(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的に許容される非毒性賦形剤と共に、酵素的に不活性なＳＣＰを含む、β溶血連鎖球菌属（Streptococcus）に対して感受性哺乳動物を免疫するためのワクチンであって、ここで、前記ＳＣＰが野生型ＳＣＰの変異体であり、前記変異体ＳＣＰが配列番号１のアミノ酸１３０，２９５若しくは５１２、又は１３０と５１２の両方に対応するアミノ酸残基で置換を有する、前記ワクチン。
【請求項２】
前記ＳＣＰがＳＣＰをコードする単離されたＤＮＡ配列から発現される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ＳＣＰが配列番号１の残基２６０から残基４１７までの連続アミノ酸残基からなる特異性クレバス、又は配列番号１の残基１３０から残基５１２までの連続アミノ酸残基からなる触媒ドメインを有する、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ＳＣＰが野生型ＳＣＰの変異体であり、ここで変異体ＳＣＰが配列番号１のアミノ酸残基１３０，２９５若しくは５１２、又は１３０と５１２の両方の置換を有し、前記アミノ酸がアラニンで置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ペプチドがシグナル配列及び／又は細胞壁貫通部を含まないという点で生来のＳＣＰとは異なっている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ＳＣＰがＡ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌又はＧ群連鎖球菌由来のＳＣＰの変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
１以上のタンパク質に接合若しくは連結し、又は１以上の多糖に接合若しくは連結する請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記タンパク質又は多糖が別の病原体のものである、前記ワクチン。
【請求項８】
前記別の病原体のタンパク質又は多糖が肺炎連鎖球菌タンパク質、Ａ群連鎖球菌多糖、Ｂ群連鎖球菌多糖、Ｃ群連鎖球菌多糖又はＧ群連鎖球菌多糖である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
有効量の免疫アジュバントを更に含んでなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒト、イヌ、ウシ、ブタ又はウマである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記β溶血連鎖球菌属がＡ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌又はＧ群連鎖球菌である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、1996年１月22日に出願の米国出願第08／589,756号の一部継続出願である。USSN 08／589,756は参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
今までに同定されているβ溶血連鎖球菌には数種類の異なる菌種が存在する。Ａ群連鎖球菌とも呼ばれるストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）は主要ヒト病原菌である。主として小児の病気で、それはヒトに咽頭炎、膿痂疹および敗血症をはじめとする様々な感染症を引き起こす。感染後、リウマチ熱や急性子球体腎炎のような自己免疫合併症をヒトに引き起こし得る。この病原体はしょう紅熱、壊死性筋膜炎および中毒性ショックのような重症の急性疾患も引き起こす。
【０００３】
「連鎖球菌性咽頭炎」とも呼ばれるＡ群連鎖球菌により引き起こされる咽頭炎は、季節によって、一般病院における全来院者の少なくとも16％を占めることがある。Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975", J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981)。この種は北米と別の四大陸における壊死性筋膜炎を伴う中毒性ショックの最近の再流行の原因でもある。Stevens, D.L., "Invasive group A streptococcus infections," Clin. Infet. Dis., 14:2-13 (1992)。Ｃ群とＧ群の連鎖球菌も連鎖球菌性咽頭炎の発生および時には中毒性ショックの発生に関係あるとされる。Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975", J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981)。
【０００４】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）としても知られるＢ群連鎖球菌は、新生児敗血症および髄膜炎の原因である。T.R. Marin他、"The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Dis., 165:306-314 (1992)。しばしば新生児1000人あたり成人女性 0.1〜0.5 人の膣粘膜微生物叢の菌が産中感染後に重い病気を発症する。Ｂ群連鎖球菌感染からの高死亡率にもかかわらず、発病のメカニズムはあまり解明されていない。Martin, T.R.他、"The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of Group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Dis., 165:306-314 (1992)。
【０００５】
連鎖球菌感染は現在のところ抗体療法により治療されている。しかしながら、治療した者の25〜30％が病気を再発しそして／または粘膜分泌液中に該微生物を放出する。今のところ連鎖球菌感染を予防するのに利用できる手段は一つもない。歴史的に、連鎖球菌ワクチン開発は細菌の細胞表面Ｍタンパク質に集中していた。Bassen, D. 他、"Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci," Infect. Immun., 56: 2666-2672 (1988); Bronze, M.S.他、"Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice," Journal of Immunology, 141:2767-2770 (1988)。
【０００６】
２つの主な問題がＭタンパク質ワクチンの使用、販売、そしておそらくＦＤＡの許可を制限するだろう。第一に、Ｓ．ピオゲネスには80以上の異なるＭ血清型が存在し、新規血清型も次々と生まれてきている。Fischetti, V.A., "Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior," Clin. Microbiol. Rev., 2:285-314 (1989)。よって、ある血清型特異的Ｍタンパク質による接種は多分、別のＭ血清型に対する防御に効果的でないだろう。第二の問題は、Ｍタンパク質ワクチンの安全性に関連する。Ｍタンパク質の幾つかの領域はヒト組織、特に心臓組織と免疫交差反応する抗原性エピトープを含む。Ｍタンパク質のＮ末端は高度に配列が可変的であり、抗原特異性がある。この可変配列を代表する80種以上のペプチドをワクチンに含めることが、Ａ群連鎖球菌感染に対する広域防御を獲得するために必要であろう。新たな変異型Ｍタンパク質がまだ発生し続けるだろうから、連鎖球菌疾患の経時的サーベイランスとワクチン組成の変更が必要とされるだろう。対照的に、Ｍタンパク質のカルボキシル末端は配列が保存されている。しかしながら、Ｍタンパク質のこの領域はヒト心臓組織と免疫交差反応性であるアミノ酸配列を含む。Ｍタンパク質のこの性質はリウマチ熱に伴う心臓弁の損傷の原因であると考えられる。P. Fenderson他、"Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins", J. Immunol. 142:2475-2481 (1989)。初期試験では、1979年にＭタンパク質をワクチン接種した子供はリウマチ熱および付随の心臓弁障害の発生率が10倍高かった。Massell, B.F.他、"Rheumatic fever following streptococcal vaccination", JAMA 207:1115-1119 (1969)。
【０００７】
ワクチン開発検討中の別のタンパク質は、発赤毒である連鎖球菌発熱外毒素Ａおよび連鎖球菌発熱外毒素Ｂである。Lee, P.K.他、"Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness," J. Clin. Microb., 27:1890-1892 (1989)。それらのタンパク質に対する免疫は中毒性ショックの致死的症状を防ぐことができるが、連鎖球菌による定着を防止することはできないだろう。
【０００８】
よって、連鎖球菌感染を予防または改善するための有効な手段が引き続き求められている。より具体的には、連鎖球菌による宿主組織への定着（コロニー形成）を予防または改善し、それによって連鎖球菌性咽頭炎および膿痂疹の発生を少なくするためのワクチンとして有用な組成物を開発する必要性がある。リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、中毒性ショックおよび壊死性筋膜炎といった続発症の除去は、急性感染症の発生と微生物の保有を減少させることの直接結果である。全てのβ溶血連鎖球菌種、即ちＡ，Ｂ，ＣおよびＧ群により引き起こされる感染を予防または改善するためのワクチンに有用である組成物を開発する必要性もある。
【０００９】
発明の要約
本発明は、β溶血連鎖球菌属（Streptococcus）に対して感受性哺乳動物を免疫するのに有効なワクチンおよびワクチン接種方法を提供する。感受性哺乳動物はヒトまたは家畜、例えばイヌ、ウシ、ブタまたはウマであることができる。そのような免疫は、哺乳動物におけるβ溶血連鎖球菌属の定着の発生を予防、改善または削減することができる。ワクチンは、生理学的に許容される非毒性の賦形剤と共に免疫原性有効量の連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）を含み、ここで前記ＳＣＰは野生型ＳＣＰの変異体である。
【００１０】
ＳＣＰの「変異体」は、生来のＳＣＰと完全には同一でないポリペプチドまたはオリゴペプチドＳＣＰである。そのような変異体ＳＣＰは、１または複数のアミノ酸の挿入、削除または置換によってアミノ酸配列を変更することにより得ることができる。タンパク質のアミノ酸配列は、生来のポリペプチドに比較した時に実質的に同じかまたは改善された性質を有するポリペプチドを作製するために、例えば置換によって変更される。置換は保存的置換であることができる。「保存的置換」とは、或るアミノ酸を似た側鎖を有する別のアミノ酸により置換することである。保存的置換は、ペプチド全体がそれの立体構造を保持しているが変更された生物活性を有するような、アミノ酸の電荷またはアミノ酸の側鎖のサイズの可能な最小限の変更（あるいは、側鎖の中の化学基のサイズ、電荷または種類の変更）を生じるアミノ酸での置換であろう。例えば、一般的な保存的置換はAspからGlu, AsnまたはGlnへ；HisからLys, ArgまたはPheへ；AsnからGln，AspまたはGluへ；およびSerからCys, ThrまたはGlyへであろう。アラニンは別のアミノ酸の置換によく用いられる。20種の必須アミノ酸は次のように分類される：無極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；無電荷の極性側鎖を有するグリシン、セリン、スレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸；並びに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニンおよびヒスチジン。L. Stryer, Biochemistry（第２版）p.14-15; Lehninger, Biochemistry p.73-75。
【００１１】
アミノ酸変更は対応する核酸配列のコドンを変更することにより達成される。そのようなポリペプチドは、抗原性または免疫原性活性を変更または改良するためにポリペプチド構造中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置換することに基づいて入手できることは知られている。例えば、別のアミノ酸の置換を通して、高められた活性や増強された免疫応答を生じるような小さなコンホメーション変化をポリペプチドに付与することができる。あるいは、或るポリペプチド中のアミノ酸置換を使って別分子を連結させることのできる残基を提供し、別の目的に有用であるに十分な程度の出発ポリペプチドの抗原性を保持しているペプチド−分子接合体を提供することができる。
【００１２】
相互作用する生物学的機能をポリペプチドに付与するのにアミノ酸のヒドロパシー指数を利用することができる。その場合、同様な生物活性を保持したままで、或るアミノ酸を同様のヒドロパシー指数を有する別のアミノ酸により置換することができることは認められる。あるいは、特に免疫学的環境での使用を意図してポリペプチドに所望する生物学的機能を付けようとする場合、疎水性に基づいて類似アミノ酸による置換を行うこともできる。隣接アミノ酸の親水性により決定される、「タンパク質」の最大局所平均親水性は、それの免疫原性と相関関係がある。米国特許第4,554,101号明細書。従って、各アミノ酸に割り当てられる親水性に基づいて置換を行うことができる。
