(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糠の存在下、米原料醸造物に発酵処理を施す工程を含み、前記米原料醸造物が液化酒粕であることを特徴とする免疫調節剤の製造方法。
【請求項２】
前記発酵処理が、乳酸菌および酵母の少なくとも一方を用いた発酵処理である、請求項１記載の免疫調節剤の製造方法。
【請求項３】
前記米原料醸造物が、さらに、γ−アミノ酪酸を含む、請求項１または２記載の免疫調節剤の製造方法。
【請求項４】
前記米原料醸造物が、さらに、グルタミン酸またはその塩を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節剤の製造方法。
【請求項５】
前記糠が、赤糠である、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫調節剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節剤およびそれを含む抗アレルギー剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国においては、近年、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎等、種々のアレルギーが大きな問題となっている。中でも花粉症は、国民病といわれるまでに増加し、社会的・経済的な損失が問題視されている。また、食物アレルギー等も増加傾向にあり、例えば、合成着色料、発色剤、漂白剤、合成香料、保存料等の添加物による影響が懸念されている。そこで、このようなアレルギーの発症を予防・治療するために、環境改善や、食物の原材料表示等の対策と並行して、アレルギーに有効な医薬品の開発が試みられている。
【０００３】
しかしながら、医薬品は、一般的に、人為的に設計され合成された有機化合物が主であるため（非特許文献１参照）、例えば、副作用の問題が懸念され、実際に個人によっては副作用から使用できない場合もある。このため、アレルギーの予防や治療に有効な、安全性に優れた物質の提供が求められている。
【非特許文献１】“抗アレルギー剤によるアナフィラキシーショックの１例”、生井晴彦、月刊臨床と研究、７５巻３号、１１５−１１６ｐｐ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、例えば、アレルギーの予防や治療に使用できる、食経験を有し安全性に優れる新たな物質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の免疫調節剤は、米原料醸造物を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤および本発明の抗アレルギー剤は、本発明の免疫調節剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、米を原料とする醸造物によれば、免疫調節が可能であることを見出し、本発明に到った。このような米原料醸造物を含む本発明の免疫調節剤によれば、例えば、アレルギー疾患の一因であるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの崩れを抑制したり、正常化するように調節することが可能である。このため、本発明の免疫調節剤は、前述のような各種アレルギー疾患に対する抗アレルギー剤として使用することができる。特に、米原料醸造物は、長年の食歴により安全性が十分に裏付けられていることからも、例えば、合成の医薬品等が抱える副作用等の問題も回避できる可能性が高く、極めて有用といえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜免疫調節剤＞
本発明の免疫調節剤は、前述のように、米原料醸造物を含むことを特徴とする。本発明の免疫調節剤は、例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスを調節できることから、後述するようにＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤として使用できる。また、本発明の免疫調節剤は、免疫調節によって抗アレルギー効果を示すことから、後述するように、本発明の抗アレルギー剤として使用できる。
【０００９】
また、本発明の免疫調節剤は、例えば、サイトカイン産生を抑制する機能を有することから、例えば、サイトカイン産生抑制剤として使用できる。前記サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αがあげられる。また、本発明の免疫調節剤は、例えば、ＩｇＥ産生を抑制する機能を有することから、例えば、ＩｇＥ産生抑制剤としても使用できる。なお、本発明における米原料醸造物は、長年の食歴があり、その安全性は十分に証明されていることから、極めて安全性に優れているといえる。
【００１０】
本発明において、前記米原料醸造物の種類は、特に制限されず、米を原料とした醸造物であればよい。具体例としては、例えば、酒、味りん、味噌、醤油等、または、これらの製造過程で発生する糠や粕等の副産物等があげられる。中でも、清酒の副産物である酒粕が好ましく、例えば、一般の酒粕や、液化酒粕等があげられる。前記液化酒粕とは、例えば、液化酵素で液化した原料米をアルコール発酵することによって製造する清酒製造において生成する酒粕である（今安  聰ら：日本農芸化学会誌、第６３号、第９７１頁、１９８９年、特開昭５９−６６８７５号）。前記醸造物の原料である米の種類も何ら制限されない。本発明において、米原料醸造物の種類は、何ら制限されず、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。なお、本発明における米原料醸造物とは、例えば、前述の酒等の主産物や、酒粕等の副産物の他に、前記主産物や副産物をさらに処理した物、例えば、後述のように、前記主産物や副産物にさらなる発酵処理を施した物等も含まれる。
