(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓＬＯＸ−１  １Ａ７」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４５）、または「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓＬＯＸ−１  ６Ｂ１１」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４６）により産生される、モノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。
【請求項２】
請求項１に記載するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３】
「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓＬＯＸ−１  １Ａ７」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４５）、または「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓＬＯＸ−１  ６Ｂ１１」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４６）である、請求項２記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を含む、ヒト可溶型ＬＯＸ−１検出用試薬キット。
【請求項５】
急性冠症候群診断キットである請求項４に記載する試薬キット。
【請求項６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として用いる工程を有する、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出方法。
【請求項７】
急性冠症候群の治療薬または治療候補薬が投与されたヒトから得た体液を対象として、請求項１に記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を用いて、当該体液中の可溶性ＬＯＸ−１を測定する工程を有する、急性冠症候群の治療薬または治療候補薬の薬効の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化低比重リポタンパク（以下、「酸化ＬＤＬ」という）の受容体であるレクチン様酸化低比重リポタンパク質受容体−１（Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1）（以下、「ＬＯＸ−１」という）の一部が開裂して生じる可溶型分子（以下、「可溶型ＬＯＸ−１」という）に特異的親和性を有して結合するモノクローナル抗体、および当該抗体を産生するハイブリドーマに関する。さらに本発明は、当該モノクローナル抗体の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
不安定狭心症から急性心筋梗塞、さらにはこれらに合併する心臓性突然死までの一連の病態は包括的に急性冠症候群（ＡＣＳ）と呼ばれる。いずれも心臓に栄養を供給する冠動脈の動脈硬化により生じた粥腫（プラーク）が崩壊し、これに血栓が付着した結果、冠動脈の狭窄や閉塞が生じて発症するとされる。現代社会において、急性冠症候群は増加の一途をたどっているが、その大部分は何の前兆もなく突然に発症するため、救命できず突然死の経過をたどることも多い。また、たとえ速やかに病院に収容された場合でも、救命のために緊急心臓手術、緊急経皮経管冠動脈血管形成術（ＰＣＩ）等が必要になることも多く、その医療経済上の負担は計り知れない。【０００３】
急性冠症候群の発症は、粥状動脈硬化プラークの破綻あるいは糜爛に続発して生じる閉塞性の血栓形成に起因することが近年明らかになってきた（非特許文献１）。プラークの破綻、糜爛には血管壁内での催炎症反応、酸化ストレスが重要な役割を担うことが示されてきたが、中でも酸化変性を受けたＬＤＬ（低比重リポタンパク質）により惹起された、プロテアーゼ活性の増加及びアポトーシス（細胞死）を中心とする血管壁の機能障害がその主要な原因として知られている。ＬＯＸ−１は、この酸化ＬＤＬの受容体タンパク質として同定されたものである（非特許文献２）。このＬＯＸ−１は、生体内において通常、膜タンパク質として細胞表面に発現しているが、プロテアーゼの作用により膜貫通部近傍の細胞外ドメインにて切断されて可溶型（soluble）ＬＯＸ−１として血中に遊離することが知られている（非特許文献３）。また急性冠症候群の急性期においては、この可溶型ＬＯＸ−１の血中濃度が著明に上昇することから、急性冠症候群の一次的診断マーカーとしての可能性が報告されている（非特許文献４）。【０００４】
そのため、血中に存在する可溶型ＬＯＸ−１の量を早期の段階で正確に定量できれば、急性冠症候群（ＡＣＳ）を未然に防止することができるといえる。一方、ＬＯＸ−１に対する抗体についての報告はあるが、いずれも一般的な記載に止まっており、上記の目的にかなうＥＬＩＳＡなどの免疫化学的測定系に使用できる高い親和性を有するモノクローナル抗体は、報告されていないのが現状である(特許文献１〜３)。
【非特許文献１】Medical Tribune, 1999, Vol. 32, No.31, p.6
【非特許文献２】Nature, 1997, Vol.386, p.73-77
【非特許文献３】Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. , 2000, 20(3), p.715-720
【非特許文献４】Circulation, 2005, 112(6), p.812-818
【特許文献１】特開平９−９８７８７号公報
【特許文献２】特開２０００−１０９４３５号公報
【特許文献３】特表２００２−５１０７１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒト酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−１の可溶型分子である、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、特にヒト可溶型ＬＯＸ−１との解離定数が１×１０−９（Ｍ）以下の、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体を提供することである。また、本発明は、当該モノクローナル抗体の用途、例えば当該抗体が有するヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的親和性および結合性を利用した免疫学的試薬（例えば、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的結合試薬または特異的検出試薬）、及び当該試薬を利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的かつ高感度な検出法を提供することを目的とする。【０００６】
さらに本発明は、血中に存在するヒト可溶型ＬＯＸ−１を検出または定量することによって、心筋梗塞に代表される急性冠症候群を診断する方法、ならびに急性冠症候群の治療薬やその候補薬の薬効を評価する方法を提供することを目的とする。【０００７】
急性冠症候群の診断や急性冠症候群に対する被験薬物の薬効評価は、上記モノクローナル抗体を用いて血中に存在するヒト可溶型ＬＯＸ−１を検出または定量することにより、従来法よりも容易且つ早期に行うことが可能になる。ゆえに、本発明は、かかる急性冠症候群の診断や薬効評価におけるモノクローナル抗体の用途を提供することをも目的とする、
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を行ったところ、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイとの結合を指標として調製したハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体が、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対して、解離定数が１×１０−９（Ｍ）以下と極めて高い親和性を有していることを見出し、さらに、これらのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によれば、急性冠症候群の病態を反映する血中の可溶型ＬＯＸ−１の存在を高感度に検出測定することができることを確認した。これらの知見から、本発明にかかるモノクローナル抗体を使用した検査キットを用いれば、急性冠症候群の高精度な診断が可能になること、また急性冠症候群に対する被験薬の薬効が高い精度で評価できることを確信した。【０００９】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の態様を含む：
（Ｉ）モノクローナル抗体
（I-1）ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合する性質を有する、モノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。【００１０】
（I-2）ヒト可溶型ＬＯＸ−１との解離定数（Ｋｄ）が、１×１０−９（Ｍ）以下であることを特徴とする、（I-1）に記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。【００１１】
（I-3）下記の工程を含む方法で調製されるハイブリドーマにより産生される、（I-1）または（I-2）に記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物：
（１）非ヒト動物に、原核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインを免疫する工程、
（２）当該動物から抗体産生細胞を回収する工程、
（３）当該抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する工程、
（４）上記工程で得られた融合細胞のなかから、前記ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、および
（５）当該選択したハイブリドーマのなかから、真核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程。【００１２】
（I-4）ハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１１Ａ７」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４５）、または「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ ６Ｂ１１」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４６）により産生されるモノクローナル抗体もしくはヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合するその一部、またはこれらの標識物。【００１３】
（I-5）モノクローナル抗体の一部が、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体のＦａｂ’断片である、（I-1）〜（I-4）のいずれかに記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。【００１４】
（II）モノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物の用途
上記のモノクローナル抗体またはその一部は、血液などの体液に存在するヒト可溶型ＬＯＸ−１の高感度検出に有効に利用でき、急性冠症候群の診断に応用することが可能である。また、これらのモノクローナル抗体またはその一部は、急性冠症候群の治療薬または治療候補薬の薬効評価に有効に利用することができる。よって、本発明には下記の態様が含まれる。【００１５】
（II-1）急性冠症候群の診断に使用される、（I-1）〜（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。【００１６】
（II-2）（I-1）〜（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を用いて、ヒト体液中の可溶性ＬＯＸ−１を測定する工程を有する、急性冠症候群の診断方法。【００１７】
（II-3）急性冠症候群の治療薬または治療候補薬の薬効評価に使用される、（I-1）〜（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物。【００１８】
（II-4）急性冠症候群の治療薬または治療候補薬が投与されたヒトの体液を対象として、（I-1）〜（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を用いて、当該ヒト体液中の可溶性ＬＯＸ−１を測定する工程を有する、急性冠症候群の治療薬または治療候補薬の薬効の評価方法。【００１９】
（III）ハイブリド−マおよびその調製方法
（III-1）（I-1）〜（I-5）のいずれかに記載するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。【００２０】
（III-2）ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの可溶性画分とＣＨＯ細胞由来可溶型ＬＯＸ−１との競合的結合をスクリーニングの指標として調製される(III-1）記載のハイブリドーマ。【００２１】
