(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＪ−１タンパク質の活性部位への結合エネルギーが−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である化合物を主成分とする神経細胞死抑制剤であって、該化合物が、下記一般式（化３）で表される化合物である、前記神経細胞死抑制剤。
【化１】
0005145563.tif 000015
式中、
Ｒ９〜Ｒ１１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１４、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ１５、Ｒ１５は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ９及びＲ１０は共同して下式（化２）
【化２】
0005145563.tif 000016
を形成してもよく、
Ｒ１２は、水素原子又は−（ＣＯＮＨ）ｐＲ１６（式中、Ｒ１６はアルキル基、アリール基又は−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ｑ（ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２）ｒ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）ｓ（式中、ｑ、ｒ及びｓは、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２を満たす０〜２の整数を表す。）を表し、ｐは１又は２を表す。）を表し、
Ｒ１３は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基を表し、
ｎは０〜２の整数を表し、
ｏは０又は１を表し、
ｎ＋ｏ＝１または２である。
【請求項２】
下式のいずれかで表される化合物を主成分とする、請求項１に記載の神経細胞死抑制剤。
【化３】
0005145563.tif 000017
【請求項３】
ＤＪ−１タンパク質の活性部位への結合エネルギーが−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である化合物を主成分とする神経細胞死抑制剤であって、該化合物が、下記一般式（化１）で表せる化合物である、前記神経細胞死抑制剤。
【化４】
0005145563.tif 000018
式中、
Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、
Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化５】
0005145563.tif 000019
を形成してもよく、
ｍは０または１を表し、
Ｒ４は水素原子またはアセチル基を表し、
Ｒ５は水素原子、水酸基又はニトロ基を表す。
【請求項４】
下記一般式（化１−（１））で表せる化合物を主成分とする、請求項３に記載の神経細胞死抑制剤。
【化６】
0005145563.tif 000020
式中、
Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、若しくはシロキシメチル基（−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、
Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化７】
0005145563.tif 000021
を形成してもよく、
ｍは０または１を表す。
【請求項５】
下記一般式（化１−（２））で表せる化合物を主成分とする、請求項３に記載の神経細胞死抑制剤。
【化８】
0005145563.tif 000022
式中、
Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、
Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化９】
0005145563.tif 000023
を形成してもよく、
ｍは０または１を表し、
Ｒ４は水素原子またはアセチル基を表す。
【請求項６】
下記一般式（化１−（３））で表せる化合物を主成分とする、請求項３に記載の神経細胞死抑制剤。
【化１０】
0005145563.tif 000024
式中、
Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、
Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化１１】
0005145563.tif 000025
を形成してもよく、
ｍは０または１を表し、
Ｒ５は、水酸基又はニトロ基を表す。
【請求項７】
下式のいずれかで表される化合物を主成分とする、請求項３〜６のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤。
【化１２】
0005145563.tif 000026
【請求項８】
結合エネルギーが−９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項９】
細胞内の過酸化水素を除去する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項１０】
ミトコンドリアｃｏｍｐｌｅｘ１の活性を維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項１１】
パーキンソン病を処置するために用いられる、請求項１〜１０のいずれかに記載の神経細胞死抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、神経変性疾患治療薬に関し、より詳細にはパーキンソン病を治療するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、中脳のドーパミン神経細胞死が起こり、線条体に放出されるドーパミン量が減少し、線条体のアセチルコリンとのバランスが崩れて、それにより運動障害が発症する。
