(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体であって、加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであること、かつ、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むことを特徴とする、上記の抗体。
【請求項２】
β-アミロイドの残基３９と４０の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
β-アミロイドの残基４０と４１の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
β-アミロイドの残基４１と４２の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、しかもＥＬＩＳＡを使用して検出するために十分な親和性で天然のβ-アミロイドにも結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてＥＬＩＳＡを使用して検出するために十分な親和性で天然のβ-アミロイドに結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
血液脳関門をわたる能力および予め定められたアミド結合におけるβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とし、かつ、加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであること、および遷移状態類似体がスタチン類似体を含むことを特徴とする、ベクター化された抗体。
【請求項８】
二重特異性抗体である、請求項７に記載のべクター化された抗体。
【請求項９】
トランスフェリンレセプターに対する第１の特異性および加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態に対する第２の特異性を有する、請求項８に記載のベクター化された抗体。
【請求項１０】
残基３９と４０の間のβ-アミロイドアミドの加水分解を触媒する請求項９に記載のベクター化された抗体。
【請求項１１】
有効成分として、β-アミロイドに特異的な抗体を含んで成る動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶するための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項１２】
動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶するための製薬学的製剤であって、有効成分として、内因性β-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原および予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産された抗体を含んでなり、該遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために動物を免疫感作するのに使用されるものである、ことを特徴とする上記の製薬学的製剤。
【請求項１３】
有効成分として、内因性のβ-アミロイドに特異的な抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項１４】
β-アミロイドに特異的な抗体が、予め定められたアミド結合でβ-アミロイドの加水分解を触媒する触媒抗体である、請求項１３に記載の製薬学的製剤。
【請求項１５】
抗体がモノクローナルである請求項１３に記載の製薬学的製剤。
【請求項１６】
抗体がポリクローナルである請求項１３に記載の製薬学的製剤。
【請求項１７】
抗体がβ-アミロイド1-43のＣ−末端上のエピトープを特異的に認識する、請求項１３に記載の製薬学的製剤。
【請求項１８】
有効成分として、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものであり、かつ、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項１９】
抗原が、スタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、かつ、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものである、請求項１８に記載の製薬学的製剤。
【請求項２０】
抗原が、Ａβ10-25を含んで成る、請求項１８に記載の製薬学的製剤。
【請求項２１】
生成した抗体が、天然のβ-アミロイドよりも遷移状態類似体に対して高い親和性を有する、請求項１９に記載の製薬学的製剤。
【請求項２２】
生成した抗体が内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する、請求項１９に記載の製薬学的製剤。
【請求項２３】
有効成分として、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイド斑の形成を防止するための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものであり、かつ、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項２４】
有効成分として、内因性のβ-アミロイドポリペプチドの予め定められたアミド結合における加水分解遷移状態の模造物であるエピトープを含有する抗原を含んで成る動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、かつ、該抗原がβ-アミロイド加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項２５】
有効成分として、内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項２６】
有効成分として、予め定められたアミド結合において、動物により生成されるβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の血中のβ-アミロイドレベルにおいて有意な低下を引き起こすために動物に投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項２７】
有効成分として、予め定められたアミド結合において動物のβ-アミロイドの加水分解を触媒する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された二重特異性抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項２８】
ベクター化された二重特異性抗体がトランスフェリンレセプターに特異的に結合する、請求項２７に記載の製薬学的製剤。
【請求項２９】
ベクター化された二重特異性抗体が、β-アミロイドの残基39と40との間のアミド結合の加水分解を触媒する、請求項２７に記載の製薬学的製剤。
【請求項３０】
有効成分として、予め定められたアミド結合において動物により生成されたβ-アミロイドの加水分解を触媒する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された二重特異性抗体を含んで成る動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解するための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の脳内のβ-アミロイドレベルに有意な減少を引き起こすために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項３１】
有効成分として、予め定められたアミド結合において内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解するための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
【請求項３２】
β−アミロイドの加水分解を触媒する抗体の生成方法であって、
ａ）ポリペプチドの予め定められたアミド結合における加水分解遷移状態の立体配置を模するスタチン類似体を有するエピトープを含有し、かつ、β−アミロイドである抗原を提供する工程、
ｂ）該加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な条件下で、該抗原で非ヒト動物を免疫感作する工程
を含んで成る、上記の抗体の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（技術分野）
発明の背景
アルツハイマー病は、老齢人口のかなりの部分に影響を及ぼす進行性の、そして最終的には致命的な痴呆の状態である。解剖による決定的診断は、高密度の老人性斑が顕著な神経病理学的な脳の創傷の存在による。これらの細胞外沈着は、新−皮質、海馬および扁桃ならびに髄膜および大脳血管の壁に見いだされる。このような斑の主成分は39〜43残基のβ-アミロイドペプチドである。各斑が、約20フェントモル（80ピコモル）のこの４kDaペプチドを含む（Selkoe et al.,J.of Neurochemistry 46:1820(1986)）。アポリポタンパク質Ｅおよび微小管結合タウタンパク質により形成される神経細線維のもつれがアルツハイマー病に関係することが多い。
【０００２】  β-アミロイドは、β−アミロイド前駆体タンパク質と呼ばれる内在性膜タンパク質から、タンパク質溶解的に開裂される。ヒトのこのタンパク質をコードする遺伝子は、染色体21上に見いだされる（St George-Hyslop et al.,Science 235:885(1987)、Kang et al.,Nature 325:733(1987)）。多数の培養された細胞および組織（例えば脳、心臓、脾臓、腎臓および筋肉）がこのβ−アミロイド前駆体タンパク質を発現し、そしてまた見かけ上、正常のプロセッシング経路の一部として４kDaのβ-アミロイドフラグメントを培養基に分泌する。
【０００３】  β-アミロイドまたはそれが形成する斑と、アルツハイマー病との間の絶対的な因果関係を確立することは難しいが、β-アミロイドの病因的役割を支持する十分な証拠がある。例えばダウン症候群の患者は染色体21の三染色体性により、β-アミロイド前駆体タンパク質の過剰なコピーを有する（St George-Hyslop etal.,Science 235:885(1987)、Kang et al.,Nature 325:733(1987)）。彼らは相そうじて早期発生のアルツハイマー病の神経病状を30〜40歳で発症する。さらに早期発生の家族性アルツハイマー病は、β-アミロイド配列内またはそれに隣接して存在するβ-アミロイド前駆体タンパク質遺伝子内の突然変異から生じ得る（Hardy,J.,Nature Genetics 1:233(1992)）。これらの観察は、脳内の斑としてのβ-アミロイドの沈着がその細胞外濃度の上昇により加速されるという知見と一致する（Scheuner et al.,Nature Med.2:864(1996)）。β-アミロイドがインビトロおよびインビボの両方で直接的に神経毒性であるという知見（Kowall etal.,Proc.Natl.Acad.Sci. 88:7247(1991)）は、斑自体ではなく可溶性の凝集したβ−アミロイドが病状を生じる可能性があることを示唆している。
【０００４】  アミロイド斑の形成が結晶化型のメカニズムにより進行し得るという考察が示された（Jarrett et al.,Cell 73:1055(1993)）。このモデルによれば、斑の核形成を開始する種は、42または43アミノ酸長のβ-アミロイドである（Ａβ1-43）。Ａβ1-43またはＡβ1-42により形成される速度を決定する核（rate-determining nucleus）は、ペプチドＡβ1-40またはより短いものをアミロイド沈着へ急速に成長させる原因である。この核形成現象は、Ａβ1-42が動力学的に安定な過飽和のＡβ1-40溶液の瞬間的凝集を引き起こす能力によりインビトロで証明された。この知見は、Ａβ1-40が核形成ペプチドＡβ1-42またはＡβ1-43の不存在下では比較的無害であるかもしれないという可能性を導いた。実際には、これらの長いペプチドレベルの上昇が、家族性アルツハイマー病の患者の血液中では見いだされた（Scheuner et al.,Nature Med.2:864(1996)）。さらにＡβ1-42またはＡβ1-43が、多くのアルツハイマー病患者の脳の斑中に沈着する主要な形態となることが分かった（Gravina et al.,J.of Biol.Chem.270:7013(1995)）。
【０００５】  β-アミロイドが果たす中心的役割を考慮すると、体内のこのような分子の様々なプール間の相互関係を解明することがますます重要になってきた。血液中に存在する遊離β-アミロイドは、ほとんどが末梢組織中の細胞上に存在するβ-アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質溶解的開裂により放出されたペプチドから生じるらしい。同様に、脳および脳脊髄液に見いだされる遊離β-アミロイドのほとんどが、恐らく脳細胞で発現されたβ-アミロイド前駆体タンパク質のセクレターゼ開裂により放出されたペプチドに由来するのであろう。このペプチドは起源とは無関係に同一であり、そして幾つかの研究結果からこのようなプール間の相互連絡が示唆されている。
発明の要約
本発明の１つの観点は、予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体である。１つの態様では、抗体は予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてまたELISAを使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドに結合する。別の観点では、抗体は予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてELISAを使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドには結合しない。生成される抗体は、それらが加水分解するアミド結合が特徴である。特異的抗体には、β-アミロイドの残基39と40、40と41、および41と42の間のアミロイド結合での加水分解を触媒するものを含む。
