(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクタデカペンタエン酸およびその塩、並びにそのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤であって、
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよびグリセリルエステルからなる群から選択される少なくとも１種である、平滑筋収縮抑制剤。
【請求項２】
脂質を含有する平滑筋収縮抑制剤であって、
前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸であることを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤。
【請求項３】
脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項２に記載の平滑筋収縮抑制剤。
【請求項４】
単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項３に記載の平滑筋収縮抑制剤。
【請求項５】
グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項４に記載の平滑筋収縮抑制剤。
【請求項６】
複合脂質が、リン脂質である、請求項３に記載の平滑筋収縮抑制剤。
【請求項７】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびこれらのリゾ体、並びにスフィンゴミエリンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項６に記載の平滑筋収縮抑制剤。
【請求項８】
オクタデカペンタエン酸およびその塩、並びにそのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、循環器系疾患治療剤であって、
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよびグリセリルエステルからなる群から選択される少なくとも１種である、循環器系疾患治療剤。
【請求項９】
脂質を含有する循環器系疾患治療剤であって、
前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸であることを特徴とする、循環器系疾患治療剤。
【請求項１０】
脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項９に記載の循環器系疾患治療剤。
【請求項１１】
単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項１０に記載の循環器系疾患治療剤。
【請求項１２】
グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項１１に記載の循環器系疾患治療剤。
【請求項１３】
複合脂質が、リン脂質である、請求項１０に記載の循環器系疾患治療剤。
【請求項１４】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびこれらのリゾ体、並びにスフィンゴミエリンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１３に記載の循環器系疾患治療剤。
【請求項１５】
循環器系疾患が血管攣縮である、請求項８〜１４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１６】
血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、請求項１５に記載の治療剤。
【請求項１７】
オクタデカペンタエン酸およびその塩、並びにそのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、循環器系疾患予防剤であって、
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよびグリセリルエステルからなる群から選択される少なくとも１種である、循環器系疾患予防剤。
【請求項１８】
脂質を含有する循環器系疾患予防剤であって、
前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸であることを特徴とする、循環器系疾患予防剤。
【請求項１９】
脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項１８に記載の循環器系疾患予防剤。
【請求項２０】
単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項１９に記載の循環器系疾患予防剤。
【請求項２１】
グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項２０に記載の循環器系疾患予防剤。
【請求項２２】
複合脂質が、リン脂質である、請求項１９に記載の循環器系疾患予防剤。
【請求項２３】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびこれらのリゾ体、並びにスフィンゴミエリンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２２に記載の循環器系疾患予防剤。
【請求項２４】
循環器系疾患が血管攣縮である、請求項１７〜２３のいずれかに記載の予防剤。
【請求項２５】
血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、請求項２４に記載の予防剤。
【請求項２６】
オクタデカペンタエン酸およびその塩、並びにそのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤であって、
