(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属の蒸着膜を基板の片面全体又は片面の一部に有し、
前記貴金属の蒸着膜の波長６００ｎｍにおける吸光度が、０．０８〜０．５であり、
前記貴金属の蒸着膜の平均厚さが、０．１〜６０ｎｍであり、
前記貴金属の蒸着膜は、連続した膜であり、かつ、その一部に前記連続した膜に囲まれ、蒸着により形成された窪みを有していることを特徴とする
生体高分子の結晶化用基板。
【請求項２】
前記窪み部分において前記基板が露出している、請求項１に記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項３】
前記貴金属が、金、銀、白金、及び／又は、これらの合金である、請求項１又は２に記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項４】
前記貴金属が、金である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項５】
前記貴金属の蒸着膜の平均厚さが、５〜５０ｎｍである、請求項１〜４のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項６】
生体高分子の光照射による結晶化用である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項７】
前記貴金属の蒸着膜を表面に有する前記基板の形状が、平板状である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項８】
前記貴金属の蒸着膜が、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲に吸収を有する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を備えた生体高分子の結晶化用容器。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を備えた生体高分子の結晶化装置。
【請求項１１】
前記貴金属の蒸着膜に光を照射する光照射手段を有する、請求項１０に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項１２】
基板の片面全体又は片面の一部に貴金属を蒸着させ、請求項１〜８のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を準備する準備工程、及び、
前記貴金属の蒸着膜と生体高分子溶液とを接触させる接触工程、を含む
生体高分子結晶の製造方法。
【請求項１３】
生体高分子溶液と接触している前記貴金属の蒸着膜に光を照射する光照射工程を更に含む、請求項１２に記載の生体高分子結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶化用基板、結晶化用容器、結晶化装置、及び、結晶の製造方法に関し、前記結晶が生体高分子結晶である場合に特に好適に適用することができる結晶化用基板、結晶化用容器、結晶化装置、及び、結晶の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質等の生体高分子を結晶化させるには、バッチ法、透析法、液相間拡散法、気液相関拡散法等の方法が用いられている（非特許文献１参照）。
例えば、バッチ法によれば、蛋白質溶液に硫酸アンモニウム等の沈殿剤を結晶化濃度まで直接加える。一般には、生体高分子溶液の入った容器に沈殿剤を加え生体高分子が過飽和となるように制御し、生体高分子結晶を作製していた。このバッチ法では、高濃度の高分子試料を大量に必要とすること、操作に熟練を要し再現性が低いこと、結晶化条件のスクリーニングが困難であること等の欠点がある。また、従来の上記結晶化方法は、特定の高分子に比較的特異な結晶化条件を要し、汎用的な条件がないという欠点を有している。
【０００３】
また、例えば、特許文献１には、蛋白質結晶の核形成に適した温度条件に設定した蛋白質溶液に可視域と思われるレーザー光を照射し、このレーザー光の散乱状況を解析することにより蛋白質結晶の核形成の開始を検出し、核形成の開始を検出した時点で蛋白質溶液を結晶成長に適した温度条件に制御するようにした技術が開示されている。
更に、特許文献２には、過飽和状態であるが蛋白質結晶の核形成に適さない低過飽和度の溶液（準安定溶液）にネオジウムＹＡＧレーザーの第四高調波２６６ｎｍ光、あるいは５００Ｗキセノンランプ光を照射することにより、ニワトリ卵白リゾチームの結晶を出現させる方法が開示されている。
特許文献３には、結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、ピコ秒パルスレーザーおよびフェムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザーを照射することにより結晶核を生成させる結晶核の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１１６０９８号公報
【特許文献２】特開２００３−３０６４９７号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０１８７４４号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本生化学会編、新生化学実験講座１「蛋白質Ｉ−分離・精製・性質−」、１９９０年、（株）東京化学同人発行、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、簡便かつ効率的に結晶、好ましくは生体高分子結晶を製造できる結晶化用基板、結晶化用容器、結晶化装置、及び、結晶の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題は、以下の＜１＞、＜１０＞、＜１２＞、＜１３＞又は＜１６＞〜＜１９＞に記載の解決手段により達成された。好ましい実施態様である＜２＞〜＜９＞、＜１１＞、＜１４＞及び＜１５＞と共に以下に記載する。
