(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲによって生成させた増幅産物の定性または定量を行う増幅産物の解析方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｂ）工程を含むことを特徴とする、増幅産物の解析方法。
（Ａ）ＰＣＲによって、全血試料中の全血由来標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程であり、
前記ＰＣＲの反応液における全血試料の添加割合が、０．０１〜０．９体積％またはヘモグロビン量に換算して０．０１〜１．８ｇ／Ｌである工程
（Ｂ）前記増幅産物を光学的手段により検出する工程
【請求項２】
ＰＣＲの反応開始に先立ち、前記ＰＣＲの反応液にアルブミンを添加する、請求項１記載の増幅産物の解析方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲの反応液における前記アルブミンの添加割合が、０．１〜１重量％の範囲である、請求項２記載の増幅産物の解析方法。
【請求項４】
前記アルブミンが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミンおよびウマ血清アルブミンからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２または３記載の増幅産物の解析方法。
【請求項５】
ＰＣＲの反応開始に先立ち、全血試料に加熱処理を施す工程を含む、請求項１から４のいずれか一項記載の増幅産物の解析方法。
【請求項６】
前記加熱処理工程において、全血試料を希釈した希釈試料に加熱処理を施し、前記希釈試料における全血試料の割合が、０．０１〜９０体積％の範囲である、請求項５記載の増幅産物の解析方法。
【請求項７】
前記加熱処理工程における加熱温度が、８０℃〜９９℃の範囲である、請求項５または６記載の増幅産物の解析方法。
【請求項８】
前記加熱処理工程における処理時間が、３０秒以上である、請求項５から７のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項９】
前記全血試料中の標的核酸がＤＮＡであり、前記ＤＮＡをＰＣＲの鋳型とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１０】
前記全血試料中の標的核酸がＲＮＡであり、前記ＲＮＡから逆転写反応により生成させたｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１１】
ＰＣＲの増幅回数が３０サイクル以上である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１２】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物を経時的に検出する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１３】
前記増幅産物から発生する蛍光の測定により前記増幅産物を検出する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１４】
前記光学的手段が蛍光光度計である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１５】
ＰＣＲ反応液が、さらに、二本鎖ＤＮＡにインターカレートするインターカレーターを含み、
前記（Ｂ）工程において、前記インターカレーターへの励起光照射によって発生する蛍光の測定により、前記増幅産物を検出する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１６】
ＰＣＲ反応液が、さらに、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つＰＣＲの鋳型に相補的な部分配列であるプローブを含み、
前記（Ｂ）工程において、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の測定により、前記増幅産物を検出する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１７】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物の検出方法が、Ｔｍ解析である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の増幅産物の解析方法。
【請求項１８】
試料中に含まれる標的核酸を定量する標的核酸の解析方法であって、
前記試料が、全血試料であり、下記(Ａ)〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする標的核酸の解析方法。
（Ａ）  ＰＣＲによって、全血試料中の全血由来標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程であり、
前記ＰＣＲの反応液における全血試料の添加割合が、０．０１〜０．９体積％またはヘモグロビン量に換算して０．０１〜１．８ｇ／Ｌである工程
（Ｂ）  前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する工程
（Ｃ）  前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記全血試料中に含まれる標的核酸を定量する工程
【請求項１９】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物を経時的に検出する、請求項１８記載の標的核酸の解析方法。
【請求項２０】
前記増幅産物から発生する蛍光の測定により前記増幅産物を検出する、請求項１８または１９記載の標的核酸の解析方法。
【請求項２１】
前記光学的手段が蛍光光度計である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の標的核酸の解析方法。
【請求項２２】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物の検出方法が、Ｔｍ解析である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の標的核酸の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる増幅産物の製造方法、および、それを用いた増幅産物ならびに標的核酸の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床や病理学等の様々な分野において、遺伝子の発現解析、機能解析、診断等を目的として、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く利用されている。ＰＣＲ法は、一般に、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸に相補的なＤＮＡを増幅する方法である。【０００３】
