(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出する方法であって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を用いて、以下の工程（１）〜（３）：
（１）前記変異構成塩基毎に、前記標的核酸と前記クエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、前記クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを連結して連結分子を得る連結工程と、
（２）前記変異構成塩基毎に得られる前記連結分子と前記キャプチャープローブとを前記固相担体上でハイブリダイズ可能に接触させる接触工程と、
（３）前記固相担体上において前記キャプチャープローブ毎に前記標識要素に基づくシグナル情報を取得するシグナル情報取得工程と、
を実施する、検出方法。
【請求項２】
前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド種として前記クエリクレオチドのみを有し、当該クエリヌクレオチドで連結反応が終結されるように形成されている、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、相互に同一の標識要素を備える、
請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記変異の有無又は前記構成変異塩基の比率を、以下の式；
[前記変異構成塩基の一つについて得られた連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の比]／[前記変異について得られたすべての連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の和]
に基づいて検出する、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基間に同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、前記変異構成塩基毎に異なる標識要素を備える、
請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項６】
前記接触工程は、前記変異構成塩基毎に実施された連結工程の各連結分子の混合物を一つの前記固相担体上に供給することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
１種又は２種以上の標的核酸についての複数の変異を検出するのにあたり、複数の変異につき前記（１）〜（３）の各工程をそれぞれ一括して実施する、請求項１〜６のずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記複数の標的核酸は、検体中の核酸に対してマルチプレックスＰＣＲにて準備する、請求項７に載の検出方法。
【請求項９】
固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出するためのキットであって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。
【請求項１０】
標的核酸中の変異を検出するのに用いるキットであって、
複数のキャプチャープローブを備える固相担体と、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸中の一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms）を含む遺伝子上の変異を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどにおけるＳＮＰを含む遺伝子変異は体質や遺伝病のみならず、特定疾患についての罹患率、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択等にも関連していることがわかっている。ＳＮＰや遺伝子変異は、通常、複数個が関連しているとともに、個別化医療の促進のためには、できるだけ多くのＳＮＰや変異を網羅的に検出又は定量することが求められている。
【０００３】
そこで、ＳＮＰ等を効率的に検出又は定量する方法として、ＤＮＡコンピュータ技術を利用した方法が提案されている（非特許文献１）。この方法では、図６に示すように、予め、多数の相互に相違する配列のキャプチャープローブを保持する固相担体を準備する。そして、標識用タグ配列とＳＮＰの特定塩基を含む特定部分配列に相補的なクエリ配列とを有する２種類の５’クエリプローブと、前記特定部分配列に隣接する共通部分配列に相補的なクエリ配列とキャプチャーに相補的な識別用タグ配列とを有する一つの３’クエリプローブと、を用いる。２種類の５’クエリプローブの各標識用タグ配列１、２は、それぞれのクエリ配列を区別可能に、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５等の異なる標識物質で標識可能に形成されている。また、識別用配列は、キャプチャープローブと相補的となっている。
【０００４】
この方法は、図６に示すように、まず、被験試料中の核酸中の標的核酸をマルチプレックスＰＣＲ等により増幅する（増幅工程）。次いで、ＰＣＲ増幅産物と５’クエリプローブと３’クエリプローブとのハイブリダイゼーション反応及びライゲーション反応によって、５’クエリプローブと３’クエリプローブとを連結させる（連結・コード化工程）。次に、得られた連結分子の標識用タグ配列を利用してＰＣＲでラベリングする（ラベリング工程）。こうした連結及びラベリングにより、ＳＮＰの特定塩基に関連付けた標識物質を備え、かつ一種類の識別用タグ配列を備える連結分子を得る。さらに、ラベリングした連結分子を識別用タグ配列に相補的なキャプチャープローブが固定化されたアレイで検出するというものである（検出工程）。
【０００５】
この方法では、２種類の異なる標識物質を有する連結分子が識別用タグ配列を介して一つのキャプチャープローブにハイブリダイズしたときの、それぞれの標識物質に基づくシグナル強度のプロットに基づいてＳＮＰのタイプ（２種類のホモと１種類のヘテロ）を検出する。
【０００６】
【非特許文献１】Analytical Biochemistry 364(2007)78-85
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記非特許文献１に記載の方法は、標的核酸中の特定部分配列に応じたキャプチャープローブを固定化した固相担体を準備することなく、特定塩基を含む部分配列とは無関係に設定した塩基配列を有するキャプチャープローブを固定化したユニバーサルな固相担体を利用できるという利点がある。また、ＳＮＰを構成する２種類の塩基置換を２種類の標識物質を用いて一つのキャプチャープローブで検出するため、網羅的に多数のＳＮＰを検出できるという利点もある。
