(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される糖鎖を部分構造とする両親媒性物質、または、式（１）で示される化合物と式（２）で示される化合物の混合物が形成するミセル水溶液を用い、このミセル水溶液を疎水表面と接触させることによって、当該両親媒性物質、または、それを含む混合物を、当該疎水表面に固定化する方法。
【化１】
0005129936.tif 000004
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、ＸはＯまたはＮＨを、Ｒ１は単糖またはオリゴ糖または還元末端が開環したオリゴ糖を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
【化２】
0005129936.tif 000005
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
【請求項２】
請求項１に記載した方法で固定化された糖鎖を用いることを特徴とする糖鎖に結合する物質の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な糖鎖を部分構造とする両親媒性物質の固定化の方法、及び、その方法によって固定化された糖鎖を用いて糖鎖に結合する物質を精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は生体内で様々な機能を担っていることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そうした糖鎖の機能の多くは、各々の糖鎖とそれを特異的に認識する物質との相互作用を分子的な基盤としている。従って、糖鎖に結合する物質を精製する方法は、糖鎖の機能を医薬品や診断薬に応用する上で重要である。
【０００３】
我々はこれまでに、長鎖アルキルオキシベンジルアルコール誘導体あるいは長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を基本骨格とする人工脂質に糖鎖を結合した糖鎖プローブ（特許文献１〜３参照）、あるいは、長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体の基本骨格に天然由来の糖鎖を還元アミノ化によって導入した糖鎖プローブ（特許文献４参照）等を提供してきた。これらの人工脂質型の糖鎖プローブは、その脂質部分を利用してプラスチックディッシュ等の疎水表面に固定することにより、糖鎖に結合する物質を探索、捕捉するための糖鎖プローブとして使用することができる。しかし、疎水表面上に固定した糖脂質型の糖鎖プローブには、表面自体の疎水性あるいは人工脂質部分に由来すると考えられる非特異的な相互作用が問題になる場合があった。
【０００４】
そこで、我々は、そうした疎水性相互作用に由来する非特異的な相互作用をできる限り低く抑える目的で、オリゴエチレングリコールが結合した長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を提供し、そうした化合物を疎水表面に固定することで、非特異的な相互作用が低減できることを示している（特許文献５参照）。さらに、その末端に糖鎖を導入した糖鎖プローブを提供している（特願２００５−１５９０３８参照）。
【０００５】
一般に、両親媒性の糖脂質型の糖鎖プローブ化合物を疎水表面に固定化するには、その有機溶媒溶液を用いるか、それを有効成分とするリポソームを用いるのが一般的であり、我々が提供する各種の糖鎖プローブの固定化にも同様の手法を用いてきた。
【０００６】
しかし、通常の手段として用いられるプラスチックディッシュ等への固定化を考えた場合、有機溶媒の溶液を用いる手法では、エタノールの様な一部の溶媒を除き、プラスチックディッシュを溶解するために、適用は不可能であるし、エタノール溶液を用いても、単純にエタノールを蒸発される通常の方法では均一な糖鎖の提示は困難である（例えば、非特許文献２参照）。また、一般に、糖鎖を部分構造とする両親媒性物質単体では、リポソームを形成するものはほとんどなく、リポソームを形成する化合物との混合が必要となる、あるいは、リポソームの作成及びその固定化には、多段階の手順と熟練を要する（例えば、非特許文献３参照）といった難点があった。
【特許文献１】特開２００１−１２２８８９
【特許文献２】特開２００１−２５３８９６
【特許文献３】特開２００２−３００９１
【特許文献４】特開２００４−７５６４１
【特許文献５】特開２００５−２３２０６１
【非特許文献１】谷口直之他編、「糖鎖機能」（蛋白質核酸酵素２００３年６月号増刊、共立出版、２００３年）
【非特許文献２】ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、２００４年、２０巻、ｐ．９７２０−９７２８
【非特許文献３】ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ）、１９９２年、１１０３巻、３０７−３１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規な糖鎖を部分構造とする両親媒性物質の固定化の方法、および、その方法によって固定化された糖鎖を用いる糖鎖に結合する物質の精製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、オリゴエチレングリコール誘導体を介して糖鎖と長鎖アルキルオキシベンズアミド誘導体を結合した化合物が水中でミセルを形成することを発見したことを端緒に、新らたに、糖鎖を部分構造とする両親媒性物質またはその混合物が形成するミセル水溶液を用いて、その化合物またはその混合物が疎水表面上に固定化可能であること、固定化された糖鎖提示化合物が糖鎖に結合する物質を選択的に捕捉し、捕捉された糖鎖に結合する物質は回収可能であることを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、糖鎖を部分構造とする両親媒性物質、または、それを含む混合物が形成するミセル水溶液を用い、このミセル水溶液を疎水表面と接触させることによって、当該両親媒性物質、または、それを含む混合物を、当該疎水表面に固定化する方法を提供する。
