(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に凹部を有する担体と、
前記担体の表面を覆い前記担体と接着されたカバー部材と、
前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材と、
前記担体と前記カバー部材との間の空隙内に封入されてなる撹拌子とからなる分析チップであって、
前記担体表面に前記接着部材が接着し、当該接着部材にカバー部材が接着しており、
前記担体表面における担体と接着部材との接着地点が、凹部の外周部端面より離れた外側の領域に位置しており、前記接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔が、撹拌子の最短径より短いことを特徴とする分析チップ。
【請求項２】
前記カバー部材の担体側表面外周に凸部が設けられており、前記接着部材が、前記担体と前記カバー部材の担体側表面外周の凸部との間に介在することを特徴とする請求項１記載の分析チップ。
【請求項３】
前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記カバー部材が、前記担体に脱離可能に接着されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記接着部材が、シリコーン系ポリマー、アクリル系ポリマー及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析チップ。
【請求項６】
（Ａ）請求項３〜５のいずれか１項に記載の分析チップに被検物質をアプライする工程；
（Ｂ）前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に選択的に結合させる工程；及び
（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程
を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項７】
前記分析チップが、前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有し、前記工程（Ｃ）が、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることを含む、請求項６記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）を固定化した担体を備え、被検物質が含まれる溶液と選択結合性物質との反応による分析を行う際に用いうる分析チップ及び当該分析チップを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、ＤＮＡのみならず蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用されている。これらの方法の大きな特徴は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点にあり、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法に応用され、サンプル中の遺伝子量の迅速な推定に貢献している。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。
【０００４】
ＤＮＡチップの使用時は、調製した検体溶液を、ＤＮＡチップ上の選択結合性物質が設けられた領域全体に広がるようにアプライすることが必要であると同時に、チップ上の微量な検体ＤＮＡ溶液を、蒸発を抑えながら安定して検体溶液とのハイブリダイゼーションを進めることが必要である。このような検体溶液の蒸発の問題を解決する手段として、ＤＮＡチップを湿潤状態に保てる密閉容器が市販されており、これを使用することで蒸発は抑えられる。しかしながら、このような手段を用いる場合、新たに密閉容器を購入することで実験コストが上昇するという問題や、密閉容器内にＤＮＡチップを安定して設置するといった操作が加わり、実験作業が煩雑になるという問題がある。
【０００５】
一方、特許文献１では、あらかじめ微粒子を検体ＤＮＡ溶液に添加しておいた微粒子分散溶液をＤＮＡチップにアプライして、カバーガラスを被せて、シール剤により密閉し、カバーガラス、ＤＮＡチップ及びシール剤により規定される密閉された空隙を形成することが開示されている。これにより微粒子の運動を利用して撹拌を行いながら検体溶液の蒸発を防いでハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０００６】
しかしながら、微粒子分散溶液のピペットでの操作は、微粒子が沈殿しやすいことなどから煩雑な作業となる。また、検体溶液を密閉する操作においては、検体溶液がシール剤に接触して、検体溶液へのシール剤のコンタミネーションによるバックグラウンドノイズの上昇や、溶液漏れによる検体溶液のロスが起こるといった不都合が多い。従って、特許文献１に開示される技術に従って良好な分析を行うには、熟練した技術が必要であるという問題がある。更に、カバー部材とチップとの間の接着部分に微粒子が付着し動かなくなり、その結果微粒子が障害物となり細部にまで検体溶液が浸透しなくなる可能性があった。
【０００７】
【特許文献１】特許第３５５７４１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するもので、被検物質を含む溶液を、選択結合性物質固定化担体上にアプライする際に、撹拌子の動きを妨げることなく、気泡の発生を防止して検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる分析チップ及び分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕  表面に凹部を有する担体と、
前記担体の表面を覆い前記担体と接着されたカバー部材と、
前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材と、
前記担体と前記カバー部材との間の空隙内に封入されてなる撹拌子とからなる分析チップであって、
前記担体表面における担体とカバー部材との接着地点が、凹部の外周部端面より離れた外側の領域に位置しており、前記接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔が、撹拌子の最短径より短いことを特徴とする分析チップ。
〔２〕  前記カバー部材の担体側表面外周に凸部が設けられており、前記接着部材が、前記担体と前記カバー部材の担体側表面外周の凸部との間に介在することを特徴とする前記〔１〕記載の分析チップ。
〔３〕  前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有することを特徴とする、前記〔１〕または〔２〕に記載の分析チップ。
〔４〕  前記カバー部材が、前記担体に脱離可能に接着されていることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の分析チップ。
〔５〕  前記接着部材が、シリコーン系ポリマー、アクリル系ポリマー及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物であることを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の分析チップ。