【０００６】  本発明の別の観点は、血液脳関門をわたる能力および予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とする、ベクター化された抗体である。１つの態様では、ベクター化された抗体は二重特異性抗体である。好ましくはベクター化された抗体はトランスフェリンレセプターに対する第１の特異性および加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態に対する第２の特異性を有する。特異的なベクター化された抗体は、β-アミロイドの残基39と40、40と41、および41と42の間のアミロイド結合での加水分解を触媒するものを含む。
【０００７】  本発明の別の観点は、循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために十分な量で、β-アミロイドに特異的な抗体を動物に静脈内投与することにより、動物の血流中の遊離β−アミロイドを隔絶する方法である。この方法の治療的応用には、アルツハイマー病の、またはアルツハイマー病の危険性があると診断された患者を処置することを含む。
【０００８】  本発明の別の観点は、内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために適切な条件下で、動物に対して内因性のβ-アミロイドに上に存在するエピトープを含んで成る抗原で動物を免疫感作することにより、動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法である。この方法の治療的応用には、アルツハイマー病の、またはアルツハイマー病の危険性があると診断された患者を処置することを含む。
【０００９】  本発明の別の観点は、動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために十分な量で、内因性のβ-アミロイドに特異的な抗体を動物に静脈内投与することにより、動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法である。１つの態様では、抗体は予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する触媒抗体である。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかでよい。１つの態様では、抗体はβ-アミロイド1-43のＣ-末端上のエピトープを特異的に認識する。
【００１０】  本発明の別の観点は、内因性のβ-アミロイドに結合する抗体を生成するために適切な条件下で、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る抗原で動物を免疫感作することにより、動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法である。１つの態様では、抗原は、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体である。好適な態様では、抗原はＡβ10-25を含んで成る。好ましくは生成した抗体は自然なβ-アミロイドよりも遷移状態類似体に対して高い親和性を有し、そして内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する。
【００１１】  動物の循環しているβ-アミロイドのレベルを低下させるために、β-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を利用または生成する同様な方法、および動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止するための方法も本発明により提供される。またβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を利用または生成することにより、動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法も提供する。
【００１２】  本発明の別の観点は、動物の脳内のβ-アミロイドレベルの有意な減少を引き起こすために十分な量で動物にベクター化された二重特異性抗体を静脈内投与することによる、動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法である。ベクター化された二重特異性抗体は、血液脳関門をわたり細胞輸送することができ、そして結合すると予め定められたアミド結合で内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を有する。好ましくは、ベクター化された二重特異性抗体は、トランスフェリンレセプターに特異的に結合する。
【００１３】  本発明の別の態様は、加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な条件下で、ポリペプチドの予め定められた加水分解遷移状態の立体配置を模するスタチン類似体を有するエピトープを含んで成る抗原で動物を免疫感作することにより、タンパク質またはポリペプチドの加水分解を触媒する抗体を生成する方法である。この方法は、β-アミロイドに対する触媒的抗体を生成するために使用することができる。ポリペプチドの加水分解遷移状態の立体配置を模する還元されたペプチド結合類似体を利用する類似法も提供する。
発明の詳細な記述
本発明は動物体内のβ-アミロイドのレベルを制御するための免疫学的に基づく方法に関する。本発明はβ-アミロイドに特異的な抗体が生理学的レベルのヒト血清アルブミンの存在下でβ-アミロイドに結合することができるという知見に基づく。本発明はまた、動物が血流中のβ-アミロイドを隔絶するために十分な量でβ-アミロイドに特異的な抗体の存在に耐容できるという知見に基づく。
【００１４】  本発明の１つの観点は、動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法に関する。動物中に存在するβ-アミロイドの可溶性および不溶性形態は、力学的な平衡にある。可溶性β-アミロイドは血液と脳脊髄液との間を転移すると考えられている。不溶性のβ-アミロイド凝集物はアミロイド斑として脳内の可溶性プールから沈着する。以下の章の実施例に詳細に記載した結果は、β-アミロイドに特異的な抗体の動物への静脈内投与が、末梢の循環からの可溶性β-アミロイドの通過を妨げることを示す。これは末梢の循環に限定されているβ-アミロイドに特異的な抗体がβ-アミロイドに結合し、そしてβ-アミロイドを循環から隔絶(sequestering)するために起こる。そのような隔絶は、β-アミロイドに特異的な抗体の適切な量を動物へ静脈内投与することを介して達成される。隔絶を生じるために十分な抗体の量は、種々の因子（例えば送達される抗体に特別な特性、サイズ、代謝および動物の全体的な健康状態）に依存し、そしてその場に応じて決定される。
【００１５】  投与される抗体はモノクローナル抗体、異なるモノクローナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体、またはそれらの任意の組み合わせ物であることができる。１つの態様では、抗体はβ-アミロイドのＣ-末端領域に結合する。そのような抗体は小さく、そしてより害が少ないＡβ1-40とは反対に、量は少ないがより有害なＡβ1-43に特異的に血流中で結合する。別の態様では、β-アミロイドの種々の領域に特異性を有する抗体の組み合わせ物を投与する。別の態様では、以下に詳細に検討するβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を、単独または他の抗-β-アミロイド抗体と組み合わせて投与する。
【００１６】  抗体を投与される動物は、循環している可溶性β-アミロイドを有する任意の動物である。１つの態様では、動物はヒトである。ヒトは健康な個体、または上昇したβ-アミロイドレベルが役割を果たす疾患（例えばアルツハイマー病のような神経変性的疾患）に罹患しているか、またはその疾患の危険性にあってもよい。
【００１７】  本発明の関連する観点は、内因性のβ-アミロイドに対して動物内の免疫応答を刺激することにより、動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法である。以下の実施例で詳細に記載する結果は、上に記載したβ-アミロイド結合抗体の投与法と同じ様式で、動物が内因性β-アミロイドに対する抗体を生じる免疫応答の誘導に耐容でき、そしてそのような抗体の存在が体内のβ-アミロイドの分布を改変することを示している。この内因性β-アミロイドに対する免疫応答は、内因性β-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る１以上の抗原で動物を免疫感作することにより生成される。接種した抗原上に存在するエピトープは、β-アミロイド分子の任意の領域に存在するエピトープに対応することができる。好適な態様では、β-アミロイドのＣ-末端領域上に見いだされるエピトープを、より小さいＡβ1-40とは反対にＡβ1-43に特異的に結合する抗体を生成するために使用する。別の態様では、種々のエピトープの組み合わせ物を投与して、β-アミロイドに対する種々の抗体を生成する。より全身性の免疫応答は、異なる小さいペプチド抗原の混合物、または完全長の43残基のβ-アミロイドペプチドのいずれかを用いて免疫感作することにより生成される。別の態様では接種に使用する抗原は、以下に詳細に記載するように、β-アミロイド加水分解に向けた触媒活性を有する抗体を誘導するために、β-アミロイドペプチドの遷移状態類似体を含む。
【００１８】  抗原の免疫反応性は種々の方法により強化することができるが、その多くには抗原の免疫原性キャリアーへのカップリングが含まれる。さらに内因性分子またはそれに含まれるエピトープの免疫原性を特異的に強化するための種々の方法が、当業者には既知であり、しかも利用可能である。アミロイド抗原をヒトの使用により適するようにするために、種々の修飾を本明細書に記載するアミロイド抗原（１つまたは複数）に作成することができる。例えばペプチド（１つまたは複数）は、適当な抗原性キャリアーに遺伝子操作することができ、またはDNAワクチンを設計することができる。
【００１９】  循環からβ-アミロイドを隔絶するための上記技法も、脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるために有用である。脳内のアミロイド斑の形成は少なくとも部分的には脳内に存在する遊離β-アミロイドのレベルに依存するので、動物の脳のβ-アミロイドのレベルを減少させることが、次に脳内のアミロイド斑の形成を減少させる。したがって上記技法は、動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止するために有用である。これはアミロイド斑発生の危険性があると考えられる動物に特に応用することができ：この危険性は遺伝的な疾病素質から、または環境的な要因からもたらされ得る。β-アミロイドに対する抗体の投与、すなわち内因性抗体を生成するための動物を免疫感作は、そのような動物（例えばアルツハイマー病の家系であるヒト、またはこの疾患と診断されたヒト）に対して治療的に有益となる。
【００２０】  本発明の別の観点は、予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とする抗体に関する。実施例の章で詳細に記載する実験は、β-アミロイドに対するタンパク質溶解的活性を有する様々な抗体の生成を示す。そのような抗体は動物を、β-アミロイドペプチドの遷移状態類似体である抗原で免疫感作することにより生成される。遷移状態類似体は、予め定められたアミド結合の加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する。触媒抗体の生成に有用な遷移状態類似体は、限定するわけではないが、スタチン、フェニルアラニンスタチン、ホスホネート、ホスホンアミデートおよび還元されたペプチド結合遷移状態類似体である。
【００２１】  遷移状態に特有のエピトープに対して生成された抗体は、遷移状態のβ-アミロイドに優先的に結合する。このような抗体の結合は遷移状態を安定化し、これは対応するアミド結合の加水分解を導く。加水分解される特定のアミド結合は、所望する開裂産物に基づき選択される。例えば、完全長のβ-アミロイドのアミロイド斑に凝集することができない２つのペプチドフラグメントへの開裂は、本明細書に開示する方法において治療的に使用されるだろう。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでよい。幾つかのそのような遷移状態模造物が作成され、そして示した結合での開裂を触媒するモノクローナル抗体の生成に抗原として使用される。これらの抗原および生成した抗体は、以下の実施例の章の表８に掲げる。特異的なアミド結合において取り込まれた遷移状態模造物を有する抗原に対して生成した抗体は、自然なβ-アミロイド中のこのような結合の自然な加水分解遷移 状態に結合し、遷移状態を安定化し、そしてその結合における開裂を触媒するはずである。
【００２２】  少なくとも２つの異なる抗体が上記方法により生成される。１種類目は遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてまた結合を検出するために、実施例の章に詳細に記載するELISAを使用して自然なβ-アミロイドと検出可能に交差反応する。２種類目は遷移状態類似体に結合し、そして結合を検出するために、実施例の章に詳細に記載するELISA手法を使用して自然なβ-アミロイドと検出可能に交差反応しない。両種類の抗体も、触媒抗体として有力な価値がある。抗-遷移状態抗体の各結合親和性は、加水分解の触媒でその能力を反映するだろう。抗体がタンパク質の加水分解を触媒する活性を有するためには、抗体は少なくともタンパク質の自然な（非遷移）状態に結合する最小能力を保有しなければならないと考えられる。β-アミロイドに対する重要な結合を保持する（自然なβ-アミロイドと強力に交差反応する）抗体は、より高い効率のβ-アミロイド結合により、加水分解をより効率的に触媒するだろう。いったん結合すれば、これらの抗体は加水分解的開裂のためにタンパク質を遷移状態の立体配置に強制する。あるいは自然なβ-アミロイドとわずか最小に交差反応する抗体は、自然なβ-アミロイドとの結合では効率は低いが、加水分解的開裂のために結合したβ-アミロイドを遷移状態の立体配置により効率よく強制するだろう。本明細書の実施例で提示されるELISA法により自然なβ-アミロイドへの抗-遷移状態抗体の結合を検出することができないことは、触媒抗体として機能するために十分に自然なβ-アミロイドに結合できないことを必ずしも反映しているものではないことを指摘するべきである。むしろ検出されないことは単にアッセイの感度限界を反映しているのだろう。
