(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が載置されるステージと、
前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
前記試料に向けて光を照射する光源と、
前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、
前記第２の撮像手段の撮像面に、前記第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、
前記第２の光路に配置され、前記撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、
前記領域制御手段は、前記ステージの走査速度と、前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域との間の間隔とに基づいて、前記第１の撮像領域での撮像から前記第２の撮像領域での撮像までの待ち時間を設定することを特徴とする画像取得装置。
【請求項２】
前記第２の撮像手段は、エリアセンサであることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
【請求項３】
前記光路差生成部材は、前記撮像面の少なくとも一部に重なるように配置された平板部材であり、
前記領域制御手段は、前記平板部材のエッジ部分による前記第２の光像の影を避けるように、前記平板部材に重なる領域と前記平板部材に重ならない領域とに前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とをそれぞれ設定することを特徴とする請求項２記載の画像取得装置。
【請求項４】
前記光路差生成部材は、前記撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有する部材であり、
前記領域制御手段は、前記光路差生成部材の厚みの異なる部分に重なるように前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とを設定することを特徴とする請求項２記載の画像取得装置。
【請求項５】
前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とは、別々のラインセンサによって構成されていることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
【請求項６】
前記試料に対峙する対物レンズと、
前記焦点制御手段による制御に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの位置を相対的に制御する対物レンズ制御手段とを備え、
前記対物レンズ制御部は、前記焦点制御手段による焦点位置の解析実行中は前記対物レンズの駆動を行わず、前記焦点制御手段による焦点位置の解析非実行中に前記対物レンズを前記試料に対して一方向に移動させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の画像取得装置。
【請求項７】
試料が載置されるステージと、
前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
前記試料に向けて光を照射する光源と、
前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、
前記第２の撮像手段の撮像面に、前記第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定し、
前記撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を前記第２の光路に配置し、
領域制御手段によって、前記ステージの走査速度と、前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域との間の間隔とに基づいて、前記第１の撮像領域での撮像から前記第２の撮像領域での撮像までの待ち時間を設定することを特徴とする画像取得装置のフォーカス方法。
【請求項８】
前記第２の撮像手段として、エリアセンサを用いることを特徴とする請求項７記載の画像取得装置のフォーカス方法。
【請求項９】
前記光路差生成部材として、前記撮像面の少なくとも一部に重なるように配置された平板部材を用い、
前記領域制御手段によって、前記平板部材のエッジ部分による前記第２の光像の影を避けるように、前記平板部材に重なる領域と前記平板部材に重ならない領域とに前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とをそれぞれ設定することを特徴とする請求項８記載の画像取得装置のフォーカス方法。
【請求項１０】
前記光路差生成部材として、前記撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有する部材を用い、
前記領域制御手段によって、前記光路差生成部材の厚みの異なる部分に重なるように前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とを設定することを特徴とする請求項８記載の画像取得装置のフォーカス方法。
【請求項１１】
前記第１の撮像領域と前記第２の撮像領域とを別々のラインセンサによって構成することを特徴とする請求項７記載の画像取得装置のフォーカス方法。
【請求項１２】
前記画像取得装置は、
前記試料に対峙する対物レンズと、
前記焦点制御手段による制御に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの位置を相対的に制御する対物レンズ制御手段とを備え、
前記対物レンズ制御手段によって、前記焦点制御手段による焦点位置の解析実行中は前記対物レンズの駆動を行わず、前記焦点制御手段による焦点位置の解析非実行中に前記対物レンズを前記試料に対して一方向に移動させることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項記載の画像取得装置のフォーカス方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料等の画像取得に用いられる画像取得装置及びそのフォーカス方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
