(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性結腸直腸癌細胞あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞について個体をスクリーニングするインビトロ方法であって、個体からの腸外組織および／または体液の試料を検査して、該試料中の細胞がＣＤＸ２を発現しているか判定する工程を含み、その際、ＣＤＸ２の発現は試料中に転移性結腸直腸癌細胞あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞がある可能性を指示するものである方法。
【請求項２】
細胞によるＣＤＸ２の発現を、遺伝子転写生成物の存在を検出することにより判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞によるＣＤＸ２の発現を、試料と遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーとを接触させるポリメラーゼ連鎖反応により判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞によるＣＤＸ２の発現を、試料とＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体とを接触させる免疫アッセイにより判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料が血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料がリンパ組織および／またはリンパ液である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料がリンパ節試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと以前に診断されたことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと以前に診断され、かつそれに対する処置を受けたことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
転移性結腸直腸癌細胞あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞について個体をスクリーニングするインビトロ方法であって、個体からの腸外組織および／または体液の試料を検査して、該試料中にＣＤＸ２遺伝子転写または翻訳生成物が存在するか判定する工程を含み、その際、該試料中のＣＤＸ２遺伝子転写または翻訳生成物の存在はその個体が試料中に
転移性結腸直腸癌細胞あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を有する可能性を指示するものである方法。
【請求項１２】
個体からの腸外組織および／または体液の試料を検査して、該試料中にＣＤＸ２遺伝子転写生成物が存在するか判定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤＸ２遺伝子転写生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーとを接触させるポリメラーゼ連鎖反応により判定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体とを接触させる免疫アッセイにより判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
試料が体液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
試料が血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
試料がリンパ組織および／またはリンパ液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
試料がリンパ節試料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと以前に診断されたことがある、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと以前に診断され、かつそれに対する処置を受けたことがある、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞を有する疑いがある患者から採取した腫瘍細胞が結腸直腸、胃または食道の腫瘍細胞であることを確認するインビトロ方法であって、腫瘍細胞がＣＤＸ２を発現するか判定する工程を含み、その際、ＣＤＸ２の発現は該腫瘍細胞が胃または食道の腫瘍細胞であることを指示するものである方法。
【請求項２２】
腫瘍細胞によるＣＤＸ２の発現を、ＣＤＸ２の遺伝子転写生成物の存在の検出により判定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍細胞によるＣＤＸ２の発現を、腫瘍細胞からのｍＲＮＡまたはそれから形成されたｃＤＮＡとＣＤＸ２遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーとを接触させるポリメラーゼ連鎖反応により判定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍細胞によるＣＤＸ２の発現を、腫瘍細胞からのタンパク質とＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体とを接触させる免疫アッセイにより判定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
個体において胃組織の試料におけるＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在を検出する方法であって、胃組織の試料を検査してＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在を検出する工程を含み、その際、胃試料中におけるＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在は胃癌を指示するものである方法。
【請求項２６】
胃組織の試料を検査して該試料中にＣＤＸ２遺伝子転写生成物が存在するか判定する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤＸ２遺伝子転写生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーとを接触させるポリメラーゼ連鎖反応により判定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体とを接触させる免疫アッセイにより判定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
個体において食道組織の試料におけるＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在を検出する方法であって、食道組織の試料を検査してＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在を検出する工程を含み、その際、食道試料中におけるＣＤＸ２転写体または翻訳生成物の存在は食道癌を指示するものである方法。
【請求項３０】
食道組織の試料を検査して該試料中にＣＤＸ２遺伝子転写生成物が存在するか判定する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤＸ２遺伝子転写生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーとを接触させるポリメラーゼ連鎖反応により判定する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物の存在を、試料とＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体とを接触させる免疫アッセイにより判定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
結腸直腸癌、胃癌および／または食道癌を伴う個体を診断するための、下記のいずれかを含むキット：
ａ）ＣＤＸ２遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを選択的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応プライマーを含む容器；
ならびに下記のうち１又はそれより多く：
陽性ＰＣＲアッセイ対照試料を含む容器、
陰性ＰＣＲアッセイ対照試料を含む容器、
試料を入手および／または処理するための指示書、
ＰＣＲ診断アッセイを実施するための指示書、ならびに
ＰＣＲ診断アッセイの陽性結果および／または陰性結果を表わす写真または図；
あるいは
ｂ）ＣＤＸ２遺伝子翻訳生成物に特異的に結合する抗体を含む容器；
ならびに下記のうち１又はそれより多く：
陽性免疫アッセイ対照試料を含む容器、
陰性免疫アッセイ対照試料を含む容器、
試料を入手および／または処理するための指示書、
免疫診断アッセイを実施するための指示書、ならびに
免疫診断アッセイの陽性結果および／または陰性結果を表わす写真または図。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、消化管の癌細胞、特に原発性および転移性の胃癌および食道癌ならびに転移性結腸直腸癌を検出するためのインビトロ診断方法、ならびにそのような方法を実施するためのキットおよび試薬に関する。本発明は、消化管由来の腫瘍、特に原発性および転移性の胃および食道の腫瘍ならびに転移性結腸直腸腫瘍のインビボイメージングおよび処置のための化合物および方法に関する。本発明は、ターゲティングした遺伝子療法組成物、アンチセンス組成物および薬物組成物、それらを調製および使用するための方法および組成物に関する。本発明は、消化管の癌細胞、特に原発性および転移性の胃癌および食道癌ならびに転移性結腸直腸癌に対する予防用および治療用ワクチン、ならびにそれらを調製および使用するための組成物および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
本出願は、米国仮特許出願６０／１９２，２２９（２０００年３月２７日出願）（それを本明細書に援用する）の優先権を主張する。
【０００３】
本出願は、米国特許ＵＳＰ５，５１８，８８８（１９９６年５月２１日発行）、ＵＳＰ５，６０１，９９０（１９９７年２月１１日発行）、ＵＳＰ６，０６０，０３７（２０００年４月２６日発行）、ＵＳＰ５，９６２，２２０（１９９９年１０月５日発行）およびＵＳＰ５，８７９，６５６（１９９９年３月９日発行）（それらを本明細書に援用する）、ならびに米国特許出願０９／１８０，２３７（１９９７年３月１２日出願）（それを本明細書に援用する）の優先権を主張する。
【０００４】
消化管由来の癌、特に原発性および転移性の胃癌および食道癌ならびに転移性結腸直腸癌を伴う個体をスクリーニング、診断およびモニターするための試薬、キットおよび方法が求められている。由来の分からない癌が消化管由来であることを同定および確認するための、また組織および癌試料を分析して消化管由来の癌を同定および確認し、かつそのような癌細胞の転移レベルを判定するための試薬、キットおよび方法が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞を特異的にターゲティングしうる組成物が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞に特異的に結合しうるイメージング剤が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞をイメージングするための改良法が求められている。結腸直腸、胃癌および食道癌の細胞に特異的に結合しうる療法薬が求められている。原発性および／または転移性の胃癌または食道癌あるいは転移性結腸直腸癌に罹患している疑いがある個体を治療するための改良法が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌を処置するためのワクチン組成物が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌を治療および予防するためのワクチン組成物が求められている。結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞へ療法薬、アンチセンス化合物および他の薬物を特異的に運搬しうる療法薬が求められている。
【０００５】
発明の概要
本発明はさらに、個体が消化管由来の癌、特に原発性および転移性の胃癌および食道癌ならびに転移性結腸直腸癌を伴うか否かを判定するためのインビトロ方法に関する。本発明は、個体からの非結腸直腸組織および体液の試料を検査して、結腸以外の試料中の細胞がＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２のうち１又はそれより多く（それぞれ、正常な結腸細胞、ならびに結腸直腸、胃および食道の腫瘍細胞が発現する）を発現しているか否かを判定するためのインビトロ方法に関する。結腸直腸管の外側の試料中にＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くが存在することは、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現の指標であり、かつその個体が転移性の結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）あるいは原発性または転移性の胃癌および／または食道癌に罹患している可能性がある証拠である。結腸直腸癌に罹患している疑いがある患者において結腸直腸管の外側の試料中にＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くが存在することは、その個体が転移性結腸直腸癌に罹患しているという結論を支持する。転移性結腸直腸癌の診断を下すかまたは確認することができる。胃癌または食道癌に罹患している疑いがある患者において結腸直腸管の外側の試料中にＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くが存在することは、その個体が原発性および／または転移性の胃癌または食道癌に罹患しているという結論を支持する。原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の診断を下すかまたは確認することができる。
【０００６】
本発明はさらに、腫瘍細胞が結腸直腸、胃または食道に由来するか否かを判定するためのインビトロ方法に関する。本発明は、癌に罹患している個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患しているか否かを診断するためのインビトロ方法に関する。本発明は、個体からの腫瘍試料を検査して、結腸直腸、胃または食道の腫瘍細胞が発現するＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くをその腫瘍細胞が発現しているか否かを判定するためのインビトロ方法に関する。患者から得た試料中にＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くが存在することは、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多く発現の指標であり、かつその個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患している可能性がある証拠である。結腸直腸、胃または食道の腫瘍である疑いがある腫瘍において、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くが存在することは、それらの腫瘍が結腸直腸癌、胃癌または食道癌であるという結論、および結腸直腸癌、胃癌または食道癌の診断を支持する。
【０００７】
本発明はさらに、本発明方法を実施するためのインビトロキット、ならびにそのような本発明のインビトロキットにおける構成要素として有用な試薬および組成物に関する。
【０００８】
本発明はさらに、原発性および転移性の胃および食道の腫瘍ならびに転移性結腸直腸腫瘍のイメージング方法、ならびに原発性および転移性の胃および食道の腫瘍ならびに転移性結腸直腸腫瘍に罹患している疑いがある個体の処置方法であって、その個体に本発明による医薬組成物を投与する工程を含み、その際、組成物またはコンジュゲート化合物が原発性および／または転移性の胃または食道の腫瘍ならびに転移性結腸直腸腫瘍癌に罹患しているヒトの療法用または診断用として有効な量で存在する方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、原発性および転移性の胃および食道の腫瘍細胞ならびに転移性結腸直腸腫瘍細胞へ有効物質を運搬する方法であって、原発性および／または転移性の胃または食道の腫瘍あるいは転移性結腸直腸癌を伴う個体に、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、および表面にＳＩリガンドを含むリポソームおよびそれに封入された有効成分を含む非コンジュゲート組成物を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を含む死滅または不活化した結腸直腸、胃または食道の腫瘍細胞；およびそれを含むワクチンに関する。ある態様において、死滅または不活化した細胞または粒子は、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くを含む。ある態様において、死滅または不活化した細胞または粒子は、ハプテン化されている。
【００１１】
本発明はさらに、結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患している個体の処置方法、および結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症しやすい個体の処置方法に関する。本発明方法は、そのような個体に有効量のそのようなワクチンを投与することを提供する。本発明はさらに、そのようなワクチンを免疫療法薬として利用することに関する。
【００１２】
本発明は、転移性癌の診断に有用な組織特異的分子マーカーを単離するための方法に関する。本発明の１態様は、起源組織から到達組織（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ）または体液へ転移した腫瘍細胞の検出に有用な分子マーカーを同定する方法である。本方法は下記の工程を含む：起源組織細胞集団において、起源組織の最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に関連する転写因子の活性をダウンレギュレートし；ダウンレギュレートされた起源細胞集団の発現プロフィールを、対照の起源細胞集団の発現プロフィールと比較し；対照の起源細胞集団において発現しているがダウンレギュレートされた起源細胞集団においては発現していない候補マーカーを同定し；そして対照の起源細胞集団、癌の起源細胞集団、および到達細胞集団における候補マーカーの発現を比較し、その際、対照の起源細胞集団および癌の起源細胞集団において発現しているが到達細胞集団においては発現していない候補マーカーは、起源組織から到達組織へ転移した癌の検出のための有用なマーカーである。本方法は、分子マーカーを単離する追加工程を含むことができる。本方法は、起源組織の最終分化に関連する遺伝子の調節領域に結合する転写因子を同定する追加工程を含むこともできる。
【００１３】
好ましい態様の説明
定義
本明細書中で用いる用語”ＳＩ”は、正常な結腸直腸細胞、ならびに原発性および転移性の結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞が発現する細胞タンパク質であって、スクラーゼ−イソマルターゼとしても知られるタンパク質を表わすものとする。
【００１４】
本明細書中で用いる用語”ＣＤＸ１”は、正常な結腸直腸細胞、ならびに原発性および転移性の結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞が発現する細胞タンパク質ＣＤＸ１を表わすものとする。
【００１５】
本明細書中で用いる用語”ＣＤＸ２”は、正常な結腸直腸細胞、ならびに原発性および転移性の結腸直腸癌、胃癌および食道癌の細胞が発現する細胞タンパク質ＣＤＸ２を表わすものとする。
【００１６】
本明細書中で、用語”ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くの機能性フラグメント”中に用いる用語”機能性フラグメント”は、全長配列をもつ核酸分子と関連した機能をもつＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子転写体フラグメントを表わすものとする。たとえば、機能性フラグメントはオリゴヌクレオチドもしくは核酸プローブ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは核酸分子、またはコード配列として使用できる。
【００１７】
ヒトＳＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃｈａｎｔｒｅｔ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５２（Ｐｔ  １），５７−６１（１９８８）およびＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＮＭ００１０４１に示されている；それら両者を本明細書に援用する。
【００１８】
ＣＤＸ１タンパク質のアミノ酸配列およびＣＤＸ１遺伝子転写体のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＸＭ００３７９１に示されている；これを本明細書に援用する。
【００１９】
ＣＤＸ２タンパク質のアミノ酸配列およびＣＤＸ２遺伝子転写体のヌクレオチド配列は、Ｍａｌｌｏ，Ｇ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７４（１）：３５−４４およびＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．Ｕ５１０９６に示されている；それら両者を本明細書に援用する。
【００２０】
本明細書中で、用語”ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質の機能性フラグメント”中に用いる用語”機能性フラグメント”は、全長配列をもつＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質と同じ機能をもつＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質フラグメントを意味する。たとえばＳＩタンパク質の免疫原機能性フラグメントは、抗ＳＩ抗体が認識するエピトープを含む。ＳＩのリガンド結合機能性フラグメントは、ＳＩタンパク質を認識して結合するリガンドに結合しうる構造を形成する配列を含む。
【００２１】
本明細書中で用いる用語”抗ＳＩタンパク質抗体が認識するエピトープ”は、抗ＳＩタンパク質抗体が特異的に認識するエピトープを表わす。
本明細書中で用いる用語”抗ＣＤＸ１タンパク質抗体が認識するエピトープ”は、抗ＣＤＸ１タンパク質抗体が特異的に認識するエピトープを表わす。
【００２２】
本明細書中で用いる用語”抗ＣＤＸ２タンパク質抗体が認識するエピトープ”は、抗ＣＤＸ２タンパク質抗体が特異的に認識するエピトープを表わす。
本明細書中で用いる用語”抗体”は、完全無傷の抗体、ならびにそのＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）2フラグメントを表わすものとする。完全無傷の抗体には、モノクローナル抗体、たとえばネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【００２３】
本明細書中で用いる用語”ＳＩリガンド”は、ＳＩタンパク質に特異的に結合する化合物を表わすものとする。ＳＩに結合する抗体はＳＩリガンドである。ＳＩリガンドはタンパク質、ペプチドまたは非ペプチドであってよい。
【００２４】
本明細書中で用いる用語”有効物質”は、療法薬またはイメージング剤である化合物を表わすものとする。
本明細書中で用いる用語”放射安定性”は、放射性崩壊を生じない化合物、すなわち放射性でない化合物を表わすものとする。
【００２５】
本明細書中で用いる用語”療法薬”は、化学療法薬、毒素、放射線療法薬、ターゲティング剤または放射線増感剤を表わすものとする。
本明細書中で用いる用語”化学療法薬”は、細胞と接触した場合および／または細胞に取り込まれた場合に細胞に影響を及ぼす化合物、たとえば細胞死をもたらし、細胞分裂を阻害し、または分化を誘発する化合物を表わすものとする。
【００２６】
本明細書中で用いる用語”毒素”は、細胞と接触した場合および／または細胞に取り込まれた場合に細胞死を起こす化合物を表わすものとする。
本明細書中で用いる用語”放射線療法薬”は、細胞と接触した場合および／または細胞に取り込まれた場合に細胞死を起こす放射性核種を表わすものとする。
【００２７】
本明細書中で用いる用語”ターゲティング剤”は、他の化合物が結合しうる化合物または他の化合物と反応しうる化合物を表わすものとする。ターゲティング剤は、ターゲティング剤と結合した化学療法薬、毒素、酵素、放射線療法薬、抗体またはイメージング剤を細胞へ運搬するのに使用でき、および／または共投与した有効物質を変換その他の形で変化もしくは増強させるのに使用できる。ターゲティング剤は細胞へ局在化させる第１物質を構成する部分を含み、これが第２物質と接触した際に、目的活性をもつ第３物質に変換されるか、または第２物質を目的活性をもつ物質に変換してもよい。その結果、局在化した物質は癌細胞が目的活性をもつ物質に曝露されるのを促進する。
【００２８】
本明細書中で用いる用語”放射線増感剤”は、イオン化放射線の傷害作用に対する細胞の感受性を高める物質を表わすものとする。放射線増感剤は、より低い線量の放射線を照射してもなお療法有効線量が付与されるのを可能にする。
【００２９】
本明細書中で用いる用語”イメージング剤”は、検出できる化合物を表わすものとする。
本明細書中で用いる用語”ＳＩ結合部分”は、コンジュゲート化合物のＳＩリガンド構成部分を表わすものとする。
【００３０】
本明細書中で用いる用語”有効部分”は、コンジュゲート化合物の有効物質構成部分を表わすものとする。
本明細書中で用いる用語”コンジュゲート化合物”および”コンジュゲート組成物”は互換性をもって用いられ、ＳＩ結合部分および有効部分を含み、ＳＩに結合しうる化合物を表わすものとする。本発明によるコンジュゲート化合物は、ＳＩリガンドを構成する部分および有効物質を構成する部分を含む。したがって本発明のコンジュゲート化合物は、ＳＩに特異的に結合でき、かつ療法薬またはイメージング剤である部分を含む。コンジュゲート組成物は、架橋剤および／または上記部分間のスペーサーとして用いられる分子を含むことができる。
【００３１】
本明細書中で用いる用語”架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ，ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）”、”コンジュゲート剤、”結合剤”、”縮合剤”および”二官能性架橋剤”は互換性をもって用いられ、ＳＩリガンドと有効物質に結合することによりコンジュゲート化合物を形成するために用いられる分子基を表わすものとする。
【００３２】
本明細書中で用いる用語”結腸直腸癌”は、結腸直腸癌が小腸より下方の腸管（すなわち大腸（結腸）：盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸を含む；ならびに直腸）の細胞の癌を特徴とする医学的状態であると定める、十分に受け入れられた医学的定義を含むものとする。さらに、本明細書中で用いる用語”結腸直腸癌”は、十二指腸および小腸（空腸および回腸）の細胞の癌を特徴とする医学的状態をさらに含むものとする。本明細書中で用いる結腸直腸癌の定義は一般の医学的定義より広いが、十二指腸および小腸の細胞もＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を含有するのでこのように定められる。
【００３３】
本明細書中で用いる用語”胃癌”は、胃癌が胃細胞の癌を特徴とする医学的状態であると定める、十分に受け入れられた医学的定義を含むものする。
本明細書中で用いる用語”食道癌”は、食道癌が食道細胞の癌を特徴とする医学的状態であると定める、十分に受け入れられた医学的定義を含むものする。
【００３４】
本明細書中で用いる用語”転移”は、身体の１つの臓器または部分に由来する癌細胞が身体の他の部分へ再配置して増殖し続けるプロセスを表わすものとする。転移した細胞はその後、腫瘍を形成し、これがさらに転移する可能性がある。したがって転移は、癌が最初に起きた身体部分から身体の他の部分へ拡散することを表わす。
【００３５】
本明細書中で用いる用語”転移性結腸直腸癌細胞”は、転移した結腸直腸癌細胞を表わすものとする。転移性結腸直腸癌細胞は、十二指腸、小腸（空腸および回腸）、大腸（結腸）（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸を含む）ならびに直腸以外の身体部分に局在する。
【００３６】
本明細書中で用いる用語”転移性胃癌細胞”は、転移した胃癌細胞を表わすものとする。転移性胃癌細胞は、胃以外の身体部分に局在する。
本明細書中で用いる用語”転移性食道癌細胞”は、転移した結腸直腸癌細胞を表わすものとする。転移性食道癌細胞は、食道以外の身体部分に局在する。
【００３７】
本明細書中で用いる用語”非結腸直腸試料”および”腸外試料”は互換性をもって用いられ、結腸直腸以外の供給源からの組織または体液の試料を表わすものとする。ある好ましい態様において、非結腸直腸試料はリンパ節などの組織の試料である。ある好ましい態様において、非結腸直腸試料は由来が未確認の腺癌である腸外組織の試料である。ある好ましい態様において、非結腸直腸試料は血液試料である。
【００３８】
本明細書中で用いる”由来が未確認の腺癌に罹患した個体”は、由来が明確に同定されていない腫瘍を伴う個体を表わすものとする。
本明細書中で用いる”結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症しやすい疑いがある個体”は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症する特別なリスクをもつ個体を表わすものとする。結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症する特別なリスクをもつ個体の例は、その家族病歴が家族構成員の結腸直腸癌、胃癌もしくは食道癌の平均発症率より高い個体、および／または既に結腸直腸癌、胃癌もしくは食道癌を発症し、効果的な処置を受け、したがって再発および反復のリスクに直面している個体である。
【００３９】
本明細書中で用いる用語”アンチセンス組成物”および”アンチセンス分子”は互換性をもって用いられ、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズして転写または翻訳が起きるのを阻害および／または阻止することにより転写または翻訳を調節する化合物を表わすものとする。アンチセンス分子には、核酸分子ならびにその誘導体および類似体が含まれる。アンチセンス分子は、アンチセンス分子が核酸分子またはその誘導体もしくは類似体であるか否かに関係なく、相補的ヌクレオチド配列が行うのと同じ様式でＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする。アンチセンス分子は、その発現が癌に関連する遺伝子の転写または翻訳を阻害または阻止することができる。
【００４０】
本明細書中で用いる用語”ＳＩ免疫原”は、ＳＩタンパク質もしくはそのフラグメント、またはそれらもしくはそれらのハプテン化生成物を含むタンパク質、少なくとも１つのＳＩエピトープを示す細胞および粒子、ならびに少なくとも１つのＳＩエピトープを示すハプテン化した細胞およびハプテン化した粒子を表わすものとする。
【００４１】
本明細書中で用いる用語”ＣＤＸ１免疫原”は、ＣＤＸ１タンパク質もしくはそのフラグメント、またはそれらもしくはそれらのハプテン化生成物を含むタンパク質、少なくとも１つのＣＤＸ１エピトープを示す細胞および粒子、ならびに少なくとも１つのＣＤＸ１エピトープを示すハプテン化した細胞およびハプテン化した粒子を表わすものとする。
【００４２】
本明細書中で用いる用語”ＣＤＸ２免疫原”は、ＣＤＸ２タンパク質もしくはそのフラグメント、またはそれらもしくはそれらのハプテン化生成物を含むタンパク質、少なくとも１つのＣＤＸ２エピトープを示す細胞および粒子、ならびに少なくとも１つのＣＤＸ２エピトープを示すハプテン化した細胞およびハプテン化した粒子を表わすものとする。
【００４３】
本明細書中で用いる用語”組換え発現ベクター”は、適切な宿主に導入した場合にそのタンパク質をコードするコード配列の発現を指令するのに必要な遺伝子エレメントを含有するプラスミド、ファージ、ウイルス粒子または他のベクターを表わすものとする。コード配列は、必要な調節配列に機能可能な状態で結合している。発現ベクターは周知であり、容易に入手できる。発現ベクターの例には、プラスミド、ファージ、ウイルスベクターおよび他の核酸分子、または宿主細胞を形質転換してコード配列の発現を促進するのに有用なビヒクルを含有する核酸分子が含まれる。
【００４４】