（III-3）「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ １Ａ７」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４５）、または「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ ６Ｂ１１」（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４６）である、（II-1）または（II-2）に記載するハイブリドーマ。【００２２】
（III-4）下記の工程を含む、（III-1）に記載するハイブリドーマの調製方法。
（１）非ヒト動物に、原核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインを免疫する工程、
（２）当該非ヒト動物から抗体産生細胞を回収する工程、
（３）当該抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する工程、
（４）上記で得られた融合細胞のなかから、前記ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、および
（５）当該選択したハイブリドーマのなかから、真核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程。【００２３】
（III-5）（III-4）に記載される方法によって調製されたハイブリドーマ。【００２４】
（III-6）（III-4）に記載される方法によって調製される（III-1）〜（III-3）のいずれかに記載されるハイブリドーマ。【００２５】
（IV）ヒト可溶型ＬＯＸ−１検出用試薬キットおよびその用途
（IV-1）(I-1）〜（I-5）のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬またはヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出試薬として含む、ヒト可溶型ＬＯＸ−１検出用試薬キット。【００２６】
（IV-2）急性冠症候群診断キットである、（IV-1）に記載する試薬キット。【００２７】
なお、当該試薬キットは、「(I-1）〜（I-5）のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を含む、急性冠症候群診断キット。」と言い換えることができる。【００２８】
（V）ヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出方法
（V-1）(I-1）〜（I-5）のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその一部、またはこれらの標識物を、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として用いる工程を有する、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出方法。【００２９】
急性冠症候群の病態に関連して血液中の可溶型ＬＯＸ−１量が増加することから、上記検出方法を利用することにより、被験者について急性冠症候群の病態の有無やその程度を診断することが可能となる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を特異的に認識し、高い親和性でもって結合するため、当該ヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出及び特異的結合に有用である。かかる本発明のモノクローナル抗体、その一部またはこれらの標識物（またはこれらのいずれかを含むヒト可溶型ＬＯＸ−１検出試薬）並びにそれを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出法によれば、生体組織または生体試料における可溶型ＬＯＸ−１の発現分布や存在を免疫化学的に調べることができ、可溶型ＬＯＸ−１の生理学的作用並びに意義をより詳細に解明することが可能となる。また、本発明のモノクローナル抗体、その一部またはこれらの標識物（またはこれらのいずれかを含むヒト可溶型ＬＯＸ−１検出試薬）並びにそれを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出法によれば、ＬＯＸ−１の発現（発現亢進、発現不全／減少）に関連して生じる種々の疾患や病態を、免疫化学的または免疫組織学的に診断することが可能となる。これらの疾患または病態としては、ＬＯＸ−１の発現亢進を伴う（または発現亢進に起因する）疾患または病態、例えば動脈硬化およびそれがより進展した病態である例えば心血管疾患（虚血性心疾患、心不全）、すなわち急性冠症候群を例示することができる。【００３１】
特に、実施例に示すように、本発明のモノクローナル抗体を２種類組みあわせて用いた２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡによれば、ヒト血清１ｍＬあたり約０．１ｎｇ／ｍＬの定量限界でもって、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の血中濃度を測定することができる。かかる測定感度は、従来の測定方法の約１０倍に相当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
Ｉ．モノクローナル抗体、及びその製造方法
以下、本発明で用いられる各種用語の意味を明らかにすることにより、本発明のモノクローナル抗体、およびその製造方法を詳細に説明する。【００３３】
本発明において「ＬＯＸ−１」とは、哺乳動物に由来する酸化ＬＤＬ（Oxdized low density lipoprotein）の受容体である。ここで哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を挙げることができるが、好ましくは既報に記載されるヒト、ウシ、ウサギ、ラットまたはマウスの酸化ＬＤＬ受容体（Oxdized low density lipoprotein receptor）である（Nature, Vol.386, p.73-77, 1997；脂質生化学研究、Vol. 39, p.83-84, 1997; 特開平９−９８７８７号公報；GenBank Accession No.BAA81912；Biochem. J., Vol.330 (Pt.3), p.1417-1422, 1998）。具体的には、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＬＯＸ−１を挙げることができる。【００３４】
かかるＬＯＸ−１は、糖鎖が付加された約５０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質でＮ末より細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインからなり、さらに当該細胞外ドメインは、ネックドメインとレクチン様ドメインの２つのドメインからなる（計４つのドメイン）。このうちレクチン様ドメインが酸化ＬＤＬの認識部位として働いている（沢村達也、臨床検査、Vol.45, No.3, p297）。ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）の場合、具体的には、そのアミノ酸１−３６領域が細胞内ドメイン、アミノ酸３７−５７領域が膜貫通ドメイン、アミノ酸５８−２７３領域が細胞外ドメインに相当する。【００３５】
本発明において「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」とは、前述するＬＯＸ−１の全構造のうち「細胞外ドメイン」の全部またはその一部を意味する。具体的には、膜貫通タンパクであるＬＯＸ−１において、細胞膜の外界側に存在する部分構造（部分領域）の全部または一部を意味する。換言すれば、「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」とは、膜内に取り込まれている膜貫通ドメイン及び当該ドメインに引き続いて細胞質内に存在する細胞内ドメインを除いた領域の全部または一部を意味する。ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）の場合、前述するように、そのアミノ酸配列の５８−２７３の領域が「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」の全部に相当する。【００３６】
「ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部」とは「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」の一部をさし、ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸配列（配列番号１）の８５−２７３領域（配列番号２）の他、「可溶型ＬＯＸ−１」など可溶性を示す部分領域を挙げることができる。【００３７】
本発明において「可溶型ＬＯＸ−１」とは、膜中に存在するＬＯＸ−１の一部（普通は「細胞外ドメイン」の一部）が切断されて（解離して）血中に放出（分泌）された、ＬＯＸ−１の一部を意味する。【００３８】
より具体的には、ヒト可溶型ＬＯＸ−１とはヒトＬＯＸ−１の細胞外ドメインの一部からなる可溶型レセプターのことである。ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部に相当する可溶型レセプター分子の例としては、ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸配列（配列番号１）の８８−２７３領域（配列番号３）からなる分子、または当該アミノ酸配列（配列番号１）の９２−２７３領域（配列番号４）からなる分子を例示することができる。またヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部に相当する分子には、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインのＮ端側に位置するペプチドが含まれる。当該ペプチドとして、具体的には、可溶型分子のアミノ酸配列（配列番号３）の１−１０領域に相当するペプチド（配列番号５）、および可溶型分子のアミノ酸配列（配列番号４）の１−１０領域に相当するペプチド（配列番号６）を例示することができる。なお、これらのペプチドは、ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸配列（配列番号１）のそれぞれ８８−９７領域および９２−１０１領域に相当する。【００３９】
本発明が対象とする「モノクローナル抗体」とは、前述するヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。ヒト血液中には、ＬＯＸ−１の一部が開裂して生成する配列番号３または４で示されるアミノ酸配列を有する可溶型ＬＯＸ−１が存在しており、その量は急性冠症候群の進展に伴って増加することから、当該可溶型ＬＯＸ−１は急性冠症候群、具体的は動脈硬化やそれ起因して発症する虚血性心疾患の病態を反映する診断指標となり得ると考えられている（林田ら、Circulation、2005，112(6)、p.812-818）。【００４０】
よって本発明が対象とする「モノクローナル抗体」は、好適には、配列番号３または４で示されるアミノ酸配列を有するヒト可溶型ＬＯＸ−１に対して高い親和性を有する抗体である。【００４１】
かかるヒト可溶型ＬＯＸ−１に対して特異的結合性を有する本発明の「モノクローナル抗体」は、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部（天然体、組換体、合成物、細胞培養上清を含む）を免疫原として用いて調製することができる。具体的には、まずヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部を免疫原として、また必要に応じてフロイントアジュバントとともに、非ヒト哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマあるいはウシ（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜２１日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜１０日後に免疫感作された該非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。【００４２】
なお、標準物質、免疫原（ハプテン）及びスクリーニングに、使用される「ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部」としては、例えば下記のものを例示することができる。なお、いずれもヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部を高濃度で含むものであればよく、画分であってもよい。【００４３】
（イ）ヒトＬＯＸ−１を細胞表面に発現する細胞もしくは細胞表面に発現するように人工的に樹立した細胞株、またはヒトＬＯＸ−１を細胞表面に発現するように遺伝子組換え技術を用いて作成した遺伝子組換え細胞を培養して得た培養上清、または当該培養上清から精製されたヒト可溶型ＬＯＸ−１；
（ロ）ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの部分領域をタンパク質として発現するように遺伝子組換え技術を用いて作成された遺伝子組換え細胞を培養して得た培養上清もしくは当該培養上清から精製されたヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの部分領域；または