〔６〕  （Ａ）前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の分析チップに被検物質をアプライする工程；（Ｂ）前記被検物質を前記担体に選択的に結合させる工程；及び（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔７〕  前記分析チップが、前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有し、前記工程（Ｃ）が、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることを含む、前記〔６〕記載の分析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分析チップ及び分析方法によれば、核酸等のハイブリダイゼーションに代表される、検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる。特に微量検体溶液による反応においても適用可能であり、より高精度な結果を得ることができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分析チップは、表面に凹部を有する担体と、担体の表面を覆い担体と接着されたカバー部材と、前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材と、前記担体と前記カバー部材との間の空隙に封入されてなる撹拌子とを備える。
【００１２】
本発明の分析チップとは、被検物質を含む溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び担体表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。選択結合性物質及びその固定化の態様については後述する。
【００１３】
前記担体としては、表面に凹部を有するものを用いることが必要である。前記カバー部材は、前記担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。
そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記担体に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。担体の形状、前記選択結合性物質、その固定化の態様、空隙の形状、接着の態様等の具体例については後に詳述する。
【００１４】
図１は、本発明の分析チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図２は図１の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図１及び図２に示す例においては、担体２が、接着部材３を介してカバー部材１で覆われ、凹部Ｒ１を含む空隙５を形成しており、空隙５は、本発明において必要に応じて設けることのできる複数の貫通孔４を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間となっている。
図１及び図２の例においては、担体表面における担体とカバー部材との接着地点Ｐ１が凹部Ｒ１の外側に位置している。また、図示しないが、空隙５に撹拌子が封入されており、接着部材の厚みＨ１が撹拌子の最短径より短いものである。
【００１５】
本発明の分析チップにおいて、担体表面における担体とカバー部材との接着地点は、担体表面の凹部以外の領域に位置していることが必要である。このように、接着地点が凹部以外の領域に位置していることにより、接着部材に撹拌子が付着しないため微粒子が自由に動きまわり、その結果気泡の発生を防止して検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる。
【００１６】
ここで、担体とカバー部材との接着地点とは、担体とカバー部材との間に介在する接着部材の位置を意味し、本発明においては、担体側の接着地点が、接着部材と担体表面の凹部の外周部端面より離れた外側の領域に位置する必要がある。凹部の外周部端面から接着地点までの距離（例えば、図２のｗ）は、使用する攪拌子が接着部材に接触しない距離であれば特に限定されないが、１〜７００μｍであることが好ましい。
【００１７】
接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔は、空隙５に封入される撹拌子の最短径より短い必要がある。ここでいう接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔は、例えば図１及び図２の例のようにカバー部材が平坦である場合は、接着部材の厚み（例えば、図２のＨ１）であり、また、例えば後述する図３又は図４のようにカバー部材の担体側表面外周に凸部が設けられている場合は、接着部材の厚みと凸部の高さ（凸部上面とカバー部材内面との間隔）の合計（例えば、図３および図４のＨ１＋Ｈ２の高さ）となる。該間隔は、撹拌子が入り込まない長さであれば特に限りはないが、好ましくは撹拌子の最短径の９０％以下、より好ましくは８０％以下である。ここで、撹拌子の最短径とは撹拌子の形状を規定する径のうち最も短い径を意味する。
また、後述するように、使用する撹拌子をふるいなどに掛けて選抜している場合には撹拌子の最短径に多少の幅が生じる場合もあるが、その場合には、もっとも小さいサイズの撹拌子の最短径を基準として、これより短い間隔とすることができる。
撹拌子の最短径は、撹拌子の形状が球形の場合には直径が該当し、マイクロロッド状（棒状）の場合には底面の直径が該当する。尚、撹拌子の形状は球状やマイクロロッド状に限定されない点については、後述するとおりである。
【００１８】
上述したように、接着地点は、接着部材と担体表面の凹部の外周部端面より離れた外側の領域に位置することにより、接着地点において、担体表面の凹部とカバー部材と接着地点により三方向を囲まれた空間が生じることとなる。
図２を引用して具体的に説明すると、凹部Ｒ１の外周部端面Ｐ２が接着部材の内側断面Ｐ３よりも内側に位置し、担体表面において、凹部Ｒ１に隣接して凹部Ｒ１よりも高い部分Ｐ４が生じる。その結果、空隙５の外縁部分には、接着部材の断面Ｐ３、担体のＰ４及びカバー部材の一部により三方を囲まれた空間Ｓ１が形成される。
本発明の分析チップにおける接着部材の厚みは、通常は１μｍ〜１００μｍの範囲で規定され、一定の接着強度を備えるために、５〜８０μｍとすることが好ましい。図１及び図２の例のような平面状のカバー部材を用いる場合は、接着部材の厚みが接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔になるので、接着部材の厚みを撹拌子の最短径より短くする必要がある。
【００１９】
一方、本発明の分析チップの形状は特に限定されず、図１及び図２の例のように平面状のものを利用することができるほか、カバー部材の担体側表面外周に凸部が設けられたものを用いることができる。このような凸部が設けられたカバー部材を用いることにより、接着部材の位置決めが容易となるので好ましい。この場合、前記接着部材は、担体とカバー部材の凸部との間に介在させることができる。すなわち、前記カバー部材表面における担体とカバー部材との接着地点を前記凸部の一部分、好ましくは凸部上面の全部あるいは一部分、特に好ましくは凸部上面のうち少なくとも内周部分を含む一部分或いは全部に位置させることができる。この場合も、担体表面、カバー部材（具体的には担体側表面及びカバー部材の凸部側面）、及び接着部材により三方向を囲まれた空間が生じることが好ましい。特に、カバー部材の凸部の側面と接着部材の空隙側端面とが平面を構成するか、あるいは接着部材の空隙側端面の方がカバー部材の凸部の側面よりもやや外側に位置すると、微粒子と接着部材との接着を効果的に回避できるので好ましい。凸部の形状については特に限定されないが、凸部の高さ（図３及び図４のＨ２）としては０〜１５０μｍの範囲であることが好ましい。また担体との接着面が凸部の上面であることが好ましく、中でも上面がカバー部材の担体側表面に対し水平であることが好ましく、さらに凸部の高さが均一であることがもっとも好ましい。また、凸部の内側面の形状については特に問わないが、平面であることが好ましく、カバー部材の担体側表面に対し略直行する平面を呈することが最も好ましい。尚、カバー部材に凸部を設ける場合も接着部材の厚み（図３及び図４のＨ１）については、上述したように通常は１μｍ〜１００μｍの範囲で規定され、一定の接着強度を備えるために、５〜８０μｍとすることが好ましい。このようなカバー部材を備える分析チップの一例を図３及び図４に示す。