本明細書中で用いる用語”非正統的（非相同的）転写（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）”は、他の組織からの細胞における組織特異的遺伝子の低レベル発現またはバックグラウンド発現を表わすものとする。したがって非正統的転写現象により、他の組織における組織特異的転写体に対するｍＲＮＡのコピーが産生される。遺伝子発現の検出に用いる検出方法の感度が非正統的転写の検出に十分なほど高ければ、対照アッセイおよび／または定量アッセイおよび／または他の手段で陰性試料における非正統的転写による転写の発現レベルを差し引いて、非正統的転写による偽陽性の発生を排除しなければならない。あるいは非正統的転写により存在するＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くを検出せずに、試料中におけるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子のうち１又はそれより多くの発現の証拠を検出することができる。これは、非正統的転写のため存在する、バックグラウンドとして存在するＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くを検出するのに十分な感度をもたない方法を用いて達成される。
【００４５】
ＳＩ
結腸直腸、胃または食道の細胞に由来する癌は、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現する。そのような腫瘍がＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現することにより、このタンパク質およびそのｍＲＮＡは腸外組織および血液中に癌細胞が存在することの特異的バイオマーカーとなりうる。実際にこの特徴により、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２  ｍＲＮＡ検出は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌患者の病期を判定し、再発性疾患の証拠を血中に求めるために術後の患者を追跡し、また結腸直腸癌、胃癌または食道癌を検出するための、診断検査となりうる。さらに、有効物質をインビボで腫瘍細胞へ運搬するために、有効物質にコンジュゲートしたリガンドでＳＩをターゲティングすることができる。
【００４６】
米国特許ＵＳＰ５，５１８，８８８（１９９６年５月２１日、Ｗａｌｄｍａｎに発行）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２（１９９４年１０月２６日出願）、米国特許出願０８／４６７，９２０（１９９５年６月６日出願）および米国特許出願０８／５８３，４４７（１９９６年１月５日出願）（それらをそれぞれ本明細書に援用する）には、有効化合物を運搬するためにＳＴ受容体（グアニリンシクラーゼＣまたはＧＣＣとも呼ばれる）をターゲティングすることにより転移性結腸直腸腫瘍をターゲティングしうることが開示されている。腸管の外側の細胞に結腸直腸癌のマーカーとしてのＳＴ受容体が存在すると、転移性結腸直腸腫瘍を伴う個体をスクリーニング、同定および処置できる。ＳＴ受容体を利用して、結腸直腸細胞への遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物の運搬をターゲティングすることもできる。
【００４７】
米国特許ＵＳＰ５，６０１，９９０（１９９７年２月１１日、Ｗａｌｄｍａｎに発行）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２（１９９４年１０月２６日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０７４６７（１９９７年５月２日出願）（それらをそれぞれ本明細書に援用する）には、腸管の外側から得た組織および体液の試料中にＳＴ受容体発現の証拠を検出することが転移性結腸直腸癌の指標になると開示されている。
【００４８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０７５６５（１９９７年５月２日出願）（本明細書に援用する）には、ＳＴ受容体と反応する抗体でターゲティングできるエピトープを含む免疫原を、予防用および治療用の抗−転移性結腸直腸癌組成物として有用なワクチン組成物に使用できることが開示されている。
【００４９】
正常な結腸細胞のほか、原発性および転移性の結腸癌、胃癌および食道癌の細胞もＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現することが見いだされた。正常な胃および食道の細胞はＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現しない。したがって本発明は、転移性結腸癌ならびに原発性および転移性の胃癌および食道癌を伴う患者の診断、病期判定および術後監視のための特異的な分子診断マーカーとしてのＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２の使用を提供する。
【００５０】
分子技術を用いるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２の発現検出、たとえばＲＴ−ＰＣＲ（これに限定されない）を用いて患者を診断および病期判定し、外科処置後再発および／または寛解を追跡することができ、かつ結腸直腸癌、胃癌および食道癌の発症について正常者をスクリーニングできる。
【００５１】
ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２は正常な腸細胞にのみ発現するという点で特異である。腸を内張りしている粘膜細胞は互いに密な接合により結合し、血流中への腸内容物の通過および腸内腔への血流成分の通過に対するバリヤーを形成している。したがって、ＳＩ発現細胞が先端に位置するためそれらの細胞は循環系から隔離され、これにより身体の残りの部分から分離され、本質的に身体の”外側”にあると考えられる。したがって、身体の残りの部分は腸管の”外側”とみなされる。腸管の”外側”に投与した組成物は、正常にＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現する細胞のみから隔離および分離した状態を維持する。逆に、腸管の外側の組織から採取した組織試料は、正常であればＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現する細胞を含まない。
【００５２】
結腸直腸癌に罹患している個体において、癌細胞はしばしばＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を産生および表示する細胞に由来し、これらの癌細胞はＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を産生し続ける。結腸直腸癌細胞はＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現することが認められた。同様に、胃癌および食道癌の細胞もＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現する。
【００５３】
結腸直腸腫瘍細胞によるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２の発現は、インビトロでのスクリーニング、モニタリングおよび病期判定のための検出可能なターゲット、ならびにイメージングおよび処置のための有効物質を含むコンジュゲート組成物のインビボ運搬のためのターゲットを提供する。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２は、転移性結腸直腸癌に対する予防または転移性結腸直腸癌を伴う個体の治療に使用できるワクチンのターゲットとしても使用できる。
【００５４】
胃または食道の腫瘍細胞によるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２発現は、インビトロでのスクリーニング、モニタリングおよび病期判定のための検出可能なターゲット、ならびにイメージングおよび処置のための有効物質を含むコンジュゲート組成物のインビボ運搬のためのターゲットを提供する。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２は、原発性および転移性の胃癌および食道癌に対する予防、または原発性および転移性の胃癌および食道癌を伴う個体の治療に使用できるワクチンのターゲットとしても使用できる。
【００５５】
インビトロ診断薬
本発明のある態様によれば、患者および患者試料をスクリーニング、診断および分析して腸管の外側の細胞によるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現の証拠を検出するためのインビトロ方法が提供される。その際ＳＩ発現は、転移性結腸直腸癌または原発性もしくは転移性の胃癌もしくは食道癌を示唆する。転移性結腸直腸癌または原発性もしくは転移性の胃癌もしくは食道癌を伴う疑いがある患者において、腸管の外側の細胞によるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現は転移性結腸直腸癌または原発性もしくは転移性の胃癌もしくは食道癌の指標であり、そのような患者の診断、モニタリングおよび病期判定に利用できる。さらに本発明は、患者および患者試料をインビトロでスクリーニングおよび分析して腸管の外側の細胞によるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現の証拠を検出するのに有用な方法、組成物およびキットに関する。その際、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くを発現する細胞の存在は、その腫瘍が結腸直腸癌または胃癌もしくは食道癌に由来することを示唆または確定する。本発明の他の態様においては、転移性結腸直腸癌または原発性もしくは転移性の胃癌もしくは食道癌の細胞を視覚化するのに有用な組成物、キットおよび方法が提供される。
【００５６】
インビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、方法およびキットは、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の高リスク群に属する個体、たとえば限局性疾患および／または転移性疾患を伴うと診断された個体、ならびに／あるいはその疾患に遺伝的関連をもつ個体のモニタリングに使用できる。インビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、方法およびキットは、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の治療を受けている個体および／または受けたことがある個体のモニタリングに使用して、その癌が転移しているかどうかを判定できる。インビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、方法およびキットは、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の治療を受けている個体および／または受けたことがある個体のモニタリングに使用して、その癌が排除されたかどうかを判定できる。インビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、方法およびキットは、そのほかの発症しやすい個体、すなわち遺伝子スクリーニングおよび／または家族歴により遺伝的素因があると同定された個体のモニタリングに使用できる。遺伝学的理解の進歩、ならびに技術および疫学の発達により、胃癌または食道癌の発症について個体がもつ確率の判定およびリスク評価が可能となった。家族健康歴および／または遺伝子スクリーニングを用いると、ある個体が結腸直腸癌、胃癌または食道癌を含めた特定の型の癌を伴う確率を推定できる。特定の型の癌を発症する素因があると同定された個体をモニタリングまたはスクリーニングして、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の証拠を検出することができる。そのような証拠が発見されると、その疾患を克服するために早期処置を行うことができる。したがって、結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症するリスクのある個体を同定し、そのような個体から試料を採取する。本発明は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患した血族を含めた家族病歴をもつと同定された個体のモニタリングに特に有用である。同様に、本発明は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断された個体、特に腫瘍の治療を受け、摘出され、および／または他の寛解を経験した個体（結腸直腸癌、胃癌または食道癌の治療を受けた個体を含む）のモニタリングにも特に有用である。
【００５７】
インビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、方法およびキットは、腫瘍の分析に使用できる。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現は細胞タイプのマーカーであり、由来が確認されていない腺癌の由来が結腸直腸癌、胃癌または食道癌である可能性を示唆する。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの発現の検出は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の初期診断の補助、またはそのような診断の確認にも利用できる。本発明の組成物、方法およびキットを用いて、結腸直腸癌、胃癌または食道癌由来であると思われる腫瘍をそうであると確認できる。
【００５８】
本発明のインビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、キットおよび方法を用いて、胃または食道からの組織試料を分析し、原発性の胃癌または食道癌を同定できる。
【００５９】
本発明のインビトロでのスクリーニング用および診断用の組成物、キットおよび方法を用いて、結腸からの組織試料を分析し、腸組織への原発性結腸直腸癌の浸潤度を検出できる。
【００６０】
本発明によれば、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２  ＳＩ遺伝子転写体またはタンパク質に結合する化合物が提供される。身体の正常組織は、腸管細胞以外はＣＤＸ１およびＣＤＸ２転写体またはタンパク質をもたない。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２の発現は細胞タイプのマーカーであり、腸外試料中の結腸直腸癌、胃癌または食道癌の同定に有用である。
【００６１】
本発明のある態様においては、非結腸直腸組織および体液試料または腫瘍試料をスクリーニングして、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くの存否を同定できる。ＥＬＩＳＡアッセイおよびウェスタンブロット法などの方法を実施して、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くが試料中に存在するか判定できる。
【００６２】
本発明のある態様においては、非結腸直腸組織試料および体液試料または腫瘍試料をスクリーニングしてＳＩ遺伝子転写体の存否を検出することにより、結腸直腸管の外側の細胞がＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くを発現しているか同定できる。ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くまたはそれから形成されたｃＤＮＡの存在は、ＰＣＲ増幅、分枝鎖オリゴヌクレオチド法、ノーザンブロット法（ｍＲＮＡ）、サザンブロット法（ｃＤＮＡ）またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションなどの方法により判定できる。
【００６３】
本発明のある態様においては、非結腸直腸組織試料または腫瘍試料からの細胞を検査して、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くの存否を同定できる。組織切片について免疫組織化学的ブロット法などの方法を実施して、試料中にＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くが存在するか判定できる。
【００６４】
本発明のある態様においては、非結腸直腸組織試料または腫瘍試料からの細胞を検査してＳＩ遺伝子転写体の存否を検出することにより、結腸直腸管の外側の細胞にＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くが発現しているか判定できる。組織切片からの細胞中におけるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くまたはそれから形成されたｃＤＮＡの存在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法により判定できる。
【００６５】
非結腸直腸組織試料および体液試料中、または非結腸直腸組織試料からの細胞におけるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの存在は、胃癌または食道癌の可能性を示唆する。腫瘍試料中または腫瘍細胞におけるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くの存在は、その腫瘍が結腸直腸、胃または食道に由来する可能性を示唆する。非結腸直腸組織試料および体液試料中、または非結腸直腸組織試料からの細胞におけるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くの存在は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の可能性を示唆する。腫瘍試料中または腫瘍細胞におけるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くの存在は、その腫瘍が結腸直腸、胃または食道に由来する可能性を示唆する。
【００６６】
試料は切除組織、または穿刺生検を含めた生検材料から得ることができる。外科病理学的検査のための組織切片標本は凍結でき、標準法により作製できる。組織切片についての免疫組織化学的検査およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結合アッセイは、固定した細胞において実施される。腸外試料を標準法、たとえば超音波処理、機械的破壊または化学的細胞溶解（界面活性剤溶解など）によりホモジナイズできる。体液、たとえば血液、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、膣液、精液および便などの試料中の腫瘍試料をスクリーニングして、それらの腫瘍が結腸直腸、胃または食道に由来するかどうかを判定することもことも考慮される。
【００６７】
非結腸直腸組織試料は、結腸直腸管（すなわち小腸より下方の腸管（すなわち大腸（結腸）：盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸を含む；ならびに直腸）、さらに十二指腸および小腸（空腸および回腸））、以外の任意の組織から得ることができる。結腸直腸管以外のすべての組織の正常細胞は、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２を発現しない。したがって、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２タンパク質またはＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体が非結腸直腸試料中に検出されると、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞が存在する可能性が示唆される。ある好ましい態様において、組織試料はリンパ節である。
【００６８】
組織試料は、生検針の使用を含めた外科的標準法により得ることができる。当業者には、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くについて検査しうる多様な被験試料が容易に理解され、組織試料を得る方法も自明であろう。
【００６９】
ＳＩの存在をスクリーニングするために、組織試料を周知の方法、たとえば超音波処理、機械的破壊、化学的細胞溶解（界面活性剤溶解など）またはその組合わせによりホモジナイズし、または他の形で調製できる。
【００７０】
体液試料の例には、血液、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、膣液および精液が含まれる。ある好ましい態様においては、体液試料として血液を用いる。体液試料から、たとえば遠心により細胞を単離できる。当業者には、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くについて検査しうる多様な被験試料が自明であろう。試料は注射器またはスワブにより体液を採取する方法などにより得ることができる。当業者には、被験試料を得るための他の方法が自明であろう。
【００７１】
血液試料を用いるアッセイにおいては、血球から血漿を分離してもよい。血漿をＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くについてスクリーニングすることができる。これには、腫瘍細胞からＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２のうち１又はそれより多くが開裂または脱落した場合に血中へ放出されたトランケート形タンパク質も含まれる。ある態様においては、血球画分を結腸直腸、胃または食道の腫瘍細胞の存在についてスクリーニングする。ある態様においては、血球画分中に存在するリンパ球をスクリーニングする；これは、血球を溶解し、血球が抱き込んだ胃または食道の腫瘍細胞が存在した結果として存在する可能性のあるＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２タンパク質のうち１又はそれより多くまたはＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体のうち１又はそれより多くの存在を検出することによる。ある好ましい態様においては、試料からｍＲＮＡを単離する前に、市販の免疫カラムによりＣＤ３４＋細胞を分離する。
【００７２】
本発明の態様には、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体を検出するヌクレオチド配列ベースの分子分析により試料がＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２発現細胞を含有するか判定する種々の方法が含まれる。このためには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、分枝鎖オリゴヌクレオチド法、ノーザンブロット法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を含めた幾つかの異なる方法を利用できる。
【００７３】
本発明は、ＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体の同定方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、ならびにそれらの構成要素を含む診断キットに関する。
【００７４】
ＳＩ遺伝子転写体を検出するためのｍＲＮＡ配列ベースの方法にはポリメラーゼ連鎖反応法、分枝鎖オリゴヌクレオチド法、ノーザンおよびサザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法ならびにオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書に記載する方法は本発明を実施する方法を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。非結腸直腸試料中のＳＩ、ＣＤＸ１およびＣＤＸ２遺伝子転写体の存在を検出するための他の配列ベースの方法も、本発明により採用できるものとする。
【００７６】
非結腸直腸試料に由来する遺伝子材料中の遺伝子転写体を検出するための好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる。ＰＣＲ法は当業者がルーティンに実施しており、診断にそれを用いることは周知であり、受け入れられている。ＰＣＲの実施方法は、”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に示されており、これを本明細書に援用する。ＰＣＲ法の応用は”Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９）に示されており、これを本明細書に援用する。ＵＳＰ４，６８３，２０２、ＵＳＰ４，６８３，１９５、ＵＳＰ４，９６５，１８８およびＵＳＰ５，０７５，２１６（これらを本明細書に援用する）には、ＰＣＲの実施方法が記載されている。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｅｕｓ  ＧＥＮＥ  ＡＭＰ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｎ８０８−００１７を用いてルーティンに実施できる。
【００７７】
ＰＣＲ法によれば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子中に存在する配列にハイブリダイズする５’および３’プライマーを用意し、さらに遊離ヌクレオチド、およびプライマー間のヌクレオチド配列に相補的な塩基に遊離ヌクレオチドをフィルインして相補的ＤＮＡ鎖を生成する酵素を供給することにより、ＤＮＡ配列の多数のコピーを迅速生成できる。酵素はこれらのプライマーに隣接する相補配列をフィルインする。５’プライマーと３’プライマーが両方とも同一の核酸小フラグメント上のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、特異的二本鎖サイズの生成物が対数的に増幅する。核酸フラグメントに単一プライマーのみがハイブリダイズする場合、直線的増幅により種々の長さの一本鎖生成物が生成する。
【００７８】
ＰＣＲプライマーは、当業者が配列情報を用いてルーティンに設計できる。ＳＩ遺伝子転写体のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す。ＣＤＸ１遺伝子転写体のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す。ＣＤＸ２遺伝子転写体のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す。この方法を実施するためには、試料中の細胞からＲＮＡを抽出し、試験するか、あるいは周知の方法および容易に入手できる出発物質を用いてｃＤＮＡを作製するのに使用する。当業者は容易にＰＣＲプライマーを調製できる。一組のプライマーは、一般に２種類のプライマーを含む。抽出したｍＲＮＡまたはそれから形成されたｃＤＮＡについてＰＣＲを実施する場合、ＳＩ遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡが存在するときは、多数コピーのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが形成されるであろう。それが存在しないときは、検出できる別個の生成物はＰＣＲにより形成されないであろう。プライマーは一般に８〜５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３５ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２８ヌクレオチドであり、遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡと同一または相補的であり、したがってそれらにハイブリダイズする。好ましい態様において、プライマーはそれぞれ１５〜３５ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２８ヌクレオチドのフラグメントである。プライマーは増幅すべき配列にハイブリダイズしなければならない。一般的プライマーは長さ１８〜２８ヌクレオチドであり、一般に５０〜６０％のＧ＋Ｃ組成をもつ。プライマーがハイブリダイズしなければならない配列にプライマー全体が相補的であることが好ましい。好ましくはプライマーは１００〜２０００塩基対のＰＣＲ生成物を形成する。しかし５０〜１０ｂｐ以上の生成物を形成することもできる。ｍＲＮＡを鋳型として用いる場合、プライマーはｍＲＮＡ配列にハイブリダイズしなければならない。ｃＤＮＡを鋳型として用いる場合、プライマーはｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしなければならない。
【００７９】
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、標準ＰＣＲプロトコルに従ってプライマー、遊離ヌクレオチドおよび酵素と混和する。この混合物が一連の温度変化を受ける。遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡが存在する場合、両プライマーが同一分子にハイブリダイズしたときは、プライマーおよび介在する相補配列を含む分子が対数的に増幅するであろう。増幅したＤＮＡは、多数の周知の方法で容易に検出できる。遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡが存在しない場合、ＰＣＲ生成物が対数的に増幅することはない。したがってＰＣＲ法は、試料中の遺伝子転写体を検出するためのきわめて容易な直接的かつ信頼性のある方法を提供する。
【００８０】
ＰＣＲ生成物は幾つかの周知の方法で検出できる。増幅ＤＮＡの存在を検出するための好ましい方法は、ＰＣＲ反応材料をゲル電気泳動により分離し、増幅ＤＮＡが存在する場合にそれを視覚化するためにゲルを臭化エチジウムで染色するものである。増幅ＤＮＡの予想サイズのサイズ標準品をゲル上に対照として流すことが好ましい。
【００８１】
ＲＮＡの回収量が異例に少なく、それから形成されるｃＤＮＡがごく少量であるような場合、１回目のＰＣＲ反応生成物についてＰＣＲ反応を実施することが望ましく、または必要である。すなわち、１回目のＰＣＲで生成した増幅ＤＮＡの量が検出困難である場合、２回目のＰＣＲを実施して１回目の増幅ＤＮＡの多数コピーのＤＮＡ配列を作製することができる。２回目のＰＣＲ反応には入れ子型プライマーセットを用いる。入れ子型プライマーセットは、１回目の反応に用いた５’プライマーの下流および３’プライマーの上流にハイブリダイズする。
【００８２】
本発明は、遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ法の実施のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを含む。
本発明によれば、非結腸直腸組織試料中の遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡの存在を検出する方法を実施するのに有用な診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットは、ＰＣＲ法の実施のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを含む。本発明による診断キットは、増幅ＤＮＡの存在を検出するために用いる、ゲル上に標準品として流すサイズマーカーを入れた容器を含むことが好ましい。サイズマーカーは、遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡの存在下でプライマーにより形成されるＤＮＡと同一サイズである。あるキットにおける他の構成要素には、アッセイを実施するための指示書が含まれる。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。陽性および陰性対照を備えていてもよい。
【００８３】
ＰＣＲアッセイは、ホモジナイズした組織試料中および体液試料の細胞中にある遺伝子転写体の検出に有用である。体液試料の血漿部分についてのＰＣＲを用いて遺伝子転写体を検出することが考慮される。
【００８４】
試料がＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現細胞を含有するか判定するための他の方法は、試料から抽出したｍＲＮＡの分枝鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析による。分枝鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、ＵＳＰ５，５９７，９０９、ＵＳＰ５，４３７，９７７およびＵＳＰ５，４３０，１３８の記載に従って実施でき、これらを本明細書に援用する。これらの特許の教示および遺伝子転写体の配列に従って試薬を設計できる。
【００８５】
試料がＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現細胞を含有するか判定するための他の方法は、非結腸直腸試料から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロット分析による。ノーザンブロット分析を実施するための方法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに記載されている。ｍＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡの電気泳動分離、ブロッティング、プローブ調製およびハイブリダイゼーションは周知の技術であり、容易に入手できる出発物質を用いてルーティンに実施できる。
【００８６】
ポリｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを抽出し、この材料を電気泳動により分離し、そしてたとえばニトロセルロースペーパーに移す。単離した特異的フラグメント（１又は複数）から作製した標識プローブを用いて、ペーパーに固定された相補フラグメントの存在を視覚化することができる。ノーザンブロット中のｍＲＮＡの同定に有用なプローブは、遺伝子転写体に相補的なヌクレオチド配列をもつ。当業者は本明細書の配列表の配列情報を用いてそのようなプローブを設計し、あるいは遺伝子転写体またはそれから形成されたｃＤＮＡを単離およびクローニングしてプローブとして用いることができる。そのようなプローブは、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０〜２００、より好ましくは４０〜１００ヌクレオチドのフラグメントであり、全遺伝子転写体であってもよい。
【００８７】
本発明によれば、非結腸直腸試料中の遺伝子転写体の存在をノーザンブロット分析により検出する方法を実施するのに有用な診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットは、ｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含む。プローブは放射性標識されていてもよい。本発明による診断キットは、ゲル上に標準品として流すサイズマーカーを入れた容器を含むことが好ましい。本発明による診断キットは、プローブにハイブリダイズする陽性対照を入れた容器を含むことが好ましい。あるキットにおける他の構成要素には、アッセイを実施するための指示書が含まれる。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。
【００８８】
ノーザンブロット分析は、ホモジナイズした組織試料中および体液試料の細胞中にある遺伝子転写体の検出に有用である。体液試料の血漿部分についてのＰＣＲを用いて遺伝子転写体を検出することが考慮される。
【００８９】
遺伝子転写体の存在を検出する他の方法は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法による。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法は当業者に周知である。要約すると、遺伝子転写体のヌクレオチド配列にハイブリダイズする特異的ヌクレオチド配列を含む検出可能なプローブを用いる。試料からのＲＮＡまたはそれから形成されたｃＤＮＡを、通常は濾紙などに固定する。プローブを添加し、固定された遺伝子材料にプローブが完全に相補する場合にのみハイブリダイズしうる条件下に保持する。その条件は、固定された材料にプローブの一部のみがハイブリダイズするプローブを洗い去るのに十分なほどストリンジェントである。洗浄したフィルター上にプローブが検出されたことは、相補配列を指示する。
【００９０】
オリゴヌクレオチドアッセイに有用なプローブは少なくとも１８ヌクレオチドの相補的ＤＮＡであり、遺伝子転写体に対する完全相補配列ほどに大きくてもよい。ある好ましい態様において、本発明のプローブは３０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１００ヌクレオチドである。
【００９１】
当業者は配列表に開示された配列情報を用いて本発明に有用なプローブを設計できる。不完全相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンド信号を最小に抑えるために、ハイブリダイゼーション条件をルーティンに最適化できる。ある好ましい態様において、プローブは全長クローンである。プローブは、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０〜２００、より好ましくは４０〜１００ヌクレオチドのフラグメントであり、全遺伝子転写体であってもよい。
【００９２】
本発明は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを実施するためのプローブとして有用な標識オリゴヌクレオチドを含む。本発明の標識プローブは、放射性標識ヌクレオチドで標識され、あるいは容易に入手できる非放射性検出シスタムにより検出される他のもので標識される。
【００９３】
本発明によれば、本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法を実施するのに有用な診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットは、遺伝子転写体の部分をコードする標識オリゴヌクレオチドを含む。本発明によるオリゴヌクレオチド診断キットの標識プローブは、放射性ヌクレオチドで標識されていることが好ましい。本発明によるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションベースの診断キットは、好ましくは陽性および陰性対照であるＤＮＡ試料を含む。陽性対照ＤＮＡ試料は、キットのプローブに対して完全相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸分子を含むものであり、したがってプローブはアッセイ条件下でこの分子にハイブリダイズする。陰性対照ＤＮＡは、ヌクレオチド配列がキットのプローブの配列に対して部分相補的である少なくとも１つの核酸分子を含むものである。プローブはアッセイ条件下で陰性対照ＤＮＡ試料にハイブリダイズしないであろう。あるキットにおける他の構成要素には、アッセイを実施するための指示書が含まれる。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。
【００９４】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法は、ホモジナイズした組織試料中および体液試料の細胞中にある遺伝子転写体の検出に有用である。体液試料の血漿部分についてのＰＣＲを用いて遺伝子転写体を検出することが考慮される。
【００９５】
本発明は、腫瘍試料を評価してそれらが結腸直腸、胃または食道に由来するか否かを判定するためのインビトロキット、ならびにそれを実施するのに有用な試薬および組成物に関する。本発明のある態様において、腫瘍試料は結腸直腸、胃もしくは食道の腫瘍または他の臓器の腫瘍を切除する外科処置を受けつつあるか、あるいはその回復期にある個体から摘出でき、あるいは生検材料であってもよい。腫瘍試料を分析して、遺伝子転写体の存否を同定する。免疫組織化学的アッセイなどの方法を実施して、腫瘍試料の細胞中にＳＩ、ＣＤＸ１および／またはＣＤＸ２が存在するか判定できる。タンパク質またはそれから形成されたｃＤＮＡをコードするｍＲＮＡの存在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学的方法およびｉｎ  ｓｉｔｕ  ＳＴ結合アッセイなどの方法で判定できる。
【００９６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は当業者に周知である。要約すると、細胞を固定し、この固定細胞に特異的ヌクレオチド配列を含む検出可能なプローブを添加する。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合、検出可能なプローブはそれらにハイブリダイズするであろう。
【００９７】
オリゴヌクレオチドアッセイに有用なプローブは少なくとも１８ヌクレオチドの相補的ＤＮＡであり、遺伝子転写体に対する完全相補配列ほどに大きくてもよい。ある好ましい態様において、本発明のプローブは３０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１００ヌクレオチドである。
【００９８】
当業者は配列表に開示された配列情報を用いて、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現細胞を同定するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に有用なプローブを設計できる。プローブは、好ましくは遺伝子転写体に対応するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。不完全相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンド信号を最小に抑えるために、ハイブリダイゼーション条件をルーティンに最適化できる。プローブは、好ましくは全長遺伝子転写体にハイブリダイズする。プローブは、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０〜２００、より好ましくは４０〜１００ヌクレオチドのフラグメントであり、遺伝子転写体であってもよく、より好ましくは遺伝子転写体の１８〜２８ヌクレオチドフラグメントであってもよい。
【００９９】
プローブは完全相補的であり、部分相補配列には十分にはハイブリダイズしない。本発明によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためには、プローブは蛍光により検出できることが好ましい。一般的方法は、プローブをビオチン修飾ヌクレオチドで標識し、次いで蛍光タグ付きアビジンで検出するものである。このようにプローブ自体が蛍光標識される必要はなく、後に蛍光マーカーで検出することができる。
【０１００】
本発明は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを実施するのにプローブとして有用な標識オリゴヌクレオチドを含む。すなわち、それらはｍＲＮＡ配列と完全相補的であるが、ゲノム配列ではない。本発明の標識プローブは放射性標識ヌクレオチドで標識され、あるいは容易に入手できる非放射性検出シスタムにより検出される他のもので標識される。
【０１０１】
本発明は、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現細胞を同定するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに有用なプローブに関する。
細胞を固定し、プローブを遺伝子材料に添加する。プローブは試料中に存在する相補的核酸配列にハイブリダイズする。蛍光顕微鏡を用いてプローブをそれらの蛍光マーカーにより視覚化できる。
【０１０２】
本発明によれば、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を実施するのに有用な診断キットを組み立てることができる。ｍＲＮＡ配列と完全相補的であるが、ゲノム配列ではない。たとえばｍＲＮＡ配列は異なるエキソン配列を含む。本発明によるｉｎ  ｓｉｔｕ診断キットの標識プローブを蛍光マーカーで標識することが好ましい。
【０１０３】
ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２を含む細胞を同定および本質的に染色するために、免疫組織化学的方法を用いることができる。そのような”染色”により、転移性移行を分析できる。前記のような抗ＳＩ抗体を固定細胞と接触させると、細胞中に存在するＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２が抗体と反応する。抗体は検出可能に標識されており、あるいは標識された第２抗体または細胞を染色するプロテインＡを用いて検出される。
【０１０４】
本明細書に記載した腫瘍切片評価方法を用いてリンパ節および他の組織の試料について組織切片を分析し、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現細胞の存在を同定できる。試料を調製および”染色”してＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２発現を検出することができる。
【０１０５】
結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴う疑いがある個体または発症しやすい個体から得た非結腸直腸組織または体液の試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在をそのようなＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質への曝露に応答して産生された抗体で検出することによる免疫アッセイ法を、結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患している個体の診断に採用できる。さらに、腫瘍試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在をそのようなＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質への曝露に応答して産生された抗体で検出することによる免疫アッセイ法を用いて、結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患している個体を同定できる。
【０１０６】
抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は好ましくはヒト細胞において形成されたＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に対して産生される。免疫アッセイは周知であり、それらの設計は当業者がルーティンに実施できる。ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に特異的に結合し、本発明の方法およびキットに有用であるモノクローナル抗体を、当業者は標準法および容易に入手できる出発物質を用いて調製できる。モノクローナル抗体の調製方法は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（本明細書に援用する）に概説され、そこにはターゲットタンパク質に特異的に結合するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製について詳細な指針が示されている。抗体の代わりに、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２翻訳生成物に特異的に結合するＦａｂ、組換えＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2、組換えＦ（ａｂ）2も本発明の範囲に含まれる。
【０１０７】
要約すると、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質をマウスに注射する。マウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離し、不死化したマウス細胞と融合させる。このハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマを培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。それらの抗体を分析し、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に特異的に結合することが認められれば、それらを産生するハイブリドーマを培養して特異的抗体を連続供給させる。
【０１０８】
抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は好ましくはヒト細胞において形成されたＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に対して産生される。
被験試料中のタンパク質の存在を検出する手段はルーティンであり、当業者は周知の方法を用いてタンパク質または抗体の存否を検出できる。タンパク質の存在を検出するための周知の方法の１つは、免疫アッセイである。当業者には、試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質の存在を検出する免疫アッセイを実施するための多数の方法が自明である。
【０１０９】
ある態様によれば、免疫アッセイは下記を含む。試料中のタンパク質を固相支持体、たとえばプラスチック表面に結合させる。次いで、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に選択的に結合する検出可能な抗体を添加する。検出可能な抗体が検出されたことは、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在を指示する。検出可能な抗体は標識抗体または非標識抗体のいずれであってもよい。非標識抗体は、第１抗体に特異的に結合する第２の標識抗体、または標識プロテインＡ（抗体と複合体形成するタンパク質）を用いて検出できる第２の非標識抗体を用いて検出できる。種々の免疫アッセイ法がＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ８０’ｓ，Ａ．Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ，１９８１に記載されており、これを本明細書に援用する。
【０１１０】
固相支持体を被験試料と接触させる簡単な免疫アッセイを実施できる。被験試料中に存在するタンパク質はいずれも固相に結合し、特異的な検出可能な抗体調製物により検出できる。そのような手法はドットブロット、ウェスタンブロットおよびこれらに類する他のアッセイ法の本質である。
【０１１１】
他の免疫アッセイ法はより複雑であるが、実際に卓越した結果を与える。代表的な好ましい免疫アッセイ法には、タンパク質検出のための”フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）”アッセイが含まれる。この場合、固相支持体に結合した第１の抗タンパク質抗体を被験試料と接触させる。適切なインキュベーション期間後、固相支持体を洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。次いで第２の別個の抗タンパク質抗体を添加する。これは、特異的タンパク質の第１抗体が認識しない部分に特異的である。第２抗体は好ましくは検出可能である。この検出可能な抗体を第１抗体により固相支持体に結合している特異的タンパク質と複合体形成させる第２インキュベーション期間後、固相支持体を再洗浄して、結合していない検出可能な抗体を除去する。あるいは第２抗体は検出可能でなくてもよい。この場合、第２抗体に結合する第３の検出可能な抗体を添加する。このタイプの”フォワードサンドイッチ”アッセイは、結合が起きたか判定する単純な有／無アッセイであってもよく、あるいは検出可能な抗体の量と対照において得た量の比較により定量的なものにすることもできる。そのような”二部位”または”サンドイッチ”アッセイは、Ｗｉｄｅ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｋｉｒｋｈａｍ編，Ｅ．＆  Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，エディンバラ，１９７０，ｐｐ．１９９−２０６に記載されており、これを本明細書に援用する。
【０１１２】
他のタイプのイムノメトリーアッセイ法は、いわゆる”同時”および”逆”アッセイである。同時アッセイは単一インキュベーション工程を伴い、この場合、固相支持体に結合した第１抗体、第２の検出可能な抗体、および被験試料を同時に添加する。インキュベーション終了後、固相支持体を洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。次いで固相支持体に付随する検出可能な抗体の存在を、通常の”フォワードサンドイッチ”アッセイの場合と同様に判定する。同時アッセイは、被験試料中の抗体の検出にも同様に応用できる。
【０１１３】
”逆”アッセイは、被験試料への検出可能な抗体の溶液の段階的添加、続いてインキュベーション期間、そして固相支持体に結合した抗体の添加、次いで追加インキュベーション期間を含む。固相支持体を常法により洗浄して、結合していないタンパク質／抗体複合体および未反応の検出可能な抗体を除去する。次いで固相支持体に結合した検出可能な抗体の測定を、”同時”および””フォワード”アッセイの場合と同様に行う。逆アッセイは、被験試料中の抗体の検出にも同様に応用できる。
【０１１４】
イムノメトリーアッセイの第１成分を、タンパク質を固定化しうるニトロセルロースその他の固相支持体に添加してもよい。被験試料中におけるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在を検出するための第１成分は、抗体である。”固相支持体”または”支持体”とは、タンパク質を結合しうる任意の材料を表わすものとする。周知の固相支持体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが含まれる。支持体の性質は、本発明の目的に関してはある程度可溶性であってもよく、不溶性であってもよい。支持体の形状は、ビーズのような球体、または試験管の内面もしくは棒の外面のような円筒形であってよい。あるいは、シート、試験片などのように表面が平坦であってもよい。当業者には、タンパク質を結合させるための他の多数の適切な”固相支持体”が既知であり、あるいはルーティン実験を用いてそれらを確認できるであろう。好ましい固相支持体は９６ウェルマイクロタイタープレートである。
【０１１５】
ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在を検出するために、検出可能な抗体を用いる。抗体を検出するための幾つかの方法が周知である。
抗体を検出可能に標識しうる方法のひとつは、抗体を酵素に結合させた後、その抗体を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、たとえば捕獲ＥＬＩＳＡに使用することによる。次いで酵素がその基質に曝露されると基質と反応し、たとえば分光測光、蛍光測光または視覚的手段で検出できる部分を生成する。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ。当業者には使用できる他の酵素が自明であろう。
【０１１６】
抗体を検出可能に標識できる他の方法は放射性同位体によるものであり、次いでこれをラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に用いる（たとえばＷｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク，１９７８参照；本明細書に援用する）。放射性同位体は、ガンマ計数器もしくはシンチレーション計数器またはオートラジオグラフィーを用いる手段などで検出できる。本発明の目的に特に有用な同位体は、3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓおよび14Ｃである。好ましくは同位体は125Ｉである。当業者には、同様に使用できる他の放射性同位体が自明であろう。
【０１１７】
抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識抗体を適切な波長の光で照射すると、その蛍光のためその存在を検出できる。最も一般的に用いられる蛍光標識用化合物には、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンが含まれる。当業者には、同様に使用できる他の蛍光化合物が自明であろう。
【０１１８】
抗体を蛍光発光金属、たとえば152Ｅｕまたは他のランタニド系列で検出可能に標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて、これらの金属をタンパク質特異的抗体に結合させることができる。当業者には、同様に使用できる他の蛍光発光金属および他の金属キレート基が自明であろう。
【０１１９】
抗体を化学発光化合物への結合により検出可能に標識することもできる。化学発光標識抗体の存在は、化学反応の経過中に発せられるルミネセンスの存在を検出することにより判定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアリクジニウムエステル、イミダゾール、アリクジニウム塩およびシュウ酸エステルである。当業者には、同様に使用できる他の化学発光化合物が自明であろう。
【０１２０】
同様に生物発光化合物を用いて抗体を標識できる。生物発光は生物系にみられる一種の化学発光であり、この場合、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することにより判定される。標識のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。当業者には、同様に使用できる他の生物発光化合物が自明であろう。
【０１２１】
タンパク質特異的な抗体、フラグメントまたは誘導体の検出は、たとえば検出可能な標識が放射性ガンマ線放出体である場合はシンチレーション計数器により行うことができる。あるいは、たとえば標識が蛍光物質である場合は、検出は蛍光光度計により行うことができる。酵素標識の場合、検出は酵素の基質を用いる比色法により行うことができる。基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準品と対比した視覚比較により検出を行うこともできる。当業者には、同様に使用できる他の適切な検出方法が自明であろう。
【０１２２】
あるロットの抗体の結合活性は周知の方法で測定できる。当業者は、ルーティン実験により各測定のための操作可能な最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【０１２３】
陽性および陰性対照を実施でき、その場合、被験アッセイと並行して実施するアッセイにそれぞれ既知量のタンパク質を添加し、およびタンパク質を添加しない。当業者は適切な対照を実施するのに必要な知識をもっているであろう。さらに、キットはアッセイを実施するための指示書を含んでもよい。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。
【０１２４】
ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２を陽性対照用試薬としてルーティンに調製できる。当業者にはＳＩタンパク質を産生および単離しうる多様な方法が自明であろう。
【０１２５】
抗体組成物とは、タンパク質の検出に必要な抗体または抗体類を表わす。たとえば被験試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２を検出するために用いる抗体組成物は、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に結合する第１抗体、およびそれぞれ第１または第２抗体に結合する第２または第３の検出可能な抗体を含む。
【０１２６】
ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在について試料を検査するために、たとえば下記に述べるような標準イムノメトリーアッセイを実施できる。ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の特異的部分を認識する第１抗体を、ある体積の緩衝液中において９６ウェルマイクロタイタープレートに添加する。プレートを結合が起きるのに十分な期間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して、結合していない抗体を除去する。次いでプレートをＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でブロックして、試料タンパク質がマイクロタイタープレートに非特異的に結合するのを防ぐ。次いで被験試料をウェルに添加し、プレートを結合が起きるのに十分な期間インキュベートする。ウェルをＰＢＳで洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。第１抗体により認識されないＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２部分を認識する標識抗体をウェルに添加する。プレートを結合が起きるのに十分な期間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して、結合していない標識抗体を除去する。次いで、結合している標識抗体の量を標準法により測定する。
【０１２７】
被験試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の検出に有用なキットは、抗ＳＩ抗体を入れた容器、および対照を入れた容器（１または複数）を含む。対照には、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２を含有しない１つの対照試料、および／またはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２を含有する他の対照試料が含まれる。キットに用いる抗体は検出可能に標識されていれば検出できる。検出可能な抗体が標識されていない場合、それをたとえば第２の抗体またはプロテインＡにより検出でき、あるキットではこれらを別個の容器に入れて提供してもよい。あるキットにおける追加の構成要素には、固体支持体、緩衝液、およびアッセイを実施するための指示書が含まれる。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。
【０１２８】
免疫アッセイ法は、ホモジナイズした組織試料中、および体液試料、たとえば体液試料の血漿部分または細胞中にあるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の検出に有用である。
【０１２９】
ウェスタンブロット法は、非結腸直腸組織または体液中におけるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在を検出することにより、胃癌または食道癌に罹患している個体の診断を補助するのに有用である。ウェスタンブロット法は、癌に罹患している個体からの腫瘍試料中におけるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の存在を検出するのにも使用できる。ウェスタンブロット法は、試料中にＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２が存在すればそれに結合する検出可能な抗体を用い、これによりその試料中にこの受容体が存在することを指示する。
【０１３０】
ウェスタンブロット法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに記載されており、これを本明細書に援用する。これは免疫アッセイ法に類似し、本質的な相異は、試料を抗体に曝露する前に試料中のタンパク質をゲル電気泳動により分離し、次いで分離したタンパク質を抗体で検査する点である。ある好ましい態様において、マトリックスはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルマトリックスであり、マトリックス中の分離したタンパク質を濾紙などのキャリヤーに移した後、抗体で検査する。前記の抗体をウェスタンブロット法にも使用できる。
【０１３１】
一般に試料をホモジナイズし、界面活性剤、たとえばＴｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて細胞を溶解する。次いでこの材料をＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーの標準法により分離する。
【０１３２】
ウェスタンブロット法による被験試料中のＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の検出に有用なキットは、抗ＳＩ抗体を入れた容器、および対照を入れた容器（１又は複数）を含む。対照には、ＳＩを含有しない１つの対照試料、および／またはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２を含有する他の対照試料が含まれる。キットに用いる抗体は検出可能に標識されていれば検出できる。検出可能な抗体が標識されていない場合、それをたとえば第２の抗体またはプロテインＡにより検出でき、あるキットではこれらを別個の容器に入れて提供してもよい。あるキットにおける追加の構成要素には、アッセイを実施するための指示書が含まれる。さらに、キットは所望により陽性および陰性の結果の外観を表わす図または写真を含むことができる。
【０１３３】
ウェスタンブロット法は、ホモジナイズした組織試料中、および体液試料、たとえば体液試料の血漿部分または細胞中にあるＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の検出に有用である。
【０１３４】
インビボイメージングおよび療法薬
本発明のある態様によれば、個体における転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃または食道の腫瘍を検出、イメージングまたは処置するための組成物およびインビボ方法が提供される。
【０１３５】
本発明のコンジュゲート組成物を腸管の外側に投与すると、たとえば循環系に投与した場合、それらは腸管を内張りする細胞とは分離された状態を維持し、腸管の外側にあるＳＩ発現細胞にのみ結合する。本発明のコンジュゲート組成物は正常細胞には結合しないが、転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞には結合する。こうして、腸管の外側に投与したコンジュゲート組成物の有効部分が、ＳＩ発現細胞、たとえば原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞へ運搬される。
【０１３６】
本発明に有用な療法用および診断用医薬組成物は、ＳＩ発現細胞を特異的にターゲティングするコンジュゲート化合物を含有する。これらのコンジュゲート化合物はＳＩに結合する部分を含み、これは身体の腸管細胞以外の正常組織の細胞には結合しない。他の組織はＳＩを発現しないからである。
【０１３７】
正常な結腸直腸細胞と異なり、ＳＩを発現する癌細胞は腸管の外側に投与した物質、たとえば循環系に投与した物質に接近できる。正常組織中の唯一のＳＩは腸粘膜細胞の頂端側細胞膜中に存在するので、腸管の外側に投与されるターゲティングした癌化学療法薬およびイメージング剤からは腸粘膜バリヤーによって効果的に隔離される。こうして、本発明のコンジュゲート化合物を腸管の外側に導入することにより、たとえばコンジュゲート化合物を含む医薬組成物を循環系に投与することにより、これらの化合物で転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞をターゲティングできる。