【００１１】
本発明における免疫調節剤は、例えば、γ−アミノ酪酸（以下、「ＧＡＢＡ」ともいう）を含むことが好ましい。これによって、より優れた効率でＴｈ１／Ｔｈ２バランスの調節が実現できる。前記γ−アミノ酪酸は、一般的に、４つの異性体が知られているが、本発明においては、いずれであってもよく、また、同様の効果を奏する限り、γ−アミノ酪酸の誘導体であってもよい。本発明の免疫調節剤に含まれるγ−アミノ酪酸は、例えば、化学的に合成された物質でもよいし、遺伝子工学的に生産された物質でもよいし、天然物であってもよい。本発明においては、例えば、後述するように、前記米原料醸造物に対してさらに発酵処理を施すことによって、前記米原料醸造物中にγ−アミノ酪酸を生化学的に含有させることが特に好ましい。この場合、例えば、発酵処理によって生成させたγ−アミノ酪酸を、本発明における米原料醸造物に添加してもよいが、コスト面や労力を低減し、効率良くγ−アミノ酪酸を含有できることから、米原料醸造物に前記発酵処理を施すことで、前記醸造物中にγ−アミノ酪酸を生成させることが好ましい。
【００１２】
本発明の免疫調節剤におけるγ−アミノ酪酸の含有量は、特に制限されないが、米原料醸造物１ｇあたり、例えば、１ｍｇ以上が好ましく、より好ましくは５ｍｇ以上であり、特に好ましくは１０ｍｇ以上である。また、γ−アミノ酪酸の含有量の上限は、特に制限されない。
【００１３】
本発明において、前記米原料醸造物は、例えば、前述のような理由から、さらに、発酵処理を施された醸造物であることが好ましい。ここで、さらなる発酵処理とは、例えば、酒等の製造工程において得られた酒や酒粕等に、前記製造工程後、さらに施す発酵処理を意味する。前記発酵処理は、特に制限されないが、例えば、乳酸菌や酵母を用いた発酵処理があげられ、中でも、乳酸菌を用いた発酵処理が好ましい。前記乳酸菌としては、特に制限されないが、例えば、γ−アミノ酪酸生成能を有するものが好ましく、Lactobacillus属、Leuconostoc属、Streptococcus属、Pediococcus属、および、Bifidobacterium属等の菌体があげられる。中でも、Lactobacillus属菌体が好ましく、具体例として、Lactobacillus brevis、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus lactis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、および、Lactobacillus fermentum等があげられる。これらの中でも、特に、Lactobacillus brevisに属する菌体が好ましい。前記発酵処理において使用する乳酸菌および酵母は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上であってもよく、また、乳酸または酵母のみを使用してもよいし、乳酸および酵母の両方を使用してもよい。
【００１４】
前記米原料醸造物の発酵処理の条件は、例えば、乳酸菌や酵母等が生育できる条件であればよく、特に制限されない。発酵温度は、例えば、１５〜４５℃が好ましく、より好ましくは、３０〜４０℃であり、発酵時間は、例えば、１６〜７２時間が好ましく、より好ましくは、２０〜５０時間である。また、発酵処理時の前記米原料醸造物の形態は、例えば、固体および液体のいずれでもよいが、効率良く発酵処理を行えることから、液体状態が好ましい。前記米原料醸造物が、前述の酒粕等のように固体の場合は、例えば、溶媒に米原料醸造物を懸濁した後、発酵処理を行うことが好ましい。前記米原料醸造物の体積に対する溶媒の割合は、特に制限されないが、例えば、米醸造物の体積に対して、０．５〜１０倍量の溶媒を添加することが好ましく、より好ましくは、１〜５倍である。前記溶媒の種類は、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、酸水溶液、アルカリ水溶液等が好ましい。また、前記米原料醸造物が懸濁された懸濁液のｐＨは、例えば、ｐＨ３〜９であることが好ましく、より好ましくはｐＨ５〜７である。また、液体の米原料醸造物についても、例えば、必要に応じて、溶媒と混合した後に、発酵処理を行ってもよい。
【００１５】
前記発酵処理には、例えば、予め前培養をしておいた乳酸菌や酵母を使用することが好ましい。発酵処理の対象が、例えば、液体の米原料醸造物や懸濁液等の場合、乳酸菌や酵母の添加量は、特に制限されないが、例えば、１０５〜１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることが好ましく、より好ましくは、１０６〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。
【００１６】