図３に示す例においては、カバー部材の担体側表面外周に凸部１Ａが設けられ、凸部１Ａ上面の一部に担体とカバー部材との接着地点Ｐ５が位置している。一方、図４に示す例では、カバー部材の担体側表面外周に凸部１Ａが設けられ、凸部１Ａの上面全体が担体とカバー部材との接着地点Ｐ５となっている。
【００２０】
本発明の分析チップにおいて、カバー部材は、担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。担体がＤＮＡチップの場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要である。その時、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００２１】
カバー部材を担体に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着することができる。
【００２２】
接着部材として両面テープを使用した場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましい。より具体的には、両面で接着力の異なる両面テープの、接着力の弱い面を担体側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に担体より脱離し易く、それにより、担体上への接着部材の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。
【００２３】
接着部材として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらを接着層に用いることで両面テープより密閉性を高めることが可能となるので、これらも好ましく用いることができる。特に、このような樹脂組成物を接着部材とした場合、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。
【００２４】
特に、接着部材としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。特に、接着部材としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができるので好ましい。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（ダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。
【００２５】
カバー部材の担体への接着は、ディスペンサー（武蔵エンジニアリング社製）を用いて、前記担体の凹部から離れた場所に接着部材を塗布し、前記カバー部材をプローブＤＮＡ固定化領域に被さるように設置し、カバー部材の上から荷重を掛け、静置して乾燥させることにより行うことができる。この時、掛ける荷重により、接着部材の厚みを調節することができる。接着時の荷重は、１０〜１００ｇ重の範囲を好ましく用いることができる。
【００２６】
本発明の分析チップでは担体、カバー部材及び接着部材を含む構造により規定される空隙内に封入された撹拌子をさらに含む。当該撹拌子を含むことにより、検体溶液をアプライした後に分析チップを揺動、回転等させることで、空隙内で撹拌子を運動させ、検体溶液の十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。
【００２７】
特許文献１に開示される、微粒子を含む検体溶液をアプライしてカバーガラスを被せてシール剤により密閉する方法では、上述の通り操作が煩雑となり、且つ、バックグラウンドノイズの上昇を起こすことがある。しかし、本発明の分析チップの場合、カバー部材及び担体等が接着され一体となっているため、予め撹拌子を封入しておくことができ、検体溶液のアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。
【００２８】
前記撹拌子の形状は、特に限定されず、球状の形状以外に、多角形、円筒形などの任意の形状とすることができる。また、撹拌子のサイズは、接着地点における担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔が、撹拌子の最短径より短いものであれば特に限りはない。好ましくは、該間隔が撹拌子の最短径の９０％以内、より好ましくは８０％以内となるものを用いる。例えば球状の微粒子の場合、直径０．１〜４００μｍ、好ましくは０．１〜３００μｍの範囲とすることができ、また、円筒形の微粒子の場合、長さ５０〜３００００μｍ、底面直径１０〜４００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの範囲とすることができる。撹拌子が球状の微粒子であってそのサイズにバラツキがある場合には、微粒子を特定サイズのふるいに掛け、これを通過しない微粒子を選別することで、所望の最短径を有する微粒子を得ることができる。ふるいのサイズは任意に選択できるが、例えば２５０μｍ、２１２μｍ、１９８μｍ、１８０μｍ、１５０μｍ、１２５μｍ、９０μｍのサイズのふるいを用いることにより、これらを最短径とする微粒子を得ることができる。また、特定のサイズのふるいを通過する微粒子を選別することで、所望の最長径を有する微粒子を得ることができる。尚、撹拌子としてサイズや形状の異なる２種類以上の微粒子を組み合わせて用いることもできる。
前記撹拌子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。
【００２９】
本発明の分析チップは、撹拌子を、予め封入した態様であることが好ましいが、これには限定されず、撹拌子が封入されていない態様であってもよい。この場合、撹拌子を使用せず分析を行ってもよく、検体溶液に撹拌子を混入させて検体溶液のアプライと同時に空隙内に撹拌子を充填してもよく、または検体溶液のアプライの前又は後に、貫通孔を介して撹拌子を別途充填してもよい。
【００３０】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することが好ましい。図１〜図４に示す分析チップの使用においては、検体溶液を貫通孔４の任意の１箇所以上よりアプライし、空隙５に充填する。その後、貫通孔４を封止部材で塞ぐことで、検体溶液を簡便に密閉保持することができる。その結果、検体と、担体の領域Ｒ１に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。貫通孔を有す貫通孔の数は、１つ以上であれば良いが、被検物質が含まれる溶液の充填が容易となる観点から、複数、特に３〜６個とすることが好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、特に３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。貫通孔の孔径は必要に応じて適宜設定可能であるが、複数の貫通孔を設ける場合、そのうちの一部をアプライ口とし、その他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径、例えば直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔をより狭い孔径、例えば０．０１〜１．０ｍｍとすることができる。