【０００８】
しかしながら、上記方法では、検出工程に用いる試料を調製するまでに多くのステップを要しており、しかも全体として少なくとも十数時間を要していた。また、連結・エンコード工程及びラベリング工程で用いる酵素が検出結果に及ぼす影響を抑制するため、連結・エンコード工程以後検出工程まで（７時間程度）を同日中に実施する必要があった。このため、日常的な作業時間を考慮すると、増幅工程と連結・コード化工程以後とを異なる日に行わざるを得なかった。
【０００９】
さらに、上記方法では、ＳＮＰのタイプ判別をシグナル強度のプロットによらなければならないほか、標識物質間の退色性などに差がある場合には、ＳＮＰのタイプ判別の精度を十分に確保できない場合もありえる。
【００１０】
そこで、本発明は、迅速に標的核酸中の変異を検出又は定量する方法及びそのためのプローブセット等を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、さらに精度もよく変異を検出又は定量する方法及びそのためのプローブセット等を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、標的核酸中の１塩基多型等の変異を迅速に検出するのにあたり、連結・コード化工程と標識工程とを同時に実現することが重要であると考え、種々検討した。この結果、予め固相担体上に備えられるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列と変異部位に隣接する塩基配列と相補的であり、変異部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するクエリ配列とを備えるクエリプローブと、標的核酸中の変異部位のヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を５’末端に有するクエリヌクレオチドと標識要素とを備えるプローブとを用いることで、一挙にエンコードとラベリングを実現できるという知見を得た。本発明によればこうした知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１２】
[１]固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出する方法であって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を用いて、以下の工程（１）〜（３）：
（１）前記変異構成塩基毎に、前記標的核酸と前記クエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、前記クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを連結して連結分子を得る連結工程と、
（２）前記変異構成塩基毎に得られる前記連結分子と前記キャプチャープローブとを前記固相担体上でハイブリダイズ可能に接触させる接触工程と、
（３）前記固相担体上において前記キャプチャープローブ毎に前記標識要素に基づくシグナル情報を取得するシグナル情報取得工程と、
を実施する、検出方法。
[２]前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド種として前記クエリクレオチドのみを有し、当該クエリヌクレオチドで連結反応が終結されるように形成されている、[１]に記載の検出方法。
[３]前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、相互に同一の標識要素を備える、
[１]又は[２]に記載の検出方法。
[４]前記変異の有無又は前記構成変異塩基の比率を、以下の式；
[前記変異構成塩基の一つについて得られた連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の比]／[前記変異について得られたすべての連結分子がハイブリダイズしたキャプチャープローブについて得られるシグナル強度の和]
に基づいて検出する、[３]に記載の検出方法。
[５]  前記変異につき、
前記クエリプローブは、前記変異構成塩基間に同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備え、
前記標識ヌクレオチドは、前記変異構成塩基毎に異なる標識要素を備える、
[１]又は[２]に記載の検出方法。
[６]  前記接触工程は、前記変異構成塩基毎に実施された連結工程の各連結分子の混合物を一つの前記固相担体上に供給することを含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の検出方法。
[７]  １種又は２種以上の標的核酸についての複数の変異を検出するのにあたり、複数の変異につき前記（１）〜（３）の各工程をそれぞれ一括して実施する、[１]〜[６]のずれかに記載の検出方法。
[８]前記複数の標的核酸は、検体中の核酸に対してマルチプレックスＰＣＲにて準備する、[７]に載の検出方法。
[９]  固相担体上に固定化された複数種類のキャプチャープローブを用いて標的核酸中の変異を検出するためのキットであって、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。
[１０]  標的核酸中の変異を検出するのに用いるキットであって、
複数のキャプチャープローブを備える固相担体と、
前記標的核酸中の前記変異に関し特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎に以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記キャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を備えるとともに前記標的核酸中の特定部位に隣接する塩基配列に相補的なクエリ配列を、前記標的核酸中の前記特定部位に隣接するヌクレオチド種を相補するヌクレオチド種を３’末端に有するよう備えるクエリプローブ、
（ｂ）前記標的核酸中の前記特定部位のヌクレオチド種を相補するクエリヌクレオチドを有するとともに、標識要素を備える標識ヌクレオチドと、
