(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノム配列中の配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基を緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法。
【請求項２】
以下の工程を含む緑内障の発症リスクを判定する方法：
（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、
（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基を同定する工程、及び
（Ｃ）配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基の同定結果がＴである場合に、前記検体の由来である被検者における緑内障の発症リスクが高いと評価し、前記同定結果がＣである場合に、前記検体の由来である被検者における緑内障の発症リスクが低いと評価する工程。
【請求項３】
配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを備えた緑内障発症リスク判定キット。
【請求項４】
配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列が、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項３に記載の緑内障発症リスク判定キット。
【請求項５】
配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ配列が、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項４に記載の緑内障発症リスク判定キット。
【請求項６】
配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列のアンチセンスＤＮＡ配列からなるプローブを備えた緑内障発症リスク判定キット。
【請求項７】
プローブの長さが１５〜３０ｂｐであることを特徴とする請求項６記載の緑内障発症リスク判定キット。
【請求項８】
配列番号１記載のＤＮＡ配列の配列番号７４７に対応するアンチセンスＤＮＡ配列の塩基が、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）であることを特徴とする請求項６又は７記載の緑内障発症リスク判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism：一塩基多型）を利用した緑内障の発症リスクを判定する方法や、ＳＮＰを緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法や、緑内障発症リスク判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は全世界でおよそ６０００万人以上が罹患し、西暦２０２０年には８０００万人に到達するといわれており、失明原因としては白内障に次ぐ第２位の疾患である。緑内障の病型としてはそのうち７４％が開放隅角緑内障（open angle glaucoma; ＯＡＧ）である。ＯＡＧにより両眼失明する患者数は２０１０年には４５０万人、２０２０年には５９０万人に達すると推計されている（非特許文献１）。
【０００３】
日本においては、緑内障患者が２５０万人以上存在しているほか、４０歳以上の人口の約５％の者が潜在的に罹病していると考えられる。また日本における失明原因としては、緑内障は糖尿病網膜症に次いで第２位である。日本における緑内障の病型としては７８％がＯＡＧであり、そのうち眼圧が正常範囲内にある正常眼圧緑内障（normal tension glaucoma; ＮＴＧ）が９割以上を占めるため、日本の緑内障患者の７２％はＮＴＧ患者ということになる (非特許文献２)。なお、２０２０年には日本の緑内障患者は３００万人を超えると推計され、今後増え続けることが予測されている（非特許文献１）。
【０００４】
また、緑内障患者のおよそ２０％に家族歴が認められるため、緑内障には遺伝的要因の存在も考えられる。実際に、ＯＡＧの原因遺伝子であるMyocillin (非特許文献３、４、特許文献１、２) やOptineurin (非特許文献５、特許文献３）、若年発症の発達緑内障の原因遺伝子としてＣＹＰ１Ｂ１ (非特許文献６、特許文献４、５）が現在までに明らかにされている。しかし、緑内障の発症メカニズムは未だ充分には解明されておらず、現在までの治療方法は、早期に発見し、眼圧を対症療法的に下降させることであった。しかし、日本人に多い病型であるＮＴＧの場合、眼圧を下降させることが困難であるばかりでなく、眼圧下降が病状の進行を阻止できるかさえも明らかではない。ＮＴＧの原因に関連して、最近では視神経乳頭の血流障害の要素が報告されるようになり、さらに視神経乳頭篩板部の軸策流や血流障害により神経節細胞が細胞死を起こしていることがわかってきた（非特許文献７）。これらの視神経の循環障害を引き起こすものとして、血管内皮細胞で産生される強力な血管収縮因子であるエンドセリン−１の血漿濃度がＮＴＧ患者で正常人と比較して有意に大きいことなども報告されている（非特許文献８）。また、エンドセリン−１の血漿濃度は動脈硬化の重症度に相関して高いという報告がそれ以前になされており（非特許文献９）、ＮＴＧの病因としての血管生理の機能異常が関与していることが示唆される。
【０００５】
一方、プロスタサイクリン受容体（ＰＴＧＩＲ）は、血管内皮細胞上に発現するＧタンパク質共役型受容体の一つであり、血栓凝固及び動脈硬化病変形成を抑制し、その異常により動脈硬化病変の形成に関与すると考えられている。本発明者らは、以前この受容体の１塩基遺伝子多型を調べ、アミノ酸置換を伴う遺伝子変異を見出したが、これまでこのアミノ酸変異と疾患についての報告はない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５９１６７７８号公報
【特許文献２】米国特許第５９２５７４８号公報
【特許文献３】米国特許第２００４０１９１７９８号公報
【特許文献４】米国特許第５８３０６６１号公報
【特許文献５】米国特許第６１２７１２８号公報
【非特許文献１】Quigley HA, Broman AT. (2006) The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90:262-267.
