(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とするＢ細胞悪性リンパ腫治療薬。
【請求項２】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、ＨＭＧＢ１タンパク質のＣ末端配列をエピトープとするものである請求項１に記載のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬。
【請求項３】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、ＨＭＧＢ１タンパク質のＣ末端配列である２０８ＥＥＥＤＤＤＤＥ２１５をエピトープとするものである請求項１に記載のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬。
【請求項４】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、１回当たり０．２〜５ｍｇ／（ｋｇ体重）投与するものである請求項１〜３の何れかに記載のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬。
【請求項５】
静脈注射投与するものである請求項１〜４の何れかに記載のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ細胞悪性リンパ腫を治療するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各国、特に先進国において悪性腫瘍は死亡原因の上位を占めているが、その根本的な治療法はいまだ確立していないのが現状である。悪性腫瘍の治療方法としては、主として外科的手術、放射線治療、および抗腫瘍薬の投与といった化学療法が挙げられ、それぞれに一長一短がある。
【０００３】
悪性腫瘍の中でも悪性リンパ腫はリンパ系に生じ、上皮細胞由来の癌などとは異なり、リンパ系自体が全身組織であることから外科的手術による切除は不可能である。よって、治療手段としては一般的に放射線療法と化学療法が採用される。
【０００４】
化学療法は全身に作用させることができるので、微小腫瘍組織や転移能を有する進行性悪性腫瘍に効果を示す。腫瘍細胞はもともと患者自身の細胞が正常な制御に反して無秩序に増殖したものであるので、放射線や抗腫瘍薬は腫瘍に対して治療効果を示すが、正常な細胞にもダメージを与えるという欠点がある。そこで、腫瘍に対する治療効果に優れ且つ副作用が少ないといった、より良い抗腫瘍薬の登場が期待されている。
【０００５】
しかし、悪性リンパ腫は全身に発生するという性質上、腫瘍細胞が完全に消失したことを証明することはできない。それどころか、いったん治療した後にも再発する例が多いため、治療が困難であると考えられる。
【０００６】
悪性リンパ腫は様々な分類がされており、その発生比率は人種、国や地域などにより異なる。例えば、リンパ球にはＢ細胞、Ｔ細胞とＮＫ細胞があり、我が国では７０〜８０％がＢ細胞悪性リンパ腫、２０〜３０％がＴ細胞悪性リンパ腫で、ＮＫ細胞悪性リンパ腫は５％以下に過ぎないというデータがある。この様に、Ｂ細胞悪性リンパ腫は悪性リンパ腫の中でも高い比率で発生することがあるので、有効な治療手段が求められている。
【０００７】
ところで、ＨＭＧＢ１（High Mobility Group box 1）は、げっ歯類からヒトまで９５％以上のアミノ酸配列が等しいタンパク質である。このＨＭＧＢ１は正常細胞にも存在するが、敗血症（全身性炎症反応症候群）において放出される菌体内毒素であるＬＰＳ（リポ多糖）による刺激によって血中濃度が上昇し、最終的な組織障害をもたらす。よって、特許文献１記載の技術では、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする症状を治療するためにＨＭＧＢ１アンタゴニストを投与しており、治療対象としてリンパ腫も例示されている。しかし当該特許文献１には、致死量のＬＰＳを投与した敗血症モデルマウスの死亡率が抗ＨＭＧＢ１抗体の投与により低下した実験例が開示されているものの、他の疾患に対する抗ＨＭＧＢ１抗体の効果は実証されていない。
【０００８】
特許文献２には、壊死組織により誘導される副作用の治療のための組成物として、ＨＭＧＢ１抗体等を含む組成物が開示されている。しかし、当該副作用としては、近傍の生存細胞の活性化、骨髄細胞の動員および活性化、内皮のバリア機能の喪失、浮腫のみが例示されており、Ｂ細胞悪性リンパ腫については記載されていない。
【０００９】
また、本発明者らは従前より抗ＨＭＧＢ１抗体について研究を継続しており、特許文献３と４の通り、これまで抗ＨＭＧＢ１抗体の脳梗塞と脳血管攣縮に対する抑制効果を見出している。
【特許文献１】特表２００３−５２０７６３号公報
【特許文献２】特表２００５−５３７２５３号公報
【特許文献３】特開２００７−１１９３４７号公報
【特許文献４】特許第３８８２０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した様に、抗腫瘍薬は一般的に腫瘍細胞のみならず正常細胞にもダメージを与え得るものである。また、Ｂ細胞悪性リンパ腫は悪性リンパ腫の中でも発生比率が比較的高いものであるので、より良い治療手段が求められている。
【００１１】
そこで、本発明が解決すべき課題は、Ｂ細胞悪性リンパ腫に対する治療効果を有し且つ副作用の少ない薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、Ｂ細胞悪性リンパ腫の治療に有効な薬剤につき種々検討を進めた。その結果、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が非常に優れた効果を有することを見出して、本発明を完成した。
【００１３】
本発明のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬は、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。
