(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬の発見のための方法であって、
前記方法は、
（Ａ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイ（protein-fragment complementation assay:ＰＣＡ）を実施する工程を含み、
前記相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータを選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータを、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ断片を別々に他の分子へと融合又は結合させる工程とを含み、
前記相補性アッセイの前記蛋白質レポータを構築するレポータ断片に融合又は結合した分子が、（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリ・スクリーニング、（ＩＩ）相互作用マッピング、および、（ＩＩＩ）ペアの蛋白質間の相互作用の存在に関する予備知識、からなる群から選ばれる方法によって同定され、
前記相補性アッセイはさらに、
（ｉｖ）前記断片に融合又は結合された前記他の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程とを含み、
前記方法はさらに、
（Ｂ）前記相補性アッセイの蛋白質レポータの活性に対する化合物の効果を、前記蛋白質レポータによるシグナル出力を測定することで調べる工程と、
（Ｃ）前記調べる工程の結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、
を含み、
前記相補性アッセイはユビキチン断片を用いないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
薬の発見のための蛋白質−断片の相補性アッセイであって、蛋白質レポータ分子の別個の断片の再構築を含み、当該相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータ分子を選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータ分子を、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ分子の断片を別々に他の分子へと融合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合している前記他の分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記蛋白質レポータ分子の前記断片に融合する分子が、受容体、腫瘍抑制遺伝子、キナーゼ、キナーゼ基質、腫瘍遺伝子、アダプタ蛋白質、ユビキチン様分子、および、転写因子からなる群から選ばれ、
前記蛋白質レポータ分子の前記断片の再構築によって光学的に検出可能なシグナルが発生し、
前記断片は、ユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
第１蛋白質レポータ分子の複数の相補性の断片を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物であって、前記相補性の断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現し、各断片が、受容体、腫瘍抑制遺伝子、キナーゼ、キナーゼ基質、腫瘍遺伝子、アダプタ蛋白質、ユビキチン様分子、および、転写因子からなる群から選ばれた、別の分子に融合されており、
前記アッセイ組成物を用いるアッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉｖ）前記断片に融合している前記別の分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記断片は、ユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とするアッセイ組成物。
【請求項４】
薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
（ａ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第１蛋白質レポータ分子の第１蛋白質断片と、
２）前記第１蛋白質断片と融合している第２分子と、
を含む第１の融合産物と、
（ｂ）１）前記第１蛋白質レポータ分子の第２蛋白質断片と、
２）前記第２蛋白質断片に融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第２蛋白質レポータ分子の第１断片と、
２）前記第１蛋白質断片と融合している第４分子と、
を含む第３の融合産物と、
（ｄ）１）前記第２蛋白質レポータ分子の第２蛋白質断片と、
２）前記第２蛋白質断片に融合している第５分子と、
を含む第４の融合産物と、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の融合産物の組み合わせと、
からなる群から選ばれる産物を含み、
前記アッセイ組成物を用いるアッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉｖ）前記断片に融合している前記分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記蛋白質断片は、ユビキチン断片でないことと、前記融合産物（ａ）及び前記融合産物（ｂ）はツーハイブリッド構築物でないこととを前提とする
ことを特徴とするアッセイ組成物。
【請求項５】
薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
蛋白質レポータ断片融合産物をコードしている核酸分子を含み、
前記核酸分子が、
（ａ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第１蛋白質レポータ分子の断片と、
２）前記第１蛋白質レポータ分子の前記断片と融合している第２分子と、
を含む第１蛋白質レポータ融合産物と、
（ｂ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第２蛋白質レポータ分子の断片と、
２）前記第２蛋白質レポータ分子の前記断片と融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の２つの融合産物と、
からなる群から選ばれる蛋白質レポータ断片融合産物をコードしている配列を含み、
前記アッセイ組成物を用いるアッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉｖ）前記断片に融合している前記分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記蛋白質断片は、ユビキチン断片でないことと、前記融合産物（ａ）及び前記融合産物（ｂ）はツーハイブリッド構築物でないこととを前提とする
ことを特徴とするアッセイ組成物。
【請求項６】
薬の発見のための方法であって、
前記方法は、
（Ａ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイ（protein-fragment complementation assay:ＰＣＡ）を実施する工程を含み、
前記相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータを選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータを、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ断片を別々に他の分子へと融合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合された前記他の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程とを含み、
前記方法はさらに、
（Ｂ）前記相補性アッセイの蛋白質レポータの活性に対する化合物の効果を、前記蛋白質レポータによるシグナル出力を測定することで調べる工程と、
（Ｃ）前記調べる工程の結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、
を含み、
前記相補性アッセイの蛋白質レポータを構築するレポータ断片に融合した分子が、受容体、腫瘍抑制遺伝子、キナーゼ、キナーゼ基質、腫瘍遺伝子、アダプタ蛋白質、ユビキチン様分子、および、転写因子からなる群から選ばれ、
前記相補性アッセイはユビキチン断片を用いないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
薬の発見のための方法であって、
前記方法は、
（Ａ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイ（protein-fragment complementation assay:ＰＣＡ）を実施する工程を含み、
前記相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータを選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータを、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ断片を別々に他の分子へと融合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合された前記他の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程とを含み、
前記方法はさらに、
（Ｂ）前記相補性アッセイの蛋白質レポータの活性に対する化合物の効果を、前記蛋白質レポータによるシグナル出力を測定することで調べる工程と、
（Ｃ）前記調べる工程の結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、
を含み、
前記相補性アッセイの蛋白質レポータを構築するレポータ断片に融合した分子が、ｐ５３、Ｃｈｋｌ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｒａｄ  ５１、ＰＤＫ２、ＳＴＡＴ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＡＰ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６蛋白質、４Ｅ−ＢＰ１、ＰＰＰ２Ａ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＮＦカッパＢのｐ６５サブユニット、ＮＦカッパＢのｐ５０サブユニット、ＣＢＰ、ＴＲＡＦ２、ユビキチン、ＩＫＫ−ベータ、ＩＫＫ−ガンマ、ＩカッパＢアルファ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＰＩ−３−キナーゼ、ＰＫＢ、Ｆｔ１、ＧＣＮ４、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３、ＮＦ−ＡＴ、および、カルシニューリン、ならびに、これらのドメイン、断片、もしくは、相同物からなる群から選ばれ、
前記相補性アッセイはユビキチン断片を用いないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
薬の発見のための蛋白質−断片の相補性アッセイであって、蛋白質レポータ分子の別個の断片の再構築を含み、当該相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータを選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータを、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ断片を別々に他の分子へと融合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合された前記他の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記蛋白質レポータ分子の前記断片に融合する分子が、ｐ５３、Ｃｈｋｌ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｒａｄ  ５１、ＰＤＫ２、ＳＴＡＴ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＡＰ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６蛋白質、４Ｅ−ＢＰ１、ＰＰＰ２Ａ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＮＦカッパＢのｐ６５サブユニット、ＮＦカッパＢのｐ５０サブユニット、ＣＢＰ、ＴＲＡＦ２、ユビキチン、ＩＫＫ−ベータ、ＩＫＫ−ガンマ、ＩカッパＢアルファ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＰＩ−３−キナーゼ、ＰＫＢ、Ｆｔ１、ＧＣＮ４、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３、ＮＦ−ＡＴ、および、カルシニューリン、ならびに、これらのドメイン、断片、もしくは、相同物からなる群から選ばれ、
前記蛋白質レポータ分子の前記断片の再構築によって光学的に検出可能なシグナルが発生し、
前記断片はユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
第１蛋白質レポータ分子の複数の相補性の断片を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物であって、前記相補性の断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現し、当該アッセイ組成物を用いるアッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉｖ）前記断片に融合された別の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
各断片が、ｐ５３、Ｃｈｋｌ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｒａｄ  ５１、ＰＤＫ２、ＳＴＡＴ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＡＰ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６蛋白質、４Ｅ−ＢＰ１、ＰＰＰ２Ａ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＮＦカッパＢのｐ６５サブユニット、ＮＦカッパＢのｐ５０サブユニット、ＣＢＰ、ＴＲＡＦ２、ユビキチン、ＩＫＫ−ベータ、ＩＫＫ−ガンマ、ＩカッパＢアルファ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＰＩ−３−キナーゼ、ＰＫＢ、Ｆｔ１、ＧＣＮ４、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３、ＮＦ−ＡＴ、および、カルシニューリン、ならびに、これらのドメイン、断片、もしくは、相同物からなる群から選ばれた、別の分子に融合されており、
前記断片はユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とする
ことを特徴とするアッセイ組成物。
【請求項１０】
薬の発見のための方法であって、
（Ａ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイ（protein-fragment complementation assay:ＰＣＡ）を実施する工程を含み、
前記相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータを選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータを、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ断片を別々に他の分子へと融合又は結合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合又は結合された前記他の分子の相互作用によって、前記レポータ断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記レポータ断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程とを含み、
前記方法はさらに、
（Ｂ）前記相補性アッセイの蛋白質レポータの活性に対する化合物の効果を、前記蛋白質レポータによるシグナル出力を測定することで調べる工程と、
（Ｃ）前記調べる工程の結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、
を含み、
前記相補性アッセイはユビキチン断片を用いないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とし、
前記方法は、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、熱ショック蛋白質阻害剤、Ｅ３リガーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、蛋白質−蛋白質相互作用阻害剤もしくはプロテアソーム阻害剤をスクリーニングするために用いられる
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
薬の発見のための蛋白質−断片の相補性アッセイであって、蛋白質レポータ分子の別個の断片の再構築を含み、当該相補性アッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉ）蛋白質レポータ分子を選択する工程と、
（ｉｉ）前記蛋白質レポータ分子を、レポータ機能の可逆的損失をもたらすように断片化させる工程と、
（ｉｉｉ）前記蛋白質レポータ分子の断片を別々に他の分子へと融合又は結合させる工程と、
（ｉｖ）前記断片に融合又は結合している前記他の分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記蛋白質レポータ分子の前記断片の再構築によって光学的に検出可能なシグナルが発生し、
前記断片はユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とし、
前記相補性アッセイは、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、熱ショック蛋白質阻害剤、Ｅ３リガーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、蛋白質−蛋白質相互作用阻害剤もしくはプロテアソーム阻害剤をスクリーニングするために用いられる
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
薬の発見のためのアッセイ組成物であって、第１蛋白質レポータ分子の複数の相補性の断片を含む、前記相補性の断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現し、各断片が別の分子に融合されており、
前記アッセイ組成物を用いるアッセイは、生細胞系を用いたアッセイであって、
（ｉｖ）前記断片に融合している前記別の分子の相互作用によって、前記断片を再会合させる工程と、
（ｖ）前記断片の再会合によって生じるレポータ分子の光学活性を測定する工程と、を含み、
前記断片は、ユビキチン断片でないことと、前記相補性アッセイはツーハイブリッド・アッセイでないこととを前提とし、
前記相補性アッセイは、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、熱ショック蛋白質阻害剤、Ｅ３リガーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、蛋白質−蛋白質相互作用阻害剤もしくはプロテアソーム阻害剤をスクリーニングするために用いられる
ことを特徴とするアッセイ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関係各位殿:
本書をもって次のことを証する。我々、カナダ国モントリオールの居住者でカナダ国の公民ステファン・Ｗ・ミフニク（Stephen W. Michnick）、カナダ国モントリオールの居住者でカナダ国の公民イングリッド・レミー（Ingrid Remy）、カリフォルニア州リバーモアの居住者でアメリカ合衆国の公民ジェイン・ラマーディン（Jane Lamerdin）、カリフォルニア州マウンテンビューの居住者でアメリカ合衆国の公民ヘレン・ユー（Helen Yu）、カリフォルニア州サンラモンの居住者でアメリカ合衆国の公民ジョン・ウエストウィック（John Westwick）、およびカリフォルニア州プレザントンの居住者でアメリカ合衆国の公民マルニエ・Ｌ・マクドナルド（Marnie L. MacDonald）は、以下を明細書とする「ハイスループットおよびハイコンテント・スクリーニングのための蛋白質断片の相補性アッセイ」においていくつかの新規で有用な改良発明を行った。
【０００２】
本出願は、２００３年２月６日に提出した「ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニングのための蛋白質断片の相補性アッセイ」と題する出願番号第６０／４４５，２２５号の米国仮特許出願の優先権による利益を米国特許法１１９条に基づき主張するものであり、この仮出願については全文引用により本明細書に組み込まれている。また、本出願は、２００２年５月２４日出願の係属中米国特許出願第１０／１５４，７５８号の継続出願であり、２０００年２月７日出願の米国特許出願第０９／４９９，４６４号で既に付与されている米国特許第６，４２８，９５１号の継続出願であり、１９９８年２月２日出願の米国出願第０９／０１７，４１２号で既に付与されている米国特許第６，２７０，９６４号の継続出願である、２００３年１月２９日出願の係属中米国特許出願第１０／１５４，７５８号の一部継続出願でもある。これらの全ての特許および特許出願の内容は、全文引用により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
新薬の発見および開発に対する製薬会社の投資は、この１０年間で飛躍的に増加したが、新薬として承認される割合はこれに見合ったものとなっていない。前臨床および臨床上の失敗が高価なものにつくことが、現行のプロセスの非効率の大部分の原因となっている。現在、薬の発見と共に、生物学的に適切なアッセイを高い処理能力で実施することができる迅速で強力な方法の開発が望まれている。特に、化合物の生物活性および新規な生物学的標的に対する作用メカニズムの推定には、細胞を利用したアッセイが不可欠である。
【０００４】
また、多数の化合物を迅速で安価にスクリーニングすることも必要とされている。この必要性が生じているのは、種々の生物学的標的、例えば、受容体、酵素、シグナル伝達蛋白質などに対する作用について化合物のテストを日常的に行っている製薬業界である。こうした化合物は、化合物の種類が百万種を超えることもある大きなライブラリとして収集されている。化合物という用語は、広義に解釈して使用するよう意図されており、このため、例えば、単純な有機および無機分子、蛋白質、ペプチド、抗体、核酸とオリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、もしくは生物学的に重要な任意の化学物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、化学物質ライブラリという用語も、広義に解釈して使用するよう意図されており、例えば、分子のコレクションが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０００５】
化学物質ライブラリのスクリーニングの多くは、インビトロ（試験管内で）のアッセイ法により行われている。このようなアッセイ法は、ひとたび構築されれば、高感度で再現性があり、費用をかけずに実施できる。シンチレーション近接法、蛍光偏光法と時間分解蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴分光法などの技術により、リガンド−受容体結合、プロテインキナーゼ活性などの種々の生化学的過程のスクリーニングを大規模に行うことが可能になっている。このようなアッセイ法は費用をかけずに実施することができるが、構築するのに６ヶ月以上かかることがある。また、大きな問題となるのは、インビトロ・アッセイ法を構築するには、スクリーニング実施の対象となる標的に対する精製蛋白質など、対象の標的ごとに特異試薬が必要になることである。目的の蛋白質を発現させ、および／または十分な量のその蛋白質を純品として得ることは困難な場合が多い。さらに、インビトロ・アッセイ法は薬理および構造活性相関の研究における最も基準になる方法であるが、インビトロ・アッセイ法では、ヒットした化合物の生物学的な利用能もしくは活性についての情報は得られない。
【０００６】
細胞利用のＨＴＳおよびＨＣＳアッセイ法は、特性が十分に明らかにされていない標的に対して最も迅速なスクリーニング方法となろう。ゲノミクスに基づく方法から得られる薬剤の標的の数が増加したことにより、特性が十分に明らかにされていない標的から直接情報を得るための、その多くが細胞アッセイ系を利用する多数の「遺伝子スクリーニング」法の開発が促進されている。例えば、細胞利用のスクリーニング法は、（リガンドが知られていない）受容体もどき（ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対して頻繁に用いられてきた。こうした推測上の標的は、この標的を生理学的に最も適切な様式で発現させ、制御する方式で極めて容易にスクリーニングすることができる。こうしたものとしては、生化学的経路を調節する標的、このような過程に関与している不明なところの多いパートナによってそれ自体が調節されている標的、または転写制御複合体の構築を必要とする標的が挙げられる。必要な構成成分が全て事前に構築され、調節されている細胞の自然な状態を利用してこのような標的をスクリーニングすることが最良と考えられる。
