(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質および／またはＲｅｖタンパク質により転写が誘導されるヒト免疫不全ウイルスのＬＴＲと、その下流に前記ＬＴＲにより発現の制御が可能な形態に配置されたＭａｚＦタンパク質をコードする遺伝子とを含有する核酸。
【請求項２】
ベクターに組み込まれている請求項１記載の核酸。
【請求項３】
請求項１記載の核酸をエクス・ビボで細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルスの複製が抑制される細胞の製造方法。
【請求項４】
細胞がＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む細胞集団である請求項３記載の方法。
【請求項５】
核酸がウイルスベクターにより細胞に導入されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
レトロウイルスベクターにより核酸が細胞に導入される請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫不全ウイルスの感染に起因する疾患の治療または予防に有用な核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）はＣＤ４分子を発現する細胞、例えばＴ細胞に感染し、前記細胞を破壊する。このため、ＨＩＶの感染を受けたヒトの体内ではＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）の減少と細胞性免疫の低下が起こる。ついには重度の免疫不全状態に陥り、カリニ肺炎のような日和見感染症を発症する。この状態は後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）と称されている。【０００３】
ＨＩＶ感染症の治療方法として、ＨＩＶ生活環を遮断する抗ウイルス剤（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）やワクチンの開発が行われており、いくつかの抗ウイルス剤がすでに実用化されている。しかし、変異頻度の高いＨＩＶでは感染した個体内で前記の薬剤の効果の及ばない変異体の出現することがあり、必ずしも特効薬として完成された状況にはない。別のアプローチである、ＲＮＡデコイやリボザイムのような核酸、トランスドミナント変異タンパクや細胞内抗体のようなタンパク質を有効成分としてＨＩＶの増殖を阻止する遺伝子治療薬を開発する試みもいまだ完成の域には達していない。【０００４】
また、ＨＩＶの感染した細胞に特異的に細胞死を起こさせる方法が考案されている（例えば特許文献１、非特許文献１、２、３）。前記の方法はＨＩＶ由来のＬＴＲプロモーターの下流に細胞毒性を示す産物をコードする遺伝子を接続するものであるが、これまでのところ臨床的に応用された例は知られていない。特許文献２（米国特許５８３７５１０号
）には前記の細胞毒性を示す産物としてリボヌクレアーゼを使用することが記載されているが、リボヌクレアーゼによるＨＩＶ感染細胞の細胞死は確認されていない。また、代表的なリボヌクレアーゼであるヒト膵臓由来リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ１）は細胞質に存在するリボヌクレアーゼ・インヒビターにより阻害されることが知られており（非特許文献４）、前記の目的に適したものとは言えない。【０００５】
いくつかの原核生物のプラスミドは、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺すｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｋｉｌｌｉｎｇ（ＰＳＫ）の機能を有することが報告されている。これらのプラスミドにはトキシン−アンチトキシン遺伝子が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合しトキシンを不活性化しているが、アンチトキシンはプロテアーゼに対して分解されやすく、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解されると安定なトキシンが活性化される。このようなトキシン−アンチトキシン遺伝子はほとんどの原核生物のクロモソームにも存在し、さまざまなストレスに対応し、プログラム細胞死の機能を担っている。これらのトキシンの機能はまだすべて明らかになっていないが、ｍａｚＥ−ｍａｚＦ系のトキシンであるＭａｚＦ（非特許文献５）、ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系トキシンであるＰｅｍＫ（非特許文献６）はどちらも配列特異的なリボヌクレアーゼ活性を有することが知られている。さらに、これらのトキシンを利用してｍＲＮＡを分解し、前記トキシンの切断する配列をあらかじめ除いておいた目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡからの翻訳だけを行わせ、高純度の目的タンパク質を取得する方法が提案されている（特許文献３）【０００６】
【特許文献１】米国特許第５５５４５２８号明細書
【特許文献２】米国特許第５８３７５１０号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット
【非特許文献１】ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ５３−６１（１９９１）
【非特許文献２】プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９１巻、ｐ３６５−３６９（１９９４）
【非特許文献３】ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１０巻、ｐ１０３−１１２（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９５巻、ｐ１０４０７−１０４１２（１９９８）
【非特許文献５】モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）、第１２巻、ｐ９１３−９２０（２００３）
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ２０６７８−２０６８４（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記従来技術を鑑みて行われたものであり、本発明の目的はより有効性の高いＨＩＶ感染症の治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により誘導される転写調節配列の下流に一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を接続した核酸構築物が導入された細胞では、ＨＩＶの感染によって一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドの発現が誘導され、細胞内のｍＲＮＡが分解されること、この結果、前記細胞でのＨＩＶの複製と他の細胞への感染が防止できることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とを含有する核酸、
［２］Ｔａｔタンパク質および／またはＲｅｖタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を含有する［１］の核酸、
［３］ヒト免疫不全ウイルスのＬＴＲの下流に一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている［１］の核酸、
［４］一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが塩基配列特異的にＲＮＡを切断する活性を有するものである［１］の核酸、
［５］一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドがＭａｚＦタンパク質である［１］の核酸、
［６］ベクターに組み込まれている請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸。
［７］［１］〜［６］いずれかの核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルスの複製が抑制される細胞の製造方法、
［８］細胞がＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含む細胞集団である［７］の方法、
［９］核酸がウイルスベクターにより細胞に導入されることを特徴とする［７］の方法、
［１０］レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターにより核酸が細胞に導入される［９］の方法、
［１１］［１］〜［６］いずれかの核酸を細胞に導入することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルス感染症の治療または予防方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞内においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を抑制することを可能とする核酸構築物が提供される。前記の核酸構築物は、ＨＩＶ感染症の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＩＶ感染細胞の培養上清中の、ＨＩＶ由来のタンパク質量を示す図である。
【図２】ＨＩＶ感染細胞の培養上清中の、ＨＩＶ由来のタンパク質量を示す図である。
【図３】ＨＩＶ感染細胞の培養における、生存細胞数の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の核酸構築物は、ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とにより構成されている。【００１３】
ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列には特に限定はないが、例えば、ＨＩＶのＴａｔタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を使用することができる。Ｔａｔタンパク質はＨＩＶのＬＴＲプロモーターの作用により転写が開始されたＲＮＡ内に存在するＴＡＲ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に結合してそれより下流の転写を活性化することから、本発明には、転写開始点の下流にＴＡＲ領域の塩基配列を有する転写調節配列を使用することができる。特に好適には、ＨＩＶのＬＴＲや、前記ＬＴＲに適切な改変を施した転写調節配列が使用される。前記の改変としては、例えばプロモーター内に存在する宿主細胞由来の転写因子との結合部位の欠失やＴａｔ特異的な転写に不要な領域の欠失が例示される。前者の改変により、宿主由来転写因子による、ＨＩＶ感染とは無関係な転写のレベルを低下させることが可能である。このような転写調節配列の改変については、例えば非特許文献２に記載されている。また、後者の改変としてＬＴＲのＵ５領域やＴＡＲ配列より下流の領域（Ｒ領域の一部及びＵ５領域）の欠失が例示される。このような欠失ＬＴＲを有する本発明の核酸は、当該核酸を保持する高タイターのレトロウイルスベクターを作製する際に有利である。【００１４】
また、ＨＩＶゲノムに存在するＲＲＥ（Ｒｅｖ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、ＨＩＶ由来のトランス作用因子であるＲｅｖタンパク質との相互作用によってタンパク質の発現を促進することが知られている（非特許文献３）。さらに、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子内に存在するＩＮＳと呼ばれる領域は、Ｒｅｖタンパク質の非存在下ではＨＩＶのｍＲＮＡの転写を抑制しているが、前記のＲＲＥならびにＲｅｖタンパク質との相互作用によってこの抑制作用が解除されることが知られている［ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ７１７６−７１８２（１９９２）］。したがって、本発明の核酸において、外来のポリペプチドをコードする遺伝子の３’側にこれらの転写調節配列を組み込むことにより、前記核酸にコードされるポリペプチドをＲｅｖタンパク質依存的に、すなわちＨＩＶ感染依存的に発現させることができる。【００１５】
前記のＨＩＶ由来のトランス作用因子と相互作用する配列は、当該配列が本来的に組み込まれている機能的配列、例えばプロモーターとともに使用してもよく、異種の機能的配列と組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の核酸の導入が望まれる細胞においてｍＲＮＡの転写を開始しうる、ＨＩＶ由来ではないプロモーターと前記の配列を組み合わせて構築された配列も、本発明に使用される「転写調節配列」に包含される。【００１６】
本発明の核酸は、上記の転写調節配列に、前記転写調節配列によって発現の制御が可能な形態で一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を接続することにより作製される。【００１７】
本明細書において、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性とは、構成塩基として少なくとも１分子のリボヌクレオチドを含有する一本鎖核酸中の、リボヌクレオチドの３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解する活性を意味する。前記活性により加水分解された核酸は、水酸基を有する３’末端とリン酸基を有する５’末端、リン酸基を有する３’末端と水酸基を有する５’末端、もしくは２’，３’サイクリックホスフェートと水酸基を有する５’末端を生じる。本発明を特に限定するものではないが、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド等は切断できないポリペプチドを本発明に使用することができる。前記の基質特異性は、一本鎖ＲＮＡであるＨＩＶのゲノムを効率よく分解するという観点から本発明に適している。特に好適には、ＲＮＡをその塩基配列特異的に切断する活性を有するもの、リボソーム非依存的にｍＲＮＡを分解しうるものが本発明に使用される。前記のポリペプチドとしては、後述のＭａｚＦやＰｅｍＫのような、ｍＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｅｆｅｒａｓｅと称される酵素が例示される（特許文献２）。【００１８】
本発明に使用される、配列特異性を有し、リボソーム非依存的に一本鎖ＲＮＡを分解する活性を有するポリペプチドは、本発明を特に限定するものではないが、例えば微生物由来のものであってもよい。この場合、前記ポリペプチドをコードする遺伝子は微生物のゲノムやプラスミドより単離することができる。例えば、非特許文献４、５に記載されたトキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼであるＭａｚＦやＰｅｍＫをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。ＭａｚＦは一本鎖ＲＮＡ中の5'-A/CA-3'の配列を、ＰｅｍＫは主に5'-U/A(C,A or U)-3'を切断する酵素である。さらに、公知のデータベースから前記のＭａｚＦやＰｅｍＫのアミノ酸配列との間に高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を選択し、これを単離して本発明に使用することもできる。すでに藍藻類や古細菌を含む多数の微生物から前記の活性を有するポリペプチドが見出されている［Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（NP_388347；5'-U/ACAU-3'）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１３０９０（NP_275029；5'-/ACU-3'）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１（NP_294385；5'-UU/CCUUU-3'）、Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（NP_855664；5'-U/CCUU-3'）、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ７１２０（NP_487251；5'-U/ACA-3'）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３（NP_816859；5'-U/ACAU-3'）、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８（NP_841355；5'-GA/AU-3'、5'-G/AAU-3'、5'-AA/AU-3'または5'-A/AAU-3'）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＡＴＣＣ７００８６０（NP_143082；5'-U/GG-3'、5'-U/UG-3'、5'-U/GA-3'、5'-A/GG-3'または5'-A/AG-3'）：カッコ内はＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅにおける前記活性を有するポリペプチドの受託番号、ならびに該ポリペプチドが認識、切断する塩基配列をそれぞれ示す］。好適には、本発明にはＭａｚＦをコードする遺伝子が使用される。ＭａｚＦのアミノ酸配列、ならびにＭａｚＦをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１、２に示す。【００１９】
前記の、トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは、ヒト胎盤由来リボヌクレアーゼインヒビターのような、細胞質リボヌクレアーゼインヒビターにより阻害されることがないので（特許文献３）、本発明への使用に適している。さらに、前記のエンドリボヌクレアーゼを持続的に発現させた場合、細胞では新たな蛋白質の合成が起こらなくなるため、細胞は増殖阻害を起こし、さらには細胞死が誘導される。しかし前記酵素はリボソームを構成した状態のｒＲＮＡや高次構造を形成したｔＲＮＡを分解しないため、本発明の核酸が導入された細胞においてＨＩＶのＲＮＡが分解、排除され、かつ前記のエンドリボヌクレアーゼの発現が停止すると、細胞は増殖能を回復することができる。したがって、ＨＩＶがプロウイルスとして染色体に組み込まれた細胞であっても、ウイルスの複製が妨げられた状態の細胞は増殖能を維持している。生体内のＴ細胞数を大きく低下させることなくＨＩＶの複製、ＡＩＤＳ発症を防止できる点で、前記のエンドリボヌクレアーゼの使用は有利である。【００２０】
トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは３〜７塩基程度の短い塩基配列を認識して一本鎖ＲＮＡを切断することから、前記のエンドリボヌクレアーゼが細胞内で発現された場合には細胞内のほとんどのｍＲＮＡが分解されて細胞内でのタンパク質合成、細胞増殖が阻害される。また、ＨＩＶのゲノムであるＲＮＡをも切断されるため、ＨＩＶの複製、細胞外への放出（出芽）も防止される。さらに、ＨＩＶゲノムにコードされているポリペプチドの発現も阻止されることから、たとえば細胞外に放出されたＴａｔタンパク質によるＨＩＶ非感染細胞のアポトーシス誘発等も抑制される。【００２１】