【００２３】  自然なβ-アミロイドペプチドの予想される開裂産物に対して実質的な親和性を有する抗体は生産物阻害を受け、したがって低い代謝回転を表すかもしれない。そのような望ましくない抗体は、予想される開裂産物のエピトープを含むペプチドを使用した２次スクリーニングにより同定することができる（例えばELISAを介して）。
【００２４】  好適な態様では、抗体はモノクローナルである。モノクローナル抗体は、動物（例えばマウス、モルモットまたはラット）を、遷移状態類似体抗原で免疫感作し、そして続いて標準的手法により動物からハルブリドーマを作成することにより生産される。所望のモノクローナル抗体を生産するハルブリドーマは、スクリーニングにより同定する。スクリーニング法の１例は、以下の実施例の章に提示する。別の態様では、抗体はポリクローナルである。ポリクローナル抗体は動物（例えばウサギ、ニワトリまたはヤギ）を抗原で免疫感作し、そして動物から血清を得ることにより生産する。所望の結合親和性を有するポリクローナル抗体は、日常的な実験過程を通して当業者により血清からさらに精製することができる。
【００２５】  あるいはβ-アミロイドに特異的な触媒抗体は、触媒抗体の生産を誘導するように設計された抗−イディオタイプワクチンの使用を通して個体で生成することができる。そのようなワクチンはRaso and Paulus（1998年6月22日に出願され、現在係属中の米国特許出願第09/102,451号明細書、触媒抗体を誘導するための抗−イディオタイプワクチン（ANTI-IDIOTYPE VACCINES TO ELICIT CATALYTIC ANTIBODIES)）の開示に記載され、その内容は引用により本明細書に編入する。
【００２６】  本発明の別の観点は、タンパク質溶解活性を有する触媒抗体を誘導するためのスタチンおよび還元されたペプチド結合類似体を使用することである。以下の実施例の章では、触媒抗体の生産において抗原としてスタチン類似体を使用するための方法を詳細に記載し、そしてまたこのような方法を使用して生成された抗-遷移-状態抗体の例を掲げる。「スタチル（statyl)」部分は、アマスタチン、ペプスタチンおよびベスタチンのような自然に放出されるプロテアーゼ遷移状態インヒビターに由来する。このような自然に存在するスタチンに基づくインヒビターは、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびHIVプロテアーゼの活性を効果的に遮断するために使用され来た。スタチン残基を含有する合成ペプチドは、触媒抗体の誘導に新たな特徴を提供する。スタチル部分は四面体の結合構造を有し、その長さは２つのCH2単位により延長され、これは計画的に配置されたOH基を有し、そして構造は電荷をもたない。さらなるCH2単位の存在により、より延長された抗体結合部位を誘導すると予想され、そしてこの延長部位を有する抗体は、ペプチド基質上にさらなる歪み（strain）を誘導し、加速された触媒作用を生成する。さらにこれらのスタチン類似体中の-OH基が、真の遷移状態の位置および化学によりよく近付けると考えられる。したがってスタチンに基づく遷移状態類似体は、より多く使用される負に荷電したホスホネート類似体から得られるものとは有意に異なる種類の抗体を誘導するはずである。
【００２７】  還元されたペプチド結合類似体は、アミノ酸残基間の距離を増すことなく四面体の立体配置を導入する。この特徴はこれまでに使用された類似体よりも真の遷移状態の構造により近付けるはずである。正に荷電した２級アミンを自然なポリペプチドのアミド窒素に置き換え、そして抗体結合部位中の近位で完全に負に荷電した側鎖を誘導するはずである。抗体上のそのような補助的なグルタミンまたはアスパラギン基は、酸−塩基交換を介してペプチド開裂の抗体が媒介する触媒を補助するだろう。したがって還元されたペプチド結合に基づく遷移状態類似体は、より多く使用される負に荷電したホスホネート類似体を使用することから得られるものとは有意に異なる種類の抗体を誘導するはずである。還元されたペプチド結合類似体およびスタチン類似体は、広範なタンパク質またはポリペプチドに特異的な遷移状態類似体抗原を生成するために使用することができる。これらの抗原は次に、各触媒抗体を生成するために使用することができる。
【００２８】  上記のβ-アミロイド触媒抗体を投与は、１）動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶するために、２）動物の脳内のβ-アミロイドレベルを下げるために、そして３）動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止するために、上記の方法で使用して類似の結果を生じることができる。実施例に提示した実験では、遷移状態類似体を用いた動物の免疫感作により、免疫応答を生じて遷移状態を認識し、そしてβ-アミロイドタンパク質の加水分解を触媒する抗体の生成をもたらすことが証明される。これは遷移状態類似体がこれらの方法で抗原として使用されて、内因性のβ-アミロイドを認識し、そして開裂を触媒する抗体の動物中での生成を誘導できることを示している。
【００２９】  上記の触媒抗体のタンパク質溶解的作用を通して動物中の全体的なβ-アミロイドレベルを下げることを含む方法も、本発明により包含される。動物内の循環中に機能的な触媒抗体が存在すると、選択的な加水分解的開裂により循環中の完全なβ-アミロイドレベルを下げるだろう。したがって、本発明は動物に上記の触媒抗体を導入することにより、動物内で循環しているβ-アミロイドのレベルを下げる方法を提供する。動物への抗体の投与は、好ましくは静脈内投与を介する。そのような抗体はモノクローナル、混合モノクローナル、ポリクローナルまたはそれらの混合物である。抗体の起源は動物中の抗体の半減期に影響を及ぼすことができ；関連性が少ない種に由来する抗体は、動物の免疫系により外来であるとより認識されるだろう。好ましくは投与する抗体は、半減期を最大にし、そして宿主による悪い副反応を最小にするために、動物に親密に関連する種に由来する。
【００３０】  これに関して、単離された可変領域抗体フラグメントの投与は有益な結果を生じることができる。
【００３１】  本発明は内因性の触媒抗体を誘導するために、β-アミロイド遷移状態類似体で動物を免疫感作することにより、動物内に循環しているβ-アミロイドのレベルを低下させる方法も提供する。そのようなワクチンの使用および設計を上に記載し、そして以下の実施例の章で詳細に説明する。
【００３２】  動物の循環中のβ-アミロイドレベルの減少は、体内のβ-アミロイドの平衡を置き換え、そして最終的には大量の作用（mass action）を通して動物の脳内におけるβ-アミロイドレベルの減少を導くと期待される。これに関して、本発明は動物に触媒抗体を投与するいずれかにより、または内因性の抗体生成を誘導するために遷移状態類似体を投与することによるいずれかで、動物の脳内のβ-アミロイドレベルを減少させる方法を提供する。生じた動物の脳内のβ-アミロイドレベルの低下がアミロイド斑の形成を防止するはずであるので、続いてこのような手法はまた、動物の脳内に存在するアミロイド斑の形成を防止する方法としても価値がある。またこれらの手法は、脳のより低いβ-アミロイドレベルが斑の分解（disaggregation)を導くことができる証拠が示されているので、動物の脳内に存在するアミロイド斑の分解法としての価値を有する。
【００３３】  本発明の別の観点は、脳に抗-β-アミロイド抗体を実際に送達することにより、脳内のβ-アミロイドの分布を改変させるより直接的な方法を提供する。脳内のβ-アミロイドレベルを減少させるための、およびアミロイド斑の凝集を防止するための上記の方法は、血液、組織、脳脊髄液および脳内のβ-アミロイドプール間の交換に依存し、この交換はこれらの異なるプール間の平衡分布の抗体が媒介する破壊により動かされる(driven)。対照的に、抗-β-アミロイド抗体の脳への送達は、β-アミロイド凝集に直接影響を及ぼすだろう。以下の実施例に提示される証拠は、特定の抗-β-アミロイド抗体の結合がインビトロでβ-アミロイドの初期の凝集を阻害し、そしてまたインビトロの形成されたβ-アミロイド複合体を分解することを示す。さらに不溶性ペプチドが低レベルの可溶性β-アミロイドと平衡にある場合、抗-β-アミロイド結合抗体がこのバランスを崩し、そして次第に沈殿を溶解する。このような観察は、脳内のβ-アミロイドの存在がアミロイド斑の形成を直接阻害し、そしてまた可溶性β-アミロイドと斑として沈着した線維性β-アミロイドとの間の力学的平衡を破壊することにより、形成された斑を分解することを示している。さらに高度に活性な触媒抗体が発現されて、構成成分である凝集したペプチドを加水分解的に開裂することにより、不溶性β-アミロイド斑を破壊すると期待される。
【００３４】  脳に抗体を送達するための１方法は、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された抗体を生成することによる。ベクター化された抗体は、抗体を、循環から体内の予め定めた方向への送達を促進する作用物質に共有結合させることにより生成する。血液脳関門を横断することができるベクター化分子の例は、従来技術に見いだされる（Bickel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2618-2622(1993) ;Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）。これらの実施例では、抗体を別の分子に連結し、抗体は高分子の送達を促進する作用物質である。そのような作用物質の１例は、細胞表面から移動させられるレセプターのような細胞表面成分に向かうようにされた抗体である。血液脳関門を細胞輸送するための能力を付与する抗体の例は限定するわけではないが、抗-インスリンレセプター抗体、およびまた抗-トランスフェリンレセプター（Saito et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10227-31(1995);Pardridge et al.,Pharm,Res.12:807-816(1995);Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）を含む。この第１抗体をβ-アミロイドに結合する抗体に共有結合する。あるいはβ-アミロイド抗体をこのようなレセプターに結合するリガンド（例えばインスリン、トランスフェリンまたは低密度リポタンパク質）にカップリングすることは、循環から脳へ送達するためにベクター化された抗体成分を生成する（Descamps et al.,Am.J.Physiol.270:H1149-H1158(1996);Duffy et al.,Brain Res.420:32-38(1987);Dehouck et al.,J.Cell.Biol.138:877-889(1997)）。
【００３５】  ベクター部分は抗-β-アミロイド抗体に化学的に結合して、それを中枢神経系へ送達し易くすることができる。あるいは部分を組込み成分として抗体に遺伝的に操作することができる。このベクター成分は例えば、血液脳関門を作る脳の毛細管内皮細胞上に存在するレセプターに結合する抗-トランスフェリンレセプター抗体または抗-インスリンレセプター抗体であることができる（Bickel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2618-22(1993);Pardridge et al.,J.Pharmcol.Exp.Ther.259:66-70(1991);Saito et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10227-31(1995);Friden et al.,J.Pharmcol.Exp.Ther.278:1491-1498(1996)）。生成した二機能性抗体は、管の管腔側上の適切なレセプターに結合する（Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27623-27628(1997):Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27618-27622(1997):Raso,V.Anal.Biochem.222:297-304(1994);Raso et al.,Cancer Res.41:2073-2078(1981);Raso et al.,トキシンに共有的または非共有的に結合した細胞標的キャリアーとしてのモノクローナル抗体。薬剤のレセプターが媒介するターゲッティング（Receptor mediated targeting of drugs)、第82巻で、G.Gregoriadis,G.Post,J.Senior and A.Trouet、編集。NATOアドバンスト  スタディズ研究所（Advanced Studies Inst.)、ニューヨーク、119-138(1984)）。いったんレセプターに結合したら、二重特異性抗体の両成分は細胞輸送のプロセスにより血液脳関門をわたって進む。脳に入った抗-β-アミロイド抗体は、β-アミロイド斑および可溶性β-アミロイドプールの両方と、直接相互反応する。これらの脳毛細管に濃縮されたタンパク質標的部位を介するベクターが媒介する送達を使用して、脳内で10-8〜10-7Mの範囲の高分子の濃度が達成できると予想された（Maness et al.,Life Science 55:1643-1650(1994);Lerner et al.,Science 252:659-667(1991））。重要なことは、２週間、毎日抗-トランスフェリンレセプター抗体を投与された動物が、放射性シュクロースプローブを使用して血液脳関門の完全性の損失を示さなかったので、ベクターは安全であるという点である（Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）。
【００３６】  実施例は、β-アミロイドに結合するベクター化された二重特異性抗体の生成を詳細に記載する。二重特異性抗体はトランスフェリンレセプターに結合する第１の特異性を介して血液脳関門をわたって細胞輸送する。血液脳関門をわたる作用物質の送達のために、トランスフェリンレセプターに結合する抗体を使用することは、Friden et al.により米国特許第5,182,107号;同第5,154,924号；同第5,833,988号；および同第5,527,527号明細書に記載されており、その内容は引用により本明細書に編入する。
【００３７】  以下の実施例の章で提示する実験結果は、生成された二重特異性抗体がそれらの別々の特異性を保持し、そして静脈内投与された時に血液脳関門をわたって生きている動物の脳の実質および脳の毛細管に送達されることを示す。