を備える、キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、上記のとおりのクエリプローブと標識ヌクレオチドとを用いるため、クエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせて、クエリローブに標識ヌクレオチドを連結することにより、標的核酸中の変異構成塩基を検出して固相担体上の予め配列が決まったキャプチャープローブにハイブリダイズ可能にコード化し、しかも標識要素を備えた連結分子を一挙に得ることができる。この連結分子を固相担体上に供給するハイブリダイズ試料として用いて、連結分子が備える標識要素に基づいてシグナル強度情報を取得することで、変異構成塩基の有無や比率を検出できる。したがって、従来の連結・コード化工程とラベリング工程とを省略・簡略化して、迅速に検出工程に到達できる。
【００１４】
さらに、変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするキャプチャー配列を有するクエリプローブと変異構成塩基間で同一での識別要素を用いる標識ヌクレオチドとを用いることで、得られる連結分子は、変異構成塩基の種別に応じて固相担体上の異なるキャプチャープローブで識別できるキャプチャー配列と他の変異構成塩基に応じた連結分子と同一の識別要素とを備えている。このため、標識要素間でのバラツキを抑制するとともに、定性的な検出精度も定量程度も向上させることができる。
【００１５】
なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ-オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸であって、実際の検出対象とする変異を有する一本鎖の状態をいうものとする。通常、多くの生物において染色体ＤＮＡは相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡであるが、本発明において検出対象となるのはセンス鎖（コード鎖）及びアンチセンス鎖(鋳型鎖)のいずれであってもよい。なお、標的核酸は、典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。
【００１６】
標的核酸としては、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸の全てが増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
【００１７】
本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
【００１８】
本明細書において「変異」とは、遺伝子上の１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれか１種以上を含む変化をいう。「変異」には、一塩基多型及びそれ以外の多型を含む広い意味で使用するものとする。「多型」としては、典型的には一塩基多型が挙げられる。本明細書において「変異構成塩基」とは、一つの変異における正常型及び変異型を構成する塩基をいう。また、例えば、ＡがＧに置換される一塩基多型にあっては、「変異構成塩基」は２種類存在することになる。
【００１９】
以下、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。
【００２０】
[標的核酸中の変異又は多型を検出する方法]
本発明の検出方法は、クエリプローブと標識ヌクレオチドとを連結する連結工程と、連結分子とキャプチャープローブとを接触させる接触工程と、シグナル強度情報取得工程と、を備えている。本発明の検出方法は、１種又２種以上の標的核酸を適用対象とし、これらの標的核酸中の変異に関する特定部分配列を検出対象とする。以下、一種の標的核酸についての一つの変異を検出する一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸中の複数の変異を同時に検出する場合にも適用される。また、以下の工程は、一つの標的核酸の複数の変異を検出する場合において、個々の変異に適用される。
【００２１】
図１Ａ及び図１Ｂには、本発明の検出方法の概要を示し、図２には、本発明に用いるプローブセットの一例の概要を示し、図３には、本発明に用いるプローブセットの他の一例の概要を示し、図４には、タグ配列及びキャプチャープローブの融解温度についての説明図を示す。なお、図１〜図３は、ＳＮＰを検出するための検出方法及びキットについての一例である。以下、まず、本発明の検出方法に用いるプローブ等について説明し、次いで各工程について説明する。
【００２２】
（クエリプローブ）
クエリプローブは、クエリ配列を３’側に有しており、キャプチャープローブにハイブリダイズ可能に相補的なタグ配列をその５’側に有することができる。
【００２３】
（クエリ配列）
図１〜図３に示すように、クエリプローブは、標的核酸の検出しようとする特定の変異部位に隣接する塩基配列と相補的なクエリ配列を備えている。より具体的には、クエリ配列は、標的核酸中の変異部位の３’側に隣接する塩基配列の少なくとも一部に相補的である。こしたクエリ配列は、標的核酸に存在する可能性のある変異部位を含んでおらず、標的核酸中において保存されている領域に向けられている。したがって、クエリ配列は、検出しようとする一つの変異につき共通である。
【００２４】
また、クエリプローブは、標的核酸中の変異部位に隣接するヌクレオチド種(以下、単に隣接ヌクレオチド種ともいう。)を相補するヌクレオチド種を３’末端となるようにクエリ配列を備えている。クエリプローブの３’末端、すなわち、クエリ配列の３’末端には、後述する連結工程において、標識ヌクレオチドが連結される。
【００２５】
クエリ配列は、必要に応じ、例えば、連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。また、クエリ配列の長さは特に限定されないが、たとえば１０塩基長以上であることが好ましい。
【００２６】
（タグ配列）
図１〜図３に示すように、タグ配列は、固相担体に固定化されているキャプチャープローブとハイブリダイズ可能に相補的な塩基配列からなる。
【００２７】
タグ配列は、変異構成塩基との関係で２つの形態を有する。一つの形態は、図１Ａ及び図２に示すように、タグ配列が変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブとハイブリダイズするよう準備される形態である。このとき、検出しようとする変異についてのクエリプローブは、同一のクエリ配列と変異構成塩基毎に異なるタグ配列とを有するため、クエリプローブは変異構成塩基の種類に応じた種類が準備されることになる。この結果、検出しようとする変異につき得られる連結分子は、固相担体上の変異構成塩基毎に予め決められたそれぞれ異なるキャプチャープローブとハイブリダイズすることになる。なお、図１Ａでは、２種類の変異構成塩基をそれぞれ検出するための２種類のタグ配列が設定されているが、３種類又は４種類の変異構成塩基である場合であっても、対応するタグ配列を変異構成塩基毎に設定すればよい。
【００２８】
