(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核磁気共鳴信号取得可能な核を含む化合物を測定対象とする核磁気共鳴信号測定法において、
前記測定対象として、核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する互いに結合した少なくとも２つの核を天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した同位体標識化合物を選択し、
測定試料中に存在する前記同位体標識化合物における前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核を含んだ、互いに結合した核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する３つの核の間での、第１の核から第２の核への磁化移動、該第２の核から第３の核への磁化移動、該第３の核から前記第２の核への磁化移動、及び該第２の核から前記第１の核への磁化移動を経由する前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を観測する手段と、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号に位置情報を付加する手段と、を持つパルスシークエンスを用いて前記同位体標識化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号および位置情報を選択的に観測する工程を有し、
前記同位体標識しない化合物に由来する前記第１の核と同じ核種の核磁気共鳴信号を減少させて、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を選択的に観測することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
【請求項２】
前記第１の核から前記第２の核への磁化移動が単量子コヒーレント状態で行われ、前記第２の核から前記第３の核への磁化移動が単量子コヒーレント状態もしくは多量子コヒーレント状態で行われることを特徴とする請求項１に記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項３】
少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の二重反位相横磁化が生成した後、前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化の再結像を待った後、前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項４】
前記前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程の後に、前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程を有し、
前記第２の核の二重反位相横磁化が生成した後、前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程の後に、前記第３の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程を有する
ことを特徴とする請求項３に記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項５】
少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項６】
少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核と前記第３の核との間に交差分極を生じさせうる第1のスピンロックパルスを発生させる工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核と前記第３の核との間に交差分極を生じさせうる第2のスピンロックパルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする請求項１または２に記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項７】
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程
との間に、
少なくとも、傾斜磁場パルスを発生させる工程を有することを特徴とする請求項６に記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項８】
水の励起高周波パルスを発生させる工程と、水のシグナルを消去しうる傾斜磁場パルスを照射する工程と、を有することを特徴とする請求項３乃至７のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項９】
コヒーレンスの選択をなし得る傾斜磁場パルスを発生させる工程を有することを特徴とする請求項３乃至８のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１０】
前記第２の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れかが選択励起パルスであることを特徴とする請求項３乃至９のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１１】
前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れか３つを周波数選択励起パルスとし、３つの前記周波数選択励起パルスそれぞれの発生と同時に、ｘ、ｙ、およびｚ軸方向の傾斜磁場パルスをそれぞれ発生させることを特徴とする請求項３乃至１０のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１２】
前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを発生させていない時間に、ｘ、ｙおよびｚ軸方向の何れか２方向への位相エンコードを行うことを特徴とする請求項３乃至１１のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１３】
前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスのいずれか１つを周波数選択励起パルスとし、該選択励起パルスを発生させるのと同時に、ｘ、ｙ、もしくはｚ軸方向のいずれかの傾斜磁場パルスを発生させる工程と、前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを発生させていない時間にｘ、ｙおよびｚ軸方向の残る２方向への位相エンコードを行う工程と、を有することを特徴とする請求項７乃至１０のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１４】
前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核が前記第２の核及び前記第３の核であり、前記第２の核及び前記第３の核がそれぞれ独立に、炭素１３、窒素１５、酸素１７、硫黄３３の何れかより選択されることを特徴とする、請求項１乃至１３にいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１５】
前記第１の核が水素１、フッ素１９、リン３１の何れかより選択されることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【請求項１６】
前記同位体標識化合物が、代謝物質であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の核磁気共鳴測定方法。
【請求項１７】
前記同位体標識化合物がコリンであり、かつ、前記第２の核が炭素１３、前記第３の核が窒素１５であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載の核磁気共鳴信号測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の核を同位体標識した化合物をプローブ剤として用い、前記プローブ剤の核磁気共鳴信号を高選択的かつ高感度に取得し、前記核磁気共鳴信号に空間的な位置情報を付加することが可能な核磁気共鳴測定法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
MRI（magnetic resonance imaging）装置は、高い強度の静磁場中（数百ミリ〜数テスラ）に測定試料を配置し、数十〜数百メガヘルツの電磁波パルスを傾斜磁場パルスと共に印加することで、測定試料内の水等に含まれる水素原子からの核磁気共鳴信号及び位置情報を取得しうる装置である。ＭＲＩ装置による測定試料として生体を選択することにより、非侵襲で生体内部の形態画像を得ることができる。人体を測定試料とするＭＲＩ診断装置は現在臨床の現場で幅広く利用されており、それにより取得される形態画像は診断にもその力を発揮している。
【０００３】
