(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物を培地で培養して、L-アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL-アミノ酸を採取する、発酵法によるL-アミノ酸の製造法であって、
前記微生物がコリネバクテリウム属細菌またはブレビバクテリウム属細菌であり、
前記L-アミノ酸が、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニンから選択されるL-アミノ酸である、方法。
【請求項２】
前記微生物が、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりホスホトランスアセチラーゼ活性が増強した微生物である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の製造法：
（ａ）配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１、もしくは配列番号４０の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１、もしくは配列番号４０の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホトランスアセチラーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ホスホトランスアセチラーゼ活性がramB遺伝子を不活性化させることにより増強されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項５】
前記微生物がさらにD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性が増強するように改変された微生物である請求項１〜４の
いずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
前記微生物がさらにピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項７】
前記微生物がさらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように
改変された微生物である請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインなどのL-アミノ酸を発酵により効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献８参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、L-グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献９参照）。
【０００４】
ホスホトランスアセチラーゼは酢酸代謝に関与している酵素である。エシェリヒア・コリにおいては、酢酸生成の主経路の一部であるアセチル−CoAとリン酸からアセチルリン酸を生成する反応を担っている。一方、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいては、酢酸を資化しアセチル−CoAを生成する時にホスホトランスアセチラーゼの活性が上がること、また、ホスホトランスアセチラーゼ活性の負の制御に転写因子であるRamBが関与していることが知られている（非特許文献２、３参照）。
ホスホトランスアセチラーゼ活性を増強させた菌による有用物質の発酵生産としては、poly-β-hydroxyalkanoate copolymerの生産（特許文献１０，１１参照）及びエタノールの生産（特許文献１２参照）が知られている。また、ホスホトランスアセチラーゼを酵素として利用したL-含硫アミノ酸の製造法（特許文献１３参照）が知られている。しかし、L-アミノ酸発酵生産菌の育種においてホスホトランスアセチラーゼの増強が有効であること、及びホスホトランスアセチラーゼ活性とL-アミノ酸生産性との関係については知られていない。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献９】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，８９１，６８６号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，５６９，５９５号明細書
【特許文献１２】国際公開第２００３／０７８６４３号パンフレット
【特許文献１３】特開平９−００９９８２号公報
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】Microbiology 1999年 第145巻 p.503-513
【非特許文献３】Journal of Bacteriology 2004年 Vol.186, No.9 p.2798-2809
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はL-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインなどのL-アミノ酸を発酵法によって製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、L-アミノ酸生産能が付与され、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物を培養することにより、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインなどのL-アミノ酸を効率よく製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）L-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物を培地で培養して、L-アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL-アミノ酸を採取する、L-アミノ酸の製造法。
（２）前記微生物が、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりホスホトランスアセチラーゼ活性が増強した微生物である、（１）の製造法。
（３）前記ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）の製造法：
（ａ）配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１、もしくは配列番号４０の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１、もしくは配列番号４０の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスホトランスアセチラーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ホスホトランスアセチラーゼ活性がramB遺伝子を不活性化させることにより増強されたことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの製造法。
（５）前記微生物がさらにD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性が増強するように改変された微生物である（１）〜（４）のいずれかの製造法。
（６）前記微生物がさらにピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である（１）〜（５）のいずれかの製造法。
（７）前記微生物がさらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である（１）〜（６）のいずれかの製造法。
（８）前記微生物がコリネ型細菌、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌またはエシェリヒア属細菌である、（１）〜（７）のいずれかの製造法。
（９）前記L-アミノ酸が、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインから選択されるL-アミノ酸である、（１）〜（８）のいずれかの製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造法により、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインなどのL-アミノ酸を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＜1−1＞ 本発明の微生物
本発明の製造法に用いられる微生物（本発明の微生物ともいう）はL-アミノ酸生産能を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されるように改変された微生物である。本発明の微生物は、L-アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、それをホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変することによって得ることができる。本発明の微生物は、本来的にL-アミノ酸生産能を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種によりL-アミノ酸生産能を付与されたものであってもよい。
【００１０】
ここで「L-アミノ酸生産能」とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、L-アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、同条件で培養された野生株又は非改変株よりも、多量のL-アミノ酸を生産する能力を有することをいう。
【００１１】
L-アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン（シスチン）、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ホモセリンが挙げられるが、アセチルCoA由来のL-アミノ酸が好ましく、特にL-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アルギニン、L-ロイシン、L-システインが好ましい。
【００１２】
ここで、本発明の製造法において使用される微生物としては、エシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する微生物や、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００１３】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１４】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１５】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００１６】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC:住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/）。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM  BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１７】
本発明に用いる腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属などのL-アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlo
ck）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
【００１８】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１９】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２０】
以下、上記のような微生物にL-アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
L-アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、L-アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、L-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるL-アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２１】
L-アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつL-アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。またL-アミノ酸生産菌は、遺伝子組換えによって、L-アミノ酸の生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。なお、L-アミノ酸生産能は、微生物の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。さらに後述するようにして、ホスホトランスアセチーゼ遺伝子の発現を増強させることによりL-アミノ酸生産能が付与されたものでもよい。