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよびグリセリルエステルからなる群から選択される少なくとも１種である、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項２７】
脂質を含有するＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤であって、
前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸であることを特徴とする、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項２８】
脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項２７に記載のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項２９】
単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項２８に記載のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項３０】
グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項２９に記載のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項３１】
複合脂質が、リン脂質である、請求項２８に記載のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【請求項３２】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびこれらのリゾ体、並びにスフィンゴミエリンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項３１に記載のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平滑筋収縮抑制剤に関する。より詳しくは、平滑筋のカルシウム非依存性異常収縮の抑制剤、循環器系疾患治療剤および予防剤、さらにＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
平滑筋の収縮には、細胞質のカルシウムイオン濃度の上昇に依存した収縮と、これに依存しない収縮があることが知られている。【０００３】
即ち、神経刺激のような細胞膜脱分極の場合には、細胞質のカルシウムイオン濃度を上昇させ、カルシウムイオン−カルモジュリン複合体を形成し、この複合体によってミオシン軽鎖キナーゼが活性化されてミオシン軽鎖がリン酸化されて収縮を起こすものと考えられている。このようなカルシウムイオン依存性の平滑筋収縮は、正常な収縮と考えられている。【０００４】
一方、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）等の一部の血管収縮物質は、細胞質のＲｈｏキナーゼを介してカルシウムイオン感受性が増強され、カルシウムイオン濃度上昇を超える収縮またはカルシウムイオン濃度に依存しない収縮を起こすことが知られている。これらは、カルシウムイオン非依存性の収縮であり、異常な収縮と考えられている。例えば、ＳＰＣは、細胞質のカルシウム濃度を上昇させることなく、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの１種であるＦｙｎを活性化し、さらにＲｈｏキナーゼを活性化し、ミオシン軽鎖をリン酸化して、カルシウムイオン非依存的に平滑筋を収縮させると考えられている（麻酔、４７巻、５号、５３０−５４０ページ、１９９８年）。【０００５】
このようなカルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮阻害剤としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるファスジル酸またはＹ−２７６３２が知られている（Ｎａｔｕｒｅ，３８９巻、１０月３０日号、９９０−９９４頁、１９９７年）。しかしながら、これらの薬剤は、カルシウム依存性収縮を抑制する作用も有しているため、副作用のみならず、その治療効果に限界がある。従って、選択的にカルシウム非依存性収縮のみを抑制する作用をもつ薬物が切望されているのが現状である。【０００６】
また、特開２００１−２６１５５６には、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、Ｆｙｎの活性化を阻害することによって、カルシウムイオン非依存的な異常収縮のみを選択的に抑制することが報告されている。【０００７】
しかし、特開２００１−２６１５５６には、エイコサペンタエン酸のナトリウム塩が平滑筋収縮抑制作用を有しているが、エイコサペンタエン酸のエチルエステルおよびエイコサペンタエン酸のトリグリセリドには、平滑筋収縮抑制作用がないことが記載されている。【０００８】
また、エイコサペンタエン酸は、内服のみが可能であり、急性発症した血管病に的確に対応できない場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、特定のアシル基を有する脂質、並びにオクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸が上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
即ち、本発明は、オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤である。【００１２】
