(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞からマウスすい臓を生産する方法であって、以下の工程：
Ａ）マウスＥＳ細胞を、フィーダー細胞上で血清および白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養してコロニー形成を行う工程、
Ｂ）その後、ＬＩＦを含まない培地中で形成された該コロニーを培養して胚様体様凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅ）を形成させる前培養工程；
Ｃ）その後、フィーダー細胞およびＬＩＦの非存在下で該胚様体様凝集塊にアクチビンとレチノイン酸とに同時に曝す曝露工程；および
Ｄ）その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記前培養工程は、１〜１０日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記曝露工程は、１〜４日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ）工程およびＤ）工程で使用される培地は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標）（ＫＳＲ（商標））培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記曝露工程は、浮遊培養の条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記浮遊培養は、低接着性コーティング培養容器上で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞は、マウス胎仔線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃ）工程のアクチビンは、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ）工程のレチノイン酸は、０．０１μＭより多く１μＭ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記工程Ｄ）は、分化させた前記凝集塊を、コーティングされた培養容器上の培地中で培養する分化工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記コーティングは、ゼラチンコーティングである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分化工程において用いられる培地は、ＫＳＲ（商標）培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化工程は、機能的すい臓が生産されるに十分な期間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化工程は、７〜２１日間行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程Ｃ）は、アクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で１〜４日間培養する工程を包含し、前記工程Ｄ）は、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で１週間〜３週間培養する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃ）工程において、前記アクチビンの使用濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ未満であり、前記レチノイン酸の使用濃度は０．０１μＭより多く１μＭ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記すい臓は、すい臓マーカーIpf1/pdx-1を発現し、すい臓が形成される時期にその発現量が低下するマーカーＳｈｈを発現しないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記すい臓は、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｇｌｕｃａｇｏｎおよびａｍｙｌａｓｅ  ２からなる群より選択される少なくとも１つのすい臓マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記すい臓は、α細胞とβ細胞と外分泌細胞と導管構造を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択されるすべての特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器再生技術に関する。より詳細には、未分化細胞からすい臓を生産する技術および生産されたすい臓に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで「すい臓」を作るための方法が幾つか開発され報告されている（例えば、非特許文献１＝Ｌｏｅｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；非特許文献２＝Ｓｏｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００；非特許文献３＝Ｓｈｒｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２；非特許文献４＝Ｌｅｏｎ−Ｑｕｉｎｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００４；非特許文献５＝Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし、これらのすい臓は、完全なものではない。これは、これまでＥＳ細胞も含めてどのような哺乳類の未分化細胞からも、ベータ細胞（β細胞：体の組織による糖の取り込みおよび糖新生の抑制などを司るホルモンであるインスリンを特異的に作って分泌する内分泌系の細胞）を作ることにのみ着目してすい臓が作られてきたことに起因する。これは、現在の医療水準および技術では根本的に治療できない多くの糖尿病患者を、インスリン分泌活性を有するβ細胞を移植することによって救うための細胞医療（ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）および組織医療（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）という再生医療を目指しているからである。そのため、自然のすい臓が有する他の機能および構造を有するようなすい臓を作ることはこれまでできなかった。【０００３】
そのような自然のすい臓とは、好ましくは、
１）血糖値（すなわち、血中のグルコース濃度）に応答してインスリンを分泌する内分泌細胞（β細胞）をもち、
２）グルカゴンを作り分泌する内分泌細胞（アルファー細胞、α細胞：グリコーゲンの分解および糖新生などを司るホルモンであるグルカゴンを特異的に作って分泌する内分泌系の細胞）を持ち、
３）消化酵素類など（例：アミラーゼ）を作り腸管内に分泌する外分泌細胞（腺房細胞）を持ち、さらに、
４）すい臓から消化酵素類を腸管に外分泌するための導管構造などのすべての機能と構造を備えたすい臓を意味する。【０００４】
健康な身体の中では、血糖値はインスリンとグルカゴンとの競争的な作用により、適切に維持されている。そのために、糖尿病の治療のためには、インスリンだけを分泌するようなすい臓ではなく、同時にグルカゴンも分泌できるすい臓が必要だが、そのようなすい臓をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作る方法はこれまでなかった。すい臓の機能不全、およびすい臓がんのためにすい臓が摘出されなければならない患者を治療するためには、内分泌機能だけでなく、消化酵素類を作り、それを外分泌する機能も備えたすい臓を移植する必要があるが、そのようなすい臓をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作る方法がなかった。また、消化酵素類が組織内に分泌されると、身体自体が消化されることになり危険なので、消化酵素類を消化管内に導くための導管も必要であるが、導管構造を持つようなすい臓をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作る方法がなかった。【０００５】
この点に関しては、本発明者らは、特許文献１（特開２００１−３３３７７０）、特許文献２（特開２００１−２９９３３５）、非特許文献６（実験医学  Ｖｏｌ．１９  Ｎｏ．１５，１５９−１６６，２００１）、非特許文献７（医学のあゆみ  Ｖｏｌ．１９５  Ｎｏ．７，４８８−４８９，２０００）、非特許文献８（科学新聞平成１２年６月２日号，２０００）、非特許文献９（第２６回情報化学討論会  ＰＬ−１，２００３）、非特許文献１０（日本組織細胞化学総会・学術集会講演プログラム・予稿集  ＶＯＬ．４４ｔｈ；ＰＡＧＥ，２９，２００３）非特許文献１１（現代化学増刊  ＶＯＬ．４１ｔｈ；ＰＡＧＥ，１２４−１３１，２００２）および非特許文献１２（Ｄｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４２：  ５９３−６０２，２０００）において、マウスまたは両生類を用いてすい臓を生産する試みを行っている。しかし、これらの文献に記載されている方法で生産されたすい臓は、完全に機能するとはいえない。また、詳細な条件は記載されていない。再生においては詳細な条件が不明な場合が多いが、少し濃度が異なるだけで別の臓器が生産されることも報告されている。従って、本発明者らのこれまでの開示からでは、完全に機能するすい臓を生産することができるとまではいえない。【０００６】
特許文献３（特開２００３−９８５４号）は、胚性幹細胞を、特定の因子を含む培地を用いて培養する工程を含むことを特徴とする、胚性幹細胞からエンブリオイドボディを形成する方法、該方法のために用いるための培地及び分化誘導剤、該方法を用いた分化細胞の誘導方法、該分化誘導した細胞、並びにそれらの利用を開示する。【０００７】
このほか、未分化細胞からすい臓を生産しようとする試みは、特許文献４（ＷＯ２００２／０７９４５７）；特許文献５（ＷＯ２００２／０８６１０７）；特許文献６（ＷＯ２００２／０１０３４７）；特許文献７（ＷＯ２００２／０５９２７８）；特許文献８（ＷＯ２００２／０９２７５６）；非特許文献１３（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６４：  １−１４，２００３）；非特許文献１４（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：  Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１−６，２０００）；非特許文献１５（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２０：  ２８４−２９２，２００２）；非特許文献１６（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４７：  １４４２−１４５１，２００４）；非特許文献１７（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：  １３８９−１３９４，２００１）；非特許文献１８（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ６１：  ４４８−４５６，２００３）；非特許文献１９（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ３７：  ３７４−３８３，１９９７）；非特許文献２０（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２３：  ６５６−６６２，２００５）；非特許文献２１（Ｄｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４２：  ５９３−６０２，２０００）；非特許文献２２（Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．５４（３）．２６２，Ｐ−０４８，２００５）などがあるが、いずれも、機能的なすい臓の生産には至っておらず、また、哺乳動物細胞からの生産は、ほとんど行われていない。さらに、ＥＳ細胞などの未分化性の高い細胞からの分化による生産もほとんど試みられておらず、ましてや、哺乳動物のＥＳ細胞から機能的なすい臓を生産することに成功した例はない。【０００８】
上述のように、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む種々の未分化細胞から完全に機能するすい臓を生産することは、まだ達成されていない。
【非特許文献１】Ｌｏｅｂｅｌ，Ｄ．Ａ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｅ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｔａｍ，Ｐ．Ｐ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２６４，１  （２００３）．
【非特許文献２】Ｓｏｒｉａ，Ｂ．，Ｒｏｃｈｅ，Ｂｅｒｎａ，Ｇ．，Ｌｅｏｎ−Ｑｕｉｎｔｏ，Ｔ．，Ｒｅｉｇ，Ｊ．Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４９，１５７  （２０００）．
【非特許文献３】Ｓｈｒｏｉ，Ａ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｉ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｓ．，Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０，２８４  （２００２）．
【非特許文献４】Ｌｅｏｎ−Ｑｕｉｎｔｏ，Ｔ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ｓｋｏｕｄｙ，Ａ．，Ｂｕｒｃｉｎ，Ｍ．，Ｓｏｒｉａ，Ｂ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４７，１４４２  （２００４）．
【非特許文献５】Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，Ｎ．，Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ｏ．，Ｌａｅｎｇ，Ｐ．，Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｌ．，Ｒａｖｉｎ，Ｒ．，ＭｃＫａｙ，Ｒ．，Ｓｃｉｎｅｃｅ，２９２，１３８９  （２００１）．
【非特許文献６】実験医学  Ｖｏｌ．１９  Ｎｏ．１５，１５９−１６６，２００１
【非特許文献７】医学のあゆみ  Ｖｏｌ．１９５  Ｎｏ．７，４８８−４８９，２０００
【非特許文献８】科学新聞  平成１２年６月２日号，２０００
【非特許文献９】第２６回情報化学討論会  ＰＬ−１，２００３
【非特許文献１０】日本組織細胞化学総会・学術集会講演プログラム・予稿集  ＶＯＬ．４４ｔｈ；ＰＡＧＥ，２９，２００３
【非特許文献１１】現代化学増刊  ＶＯＬ．４１ｔｈ；ＰＡＧＥ，１２４−１３１，２００２
【非特許文献１２】Ｄｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４２：  ５９３−６０２，２０００
【非特許文献１３】Ｂｏｃｋ，Ｇ．，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｈ．Ｂ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍ．，Ｌｅａｐｍａｎ，Ｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６１，４４８  （１９９７）．
【非特許文献１４】Ｇｏｐｉｎｇ，Ｂ．，Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｎｅｉｍ，Ｍ．，Ｅｇｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍ．（２００３）．
【特許文献１】特開２００１−３３３７７０公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３３５公報
【特許文献３】特開２００３−９８５４公報
【特許文献４】国際公開２００２／０７９４５７パンフレット
【特許文献５】国際公開２００２／０８６１０７パンフレット
【特許文献６】国際公開２００２／０１０３４７パンフレット
【特許文献７】国際公開２００２／０５９２７８パンフレット
【特許文献８】国際公開２００２／０９２７５６パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、未分化細胞から完全に機能するすい臓を生産することを課題とする。【００１０】
哺乳類の未分化細胞から、自然の機能と構造を有するすい臓をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作る方法を開発する。具体的な課題は次の通り。
１）グルコース負荷に対して応答してインスリンを分泌するβ細胞を持ち、
２）内分泌細胞として、β細胞だけでなくα細胞を持ち、
３）消化酵素類（アミラーゼなど）を作る外分泌細胞（腺房細胞）を持ち、
４）導管構造などのすべての機能と構造を備えたすい臓を作ることである。【００１１】
もし、哺乳類の未分化細胞から、このようなすい臓を作ることができれば、多くの糖尿病患者、およびすい臓摘出患者などを治療するための有用な材料を提供する可能性がある。また、このような自然のすい臓と同じ機能と構造をもつすい臓であれば、すい臓に関わる生物・医学的研究、およびすい臓疾患の原因解明の研究、さらには、すい臓疾患の治療およびすい臓がんの治療のための薬剤の開発における有用なモデルおよび評価系（アッセイ系）となることも期待できる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題は、本発明者らが、アクチビンとレチノイン酸の特定の濃度を用い、事前に未分化細胞に特定の処理をすることによって、機能的なすい臓へと分化させることができることを見出したことによって解決した。【００１３】
本発明は、哺乳類の「未分化細胞」と「アクチビンとレチノイン酸の処理」との組み合わせからなる。図１で例示したように、はじめに、フィーダー細胞上で、ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ）の存在下、血清培地中で、未分化細胞を培養してＥＳ細胞のコロニー形成を行ない、さらに、その凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅｓ，ＥＢＳ）を形成させる。その後に、フィーダー細胞とＬＩＦ  の非存在下で、無血清倍地中でアクチビンとレチノイン酸とを同時に処理して、形成された凝集塊からすい臓をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導して作る。【００１４】
図１に模式的な代表図が示してある。未分化細胞（ＥＳ細胞）からのすい臓の分化誘導の概略図。ＬＩＦ，白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）；ＥＢＳ，胚様体様の凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅｓ）。【００１５】
より具体的には、哺乳類を代表するためのよいモデルであるマウス由来のＥＳ細胞を未分化細胞として用いる。はじめに、血清培地（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ培地）中で、ゼラチンコートした培養容器にフィーダー細胞を培養し、その上でＬＩＦ（白血病阻害因子）の存在下でＥＳ細胞を培養してＥＳ細胞の集合体であるコロニー、さらに、その凝集塊を作る。次に、そうして得られた凝集塊を、低接触性コート培養プレートを用いた浮遊培養の条件下で、アクチビンとレチノイン酸を添加した誘導培地（１０％の血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ）で２日間培養する。さらに、凝集塊を、ゼラチンコートした培養プレートにおいてＫＳＲ培地中で培養することにより、すい臓を作ることができる（図１）。【００１６】
このようにして分化誘導して作ったすい臓には、すい臓内分泌系細胞であるα細胞とβ細胞があり、グルコース負荷に応答してインスリンの分泌が増加すること、また、内分泌系細胞以外にも、すい臓外泌系細胞と導管構造と備わっていることを、光学顕微鏡、電子顕微鏡、抗インスリン抗体（抗インスリンＣ−ペプチド抗体）、抗グルカゴン抗体、抗アミラーゼ抗体、すい臓の発生に伴い特異的に増加および減少する遺伝子マーカー群の同定などにより確認した。【００１７】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）未分化細胞からすい臓を生産する方法であって、以下の工程：