【００１３】
各アミノ酸に数値を割り当てる親水性指数またはヒドロパシー指数のいずれかを使う場合、それらの値が±２であるようなアミノ酸置換を行うことが好ましく、±１が特に好ましく、そして±0.5以内の置換が最も好ましい置換である。
【００１４】
変異体ＳＣＰは、少なくとも７アミノ酸残基、好ましくは約100〜約1500残基、より好ましくは約300〜約1200残基、更により好ましくは約500〜約1180残基を含んでなり、変異体ＳＣＰは対応する生来のＳＣＰのアミノ酸配列に対して少なくとも50％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％で且つ100％未満の連続アミノ酸配列相同性または同一性を有する。
【００１５】
変異体ＳＣＰポリペプチドのアミノ酸配列は生来のＳＣＰアミノ酸配列に本質的に一致する。本明細書中で用いる「本質的に一致する」とは、生来のＳＣＰによって誘導される免疫応答と実質的に同じである防御免疫応答を惹起するであろうポリペプチド配列を言う。そのような応答は、生来のＳＣＰにより惹起されるレベルの少なくとも60％であることができ、生来のＳＣＰにより惹起されるレベルの少なくとも80％であることもできる。組成物またはワクチンに対する免疫応答は、着目のポリペプチドまたはワクチンに対する宿主による細胞性免疫および／または抗体媒介免疫応答の発生である。普通、そのような応答は、着目の組成物またはワクチン中に含まれる１または複数の抗原に特異的に向けられた、宿主産生抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞から成る。
【００１６】
ＳＣＰはＡ群連鎖球菌（ＳＣＰＡ）、Ｂ群連鎖球菌（ＳＣＰＢ）、Ｃ群連鎖球菌（ＳＣＰＣ）またはＧ群連鎖球菌（ＳＣＰＧ）からのＳＣＰの変異体であることができる。
【００１７】
本発明の変異体は、対応する生来のＳＣＰ中に存在しないアミノ酸残基を含むことができまたは対応する生来のＳＣＰに比較して欠失を含むことができる。変異体は対応する生来のＳＣＰに比較して先端が切り取られた「断片」であってもよく、すなわち、全長タンパク質の一部分のみであってもよい。例えば、変異体ＳＣＰは、細胞壁貫通部を含まないという点で生来のＳＣＰと異なっていてもよい。ＳＣＰ変異体には少なくとも１つのＤアミノ酸を有するペプチドも包含される。
【００１８】
ワクチンの変異体ＳＣＰは、該変異体ＳＣＰをコードする単離されたＤＮＡ配列から発現させることができる。例えば、変異体ＳＣＰはそれがシグナル配列または細胞壁貫通部を含まないという点で生来のＳＣＰと異なってもよい。ＤＮＡが特異性クレバスまたは触媒ドメインをコードしてもよい。特に、該ＤＮＡは触媒ドメインのアミノ酸残基130, 193, 295もしくは512または特異性クレバスの260, 261, 262, 415, 416もしくは417をコードすることができ、あるいはそのような残基における置換をコードすることができる。特に、該ＤＮＡはＳＣＰＡ49Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ49Ｈ193Ａ、ＳＣＰＡ49Ｎ295Ａ、ＳＣＰＡ49Ｓ512Ａ、ＳＣＰＡ1Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ1Ｈ193Ａ、ＳＣＰＡ1Ｎ295Ａ、ＳＣＰＡ1Ｓ512Ａ、ＳＣＰＢＤ130Ａ、ＳＣＰＢＨ193Ａ、ＳＣＰＢＮ295Ａ、ＳＣＰＢＳ512ＡまたはΔＳＣＰＡ49をコードすることができる。上記列挙において、ＳＣＰＡ49Ｈ193Ａとは、残基番号193のところのHisがAlaにより置換されている、Ａ群連鎖球菌血清型49からのＳＣＰを意味する。ワクチンのＳＣＰは酵素Ｃ５アーゼまたはペプチダーゼ活性を欠いていてもよい。ワクチンは免疫アジュバントを含んでもよい。該ワクチンはＡ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌またはＧ群連鎖球菌による感染を予防するために使うことができる。該ワクチンは免疫原性ペプチドもしくは免疫原性多糖に接合または連結された免疫原性組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼを含むことができる。「組換え体」は、遺伝子操作法により製造されたペプチドまたは核酸として定義される。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は本明細書中互いに交換可能に用いられる。
【００１９】
連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼワクチンは皮下または筋肉内注射により投与することができる。あるいは、該ワクチンは経口摂取または鼻腔内接種により投与することができる。
【００２０】
本発明は更に、野生型ＳＣＰの変異体である単離・精製されたＳＣＰペプチド、および変異体ＳＣＰをコードする単離・精製されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、ＳＣＰは触媒ドメインのアミノ酸残基130, 193, 295もしくは512または特異性クレバスの260, 261, 262, 415, 416もしくは417を含むことができる。ＳＣＰはＳＣＰＡ49Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ49Ｈ193Ａ、ＳＣＰＡ49Ｎ295Ａ、ＳＣＰＡ49Ｓ512Ａ、ＳＣＰＡ1Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ1Ｈ193Ａ、ＳＣＰＡ1Ｎ295Ａ、ＳＣＰＡ1Ｓ512Ａ、ＳＣＰＢＤ130Ａ、ＳＣＰＢＨ193Ａ、ＳＣＰＢＮ295Ａ、ＳＣＰＢＳ512ＡまたはΔＳＣＰＡ49であることができる。
【００２１】
発明の具体的説明
様々な病原菌による感染に対する重要な第一防御ラインは、感染部位における食作用性多形核白血球（ＰＭＮ）と単核細胞の蓄積である。これらの細胞の誘引は、走化性刺激物質、例えば宿主因子または侵略生物により分泌される因子によって媒介される。Ｃ５ａ化学誘引物質は哺乳類におけるこの免疫反応の刺激の中枢である。Ｃ５ａは補体の第五成分（Ｃ５）から開裂される74残基の糖ペプチドである。食細胞は直接的にＣ５ａの勾配に反応し、感染部位に蓄積する。Ｃ５ａは炎症過程中最も直接的な食細胞誘引物質であるかもしれない。ＰＭＮが炎症部位に浸潤するにつれて、それらは別のケモカイン、例えばＩＬ８を分泌し、それが更に炎症反応を増強する。
【００２２】
連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）は、Ｃ５ａが局所的に生産されると、病原性連鎖球菌の表面上に存在しそこでＣ５ａを破壊するタンパク質分解酵素である。ＳＣＰは、Ｃ５ａ走化性因子をＰＭＮ結合部位のところ（Ｃ５ａのHis67−Lys68残基の間）で特異的に開裂せしめ、Ｃ５ａの最もＣ末端の７残基を遊離させる。ＰＭＮ結合部位のこの開裂は走化性シグナルを除去する。Cleary, P.他、"Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992); Wexler, D.E.他、"Mechanism of action of the group A streptococcal C5a inactivator," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8144-8148 (1985)。
【００２３】
Ａ群連鎖球菌からのＳＣＰは、124,814ダルトンのＭrを有し、且つ多数のグラム陽性菌表面タンパク質に共通である細胞壁固定モチーフを有するズブチリシン様セリンプロテアーゼである。Ｃ５ａペプチダーゼの構造を図１に示す。ストレプトコッカス・ピオゲネスの連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列は既に発表されている。Chen, C. & Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)。ズブチリシンとは異なり、ＳＣＰは非常に狭い基質特異性を有する。この狭い特異性は、両者の触媒ドメイン間に顕著な類似性があることから見ると驚くべきことである。Cleary, P.他、"Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun. 60:5219-5223 (1992)。結合ポケットの両側の残基のように、電荷移動に関係する残基は保存されているが、しかしＳＣＰの残りの残基はズブチリシンの残基とは無関連である。Ａ群連鎖球菌の40種以上の血清型がＳＣＰタンパク質を生産するかまたはその遺伝子を所有することがわかった。Cleary, P.他、"A streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci," Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease p.179-180 (S. Kotami およびY. Shiokawa 編; Reedbooks Ltd., Berkshire, England; 1984); Podbielski, A. 他、"The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structual vir regulon genes," Infect. Immun., 63:9- 20 (1995)。
【００２４】
ＳＣＰの触媒ドメインまたは活性部位は電荷移動系と特異性クレバスから構成される。触媒ドメインとも呼ばれる電荷移動系は、残基Asp130, His193, Asn295およびSer512を含有する（図１と図２）。それらのアミノ酸のいずれか１つの変更、すなわち欠失、挿入または置換が該酵素を不活性化するであろう。他方で、特異性クレバスはSer260, Phe261, Gly262, Ile415, Tyr416およびAsp417により構成されると推定される。これらのアミノ酸の置換は酵素の基質特異性を変更するかタンパク質分解活性を完全に除去し得る。これらのアミノ酸の欠失による変更も酵素を不活性化するだろう。触媒ドメインは、成熟酵素をその活性状態へと折り畳むときに形成されるタンパク質の三次構造に依存する。このドメインはアミノ酸残基の連続直鎖状アレイから構成されない。あるいは、変更は変異体ＳＣＰの結合も減少させることができる。結合は50％、70％または80％さえも減少させることができる。
【００２５】
Ｂ群連鎖球菌に関連するＣ５ａペプチダーゼ酵素も同定されている。Hill, H.R.他、"Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement," J. Immunol. 141:3551-3556 (1988)。scpBヌクレオチド配列の制限マッピングと比較は、scpBがscpAと97〜98％同じであることを示した。Ａ群連鎖球菌血清型49、Ａ群連鎖球菌血清型12、Ｂ群連鎖球菌およびＡ群連鎖球菌血清型１からのＳＣＰのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号23）の比較については図２を参照のこと。Ｂ群連鎖球菌の全血清型に相当する30株以上がscpB遺伝子を担持する。Cleary, P.他、"Similarity between the Group B and A streptococcal C5a Peptidase genes," Infect. Immun., 60:4239-4244 (1992) ; Suvorov A.N.他、"C5a peptidase gene from group B streptococci," Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, p.230-232 (G. Dunny, P. Cleary & L. McKay 編; American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1991)。
【００２６】
Ｇ群およびＣ群連鎖球菌のヒト分離株もscpA様遺伝子を所有する。幾つかのＧ群株はそれらの表面上にＣ５ａ特異的プロテアーゼ活性を発現することが証明された。Cleary, P.P.他、"Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci," Infect. Immun., 59:2305-2310 (1991)。従って、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、Ｃ群連鎖球菌およびＧ群連鎖球菌の全血清型（＞80）がＳＣＰ酵素を生産する。
【００２７】
ＳＣＰは、感染部位への貧食白血球の流入を阻害することにより、連鎖球菌が潜在的感染部位（例えば鼻咽頭粘膜）に定着するのを助ける。これは宿主による連鎖球菌の初期クリアランスを妨げる。プロテアーゼ構造遺伝子中に明確に限定された変異を有する連鎖球菌株を使って、炎症、Ｃ５ａ白血球走化性および連鎖球菌ビルレンス（毒力）に対するＳＣＰの影響を調べた。標的プラスミド挿入によりおよび特定の内部欠失を含むscpAと野性型遺伝子との置換によりＳＣＰ変異体を作製した。それらの変異体はＣ５ａプロテアーゼ活性を欠き、Ｃ５ａに対するヒトまたはマウスＰＭＮの試験管内走化性応答を阻害しなかった。
【００２８】