【０１３８】
当業者は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌に罹患している疑いがある個体を同定できる。結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断された個体において、転移を疑い、転移した細胞の根絶を積極的に試みるのは異例ではなく、場合によっては標準療法である。本発明は、イメージングのための医薬組成物および方法を提供する。これにより原発性および転移性の疾患をより精確に診断できる。さらに本発明は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を特異的にターゲティングおよび排除するための療法薬を含む医薬組成物および方法を提供する。さらに本発明は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を特異的に排除するための療法薬を含む医薬組成物および方法を提供する。
【０１３９】
本発明のコンジュゲート組成物を含む医薬組成物は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃または食道の腫瘍に罹患している個体を診断または処置するのに使用できる。
【０１４０】
本発明は、コンジュゲート組成物中のＳＩ結合部分の利用に依存する。ＳＩ結合部分は、本質的にコンジュゲート組成物の、ＳＩに対するリガンドとして作用する、したがってそれに特異的に結合する部分である。コンジュゲート組成物は、ＳＩ結合部分と結合した有効部分をも含む；有効部分は、細胞のイメージング、ターゲティング、中和、または死滅に有用な有効物質である。
【０１４１】
本発明によれば、ＳＩ結合部分はコンジュゲート組成物のＳＩリガンド部分である。ある態様において、ＳＩリガンドは抗体である。
ある好ましい態様において、コンジュゲート化合物は抗ＳＩ抗体を含むＳＩ結合部分を含む。
【０１４２】
ＳＩ結合部分として用いるＳＩリガンドは可能な限り小さいことが好ましい。たとえばＳＩリガンドは非ペプチド低分子または低分子ペプチド、好ましくは２５アミノ酸未満、より好ましくは２０アミノ酸未満のものである。ある態様において、コンジュゲート組成物のＳＩ結合部分を構成するＳＩリガンドは１５アミノ酸未満である。１０アミノ酸未満を含むＳＩ結合ペプチド、また５アミノ酸未満を含むＳＩ結合ペプチドを、本発明によるＳＩ結合部分として使用できる。ＳＩ結合部分として用いられる、より大きな分子を含むものも本発明の範囲に含まれ、これにはＳＩに特異的に結合する抗体などの分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
さらにＳＩリガンドは、普通は酵素によりプロセシングされる任意の周知の炭水化物基質を含むことができる。これには、酵素開裂部位により認識されるように工学的に処理されているがプロセシングに対しては抵抗性である基質が含まれる。ＨｏｒｉｉＳ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：１０３８−１０４６（１９８６）（本明細書に援用する）に、そのような化合物の例が示されている。
【０１４４】
ＳＩ結合部分として用いられるＳＩリガンドは、多様な既知のコンビナトリアルライブラリースクリーニング法、たとえば本明細書の実施例１に示す方法で同定できる。
【０１４５】
ペプチドおよび非ペプチド組成物の両方を試験してそれがＳＩリガンドであるか否かを判定し、コンジュゲート組成物を試験してそれがＳＩ結合活性をもつか否かを判定するアッセイ法を使用できる。ＳＩに特異的に結合する組成物は、ＳＩに結合することが分かっている抗体を用いる競合結合アッセイにより同定できる。競合結合アッセイ法は薬理学における標準法であり、入手しやすい出発物質を用いて当業者が容易に実施できる。
【０１４６】
ＳＩは合成、組換え、または天然源からの単離により調製できる。
たとえば固相合成を用いる場合、保護または誘導体化したアミノ酸を保護されていないカルボキシル基またはアミノ基により不活性固体支持体に結合させる。次いでこのアミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補的（アミノまたはカルボキシル）基をもつ、配列中の次のアミノ酸を混和し、既に固体支持体に結合している残基と反応させる。次いでこの新たに付加されたアミノ酸残基からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去し、次のアミノ酸（適切に保護されたもの）を添加し、以下同様に操作する。目的アミノ酸がすべて適切な配列で結合した後、残りの末端基および側鎖基の保護基（および固体支持体）を逐次または同時に除去すると、最終ペプチドが得られる。本発明のペプチドは、好ましくはベンジル化またはメチルベンジル化されたアミノ酸を含まない。合成の途中でそのような保護基部分を用いてもよいが、ペプチドの使用前にそれらを除去する。他の箇所に記載するように、コンホメーションを維持するために分子内結合を形成する追加反応が必要な場合もある。
【０１４７】
ＳＩに対する抗体をルーティンに調製し、本発明によりＳＩリガンド同定のための競合アッセイに、またはコンジュゲート化合物の出発物質として使用できる。
【０１４８】
本発明によれば、有効部分は療法薬またはイメージング剤であってよい。ＳＩリガンドで癌細胞を特異的にターゲティングしうること、およびそのようなリガンドを多様な有効物質とコンジュゲートしうることの利点が、当業者には自明であろう。
【０１４９】
ＳＩ結合部分にコンジュゲートした場合にＳＩ発現細胞、たとえば胃癌または食道癌の細胞へ特異的に運搬される有効部分として有用な化学療法薬は、一般に化学合成により製造される低分子化学物質である。化学療法薬には細胞毒性および細胞分裂抑制薬物が含まれる。化学療法薬には、トランスフォーミング状態から分化状態への反転など他の作用を細胞に及ぼすもの、または細胞複製を阻害するものも含まれる。化学療法薬の例には、一般的な細胞毒性および細胞分裂抑制薬物、たとえば下記のものが含まれる：メトトレキセート（アメトプテリン）、ドキソルビシン（アドリマイシン）、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、および他のナイトロジェンマスタード（たとえばシクロホスファミド）、シスプラチン、ビンデシン（および他のビンカアルカロイド）、マイトマイシン、およびブレオマイシン。他の化学療法薬には下記のものが含まれる：ピューロチオニン（ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ、オオムギ粉オリゴペプチド）、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体およびトレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）。
【０１５０】
毒素は有効部分として有用である。毒素をＳＩ結合部分とコンジュゲートさせると、コンジュゲート組成物はＳＩ結合部分によりＳＩ発現細胞、たとえば胃癌または食道癌の細胞へ特異的に運搬され、毒素部分が細胞を死滅させる。毒素は一般に、細菌、植物などを含めた種々の生物の複雑な有毒産物である。毒素の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：リシン（ｒｉｃｉｎ）、リシンＡ鎖（リシン毒素）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰＲ）、アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、アブリンＡ鎖（トウアズキ毒素）、コブラ毒因子（ＣＶＦ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ；ＧＥＬ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ；ＳＡＰ）、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ビスキュミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）およびボルケンシン（ｖｏｌｋｅｓｉｎ）。上記のようにタンパク質毒素をＳＩ結合ペプチドと共に用いる場合、コンジュゲート組成物は組換えＤＮＡ法により製造できる。要約すると、キメラ遺伝子上にＳＩリガンドと毒素の両方をコードする組換えＤＮＡ分子を構築できる。このキメラ遺伝子が発現すると、ＳＩ結合部分と有効部分を含む融合タンパク質が産生される。タンパク質毒素は非ペプチド結合によりＳＩ結合ペプチドとコンジュゲート化合物を形成するのにも有用である。
【０１５１】
さらに、有効物質を癌の処置に利用するための他の方法がある。たとえば、ＳＩ結合部分および有効酵素である有効部分を含有するコンジュゲート組成物を製造できる。ＳＩ結合部分はコンジュゲート組成物を腫瘍細胞へ特異的に局在化させる。この酵素により有効薬物に変換されうる不活性プロドラッグを患者に投与する。腫瘍に局在化したプロドラッグのみが酵素により有効薬物に変換される。酵素／プロドラッグ対の例には、アルカリ性ホスファターゼ／リン酸エトポシドが含まれる。そのような例では、アルカリ性ホスファターゼをＳＩ結合性リガンドにコンジュゲートさせる。コンジュゲートした化合物を投与すると、癌細胞に局在化する。リン酸エトポシド（プロドラッグ）と接触すると、リン酸エトポシドは化学療法薬エトポシドに変換され、癌細胞に取り込まれる。
【０１５２】
放射線増感剤は、放射線に対する細胞の感受性を高める物質である。放射線増感剤の例には、ニトロイミダゾール、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、ミソニダゾール（ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ）が含まれる（参照：ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．Ｔ．Ｊｒ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐ．６８，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ社，ニューヨーク，１９８３；本明細書に援用する）。有効部分として放射線増感剤を含むコンジュゲート化合物を投与すると、結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞に局在化する。この個体を放射線照射すると、放射線増感剤が”励起”され、細胞を死滅させる。
【０１５３】
放射線療法またはイメージング操作に有用な医薬組成物中に放射性核種を使用できる。
放射線療法において毒素として有用な放射性核種の例には、下記のものが含まれる：
【０１５４】
【化３】
0005122713.tif 000002
【０１５５】
当業者が使用する他の放射性核種には、下記のものが含まれる：
【０１５６】
【化４】
0005122713.tif 000003
【０１５７】
全ベータマイナスおよび／またはオージェエミッター。若干の好ましい放射性核種には90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ、および212Ｐｂ／212Ｂｉが含まれる。
本発明によれば、有効部分はイメージング剤であってもよい。イメージング剤は有用な診断手段であり、かつ癌細胞の位置を同定するのに用いられる手段である。イメージングは当業者に周知の多数の方法で実施でき、そのような方法に有用な適切なイメージング剤を周知の手段でＳＩリガンドにコンジュゲートさせることができる。イメージングはたとえばラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）により実施できる。最も一般的に用いられる放射性核種イメージング剤には、放射性ヨウ素およびインジウムが含まれる。ＣＴスキャンによるイメージングには、重金属、たとえば鉄キレートを使用できる。ＭＲＩスキャンにはガドリニウムまたはマンガンのキレートを使用できる。さらに、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子エミッターを用いる陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）も可能である。イメージング法に有用な放射性核種の例には、下記のものが含まれる：
【０１５８】
【化５】
0005122713.tif 000004
【０１５９】
コンジュゲート組成物は非免疫原性であるか、または免疫原性がきわめて低いことが好ましい。したがって、ＳＩ結合部分は低分子で免疫原性が少ないかまたは非免疫原性のペプチドまたは非ペプチドであることが好ましい。ＳＩ結合部分は、ヒト化もしくは霊長類化された抗体、またはヒト抗体であってよい。
【０１６０】
ＳＩリガンドは、当業者が多大な実験なしに容易に実施しうる多様な周知の方法で有効物質にコンジュゲートされる。ＳＩリガンドを有効物質にコンジュゲートさせるために用いられる方法は、ＳＩリガンドおよび有効物質の分子の性質に依存する。ＳＩリガンドと有効物質をコンジュゲートさせて単一分子を形成した後、そのコンジュゲート分子がそれらの部分の活性を保持しているかを確認するためにアッセイを行うことができる。前記の競合結合アッセイ法を用いて、ＳＩ結合部分がコンジュゲート化合物としてその結合活性を保持することを確認できる。同様に、有効物質の各タイプについての種々のアッセイ法を用いて、有効部分の活性を試験することができる。放射性核種はコンジュゲーションに関係なくそれらの活性、すなわち放射能を保持する。毒素、薬物およびターゲティング剤などの有効物質に関しては、非コンジュゲート形のこれらの化合物の活性を証明する標準アッセイ法を用いて、活性が保持されていることを確認できる。
【０１６１】
コンジュゲーションは、ＳＩリガンドと有効物質の間で直接行ってもよく、あるいは結合用の中間分子基をＳＩリガンドと有効物質の間に付与してもよい。架橋剤は、各部分に結合部位を付与することによりコンジュゲーションを促進するのに特に有用である。架橋剤は、一方が他方の活性を妨害するのを防ぐために、これらの部分を互いに分離するスペーサーとして作用する追加分子基を含むことができる。
【０１６２】
当業者は周知の方法を用いてＳＩリガンドを化学療法薬にコンジュゲートさせることができる。たとえばＭａｇｅｒｓｔａｄｔ，Ｍ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，米国Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．１１０−１５２（本明細書に援用する）には、種々の細胞分裂抑制薬物を抗体のアミノ酸にコンジュゲートさせる方法が教示されている。そのような反応は、適切なリンカーを用いてＳＩリガンド（抗ＳＩ抗体を含む）に化学療法薬をコンジュゲートさせるのに適用できる。癌の処置に現在用いられている大部分の化学療法薬は、タンパク質と直接架橋できる官能基をもつ。たとえばメトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシンおよびブレオマイシン上には遊離アミノ基があり、一方メトトレキセート、メルファランおよびクロラムブシル上には遊離カルボン酸基がある。これらの官能基、すなわち遊離アミノ基および遊離カルボン酸基は、多様なホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤のターゲットであり、これらの薬物を抗体の単一遊離アミノ基に直接架橋させることができる。たとえば遊離アミノ基をもつＳＩリガンドを、遊離アミノ基をもつ有効物質、たとえばメトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシンおよびブレオマイシン、またはアルカリ性ホスファターゼ、またはタンパク質もしくはペプチドベースの毒素に架橋するための方法のひとつは、好ましくは炭素鎖スペーサーをもつホモ二官能性スクシンイミジルエステル、たとえばスベリン酸ジスクシンイミジル（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を用いる。開裂性のコンジュゲート化合物が必要な場合、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート；Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて同プロトコルを使用する。
【０１６３】
ペプチドまたはタンパク質であるＳＩリガンドをペプチドベースの有効物質、たとえば毒素にコンジュゲートさせるためには、標準ペプチド合成または組換えＤＮＡ法により、ＳＩリガンドおよび毒素を単一の融合タンパク質として製造できる。標準ペプチド合成及び組換えＤＮＡ法は両方とも当業者がルーティンに実施できる。あるいは、２種類のペプチド、すなわちＳＩリガンドペプチドとペプチドベースの毒素を別個のペプチドとして製造および／または単離し、そして架橋剤によりコンジュゲートさせることもできる。化学療法薬を含有するコンジュゲート組成物に関しては、ＳＩ結合ペプチドの受容体結合機能を保持しつつこの分子の単一遊離アミノ基を修飾できることを、ＳＩ結合ペプチドと毒素のコンジュゲーションに利用できる。
【０１６４】
当業者は周知の方法を用いてＳＩリガンドを放射性核種にコンジュゲートさせることができる。たとえばＭａｇｅｒｓｔａｄｔ，Ｍ．（１９９１），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；およびＢａｒｃｈｅｌ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ｈ．（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク州ニューヨーク（それぞれを本明細書に援用する）には、種々の療法用および診断用放射性核種を抗体のアミノ酸にコンジュゲートさせる方法が教示されている。
【０１６５】
本発明は、本発明のコンジュゲート化合物および医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は当業者が配合できる。適切な医薬用キャリヤーは、この分野の標準参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載されており、これを本明細書に援用する。本発明方法を実施するに際し、本発明のコンジュゲート化合物を単独で、または他の診断薬、療法薬または添加剤と組み合わせて使用できる。そのような添加剤には、賦形剤、たとえば着色剤、安定剤、浸透圧調節剤および抗菌薬が含まれる。医薬組成物は好ましくは無菌であり、かつ発熱物質を含有しない。
【０１６６】
本発明のコンジュゲート組成物は、たとえば医薬的に許容できる非経口ビヒクルと共に液剤、懸濁液剤または乳剤として配合できる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームも使用できる。ビヒクルは、等張性を維持する添加剤（たとえば塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加剤（たとえば緩衝剤および保存薬）を含有してもよい。配合物は常法により滅菌される。たとえば注射による投与に適した非経口組成物は、１．５重量％の有効成分を０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解することにより調製される。
【０１６７】
本発明による医薬組成物は、１回量または多数回量として投与できる。本発明の医薬組成物は、個々の療法薬として、または他の療法と組み合わせて投与できる。本発明の療法薬を通常の療法と組み合わせて、逐次または同時に投与できる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物は、コンジュゲート化合物をターゲット細胞に到達させうる任意の手段で投与できる。ある態様において、投与経路には静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍が存在する臓器の血液供給中への局所投与、または腫瘍自体への直接投与よりなる群から選択されるものが含まれる。コンジュゲート化合物は、術中スプレーのほか、クモ膜下（髄腔内）、脳室内、定位（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃａｌｌｙ）、肝内（たとえば門脈を経て）、吸入により、および胸膜内に投与できる。静脈内投与が好ましい投与様式である。これを注入ポンプの補助により達成してもよい。
【０１６９】
投与量は下記のような要因に応じて異なる：有効部分の性質；コンジュゲート組成物の性質；薬物動態特性；投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；併用処置の種類；ならびに処置の頻度。
【０１７０】
コンジュゲート化合物は１又はそれより多くのＳＩ分子を含む細胞を特異的にターゲティングするので、化学療法薬または毒素を含むコンジュゲート化合物は、コンジュゲートしていない有効物質としてそれらの化学療法薬または毒素を投与する場合に使用する量より少ない用量で、好ましくは最高１００倍少ない量の有効物質を含有する用量で投与される。ある態様においては、化学療法薬または毒素を含むコンジュゲート化合物は、コンジュゲートしていない有効物質として投与される化学療法薬または毒素の用量より１０〜１００倍少ない量の有効物質を含有する用量で投与される。適切な用量を判定するために、化合物の量を重量ではなくモルで測定することが好ましい。この方法では、異なるＳＩ結合部分の重量変動が計算に影響を及ぼすことがない。本発明のコンジュゲート組成物においてＳＩ結合部分と有効部分が１：１の比率であるとすれば、コンジュゲートしていない化合物の投与モル数と比較して少ないモル数、好ましくは最高１００倍少ないモル数のコンジュゲート化合物を投与すればよい。
【０１７１】
一般に化学療法薬コンジュゲートを多数回の分割量で静脈内投与する。
一般に、静脈内最高２０ｇ／回のメトトレキセートがコンジュゲートしていない形で投与される。メトトレキセートを本発明のコンジュゲート化合物の有効部分として投与する場合、用量は１０〜１００倍少なくなる。たとえば各コンジュゲート化合物が１つのＳＩ結合部分に対して１モルのメトトレキセートをコンジュゲートしているとすれば、コンジュゲート化合物の全投与量中には約０．２〜２．０ｇのメトトレキセートが存在し、したがって投与される。ある態様においては、コンジュゲート化合物の全投与量中に約２００ｍｇ〜２ｇのメトトレキセートが存在し、したがって投与される。
【０１７２】
イメージング剤として有用な医薬組成物中において放射性同位体である有効部分に結合したＳＩ結合部分を含むコンジュゲート組成物を投与するために、各ＳＩ結合部分が１つの放射性有効部分に結合しているものとする。放射性同位体の投与量はその放射性同位体に依存する。当業者は、有効部分として用いるその放射性核種の比放射能およびエネルギーに基づいて、コンジュゲート化合物の投与量を容易に決定できる。一般に１回当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは１〜１０ミリキュリー、最も一般的には２〜５ミリキュリーのイメージング剤が投与される。たとえばＳＩ結合部分および放射性部分を含むコンジュゲート化合物を含むイメージング剤として有用な本発明による医薬組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、ある態様において好ましくは１〜１０ミリキュリー、ある態様において好ましくは２〜５ミリキュリー、ある態様においてより好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。投与量の例には下記のものが含まれる：131Ｉ＝１回当たり０．１〜１００ミリキュリー、ある態様において好ましくは１〜１０ミリキュリー、ある態様においては２〜５ミリキュリー、ある態様においては約４ミリキュリー；111Ｉｎ＝１回当たり０．１〜１００ミリキュリー、ある態様において好ましくは１〜１０ミリキュリー、ある態様においては１〜５ミリキュリー、ある態様においては約２ミリキュリー；99mＴｃ＝１回当たり０．１〜１００ミリキュリー、ある態様において好ましくは５〜７５ミリキュリー、ある態様においては１０〜５０ミリキュリー、ある態様においては約２７ミリキュリー。Ｗｅｓｓｅｌｓ  Ｂ．Ｗ．ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｒｏｇｕｓ（１９８４）Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．，１１：６３８およびＫｗｏｋ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．，１２：４０５（両者を本明細書に援用する）には、診断用および療法用コンジュゲートに関する詳細な用量計算が示されており、放射性コンジュゲート化合物を含有する本発明の医薬組成物の調製に際してこれを採用できる。
【０１７３】
本発明の１態様は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌に罹患している疑いがある個体の処置方法に関する。そのような個体は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含む医薬組成物をその個体に投与することにより処置でき、その際、有効部分は放射安定性療法薬である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は放射安定性有効物質であり、ＳＩ結合部分は抗体である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は放射安定性療法薬である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は下記よりなる群から選択される放射安定性有効物質である：メトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ピューロチオニン、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体、トレニモン、リシン、リシンＡ鎖、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスホスホリパーゼＣ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、アブリンＡ鎖、コブラ毒因子、ゲロニン、サポリン、モデッシン、ビスキュミン、ボルケンシン、アルカリ性ホスファターゼ、ニトロイミダゾール、メトロニダゾールおよびミソニダゾール。処置される個体は、転移した結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断され、あるいは原発性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断され、まだ何らかの転移が検出されていない場合は前向処置を受けていてもよい。本発明の医薬組成物は、療法有効量のコンジュゲ+ート組成物を含有する。療法有効量は、その個体に致死的な副作用を与えることなく癌細胞に細胞毒性または細胞分裂抑制作用を及ぼすのに有効な量である。
【０１７４】
本発明の１態様は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌に罹患している疑いがある個体の処置方法に関する。そのような個体は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含む医薬組成物をその個体に投与することにより処置でき、その際、有効部分は放射性である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は放射性有効物質であり、ＳＩ結合部分は抗体である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は下記よりなる群から選択される放射性物質である：
【０１７５】
【化６】
0005122713.tif 000005
【０１７６】
全ベータマイナスおよび／またはオージェエミッター。処置される個体は、転移した癌を伴うと診断され、あるいは局在性癌を伴うと診断され、そして、まだ検出されていない何らかの転移が存在しうる場合に前向処置を受けていてもよい。本発明の医薬組成物は、療法有効量のコンジュゲート組成物を含有する。療法有効量は、その個体に致死的な副作用を及ぼすことなく転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞に細胞毒性または細胞分裂抑制作用を引き起こすのに有効な量である。本発明の組成物を原発性腫瘍中へ腫瘍内注射してもよい。
【０１７７】
本発明の１態様は、原発性または転移性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患している疑いがある個体において、放射線イメージング法により転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を検出する方法に関する。個体は、原発性の胃または食道の腫瘍を伴う疑いがあってもよく、ＳＩに結合するイメージング剤を個体に投与することによりその診断を確認できる。胃または食道における局在化を検出することにより、腫瘍をイメージングできる。個体は、転移した結腸直腸癌、胃癌または食道癌に罹患していると診断されていてもよく、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物（有効部分は放射性である）を含む医薬組成物をその個体に投与し（好ましくは静脈内投与による）、局在化した放射能の蓄積または凝集の存在（ＳＩを含む細胞の存在を指示する）を検出することにより、その転移した結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞を検出できる。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は放射性物質であり、ＳＩ結合部分は抗体である。本発明のある態様において医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＩ結合部分および有効部分を含むコンジュゲート化合物を含み、その際、有効部分は下記よりなる群から選択される放射性物質である：放射性重金属、たとえば鉄キレート、放射性ガドリニウムまたはマンガンキレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子エミッター、
【０１７８】
【化７】
0005122713.tif 000006
【０１７９】
処置される個体は、転移した結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断され、あるいは局在性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌を伴うと診断され、そして、まだ検出されていない何らかの転移が存在しうる場合に前向処置を受けていてもよい。本発明の医薬組成物は、療法有効量のコンジュゲート組成物を含有する。診断有効量は、その個体に致死的な副作用を及ぼすことなく、ＳＩを含む細胞のある身体部位を検出できる量である。
【０１８０】
光力学的イメージングおよび療法
本発明のある態様によれば、ＳＩ結合部分を光活性化したイメージング剤または療法薬にコンジュゲートさせる。Ｍａｉｅｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６：４６１−４６６（２０００）（本明細書に援用する）には、光力学的療法の例が示されている。ＱＬＴ社（ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）は、ＳＩリガンドに結合しうる感光性有効物質を販売している。そのようなコンジュゲート化合物を光力学的療法およびイメージングプロトコルに用いて、ＳＩ結合したコンジュゲート物質を活性化し、こうして腫瘍細胞へターゲティングすることができる。ある態様においては、コンジュゲート化合物を術中スプレーとして適用し、次いで光照射して、ＳＩ発現細胞に結合している化合物を活性化する。
【０１８１】
ある態様において、光力学的物質は発蛍光団またはポルフィリン類である。ポルフィリンの例には、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）およびポルフィマーナトリウム（ｐｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ）（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ；登録商標）が含まれる。第２世代の感光剤はＢＰＤベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）である。ある態様において、発蛍光団はテトラメチルロタミンである。レーザーは一般にポルフィリンを活性化するのに用いられる主な光源である。発光ダイオード（ＬＥＤ）および蛍光光源も場合により用いられる。
【０１８２】
術中スプレーのほか、コンジュゲート化合物をクモ膜下（髄腔内）、脳室内、定位（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃａｌｌｙ）、肝内（たとえば門脈を経て）、吸入により、および胸膜内に投与できる。
【０１８３】
胃癌または食道癌の細胞全般をターゲティングした薬物運搬
