(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
0005157576.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または相異なり、炭素数１〜４のアルキル基を示す。）
で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を用いて、式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを不斉加水分解する工程を含むことを特徴とする式（２）
0005157576.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ前記と同じ意味を示し、＊は当該炭素原子が不斉中心であることを示す。）
で示される光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの製造方法。
【請求項２】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ１がメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ２がメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ３がメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ１とＲ２が共にメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ２とＲ３が共にメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンにおいて、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のいずれもがメチル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
酵素が、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属またはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
酵素が、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、キャンディダ・シリンダラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、キャンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・アンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｃｔｉｃａ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはクロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）の微生物あるいは好熱性微生物（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ）を起源とする加水分解酵素である請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンは、天然物や医薬などの合成において不斉炭素導入原料として有用な化合物である。
これまで、かかる光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを製造する方法としては、例えば、不斉銅触媒の存在下でシリルエノラートとアルキリデンマロネートとを付加させる方法（非特許文献１）が挙げられる。該製法により得られるチオエステルのエステル交換を行えば、光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンが得られる。しかしながら、かかる方法ではハロゲン化溶媒を用いており、また、目的物の光学純度を高めるには低温条件が必要であった。しかも−７８℃で反応を行っても光学純度は最高９３％ｅｅ（光学活性中心の炭素原子に結合するアルキル基がメチル基の場合は４３％ｅｅ）であり、必ずしも工業的に満足できる方法であるとはいえなかった。
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，９１３４（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明者らは、ラセミ化合物である２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを原料として、通常の酵素反応条件下、種々の酵素を用いて光学選択的に加水分解することにより光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを製造する方法について鋭意検討した結果、光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの両異性体をそれぞれ容易に効率よく製造できることを見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち本発明は、式（１）
0005157576.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または相異なり、炭素数１〜４のアルキル基を示す。）
で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を用いて、式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを不斉加水分解する工程を含むことを特徴とする式（２）
0005157576.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ前記と同じ意味を示し、＊は当該炭素原子が不斉中心であることを示す。）
で示される光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の方法によれば、低温条件を用いることなく、高い光学純度で光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明方法において用いられる原料である式（１）で示される２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（以下、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）と略記する。）は、塩基の存在下でマロン酸ジアルキルとβ−アルキル−α，β−不飽和アルキルエステルとを反応させる方法（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４，１１９（１９８８）参照。）等の任意の公知の方法にて製造して、本発明に用いることができる。
【０００７】
本発明の式（１）および（２）で示される化合物におけるＲ１、Ｒ２およびＲ３で示される炭素数１〜４のアルキル基として、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が例示される。
【０００８】
かかる２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）として、具体的には２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、２−メチル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、２−メチル−１，１，３−トリｎ−プロポキシカルボニルプロパン、２−エチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、２−エチル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、２−ｎ−プロピル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、２−ｎ−プロピル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、２−メチル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、２−メチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、２−エチル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、２−エチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、２−ｎ−プロピル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、２−メチル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、２−メチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、２−エチル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、２−ｎ−プロピル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン等が挙げられる。
【０００９】
２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＳ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えば、キャンディダ・シリンダラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、キャンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）等のキャンディダ属の微生物、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）の微生物、ブタ肝臓（Ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ）または好熱性微生物（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ）由来の酵素を挙げることができる。キャンディダ・シリンダラセア、キャンディダ・ルゴサ等のキャンディダ属の微生物、クロモバクテリウム・チョコレータムの微生物または好熱性微生物由来の酵素が好ましい。
【００１０】