【００１４】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の投与量としては、後述する実験結果より、１回当たり０．２〜５ｍｇ／（ｋｇ体重）が好適であると考えられる。また、本発明のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬の主成分は抗体であることから、投与形態としては静脈投与が好適である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の治療薬は、悪性リンパ腫の中でも比較的高い発生比率を示すＢ細胞悪性リンパ腫を効果的に抑制することができる。また、現在使用されている抗体薬剤を考慮すれば、重篤な副作用を生じる可能性は極めて少ないと考えられる。従って、本発明のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬は、より良い治療手段が切望されているＢ細胞悪性リンパ腫を副作用なく効果的に治療できるものとして、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のＢ細胞悪性リンパ腫は、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とする。
【００１７】
Ｂ細胞悪性リンパ腫は非ホジキン悪性リンパ腫の一種である。非ホジキン悪性リンパ腫にはＢ細胞悪性リンパ腫とＴ細胞悪性リンパ腫があるが、人種や地域などによってはＴ細胞悪性リンパ腫よりもＢ細胞悪性リンパ腫の発生比率の方が圧倒的に高い場合がある。その症状としてはリンパ節の腫大が見られるが、一般的には無痛であるために自覚症状がないままに悪化することから問題である。Ｂ細胞悪性リンパ腫は全身性であることから、その治療手段としては、患者の年齢や重篤度などにもよるが、一般的には多剤併用化学療法が採用される。よって、抗がん剤の副作用による患者への負担が大きいことから、Ｂ細胞悪性リンパ腫に対しては副作用のより少ない抗がん剤が求められていた。
【００１８】
本発明者らは、先ずＨＭＧＢ１がＢ細胞悪性リンパ腫の増殖を濃度依存的に高めることを見出した上で、さらに抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体がＢ細胞悪性リンパ腫の増殖を有意に抑制することを確認した。なお、Ｔ細胞悪性リンパ腫についても同様の実験を行ったが、抗ＨＭＧＢ１抗体によりかえって増殖する場合があった。よって、現段階における本発明者らの知見によれば、抗ＨＭＧＢ１抗体による細胞増殖の抑制効果は、Ｂ細胞悪性リンパ腫に特異的なものであると考えられる。
【００１９】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、炎症反応などに関与すると考えられているＨＭＧＢ１へ選択的に作用し、その作用機序は明らかではないが、Ｂ細胞悪性リンパ腫の増殖を抑制する。その一方で、基本的に他のケミカルメディエーター等には作用しない。よって、副作用が生じる可能性はないか、極めて少ないと考えられる。
【００２０】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製は、常法に従えばよい。例えば、市販のＨＭＧＢ１を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、ＨＭＧＢ１へ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００２１】
本発明で使用する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の種類は、特に制限されない。例えば、ヒト型抗体や完全ヒト抗体を用いることができる。
【００２２】
本発明に係るＢ細胞悪性リンパ腫治療薬の剤形は特に問わないが、有効成分である抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体がペプチドであることを考慮すれば、注射剤としての投与を志向して、溶液やエマルション製剤などの液状製剤とすることが好ましい。
【００２３】
液状製剤の溶媒としては、ｐＨを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。また、抗体を塩類等と共に凍結乾燥した場合には、純水、蒸留水、滅菌水等も使用できる。その濃度も通常の抗体製剤のものとすればよく、一般的には０．１〜１ｍｇ／ｍＬ程度、点滴用では０．０２〜０．２ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。但し、注射剤の浸透圧は、血漿と同等にする必要がある。
【００２４】
本発明のＢ細胞悪性リンパ腫治療薬は、単独で或いは他の抗腫瘍薬や治療手段と併用して使用する。他の抗腫瘍薬と併用する場合には、他の抗腫瘍薬の通常の使用量を抑制することができ、結果としてその副作用を軽減できると考えられる。
【００２５】
本発明に係るＢ細胞悪性リンパ腫治療薬の投与頻度や投与量は、患者の重篤度や年齢などにより適宜調整すればよい。後述する実施例で示す通り、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の濃度が１μｇ／ｍＬの培地でも十分なＢ細胞悪性リンパ腫の増殖抑制効果が観察される。よって、投与すべき製剤の濃度や抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の投与量は適宜調整すればよいが、例えば１回当たり０．２〜５ｍｇ／（ｋｇ体重）投与することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２７】
実施例１  抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製
（ａ）ラットの免疫