【００３１】
貫通孔の少なくとも１つは、貫通孔の封止を容易かつ確実に行う観点から、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバーを備えるものとすることが好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形等の任意の形状を適宜選択とすることができ、特に製造の容易さ及び検体溶液の上昇抑制効果の高さ等の観点からは、円柱形が好ましい。
【００３２】
貫通孔の孔径サイズは検体溶液のアプライを容易に行うとともに、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制する観点から定めることができる。例えば、図５に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔４及び液面駐止用チャンバー４Ａとの組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔４の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。
一方、液面駐止用チャンバー４Ａの孔径サイズ（直径）については、十分な液面駐止効果を得る観点から定めることができ、通常１．０ｍｍ以上、好ましくは１．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー４Ａの深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００３３】
上記カバー部材の形状は、前記基材の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基材と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうる形状を適宜選択することができる。カバー部材の脱離の際の基材損傷を回避する観点から、その外周部分において、基材に近い部分より基材に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものであってもよい。
【００３４】
本発明の分析チップは、担体、カバー部材及び任意に接着部材を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図５に示すような仕切り構造により設けることができる。図５に示す例においては担体の凸部２Ｂ及びカバー部材１が接着部材３Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間５を設けている。この例においては、空間５は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔４及び液面駐止用チャンバー４Ａを有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析チップに複数種の検体溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の検体を同時に１枚の分析チップで測定することができる。
【００３５】
また、本発明の分析チップは、一枚の担体あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図６及び図７に示す通り、一枚の担体２上に、複数のカバー部材１を有することができる。複数のカバー部材１のそれぞれは、それぞれ別の接着部材３Ｃを介して担体２上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材１のそれぞれが、担体２との間に空隙５を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材１がそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域（凹部）Ｒ１を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の検体を同時に１枚の分析チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域Ｒ１についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域Ｒ１について分析を行った後に他の領域Ｒ１を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。
【００３６】
本発明の分析チップを構成するカバーの材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバーの作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００３７】
本発明の分析チップを構成する担体は、前述の通り表面に凹部を有するものであれば特に限定されないが、その少なくとも一面の一部、好ましくは凹部の一部に選択結合性物質が固定化された領域を有するものとすることが好ましい。特に凹部はその内部に凸部を１つ以上有するものとし、凸部上面に選択結合性物質が固定化されることが好ましい。このような構造を取ることにより、検出の際、非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００３８】
凹部に設けられる凸部の高さに関しては、それぞれの凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
【００３９】
凹部において、表面上方からみた際の凸部の配置は、列状であっても良いしランダム状であっても良い。凸部を列状に配置させる場合は、列間を等間隔または、任意の間隔とすることができる。また、凸部の列間を調整してマトリクス状に配置されたサブブロック領域を形成させることもでき、この場合には列間に応じた複数のサイズおよび／または形状の撹拌子と組み合わせて用いることができる。但し、凹部にマイクロロッド状の撹拌子を保持する場合には、列状、特に、一定の方向に等間隔或いは任意の間隔にて凸部が配置されてなることが好ましい。また、凸部分の上面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。尚、上面が平坦であれば、凸部全体の形状は台形、円柱状、多角柱状などの任意の形状を取っていても良い。
【００４０】
本発明の分析チップは、さらに好ましくは、担体の凹部が設けられる表面の凹部以外の部分には平坦部が設けられていることが好ましい。この場合、平坦部に接着地点が位置することになる。担体表面の凹部内に凸部を設ける場合、凸部の上面の高さと平坦部分の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００４１】
本発明の分析チップの構成要素として好ましく用いうる担体の具体例を図８及び図９に例示する。図８及び図９に示す例において、選択結合性物質が固定化された領域Ｒ１は、複数の凸部６を含む凹部により構成されており、その周りに平坦部８が設けられている。凸部６の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、スキャナーが担体の表面に励起光の焦点を合わせる際には図１０に示すように、バネ１３で付勢して治具１４に担体２を突き当て、この治具の突き当て面１５の高さにレーザー光１２が合焦するようレンズ１１等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の分析チップの担体の平坦部を治具の面１５に突き当てることにより、容易に担体の凸部上面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。なお、図１０の例においては、担体２は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。