【非特許文献２】Iwase A, Suzuki Y, Araie M, et al(2004) The prevalence of primary- open angle glaucoma in Japanese: the Tajimi Study. Ophthalmology. 111: 1641-1648
【非特許文献３】Kubota R,Noda S,Wang,et al.(1997) A novelmyosin-like protein (myocilin) expressed in the connecting cilium of the photoreceptor:molecular cloning,tissue expression and chromosomal mapping. Genomics. 41:360-369
【非特許文献４】Stone EM, Fingert JH, Alward WLM. et al. (1997) Identification of a Gene That Causes Primary Open Angle Glaucoma. Science. 275: 668-670
【非特許文献５】Rezaie T, Child A, Hitchings R, et al. (2002) Adult-onset primary open-angle glaucoma caused by mutations in optineurin. Science. 295: 1077-1079
【非特許文献６】Stoilov I, Akarsu AN, Sarfarazi M (1997) Identification  of three different truncating mutations in cytchrome P4501B1(CYP1B1) as the principal cause of primary congenital glaucoma(Buphthalmos) in families linked to the GLC3A locus on chromosome 2p21. Hum Mol Genet. 6: 641-647
【非特許文献７】Oku H, Sugiyama T, Kojima S,et al (1999) Experimental optic cup enlargement caused by endothelin-1-induced chronic optic nerve head ischemia. Surv Ophthalmol.44 Suppl 1:S74-84
【非特許文献８】Cellini M, Possati GL, Profazio V et al. (1997) Color Doppler imaging and plasma levels of endothelin-1 in low-tension glaucoma. Acta Ophthalmol Scand. Suppl. 224:11-13
【非特許文献９】Lerman A, Edwards BS, Hallett JW, et al. (1991) Circulating and tissue endothelin immunoreactivity in advanced atherosclerosis. N Engl J Med.325:997-1001.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように緑内障の原因遺伝子として今までに３種類の遺伝子変異が同定されているが、緑内障発症のメカニズムは未だほとんど解明されておらず、また、血管生理の関与が示唆されてはいるものの、その明らかな証拠は得られていない。本発明の課題は、緑内障の発症リスクをより迅速、簡便かつ高精度で判定する方法や、より迅速、簡便かつ高精度で緑内障発症リスクを判定し得る緑内障発症リスク判定キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の背景技術でも述べたように、プロスタサイクリン受容体（ＰＴＧＩＲ）と緑内障との関連は知られていなかった。このような状況下で、本発明者らは、開放隅角緑内障（open angle glaucoma; ＯＡＧ）患者のゲノムＤＮＡと、健常者のゲノムＤＮＡを対比し、ＰＴＧＩＲの特定のＳＮＰ（一塩基多型）が緑内障の発症と極めて密接に関連していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ヒトゲノム配列中の配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基を緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（２）以下の工程を含む緑内障の発症リスクを判定する方法：（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基を同定する工程、及び（Ｃ）配列番号１記載のＤＮＡ配列の塩基番号７４７の塩基の同定結果がＴである場合に、前記検体の由来である被検者における緑内障の発症リスクが高いと評価し、前記同定結果がＣである場合に、前記検体の由来である被検者における緑内障の発症リスクが低いと評価する工程：に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（３）配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを備えた緑内障発症リスク判定キットや、（４）配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列が、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ配列であることを特徴とする上記（３）に記載の緑内障発症リスク判定キットや、（５）配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ配列が、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ配列であることを特徴とする上記（４）に記載の緑内障発症リスク判定キットや、（６）配