(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1又は13に示される塩基配列内の少なくとも15塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズする、15塩基長以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる、がん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
【請求項２】
プローブ又はプライマーである、請求項１記載のがん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
【請求項３】
下記工程（１）〜（３）を含む、不死化がん細胞の判定方法：
（１）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と請求項１又は２のいずれか１項記載の遺伝子マーカーとを結合させる工程、
（２）上記遺伝子マーカーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、該遺伝子マーカーを指標として測定する工程、
（３）上記工程（２）で得られたRNA又はその派生物の量（以下、総称して「RNA量」という）と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又はその派生物の量（以下、総称して「対照RNA量」という）とを比較する工程。
【請求項４】
さらに下記工程（４）を含む、請求項３に記載する不死化がん細胞の判定方法：
（４）工程（２）で得られたRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【請求項５】
下記工程（１’）〜（３’）を含む、不死化がん細胞の判定方法。
（１’）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と、配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体とを結合させる工程
（２’）上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
（３’）上記工程（２’）で得られたポリペプチド量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量（以下、「対照ポリペプチド量」という）とを比較する工程。
【請求項６】
下記工程（４’）を含む、請求項５に記載する不死化がん細胞の判定方法。
（４’）工程（２’）で得られたポリペプチド量が対照ポリペプチド量より高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【請求項７】
請求項１に記載する遺伝子マーカー、および
配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、不死化がん細胞判定用試薬キット。
【請求項８】
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（Ａ）被験物質と、配列番号1又は13に示される塩基配列からなる遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程
（Ｂ）被験物質を接触させた細胞について、配列番号1又は13に示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を測定する工程
（Ｃ）上記工程（Ｂ）で得られた遺伝子の発現量と被験物質を接触させない対照の細胞における対応する遺伝子の発現量（以下、「対照発現量」という）を比較する工程、および
（Ｄ）上記工程（Ｂ）で得られた遺伝子の発現量が対照発現量よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【請求項９】
下記工程（Ａ’）〜（Ｄ’）を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（Ａ’）被験物質と、配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとを接触させる工程、
（Ｂ’）被験物質を接触させた配列番号14又は26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を測定する工程、
（Ｃ’）上記工程（Ｂ’）で得られたポリペプチドの活性と被験物質を接触させない対照の活性（以下、「対照活性」という）を比較して、上記工程（Ｂ’）で得られたポリペプチドの活性の程度を識別する工程、および
（Ｄ’）上記工程（Ｂ’）で得られたポリペプチドの活性が対照活性よりも低い場合に、
当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【請求項１０】
配列番号1又は13に示される塩基配列の少なくとも15塩基長以上の連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする、15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを有効成分とする、不死化がん細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
上記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜30及び75〜76のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１０記載の不死化がん細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞の不死化に関わる遺伝子（不死化規定遺伝子）および当該遺伝子を有する不死化がん細胞を標的とした選択的ながん治療に有用な方法に関する。より具体的には、本発明は不死化規定遺伝子を指標とする不死化がん細胞の判定方法、およびその判定に使用する試薬に関する。また本発明は、不死化がん細胞を標的にする選択的な抗がん剤（不死化がん細胞増殖抑制剤）の有効成分をスクリーニングする方法、および当該抗がん剤（不死化がん細胞増殖抑制剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト固形癌は根治手術がなされない限り予後不良であり、その主因は現在の化学療法の効果が不十分であることによる。従来の化学療法薬は、核酸合成過程、DNA、微小管を作用点とし、核酸からタンパク質生成過程を阻害することを基本とするため、癌細胞のみならず、細胞増殖を行っている再生性組織正常細胞への障害が避けられなかった。最近、癌細胞に特異的に発現している分子が次々と同定されつつあり、それを標的とする阻害薬ならば正常細胞への有害反応は最小限にとどめることが可能で、その結果、投与量も増大することができる。こうした分子標的治療薬も開発されてきたが、その最大の欠点は、必ずしも多くの症例に有効なわけではなく、個々の症例により効果が異なり、それを投与前に予測することが不完全なことである。分子標的治療薬の効果が個々の症例で大きく異なる理由として、治療の標的とされてきた分子が発がん過程や転移に関わる遺伝子であることを挙げることができる。発がん過程はがん種によるのみならず同じがん種の中でも多様であるため、標的とする分子のがん増殖に関与する程度は個々の症例で異なると考えられる。ゆえに、がん種を越えて普遍的に中心的役割を果たす分子が同定されれば、多くのがん症例に普遍的に効果が期待できる分子標的治療薬の開発が可能となる。
【０００３】
ヒトを含むすべての脊椎動物の染色体の両末端は“TTAGGG”という単純反復配列が続くが（ヒトでは約10 kb、マウスはその数倍）、細胞分裂に伴うDNA複製のたびに末端を完全には複製できず少しずつ（ヒトでは約200塩基）短縮してゆく。この末端構造が「テロメア」であり、テロメアが細胞分裂にともない一定（ヒト非がん細胞では約5 kb）以下に短縮すると、もはや細胞は分裂できなくなる。がん化するとさらに分裂可能であるが、それでもテロメアが究極的に短縮する（約2 kb）と細胞は死滅する。この短縮したテロメアを伸長してテロメア長を安定に保つことにより細胞分裂寿命を延ばすことができるのが、逆転写酵素「テロメラーゼ」である（非特許文献１参照）。このテロメラーゼは、通常の正常体細胞では発現しておらず、ゆえに分裂可能回数は数十回に限られているが、無限に増殖することが可能な生殖細胞と不死化がん細胞では高く発現している。以前はがん細胞はすべてが不死化しているものと考えられがちであったが、臨床的に明らかながんであっても必ずしもテロメラーゼ活性が検出されない例があること(非特許文献２および３など参照)、テロメラーゼ酵素成分TERTを非がん細胞に強制発現させてもがん細胞の形質を示さないこと(非特許文献４参照)などから、現在はがん化と不死化は異なる現象であると理解されている。
【非特許文献１】Harley CB, Mutation Res, 256: 271-82, 1991
【非特許文献２】Kim NWら、Science 266: 2011-5, 1994
【非特許文献３】Hiyama Kら、J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995
【非特許文献４】Morales CPら、Nat Genet 21: 115-8, 1999
【非特許文献５】Shay JW, Bacchetti S, Eur J Cancer 33: 787-91, 1997
【非特許文献６】Hiyama Kら、J Immunol 155: 3711-5, 1995
【非特許文献７】Hiyama Eら、Int J Oncol 9: 453-8, 1996
【非特許文献８】Forsyth NRら、Aging Cell 2: 235-43, 2003
【非特許文献９】Bodnar AGら、Exp Cell Res 228: 58-64, 1996
【非特許文献１０】Hiyama Kら、Int J Oncol 27: 87-95, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、不死化がん細胞の判定方法、およびその判定に使用する試薬に関する。また本発明は、不死化がん細胞の増殖を特異的に抑制する作用を有し、選択的な抗がん剤として有用な、不死化がん細胞増殖抑制剤の有効成分をスクリーニングする方法、および当該不死化がん細胞増殖抑制剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、がん治療、特に多くのがん症例に普遍的に効果が期待される分子標的治療薬の開発をめざして、がん細胞のがん化（悪性化）形質とは異なるもう一つの形質「不死化」に着目した。すなわち、体内にがん細胞が出現しても無限増殖を抑制してやれば、宿主を死に至らしめるまで増大・転移しないのみならず、通常の化学療法や非根治的手術によりある程度残存がん細胞数を減らすことで、それが再度増大するまでに分裂寿命が尽きて自然に死滅することが期待される。これまでに調べられた数千検体もの臨床がん検体の80%以上がテロメラーゼを発現していること（非特許文献５参照）、これまでに調べられたあらゆるがん種においてテロメラーゼ発現が確認されたこと、ヒトがん由来の細胞株はほとんどすべてテロメラーゼを発現していること(非特許文献２参照)、ひとたびテロメラーゼを発現したがん細胞は自然に陰性とはならないことなどから、多様な発がん過程と異なり、この不死化過程は、多くのがん細胞にかなり普遍的に共通に存在するものと考えられる。すなわち、不死化を規定する分子を標的とすることにより、がん種を越えて普遍的に多くの症例に有効ながんの無限増殖抑制が可能となるものと期待できる。この意味で、テロメラーゼ自体を標的とする抗がん戦略も試みられている。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは正常体細胞であっても再生性組織の前駆細胞やリンパ球にはテロメラーゼ活性が検出されることを既に見出しており(非特許文献６および７参照)、さらにテロメラーゼ酵素成分TERTを非がん細胞に強制発現させても必ずしも不死化しないこと(非特許文献８参照)、テロメラーゼを発現する正常前駆細胞やリンパ球は決して不死化しているわけではなく延命のみであること(非特許文献６および９参照)などからも、テロメラーゼの発現のみで細胞が不死化するわけではないことは明らかである。すなわち、ヒト細胞の不死化には、染色体末端テロメアを延長する酵素テロメラーゼの活性化がほぼ必須であるが十分ではなく、テロメラーゼ活性化に加えて不死化に不可欠な分子が存在しており、その分子はがん細胞に特異的に働いているものと予想される。事実、本発明者らは、正常体細胞にTERTを導入してテロメラーゼを強制発現させ不死化させたクローンにおいて特異的に発現変動している遺伝子は、報告されているがん細胞における発現変動と全く異なっていることを確認している（非特許文献１０参照）。こうしたことからも正常細胞の不死化とがん細胞の不死化に関わる遺伝子は異なると言える。テロメラーゼ自体を標的にすると、リンパ球、血液前駆細胞および消化管粘膜クリプト細胞などの分裂能が抑制され、がん治療の有害事象として致命的となる免疫能、造血能および消化管機能が障害される危険性が高いが、がん細胞のみで働いている不死化規定因子を標的とすれば、テロメラーゼ活性陽性の正常幹／前駆細胞、リンパ球などの機能を損なうことなくがん細胞特異的な無限増殖の阻止が可能となると考えられる。
【０００７】
かかる考えのもとで、本発明者らはヒトがん細胞の不死化に普遍的に関わる遺伝子を見出すべく、鋭意思考を行った。その結果、当該遺伝子は正常細胞におけるテロメラーゼの活性化による延命には関わらず、がん細胞の増殖維持に特異的に作用しているとの考えに至り、その不死化規定遺伝子13遺伝子（表１参照）を特定した。その概略は次の通りである。まず、がん種を越えて普遍的に発現増強している遺伝子をマイクロアレイ解析により抽出し、得られた遺伝子の中から、不死化したがん細胞で構成されている臨床的がん組織において、不死化していないがん細胞で構成されているがん組織の発現レベルよりも発現が増強しており、さらに、正常細胞にテロメラーゼを導入して発現させた細胞では発現増強していない遺伝子を13種選択した。次いで、得られた13種の遺伝子の発現を不死化がん細胞内でsiRNAにより抑制すると、いずれも不死化がん細胞の増殖が抑制されることを確認した。
【０００８】
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の態様を有するものである。
項１．配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列内の少なくとも15塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズする、15塩基長以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる、がん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