また、パーキンソン病は、酸化ストレスとミトコンドリア複合体Iの阻害によって生じることが確認されており（非特許文献１〜３）、酸化ストレスとミトコンドリア複合体Iの阻害を抑制することによって、パーキンソン病を治療できることを示唆している。
現在用いられているパーキンソン病治療法は、以下の４つに大別される。
１）ドーパミンの補充療法である。ただし、ドーパミン自体の血液関門（ＢＢＢ）透過性は低いため、ＢＢＢ透過性の高いドーパミン前駆体であるL-dopa（レボドパ）を投与する。L-dopaは、投与初期には優れた効果を示すが、L-dopa自体が神経細胞に酸化ストレスを与え、逆に症状を悪化させることがある。
２）ドーパミンの分解系を抑制する薬剤を投与する。たとえば、ドーパミン分解に関与するモノアミン酸化酵素ＭＡＯを阻害する薬剤として、セレギリンが知られている。
３）線条体の膜に存在して、ドーパミンを線条体内に取り込む機能を有するドーパミントランスポーターを活性化する薬剤を投与する。
４）過剰興奮状態となっているコリン作動性神経の機能を抑制することによって、アセチルコリン産生を抑制する薬剤（トリヘキシルフェニジルなど）を投与する。
しかし、これらの治療法は、神経細胞死によるドーパミン量の減少に対する対症療法であるため、神経細胞死自体を抑制する治療法が切望されている。
【０００３】
一方、ＤＪ-１タンパク質は、神経細胞を含む広範なヒト細胞に存在しており、１８９のアミノ酸からなる。ＤＪ-１タンパク質はガン遺伝子産物であり、PARK7（家族性パーキンソン氏病）と関連があることが知られている（非特許文献４）。
さらに、ＤＪ-１タンパク質は酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有することが知られている。すなわち、酸化ストレスを与える６−ヒドロキシドーパミンを注入されたパーキンソン病モデルラットに、６−ヒドロキシドーパミンの注入と同時又は注入後にＤＪ-１タンパク質を注入すると、ドーパミン神経細胞死が抑制され、行動異常が改善されることが報告されている（非特許文献５）。
また、パーキンソン病モデルラットに、ＤＪ-１タンパク質のＣ１０６変異体（１０６番目のアミノ酸残基が、システインからセリンに置換されたもの）は、ドーパミン神経細胞死を抑制しないことも報告されている（非特許文献６及び７）。
【０００４】
【非特許文献１】
Neurochem Res 2004 Mar, 29(3);569-577
【非特許文献２】
Neurochem Res 2003 Oct, 28(10);1563-1574
【非特許文献３】
Annals of Neurol 1996 Oct, 40(4);663-671
【非特許文献４】
Science. 2003 Jan, 299(5604);256-9
【非特許文献５】
Experimental Neulology. 2002, 175;303-317
【非特許文献６】
EMBO Reports. 2004 Feb, 5(2);213-8.
【非特許文献７】
Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jul 23, 320(2);389-97.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経細胞死抑止剤及び神経変性疾患治療薬、特にパーキンソン病を治療するための薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＤＪ-１タンパク質に注目した。このＤＪ-１タンパク質は、パーキンソン氏病と関連があること（非特許文献４）、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有すること（非特許文献５）、更にパーキンソン病モデルラットのＤＪ-１タンパク質をＣ１０６変異させたものはドーパミン神経細胞死を抑制しないこと（非特許文献６及び７）等が知られていた。
ＤＪ−１は１０６番目のシステイン（Ｃ１０６）の酸化状態で活性が調節されており、−ＳＨ（還元型）からＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈへの酸化型に酸化程度により移行する。この内、ＤＪ−１が活性を有するのは前２者（とりわけ、ＳＯ２Ｈ型が活性が最も高い）であり、ＳＯ３Ｈ型は不活性である。
このことから、本発明者らは、ＤＪ−１タンパク質の活性部位（即ち、１０６番目のシステイン残基の周辺領域）に結合する低分子化合物は、−ＳＨ、ＳＯ２Ｈ型に結合し、ＳＯ３Ｈへの移行を阻害することにより、活性型ＤＪ−１を維持すると考え、解析ソフトウェアＦａｓｔＤｏｃｋ（富士通株式会社製）を用いて候補化合物をスクリーニングした。
即ち、いくつかの候補低分子化合物を用いて、ＤＪ−１タンパク質の活性部位への結合力を計算し、結合力（結合エネルギー）がある程度強い低分子化合物を選択し、その化合物を実際に各種試験を行った（後記の実施例参照）。
その結果、結合エネルギーが一定値以下（例えば、−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下）のものは、神経細胞死抑止効果及び神経変性疾患治療効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の化合物は、ＤＪ−１タンパク質の酸化ストレスによる神経細胞死の抑制効果を有するといえる。
［０００７］
即ち、本発明は、下記一般式（化１）
［化１］
0005145563.tif 000002
（式中、Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシメチル基若しくはシロキシメチル基（−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化２】
0005145563.tif 000003
を形成してもよく、ｍは０又は１を表し、Ｒ４は水素原子又はアセチル基を表し、Ｒ５は水素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）で表される化合物を主成分とする神経変性疾患治療薬である。
【０００８】
また本発明は、下記一般式（化３）
【化３】
0005145563.tif 000004