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列のアンチセンスＤＮＡ配列からなるプローブを備えた緑内障発症リスク判定キットや、（７）プローブの長さが１５〜３０ｂｐであることを特徴とする上記（６）記載の緑内障発症リスク判定キットや、（８）配列番号１記載のＤＮＡ配列の配列番号７４７に対応するアンチセンスＤＮＡ配列の塩基が、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）であることを特徴とする上記（６）又は（７）記載の緑内障発症リスク判定キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の緑内障の発症リスクを判定する方法や、緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法によると、迅速、簡便かつ極めて高精度で緑内障の発症リスク（易罹患性）を判定することができる。したがって、緑内障に発症する前の段階で緑内障の発症リスクを知ることや、緑内障の早期の段階で緑内障を発見することができるため、緑内障の処置の遅れやそれによる症状の悪化を避けることが可能となる。
また、本発明によって示されたプロスタサイクリン受容体（ＰＴＧＩＲ）遺伝子変異と緑内障との関連に着目して、本発明のスクリーニング方法を行うことにより、ＰＴＧＩＲの変異による影響を抑止又は軽減し得るファクターを調べることができる。そのファクターを利用すれば、従来の眼圧下降に頼る対症療法とは全く異なる、新しい画期的な緑内障の治療薬を得ることができる。
さらに、本発明の緑内障の判定方法や判定キットを用いることにより、個々の緑内障患者の緑内障がＰＴＧＩＲに起因するものであるかを判定することができ、ＰＴＧＩＲに起因する緑内障に適した治療方法や治療薬を選択することが可能となる。
以上のように、本発明の緑内障の判定方法、判定キット及びスクリーニング方法は、ＰＴＧＩＲなどの血管生理に関わる因子に起因する緑内障の発症メカニズムの解明や、そのような緑内障に対する新たなオーダーメイド医療へとつながる非常に重要なものといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、一塩基多型（ＳＮＰ）とは、ゲノムＤＮＡにおける塩基配列上、核酸の変異により個体間で１塩基が異なる状態をいう。本明細書において一塩基多型を記載する場合に、アルファベット１文字で表す場合は、「コーディング鎖側の塩基」を記載し、アルファベット２文字で表す場合は、「非コーディング鎖側の塩基／コーディング鎖側の塩基」を記載する。ある一塩基多型部位において頻度がもっとも高いアレルをメジャーアレルという。マイナーアレルとは、ある一塩基多型部位においてより低い頻度を持つアレル、すなわち、メジャーアレルではない遺伝子型を意味する。
【００１４】
本発明において、緑内障発症リスク判定マーカーとして使用することができるヒトゲノム配列中の塩基は、配列番号１記載の塩基配列の塩基番号７４７の塩基、すなわち米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ４９８７２６２で表される塩基である。この塩基は、Ｃ／Ｃがメジャーアレル、Ｃ／ＴがマイナーアレルであるＳＮＰ（以下、「ＳＮＰ７４７」ともいう。）である。ＳＮＰ７４７は、プロスタサイクリン受容体（ＰＴＧＩＲ）遺伝子（塩基配列：配列番号１；  アミノ酸配列：配列番号２）の２１２番目のアミノ酸配列に対応するコドンの一つであり、メジャーアレルの場合は２１２番目のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）であり、マイナーアレルの場合はそのアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）となる。したがって、マイナーアリルを有するＰＴＧＩＲ遺伝子の変異体を「Ｒ２１２Ｃ」ともいう。
上記の緑内障発症リスク判定マーカーとして使用することができるヒトゲノム配列中の塩基（ＳＮＰ７４７）は、本発明の緑内障の発症リスクを判定する方法において同定・評価の対象となっている。
【００１５】
ＳＮＰ７４７を緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法としては、このＳＮＰを含む領域をＳＮＰタイピングする方法を挙げることができる。ＳＮＰタイピングの方法としては、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、以下「ＤＧＧＥ」という）法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法等の当業者に周知の方法（例えば、「ゲノム創薬の最前線」ｐ４４−ｐ５４、野島 博 編、羊土社、参照）を用いることができる。以下に、前述のＳＮＰタイピング方法について説明する。
【００１６】
１）ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法：
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素で消化されることにより生じるＤＮＡ断片の長さの違いにより、当該遺伝子多型の判定が可能である。この場合、（ａ）ゲノムＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行なう方法と、（ｂ）多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析する方法が挙げられる。（ａ）の方法において用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、かつその多型部位から５’末端側および３’末端側それぞれの約０．０５〜２ｋｂまでにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチンあるいは蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、（ｂ）の方法に用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）：