生体内の代謝物質の持つ水素原子はその化学的環境（化学結合状態）に応じてそれぞれ異なる核磁気共鳴周波数を持ち、核磁気共鳴信号の共鳴周波数のずれとして観測される。これを一般的に化学シフトと呼ぶ。一般にこの化学シフトのずれを利用し、直接生体内の代謝物質を核磁気共鳴スペクトルとして検出する方法がＭＲＳ（Magnetic Resonance Spectroscopy）であり、水素１を対象としたＭＲＳが１Ｈ ＭＲＳ（1H Magnetic Resonance Spectroscopy）である。１Ｈ ＭＲＳは通常のＭＲＩで得られる形態画像と異なり、非侵襲的に内在性の代謝物質を、必要であれば位置情報と共に、検出することができるため様々な診断への応用も期待されている。例えば、被検体者の対象となる部位のコリン、クレアチンおよびクエン酸の比を１ＨＭＲＳで観測し、前立腺ガンの評価を行う研究がなされている（例えば非特許文献１を参照のこと）。これ以外にも脳腫瘍、脳梗塞の鑑別、脳代謝に関する１ＨＭＲＳの研究もなされている。さらに１Ｈ ＭＲＳをイメージング像として観測する１Ｈ ＭＲＳＩ(1H Magnetic Resonance Spectroscopy Imaging)も知られている。
【０００４】
核スピンを持つ水素１の天然同位体存在比がほぼ１００％であると共に核磁気回転比が大きいため、１ＨＭＲＳは最も感度が高い。しかし、生体内には水を含めて多くの水素原子を含む物質があるため、注目した特定の物質を観測しようとすると周囲の組織からのコンタミネ−ションシグナルが問題となる。１ＨＭＲＳは観測周波数の幅も狭く複数のピークが重なることも多い。
【０００５】
一方、炭素の同位体である炭素１３の核磁気共鳴信号を用いた１３ＣＭＲＳ（13C Magnetic Resonance Spectroscopy）も知られている。１３ＣＭＲＳは観測周波数幅が１ＨＭＲＳと比較して広い為、ピーク分離が非常に良く、より詳細な代謝物質等の解析が可能となる。しかし、水素１と異なり核スピンを持つ炭素１３の天然同位体存在比が１．１％程しかない為、１ＨＭＲＳと比較して極端にＳ／Ｎが低い。
【０００６】
そこで、炭素１３の同位体標識した化合物をプローブ剤と組み合わせることで、１３ＣＭＲＳを観測することが有効である。例えば生体内に元々存在するグルコースなどの炭素原子を炭素１３で同位体標識し、プローブ剤として用いることが出来る。
【０００７】
MRI撮像において、ＭＲＩ造影剤あるいはプローブ剤の使用を行う場合がある。ＭＲＩ造影剤は血管の状態、臓器の血流状態、病気の部位の血流状態や特徴などをＭＲＩ画像上で際立たせることで、診断に当たって情報量を増やすことができる。また、造影剤を使わなければ病気を見つけることができないこともある。ＭＲＩ造影剤もしくはプローブ剤としては、ガドリニウムイオンと有機物とを錯形成させ安定化したガドリニウム製剤や、酸化鉄微粒子等の鉄製剤が、主に用いられている。これらの製剤は常磁性である為、製剤が存在する領域からの核磁気共鳴信号の緩和時間や化学シフトに影響を与え、ＭＲＩ画像にコントラストを与える。しかし、これらの製剤は本来生体内には存在しない物質であるとともに、コントラストを出す為にこれらの製剤を大量に投与する必要があるため、生体への影響が懸念されるという課題が存在する。それに対して、元々生体内に存在する化合物を炭素１３で同位体標識した化合物をプローブ剤として用いる方法は、ある程度大量に投与しても生体への影響が小さいという利点がある。さらに、この方法は、代謝等による前記プローブ剤の生体内での分布、濃度に関する有用な情報を得る有効な手段となる。また炭素１３の天然同位体存在比の低さによる感度の低さを補うことができる。
【０００８】
一方、炭素１３の核磁気回転比が水素１の核磁気回転比の１/４しかない為、炭素１３で同位体標識（ラベル）した化合物をプローブ剤として用いたとしても１ＨＭＲＳよりＳ／Ｎが低いという問題がある。これを解決するために水素１と炭素１３との間の磁化移動を利用してＳ／Ｎを向上させる方法が提案されている。これは水素１の共鳴周波数のラジオ波を照射し高い分極状態を作り出した後に炭素１３の共鳴周波数のラジオ波を照射することで、水素１の高い分極状態を炭素１３に移動させて炭素１３の核磁気共鳴信号を観測する方法である。これは、二重共鳴法と言われる手法の一つである。このような方法のうち、代表的なものとしては、ＩＮＥＰＴ（Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer）やＤＥＰＴ（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer）が知られている。測定の繰り返し時間をＴ、水素１の磁気回転比および縦緩和時間をγ1H、Ｔ1H、炭素１３の磁気回転比および縦緩和時間をγ13C，Ｔ13Cとすると、炭素１３の核磁気共鳴信号の感度は観測方法の違いにより次のような差を生じる。すなわち、炭素１３を直接観測した場合の感度はγ13C5/2（１−ｅ-T/T13C）であり、一方、磁化移動を用いて炭素１３を観測した場合の感度は（γ1H／γ13C）3/2（１−ｅ-T/T1H）であるから、前記の磁化移動を用いると原理上およそ４倍の感度が得られる。
【０００９】
さらに水素１の高い分極状態を炭素１３に移動した後、再び水素１に分極を戻して水素１の核磁気共鳴信号を観測する方法も知られている。このような２度の磁化移動を用いた代表的な方法としてはＨＳＱＣ（Heteronuclear Single Quantum Coherence）やＨＭＱＣ（Heteronuclear Multi Quantum Coherence）が知られている。この方法を用いた場合、感度はγ1H5/2（１−ｅ-T/T1H）となり、磁化移動を用いて炭素１３を観測した場合の感度と比較してさらに高い感度が得られる。このように水素１、炭素１３間での２度の磁化移動を用いたＨＳＱＣやＨＭＱＣを用いた１Ｈ ＭＲＳの測定例も報告されている（非特許文献２、特許文献１〜３を参照のこと）。
【００１０】
核間の磁化移動は、磁化移動をさせる各々の核が核スピンを持っていなければ起こらないため、水素原子と炭素原子との間の磁化移動を考えた場合、炭素１３に結合した水素原子の信号のみが観測され、炭素１２に結合した水素原子の核磁気共鳴信号は検出されない。従って炭素１３で同位体標識したプローブ剤を生体内に取り込ませ、上述のＨＳＱＣ，もしくはＨＭＱＣ法を用いて１Ｈ ＭＲＳを測定した場合、主に炭素１３の同位体標識した化合物に由来する水素原子の核磁気共鳴信号が検出される。しかし、炭素１３は天然にも１．１％存在するため、観測部位にはプローブ剤の他にも炭素１３に結合した水素原子を持つ物質がある程度の割合で存在する。従ってこれらの物質から観測される水素原子の核磁気共鳴信号はコンタミネ−ションシグナルとなり、Ｓ／Ｎを下げる要因となる。
【００１１】
さらに、上記の１Ｈ ＭＲＳでは、生体内での炭素１３で同位体標識したプローブ剤の分布、濃度を観測しようとすると、元々生体内に存在する前記プローブ剤の化合物と同じ化学構造を有する化合物（プローブ剤の炭素１３と同じ位置に元々炭素１３を有している化合物）の核磁気共鳴信号との切り分けが問題となる。すなわち、例えば炭素１３で同位体標識したグルコースをプローブ剤として用いた場合、元々生体内に存在するグルコースの１．１％はプローブ剤の炭素１３と同じ位置に炭素１３を含んでいる為、上記の１ＨＭＲＳで観測されてしまう。同位体標識したプローブ剤を生体に取り込ませた場合、その濃度はかなり希釈されることを想定すると、元々生体内に存在するグルコースに由来する１．１％のシグナルは、炭素１３で同位体標識したグルコースの分布、濃度を評価する上で邪魔となる。
【００１２】
ところで、異なる共鳴周波数を有する３つの核スピン間での磁化移動を用いた手法が三重共鳴法である。三重共鳴法は主にタンパク、ペプチド等の分子構造解析に用いられており、代表例としてはHNCA法やHN(CO)CA法、HNCO法などが知られている。例えばHNCA法（例えば非特許文献３を参照のこと）では、アミド結合の水素１からそれに結合する窒素１５、さらにそれに結合するアルファー位の炭素１３へと磁化移動させ、さらにこの経路を逆にたどって水素１へと磁化移動させる。このような磁化移動をさせることにより、前述した磁化移動経路をたどった水素１の核磁気共鳴信号が二次元もしくは三次元スペクトルとして観測され、タンパク、ペプチド等の主鎖配列に関する情報を得ることができる。また、非特許文献４には水素１、炭素１３およびリン３１の間の三重共鳴法も報告されている。
【００１３】
一般に知られる三重共鳴法は、タンパク、ペプチド等の主鎖配列等、分子構造に関する情報を解析することを目的としているものである。そのため、タンパク、ペプチド等を溶液とし測定することで、2次元もしくは３次元スペクトルとして観測するものであり、３つの核種の共鳴周波数軸に対し、複数回の化学シフト展開を行う。従って、一般に知られる三重共鳴法でイメージング等の空間的な位置情報を得ることは難しい。イメージングを行おうとすると、３つの核種の共鳴周波数軸のそれぞれに対し、複数回の化学シフト展開が必要であるため、さらに空間的な３軸方向へのイメージングを行おうとすると、極めて長い測定時間が必要となる。以上の理由により、一般に知られる三重共鳴法は、生体をそのものを直接測定し且つ代謝物質等の検出およびイメージングに用いる方法には適さない。
【００１４】
一方、本発明において用いられる三重共鳴法は、同位体ラベルされたプローブ剤を選択的に検出するために用いるものであって、３つの核種の共鳴周波数軸に対し、複数回の化学シフト展開を必要としない。なお、特許文献４では三重共鳴法を用いたMRIに関する概念が公開されてはいるが、具体的な技術の開示は行われていない。