【０００９】
項２．プローブ又はプライマーである、項１記載のがん細胞の不死化を判定するための遺伝子マーカー。
【００１０】
項３．下記工程（１）〜（３）を含む、不死化がん細胞の判定方法：
（１）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と項１又は２のいずれか１項記載の遺伝子マーカーとを結合させる工程、
（２）上記遺伝子マーカーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、該遺伝子マーカーを指標として測定する工程、
（３）上記工程（２）で得られたRNA又は当該RNAの派生物の量（以下、これらを総称して「RNA量」という）と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又は当該RNAの派生物の量（以下、これらを総称して「対照RNA量」という）とを比較する工程。
【００１１】
項４．さらに下記工程（４）を含む、項３に記載する不死化がん細胞の判定方法：
（４）工程（２）のRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【００１２】
項５．配列番号14〜26のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体。なお、当該抗体は、がん細胞の不死化を判定するために好適に用いられる。
【００１３】
項６．下記工程（１’）〜（３’）を含む、不死化がん細胞の判定方法。
（１’）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と項５記載の抗体とを結合させる工程
（２’）上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
（３’）上記工程（２’）のポリペプチド量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量（以下、「対照ポリペプチド量」という）とを比較する工程。
【００１４】
項７．さらに下記工程（４’）を含む、項６に記載する不死化がん細胞の判定方法： 
（４’）工程（２’）のポリペプチド量が対照ポリペプチド量より高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【００１５】
項８．項１に記載する遺伝子マーカーおよび項５記載の抗体からなる群から選択される少なくとも１つを不死化がん細胞判定用試薬として含む、不死化がん細胞判定用試薬キット。
【００１６】
項９．下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法：
（Ａ）被験物質と、配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列からなる遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程
（Ｂ）被験物質を接触させた細胞について、配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を測定する工程
（Ｃ）上記工程（Ｂ）で得られた遺伝子の発現量と被験物質を接触させない対照の細胞における対応する遺伝子の発現量を比較する工程、および
（Ｄ）上記工程（Ｂ）で得られた遺伝子の発現量が対照の発現量よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【００１７】
項１０．下記工程（Ａ’）〜（Ｄ’）を含む、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（Ａ’）被験物質と、配列番号14〜26のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとを接触させる工程、
（Ｂ’）被験物質を接触させた配列番号14〜26のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を測定する工程、
（Ｃ’）上記工程（Ｂ’）で得られたポリペプチドの活性と被験物質を接触させない対照の活性を比較する工程、および
（Ｄ’）上記工程（Ｂ’）で得られたポリペプチドの活性が対照の活性よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【００１８】
項１１．配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列の少なくとも15塩基長以上の連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする、15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを有効成分とする、不死化がん細胞増殖抑制剤。
【００１９】
項１２．上記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜76のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、項１１記載の不死化がん細胞増殖抑制剤。
【００２０】
項１３．項１１または１２に記載する不死化がん細胞増殖抑制剤を患者のがん細胞に導入する工程を有する、抗がん療法。
【００２１】
項１４．配列番号1〜13のいずれかに示される塩基配列の少なくとも15塩基長以上の連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドの、不死化がん細胞増殖抑制剤の製造のための使用。
【００２２】
項１５．上記ポリヌクレオチドが配列番号27〜76のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、項１４に記載する使用。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、複数のがん種において、不死化がん細胞に特異的に発現が増大しており、がん種を越えて普遍的にがん細胞の不死化を規定する遺伝子が明らかになった。本発明の不死化がん細胞の判定方法ならびにその判定方法に使用する試薬によれば、かかる不死化規定遺伝子の発現の程度が識別でき、その程度から、通常の病理診断では判定できなかった不死化がん細胞と有限寿命細胞とを鑑別することができる。そして当該鑑別により、がんの早期診断・治療選択・予後予測への臨床応用が可能となる。
【００２４】
また本発明の不死化規定遺伝子を標的としたスクリーニング方法によると、不死化がん細胞の増殖を特異的に抑えることのできる抗がん剤の有効成分を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（Ｉ）不死化規定遺伝子
本発明において「不死化していないがん細胞」とは、がん細胞のうち、(1)テロメラーゼ活性が陰性であり、(2)テロメア長が短縮しており、且つ(3)テロメラーゼタンパク質の発現が確認できない有限寿命細胞を意味する。一方、本発明において「不死化がん細胞」とは、がん細胞のうち、上記(1)〜(3)のうち少なくとも１つの特徴を備えていない細胞、すなわちテロメラーゼ活性が陽性であるか、テロメア長が延長しているか、またはテロメラーゼタンパク質の発現が確認できる細胞で、無限に細胞増殖することが可能になった細胞を意味する。
【００２６】
本発明において「不死化規定遺伝子」とは、がん細胞の不死化を規定する遺伝子を意味する。
【００２７】
本発明が対象とするがん細胞は特に限定はなく、その由来としては、例えば、肺癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌等が挙げられる。
【００２８】
不死化規定遺伝子として、具体的には、（1）UBE2S遺伝子、（2）RFC4遺伝子、（3）PTGES2遺伝子、（4）MAF1遺伝子、（5）ACVR2B遺伝子、（6）FAM119A遺伝子、（7）LTB4DH遺伝子、（8）DPM2遺伝子、（9）SEPX1遺伝子、（10）PSMA3遺伝子、（11）CHCHD3遺伝子、（12）LSM3遺伝子、及び（13）GTSE1遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子のGenBankアクセッション番号、正式な遺伝子名、遺伝子シンボル、及びこれらの遺伝子の塩基配列を示した配列番号を下記表１に示す。尚、表中の遺伝子名、遺伝子シンボル等は、NCBIでインターネット公開（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)されたデータに基づいて記載している。
【００２９】
【表１】
0005312024.tif 000002
【００３０】
実施例１に示すように、上記各種の不死化規定遺伝子は、いずれも肺癌、食道癌及び乳癌などの複数のがん種に由来する不死化がん細胞に特異的に高発現している。また、実施例２に示すように、これら13種の遺伝子の発現を不死化がん細胞内でsiRNAにより抑制すると、いずれも不死化がん細胞の増殖が抑制された。これらのことから、上記13種の不死化規定遺伝子はいずれもがん細胞の不死化を規定する遺伝子（不死化規定遺伝子）であると考えられる。
【００３１】
（II）がん細胞の不死化を判定するための試薬（遺伝子マーカー）
前述するように配列番号1〜13に示す塩基配列からなる各不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）は、いずれも複数のがん種に由来する不死化がん細胞に特異的に高発現していることから、これを指標（マーカー遺伝子）とすることにより、がん細胞の不死化の有無を判定することが可能となる。
【００３２】
本発明は、かかるがん細胞の不死化を判定するために好適に使用されるツール（試薬）を不死化規定遺伝子マーカー（本発明では、省略して「遺伝子マーカー」と称する）として提供する。当該遺伝子マーカーは、前述する配列番号1〜13のいずれかに示される不死化規定遺伝子の塩基配列内の少なくとも15塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、少なくとも15塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。なお、本発明の遺伝子マーカーの形態は、目的に応じて適宜設定することができ、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA及びDNA:RNAハイブリッドのいずれであってもよい。
【００３３】
当該遺伝子マーカーには、不死化がん細胞を判定する際に、がん細胞中での不死化規定遺伝子の発現の有無やその程度（発現量）を検出するのに有用なプローブやプライマーが含まれる。また、これらのプローブやプライマーは、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニングに際して、不死化規定遺伝子の発現変動を検出するツール（検出試薬）としても有用である。
【００３４】
(II-1)プローブ
がん細胞の不死化の判定は、不死化がん細胞に特異的に高発現している上記不死化規定遺伝子〔（1）UBE2S遺伝子、（2）RFC4遺伝子、（3）PTGES2遺伝子、（4）MAF1遺伝子、（5）ACVR2B遺伝子、（6）FAM119A遺伝子、（7）LTB4DH遺伝子、（8）DPM2遺伝子、（9）SEPX1遺伝子、（10）PSMA3遺伝子、（11）CHCHD3遺伝子、（12）LSM3遺伝子、または（13）GTSE1遺伝子〕のいずれか少なくとも一つを検出することによって行われる。
【００３５】
これらの不死化規定遺伝子の検出には、これらの各遺伝子の塩基配列に特異的にハイブリダイズし、当該不死化規定遺伝子を特異的に検出することができるポリヌクレオチドがプローブとして用いられる。なお、本発明において、「ポリヌクレオチド」という用語には複数個の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００３６】
かかるポリヌクレオチドは、各不死化規定遺伝子の塩基配列内の、少なくとも15塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長、好ましくは20塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長、より好ましくは30塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長の連続した塩基配列と、特異的にハイブリダイズするように、上記に対応する塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００３７】
本明細書全体を通じて、また特許請求の範囲において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Tm）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件、より厳格には「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度の条件、さらに厳格には「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件が挙げられる。
【００３８】
なおポリヌクレオチド（プローブ）は、上記不死化規定遺伝子の少なくとも15塩基長の連続する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが好ましいが、上記特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは不死化規定遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。ここで、塩基配列の同一性は、同一性検索、配列アラインメントプログラム、BLAST、FASTA、ClustalWなどにて計算することができる。
【００３９】
本発明が対象とするプローブとして、具体的には、下記(1)〜(13)からなる群から選択される少なくとも一つのポリヌクレオチド（但し、当該ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合は、配列中の塩基「ｔ」は「ｕ」に読み替えられるものとする）にハイブリダイズする15塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長、好ましくは20塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長、より好ましくは30塩基長〜各不死化規定遺伝子の全塩基長の連続した塩基配列からなるオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４０】