また、本発明は、脂質を含有する平滑筋収縮抑制剤であって、前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤である。【００１３】
また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の平滑筋収縮抑制剤である。【００１４】
また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の平滑筋収縮抑制剤である。【００１５】
また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、上記の平滑筋収縮抑制剤である。【００１６】
また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の平滑筋収縮抑制剤である。【００１７】
また、本発明は、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、上記の平滑筋収縮抑制剤である。【００１８】
また、本発明は、オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、循環器系疾患治療剤である。【００１９】
また、本発明は、脂質を含有する循環器系疾患治療剤であって、前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、循環器系疾患治療剤である。【００２０】
また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の循環器系疾患治療剤である。【００２１】
また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の循環器系疾患治療剤である。【００２２】
また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、上記の循環器系疾患治療剤である。【００２３】
また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の循環器系疾患治療剤である。【００２４】
また、本発明は、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、上記の循環器系疾患治療剤である。【００２５】
また、本発明は、循環器系疾患が血管攣縮である、上記の治療剤である。【００２６】
また、本発明は、血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、上記の治療剤である。【００２７】
また、本発明は、オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、循環器系疾患予防剤である。【００２８】
また、本発明は、脂質を含有する循環器系疾患予防剤であって、前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、循環器系疾患予防剤である。【００２９】
また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の循環器系疾患予防剤である。【００３０】
また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の循環器系疾患予防剤である。【００３１】
また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、上記の循環器系疾患予防剤である。【００３２】
また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の循環器系疾患予防剤である。【００３３】
また、本発明は、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、上記の循環器系疾患予防剤である。【００３４】
また、本発明は、循環器系疾患が血管攣縮である、上記の予防剤である。【００３５】
また、本発明は、血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、上記の予防剤である。【００３６】
また、本発明は、オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００３７】
また、本発明は、脂質を含有するＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤であって、前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００３８】
また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００３９】
また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００４０】
また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、上記のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００４１】
また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。【００４２】
また、本発明は、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、上記のＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明が対象とする平滑筋としては、臓器や部位等について特に制限はないが、例えば、血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋等を挙げることができ、特に血管平滑筋を好ましい例として挙げることができる。【００４５】