Ａ）未分化細胞を、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養してコロニー形成を行い、凝集塊を形成させる前培養工程；および
Ｂ）ＬＩＦ非存在下で上記未分化細胞にアクチビンとレチノイン酸とに曝す曝露工程
を包含する、方法。
（２）  上記未分化細胞は、フィーダー細胞上で培養される、上記項目に記載の方法。
（３）  上記凝集塊は、胚様体様凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅ）である、上記項目に記載の方法。
（４）上記前培養工程は、１〜１０日間行われる、上記項目に記載の方法。
（５）上記前培養工程は、約４日間行われる、上記項目に記載の方法。
（６）上記曝露工程は、１〜４日間行われる、上記項目に記載の方法。
（７）上記曝露工程は、約２日間行われる、上記項目に記載の方法。
（８）上記未分化細胞は、哺乳動物の細胞である、上記項目に記載の方法。
（９）上記培地は、血清を含む、上記項目に記載の方法。
（１０）上記培地は、ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）培地である、上記項目に記載の方法。
（１１）上記曝露工程は、浮遊培養の条件下で行われる、上記項目に記載の方法。
（１２）上記浮遊培養は、低接着性コーティング培養容器上で行われる、上記項目１に記載の方法。
（１３）上記未分化細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である、上記項目に記載の方法。
（１４）上記フィーダー細胞は、マウス胎仔線維芽細胞である、項目２に記載の方法。
（１５）上記アクチビンは、５０ｎｇ／ｍｌ未満である、上記項目に記載の方法。
（１６）上記アクチビンは、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ未満である、上記項目に記載の方法。
（１７）上記アクチビンは、１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌである、上記項目に記載の方法。
（１８）上記アクチビンは、１０ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌである、上記項目に記載の方法。
（１９）上記レチノイン酸は、０．０１μＭより多く１μＭ未満である、上記項目に記載の方法。
（２０）上記レチノイン酸は、０．０１μＭより多く０．１μＭ以下である、上記項目に記載の方法。
（２１）上記レチノイン酸は、０．１μＭ以上１μＭ未満である、上記項目に記載の方法。
（２２）さらに、Ｃ）分化させた上記凝集塊を、コーティングされた培養容器上の培地中で培養する分化工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（２３）上記コーティングは、ゼラチンコーティングである、上記項目に記載の方法。
（２４）上記分化工程において用いられる培地は、ＫＳＲ培地である、上記項目に記載の方法。
（２５）上記分化工程は、機能的すい臓が生産されるに十分な期間である、上記項目に記載の方法。
（２６）上記分化工程は、７〜２１日間行われる、上記項目に記載の方法。
（２７）上記分化工程は、１０〜１４日間行われる、上記項目に記載の方法。
（２８）上記分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で培養する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（２９）上記分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で約１〜４日間培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で１週間〜３週間培養する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（３０）上記分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で約２日間培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で約１０日間〜約２週間培養する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（３１）上記アクチビンと上記レチノイン酸の使用濃度は、上記項目１５〜２１からなる群より選択される条件である、上記項目に記載の方法。
（３２）上記機能的すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、上記項目に記載の方法。
（３３）上記機能的すい臓は、すい臓マーカーIpf1/pdx-1を発現し、すい臓が形成される時期にその発現量が低下するマーカーＳｈｈを発現しないことを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（３４）上記機能的すい臓は、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｇｌｕｃａｇｏｎおよびａｍｙｌａｓｅ  ２からなる群より選択される少なくとも１つのすい臓マーカーを発現する、上記項目に記載の方法。
（３５）上記機能的すい臓は、α細胞とβ細胞と外分泌細胞と導管構造を含むことを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（３６）上記機能的すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択されるすべての特徴を有する、上記項目に記載の方法。
（３７）上記項目に記載の方法によって生産されたすい臓。
（３８）上記項目に記載のすい臓を用いることを特徴とする、機能的すい臓を必要とする患者の処置のための方法。
（３９）上記患者は糖尿病に罹患している、上記項目に記載の方法。
（４０）上記患者は哺乳動物である、上記項目に記載の方法。
（４１）機能的すい臓を必要とする患者の処置のための医薬を製造するための、アクチビンおよびレチノイン酸の使用。
（４２）上記患者は糖尿病に罹患している、上記項目１に記載の使用。
（４３）上記患者は哺乳動物である、上記項目に記載の使用。
（４４）上記医薬は幹細胞から製造される、上記項目に記載の使用。
（４５）上記医薬は胚性幹細胞から製造される、上記項目に記載の使用。【００１８】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。【００１９】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面等を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００２０】
本方法により、これまで実現されていなかった哺乳類の未分化細胞から、
１）グルコース負荷に対して応答してインスリンを合成して分泌するβ細胞を持ち、
２）内分泌細胞として、β細胞だけでなく、グルカゴンを合成して分泌するα細胞を持ち、
３）消化酵素類（アミラーゼなど）を作り腸管内に分泌する外分泌細胞（腺房細胞）を持ち、
４）すい臓から消化酵素類を腸管に外分泌するための導管構造などのすべての機能と構造を備えたすい臓を作ることが世界ではじめてできた。【００２１】
ヒトＥＳ細胞から本発明者らの方法とは別の方法で誘導されたβ細胞は、米国においては、既にヒトの糖尿病の治療に対して試験的に応用されている。本発明者らの開発した方法でヒトの未分化細胞からβ細胞だけでなく、本発明者らが示したように完全なすい臓（機能的なすい臓）を作ることができるならば、多くの糖尿病患者およびすい臓機能不全患者だけでなく、すい臓がんなどのためにすい臓を摘出せざるを得ない患者も治療するための、これまでにない有用な材料を提供する可能性がある。また、すい臓に関わる生物・医学研究、およびすい臓疾患の原因解明の研究、さらには、すい臓疾患の治療およびすい臓がんの治療のための薬剤の開発における有用なモデルおよび評価系（アッセイ系）となることも期待できる。このように、本方法の実用化と産業上の見通しは極めて明るいものと判断する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】未分化細胞（ＥＳ細胞）からのすい臓の分化誘導の概略図。ＬＩＦ，白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）；ＥＢＳ，胚様体様の凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅｓ）。オールシスレチノイン酸（ＲＡ）およびアクチビンを使用した。マウス由来のＥＳ細胞を未分化細胞として用いた。はじめに、血清培地（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ培地）中で、ゼラチンコートした培養容器にフィーダー細胞を培養し、その上でＬＩＦ（白血病阻害因子）の存在下でＥＳ細胞を培養してＥＳ細胞の集合体であるコロニー、さらに、その凝集塊を作る。次に、そうして得られた凝集塊を、低接触性コート培養プレートを用いた浮遊培養の条件下で、アクチビンとレチノイン酸を添加した誘導培地（１０％の血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ）で２日間培養する。さらに、凝集塊を、ゼラチンコートした培養プレートにおいてＫＳＲ培地中で培養することにより、すい臓を作ることができる。
【図２】図２．Ａ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された腸管様構造とその脇に発達した導管様構造と黒い斑点を含む組織（矢印）。中心部にある腸管様構造は、ゆっくりとしたぜん動運動を行なう。この黒い斑点を持つ組織の特徴は分泌性組織のものである。Ｂ，アクチビンとレチノイン酸がない条件で同じように培養したマウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）。Ａに見られる腸管様構造、導管様構造、黒い斑点を含む組織が見られない。スケールバーは１００μＭ。
【図２Ｃ】分化したすい臓を含むＥＢＳおよび分化誘導の後の遺伝子発現についての位相差顕微鏡写真である。（ａ，ｂ）０．１μＭのレチノイン酸および１０ｎｇ／ｍｌアクチビンでの処理後１３日後に示される腸管状構造（Ｇ）およびすい臓管状構造（Ｄ）である。この近くには、外分泌細胞が見られ、これは、数多くの黒い斑点として観察される（ｂ、矢頭）。（ｃ）レチノイン酸およびアクチビンで処理したＥＢＳおよび処理していないＥＢＳ中のＲＴ−ＰＣＲによって検査されたすい臓マーカー遺伝子の発現。ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ，ｇｌｕｃａｇｏｎｓ，ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎおよびIpf1/pdx-1の発現は、処理後２日目に増加を始め、他方ａｍｙｌａｓｅおよびｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅは、それぞれ６日目および８日目に増加を始めた。Ｓｈｈの発現は、処理後減少した［バー＝５０μＭ（ａおよびｂ）］。（ｄ）ＥＢＳ中のすべてのすい臓マーカーの最も効率のよい遺伝子発現は、０．１μＭレチノイン酸を１０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡと共に用いたときに観察された。レチノイン酸およびアクチビンをこの濃度で使用したとき、処理したＥＢＳのうち４７．６±７．３％が、上記すい臓遺伝子を発現していた。他の濃度では、すい臓遺伝子発現は効率よく誘導されなかった。
【図３】図３．Ａ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された黒い斑点を含む組織（図１参照）の電子顕微鏡像。Ｂ，妊娠後期のラット胎児のすい臓の外分泌細胞の電子顕微鏡像（Ｂｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。どちらの細胞も、電子密度の高い顆粒様の構造を多数含み、また発達した小胞体を持つなど、その構造が極めてよく似ている。ＥＲ，小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）；Ｎ，核。
【図３Ｃ】図３．Ｃ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された導管様構造（図１参照）の電子顕微鏡像。自然のすい臓導管の上皮構造に極めてよく似ている。Ｄ，同じく、マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された分泌顆粒様構造をもつ細胞（図１参照）の電子顕微鏡像。写真内の点線で囲まれた箇所を拡大した像も示している。この像は、その右（Ｅ）に示したマウス生体のすい臓のβ細胞内にある内分泌顆粒像（Ｇｏｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；矢印で示した）と同じように、黒い中心部とそれを包む袋の間に隙間が見られる（矢印で示した）。Ｎ，核。
【図３Ｅ】分化したすい臓を含むＥＢＳの形態学。０．１μＭのレチノイン酸および１０ｎｇ／ｍｌアクチビンで処理したＥＢＳの切片は、処理後１１日に球状組織となり、管状腔野付近がトルイジンブルーで強く染色された（ａ、矢頭）、球状組織付近ではすい臓様構造（Ｄ）が見られた（ｃ、ｄ）。低い円柱上皮によって囲まれたすい臓管に似た構造藻また観察された（ｄ）。処理していないＥＢＳの切片では、球状組織も管状組織構造も見られなかった（ｂ）。Ｎは核、縮尺のバーは５０μｍ（ａ−ｃ）または５μｍ（ｄ）である。
【図４Ａ】図４−１．１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１  μＭのレチノイン酸で処理したマウスＥＳ細胞由来のコロニーの凝集塊（ＥＢＳ）の免疫組織学的観察像。Ａ、インスリンＣペプチド；Ｂ，アミラーゼ；Ｃ，ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；核の染色剤）、Ｄ，Ａ  ＋Ｂ  ＋Ｃ。スケールバーは５０  μＭ。インスリンＣペプチドとアミラーゼが別の細胞によって作られている。この条件下では、インスリンよりもアミラーゼが優先的に合成されている。
【図４Ｂ】図４−２．２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１μＭのレチノイン酸で処理したマウスＥＳ細胞由来のコロニーの凝集塊（ＥＢＳ）の免疫組織学的観察像。Ａ、インスリンＣペプチド；Ｂ，アミラーゼ；Ｃ，ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；核の染色剤）、Ｄ，Ａ＋Ｂ＋Ｃ。スケールバーは５０μＭ。図４−１と同様に、インスリンＣペプチドとアミラーゼが別の細胞によって作られているが、この条件下では、インスリンがアミラーゼよりも優先的に合成されている。
【図４Ｃ】分化したすい臓を含むＥＢＳの構造分析。電子顕微鏡観察において、大量のチモーゲン粒子を含む細胞があきらかになった（ａ、ｂ）、これは、非常に発達した小胞体であり、そして暗い均質な染色を示した。これは、腺房細胞の特徴である（ａ）。すい臓内分泌細胞に形態学的に類似する細胞も認められた（ｃ、ｄ）。しかし、これらは、すい臓外分泌細胞に類似する細胞よりも数が少なかった。これらの細胞は、大量の内分泌顆粒を含んでいた（ｄ）。これは、外分泌細胞に含まれる顆粒とは形態学的に異なっていた（ｂ）。暗い中心領域と側方の膜との間の大きな空間は、すい臓β細胞の顆粒と一致しており、これは（ｄ）においても観察された。（ＥＲ：小胞体、Ｍ：ミトコンドリア、Ｎ：核、Ｚ：チモーゲン顆粒）。縮尺バーは、５μｍ（ａ−ｃ）および１μｍ（ｄ）。
【図５】マーカータンパク質の免疫組織化学的検出。０．１μＭレチノイン酸および１０ｎｇ／ｍｌアクチビンで処理したＥＢＳの免疫染色によって、アミラーゼ陽性チモーゲン顆粒を含む細胞（ｃ）およびインスリンＣペプチド陽性顆粒を含む少数の細胞（ｄ）の存在が明らかになった。８週齢マウスのすい臓を、染色してこれをポジティブコントロールとして用いた（ａ、ｂ）。細胞を、ＤＡＰＩ（４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて対比染色した（ａ−ｄ）。（ＥＲ：小胞体、Ｍ：ミトコンドリア、Ｎ：核、Ｚ：チモーゲン顆粒）。縮尺バーは２０μｍ。
【図６】ＥＢＳにおけるすい臓マーカー遺伝子およびｓｈｈの発現。トータルＲＮＡをレチノイン酸（０，０．１μＭおよび１μＭ）およびアクチビン（０，１０ｎｇ／ｍｌ、および２５ｎｇ／ｍｌ）で処理したＥＢＳから収集し、そして以下のマーカーの発現レベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した；ａｍｙｌａｓｅ  ２（ａ），ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ（ｂ），ｐｔｆ１ａ／ｐ４８（ｃ）およびＳｈｈ（ｄ）。発現レベルを、処理していないＥＢＳにおけるものに対して正規化した。Ｓｈｈ発現は、レチノイン酸単独、アクチビン単独およびレチノイン酸およびアクチビンの組み合わせでの処理のすべての組み合わせにおいて減少していた（ｃ）。ｉｎｓｕｌｉｎＩＩ  およびａｍｙｌａｓｅ  ２の量の増加は、レチノイン酸単独で処理したＥＢＳにおいて見られたが、アクチビン単独では、処理していないＥＢＳに比較してｉｎｓｕｌｉｎ発現に対して効果がなかった。しかし、アクチビン単独で、ａｍｙｌａｓｅ２発現が減少した（ａ，ｂ）。ＥＢＳを一定濃度のレチノイン酸（０．１μＭｌａ，ｂの中段）で処理し、そして比較的低濃度のアクチビン（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した場合、ａｍｙｌａｓｅ２の発現は、レチノイン酸およびアクチビンの両方での処理群において処理していない群よりもはるかに高く、他方で、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現は、２群において変化がなかった。対照的に、レチノイン酸を高濃度のアクチビン（２５ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせると、およそ１５０倍のｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ発現の増大が見られ、他方、比較的低レベルのａｍｙｌａｓｅ  ２発現が観察された。ｐｔｆ１ａ／ｐ４８の発現パターンは、ａｍｙｌａｓｅ２のモノと強く相関していた。マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導されたすい臓構造のＲＴ−ＰＣＲ法により得たｍＲＮＡ発現プロファイル。Ｉｎｓｕｌｉｎ  ２，ｇｌｕｃａｇｏｎ，ａｍｙｌａｓｅ  ２とＩｐｆ１／ｐｄｘ−１は、すい臓の発生において特異的に発現するマーカー遺伝子（正のマーカー）であり、一方Ｓｈｈは、すい臓の発生に伴い発現が減少する遺伝子（負のマーカー）である。また、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、すべての細胞が高レベルで発現している構成的タンパク質（酵素）なので、実施したアッセイ法が適切であることを保証する目的で用いた。
【図７】外分泌細胞および内分泌細胞の概観に対する刺激濃度の効果。８週齢のマウスのすい臓（ａ）、処理していないＥＢＳ（ｂ）および０．１μＭのレチノイン酸および１０ｎｇ／ｍｌアクチビン（ｃ）または２５ｎｇ／ｍｌアクチビン（ｄ，ｅ）で処理したＥＢＳを抗インスリンＣペプチド抗体、抗アミラーゼ抗体およびＤＡＰＩで、処理後１３日（ＥＢＳ形成開始後１９日）で染色した。インスリン陽性細胞もアミラーゼ陽性細胞も処理されていないＥＢＳにおいて観察されなかった（ｂ）。０．１μＭのレチノイン酸および１０ｎｇ／ｍｌアクチビンで処理したＥＢＳではインスリン陽性細胞がアミラーゼ陽性細胞よりも少なかった（ｃ）。対照的に０．１μＭのレチノイン酸および２５ｎｇ／ｍｌアクチビンで処理したＥＢＳでは、インスリン産生細胞が顕著に増加していた（ｄ）。さらに、抗グルカゴン抗体染色によって、少量であるが、有意数のグルカゴン産生細胞（赤）がインスリン産生細胞に混じって観察された（ｅ）。縮尺バー：５０μ（ａ−ｄ）および２０μｍ（ｅ）。
【配列表の説明】
【００２３】