しかしながら、生体試料、中でも全血試料をＰＣＲに供した場合、ＤＮＡ変性のための熱処理によって、前記試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生する。このような沈殿物等の発生は、例えば、増幅産物の有無を電気泳動で確認する場合には大きな問題にはならない。しかしながら、増幅産物の有無を光学的手段によって確認する場合には、沈殿物や濁りが照射光を遮るため、正確な測定結果が得られないという問題がある。特に、ＰＣＲにおいて増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングする方法（いわゆる、リアルタイムＰＣＲ法）によれば、例えば、１サイクルごとの増幅産物の定量や、増幅産物が所定量（閾値）に達する際のサイクル数をカウントすることが可能であり、また、それらの情報に基づけば、生体試料中の標的核酸の定量も可能である。このため、光学的手段による正確な測定の実現が、非常に重要視されている。【０００４】
そこで、このような問題を解決するために、従来では、予め生体試料を精製（前処理）してからＰＣＲ用試料として使用する方法や、反応後にＰＣＲ反応液を精製（後処理）する方法がとられている。前記生体試料の前処理とは、例えば、予め、生体試料を熱処理し、発生した沈殿物等を除去して、得られた上清をＰＣＲ試料として使用する方法や、予め、沈殿物や濁りの原因物質を生体試料から除去する方法である。また、ＰＣＲ反応液の後処理とは、例えば、ＰＣＲ反応の後、発生した沈殿物等を除去してから検出を行う方法である。【０００５】
他方、生体試料を用いたＰＣＲについては、操作の簡便性や迅速性の観点から、精製処理等の前処理を行うことなく、前記生体試料をそのまま使用することが求められている。なお、この際、ＰＣＲ反応液中の全血試料の添加割合は、１〜１０体積％程度と報告されている（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）。【０００６】
しかしながら、前述のように、光学的手段により増幅産物の検出を行う場合、前者の方法では、生体試料の前処理（精製処理）が必須となってしまう。また、後者の方法では、前処理していない生体試料をそのまま使用できるものの、反応終了後の沈殿物除去が必須であるため、前者と同様に操作が煩雑となり、さらに、反応終了後でなければ解析を行うことができないという問題がある。つまり、最終的に得られる増幅産物の解析は可能であっても、光学的手段により増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングすることは困難である。また、全血試料をはじめとする生体試料は、前処理を行わなければ、それに含まれる成分によってＰＣＲ反応が阻害されるという問題もある（非特許文献３および非特許文献４）。
【特許文献１】特許第３７２７６６７号公報
【非特許文献１】Nucleic  Acids  Research,  Vol.18,  No.19,  5908  (1990)
【非特許文献２】Nucleic  Acids  Research,  Vol.19,  No.5,  1151  (1991)
【非特許文献３】Nucleic  Acids  Research,  Vol.16,  No.20,  9775-9787  (1998)
【非特許文献４】Journal  of  Clinical  Microbiology,  Vol.39,  No.2,  p485-493  (2001)
【発明の開示】
【０００７】
そこで、本発明は、光学的手段による増幅核酸の検出において、全血試料由来の沈殿物や濁り等による前記検出への影響を抑制できる、ＰＣＲによる増幅産物の製造方法の提供を目的とする。より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に先立つ全血試料の精製処理（前処理）や、ＰＣＲ反応後におけるＰＣＲ反応液の精製処理（後処理）を必須とすることなく、検出時における濁りや沈殿物等による検出への影響を抑制できる、ＰＣＲ増幅産物の製造方法に関する。また、本発明は、濁りや沈殿物等の影響を抑制して、光学的手段により増幅産物の定性や定量を行う増幅産物の解析方法、ならびに、全血試料における標的核酸の解析の提供を目的とする。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の増幅産物の製造方法は、ＰＣＲによって全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を製造する方法であって、ＰＣＲの反応液における全血試料の添加割合が０．０１〜０．９体積％である。また、前記ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合は、ヘモグロビン量に換算して０．０１〜１．８ｇ／Ｌの範囲であってもよい。
【０００９】
本発明の増幅産物の解析方法は、ＰＣＲによって生成させた増幅産物の定性または定量を行う増幅産物の解析方法であって、下記（Ａ）〜（Ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  本発明の増幅産物の製造方法によって、全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程
（Ｂ）  前記増幅産物を光学的手段により検出する工程
【００１０】
本発明の標的核酸の解析方法は、試料中に含まれる標的核酸を定量する標的核酸の解析方法であって、前記試料が、全血試料であり、下記(Ａ)〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  本発明の増幅産物の製造方法によって、全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程
（Ｂ）  前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する工程
（Ｃ）  前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記全血試料中に含まれる標的核酸を定量する工程
【００１１】
本発明の増幅産物の製造方法によれば、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定するのみで、従来のような全血試料の前処理やＰＣＲ反応液の後処理等を行うことなく、濁りや沈殿等の検出への影響を抑制できる増幅産物を得ることができる。なお、前記添加割合であれば、全血試料中に標的核酸が存在すればＰＣＲにより増幅可能であり、十分な増幅効率が確保されていることは確認済みである。そして、本発明によれば、このように濁りや沈殿等の影響を抑制できるため、従来のような電気泳動ではなく、光学的手段であっても、増幅産物を検出することが可能である。さらに、光学的手段での検出が可能であることから、電気泳動では不可能であった増幅産物の生成過程における経時的なモニタリングも実現できる。このため、本発明によれば、精製処理等を行っていない未処理の全血試料を使用する場合であっても、例えば、増幅産物の定性・定量のみならず、全血試料における標的核酸の定性・定量が可能となる。なお、増幅産物の検出において、前述のような濁りや沈殿等が問題となる場合（すなわち、光学的手段による検出の場合）、後述するように、未処理の全血試料を使用すること自体が、従来試みられていないことから、本発明の構成はもちろんのこと本発明の課題も新規といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、ＰＣＲ反応液中の全血添加割合と、ＰＣＲ増幅物に対応する蛍光値との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２において、ＢＳＡを含むＰＣＲ反応液中の全血添加割合と、ＰＣＲ増幅物に対応する蛍光値との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３において、反応液中におけるＢＳＡ濃度と、反応液の蛍光値との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例４において、各試料について、リアルタイムＰＣＲのサイクル数と蛍光値との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例５において、各試料について、リアルタイムＰＣＲのサイクル数と蛍光値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜増幅産物の製造方法＞