【００２２】
以下、L-アミノ酸生産能を付与する方法、及びL-アミノ酸生産能が付与された微生物について例示する。
育種によってＬ−グルタミン酸生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。
【００２３】
これらの遺伝子の発現を増強するための方法としては、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００２４】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できる。
【００２５】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００２６】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を用いて改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP−4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP−4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス  AJ13355 (FERM BP-6614)
が挙げられる。
【００２７】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００２８】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００２９】
コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、米国特許第6303383号参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県
つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００３０】
さらにコリネ型細菌にL-グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490]；配列番号３２）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。ここで用いる変異型yggB遺伝子としては、以下のような遺伝子を挙げることができる。
【００３１】
（１）C末端側変異
この変異は、配列番号３３のアミノ酸番号４１９−５３３の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス（以下ISという）や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。C末端側に転移因子が挿入されたyggB遺伝子の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
また、C末端側変異として、配列番号３３のアミノ酸番号４１９−５３３の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異も挙げられる。
（２）膜貫通領域の変異
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測されており、配列番号３３の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号１〜２３（第１膜貫通領域）、２５〜４７（第２膜貫通領域）、６２〜８４（第３膜貫通領域）、８６〜１０８（第４膜貫通領域）、１１０〜１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。yggB遺伝子の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。
膜貫通領域の変異の例としては、配列番号３３に示されるアミノ酸配列において、14位のロイシン残基と15位のトリプトファン残基間に１又は数アミノ酸挿入する変異、１００位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異、１１１位のアラニン残基を他のアミノ酸残基へ置換する変異などが挙げられる。
【００３２】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P- P-5020；特開昭56-1889号公報参照)ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM-P4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号
公報参照）
【００３３】
Ｌ−グルタミン生産能が付与された微生物として好ましいものは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した腸内細菌科に属する微生物である。（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）の破壊、PII制御タンパク質（glnB）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397番目のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる。（米国特許出願公開第2003-0148474号明細
書）
【００３４】
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497), プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694), α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492, 特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERMBP-10381, 特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212 (FERM P-8123, 特開昭61-202694)
【００３５】
L-プロリン生産能が付与された微生物としては、例えば、L-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌やL-プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。L-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)に開示されている。また、L-プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。L-プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056), VKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315), および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体やBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体などが挙げられる。
【００３６】
また、Ｌ−プロリン生産能が付与された微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPM B-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPM B-8012株）や、b2682およびb2683、又はb1242もしくはb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE.coli等も挙げられる。（特開2002−300874号公報）。
【００３７】
L-ロイシン生産能が付与された微生物としては、例えば、4-アザロイシンまたは5,5,5-トリフルオロロイシンに耐性を示すエシェリヒア・コリ H-9068株 (ATCC 21530), H-9070(FERM BP-4704) および H-9072 (FERM BP-4706) (米国特許5,744,331), およびL-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリ(欧州特許1067191), β-2-チエニルアラニン及びβ-ヒドロキシロイシンに耐性を示すエシェリヒア・コリ AJ11478株 (米国特許5,763,231), エシェリヒア・コリ 57株(VKPM B-7386, ロシア特許 No.2140450)などが挙げられる。
【００３８】
L-システイン生産能が付与された微生物としては、フィードバック阻害が解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードするcysE遺伝子アレルで形質転換されたエシェリヒア・コリJM15株 (米国特許 6,218,168); 細胞毒性物質を排除するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリW3110株 (米国特許 5,972,663); システインデスルフヒドラーゼ活性を低下させたエシェリヒア・コリ(特開平11−155571); cysB遺伝子によってコードされるシステインレグロンの転写活性化因子を増幅したエシェリヒア・コリW3110株 (WO01/27307) などが挙げられる。
【００３９】
L−イソロイシン生産能が付与された微生物としては、例えば、6-ジメチルアミノプリン耐性を示すエシェリヒア属細菌の変異株(特開平5-304969)、L-イソロイシンヒドロキサメート、チアイソロイシン、DL-エチオニンまたはアルギニンヒドロキサメートに耐性を示す変異株 (特開平5-130882)、スレオニンデアミナーゼ遺伝子及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が増幅された組換え株(特開平2-458, 特開平2-42988、特開平8-47397)
などが挙げられる。
【００４０】
L-バリン生産能は、例えば、ilvGMEDA オペロンによってコードされるL-バリン合成酵素、特にilvG遺伝子によってコードされるアセトヒドロキシレートシンターゼの活性を増加させることによって付与することができる（特公平JP02-748418)。L-バリン合成酵素はL-バリンによるフィードバック阻害が解除されたものであってもよい。Ｌ−バリン生産能は、アセトラクテートシンターゼIII遺伝子(ilvIH 遺伝子)の発現を低下させることによっても付与することができる。
さらに、細菌にアミノ酸アナログ耐性を付与することによってＬ−バリン生産能を付与することもできる。そのような細菌の例としては、例えば、L-イソロイシン及びL-メチオニン要求性であり、D-リボース、プリンヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を示す変異株 (FERM P−1841, P−5556; 特開昭53−025034)やポリケチド耐性を示す変異株(FERM P-9325; 特許1934507号)が挙げられる。
【００４１】
L-アラニン生産能が付与された微生物としては、例えば、H+-ATPase 活性が欠損したコリネ型細菌 （Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40）やアスパラギン酸 b−デカルボキシラーゼ遺伝子が増幅されたコリネ型細菌(特開平07-163383)などが挙げられる。
【００４２】
Ｌ−アルギニン生産能が付与された微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭５６−１０６５９８号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ３８２株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ３８２株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の番号で寄託されている。
【００４３】
またＬ−アルギニン生産能が付与された微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である。（欧州出願公開1170361号明細書）
【００４４】
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ
（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与することができる。
【００４５】
Ｌ−リジン生産能が付与された微生物としては、例えば、Ｌ−リジン生産能を有するＬ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株、具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000−189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にAEC(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００４６】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産能が付与された微生物を得ることが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、発現調節配列を改変することによって、達成できる。