【００４２】
本発明の分析チップの担体において、凹部内の選択結合性物質が固定化される凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうが、担体はその他に、何も固定化していない凸部や、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分を有していてもよい。
【００４３】
本発明の分析チップの担体が、選択結合性物質が固定化された凸部を有する場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００４４】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。
【００４５】
本発明で好ましく用いられる担体の凹部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００４６】
本発明の分析チップにおける、担体、カバー部材、接着部材及び撹拌子の関係の好ましい例を、図１１及び図１２を参照して説明する。図１１及び図１２に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質９は、担体２の凸部上面６上に固定化されている。そして、撹拌子（この場合は球状のビーズ）７は、担体２の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質９及び撹拌子７は、検体ＤＮＡ（被検物質）が含まれる検体溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、担体２、接着部材３及びカバー部材１により規定される空隙内で保持されることになる。図１１の例においては、担体の凸部上面６とカバー部材１との間隔の最短距離が、撹拌子７の直径未満となっている。それにより、撹拌子７が凸部上面６に接触できなくなり、凸部上面６上の選択結合性物質９を傷つけることを防ぐことができる。撹拌子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が撹拌子の最小径未満であれば、同様に凸部上面６と撹拌子との接触を防ぎ、選択結合性物質９の損傷を防ぐことが可能となる。
【００４７】
本発明の分析チップの担体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。また、上記材料に加え、担体を黒色にし光学的測定のＳ／Ｎ比を高めるため、カーボンブラック等の添加剤を配合することができる。
【００４８】
担体は、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
【００４９】
成型した担体は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００５０】
担体の表面に固定化する選択結合性物質としては、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を用いることができ、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ'）2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
【００５１】
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの方法（Blin et al.，Nucleic Acids Res．3：2303（1976））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法（Favaloro et al.，Methods Enzymol．65：718（1980））等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００５２】
本発明の分析チップを用いた分析方法に供せられる被検物質としては、分析すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【００５３】
本発明の被検物質の分析方法は、（Ａ）前記本発明の分析チップに被検物質をアプライする工程；（Ｂ）前記被検物質を前記担体に選択的に結合させる工程；及び（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程を含む。
【００５４】
前記工程（Ａ）は、必要に応じ上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、ピペット等の通常の器具で担体の凹部に注入することにより行うことができる。特に、前記分析チップとして貫通孔を備えるカバー部材を備えるものを用いる場合には、注入を貫通孔より行うことができる。
【００５５】
貫通孔を備えるカバー部材を備える分析チップを用いる場合には、貫通孔に被検物質を注入した後、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様で封止部材を貼付することにより封止することが望ましい。前記封止部材としては、例えばカプトン（商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製）、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。
【００５６】
封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の担体上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。
【００５７】
封止の具体例を、図１２を参照して説明する。図１２の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔４よりアプライした後、可とう性の粘着テープ１０を、液面駐止用チャンバー４Ａの全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００５８】
前記工程（Ｂ）は、従来の分析チップにおける操作と全く同様に行うことができる。前記工程（Ｂ）は、好ましくは前記分析チップとして前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有するものを用い、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることにより行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、前記工程（Ｂ）においては、必要に応じて、分析チップを揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程（Ｃ）に供することができる。
【００５９】
前記工程（Ｃ）も、従来の分析チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被検物質の量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００６０】
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」は検出と定量の両者を示すものである。