マウス結合組織気嚢（air sac)モデルを使って、ＳＣＰが貧食細胞の流入および感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせることを確かめた。結合組織気嚢は、25ゲージ注射針を使って少量の空気とＰＢＳ（その中に連鎖球菌を含むかまたは含まない）をマウスの背中の皮下に注入することにより作製する。Boyle, M.D.P. 他、"Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo," Meth. Enzymol. 162:101-115 (1988)。実験の終わりに、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスから気嚢を切開し、気嚢を緩衝液中でホモジナイズした。気嚢モデルの利点は、気嚢が数日間膨張したままであり且つ刺激原を注射しない限り炎症から免れることである。よって、注入した細菌およびそれから生じる炎症反応が短期感染期間に渡って局在化されたままである。
【００２９】
野性型ＳＣＰ+とＳＣＰ-連鎖球菌（すなわち、非機能形の変異型ＳＣＰを有するＡ群連鎖球菌）のクリアランスを比較しそして感染初期の細胞浸潤物を分析するために気嚢モデルを変更した。組織懸濁液を血液寒天平板上で生存可能連鎖球菌について分析し、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）により細胞浸潤物を分析した。ＦＡＣＳ分析法では、懸濁液中の個々の細胞を特異的蛍光モノ抗体で標識する。標識細胞のアリコートをFAC-Scan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器（特有の蛍光に基づいて細胞を計数する）中に注入する。気嚢モデルを使った実験は、ＳＣＰ+連鎖球菌がＳＣＰ-連鎖球菌よりも一層毒性であることを示した。
【００３０】
ヒト血清および唾液中のＳＣＰに対するIgＡとIgＧの両方のヒト抗体の産生を測定する研究を行った。O'Connor, SP他、"The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Dis. 163:109-116 (1991)。一般に、未感染の乳幼児からの血清および唾液はＳＣＰに対する抗体を欠いていた。対照的に、健康な成人からの血清試料と唾液試料の大部分が、測定可能なレベルの抗ＳＣＰ IgＧおよびＳＣＰ特異的分泌IgＡ（抗ＳＣＰ sIgＡ）を有した。連鎖球菌性咽頭炎を有する患者からの急性および回復期の対合血清は、健康な個体からの血清には含まれなかった高レベルの抗ＳＣＰ IgＧを有した。高濃度の抗ＳＣＰ免疫グロブリンを含む血清はＳＣＰ活性を中和することができた。連鎖球菌性咽頭炎に最近かかった小児から得られた唾液試料の＞90％においてこの抗体が検出されたことは、小児が抗体応答を生じ得ることを証明した。
【００３１】
ヒト被検者が自然連鎖球菌感染に応答してＳＣＰに対するIgＧおよびIgＡを生産したとしても、抗ＳＣＰ免疫グロブリンが感染に対する何らかの防御を提供するかどうかはわからなかった。更にＳＣＰタンパク質がβ溶血連鎖球菌の定着または感染に対するワクチンとして機能できるかどうかもわからなかった。まず最初に、鼻咽頭への定着におけるＳＣＰの役割を調べるために実験を行った。生存Ａ群連鎖球菌による鼻腔内感染の後、10日目まで毎日咽頭培養物を採取した。野性型連鎖球菌および同系ＳＣＰ欠損変異型連鎖球菌を、この10日間に渡り咽頭に存続する能力について比較した。予想通り、ＳＣＰ欠損変異型連鎖球菌の方がより迅速に鼻咽頭から浄化された。
【００３２】
同じ鼻腔内マウスモデルを使って、定着を予防する免疫を誘導するＳＣＰの能力を試験した。Thr63をコードするヌクレオチドで始まる組換えscpA49遺伝子の変異型をクローニングした。この変異体をΔＳＣＰＡ49と命名し、それは長さ2908 bpである（下記実施例４参照）。変異体ＳＣＰタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによりＥ．コリ組換え体から精製した。このタンパク質製剤を皮内にワクチン接種したウサギの血清は、試験管内でＳＣＰ活性を中和した。精製タンパク質（40μｇ）を５週間に渡りマウスに鼻腔内投与した。免疫処置マウスは１〜２日間で連鎖球菌を浄化し、一方で非免疫処置マウスの咽頭培養物は10日間まで陽性のままであった。３種の異なるＳＣＰタンパク質製剤をワクチン接種した３組のマウスにおいてこの実験を繰り返した。
【００３３】
単一抗原を使った動物の免疫処置が複数の血清型による定着を予防するかどうかを調べるために別の実験を行った。ΔＳＣＰＡ49を発現ベクター中でクローニングし、Ｅ．コリ中で発現させた。アフィニティー精製した変異体ΔＳＣＰＡ49タンパク質は、マウスおよびウサギにおいて高度に免疫原性であることが証明された。精製変異体ΔＳＣＰＡ49免疫原は酵素活性を欠くけれども、それはＭ１，Ｍ６，Ｍ12およびＭ49連鎖球菌に関連したペプチダーゼ活性を試験管内で中和することができる高力価のウサギ抗体を誘導した。これにより、抗ペプチダーゼ抗体が血清型特異性を欠くことが確かめられた。次いで、４組のマウスを精製済変異体ΔＳＣＰＡ49で免疫処置し、各々を異なる血清型のＡ群連鎖球菌によりチャレンジした。ΔＳＣＰＡ49タンパク質によるマウスの免疫は、有意なレベルの特異的唾液sIgＡ抗体と血清IgＧ抗体の生産を刺激し、そして野性型Ｍ１，Ｍ２，Ｍ６，Ｍ11およびＭ49連鎖球菌の定着力（コロニー形成活性）を減少させた。この実験は、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼワクチンによる免疫処置が鼻咽頭への定着を予防するのに有効であることを確証する。
【００３４】
Ｍ１ ＯＦ-株とＭ49 ＯＦ+株からの変異体ＳＣＰを開発する実験も行った。活性ＳＣＰは宿主に対して有害となり得るので、変異体タンパク質が酵素活性を欠くことは重大であった。触媒活性に必要とされるアミノ酸を、該酵素を不活性化すると予想されるアミノ酸により置き換えた。
【００３５】
変異体タンパク質の２つの性質を評価した。第一に、野生型タンパク質と変異型タンパク質の比活性をＰＭＮ付着アッセイにより測定した。この実験は、置換したアミノ酸が酵素活性を90％超減少させたことを示した。第二に、野生型酵素に対して向けられた抗体を結合する能力について、変異体タンパク質と野生型タンパク質とを比較した。この目的には競合ELISAアッセイを使った。その結果は、アミノ酸置換が変異体タンパク質に結合する抗体の能力を変更しなかったことを示した。
【００３６】
アフィニティー精製したΔＳＣＰＡ49タンパク質をアジュバントなしで鼻腔内投与することにより、初期防御実験を行った。しかしながら、歴史的には、抗原の筋肉内または皮下（ＳＱ）注射が好ましく且つより受け入れられるワクチン投与方法である。従って、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）またはミョウバン（AlPO4）を伴うΔＳＣＰＡのＳＱ注射が防御免疫応答を誘導するかどうか、そしてＡ群連鎖球菌のチャレンジ株がＳＣＰＡワクチンの入手源とは血清型で異なる場合、その応答が定着を減少させるかどうかを調べるために実験を行った。培養によるかまたは鼻組織切片のサンプリングにより、口−鼻咽頭粘膜から連鎖球菌を浄化する免疫マウスの浄化力を評価した。
【００３７】
鼻組織に関係する連鎖球菌の数は、予想通り時間と共に減少し、その減少はＳＣＰＡ抗原で免疫処置したマウスにおいて一層迅速で且つ完全であった。この結果は、単一のＳＣＰＡ抗原が非相同血清型に対しても防御を誘導できることを確証した。防御は、細菌表面上のペプチダーゼ活性を中和する抗体によって供給される。これは、連鎖球菌が粘膜組織上に付着した時点から数時間内に食細胞の流入を増加させる。食細胞による連鎖球菌の迅速なクリアランスは、その後の細菌の増殖や存続を防止すると予想される。かくして、アジュバントを使ったＳＣＰＡのＳＱ注射は一貫して活発な抗体応答を誘導した。
【００３８】
従って、本発明は、β溶血連鎖球菌属の定着または感染に対して哺乳類を防御するために用いられるワクチンを提供する。本発明の一態様では、ワクチンに通例であるように、変異体連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼは薬理学的に許容される賦形剤中で哺乳類に投与することができる。本発明のワクチンは、免疫応答を増強することが知られている有効量の免疫アジュバントを含むこともできる。
【００３９】
ＳＣＰは別のペプチドにもしくは多糖に接合または連結せしめることができる。例えば、当業界で周知である免疫原性タンパク質（「担体」としても知られる）を使うことができる。有用な免疫原性タンパク質としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒトγグロブリン、ニワトリ免疫グロブリンＧ、およびウシγグロブリンが挙げられる。有用な免疫原性多糖類としては、Ａ群連鎖球菌多糖、Ｂ群連鎖球菌からの多糖Ｃ、または肺炎連鎖球菌（Streptococci pneumoniae）の莢膜多糖が挙げられる。あるいは、ワクチンとして用いられる別の病原体の多糖またはタンパク質をＳＣＰに接合もしくは連結せしめることができまたはＳＣＰと混合することができる。
【００４０】
本発明は更に、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼの少なくとも一部分をコードする、すなわち本明細書中に記載のＳＣＰもしくはそれの変異体、例えばＳＣＰＡ49Ｓ512Ａ、ＳＣＰＡ49Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ49Ｎ295Ａ、ＳＣＰＡ１Ｓ512Ａ、ＳＣＰＡ1Ｄ130Ａ、ＳＣＰＡ1Ｎ295Ａ、ΔＳＣＰＡ49、ＳＣＰＢＳ512Ａ、ＳＣＰＢＤ130Ａ、ＳＣＰＢＨ193ＡもしくはＳＣＰＢＮ295Ａ、またはそれらの変異の任意組合せをコードする、予め決められた核酸セグメントを含んでなる単離・精製された核酸分子、例えばＤＮＡ分子を提供する。例えば、本発明は、伝令ＲＮＡ（「標的」ｍＲＮＡ）の全部または一部と実質的に同一（センス）であるＲＮＡ分子（すなわち内因性ＳＣＰ  ｍＲＮＡまたは「生来の」ＳＣＰ  ｍＲＮＡ）をコードする選択されたＤＮＡセグメントを含んでなる発現カセットを提供する。発現カセット中の予め選択されたＤＮＡセグメントはプロモーターに作用可能に連結される。本明細書中で用いる配列に関する「実質的に同一」とは、２つの核酸配列が互いに少なくとも約65％、好ましくは約70％、より好ましくは約90％、更に好ましくは約98％の連続ヌクレオチド配列同一性を有することを意味する。好ましくは、予め選択されたＤＮＡセグメントは、ハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、対応する生来のＳＣＰをコードする核酸分子にハイブリダイズする。
【００４１】
本明細書中で用いる「実質的に純粋」とは、対象の種が優勢存在種である（すなわち、モルに基づいて組成物中の別の個々の種よりもずっと豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に純粋な画分は、対象の種が存在する全巨大分子種の少なくとも約50％（モルに基づき）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、該組成物中に存在する全巨大分子種の約80％、より好ましくは約85％、約90％、約95％、そして約99％超を含んでなるだろう。最も好ましくは、対象の種が本質的に均一にまで精製され（通常の検出方法により組成物中に夾雑種が検出できない）、その場合は組成物は単一の巨大分子種から本質的になる。
【００４２】
本明細書中で用いる「組換え核酸」または「予め選択された核酸」、例えば「組換えＤＮＡ配列またはセグメント」または「予め選択されたＤＮＡ配列またはセグメント」とは、任意の適当な入手源より誘導または単離されており、その配列が天然に存在しないように、または外因性ＤＮＡにより形質転換されてないゲノム中にそれらが位置しているのと同じようには位置しない天然配列に対応するように、続いて試験管内で化学的に変更することができる核酸、例えばＤＮＡを指していう。或る入手源より「誘導された」予め選択されたＤＮＡの一例は、与えられた生物中に有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形で化学合成されるＤＮＡ配列であろう。そのような或る入手源より「単離された」ＤＮＡの一例は、遺伝子操作方法論によって本発明での使用のためにそれを更に操作（例えば増幅）できるように、化学的手法により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により、前記入手源から切除または分離される有用なＤＮＡ配列であろう。
【００４３】
制限消化物からのＤＮＡの特定断片の回収または単離は、電気泳動によるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上での消化物の分離、既知分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度に対する着目の断片の移動度の比較による着目の断片の同定、所望の断片を含むゲル切片の切除、およびＤＮＡからのゲルの分離を利用する。Lawn他、Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981)およびGoeddel他、Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980)を参照のこと。従って、「予め選択されたＤＮＡ」には、完全合成ＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物源から単離されたＤＮＡ配列、およびＲＮＡから誘導されたＤＮＡ配列、並びにそれらの混合物が包含される。