他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示すように、タグ配列が変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするよう準備される形態である。このとき、検出しようとする変異についてクエリプローブは、同一のクエリ配列と同一のタグ配列とを備えることになり、すべての変異構成塩基について共通の一つのクエリププローブが準備されることになる。この結果、得られる連結分子は、固相担体上の予め決められた一つのキャプチャープローブとハイブリダイズすることになる。なお、この場合、各変異構成塩基は、標識ヌクレオチドの標識要素で識別される。
【００２９】
タグ配列がハイブリダイズするキャプチャープローブのキャプチャー配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイゼーションのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、H.Yshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vol.54 9-20(2000)および特願2003-108126に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
【００３０】
例えば、キャプチャー配列としては、配列番号１〜100で表される塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイゼーションにおいて均質なハイブリダイゼーション結果が得られることが期待される。
【００３１】
タグ配列が変異構成塩基毎に準備される場合、各タグ配列とキャプチャープローブとの融解温度は、相互に近接していることが好ましい。同時に網羅的に複数の標的核酸の複数の変異を検出しようとする場合には、一つの標的核酸に対して使用する複数のクエリプローブの複数のタグ配列とキャプチャー配列との融解温度は互いに最も近似するように組み合わされていることが好ましい。例えば、図４に示すように、タグ配列（キャプチャー配列）を融解温度の順に配列したとき、一つの標的核酸に対する２種類以上のクエリプローブにおけるタグ配列を、当該順列において隣り合う２種類以上の塩基配列から選択することができる。また、他の標的核酸に対応するクエリプローブセットのタグ配列及びキャプチャー配列は、図４に示すように、既に選択した塩基配列にすぐ隣の一連の塩基配列から選択してもよいし、離れた一連の塩基配列から選択してもよい。同時に検出しようとする標的核酸に対応する全てのクエリプローブセットで使用されるタグ配列及びキャプチャー配列の融解温度が前記融解温度の順列において一連の塩基配列を用いることが好ましい。なお、融解温度は、ＧＣ％法、Wallace法、Current Protocols in Molecular Biologyに準拠した方法(秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲｐ２５に記載)等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるNearest-Neighbor法によって算出されることが好ましい。Nearest-Neighbor法による融解温度は、例えば、Visual OMP（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）とのソフトウエアや日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（Oligo Calculator；http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）により容易に取得できる。配列番号１〜１００で表されるキャプチャー配列は、Visual OMPによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ+イオン及び１．５ｍＭ Ｍｇ+イオン）の高い順に配列されている。
【００３２】
なおクエリプローブのタグ配列とクエリ配列との間に適当なスペーサー配列を備えていてもよい。スペーサーを備えることで、キャプチャープローブとのハイブリダイズ時における立体障害を回避又は抑制できる。スペーサーとしては、特に限定されないが、例えば、天然型または非天然型のポリヌクレオチド鎖、炭化水素鎖、ペプチド鎖、ペプチド核酸糖鎖などが挙げられる。スペーサーとしてヌクレオチド又はその誘導体等を用いるときヌクレオチド残基数は、標的核酸に相補的な塩基配列とタグ配列に応じて適宜決定すればよいが、好ましくは３〜１０残基である。
【００３３】
（標識ヌクレオチド）
標識ヌクレオチドは、標的核酸中の変異構成塩基に相補的な塩基を有するクエリヌクレオチドを有するとともに標識要素を備えることができる。
【００３４】
標識ヌクレオチドは、連結反応の種類に応じて適宜選択される。例えば、連結反応をＤＮＡポリメラーゼ反応を用いて行う場合には、標識ヌクレオチドは、５’末端に、クエリヌクレオチドとして、変異構成塩基に対応するクエリヌクレオチド（三リン酸）を備えている。この場合、クエリヌクレオチドは、追加的にヌクレオチドが連結されないで当該ヌクレオチドで連結反応が終結されるよう、デオキシリボース等の３’ＯＨが水素基となっていることが好ましい。こうした標識ヌクレオチドを用いることにより、一塩基伸長反応によって最も短い連結分子でエンコード及び標識できる。このようなクエリヌクレオチドとしては、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、すなわち、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰが挙げられる。
【００３５】
また、連結反応をＤＮＡリガーゼを用いて行う場合には、標識ヌクレオチドは、５’末端に変異構成塩基に対応するクエリヌクレオチド（一リン酸）を備えている。ＤＮＡリガーゼを用いる場合には、標識ヌクレオチドは、クエリヌクレオチド以外にその３’末端側に数個から２０個程度までの標的核酸の対応する領域に相補的な塩基配列（標的核酸の変異構成塩基の５’側に隣接する領域に対するクエリ配列である。）を備えるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３６】
標識ヌクレオチドは、図１〜図３に示すように、変異構成塩基毎に準備される。例えば、これらの図に例示するのは、ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合の標識ヌクレオチドであるとして説明すると、図１Ａに示すように、ＳＮＰにおいて変異構成塩基がＡ及びＧのときには、ｄｄＴＴＰ及びｄｄＣＴＰをそれぞれクエリヌクレオチドとする２種類の標識ヌクレオチド（Ａクエリ標識ヌクレオチド及びＧクエリ標識ヌクレオチド）が準備される。