本発明の増幅産物の製造方法は、前述の通り、ＰＣＲによって全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を製造する方法であって、ＰＣＲの反応液における全血試料の添加割合が約０．０１〜約０．９体積％である。本発明において、全血試料の添加割合は、前記ＰＣＲ反応液における終濃度（体積％）を意味する。【００１４】
全血試料の添加割合が０．９体積％を超えると、例えば、ＰＣＲにおける熱処理によって前記試料中のタンパク質等が変性し、前記反応液における沈殿物等の発生が検出に与える影響を十分に抑制できないおそれがある。また、全血試料の添加割合が０．９体積％を超えると、例えば、前記試料中の成分によるＰＣＲ反応の阻害を十分に抑制できず、増幅効率が不十分となるおそれがある。また、本発明の増幅産物の製造方法によれば、全血試料の添加割合を前記範囲に設定することによって、例えば、ＰＣＲ反応時における沈殿等の発生を抑制することもできる。この場合、本発明は、沈殿物や濁り等の発生抑制方法ということもできる。また、これらの沈殿物等は、前述のように、増幅産物を光学手段により検出する際の検出阻害物質であることからも、本発明は、前記検出阻害物質の発生抑制方法ということもできる。【００１５】
また、全血の添加割合が、前述の特許文献や非特許文献では１〜１０体積％程度であるのに対し、本発明では０．０１〜０．９体積％に軽減されている。このため、例えば、全血試料に含まれる成分によるＰＣＲ反応の阻害も低減できることから、増幅効率の向上も可能である。【００１６】
前記反応液における全血試料の添加割合の下限は、前述のように０．０１体積％以上、好ましくは０．０２体積％以上であり、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限は、前述のように０．９体積％以下、好ましくは０．８体積％以下であり、より好ましくは０．７体積％以下、さらに好ましくは０．６体積％以下である。【００１７】
また、本発明において、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して約０．０１〜約１．８ｇ／Ｌの範囲である。Ｈｂ量の下限は、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上であり、Ｈｂ量の上限は、好ましくは１．５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１ｇ／Ｌ以下である。好ましい範囲は、例えば、０．０５〜１．５ｇ／Ｌであり、より好ましい範囲は、０．１〜１ｇ／Ｌである。なお、前記反応中において、全血試料の添加割合は、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいが、いずれか一方を満たすのみでもよい。【００１８】
全血は、一般に、血小板、白血球（顆粒球、単球、リンパ球）および赤血球からなる血液細胞（固体成分）と、血漿（液体成分）とから構成されており、例えば、赤血球中にはＨｂ等が、血漿中にはアルブミン、グロブリン、血液凝固因子等が含まれている。前述のように、本発明によれば、ＰＣＲの反応開始に先立って、例えば、全血試料に熱処理を施し、発生した沈殿物を除去して上清を回収する前処理や、沈殿物等の発生原因となる糖類やタンパク質等を除去する前処理等が不要である。このため、本発明における「全血試料」とは、通常、沈殿物等の原因となる成分や発生した沈殿物等の除去を目的とする前処理を施していないもの（以下、「未処理の全血試料」ともいう）を意味する。ＰＣＲに供する全血試料の形態は、特に制限されず、例えば、患者から採取した全血をそのまま使用してもよいし、凍結保存した全血を凍解して使用することもできる。また、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。【００１９】
ＰＣＲによって増幅させる標的核酸は、例えば、全血由来のＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）の他に、細菌やウィルス等によって全血に導入された外来核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）等があげられる。また、これらの標的核酸の所在に応じて、例えば、全血試料の溶血の要否等を決定することもできる。【００２０】
本発明は、より好ましい形態として、さらに、ＰＣＲの反応開始に先立ち、前記ＰＣＲ反応液にアルブミンを添加する。このように、アルブミンを添加すれば、沈殿物や濁り等による影響をより一層抑制することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。【００２１】
前述のように、全血試料をはじめとする生体試料に含まれる成分がＰＣＲ反応を阻害することが知られており、この反応阻害を軽減する方法として、ＰＣＲ反応液にアルブミンを添加する技術が報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。しかしながら、本発明のより好ましい形態に示すように、前記ＰＣＲ反応液へのアルブミンの添加によって、沈殿物等による検出への影響をさらに抑制できることは全く知られておらず、この事実は本発明者らが鋭意研究の結果見出したものである。特に、本発明においては、前記ＰＣＲ反応液に対するアルブミン添加の前提条件として、前記ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合を前記範囲に設定することが必須であり、単にアルブミンを添加しても、沈殿物等による検出への影響を抑制することはできない。つまり、ＰＣＲ反応液にアルブミンを添加するのみで沈殿物等による検出への影響が抑制されるのではなく、全血試料の添加割合を前記範囲に設定することで沈殿物等による影響が抑制され、さらに、この反応液にアルブミンを添加して共存させることで、前記影響をさらに抑制できる。【００２２】