（ハ）化学的に合成されたヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインのN末端領域。【００４４】
具体的には（イ）のヒト可溶型ＬＯＸ−１としては、例えば、細胞の培養液中に分泌されるヒト可溶型ＬＯＸ−１を挙げることができる。これは細胞の培養液中に分泌される可溶型ＬＯＸ−１が、天然のヒト可溶型ＬＯＸ−１に最も近いからである。当該ヒト可溶型ＬＯＸ−１は、実施例１（２）に記載する方法のように、遺伝子工学的に調製することができる(特開２００２−１７３５３号公報など参照)。【００４５】
また（ロ）のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの部分領域としては、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸配列５８−２７３領域）の一部（例えば、配列番号２）を挙げることができる。当該部分領域は、実施例１（１）に記載する方法のように、遺伝子工学的に調製することができる。【００４６】
さらに（ハ）のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインのN末端領域としては、配列番号５または６に記載するアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。当該ペプチドは、ハプテンとして使用する場合は、ウシ血清アルブミン（BSA）などの高分子とコンジュゲートさせる必要がある。【００４７】
本発明で使用される免疫原として、好ましくは、(ロ)の大腸菌など原核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの部分領域である。【００４８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, 1975, Vol.256, p.495-497）、及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。【００４９】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８.Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ.２.３、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５を使用することができる。【００５０】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、まず、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖が見られたウェルの培養上清の、前述する非ヒト動物への免疫感作に用いた免疫原（上記（イ）〜（ハ）のいずれか。好ましくは（ロ）の方法で調製した原核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部）に対する反応性を、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、当該免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。この方法において、通常は、免疫原を固相化し、そこに結合する培養上清中の抗体を、酵素で標識した第二抗体で検出するという、非競合法ＥＬＩＳＡが用いられる。しかしながらこの非競合法は非特異的な結合も検出するため、特異的な結合をする抗体のみを検出することが難しい。さらに、一般にタンパクを大腸菌などの原核生物の細胞で発現させたとき、その立体構造は天然のものとは異なる。大腸菌で発現させたヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部についても、多くは沈殿物となる。このため、免疫原としてその沈殿と上清の懸濁液が用いられるが、この場合、産生する抗体も天然のヒト可溶型ＬＯＸ−１とは異なる沈殿等の変性タンパクと結合するものが多く含まれることが予想される。【００５１】
そこで本発明者らは、下記の(1)および(2)のスクリーニングを段階的に行い、その結果、天然型のヒト可溶型ＬＯＸ−１と極めて高い親和性をもって結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。【００５２】
(1)固相化した第二抗体に、ハイブリドーマの培養上清中の抗体を結合させ、これに、まず原核細胞に由来するヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部を添加し、ビオチンで標識したヒト可溶性ＬＯＸ−１と競合反応させて、原核細胞に由来するヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部と反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。【００５３】
(2)上記で選択されたハイブリドーマの培養上清を用いて、この中に含まれる抗体を、固相化した第二抗体に結合させ、これに、真核細胞に由来するヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部とビオチンで標識したヒト可溶性ＬＯＸ−１を競合反応させて、真核細胞由来のヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部と反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。【００５４】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。【００５５】
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥのいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体であることができる。好ましくはＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２であり、特に好ましくはＩｇＧ１である。【００５７】
本発明において「モノクローナル抗体の一部」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合性を有する領域を意味する（以下、これを単に「抗体断片」ともいう）。【００５８】
かかる抗体断片としては、具体的には、前述するヒト可溶型ＬＯＸ−１に対して特異的結合性を有する、Ｆａｂ (ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ)、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ; 以下、「ｓｃＦｖ」と表記する)、２量化体Ｖ領域断片 (以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ; 以下、「ｄｓＦｖ」と表記する)、ｄＡｄ（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。【００５９】
Ｆａｂは、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成される、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。当該Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合 (Ｓ−Ｓ結合) の上部のペプチド部分を、酵素パパインで分解することによって調製することができ、本発明で使用されるＦａｂも、上記本発明のモノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。または、上記本発明のモノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞に導入して発現させることによってもＦａｂを製造することができる。【００６０】
Ｆ(ａｂ')２は、２つのＦａｂ’領域がヒンジ部分で結合して構成される、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。当該Ｆ(ａｂ')２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のＳ−Ｓ結合の下部を酵素ペプシンで分解することによって調製することができ、本発明で使用されるＦ(ａｂ')２も、上記本発明のモノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞に導入して発現させることによってもＦ(ａｂ')２を製造することができる。【００６１】
Ｆａｂ'は、上記Ｆ(ａｂ')２のヒンジ間のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂ'は、上記本発明のモノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦａｂ'をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞に導入して発現させることによってもＦａｂ'を製造することができる。【００６２】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー (以下、Ｐと表記する) を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、上記本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞に導入して発現させることによって製造することができる。【００６３】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、Ｓ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法 (Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７ (１９９４)) に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨあるいはＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、適当な発現ベクターに挿入してｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞に導入し、発現させることにより製造することができる。【００６４】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、本発明のモノクローナル抗体に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを動物細胞に導入してＤｉａｂｏｄｙを発現させることにより、製造することができる。【００６５】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞に導入して発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法 (フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法 (ｔ−ブチルオキシカルボニル法) 等の化学合成法によって製造することもできる。【００６６】
「モノクローナル抗体の一部」として好ましくは、本発明のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）をペプシン処理して得られるＦ（ａｂ’）２を挙げることができる。【００６７】
モノクローナル抗体またはその一部の抗原に対する親和性を表す指標として用いられる解離定数（Ｋｄ）は、種々の方法に従って解析することができる．たとえば、各種標識剤で標識した抗原を用いたＳｃａｔｃｈａｒｄ法や、市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅシステム（アマシャムファルマシア社製）または類似のキットを用いて、当該キットに添付された取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に解析することができる。これらの方法を用いて求められるＫｄ値はＭ（モル）なる単位で表される。試験されたモノクローナル抗体は、解離定数（Ｋｄ値）が小さいほど強い親和性を有していることを示す。【００６８】
本発明が対象とするモノクローナル抗体またはその一部には、ヒト可溶型ＬＯＸ−１との解離定数（Ｋｄ）が、１×１０−９（Ｍ）以下、好ましくは５×１０−１０（Ｍ）以下、より好ましくは２×１０−１０（Ｍ）以下である、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部が含まれる。【００６９】
本発明が対象とするモノクローナル抗体およびその一部は、解離定数が１×１０−９（Ｍ）以下と、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する親和性が非常に高いことから、従来では達成できなかった、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の高感度の検出及び定量が可能である。特に、本発明のモノクローナル抗体によれば、健常人においては血清中の可溶型ＬＯＸ−１の濃度が大変低く、従来の測定方法では正確な測定はできなかったという問題を、克服することができる。【００７０】