本発明の他の態様は、ＳＩを含む細胞、たとえば転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞へ療法薬を運搬するＳＩリガンドを含む非コンジュゲート組成物およびコンジュゲート組成物に関する。ある態様において、療法薬は薬物または毒素、たとえば下記のものである：メトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ピューロチオニン、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体、トレニモン、リシン、リシンＡ鎖、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスホスホリパーゼＣ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、アブリンＡ鎖、コブラ毒因子、ゲロニン、サポリン、モデッシン、ビスキュミン、ボルケンシン、アルカリ性ホスファターゼ、ニトロイミダゾール、メトロニダゾールおよびミソニダゾール。遺伝子材料を癌細胞へ運搬して、免疫系がターゲティングしうる抗原を産生させ、あるいは細胞を死滅させるかまたはその増殖を阻害するタンパク質を産生させる。ある態様においては、ＳＩリガンドを用いて、欠損している内因性遺伝子の代替となる核酸分子をコードする核酸または療法タンパク質をコードする核酸を運搬する。ある態様においては、本発明の組成物を遺伝子療法プロトコルに使用し、遺伝子欠損の補充に必要および／または望まれる遺伝子材料を個体へ運搬する。
【０１８４】
ある態様においては、ＳＩリガンドを運搬ビヒクルと結合させ、またはそれに取り込ませ、これによりその運搬ビヒクルを特異的ターゲティング運搬ビヒクルに変換する。たとえばＳＩ結合ペプチドをウイルス粒子の外部に組み込ませ、そのウイルスをＳＩ保有細胞特異的ウイルスにすることができる。同様に、ウイルスのコートタンパク質が活性ＳＩ結合ペプチドを含有する融合タンパク質として産生され、これがウイルス粒子の外側に露出するかまたは他の形で接近可能となるように工学的に処理し、これによりそのウイルスをＳＩ保有細胞特異的ウイルスにすることもできる。ある態様においては、ＳＩリガンドをリポソームに組込ませ、または他の形で取り込ませ、その際ＳＩリガンドがリポソームの外側に露出するかまたは他の形で接近可能となり、これによりそのリポソームをＳＩ保有細胞へ特異的にターゲティングさせることもできる。
【０１８５】
本発明のこの態様におけるコンジュゲート組成物または非コンジュゲート組成物中の有効物質は、薬物、毒素または核酸分子である。核酸はＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡである。ある態様において核酸分子は、細胞中に存在すると望ましくないタンパク質の産生が阻害されるアンチセンス分子であるか、あるいはそのアンチセンス配列をコードする。ある態様において核酸分子は、細胞中に存在すると望ましくないタンパク質の産生が阻害されるリボザイムをコードする。ある態様において核酸分子は、細胞において産生されるのが望ましいタンパク質またはペプチドをコードする。ある態様において核酸分子は、ターゲティングした細胞中で有効な遺伝子の機能性コピーをコードする。核酸分子は、細胞におけるコード配列発現に必要な調節エレメントに機能可能な状態で結合していることが好ましい。
【０１８６】
リポソームは脂質からなる小胞である。ＳＩ保有細胞において発現するのが望まれるタンパク質をコードする遺伝子構築体を、これらの小胞の中心に導入する。この小胞の外殻がＳＩリガンドを含む。Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｖｏｌ．１，２，３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（本明細書に援用する）には、外殻に抗体を含有するリポソーム封入有効物質の調製が示されている。本発明においては、ＳＩリガンド、たとえば抗ＳＩ抗体を外殻と結合させる。内側の有効物質と共にＳＩリガンドをリポソームのマトリックス中に含む非コンジュゲート組成物には、ＳＩリガンドが好ましくは抗体である組成物が含まれる。
【０１８７】
ある態様においては、癌細胞への正常コピー数のｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の運搬が、ＳＩリガンドを用いてこの遺伝子療法薬をターゲティングさせることにより達成される。ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の変異は、多くの癌の発症に主要な役割を果たすと思われる。この疾患を克服する方法のひとつは、変異数のこの遺伝子を発現している癌細胞へ正常コピー数のこの遺伝子を運搬するものである。正常なｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子を含む遺伝子構築体を、ＳＩリガンドを含むリポソームに取り込ませる。この組成物は腫瘍へ運搬される。ＳＩリガンドは正常遺伝子を含有するリポソームを特異的にターゲティングおよび方向づけして、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の変異により生じた病変を補正する。遺伝子構築体の作製は当業者が容易になしうる。本発明によれば、本発明のＳＩリガンドを用いることにより、そのような構築体を特異的にターゲティングさせることができる。本発明の組成物は、運搬ビヒクルと結合したＳＩリガンド、たとえば抗ＳＩ抗体、および腸管の細胞において産生することが望まれるタンパク質のコード配列がその細胞における発現に必要な調節配列に結合した遺伝子構築体を含む。腸管の細胞が取り込むためには、組成物を経口または浣腸により投与する。これにより組成物は腸管に進入し、ＳＩを含む細胞と接触する。運搬ビヒクルはＳＩリガンドによりＳＩと結合し、ビヒクルが細胞にインターナリゼーションされ、あるいは他の形で有効物質／遺伝子構築体が細胞に取り込まれる。インターナリゼーションされると、構築体はその個体に療法効果をもたらすことができる。
【０１８８】
アンチセンス
本発明は、アンチセンス化合物を結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞へ特異的に運搬し、これにより望ましくない遺伝子発現が起きている細胞における遺伝子発現を停止させ、そのような発現が起きていない細胞には不都合な影響を及ぼさない手段を提供することにより結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞を予防および治療するのに有用な、組成物、キットおよび方法を提供する。
【０１８９】
本発明のコンジュゲート組成物は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞を含めたＳＩ発現細胞をターゲティングするのに有用である。本発明のコンジュゲート組成物は非結腸直腸由来の細胞には結合しない。ＳＩを含まない非結腸直腸細胞は、本発明のコンジュゲート組成物を取り込まない。正常な結腸直腸細胞はＳＩを含み、本発明組成物を取り込むであろう。本発明は、アンチセンス組成物を正常および癌性の結腸直腸細胞ならびに胃癌または食道癌の細胞へ運搬する組成物および方法を提供する。
【０１９０】
本発明は、正常および癌性の結腸直腸細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を化合物の有効部分に曝露し、それらの細胞のみがコンジュゲート化合物により影響される、細胞特異的方法を提供する。ＳＩ結合部分は正常および癌性の結腸直腸細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞に結合する。コンジュゲート化合物がこれらの細胞に結合するとインターナリゼーションされ、分子のアンチセンス部分を含めたコンジュゲート化合物の運搬が行われる。正常な結腸直腸細胞中にコンジュゲート化合物が存在してもそれらの細胞には影響を与えない。コンジュゲート化合物の有効部分を構成するアンチセンス分子が相補的である癌関連遺伝子は、発現していないからである。しかし結腸直腸癌細胞の場合、コンジュゲート化合物の有効部分を構成するアンチセンス分子が相補的である癌遺伝子が発現している。結腸直腸癌細胞中にコンジュゲート化合物が存在すると、癌細胞の転写または翻訳を阻害または阻止する作用をし、トンラスフォームした表現型はこれにより減少し、または排除される。
【０１９１】
本発明を利用して、原発性および／または転移性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌を克服し、正常な結腸細胞中にトンラスフォームした表現型が出現するのを阻止できる。したがって本発明は治療にも予防にも利用できる。
【０１９２】
当業者は、胃癌または食道癌に罹患している疑いがある個体を容易に同定できる。胃癌または食道癌を伴うと診断された個体において、転移を疑い、転移細胞の根絶を積極的に試みるのは標準療法である。本発明は、転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を特異的にターゲティングおよび排除するための医薬組成物および方法を提供する。さらに本発明は、転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞を特異的に排除するための療法薬を含む医薬組成物および方法を提供する。
【０１９３】
本発明は、コンジュゲート組成物中にＳＩ結合部分を使用することに依存する。ＳＩ生成物結合部分は本質的にコンジュゲート組成物の一部であり、ＳＩに対するリガンドとして作用し、したがってこれらの受容体に特異的に結合する。コンジュゲート組成物は、ＳＩ結合部分と結合した有効部分をも含有する；有効部分は、その発現が癌に関連する遺伝子の転写または翻訳による発現を阻害または阻止するのに有用なアンチセンス組成物である。
【０１９４】
本発明によれば、有効部分はアンチセンス組成物である。特に、コンジュゲート化合物の有効部分を構成するアンチセンス分子は結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞のＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、そのＤＮＡまたはＲＮＡの転写または翻訳が起きるのを阻害および／または阻止する。アンチセンス組成物は核酸分子、その誘導体または類似体であってよい。アンチセンス組成物の化学的性質は、発現を阻害または他の形で阻止すべきＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な、核酸分子もしくは修飾核酸分子、またはＤＮＡまたはＲＮＡ分子を模倣した官能基をもつ非核酸分子がもつ性質であってよい。アンチセンス組成物は、その発現が結腸直腸癌、胃癌または食道癌に関係する遺伝子、すなわち癌関連遺伝子の転写または翻訳を阻害または阻止する。
【０１９５】
点変異の挿入、およびＫ−ｒａｓおよびＨ−ｒａｓの欠失が多くの腫瘍において同定されている。癌遺伝子ＨＥＲ−２／ＥＲＢＢ−２、ＨＥＲ−１／ＥＲＢＢ−１、ＨＲＡＳ−１、Ｃ−ＭＹＣおよび抗−癌遺伝子ｐ５３、ＲＢ１の変化の特性は複雑である。
【０１９６】
ラットモデルにおける化学的発癌により、転写調節および増殖を仲介する癌遺伝子ｆｏｓにおける点変異が証明された。参照：Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素により誘導されたラット結腸腫瘍における癌遺伝子変化，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０３（１）：１６−２４，１９９２，１月；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０１９７】
ラットモデルにおける化学的発癌により、癌遺伝子ａｂｌにおける点変異が証明された。参照：Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素により誘導されたラット結腸腫瘍における癌遺伝子変化，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０３（１）：１６−２４，１９９２年１月。
【０１９８】
ＭＹＣは、転写および増殖の調節において役割をもつ癌遺伝子である。ｍｙｃに対するエキソンＩＩの翻訳開始領域に相補的な１５塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、結腸直腸癌細胞と共にインキュベートした。このアンチセンス分子は結腸直腸癌細胞の増殖をｄｏｓ依存性様式で阻害した。興味深いことに、このオリゴヌクレオチドの取込みは低かった（０．７％）。正常な第５染色体を結腸直腸癌細胞に移した場合もｍｙｃ発現が調節され、増殖が低下した。これらのデータは、ｍｙｃの調節に重要な腫瘍サプレッサー遺伝子がこの染色体に含まれることを示唆する。
【０１９９】
新規タンパク質チロシンホスファターゼＧ１が同定された。結腸直腸腫瘍細胞においてこのタンパク質をコードするｍＲＮＡの検査により、これはこれらの細胞において点変異および欠失を受け、これらの細胞の増殖特性において役割をもつ可能性があることが明らかになった。Ｔａｋｅｋａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，タンパク質チロシンホスファターゼＧ１遺伝子の染色体位置決定およびヒト結腸癌細胞における異常転写体の特性解明，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３９（３）：２２２−８，１９９４年２月２１日；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２００】
ガストリンは、ＰＫＡが仲介するサイクリックＡＭＰ依存性機序により、結腸癌細胞の増殖を調節する。特定のＰＫＡクラスの調節サブユニットに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、結腸癌細胞においてサイクリックＡＭＰの増殖促進作用を阻害した。参照：Ｂｏｌｄ，ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，ヒト結腸癌の実験的遺伝子療法，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１６（２）：１８９−９５；考察１９５−６，１９９４年８月、およびＹｏｋｏｚａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのＲＩアルファサブユニットを欠如するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはヒト癌細胞の増殖阻害を誘発する，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３（４）：８６８−７２，１９９３年２月１５日；これら両者を本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２０１】
ＣＲＩＰＴＯは大部分の結腸直腸癌腫瘍において発現する上皮増殖因子関連遺伝子である。ＣＲＩＰＴＯ  ｍＲＮＡの５’末端に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロおよびインビボでＣＲＩＰＴＯ発現を有意に低下させ、結腸直腸腫瘍細胞の増殖を阻害した。Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，アンチセンスＲＮＡおよびオリゴデオキシヌクレオチドによるヒト結腸癌細胞におけるＣＲＩＰＴＯ発現および腫瘍形成性の阻害，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９（１）：２９１−８，１９９４年１月；これら両者を本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２０２】
多くの癌細胞がトランスフォーミング増殖因子アルファを分泌する。ＴＧＦアルファｍＲＮＡに対する２３ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結腸直腸癌細胞のＤＮＡ合成および増殖の両方を阻害した。Ｓｉｚｅｌａｎｄ，ＡＭ，Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＡＷ，アンチセンストランスフォーミング増殖因子アルファオリゴヌクレオチドはオートクリン刺激による結腸直腸癌細胞系の増殖を阻害する，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３（１１）：１２３５−４３，１９９２年１１月；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２０３】
オリゴヌクレオチド、その誘導体および類似体を含めたアンチセンス組成物、コンジュゲーションプロトコル、ならびに転写および翻訳の阻害のためのアンチセンス方式は、全般的に下記に記載されている；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社，ニューヨーク，１９９０；およびＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社，ニューヨーク，１９９１；これらをそれぞれ本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２０４】
本発明のアンチセンス分子は、結腸直腸癌遺伝子のフラグメントに相補的な配列を含む。参照：Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８６，５：２５０３；これを本明細書に援用する。
【０２０５】
本発明のコンジュゲート組成物中の有効部分を構成することができるアンチセンス組成物には、ホモピリミジン類から形成されるオリゴヌクレオチドが含まれる；これはＤＮＡ二重らせんの主溝中のホモプリンの局部伸長を認識してこれらに結合し、三重らせんを形成する。参照：Ｈｅｌｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｔｏｕｌｍｅ，ＪＪ．，アンチセンス、センスおよび抗遺伝子核酸による特異的な遺伝子発現調節，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４９：９９−１２５，１９９０；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。三重らせんの形成は、その遺伝子がＲＮＡポリメラーゼにより転写を受ける能力を妨害するであろう。ｍｙｃ特異的オリゴヌクレオチドを用いて三重らせん形成が観察された。参照：Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６−４５９；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２０６】
イントロンとエキソンの境界にある配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、それらの遺伝子の新たに生成する核ＲＮＡ転写体が転写のためにｍＲＮＡに成熟するのを阻止することができる。
【０２０７】
特定の遺伝子に相補的なアンチセンスＲＮＡは、ｔａｔ遺伝子に対するｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳を阻止できる。アンチセンスＲＮＡを、インビトロ合成した”そのまま使用できる”ＲＮＡとして細胞に供給してもよく、あるいは細胞中へ安定に形質転換したアンチセンス遺伝子として供給し、これが転写に際してアンチセンスＲＮＡを生成してもよい。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズした分子がＲＮＡｓｅ  Ｈで分解され、および／または翻訳複合体の形成が阻害される。いずれの場合も本来の遺伝子の生成物を産生できない。
【０２０８】
ＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンス配列を細胞へ運搬できる。これらの分子が特異的配列を認識する能力を損なうことなく、その安定性を延長し、機能を改善するために、幾つかの化学修飾が開発された。これらには下記のものが含まれる：ＤＮａｓｅによる分解に対するそれらの抵抗性を高めること：ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ホスホロチオエート、アルファ−アノマーが含まれる；種々のインターカレーション剤、たとえばプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）類への共有結合によりターゲットに対するそれらの親和性を高めること；およびポリリシンを含めた種々の基へのコンジュゲーションにより細胞による取込みを高めること。これらの分子は、ｍＲＮＡ中にコードされる特異的配列を認識し、それらのハイブリダイゼーションにより翻訳を阻止し、これらのメッセージの破壊を増加させる。
【０２０９】
本発明のコンジュゲート組成物は、新生トランスフォーメーションを引き起こす遺伝子の発現を終止させるための特異的かつ有効な手段を提供する。ＳＩはリガンド誘発性エンドサイトーシスを受け、コンジュゲート化合物を細胞の細胞質へ運搬できる。
【０２１０】
ＳＩ結合部分は、アンチセンス組成物、たとえば応答誘発活性をもつ核酸に直接コンジュゲートする。たとえばＭＹＣに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗ＳＩ抗体に直接コンジュゲートする。ＣＤ４受容体に結合するペプチドを用いてこれが実施された。参照：Ｃｏｈｅｎ，ＪＲ編，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８９；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。正確な主鎖およびその合成は明記されておらず、十分に確立した技術から選択できる。合成には化学的コンジュゲーション、またはＦＭＯＣ化学を用いる固相合成によるキメラ分子の直接合成を伴う。参照：Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２８：５１９９−５２０２；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。あるいはペプチド−核酸コンジュゲートを、固相合成によるペプチド−ペプチド核酸キメラとして、固相合成により直接合成できる。Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ＤＮＡ鋳型鎖に結合したペプチド核酸による配列特異的転写停止，Ｇｅｎｅ，１４９：１３９−１４５；これを本明細書に援用し、そこに引用されたすべての参考文献も本明細書に援用する。
【０２１１】
ある態様においては、ポリリシンを核酸への非共有結合様式で本発明のコンジュゲート組成物に複合体形成させ、細胞の細胞質へのこれらの分子の運搬を高めるのに使用できる。さらに、ペプチドおよびタンパク質をポリリシンに共有結合様式でコンジュゲートさせ、このコンジュゲートを複合体非共有結合様式で核酸と複合体形成させて、特異性および細胞への核酸の取込み効率をさらに高めることができる。このように、確立した方法でＳＩリガンドをポリリシンに化学的にコンジュゲートさせる。ポリリシン−ＳＩ翻訳生成物リガンドコンジュゲートを任意の核酸と複合体形成させることができる。たとえば、ポリリシン−オロソムコイドコンジュゲートを用いて、オロソムコイド受容体を発現している肝癌細胞に遺伝子含有プラスミドを特異的に発現させた。この方法を用いて全遺伝子またはオリゴヌクレオチドを運搬できる。たとえば、これは望ましくない遺伝子（たとえばＭＹＣ、ｒａｓ）の発現を終止させ、あるいは喪失または欠失した遺伝子（たとえばｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびｈＰＭＳ２）の機能を代替する可能性をもつ。
【０２１２】
好ましい態様によれば、Ｍｙｃはコンジュゲート組成物中のアンチセンス分子により発現が阻害される遺伝子として作用する。ＳＩ結合部分は、エキソンＩＩの翻訳開始領域に相補的な１５塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドをｍｙｃへ運搬するために用いられる。ＭＹＣに対する１５塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドはＣｏｌｌｉｎｓ，ＪＦ，Ｈｅｒｍａｎ，Ｐ，Ｓｃｈｕｃｈ，Ｃ，Ｂａｇｂｙ，ＧＣ，Ｊｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８９（５）：１５２３−７，１９９９年５月の報告に従って合成される。ある態様においては、先に報告されたようにコンジュゲート組成物をポリリシンにコンジュゲートさせる。Ｗｕ，ＧＹ  ａｎｄ  Ｗｕ，ＣＨ（１９８８），インビトロでのＨｅｐＧ２肝癌細胞へのｅｄ遺伝子運搬の証明，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：８８７−８９２；これを本明細書に援用する。
【０２１３】
コンジュゲート組成物を、キメラ分子として固相合成により直接合成できる。ピコモルまたはナノモル濃度のこのコンジュゲートがインビトロで結腸直腸細胞においてＭＹＣ合成を抑制する。
【０２１４】
アンチセンス分子は、好ましくは長さ５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは５〜２５ヌクレオチド、ある態様においては１０〜１５ヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズする、すなわち相補的である。
【０２１５】
さらに、本発明方法を達成する前記において同定した配列内の不適正塩基対であって、その不適正塩基対配列が癌遺伝子配列に実質的に相補的なものも、本発明の範囲内であるとみなされる。癌遺伝子配列に対する実質的相補性をもたらす不適正塩基対は、本発明の開示によれば当業者に自明であろう。これらのオリゴ体を修飾してもよく、修飾しなくてもよい。
【０２１６】
結腸直腸癌、胃癌または食道癌が局在性および／または転移性の場合、療法用の組成物および方法を用いてそれらの癌を克服できる。個体に療法有効量のコンジュゲート化合物を投与する。療法有効量は、その個体に致死的な副作用を与えることなく癌細胞に細胞毒性または細胞分裂抑制作用を及ぼすのに有効な量である。療法有効量のコンジュゲート組成物を投与された個体は、療法有効量を投与されなかった個体がもつリスクと比較して、結腸直腸癌、胃癌または食道癌を排除する機会が増す。
【０２１７】
局在性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌を処置するために、療法有効量のコンジュゲート組成物をその局在性腫瘍と接触するように投与する。たとえばコンジュゲート化合物を経口または腫瘍内投与できる。経口用または直腸用の製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，ペンシルベニア州イーストンに記載されており、これを本明細書に援用する。
【０２１８】
本発明による医薬組成物は、１回量または多数回量として投与できる。本発明の医薬組成物は、個々の療法薬として、または他の療法と組み合わせて投与できる。本発明の療法薬を通常の療法と組み合わせて、逐次または同時に投与できる。
【０２１９】
本発明は、哺乳動物においてアンチセンス化合物を正常および癌性の結腸直腸細胞、ならびに胃癌または食道癌の細胞へ運搬し、癌遺伝子の発現を阻害する方法に関する。本方法は、癌細胞のＤＮＡまたはｍＲＮＡのある領域に相補的な配列をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＳＩ結合部分を含む有効量のコンジュゲート組成物を、哺乳動物に投与することを含む。
【０２２０】
コンジュゲート化合物を、意図する投与経路および標準的医療に関して選択した医薬的に許容できるキャリヤーとの混合物として哺乳動物に投与できる。投与量は、患者の体重および臨床状態との関連で設定される。本発明のコンジュゲート組成物は、哺乳動物が未分化細胞および／または異常な表現型の細胞を含まなくなるのに十分な期間投与される。療法においては、トランスフォームした細胞が増殖するのを阻害するのに十分な期間治療を延長し、患者の癌を処置および克服するためにコンジュゲート組成物を他の化学療法薬と組み合わせて投与してもよい。
【０２２１】
本発明のコンジュゲート化合物を単独で、または他の化合物と組み合わせて本発明方法に使用できる。投与量は、同様に患者の年齢、体重および臨床状態などの要因に依存するであろう。参照：Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａｌｆｏｎｓｏ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，ペンシルベニア州イーストン。
【０２２２】
治療用および予防用ワクチン
本発明は、転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞に対して個体を保護するための、ならびに転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞をもつ個体を治療するための、予防用および治療用ワクチンに関する。
【０２２３】
本発明によれば、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２はそれに対する防御または治療のための免疫応答を誘発しうるターゲットとして作用する。具体的には、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２に対する免疫応答を誘発するワクチンを提供する。本発明には下記のワクチン技術が含まれるが、これらに限定されない：
１）ＤＮＡワクチン、すなわちＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２由来の少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡを個体の細胞に投与し、そこでエピトープが発現し、免疫応答のターゲットとして作用する；
２）感染性ベクター仲介ワクチン、たとえば組換えアデノウイルス、ワクシニア、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびＢＣＧ；これらにおいて、ベクターはＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープをコードする遺伝子情報を保有し、したがって感染性ベクターが個体に投与されるとエピトープが発現し、免疫応答のターゲットとして作用する；
３）死細胞または不活化ワクチン；ａ）ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを提示する死細胞または不活化したウイルス粒子を含み、そしてｂ）個体に投与された際に免疫応答のターゲットとして作用する；
４）ハプテン化した死細胞または不活化ワクチン；ａ）ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを提示する死細胞または不活化したウイルス粒子を含み、ｂ）免疫原性を高めるためにハプテン化され、そしてｃ）個体に投与された際に免疫応答のターゲットとして作用する；
５）サブユニットワクチン、すなわちＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質分子を含有するワクチン；ならびに
６）ハプテン化したサブユニットワクチン；ａ）ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質分子を含有し、かつｂ）免疫原性を高めるためにハプテン化されている。
【０２２４】
本発明は、それに対する治療用および予防用免疫応答を誘発しうる免疫原エピトープを含むタンパク質またはコードする核酸分子を個体に投与することに関する。それらのエピトープは、一般に少なくとも６〜８アミノ酸の長さである。したがって本発明のワクチンは、ＳＩタンパク質由来の少なくとも６〜８アミノ酸の長さのタンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。本発明のワクチンは、少なくとも１０〜１０００アミノ酸の長さのタンパク質、またはそれをコードする核酸を含むことができる。本発明のワクチンは、少なくとも２５〜５００アミノ酸の長さのタンパク質、またはそれをコードする核酸を含むことができる。本発明のワクチンは、少なくとも５０〜４００アミノ酸の長さのタンパク質、またはそれをコードする核酸を含むことができる。本発明のワクチンは、少なくとも１００〜３００アミノ酸の長さのタンパク質、またはそれをコードする核酸を含むことができる。
【０２２５】
本発明は、転移性結腸直腸癌細胞ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌の細胞をもつことが分かっている個体を処置するための組成物および方法に関する。転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌は、当業者が本明細書に記載の方法または当技術分野で受け入れられている臨床および実験室病理学的プロトコルを用いて診断できる。本発明は、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌に罹患していると診断された個体の処置に有用な免疫療法ワクチンを提供する。本発明の免疫療法ワクチンは、他の療法と組み合わせて投与できる。
【０２２６】
本発明は、結腸直腸癌、胃癌または食道癌を発症しやすい疑いがある個体において転移性結腸直腸癌ならびに原発性および／または転移性の胃癌または食道癌を阻止するための組成物および方法に関する。そのような個体には、その家族病歴が家族構成員の結腸直腸癌、胃癌もしくは食道癌の平均発症率より高い個体、および／または既に結腸直腸癌、胃癌もしくは食道癌を発症し、効果的な処置を受け、したがって再発および反復のリスクに直面している個体が含まれる。そのような個体には、結腸直腸癌、胃癌または食道癌（局在性の結腸直腸癌、胃癌または食道癌のみ、または局在性かつ転移性のものが含まれる）を伴うと診断され、切除その他の処置を受けた個体が含まれる。本発明のワクチンは、転移性結腸直腸癌ならびに原発性および転移性の胃癌または食道癌を阻止および克服するために、発症しやすい個体に予防的に投与できる。
【０２２７】
本発明は、そのようなワクチンの有効成分である組成物または有効成分を構成するのに必要な組成物、有効成分を含有するそのような組成物を製造する方法、ならびにワクチンを製造および使用する方法に関する。
【０２２８】
本発明は、ＳＩ遺伝子転写体またはそのフラグメントを含む組換えベクター（発現ベクターを含める）に関する。本発明は、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質またはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター（発現ベクターを含める）に関する。