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法である［Biotechniques, 16, 296-297 (1994)；  Biotechniques), 21, 510-514 (1996)］。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。この方法に用いられるＰＣＲ増幅用プライマーは、好ましくは、５’末端を蛍光色素で標識した多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
３）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法：
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したヌクレオチド配列を有する通常１５〜２５ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドプローブ（シグナルを得るにはラジオアイソトープ、ビオチンまたは蛍光色素による標識が必要）とのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値に準じた洗浄操作により、１ヌクレオチドのミスマッチの検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）をする方法である［Clin.Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
４）ダイレクトシークエンス法：
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法である［Biotechniques, 11, 246-249 (1991)］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２０】
５）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法：
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動的に検出不可能になる。ＡＲＭＳ法は、３’末端ヌクレオチドが検出しようとする変異ヌクレオチドに相補的になるようなプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を判定することにより遺伝子多型を検出する方法である［Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；  Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)］。ＡＲＭＳ法におけるＰＣＲに用いられるプライマーは、１つは３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、もう１つは、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
６）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、以下「ＤＧＧＥ」という）法：
ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲ産物中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法である［Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)］。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素およびホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差がさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
７）ＲＮａｓｅＡ切断法：
ＲＮａｓｅＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖のＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。したがって、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、アイソトープにより標識したＲＮＡプローブを、変性し１本鎖にしたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理後、電気泳動により分離すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるので、２本のバンドとして検出できる［DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)］。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０ｍｅｒのものが好ましい。
【００２３】
８）化学切断法：
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、上記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる［Biotechniques, 21, 216-218 (1996)］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
９）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法：
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法である［Genome Res., 8, 549-556 (1998)］。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
１０）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法：