前記発酵処理の際には、例えば、乳酸菌や酵母の生育を促進するために、前記米原料醸造物に、さらに、グルコース等の糖類を添加しておくことが好ましい。前記米原料醸造物が前述の酒粕等のように固体の場合は、例えば、溶媒に前記米原料醸造物を懸濁した後、この懸濁液に前記糖類を添加してもよいが、固体の米原料醸造物に前記糖類を添加して、ミキサーやグラインダー等を用いて粉砕混合した後に、液体に懸濁することが好ましい。前記米原料醸造物（例えば、酒粕）に対する前記糖類の添加量は、特に制限されないが、例えば、米原料醸造物１００重量％に対して、例えば、０〜１０重量％であり、好ましくは、０．５〜５重量％である。
【００１７】
前記米原料醸造物は、さらに、米糠等の糠、または、グルタミン酸もしくはその塩を含んでもよい。前記米糠としては、例えば、赤糠、中糠、白糠等があげられるが、中でも、米の赤糠が好ましい。本発明においては、これらを含有した状態で、前述のような発酵処理が施された前記米原料醸造物であることが特に好ましい。これらの存在下で前記発酵処理を施すことによって、例えば、前記醸造物中で、より優れた効率でγ−アミノ酪酸が生成するため、前記醸造物中にγ−アミノ酪酸をより優れた効率で含有させることができる。なお、これらの存在下で前記発酵処理を施した場合、前記発酵処理後の前記米原料醸造物には、例えば、添加した糠やグルタミン酸等が残存してもよいし、残存していなくてもよい。
【００１８】
前記米原料醸造物に対する糠の添加割合は、特に制限されないが、米原料醸造物１００重量％に対して、例えば、０〜５０重量％であり、好ましくは、２〜２０重量％である。また、前記米原料醸造物に対するグルタミン酸またはその塩の添加量は、特に制限されないが、例えば、０〜３０重量％であり、好ましくは、１〜１５重量％である。
【００１９】
本発明の免疫調節剤の製造に使用する前記米原料醸造物の形態は、特に制限されず、例えば、液体でも固体でもよい。すなわち、前記米原料醸造物が固体の場合、例えば、そのまま使用してもよいし、粉砕や凍結乾燥等により粉末にして使用してもよく、また、溶媒に溶解または懸濁して使用してもよい。また、前記米原料醸造物が液体の場合、例えば、そのまま使用してもよいし、濃縮して使用してもよいし、凍結乾燥等により粉末にして使用してもよい。
【００２０】
本発明の免疫調節剤は、前述のような米原料醸造物を含んでいればよいが、さらに、例えば、薬学的に許容可能な添加物等を含んでいても良い。前記添加物としては、例えば、後述する剤形に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、保存剤、等張剤等の従来公知の添加物が選択できる。前記賦形剤としては、特に制限されないが、具体例として、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン類、結晶セルロース等のセルロース類、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の無機塩類等があげられる。結合剤としては、特に制限されないが、具体例として、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等があげられる。前記崩壊剤としては、特に制限されないが、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等があげられる。前記潤沢剤としては、特に制限されないが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などがあげられる。前記付湿剤としては、特に制限されないが、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等があげられる。前記矯味矯臭剤としては、特に制限されないが、例えば、甘味料、酸味料、香料等があげられ、具体例として、例えば、白糖、グルコース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ケイヒ油、ハッカ油、メントール等があげられる。
【００２１】
本発明の免疫調節剤における前記米原料醸造物の含有量は、特に制限されず、例えば、前記米原料醸造物の種類や形態に応じて適宜決定できる。具体例として、前記米原料醸造物が酒粕の場合、例えば、一日の摂取量が、１００ｍｇ〜１００ｇとなるように設定されていることが好ましく、より好ましくは1ｇ〜３０ｇである。
【００２２】
本発明の免疫調節剤の形態は、特に制限されず、例えば、溶液状、固形状、粉末状、溶媒に前記米原料醸造物を分散させた状態であってもよい。具体的な剤形としては、例えば、投与方法に応じて、錠剤、丸剤、細粒剤（散剤を含む）、顆粒剤、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等の経口投与剤、注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等があげられる。これらの各剤形に応じて、例えば、適した添加剤や基材等を使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従って製造できる。
【００２３】
本発明の免疫調節剤の使用方法は、何ら制限されず、例えば、アレルギー疾患により免疫系のバランスが崩れている検体や崩れる可能性のある検体、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが崩れている検体や崩れる可能性のある検体等に投与することが好ましい。これによって、例えば、検体におけるアレルギー症状の発生を予防したり、発生したアレルギーの症状を緩和したり、アレルギー体質を改善または治療することが可能となる。
【００２４】