【００４４】
本明細書中でＲＮＡ分子に関して用いる「誘導された」という用語は、ＲＮＡ分子が特定のＤＮＡ分子に対する相補的配列同一性を有することを意味する。
【００４５】
ＳＣＰのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法により調製される。それらの方法としては、非限定的に、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、ＳＣＰの予備調製変異体または非変異体形のオリゴヌクレオチド指令（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
【００４６】
被検体を免疫するために、変異体ＳＣＰは、非経口的に、通常は適当な賦形剤中での筋肉内もしくは皮下注射により、投与される。しかしながら、別の投与方法、例えば経口投与または鼻腔内投与も受け入れられる。有効量は、β溶血連鎖球菌定着の発生を予防、改善または低減するのに十分な量である。ワクチン製剤は賦形剤中に有効量の活性成分を含有するだろう。その有効量は当業者により容易に決定され得る。活性成分は典型的には組成物の約１％〜約95％(w/w)の範囲であり、または適当ならばそれより多くまたは少なくてもよい。投与すべき量はワクチン接種を考えている動物またはヒト被検体の年齢、体重および体調といった要因に依存する。投与すべき量は抗体を産生する動物の免疫系の能力、および所望する防御の度合にも依存する。有効量は用量応答曲線を作成する通常の試験を通して当業者により容易に決定することができる。まずＳＣＰまたはその断片を１回または複数回投与することにより被検者を免疫する。連鎖球菌に対する免疫の状態を維持するために必要とされるように多数回量投与してもよい。
【００４７】
鼻腔内用製剤は、鼻粘膜に刺激を引き起こしたり繊毛機能を有意に妨害したりしない賦形剤を含むことができる。希釈剤、例えば水、食塩水または既知の他の物質を本発明と共に使用できる。鼻用製剤は、非限定的にクロロブタノールや塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含んでもよい。鼻粘膜による目的タンパク質の吸収を高めるために界面活性剤が存在してもよい。
【００４８】
経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性の懸濁液剤、液剤、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形であってもよく、あるいは錠剤形に乾燥した製品としてまたは使用前に水もしくは他の適当な賦形剤で再構成される製品として提供してもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤（食用油を含んでもよい）または保存剤といった常用の賦形剤を含んでもよい。
【００４９】
ワクチンを調製するために、精製ＳＣＰを単離し、凍結乾燥しそして安定化することができる。次いでＳＣＰペプチドを適当な濃度に調整し、所望により適当なワクチンアジュバントと組合せ、そして使用のために包装することができる。適当なアジュバントとしては、非限定的に、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール；ポリアニオン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ＭＰＬ、ジメチルグリシン、タフトシン、油状乳剤、ミョウバン、並びにそれらの混合物が挙げられる。別の可能なアジュバントとしては、Ｅ．コリ熱不安定性毒素のまたはコレラ毒素のＢペプチドサブユニットが挙げられる。McGhee, J.R.他、"On vaccine development," Sem. Hematol., 30:3-15 (1993) 。最終的に、免疫原性生成物はワクチン製剤用のリポソーム中に組み込まれるか、あるいはアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなタンパク質または他のポリマーに接合することができる。
【００５０】
定着に対抗する哺乳類のワクチン接種のためのＳＣＰの使用は、他のワクチン候補を上回る利点を提供する。単一タンパク質の接種による定着または感染の予防は、連鎖球菌性咽頭炎および膿痂疹のごく一般的な問題の発生を減らすだけでなく、リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、中毒性ショックおよび壊死性筋膜炎といった続発症も排除するだろう。
【００５１】
下記の実施例は本発明を例証するためのものであって制限するためのものではない。
【００５２】
実施例１
scpA49およびscpA6の挿入変異体と欠失変異体の作製並びに試験管内分析
a)  菌株および培養条件。Ｓ．ピオゲネス CS101株は、血清型Ｍ49で血清乳白度陽性（ＯＦ+）株である。CS159は、Ｍ遺伝子クラスターとscpAを通って広がる欠失を有する臨床分離株である。CS101株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体であるCS101Smは、ストレプトマイシン（200μg/ml）を含むトリプトース血液寒天培地上で定常期培養物から連鎖球菌を平板培養することにより選択された。連鎖球菌CS210株とCS463株は、ＯＦ+、クラスII、それぞれ血清型Ｍ２およびＭ11株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体株である。連鎖球菌90-131株とUAB200株は、Ａ群連鎖球菌のＯＦ+、クラスＩ、それぞれ血清型Ｍ１とＭ６のヒト分離株である。
【００５３】
CS101::pG+host5 は、未知の位置であるがただしscpAとemm遺伝子クラスターの外側においてpG+host5 が染色体中に組み込まれているCS101株である。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ER1821株（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから入手）を、自己不活化ベクタープラスミドpG+host5のための受容細胞として使用した。プラスミドpG+host5はAppligene, Inc., Pleasanton, CAから入手した。連鎖球菌は２％ネオペプトンもしくは１％酵母エキスが補足されたトッド−ヒューイットブロス中で、または５％ヒツジ血液を含むトリプトース寒天平板上で増殖させた。プラスミドpG+host5を含有するＥ．コリ ER1821株は、エリスロマイシン（300μg/ml）を含むＬＢブロス中で増殖させた。プラスミドpG+host5を含有する連鎖球菌は、１μg/mlのエリスロマイシン(Erm)含有１％酵母エキスが補足されたトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＹ）中で増殖させた。
【００５４】
ＳＣＰは、一般的にβ溶血連鎖球菌属からの連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼのことを言う。ＳＣＰＡ１，ＳＣＰＡ12，ＳＣＰＡ49およびＳＣＰＡ６はそれぞれＡ群連鎖球菌Ｍ血清型１，12, 49および６株からの特異的ペプチダーゼである。scpAという語は、Ａ群連鎖球菌からのＳＣＰをコードする遺伝子のことを言う。scpA1, scpA12, scpA6およびscpA49は、それぞれＳＣＰＡ１，ＳＣＰＡ12，ＳＣＰＡ49およびＳＣＰＡ６ペプチダーゼをコードする遺伝子である。ＳＣＰＢおよびscpBは、Ｂ群連鎖球菌からのペプチダーゼと遺伝子である。ＳＣＰＡ49（配列番号１）、ＳＣＰＡ12（配列番号２）、ＳＣＰＡ１（配列番号23）およびＳＣＰＢ（配列番号３）のアミノ酸配列は図２に与えられる。
【００５５】
b)  scpA49挿入変異体の作製。プラスミド挿入および遺伝子置換法を使って、明確なscpA49挿入変異体を作製した。挿入標的である内部scpA49 BglII-BamHI断片を、熱感受性シャトルベクターpG+host5中に連結せしめてプラスミドpG::scpA1.2を作製し、それをＥ．コリ ER1821中に形質転換せしめた（図３）。pG+host5ベクターは、39℃で活性であるＥ．コリ複製開始点、温度感受性グラム陽性（Gram+）複製開始点（連鎖球菌中で30℃で活性であり39℃で不活性である）、および選択用のエリスロマイシン耐性遺伝子を含有する。高温は、10-2〜10-3の範囲の頻度での相同組換えによりＡ群連鎖球菌の染色体ＤＮＡ中に該プラスミドを強制的に組み込ませる。
【００５６】
組換えプラスミドＤＮＡ pG::scpA1.2をCS101受容細胞中にエレクトロポレーション移入せしめた。形質転換体を１μg/mlエリスロマイシンを含むＴＨＹ−寒天平板上で30℃にて選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpA49との間での組換えから生じた染色体組込み体を、39℃にてエリスロマイシン耐性により選択した。２つの挿入変異体Ｍ14とＭ16を分析した。抗生物質を含まないＴＨＹ中での30℃での継代によりＭ14およびＭ16株のEmrS復帰変異体を得、最後にErm選択を使わずに37℃で平板培養した。プラスミドを失ってしまったコロニーを単離して、変異体の表現型が無関係の自然変異ではなくてscpA49中へのプラスミドの挿入に起因することを確かめた。
【００５７】
c)  scpA6挿入変異体の作製。上記項目(b)に記載したのと同様にscpA6挿入変異体 AK1.4を作製した。組換えプラスミドＤＮＡであるpG::scpA1.2は、scpA遺伝子の内部BglII-BamHI断片を含有する。このプラスミドをUAB200受容細胞中にエレクトロポレーション移入せしめ、そしてエリスロマイシンを含有するＴＨＹ寒天平板上で30℃にて形質転換体を選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpA6との間の組換えから生じたpG::scpA1.2の染色体組込み体AK1.4株は、エリスロマイシンを含有する寒天培地上での39℃での増殖により選択した。scpA6中への挿入は、プローブとしてscpAを使ったサザンブロッティングと、該プラスミドに特異的なＭ13万能プライマー（5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'）（配列番号６）とＧＡＳの染色体scpAに特異的なscpA For835プライマー（5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3'）（配列番号７）を使ったＰＣＲにより確かめた。
【００５８】
d)  scpA中への明確な欠失の導入（図３）。scpA49中への挿入が正反対であるために下流遺伝子（細菌のビルレンスに寄与する可能性もある未知の遺伝子）の発現を低下させ得るという可能性を取り除くために、scpAの内部に明確な欠失を有する変異体株を作製した。まず第一に、
【化１】
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【００５９】
を使った裏返し（inside-out）ＰＣＲ法によりscpAのBglII-HindIII断片中に限定欠失を作った。下線を引いたヌクレオチドは、それぞれ座標2398および2322を有するscpA配列に相当し、そしてボールド体のヌクレオチドはEcoRI認識部位に相当する。これらのプライマーは、scpA遺伝子中に枠内（in-frame）欠失を製造するために選択された。これらのプライマーは反対方向でプラスミドＤＮＡを複製し、欠失の境界を限定する。Innis, M.A. 他編、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990)。プラスミドpG::scpA1.2 ＤＮＡを鋳型として使った。
【００６０】
増幅生成物をEcoRIで消化し、プラスミドpG+host5中に連結せしめた。得られたプラスミドpG::ΔscpA1.1は、scpAの内部に76 bp の欠失を含んだ。この枠内欠失は、セリンプロテアーゼの推定触媒中心の一部を構成するセリンを含む、25アミノ酸を除去した。Chen, C. & Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)。欠失の箇所にEcoRV部位が作製された。この欠失部と重複するＤＮＡを配列決定して、この欠失の境界を確かめた。
【００６１】
欠失を含むプラスミドpG::ΔscpA1.1 をＥ．コリ ER1821中に形質転換せしめた。ErmRについてコロニーを選択し、次いでEcoRIによって制限したミニプレプ・プラスミドＤＮＡを使って適当なscpA欠失についてスクリーニングした。正確な欠失境界線をＤＮＡ配列分析により確かめた。プラスミドpG::ΔscpA1.1を上述のCS101Sm株中にエレクトロポレーションにより導入し、次いで39℃でのErm上での増殖により組込み体を選択した。Ｍ49株CS101Smの染色体中へのプラスミドの組込みは高温選択を使った。ＰＣＲにより挿入位置を確かめた。エリスロマイシン選択を使わない低温でのCS101Sm(pG::scpA1.1)の増殖は、ランダム欠失現象によるかまたは挿入によって生じる重複したscpA配列間での組換えから起こる切除によりプラスミドを失ってしまったErmS復帰変異体の高頻度分離を引き起こした。２つの欠失変異体、MJ2-5およびMJ3-15が同定され、それらを更に研究した。プラスミドpG::scpA1.1の組換え切除により後に残された染色体欠失を、ＰＣＲ法とEcoRVで消化したＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーション法により明らかにした。