【０００７】
本発明は、ハイスループットおよびハイコンテント・スクリーニングのための蛋白質−断片の相補性アッセイ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）の構築および用途に関する。薬の発見への特異的で広範な用途、具体的には、（１）特定の生化学的経路の機能を変える化学物質の同定のための化合物および化学物質ライブラリのスクリーニング法、ならびに（２）特定の生化学的経路においてある役割を果たしている遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリのスクリーニング法を提供する。
【０００８】
我々は、これまでに、生化学的経路からインビボ（生体内で）で直接情報を得るためのＰＣＡについて報告している。基本的に、ＰＣＡは、完全な状態の生細胞を用いて蛋白質−蛋白質相互作用を測定する方法である。しかしながら、これには、薬の発見においてこれが重要な手段となるだけの以下のような特定の独特な特徴がある：即ち、（ａ）このＰＣＡ法は、ヒト細胞を含む任意の対象細胞に適用可能な最初で唯一の直接的、定量的な機能的アッセイ法であり、（ｂ）酵母ツーハイブリッド法もしくは転写レポータ法とは異なり、ＰＣＡは、シグナルの解析時または二次もしくは三次実験において（酵母転写装置などの）別の細胞機構を利用しない、（ｃ）遺伝子が細胞の適切な状況において発現され、生じる蛋白質が、適正な翻訳後の修飾など、自然のままの生物学的状態を反映しており、（ｄ）蛋白質および薬剤の作用を適切な細胞内状況で評価することができ、（ｅ）蛍光もしくは発光計測値を用いるＰＣＡにより定量的なハイスループットおよびハイコンテント・アッセイ法を容易に構築することができ、（ｆ）シグナル強度、安定性、分光特性、色彩などの必要な特性を全て有するアッセイ法を作成できるように、ＰＣＡ用断片を合成および／または遺伝子操作により作製することができ、（ｇ）発現ベクターの設計に柔軟性をもたせることにより、ユーザーが、アッセイ上の必要性に応じて、種々の遺伝子配置、リンカーの長さ、レポータの種類、構成的なもしくは誘導性のプロモータ、および種々の選択可能な標識法から選択することができ、最後に、（ｈ）蛍光分光法もしくはサブユニット相補性アプローチと異なり、蛋白質ペアの発現レベルを注意深く調整する必要がない。
【０００９】
細胞利用のレポータおよび計測
細胞スクリーニング法は、細胞可溶化物を分析する準生化学的な方法、もしくは生細胞アッセイ法の２群に大別することができる。本発明では、主として細胞全体を用いるアッセイに焦点を当てている。細胞全体を用いるアッセイ方法は、アッセイの原理によって異なるが、大部分は共通して発光もしくは蛍光の検出様式を採る。発光とは、エネルギーが特異的に分子に誘導されて励起状態を生じる現象である。発光には、蛍光、リン光、化学発光および生物発光が含まれる。
【００１０】
蛍光蛋白質は増加の一途をたどっているが、これらのものとしては、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰおよびそのスペクトル変異体が挙げられ、広く用いられている。枚挙されるものの中には、他の海洋生物、細菌、真菌、藻類、渦鞭毛藻類および一部の陸生種に由来する種々の蛍光蛋白質が含まれる（表Ｉ参照）。これらのレポータは、シグナルの発生に外来性の基質もしくは補因子を何ら必要としないという利点を有するが、内在性蛍光体の励起のために外部の放射線源を必要とする。さらに、広範囲の蛍光レポータ蛋白質をコードする遺伝子が入手しやすくなって、特定の用途、細胞種および検出系のためにカスタマイズされたアッセイ法の構築が可能になっている。
【００１１】
別のクラスの発光蛋白質−ルシフェラーゼ−が細菌および真核生物で見つかっている。ルシフェラーゼは、天然の基質の可視スペクトルの光を発する産物への転換を触媒する蛋白質であり、従って、外部の放射線源を必要としない。いくつかの例を表Ｉに挙げた。単量体型のルシフェラーゼは、ホタル、Ｒｅｎｉｌｌａその他の生物からクローニングされている。ホタル・ルシフェラーゼは、生物発光レポータのうちで最も一般的なものであり、２段階酸化反応を触媒して光を生じる６１ｋＤの単量体酵素である。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、セレンテラジンの酸化を触媒してセレンテラミドおよび４８０ｎｍの青色を生じる３１ｋＤの単量体酵素である。ルシフェラーゼの基質は、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、インビトロゲン・モレキュラー・プローブズ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などの販売元から広く入手することができる。
【００１２】
種々の有用な酵素レポータは、蛍光シグナルを発生し、または蛍光部分で標識することができる小分子を結合して蛍光プローブとしての機能を果たすことができる酵素である。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は、高い親和性でメトトレキサートと結合させることができ、メトトレキサート−蛍光体結合体は、細胞内のＤＨＦＲ量を定量的に測定するための蛍光試薬とすることができる。フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＢＯＤＩＰＹおよび他の市販分子（例えば、モレキュラー・プローブズ社／インビトロゲン社その他の供給元から入手可能なもの）などのいくつかの蛍光分子のうちの任意のものでメトトレキサートを標識することにより、広範な種類の蛍光情報を得ることができる。免疫組織化学および免疫細胞化学のこうした広範囲の技術は、まるごとの細胞（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）に対して適用することができる。例えば、リガンドその他のプローブは、フルオレセインもしくは別の蛍光体で直接標識することにより細胞蛋白質への結合を検出することができ、またはアルカリ・ホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素で標識することによりシグナルを間接的に検出しその位置を確認することができる。
【００１３】
蛍光を発するか、酵素による切断時に蛍光スペクトルをシフトする特定の細胞透過性基質を用いることで蛍光シグナルを生細胞内で発生させるのに、他の多くの酵素を使用することができる。例えば、ベータ・ラクタマーゼの場合、蛍光体が結合するベータ・ラクタム・コア部分が切断されると蛍光放射特性が測定可能な形で変化する基質が存在する。こうした変化としては、蛍光体の吸収もしくは放射波長のシフト、または放射と吸収がマッチした蛍光体ペアの共有結合構築物の切断が挙げられ、この構築物では共有結合により構築されている形ではこれら２つの蛍光体間の共鳴エネルギー移動が維持されているが、これら２つが分離されると、この移動がなくなる。広く用いられているＣＣＦ２／ＡＭなどの膜を通過する蛍光性ＢＬＡ基質により、生物活性化学物質のライブラリからの化合物の非存在下もしくは存在下で哺乳動物生細胞内の遺伝子発現を測定することが可能になる。
【００１４】
発光、蛍光もしくは生物発光シグナルは、蛍光マルチウェルプレート・リーダ、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）、およびシグナルの空間分解能を有する細胞利用の自動イメージングシステムを含む種々の自動および／または高性能計測システムのうちの任意のシステムを用いて容易に検出および定量することができる。セロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＴＴＰ社、Ｑ３ＤＭ社、エボテック社（Ｅｖｏｔｅｃ）、ユニバーサル・イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）およびツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）により開発された自動蛍光イメージングおよび自動顕微鏡システムなど、ＨＣＳを自動化するための種々の計測システムが開発されている。また、生細胞内の蛋白質の移動を検討するのに、光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡法（ｔｉｍｅ  ｌａｐｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が用いられている。光学的計測法およびハードウェアはあらゆる生物発光シグナルを高感度、高性能で検出することができるまで進歩したが、既存のアッセイ法の選択には、その適用範囲、方式、生物学的妥当性に関して、または使い勝手の良さに関して制約がある。
【００１５】
転写レポータ・アッセイ
シグナル伝達および遺伝子発現を伴う細胞事象のモニタリングを可能にする転写レポータ・アッセイを構築するのに、細胞利用のレポータがよく用いられている。レポータ遺伝子アッセイでは、標的の生物活性を検出が容易な酵素もしくは蛋白質レポータの発現と結びつける。種々のレポータ遺伝子に転写制御エレメントを融合させることによって、こうした系から細胞内の遺伝子発現に対する一連のシグナル伝達事象の影響が「報知（ｒｅｐｏｒｔ）」される。特定の反応エレメントの合成繰返し体をこのレポータ遺伝子の上流に挿入することにより、生細胞内の特定の経路を賦活化することで生成されるシグナル伝達分子に反応したその発現を調節することができる。転写レポータ遺伝子およびその応用の多様性は極めて広く、例えば、ベ−タ・ガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスファターゼ（発光アッセイ）、ＧＦＰ、エクオリンおよび種々の比較的新しい生物発光もしくは蛍光レポータを用いた薬剤スクリーニング系が挙げられる。
【００１６】
一般に、転写レポータ・アッセイでは、１つまたは１つ以上の生化学的経路の天然もしくは合成化学物質に対する経路の反応に関する情報を得ることができるが、経路の賦活化もしくは阻害の結果を測定することで経路に対する物質の作用が間接的に判定されるに過ぎず、この化合物の作用部位が判定されるものではない。このため、細胞の生化学的経路の機能エレメントを含む蛋白質−蛋白質相互作用を直接定量し、こうした経路を利用した薬の発見向けのアッセイ法を構築するための哺乳動物細胞を用いる方法が求められている。
【００１７】
蛍光体もしくは発光団で標識した個々の蛋白質の細胞アッセイ
シグナル伝達蛋白質の細胞内区画化は、生化学的経路の賦活化のされ方を規定する点のみならず、経路の賦活化による所望の生理学的な結果に影響を及ぼす点でも、重要な現象である。薬の発見に関しては、異なる分子特性を有するそれ自体蛍光性の種々の蛋白質がクローニングされ入手可能となった結果、上記の面で大きな進展が見られている。ハイコンテント（ハイコンテキストとも呼ばれる）スクリーニング（ＨＣＳ）は、細胞の画像に基づく解析を利用して、細胞過程の刺激もしくは阻害剤への反応による蛋白質の細胞内配置および再分布を検出する生細胞使用のアッセイ法である。ＨＣＳでは蛍光プローブを使用することができ、例えば、受容体の細胞内移行は、トランスフェリン受容体に結合する蛍光標識リガンドを用いて測定することができる。多くの場合、個々の蛋白質は、−対象とする蛋白質をＧＦＰなどの検出可能部分と融合させた−融合蛋白質として発現させるか、固定後、Ｃｙ３もしくは別の適切な色素に結合させた抗体を用いるなどして免疫組織化学法により検出する。このような方法で、蛋白質の細胞内配置を実時間でイメージングし、追跡することができる。最大の開発領域の１つは、ＧＦＰの色を変えた変異体その他の比較的最近単離された新規な蛍光蛋白質の用途にあり、これらの蛋白質を用いると、マルチカラー・アッセイなどのさらに一層進歩した生細胞利用アッセイ法の構築が可能になる。生細胞内のＧＦＰ融合蛋白質の再分布を追跡することにより主要な細胞内シグナル伝達経路を分析する一連のＧＦＰアッセイ法が開発されている。ＨＣＳによる薬物スクリーニングの目標は、主要なシグナル伝達蛋白質のその細胞内作用部位への移動を阻害することにより病的経路を遮断する治療化合物を同定することにある。
【００１８】
蛍光体もしくは発色団で蛋白質を標識すると、細胞刺激もしくは阻害剤に反応したその特定の蛋白質の追跡が可能になる。例えば、ＴＮＦによる細胞シグナル伝達の賦活化は、ＮＦｋＢ転写複合体のｐ６５サブユニットをＧＦＰ融合体として発現させ、次いで、生細胞のＴＮＦによる刺激後数分以内に細胞質区画から細胞の核区画への蛍光の再分布を追跡することにより、検出することができる（ＪＡシュミットほか（JA Schmid et al.）、２０００年、「緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質によるＮＦｋＢおよびＩｋＢａの動態の検討（Dynamics of NFkB and IkBa studied with green fluorescent protein (GFP) fusion proteins）」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２７５：ｐ１７０３５−１７０４２）。こうした方法に関して特有であったことは、生細胞内の個々の蛋白質移動の動態のモニタリングを可能にすることにより、シグナル伝達の空間的側面と時間的側面を共に扱うことができたことである。
【００１９】
蛋白質-蛋白質相互作用の測定
単一蛋白質のモニタリングとは対照的に、蛋白質−蛋白質相互作用アッセイは、２種の蛋白質間の複合体の存在および量を評価することができる。
【００２０】
古典的な酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系は、このようなアッセイの広く用いられてきた例であり、哺乳動物のツーハイブリッド系に合うように改良されてきた。特に、このアッセイ法は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングしてある既知の蛋白質と相互作用する蛋白質を同定する際に用いられてきた。既知の「おとり（ｂａｉｔ）」蛋白質と相互作用することが明らかにされることによって、ｃＤＮＡ産物は、この既知の蛋白質が関与する生化学的経路に関与している可能性があると推論することができる。Ｙ２Ｈによるおとり対ライブラリ・スクリーニングは高い処理能力で実施することができるが、Ｙ２Ｈのいくつかの特質によって機能蛋白質の標的としてのバリデーションおよび化学物質ライブラリのスクリーニングのための有用性が制約されている。第一に、Ｙ２Ｈでは酵母細胞などの細胞の核内での対象蛋白質の発現を必要とする場合が多く、このことは多くのヒト蛋白質には不自然な状況であり、受容体などのヒト膜蛋白質にはこれを用いることはできない。第二に、酵母は、薬の発見に重要なヒトの生化学的経路を有せず、このことが、薬物の標的となる可能性のある新規な蛋白質の、経路を利用した発見およびバリデーションを妨げている。第三に、蛋白質−蛋白質相互作用を直接阻害する化学物質は別として、哺乳動物の生化学的経路を阻害する薬理学的に活性な分子を同定するのにＹ２Ｈは役立たない。
【００２１】
原理的には、細胞利用の蛋白質−蛋白質相互作用アッセイは、蛋白質の動的な結合および解離をモニターすることの他に、生細胞の生化学的経路の活性をモニターすると共に、こうした経路に対する化学物質の作用を直接調べるのに用いることができる。転写レポータ・アッセイ法とは異なり、蛋白質−蛋白質相互作用のモニタリングにより得られる情報は、特に、細胞のシグナル伝達経路の終点ではなく、その特定の分枝もしくは分岐点で発生するものである。
【００２２】
最も広く普及している蛍光、細胞利用の蛋白質−蛋白質相互作用アッセイ法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）もしくは生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）の現象を利用したものである。ＦＲＥＴアッセイでは、ＦＲＥＴを行うことができる２種の蛍光レポータの遺伝子を対象をコードする遺伝子に別々に融合させ、これらの融合蛋白質を生細胞内で共発現させる。対象蛋白質間に蛋白質複合体が形成される時、これらの２つの蛋白質の発光および励起が重なり合い、蛍光体が近接して組み込まれている場合には、第１の「ドナー」蛍光体から光子が放出されると、第２の「アクセプター」蛍光体によりその放出された光子が効率的に吸収される。このＦＲＥＴのペアは、生細胞内でいずれかの蛍光体単独のものとは識別できる励起および発光波長の特有の組み合わせにより蛍光を発する。ＦＲＥＴアッセイに用いられてきた具体例としては、シアンブルー、レモン色、強化緑色および強化青色蛍光蛋白質などの各種ＧＦＰ変異体が挙げられる。ＢＲＥＴの場合には、発光蛋白質、例えば、酵素Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）がドナーとして用いられ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）がアクセプター分子として用いられる。ＲＬｕｃの基質となる化合物を加えた状態で、ＲＬｕｃが発する青色光の量をＧＦＰが発する緑色光の量と比較することによりＦＲＥＴシグナルが測定される。これら２つの蛋白質が近くに組み込まれているほど、青色に対する緑色の割合は増加する。ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴの定量は技術的に困難なことがあり、蛋白質−蛋白質相互作用のイメージングへの使用は、ＦＲＥＴシグナルが極弱いため、極めて限定される。多くの場合、ＦＲＥＴは、アクセプターの蛍光体がドナーの励起によって間接的に励起されるに過ぎないので、余り明るいシグナルを生じない。ＦＲＥＴではドナーの発光とアクセプターの励起との重なりを必要とするので、ドナーおよびアクセプターの蛍光波長は、ＦＲＥＴが機能するにはかなり接近していなければならない。ブリードスルー（ｂｌｅｅｄｔｈｒｏｕｇｈ）および自己蛍光からのＦＲＥＴの解析を可能にするさらに新しい方法が開発中である。さらに、蛍光寿命画像顕微鏡法（ＦＬＩＭ）では、単一のＦＲＥＴ強度の定量に伴うアーチファクト不随物の多くが除かれる。しかしながら、後述のように、現在のところ、ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴはｃＤＮＡライブラリもしくは化学物質ライブラリのハイスループット・スクリーニングに容易には適用できない。
【００２３】
これまでに、野性型ベータ・ガラクトシダーゼの活性、またはアルファもしくはオメガ相補性の現象を利用して、種々のアッセイ法が構築されている。ｂｅｔａ−ｇａｌは最大百万ダルトンまでの４量体および８量体複合体を形成する多量体酵素である。ｂｅｔａ−ｇａｌサブユニットは自己オリゴマー形成を行って活性を生じる。この自然に起こる現象を利用して、３０件を超える特許の対象となっている各種のインビトロ均一系アッセイ法が開発されている。ｂｅｔａ−ｇａｌのアルファもしくはオメガ相補性は１９６５年に最初に報告されたが、その後これを利用して、抗体−抗原、薬物−蛋白質、蛋白質−蛋白質その他の生体分子相互作用を検出するためのアッセイ法が開発されている。しかしながら、上記現象が自然に起こる結果、かなりのバックグラウンド活性が生じるため、生細胞アッセイに対するｂｅｔａ−ｇａｌ相補性の適合性は限定されている。このバックグラウンド活性の問題は、自然に相補性を示す能力が低減もしくは皆無に近い低親和性変異体サブユニットの開発によって部分的に解決されており、このため、例えば、生細胞におけるＥＧＦ受容体のリガンド依存性活性化の検出を含む種々のアッセイが可能になっている。ところが、ｂｅｔａ−ｇａｌ反応の生成物は細胞全体に拡散するので、ｂｅｔａ−ｇａｌはハイコンテント・アッセイには適していない。
【００２４】
蛋白質−断片相補性を利用した蛋白質−蛋白質相互作用アッセイ（ＰＣＡ）
ＰＣＡは、細胞内蛋白質−蛋白質複合体の結合、解離もしくは局在化を測定するための、ＦＥＲＴおよびＢＲＥＴに代わる方法となる。ＰＣＡにより生細胞内の蛋白質−蛋白質複合体の量および細胞内局在を測定し、定量化することが可能になる。ＰＣＡの場合、蛋白質は、遺伝子操作により作製するポリペプチド断片との融合体として発現されるが、このポリペプチド断片自体は（ａ）蛍光性もしくは発光性部分ではなく、（ｂ）天然に存在するものではなく、（ｃ）レポータの断片化により作製されるものである。
【００２５】
ミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）は、ＰＣＡに上記のレポータのうちの任意のものを含む任意の対象レポータ蛋白質を用いることができることを開示している。即ち、ＰＣＡに適したレポータとしては、いくつかの酵素および蛍光、発光もしくはリン光を発する蛋白質のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＡ用には、単量体酵素、単量体蛍光蛋白質など、小（約１５０個のアミノ酸）断片が得られる小単量体蛋白質が好ましい。ミフニクほか（Michnick et al.）により確立された原理によると、任意のレポータ蛋白質を断片化することができるので、細胞種、標的、シグナル伝達プロセスおよび選択した計測器の特定の要件に合わせてアッセイ法をカスタマイズすることができる。最終的に、広範囲のレポータ断片の中から選択することができることにより、蛍光、発光、リン光またはその他の方法で検出可能なシグナルの構築およびハイコンテントもしくはハイスループット・アッセイ方式の選択が可能になる。
【００２６】
これまでに本発明で明らかにしてきたように、ＰＣＡ用に遺伝子操作で作製した断片は単独では蛍光性でも発光性でもない。このＰＣＡの特徴によって、例えば、蛋白質をＧＦＰその他の発光団で標識する米国特許第６，５１８，０２１号（タストラップほか（Thastrup et al.））など、蛍光分子もしくは発光団で蛋白質を標識する他の発明からＰＣＡは区別される。ＰＣＡの断片は発光団ではないので、これによって個々の蛋白質の再分布をモニターすることはできない。その一方、ＰＣＡで測定できるのは、２つの蛋白質の複合体の形成である。
【００２７】
最終的には、ＰＣＡは、米国特許第５，９８９，８３５号に開示されているような既存のハイコンテント計測器およびソフトウェアを含む、薬の発見のための種々の既存の自動化システムと併せて用いることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
［本発明の目的および利点］
本発明の目的は、生細胞の自然な状態を用いた大規模な薬の発見のための方法を提供することにある。
【００２９】
より詳細には、本発明の目的は、対象とする任意の生化学的経路もしくは遺伝子に対する細胞利用のアッセイ法を迅速に構築することにより、ヒトの各種症状の治療剤となる可能性のある化合物の同定を迅速化することにある。
【００３０】
本発明の別の目的は、新規な生化学的経路の同定、およびその経路に対するハイスループットスクリーニング・アッセイ法の迅速な構築を可能にすることにある。
【００３１】
本発明の別の目的は、ハイスループットもしくはハイコンテント・アッセイ法であって、このアッセイの実施のために特化された計測法を必要とせず、既存の種々の計測原理に広く適用できるアッセイ法を提供することにある。
【００３２】
さらに、本発明の別の目的は、生細胞内で検出することができるシグナルを発生する各種の有用なレポータを利用して上記のアッセイ法を構築する方法を提供することにある。
【００３３】
従って、本発明の目的は、任意のレポータ蛋白質を断片化して用いることにより、生細胞内でシグナルを発生させることができ、また、ハイスループットおよびハイコンテント・アッセイ法に適した数多くのレポータが得られることを立証することにある。
【００３４】
本発明の別の目的は、従来の方法ではスクリーニングするのが困難と考えられる各種標的に対する、薬の発見を迅速化するためのハイスループット・アッセイ法およびハイコンテント・アッセイ法の構築を可能にすることにある。
【００３５】
本発明の別の目的は、治療に関連する生化学的経路のアゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤の効果を検出するのに本発明を利用することができることを立証することにある。
【００３６】
本発明の別の目的は、ハイスループット・スクリーニングおよびハイコンテント・スクリーニングに有用なベクター構造およびエレメントを提供することにある。
【００３７】
本発明のさらに別の目的は、薬の発見に有用な特定の経路、標的クラスおよび標的蛋白質を利用するアッセイ法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明には、対象とする任意の経路、遺伝子、遺伝子ライブラリ、標的クラス、レポータ蛋白質、検出方法、化学物質ライブラリ、自動化方式、自動化計測、ベクター設計および細胞種に広く適用できるという利点がある。
【００３９】
本発明は、薬の発見に必要な上記のものを提供しようとするものである。本発明は、蛋白質−断片の相補性アッセイを利用して薬の発見を行うための一般的な方法を提供する。本発明は、生細胞内の特定の生化学的もしくは病的経路を阻害もしくは賦活化することができる天然物、有機分子、リガンド、抗体その他の薬理学的に活性な物質を同定するために、このアッセイ法を化合物および化学物質ライブラリのスクリーニングにどのように利用することができるかについて開示する。
【００４０】
化学物質ライブラリをスクリーニングして治療的に有用となる可能性のある化合物を同定するためのハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）およびハイコンテント／ハイコンテキスト・スクリーニング（ＨＣＳ）に関する方法および組成物を提供する。この両タイプのアッセイ法は、蛍光、生物発光、化学発光もしくはリン光などの、生細胞、固定細胞もしくは可溶化細胞アッセイで光学的に検出可能な情報を利用する。両タイプのアッセイ法とも、最新の計測法、データ入力、ソフトウェアおよび自動化に十分に適合する。
