして用いた。【０１１８】
（２）ＡＡＴ遺伝子のクローニング
ａ）ゲノムＤＮＡのライブラリーの構築
実施例１（１）ａ）で得られたゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、９〜２３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収断片をフェノール処理し、エタノール沈殿により精製した後、λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、およびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて、部分消化したゲノムＤＮＡ断片とλＥＭＢＬ３ベクターを連結した。得られたｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅをＭａｘｐｌａｘ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（エピセンター社製）を用いてパッケージングした後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた２．０×１０５個のファージライブラリーを用いて、目的遺伝子のクローニングを行った。【０１１９】
ｂ）ライブラリーのスクリーニング
実施例１（１）ｃ）で得られたプラスミドｐＳＨ−ＡＡＴをＥｃｏＲＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて精製し、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  Ｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてプローブをＤＩＧ標識した。【０１２０】
次に、実施例１（２）ａ）で得られたファージライブラリーをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブラン（アマシャムバイオサイエンス社製）に写し取り、０．５Ｎ水酸化ナトリウムで変性後、５×ＳＳＣ（１×ＳＳｃ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させてＤＮＡを固定した。前述キットの記載に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、熱変性した標識化プローブを添加し、１６時間ハイブリダイゼーション（４２℃）を行った。ラベルの洗浄についてもキット記載の方法に従い、まず、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、室温で５分間×２回洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣで、６５℃で１５分間×２回洗浄した。更に、キット記載の方法に従い、アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を反応させた後、キット添付の基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を添加した。結果、青色を呈する２個の陽性クローンが得られた。【０１２１】
ｃ）ファージＤＮＡの調製
陽性のファージを、前述λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ記載の方法に従い大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ株に感染させた後、１６時間後にファージ粒子を回収し、Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒの方法（Grossberger, D., Nucleic Acids. Res., 15:6737, 1987）に従い、プロティナーゼＫおよびフェノール処理後、エタノール沈殿によりファージＤＮＡを調製した。【０１２２】
ｄ）サザンハイブリダイゼーション
実施例１（１）ａ）で得られたゲノムＤＮＡおよび、実施例１（２）ｃ）で得られたファージＤＮＡを複数の制限酵素でそれぞれ消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｎの方法（Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98:503-517,1975）により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブランに写し取った後、ＥＣＦ  Ｒａｎｄｏｍ−Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてハイブリダイゼーションを実施した。本システム記載の方法により、３０分間のプレハイブリダイゼーション（６０℃）の後、熱変性した標識化プローブを添加し、１６時間ハイブリダイゼーション（６０℃）を行った。プローブは、実施例１（２）ｂ）で得られたｐＳＨ−ＡＡＴ由来の約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、本システム記載の方法によりフルオレセイン標識して用いた。ラベルの洗浄についても本システム記載の方法に従い、まず、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで、６０℃で１５分間洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣで、６０℃で１５分間洗浄した。更に、本システム記載の方法に従い、アルカリホスファターゼ標識抗フルオレセイン抗体を反応させた後、本システム添付の基質（ＥＣＦ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を添加し、得られた蛍光バンドをモレキュラーイメージャーＦＸ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ社製）で検出した。その結果、ゲノムＤＮＡおよびファージＤＮＡをＢａｍＨＩで処理した場合に約４．３ｋｂｐの共通のバンドが、ＰｓｔＩで処理した場合に約２．７ｋｂｐの共通のバンドが、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した場合に約１．５ｋｂｐの共通のバンドがそれぞれ得られることが明らかとなった。【０１２３】