本発明に用いるオクタデカペンタエン酸としては、特に制限はないが、例えば全−シス−３，６，９，１２，１５−オクタデカペンタエン酸を好ましい例として挙げることができる。【００４６】
また、本発明に用いるオクタデカテトラエン酸としては、特に制限はないが、例えば全−シス−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸を好ましい例として挙げることができる。【００４７】
また、本発明に用いるエイコサペンタエン酸としては、特に制限はないが、例えば、全−シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸を好ましい例として挙げることができる。【００４８】
オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸は、酸の形態のものの他、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩の様な塩の形態のものでもよく、特にナトリウム塩を好ましい塩として挙げることができる。また、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸は、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステル、グリセリルエステル等のエステルの形態でもよく、また、ホスファチジルコリン等のリン脂質やその他の複合脂質の形態であってもよい。これらのなかで、特にエチルエステルを好ましいエステルとして挙げることができる。【００４９】
本発明に用いるオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸の製造方法としては、特に制限はなく、化学合成によることや微生物に産生させることの他、海藻等の天然物から抽出することによっても製造することができる。【００５０】
本発明に用いる特定のアシル基を有する脂質は、少なくとも１つのアシル鎖がオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であれば、特に制限はなく、単純脂質及び複合脂質を挙げることができる。【００５１】
単純脂質がグリセリドである場合は、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸が結合するグリセロールの位置としては、α位、β位、γ位のいずれであってもよく、少なくとも１つのアシル鎖がオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であれば良い。オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸以外のアシル鎖としては、特に制限はなく、例えば炭素数１〜３０の飽和若しくは不飽和脂肪酸を挙げることができる。また、少なくとも１つのアシル鎖がオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であれば、グリセロールに結合しているアシル鎖は３つでも２つでも１つでも良い。以下、アシル鎖がエイコサペンタエン酸であるモノアシルグリセリド及び少なくとも１つのアシル鎖がエイコサペンタエン酸であるジアシルグリセリドを、それぞれ「ＥＰＡ−モノグリセリド」、「ＥＰＡ−ジグリセリド」ということがある。【００５２】
本発明に用いる少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸である単純脂質を製造する方法としては、特に制限はないが、例えば、グリセリドの場合は、グリセロールとオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸をリパーゼ等の酵素によって結合させ、クロマトグラフィー等で分画することにより、製造することができる。さらには、グリセロールとオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸から化学合成する方法や、天然物から分離する方法を用いることもできる。【００５３】
また、単純脂質がセラミドの場合は、スフィンゴシンとオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸をSCDaseなどの酵素によって結合させ、クロマトグラフィー等で分画することにより、製造することができる。さらには、スフィンゴシンとオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸から化学合成する方法を用いることもできる。【００５４】
本発明に用いる複合脂質としては、その分子内に炭素原子、酸素原子、水素原子の他、リン原子および／または窒素原子および／または硫黄原子を含むものであれば、特に制限はないが、リン脂質を好ましい例として挙げることができる。【００５５】
本発明に用いるリン脂質としては、リン酸を含む脂質であれば特に制限はないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンおよびそれらのリゾ体を挙げることができる。これらのなかで、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールを好ましいリン脂質として挙げることができる。なお、これらのリン脂質は、単独で用いることのほか、２種以上を組み合わせて用いることもできる。【００５６】
