(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性関節リウマチの疾患遺伝子の検出方法であって、被験者から単離した生体試料から、配列番号１の第19番目塩基から第274番目塩基までの領域が配列番号２の塩基配列に置換しているcDNAを検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、ヒトＸ染色体に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子と、この疾患遺伝子またはその発現産物の存在を検出することを特徴とする慢性関節リウマチの診断方法に関するものである。
背景技術
慢性関節リウマチの原因である関節炎と関節破壊の様相特にそれらの病理過程は種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、この慢性関節リウマチの属する自己免疫疾患の多くは多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・増悪するため、疾患の正しい解明と適切な治療を行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。
慢性関節リウマチは、世界的には罹患率１％以下の疾患であるが（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１２７７−１２８９，１９９０）、患者の同胞では約８％以上が発症する（Ｃｅｌｌ，８５：３１１−３１８，１９９６）ことから、その原因因子として何らかの遺伝的要因が想定されている。しかしながら、疾患の遺伝的因子を特定するため通常用いられている分子遺伝学的手法や遺伝子工学的手法は、自己免疫疾患に対しては有効に機能していない。何故ならば、自己免疫疾患は、癌のように突然変異を生じた１個の遺伝子の異常増殖という生物学的に単純な機構によって発症するものではないからである。また、疾患の遺伝的基盤を求める従来の古典的遺伝学の手法は、自己免疫疾患が多因子遺伝によることを明確にしたものの、その内部あるいは本体に立ち入ることはできなかった。このように、慢性関節リウマチに関連する遺伝子については、その実体はもとより、染色体上の遺伝子座位すら全く捉えられていないのが実状であった。
これに対して、この出願の発明者等は、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析を慢性リウマチ患者およびその血縁者に対して実施することにより、慢性関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０（１２）：１８９１−１８９５，１９９８；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４（３）：１５６−１５８，１９９８）、以下の疾患遺伝子を既に特許出願している（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０１６６５号）。
（１）    ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤ１Ｓ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）    ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）    ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳ１００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
この出願の発明者等は、前記先願発明の各疾患遺伝子についてさらに研究を続けた結果、前記（３）の疾患遺伝子についてその具体的遺伝子を特定し、その分子構造を決定した。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決する発明として、配列番号１にその第２６７９番目塩基から第２９５２番目塩基までの配列を示したｃＤＮＡをコードしているｍＲＮＡを転写するプロトオンコジーンＤｂｌ遺伝子の変異配列であって、配列番号１の第２０番目塩基から第２７４番目塩基までの領域が配列番号２の配列に置換されているｃＤＮＡをコードしているｍＲＮＡを転写することを特徴とする慢性関節リウマチの疾患遺伝子を提供する。
またこの出願は、前記疾患遺伝子のｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの一部配列からなるＤＮＡ断片、前記疾患遺伝子が発現するタンパク質、このタンパク質の一部からなるペプチド、および前記タンパク質に対する抗体を提供する。
さらにこの出願は、生体試料中における前記疾患遺伝子のｍＲＮＡまたは前記タンパク質の存在を検出することを特徴とする慢性関節リウマチの診断方法を提供する。
この出願は、またさらに、Ｄｂｌ欠損を機能的に補完する方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
上記のとおりの特徴を有するこの出願の発明について、以下にその実施の形態を説明する。
この発明の慢性関節リウマチ疾患遺伝子（以下「ＲＡ疾患遺伝子」と記載する）は、後記する実施例の方法によりヒトＸ染色体から単離された遺伝子であり、公知のプロトオンコジーンＤｂｌ遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．７（８）：２４６５−２４７３，１９８８；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１２５５６）の変異配列である。すなわち、このＤｂｌ遺伝子は、配列番号１に第２６７９番目塩基から第２９５２番目塩基までの配列を示したｃＤＮＡをコードしているｍＲＮＡを転写するが、この変異遺伝子のｃＤＮＡにおいては、配列番号１の第２４１番目塩基から３’側の配列が第１８番目塩基下流に結合してアミノ酸翻訳のフレームシフトを誘起した結果、配列番号１の第１９番目塩基から第２７４番目塩基までの領域が配列番号２の配列に置換されている。図１は、健常者（Ｎｏｒｍａｌ）におけるＤｂｌ遺伝子ｃＤＮＡの第２６７９番目塩基から第２９５２番目塩基までの塩基配列（配列番号１と同一）と、これに対応するＲＡ疾患遺伝子の塩基配列、並びにこれらの塩基配列がそれぞれコードするアミノ酸残基（１文字表記）の配列である。
なお、一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡをコードする遺伝子もこの発明のＲＡ疾患遺伝子に含まれる。同様に、これらの塩基の変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質もこの発明に含まれる。