【００４７】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、L−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
【００４８】
さらに、Ｌ−リジン生産能が付与された微生物は、Ｌ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイムがあり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００４９】
Ｌ−トリプトファン生産能が付与された微生物として好ましいものは、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより
、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を腸内細菌科に属する微生物に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5（国際公開第94/08031号パンフレット参照）を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。
【００５０】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入することによってもＬ−トリプトファン生産能を付与することができる。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが挙げられる（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００５１】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損させるか、またはtrpRに変異を導入することによってＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）
【００５２】
また、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された細菌も好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、aceオペロンのプロモーターがリプレッサーであるiclRによって抑制を受けないこと、抑制が解除されていることが望ましく、このような細菌はiclR遺伝子を破壊することによって、達成することができる。
aceオペロンの発現が強化された細菌は、aceオペロンを含むＤＮＡを強力なプロモーターに連結し、これをプラスミドや相同組換えによって、細菌内に導入することや、トランスポゾンによって上記ＤＮＡを多コピー存在させることによって達成できる。
【００５３】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産能が付与された微生物として、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げられる。
【００５４】
L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい。（欧州特許763127号明細書参照）
【００５５】
Ｌ−フェニルアラニン生産能が付与された微生物としては、tyrA,tyrRが欠損したAJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、yed
A増幅株（国際公開第03/044192号パンフレット）が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−スレオニン生産能が付与された微生物として好ましいものは、L-スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコ−ドする遺伝子としては、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコ−ドされるアスパルトキナ−ゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナ−ゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンタ−ゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナ−ゼ活性が欠損したTDH６株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００５７】
L−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のL−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、L−スレオニン生産菌を構築するためには、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにL−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエ−タ−構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエ−ション領域のリ−ダ−配列あるいは、アテニュエ−タ−を除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００５８】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、L−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−amino−β−hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００５９】
このようにL−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００６０】
L−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのL−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ−ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノ−ルピルビン酸シンタ−ゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００６１】
また、L−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、L−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にL−スレオニン耐性、L−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−
135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００６２】
L-スレオニン生産能が付与された微生物として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することも出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年４月７日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、このVKPM
B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００６３】
また、エシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も好適なＬ−スレオニン生産能が付与された細菌として例示することができる。B-5318株は、1990年5月3日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、ＰRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
【００６４】
＜１−２＞  ホスホトランスアセチラーゼ活性の増強
上記のようなL-アミノ酸生産能が付与された微生物を、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変することによって、本発明の製造法に用いる微生物を得ることができる。ただし、ホスホトランスアセチラーゼ活性増強のために改変とL-アミノ酸生産能の付与はどちらを先に行ってもよい。
「ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのホスホトランスアセチラーゼ分子の数が増加した場合や、ホスホトランスアセチラーゼ分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生株とは、コリネ型細菌の場合、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869やATCC13032である。エシェリヒア・コリの野生株としては、具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。またパントエア・アナナティスの野生株としては、具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）が挙げられる。
【００６５】
本発明において、ホスホトランスアセチラーゼ（phospho acetyltransferase）とは、アセチルリン酸とCoAからアセチルCoAとリン酸を生成する反応を触媒する活性、あるいはその逆反応を触媒するタンパク質であり、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（Phosphate acetyltransferase）、ホスホアセチラーゼ（Phoshoacetylase）とも呼ばれる。（EC 2.3.1.8）本発明において、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されたことの確認は、D. J. Reinscheid, S. Schnicke, D. Rittmann, U. Zahnow, H. Sahm and B. J. E
ikmanns (1999)Microbiology. 145: 503-513に記載の方法で活性を測定することによって確認できる。
また、ホスホトランスアセチラーゼ活性が増強されたことの確認は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子のm-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。活性あるいは発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【００６６】
コリネ型細菌のホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（pta遺伝子）としては、Genbankに登録されている、ATCC13032のNCgl2657 (accession NC_003450.3 の2936506..2937891の相補鎖)が利用できる。該遺伝子の塩基配列を配列番号40に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号41に示す。またC.glutamicumATCC13869株のpta遺伝子の塩基配列を配列番号３４の塩基番号１２１４〜２６４１に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３５に示す。
【００６７】
また、本発明の遺伝子は、コリネ型細菌においてホスホトランスアセチラーゼ活性を有する限り、他の微生物由来のpta遺伝子のホモログ遺伝子を用いてもよい。pta遺伝子のホモログは、BLAST等によって配列番号３４の塩基番号１２１４〜２６４１または配列番号４０の塩基配列を参照して、検索出来る（http://blast.genome.jp/）。
【００６８】
本発明に用いることが出来るpta遺伝子は、既に配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列番号９及び１０に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、ptaとptaの制御領域を含む領域を取得することができる。他の微生物のptaのホモログも、同様にして取得され得る。
【００６９】