【００３７】
標識ヌクレオチドは、適当な標識要素を備えている。ｄｄＮＴＰに付加できる標識要素としては、公知の標識物から適宜選択される。例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物質が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、32Ｐ、35Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００３８】
標識ヌクレオチドにおける標識要素は、変異構成塩基との関係に関して２種の形態を採ることができる。すなわち、一つの形態は、図１Ａ及び図２に示すように、標識ヌクレオチドの標識要素を、変異構成塩基間で同一、すなわち、検出しようとする変異につき同一とする形態である。この形態は、クエリプローブのタグ配列が変異構成塩基毎に準備されている場合に組み合わされる。このようなクエリプローブから得られる連結分子は、標識要素が変異構成塩基間で同一であっても、変異構成塩基の有無や比率を、変異構成塩基毎に準備されるキャプチャープローブにおけるシグナル強度情報により検出できる。
【００３９】
標識要素の他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示すように、標識ヌクレオチドの標識要素が、変異構成塩基毎に相違する形態である。すなわち、標識要素を、検出しようとする変異の変異構成塩基の種類に応じて異なる種類の識別標識とする形態である。この形態は、クエリプローブのタグ配列が変異構成塩基間で同一に準備されている場合に組み合わされる。このようなクエリプローブから得られる連結分子は、検出した変異構成塩基が異なっていても同一のキャプチャープローブとハイブリダイズするため、各変異構成塩基を異なる標識要素に基づくシグナル強度情報により検出しなければならないからである。
【００４０】
多型や変異比率の検出精度の観点からは、一つの変異についての異なる変異構成塩基間で同一の標識要素を用いることが好ましい。同一の標識要素を用いることで標識間におけるシグナル強度の相違や品質等によるバラツキを抑制できるからである。一方、キャプチャープローブ数を低減するためには、一つの変異についての異なる変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブを用い、変異構成塩基毎に異なる標識要素を用いることが好ましい。
【００４１】
（連結工程）
連結工程は、変異構成塩基毎に、標的核酸とクエリプローブとをハイブリダイズさせるとともに、クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを付加して連結分子を得る工程である。連結工程は、変異構成塩基毎に行われる。すなわち、図２に示すプローブセットを用いる場合には、図１Ａに示すように、変異構成塩基がＴであるときには、変異構成塩基としてＴを検出するためのクエリプローブと、アデニンを塩基として有するヌクレオチド種を有する標識ヌクレオチドと、標的核酸と、を用いる。すなわち、Ｔを検出するために構成された組み合わせを用いる。また、図３に示すプローブセットを用いる場合には、変異構成塩基がＣであるときには、図１Ｂに示すように、変異構成塩基としてＣを検出するためのクエリプローブ（変異構成塩基としてＴを検出する場合と同一のクエリプローブではある。）と、グアニンを塩基として有するヌクレオチド種を有する標識ヌクレオチドと、標的核酸と、を用いる。
【００４２】
上記のように変異構成塩基毎に準備されたクエリプローブと標識ヌクレオチドの存在下で連結工程を実施することで、意図しないで連結された連結分子の生成を排除できるとともに、他のクエリヌクレオチド種が並存することによって意図した連結分子の生成率がバラツキを抑制できる。特に、変異構成塩基毎にクエリプローブが準備されるときには、意図しない連結分子が生成されてしまって、変異等の検出ができなくなる。
【００４３】
クエリプローブの３’末端に標識ヌクレオチドを付加するには、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼが用いられる。ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性のＤＮＡポリメラーゼである。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、連結分子の生成量を増加させることができる。ＤＮＡリガーゼは、確実性及び効率の観点から好ましくは耐熱性のＤＮＡリガーゼである。
【００４４】
連結工程の実施により、連結分子が得られる。標識ヌクレオチドは、追加の塩基伸長工程がされないように修飾されているため、連結工程の実施により、クエリ配列の３’末端の隣接ヌクレオチド種に変異構成塩基を相補するヌクレオチド種が連結されて、伸長反応が停止される。この結果、標的核酸中の変異構成塩基を検出可能にキャプチャープローブと関連付けられかつ標識要素が備えられた連結分子が得られる。
【００４５】
連結分子の一つの形態は、図１Ａ及び図３に示すように、変異構成塩基毎にキャプチャープローブに関連付けられたタグ配列（ＣＰ１（−）及びＣＰ２（−）をそれぞれ有し、変異構成塩基Ａに相補するチミジン（Ｔ）ヌクレオチドが付加された連結分子及び変異構成塩基Ｇに相補するシトシン（Ｃ）ヌクレオチドが付加された連結分子が得られる。これらの連結分子は同一の標識要素を有している。また、他の一つの形態は、図１Ｂ及び図２に示すように、変異構成塩基間で同一のキャプチャープローブに関連付けられたタグ配列（ＣＰ３（−）をそれぞれ有し、変異構成塩基Ｃに相補するグアニン（Ｇ）ヌクレオチドが付加された連結分子及び変異構成塩基Ａに相補するチミン（Ｔ）ヌクレオチドが付加された連結分子が得られる。これらの連結分子は相互に異なる標識要素を有している。
【００４６】
同時に複数の標的核酸について複数の変異を検出することを考慮すると、図１Ａ及び図３に示す検出形態を好ましく採用できる。標識要素を変異に応じて準備する必要がなく、また、異なるキャプチャープローブで異なる塩基種の変異を検出するため、検出精度もより高いからである。なお、同時に複数の標的核酸について複数の変異を検出するときでも、複数の標的核酸について準備されるクエリヌクレオチドと標的核酸とを一括して変異構成塩基毎に準備した標的ヌクレオチドと反応させればよい。
【００４７】
（接触工程）
接触工程は、連結分子中のタグ配列と相補的なキャプチャー配列を有する２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。この工程によれば、連結分子中のタグ配列がキャプチャープローブ中のキャプチャー配列と一定条件下において選択的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし二重鎖を形成する。この接触工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、用いられるキャプチャープローブ等に応じて適宜設定される。
