(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍マーカーであって、
抗ヒト由来Sideroflexin抗体を含む腫瘍マーカー。
【請求項２】
前記抗体が血清中の自己抗体である、請求項１記載の腫瘍マーカー。
【請求項３】
前記抗ヒト由来Sideroflexin抗体が、抗ヒト由来Sideroflexin−１抗体、抗ヒト由来Sideroflexin−２抗体および抗ヒト由来Sideroflexin−３抗体の少なくとも一つである、請求項１または２記載の腫瘍マーカー。
【請求項４】
前記抗ヒト由来Sideroflexin抗体が、抗ヒト由来Sideroflexin−３抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の腫瘍マーカー。
【請求項５】
前記腫瘍マーカーが、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のためのマーカーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の腫瘍マーカー。
【請求項６】
血清免疫測定法を用いた腫瘍診断キットであって、
腫瘍特異的抗原と標識化二次抗体とを含み、
前記腫瘍特異的抗原が、ヒト由来Sideroflexinであり、前記標識化二次抗体が、前記ヒト由来Sideroflexinに対する自己抗体を認識する標識化抗体である、腫瘍診断キット。
【請求項７】
前記ヒト由来Sideroflexinが、ヒト由来Sideroflexin−１、ヒト由来Sideroflexin−２およびヒト由来Sideroflexin−３の少なくとも一つである、請求項６記載の腫瘍診断キット。
【請求項８】
前記ヒト由来Sideroflexinが、ヒト由来Sideroflexin−３である、請求項６または７記載の腫瘍診断キット。
【請求項９】
前記ヒト由来Sideroflexinが、組換タンパク質である、請求項６から８のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
【請求項１０】
前記腫瘍診断キットが、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のためのキットである、請求項６から９のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
【請求項１１】
血清免疫測定法が、血清ＥＬＩＳＡ法であり、前記標識化二次抗体が、酵素で標識された二次抗体である、請求項６から１０のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
【請求項１２】
前記標識化二次抗体が、標識された抗ヒト由来ＩｇＧ抗体である、請求項６から１１のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
【請求項１３】
腫瘍マーカーの測定方法であって、
前記腫瘍マーカーが、ヒト由来Sideroflexinに対する血清中の自己抗体を含むマーカーであり、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、腫瘍マーカーの測定方法。
（ａ）  血清試料にヒト由来Sideroflexinを添加し、前記ヒト由来Siderflexinに前記血清試料中の前記自己抗体を結合させて複合体を形成させる工程
（ｂ）  前記複合体を測定する工程
【請求項１４】
前記（ｂ）工程において、前記複合体の測定方法が、前記複合体の前記自己抗体に二次抗体を結合させ、前記二次抗体を測定する方法である、請求項１３記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）工程において、前記二次抗体が標識化二次抗体であり、前記標識を測定することにより前記複合体を測定する、請求項１４記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項１６】
前記標識化二次抗体が、酵素で標識された抗ヒト由来ＩｇＧ抗体である、請求項１５記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項１７】
前記ヒト由来Sideroflexinが、ヒト由来Sideroflexin−１、ヒト由来Sideroflexin−２およびヒト由来Sideroflexin−３の少なくとも一つである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項１８】
前記ヒト由来Sideroflexinが、ヒト由来Sideroflexin−３である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項１９】
前記ヒト由来Sideroflexinが、組換えタンパク質である、請求項１３から１８のいずか一項に記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【請求項２０】
前記腫瘍マーカーが、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のための腫瘍マーカーである、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の腫瘍マーカーの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍マーカー、腫瘍診断キット、腫瘍マーカーの測定方法および腫瘍判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断においては、従来、Ｘ線による画像診断が実施されてきたが、最近では、血清中の腫瘍マーカーを利用した診断が多用されている。前記腫瘍マーカーとは、一般的に、癌細胞が産生する物質または癌細胞との反応により体内の正常細胞が産生する物質であって、その中でも、それらを、血液、組織、排泄物等の生体試料中から検出することが、癌の診断または治療の目印として役立つものをいう。これまでに、種々の生体物質が腫瘍マーカーとして有効であることが報告されている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。例えば、肝臓癌の腫瘍マーカーとして、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡＩＩ等、膵癌の腫瘍マーカーとして、ＣＡ１９−９等、前立腺癌の腫瘍マーカーとして、ＰＳＡ等、扁平上皮癌の腫瘍マーカーとして、ＳＣＣおよびＣＹＦＲＡ等が使用されている。これらの腫瘍マーカーの測定は、診断対象患者から血清を採取し、前記血清中の前記腫瘍マーカーに対する自己抗体のタンパク質量もしくは単位濃度を測定することにより、間接的に実施される。この測定結果から、腫瘍マーカーについて、陽性および陰性が判断される。【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２４０７７４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２２（９）：２１８２〜２１９０，Ｏｃｔ．，１９８７
【非特許文献２】ＣＡＮＣＥＲ  Ｍａｒｃｈ  １，１９９９／Ｖｏｌ．８５／Ｎｏ．５／１０１８−１０２５
【非特許文献３】臨床病理  ５３：５・２００５，４３７−４４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の腫瘍マーカーは、感度の点で問題があり、良性疾患等で偽陽性を示すことも少なくない。また、従来の腫瘍マーカーは、早期癌を検出することが困難なもの、すなわち、陰性を示すものもあった。このため、感度および特異性の高い腫瘍マーカーの開発が望まれている。【０００５】
そこで、本発明は、感度および特異性の高い新規な腫瘍マーカー、前記腫瘍マーカーを利用した腫瘍診断キット、前記腫瘍マーカーの測定方法および腫瘍判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の腫瘍マーカーは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子のｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む。【０００７】
本発明の腫瘍診断キットは、血清免疫測定法を用いた腫瘍診断キットであって、腫瘍特異的抗原と標識化二次抗体とを含み、前記腫瘍特異的抗原が、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎであり、前記標識化二次抗体が、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する自己抗体を認識する抗体である。【０００８】
本発明の腫瘍マーカーの測定方法は、前記腫瘍マーカーが、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する血清中の自己抗体を含むマーカーであり、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）  血清試料にヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを添加し、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｆｌｅｘｉｎに前記血清試料中の前記自己抗体を結合させて複合体を形成させる工程
（ｂ）  前記複合体を測定する工程【０００９】
本発明の判定方法は、患者の腫瘍を判定する方法であって、下記工程（ｃ）および（ｄ）を含む。
（ｃ）患者から採取した生体試料における本発明の腫瘍マーカーを測定する工程
（ｄ）前記測定した腫瘍マーカーの有無または量によって、癌（悪性腫瘍）の有無または癌の進行度を判定する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明者等は、感度および特異性の高い新規な腫瘍マーカーを得るために、一連の研究を重ねた。その結果、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一つが、感度および特異性の高い腫瘍マーカーとなり得ることを見出し、本発明に到達した。本発明の腫瘍マーカーは、例えば、感度が高く、また、特異性が高い。このため、本発明の腫瘍マーカーによれば、例えば、偽陽性率が低く、また、早期癌について高精度で検出することも可能である。また、本発明の腫瘍診断キット、腫瘍マーカーの測定方法および腫瘍判定方法によれば、癌を高感度で特異的に測定できるため、高精度な診断、また、早期診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一実施例における口腔扁平上皮癌の一結果を示すグラフである。