また、コリネ型細菌の種や菌株によってpta遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明に用いるpta遺伝子は配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１または40の配列には限られず、コードされるPtaタンパク質の機能、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有する限り、配列番号３５または４１のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１〜数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１から２０個、好ましくは、１から１０個、より好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、pta遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７０】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe,trp,tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu,ile,val間で、極性アミノ酸である場合には、gln,asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys,arg,his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp,glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser,thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又は
argへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
【００７１】
さらに、pta遺伝子は、配列番号３５あるいは４１のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることが出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれptaが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
同様にpta遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号３５あるいは４１のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長・削除したものでもよい。
【００７２】
このようなpta遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号34の塩基番号１２１４〜２６４１、または配列番号40の塩基配列を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、上記塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラープローンPCR 、DNA shuffling, StEP−PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にptaに変異を導入して活性の高いpta遺伝子を取得することが出来る。（Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction.）これらのpta相同遺伝子がホスホトランスアセチラーゼをコードしているか否かは、例えば、上述の方法により酵素活性を測定することによって確かめることができる。
【００７３】
またpta遺伝子は、配列番号３４の塩基番号１２１４〜２６４１または配列番号４０の塩基配列と相補的な配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80,90,95,または97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７４】
プローブとして、配列番号３４の塩基番号１２１４〜２６４１、配列番号４０の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、該塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号34の塩基番号1214〜2641の塩基配列、または配列番号４０の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる
場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００７５】
pta遺伝子の発現量の増強は、pta遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ptaを含む遺伝子をコードする断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物に導入して形質転換すればよい。また、野生型の微生物に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を付与してもよい。また、コピー数の上昇は、ptaをコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にpta遺伝子が転移したことの確認は、pta遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００７６】
また、pta遺伝子の発現の増強は、pta遺伝子の発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、ptaのプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る。（国際公開第ＷＯ００／１８９３５号パンフレット）
【００７７】
以下、ホスホトランスアセチラーゼ活性が上昇するように改変したコリネ型細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001）等のマニュアルに従って実施出来る。他の微生物も同様にしてホスホトランスアセチラーゼ活性が上昇するように改変することができる。
【００７８】
同遺伝子の発現量の増強は、pta遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでpta遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずpta遺伝子は、コリネ型細菌の染色体からクローニングする。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号９、１０に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いpta遺伝子を増幅することが出来る。
【００７９】
PCR法により増幅されたpta遺伝子を含む遺伝子断片は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００８０】
上記DNAをコリネ型細菌で機能するベクターに導入する。コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。
【００８１】
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００８２】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００８３】
pta遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、ptaの末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめptaの増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００８４】
上記のように調製した組換えプラスミドをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）.によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
【００８５】
ptaのコピー数を高めることは、ptaをコリネ型細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DNA上にptaを複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。
染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、ptaをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平2-109985号、特開平７−１０７９７６号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。
【００８６】
また、宿主で複製できない複製起点あるいは、宿主で複製出来ない複製起点と宿主への接合伝達能を有するプラスミドにpta遺伝子を導入して、染色体上で増幅させる方法も適用できる。例えば用いることが出来るベクターは、ｐＳＵＰ３０１（Simo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Schaefer等, Gene
145, 69〜73 (1994) ）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madison, WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; USP 5487993）、ｐＣＲ(R)Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993)）、ｐＥＭ１（Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516）またはｐＢＧＳ８（spratt等, 1986, Gene, 41：337〜342）等が挙げられる。pta遺伝子を含むプラスミドベクター
をコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等（Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988)）、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等（FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994)）に記載されている。
【００８７】
また、ptaの活性を上昇させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のpta遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること、ptaの発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される。(Hamilton et al,; Journal of Bacterology171:4617-4622) 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PS2プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換し、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
pta遺伝子の上流領域としては、例えば、配列番号34の塩基番号１〜１２１３の領域が挙げられる。pta遺伝子上流のプロモーター等の発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりpta遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、pta遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
また、発現量の上昇は、m-RNAの生存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。
【００８８】
また、pta活性を上昇させる一手段として、pta遺伝子上流のRamBタンパク質結合部位を改変することによって達成される。pta遺伝子上流のRamBタンパク質結合部位は、J Bacteriol. 2004 May;186(9):2798-809に報告されており、pta遺伝子の開始コドン上流の87番目AAAACTTTGCAAA、203番目のAAAACTTTGCAAAと推定されている。（それぞれ配列番号34の塩基番号1000-1012、1115-1127）（J.Bacteriol May 2004 p2798-2809）RamBタンパク質結合領域としては、AA/GAACTTTGCAAAが保存配列として推測されており、高濃度の酢酸存在下で発現が誘導されるaceA遺伝子（isocitrate lyaseをコードする）、aceB遺伝子（malate synthaseをコードする）、pta-ackオペロンの上流領域に存在する。従って、この保存配列を改変することによりRamB結合による発現低下を抑えることが出来、改変する配列は、例えばA、TをG、Cに置換する改変、G、CをA、Tに置換する改変が挙げられ、望ましくは、AAAACTTTGCAAA配列をaaaacGAGgcGaGに置換する改変、aaaacGAGgcaaaに置換する改変が挙げられる。
ramB遺伝子により制御を受けないように改変されたかどうかは、酢酸非存在下（例えば炭素源がグルコースのみ）で、構成的に発現されているかどうかを検討することによって、確認することができる。（J Bacteriol. 2004 May;186(9):2798-809）
【００８９】
また、ホスホトランスアセチラーゼの活性は、当該酵素の発現調節を司るレギュレータータンパク質を改変することによっても上昇させることができる。ホスホトランスアセチラーゼの活性調節因子としては、ホスホトランスアセチラーゼの発現を負に制御する上記のRamBタンパク質が挙げられる。コリネ型細菌のramB遺伝子としては、Genbankに登録さ