複合脂質がグリセロリン脂質である場合は、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸が結合するグリセロールの位置としては、α位、β位のいずれであってもよい。そして、グリセロリン脂質が２つのアシル鎖を有する場合、もう一方のアシル鎖としては、特に制限はなく、例えば炭素数１〜３０の飽和若しくは不飽和脂肪酸を挙げることができ、これらのアシル鎖は分枝鎖を有していても良い。また、もう一方のアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であってもよい。これらのなかで、少なくとも１つのアシル鎖がオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であるホスファチジルコリンを、好ましい例として挙げることができる。以下、少なくとも１つのアシル鎖がエイコサペンタエン酸であるホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールを、それぞれ「ＥＰＡ−ＰＣ」、「ＥＰＡ−ＰＥ」、「ＥＰＡ−ＰＧ」ということがある。【００５７】
本発明に用いる複合脂質を製造する方法としては、特に制限はないが、例えばリン脂質の場合は、リゾリン脂質とオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸をホスホリパーゼなどの酵素によって結合させ、クロマトグラフィー等で分画することにより、製造することができる。さらには、リゾリン脂質とオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸から化学合成する方法や天然物から分離する方法を用いることもできる。【００５８】
本発明が対象とする循環器系疾患としては、特に制限はないが、例えば、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮のような血管攣縮を挙げることができる。【００５９】
本発明において、「Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤」とは、ＳＰＣ等の刺激によりＦｙｎチロシンキナーゼが活性化され、さらにＲｈｏキナーゼが活性化されることにより、タンパク質リン酸化が亢進する一連の経路の全部またはその一部を阻害するものをいう。【００６０】
本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の剤形としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤等の経口剤、注射剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤等を挙げることができる。【００６１】
また、本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤には、薬学上許容されるキャリアや他の成分を含むことができる。【００６２】
本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与方法としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば経口、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、経粘膜などの投与方法を挙げることができる。特に、循環器系疾患治療剤の場合は、動脈や静脈への注射による投与を好ましい例として挙げることができる。【００６３】
本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与量としては、それぞれの目的に応じて適宜決定され、その剤形、投与用法、症状の程度、性別、年齢、体重等により適宜調整されることとなる。例えば、循環器系疾患の治療剤として、動脈内あるいは静脈内への投与する場合は、通常１〜２００ｍｇ、好ましくは５〜１００ｍｇ、より好ましくは１０〜５０ｍｇのオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸または脂質を、１日１回または複数回に分けて投与される。また、循環器系疾患の治療剤として経口投与する場合は、通常０．１〜９ｇ、好ましくは０．５〜６ｇ、より好ましくは１〜３ｇのオクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸または脂質を、１日１回または複数回に分けて投与される。さらに、循環器系疾患の予防剤として経口投与する場合は、治療剤として投与する場合よりも一般的に少ない投与量となる。
【実施例】
【００６４】
＜＜実施例１：ｎ−３オクタデカペンタエン酸、ｎ−３オクタデカテトラエン酸の調製＞＞
南極海産のハプト藻Ｂ株を以下の様にして培養した。５００ｍＬのフラスコに４００ｍＬの培地を入れ、ハプト藻Ｂ株を植菌し、４℃で６−９週間、白色蛍光灯の下２４時間明期条件下で計１６本静置培養した。培地は、人工海水（マリンアートハイ、千寿製薬（株））１００ｍＬ当たり１ｍＬの海産微細藻類用ダイゴ１ＭＫ培地（日本製薬（株））を添加したものを使用した。【００６５】
培養後、遠心沈降法で細胞を回収し湿重量１１ｇの藻体を得た。常法（Ｂｌｉｇｈ，ＥＧ＆Ｄｙｅｒ  ＷＪ（１９５９）  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−７）に従って藻体より脂質抽出を行い４２８ｍｇの脂質を得た。得られた全脂質を、１０％塩化アセチルを含むメタノール中で１００℃、３時間反応させヘキサン抽出物を１６７ｍｇ得た。このヘキサン抽出物の脂肪酸組成は、ミリスチン酸１１％、パルミチン酸５％、ｎ−３オクタデカテトラエン酸４％、ｎ−３オクタデカペンタエン酸１４％、ｎ−３ドコサヘキサエン酸８％であった。【００６６】