【００６２】
e)  ＳＣＰに対する変異の試験管内効果。ＳＣＰ抗原の発現およびペプチダーゼ活性に対する挿入と欠失の影響をウエスタンブロットとＰＭＮ付着アッセイにより評価した。連鎖球菌を100 mlのＴＨＹ中で37℃にて一晩インキュベートした。培養ペレットを５mlの冷0.2 M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)中で２回洗浄し、次いで１mlのＴＥ−ショ糖緩衝液（20％ショ糖, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.0）および40μｌのムタノリシン中に懸濁した。この混合物を37℃で２時間回転させ、次いで4500 rpmで５分間遠心分離した。上清はプロテアーゼ阻害剤として100 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含んだ。Laemmli, U.K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227:680-685 (1970) に記載された通りに、電気泳動およびウエスタンブロット法を実施した。ウエスタンブロットおよびコロニーブロット上でＳＣＰタンパク質を検出するために用いる一次抗血清は、精製済の組換えＳＣＰタンパク質でのウサギの免疫処置によって調製した。結合は抗ウサギ抗体−アルカリホスファターゼ接合体により検出した。
【００６３】
Ｃ５ａペプチダーゼ活性はＰＭＮ付着アッセイを使って測定した。Booth, S.A.他、"Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherence function," J. Invest. Dermatol. 98:135-140 (1992)。Ｃ５ａ（Sigma, St. Louis, MO）を連鎖球菌抽出物または精製プロテアーゼと共にインキュベートした後、残余Ｃ５ａはＰＭＮを活性化してＢＳＡ被覆ウエルに付着させることができる。初めに、マイクロタイタープレートウエルをＰＢＳ中0.5 ％ＢＳＡで被覆し、37℃で１時間インキュベートした。フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（Sigma, St.Louis, MO）中での遠心分離によりヒトＰＭＮを単離した。40μｌのそのままの連鎖球菌またはタンパク質抽出物を、１％グルコースと0.1 ％CaCl2を含むＰＢＳ 340μl中で、20μlの５μM Ｃ５ａと共に37℃で45分間インキュベートした。ＢＳＡ被覆ウエルをＰＢＳで洗浄し、ＰＭＮを再懸濁させ、次いでウエルに残余Ｃ５ａを添加した。この混合物を７％CO2中で37℃で45分間インキュベートした。最後に、ウエルを洗浄して非付着性ＰＭＮを除去した。付着性ＰＭＮをクリスタルバイオレットで染色し、ELISA リーダー中でＯＤ570nmを読み取った。光学濃度は残余Ｃ５ａの量に比例し、またはＳＣＰ活性の量に反比例する。
【００６４】
親および変異体培養物からの細胞表面タンパク質のムタノリシン抽出物を、ＳＣＰＡ特異的血清を使ったウエスタンブロットにより分析した。変異体はＳＣＰＡを欠いていることが確かめられた。ＳＣＰＡ-変異体AK1.4とMJ3-15の抽出物は抗ＳＣＰＡ血清と反応しなかった。野生型株CS101とUAB200からの抽出物には予想通りのサイズのＳＣＰＡタンパク質が観察された。変異体株AK1.4とＭJ3-15がＣ５ａペプチダーゼ活性を生産できないことは、rhＣ５ａを分解するそれらの能力を比較することにより確認した。rhＣ５ａへの分離ＰＭＮの暴露により、ＰＭＮがＢＳＡ被覆マイクロタイタープレートに付着するように誘導した。連鎖球菌ＳＣＰＡまたは精製ＳＣＰＡとのインユベーションはrhＣ５ａを特異的に開裂させ、そしてＰＭＮを活性化する能力を変更した。残余rhＣ５ａに反応しそしてＢＳＡ被覆ウエルに結合したＰＭＮを染色し、次いで分光光度測定した。親培養物UAB200およびCS101とrhＣ５ａとのインキュベーションはrhＣ５ａを破壊し、ＰＭＮ付着をそれぞれ58.8％と54.5％だけ阻害した。対照的に、ＳＣＰＡ-変異体AK1.4とMJ3-15はrhＣ５ａを変更せず、ＢＳＡ被覆ウエルへのＰＭＮの付着も変更しなかった（表１）。この実験をウエスタンブロットにより確かめると、ＳＣＰＡ-培養物がrhＣ５ａを分解し得る別のプロテアーゼを欠いていることが証明された。
【００６５】
【表１】
0005122703.tif 000003
【００６６】
scpA中の突然変異によりＭタンパク質発現が影響を受けると予想しなかったけれども、ＳＣＰＡ-変異体連鎖球菌がまだＭタンパク質を発現しそして貧食に耐える能力を有するかどうかを評価するためにアッセイを行った。３時間のインキュベーションの間の新鮮なヒト血液中での連鎖球菌の増殖は、それらの表面上に抗貧食性Ｍタンパク質の存在を示す。R.C. Lancefield, "Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test," J. Exp. Med., 106, pp.525-685 (1957)。予想通り、親の連鎖球菌UAB200とCS101は、それぞれ40倍と49倍増加した（表１）。Ｍ+ＳＣＰＡ-培養物であるAK1.4株とMJ3-15株は、それぞれ37.5倍と14倍増加した。このことは、scpA突然変異がＭタンパク質発現とヒト全血中での貧食に対する耐性にほとんど影響を与えないことを確証した。両変異体株が幾分乏しい増殖を有することは再現性があり予想外のことであった。ヒト血漿中での変異体と親培養物の増殖速度は区別できなかった。ＳＣＰＡの不活性化がＣ５ａを循環血液中に蓄積可能にし、次いでそれがＰＭＮを活性化したという可能性がある。活性化したＰＭＮはより貧食性になり、Ｍ+連鎖球菌をより殺傷することができる。表面タンパク質抽出物は、抗Ｍ49抗血清と抗Ｍ６抗血清を使ったウエスタンブロットにより分析するとＭ６およびＭ49抗原を含有する。この結果は、ＳＣＰＡ中の突然変異がＭタンパク質発現を変更しないことを確証する。
【００６７】
実施例２
ＳＣＰは食細胞の漸増および皮下感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせる
ＳＣＰがＣ５ａの不活性化を招くことを確かめるために、上記実施例１に記載した通りにscpA49の挿入変異体および欠失変異体を作製し、そして活性試験した。scpA49中に挿入または欠失を導入すると、変異体ＳＣＰはマイクロタイタープレートへのＰＭＮのＣ５ａ活性化付着を破壊することができなかった。
【００６８】
ビルレンスに対するscpA49変異の影響を、連鎖球菌が局在化されたままでありそして炎症細胞の流入を分析することができる動物モデルを使って試験した。ＳＣＰがごく初期に該微生物の浄化を遅らせる働きをするという仮定を検証するために、結合組織気嚢の接種後ちょうど４時間目にＳＣＰ+およびＳＣＰ-連鎖球菌の量を比較した。更に、この感染から短期間後のリンパ節および脾臓への連鎖球菌の散在も評価した。
【００６９】
Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MAから入手したＣＤ１非近交系雄マウス（25 g）を全ての実験に使用した。結合組織気嚢は、25ゲージの注射針を使ってマウスの背中の皮膚の下に空気0.9 mlとＰＢＳ中に希釈したＡ群連鎖球菌0.1 mlを注入することにより作製した。ある実験では、陽性対照としてＳＣＰ+ CS101::pG+host5を使った。別の実験では陽性対照としてCS101Sm株を使った。感染後４時間目に頸部脱臼によりマウスを安楽死させた。指示した場合、４つの鼠径部リンパ節、脾臓および気嚢を動物から切開し、ＰＢＳ中でホモジナイズした。組織懸濁液を、１μg/mlエリスロマイシンまたは200 μg/mlストレプトマイシンを含む血液寒天平板上で生存可能コロニー形成単位（ＣＦＵ）についてアッセイした。
【００７０】
予備実験において、気嚢をスライド上に固定し、ライト染料により染色し、顕微鏡検査した。この方法による顆粒球数は信頼できないけれども、固定化組織の中の残余ＳＣＰ-は野性型連鎖球菌よりも有意に少ないように見えた。この差を測るための試みとして追加の実験を行った。気嚢をＰＢＳ中で粉砕することにより気嚢の分散細胞集団を調製し、それらをナイロンモノフィラメントメッシュ
（TETKO Co, New York）に通した。
【００７１】
300×gで５分間の遠心により細胞をペレットにし、それをFACS緩衝液（フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶液、0.1％NaN3、1.0％ＢＳＡ画分Ｖ）中に５×106／mlの密度に再懸濁した。細胞（1.0 ×106個）を１μgのFITC抗マウスMac-1で直接染色するかまたは１μgのビオチン接合抗マウスGr-1に続いて蛍光もしくはFITCで標識した１μgのストレプトアビジンにより間接染色した。モノクローナル抗体Mac-1とGr-1はPharmingen, Inc., CA から入手した。標識細胞を1.0％パラホルムアルデヒド中で固定した。FAC-Scan流動細胞計測器（フローサイトメーター）とConsort 32ソフトウエア（Becton Dickinson）を使って蛍光プロフィールを作成した。マウスＰＭＮを全血からフィコール−ハイパック密度勾配遠心により精製し、混成細胞集団中の限定されたＰＭＮのための標準として使用した。特異的に標識された細胞の測定用に、各抗体マーカーについて平均蛍光を測定し、強く標識された細胞を映し出すためにゲートを設定した。対照は未染色の細胞、およびストレプトアビジン−FITCにのみ暴露された細胞を含んだ。
【００７２】
２つの実験を実施した。第一はscpA49挿入変異体Ｍ16をそれのＳＣＰ+親培養物であるCS101株と比較した。第二はscpA49欠失変異体ＭJ3-15を、それの親であるCS101Sm株と比較した（表２）。両実験とも、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種したマウスからホモジナイズした気嚢は、野性型連鎖球菌を接種した気嚢よりも、４時間後の連鎖球菌の数が少なかった。第一の実験は２分の１への減少を示し、第二の実験は４分の１への減少を示した。その差は、不対（Unpaired）ｔ検定を使った場合にそれぞれＰ＜0.05およびＰ＜0.001で統計的に有意であった。野性型ＳＣＰ+連鎖球菌が８匹のマウスのうちの７匹および８匹のマウスのうちの６匹からの脾臓ホモジネートにおいて検出され；一方、ＳＣＰ-変異体は脾臓中にまれにしか検出されなかった。リンパ節ホモジネートの場合は全く逆であった。ＳＣＰ-連鎖球菌を接種した16匹のマウスのうち10匹からのリンパ節が生存可能な連鎖球菌を有していたのに対し、野性型連鎖球菌を感染させた16匹のマウスのうちのわずか４匹のリンパ節が生存可能菌を含んでいた。この差はフィッシャーの精密検定を使ってＰ＜0.05において統計的に有意であると決定された。
【００７３】
【表２】
0005122703.tif 000004
【００７４】
気嚢からの連鎖球菌のより迅速なクリアランスはＰＭＮの強力な漸増に起因していた。気嚢中の全細胞集団数、Mac-1陽性顆粒球の比率〔Springer, G.他、"Mac-1: macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody," Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)〕、およびGr-1陽性ＰＭＮの比率〔Brummer, E.他、"Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungal killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in virto," J. Leuko. Bio. 36:505-520 (1984)〕を、単色FACS分析により比較した。Clark, J.M., "A new method for quantitation of cell-mediated immunity in the mouse," J. Reticuloendothel. Soc. 25:255-267 (1979) 。簡単に言えば、FACS分析において、懸濁液中の個々の細胞を特異的な蛍光単一抗体で標識する。標識された細胞のアリコートをFAC-Scan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器に注入し、それらの特有の蛍光に基づいて細胞数を計測する。
【００７５】
ＳＣＰ-欠失変異体を感染させた気嚢は、ＳＣＰ+連鎖球菌を接種したものの２倍の数の炎症細胞を含んでいた（図４）。接種サイズを100倍にしてもこの差に変化はなかった。１×106個のＳＣＰ-細胞（ＭJ3-15株）を感染させた気嚢は、ＳＣＰ+培養株を接種したものの３倍の数のGr-1陽性細胞を含んでいた。ＳＣＰ+連鎖球菌を接種した気嚢では、細胞の約６％がＰＭＮであり21％が別の種のMac-1+顆粒球（ＰＭＮを含む）であった。対比して、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種した気嚢は卓越的にＰＭＮを含んでいた。Gr-1陽性細胞はMac-1陽性細胞の数に等しいかまたはそれより多数であった。流動細胞計測器のゲートを高染色性顆粒球のみを測定するように設定した。いずれの抗体でも染色されなかった残りの70〜80％の細胞は多分、低染色性顆粒球、赤血球またはリンパ球のいずれかであるだろう。ライト染料で染色した気嚢調製物中に多数のリンパ球が顕微鏡下で観察された。