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である［Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；  J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度の長さであり、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、同時に３’末端がクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。
【００２６】
１１）インベーダー法：
インベーダー法は、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法と同様にアレル特異的オリゴヌクレオチドと鋳型をハイブリダイゼーションさせることによりタイピングする方法である［Science, 5109, 778-783 (1993)；  J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999)；  Nat. Biotechnol.,17,292-296 (1999)］。
【００２７】
１２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なるヌクレオチドを含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法である［Genome Res., 7, 378-388 (1997)；  Eur.J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)］。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルにより解析する。このときに用いられたＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５から３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２８】
１３）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法：
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取りこませる方法である［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)］。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７、アプライドバイオシステムズ社製）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００２９】
上記本発明の緑内障発症リスク判定マーカーとして使用する方法における判定としては、ＳＮＰ７４７がＴ（Ｃ／Ｔ）のとき、緑内障の発症リスクが高い（緑内障に罹患しやすい）と判定することができ、ＳＮＰ７４７がＣ（Ｃ／Ｃ）のとき、緑内障の発症リスクが低い（緑内障に罹患しにくい）と判定することができる。
【００３０】
本発明の緑内障の発症リスクを判定する方法としては、（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡ、好ましくは日本人のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、ＳＮＰ７４７の塩基（refSNP ID: rs4987262）を同定・評価する工程を備えていれば特に制限はされず、上記検体としては、末梢血などの血液、唾液、汗等の体液、体細胞及びそれを含む組織又は器官等を挙げることができるが、末梢血を用いることが好ましい。塩基（ＳＮＰ）の同定方法としては、上記のようにＳＮＰ７４７を含む領域をＳＮＰタイピングする方法を挙げることができる。また、判定としては、ＳＮＰ７４７の同定結果がＴ（Ｃ／Ｔ）のとき、上記検体における緑内障の発症リスクが高いと判定され、ＳＮＰ７４７の同定結果がＣ（Ｃ／Ｃ）のとき、上記検体における緑内障の発症リスクが低いと判定することができる。
【００３１】
緑内障の発症リスクを判定するための本発明の判定キットは、ＳＮＰ７４７の同定に必要な核酸や酵素を含んでいる限り特に制限されないが、ＳＮＰ７４７を同定に必要なプライマーやプローブを備えたキットを好ましく例示することができる。
【００３２】
上記プライマーとしては、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを例示することができ、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ配列を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを好適に例示することができ、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ配列を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをより好適に例示することができる。
上記オリゴヌクレオチドの配列は、当業者であれば、例えば配列番号１記載のＤＮＡ配列に基づいて、適宜好ましい配列を選択することができる。また、上記オリゴヌクレオチドとしては、フォワードプライマーとなるオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとなるオリゴヌクレオチドとのセットであることがより好ましい。
【００３３】
一方、ＳＮＰ７４７を同定に必要なプローブとしては、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、塩基番号７４６〜７４８のＤＮＡ配列を含む１５〜３０ｂｐのＤＮＡ配列のアンチセンスＤＮＡ配列を好ましく例示することができる。前記プローブを備えたキットとしては、より精度よくＳＮＰタイピングを行う観点から、メジャーアレルとマイナーアレルに対応するプローブを両方備えているキットをより好適に例示することができる。なお、上記プローブにおいて配列番号１の７４７番目に対応する塩基は、メジャーアレル用のプローブではＧ（グアニン）であり、マイナーアレル用のプローブではＡ（アデニン）となる。
【００３４】