【図２】図２は、前記一実施例における口腔扁平上皮癌のその他の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、前記一実施例における口腔扁平上皮癌のさらにその他の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のその他の実施例における各種癌の一結果を示すグラフである。
【図５】図５は、前記一結果において、各種癌をまとめて示す別のグラフである。
【図６】図６は、前記その他の実施例における各種癌のその他の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、前記その他の結果において、各種癌をまとめ示す別のグラフである。
【図８】図８は、前記その他の実施例における各種癌のさらにその他の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、前記さらにその他の結果において、各種癌をまとめて示す別のグラフである。
【図１０】図１０は、前記一実施例における質量分析の一結果を示す表である。
【図１１】図１１は、本発明のさらにその他の実施例における癌と腫瘍マーカーとの関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜腫瘍マーカー＞
Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、一般に、ミトコンドリアの鉄輸送に関わるタンパク質といわれている。マウスもＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを持つが、鉄欠乏性貧血のマウスにおいては、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの変異が確認されている。また、ヒトのＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、膵β細胞の分化に重要な役割を果たすとの報告もある（Ｙｏｓｈｉｋｕｍｉ  Ｙ，Ｍａｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｕｅｄａ  Ｎ，Ｏｈｎｏ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｊ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｓｅｋｉｎｅ  Ｎ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｄａ  Ｈ，Ｉｉｒｉ  Ｔ，Ｏｍａｔａ  Ｍ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｔ，Ｋｏｊｉｍａ  Ｉ．“Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＣＴＰＬ／Ｓｆｘｎ３  ａｎｄ  Ｓｆｘｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ．”２００５，９５，１１５７−１１６８）（Ｙｏｓｈｉｋｕｍｉ  Ｙ，Ｍａｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｕｅｄａ  Ｎ，Ｏｈｎｏ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｊ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｓｅｋｉｎｅ  Ｎ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｄａ  Ｈ，Ｉｉｒｉ  Ｔ，Ｏｍａｔａ  Ｍ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｔ，Ｋｏｊｉｍａ  Ｉ．“Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＣＴＰＬ／Ｓｆｘｎ３  ａｎｄ  Ｓｆｘｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ．”２００５，９５，１１５７−１１６８）。【００１３】
本発明の腫瘍マーカーは、前述のように、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子のｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む。特に好ましい腫瘍マーカーは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎおよび抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体である。【００１４】
本発明の腫瘍マーカーにおいて、その対象となる腫瘍は、特に制限されないが、例えば、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌等があげられる。前記口腔癌は、口腔扁平上皮癌であることが好ましい。なお、これらの癌以外についても、本発明における対象となる。本発明の腫瘍マーカーによれば、後述するように、例えば、列挙した癌やそれ以外の様々な癌を診断することができる。【００１５】
（１）ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ
ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、１から５の五つのファミリーがある。これらの中でも、本発明の腫瘍マーカーとして好ましいのは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２およびヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３であり、特に好ましいのは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３である。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上をマーカーとして検出してもよい。ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを本発明の腫瘍マーカーとする場合、例えば、後述するように、採取した生体試料中におけるその有無や量を測定することによって、癌の診断を行うことができる。また、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、天然から分離したヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎおよび遺伝子工学により作製された組換えタンパク質のヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎのいずれでもよい。前記生体試料としては、例えば、前述のような診断対象の癌の種類に応じて決定できる。すなわち、診断対象となる組織細胞を生体試料とすることができ、一例として、膵臓細胞、肝臓細胞、胆管細胞、結腸細胞、直腸細胞、胃細胞、乳腺細胞、口腔細胞等があげられる。【００１６】
ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１としては、例えば、下記（Ａ）若しくは（Ｂ）のタンパク質があげられる。下記（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列は、下記（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。また、下記（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１６１残基、好ましくは、１〜６４残基、より好ましくは、１〜３２残基である。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１としての機能を有するタンパク質【００１７】
ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２としては、例えば、下記（Ｃ）若しくは（Ｄ）のタンパク質があげられる。下記（Ｄ）のタンパク質のアミノ酸配列は、下記（Ｃ）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。また、下記（Ｄ）のタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１６１残基、好ましくは、１〜６４残基、より好ましくは、１〜３２残基である。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２としての機能を有するタンパク質【００１８】
ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３としては、例えば、下記（Ｅ）若しくは（Ｆ）のタンパク質があげられる。下記（Ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列は、下記（Ｅ）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。また、下記（Ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１６１残基、好ましくは、１〜６４残基、より好ましくは、１〜３２残基である。
（Ｅ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３としての機能を有するタンパク質【００１９】
（２）抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体
前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体は、前述のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する抗体である。本発明において、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体は、例えば、被検体（患者）から採取した生体試料中の自己抗体である。自己抗体とは、一般に、ある個体に産生された抗体で、前記個体自身の構成物である抗原成分と反応する抗体を意味する。前記生体試料としては、例えば、血清試料があげられる。前記抗体は、血清試料中の自己抗体であることがさらに好ましい。本発明において血清試料とは、血清を含んでいればよく、例えば、血清画分のみでもよいし、血清画分を含む全血試料等でもよい（以下、同様）。また、前述のように、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、五つのファミリーがある。このため、前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体は、例えば、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１抗体、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２抗体および抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３抗体が好ましい。中でも特に好ましい抗体は、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３抗体である。前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上をマーカーとして検出してもよい。【００２０】