ｅ）目的遺伝子のサブクローニング
まず、実施例１（２）ｃ）で得られたファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約４．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１１８  ＢａｍＨＩ−ＢＡＰ処理ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に連結し、得られたプラスミドをｐ１１８Ｇ−４１１Ｂとした。同様にファージＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで処理し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した後、ｐＵＣ１１８  ＰｓｔＩ−ＢＡＰ処理ＤＮＡに連結し、得られたプラスミドをｐ１１８Ｇ−４１１Ｐとした。【０１２４】
得られたプラスミドｐ１１８Ｇ−４１１Ｐを制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。次に、プラスミドｐ１１８Ｇ−４１１Ｂを制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。得られたＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ；タカラバイオ社製）処理により脱リン酸化した後、先に得られたｐ１１８Ｇ−４１１Ｐ由来の約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＡＡＴ３−５とした。【０１２５】
得られたプラスミドｐＡＡＴ３−５を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。次に、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩで消化した後、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製し、先に得られたプラスミドｐＡＡＴ３−５由来の約２．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＨＸ−０１とした。【０１２６】
Streptomyces hygroscopicus由来のＡＡＴ遺伝子を含む約５．８Ｋｂｐの制限酵素地図を図１に示す。【０１２７】
実施例２：Streptomyces hygroscopicus 由来のＡＡＴ遺伝子の塩基配列解析
（１）プラスミドｐＨＸ−０１の塩基配列の解析
ａ）シーケンス反応
シーケンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いて実施した。反応には、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＨＸ−０１を、プライマーとしては下記の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用した。
Ｍ１３−２０：５’−ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：８）
Ｍ１３−Ｒ  ：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’ （配列番号：９）【０１２８】
付属のマニュアルに従い反応液を調製後、サーマルサイクラーに使用して９６℃・１０秒間、５０℃・５秒間、６０℃・４分間のサイクルを３０回繰り返すことによりシーケンス反応を実施した。【０１２９】
ｂ）シーケンス解析
実施例２（１）ａ）で得られた反応液から、余剰の蛍光色素およびプライマーをエターノール沈殿法により除去した後、サンプルを３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）に供した。得られた塩基配列データを基に新規のプライマーを作製し、シーケンス反応・解析を繰り返すことにより、全長を両方向でカバーする配列データを取得した。最後にＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ジーンコード社製）を使用して得られた配列データのアセンブルを実施し、塩基配列を確定した（配列番号：１０）。【０１３０】
（２）公共のデータベースを利用した相同性解析
実施例２（１）ｂ）で決定した配列を用いて、公共のデータベース（ＤＤＢＪホームページ http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html で利用可能な公共データベース）上の配列との相同性検索を実施した。検索プログラムとしてｂｌａｓｔｘ（ＤＮＡ配列×アミノ酸配列ＤＢ）を使用し、フィルターＯＦＦの条件で検索を行った結果、Streptomyces celicolorのＡＡＴ遺伝子と８７％、Streptomyces virginiaeのＡＡＴ遺伝子と８８％の同一性をそれぞれ示した。【０１３１】
実施例３：Streptomyces hygroscopicus 由来のＡＡＴ遺伝子の高発現
（１）発現ベクターｐＬＧ０４、ｐＳＧ１１の構築
発現ベクターｐＬＧ０４は図２に示すようにして構築した。また、発現ベクターｐＳＧ１１は図３に示すように構築した。【０１３２】
ａ）プラスミドｐＳＹＴＬ０３の構築
Katz, E., J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714, 1983に記載のプラスミドｐＩＪ７０２を制限酵素ＰｓｔＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。次に、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）も同様にＰｓｔＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。得られた２種類のＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＳＹＴＬ０３を構築した（図２）。【０１３３】