画像取得装置として、例えば試料の撮像領域を予め複数の領域に分割し、各分割領域を高倍率で撮像した後、これらを合成するバーチャル顕微鏡装置がある。このようなバーチャル顕微鏡での画像取得では、従来、生体サンプルなどの試料の画像を取得する際の撮像条件として、試料の全領域を対象とする焦点マップが設定され、焦点マップに基づく焦点制御を行いつつ試料の画像取得が行われている。
【０００３】
焦点マップの作成には、まず、マクロ光学系を備える画像取得装置を用い、試料全体をマクロ画像として取得する。次に、取得したマクロ画像を用い、試料の撮像範囲を設定すると共に、撮像範囲を複数の分割領域に分割し、各分割領域に対して焦点取得位置を設定する。焦点取得位置の設定の後、ミクロ光学系を備える画像取得装置に試料を移し、設定された焦点取得位置における焦点位置を取得し、これらの焦点位置から焦点マップを作成する。
【０００４】
しかしながら、このような焦点マップを作成するにあたっては、処理に時間を要するという問題があった。また、取得する焦点の間隔や数を抑えれば処理に要する時間は短縮されるが、その場合にはフォーカス精度が低下するという問題があった。そのため、焦点位置を取得しつつ試料の高倍率画像を取得するダイナミックフォーカスの開発が進められている。この方式は、画像取得用の撮像装置に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）との光強度差或いはコントラスト差に基づいて現在の対物レンズの高さに対する焦点位置のずれ方向を検出し、ずれをキャンセルする方向に対物レンズを移動させて画像を取得する方式である。
【０００５】
例えば特許文献１に記載の顕微鏡システムでは、第１の撮像手段が撮像する領域よりも手前の領域を撮像する第２の撮像手段と、第２の撮像手段で撮像された画像に基づいて、第１の撮像手段の撮像位置での対物レンズの合焦位置を調整する自動合焦制御手段と、分割領域間の距離と試料の移動速度とに応じて、分割領域が第２の撮像手段の撮像位置から第１の撮像手段の撮像位置まで移動するタイミングと、第２の撮像手段で撮像された分割領域の結像位置を第１の撮像手段の撮像面に位置させるタイミングとを揃えるタイミング制御手段とが設けられている。また、例えば特許文献２，３に記載の顕微鏡装置では、ガラス部材を用いて焦点制御用の導光光学系内での光路長差を形成している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−０８１２１１号公報
【特許文献２】再公表特許ＷＯ２００５／１１４２８７号公報
【特許文献３】再公表特許ＷＯ２００５／１１４２９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した特許文献１に記載の顕微鏡システムでは、ハーフミラー及びミラーを用いることによって光路差光学系を形成し、第２の撮像手段の２つの撮像領域に対して光路長の異なる光をそれぞれ入射させている。この従来の顕微鏡システムでは、例えばラインセンサによって第１の撮像手段及び第２の撮像手段を構成している。ラインセンサでは露光時間が短いため、鮮明な画像を取得するために光量の確保が重要となるのに対し、この従来の顕微鏡システムでは、光路差光学系で光を分岐させているため、光量の確保が難しくなるという問題がある。また、ラインセンサの露光時間を考慮して第１の撮像手段及び第２の撮像手段による画像取得のタイミングを設定する必要がある。
【０００８】
本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる画像取得装置及びそのフォーカス方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題の解決のため、本発明に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、第２の撮像手段の撮像面に、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、第２の光路に配置され、撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、領域制御手段は、ステージの走査速度と、第１の撮像領域と第２の撮像領域との間の間隔とに基づいて、第１の撮像領域での撮像から第２の撮像領域での撮像までの待ち時間を設定することを特徴としている。
【００１０】
この画像取得装置では、第２の光路に光路差生成部材が配置されていることにより、第２の撮像手段の第１の撮像領域及び第２の撮像領域において、第１の撮像手段に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ撮像することができる。この画像取得装置では、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに光路長差を形成できるので、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段での撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置では、ステージの走査速度と、第１の撮像領域と第２の撮像領域との間の間隔（距離）とに基づいて、第１の撮像領域での撮像から第２の撮像領域での撮像までの待ち時間が設定される。したがって、試料の同じ位置からの光が第１の撮像領域と第２の撮像領域とに入射するため、焦点位置の制御を精度良く実施できる。
【００１１】
また、第２の撮像手段は、エリアセンサであることが好ましい。この場合、第１の撮像領域と第２の撮像領域とを好適に設定できる。また、装置の簡素化が図られる。
【００１２】