ＨＩＶ感染症の治療または予防のためには、本発明の核酸構築物はＨＩＶの感染する可能性のある細胞、すなわちＣＤ４陽性細胞を含む細胞（細胞群）に導入されることが望まれる。したがって、本発明ではＣＤ４陽性細胞（たとえばＴ細胞）やＣＤ４陽性細胞に分化しうる前駆細胞（たとえば造血幹細胞）、あるいは前記の細胞を含有する細胞集団を標的細胞として遺伝子導入が実施される。ＨＩＶの感染を受ける可能性のある細胞に網羅的に前記の核酸構築物を導入する観点から、本発明では造血幹細胞または当該細胞を含有する細胞集団を標的とすることが好ましい。前記の細胞は、ＣＤ４陽性細胞やその前駆細胞を含有するものであれば特に限定はなく、個体より採取された血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞)、骨髄細胞や、前記の細胞から公知方法により分画されたＣＤ４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞の前駆細胞、造血幹細胞等が例示される。【００２２】
本発明の核酸構築物を細胞に導入する方法には特に限定はない。たとえば、本発明の核酸をプラスミドベクターやウイルスベクターに組み込んだうえ、適切な方法で細胞に導入すればよい。プラスミドベクターを使用する場合は、リン酸カルシウム法、カチオニック・リピド法、リポソーム法、エレクトロポーレーション法等の遺伝子導入法が使用できる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターに組み込んだ場合には、各ウイルスに適した条件で目的の細胞に感染させ、本発明の核酸を導入すればよい。本発明の核酸を染色体上に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは本発明に好適である。【００２３】
レトロウイルスを使用する態様において、本発明に使用されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。無制限な感染、遺伝子導入を防止する観点からは、本発明には複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、ＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（ＷＯ  ９２／０７９４３号国際公開パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターあるいはこれらを改変したベクターが例示される。前記のレンチウイルスベクターとしてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター［野生型ＬＴＲを有するＨＩＶベクター（例えば米国特許５６６５５７７号）や改変されたＬＴＲを有するＨＩＶベクター（例えばｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５：インビトロジェン社製）］、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター［例えばヒューマン・ジーン・セラピー、第１１巻、ｐ１８６３−１８７４（２０００）］等が例示されるが、これらに限定されるものではない。【００２４】
前記のレトロウイルスベクターは公知の方法で調製し、本発明に使用すればよい。調製方法には特に限定はなく、使用するレトロウイルスベクターに適したレトロウイルス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して本発明に使用することができる。前記のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レトロウイルスベクタープラスミドのトランスフェクションにより一過性にレトロウイルス粒子を生産するもののいずれでも構わない。【００２５】
上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］等を使用してもよい。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。【００２６】
本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープやエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウイルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスベクターも本発明に使用できる。【００２７】
本発明では、上記の各種ベクター、好適には前記のレトロウイルスベクターに、ヒト免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記の転写調節配列の下流に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とが挿入される。さらに、前記遺伝子の転写を制御するオペレーター、エンハンサー、ターミネーター等の配列を含有することができる。また、前記の遺伝子とは独立して、本発明の核酸には遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼのようなレポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子等）、レセプター遺伝子等を有していてもよい。さらに、本発明の核酸は遺伝子導入細胞による治療が完遂した場合、あるいは何らかの副作用が生じた場合に生体内から遺伝子導入細胞を排除する目的で、自殺遺伝子を搭載していても良い。【００２８】
本発明の１つの態様では、生物個体より採取された細胞に生体外でベクターを導入するエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子導入が使用される。ウイルスベクターを使用する場合、生体より採取された前記の標的細胞とウイルスベクター、たとえばウイルス産生細胞の培養液上清や前記上清から精製されたウイルスベクターとを混合し、適切な条件でインキュベートすることにより、遺伝子の導入が達成される。イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で遺伝子導入可能なベクター、例えばアデノウイルスベクターを使用する場合には、本発明の核酸を含有するベクターを個体に直接投与してもよい。【００２９】
レトロウイルスベクターをエクス・ビボ遺伝子導入に使用する場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞にレトロウイルスベクターを高効率で感染させることができる。【００３０】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用する遺伝子導入方法は、例えばＷＯ  ９５／２６２００号国際公開パンフレット、ＷＯ  ９７／１８３１８号国際公開パンフレット、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、第８７６−８８２頁（１９９６）等に記載されている。当該方法には、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位の両方を同一分子上に有する機能性物質を使用する方法、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的細胞結合部位とを有する機能性物質との混合物を使用する方法とがあり、本発明にはいずれの方法にも使用することができる。【００３１】
上記の機能性物質は、レトロウイルス結合活性および／または標的細胞結合活性を有するものであれば特に限定はない。例えば、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメイン（ヘパリン−ＩＩドメイン）、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲンのフラグメント、前記のポリペプチドの誘導体や改変体、ポリリジン、ＤＥＡＥデキストランなどがレトロウイルス結合活性を有する機能性物質として例示される。また、標的細胞結合活性を有する機能性物質には、所望の標的細胞に結合する能力を有する任意の物質を使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、例えば、細胞結合活性を有するポリペプチド（細胞骨格タンパク質等）、細胞もしくは細胞表面の生体分子を認識する抗体、成長因子、サイトカイン、糖鎖等が標的細胞結合活性を有する機能性物質として例示される。【００３２】
本発明の好適な態様の１つとして、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメインを含有する機能性物質の存在下に標的細胞への遺伝子導入を行う方法が挙げられる。前記機能性物質は、好適には、細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメインの両者を有するフィブロネクチンフラグメントが例示される。前記細胞接着ドメインとしては、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドが特に好適である。前記のフィブロネクチンフラグメントは、生体より精製されたフィブロネクチンからプロテアーゼ消化などの手段で調製することができ、また、組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、レトロネクチン（登録商標）としてタカラバイオ社から発売されている組換えフィブロネクチンフラグメントは本発明に好適である。【００３３】
以上のように、本発明はヒト免疫不全ウイルス感染症の治療または予防に有用な細胞組成物の製造に有用である。さらに、本発明により前記の細胞組成物を使用する、ＨＩＶ感染症の治療方法または予防方法も提供される。すなわち、本発明の核酸を導入された細胞を個体に投与することにより、個体中のＨＩＶ感染細胞を減少させ、もしくは該細胞におけるＨＩＶの複製を抑制することが可能となる。【００３４】