【００４１】
ハイスループット・スクリーニングの場合、例えば、蛍光マイクロタイタープレート・リーダーを用いる蛍光分光法、ＦＡＣＳアナライザー、照度計、もしくは同様の装置により、大量の蛍光もしくは発光シグナルを検出する。ハイコンテント・スクリーニングの場合、個々の細胞をイメージングし、ＰＣＡシグナルおよびその細胞内局在を検出する。本発明で提供する方法およびアッセイは、マルチウェルフォーマット、マイクロタイタープレート、マイクロスポット方式もしくはアレイを用いて行うことができるので、アッセイの方式設定およびコンパクト化に柔軟性を持たせることができる。
【００４２】
ＨＴＳもしくはＨＣＳ方式のいずれを選択するかは、前記プロセスの生物学的特質およびスクリーニングすべき蛋白質の機能によって決まる。いずれにせよ、これらのアッセイ法は特別な計測器の使用を必要としないことに注目されたい。本発明の対象であるＨＴＳおよびＨＣＳアッセイの結果が、選択されたレポータが生じるシグナルの検出に適した任意の計測器を用いて読み取ることができることは、当業者には理解されよう。そのような計測器システムの多くは市販されている。
【００４３】
また、本出願では、スクリーニングすべき経路内で相互作用する蛋白質ペアを選択する方法を開示する。本発明では、相互作用する蛋白質ペアを同定する方法が提供されており、このような方法としては、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング、遺伝子毎の相互作用マッピング、および経路もしくは蛋白質−蛋白質相互作用に関する予備知識の活用が挙げられる。これらの方法のそれぞれの例については、本発明により薬の発見に利用するのに適した特定の経路、標的クラスおよび個々の蛋白質の場合と同様に、本明細書に示されている。
【００４４】
また、本出願では、ＰＣＡに用いる特定のレポータを選択する根拠を説明する。ＰＣＡと併用するＨＴＳおよびＨＣＳに適したレポータについては表Ｉに示したが、その特徴、および種々の断片化方法については、既にミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）により説明されている。６種のこのようなレポータを用いたＰＣＡの例を本明細書に示したが、そのような例として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）とその２種の変異体（ＹＦＰおよびＩＦＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ベータ・ラクタマーゼ、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）が挙げられる。本発明が提示した特定のＰＣＡ、および本明細書に示した実施例においてこれが用いられた状況に限定されないことは、当業者には理解されよう。本発明は、検出可能なシグナルを生じる任意のレポータを利用することにより、薬の発見に特に必要とされている蛋白質−断片の相補性アッセイ法を構築することができることを開示する。
【００４５】
【表１−１】
0005122129.tif 000002
【００４６】
【表１−２】
0005122129.tif 000003
【００４７】
【表１−３】
0005122129.tif 000004
【００４８】
【表１−４】
0005122129.tif 000005
【００４９】
また、本発明は、薬の発見のための方法であって、（Ａ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、（Ｂ）前記アッセイの活性に対する化合物の効果を調べる工程と、（Ｃ）前記アッセイの結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、を含む方法に関する。
【００５０】
また、本発明は、化合物をスクリーニングする方法であって、（Ａ）細胞経路の１つまたは１つ以上の段階に対する蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、（Ｂ）前記アッセイの活性に対する上記化合物の効果を調べる工程と、（Ｃ）スクリーニングの結果を用いて、対象細胞経路を賦活するもしくは阻害する化合物を同定する工程と、を含む方法に関する。
【００５１】
さらに、本発明は、化合物をスクリーニングする方法であって、（Ａ）化学物質のライブラリを選択する工程と、（Ｂ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、（Ｃ）前記ライブラリから前記アッセイに対する化合物の効果を調べる工程と、（Ｄ）スクリーニングの結果を用いて、上記アッセイで発生するシグナルを増強もしくは低減させる特定の化合物を同定する工程と、を含む方法に関する。
【００５２】
さらに、本発明は、化合物をスクリーニングする方法であって、（Ａ）化学物質のライブラリを選択する工程と、（Ｂ）１つまたは１つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、（Ｃ）前記ライブラリから前記アッセイに対する化合物の効果を調べる工程と、（Ｄ）スクリーニングの結果を用いて、前記アッセイで発生するシグナルの細胞内部位（subcellular location）を変える特定の化合物を同定する工程と、を含む方法を提供する。
【００５３】
また、本発明は、アッセイを構築する方法であって、（ａ）相互作用する蛋白質の各遺伝子を選択する工程と、（ｂ）適切なレポータ分子を選択する工程と、（ｃ）前記レポータ分子を断片化することにより、前記断片化がレポータ機能を可逆的に欠損させる工程と、（ｄ）前記レポータ分子の各断片を他の分子にそれぞれ融合もしくは結合させる工程と、（ｅ）前記断片に融合もしくは結合している分子同士の相互作用によって前記レポータ断片を再結合させる工程と、（ｆ）自動計測により前記レポータ分子の活性を測定する工程と、を含む方法に関する。
【００５４】
さらに、本発明は、レポータ分子の個々の断片を再構築することを含み、これらのレポータ断片の再構築により光学的に検出可能なシグナルが生じる、薬の発見のための蛋白質断片の相補性アッセイを提供する。さらに、本発明は、前記アッセイのシグナルが自動計測により検出される、薬の発見のための蛋白質断片の相補性アッセイを提供する。
【００５５】
また、本発明は、第１レポータ分子の相補性の断片を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物であって、前記相補性の断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現し、各断片が別の分子に融合されているアッセイ組成物を提供する。
【００５６】
また、本発明は、
（ａ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第１レポータ分子の第１断片と、
２）前記第１断片と融合している第２分子と、
を含む第１の融合産物と、
（ｂ）１）前記第１レポータ分子の第２断片と、
２）前記第２断片に融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の２つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含む薬の発見のためのアッセイ組成物に関する。
【００５７】
さらに、本発明は、
（ａ）１）断片同士が結合により検出可能な活性を発現する第１レポータ分子の第１断片と、
２）前記第１断片と融合している第２分子と、
を含む第１の融合産物と、
（ｂ）１）前記第１レポータ分子の第２断片と、
２）前記第２断片に融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の２つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含む薬の発見のためのアッセイ組成物に関する。
【００５８】
また、本発明は、レポータ断片融合産物をコードしている核酸分子を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
前記核酸分子が、
（ａ）１）断片同士が結合により検出可能な活性を発現する第１レポータ分子の断片と、
２）前記第１レポータ分子の断片と融合している第２分子と、
を含む第１レポータ融合産物と、
（ｂ）１）前記第１レポータ分子の第２断片と、
２）第２もしくは第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との２つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含むアッセイ組成物を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、
（ａ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第１レポータ分子の第１断片と、
２）前記第１断片と融合している第２分子と、
を含む第１の融合産物と、
（ｂ）１）前記第１レポータ分子の第２断片と、
２）前記第２断片に融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第２レポータ分子の第１断片と、
２）この第１断片と融合している第４分子と、
を含む第３の融合産物と、
（ｄ）１）前記第２レポータ分子の第２断片と、
２）前記第２断片に融合している第５分子と、
を含む第４の融合産物と、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の融合産物のの組み合わせと、
からなる群から選ばれる産物を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物を提供する。
【００６０】
別の実施態様として、本発明は、レポータ断片融合産物をコードしている核酸分子を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
前記核酸分子が、
（ａ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第１レポータ分子の断片と、
２）前記第１分子の断片と融合している第２分子と、
を含む第１レポータ融合産物と、
（ｂ）１）断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第２レポータ分子の断片と、
２）前記第２分子の前記断片と融合している第３分子と、
を含む第２の融合産物と、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との２つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含むアッセイ組成物を提供する。
【００６１】
最後に、本発明は、レポータ断片に動作可能に結合した、少なくとも１つの対象分子を含む発現ベクターを有する、薬の発見のためのアッセイ組成物、および（ａ）誘導性プロモータと、（ｂ）レポータ断片に動作可能に結合した対象遺伝子とを含む発現ベクターを有する、薬の発見のためのアッセイ組成物を提供する。
【００６２】
本発明は、ハイスループットおよびハイコンテント・スクリーニングに適した広範囲な組成物、レポータ、方式およびアッセイ特性を提供するので、薬の発見を広く可能にしている。これらのアッセイは、構築および実施が容易であり、コスト効率が良く、生物学的にも妥当なものである。こうしたアッセイでは、対象蛋白質を対象細胞内で発現させるだけでアッセイ結果が得られるので、個々の蛋白質を精製する必要がない。本明細書に記載した様々なアッセイ法は、適切な発現ベクターのアクセプター部位に対象遺伝子をサブクローニングするだけで構築することができる。一過性（ｔｒａｎｃｉｅｎｔ）アッセイはトランスフェクション時からわずか２４乃至２８時間内に構築することができ、ベクターカセット内に選択マーカを含ませることによって継代可能な（ｒｅｎｅｗａｂｌｅ）安定した細胞株を作製することができる。要するに、本明細書に記載した方法、アッセイおよび組成物により、生細胞の自然な状態を用いてこれまでにない規模で薬の発見を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイの構築
ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイを構築するプロセスの概略を図１に示した。ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイに用いるべき遺伝子は、相互作用する既知もしくは新規蛋白質のいずれをコードしていてもよい。これらの相互作用する蛋白質は、おとり（ｂａｉｔ）対ライブラリスクリーニング；（遺伝子毎の）２つ１組の相互作用のマッピング；および／または経路もしくは相互作用性蛋白質ペアの予備知識の活用を含む１つまたは１つ以上の方法により選択することができる。この略図の番号３および４の蛋白質は、受容体媒介性細胞シグナル伝達経路に関与することが分かっており（もしくはこれを示すことができ）、この経路をブロックする化合物を同定するＨＴＳもしくはＨＣＳスクリーニングを構築するために選択することができる。全ての蛋白質−蛋白質複合体が経路のアゴニスト、アンタゴニスト、賦活剤もしくは阻害剤に反応する訳ではないことに留意されたい。ＰＣＡを用いることにより経路の活性を選び出して報知することができる「標識(sentinel)」としての機能を果たす蛋白質−蛋白質ペアを同定することができるのは本発明の利点である。いずれにせよ、一旦対象遺伝子が同定されれば、以下のスキームに従って、アッセイを構築することができる：即ち、レポータ断片ペアＦ１／Ｆ２を作製する（一部のレポータについては表Ｉに列挙してある）。例えば、図１に（３，４）として示した蛋白質−蛋白質ペアをコードする２種の対象遺伝子を用いて、一方が可変リンカーおよびＦ１レポータ断片にインフレームで融合させた遺伝子「３」を含み、他方が可変リンカーおよびＦ２レポータ断片にインフレームで融合させた遺伝子「４」を含むことにより対象遺伝子、リンカーおよびレポータ断片がインフレームとなり、プロモータに動作可能なように結合するようにした２種の発現構成体を作製する。（多シストロン性ベクターを用いることもできる。選択可能なベクターの詳細については実施例１２に記載されている）。図１の遺伝子は５’末端で融合されているので、コードされている対象蛋白質はこの融合体のＮ−末端にあることになるが、他の組み合わせ、ならびにベクターの構築およびベクターのエレメントの詳細については図１６に示した。細胞を相補性Ｆ１、Ｆ２遺伝子構成体でコトランスフェクションすることにより蛋白質を発現させる。一過性アッセイを実施することができ、また、安定な細胞株は、この株を得るのに選択マーカもしくは生存選択ＰＣＡを用いることにより、「内部にＰＣＡ」を有するものとして構築することができる。得られる細胞もしくは安定細胞株は、対象化学物質ライブラリと併せてＨＴＳもしくはＨＣＳのために用いる。
【００６４】
本発明の以上の態様を例示するために、（Ｃｈｋｌ／ｐ５３およびｐ５３／ｐ５３を標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）とする）ＤＮＡ損傷応答経路、（ＦＫＢＰ／ＴＯＲを標識とする）ラパマイシン依存性経路および（ｐ６５／ｐ５０、ＩｋＢ／ｐ６５およびＩｋＢａ／ユビキチンを標識とする）ＴＮＦ／ＮＦｋＢシグナル伝達経路を含むいくつかの異なる細胞経路についての例を提供する。また、おとり（ｂａｉｔ）対ライブラリ・スクリーニングおよび／または遺伝子毎の（ｇｅｎｅ−ｂｙ−ｇｅｎｅ）相互作用マッピングによって相互作用する蛋白質を同定する−およびこれらが構成的な相互作用を行うのか誘導性の相互作用を行うのかを明らかにする−方法ならびに例についても示す。さらに、蛍光もしくは発光計測値の得られる様々な異なるＰＣＡを用いて定量的なハイコンテントおよび／またはハイスループット・アッセイを行うための方法および成分について示すと共に、ＧＦＰ  ＰＣＡとその２つの変法（ＹＦＰ  ＰＣＡおよびＩＦＰ  ＰＣＡ）、ベータ・ラクタマーゼＰＣＡ（ＢＬＡ  ＰＣＡ）、ルシフェラーゼＰＣＡ（ＲＬｕｃ  ＰＣＡ）、ならびにジヒドロ葉酸還元酵素ＰＣＡ（ＤＨＦＲ  ＰＣＡ）の具体的な例を提供する。さらに、経路のどの段階に対してもハイコンテントおよび／またはハイスループット・アッセイおよびスクリーニングを構築することができることを明らかにすると共に、小分子および薬物ライブラリをスクリーニングして細胞プロセスを賦活もしくは阻害する化合物を同定する際のこのようなアッセイの利用例を示す。また、最後に、単色アッセイ、多色アッセイ、ＰＣＡ用発現ベクターおよびエレメントの種々の選択、ならびに断片組成物の例についても示す。
【００６５】
ＰＣＡに適切なレポータの選択
多種多様なレポータの中から選択することができることにより本発明が大規模な薬の発見に特に有用となることは当業者には明瞭に理解されよう。ＰＣＡの原理によれば、単一（単量体）蛋白質として天然に存在するレポータを含む任意のレポータを断片化することができることにより、このことが可能になる。従って、一連の蛋白質発現レベル、細胞種および検出方法に適していると考えられる特定の波長および強度の光を発するレポータを選択することができる。薬の発見のための対象となる生物学的プロセスおよび生化学的標的が広範囲にわたるので、柔軟性は本発明の重要な特徴である。一部の蛋白質では、経路を−例えば、受容体アゴニストもしくは薬物によって−賦活化すると、蛋白質−蛋白質複合体の形成が、この複合体の細胞内局在の変化を伴うことなく、増大もしくは低減する。蛋白質により形成された蛋白質−蛋白質複合体の数が増加もしくは減少すると、ＰＣＡが生じるシグナルがそれぞれ増強もしくは低減する。この場合、対象複合体の量を示す大量の蛍光シグナルを測定するのにハイスループット・アッセイ方式を用いることができる。本明細書には、経路標識としてＣｈｋｌ／ｐ５３、ｐ５３／ｐ５３、ＰＫＢ／ｈＦｔｌ、ＰＤＫｌ／ｈＦｔ１、ＦＫＢＰ／ＴＯＲ（ＦＲＡＰ）、ＩｋＢａ／ｐ６５およびＩｋＢａ／ユビキチンを選択した３種の経路の例を示した。ＮＦｋＢ（ｐ５０／ｐ６５）などの他の蛋白質の場合、経路を賦活化すると、ある細胞内区画の別の区画に対する（膜対細胞質、細胞基質対核などの）蛋白質−蛋白質複合体の量比に変化が生じる。後者の場合、細胞内の蛋白質−蛋白質複合体の部位に再構築されたレポータが生じる蛍光シグナルの存在部位を特定するのにハイスループット・アッセイ方式を用いることができる。
【００６６】
本発明のいくつかの実施態様として、単量体酵素を用いてＰＣＡを構築する。ＤＨＦＲを用いることにより、再構築ＤＨＦＲに対するメソトレキサート（ＭＴＸ）の高親和性結合を利用した蛍光アッセイを構築した。メソトレキサートに蛍光体を結合させ、余剰の未結合ＭＴＸを細胞から洗い流すと、蛋白質−蛋白質複合体の量および細胞内部位（subcellular location）を明らかにすることができる。ＭＴＸに結合させる蛍光体を変えることによって種々のスペクトル特性を得ることができる。本発明では、このＤＨＦＲ  ＰＣＡを用いてＮＦｋＢの転位に対するハイコンテント・アッセイを構築することにより、ＴＮＦ経路をブロックする物質を同定した。
【００６７】
本発明の別の例として、ハイスループット・アッセイを構築するのにベータ・ラクタマーゼ（ＢＬＡ）をレポータとして用いる。このＢＬＡ  ＰＣＡについてはこれまでにも報告されているが、本発明では、これを新規なセファロスポリン系基質と併せて用いることにより、ｐ５３およびその上流エレメントに作用するＤＮＡ損傷応答経路の阻害剤の蛍光ハイスループット・アッセイを構築した。
【００６８】
本発明の別の実施態様として、ハイスループット・アッセイを構築するのにルシフェラーゼをレポータとして用いる。ＰＣＡへのルシフェラーゼの使用についてはミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）によって最初に報告された。本発明では、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）ＰＣＡを選択してＤＮＡ損傷応答経路の阻害剤のハイスループット・アッセイを構築することにより、高性能計測器で数分以内に記録することができる強いシグナルを伴うアッセイ法が得られた。また、安定性を改善するために変異体ＲＬｕｃ断片についても提供する。
【００６９】
本発明の別の実施態様として、ＧＦＰなどのそれ自体蛍光性の蛋白質を用いてＰＣＡを構築する。ＧＦＰ  ＰＣＡについてはミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）によって最初に報告された。ＧＦＰもしくはその変異体を用いるＰＣＡは、そのシグナルが断片相補性部位にあるため、特にＨＣＳに適している。ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰおよび他の変異体などの蛍光蛋白質ならびに表１に挙げた比較的新しいレポータは、シグナル発生に補因子もしくは基質の追加を必要としないので、本発明に特に有用である。これらの蛋白質を用いるＰＣＡは、シグナルが蛋白質−蛋白質複合体の部位にあるので、ハイコンテント・アッセイに特に有用である。ＧＦＰおよびその２種の変異体（ＹＦＰおよび「ＩＦＰ」）を用いたＰＣＡの例を示した。これらのアッセイの結果は自動蛍光顕微鏡、自動共焦点イメージングシステムなどによるハイコンテント計測器によって読み取ることができ、または、特定のアッセイのペアが蛍光強度の全体としての増強もしくは低減を生じる場合には、図６に示したように、ハイスループット計測器によって大量の（ｂｕｌｋ）蛍光の変化を読み取ることができる。
【００７０】
高量子収率をもたらすレポータは、感度上の理由で好ましい場合が多い。例えば、完全長のＹＦＰ蛋白質では完全長のＧＦＰ蛋白質よりも明るいシグナルが得られるのと同様に、ＹＦＰ  ＰＣＡではＧＦＰ  ＰＣＡよりも明るいシグナルが得られ、また、変異体（ＩＦＰ）断片ではこれに対応するＹＦＰ断片より明るいシグナルが得られる。米国特許第６，２７０，９６４号（ミフニクほか（Michnick et al.））に開示されている方法を用いて、対象とする任意のレポータに対し、種々の有用なＰＣＡ断片を作製することができ、これらの断片を、さらに改良することにより断片再構築時により明るいシグナルが得られる。本出願では、蛋白質断片をＰＣＲ法もしくは合成法（オリゴヌクレオチド合成）により作製することにより、所望のアッセイ特性を有する断片を得た。酵素を再構成するＰＣＡ断片を種々の基質もしくはプローブと併せて用いることにより、種々のスペクトル特性を有するアッセイ法を得ることができる。本発明では、ベータ・ラクタマーゼＰＣＡをセファロスポリン系基質と併せて用いることにより、マイクロタイター・プレート・リーダーで読み取ることができる青色蛍光産物が得られる。同様に、ＤＨＦＲ  ＰＣＡをテキサスレッド−ＭＴＸプローブと併せて用いることにより、自動顕微鏡法によって検出することができる赤色蛍光シグナルが得られる。Ｃ１５２Ａなどの変異型ルシフェラーゼ（表１）が報告されており、本発明と組み合わせて用いることができる。ＰＣＡ用の任意のレポータ断片の有用な変異体を作製するのに遺伝子工学の標準的な技術を利用することができることは、当業者には自明であろう。
【００７１】
多色ＰＣＡを用いることにより、２種以上の細胞プロセスもしくは経路を同時にモニターして、例えば、対象化合物が同一細胞内の２種以上の経路に作用するかどうかを明らかにしたり、単に、効率および費用節減上の理由でアッセイを多重化することが可能となる。多色測定を行うことができることによって、例えば、対照が赤色蛍光シグナルを示すのに対し、対象蛋白質が黄色蛍光シグナルを示す場合のように、内部アッセイ対照の使用が可能になる。本発明では、ＤＨＦＲ  ＰＣＡ（赤色蛍光）をＹＦＰ  ＰＣＡ（黄色蛍光）と同一細胞内で併用することにより種々の細胞内部位（subcellular location）の異なる蛋白質−蛋白質複合体の視覚化を可能にする多色ＰＣＡについて示した。ＧＦＰの黄色、シアンブルー、レモン色、ＳＥＹＦＰ、ヴィーナスおよび赤色ホモログなど、ＧＦＰの多岐にわたる形態は、全てＰＣＡに好適であり、また、さらに改良することにより、本発明に用いる断片のシグナル強度を向上させることができる。アッセイ計測値の数および種類は、放射される光の種々の波長に対する計測器の分離能によってのみ限定される。他の多くの多色アッセイも本発明で開示した原理および方法を用いて構築することができる。
【００７２】
ＰＣＡに好適な他のレポータについては表１に記載したが、ミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）によっても開示されており、これらのものとしては、単量体酵素および蛍光性、発光性もしくはリン光性蛋白質が挙げられる。また、抗原もしくは抗体の断片を利用するＰＣＡを構築して単純な検出方法と組み合わせて使用することができる。例えば、外来抗原の断片を利用したＰＣＡを構築することにより、蛋白質−蛋白質相互作用によって、ビオチン、フルオレセインなどの検出可能な成分と結合させた抗原で検出することができるエピトープを再構成することができよう。同様に、抗体断片を利用したＰＣＡを構築することにより、分子相互作用によって、蛍光体などの検出可能な成分を結合させた抗原に結合する機能性抗体を再構成することができよう。こうしたレポータおよび類似のレポータならびにこれらの修飾体は、いずれも本発明と併せて用いることができる。
【００７３】
［実施例１］
ＨＴＳおよびＨＣＳのための蛍光および発光アッセイ
本発明のこの第１の実施例は、蛍光および発光ＰＣＡを用いる多種多様の有用なアッセイの構築方法を示すと共に、標準的なＨＴＳおよびＨＣＳ計測を併用したハイスループットおよびハイコンテント・アッセイへのこれらの利用方法を示したものである。ＤＮＡ損傷応答経路のエレメントを使用した。
【００７４】
図２は、この経路の模式図、ならびにベータ・ラクタマーゼＰＣＡ（ＢＬＡ  ＰＣＡ）を利用したＨＴＳアッセイおよびＧＦＰ  ＰＣＡを利用したＨＣＳアッセイの結果を示す。図３は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ  ＰＣＡ）を用いたＨＴＳアッセイ結果を示す。図４は、ＩＦＰ  ＰＣＡを用いたハイコンテント・アッセイの結果を示す（ＩＦＰはＧＦＰの変異体である）。これらの例では、アッセイした蛋白質は、ＤＮＡ損傷応答経路内で相互作用するペア、具体的には、腫瘍抑制因子ｐ５３と相互作用するチェックポイント・キナーゼＣｈｋ１（Ｃｈｋ１／ｐ５３  ＰＣＡ）、もしくはそれ自体でホモ二量体を形成するｐ５３である。