（式中、Ｒ９〜Ｒ１１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基（−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１４、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）又はスルホニルオキシ基（−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ１５、Ｒ１５は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基を表す。）を表し、但し、Ｒ９及びＲ１０は共同して下式（２）
【化２】
0005145563.tif 000005
を形成してもよく、Ｒ１２は水素原子又は−（ＣＯＮＨ）ｐＲ１６（式中、Ｒ１６はアルキル基、アリール基又は−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ｑ（ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２）ｒ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）ｓ（式中、ｑ、ｒ及びｓは、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２を満たす０〜２の整数を表す。）を表し、ｐは１又は２を表す。）を表し、Ｒ１３は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基を表し、ｎは０〜２の整数を表し、ｏは０又は１を表す。）で表される化合物を主成分とする神経変性疾患治療薬である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、これまでの神経変性疾患の治療薬である対症療法薬とは異なるメカニズムの原因療法薬が提供される。特に、パーキンソン病の新たな治療薬又は予防薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の化合物は下式（化１）で表される。この中で（１）が好ましい。これら化合物はプリン又はピリミジン残基及び糖残基を含む共通の構造を有しており、ＤＪ-１タンパク質の活性部位との結合という観点から見た場合に、これら化合物の違いは著しい差をもたらすものではない。
【化１】
0005145563.tif 000006
【００１１】
Ｒ１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）、シロキシメチル基、又は２個のＲ１は共同して酸素原子（＝Ｏ）を表し、好ましくは一方が水素原子で他方がヒドロキシメチル基を表す。
このシロキシメチル基は−ＣＨ２−Ｏ−ＳｉＲ６３で表され、式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を表す。このアルキル基としてはメチル基が好ましく、アリール基としてはフェニル基が好ましい。
【００１２】
Ｒ２及びＲ３は、同じであっても異なってもよく、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はスルホニルオキシ基、好ましくは水酸基を表す。
このアルコキシ基としては、炭素数が１〜６のアルコキシ基が好ましく、アリールオキシ基としては、フェノキシ基が好ましい。
このアシルオキシ基は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ７で表され、式中、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を表す。このアルキル基としてはメチル基が好ましく、アリール基としてはフェニル基が好ましい。
このスルホニルオキシ基は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ８で表され、式中、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を表す。このアルキル基としてはメチル基が好ましく、アリール基としてはフェニル基が好ましい。
【００１３】
また、Ｒ２とＲ３は共同して下式（化２）
【化２】
0005145563.tif 000007
を形成してもよく、これらは共同して式（化２）（１）を形成することが好ましい。
ｍは０又は１、好ましくは０を表す。
Ｒ４は水素原子又はアセチル基（−ＣＯＣＨ３）、好ましくはアセチル基を表す。
Ｒ５は水素原子、水酸基又はニトロ基（−ＮＯ２）、好ましくはニトロ基を表す。
【００１４】
本発明の別の化合物は下式（化３）で表される。この化合物はベンゼン環から炭素骨格２つを挟んでペプチド結合という特徴的な構造を有しており、ＤＪ-１タンパク質の活性部位との結合という観点から見た場合に、この一般式に含まれる化合物の違いは著しい差をもたらすものではない。
【化３】
0005145563.tif 000008
Ｒ９〜Ｒ１１は、同じであっても異なってもよく、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はスルホニルオキシ基を表す。
アシルオキシ基は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ１４で表され、式中、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を表す。このアルキル基としてはメチル基が好ましく、アリール基としてはフェニル基が好ましい。
スルホニルオキシ基は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒ１５で表され、式中、Ｒ１５は炭素数１〜６のアルキル基又はアリール基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を表す。このアルキル基としてはメチル基が好ましく、アリール基としてはフェニル基が好ましい。
【００１５】
Ｒ９〜Ｒ１１のうち、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは２つ、最も好ましくは全ては水素原子である。
Ｒ９及びＲ１０は共同して下式（２）
【化２】
0005145563.tif 000009