（1）UBE2S遺伝子の塩基配列（配列番号1）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（2）RFC4遺伝子の塩基配列（配列番号2）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（3）PTGES2遺伝子の塩基配列（配列番号3）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（4）MAF1遺伝子の塩基配列（配列番号4）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（5）ACVR2B遺伝子の塩基配列（配列番号5）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（6）FAM119A遺伝子の塩基配列（配列番号6）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（7）LTB4DH遺伝子の塩基配列（配列番号7）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（8）DPM2遺伝子の塩基配列（配列番号8）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（9）SEPX1遺伝子の塩基配列（配列番号9）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（10）PSMA3遺伝子の塩基配列（配列番号10）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（11）CHCHD3遺伝子の塩基配列（配列番号11）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（12）LSM3遺伝子の塩基配列（配列番号12）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（13）GTSE1遺伝子の塩基配列（配列番号13）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４１】
なお、これらのポリヌクレオチド（プローブ）は、各不死化規定遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作製することができる。また不死化規定遺伝子の塩基配列を鋳型としてPCR法によって調製することもできる。
【００４２】
さらに好ましくは、当該プローブは、各不死化規定遺伝子を容易に検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい（詳細は後述する）。
【００４３】
またこれらのプローブは、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明が対象とするプローブには、上記ポリヌクレオチドを任意の固相に固定化したプローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、cDNAマイクロアレイ、オリゴDNAアレイ、メンブレンフィルター等）も含まれる。当該プローブは、好適には不死化規定遺伝子検出用、すなわち不死化がん細胞検出用のDNAチップとして利用することができる。
【００４４】
上記プローブ（ポリヌクレオチド）の固定化に使用される固相は、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのポリヌクレオチドの固定は、予め合成したポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（コスモ・バイオ社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるポリヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００４５】
（II-2）プライマー
本発明は、遺伝子マーカーとして各不死化規定遺伝子の塩基配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
【００４６】
かかるポリヌクレオチドとしては、下記(1)〜(13)からなる群から選択される少なくとも一つのポリヌクレオチド（但し、当該ポリヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）の一部に特異的にハイブリダイズし、当該ポリヌクレオチドまたはその一領域を特異的に増幅するために用いられる、少なくとも15塩基長、好ましくは15〜100塩基長、より好ましくは15〜50塩基長、さらに好ましくは15〜35塩基長の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４７】
（1）UBE2S遺伝子の塩基配列（配列番号1）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（2）RFC4遺伝子の塩基配列（配列番号2）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（3）PTGES2遺伝子の塩基配列（配列番号3）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（4）MAF1遺伝子の塩基配列（配列番号4）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（5）ACVR2B遺伝子の塩基配列（配列番号5）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（6）FAM119A遺伝子の塩基配列（配列番号6）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（7）LTB4DH遺伝子の塩基配列（配列番号7）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（8）DPM2遺伝子の塩基配列（配列番号8）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（9）SEPX1遺伝子の塩基配列（配列番号9）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（10）PSMA3遺伝子の塩基配列（配列番号10）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（11）CHCHD3遺伝子の塩基配列（配列番号11）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（12）LSM3遺伝子の塩基配列（配列番号12）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（13）GTSE1遺伝子の塩基配列（配列番号13）において15塩基長以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００４８】
このようなポリヌクレオチド（プライマー）は、プローブと同様、上記各不死化規定遺伝子の少なくとも15塩基長の連続する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが好ましいが、特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは不死化規定遺伝子の塩基配列内の連続する少なくとも15塩基以上の塩基配列を有するポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００４９】
なお、これらのポリヌクレオチドは、プローブと同様、上記各不死化規定遺伝子の塩基配列に基づいて、市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作製することができる。
【００５０】
（II-3）標識物
上記本発明の遺伝子マーカー（プローブまたはプライマー）には、前述するポリヌクレオチドに、不死化規定遺伝子検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００５１】
例えば、本発明において用いられる蛍光色素、放射性同位体または化学発光物質などの標識物としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用できる。例えば、蛍光色素としては、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００５２】
以上の、遺伝子マーカー（非標識または標識されたプローブまたはプライマー）は、不死化規定遺伝子検出用試薬、言い換えれば不死化がん細胞検出用試薬として利用することができる。
【００５３】
（II-4）不死化がん細胞検出用試薬キット
本発明はまた、上記不死化がん細胞検出用試薬〔遺伝子マーカー（非標識または標識されたプローブまたはプライマー）〕をキットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられる、非標識または標識されたポリヌクレオチド（なお、これらは固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明の試薬キットは上記遺伝子マーカー（プローブまたはプライマー）の他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、後述する本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【００５４】
（III）不死化がん細胞の判定方法
(III-1) 上記本発明の遺伝子マーカー（プローブ又はプライマー）を使用することにより、被験者から採取したがん細胞について不死化規定遺伝子（マーカー遺伝子）の発現量を測定することができ、さらに、その発現量に基づき当該がん細胞が「不死化がん細胞」であるか、それとも「不死化していないがん細胞」であるかを判定することができる。従来の病理診断では不死化がん細胞の判定ができなかったが、本発明に係る不死化がん細胞の判定方法によれば、進行する前の早期の不死化がん細胞でも判定でき、それにより患者にあったがん治療を早期に促すことができる。
【００５５】
この場合、上記本発明のプライマーは、上記不死化規定遺伝子の発現によって生じたRNAまたはそれから調製されるポリヌクレオチド（例えば、cDNA）を特異的に認識して増幅するためのプライマーとして、また本発明のプローブは、当該RNAまたはそれから派生するポリヌクレオチド（例えばcDNA、またはRNAやcDNAから増幅されたDNA）を特異的に検出するためのプローブとして利用される。
【００５６】
すなわち、本発明の遺伝子マーカー（プライマー又はプローブ）は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法に従って、不死化規定遺伝子を特異的に検出するためのプライマーおよびプローブとして利用することができる。また、がん細胞における不死化規定遺伝子の発現量は、DNAチップを使用して検出或いは定量することもできる。この場合、本発明のプローブは、当該DNAチップのプローブとして使用することができる。
【００５７】
例えば、ノーザンブロット法による不死化規定遺伝子の発現量の測定は、本発明のプローブ、好ましくは放射性同位元素、蛍光物質または化学発光物質などの標識物で標識されたプローブを使用することにより行うことができる。具体的には、被験者のがん細胞から調製されたRNAをナイロンメンブレン等にトランスファーしておき、これに標識されたプローブをハイブリダイズさせる。続いて、形成されたプローブとRNAの二本鎖の量を、該プローブの標識物に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、プローブの標識物に応じて常法により、例えば、放射線検出器や蛍光検出器などで測定して行うことができる。なお、市販ノーザンブロット法用試薬キットを利用して、当該試薬キットのプロトコールにしたがって実施することも可能である。
【００５８】
また、RT-PCR法による不死化規定遺伝子発現量の測定は、本発明のプライマー、好ましくは放射性同位元素、蛍光物質または化学発光物質などの標識物で標識されたプライマーを使用することにより行うことができる。具体的には、被験者のがん細胞から調製されたRNAから調製したcDNAを鋳型として、これに標識された一対のプライマーをハイブリダイズさせて、常法に従いPCRを行う。続いて、得られた増幅二本鎖DNAの量を、当該プライマーの標識に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、常法により、例えば、放射線検出器や蛍光検出器などで測定して行うことができる。なお、市販RT-PCR用試薬キットを利用して、当該試薬キットのプロトコールにしたがって実施することも可能である。
【００５９】
DNAチップ解析による不死化規定遺伝子発現量の測定は、本発明のプローブ、好ましくは放射性同位元素や蛍光物質などの標識物で標識されたプローブを使用することにより行うことができる。具体的には、まず、放射性同位元素、蛍光物質または化学発光物質などで標識したプローブを適当な担体に固定させてなるDNAチップを用意する。次に、当該DNAチップと被験者のがん細胞から調製されたRNAをもとに調製された標識DNAあるいはRNAをハイブリダイズさせる。続いて、形成されたプローブと標識DNAあるいはRNAの二本鎖の量を、該プローブの標識物に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、常法により、例えば、放射線検出器や蛍光検出器などで測定して行うことができる。なお、本発明のプローブに相当するDNAが固定されているものであれば、市販DNAチップを利用してもよい。
【００６０】
これらの不死化規定遺伝子発現量の測定は、基本的には下記工程（１）および（２）を有する。
（１）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたRNA又は当該RNAの派生物と本発明に係るプローブまたはプライマーとを結合させる工程、
（２）プローブまたはプライマーに結合したRNA又は当該RNAの派生物の量を、当該プローブまたはプライマーを指標として測定する工程。
【００６１】
なお、上記工程（１）において、生体試料は被験者自身のものであり、がん細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類やがん種に応じた方法により適宜選択することができる。生体試料からのRNAの調製は、常法により行うことができる。
【００６２】
なお、本明細書全体を通じて、また特許請求の範囲において「RNAの派生物」とは、生体試料から調製されるRNAを原料として調製されるものを意味し、RNAから転写調製された相補的ポリヌクレオチド（cDNA）、および当該RNAまたはcDNAからPCRによって増幅されたDNAが含まれる。cDNAは常法により調製することができ、また上記DNAは、上記各不死化規定遺伝子に対する本発明のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。なお、工程（１）で用いる本発明のプローブまたはプライマーは、放射性同位元素、蛍光物質または化学発光物質などの標識物で標識されていることが好ましい。