また、本発明は、式（１）で示される糖鎖を部分構造とする両親媒性物質、または、式（１）で示される化合物と式（２）で示される化合物の混合物が形成するミセル水溶液を用い、このミセル水溶液を疎水表面と接触させることによって、当該両親媒性物質、または、それを含む混合物を、当該疎水表面に固定化する方法を提供する。
【化３】
0005129936.tif 000002
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、ＸはＯまたはＮＨを、Ｒ１は単糖またはオリゴ糖または還元末端が開環したオリゴ糖を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
【化４】
0005129936.tif 000003
（ただし、式中で、ｍは１から１００までの整数を、ｎは１１から１７までの整数を、Ｒ２はＯ（ＣＨ2）nＣＨ3またはＨを表す。）
さらに、本発明は、上記の方法で固定化された糖鎖を用いることを特徴とする糖鎖に結合する物質の精製法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、新規な糖鎖を部分構造とする両親媒性物質の固定化の方法、及び、その方法によって固定化された糖鎖を用いる糖鎖に結合する物質の精製法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の固定化方法及び精製方法には、式（１）で示される化合物以外に、一般に、糖鎖を部分構造とする両親媒性物質、あるいは、式（２）で示される化合物以外に、一般に、ミセルを形成する両親媒性物質を用いることが可能である。糖鎖を部分構造とする両親媒性物質としては、天然由来のスフィンゴ糖脂質やグリセロ糖脂質、有機合成によるスフィンゴ糖脂質及びグリセロ糖脂質の誘導体及び類縁体等を代表例として、糖鎖と直鎖アルキル鎖を直接、あるいは、介在構造を介して結合させたネオグライコリピッドと総称される化合物が挙げられる。ミセルを形成する両親媒性物質としては、天然由来のスフィンゴリン脂質やグリセロリン脂質、有機合成によるスフィンゴリン脂質及びグリセロリン脂質の誘導体及び類縁体等を代表例として、一般に、親水基と直鎖アルキル鎖を直接、あるいは、介在構造を介して結合させた化合物が挙げられる。本発明の目的から、直鎖アルキル鎖を２本以上有する化合物が望ましい。
【００１２】
以下では、便宜上、式（１）及び式（２）で示される化合物を例として説明を行う。
式（１）及び式（２）で示される化合物は、既知の合成法（特開２００５−２３２０６１、特許願２００５−１５９０３８参照）に従って合成される。
式（１）において、ｍは１から１００までの整数が有効であるが、充分に低い非特異相互作用を与えること、化合物調製に必要とする工程数等を考慮すると、好ましくは２から１１の整数である。また、式（１）のＲ１として、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、グルクロン酸、イズロン酸等の単糖、天然の糖蛋白質由来のＮ−結合型糖鎖またはＯ−結合型糖鎖、または、それらの部分オリゴ糖、天然の糖脂質由来の糖鎖、または、その部分オリゴ糖、天然のプロテオグリカン由来の糖鎖、または、その部分オリゴ糖、あるいは、有機合成等を用いて調製した天然型および非天然型の糖鎖等が挙げられる。
【００１３】
式（１）で示される化合物の内、ＸがＯである化合物は、通常用いられるグリコシレーションを用いる糖鎖導入法（例えば、木曽眞編、「生理活性糖鎖研究法」（学会出版センター、東京、１９９９年）参照）によって合成される。また、ＸがＮＨである化合物は、還元アミノ化法（例えば、特開２００４−７５６４１参照）を用いることによって、還元末端の糖残基が開環した形で糖鎖が導入される。糖鎖部分の保護、脱保護が不要なため、天然由来の糖鎖導入にはこの還元アミノ化を用いる方法が有効である。
糖鎖の導入手順は、式（１）においてＲ１がＨである合成中間体を経て、最後に糖鎖導入を行う上記の方法以外に、一端または両端がアミノ基に変換されたエチレングリコールのオリゴマーまたはポリマーの一端のアミノ基を適当な保護基で保護した化合物、あるいは、保護されたアミノ基の代わりに容易にアミノ基に変換可能な官能基（例えば、アジド等）とした化合物に対して、まず、上記と同様に糖鎖導入を行い、次いで、アミノ基の脱保護、あるいは、アミノ基への変換を行い、その後、長鎖のアルキル基がエーテル結合した３，５−ジヒドロキシ安息香酸あるいは３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸との縮合を行う手順を用いることもできる。
式（２）で示される化合物は、式（１）で示される化合物との混合物がミセル水溶液を与えれば、それぞれのｍ、ｎ及びＲ２を独立に選択することが可能であるが、式（１）で示される化合物と同一のｍ、ｎ、Ｒ２を選択することが望ましい。
【００１４】
式（１）で示される化合物、あるいは、式（１）で示される化合物と式（２）で示される化合物との混合物を固定化するには、例えば、以下の手順によって行う。まず、式（１）で示される化合物、あるいは、式（１）で示される化合物と式（２）で示される化合物との混合物を水に懸濁させ、１ｎＭから１Ｍ、好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭのミセル溶液とし、プラスチックディッシュ、マイクロビーズ、中空糸等の適当な形状を持った疎水性表面に接触させることにより、当該化合物またはその混合物を、それらの疎水性表面上に固定化する。