【００４８】
（キャプチャープローブが固定化された固相担体）
接触工程では、２種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体を用いることができる。こうした固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のキャプチャープローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のキャプチャープローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよい。
【００４９】
また、好ましい固相担体は、２種類以上のキャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである。例えば、こうしたアレイを用いて、このキャプチャープローブの順序に沿って、各標的核酸に対応する２種類以上のキャプチャープローブを割り当てることで、キャプチャー配列の融解温度の差に由来するハイブリダイゼーションのバラツキを抑制して、精度よく標的核酸中の変異構成塩基を含む特定部分配列を検出することができる。好ましいアレイの一例を図４に示す。
【００５０】
接触工程で用いる固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャーが互いに隣接する配置状態を備えるアレイであることが好ましい。これらが隣接していることにより、アレイ上におけるハイブリダイゼーションのキャプチャープローブの固定化位置に由来するバラツキを抑制して、精度よく変異構成塩基を含む標的核酸中の特定部分配列を検出することができる。
【００５１】
さらに好ましい固相担体は、一つの標的核酸に用いるキャプチャープローブが互いに隣接する配置状態を備え、かつこれらの隣接するキャプチャープローブ間の融解温度の最大温度差（絶対値）が５℃以下好ましくは０．２℃以下となるように配置されているアレイである。こうしたアレイを用いることで、アレイ上でキャプチャープローブの固定化位置及びキャプチャープローブの融解温度の差に基づくハイブリダイゼーションのバラツキを抑制できる。典型的には、多数のキャプチャープローブを融解温度に基づく順序で配列したとき連続して配列されているキャプチャープローブを一つの標的核酸の特定部分配列を検出するための２種類以上のキャプチャープローブとして採用すればよい。
【００５２】
固相担体に固定化される複数のキャプチャープローブは、それぞれ配列番号１〜１００から選択されるキャプチャー配列を有することができる。なお、これらの塩基配列は既に説明したように、一定条件で設計された正規直交化配列である。
【００５３】
キャプチャープローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。キャプチャープローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくはキャプチャープローブ間において同一塩基長で同一配列とする。
【００５４】
（シグナル強度情報取得工程）
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の固相担体上の標識要素に基づくシグナル強度情報を取得する工程である。標的核酸中の変異構成塩基は、所定の標識要素及び所定のキャプチャープローブに予め関連付けされている。このため、所定のキャプチャープローブの位置で所定の標識要素に基づくシグナル強度情報を取得することで、標的核酸中の特定部分配列の有無やその量等を定量することができる。
【００５５】
こうしたキャプチャープローブに関連付けされたシグナル強度情報は、標的核酸中に存在する変異構成塩基の数だけ得ることができる。すなわち、変異要素塩基毎に異なる標識要素で標識されていても、変異構成塩基舞に異なるキャプチャープローブで識別され同じ標識要素で検出されていても同様である。
【００５６】
シグナル強度情報取得工程は、用いた固相担体の形態や標識物質の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、固相担体からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。固相担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。
【００５７】
（検出工程）
検出工程は、所定の標識要素及び所定のキャプチャープローブに関連付けられた変異構成塩基についてのシグナル強度情報に基づいて、変異構成塩基の有無や比率等を検出する工程である。すなわち、検出工程により、変異の有無、多型のタイプ及び変異率を検出することができる。本発明方法によれば、単時間で標的核酸中の変異を検出するためにキャプチャープローブに関連付けられて所定の標識要素で標識された連結分子を得ることができるため、迅速に変異検出が可能である。特に、複数の（多数の）標的核酸中の複数の（多数の）変異を検出する場合にも、変異構成塩基毎に複数の標的核酸につき一括して実施できる。このため、複数の標的核酸につき複数の変異を検出するにあたっても、一種類の核酸中の一つの変異を検出するのと同じ時間で連結分子を作製できる。したがって、本発明方法は、特に網羅的に遺伝子の変異を検出するのに好ましい。また、本発明方法は、ＳＮＰや変異を効率的にハイスループットで検出するのに特に適している。
【００５８】
標的核酸中の多型又は変異を検出するには、二つの形態がある。一つは、図１Ａ及び図２に示す検出形態である。この形態では、変異構成塩基毎に関連付けられたキャプチャープローブＣＰ１、ＣＰ２について同一の標識要素に基づくシグナル強度情報から変異を検出する。キャプチャープローブＣＰ１及びＣＰ２について得られたシグナル強度情報の比から、多型のタイプ、たとえば、ＡＡホモ、ＧＧホモ及びＡＧヘテロなどの多型のタイプを検出できる。また、Ａが正常型でありＧが変異型である変異であると仮定したとき、[キャプチャープローブＣＰ２について得られたシグナル強度情報／キャプチャープローブＣＰ１、ＣＰ２について得られるシグナル強度情報]を算出することで、変異比率（変異構成塩基がＧである比率）を得ることができる。こうした検出形態では、同一標識要素に基づくシグナル強度情報を利用しているため、標識要素自体の特性や品質に基づくバラツキを抑制して精度よい検出が可能となる。特に、変異比率の取得には、変異構成塩基毎に異なるキャプチャープローブを用いることが好ましい。
【００５９】
