(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法で水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドを形成させ、
（Ｂ）希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも１種の酸で、アルコールの存在下、固相と糖ペプチドとの結合を切断して、Ｃ末端にカルボキシル基を有する糖ペプチドを製造し、
（Ｃ）溶媒中、縮合剤の存在下、チオール化合物を−１００〜０℃で反応させることを特徴とする水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドのチオエステル化合物の製造方法。
0005328345.tif 000018
［式中、Ｒ１はＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１−４アルコキシ基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。］
【請求項２】
（Ａ） 式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法で水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドを形成させ、
（Ｂ） 希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも１種の酸で、アルコールの存在下、固相と糖ペプチドとの結合を切断することを特徴とするＣ末端にカルボキシル基を有する水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法。
0005328345.tif 000019
【請求項３】
Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドに溶媒中、縮合剤の存在下チオール化合物を−１００〜０℃で反応させることを特徴とするペプチドのチオエステル化合物の製造方法。
【請求項４】
ペプチドのＮ末端アミノ酸がシステインである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
システインのチオール基が脂溶性保護基で保護されたペプチドである請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂が、アミノＰＥＧＡ樹脂のアミノ基に式（１）で表されるリンカーが結合した樹脂である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項７】
アルコールがハロゲノアルコールである請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
溶媒が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンから選ばれる少なくとも１種である請求項１又は３に記載の製造方法。
【請求項９】
縮合剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジイソプロピルカルボジイミド又はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／ジイソプロピルエチルアミンである請求項１又は３に記載の製造方法。
【請求項１０】
ペプチドが糖ペプチドである請求項３、４、５、８、又は９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのチオエステル化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するタンパク質の多くは、糖鎖を有する糖タンパク質である。糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の３次元構造の維持や溶解性の調節、プロテアーゼ耐性の付加などの働きを担っている。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。このように、タンパク質に結合した糖鎖は様々な生理機能に重要な役割を果たしている。しかし、これら糖鎖の構造は多様で、その種類は膨大であるため、どの構造の糖鎖が生命現象に関与しているかを特定するのはきわめて困難な状況である。こういった機能の解明のためにも、単一構造の糖鎖を持った糖タンパク質、糖ペプチドの合成が必要不可欠である。現在のところ、生物学的手法ではタンパク質発現を用いて糖タンパク質を発現させることは可能であるが、均一な構造の糖鎖を持った糖タンパク質を得ることは難しい。そのため、近年では単一構造の糖鎖を有する糖ペプチド、糖タンパク質を化学的に精密合成することが検討されている。
本発明者等は、原料となりうる２分岐複合型糖鎖を鶏卵より酵素法と化学法を組み合わせることで大量に調製する方法（特許文献１）、また複合型糖鎖をペプチドの固相合成法を応用することで、シアリル糖鎖ペプチドを合成する方法（特許文献２）を確立した。糖ペプチドを高分子化することができれば、単一構造の糖鎖を持つ大型の糖タンパク質の合成を行うことが可能となる。
ペプチドを高分子化する方法としては、現在のところＮ末端のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）のペプチドフラグメントとＣ末端にチオエステルを持つペプチドをカップリングさせるＮａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ法（非特許文献１）が最も有効であると考えられている。
ペプチドの合成方法としては、不溶性樹脂担体にＮ末端が保護されたアミノ酸を固定化し、アミノ酸の保護基を脱保護した後に順次ペプチド鎖を伸長させていく固相合成法が一般的に用いられる。Ｃ末端にチオエステルを持つペプチドを製造する方法としては、固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化を行う方法、固相からペプチドを切り出した後にペプチドのＣ末端カルボキシル基をチオエステル化する方法等が挙げられる。
固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化する方法としては、例えば固相樹脂にＳａｆｅｔｙ  Ｃａｔｃｈ  Ｌｉｎｋｅｒを用いてペプチドを製造し、チオール化合物を作用させる方法が知られている（非特許文献１、２）。しかしながら、１つ目のアミノ酸を樹脂へ固定化する際の縮合効率が悪い点や、その縮合時にアミノ酸が僅かにラセミ化する点、チオール化合物によるエステル化の反応性が劣るなど多くの問題を有している。また、糖ペプチドの糖鎖水酸基が保護されていない場合には、Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｔｃｈ  Ｌｉｎｋｅｒの活性化のために行われるアルキル化は、容易に糖水酸基をもアルキル化することになり、脱アルキル化の処理を行わなければならず、条件によっては糖鎖結合等に影響し、得られる糖ペプチドの均一な糖鎖構造を確保することができない。これを解消するために、予め糖鎖水酸基を保護することが提案されているが、保護、脱保護の工程を増加することになり、効率的な方法とは言えない。
固相樹脂からペプチドを切り出す場合、通常、９５％トリフルオロ酢酸やフッ化水素等の強酸を使用する。しかし、このような強酸の使用はペプチド側鎖の脱保護や糖ペプチドの糖鎖結合の切断を伴う。そのため弱酸を使用して脱保護しないように固相樹脂からペプチドを切り出す方法として、トリチル樹脂を固相とし、切り出しに酢酸を使用する方法（非特許文献３，４，５）や４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸で修飾した樹脂（ＨＭＰＢレジン）を固相とし、切り出しに１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する方法が報告されている（非特許文献６）。しかしながら、トリチル樹脂を用いた方法では、水酸基を保護していない糖ペプチドを製造することができない。一方、ＨＭＰＢレジンを固相として使用して、糖ペプチドを作製した場合には１％ＴＦＡでは切り出すことができず、１０％ＴＦＡを使用した場合には、ペプチド側鎖の保護基も一部脱保護される。ペプチドのチオエステル化を行なう場合には、特にＮ末端システインのチオール基の保護が自己縮合を防止するために必須であるが、切り出し時の脱保護は次反応に致命的な結果を招くことになる。よって、これら方法はＣ末端にチオエステルを持つペプチドの製造原料となるカルボキシル基を有するペプチドの製造方法として十分な方法とはいえない。
ペプチドのチオエステル体は、側鎖が保護されたペプチドをアルキルチオールと反応させることで製造することができるが、Ｃ末端のアミノ酸がラセミ化する問題がある。ラセミ化を避けるため、Ｃ末端のアミノ酸をグリシンに置き換える方法（非特許文献７）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中、縮合剤としてベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を使用する方法（非特許文献８）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中、縮合剤として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ＤＩＰＥＡを使用する方法（非特許文献９）が報告されている。しかし、Ｃ末端アミノ酸をグリシンとする方法には、製造するペプチドが自ずと制限される。また、保護基で保護されていない水酸基を有する糖ペプチドをＤＣＭやＴＨＦのような溶媒に溶解させることができずに溶媒の変更を余儀なくされるが、Ｃ末端アミノ酸のラセミ化問題が再び生じてしまう。