本発明の核酸が導入されたＣＤ４陽性細胞や、本発明の核酸が導入されたＣＤ４陽性細胞の前駆細胞（造血幹細胞等）から分化したＣＤ４陽性細胞は、ＨＩＶの感染を受けて細胞内にＨＩＶ由来のトランス作用因子が生成した場合には、転写調節配列の下流に位置する一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が誘導されるため、生成したポリペプチドにより細胞内のｍＲＮＡが分解され、蛋白質の生合成が阻害される。この際、ＨＩＶの複製過程で生成されるＲＮＡゲノムも分解を受ける。このように、ＨＩＶゲノムにコードされているポリペプチドの翻訳、ＨＩＶゲノムの複製が阻害されることから、新たな感染性ＨＩＶ粒子の生成と他の細胞への感染が防止される。【００３５】
前記の、ＭａｚＦやＰｅｍＫのようなトキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは、対応するアンチトキシン（ＭａｚＥやＰｅｍＩ）が共存する場合にはその活性が抑制される。したがってトキシンであるエンドリボヌクレアーゼ遺伝子を本発明に使用する場合にアンチトキシン遺伝子を併用することにより、非ＨＩＶ感染細胞における、エンドリボヌクレアーゼ活性に起因する細胞毒性の発現を抑制または制御することができる。前記の態様の一例としては、たとえば適当なハウスキーピング遺伝子（グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、β−アクチン遺伝子等）のプロモーターの下流にアンチトキシン遺伝子を接続して非ＨＩＶ感染細胞において微量のアンチトキシンを発現させておくことにより、トキシンの活性をアンチトキシンの作用によって抑制することが考えられる。この細胞にＨＩＶが感染した際には、前記のトランス作用因子の作用によってトキシンの発現が促進され、アンチトキシンの発現量を上回った場合には初めて細胞毒性が発揮されるようになる。こうして、ＨＩＶ感染細胞に対する細胞毒性の選択性をより向上させることができる。【００３６】
従来報告されていた、細胞毒性を有するタンパク質（たとえばジフテリアトキシン等）や無毒の前駆体を細胞毒性を有する化合物に活性化する酵素（たとえばチミジンキナーゼ等）の作用によりＨＩＶ感染細胞を破壊する方法では、破壊後の細胞から放出されるトキシンや活性化された化合物が非ＨＩＶ感染細胞に侵入して細胞毒性を示す可能性があるが、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドを使用する本発明の方法では、周囲の細胞が障害を受けるおそれは少ない。【００３７】
現在では、３〜４種類の抗ウイルス薬（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）を併用する多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ）がＨＩＶ感染症の治療法の主流である。前記の治療を行うことにより、ＨＩＶ感染患者血液中のＨＩＶ量は顕著に減少し、臨床症状の改善が見られるようになる。しかし、ウイルス粒子の産生を積極的に行わないＨＩＶ感染細胞（長期生存型感染細胞：リザーバー）の存在のため、ＨＩＶの完全な排除は困難である。本発明は前記のＨＡＡＲＴと組み合わせて実施してもよい。【００３８】
本発明の核酸構築物が導入された導入された細胞では、Ｔａｔの発現に応じてエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドが発現される。ＨＩＶがプロウイルスとして染色体に組み込まれた細胞に前記の核酸構築物が存在している場合、プロウイルスからのＲＮＡの転写が開始されるとこのＲＮＡから翻訳されるＴａｔによってエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドの発現が誘導され、ＨＩＶゲノムを含む細胞内の一本鎖ＲＮＡが分解される。この結果、当該細胞ではＨＩＶの複製、出芽が阻止される。ＨＩＶ由来のＲＮＡが分解されてＴａｔの発現が停止し、かつ発現されていたＴａｔが細胞から消失するとエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドの発現も停止する。一本鎖ＲＮＡに特異的に作用するエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドを使用する本発明においては、細胞内のリボソームやｔＲＮＡが破壊されないため（非特許文献５）、前記ポリペプチドの発現の停止とともに通常のタンパク質合成が再開されるため、この時点で破壊されていない細胞は増殖を再開する。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００４０】
実施例１  Ｔａｔ発現プラスミドの構築
プラスミドｐＱＢＩ−ｔａｔＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）よりＴａｔ、ｓｇＧＦＰのそれぞれをコードする領域をＳａｃＩＩ、ＥｃｏＲＩの二重消化によって除去したうえ、５’側に開始コドンを付加し、３’側に終止コドンを新たに付加したＴａｔを挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＱＢＩ−ＴＡＴと命名した。前記プラスミドはＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にＴａｔタンパク質を発現することができるプラスミドである。【００４１】
実施例２  ＭａｚＦ発現プラスミドの構築
プラスミドｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているｇａｇ、ｓｇＧＦＰ、ＲＲＥのそれぞれをコードする領域を制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩの二重消化によって除去したうえ、ここに配列表の配列番号３に示す塩基配列のＭａｚＦタンパクをコードする、化学的に合成されたＤＮＡを挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１と命名した。【００４２】
前記プラスミドはＨＩＶの５’ＬＴＲの制御下にＭａｚＦタンパク質を発現することができるプラスミドである。配列番号３の塩基配列は、配列番号１に示されるＭａｚＦのアミノ酸配列をコードし、かつ天然のＭａｚＦのアミノ酸配列を変化させることなしにＭａｚＦ遺伝子中に存在するＡＣＡの塩基配列を他の塩基配列に変換したものである。したがってこのプラスミドから転写されるＭａｚＦのＲＮＡはＭａｚＦの活性によって切断されることはなく、細胞内において安定的にＭａｚＦを発現させることができる。【００４３】
実施例３  細胞へのプラスミドの導入
２４ウェルのコラーゲンコートプレートの各ウェルに１×１０５個のヒト２９３Ｔ／１７細胞［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８］を添加し２４時間培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）を使用した。次いで各ウェルの細胞にｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１（０．２５μｇ）、またはｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１とｐＱＢＩ−ＴＡＴの両方（各０．２５μｇ）を導入した。プラスミドの導入にはＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を使用し、添付の説明書の記載どおりに操作を行った。なお、上記の操作は各群２連で実施し、対照としてＭａｚＦ遺伝子を含まないｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）とｐＱＢＩ−ＴＡＴ（各０．２５μｇ）を導入した群も設定した。【００４４】
プラスミドが導入された細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養終了後に顕微鏡下で細胞を観察したところ、対照として設定したｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰとｐＱＢＩ−ＴＡＴを導入した群においては、ｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰとｐＱＢＩ−ＴＡＴを同時に導入することによってＧＦＰタンパクの発現が確認されたことから、ＬＴＲのプロモーター活性がＴＡＴ依存的に誘導されていることが確認された。また、ｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１のみが導入されたウェルでは対照との間に差は認められなかったが、ｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦとｐＱＢＩ−ＴＡＴを同時に導入した群では対照に比較して明らかな細胞増殖の抑制が認められた。このことは、ｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦからのＭａｚＦの発現がＴａｔタンパク依存的に起こることを示している。すなわち、Ｔａｔタンパク誘導性のＬＴＲの制御下にＭａｚＦ遺伝子を配置した構築物により、ＨＩＶ感染細胞の増殖を抑制できることが示唆された。【００４５】
実施例４  レトロウイルスベクタープラスミドの構築
（１）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦの構築
実施例１で作製されたプラスミドｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１を制限酵素ＳｔｕＩとＸｂａＩで切断し、ＨＩＶ−ＬＴＲ支配下にＭａｚＦが発現する発現カセット（約１３４０ｂｐ）を獲得し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で平滑化した。【００４６】
レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）のＬＴＲプロモーター活性を消失させるため、３’ＬＴＲのＵ３領域のＮｈｅＩ部位からＳａｃＩ部位までを削除して再構築し、ＬＴＲプロモーター活性を消失した自己不活型レトロウイルスベクタープラスミドｐＳＩＮを得た。ｐＳＩＮのＰｍｅＩ部位を切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化し、前記の発現カセットをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦと命名した。【００４７】
（２）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦの構築
ｐＭＴベクター［ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１１巻、９４〜９９頁（２００４）］の３’ＬＴＲのＵ３領域について、当該領域４３〜３０９番目の塩基にわたる部分を欠損させたプラスミドベクターｐＭＴＤ３を作製した。内部プロモーターとして使用するＨＩＶのＵ３−Ｒ領域およびＵ３−ＴＡＲ領域は、それぞれ実施例４−（１）で作製されたプラスミドｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦを鋳型としたＰＣＲにより取得した。Ｕ３−Ｒ領域の増幅に用いたプライマー、５’ＨＩＶ１  Ｕ３、３’ＨＩＶ１  Ｒの塩基配列をそれぞれ配列番号４、５に示す。Ｕ３−ＴＡＲ領域の増幅には前記の５’ＨＩＶ１  Ｕ３と配列番号６記載の塩基配列のプライマー、３’ＨＩＶ１  ＴＡＲを組み合わせて使用した。両ＰＣＲ増幅断片をそれぞれＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩで消化してｐＭＴＤのＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、２種のレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲを構築した。【００４８】
ＭａｚＦをコードする遺伝子は上記のプラスミドｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦを鋳型としたＰＣＲにより取得した。増幅に用いた２種のプライマー、５’ＭａｚＦ、３’ ＭａｚＦの塩基配列をそれぞれ配列番号７、８に示す。得られた増幅断片をＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩで消化してｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲのＢａｍＨＩサイトに挿入した。こうして構築されたＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドをそれぞれｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦと命名した。【００４９】
（３）対照レトロウイルスベクタープラスミドの構築
対照として使用するため、ｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒに蛍光タンパク質であるｅＧＦＰをコードする遺伝子を挿入した発現プラスミドを構築した。すなわち、プラスミドｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙ−ｅＧＦＰ［ジャーナル・オブ・ジーン・メディシン（J.  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．）、第６巻、７２４〜７３３頁（２００４）］よりＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ消化によって切り出したｅＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＭＴＤ３−Ｕ３ＲのＢａｍＨＩサイトに挿入してｅＧＦＰ発現プラスミドであるｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲのＢａｍＨＩサイトに挿入し２種のレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＧＦＰ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＧＦＰを構築した。【００５０】
実施例５  ＭａｚＦ発現ＣＥＭ−ＳＳ細胞株の樹立
（１）ＧａＬＶシュードタイプウイルスを作製するために使用するエンベロープ発現プラスミドは下記の操作により構築した。まず、ＧａＬＶウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）より調製したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅した。増幅に用いた２種のプライマー、５’ＫｐｎＩ、３’ＣｌａＩの塩基配列をそれぞれ配列番号９、１０に示す。アンフォトロピック・エンベロープ発現プラスミドであるｐＶＭ−ＡＥ［Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ジーン  セラピー）、第１０巻、ｐ７０６−７１１（２００３）］をＫｐｎＩ、ＣｌａＩで消化し、エンベロープタンパクをコードする領域のうちＲペプチド部分を除く部分を除去したプラスミド断片を作成した。上記の増幅断片をＫｐｎＩ、ＣｌａＩで消化したものをこのプラスミド断片に挿入し、ＧａＬＶエンベロープ発現プラスミド、ｐＶＭ−ＧｅＲを得た。【００５１】
（２）１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭを入れた６ｃｍ径のプレートに２×１０６個の２９３Ｔ細胞を入れ、４μｇのレトロウイルスベクタープラスミド（実施例４で作製されたプラスミドのいずれか）、４μｇのパッケージングプラスミドｐＶＭ−ＧＰ［Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１０巻、ｐ７０６−７１１（２００３）］、ＧａＬＶエンベロープ発現プラスミドｐＶＭ−ＧｅＲを用いてリン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。トランスフェクション開始６時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。２日後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をウイルス上清として以下の実験に使用した。【００５２】
ＣＥＭ−ＳＳ細胞は１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０（ライフ・テクノロジーズ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。６ウェル細胞培養プレートのウェル内のＣＥＭ−ＳＳ細胞（５×１０５個／２ｍｌ培地）に対し、実施例６−（１）で作製した各レトロウイルスベクター（ウイルス上清）１ｍｌと終濃度８μｇ／ｍｌのポリブレンを添加し、さらにプレートをＣＲ３２２遠心分離機（Ｊｏｕａｎ社製）を使用し、２５℃、２８００ｒｐｍで９９分間遠心し、細胞へのレトロウイルスベクターの吸着を促した。遠心操作後の細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間インキュベートした後、細胞をＴ２５フラスコに移して３７℃、５％ＣＯ２存在下での培養を継続した。２日後、遺伝子導入された細胞を１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）で選択することにより、各ウイルスで形質転換されたポリクローナルな細胞株を作製した。【００５３】
実施例６  ＨＩＶ感染
２４ウェル細胞培養プレートのウェルに入れた、実施例５で作製された各細胞株の細胞２×１０６個（／１ｍｌ培地）に種々の量のＨＩＶ−１  IIIｂ（ｐ２４タンパク量換算で０．２、２、２０、２００ｎｇ）を接種し、３７℃で２時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後に１０ｍｌのＲＰＭＩ（１０％のＦＢＳを含む）に懸濁してＴ２５フラスコに移した。このフラスコから継時的に採取した培養上清についてｐ２４量をＥＬＩＳＡ法（ｐ２４  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、パーキン・エルマー社製）で定量し、ＨＩＶの量を評価した。実験結果を図１、図２に示す。図１、図２はそれぞれ感染７、１０日後の結果である。図中、ＣＥＭ−ＳＳは遺伝子導入されていないＣＥＭ−ＳＳ細胞、ＣｏｎｔｒｏｌはｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＧＦＰウイルスで形質転換されている細胞、Ａ，Ｂ、ＣはそれぞれｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＭａｚＦウイルス、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦウイルスで形質転換された細胞での結果を示す。縦軸はｐ２４タンパク量（単位：ｎｇ／ｍｌ）である。また、感染後４、７、１０日目（Day 4、Day 7、Day 10）の生存細胞数をトリパンブルー排出試験により計測した。この結果を図３に示す。図３において、菱形は遺伝子導入されていないＣＥＭ−ＳＳ細胞、×はｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＧＦＰウイルスで形質転換されている細胞、四角、三角、丸はそれぞれｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＭａｚＦウイルス、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦウイルスで形質転換された細胞での結果を示す。縦軸は生存細胞数（単位：１０４個）である。【００５４】