＜１＞５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を表面に有することを特徴とする生体高分子の結晶化用基板、
＜２＞前記貴金属膜の波長６００ｎｍにおける吸光度が、０．０８〜０．５である、上記＜１＞に記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜３＞前記貴金属膜の平均厚さが、０．１〜６０ｎｍである、上記＜１＞又は＜２＞に記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜４＞前記貴金属膜の一部に窪みを有している、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜５＞前記窪み部分において前記基板が露出している、上記＜４＞に記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜６＞前記貴金属が、金、銀、白金、及び／又は、これらの合金である、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜７＞前記貴金属が、金である、上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜８＞前記貴金属膜の平均厚さが、５〜５０ｎｍである、上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜９＞生体高分子の光照射による結晶化用である、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板、
＜１０＞上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を備えた生体高分子の結晶化用容器、
＜１１＞上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を備えた生体高分子の結晶化装置、
＜１２＞前記貴金属膜に光を照射する光照射手段を有する、上記＜１１＞に記載の生体高分子の結晶化装置、
＜１３＞上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の生体高分子の結晶化用基板を準備する準備工程、及び、前記貴金属膜と生体高分子溶液とを接触させる接触工程、を含む生体高分子結晶の製造方法、
＜１４＞生体高分子溶液と接触している前記貴金属膜に光を照射する光照射工程を更に含む、上記＜１３＞に記載の生体高分子結晶の製造方法、
＜１５＞前記準備工程が、基板に貴金属を蒸着させる工程である、上記＜１３＞又は＜１４＞に記載の生体高分子結晶の製造方法、
＜１６＞５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を表面に有することを特徴とする結晶化用基板、
＜１７＞上記＜１６＞に記載の結晶化用基板を備えた結晶化用容器、
＜１８＞上記＜１６＞に記載の結晶化用基板を備えた結晶化装置、
＜１９＞上記＜１６＞に記載の結晶化用基板を準備する準備工程、及び、前記貴金属膜と被結晶化物質溶液とを接触させる接触工程、を含む結晶の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便かつ効率的に結晶、好ましくは生体高分子結晶を製造できる結晶化用基板、結晶化用容器、結晶化装置、及び、結晶の製造方法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１〜４及び比較例１において作製した金の薄膜の２００〜１，０００ｎｍの波長範囲における吸収スペクトルを示す図である。
【図２】実施例１において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による３種の倍率の写真を示す図である。
【図３】実施例２において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による４種の倍率の写真を示す図である。
【図４】実施例５において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による４種の倍率の写真を示す図である。
【図５】実施例２（金蒸着あり、かつアニール前）、実施例５（金蒸着あり、かつアニール後）、及び、比較例１（金蒸着なし）の２４時間経過時における結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明において、数値範囲を表す「下限〜上限」の記載は、「下限以上、上限以下」を表し、「上限〜下限」の記載は、「上限以下、下限以上」を表す。すなわち、上限及び下限を含む数値範囲を表す。
【００１１】
（結晶化用基板）
本発明の結晶化用基板は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を表面に有することを特徴とする。
また、本発明の結晶化用基板は、生体高分子の結晶化用基板として好適に用いることができる。
本発明の結晶化用基板は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を表面に有することにより、簡便かつ効率的に結晶、好ましくは生体高分子結晶を製造することができる。
【００１２】
本発明の結晶化用基板は、基板表面の少なくとも一部に５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を有していればよい。例えば、基板の片面全体に貴金属膜を有していても、片面の一部に有していても、両面に有していてもよく、また、側面に有していてもよいが、コストの観点から、基板の片面全体又は片面の一部に貴金属膜を有していることが好ましい。