本発明の免疫調節剤の検体への投与方法は、何ら制限されず、例えば、前述のように経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。
【００２５】
また、本発明の免疫調節剤は、例えば、食品、食品添加剤、栄養補助剤（サプリメント）等として使用することもできる。なお、免疫調節剤を、例えば、食品添加剤や栄養補助剤として使用する場合、その形態は、何ら制限されず、前述と同様の形態で使用できる。前記食品添加剤として使用する際、添加対象の食品は、何ら制限されず、例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、アイスクリーム、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭等の菓子；酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料；ヨーグルト、バター、チーズのような乳製品；ハム、ソーセージ、蒲鉾、竹輪のような練り物加工品；ソース、ドレッシング、マヨネーズ、醤油、味噌、酢、味りん、トマト加工品（ケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ）、カレールウ、酒粕、顆粒だし等の調味料；ふりかけ、漬物、佃煮、塩昆布のような常備惣菜類；惣菜；麺、米飯、粥等の主食類等があげられる。また、前記免疫調節剤は、前記食品添加剤として、予め、これらの食品に添加されてもよいし、飲食時に添加されてもよい。
【００２６】
＜Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤＞
本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤は、前述のように、本発明の免疫調節剤を含むことを特徴とする。本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤は、このように免疫調節剤として、前述の米原料醸造物を含んでいればよく、その他の構成や形態等は、何ら制限されない。具体的に、本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤は、例えば、前記本発明の免疫調節剤と同様の構成や形態があげられ、同様にして使用できる。
【００２７】
Ｔｈ１およびＴｈ２は、それぞれヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）に属し、機能上、Ｔｈ１型とＴｈ２型に分類されている。Ｔｈ１（Ｔｈ１型ヘルパーＴ細胞）は、主に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）やインターフェロン（ＩＦＮ）−γ等のサイトカインを放出して、キラーＴ細胞活性化、ならびに、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３産生を促進し、細胞性免疫を活性化する役割を担っている。一方、Ｔｈ２（Ｔｈ２型ヘルパーＴ細胞）は、主に、ＩＬ−４やＩＬ−５等のサイトカインを放出して、肥満細胞活性化、好酸球遊走、ならびに、ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＡ産生を促進し、体液性免疫を活性化する役割を担っている。そして、Ｔｈ１の放出するサイトカインは、Ｔｈ２の活性化を、Ｔｈ２の放出するサイトカインは、Ｔｈ１の活性化を、それぞれコントロールしている。このように、生体内では、この二つのヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）が、相互にバランスを保つことで、免疫応答が制御されている。このようなＴｈ１とＴｈ２とのバランスは、「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス」と呼ばれている。しかしながら、このＴｈ１／Ｔｈ２バランスが傾くと、アレルギー体質に陥りやすいことが知られている。例えば、Ｔｈ２が優位になると、Ｔｈ２が放出するサイトカインによって、Ｔｈ１の増殖が抑制され、Ｔｈ２によるＩｇＥ等の抗体産生が過剰に行われ、アレルギー反応を起こす。本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤によれば、このバランスの傾きを防止したり、正常なバランスへの調節が可能である。具体例としては、例えば、アレルギー患者におけるＴｈ２側へシフトしたバランスを、Ｔｈ１側に調節することが可能である。したがって、本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤によれば、例えば、アレルギーの予防または治療に有効な抗アレルギー剤としての使用も可能である。
【００２８】
なお、本発明におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤、すなわち前述の米原料醸造物については、例えば、刺激により増加する各種炎症系サイトカインの産生抑制、Ｔｈ２側へのシフトにより増加する抗体（例えばＩｇＥ）の産生抑制が確認されている。このことから、本発明のＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節剤が、Ｔｈ１／Ｔｈ２の傾いたバランスを調節できることは、本発明者より明らかとなった。
【００２９】
＜抗アレルギー剤＞