【００７５】
ＢＬＡ  ＰＣＡの場合、対象遺伝子−ＤＮＡ損傷応答経路に関与することが知られている−は、ＢＬＡレポータ断片に融合させ、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞内にペアで（６回繰り返して）コトランスフェクションさせた。具体的には、２種の主要蛋白質、ｐ５３とチェックポイント・キナーゼＣｈｋ１との相互作用についてＤＮＡ損傷剤カンプトセシン（ＣＰＴ）および各種の既知薬物もしくは化合物に対するその応答を評価した。ｐ５３［ＮＭ＿０００５４６］およびＣｈｋ１［ＮＭ＿００１２７４］をコードしている（配列の確認された）完全長のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させ、得られた断片を可変１０アミノ酸リンカーを介してＢＬＡ［１］もしくはＢＬＡ［２］の３’末端にインフレームで融合させた。得られたＢＬＡ［１］−ｐ５３、ＢＬＡ［２］−ｐ５３およびＢＬＡ［２］−Ｃｈｋ１構築物はＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるエピソーム複製のＥＢＮＡ−１起点を含んでいたが、細胞培養における長期維持のための選択マーカを含んでいなかった。全ての構築物について配列決定を行い、アッセイに使用する前に、レポータ−遺伝子融合の完全性を確認した。トランスフェクションの約３６乃至４０時間後に、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をＢＬＡ［１］−ｐ５３およびＢＬＡ［２］−Ｃｈｋ１融合体のＤＮＡを２５０ｎｇ（合計量）用いて（もしくはＢＬＡ［１］−ｐ５３およびＢＬＡ［２］−ｐ５３を用いて）コトランスフェクションして、これを３００ｎＭのカンプトセシン２時間処理し、次いで、Ｃｈｋ１の触媒活性の既知の阻害剤（例えば、１０μＭ（マイクロモル）のＤＢＨおよび５０μＭのＧｏ６９７６）もしくは上流ＡＴＲキナーゼの阻害剤（２ｍＭのカフェイン）で処理するか、この処理を行わなかった。２時間（もしくは最大６時間）後に、これらの薬物を除去し、ベータ・ラクタマーゼの基質を加えた（図２（Ｂ））。この基質は、以前に報告されたセファロスポリン（クワンテほか(Quante et al.）；文献参照）の誘導体とした。再構成ＢＬＡによりベータ・ラクタム環を加水分解すると、青色蛍光を有する遊離クマリンが放出される。薬物処理後、細胞を２００μｌ（マイクロリツトル）のＰＢＳ（これにカルシウムおよびマグネシウムを加える）で洗浄し、次いでカルシウムもマグネシウムも加えない２５μｌのＰＢＳで被覆した。ＢＬＡ基質を新たに希釈して最終濃度が２％ＤＭＳＯ中２０μＭとなるように（最終容量を５０μｌとして）各ウェルに加えた。各蛋白質ペアについて、基質の加水分解反応速度は、モレキュラー・デバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＧｅｍｉｎｉ  ＸＳプレートリーダーを用いたカイネティックアッセイにより、基質添加直後から測定した。蓄積した蛍光基質は、３４５ｎｍで励起し、４４０ｎｍで９０分間１０分毎に検出した。図２（Ａ）の棒グラフに示したデータは、各条件における加水分解反応の平均速度を表し、エラーバーは平均値の９５％信頼区間を表す。図２（Ａ）から明らかなように、Ｃｈｋ１とｐ５３との相互作用に対して、２種のＣｈｋ１阻害剤、ＤＢＨおよびＧｏ６９７６の有意な効果を検出することができる。
【００７６】
ＰＣＡ用にＧＦＰを用いるアッセイ
ＢＬＡ  ＰＣＡにより数値化した相互作用を確認し、その細胞内局在を評価するために、同じＤＮＡ損傷応答エレメントを用いてＧＦＰ  ＰＣＡを構築し、複合体の細胞内局在を蛍光顕微鏡によりイメージングした（図２（Ａ）、左側パネル）。ＰＣＲにより、ｐ５３およびＣｈｋ１をコードしている完全長のｃＤＮＡを増幅させた。この融合遺伝子は、ＧＦＰ［１］−ｐ５３のゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）選択マーカおよびＧＦＰ［２］−Ｃｈｋ１およびＧＦＰ［２］−ｐ５３のハイグロマイシン・マーカを有するｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロゲン社）内にサブクローニングした。（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）からなる可変１０−アミノ酸リンカーにより、対象遺伝子とＹＦＰ断片とを離隔した。対象遺伝子とこのレポータ断片との間に可変リンカーを用いることにより、融合体の配向および配列が蛋白質断片を極近接して組み込むのに最適なものとなることが保証される（Ｊ．Ｎ．ペルティエ（J.N. Pelletier）、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−ヴァロワ（F.-X. C.-Valois）、Ｓ．Ｗ．ミフニク（S.W. Michnick）、１９９８年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Proc Nail Acad Sci USA）９５：ｐ１２１４１−１２１４６）。ＧＦＰ［１］はＧＦＰのアミノ酸１乃至１５８番目に相当し、ＧＦＰ［２］はＧＦＰのアミノ酸１５９乃至２３９番目に相当し、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ（クロンテク社）からＰＣＲによって増幅させた。
【００７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、４８−穴細胞培養皿（コスタール社（Ｃｏｓｔａｒ））に１０，０００個／ウェル接種した。細胞のトランスフェクションは、メーカーの推奨どおり、ＦｕＧｅｎｅ（ロッシュ社）を用い、ＧＦＰ［１］−ｐ５３およびＧＦＰ［２］−Ｃｈｋ１、もしくはＧＦＰ［１］−ｐ５３およびＧＦＰ［２］−ｐ５３からなる１５０ｎｇのトータルＤＮＡを使用して行った。約４８時間発現させた後、細胞をＰＢＳ中で一度洗い、次いで、蛍光顕微鏡で調べるために７５μｌの（対比染色剤を含まない）ＰＢＳをかぶせた。Ｃｈｒｏｍａ  ＦＩＴＣフィルター（励起：４６０−５００ｎｍ、発光：５０５−５６０ｎｍ、２色性ミラー：５０５ＬＰ）を用いたＳＰニコン（Ｎｉｋｏｎ）蛍光顕微鏡で生細胞のイメージングを行った。
【００７８】
ＨＴＳのための発光ＰＣＡ
また、我々は蛋白質−断片相補性を利用する発光アッセイ（ＰＣＡ）の使用について実証を試みた。ミフニクほか（Michnick et al.）（米国特許第６，２７０，９６４号）により開示された方法を用いてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）の断片をデザインした。１６０番目のグルタミン酸残基（Ｅ１６０）が完全な状態のＲＬｕｃの断片と一致するオリゴヌクレオチドを合成することを選択した。別の断片部位を使用することも可能であり、従って、本発明が本明細書で用いている特定の断片に限定されないことに留意されたい。出発／停止コドンとなるように断片内に設けたコドンには下線が引かれている。上記蛋白質断片が構築物の５’末端にある場合は開始メチオニン（ａｔｇコドン）がこれの前方に来るが、この断片が構築物の３’末端にある場合は開始メチオニン（ａｔｇコドン）が対象遺伝子の前方に来ることに留意されたい。従って、本発明は天然型のメチオニンを有するＦ１断片ばかりでなく、Ｆ１断片が構築物の３’末端にあることになる場合に上記開始メチオニンを除去するように修飾された同じＦ１断片をもカバーしている。同様に、本発明は、天然では開始メチオニンで始まらないＦ２断片だけでなく、Ｆ２断片が構築物の５’末端にあることになる場合に開始メチオニンを含むように修飾された同じＦ２断片をもカバーしている。
【００７９】
我々は２種のＲＬｕｃ  ＰＣＡを作製した。第１のＲＬｕｃ  ＰＣＡは野性型Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いたものであり、この断片は以下の配列を有する：
【００８０】
【化１】
0005122129.tif 000006
【００８１】
【化２】
0005122129.tif 000007
【００８２】
【化３】
0005122129.tif 000008
【００８３】
【化４】
0005122129.tif 000009
【００８４】
【化５】
0005122129.tif 000010
【００８５】
【化６】
0005122129.tif 000011
【００８６】
【化７】
0005122129.tif 000012
【００８７】
【化８】
0005122129.tif 000013
【００８８】
さらに、我々は、Ｆ１断片内の一箇所を突然変異（Ｃ１２４Ａ）させた変異体ＲＬｕｃ  ＰＣＡを作製した。リウ（Liu）とエッシャー（Escher）（ジーン（Gene）２３７（１９９９年）ｐ１５３−１５９）は、Ｃ１５２Ａ（ＳＲＵＣ３）ミュータントが活性の向上を示す分泌型の変異型ＲＬｕｃを報告した。我々のＲＬｕｃにはＮ末端にシグナル配列がなく、従って、このＣ１５２Ａミュータントは、翻訳された開始コドンから番号付けするとしてＣ１２４Ａに相当する。リウとエッシャーは、こうした分泌型蛋白質内のこのミュータントがシグナル強度を高めるので、これがＨＴＳに特に有用となることを明らかにした。従って、また、本発明において我々は以下の配列を有する、ＰＣＡ用の新規Ｆ１断片（ＲＬ１［Ｃ１２４Ａ］）を提供する：
【００８９】
【化９】
0005122129.tif 000014
【００９０】
【化１０】
0005122129.tif 000015
【００９１】
【化１１】
0005122129.tif 000016
【００９２】
【化１２】
0005122129.tif 000017
【００９３】
野性型ＲＬｕｃＦ１もしくは変異体ＲＬｕｃＦ１（Ｃ１２４Ａ）を前記のＲＬｕｃＦ２断片と組み合わせて使用することにより発光ＰＣＡを作製することができる。以下の例では、野性型ＲＬｕｃ断片で得られた結果を示す。上記のＦ１およびＦ２断片はオリゴヌクレオチド合成（ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー社、ボセル、ＷＡ）により作製し、ＲＬ［１］（ａａ１−１６０）およびＲＬ［２］（ａａ１６１−３１１）と命名した。これらの合成断片は、ＰＣＲによって増幅させて、各レポータ断片配列の５’もしくは３’末端への対象遺伝子の融合が可能となる配置で、制限部位、および可変１０アミノ酸ペプチドリンカーをコードするリンカー配列を組み込んだ。次いで、これらの増幅させたＲＬ［１］およびＲＬ［２］の断片を哺乳動物の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ、インビトロゲン社）内にサブクローニングして、図１６に示した４つの個別のベクター（各レポータ断片に対するＮ末端およびＣ末端融合ベクター）を作製した。
【００９４】
負の対照ＰＣＡとしてＳＴＡＴ１／ＰＤＫ２を用いた。Ｐ５３、ＳＴＡＴ１およびＰＤＫ２の完全なコーディング配列を配列の確認された完全長のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ産物を脱塩し、定方向クローニングを可能にするため適切な制限酵素で消化させ、可変１０アミノ酸ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）をコードするリンカーを介してＲＬ［１］、ＲＬ［２］、ＲＬ［３］もしくはＲＬ［４］の５’もしくは３’末端にインフレームで融合させることによって、空間の融合体の配向／配列が蛍光蛋白質断片を極近接させて組み込むのに最適なものとなることが保証された。組換え構築体からのＤＮＡは、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＦＸロボットワークステーション（ベックマン・コールター社、フラートン、ＣＡ）でキアゲン・バイオロボット・プレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｕｒｂｏ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて単離した。単離ＤＮＡは、定量した後、５０ｎｇ／μｌの濃度に標準化した。
【００９５】
ｐ５３のホモ二量体化を数値化するためのルシフェラーゼＰＣＡ（ｐ５３／ｐ５３  ＰＣＡ）を構築し、負の対照ＲＬｕｃ  ＰＣＡ（Ｐｄｋ２／ＳＴＡＴ１）と比較した。後者の蛋白質は互いに相互作用しない。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、ポリリジンでコーティングした９６−穴プレートで（２４時間アッセイではウェル当たり１０，０００１個の細胞、４８時間アッセイではウェル当たり１５，０００個の細胞を）平板培養した。細胞は、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（ロッシュ・ダイアグノスティクス社、インディアナポリス、ＩＮ）をメーカーの推奨の通りに用い、０．１μｇ（マイクログラム）のトータルＤＮＡ（各レポータ構築物５０ｎｇ）でトランスフェクションした。２４時間もしくは４８時間発現させた後、細胞をＰＢＳで一度洗い、次いで、２０μｌのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイ用溶解緩衝液（プロメガ社、Ｃａｔ＃Ｅ２８１０））で溶解させた。各溶解液を９６−穴のプレートのウェルに加え、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質セレンテラジンの専売製剤（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を含むＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・アッセイ用緩衝液（プロメガ社、Ｃａｔ＃Ｅ２８１０））をサーモ・ラボ・シンテムズ社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のルミノスカン・アセント（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）照度計内に注射器を用いて加えた。各サンプルについて、放出された発光を、サンプルへの基質の添加後２秒遅れで、１０秒間かけて捕捉した。データは相対発光単位（ＲＬＵ）として記録し、蛋白質含量に対して標準化しなかった。
【００９６】
図３（Ａ）は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの断片に融合したｐ５３／ｐ５３もしくはＰｄｋ２／ＳＴＡＴ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解液全体から、発現後２４および４８時間後に生じた発光を示す。図の説明文は、各レポータ断片に対するコード蛋白質の配向を明らかにしたものである。これらの結果から、Ｅ１６０におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの断片化は効率的なＰＣＡをもたらすことが明らかであり、考えられる４種の融合ペアは全て発現の２４および４８時間後に検出可能な発光を生じた。
【００９７】
Ｐｄｋ２／ＳＴＡＴ１  ＰＣＡの生じるシグナルは無視できるほどわずかであることに留意されたい。このことは、このアッセイのＰＣＡシグナルが相補性ＰＣＡ断片に融合した２種の相互作用蛋白質の存在に完全に依存していること、つまり、こうした断片自体は、これらの相補性の断片に融合した蛋白質により相補性が支えられない限り、活性な酵素に再構築され得ないことを示しているので、重要なポイントである。この重要な特徴は、本発明とＦＲＥＴ、ＢＲＥＴなどの別の蛋白質−蛋白質相互作用技術との違いを際立たせている。さらに、この特徴は、本発明とＧＦＰなどの発光団による単一蛋白質の標識を利用するハイコンテント・アッセイとの違いを際立たせている。後者の場合、個々の蛋白質は蛋白質−蛋白質相互作用がなくてもシグナルを生じる。
【００９８】
図３に示したように、前記ｐ５３／ｐ５３複合体は、遺伝子−断片の配向に応じて、２０ＲＬＵから２００ＲＬＵ超までの範囲のシグナルを生じ、ＲＬｕｃ  ＰＣＡのシグナル対バックグラウンドの比は２００：１もの大きさになる。このアッセイにおけるカンプトセシンの効果を明らかにするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、ポリリジンでコーティングした９６−穴プレート中で（ウェル当たり１５，０００個の細胞を）平板培養した。テストした各条件において、細胞は、前記のＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、０．１μｇのトータルＤＮＡ（各５０ｎｇのＲＬ［１］−ｐ５３およびＲＬ［２］−ｐ５３）でトランスフェクションし、これを４通り行った。４つのウェルでは（トランスフェクション試薬を用いるがＰＣＡ構築物を使用しない）偽トランスフェクションを行い、セレンテラジンの自己蛍光によりもたらされるバックグラウンド対照とした。３０時間発現させた後、各ＰＣＡの４通りのウェルを０．１％のＤＭＳＯもしくは５００ｎＭのカンプトセシン（ＣＰＴ；カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））で１８時間処理した。薬物をＰＢＳで２回洗浄して除去し、前述のようにして細胞溶解液を調製した後、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光検出アッセイ（プロメガ社）を行った。図３（Ｂ）のグラフの各棒は、４つの個別のサンプルの平均値を表し、エラーバーはこれらの測定値の標準偏差を示す。ＣＰＴ処理ｐ５３：ｐ５３  ＰＣＡでは、ビヒクルのみ（０．１％ＤＭＳＯ）で処理した同じＰＣＡに対し、発光の統計的に有意な増強が認められた。同じ処理は、負の対照（Ｐｄｋ２：ＳＴＡＴ１）に対しては効果がなかった。
【００９９】
以上の結果から、ルシフェラーゼＰＣＡは感度の良いハイスループット・アッセイになることが分かる。このＲＬｕｃ  ＰＣＡは、全細胞アッセイもしくは細胞溶解液を用いた多数の蛋白質および治療標的のＨＴＳに適用することができる。ルシフェラーゼＰＣＡは、このアッセイの感度が鋭敏なため、ハイスループットおよび超ハイスループット方式で構築することができる。これらのアッセイは、１５３６−穴もしくはそれ以上もの方式にスケールアップすることができ、プレート全体を数分以内に読み取ることができる。さらに、遺伝子工学を利用することにより、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・ホロ酵素の発光出力を増強することが分かっている（表１の文献参照）Ｃ１５２Ａなどの突然変異を導入して、突然変異型ルシフェラーゼＰＣＡを構築することができる。
【０１００】
我々が以前にＤＨＦＲ  ＰＣＡに対して明らかにしたように、また、前記のＲＬｕｃ  ＰＣＡに関して言えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム変異導入法および／またはコンビナトリアル合成法を用いることにより、当業者に公知の方法を使用して任意の適切なレポータのための新規なＰＣＡ断片を作製することができる。
【０１０１】
ＹＦＰ  ＰＣＡおよびＩＦＰ  ＰＣＡの構築
ＧＦＰ  ＰＣＡよりも明るいシグナルを有するハイコンテント・アッセイを構築するために、黄色蛍光を生じるＧＦＰ断片の２種の変異型を作製した。第１断片の配列は、完全長のＥＹＦＰに相当する。完全長ＥＹＦＰは、完全長ＧＦＰに対してスペクトル特性が向上することが分かっている（タバレほか（Tavare et at.）２００１年、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Journal of Endocrinology）１７０：２９７−３０６）。本明細書に記載したＰＣＡは、先ず、ＥＧＦＰの既存のオリゴヌクレオチド断片にＥＹＦＰに特有の突然変異Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２ＡおよびＴ２０３Ｙ（２４）を導入することにより作製し、完全長ＥＹＦＰ（２１、１５）の１乃至１５８番目および１５９乃至２３９番目のアミノ酸に相当するＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］と命名した断片を得た。次いで、ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］に相当する合成オリゴヌクレオチド（ブルー・ヘロン社（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ））を直接用いて開始することによりアッセイを構築した。断片ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］の組成は以下の通りであった：
【０１０２】
【化１３】
0005122129.tif 000018
【０１０３】
【化１４】
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【０１０４】
【化１５】
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【０１０５】
【化１６】
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【０１０６】
【化１７】
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【０１０７】
【化１８】
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【０１０８】
【化１９】
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【０１０９】
【化２０】
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【０１１０】
別の実験のためにこれらの断片をさらに突然変異させて、さらに強度の高いＰＣＡ「ＩＦＰ  ＰＣＡ１」を作製した。突然変異法は、ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（ヴィーナス社）と呼ばれるＹＦＰ変異体に基づいて選択した。これらの突然変異は、完全な状態の蛋白質内における蛍光シグナルの成熟を促進することが明らかにされている（Ｔ．ナガイほか（T. Nagai et al.）、２００２年、「細胞−生物学的用途の、成熟が迅速で効率的な黄色蛍光蛋白質の変異体（A variant of yellow fluorescent protein with maturation for cell-biological applications）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）２０：ｐ８７−９０）。ＰＣＲを用いた突然変異誘発法により、さらにＳＥＹＦＰ［１］内にＦ４６Ｌ、ＹＦＰ［２］内にＶ１６３ＡおよびＳ１７５Ｇの突然変異を導入して、我々がＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］と命名した新規な断片を得た。
【０１１１】
【化２１】
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【０１１２】
【化２２】
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【０１１３】
【化２３】
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【０１１４】
【化２４】
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【０１１５】
【化２５】
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【０１１６】
【化２６】
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【０１１７】
【化２７】
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【０１１８】
【化２８】
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【０１１９】
完全長のヒトｐ５３の各読み取り枠をＩＦＰ［１］の５’末端およびＩＦＰ［２］の３’末端にインフレームで融合させることにより、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン社）内に以下の構築物：ｐ５３−ＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］−ｐ５３を形成させた。最終のｐ５３−ＩＦＰ［１］構築物にはゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）選択マーカを含ませ、ＩＦＰ［２］−ｐ５３構築物にはハイグロマイシン選択マーカを含ませた。融合体には全て、全体を通して（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）とも呼ぶ１０−アミノ酸ペプチド（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２をコードする可変リンカーを介させた。組換え構築物からのＤＮＡは、キアゲン・バイオロボット・プレップ・キットを用いてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＦＸロボットワークステーション（ベックマン・コールター社、フラートン、ＣＡ）により、またはキアゲン・ミディ・プレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて手動で単離した。単離ＤＮＡは、定量した後、５０ｎｇ／μｌの濃度に標準化した。
【０１２０】