【０２２９】
本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞、およびそのような組換え細胞を用いてＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質を製造する方法に関する。
本発明は、単離したＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２遺伝子転写体、および単離したＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２タンパク質、およびそれらのタンパク質に特異的な単離した抗体、およびそれらの抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０２３０】
本発明は、単離したＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２およびその機能性フラグメントに関する。したがって本発明のある態様は、ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２の少なくとも１つのエピトープを含む単離したタンパク質に関する。
【０２３１】
本発明のある態様は、それらの免疫原性を高めるためにハプテン化された単離した前記タンパク質に関する。すなわち本発明のある態様は、少なくとも１つのＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２エピトープを含むハプテン化されたタンパク質に関する。
【０２３２】
したがって本発明のある態様は、少なくとも１つのＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２エピトープを含むタンパク質をコードする単離した核酸分子に関する。
裸のＤＮＡワクチンがＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５に記載されており、これを本明細書に援用する。他にリポソーム仲介ＤＮＡ伝達、マイクロプロジェクタイルを用いるＤＮＡ運搬（ＵＳＰ４，９４５，０５０、１９９０年７月３１日、Ｓａｎｆｏｒｄらに発行；これを本明細書に援用する）、およびエレクトロポレーションを用いるＤＮＡ運搬の利用が教示されている。それぞれの場合、ＤＮＡは細菌において産生されるプラスミドＤＮＡであってよく、これを単離し、処置すべき動物に投与する。プラスミドＤＮＡ分子は動物細胞により取り込まれ、そこで目的タンパク質をコードする配列が発現する。こうして産生されたタンパク質は、その動物に治療または予防効果を与える。
【０２３３】
治療用および／または予防用の免疫作用を個体に及ぼす核酸分子を個体の細胞へ運搬するための、ウイルスベクターを含めたベクターその他の手段も周知である。ワクシニアウイルスベクターを用いる組換えワクチンは、たとえばＵＳＰ５，０１７，４８７（１９９１年５月２１日、Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇらに発行；これを本明細書に援用する）に開示されている。
【０２３４】
場合により、患者から得た腫瘍細胞を死滅させ、または不活化し、ワクチン製剤として投与する。Ｂｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６年５月，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：２５７２−２５７７、およびＢｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年５月，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：２７３１−２７３４（これらを本明細書に援用する）には、腫瘍細胞ベースのワクチン製剤の製造および使用が記載されている。本発明のある態様によれば、黒色腫細胞の代わりに結腸直腸癌、胃癌または食道癌の細胞を用いて、Ｂｅｒｄらの文献に記載された方法および技術を適用する。
【０２３５】
たとえば実験用試薬またはサブユニットワクチンの成分として有用な単離した翻訳生成物およびそのフラグメントの製造および使用は周知である。当業者は、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２遺伝子転写体、またはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントをコードするその特異的部分を単離できる。単離すると、標準法および容易に入手できる出発物質を用いて、その核酸分子を発現ベクターに挿入できる。
【０２３６】
組換え発現ベクターは、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントをコードする核酸分子コードするかあるいはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の組換え発現ベクターは、宿主を形質転換して、本発明の単離タンパク質を製造するための組換え発現系を作製するのに有用である。
【０２３７】
本発明は、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントをコードするかあるいはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。タンパク質産生のために周知の組換え発現系に用いる宿主細胞は周知であり、容易に入手できる。宿主細胞の例には、細菌細胞、たとえば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、酵母細胞、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、たとえばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ヒト以外の哺乳動物の組織培養細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒト組織培養細胞、たとえばＨｅＬａ細胞が含まれる。
【０２３８】
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。組換えタンパク質の産生に有用なヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は周知であり、トランスジェニック動物の作製に必要な発現ベクターおよび技術も周知である。一般にトランスジェニック動物は、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントをコードするかあるいはＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列が哺乳動物細胞特異的プロモーターに機能可能な状態で結合した組換え発現ベクターを含む。これによりコード配列は哺乳動物細胞においてのみ発現し、こうして発現した組換えタンパク質を動物の乳汁から回収する。
【０２３９】
ある態様において、当業者はたとえば周知の技術を用いてそのようなＤＮＡ分子を本明細書に記載するような周知の発現系に用いる市販の発現ベクターに挿入することができる。
【０２４０】
ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはその機能性フラグメントをコードするかあるいはＳＩまたはその機能性フラグメントを含むタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを用いて、適合する宿主を形質転換し、次いでこの外来ＤＮＡの発現が起きる条件下で宿主を培養および維持する。こうして産生された本発明のタンパク質を、適宜、当業者に既知のとおり培養物から細胞溶解により、または培地から回収する。ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質を、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて精製する方法は周知である。特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、周知の技術および容易に入手できる出発物質により、天然源からこのタンパク質を精製できる。そのような抗体を用いて、組換えＤＮＡ法によりタンパク質を製造する際に得られる材料からこのタンパク質を精製することもできる。本発明は、１又はそれより多くのＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２翻訳生成物上に存在するエピトープまたはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質に結合する、抗体に関する。ＳＩ、ＣＤＸ１またはＣＤＸ２上に存在するエピトープに結合する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなど周知の方法でこのタンパク質を天然源または組換え発現系のいずれから単離および精製するのにも有用である。免疫アフィニティー法は、一般にＷａｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９５：３９１−３９６に記載されており、これを本明細書に援用する。抗体は、試料中のそのようなタンパク質の存在を検出し、細胞がそのタンパク質を発現しているかどうかを判定するのに有用である。抗体の調製、ならびに完全無傷の抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）2フラグメントのタンパク質構造、ならびにそのような分子をコードする遺伝子配列の組立ては周知であり、たとえばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに記載されており、これを本明細書に援用する。
【０２４１】
本発明のある態様においては、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する。本発明によるトランスジェニック動物は、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質をコードするヌクレオチドを、哺乳動物特異的プロモーターの調節制御下に含む。当業者は、標準法、たとえばＵＳＰ４，８７３，１９１（１９８９年１０月１０日、Ｗａｇｎｅｒに発行）およびＵＳＰ４，７３６，８６６（１９８８年４月１２日、Ｌｅｄｅｒに発行）（両者を本明細書に援用する）に教示される方法を用いて、ＳＩもしくはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質を産生するトランスジェニック動物を作製できる。好ましい動物はヤギおよびげっ歯類、特にラットおよびマウスである。
【０２４２】
これらのタンパク質を組換え法で製造するほか、自動ペプチド合成装置を用いてＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメント（もしくはそのフラグメント）またはそれを含むタンパク質を製造することもできる。そのような技術は当業者に周知であり、置換基をもつ誘導体がＤＮＡコードによるタンパク質産生では得られない場合には有用である。
【０２４３】
ある態様において、サブユニットワクチンを構成するタンパク質、または死細胞もしくは不活化ワクチンの細胞もしくは粒子をハプテン化して、免疫原性を高めることができる。場合により、ハプテン化は、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質に、より大きな分子構造体をコンジュゲーションするものである。場合により、有効なワクチン製剤を製造する手段として患者から得た腫瘍細胞を死滅させてハプテン化する。ＳＩもしくはそのフラグメントまたはそれを含むタンパク質を形成および表示する遺伝子情報を付与した他の細胞、たとえば細菌または真核細胞を死滅させ、有効ワクチン成分として用いる場合、それらの細胞をハプテン化して免疫原性を高める。ハプテン化は周知であり、容易に実施できる。
【０２４４】
細胞全般、特に腫瘍細胞のハプテン化方法は、Ｂｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６年５月，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：２５７２−２５７７、およびＢｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年５月，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：２７３１−２７３４に記載されており、これを本明細書に援用する。他のハプテン化プロトコルはＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７（５：１）：１５９１−１５２６に示されている。
【０２４５】
本発明によるハプテン化した免疫原の製造に用いるのに適したハプテン化組成物および方法には、下記の米国特許に記載されるものが含まれ、これらをそれぞれ本明細書に援用する：ＵＳＰ５，０３７，６４５（１９９１年８月６日，Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚに発行）；ＵＳＰ５，１１２，６０６（１９９２年５月１２日，Ｓｈｉｏｓａｋａらに発行）；ＵＳＰ４，５２６，７１６（１９８５年７月２日，Ｓｔｅｖｅｎｓに発行）；ＵＳＰ４，３２９，２８１（１９８２年５月１１日，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎらに発行）；およびＵＳＰ４，０２２，８７８（１９７７年５月１０日、Ｇｒｏｓｓに発行）。ペプチドワクチン、および本発明の免疫原の修飾に適用できるペプチド免疫原性増強方法も、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：６５９−６７６に記載されており、これを本明細書に援用する。Ｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｌｏｇｙ，７６：５９９−６０３（本明細書に援用する）には、ゴナドトロピン放出ホルモンをジフテリアトキソイドにコンジュゲートすることによる免疫療法ワクチンの製造方法が教示されている。ＳＩ免疫原を同様にコンジュゲートさせて、本発明の免疫療法ワクチンを製造できる。ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６：２１５−２２２（本明細書に援用する）には、免疫療法ワクチンを製造するためのコンジュゲーション法が記載されており、これを本発明の免疫療法ワクチンの製造に適用できる。ハプテンはキーホールリンペットヘモシアニンであり、これを免疫原にコンジュゲートさせることができる。
【０２４６】
本発明のある態様によるワクチンは、免疫原と共に医薬的に許容できるキャリヤーを含む。医薬配合物は周知であり、そのようなタンパク質を含む医薬組成物は当業者がルーティンに配合できる。医薬的に許容できる適切なキャリヤーは、この分野の標準参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載されており、これを本明細書に援用する。本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーおよび免疫原を含む注射用医薬組成物に関する。免疫原は、好ましくは無菌であり、無菌の医薬キャリヤーと混和される。
【０２４７】
たとえばある態様においては、ＳＩ、ＣＤＸ１もしくはＣＤＸ２またはそのフラグメント（もしくはそのフラグメント）またはそれを含むタンパク質を、医薬的に許容できるビヒクルと一緒に液剤、懸濁液剤、乳剤または凍結乾燥粉末として配合できる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび非水性ビヒクル、たとえば固定油も使用できる。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（たとえば塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加剤（たとえば緩衝剤および保存薬）を含有してもよい。配合物は常法により滅菌される。
【０２４８】
注射用組成物は、免疫原を希釈剤、たとえば無菌水、電解質／デキストロース、植物性脂肪油、脂肪エステル、またはポリオール、たとえばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール中に含むことができる。注射剤は無菌でありかつ発熱物質を含まないものでなければならない。
【０２４９】
本発明のワクチンは、認識および免疫原応答誘発のために免疫原物質を身体の免疫系に提示しうる任意の手段で投与できる。医薬組成物を非経口的に、すなわち静脈内、皮下、筋肉内に投与できる。
【０２５０】
投与量は、各物質の薬力学的特性、ならびにその投与様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度、併用処置の種類、処置の頻度、ならびに目的とする効果など、既知の要因に応じて異なるであろう。防御または療法に有効な免疫応答を誘発する量の免疫原を運搬させる。当業者はその範囲および最適投与量をルーティン方法で容易に決定できる。
【０２５１】
以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【０２５２】
実施例
前記のように、ＳＩ結合部分はＳＩリガンドであり、抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは非ペプチドであってよい。ペプチドおよび非ペプチドＳＩリガンドは周知の技術で同定できる。
【０２５３】
この１０年で、受容体とリガンド、たとえばＳＩと抗ＳＩ抗体の特異的な高親和性相互作用は、リガンドの三次元コンホメーション空間、およびリガンド結合に関与する分子領域の相補的三次元立体配置に基づくことが認められるようになった。さらに、多様な天然アミノ酸、非天然アミノ酸および有機分子のアレイを、直線構造は天然リガンドに関係ないがコンホメーション空間が天然リガンドの三次元構造に似た立体配置にオーガナイズでき、したがって高い親和性および特異性で受容体が認識することが認められるようになった。さらに、当業者がこれらの天然アミノ酸、非天然アミノ酸および有機化合物のアレイの大規模ライブラリーを形成し、受容体の天然リガンドと無関係であるがその受容体と高い親和性および特異性で相互作用する各化合物を予想同定しうる技術が文献に記載されている。したがって、ＳＩ抗体と構造的には関係がないがＳＩに特異的かつ緊密に結合しうる天然アミノ酸、非天然アミノ酸または有機化合物のアレイを当業者が同定するのは比較的容易な作業である。
【０２５４】
ペプチドであるＳＩリガンドを同定するために、当業者はランダムペプチドライブラリーをスクリーニングするためのいずれか周知の方法を、ＳＩに結合するペプチドの同定に使用できる。最も基本的な方法においては、ターゲットに結合するペプチドを単離して配列決定する。ある方法では、各ランダムペプチドを、そのランダムペプチドのコード配列を含む核酸分子に結合させる。それぞれコード配列が結合したランダムペプチドをＳＩと接触させ、ＳＩに結合していないペプチドを除去する。次いで、このＳＩに結合したペプチドのコード配列を含む核酸分子を用いてそのペプチドのアミノ酸配列を決定し、そのペプチドを大量に製造する。固体支持体上にペプチドライブラリーを調製することもでき、その際、支持体上の空間位置は特定の合成に対応し、したがって特定のペプチドに対応する。そのような方法ではしばしば写真平板法様の工程を用いて多様なペプチドライブラリーを固体支持体上に作製し、支持体上の空間アドレスにより配列を決定できる。
【０２５５】
固体支持体上の有機化合物ライブラリーの作製法は、非ペプチド化合物、たとえばオリゴヌクレオチドおよび糖類のコンビナトリアルライブラリー作製にも利用できる。固体支持体上のペプチドライブラリーの場合と同様に、支持体上の空間位置は特定の合成に対応し、したがって特定の化合物に対応する。そのような方法ではしばしば写真平板法様の工程を用いて多様な化合物ライブラリーを固体支持体上に作製し、支持体上の空間アドレスから化合物を製造した合成スキームを判定できる。合成スキームが同定されると、その化合物の構造を知ることができる。
【０２５６】
Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２３３（本明細書に援用する）には、ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、そのようなライブラリーからターゲットタンパク質に結合するペプチドを同定するための種々の方法のうち幾つかが概説されている。当業者はこれらの教示に従って、ペプチドでありかつＳＩ特異的結合部分として有用であるＳＩ特異的リガンドを同定できる。
【０２５７】
ファージ粒子上に表示されるペプチドおよびタンパク質は、Ｇａｌｌｏｐら（前掲）に記載されている。細菌の感染に用いるバクテリオファージの表面タンパク質をコードする遺伝子にランダム核酸アレイを挿入して、ランダムヌクレオチドアレイによりコードされるペプチドを表面に発現するファージを生成することができる。ペプチドを表示するこれらのファージを利用して、それらのペプチドが特定のタンパク質、受容体、抗体などに結合しうるか判定できる。ペプチドの同定は、そのペプチドを発現するファージから得た組換えＤＮＡの配列決定により実施できる。この方法で１ライブラリー中に多数アレイのペプチドを得ることができる（最高１０9個のユニークペプチド）。この方法を用いて、血小板上のフィブリノーゲン受容体に結合するがこの受容体の天然リガンドとは配列相同性のない新規な結合ペプチドが同定された（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２８：３７；本明細書に援用する）。同様に、この方法はＭＨＣクラスＩＩ受容体に結合するペプチド（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ，７４：１９７；本明細書に援用する）およびカペロニン受容体に結合するペプチド（Ｂｌｏｎｄ−Ｅｌｇｕｉｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ，７５：７１７；本明細書に援用する）の同定に応用された。
【０２５８】
プラスミド上に表示されるペプチドはＧａｌｌｏｐら（前掲）に記載されている。この方法で、ペプチドライブラリーをコードするランダムオリゴヌクレオチドを特定のプラスミド上に発現させることができる；その発現は特定のプロモーター（たとえばｌａｃオペロン）の制御下にある。これらのペプチドは、Ｌａｃ  Ｉタンパク質に結合した融合タンパク質として、ｌａｃオペロンの制御下に発現する。この融合タンパク質はプラスミド上のｌａｃオペレーターに特異的に結合し、したがってそのランダムペプチドはそれをコードする特異的ＤＮＡエレメントと結合する。この方法で、融合タンパク質に結合したＤＮＡのＰＣＲにより、ペプチドの配列を演繹できる。溶液相中のこれらのタンパク質をスクリーニングして、それらが特定の受容体に結合するか判定できる。この方法を用いて、特定の酵素に対する新規な基質が同定された（Ｓｃｈａｔｚ，１９９３）。
【０２５９】
前記方法の変法であって、同様にＧａｌｌｏｐら（前掲）に記載される、プラスミド上のペプチドライブラリーをコードするランダムオリゴヌクレオチドを無細胞系で発現させうる方法も使用できる。この方法では、ランダムオリゴヌクレオチドアレイを含む分子ＤＮＡライブラリーを構築し、次いでこれを細菌のインビトロ転写／翻訳系で発現させることができる。リガンドの同定は、目的ｍＲＮＡを含有する新生鎖ペプチド／ポリソーム複合体を、受容体を含むアフィニティー樹脂上で精製し、次いでＲＴ−ＰＣＲで増幅させた後に配列決定することにより行われる。この方法を用いると、大規模ライブラリーを形成できる（最高１０11個の組換え体）。ダイノルフィンに対して特異的に形成された抗体を認識するペプチドがこの方法で同定された（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８６５；本明細書に援用する）。
【０２６０】
受容体に対してスクリーニングするためのペプチドライブラリーを化学合成により形成できる。たとえば、Ｇａｌｌｏｐら（前掲）に記載される多重ペプチド合成方法を用いて、多数の多様なペプチドが同時形成された。ある応用例では、ポリアクリルアミドマイクロタイタープレート上で標準的固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成によりランダムペプチドを形成し（マルチピン（ｍｕｌｔｉｐｉｎ）合成）、次いで受容体結合に対して競合する能力について標準的競合結合アッセイによりスクリーニングする（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，３：４４７；本明細書に援用する）。実際に、この方法でサブスタンスＰ受容体に対する新規な結合ペプチドが同定された（Ｗａｎｇら，前掲）。同様に、固体支持体樹脂のバッグを順に各種アミノ酸と共にインキュベートして種々のペプチドのアレイを形成する”ティーバッグ”法を用いる多重ペプチド合成により、ペプチドライブラリーを構築できる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。この方法を用いて、インテグリン受容体に結合するペプチド（Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５７０８；本明細書に援用する）およびニューロペプチドＹ受容体に結合するペプチド（Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３６：５２２；本明細書に援用する）が同定された。
【０２６１】
一般に、コンビナトリアルライブラリーの形成および有用性は下記に依存する：（１）多様な構築ブロックアレイを形成する方法、（２）目的とする機能をもつアレイメンバーの同定方法、および（３）そのメンバーの構造をデコンボリューションする方法。これらの条件を満たす幾つかの方法が決定された。
【０２６２】
以下に、本発明によるＳＩリガンドの同定方法に使用できるライブラリー形成方法を記載する：
前記方法の変法を用い、一組の化学構築ブロックのメンバー、たとえばアミノ酸を可能なすべての組合わせで互いに結合させることにより、多様な分子種のライブラリーを形成できる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。ある方法では、固体支持体上で生長しつつあるアミノ酸鎖に、活性化したモノマーの混合物を各サイクルで結合させる。これは多価合成系である。
【０２６３】
スプリット合成は、各反応において単一構築ブロックのみを含有する生長しつつある鎖をインキュベートすることを伴う（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。結合後、すべての反応からの樹脂を混合し、次の結合工程に各反応物を配分する。これらの方法で、スクリーニングのためのｎx個の異なるペプチドの確率的コレクションが得られる。ここでｎは構築ブロック数、ｘは反応サイクル数である。
【０２６４】
あるいは、１又はそれより多くの位置に既知のアミノ酸を含有するが残りはランダムである分子アレイを形成できる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。これらは限定されたライブラリーを与え、これスクリーニングして目的活性をもつメンバーを求める。これらのメンバーが同定されると構造を決定し、特定されたアミノ酸を含む他の位置と共にこの構造を再生し、スクリーニングする。この反復法により最終的に、受容体のコンホメーショナル結合ポケットを認識するのに最適なペプチドが得られる。
【０２６５】
さらに、アレイはペプチド形成アミノ酸に限定されず、線状および非線状の有機分子アレイに拡大できる（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１３８５；本明細書に援用する）。実際に、ランダムアレイの無機構築ブロックのライブラリーを形成するためにこの方法を用いて、７回膜貫通受容体に結合するリガンドが同定された（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６７８；本明細書に援用する）。
【０２６６】
合成後に修飾して側鎖基および結合を変更し、それらと受容体の相互作用を調べるための”デザイナー”アレイを得ることができるライブラリーが、現在構築中である（Ｏｓｔｅｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１３８；本明細書に援用する）。”ライブラリーからライブラリー”を形成するこの方法をペプチドライブラリーの完全メチル化に適用し、グラム陽性細菌に対する選択的抗微生物活性をもつ化合物が得られた。
【０２６７】
特異的なアミノ酸構造アレイではなく、薬理学的モチーフのアレイを発現するライブラリーも構築できる（Ｓｅｐｅｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：５４２６；本明細書に援用する）。この方法は、受容体に対する特異的親和性をもつ構造モチーフを同定するためのものであり、構造活性関係を規定するライブラリーを用いてこれをさらに詳細に修飾できる。モチーフライブラリーを検索して”ライブラリーのライブラリー”を形成するこの方法を用いると、初期ライブラリー検査においてスクリーニングに必要な成分メンバー数が少なくなる。
【０２６８】
以下に、ランダムに形成された分子のライブラリーから本発明によるＳＩリガンドを同定する方法を記載する：
受容体と相互作用するライブラリー成分を、固体支持体に固定化した受容体への結合により同定できる（Ｇｏｒｄｏｎら、前掲）；
それらを、溶液相中のコグネイト受容体への結合に対して天然リガンドと競合する能力により同定することもできる（Ｇｏｒｄｏｎら、前掲）；
それらの成分を固体支持体に固定化した場合、成分を可溶性受容体に結合させることにより同定できる（Ｇｏｒｄｏｎら、前掲）。
【０２６９】
受容体を結合するライブラリーメンバーが同定されると、構造を同定して作業に用いる、または他の類似体を開発して構造活性関係を研究するのに用いる大量を形成するために、そのメンバーの構造をデコンボリューション（演繹）しなければならない。以下に、本発明による潜在ＳＩリガンドと同定された分子の構造を演繹するためのデコンボリューション方法を記載する。
【０２７０】
ペプチドライブラリーをバクテリオファージ粒子の表面に発現させることができる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。受容体と相互作用するペプチドが同定されると、ファージからそのＤＮＡを単離し、ＰＣＲによりその配列を決定することにより、その構造を演繹できる。
【０２７１】
Ｌａｃ  オペロンの制御下でプラスミド上に発現したライブラリーをデコンボリューションできる。これらのペプチドは、そのペプチドをコードするプラスミド上のｌａｃオペロンと特異的に相互作用するｌａｃ  Ｉタンパク質と融合しているからである（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。ｌａｃ  Ｉタンパク質に結合したプラスミドを単離し、ＰＣＲによりヌクレオチドおよびペプチドの配列を演繹することにより、構造を演繹できる。
【０２７２】
プラスミド上に発現するライブラリーを、転写／翻訳系を用いて無細胞系で発現させることもできる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。このパラダイムでは、受容体と相互作用するタンパク質を、それが結合しているリボソームおよびｍＲＮＡと共に単離する。このペプチドの配列を、結合しているｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより演繹する。
【０２７３】
ライブラリー構築体を写真平板法と連結し、支持体アレイ内のその位置を判定することにより、ライブラリーのいずれのメンバーの構造も演繹することができる（Ｇａｌｌｏｐら、前掲）。メンバーの精確な位置により構造情報を演繹できるので、この方法はポジショナルアドレッサビリティー（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）と呼ばれる。
【０２７４】
ライブラリーを同定可能な他の分子のアレイで標識することにより、ライブラリーのメンバーを同定することもできる（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０９２２、本明細書に援用する；およびＧａｌｌｏｐら、前掲）。この方法は、ペプチドとその配列をコードするファージプラスミドを結合させる前記方法の変法である。ある方法は、そのペプチドの逐次合成歴をコードするヌクレオチドのアレイを用いる。たとえば、生長しつつあるペプチドにヌクレオチドを逐次結合させ、ＰＣＲにより復号して、結合したペプチドの構造を求めることができる。あるいは、そのペプチドの逐次合成歴をコードする有機低分子のアレイを、配列決定可能な標識として使用できる。たとえば生長しつつあるペプチドにヌクレオチドを逐次結合させ、ＰＣＲにより復号して、結合したペプチドの構造を求めることができる。あるいは、そのライブラリーメンバーの逐次合成歴をコードする有機低分子のアレイを配列決定可能な標識として使用できる。
【０２７５】
最後に、アミノ酸配列分析によりライブラリーのメンバーの構造を直接決定できる。
以下の特許（それぞれ本明細書に援用する）には、ランダムペプチドまたは非ペプチドライブラリーの作製方法、およびそれらのライブラリーをスクリーニングしてターゲットタンパク質に結合する化合物を同定する方法が記載されている。本発明に用いるＳＩは、これらの特許に従って形成およびスクリーニングされるペプチドおよび非ペプチドリガンドの同定に用いられるターゲットとなりうる。
【０２７６】
ＵＳＰ５，２７０，１７０（１９９３年１２月１４日、Ｓｃｈａｔｚらに発行）およびＵＳＰ５，３３８，６６５（１９９４年８月１６日、Ｓｃｈａｔｚらに発行）（両者を本明細書に援用する）は、ペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法に関するものであり、これらを用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２７７】