【００６３】
上記工程（２）で得られるRNA又は当該RNAの派生物の量は被験者における不死化規定遺伝子の発現量を反映する。従って、上記工程（２）で得られたRNA又は当該RNAの派生物の量（以下、これらを総称して単に「RNA量」ともいう）を、不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又は当該RNAの派生物の量（以下、これらを総称して単に「対照RNA量」ともいう）と比較することにより、被験者のがん細胞が不死化しているか否かを判定することができる。すなわち、上記工程（２）で得られた被験者におけるRNA量（不死化規定遺伝子の発現量）が対照RNA量（対照の不死化規定遺伝子の発現量）よりも高い場合、被験者のがん細胞は不死化していると判定し、高くない場合は被験者のがん細胞は不死化していないと判定することができる。
【００６４】
ゆえに本発明の不死化がん細胞の判定方法は、上記の工程（１）および（２）に加えて、下記の工程（３）、さらに好ましくは工程（４）を有する。
【００６５】
（３）上記工程（２）で得られたRNA又は当該RNAの派生物の量（RNA量）を、不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するRNA又は当該RNAの派生物の量（対照RNA量）と比較する工程、
（４）工程（２）のRNA量が対照RNA量より高い場合に、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、RNA量が対照RNA量より高くない場合に、被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【００６６】
なお、不死化していない正常もしくはがん細胞における不死化規定遺伝子のRNA量（対照RNA量）は、複数の不死化していない正常細胞もしくはがん細胞における不死化規定遺伝子のRNA量を均一な条件であらかじめ測定しておき、そのRNA量の平均値又は中間値を採用することができる。
【００６７】
(III-2) また、がん細胞の不死化の判定は、本発明の不死化規定遺伝子の発現産物、すなわち当該遺伝子によりコードされるポリペプチド（以下、「不死化規定ポリペプチド」という）の産生量に基づいて行うことができる。当該不死化規定ポリペプチドの産生量は、当該ポリペプチドを認識する抗体を用いることにより測定することができる。
【００６８】
ここで本発明が対象とする不死化規定ポリペプチドとしては、前述する各種の不死化規定遺伝子〔(1)〜(13)〕に対応して下記のものを挙げることができる。
【００６９】
（14) UBE2Sポリペプチド：配列番号1に示される塩基配列からなるUBE2S遺伝子(1)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（15）RFC4ポリペプチド：配列番号2に示される塩基配列からなるRFC4遺伝子(2)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（16）PTGES2ポリペプチド：配列番号3に示される塩基配列からなるPTGES2遺伝子(3)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（17）MAF1ポリペプチド：配列番号4に示される塩基配列からなるMAF1遺伝子(4)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号17に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（18）ACVR2Bポリペプチド：配列番号5に示される塩基配列からなるACVR2B 遺伝子(5)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号18に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（19）FAM119Aポリペプチド：配列番号6に示される塩基配列からなるFAM119A遺伝子(6)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（20）LTB4DHポリペプチド：配列番号7に示される塩基配列からなるLTB4DH 遺伝子(7)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（21）DPM2ポリペプチド：配列番号8に示される塩基配列からなるDPM2遺伝子(8)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号21に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（22）SEPX1ポリペプチド：配列番号9に示される塩基配列からなるSEPX1遺伝子(9)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号22に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（23）PSMA3ポリペプチド：配列番号10に示される塩基配列からなるPSMA3遺伝子(10)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（24）CHCHD3ポリペプチド：配列番号11に示される塩基配列からなるCHCHD3遺伝子(11)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号24に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（25）LSM3ポリペプチド：配列番号12に示される塩基配列からなるLSM3遺伝子(12)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号25に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（26）GTSE1ポリペプチド：配列番号13に示される塩基配列からなるGTSE1遺伝子(13)によりコードされるポリペプチド、具体的には配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００７０】
ここで（14）UBE2Sポリペプチドは、公知のポリペプチドであり、その取得方法もJ. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)に記載されるように公知である。同様に、（15）RFC4ポリペプチドもProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12), 5211-5215 (1992)に記載されるように公知であり、以下、（16）PTGES2ポリペプチドはBiochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)；（18）ACVR2BポリペプチドはMol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)；（20）LTB4DHポリペプチドはJ. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)；（21）DPM2ポリペプチドはEMBO J. 19 (11), 2475-2482 (2000)；（22）SEPX1ポリペプチドはJ. Biol. Chem. 274 (48), 33888-33897 (1999)；（23）PSMA3ポリペプチドはBiochem. Biophys. Res. Commun. 207 (1), 318-323 (1995)；（25）LSM3ポリペプチドはEMBO J. 18 (12), 3451-3462 (1999)；（26）GTSE1ポリペプチドはGene 254 (1-2), 229-236 (2000)、にそれぞれ記載されており、いずれも公知のポリペプチドである。
【００７１】
また、これらの不死化規定ポリペプチド〔(14)〜(26)〕は、対応する不死化規定遺伝子〔(1)〜(13)〕をクローニングし、ベクタープラスミドにライゲーションした後、大腸菌等の宿主細胞へ形質転換し、得られる形質転換細胞を培養し、培養物中から回収することによっても調製することができる。
【００７２】
本発明で用いられる抗体は、上記各不死化規定ポリペプチドを認識するものであれば制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また抗体は、上記不死化規定ポリペプチドを免疫抗原として調製される抗体であっても、また当該不死化規定ポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体であってもよい。かかるポリペプチドは、本発明に係る不死化規定ポリペプチドのアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列に基づき、通常、公知の方法で合成することができる。例えば、アミノ酸合成機による化学的合成手法や、遺伝子工学的手法を挙げることができる。
【００７３】
本発明に係る抗体は、常法に従って製造することができる（例えば、Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987), Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13）。例えば、ポリクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌で発現し精製した上記ポリペプチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、例えばモノクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記ポリヌクレオチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該実験動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、該細胞中から得ることができる。
【００７４】
なお、これらの抗体もまた、前述するがん細胞の不死化を判定するための試薬および試薬キットの一成分に含まれる。
【００７５】
不死化がん細胞の判定は、具体的には、下記工程（１’）〜（２’）により行うことができる。
（１’）被験者から採取されたがん細胞を含み得る生体試料から調製されたポリペプチドを含むタンパク質含有画分と、本発明の不死化規定ポリペプチドを認識する抗体とを混合する工程
（２’）上記抗体に結合したポリペプチドの量を、該抗体を指標として測定する工程
なお、上記工程（２’）で得られるポリペプチドの量は、不死化規定ポリペプチドの産生量を反映するものである。
【００７６】
工程（２’）において、生体試料は、被験者自身のものであり、がん細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類やがん種に応じた方法により適宜選択することができる。生体試料からのタンパク質含有画分（ポリペプチドを含む）の調製は、公知の分画、精製方法を適宜組み合わせて行うことができる。当該タンパク質含有画分に対して、例えばウェスタンブロット法、酵素免疫法（ＥＩＡ）、ラジオアイソトープ免疫法（ＲＩＡ）、蛍光免疫法などの免疫学的検出法において、上記抗体をプローブとして使用することによって、不死化規定ポリペプチドを検出することができる。
【００７７】
工程（１’）および（２’）を、ウェスタンブロット法を用いてポリペプチド量（不死化規定ポリペプチドの産生量）を測定する場合を例にして詳細に説明すると、まず、当該不死化規定ポリペプチドに対する抗体を一次抗体として、被験者の生体試料から調製されたタンパク質含有画分と混合し、当該タンパク質含有画分に含まれる不死化規定ポリペプチドに結合させる。次に、放射性同位元素、蛍光物質または化学発光物質などの標識物で標識した二次抗体を一次抗体に結合させる。続いて、不死化規定ポリペプチドの量を、二次抗体の標識に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、常法により、例えば、放射線検出器や蛍光検出器などで測定して行うことができる。
【００７８】
上記工程（２’）で得られた被験者におけるポリペプチド量（不死化規定ポリペプチドの産生量）を、不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチド量（対照ポリペプチド量）（すなわち、対照の不死化規定ポリペプチドの産生量（対照産生量））と比較し、その程度を識別することにより、被験者のがん細胞が不死化しているか否かを判定することができる。すなわち、上記工程（２’）で得られた被験者におけるポリペプチド量（不死化規定ポリペプチドの産生量）が対照ポリペプチド量（対照産生量）より高い場合、被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合、被験者のがん細胞が不死化していないと判定することができる。
【００７９】
ゆえに本発明の不死化がん細胞の判定方法は、上記の工程（１’）および（２’）に加えて、下記の工程（３）、さらに好ましくは工程（４）を有する。
（３’）上記工程（２’）で得られたポリペプチドの量と不死化していない正常もしくはがん細胞における対応するポリペプチドの量（対照ポリペプチド量）とを比較する工程、
（４’）上記工程（２’）のポリペプチド量が対照ポリペプチド量に比して高い場合に被験者のがん細胞が不死化していると判定し、高くない場合に被験者のがん細胞が不死化していないと判定する工程。
【００８０】
ここで不死化していない正常もしくはがん細胞における不死化規定ポリペプチドの産生量として、複数の不死化していない正常細胞もしくはがん細胞における不死化規定ポリペプチドの産生量を均一な条件であらかじめ測定しておき、その産生量の平均値又は中間値を採用することができる。
【００８１】
（ＩＶ）不死化がん細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法
（IV-1）実施例に示すように、本発明にかかる不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）は、不死化がん細胞に特異的に高発現しており、また、当該各不死化規定遺伝子のsiRNAを用いてその発現を抑制することにより、不死化がん細胞の増殖を抑制することができる。このことは、不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）の発現を抑制する作用を有する物質が、不死化がん細胞増殖抑制剤（抗がん剤）となり得ることを示している。すなわち、前述する不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）の発現抑制を指標とすることにより、不死化がん細胞の増殖を抑制する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００８２】