ｂ）発現ベクターｐＬＧ０４の構築
まず、実施例３（１）ａ）で得られたプラスミドｐＳＹＴＬ０３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。次に、実施例１（２）ｅ）で得られたプラスミドｐＨＸ０１も同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後、約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、精製した。これら２種類のＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られたｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを放線菌Streptomyces lividansに形質転換した。Streptomyces lividansの形質転換は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎの方法（Thompson, C. J., J. Bactriol., 151:668-677, 1982）に従い実施した。Streptomyces lividansプロトプラスト、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔ培地を混合した後、２０％ポリエチレングリコール１０００を添加してＤＮＡを導入し、Ｒ２ＹＥ  ａｇａｒプレート（２０ｍｌ培地／プレート）上で３０℃、一晩培養した。その後、１００μｇ／ｍｌのチオストレプトン２ｍｌをプレート一枚に重層した（チオストレプトン終濃度１０μｇ／ｍｌ）。３０℃で更に数日間培養し、形成したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む８０ｍｌ  ＹＥＭＥ培地で３０℃、２日間、振とう培養した後、培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。Streptomyces lividans形質転換体からのプラスミドＤＮＡの調製は、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使用し、キット添付の説明書に従い実施した。ただし、菌体の溶菌を促進させるため、キット添付のｂｕｆｆｅｒ  Ｐ１に終濃度１０ｍｇ／ｍｌになるようリゾチームを添加し、本溶液で菌体を室温で３０分、プレインキュベートするという前処理工程を追加して実施した。培養液２０ｍｌよりＤＮＡを回収し、最終的に５０μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。複数の形質転換体を処理し、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断後、０．８％アガロース電気泳動に供し、切断パターンを確認した。約２．９ｋｂｐと約４．９ｋｂｐのバンドを呈するプラスミドＤＮＡを目的のＤＮＡとして選択し、これを発現ベクターｐＬＧ０４とした（図２）。【０１３４】
ｃ）発現ベクターｐＳＧ１１の構築
実施例１（２）ｅ）で得られたプラスミドｐＨＸ０１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、精製した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８  ＢａｍＨＩ−ＢＡＰ処理ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に連結し、得られたプラスミドをｐ１１８−Ｇ１とした（図３）。【０１３５】
このプラスミｐ１１８−Ｇ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、精製した。また、実施例３（１）ａ）で得られたプラスミドｐＳＹＴＬ０３も同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、精製した。これら２種類のＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、得られたｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを実施例３（１）ｂ）の方法に従い放線菌Streptomyces lividansに形質転換した。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む８０ｍｌＹＥＭＥ培地で３０℃、２日間、振とう培養した後、培養液から実施例３（１）ｂ）の方法に従い、プラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断後、０．８％アガロース電気泳動に供し、切断パターンを確認した。約１．５ｋｂｐと約４．９ｋｂｐのバンドを呈するプラスミドＤＮＡを目的のＤＮＡとして選択し、これを発現ベクターｐＳＧ１１とした（図３）。【０１３６】
（２）発現ベクターｐＬＧ０４、ｐＳＧ１１によるStreptomyces hygroscopicus の形質転換
ａ）プロトプラストの調製
Streptomyces hygroscopicus（ＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８）の菌株ストック（凍結乾燥菌体）を１０ｍｌのＳ１培地（２％でんぷん、１％ポリペプトン、０．３％モルトエキストラクト、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．０）に植菌し、２８℃で４０時間、振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを、５％グリシンを含む８０ｍｌのＳ２培地（１％グルコース、０．４％ペプトン、０．４％イーストエキストラクト、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．０）に移植し、２８℃で１８時間、振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、０．