また、光路差生成部材は、撮像面の少なくとも一部に重なるように配置された平板部材であり、領域制御手段は、平板部材のエッジ部分による第２の光像の影を避けるように、平板部材に重なる領域と平板部材に重ならない領域とに第１の撮像領域と第２の撮像領域とをそれぞれ設定することが好ましい。この場合、平板部材を用いることで、光路差生成部材の構成を簡単化できる。また、平板部材のエッジ部分は、第２の撮像装置の撮像面における第２の光像の影を形成するので、影を避けて第１の撮像領域と第２の撮像領域を設定することで、焦点位置の制御の精度を担保できる。
【００１３】
また、光路差生成部材は、撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有する部材であり、領域制御手段は、光路差生成部材の厚みの異なる部分に重なるように第１の撮像領域と第２の撮像領域とを設定することが好ましい。この場合、第１の撮像領域の位置と第２の撮像領域の位置とを調整することで、前ピンと後ピンとの間隔を自在に調整できる。これにより、試料の焦点位置を精度良く検出することが可能となる。
【００１４】
第１の撮像領域と第２の撮像領域とは、別々のラインセンサによって構成されていることが好ましい。この場合、第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定に要する時間を短縮させることができる。
【００１５】
また、試料に対峙する対物レンズと、焦点制御手段による制御に基づいて、試料に対する対物レンズの位置を相対的に制御する対物レンズ制御手段とを備え、対物レンズ制御部は、焦点制御手段による焦点位置の解析実行中は対物レンズの駆動を行わず、焦点制御手段による焦点位置の解析非実行中に対物レンズを試料に対して一方向に移動させることが好ましい。焦点位置の解析中に対物レンズと試料との位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。
【００１６】
また、本発明に係る画像取得装置のフォーカス方法は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、第２の撮像手段の撮像面に、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定し、撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を第２の光路に配置し、領域制御手段によって、ステージの走査速度と、第１の撮像領域と第２の撮像領域との間の間隔とに基づいて、第１の撮像領域での撮像から第２の撮像領域での撮像までの待ち時間を設定することを特徴としている。
【００１７】
このフォーカス方法では、第２の光路に光路差生成部材が配置することにより、第２の撮像手段の第１の撮像領域及び第２の撮像領域において、第１の撮像手段に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ撮像することができる。このフォーカス方法では、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに光路長差を形成できるので、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段での撮像を行う際の光量を確保できる。また、このフォーカス方法では、ステージの走査速度と、第１の撮像領域と第２の撮像領域との間の間隔（距離）とに基づいて、第１の撮像領域での撮像から第２の撮像領域での撮像までの待ち時間を設定する。したがって、試料の同じ位置からの光が第１の撮像領域と第２の撮像領域とに入射するため、焦点位置の制御を精度良く実施できる。
【００１８】
また、第２の撮像手段として、エリアセンサを用いることが好ましい。この場合、第１の撮像領域と第２の撮像領域とを好適に設定できる。また、装置の簡素化が図られる。
【００１９】
また、光路差生成部材として、撮像面の少なくとも一部に重なるように配置された平板部材を用い、領域制御手段によって、平板部材のエッジ部分による第２の光像の影を避けるように、平板部材に重なる領域と平板部材に重ならない領域とに第１の撮像領域と第２の撮像領域とをそれぞれ設定することが好ましい。この場合、平板部材を用いることで、光路差生成部材の構成を簡単化できる。また、平板部材のエッジ部分は、第２の撮像装置の撮像面における第２の光像の影を形成するので、影を避けて第１の撮像領域と第２の撮像領域を設定することで、焦点位置の制御の精度を担保できる。
【００２０】
また、光路差生成部材として、撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有する部材を用い、領域制御手段によって、光路差生成部材の厚みの異なる部分に重なるように第１の撮像領域と第２の撮像領域とを設定することが好ましい。この場合、第１の撮像領域の位置と第２の撮像領域の位置とを調整することで、前ピンと後ピンとの間隔を自在に調整できる。これにより、試料の焦点位置を精度良く検出することが可能となる。
【００２１】
また、第１の撮像領域と第２の撮像領域とを別々のラインセンサによって構成することが好ましい。この場合、第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定に要する時間を短縮させることができる。
【００２２】
また、画像取得装置は、試料に対峙する対物レンズと、焦点制御手段による制御に基づいて、試料に対する対物レンズの位置を相対的に制御する対物レンズ制御手段とを備え、対物レンズ制御手段によって、焦点制御手段による焦点位置の解析実行中は対物レンズの駆動を行わず、焦点制御手段による焦点位置の解析非実行中に対物レンズを前記試料に対して一方向に移動させることが好ましい。この場合、焦点位置の解析中に対物レンズと試料との位置関係が変化しないので、焦点位置の解析精度を担保できる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。
【図２】本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。
【図３】第２の撮像装置を示す図である。
【図４】光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの一例を示す図である。
【図５】光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの別の例を示す図である。