従って、本発明は前述する不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）の発現抑制を指標とした不死化がん細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８３】
当該方法は、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を有することができる。
（Ａ）被験物質と、(1)〜(13)のいずれかの不死化規定遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（Ｂ）被験物質を接触させた細胞における、当該不死化規定遺伝子の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記工程（Ｂ）で得られた不死化規定遺伝子の発現量と、被験物質を接触させない細胞における当該不死化規定遺伝子の発現量（対照発現量）とを比較する工程、および
（Ｄ）上記工程（Ｂ）で得られた遺伝子の発現量が対照発現量より低い場合に該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【００８４】
本発明において使用する細胞は、前述する(1)〜(13)のいずれか少なくとも一つの不死化規定遺伝子が発現可能であれば、どの組織由来の細胞でもよく、その由来として、例えば、肺、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢・胆管、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮、骨髄、リンパ節、血液等が挙げられる。細胞の由来は、哺乳類または鳥類のいずれかであればよく、哺乳類がより好ましく、ヒトがさらに好ましい。また、不死化規定遺伝子の発現は、内在性でも外来性でもよい。
【００８５】
被験物質としては、制限されないが、核酸（ポリヌクレオチドを含む）、ペプチド（ポリペプチドを含む）、有機化合物、無機化合物などのいずれでもよい。スクリーニングは、具体的にはかかる被験物質または当該被験物質を含む試料（被験試料）を、上記不死化規定遺伝子を発現しえる細胞と接触させることにより行うことができる。かかる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、植物や動物の天然物の抽出物などが含まれる。
【００８６】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞を接触させる条件は、細胞が死なず、当該細胞において不死化規定遺伝子が発現できる条件であれば特に制限されない。
【００８７】
上記工程（Ｂ）及び（Ｃ）において不死化規定遺伝子の発現量は、不死化規定遺伝子のmRNAまたはそれから派生するcDNAや２本鎖DNAの量を、前述する本発明のプローブまたはプライマーを用いてノーザンブロット法またはRT-PCR法などの方法により測定することができる。また、上記工程（Ｂ）及び（Ｃ）における不死化規定遺伝子の発現量として、不死化規定遺伝子の発現産物としての不死化規定ポリペプチドの量を採用しても良い。不死化規定ポリペプチドの量は、前述する不死化規定ポリペプチドに対する抗体を用いて、ウェスタンブロット法、酵素免疫法（ＥＩＡ）、ラジオアイソトープ免疫法（ＲＩＡ）、蛍光免疫法などの免疫学的検出法を行うことにより測定することもできる。
【００８８】
工程（Ｃ）において、上記工程（Ｂ）で得られた不死化規定遺伝子の発現量を、被験物質を細胞に接触させない場合の不死化規定遺伝子の発現量（対照発現量）と比較することにより、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質を選択することができる。すなわち、上記工程（Ｂ）で得られた不死化規定遺伝子の発現量が対照発現量に比して低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択することができる。
【００８９】
（IV-2）不死化がん細胞の増殖抑制剤のスクリーニングは、本発明に係る不死化規定遺伝子（(1)〜(13)）の発現産物である不死化規定ポリペプチド（(14)〜(26)）の活性阻害を指標とすることにより行うこともできる。例えば、（14）UBE2Sポリペプチドは、ユビキチン化活性（E2）を有することが知られている（J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)）。同様に、（16）PTGES2ポリペプチドは、プロスタグランジンＨ２をプロスタグランジンＥ２に変換する活性を有すること（Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)）；（18）ACVR2Bポリペプチドは膜貫通受容体であり、その細胞内ドメインにSer/Thr kinase活性を有すること（Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)）；（20）LTB4DHポリペプチドはロイコトリエンＢ４を12-oxo-leukotriene B4に変換する活性を有すること（J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)）；（22）SEPX1ポリペプチドはメチオニンスルホキシド還元活性を有すること（Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)）が、おのおの知られている。従って、不死化がん細胞の増殖抑制剤のスクリーニングは、特にこれらの不死化規定ポリペプチドの活性阻害を指標とすることにより行うことができる。
【００９０】
具体的には、下記工程（Ａ’）〜（Ｄ’）により、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
（Ａ’）被験物質と、(14)〜(26)のいずれかの不死化規定ポリペプチドとを接触させる工程、
（Ｂ’）被験物質を接触させた不死化規定ポリペプチドの活性を測定する工程、
（Ｃ’）上記工程（Ｂ’）で得られた不死化規定ポリペプチドの活性と被験物質を接触させない水溶液、細胞または細胞画分における不死化規定ポリペプチドの活性（対照活性）とを比較する工程、
（Ｄ’）上記工程（Ｂ’）で得られた不死化規定ポリペプチドの活性が対照活性よりも低い場合に、当該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択する工程。
【００９１】
かかるスクリーニングは、不死化規定ポリペプチドの活性を指標とするものであり、(14)〜(26)〔好ましくは(14)、(16)、(18)、(20)または(22)〕のいずれかの不死化規定ポリペプチドを含むか、含み得るものを対象として行うことができ、具体的には不死化規定ポリペプチドの機能（活性）に応じて、(14)〜(26) 〔好ましくは(14)、(16)、(18)、(20)または(22)〕のいずれかの不死化規定ポリペプチドを含む水溶液、(1)〜(13) 〔好ましくは(1)、(3)、(5)、(7)または(9)〕のいずれかの不死化規定遺伝子を発現可能な細胞または当該細胞から調製した細胞画分のいずれかの形態のものを例示することができる。ここで水溶液とは、不死化規定ポリペプチドを含むものであればよく、制限されないが、例えば、通常の水溶液の他、細胞溶解液、核抽出液、あるいは培養上清なども含まれる。また、細胞としては、内在性および外来性などの由来に関わらず、不死化規定遺伝子を発現しえる状態にある細胞を挙げることができる。また細胞画分とは、かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであり、例えば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などを挙げることができる。
【００９２】
なお、スクリーニングに使用する細胞、および対象とする被験物質は、前記のスクリーニング方法と同様のものを使用することができる。
【００９３】
工程（Ｂ’）におけるUBE2Sポリペプチド(14)のユビキチン化活性の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)に記載されている通り、ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（E1）及びUBE2Sポリペプチドを含む系において、UBE2Sポリペプチドのユビキチン化反応を行い、UBE2Sポリペプチドに結合したユビキチンの量を測定することにより行うことができる。ここでユビキチンの量の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質、酵素などで標識したユビキチンを用いて上記反応を行い、その標識物の量を測定することで行うことができる（J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)、J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)）。また、抗ユビキチン抗体で検出することにより測定することもできる（J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)）。ユビキチン及びユビキチン活性化酵素（E1）は、公知のタンパク質合成法により取得しても良く、また、市販品を用いても良い。
【００９４】
工程（Ｂ’）におけるPTGES2ポリペプチド(16)のプロスタグランジンＥ２合成活性の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)に記載されているとおり、PTGES2ポリペプチド及びプロスタグランジンＨ２を含む系において、PTGES2ポリペプチドによるプロスタグランジンＥ２変換反応を行い、産生されるプロスタグランジンＥ２の量を測定することにより行うことができる。ここでプロスタグランジンＥ２の量の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質、酵素などで標識したプロスタグランジンＨ２を用いて上記反応を行い、産生されたプロスタグランジンＥ２の標識物の量を測定することにより行うことができる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (13), 7220-7225 (1999)）。また、抗プロスタグランジンＥ２抗体で検出することにより測定することもできる（J. Dairy. Sci. 87 (7), 2197-2210 (2004)）。プロスタグランジンＨ２は、公知の合成法により取得しても良く、また、市販品を用いても良い。
【００９５】
工程（Ｂ’）におけるACVR2Bポリペプチド(18)のSer/Thr kinase活性の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996) に記載されているとおり、ACVR2Bポリペプチドを含む系において、基質とATP存在下にkinase反応を行い、基質のリン酸化量を測定することにより行うことができる。ここで基質のリン酸化量の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、γ32P-ATPあるいはγ33P-ATPをトレーサーとして用いることで放射活性を測定することによりリン酸化量を測定できる（Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)）。また、蛍光物質やビオチンなどで標識した基質を用いてリン酸化反応を行い、リン酸化標識物の量を測定することにより行うことができる。基質としては、ACVR2Bポリペプチド、特異的基質あるいはペプチドをあげることができる。
【００９６】
工程（Ｂ’）におけるLTB4DHポリペプチド(20)のロイコトリエンＢ４変換活性の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)に記載されているとおり、LTB4DHポリペプチド及びロイコトリエンＢ４を含む系において、LTB4DHポリペプチドによるロイコトリエンＢ４変換反応を行い、産生される12-oxo-leukotriene B4の量を測定することにより行うことができる。ここで12-oxo-leukotriene B4の量は、HPLCなど公知の方法により測定することができる。ロイコトリエンＢ４は、公知の化学合成法により取得しても良く、また、市販品を用いても良い。
【００９７】
工程（Ｂ’）におけるSEPX1ポリペプチド(22)のメチオニンスルホキシド還元活性の測定は公知の方法により行うことができ、例えば、Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)に記載されている通り、SEPX1ポリペプチド及びメチオニンスルホキシドを含む系において、SEPX1ポリペプチドによるメチオニンスルホキシド還元反応を行い、産生されるメチオニンの量を測定することにより行うことができる。ここでメチオニンの量は、HPLCなど公知の方法により測定できる。メチオニンスルホキシドは、公知の化学合成法により取得しても良く、また、市販品を用いても良い。
【００９８】
工程（Ｃ’）および（Ｄ’）において、上記工程（Ｂ’）で得られた不死化規定ポリペプチドの活性を対照活性と比較することにより、不死化がん細胞の増殖を抑制する物質を選択することができる。すなわち、上記工程（Ｂ’）で得られた不死化規定ポリペプチドの活性が対照活性よりも低い場合に、該被験物質を不死化がん細胞の増殖を抑制する物質として選択することができる。
【００９９】
実施例で説明するように、表２及び３に示したアンチセンスポリヌクレオチド（siRNA）（配列番号27〜76）は、がん細胞内で本発明に係る不死化規定遺伝子とハイブリダイズすることにより、該不死化規定遺伝子の発現を抑制し、その結果不死化がん細胞の増殖を抑制する。したがって、これらのアンチセンスポリヌクレオチド（siRNA）は、不死化がん細胞増殖抑制剤として用いることができる。よって本発明は、かかるアンチチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする不死化がん細胞増殖抑制剤を提供する。
【０１００】
かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、(1)〜(13)の不死化規定遺伝子のいずれかの塩基配列の少なくとも15塩基以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする15塩基長以上のポリヌクレオチドからなる。当該ポリヌクレオチドは、上記(1)〜(13)の不死化規定遺伝子の少なくとも15塩基以上の連続した塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、上記の特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、当該不死化規定遺伝子とハイブリダイズすることにより、当該不死化規定遺伝子の発現を抑制することができれば、完全に相補的である必要はない。例えば、該不死化規定遺伝子の相補配列と比較して、塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有し、且つ該不死化規定遺伝子のRNAとハイブリダイズすることにより、該不死化規定遺伝子の発現を抑制することができるポリヌクレオチドであってもよい。なお、本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドの塩基長は、15〜1000塩基長が好ましく、15〜500塩基長がさらに好ましく、16〜30塩基長が特に好ましい。
【０１０１】
本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号27〜76のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが好ましく、これらの二本鎖RNAがより好ましい。
【０１０２】
また、本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドは、安定性及び細胞透過性を高めるため、公知の修飾がなされていてもよい。例えば、各ヌクレオチドのリン酸残基は、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。
【０１０３】
本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドの形態は、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA及びDNA:RNAハイブリッドのいずれであってもよい。
【０１０４】
本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドは、通常、公知の方法により合成でき、例えば、合成機を用いて化学的に合成することができる。
【０１０５】
本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ex vivo法やin vivo法等により患者のがん細胞に導入することができ、斯くして抗がん療法に好適に用いることができる。よって、本発明には、当該アンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする不死化がん細胞増殖抑制剤をがん患者に投与する工程を含む、抗がん療法が含まれる。
【０１０６】
本発明に係る不死化がん細胞増殖抑制剤は、上記アンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とするものであり、その細胞増殖抑制作用を害さない範囲で安定化剤、懸濁剤、凍結剤、緩衝液、溶媒などを含有することができる。また、本発明に係る不死化がん細胞増殖抑制剤のがん患者に対する投与量及び投与スケジュールは、対象疾患、患者の年齢・体重などから当業者により適宜設定できる。そのような投与スケジュールとして、例えば、1サイクルを3週間として、そのうち2〜3週間連続で2〜10 mg/kg/dayの上記アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内投与する投与スケジュール、1サイクルを1週間として、そのうち5日間連続で80〜120 mg/m2/dayの上記アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内投与する投与スケジュール、及び1サイクルを4週間として、そのうち3週間連続で80〜120 mg/m2/dayの上記アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内投与する投与スケジュールが挙げられる。
【実施例】
【０１０７】
以下に、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１０８】
実施例１ 不死化規定遺伝子の同定
１．ヒト組織サンプルおよびヒトがん細胞株、ヒト非腫瘍性培養細胞からのtotal RNAの調製
９種の肺癌細胞株、２１種の食道癌細胞株、９種の消化器癌、他さまざまながん（胃癌、大腸癌、頭頚部癌、白血病）細胞株および２種の非腫瘍性食道上皮細胞、２種の正常気道上皮からRNeasyTM Mini kit（Qiagen社製）を用いて添付プロトコールに従いtotal RNAを抽出し、-80℃で保存した。
【０１０９】
さらに、11種の乳癌細胞株、10種の卵巣癌細胞株、10種の膵臓癌細胞株、１種の非腫瘍性不死化乳腺上皮、１種の非腫瘍性乳腺上皮、同一膵臓癌患者由来の膵臓癌組織と非癌部膵臓組織10組、同一非小細胞性肺癌患者由来の原発巣と３ヶ所の転移肺癌組織からも同様にtotal RNAを抽出し保存した。total RNAは2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製） およびRNA LabChip（Agilent Technologies社製）を用いて、18Sおよび28S rRNAのピークが鮮明で高品質であることを確認してからマイクロアレイ解析に供した。
【０１１０】
２．マイクロアレイ解析
上記で調製したtotal RNAを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイはCodeLink UniSet Human 20K I Bioarray （19881プローブ）を用い、（１） total RNAからcDNAの合成、（２） cDNAからラベル化cRNAの合成、（３）ラベル化cRNAの断片化、（４）断片化cRNAとマイクロアレイとのハイブリダイズ、（５）マイクロアレイの染色、（６）マイクロアレイのスキャン、（７）遺伝子発現解析の手順で行った。
【０１１１】
（１）total RNAからcDNAの合成
CodeLink Expression Assay Reagent Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、そのプロトコールに従いfirst-strand cDNA合成を行った。すなわち、１で得られた各total RNA 1μgを10μl にNuclease-free Waterで調製し、該キットに含まれる1μl Bacterial Control mRNA 希釈溶液、1μl T7 Oligo（dT）Primerを混合し、計12μl を70℃で10 分間加温した後、氷上で3 分間急冷した。氷上で該キットに含まれる2μl の10 × First-strand Buffer、4μl の5 mM dNTP Mix、1μl のRNase Inhibitor、1μl のReverse Transcriptase（200 U/μl）を加え、計20μl を42℃で2 時間加温した。
【０１１２】
引き続きプロトコールに従いRNA-DNA ハイブリッド中のRNA を分解し、RNA 鎖をDNA 鎖に置換してSecond-strand cDNA （二本鎖cDNA） を合成した。すなわち、 上記20μl First-strand cDNA 反応液に、63μl Nuclease-free Water、該キットに含まれる10×Second-strand Buffer（10μl）、5 mM dNTP Mix（4μl）、DNA Polymerase Mix（2μl：10 U/μl）、1μl RNase Hを加え、計100μl をよく混合し、16℃で2 時間加温した。
【０１１３】
反応終了後、QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN 社製）を用いて添付プロトコールに従い、合成した二本鎖cDNA を精製した。すなわち、cDNA 溶液100μlに該キットに含まれる500μlのBuffer PB を添加混合し、2 ml の遠心チューブにセットしたQIAquick スピンカラムに添加し、13,000 rpmで50 秒間遠心した。溶出液を除去して再びQIAquick スピンカラムをセットし、該キットに含まれる700μl のBuffer PE を添加し、13,000 rpmで1 分間遠心した。溶出液を除去して再びQIAquick スピンカラムをセットし、再度13,000 rpmで1 分間遠心して完全にBuffer PE を除去した。QIAquick スピンカラムを新しい1.5 ml チューブにセットし、30μl のNuclease-free WaterをQIAquick スピンカラムのメンブレン上に直接添加し、1分間静置後13,000 rpmで1分間遠心し、この操作を再度繰り返した（計60μlで溶出）。真空乾燥機で、cDNA 溶液を9.5μl 以下まで濃縮し、Nuclease-free Waterで9.5μl にメスアップした。
【０１１４】
（２）cDNAからラベル化cRNAの合成
引き続きCodeLink Expression Assay Reagent Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のプロトコールに従いビオチン標識ヌクレオチド存在下でin vitro transcription (IVT) 反応を行い、cRNA を合成した。すなわち、該キットに含まれる4.0μl の10 × T7 Reaction Buffer、4.0μl のT7 ATP Solution、4.0μl のT7 GTP Solution、4.0μl のT7 CTP Solution、3.0μl のT7 UTP Solutionを混合し、7.5μl の10 mM Biotin-11-UTP (Perkin Elmer社製)も加え、計26.5μl を（１）で調製した9.5μl cDNA 溶液に添加した。さらに該キットに含まれる4.0μl の10 × T7 Enzyme Mixを加え、計40.0μlをよく混合し、気相で37℃14 時間加温した。反応終了後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN 社製）を用いて添付プロトコールに従い、合成したcRNAを精製した。すなわち、IVT 反応液（40μl）に60μl のNuclease-free Waterを添加し、合計100μl の溶液に該キットに含まれる350μl のBuffer RLT を添加してよく混合し、さらに250μl の100% エタノールを添加してよく混合し、全量（700 μl）を該キットに含まれるRNeasy ミニスピンカラムに添加して、12,000 rpmで15 秒間遠心した。RNeasy ミニスピンカラムを新しい2 ml チューブにセットし、該キットに含まれる500μl のBuffer RPE をカラムに添加して12,000 rpmで15 秒間遠心し、この操作を再度繰り返した。溶出液を除去した後、再度RNeasy ミニスピンカラムを元の2 ml チューブにセットし、12,000 rpmで2 分間遠心してカラム内のメンブレンを乾燥させた後、RNeasy ミニスピンカラムを新しい1.5 ml チューブに移し、50μl のNuclease-free Waterをメンブレン上に直接添加した。室温で10 分間静置した後、12,000 rpmで1分間遠心し、この操作を再度繰り返した（計100μlで溶出）。
【０１１５】
サンプルをよく混合し、2μl はAgilent 2100 Bioanalyzer によるcRNA品質チェック用に、2μl は滅菌蒸留水で50倍希釈してcRNA定量用に分注し、残りは−80℃で保存した。定量は50倍希釈溶液の260 nm および280 nm 吸光度を測定し、cRNA濃度を定量するとともに、260 nm/280 nm の吸光度比が1.8以上であることを確認した。cRNA濃度が0.5μg/μl 以下の場合は真空乾燥機で濃縮した。cRNAの品質チェックはAgilent 2100 Bioanalyzer およびRNA LabChipを用いて添付プロトコールに従って泳動し、スメアピークの長さが500塩基以上であることを確認した。
【０１１６】
（３）ラベル化cRNAの断片化
引き続きCodeLink Expression Assay Reagent Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のプロトコールに従い、cRNA を約100〜200塩基に断片化した。すなわち、10μg のcRNA が20μl になるよう、Nuclease-free Waterでメスアップし、該キットに含まれる 5μlの 5 × Fragmentation Buffer を添加し、94℃で20分間加熱後、氷上で急冷した。断片化された10μg のcRNA を含む25μl の溶液に、該キットに含まれる78μl Hybridization Buffer A、130μl Hybridization Buffer B、27μl Nuclease-free Waterを加え、計260μlのハイブリダイゼーション溶液を調製した。最高速度で5 秒間ボルテックスしてスピンダウン後、90℃で5分間加熱してcRNA の熱変性を行い、氷上で冷却した。
【０１１７】
（４）断片化cRNAとマイクロアレイとのハイブリダイズ
CodeLink Shaker Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）、CodeLink INNOVA シェイカーを用いてプロトコールに従いハイブリダイズを行った。すなわち、CodeLink UniSet Human 20K I Bioarrayを該キットに含まれる12 Slide Shaker Tray にセットした。（３）で調製したハイブリダイゼーション溶液を最高速度で5秒間ボルテックス後スピンダウンし、ハイブリダイゼーション溶液250μlをアレイのシール型チャンバーの右下の穴から注入し、アレイ付属のSealing strip（シール）で穴を密封した。アレイを載せたShaker Tray をCodeLink INNOVA シェイカーの中に設置し、37℃、300 rpmで旋回させながら18時間加温した。
【０１１８】
（５）マイクロアレイの染色
CodeLink Parallel Processing Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてプロトコールに従い、アレイの染色および洗浄を行った。すなわち、上記で得られたハイブリダイズ済みアレイのシールチャンバーを剥がし、室温で13 ml の0.75 × TNT Buffer （0.1 M Tris-HCl（pH 7.6）、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20）を満たし、該キットに含まれるBioarray Rack をセットしたMedium Reagent リザーバーの各スロットに挿入した。数回Rackを上下に動かして余分のハイブリダイゼーション溶液をアレイから落とし、46℃に加温した240 ml 0.75 × TNT Bufferを満たしたLarge Reagent リザーバーにアレイを保持しているBioarray Rack を移し、46℃で1 時間加温した。