一方、類似の免疫原を用いたモノクローナル抗体の報告がなされているものの（ＷＯ０１／６４８６２）、治療を目的としたヒト型抗体であり、開示されているいずれのモノクローナル抗体も解離定数は１×１０−８（Ｍ）より大きい値を示している。この程度の解離定数では、健常人もしくは慢性期のような血清中の可溶型ＬＯＸ−１の濃度が低い被験者を測定する場合において、感度の面から診断マーカーとしての目的は達成できないと考えられる（実施例5（9）参照）。【００７１】
本発明が対象とするモノクローナル抗体のうち、より好適なものとしては、実施例で示すように、ハイブリドーマ６Ｂ１１または１Ａ７から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。【００７２】
これらのハイブリドーマ６Ｂ１１および１Ａ７から産生される各モノクローナル抗体の「解離定数（Ｋｄ）」を下記に示す。【００７３】
【表１】
0005147696.tif 000002
【００７４】
当該ハイブリドーマ６Ｂ１１および１Ａ７については、それぞれ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ １Ａ７」および「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ ６Ｂ１１」として、２００６年７月２６日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１  中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、国際寄託されている。各ハイブリドーマの受領番号および受託番号は、下記の通りである。【００７５】
【表２】
0005147696.tif 000003
【００７６】
ＩＩ．可溶型ＬＯＸ−１検出用試薬キットおよびそれを用いた可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出方法
前述する本発明のモノクローナル抗体およびその一部（抗体断片）は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１と高い親和性をもって特異的に結合する。  【００７７】
このため、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片によれば、免疫測定法を利用して、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を選択的且つ特異的に検出することができる。よって、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の組織局在性やその発現の程度を調べたり、被験試料中に存在し得るヒト可溶型ＬＯＸ−１を検出したり定量するための免疫学的試薬（例えば、免疫電気泳動用試薬や免疫測定用試薬など）として有効に使用することができる。すなわち、前述する本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、免疫電気泳動法または免疫測定法を利用してヒト可溶型ＬＯＸ−１を検出し測定するにあたって、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬（免疫学的試薬）として有効に使用することができる。ここで、免疫測定法の例としては、直接または間接の競合アッセイまたは非競合アッセイ（例えば、サンドイッチ法等）挙げることができる。また、免疫電気泳動法または免疫測定法には、ウエスタンブロット法、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ法）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法など）、免疫沈降法などが含まれる（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)；続生化学実験講座５、免疫生化学研究会（東京化学同人（1986)など）。【００７８】
本発明は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を免疫電気泳動法または免疫測定法を利用して特異的に検出または測定するための試薬キットを提供する。当該本発明は、被験試料中のヒト可溶型ＬＯＸ−１の存在またはその量を、抗原−抗体反応を利用して検出測定するための試薬キットであり、前述する本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬成分または特異的検出試薬成分として含むことを特徴とするものである。また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片に代えて、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合を有するその一部（抗体断片）を用いることもできる。【００７９】
本発明のモノクローナル抗体またはその一部（抗体断片）は、免疫測定用の試薬として、そのままで使用されても、また固体支持体に結合した形態で使用することもできる。ここでこれらのモノクローナル抗体または抗体断片を結合させる固体支持体としては、当業界で周知のものを任意に使用することができ、例えばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然／変性セルロース、ポリアクリルアミド、寒天およびマグネタイトなどを挙げることができる。なお、これらの固体支持体には、反応トレイのウェル、試験管、ポリスチレンビーズ、マグネチックビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子等が含まれる。これらの固体支持体へのモノクローナル抗体または抗体断片の結合方法も公知であり、本発明もまた当該公知の方法を適用することができる。【００８０】
また本発明のモノクローナル抗体及びその抗体断片は、免疫電気泳動用及び免疫測定用などの免疫学的試薬として、そのままでもよいし、また任意の標識剤で標識された標識物の形態で使用することもできる。本発明で使用可能な標識剤としては、モノクローナル抗体への結合標識剤として当業界で公知の酵素〔例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等〕、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、蛍光性化合物〔例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等〕、化学発光性化合物、及び生物発光性化合物等を広く挙げることができる。なお、これらを標識剤として使用する免疫測定法は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、エンザイムイムノメトリックアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ等と称されている。【００８１】
好ましくは、酵素を標識剤として使用する免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）であり、具体的には酵素としてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、検出用の発色基質として化学発光基質ＡＰＳ−５（phosphoric acid mono-[(4-chloro-phenylsulfanyl)-(10-methyl-10H-acridin-9-ylidene)-methyl] ester disodium salt（Lumigen APS-5，オリエンタル酵母））を用いたＥＬＩＳＡ法や酵素としてペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、検出用の発色基質として比色基質テトラメチルベンジジンを用いたＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。【００８２】
本発明が提供する好適なヒト可溶型ＬＯＸ−１検出用試薬キットは、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合する２つのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ用の試薬キットである。当該試薬キットには、少なくとも、固体支持体に固定化されてなる本発明のモノクローナル抗体またはその断片、前述する標識剤で標識されてなる本発明のモノクローナル抗体またはその断片、および当該標識剤と反応して発色、発蛍光または発光する基質が含まれる。この場合、標識剤として、好ましくは前述する酵素、特にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を挙げることができ、また基質として好ましくはＡＰＳ−５を挙げることができる。かかるサンドイッチＥＬＩＳＡによれば、より高い感度で可溶型ＬＯＸ−１を検出することができる。【００８３】
尚、これらの標識剤による標識方法や間接的な標識化による修飾方法、並びにそれらの検出方法等は、自体公知の方法に従って行うことができる（「単クローン抗体」岩崎辰夫他著、講談社サイエンティフィク、1984年；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治 他著、医学書院、1982年等）。【００８４】
本発明の試薬キットには、上記本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片またはこれら標識物のほか、免疫電気泳動法または免疫測定法などその用途に応じて、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の標準液、転写溶液、泳動溶液、反応停止液、抗体検出試薬、標識活性測定試薬、染色液、反応プレート、ニトロセルロースフィルター、ポリアクリルアミドゲル等が含まれていてもよい。なお、ここで抗体検出試薬としては、本発明のモノクローナル抗体と結合する二次抗体、例えば放射性物質や酵素などで標識した抗ＩｇＧ抗体やプロテインＡ等を挙げることができる。【００８５】
本発明のモノクローナル抗体、抗体断片またはこれらの標識物を結合または検出試薬として含む上記試薬キットを利用することにより、一般の免疫電気泳動法及び免疫測定法に従い、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を簡便に、特異的にかつ高感度に検出及び測定することができる。【００８６】
ゆえに本発明は、さらに、本発明のモノクローナル抗体、抗体断片またはこれらの標識物をヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として用いることを特徴とするヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的測定方法を提供する。【００８７】
本発明の測定方法は、前述する本発明のモノクローナル抗体、抗体断片またはこれらの標識物をヒト可溶型ＬＯＸ−１に対する特異的結合試薬または特異的検出試薬として使用することを必須とするものであって、その限りにおいて、他の基本的操作等は特に制限されることなく、通常の免疫電気泳動法または免疫測定法における慣用の方法を広く採用することができる。故に、本発明のモノクローナル抗体、抗体断片またはこれらの標識物を利用した抗原−抗体反応、及び生じた抗原−抗体結合物と抗体検出試薬との反応条件も特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。通常、４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温度条件下、ｐＨが約５〜９程度の下で、約０．５〜４０時間、好ましくは１〜２０時間程度放置するかもしくはインキュベーションする方法を挙げることができる。【００８８】
本発明が提供する好適なヒト可溶型ＬＯＸ−１の測定法は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合する２つのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法である（２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡ法）。当該方法は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片が固定化された固体支持体（固相化抗体）に、被験試料およびヒト可溶型ＬＯＸ−１の標準液（抗原）を結合させ、次いで標識剤で標識した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片（標識抗体）を反応させて、固相化抗体−抗原（ヒト可溶型ＬＯＸ−１）−標識抗体のサンドイッチ型複合体を形成させ、斯くして形成された複合体を、その標識剤と基質との反応による発光に基づいて検出または定量するというものである。【００８９】
本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片およびこれらの標識物は、ヒト可溶型ＬＯＸ−１を特異的に認識して高い親和性で結合するため、当該抗体を含む上記試薬キットを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１測定法は、被験試料（例えば、血液、尿等）や各種組織中のヒト可溶型ＬＯＸ−１の特異的検出や定量、ヒト可溶型ＬＯＸ−１発現組織の分布測定、及びアフィニティを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１の精製に利用されるほか、ヒトＬＯＸ−１の発現の増加を伴う（またはヒトＬＯＸ−１発現の増加に起因する）種々の疾患の免疫化学的及び免疫組織学的診断に有用である。【００９０】