（３）ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびそのｍＲＮＡ
前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子は、前述のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎをコードする遺伝子である。本発明の腫瘍マーカーは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびそのｍＲＮＡのいずれかでもよいし、双方であってもよい。ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびそのｍＲＮＡを本発明の腫瘍マーカーとする場合、後述するように、採取した生体試料中におけるその有無や発現量の測定によって、癌の診断を行うことができる。前記腫瘍マーカーとしては、例えば、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子のｍＲＮＡが好ましく、後述する診断においては、前記ｍＲＮＡの転写の有無または転写量を測定することが好ましい。前記遺伝子およびｍＲＮＡは、天然から分離されたものでもよく、遺伝子工学により作製された組換え遺伝子または組換えＲＮＡでもよい。後述するように、前記遺伝子の発現、または、ｍＲＮＡの転写を指標にしても、腫瘍を検出できるからである。前記生体試料としては、例えば、前述のような診断対象の癌の種類に応じて決定できる。すなわち、診断対象となる組織細胞を生体試料とすることができ、一例として、膵臓細胞、肝臓細胞、胆管細胞、結腸細胞、直腸細胞、胃細胞、乳腺細胞、口腔細胞等があげられる。【００２１】
また、前述のように、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、五つのファミリーがある。このため、前記Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１遺伝子およびそのｍＲＮＡ、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２遺伝子およびそのｍＲＮＡ、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３遺伝子およびそのｍＲＮＡが好ましい。中でも特に好ましいのは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３遺伝子およびそのｍＲＮＡである。ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、前記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡがあげられる。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、前記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡがあげられる。ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、前記（Ｅ）または（Ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡがあげられる。具体例として、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１は、例えば、遺伝子（ｍＲＮＡ）がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ０６３２４１、タンパク質がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＡＨ６３２４１、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２は、例えば、遺伝子（ｍＲＮＡ）がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１７８８５８、タンパク質がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＣＡＩ４０８６３、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３は、例えば、遺伝子（ｍＲＮＡ）がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３０９７１、タンパク質がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＰ１１２２３３、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−４は、例えば、遺伝子（ｍＲＮＡ）がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＬ３５５５９８、タンパク質がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＣＡＩ１４１３０、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−５は、例えば、遺伝子（ｍＲＮＡ）がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ１０１３１３、タンパク質がＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＡＩ０１３１４に、それぞれ登録されている。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびｍＲＮＡは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上をマーカーとして検出してもよい。【００２２】
＜腫瘍マーカーの測定方法＞
本発明の腫瘍マーカーの測定方法は、特に制限されない。具体的な方法は、例えば、腫瘍マーカーの種類に応じて適宜決定できる。【００２３】
（１）ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの測定
前記本発明の腫瘍マーカーが、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの場合、特定のタンパク質を検出する従来公知の測定方法が採用できる。前記測定方法は何ら制限されない。具体例としては、例えば、抗体を用いた免疫測定法（イムノアッセイ法）があげられる。前記免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラテックス免疫凝集法等の免疫凝集法、ラテックス免疫比朧法等の免疫比朧法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング法等があげられる。前記免疫測定法としては、中でも、ＥＬＩＳＡが好ましい。前記ＥＬＩＳＡとしては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法や競合ＥＬＩＳＡ法等があげられる。【００２４】
免疫測定法によりヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを測定する場合、検出用抗体としては、例えば、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体があげられる。前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の種類は、通常、測定目的のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの種類に応じて決定できる。本発明においては、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を含む試薬を、腫瘍マーカーの測定用試薬として使用できる。前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体は、例えば、従来公知の方法によって調製できる。具体例としては、例えば、動物に、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを抗原として接種し、免疫感作することによって、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を得ることができる。免疫感作させる宿主細胞の動物の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、モルモット等のヒトを除く哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等が使用できる。また、動物に対する抗原の接種方法も、特に制限されず、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が採用できる。このようにして得られる抗体は、通常、免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧである。また、得られた抗体は、それ自体を抗体として使用することもでき、さらに酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体の活性フラグメントを、抗体として使用することもできる。【００２５】
ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの測定について、一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。【００２６】
すなわち、本発明の腫瘍マーカーの測定方法は、前述のように、前記腫瘍マーカーが、生体試料中のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを含むマーカーであり、下記工程（ａ’）および（ｂ’）を含む。