を形成してもよく、これらは共同して式（化２）（１）を形成することが好ましい。
【００１６】
Ｒ１２は水素原子又は−（ＣＯＮＨ）ｐＲ１６、好ましくは−（ＣＯＮＨ）ｐＲ１６を表し、ｐは１又は２、好ましくは１を表す。式中、Ｒ１６はアルキル基、アリール基又は−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ｑ（ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２）ｒ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）ｓ、好ましくは−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ｑ（ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２）ｒ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）ｓを表す。アルキル基としては好ましくは炭素数が１〜６のアルキル基、アリール基としては好ましくはフェニル基を表す。この式中、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２を満たす０〜２の整数を表し、好ましくはｑは１である。Ｒ１２は、例えば、下式（化４）
【化４】
0005145563.tif 000010
で表される。
Ｒ１３は、水素原子、水酸基又はアルコキシ基、好ましくは水素原子を表す。アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。
ｎは０〜２の整数、好ましくは０又は１を表す。
ｏは０又は１、好ましくは０を表す。
【００１７】
候補化合物がＤＪ-１タンパク質の活性部位（即ち、１０６番目のシステイン残基の周辺領域）に結合するか否かは、以下のようにＤＪ-１タンパク質の活性部位の構造に基づくコンピューターによるバーチャルスクリーニングによりのＤＪ-１タンパク質と候補化合物との複合体の結合エネルギーに基づいて判断した。
このバーチャルスクリーニングは、解析ソフトウェアＦａｓｔＤｏｃｋ（富士通株式会社製）を用いて行った。このＦａｓｔＤｏｃｋは、拡張ＰＭＦ法という評価関数を用いてタンパク質と候補化合物との間の結合エネルギーの計算を行うためのソフトウェアである。ハードウェアにはＢｉｏＳｅｒｖｅｒ（富士通株式会社製）を用いた。
複合体の結合エネルギーは、ＰＭＦ（Protein Mean Force）手法に基づいて計算した。ＰＭＦ手法とは、タンパク質とリガンドとの結合エネルギーを、三次元構造データベースを用いた統計解析により予測するための手法であって、タンパク質−リガンド（化合物）複合体を設定し、その設定された複合体の原子間の全組における相互作用エネルギーの合計を求める。このバーチャルスクリーニングで用いられるＰＭＦ手法は、レナードジョーンズポテンシャルを用いた手法である。
【００１８】
バーチャルスクリーニングは以下の工程から成る。
第一工程：ＤＪ−１タンパク質の活性部位の最適化構造の情報を得る。
第二工程：対象とする化合物の構造の情報を得る。
第三工程：最適化構造の活性部位と、化合物との複合体の結合エネルギーを、化合物の構造のコンフォーマーを変化させながら求める（ドッキング工程）。
【００１９】
［第一工程について］
ＤＪ−１タンパク質の活性部位の最適化構造の情報は、１）ＤＪ−１タンパク質全体のＸ線構造解析の情報を得て、２）得られた情報から分子構造を修正し、かつ全体構造を最適化して、３）ＤＪ−１タンパク質のＣ１０６領域を活性部位として設定する、ことにより得られる。ＤＪ−１タンパク質全体のＸ線構造の情報は、J. Biol. Chem. 278 pp.31380 (2003)から得た。得られたＸ線構造の情報からのＤＪ−１タンパク質全体の分子構造の修正を行うための処理の例には、水素付加処理、及び水分子の処理などが含まれる。水素付加処理とは、読み込まれたＸ線構造の情報に水素原子を付加する処理であって、水素結合を反映させた最適化構造を得るために必要となる処理である。水分子の処理とは、溶媒及びタンパク質内部にある水分子を含んだ状態の、ＤＪ−１タンパク質全体の立体構造を得た後に、タンパク質内部の水分子を取り除いて最適化された構造を得るための処理である。水分子の処理により、最適化構造に水分子の影響を考慮に入れつつ、化合物との複合体の結合エネルギーが、ＤＪ−１タンパク質と化合物との直接的な結合に基づいて算出されうる。
［第二工程について］
化合物ライブラリーに含まれるｓｄｆファイルから化合物の二次元構造を読み取り、分子力学計算により水素位置の補正を行うことで三次元構造にする。
［第三工程について］
ドッキング工程は、対象とする化合物の三次元構造を変化させながら、化合物の各コンフォーマーと、最適化された構造の活性部位との複合体の結合エネルギーをそれぞれ計算し、もっとも低い結合エネルギーを求める。三次元構造を変化させるとは、化合物の結合のねじれを変化させながら空間的な配置を変えることであり、種々のコンフォーマーを発生させる。
【００２０】
この計算と後述の実施例から、ＤＪ−１活性部位との結合エネルギーが−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、特に−９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の低分子化合物は、神経細胞死抑止効果及び神経変性疾患治療効果があることがわかった。
ＤＪ−１活性部位と低分子化合物の結合エネルギーが−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、特に−９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることによって、強固な結合が維持され、後述の実施例にあるように、ＤＪ−１の−ＳＯ３Ｈ型への過剰酸化型への移行を抑制し、その結果、ＤＪ−１の生物活性が高められ、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制することができたためと考えられる。
【００２１】