【０１１９】
染色液として、アレイ１枚につき、1 mg/mlにNuclease-free Waterで溶解したStreptavidin-Cy5液6.8μlを室温の3393.2μl のTNB Buffer（0.1 M Tris-HCl（pH 7.6）、0.15 M NaCl、0.5 % TSA Blocking Reagent ( Perkin Elmer社製)で500倍に希釈し、計3.4 ml を該キットに含まれるSmall Reagent リザーバーのスロットに満たした。このSmall Reagent リザーバーに、アレイを保持しているBioarray Rack を移し、アルミ等で遮光して室温（23℃±2℃）で30 分間染色した。
【０１２０】
染色後、Bioarray Rack を240 mlのTNT Buffer（室温）を満たしたLarge Reagentリザーバーに移し、数回上下させた後室温で5 分間放置し、あらたなTNT Buffer（室温）を満たしたLarge Reagentリザーバーに移し数回上下させた後室温で5 分間放置し、これを計４回繰り返して洗浄した。最後に240 ml の0.05％ Tween 20 溶液で５秒間上下に動かしながら洗浄し、これを再度繰り返した。Bioarray Rack を乾燥したMedium Reagent リザーバーにセットし、600 × g、室温で3分間遠心して乾燥させた。
【０１２１】
（６）マイクロアレイのスキャン
染色した各アレイをAgilent G2565 (Agilent社製)スキャナに供し、染色パターンを読み取りTIFF imageとして保存した。TIFF imageをCodeLink Expression Analysis ソフトウエアで処理し、アレイ上の各遺伝子スポットのシグナル強度を数値化した。
【０１２２】
（７）遺伝子発現解析 
上記で得られたシグナル強度データをGeneSpring GX (Agilent社製)マイクロアレイ遺伝子発現解析ソフトを用いてNormalizationを行い解析した。すなわち、スポットシグナルから背景シグナルを差し引き、その値が0.01未満は0.01とし、アレイの全スポットシグナルの中央値で割った値をそれぞれの遺伝子の標準化した相対的発現量とした。この相対的発現量が正常細胞（図１、左上）に比べ共通して不死化がん細胞株（図１、右下）で増加している遺伝子を以下のようにして選択した。臓器を越えて普遍的に発現増強している遺伝子は、正常体細胞（図１、左上）のがん化（図１中、下向き青矢印）に関わる遺伝子よりも、がん細胞の不死化（図１中、右向き赤矢印）に関わる遺伝子であることが予想される。
【０１２３】
９種の肺癌細胞株のうち８種以上で２種の正常気道上皮の中央値よりも２倍以上高発現し、21種の食道癌細胞株のうち19種以上で２種の非腫瘍性食道上皮の中央値よりも２倍以上高発現し、かつ９種の消化器癌、他さまざまながん（胃癌、大腸癌、頭頚部癌、白血病）細胞株のうち８種以上で、上記４種の非腫瘍性上皮（２種の気道上皮と２種の食道上皮）の中央値よりも２倍以上高発現している遺伝子として、51遺伝子を抽出した（図２、左上）。一方、これら３群の臓器別がん細胞株の発現レベルの平均値がそれぞれ対照とした正常上皮の平均値の２倍以上で（但し、この平均値による選択に用いた食道癌細胞株は最初に解析を行った７種）、かつ不死化肺癌細胞で構成される転移肺癌組織における発現レベルが同一症例の非不死化肺癌細胞で構成される原発組織および転移組織の平均値の２倍以上である遺伝子を、80遺伝子抽出した（図２、右上）。これら２群で抽出された遺伝子のうち、７遺伝子が両群に共通して抽出された。
【０１２４】
がん細胞株がすべて不死化した細胞であることは周知の事実であり、ここで用いた不死化・非不死化肺癌組織は、テロメラーゼ活性（Hiyama Kら、J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995, Case G）、テロメア長（Hiyama Kら、Oncogene 10: 937-44, 1995, Case 92-D）、およびhTERT蛋白in situ発現（Hiyama Eら、Neoplasia 3: 17-26, 2001, Fiｇ 6A,B）解析により、同一症例の原発巣（図３中、「D2Pr」）および肝転移巣（図３中、「D5M3」）は不死化していないこと（テロメラーゼ活性陰性、テロメア長短縮、hTERT蛋白発現認めず）、リンパ節転移巣の一つ（図３中、「D4M2」）はほぼ不死化細胞のみで構成されること（高テロメラーゼ活性、テロメア長延長、ほとんど全ての細胞でhTERT蛋白発現）、もう一つの転移巣（図３中、「D3M1」）は、不死化細胞が非不死化細胞の中に混在していること（低テロメラーゼ活性、hTERT蛋白発現細胞が非発現細胞の中に混在）を確認した。
【０１２５】
さらに、乳癌11細胞株、卵巣癌10細胞株、膵臓癌10細胞株においても共通して高発現である遺伝子を絞り込み、最終的に、(1)ubiquitin-conjugating enzyme E2S（UBE2S）、(2) replication factor C (activator 1) 4, 37kDa（RFC4）(3) prostaglandin E synthase 2（PTGES2）、(4) MAF1 homolog (S. cerevisiae)（MAF1）、(5) activin A receptor, type IIB（ACVR2B）、（6）family with sequence similarity 119, member A（FAM119A）、（7）leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase（LTB4DH）、（8）dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 2, regulatory subunit（DPM2）、（9）selenoprotein X, 1（SEPX1）、（10）proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type, 3（PSMA3）、（11）coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3（CHCHD3）、（12）LSM3 homolog, U6 small nuclear RNA associated (S. cerevisiae)（LSM3）、および（13）G-2 and S-phase expressed 1（GTSE1）の合計１３遺伝子が、肺癌細胞株、食道癌細胞株、消化器癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、膵臓癌細胞株、その他のがん細胞株の大半に共通して、有限寿命非腫瘍性細胞に比し高発現であり、テロメラーゼ陽性肺癌転移組織（不死化がん細胞）において同一症例のテロメラーゼ陰性肺癌転移組織および原発組織（非不死化がん細胞）よりも高発現し、さらに不死化していないがん細胞が混在している膵臓癌組織よりも不死化した細胞だけで構成される膵臓がん細胞株で高発現していることを確認した（図３）。ここで用いた膵臓癌組織は、同一症例の正常膵臓組織に比較しテロメラーゼコード遺伝子TERTのfull length mRNA発現量が高いが、不死化膵臓癌細胞株に比し明らかに低く、不死化していない細胞が混在していると考えられる。
【０１２６】
上記の１３遺伝子は、図３〜１５に示すように、
（１）不死化細胞（図３〜１５黒塗り：MCF-12A、SV11e、SV11-106以外はすべてヒトがん由来細胞株）で、有限寿命の非腫瘍性細胞（図３〜１５白抜き）に比し発現が亢進している、
（２）ヒトがん由来不死化がん細胞（図３〜１５ MCF-12A、SV11e、SV11-106以外の黒塗り）で有限寿命がん細胞（図３〜１５ SV12e、SV12-72以外の斜線）よりも発現が亢進している、
（３）正常肺線維芽細胞にテロメラーゼコード遺伝子TERTを導入して得られた非腫瘍性テロメラーゼ発現延命細胞（図３〜１５ 菱形ドットTERT6e, TERT6-85）では、親細胞（TIG-1）に比し発現の亢進が認められない、
遺伝子であり、がん細胞特異的にテロメラーゼ陽性不死化細胞で高発現している遺伝子である。このことから、これらの遺伝子は、がん細胞の不死化を規定する遺伝子（不死化規定遺伝子）であると考えられる。
【０１２７】
さらに、正常肺線維芽細胞にテロメラーゼコード遺伝子TERTおよびSV40 early antigenをコードする遺伝子を導入して得られた不死化トランスフォーム細胞（図３から１５ SV11e, SV11-106: colony formation assay with soft agarでコロニーを作ること、300 PDL以上継代可能であることも確認している）では、親細胞(TIG-1)や非腫瘍性延命細胞（TERT6e, TERT6-85：colony formation assay with soft agarでコロニーを作らないこと、100 PDL未満で細胞増殖が停止することも確認している）に比し、MAF1、LTB4DH以外は発現が亢進していた。これら２遺伝子は、インビトロでトランスフォームさせた細胞は必ずしもヒトのがんと同一性状ではないためと考えた。
【０１２８】
実施例２   不死化規定遺伝子のsiRNA（small interfering RNA）によるがん細胞増殖抑制
実施例１で特定した13種の不死化規定遺伝子のがん細胞増殖との関連性を解析するために各遺伝子配列特異的siRNAを設計・作製後、３種のがん細胞株（HeLa: 子宮頸癌、KYSE150: 食道癌、HCC50:大腸癌）に遺伝子導入し、不死化規定遺伝子のmRNA発現の抑制、および導入後96時間後の細胞増殖能への影響を検討した。
【０１２９】
（１）不死化規定遺伝子配列特異的siRNA（small interfering RNA）の設計及び作製
13種の各不死化規定遺伝子について、２種あるいは４種の特異的なsiRNA配列を設定し、sense鎖とantisense鎖により二本鎖が形成されたsiRNAをQiagen社及び日本バイオサービス社より購入した。作製した各siRNAの配列のうち、sense鎖のみを表２および３に示す。各遺伝子のsiRNA-1は２種類の等モル混合とした。
【０１３０】
【表２】
0005312024.tif 000003
【０１３１】
【表３】
0005312024.tif 000004
【０１３２】
（２）ヒトがん細胞株の培養
３種のがん細胞株（HeLa: 子宮頸癌、KYSE150: 食道癌、HCC50:大腸癌）はそれぞれ以下の条件で培養した。HeLaは10% Fetal Bovine Serum（Sigma社製）及びゲンタマイシン（Sigma社製）を含むDMEM培地（Nacalai Tesque社製）を用いて、KYSE150とHCC50は10% Fetal Bovine Serum及びゲンタマイシンを含むRPMI 1640培地（Nacalai Tesque社製）を用いて培養した。
【０１３３】
（３）不死化規定遺伝子配列特異的siRNAの癌細胞株への遺伝子導入
トランスフェクションの前日に、予め培養した各がん細胞をトリプシン処理で回収し、（２）に記載した培地に懸濁した後、24ウェルプレートの1ウェルあたり、HeLaを1.2×104個、KYSE150を2×104個、HCC50を1.5×104個の細胞数で播種した。トランスフェクション当日に無血清培地 Opti-MEM（Invitrogen社製）に交換し、Oligofectamine（Invitrogen社製）あるいはLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いて表２及び３に示したsiRNAをトランスフェクションした。また、トランスフェクション時のsiRNAの濃度は1ウェルあたり、40 nMとした。ネガティブコントロールとして、Control（non-silencing）siRNA（Qiagen社製）を使用した。
【０１３４】
（４）不死化規定遺伝子の相対的mRNA発現量の抑制解析
（３）で行ったトランスフェクション１日後の各がん細胞株から、RNeasy Mini（Qiagen社製）を用いて製品の説明書に従い、total RNAを抽出した。QuantiTect Probe RT-PCR（Qiagen社製）及び不死化規定遺伝子配列特異的TaqMan Probe（ABI社製）を用いて、以下の条件にて定量RT-PCR（ABI社製、ABI PRISM 7000 sequence detection systemを使用）を行った。
i）50℃、30分間、
ii）95℃、15分間、
iii）94℃、15秒間 → 60℃、1分間を35〜45サイクル。
【０１３５】
内部標準としてβ-actinを使用し、各々の増幅曲線から発現量を数値化した。ControlとしてNS配列siRNAを導入した細胞の値を用いた。なお、不死化規定遺伝子の相対的mRNA量の測定は、同一標的遺伝子、同一がん細胞株において同条件で2回ずつ行った。
【０１３６】
Controlにおける各不死化規定遺伝子のmRNA量を100％としたときの各siRNAを導入した細胞における各不死化規定遺伝子の相対的mRNA量を、図１６〜２８にmRNA定量1、mRNA定量2として示した。すべての標的遺伝子おいて、siRNAによるmRNA発現量の抑制が認められた。
【０１３７】
（５）がん細胞株の増殖測定
がん細胞株の増殖は生細胞数測定試薬SF（Nacalai Tesque社製）を用いて行った。（３）で行ったトランスフェクション96時間後に、１ウェルあたり、WST試薬を10μl添加し、37℃で３時間インキュベートした後に450nm及び595nm（参照波長）の吸光度をプレートリーダー（Perkin Elmer社製、Wallac ARVO MX1420 Multilabel Counter）を用いて測定した。450nmの吸光度−595nmの吸光度−BG（培地のみ）の吸光度で数値化を行い、３ウェルあたりの平均値を求め、NS配列siRNA導入細胞の値を100％として表示した。なお、がん細胞株の増殖測定は、同一標的遺伝子、同一がん細胞株において同条件で2回ずつ行った。
【０１３８】
NS配列siRNA導入時の細胞数を100％としたときの各siRNA導入時の細胞数を、図16〜28にMTT assay1、MTT assay2として示した。すべての標的遺伝子において、いずれかのsiRNAにより３種のがん細胞で増殖抑制が認められ、このことからこれら13種の不死化規定遺伝子が、普遍的に不死化がん細胞の増殖抑制をもたらす分子標的となり得ることが示された。
【０１３９】
治療薬の開発のみならず、がん細胞において不死化と有限寿命を鑑別することは、疾患マーカーとしての意義も大きい。通常がんの診断は病理所見によってなされ、分化度や異型性も診断可能であるが、その細胞が不死化しているか否か、すなわち無限寿命を獲得しているか否かは通常の病理解析では判定できない。従来ヒトテロメラーゼの活性化が不死化のマーカーとして注目されてきたが、前述のごとく正常細胞の一部でもテロメラーゼが活性化され、テロメラーゼの活性化だけでは必ずしも細胞は不死化しないことも明らかになっている。さらに、テロメラーゼの発現量は非常に低く、免疫組織染色法が確立されているものの一部の研究室でのみ成功しているにすぎない（Hiyama Eら、Neoplasia 3: 17-26, 2001）。上記本発明の不死化規定遺伝子の発現をマーカーとして用いることにより、通常の病理診断では判定できなかった不死化がん細胞を有限寿命細胞から鑑別することが可能となり、がんの早期診断・治療選択・予後予測への臨床応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ヒト細胞のがん化不死化のメカニズムを示す概略図である。