配列番号１は、ヒトインヒビンβＡのアクセッション番号ＮＭ００２１９２の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号２は、ヒトインヒビンβＡのアクセッション番号ＮＭ００２１９２のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号３は、ヒトインヒビンβＢのアクセッション番号ＮＭ００２１９３の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号４は、ヒトインヒビンβＢのアクセッション番号ＮＭ００２１９３のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号５は、ヒトインヒビンβＣのアクセッション番号ＮＭ００５５３８の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号６は、ヒトインヒビンβＣのアクセッション番号ＮＭ００５５３８のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号７は、ヒトインヒビンαのアクセッション番号ＮＭ００２１９１の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号８は、ヒトインヒビンαのアクセッション番号ＮＭ００２１９１のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号９は、アクセション番号：Ｘ６８２５０（アフリカツメガエルアクチビンＡ）の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号１０は、アクセション番号：Ｘ６８２５０（アフリカツメガエルアクチビンＡ）のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号１１は、アフリカツメガエルにはインヒビンβＢ（アクセッション番号：Ｓ６１７７３）の核酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号１２は、アフリカツメガエルにはインヒビンβＢ（アクセッション番号：Ｓ６１７７３）のアミノ酸配列である。本発明においてアクチビンとして用いられ得る。
配列番号１３は、ヒトのＬＩＦの核酸配列である。
配列番号１４は、ヒトのＬＩＦのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、マウスのＬＩＦの核酸配列である。
配列番号１６は、マウスのＬＩＦのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ａｍｙｌａｓｅ  ２フォワードプライマーである。
配列番号１８は、ａｍｙｌａｓｅ  ２リバースプライマーである。
配列番号１９は、ｇｌｕｃａｇｏｎ  フォワードプライマーである。
配列番号２０は、ｇｌｕｃａｇｏｎ  リバースプライマーである。
配列番号２１は、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ  フォワードである。
配列番号２２は、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ  リバースプライマーである。
配列番号２３は、Ｉｐｆ１／ｐｄｘ−１  フォワードプライマーである。
配列番号２４は、Ｉｐｆ１／ｐｄｘ−１  リバースプライマーである。
配列番号２５は、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）フォワードプライマーである。
配列番号２６は、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）リバースプライマーである。
配列番号２７は、すい臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）グルカゴン  フォワードプライマーである。
配列番号２８は、すい臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）グルカゴン  リバースプライマーである。
配列番号２９は、Ｓｈｈ  フォワードプライマーである。
配列番号３０は、Ｓｈｈ  リバースプライマーである。
配列番号３１は、ＧＡＰＤＨ  フォワードプライマーである。
配列番号３２は、ＧＡＰＤＨ  リバースプライマーである。
配列番号３３は、ａｍｙｌａｓｅ  ２  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３４は、ａｍｙｌａｓｅ  ２  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３５は、ＧＡＰＤＨ  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３６は、ＧＡＰＤＨ  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３７は、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３８は、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号３９は、Ipf1/pdx-1  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号４０は、Ipf1/pdx-1  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号４１は、ｐｔｆｌａ  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号４２は、ｐｔｆｌａ  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号４３は、Ｓｈｈ  フォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
配列番号４４は、Ｓｈｈ  リバースＲＴ−ＰＣＲプライマーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２５】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００２６】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。【００２７】
本明細書において「未分化細胞」とは、上記のような多分化能を有する細胞をいう。未分化細胞としては、例えば、幹細胞を挙げることができるがそれに限定されない。【００２８】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。【００２９】
本明細書において「フィーダー層」または「フィーダー細胞」（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒまたはｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）とは、互換可能に用いられ、培養基質に設けられる、単独では培養維持することのできない細胞種の増殖および／または分化形質発現を可能にするような、他の細胞種による支持細胞層をいう。組織細胞には、通常の細胞培養条件下では，分化形質発現はもとより増殖すらできない細胞種も多いといわれており、そのような細胞としては、例えば、ある種の幹細胞（特に、上皮幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞など）、角膜、表皮などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの細胞種は一般に、栄養要求性が高く特異的な増殖因子、分化誘導因子を必要とするとされる。このような細胞種でも生体内でのその細胞種の支持細胞あるいはそれと類似の細胞が形成する特定の細胞の層を培養基質に活用することで、培養される細胞種が要求する因子および／または栄養源が供給されることによって、増殖および分化をするようになるといわれている。フィーダー細胞として用いる細胞種は、対象となる細胞種によって選択されるが、抗生物質投与（例えば、マイトマイシンＣなど）、ＵＶ照射などの方法で細胞増殖を抑制して用いることが多い。生殖細胞、初期胚細胞、造血幹細胞などの培養が可能になったのは，フィーダー層の活用に負うところが大きいとされている。フィーダー細胞としては、線維芽細胞のほか、脂肪由来の幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞などを用いることができ、そのような場合、フィーダーを抜いてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳという最も基本的な培養条件により培養して、線維芽細胞に分化させて用いることが好ましい。【００３０】
本明細書において「初代培養細胞」とは、体から分離した細胞、組織、器官などを植え込み，第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。【００３１】
本発明の細胞は、細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＫＳＲ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）およびそれらの混合物などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウム、コレラトキシンなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。【００３２】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。本明細書において「すい臓」への分化は、特異的なマーカーの発現または消失によって、またはその機能（例えば、インスリン、グルカゴン、または消化酵素（アミラーゼなど）の発現または分泌の判定、特異的な構造（導管構造など）の確認などによって、確認することができる。本明細書において使用することができるすい臓マーカーとしては、例えば、すい臓マーカーIpf1/pdx-1、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｇｌｕｃａｇｏｎ、ａｍｙｌａｓｅ  ２、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、Ｇｌｕｔ−２、ＣＫ−１９などを挙げることができる。すい臓であるかどうかを確認する別の手段としては、すい臓が形成される時期にその発現量が低下するマーカーＳｈｈの減少を確認する手段を挙げることができる。【００３３】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。【００３４】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。【００３５】
本明細書において、「すい臓」または「膵臓」とは、脊椎動物において、消化管に付随する肝臓に次ぐ大形の腺性器官である。肝臓に近く位置し、形状、腸管への開口様式は動物の種類により多様．消化液としての膵液を分泌する外分泌部と、血糖レベルの調整に関与するインシュリンとグルカゴンを分泌する内分泌部（ランゲルハンス島）とに区別される．膵液の輸管としての膵管（ｄｕｃｔｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｕｓ）は十二指腸に開口するが、肝臓に始まる輸胆管と癒合して共通の開口をもつものも多い．発生学的には、通常は腸の始部よりの２〜３個の内胚葉性の突起がその原基であり、多くの動物では発生が進むにつれて、それらが合して１個のすい臓を構成する．しかし多くの硬骨魚類・円口類ではすい臓は１個の器官にまとまらず小組織塊として分散し、その場合はランゲルハンス島組織は膵液分泌組織と分離していることが多く、これをブロックマン小体（Ｂｌｏｃｋｍａｎ＿ｓ  ｂｏｄｙ、シュタニウス小体）とよぶ．原基基部は膵管をなすが、多くの哺乳類では２本が残存し、腹側のものが主膵管（ウィルスング管Ｗｉｒｓｕｎｇ＿ｓ  ｄｕｃｔ）を，背側のものは副膵管（サントリーニ管Ｓａｎｔｏｒｉｎｉ’ｓ  ｄｕｃｔ）を形成，それぞれ別個に十二指腸に開口する。【００３６】
本明細書において「機能的すい臓」または「自然のすい臓」とは、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有し、好ましくは、そのすべてを有するすい臓をいう。従って、好ましくは、機能的すい臓とは、１）血糖値（すなわち、血中のグルコース濃度）に応答してインスリンを分泌する内分泌細胞（β細胞）をもち、２）グルカゴンを作り分泌する内分泌細胞（アルファー細胞、α細胞：グリコーゲンの分解および糖新生などを司るホルモンであるグルカゴンを特異的に作って分泌する内分泌系の細胞）を持ち、３）消化酵素類など（例：アミラーゼ）を作り腸管内に分泌する外分泌細胞（腺房細胞）を持ち、さらに、４）すい臓から消化酵素類を腸管に外分泌するための導管構造などのすべての機能と構造を備えルことを意味する。【００３７】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、哺乳動物のもの（例えば、げっ歯類（マウス、ラットなど）、霊長類（サル、ヒトなど））が用いられる。【００３８】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。【００３９】
本明細書において「アクチビン」とは、卵巣の顆粒膜細胞などから分泌され，下垂体前葉の濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を促進するタンパク質ホルモンをいう。代表的なアクチビンとしては、例えば、アクチビン−Ａ、アクチビン−Ｂ、アクチビン−Ｃ、インヒビンなどがあり、これらは、動物間でよく保存されており、ヒトのものがアフリカツメガエルに作用したり、逆も真であることが予期されている。配列番号１および配列番号９（アクセッション番号：ＮＭ００２１９２（ヒトインヒビンβＡの配列番号）およびアクセション番号：Ｘ６８２５０（アフリカツメガエルアクチビンＡ）＝核酸配列）および配列番号２および配列番号１０（それぞれヒトインヒビンβＡの配列番号およびアクセッション番号Ｘ６８２５０（アフリカツメガエルアクチビンＡ）＝アミノ酸配列）に示されるような配列を有する因子および他の種の動物において対応する因子（オルソログ）が挙げられるがそれに限定されない。また、アフリカツメガエルにはインヒビンβＢ（アクセッション番号：S61773）の登録がある（配列番号１１および１２）。分子量２５０００．インヒビンβ鎖のサブユニットがＳ−Ｓ結合した二量体であり，アクチビンＡ（βＡβＡ），アクチビンＡＢ（βＡβＢ），アクチビンＢ（βＢβＢ）の３種類が知られている．アクチビンＡは赤芽球分化誘導因子（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ＥＤＦ）ともいう．インヒビンβ鎖が形質転換成長因子ＴＧＦ−βと約４０％の相同性をもっており，また一次構造中のシステイン残基の位置がよく保存されているので，アクチビンをＴＧＦ−βファミリーに入れることもある。アクチビンは、卵巣の顆粒膜細胞などから分泌され，下垂体前葉の濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を促進するタンパク質ホルモンである。インヒビンを精製する過程で卵胞液中から単離された（１９８６）．分子量２５０００．インヒビンβ鎖のサブユニットがＳ−Ｓ結合した二量体であり，アクチビンＡ（βＡβＡ），アクチビンＡＢ（βＡβＢ），アクチビンＢ（βＢβＢ）の３種類が知られている．アクチビンＡは赤芽球分化誘導因子（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ＥＤＦ）ともいう．インヒビンβ鎖が形質転換成長因子ＴＧＦ−βと約４０％の相同性をもっており，また一次構造中のシステイン残基の位置がよく保存されているので，アクチビンをＴＧＦ−βファミリーに入れることもある．脊椎動物のいろいろな臓器でアクチビン遺伝子の発現が報告されており，卵巣の顆粒膜細胞におけるＦＳＨ受容体の合成の促進，フレンド細胞および骨髄の赤芽球前駆細胞の増殖抑制とヘモグロビン合成の誘導，すい臓からのインシュリン分泌の促進，両生類胚における中胚葉誘導など，多くの生理活性をもつ。アクチビンについては、以下を参照することができる：Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ｂ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，１６３８５−９；Ｕｃｈｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ａｓａｓｈｉｍａ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２，１８７，３４７−５２；Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｎｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９３，１５９，１３１−９；Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎｓ  Ａ，ＡＢ，ａｎｄ  Ｂ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９４，１６３，２７９−８１；Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｎ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．１９９５，４４，Ｓｕｐｐｌ．２，１５−２２。【００４０】
アクチビンは、ヒト、ラット、マウス、アフリカツメガエルなどを含む哺乳動物のほか、ショウジョウバエなどでもそのホモログが知られている。従って、本明細書においてアクチビンは、通常、哺乳動物のほか、生物一般において存在するアクチビンを指す。アクチビン−ＡはインヒビンβＡの二量体である（ヒトインヒビンβＡのアクセッション番号ＮＭ００２１９２；配列番号１および２（核酸およびアミノ酸））。アクチビン−ＡＢはインヒビンβＡとインヒビンβＢの二量体である（ヒトインヒビンβＢのアクセッション番号ＮＭ００２１９３；配列番号３および４（核酸およびアミノ酸））。アクチビン−ＢはインヒビンβＢの二量体である。アクチビン−ＣはインヒビンβＣの二量体である（ヒトインヒビンβＣのアクセッション番号ＮＭ００５５３８；配列番号５および６（核酸およびアミノ酸））。インヒビンはインヒビンαの二量体である（ヒトインヒビンαのアクセッション番号ＮＭ００２１９１；配列番号７および８（核酸およびアミノ酸））。【００４１】
そのようなアクチビン遺伝子としては、例えば、
（Ａ）（ａ）配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいはそれがコードするポリペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。【００４２】
本明細書において「レチノイン酸」とは、ビタミンＡ（レチノール）の重要な代謝物．視覚における役割はもたないが，動物の正常な発育，上皮組織および軟骨の分化増殖に必須である．脊椎動物の発生過程においてモルフォーゲン様作用をもつ。レチノイン酸受容体を介して遺伝子の発現を制御することによってその作用を発揮する．全トランス型が最も重要な異性体だが，９−シスおよび１３−シス体も存在する。【００４３】
【化１】
0005122973.tif 000002
【００４４】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）は、ビタミンＡの活性型といえるレチノイン酸が作用を発揮するために必要な核内に存在する受容体である。全トランス−レチノイン酸が結合するＲＡＲ−α，−βおよび−γ，９−シス−レチノイン酸が結合するレチノイン酸Ｘ受容体ＲＸＲ−α，−βおよび−γが知られている．これらはいずれもステロイド受容体と類似構造をもつリガンド依存的核内受容体であり，リガンドであるレチノイン酸と結合ののち遺伝子の特定の位置に結合してその遺伝子の転写を制御する．発生，形態形成，細胞分化に関与する。【００４５】
本明細書において「白血病阻害因子（ＬＩＦ）」とは、配列番号１３または１５（核酸配列）および１４または１６（アミノ酸配列）に示されるような配列を有する因子および他の種の動物において対応する因子（オルソログ）をいう。【００４６】
ＬＩＦは、単球細胞株Ｍ１の成熟マクロファージへの分化を誘導する因子として精製および単離された（Ｇｅａｒｉｎｇ  Ｄ．Ｐ．，Ｇｏｕｇｈ  Ｎ．Ｍ．，Ｋｉｎｇ  Ｊ．Ａ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９９５−４００２（１９８７）；およびＧｏｕｇｈ  Ｎ．Ｍ．，Ｇｅａｒｉｎｇ  Ｄ．Ｐ．，Ｋｉｎｇ  Ｊ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２６２３−２６２７（１９８８））。Ｍ１細胞増殖およびクローン原性から白血病阻害因子と命名された。しかし、ＬＩＦは、上記報告以外においても、種々のグループから種々の観点で発見され、分化誘導因子（Ｄ因子またはＤＩＦ）（Ｔｏｍｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２５９（１７）：１０９７８−８２（１９８４）；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；４０：４８０４−９（１９８０））；マクロファージ／顆粒球誘導因子２型（ＭＧＩ−２）；分化阻害活性（ＤＩＡ）；分化遅延因子（ＤＲＦ）；ＤＡ−１ａ細胞に対するヒトインターロイキン（ＨＩＬＤＡ）；ＴＳ−１細胞に対する増殖刺激活性（ＧＡＴＳ）；肝細胞刺激因子Ｉ型およびＩＩＩ型（ＨＳＦ−ＩＩおよびＨＳＦ−ＩＩＩ）；コリン作動性神経分化因子（ＣＤＦ）；メラニン細胞由来リポタンパク質リパーゼインヒビター（ＭＬＰＬＩ）；破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）（Ｌａｓｓ  Ａ，Ｗｅｉｓｅｒ  Ｗ，Ｍｕｎａｆｏ  Ａ，Ｌｏｕｍａｙｅ  Ｅ．；Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ；７６：１０９１−６（２００１）；Ｋｎｉｇｈｔ  Ｄ．Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ；１４：１６９−７６（２００１）などを参照）とも呼ばれる。【００４７】