ＵＳＰ５，３９５，７５０（１９９５年３月７日、Ｄｉｌｌｏｎらに発行；本明細書に援用する）は、予め定めた抗原に結合するタンパク質の製造方法に関する。これらの方法を用いてＳＩリガンドを製造できる。
【０２７８】
ＵＳＰ５，２２３，４０９（１９９３年６月２９日、Ｌａｄｎｅｒらに発行；本明細書に援用する）は、新規な結合タンパク質を目的とした開発に関する。その開示に従ってそれらのタンパク質を製造およびスクリーニングして、ＳＩリガンドを同定できる。
【０２７９】
ＵＳＰ５，３６６，８６２（１９９４年１２月２２日、Ｖｅｎｔｏｎらに発行；本明細書に援用する）は、有用なペプチドの形成およびスクリーニング方法に関する。そこに記載の方法を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８０】
ＵＳＰ５，３４０，４７４（１９９４年８月２３日、Ｋａｕｖａｒらに発行）ならびにＵＳＰ５，１３３，８６６、ＵＳＰ４，９６３，２６３およびＵＳＰ５，２１７，８６９（これらをそれぞれ本明細書に援用する）を用いて、ＳＩリガンドを同定できる。
【０２８１】
ＵＳＰ５，４０５，７８３（１９９５年４月１１日、Ｐｉｒｒｕｎｇらに発行；本明細書に援用する）は、ポリマーアレイの大規模写真平板法固相合成に関する。その教示を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８２】
ＵＳＰ５，１４３，８５４（１９９２年９月１日、Ｐｉｒｒｕｎｇらに発行；本明細書に援用する）は、ポリペプチドの大規模写真平板法固相合成およびその受容体結合スクリーニングに関する。
【０２８３】
ＵＳＰ５，３８４，２６１（１９９５年１月２４日、Ｗｉｎｋｌｅｒらに発行；本明細書に援用する）は、機械的に指示したフローパターンを用いるきわめて大規模な固定化ポリマー合成に関する。そのような方法はＳＩリガンドの同定に有用である。
【０２８４】
ＵＳＰ５，２２１，７３６（１９９３年１月２２日、Ｃｏｏｌｉｄｇｅらに発行；本明細書に援用する）は、免疫アフィニティー法を用いるペプチドおよびオリゴヌクレオチドの逐次合成に関する。そこに記載の方法を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８５】
ＵＳＰ５，４１２，０８７（１９９５年５月２日、ＭｃＧａｌｌらに発行；本明細書に援用する）は、オリゴヌクレオチドその他の生物ポリマーを空間アドレス指定可能な状態で表面に固定化することに関する。そこに記載の方法を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８６】
ＵＳＰ５，３２４，４８３（１９９４年６月２８日、Ｃｏｄｙらに発行；本明細書に援用する）は、多重同時合成のための装置に関する。そこに開示される装置および方法を用いて多重の化合物を製造し、スクリーニングして、ＳＩリガンドを同定できる。
【０２８７】
ＵＳＰ５，２５２，７４３（１９９３年１０月１２日、Ｂａｒｒｅｔｔらに発行；本明細書に援用する）は、抗リガンドを空間アドレス指定可能な状態で表面に固定化することに関する。そこに記載の方法および組成物を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８８】
ＵＳＰ５，４２４，１８６（１９９５年６月１３日、Ｆｏｄｅｒらに発行；本明細書に援用する）は、きわめて大規模な固定化ポリマー合成に関する。そこに記載のオリゴヌクレオチド合成方法を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２８９】
ＵＳＰ５，４２０，３２８（１９９５年５月３０日、Ｃａｍｐｂｅｌｌらに発行；本明細書に援用する）は、ホスホナートエステルの合成方法に関する。こうして製造されるホスホナートエステルをスクリーニングして、ＳＩリガンドである化合物を同定できる。
【０２９０】
ＵＳＰ５，２８８，５１４（１９９４年２月２２日、Ｅｌｌｍａｎらに発行；本明細書に援用する）は、固体支持体上でのベンゾジアゼピン化合物の固相およびコンビナトリアル合成に関する。それらの方法および化合物を用いてＳＩリガンドを同定できる。
【０２９１】
前記のように、ＳＩリガンドは抗体およびそのフラグメントであってもよい。実際に、これらの受容体のユニークな決定因子に対して産生された抗体はそのタンパク質（このタンパク質のみ）を認識し、その結果、新規な診断薬および療法薬をこのユニークなマーカーへ指向させるのに使用できる特異的ターゲティング分子として作用しうる。さらに、これらの抗体を用いて生物試料中のＳＩまたはそのフラグメントの存在を同定できる。
【０２９２】
実施例２：転移性癌の診断に有用な分子マーカーを同定するための発現プロファイリングの使用
癌は世界的に重大な保健上の問題である。癌は細胞の無制御な増殖および拡散である。多くの癌のため、隣接組織または離れた組織への転移の結果、生理的障害が生じ、しばしば死に至る。原発性腫瘍を早期診断し、かつその転移を診断できれば、腫瘍性疾患の効果的処置に著しい貢献となる。
【０２９３】
診断時の病期は癌患者の予後を決定する最も重要な要因の１つであり、この疾患のアジュバント化学療法の役割を決定する。病期判定は予後および療法上重要なので、癌細胞の浸潤を検出するためにリンパ節の精確な組織病理学的評価がきわめて重要である。癌転移の特定診断は、現在は正常組織との組織学的および細胞学的類似性により行われている。癌細胞はしばしばそれらの正常な起源細胞の表現型特性を保持する。
【０２９４】
しかし一般的なリンパ節鏡検は方法論的に限界がある。他の細胞タイプから１個の腫瘍細胞、または腫瘍細胞小塊ですら識別するのが困難であり、感度に限界がある。各リンパ節からの組織切片をわずか数個検査する標準法では各検体の＞９９％が観察から除外され、サンプリング誤差が導入される可能性がある。これらの限界はＩ期およびＩＩ期結腸直腸癌患者の再発頻度を考慮すれば明らかである。自明のこととして、これらの患者は治癒切除した時点では腸外疾患をもたない。しかし粘膜（Ｉ期）に限定した病変について１０〜３０％、腸壁（Ｉ期）に限定した病変について３０〜５０％の再発率が報告されている。
【０２９５】
少数の腫瘍細胞を検出するための別法が病期判定に適用された。これには、系列組織切片の綿密な観察、腫瘍特異的変異を検出するためのＰＣＲ、免疫組織化学的検査、および腫瘍トランスフォーメーションを生じた細胞に特異的に発現するバイオマーカーを検出するためのＲＴ−ＰＣＲが含まれる（Ｓｌｏａｎｅ，１９９５，Ｌａｎｃｅｔ，３４５：１２５５−６；Ａｂａｔｉ  ａｎｄ  Ｌｉｏｔｔａ，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ，７８：１０−６６）。ある結腸直腸癌の研究で、これらの方高感度法による病期判定と疾患の関連が認められた。しかし、系列切片作製労力と経費がかかること、変異と腫瘍トランスフォーメーションに均一な関連性がないこと、および多くのバイオマーカーに特異性がないことにより、これらの方法の適用性には限界がある。
【０２９６】
したがって、大多数の転移性腫瘍が均一に発現する容易に検出できる分子マーカーがあれば、転移の検出および疾患の病期判定に有用であろう。特に必要なものは、組織および／または体液中の転移性腫瘍細胞の検出に有用な分子マーカーを単離する方法である。そのような方法は理想的には、処理量が多く、確立された確実なプロトコルを用いるものであろう。
【０２９７】
本発明の１態様は、転移性腫瘍細胞の検出に有用な分子マーカーを同定および特性解明する方法に関する。最も一般的には、腫瘍細胞の検出に用いる分子マーカーは、細胞の過剰増殖状態の結果として特異的に発現する転写体またはタンパク質である。これに対し、本発明方法により同定および特性解明される分子マーカーは、最終分化した組織において発現し、腫瘍細胞に特異的ではない。腫瘍細胞は、それらの起源組織の最終分化に関連する遺伝子を発現し続ける。これらの遺伝子の転写体は理想的には、到達組織、たとえばリンパ節へ転移した腫瘍細胞の検出に適するものである。起源組織特異的マーカーは、到達組織にあるはずがないからである。これらの分子マーカーは起源組織に特異的であって、特定の腫瘍に特異的ではないので、それらは起源組織から転移した多くの腫瘍を幅広く認識する。
【０２９８】
転移性腫瘍細胞の検出に有用な分子マーカーを同定する方法により”候補”となる組織特異的分子マーカーを同定し、これらの候補マーカーのうちどれが転移性癌の検出に適するかを判定する。目的とする起源組織の最終分化に関連する組織特異的マーカーは下記により解明される：起源組織の最終分化に関連する転写因子の活性をダウンレギュレートし、ダウンレギュレートされた起源細胞の発現プロフィールを変化していない対照の起源細胞の発現プロフィールと比較し、発現が転写因子のダウンレギュレーションに関連してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることにより組織特異的マーカーの候補である転写体またはタンパク質を同定する。組織特異的マーカー候補の発現を、対照の起源組織、その起源組織に由来する腫瘍、および生検のための到達組織において比較する。対照の起源組織および腫瘍において発現しているが到達組織においては発現していない候補マーカーが、転移性腫瘍細胞の検出に有用なマーカーである。
【０２９９】
本明細書中で用いる用語”最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）”は、それ以上の分化は起き得ない細胞または組織の分化状態を表わす。
【０３００】
本発明の起源組織は、腫瘍細胞が最初に出現した最終分化したいずれかの身体組織である。”出現した”とは、腫瘍細胞に関連する過剰増殖性表現型を細胞に付与することを意味する。起源組織は、好ましくはそれから癌細胞が転移する可能性の最も高い組織である。好ましい態様において、組織は哺乳動物のものであり、最も好ましい態様においては組織はヒトのものである。好ましい態様において、起源組織には結腸直腸、腸、胃、肝臓、口、食道、咽喉、甲状腺、皮膚、脳、腎臓、膵臓、胸部、頸、卵巣、子宮、精巣、前立腺、骨、筋肉、膀胱および肺が含まれるが、これらに限定されない。本発明方法には樹立した細胞系を用いるのが特に有利である。特に好ましい細胞系は最終分化した起源組織の細胞であり、これには胚組織細胞系および不死化細胞系が含まれる（Ｙｅａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｅｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４６５−４６９）。特に好ましい細胞系にはＴ８４、Ｃａｃｏ２、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＮＣＩＨ５０８、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３、ＨｅｐＧ２、ＨＳ７６６ＴおよびＨｅＬａが含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他の起源組織細胞系がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から入手でき、また市販されている。
【０３０１】
癌の起源組織は、起源組織中に出現する腫瘍から単離される。癌細胞は、患者から腫瘍を摘出することにより得られる。樹立した腫瘍組織集団、すなわち腫瘍細胞の細胞系を本発明方法に使用するのが有利である。目的とする癌細胞系には、Ｔ８４、Ｃａｃｏ２、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＮＣＩＨ５０８、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３、ＨｅｐＧ２、ＨＳ７６６ＴおよびＨｅＬａが含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞系および他の有用な細胞系がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から入手でき、また市販されている。
【０３０２】
本発明の到達組織は、転移性腫瘍細胞を検出するために生検できるいずれかの組織または体液である。転移性腫瘍細胞を蓄積する傾向のある幾つかの身体組織が当業者に周知であり、これらの組織が到達組織として好ましい。しかし到達組織は任意の身体組織であってよい。特に重要な到達組織にはリンパ節、血液、脳脊髄液および骨髄が含まれるが、これらに限定されない。他の起源組織細胞系がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から入手でき、また市販されている。好ましくは、生検組織または切除組織を到達組織として用いる。
【０３０３】
本発明方法に用いる転写因子は、起源組織の最終分化に関連する転写因子である。そのような多数の転写因子が当業者に既知である。好ましい態様において、転写因子は好ましい起源組織の最終分化に関連する。好ましい態様において、転写因子には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｃｄｘ２（腸）（Ｍａｌｌｏ，Ｇ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，７４：３５−４４；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＢＦ５９１０６５）、ＳＴＡＴ５（胸部）（Ｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：３２１−３２９；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．Ｌ４１１４２）、ＮＫＸ３．１（前立腺）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＡＦ２４７７０４）、ＧＢＸ２（前立腺）（Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３１：３５−３４２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＮＭＵ１３２１９）、ＦＲＥＡＣ−２（肺）（Ｐｉｅｒｒｏｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：５００２−５０１２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．Ｕ１３２２０）、Ｐｉｔ１（甲状腺）（Ｗｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１８：１４７−９；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＮＭ００６２６１）、ＨＮＦ４（肝臓）（Ｃｈａｒｔｉｅｒ，Ｆ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ，１４７：２６９−２７２；Ｋｒｉｔｉｓ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ，１７３：２７５−８０；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．Ｘ７６９３０，Ｘ８７８７０，Ｘ８７８７２，Ｘ８７８７１）、ＬＦＢ１（肝臓）（Ｂａｃｈ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８：１５５−１６４；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＮＭ０００５４５）、ＩＰＦ１（膵臓）（Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８：１２５−１２６；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＮＭ０００２０９，Ｕ３０３２９）、Ｉｓｌ１（膵臓）（Ｗａｎｇ，Ｍ  ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，１９９４，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３４：１４１６−１４２２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．ＸＭ００３６６９，ＮＭ００２２０２）およびＭｙｏＤ（筋肉）（Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．Ｈ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：１１４８；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．Ｘ５６６７７）；これらをすべて本明細書に援用する。
【０３０４】
本発明方法は、ある態様においてはさらに最終分化に関連する転写因子遺伝子を同定する工程を含む。これらの追加工程は、起源組織の最終分化に関連する遺伝子の調節領域に結合する転写因子を単離することを含む。現在、転写因子および転写因子遺伝子の特性を解明するための多数のプロトコルがあり、当業者に知られている。好ましい態様においては、電気的移動度シフトアッセイおよび／またはスーパーシフトアッセイを用いて、その発現が最終分化に関連する遺伝子の調節領域に結合する転写因子の特性を解明する。実施例１に、腸特異的タンパク質グアニリルシクラーゼＣをコードする遺伝子の調節領域への結合による転写因子Ｃｄｘ２の特性解明を示す。
【０３０５】
本発明方法においては、起源組織細胞集団における最終分化に関連する転写因子の活性を”ダウンレギュレートする”。”ダウンレギュレートする”とは、その細胞集団における転写因子の活性を”正常な”または対照細胞集団と比較して低下させることを意味する。本明細書中で用いる”細胞集団”は、細胞培養物、組織培養物、切除組織もしくは生検試料、または目的とする組織タイプに由来するいずれかの細胞群を表わす。正常または対照の起源細胞集団は、転写因子をダウンレギュレートするのに用いる起源組織の培養物に由来する起源細胞集団であり、ただし転写因子の活性が修飾されていないものである。
【０３０６】
細胞集団における転写因子の活性は、当業者に周知の幾つかの手段でダウンレギュレートできる。ある態様においては、遺伝子のコード領域または調節領域の部位特異的変異形成により、転写因子を、または転写因子遺伝子のコード配列にから構築されるアンチセンス遺伝子の転写を、ダウンレギュレートする。あるいは他の態様においては、特異的抗体、ＤＮＡ結合分子、あるいは転写複合体のアセンブリーおよび／または開始の妨害により転写因子の活性を妨害する低分子によって、転写因子の活性をブロックまたは阻害する。重要なインヒビターポリヌクレオチド分子にはＦＰ１、ＦＰ１ＢおよびＳＩＦ１が含まれるが、これらに限定されない（実施例１参照）。最後に他の態様においては、転写因子を不活性化するシグナリング事象の活性化により、たとえば転写因子をリン酸化および不活性化する細胞シグナリング事象を開始する細胞外リガンドの添加により、転写因子をダウンレギュレートできる。これらの方法は当業者に周知であり、そのプロトコルは多数の実験手引き、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，２０００中にみられる。これらの態様は、ダウンレギュレートされた起源細胞を形成する方法を説明するものである。他のダウンレギュレーション方法も当業者に周知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０３０７】
好ましい態様において、ダウンレギュレートされる起源細胞はＣｄｘ２−ｎｕｌｌポリープである。Ｃｄｘ２−ｎｕｌｌポリープは、腸上皮における分化を制御するホメオボックス遺伝子ｃｄｘ２の不活性コピーについてヘテロ接合体であるマウスから切除できる（Ｃｈａｗｅｎｇｓａｋｓｏｐｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：８４−８７；Ｔａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：２９６５−２９７０；Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ，９６：７３１８−７３２３；本明細書に援用する）。Ｃｄｘ２はエンドサイト（ｅｎｄｏｃｙｔｅ）分化のマーカーを刺激する。これらのヘテロ接合マウスは、活性Ｃｄｘ２およびＣｄｘ２関連マーカーを発現しない多数の腸ポリープ様病変を発症する。この態様においては、Ｃｄｘ２−ｎｕｌｌポリープと周囲の腸組織の発現プロフィールを比較して、Ｃｄｘ２により刺激されたエンドサイト分化マーカーを同定する。
【０３０８】
本発明方法は、ダウンレギュレートされた起源細胞集団の発現プロフィールと対照の起源細胞集団の発現プロフィールを比較する工程を含む。”発現プロフィール”とは、その細胞集団において発現した核酸またはタンパク質のアレイを意味する。最も一般的には、発現プロフィールはプロファイリングされた細胞集団にみられる核酸分子、主にｍＲＮＡ分子のアレイである。ＲＮＡ発現プロフィールを比較する方法は当業者に周知である。重要なある方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ディファレンシャルディスプレイ法（Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：４６９５−４９７０；Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９６７−９７０；Ｂａｒｎｅｓ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２２１６−２２２０；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５６９５−５６９９；およびそれらに引用される文献）、サブトラクティブハイブリダイゼーション（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：６０２５−６０３０；Ｇｕｒｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０：９０−９７；Ｅｎｄｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：５４２−５５０；およびそれらに引用される文献）、発現アレイ（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０；Ｓｈａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：６３９−６４５；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１（Ｓｕｐｐｌ．）：１５−１９；およびそれらに引用される文献）、遺伝子発現系列分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＳＡＧＥ）（Ｖｅｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４８４−４８７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１２６８−１２７２；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１８：２６１−２６１；およびそれらに引用される文献）、遺伝子発現迅速分析（Ｒａｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＲＡＧＥ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４６０９−４６１８；およびそれらに引用される文献）、マッシブリイパラレルシグナチュアシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＭＰＳＳ）（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：６３０−６３４；およびそれらに引用される文献）および発現配列タグタンデムアレイライゲーション（Ｔａｎｄｅｍ  Ａｒｒａｙｅｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ；ＴＡＬＥＳＴ）（Ｓｐｉｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：ｅ２２（Ｉ−ＶＩＩＩ）；およびそれらに引用される文献）。
【０３０９】
上記方法の多くは市販のキット、試薬および装置を用いて実施できる。ディファレンシャルディスプレイ用の市販キットは特にＤｅｌｔａ（登録商標）ディファレンシャルディスプレイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）などとして購入できる。サブトラクティブハイブリダイゼーション用の市販キットは特にＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）として購入できる。普通のｃＤＮＡ集団のマイクロアレイは購入でき（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ミズーリ州セントルイス）、または注文生産マイクロアレイは業者に注文できる（Ｒａｄｉｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチュセッツ州メドフィールド；ＰｒｏｔｏＧｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州メンローパーク）。好ましいメンブラン型マイクロアレイはＬｉｆｅＧｒｉｄ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｖｅｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ミズーリ州セントルイス）であり、好ましいスライド型マイクロアレイはＧＥＭ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ミズーリ州セントルイス）である。ＲＡＧＥ用の市販キットはＫｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（メリーランド州ガイザースバーグ）から入手できる。Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）が開発した有標技術ＧｅｎｅＴａｇ（登録商標）も、ＲＮＡ転写体のプロフィールにおける遺伝子発現の定量に使用できる。
【０３１０】
タンパク質発現プロフィールも当業者に周知の方法で比較することができる。特に重要な方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：二次元電気泳動−質量分析（２ＤＥ−ＭＳ）（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，１９７５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４００７−４０２１；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，１９９５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１６：１７９１−１８１４；Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：３９６−４０１；およびそれらに引用される文献）および同位体コードアフィニティータグ（Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｃｏｄｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇｓ；ＩＣＡＴ）（Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：９９４−９９９；Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：３９６−４０１；およびそれらに引用される文献）。
【０３１１】
発現プロフィールの比較により同定された目的とする核酸分子またはタンパク質分子をさらに、当業者に周知の方法で単離できる。選択する単離方法は、多くの場合、発現プロフィールの比較に用いた方法に依存し、好ましい方法は比較方法を記載した文献に記載されていることが多い（前記の引用文献を参照）。たとえば核酸バンドをポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルまたはニトロセルロースから取り出し、核酸を溶離し、当技術分野で周知の方法によりクローニングすることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，２０００）。
【０３１２】
本発明方法は、候補マーカーの発現を数種類の細胞において比較する工程を含む。単一遺伝子の発現を比較する方法は多数あり、当業者に周知であろう（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，２０００）。これにはノーザン分析、ｃＤＮＡについてのサザン分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、競合ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、５’ヌクレアーゼアッセイ（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８およびそれに引用される文献）、ウェスタン分析、ドットブロットウェスタン、ＥＬＩＳＡおよび他の免疫アッセイ、ならびに免疫組織化学的分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１３】
本発明方法により同定された分子マーカーを用いて哺乳動物患者の癌を診断し、病期を判定することができる。これには、術後の癌再発の追跡および正常な患者の癌発症のスクリーニングも含まれる。癌患者の場合、用いる分子マーカーは理想的にはその患者の癌が発症したと同じ組織から同定されたものであろう。癌病歴のない患者の場合、種々の臓器組織から単離した分子マーカーを選択することが好ましい。転移は、核酸またはタンパク質分子マーカーを検出するいずれかの方法で診断できる。検出できる転移のサイズは、一部はその方法の感度により決まる。好ましい方法ではＰＣＲ、ＥＬＩＳＡなどを利用する。実施例２に、本発明方法の分子マーカーを用いて転移性癌を診断するための特に好ましい方法を示す。
【０３１４】
組織特異的分子マーカーを使用して、療法薬を特定の組織および臓器系へ局在化させることもできる。この使用は、組織細胞の表面に局在化する組織特異的分子マーカーに特に適する。これらの療法薬には化学療法薬、鎮痛薬、抗体、抗炎症薬、ホルモンおよび刺激薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１５】
タンパク質分子マーカーを用いて抗体を産生することもでき、これらを診断方法および療法薬の局在化に使用できる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそのフラグメント、ならびにそれらの種々のコンジュゲートを、当技術分野で周知の方法により調製できる。
【０３１６】
実施例３  Ｃｄｘ２はグアニリルシクラーゼＣ腸特異的発現に関連する転写因子である
これは、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣ−Ｃ）の腸特異的発現に必要な転写活性化因子の同定を示す。腸細胞における特異的発現に必要な近位ＧＣ−Ｃプロモーター領域は、Ｃｄｘ２に対するコンセンサス結合配列をもつ保護された領域ＦＰ１を含む。ＦＰ１は腸細胞由来の核タンパク質のみと特異的に複合体を形成し、この複合体を抗Ｃｄｘ２抗体が認識する。ＦＰ１内のＣｄｘ２コンセンサス結合配列を除去または変異させると、腸細胞のレポーター遺伝子活性は腸外細胞において得た活性にまで低下した。これらのデータは、Ｃｄｘ２がＧＣ−Ｃの組織特異的転写を活性化することを示唆する。
【０３１７】
材料および方法
ゲノムライブラリースクリーニングおよび配列決定：ＧＣ−Ｃ遺伝子５’調節領域をλＦＩＸＩＩヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホヤ）からクローニングした。グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣ−Ｃ）ｃＤＮＡのエキソン１に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより、ライブラリーをスクリーニングした。転写開始部位の２ｋｂ上流にある２．８ｋｂ  ＸｂａｌＩフラグメントを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。全構築体をこのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＣ−Ｃ遺伝子構築体から形成した。各構築体の核酸配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７  ＤＮＡ配列決定システムによる配列分析のためのＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）反応化学により確認した（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州ノーウォーク；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター・シティー）。
【０３１８】