これに対して、アルブミンの添加が記載されている非特許文献３および４には、全血試料の添加割合はもちろんのこと、未処理の全血試料を使用すること、光学的検出等における沈殿物等の問題についても全く開示されていない。また、全血試料が開示されている特許文献１および非特許文献２の場合、記載されている全血添加割合（１体積％以上）では、さらにアルブミンを添加してもＰＣＲ反応液がゼリー状に変化するため、光学的な検出は困難であるとの結果も得られている。さらに重要なのは、本発明は、光学的手段による増幅産物の検出を目的とするからこそ、濁り等による影響の抑制を図っているのであり、前述のように、未処理の全血試料を使用し且つ光学的検出すること自体が従来試みられていない。【００２３】
前記ＰＣＲ反応液におけるアルブミンの添加割合は、制限されず、下限が、例えば、０．０１重量％以上、好ましくは、０．１重量％以上、より好ましくは、０．２重量％以上であり、上限が、例えば、５重量％以下、好ましくは２重量％以下、より好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは０．８重量％以下である。好ましい範囲は、０．０１〜５重量％、より好ましくは、０．１〜２重量％、さらに好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられる。これらは、いずれか一種類でもよいし二種類以上を併用してもよい。本発明において、アルブミンの添加割合は、例えば、前記ＰＣＲ反応液における終濃度（重量％）を意味する。【００２４】
また、本発明は、より好ましい形態として、さらに、ＰＣＲの反応開始に先立ち、全血試料に加熱処理を施す工程を含む。このように、ＰＣＲ反応に先立って、全血試料に加熱処理を施せば、例えば、初期鋳型量をさらに増加でき、それによって、増幅効率をより一層向上することができる。なお、全血試料の加熱処理によって、例えば、濁りや沈殿等が発生した場合であっても、ＰＣＲ反応の際に、ＰＣＲ反応液における全血試料の割合を前述の添加割合とすることによって、前記濁り等の影響が抑制されるため、光学的手段による増幅産物の検出が可能であり、且つ、増幅効率のさらなる向上も可能である。また、前述のようにアルブミンを添加する場合にも、加熱処理を施してもよく、例えば、アルブミン添加の前後、いずれに行ってもよい。【００２５】
前記加熱処理工程において、前記全血試料は、希釈した試料であることが好ましい。希釈試料を使用することによって、例えば、増幅効率向上のための加熱処理によって、沈殿や濁り等が発生することを抑制できる。前記希釈試料における全血試料の割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜９０体積％の範囲であり、好ましくは０．０５〜５０体積％であり、より好ましくは０．５〜５体積％である。加熱処理を行う場合、例えば、前記希釈試料を加熱処理した後、全血試料が前記範囲となるようにＰＣＲ反応液に添加してもよいし、全血試料が前記範囲となるようにＰＣＲ反応液に添加した後、ＰＣＲ反応に先立って、これに加熱処理を施してもよい。【００２６】
前記加熱処理工程における加熱温度は、制限されないが、例えば、８０℃以上であり、好ましくは８０〜９９℃、より好ましくは９０〜９９℃、特に好ましくは９５〜９９℃である。また、処理時間は、制限されないが、例えば、３０秒以上であり、好ましくは３０秒〜１５分、より好ましくは１分〜１５分、特に好ましくは３分〜１５分である。【００２７】
つぎに、本発明の増幅産物の製造方法について、全血試料中の標的核酸がＤＮＡであり、前記ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用する例をあげて説明する。なお、本発明は、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。【００２８】
まず、全血試料が前述の範囲となるように、ＰＣＲ反応液を調製する。全血試料は、その添加割合がＰＣＲ反応液において前記範囲となればよく、その添加方法は制限されない。例えば、全血試料をそのままＰＣＲ反応液に添加してもよいし、全血試料を、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してからＰＣＲ反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は、ＰＣＲ反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲であればよいが、例えば、１００〜２０００倍であり、好ましくは２００〜１０００倍である。また、ＰＣＲ反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（例えば、サーマルサイクラー）等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μｌであり、好ましくは１０〜１００μｌである。【００２９】
前記ＰＣＲ反応液における全血試料以外の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、プライマーおよび溶媒等があげられる。また、前述のように、前記ＰＣＲ反応液にはアルブミンを添加することが好ましい。なお、前記ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。【００３０】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第4,889,818号および同第5,079,352号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（WO  91/09950）（rTth  DNA  polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（WO  92/9688）（Pfu  DNA  polymerase：Stratagenes社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（EP-A  455  430）（商標Vent：Biolab  New  England社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。【００３１】
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、５〜５０Ｕ/ｍｌであり、好ましくは１〜１００Ｕ/ｍｌであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ/ｍｌである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍｌ活性化サケ精子ＤＮＡ）中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。【００３２】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。【００３３】
前記プライマーは、標的核酸の配列や長さに応じて適宜決定すればよい。プライマーの長さは、一般的に１０〜５０ｂｐ程度である。前記反応液中のプライマーの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜５μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜３μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。【００３４】