ＬＩＦは、ヒトおよびマウスで発見され、ヒトおよびマウスの型の場合、ジスルフィド結合を有するモノマーの１８０残基の糖タンパク質であり、分子量は約２０ｋＤａである。ＬＩＦは天然では、グリコシル化されて存在しており、精製されたＬＩＦは、およそ３８−６７ｋＤａの見かけ上の分子量を有し（Ｇａｓｃａｎ  Ｈ．，Ｇｏｄａｒｄ  Ａ．，Ｆｅｒｅｎｚ  Ｃ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５０９−２１５１５；Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｎｉｃｏｌａ  Ｎ．Ａ．，Ｇｏｕｇｈ  Ｎ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：３５９−３６７）、グリコシル残基の有無はＬＩＦの活性には関係ない（Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｇｏｕｇｈ  Ｎ．Ｍ．，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｇｅａｒｉｎｇ  Ｄ．Ｐ．（１９８８）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １４：４３１−４４２）。ＬＩＦは、らせん構造をしており、長鎖タイプのサイトカインに分類される。このサイトカインは、長いらせん、長い頭部Ａ−ＢおよびＣ−Ｄループ、およびさらなる５番目のらせんＡループがある（Ｐｕｒｖｉｓ  Ｄ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｂｂｕｔｔ  Ｂ．Ｃ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（３３）：１０１４６−１０１５４）。【００４８】
本発明において使用されるポリペプチドには、ＬＩＦレセプターに結合する能力を有する「ＬＩＦ様因子」も包含される。「ＬＩＦ様因子」とは、ＬＩＦレセプターと相互作用する能力を有する因子をいう。ＬＩＦ様因子は、ｇｐ１３０を活性化し、その後のシグナル伝達を惹起するものであれば、その相互作用は、直接の結合であっても、間接的な作用であってもよい。ＬＩＦレセプターと相互作用する能力は、ＬＩＦアッセイで測定することができる。そのようなＬＩＦアッセイとして、たとえば、下流のシグナル（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ伝達系）のいずれか一つの分子の活性化（例えば、リン酸化）を測定する機構を利用することができ、ｇｐ１３０およびＬＩＦレセプターの複合体またはＳＴＡＴ−３のチロシンリン酸化を利用するアッセイが挙げられる。【００４９】
好ましくは、ＬＩＦがＬＩＦレセプターに結合し、ｇｐ１３０を介して細胞内シグナル伝達を惹起することから、本発明では、ｇｐ１３０リガンドまたはＬＩＦ様因子を用いて、同様の機構により効果を奏することができる。【００５０】
本明細書において、「ＬＩＦレセプター」とは、当該分野において使用されるのと同じ意味で使用され、ＬＩＦに特異的に結合するレセプターをいう。ＬＩＦレセプターは、Ｋｄ値が２０〜１００ｐＭの高親和性のレセプターと、Ｋｄ値が１〜２ｎＭの高親和性のレセプターがある（Ａｌｌａｎ  Ｅ．Ｈ．，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ  Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４５：１１０−１１９（１９９０）；Ｇｏｄａｒｄ  Ａ．，Ｈｅｙｍａｎｎ  Ｄ．，Ｒａｈｅｒ  Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：３２１４−３２２２（１９９２）；Ｈｅｎｄｒｙ  Ｌ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙ  Ｍ．，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｎｉｃｏｌａ  Ｎ．Ａ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐ．ＦＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３４２７−３４３４（１９９２）；Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｎｉｃｏｌａ  Ｎ．Ａ．ａｎｄ  Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ．Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１６７：２２７−２３９（１９９２）；Ｒｏｄａｎ  Ｓ．Ｂ．，Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ  Ｇ．，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｎｉｃｏｌａ  Ｎ．Ａ  ａｎｄ  Ｒｏｄａｎ  Ｇ．Ａ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２７：１６０２−１６０８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ．Ｌ．，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｐｅａｓｅ  Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８４−６８７（１９８８）；およびＹａｍａｍｏｔｏ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ．，Ｔｏｍｉｄａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｚｕｍｉ  Ｍ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１６４：９７−１０２（１９８６））。ＬＩＦレセプターは、造血因子レセプターに分類される。ＬＩＦレセプターは、ｇｐ１３０と共同でレセプター複合体を形成し、ＬＩＦに対して高親和性を示す。マウスでは可溶性ＬＩＦレセプターが発見されており、その役割が注目されている。可溶性ＬＩＦレセプターとＬＩＦとのレセプター複合体を形成させると、その複合体は、ｇｐ１３０と反応し得、シグナル伝達を刺激することが明らかになっている（Ｈｅｙｍａｎｎ  Ｄ．，Ｇｏｄｄａｒｄ  Ａ．，Ｒａｈｅｒ  Ｓ．（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（３）：１９７−２０５）。従って、このようなレセプターコンバージョンモデルを用いたシグナル伝達機構を利用することによっても、本発明の効果を奏することができる。ＬＩＦレセプターとｇｐ１３０とは、他のサイトカインのレセプターの成分としても知られる、そのようなサイトカインとしては、ＩＬ−６スーパーファミリーのメンバーが挙げられ、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ、ＯＳＭなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００５１】
本明細書において、「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。アクチビンまたはレチノイン酸がリガンドとすれば、同様の（等価の）作用を有するリガンドは、本発明の範囲内であることが意図される。【００５２】
本発明において用いられるアクチビン、ＬＩＦなどのポリペプチドについて、糖鎖が付加され得る部分としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが結合するＮ−グルコシド結合可能な部分、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合をする部分（セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分）が挙げられる。本明細書において使用されるアクチビンは、糖鎖の有無は特に活性に影響を与えるというわけではないが、これらの糖鎖が付加されたタンパク質は、通常生体内での分解に対して安定であり、強い生理活性を有し得る。従って、これら糖鎖が付加されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。【００５３】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または複数のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。【００５４】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。【００５５】
本明細書において「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１または複数の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。本発明の遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。【００５６】
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明で使用され得る遺伝子（アクチビン遺伝子）には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。【００５７】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、アクチビンなどの遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、神経再生、神経疾患の診断、治療、予防、予後などに有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。【００５８】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。【００５９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。【００６０】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。【００６１】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。【００６２】
本明細書において用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。【００６３】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。本明細書におけるアクチビンとしては、天然型のアミノ酸を含むもののほか、このようなアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体を含むものが使用され得る。【００６４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。【００６５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。【００６６】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。従って、本明細書においてマウスアクチビンにおける特定のアミノ酸配列は、アラインメントなどの解析によって、ヒトアクチビンにおける特定のアミノ酸に対して対応付けることができる。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。【００６７】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、アフリカツメガエルのアクチビンなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、アフリカツメガエルのアクチビンなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。【００６８】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能（例えば、分化調節作用、他の分子との特異的相互作用）が保持されているかどうかによって決定され得る。【００６９】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。【００７０】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。【００７１】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、アクチビンが幹細胞の分化に使用され得るが、アクチビンと同一の生物学的活性を有する因子であれば、本発明においてアクチビンと交換可能に用いられ得ることが理解される。このような因子は、本明細書における開示に基づいて、当該分野における技術常識を用いてスクリーニングすることによって同定することができ、これらは、周知・慣用技術の範囲内であることが理解される。【００７２】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。【００７３】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。【００７４】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のアクチビンなど（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）に対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。代表的には、接触させたい因子（例えば、アクチビン）を含む溶液（例えば、培地）に接触対象（例えば、細胞）を入れることなどによって接触が達成され得る。【００７５】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書においてアクチビンとしては、このような複合分子の形態でも用いられ得る。【００７６】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。【００７７】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。【００７８】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。【００７９】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、アクチビンとその特異的因子とが結合する）場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。【００８０】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明において使用されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、アクチビンに対する特異的因子の結合の競合阻害のようなアッセイによって測定され得る。【００８１】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。【００８２】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。【００８３】
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。【００８４】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件で入手されるポリヌクレオチドをいう。本発明において使用されるポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、アクチビン）をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００８５】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００８６】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００８７】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。【００８８】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。【００８９】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。【００９０】
アクチビンまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいアクチビンまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１または３に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。【００９１】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるアクチビンなどには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。【００９２】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。【００９３】
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリ配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリ配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００９４】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。【００９５】
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子（例えば、アクチビンなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。【００９６】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【００９７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。【００９８】
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【００９９】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。【０１００】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。【０１０１】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。【０１０２】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【０１０３】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。【０１０４】
本発明において使用されるポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明において使用されるポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。【０１０５】
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。【０１０６】
本発明において使用されるポリペプチドのペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のペグ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３，４−１０（１９９２）；ＥＰ  ０  １５４  ３１６；およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明において使用されるポリペプチド（例えば、アクチビン、Ｍｅｌ−１８、Ｍ３３、Ｍｐｈ−１／Ｒａｅ２８など）のペグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。【０１０７】