【非特許文献１】Journal of Experimental & Clinical Cancer Research ), 24(4), 523 (2005)
【非特許文献２】Magnetic resonance in medicine, 43, 525(2000)
【非特許文献３】Journal of Magnetic Resonance, 89,4965 (1990)
【非特許文献４】Magnetic. Resonance in. Chemistry, 31, 1021(1993)
【特許文献１】特開平１０−１３７２１４号公報
【特許文献２】特開平９−２６２２２１号公報
【特許文献３】特開平１１−０８９８１４号公報
【特許文献４】国際公開第９８／５７５７８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来のＭＲＳでは、励起された核磁気共鳴信号を非選択的に観測している。すなわち、観測核種を含む化合物で化学構造の異なるものが複数存在する混合試料では、それぞれの化合物に由来する観測核種の核磁気共鳴信号の重ね合わせが観測されることになる。このため、代謝物質等を検出し、分布、濃度等をＭＲＳで観測しようとした場合、他の異なる化学構造を有する化合物からの核磁気共鳴信号とスペクトルが重複し、解析が困難になってしまう。この問題は実際に生体や生体組織および生体細胞中の代謝等の研究、診断において１ＨＭＲＳを観測した場合は顕著であり、周囲に存在する無数の化合物の水素原子からのコンタミネ−ションシグナルが激しく、解析の障害となる。
【００１６】
このような問題点を解決するためには、生体影響の少ない、元々生体内に存在する化合物を炭素１３で同位体標識したプローブ剤を用い、１３ＣＭＲＳを観測する方法が考えられる。しかし、この場合周囲に大量に存在する炭素原子に含まれる１．１％の炭素１３からのコンタミネ−ションシグナルはＳ/Ｎを下げる要因となる上、１３ＣＭＲＳは１ＨＭＲＳと比較して観測感度が低いという問題がある。
【００１７】
また、炭素１３で同位体標識したプローブ剤を対象として、水素１と炭素１３との間の磁化移動（ＨＭＱＣやＨＳＱＣ）を用いて１ＨＭＲＳを観測した場合でも、周囲に存在する炭素１３（天然存在比１．１％）に結合した水素１からのコンタミネ−ションシグナルはＳ/Ｎを下げる要因となる。さらには外部より取り込ませた炭素１３で同位体標識したプローブ剤の核磁気共鳴信号と、
元々生体内に存在する、前記プローブ剤として用いている化合物と同じ化学構造を有する化合物に由来する核磁気共鳴信号の切り分けが問題となる。
【００１８】
以上を踏まえ、本発明の目的は、複数の化合物が混在する生体試料に生体由来の化合物を同位体標識したプローブ剤を外部から導入することで、生体への影響を抑制して前記プローブ剤の代謝等による生体内での挙動、分布、濃度をＭＲＳにより観測するために適した方法を提供することにある。
【００１９】
また、本発明の他の目的は、前記プローブ剤を用いたＭＲＳによる観測において、周囲からのコンタミネ−ションシグナルを低減し、プローブ剤の化合物と同じ化学構造を有する同位体標識していない化合物からの核磁気共鳴信号と切り分けることによって、前記プローブ剤に由来する核磁気共鳴信号を選択的に、高いＳ/Ｎ比で観測するために適した方法を提供することにある。
【００２０】
さらに、本発明の他の目的は、ＭＲＩにおいて、生体試料に導入して観測する、同位体標識した化合物からなるプローブ剤の生体中での空間的位置情報を得るために適した方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、核磁気共鳴信号取得可能な核を含む化合物を測定対象とする核磁気共鳴信号測定法において、
前記測定対象として、核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する互いに結合した少なくとも２つの核を天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した同位体標識化合物を選択し、
測定試料中に存在する前記同位体標識化合物における前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核を含んだ、互いに結合した核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する３つの核の間での、第１の核から第２の核への磁化移動、該第２の核から第３の核への磁化移動、該第３の核から前記第２の核磁化移動、及び該第２の核から前記第１の核への磁化移動を経由する前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を観測する手段と、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号に位置情報を付加する手段と、を持つパルスシークエンスを用いて前記同位体標識化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号および位置情報を選択的に観測する工程を有し、
前記同位体標識しない化合物に由来する前記第１の核と同じ核種の核磁気共鳴信号を減少させて、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を選択的に観測することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、プローブ剤の生体内動態を、ＭＲＳを用いて高選択的に観測することができる。すなわち、本発明にはＭＲＳを測定する際のコンタミネ−ションシグナルを抑え、Ｓ/Ｎ比の高いＭＲＳが測定可能になるという効果がある。さらに、ＭＲＳで重要となる空間的な位置情報を付加することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（核磁気共鳴信号取得可能な核）
「核磁気共鳴信号取得可能な核」とは、０以外のスピン数を有し、共鳴周波数の電磁波により励起されて核磁気共鳴信号を生じる原子核（核）である。このような核の具体例としては、以下のものが挙げられる。例えば、水素１（1Ｈ）、フッ素１９（19Ｆ）、炭素１３（13Ｃ）、リン３１（31Ｐ）はスピン数として１/２を有する。また、窒素１４（14Ｎ）、水素２（2Ｈ）はスピン数が１であり、ホウ素１１（11Ｂｒ）、塩素３５（35Ｃｌ）はスピン数が３/２である。これらはいずれも核磁気共鳴信号を取得することができる核である。
【００２４】
また、「観測対象の化合物の核磁気共鳴信号を選択的に観測する」とは、観測核種（測定時に核磁気共鳴信号を生じさせたい核又は磁化移動の経路としたい核と原子数及び質量数が等しい核）を含む化合物であって、測定対象の化合物とは化学構造が異なる化合物が存在する測定環境下で、測定対象の化合物の核磁気共鳴信号を他の化合物の核磁気共鳴信号と重ならずに観測することをいう。
【００２５】
（核磁気共鳴検出法）
本発明は、観測核種を含む化合物であって、測定対象の化合物とは化学構造が異なる化合物が存在する混合試料において、測定対象以外の化合物の観測核種の核磁気共鳴信号を減少させて、測定対象化合物に由来する観測核種の核磁気共鳴信号を観測することを可能なならしめる選択的核磁気共鳴信号測定の方法を提供する。
【００２６】
本実施形態の核磁気共鳴信号測定方法は以下の（工程１）及び（工程２）を少なくとも有する。
（工程１）
核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する互いに結合した少なくとも２つの核を天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した同位体標識化合物を測定対象とし、前記同位体標識化合物を測定試料に付与する工程。
（工程２）
工程１で測定試料に付与した同位体標識化合物における、同位体標識した少なくとも２つの核を含んだ、互いに結合した核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する３つの核の間でのスピンスピン結合に基づく、第１の核から第２の核への磁化移動、第２の核から第３の核への磁化移動、第３の核から第２の核への磁化移動、及び第２の核から第１の核への磁化移動を経由する核磁気共鳴信号を観測可能なパルス系列を用いて、測定試料中の前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を観測する工程。
【００２７】
なお、（工程１）での同位体標識化合物について、天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した２つの核が、それぞれ独立に、炭素１３、窒素１５、酸素１７、硫黄３３のいずれかより選択されることが好ましい。同位体標識化合物を付与する測定試料として、生体、生体組織、生体細胞が挙げられる。また、同位体標識の対象となる化合物として、生体に存在する物質（生体内物質）を選択することは、同位体標識化合物が生体内物質と同じ化学構造を有するため、生体への負担を低減することができるため好ましい。
【００２８】