トランスフェクションの約２４時間前に、細胞を、マルチドロップ（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ）３８４蠕動ポンプ装置（サーモ・エレクトロン社）を用いて９６−穴ポリ−Ｄ−リジン被覆プレート（グライナー社）に、ウェル当たり７，５００個の細胞濃度で接種した。Ｆｕｇｅｎｅ６（ロッシュ社）をメーカーのプロトコルに従って用い、計１００ｎｇのＤＮＡ（ｐ５３−ＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］−ｐ５３）をコトランスフェクションした。刺激作用のない状態でこのＰＣＡペアを発現する細胞を、薬物含有培地と共に３０分間、９０分間および８時間インキュベートした。一方、カンプトセシン（ＣＰＴ）で刺激した細胞は、薬物で２時間前処置した後、上記ｐ５３経路に作用することが知られ、もしくは考えられる以下のテスト化合物の存在下に５００ｎＭ  ＣＰＴと共にさらに１６時間インキュベートした：図４の説明文に示された濃度のＣＰＴ、ゲニステイン、トリコスタチンＡ、ＭＳ−２７５、ＬＹ２９４００２、ＳＢ２０３５８０、ＨＡ１４−１もしくはゲルダナマイシン。薬物処理後の細胞は、３３μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（モレキュラー・プローブス社）および１５μｇ／ｍｌのテキサスレッド結合小麦胚凝集素（ＴｘＲ−ＷＧＡ；モレキュラー・プローブス社）で同時染色し、２％ホルムアルデヒド（テド・ペラ社（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ））で１０分間固定した。次いで、細胞をＨＢＳＳ（インビトロゲン社）で洗い、画像獲得の間、同じ緩衝液中に保持した。ＩＦＰ  ＰＣＡから生じる蛍光は、ロボットアーム（ＣＲＳキャタリスト・エキスプレス；サーモ・エレクトロン社、ウォルサム、Ｍａｓｓ）を装備したディスカバリ−１自動撮像装置（モレキュラー・デバイス社）を用いて捕捉した。ＹＦＰ蛍光（励起フィルター：４８０／４０ｎｍ；発光フィルター：５３５／５０ｎｍ）、ヘキスト蛍光（励起フィルター：３６０／４０ｎｍ；発光フィルター：４６５／３０ｎｍ）およびテキサスレッド蛍光（励起フィルター：５６０／５０ｎｍ；発光フィルター：６５０／４０ｎｍ）の画像を獲得した。各ウェル内の４つの特有の細胞集団をイメージングすることにより、処理条件当たり各蛍光色素の計８画像が得られた。
【０１２１】
ｐ５３：ｐ５３  ＰＣＡに対する薬物効果の代表的な画像を図４に示した。左パネルの３つの画像は、ＣＰＴ非存在下のこのＰＣＡに対するゲルダマイシンもしくはトリコスタチンＡの効果に相当し、右のパネルは５００ｎＭのカンプトセシンの存在下のこれら薬物の効果を示す。ＤＭＳＯ（上端の画像）は薬物の再懸濁のために用いたピヒクルである。
【０１２２】
ゲルダマイシンは、野性型および突然変異型ｐ５３を含むいくつかの細胞蛋白質に対するシャペロン蛋白質であるＨｓｐ９０の既知の阻害剤である（キングほか（King et al.）２００１年）。この薬物の効果は、我々が観察したように、ｐ５３の安定性を低下させ、従って、シグナルを低減させることにあると考えられる。以上の結果から、Ｈｓｐ９０阻害剤は、ＰＣＡの少なくとも一方がＨｓｐ９０クライアント蛋白質であるＰＣＡを構築することにより検出することができることが分かる。こうしたアッセイにより、例えば、多数の蛋白質−蛋白質複合体に対するＰＣＡを構築し、ゲルダマイシンの非存在下および存在下にこのＰＣＡをテストしてＨｓｐ９０阻害に感受性の蛋白質を同定することによって別のＨｓｐ９０クライアント蛋白質の大規模なスクリーニングが可能になろう。さらに、このようなアッセイは、ＨＴＳに直接用いてＨｓｐ９０活性の低分子阻害剤を同定することができる。ゲルダマイシンおよびその誘導体１７−ＡＡＧは強力な抗腫瘍活性を有するので、Ｈｓｐ９０阻害に感受性のアッセイを構築できることにより、新しい領域の抗癌剤発見が可能になる。
【０１２３】
トリコスタチンＡは、ヒストン脱アセチル化酵素Ｉ（ＨＤＡＣ１）である。カンプトセシンの存在下に脱アセチル化を阻害すると、ｐ５３のアセチル化が誘発され、従って、この蛋白質が安定化してその転写活性が増大する。我々は、ＰＣＡを用いて、カンプトセシンの存在下にｐ５３：ｐ５３  ＰＣＡシグナルの劇的な増強を認め、この増強は、図２および３にそれぞれ示したように、１６時間のＣＰＴ前処理ではこれより短時間のＣＰＴ前処理の場合よりも大きかった。従って、こうしたアッセイを用いることにより、ＨＤＡＣの新規阻害剤をスクリーニングすることができ、これは癌生物学のさらに重要な領域となる。
【０１２４】
イメージＪフリーウェアを利用して自動画像解析を行うことにより、各画像の、上記ＰＣＡによってもたらされる蛍光のレベルを定量した。ｐ５３：ｐ５３  ＰＣＡの場合、細胞の自己蛍光によりもたらされるバックグラウンドは各画像から差し引き、次いで、各細胞の核内の平均画素蛍光強度を求めた。図４では、得られた値、核平均（Ｙ−軸）が各薬物処理（Ｘ−軸）に対してグラフ化されている。刺激されなかったＰＣＡの定量値はモーブ色で示し、ＣＰＴにより刺激したアッセイからのデータは青色で示した。図４の画像と一致して、ＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡおよびＭＳ−２７５は、ＣＰＴの存在下対照よりも有意にｐ５３／ｐ５３相互作用を刺激した。同様な効果は、ＢＣＬ−２阻害剤ＨＡ１４−１でも見られた。キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ）およびＳＢ２０３５８０（ｐ３８ＭＡＰＫ）は、両アッセイにおいて結合の増大をもたらした。ゲルダナマイシンは、画像および関連のヒストグラムから明らかなように、両アッセイを有意に阻害した。これらのアッセイは、ＤＮＡ損傷応答を調節する新規な物質について化学物質ライブラリをスクリーニングするのに有用となろう。
【０１２５】
［実施例２］
新規な蛋白質-蛋白質相互作用の確認および定量的アッセイの構築
次に、本発明で開示し、図１に示したＰＣＡ法を用いてＰＩ−３−キナーゼおよびＰＫＡ／ＰＫＣ−媒介性経路の新規な蛋白質−蛋白質相互作用を同定した後、この新規な相互作用を利用して定量的なスクリーニングを行った。先ず、ＧＦＰ  ＰＣＡによりｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行うことによってＰＫＢと相互作用する蛋白質を同定した。このＧＦＰ  ＰＣＡスクリーニングによりＰＫＢとＦｔ１との間の新規な相互作用が同定された。続いて、このＧＦＰ  ＰＣＡを用いてＰＫＢ／Ｆｔ１およびＰＤＫ１／Ｆｔ１の蛍光アッセイ法を構築した。この経路の構成およびＰＫＢ／ｈＦｔ１相互作用の位置については図５（Ａ）に示した。以下に、ＰＣＡを用いたライブラリのスクリーニング方法およびアッセイの構築方法を記載する。
【０１２６】
ＤＮＡ構築物。ＰＫＢ、ＰＤＫ１、ＰＫＣアルファ、ＰＫＡ（ＰＫＡｃ）のサブユニット、ＧＳＫ３ベータ、ＢＡＤ、カスパーゼ９およびＦＫＨＲＬ１をコードする完全長のｃＤＮＡをそれぞれＰＣＲにより増幅させ、真核生物発現ベクターｐＭＴ３［カウフマン（Kaufman）、１９８９年＃２３］中、ＧＦＰのＦ［２］断片の５‘末端にサブクローニングした。ＧＦＰ［１］はＧＦＰのアミノ酸１乃至１５８番目に相当し、ＧＦＰ［２］はＧＦＰのアミノ酸１５９乃至２３９番目に相当し、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ（クロンテク社からＰＣＲによって増幅させた。また、ＰＫＢ−ＧＦＰ［２］は、このｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのためにアンピシリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子により置換したｐＭＴ３ベクター（ｐＭＴ３−クロラムフェニコール）に挿入した。全ての場合において、上記のｃＤＮＡとＧＦＰ断片との間に（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）からなる１０アミノ酸可変リンカーを挿入することにより、空間の融合体の配向／配列が蛋白質断片を極近接させて組み込むのに最適なものとなることが保証された。ＧＦＰ［１］−ＧＣＮ４およびＧＣＮ４−ＧＦＰ［２］構築物は、ＧＣＮ４ロイシン・ジッパー形成配列との融合体からなり、対照として用いる。このＧＦＰ  ＰＣＡを用いたｃＤＮＡライブラリ・スクリーニングの場合、ベクターｐＥＸＰ１（クロンキャプチャー（ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ）ｃＤＮＡライブラリ、クロンテク社）から、ＳｆｉＩ制限部位を用いてヒト脳ｃＤＮＡライブラリを切り取り、上記ｐＭＴ３ベクター中、ＧＦＰのｆ［１］断片の３’末端および１０アミノ酸可変リンカーに挿入した。このＰＣＡ−ｃＤＮＡライブラリ融合発現ベクターは、（挿入ｃＤＮＡの大きさ−０．５乃至４．６ｋｂ−によって）いくつかのプールに分け、液体培地中３０℃で増幅させた。
【０１２７】
細胞株
ＣＯＳ−１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ハイクローン社）を補充したＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ社）中で増殖させた。ヒトＴａｇ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現し、ＮＦ−ＡＴ結合部位の３つのタンデム型コピーがｌａｃＺ遺伝子の転写を誘導する組込みβ−ガラクトシダーゼ・レポータ・プラスミドを収容している。これは、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭヘペスを補充したＲＰＭＩ−１６４０（ライフ・テクノロジーズ社）中で増殖させた。
【０１２８】
ＰＣＡを用いたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングによる新規蛋白質−蛋白質相互作用の同定。ＣＯＳ−１細胞を、トランスフェクションの２４時間前から１５０−ｍｍ皿で平板培養した。細胞は、ＧＦＰのＦ［１］断片に融合させたヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（ＧＦＰ［１］−ｃＤＮＡライブラリ）を収容するｐＭＴ３ベクターおよびＧＦＰのＦ［２］断片に融合させた完全長のＰＫＢ（ＰＫＢ−ＧＦＰ［２］）を含むｐＭＴ３−クロラムフェニコール・ベクターを用いて、約６０％コンフルエンスで、リポフェクタミン試薬（ライフ・テクノロジーズ社）により（計１０μｇＤＮＡ／皿）トランスフェクションした。上記ＧＦＰ［１］−ｃＤＮＡライブラリ融合体は、その大きさに応じて、いくつかのプールを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、陽性クローン（断片からのＧＦＰの再構成）を螢光励起細胞分離捕集（ＦＡＣＳ）分析装置（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、ベクトン・ディッキンソン社）で収集した。陽性細胞の各プールからのトータルＤＮＡを抽出し（組織用ＤＮｅａｓｙキット、キアゲン社）、ＤＨ５−アルファ細菌細胞内に形質転換して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天上で平板培養した（前記ＰＫＢ−Ｆ［２］融合体を収容するクロラムフェニコール耐性ベクターの増殖なし）。個々のクローンからＦ［１］−ｃＤＮＡ融合体を含むＤＮＡプラスミドを抽出し、これをＰＫＢ−ＧＦＰ［２］もしくはＧＦＰ［２］単独（陰性対照）と共に別々に再トランスフェクションして、細胞選別過程でそのプールに入る陰性クローンを除いた。この２回目の選択の後、陽性クローンに相当するＤＮＡプラスミドを配列分析にかけた。
【０１２９】
ＣＯＳ−１細胞は、トランスフェクションの１２時間前に１２−穴のプレートで分割した。細胞のトランスフェクションは、リポフェクタミン試薬（ライフ・テクノロジーズ社）をメーカーの使用説明書に従って用い、種々のＤＮＡ構築物（１μｇのトータルＤＮＡ／ウェル）を収容する種々の組み合わせのｐＭＴ３プラスミドにより、約６０％のコンフルエンスで行った。Ｔａｇ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（ライフ・テクノロジーズ社）を用いて１×１０６個／ウェル（２μｇのトータルＤＮＡ／ウェル）をトランスフェクションした。各実験においてトランスフェクションしたＤＮＡの量は、空のベクターを加えることによって一定に保った。Ｔａｇ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の場合、次の日に、増殖培地に１μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを加えることによりプロモータ活性および遺伝子発現を増強させた。ＣＯＳ−１細胞は、トランスフェクションの４８時間後、ＰＢＳで一度洗い、穏やかにトリプシン処理した後、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。Ｔａｇ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、そのまま採取して２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。融合蛋白質パートナ間の相互作用の指標である再構成ＧＦＰの相対量は、蛍光分析によって検出した。全細胞懸濁液を９６−穴黒色マイクロタイタープレート（ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）、ＶＷＲサイエンティフィック社）に移し、蛍光分析（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ、モレキュラー・デバイシズ社））を行った。ＧＦＰ［１］−ｈＦｔ１およびＰＫＢ−ＧＦＰ［２］融合体もしくはＧＦＰ［１］−ｈＦｔ１およびＰＤＫ１−ＧＦＰ［２］融合体を共発現する細胞を以下の通り、アゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤で処理した。ＣＯＳ−１細胞は、トランスフェクションの４８時間後にＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地で５時間インキュベートし、最後の１時間は３００ｎＭのワートマニンもしくは５０μＭのＬＹ２９４００２（カルビオケム社）で処理または非処理とした。その後、細胞は１０％血清もしくは２０μｇ／ｍｌインスリン（ロッシュ・ダイアグノスティクス社）で３０分間刺激した。Ｔａｇ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、３００ｎＭのワートマニンで９０分間、または５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体もしくは５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）もしくは１μＭのイオノマイシンもしくは１０μＭのフォルスコリンまたは／および５００ｎＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（全てカルビオケム社製）で３０分間処理した後、蛍光分析を行った。その後、データを細胞溶解液の総蛋白質濃度に標準化した（バイオ−ラド蛋白質アッセイ）。ＧＣＮ４ロイシン・ジッパーの構成的な二量体化を陽性対照とした。トランスフェクションしなかった細胞に対応するバックグラウンド蛍光強度は全てのサンプルの蛍光強度から差し引いた。また、ｈＦｔ１／ＰＫＢおよびｈＦｔ１／ＰＤＫ１蛋白質−蛋白質複合体の細胞内部位（subcellular location）は生細胞で蛍光顕微鏡法により確認した。蛍光顕微鏡法の場合、ＣＯＳ−１細胞はトランスフェクションの前にカバーガラス上で増殖させた。細胞は、ＰＢＳで２度洗浄した後、スライドガラスにのせた。蛍光顕微鏡法は、Ｚｅｉｓ��  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（対物レンズＺｅｉｓｓ  Ｐｌａｎ  Ｎｅｏｆｌｕａｒ  １００Ｘ／１．３０）を用いて生細胞で行った。
【０１３０】
図５（Ｂ）のパネル１は、ＣＯＳ−１細胞を用いたＰＣＡで得られた蛍光の定量結果を示し、パネル２はＪｕｒｋａｔ細胞を用いて得られた結果を示す。図５（Ｂ）のパネル３は、蛋白質−蛋白質複合体の画像およびその細胞内部位（subcellular location）を示す。この経路を刺激する物質は蛍光の増強をもたらしたのに対し、この経路を阻害する化合物はこの経路内の蛋白質−蛋白質複合体の蛍光の低減をもたらした。例えば、ＣＯＳ細胞では、血清およびインスリンはＰＫＢ／ｈＦｔ１複合体およびＰＤＫ１／ｈｆＴ１複合体の量の増加ならびに細胞基質から膜への蛋白質−蛋白質複合体の再配分をもたらしたが、これらの作用はＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるワートマニンおよびＬＹ２９４００２によってブロックすることが可能である。以上の結果から、ＰＫＢ／ｈＦＴ１およびＰＤＫ１／ｈＦｔ１は経路活性の標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）であり、ＰＣＡは標準的な蛍光計測器および顕微鏡による検出に適した定量的アッセイ法の構築に用いることができることが分かる。さらに、これらのアッセイ法は、インスリン−および血清−媒介性経路を賦活もしくは阻害する新規化合物の同定に有用となろう。
【０１３１】
［実施例３］
ＹＦＰ  ＰＣＡを用いたハイスループット・アッセイ
次に、我々は、適切な薬理学的情報をもたらす定量的なアッセイ法としてＰＣＡを用いることができることを明らかにしようとした。以下の例では、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合蛋白質）およびその同族パートナＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン−結合性蛋白質）のよく特徴付けられた相互作用を用いた。この相互作用は未処理細胞では極低いレベルで生じるが、免疫抑制剤ラパマイシンにより顕著に誘発される。ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ相互作用を標識とするヒトの成長（ｇｒｏｗｔｈ）経路の構成は、図６Ａに示した。
【０１３２】
この研究では、ＹＦＰ  ＰＣＡを用いた。９６−穴プレート中にＨＥＫ２９３Ｅ細胞をウェル当たり１３，０００個の細胞濃度で接種した。細胞培地はＭＥＭ−アルファ増殖培地とした。総容量は１００μｌとした。トランスフェクションの前に、細胞を２０乃至２４時間増殖させた−トランスフェクション時には細胞は７０乃至８０％の密集状態にあった。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞のトランスフェクションは、Ｆｕｇｅｎｅ（ロッシュ社）によりウェル当たり計０．１μｇのＤＮＡを用いて行った。ＦＫＢＰ−ＹＦＰ［ｌ］およびｍＴＯＲ−ＹＦＰ［２］を発現するＨＥＫ２９３を、以下の通り、漸増用量のラパマイシンで処理した。トランスフェクションの２４時間後、各ウェルに１００μｌの新鮮培地を加え、さらに２０乃至２４時間インキュベートした後に３７℃、５％ＣＯ２でラパマイシンによる誘発を行った。各ウェルにはラパマイシンの適切な希釈液を含む１００μｌの培地を加えた。次いで、このプレートを組織培養インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）中で２．５時間インキュベートした。次に、各ウェルを（３７℃に予め加温した）２００μｌのＨＢＳＳで洗浄した後、ウェル当たり１００μｌのＨＢＳＳを加えた。このプレートを組織培養インキュベータに１時間戻した後、励起４８５ｎｍ、発光５２７ｎｍでプレートリーダーによる読み取りを行った。
【０１３３】
図６は、このアッセイの結果として、ＦＫＢＰとｍＴＯＲ（ｍＴＯＲは、ヒト蛋白質であるＦＫＢＰ−ラパマイシン結合性蛋白質ＦＲＡＰのマウス相当物である）との相互作用に対するラパマイシンの効果を示すものである。ラパマイシンはＦＫＢＰとｍＴＯＲとの複合体形成を誘導したが、これは顕微鏡法により認めることができ（図６Ｂ）、それぞれ４８５および５２７ｎｍの励起および発光波長を用いた９６−穴プレートにおける蛍光分光により数値化することができる。このようなアッセイ法を、小分子、天然物、コンビナトリアル、ペプチドもしくはｓｉＲＮＡのライブラリと組み合わせて用いることにより、蛋白質−蛋白質相互作用に直接作用するか、ＰＣＡ標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）の上流に作用して前記蛋白質−蛋白質複合体を賦活もしくは阻害する分子を同定することができる。
【０１３４】
［実施例４］
ＰＣＡによる遺伝子毎の相互作用のマッピング
図１から明らかなように、蛋白質−蛋白質相互作用は、遺伝子毎の相互作用のマッピングなどの種々の方法により同定することができる。本発明の態様をさらに明示し、ＰＣＡを系統的に適用することにより相互作用する蛋白質を迅速大量に同定することができることを示すために、遺伝子毎の相互作用のマッピングを行って新規な蛋白質−蛋白質相互作用を同定した。遺伝子毎の相互作用のマッピングは、互いに対して規定されたセットの遺伝子をテストすることが望まれる場合に、またはアッセイの最適化のために、おとり（ｂａｉｔ）対ライブラリ・スクリーニングに代わるものとなる。さらに、遺伝子毎の相互作用のマッピングでは、完全長の蛋白質を他の完全長の蛋白質との相互作用についてテストすることが可能になる。この原理を示すために、図１６によってデザインしたＹＦＰ  ＰＣＡ構築物内のランダムに選択した完全長ｃＤＮＡを、９６−穴式プレート内にＹＦＰ［ｌ］／ＹＦＰ［２］ペアとしてロボットを用いてプールし、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬を用いて各ＤＮＡプールの５０ｎｇをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションした。細胞の各９６−穴マイクロタイター・プレートは異なる蛋白質−蛋白質ペア形成を示す２８種のＰＣＡおよび４組の対照（１組の陽性対照および３組の陰性対照）を含み、これらは全て３回ずつアッセイした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をヘキスト３３３４２と短時間インキュベートすることにより、標準化のために各ウェルの細胞計数を行った。蛍光強度の測定値は、ＹＦＰもしくはヘキストに適切な個別の設定によりモレキュラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレート・リーダーを用いて得た。データは統計解析のため転送し、リレーショナル・データベースとして保存した。陰性対照と統計的に異なる相互作用を（スチューデントｔ−検定により求めた）有意水準および平均蛍光単位により選別した。
【０１３５】
解析した６４１のアッセイ結果から、プレートリーダー・アッセイで得たデータと顕微鏡法で得た画像データとの一致率は８８．８％であった。図７（Ａ、Ｂ）は、２つのプレートによるスクリーニング結果を示す。各プレートは、４組の対照（１組の陽性対照と３組の陰性対照）の他に、異なる遺伝子ペア形成を示す２８種のＰＣＡを含み、これらは全て３回ずつアッセイした（ｘ軸に表示）。ｙ軸は各ＰＣＡの平均蛍光強度測定値を示し、測定誤差は９５％信頼区間として示した。陽性対照はｐ６５／ｐ５０とし、陰性対照はＰＤＫ１／ＰＤＫ１とした。各プレートの陰性対照は赤で、陽性対照は黄色で強調表示した。陰性対照と統計的に異なる相互作用は、説明文にあるように色分けして、平均蛍光のスチューデントｔ−検定により求めた各測定値に関連する統計的有意水準を示した。このアッセイで得られるシグナル強度の陽性対照に対する較差を表すｙ軸がパネルＡとパネルＢで異なることに留意されたい。このアッセイは、ＨＴＳもしくはＨＣＳ方式による薬の発見のための対象経路内の蛋白質−蛋白質複合体の同定、またはアッセイ形成のための遺伝子ペア配向の最適化に用いることができる。
【０１３６】
図７（Ｃ）は、自動顕微鏡法により得られた個々のウェル内の細胞の画像を示す。図７Ａおよび７Ｂの場合、プレート・リーダーでＹＦＰ  ＰＣＡの蛍光強度を定量した後、ディスカバリ−１（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１）撮像装置（ユニバーサル・イメージング社）で同じ９６−穴プレートから画像を獲得した。対照ウェルのヘキスト染色細胞（図７Ｄの青色染色した細胞）を用いてプレート全体にわたって画像を獲得するための適切な焦点面を確立した。次いで、１０×の対物レンズを用い、ヘキストおよびＹＦＰのそれぞれに適した波長で各ウェルの２箇所から画像を獲得した。パネルＣでは、プレート全体にわたって合併したビューを見ることができる。陽性および陰性対照ならびに「新規な」陽性の例をパネルＤに示した。パネルＤにおいて「新規」蛋白質−蛋白質相互作用が主に細胞質に局在している場合から明らかなように、細胞内局在パターンに関する情報を得ることができる。図７に示した相互作用マッピングは、同じリンカー長、プロモータおよびレポータ断片を有する「一般的なベクター」を用いて行ったことに留意されたい。これにより、完全長ｃＤＮＡの半自動サブクローニングが可能になり、各アッセイのために個別にベクターを構築する必要が無くなる。陽性シグナルを示すＤＮＡは、例えば、図５の例で新規ｈＦｔ１／ＰＫＢ相互作用について示したように経路の賦活剤および阻害剤を加えることによって、さらに特徴付けることができよう。従って、本発明の利点は、蛋白質−蛋白質相互作用を迅速にマッピングすることができ、ハイスループット・アッセイおよび／またはハイコンテント・アッセイで生細胞内の各相互作用を同時に特徴付けることができること、ならびに、その後、同じＰＣＡ構築物を用いることにより、これらの蛋白質複合体がＰＣＡにおいて意味した経路を賦活もしくは阻害する分子の強固で安定なハイスループット・スクリーニング法を開発することができることにある。
【０１３７】
シグナル伝達経路内の一連の標的のマッピング、特徴付けおよびスクリーニング