【００１５】
このようにして固定化された糖鎖を用いて、その糖鎖と結合する物質を精製するには、例えば、以下の手順によって行う。まず、目的とする糖鎖に結合する物質を含む溶液を、化合物が固定された表面と接触させることにより、糖鎖に結合する物質を捕捉し、次いで、糖鎖と結合しない物質を洗い流す。こうして捕捉された糖鎖に結合する物質を、例えば、より強い洗いの条件を用いる、あるいは、ｐＨや温度を変化させる、あるいは、酸化や還元や光反応等を用いる、あるいは、蛋白質や糖鎖の消化酵素を用いる等の、適当な手段によって回収することによって、特定の糖鎖構造と選択的に結合する物質を精製することができる。
以下に、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
（ミセル水溶液を用いた固定化と糖鎖結合物質との相互作用解析）
ミセル水溶液を用いて、糖鎖プローブを疎水性表面に固定化し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び、糖鎖を認識する蛋白質であるレクチンとの相互作用を、分子間相互作用解析装置ＩＡｓｙｓＰｌｕｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社製）を用いて解析した。
【００１７】
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（１）において、Ｒ１がマンノース、ＸがＯ、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）が２ｍＭになるように純水に懸濁させ、１００ｎｍの孔径を持つポリカーボネート製フィルターを通すことによりミセル水溶液を作成した。
ＩＡｓｙｓＰｌｕｓの疎水キュベットを、界面活性剤水溶液、バッファーで洗浄後、上記ミセル水溶液を６０μＬ加え１分間放置し、その後、排出。この一連の操作を３回繰り返して化合物の固定化を行った。
化合物が固定化されたキュベットを塩酸水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、バッファーで洗浄した。ＢＳＡの１ｍｇ／ｍＬ溶液を５０μＬ添加して５分間放置、さらに、バッファーに置換して３分間放置した後のＢＳＡの結合量を求めた。
また、マンノースに特異的に結合するレクチンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の２０μＭ溶液を５０μＬ添加して５分間放置、さらに、バッファーに置換して３分後のＣｏｎＡの結合量を求めた。
【００１８】
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミドの固定化量は５４９．４９Ａｒｃｓｅｃ．、ＢＳＡの結合量は８．８６Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は１９０５．９１Ａｒｃｓｅｃ．であり、疎水性に由来するＢＳＡとの非特異的な相互作用はほとんど観察されないが、糖鎖に結合する物質であるＣｏｎＡは糖鎖構造特異的に捕捉されることが確認された。捕捉されたＣｏｎＡは、１００ｍＭリン酸水溶液を用いることにより回収された。
【実施例２】
【００１９】
（混合物のミセル水溶液を用いた固定化と糖鎖結合物質との相互作用解析）
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド、及び、Ｎ−（１７−ヒドロキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（２）において、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）の混合物を用いて、混合物の濃度が２ｍＭであるミセル溶液を調製し、実施例１と同様の解析を行った。
【００２０】
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミドが５０％の場合、混合物の固定化量は４４４．４２Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は１１２６．３８Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、３０％の場合、混合物の固定化量は５２６．３５Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は１０６５．６２Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、２０％の場合、混合物の固定化量は５５１．３８Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は１０７９．４１Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、１０％の場合、混合物の固定化量は６９２．２１Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は９６３．５９Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、５％の場合、混合物の固定化量は５５３．４７Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は３２５．１２Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、３％の場合、混合物の固定化量は５５６．５６Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は３２５．１２Ａｒｃｓｅｃ．であった。同じく、２％の場合、混合物の固定化量は５８３．１３Ａｒｃｓｅｃ．、ＣｏｎＡの結合量は２１３．８３Ａｒｃｓｅｃ．であった。