【図２】本発明で行った標的遺伝子抽出方法を示す概略図である。
【図３】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のUBE2S遺伝子の発現レベルを示す。
【図４】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のRFC4遺伝子の発現レベルを示す。
【図５】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のPTGES2遺伝子の発現レベルを示す。
【図６】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のMAF1遺伝子の発現レベルを示す。
【図７】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のACVR2B遺伝子の発現レベルを示す。
【図８】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のFAM119A遺伝子の発現レベルを示す。
【図９】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のLTB4DH遺伝子の発現レベルを示す。
【図１０】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のDPM2遺伝子の発現レベルを示す。
【図１１】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のSEPX1遺伝子の発現レベルを示す。
【図１２】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のPSMA3遺伝子の発現レベルを示す。
【図１３】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のCHCHD3遺伝子の発現レベルを示す。
【図１４】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のLSM3遺伝子の発現レベルを示す。
【図１５】オリゴアレイによる各種不死化がん細胞のGTSE1遺伝子の発現レベルを示す。
【図１６】がん細胞株におけるsiRNAによるUBE2S遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図１７】がん細胞株におけるsiRNAによるRFC4遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図１８】がん細胞株におけるsiRNAによるPTGES2遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図１９】がん細胞株におけるsiRNAによるMAF1遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２０】がん細胞株におけるsiRNAによるACVR2B遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２１】がん細胞株におけるsiRNAによるFAM119A遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２２】がん細胞株におけるsiRNAによるLTB4DH遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２３】がん細胞株におけるsiRNAによるDPM2遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２４】がん細胞株におけるsiRNAによるSEPX1遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２５】がん細胞株におけるsiRNAによるPSMA3遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２６】がん細胞株におけるsiRNAによるCHCHD3遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２７】がん細胞株におけるsiRNAによるLSM3遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【図２８】がん細胞株におけるsiRNAによるGTSE1遺伝子の発現抑制とその増殖抑制効果を示す（実施例２）。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号２７はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-1（44-64）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号２８はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-1（146-166）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号２９はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３０はUBE2S遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３１はRFC4遺伝子に関するsiRNA-1（897-917）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３２はRFC4遺伝子に関するsiRNA-1（189-209）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３３はRFC4遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３４はRFC4遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３５はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-1（2003-2023）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３６はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-1（1105-1125）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３７はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３８はPTGES2遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号３９はMAF1遺伝子に関するsiRNA-1（1538-1558）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４０はMAF1遺伝子に関するsiRNA-1（1031-1051）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４１はMAF1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４２はMAF1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４３はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-1（626-646）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４４はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-1（208-228）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４５はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４６はACVR2B遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４７はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-1（754-774）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４８はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-1（1068-1088）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号４９はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５０はFAM119A遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５１はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-1（775-795）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５２はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-1（658-678）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５３はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５４はLTB4DH 遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５５はDPM2遺伝子に関するsiRNA-1（145-165）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５６はDPM2遺伝子に関するsiRNA-1（84-104）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５７はDPM2遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５８はDPM2遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号５９はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-1（870-890）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６０はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-1（794-814）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６１はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６２はSEPX1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６３はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-1（853-873）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６４はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-1（686-706）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６５はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６６はPSMA3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６７はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-1（546-566）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６８はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-1（1450-1470）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号６９はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７０はCHCHD3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７１はLSM3遺伝子に関するsiRNA-1（540-560）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７２はLSM3遺伝子に関するsiRNA-1（37-57）のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７３はLSM3遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７４はLSM3遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７５はGTSE1遺伝子に関するsiRNA-2のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号７６はGTSE1遺伝子に関するsiRNA-3のセンス鎖の塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005312024.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005312024.tif 000020
【図１７】
0005312024.tif 000021
【図１８】
0005312024.tif 000022
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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