また、本発明の結晶化用基板は、光照射による結晶化用基板として好適に用いることができ、生体高分子の光照射による結晶化用基板としてより好適に用いることができる。
光照射の好ましい条件としては、後述する結晶の製造方法に記載の好ましい態様と同様である。
本発明の結晶化用基板における基板の形状は、特に制限はなく、平板状であっても、平板状でなくともよく、例えば、平板状以外に、多角柱状、円柱状、多角錐状、円錐状、粒子状、不定形状など所望の形状であってもよいが、平板状であることが好ましい。
また、本発明の結晶化用基板における基板の大きさについても、特に制限はなく、所望の大きさであればよい。
本発明の結晶化用基板における基板の材質としては、貴金属以外であれば特に制限はなく、ガラス、樹脂、金属等が挙げられるが、結晶生成性の観点から、透明材料であることが好ましく、ガラスであることが特に好ましい。
【００１３】
本発明の結晶化用基板における貴金属膜の吸収スペクトルの測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いて行えばよいが、分光光度計Ｕ−２０１０又はＵ−２１００（（株）日立ハイテクノロジーズ製）により測定することが好ましい。
本発明の結晶化用基板における貴金属膜の波長６００ｎｍにおける吸光度は、０．０８〜０．５であることが好ましく、０．０８〜０．４５であることがより好ましく、０．２０〜０．４５であることが更に好ましい。上記範囲であると、結晶生成性により優れる。
【００１４】
本発明の結晶化用基板における貴金属膜の平均厚さは、０．１〜６０ｎｍであることが好ましく、５〜５０ｎｍであることがより好ましく、１０〜５０ｎｍであることが更に好ましく、１５〜４５ｎｍであることが特に好ましい。上記範囲であると、結晶生成性により優れる。
貴金属膜の平均厚さの測定方法としては、例えば、基板上における貴金属膜が形成された面積及び基板上の貴金属量から算出する方法や、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により基板表面を観察し、画像処理により厚さを算出する方法などが挙げられる。
なお、貴金属膜の平均厚さは、基板全体の貴金属膜の平均厚さに限定されるわけではなく、基板上の貴金属膜が形成されている部分における貴金属膜の平均厚さであることは言うまでもない。
【００１５】
本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜は、その一部に窪みを有していることが好ましい。窪みを有することにより、貴金属膜の吸収スペクトルに関係するためではないかと推定されるが、結晶生成性により優れる。
一部に窪みを有する貴金属膜の形成方法としては、基板表面の少なくとも一部に貴金属を蒸着させる方法が好ましく例示できる。また、特に形成する貴金属膜の平均厚さが０．１〜６０ｎｍであると、蒸着により膜を形成することにより、その一部に窪みを有する貴金属膜を容易に形成することができるため、好ましい。
また、前記貴金属膜の一部における窪み部分において、基板が露出していることが好ましい。上記態様であると、貴金属膜の吸収スペクトルに関係するためではないかと推定されるが、結晶生成性により優れる。
なお、前記貴金属膜の構造（窪み、基板露出など）の確認方法としては、特に制限はないが、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認する方法が好ましく挙げられる。
一部に窪みを有する貴金属膜を形成する方法としては、蒸着により０．１〜６０ｎｍの厚さの貴金属膜を形成する方法が好ましい。基板上に０．１〜６０ｎｍの厚さの貴金属膜を蒸着により形成すると、容易に一部に窪みを有する膜を形成することができる。また、蒸着により形成された貴金属膜は、アニール（熱処理）されていない膜であることが好ましい。アニールを行うと、貴金属の蒸着膜がより均一な厚さに形成されると推定される。
本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜は、０．１〜６０ｎｍの厚さの貴金属の蒸着膜であることが好ましく、アニールされていない０．１〜６０ｎｍの厚さの貴金属の蒸着膜であることがより好ましい。上記態様であると、貴金属膜の吸収スペクトルに関係するためではないかと推定されるが、結晶生成性により優れる。
【００１６】
本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜を構成する貴金属としては、金、銀、白金、及び／又は、これらの合金であることが好ましく、金、銀、又は、白金であることがより好ましく、金であることが特に好ましい。上記態様であると、結晶生成性により優れる。
【００１７】
本発明の結晶化用基板を使用して結晶化させるものとしては、特に制限はなく、無機化合物であっても、有機化合物であっても、高分子化合物であってもよいが、生体高分子であることが好ましい。例えば、本発明の結晶化用基板を生体高分子の結晶化に使用する場合、特許文献１〜３に記載されている方法のように、生体高分子の溶液に強いレーザー光又は紫外光を照射すると、生体高分子が変性してしまう可能性があるため、強いレーザー光又は紫外光を照射することなく、結晶化を誘起させることが好ましい。
生体高分子として具体的には、ポリペプチド、蛋白質、及び、核酸（例えば、ＤＮＡなど。）、並びに、それらの誘導体等が例示できる。また、前記生体高分子には、合成ポリペプチドや合成蛋白質等の合成物も含まれる。また、ポリペプチドとしては、大腸菌、酵母、動物細胞における発現によって得た後に慣用的な方法で単離されたポリペプチド、又は、合成ポリペプチドを挙げることができる。前記誘導体には、例えば、糖蛋白質、ＤＮＡコンジュゲート等が含まれる。
また、前記生体高分子の（重量平均）分子量が１，０００以上であることが好ましく、１，０００以上１００万以下がより好ましい。
これらの中でも、生体高分子としては、ポリペプチド、蛋白質及びこれらの誘導体が好ましく、蛋白質及びその誘導体（本発明において、単に「蛋白質」ともいう。）がより好ましい。また、蛋白質には、酵素も含まれる。