【特許文献１】ＷＯ  ０３／００８４３１号公報
【特許文献２】ＷＯ  ２００４／００５３３０号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１１３６９−１１３７４（１９９９）
【非特許文献２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４，１６５０−１６５４（２００５）
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３８，６２３７−６２４０（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４４，３５５１−３５５４（２００３）
【非特許文献５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，３８８５−３８９１（２００１）
【非特許文献６】Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ，４９，９３０７−９３２０（１９９３）
【非特許文献７】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３８，６２３７−６２４０（１９９７）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４４，３５５１−３５５４（２００３）
【非特許文献９】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，３８８５−３８９１（２００１）
【０００３】
本発明の目的は、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドであっても適用可能な、ペプチド側鎖の保護基が維持されたＣ末端にカルボキシル基を有するペプチドの製造方法を提供することにある。
本発明の目的は、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドであっても適用可能な、ラセミ体の生成を抑制したペプチドのチオエステル化合物の効率的な製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は以下の発明に係る。
（Ａ）式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、
（Ｂ）希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも１種の酸で固相とペプチドとの結合を切断して、Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドを製造し、
（Ｃ）溶媒中、縮合剤の存在下、チオール化合物を−１００〜０℃で反応させることを特徴とするペプチドのチオエステル化合物の製造方法。
0005328345.tif 000002
［式中、Ｒ１はＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１−４アルコキシ基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。］
本発明者等は、特定の固相樹脂を使用し、特定条件で生成したペプチドを該固相樹脂から切り出すことで、糖鎖構造に影響せず、側鎖保護基を維持したＣ末端にカルボキシル基を有するペプチドを製造できることを見出した。
更に得られたペプチドのＣ末端カルボキシル基にチオール化合物を特定の縮合剤の存在下、低温で作用させることでペプチドのＣ末端のラセミ化が抑制されたペプチドのチオエステル化合物を製造できることを見出した。
本発明のペプチドのチオエステル化合物の製造方法は、（Ａ）式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、（Ｂ）希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも１種の酸で固相とペプチドとの結合を切断して、Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドを製造し、（Ｃ）溶媒中縮合剤の存在下チオール化合物を−１００〜０℃で反応させる工程からなる。
工程（Ａ）：ペプチドの形成
本工程においては、式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂（レジン）を使用する。
0005328345.tif 000003
［式中、Ｒ１はＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１−４アルコキシ基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。］
Ｃ１−４アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１から４のアルキル基を示す。
Ｃ１−４アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１から４のアルコキシ基を示す。
式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂は、市販されているものや従来公知の樹脂であってもよく、例えばＨＭＰＢ−ＢＨＡ樹脂（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸−ベンズヒドリルアミン）、ＨＭＰＢ−ＭＢＨＡ樹脂（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸−メチルベンズヒドリルアミン）等が挙げられるが、糖ペプチドの製造においては、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（ノババイオケム社製）のアミノ基と式（２）で表されるカルボン酸化合物のカルボキシル基とを、従来公知のアミド化反応に従い、脱水縮合剤の存在下で反応させることによって得られた膨潤性に優れた樹脂を用いることができる。ここでＰＥＧＡレジンとはビスアクリルアミドプロプ−１−イルポリエチレングリコールを示す。
0005328345.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記に同じ。］
得られる式（１）で表されるリンカーを有する樹脂の中でも、Ｒ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｃ１−４アルキル基である樹脂が好ましく、更にはＲ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｃ１−４アルキル基、ｎが２〜４である樹脂が好ましく、Ｒ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｃ１−４アルキル基、ｎが３である樹脂が特に好ましい。
具体的には、例えば式（３）で表される樹脂が特に好ましい。
0005328345.tif 000005
［式中、Ｒ２は前記に同じ。］
上記の式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として用いてペプチドを製造する。
例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程が挙げられる。
（ａ）  式（１）で表されるリンカーで修飾された樹脂の式（１）で表されるリンカー部の水酸基と、保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
（ｂ）  アミノ基の保護基を脱保護して、保護されていないアミノ基を形成させ、
（ｃ）  この保護されていないアミノ基と、アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化反応させ、
（ｄ）  上記保護基を脱保護して、保護されていないアミノ基を形成させ、
（ｅ）  上記（ｃ）及び（ｄ）の工程を１回以上繰り返してペプチドを形成する。
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート（Ａｌｌｏｃ）基等のカーボネート含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基等を挙げることができる。保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
脂溶性保護基でアミノ基を保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸のアミノ基に上記の方法又は公知の方法で脂溶性保護基を導入することで製造することができ、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸としてはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