【００３８】  二重特異性試薬を遺伝子操作するために、または２つの異なるハイブリドーマクローンを融合することにより二重特異性抗体を細胞内で生産するために、二重特異性抗体の別の生成法が記載された（Holliger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-6448(1993);Milstein et al.,Nature 305:537(1983);Mallander et al.,J.Biol.Chem,269:199-206(1994)）。これらの技法により生成されたベクター化された二重特異性抗体も、本発明の方法に使用することができる。
【００３９】  全抗体を脳に導入することは、抗体が補体を結合し、そして神経細胞の補体が媒介する溶解を促進すれば有害となるので、より小さいベクター化F(ab′)2二重特異性試薬を生成し、そして使用することが有益となり得る。凝集したβ-アミロイド自体は抗体無しで補体を結合することができ、そして生じた炎症がアルツハイマー病の病状に関与し得ることが示された。同様の効果を有する脳内抗体の可能性は、抗体のFc領域を排除することにより大きく下げることができる。さらに、Fab′の半分をカップリングすることは本来のヒンジ領域システインを使用するので、外因性の代替連結基が加えられる必要がない。より速く、またはより効率的に脳に入ることは、より小さいF(ab′)2またはFv2試薬が脳内送達に提供することができる別の潜在的な利点を表している。さら２種類のベクター化分子は、異なる体内分布および血漿半減期特性を有することができる（Spiegelberg et al.,J.Exp.Med.121:323(1965)）。
【００４０】  抗-β-アミロイド二重特異性抗体の設計に依存して、それらは脳内で可溶性β-アミロイドおよびβ-アミロイド沈着を３つの有力なメカニズムにより減少させることができる。可溶性β-アミロイドに強力に結合する抗-β-アミロイド二重特異性抗体はペプチドを隔絶するだけではなく、中枢神経系からのベクター化分子の流出により（Kang et al.,J.Pharm.Exp.Ther.269:344-350(1994)）、結合したβ-アミロイドも脳外に運び、それらを血流中に放出することができる。そのようなクリアランスメカニズムは、脳から出るβ-アミロイドの連続する循環を導くだろう。さらに抗体が触媒活性を有する場合、それらは分解により有害なβ-アミロイドのレベルを直接下げるだろう。触媒抗体は代謝回転を示すので、各抗体は多くのβ-アミロイド分子を不活性化することができる。すなわちβ-アミロイドの所望する減少を達成するために、脳に送達されなければならないベクター化された二重特異性抗体はより一層少ない。
【００４１】  効果的にするために、二重特異性抗体の抗-β-アミロイド部位は血液から出て、そして脳内に進む前に空でなければならない。したがって、動物内の二重特異性抗体の濃度は血液中を循環しているβ-アミロイドのレベルを越えなければならない。既知のβ-アミロイドレベルに基づき行われる循環（Scheuner et al.,Nature Med.2:864-870(1996)）および処置した動物において予想される二重特異性抗体の中程度の範囲の血漿レベルは、脳に入る99.9％の二重特異性抗体が非占有抗-β-アミロイド結合部位を有することを示した。
【００４２】  抗体を脳に送達する別の方法は、抗-β-アミロイド抗体の動物の脳への直接的注入を介する。この技法は、血液脳関門を横断する必要無しに脳内のβ「アミロイドにこれらの抗体を直ちに接近させる。直接注入は、直接実質に、または脳室内注入を介して行うことができる（knof et al,,J.Immunol.161:692-701(199)）。簡単に説明すると、動物に麻酔をかけ、そして定位フレイムに配置する。頭皮上に正中切開を行い頭蓋を露出し、そして下にある筋膜をかき出す。先端がおよそ脳内に位置するように定位に進行する滅菌したステンレス鋼製の皮下チューブの長さを受けるために、ドリルで穴をあける。次いでガイドカニューレを頭蓋につけ、そして密閉する。カニューレは脳に抗体を多数回注入するために正しい位置に留まる。モノクローナル抗-β-アミロイドの滅菌した50mg/ml溶液のボーラスを、２〜８分間にわたり固定化された動物に注入カニューレを介して注入することができる。
【００４３】  上記の方法の１つを介して動物の脳に触媒抗体を送達することは、脳に存在するアミロイド判の分解にも使用することができる。脳へのβ-アミロイド特異的触媒抗体の送達の利点は２倍である。触媒作用は連続的であり、各抗体が脳内の多くの標的β-アミロイド分子を不活性化するので、β-アミロイドペプチドはそのような抗体により永久的に破壊される。すなわちβ-アミロイドの所望する減少を達成するために、中枢神経系に注入しなければならない抗体は一層少ない。
【００４４】  動物に投与または送達される抗体の量は、動物の脳内のβ-アミロイドレベルに有意な減少を引き起こすために十分であるべきである。適切な量は種々のパラメーター（例えば使用する特定の抗体、動物のサイズおよび代謝、ならびに内因性β-アミロイドレベル)に依存し、そしてその場に応じて決定されるべきである。そのような決定は、日常的に実験を行うだけで、平均的な当業者の技術範囲にある。
【００４５】  脳のβ-アミロイドレベルを下げ、そしてアミロイド斑を防ぐ、または分解することに関して、さらなる利点が上記方法の１以上の組み合わせを利用することにより達成することができると期待される。
【実施例】
【００４６】 実施例
第１章：循環中β-アミロイドの停留
β-アミロイドペプチド抗原の合成
４３残基のβ-アミロイドペプチド（Ａβ）のアミノ酸配列を図１に掲げる。このβ-アミロイドペプチド上のどの部位が抗体が媒介する治療に最も適するかを決定するために、Ａβ43-merの３つの重要な領域（アミノ−末端、中央およびカルボキシ−末端）を選択して、エピトープに特異的なワクチンを生成した。これらの短縮化されたペプチドは、高度に特異的な抗体応答を誘導するために抗原性ペプチドとして役立てた。【００４７】  Ａβのアミノ−末端領域に対するモノクローナル抗体は、Ａβ凝集物を可溶化する能力があると過去に示された（Solomon et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 94(8):4109(1997);Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1):452(1996)。Ａβのアミノ−末端領域から成るペプチドは本実験のために同様に設計し（図２に示し、そして配列番号２に掲げる）、そしてＡβに結合するアミノ−末端特異的抗体を誘導するために使用した。Cys残基をＡβ配列のＣ−末端に加えて、このペプチドをマレイミド−活性化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような抗原性キャリアータンパク質にカップリングするための適当な連結基を提供した。【００４８】  Ａβの中央領域を包含するペプチドも合成した（図３に示し、そして配列番号３に掲げる）。Cys残基をＡβ配列のＮ−末端に配置して、このペプチドをマレイミド−活性化KLHのような抗原性キャリアータンパク質にカップリングするためのスルフヒドリル連結基を提供した。【００４９】  Ａβのカルボキシ−末端に対して向けられた免疫応答を誘導するための抗原を生成するために（Suzuki et al.,Science 264:1336(1994)）、Ｎ−末端にCys残基を付加したＡβのＮ−末端領域を包含するデカペプチドを合成した（図４に示し、そして配列番号４に掲げる）。Cys置換はこのペプチドをKLHのような抗原性キャリアータンパク質にカップリングするためのスルフヒドリル連結基を提供するために設計した。
ペプチドの抗原性キャリアータンパク質へのカップリング
様々なCysを含むＡβペプチドを、個々にマレイミド−活性化KLHにチオエーテル結合させた。多価Ａβワクチンも、３種のすべてのこのようなペプチドをマレイミド−活性化KLHに同時に連結することにより生成した。さらに完全長Ａβ43-merをグルタルアルデヒドを使用してKLHに連結した。
β-アミロイドワクチンを用いて誘導された抗体
正常なＢＡＬＢ／ｃマウスは、標準的な手順により上記のKLH-連結Ａβワクチンを用いて免疫感作した。マウスは採血するか、またはハイブリドーマ作成のために脾臓を摘出するために屠殺した。得られた血清およびモノクローナル抗体は、Ａβに対する結合について特性決定した。【００５０】  表１は、２匹の非免疫感作対照マウスからの血清で希釈した1/100  対  中央領域Ａβペプチド-KLHワクチンで免疫感作したマウスからの血清で希釈した1/100および1/1000でのELISA実験からの結果を示す。血清中の抗-KLH抗体の検出を回避するために、遊離Ａβペプチドをマイクロタイタープレートに直接吸着させた。【００５１】
【表１】
0005249482.tif 000002
【００５２】  この中央領域Ａβペプチドに対して生成された、およびハイブリドーマ融合により生成されたモノクローナル抗体は、上記のELISAアッセイを使用して同定した。結合アッセイは、同定されたモノクローナル抗-Ａβ抗体が完全長のＡβペプチドにも結合するかどうかを決定するために行った。125Ｉ-Ａβ1-43プローブは、示したクローンからのハイブリドーマ分泌物とインキューベーションした。標準的ポリエチレングリコール分離法を使用して、125Ｉ-Ａβ1-43結合抗体を検出した（表２）。表２に示す結果は、ペプチドフラグメントに対して生成された抗体が完全長のＡβ1-43にも結合することを示す。【００５３】
【表２】
0005249482.tif 000003
【００５４】 125Ｉ-Ａβ1-40をヒト血漿に加えた時、〜89％がアルブミンに結合することが報告された（Biere et al.,J.of.Biol.Chem.271(51):32916(1996)）。これは結合したアルブミンが抗体結合を妨害するという懸念を生じる。アルブミンの結合が抗体のＡβへの結合を妨害するのかどうかを決定するために、結合アッセイを血清アルブミンの存在および不存在下で行った。精製した5A11モノクローナル抗-Ａβ抗体が125Ｉ-Ａβ1-40に結合する能力は、60mg/mlのヒト血清アルブミン(HSA)の存在により、たとえこれが抗体濃度よりも500倍モル過剰でも影響を受けなかった（表３）。これらの結果は、抗体が血中のＡβに結合し、そして隔絶する能力が、他の結合タンパク質の存在により弱化されないことを示す。【００５５】
【表３】
0005249482.tif 000004
【００５６】モノクローナル抗体の生産
マウスは中央領域Ａβ10-25ペプチド（このペプチド抗原は、以下の章IIでさらに検討するフェニルアラニンスタチン遷移状態類似体をアミド結合で有する）のKLH結合物を用いて免疫感作した。ハイブリドーマの融合を行い、そして生産されたモノクローナル抗体を分析してワクチンに対する免疫応答の特異性を特性決定した。融合で生成されたハイブリドーマ上清は、ELISAを使用してスクリーニングしてそれらのＡβ１−４３ペプチドに対する結合を評価した。【００５７】  生産されたモノクローナル抗体は、ELISAプレートに直接吸着されたＡβ1-43ペプチドに結合すると決定された。強力な発色反応が、わずか10ulのハイブリドーマ上清を使用したELISAで得られたが、培地を単独で加えると低いバックグラウンド色を生じた。これらの結果は抗体が小さいペプチド免疫原に結合するだけでなく、完全長のＡβ1-43にも反応性であることを示している。重要なことは、抗体がマイクロタイタープレートに直接吸着したキャリアーをもたないＡβペプチドに結合し、それらが免疫原性キャリアーよりはむしろペプチドに対する特異性を示したことである。高親和性5A11モノクローナル抗体（表３）は、このハイブリドーマ融合から得られた。【００５８】  第２のマウスは、ＡβのＣ-末端領域を包含するＡβ35-43類似体のKLH結合物を用いて免疫感作した。マウスに由来する血清は、ELISAウェル上に直接吸着させたＡβ1-43との反応性についてスクリーニングした。このアッセイ結果を表４に示す。このマウスからの脾臓は次いでハイブリドーマ融合に使用して、その免疫応答の特異性を特性決定した。重要なことは、Ａβワクチンで免疫感作されたマウスまたは抗-Ａβ腹水-生産マウスのいずれもが、このような誘導された抗体の幾つかはマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク質と交差反応するにもかかわらず、病気を示さなかったことである。【００５９】
【表４】
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【００６０】  上記のように作成されたハイブリドーマクローンに由来するモノクローナル抗体を、小さいカルボキシ−末端ペプチドＡβ35-43および完全長Ａβ1-43に対する結合に関してスクリーニングした。結果を図５に示す。モノクローナル抗体は、マイクロタイタープレートに直接吸着したこのようなキャリアーを含まない各Ａβペプチドのカルボキシ−末端部位に結合し、それらの免疫キャリアーよりはむしろペプチドに対する特異性が確認された。クローンもＡβ1-40を用いて試験して、この短縮化された40アミノ酸残基のＡβ変異体とは反応しない抗体、すなわちＡβ1-43のカルボキシ−末端に特異的に結合する抗体を同定した（図５）。治療的に使用すると、このワクチンはより小さく、そしてより害が少ないＡβ1-40ではなく、数は少ないが、より有害な血流中のＡβ1-43種に優先的に結合する。【００６１】  別の実験で、マウスをβ-アミロイドの別個の領域を表す３種の異なるKLH−ペプチド抗原（図２〜４）のカクテルから成るワクチンで免疫感作した（図１）。対照マウスはKLH単独で免疫感作した。抗原は、初回注射前に完全フロインドアジュバントで乳化し、そして続く注射には不完全フロインドアジュバントで乳化した。試験はこれらのＡβ-KLH免疫感作マウスに由来する希釈した血清について行い、特異的な抗-Ａβ抗体の存在について測定した。Ａβ1-16、Ａβ14-25、Ａβ34-43、Ａβ1-40およびＡβ1-43ペプチドを使用して、抗体の特異性を確認した。ペプチドをELISAプレートに直接吸着させた。結果は表５に与える。この結果は３種ペプチド抗原のカクテルで免疫感作したマウスが、アミノ−末端、中央領域およびカルボキシ−末端ペプチド、ならびに完全長Ａβ40-merおよび43merと反応する抗体を含む血清を生成したことを示す。この抗-Ａβ抗体のスペクトルの一貫した存在は、予防接種した動物の末梢循環内のすべての可溶性Ａβとの結合に大変効果的である。【００６２】
【表５】
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【００６３】非ヒト霊長類におけるワクチン試験