れている。C.glutamicumATCC13032のaccession No.NC_006958.1: 390784..392208として登録されている配列が利用できる。本遺伝子配列を配列番号４２に、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号４３に示す。またC.glutamicumATCC13869株のramB遺伝子を配列番号３６に、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号３７に示す。
ramB遺伝子は、配列番号３６または４２の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRamB結合配列に結合してホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。なお、「ストリンジェントな条件」については前述したとおりである。
【００９０】
例えば、上記のRamBタンパク質の発現を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。ramB遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能するRamBタンパク質を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換し、変異型ramB遺伝子と染色体上のramB遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のramB遺伝子を変異型に置換することが出来る。
【００９１】
変異型ramB遺伝子を宿主染色体上のramB遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。まず、温度感受性複製起点、変異型ramB遺伝子、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子及びクロラムフェニコール等の薬剤耐性を示すマーカー遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。
【００９２】
ここで、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子は、染色体上からベクター部分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer,A.et al.Gene145 (1994)69-73）。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼを搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。
【００９３】
sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出来る。バチルス・ズブチルス：sacB  GenBank Accession Number X02730 （国際公開2005/113745 号パンフレット）
バチルス・アミロリキュファシエンス：sacB  GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス：sacB  GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス：surB  GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス：frfA  GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス：lsxA  GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス：lsdA GenBank Accession Number L41732
【００９４】
上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能する温度（25℃）で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を温度感受性複製起点が機能しない高温（例えば３４℃）で培養し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、プラスミド上の変異型ramB遺伝子と染色体上のramB遺伝子と組換えを起こした菌株が出現する。
【００９５】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するramB遺伝子配列との組換えを起こし、染色体のramB遺伝子と欠失型ramB遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカ
ー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【００９６】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型のramB遺伝子のみを残すために、ramB遺伝子領域をベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なramB遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ramB遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ramB遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なramB遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度（高温）で培養すると、プラスミド上のramB遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。sacBを搭載したプラスミドを用いている場合には、この時に培地にスクロースを添加することにより、プラスミドが細胞から脱落した株を効率的に選択できる。プラスミドを脱落した株よりramB遺伝子に変異が残った株を選択することによって、ramB遺伝子が欠失型に置換された株を取得することができる。
【００９７】
本発明の製造法に使用する微生物は、ホスホトランスアセチラーゼの活性の増強に加えて、さらにD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性を増強するように改変された微生物でもよい。
D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を活性化してもよいし、両方を活性化してもよい。なお、本明細書ではD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。
D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−５−リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (Methods Enzymol., 9,515-520 (1966) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)に記載の方法によって測定することができる。
また、フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース6-リン酸をエリスロース-4-リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)に記載の方法によって測定することができる。
【００９８】
これらのホスホケトラーゼ活性は、非改変株と比較して、1.5倍以上増強させることが好ましく、2倍以上増強させることがより好ましく、3倍以上増強させることが特に好ましい。
ホスホケトラーゼとの活性増強は、上述したホスホトランスアセチラーゼの活性増強と同様に、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子のコピー数の増加やホスホケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーターの改変などによって行うことができる。
ホスホケトラーゼ遺伝子は宿主が持っているものを増幅してもよいし、宿主がホスホケトラーゼ活性を持たない場合は、他の種の遺伝子を導入することにより、ホスホケトラーゼ活性を付与してもよい。
D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、該酵素活性を有する微生物の染色体DNAを鋳型にしてPCRなどの手段によって得ることができる。このような微生物としては、乳酸菌、メタノール資化性細菌、メタン資化性細菌、ストレプトコッカス属細菌、アセトバクター（Acetobacter）属細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、チオバチルス（Thiobacillus）属細菌、メチロコッカス（Methylococcus）属細菌、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）属細菌、フィブロバクター（Fibrobacter）属細菌などの細菌や、キャンディダ（Candida）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ピキア（Pichia）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、クルイベロ
ミセス(Kluyveromyces)属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ウィンゲア(Wingea) 属などに属する酵母などが挙げられる。
フルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、該酵素活性を有する微生物の染色体DNAを鋳型にしてPCRなどの手段によって得ることができる。このような微生物としては、アセトバクター属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、クロロビウム（Chlorobium）属細菌、ブルセラ（Brucella）属細菌、メチロコッカス属細菌、ガードネレラ( Gardnerella)属細菌などの細菌や、キャンディダ属、ロドトルラ属、サッカロミセス属などに属する酵母などが挙げられる。
【００９９】
D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼをコードする遺伝子として具体的には、Lactobacillus pentosus MD363 のD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼをコードするxpkA 遺伝子を挙げることができる。この塩基配列はEMBL/GenBank データベースにアクセス番号AJ309011 (Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002))で登録されている（配列番号５２）。xpkA遺伝子のホモログには、配列番号５２の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
また、Lactobacillus plantarum のxpk1遺伝子を使用することもできる。この塩基配列はEMBL/GenBank データベースにアクセス番号NC_004567 Region: complement (2362936..2365302) (Kleerebezem, M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 1990-1995 (2003)) で登録されている（配列番号５４）。xpk1遺伝子のホモログには、配列番号５４の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
その他にも、これらの遺伝子のホモログとして、GenBank Accession No. NC_004567 Complement (3169067-3171478)の Lactobacillus plantarum の遺伝子、GenBank Accession
No. NP_736274のアミノ酸配列をコードするStreptococcus agalactiae の遺伝子、GenBank Accession No. NP_267658のアミノ酸配列をコードするLactococcus lactis subsp. Lactisの遺伝子、GenBank Accession No. のNC_005362 696462..698867のLactobacillus johnsonii の遺伝子、GenBank Accession No. YP_193510のアミノ酸配列をコードするLactobacillus acidophilus の遺伝子などが挙げられる。
【０１００】
D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼの両方の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることもできる。このような遺伝子としては、Bifidobacterium animalisの xfp遺伝子が挙げられ、この塩基配列は、EMBL/ GenBank データベースにアクセス番号AJ293946 (Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001)) で登録されている（配列番号５６）。