次に、高度不飽和脂肪酸組成を上げるために薄層クロマトグラフィーを行った。ヘキサン抽出物をシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社）に塗布し、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル＝１９：１を用いて、二重結合を分子内に３個以上含む高度不飽和脂肪酸メチルエステル画分を３７ｍｇ回収した。このメチルエステル混合物の脂肪酸組成は、ｎ−３オクタデカテトラエン酸１４％、ｎ−３オクタデカペンタエン酸３６％、ｎ−３ドコサヘキサエン酸３４％であり、ミリスチン酸、パルミチン酸は殆ど検出されなかった。【００６７】
この高度不飽和脂肪酸メチルエステル混合物中のｎ−３オクタデカペンタエン酸メチルエステル、ｎ−３オクタデカテトラエン酸メチルエステルを液体クロマトグラフィーにより精製した。用いたカラムはＯＤＳ逆相カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−１２０Ｔ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、東ソー（株））で、溶媒はアセトニトリル：水＝８５：１５、２０５ｎｍ波長の紫外吸光度計で検出することによりｎ−３オクタデカペンタエン酸メチルエステル、ｎ−３オクタデカテトラエン酸メチルエステルを回収した。回収したｎ−３オクタデカペンタエン酸メチルエステル、ｎ−３オクタデカテトラエン酸メチルエステルはそれぞれ１２ｍｇ、６ｍｇであり、その純度はガスクロマトグラフィー分析により、それぞれ９９．７％、９１．０％であった。【００６８】
得られたｎ−３オクタデカペンタエン酸メチルエステル、ｎ−３オクタデカテトラエン酸メチルエステルは、０．５ＮＨＣｌを含むアセトニトリル：水＝９：１溶液中で、１００℃、３時間反応させ、遊離ｎ−３オクタデカペンタエン酸、遊離ｎ−３オクタデカテトラエン酸とした。【００６９】
＜＜実施例２：ｎ−３オクタデカテトラエン酸結合型セラミドの調製＞＞
ｎ−３オクタデカテトラエン酸（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）１２．８μｍｏｌ、牛脳セレブロシド由来Ｄ−スフィンゴシン（ＳＩＧＭＡ）５．１２μｍｏｌとＳＣＤａｓｅ（タカラバイオ）８０ｍＵを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３．２ｍｌに分散させ、３７℃で４０時間合成反応を行った。この酵素合成反応を計１４本行った後、常法（Ｂｌｉｇｈ，ＥＧ＆Ｄｙｅｒ  ＷＪ（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−７）に従って脂質抽出を行った。【００７０】
得られた脂質画分を調製用シリカゲル−ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、０．５ｍｍ厚、メルク社）に供し、ジエチルエーテル：酢酸（１０：０．１，ｖ／ｖ）にて展開した。合成されたｎ−３オクタデカテトラエン酸結合型セラミドのスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し３．２ｍｇのｎ−３オクタデカテトラエン酸結合型セラミドを得た。【００７１】
＜＜実施例３：ＥＰＡ−ＰＣの調製＞＞
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）１８０ｍｇと卵黄由来のリゾホスファチジルコリン１１０ｍｇをグリセロール５５００ｍｇに分散させ，これにブタ膵臓由来ホスホリパーゼＡ２  ２３ｍｇ，フォルムアミド０．５ｍｌ，ＣａＣｌ２３μｍｏｌを添加し、３７℃の暗所にて５０−２００ｒｐｍで攪拌しながら４８時間合成反応を行った。反応終了後，Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４６，３５−４４（１９４２））により脂質画分を回収した。【００７２】
得られた脂質画分を調製用シリカゲル−ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、０．５ｍｍ厚、メルク社）に供し，クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。合成されたＥＰＡ結合型ホスファチジルコリン（ＥＰＡ−ＰＣ）のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し９０  ｍｇのＥＰＡ−ＰＣを得た。調製したＥＰＡ−ＰＣには、４６．６％のＥＰＡが含まれていた。【００７３】
＜＜実施例４：ＥＰＡ−ＰＥ、ＥＰＡ−ＰＧの調製＞＞
１０００ｍＬのフラスコに２００ｍＬの培地を入れ、ＥＰＡ生産細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂｅｎｔｈｉｃａ  ＡＴＣＣ４３９９１株を植菌し、１０℃で１週間、計２８本振とう培養した。培地はＬＢ＋Ｎａ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、３．０％塩化ナトリウム）を用いた。【００７４】
培養後、遠心沈降法で細胞を回収し湿重量３６ｇの菌体を得た。常法（Ｂｌｉｇｈ，ＥＧ＆Ｄｙｅｒ  ＷＪ（１９５９）  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−７）に従って菌体より全脂質抽出を行い４６８ｍｇの脂質を得た。得られた全脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０、メルク社）に塗布し、展開溶媒クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４を用いて展開した。ＥＰＡを多く含むＰＥおよびＰＧのスポットを掻き取りシリカゲルより各々抽出し、それぞれ４９ｍｇ、２７ｍｇの脂質を得た。これらＥＰＡを多く含むＰＥおよびＰＧを、各々ＥＰＡ−ＰＥおよびＥＰＡ−ＰＧとした。ＥＰＡ−ＰＥおよびＥＰＡ−ＰＧには、それぞれ３８％、３９％のＥＰＡが含まれていた。【００７５】
＜＜実施例５：ＥＰＡ−ＰＳの調製＞＞