【００７６】
脾臓ホモジネートから出現した連鎖球菌のＳＣＰ+コロニーは、多くが莢膜に包まれており、水滴に似ていた。対照的に、リンパ節から生じた少数のＳＣＰ-コロニーは、より接種材料に似ていた。それらは非粘液性コロニーと中程度に粘液性のコロニーの混合物であった。これらのデータは、Ｍ+ＳＣＰ+莢膜封入連鎖球菌が感染後４時間以内に適応し、増殖しそして血流中に侵入することを示唆する。変異型連鎖球菌と野性型連鎖球菌の差別的往来（trafficking）の基本は、ＳＣＰ-菌に反応した食細胞の激しい流入のためであるかもしれない。マクロファージおよび／または皮膚樹状細胞がＳＣＰ連鎖球菌をより迅速に吸い込み、そしてそれらをリンパ節に運ぶのかもしれない。野性型に比較した変異型連鎖球菌の減少は意外な発見である。何故なら、ＳＣＰ-連鎖球菌はＭ+であり、試験管内のヒト好中球による貧食に耐性であるからである。
【００７７】
実施例３
ＳＣＰはマウス鼻咽頭への定着に必要である
野性型（ＳＣＰ+）およびＳＣＰ-連鎖球菌が鼻咽頭に定着する相対能力を評価するためにマウスの鼻腹腔内に接種した。ストレプトマイシン耐性Ｍ49株CS101および欠失変異体ＭJ3-15をこの実験に使用した。独特にマウス毒性であるが、動物体内での存続がもはやＭタンパク質および／またはＳＣＰに依らないかもしれない変異体の選択を避けるために、培養物をマウスに継代しなかった。
【００７８】
20％正常ウサギ血清を含むトッド−ヒューイットブロス中で増殖させ次いで10μｌのＰＢＳ中に再懸濁したチャレンジ連鎖球菌株（１×108〜９×108 CFU）の16時間培養物を、25ｇの雌CD1（Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA）またはBALB/cマウス（Sasco, Omaha, NE）に鼻腔内投与した。培養物の希釈液を血液寒天平板上で平板培養することにより、生存菌数を計数した。接種後６〜10日間に渡り、麻酔ウマウスから咽喉スワブを採取し、200μg/mlのストレプトマイシンを含有する血液寒天平板上に画線した。37℃で一晩インキュベートした後、平板上のβ溶血コロニーの数を計数した。全チャレンジ株は、正常細菌叢中で存続できるβ溶血菌と区別するためにストレプトマイシン耐性によりマーキングした。咽喉スワブをストレプトマイシン含有血液寒天上で培養した。１つのβ溶血コロニーの存在を陽性培養とみなした。
【００７９】
CD1非近交系マウスに２×108ＣＦＵの定常期連鎖球菌を鼻腔内に接種した。麻酔したマウスの鼻咽頭から８〜10日間毎日スワブ標本をとり、スレプトマイシンを含む血液寒天上に画線した。ＳＣＰ+とＳＣＰ-の差は第１日目までに明らかであったが、しかし統計的に有意な差は第３日および第４日目までは観察されなかった（図５）。第４日目までに、Ｍ+ＳＣＰ+連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中９匹が陽性の咽喉培養物を生じたのに対して、Ｍ+ＳＣＰ-連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中２匹しか咽喉中に連鎖球菌を保持していなかった。18匹中４匹のマウスがＳＣＰ+連鎖球菌感染後に死亡した。ＳＣＰ-連鎖球菌感染後には１匹も感染により死ななかった。血液寒天平板上のコロニーの数もＳＣＰ-連鎖球菌の一層迅速なクリアランスと一致していた。例えば、第３日目に、７匹のマウスからの培養物が＞100 ＳＣＰ+ ＣＦＵを含んだのに対し、ＳＣＰ-連鎖球菌を接種したマウスでは１匹だけが＞100 ＣＦＵを含んでいた。
【００８０】
Ｍ49連鎖球菌は皮膚感染に頻繁に関連づけられるので、上記実験をＭ６株、すなわち咽喉感染と頻繁に関連づけられる血清型、を使って上記実験を繰り返した。Ｍ６株UAB200と実施例１に上述した方法を使って、挿入変異体AK1.4株を作製した。AK1.4株もまた、野性型Ｍ６培養物よりも迅速に鼻咽頭から浄化された（図６）。上記実験は、マウス鼻咽頭中でのＡ群連鎖球菌の存続がＳＣＰに依存するということを確証する。上記実験に使用した全てのＳＣＰ-変異体がＭ+であり、すなわち新鮮なヒト血液による食作用に耐性であった。それでもなお、それらは鼻咽頭から浄化された。
【００８１】
実施例４
精製組換えＳＣＰＡ49によるマウスの鼻腔内免疫処置は鼻腔内チャレンジ後の定着を防止する
a)  Thr63からHis1031までをコードする組換えワクチンΔＳＣＰＡ49の作製（図２および図７）
scpA49遺伝子の先端欠失形に相当するＰＣＲ断片を、CS101 Ｍ49型Ａ群連鎖球菌（ΔＳＣＰＡ49）からクローニングした。この断片を、ヌクレオチド1033で始まる正プライマーとヌクレオチド3941で始まる逆プライマーを使ってＰＣＲにより増幅させた〔番号付け法はChen, C. & Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol.Chem., 265:3161-3167 (1990)の方法に従った〕。該ＰＣＲ断片をPharmacia Inc.からのpGEX-4T-1高発現ベクター上のグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子のトロンビン結合部位に連結せしめた。scpA断片を含むpJC6と命名したプラスミドをブダペスト条約の規定に基づいてATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）（Rockville, MD）に寄託し、ATCC受託番号98225 が付与された。
【００８２】
scpA49の2908 bp断片であるΔＳＣＰＡ49を、BamHI認識配列を含むscpA49正プライマー（5'-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3'）（配列番号８）とscpA逆プライマー（5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3'）（配列番号９）を使ったＰＣＲにより増幅せしめた。得られたＰＣＲ生成物から、ＳＣＰＡタンパク質のシグナルペプチドと膜固定領域をコードする配列を削除した。ＰＣＲ生成物をBamHIで消化し、そしてPharmacia Inc. (Piscataway, NJ）からのpGEX-4T-1高効率発現ベクター上のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子のトロンビン認識部位の中のBamHI制限部位とSmaI制限部位に連結した。得られた組換えプラスミドを用いてＥ．コリDH5αを形質転換せしめた。１つの形質転換体Ｅ．コリ(pJC6)からのΔＳＣＰＡ49融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース４Ｂカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１つのＥ．コリクローンからトランスフェラーゼ−ＳＣＰ融合タンパク質を発現させ、グルタチオン−セファロース４ｂカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全ての方法が製造業者により記載されている。ハイブリッドタンパク質からトロンビン消化によりΔＳＣＰＡ49を開裂せしめた。ベンズアミジン−セファロース６Ｂカラム(Pharmacia)上でのクロマトグラフィーにより溶出したＳＣＰからトロンビンを除去した。トロンビンでの消化後、ベンズアミジン−セファロース６Ｂカラム(Pharmacia)上でのクロマトグラフィーによりトロンビンを除去した。発現方法と精製方法は製造業者により記載されている。アフィニティー精製されたタンパク質はSDS-PAGEとウエスタンブロットにより純粋なΔＳＣＰＡ49であることが確認された。このアフィニティー精製済みの先端欠失ΔＳＣＰＡ49タンパク質は、ＰＭＮ付着アッセイにより試験するとペプチダーゼ活性を欠いていた（上記実施例１に記載）。ウサギを使って精製ΔＳＣＰＡ49に対して向けられた高度免疫抗血清を調製した。
【００８３】
b)  免疫およびチャレンジプロトコル。
10μｌのＰＢＳ中20μgのアフィニティー精製済ΔＳＣＰＡ49タンパク質を各外鼻孔に投与することにより、４週齢の非近交CD1雌マウスを免疫した。一日おきに３回マウスを免疫し、３回目の免疫の３週間後に再び追加免疫した。２週間の休止後、マウスを再び追加免疫した。D. Bessen他、"Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitope of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci," Infect. Immun., 56, pp.2666-2672 (1988)。対照マウスにはＰＢＳのみを投与した。感染前に、ΔＳＣＰＡ49タンパク質で免疫した全てのマウスがそれらの血清および唾液中に高力価のΔＳＣＰＡ49抗原に対する抗体を有することがELISA により測定された。Ａ群連鎖球菌のCS101株（2.0×108 ＣＦＵ）、CS210株（3.6×108 ＣＦＵ）、CS463株（7.8×108 ＣＦＵ）、90-131株（3.4×108 ＣＦＵ）およびUAB200株（9.6×108 ＣＦＵ）を使って、最後のワクチン注射後７日目にマウスを鼻腔内的にチャレンジした。動物実験はNational Institute of Health ガイドラインに沿って実施した。
【００８４】
c)  試料収集とELISA。
免疫処置後に麻酔したマウスから血液試料と唾液試料を採取した。全ての血清を上述した通りにELISA によってＳＣＰＡ49抗体の存在について試験した。S.P.O'Connor 他、"The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptides," J. Infect. Dis., 163, 109-116頁（1990）。0.05Ｍ炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）中500 ngの精製タンパク質を添加することにより、精製済ＳＣＰＡ49タンパク質をマイクロタイターウエルに結合させた。４℃で一晩インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、ＰＢＳ中0.5％ＢＳＡを使って１時間ブロックした。100 μｌの0.1％ピロカルピン(Sigma)溶液の皮下注射によりマウスにおいて唾液分泌を刺激した。唾液試料を採取し、エッペンドルフ超遠心管中で14,000 rpmにて５分間回転させた。その上清をΔＳＣＰＡ49タンパク質に対する分泌型IgＡの存在についてELISAにより試験した。ELISA力価は、ＯＤ405≧0.1を有した各血清および唾液の最大希釈度を表す。
【００８５】
d)  ΔＳＣＰＡ49に対する抗体応答の評価
サブユニットΔＳＣＰＡ49ワクチンの免疫原性を評価した。ウサギを精製ΔＳＣＰＡ49により免疫した。ELISAにより測定するとそのウサギはΔＳＣＰＡ49タンパク質に対する高レベルの抗体を産生した。精製ΔＳＣＰＡ49免疫原は機能的活性を欠いているにもかかわらず、高度免疫ウサギ抗血清は試験管内で精製済の野性型ＳＣＰＡ49酵素のペプチダーゼ活性を中和することができた。更に、ΔＳＣＰＡ49タンパク質に対する未希釈のウサギ抗血清は非相同の血清型に関連するＣ５ａペプチダーゼ活性を中和することができた。無傷のＭ１，Ｍ６およびＭ12連鎖球菌に関連するＣ５ａペプチダーゼ活性がこの抗血清によって阻害されたことは、ΔＳＣＰＡ49タンパク質に対する抗体が血清型特異性を欠いているということの確証である。
【００８６】
また、10匹の免疫処置マウスと10匹の対照マウスから血清試料と唾液試料を採取し、アジュバント無しで鼻腔内ルートによって投与した時のΔＳＣＰＡ49タンパク質の免疫原性を評価した。精製ΔＳＣＰＡ49タンパク質で免疫処置したマウスは、ＰＢＳを投与した対照マウスに比べて高力価のΔＳＣＰＡ49特異的IgＧを血清中に産生した（図９）。ΔＳＣＰＡ49に対して向けられた血清IgＧの力価は、１：10,240〜１：20,480であった。対比して、対照マウスのΔＳＣＰＡ49特異的IgＧ力価は血清中に検出できなかった。精製ΔＳＣＰＡ49タンパク質で免疫処置したマウスは、対照マウスに比較してΔＳＣＰＡ49特異的唾液sIgＡの有意な増加も示した。免疫処置マウスの唾液中の特異的sIgＡ力価は１：16よりも大きかった。対比して、対照マウスの唾液中のΔＳＣＰＡ49特異的sIgＡは検出できなかった。それぞれ1/2560希釈した血清中および1/2希釈した唾液中のIgＧおよびsIgＡの相対濃度を図９に示す。これらの結果は、精製ΔＳＣＰＡ49タンパク質が、鼻腔内投与するとマウスに特異的な全身性抗体応答および分泌型抗体応答を誘導する有効な免疫原であることを証明する。
【００８７】
e)  感染マウスからの連鎖球菌の浄化に対するワクチンΔＳＣＰＡ49の効果
Ｃ５ａペプチダーゼでの免疫処置が鼻咽頭からの連鎖球菌の浄化（クリアランス）を増強するかどうかを調べるために実験を行った。高レベルの抗ＳＣＰＡ抗体を含む高度免疫ウサギ血清およびヒト血清の両方が試験管内でＳＣＰＡ活性を中和することができる。S.P. O'Connor 他、"The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Dis., 163, 109-116 (1990)。ＳＣＰＡが口腔粘膜への定着を有意に促進するという事実は、精製ΔＳＣＰＡ49によるマウスの免疫処置が連鎖球菌の鼻咽頭定着能力を低下できたことを示唆する。この可能性を調査するために、アフィニティー精製した遺伝子不活性化ＳＣＰＡによりマウスを鼻腔内免疫処置した。先端切除タンパク質ΔＳＣＰＡ49をアジュバントも担体も使わずに鼻腔内に投与した。野性型Ｍ+ＳＣＰＡ+連鎖球菌によるワクチン接種マウスの咽頭定着は、精製ΔＳＣＰＡ49タンパク質の２種類の別製剤を使ってワクチン接種したマウスを使う３つの独立した実験において、ＰＢＳを投与したマウスとは有意に異なっていた（表３と表４；図10）。ΔＳＣＰＡ49タンパク質で免疫処置した13匹のマウスのうちの１匹だけが、接種後10日目に連鎖球菌について培養陽性であった（表４；図10）。対比して、ワクチン接種しない対照マウスの30〜58％が６日間の間培養陽性のままであり、何匹かは感染後10日目にまだ陽性であった。血液寒天平板上のβ溶血性でストレプトマイシン耐性のコロニーの数も、ΔＳＣＰＡ49ワクチン接種マウスと対照マウスとの間に有意差を示した。別の免疫処置マウスのグループは、非免疫処置対照よりも鼻咽頭から有意に迅速に血清型Ｍ49連鎖球菌を浄化した。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