【００６１】
本発明の分析キットは、前記本発明の分析チップのうち貫通孔を有するものと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含む。当該封止部材としては、前記本発明の分析方法の工程（Ａ）において説明したものと同様のものを含むことができる。本発明の分析キットは、前記本発明の分析方法に従って使用することができる。
【実施例】
【００６２】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６３】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
平均分子量５万のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）９９質量部及びカーボンブラック（三菱化学製  商品名  ＃３０５０Ｂ）１質量部を混合し樹脂組成物を調製した。
【００６４】
公知の方法であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製した。この型を用い、上記樹脂組成物を射出成型し、後述する通りの形状を有する黒色の担体を得た。
【００６５】
担体の形状は、概ね図１３に示す通りの形状であり、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分Ｒ１を除き表面は平坦であった。担体の中央部分Ｒ１には、縦横１０ｍｍ、深さ１５０μｍの矩形の凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径１３０μｍ、高さ１５０μｍ、上面の径１３０μｍの凸部６を６４箇所（８×８）設けた（図１３は概略図であるため、図中に示される凸部の数は、実際のものより少ない。）。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分８との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）を測定したところ、３μｍ以下であった。さらに、凸部のピッチＬ１（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は５６０μｍであり、最外側の凸部から凹部周縁部までの距離は７９０μｍであった。
【００６６】
この黒色担体の分光反射率と、分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、厚み方向の透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００６７】
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１に示される配列を有し、５’末端がアミノ化されたＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、図１５に示すスキームにしたがって固定化した。
【００６８】
上記の担体２を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。
【００６９】
ＤＮＡを純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、この混合溶液をガラスキャピラリーで担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄し、担体凸部上面上に固定化プローブＤＮＡを得た。
【００７０】
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な、配列番号４の塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。このＤＮＡの調製方法を以下に示す。
【００７１】
配列番号２と配列番号３の塩基配列を持つＤＮＡを合成した。これらをそれぞれ純水に溶解して濃度１００μＭの水溶液とした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５：２２４６塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００７２】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４（９６８塩基）に示す配列を有するＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００７３】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにKlenow Fragment（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのKlenow Fragmentを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００７４】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００７５】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった。
【００７６】
（分析チップの作製）
厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ板から切削加工により図１３及び図１４に示す貫通孔４を４つ有し、担体側表面外周に高さが１００μｍの凸部を有するカバー部材を作製した。このカバー部材の凸部は、その接着地点が担体表面凹部の端面から外側５００μｍの距離（図１３のＷ）に位置するように作製した。
シリコーン系エラストマー（シルガード）３を接着部材として、ディスペンサーを用いて、吐出圧力０．４５ＭＰａで前記担体の凹部から離れた場所に接着部材を塗布した。前記カバー部材を、プローブＤＮＡ固定化領域に被さるように設置し、カバー部材の上から５０ｇ重の荷重を掛け、接着部材が接着面全域に広がるまで静置した。接着部材が全面に広がるのを確認した後、荷重を取り外し、接着部材が完全に固まるまで４２℃のオーブン内で２時間静置した。
接着部材の厚みをマイクロメーターを用いて測定した。具体的には、作成した分析チップの厚みから、予め測定しておいた担体およびカバー部材凸部の厚みを差し引くことで算出した。各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）は、各々１４μｍ、１０μｍ、９μｍ、１２μｍであり（図１４参照）、ほぼ所望とした１０μｍ厚となった。すなわち、担体表面とカバー部材の担体側表面との間隔は、ほぼ１１０μｍとなった。
カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が１５０μｍ〜１８０μｍのジルコニア製撹拌子を添加し、図１３及び図１４に示す分析チップを得た。
【００７７】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られた分析チップに上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌを貫通孔４より注入した。その後、カプトンテープ（アズワン株式会社製、型番  ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞いだ。但し、カプトンテープとしては３ｍｍ角にカットしたもの４枚を用い、それぞれで１つずつの貫通孔を塞ぐこととした。その後、分析チップを４２℃の条件で１６時間インキュベートした。インキュベート後、担体からカバー部材と接着部材を脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