実施例２で合成したＥＰＡ−ＰＣ  ３０ｍｇを酢酸エチル２．５ｍｌに溶解させた後，３．４ＭのＬ−セリンを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１ｍｌを加えた。更に、ホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来）を１ｕｎｉｔ添加して反応を開始した後、３７℃の暗所にて３００−４００ｒｐｍで攪拌しながら２４時間ホスファチジル基転移反応を行った。反応終了後，Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４６，３５−４４（１９４２））により脂質画分を回収した。【００７６】
得られた脂質画分を調製用シリカゲル−ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、０．５ｍｍ厚、メルク社）に供し，クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。合成されたＥＰＡ結合型ホスファチジルセリン（ＥＰＡ−ＰＳ）のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し１２ｍｇのＥＰＡ−ＰＳを得た。調製したＥＰＡ−ＰＳには、４７％のＥＰＡが含まれていた。【００７７】
＜＜実施例６：酵素合成ＥＰＡ−ＰＧの調製＞＞
実施例２で合成したＥＰＡ−ＰＣ  ５０ｍｇを酢酸エチル２．２ｍｌに溶解させた後，１４  ｍｇの牛血清アルブミンを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１．２ｍｌを加えた。更に、グリセロール４００μｌとホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来）を２．４ｕｎｉｔｓ添加して反応を開始した後、３７℃の暗所にて３００−４００  ｒｐｍで攪拌しながら４時間ホスファチジル基転移反応を行った。反応終了後，Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４６，３５−４４（１９４２））により脂質画分を回収した。【００７８】
得られた脂質画分を調製用シリカゲル−ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、０．５ｍｍ厚、メルク社）に供し，クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４，ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。合成されたＥＰＡ結合型グリセロール（ＥＰＡ−ＰＧ）のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し２０  ｍｇの酵素合成ＥＰＡ−ＰＧを得た。調製した酵素合成ＥＰＡ−ＰＧには、５０％のＥＰＡが含まれていた。【００７９】
＜＜実施例７：ＥＰＡ−モノグリセリド、ＥＰＡ−ジグリセリドの調製＞＞
ＥＰＡ３００ｍｇとグリセロール５ｇをα−トコフェロール９ｍｇ存在下で十分に分散させた後，これにＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＲＭ  ＩＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）３０ｍｇを添加し、３７℃の暗所にて３００−４００ｒｐｍで攪拌しながら２４時間合成反応を行った。反応終了後，ジエチルエーテル：水（１：１，ｖ／ｖ）を用いて分配を行い、ジエチルエーテル層より脂質画分を回収した。【００８０】
得られた脂質画分を調製用シリカゲル−ＴＬＣプレート（シリカゲル６０、０．５ｍｍ厚、メルク社）に供し，ｎ−ヘキサン：エーテル（６０：４０，ｖ／ｖ）にて展開した。合成されたＥＰＡ−モノグリセリド、ＥＰＡ−ジグリセリド（１，２−ＥＰＡ−ジグリセリドと１，３−ＥＰＡ−ジグリセリドの混合物として回収）とのスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し８０ｍｇのＥＰＡ−モノグリセリド、９０ｍｇのＥＰＡ−ジグリセリドを得た。【００８１】
＜＜実施例８：張力試験＞＞
＜標本＞
ブタ冠状動脈（左前下行枝）を主幹分岐部から１ｃｍ遠位で約３ｃｍ切り取り、あらかじめ混合ガス（９５％Ｏ２，５％ＣＯ２）を通気し氷冷したＫｒｅｂｓ液（１２３ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７ｍＭ  ＫＣｌ，１５．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  １．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１１．５ｍＭ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）に浸した。以下のサンプル調製は、上記Ｋｒｅｂｓ液を１５分おきに交換しながら行った。血管の周りの脂肪を取り除いたあと、外膜を取り除き、綿棒で内皮を除去し、剃刀を用いて平滑筋条片１ｍｍ×４ｍｍを作製した。【００８２】
＜試料＞