５Ｍ  シュクロースで洗浄した後、終濃度２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームと終濃度１．２５ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼを含むＰ３培地（７０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  シュクロース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｍＭ  ＴＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ７．２）に懸濁し、３０℃で一時間振とうし、溶菌させた。生じたプロトプラストをＰ３培地で洗浄した後、約５００μｌのＰ３培地に懸濁し、これをプロトプラスト溶液とした。【０１３７】
ｂ）形質転換
ｂ）−１  培地の調製
形質転換の際に使用するＴＨ培地は以下の方法で調製した。まず、Ｏｋａｎｉｓｈｉの方法（Okanishi, M., J. Gen. Microbiol., 80, 389-400, 1974）に従い、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。次に、シュークロース  ２６．７ｇ、Ｋ２ＳＯ４  ０．０３７５ｇを約６０ｍｌに溶解し、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ０．３ｍｌを加えた後、水で７７．５ｍｌにメスアップし、これを３／２ＴＨ培地とした。この３／２ＴＨ培地  ７．７５ｍｌに、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ０．７５ｍｌと０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）１．５ｍｌを加え、これをＴＨ培地とした。【０１３８】
プロトプラスト再生用のＲＭＥ培地は以下の方法で調製した。まず、プロリン  ２ｇ、グルコース  １０ｇ、イーストエキストラクト  ２ｇ、カザミノ酸  ２ｇ、シュークロース  １７４ｇ、ＫＣｌ  １５ｇ、Ｋ２ＳＯ４  ０．２５ｇ、ＤＥＸＴＲＡＮ  ＳＵＬＦＡＴＥ  ０．０５ｇ、ＬＡＢ  ＤＥＭＣＯ  １ｇを水に溶解し、１０％  ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整し、水で５００ｍｌにメスアップし、これを２×ＲＭＥ培地とした。２×ＲＭＥ培地５００ｍｌ、０．５％ＫＨ２ＰＯ４  １０ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ５０ｍｌ、３％コーンスティープリカー（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１００ｍｌ、５％アスパラギン酸ナトリウム（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１０ｍｌ、３．０３％アガー  ３３０ｍｌを別々に殺菌後、混合しこれをＲＭＥ培地（アガー終濃度  １％）とした。重層用のＲＭＥソフトアガー培地は、ＲＭＥ培地のアガー終濃度を０．５％に変更したものを用いた。【０１３９】
ｂ）−２  形質転換体の作出
実施例３（１）ｂ）で得られたベクターｐＬＧ０４および実施例３（１）ｃ）で得られたベクターｐＳＧ１１のＤＮＡ溶液各２５μｌ、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌに実施例３（２）ｂ）−１で得られたＴＨ培地１００μｌを加えよく混合した後、実施例３（２）ａ）で得られたプロトプラスト溶液１００μｌを加え、緩やかに混合した。このＤＮＡ／プロトプラスト混合液にＰＥＧ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｇ  ポリエチレングリコール１０００、６ｍｌ  ＴＨ培地）３７５μｌを加え、約１分間混合した後、適当量（１０μｌ〜１００μｌ）をＲＭＥ培地（約２０ｍｌ／プレート）にプレーティングし、さらにＲＭＥソフトアガー培地を重層した（約２ｍｌ／プレート）。２８℃で約２日間培養した後、１００μｇ／ｍｌのチオストレプトン溶液２ｍｌをプレートに添加し塗布した。さらに２８℃で７〜１０日間培養し、得られたコロニーを形質転換体とした。【０１４０】
（３）発現ベクターｐＬＧ０４およびｐＳＧ１１による形質転換体の評価
ａ）形質転換体の培養
実施例３（２）ｂ）−２で得られたコロニーを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む１０ｍｌのＳＰＹ培地に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３０ｍｌのＳＰＹ培地に植菌し、２８℃で２日間、更に振とう培養した。【０１４１】
ｂ）形質転換体の評価
実施例３（３）ａ）で得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、０．９％食塩水で洗浄した後、菌体を−８０℃で凍結した。凍結菌体を２０ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ａ２（２０ｍＭ  リン酸バッファー、０．１ｍＭ  ピリドキサルリン酸、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド；ｐＨ７．０）に溶解、懸濁し、菌体を超音波により破砕した。破砕液から遠心分離により細胞断片を除去し、上清を粗酵素液とした。得られた粗酵素液を用いて、Ｔａｎａｋａらの方法（Tanaka, T., Agric. Biol. Chem., 54:625-631, 1990）に従い、３７℃、ｐＨ７．５におけるＡＡＴ活性を測定した。【０１４２】
その結果、ｐＬＧ０４形質転換体のＡＡＴ活性に対してｐＳＧ１１形質転換体のＡＡＴ活性が約５．４倍と顕著に高活性であったことから（表１）、ｐＳＧ１１形質転換体をＡＡＴ高発現株として以降の実験に用いた。
【表１】
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【０１４３】