【図６】光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの別の例を示す図である。
【図７】光路差生成部材の更なる変形例を示す図である。
【図８】画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。
【図９】試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離に一致している場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。
【図１０】試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも長い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。
【図１１】試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも短い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。
【図１２】ステージの走査時間に対する対物レンズと試料の表面との距離の関係を示す図である。
【図１３】ステージ制御部によるステージの走査方向の制御を示す図である。
【図１４】ステージ制御部によるステージの走査速度の制御を示す図である。
【図１５】画像取得装置の動作を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２６】
図１は、本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。また、図２は、本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。図１及び図２に示すように、画像取得装置Ｍは、試料Ｓのマクロ画像を取得するマクロ画像取得装置Ｍ１と、試料Ｓのミクロ画像を取得するミクロ画像取得装置Ｍ２とによって構成されている。画像取得装置Ｍは、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得したマクロ画像に対して例えばライン状の複数の分割領域４０（図１３参照）を設定し、各分割領域４０をミクロ画像取得装置Ｍ２で高倍率に取得して合成することにより、バーチャルマイクロ画像を生成する装置である。
【００２７】
マクロ画像取得装置Ｍ１は、図１に示すように、試料Ｓが載置されるステージ１を備えている。ステージ１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータによって水平方向に駆動するＸＹステージである。画像取得装置Ｍで観察する試料Ｓは、例えば細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ１に載置される。このステージ１をＸＹ面内で駆動させることにより、試料Ｓに対する撮像位置を移動させることができる。
【００２８】
ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１とミクロ画像取得装置Ｍ２との間を往復可能となっており、両装置間で試料Ｓを搬送する機能を有している。なお、マクロ画像取得においては、試料Ｓの全体画像を１度の撮像で取得してもよく、試料Ｓを複数の領域に分割して撮像してもよい。また、ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１及びミクロ画像取得装置Ｍ２の双方にそれぞれ設けておいてもよい。
【００２９】
ステージ１の底面側には、試料Ｓに向けて光を照射する光源２と、光源２からの光を試料Ｓに集光する集光レンズ３とが配置されている。光源２は、試料Ｓに向けて斜めに光を照射するように配置されていてもよい。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系４と、試料Ｓの光像を撮像する撮像装置５とが配置されている。導光光学系４は、試料Ｓからの光像を撮像装置５の撮像面に結像させる結像レンズ６を有している。また、撮像装置５は、例えば２次元画像を取得可能なエリアセンサである。撮像装置５は、導光光学系４を経て撮像面に入射した試料Ｓの光像の全体画像を取得し、後述のバーチャルマイクロ画像格納部３９に格納する。
【００３０】
ミクロ画像取得装置Ｍ２は、図２に示すように、ステージ１の底面側にマクロ画像取得装置Ｍ１と同様の光源１２及び集光レンズ１３を有している。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系１４が配置されている。光源１２からの光を試料Ｓに照射させる光学系には、試料Ｓに励起光を照射するための励起光照射光学系や試料Ｓの暗視野画像を取得するための暗視野照明光学系を採用してもよい。
【００３１】
導光光学系４は、試料Ｓと対峙して配置された対物レンズ１５と、対物レンズ１５の後段に配置されたビームスプリッタ（光分岐手段）１６とを有している。対物レンズ１５には、ステージ１の載置面に直交するＺ方向に対物レンズ１５を駆動するステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータが設けられている。これらの駆動手段によって対物レンズ１５のＺ方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点位置が調整可能になっている。なお、焦点位置の調整は、ステージ１のＺ方向の位置を変えてもよく、対物レンズ１５及びステージ１の双方のＺ方向の位置を変えてもよい。
【００３２】
ビームスプリッタ１６は、試料Ｓの光像を画像取得用の第１の光路Ｌ１と焦点制御用の第２の光路Ｌ２とに分岐する部分である。このビームスプリッタ１６は、光源１２からの光軸に対しておよそ４５度の角度で配置されており、図２において、ビームスプリッタ１６を通過する光路が第１の光路Ｌ１となっており、ビームスプリッタ１６で反射する光路が第２の光路となっている。
【００３３】