最後に導入するアミノ酸としてシステイン（Ｃｙｓ）を選択すれば、Ｎ末端にシステインを有するペプチドを製造することができ、Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎにおいてペプチドのチオールエステル化合物とカップリングさせるフラグメントとして使用することができる。
アミノ酸に糖鎖が結合した糖鎖アミノ酸を使用することにより、糖鎖アミノ酸をペプチド鎖の任意の位置に導入した糖ペプチドを製造することができる。
使用する糖鎖アミノ酸としては、任意の数の糖残基を有するものであれば特に制限されず、マンノースを多く含む高マンノース、糖鎖の非還元末端にシアル酸やガラクトース残基を有する複合型糖鎖（Ｆｉｇｕｒｅｌ）、高マンノース構造と複合型糖鎖が混ざった混成型糖鎖、アスパラギンの側鎖のアミド基とＮグリコシル化されたＮ結合型糖鎖、セリン、スレオニンの側鎖のアルコールがグリコシル化されたＯ結合型糖鎖等を挙げることができる。具体的には、ＷＯ０３／００８４３１号公報に記載の糖鎖アスパラギンを挙げることができる。中でもジシアロ糖鎖アスパラギン又はモノシアロ糖鎖アスパラギンが好ましく、例えば、式（４）で表される該シアル酸のカルボキシル基がベンジル基等の保護基により保護された糖鎖が特に好ましい。このようなジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンが結合した糖ペプチドは好ましい糖ペプチドである。
0005328345.tif 000006
樹脂のリンカー部の水酸基と、上記保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基とのエステル化反応は、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ＤＣＣ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の脱水縮合剤を用いて行うことができ、例えば固相カラムにレジンを入れ、溶媒で洗浄し、その後アミノ酸の溶媒溶液を加えることにより行うのが好ましい。
洗浄用溶媒としては、例えばＤＭＦ、２−プロパノール、ＤＣＭ等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＣＭ等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングすることも可能である。
アミノ基の保護基の脱保護は、酸又は塩基で処理することにより行うことができ、例えば保護基がＦｍｏｃ基である場合、ピペリジン、モルホリン等の塩基を使用することができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましく、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
保護されていないアミノ基と、アミノ基が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とをアミド化する反応は、活性化剤および溶媒の存在下で行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
溶媒としては例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、式（２）で表されるカルボン酸化合物に対して、０．１〜２０当量、好ましくは０．５〜１０当量、さらに好ましくは、０．８〜５当量とするのが好ましい。反応は溶媒中で行うことができ、０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。また、固相合成用カラム中で反応を行うことによって、そのまま後の固相合成に使用することができ、好ましい。
保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
工程（Ｂ）：ペプチドの切り出し
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。使用する酸としては、希塩酸、希硫酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸等のカルボン酸類を挙げることができる。希塩酸又は希硫酸としては、０．０１〜２規定程度、好ましくは０．０５〜１規定程度の塩酸又は硫酸の水溶液が挙げられる。これらの酸の中でも酢酸が好ましい。酸の使用量の使用量としては、ペプチド１当量に対して１当量以上であれば特に制限されず、例えば、１〜１００００当量程度、好ましくは１０〜１０００当量程度とすればよい。
本反応はアルコール存在下で行うのが好ましく、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、トリクロロエタノール等のハロゲノアルコールが挙げられる。これらのアルコールの中でも、メタノール、トリフルオロエタノールが好ましく、トリフルオロエタノールが特に好ましい。アルコールの使用割合は、酸１容量に対してアルコールを０．１〜２容量、好ましくは０．５〜１．５容量、更に好ましくは０．８〜１．２容量とすればよい。
また、本反応は必要に応じて、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の有機溶媒を使用してもよい。
溶媒の使用量は特に制限されず、酸１容量に対して０．１〜１００容量程度とすればよい。
反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜３０時間程度行うのがよい。
以上のようにして、Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドを得ることができる。
工程（Ｃ）：ペプチドのチオエステル化合物の製造
得られたペプチド（原料ペプチド）を溶媒中で縮合剤の存在下チオール化合物を作用させることでＣ末端がチオエステルであるペプチドを製造することができる。チオール化合物としては、フェニル環上任意の位置に、任意の数のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基、ニトロ基等の置換基を有していてもよいベンジルメルカプタン類、メタンチオール、エタンチオール等の低級アルカンチオール類等を挙げることができる。これらのチオール化合物の中でもベンジルメルカプタンが特に好ましい。
チオール化合物の使用量としては、原料ペプチド１当量に対して１〜１００当量、好ましくは１０〜８０当量、更に好ましくは２０〜５０当量とすればよい。特に、ペプチドのＣ末端のラセミ化を抑制するためには、大過剰の量を使用するのが好ましく、３０当量程度以上とするのが好ましい。
使用する溶媒としては、例えばＴＨＦ、ＤＣＭ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等が挙げられるが、これらの中でもＤＭＦが好ましい。
縮合剤としては、ＨＯＢｔ／ＤＩＰＣＩ又はＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡ等を挙げることができ、ＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡが好ましい。
ＨＯＢｔ／ＤＩＰＣＩの使用割合はＨＯＢｔ１当量に対してＤＩＰＣＩを０．１〜１０当量、好ましくは０．５〜５当量、更に好ましくは０．８〜１．２当量とすればよい。
ＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡの使用割合はＰｙＢＯＰ１当量に対してＤＩＰＥＡを０．１〜１０当量、好ましくは０．５〜５当量、更に好ましくは０．８〜１．２当量とすればよい。
ＨＯＢｔの使用割合は、原料ペプチド１当量に対して、１〜２０当量、好ましくは３〜１５当量、更に好ましくは８〜１２当量とすればよい。
ＰｙＢＯＰの使用割合は、原料ペプチド１当量に対して、１〜１０当量、好ましくは２〜８当量、更に好ましくは３〜６当量とすればよい。
本反応においては、モレキュラーシーブ等の脱水剤を使用するのが好ましい。ペプチドのラセミ化は原料ペプチドのＣ末端カルボン酸が活性化された時点で生じる。そのため、反応は、原料ペプチドとチオール化合物とを混合した後、縮合剤を加えて行うことが好ましい。反応温度は−１００〜０℃、好ましくは−８０〜−１０℃とすればよく、３０分〜２時間程度行えばよい。
本発明においては得られるペプチドのラセミ体の割合が抑制され、通常ラセミ体の割合は６％以下、好ましくは４％以下、更に好ましくは２％以下、特に好ましくは０〜１％である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
使用するＦｍｏｃ化されたアミノ酸は、公知のものであり、市販品かアミノ酸にＦｍｏｃ基を導入することで容易に調製できる。