アルツハイマー病のヒト患者についてβ-アミロイドワクチン療法の潜在的重要性を考慮して、ヒトに適合可能なalumに基づくＡβペプチドワクチン調製物を非ヒト霊長類で試験した。ヒトに適合可能な抗体生産および安全性試験は、カニクイザル（Macaca fascicularis）で実施した。この動物系はこれら霊長類の予想されるβ-アミロイドのアミノ酸配列がヒトと同一であり、そしてそれらの基本的な生理学および免疫学系が臨床的状況において遭遇する状況に極めて近いことから、ヒトへの応用と高度に関連している。カニクイザルは毎月予防接種し、そして血清中の抗-Ａβレベルをモニターするために周期的に採血した。【００６４】  カニクイザルは、水酸化アルミニウムゲルに吸着させた完全長のβ-アミロイドペプチドを含んで成る最も単純なワクチン調製物の単回注射に対して強い免疫応答を生じた。そのような初期の抗-β-アミロイド抗体の特異性は、種々のＡβペプチドフラグメントを使用してELISAにより特性決定した（表６）。この分析はサルが完全長のペプチドに結合し、そしてそのアミノ末端、中央およびカルボキシ−末端領域で反応する抗体を生成したことを示した。【００６５】
【表６】
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【００６６】  重要なことは、予防接種したサルが完全に健康であり、そして３カ月間にわたりそれらの体内で循環していた抗-Ａβ-抗体と適合性があると思われる点である。すなわち抗-Ａβ-抗体と自然に存在するβ-アミロイド前駆体タンパク質または他のウイルス成分との交差反応による明らかな副作用はない。これらの動物は獣医師により細かく観察され、そして自己免疫疾患、免疫複合体病または予防接種に対する任意の他の悪性／毒性反応を現さなかった。【００６７】  実験を続行して、常法のように追加免疫注射を行う。生成した血清は、免疫応答が強くなり、そして成熟した時に抗体の特異性および親和性パラメーターについてモニターする。最後に、サルについて完全な検死および組織病理学的検査を行う。以下に検討する遺伝子操作したＡβワクチンもカニクイザルで評価して、それらがさらによい免疫原となるかどうかを決定する。
正常なマウスにおける125Ｉ-Ａβの分布に及ぼす抗体の影響
循環中の抗-Ａβ抗体は血液脳関門を十分な程度で横断することができないので、125Ｉ-Ａβ1-40が脳に到達することを防止するシンク（sink）として作用するはずである。この停留効果は、マウスに等量の125Ｉ-Ａβ1-40を単独または我々の5A11抗-Ａβモノクローナル抗体と注射した４時間後に、マウスの血液レベルを測定することにより証明された（表７）。末梢の循環から出た125Ｉ−Ａβ1-40の通過は、特異的な抗-Ａβ抗体を同時に受容した動物において大きく縮小した。その知見は、実験動物でＡβに効果的に結合することができる抗体を示すことにより、5All抗体を用いて（表３）得たインビトロの結果に拡張される。この抗体で処置した動物が循環中に１０倍多い125Ｉ-Ａβ1-40を停留するという観察は、体内のＡβの平衡分布を、血中の選択的隔絶により劇的に改変できることを示している。【００６８】
【表７】
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【００６９】遺伝子操作したワクチン
防御レベルの抗-β-アミロイド抗体を誘導するために、ヒトに使用するための遺伝子操作したβ-アミロイド抗原が現在開発されている。β-アミロイドフラグメントは、高度に免疫原性のキャリアー部分を組込んだキメラＡβワクチンに工作されて、ヒト患者の適切な免疫原性応答を上昇させる。使用に適するキャリアー部分は、ジフテリア毒素（DT）およびＢ型肝炎コア抗原（HBcAg）を含む。これらはβ-アミロイドペプチドの強力な送達系を表し、そしてアジュバントとしてalumを使用した時に優れた、高力価の免疫応答を誘導することが知られている。【００７０】DTはＢ型インフルエンザ（H.influenza）用の複合ワクチンとして使用が認可されており、そしてこの免疫原をＴ-細胞依存的とする。組換え大腸菌（E.coli）でのDTの発現は高い。１以上の上記β-アミロイドペプチドをDTの触媒ドメインのＣ−末端、あるいはDTの結合した膜貫通／レセプター結合ドメインのいずれかの末端で融合する。生成した融合物は水酸化アルミニウムゲルアジュバントと使用して有力なワクチンを生成する。【００７１】  ヘテロロガスなエピトープに対する高力価の抗体が、HBcAg送達系および水酸化アルミニウムゲルアジュバントを使用して生成された。HBcAgは、Ａβペプチドの融合パートナーとして幾つかの顕著な利点を有する。アミノ酸75と81の間の免疫優勢な内部部位は、45アミノ酸までのヘテロロガスな配列を収容することができる。コアは、高度に免疫原性の大きな27nm粒子に自己集合する。さらにHBcAｇは組換え大腸菌（E.coli）中で高レベルで生産されることができる。【００７２】  生産された遺伝子操作されたワクチンは、マウスおよび他の関連する動物モデルを使用して、斑を減少または防止することに対する効果を試験する。抗体生産およびワクチンに関する安全性試験は、カニクイザルで行う。
本発明の方法
ペプチド合成。40merのＡβ1-40、43merのＡβ1-43および３種の小さいＡβペプチドＡβ1-16、Ａβ10-25およびＡβ35-43を、標準的な自動化Fmoc化学により合成した。新しく合成したペプチドはHPLCにより精製し、そしてそれらの組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。Ａβ43merは、市販のものから得た（バッケム：Bachem、トランス、カリフォルニア州）。
β-アミロイドペプチドの免疫原生キャリアーへの連結。小さいＡβペプチドを抗原性にするために、KLHキャリアータンパク質に連結した。Cys残基をこれらＡβペプチドのＮ−およびＣ−末端に計画的に配置して、それらをマレイミド活性化キャリアータンパク質へのチオエーテル結合を介してカップリングするための適当な連結基を提供した。この連結は安定であり、そしてペプチドを定めた方向に結合する。この連結法により典型的には〜20ペプチド／KLHの付加が得られる。より長い、完全長のＡβペプチドは、グルタルアルデヒドカップリング法を使用してキャリアータンパク質に連結した。
β-アミロイド抗原カクテル。図２〜４に示した３種のＡβペプチドを、それぞれKLHに連結した。20μｇのこれら各３種の結合物を次いで一緒に混合した。この混合物を完全フロイントアジュバントで乳化し、そしてマウスにi.p.注射した。続いて毎月のi.p.追加免疫注射は、不完全フロイントアジュバントで乳化した同じカクテル混合物を使用した。対照マウスは同様の免疫感作プロトコールを受けたが、Ａβペプチドとは連結していないKLHを使用した。
マスの免疫感作。正常なBALB/cマウスは、上記のKLH-連結Ａβワクチンを用いた標準的手法により免疫感作した。簡単に説明すると、マウスに完全フロイントアジュバントで乳化した抗原をi.p.注射し、続いて不完全フロイントアジュバントで２回目の感作を行った。マウスは採血またはモノクローナル抗体を生産するためのハイブリドーマ融合用に脾臓を取り出す３日前に、PBS中の抗原をi.v.により追加免疫感作した。【００７３】  Ａβワクチンで免疫感作したマウスまたは抗-Ａβ腹水−生産マウスのいずれも、幾つかの抗体がマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク質と交差反応したにもかかわらず、病気の兆候を現さなかった。
ELISA。結合した抗−ペプチド抗体の存在は、ペルオキシダーゼで標識した抗−マウスIgGプローブを使用することにより、続いて発色体基質により明らかにされた（Engvall et al.,Immunochemistry 8:871-875(1971)）。
結合アッセイ。Ａβ1-43およびＡβ1-40の両方を125Ｉで放射標識した。ヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、本質的に定量的に特異的な活性を与えた（〜2000Ci/mmol）（Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:5462(1992)）。125Ｉ-Ａβ1-43プローブを23℃で１時間、モノクローナル抗-Ａβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取ったHy培地とインキューベーションした。標準的なポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合した125Ｉ-Ａβ1-43の量を検出した。
霊長類用のβ-アミロイドワクチン。使用した免疫原は、Ａβタンパク質のアミノ酸1〜41を包含する合成Ａβペプチドであった。このペプチドをHPLCにより精製し、そして凍結乾燥させ、そして次いで滅菌水に1.5mg/mlの濃度で再懸濁した。ワクチンは、本明細書ではalumゲルと呼ぶ7.5mlの２％水酸化アルミニウムゲルアジュバント（Alhydrogel、スパーホス  バイオセクター(Superfos Biosector）、デンマーク）を、7.5mlのペプチドと混合することにより調製した。試験ではすべてのペプチドが25℃で12時間混合した後にalumゲルに吸着したことが示された。【００７４】  サルは最初に0.5mlのalum-吸着ペプチドを筋肉内（i.m.)注射することにより予防接種した。同じワクチン調製物(0.5ml)を用いた２回目の予防接種（追加免疫感作）は、１カ月後に投与した。続いて同一の毎月の注射（追加免疫感作）を、実験が終了するまで与える。
遺伝子操作したワクチン。高度に免疫原性のキャリアー部分を使用して、キメラＡβワクチンを構築する。使用した部分は、ジフテリア毒素（DT）およびＢ型肝炎コア抗原（HBcAg）を含む。HBcAg発現系を使用する（Schodel et al.,Infect.and.Immun.57:1347-1350);Schodel et al.,J.of Exer.Med.180:1037-1046(1994);Schodel et al.,J.of Virology 66:106-114(1992);Milich et al.,AnnalsNew York Academy of Sciences:187-201(1993))。HBcAgの触媒ドメインのアミノ末端は、Ａβ融合タンパク質を培養基中に分泌させるべくシグナル配列を有する。培養基は、大きなアミコン（Amicon）超遠心デバイスを使用して濃縮し、そして濃縮物を大きなSuperdex 75カラムでカラムクロマトグラフィーにかける。溶解した細胞内から得られた組換え産物は、陰イオン交換体およびサイズ排除FPLCの組み合わせを使用して細菌タンパク質から分離する。
第II章：遷移状態抗原を用いたモノローナル抗体の誘導
遷移状態ペプチド抗原
異なる型の遷移状態ペプチド抗原を合成して、予め定めたアミド結合位置でＡβの遷移状態を優先的に認識（加水分解）する抗体の生成に使用した。【００７５】  Ａβのカルボシ−末端領域（Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−ＶａＩ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＶａＩ／Ｓｔａ−Ｖａｌ／Ｓｔａ−Ｉｌｅ／Ｓｔａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）を包含する一連のスタチン（Sta）遷移状態類似体を合成した。提案したVal39とVal40、Val40とIle41、およびIle41とAla42の間の切れ易い（sicissile）ペプチド結合の、「スタチル」部分．（-CHOH-CH2-CO-NH-）への置き換えを設計して、これらの部位の１つで加水分解的にＡβを開裂する触媒抗体を誘導した（図６）。Cys残基をこのようなペプチドのＮ-末端に配置し、マレイミド-活性化キャリアータンパク質にカップリングするために適当な連結基を提供した。【００７６】  Ａβの中央領域（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ／ＰｈＳｔａ−Ｐｈｅ／ＰｈＳｔａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−アミド）を包含する一連のフェニルアラニンスタチン（PhSta）遷移状態類似体をこの研究室で合成した。【００７７】  提案したPhe19とPhe20、およびPhe20とAla21の間の切れ易いペプチド結合の、スタチル部分（-CHOH-CH2-CO-NH-）への置き換えを設計して、これらの部位で加水分解的にＡβを開製する触媒抗体を誘導した（図７）。Cys残基をこのようなペプチドのＣ-末端に配置し、ペプチドをKLHのような抗原性のマレイミド−活性化キャリアータンパク質にカップリングするためにスルフヒドリル連結基を提供した。【００７８】  自然なＡβペプチドと遷移状態フェニルアラニンスタチンＡβペプチドとの間の構造的比較（図８）を、画像的ワークステーションを使用して行った。エネルギー最小化アルゴリズム（2000の繰り返し）を適用して、最も好ましい立体配置に各ペプチドを配列した。【００７９】  Phe19とPhe20との間のペプチド結合(-CO-NH-)を、延長した「スタチル」部分(-CHOH-CH2-CO-NH-)に置き換え、そしてエネルギー最小化を適用した。この配置は、自然なＡβ（左）の平面的なペプチド結合(-CO-NH-)と遷移状態ペプチド（右）の四面体：「スタチル」部分(-CHOH-CH2-CO-NH-)との間の差異を示す。四面体スタチン遷移状態類似体に相補的な抗体結合部位は、Ａβ基質の平面的なペプチド結合を遷移状態-様の立体配置に強制する。そのような歪みが、ペプチド配列中のその位置でＡβの開裂を触媒する。【００８０】  アミド結合の加水分解中に遷移状態を模するために、還元されたペプチド結合を使用することの可能性も調査した。還元されたペプチド結合の連結は、Ａβ分子のほとんどいかなる部位にも容易に配置して、還元型のペプチド結合遷移状態類似体を生成することができる。この類似体も選択した部位でＡβを加水分解的に開裂する触媒抗体を誘導するために使用することができる。作成した還元型のペプチド結合遷移状態Ａβ類似体は、（Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨ2−ＮＨ2+−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−アミド）中央領域ペプチドであった；[計算値1,342(M+1)；観察値1,344]。【００８１】  自然なＡβペプチドと還元型のペプチド結合遷移状態Ａβ類似体との間の構造的比較（図９）を、画像的ワークステーションを使用��て行った。Phe19とPhe20との間のペプチド結合(-CO-NH-)を、還元型のペプチド結合(-CH2-MH2+-)に置き換え、そしてエネルギー最小化を適用した。示したこの配置は、自然なＡβ（左）の平面的なペプチド結合(-CO-NH-)と対応する還元型のペプチド結合遷移状態類似体（右）の四面体部分(-CH2-MH2+-)との間の差異を示す。エネルギー最小化アルゴリズム（2000の繰り返し）を適用して、最も好ましい立体配置の各ペプチドを配列した。【００８２】  Ａβのカルボキシ-末端領域のホスホンアミデート遷移状態類似体も合成した（図１０）。提案したGly38とVal39の間の切れ易いペプチド結合の、ホスホンアミデート部分（-PO2--NH-）への置き換えを設計して、この部位で加水分解的にＡβを開裂する触媒抗体を誘導した。N-アセチル-Cys残基をLeu34の位置に配置して、このペプチドを抗原性のキャリアータンパク質ヘカップリングするために適当な連結基を提供した。図１１の構造は、亜鉛ペプチダーゼによるペプチド加水分解に関する推定上の遷移状態 対 ホスホネートおよびホスホンアミデート模造物の構造を示す。同様な四面体の遷移状態中間体は、４種類のタンパク質溶解酵素、セリン−、システイン−、アスパラギン酸−およびメタロ−ペプチダーゼの各々を用いた反応により形成されることが知られている。【００８３】  自然なＡβペプチドと遷移状態のボスホンアミデートＡβペプチドとの間の構造的比較（図１２）を、画像的ワークステーションを使用して行った。Gly38とVal39の間のペプチド結合(-CO-NH-)を、ホスホンアミデート結合（-PO2--NH-）に置き換え、そしてエネルギーの最小化を適用した。図１２に示した配置は、自然なＡβ（左）の平面的なペプチド結合（-CO-NH-）と対応する四面体のホスホンアミデート結合（-PO2--NH-）（右）との間の差異を具体的に説明する。【００８４】  図１２の右側の四面体の遷移状態類似体に相補的な抗体結合部位は、左側のＡβ基質ペプチドの通常は平面の結合を、遷移状態様の配置に強制する。そのような結合の歪みが、Gly38−Val39連結でＡβペプチドの加水分解的開裂を触媒する。