また、（工程２）では、核磁気共鳴信号を観測する核を第１の核とする。そして、磁化移動が第１の核から、第１の核に結合する第２の核へ、さらに第２の核に結合する第３の核へ移動し、さらに第３の核から第２の核、さらに第１の核へ順に移動する経路で磁化移動をさせた後に、第１の核の核磁気共鳴信号を観測するパルス系列を測定試料に付与する。この三重共鳴法における第１の核は、水素１、フッ素１９、リン３１の何れかから選択され、第２および第３の核は、それぞれ独立に、炭素１３、窒素１５、酸素１７、硫黄３３の何れかから選択されることが好ましい。
【００２９】
また、（工程２）において、当該磁化移動させるパルス系列の好ましい形態の一つとして、第１の核と第２の核との間の磁化移動が単量子コヒーレント状態で行われ、第２の核と第３の核との間の磁化移動が多量子コヒーレント状態で行われるように設定することができる。さらに他の好ましい形態の一つとして、第１の核と第２の核との間の磁化移動が単量子コヒーレント状態で行われ、第２の核と第３の核との間の磁化移動が単量子コヒーレント状態で行われるように設定することができる。
【００３０】
さらに、（工程２）において、ｘ軸、ｙ軸およびｚ軸に関する傾斜磁場パルスを印加することにより、前記同位体標識化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号の測定試料における位置情報を取得する工程を含ませることが好ましい。このようにすることで、同位体標識化合物の生体中での位置情報を取得することができる。このような位置情報取得方法として、具体的には、ＭＲＩなどの核磁気共鳴法による画像形成方法を適用することができる。
【００３１】
以下、互いに結合する複数の核を同位体標識した有機化合物をプローブ剤として、三重共鳴法を用い、前記プローブ剤からの核磁気共鳴信号を選択的に検出する形態についての概要を説明する。
【００３２】
まずＭＲＩで、生体内での挙動を観測したい化合物を同位体標識し、プローブ剤とする。このプローブ剤としては、互いに結合する複数の核を同位体標識した有機化合物を用いる。このプローブ剤において、同位体標識する核の数は２つ以上であれば２つでも、３つでもさらにそれ以上でも構わない。また、同位体標識する核は核スピンを有するものであれば特に限定されるものではないが、天然同位体存在比が少ない、核スピンが１/２の核種が望ましい。さらに、プローブ剤が有機化合物であることを鑑みると、炭素１３や窒素１５が有効である。前記プローブ剤は特に限定されるものではないが、各種代謝物質、糖類、アミノ酸、ペプチド等の生体内に元々存在する有機化合物、とりわけ代謝物質である有機化合物を同位体標識したものを用いるのが望ましい。生体内に元々存在する有機化合物を同位体標識したものを用いることによって、測定対象となる生体への悪影響を低減することができる。
【００３３】
また、前記プローブ剤においては互いに結合する複数の核が同位体標識されるが、各々の核種はすべて異なった核種でも同一の核種であっても良い。ただし同一の核種を複数同位体標識した場合は、同位体標識した核各々の核磁気共鳴信号の化学シフトが異なることが望ましい。
【００３４】
三重共鳴法を用いて前記プローブを観測する際の観測核は、最初に高周波パルスを用いて磁化が倒される第１の核である。前記第１の核は核スピンを有するものであれば特に限定されるものではないが、高感度に前記プローブの核磁気共鳴信号を検出する為に、天然同位体存在比が高く、核磁気回転比が高い核種が望ましい。具体的には水素１、フッ素１９、もしくは３１リンであることが好ましい。水素１、フッ素１９が特に望ましい。
【００３５】
前記プローブ剤中の同位体標識した核の何れかに水素１、フッ素１９もしくはリン３１が少なくとも１つ結合していることが望ましい。
【００３６】
次に、前記プローブ剤を生体、生体組織もしくは生体細胞などに適宜付与し、取り込ませたものを測定試料とする。
【００３７】
このようにして準備された測定試料を核磁気共鳴装置内に配置した後、前記プローブ剤の核磁気共鳴信号を高選択的に検出し、前記プローブ剤の生体内挙動を観測する。
【００３８】
図１に、本発明を実施するために用いられる前記核磁気共鳴装置の構成の一例を表す模式図を示す。図１において、磁石１は、測定試料に核磁気共鳴信号取得に必要な静磁場をかける為のものである。その内側（測定試料側）にはシムコイル２および傾斜磁場コイル３が配置される。シムコイル２により、測定試料に一様な静磁場が印加されるよう調整される。傾斜磁場コイル３は静磁場方向（ｚ軸）、及び静磁場方向に直交するとともに互いに直交する２つの方向（ｘ軸およびｙ軸）の計３方向に線形の傾斜磁場分布を持つ傾斜磁場を付与する為のものである。
【００３９】
さらに内側に、第１の核、第２の核および第３の核の共鳴周波数に対応する高周波パルスをそれぞれ送受信するためのコイル４が配置される。測定試料は試料空間５に配置される。コイル４は送信用と受信用が分離した構造でもよいし、送受信を兼ねた構造でも良い。また、コイル４は測定試料に近い位置に配置される表面コイル型でも構わない。コイル４は複数のコイルが配置されるマルチコイル型でも良い。第１の核用高周波送信部７、第２の核用高周波送信部８、および第３の核用高周波送信部９はそれぞれ第１の核、第２の核および第３の核、それぞれの共鳴周波数に応じた高周波パルスを発生させ、コイル４に送信するものである。観測された第１の核の核磁気共鳴信号はコイル４を介してそれぞれ第１の核用信号受信部１０、第２の核用信号受信部１１、第３の核の信号受信部１２を経由し、信号収集部１３で受信検波され、アナログ−デジタル信号変換が行われた後、データ処理部１５へと送られ、最終的にフーリエ変換等の処理が行われる。このようにして、形態画像、イメージング像、スペクトルデータが得られる。図１において、６はシークエンス制御部であり、１４は装置制御部である。
【００４０】
このような装置を用いて、前記核磁気共鳴装置内に配置された測定対象の三重共鳴法によるＭＲＳ測定又はＭＲＳＩ測定を行う。具体的には、まず、第１の核の核スピン磁化を高周波パルスで励起する。核磁気共鳴信号の観測核は前記第１の核である。その後、高周波パルスを印加することで、前記第１の核で生じた磁化分極を第２の核へ移動させる。さらに、高周波パルスを印加することで、前記第２の核へ移動させた磁化分極をさらに第３の核へ移動させる。同様のプロセスを逆に行うことで、第３の核から第２の核へ、さらに第１の核へと磁化分極を移動させ、第１の核に関する核磁気共鳴信号を取得する。
【００４１】
前記の磁化移動経路を経てきた第１の核の核磁気共鳴信号には、第２の核および第３の核の化学シフト情報が付加されている。磁化移動は各々核スピンを持つ核同士の間でのみ起こり得るため、磁化移動出来ない核（核スピンを持たない核。例えば炭素１２）を第２もしくは第３の核に含む化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号は観測されない。
【００４２】
例えば、水素原子−炭素原子−窒素原子の結合を持つプローブ剤を観測対象とする場合、第１の核は水素１であり、観測核である。また、第２の核は炭素１３であり、第３の核は窒素１５である。すなわち、このプローブ剤において、同位体標識される核は互いに結合した炭素原子および窒素原子である。
【００４３】
一方、例えば、水素原子−炭素原子−炭素原子の結合を持つプローブ剤を用いても良い。この場合第１の核は水素１であり、観測核である。また、第２の核および第３の核は共に炭素１３である。すなわち、このプローブ剤において、同位体標識される核は互いに結合した二つの炭素原子である。ただし、この場合同位体標識された二つの炭素１３は異なる共鳴周波数（化学シフト値）を持ち、それぞれ異なる周波数の高周波パルスで励起されることが望ましい。
【００４４】
以下、水素原子−炭素原子−窒素原子の結合を持つプローブ剤を例にとって説明する。
なお、説明の容易さを考慮して上記の組み合わせの核種を取り上げるが、核磁気共鳴信号取得可能な核種で且つ第１、第２、および第３の核の共鳴周波数が異なれば、その種類、組み合わせが限定されるものではないことはいうまでもない。
【００４５】
水素原子はほぼ１００％の割合で水素１であり、核スピン１/２を持つ核種である。一方、炭素原子の安定同位体は炭素１２と炭素１３があり、そのうち炭素１３が核スピン１/２を持つ核種である（炭素１３の天然同位体存在比は１．０７％）。窒素原子の安定同位体は窒素１４と窒素１５であり、そのうち窒素１５が核スピン１/２を持つ核種である（窒素１５の天然同位体存在比は０.３６４％）。従って、水素原子−炭素原子−窒素原子結合を一つ有する化合物中で、水素１−炭素１３−窒素１５の結合を持つものの天然存在比はわずか０.００３８９％（１.０７％×０.３６４％）であり、このわずかな化合物に由来する水素１の核磁気共鳴信号のみが三重共鳴法で観測されることとなる。
【００４６】
一方、本例で用いられるプローブ剤は互いに結合した炭素原子と窒素原子がそれぞれ炭素１３および窒素１５で同位体標識されている。従ってこのプローブ剤に含まれる水素原子−炭素原子−窒素原子の結合は、ほぼすべてが水素１−炭素１３−窒素１５である。
【００４７】
従って、前記プローブ剤を測定試料に付与し、三重共鳴法を用いて前記プローブ剤の核磁気共鳴信号を観測すれば、元々試料中に存在する測定対象以外の化合物に由来する水素１のコンタミネ−ションシグナルは低減され、高選択的に前記プローブ剤の１ＨＭＲＳが観測される。
【００４８】