この発明のｃＤＮＡは、例えば、後記する実施例の方法に従って単離することができる。また、この発明のｃＤＮＡは、例えば慢性関節リウマチ患者の細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２；  Ｊ，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９，１９８３；  Ｇｅｎｅ  １５０：２４３−２５０，１９９４）により作成したｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。クローン化の方法としては、例えば、この発明によって提供される配列情報に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、慢性リウマチ患者の細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡを調製することもできる。
この発明のＤＮＡ断片は、前記ｃＤＮＡの一部配列であって、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ断片である。すなわち、この配列番号３は図１に下線を付した配列であり、健常者Ｄｂｌ遺伝子やそのｃＤＮＡには存在しない特徴的な領域である。なお、このＤＮＡ断片にはセンス鎖およびアンチセンス鎖が含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブ等として用いることができる。
この発明のタンパク質は、この発明のＲＡ疾患遺伝子の発現産物であって、そのＣ末端アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列であるタンパク質である。このタンパク質は、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供されるｃＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことにより、タンパク質を得ることができる。またｃＤＮＡの翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体でタンパク質を大量に発現させることができる。
この発明のタンパク質をインビトロ翻訳で生産させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
また、この発明のタンパク質を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すればよい。その際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的とするタンパク質のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
この発明のタンパク質を真核細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
上記の方法により原核細胞や真核細胞でタンパク質を発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
なお、この発明のタンパク質には、他の任意のタンパク質との融合蛋白質も含まれる。
この発明のペプチドは、少なくとも配列番号２のアミノ酸配列における一部配列（５アミノ酸残基以上）を含むペプチド断片である。このペプチドは抗体を作製するための抗原等として用いることができる。
この発明の抗体は、前記タンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
この発明の慢性関節リウマチ診断方法は、例えば、被験者の生体試料（体液、細胞等）におけるＲＡ疾患遺伝子から転写される特徴的なｍＲＮＡの存在を検出することによって行うことができる。そのようなｍＲＮＡの検出は、例えば、その特徴的配列部分（例えば、図１の下線配列）を含むｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅する方法、ＲＡ疾患遺伝子ｍＲＮＡの特徴的配列部分をプローブとしたｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーション分析やｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション分析等により行うことができる。
さらにこの発明の慢性関節リウマチ診断方法は、被験者の生体試料におけるＲＡ疾患遺伝子から発現されるタンパク質の存在を検出することによって行うことができる。このような検出は、例えば、この発明の抗体を用いた酵素免疫アッセイや放射免疫アッセイ等により行うことができる。また、このような遺伝子発現またはタンパク質の検出は、診断キット（例えば、ＤＮＡチップ等のハイブリダイゼーション分析キットあるいはＥＬＩＳＡキット等の免疫アッセイキット）により行うこともできる。
この発明のＤｂｌ欠損を補完的する方法としては、タンパク質や低分子化合物を使用する等の方法が挙げられる。
実施例
以下、実施例を示してこの発明のＲＡ疾患遺伝子についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞ＲＡ疾患遺伝子の同定
遺伝解析をマイクロサテライトマーカーを用いた罹患同胞対検索法によって行うためにリウマチ患者家系ＤＮＡを患者２、健常者１を１家系としてグアニジンチオシアネート法（日本輸血学会雑誌４０（２）、４１３）により末梢血から調製した。さらに多型性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が約０．７を越えるマイクロサテライトマーカーを、発明者等が既に明らかにした候補遺伝子座（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０（１２）：１８９１−１８９５；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４（３）：１５６−１５８，１９９８）の範囲内について１１マーカー（ＤＸＳ１０４７，ＤＸＳ８０７２，ＤＸＳ８０４１，ＤＸＳ８０９４，ＤＸＳ１１９２，ＤＸＳ１２０５，ＤＸＳ１２２７，ＤＸＳ８１０６，ＤＸＳ８０４３，ＤＸＳ８０２８，ＤＸＳ１２００）を選択（Ｎａｔｕｒｅ  ３６０，１９９６）し、それぞれの部位を増幅できる蛍光標識プライマーをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社にて合成した。プライマー配列は前記文献に記載されており公知である。各マーカー領域の単離は下記の条件のＰＣＲ反応により行った。反応液組成はプライマー５ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ約０．５μｇ、ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）１．５μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を１．０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ酵素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）０．