本発明の化合物をヒトを含む生体内に投与すると、神経細胞内の活性酸素を消去し、その細胞死を抑制し、神経細胞死抑止剤及び神経変性疾患治療薬として機能する。これは、本発明の化合物がＤＪ−１タンパク質に結合し、後述の実施例において示すように、ＤＪ−１タンパク質の抗酸化作用を高めるためであると考えられる。
【００２２】
一方、ドーパミン神経細胞死を抑制するための神経変性疾患治療剤は血管脳関門を通過できることが好ましいが、一般に核酸構造を有する化合物は血管脳関門を通過することができるので、本発明の化合物のようにプリン又はピリミジン残基と糖残基を含む化合物は神経変性疾患治療剤として好ましく用いられうる。
本発明の化合物が治療薬として用いられうる神経変性疾患の例には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、ＡＬＳ、卒中などが含まれるが、好ましくはパーキンソン病である。これらの神経変性疾患は、酸化ストレスによる神経細胞死が発症原因と考えられており、本発明の化合物が有効に作用する。
神経変性疾患治療薬に含まれる本発明の化合物の濃度は特に限定されない。本発明の神経変性疾患治療薬は、本発明の効果を損なわない限り、前記化合物以外に任意の成分を含むことができる。本発明の変性疾患治療薬の投与方法は特に限定されず（経口投与、注射投与など）、またその剤型も特に限定されない（散剤、錠剤、注射液剤など）。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
製造例１
実施例で用いるためにＤＪ−１に結合する化合物として下式の化合物１〜６、ＤＪ−１との結合力が低い化合物として下式の化合物７及びＤＪ−１に結合しない化合物として下式の化合物８を用意した。
【化５】
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【００２４】
【化６】
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【化７】
0005145563.tif 000013
【００２５】
入手先又は製法：
化合物１〜４、７：愛知学院大学  薬学部  薬化学講座・廣田 耕作氏
化合物５：星薬科大  薬品製造化学・本多利雄氏
化合物６：University of Sofia, Medicinal Chemistry, Prof. Hristo Daskalov
化合物８：東北大学  大学院薬学研究科  医薬資源化学・大島 吉輝氏
【００２６】
化合物５：下式のフェネチルアミン（Ｉ）（1.0 mol）をベンゼンに溶解し、下式のカルボン酸（ＩＩ）（1.1 mol）を室温にて徐々に加えた。この溶液を原料が消失するまで攪拌し、ろ過や水洗等の処理をした後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、対応するアミドを無色結晶として収率７０％で得た。
【化８】
0005145563.tif 000014
【００２７】
化合物６：L-フェニルアラニン・メチルエステルヒドロキシクロライド（Fluka Chemical社）862mgを0.2Mマレイン酸緩衝液に溶解し、0.5N水酸化ナトリウムを用いてpH6.7に調整した。サーモリシン（Fluka Chemical社）10mgを加え、ベンジルオキシカルボニルグリシン（Fluka Chemical社）418mgをさらに加えた。反応溶液を3時間混合し、2-(2-ベンジロキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)-3-フェニル−プロピオニック酸メチルエステルを得た。
前記2-(2-ベンジロキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)-3-フェニル−プロピオニック酸メチルエステル370mgをメチルアルコール50mlに溶解し水酸化ナトリウムを用いて溶液をアルカリ性にし、一晩室温にて混合した。さらに塩酸を用いてpH7.0に調整した後、蒸発によって結晶2-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)-3-フェニルプロピオニック酸を析出させた。
前記2-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)-3-フェニルプロピオニック酸712mgを0.2M重炭酸緩衝液10mlに溶解させ、5N塩酸でpH9.3に調整した。そしてα-キモトリプシン（Fluka Chemical社）24mgを加え、さらにL-システインスルホンアミド（Fluka Chemical社）334mgを加えた。反応溶液を2時間混合した後、ろ過して生成物を得た。
【００２８】
これらの化合物は、財団法人科学技術教育協会（Foundation for Education of Science and Technology）の構築する大学化合物データベース（The University Compound Data Base）に登録されており、同協会から入手可能である。
【００２９】
それぞれの化合物について下記の条件で質量分析（Electrospray (ESI) mass spectra）を行った。使用機器と条件は以下のとおりである：JMS-700TZ (JEOL, Tokyo, Japan) four-sector (BE/BE) tandem mass spectrometer. Typical measurement conditions are as follows: acceleration voltage, 5.0 kV; needle voltage, 3.24 kV; orifice 1 voltage, 0.0 kV; ring lens voltage, 60.0 V; desolvation temperature, 80℃; orifice 1 temperature, 230℃; sample flow rate, 22μL/min; solvent, chloroform. For sample injection, a syringe pump (Harvard PHD 2000 Advanced Syringe Pump, Harvard Apparatus, Holliston, MA) was used. Mass spectra were recorded in the positive ion mode within m/z 100-1500.