本発明において使用されるポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ペグ化した本発明において使用されるポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）アクチビンが１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。【０１０８】
ペグ化された本発明において使用されるポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明において使用されるポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明において使用されるポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイトカイン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および／または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。【０１０９】
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。【０１１０】
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。【０１１１】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。【０１１２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【０１１３】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【０１１４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【０１１５】
（遺伝子工学）
本発明において用いられるアクチビンなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。【０１１６】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明において使用されるポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。【０１１７】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。【０１１８】
従って、本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【０１１９】
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。【０１２０】
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。【０１２１】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。【０１２２】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。【０１２３】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。【０１２４】
例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え哺乳動物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，５３７−５４６））、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８，７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５４７３−５４７７）、すい臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２６４，１６６）が挙げられるがそれらに限定されない。【０１２５】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。【０１２６】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【０１２７】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【０１２８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【０１２９】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。【０１３０】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。【０１３１】
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。【０１３２】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。【０１３３】
（ポリペプチドの製造方法）
本発明において使用されるポリペプチド（例えば、アクチビン、ＬＩＦまたはその改変体もしくはフラグメントなど）をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明において使用されるポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明において使用されるポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。【０１３４】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【０１３５】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。【０１３６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【０１３７】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【０１３８】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【０１３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。【０１４０】
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。【０１４１】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【０１４２】
本発明において使用される発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明において使用されるポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。【０１４３】
本発明において使用されるポリペプチド（例えば、アクチビン、ＬＩＦまたはその改変体もしくはフラグメントなど）が本発明において使用されるポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。【０１４４】
本発明において使用されるポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明において使用されるポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明において使用されるポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【０１４５】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明において使用されるポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明において使用されるポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【０１４６】
また、本発明において使用されるポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。【０１４７】
さらに、本発明において使用されるポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明において使用されるポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる。【０１４８】
本発明において使用されるポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。【０１４９】
精製した本発明において使用されるポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明において使用されるポリペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。【０１５０】
本発明において使用されるポリペプチド（例えば、アクチビン、ＬＩＦなど）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。【０１５１】
（細胞培養）
当該分野において公知の広範な培地処方物の、幹細胞分化に関する細胞培養特性は、本明細書中において開示されるアクチビン、レチノイン酸、ＬＩＦまたはその等価物の添加量の調節によって劇的に変化することが見出された。【０１５２】
多くの培地処方物が、幾年もの間開発され、所定の培養された細胞または細胞株についての細胞増殖、細胞生存能、および／または生物製剤産生を最大限にしてきた。これらの培地組成物は、例えば、培地に添加される成長因子、抗生物質、およびアミノ酸補充物の数、タイプ、および濃度が相互に異なり、そしてプロテアーゼインヒビターのような成分、および特に細胞が懸濁内で増殖される場合には、１つまたはそれ以上の消泡剤（ａｎｔｉ−ｆｏａｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。他の個性化された成分は、組換えタンパク質産生を増強する添加物を包含する。例えば、宿主細胞が、組換えタンパク質の遺伝子増幅のために開発された場合、選択マーカーＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、代表的には、選択マーカーとしてトランスフェクトされた宿主の一部を構成し、そしてメトトレキセートは培養培地に含まれる。インスリンまたは他の成長因子、例えば、ＩＧＦのようにエネルギー源カスケードの役割を果たす因子はまた、しばしば含有されて細胞増殖を増強する。【０１５３】
本明細書中において開示されるアクチビン、レチノイン酸、ＬＩＦまたはその等価物は、種々の培地処方物に対して、ならびに標準的な処方物中において、効果を有することが期待される。【０１５４】
例えば、すべての無血清培地処方物は、細胞増殖を可能にする必須成分を含み、（１）エネルギー源、代表的にはグルコースまたはグルタミン、あるいは他の糖、例えば、フククトース、ガラクトース、マンノースなど；（２）窒素源（典型的には１つまたはそれ以上のアミノ酸の包含により得られる）；および（３）ビタミン（酵素反応における補因子）を含む。また、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、ＨＰＯ３２−などを含む広範な無機塩、ならびに脂肪酸（好ましくは結合物）、コレステロール、リン脂質、およびそれらの前駆体を含む広範な脂肪および脂溶性成分も必須である。標準的な無血清培地処方物の成分は表１に挙げられる。これには、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏ．（ＧＩＢＣＯ），ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．のような培地製造者から得られる「ＤＭＥＭ／Ｆ−１２」に見出される成分が含まれる。動物細胞培養培地の検討については、ＭｉｚｒａｈｉおよびＬａｚａｒ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１９９−２１４（１９８８）を参照のこと。昆虫細胞培養についての培地の考察は、Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｈ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４７：２０９−２１０に開示されている。ハイブリドーマの培養について個性化された、規定された無血清培地の例が、Ｋｏｖａｒ，Ｊ．（１９８７）ＦｏｌｉａＢｉｏｌｏｇｉａ３３：３７７−３８４により記載されている。Ｉｍａｇａｗａら（１９８９）ＰＮＡＳ８６：４１２２−４１２６は、マウス乳房上皮細胞における細胞増殖を最大にするように開発された培地について記載し、そしてＭｉｙａｚａｋｉら（１９９１）Ｒｅｓ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：７７−８３は、ラット肝細胞の生存能をインビトロで増強するように培地について記載する。【０１５５】
本明細書において「栄養培地」とは、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、未分化細胞を、自己を含めた増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、通常、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる培地であってもよい。例を挙げると、たとえばＳｔｅｉｎｂｅｒｇ培地、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などが挙げることができる。基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。【０１５６】
培地成分は代表的には任意の順序で添加され得、そして最終的な組合せは、標準的な方法、例えば、濾過滅菌により滅菌され得る。【０１５７】
本発明の培地を利用して、広範な細胞（脊椎動物および無脊椎動物の両方）の幹細胞を所望の方向に分化させ得る。本発明の培地を用いて、多くの異なる細胞培養系における細胞培養特性を改善し得る。【０１５８】
動物の場合は、通常動物細胞の培養で用いられるイスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地等の血清を含まない培地を用いることができる。また、公知文献等により、細胞の増殖および維持に有効であることが知られている血清以外の因子、たとえば脂質および脂肪酸源、コレステロール、ピルビン酸塩、グルココルチコイド、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成ヌクレオシド等を添加してもよい。【０１５９】
本明細書において「培養容器」とは、所望の細胞、例えば、未分化細胞を増殖させるときに用いる容器のことであり、必要に応じてストローマ細胞などのフィーダー細胞が維持・生存でき、未分化細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には培養容器の素材としてはガラス、合成樹脂、天然樹脂、金属、プラスチックなどが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円柱（底面が円形、楕円形または半円形等を含む）などを挙げることができ、また例えば半球形から球形のように培養中に必要に応じて形状を変化させてもよい。培養は開放条件下であってもよいし、閉鎖（密閉）条件下であってもよい。【０１６０】
本発明における細胞培養法は、マトリクスコーティングが異なる培養皿、またはマトリクスコーティングの有無が異なる培養皿を用いた二次元培養法、マトリジェル等のソフトゲルおよびコラーゲンスポンジ等を用いた三次元培養法、またはそれらを併用する方法が挙げられるが、好ましくは、マトリクスコーティングが異なる培養皿、またはマトリクスコーティングの有無が異なる培養皿を用いた二次元培養法であり、例えば、ゼラチンコーティング培養皿、Ｉ型コラーゲンコーティング培養皿またはラミニンコーティング培養皿のうち２つを用いる二次元培養法である。また、多分化能を有する細胞として、ヒト由来の細胞を用いる場合は、Ｉ型コラーゲンコーティング培養皿を用いるのが好ましい。【０１６１】
本発明の方法の培養条件は、実施例などの特定の条件に限定されるものではなく、一般的に許容される条件を取りうる。例えば、分化誘導開始時の細胞数としては、５．０ｘ１０３〜５．０ｘ１０６細胞／培養皿の範囲を例示できる。また、分化誘導期間としては、例えば、２〜１０日間（好ましくは５日間）、あるいは１〜４日間（好ましくは２日間）、前培養工程では２〜５日間（好ましくは３日間）である。また、ヒト間葉系細胞の場合、分化誘導期間としては、１２〜２１日間（好ましくは１４日間）である。【０１６２】
培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては死滅処理前の未分化細胞および分化後の細胞が維持・生存でき、未分化細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。好ましい条件を以下に示す。【０１６３】
温度については具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。【０１６４】
光は暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度〜気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。【０１６５】
培養系において一般的にｐＨをコントロールするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロールする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。【０１６６】
本明細書において「コロニー」とは、固型培地で１個の細胞から出発してできた可視的な集塊をいう。【０１６７】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１６８】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。【０１６９】
１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質（アクチビン）、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。【０１７０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７：１２３３。【０１７１】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。【０１７２】
（疾患）
１つの局面において、本発明は、すい臓の障害に関する任意の疾患、障害または異常状態、例えば、膵炎（急性膵炎、慢性膵炎）、すい臓がん、嚢胞性膵疾患、糖尿病、消化器系の疾患などの関連疾患、障害または異常状態を処置するための方法を提供する。【０１７３】
すい臓関連の疾患としては、代表的なものとして、１型糖尿病（または、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤ）、若年性糖尿病）があげられる。この１型糖尿病は、インスリン産生細胞の自己免疫破壊によるインスリン欠乏症であり、現在の治療法では、１型糖尿病患者は、インスリンを１日あたり数回自分で注入する必要がある。また、もう一つの糖尿病である２型糖尿病（または、非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤ）、成人発症型糖尿病）は、インスリン耐性による実効的なインスリン欠乏症であり、現在の治療法では、結果的に１型糖尿病と同様に、２型糖尿病にも追加のインスリン投与が必要となる。これらの患者では、定期的なインスリン注入にもかかわらず、血中インスリンレベルが必ずしも安定しないために、脳卒中、失明、四肢の切断、腎機能障害などの多くの合併症を併発して寿命が短縮される。また、運動不足、脂肪の過剰摂取、肥満などの生活習慣により、インスリン抵抗性を引き起こす場合、さらに、薬剤、内分泌疾患などがインスリン作用障害（抵抗因子）となる場合が挙げられる。【０１７４】
本明細書において「予防（する）」は、生物が病気にかかる（ｃｏｎｔｒａｃｔ）かまたは異常な状態を発生する可能性を減少させることをいう。【０１７５】
本明細書において「処置（する）」は、治療効果を有すること、および生物における異常な状態を少なくとも部分的に軽減するかまたは抑止することをいう。【０１７６】