また、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌは各アミノ酸のアミノ基がＦｍｏｃ基で保護されていることを意味する。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）はシステインのアミノ基がＢｏｃ基で、及びチオールがアセトアミドメチル基で保護されていることを意味する。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）は、アルギニンのα位アミノ基がＦｍｏｃ基で保護されたＮＧ−（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）アルギニンを意味する。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）は各アミノ酸のアミノ基がＦｍｏｃ基で保護され、アスパラギン酸β位及びグルタミン酸γ位のカルボキシル基がｔｅｒｔ−ブチル基で保護されていることを意味する。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）は、システインのアミノ基がＦｍｏｃ基で、及びチオールがトリチル基で保護されていることを意味する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）は、リジンのα位アミノ基がＦｍｏｃ基で、及びε位アミノ基がＢｏｃ基で保護されていることを意味する。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）は、各アミノ酸のアミノ基がＦｍｏｃ基で、及び水酸基がトリチル基で保護されていることを意味する。Ｂｏｃ−Ｌｅｕ及び（Ｂｏｃ）Ｌｅｕは、ロイシンのアミノ基がＢｏｃ基で保護されていることを意味する。（Ｂｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）は、リジンのα位及びε位アミノ基がＢｏｃ基で保護されていることを意味し、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）はリジンのε位アミノ基がＢｏｃ基で保護されていることを意味する。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）はＮ−ｔ−Ｂｏｃ−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸を意味する。Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＳｅｒ（ｔＢｕ）は各アミノ酸の水酸基がｔｅｒｔ−ブチル基で保護されていることを意味する。Ｈｉｓ（ｔｒｔ）はイミダゾール窒素が、Ｃｙｓ（ｔｒｔ）はシステインのチオール基が、及びＧｌｎ（ｔｒｔ）はグルタミンのアミド窒素がトリチル基で保護されていることを意味する。Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）及びＧｌｕ（ＯｔＢｕ）は、アスパラギン酸β位及びグルタミン酸γ位のカルボキシル基がｔｅｒｔ−ブチル基で保護されていることを意味する。Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）は１，３−チアゾリジン−４−カルボニルを意味する。Ａｒｇ（Ｐｂｆ）は、ＮＧ−（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）アルギニンを意味する。
これらの保護基の導入は従来公知の方法か、保護基が導入された市販品を使用することができる。また、Ｐｈはフェニル基を示し、Ｂｎはベンジル基を示す。
１Ｈ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ  ４００（４００ＭＨｚと表記）で測定した。
ＥＳＩ  ｍａｓｓ測定器はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製のＥｓｑｕｉｒｅ３０００  ｐｌｕｓを、ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ測定器はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製のＡｕｔｏｆｌｅｘをマトリックスにはｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄを用いた。
【実施例１】
【０００６】
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（１ｇ，５０μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（３０．１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４０．１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（１５．８μｌ，０．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で２時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（９６．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（７４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１５μｌ，０．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、室温で２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（３３．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させ１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間半攪拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸には、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（１１４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（８８．６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（７７．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）（１５４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（９５．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（１０２．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（８８．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（８４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＰｈｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（配列番号１）の１９残基ペプチドを形成させた。
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、１９残基のペプチド２μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
下記式（５）で表される糖鎖アスパラギンのジベンジル体（１０ｍｇ，３．６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（２ｍｇ，６μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１２ｍｌ）に溶解させ、エッペンチューブに入れた。
【化１】
0005328345.tif 000007
ＤＩＰＥＡ（０．６８μｌ，４μｍｏｌ）を加えて室温で１８時間攪拌した。ＤＭＦで洗浄した後に、２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を脱保護して、固相樹脂にＰｈｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ）（配列番号２）の２０残基ペプチド（６）を形成させた。
【化２】
0005328345.tif 000008
【実施例２】
【０００７】
実施例１で得られた２０残基ペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、酢酸：ＤＣＭ：メタノール（＝５：４：１）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝６０：４０→０：１００ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、２０残基のペプチド（７）（配列番号２）を得た。
得られたペプチドはＣ末端にカルボキシル基を有し、側鎖保護基が維持されたものであった。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２７９Ｈ３８２Ｎ３４Ｏ９４：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １９０６．３，ｆｏｕｎｄ．１９０５．８
【化３】
0005328345.tif 000009
【実施例３】
【０００８】
実施例２で使用した酢酸：ＤＣＭ：メタノール及び反応時間を酢酸：ＴＦＥ：ＤＣＭ（＝２：２：６）で２時間、又は酢酸：ＴＦＥ（＝１：１）で２７時間に変更して反応させた。
どちらも２０残基のペプチド（７）を得ることができた。
ただし、酢酸：ＴＦＥ：ＤＣＭでの条件は、酢酸：ＤＣＭ：メタノールの条件に比較して約５倍、更に酢酸：ＴＦＥでの条件は酢酸：ＤＣＭ：メタノールの条件に比較して約８倍の収率を与えた。