図２に本発明で用いる三重共鳴法のパルスシークエンスの一例を示す。なお、位相回しは省略している。横の辺の短い四角（Ｐ１，Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１１、Ｐ１３、Ｐ１６、Ｐ１７）は９０°パルスを、横の辺の長い四角（Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１２、Ｐ１５）は１８０°パルスを示している。まず水素１に９０°パルス（Ｐ１）を照射することによって水素１の横磁化−Ｈｙを生じさせる。その後、τ１の待ち時間の後、水素１の１８０°パルス（Ｐ２）と炭素１３の１８０°パルス（Ｐ１０）を照射した後、τ１の待ち時間を置く。これにより化学シフトはリフォーカスされ、水素１と炭素１３のカップリングは２×τ１の時間展開されることになる。水素１と炭素１３の結合定数をＪHCとすると、磁化はcos(πＪHC2τ１)Ｈｙ−sin(πＪHC2τ１)２ＨｘＣｚとなる。ここで例えばτ１を1/4JHC秒に設定することで、水素１のｙ磁化は０となり、水素１の反位相ｘ磁化は−２ＨｘＣｚとなり最適化される。この直後、水素１に９０°パルス（Ｐ３）を照射することによって縦２スピンオーダー状態２ＨｚＣｚが生成する。この状態は時間展開しない為、次に、炭素１３に９０°パルス（Ｐ１１）を照射することで、炭素１３のアンチフェーズのｙ磁化−２ＨｚＣｙが生成し、これにより水素１から炭素１３への単量子コヒーレント状態での第１の磁化移動が行われる。なお、Ｐ３とＰ１１は同時に照射しても良い。Ｐ１１照射後、水素１と窒素１５の１８０°パルス（Ｐ４，Ｐ１５）が照射されることでカップリングによる展開がリフォーカスされ、炭素１３の化学シフトが展開される。Ｐ４，Ｐ１５の照射後、τ２の待ち時間を置く。τ２の間には、炭素１３と窒素１５の間のカップリングによる展開が行われ、炭素１３の二重反位相磁化４ＨｚＣｘＮｚの項が生成する。τ２経過後、水素１と窒素１５の９０°パルス（Ｐ５、Ｐ１６）を照射することで、炭素１３から窒素１５への多量子コヒーレント状態での磁化移動が行われる。すなわち、３スピンの多量子コヒーレント状態４ＨｙＣｘＮｙが作り出される。ここで、炭素１３と窒素１５の結合定数をＪCNとし、待ち時間τ２を1/2JCN秒に設定すると、３スピンの多量子コヒーレント状態の磁化４ＨｙＣｘＮｙが最適化される。Ｐ１６照射後、水素１と炭素１３の１８０°パルス（Ｐ６，Ｐ１２）が照射される。この間、カップリングによる展開がリフォーカスされ、窒素１５の化学シフトが展開される。本例の三重共鳴法では、Ｐ１６照射後Ｐ６，Ｐ１２を照射するまでの待ち時間を短くできることが特徴である。さらにはＰ６，Ｐ１２を照射した後の水素１と窒素１５の９０°パルス（Ｐ７，Ｐ１７）を照射するまでの間の待ち時間を短くすることもできる。これにより、パルスシークエンスを短縮することが可能になる。Ｐ７およびＰ１７を照射することで、再び炭素１３の二重反位相磁化４ＨｚＣｘＮｚに戻され、ここでτ２の待ち時間を設定することで炭素１３の反位相横磁化２ＨｚＣｙにリフォーカスされる。τ２経過後、炭素１３の９０°パルス（Ｐ１３）を照射することで、縦２スピンオーダー２ＨｚＣｚが再び生成する。この状態は時間展開しない為、Ｐ１３を照射後、一定時間を置いて水素１に９０°パルス（Ｐ８）を照射することもできるし、Ｐ１３とＰ８を��時に照射しても良い。次に、水素１に９０°パルス（Ｐ８）を照射することで、水素１の反位相ｙ磁化２ＨｙＣｚが生成する。この状態で、すぐに水素１の核磁気共鳴信号を取り込むこともできる。ただし、このようにした場合、水素１の核磁気共鳴信号は反位相のダブレットとして検出される。
【００４９】
なお、図２のパルスシークエンスにおいて、13Ｃ、15Ｎの化学シフトを展開しない場合には、Ｐ４、Ｐ１５、Ｐ６、Ｐ１２の１８０°パルスは不要である。この点は、図２のパルスシークエンスの変形例である後述のパルスシークエンス（図３、４、８、１９、１０、１１の各シークエンス）においても同様である。
【００５０】
一方、図３に示すように、Ｐ８照射後、τ１の待ち時間を置き、水素１および炭素１３の１８０°パルス（Ｐ９、Ｐ１４）を照射することもできる。このようにした場合、τ１の待ち時間を入れることで、水素１の順位相磁化Ｈｘとして核磁気共鳴信号を検出することができる。水素１の反位相ｙ磁化２ＨｙＣｚを水素１の順位相磁化Ｈｘに変換することによって、水素１の核磁気共鳴信号の取り込み時に炭素１３にデカップリングパルスを加えることができる。これにより、水素１と炭素１３とのカップリングが消去される為、より高いＳ/Ｎの１ＨＭＲＳが測定可能となる。
【００５１】
図２および図３に示したパルスシークエンスにおいては水素１と炭素１３との間の磁化移動は単量子コヒーレント状態で、炭素１３と窒素１５との間の磁化移動は多量子コヒーレント状態で行われる。
【００５２】
１ＨＭＲＳでは、測定対象に水が多く存在する場合、水からの水素１の核磁気共鳴信号を消去乃至抑制する必要がある。一般的には、プレサチュレーションパルス、ＣＨＥＳＳ（化学シフト選択）パルスで水の水素１のスピンを選択的に励起し、傾斜磁場パルスで十分デフェーズすることにより水信号を抑圧する方法がある。もっとも、方法は特に限定されるものでなく、水以外を励起するパルスを用いる方法や、グラジエントパルスによるコヒーレンス選択により消去する方法等を用いても良い。
【００５３】
例として、図３のパルスシークエンスにプレサチュレーションパルスおよび傾斜磁場パルスを入れ、水消しを行うパルスシークエンスの一例を、図４に示す。
【００５４】
次に、図５に、水素１から炭素１３、炭素１３から窒素１５への磁化移動にＩＮＥＰＴ法を用いた単量子コヒーレント状態を経由する三重共鳴法のパルスシークエンスを示す。このパルスシークエンスでは、水素１と炭素１３の間の磁化移動、炭素１３と窒素１５の間の磁化移動は、いずれも単量子コヒーレント状態で行われる。この際、水素１と炭素１３の結合定数をＪHCとすると、τ１は、例えば1/4JHC秒に設定することで、最適化される。また、炭素１３と窒素１５の結合定数をＪCNとすると、τ２は、例えば1/4ＪCN秒に設定することで、最適化される。
【００５５】
図６に示すパルスシークエンスのように、炭素１３から窒素１５への磁化移動に交差分極を用いることもできる。
【００５６】
この場合、磁化移動を行う為にスピンロックパルス（Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１６、Ｐ１７）を用いる。このスピンロックパルスには例えば連続波パルスを用いても良いし、ＷＡＬＴＳやＭＬＥＶといったコンポジットパルスを用いて、ハートマンハーン条件を最適化することで磁化移動を行うことができる。この際、水素１と炭素１３の結合定数をＪHCとすると、τ１は、例えば1/4ＪHC秒に設定することで、最適化される。
【００５７】
さらに、図７に示すように、選択性を獲得する為に、Ｐ１７とＰ１８の間に傾斜磁場パルスを入れることもできる。このようにすることで、最初の９０°パルス（Ｐ１７）によって窒素１５の横磁化を縦磁化に戻し、傾斜磁場パルスによって余計な核磁気共鳴信号をスポイルし、さらに二度目の９０°パルス（Ｐ１８）によって窒素１５の横磁化を回復させる。さらに、例えば水消しのためのパルスも加えることで、余計な核磁気共鳴信号をさらに減少させることができる。
【００５８】
炭素１３の励起パルスを選択励起パルスに置き換えることもできる。図８にそのようなパルスシークエンスの一例を示す。本例は、図３に示すパルスシークエンスの変形例である。本例では、選択的に観測したい同位体標識されたプローブ剤の炭素１３の化学シフト値をあらかじめ測定しておき、前記プローブ剤の炭素１３の化学シフト値（共鳴周波数）を選択的に励起する為の選択励起パルスを、炭素１３の９０°パルス（Ｐ１１又はＰ１３、あるいはその両方）に用いる。また、図示はしていないが、選択励起パルスを１８０°パルスに用いることもできる。このようにすることによって、同位体標識されたプローブ剤の炭素１３の核スピンのみを励起できるため、同位体標識されたプローブ剤の水素１の核磁気共鳴信号をさらに選択的に取得できる。このような置き換えは、他のパルスシークエンスにおいても可能である。
【００５９】
また、同様にして、窒素１５の励起パルスを選択励起パルスに置き換えることもできる。
【００６０】
図９に、三重共鳴法によるＭＲＳデータに三軸位置情報を付加するための、三重共鳴のパルスシークエンスの一例を示す。本例は、図３に示すパルスシークエンスの変形例である。具体的には、図３のパルスシークエンスにおいて、例えばＰ１パルス、Ｐ３パルス、Ｐ８パルスの高周波パルスがそれぞれｘ軸、ｙ軸およびｚ軸に関するスライス選択パルスとして、傾斜磁場パルスＧｘ、Ｇｙ，Ｇｚと共に印加される。この際、Ｐ１、Ｐ３およびＰ８パルスとしては、選択励起用９０°パルスを用いる。このようにすることにより、ボクセル選択を行うことができ、ｘ軸方向、ｙ軸方向、およびｚ軸方向への三軸方向での空間的な位置情報を特定することが可能であり、特定の空間の１ＨＭＲＳが観測できる。また、図１０に示したように、高周波パルスの合い間の空き時間（例えば、核磁気共鳴信号検出の直前の空き時間）に位相エンコードを行うこともできる。図１０に示すように、1度スライス選択パルスを印加し、２軸方向への位相エンコードを行うことによって、あるスライスにおける１ＨＭＲＳイメージングが可能となる。、なお、図１０のパルスシークエンスではスライス選択パルスとしてＰ１を選択しているが、スライス選択パルスとしてはＰ１以外にも、例えばＰ３、Ｐ８パルスなどを用いることもできる。また、図１１に示したように、図１０のパルスシークエンスに水消しのためのパルスを付け加えても良い。さらに、傾斜磁場パルスによるコヒーレンス選択を組み合わせても良い。