市販のウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２との混合物（和光純薬工業社製、コード番号：０８０−０７０７４１）１ｍｇ／ｍＬを２ｍＬガラス製注射筒にとり、別の２ｍＬガラス製注射筒にとった等容量のフロイント完全アジュバンドと連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルションとした。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足蹠に、得られたエマルションを０．１ｍＬずつ、計０．２ｍＬ注射投与した。２週間後、頚静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与から５週間後に無菌的に取り出した。得られた２個のリンパ節から、約６×１０7個の細胞を回収することができた。
【００２８】
（ｂ）細胞融合とクローニング
上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２）細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を９６穴マイクロプレートに蒔いた。１週間後、最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行ない、陽性ウェルについて、ウェスタンブロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すウェル細胞を２４穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルエントな状態（約２×１０5個）に殖やしてから、０．５ｍＬの凍結培地（ＧＩＴ培地にウシ胎児血清を１０％とジメチルスルホキシドを１０％添加したもの）を用いて、液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、９６穴マイクロプレートでクローニングした。
【００２９】
（ｃ）抗体の精製
回転培養装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製）により上記陽性細胞を２週間大量培養し、濃度２〜３ｍｇ／ｍＬの抗体液を得た。この抗体液をアフィニティゲル（インビトロジェン社製、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ）と中性ｐＨ下で混和し、抗ＨＭＧＢ１抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、グリシン−塩酸バッファー（ｐＨ４）により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、セファロースＣＬ６Ｂゲル濾過カラム（直径２ｃｍ×長さ９７ｃｍ）によって、さらに精製した。
【００３０】
得られたモノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１タンパク質のＣ末端配列である２０８ＥＥＥＤＤＤＤＥ２１５（Ｅはグルタミン酸を示し、Ｄはアスパラギン酸を示す）をエピトープとして特異的に認識する抗体である。例えば、ＨＭＧＢ１に類似するタンパク質としてＨＭＧＢ２があるが、ＨＭＧＢ２には２１１以下のＤＤＤＤＥの配列が存在しないため、本発明に係るモノクローナル抗体はＨＭＧＢ２に結合せず、ＨＭＧＢ１のみを特異的に認識して結合することができる。
【００３１】
実施例２  ＨＭＧＢ１による細胞増殖実験
液体培地（ニッスイ社製、製品名「ＲＰＭＩ  １６４０」）に、別途調製したヒトＨＭＧＢ１を１×１０-10〜１×１０-6ｇ／ｍＬの濃度で溶解した。また、比較のためにＨＭＧＢ１を添加しない培地も用意した。これら培地（１ｍＬ）を直径２ｃｍのシャーレに加え、さらにＢ細胞悪性リンパ腫株であるＦＬ１８とＦＬ２１８（医仁会武田総合病院の大野仁嗣先生より入手）をそれぞれ約２０万個／ｍＬの割合で添加した。なお、ＦＬ１８はヒトＢ細胞悪性リンパ腫株であり、ＦＬ２１８は、アポトーシスの抑制作用を有するＢｃｌ−２遺伝子が欠損したＦＬ１８である。これらＢ細胞悪性リンパ腫株を３７℃で４８時間培養した後、各培地における細胞の濃度を顕微鏡で観察することにより測定した。ＦＬ１８の結果を図１（１）に、ＦＬ２１８の結果を図１（２）に示す。なお、図１中の「＊」は、得られた結果をＤｕｎｎｅｔ’ｓテストにおいて検定した場合にｐ＜０．０５で有意差がある場合を示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差がある場合を示す。
【００３２】
図１の通り、ＨＭＧＢ１は濃度依存的にＢ細胞悪性リンパ腫Ｂの増殖を促進し、特に１×１０-7〜１×１０-6ｇ／ｍＬの濃度で増殖速度を有意に高めることが分かった。
【００３３】
実施例３  抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体による細胞増殖抑制実験
実施例１で得た抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で液体培地に溶解した以外は上記実施例２と同様にして、２種のＢ細胞悪性リンパ腫株を３７℃で４８時間培養した。培養開始直後、並びに培養開始から２時間後、６時間後、１８時間後、２４時間後および４８時間後における各培地の細胞の濃度を、上記実施例２と同様に測定した。ＦＬ１８の結果を図２（１）に、ＦＬ２１８の結果を図２（２）に示す。
【００３４】
図２の通り、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体はＢ細胞悪性リンパ腫の増殖を経時的に抑制している。よって、本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、Ｂ細胞悪性リンパ腫の治療効果を有することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＨＭＧＢ１によるＢ細胞悪性リンパ腫の増殖実験の結果を示すグラフである。（１）はＦＬ１８の結果を示し、（２）はＦＬ２１８の結果を示す。
【図２】抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体によるＢ細胞悪性リンパ腫の増殖抑制実験の結果を示すグラフである。（１）はＦＬ１８の結果を示し、（２）はＦＬ２１８の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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