第１の光路Ｌ１には、ビームスプリッタ１６を通過した試料Ｓの光像（第１の光像）を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７の結像位置に撮像面を配置した第１の撮像装置（第１の撮像手段）１８とが配置されている。第１の撮像装置１８は、試料Ｓの第１の光像による１次元画像（第１の画像）を取得可能な装置であり、例えばＴＤＩ（Ｔｉｍｅ  Ｄｅｌａｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）駆動が可能な２次元ＣＣＤセンサやラインセンサが用いられる。また、ステージ１を一定の速度で制御しながら、試料Ｓの画像を順次取得する方式であれば、第１の撮像装置１８は、ＣＭＯＳセンサやＣＣＤセンサなどの２次元画像を取得可能な装置であってもよい。第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像は、レーンバッファなどの一時保存メモリに順次保存された後、圧縮されて後述の画像生成部３８に出力される。
【００３４】
一方、第２の光路Ｌ２には、ビームスプリッタ１６で反射した試料の光像（第２の光像）を縮小する視野調整レンズ１９と、第２の撮像装置（第２の撮像手段）２０とが配置されている。また、第２の撮像装置２０の前段には、第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１が配置されている。視野調整レンズ１９は、第２の光像が第１の光像と同程度の大きさで第２の撮像装置２０に結像するように構成されていることが好ましい。
【００３５】
第２の撮像装置２０は、試料Ｓの第２の光像による２次元画像（第２の画像）を取得可能な装置であり、例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）やＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）などのセンサが用いられる。また、ラインセンサを用いてもよい。
【００３６】
第２の撮像装置２０の撮像面２０ａは、第２の光路Ｌ２に直交するＸＺ面と略一致するように配置されている。この撮像面２０ａには、図３に示すように、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂが設定されている。第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂは、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（走査方向：Ｚ方向）に対して垂直となる向きに設定される。第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとは、所定の間隔をもって設定されており、いずれも第２の光像の一部をライン状に取得する。これにより、第１の撮像装置１８で取得される試料Ｓの第１の光像と同じ領域の光像を第２の光像として第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂで取得できる。なお、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを別々のラインセンサを用いて設定してもよい。この場合、各ラインセンサを別々に制御することで、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定に要する時間を短縮させることができる。
【００３７】
光路差生成部材２１は、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせるガラス部材である。図４に示す例では、光路差生成部材２１Ａは、断面三角形のプリズム状をなしており、撮像面２０ａのＺ方向の中央部分に頂部が略一致するように配置されている。したがって、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、撮像面２０ａにおけるＺ方向の中央部分で最も光路が長くなり、撮像面２０ａにおけるＺ方向の両端部分に向かうほど光路が短くなる。また、光路差生成部材２１は、第２の撮像装置２０と対向する面が第２の撮像装置の撮像面（受光面）２０ａと平行となるように配置されることが好ましい。これにより、第２の撮像装置２０と対向する面による光の屈折を低減でき、第２の撮像装置２０で受光する光量を確保することができる。
【００３８】
これにより、第２の撮像装置２０では、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置に基づいて、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とを取得できる。本実施形態では、例えば第１の撮像領域２２Ａが前ピンとなり、第２の撮像領域２２Ｂが後ピンとなるように第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置とが設定される。前ピンと後ピンとの間のフォーカス差は、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ１及び屈折率と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ２及び屈折率との差に依存する。
【００３９】
なお、光路差生成部材は、撮像面２０ａの面内方向に沿って厚みが変化する部分を有する部材のほか、図５（ａ）に示すように、平板形状のガラス部材で形成された光路差生成部材２１Ｂを用いることもできる。この場合、図５（ｂ）に示すように、撮像面２０ａにおけるＺ方向の下半分領域が光路差生成部材２１Ｂに重なるようにし、第１の撮像領域２２Ａを撮像面２０ａの上半分領域に設定し、第２の撮像領域２２Ｂを撮像面２０ａの下半分領域に設定することで、光路差生成部材２１Ｂの厚さ及び屈折率に応じて前ピンと後ピンとの間のフォーカス差を形成できる。
【００４０】
また、この場合、光路差生成部材２１Ｂのエッジ部分Ｅは、撮像面２０ａにおける第２の光像の影２３を形成するおそれがある。したがって、図５（ｂ）に示すように、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄを影２３の幅よりも広くし、影２３を避けた位置に第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを設定することが好適である。