遷移状態ペプチド抗原を用いた免疫感作
マウスの免疫感作前に、ペプチド抗原を免疫原性キャリアーKLHにカップリングした。標準的なプロトコールを使用して、BALB/cマウスは前記の章に記載したKLHを連結したＡβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手順はフロイントアジュバントで乳化した種々の抗原のi.p.注射、続いて２回目は不完全アジュバントで乳化して使用した。ハイブリドーマ融合の３日前に、BALB/cマウスをi.v.でPBS中の抗原を用いて追加免疫感作した。【００８５】  ハイブリドーマ融合は、生成したフェニルアラニンスタチン遷移状態抗原の混合物（図７）、生成したスタチン（Sta)遷移状態Ａβ抗原の混合物（図６）、生成した還元型ペプチド結合遷移状態Ａβ抗原（Phe19−Phe20間に位置する遷移状態模造物）、または生成したホスホアミデート遷移状態Ａβ抗原（Gly38−Val39間に位置する遷移状態模造物）のいずれかを用いて免疫感作したマウスの脾臓を使用して行った。表８に掲げるモノクローナル抗体は、このようなマウスから生成された。【００８６】
【表８】
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【００８７】生成した抗体によるＡβ結合の証明
抗-Ａβおよび抗-遷移状態Ａβモノクローナル抗体が、隔絶または開裂されるように設計された天然のＡβ1-43ペプチドに結合することを示すことは大変重要であった。このために、Ａβ1-40およびＡβ1-43を125Ｉで標識し、そしてヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離した。プローブを精製した抗-Ａβ抗体または抗-Ａβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培地のいずれかとインキューベーションした。抗体に結合した125Ｉ-Ａβ1-43の量は、ポリエチレングリコール分離法を使用して決定した。実験結果を表３に与える。【００８８】  表３の結果は、精製した5A11モノクローナル抗-Ａβ抗体が高い割合で125Ｉ-Ａβ1-40に結合する能力を示す。この結合アッセイを使用して、クローンおよび精製した抗体（表３）のＡβに結合する能力をスクリーニングした。同様の手順が、種々の非標識Ａβペプチドの相対的結合強さを測定するために、競合的置換アッセイの基礎としても役立ち得る。（注意：大変効率的な触媒抗体を用いる場合、インキューベーション時間中にＡβの開裂が起こらないことを確実とするために、この結合アッセイは氷上で行なわなければならない。）このアッセイは、高い親和性の抗-Ａβ抗体を生産しているクローンを迅速に同定する。【００８９】  フェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβ-KLH抗原を使用して得たハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体をELISAによりスクリーニングして、正常なＡβ1-43ペプチドおよびフェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβペプチドの両方に対するそれらの結合を評価した。２つの主要なパターンが見いだされた（図１３）。【００９０】  １つの群の抗体（図１３の左部分）は、免疫感作した遷移状態ペプチドに結合し、そして自然なＡβ1-43ペプチドと強力に交差反応した（各々が、ELISAプレートに直接吸着していた）。第２群（右部分）は、フェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβペプチドに高い結合優先性を示し、そして自然なＡβ1-43との反応は最小であった。【００９１】  強力な発色反応が、わずか10μlのハイブリドーマ上清を使用してこのELISAにより得られたが、Hy培地単独またはPBSは低いバックグラウンドを与えた（図１３）。これらの結果は、競合的なELISAスクリーニングが結合の半定量的測定のみではあるが、遷移状態に高度に選択的であり、しかも最も反応性のモノクローナル抗体を同定するための手段を提供することを示す。重要なことは、実験はマイクロタイタープレートに直接吸着したキャリアーを含まないＡβペプチドを用いて行ったことであり、キャリアーではなくＡβペプチドに対する抗体の特異性を示している点である。【００９２】  これらの知見は、生成した抗-Ａβ遷移状態抗体の幾つかが独特であることを示している。それらはフェニルアラニンスタチン−および正常−Ａβペプチドの両方に結合した。しかしそれらの遷移状態の選択的認識、および自然なＡβ1-43との交差反応は、この結合する相互反応が従来の抗-天然Ａβ抗体とは大変異なることを示している。さらにこれらの新規抗体は天然のＡβペプチドを加水分解的開裂のために遷移状態に似た立体配置に強制することを示す。重要なことは、このELISAにおいてＡβ1-43と最小の結合しか示さなかった抗体の中には、高度に感受性のある125Ｉ-Ａβ1-43結合アッセイを使���して自然なペプチドとの交差反応性を示すものがあるという点である（表３）。【００９３】  ELISAを行って、抗-スタチン類似体抗体の正常Ａβ1-43ペプチドおよびスタチン遷移状態Ａβペプチドへの結合も調査した（図１４）。この抗体はこれらのキャリアーを含まないＡβペプチド（マイクロタイタープレートに直接吸着した）上のＣ−末端位置に結合し、それらの抗-ペプチド特異性が確認された。ほとんどの抗体がスタチンＡβ遷移状態を優先的に認識したが、自然なＡβ1-43と交差反応した。これはこれらの新規抗体が、天然のＡβペプチドを、そのＣ−末端アミノ酸の加水分解開裂のために遷移状態に似た立体配置に強制することを示す。そのような開裂はＡβ1-43をＡβ1-40またはＡβ1-39のようなより害が少ない短いペプチドに転換すると予想される。【００９４】  クローン11E9はスタチン類似体について最強の選択性(preference)を有し、そして最大の触媒活性を有するらしい（図１４）。幾つかのクローンは天然 対 スタチン遷移状態Ａβペプチドで、それらの反応性に差異を表さなかった。このクローンもＡβ1-40を用いて試験し、この短縮されたＡβの40アミノ酸変異体と反応しない抗体を同定した（図１４）。治療的に使用する場合、そのような抗体は小さいく、しかも害が少ないＡβ1-40に対して、血液中のより数が少ないがより有毒なＡβ1-43種に優先的に結合／開裂するはずである。
固相およびTLCのＡβタンパク質溶解アッセイ
固相125Ｉ-標識Ａβアッセイを開発して、特異的タンパク質溶解活性について抗−遷移状態抗体ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。Ａβのアミノ酸14〜25を包含するペプチドＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−アミド（配列番号５）を放射標識し、そしてチオール−反応性、ヨードアセチル-Sepharoseゲルにカップリングして、無関係な連結を作成した。生成物は抗-遷移状態抗体とインキューベーションし、そして固相マトリックスからの可溶性125Ｉ-ペプチドの進行的放出をアッセイした。125Ｉ-Ａβ-Sepharoseからの放射活性の放出は、触媒活性を確認するために使用した（図１５）。このアッセイは、このSepharoseを連結したＡβ基質を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアーゼの能力により確認した。インキューベーション時間に伴い上昇する可溶性125Ｉ-ペプチドの放出により明らかにされるように、ペプチドは容易にタンパク質溶解的に開裂されることが可能であった。【００９５】  図１５に示す結果は、幾つかのクローンの抗体を含有する培体が、この融合またはPBSおよびHy媒質対照からの他のクローンよりも大きな速度で125Ｉ-ペプチドを放出することを示す。大量のこれら抗体を得、精製し、そしてさらに一層早い開裂速度を達成するためにより高濃度で試験し、そして抗体が通常の酵素的動力学を使用した触媒様式で作用していることを確認することができる。125Ｉ−ペプチドの組成の変化させることにより、この同じ方法を使用して、Ａβの異なる領域と反応性の抗体をアッセイすることがてきる。【００９６】  Ａβの抗体が媒介する開裂についてより明確な証拠を得るために、薄層クロマトグラフィーに基づくオートラジオグラフィーアッセイを考案した。選択した抗-フェニルアラニンスタチンＡβ遷移状態クローンを拡張し、そして腹水生産を誘導した。異なるモノクローナル抗体は、プロテインＡ-Sepharoseを使用して単離した。２つの125Ｉ-標識ペプチド、Ａβ1-40およびＡβのアミノ酸9-25を包含する17merを使用して、ペプチド開裂について試験した。抗体を125Ｉ-ペプチドに加えてインキューベートし、そして反応混合物をポリアミド薄層シートにスポット添加し、これを次いで異なる溶媒中で展開した。125Ｉ-生成物の移動は、シートを定量的なホスホイメジャー（Phosphoimager)システムを使用して暴露することにより追跡した。生成された異なる標識ペプチドフラグメントの定量は、抗体のＡβペプチドへの添加が未処理ペプチドと比較してＡβペプチドの有意な分解を導くことを示した。
モノクローナル抗体によるβ-アミロイドの分解(disaggregation)
合成Ａβペプチドの自己−集合は、脳内でアミロイド斑に似た顕微鏡構造を導くと既に示され（Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997)；Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996)）、これがチオフラビンＴに暴露すると同じ明るい緑色の蛍光を現す。これらの凝集物は大変安定であり、そして通常は溶解するために苛酷な界面活性剤または強酸が必要である。しかし特定の抗-Ａβモノクローナル抗体の結合がこのペプチドの初期の凝集を効果的に阻害し、そしてまた形成されたＡβ複合体を分解できることが証明された（Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997)；Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996)）。【００９７】  放射活性のアッセイを使用して、本実験により生成された種々のモノクローナル抗体が、形成されたＡβ凝集物（125Ｉ標識および非標識の可溶性Ａβペプチドを用いて作成した）を溶解する能力について迅速にスクリーニングした。標識した凝集物のアリコートをPBS、5A11抗-Ａβ抗体または等量の無関係なマウス抗体（7D3、抗-ヒトトランスフェリンレセプター)とインキューベーションし、そして放出された放射活性のレベルを続いて測定した（表９）。Ａβ-特異的5A11抗体はＡβ凝集物の80％を可溶化したが、等量の対照抗体はわずかな効果を有するだけで、平衡が可溶性Ａβの抗体により媒介される結合により置き換わることを示唆していた。【００９８】
【表９】
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【００９９】ベクター化された抗-Ａβ／抗-レセプター二重特異性抗体の生成
抗-Ａβ抗体は、抗-Ａβ抗体を脳に送達するためのベクターとして役立つ抗−トランスフェリンレセプター抗体（抗-TfR）に連結した。7D3マウスモノクローナル抗体を構築物の抗-TfR部分として使用した。7D3はヒトレセプターに特異的であり、そして正常なヒトの脳組織中の皮質毛細管を選択的に免疫染色する（Recht et al.,J.Neurosurg. 72:941-945（1990)）。レセプターへの抗体のアタッチメントは、過剰なヒトのトランスフェリンにより遮断されない。この抗体により認識されるエピトープは、したがってレセプター−リガンド結合部位からは離れている。この7D3抗体および抗-Ａβ抗体を用いて構築された二重特異性抗体は、アルツハイマー病の患者の治療に有用となると予想される。【０１００】  アルツハイマー病のマウスモデルにおける実験のために、ラットで生成された抗-マウストランスフェリンレセプターモノクローナル抗体を得た。この抗体もリガンド結合に関与しないトランスフェリンレセプターエピトープを認識するように思われる。したがって抗体はマウス系に使用した時に、細胞増殖には効果を及ぼさない。【０１０１】  合成の完了後に、抗-Ａβ／抗-トランスフェリンレセプター二重特異性抗体の一連の機能アッセイ、精製およびサイズ分析を行った。マウストランスフェリンレセプターに対するラットモノクローナル抗体に加えて、5A11マウス抗-Ａβモノクローナル抗体から成るベクター化された二重特異性抗体を、トランスフェリ、ンレセプターを持つマウスの細胞に付く能力について試験した。二重特異性抗体の両成分は、この二重抗体(duplex)をトランスフェリンレセプター陽性マウス細胞と反応させ、そしてラットIgG-特異的またはマウス-IgG特異的蛍光２次抗体試薬のいずれかと反応させた時、細胞蛍光測定により細胞膜上に検出された（図１６）。【０１０２】  ハイブリッド試薬が125Ｉ-Ａβに結合する能力は、元の抗-Ａβ抗体の能力によく対応する（表１０）。【０１０３】