オクタデカペンタエン酸は、実施例１にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、Ｋｒｅｂｓ液で最終濃度となるように希釈して用いた。ＥＰＡ−ＰＣは、実施例３にしたがって得られたものを、濃度を調整して用いた。ＥＰＡ−ＰＥ、ＥＰＡ−ＰＧは、実施例４に従って得られたものを、ＥＰＡの含量を元に、ＥＰＡの濃度として最終濃度になるように調整して用いた。オクタデカテトラエン酸、オクタデカペンタエン酸は、実施例１にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、Ｋｒｅｂｓ液で最終濃度となるように希釈して用いた。ＥＰＡ−モノグリセリド、ＥＰＡ−ジグリセリドは、実施例７にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、Ｋｒｅｂｓ液で最終濃度となるように希釈して用いた。ＥＰＡ−ＰＳは、実施例５に従って得られたものについて、溶媒を窒素ガスで揮発後、少量のＫｒｅｂｓ液を加えて超音波処理で懸濁し、これを更にＫｒｅｂｓ液で最終濃度となるように希釈して用いた。酵素合成ＥＰＡ−ＰＧ、オクタデカテトラエン酸セラミドは実施例６、実施例２にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、Ｋｒｅｂｓ液で最終濃度となるように希釈して用いた。【００８３】
＜装置＞
標本をつるしたワイヤーをトランスデューサー（ＦＤピックアップ：日本光電）につなぎ、増幅器（歪圧力用アンプ：日本光電）を通して記録計（卓上型ペンレコーダーＵ−２２８：Ｐａｎｔｏｓ）で張力を検出した。標本は３７℃に保った５ｍＬのマグヌス管中にひたし、試験液は３７℃に保ち混合ガスを負荷したものを用いた。【００８４】
＜測定方法＞
レファレンス（１００％）の収縮として、１１８ｍＭ高カリウム溶液による脱分極性のカルシウム依存性収縮を１５分間起こし、その後Ｋｒｅｂｓ液で１５分間弛緩させる操作を繰り返し、高カリウム脱分極による張力の波形が安定してきたところで、４０ｍＭカリウム溶液を加え、その収縮がプラトーに達したところでブラジキニン１μＭを加えて、内皮の有無を確認した。ブラジキニンによって平滑筋が弛緩しないことにより、内皮が除去されていると判断した。その後、Ｋｒｅｂｓ液で２０分弛緩させ、ＳＰＣ３０μＭで刺激を加えた。更に、ＳＰＣ刺激による張力が最大、かつ、プラトーになったところで、オクタデカペンタエン酸、ＥＰＡ−ＰＣ、ＥＰＡ（参考例）を最終濃度が６０μＭになるように加えた。ＥＰＡ−ＰＥ、ＥＰＡ−ＰＧは、ＥＰＡの含量を元に、ＥＰＡの最終濃度が６０μＭとなるように加えた。オクタデカテトラエン酸は最終濃度が６０μＭになるように加えた。ＥＰＡ−モノグリセリド、ＥＰＡ−ジグリセリドはＥＰＡの含量を元に、ＥＰＡの最終濃度が６０μＭとなるように加えた。ＥＰＡ−ＰＳ、酵素合成ＥＰＡーＰＧはＥＰＡの含量を元に、ＥＰＡの最終濃度が６０μＭとなるように加えた。オクタデカテトラエン酸セラミドは、オクタデカテトラエン酸の含量を元に、オクタデカテトラエン酸の最終濃度が６０μＭとなるように加えた。【００８５】
＜結果＞
図１にＥＰＡによる参考例を、図２にオクタデカペンタエン酸による実施例を、図３にＥＰＡ−ＰＣによる実施例を、図４にＥＰＡ−ＰＥによる実施例を、図５にＥＰＡ−ＰＧによる実施例を、図６にオクタデカテトラエン酸による実施例を、図７にＥＰＡ−モノグリセリドによる実施例を、図８にＥＰＡ−ジグリセリドによる実施例を、図９にＥＰＡ−ＰＳによる実施例を、図１０に酵素合成ＥＰＡ−ＰＧによる実施例を、図１１にオクタデカテトラエン酸セラミドによる実施例それぞれ示す。【００８６】
いずれもブラジキニンによる内皮依存性弛緩反応は観察されなかったので、内皮細胞は除去されている血管であることがわかる。【００８７】
図１〜１１より、オクタデカペンタエン酸およびＥＰＡ−ＰＣ、ＥＰＡ−ＰＥ、ＥＰＡ−ＰＧ、オクタデカテトラエン酸、ＥＰＡ−モノグリセリド、ＥＰＡ−ジグリセリド、ＥＰＡ−ＰＳ、酵素合成ＥＰＡ−ＰＧ、オクタデカテトラエン酸セラミドは、ＥＰＡと同様にＳＰＣによる異常収縮を抑制することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によれば、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡによる収縮抑制を示す図である。
【図２】図２は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するオクタデカペンタエン酸による収縮抑制を示す図である。
【図３】図３は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−ＰＣによる収縮抑制を示す図である。
【図４】図４は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−ＰＥによる収縮抑制を示す図である。
【図５】図５は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−ＰＧによる収縮抑制を示す図である。
【図６】図６は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するオクタデカテトラエン酸による収縮抑制を示す図である。
【図７】図７は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−モノグリセリドによる収縮抑制を示す図である。
【図８】図８は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−ジグリセリドによる収縮抑制を示す図である。
【図９】図９は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡ−ＰＳによる収縮抑制を示す図である。
【図１０】図１０は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対する酵素合成ＥＰＡ−ＰＧによる収縮抑制を示す図である。
【図１１】図１１は平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するオクタデカテトラエン酸セラミドによる収縮抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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