【００６１】
以下、細胞試料および癌細胞を担持させたマウスを対象として、本発明で開示された三重共鳴法を用いて、細胞内および組織内に取り込まれた同位体標識されたプローブ剤の選択的核磁気共鳴を検出した実施例を示す。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
出芽酵母(BY4741/4742)を5 mL YPD液体培地に植菌し、25℃で２日間培養を行った。次に、13Cおよび15Ｎで同位体ラベルした5 mgの同位体ラベルコリンを含む100 mL YPD液体培地に注ぎ、波長660nmにおける吸光度がABS ~ 1.0となるまで25℃で培養を行った。
【００６３】
培養液を50 mLコニカルチューブ２本に分注し、1000×gで10分間スピンダウンして酵母細胞を回収した。それぞれのチューブについて50 mLのリン酸バッファに酵母細胞を懸濁し、1000×gで10分間スピンダウンを行った。前記操作を計３回繰り返し、洗浄した酵母細胞を最小量のYPD（ペレット容量の2〜3倍程度）で懸濁して1Ｈ核磁気共鳴信号測定を行った。
【００６４】
図１２に、通常の1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを示す。図１２のデータにおいては、複数の出芽酵母成分由来のシグナルが検出されており、同位体ラベルコリンの選択的な核磁気共鳴信号検出は困難である。
【００６５】
また、図１３に、二重共鳴法を用いた場合の1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを示す。図１３においても複数の1Ｈ核磁気共鳴信号が検出され、同位体ラベルコリンの選択的な核磁気共鳴信号検出は困難である。
【００６６】
一方、図１４に本発明の三重共鳴法を用いた1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを示す。図１４において、３ｐｐｍ付近に同位体ラベルコリンに帰属されるシグナルが選択的に観測されているのが分かる。なお、４〜５ｐｐｍに観測されているシグナルは水に起因するものである。
【００６７】
また、上記の1Ｈ核磁気共鳴信号測定後に酵母細胞試料の上澄みを取り出し、凍結保存して融解後、三重共鳴法を用いて1Ｈ核磁気共鳴信号測定を行った。その結果を図１５に示す。図１５に示したように酵母細胞試料の上澄みには前記同位体ラベルコリンは極少量しか含まれていないことが確認された。このことから確かに図１４で観測された1Ｈ核磁気共鳴信号は酵母細胞に取り込まれた同位体ラベルコリンに由来するものであることが確認された。
【００６８】
（実施例２）
13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物のHeLa細胞へのとりこみと三重共鳴NMRによる確認
まず、13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物(10 mg, 69.6 μmol ) をDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Mudium）培地（5 ml）に溶解し、220 nm孔径のミリポアフィルターを用いて濾過滅菌した。この濾液を5枚のシャーレにそれぞれ1 mlづつ加えた。それぞれのシャーレにDMEM （9 ml）とHeLa細胞 (約25万個) を加え、5% CO2存在下37 ℃で5日間インキュベートした。その後、DMEMを除去し、リン酸緩衝液PBS(-)（5 ml）を用いてシャーレ上のHeLa細胞を洗浄した。ついで、各シャーレにトリプシン−EDTA（1.5 ml）を加え、1分間常温でインキュベートした後、これを除去した。5枚のシャーレそれぞれの中で、シャーレからはがれたHeLa細胞をPBS(-)（10 ml）を用いてピペッティングし、全ての細胞（約1500万個）を50 ml チューブに回収した。遠心分離でHeLa細胞を沈殿させ、上澄みを除去した。同様の操作により洗浄を２回行った後、これを十分乾燥し、本発明の三重共鳴法を用いた1Ｈ核磁気共鳴信号測定を行ったところ、実施例１と同様に同位体ラベルコリンに帰属されるシグナルが選択的に観測された。その結果を図１６に示す。
【００６９】
一方、図１７に、通常の1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを示す。図１７のデータにおいては、複数のHeLa細胞成分由来のシグナルが検出されており、同位体ラベルコリンの選択的な核磁気共鳴信号検出は困難である。
【００７０】
（実施例３）
13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物のHeLa細胞へのとりこみと三重共鳴NMRによる確認（その２）
前記実施例２と同様に実験を行い、50 mlのチューブにHeLa細胞を回収した。遠心分離でHeLa細胞を沈殿させ、上澄みを除去した。これを乾燥することなく（測定後にトリパンブルー染色で、ほぼ全ての細胞が生細胞であることを確認した。）本発明の三重共鳴法を用いた1Ｈ核磁気共鳴信号測定を行ったところ、同位体ラベルコリンに帰属されるシグナルが選択的に観測された。その結果を図１８に示す。
【００７１】
一方、図１９に、通常の1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを、図２０に二重共鳴法を用いた場合の1Ｈ核磁気共鳴信号測定のデータを示す。図１９のデータにおいては、複数のHeLa細胞成分由来のシグナルが検出されており、同位体ラベルコリンの選択的な核磁気共鳴信号検出は困難である。また図２０のデータにおいても少量ではあるが、HeLa細胞成分由来と思われるシグナルが検出されている。また、上記の1Ｈ核磁気共鳴信号測定後にHeLa細胞試料の上澄みを取り出し、三重共鳴法を用いて1Ｈ核磁気共鳴信号測定を行った。その結果を図２１に示す。図２１に示したようにHeLa細胞試料の上澄みのスペクトルでは図１８で示したスペクトルと比較して、前記同位体ラベルコリンのシグナルが明らかに弱いことがわかる。このことから確かに図１８で観測された1Ｈ核磁気共鳴信号はHeLa細胞に取り込まれた同位体ラベルコリンに由来するものであることが確認された。
【００７２】
（実施例４）
13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物の癌細胞を担持させたマウスへの投与と三重共鳴NMRによる確認
13Ｃ3−15Ｎ−コリン塩化物を、下記手順に従い癌細胞を担持させたマウスに投与し、核磁気共鳴法による測定で各器官における13Ｃ3−15Ｎ−コリン化合物の有無を確認した。
(i) 担癌マウスの作製
腹空にmeth-A細胞を飼っているBALB/cマウスにシリンジで生理食塩水 (50 ml) を加え、meth-A細胞を回収した。遠心分離で細胞を沈殿させた後、上澄み液を除去し、PBS (50ml) に溶解させた。細胞数をカウントして、2.0×107 個/mlになるように調整し、これを新しく用意したBALB/cマウスの左足の皮下に100 ml投与した。
(ii) 二重ラベル化コリンの投与・解剖・NMR解析
二重ラベル化コリンPBS溶液（2 mg/ml, 100 ml）を担癌マウスに、尻尾の静脈から投与した。1時間経過後、マウスを開切し、必要な臓器 (血液(200ml)・肝臓・腎臓・癌) を順に取り出して、それぞれエッペンチューブに回収した。これに1×Lysis buffer (500 ml) を加え、ビーズを用いて各臓器をすり潰し、遠心分離(4℃, 14000rpm, 30min)で不溶物を沈殿させた後、上澄み液を回収して1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの３元素間での磁気コヒーレンス移動を利用した三重共鳴NMR解析を行った。(図２２、図２３、図２４、図２５)
その結果、3.0ppmにコリンのメチル基由来のシグナルが、肝臓・腎臓・癌で検出することができた。
【００７３】
以上をまとめると、本発明の要旨は、以下のとおりである。
【００７４】
まず、本発明は、
核磁気共鳴信号取得可能な核を含む化合物を測定対象とする核磁気共鳴信号測定法において、
前記測定対象として、核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する互いに結合した少なくとも２つの核を天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した同位体標識化合物を選択し、
測定試料中に存在する前記同位体標識化合物における前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核を含んだ、互いに結合した核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する３つの核の間での、第１の核から第２の核への磁化移動、該第２の核から第３の核への磁化移動、該第３の核から前記第２の核磁化移動、及び該第２の核から前記第１の核への磁化移動を経由する前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を観測する手段と、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号に位置情報を付加する手段と、を持つパルスシークエンスを用いて前記同位体標識化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号および位置情報を選択的に観測する工程を有し、