【実施例４】
【０００９】
実施例１と同様にしてＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（２５μｍｏｌ）を得、固相合成の固相として用いて、アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例１と同様に行なった。第１のアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ａｌａ（３８．９ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を用い、ＭＳＮＴ（３７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（７．５μｌ，９４μｍｏｌ）、ＤＣＭ（０．５ｍｌ）によって縮合させた。
その後のアミノ基を保護したアミノ酸をＨＯＢｔ（１６．９ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１９．２μｌ，０．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）によって順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（４６．１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）（４９．７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ（４４．２ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（４２．４ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（４７．９ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた。
ペプチド伸長後、樹脂２μｍｏｌに対して式（５）で表される糖鎖アスパラギンのジベンジル体（１０ｍｇ，３．６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（２ｍｇ，６μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６８μｌ，４μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．１２ｍｌ）とを用いた。その後、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（２．９ｍｇ，１０μｍｏｌ）をＨＯＢｔ（１．３６ｍｇ，１０μｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１．５４μｌ，１０μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）によって縮合した。
樹脂にＡｃＯＨ：ＴＦＥ＝１：１（１ｍｌ）を加え、室温で１４時間反応させた。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝６０：４０→０：１００ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製することで側鎖の保護された９残基ペプチド（８）（配列番号３）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５５Ｈ２４９Ｎ１８Ｏ７９Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １８３０．３，ｆｏｕｎｄ．１８３１．０．
【化４】
0005328345.tif 000010
【実施例５】
【００１０】
実施例４で製造した９残基ペプチド（８）（２ｍｇ，０．５５μｍｏｌ）とモレキュラーシーブ（ＭＳ）４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（２μｌ，１６．４μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（８５μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（１．４ｍｇ，２．７μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．４６μｌ，２．７μｍｏｌ）を加え４時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテル（５ｍｌ）を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をアセトニトリル５０％水溶液で回収した。これを凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、５０％アセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→２５：７５ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（９）で表されるＣ末端がベンジルチオエステルであるペプチド（ＮＨ２−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ＣＯＳＢｎ）（配列番号４）を製造した。
【化５】
0005328345.tif 000011
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，２９５Ｋ ｉｎ Ｄ２Ｏ，ＨＯＤ＝δ４．８１）７．５３−７．３３（ｍ，１５Ｈ，Ｐｈ×３），５．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），５．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０２（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４′−Ｈ−１），４．６５−４．５２（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５′−Ｈ−１），２．９１−２．７８（ｍ，４Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ２，Ｃｙｓ−・βＣＨ２），２．６７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７′−Ｈ３ｅｑ），２．３９−２．３１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｎ−γＣＨ３），１．８３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．１，１３．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７′−Ｈ−３ａｘ），１．３８（ｄ，３Ｈ，Ａｌａ−βＣＨ３），１．２０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５１Ｈｚ，Ｔｈｒ−γＣＨ３），１．１７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４０Ｈｚ，Ｔｈｒ−γＣＨ３），０．９５−０．８０（ｍ，１２Ｈ，Ｖａｌ−γＣＨ３，Ｉｌｅ−・γＣＨ３，・ＣＨ３）
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４５Ｈ２２３Ｎ１８Ｏ７６Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １７４９．８，ｆｏｕｎｄ．１７４９．２
【実施例６】
【００１１】
Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（配列番号５）を従来公知の方法で製造し、原料として使用した。当該ペプチド（０．５ｍｇ，１μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（３．７ｍｇ，３０μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（０．１４ｍｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２．６ｍｇ，５μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．８５μｌ，５μｍｏｌ）を加え１７時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテル（５ｍｌ）を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をアセトニトリル５０％水溶液で回収した。これをＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０→４０：６０ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製することによりＣ末端がベンジルチオエステルであるＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＳＢｎ（配列番号６）を得た。