また、いずれの場合にも、ＢＳＡの結合量は低い値を示し、混合物のミセル水溶液を用いても糖鎖に結合する物質が糖鎖構造特異的に捕捉されることが確認された。捕捉されたＣｏｎＡは、１００ｍＭリン酸水溶液を用いることにより回収された。
【実施例３】
【００２１】
（プラスチックディッシュへの固定化と構造特異的な糖鎖結合物質の結合）
ミセル水溶液を用いる糖鎖プローブのプラスチックディッシュへの固定化と、その結果得られた糖鎖が固定化されたプラスチックディッシュを用いる構造特異的な糖鎖結合物質の捕捉を検討した。
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（１）において、Ｒ１がα−マンノース、ＸがＯ、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）、及び、Ｎ−（Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（１）において、Ｒ１がβ−ガラクトース、ＸがＯ、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）、及び、Ｎ−（１７−ヒドロキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（２）において、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）、それぞれの１ｍＭミセル水溶液を調製し、１００ｎｍの孔径を持つポリカーボネート製フィルターを通した。
９６穴プラスチックディッシュ（ナルジェヌンク、ヌンクロンデルタ処理）の各ウエルに、上記のミセル溶液１００μｌを添加し、室温で一晩放置した。ミセル溶液を吸引によって除き、２００μｌのＨＥＰＥＳバッファーで洗浄することによって糖鎖が固定化されたプラスチックディッシュを得た。
【００２２】
このプラスチックディッシュの各ウエルに適当に希釈したペルオキシダーゼ標識されたＣｏｎＡ溶液（生化学工業）１００μｌを加え２時間放置の後、ＣｏｎＡ溶液を吸引によって除き、２００μｌのＨＥＰＥＳバッファーで３回洗浄した。
次いで、ＴＭＢキットＨＹＰＥＲ（ナカライ）を用いてペルオキシダーゼ発色反応を行った。１００μｌの発色液を加え１０分間放置の後、１００μｌの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーにより各ウエルの発色を４５０ｎｍの吸光度として測定した。
マンノース誘導体を固定化したウエルの吸光度は１．２８８±０．１１６、ガラクトース誘導体を固定化したウエルの吸光度は０．１０７±０．００２、糖鎖を結合していない化合物を固定化したウエルの吸光度は０．０８４±０．０１０であり、プラスチックディッシュへの固定化と糖鎖構造特異的な糖鎖結合物質の結合が確認された。
【実施例４】
【００２３】
（プラスチックディッシュへのマンノース混合物ミセル溶液を用いた固定化）
Ｎ−（Ｏ−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（１）において、Ｒ１がα−マンノース、ＸがＯ、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）とＮ−（１７−ヒドロキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（２）において、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）の混合物のミセル溶液を用いて、実施例３と同様の条件によって、プラスチックディッシュへの固定化とＣｏｎＡの選択的結合の測定を行った。
マイクロプレートリーダーによる吸光度測定の結果、マンノース１００％では０．６０５±０．０１５、マンノース５０％では０．３６１±０．０１３、マンノース１０％では０．１７２±０．００５、マンノース１％では０．０９１±０．００４、マンノース０％では０．０８３±０．００２であり、混合物の固定化とマンノース含有率に依存した糖鎖結合物質の結合を確認した。
【実施例５】
【００２４】
（プラスチックディッシュへのガラクトース混合物ミセル溶液を用いた固定化）
Ｎ−（Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１７−オキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（１）において、Ｒ１がβ−ガラクトース、ＸがＯ、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）とＮ−（１７−ヒドロキシ−３,６,９,１２,１５−ペンタオキサヘプタデシル）−３,５−ビス（ドデシルオキシ）ベンズアミド（式（２）において、ｍが５、ｎが１１、Ｒ２がＨである化合物）の混合物のミセル溶液を用いて、実施例３と同様の条件によって、プラスチックディッシュへの固定化を行い、ペルオキシダーゼ標識されたＲＣＡ１２０溶液（生化学工業）を用いて糖鎖構造選択的結合の測定を行った。
マイクロプレートリーダーによる吸光度測定の結果、ガラクトース１００％では０．５７１±０．０３３、ガラクトース５０％では０．３７４±０．０６２、ガラクトース１０％では０．２８６±０．０３９、ガラクトース１％では０．０９７±０．００１、ガラクトース０％では０．０７７±０．００６であり、混合物の固定化とガラクトース含有率に依存した糖鎖結合物質の結合を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、新規な糖鎖を部分構造とする両親媒性物質の簡便かつ均質な固定化方法を提供するものであり、特に、生体由来試料等やファージ抗体ライブラリー等の非特異結合のバックグラウンドが高い試料から、糖鎖に結合する物質を選択的に精製するのに有効に利用できる。