【００４１】
さらに、図６（ａ）に示すように、Ｚ方向の長さが異なる複数の平板形状のガラス部材を重ね合わせた光路差生成部材２１Ｃを用いることもできる。この場合も、図６（ｂ）に示すように、撮像面２０ａにおけるＺ方向の下半分領域が光路差生成部材２１Ｃに重なるようにし、第１の撮像領域２２Ａを撮像面２０ａの上半分領域に設定し、第２の撮像領域２２Ｂを撮像面２０ａの下半分領域に設定することで、光路差生成部材２１Ｃの厚さ及び屈折率に応じて前ピンと後ピンとの間のフォーカス差を形成できる。
【００４２】
この場合も、光路差生成部材２１Ｃのエッジ部分Ｅは、撮像面２０ａにおける第２の光像の影２３を形成するおそれがある。したがって、図６（ｂ）に示すように、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄを影２３の幅よりも広くし、影２３を避けた位置に第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを設定することが好適である。
【００４３】
その他、図７（ａ）に示すように、断面直角三角形のプリズム状をなす光路差生成部材２１Ｄを、Ｚ方向に進むにつれて厚さが増加するように配置してもよく、図７（ｂ）に示すように、図５と同様の平板形状の光路差生成部材２２Ｅを、撮像面２０ａのＺ方向の中心に一致するように配置してもよい。図７（ｂ）の場合、光路差生成部材２２Ｅの２つのエッジ部分Ｅが撮像面２０ａに投影されるので、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄを影２３の幅よりも広くし、これら２つの影２３を避けた位置に第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを設定することが好適である。
【００４４】
図８は、画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。同図に示すように、画像取得装置Ｍは、ＣＰＵ、メモリ、通信インタフェイス、ハードディスクといった格納部、キーボードなどの操作部３１、モニタ３２等を備えたコンピュータシステムを備え、制御部３３の機能的な構成要素として、焦点制御部３４と、領域制御部３５と、対物レンズ制御部３６と、ステージ制御部３７と、画像生成部３８と、バーチャルマイクロ画像格納部３９とを備えている。
【００４５】
焦点制御部３４は、第２の撮像装置２０で取得した第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御する部分である。より具体的には、焦点制御部３４は、まず、第２の撮像装置２０において、第１の撮像領域２２Ａで取得した画像のコントラスト値と、第２の撮像領域２２Ｂで取得した画像のコントラスト値との差分を求める。
【００４６】
ここで、図９に示すように、試料Ｓの表面に対して対物レンズ１５の焦点位置が合っている場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値と第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値とが略一致し、これらの差分値はほぼゼロとなる。
【００４７】
一方、図１０に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも長い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が大きくなり、これらの差分値はプラスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに近づける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。
【００４８】
また、図１１に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも短い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が小さくなり、これらの差分値はマイナスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに遠ざける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。
【００４９】
領域制御部３５は、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置を制御する部分である。領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、予め設定された位置にまず第１の撮像領域２２Ａを設定し、第１の撮像領域２２Ａでの撮像が行われた後、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除する。次に、第１の撮像領域２２ＡからＺ方向（走査方向）に所定の間隔をもって第２の撮像領域２２Ｂを設定し、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が行われた後、第２の撮像領域２２Ｂの設定を解除する。
【００５０】
このとき、第１の撮像領域２２Ａでの撮像から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像までの待ち時間Ｗは、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄと、ステージ１の走査速度ｖに基づいて設定される。例えば、待ち時間Ｗを第１の撮像領域２２Ａでの撮像開始から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像開始までの時間Ｗ１とすると、第１の撮像領域２２Ａでの撮像の露光時間ｅｌ、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔを考慮して、Ｗ１＝ｄ／ｖ−ｅｌ−ｓｔで求めることができる。
【００５１】