【００７８】
（評価）
上記のハイブリダイゼーションの過程において、分析チップの空隙内部の観察を行い、次の項目に関して評価した。
（１）攪拌によって、接着部材へ攪拌子が付着していないか。
（２）検体溶液をアプライしたときに、溶液が空隙内全体に行き渡っているか。
（３）攪拌時に攪拌子が空隙内をスムーズに動き回るか。
（４）ハイブリダイゼーション中、空隙内部に気泡が発生していないか。
本実施例において評価した結果、以下のとおりであった。接着部材に撹拌子の付着は見られなかった。得られた分析チップに検体溶液をアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、細部に隙間は見られなかった。検体溶液をアプライした後、撹拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の撹拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。
【００７９】
分析チップのプローブＤＮＡを固定化した凸部３箇所（スポット１〜３）の蛍光強度を測定して、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション結果を評価した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000B）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで示す３つの蛍光強度は、異なる凸部３箇所のハイブリダイゼーション後の蛍光強度の値である。
測定の結果、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００８０】
比較例１
担体とカバー部材との接着部材を介在した接着地点が前記担体の凹部と接して位置していること以外は、実施例１と同様に操作し、図１６に示すような分析チップを調製し、空隙内部の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
検体溶液のアプライ前に空隙内に撹拌子を添加したところ、接着部材部分に撹拌子が付着して固定化され、検体溶液を注入する際に固定化された撹拌子が障害となり、検体溶液が領域全体に広がらなかった。
また、付着した撹拌子と接着部材との間に隙間が発生したことにより、これが起因となり、ハイブリダイゼーション後に空隙内全体に気泡が発生した。
また、全体的に蛍光強度が低下し、スポット場所による蛍光強度のばらつきが見られた。
【００８１】
比較例２
担体とカバー部材との接着地点が前記担体の凹部から離れて位置しているが、撹拌子の直径が担体とカバー部材との隙間より小さいこと以外は、実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、空隙内部の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
その結果、実施例１と比べて、空隙内に撹拌子を添加する際に担体とカバー部材との隙間に撹拌子が入り込み、接着部材部分に撹拌子が付着した。このため、検体溶液をアプライする際に付着した撹拌子が障害となり、領域全体に検体溶液が広がらなかった。
また、付着した撹拌子周りに発生した隙間が起因となり、ハイブリダイゼーション後に空隙内全体に気泡が発生した。
また、全体的に蛍光強度の低下が見られ、スポット場所により蛍光強度のばらつきが見られた。
【００８２】
比較例３
担体とカバー部材との間の空隙内に撹拌子を封入しないこと以外は実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
撹拌子を封入しない場合は、空隙内全体に検体溶液が行き渡ることを確認した。また、ハイブリダイゼーション後に、空隙内には泡が観察されなかった。しかし、撹拌子が存在しないために空隙内の撹拌が十分行われず、スポット場所による蛍光強度のばらつきが著しかった。また、スポット場所により、蛍光強度の低下が見られた。
【００８３】
実施例２
カバー部材をその上から２０ｇ重の荷重を掛けて接着して、各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）が各々２４μｍ、２６μｍ、２８μｍ、２５μｍとなった分析チップを使用したことと、カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が１８０μｍ〜２１２μｍのジルコニア製攪拌子を添加したこと以外は、実施例１と同様に操作し、図１３及び図１４（但し、図１４中のＨは上述の数値に代えたものである。）に示すような分析チップを調製し、空隙内の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
【００８４】
検体溶液のアプライ前において、接着部材への攪拌子の付着は見られなかった。検体溶液を分析チップにアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、攪拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の攪拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。ハイブリダイゼーション後に得られた異なる凸部３箇所における蛍光強度は、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００８５】
実施例３
カバー部材をその上から１０ｇ重の荷重を掛けて接着して、各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）が各々５２μｍ、５５μｍ、５６μｍ、５４μｍとなった分析チップを使用したことと、カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が２１２μｍ〜２５０μｍのジルコニア製攪拌子を添加したこと以外は、実施例１と同様に操作し、図１３及び図１４（但し、図１４中のＨは上述の数値に代えたものである。）に示すような分析チップを調製し、空隙内の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
【００８６】
検体溶液のアプライ前において、接着部材への攪拌子の付着は見られなかった。検体溶液を分析チップにアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、攪拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の攪拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。ハイブリダイゼーション後に得られた異なる凸部３箇所における蛍光強度は、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００８７】
実施例４
カバー部材をその上から５０ｇ重の荷重を掛けて接着して、各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）が各々１０μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１１μｍとなった分析チップを使用したことと、カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が１８０μｍ〜１９８μｍのジルコニア製攪拌子を添加したこと以外は、実施例１と同様に操作し、図１３及び図１４（但し、図１４中のＨは上述の数値に代えたものである。）に示すような分析チップを調製し、空隙内の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