他の一つの形態は、図１Ｂ及び図３に示す検出形態である。この形態では、同一のキャプチャーＣＰ３についての、変異構成塩基毎に関連付けられた異なる標識要素に基づくシグナル強度情報から変異を検出する。キャプチャープローブＣＰ３について得られた２種類の標識要素についてのシグナル強度情報の比（それぞれのシグナル情報をＸＹ軸にプロットすること）から、多型のタイプ（ＣＣホモ、ＴＴホモ及びＣＴヘテロ）を検出できる。また、図１Ａ等の検出形態と同様に変異比率を得ることができる。
【００６０】
標的核酸中の変異構成塩基を異なるキャプチャープローブで検出する場合、キャプチャープローブは融解温度が近いものを採用しているものの融解温度及びその他の事情によりキャプチャープローブ間におけるハイブリダイズ量にバイアスが生じる可能性があるが、以下のように各工程を実施することでこれを抑制又は回避することができる。
【００６１】
例えば、連結分子とともに、ターゲットとするキャプチャープローブ毎に、所定のタグ配列と標的核酸について用いたのとは異なる標識物質とを備え相互に同一濃度で準備した補正用オリゴヌクレオチドを、固相担体上で前記キャプチャープローブとハイブリダイズ可能に接触させるようにし、シグナル強度情報取得工程で標的核酸及び補正用オリゴヌクレオチドについてのシグナル強度情報を取得する。キャプチャープローブ間での補正用シグナル強度情報の大小を比較することで、キャプチャープローブ間のハイブリダイゼーション効率（量）の差の有無を検出できる。キャプチャープローブ間で得られたシグナル強度に差が生じた場合には、そのようなシグナル強度の差が連結分子にも存在するとして補正する。こうした補正用シグナル強度情報を利用した補正は、多型の有無（タイプ）並びに変異の有無及び変異率のいずれを得る場合にも適用できるとともに、後述する参照用シグナル強度情報に基づく補正と併用することができる。
【００６２】
遺伝子変異を検出及び変異率を定量するときには、例えば、標的核酸に替えて準備した、検出しようとする前記変異について所定の比率で変異構成塩基を備える参照用オリゴヌクレオチドにつき、接触工程、連結工程、接触工程及び前記シグナル強度情報取得工程を実施して、前記参照用オリゴヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報を利用して前記検出工程を実施することができる。好ましくは、２種類以上の変異比率で準備した参照用オリヌクレオチドについて取得した参照用シグナル強度情報に基づいて検量線を作製し、この検量線を利用して試料中の標的核酸中の多型や変異などを検出し変異率を定量することができる。検量線を用いることで精度の高い検出及び定量が可能となる。なお、参照用シグナル強度情報の取得及び検量線の作製は予め行っておいてもよいし、標的核酸についての変異検出時に同時に行ってもよい。
【００６３】
なお、補正に関して用いる参照用オリゴヌクレオチド及び補正用オリゴヌクレオチドは、必ずしも1本鎖で準備される必要はなく、２本鎖であってもよい。
【００６４】
（プローブセット）
本発明のプローブセットは、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットである。本発明のプローブセットは、標的核酸中の特定部位において検出する可能性のある変異構成塩基毎にキャプチャープローブと標識ヌクレオチドとを備えている。キャプチャープローブと標識ヌクレオチドについては既に説明したとおりである。
既に説明したキャプチャープローブと標識ヌクレオチドを用いることで、標的核酸中の変異を迅速に検出できる。本発明のプローブセットは、このようなキャプチャープローブが固定化されたアレイなどの固相担体とキット化されていてもよい。
【００６５】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。以下の実施例では、本発明の検出方法による遺伝子変異（ＳＮＰ）の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（1）変異遺伝子検出用DNAマイクロアレイの作製
（2）サンプル遺伝子の増幅
（3）連結（ラベル化含む）反応
（4）DNAマイクロアレイを用いた検出
（5）データ解析
【００６６】
(1)変異遺伝子（SNP遺伝子）検出用DNAマイクロアレイの作製
商業的に入手したプラスチック基板に、3’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液をキャプチャープローブとし、日本ガイシ株式会社にてGENESHOTスポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のD1_1からD1_100のうちTmが高い順に、D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41, D1_92, D1_79, D1_78, D1_65の9種とした(表1)。 スポットの後、80℃、1時間のベークを行った。さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴDNAの固定化を行った。
【００６７】
【表１】
0005319148.tif 000002
【００６８】
合成オリゴＤＮＡは以下の手順で固定化した。上記ベーク後、2×SSC/0.2％SDSによる洗浄を15分間実施し、 95℃ 2×SSC/0.2％SDSによる洗浄を5分間実施し、さらに、滅菌水洗浄（10回上下振とう） 3回を行った後、 遠心（1000rpm×3分)により液切りした。
【００６９】
（２）変異遺伝子サンプルの調製と増幅
検出対象とする変異遺伝子の塩基配列は、以下の表に示す変異遺伝子周辺配列を持っている。いずれも150bp程度の人工合成遺伝子である。４種類の変異遺伝子サンプルは、以下の変異１〜４の野生型及び変異型のそれぞれ合成オリゴＤＮＡを５とおりの比率（野生型：変異型の比を100：0、95：5、90：10、75：25、50：50の5通り）で含んだものとして調製した。
【００７０】
【表２】
0005319148.tif 000003
【００７１】
サンプル増幅手順は以下の通りであった。サンプル増幅用試薬として、TaKaRa Bio社のTaKaRa Ex Taq(R)（Catalog# RR001B）を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、PCRプライマーについてはTm=58.90±0.75℃の範囲となるよう設計を行った。各プライマー配列を表3に示す。
【００７２】
【表３】
0005319148.tif 000004
【００７３】
変異遺伝子サンプル増幅は以下のようにして行った。なお、本実施例では、各変異遺伝子サンプルにつき個々に増幅した。まず、以下の試薬を個々の変異遺伝子サンプルごとに調製した。
【００７４】
【表４】