従って、我々は、よく特徴付けられた細胞シグナル伝達経路の多数の個々の段階に対するアッセイ法の構築にＰＣＡを適用し、また、こうしたアッセイ法を化学物質ライブラリのスクリーニングに持ち込むことを試みた。図８は、ＮＦｋＢ転写因子複合体（ｐ６５／ｐ５０）の役割を含む、ＴＮＦ受容体から核に至る経路の構成を示したものである。ＴＮＦがその受容体に結合すると、ＩＫＫ複合体が活性化され、その結果、プロテアソームによるＩｋＢａのリン酸化および分解が起こる。ＩｋＢａが分解すると、ＮＦｋＢ転写因子複合体（ｐ６５／ｐ５０）が遊離型となって細胞質から核へ転位し、そこで炎症に関与する遺伝子の転写を開始させることができる。ＡＬＬＮ、エポキソミシン（および現在使われている抗癌剤ベルケード（Ｖｅｌｃａｄｅ）（商標））などのプロテアソーム阻害剤はＩｋＢａの分解をブロックし、細胞基質にＮＦｋＢの貯留を生じる。
【０１３８】
抗ＴＮＦおよび抗プロテアソーム療法は、それぞれ炎症および癌の治療に有効であることが分かっている。このため、経口的に使用できる新規薬剤の主成分となるＴＮＦ経路の新規な小分子阻害剤を同定することに大きな関心が持たれている。我々はこの原型的経路を用いて本発明の以下の態様を明示した：（１）本発明の使用によるシグナル伝達経路の蛋白質成分のマッピングおよび経路の活性を報知する「標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）」アッセイの構築；（２）本発明の使用による、蛋白質機能もしくは細胞内状況とは無関係な、シグナル伝達カスケードの一連の事象につてのハイコンテントおよび／またはハイスループット・アッセイ；（３）本発明の使用による一過性アッセイもしくは「ＰＣＡインサイド（Ｉｎｓｉｄｅ）」を用いた安定な細胞株の作製；（４）種々のレポータおよび計測情報と併せた本発明の使用による単色および多色アッセイを含むアッセイの構築；（５）：経路の賦活および阻害を検出し数値化する際の本発明の使用；ならびに（６）小分子ライブラリのスクリーニングに本発明を使用することによる治療的性質を有すると考えられる阻害剤の同定。
【０１３９】
［実施例５］
生細胞内の個々の蛋白質-蛋白質複合体の可視化
図１に示した一般的なスキームに従って、ＴＮＦ経路の既知のエレメントをコードする完全長のｃＤＮＡを用い、また、ＤＨＦＲ  ＰＣＡ（赤色蛍光）および／またはＹＦＰ  ＰＣＡ（黄色／緑色蛍光）を用いて一連のＰＣＡを構築した（図９）。これらのＰＣＡ構築物では、ｐ６５、ｐ５０、ＣＢＰ、ＣＢＰｎｔ、ＴＮＦＲＩ、ＴＲＡＦ２の読み取り枠およびユビキチンの単一コーディング単位をＰＣＲ増幅させ、ＤＨＦＲもしくはＹＦＰの相補性の断片にインフレームで融合させ、ｐＣＤＮＡ３．１ｚｅｏ中にサブクローニングした。遺伝子のＲＥＦＳＥＱもしくはＧＥＮＢＡＮＫ識別子としては、ＮＭ００９０４５（ｐ６５／Ｒｅ１Ａ）、ＮＭ００３９９８（ＮＦｋＢｌ／ｐ５０）、ＡＹ０３３６００、ＮＭ００４３８０（ＣＢＰ）、ＮＭ００３８２４（ＦＡＤＤ）、ＮＭ００３７８９（ＴＲＡＤＤ）、ＢＣ０３３８１０（ＴＲＡＦ２）、ＸＭ０３２４９１（ＩＫＫベータ）、ＢＣ０００２９９（ＩＫＫガンマ）およびユビキチンＣ（ＢＣ０３９１９３）を使用した。ＣＢＰｎｔ［（Ｓ６６３８５（１．．２３１３）］はＣＢＰのアミノ末端７７１個のアミノ酸に相当する。ユビキチンＣは７６ｋＤａユビキチン単量体に相当する。
【０１４０】
アッセイ法構築の方法は以下の通りであった。ＤＨＦＲ断片Ｆ［１，２］およびｆ［３］は、それぞれマウスＤＨＦＲ残基１乃至１０５および１０６乃至１８６に相当する（ペルティエ（Pelletier）、キャンベル−バロアほか（Campbell-Valois et al.）１９９８年）。ＤＨＦＲ  ＰＣＡでは、対象蛋白質をコードするＤＮＡをＤＨＦＲ−Ｆ［１，２］およびＤＨＦＲ−Ｆ［３］の５’もしくは３’末端に結合させることにより、それぞれＮもしくはＣ末端融合体を作製した。（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３０）からなる可変リンカーにより対象遺伝子とＤＨＦＲ断片とを離隔した。ＤＨＦＲ  ＰＣＡ構築物の一過性発現では、８ｘ１０４個のＣＨＯ  ＤＵＫＸＢ１１（ＤＨＦＲ−欠損）細胞を１２穴プレート中に接種し、２４時間後に、Ｆｕｇｅｎｅ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））をメーカーの使用説明書に従って用い、融合構築物の相補性ペアを１：１のモル比で含むウェル当たり１μｇのＤＮＡでコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を増殖培地（アルファ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清）中３７℃で２時間、４μＭのテキサスレッド−メソトレキサート（モレキュラー・プローブズ社／インビトロゲン社）と共にインキュベートした。２種の対象蛋白質を相互作用させると、ＴｘＲ−ＭＴＸが再構成ＤＨＦＲに結合する。未結合のＴｘＲ−ＭＴＸは、洗浄後、新鮮培地で３０分間インキュベーションすることにより除去した。細胞を観察し、ニコン・エクリプス（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＴＥ１０００蛍光顕微鏡を用いて励起波長５８０ｎｍおよび発光波長６２５ｎｍで画像を獲得した。
【０１４１】
ＹＦＰ  ＰＣＡでは、選択したｃＤＮＡの読み取り枠を、上記の１０−アミノ酸可変リンカーにより離隔した相補性ＹＦＰ断片にインフレームで融合させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（インビトロゲン社）を、ポリ−Ｌ−リジン被覆９６−穴プレート中に１．５×１０４個／ウェルの濃度で接種した後、融合構築物の相補性ペアを１：１のモル比で含むウェル当たり１００ｎｇのＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ディスカバリ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）−１自動顕微鏡（ユニバーサル・イメージング社／モレキュラー・デバイス社）を用いて励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２７ｎｍで観察した。
【０１４２】
ＴＮＦシグナル伝達経路に関与することが知られているいくつかの蛋白質は、生細胞内でＰＣＡにより容易に検出することができる蛋白質−蛋白質複合体を形成した。これらの一部を図９に示した。黄色／緑色で示した蛍光シグナルはＹＦＰ  ＰＣＡを表し、赤色で示したシグナルはＤＨＦＲ  ＰＣＡを表す。一過性にトランスフェクションした細胞においてＰＣＡにより選択した蛋白質−蛋白質複合体の強い蛍光シグナルおよび正確な細胞内局在を検出することができた。ＰＣＡによって観察される複合体としては、ＴＮＦＲＩ／ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩ／ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ／ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ／ＴＲＡＦ２、ＦＡＤＤ／ＴＲＡＦ２；ＩＫＫ複合体サブユニットＩＫＫベータ／ＩＫＫガンマ、アダプタＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤおよびＴＲＡＦ２を有する種々のＩＫＫ蛋白質；ＩＫＫガンマ／ＴＮＦＲＩ、ＩＫＫベータ／ＩカッパＢアルファ、ＩＫＫガンマ／ＩｋＢアルファ、ＩｋＢａ／ｐ６５、ＩｋＢａ／ｐ５０、ならびにホモ−およびヘテロ−２量体複合体としてのＮＦｋＢサブユニットｐ６５およびｐ５０；ならびにＩｋＢａ／ユビキチン（Ｕｂ）などのユビキチン複合体など、これまでに立証された全ての相互作用が挙げられる。さらに、我々は、ｐ５０、ｐ６５およびＩｋＢａと上流アダプタ分子ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤおよびＴＲＡＦ２との間のこれまでにまだ報告されなかった相互作用を観察した。これらのアダプタ蛋白質は、リガンド媒介性の受容体三量体形成時にＴＮＦ受容体に動員される。これらの転写因子との相互作用から、シグナル伝達カスケードの末端段階に関与する蛋白質からなるマルチ・サブユニット複合体の存在が示唆される。複合体の細胞内部位（subcellular location）はその細胞内での機能と整合している。例えば、ＴＮＦ受容体は、自己結合してプラズマ細胞膜に明確に局在する複合体（ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ１）を形成する３つの同一サブユニットからなる。ＰＣＡにより、主として細胞質に蛋白質複合体ＴＲＡＦ２／ＩｋＢａ、ＴＲＡＦ２／ｐ６５、ＩｋＢａ／ｐ６５、ＩＫＫベータ／ＩＫＫガンマおよびｐ６５／ｐ５０、主として核にＣＢＰ／ＣＢＰおよびＣＢＰ／ｐ６５複合体を明確に認めた。さらに、ＹＦＰの１断片に融合したユビキチン単量体をコードするＤＮＡおよびＹＦＰの相補性の断片に融合したＩｋＢａの完全長ｃＤＮＡを用いてＰＣＡを構築することによりユビキチン結合を直接観察することができた。これは、生細胞内でのユビキチン結合蛋白質の最初の直接的な視覚化であり、我々の知る限りでは、他の技術でユビキチン−蛋白質複合体を直接検出することは可能ではない。
【０１４３】
［実施例６］
多色アッセイ法
また、それぞれが異なる蛍光シグナルを生成する種々のレポータを用いてＰＣＡを構築することができることにより、多色アッセイ法の構築も可能になる。この原理の証明として、／ｐ６５複合体を、ＤＨＦＲ  ＰＣＡにより検出されるＣＢＰ／ｐ６５複合体（赤色）を同時に発現する細胞においてＹＦＰ  ＰＣＡ（黄色／緑色）を用いて可視化した。同時に、前述のようにして、ＤＨＦＲレポータ融合体ＤＨＦＲ−Ｆ［１，２］−ＣＢＰｎｔおよびｐ６５−ＤＨＦＲ−Ｆ［３］、ならびにＹＦＰレポータ融合体ＩｋＢａ−ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］−ｐ６５を用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＴｘＲ−ＭＴＸで染色し、ＤＨＦＲ  ＰＣＡおよびＹＦＰ  ＰＣＡについてそれぞれ記載したようにして顕微鏡により視覚化した。図９から明らかなように、ＩｋＢａ／ｐ６５複合体により生成されるシグナルが細胞基質内に局在する（ＹＦＰ  ＰＣＡにより生じる黄色／緑色シグナル）のに対して、ＣＢＰ／ｐ６５により生成されるシグナルは核内に明確に局在する（テキサスレッドを用いたＤＨＦＲにより生じる赤色シグナル）。
【０１４４】
この実施例では、本発明と、完全な状態のＧＦＰによるｐ６５の標識に依存するこれまでのｐ６５の検討結果（例えば、ＪＡシュミットほか（JA Schmid et al.）、２０００年、「緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質を用いたＮＦｋＢおよびＩｋＢａの動力学の検討」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２７５（２２）：ｐ１７０３５−１７０４２）との違いを浮き彫りにしている。後者の場合、検討されているのは、ｐ６５の細胞内区画のみである。ＰＣＡの場合、図９に示したように、検討されているのは、異なる細胞内区画（それぞれ、細胞基質および核）内の種々の蛋白質（ＩｋＢａおよびＣＢＰ）とｐ６５との相互作用である。Ｐ６５はＴＮＦのシグナル伝達カスケードの連続した段階において異なる蛋白質と相互作用するので、ＰＣＡを用いると、ＴＮＦ誘導性シグナル伝達の高忠実度の検出が可能になる。さらに、ＰＣＡを用いて多色、マルチパラメトリック分析法を構築することができることにより、細胞生物学、生化学およびシグナル伝達分野において広範囲な基礎研究を可能にする柔軟な方法、ならびにアッセイのデザインおよび開発において並はずれた柔軟性および効率が得られる。
【０１４５】
生細胞におけるハイコンテントおよびハイスループット・アッセイ法の構築。ＴＮＦ経路の前記アッセイ法のうちの３つ（ｐ５０／ｐ６５、ｐ６５／およびＩｋＢａ／ユビキチン）を用いて、動的な経路の賦活および阻害の検出が可能になることを明らかにした。図１に示したように、これらのアッセイ法の原理は、経路が、事実上、複合体内の蛋白質の物理的な結合、解離もしくは運動を含む一連の段階であるということである。これらの事象は、生細胞においてリアルタイムに特定の細胞内区画で起こる。本発明によって、任意の経路内の任意の蛋白質のこうした動的な事象を測定するアッセイ法の構築が可能になる。我々は、３つの異なる標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）のアッセイ法を構築し、その情報が経路活性の感度の良い指標であることを示すことによって本発明のこの態様を明示する。ＩｋＢａ／ｐ６５複合体の場合、ＴＮＦ経路の賦活化によりプロテアソームによるＩｋＢａ／ｐ６５の分解が生じる。このため、ＩｋＢａ／ｐ６５複合体から生じる全蛍光はＴＮＦ処理で低減し、この作用はプロテアソーム阻害剤によりブロックすることができる。ＮＦｋＢ（ｐ６５／ｐ５０）転写複合体の場合、ＴＮＦ経路の賦活化によりＩｋＢａによる阻害からｐ６５が解放される。従って、このｐ６５／ｐ５０複合体は、細胞基質から核へ再分配される。プロテアソーム阻害剤で前処理しておくと、ＩｋＢａの分解がブロックされることにより、ＮＦｋＢ複合体は細胞基質内に保持される。後者のアッセイ結果は、こうした複合体の細胞内部位（subcellular location）を検出することができるＰＣＡを用いてハイコンテント方式で読み取ることができる。ＩｋＢａ／ユビキチンの場合、ＩｋＢａの分解をブロックするプロテアソーム阻害剤によってＩｋＢａ／ユビキチン複合体の蓄積が起こる。後者のアッセイ結果は、ハイコンテント（自動顕微鏡もしくは自動イメージング）またはハイスループット（大量（ｂｕｌｋ）の蛍光）方式で読み取ることができる。
【０１４６】
これらのアッセイ法のうちの任意のもの、もしくは全てがＴＮＦシグナル伝達の阻害剤のスクリーニングに有用となる。Ｐ５０／ｐ６５のハイコンテント・アッセイを利用したスクリーニング作戦（ｃａｍｐａｉｇｎ）についての詳細を以下に説明する。特にこれらのアッセイ法は、抗炎症作用および／または抗癌作用を有する物質の同定に有用となろう。さらに詳細に検討した３つの「標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）」ＰＣＡは全て、ＡＬＬＮなどのプロテアソーム阻害剤の感度の良い検出手段出会った。最後に、蛋白質のユビキチン結合を検出することができることにより、ユビキチン結合によって分解される蛋白質の大規模なスクリーニングが可能となる。このような化合物に対する感度の良い特異的なアッセイ法は、プロテアソーム阻害剤である市販薬「ベルケード（商標）」が強力な抗腫瘍作用を有することから、製薬業界では特に関心が持たれている。
【０１４７】
［実施例７］
ＮＦｋＢ転位のハイコンテント・アッセイ
ＰＣＡを用いて生細胞における経路の賦活化および阻害を検出することができることを明示するために、我々は、先ず、ＴＮＦ−アルファへの反応によるｐ６５／ｐ５０複合体の核転位量を測定し、ＡＬＬＮによる阻害を評価するための一過性ハイコンテント・アッセイ法を構築した。融合遺伝子は、ＹＦＰ［１］−ｐ５０のゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）選択マーカおよびＹＦＰ［２］−ｐ６５のハイグロマイシン・マーカを含むｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロゲン社）中にサブクローニングした。（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）からなるリンカーにより対象遺伝子とＹＦＰ断片を離隔した。ＣＨＯ  ＤＵＫＸＢ  １１細胞を９６−穴プレートに８×１０３個／ウェルの濃度で接種し、２４時間後に、Ｆｕｇｅｎｅ（ベーリンガー・マンハイム社）をメーカーの説明書に従って用い、１：１のモル比のＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］融合体遺伝子でトランスフェクションした。各サンプルにつきウェル当たり計２０ｎｇのＤＮＡを用いた。トランスフェクションの３６時間後、細胞を、０．２５％ＦＢＳを補充したａＭＥＭ中でさらに１６乃至１８時間インキュベートすることにより、血清不足状態にした。サイトカインによる誘導を行うため、一部の細胞を２５ｎｇ／ｍｌのｍＴＮＦ（ベーリンガー・マンハイム社）で３０分間処理した。ＮＦｋＢの核転位に対するプロテアソーム阻害の影響を調べるため、上記の血清不足状態の細胞を、ｍＴＮＦアルファによる誘導期間の前および期間中に４０μｇ／ｍｌのALLN（カルビオケム社）で１時間処理した。次いで、この細胞をＰＢＳで洗浄し、ＮＦｋＢ複合体の細胞内部位（subcellular location）を可視化して、ニコン・エクリプスＴＥ２０００蛍光顕微鏡を用いて励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２７ｎｍで画像を獲得した。蛍光強度の定量的な分析はメタモルフ（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ）ソフトウェア（ユニバーサル・イメージング社、モレキュラー・デバイシズ社）を用いて行った。
【０１４８】
図１０は、ＹＦＰ  ＰＣＡを用いた、ＣＨＯ細胞内のＮＦｋＢ（ｐ６５／ｐ５０）の細胞質から核への転位に対する一過性アッセイの結果を示す。ＴＮＦの非存在下では、このｐ６５／ｐ５０複合体は、細胞基質と核との間で均等に分布した。ＴＮＦ処理細胞では、核対細胞質蛍光比は平均２倍増加し、ｐ６５／ｐ５０複合体は、蛍光顕微鏡により生細胞の核内に可視化することができた。次いで、我々は、よく特徴付けられたプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮによるＮＦｋＢ核転位の阻害を明らかにすることを試みた。ｐ５０およびｐ６５の相補性ＹＦＰ断片融合体を共発現するＣＨＯ細胞をＴＮＦの非存在下もしくは存在下にインキュベートした。示されている場合、細胞は、プロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮで前処理した。各細胞の核および細胞質内の平均蛍光強度を測定し、比率で表した。ＡＬＬＮはＹＦＰ  ＰＣＡアッセイにおいてＮＦｋＢ複合体の細胞質から核へのＴＮＦ誘導性転位を阻害した。サイトカインおよび阻害剤の作用は個々の細胞の分析から容易に明らかとなったが、一過性トランスフェクションにより細胞間に著しい不均一性が生じた。従って、我々は、多様な小分子、既知薬物および天然物ライブラリのスクリーニングに用いるための、「内部にＰＣＡ」を有する安定な細胞株を確立することを試みた。
【０１４９】
［実施例８］
内部にＰＣＡを有する安定な反応性細胞株
安定な細胞株は、冷凍貯蔵細胞からいつでもアッセイを再構築することができるので、ＨＴＳの標準となる。内部にＰＣＡを有する確固たる安定細胞株の構築を明示するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（ジェミニ・バイオ−プロダクツ社（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））、１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシンを補充したＭＥＭアルファ培地（インビトロゲン社）中で増殖させ、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータ内に維持した。先ず、細胞を、ＹＦＰ［２］−ｐ６５をコードするベクターを用いてコトランスフェクションし、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（インビトロゲン社）を用いて安定な細胞株を選択した。次いで、選択した細胞株をＹＦＰ［ｌ］−ｐ５０でトランスフェクションした。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび５００μｇ／ｍｌのゼオシンによる二重抗菌性選択の後、ＹＦＰ［ｌ］−ｐ５０／ＹＦＰ［２］−ｐ６５を発現する安定な細胞株を単離した。免疫ブロット分析および蛍光顕微鏡法により、その融合体遺伝子を安定的に発現する細胞クローンを同定した。各トランスフェクタントの単一細胞株を選択してさらに特徴付けを行った。これらの株の蛍光は、少なくとも２５継代にわたって安定である（データは示されていない）。安定なＭＥＫ／ＥＲＫ細胞株−下記のようにして構築した−は、ＴＮＦ作用のための対照として用いた。全てのトランスフェクションで、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（ロッシュ社）をメーカーの説明書に従って使用した。ＹＦＰ［ｌ］−ｐ５０／ＹＦＰ［２］−ｐ６５を安定的に発現する細胞を、壁の黒いポリ−リジン被覆９６−穴プレート（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ））中に２０，０００個／ウェル接種した。２４時間後、これらの細胞をヒトＴＮＦ−アルファ（ロッシュ社）と共に３０分間インキュベートした。次いで、核を１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で１０分間染色した。細胞はＨＢＳＳ（インビトロゲン社）で洗浄し、同じ緩衝液中に保存した。次に、蛍光を可視化し、それぞれ４７０／３５および５３５／６０の励起および発光フィルターを取り付けたディスカバリ−１（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１）自動蛍光撮像装置（モレキュラー・デバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて画像を獲得した。示されている場合、細胞を２５μＭのＡＬＬＮ（カルビオケム社）で６０分間処理した後、この阻害剤を存在させたまま、ＴＮＦによる誘導を行った。下記のハイスループット・スクリーニング作戦では、細胞は、化合物（１０μＭ）で６０分間前処理した後、薬物の存在下にＴＮＦアルファで３０分間刺激した。次いで、細胞をＨＢＳＳの２％ホルムアルデヒド溶液で固定した後、ヘキスト３３３４２で染色した。液処理は全て、バイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）ＦＸ（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））機器を用いて行い、画像は前述のようにして獲得した。画像の解析はイメージＪ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて行った。転位は、所与の条件のいくつかの画像に対して（ｎで示した）細胞集団の平均蛍光強度の核／細胞質比を算出することにより評価した。
【０１５０】
図１１から明らかなように、上記安定細胞株では、ＴＮＦ処理を行わない場合、ｐ５０／ｐ６５複合体は主として細胞質に局在した（パネルＡ）。ＴＮＦ処理を行うと、ｐ５０／ｐ６５複合体は核内へ転位した（パネルＢ）。対照として用いた安定なＭＥＫ／ＥＲＫ  ＰＣＡでは、ＭＥＫ／ＥＲＫ複合体は細胞基質に局在した（パネルＣ）。ｐ５０／ｐ６５による結果とは対照的に、ＴＮＦはＭＥＫ／ＥＲＫ  ＰＣＡ細胞株では作用を示さなかった（パネルＤ）。以上の結果から明らかなように、ＰＣＡ構築物が比較的低いレベルで発現される条件下でも、強い蛍光シグナルが認められた。また、我々は、これらの遺伝子操作した細胞株が少なくとも２０継代にわたって安定な蛍光を示すことを見出した（データは示されていない）。
【０１５１】
ＮＦｋＢシグナル伝達のハイコンテント分析のためのこれまでの方法は、抗ｐ６５抗体を用いる免疫細胞化学か、完全な状態の蛍光蛋白質に融合したｐ６５の発現に依存していた。今回の場合も、図１１は、これらの断片自体はシグナルを生じないという重要な特徴を示している。図１１（ＥおよびＦ）から明らかなように、単一のＰＣＡ融合体（ｐ６５−ＹＦＰ［２］）を含む安定細胞株は蛍光シグナルを生じなかった。ＰＣＡの場合、シグナルの生成は、相補性の断片が融合する相手の２つの分子の効果的な相互作用を介する断片の相補性に依存している。従って、本発明は、細胞内の個々の蛋白質の動きをモニターする他の方法とは明らかに異なるものである。
【０１５２】
さらに、我々は、定量的な画像解析により安定なｐ５０／ｐ６５細胞株の特性を決定した（図１２［Ａ］）。個々の細胞の核および細胞質の平均蛍光量を定量し、Ｎ：Ｃ蛍光比を算出した。このｐ５０／ｐ６５細胞株を漸増用量のＴＮＦで処理すると、Ｎ：Ｃ比は０．４７から１．４２へ３倍の増加を示し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦで最大の２分の１の反応が認められた。このＴＮＦ反応の経時変化を分析すると、ｐ５０／ｐ６５の核内への転位は５分のｔ１／２で起こることが明らかとなった。１５分で最大の反応が見られた後、６０分で減少し、ＮＦｋＢ賦活のフィードバック回復と一致していた。細胞集団全体にわたって、ｐ５０／ｐ６５のＮ：Ｃ比の変化は統計的に高度に有意であった（ｐ＜０．０００１）。４つの独立した実験の結果を分析すると、ＴＮＦに対するＰＣＡ反応には一貫性がある（アッセイ間ＣＶ＝５．９；データは示されていない）ことが分かった。このアッセイ法は、経路刺激に対する内在性転写因子の反応を機能的に極めて忠実に再現しており、ＴＮＦシグナル伝達経路の感度の良い指標である。
【０１５３】
以上の安定な細胞株がＴＮＦ／ＮＦｋＢ依存性経路の新規阻害剤の同定に適しているかどうかを確認するために、我々は、先ず、上記ｐ５０／ｐ６５  ＰＣＡを用いてプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮの作用を調べた（図１２［ｂ］）。その結果、ＡＬＬＮを４時間処理すると、ｐ５０／ｐ６５複合体のＮ：Ｃ比のＴＮＦによる増加は７６％ブロックされた。こうした結果から、ＰＣＡによるＮＦｋＢ複合体の視覚化は、ユビキチン／プロテアソーム媒介性事象を介するＴＮＦシグナル伝達により調節されることが明らかとなり、さらに、これはＨＴＳ設定で新規治療剤を同定するための感度の良いアッセイ法になることが示唆された。
【０１５４】
［実施例９］