前記同位体標識しない化合物に由来する前記第１の核と同じ核種の核磁気共鳴信号を減少させて、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を選択的に観測することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法である。
【００７５】
そして、前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核が、それぞれ独立に、炭素１３、窒素１５、酸素１７、硫黄３３の何れかより選択されることが好ましい。
【００７６】
また、前記第１の核が水素１、フッ素１９、リン３１の何れかより選択され、前記第２の核および第３の核が、それぞれ独立に、炭素１３、窒素１５、酸素１７、硫黄３３の何れかより選択されることが好ましい。
【００７７】
前記測定試料は、生体、生体組織、生体細胞の何れかであってよい。ここで、生体は人体を包含する概念である。また、前記同位体標識化合物は、生体内物質と同じ化学構造を有することが好ましい。
【００７８】
前記第１の核から前記第２の核への磁化移動が単量子コヒーレント状態で行われ、前記第２の核から前記第３の核への磁化移動が単量子コヒーレント状態もしくは多量子コヒーレント状態で行われることが好ましい。
【００７９】
本発明の具体的な態様としては、以下のものが挙げられる。
（１）少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の二重反位相横磁化が生成した後、前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第３の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化の再結像を待った後、前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
【００８０】
（２）少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
【００８１】
（３）少なくとも、
前記第１の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核と前記第３の核との間に交差分極を生じさせうる第1のスピンロックパルスを発生させる工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第２の核と前記第３の核との間に交差分極を生じさせうる第2のスピンロックパルスを発生させる工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
【００８２】
上記（３）においては、前記第３の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程は、前記第１のスピンロックパルスを照射する工程と前記第２のスピンロックパルスを照射する工程の間に２回行う。（３）においては、前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程との間に、少なくとも、傾斜磁場パルスを発生させる工程を有することが好ましい。
【００８３】
また、これらの全ての態様において、以下のようにすることが好ましい。まず、水の励起高周波パルスを発生させる工程と、水のシグナルを消去しうる傾斜磁場パルスを照射する工程と、を有することが好ましい。また、コヒーレンス選択をなし得る傾斜磁場パルスを発生させる工程を有することが好ましい。また、前記第２の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れかが選択励起パルスであることが好ましい。また、前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れか３つを周波数選択励起パルスとし、これらの選択励起パルスそれぞれの発生と同時に、ｘ、ｙ、およびｚ軸方向の傾斜磁場パルスをそれぞれ発生させることが好ましい。また、前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを発生させていない時間に、ｘ、ｙおよびｚ軸方向の何れか２方向への位相エンコードを行うことが好ましい。また、前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスのいずれか１つを周波数選択励起パルスとし、該選択励起パルスを発生させるのと同時に、ｘ、ｙ、もしくはｚ軸方向のいずれかの傾斜磁場パルスを発生させる工程と、前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを発生させていない時間にｘ、ｙおよびｚ軸方向の残る２方向への位相エンコードを行う工程と、を有することが好ましい。
【００８４】
また、以下、異なった観点から本発明の要旨を述べる。
【００８５】
異なった観点からの本発明は、
核磁気共鳴信号取得可能な核を含む化合物を測定対象とする核磁気共鳴信号測定法において、
前記測定対象として、核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する互いに結合した少なくとも２つの核を天然同位体存在比より高い比率で同位体標識した同位体標識化合物を選択し、
前記同位体標識化合物を測定試料に付与する工程と、前記同位体標識化合物における前記同位体標識した互いに結合する少なくとも２つの核を含んだ、互いに結合した核磁気共鳴信号取得可能で異なる核磁気共鳴周波数を有する３つの核の間での、第１の核から第２の核への磁化移動、該第２の核から第３の核への磁化移動、該第３の核から前記第２の核磁化移動、及び該第２の核から前記第１の核への磁化移動を経由する前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を観測する手段と、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号に位置情報を付加する手段と、を持つパルスシークエンスを用いて前記同位体標識化合物に由来する第１の核の核磁気共鳴信号および位置情報を選択的に観測する工程を有し、
前記同位体標識しない化合物に由来する前記第１の核と同じ核種の核磁気共鳴信号を減少させて、前記同位体標識化合物に由来する前記第１の核の核磁気共鳴信号を選択的に観測することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法である。
【００８６】
異なった観点から見た本発明の具体的な態様としては、以下のものが挙げられる。
（１ａ）少なくとも、
前記第１の核の横磁化を発生させるために前記第１の核にの共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の反位相横磁化を前記第２の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の二重反位相横磁化が生成した後、前記第２の核の二重反位相横磁化を多量子コヒーレント状態に変換し前記第２の核から前記第３の核への磁化移動を行う為に前記第１の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第３の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第３の核の多量子コヒーレントを前記第２の核の二重反位相横磁化へ変換し前記第３の核から前記第２の核への磁化移動を行う為に前記第１の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化の再結像を待った後、前記第２の核の反位相横磁化を前記第１の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有する核磁気共鳴信号測定法。
（２ａ）少なくとも、
前記第１の核の横磁化を発生させるために前記第１の核にその共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の反位相横磁化を前記第２の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化を前記第３の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第３の核の反位相横磁化を前記第２の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化を前記第１の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
（３ａ）少なくとも、
前記第１の核の横磁化を発生させるために前記第１の核にその共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の反位相横磁化を前記第２の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核から前記第３の核に磁化移動させる為に，これらの間に交差分極を生じさせる第1のスピンロックパルスを照射する工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程と、