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。【００３５】
また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、グリセロ−ル、ヘパリン、ベタイン等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。【００３６】
ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（１）１本鎖ＤＮＡの解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数も特に制限されないが、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。【００３７】
【表１】
0005144518.tif 000002
【００３８】
以上のようにして、標的核酸に相補的な増幅産物を製造すれば、光学的手段により検出する際に濁りや沈殿物等の影響を受け難い増幅産物が得られる。【００３９】
また、全血試料中の標的核酸がＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）の場合は、例えば、前記ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを生成させ、このｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用する以外は、前述と同様にしてＰＣＲを行えばよい（いわゆる、ＲＥＶＥＲＳＥ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＰＣＲ）。【００４０】
逆転写反応は、例えば、従来公知の逆転写酵素、前記ＲＮＡに対するプライマーおよびヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む逆転写反応液に、前記全血試料を添加して行うことができる。前記反応液における全血試料の添加割合は、例えば、前述のＰＣＲ反応液における添加割合と同じに設定できる。【００４１】
この逆転写反応は、通常、前述のＰＣＲ反応に先立って行われる。例えば、逆転写反応後、その反応液にさらにＰＣＲ反応液の組成成分を添加してもよいが、簡便かつコンタミネーションの危険性も軽減できることから、１つの反応系内で、逆転写反応とＰＣＲ反応とを連続的に行うことが好ましい（いわゆる、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ法）。【００４２】
逆転写反応の反応条件は、特に制限されないが、例えば、反応温度３０〜７０℃、反応時間１〜１２０分であり、好ましくは反応温度４０〜６０℃、反応時間１０〜６０分であり、より好ましくは反応温度４５〜５０℃、反応時間２０〜４０分である。【００４３】
＜増幅産物の解析方法＞
つぎに、本発明の増幅産物の解析方法は、前述のように、ＰＣＲによって生成させた増幅産物の定性または定量を行う増幅産物の解析方法であって、下記（Ａ）〜（Ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  本発明の増幅産物の製造方法によって、全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程
（Ｂ）  前記増幅産物を光学的手段により検出する工程【００４４】
本発明の解析方法は、増幅産物の生成工程において、前述のように、ＰＣＲ反応液中の全血試料を前記添加割合に設定することが特徴である。これによって、沈殿物や濁り等に影響が抑制され、光学的手段による増幅産物の検出を精度良く行うことができる。したがって、本発明の解析方法においては、ＰＣＲ反応液中の全血試料の割合が前記範囲であればよく、その他の条件や工程等については何ら制限されない。【００４５】
リアルタイムＰＣＲ法は、一般的に、ＰＣＲにおいて増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングする方法を意味する。本発明において、前記（Ｂ）工程「増幅産物を光学的手段により検出する工程」を、以下、リアルタイムＰＣＲという。なお、前記（Ｂ）工程における増幅産物の検出は、例えば、前記（Ａ）工程の終了時または終了後、すなわち、ＰＣＲ反応終了時または終了後に行ってもよいし、前記（Ａ）工程と並行して行ってもよい。前記（Ａ）工程と並行して行う場合、前記（Ｂ）工程における増幅産物の検出は、例えば、経時的に行うことができる。経時的な検出（モニタリング）は、例えば、連続的であっても非連続的（断続的）であってもよい。また、前記（Ａ）工程におけるＰＣＲの反応途中のみのモニタリングであってもよい。【００４６】
前述の方法により生成した増幅産物は、例えば、前記増幅産物から発生する蛍光強度の測定により検出できる。蛍光検出としては、特に制限されないが、従来公知のインターカレーター法、Ｔａｑ  Ｍａｎ（商標）プローブ法、ハイブリダイゼーション法、サイクリングプローブ法などがある。【００４７】
インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートし、励起光を照射すると蛍光を発するインターカレーターを使用する方法である。この方法を利用する場合は、例えば、前記ＰＣＲ反応液に予め前記インターカレーターを添加しておき、前記反応液（前記反応液中のインターカレーター）に励起光を照射して、前記インターカレーターより発生する蛍光を測定すればよい。【００４８】
Ｔａｑ  Ｍａｎ（商標）プローブ法は、ＰＣＲの鋳型に相補的な部分配列であり且つ蛍光物質とクエンチャーとを有するプローブを使用する方法である。前記プローブとしては、鋳型の標的配列に特異的にアニールするオリゴヌクレオチドの末端を、蛍光物質（５’末端）とクエンチャー（３’末端）とでそれぞれ標識化したものが例示できる。前記プローブは、特に制限されないが、例えば、２０〜３０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。この方法を利用する場合、例えば、ＰＣＲ反応液に予め前記プローブを添加しておき、前記反応液（前記反応液中の蛍光物質）に励起光を照射して、前記蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、ＰＣＲ反応液において、前記プローブが鋳型にアニールしたのみでは、励起光を照射しても前記クエンチャーにより蛍光物質の蛍光は抑制されるが、伸長工程においてＤＮＡ伸長が起こると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブが分解され、蛍光物質がクエンチャーから離れることにより蛍光を発するという原理に基づく。【００４９】