ＰＣＡによる化学物質ライブラリのハイスループット・スクリーニング
ハイスループット・スクリーニングにおけるＰＣＡの利用を明示するために、前記ｐ５０／ｐ６５  ＰＣＡを発現するように遺伝子操作された細胞を用いて、化合物のジェネシス・プラス・コレクション（マイクロソース・ディスカバリ・システムズ社）をアッセイした（図１２［Ｃ］）。ジェネシス・プラスは９６０種の化合物のコレクションであり、毒性もしくは蛍光性が既知の化合物を含む。このような特性を有する化合物を含めることは、これらが分析を複雑にするので、ＨＴＳアッセイのバリデーションにおいて重要である。ウェル中の化合物の最終濃度は１０μＭとし、全てのウェルにはＤＭＳＯを０．５％の濃度で含ませた。細胞は化合物（もしくはビヒクル）で９０分間処理した後、２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦで３０分間処理した。固定および核の染色後、自動蛍光顕微鏡プラットホーム（ディスカバリ−１；ユニバーサル・イメージング社／モレキュラー・デバイス社）を用いて蛍光を分析した。
【０１５５】
平均ＮＣ比は、前述のように、自動画像解析によって得、化合物処理したウェルを非刺激およびＴＮＦ刺激対照ウェルと比較した。この的を絞ったライブラリ・スクリーニングの結果およびＴＮＦ反応のプレート間の変動については図１２（Ｃ）に示した。一般に用いられているアッセイ信頼性（ａｓｓａｙ  ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）の基準値であるＺ係数は、既知の活性化合物および蛍光化合物の数が大きいため、この化合物のサブセットには適用できない。我々は、対照ウェル全体にわたって同じ統計パラメータを測定してアッセイの質を推定するＺ’係数を用いた。このＺ’値は、平均値が０．６２７、１２のアッセイ・プレート全体の中央値が０．６７であった。蛍光性および毒性化合物はＮＣ比の自動解析で容易に特定することができるので、これらの性質を有する化合物は、スクリーニング作戦では擬陽性として確認することができることが分かった（データは示されていない）。前記ＮＦｋＢ経路に作用することが知られているこのセットの化合物ロテノンおよび３−メチルキサンチンは、このアッセイのヒットと呼んだ。
【０１５６】
この化合物セットの中のこの経路の既知の阻害剤の他に、我々は新規なＮＦｋＢ経路の阻害剤を同定した。例えば、ヒットの確認および８−ポイント用量−反応解析から、我々がＯＤＣ００００１６０と命名した化合物は１．１μＭのＩＣ５０で前記ｐ５０／６５  ＰＣＡアッセイを阻害し、細胞利用のアッセイのスクリーニング・ヒットとして比較的強力であることが分かる（図１２［Ｄ］）。この化合物は、ヒト臨床試験で用いられたことがあるが、これまでＮＦｋＢ経路と結びつけられたことはない。明らかに、このアッセイでのその活性は機構上の意味を有すると考えられ、これは、ＯＤＣ００００１６０がヒト腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができるという事実（データには示されていない）により裏付けられた考え方である。標準的なプロトコルを用いたヘキスト染色による細胞数および核形態の分析で可能となる毒性化合物の同時的除外によって、これらのアッセイで得られるヒットに対する信頼性が増加する。
【０１５７】
［実施例１０］
ＰＣＡ法の一般性
さらに、ＰＣＡに対して任意のレポータを併用することができることを明らかにするため、我々は、ＤＨＦＲ  ＰＣＡを用いたＴＮＦ経路のアッセイ法についても構築した（図１３）。ＮＦｋＢサブユニットｐ６５およびｐ５０（Ｎ−末端４３６個のアミノ酸に相当）のコーディング領域を、それぞれマウスおよびヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、ｐＣＤＮＡ３．１ｚｅｏ（インビトロゲン社）内で１５アミノ酸可変リンカー（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３０）、次いでＤＨＦＲ断片Ｆ［１，２］もしくはＦ［３］の下流にインフレームで結合させた。ｐＣＤＮＡ３．１には別個にＩｋＢａをサブクローニングした。これらの遺伝子の一過性発現のために、８×１０４ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞を１２穴プレートに接種し、２４時間後に、Ｆｕｇｅｎｅ（ベーリンガー・マンハイム社）をメーカーの使用説明書に従って用い、［Ｆ１，２］−ｐ６５、［Ｆ３］−ｐ５０およびＩｋＢａを各融合構築物のモル比１：１：１で用いてトランスフェクションした。対照には、示されている場合、ＩｋＢａの代わりに空のｐＣＤＮＡ３．１を用いた。ＤＮＡはウェル当たり計１μｇ用いた。
【０１５８】
トランスフェクションの４８時間後、蛍光顕微鏡により［Ｆ１，２］−ｐ６５および［Ｆ３］−ｐ５０の複合体を検出した。一過性にトランスフェクションした細胞は、増殖培地（（アルファ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清）中３７℃で２時間、４マイクロＭのＴｘＲ−ＭＴＸ（モレキュラー・プローブズ社）と共にインキュベートした。相補性の断片から構築したＤＨＦＲにＴｘＲ−ＭＴＸを結合させ、これをｐ６５およびｐ５０に融合させた。未結合ＴｘＲ−ＭＴＸは、洗浄した後、新鮮培地で３０分間インキュベーションすることにより洗い流した。サイトカインによる誘導を行うため、一過性にトランスフェクションした細胞を、上記３０分間の洗浄時に２５ｎｇ／ｍｌのｍＴＮＦアルファ（ベーリンガー・マンハイム社）と共にインキュベーションした。
【０１５９】
図１３はＤＨＦＲ  ＰＣＡの結果を示したものである。ＤＨＦＲ−Ｆ（３）／ｐ５０と共にＤＨＦＲ−Ｆ（１，２）／ｐ６５を一過性に共発現するＣＨＯ  ＤＵＫＸＢ１１細胞をＩ□Ｂでコトランスフェクションし、棒グラフに示したように、ｍＴＮＦアルファの存在下もしくは非存在下に３０分間インキュベートした。ＩｋＢａをコードする遺伝子をコトランスフェクションすると、ＴＮＦ非存在下、細胞基質内にｐ６５／ｐ５０複合体が保持され、ＴＮＦで処理すると、このｐ６５／ｐ５０複合体は細胞質から核へ転位した。図１３上段の顕微鏡写真は、ＮＦｋＢ複合体が主として細胞質に局在するＩｋＢａを共発現するサンプルからの代表的な蛍光画像を示したものである。図１３下段の顕微鏡写真は、ＮＦｋＢ複合体が主として核内に局在する、ＩｋＢａを共発現し、ＴＮＦで誘導されるサンプルからの代表的な蛍光画像を示したものである。我々は、一過性にコトランスフェクションした細胞においてＤＮＡ濃度が細胞内局在化に顕著な影響を与えることを観察した。ＮＦｋＢは、ＩｋＢａにより非刺激細胞の細胞質内に有効に保持される。この実験においてｐ５０／ｐ６５を高レベルで発現させると、その転写因子とこれのモジュレータとの間の均衡が妨げられた。ＩｋＢａに結合しない余剰のｐ５０／ｐ６５複合体はこうした細胞の核に自由に転位したが、この現象はＩｋＢａのコトランスフェクションにより是正することができ、これによりこのアッセイをＴＮＦ刺激に対し感受性にすることができる。これに対し、ＩｋＢａのコトランスフェクションは前述したより明るいＹＦＰ  ＰＣＡの場合には必ずしも必要ではない。何故なら、ＹＦＰシグナルの強度が高いためにＹＦＰ  ＰＣＡ構築物の極めて低いレベルの異所性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）発現を利用することができるからである。
【０１６０】
ＮＦｋＢの核への転位に及ぼすプロテアソーム阻害の影響を検討するために、ＤＨＦＲ  ＰＣＡを発現する一過性にトランスフェクションした細胞を、ＴｘＲ−ＭＴＸ標識の前の１時間およびその後の実験継続期間に、４０μｇ／ｍｌのＡＬＬＮ（カルビオケム社）で処理した。次いで、この細胞をＰＢＳで洗い、ニコン・エクリプスＴＥ２０００蛍光顕微鏡を用いて励起波長５８０ｎｍおよび発光波長６２５ｎｍで、ＮＦｋＢ複合体の細胞内局在を視覚化した。細胞の核および細胞質の平均蛍光強度は、ＮＩＨイメージ（Ｉｍａｇｅ）および／またはオープンラボ（ＯｐｅｎＬａｂ）（インプロビジョン社（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ））を用いて定量した。図１３（Ｂ）から明らかなように、プロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮは、このＤＨＦＲ  ＰＣＡアッセイにおいてＮＦｋＢ複合体のＴＮＦによる細胞質から核への転位を阻害する。ＡＬＬＮの存在下では、このｐ５０／ｐ６５複合体は細胞基質内に保持される。
【０１６１】
以上の一過性アッセイでの細胞間のばらつきは、予想されるように、安定な細胞株に比し、大きい。従って、一過性アッセイは相互作用のマッピングおよびアッセイのバリデーションには有用であるが、安定な細胞株は確固たる（ｒｏｂｕｓｔ）ＨＴＳおよびＨＣＳアッセイに好適である。安定な細胞株は、当業者に公知の種々の方法を用いて作製することができる。任意のＰＣＡに対して、安定な細胞株を、本明細書に記載した抗生物質抵抗性マーカその他各種の当業者に公知の選択マーカなどの選択マーカを用いて作製することができる。上記ＤＨＦＲ  ＰＣＡの場合、安定な細胞株は、本質的に、ＤＨＦＲ−細胞においてミフニクほか（Michnick et al.）がこれまでに報告しているように、生存−選択を利用して作製することができ、あるいは、ＤＨＦＲ  ＰＣＡを発現する細胞のみが選択圧下に生存することができるように、内在性ＤＨＦＲを含む細胞を用いてＭＴＸ選択圧を利用することができる。
【０１６２】
以上の結果から、所望の性質を操作して断片にすることによりアッセイの性能を向上させることができるというＰＣＡの特徴が浮き彫りになる。アッセイの正確な条件、所望の検出方法、バックグラウンドに対する必要なシグナル、および検討中のプロセスおよび標的の生体環境（ｂｉｏｌｏｇｙ）に応じて、ＰＣＡのレポータを任意に選択することができることは、本発明の利点である。
【０１６３】
［実施例１１］
蛍光強度の変化を利用したアッセイ：ＩｋＢａ／ｐ６５
ユビキチン結合およびプロテアソーム分解の結果であるＩｋＢａのＴＮＦ誘導性分解により、結合ＮＦｋＢが解放され、この転写因子の核内への転移が起こる。従って、ＩｋＢａ−ＮＦｋＢ複合体の分解はＮＦｋＢ媒介性遺伝子制御の重要な段階である。このレベルのＮＦｋＢ経路の調節を視覚化するために、我々はＩｋＢａ／ｐ６５  ＰＣＡを発現する安定な細胞株を作製した（図１４）。対照としてはＥＲＫ１／ＭＥＫ１を用いた。ＥＲＫ１をＹＦＰ［１］の５’末端に結合させると同時に、ＩｋＢａおよびＭＥＫ１をＮ−末端融合体としてＹＦＰ［２］に付加した。この融合遺伝子を、ＹＦＰ［１］−ｐ５０、ＩｋＢａ−ＹＦＰ［１］およびＥＲＫ１−ＹＦＰ［１］のゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）選択マーカならびにＹＦＰ［２］−ｐ６５およびＥＲＫ１−ＹＦＰ［２］のハイグロマイシン選択マーカを含むｐＣＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロゲン社）中にサブクローニングした。また、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１）からなるリンカーによって対象遺伝子とＹＦＰ断片を離隔した。
【０１６４】
ＩｋＢａ−ＹＦＰ［１］／ＹＦＰ［２］−ｐ６５もしくは対照のＭＥＫ−ＹＦＰ［２］／ＥＲＫ１−ＹＦＰ［１］を発現する細胞を壁の黒いポリ−リジン被覆９６穴プレート（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ））に、ウェル当たり２０，０００個の細胞濃度で接種した。２４時間後、これらの細胞をヒトＴＮＦ（ロッシュ社）と共に３０分間インキュベートした。次いで、核を３３μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（モレキュラー・プローブス社）で１０分間染色した。細胞はＨＢＳＳ（インビトロゲン社）で洗浄した後、同じ緩衝液中に維持した。次に、蛍光を可視化し、それぞれ４７０／３５および５３５／６０の励起および発光フィルターを取り付けたディスカバリ−１自動蛍光撮像装置（モレキュラー・デバイシズ社）を用いて画像を獲得した。次いで、ＩｋＢａ／ｐ６５  ＰＣＡを用いてプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮをテストした。２５μＭのＡＬＬＮ（カルビオケム社）で６０分間細胞を処理した後、この阻害剤を存在させたままＴＮＦによる誘導を行った。
【０１６５】
画像の解析はイメージＪ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて行った。全ての細胞の全平均蛍光強度は、所与の条件の集団における個々の細胞の核および細胞質の蛍光強度の加重平均＋／−標準誤差によって求めた。蛍光のイメージングにより、ＩｋＢａ／ｐ６５複合体は主として細胞質に局在し、細胞をＴＮＦで処理すると、ＩｋＢａのサイトカイン誘導性蛋白質分解およびＩｋＢａ／ｐ６５  ＰＣＡ複合体の分解と一致して蛍光が著しく減少する（図１４）ことが明らかとなった。ＡＬＬＮで４時間処理すると、ＩｋＢａ／ｐ６５複合体のＴＮＦ誘導性減少は９８％抑制され、この作用は顕微鏡画像で明らかであった。定量的な画像解析では、対照（ＭＥＫ／ＥＲＫ）複合体ではなくＩｋＢａ／ｐ６５複合体細胞の平均蛍光強度がＴＮＦにより用量依存性に減少することが分かった。このことから、ＴＮＦはＩｋＢａ／ｐ６５複合体の分解を特異的に誘導したことが示唆される。最大の反応は１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ濃度で認められたが、ＩｋＢａ／ｐ６５複合体の平均細胞蛍光強度は非刺激細胞の約４０％であった。ＴＮＦ反応の経時変化についての検討では、ｔ１／２が４分、最大反応が２０分に認められることが分かった。対照（ＭＥＫ／ＥＲＫ）  ＰＣＡの蛍光強度に対してはＴＮＦ処理の影響は認められなかった。以上の結果から、ＰＣＡは、生細胞においてシグナル伝達複合体の動的な調節を評価するのに十分適していることが分かる。
【０１６６】
［実施例１２］
蛋白質のユビキチン結合についてのアッセイおよびプロテアソーム阻害剤同定におけるその利用
多くの蛋白質の選択的な分解は、蛋白質がユビキチンへの共有結合による分解の標的となる一連の段階からなるユビキチン・システムから始まる。ユビキチンは高度に保存された７６−アミノ酸ポリペプチドである。１９７０年代中頃に発見されて以来、ユビキチンは、損傷蛋白質の除去などの細胞のハウスキーピング機能と関連づけられてきた。最近、ユビキチンはプラズマ細胞膜から核に至る種々の細胞内部位（subcellular location）の他の重要なプロセス、例えば、細胞周期の進行、シグナル伝達、転写調節、受容体の下方制御およびエンドサイトーシスに関与していることが明らかになった。
【０１６７】
ユビキチンは、そのカルボキシ末端グリシンと標的蛋白質のリジンのイプシロン−アミノ基とのイソペプチド結合を介して蛋白質に共有結合する。この結合は、ユビキチン部分を活性化し、最終的にこれを基質のリジン残基に結合させる酵素によって触媒される。この後、さらに、この結合したユビキチン自体の特定のリジン残基にユビキチンが付加されることによりポリ−ユビキチン鎖が生じる。この共有結合による修飾は、このイソペプチド結合に特異的なユニークなプロテアーゼにより無効化される。ユビキチンは最も良く特徴付けられたポリペプチド変性剤であるが、他のポリペプチド（ユビキチン様もしくはＵｂｌと呼ばれることが多い）も類似の反応で標的に結合する。配列類似性はユビキチンと異なるが構造的にユビキチンに類似しているこうした「代替的な」変性剤としては、ＳＵＭＯ；Ｎｅｄｄ８；Ｈｕｂｌ、ＩＳＧ１５もしくはＵＣＲＰ；およびＡｐｇ１２が挙げられる。
【０１６８】
ユビキチン結合蛋白質はプロテアソームの１９Ｓ調節サブユニットにより認識され、これによってリサイクリングのためのユビキチン鎖が除去され、この消えゆく運命の（ｄｏｏｍｅｄ）蛋白質が変性する。次に、変性した蛋白質はプロテアソームのコア内に送られ、短ペプチド（２２残基未満）に縮小される。ユビキチン結合している蛋白質についてはすでにいくつか同定されている。これらのものとしては、サイクリンおよび関連蛋白質（サイクリンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤）；ｐ５３などの腫瘍抑制因子；ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃなどの腫瘍遺伝子；ＩカッパＢアルファおよびｐ１３０などの抑制性蛋白質；ならびにｃｄｃ２５ホスファターゼ、チロシン・アミノトランスフェラーゼおよびトポイソメラーゼ（ＩおよびＩＩアルファ）などの酵素が挙げられる。真核生物のゲノムには２種の蛋白質モチーフ−蛋白質代謝回転の標的を識別すると考えられているＦ−ボックスおよびリングフィンガー−のコピーが数百個にも上り、代謝回転がユビキチン・システムによって調節されている多数の蛋白質の存在が示唆される。
【０１６９】
プロテアソーム機構そのものの他に、プロテアソームの上流の調節的事象（即ち、プロテアソームの基質およびそのレギュレータのリン酸化およびユビキチン結合）が薬の発見のために活発に検討されつつある。蛋白質分解の選択性は、主としてユビキチンへの結合の段階で決まる。先ず、ユビキチンはＥ２ユビキチン結合酵素のファミリーの酵素に結合する必要がある（Ｅ１ユビキチン活性化酵素は最初のＡＴＰ依存性活性化をもたらす）。次いで、このＥ２酵素自体もしくは、より一般的にはＥ３リガーゼが、ユビキチンの標的蛋白質（リガーゼの基質）への移動に特異性を与える。通常、Ｅ１は単一であるが、Ｅ２には多くの種類があり、Ｅ３には複数のファミリーもしくは多蛋白質複合体がある。特定のＥ３は、主としてユビキチン−蛋白質結合（従って、蛋白質分解）の選択性に関与していると考えられる。これは、特定の識別シグナルを含む特定の蛋白基質を結合することによって行われる。ユビキチン負荷Ｅ２（ユビキチンを結合している）酵素に連結する蛋白質−蛋白質相互作用ドメインを含む蛋白質としてＥ３ユビキチン・リガーゼを同定することにより、基質認識とユビキチン鎖形成の触媒段階とが結びつけられる。
【０１７０】
ＮＦ−ｋＢのシグナル誘導性活性化は、ＩｋＢａ（ＩカッパＢアルファ）のリン酸化依存性ユビキチン結合を含み、これがこの蛋白質をプロテアソームによる迅速な分解の標的とさせ、ＮＦｋＢを解放して核へ転位させる。ＩｋＢａのＴＮＦ誘導性ユビキチン結合は、その蛋白質分解およびその後のＮＦｋＢの活性化に不可欠である。従って、ユビキチン結合した蛋白質およびプロテアソームの阻害剤を同定する際のＰＣＡの使用を明示しようとした。
【０１７１】
ＩｋＢａ−ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］−ユビキチンを前述のようにして構築し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現させた。図１５から明らかなように、平均蛍光強度は、対照のビヒクル処理細胞と比較して、プロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮで処理したＴＮＦ誘導細胞において著しく増加した。この結果は、ＰＣＡが基質蛋白質へのユビキチンの動的なシグナル誘導性結合を捕捉することを示し、ユビキチン−プロテアソーム経路の阻害剤の同定への利用を明示するものである。本発明は、ユビキチンおよびユビキチン様ポリペプチドにより修飾された蛋白質の大規模な同定に適用することができ、例えば、「おとり（ｂａｉｔ）」がユビキチンもしくはユビキチン様分子である本発明の実施例２のようなライブラリ・スクリーニングを用いることにより、またはユビキチンもしくはユビキチン様分子を個々のＤＮＡに対してテストすることによりユビキチン−蛋白質複合体を同定する実施例４のような相互作用マッピングを用いることによって適用することができる。さらに、特定の蛋白質標的に対するユビキチンＰＣＡを構築することによって、本発明の対象であるアッセイをそのまま新規治療剤のハイスループット・スクリーニングに適用することができる。
【０１７２】
［実施例１３］
ベクターおよびベクター・エレメント
本発明と併せて多数の異なるベクターを使用することができることは当業者には明らかであろう。有用なベクターのエレメントは、対象細胞、所望のプロモータ、レポータの選択、リンカーの長さおよびクローニング部位により必要に応じて変更することができる。本発明は、前記ベクター配列、そのエレメントもしくは前記遺伝子発現方法に限定されない。プラスミド、レトロウイルスおよびアデノウイルス・ベクターは全て、本発明に適合する。ＰＣＡに特有なベクターのデザインおよび特徴に焦点を当てたいくつかの例を以下に示す。これらの例は本発明の用途を限定するものではない。
【０１７３】
リンカーの長さの選択。対象遺伝子と相補性の断片との間に可変リンカーを使用すると、ＰＣＡの実施が容易になる。ＰＣＡにはアミノ酸が５乃至３０個の長さのリンカーが用いられている。このリンカーの長さは、相補性に必要な相互作用する分子の分子間距離を調節するために自由に変更することができる。例えば、レミー（Remy）およびミフニク（Michnick）は、対象遺伝子と相補性の断片との間の可変リンカーの長さを短くすると、リガンド結合時のエリスロポエチン受容体のアロステリックな変化を正確に検出することができることを明らかにした（文献参照）。補助された相補性−例えば、第３分子に互いに結合することによって間接的に結合している蛋白質同士、もしくは比較的長い分子間距離で構造的に結合している蛋白質同士の間でみられる相補性−についても比較的長いリンカーを用いることによって詳細に研究することができる。
【０１７４】
多くの用途において、アミノ酸１０乃至１５個の準標準リンカー−例えば、本明細書で用いている５−アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）（配列番号３１）配列の反復配列−は、これを用いることによって断片の相補が容易になり、本発明で明らかにしたように、ＰＣＡの多くの用途に適している。その結果、一定の長さのリンカーを用い、遺伝子を迅速にサブクローニングして図１および図１６のようなアッセイを構築することができる標準ベクターを作製することができる。
【０１７５】
選択マーカの選択およびデザイン。選択マーカの多種多様な選択肢をここに提示するが、これらが本発明に適用できることは当業者に容易に理解されよう。
【０１７６】
生存−選択アッセイを利用するＰＣＡ−例えば、アミノグリコシド・キナーゼ（ＡＫ  ＰＣＡ）もしくはハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ  ＰＣＡ）などの、それ自体が薬剤耐性マーカとして機能する酵素の断片を用いるＰＣＡ、またはＤＨＦＲ  ＰＣＡなどの、ＰＣＡが代謝経路を補完するＰＣＡ−の場合、発現プラスミドに別の薬剤耐性遺伝子を組み込む必要はない。これらの場合、断片相補時に選択マーカが再構成されることにより、選択圧下に細胞の生存が可能となる。
【０１７７】
上記ＰＣＡが光学的に検出可能なシグナルを生じる蛋白質を利用する場合、別の薬剤耐性もしくは生存遺伝子を発現させることによって対象蛋白質を発現する細胞を選択することを可能にすることができる。例えば、図１６に示し、本発明の安定細胞株（図１１および図１４）の作製に用いたベクターでは、ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］プラスミド上に種々の抗生物質耐性マーカ（ハイグロマイシンおよびゼオシン）を用いることによって、ＹＦＰ  ＰＣＡを発現する安定細胞株の作製が容易になった。
【０１７８】
このＰＣＡの蛍光もしくは発光シグナルそのものを用いることによって、例えば、陽性シグナルを有する細胞を選別するためのＦＡＣＳもしくはビーズ利用の選択方法を用いて、上記安定発現細胞を選択することができる。また、ＦＡＣＳもしくは類似の方法は、例えば、ＰＣＡが蛍光標識抗体で検出可能な非天然型細胞表面マーカを再構成する細胞表面ＰＣＡに対する抗体と併用することができる。
【０１７９】
抗生物質耐性遺伝子もしくはＤＨＦＲなどの代謝生存遺伝子に代わるものとして、抗原もしくは抗体を、ＰＣＡと併用する選択マーカもしくは検出プローブとして用いることもできる。例えば、抗原を断片化してＰＣＡに用いることにより、これらのＰＣＡに、蛍光標識抗体で検出可能な蛋白質を再構成させることができる。この再構成された抗原がトランスフェクションした細胞において異種蛋白質となる場合、この抗原を再構成する蛋白質−蛋白質相互作用が存在しなければバックグラウンド活性は生じないことになる。あるいは、抗原（もしくは抗体）を、別の動作不能なように結合したエレメントとして、遺伝子−断片融合体を有するベクター内に含ませることができる。その場合、対象とする遺伝子−断片融合体の共発現は、この抗原エレメントに特異的な抗体を用いる抗体利用の選択法により検出することができる。選択は、抗原発現細胞の単色もしくは多色ＦＡＣＳ選別により、またはビーズもしくは固体担体に結合させた抗体による結合によって達成することができる。
【０１８０】
［実施例１４］
ＨＴＳおよびＨＣＳ用細胞株の迅速選択が可能となる、蛍光もしくは発光ＰＣＡと生存−選択ＰＣＡとを組み合わせたデュアルＰＣＡ
ＰＣＡは、本発明のように、別々のプラスミド上に構築することができるが、図１７に示したように、１つまたは１つ以上の多シストロン性ベクターをＰＣＡと組み合わせて用いることもできる。この例によって、我々は、ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイの構築が安定細胞株の作製に関連づけられる「デュアルＰＣＡ」を提供する。例えば、ロイシン・ジッパー誘導性（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＨＦＲ  ＰＣＡを含む安定細胞株を作製するのに相補性の２シストロン性ベクターを用い、この場合、この細胞株は蛍光もしくは発光ＰＣＡをも含み、この蛍光もしくは発光シグナルは２つの対象蛋白質の相互作用により駆動される。
【０１８１】