図１、２に示されるように、ＭａｚＦ遺伝子を含有するレトロウイルスで形質転換されている細胞では、非遺伝子導入ＣＥＭ−ＳＳ細胞、対照として使用したＭａｚＦ遺伝子を含有しないｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＧＦＰウイルスで形質転換された細胞と比較して培養上清中のＨＩＶの量が非常に低いことが明らかとなった。さらに、各群の細胞の増殖率を比較すると、図３から明らかなように、ＭａｚＦ遺伝子を含有するレトロウイルスで形質転換されている細胞は感染後７日目以降に細胞増殖率が向上していることが示された。このことは、これらの細胞ではＨＩＶに起因する細胞死が抑制されていることを示唆している。また、ｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３Ｒ−ＭａｚＦウイルス、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦウイルスで形質転換された細胞にＨＩＶを感染させ、６０日間培養を継続した。培養上清にはＨＩＶは検出されなかったが、細胞から抽出したＤＮＡにはＨＩＶ由来のＤＮＡが検出されたことから、ＨＩＶはプロウイルスとして細胞内に保持されていることが示された。このことから、本発明の核酸で形質転換された細胞ではＨＩＶの感染を受けた後も、ＨＩＶの複製と出芽が妨げられた状態で増殖していることが示唆された。【００５５】
さらに、ＨＩＶ接種量をｐ２４量換算で１０００ｎｇまで増やして同様の感染試験を行い、感染から１６日後に培養上清中のｐ２４量を測定した。この場合も、ＭａｚＦ遺伝子を有する各レトロウイルスベクターで形質転換された細胞の培養上清中のｐ２４量は非形質転換細胞ならびに対照の量の１／１０００以下であった。【００５６】
実施例７  種々のｍＲＮＡ  ＩｎｔｅｒｆｅｒａｓｅをＴａｔ依存的に発現させることによる細胞増殖阻害
（１）Ｎ．  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１遺伝子の単離とレトロウイルスベクタープラスミドの構築
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１遺伝子について、そこにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列および塩基配列をＮＣＢＩ  データベースより入手した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿８４１２３７およびＮＣ＿００４７５７）。ＮＥ１１８１の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域のＤＮＡをＰＣＲで増幅できるように、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ（配列番号１１）およびプライマーＮＥ１１８１−Ｒ（配列番号１２）をそれぞれ合成した。【００５７】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８株のゲノムＤＮＡはＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  １９７１８Ｄ）。【００５８】
５０ｎｇのＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８株ゲノムＤＮＡ、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ  およびＮＥ１１８１−Ｒを使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを実施して３６２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してアガロース電気泳動に供し、泳動後のゲルより３４１ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたｐＥＴ２１ａベクター（ノバジェン社製）に上記の３４１ｂｐのＤＮＡ断片を接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメーションした。こうして得られた形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１と命名した。【００５９】
発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１に挿入されたＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１ポリペプチドをコードする塩基配列を配列番号１３に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す。なお、前記の発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１によれば配列番号１のアミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端に６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸残基からなるヒスチジン−タグが付加されたポリペプチドが発現される。ＮＥ１１８１から翻訳されるポリペプチドはＧＡＡＵまたはＡＡＡＵの４塩基配列を認識してＲＮＡを切断することを、合成オリゴリボヌクレオチドを基質として確認した。【００６０】
ＮＥ１１８１遺伝子はそのｍＲＮＡ中にＮＥ１１８１ポリペプチド自身が切断する認識配列を有するため、コードするアミノ酸配列を変化させないようにコドンに変異を入れて前記の認識配列を消去した遺伝子を人工合成した。この遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示す。次に、実施例４で作製されたレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲのＢａｍＨＩサイトに人工合成したＮＥ１１８１遺伝子を挿入した。こうして構築されたＮＥ１１８１発現レトロウイルスベクタープラスミドをｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−Ｎ４と命名した。【００６１】
（２）Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１由来ＤＲ０６６２の単離レトロウイルスベクタープラスミドの構築【００６２】
Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎ  Ｒ１株由来ＤＲ０６６２、Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ株由来Ｍｂ２０１４ｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  の単離と発現プラスミドの構築
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎ  Ｒ１株由来ＤＲ０６６２のアミノ酸配列および塩基配列をＮＣＢＩ  データベースより入手した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿２９４３８５およびＮＣ＿００１２６３）。ＤＲ０６６２の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域のＤＮＡをＰＣＲで増幅できるように、プライマーＤＲ０６６２−Ｆ（配列番号１６）およびプライマーＤＲ０６６２−Ｒ（配列番号１７）をそれぞれ合成した。【００６３】
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎ  Ｒ１株のゲノムＤＮＡはＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  １３９３９Ｄ）。５０ｎｇのＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎ  Ｒ１株ゲノムＤＮＡ、プライマーＤＲ０６６２−Ｆ  およびＤＲ０６６２−Ｒを使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを実施して３６８ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してアガロース電気泳動に供し、泳動後のゲルより３４７ｂｐのＤＮＡ断片をゲルより回収した。制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたｐＥＴ２１ａベクター（ノバジェン社製）に上記の３４７ｂｐのＤＮＡ断片を接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメーションした。こうして得られた形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、発現ベクターｐＥＴ−ＤＲ０６６２と命名した。【００６４】
こうして得られた、発現ベクターｐＥＴ−ＤＲ０６６２に挿入されたＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎ  Ｒ１株由来ＤＲ０６６２ポリペプチドをコードする塩基配列を配列番号１８に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９にそれぞれ示す。なお、前記の発現ベクターｐＥＴ−ＤＲ０６６２およびｐＥＴ−Ｍｂ２０１４ｃＨｌｇによれば配列番号１のポリペプチドのＣ末端に６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸残基からなるヒスチジン−タグが付加されたポリペプチドが発現される。ＤＲ０６６２から翻訳されるポリペプチドはＵＵＣＣＵＵＵの７塩基配列を認識してＲＮＡを切断することを合成オリゴリボヌクレオチドを基質として確認した。【００６５】