ラセミ体の生成は２％以下であった。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３６Ｎ６Ｏ５Ｓ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ５９２．３，ｆｏｕｎｄ．５９２．２
【実施例７】
【００１２】
反応温度を０℃とする以外は実施例６と同様に操作してベンジルチオエステル体ＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＳＢｎ（配列番号６）を得た。得られた化合物のマススペクトルは実施例６のものと同一であった。ラセミ体の生成は６％であった。
【実施例８】
【００１３】
ペプチドＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（０．５ｍｇ，１μｍｏｌ）（配列番号５）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ＨＯＢｔ（０．７ｍｇ，５μｍｏｌもしくは１．４ｍｇ，１０μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（０．１４ｍｌ）アルゴン気流下０℃で１時間攪拌した後、ＤＩＰＣＩ（０．８μｌ，５μｍｏｌもしくは１．６μｌ，１０μｍｏｌ）とベンジルメルカプタン（３．７ｍｇ，３０μｍｏｌ）を加えた。以下、実施例６と同様に処理してベンジルチオエステル体ＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＳＢｎ（配列番号６）を得た。ＨＯＢｔを５当量使用した場合の収率は７５％で、１０当量での収率は９８％であった。得られた化合物のマススペクトルは実施例６のものと同一であった。ラセミ体の生成はそれぞれ５％であった。
【実施例９】
【００１４】
Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドＡｃＮＨ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＣＯＯＨ（配列番号７）を従来公知の方法で製造し、原料として使用した。当該ペプチド（０．５ｍｇ，１μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１．４ｍｇ，１０μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（０．１４ｍｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＤＩＰＣＩ（１．６μｌ，１０μｍｏｌ）とベンジルメルカプタン（３．７ｍｇ，３０μｍｏｌ）を加え反応させた。以下、実施例６と同様に処理してベンジルチオエステル体ＡｃＮＨ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＣＯＳＢｎ（配列番号８）を得た。
ラセミ体の生成は２％以下であった。
【実施例１０】
【００１５】
Ｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（１５０μｍｏｌ）を固相合成の固相として用いて、順次アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例１と同様に行なった。
第１のアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（１５９．０ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を用い、ＤＣＭ（０．９ｍｌ）及びＤＩＥＡ（２０４．１μｌ，１．２ｍｍｏｌ）によって縮合させた。
その後のアミノ基が保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ（１０１．３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１１５．４μｌ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３ｍｌ）によって縮合させた。
アミノ基が保護されたアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ（２５３．１ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）（４８６．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（３３４．７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（３１９．２ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ（２７８．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）（２９８．１ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）（４３９．３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（２３３．５ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（２５３．１ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（３５１．４ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（２５３．１ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（３３４．７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（３１９．２ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（２８７．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）（４３９．３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（３０８．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（２５４．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（２８７．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（２５４．６ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（２３３．５ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（２３３．５ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（１８７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた。
樹脂にＡｃＯＨ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：４：１（１ｍｌ）を加え、室温で３時間反応させた。反応溶液にヘキサンを加えた。その後ろ過して樹脂を除いた。樹脂をＭｅＯＨで洗浄し、その溶液を濃縮した。濃縮残渣にベンゼンを加えて更に濃縮して、側鎖の保護された２３残基ペプチド（（Ｂｏｃ）Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨ）（１０）（配列番号９）を得た。
得られた２３残基ペプチド（１０）（３９ｍｇ，１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、ベンジルメルカプタン（３５．５μｌ，３００μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１３５０μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８．５μｌ，５０μｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収した。これを濃縮し、残渣に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌し、その後凍結乾燥した。
凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０ １５分 流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（１１）で表されるＣ末端がベンジルチオエステルであるペプチド（Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＣＯＳＢｎ）を製造した（配列番号１０）。
収量：２０ｍｇ
ラセミ体の生成率：２％以下
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１８Ｈ１８１Ｎ２７Ｏ３４Ｓ４：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １３２５．１，ｆｏｕｎｄ．１３２５．３．
【化６】
0005328345.tif 000012
【実施例１１】
【００１６】