xfp遺伝子のホモログ遺伝子として、GenBank Accession No. NP_696135のアミノ酸配列をコードするBifidobacterium longum の遺伝子、GenBank Accession No. NP_662409のアミノ酸配列をコードするChlorobium tepidum の遺伝子、GenBank Accession No. NP_699578のアミノ酸配列をコードするBrucella suis の遺伝子、GenBank Accession No. YP_223570のアミノ酸配列をコードするBrucella abortus の遺伝子などを用いることもできる。xfp遺伝子のホモログには、配列番号５６の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼの両方の活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。
その他のD-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ遺伝子及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ遺伝子の例としては、WO2006/016705に開示されているものが挙げられる。
【０１０１】
本発明の製造法に使用する微生物は、ホスホトランスアセチラーゼ、D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性の増強に加えて、さらにピルビン酸カルボキシーゼ活性が増強されるように改変された微生物でもよい。ピルビン酸カルボキシーゼをコードする遺伝子は、例えば、コリネ型細菌、バチルス属細菌由来の遺伝子を利用でき、C.glutamicum ATCC13032のpyc遺伝子(NCgl0659  配列番号64)やB.subtilisのpyc遺伝子（欧州特許  1092776号）が利用できる。ピルビン酸カルボキシーゼをコードする遺伝子は、配列番号６４の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【０１０２】
本発明の製造法に使用する微生物は、ホスホトランスアセチラーゼ、D-キシロース５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性の活性の増強に加えて、さらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されるように改変された微生物でもよい。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子は、例えば、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌の遺伝子が利用でき、C.glutamicum ATCC13032のppc遺伝子（NCgl1523  配列番号62）や、E.coliMG1655のppc遺伝子（Genbank Accession No.NP_418391）が利用できる。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子は、配列番号６２の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼはアスパラギン酸にフィードバック阻害を受けることがあるので、アスパラギン酸にフィードバック阻害を受けないように改変することが好ましい。（欧州特許0723011号）
【０１０３】
＜２＞L-アミノ酸物質の製造法
上記のようにして得られるコリネ型細菌などの微生物を培地に培養し、培地中にL-アミノ酸を生成蓄積せしめ、L-アミノ酸を該培地から採取することにより、L-アミノ酸を製造することが出来る。
【０１０４】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【０１０５】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【０１０６】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸などのＬ−アミノ酸が蓄積される
。
【０１０７】
また、L-グルタミン酸を製造する場合、L-グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる（欧州特許出願公開第1078989号明細書）。
【０１０８】
培養終了後の培養液からL-アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１０９】
［実施例］
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
【０１１０】
実施例1. ATCC13869pta増幅株の構築
pta遺伝子増幅の親株として、sucA破壊、yggB変異導入株を用いた。sucA破壊、yggB変異株は以下の方法で構築できる。
(１−１) sucA破壊株の構築
ATCC13869のsucA欠損株（ATCC13869ΔsucA）は以下のようにして構築した。
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードするsucA遺伝子の破壊は、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子を搭載したプラスミドpBS3を用いて行った。sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築は、国際公開2005/113745 号パンフレット及び2005/113744号パンフレットに記載のpBS3を用いた。
C.glutamicum ATCC13869株由来のsucAのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC_003450）の該遺伝子の塩基配列（配列番号３０）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得した。具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号１、２の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、sucA遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、sucA遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号３、４の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行った。配列番号２と３は互いに相補的であり、sucAのORFの全配列を欠損させた構造となっている。
次に内部配列を欠失したsucA遺伝子断片を得るために、上記sucA N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号５と６の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い変異導入されたsucA遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後BamHIで消化し、上述のpBS3 のBamHI部位に挿入する。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養し、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたプラスミドをpBS3ΔsucAと命名した。
【０１１１】
上記（A）で得られたpBS3ΔsucAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、低頻度であるが本プラ
スミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現した。C.glutamicumATCC13869株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS3ΔsucAを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 μg/L、寒天15g/L、 NaOHでpH7.5に調整）に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのsucA遺伝子断片とATCC13869株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地（CM-Dexプレート培地の成分から寒天を除いて作成）にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10プレート培地（ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、寒天15g/L、 KOHでpH7.5に調整）に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養する。その結果、2回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと推定される株を得ることができる。
この様にして得られた株の中には、そのsucA遺伝子がpBS3ΔsucAに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。sucA遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10プレート培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、sucA遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。sucA遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号5および配列番号6）を用いて分析した際、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型にしたものよりもPCR産物の大きさが小さいものをsucA欠損株として以降の実験
に使用した。
【０１１２】
sucA欠損株のＬ−グルタミン酸の生産能の評価を以下の方法で行った。これらの菌株をCM-Dexプレート培地にて培養して、生育した各菌株を、グルコース 30ｇ、KH2PO4 1ｇ、MgSO4 0.4ｇ、(NH4)2SO4 15ｇ、FeSO4・7H2O 0.01ｇ、MnSO4・7H2O 0.01ｇ、大豆加水分解液 13.7ml、サイアミン塩酸塩 200μｇ、ビオチン 300μｇ、及びCaCO3 50ｇを純水 1L中に含む培地（KOHを用いてpHは8.0に調整されている）20ｍｌを坂口フラスコに分注して、31.5℃にてしんとう培養する。培養後に培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積量を測定し、そのうちL-グルタミン酸発酵収率が大きい株を選択し、ATCC13869ΔsucAとした。
【０１１３】
(１−２) 変異型yggB遺伝子の導入
ATCC13869ΔsucA株に変異型yggB遺伝子を導入した。導入された変異は、yggB遺伝子のC末端側の領域にIS（Insertion sequence）が挿入されている。（図１）。変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に記した。本変異が導入された株をATCC13869ΔsucAyggB::ISとした。
yggBのC末端側にISが挿入された株は、以下のようにして３断片に分けてPCRを行うことで構築することもできる。
まず、配列番号４４と配列番号４５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行いyggBの上流側断片を取得する。一方で、配列番号４６と配列番号４７をプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、IS断片を取得する。配列番号４５と配列番号４６は互いに相補的な領域を含む。次に、これらのPCR産物をほぼ等モルとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号４４と配列番号４７をプライマーとしてISの上流にyggB断片が付加された断片を調製する。
一方で、配列番号４８と配列番号４９をプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行いyggBの下流側断片を取得する。なお、配列番号４７と配列番号４８は互いに相補的である。これと、先に調製したISの上流にyggB断片が付加された断片をほぼ等モルとなるように混合し、配列番号５０と配列番号５１のDNAをプライマーとして、P
CRを行いyggBにISが挿入された断片を取得できる。得られた断片をSacIで処理し、pBS4S（国際公開2005/113745号パンフレット及び2005/113744号パンフレット）のSacI部位に導入し、染色体上のyggBをyggB::ISに置換するためのプラスミドを構築する。なお、ATCC13869株には類似のISが複数存在するため、配列番号７と完全に一致するIS挿入遺伝子を取得するためには、構築したプラスミドの配列を確認し同一配列を有するクローンであることを確認する必要があるが、ISに由来する領域の多少の塩基の相違は、ISが挿入されたyggBの機能発現において大きな影響を及ぼさない。こうして得られたプラスミドを用いて定法に従って染色体上のyggBを置換することにより染色体上のyggBにISが挿入された株を構築することができる。