【００８８】
検体溶液のアプライ前において、接着部材への攪拌子の付着は見られなかった。検体溶液を分析チップにアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、攪拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の攪拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。ハイブリダイゼーション後に得られた異なる凸部３箇所における蛍光強度は、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００８９】
実施例５
カバー部材の凸部の接着地点が、担体表面凹部の端面から外側７００μｍの距離（図１３のＷ）に位置し、かつ、カバー部材をその上から５０ｇ重の荷重を掛けて接着して、各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）が各々１１μｍ、１２μｍ、１２μｍ、１１μｍとなった分析チップを使用したであることと、カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が１２５μｍ〜１５０μｍのジルコニア製攪拌子を添加したこと以外は実施例１と同様に操作し、図１３及び図１４（但し、図１４中のＨは上述の数値に代えたものである。）に示すような分析チップを調製し、空隙内部の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
【００９０】
検体溶液のアプライ前において、接着部材への攪拌子の付着は見られなかった。検体溶液を分析チップにアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、攪拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の攪拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。ハイブリダイゼーション後に得られた異なる凸部３箇所における蛍光強度は、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００９１】
実施例６
カバー部材の凸部の接着地点が、担体表面凹部の端面から外側３００μｍの距離（図１３のＷ）に位置し、かつ、カバー部材をその上から５０ｇ重の荷重を掛けて接着して、各辺における接着部材の厚み（図１３のＨ）が各々１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１１μｍとなった分析チップを使用したことと、カバー部材の貫通孔を通じて、空隙内に、直径が１８０μｍ〜２１２μｍのジルコニア製攪拌子を添加したこと以外は実施例１と同様に操作し、図１３及び図１４（但し、図１４中のＨは上述の数値に代えたものである。）に示すような分析チップを調製し、空隙内部の目視観察、ハイブリダイゼーション及び蛍光強度の測定を行った。結果を表１に示す。
【００９２】
検体溶液のアプライ前において、接着部材への攪拌子の付着は見られなかった。検体溶液を分析チップにアプライすると、検体溶液は空隙内全体に行き渡り、攪拌子は空隙内で滞りなく運動し、空隙内の攪拌が効率よく行われることが確認できた。ハイブリダイゼーション後に空隙内部の観察を行ったところ、空隙内において気泡の発生は確認されなかった。ハイブリダイゼーション後に得られた異なる凸部３箇所における蛍光強度は、３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のばらつきは見られなかった。
【００９３】
【表１】
0005145752.tif 000002
【００９４】
【表２】
0005145752.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示される本発明の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した部分断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析チップの一例を示す部分断面図である。
【図４】図４は、本発明の分析チップの一例を示す部分断面図である。
【図５】図５は、仕切り構造を有する本発明の分析チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図６】図６は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す斜視図である。
【図７】図７は、図６に示される本発明の分析チップを矢印Ａ２に沿った面で切断した部分断面図である。
【図８】図８は、本発明の分析チップを構成する担体の一例を概略的に示す斜視図である。
【図９】図９は、図８に例示される担体の縦断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の分析チップを用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す断面図である。
【図１２】図１２は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１３】図１３は、実施例における分析チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１４】図１４は、図１３の分析チップのうちカバー部材を上方より見た平面図である。
【図１５】図１５は、本願実施例及び比較例における、プローブＤＮＡの固定化を示す概略図である。
【図１６】図１６は、比較例における分析チップを概略的に示す断面図である。
【符号の説明】
【００９６】
１  カバー部材
１Ａ  カバー部材の凸部
２  担体
３、３Ｃ  接着部材
４  貫通孔
４Ａ  液面駐止用チャンバー
５  空隙（空間）
６  担体表面の凸部
７  撹拌子
８  平坦部
９  選択結合性物質
１０  封止部材（テープ）
１１  対物レンズ
１２  レーザー励起光
１３  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
１４  治具
１５  治具突き当て面
Ｐ１  担体側の接着地点
Ｐ２  担体表面の凹部の外周部端面
Ｐ３  接着部材の内側断面
Ｐ４  担体の凹部外側の表面部分
Ｐ５  カバー部材側の接着地点
Ｓ１  空間
Ｒ１  選択結合性物質が固定化された領域（凹部）
Ｌ１  凸部ピッチ
【図１】
0005145752.tif 000004
【図２】
0005145752.tif 000005
【図３】
0005145752.tif 000006
【図４】
0005145752.tif 000007
【図５】
0005145752.tif 000008
【図６】
0005145752.tif 000009
【図７】
0005145752.tif 000010
【図８】
0005145752.tif 000011
【図９】
0005145752.tif 000012
【図１０】
0005145752.tif 000013
【図１１】
0005145752.tif 000014
【図１２】
0005145752.tif 000015
【図１３】
0005145752.tif 000016
【図１４】
0005145752.tif 000017
【図１５】
0005145752.tif 000018
【図１６】
0005145752.tif 000019
【配列表】
0005145752000001.app