かかる２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＳ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としてさらに具体的には、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の酵素もしくは市販酵素としてＣＨＩＲＡＺＹＭＥ（登録商標）  Ｅ−３（好熱性微生物由来）、リパーゼＣＨＩＲＡＺＹＭＥ（登録商標）  Ｌ−３（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来）、コレステロールエステラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来）（以上、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、リパーゼＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＣＲ（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）、リパーゼＬｉｐａｓｅ−ＭＹ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来）（名糖産業社製）、リパーゼ  Ｌｉｐａｓｅ  ＯＦ（名糖産業社製）またはＰＬＥ−Ａ（天野エンザイム社製）を挙げることができる。クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来の酵素がより好ましい。
【００１１】
２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＲ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えば、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属の微生物、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の微生物、キャンディダ・アンタクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｃｔｉｃａ）の微生物、ウシ膵臓（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ）または好熱性微生物（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ）由来の酵素を挙げることができる。バシラス・リケニフォルミス、バシラス・サブチリス等のバシラス属の微生物、アルスロバクター・グロビフォルミスの微生物または好熱性微生物由来の酵素が好ましい。
【００１２】
かかる２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＲ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としてさらに具体的にはアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来の酵素、もしくは市販酵素としてエステラーゼＣＨＩＲＡＺＹＭＥ（登録商標）  Ｅ−４（好熱性微生物由来）、プロテアーゼＣＨＩＲＡＺＹＭＥ（登録商標）  Ｐ−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）（以上、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、プロテアーゼ  Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）  ４０００Ｅ（ＧＥＮＥＮＣＯＲ社製）、プロテアーゼ  α−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）、リパーゼ  ＳＰ−５２５（ノボザイムズジャパン社製）を挙げることができる。アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来の酵素がより好ましい。
【００１３】
これらの２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素（以下、本酵素と記す）としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、これらの微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
【００１４】
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法、あるいはそれらに準じた方法により作製できる。さらに具体的には、特開２００１−４６０８４号公報、特許第３８５５３２９号公報、特許第３８７５２８３号公報、または特許第３１５１８９３号公報に記載の方法、あるいはそれらに準じた方法により作製できる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（特許第３８７５２８３号公報）またはアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼ（特許第３１５１８９３号公報）等を挙げることができる。
【００１５】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼの具体例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素が挙げられ、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼの具体例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる酵素が挙げられる。
【００１６】
また、本酵素をコードする遺伝子の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００１７】
本発明には、下記ａ）〜ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質からなる酵素を用いることが好ましい。
ａ）配列番号１または３で示されるアミノ酸配列。
ｂ）ｉ）配列番号２または４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｃ）ｉ）配列番号２または４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ii）２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｄ）ｉ）配列番号１または３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ii）２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)ｉ）配列番号１または３で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、かつ、ii) ２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
なかでも、配列番号１で示されるアミノ酸配列において４３番目のＮ（アスパラギン）がＳ（セリン）に置換され、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列（特開２０００−７８９８８号公報に記載のＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ）、または、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１６０番目のＧ（グリシン）がＳ（セリン）に、１８９番目のＧ（グリシン）がＦ（フェニルアラニン）置換され、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列（特許第３４８６９４２号公報に記載の１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ）からなるタンパク質からなる酵素を用いることが、より好ましい。
【００１８】
「配列番号２または４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。具体的には、例えば、配列番号１または３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１または３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１または３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ等が挙げられる。
【００１９】
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）等の配列分析用ツールを用いて算出し得る。
【００２０】
また、「配列番号１または３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、配列番号１または３で示されるアミノ酸配列において１アミノ酸若しくは２アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、本酵素は配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２１】
本酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどを使用することができる。また、上記微生物の有する２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）の不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいは２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）を適宜培地に添加してもよい。
【００２２】
さらに、tacプロモーター、trcプロモーターおよびlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターの下流に本酵素をコードするＤＮＡが接続されたプラスミドが導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００２３】
培養は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度は、２０〜４０℃程度、好ましくは、２５〜３５℃程度で、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
【００２４】
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ｆａｓｔｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）やＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）６５０Ｓ（東ソー株式会社製）等を挙げることができる。
【００２５】
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００２６】
かかる本酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）に対して通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、その使用量は２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）に対して通常は０．０１〜２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００２７】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）に対して通常０．５モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられ、通常は２００重量倍以下である。