ハイブリダイゼーション法は、ＰＣＲの鋳型に相補的な部分配列である、隣接する２種類のプローブを使用する方法である。前記２種類のプローブとしては、例えば、鋳型の３’側にアニールし且つ３’末端がアクセプター蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、鋳型の５’側にアニールし且つ５’末端がドナー蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせが例示できる。この方法を利用する場合は、例えば、ＰＣＲ反応液に予め前記二種類のプローブを添加しておき、前記反応液（前記反応液中のアクセプター蛍光物質）に励起光を照射して、前記アクセプター蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、ＰＣＲ反応液において、二種類のプローブが鋳型にアニールして、それぞれのアクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質とが隣接すると蛍光が発生するが、伸長工程においてＤＮＡ伸長が起こると、アクセプター蛍光物質で標識されたプローブが分解され、アクセプター蛍光物質がドナー蛍光物質から離れることにより蛍光を発生しないという原理に基づく。【００５０】
サイクリングプローブ法は、ＰＣＲの鋳型に対して相補的な配列であり、末端が蛍光物質（５’末端）とクエンチャー（３’末端）とでそれぞれ標識され、且つ、中央のみがＲＮＡ配列（リボヌクレオチド配列）となったプローブを使用する方法である。この方法を利用する場合は、例えば、前記ＰＣＲ反応液に予め前記プローブおよびＲＮａｓｅＨを添加しておき、前記反応液（前記反応液中の蛍光物質）に励起光を照射して、前記蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、前記ＰＣＲ反応液において、前記プローブが鋳型にアニールしたのみでは、励起光を照射しても前記クエンチャーにより蛍光物質の蛍光は抑制されるが、キメラ二本鎖を形成したＲＮＡ部分がＲＮａｓｅによって切断されると、両端の蛍光物質とクエンチャーとが離れるため蛍光を発し、ＲＮＡ領域にミスマッチが存在するとＲＮａｓｅＨによる切断は生じないという原理に基づく。【００５１】
蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用される。具体例としては、市販のＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（商品名、タカラバイオ社製）、ライトサイクラー（商品名、ロシュ・ダイアグノスティック社製）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（商品名、アプライド・バイオシステム社製）等があげられる。【００５２】
このように光学的手段による検出を行えば、例えば、増幅産物の定性（増幅の有無または標的核酸の有無）ならびに定量（増幅産物の量）が可能である。リアルタイムＰＣＲにおいては、通常、サイクルごとの蛍光強度をプロットした増幅曲線を作成し、増幅産物が設定した値（閾値：例えば、増幅が停止する量）となったサイクル数（Ｃｔ値：Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）を解析する。この解析内容に基づけば、増幅産物の定性や定量、ならびに、全血試料に含まれる標的核酸の定性や定量等も可能となる。なお、閾値の設定や定量方法は、従来公知の方法を適用できる。また、ＰＣＲ反応の終了後、反応液の温度を上昇させて増幅産物の融解温度（Ｔｍ値）を前記光学的手法により検出（解析）すれば、例えば、得られた増幅産物が１種類かそれ以上であるかを確認することもできる。【００５３】
＜標的核酸の解析方法＞
つぎに、本発明の標的核酸の解析方法は、前述のように、試料中に含まれる標的核酸を定量する標的核酸の解析方法であって、前記試料が、全血試料であり、下記(Ａ)〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  本発明の増幅産物の製造方法によって、全血試料中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させる工程
（Ｂ）  前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する工程
（Ｃ）  前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記全血試料中に含まれる標的核酸を定量する工程【００５４】
本発明において、前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程は、前述した本発明の増幅産物の解析方法にあたる。本発明は、増幅産物の生成工程において、前述のように、ＰＣＲ反応液中の全血試料を前述の添加割合に設定することが特徴である。これによって、沈殿物や濁り等に影響が抑制され、光学的手段による増幅産物の検出を精度良く行うことができ、結果的に、標的核酸を制度良く解析することができる。したがって、本発明の解析方法においては、ＰＣＲ反応液中の全血試料の割合が前記範囲であればよく、その他の条件や工程等については何ら制限されない。【００５５】
ＰＣＲでは、通常、増幅産物がある一定の量（閾値）に達すると、それ以上の増幅は起こらない。このため、最終的に生成した増幅産物の量を測定するのみでは、全血試料に含まれる標的核酸の量を定量することは困難である。しかし、前述のようなリアルタイムＰＣＲによれば、サイクルごとの増幅産物の生成をモニタリングし、設定した閾値に達するサイクル数（Ｃｔ値）をカウントするため、例えば、閾値とＣｔ値とに基づいて、全血試料に含まれる標的核酸を定量することも可能である。
【実施例】
【００５６】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。【００５７】
［実施例１］
本実施例は、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合を様々な値に設定してＰＣＲを行い、得られた増幅産物のＴｍ解析を行った例である。プライマーとして、配列番号１および２で表されるｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ＧＨ２０（商品名、Ｔａｋａｒａ社製）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ＧＨ２１（商品名、Ｔａｋａｒａ社製）を用い、β−グロブリン（ヒト）のうち４０８ｂｐの領域を増幅させた。また、ＰＣＲの増幅を確認するための蛍光物質としては、インターカレーターである商品名ＳＹＢＥＲ  ＧｒｅｅｎＩを使用した。
配列番号１（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ＧＨ２０）
５’−gaagagccaaggacaggtac−３’
配列番号２（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ＧＨ２１）
５’−ggaaaatagaccaataggcag−３’【００５８】
健常人の全血を所定の添加割合（０．０２、０．０２５、０．０３３、０．０３６、０．０３８、０．０４２、０．０４５、０．０５、０．００５６、０．０６２５、０．０７１、０．０８３、０．１、０．１２５、０．１７、０．２５、０．２９、０．３３、０．４、０．５、０．６７、１、２、２．５、３．３、５、１０体積％）となるように下記ＰＣＲ反応液に添加した。前記ＰＣＲ反応液について、増幅装置を用いて、下記条件によりＰＣＲ反応を行った。そして、ＰＣＲ反応後の反応液について、波長５１５〜５５５ｎｍの蛍光値（％）の測定により、Ｔｍ解析を行った。Ｔｍ解析の条件は、以下の通りである。なお、前記増幅装置としては、サーマルサイクラー（商品名Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｅｐＳ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）と下記光学系（商品名Ａｒｋｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒ．４）とを組み合わせたものを使用し（他の実施例も同様）、ＰＣＲならびにＴｍ解析を行った（ＷＯ２００５／１１８７７２参照）。【００５９】