最後に、ある血清型のＳＣＰが別の血清型からの感染に対して動物を予防するかどうかを調べた。Ａ群連鎖球菌の血清型は80種類以上存在する。有効なワクチンは複数の連鎖球菌血清型による感染を予防すべきである。ＯＦ+血清型Ｍ２およびＭ11並びにＯＦ-血清型Ｍ１およびＭ６の連鎖球菌による定着（コロニー形成）に対する交差感染防御が観察された。血清型Ｍ49連鎖球菌からのΔＳＣＰＡ49タンパク質に対して向けられたウサギ血清が数種類の異なる血清型に関連したペプチダーゼ活性を中和したという事実は、単一のサブユニットワクチンによる鼻腔内免疫処置がそれらの血清型による咽頭定着を低減または排除するかもしれないということを示唆した。この可能性を調査するために、上述のアフィニティー精製したΔＳＣＰＡ49タンパク質の鼻腔内接種により20匹のマウスから成る４グループを免疫処置した。対照マウスにはＰＢＳを投与した。連鎖球菌でチャレンジする前に、無作為に選んだ免疫処置マウスと対照マウスからの血清試料と唾液試料を抗ＳＣＰＡ抗体についてアッセイした。試験した全ての免疫処置マウスが強力な血清抗体応答と測定可能な唾液抗体応答を発生していた。４種の血清型の菌株によるΔＳＣＰＡ49タンパク質で免疫処置したマウスの咽頭定着が全て、非免疫処置対照に比較して減少した。その差は接種後３日目および５日目に有意であった（表５）。
【００９１】
【表５】
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【００９２】
血清型Ｍ２，Ｍ11およびＭ１株を接種した免疫処置マウスと対照マウスとの間に統計的に有意な差が観察された。しかしながら、ＯＦ+ 血清型Ｍ２とＭ11はＯＦ-株のＭ１とＭ６よりも一層効率的に除去された。免疫処置マウスのＭ１連鎖球菌定着は、対照マウスに比較してかなり減少した。免疫処置マウスのわずか10.5％が感染後５日目に培養陽性であった。対比して、対照マウスの37％がこの株に関して培養陽性であった。免疫処置マウスはＭ６連鎖球菌をより迅速に除去したように見えるけれども、その差は統計的に有意でなかった。予備実験と同様に、血液寒天平板上のβ溶血連鎖球菌コロニーの数は対照動物から採取した試料よりもワクチン接種したマウスから採取した試料のほうが有意に少なかった。よって、ΔＳＣＰＡ49タンパク質は別の連鎖球菌血清型に対して交差防御免疫を提供する有効なワクチンであった。
【００９３】
実施例５
ＳＣＰＡ49の部位特異的変異誘発
Ａ群連鎖球菌血清型は２つの主なグループＯＦ+株とＯＦ-株に分けることができる。後者がリウマチ熱や中毒性ショックに関係があり、一方でＯＦ-株は膿痂疹や急性糸球体腎炎の共通原因である。それらのグループのＳＣＰＡタンパク質は95〜98％同一であるが、それらに対する免疫応答は幾分異なる可能性がある。この考えは、Ｍ１ ＯＦ-株からとＭ49 ＯＦ+株から並行して特定の変異体ＳＣＰを作製する努力を促した。触媒活性に必要であるアミノ酸を、酵素を不活性化すると予想されるアミノ酸により置換した（図１）。pGEX-4T-1サブクローンから発現させたＳＣＰＡ49のＮ末端およびＣ末端境界アミノ酸はそれぞれAsn32とHis1139であった（図１と図８）。ＳＣＰＡ49タンパク質のSer512（ＳＣＰＡ49Ｓ512Ａ）、Asn295（ＳＣＰＡ49Ｎ295Ａ）およびAsp130（ＳＣＰＡ49Ｄ130Ａ）をAlaにより置換し、そしてAsn295（ＳＣＰＡ49Ｎ295Ｒ）をArgにより置換した（Deborah Stafslien, M.S. Thesis, University of Minnesota）。
【００９４】
連鎖球菌CS101株からのscpA49遺伝子中に突然変異を導入するのに用いた方法は、部位特異的変異誘発の「メガプライマー」法であった。Barik, S., "Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR", Methods in Molecular Biology, 第57巻, In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996)。プライマーscpFor940（5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC-3'）（配列番号10）とscpmutrev1883（5'-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3'）（配列番号11）を使ってセリン変異を導入し、1450 bp二本鎖ＰＣＲ生成物を増幅せしめた。「メガプライマー」と呼ばれるこの第一ＰＣＲ生成物を、Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kitを使って精製し、次いで所望の変異を含む3.3 kb scpA49遺伝子を増幅させる第二の非対称ＰＣＲ反応に使用した。変性（93℃、１分）と伸長（72℃、５分）の５回目のサイクルを行った後、逆プライマーscpRev4263（5'-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3'）（配列番号12）を添加した。72℃での５サイクルの間に、逆プライマーを１mM濃度で添加した。94℃で１分、58℃で２分および72℃で２〜3.5分の25サイクルを使って増幅を完了させた。正プライマーを加えなかったこととメガプライマーを反応液100μｌあたり４〜６μｇの濃度で添加したことを除き、反応体濃度は前の項目に記載したのと同じであった。この操作は変異体タンパク質ＳＣＰＡ49Ｓ512Ａを提供した（下記の表６参照）。
【００９５】
大部分同じやり方で、逆プライマーscpmutrev717（5'-CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA-3'）（配列番号13）とscpmutrev1214（5'-AGCTACTATCAGCACCAG-3'）（配列番号14）を使ってアスパラギン酸およびアスパラギン変異体を作製し、それぞれ311 bpおよび805 bpメガプライマーを調製した。変異体タンパク質ＳＣＰＡ49Ｄ130Ａを作製するにはプライマーscpmutrev717を使用し、そして変異体タンパク質ＳＣＰＡ49Ｎ295Ａを作製するにはプライマーscpmutrev1214を使用した（下記の表６参照）。しかしながら、Qiaquick精製後、メガプライマーを0.1Ｕのマングビーンヌクレアーゼ（４μｇＤＮＡあたり）で処理し、30℃で10分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出によりヌクレアーゼを除去し、エタノール沈澱により水性相中にメガプライマーを回収した。ペレットを80μｌの無菌再蒸留水に再懸濁し、それの37μｌを各100μｌ非対称ＰＣＲ反応に使用した。次いで上述した通り、変異遺伝子をpGEX 4T-1中にクローニングした。Ｓ35標識ｄＡＴＰとSequenaseキット（Stratagene）を使用するか、またはUniversity of Minnesota Microchemical Facilityでの自動蛍光配列分析を使って、変異体を配列決定した。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
Ｅ.コリ発現ベクターpGEX 4T-1を使って変異体ＳＣＰＡをＧＳＴ融合タンパク質として過剰発現させた。この作業の前にGST Gene Fusion System Handbook (Pharmacia)中に与えられたプロトコルに従って組換えＳＣＰＡを精製した。ＳＣＰＡタンパク質抗原は上述の通りアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００９８】
実施例６
ＳＣＰＡ１変異体とＳＣＰＢ変異体の作製
次のようにしてＳ．ピオゲネスのＭ１血清型（90-226株）から野生型scpA1遺伝子をＰＣＲにより増幅せしめた。まず、完全遺伝子の断片のみが発現されるようにプライマーをデザインした。この断片は成熟タンパク質の出発部分に相当し、残基Asn32からAsp1038までの細胞壁固定ドメインの直前で終わる。正プライマー
【化２】
0005122703.tif 000009
は、塩基番号940〔Chen, C. & Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)のものに対応する番号付け法〕のところにアニールする。反対の逆ＰＣＲプライマー
【化３】
0005122703.tif 000010
は、ＤＮＡ反復領域のすぐ上流の塩基番号3954のところにアニールする。該タンパク質のこの反復領域は、細胞壁を貫通し、次いで細胞壁のペプチドグリカンに結合する部分であると推定される。各プライマーのイタリック体で記載した領域は、クローニング工程を可能にするためにＳ．ピオゲネス配列に付加された追加配列である。正プライマーの下線領域はEcoRI制限部位を含み、逆プライマーの下線部分はBamHI部位を含む。逆プライマーは該遺伝子の枠内に翻訳を終結する終止コドン（ＴＡＡ）も含む。
【００９９】
塩基940-3954に相当する得られたＰＣＲ生成物を、中間ベクターpCR2.1 (Invitrogen, Inc.)中にクローニングし、次いでＥ．コリ Top10F細胞(Invitrogen, Inc.)中に形質転換せしめた。適当な形質転換体より得られたプラスミドをEcoRIとBamHIで制限した。scpA1の断片を含有する3018塩基断片を標準手順に従ってゲル精製し、次いで同酵素により制限消化した発現ベクターpTrc99a (Pharmacia)中に連結した。この連結生成物を用いてＥ．コリ DH5α細胞を形質転換し、所望のプラスミド構成物を含有する形質転換体を選択した。得られたプラスミドは、ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列とＡＴＧ開始コドンの後方にscpA1のＰＣＲ断片を配置し、該ＰＣＲ断片をアロラクトース類似体IPTGにより誘導可能であるtrcプロモーターの転写調節下に置く。
【０１００】
野生型scpA1の部位特異的遺伝子変異体は、C.L. Fisher & G.K. Pei, "Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method," BioTechniques, 23:570-574 (1997)により記載された方法に従って作製した。プロテアーゼ活性に重要であるＳＣＰＡ１中の適当なアミノ酸残基を、ズブチリシン様セリンプロテアーゼファミリーとの配列比較により推測した。Siezen, R.J.他、"Homology modeling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases," Protein Engineering, 4:719-737 (1991); Chen, C. & Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)。このファミリー内で保存されている３残基は活性部位の形成に関与する。ＳＣＰＡ１では、それらはAsp130, His193およびSer512である。それらのアミノ酸残基のうちの各１つを変更するため、ＰＣＲ用に３セットの非重複オリゴヌクレオチドをデザインした。それらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡの向き合った鎖の上で互いから離れる方向に増幅させるようにデザインした。各セットで、一方のプライマーの５′末端が突然変異用に上記アミノ酸の１つをコードするコドンを含み、このコドンがアラニンをコードするように変更される。それらの３セットのプライマーを下記に列挙する。変異コドンがイタリック体で記される。
【０１０１】
Ｄ130Ａ：
正プライマー（配列番号17）
【化４】
0005122703.tif 000011
ＧＡＴからＧＣＴへのコドン変化がアスパラギンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。
逆プライマー（配列番号18）
5'- CAC TGC AAC AAC AGT CCC - 3'
【０１０２】
Ｈ193Ａ：
正プライマー（配列番号19）
【化５】
0005122703.tif 000012
ＣＡＣからＧＣＣへのコドン変化がヒスチジンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。
逆プライマー（配列番号20）
5'- TTG ATC GAC AGC GGT TTT ACC - 3'
【０１０３】
Ｓ512Ａ:
正プライマー（配列番号21）
【化６】
0005122703.tif 000013
ＡＣＴからＧＣＴへのコドン変化がセリンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。
逆プライマー（配列番号22）