また、待ち時間Ｗを第１の撮像領域２２Ａでの撮像開始から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像完了までの待ち時間Ｗ２とすると、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔを考慮して、Ｗ２＝ｄ／ｖ−ｓｔで求めることができる。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄは、光路差生成部材２１によって生じる光路長差に基づいて設定される。ただし、この間隔ｄは、実際には試料Ｓのスライド上の距離に対応しており、最終的には間隔ｄを第２の撮像領域２２Ｂの画素数に変換する必要がある。第２の撮像装置２０の画素サイズをＡＦｐｓｚ、倍率をＡＦｍａｇとした場合、間隔ｄに対応する画素数ｄｐｉｘは、ｄｐｉｘ＝ｄ÷（ＡＦｐｓｚ／ＡＦｍａｇ）で求められる。
【００５２】
また、領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置の少なくとも一方を撮像面２０ａの面内の走査方向（ここではＺ方向）に沿って変更することができる。この場合、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置のいずれか一方のみを変更してもよく、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄを維持したまま、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。
【００５３】
第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置を変更することにより、例えば図４に示したようなプリズム状の光路差生成部材２１Ａを用いる場合には、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ１と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ２とを変化させることができる。これにより、前ピン及び後ピンの間隔が変わり、コントラスト値の差分を求める際の分解能を調整できる。また、例えば図６に示したような平板状のガラス部材を重ねてなる光路差生成部材２１Ｃを用いる場合にも、第２の撮像領域２２Ｂの位置をガラス厚の異なる位置に切り替えることで、前ピンと後ピンとの間のフォーカス差を段階的に切り替えることができる。
【００５４】
対物レンズ制御部３６は、対物レンズ１５の駆動を制御する部分である。対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４から出力される指示情報を受け取ると、指示情報の内容に従って、対物レンズ１５をＺ方向に駆動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ１５の焦点位置が調整される。
【００５５】
なお、対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４による焦点位置の解析中は対物レンズ１５の駆動は行わず、また、次の焦点位置の解析が開始されるまで、対物レンズ１５をＺ方向に沿って一方向にのみ駆動させる。図１２は、ステージの走査時間に対する対物レンズと試料の表面との距離の関係を示す図である。同図に示すように、試料Ｓの走査中は、焦点位置の解析期間Ａと、解析結果に基づく対物レンズ駆動期間Ｂとが交互に生じることとなる。このように、焦点位置の解析中に対物レンズ１５と試料Ｓとの位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。
【００５６】
ステージ制御部３７は、ステージ１の駆動を制御する部分である。より具体的には、ステージ制御部３７は、操作部３１からの操作に基づき、試料Ｓが載置されたステージ１を所定の速度で走査させる。このステージ１の走査により、第１の撮像装置１８及び第２の撮像装置２０での試料Ｓの撮像視野が相対的に順次移動する。ステージ１の走査方向は、図１３（ａ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了する度にステージ１の位置を走査開始位置まで戻してから次の分割領域４０を同一方向に走査する一方向走査であってもよく、図１３（ｂ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了した後、ステージ１を走査方向と直交する方向に移動させて次の分割領域４０を反対方向に走査する双方向走査であってもよい。
【００５７】
また、画像取得の間のステージ１の走査速度は一定であるが、実際には走査の開始直後にステージ１の振動等の影響によって走査速度が不安定な期間が存在する。このため、図１４に示すように、分割領域４０よりも長い走査幅を設定し、ステージ１が加速する加速期間Ｃ、ステージ１の走査速度が安定化するまでの安定化期間Ｄ、及びステージ１が減速する減速期間Ｆのそれぞれが、分割領域４０よりも外側を走査しているときに生じるようにすることが好ましい。これにより、ステージ１の走査速度が一定となる一定速度期間Ｅに合わせて画像取得を行うことが可能となる。なお、安定化期間Ｄ中に撮像を開始し、画像取得後に安定化期間Ｄ中に取得したデータ部分を削除するようにしてもよい。このような手法は、データの空読みが必要な撮像装置を用いる場合に好適である。
【００５８】
画像生成部３８は、取得した画像を合成してバーチャルマイクロ画像を生成する部分である。画像生成部３８は、第１の撮像装置１８から出力される第１の画像、すなわち、各分割領域４０の画像を順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の画像を合成する。そして、この合成画像に基づいてこれよりも低い解像度の画像を作成し、高解像度の画像と低解像度の画像とを関連付けてバーチャルマイクロ画像格納部３９に格納する。バーチャルマイクロ画像格納部３９では、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得した画像も更に関連付けてもよい。バーチャルマイクロ画像は、１枚の画像として格納してもよく、複数に分割された画像として格納してもよい。