【００３０】
化合物１〜８の質量分析チャートを図１〜８に示す。
なお、上述の解析ソフトウェアＦａｓｔＤｏｃｋ（富士通株式会社製）を用いて行ったＤＪ-１タンパク質の活性部位（即ち、１０６番目のシステイン残基の周辺領域）との複合体の結合エネルギーは、それぞれ、-91.3kcal/mol(化合物1)、-101.9kcal/mol(化合物2)、-98.1kcal/mol(化合物3)、-97.9kcal/mol(化合物4)、-103.4kcal/mol(化合物5)、-102.91kcal/mol(化合物6)、-56.3kcal/mol（化合物7）、+209.9kcal/mol(化合物8)であった。
【００３１】
実施例１
本実施例では、化合物１〜８のヒト神経細胞ＳＨ‐ＳＹ５Ｙの細胞死の抑制効果を調べた。
９６穴プレートにヒト神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（米国・American Tissue Culture Collection）を播種して、８０％コンフルエントまで培養した。
滅菌水溶液中の化合物１〜８をそれぞれ添加してサンプル濃度を１μＭとし、コントロール用に滅菌水を添加した。
化合物１〜８又は滅菌水添加の２４時間後に、それぞれに、6-ヒドロキシド−パミン（PBS溶媒）（和光純薬）を添加して6-ヒドロキシド−パミン濃度を１００μＭとし、一方、同量のＰＢＳ（６−ヒドロキシド−パミンを含まない）を添加した。さらに、６−ヒドロキシド−パミン添加の４０時間後に、ＭＴＴアッセイを行うためのCell Counting Kit-8を添加した。
３時間後に、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定して生存細胞数を計測した。化合物１〜８及びコントロールのそれぞれについて、「６−ヒドロキシド−パミンを添加した場合の生存細胞数／６−ヒドロキシド−パミンを添加していない場合の生存細胞数」を求めて細胞生存率（Viability）とした。
図９に、化合物１〜８又は滅菌水（コントロール）を添加した場合の細胞生存率を示した。コントロール及び化合物７及び８と比較して、化合物１〜６を添加した場合はいずれも、細胞生存率が高まっていることがわかる。
【００３２】
実施例２
本実施例では、化合物１〜５の過酸化水素消去効果を調べた。
１０ｃｍディッシュにヒト神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙを播種して、８０％コンフルエントまで培養した。化合物１〜５をそれぞれ添加して化合物濃度を１０μＭとし、又は滅菌水を添加した。化合物又は滅菌水添加の２４時間後に、過酸化水素を添加して過酸化水素濃度を５０μＭとした。過酸化水素添加の１時間後に、蛍光色素ＤＣＦＨ-ＤＡ（Dichlorofluorescein diacetate）を添加して１５分間インキュベートした。細胞を回収して、蛍光強度をＦＡＣＳで測定して、細胞内過酸化水素量を求めた。
図１０に測定結果を示す。いずれの場合も、化合物と過酸化水素を添加したときは、過酸化水素だけを添加したときと比較して、蛍光強度が弱い、すなわち過酸化水素量が少ないことがわかる。
【００３３】
実施例３
本実施例では、ＡｆｆｉｎｉｘＱ（株式会社イニシアム）を用いて、化合物１，２，４及び６がＤＪ-１タンパク質に結合することを確認した。
ＡｆｆｉｎｉｘＱとは、生体分子間の相互作用を水晶発振子の周波数変化によりナノグラムオーダーで定量化する装置である。水晶振動子の振動数変化と、水晶振動子表面に付着した重量との間に、比例関係があることを利用している。
発振子であるセンサーチップ上に、化合物をアミノカップリング試薬を用いて固定した。８ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝液）が入れられた測定槽に、化合物を固定したセンサーチップを浸し、振動数が一定になるまで保持した。その後、測定槽中に１ｍｇ／ｍｌのＤＪ-１タンパク質又はＢＳＡ（bovine serum albumin）を８μｌ添加した。
それぞれの振動数変化を測定した結果を、図１１に示す。ＤＪ−１を添加した場合は、ＢＳＡを添加した場合と比較して、振動数が顕著に減少しており、ＤＪ-１と化合物が結合していることを示す。
【００３４】
実施例４
本実施例では、化合物１と化合物５がＤＪ−１の酸化型への移行を抑制していることを確認した。
０．５ｍｇのＤＪ−１精製タンパク質をＰＢＳ１ｍｌに溶解した。そのＤＪ−１タンパク質溶液５００μｌに１ｍＭの化合物１、５又は７を１０μｌ加え、１時間、４℃でローテートした。その後、０．４又は４ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を加え、１時間室温に放置し、過酸化水素濃度を０．２ｍＭ又は２ｍＭとした。さらにＰＢＳで３回、合計で４．５時間、透析を行った後、ＤＪ−１タンパク質０．５μｇ分を等電点電気泳動に使用した。等電点電気泳動に用いた試薬を以下に示す。
等電点電気泳動用ゲル溶液: 9.2 M Urea, 2 % NP-40, 4 % acrylamide, 1 % Ampholine (pH 5-8; Amersham Bioscience), 1 % Ampholine (pH 3-10 ; Amersham Bioscience)
Sample Buffer: 5 M Urea, 2 M Thio Urea, 2 % NP-40, 5 % Glycerin, 5 % 2-mercaptoethsnol, 1.6 % Ampholine (pH 5-8), 0.4 % Ampholine (pH 3.5-10)
保護液: 8 M Urea, 0.8 % Ampholine (pH 5-8), 0.2 % Ampholine (pH 3.5-10)
泳動 Buffer ＋極: 0.02 M Phosphoric acid
−極: 0.02 M NaOH
Towbin: 25 mM Tris, 192 mM Glycine
図１２に泳動結果を示した。化合物８と比較して化合物１及び化合物５ではＤＪ−１タンパク質の酸化型への移行が抑制されていることがわかる。
【００３５】
実施例５