本明細書において「治療効果」は、異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害因子または活性化因子をいう。治療効果は、異常な状態の症状の１つ以上をある程度緩和する。異常な状態の処置に関して、治療効果とは、以下の１つ以上をいい得る：（ａ）細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、および／または分化における増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、遅らせることまたは停止させること）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関連する症状の１つ以上をある程度緩和する；および（ｅ）罹患した細胞集団の機能を強化すること。異常な状態に対する効力を示す化合物は、本明細書中に記載されるように同定され得る。【０１７７】
本明細書において「異常な状態」は、生物におけるその正常な機能から逸脱する、生物の細胞または組織における機能をいう。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達、または細胞生存に関連し得る。異常な状態としてはまた、造血障害、肥満、網膜変性のような糖尿病合併症、ならびにグルコースの取り込みおよび代謝における不規則性、ならびに脂肪酸の取り込みおよび代謝における不規則性が挙げられ得る。【０１７８】
異常な細胞増殖状態としては、例えば、がん、新生物、腫瘍および炎症などが挙げられる。【０１７９】
異常な分化状態としては、例えば、奇形、がんなどが挙げられる。【０１８０】
異常な細胞シグナル伝達状態としては、例えば、異常な細胞分化が挙げられる。【０１８１】
異常な細胞生存状態はまた、アポトーシス（プログラム細胞死）経路が活性化されるかまたは抑止される状態に関連する。多数のタンパク質キナーゼが、アポトーシス経路に関連している。タンパク質キナーゼのいずれか１つの機能における異常は、細胞不死または未熟な細胞死を生じ得る。【０１８２】
別の局面において、本発明は、すい臓関連疾患、障害または異常状態のある（罹患しているおそれのある）被験体または上記障害を有する被験体を処置する、予防的方法および治療的方法の両方を提供する。【０１８３】
本発明はまた、本発明の医薬の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。【０１８４】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明において使用されるポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。【０１８５】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。【０１８６】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。【０１８７】
したがって、本発明では、アクチビンまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり得る。【０１８８】
本明細書中で使用され、かつ、当該分野で理解されるように、用語「合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」または「合成する（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ）」とは、酵素的方法とは対照的に、純粋に化学的に生成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）をいう。従って、「全体が」（ｇｌｏｂａｌｌｙ）合成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）は、その全体が化学的手段によって生成され、そして「部分的に」合成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）は、その得られた化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）の一部分のみが化学的手段によって生成された化学物質（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）を包含する。【０１８９】
本明細書において使用される用語「領域」によって、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。用語「ドメイン」は、本明細書中で、生体分子の既知の機能または推測されている機能に寄与する、その生体分子の構造部分をいうものとして定義される。ドメインは、領域またはその部分と同じ広がりを有し得；ドメインはまた、その領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と区別される生体分子の一部を組み込み得る。本発明のアクチビンのドメインの例としては、シグナルペプチド、細胞外（すなわち、Ｎ末端）ドメイン、ロイシンリッチ反復ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。【０１９０】
（再生／治療／予防のための投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による、神経疾患、障害または異常状態、あるいは造血関連疾患、障害または異常状態の処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。【０１９１】
本明細書において「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。【０１９２】
本発明が対象とする動物は、神経系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。【０１９３】
本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。【０１９４】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、アクチビンまたはその改変体もしくはフラグメントなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。【０１９５】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１９６】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【０１９７】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。【０１９８】
本発明において使用されるポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明において使用されるポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１９９】
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。【０２００】
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０１】
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。【０２０２】
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０３】
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０４】
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０５】
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０６】
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０７】
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０８】
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２０９】
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。【０２１０】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。【０２１１】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１２】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１３】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１４】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１５】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１６】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１７】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２１８】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。【０２１９】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。【０２２０】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。【０２２１】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その補遺またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。【０２２２】
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。【０２２３】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。【０２２４】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。【０２２５】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。【０２２６】
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。【０２２７】
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。【０２２８】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。【０２２９】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。【０２３０】
本明細書中、「投与する」とは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、因子などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。【０２３１】
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物（本発明によって同定される薬剤など）を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギまたはサル（ｍｏｎｋｅｙまたはａｐｅ）などの実験動物、および最も好ましくは、ヒトである。【０２３２】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。【０２３３】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果またはアクチビンなどに関連する疾患（例えば、血液系疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、アクチビンなどに関連する疾患（例えば、血液系疾患）の再発により再開することができる。【０２３４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える医薬品パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。【０２３５】
血漿、腫瘍および主要器官中での薬物および代謝産物の血漿半減期および体内分布はまた、障害を阻害するのに最も適切な薬物の選択を容易にするように決定され得る。このような測定が行われ得る。例えば、ＨＰＬＣ分析は、薬物で処置された動物の血漿において行われ得、放射線標識された化合物の位置が、Ｘ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩのような検出方法を用いて決定され得る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが、薬物動態学的特徴が不十分な化合物は、化学構造の変更および再試験によって最適化され得る。この点について、良好な薬物動態学的特徴を示す化合物が、モデルとして使用され得る。【０２３６】
毒性研究はまた、本発明の組成物を試験することによって行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）化合物がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球および白血球の数、組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。【０２３７】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９〜２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす化合物は、主要な器官に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。【０２３８】
（発明を実施するための最良の形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０２３９】
１つの局面において、本発明は、未分化細胞からすい臓を生産する方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）未分化細胞を、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養してコロニー形成を行い、凝集塊（代表的には、胚様体様凝集塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｓｐｈｅｒｅ））を形成させる前培養工程；およびＢ）ＬＩＦ非存在下で該未分化細胞にアクチビンとレチノイン酸とに曝す曝露工程を包含する。本発明の方法において用いられる未分化細胞は、分化し得る能力が残存している限りどのような細胞であっても用いることができる。【０２４０】
本発明の方法において、コロニー形成は、未分化細胞をＬＩＦの存在下で培養することによって達成させることができる。コロニー形成は、肉眼で確認することができ、その培養期間は、当業者が適宜設定することができる。【０２４１】
本発明の方法において、未分化細胞は、任意の培養方法で培養することができるが、好ましくは、フィーダー細胞上にて培養されることが有利である。【０２４２】
本発明の方法において、前培養工程は、任意の期間にて行うことができるが、好ましくは、１〜１０日程度、通常１〜４日間、代表的には約２日間または約４日間行うことが有利である。ただし、１日未満であっても、１０日以上であっても、分化に適している限り、問題ないと考えられる。【０２４３】
本発明において用いられる未分化細胞はすい臓に分化し得る細胞であればどのような細胞でも良い。従来哺乳動物の細胞から機能的なすい臓に分化させた例はなく、従って、本発明は、哺乳動物の細胞を機能的なすい臓にさせたという点において顕著性が認められるべきである。【０２４４】
本発明において用いられる培地は、血清を含んでいることが有利である。もっとも、含まれる血清は、細胞の維持・増殖に一般的に用いられている任意の物を利用することができ、例えば、ウシ血清、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清などを上げることができるがそれらに限定されない。使用される培地もまた、どのような培地であってもよいが、代表的には、ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）培地が用いられる。【０２４５】
本発明の方法における曝露工程は、どのような培養条件で行われても良いが、好ましくは浮遊培養の条件で行うことが有利である。浮遊培養をするにおいて、血液細胞および種々の腹水癌細胞のように生体内でも浮遊状態で増殖する細胞は、振盪および回転を与えなくても浮遊培養できるが、多くの場合撹拌子を回転させたり（撹拌培養）、培養瓶ごと振盪したり（振盪培養），あるいは培養器を旋回させたり（旋回培養）する必要がある。浮遊培養としては、例えば、低接着性コーティング培養容器による浮遊培養、スピンナーフラスコ（酸素ガスの有無）による浮遊培養などを挙げることができる。【０２４６】
好ましい実施形態では、浮遊培養は、低接着性コーティング培養容器（例えば、Ｎｕｎｃから入手可能）上で行われることが好ましい。理論の束縛されることを希望しないが、このような低接着性コーティング培養容器を用いた場合、分化が効率よく行われるようであるからである。【０２４７】
本発明の方法において使用される未分化細胞は、どのような未分化細胞でもよいが、好ましくは幹細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞である。胚性幹細胞を使用する場合は、好ましくは、フィーダー細胞と共に培養されることが好ましく、この場合フィーダー細胞としては、例えば、マウス胎仔線維芽細胞を用いることが好ましい。【０２４８】
本発明の方法において用いられるアクチビンは、５０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で使用され得る。例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ未満、１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌなどの濃度で用いることができる。アクチビンは１０ｎｇ／ｍｌで用いられるときと、２５ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられるときとでレチノイン酸の必要量などが変動することから、目的に応じていずれをも用いることができることに留意すべきである。【０２４９】
本発明の方法において用いられるレチノイン酸は、０．０１μＭより多く１μＭ未満で用いられ得、そして通常、０．０１μＭより多く０．１μＭ以下であり得、０．１μＭ以上１μＭ未満であり得る。【０２５０】
本発明の方法は、さらに、Ｃ）分化させた凝集塊を、コーティングされた培養容器上の培地中で培養する分化工程を包含してもよい。このような工程を用いることによって、分化の状態を改善することができる。本発明において用いる場合は、コーティングは、どのようなコーティングでもよいが、好ましくはゼラチンコーティングであり得る。【０２５１】
使用される培地はどのようなものでも良いが、好ましくは、分化工程において用いられる培地は、ＫＳＲ培地である。分化工程は、機能的すい臓が生産されるに十分な期間であり得、通常７〜２１日間であり、好ましくは、１０〜１４日間であり得るが、これに限定されない。【０２５２】
１つの実施形態では、本発明の方法における分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で培養する工程を包含する。このような方法が、分化を促進させることが示されたからである。【０２５３】
１つの好ましい実施形態では、上記分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で約１〜４日間培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で１週間〜３週間培養する工程を包含する。【０２５４】
１つの好ましい実施形態では、上記分化工程は、最初にアクチビンとレチノイン酸とを含む培地中で約２日間培養し、その後、アクチビンとレチノイン酸とを含まない培地中で約１０日間〜約２週間培養する工程を包含する。【０２５５】
本発明によって得られる記機能的すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する。このような機能的すい臓は、すい臓マーカーIpf1/pdx-1を発現し、すい臓が形成される時期にその発現量が低下するマーカーＳｈｈを発現しないことを特徴とする。マーカーは免疫学的手法により検出することができる。例えば、このような機能的すい臓は、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｇｌｕｃａｇｏｎおよびａｍｙｌａｓｅ  ２からなる群より選択される少なくとも１つまたはそれより多くのすい臓マーカー、好ましくはすべてのこのようなマーカーを発現することを確認することによって判定することができる。【０２５６】