本発明の抗アレルギー剤は、前述のように、本発明の免疫調節剤を含むことを特徴とする。本発明の抗アレルギー剤は、このように免疫調節剤として、前述の米原料醸造物を含んでいればよく、その他の構成や形態等は、何ら制限されない。具体的には、本発明の抗アレルギー剤は、例えば、前記本発明の免疫調節剤と同様の構成や形態があげられ、同様にして使用できる。
【００３０】
アレルギーは、一般に、Ｉ〜IV型に分類されるが、本発明の抗アレルギー剤が対応できるアレルギーの型は、何ら制限されない。アレルギーにより発生する疾患の種類も、何ら制限されず、例えば、花粉症、アレルギー性気管支喘息、食物アレルギー、アトピー皮膚炎、蕁麻疹、食物アレルギー、水疱症、薬剤性の溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、中毒性表皮壊死症、血清病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性接触皮膚炎等があげられる。
【００３１】
＜免疫賦活剤＞
本発明の免疫賦活剤は、本発明の免疫調節剤を含むことを特徴とする。本発明の免疫賦活剤は、このように免疫調節剤として、前述の米原料醸造物を含んでいればよく、その他の構成や形態等は、何ら制限されない。具体的には、本発明の免疫賦活剤は、例えば、前記本発明の免疫調節剤と同様の構成や形態があげられ、同様にして使用できる。
【００３２】
また、本発明の免疫賦活剤は、例えば、ＩｇＡ抗体の産生を促進する機能を有するため、ＩｇＡ産生促進剤ということもできる。
【００３３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。
【実施例１】
【００３４】
米原料醸造物として酒粕由来サンプルを使用し、そのＩＬ−６産生抑制能をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。
【００３５】
＜酒粕由来サンプルの調製＞
サンプルＥＫ
特開昭５９−６６８７５号に基づいて、原料米１０００ｇから液化酒粕１２０ｇ（固形分７０％）を得た。この液化酒粕を凍結乾燥して、サンプルＥＫとした。
【００３６】
サンプルＳＧＫ
前記サンプルＥＫの調製で得られた凍結乾燥前の液化酒粕１００ｇを水２００ｍｌに懸濁して、６５℃で３０分間加熱した後、室温まで冷却した。冷却後の懸濁液に、予め前培養しておいた乳酸菌Lactobacillus brevisを１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように接種して、３７℃で４８時間、乳酸発酵させた。乳酸発酵後の前記懸濁液を凍結乾燥して、凍結乾燥サンプルＳＧＫとした。
【００３７】
サンプルＧＫ１
前記サンプルＥＫの調製で得られた凍結乾燥前の液化酒粕１００ｇと赤糠１５ｇとグルタミン酸ナトリウム３ｇとを水２００ｍｌに懸濁して、６５℃で３０分間加熱した後、室温まで冷却した。冷却後の懸濁液に、予め前培養しておいた乳酸菌Lactobacillus brevisを１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように接種して、３７℃で４８時間、乳酸発酵させた。乳酸発酵後の前記懸濁液を凍結乾燥して、凍結乾燥サンプルＧＫ１とした。
【００３８】
前述の各種凍結乾燥サンプル４ｇを水３０ｍｌに懸濁した後、遠心分離によって上清を回収した。回収した前記各上清を凍結乾燥した後、１００ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳに溶解し、メンブレン（メンブレン孔径０．２２μｍ）を用いてろ過滅菌した。これらの液体をそれぞれ、ＩｇＡ測定用の液体サンプル（ＥＫ、ＳＧＫ、ＧＫ１）とした。
【００３９】
＜ＩＬ−６測定＞
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１４週齢、オス、日本チャールズリバー社製）６頭の小腸のパイエル板からパイエル板細胞を採取した。そして、採取した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、２×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、これを１ウェルあたり５×１０５細胞／２５０μｌとなるように４８穴細胞培養用プレートに播種した。さらに、前記ウェル中の前記細胞懸濁液に、前述の各種液体サンプル（ＥＫ、ＳＧＫ、ＧＫ１）ならびにリポサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来、生化学工業（株）製）を添加した。前記液体サンプルは、前記培地で濃度を調整したサンプル溶液を準備し、サンプルの最終濃度が１ウェルあたり１００μｇ／ｍｌとなるように５０μｌ／ウェル添加した。また、ＬＰＳは、前記培地で濃度を調整したＬＰＳ溶液を準備し、ＬＰＳの最終濃度が所定濃度（０μｇ／ｍｌまたは０．５μｇ／ｍｌ）となるように２００μｌ／ウェル添加した。そして、トータル５００μｌ／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ２条件下、所定時間（４８時間、７２時間）培養した。コントロールとしては、前記液体サンプルに代えて、ＰＢＳのみを前記液体サンプルと同様に前記培地で希釈したものを、前記細胞懸濁液に添加した以外は、同様にして培養した。培養終了後、細胞を回収し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−６産生量を測定した。
【００４０】