（ａ’）  生体試料に、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を添加し、前記生体試料中のヒト由来Ｓｉｄｅｒｆｌｅｘｉｎに、前記抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を結合させて複合体を形成させる工程
（ｂ’）  前記複合体を測定する工程【００２７】
前記（ａ’）工程において、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体は、前記生体試料に添加する抗体であり、生体試料中のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを検出するための抗体であることから、以下、「外来の検出用抗体」ともいう。また、取り扱い性に優れることから、前記外来検出用抗体は、例えば、前記（ａ’）工程に先立って、プレート（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に固定（吸着）させておくことが好ましい。この場合、前記プレートに生体試料を添加し、前記プレート内で前記複合体を形成することができる。前記（ｂ’）工程において、前記複合体の測定方法は、特に制限されない。具体例として、前記複合体の抗原（生体試料中のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ）に、さらに標識化された抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を結合させ、前記標識化抗体を測定する方法があげられる（サンドイッチ免疫測定法）。前記標識としては、特に制限されず、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射能標識等の従来公知の標識があげられる。標識化抗体としては、中でも、酵素標識化抗体が好ましい。【００２８】
標識化物質として酵素を使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一例を説明する。まず、患者から、診断対象となる組織細胞を採取する。例えば、口腔癌の診断を目的とする場合は、口腔細胞を採取する。そして、前記組織細胞からタンパク質を抽出し、抽出画分を調製する。他方、測定目的のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を準備し、これを測定容器に固定化する。そして、前記測定容器に前記抽出画分を加える。これによって、固定化抗体と前記抽出画分中の抗原（ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ）とが反応し、両者が結合する。前記測定容器を洗浄後、さらに、酵素で標識化した抗体（標識化抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体）を加える。これによって、前記固定化抗体に結合した抗原と前記標識化抗体とが反応して、両者が結合し、前記抗原を２つの抗体が挟んだ形状の複合体が形成される。そして、前記抗原と結合しなかった標識化抗体を除去した後、前記複合体における標識（酵素）の活性を測定する。この酵素活性は、前記複合体の量に比例し、前記抽出画分における測定目的の抗原の量を示すこととなる。前記酵素としては、何ら制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が使用できる。この方法において使用する２種類の抗体は、例えば、互いに、抗原に対して異なる結合部位を持つことが好ましい。【００２９】
以上のような免疫測定法による腫瘍マーカーの測定、すなわち、生体試料中のヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの測定方法は、例えば、以下に示す腫瘍診断キットにより実施することができる。【００３０】
前記腫瘍診断キットは、免疫測定法を用いた腫瘍診断キットであって、腫瘍特異的抗原を認識する２種類の抗体を含み、少なくとも一方の抗体が、標識化抗体であり、診断の目的である前記腫瘍特異的抗原がヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎである。この腫瘍診断キットを前述の測定方法に使用すれば、患者の生体試料中に存在するヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを簡便に測定できる。そして、測定結果から、例えば、生体試料の採取部位（組織）における腫瘍の有無ならびに前記腫瘍が悪性（癌）か否かを診断することができる。前記免疫測定法は、特に制限されず、前述のような測定法があげられる。前記免疫測定法が、ＥＬＩＳＡ法の場合、前記標識化抗体は、例えば、酵素で標識化された抗体である。また、前記腫瘍診断キットは、さらに、ＥＬＩＳＡ法等の免疫測定法に必要な各種試薬や器具を含んでいても良い。【００３１】
（２）抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の測定
前記本発明の腫瘍マーカーが、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の場合、特定の抗体を検出する従来公知の測定方法が採用できる。具体例としては、例えば、抗原を用いた免疫測定法（イムノアッセイ法）があげられる。前記免疫測定法としては、前述のような方法が採用でき、中でも、ＥＬＩＳＡが好ましい。【００３２】
免疫測定法により抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を測定する場合、検出用抗原としては、例えば、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎがあげられる。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの種類は、通常、測定目的の抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の種類に応じて決定できる。本発明においては、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを含む試薬を、腫瘍マーカーの測定用試薬として使用できる。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、例えば、天然から分離したヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ、および、遺伝子工学により作製された組換えタンパク質のヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎのいずれであってもよい。前記組換えタンパク質の作製に使用する遺伝子およびｍＲＮＡは、例えば、天然から分離されたものでもよく、遺伝子工学により作製された組換え遺伝子または組換えＲＮＡでもよい。また、前記組換えタンパク質は、例えば、抗原抗体反応に影響を与えない範囲で、他のタンパク質とヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎとの融合タンパク質であってもよい。前記他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンSトランスフェラーゼ）等があげられる。【００３３】
体内で作られた自己抗体である抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の測定について、一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。【００３４】
すなわち、本発明の腫瘍マーカーの測定方法は、前述のように、前記腫瘍マーカーが、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する血清中の自己抗体を含むマーカーであり、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）  血清試料にヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを添加し、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｆｌｅｘｉｎに前記血清試料中の前記自己抗体を結合させて複合体を形成させる工程
（ｂ）  前記複合体を測定する工程【００３５】
前記（ａ）工程において、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、前記血清に添加する抗原であり、血清試料中の自己抗原を検出するための抗原であることから、以下、「外来の検出用抗原」ともいう。前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、前述のように、例えば、天然由来でもよいし、組換えタンパク質でもよい。また、測定対象としては、前述のように、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３が特に好ましいことから、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３が特に好ましい。また、取り扱い性に優れることから、前記外来検出用抗原は、例えば、前記（ａ）工程に先立って、プレート（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に固定（吸着）させておくことが好ましい。この場合、前記プレートに生体試料を添加し、前記プレート内で前記複合体を形成することができる。【００３６】
前記（ｂ）工程において、前記複合体の測定方法は、特に制限されない。具体例として、前記複合体の前記自己抗体に二次抗体を結合させ、前記二次抗体を測定する方法があげられる。二次抗体とは、自己抗体に対する抗体であって、第二抗体とも呼ばれる。前記二次抗体としては、標識化された二次抗体が好ましく、例えば、この標識を測定することによって、前記複合体を測定することができる（サンドイッチ免疫測定法）。前記標識は、特に制限されず、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射能標識等の従来公知の標識があげられる。前記標識化二次抗体としては、中でも、酵素標識化抗体が好ましい。前記酵素標識としては、何ら制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が使用できる。測定対象がヒトの自己抗体であることから、前記二次抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体が好ましい。前記抗ヒトＩｇＧ抗体は、例えば、ウサギやマウス等の動物にヒトＩｇＧを免疫することによって調製でき、また、市販品を使用することもできる。前記標識化二次抗体の一例としては、例えば、パーオキシダーゼ標識化抗ヒトＩｇＧ抗体があげられる。【００３７】