２シストロン性ベクターは、選択マーカのような、あるポリペプチドの発現を別のポリペプチドの発現に関連づける能力があるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入配列）を含む。２シストロン性ベクターを作製することにより、単一のポリペプチドをコードする遺伝子および単一ｍＲＮＡとして２種の蛋白質に翻訳されるＤＨＦＲ遺伝子を発現することが可能になった（デービス・ＭＶ（Davies MV）、カウフマン・ＲＪ（Kaufman RJ）、１９９２年、「脳心筋炎ウイルス・リーダー内の開始コドンの配列情報は内部翻訳開始の効率を調節する。（The sequence context of the initiation codon in the encephalomyocarditis virus leader modulates efficiency of internal translation initiation.）」ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６６：ｐ１９２４−１９３２）。このＤＨＦＲ遺伝子および単一ｍＲＮＡとしての上記組換え遺伝子を発現させることにより、両遺伝子のメソトレキサート増幅が高まり、対象分子の産生が大きく増大する。
【０１８２】
図１７に示したように、我々は、２つの２シストロン性ベクターを組み合わせることにより、ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイの構築および安定細胞株の迅速で本質的な選択を可能にするデュアルＰＣＡを構築した。それぞれが蛍光もしくは発光ＰＣＡの半分と生存−選択ＰＣＡの半分を有する２つの相補性２シストロン性ベクターを構築する。示した例では、我々は、本発明に基づく蛍光もしくは発光ＰＣＡと、活性ＤＨＦＲのロイシン・ジッパー誘導性再構築による安定細胞株の迅速な選択を可能にするこれまでに報告されているＤＨＦＲ  ＰＣＡ（ペルティエ・Ｊ．Ｎ．（Pelletier, J.N.）、Ｃ．−ヴァロワ・Ｆ．−Ｘ．（C.-Valois, F.-X.）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）、１９９８年、「合理的にデザインした断片からの活性ジヒドロ葉酸還元酵素のオリゴマー形成ドメイン誘導性再構築（Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally-designed fragments）」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro. Natl. Acad Sci）ＵＳＡ、９８：ｐ７６７８−７６８３）。ＨＴＳ−もしくはＨＣＳ−適合性ＰＣＡの各半分の発現を、生存−選択ＰＣＡの半分の発現と結びつけることによって、細胞が選択圧の下に生存すれば、得られる細胞株はＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイを含むＰＣＡペアが陽性であることになる。
【０１８３】
図１７に示したように、プロモータは、光学的に検出可能なレポータの各Ｆ１およびＦ２断片に動作可能なように結合した対象遺伝子を含む第１のＰＣＡの発現を駆動するが、これら２つのベクターのそれぞれのＩＲＥＳは第２のＰＣＡの２つの半分をコードし、後者は（本発明の実施例９で使用したＤＨＦＲの断片のような）選択マーカの各Ｆ１およびＦ２断片に動作可能なように結合した（本発明の実施例２で使用した構造的に二量体化するＧＣＮ４ロイシン・ジッパーのような）２つのオリゴマー形成ドメインを含む。これら２つの２シストロン性ベクターを細胞内にコトランスフェクションした後、前記ＤＨＦＲ  ＰＣＡについてこれまでに報告したように選択圧をかけることによって、この第２のＰＣＡペアの共発現により第１のＰＣＡペアをも共発現する細胞の選択が可能になる。細胞は、両断片が発現され、ＤＨＦＲがロイシン・ジッパー誘導性相補により再構成される場合にのみこの細胞が生存する、これまでに我々が説明した条件下で増殖させる。従って、安定細胞株は、ＨＴＳもしくはＨＣＳ用のＰＣＡを用いて自動的に作製することができる。このデュアルＰＣＡは、抗生物質による選択を必要としないで安定細胞株を作製する有効な手段となり、多くのスクリーニング用途のための安定細胞株の確立を迅速化することになろう。
【０１８４】
プロモータの選択。本発明では、本明細書に示したいくつかの例で用いたＣＮＶプロモータなどの構成的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモータを使用することができる。しかしながら、本発明と共に用いるには別のベクターおよびプロモータ系統が適しており、以下では特に、経路特異的および／または細胞特異的プロモータに関して説明する。
【０１８５】
個々の相補性の断片−融合体ペアは、誘導性プロモータの制御下に置くことができる。このような系では、これら２つの相補性の断片融合体を作動させ、発現レベルをこの誘導因子を用いた用量依存性の発現によって制御することができる。誘導性プロモータとしては、市販のもの（例えば、Ｔｅｔもしくはエクジソン（Ｅｃｄｙｓｏｎｅ）反応性エレメント）を用いることができる。
【０１８６】
また、本発明は、ＰＣＡとの組み合わせによるシス作用エレメントの新規な使用を提供する。誘導性プロモータをＰＣＡと組み合わせることによって、ＰＣＡ反応がシグナル伝達経路に対する薬物の作用により増強もしくは減弱するシステムが得られる。本発明のこの実施態様では、ＰＣＡ断片コーディング配列に動作可能なように結合させた完全長のヒト遺伝子を真核生物の発現ベクター中にクローニングする。この融合蛋白質の発現は、この融合体によりコードされているヒト遺伝子の転写調節エレメント、もしくは別のシス作用調節エレメントによって制御する。これらのアッセイでは、（ＰＣＡ成分を介する）蛋白質の活性と転写レベル（転写制御エレメント）で調節される蛋白質の濃度とが同時に捕捉される。
【０１８７】
本発明のこの態様の詳細は以下の通りである。多くのシグナル伝達事象（およびその構成要素である薬物標的）は、蛋白質コーディング情報の転写調節、翻訳調節、（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化およびアロステリック制御を含む）蛋白質活性ならびに蛋白質の安定性および半減期を含む複数の段階で制御されている。調節されたプロモータの制御の下にＰＣＡを発現させると、ＰＣＡアッセイの予測的な経路マッピング能と比較的オーソドックスな転写レポータ遺伝子アッセイにより特徴付けられる遺伝子調節を定量化する能力とが組み合わされる。この両タイプの情報の同時捕捉により、細胞活性の総合的なリアルタイムの評価が容易になる。
【０１８８】
転写調節エレメントの例としては、サイクリンＤ１その他のサイクリンなどの細胞周期制御蛋白質、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ）などの細胞周期進行過程で制御されるキナーゼおよびホスファターゼが挙げられる。Ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｍｙｃ、ＥＧＲ−１、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＡＴＦ−２、ＣＲＥＢなどの転写因子は、転写レベルで部分的に制御される。その他の例としては、（マトリックス金属蛋白分解酵素、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータおよびこれらの受容体などの）サイトカインおよび成長因子誘導性蛋白質、ストレス−もしくは毒性−誘発性蛋白質（例えば、熱ショック蛋白質、ＡＴＦ−３）、ならびに急性期蛋白質（例えば、ベータ２−マクログロブリンおよびトランスフェリン）が挙げられる。いずれの場合にも、その遺伝子の完全長のプロモータおよびエンハンサ配列を用いてＰＣＡ融合蛋白質の発現を誘導することができる。プロモータおよびエンハンサのシス作用エレメントは、トランス作用転写因子に対する複数の連続的な重複結合部位からなることが明らかにされている。一般に、これらの部位がその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの転写を誘導する作用は、結合部位の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）および転写開始部位からの距離とは無関係であると考えられている。多くの研究は、これらのシス作用エレメントを切断する（ｄｉｓｓｅｃｔ）ことにより個々の転写因子結合部位を同定することができることを明らかにしている。さらに、これらの部位を遺伝子発現ベクター中に導入することによって、発現される遺伝子の活性が、単離された部位に結合する転写因子の量および活性により決まるようにすることができる。最終的に、これらの個々の転写因子結合部位を多量体化することによって、特定の刺激に対する反応として転写によるこの遺伝子の発現の誘導を増強することができる。特定の刺激もしくは経路の賦活化に対する反応を最適化するための単一および多量体化転写反応エレメントの設計の例については、（ウェストウィックほか（Westwick et al.）、１９９７年、および本明細書に記載の文献）に示されている。単一体であれ多量体であれ、部分的もしくは完全長のプロモータ・エンハンサー配列、または別個のシス作用エレメントを利用することによってＰＣＡ融合体の発現を誘導することができる。
【０１８９】
前記ＴＮＦ経路に対する誘導性プロモータの使用例は以下の通りである。前記ＩｋＢａ遺伝子をＰＣＡレポータ断片コーディング配列にインフレームで融合させる。得られたＩｋＢａ融合体は、主としてＮＦｋＢ依存性シグナルにより制御されているＩｋＢａプロモータの制御下に発現させる。この構築体（もしくは同族の作製（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）細胞株）を、転写因子ｐ６５などのＩｋＢａの結合パートナをコードするベクターでコトランスフェクションする。ＮＦｋＢ経路の賦活をもたらす細胞刺激を行うと、ＩｋＢａ−ＰＣＡ融合蛋白質の発現はこの融合体の転写誘導により増強される。さらに、ＩｋＢａおよびｐ６５  ＰＣＡ融合体の翻訳後調節については、そのＰＣＡシグナルの強度および細胞内局在により評価することができる。図１１乃至１４から明らかなように、ＮＦｋＢ経路の賦活化は、結果として、ＩｋＢａの分解（図１４）およびこの複合体のｐ６５成分の核転位（図１１乃至１３）をもたらす。この経路の転写および転写後調節の相互作用により、細胞内にＩｋＢａ蛋白質レベル（および活性）の周期が生じる。従って、誘導性プロモータ−ＰＣＡアッセイを用いることにより、ＴＮＦ経路の複雑な生物学および類似の複雑な生体系を評価することができる。
【０１９０】
あるいは、ＰＣＡアッセイの相互作用するペアが発現時に構造性の活性（例えば、蛍光もしくは発光）を生じる任意の誘導性プロモータの制御を受ける遺伝子−断片融合体を構築することができる。ＰＣＡは、両プロモータが活性である場合にのみ行うことになる。これは、１つもしくは２つの遺伝子調節性シス作用エレメントの転写活性に対する生細胞利用の感度の良いリアルタイムのアッセイ法となる。核ＰＣＡエレメントを別のプロモータに融合させることによって、アッセイは、両プロモータが対象細胞内で活性である場合にのみ、陽性シグナルを生じることになる。
【０１９１】
「汎用（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」ベクター。ひとたび発現ベクター、リンカーの長さ、レポータ断片およびプロモータを選択すれば、ＰＣＡ用の対象遺伝子もしくはライブラリを迅速かつ容易にサブクローニングするためのベクターを構築することができる。手短に言えば、所与のレポータに対して、グリシンおよびセリン残基からなる可変リンカーにインフレームで融合させた（Ｆ１およびＦ２として示した）対象レポータ断片をコードする４種の汎用ベクターを作製することができる。次いで、対象遺伝子を上記レポータに、例えば、リンカーの唯一の制限部位を介してこの遺伝子の５’もしくは３’末端で融合させることにより、図１ａおよび図１６に示したような４種の可能な融合蛋白質を作製する。あるいは、本発明に好適なベクターの構築は、任意の適切な組換え方法、例えば、インビトロゲン社から販売されているゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）システムを用いて達成することができ、別の迅速クローニング・システムも本発明に適合する。
【０１９２】
文献
以下の特許および刊行物の引用文献を含む内容は全文引用により組み込まれている。
【０１９３】
第６，２７０，９６４号  ミフニクほか（Michnick, et al.）
第６，２９４，３３０号  ミフニクほか（Michnick, et al.）
第６，４２８，９５１号  ミフニクほか（Michnick, et al.）
第５，９８９，８３５号  ダンレイほか（Dunlay, et al.）
第６，５１８，０２１号  タストラップほか（Thastrup, et al.）
第５，５８３，２１７号  クワンテほか（Quante et al.）
第５，５１６，９０２号  クワンテほか（Quante et al.）
第５，５１４，５６１号  クワンテほか（Quante et al.）
第５，３３８，８４３号  クワンテほか（Quante et al.）
刊行物
ペルティエ・Ｊ．Ｎ．（Pelletier, J.N.）、レミー・Ｉ．（Remy, I）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（１９９８年）．「蛋白質−断片の相補性アッセイ：蛋白質−蛋白質相互作用のインビボ検出の一般的方法（Protein-Fragment Complementation Assays: a General Strategy for the in vivo Detection of Protein-Protein Interactions.）」ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・テクニークス（Journal of Biomolecular Techniques）、１０：ｐ３２−３９．
レミー・Ｉ．（Remy, I）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（１９９８年）．「クローン選択および蛋白質断片の相補性アッセイによる蛋白質相互作用のインビボ定量化（Clonal Selection and In Vivo Quantitation of Protein Interactions with Protein Fragment Complementation Assays）」プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro. Natl. Acad Sci）ＵＳＡ、９６：ｐ５３９４−５３９９．
レミー・Ｉ．（Remy, I）、ペルティエ・Ｊ．Ｎ．（Pelletier, J.N.）、ガラニュウ・Ａ．（ Galarneau, A.）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（２００２年）「蛋白質断片相補法による蛋白質相互作用およびライブラリ・スクリーニング（Protein Interactions and Library Screening with Protein Fragment Complementation Strategies）」プロテイン−プロテイン・インタラクションズ：ア・モレキュラー・クローニング・マニュアル（Protein-protein interactions: A molecular cloning manual）、Ｅ．Ａ．ゴレミス（E.A. Golemis）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、第２５章、２５：ｐ４４９−４７５．
レミー・Ｉ．（Remy, I）、ウイルソン・Ｉ．Ａ．（Wilson, I.A.)、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（１９９９年）「リガンド誘発性構造変化によるエリスロポエチン受容体の賦活化（Erythropoietin receptor activation by a ligand-induced conformation change）」、サイエンス（Science）、２８３：ｐ９９０−９９３．
ガラニュウ・Ａ．（Galarneau, A.）、プリミュー・Ｍ．（Primeau, M.）、トルドー・Ｌ．−Ｅ．（ Trudeau, L.-E.）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（２００２年）「蛋白質−蛋白質相互作用の検出のためのＴＥＭ１β−ラクタマーゼを用いた蛋白質断片の相補性アッセイ（A Protein fragment Complementation Assay based on TEM 1 13-lactamase for detection of protein-protein interactions）」ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat Biotechnol）、２０：ｐ６１９−６２２．
ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）、レミー・Ｉ．（Remy, I）、Ｃ．−ヴァロワ・Ｆ．−Ｘ．（C.-Valois, F.-X.）、ヴァリー-ベリスル・Ａ．（Vallee-Belisle, A.）、ガラニュウ・Ａ．（Galarneau, A.）、ペルティエ・Ｊ．Ｎ．（Pelletier, J.N.）（２０００年）「蛋白質断片相補法による蛋白質−蛋白質相互作用の検出（Detection of Protein-Protein Interactions by Protein Fragment Complementation Strategies）」パートＡおよびＢ（ジョンＮ．アベルソン（John N. Abelson）、スコットＤエムール（Scott D Emr）、ジェレミー・ソーナー（Jeremy Thorner）編）ア・ボリューム・オブ・メソッズ・イン・エンザイモロジー（A Volume of Methods in Enzymology）３２８：ｐ２０８−２３０．
レミー・Ｉ．（Remy, I）、ミフニク・Ｓ．Ｗ．（Michnick, S.W.）（２００１年）「生細胞における生化学的ネットワークの視覚化（Visualization of Biochemical Networks in Living Cells）」プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro. Natl. Acad Sci）ＵＳＡ、９８：ｐ７６７８−７６８３．
シュミット・Ｊ．Ａ．ほか（Schmid, J.A., et al.）（２０００年）「緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質を用いたＮＦカッパＢおよびＩカッパＢアルファの動態に関する検討（Dynamics of NFkappaB and IkappaBalpha studied with green fluorescent protein (GFP) fusion proteins）」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２７５（２２）：ｐ１７０３５−１７０４２．
本明細書に開示した本発明の多くの形態はここでは好ましい実施態様を構成するが、他の多くの実施態様も可能であり、さらに、これらの好ましい実施態様および他の可能な実施態様の細部は限定的なものと見なされるべきではない。本明細書に用いた用語が限定的なものではなく単に記述的なものであること、および特許請求した本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく種々の変更および均等範囲に属する多くの変形を行い得ることは、理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】ＰＣＡを用いたハイスループットもしくはハイコンテント・アッセイの構築。
【図２】ＤＮＡ損傷応答経路、ならびにＣｈｋ１／ｐ５３およびｐ５３／ｐ５３相互作用に対するベータ−ラクタマーゼＰＣＡ（ＢＬＡ  ＰＣＡ）利用のハイスループット・アッセイおよびＧＦＰ（ＧＦＰ  ＰＣＡ）利用のハイコンテント・アッセイ。ＣＰＴ＝カンプトセシン
【図３Ａ】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いたＨＴＳの発光ＰＣＡ（ＲＬｕｃ  ＰＣＡ）。
【図３Ｂ】ＲＬｕｃ  ＰＣＡにおけるカンプトセシンによるｐ５３／ｐ５３相互作用の誘導。
【図４】ＩＦＰ  ＰＣＡ利用の蛍光ハイコンテント・アッセイ。細胞画像は、ＣＰＴの非存在下および存在下のｐ５３／ｐ５３相互作用に対するゲルダナマイシンの阻害作用およびトリコスタチンＡの増強作用を示す。棒グラフは、細胞の核内の平均蛍光に対する各種既知薬剤の影響を示す。棒グラフの説明：１＝ビヒクル（ＤＭＳＯ）；２＝カンプトセシン（５００ｎＭ  ＣＰＴ）；３＝ゲニステイン（１２．５μＭ）；４＝トリコスタチンＡ（０．５μＭ）；５＝ＭＳ−２７５（１０μＭ）；６＝ＬＹ２９４００２（２５μＭ）；７＝ＳＢ  ２０３５８０（２５μＭ）；８＝ＨＡ  １４−１（２μＭ）；９＝ゲルダナマイシン（２．５μＭ）。
【図５Ａ】ＧＦＰ  ＰＣＡを用いたｃＤＮＡライブラリ・スクリーニングにより同定されたＰＫＢとｈＦｔ１との新規相互作用を含む、ＰＩ−３−キナーゼおよびＰＫＡ／ＰＫＣ−媒介性経路の構成。
【図５Ｂ】蛍光分光検出法を用いてＧＦＰ  ＰＣＡにより検出した、生細胞内のＰＫＢ／ｈＦｔ１およびｈＦｔ１／ＰＤＫ１複合体の量および細胞内局在に対する活性剤および阻害剤の影響。１＝ＣＯＳ−１細胞；２＝Ｊｕｒｋａｔ細胞；３＝内部にＰＣＡを有するＣＯＳ−１細胞の画像。ＧＣＮ４／ＧＣＮ４ロイシン・ジッパーの二量体化を対照として用いた。
【図６】（Ａ）ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン−結合性蛋白質）；（Ｂ）ＦＫＢＰとｍＴＯＲ（ｍＴＯＲは、ＦＲＡＰのマウス相当物である）との相互作用に対する薬物ラパマイシンの効果の視覚化を可能にするＹＦＰ  ＰＣＡ；（Ｃ）ハイスループット・アッセイにおけるラパマイシンの用量−反応曲線。
【図７Ａ】ＹＦＰ  ＰＣＡによる遺伝子毎の相互作用マッピングを行って蛋白質−蛋白質相互作用を同定した９６−穴プレート・アッセイの定量結果。アッセイ結果は蛍光分光法により読み取った。
【図７Ｂ】陽性ＰＣＡ対照、陰性対照および新規相互作用の拡大画像を含む、図７Ａのハイスループット相互作用マッピング・アッセイからのウェルの走査画像。蛋白質−蛋白質複合体の細胞内局在を見ることができる。画像は自動顕微鏡により獲得した。
【図８】ＩＫＫ（Ｉ−カッパ−Ｂ−キナーゼ）複合体；ＴＮＦ刺激時に核へ再局在するＮＦ−カッパ−Ｂ（ＮＦｋＢ）転写因子複合体（ｐ６５／ｐ５０）；細胞質Ｉ−カッパ−Ｂ−アルファ（ＩｋＢａ）／ＮＦｋＢ複合体；およびＡＬＬＮなどのプロテアソーム阻害剤によるＮＦｋＢシグナル伝達の阻害を含む、ＴＮＦ受容体から細胞核に至る経路の構成。
【図９】正確な細胞内局在を示し、任意の蛋白質に対して多色ＰＣＡを構築することができることを示す、ＴＮＦ経路内の多数の蛋白質−蛋白質複合体の蛍光ＰＣＡ。受容体から核まで、膜、細胞基質および核の複合体が示されている。
【図１０】ＴＮＦへの反応による蛋白質−蛋白質複合体の再分布およびプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮによるＴＮＦ反応の阻害を示す、一過性トランスフェクション細胞内のＮＦカッパＢ（ＮＦｋＢ、ｐ６５／ｐ５０）に対するハイコンテントＰＣＡの結果。
【図１１】「内部にＰＣＡ」を有する２種の安定細胞株。Ａ、Ｂ：ＴＮＦによるｐ６５／ｐ５０の核への転位の誘導；Ｃ、Ｄ：対照（ＭＥＫ／ＥＲＫ）細胞株に対するＴＮＦの無影響；Ｅ、Ｆ：個々の断片が蛍光を発しないことを示す、単一ＰＣＡ構築物（ｐ６５−Ｆ［２］）におけるシグナルの欠如。
【図１２Ａ】図１１に示した安定ＰＣＡ細胞株におけるＮＦｋＢ（ｐ６５／ｐ５０）の核転位誘導のＴＮＦ用量−反応曲線および経時変化。
【図１２Ｂ】図１１に示した安定ＰＣＡ細胞株におけるプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮによるＴＮＦ反応の阻害。
【図１２Ｃ】化学物質ライブラリのハイコンテント・スクリーニングのための図１１からの安定ＰＣＡ細胞株の別の使用。
【図１２Ｄ】図１２Ｃに示した化学物質ライブラリ・スクリーニングからの「ヒット」の定量的用量−反応曲線。
【図１３Ａ】ＤＨＦＲ  ＰＣＡに基づく赤色蛍光シグナルを生じる、生細胞におけるＮＦｋＢ転位の別のハイコンテントＰＣＡ。
【図１３Ｂ】ＤＨＦＲ  ＰＣＡを用いることによりプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮによるＮＦｋＢの核転位の阻害を検出することもできること。
【図１４】ＴＮＦシグナル伝達経路の別の標識（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）（ＩｋＢａ／ｐ６５）に対する、安定細胞株を用いた定量的蛍光ハイスループットＰＣＡ。画像は、ＴＮＦへの反応によるシグナルの減少、およびこの作用のプロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮによるブロックを示す。パネルＡ：ＩｋＢａ／ｐ６５  ＰＣＡのＴＮＦ用量−反応；パネルＢ：ＩｋＢａ／ｐ６５  ＰＣＡに対するＴＮＦ作用の経時変化。
【図１５】プロテアソーム阻害剤ＡＬＬＮがＴＮＦの存在下にユビキチン−ＩｋＢａ複合体の蓄積を増大させることを示す、ＰＣＡによるユビキチン−蛋白質複合体の検出および定量。
【図１６】本発明に適切なＰＣＡベクターの例を示すためのベクター構築の概要。
【図１７】ＨＴＳもしくはＨＣＳアッセイの構築が安定細胞株の作製に結びつけられる「デュアルＰＣＡ」。例えば、ロイシン・ジッパー誘導性ＤＨＦＲ  ＰＣＡを含む安定細胞株を作製するのに相補性の２シストロン性ベクターを用い、この場合、この細胞株は蛍光もしくは発光ＰＣＡをも含み、この蛍光もしくは発光シグナルは２つの対象蛋白質の相互作用により駆動される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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