【表２】
0005144518.tif 000003
【００６０】
【表３】
0005144518.tif 000004
【００６１】
【表４】
0005144518.tif 000005
【００６２】
これらの結果を図１に示す。図１は、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合と蛍光値との関係を示すグラフである。同図において、縦軸は蛍光値（％）であり、横軸はＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合（終濃度：体積％）である。【００６３】
この結果、図１に示すように、ＰＣＲ反応液における全血添加割合が高濃度（特に、２体積％以上）の場合、ＰＣＲの増幅を蛍光測定によって確認することができなかった。これは、ＰＣＲ反応において、前記反応液中に沈殿物や濁り等が発生し、これによって照射光が遮断されたためと推測される。これに対して、図１に示すように、ＰＣＲ反応液における全血添加割合を０．５体積％以下に設定することによって、ＰＣＲ増幅産物の蛍光測定が十分に可能となった。これは、ＰＣＲの増幅効率を十分に保ち且つ濁り等の発生も抑制できたためと推測される。この結果、全血添加割合を前述のような範囲に設定することによって、例えば、全血試料を前処理することなく標的核酸の定性や定量が可能になるといえる。【００６４】
［実施例２］
本実施例は、ＰＣＲ反応液にさらにＢＳＡを添加し、得られた増幅産物のＴｍ解析を行った例である。なお、ＢＳＡを０．４重量％となるように添加した以外は、前記実施例１と同一であり、あわせてＢＳＡ無添加の系についても同様に測定を行った。これらの結果を図２に示す。図２は、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合と蛍光値との関係を示すグラフである。同図において、■は、ＢＳＡ添加の結果、◆はＢＳＡ無添加の結果を示す。【００６５】
同図に示すように、ＰＣＲ反応液にＢＳＡを添加することによって、無添加の結果と比較して、蛍光値のさらなる増加が見られた。特に、ＰＣＲ反応液における血液添加割合（体積％）が０．５体積％以下の試料については、ＢＳＡ無添加の結果に比べてより一層の増加が見られた。この結果から、ＰＣＲ反応液において、血液添加割合を０．５体積％以下に設定するのに加えて、さらにＢＳＡを添加することによって、より一層確実にＰＣＲ増幅物の蛍光測定が可能になるといえる。【００６６】
［実施例３］
加熱による沈殿物等の生成に対するＢＳＡ添加の影響を確認した。なお、この影響は、蛍光測定における光の阻害により確認するため、熱処理を施すのみで、ＰＣＲによる増幅反応は行わなかった。具体的には、下記組成の反応液に、全血を添加割合が０．４体積％となるように、また、ＢＳＡを所定の添加割合（０、０．０４、０．０８、０．１２、０．１６、０．２、０．２４、０．２８、０．３２、０．３６、０．４、０．４４、０．４８、０．５２、０．５６、０．６、０．６４、０．６８、０．７２、０．７６、０．８）となるようにそれぞれ添加した。そして、この反応液を、前記実施例１と同じ装置を用いて、９５℃で５分処理した後、Ｔｍ解析を行った（測定波長５１５〜５５５ｎｍ）。これらの結果を図３に示す。図３は、ＰＣＲ反応液におけるＢＳＡの添加割合と蛍光値との関係を示すグラフである。【００６７】
【表５】
0005144518.tif 000006
【００６８】
同図に示すように、ＢＳＡを添加することによって、蛍光値の増加が確認された。特に、ＢＳＡ添加割合を０．２体積％以上に設定することにより、蛍光値の著しい増加が確認された。これは、ＢＳＡの添加によって、沈殿物等の生成が抑制されたためと推測される。この結果から、ＰＣＲ反応液において、血液添加割合を０．５体積％以下に設定するのに加えて、さらにＢＳＡを添加することによって（特に０．２体積％以上）、より一層確実にＰＣＲ増幅物の蛍光測定が可能になるといえる。【００６９】
［実施例４］
本実施例は、ＰＣＲ反応前に、全血の希釈試料を加熱した上で、ＰＣＲ反応液における全血の添加割合を所定の割合に設定して、ＰＣＲならびにＴｍ解析を行った例である。【００７０】
プライマーとして、配列番号３および４で表されるｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用い、アミリン遺伝子のうち１０５ｂｐの領域を増幅させた。また、ＰＣＲの増幅を確認するために、配列番号５で表される下記プローブを使用した。
配列番号３（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）
５’−cacatgtgcaacgcagcg−３’
配列番号４（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ctcttgccatatgtattggatccc−３’
配列番号５（検出用プローブ）
５’−(FAM)-ttcattccagcaacaactttggtgccattctctc-(DABCYL)−３’【００７１】
ヘパリン採血管を用いて採血した健常人の全血１０μｌを、９０μｌの下記検体希釈液１に添加して混合した。この混合液１０μＬを、９０μｌの下記検体希釈液２に添加して混合した。これを希釈試料とした。さらに、前記希釈試料１０μｌを９５℃で５分間加熱処理した。そして、非加熱の希釈試料１０μｌまたは加熱した希釈試料１０μｌを用いて、下記組成のＰＣＲ反応液により、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、同じ試料について３回ずつ分析を行った（ｎ＝３）。
（検体希釈液１：以下同様）
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．０５％  ＮａＮ３
０．３％    ＳＤＳ
（検体希釈液２：以下同様）
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．０５％  ＮａＮ３【００７２】
【表６】
0005144518.tif 000007
【００７３】
前記リアルタイムＰＣＲの条件は、次の通りである。ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（商品名、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により、５０℃で２分間、９５℃で２分間処理した後、９５℃１５秒および５６℃４５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、各サイクルにおける５６℃４５秒のステップで、前記検出用プローブにおけるＦＡＭの蛍光を、波長５３０ｎｍでモニタリングした。【００７４】