標識化物質として酵素を使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一例を説明する。まず、患者から、試料として血液を採取する。この際、血液試料は、抗体が含まれる画分であればよく、例えば、全血でもよいし、血清画分であってもよい。他方、測定目的の抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体に対する抗原（ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ）を準備し、これを測定容器に固定化する。そして、前記測定容器に前記血液試料を加える。これによって、固定化抗原と前記血液試料中の自己抗体（抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体）とが反応し、両者が結合する。前記測定容器を洗浄後、さらに、酵素で標識化した二次抗体を加える。これによって、前記固定化抗原に結合した自己抗体と前記標識化二次抗体とが反応して、両者が結合し、前記自己抗体を抗原と二次抗体とが挟んだ形状の複合体が形成される。そして、前記自己抗体と未結合の前記標識化二次抗体を除去した後、前記複合体における標識（酵素）の活性を測定する。この酵素活性は、前記複合体の量に比例し、前記血液試料における自己抗体の量を示すこととなる。【００３８】
このような免疫測定法による腫瘍マーカーの測定、すなわち、血清中の自己抗体の測定方法は、例えば、以下に示す腫瘍診断キットにより実施することができる。【００３９】
本発明の腫瘍診断キットは、免疫測定法を用いた腫瘍診断キットであって、腫瘍特異的抗原と標識化二次抗体とを含み、前記腫瘍特異的抗原が、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎであり、前記標識化二次抗体が、前記ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する自己抗体を認識する抗体である。この腫瘍診断キットは、血清中の抗ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の測定を行うことから、前記免疫測定法は、いわゆる血清免疫測定法である。この腫瘍診断キットを前述の測定方法に使用すれば、患者の血清試料中に存在する抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体を簡便に測定できる。そして、測定結果から、例えば、患者の腫瘍の有無ならびに前記腫瘍が悪性（癌）か否かを診断することができる。前記免疫測定法は、特に制限されず、前述のような測定法があげられる。前記免疫測定法が、ＥＬＩＳＡ法（血清ＥＬＩＳＡ法）の場合、前記標識化二次抗体は、例えば、酵素で標識化された二次抗体である。また、前記腫瘍診断キットは、さらに、ＥＬＩＳＡ法等の免疫測定法に必要な各種試薬や器具を含んでいても良い。【００４０】
（３）ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびそのｍＲＮＡの測定
前記本発明の腫瘍マーカーが、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびｍＲＮＡの少なくともいずれかの場合、例えば、前記遺伝子の発現、ｍＲＮＡの転写等を測定すればよい。これらの測定方法としては、従来公知の測定方法が採用できる。具体例としては、例えば、特異的なプライマーを用いた核酸増幅法や、検出プローブを用いた方法があげられる。前者としては、例えば、ＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等があげられ、後者としては、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法等があげられる。なお、特異的プライマーや検出プローブの配列は、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子およびｍＲＮＡの配列に基づいて適宜決定できる。【００４１】
ｍＲＮＡの発現（転写）を測定する場合、一般的に、逆転写ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法が広く利用されている。この手法は、例えば、生体試料中で発現したトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として、逆転写ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲによって、前記ｃＤＮＡを鋳型として、目的配列の増幅を行う。これによって、前記生体試料中で発現した目的のｍＲＮＡの量が測定できる。したがって、本発明においては、例えば、生体試料中で発現したヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ以外に、ＰＣＲ等の遺伝子工学的手法によって合成したｃＤＮＡや、増幅した目的配列（増幅ＤＮＡ産物）を腫瘍マーカーということもできる。なお、トータルＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として合成するｃＤＮＡは、特に制限されないが、例えば、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ遺伝子の全長ｃＤＮＡまたはその部分配列を含んでいればよい。また、ｃＤＮＡを鋳型として増幅させる目的配列は、例えば、ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎの全長ｃＤＮＡ配列でもよいし、部分的なｃＤＮＡ配列でもよい。【００４２】
＜腫瘍の判定方法＞
本発明の判定方法は、患者の腫瘍を判定する方法であって、下記工程（ｃ）および（ｄ）を含む方法である。
（ｃ）前記本発明の腫瘍マーカーの測定方法により、患者から採取した生体試料における腫瘍マーカーを測定する工程
（ｄ）前記測定した腫瘍マーカーの有無または量によって、癌（悪性腫瘍）の有無または癌の進行度を判定する工程
【００４３】
本発明の判定方法によれば、本発明の腫瘍マーカーを測定するのみで、目的の判定部位における癌の有無や、癌の進行状況（例えば、高度進行癌か軽度等度進行癌か）を判定することができる。特に、本発明によれば、早期癌についても、高精度で判定することができる。具体的には、腫瘍マーカーが検出されれば、癌が存在すると判定でき、腫瘍マーカーが未検出であれば、癌が非存在と判定できる。また、さらにその他の臨床情報や検査情報と組み合わせることによって、より高い精度で判定が可能となる。
【００４４】
本発明の腫瘍マーカー、腫瘍診断キット、腫瘍マーカーの測定方法および腫瘍の判定方法において、その対象となる腫瘍は、例えば、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌である。また、これら以外の癌も、その対象となる。前記口腔癌は、口腔扁平上皮癌であることが好ましい。また、本発明の腫瘍マーカーの測定方法や、腫瘍の判定方法における被検対象は、例えば、ヒトや、ヒト以外の哺乳類動物、モデル動物等、種々の動物があげられる。
【００４５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら制限されない。
【実施例１】
【００４６】
本実施例は、口腔扁平上皮癌患者の血清中に、前記癌の腫瘍マーカーであるヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する自己抗体が存在することを確認した例である。さらに、本実施例では、組換えタンパク質であるヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎを用いて、被験者の血清中の前記自己抗体を腫瘍マーカーとして、癌の判定を行った。【００４７】
１．自己抗体の存在確認
（１）血清の調製
１８人の口腔扁平上皮癌患者、９人の良性疾患患者および１８人の健常者より同意を得た上で、各患者の血清を術前時に採取した。これらを血清試料とした。口腔扁平上皮癌患者の内訳は、男１０人、女８人、年齢４０〜８５歳、平均年齢６８．３歳であった。良性疾患患者の内訳は、男４人、女５人、年齢２４〜６９歳、平均年齢４９．８歳であった。良性疾患の内訳は、嚢胞性疾患４例、良性腫瘍（多形性腺腫）２例、唾石症２例、骨髄炎１例であった。健常者の内訳は、男１０人、女８人、年齢２４〜８０歳、平均年齢４９．１歳であった。【００４８】
（２）細胞株の可溶化サンプル
細胞株として、ヒト繊維芽細胞株ＭＲＣ−５を用いた。前記細胞株は、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＣＯ２インキュベータで培養した。培養した前記ＭＲＣ−５細胞株を回収し、下記可溶化バッファーと混和した。得られたＭＲＣ−５細胞株の可溶化物を２次元電気泳動のサンプルとした。このサンプルは、使用時まで−８０℃で保存した。前記可溶化バッファーの組成は、８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、６０ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＩＰＧ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＰＩ  ３−１０および０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅとした。【００４９】
（３）２次元電気泳動
前記ＭＲＣ−５細胞株の可溶化サンプルの２次元電気泳動を行った。まず、１次元目の電気泳動として、市販の電気泳動装置（商品名Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ  II、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、等電点電気泳動を行った。前記等電点電気泳動用のゲルとして、商品名Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ，７ｃｍ，ｐＩ  ３−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用した。次に、２次元目の電気泳動として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルとして、商品名Ｒｅａｌ  Ｇｅｌ  Ｐｌａｔｅ（１０％  ｇｅｌ、ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ社）を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルについて、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色を行った。【００５０】