上記のようなプライマー又はプローブとして用いられ得るＤＮＡ配列は、本発明の技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
【００３５】
本発明の判定キットは、上記のＳＮＰタイピング方法等にしたがって用いることができる。いずれのＳＮＰタイピング方法を用いるかは、その判定キットの構成に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
緑内障に関連するＳＮＰ解析を行うために、緑内障患者と健常者（正常コントロール）のゲノムＤＮＡを入手した。具体的には、緑内障の研究のために慶應義塾大学が主体となって収集し抽出した開放隅角緑内障（ＯＡＧ）患者６７５例[うち正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）患者３５６例、狭義の原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）患者３１９例]および正常コントロール３０１例の合わせて１０００例弱のゲノムＤＮＡを用意した。これらのゲノムＤＮＡはいずれも多施設の眼科で集められたものである。正常コントロールは、主として加齢性白内障手術目的に眼科を受診した患者であって、緑内障を発症していないことが確認され、かつ、緑内障家族歴もない患者から構成される。
【００３８】
上記の緑内障患者と正常コントロールのゲノムＤＮＡを比較した結果、プロスタサイクリン受容体（ＰＴＧＩＲ）の２箇所のＳＮＰが候補として見い出された。そのＳＮＰの１つは、ＰＴＧＩＲの遺伝子（配列番号１）の塩基番号７４７における一方のアリールの塩基がシトシンからチミンに変異したもの（ＳＮＰ７４７）であり、その結果、ＰＴＧＩＲタンパク質（配列番号２）の２１２番目のアルギニン（Ｒ）がシステイン（Ｃ）に変異している（以下、このＳＮＰ７４７を「Ｒ２１２Ｃ」ともいう）。もう一方のＳＮＰは、ＰＴＧＩＲの遺伝子（配列番号１）の塩基番号７９２における一方のアリールの塩基がシトシンからチミンに変異したもの（ＳＮＰ７９２）であり、その結果、ＰＴＧＩＲタンパク質（配列番号２）の２２７番目のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に変異している（以下、このＳＮＰ７９２を「Ｒ２２７Ｗ」ともいう）。Ｒ２１２Ｃは、本発明者らが以前に新規ＳＮＰとして登録を行っていたrefSNP ID: rs4987262に相当するＳＮＰであった。表１に、Ｒ２１２Ｃ及びＲ２２７Ｗの概要を示す。
【００３９】
【表１】
0005169306.tif 000002
【００４０】
表１に記載されているように、Ｒ２２７Ｗは、正常コントロール群で１例のみheterozygousが認められたが、緑内障群ではheterozygous、homozygousともに１例も認められなかった。この場合のＲ２２７Ｗのアリール頻度のＰ値（Fisher's exact method）は０．３０８であり、正常コントロール群と緑内障群に有意差は認められなかった。一方、Ｒ２１２Ｃは、正常コントロール群では１例のみheterozygous が認められたが、後に緑内障を発症した。また、緑内障群では１３例が Ｒ２１２Ｃのheterozygousであり、homozygousは認めなかった。正常コントロール群において後に緑内障を発症した１例は、結果的には正常ではなかったのであるから、これを正常コントロール群から除外すると、この場合のＲ２１２Ｃのアリール頻度のＰ値（Fisher's exact method）は０．０１３となり、正常コントロール群と緑内障群に有意差が認められた。
【００４１】
上記表１のＲ２１２Ｃの結果について、invader法にてＳＮＰ解析を行った結果等をより詳細に記したものを表２に示す。なお、Ｒ２１２Ｃを解析するためのinvader法に用いたオリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである。すなわち、ターゲットとなる配列を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、フォワードプライマー（CTGCCATCTTCCTCTGCAAC：配列番号３）及びリバースプライマー（ACAGGCCATGACCACT：配列番号４）を用い、インベーダー配列として、インベーダーオリゴ（GCTCGGTCACCCTCAGCCTCTGCA：配列番号５）を用い、シグナルプローブとして、シグナルプローブＣ（CGCGCCGAGGCGCATGTACCGCC：配列番号６）及びシグナルプローブＴ（ACGGACGCGGAGTGCATGTACCGCCA：配列番号７）を用いた。
【００４２】
【表２】
0005169306.tif 000003
【００４３】
表２から分かるように、Ｒ２１２Ｃ（rs4987262）は開放隅角緑内障（ＯＡＧ）患者１３例にheterozygousに発現しているのに対し、正常コントロールには１例のみ発現していた。前述の表１の説明でも述べたが、正常コントロール群においてＲ２１２Ｃを発現していた１例は、後に緑内障を発症した。正常コントロール群において後に緑内障を発症した１例は、結果的には正常ではなかったのであるから、これを正常コントロール群から除外すると、Ｒ２１２Ｃのアリール頻度のＰ値（Fisher's exact method）は０．０１３となり、正常コントロール群と緑内障群に有意差が認められた。これらの結果から、Ｒ２１２Ｃは、緑内障発症の原因遺伝子であることが考えられた。このことは、該遺伝子変異（Ｒ２１２Ｃ）をもつ者は、すべて開放隅角緑内障（ＯＡＧ）を発症しているか、又は後に発症することを示すと共に、開放隅角緑内障（ＯＡＧ）患者のおよそ２％（１３×１００／６６２（％））は該遺伝子変異が原因となり緑内障を発症していることを示唆している。なお、上記のＲ２１２Ｃを発現する１３例の患者と、後に発症した１例の者に関する情報（性別、診断時年齢、高血圧の有無、糖尿病の有無、虚血性心疾患の有無、家族歴の有無）を表３に示す。
【００４４】
【表３】
0005169306.tif 000004
【００４５】
なお、上記項目のうち、有無を表す項目については、「有」の場合は「＋」と表し、「無」の場合は空欄とした。
【配列表】
0005169306000001.app