（４）発現ベクターｐＳＧ１１による形質転換体の評価
ａ）形質転換体の培養
実施例３（２）ｂ）−２で得られた発現ベクターｐＳＧ１１による形質転換体の菌株ストック（凍結乾燥菌体）を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む１０ｍｌのＳＰＹ培地に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３０ｍｌのＰ−１０１培地（７％グルコース、４．４％ソイトン、０．３２７％ＫＨ２ＰＯ４、０．０８５％Ｎａ２ＨＰＯ４、１．１５％  ＴＥＳ、０．０００１％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；ｐＨ６．０）に移植し、２８℃で４日間振とう培養した。対照として親株（プラスミドなし）および特開平２−１９５８８９号公報記載のプラスミドｐＭＳＢ５１５による形質転換体も同様の工程で培養した（ただし、親株はチオストレプトンを含まない培地で培養した）。【０１４４】
ｂ）酵素活性の測定
ｂ）−１  粗酵素液の調製
実施例３（４）ａ）で得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、０．９％食塩水で洗浄した後、菌体を−８０℃で凍結した。凍結菌体を２０ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ａ２に溶解、懸濁し、菌体を超音波により破砕した。破砕液から遠心分離により細胞断片を除去し、上清を粗酵素液とした。得られた粗酵素液を用いて、ＡＡＴおよびＰＡＴ活性を測定した。【０１４５】
ｂ）−２  ＰＡＴ活性およびＡＡＴ活性の測定
ＰＡＴ活性の測定は、Ｓｃｈｕｌｚの方法（Schulz, A., Appl. Environ. Microbiol., 56, 1-6, 1990）に従って実施した。ＰＡＴ活性測定用基質（１５０ｍＭ  グルタミン酸、５０ｍＭ  ＯＭＰＢ、０．１ｍＭ  ピリドキサルリン酸、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ８．５）と粗酵素液を混合し、３７℃、２０分間インキュベートした後、沸騰水浴中で５分間加熱することにより反応を停止した。反応停止後、サンプルを０．４５μｍのフィルターによりろ過し、アミノ酸分析用ＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−ＶＰ、島津製作所社製）に供し、生成したＬ−ホスフィノスリシン濃度を測定した。酵素力は、１分間に１μｍｏｌのＬ−ホスフィノスリシンを生成する能力を１Ｕ（ユニット）として定義した。粗酵素液中のタンパク質濃度をプロティンアッセイキット（バイオラッド社製）を用いてγ−グロブリンをスタンダードとして測定し、粗酵素液の比活性（Ｕ／ｍｇ）を求めた。【０１４６】
ＡＡＴ活性の測定は、以下の方法で実施した。ＡＡＴ活性測定用基質（１５０ｍＭ  アスパラギン酸、５０ｍＭ  α−ケトグルタル酸、０．１ｍＭ  ピリドキサルリン酸、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ；ｐＨ８．５）と粗酵素液を混合し、３７℃、２０分間インキュベートした後、沸騰水浴中で５分間加熱することにより反応を停止した。反応停止後、サンプルを０．４５μｍのフィルターによりろ過し、アミノ酸分析用ＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−ＶＰ、島津製作所社製）に供し、生成したグルタミン酸濃度を測定した。酵素力は、１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成する能力を１Ｕ（ユニット）として定義した。粗酵素液中のタンパク質濃度を上述のプロティンアッセイキットで測定し、粗酵素液の比活性（Ｕ／ｍｇ）を求めた。【０１４７】
その結果、ｐＳＧ１１の組換え体のＰＡＴ活性は親株とほとんど変わらなかったが、ＡＡＴ活性は親株の約４７倍であった（表２）。
【表２】
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【０１４８】
実施例４：ＡＡＴ遺伝子の高発現株によるＬ−ホスフィノスリシンの生産
（１）発現ベクターｐＳＧ１１による形質転換体の培養
実施例３で得られたｐＳＧ１１による形質転換体の菌株ストック（凍結乾燥菌体）を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３０ｍｌのＳＰＹ培地に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む４０ｍｌのＳＰＹ培地に移植し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液のうち２０ｍｌを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む４００ｍｌのＳＢＫ培地（２％でんぷん、３％脱脂大豆かす、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．０）に移植し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液のうち５ｍｌを４ＬのＳＢＫ培地に移植し、２８℃で２日間、通気攪拌培養した。得られた培養液のうち４００ｍｌを４ＬのＰ２培地（３％グルコース、３％脱脂大豆かす、１％グルテンミール、０．００１％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１３％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；ｐＨ７．０）に移植し、２８℃で４日間通気攪拌培養した。得られた培養液を用いて、下記の条件で微生物変換を実施し、Ｌ−ホスフィノスリシンの生産を行った。尚、対照として親株（プラスミドなし）およびプラスミドｐＭＳＢ５１５による形質転換体も同様の工程で培養し（ただし、親株はチオストレプトンを含まない培地で培養した）、同様に変換反応を行った。【０１４９】
（２）微生物変換によるＬ−ホスフィノスリシンの生産
ａ）基質溶液Ａの調製