本実施例では、化合物１，５及び８のミトコンドリアcomplex1活性の維持効果を調べた。
6-ヒドロキシド−パミンはComplex1の酵素活性を低下させ機能障害を起こすことで酸化ストレスを誘導する。今回同定した化合物はcomplex1活性低下を防ぐことで、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制しているのではないかと考え、化合物添加によるcomplex1活性の変化を測定した。
１０ｃｍディッシュにヒト神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙを播種して、８０％コンフルエントまで培養した。化合物１，５及び８をそれぞれ添加して化合物濃度を１μＭとし、又は滅菌水を添加した。化合物又は滅菌水添加の２４時間後に、６−ヒドロキシド−パミン（ＰＢＳ溶媒）を添加して６−ヒドロキシド−パミン濃度を５０μＭとし、一方、同量のＰＢＳ（６−ヒドロキシド−パミンを含まない）を添加した。さらに、６−ヒドロキシド−パミン添加の６時間後に細胞を回収した。この細胞懸濁液をポッターホモジナイザーで８０回、氷中で破砕した。この破砕液を４℃，８００×ｇで８分間遠心し、その上清をさらに４℃，１１０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除き、そのペレットに０．２５Ｍｓｕｃｒｏｓｅを２００μｌ加え、これをミトコンドリア画分とした。タンパク定量後、１００μｇ分のミトコンドリアタンパク質をreaction bufferの入ったキュベットに加え、全量で４８０μｌにした。３７℃で３分間インキュベートした後、５ｍＭＮＡＤＨを２０μｌキュベットに添加し、吸光光度計を用いて３４０ｎｍの吸光度の減少を４分間測定した。
【００３６】
reaction bufferの組成ならびにComplex1活性の算出法を以下に示す。
Reaction buffer：6.65 mM NaH2PO4, 28.35 mM Na2HPO4, 5 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 1 mg/ml BSA, 2 ng/ml antimycine, 50μM ubiquinone 1, 2.65 mM NaCN
Complex 1活性 (μmol NADH oxidized/mg protein)=ΔA340 /4/6.22×1000×0.5/0.1
ΔA340 ：測定前後の340 nmの吸光度の差
4 ：測定時間（分）
6.22 ：NADHのmmol分子吸光係数
0.5 ：キュベット中の溶液量（ml）
0.1 ：タンパク質量（mg）
【００３７】
図１３に、化合物１，５及び８又は滅菌水（コントロール）を添加した場合のComplex1活性を示した。コントロール及び化合物８と比較して、化合物１又は５を添加した場合にはComplex1活性が維持されていることがわかる。
【００３８】
実施例６
本実施例では化合物１，５及び８をラットの中脳左黒質に注射してその影響を調べた。
（１）６ｍＭ６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）単独、又は６ｍＭ６−ＯＨＤＡに各化合物１ｍＭ加えた混合液を、ラット（Wister rat,オス、250g）の中脳左黒質（４．８ｍｍｘ１．８ｍｍ，７．８ｍｍｄｅｐｔｈ）に注射した。このラット中脳の左黒質に６ｍＭ６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）注入したラットでは右側黒質は正常、左側は酸化ストレス誘導ドパミン神経細胞死が起こっているため、作用のドパミン量のアンバランスからラットは時計回りに回転し、パーキンソン病患者特有の行動異常を示す。
９週間後、ラットにドパミン遊離を引き起こすメタンフェタミン（大日本製薬）を注射すると、ドパミンニューロンより多量のドパミンが線条体に遊離される。左右黒質の放出されるドパミン量のアンバランスにより、ラットは時計回りに回転を始める。ラットをローターメーターにいれ、この回転数を測定した。６０分での総回転数を図１４に、５分毎の時間経過による回転数を図１５に示す。
この図より、化合物１又は５を６−ＯＨＤＡと同時に注入すると、回転数の減少が観察され、行動異常が５５−６５％抑制された。この抑制効率の割合は極めて高いといえる。一方、化合物８はその効果がなかった。即ち、パーキンソン病に見られる行動異常が化合物１，５によって大幅に改善された。
【００３９】
（２）上記で行動異常テストを行ったラットを10 mM PBS50 ml で還流後、100 mM リン酸バッファー（4% パラホルムアルデヒド、0.35% グルタルアルデヒド、0.2% ピクリン酸を含む。） 300 mlで還流した。中脳黒質（SNpc）を取り出し、4% パラホルムアルデヒドを含んだ100 mM リン酸バッファーで2日間固定後、100 mM リン酸バッファー（15% スクロース、0.1% アジドナトリウムを含む。）に沈めた。クリスタルスタットで厚さ20μmに切片を作成し、0.3% Triton X-100を含んだ100 mM リン酸バッファー(PBS-T)に沈めた。
この脳切片を抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ドパミン整合性の酵素でドパミン神経のマーカー、Sigma社製、1:20,000 稀釈)と４℃で３日反応させた後、洗浄し、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体(1:2,000 稀釈)と室温、２時間反応させた。その後、ABC kit(Vector Laboratories)を使い、アビジンペルオキシダーゼ発色を室温１時間行った。ＰＢＳ−Ｔで数回洗浄後、ニッケルアンモニウムを有する3,3'-diaminobenzidine(DAB)で発色させた。その結果を図１６に示す。図中、黒く染色されたところはドパミン神経の存在を示す。
６−ＯＨＤＡのみが注射された左黒質では、ＴＨ染色が見られないことから、ドパミン性ニューロン死が見られるが、右黒質は６−ＯＨＤＡ注射をしていないので、生きたドパミン性ニューロンが見られる（図１６（１））。しかし、化合物１又は５を６−ＯＨＤＡと同時注射した左黒質は、かなりの割合で神経細胞死の抑制が見られた（図１６（２）（３））。化合物８はその効果がなかった（図１６（４））。