（４）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲル中のタンパク質を、セミドライ式ブロッティング装置（Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｅｒ）を用いて、電気的にＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写した。前記ＰＶＤＦ膜を、下記ブロッキングバッファー中、室温で一時間インキュベートした。前記ブロッキングバッファーの組成は、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ），５％  ｎｏｎｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０とした。インキュベート後、前記ＰＶＤＦ膜を浸漬させたブロッキングバッファーに、さらに、１０００倍希釈した前述の各種血清を添加し、室温で１時間インキュベートした。続いて、前記ブロッキングバッファーに、さらに、１００００倍希釈した標識化二次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。前記標識化二次抗体としては、パーオキシダーゼ標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）を使用した。そして、インキュベート後の前記ＰＶＤＦ膜をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、ついで、蛍光検出試薬（商品名ＥＣＬ、Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて化学発光させた。なお、血清および標識化二次抗体の希釈には、０．５％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を使用した（以下、同様）。この結果、前記ＭＲＣ−５細胞株の可溶化サンプル中のタンパク質は、良性疾患患者および健常者の血清よりも、口腔扁平上皮癌患者の血清に対して顕著な反応を示した。【００５１】
（５）タンパク質同定
前記Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにおいて、口腔扁平上皮癌患者血清と反応したスポットを、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから切り取った。このゲルを、脱色液（５０％アセトニトリル／２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ））１００μＬに１５分間浸漬して脱色を行った。その後、前記脱色液を吸引除去し、同じ脱色操作を合計３回繰り返し行った。続いて、脱色処理後のゲル試料を１００％アセトニトリル溶液３０μＬに５分間浸した。前記アセトニトリル溶液を吸引除去後、前記ゲル試料を、遠心エバポレーター（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ）によって約１５分間乾燥させ、完全に脱水を行った。そして、脱水したゲル試料に、−８０℃で凍結保存したトリプシン溶液（１０μｇ／ｍｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ／５０ｍＭ  ＮＨ４  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を２０μＬずつ入れ、３７℃で一晩酵素処理を行った。酵素処理後の溶液に、さらに、抽出液（５０％アセトニトリル／５％トリフルオロ酢酸）５０μＬを添加し、３０分間、室温で振とうさせた。液体画分を回収した後、残存する固体画分に、さらに新たな抽出液２５μＬを添加し、同様の処理を行うことによって、合計７５μＬの液体画分を抽出画分として回収した。この抽出画分を、遠心エバポレーターで５〜１０μＬまで濃縮し、濃縮液を分析用の試料液とした。そして、分析用試料液について質量分析を行った。この質量分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（商品名Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、ＭＳ  Ｆｉｔ（ＵＣＳＦ）のサーバーを利用したＰｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ（ＰＭＦ）法により行った。その結果、前記癌患者血清と特異的に反応したタンパク質が、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ（１，２，３等）が同定された。この中で、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の質量分析の結果を、図１０に示す。同図（Ｒｅｓｕｌｔ  Ｓｕｍｍａｒｙ）に示すように、前記血清と特異的に反応したタンパク質について、ＭＯＷＳＥ  Ｓｃｏｒｅ  ３．２０４ｅ＋０４、＃／３２（％）Ｍａｓｓｅｓ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ６（１８）、％Ｃｏｖ  １８．０、％ＴＩＣ１８．８、Ｍｅａｎ  Ｅｒｒ  ｐｐｍ  −４３．９、Ｄａｔａ  Ｔｏｌ  ｐｐｍ  ２５１、ＭＳ−Ｄｉｇｅｓｔ  Ｉｎｄｅｘ＃  ２１７８５６８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＷ（Ｄａ）／ｐｌ  ３５５０４／９．３、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  ５６４６２５６１  Ｍ、Ｓｐｅｃｉｅｓ  ＨＯＭＯ  ＳＡＰＩＥＮＳ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｍｅ  Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ  ３との結果が得られた。このように、口腔扁平上皮癌患者の血清と反応した前記ＭＲＣ−５細胞株のタンパク質は、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎであることから、前記癌患者の血清には、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する自己抗体が存在することが証明された。【００５２】
２．癌の判定
（１）組換えタンパク質の作製
前記ＭＲＣ−５培養細胞株よりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成には、商品名Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を使用した。そして、前記ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の各遺伝子に対する各特異的プライマーを用いて、下記ＰＣＲ法によって、各目的タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれクローニングした。ＰＣＲの条件は、以下に示す。得られた各遺伝子（ｃＤＮＡ）をベクター（商品名ｐＧＥＸ−６Ｐ−２  ｖｅｃｔｏｒ、Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に組み込んで組換えベクターを作製し、大腸菌の形質転換を行った。使用した大腸菌は、以下に示す。そして、組換えタンパク質として、目的タンパク質を含むＧＳＴ融合タンパク質を前記大腸菌に発現させた。得られた組換えタンパク質は、ゲル担体（商品名Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｃｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたゲルクロマトグラフィーによって常法により精製した。具体的には、前記大腸菌から回収したタンパク質画分に前記ゲル担体を加え、前記ゲル担体に前記画分に含まれる組換えタンパク質を融合させた。そして、遠心分離により前記組換えタンパク質が融合させたゲル担体を回収した後、前記ゲル担体にＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍＬを添加して攪拌した後、遠心分離（２５００ｒｐｍ×５分  ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）することによって、前記ゲル担体の洗浄を行った。この洗浄工程を５回繰り返した。そして、洗浄後の前記ゲル担体に、溶出液（２％Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  、Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）５００μＬ入れ、一晩、攪拌混合した。そして、遠心分離（２５００ｒｐｍ×５分間、ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）により上清のみを回収し、これをリン酸バッファーで一晩透析した。このようにして精製した組換えタンパク質を、外来の検出用抗原タンパク質として後述する実験に使用した。得られた抗原タンパク質は、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２およびＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の三種類である。【００５３】
＜ＰＣＲ条件＞
Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の各遺伝子のクローニングには、以下に示すｃｕｓｔｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）を購入し、各々１０μＭの濃度で使用した。各プライマーの配列を以下に示す。ＷＦおよびＦは、フォワードプライマーであり、ＷＢおよびＢは、バックプライマー（リバースプライマー）である。また、Ｆは、ＢａｍＨＩの認識配列を有するプライマーであり、Ｂは、ＥｃｏＲＩの認識配列を有するプライマーである。ＰＣＲの反応液には、商品名ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ社）を使用した、まず、ＷＦおよびＷＢからなる各プライマーセット１を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。続いて、得られたＰＣＲ産物を鋳型として、ＦおよびＢからなる各プライマーセット２を用いてＰＣＲを行い、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の各全長遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングした。ＰＣＲ条件は、９４℃×１ｍｉｎの後、「９４℃×１０ｓｅｃ、アニーリング温度×１５ｓｅｃ、７２℃×９０ｓｅｃ」を１サイクルとして合計３５サイクル行い、最後に７２℃で７ｍｉｎ反応させて、以後は４℃で保存した。【００５４】