ｐＥＴ−ＤＲ０６６２を鋳型として、ＰＣＲ法によりＤＲ０６６２遺伝子を取得し、実施例４で作製されたレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲのＢａｍＨＩサイトにＰＣＲ増幅したＤＲ０６６２遺伝子を挿入した。こうして構築されたＤＲ０６６２発現レトロウイルスベクタープラスミドをｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−Ｄ３と命名した。ＤＲ０６６２遺伝子の増幅に使用したプライマーを配列番号２０、２１に示す。【００６６】
（３）Ｔａｔ発現レトロウイルスベクターの作製
実施例１に記載のｐＱＢＩ−Ｔａｔを制限酵素ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＶで消化し、平滑化後レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩのＰｍｅＩ部位に挿入し、ｐＤＯＮ−Ｔａｔを構築した。次にｐＤＯＮ−ＴａｔをＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化してＳＶ４０プロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を除去し、クロンテック社のｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１からＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子断片を獲得し、先の制限酵素消化したｐＤＯＮ−ＴａｔのＴａｔ遺伝子の下流に挿入し、ｐＤＯＮ−Ｔａｔ−ＺｓＧｒｅｅｎを構築した。【００６７】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭを入れた６ｃｍ径のプレートにＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を入れ、１０μｇのレトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−Ｔａｔ−ＺｓＧｒｅｅｎとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。トランスフェクション開始８時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフェクション開始２４時間後に再度培地交換し、２４時間後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をウイルス上清として以下の実験に使用した。このウイルスベクター導入細胞からはＴａｔタンパク質と緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎが発現する。【００６８】
（４）ＭａｚＦ、ＮＥ１１８１、またはＤＲ０６６２をコードする遺伝子を導入されたＣＥＭ細胞株の樹立
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭを入れた６ｃｍ径のプレートにＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を入れ、１０μｇのレトロウイルスベクタープラスミド（ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−Ｎ４、ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−Ｄ３のいずれか）とＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。トランスフェクション開始８時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフェクション開始２４時間後に再度培地交換し、２４時間後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をウイルス上清として以下の実験に使用した。【００６９】
ＣＥＭ細胞は１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ―１６４０中、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。表面未処理２４穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、先のウイルス上清０．５ｍｌをウェルに加え、３２℃、２０００ｇ、２時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、１×１０５個／ｍｌに調製したＣＥＭ細胞懸濁液１ｍｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）含有培地で３週間培養することにより、各ウイルスで形質転換されたポリクローナルな細胞株を作製した。【００７０】
（５）ＭａｚＦ、ＮＥ１１８１、およびＤＲ０６６２の発現誘導による細胞増殖の阻害
（１）表面未処理２４穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、実施例８で作製されたＴａｔ発現レトロウイルスベクター０．５ｍｌをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇ、２時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、実施例９で作製されたＭａｚＦ、ＮＥ１１８１、およびＤＲ０６６２発現ＣＥＭ細胞株をそれぞれ１×１０５個／ｍｌに調製し、ウェルあたり１ｍｌ添加して感染を行った。対照としてｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入していないＣＥＭ細胞を用い、同様にＴａｔ発現レトロウイルスベクターを感染した。感染から２日後および１５日後、フローサイトメーターでＺｓＧｒｅｅｎ陽性率を測定することにより、Ｔａｔ発現レトロウイルス感染効率を測定した。結果を表１に示す。表１に示すとおり、ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ遺伝子ＭａｚＦ、ＮＥ１１８１、およびＤＲ０６６２をコードする遺伝子が導入されたＣＥＭ細胞においては、Ｔａｔタンパク質依存的に遺伝子が発現し、その結果ｍＲＮＡが分解に伴う細胞死が誘発され、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性率が低下した。以上の結果より、ＭａｚＦとは異なる塩基配列特異性を有するｍＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅの遺伝子を使用した場合も、同様にＨＩＶ感染細胞の増殖を抑制できることが示された。【００７１】
【表１】
0005122957.tif 000002
【００７２】
実施例８  ＭａｚＦ発現によるｍＲＮＡ分解とリボゾームＲＮＡの分析
（１）ＭａｚＦと蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎが１つのｍＲＮＡから発現するベクターは以下の手順で作製した。実施例２に記載のｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１を鋳型とし、ＰＣＲ法によりＭａｚＦ遺伝子を取得し、クロンテック社のｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩサイトにＰＣＲ増幅したＭａｚＦ遺伝子を挿入した。こうして構築されたＭａｚＦとＺｓＧｒｅｅｎが同時に発現するプラスミドをｐＭａｚＦ−ＩＺと命名した。ＭａｚＦ遺伝子の増幅に使用したプライマーを配列番号２２、２３に示す。また、対照としてｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩサイトにルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドｐＬｕｃ−ＩＺを構築した。【００７３】
（２）ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養を行った。２４穴コラーゲンコートプレート（コーニング社製）に２ｘ１０５個／ｍｌに調製した２９３細胞懸濁液をウェルあたり０．５ｍｌ播種し、２４時間培養を行った。先に記載したｐＭａｚＦ−ＩＺおよびｐＬｕｃ−ＩＺをＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクションし、２４、４８、７２時間後に蛍光タンパク質の発現をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・デッキンソン社製）で解析した。また、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ（キアゲン社製）で回収した。回収したＲＮＡは微量電気泳動装置アジレント２１００バイオアナライザ（アジレント社製）で分析を行った。フローサイトメーター解析による遺伝子導入細胞の蛍光強度の値を表２に示す。表２に示すとおり、ｐＭａｚＦ−ＩＺを導入した細胞ではＺｓＧｒｅｅｎの発現が抑制されていることが示された。これは、発現したＭａｚＦの作用によりｍＲＮＡが分解され、ＺｓＧｒｅｅｎの翻訳が抑制されたためであると考えられる。一方、全ＲＮＡの電気泳動分析による２８ｓと１８ｓリボゾームＲＮＡの比率を表３に示す。表３に示すとおり、ｐＭａｚＦ−ＩＺを導入した細胞とｐＬｕｃ−ＩＺを導入した細胞の２８ｓと１８ｓリボゾームＲＮＡの比率は同等であり、ＭａｚＦの発現によりリボゾームＲＮＡは分解されていないことが示された。【００７４】