従来の技術の欄で述べるように、ＬＯＸ−１は酸化ＬＤＬ受容体として機能しており、動脈硬化病変における粥腫の形成には、血管内膜に集簇したマクロファージにおける酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）を介した取り込みによるコレステロールエステルの細胞内蓄積が、主要な役割を占めることが知られている。また実際に動脈硬化の初期病変を覆う血管内皮細胞と進行した動脈硬化プラークの内膜平滑筋細胞とマクロファージにはＬＯＸ−１の発現が増強されていることが示されている。このように、酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）を介した酸化ＬＤＬの取り込みは、血管内皮細胞における機能障害のみならず、血管平滑筋細胞の機能障害やマクロファージの泡沫細胞化にも関与し、粥状動脈硬化の進展に深くかかわっている。さらに、ＬＯＸ−１は、その一部が細胞外ドメインの膜近傍部位にて切断され、血液中で可溶型分子（可溶型ＬＯＸ−１）として存在することが示されている。このように、可溶型ＬＯＸ−１の血中濃度は、in vivo細胞におけるＬＯＸ−１発現の程度を反映するため、急性冠症候群の病態を反映する診断マーカーとして注目されており、これを測定することによって、急性冠症候群の早期診断が可能であると考えられている（Medical Tribune, 1999, Vol.32, No.31, p6；Circulation, 2005, 112(6), p.812-818）。【００９１】
ゆえに、上記本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片またはこれらの標識物を含む試薬キットを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１測定法によれば、被験者の血液中のヒト可溶型ＬＯＸ−１を測定することにより、当該被験者について急性冠症候群のリスクの程度を診断することができる。特に、急性冠症候群の再発のリスクの程度の診断にも有効である（WO 2007/072896）。【００９２】
また上記するように、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の血中濃度は、急性冠症候群の病態を反映するバイオマーカーとなることから、当該濃度を指標とすることで、急性冠症候群に対する被験薬の薬効を評価することが可能である。具体的には、本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片またはこれらの標識物を含む試薬キットを利用したヒト可溶型ＬＯＸ−１測定法によれば、例えば、急性冠症候群の臨床試験にあたって、被験者に対する治験薬の薬効を、当該被験者の血液中のヒト可溶型ＬＯＸ−１を測定することにより、容易に判断することができる。また、上記ヒト可溶型ＬＯＸ−１測定法によれば、急性冠症候群の患者に対する被験薬の治療効果を、当該被験者の血液中のヒト可溶型ＬＯＸ−１を測定することにより、容易に判断することができる。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９４】
実施例１  [標準物質の調製]
標準物質として、下記に示すように(１)ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイン、および(２) ＣＨＯ細胞由来の可溶型ＬＯＸ−１を調製した。【００９５】
（１）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク
ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部をコードする配列（配列番号２）をｐＱＥベクター（キアゲン）に組み込んでプラスミド（ｐＱＥ−ｈＬＯＸ−１）を作製し、これを大腸菌（高速形質転換大腸菌ＤＨ５α、（株）ニッポンジーン製）に導入した。この大腸菌をアンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍＬ及び硫酸カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地５０ｍＬで一晩培養してスターターを作り、これを１Ｌの培地に移した後、０.５ ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ(Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ)を添加して４時間培養した。【００９６】
培地を遠心分離（８,０００ｍｉｎ−１、１０分間）し、集菌した大腸菌をＰｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（シグマ製）０.５ｍＬ及びリゾチーム２０ｍｇを含む緩衝液Ａ（１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０.０５ Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８.０）１０ ｍＬに懸濁し氷冷下で１時間放置した。次いで、超音波処理（１分間で１０回）で破砕し、遠心（９０００ｍｉｎ−１、１５分間）して沈殿を集めた。この不溶性画分を緩衝液Ｂ（８Ｍ尿素、０.１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む０.０１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８.０）８ｍＬで可溶化し、これにＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅゲル（キアゲン製）８ｍＬを加え室温で１時間混合した。次に、ゲルを空カラム（１.１ ｉｄ ｘ １３ｃｍ）に移し、２０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾールを含む緩衝液Ｂで十分洗浄した後、２５０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾールを含む緩衝液ＢでＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク（ｓＬＯＸ−１−Ｄ）を溶出させた。このタンパク溶出画分を０.０５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ９.０）に対して透析した。透析時に加える尿素濃度を４、２、１、および０ ｍｏｌ／Ｌと段階的に薄めてタンパクのリフォールディングを行った。【００９７】
透析により全成分の９０％以上が沈殿し、最終的に得られたヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク可溶画分（以下、「ｓＬＯＸ−１−Ｄ」という）は２.４ ｍｇ／１５ ｍＬであった。得られたｓＬＯＸ−１−ＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックしたところ、ほぼ１バンドで、ほぼ単一のｓＬＯＸ−１−Ｄであることが確認された。【００９８】
（２）ＣＨＯ細胞由来の可溶型ＬＯＸ−１
ヒトＬＯＸ−１発現ＣＨＯ細胞の培養液中に分泌されるｓＬＯＸ−１が、天然のヒト可溶型ＬＯＸ−１に最も近いと考えられる。そこで、ヒトＬＯＸ−１をコードするｃＤＮＡをｐＶＰ２２／ｍｙｃ−ｈｉｓベクター（インビトロジェン製）に組み込んでｐＶＰ２２／ｍｙｃ−ｈｉｓ−ＬＯＸ−１を作製し、これをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ（ヒトＬＯＸ−１（Ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付き）発現ＣＨＯ細胞）をつくった。このヒトＬＯＸ−１（Ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付き）発現ＣＨＯ細胞を２０ｍＬの培養液（１０ ｖｏｌ ％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）及び ０.０４ｇ／ｄＬ Ｇ−４１８を含む Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地）を入れた培養フラスコ（８０ｃｍ２）で培養（３７℃、５％ＣＯ２）し、その培養細胞から次の方法に従って継代を行った。【００９９】
まず、培養のフラスコを３〜４日ごとに培地交換して細胞が集密状態になったとき、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行い、集めた細胞を数個の培養フラスコに移して継代培養した。また、細胞は一方を凍結保管し、他方を拡大培養に用いた。拡大培養には、細胞約５×１０６ 個を入れた３層培養フラスコ（５００ｃｍ２、培養液１５０ｍＬ）中で３７℃、４〜６日間、さらに無血清の培養液に交換して２日間培養した後、その培養上清を限外ろ過（０.２２μｍ ｆｉｌｔｅｒ） し、１０倍濃縮のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを ０．３３ｍＬを加えて凍結保存した。【０１００】
このＬＯＸ−１（Ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付き）発現ＣＨＯ細胞培養上清を集めて、硫安塩析・透析・濃縮後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン）カラムを用いてアフィニティ精製した。Ｎｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅカラムからの溶出時にイミダゾール濃度を５、１０、２０、５０及び１００ｍｍｏｌ／Ｌと細かく変えて洗浄し、及び２５０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを用いて目的のタンパク（ＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１）を溶出採取した。【０１０１】
実施例２  ［ＴＲ−ＦＩＡ法、並びにそれを使用した抗体価及びアフィニティの測定］
抗体のスクリーニング法としてＴＲ−ＦＩＡ（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法を構築した。当該方法は、第二抗体固相化プレートに被験抗体試料を加え、そこにビオチン標識した抗原（ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄ）を結合させて複合体を生成させ、生成した複合物（第二抗体−抗ｓＬＯＸ−１抗体−ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄ）を、ユウロピウム（Ｅｕ）標識アビジン（またはＥｕ標識ストレプトアビジン）で標識して、時間分解蛍光法により検出することを原理とするものである（図１参照）。【０１０２】
当該反応系に、実施例１（１）または（２）で調製した標準物質（ｓＬＯＸ−１−ＤまたはＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１）を添加して、ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄと競合させて、被験抗体試料とビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄとの結合を阻害することにより、被験抗体試料の上記各標準物質（ｓＬＯＸ−１−ＤまたはＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１）に対するアフィニティを測定することができる。【０１０３】
（１）ｓＬＯＸ−１−Ｄのビオチン化（ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄの調製）
実施例１（１）で調製したヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク（ｓＬＯＸ−１−Ｄ）をビオチン化試薬（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ、ピアス製）を用いてビオチン化した。すなわち、マニュアルに従って下記の方法を行った。【０１０４】
（ｉ）ｓＬＯＸ−１−Ｄ ０.０６ ｍｇ（３×１０−９ｍｏｌｅ）を反応バッファー（０.１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー、ｐＨ７.４）０.２５ ｍＬに溶解し、そこにｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（ピアス製）０.０２５ ｍｇ （４.５×１０−８ｍｏｌｅ）を溶解した反応バッファー０.０２５ ｍＬを加える。【０１０５】
（ｉｉ）室温で ２時間、撹拌し反応を行なう。
（ｉｉｉ）反応後、ゲルろ過（ＰＤ−１０、アマシャム製）により目的物（ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄ）を分取後、濃縮する。【０１０６】
（２）第二抗体固相化プレートの調製
第二抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ血清（シバヤギ）からＭＡＰＳ−ＩＩキット（バイオラッド製）により精製して得られたＩｇＧ画分 (１５.８ｍｇ／ｍＬ）を用いた。当該ＩｇＧ画分を用時、固相化バッファー（０.０５ｇ／ｄＬ窒化ナトリウム含有０.０５ ｍｏｌ／Ｌトリスバッファー、ｐＨ７.８）にて１０μｇ／ｍＬに調製し、マイクロタイタープレート（マキシソープフルオロ、ヌンク）の各ウェルに１００μＬずつ分注した。室温で一晩以上静置した後、ブロッキングバッファー（２０ｇ／ｄＬシュークロース及びブロックエース（１包４ｇ、雪印乳業）を精製水１００ｍＬと固相化バッファー １００ ｍＬを加え溶解したもの）で２回洗浄し、さらにブロッキングバッファー２００μＬを加えて５時間以上静置した。ブロッキングバッファーを吸引し、このプレートを減圧下室温で乾燥して第二抗体固相化ドライプレート(４℃保管)とした。【０１０７】