固相がＴｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ（４０μｍｏｌ）である２６残基ペプチド（Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＣＯ−（Ｔｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ））（配列番号１１）（３００ｍｇ，ノババイオケム社製造品）に、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）（４６．７ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を、ＨＯＢｔ（２７．０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３０．８μｌ，０．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させた。
樹脂に１％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液（１．０ｍｌ）を加え、室温で２分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を５回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加えて側鎖の保護されたペプチドを沈殿させた。沈殿物をＤＭＦ溶液で回収し、濃縮して、側鎖の保護された２７残基ペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ）（１２）（配列番号１２）を得た。
得られた２７残基ペプチド（１２）（１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）、チオフェノール（３０．６μｌ，３００μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．３６μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（８．６ｍｇ，５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６．０μｌ，５０μｍｏｌ）を加え４時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、５０％アセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→２５：７５ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（１３）で表されるＣ末端がフェニルチオエステルであるペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＣＯＳＰｈ）（配列番号１３）を製造した。
収量：５ｍｇ
ラセミ体の生成率：１％以下
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２８Ｈ２０４Ｎ３６Ｏ４３Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １４９９．７，ｆｏｕｎｄ．１４９９．８．
【化７】
0005328345.tif 000013
【実施例１２】
【００１７】
固相がＴｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ（４０μｍｏｌ）である１７残基ペプチド（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＣＯ−（Ｔｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ））（配列番号１４）（５００ｍｇ，ノババイオケム社製造品）に、Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）（４６．７ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を、ＨＯＢｔ（２７．０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３０．８μｌ，０．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させた。
樹脂に１％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液を加え、室温で２分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を５回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加え側鎖の保護されたペプチドを沈殿させた。沈殿物をＤＭＦ溶掖で回収し、濃縮して、側鎖の保護された１８残基ペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ）（１４）（配列番号１５）を得た。
得られた１８残基ペプチド（１４）（１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（３６．０μｌ，３００μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．３６μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（８．６ｍｇ，５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２６．０μｌ，５０μｍｏｌ）を加えて４時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に９５％ＴＦＡ（エタンジチオール（ＥＤＴ）を含む）水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、５０％アセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→２５：７５ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（１５）で表されるＣ末端がベンジルチオエステルであるペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＣＯＳＢｎ）（配列番号１６）を製造した。
収量：４ｍｇ
ラセミ体の生成率：１％以下
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８９Ｈ１２９Ｎ１９Ｏ２９Ｓ４：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ２０５６．８，ｆｏｕｎｄ．２０５７．２．
【化８】
0005328345.tif 000014
【実施例１３】
【００１８】
固相がＴｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ（２０μｍｏｌ）である２２残基ペプチド（（Ｂｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯ−（Ｔｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ））（配列番号１７）（２５０ｍｇ，ノババイオケム社製造品）に１％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液を加え、室温で２分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を５回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加え側鎖の保護されたペプチドを沈殿させた。沈殿物をＤＭＦ溶液で回収し、濃縮して、側鎖の保護された２２残基ペプチド（（Ｂｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ）（１６）（配列番号１７）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７０Ｈ２４５Ｎ２９Ｏ３４Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １６５２．０，ｆｏｕｎｄ．１６５１．６
得られた２２残基ペプチド（１６）（７．５ｍｇ，２．２μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（２０．０ｍｇ）、チオフェノール（６．７μｌ，１１．０μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（３００μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（５．７ｍｇ，６６．０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．７μｌ，１１．０μｍｏｌ）を加え４時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、５０％アセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→２５：７５ １５分 流速０．１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（１７）で表されるＣ末端がフェニルチオエステルであるペプチド（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯＳＰｈ）（配列番号１８）を製造した。