0005319148.tif 000005
【００７５】
次いで、サーマルサイクル反応を行った。具体的には、94℃で30秒後、94℃で40秒、66℃で40秒及び72℃で2分を40サイクル行い、その後4℃に下げた。個々に増幅した産物（計4変異種）を変異遺伝子割合ごとにチューブに混ぜ、PCR productsとし、野生遺伝子：変異遺伝子比が100：0、95：5、90：10、75：25、50：50の5チューブを調製した。以上により、標的変異遺伝子を含むPCR産物５種を得た。
【００７６】
（３）連結(ラベル化込み)反応
増幅済みサンプルのライゲーション（ラベル化込み）反応手順は以下の通りに行った。反応にはTaKaRa Bio社のTaKaRa Ex Taq(R)(RR001A)を使用した。加熱にはサーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、クエリプローブ配列及び試薬を以下の表に示す。
【００７７】
【表５】
0005319148.tif 000006
【００７８】
【表６】
0005319148.tif 000007
【００７９】
まず、上記試薬を調製した。なお、試薬は、変異遺伝子サンプルの異なる変異遺伝子割合毎に調製した。Cy3標識ddNTPおよびクエリプローブの組合せについては、以下の表に示す通りとした。なお、以下の表においてYはクエリプローブ数を表す。
【００８０】
【表７】
0005319148.tif 000008
【００８１】
連結反応（一塩基伸長反応）は、以下のとおりに行った。すなわち、９２℃で1分の後、３０℃で１５分、７５℃で１０分、その後、１０℃に冷却した。次に、５通りの変異遺伝子割合ごとに得られた産物各４種類を混合したものを各変異遺伝子割合に対する産物（５種）とした。
【００８２】
（４）DNAマイクロアレイを用いた検出
ラベル化済みサンプルを用いたDNAマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。ハイブリダイズ用の標識サンプル溶液の組成を以下の表に示す。
【表８】
0005319148.tif 000009
【００８３】
（ハイブリダイズ）
調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱した後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N）を使用し80℃で1分加熱した。次いで、上記サンプル溶液を各9μｌずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーモブロックＳｌｉｄｅ（eppendorf社）を使用し、37℃で60分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。
【００８４】
（洗浄）
洗浄は以下のように行った。すなわち、以下に示す組成の洗浄液をガラス染色バットに移した後、ハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、5分間上下振とうして行った。その後、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、1分間上下振とうし、さらに、2000rpmで1分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。
【００８５】
【表９】
0005319148.tif 000010
【００８６】
（スキャナーによる蛍光検出）
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。
【００８７】
（５）データ解析
キャプチャー間のハイブリダイズ効率(量)の差の有無を確認するため、同時にハイブリダイズしたHybri Controlの蛍光シグナルを測定した。変異1遺伝子検出用スポット（D1_52およびD1_71）それぞれの測定結果を以下の表に示す。
【００８８】
【表１０】
0005319148.tif 000011
【００８９】
表１０の結果より、変異1遺伝子検出用の２スポット間の蛍光シグナル比はほぼ1であり、２スポット間のハイブリダイズ吸着量に大きな差はないと考えられる。よって、変異1遺伝子検出用スポットの補正は不要と判断した。
【００９０】
次に、変異1遺伝子についてスキャナーによる蛍光シグナル検出（D1_52およびD1_71）を行った。結果を以下の表に示す。
【００９１】
【表１１】
0005319148.tif 000012
【００９２】
表１１の結果をもとに、横軸に変異遺伝子割合、縦軸にＢ／（Ａ＋Ｂ）をプロットし、検量線を作成した。結果を図５に示す。
【００９３】
これらの結果によれば、変異遺伝子における変異型の存在を容易に検出することができ、低い変異率であっても容易に検出することができることが分かった。また、野生型：変異型の比率も容易に検出できることが分かった。
【００９４】
以上説明したように、本発明により、従来の連結・コード化工程及び標識工程を同時に行うことが可能となった。その結果、連結と標識とを実施するのに必要な時間は１．５時間となり、工程を実施するのに必要な時間を、従来の５時間の１／３以下の時間に短縮することが可能となった。なお、こうした工程時間の短縮にも関わらず、低い変異率の場合でも精度よく検出できたことから、本発明によれば、検出精度を落とすことなく工程時間を短縮できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】本発明の検出形態の一例の概要を模式的に示す図である。
【図１Ｂ】本発明の検出形態の他の一例の概要を模式的に示す図である。
【図２】本発明に用いるクエリプローブと標識ヌクレオチドとの組み合わせの一例を示す図である。
【図３】本発明に用いるクエリプローブと標識ヌクレオチドとの組み合わせの他の一例を示す図である。
【図４】本発明に用いるタグ配列とキャプチャー配列の一例を示す図である。
【図５】実施例で作成した検量線を示す図である。
【図６】従来技術によるＳＮＰ検出形態を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１〜１０９：キャプチャープローブ、配列番号１１０〜１１７：人工合成遺伝子、配列番号１１８〜１２５：プライマー、配列番号１２６〜１３３：合成プローブ
【図１Ａ】
0005319148.tif 000013
【図１Ｂ】
0005319148.tif 000014
【図２】
0005319148.tif 000015
【図３】
0005319148.tif 000016
【図４】
0005319148.tif 000017
【図５】
0005319148.tif 000018
【図６】
0005319148.tif 000019
【配列表】
0005319148000001.app