【表１０】
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【０１０４】  これらの結合活性の両方が二重特異性抗体上にあることを確実にするために、トランスフェリンレセプター陽性細胞をハイブリッド試薬で処理し、非結合材料を洗い出し、そして次いで結合した抗体を持つ細胞を125Ｉ-Ａβ1-40に暴露した。非結合Ａβを洗い出した後、細胞に結合した放射活性を、二重特異性抗体を用いた前処理を除いて同一に調製した対照細胞と比較した。結果を表１１に与え、そして抗体が同時に細胞膜に付き、そして125Ｉ-Ａβ1-40に結合できることを明らかに示すことにより、この二重特異性抗体の二重特異性を確認する。【０１０５】
【表１１】
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【０１０６】脳への二重特異性抗体の細胞輸送
新規なベクター化された二重特異性構築物の脳への侵入(entry)をモニターすることができるように、ラットモノクローナル抗-マウストランスフェリンレセプター抗体を、マウスモノクローナル抗体（アメリカン タイプ カルチャー コレクション(ATCC TIB 219)から得た。R17 217．1．3とも呼ばれる（Cell.Immunol.83:14-25(1984)）にカップリングした。二重特異性抗体を125Ｉで標識し、そして正常なマウスにi.v.注射した。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−脳バリアーを横断し、そして脳に入った125Ｉ-二重特異性抗体の量を、マウス毛細管消費法（mouse capillary depletion method）（Friden et al.,J.Pharrm.Exper.Ther.278:1491-1498(1996)；Triguero et al.,J.Neurochem.54:1882-1888(1990))により測定した。【０１０７】  脳の実質または脳の毛細管画分に見いだされたベクター化二重特異性抗体の量は、脳のホモジネートの分別密度遠心後に測定した。これらの値をi.v.注射後の時間の関数としてプロットした（図１７）。毛細管からの、そして実質への放射標識した二重特異性抗体の時間に依存した再分布は、大脳内皮の血液−脳バリアーをわたった通過と一致した（Joachim et al.,Nature 341:6239:226-30(1989))。実質中でのさらにより多くの蓄積は、抗体が斑を持つマウスの大脳斑中のＡβに付いた時に起こると期待される。
生きているマウスにおける二重特異性抗体の脳分布のモニタリング
生きてマウスにおける脳内のベクター化された二重特異性抗体の侵入および蓄積を追跡する能力は、斑を持つマウスの脳内処置の開発で大いに援助されるだろう。そのような開発はタイム−コース実験を可能とし、そしてマウス間の変異性の問題を大きく減らすだろう。125Ｉ-標識二重特異性抗体を用いた予備実験は、イムノシンチグラフィーがこの系で利用できるかどうかを決定するために行った。第１段階として、放射性標識したベクター化二重特異性抗体（125Ｉ-R17/5A11）または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに投与した。連続的な脳の画像は、125Ｉ-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与してから１、６、24および48時間後に累積した。この技法はどのくらい多くのシグナルが脳を通って循環している血管−骨放射活性レベルによるものであるかを決定するには難点があるが、マウストランスフェリンレセプター反応性二重特異性抗体で処置したマウス 対 対照の二重特異性抗体を受容したマウスの脳で、有意な識別が記録された。ベクター化された作用物質を使用した時、脳のレベルは１から６時間の間に上昇し、そして次いで24から48時間の間に大変低いレベルに低下した。対照で処置したマウスは１から６時間の間に上昇を示さなかった。脳のレベルが24時間以降で低下した理由はわからないが、二重特異性抗体プローブの脱ハロゲン化により遊離の125Ｉが放出されたのかもしれない。ヨウ素の使用が技術的な問題を与える場合には、ベクター化された二重特異性抗体に結合した111In（Sheldon et al.,Nucl.Med.Biol.18:519-526(1991))または99mTc（Texic et al.,Nucl.Med.Biol.22:451-457(1995))のような放射性標識を利用する別の方法を、さらなる実験で利用することができる。この造影法は、異なる物理的特性および改変された生物分布を持つより小さいベクター化された二重特異性抗体（例えばF(ab')2）が脳により効率的に浸透すかどうかを決定するために有用となるだろう。
ベクターが媒介する脳への輸送のためのF(ab')2ヘテロ二量体
全抗体を脳に導入することは、それらが補体を結合し、そして補体が媒介する神経細胞の溶解を促進するならば、有害となるだろう。より小さいベクター化F(ab')2二重特異性試薬の開発は、この問題を回避するものと期待される。凝集したＡβ自体が任意の抗体の不存在下で補体を結合し、そして生じた炎症がアルツハイマー病の病状の原因となることが示された。類似の効果を有する脳内抗体の可能性は、抗体のFc領域を排除することにより大きく減少するだろう。さらにFab'の半分のカップリングには本来のヒンジ領域を利用するので、外来の置換連結基を加える必要はない。【０１０８】  より速く、またはより効率的な脳内への侵入は、より小さいF(ab')2またはFv2試薬が脳内送達に提供する別の有力な利点を表す。そのような修飾された二重特異性試薬は、本明細書に記載する方法により調製し、そして完全なサイズのハイブリッド抗体と、それらの脳への到達における相対的効率、血液−脳バリアーの横断、およびＡβ斑発生に及ぼす影響を比較することができる。しかし異なったサイズの抗-トランスフェリンレセプター二重特異性試薬のレセプターが媒介する細胞輸送によりトキシンを細胞に送達する能力を比較した時、わずかな差異しか見いだされなかったことは注目に値するほど重要である(Raso et al.,J.Biol.Chem. 272:27623-27628(1997))。この観察は小さい変動が血液−脳バリアーを形成する脳の毛細管内皮細胞をわたる細胞輸送に少ししか見られないことを示しているかもしれない。しかし少なくとも、２種類のベクター化された分子は異なる生物分布および血漿半減期特性を有すると期待される（Spiegelberg et al.,J.Exp.Med.121:323(1965)）。
発明の方法
抗原の合成。スタチンおよびフェニルアラニンスタチン遷移状態ペプチドは、自動化Fmoc化学を使用して合成した。Fmoc−スタチン（Sta）、［N-Fmoc-(3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチル-ヘプタン酸］およびFmoc-“フェニルアラニンスタチン"(PhSta)、［N-Fmoc-(3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸］は市販されているものを購入した。各ペプチドは純度をHPLCにより検査し、そしてその組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。【０１０９】  ホスホンアミデート−およびホスホネートに基づく遷移状態ペプチドを合成するための設計計画および方法は簡単である（Bartlett et al.,Am.Chem.Society 22:4618-4624(1983)；Bartlett et al.,Biochemistry 26:8553-8561(1987))。ペプチドのＮ−末端部分（N-アセチル-Cys-Met-Val-Gly）は、標準的な自動化Fmoc化学を使用して合成した。樹脂から開裂した後、N-アセチルテトラペプチドをピリジンジスルフィドで処理して、そのスルフヒドリル基を保護した。Cbz-グリシンホスホン酸モノメチルエステルの酸クロライド（Bartlett et al.,Am.Chem.Society 22:4618-4624(1983)；Bartlett et al.,Biochemistry 26:8553-8561(1987))は、自動化Fmoc化学を使用して合成したVal-Val-Ile-Ala-アミドにカップリングした。Ａβの最後のアミノ酸であるThrは、その非保護ヒドロキシル基が持つ潜在的問題により省略した。生成物であるCbz-Gly-PO2--NH-Val-Val-Ile-Ala-アミドは、GlyとVal残基との間にホスホンアミデート(メチルエステル)け結合を有する。次に保護されたN-アセチル-Cys-Met-Val-GlyペプチドがHBUT-活性化ペプチド結合によりこの遷移状態ペプチドのアミノ末端に付加できるように、Cbzブロッキング基を水素を使用して除去した。メルカプトエタノールおよびウサギ肝臓エステラーゼを用いた処理を使用してペプチドを脱ブロッキングした。合成スキーム中の各々の重要な成分は、HPLCにより純度を検査し、そしてその組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。【０１１０】  還元されたペプチド結合連結は、Ａβ分子の示した部位に配置した。自動化Fmoc化学を使用してこのペプチドの合成を始めた。次いで前合成したFmocアミノアルデヒドを手で加え、そしてイミドを還元した後、自動化合成を再開した(Meyer et al.,J.Med.Chem.38:3462-3468(1995)）。
抗原のキャリアーへのカップリング。免疫応答を誘導するために、天然および遷移状態Ａβペプチドを、マレイミド-活性化KLHに標準的手法でカップリングした（Partis et al.,J.Pro.Chem.2:263-277(1983))。Cys残基を計画的にペプチドのＮ−またはＣ−末端に配置して、それらをチオエーテル結合を介してマレイミド活性化キャリアータンパク質にカップリングさせるための適当な連結基を提供した。この安定な連結は、定めた方向にペプチドを付ける。〜20ペプチド／KLHの付加が、この加水分解された結合物のアミノ酸分析により決定されたように、遷移状態アミノ酸含量に基づき得られた（Taso et al.,Anal.Biochem.197:137-142(1991))。
マウスの免疫感作。標準的なプルトコールを使用して、マウスを前記の章に記載したKLH-連結Ａβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手法は完全フロイントアジュバントで、続いて２回目からは不完全フロイントアジュバント乳化した様々な抗原のi.v.注射を使用した。ハイブリドーマ融合の３日前、BALB/cマウスをPBS中の抗原で追加免疫感作した。【０１１１】  〜１カ月後、動物に不完全フロイントアジュバントで乳化した抗原を用いてi.p.追加免疫を与えた。これらの動物からの血清は、ELISAにより抗-ペプチド抗体について分析した。豊富な抗体生成を示すBALB/cマウスを、抗原を含むi.v.注射により追加免疫感作し、そして３日後、それらをモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンの作成に使用した。【０１１２】  Ａβワクチンで免疫感作したマウスまたは抗-Ａβ腹水生成マウスのいずれもが、誘導された抗体の中にはマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク質と交差反応するものがあるにもかかわらず、病気の兆候を示さなかった。
ハイブリドーマの作成I。ハイブリドーマ融合は、フェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβ-KLH抗原で免疫感作したマウスの脾臓を使用して行った。マウスから最高力価を持つ脾臓細胞をマウスミエローマNS-1細胞と融合して、標準的な手法に従いハイブリドーマを樹立した（Koehler et al.,Nature 256:495(1975)；R.H.Kennett、融合プロトコール。モノクローナル抗体（Fusion Protocol.Monoclonal Antibodies）、R.H.Kennett、T.J.McKearnおよびK.B.Bechtol編集。プレナム出版、ニューヨーク。365-367頁。(1980)）。
125Ｉ-Ａβ結合アッセイ。Ａβ1-40およびＡβ1-43を125Ｉで放射性標識し、そして次いでヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、定量的な特異的活性を与えた（〜2000Ci/ミリモル）（Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:5462-5466(1992)）。このプローブを23℃で１時間、精製した抗-Ａβ抗体または抗-Ａβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培地とインキューベーションした。ポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合した125Ｉ-Ａβ1-43の量を検出した。連続希釈を使用することにより、このアッセイは異なるハイブリドーマ上清または精製抗体に関する相対的な結合親和性を提供することができる。
固相Ａβタンパク質溶解アッセイ。固相125Ｉ-標識Ａβアッセイは、抗-遷移状態抗体ハイブリドーマ上清を特異的なタンパク質溶解活性についてスクリーニングするために開発した。Ａβのアミノ酸14〜25を包含するＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−アミド  ペプチド（配列番号５）を125Ｉで放射性標識し、そしてヨウ素化したペプチドを次いで非標識材料からHPLCにより分離した。高度に放射性のＡβペプチドをチオール−反応性のヨードアセチルSepharoseゲルにカップリングして、無関係な連結を形成した。抗体を標識したＡβに加え、これを次いでpH７、25℃で固相マトリックスから可溶性125Ｉ-ペプチドの進行的放出についてアッセイした。このアッセイは、このSepharoseを連結したＡβ基質を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアーゼの能力により確認した。可溶性125Ｉ-ペプチドの放出はインキューベーション時間に伴い上昇した。【０１１３】  Ａβは幾つかの自然に存在するプロテアーゼにより開裂されるが、予備試験では高レベルのバックグラウンド加水分解からの妨害が触媒抗体を生産するクローンのハイブリドーマ上清をアッセイした時には問題にならないことが示された。外因性のプロテアーゼに対してさらに注意しなければならないのは、すべてのハイブリドーマ細胞融合および無血清培地中での細胞培養を行うことである。