＜Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１用＞
プライマーセット１
ＷＦ（配列番号４）
５’−ＧＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＣ−３’
ＷＢ（配列番号５）
５’−ＣＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧ−３’
アニーリング温度：５９℃
プライマーセット２
Ｆ  ＢａｍＨ１（配列番号６）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡ−３’
Ｂ  ＥｃｏＲ１（配列番号７）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＴ−３’
アニーリング温度：５９℃【００５５】
＜Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２用＞
プライマーセット１
ＷＦ（配列番号８）
５’−ＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＣ−３’
ＷＢ（配列番号９）
５’−ＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＧ−３’
アニーリング温度：５５℃
プライマーセット２
Ｆ  ＢａｍＨ１（配列番号１０）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴ−３’
Ｂ  ＥｃｏＲ１（配列番号１１）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＡ−３’
アニーリング温度：５５℃【００５６】
＜Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３用＞
プライマーセット１
ＷＦ（配列番号１２）
５’−ＡＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧ−３’
ＷＢ（配列番号１３）
５’−ＣＣＡＣＣＣＴＡＡＴＡＧＧＴＴＧＣＴＡＣＣＣＴＣ−３’
アニーリング温度：６１℃
プライマーセット２
Ｆ  ＢａｍＨ１（配列番号１４）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡ−３’
Ｂ  ＥｃｏＲ１（配列番号１５）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴ−３’
アニーリング温度：５７℃【００５７】
＜使用した大腸菌株＞
まず、作製した組換えベクターを大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入し、大腸菌の培養によって、前記組換えベクターを増幅させた。そして、回収した組換えベクターについて、前記Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎをコードする遺伝子が挿入されていることを確認し、さらに、前記組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１株に導入した。この形質転換体を培養して、それぞれの目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させた。【００５８】
（２）血清ＥＬＩＳＡ
前述の各検出用抗原タンパク質を、炭酸バッファー（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２Ｍ、ｐＨ９．５）に希釈し、タンパク質濃度１０ｎｇ／μＬの各抗原溶液を調製した。これらの抗原溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ入れ、４℃で一晩放置した後、前記各ウェルを洗浄バッファーで３回洗った。これによって、前記抗原タンパク質をプレートに固定化した。そして、前記「１．（１）」と同様に、１０００倍希釈した前記各種血清を前記各ウェルに添加し（５０μＬ／１ウェル）、室温で１時間反応させた。つぎに、各ウェルを洗浄バッファーで３回洗った後、４０００倍希釈した標識化二次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。前記標識化二次抗体としては、パーオキシダーゼ標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）を使用した。インキュベート後の各ウェルに、１００μＬ／ウェルとなるように、発色用反応液を添加し、室温で３０分反応させた。前記反応液の組成は、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム三水和物１０ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＴＭＢ１００μＬ、Ｈ２Ｏ２１０μＬとした。そして、前記反応液に１０％硫酸（５０μＬ／ウェル）を添加して、反応を停止させた。その後、速やかに、測定装置（商品名ＥＬＩＳＡリーダー  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）により、前記反応液の吸光度（Ｄｕａｌ  ｗａｖｅ  ｍｏｄｅ  ４５０ｎｍ、６２０ｎｍ）を測定した。【００５９】
前記血清ＥＬＩＳＡの結果を、図１から図３のグラフに示す。図１は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１の組換えタンパク質を使用した結果であり、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１抗体と口腔扁平上皮癌との関係を示すグラフである。図２は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２の組換えタンパク質を使用した結果であり、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２抗体と口腔扁平上皮癌との関係を示すグラフである。図３は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の組換えタンパク質を使用した結果であり、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３抗体と口腔扁平上皮癌との関係を示す結果である。また、二項検定により癌患者の結果と健常者の結果との間におけるｐ（＊１）、癌患者の結果と良性疾患患者の結果との間におけるｐ（＊２）を求めた。これらの結果を各図にあわせて示す（他の図においても同様）。ｐ＜０．０５であれば、有意差があると判断できる。【００６０】
図示のように、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２およびＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３に対する各自己抗体は、健常者および良性疾患患者の血清と比較して、癌患者血清において極めて顕著に存在することが明らかとなった。この結果から、抗ヒト由来Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体のうちいずれの自己抗体を検出しても、癌患者と、健常者および良性疾患患者とを、明確に区別できることがわかった。特に、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の組換えタンパク質を用いた場合に、閾値（カットオフ値）を吸光度０．３にすると、より明瞭に陽性患者および陰性患者を区別することができた。この内訳を下記表１に示す。【００６１】
【表１】
0005358808.tif 000002
【００６２】
つぎに、マーカー検出用の抗原タンパク質としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の組換えタンパク質を用いた場合における、早期癌患者の判別について、検討した。癌の進行度は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の４つのグループに分類でき、Ｔ１が最も早期の癌であり、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の順で癌の症状が進んでいる。前記口腔扁平上皮癌患者１８名は、Ｔ１（５人）、Ｔ２（５人）、Ｔ３（４人）およびＴ４（４人）に分類できる。そこで、口腔扁平上皮癌患者のうちＴ１（５人）の早期癌患者について、前述と同様の血清ＥＬＩＳＡにより、陽性率を調べた。下記表２に示すように、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ（特に、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３）を用いて、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎに対する血清中の自己抗体の測定を行えば、従来困難であった早期癌であっても、高精度で判定できる。【００６３】
【表２】
0005358808.tif 000003
【実施例２】
【００６４】
本実施例は、マーカー検出用の抗原タンパク質を使用して、各種癌の判定を行った例である。前記抗原タンパク質としては、実施例１で調製した３種の組換えタンパク質（ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３）を使用した。また、被検試料としては、膵癌、肝・胆管癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌の各種癌患者の血清を用いた。【００６５】
（１）血清の調製