これらの結果を図１に示す。図１は、各酒粕由来サンプルの存在下におけるマウスパイエル板初代培養細胞におけるＩＬ−６産生量を示すグラフである。同図において、縦軸は、ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。各バーは、ＬＰＳ添加（０μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ無添加（０．５μｇ／ｍｌ）の条件下におけるＩＬ−６産生量の結果であり、白いバーは、４８時間培養の結果、黒いバーは、７２時間培養の結果である。同図における４８時間培養の結果（白いバー）に示すように、コントロールと比較して、７２時間培養の結果（黒いバー）においても、同様の傾向が確認された。中でも、酒粕をさらに発酵処理したＳＧＫによれば、さらにＩＬ−６産生を抑制でき、特に、糠存在下で発酵処理した酒粕サンプルＧＫ１によれば、著しくＩＬ−６産生を抑制できることがわかった。
【実施例２】
【００４１】
実施例１で調製した凍結乾燥サンプルＧＫ１をＢＡＬＢ／ｃマウス摂取試験に供し、そのサイトカイン産生抑制能および抗体産生抑制能をｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで確認した。
【００４２】
実施例１の凍結乾燥サンプルＧＫ１を酸化エチレンガスを用いて滅菌処理した。滅菌後の凍結サンプルＧＫ１と粉末ＮＭＦ（商品名、オリエンタル酵母社製）（ガンマ線滅菌済）とを、５：９５の重量比で配合し、テスト群用飼料とした。なお、コントロール群用飼料としては、前記粉末ＮＭＦを用いた。
【００４３】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、オス、日本チャールズリバー社製）１２頭を、テスト群６頭およびコントロール群６頭の二群に分け、各群に対し、前記各群用飼料および飲料水を自由摂取として２８日間、ＳＰＦ環境下で飼育した。各群間で、摂取試験中の体重増加量、摂餌量、摂水量の差は生じなかった。摂取試験終了後、各マウスの脾臓から、脾臓細胞を採取した。そして、採取した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、４×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、これを１ウェルあたり１×１０６細胞／２５０μｌとなるように４８穴細胞培養用プレートに播種した。前記ウェル中の前記細胞懸濁液に、E．coli由来ＬＰＳ（生化学工業（株）製）またはSalmonella enterica serotype typhimuriumu由来ＬＰＳ（SIGMA社製）を添加した。各ＬＰＳは、前記培地で濃度を調整したＬＰＳ溶液を準備し、ＬＰＳの最終濃度が所定濃度（０μｇ／ｍｌまたは０．５μｇ／ｍｌ）となるように２５０μｌ／ウェル添加した。そして、トータル５００μｌ／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で所定時間培養した。各種サイトカインは、４８時間培養後の上清を使用し、各種抗体は、１週間培養後の上清を使用し、それぞれＥＬＩＳＡ法により産生量の測定を行った。また、各群用試料の投与開始前および投与終了時に、各マウスから血清を採取し、血清中の各種抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。これらの結果を下記表にそれぞれ示す(Average±SD、n=6）。下記表において、コントロールは、粉末ＮＭＦを投与したコントロール群の結果であり、ＧＫ１は、サンプルＧＫ１を含むテスト群用試料を投与したテスト群の結果である。
【００４４】
【表１】
0005206134.tif 000002
【表２】
0005206134.tif 000003
【００４５】
表１に示すように、前記脾臓初代細胞に対して、E.coli由来ＬＰＳおよびS.typhi由来ＬＰＳのいずれで刺激を与えた場合であっても、炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生を抑制できた。また、表２に示すように、マウスの血清中においてＩｇＥの産生を抑制できた。
【実施例３】
【００４６】
実施例１で調製した凍結乾燥サンプルＧＫ１をDO11．10マウス摂取試験に供し、そのサイトカイン産生抑制能および抗体産生抑制能をｉｎ ｖｉｖｏならびにｅｘ ｖｉｖｏで確認した。DO11．10マウスは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的なＴ細胞レセプターのみを発現させたトランスジェニックマウスであり、Ｔ細胞の抗原特異的反応の変化の測定に適した実験動物である。
【００４７】
実施例１の凍結乾燥サンプルＧＫ１を酸化エチレンガスを用いて滅菌処理した。滅菌後の凍結サンプルＧＫ１と粉末ＮＭＦ（ガンマ線滅菌済、オリエンタル酵母社製）とを、１：９の重量比で配合し、テスト群用飼料とした。なお、コントロール群用飼料としては、前記粉末ＮＭＦを用いた。
【００４８】