【００２８】
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）に対して２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍程度の範囲である。
【００３０】
不斉加水分解反応は、例えば水、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）および本酵素を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）および本酵素を混合すればよい。
【００３１】
反応系のｐＨは本酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４〜１０程度、好ましくはｐＨ６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることによりｐＨを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムなどのリン酸塩、トリエチルアミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニアなどが使用される。かかる塩基は単独もしくは２種類以上を組み合わせて用いてもよい。かかる塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するものと同じものを使用することができる。さらに塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。
【００３２】
反応温度は、本酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する温度が適宜選択され、特に限定されないが、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にある。一方、温度が低いほど選択性は向上する傾向にある。通常−１０〜６５℃程度であり、好ましくは−５〜５０℃程度の範囲である。
【００３３】
かくして式（２）で示される光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（以下、光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）と略記する。）の溶液が得られるが、通常、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは加水分解反応により生じたカルボン酸などと分離するためにさらに後処理操作を行う。
【００３４】
かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後蒸留により分離精製する方法、分液操作により分離精製する方法などが挙げられる。
【００３５】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。
【００３６】
目的物である光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）と酵素や緩衝剤やその他の水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）を抽出し水層と分液すればよい。
かかる疎水性有機溶媒としては例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）に対して０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
かかる目的物の抽出時のｐＨは通常６〜１０程度の範囲、好ましくは７〜９程度の範囲である。
溶液をかかるｐＨに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。かかる酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸などの無機酸およびその塩、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸などの有機酸およびその塩などが挙げられる。かかる塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。また、同様に有機層からの水溶性成分の除去が不十分な場合も、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
【００３７】
次いで得られた有機層中の有機溶媒を留去することで目的物である光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）を単離することができる。
得られた光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）はさらにカラムクロマトグラフィーや蒸留などによって精製されてもよい。
【００３８】
本発明において、本酵素として、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＳ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、上記の分液処理の有機層から得られる光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）はＲ体に富み、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうちＲ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、上記の分液処理の有機層から得られる光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）はＳ体に富む。
【００３９】
また、上記の分液操作後の水層には、通常、有機層から得られた目的物とは逆の立体の加水分解生成物が含まれている。すなわち、Ｓ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いた場合、該水層には光学活性（Ｓ）−２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの加水分解生成物が、Ｒ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いた場合、該水層には光学活性（Ｒ）−２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパンの加水分解生成物が、それぞれ含まれる。該水層から水を留去したり、該水層を酸性に調整した後に有機溶媒を用いて抽出処理し、得られた有機層を濃縮処理したりすることによって、これらの加水分解生成物を回収することができ、得られた加水分解生成物をエステル化すれば、対応する光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）を得ることもできる。かかるエステル化は、例えば、硫酸存在下で加水分解生成物とアルコールとを反応させる方法；アジ化トリメチルシランあるいは塩化トリメチルシラン存在下で加水分解生成物とアルコールとを反応させる方法；等の常法により行えばよい。
【００４０】
かくして得られる光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）として、具体的には（Ｒ）−２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１，３−トリｎ−プロポキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−エチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−エチル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−ｎ−プロピル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−ｎ−プロピル−１，１，３−トリエトキシカルボニルプロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−エチル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−エチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−ｎ−プロピル−１，１−ジエトキシカルボニル−３−メトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−メチル−１，１−ジｎ−プロポキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−エチル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、（Ｒ）−２−ｎ−プロピル−１，１−ジメトキシカルボニル−３−エトキシカルボニル−プロパン、および、上記の（Ｒ）が（Ｓ）に置き換わった化合物等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１〜１４
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン３５ｍｇと表１に示した種々の酵素をそれぞれ表２に示した量を量り取ったところへ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌを加えた。この溶液を２５℃で、２０時間攪拌した後、アセトニトリル２．５ｍＬを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を高速液体クロマトグラフィー〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）  ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、５μｍ（ダイセル化学工業社製）〕にて光学純度を分析し、また、高速液体クロマトグラフィー〔カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｄ−２１０ＦＦ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ（住化分析センター社製）〕にて化学純度を分析して、得られた光学活性２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表２に示す。
【００４３】
実施例１５、１６
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン７０ｍｇと表１に示した酵素を表２に示した量を量り取ったところへ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌを加えた。この溶液を２５℃で、３．５時間攪拌した後、アセトニトリル５ｍＬを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を実施例１〜１４と同様に分析して、得られた光学活性２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表２に示す。