まず、ＯＭＰＢ、アスパラギン酸、グルタミン酸を各６６ｇ測りとり、約１Ｌの水に懸濁した。次に、２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調製し、水で１７６０ｍｌにメスアップし、これを基質溶液Ａとした。【０１５０】
ｂ）基質溶液Ｂの調製
まず、ＯＭＰＢ、アスパラギン酸を各６６ｇ、グルタミン酸を各１６．５ｇ測りとり、約１Ｌの水に懸濁した。次に、２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調製し、水で１７６０ｍｌにメスアップし、これを基質溶液Ｂとした。【０１５１】
ｃ）微生物変換
実施例４（１）で得られた培養液４４０ｍｌと実施例４（２）のａ）またはｂ）でそれぞれ得られた基質溶液ＡまたはＢ１７６０ｍｌを混合し反応を開始した。変換条件は、温度３７℃、ｐＨ８．５（水酸化ナトリウムで調整）とし、攪拌しながら３日間（約７０時間）反応を実施した。変換終了後、サンプルを０．４５μｍのフィルターによりろ過し、アミノ酸分析用ＨＰＬＣ（ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−ＶＰ、島津製作所社製）に供し、生成されたＬ−ホスフィノスリシンの濃度を測定した。また、変換終了時の変換液量も正確に測定し、それらの積から生産されたＬ−ホスフィノスリシン量を求めた。さらに使用したＯＭＰＢと生産されたＬ−ホスフィノスリシンのモル比を求めることにより、各培養液におけるＬ−ホスフィノスリシンへの変換率を算出した。【０１５２】
その結果、ＡＡＴ高発現株は、親株やｐＭＳＢ５１５による形質転換体に比べ、グルタミン酸濃度を低減した基質溶液Ｂにおいても、顕著に高い変換率を示した（表３）。
【表３】
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【０１５３】
実施例５：ＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子の共発現
（１）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１の構築
プラスミドｐＡＴＳＧ０１は図４に示すようにして構築した。また、発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１は図５に示すようにして構築した。【０１５４】
ａ）プラスミドｐＡＴＩＩ５１５−０３の構築
ＰＡＴ遺伝子は、ＰＡＴの一種であるＡＴ−ＩＩ（特開平２−１９５８８９号公報参照）の遺伝子を使用した。まず、特開平２−１９５８８９号公報記載のプラスミドｐＭＳＢ５１５より、ＰＡＴの一種であるＡＴ−ＩＩの遺伝子を制限酵素ＳａｃＩ（ＳｓｔＩ）で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。次に、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）も同様にＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。ｐＵＣ１８のＳａｃＩ断片をアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ；タカラバイオ社製）により処理した後、ｐＭＳＢ５１５由来の約４．７ｋｂｐのＳａｃＩ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＡＴＩＩ５１５−０３とした（図４）。【０１５５】
ｂ）プラスミドｐＡＴＳＧ０１の構築
まず、実施例１（２）ｅ）で得られたプラスミドｐＨＸ−０１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。次に、実施例５（１）ａ）で得られたプラスミドｐＡＴＩＩ５１５−０３を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約７．４ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。ｐＡＴＩＩ５１５−０３のＢａｍＨＩ断片をアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）により処理した後、ｐＨＸ−０１由来の約１．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＡＴＳＧ０１とした（図４）。【０１５６】
ｃ）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１の構築
まず、実施例３（１）ａ）で得られたプラスミドｐＳＹＴＬ０３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＤＮＡを精製した。次に、実施例５（１）ｂ）で得られたプラスミドｐＡＴＳＧ０１も同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後、約５．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、精製した。これら２種類のＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結し、得られたｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを実施例３（１）ｂ）と同様の方法で放線菌Streptomyces lividansに形質転換した。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む８０ｍｌ  ＹＥＭＥ培地で３０℃、２日間、振とう培養した後、培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断後．０．８％アガロース電気泳動に供し、切断パターンを確認した。約４．９ｋｂｐと約５．６ｋｂｐのバンドを呈するプラスミドＤＮＡを目的のＤＮＡとして選択し、これを発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１とした（図５）。【０１５７】
（２）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１によるStreptomyces hygroscopicusの形質転換と形質転換体の評価