収量：２ｍｇ
ラセミ体の生成率：１％以下
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１６５Ｎ２９Ｏ２６Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １１４５．９，ｆｏｕｎｄ．１１４５．７．
【化９】
0005328345.tif 000015
【実施例１４】
【００１９】
実施例１と同様にしてＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（５０μｍｏｌ）を得、固相合成の固相として用いて、アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例１と同様に行なった。
第１のアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（９６．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を用い、ＭＳＮＴ（７４．０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（１４．９μｌ，１８７．５μｍｏｌ）、ＤＣＭ（１ｍｌ）によって縮合させた。
その後のアミノ基が保護されたアミノ酸は、ＨＯＢｔ（３３．７ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８．５μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させた。
アミノ基が保護されたアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（８８．６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）（１４６．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１１７．１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（８８．６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（７４．３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（１１４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）（９９．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１１７．１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（配列番号１９）の９残基ペプチドを形成させた。
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、９残基のペプチド３μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
下記式（１８）で表される糖鎖アスパラギン（１２ｍｇ，６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（３ｍｇ，９μｍｏｌ）をＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１（２０１μｌ）に溶解させ、エッペンチューブに入れた。
【化１０】
0005328345.tif 000016
ＤＩＰＥＡ（１．０２μｌ，６μｍｏｌ）を加えて室温で２０時間攪拌した。ＤＭＦで洗浄した後に、２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を脱保護して、固相樹脂にＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ）（配列番号２０）の１０残基ペプチドを形成させた。この１０残基ペプチドに、前記と同様にＨＯＢｔ、ＤＩＰＣＩ、ＤＭＦでアミノ酸を更に縮合させた。
アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（１．７ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（１．９ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（１．５ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）（１．７ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた。
樹脂にＡｃＯＨ：ＴＦＥ＝１：１（１ｍｌ）を加え、室温で２０時間反応させた。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮して、側鎖の保護された１４残基ペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ）（１９）（配列番号２１）を得た。
得られた１４残基ペプチド（１９）（１１．７ｍｇ，３μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、ベンジルメルカプタン（１０．６μｌ，９０μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（４０５μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（７．８ｍｇ，１５μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２．６μｌ，１５μｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加え目的物を沈殿物として析出させた。この沈殿物を濾過により溶液と分離し、濾紙に残った沈殿物をアセトニトリル５０％水溶液に溶かし回収した。回収した溶液を濃縮し、９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。その後凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ ７５×４．６ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．０１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．０１％ＴＦＡ／アセトニトリル：水＝９０：１０グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０ １５分 流速１ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、式（２０）で表されるＣ末端がベンジルチオエステルであるペプチド（Ｃｙｓ（Ｔｈｚ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＣＯＳＢｎ）（配列番号２２）を製造した。
収量 ３ｍｇ
ラセミ体の生成は２％以下であった。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３３Ｈ２０３Ｎ２３Ｏ６７Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］＋２ １６４６．１，ｆｏｕｎｄ．１６４６．４．
【化１１】
0005328345.tif 000017
比較例１
ＰｙＢＯＰをＤＥＰＢＴ（１．５ｍｇ，５μｍｏｌ）又はＨＢＴＵ（１．９ｍｇ，５μｍｏｌ）に替えた以外は、実施例７と同様に操作し、ベンジルチオエステル体ＡｃＮＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯＳＢｎ（配列番号６）を得た。ＤＥＰＢＴを使用した場合の収率は１０％、ＨＢＴＵのそれは１０％未満であった。
比較例２
反応温度を３０℃とした以外は、実施例９と同様にしてベンジルチオエステル体ＡｃＮＨ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＣＯＳＢｎ（配列番号８）を得た。
ラセミ体の生成は４０％であった。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の方法によれば、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドであっても、その糖鎖構造に影響を与えることなく、更にペプチド側鎖の保護基を維持したＣ末端にカルボキシル基を有するペプチドを製造することが可能であり、更にペプチドＣ末端のラセミ化が殆ど生じていないチオエステル化合物を製造することができる。
得られたペプチドのチオエステル化合物を、Ｎ末端のアミノ酸がＣｙｓであるペプチドフラグメントと作用させることで高分子化することができ、単一構造の糖鎖を持つ大型の糖タンパク質の製造も可能となる。
【配列表】
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