【表２】
0005122957.tif 000003
【００７５】
【表３】
0005122957.tif 000004
【００７６】
実施例９  ＭａｚＥによるＭａｚＦの活性の抑制
ＭａｚＦのアンチトキシンであるＭａｚＥを発現するレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＳＮ−ＭａｚＥは以下の手順で構築した。【００７７】
ｐＭＴベクター［ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１１巻、９４〜９９頁（２００４）］のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に配列番号の２４に示す塩基配列のＭａｚＥ遺伝子を挿入しｐＭＴ−ＭａｚＥを構築した。ｐＭＴ−ＭａｚＥのＸｈｏＩ部位にｐＤＯＮ−ＡＩからＳａｌＩ−ＸｈｏＩ消化して得たＳＶ４０プロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む断片を挿入した。得られたＭａｚＥ発現レトロウイルスベクタープラスミドをｐＭＳＮ−ＭａｚＥと命名した。【００７８】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭを入れた６ｃｍ径のプレートにＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を入れ、１０μｇのレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＳＮ−ＭａｚＥとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。トランスフェクション開始８時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフェクション開始２４時間後に再度培地交換し、２４時間後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をＭＳＮ−ＭａｚＥウイルス上清とした。表面未処理２４穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、ＭＳＮ−ＭａｚＥウイルスベクター０．５ｍｌをウェルに加え、３２℃、２０００ｇ、２時間の遠心操作により、ＭａｚＥ発現レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、２９３細胞を１×１０５個／ｍｌに調製し、ウェルあたり１ｍｌ添加して感染を行った。３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）含有培地で２週間培養することにより、ＭａｚＥを恒常発現するポリクローナルな細胞株２９３−ＭａｚＥを作製した。【００７９】
実施例４記載のｐＳＩＮ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦからネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を除去し、代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入したレトロウイルスベクタープラスミドｐＳＩＮＨ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦを構築した。【００８０】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭを入れた６ｃｍ径のプレートにＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を入れ、１０μｇのレトロウイルスベクタープラスミドｐＳＩＮＨ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。トランスフェクション開始８時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフェクション開始２４時間後に再度培地交換し、２４時間後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をＳＩＮＨ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦウイルス上清とした。表面未処理２４穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、ＳＩＮＨ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦウイルスベクター０．５ｍｌをウェルに加え、３２℃、２０００ｇ、２時間の遠心操作により、ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、２９３−ＭａｚＥ細胞および２９３細胞を１×１０５個／ｍｌに調製し、ウェルあたり１ｍｌ添加して感染を行った。３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間インキュベートした後、遺伝子導入された細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ含有培地で２週間培養することにより、ポリクローナルな細胞株２９３−ＭａｚＥ−ＭａｚＦおよび２９３−ＭａｚＦを作製した。【００８１】
表面未処理２４穴プレートにレトロネクチン（タカラバイオ社製）をプロトコールに従いコーティングし、実施例８で作製されたＴａｔ発現レトロウイルスベクター０．５ｍｌをウェルに加え、３２℃、２０００ｇ、２時間の遠心操作により、レトロウイルスベクターをレトロネクチンコートプレートに吸着させた。上清除去後、２９３−ＭａｚＥ−ＭａｚＦおよび２９３−ＭａｚＦ細胞株を１×１０５個／ｍｌに調製し、ウェルあたり１ｍｌ添加して感染を行った。対照として２９３細胞にも感染を行った。感染から２日後顕微鏡観察により細胞の成育を観察した。２９３−ＭａｚＦ細胞ではＴａｔタンパク質の働きによりＭａｚＦが発現し細胞増殖が抑制されたが、２９３−ＭａｚＥ−ＭａｚＦ細胞では、ＭａｚＦの作用がＭａｚＥによって中和され、２９３細胞と同等の生育を示した。真核生物においてもＭａｚＥがＭａｚＦのアンチトキシンとして作用することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の治療、予防に有効な核酸構築物が提供される。前記の核酸構築物が導入された細胞はＨＩＶの複製を抑制することができることから、ＨＩＶ感染症の治療、予防に効果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
SEQ ID NO:3 ; Synthetic DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:4 ; Primer 5’HIV1 U3 to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO:5 ; Primer 3’HIV1 R to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO:6 ; Primer 3’HIV1 TAR to amplify a portion of HIV LTR.
SEQ ID NO:7 ; Primer 5’MazF to amplify a DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:8 ; Primer 3’MazF to amplify a DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:9 ; Primer 5’KpnI to amplify a DNA encoding GaLV envelope.
SEQ ID NO:10 ; Primer 3’ClaI to amplify a DNA encoding GaLV envelope.
SEQ ID NO:11 ; Primer NE1181-F to amplify a DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO:12 ; Primer NE1181-R to amplify a DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO:15 ; Synthetic DNA encoding NE1181 polypeptide.
SEQ ID NO:16 ; Primer DR0662-F to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO:17 ; Primer DR0662-R to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO:20 ; Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO:21 ; Primer to amplify a DNA encoding DR0662 polypeptide.
SEQ ID NO:22 ; Primer to amplify a DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:23 ; Primer to amplify a DNA encoding MazF.
【図１】
0005122957.tif 000005
【図２】
0005122957.tif 000006
【図３】
0005122957.tif 000007
【配列表】
0005122957000001.app