ａ）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換の作出と形質転換体の培養
実施例５（１）ｃ）で得られた発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１により、Streptomyces hygroscopicus（ＳＦ１２９３  ＮＰ−５０株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６８）を形質転換した。実施例３（２）の方法に従い形質転換を実施し、得られた形質転換体を培養した。実施例３（４）ａ）と同様の工程で培養を行い、１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＰ−１０１培地で２８℃、４日間振とう培養した培養液を得た。得られた培養液より菌体を回収し、実施例３（４）ｂ）−１の方法に従い粗酵素液を調製した。【０１５８】
ｂ）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体の評価
実施例５（２）ａ）で得られた発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体由来の粗酵素液を用いて、ＰＡＴ活性およびＡＡＴ活性を測定した。酵素活性の測定は、実施例３（４）ｂ）−２の方法に従った（対照として、実施例３（４）ｂ）−２の結果を併記した）。【０１５９】
その結果、ｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体のＰＡＴ活性は親株の約１６倍、ＡＡＴ活性は親株の約１７０倍であった（表４）。
【表４】
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【０１６０】
実施例６：ＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子の共発現株によるＬ−ホスフィノスリシンの生産
（１）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体の培養
実施例５（２）で得られた発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体を、実施例４（１）と同様の工程で培養した。Ｐ−２培地で２８℃、４日の通気攪拌間培養を実施し、得られた培養液を用いてＬ−ホスフィノスリシンの生産を行った。【０１６１】
（２）発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体の培養
実施例６（１）で得られた発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体の培養液４４０ｍｌと実施例４（２）の方法に従って調製した基質溶液ＡまたはＢ１７６０ｍｌを混合し、３７℃、ｐＨ８．５で３日間（約７０時間）反応した。得られた変換液を実施例４（２）と同様の方法で分析し、Ｌ−ホスフィノスリシンの生産量を求めた（対照として、実施例４（２）ｃ）の結果を併記した）。【０１６２】
その結果、グルタミン酸を低減した基質溶液Ｂにおいても、発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体（すなわち、ＡＡＴ・ＰＡＴ共発現株）は他の株に比べ、顕著に高い変換率を示した（表５）。
【表５】
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【０１６３】
実施例７：ＡＡＴ遺伝子とＰＡＴ遺伝子の共発現株における、高発現タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の同定
発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体において高発現したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、特許第３５９３１３４号公報の実施例Ａ２記載の方法に従い、Ｎ末端アミノ酸のシーケンスを実施した。まず、実施例５（２）ｃ）で得られた発現ベクターｐＡＨＳＧ７２０１による形質転換体の粗酵素液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ  １２％  Ｇｅｌ（テフコ社製）を用いて電気泳動した後、マルチフォーＩＩ電気泳動装置（アマシャムバイオサイエンス社製）によりタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に写し取った。次にこのＰＶＤＦ膜をコマジーブリリアントブルーＲ−２５０（ナカライテスク社製）で染色し、脱色した後、水で洗浄し風乾した。ここから５０ｋＤａと４３ｋＤａのタンパク質がブロットされた部分を切り出し、それぞれをプロティンシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２（パーキンエルマー社製）に供し、下記のようにＮ末端アミノ酸配列を決定した。
４３ｋＤａタンパク質：
Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１１）
５０ｋＤａタンパク質：
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号：１２）【０１６４】
４３ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は配列番号：２の第２番目〜第９番目と一致した。従って、４３ｋＤａタンパク質は、ＡＡＴタンパク質であることが明らかとなった。また、５０ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は配列番号：５の第２番目〜第９番目と一致した。従って、５０ｋＤａタンパク質は、ＰＡＴタンパク質であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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