【００４４】
【表１】
0005157576.tif 000004
【００４５】
【表２】
0005157576.tif 000005
【００４６】
実施例１７、１８
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン７０ｍｇとクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ（１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ）７．０ｍｇを量り取ったところへ、それぞれｐＨ５、ｐＨ９の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液４ｍｌを加えた。この溶液を２５℃で、３．５時間攪拌した後、アセトニトリル５ｍＬを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を実施例１〜１４と同様に分析して、得られた光学活性２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。実施例１５（ｐＨ７）と比較した結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
0005157576.tif 000006
【００４８】
実施例１９、２０
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン７０ｍｇとクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ（１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ）７．０ｍｇを量り取ったところへ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌを加えた。この溶液を、それぞれ１０℃、０℃で、表４に記載した時間攪拌した後、アセトニトリル５ｍＬを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を実施例１〜１４と同様に分析して、得られた光学活性２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。実施例１５（２５℃）と比較した結果を表４に示す。
【００４９】
【表４】
0005157576.tif 000007
【００５０】
実施例２１〜２９
表５に示した各エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いてE．coli JM105株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地（１００ｍｌ）にそれぞれ接種し、振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．６ｇを得た。湿菌体約０．６ｇを０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５ｍｌで懸濁し、直径０．１ｍｍのガラスビーズを５ｇ添加後、マルチビーズショッカー（安井器械社製、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１００００rpm、４℃、１０分）し、上清を粗酵素液とした。
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン７０ｍｇを量り取り、そこへ、上記の粗酵素液を、それぞれ表６に示した酵素量を量り取って加え、更に１７０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌを加えた。この溶液を２５℃で、５時間攪拌した後、ビフェニル（内部標準物質）を含むアセトニトリル２ｍＬを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を実施例１〜１４と同様に分析して、得られた光学活性２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表６に示す。
【００５１】
【表５】
0005157576.tif 000008
【００５２】
【表６】
0005157576.tif 000009
【００５３】
実施例３０−１：酵素加水分解
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン１１．３７ｇと１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）６８．４ｇを量り取ったところへ、プラスミド（ｐＣＣＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍ）を含むE．coli JM105株の形質転換体から実施例２１〜２９と同様にして調製した粗酵素液１．０ｇを加えた。この溶液を０℃で、２３時間攪拌した。攪拌中、１０重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより、溶液のｐＨを７に維持していた。攪拌終了後の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２０ｇを添加し、得られた混合物をグラスフィルターにて濾過した。濾液を有機層と水層に分液し、水層にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２０ｇを添加して分液した。水層８１．８ｇを得た。得られた有機層を合一し、５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液５．１ｇで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄色油状物として（Ｒ）−２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン４．４９ｇを得た。収率４７．７％、鏡像異性体過剰率１００％ｅｅ。
【００５４】
実施例３０−２：加水分解物の回収
実施例３０−１で得られた水層のうち７９．８ｇに、３５重量％塩酸３．１２ｇを添加することによりｐＨ２．０に調整した。そこに、酢酸エチル２０．０ｇと塩化ナトリウム２５．０ｇを添加して攪拌した後、得られた混合物を分液した。得られた水層に酢酸エチル２５．０ｇを添加して抽出した。得られた有機層を合一し、２５重量％塩化ナトリウム水溶液２５．０ｇで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄褐色油状物５．１ｇを得た。
【００５５】
実施例３０−３：エステル化
実施例３０−２で得られた黄褐色油状物のうち１．０ｇをメタノール２０．０ｇに溶解させた。得られた溶液を０℃に冷却し、そこに塩化トリメチルシラン１．０ｇを約１０分かけて滴下した。滴下終了後、得られた反応液を２０〜２５℃に昇温し、同温度で４５．５時間保温した。得られた反応液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル３２ｇで希釈した。そこに５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液４０ｇを添加して攪拌した後、分液して有機層３６．２ｇと水層５７．８ｇを得た。得られた有機層と水層について、それぞれ高速液体クロマトグラフィーにて化学純度を分析し、また、有機層について高速液体クロマトグラフィーにて光学純度を分析して、得られた光学活性な２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。上記の化学純度および光学純度の分析は、実施例１〜１４と同様に行った。上記有機層および水層に含まれていた２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率は４６．８％、上記有機層に含まれていた２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの鏡像異性体過剰率は８６．８％ｅｅ（Ｓ体）であった。
【００５６】
実施例３１−１：酵素加水分解
２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン１５０ｇと１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０３５ｇを量り取ったところへ、プラスミド（ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ）を含むE．coli JM105株の形質転換体から実施例２１〜２９と同様にして調製した粗酵素液１７．０ｇを加えた。この溶液を０℃で、４２時間攪拌した。攪拌中、１０重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより、溶液のｐＨを７に維持していた。攪拌終了後の溶液に、酢酸エチル６１３ｇを添加し、得られた混合物をグラスフィルターにて濾過した。濾液を有機層と水層に分液し、水層に酢酸エチル７５０ｇを添加して分液した。得られた有機層を合一し、有機層１５００ｇと水層１３２１ｇを得た。さらに有機層を５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液１５０ｇで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄色油状物として（Ｒ）−２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパン６７．６ｇを得た。収率３９．１％、鏡像異性体過剰率１００％ｅｅ。
【００５７】
実施例３１−２：加水分解物の回収
実施例３１−１で得られた水層のうち１３１５ｇに、３５重量％塩酸６１ｇを添加することによりｐＨ２．０に調整した。そこに、酢酸エチル３００ｇと塩化ナトリウム４１５ｇを添加して攪拌した後、得られた混合物を分液した。得られた水層に酢酸エチル３７５ｇを添加して抽出した。得られた有機層を合一し、２５重量％塩化ナトリウム水溶液３７５ｇで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄褐色油状物１０５ｇを得た。
【００５８】
実施例３１−３：エステル化
実施例３１−２で得られた黄褐色油状物のうち１．０ｇをメタノール２０．１ｇに溶解させた。得られた溶液を０℃に冷却し、そこに塩化トリメチルシラン１．０ｇを約１０分かけて滴下した。滴下終了後、得られた反応液を２０〜２５℃に昇温し、同温度で４５時間保温した。得られた反応液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル３２ｇで希釈した。そこに５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液４０ｇを添加して攪拌した後、分液して有機層３７．０ｇと水層５７．３ｇを得た。実施例３０−３と同様に分析したところ、上記有機層および水層に含まれていた２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの収率は５１．１％、上記有機層に含まれていた２−メチル−１，１，３−トリメトキシカルボニルプロパンの鏡像異性体過剰率は７０．６％ｅｅ（Ｓ体）であった。
【配列表】
0005157576000001.app