（３）抗体量（抗体価）の測定方法
（２）で調製した第二抗体固相化プレートを洗浄液（０.０１ｇ／ｄＬ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０.０５ｇ／ｄＬ窒化ナトリウムを含む生理食塩液）で２回洗浄した後、各ウェルに被験抗体試料の希釈液５０μＬ、および標識抗原混液（ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−ＤとＥｕ標識ストレプトアビジンの等量混合物）１００μＬを加え、４℃で１６時間インキュベーションし、３回洗浄する。次いで増強試薬１５０μＬ（フタル酸水素カリウム１.３９ｇ、酢酸６.０ｇ、ＴＯＰＯ（ｔｒｉ−ｎ−ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｏｘｉｄｅ） １９.３ ｍｇ、ＮＦＡ（２−ｎａｐｈｔｈｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ） ４.５９ ｍｇ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １.０ｇを精製水で１ Ｌとしたもの）を加え、固相に固定化されたユウロピウム（Ｅｕ）の時間分解蛍光強度をマルチラベルカウンタ（１４２０アルボＳＸ、ワラック製）により測定する。斯くして、蛍光強度が１０００００カウントを与える被験抗体の希釈倍数から、被験抗体試料の抗体価を求めることができる。【０１０８】
なお、本測定で試薬の調製等に用いるアッセイバッファーとしては、０.５ｇ／ｄＬ ＢＳＡ、０.０５ｇ／ｄＬ窒化ナトリウム、０.９８ｍｇ／ｄＬ ＤＴＰＡ、Ｔｗｅｅｎ ８０ ０.１ｇ及び０.９ｇ／ｄＬ塩化ナトリウムを含む０.０５ｍｏｌ／Ｌトリスバッファー (ｐＨ ７.４)を挙げることができる。【０１０９】
（４）抗体のヒト可溶型ＬＯＸ−１に対するアフィニティの評価方法（阻害曲線）
（２）で調製した第二抗体固相化プレートのウェルに、被験抗体試料の希釈液５０μＬ、ヒト可溶型ＬＯＸ−１の標準物質（ｓＬＯＸ−１−ＤまたはＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１）溶液５０μＬ、標識抗原混液（ビオチン標識ｓＬＯＸ−１−ＤとＥｕ標識ストレプトアビジンの等量混合物）５０μＬを加えた後、４℃で一晩インキュベーションし、３回洗浄する。次いで増強試薬１５０μＬを加え、固相に固定化されたユウロピウム（Ｅｕ）の時間分解蛍光強度をマルチラベルカウンタ（１４２０アルボＳＸ、ワラック製）により測定する。配合する標準物質の濃度を段階的に変えて被験抗体試料とビオチン標識ｓＬＯＸ−１−Ｄとの結合を測定し、標準物質（ｓＬＯＸ−１−ＤまたはＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１）の濃度に応じて阻害曲線を作成する。阻害曲線データのスキャッチャード解析により、被験抗体のヒト可溶型ＬＯＸ−１に対するアフィニティ（解離定数、Ｋｄ）を求めることができる。【０１１０】
実施例３  ［モノクローナル抗体の作製］
（１）免疫原
免疫原として実施例１（１）で調製したｓＬＯＸ−１−Ｄ(沈殿を含む懸濁液)、およびヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインのＮ端側に位置する配列番号５および６に示すアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド1、ペプチド２）をハプテンとした。これは、実施例１（２）のＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１の培養液中の含量は大腸菌などに比べて非常に少なく、また培養液中の夾雑物が多いため、このｓＬＯＸ−１を免疫原として使用するには、必要量を確保するのが困難だからである。上記のハプテンとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ製）のコンジュゲートを免疫原として用いた。【０１１１】
各ペプチドのＣ端には架橋試薬との結合のため、Ｃｙｓを導入した。ＢＳＡに架橋試薬Ｎ−(ε-マレイミドカプロキシ)スクシニイミド  エステル（ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、ピアス製）を用いてマレイミド基を導入し、これと上記のＳＨ基含有ペプチドフラグメントを反応させてハプテン−ＢＳＡコンジュゲートを得た。すなわちＢＳＡ２７ｍｇ（４×１０−７ｍｏｌｅ）を反応バッファー（０.０５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー、ｐＨ７.０）１ ｍＬ に溶解し、そこにｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ８.２１ ｍｇ（２×１０−５ｍｏｌｅ）を溶解した反応バッファー０.２ｍＬを加えた。室温で９０分間、撹拌し反応した。反応後、反応液全量についてゲルろ過カラム（ＰＤ−１０、アマシャム製）を用いたゲルろ過を行ってマレイミド化ＢＳＡを分取した。【０１１２】
マレイミド基導入ＢＳＡ溶液２ｍＬ（全体の１／２量）に、反応バッファー０.５ ｍＬに溶解した配列番号５に示すペプチド１（但しＣ端にｃｙｓ導入、８.６８ ｍｇ、６.８ × １０−６ ｍｏｌｅ）を加え、室温で１.５ 時間攪拌した後、４℃で一夜反応した。精製水に対して透析後、凍結乾燥した（ペプチド１−ＢＳＡ）。【０１１３】
また、配列番号６に示すペプチド２（Ｃｙｓ付き）の８.３３ ｍｇ（６.６×１０−６ ｍｏｌｅ）について、マレイミド基導入ＢＳＡ溶液２ｍＬを用いて同様に反応を行った（ペプチド２−ＢＳＡ）。【０１１４】
（２）免疫
免疫動物としてはＡ／Ｊマウス（６〜８週齢、雌、１０〜２０ｇ（体重）日本エスエルシーより入手）を用いた。Ａ／Ｊマウスは２０匹用い、４匹ずつ５群〔１−１群（Ｎｏ.１１０１〜１１０４）、２−１群（Ｎｏ.２１０１〜２１０４）、３−１群（Ｎｏ.３１０１〜３１０４）、４−１群（Ｎｏ.４１０１〜４１０４）および５−１群（Ｎｏ.５１０１〜５１０４）〕に分けた。免疫原（ｓＬＯＸ−１−Ｄ、ペプチド１−ＢＳＡ、およびペプチド２−ＢＳＡ）を生理食塩液に溶解し、等量のフロイント完全アジュバント（ディフコ）を加えて乳化させた。このエマルジョンの約１００μｇ／１００μＬを表３に示すように、各マウスの腹腔内に３週間隔で４回投与した。【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
３〜４回感作した後に採取した抗血清を被験抗体試料として、実施例２で説明するＴＲ−ＦＩＡ法を行うことにより、各抗血清の抗体価を調べた。１−１群（Ｎｏ.１１０１〜１１０４）、２−１群（Ｎｏ.２１０１〜２１０４）、３−１群（Ｎｏ.３１０１〜３１０４）のマウスから得られた抗血清の抗体価を表４に示す。【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
これらの結果から、ｓＬＯＸ−１−Ｄで免疫して得られた抗血清の抗体価（蛍光強度が１０００００ｃｐｓにおける希釈倍数）はそれぞれ１０万以上であり、２〜３回免疫でほぼプラトーに達することがわかった。また抗体価から、いずれの群のマウスの脾臓細胞も細胞融合に使用可能であると判断された。【０１１９】
さらに、この中から以下の方法によりマウスの選択を行った。具体的には、実施例２（４）のＴＲ−ＦＩＡ法により、抗血清（３回感作した後に採取したもの）を被験抗体試料として、まず免疫原として使用したｓＬＯＸ−１−Ｄに対するアフィニティを調べた。次いで、ｓＬＯＸ−１−Ｄに対してアフィニティが高かった抗血清を被験抗体試料として、ＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１に対するアフィニティを調べた。図２に、1-1群のマウスについて調べた結合阻害曲線を示す。いずれのマウスも免疫原であるｓＬＯＸ−１−Ｄとは５０％阻害濃度は低く（ウェルあたり２〜３ｎｇ）値は近似しているが、ＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１についてはマウスにより差があるが結合阻害を示している。また、ペプチド２をハプテンとするＢＳＡコンジュゲートを免疫したマウスの抗血清では、ペプチド２との反応性は高かったが、ＣＨＯ細胞由来のｓＬＯＸ−１とは結合阻害を示さなかった。このことからペプチド２ハプテンを免疫したマウスについては細胞融合を行わなかった。【０１２０】
（３）細胞融合
上記のようにして  抗血清が、免疫原として使用したｓＬＯＸ−１−ＤおよびＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１のいずれに対してもアフィニティの高かったマウス（Ｎｏ. １１０３、Ｎｏ. ２１０１、Ｎｏ. ４１０３、Ｎｏ.５１０１）から、脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞との細胞融合を行った。ミエローマ細胞としてはＰ３Ｕ１細胞（Ｐ３−Ｘ６３.Ａｇ８.Ｕ１細胞の社内継代系）を選んだ。使用前に、液体窒素中で保管してあるミエローマ細胞を解凍後、ミエローマ継代用培地（ＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳ：ＲＰＭＩ １６４０  ４５０ ｍＬに１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６.８）５ ｍＬ、ＯＰＫ溶液（オキサル酢酸 ７.５ ｍｇ／ｍＬ、 ピルビン酸Ｎａ ７.５ ｍｇ／ｍＬ、 カナマイシン５ｍｇ／ｍＬ）１０ ｍＬ及びＦＢＳ （Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）５０ ｍＬを加えたもの）を用いて７〜１０ 日間継代培養して細胞融合に供した。【０１２１】
細胞融合３日前に追加免疫した当該マウスの脾臓をエーテル麻酔下にて摘出し、ＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳ(ＲＰＭＩ１６４０  ２２５ ｍＬ及び１ｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ (ｐＨ ６.８) ２.５ ｍＬ) で洗浄後、メッシュ上で処理を行って脾臓細胞の浮遊液を調製した。この脾臓細胞約１×１０８ｃｅｌｌとＰ３Ｕ１ミエローマ細胞約２×１０７ｃｅｌｌを混和し、遠沈して上清を除去した後３７℃に保って８００μＬの５０ｇ／ｄＬポリエチレングリコール４０００ （ＰＥＧ４０００）(ガスクロマトグラフ用、メルク) を振り混ぜながら１分間で添加し、さらに１.５分間撹拌した。続いて１ｍＬのＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳを１分間内に攪拌しながら滴下するのを２回繰り返し、更に３０秒間内に１ｍＬのＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳを攪拌しながら滴下するのを２回繰り返した．次いで６ ｍＬのＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳを２分間かけて攪拌しながら追加し、最後に１２ｍＬのＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩを加えた。【０１２２】
ＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳに懸濁している細胞を遠心し、上清を完全に除いた後、ＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０ ３５０ ｍＬ、 ＮＣＴＣ１０９（ＧＩＢＣＯ）５０ ｍＬ、 ＯＰＫ溶液１０ ｍＬ、ＮＥＡＡ（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、 ＧＩＢＣＯ） ５ ｍＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６.８）５ ｍＬ、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）５ ｍＬ、ＦＣＳ１００ ｍＬ及び１０ ｖｏｌ％  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（ロシュアプライドサイエンス）を含む培地）１７０ ｍＬに懸濁させ、培養用９６ウェルマイクロプレート約９枚（８７８ウェル）に分注して(１.１×１０５ｃｅｌｌ／０.１９ ｍＬ／ｗｅｌｌ)、５%炭酸ガス培養器内で３７℃にて培養した。各細胞融合の詳しい条件を表５に示す。【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
ＰＥＧ４０００を用いた細胞融合の結果、融合効率はほぼ１００％でウェルあたり数個
〜１０数個のコロニーが認められた。【０１２５】
（４）ＨＡＴ培地による融合細胞の選別
融合細胞を培養して５日目に、３７℃に加温したＨＡＴ培地０.１ ｍＬを各ウェルに追加した。位相差顕微鏡を用いて、毎日ハイブリドーマの成長を観察しウェル全体の１〜５％にハイブリドーマが増殖したら、各ウェルの培養上清を０.１ ｍＬずつサンプリングした。これを被験抗体試料として、実施例２で説明するＴＲ−ＦＩＡ法を行って、抗体価が高いものの中から、さらにアフィニティ及び細胞増殖の強いものを選んで下記のクローニングに供した。【０１２６】