5'- TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C
【０１０４】
上記ＰＣＲプライマーセットを３つの別々の反応に使用した。鋳型ＤＮＡは野生型scpA1配列を含有するpLP605であった。次いでＰＣＲ生成物を自己連結せしめ、Ｅ．コリ株Top10F' (Invitrogen, Inc.)中に形質転換した。形質転換体を適当なセサイズと制限パターンについてスクリーニングした。Ｓ512Ａ変異体の配列変更は、この突然変異を制限分析により直接同定することができるようにユニークSpeI制限部位を破壊する。全ての可能な変異体をＤＮＡ配列分析により確かめた。続いて、タンパク質の２領域（130位と512位）の間にあるユニークPstI部位を利用して、Ｄ130Ａ変異をＳ512Ａ変異と組み合わせて二重変異体を製造した。最終変更は、カナマイシン遺伝子を含有する予め変更されたpTRC99aベクター（Pharmacia, Inc.）に変異型scpA1遺伝子を移すことにより、抗生物質選択をアンピシリンからカナマイシンへと変更することであった。
【０１０５】
ＳＣＰＡ１変異体について上述した方法を用いてＳＣＰＢタンパク質の変異体を作製した。野生型ＳＣＰＢ遺伝子はＢ群連鎖球菌78-471（IIa+型）からクローニングした。
【０１０６】
実施例７
変異体タンパク質の分析
各々の変異体構成物から発現させたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。該タンパク質の予想サイズは121 kDであるが、該酵素のカルボキシ末端に高プロリン細胞壁貫通領域があるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際に該タンパク質はわずかに遅く泳動される。従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した時の見かけ分子量は130 kDである。活性ＳＣＰは宿主に有害であり得るので、変異体タンパク質が酵素活性を欠くことは重要なことであった。変異体タンパク質の２つの性質を評価した。ＰＭＮ付着アッセイにより測定した時の野生型タンパク質と変異体タンパク質の比活性を表７において比較する。この実験は、置換されたアミノ酸残基が酵素活性を90％以上減少させることを示した。
【０１０７】
【表７】
0005122703.tif 000014
【０１０８】
野生型酵素に対して向けられた抗体を結合する能力についても、変異体タンパク質を野生型タンパク質と比較した。競合ELISAは、可溶性抗原による固定化抗原への抗体結合の阻害を測定する。一定量の野生型抗原をマイクロタイタープレートのウエルに結合させた。一定量の抗体を可変量の可溶性競合抗原と共に同時に添加する。阻害率対抗原濃度曲線の傾きは、可溶性抗原の抗体への相対結合親和力を概算する。抗血清中の抗ＳＣＰＡの正確な濃度を知らずに結合定数を算出することはできないが、幾つかのタンパク質の相対結合親和力を比較した（図11）。阻害率−濃度曲線の傾きが野生型タンパク質と変異体タンパク質とで同じであるので、アミノ酸置換が変異体タンパク質への抗体の結合能力を変更しなかったと結論づけられた。
【０１０９】
組換えＳＣＰＡ１、ＳＣＰＡ49およびＳＣＰＢタンパク質も、抗ＳＣＰ抗体に等しく良好に結合すると測定された（図12）。この実験では、プレート抗原がＳＣＰＡ49であり、そして抗体がウサギ抗ＳＣＰＡ49であった。曲線の傾きにより表されるそれらの抗原への抗体の相対結合親和力は、非常に類似している。この結果は、Ｍ49 ＯＦ+およびＭ１ ＯＦ-Ａ群連鎖球菌から並びにＢ群連鎖球菌からのＳＣＰＡタンパク質が、抗体認識に関して等価であり、ワクチン製剤において互いに交換可能に使用できることを証明する。
【０１１０】
実施例８
ＳＣＰＡ抗原の皮下（ＳＱ）投与はマウスに防御を誘導する
全ての予備防御実験は、アジュバントの非存在下でアフィニティー精製ＳＣＰＡタンパク質を鼻腔内投与することにより実施した。歴史的に抗原の筋肉内またはＳＱ注射が好ましく、より受け入れられるワクチン投与方法である。従って、ＭＰＬ／ミョウバン存在下でのＳＣＰＡのＳＱ注射が防御免疫応答を誘導するかどうか、そしてＡ群連鎖球菌のチャレンジ株がＳＣＰＡワクチン源のものと血清型で異なる場合にそのような応答が定着を減少させるかどうかを調べるために実験を行った。咽喉培養と鼻組織切片のサンプリングにより、口腔−鼻咽頭粘膜からの連鎖球菌の浄化能力を評価した。代表的な咽喉培養データを表８に与える。
【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
３種類の形態のＳＣＰＡ抗原の各々のＳＱ注射により免疫したマウスは中程度の防御を誘導した。ΔＳＣＰＡ49で免疫したマウスはＯＦ- Ｍ１株とＯＦ+ Ｍ49株の両方に対して防御した。ＳＣＰＡ49Ｓ512ＡとＳＣＰＡ１Ｓ512Ａをその後の研究用に選択した。
【０１１３】
鼻腔内チャレンジ後の連鎖球菌の存続を更に定量的なアッセイにより評価した。この方法は、感染後の様々な時点でマウスグループを犠牲にし、鼻組織（ＮＴ）を切除し、次いでそれを生存可能連鎖球菌（ＣＦＵ）についてアッセイすることを伴った。標準量のＮＴを緩衝液中でホモジナイズし、生存菌数により、ＣＦＵ／mg組織の数を求めた。
【０１１４】
３グループのマウスをＳＣＰＡ49Ｓ512Ａ、ＳＣＰＡ１Ｓ512Ａまたは破傷風トキソイドでＳＱ免疫した。全てのワクチンを上記と同様にＭＰＬ／ミョウバンと混合した。マウスに５μｇタンパク質抗原を４回注射し、次いで最終注射から二週間後にチャレンジした。ＯＦ+ Ｍ49株CS101によるチャレンジから16時間後に鼻組織を収得した。ＣＦＵ／mg組織の幾何平均を表９に示す。
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
予想通り、鼻組織に関連する連鎖球菌の数は時間と共に減少し、その減少はＳＣＰＡ抗原で免疫したマウスにおいて一層迅速で且つ完全であった。ＳＣＰＡで免疫した全マウスグループが、対照マウスよりも少数の連鎖球菌を保持していた。この実験では、チャレンジ株CS101がＯＦ+ Ｍ49でありそしてワクチンタンパク質源がＯＦ- Ｍ１株からのＳＣＰＡ１Ｓ512Ａであるので、ＳＣＰＡ１Ｓ512Ａによる免疫が最も有効であり且つ交差防御応答を誘導した。これらの結果は、単一のＳＣＰＡ抗原が非相同の血清型に対する防御を誘導できることを確証する。防御は細菌表面上のペプチダーゼ活性を中和する抗体により提供される。これは、連鎖球菌が粘膜組織上に付着した時点から数時間内に食細胞の流入を増加させる。食細胞による連鎖球菌の迅速な浄化は、その後の細菌の繁殖や存続を防止すると推測される。ELISAによりアッセイすると、マウスは一様に１：32,000以上の血清ＩｇＧ力価を有した。このことは、アジュバント存在下でのＳＣＰＡ抗原のＳＱ注射が活発な抗体応答を誘導したことを示す。
【０１１７】
実施例９
Ｂ群連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼはＭ12およびＭ49Ａ群連鎖球菌からのものと配列がほとんど同じである
Ｂ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰＢ）遺伝子をクローニングし、配列決定し、そしてＡ群連鎖球菌Ｍ12およびＭ49血清型からのものと比較した。上記に記載の方法を使ってscpA12配列の一部分に相当するプライマーを用いたＰＣＲによりscpB遺伝子全体を増幅させた。ＳＣＰＢ遺伝子は、126,237ダルトンのＭrを有する1150アミノ酸のタンパク質を特定する3450 bpの転写解読枠（ＯＲＦ）をコードする。ＳＣＰＢのアミノ酸配列を図２に示す。Ｍ12およびＭ49Ａ群連鎖球菌からのものに対するscpBヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の比較は、それぞれ98％および97％という高い類似性を示した。scpBは２つのＣ末端反復配列と重なった50 bpの欠失を含み、scpA遺伝子に対比して幾つかの別のわずかな相違を有した。両配列の整列は、scpA12が実際はscpA49に対してよりもscpBの方に系統発生的に近いことを示した。血清型III，III／Ｒ，II，Ｉａ／ｃ，ＮＴ／ｃ，ＮＴ／ｃ／Ｒ１を表す30個の株は１コピーのscpBを担持している。
【０１１８】
発現ベクタープラスミド pGEX-4T-1（ATCC受託番号98225）を使って組換えＳＣＰをＥ．コリ中で発現させると、親のＢ群連鎖球菌株78-471（型IIａ＋ｂ）から抽出された酵素と同一であることがわかった。ウエスタンブロット分析は、組換えＳＣＰがＢ群連鎖球菌から以前に精製されたＣ５ase酵素と同じであることを示唆した。
【０１１９】
全ての刊行物、特許および特許出願書類は、個別に参考として本明細書中に組み込まれるかのように本明細書中に組み込まれる。本発明を様々な特定且つ好ましい態様および技術に関して記載してきた。しかしながら、本発明の範囲内において多数の変更および改良を行えると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１．β溶血連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼの構造。Ｄはアスパラギン酸残基；Ｈはヒスチジン残基；Ｓはセリン残基；Ｌはロイシン残基；Ｐはプロリン残基；Ｔはスレオニン残基；そしてＮはアスパラギン残基を示す。Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4は反復配列を表す。数字はペプチダーゼ中のアミノ酸残基位置を示す。
【図２】  図２．Ａ群連鎖球菌血清型49（配列番号１）、Ａ群連鎖球菌血清型12（配列番号２）、Ｂ群連鎖球菌（配列番号３）およびＡ群連鎖球菌血清型１（配列番号23）からのＳＣＰのアミノ酸配列の整列。配列は指摘のアミノ酸位置を除いて同一である。三角形（▽）はシグナルペプチドの推定開裂位置を表す。酵素活性部位にあると推定されるアミノ酸は星印（＊）により表される。アミノ酸配列中の欠失はドットにより表され枠で囲まれている。星印（＊）は触媒ドメインのアミノ酸残基を示す。
【図３】  図３．ＳＣＰ挿入変異体および欠失変異体の作製。黒い箱は欠失領域を表す。
【図４】  図４．単色ＦＡＣＳ分析。ＰＭＮ上でのゲーティングにより蛍光データを分析した。第二ゲートは第一ゲートにより限定された高染色細胞を計数するために設けられた。気嚢に１×106 ＣＦＵを接種した。
【図５】  図５．鼻腔内感染後の野生型およびＳＣＰＡ-血清型Ｍ49連鎖球菌の存続。
【図６】  図６．鼻腔内感染後にマウスに定着する血清型Ｍ６のＡ群連鎖球菌のＳＣＰＡ-変異体の能力の比較。２×107 ＣＦＵのＭ６連鎖球菌を接種したBALB/cマウス（各実験グループにつき10匹）を比較する。ストレプトマイシンを含む血液寒天平板上で咽頭スワブを１日培養した。平板が１つのβ溶血コロニーを含んだ場合に、マウスを陽性と見なした。χ2検定によりデータを統計分析した。
【図７】  図７．ΔＳＣＰＡ49ワクチンの作製および免疫プロトコル。
【図８】  図８．ウサギ抗体が異なる血清型に関連したＳＣＰＡ活性を中和する。棒１は陽性対照であり、ＰＭＮに暴露する前に予備インキュベートしなかったｒｈＣ５ａを含んだ。棒10はrhＣ５ａを欠く対照である。正常ウサギ血清と予備インキュベートした完全な菌体（棒２：Ｍ１ 90-131；棒４：Ｍ６  ＵＡＢ200；棒６：Ｍ12  ＣＳ24；棒８：Ｍ49  ＣＳ101）またはウサギ抗ＳＣＰＡ49血清と予備インキュベートした完全な菌体（棒３：Ｍ１ 90-131；棒５：Ｍ６  ＵＡＢ200；棒７：Ｍ12  ＣＳ24；棒９：Ｍ49  ＣＳ101）を、20μＬの５μM ｒｈＣ５ａと共に45分間インキュベートした。ＰＭＮを活性化してＢＳＡ被覆マイクロタイタープレートウエルに付着する能力により、残余ｒｈＣ５ａをアッセイした。付着性ＰＭＮをクリスタルバイオレットで染色した。
【図９Ａ】  図９Ａ．精製ΔＳＣＰＡ49タンパク質でのマウスの鼻腔内免疫処置後の血清IgＧおよび唾液IgＡ応答。ＳＣＰＡ49特異的IgＧの血清濃度と唾液濃度を間接ELISAにより測定した。各マウスからの血清はＰＢＳ中に１：2,560希釈し、唾液はＰＢＳ中に１：２希釈した。図９ＡはｓIgＡ実験結果を示す。
【図９Ｂ】  図９Ｂ．図９Ｂは図９Ａと同様に行った、IgＧ実験結果を示す。
【図１０Ａ】  図10Ａ．免疫処置および非免疫処置CD1雌マウスへの血清型Ｍ49連鎖球菌の定着力の比較。各実験グループは、2.0×108 ＣＦＵで鼻腔内（i.n.）感染させた13匹のマウスを含んだ。χ2検定によりデータを統計分析した。
【図１０Ｂ】  図10Ｂ．図10Ｂは図10Ａの反復実験の結果を示す。
【図１１】  図11．ポリクローナル抗体への野生型ＳＣＰおよび変異型ＳＣＰ結合の競合ELISA比較。プレート抗原は組換え野生型ＳＣＰＡ49（100 ng／ウエル）である。
競合抗原は凡例により示される。
【図１２】  図12．ポリクローナル抗体へのＳＣＰＡ１、ＳＣＰＡ49およびＳＣＰＢ結合の競合ELISA比較。プレート抗原は組換え野生型ＳＣＰＡ49（100 ng／ウエル）である。競合抗原は凡例により示される。この図に示す実験に使用したＳＣＰＡ１とＳＣＰＡ49はAsn32からHis1139までを含んだ。この図に示す実験に使用したＳＣＰＢはChmouryguina, I.他、"Conservation of the C5a Peptidase Gene in Group A and B Streptococci", Infect. Immun., 64:2387-2390 (1996)に従って調製した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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