【００５９】
続いて、上述した画像取得装置Ｍの動作について説明する。
【００６０】
図１５は、画像取得装置Ｍの動作を示すフローチャートである。同図に示すように、画像取得装置Ｍでは、まず、マクロ画像取得装置Ｍ１による試料Ｓのマクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０１）。取得したマクロ画像は、例えば所定の閾値を用いて二値化された後、モニタ３２に表示され、所定のプログラムを用いた自動設定又は操作者による手動設定により、マクロ画像の中からミクロ画像を取得する範囲が設定される（ステップＳ０２）。
【００６１】
次に、試料Ｓがミクロ画像取得装置Ｍ２側に移送され、焦点取得条件の設定がなされる（ステップＳ０３）。ここでは、上述したように、ステージ１の走査速度ｖと、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄとに基づいて、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が開始されるまでの待ち時間Ｗを設定する。より好ましくは、第１の撮像領域２２Ａでの撮像の露光時間ｅｌ、及び第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔ等を考慮する。
【００６２】
焦点取得条件を設定した後、ステージ１の走査を開始し、ミクロ画像取得装置Ｍ２による試料Ｓの各分割領域４０ごとのミクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０４）。第１の撮像装置１８でのミクロ画像の取得の際、第２の撮像装置２０では第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂによって前ピンのコントラスト値と後ピンのコントラスト値の差分に基づいて試料Ｓに対する対物レンズ１５のずれ方向が解析され、対物レンズ１５の位置の調整がリアルタイムで実行される。全ての分割領域４０についてミクロ画像の取得が完了した後、取得したミクロ画像が合成され、バーチャルマイクロ画像が生成される（ステップＳ０５）。
【００６３】
以上説明したように、画像取得装置Ｍでは、第２の光路Ｌ２に光路差生成部材２１（２１Ａ〜２１Ｅ）が配置されていることにより、第２の撮像装置２０の第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂにおいて、第１の撮像装置１８に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ撮像することができる。この画像取得装置Ｍでは、焦点制御用の第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに、光路長差を形成できるため、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を十分に確保できる。また、この画像取得装置Ｍでは、ステージの走査速度ｖと、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄとに基づいて、第１の撮像領域２２Ａでの撮像から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像までの待ち時間Ｗが設定される。したがって、試料Ｓの同じ位置からの光が第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとに入射するため、対物レンズ１５の焦点位置の制御を精度良く実施できる。
【００６４】
本実施形態の光路差生成部材として、第２の撮像装置２０における撮像面２０ａの面内方向に沿って厚みが変化する部分を有するガラス部材からなる光路差生成部材２１（２１Ａ，２１Ｄ）を用いる場合、領域制御部３５によって第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置とを調整することで、前ピンと後ピンとの間隔を自在に調整できる。これにより、例えば第２の撮像装置２０で撮像した画像のコントラストのピークが複数存在する場合やピーク形状が平らである場合などに、前ピンと後ピンとのフォーカス差を調整することによって試料Ｓの焦点位置を精度良く検出することが可能となる。
【００６５】
また、本実施形態の光路差生成部材として、平板形状のガラス部材からなる光路差生成部材２１（２１Ｂ，２１Ｃ，２１Ｅ）を用いる場合には、光路差生成部材２１の構成を簡単化できる。この場合、平板部材のエッジ部分Ｅは、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第２の光像の影２３を形成するので、影２３を避けて第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂを設定することで、対物レンズ１５の焦点位置の制御の精度を担保できる。
【００６６】
上述した実施形態では、バーチャルマイクロ画像を生成する装置を例示したが、本発明に係る画像取得装置は、ステージ等によって試料を所定の速度で走査しながら画像を取得する装置であれば、種々の装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００６７】
１…ステージ、１２…光源、１４…導光光学系、１５…対物レンズ、１６…ビームスプリッタ（光分岐手段）、１８…第１の撮像装置（第１の撮像手段）、２０…第２の撮像装置（第２の撮像手段）、２０ａ…撮像面、２１（２１Ａ〜２１Ｅ）…光路差生成部材、２２Ａ…第１の撮像領域、２２Ｂ…第２の撮像領域、３４…焦点制御部（焦点制御手段）、３５…領域制御部（領域制御手段）、３６…対物レンズ制御部（対物レンズ制御手段）、Ｅ…エッジ部分、Ｌ１…第１の光路、Ｌ２…第２の光路、Ｍ…画像取得装置、Ｍ１…マクロ画像取得装置、Ｍ２…ミクロ画像取得装置、Ｓ…試料。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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