（５）クローニング（限界希釈法）
クローニングを行なうウェルのハイブリドーマをパスツールピペットではがして、２４穴の培養プレートに移動・拡大した。一部を計数して約５０ｃｅｌｌ／ｍＬ になるようにＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０ ３５０ ｍＬ、 ＮＣＴＣ１０９５０ ｍＬ、 ＯＰＫ溶液１０ ｍＬ、ＮＥＡＡ ５ ｍＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ６.８）５ ｍＬ、 ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン） ５ ｍＬ、ＦＢＳ １００ ｍＬ及び１０ｖｏｌ％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１を含む培地）で倍々希釈した（８段階）。この０.２ ｍＬ（細胞数にして０.１〜１０ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を培養プレートに分注した。３〜６日後に位相差顕微鏡にて観察し、各ウェルの細胞数をチェックした。ハイブリドーマがある程度増殖したら、ウェルあたり約２個以下のものについて培養上清を被験抗体試料として、ＴＲ−ＦＩＡ法を用いてスクリーニングを行い、抗体価・アフィニティ及び増殖性のよいものの中で、単クローンであるウェルを選んだ（一次クローニング）。選んだウェルは速やかに再度クローニング（二次クローニング）を行い、一次クローニングと同様にＴＲ−ＦＩＡ法を用いてスクリーニングをして目的の抗体を選んだ。単クローンになっていないものについては再度クローニング（三次クローニング）を行った。確立したクローンは、継代を繰り返しながら、徐々に大きな培養フラスコへ移し、約５〜１０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度に調製して、セラムチューブに０.５ ｍＬずつ分注（約５本）し、液体窒素中に保管した。このときの培養上清を分取して、抗体価をチェックした。なお、確立したハイブリドーマは凍結後、確認のため再び、培養を行い細胞の増殖性及び抗体価をチェックした。【０１２７】
ｓＬＯＸ−１−Ｄを免疫したマウス（Ｎｏ. １１０３）から得られたハイブリドーマは，細胞融合の１０日目にスクリーニングし、計１１個の陽性ウェル（>１０００００ｃｐｓ）を検出した。その中で増殖の良い５ウェルについて限界希釈法にて一次クローニングを行い、ほぼ単クローンと思われる１０ウェルを得た。さらに、二次クローニングを行い、その１０日目にスクリーニングして、単クローンと思われる３ウェルを得た。これらは、いずれも６Ｂ１１のクローンから得られたものであった。【０１２８】
また、マウス（Ｎｏ. ５１０１）から同様に作製したハイブリドーマでは、計４８個の陽性ウェルが検出された。その中でｓＬＯＸ−１−Ｄに対してアフィニティの強い９ウェルについて一次クローニングを行った。クローニング後の１０日目にスクリーニングし、抗体価及びアフィニティが良好でシングルに近いものを選んで二次クローニングを行った。その結果、計８クローン（１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ｂ８、１Ａ７）が得られた。【０１２９】
さらに、ペプチド１をハプテンとするＢＳＡコンジュゲートを３回免疫した後のＡ／Ｊマウス（Ｎｏ. ２１０１）から得られたハイブリドーマについても２回のクローニングにより、クローン（５Ｃ１１）を確立した。同様にして、マウス（Ｎｏ. ４１０３）から、２回のスクリーニング及びクローニングによりクローン（４Ｄ１）を確立した
以上のクローニング結果を表６に示す。【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
（６）モノクローナル抗体の採取（培養上清及び腹水）
（５）で調製したハイブリドーマのうち、ＬＯＸ−１の細胞外ドメインタンパク（ｓＬＯＸ−１−Ｄ）ならびにＬＯＸ−１の細胞外ドメインのＮ端ペプチドであるペプチド１のＢＳＡコンジュゲートを免疫原として調製した１１種類のハイブリドーマ（１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ｂ８、１Ａ７、６Ｂ１１、５Ｃ１１、４Ｄ１）を大量培養して、無血清培地に置き換えその培養上清を集めることによりモノクローナル抗体を採取した。【０１３２】
また、上記のハイブリドーマのうちＬＯＸ−１の細胞外ドメインタンパク（ｓＬＯＸ−１−Ｄ）を免疫原として調製したハイブリドーマ（１Ｇ２、２Ｇ１１、６Ｂ１１および１Ａ７）ならびにペプチド１をハプテンとして調製したハイブリドーマ（５Ｃ１１、４Ｄ１）を、あらかじめプリスタン１ｍＬで処理したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ及びＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ（ヌードマウス））腹腔に約２〜３×１０６ｃｅｌｌずつ接種した。なお、ハイブリドーマは液体窒素での凍結状態から解凍し、７〜１０日間拡大培養した後にマウスに腹腔内投与した。このマウスを観察し腹部が膨れてきたマウス（投与後８〜１７日）についてエーテル麻酔下にて死亡させた後、腹腔内の腹水を採取した。各ハイブリドーマを接種したマウスから１匹につき１.２〜４.９ｍＬの腹水を取得し、抗体価を測定した（表７）。【０１３３】
【表７】
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【０１３４】
（７）モノクローナル抗体の精製
（６）で調製したハイブリドーマの培養上清及びマウス腹水に含まれるモノクローナル抗体を、プロテインＡアフィニティカラム（アフィゲルプロテインＡＭＡＰＳ−IIキット、バイオラッド）に供して、ＩｇＧに精製した。具体的には、まず、空カラムに約１ｍＬのプロテインＡ固定化ビーズのゲル（懸濁液にして約１.５〜２ｍＬ）を充填し、結合バッファー（キットに添付）１０ｍＬで洗浄してプロテインＡアフィニティカラムを作成した。ハイブリドーマの培養上清またはマウス腹水０.５ｍＬと結合バッファー０.５〜１ｍＬ と混合し、遠心分離して調製した上清を、上記で作成したプロテインＡアフィニティカラムに供して、まず２０ｍＬの結合バッファーを流して保持されないものを洗浄除去し、次に溶出バッファー（キットに添付）３０ｍＬを用いてＩｇＧを脱離・溶出させた。溶出バッファーに代えた後、最初にでてくるタンパクピークをＩｇＧ溶液として採取した。溶出バッファーは酸性（ｐＨ３.０）なので、溶出してきたＩｇＧを１ｍｏｌ／Ｌトリスバッファー（ｐＨ９.０）で直ちに中和した。得られたＩｇＧ溶液はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて透析した後、凍結保管した。この結果、ハイブリドーマの培養上清の一部（３０〜４０ｍＬ）から１００〜７００μｇのＩｇＧが得られた。【０１３５】
得られたモノクローナル抗体（ＩｇＧ）のアイソタイプをＭＡｂ−ＢＡＳＥＤ ＭＯＵＳＥＩｇ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＫＩＴ（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）により決定した。その結果、１１種類（６Ｂ１１、１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ａ７、１Ｂ８、５Ｃ１１、４Ｄ１）のうち９種類がＩｇＧ１で残りがＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂであった（表８）。また、これらのモノクローナル抗体の解離定数（Ｋｄ）の一部を以下に示す（表９）。なお、上述のＫｄの各々の値は、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインの一部（配列番号２）に対するものであるが、ヒト可溶型ＬＯＸ−１（配列番号３及び４）とアミノ酸配列の差異は非常に少ないため、ヒト可溶型ＬＯＸ−１に対するＫｄもほぼ同等と考えられる。【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
【表９】
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【０１３８】
実施例４    モノクローナル抗体の組み合わせ
実施例３で得られた１１種類のモノクローナル抗体（培養上清のＩｇＧ画分）のうち１Ｂ８抗体を除く１０種類を、実施例２（１）で説明する方法に従ってビオチン標識した。これらの１０種のビオチン標識抗体と上記１１種類のモノクローナル抗体とを、実施例２（２）の方法に従って固相化したプレートを用いて２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、１１０通りの抗体の組み合わせについて、ｓＬＯＸ−１−ＤとＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１を標準物質としたときのＥＬＩＳＡ標準曲線を調べた。【０１３９】
ペプチド１（配列番号５で示されるポリペプチドの末端に結合用のシステインを付加したもの）にＢＳＡをコンジュゲートさせたペプチド１−ＢＳＡを免疫原として実施例３に従って調製した抗体（４Ｄ１抗体及び５Ｃ１１抗体）を固相にしたとき、ブランクは高いものの、どのビオチン標識モノクローナル抗体（６Ｂ１１、１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ａ７、１Ｂ８）との組み合わせのＥＬＩＳＡにおいても良好なレスポンスを示した（表１０）。【０１４０】
【表１０】
0005147696.tif 000011
【０１４１】
このことからｓＬＯＸ−１−Ｄを免疫して得られた９種類のモノクローナル抗体（６Ｂ１１、１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ａ７、１Ｂ８）は、ｓＬＯＸ−１Ｎ端ペプチドに対する抗体と同時に結合をしていることを示しｓＬＯＸ−１のＮ端（ネオエピトープ）とは異なる部位を認識していることがわかった。【０１４２】
ｓＬＯＸ−１−Ｄを免疫して得られた抗体同士（６Ｂ１１、１Ｇ２、２Ｅ４、２Ｅ５、２Ｇ１１、３Ｅ１２、７Ｇ１、１Ａ７、１Ｂ８）では、１Ａ７抗体と６Ｂ１１抗体との組み合わせでのみ強いレスポンスを示し、これ以外の抗体はどれも認識部位が近接している可能性が示唆された（表１０）。【０１４３】
なお、上記で得られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、ハイブリドーマ１Ａ７および６Ｂ１１についてはハイブリドーマの表示「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ １Ａ７」及び「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓＬＯＸ−１ ６Ｂ１１」として、２００６年７月２６日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、国際寄託した。各ハイブリドーマの受領番号および受託番号は、下記の通りである：【０１４４】
【表１１】
0005147696.tif 000012
【０１４５】
実施例５  ［化学発光ＥＬＩＳＡ］
（１）モノクローナル抗体の断片化方法
モノクローナル抗体（ＩｇＧ）の０.０２ｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー溶液（ｐＨ４.０）０.２５ｍｌにペプシン（シグマ）希釈液（５０μｇ／ｍＬ）５０μＬを加え攪拌後、３７℃で３時間反応する。反応終了後、ゲルろ過ＨＰＬＣシステム（島津ＬＣ−６Ａ、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、６.８×３００ｍｍ、溶離液：０.２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー、ｐＨ７.０、流速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ）により、保持時間約１８分のＦ(ａｂ’)２画分（分子量約９.２万）を分取した。【０１４６】
分取したＦ(ａｂ')２画分を遠心限外ろ過（ＹＭ−３０、セントリコン）で濃縮後、０.３２ ｍｇをバッファーＡ（５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む０.１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー、ｐＨ６.０）０.２５ｍＬに０.１ｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエチルアミン０.０２５ｍＬを加えて３７℃で９０分間還元した。反応終了後、ゲルろ過ＨＰＬＣシステムにより保持時間約２０分のＦａｂ’の画分（分子量約４.６万）を採取した。分取したＦａｂ’画分は遠心限外ろ過（ＹＭ−３０）で濃縮した。【０１４７】
（２）アルカリホスファターゼによる抗体の標識方法
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、ウシ小腸由来、キッコーマン）１ｍｇを０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー（ｐＨ７.０）０.２ｍＬに溶解し、精製水０.０５ｍＬに溶解したＮ−(８−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｙｌｏｘｙ)ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、 ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ、同仁化学）０.１ｍｇを加えて、室温で２時間反応させる。反応終了後、ＰＤ−１０カラム（溶離液：バッファーＡ）で精製後、その高分子画分を遠心限外ろ過（ＹＭ−１０、セントリコン）で濃縮し、マレイミド化ＡＬＰとした。【０１４８】