レポーター遺伝子構築体：転写開始部位に対し−８３５〜＋１１７、−２５７〜＋１１７、−１２９〜＋１１７、および−４６〜＋１１７のフラグメントを、選択した制限エンドヌクレアーゼ消化によりＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ構築体から単離した（Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３０５：７−１０）。これらのフラグメントを平滑末端にし、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳのＥｃｏＲＶ部位にライゲートさせた。ＳｍａＩおよびＫｐｎＩにより挿入配列をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳから切り取り、ｐＧＬ−３−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ワイオミング州マディソン）中へライゲートさせた。エンハンサーをもつＳＶ４０プロモーターを含むｐＧＬ−３対照ベクターを陽性対照として用いた。
【０３１９】
ＰＣＲベースＥｘ−ｓｉｔｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、−８３５〜＋１１７  ｐＧＬ−３−構築体中に変異を形成した。目的部位をフランキングするプライマーを用いて、欠失構築体を作製した。下記のリン酸化プライマーを用いてＦＰ１”ＣＣＣ”変異体を作製した：
【０３２０】
【化８】
0005122713.tif 000007
【０３２１】
細胞培養および形質転換：細胞系はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州ロックビル）から入手された。Ｔ８４細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）中で、Ｃａｃｏ２細胞をＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ＨｅｐＧ２およびＨＳ７６６Ｔ細胞をＤＭＥＭ高グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、バージニア州ハーンドン）中で、ＨｅＬａ細胞をグルタミン加ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気に維持し、４日目毎に継代した。レポーター遺伝子活性のアッセイは、６ウェルプレートにウェル当たり５．０×１０10細胞（Ｔ８４、Ｃａｃｏ２およびＨｅＬａ）または１．０×１０10細胞（ＨｅｐＧ２およびＨＳ７６６Ｔ）で接種した細胞について実施された。細胞を一夜インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮な培地を補充した後、形質転換した。
【０３２２】
Ｑｕａｌｉｆｉｅｒ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、バージニア州バレンシア）で精製したプラスミドを、非リポソーム脂質形質転換試薬Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）により細胞中へ形質転換した。すべての細胞系をｐＧＬ−３−Ｂａｓｉｃから修飾した実験用ホタルルシフェラーゼレポーター構築体０．４ｍｇ、およびウイルスチミジンキナーゼプロモーターで誘導されるレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照レポーターｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．１ｍｇの両方で同時形質転換した。細胞を形質転換用複合体と共に２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで適切な培地を補充してさらに２４時間インキュベートした。合計４８時間後、細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルおよび材料を用いてアッセイした。ルミネセンスをＢｉｏＯｒｂｉｔ  １２５１ルミノメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ、ウスェーデン、ウプサラ）により測定した。ｐＧＬ３構築体からのルシフェラーゼ発現をｐＲＬ−ＴＫ発現に対して正規化した。
【０３２３】
核タンパク質抽出：本質的に前記に従って核抽出物を調製した（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，２０００）。核タンパク質濃度をクーマシータンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）により測定した。
【０３２４】
ＤＮＡｓｅ  Ｉフットプリンティング：ＧＣ−Ｃ遺伝子の転写開始部位に対し−４６〜−２５７の調節領域フラグメントをＤｒａＩＩＩおよびＡｆｌＩＩ消化により採取し、平滑末端にし、前記に従ってＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＫＳのＥｃｏＲＶ部位中へサブクローニングし、次いでＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩにより消化して、プローブのコード鎖が［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで確実に単一末端標識されるようにした。フットプリンティング反応で得た生成物を変性性６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）により視覚化した。
【０３２５】
電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：ＤＮＡｓｅ  Ｉ保護アッセイと同じ緩衝液（４％グリセロール，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５ｍＭ  ＤＴＴ）中で実施するタンパク質−ＤＮＡ結合反応に、１ｍｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）−ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州ピスカッタウェイ）および３０ｋｃｐｍのプローブを含有させた。核抽出物の添加により反応を開始し、室温で３０分間インキュベートして、タンパク質複合体を形成させ、０．５×ＴＢＥランニング緩衝液中、６％非変性性ポリアクリルアミド（３７．５：１）ゲル上で分離した。ゲルを乾燥させた後、放射性標識複合体をオートラジオグラフィーにより視覚化した。競合アッセイにおいては、非標識競合体を反応混合物に標識プローブの２５〜２５０倍モル過剰濃度で添加した後、核抽出物を添加した。３０分の初期インキュベーション期間後、２ｍｌのネズミＣｄｘ２抗体の添加によりスーパーシフトアッセイを実施した：次いでさらに３０分間インキュベーションを続けた。インビトロで線状ｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｃｄｘ２発現ベクターをＴＮＴ−Ｑｕｉｃｋｃｏｕｐｌｅｄ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の鋳型として用いて、転写および翻訳されたネズミＣｄｘ２タンパク質を形成した。
【０３２６】
ＥＭＳＡ用オリゴヌクレオチドプローブを合成した。相補的オリゴヌクレオチドを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において、Ｈｙｂａｉｄ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中で、温度９５℃から２５℃まで１時間にわたってプログラミングされた勾配によりアニールさせた。プローブの一本鎖配列は下記のとおりであった：
【０３２７】
【化９】
0005122713.tif 000008
【０３２８】
太字の配列は特異的Ｃｄｘ２結合部位を示す。ＦＰ１保護部位に形成された変異に下線を施してある。アニールしたオリゴヌクレオチドプローブ５ｐｍｏｌを、１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび２ｍｌの７，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［γ−32Ｐ］ＡＴＰにより末端標識した（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，１９９９）。標識プローブをＱｕｉａｑｕｉｃｋヌクレオチドカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）により精製した。
【０３２９】
サウスウェスタンおよびウェスタンブロッティング：核抽出物を還元性ＳＤＳ試料用緩衝液中で変性させ、８％トリス−グリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースにブロットした。サウスウェスタン分析のために、ブロットしたタンパク質を４°で１時間、３％の脱脂粉乳を含有するＺ’緩衝液（２５ｍＭヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ７．６），１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２０％グリセロール，０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＺｎＳＯ4，１ｍＭ  ＤＴＴ）中においてブロックした（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ニューヨーク，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）。メンブランをＥＭＳＡ結合用緩衝液で５分間すすぎ、１００ｋｃｐｍ／ｍｌの標識ＦＰ１プローブを含むＥＭＳＡ結合用緩衝液２０ｍｌと室温で１時間ハイブリダイズさせた。次いでＥＭＳＡ結合用緩衝液を３回交換してメンブランを５分間ずつ洗浄し、乾燥させ、オートラジオグラフィーにより視覚化した。
【０３３０】
ウェスタンブロットを、５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中でブロックし、１：５０００希釈したＣｄｘ２抗体で試験した。一次抗体の結合を、アルカリ性ホスファターゼ結合したヤギ−抗ウサギ二次抗体（１：１０，０００希釈）（Ｓｉｇｍａ）により視覚化した。ＡＰ  Ｃｏｌｏｒ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）中のアルカリ性ホスファターゼ基質ＢＣＩＰおよびＮＢＴを用いた。
【０３３１】
結果
ＧＣ−Ｃ遺伝子の５’側調節領域にある腸特異的発現を制御するエレメントの決定：種々の細胞系を−４６構築体で形質転換したときの最小ルシフェラーゼ活性を求めた（図１）。それぞれ他のレポーター遺伝子構築体で形質転換した腸細胞のルシフェラーゼ活性は増大した（図１）。腸外細胞をこれらの構築体で形質転換した場合、ルシフェラーゼ活性は増大しなかった（図１）。これらの結果はこれまでのＧＣ−Ｃ遺伝子調節研究と一致し、１又はそれより多くの組織特異的調節エレメントが＋１１８〜−２５７領域にあることを示唆する。−４６〜−１２９構築体による形質転換は腸細胞のみのレポーター遺伝子活性を有意に増大させた（図１）ので、またこの領域は進化的に高度に保存されているので、これを詳細な構造−機能分析のために選んだ。
【０３３２】
ＧＣ−Ｃの５’側調節領域への腸特異的核タンパク質結合によるＤＮＡｓｅ  Ｉ保護：ＤＮＡｓｅ  Ｉ保護アッセイにより、腸細胞からの核抽出物のみで保護される２領域（−７５〜−８３，ＦＰ１；−１６４〜−１７８，ＦＰ３）が明らかになった（Ｔ８４；図２）。領域−１０４〜−１３７（ＦＰ２）および−１８０〜−２１７（ＦＰ４）は腸細胞（Ｔ８４）または腸外細胞（ＨｅｐＧ２）からの核抽出物で保護されたが、ＦＰ２の近位末端と遠位末端は異なる保護パターンを示した。これらのデータは、保護されたＦＰ１およびＦＰ３と表示される領域は腸細胞からの核抽出物に特異的な結合部位であることを示唆する。さらに、ＧＣ−Ｃ遺伝子の近位５’側フランキング領域にある開クロマチン構造の腸特異的部位を、塩基−１６３のＤＮＡｓｅ  Ｉ過感受性部位により同定した（図２）。
【０３３３】
ＦＰ１またはＦＰ３欠失後の−８５７構築体の転写活性：Ｔ８４細胞の転写から、ＦＰ３の欠失によりルシフェラーゼ活性が野生型構築体と対比して２．５倍増大することが明らかになった（図３）。これに対し、ＦＰ１の除去によりＴ８４細胞のルシフェラーゼ活性はＨｅｐＧ２細胞にみられるレベルにまで低下した（図３）。これらのデータは、ＦＰ３が負の調節エレメントを含むこと、およびＦＰ１が腸特異的な正の調節エレメントを含むことを示唆する。転写因子結合部位のデータベースであるＴＲＡＮＳＦＡＣ（Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：３６４−３７０）による分析で、ＦＰ１はホメオドメインタンパク質Ｃｄｘ２に対するコンセンサス結合部位を含むことが明らかになった（Ｑｕａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９５，２３：４８７８−８４）。Ｃｄｘ２は数種類の遺伝子の腸特異的発現を指令する転写因子であるので、ＦＰ１をより詳細に調べた（Ｔｒａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｂｅｒｇ，１９９６，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５８：２７５−９７）。
【０３３４】
腸核抽出物とＦＰ１プローブによって特異的複合体が形成される：オリゴヌクレオチドプローブをＴ８４、Ｃａｃｏ２、ＨｅｐＧ２またはＨｅＬａ細胞から調製した核抽出物と共にインキュベートすることにより、保護された部位ＦＰ１が腸特異的複合体を形成する能力を測定した。実際に、ＦＰ１プローブをこれらの細胞からの核抽出物と共にインキュベートすると、ＥＭＳＡにより数種類の複合体が得られた（図４）。しかし腸特異性に対する基準を満たしたのは１種類の複合体のみであり、これにはＨｅｐＧ２またはＨｅＬａ細胞からの抽出物ではなく、Ｔ８４およびＣａｃｏ２からの核抽出物による形成が含まれる。ＨｅｐＧ２またはＨｅＬａ細胞からの抽出物ではなく、Ｔ８４およびＣａｃｏ２からの核抽出物は、そのプローブを用いて先に得られたものと同一のＳＩＦ１とも複合体を形成し、これらの抽出物の統合性が証明された（Ｓｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４：７３４０−５１）。Ｔ８４核抽出物と形成されたＥＭＳＡ複合体はすべて、漸増量の非標識ＦＰ１と濃度依存性様式で競合した。これに対し、Ｃｄｘ２結合部位を特異的に変異させた非標識競合体（ＦＰ１−ＣＣＣプローブ；材料および方法を参照）は腸特異的複合体と競合しなかった。Ｃｄｘ２に対する２つのコンセンサス結合部位を含むオリゴヌクレオチドであるＦＰ１は、非標識ＦＰ１より強くＦＰ１依存性腸特異的複合体形成を選択的に阻害したが、残りのＴ８４−ＥＭＳＡ複合体の結合には影響を与えなかった（Ｓｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これらのデータは、ＦＰ１保護された部位に結合する腸特異的因子はＣｄｘ２である可能性が最も高いことを示唆する。
【０３３５】
Ｃｄｘ２はＦＰ１プローブに特異的に結合する：ＦＰ１がＣｄｘ２に対する結合部位であるか判定するために、標識ＦＰ１をインビトロ転写および翻訳されたネズミＣｄｘ２と共にインキュベートした。その結果、Ｔ８４核抽出物により形成された腸特異的複合体と移動度が同一である複合体が得られた。これに対し、標識ＦＰ１−ＣＣＣはＣｄｘ２またはＴ８４核抽出物のいずれのとも腸特異的複合体を形成しなかった。Ｃｄｘ２に対する抗体は、標識ＦＰ１とＴ８４核抽出物またはインビトロ転写および翻訳Ｃｄｘ２のいずれかとの間で形成された特異的複合体の移動度を低下させた。これに対し、関連のホメオドメイン転写因子Ｃｄｘ１に対する抗体は、腸特異的複合体の移動度を変化させなかった。これらのデータから、ＦＰ１保護された部位がＣｄｘ２の結合部位であるという結論に達した。
【０３３６】
サウスウェスタンおよびウェスタンブロット法による腸特異的核因子の同定：ＦＰ１プローブおよび抗Ｃｄｘ２抗体が同一の腸特異的タンパク質に結合するか調べた。ＦＰ１プローブに対する相同性の高い標識ＦＰ１ＢはＴ８４およびＣａｃｏ２核抽出物中にある約４０ｋＤａの腸特異的タンパク質に特異的に結合したが、ＨｅｐＧ２核抽出物には結合しなかった。さらに、ＦＰ１Ｂプローブは試験したすべての細胞中に存在する約１３１ｋＤａのタンパク質に結合した。同様に、抗Ｃｄｘ２抗体は、Ｔ８４細胞核抽出物において発現した約４０ｋＤａのタンパク質ダブレットを認識したが、ＨｅｐＧ２またはＨｅＬａ細胞核抽出物において発現したものは認識しなかった；これはＣｄｘ２に特徴的なパターンである（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：１５２２９−３７）。このように、ＦＰ１保護された領域はＣｄｘ２と同一の分子量および抗原認識をもつ腸特異的因子に結合する。さらにサウスウェスタンブロットにより、ＦＰ１プローブはＣｄｘ２に直接結合することが明らかになった。
【０３３７】
ＧＣ−Ｃプロモーターの腸特異的遺伝子発現におけるＣｄｘ２結合エレメント（ＦＰ１）の役割：−８３５ルシフェラーゼ遺伝子構築体のＦＰ１エレメント中へ”ＣＣＣ”変異を導入した。この変異レポーター遺伝子構築体はＴ８４細胞において活性低下を示した；これは全ＦＰ１領域を欠失させた構築体に匹敵した（図５）。ＦＰ１欠失体もＦＰ１の”ＣＣＣ”変異体も、ＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ活性は変化させなかった（図５）。これらのデータにより、ＧＣ−Ｃプロモーターの活性には無傷のＣｄｘ２結合部位が必要であることが証明された。実際に、Ｃｄｘ２結合部位を撹乱すると最小活性になった。
【０３３８】
実施例４：グアニリルシクラーゼＣメッセンジャーＲＮＡを再発性ＩＩ期結腸直腸癌の検出のための分子マーカーとして使用する
この例は、転移の診断における組織特異的分子マーカーの使用を示す。ＲＴ−ＰＣＲによるＧＣＣ  ｍＲＮＡの検出により、結腸直腸癌の病期判定の精度が向上する。リンパ節において腸外組織中の結腸直腸癌細胞に対する分子マーカーであるＧＣＣ  ｍＲＮＡが発現したことは、リンパ節が組織学的には陰性である患者における疾患再発に関連する（ＩＩ期）。ＧＣＣ  ｍＲＮＡの発現は、標準的組織病理学においては検出限界未満である結腸直腸癌ミクロ転移の存在を反映する。ＧＣＣ特異的ＲＴ−ＰＣＲは、１０7個の有核血球中１個のヒト結腸直腸癌細胞（Ｔ８４細胞、ＡＴＣＣＣ、メリーランド州ロックビル）を、信頼性および再現性をもって検出できる（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４８２７−３２）。
【０３３９】
グアニリルシクラーゼファミリー受容体のメンバーであるＧＣＣは、腸粘膜細胞にのみ特異的に発現する。しかしＧＣＣ発現は、結腸直腸癌細胞への腫瘍トランスフォーメーションを受けた腸細胞においても持続する。３００例以上の外科検体を検査して、ＧＣＣをすべての原発性および転移性結腸直腸癌細胞が特異的に発現するが、他のいずれの腸外組織または腫瘍も発現しないことを証明した。ＧＣＣは、診断後３年以下での再発を伴うＩＩ期患者からのリンパ節のみにおいて同定され、６年で再発性疾患を伴わない患者からのリンパ節には同定されなかった。
【０３４０】
材料および方法
患者および組織：Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ病院腫瘍登録データベースを、１９８９〜１９９５年に結腸直腸癌の治療を受けた患者について検索した。これはこの研究のために患者を適切に追跡できる期間である。この初期調査は、再発性ではなく継時性（ｍｅｔａｃｈｒｏｎｏｕｓ）の癌を伴う患者を不注意に含めるのを避けるために、インデックス手術後３年未満で再発性疾患を伴うＩＩ期患者を除外する目的で企画された。この調査で、外科処置時に転移の徴候がない浸潤性の結腸癌または直腸癌（Ｎ0Ｍ0）を伴う患者４４５人が得られた。これらのうち２６０人の患者はＴｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで外科処置を受け、リンパ節を提供した。続いて１６７人の患者を、ＴＮＭ  Ｉ期以下の疾患（Ｔ0、Ｔ1またはＴ2Ｎ0Ｍ0）、局所的もしくは不特定部位の再発性疾患を伴うか、またはネオアジュバント化学療法もしくは放射線療法を受けたため、除外した。次いで、再発の徴候がない５６人の患者を、追跡期間が６年未満であるため除外した。これらを除外した後、術後６年以上疾患の徴候がなく、臨床的に治癒していると考えられる合計１８人の患者が残った。これらの患者が対照群となった。同様に、術後３年以内に再発した１９人の疾患全員を症例群に入れた。対照群の１６人および症例群の１２人からは以後の分析のための病理検体が得られた。対照群の２人（患者９と１６；１２．５％）および症例群の１人（患者２４；８．３％）は、術後に５−フルオロウラシルをベースとするアジュバント化学療法を受けた。
【０３４１】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応：予備試験により、個々のリンパ節から得た１０μｍの切片より単離したｍＲＮＡで得られたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ分析に不十分なことが証明された。したがって、各患者について代表的リンパ節から少なくとも５つの１０μｍ切片をプールし、脱パラフィンし、全ＲＮＡを単離した（Ｗａｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ，４１：１−６）。ＲＮＡ  ＰＣＲキット２型を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した（宝酒造、日本、京都；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４８２７−３２；Ｗａｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ，４１：１−６）。β−アクチン特異的ＲＴ−ＰＣＲ後にアンプリコンを生成した全ＲＮＡのみを、下記に概説する試験に用いた。ＧＣＣ特異的な入れ子型癌胎児性抗原特異的ＲＴ−ＰＣＲを、先の記載に従って実施した（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４８２７−３２；Ｗａｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ，４１：１−６；Ｌｉｅｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９８：３３９：２２３−８）。ＲＴ−ＰＣＲ反応物を、４％ＮｕＳｉｅｖｅ  ３：１  ａｇａｒｏｓｅ（登録商標）（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，メーン州ロックランド）上での電気泳動により分離し、増幅生成物を臭化エチジウムで視覚化した。ＧＣＣおよび癌胎児性抗原を発現しているヒト結腸直腸癌細胞（Ｃａｃｏ２細胞；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル）から単離したＲＮＡからなる陽性対照、および鋳型を添加せず、結腸直腸癌を伴わないリンパ節からのＲＮＡを添加したインキュベーション物からなる陰性対照を含めた。アンプリコンの同一性を配列決定により確認した。増幅に用いたプライマーに対して内側の配列に相補的な32Ｐ標識アンチセンスプローブを用いるサザン分析により、ＧＣＣ特異的アンプリコンの生成を確認した（Ｋｒｏｃｚｅｋ，１９９３，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ，６１８：１３３−１４５）。
【０３４２】
統計分析：結果を平均±ＳＤとして表わす。ただし無疾患および全生存は平均±範囲として表わす。Ｐ値はＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ試験により計算された。ＳｔａｔＸａｃｔ  ４．０統計ソフトウェアパッケージ（ＣＹＴＥＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、マサチュセッツ州ケンブリッジ）を用いて、正確に９５％の信頼区間（ＣＩ）をもつ見込み率を計算した。
【０３４３】
結果
ＲＴ−ＰＣＲにより評価した患者の特性：患者の年齢は３７〜８５歳（６８±９．５歳）であった。女性（５２〜８５歳；６４．５±１０．５歳）と男性（３７〜８２歳；７０．９±７．８歳）の年齢は類似していた。男性：女性の比率は、対照群（８：９）と症例群（５：７）の間でバランスがとれていた。１人の女性患者はアフリカ系アメリカ人であり、他の患者はすべてコーカソイド（白色人種）であった。Ｔ3：Ｔ4疾患の比率は対照群では３：１３、症例群では４：８であった。患者を９〜１０５カ月間（６７．４±３０．７カ月間）追跡した。対照群の患者を７３〜１０５カ月間（８９．９±７．８カ月間）追跡した、一方、症例群の患者を９〜７８カ月間（３７．３±２２．６カ月間）追跡した。対照群では、１人（６．３％）が初診後９６カ月目に新たな原発性結腸病変を発症し、１人（６．３％）が結腸直腸癌と無関係な原因で死亡し、残りの１４人（８７．５％）が生存し、診断後８８（範囲７３〜９７）カ月間無疾患であった。症例群では、８人（６６．６％）が、それぞれ１３（範囲３〜３５）カ月間および１９（範囲９〜６４）カ月間の無疾患および全生存期間後、再発性結腸直腸癌のため死亡した。４人（３３％）は、それぞれ１２（範囲２〜３６）カ月間および５２（範囲１７〜７８）カ月間の無疾患および全生存期間後、転移を伴う状態で生存した。
【０３４４】
リンパ節におけるＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析：対照群および症例群の患者２８人について、手術時に採取した合計５２４のリンパ節（リンパ節１８．４±１２．５個／患者）が組織学的観察では腫瘍を含まないと報告された。最初の手術による病期判定時に各患者から得たリンパ節の個数は、対照群（１９．９±１３．２）と症例群（１７．２±１２．７）の間で類似していた。２１人（７５％）から、ＲＴ−ＰＣＲによって適切に評価できるパラフィン包埋リンパ節１５９個（リンパ節７．６±５．２個／患者）を得た。ＲＴ−ＰＣＲからリンパ節を除外したのは、病理学的立場から利用できなかったもの（２８人からのリンパ節３２６個；手術時に得られたリンパ節５２４個のうち６２．６％）またはＲＮＡが得られなかったもの（７人からのリンパ節３９個；手術時に得られたリンパ節５２４個のうち７．４％；ＲＴ−ＰＣＲ分析に用いたリンパ節１９８個のうち１９．７％）であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析に利用できたリンパ節の個数は、対照群（６．４±３．０）と症例群（８．１±６．３）の間でバランスがとれていた。
【０３４５】
症例群の５人（４１．７％）および対照群の２人（１６．７％）のプールしたリンパ節切片からの全ＲＮＡ中にβ−アクチン特異的アンプリコン（無傷ＲＮＡの指標）が検出されず、これらの患者を以後の分析から除外した。残り２１人からプールしたリンパ節切片より抽出した全ＲＮＡを、ＧＣＣ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより分析した。対照群患者のリンパ節からのＲＮＡを用いた反応物のいずれにも、ＧＣＣ特異的アンプリコンは検出されなかった（ｐ＝０．００４；表１）。これらの反応物中にＧＣＣ特異的アンプリコンが存在しないことはサザン分析により確認され、無疾患患者のリンパ節には結腸直腸癌のミクロ転移がないことを示唆する。これに対し、症例群患者のリンパ節からのＲＮＡを用いたすべての反応物中にＧＣＣ特異的アンプリコンが検出された（表１）。これらの反応物中にＧＣＣ特異的アンプリコンが存在することは配列決定および／またはサザン分析により確認され、再発性疾患を伴う患者のリンパ節に結腸直腸癌のミクロ転移があることを示唆する。それまでにＲＴ−ＰＣＲで分析された結腸直腸癌を伴わない他の２１人（陰性対照）からのリンパ節３９個のいずれにもＧＣＣ  ｍＲＮＡが発現していなかったことは注目される。
【０３４６】
【表１】
0005122713.tif 000009
【０３４７】
*  リンパ節中にＧＣＣ  ｍＲＮＡが検出された（＋）または存在しない（−）；
†  無疾患期間（診断後の月数）；
§  全生存期間（診断後の月数）；
¶  ＮＥＤ：疾患の徴候がない。
癌胎児性抗原は６０％未満の結腸直腸癌および他の腫瘍、正常細胞、ならびにある非悪性病理学的状態に発現する糖タンパク質である。癌胎児性抗原発現のＲＴ−ＰＣＲ分析から、これはリンパ節における結腸直腸癌ミクロ転移のマーカーであることが示唆された。この試験では、プールしたリンパ節切片から抽出した全ＲＮＡを、癌胎児性抗原特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより分析した（Ｌｉｅｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３９：２２３−８）。入れ子型ＲＴ−ＰＣＲにより、対照群の患者からの全ＲＮＡを用いた反応では癌胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的アンプリコンは生成しなかったが、症例群の患者１人において癌胎児性抗原特異的アンプリコンが検出された。癌胎児性抗原特異的アンプリコンの存在は、配列分析により確認された。
【０３４８】
リンパ節におけるＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現と臨床病理学的予後指標：症例群と対照群（２８人）を、疾患再発に関連する腫瘍および疾患特性について比較した。各群は下記に関してバランスがとれていると思われた：腫瘍等級（十分に分化：対照２（１２．５％）；症例１（８．３％）；中等度に分化：対照１３（８１．３％）；症例９（７５％）；分化不十分：対照１（８．３％）；症例２（１２．５％））；腫瘍サイズ（対照，５．７±２．３ｃｍ；症例，４．８±１．７ｃｍ）；腫瘍位置（右結腸；対照７（４３．８％）；症例４（３３．３％）；横行結腸；対照３（１８．８％）；症例０；Ｓ状結腸；対照５（３１．３％）；症例８（６６．６％）；直腸：対照１（６．３％）；症例０）：ならびに結腸周囲への腫瘍の侵入の深さおよび拡大。血管リンパ浸潤が症例群の患者３人にみられたが、対照群の患者にはみられず、これは前者における転移の基礎になると思われる機序を反映している。リンパ節におけるＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現は、すべての症例で疾患再発と関連があった（ｐ＝０．００４）。局所リンパ節におけるＧＣＣ  ｍＲＮＡ発現に関連する死亡の見込み率は１６．５（１．１〜７５６．７，９５％ＣＩ）であった。感受性分析により、”偽陰性”（対照群における死亡）または”偽陽性”（症例群における生存患者）増加結果は、１（過剰リスクなし）を含む９５％ＣＩをもつ見込み率を与えることが証明された。これは、この分析で用いた小規模の試料集団がもつ限界を反映する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＧＣ−Ｃ遺伝子プロモーターの欠失変異体の機能特性解明を示す。ＧＣ−Ｃ遺伝子５’側フランキング領域の欠失変異体をルシフェラーゼに結合させ、レニラルシフェラーゼ対照プラスミドｐＲＬ−ＴＫと一緒に腸細胞系（Ｔ８４、Ｃａｃｏ２）および腸外細胞系（ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＳ７６６Ｔ）内へ同時形質転換した。データを、ｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃ無プロモーター構築体に対するルシフェラーゼ活性（相対活性）として表示する。各棒は、二重に実施した少なくとも３回の独立した形質転換の平均±標準誤差を表わす。
【図２】  近位ヒトＧＣ−ＣプロモーターのＤＮＡｓｅ  Ｉ保護を示す。フットプリンティング反応には、指示したｍｇ量（ＮＥ）のＨｅｐＧ２またはＴ８４核抽出物、およびコード鎖の５’末端を標識した−４６〜−２５７プロモーターフラグメントを含有させた。対照消化は６０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有していた。保護された塩基を標識フラグメントのＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング反応（Ｇ＋Ａ）により同定した。ＦＰ１の配列を示す。矢頭は塩基−１６３におけるＤＮＡｓｅ  Ｉ過感受性部位を示す。
【図３】  腸特異的保護エレメントによるレポーター遺伝子発現調節を示す。−８３５ルシフェラーゼ構築体からインビトロ変異形成によりＦＰ１およびＦＰ３を欠失させ、野生型および欠失型構築体をＨｅｐＧ２およびＴ８４細胞において発現させた。結果は無プロモーター構築体に対比したルシフェラーゼ活性として表示され、二重に実施した３回の独立した形質転換の平均±標準誤差である。
【図４】  ＦＰ１プローブＥＭＳＡの腸特異性を示す。腸細胞または腸外細胞からの核抽出物またはＢＳＡ（１０ｍｇ）を、標識ＦＰ１と共に室温で３０分間インキュベートした後、非変性性６％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
【図５】  ＧＣ−Ｃレポーター遺伝子活性化にはＣｄｘ２結合エレメントＦＰ１が必要である。Ｃｄｘ２およびＨＮＦ−４ａに対する推定結合部位を−８３５構築体上に示す。Ｔ８４およびＨｅｐＧ２細胞を、ＦＰ１を欠失した−８３５レポーター構築体または”ＧＣＣ”変異体を含むこの構築体で形質転換した。結果は（変異構築体のルシフェラーゼ活性、野生型構築体のルシフェラーゼ活性）×１００として表示され、二重に実施した３回の独立した形質転換の平均±標準誤差である。相対ルシフェラーゼ活性として表示した数値は、それぞれ（野生型；ＦＰ１欠失；”ＣＣＣ”変異体）：Ｔ８４（１６．２±２．７；１．９±０．３；２．３±０．１）およびＨｅｐＧ２（２．１±０．１；２．９±０．３；２．２±０．１）である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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