前記ｉ−Ｃｙｃｌｅｒにより算出されたＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）の値を下記表に示す。Ｃｔは、前述のように、増幅産物の量と相関する蛍光値が設定値（閾値）に達するサイクル数を表す。前記閾値も、ｉ−Ｃｙｃｌｅｒによって算出され、本実施例における蛍光値の閾値は、１８４．２である。なお、リアルタイムＰＣＲの原理から、Ｃｔ値が相対的に小さいほど、初期鋳型量が相対的に多いと判断できる。【００７５】
【表７】
0005144518.tif 000008
【００７６】
また、非加熱の希釈試料および加熱した希釈試料のそれぞれについて、測定値（ｎ＝３）の平均値を、図４のグラフに示す。図４は、各試料について、サイクル数と蛍光値との関係を示すグラフであり、太線が、加熱処理した希釈試料の結果、細線が、未処理の希釈試料の結果を示す。【００７７】
前記表７に示すように、希釈試料を予め加熱処理することによって、非加熱の希釈試料と比べて、Ｃｔ値が平均して１．７サイクル減少した。これは、加熱処理することによって、初期鋳型量が約３．２倍多いことを意味する。また、図４に示すように、グラフに表した場合、非加熱の希釈試料と比較して、明らかに加熱処理した希釈試料の蛍光値が、３０サイクル付近より増加していることがわかる。前述の実施例により、ＰＣＲ反応液における全血試料の割合を所定の範囲にすることで、ＰＣＲの増幅効率を十分に保ち且つ濁り等の影響を抑制できることがわかっている。そして、本実施例により、ＰＣＲ反応前に希釈試料を加熱することで、さらにＰＣＲの増幅効率を向上できることもわかった。【００７８】
［実施例５］
ヘパリン採血管に代えて、ＥＤＴＡ採血管を用いて採血した健常人の全血１０μｌを使用した以外は、前記実施例４と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。【００７９】
下記表８に、前記ｉ−Ｃｙｃｌｅｒにより算出されたＣｔの値を示す。また、非加熱の希釈試料および加熱した希釈試料のそれぞれについて、測定値（ｎ＝３）の平均値を、図５のグラフに示す。図５は、各試料について、サイクル数と蛍光値との関係を示すグラフであり、太線が、加熱処理した希釈試料の結果、細線が、未処理の希釈試料の結果を示す。【００８０】
【表８】
0005144518.tif 000009
【００８１】
前記表８に示すように、希釈試料を予め加熱処理することによって、非加熱の希釈試料と比べて、Ｃｔ値が平均して２．４サイクル減少した。これは、加熱処理することによって、初期鋳型量が約５．３倍多いことを意味する。また、図５に示すように、グラフに表した場合、非加熱の希釈試料と比較して、明らかに加熱処理した希釈試料の蛍光値が、３０サイクル付近より増加していることがわかる。前述の実施例により、ＰＣＲ反応液における全血試料の割合を所定の範囲にすることで、ＰＣＲの増幅効率を十分に保ち且つ濁り等の発生を抑制できることがわかっている。そして、本実施例により、ＰＣＲ反応前に全血試料を加熱することで、さらにＰＣＲの増幅効率を向上できることもわかった。【００８２】
［実施例６］
本実施例は、ＰＣＲ反応前に、全血の希釈試料を所定の温度で加熱した上で、ＰＣＲ反応液における全血の添加割合を所定の割合に設定して、ＰＣＲならびにＴｍ解析を行った例である。【００８３】
プライマーとして、前記実施例４と同じｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒおよびｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いた。また、ＰＣＲの増幅を確認するために、配列番号６で表される下記プローブを使用した。
配列番号６（検出用プローブ）
５’−(FAM)−ttggtagatgagagaatggcaccaaagttgttgc−(DABCYL)−３’【００８４】
ＥＤＴＡ採血管を用いて採血した健常人の全血１０μｌを、９０μｌの前記検体希釈液１に添加して混合した。この混合液１０μＬを、９０μｌの前記検体希釈液２に添加して混合した。これを希釈試料とした。さらに、前記希釈試料１０μｌを所定の温度（９９℃、９５℃、９０℃、８５℃、８０℃）で５分間加熱処理した。そして、非加熱の希釈試料１０μｌまたは加熱した希釈試料１０μｌを用いて、下記組成のＰＣＲ反応液により、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲの条件は、前記実施例４と同様である。【００８５】
【表９】
0005144518.tif 000010
【００８６】
下記表に、前記ｉ−Ｃｙｃｌｅｒにより算出されたＣｔの値を示す。本実施例における蛍光値の閾値は、３３５．２である。【００８７】
【表１０】
0005144518.tif 000011
【００８８】
前記表に示すように、希釈試料を予め８０℃〜９９℃に加熱処理した場合、非加熱の希釈試料とのＣｔ値の差は、０．６サイクル以上であった。０．６サイクル以上とは、初期鋳型量が約１．５倍以上であることを意味する。したがって、希釈試料を８０℃以上で加熱処理することによって、さらにＰＣＲの増幅効率を向上できることがわかった。また、加熱温度が相対的に高い程、相対的に増幅効率が向上することがわかった。【００８９】
［実施例７］
本実施例は、ＰＣＲ反応前に、全血の希釈試料を８０℃または９９℃で所定時間加熱した上で、ＰＣＲ反応液における全血の添加割合を所定の割合に設定して、ＰＣＲならびにＴｍ解析を行った例である。【００９０】
加熱温度を８０℃または９９℃とし、加熱処理の時間を所定時間（３０秒、１分、３分、１０分、１５分）とした以外は、前記実施例６と同様にして、リアルタイムＰＣＲを行った。【００９１】
下記表に、前記ｉ−Ｃｙｃｌｅｒにより算出されたＣｔの値を示す。本実施例における蛍光値の閾値は、１６５．４である。【００９２】
【表１１】
0005144518.tif 000012
【００９３】
前記表に示すように、希釈試料を予め８０℃または９９℃で３０秒以上加熱処理した場合、非加熱の希釈試料とのＣｔ値の差は、０．６サイクル以上であった。０．６サイクル以上とは、前述のように、初期鋳型量が約１．５倍以上であることを意味する。したがって、希釈試料を、８０℃以上且つ３０秒以上加熱処理することによって、さらにＰＣＲの増幅効率を向上できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
以上のように、本発明の増幅産物の製造方法によれば、ＰＣＲ反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定するのみで、従来のように全血試料の前処理やＰＣＲ反応液の後処理等を行うことなく、濁りや沈殿等の検出への影響を抑制することができる。そして、このように濁りや沈殿等の影響を抑制できることから、従来のような電気泳動ではなく、光学的手段によっても増幅産物を検出することが可能となる。さらに、光学的手段による検出が可能となったことから、例えば、電気泳動では不可能である、増幅産物の生成過程における経時的なモニタリングも実現できる。このため、本発明によれば、全血試料を使用する場合であっても、例えば、増幅産物の定性・定量のみならず、全血試料における標的核酸の定性・定量が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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