【０１１４】
(１−３) pta増幅株の構築
ホスホトランスアセチラーゼ(pta)遺伝子の発現を増強した株を構築するため、C.glutamicum ATCC13869株よりホスホトランスアセチラーゼ(pta)遺伝子をPCRで増幅しpVC7シャトルベクターへクローニングした。pVC7は、ATCC13869株のクリプティックプラスミドpAM330(GenBank Database Accession No. D00038)をHindIIIで切り出し平滑末端化した断片をpHSG399（タカラバイオ）のBsaAI部位に挿入したシャトルベクターである。（米国特許出願公開20030134397号）既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032（GenBank Database Accession No.NC_003450 配列番号４０）のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNA（配列番号９、配列番号１０ ）をプライマーとして常法によりPCRを行い、プロモーター領域を含むホスホトランスアセチラーゼ遺伝子全長を有する遺伝子断片を取得した。生成したPCR産物を常法により精製後BamH I及びKpn Iで消化し、pVC7のBamH I及びKpn I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびCm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVC7-ptaと命名した。
【０１１５】
(1-4)ATCC13869Δ sucAyggB::IS株でのPTA酵素活性の増強の確認
ATCC13869ΔsucAyggB::IS株をpVK9で形質転換した株を取得した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9）と命名した。
pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。（米国特許出願公開20050196846号）
次に、ATCC13869ΔsucAyggB::IS (pVK9)株にpVC7（コントロール用プラスミド）、及びpVC7-pta（PTA増幅用プラスミド）を形質転換した株を取得した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/ml及びクロラムフェニコール5μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7-pta）と命名した。
ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7-pta）株のPTA酵素活性を測定するために、粗酵素液を以下に示す方法で調整した。まず、各菌株をCM-Dex液体培地において31.5℃にて培養した。タイテックMimi photo 518R デジタル比色計で測定したOD660が0.6-0.9の時点で培養を止め集菌した。これ以後の操作は4℃で行った。50 mM Tris/HCl (pH 7.0)溶液で2回洗浄後、緩衝液（50 mM Tris/HCl (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM, 1 mM DTT, 30%(w/v)グリセロール）に4g/ml (wet weight)になるよう溶解した。超音波破砕機（Bioruptor）により細胞を破砕し、遠心分離(15,000g, 60 min)後の上清を粗酵素液とした。粗酵素液のたんぱく質量を定量するため
の手順を以下に示す。粗酵素液及び検量線作成のための濃度既知のBSAをそれぞれCBB溶液(ナカライテスク  プロテインアッセイCBB溶液)と反応し発色後、酵素活性測定装置（Molecular Divices, spectra max 190）でOD595 nm を測定することにより、タンパク質濃度の定量をおこなった。
次に、従来の方法(D. J. Reinscheid, S. Schnicke, D. Rittmann, U. Zahnow, H. Sahm and B. J. Eikmanns (1999) Microbiology. 145: 503-513)を参考にPTA酵素活性を測定した。具体的な手順を以下に示す。酵素反応は25度で100 mM Tris/HCl (pH 7.6), 5 mM MgCl2, 0.5mM L-cystein hydrochloride, 20 mM NH4Cl2, 1 mM CoA, 20 mM acetyl phosphateに粗酵素液を加えることで反応を開始させた。酵素活性測定装置（Molecular Divices, spectra max 190）でOD232nm を測定することにより、acetyl-CoAの生成を検出することでPTA酵素活性を測定した。
【０１１６】
【表１】
0005157180.tif 000002
【０１１７】
実施例２  PTA増強ATCC13869ΔsucA株におけるL-グルタミン酸発酵収率向上効果の確認
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7-pta）株を用い、PTA増強によるL−グルタミン酸発酵収率向上の効果を上述のsucA欠損株評価と同様の方法で培養評価した。結果を以下の表に示す。L−グルタミン酸収率は、対照株と比べてPTA増強株が高いことが明らかになった。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
実施例３  PTA増強とホスホケトラーゼ増強の組み合わせによるL−グルタミン酸発酵収率向上効果の確認
つぎに、ホスホトランスアセチラーゼとホスホケトラーゼの組み合わせによる、L-グルタミン酸発酵への効果について検討することにした。
ホスホケトラーゼの発現プラスミドは以下のように構築した。
【０１２０】
(A)pVK9-xfpの構築
Bifidobacterium animalisよりホスホケトラーゼ遺伝子（配列情報は既に公開されている：AY518213：gi:41056820）をPCRで増幅し実施例１で使用したpVK9シャトルベクターへクローニングするために、ゲノムをWizard Genomic Purification Kit(Promega Corporation)を使用し抽出した。B. animalisのゲノムDNAを鋳型に配列番号１１、１２の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、プロモーター領域を含むホスホケトラーゼ遺伝子全長を有する遺伝子断片を取得した。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pVK9のXba I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコン
ピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9-xfpと命名した。
【０１２１】
(B)pVK9-PS2_xfpの構築
B. animalisホスホケトラーゼ遺伝子のプロモーター領域をPS2プロモーターに置換したDNA断片をオーバーラップPCR法(R. M. Horton, H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pullen and L. R. Pease (1989) Gene 77: 61-68)により取得した。具体的には、pPSTG1(Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y. Umezawa and H. Matsui (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 358-366)を鋳型に配列番号１3、１4の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPS2プロモーターの増幅産物を得た。一方、pVK9-xfpを鋳型に配列表配列番号１5、１6の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い、B. animalisホスホケトラーゼ遺伝子の増幅産物を得た。配列番号１4と１6は互いに相補的である。次にPS2プロモーターとB. animalisホスホケトラーゼ遺伝子を結合した断片を得るために、上記PS2プロモーターおよびB. animalisホスホケトラーゼ遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型に配列番号１2、１７の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い目的遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pVK9のXba I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLBプレート培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9-PS2_xfpと命名した。
【０１２２】
(C) PTA増強とホスホケトラーゼ増強の組み合わせによるL−グルタミン酸発酵収率向上効果の確認
上述の方法に従い、C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS株にpVK9_PS2_xfpを形質転換した株を取得し、ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp）と命名した。次に、ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp）株にpVC7（コントロール用プラスミド）、及びpVC7-pta（PTA増幅用プラスミド）を形質転換した株を取得しそれぞれ、ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp, pVC7）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta）と命名した。
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9, pVC7-pta）ATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp, pVC7）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta）株を用い、PTA増強とホスホケトラーゼ増強の組み合わせによるＬ−グルタミン酸発酵収率向上の効果を実施例１（１−１）の方法で培養評価した。結果を以下の表３に示す。Ｌ−グルタミン酸収率は、PTAまたはホスホケトラーゼを単独で増強した株双方に比べ、PTA及びホスホケトラーゼを同時に増強した株が高いことが明らかになった。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
実施例４  転写因子ramB遺伝子欠損によるPTA活性増強株の作成及び効果の検証
PTA遺伝子の発現は転写因子RamBにより負に制御されており、ramB遺伝子欠損株でPTA酵素活性が上昇することが知られている（Journal of Bacteriology May 2004 2798-2809）。そこで、ramB欠損株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果に関し検討する。
【０１２５】
（４−１）ramB遺伝子破壊用断片のクローニング
ramB遺伝子欠損は、sacB搭載温度感受性プラスミドpBS5Tを用いて破壊した。（国際公開WO2005113745 号、WO2005113744 号）ramB遺伝子ATCC13869株由来のRamBのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC_003450 配列番号３６に塩基配列を、配列番号３７にアミノ酸配列を示す）の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得する。具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号１９、２０の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いramB遺伝子N末端側の増幅産物を得る。一方、ramB遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ATCC13869株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番１８、２１の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行う。配列番号１８、１９は互いに相補的であり、RamBのORFの全配列を欠損させた構造となっている。次に内部配列を欠失したramB遺伝子断片を得るために、上記RamB N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号２２、２３の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い内部配列を欠失したramB遺伝子増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、上述のpBS5TのXbaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T-ramBと命名する。