【００４０】
以上から、ＤＪ-１タンパク質の活性部位（即ち、１０６番目のシステイン残基の周辺領域）に結合する低分子化合物が、ヒト神経細胞死抑止効果（実施例１）、ミトコンドリアcomplex1活性の維持効果（実施例５）及びラットにおけるパーキンソン病患者特有症状の改善効果（実施例６）があったのに対し、ＤＪ−１タンパク質の活性部位との結合力が低い化合物７や、ＤＪ-１タンパク質の活性部位に結合しない化合物８がこのような効果が無かったことは、ＤＪ−１の活性部位に一定以上の結合力を示す低分子化合物が神経細胞死抑止効果及びパーキンソン病治療効果があることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】化合物１（M.W. 291）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:2.4 kV、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:50 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:CHCl3:MeOH=4:1構造式から計算した分子量よりも測定値が大きいが、糖部ラクトン環が加水分解されカルボン酸になった構造を示す。
【図２】化合物２（M.W. 329）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:3.24 V、オリフィス電圧:0 VＶ、リングレンズ電圧:60 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:CHCl3  分子量と測定値が一致している。
【図３】化合物３（M.W. 289）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:2 Ｖ、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:50 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:MeOH  化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（289+23=312）が見られる。
【図４】化合物４（M.W. 312）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:3.4 V、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:50 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:CHCl3:MeOH=4:1  分子量と測定値が一致している。
【図５】化合物５（M.W. 450）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:3.24 V、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:60 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:CHCl3   分子量と測定値が一致している。
【図６】化合物６（M.W. 505）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:2 V、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:80 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:MeOH  化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（505+23=528）が見られる。
【図７】化合物７（M.W.391）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧2 V、オリフィス電圧：0 V、リングレンズ電圧：50 V、イオンガイド電圧：3 V、移動相溶媒:MeOH  化合物にナトリウムイオンがついた場合のピーク（391+23=414）が見られる。
【図８】化合物８（M.W. 604）の質量分析チャートを示す図である。ニードル電圧:3.24 V、オリフィス電圧:0 V、リングレンズ電圧:60 V、イオンガイド電圧:3 V、移動相溶媒:CHCl3   分子量と測定値が一致している。
【図９】試験化合物の細胞死抑制効果を示す図である。
【図１０】試験化合物の細胞内過酸化水素消去効果を示す図である。
【図１１】ＡｆｆｉｎｉｘＱによる試験化合物の振動数変化を示す図である。
【図１２】試験化合物のＤＪ−１酸化抑制効果を示す図である。
【図１３】試験化合物のComplex1活性維持効果を示す図である。
【図１４】DJ-1結合化合物注射60分後のモデルラットの総回転数を示す図である。
【図１５】DJ-1結合化合物注射後5分毎の時間経過によるモデルラットの回転数を示す図である。
【図１６】6-OHDAとDJ-1結合化合物を注射したラット中脳のTH（ドパミン神経のマーカー）による染色写真を示す。左側は注射した左黒質、右側は正常な右黒質を示す。右の四角内は左黒質の拡大写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005145563.tif 000036
【図１１】
0005145563.tif 000037
【図１３】
0005145563.tif 000038
【図１４】
0005145563.tif 000039
【図１５】
0005145563.tif 000040
【図１２】
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【図１６】
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