（１）で調製したモノクローナル抗体のＦａｂ’を ０.１３ ｍｇ含むバッファーＡ ０.２５ｍＬに、上記マレイミド化ＡＬＰ溶液０.０２６ｍＬ（０.１２８ｍｇ）を加えて攪拌後、室温で１６時間反応させた。反応終了後、反応液０.１５ｍＬをゲルろ過ＨＰＬＣシステム（溶離液：０.２ ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー、ｐＨ７.０）にて分離・精製し（保持時間約１５分）、ＡＬＰ標識抗体（ＡＬＰ標識Ｆａｂ’）とした。【０１４９】
（３）ＡＬＰ標識モノクローナル抗体（１Ｇ２、２Ｇ１１、６Ｂ１１）の至適量の検討
培養上清あるいは腹水から得られた３種類のモノクローナル抗体（１Ｇ２、２Ｇ１１、６Ｂ１１）のＩｇＧ画分（１Ｇ２：２.０ ｍｇ、２Ｇ１１：１.９ ｍｇ及び６Ｂ１１：１.３ ｍｇ）を、上記（１）および（２）の方法に従って、ペプシン処理後還元してＦａｂ’とし、マレイミド化ＡＬＰと反応させて、ゲルろ過ＨＰＬＣにより、３種類のＦａｂ’−ＡＬＰコンジュゲート（酵素標識抗体）を分取した。得られた酵素標識抗体はそれぞれ０.４１ ｍｇ、０.４２ ｍｇ及び０.２９ ｍｇであった。【０１５０】
得られた３種類の酵素標識抗体（１Ｇ２、２Ｇ１１及び６Ｂ１１）の評価を、３種類の固相抗体（５Ｃ１１、４Ｄ１、１Ａ７）を用いて調べた。その結果、どの酵素標識抗体（１Ｇ２、２Ｇ１１及び６Ｂ１１）も３種類の固相抗体（５Ｃ１１、４Ｄ１、１Ａ７）に対して良好なレスポンスを示し、作製した酵素標識抗体がいずれもＥＬＩＳＡに使用できることがわかった。なお、酵素標識抗体のウェルあたりの使用量は１Ｇ２では１７０ｎｇ／ｍＬ、２Ｇ１１では１５０ｎｇ／ｍＬ及び６Ｂ１１では１９０ｎｇ／ｍＬのものを１００μＬ使用することとした。【０１５１】
（４）化学発光ＥＬＩＳＡによるヒト血清試料の測定方法
モノクローナル抗体ＩｇＧ（１Ａ７のＩｇＧ）の固相化バッファー希釈液１００μＬ（１μｇ／１００μＬ）を用いて、実施例２（２）項に述べた第二抗体固相化プレート作製方法に準じて操作して、抗体固相化ドライプレートを作製した。【０１５２】
この抗体固相化プレートを洗浄液（０.０１ｇ／ｄＬ Ｔｗｅｅｎ２０及び０.０５ｇ／ｄＬ窒化ナトリウムを含む生理食塩液）で２回洗浄した後、各ウェルにｓＬＯＸ−１−Ｄ標準溶液あるいはＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１精製液１００μＬ（ヒト血清試料測定のときはアッセイバッファー１００μＬに試料１０μＬ）を加えて、５時間静置した。３回洗浄後、ＡＬＰ標識抗体溶液（６Ｂ１１のＦａｂ’−ＡＬＰコンジュゲート）１００μＬを加えた。室温で一晩インキュベーションし、４回洗浄後、固相に化学発光基質溶液（１００μＬ）を加え、直ちに各ウェルの発光強度をマルチラベルカウンタ−により測定した。発光基質にはＬｕｍｉｇｅｎＡＰＳ−５（オリエンタル酵母）を用いた。なお、固相化抗体とＡＬＰ標識抗体の組み合わせとして、１Ａ７−６Ｂ１１（固相化抗体−ＡＬＰ標識抗体）を用いた。【０１５３】
なお、試薬の調製等に用いるアッセイバッファーには、０.５ｇ／ｄＬ ＢＳＡ、０.０５ ｇ／ｄＬ窒化ナトリウム、 ０.０１ｇ／ｄＬ Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０.１ ｍｍｏｌ／Ｌ塩化亜鉛及び０.９ｇ／ｄＬ塩化ナトリウムを含む０.０５ ｍｏｌ／Ｌトリスバッファー（ｐＨ ７.４）を用いた。【０１５４】
（５）ＥＬＩＳＡ系の選択
実施例５（４）項に従って、３種類の酵素標識抗体（１Ｇ２、２Ｇ１１及び６Ｂ１１）と、モノクローナル抗体１Ａ７、５Ｃ１１及び４Ｄ１のＩｇＧを固相化（１μｇ／０.１ ｍＬ）したプレートを用いて、ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパクを標準物質とした化学発光２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線（０.２４−２５０ ｐｇ／ｗｅｌｌ）を作成した。いずれの組み合わせも高いレスポンスを示し、特に固相化抗体と標識抗体（Ｆａｂ’−ＡＬＰコンジュゲート）の組み合わせがそれぞれ１Ａ７−６Ｂ１１、５Ｃ１１−１Ｇ２、４Ｄ１−２Ｇ１１のとき高感度な標準曲線が得られた。その中でもややブランクは高いが最もレスポンスの高いものは１Ａ７−６Ｂ１１の組み合わせであった（推定検出限界０.２４ｐｇ／ｗｅｌｌ（約６ａｍｏｌ／ｗｅｌｌ））。【０１５５】
ＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１を標準物質とした化学発光２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線でも、１Ａ７−６Ｂ１１の組み合わせはペプチド１に対する抗体を固相に使用した５Ｃ１１−１Ｇ２、４Ｄ１−２Ｇ１１と比べて１００倍程度感度が良いことがわかった（図３）。【０１５６】
（６）血清成分のＥＬＩＳＡに及ぼす影響
ヒト血清（ボランティア５人分の血清をプールしたもの）、ウサギ血漿及び牛胎児血清を１／１〜１／６４まで希釈し、その５０μＬ（血清量として０.７８〜５０μＬ／ｗｅｌｌ）を上記の３種類のアッセイ系を用いて測定した。１Ａ７−６Ｂ１１（固相化抗体−ＡＬＰ標識抗体）のＥＬＩＳＡ系において、動物血清ではほとんどレスポンスはなかったが、ヒト血清では血清量に応じてレスポンスを示し、０.７８〜１２.５μＬの範囲で希釈直線性が見られた。これらの結果は、この測定系が、ヒト血清中のヒトｓＬＯＸ−１を特異的に測定することができることを示している（図４）。【０１５７】
また、ヒト血清のサンプリング量が１０μＬ以下では血清成分の影響はきわめて小さいと推定されたことから、血清のサンプリング量は１０μＬとし、標準溶液はヒト血清を含まないアッセイバッファーで調製することとした。【０１５８】
（７）マウスγグロブリンのＥＬＩＳＡに及ぼす影響
血中に抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＡＭＡ）を持つヒトが無視できない割合で存在することが知られており、マウス抗体を使用するＥＬＩＳＡにおいてこれらのヒトの血液試料は異常高値を示す。この妨害はアッセイバッファーにあらかじめマウスγグロブリン（ＩｇＧ）を添加することにより抑えることができ、本ＥＬＩＳＡにおいてもマウスγグロブリンをアッセイバッファーに添加してその影響を除くこととした。ＥＬＩＳＡ標準曲線に及ぼすマウスγグロブリン濃度の影響を調べたところ、２０μｇ／ｍＬまでならほとんど影響せず、アッセイバッファーには１０μｇ／ｍＬのマウスγグロブリンを添加することとした。なお、ここで使用したボランティア５人の血清中にＨＡＭＡは存在しなかった。図５にマウスγグロブリンを含むアッセイバッファーで作成したＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。【０１５９】
（８）プレバリデーションと定量限界の推定
ｓＬＯＸ−１濃度の低いボランティア血清（Ｎｏ. ３）にｓＬＯＸ−１−Ｄを０.１００〜１２.８ ｎｇ／ｍＬ（１〜１２８ｐｇ／ｗｅｌｌ）の濃度に添加した試料を用いてプレバリデーションを行った。表１２に示すように、０.１００〜６.４０ ｎｇ／ｍＬの範囲における実験内の精度・真度は良好であった（１.７〜１５.７%及び−１０.５〜＋１４.４%）。同濃度範囲における実験間の精度・真度も良好であった（５.３〜１２.３%及び−８.３〜+７.５%）。一方、高濃度（１２.８ｎｇ／ｍＬ）ではやや真度が悪いが、標準曲線のポイントと回帰計算方法を見直すことで改善できると思われた。これらの結果から、定量限界は約０.１ｎｇ／ｍＬと推定された。ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ（定量限界：１ｎｇ／ｍＬ）よりも１０倍の感度向上を達成できた。【０１６０】
本ＥＬＩＳＡの第一及び第二反応の時間（それぞれ５時間及び一晩）はポリクローナル抗体仕様のものに合わせたが、モノクローナル抗体を用いていることから反応時間を短縮できる可能性があり、第一反応を４時間、第二反応を１時間としたときの実験内の精度・真度を調べたところ、表１３に示すように問題のない結果が得られた（それぞれ２.３〜１４.７%及び−１４.１〜１６.０%）。【０１６１】
【表１２】
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【０１６２】
【表１３】
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【０１６３】
（９）血清中ｓＬＯＸ−１の測定
本アッセイ系を用いて健常ボランティア５人から得た血清中のｓＬＯＸ−１濃度（ｓＬＯＸ−１−Ｄを標準物質としたときのイムノリアクティビティ）を測定した。表１４に示すように健常ヒト血清のｓＬＯＸ−１の値は０.１５〜０.５７ｎｇ／ｍＬで、本ＥＬＩＳＡにより従来の方法（ポリクローナル抗体仕様のＥＬＩＳＡ）では測定できなかった健常ヒト血清中のｓＬＯＸ−１の測定が可能であった。なお、この測定結果からは性別あるいは年齢との関連は認められなかった。【０１６４】
【表１４】
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【０１６５】
健常人のｓLOX-1の血中平均濃度は0.35 ng/mLであることからその分子量を考慮すると、血清中のモル濃度は2×10−11 M程度となり、これを10倍に希釈して測定に供することから測定時のモル濃度は2×10−12 M程度と計算される。一方，本発明のモノクローナル抗体のような高親和性（Kd＝1×10−10 M以下）抗体の0.1％がｓLOX-1と結合しているときのs LOX-1の総濃度は2×10−12 M程度と見積もられる。このように高親和性モノクローナル抗体を用いることにより健常人の血清中のsLOX-1の濃度を測定でき、正確な診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングに用いた２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの概略図を示す。
【図２】ｓＬＯＸ−１−Ｄを免疫して作成したＡ／Ｊマウス〔Ｎｏ.１１０１（丸マーク）、Ｎｏ.１１０２（三角マーク）、Ｎｏ.１１０３（四角マーク）、Ｎｏ.１１０４（菱形マーク）〕の抗血清を用いて、標準物質ｓＬＯＸ−１−Ｄ（黒マーク）およびＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１（白抜きマーク）を阻害物質としてＴＲ−ＦＩＡ法を行った結果を阻害曲線として描いたグラフである（実施例３）。縦軸は各濃度（Ｂ）の蛍光強度のゼロの濃度（Ｂ０）の蛍光強度に対するパーセントを、横軸はＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質（ＳＬＯＸ−１−Ｄ）濃度あるいはＬＯＸ−１発現ＣＨＯ細胞からの可溶型ＬＯＸ−１（ｓＬＯＸ−１）の推定濃度（ｎｇ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図３】固相化抗体−標識抗体として、１Ａ７−６Ｂ１１（●）、５Ｃ１１−１Ｇ２（▲）、４Ｄ１−２Ｇ１１（■）を用いた２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。図Ａは、標準物質としてｓＬＯＸ−１−Ｄを用いて行ったＥＬＩＳＡの標準曲線、図Ｂは、標準物質としてＣＨＯ細胞由来ｓＬＯＸ−１を用いて行ったＥＬＩＳＡの標準曲線を示す（実施例５（４））。縦軸は蛍光強度（ｃｐｓ）を、横軸は各標準物質の添加濃度（ｐｇ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図４】固相化抗体−標識抗体として、１Ａ７−６Ｂ１１を用いた２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの各血清（ヒト血清◆、正常家兎血清▲）に対するレスポンスを示す（実施例５（６））。縦軸は蛍光強度（ｃｐｓ）を、横軸は血清の添加量（μｌ）を示す。
【図５】固相化１Ａ７抗体−標識６Ｂ１１抗体を用いた２サイトサンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。図Ａはｌｏｇ−ｌｏｇプロット、図Ｂはｓｅｍｉ−ｌｏｇプロットを示す。縦軸は蛍光強度（ｃｐｓ）を、横軸は標準物質（ｓＬＯＸ−１−Ｄ）の添加濃度（ｐｇ／ｗｅｌｌ）を示す。添加したγグロブリンの濃度は０μｇ／ｍＬ（○）、５μｇ／ｍＬ (●）、１０μｇ／ｍＬ (◆）、２０μｇ／ｍＬ (■）である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号５は、可溶型分子（配列番号３）のアミノ酸配列の１−１０の領域に相当するペプチドのアミノ酸配列を示す。ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）のアミノ酸配列の８８−９７領域に相当する。
配列番号６は、可溶型分子（配列番号４）のアミノ酸配列の１−１０の領域に相当するペプチドのアミノ酸配列を示す。ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）のアミノ酸配列の９２−１０１の領域に相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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