たとえば、機能的すい臓は、α細胞とβ細胞と外分泌細胞と導管構造をすべて含むことを特徴とする。このような機能的すい臓は、インスリン産生能、グルコース応答性、グルカゴン産生能、アミラーゼ等産生能および機能的導管構造からなる群より選択されるすべての特徴を有する。このような機能をすべて有するすい臓は、これまでは生産することができなかった。特に、ＥＳ細胞由来のもの、哺乳動物のものは、報告されていない。機能的導管構造を有するもの、すなわち、分泌が天然のものと同様になされ得るものも報告されていない。従って、本願発明は、真の意味で「機能的な」すい臓を提供したという点で、顕著な効果を示す。【０２５７】
１つの局面において、本発明は、本発明の方法によって生産されたすい臓を提供する。【０２５８】
別の局面において、本発明は、本発明のすい臓を用いることを特徴とする、機能的すい臓を必要とする患者の処置のための方法を提供する。【０２５９】
さらなる局面において、本発明は、機能的すい臓を必要とする患者の処置のための医薬を製造するための、アクチビンおよびレチノイン酸の使用を提供する。ここで、この患者は哺乳動物であり得る。さらに、好ましい実施形態では、上記医薬は幹細胞（たとえば、ＥＳ細胞）から製造され得る。【０２６０】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２６１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。動物の取り扱いは、東京大学動物実験施設において規定される基準を遵守し、動物愛護精神に則って行った。【０２６２】
（実施例１：ＥＳ細胞の分化誘導）
（ＥＳ細胞の培養法および分化誘導）
マウスＥＳ細胞（例：Ｅ１４（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１８２１；ＡＴＣＣから入手可能）を、次に述べるような通常の培養方法にしたがい培養する。すなわち、あらかじめ１０  μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（シグマ社）で〜２．５時間処理して細胞分裂を止めたマウス胎児繊維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でコートした培養用の容器に播種したものをフィーダー細胞として利用する。ＥＳ細胞のための維持培地として用いた血清培地は、１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＥＳ  細胞ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）、０．００１％  の  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、および、１，５００  Ｕ／ｍＬのＬＩＦ  （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含む高グルコースのＤＭＥＭ培地（Ｌグルタミン酸およびピルビン酸を含む、Ｇｉｂｃｏ  １１９９５−０６５）である。【０２６３】
上記培養の３日後に、１  ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理して、このようにして培養したＥＳ細胞をフィーダー細胞から剥離してＥＳ細胞のコロニーを得る。こうして得られたコロニーを、何も処理しない培養用ディッシュ（Ｉｗａｋｉ）内で、１５％のＫＳＲを含むＤＭＥＭ中で培養する。この培養液を２日毎に交換して培養を４日間続ける。４日後にはＥＳ細胞はＥＢＳを形成しはじめるが、このＥＢＳを低接着性の培養容器（ｌｏｗ−ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉ−ｄｉｓｈ；生体非由来成分でコート処理したもの；Ｎｕｎｃ）に移し、その後更に２日間、１５％のＫＳＲ、アクチビン（０，１０，２５，５０  ｎｇ／ｍＬ）、およびレチノイン酸（０，０．００１，０．０１，０．１，１  μＭ；Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。【０２６４】
（免疫染色）
処理終了後１３日間で（ＥＢＳ形成１９日後）に、ＥＢＳを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で４％パラホルムアルデヒドにて４０分間、室温で固定した。固定した細胞を、ディッシュ壁から剥がし、アクリル樹脂であるＬＲ  Ｇｏｌｄ  Ｒｅｓｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（構造プローブ）に包埋し、そして６００ｎｍの薄い切片に切除した。これらの切片を室温で４０分間、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリン鎖緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ＝ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，滅菌水８００ｍｌにＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２４ｇして製造する。）中にてブロッキングした。ついで、これらを、すい臓特異的な一次抗体に４℃で１２時間曝露した。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、４℃で８時間にわたり標識した二次抗体に曝露した。使用した一次抗体はウサギ抗αアミラーゼ抗体（１：１０００希釈，Ｓｉｇｍａ）、抗インスリンモノクローナル抗体（１：４００希釈，Ｓｉｇｍａ）およびヤギ抗Ｃペプチド抗体（１：８００希釈Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；二次抗体は以下の通りであった：Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙおよびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５９４−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。これらの切片は、蛍光顕微鏡で観察し、ＯＲＣＡ−３ＣＣＤカメラに接続したＡｑｕａＣｏｓｍｏｓ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で写真を撮った。コントロールとして、８週齢マウスのすい臓を固定し、そして上記のように処理した。【０２６５】
（電子顕微鏡）
処理後１１日（ＥＢＳ形成後１７日）で、ＥＢＳを４％パラホルムアルデヒド、３％グルタルアルデヒドおよび０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）の固定液中で２時間室温で前固定した。ついで、０．１Ｍカコジル酸緩衝液での洗浄後、これらを、１％四酸化オスミウムで、３０分間室温で固定後処理を行った。サンプルを０．１Ｍカコジル酸緩衝液で洗浄し、ついでエタノールおよびアセトン系により脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。非常に薄い切片（８０−９０ｎｍ）を準備し、そして酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色し、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２００ＣＸ，ＪＥＯＬ）による観察を行った。【０２６６】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
トータルＲＮＡを１６のＥＢＳから抽出し、ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用いてＥＢＳ間での遺伝子発現について正規化した。１μｇのトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡを合成した。使用したフォワードおよびリバースのプライマー、ならびにＰＣＲ産物の長さは以下の通りである：
ａｍｙｌａｓｅ  ２，ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＴＴＡ（配列番号１７）およびＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＧＡ  （配列番号１８）（４１８  ｂｐ）；
ｇｌｕｃａｇｏｎ，ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  Ｔ  （配列番号１９）およびＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ（配列番号２０）（５５４  ｂｐ）；
ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ，ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＣ（配列番号２１）および  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＧＧＣ（配列番号２２）（２３４  ｂｐ）；
Ipf1/pdx-1，ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  （配列番号２３）およびＡＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＧＴ（配列番号２４）（４１２  ｂｐ）；
ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＣＴ  （配列番号２５）およびＴＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＡＧＴ（配列番号２６）（３７７  ｂｐ）；
ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  （配列番号２７）およびＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＡＣＴ（配列番号２８）（４１９  ｂｐ）；
Ｓｈｈ，ＡＣＡ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＴＣＡ（配列番号２９）およびＣＴＣ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＧＧＴ（配列番号３０）；
ＧＡＰＤＨ，ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＣ（配列番号３１）およびＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  Ｃ（配列番号３２）。【０２６７】
ｃＤＮＡを１５分の最初の９５℃での変性、４５サイクルの９４℃での加熱（２０秒）、５４℃（２０秒）および７２℃（４０秒）、および最後に７分の７２℃での伸長工程を行って増殖した。実験は、３連にて行った。【０２６８】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＱＩＡＧＥＮ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。用いたフォワードおよびリバースのプライマーおよびそのＰＣＲ産物の長さは以下の通りである：
ａｍｙｌａｓｅ  ２，ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  （配列番号３３）およびＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  Ａ（配列番号３４）（１００  ｂｐ）；
ＧＡＰＤＨ，ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＴＣ  （配列番号３５）およびＡＧＣ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  （配列番号３６）（１３５  ｂｐ）；
ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ，ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＴ（配列番号３７）およびＣＡＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  Ｇ（配列番号３８）（１０２  ｂｐ）；
Ipf1/pdx-1，ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＧＣ（配列番号３９）およびＧＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣ（配列番号４０）（１０１  ｂｐ）；
ｐｔｆｌａ，ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  （配列番号４１）およびＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＡＧ（配列番号４２）（１３８  ｂｐ）；
Ｓｈｈ，ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＴＣ（配列番号４３）およびＧＴＣ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＣ（配列番号４４）（１１４  ｂｐ）。【０２６９】
ｃＤＮＡを１５分の最初の９５℃での変性、４５サイクルの９４℃での加熱（２０秒）、５４℃（２０秒）および７２℃（４０秒）、および最後に７分の７２℃での伸長工程を行って増殖した。実験は、３連にて行った。（細胞内インスリンの総量および分泌されたインスリンの量の定量）
誘導後１３日（ＥＢＳ形成開始から１９日）で、ＥＢＳをグルコースを含まないＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、ついで３ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭで６０分培養した。ＥＢＳを再びＤＭＥＭで洗浄し、３ｍＭまたは２５ｍＭのグルコースを含むＤＭＥＭ中で３０分間培養し、そして馴化培地を収集した。これらの細胞を、溶解緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ［ｐＨ  ７．０］，０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，０．５％  ＣＨＡＰＳ，０．１％  ＳＤＳ，１  ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解し、そしてタンパク質の総量をタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  （ＴＭＢ）Ｋｉｔ  （ＳＨＩＢＡＹＡＧＩ，Ｊａｐａｎ）を用いて馴化培地中のインスリン総量または細胞溶解物中のインスリン量を定量した。各々の実験を８つのＥＢＳで行い、実験は３連で行った。【０２７０】
（すい臓の誘導）
０．１％のゼラチンなどでコートした接着性培養容器（例えば、２４穴のウェルプレート）に、上述のごとくして得たＥＢＳを播種し、１０％  ＫＳＲを含むＤＭＥＭ中で培養して、ＥＢを培養プレート上に接着させる。次いで、ＫＳＲ培地の中で、低接着性コートの培養容器にて、２５  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと、０．１  μＭのレチノイン酸で同時に２日間処理する。ついで、アクチビンとレチノイン酸の無い条件下で、ゼラチンコートした培養容器の中で同じように１０日間〜２週間培養する。培養液は３日毎に交換する。【０２７１】
（ＥＳ細胞から腸管状およびすい臓組織の分化）
まず、ＥＳ細胞コロニーをコラゲナーゼ／ディスパーゼ処理の３日後に分離し、ついで１５％  ＫＳＲを補充したＤＭＥＭ中で培養して胚様体様凝集塊（ＥＢＳ）を形成した。このＥＢＳは分化することができる。ＥＢＳ形成後４日後、この細胞を、レチノイン酸（０，０．００１，０．０１，０．１または１μＭ）およびアクチビン（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地に写し、そしてさらに２日間浮遊培養を行い、ゼラチンコーティングしたプレート上に播種した。レチノイン酸およびアクチビンでの処理の６〜８日後（ＥＢＳ形成後１２〜１４日後）、処理したＥＢＳの比率は、球状または腸管状構造となり、その動きは、平滑筋蠕動に類似するものとなった。処理後９〜１２日後（ＥＢＳ形成後１５〜１８日）で２０％を超えるレチノイン酸およびアクチビンの両方で処理したＥＢＳが黒い斑点を含む組織を形成した。これは、所利していないＥＢＳまたはアクチビン単独で処理したＥＢＳではほとんど見られなかった（図２Ｃａ、ｂ）。【０２７２】
図２．  Ａ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された腸管様構造とその脇に発達した導管様構造と黒い斑点を含む組織（矢印）。中心部にある腸管様構造は、ゆっくりとしたぜん動運動を行なう。この黒い斑点を持つ組織の特徴は分泌性組織のものである。Ｂ，アクチビンとレチノイン酸がない条件で同じように培養したマウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）。Ａに見られる腸管様構造、導管様構造、黒い斑点を含む組織が見られない。スケールバーは１００  μＭ。【０２７３】
（すい臓の同定）
図２−Ａに示した構造には、中央部分にゆっくりとしたぜん動運動を行なう腸管様構造があり、それに導管様構造で連結された分泌細胞の特徴を持つ組織は、自然のすい臓の特徴を示している。この構造をさらに詳しく、電子顕微鏡により観察した（図３）。【０２７４】
（ＥＳ細胞由来のすい臓組織の形態学的同定）
最終の処理後１１日（ＥＢＳ形成後１７日）での０．１μＭレチノイン酸と１０ng/mlアクチビンでの処理後のＥＢＳの切片の組織学的検査により、球形の組織が示され、この組織が、管状の管腔に隣接した領域においてトルイジンブルーで強く染色されたことが示された（図３Ｅａ）。すい臓の管様構造は、球形組織の近傍に見出された（図３Ｅｃ、３ｄ）。対照的に、球形組織にも管様構造にも、処理されていないＥＢＳの切片において観察された（図３Ｅｂ）。電子顕微鏡写真による解析によって、細胞が十分に発達した小胞体を有し、大量のチモーゲン粒子を含んでいることが示された（図４Ｃａ、ｂ）。これは、すい臓の外分泌細胞（腺房細胞）と同じ表現型である。処理したＥＢＳから形成された組織もまた、管様（間隙領域）が組織の隣接領域において見られる（図４Ｃａ）という点でもすい臓の腺房細胞に似ていた。低い円柱上皮によって囲まれ、すい臓管に似た構造もまた存在した（図４Ｃｄ）。さらに、すい臓の内分泌細胞に形態学的に類似した細胞（図４Ｃｃ、ｄ）も観察されたが、これらは、外分泌細胞に類似する細胞のものよりも少なかった。これらの内分泌様細胞は、顆粒（図Ｃ４ｄ）を含んでいたが、これらは、該分泌細胞において見出された顆粒とは形態学的に異なっていた（図Ｃ４ｂ）。また、暗い中心領域と側方膜との間の透明な空間が見出された、これは、すい臓におけるβ細胞顆粒の典型的な特徴である。これらの顆粒がインスリンまたはアミラーゼを含むかどうかを確かめるために、細胞を抗アミラーゼ抗体または抗インスリンＣペプチド（プロインスリン）抗体で免疫染色した。レチノイン酸およびアクチビンの両方で処理したこれらのＥＢＳは、アミラーゼ陽性のチモーゲン顆粒を有する細胞を含んでいた（図５ｃ）。また、比較的少数の細胞がｃペプチド陽性顆粒を有する凝集体であった（図５ｄ）。これらの形態学的な知見は、すい臓管、内分泌細胞および外分泌細胞を含むすい臓組織が、レチノイン酸およびアクチビンの両方で処理したＥＢＳから形成されたことを示す。【０２７５】
図３．Ａ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された黒い斑点を含む組織（図１参照）の電子顕微鏡像。Ｂ，妊娠後期のラット胎児のすい臓の外分泌細胞の電子顕微鏡像（Ｂｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。どちらの細胞も、電子密度の高い顆粒様の構造を多数含み、また発達した小胞体を持つなど、その構造が極めてよく似ている。ＥＲ，小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）；Ｎ，核。【０２７６】
図３．Ｃ，マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された導管様構造（図１参照）の電子顕微鏡像。自然のすい臓導管の上皮構造に極めてよく似ている。Ｄ，同じく、マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導された分泌顆粒様構造をもつ細胞（図１参照）の電子顕微鏡像。写真内の点線で囲まれた箇所を拡大した像も示している。この像は、その右（Ｅ）に示したマウス生体のすい臓のβ細胞内にある内分泌顆粒像（Ｇｏｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；矢印で示した）と同じように、黒い中心部とそれを包む袋の間に隙間が見られる（矢印で示した）。Ｎ，核。【０２７７】