【０１２６】
(４−２)ramB破壊株の作成
まず、ATCC13869ΔsucAyggB::IS株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS5T-ramBを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、25℃で約60時間培養する。得られた形質転換体をCM-Dex液体培地で34℃で1晩振とう培養し、適当に希釈した後、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養する。この培地上に生育した株は該プラスミドのramB遺伝子断片とATCC13869ΔsucAyggB::IS株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地（ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、酢酸ナトリウム2g/l  pH7.5(KOH)）に塗布にし、34℃にて約30時間培養する。その結果、2回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株を得ることができる。
この様にして得られた株の中には、そのramB遺伝子がpBS5T-ramBに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ramB遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応にておこなう。変異型ramB遺伝子のみを有する株を選抜しATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramBと命名する。
【０１２７】
(４−３) ramB破壊株でL-グルタミン酸発酵収率の評価
ATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramBにpVK9（コントロール用プラスミド）、及びpVK9_PS2_xfp（ホスホケトラーゼ（PKT）増幅用プラスミド）を形質転換した株を取得する。形質
転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得る。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramB（pVK9）及びATCC13869ΔsucAyggB::IS ΔramB（pVK9_PS2_xfp）と命名する。実施例１で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9）株及び実施例１で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9_PS2_xfp）株とあわせて実施例１（１−１）の方法で培養評価する。ramB欠損株におけるL-グルタミン酸発酵収率向上の効果及びramB欠損とPKT増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
【０１２８】
実施例５  PTA遺伝子プロモーター改変によるPTA活性増強株の作成及び効果の検証
PTA活性の増強はPTAのプロモーターを改変することによっても達成できる。PTA遺伝子のプロモーターにはRamBが結合しPTAの酵素活性に影響すると考えられる領域が2箇所存在していることが知られている（J Bacteriol. 2004 May;186(9):2798-809.）。そこで、PTAプロモーターのRamB結合領域をそれぞれ改変した株及び同時に改変した株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果に関し検討する。
【０１２９】
（５−１）ptaプロモーター変異用プラスミドpBS5T-m1PTA、pBS5T-m2PTA、pBS5T-m1m2PTAの構築
ATCC13869株由来のPTAのプロモーター領域を含むORF遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC_003450）の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたPCR 法で取得する。ここでptaのプロモーター領域は、具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号２４、２５の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPTA遺伝子のプロモーター領域を含む増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後Xba Iで消化し、pUC19（宝バイオ社製）のXbaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびAmp 50μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpUC19-PTAと命名する。
次に、Site-Directed Mutagenesis Kits(STARATAGNE社製)を使用しPTAプロモーター領域に変異を導入する。pUC19-PTAを鋳型として、配列番号２６、２７の合成DNAを用い、kitに付属のマニュアルに従いRamB結合領域の一箇所に変異を導入したプラスミドを作成する。目的のプラスミドをpUC19-m1PTAと命名する。
次に、pUC19-m1PTAを鋳型として、配列番号２４、２５の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いPTA遺伝子の変異導入プロモーター領域を含む増幅産物を得る。生成したPCR産物を常法により精製後、上述のpBS5TのSmaI部位に挿入する。 このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の変異及びその他の配列にエラーが挿入されていないことを確認できたものをpBS5T-m1PTAと命名する。
同様に、もう一方のRamB結合領域に変異を導入したプラスミドを配列番号２８、２９の合成DNAを用い作成後、目的配列をpBS5Tへ再度クローニングする。目的のプラスミドをpBS5T-m2PTAと命名する。さらに、2箇所のRamB結合領域に同時に変異を導入したプラスミドも同様の手順で作成し、pBS5T-m1m2PTAと命名する。
【０１３０】
（５−２）プロモーター改変株の構築
実施例４の方法に従い、ATCC13869ΔsucAyggB::IS株より、PTAプロモーターを改変した株を取得する。変異型の確認は当該領域の配列をシークエンスすることにより確認する。
PTAプロモーターのRamB結合領域を改変した株を、それぞれATCC13869 ΔsucAyggB::IS m1、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m2、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m1m2と命名する。
【０１３１】
（５−３）PTAプロモーター改変株でL−グルタミン酸発酵収率の評価
ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m1、ATCC13869 ΔsucA yggB::IS m2、ATCC13869 ΔsucAyggB::IS m1m2それぞれににpVK9（コントロール用プラスミド）、及びpVK9_PS2_xfp（PKT増幅用プラスミド）を形質転換した株を取得する。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dexプレート培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得る。それぞれ上記プラスミドを導入した株をATCC13869ΔsucAyggB::IS m1（pVK9）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1（pVK9_PS2_xfp）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2（pVK9）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2（pVK9_PS2_xfp）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1m2（pVK9）及びATCC13869ΔsucA m1m2（pVK9_PS2_xfp）と命名する。実施例１で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9）株及び実施例１で構築したATCC13869ΔsucA（pVK9_PS2_xfp）株とあわせて実施例１（１−１）の方法で培養評価する。PTAプロモーター改変株におけるL-グルタミン酸発酵収率向上の効果及びPTAプロモーター改変とPKT増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
【０１３２】
実施例６  補充経路との組み合せ増強株の作成及び効果の検証
PTA活性の増強はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下PPCともいう）またはピルビン酸カルボキシラーゼ（以下PCともいう）の増強と組合わせてもよい。そこで、PTAとPPCまたはPCをプラスミドで発現増強した株を構築し、グルタミン酸発酵収率向上効果を検討する。
【０１３３】
（６−１）PPC発現プラスミドpVC-PPCの構築
PPCをコリネ型細菌内で高発現するプラスミドは以下のようにして構築した。まず配列番号５８と配列番号５９に示す合成DNAをプライマーとして、C. glutamicum ATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を行い、PPC遺伝子断片を得た。得られた増幅断片を平滑末端化し、pHSG399（タカラバイオ）のSmaI部位に挿入し、得られたプラスミドをpPCFとした。次に、PPC遺伝子コード領域の上流を欠失させるために、pPCFをDraIとSalIで処理し、pHSG398（タカラバイオ）のSmaI部位に挿入し、lacZ'に対して逆向きにPPC遺伝子断片が挿入されたプラスミドをpPCFdsとした。PPC遺伝子の上流にアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーターを連結するために、p399AKYB（特開平６−６２８６６参照）をPstIとApaLIで処理して平滑末端化することで、アスパルトキナーゼ遺伝子プロモーターとコリネ型細菌内で自立複製可能な領域を含むDNA断片を調製し、これをpPCFdsのSalI部位を平滑末端化した部位に挿入した。得られたプラスミドのうちアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーターとPPC遺伝子が順向きになっているものをpAKPFdsとした。pAKPFdsが含むコリネ型細菌内で自律複製可能な領域はpVK9_PS2_xfpと同様にpHM1519由来であることから、pVK9_PS2_xfpと共存できない。そこで、配列番号６０と配列番号６１に示す合成DNAをプライマーとして、pAKPFdsを鋳型としてPCRを行い、得られたPPC遺伝子断片をKpnIで処理し、pAM330由来の自律複製領域を含むpVC7（特開２０００−２０１６９２参照）のKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpVC-PPCと命名した。
【０１３４】
（６―２）PCまたはPPC増強株の構築と評価
実施例２で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS（pVK9）株、実施例3で構築したATCC13869ΔsucA（pVK9_PS2_xfp）株および実施例５で構築したATCC13869ΔsucAyggB::IS m1（pVK9）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1（pVK9_PS2_xfp）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2（pVK9）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2（pVK9_PS2_xfp）、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1m2（pVK9）及びATCC13869ΔsucA m1m2（pVK9_PS2_xfp）をpVC7またはpVC-PPCまたはPC遺伝子の発現プラスミドpBPYC6（特開２０００−２０１６９２参照）で形質転換する。得られた形質転換体を、実施例１（１−１）の方法で培養評価する。PTAプロモーター改変とPC増強
またはPPC増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果、およびPTAプロモーター改変とPKT増強とPC増強またはPPC増強の組み合わせによるL-グルタミン酸発酵収率向上効果について確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】変異型yggB遺伝子のIS挿入部位を示す図。
【図１】
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【配列表】
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