TLCによるＡβタンパク質溶解アッセイ。薄層クロマトグラフィーに基づくオートラジオグラフィーアッセイを使用して、Ａβの抗体が媒介する開裂に関するより明白な証拠を得た。選択した抗-フェニルアラニンスタチンＡβ遷移状態クローンを拡張し、そして腹水生産を誘導した。異なるモノクローナル抗体は、プロテインＡ-Sepharoseを使用して単離した。開裂アッセイは125Ｉ-Ａβ1-40およびＡβのアミノ酸9-25を包含する125Ｉ-標識した17-merを使用した。２つの125Ｉ-標識ペプチドの精製したモノクローナル抗体5A11および6E2への結合は、PEG沈殿アッセイまたは同時(co)-電気泳動法によるいずれかを使用することにより調査した。ペプチド開裂は抗体を125Ｉ-ペプチドに加え、インキューベートし、そして反応混合物をポリアミド薄層シートにスポット添加することにより試験した。クロマトグラフを異なる溶媒中(例えば0.5N HCl、0.5N NaOH、またはpH７のリン酸バッファー）で展開し、125Ｉ-生成物の移動はシートを定量的なホスホイメジャー(Phosphoimager)システムを使用して暴露することにより追跡した。
選択した抗-Ａβ抗体のスクリーニングおよび単離。ELISAを使用して最初に抗-Ａβおよび抗-遷移状態Ａβペプチドモノクローナル抗体をスクリーニングした。遷移状態ペプチドおよび対応する自然なＡβペプチドの両方が別々のマイクロタイタープレートに吸着した。ハイブリドーマ上清は、天然および遷移状態Ａβペプチドの両方への相対的結合が定量できるように、２つのアッセイを使用してスクリーニングした。拡張およびさらなる実験のために、遷移状態を優先的に認識したか、または高い親和性でＡβに結合したモノクローナル抗体を生産しているクローンを選択した。
モノクローナル抗体の増殖および精製。抗-Ａβ抗体を生産している選択したクローンおよび抗-レセプター抗体を生産しているクローンを、別個のプリスタン−適用マウスに注射した。腹水を集め、そして特異的モノクローナル抗体を単離した。腹水からの抗体の精製は、プロテインＡカラムを使用して行うか、あるいは抗体は(NH4)2SO4沈殿、そしてS-300カラムを通して150kDaの免疫グロブリン面分を得ることにより腹水から単離した。一価のFabフラグメントを調製し、そして確立された方法により単離した。それらの純度は還元および非還元条件下でSDS-PAGEにより評価した。50〜100mgの精製されたモノクローナル抗体が、各々の腹水を有するマウスから日常的に得られた。
Ａβ基質に対する触媒活性のさらなる特性決定。単離された抗-遷移状態抗体の加水分解特性を完全に明確にするために、幾つかの大変重要な制御を行うことができる。第１に、適当な遷移状態ペプチドを用いて触媒抗体活性を完全に遮断する能力を確認した。この非開裂性「インヒビター」は、抗体結合部位により一層強く結合し、これにより基質が結合または開裂することを妨げるはずである。基質特異性は、異なるアミノ酸配列を有する偽ペプチドの開裂がないことを示すことによりさらに確立することができる。加水分解の生成物もHPLC、アミノ酸およびマススペクトル分析により完全に特性決定できる。遷移状態Ａβには向けられていない対照抗体を試験し、そして触媒作用を生じないことを確認することができる。最後に触媒活性は、抗-遷移状態抗体の精製されたFabフラグメントに存在することを示すことができる。
精製した抗-Ａβ抗体は形成されたＡβ凝集物を溶解する。（Walker et al.,Soc.Neurosci.Abstr.21:257(1995),Zlokovic,B.V.,Life Science 59:1483-1497(1996)）。Ａβ沈殿を形成し、そしてインビトロで測定した（Yankner et al.,Science 250:279-282(1990)、Kowall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:7247-7251(1991))。放射性アッセイを使用して生成された様々なモノクローナル抗体について、形成されたＡβ凝集物を溶解する能力を迅速にスクリーニングした。125Ｉ-Ａβを非標識の可溶性ペプチドに加えた後、凝集物はpH５の溶液に入れるか、またはPBS中で一晩撹拌することにより形成された。標識した凝集物のアリコートをPBS、5A11抗-Ａβ抗体、または等量の無関係なマウス抗体（7D3、抗-ヒトトランスフェリンレセプター)のいずれかと１時間、インキューベーションした。遠心後、沈殿中の放射活性のレベルを測定した。
ベクター化された抗-Ａβ／抗-レセプター二重特異性抗体の作成。抗-Ａβ抗体を化学的に抗−ヒトトランスフェリンレセプターおよび抗-マウストランスフェリンレセプター抗体に、異なる方法によりカップリングさせた（Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27623-27628(1997)；Raso et al.,トキシンに共有的または非共有的に結合した細胞標的キャリアーとしてのモノクローナル抗体。薬剤のレセプターが媒介するターゲッティング（Receptor mediated targeting of drugs)、第82巻で。G.Gregoriadis,G.Post,J.Senior and A.Trouet,編集。NATOアドバンスト スタディズ研究所（Advanced Studies Inst.)、ニューヨーク、119-138(1984)）。迅速なチオエーテル連結法を使用して、Traut's試薬およびヘテロ二官能性SMBP試薬を使用した厳密に二重特異性ハイブリッドを形成した。１成分をゆるやかにチオール基（SH）に置換した。これらは以下の反応に従い、マレイミド-置換された（M）第２成分と混合すると容易に反応してチオエーテル連結を形成する：
AbA-SH ＋ AbB-M →  AbA-S-AbB
反応混合物のS-300カラムでのゲル濾過により、300kDaで、そしてＡβを結合する２つの部位に加えて脳毛細管内皮細胞上のトランスフェリンレセプターに付くための２つの部位を有する精製された二量体を得た。非-標的対照ハイブリッドは、非特異的MOPC抗体を抗-Ａβ抗体に連結することにより形成した。このハイブリッド抗体はＡβに結合するが、トランスフェリンレセプターとは反応性ではなく、血液−脳バリアーを横断しないはずである。【０１１４】  ２つの異なる抗体型のF(ab')2フラグメントを同様にチオエーテルで連結して、補体が結合すれば神経毒効果を引き起こすが、補体に結合できないFcを含まない試薬を形成することができる。このようなより小さい二重特異性ハイブリッド（100kDa)は、F(ab')2フラグメントの重鎖を連結する本来のジスルフィドを還元することにより形成することができる（Raso et al.,J.Immunol. 125:2610-2616(1980))。生成したチオールを安定化し、そしてエルマン試薬（E)を使用して、１成分上のこれらの基を活性化する（Brennan et al.,Science 229:81-83(1985))。還元されたFab'を、別の特異性を有する活性化Fab'と混合すると、反応：
Fab'A-SH + Fab'B-SS-E  →  Fab'A-SS-Fab'B ＋ E-SH
に従い、排他的に二重特異性F(ab')2ハイブリッドを形成することができる。
S-200カラムでの精製により、Ａβに結合するための１つの部位および脳の毛細管内皮細胞上の標的エピトープと相互反応するための１つの部位を有するハイブリッドを単離する。【０１１５】  同様の取り組みを使用して、血液−脳バリアーを横断するためにさらに小さいジスルフィド連結単鎖Fvヘテロ二重特異性二量体、FvA-SS-FvB(50kDa)を作成することができる。可溶性Fvsはカルボキシル−末端システインを保有するように構築して、以下の反応に示すジスルフィド交換をし易くし、そして50kDaのヘテロ二量体を排他的に作成することができる：
FvA-SH + FvB-SS-E  →  FvA-SS-FvB ＋ E-SH
全抗体とFab'またはFvに基づく二重特異性試薬のいずれかとの間の平行比較では、後者がトランスフェリンレセプターが媒介する経路を介した細胞の取り込みについて、分子基準でより穏やかに効果的であることが示された(Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27623-27628(1997))。このようなより小さい構築物は細胞表面エピトープに対して一価であるので、このような知見は２つの表面レセプターの架橋結合が細胞の免疫複合体の取り込みには必要であるという懸念をめぐいさる。
二重特異性抗体の二重結合活性の機能的アッセイ。125Ｉ-Ａβに結合するハイブリッド試薬の能力を、元の抗-Ａβ抗体と標準的なPEG結合アッセイにより比較した（結合アッセイについては表１０を参照にされたい）。【０１１６】  適当な二重特異性抗体が、トランスフェリンレセプターを持つヒトまたはマウス細胞に付く能力を、細胞蛍光測定により確認した。二重特異性抗体を、トランスフェリンレセプター陽性のヒトまたはマウス細胞と反応させ、そしてラットIgG-特異的またはマウスIgG-特異的蛍光２次抗体試薬を使用して釣り上げた。
125Ｉ-Ａβを用いたＡβ結合の測定およびポリエチレングリコール分離。二重特異性を確実とするために、ハイブリッド試薬の125Ｉ-Ａβのレセプターを持つ細胞への付着を媒介する能力を試験した。トランスフェリンレセプター陽性細胞を、ハイブリッド試験を用いて処理し、非結合材料を洗浄し、そして次いでこれらの細胞を125Ｉ-Ａβ1-40に暴露した。細胞を洗浄し、そして細胞に結合した放射活性の量を、二重特異性抗体での前処理を除き、同一に調製した対照細胞と比較した。
毛細管消費。二重特異性抗体を125Ｉで標識し、そして正常マウスにi.v.注射した。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−脳バリアーを横断し、そして脳に入った125Ｉ-二重特異性抗体の量を、マウス毛細管消費法（Friden et al.,J.Pharm.Exper.Ther.278:1491-1498(1996)；Triguero et al.,J.Neurochem.54:1882-1888(1990))により測定した。脳の実質または脳の毛細管画分に見いだされたベクター化二重特異性抗体の量は、脳のホモジネートの分別密度遠心後に測定した。値をi.v.注射後の時間の関数としてプロットした。毛細管から実質への進行的通過は、血液−脳バリアーをわたった能動的な細胞輸送を示す。
イムノシンチグラフィー。生きてマウスの脳内への放射性標識された二重特異性抗体の侵入の視覚化が関与する脳内送達法をモニタリングするための非侵襲的方法を使用することができる。放射性標識されたベクター化された二重特異性抗体（125Ｉ-R17/5A11）または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに投与した。連続的な脳の画像は、125Ｉ-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与してから１、６、24および48時間後に累積した。動物は、ケタミン／キシラジン麻酔を使用した暴露中に化学的に固定した。この造影法は、循環している抗-Ａβ抗体がi.v.投与した125Ｉ-Ａβが脳に入ることを防止するかどうかを決定するために大変有用となり得る。デジタルシンチグラフィーデータは標準および分析ソフトウェアで提供された積分関数を使用して定量した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  43残基のβ-アミロイドペプチド(Ａβ)のアミノ酸配列表である（配列番号１）。
【図２】β-アミロイドのＮ-末端配列から作成した抗原性ペプチド(Ａβ1-16)のアミノ酸配列表である（配列番号２）。
【図３】  β-アミロイドの中央領域から作成した抗原性ペプチド(Ａβ10−25)のアミノ酸配列表である（配列番号３）。
【図４】  β-アミロイドのＣ−末端配列から作成した抗原性ペプチドのアミノ酸配列表である（配列番号４）(Ａβ35-43)。
【図５】Ａβ35-43およびＡβ1-43対Ａβ1-40に結合するモノクローナル抗体を比較するELISAから得たデータの図表的表示である。
【図６】  ペプチドの異なるスタチン遷移状態類似体を作成するために、スタチル部分と独立して置き換えたβ-アミロイドＣ-末端配列（配列番号４）から作成したペプチド中のアミド結合を示す。
【図７】  ペプチドの異なるフェニルアラニンスタチン遷移状態類似体を作成するために、スタチル部分と独立して置き換えたβ-アミロイド中央配列（配列番号３）から作成したペプチド中のアミド結合を示す。
【図８】  自然なβ-アミロイドペプチドと遷移状態フェニルアラニンスタチンβ-アミロイドペプチド類似体との間の構造的比較である。
【図９】  自然なβ-アミロイドペプチドと還元されたペプチド結合遷移状態β-アミロイドペプチド類似体との間の構造的比較である。
【図１０】  β-アミロイドの自然なＣ−末端領域、およびβ-アミロイドのＣ−末端領域（Ａβ35-43）のホスホンアミデート遷移状態類似体の式的表示である。
【図１１】  ホスホネートおよびホスホンアミデート模造物と比較した、亜鉛ペプチダーゼによるペプチド加水分解に関する推定上の遷移状態を示す。
【図１２】  自然なβ−アミロイドペプチドおよび、ホスホンアミデート結合に置き換えられたGly38とVal39との間のペプチド結合を有する遷移状態ホスホンアミデートβ−アミロイドペプチドの構造的比較である。
【図１３】  生成されたモノクローナル抗体の、遷移状態β−アミロイドペプチド類似体への、正常Ａβ1-43への、そしてフェニルアラニンスタチン遷移状態β−アミロイドペプチドへの結合を評価するELISAからのデータの図式的表示である。
【図１４】  抗体の、スタチン遷移状態β−アミロイドペプチド 対 自然なＡβ1-43および自然なＡβ1-40への結合を比較するELISAからのデータの図式的表示である。
【図１５】  β-アミロイドの遷移状態類似体に対して生成されたモノクローナル抗体による125Ｉ-Ａβ-sepharoseの開裂を示すデータのグラフである。
【図１６】  二重特異性抗体のレセプター−陽性細胞への付着を定量するデータの図式的表示である。
【図１７】  ベクター化された二重特異性抗体の脳への細胞輸送を追跡するために設計された実験から得たデータの図式的表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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