１０人の膵癌患者、１人の肝癌患者、２人の胆管癌患者、６人の結腸癌患者、３人の直腸癌患者、４人の胃癌患者、５人の乳癌患者、９人の良性疾患患者および１８人の健常者より同意を得た上で、各患者の血清を術前時に採取した。膵癌患者の内訳は、男４人、女６人、年齢５４〜７８歳、平均年齢７０．４歳であった。肝癌患者は、６７歳男、胆管癌患者は７２歳と８３歳のいずれも男であった。結腸癌患者は、男４人、女２人、年齢７２〜８３歳で、平均年齢７９歳であった。直腸癌患者は。全て男、年齢５５〜７８歳、平均年齢６１．７歳であった。胃癌患者は、男２人、女２人、年齢５４〜７４歳、平均年齢６２歳であった。乳癌患者は、全て女、年齢３８〜７７歳、平均年齢５８．４歳であった。良性疾患の内訳は、胆石症５例、慢性胆嚢炎１例、慢性胆管炎１例、慢性膵炎２例、男５人、女４人、年齢４１〜８６歳、平均年齢７８．２歳であった。健常者の内訳は、男１０人、女８人、年齢２４〜８０歳、平均年齢４９．１歳であった。【００６６】
（２）血清ＥＬＩＳＡ
マーカー検出用の抗原タンパク質として、前記実施例１で調製した３種類の組換えタンパク質（ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２、ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３）を使用した。そして、前述の各種血清および各種組換えタンパク質を用いて、前記実施例１の「２．（２）」と同様にして、血清ＥＬＩＳＡを実施した。これらの結果を、図４から図９の各グラフに示す。図４は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１の組換えタンパク質を使用した結果であり、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−１抗体と各癌とのそれぞれの関係を示すグラフである。図５は、前記図４における各癌の結果を合計して表したグラフである。図６は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２の組換えタンパク質を使用した結果であり、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−２と各癌との関係を示すグラフである。図７は、前記図６における各癌の結果を合計して表したグラフである。図８は、検出用抗原としてＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３の組換えタンパク質を使用した結果であり、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３抗体と各癌との関係を示すグラフである。図９は、前記図８における各癌の結果を合計して表したグラフである。【００６７】
図４から図９の各グラフに示すように、実施例１における口腔扁平上皮癌以外の他の各種癌についても、実施例１と同様に、抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ抗体の検出により、癌患者と、健常者および良性疾患患者とを明確に判定できた。特に、図８および図９の各グラフに示すように、検出用抗原としてＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３を用いた場合に、より明確に癌の陽性および陰性を判定することができた。
【実施例３】
【００６８】
本実施例は、口腔扁平上皮癌患者に癌治療を施し、治療前後における自己抗体価の変移を確認した例である。【００６９】
（１）血清試料の調製
口腔扁平上皮癌患者４名（Ａ〜Ｄ）に対し、下記に示す治療を施し、且つ、適宜、血清の採取を行った。【００７０】
＜患者Ａおよび患者Ｂ＞
・治療
癌の存在する患部を切除する外科的処置を施した。
・血清採取
治療前（ＰｒｅＯｐ.）における一回目の血清採取を０日とし、さらに、１週間後（１Ｗ）、１ヶ月後（１Ｍ）、３ヶ月後（３Ｍ）、８ヶ月後（８Ｍ）に、血清採取を行った。なお、一回目の血清採取の直後に前記外科的処置を施した。
＜患者Ｃ＞
・治療
患部に対して動脈を経由して抗癌剤を局所投与する化学療法を施し、化学療法から１年後に再発が確認されたことから、さらに、前記患者Ａと同様の外科的処置を施した。
・血清採取
治療前（ＰｒｅＣｈｅｍ.）における一回目の血清採取を０日とし、さらに、４週間後（４Ｗ）、１年後（１Ｙ）に血清採取を行った。なお、一回目の血清採取の直後に前記化学療法を施した。また、外科的処置（Ｏｐ）から２ヶ月後（ＰｏｓｔＯｐ．２Ｍ）にも血清採取を行った。
＜患者Ｄ＞
・治療
患部に対して前記患者Ａと同様に外科的処置を施した。前記外科的処置から８ヶ月後に再発が確認されたことから、さらに、前記患者Ｃと同様の化学療法を施した。
・血清採取
治療前（ＰｒｅＯｐ.）における一回目の血清採取を０日とし、さらに、１週間後（１Ｗ）、１ヶ月後（１Ｍ）、８ヶ月後（８Ｍ）に血清採取を行った。なお、一回目の血清採取の直後に前記外科的処置を施した。また、化学療法から１６ヶ月後（１６Ｍ）にも血清採取を行った。【００７１】
（２）血清ＥＬＩＳＡ
マーカー検出用の抗原タンパク質として、前記実施例１で作製した組換えタンパク質（ＧＳＴ−Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３）を使用した。まず、この抗原タンパク質を炭酸バッファー（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１Ｍ、ｐＨ９．５）に希釈し、タンパク質濃度１μｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。この抗原用液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃３３６９、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の各ウェルに１００μＬずつ入れ、４℃で一晩放置した後、前記各ウェルを洗浄バッファーで３回洗った。これによって、前記抗原をプレートに固定化した。そして、血清試料を、前記実施例１と同様に１０００倍希釈して、前記各ウェルに添加し（１５０μＬ／１ウェル）、室温で１時間反応させた。つぎに、各ウェルを洗浄バッファーで３回洗った後、４０００倍希釈した標識化二次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。前記標識化二次抗体としては、ホースラヂィッシュパーオキシダーゼ標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）を使用した。インキュベート後の各ウェルに、１００μＬ／ウェルとなるように、発色用反応液を添加し、室温で３０分反応させた。前記反応液の組成は、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム三水和物１０ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＴＭＢ１００μＬ、Ｈ２Ｏ２１０μＬとした。そして、前記反応液に１０％硫酸（５０μＬ／ウェル）を添加して、反応を停止させた。その後、速やかに、測定装置（商品名ＥＬＩＳＡリーダー  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）により、前記反応液の吸光度（Ｄｕａｌ  ｗａｖｅ  ｍｏｄｅ  ４５０ｎｍ、６２０ｎｍ）を測定した。また、血清ＥＬＩＳＡについて、再現性と定量性を向上するため、基準血清を１．０×１０５ｕｎｉｔ／ｍＬに設定し、その希釈系列（１／１６，０００〜１／１０００）を調製し、標準単位（ｕｎｉｔ／ｍＬ）で表して、上記の実験に使用した。【００７２】
各患者における自己抗体価の結果を、図１１に示す。同図において、Ａは患者Ａ、Ｂは患者Ｂ、Ｃは患者Ｃ、Ｄは患者Ｄの結果である。各図において、縦軸は、自己抗体価に相当するペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）であり、所定の時期に採取した血清の活性を示す。【００７３】
同図ＡおよびＢに示すように、外科的処置（Ｏｐ）を単独で施した症例ＡおよびＢについては、術後に抗体価の低下が確認できた。そして、両症例では、術後に再発は確認されなかった。この結果と対応して、術後のフォローアップ期間において、抗体価の上昇も見られなかった。同図Ｃに示す化学療法（ＣｈｅｍＴｘ）を施した症例Ｃでは、治療終了後、臨床的にＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ(ＣＲ)が得られた。そして、これと対応して、治療終了時に抗体価の低下が確認された。この症例Ｃは、治療から１年後に再発（Ｒｅｃ（＋））が見られたが、これと対応して、抗体価の上昇が確認された。再発後の外科的処置（Ｏｐ）の結果、術後に抗体価は低下した。同図Ｄに示す症例Ｄは、外科的処置（Ｏｐ）により、術後に抗体価の低下が確認できた。この症例は、術後８ヶ月で再発（Ｒｅｃ（＋））が見られたが、これと対応して、抗体価の上昇が確認された。再発後、さらに化学療法（ＣｈｅｍＴｘ）を施すことによって、臨床的にＣＲが認められた。そして、この結果と対応して、抗体価の低下が確認された。【００７４】
以上のように、血清試料中の自己抗体（抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ−３抗体）は、治療によって自己抗体価が低下し、再発時には自己抗体価の上昇が確認された。このように、血清試料中の自己抗体（抗Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ‐３抗体）は、病勢を反映して増減していることから、腫瘍マーカーとして優れた信頼性を示すといえる。また、これらの自己抗体は、術後のフォローアップマーカーとしても、極めて有用であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の腫瘍マーカーは、感度が高く、また、腫瘍に対する特異性が高い。このため、本発明の腫瘍マーカーによれば、例えば、早期癌であっても高精度に検出できる。したがって、本発明の腫瘍マーカーは、癌の診断、評価等に好ましく使用することができ、臨床分野、学術研究分野および新薬から治療方法の研究開発の分野の全ての分野に広く用いることができ、その用途は制限されない。
【図１】
0005358808.tif 000004
【図２】
0005358808.tif 000005
【図３】
0005358808.tif 000006
【図４】
0005358808.tif 000007
【図５】
0005358808.tif 000008
【図６】
0005358808.tif 000009
【図７】
0005358808.tif 000010
【図８】
0005358808.tif 000011
【図９】
0005358808.tif 000012
【図１０】
0005358808.tif 000013
【図１１】
0005358808.tif 000014
【配列表】
0005358808000001.app