前記DO11．10マウス（１２週齢、メス）７頭を、テスト群４頭およびコントロール群３頭の二群に分け、各群に対し、前記実施例２と同様にして、前記各群用飼料を自由摂取条件下で１７日間飼育した。各群間で、摂取試験中の体重増加量、摂餌量、摂水量の差は生じなかった。摂取試験終了後、各マウスの脾臓から、脾臓細胞を採取し、１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、４×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、これを１ウェルあたり１×１０６細胞／２５０μｌとなるように４８穴細胞培養用プレートに播種した。前記ウェル中の前記細胞懸濁液に、ＯＶＡを添加した。前記ＯＶＡは、前記培地で濃度を調整したＯＶＡ溶液を準備し、ＯＶＡの最終濃度が所定濃度（０μＭ、５μＭまたは１０μＭ）となるように２５０μｌ／ウェル添加した。そして、トータル５００μｌ／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で所定時間培養した。そして、ＢｒｄＵラベル法により、培養７２時間後の細胞増殖活性を測定した。細胞増殖活性は、細胞中に取り込まれたＢｒｄＵ量を、細胞増殖ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ化学発光キット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を使用して化学発光ＥＬＩＳＡ法で測定し、得られた発光強度をマルチウェルルミノメーター（パーキンエルマー社）を用いて所定の方法により計測した値（ＣＰＳ）により判断した。また、ＩＬ−２およびＩＬ−４は、４８時間培養後の上清を使用し、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γは、７２時間培養後の上清を使用し、抗体は、１週間培養後の上清を使用し、それぞれＥＬＩＳＡ法により産生量の測定を行った。
【００４９】
図２に、培養７２時間後の細胞数の測定結果のグラフを示す。同グラフにおいて、縦軸は、細胞中に取り込まれたＢｒｄＵ量を示す発光強度の計測値（ＣＰＳ）である。また、各バーは、ＯＶＡの各添加量条件下における発光強度、つまり細胞増殖活性の結果であり、白いバー（Ｃｏｎｔｒｏｌ）がコントロール、黒いバー（ＧＫ１）がＧＫ１を含むテスト群用飼料を投与した結果である。同図に示すように、コントロールと比較して、ＧＫ１の添加により、ＯＶＡ刺激による細胞の増殖活性が抑制された。
【００５０】
図３に、培養細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０産生量の測定結果のグラフを示す。同図（Ａ）は、ＩＬ−４の結果であり、同図（Ｂ）は、ＩＬ−１０の結果である。両図において、縦軸は、ＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１０濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。各バーは、ＯＶＡの各添加量条件下におけるＩＬ−４産生量またはＩＬ−１０の結果であり、白いバー（Ｃｏｎｔｒｏｌ）がコントロール、黒いバー（ＧＫ１）がＧＫ１を含むテスト群用飼料を投与した結果である。同図に示すように、コントロールと比較して、ＧＫ１の添加により、ＯＶＡ刺激によるＴｈ２型サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生が抑制された。一方、Ｔｈ１型サイトカインであるＩＬ−２およびＩＮＦ−γについて確認したところ、群間で差は認められなかった。
【００５１】
また、脾臓細胞培養上清のＩｇＥ濃度は、ＯＶＡの終濃度が５μＭの場合、コントロールが４．３±１．６ｎｇ／ｍｌであり、ＧＫ１添加が、３．１±０．４ｎｇ／ｍｌであった。このように、コントロールと比較して、ＧＫ１の添加により、ＯＶＡ刺激によるＩｇＥの産生が抑制された。
【００５２】
以上のように、酒粕由来サンプルによれば、例えば、炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの抑制作用を有することで、関節リウマチ等の炎症性自己免疫疾患の改善や予防を図ることができる。また、例えば、Ｔｈ２型のサイトカインであるＩＬ−４，ＩＬ−６およびＩＬ−１０の産生抑制作用を有することで、アレルギー疾患によりＴｈ２側に傾いたＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側に調節することができる。また、例えばＩｇＥが関与する各種アレルギー疾患においても、ＩｇＥ抗体産生促進を抑制することで、アレルギー反応の抑制を図ることができる。このため、本発明によれば、例えば、炎症性サイトカインの産生抑制、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの調節、および抗体依存性アレルギー反応の抑制により、アレルギーの予防や治療を図ることができる。
【実施例４】
【００５３】
米原料醸造物として酒粕由来サンプルを使用し、そのＩｇＡ抗体産生促進能をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。
【００５４】
＜酒粕由来サンプルの調製＞
前記実施例１と同様にして、凍結乾燥サンプルＥＫ，ＳＧＫおよびＧＫ１を調製し、前記各種凍結乾燥サンプル４ｇを水３０ｍｌに懸濁した後、遠心分離によって上清を回収した。回収した前記各上清を凍結乾燥した後、１００ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳに溶解し、メンブレン（メンブレン孔径０．２２μｍ）を用いてろ過滅菌した。これらの液体をそれぞれ、ＩｇＡ測定用の液体サンプル（ＥＫ、ＳＧＫ、ＧＫ１）とした。
【００５５】
＜ＩｇＡ測定＞