図２に示したすい臓様組織には、電子密度の高い（黒い）一様な顆粒様構造を多数含み、さらに、高度に発達した小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）を持つ細胞が観察された（図３−Ａを参照）。この細胞は、妊娠後期のラット胎児のすい臓の外分泌細胞（ａｃｉｎａｒ細胞：Ｂｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ３７：  ３７４−３８３，１９９７）によく似ている（図３−Ｂを参照）。一方、同じすい臓様組織には、図３−Ａよりも幾分低い電子密度をもつ内容物と、それを取り囲む袋構造との間に隙間が見られるような構造を多数含む細胞も見られた（図３−Ｄを参照）。この細胞は、すい臓の典型的な内分泌細胞の形態（図３−Ｅ；Ｇｏｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ６１：  ４４８−４５６，２００３）を示しており、インスリン産生細胞の分化が起こったことを強く示唆していた。このように、電子顕微鏡観察により、アクチビンとレチノイン酸とを同時に処理してできたすい臓様組織には、外分泌細胞の特徴を持つ細胞と、内分泌細胞の特徴を持つ細胞が共に観察された。【０２７８】
上記のごとく、典型的には１０−２５  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１μＭのレチノイン酸で同時に２日間処理したマウスＥＳ細胞由来のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏですい臓様の構造を有する器官を分化誘導することができた。次に、このすい臓様器官が、すい臓に特異的に発現されることが期待される種々のタンパク質（すい臓マーカー）を実際に発現しているかどうかを遺伝子の発現レベルで調べた。調べたすい臓マーカーは、インスリン２（すい臓の内分泌細胞であるβ細胞に特異的）、グルカゴン（すい臓の内分泌細胞であるα細胞に特異的）、アミラーゼ２（すい臓内の外泌細胞に特異的）、Ipf1/pdx-1（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘｆａｃｔｏｒ−１、すい臓の発生を正に制御していることが分かっている遺伝子）。および、Ｓｈｈ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、すい臓の発生を負に制御していることが分かっている遺伝子）である。【０２７９】
（すい臓マーカー遺伝子の発現試験）
すい臓の発達を調節する遺伝子およびいくつかのすい臓マーカー遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて調査した（図２ｃ）。レチノイン酸およびアクチビンの両方で処理したＥＢＳは、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ  （β細胞マーカー），ｇｌｕｃａｇｏｎｓ（α細胞）、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（γ細胞），ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  （δ細胞）およびａｍｙｌａｓｅ  ２  （すい臓外分泌細胞のマーカー）ならびにＩｐｆ１／ｐｄｘ−１  およびｐｔｆ１ａ／ｐ４の発現が顕著に増加していることが分かった。Ｉｐｆ１／ｐｄｘ−１  およびｐｔｆ１ａ／ｐ４は、すい臓の発達を調節する遺伝子である。対照的に、処理していないＥＢＳはほとんどこれらの遺伝子の発現がなかった。ａｍｙｌａｓｅおよびｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅは、処理の６日目から経時的に増加した（これは、ＥＢＳ形成から数えると１２日目）。他方、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ，ｇｌｕｃａｇｏｎ，ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，Ｉｐｆ１／ｐｄｘ−１およびｐｔｆ１ａ／ｐ４８の遺伝子発現の増加は、処理の終わりからすぐに開始した。処理されていないＥＢＳにおいて、Ｓｈｈが観察期間中発現が見出されたが、他方、ＥＢＳは、レチノイン酸およびアクチビンの両方で処理したＥＢＳにおいて、Ｓｈｈ遺伝子発現は、処理後抑制されていた。【０２８０】
アクチビンの濃度を一定に（１０ｎｇ／ｍｌ）保ち、レチノイン酸の濃度を変動させると、ＥＢＳにおけるすい臓マーカーの遺伝子発現は、０．１μＭのレチノイン酸を、１０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理したときに最も効率よいことが分かった（図２ｄ）。レチノイン酸およびアクチビンのこれらの濃度を用いたとき、４７．６±７．３％の処理ＥＢＳが、記載されていたすい臓遺伝子マーカーのすべてで超過していた。レチノイン酸の濃度として、０．００１μＭ、０．０１μＭおよび１μＭを用いた場合、ＥＢＳにおいてそれぞれ４．３±２．５％、１２．８±９．６％および２５．１±６．６％の遺伝子発現が見られた。【０２８１】
図４．マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）からアクチビンとレチノイン酸で分化誘導されたすい臓構造のＲＴ−ＰＣＲ法により得たｍＲＮＡ発現プロファイル。Ｉｎｓｕｌｉｎ  ２，ｇｌｕｃａｇｏｎ，ａｍｙｌａｓｅ  ２とIpf1/pdx-1は、すい臓の発生において特異的に発現するマーカー遺伝子（正のマーカー）であり、一方Ｓｈｈは、すい臓の発生に伴い発現が減少する遺伝子（負のマーカー）である。また、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、すべての細胞が高レベルで発現している構成的タンパク質（酵素）なので、実施したアッセイ法が適切であることを保証する目的で用いた。【０２８２】
その結果、１０  ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと０．１μＭのレチノイン酸とで処理すると、正のマーカー群は全て処理後２日目から新たに発現することが確認できた。また、これら正のマーカー群は、無処理群ではまったく、あるいは、ごく僅かしか検出できなかった。一方、負のマーカーのＳｈｈの発現は、無処理群の全体と処理群の０日目で認められるが、アクチビンＡとレチノイン酸によって処理した２日以降は完全に消えていた。これらの結果から、アクチビンＡとレチノイン酸で同時に処理することにより、マウスＥＳ細胞由来のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）から、内分泌細胞（α細胞とβ細胞）だけでなく外分泌細胞も備えたすい臓がｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導できることが遺伝子発現のレベルで分かった。【０２８３】
次に、アクチビンの濃度とレチノイン酸の濃度が、正のマーカー群の中で、インスリン２とアミラーゼ２の発現に与える効果を、検証した。【０２８４】
図５．マウスＥＳ細胞のコロニー凝集塊（ＥＢＳ）から、異なるアクチビン濃度（０，１０，２５  ｎｇ／ｍＬ）とレチノイン酸濃度（０，０．１，１．０μＭ）の処理で分化誘導されたすい臓構造の、インスリン２とアミラーゼ２のｍＲＮＡ発現量の違い。縦軸は各遺伝子の相対発現量を示している。【０２８５】
その結果、まず処理するレチノイン酸の濃度は０．１μＭが、インスリン２とアミラーゼ２のｍＲＮＡの発現上、最適な濃度であることが分かった。次に、同じく０．１  μＭのレチノイン酸で処理しつつ、２５  ｎｇ／ｍＬ濃度のアクチビンで処理した時に、インスリン２の遺伝子が最も効率よく発現されること、一方、アクチビンの濃度が１０  ｎｇ／ｍＬの時にアミラーゼの遺伝子が最も効率よく発現されることが分かった。この結果は、アクチビンの処理濃度により、マウスＥＳ細胞由来の胚様体から、内分泌細胞と外分泌細胞がそれぞれ優先的に分化誘導されることを示している。【０２８６】
次に、これらの正のマーカー群の中で、インスリンとアミラーゼの遺伝子がタンパク質として実際に転写発現されているか否かを、組織免疫学的に検討した。ただし、インスリンに関しては、培養液中に含まれている可能性があるので、分化誘導されたすい臓中で新しく合成されて分泌されるインスリンのみを同定する必要がある。インスリンは、はじめ前駆体であるプレインスリンとして遺伝子から翻訳され、直ちにプレ部分が切断されたプロインスリンとなる。このプロインスリンは、再び切断されてＣペプチドという部分が除去された活性型インスリンとして細胞外に分泌される。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコロニー凝集塊（ＥＢＳ）から作成したすい臓が、インスリンを新たに合成して分泌していることを確かめるために、インスリンに結合する抗体ではなく、Ｃペプチドにだけ結合する抗体（ヤギ抗Ｃペプチド抗体、Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、組織免疫学を実施した。アミラーゼについては通常抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いた。【０２８７】
図４−１．１０  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１  μＭのレチノイン酸で処理したマウスＥＳ細胞由来のコロニーの凝集塊（ＥＢＳ）の免疫組織学的観察像。Ａ、インスリンＣペプチド；Ｂ，アミラーゼ；Ｃ，ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；核の染色剤）、Ｄ，Ａ  ＋Ｂ  ＋Ｃ。スケールバーは５０  μＭ。インスリンＣペプチドとアミラーゼが別の細胞によって作られている。この条件下では、インスリンよりもアミラーゼが優先的に合成されている。【０２８８】
図４−２．  ２５  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１  μＭのレチノイン酸で処理したマウスＥＳ細胞由来のコロニーの凝集塊（ＥＢＳ）の免疫組織学的観察像。Ａ、インスリンＣペプチド；Ｂ，アミラーゼ；Ｃ，ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；核の染色剤）、Ｄ，Ａ  ＋Ｂ  ＋Ｃ。スケールバーは５０  μＭ。図４−１と同様に、インスリンＣペプチドとアミラーゼが別の細胞によって作られているが、この条件下では、インスリンがアミラーゼよりも優先的に合成されている。【０２８９】
図４の結果、および、図３の結果から、０．１  μＭのレチノイン酸が内分泌細胞と外分泌細胞の双方の分化誘導に最もよいこと、ならびに、アクチビンの濃度が25 ng/mLの時には内分泌細胞が優先的に分化誘導されるが、アクチビンの濃度が１０  ｎｇ／ｍＬの時には外分泌細胞が優先的に分化誘導されることが判明した。【０２９０】
（濃度依存性）
アクチビンの濃度の変化が、外分泌細胞と内分泌細胞との比率を変化させる。【０２９１】
本発明者らは、アクチビンおよびレチノイン酸のＥＢＳに対するすい臓分化誘導効果が濃度依存性であることをさらに試験した。この問いに答えるために、トータルＲＮＡをＥＢＳから、レチノイン酸（０、０．１μＭまたは１μＭ）およびアクチビン（０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは２５ｎｇ／ｍｌ）での処理後１３日で抽出し、そしてリアルタイムＰＣＲを行って、未処理のＥＢＳの発現量と対比（１に正規化させた）させて以下の遺伝子の転写発現量を測定したａｍｙｌａｓｅ  ２，ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ，ｐｔｆ１ａ／ｐ４８  およびＳｈｈ（図６ａ−ｄ）。Ｓｈｈ発現は、レチノイン酸単独、アクチビン単独およびレチノイン酸＋アクチビンでの処理によって減少した（図６ｃ）。ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩおよびａｍｙｌａｓｅ  ２の発現は、レチノイン酸単独で処理したＥＢＳにおいて、未処理のＥＢＳよりも高く、アクチビン単独では、ｉｎｓｕｌｉｎ発現のレベルは有意に効果はなかったが、未処理のＥＢＳよりもａｍｙｌａｓｅ発現は減少していた（図６ａ，ｂ）。興味深い結果が、レチノイン酸の濃度を一定（０．１μＭ）に維持し、アクチビンの濃度を変化させたときに観察された。比較的低い濃度のアクチビン（１０ｎｇ／ｍｌ）では、ａｍｙｌａｓｅ２およびｐｔｆ１ａ／ｐ４８（外分泌細胞のマーカー）の発現レベルは、レチノイン酸とアクチビンさんとで処理した軍において、未処理のＥＢＳよりもはるかに高く、他方、ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現は、これらの群で変動がなかった。対照的に、より高いアクチビン濃度（２５ｎｇ／ｍｌ）では、ｉｎｓｕｌｉｎの発現は、レチノイン酸とアクチビンとで処理したＥＢＳにおいて、未処理群よりも顕著に増大し、他方、ａｍｙｌａｓｅ  ２の発現レベルは、２つのグループでは低かった。【０２９２】
リアルタイムＰＣＲの結果は、抗ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃペプチド抗体および抗ａｍｙｌａｓｅ抗体の両方での染色によって支持される（論文図７ａ−ｄ）。０．１μＭレチノイン酸および低濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）のアクチビンで処理したＥＢＳにおいて、より少ないインスリン陽性の細胞が、アミラーゼ陽性の細胞よりも見られた。しかし、高濃度のアクチビン（２５ｎｇ／ｍｌ）を０．１μＭのレチノイン酸と共に用いた場合、インスリン陽性細胞の％は顕著に増加した（図７ｄ）。処理していないＥＢＳにおいて、インスリン陽性細胞およびアミラーゼ陽性細胞は、観察されなかった（図７ｂ）。これらの結果は、ＥＢＳから誘導された組織における内分泌細胞と外分泌細胞との比率がアクチビン濃度に依存することを示す。免疫細胞化学分析によってもまた、細胞のうちのいくつかがα細胞マーカータンパク質であるグルカゴンを産生していたことが明らかになった（図７ｅ）。【０２９３】
（まとめ）
マウスＥＳ細胞のコロニーから、浮遊培養の系を利用して、アクチビンとレチノイン酸を同時処理するという新しい方法により、未分化細胞から、インスリンを合成して分泌するβ細胞とグルカゴンを合成して分泌するα細胞の双方の内分泌細胞、アミラーゼを合成して分泌する外分泌細胞、分泌物を外部に放出するための導管を有するすい臓を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成することに、世界ではじめて成功した。【０２９４】
（実施例２：グルコース応答性）
本実施例では、２５  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１μＭのレチノイン酸を処理することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成したすい臓が、外部のグルコースに応答して、インスリンの分泌量が増加するか否かを検討した（表１）。【０２９５】
インビトロでのインスリン分泌を試験するために、２５ｎｇ／ｍｌアクチビンおよび０．１μＭレチノイン酸を用いてＥＳ細胞から分化させたすい臓組織を、低濃度（３ｍＭ）および高濃度（２５ｍＭ）のグルコース負荷試験により試験した（表１）。アクチビン／レチノイン酸処理したＥＢＳは、インスリンをグルコース依存的な様式で培地中に分泌した。他方、処理していないＥＢＳからのインスリン分泌は、同じ条件下で検出限界以下であった。レチノイン酸およびアクチビンの両方で処理した個々のＥＢＳは、馴化培地において平均で０．２４ｎｇのインスリンを、そのタンパク質１ｍｇあたりで（ＥＢＳ１つあたり約９．７％の総インスリン量）分泌した。これらの結果は、レチノイン酸とアクチビンとの両方で処理したＥＢＳがグルコース濃度の増加に応答してインスリンを分泌したことを示す。これは、すい臓β細胞がインビボで持っている生理学的機能と類似している。【０２９６】
表１．２５  ｎｇ／ｍＬのアクチビンと０．１μＭのレチノイン酸とを１３日間にわたり同時処理して作成したすい臓が、グルコース濃度に応じて分泌するインスリンの量【０２９７】
【表１】
0005122973.tif 000003
【０２９８】
表１は、ＥＢＳの細胞内インスリン量およびグルコース変化によるインスリン産生量変化を示す。【０２９９】
誘導処理後１３日後での０．１μＭのレチノイン酸および２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンで処理したＥＢＳと処理していないＥＢＳにおける細胞内インスリン量。グルコース負荷に対し応答してＥＢＳから分泌されたインスリン量を測定した。分泌されたインスリンの示された量は、２５ｍＭのグルコースによって刺激開始後３０分で分泌されたインスリンの量に匹敵する。培養培地中のグルコース負荷によるインスリン分泌の増大は、レチノインおよびアクチビンの両方で処理したＥＢＳにおいて観察された。【０３００】
（実施例３：培養系で分化誘導された膵臓組織の移植方法）
実施例１〜２において作製されたマウスすい臓について、実際に糖尿病モデルマウスにおいて使用することができることを実証する。以下にその手順を説明する。【０３０１】
（動物）
糖尿病モデルマウスは、１０週令以上のＡＫＩＴＡ−ｍｏｕｓｅ  （Ｙｏｓｈｉｏｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：  ８８７，  １９９７）の雄、または膵ランゲルハンス島を選択的に破壊するｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  （ＳＴＺ）  を２５０  ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  投与することによって病態を引き起こされたヌードマウスを用いる。この場合、ＳＴＺ投与後１週間を経過した時点で移植を行う。【０３０２】
（分化誘導された膵臓組織の移植）
移植は、培養系で分化誘導した膵臓組織を培養皿からピンセットなどで組織を傷つけないように集める。これを、Ｈａｎｋｓの生理食塩水で２回洗浄する。
マウスを、ネンブタールで麻酔し、腹部を切開して、２０−３０個の分化誘導された膵臓組織を塊にして、後腹膜下に移植する。他の移植場所としては、腎皮膜下に埋め込むことも有効である。また、膵臓組織をあらかじめ膵島単離用の酵素であるリベラーゼＲＩ  （Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＲＩ：  Ｒｏｃｈｅ）  で処理して細胞を単離し、肝臓の門脈に注入する方法もある。【０３０３】
血糖値の測定は、マウスの尾の先端をメスやカミソリなどで傷つけ、数μｌの血液を採取して測定を行う。【０３０４】
このようにして、モデルマウスにおいて本発明において作製されたすい臓が実際に機能するかどうかを確認することができる。【０３０５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３０６】
本方法により、これまで実現されていなかった哺乳類の未分化細胞から、
１）グルコース負荷に対して応答してインスリンを合成して分泌するβ細胞を持ち、
２）内分泌細胞として、β細胞だけでなく、グルカゴンを合成して分泌するα細胞を持ち、
３）消化酵素類（アミラーゼなど）を作り腸管内に分泌する外分泌細胞（腺房細胞）を持ち、
４）すい臓から消化酵素類を腸管に外分泌するための導管構造などのすべての機能と構造を備えたすい臓を作ることが世界ではじめてできた。【０３０７】
ヒトＥＳ細胞から本発明者らの方法とは別の方法で誘導された細胞は、米国においては、既にヒトの糖尿病の治療に対して試験的に応用されている。本発明者らの開発した方法でヒトの未分化細胞からβ細胞だけでなく、本発明者らが示したように完全なすい臓を作ることができるならば、多くの糖尿病患者やすい臓機能不全患者だけでなく、すい臓がんなどのためにすい臓を摘出せざるを得ない患者も治療するための、これまでにない有用な材料を提供する可能性がある。また、すい臓に関わる生物・医学研究、およびすい臓疾患の原因解明の研究、さらには、すい臓疾患の治療およびすい臓がんの治療のための薬剤の開発における有用なモデルおよび評価系（アッセイ系）となることも期待できる。このように、本方法の実用化と産業上の見通しは極めて明るいものと判断する。
【図１】
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【図２】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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