前記第３の核から前記第２の核に磁化移動させる為に、前記第２の核と前記第３の核との間に交差分極を生じさせる第2のスピンロックパルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核、前記第２の核および前記第３の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第２の核の反位相横磁化を前記第１の核の反位相横磁化に磁化移動させる為に、前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
前記第１の核の反位相横磁化展開中に前記第１の核および前記第２の核に各々の共鳴周波数に相当する高周波パルスを照射する工程と、
生成した前記第１の核の順位相横磁化を観測する工程と、を
この順に有することを特徴とする核磁気共鳴信号測定法。
【００８７】
上記（３ａ）において、前記第３の核の共鳴周波数に相当する高周波パルスを発生させる工程は、前記第１のスピンロックパルスを照射する工程と前記第２のスピンロックパルスを照射する工程の間に２回行う。（３ａ）において、前記第３の核の共鳴周波数に相当する第１の高周波パルスを発生させる工程と、前記第３の核の共鳴周波数に相当する第２の高周波パルスを発生させる工程と、傾斜磁場パルスを照射する工程を有することが好ましい。
【００８８】
また、これらの全ての態様において、以下のようにすることが好ましい。まず、水の励起高周波パルスおよび傾斜磁場パルスを用いて水のシグナルを消去することが好ましい。また、傾斜磁場パルスを用いてコヒーレンス選択を行うことが好ましい。また、前記第２の核に照射される前記第２の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れかが選択励起パルスであることが好ましい。また、前記第１の核に照射される前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスの何れか３つを周波数選択励起パルスとし、これらの選択励起パルスそれぞれの照射と同時に、ｘ、ｙ、およびｚ軸方向の傾斜磁場パルスをそれぞれ照射することでボクセル選択することが好ましい。また、前記第１の核に照射される前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを照射していない時間に、ｘ、ｙおよびｚ軸方向の何れか２方向への位相エンコードを行うことが好ましい。また、前記第１の核に照射される前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスのいずれか１つを周波数選択励起パルスとし、該選択励起パルスを照射するのと同時に、ｘ、ｙ、もしくはｚ軸方向のいずれかの傾斜磁場パルスを照射することでスライス選択する工程と、前記第１の核に照射される前記第１の核の共鳴周波数に相当する複数の高周波パルスを照射していない時間にｘ、ｙおよびｚ軸方向の残る２方向への位相エンコードを行う工程と、を有することが好ましい。
【００８９】
本明細書中に述べた形態は、すべて適宜組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明を実施するに適した核磁気共鳴装置の構成の一例を模式的に示した図である。
【図２】本発明の実施形態による単量子コヒーレントおよび多量子コヒーレント状態を用いた三重共鳴法のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図３】図２のパルスシークエンスにおいてデカップリングを行う場合のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図４】図３のパルスシークエンスにおいて水消しの為にプレサチュレーションパルスおよび傾斜磁場パルスを入れた場合のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図５】本発明の実施形態による単量子コヒーレント状態を用いた三重共鳴法のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図６】本発明の実施形態による交差分極を用いた三重共鳴法のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図７】図６のパルスシークエンスにおいて水消しの為にプレサチュレーションパルスおよび傾斜磁場パルスおよびｚｚフィルターを入れた場合のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図８】図３のパルスシークエンスにおいて炭素１３の励起に選択励起パルスを用いる場合のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図９】本発明の実施形態による三重共鳴法のパルスシークエンスに置いて、観測される核磁気共鳴信号に三軸方向の空間的な位置情報を付加するためのパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態による三重共鳴法のパルスシークエンスに置いて、スライス選択および位相エンコードを用いたイメージングを行うためのパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図１１】図１０のパルスシークエンスにおいて水消しの為にプレサチュレーションパルスおよび傾斜磁場パルスを入れた場合のパルスシークエンスの一例を示す図である。
【図１２】同位体ラベルコリンを取り込ませた出芽酵母（実施例１）の1Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。
【図１３】同位体ラベルコリンを取り込ませた出芽酵母（実施例１）を二重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図１４】同位体ラベルコリンを取り込ませた出芽酵母（実施例１）を本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルの一例である。
【図１５】同位体ラベルコリンを取り込ませた出芽酵母（実施例１）試料の上澄み液を本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図１６】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例２）を本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルの一例である。
【図１７】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例２）の1Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。
【図１８】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例３）を本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルの例である。
【図１９】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例３）の1Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。
【図２０】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例３）を二重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図２１】同位体ラベルコリンを取り込ませたHeLa細胞（実施例３）試料の上澄み液を本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図２２】担癌マウスの血液を、本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図２３】担癌マウスの肝臓を、本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図２４】担癌マウスの腎臓を、本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【図２５】担癌マウスの癌組織を、本発明で開示した三重共鳴法を用いて観測した核磁気共鳴スペクトルである。
【符号の説明】
【００９１】
１  磁石
２  シムコイル
３  傾斜磁場コイル
４  コイル
５  試料空間
６  シークエンス制御部
７  第１の核用高周波送信部
８  第２の核用高周波送信部
９  第３の核用高周波送信部
１０  第１の核用信号受信部
１１  第２の核用信号受信部
１２  第３の核用信号受信部
１３  信号収集部
１４  装置制御部
１５  データ処理部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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