１２μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を０．９μｌ混合し、滅菌水で全量を１５μｌに調整した。反応はＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製サーマルサイクラー（ＰＴＣ２００型）を用い、まず酵素活性化行程として９５℃１２分１サイクル、熱変性９４℃１分、プライマーアニーリング４７℃１分、伸長反応７２℃２分の行程を１０サイクル繰り返した後、熱変性８９℃１分、プライマーアニーリング４７℃１分、伸長反応７２℃２分の行程を２０サイクル繰り返した。得られた各ＤＮＡ断片はそれぞれ試薬添付書に従ってＧｅｎｅｓｃａｎ用サイズマーカー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）と同時に泳動することでＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＡＢＩ３７７型）にて分析を行い、付属ソフトウェアＧｅｎｅｓｃａｎおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒを用いて鎖長解析を行った。得られたデータは一般公開されているＭａｐｍａｋｅｒ  Ｓｉｂｓソフトウェア（Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，５７，４３９−４５４，１９９５）を用いてＵｎｉｘシステム上で遺伝連鎖解析を行い、最大Ｌｏｄ値を単点解析法によって計算した。
その結果、発明者等が既に明らかにした候補遺伝子座（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０（１２）：１８９１−１８９５；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４（３）：１５６−１５８，１９９８）の一つであるＤＸＳ１２３２の０．１ｃＭ近傍に位置するＤＸＳ９８４において最大Ｌｏｄ値は２．０３を示し、有意な相関が得られた。これをインターネット上国際データベース（Ｇｅｎｅｍａｐ９８，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．  ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ９８／）で検索したところＧ３  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍａｐ上でＤＸＳ９８４の物理的位置が４２５９  ｃＲ１００００（Ｆ）であることが判明し、最も近傍にプロトオンコジーンＤｂｌ遺伝子が位置していることが明らかとなった。
＜実施例２＞Ｄｂｌ遺伝子異常の解析
Ｄｂｌ遺伝子のｃＤＮＡを比較するために、ＲＡ患者末梢血からＩｓｏｇｅｎ試薬（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて調製したトータルＲＮＡからＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成して２０μｌの滅菌水に溶解した。さらにＤｂｌｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１２５５６）を元にプライマー（配列番号４、５）を合成し（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ＰＣＲ法によってＤｂｌｃＤＮＡ配列の一部を単離した。ＰＣＲの反応液組成はフォワードプライマー（配列番号４）およびリバースプライマー（配列番号５）各１０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ約０．１μｇ、ＬＡ−ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（宝酒造社）２．５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘを４．０μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ酵素（宝酒造社）０．２５μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２を２．５μｌ混合し、滅菌水で全量を２５μｌに調整した。反応はＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製サーマルサイクラー（ＰＴＣ２００型）を用い、熱変性９４℃３０秒、プライマーアニーリング５２℃３０秒、伸長反応７２℃２分の行程を３５サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物は１％Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）ゲルとＰｒｏｍｅｇａ社製ＤＮＡ分子量マーカー（２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を用いてＴＡＥ緩衝液中で常法によって電気泳動し、増幅バンドを確認した。その結果、正常鎖長のＤＮＡが６６０−ｂｐであるのに対し、一部患者由来のＤＮＡは異常短鎖長（約４４０ｂｐ）であることを見出した。
次いで、それぞれの得られたバンドを切り出した後６５℃１０分の行程でゲルを融解し、常法のフェノール抽出法およびエタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡは１００ｎｇを鋳型としてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｒサイクルシークエンスキットを用いて添付書に従ってサイクルシークエンス反応および精製を行い、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＡＢＩ３７７型ＤＮＡシークエンサーによって配列解析を行った。その結果、前記の異常短鎖長ＤＮＡにおいては、図１に示したように、塩基番号２６９７番目から２９１９番目までの２２３−ｂｐが欠損しているために４３７−ｂｐとなっていることが明らかとなった。これは塩基番号２６９８番目以降の遺伝情報でコードされているアミノ酸欠損を伴い、併せてフレームシフトを誘起することによって通常よりも６５アミノ酸短い異常ポリペプチド鎖が生じていることを意味する。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、ヒトＸ染色体に存在する慢性関節リウマチの疾患遺伝子が提供される。これによって、慢性関節リウマチの診断を簡便かつ確実に行うことが可能となる。また、慢性関節リウマチの新たたな治療法および治療薬剤の開発にも有用である。
【配列表】
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【図１】
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