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、オス、日本チャールズリバー社製）の３頭の脾臓から脾臓細胞を採取した。そして、採取した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、４×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、これを１ウェルあたり１×１０６細胞／４５０μｌとなるように４８穴細胞培養用プレートに播種した。続いて、前記ウェル中の前記細胞懸濁液に、前述の各種液体サンプル（ＥＫ、ＳＧＫ、ＧＫ１）を添加した。前記各種液体サンプルは、前記培地で濃度を調整したサンプル溶液を準備し、サンプルの最終濃度が所定濃度（５０、１５０、２００μｇ／ｍｌ）となるように５０μｌ／ウェル添加した。そして、トータル５００μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。コントロールとしては、前記液体サンプルに代えて、ＰＢＳのみをサンプルと同様に前記培地で希釈したものを、前記細胞懸濁液に添加した以外は、同様にして培養した。培養終了後、細胞を回収し、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＡ産生量を測定した。
【００５６】
これらの結果を図４に示す。図４は、各酒粕由来サンプルの存在下におけるマウス脾臓初代培養細胞におけるＩｇＡ産生量を示すグラフである。同図において、縦軸は、ＩｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）であり、各バーは、添加したサンプルの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。同図に示すように、サンプルＥＫ、ＳＧＫおよびＧＫ１の添加によって、ＩｇＡの産生が促進された。また、発酵処理を施したＳＧＫおよびＧＫ１は、添加量の増加によって、より一層ＩｇＡ産生を促進した。中でも、糠存在下で発酵処理を施したＧＫ１は、著しいＩｇＡ産生促進能を示した。以上の結果から、本実施例の酒粕由来サンプルによれば、ＩｇＡの産生を促進できることから、免疫賦活剤として使用できることがわかった。
【００５７】
以上のように、米原料醸造物、中でも、発酵させた米原料醸造物、特に、糠存在下で発酵させた米原料醸造物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、全身性免疫細胞である脾臓細胞によるＩｇＡ産生を促進する作用、腸管免疫細胞であるパイエル板細胞によるＩＬ−６産生を抑制する作用を示すことがわかった。ＩｇＡは、腸管等の粘膜面において、生体防御に関わる重要な抗体であり、また、ＩＬ−６は、病的炎症を誘導するＩＬ−１７の誘導に非常に重要なサイトカインであることが、最近判明されている。したがって、本発明における米原料醸造物は、例えば、生体防御能を向上し、クローン病や潰瘍性腸疾患等の炎症性腸疾患の予防、改善、治療に利用可能な食品素材であるといえる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験およびｅｘ ｖｉｖｏ試験により、米原料醸造物を評価した結果、免疫細胞による代表的なＴｈ２型サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０の抗原特異的な産生を抑制する機能を示すことがわかった。したがって、本発明における米原料醸造物は、例えば、Ｔｈ２型サイトカインの産生過剰が原因と考えられているＩ型アレルギー（例えば、食品アレルギー、花粉症等）をはじめとする各種アレルギーの予防、改善、治療に利用可能な食品素材であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上のように、本発明の免疫調節剤によれば、例えば、アレルギー疾患の一因であるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの崩れを抑制したり正常化するように調節することが可能である。このため、本発明の免疫調節剤は、前述のような各種アレルギー疾患に対する抗アレルギー剤として使用することができる。特に、米原料醸造物は、長年の食歴により安全性が十分に裏付けられていることからも、例えば、合成の医薬品等が抱える副作用等の問題も回避することができ、極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明の一実施例において、各酒粕由来サンプルの存在下におけるマウスパイエル板初代培養細胞におけるＩＬ−６産生量を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例において、マウス脾臓初代培養細胞の７２時間培養後における細胞増殖活性を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例において、マウス脾臓初代培養細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０産生量の測定結果を示すグラフであり、同図（Ａ）は、ＩＬ−４の結果であり、同図（Ｂ）は、ＩＬ−１０の結果である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例において、マウス脾臓初代細胞におけるＩｇＡ産生量の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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