【００１８】
（結晶化用容器）
本発明の結晶化用容器は、本発明の結晶化用基板を備えた結晶化用容器である。
また、本発明の結晶化用容器は、容器自体と本発明の結晶化用基板とが物理的又は化学的に結合していても、結合していなくともよい。具体的には、例えば、本発明の結晶化用容器中に本発明の結晶化用基板を接着してもよいし、本発明の結晶化用基板を容器中に単に入れるだけでもよい。
また、本発明の結晶化用容器は、本発明の結晶化用基板を１つのみ有していても、２以上有していてもよい。
【００１９】
本発明の結晶化用容器の形状は、本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜と、結晶化させるものを含む溶液とを接触させることができる形状の容器であれば、特に制限はなく、所望の形状であればよい。
本発明の結晶化用容器は、結晶化時における結晶化させるものを含む溶液の蒸発を抑制するため、密閉可能な容器であることが好ましい。
また、本発明の結晶化用容器は、光照射を行いやすい点から、容器の少なくとも一部が透明であることが好ましい。
本発明の結晶化用容器の大きさは、特に制限はなく、必要に応じて、適宜選択すればよい。
【００２０】
（結晶の製造方法）
本発明の結晶の製造方法は、本発明の結晶化用基板を準備する準備工程、及び、前記貴金属膜と被結晶化物質の溶液とを接触させる接触工程、を含む。
また、本発明の結晶の製造方法は、生体高分子結晶の製造方法として好適に用いることができる。また、前記被結晶化物質の溶液は、生体高分子溶液であることが好ましい。
本発明の結晶の製造方法は、結晶生成をより促進させる観点から、被結晶化物質の溶液と接触している前記貴金属膜に光を照射する工程（以下、「光照射工程」ともいう。）を更に含むことが好ましい。
また、本発明の結晶の製造方法は、前記接触工程、又は、前記光照射工程の後、前記被結晶化物質の溶液を保管する工程（以下、「保管工程」ともいう。）を更に含むことが好ましい。
【００２１】
＜準備工程＞
本発明の結晶の製造方法は、本発明の結晶化用基板を準備する準備工程を含む。
本発明の結晶化用基板における貴金属膜の形成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、基板の少なくとも一部に蒸着により形成することが好ましく、基板の少なくとも一部に蒸着により形成し、かつ蒸着後アニールを行わないことがより好ましい。
すなわち、前記準備工程は、基板に貴金属を蒸着させる工程であることが好ましく、また、準備工程、及び、準備工程と接触工程との間において、結晶化用基板のアニールを行わないことが好ましい。
【００２２】
＜接触工程＞
本発明の結晶の製造方法は、本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜と被結晶化物質の溶液とを接触させる接触工程を含む。
前記接触工程においては、本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜と被結晶化物質の溶液とを接触させる以外は、特に制限はない。
「被結晶化物質の溶液」とは、被結晶化物質と、前記被結晶化物質を溶解する溶媒とを含む液であればよいが、被結晶化物質が完全に溶解した溶液であることが好ましい。
被結晶化物質の溶液に使用する溶媒は、使用する被結晶化物質に応じてそれぞれ独立に選択でき、水、有機溶媒、又は、水及び水と混合する有機溶媒（水性有機溶媒）の混合物などが例示できる。
この中でも、生体高分子を被結晶化物質として使用する場合、緩衝液であることが好ましく、酢酸緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、又は、Ｔｒｉｓ緩衝液であることがより好ましい。また、両性電解質である生体高分子の場合に、その等電点近傍にｐＨを調整した生体高分子溶液に光照射することが好ましく、また、このｐＨを調整した混合液を調製することも好ましい。
【００２３】
被結晶化物質の溶液中における被結晶化物質の濃度については、特に制限はなく、例えば、飽和濃度の１〜１００％である溶液又は過飽和の溶液が例示できる。飽和濃度の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、飽和濃度であるか過飽和であることが特に好ましい。
また、溶液濃度を維持するため、溶質である被結晶化物質の補充、温度の低下、及び／又は、沈殿剤の追加等を行ってもよい。
【００２４】
また、本発明における被結晶化物質の溶液は、結晶化剤を含有していてもよい。
本発明における「結晶化剤」とは、被結晶化物質、好ましくは生体高分子の溶解度を下げる働きをする化合物を意味し、沈殿剤、ｐＨ緩衝剤、その他高分子の結晶化に使用される添加剤等の化合物が挙げられる。
本発明に用いることができる結晶化剤としては、塩類、有機溶媒、水溶性高分子等が例示でき、公知のものを用いることができる。また、使用する結晶化剤の種類は、使用する被結晶化物質に応じて適宜選択すればよい。
塩類としては、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、有機酸塩、及び、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化物などを用いることができ、具体的には、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、及び、クエン酸ナトリウムが例示できる。
有機溶媒としては、水溶性の有機溶媒を例示できる。具体的には、例えば、２−メチル−２，４−ペンタジオール（ＭＰＤ）やエタノール、プロパノールジオキサンなどを用いることができる。
水溶性高分子としては、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどが例示できる。
結晶化剤の添加量は、特に制限はなく、使用する被結晶化物質及び使用する結晶化剤の種類に応じ、適宜設定すればよい。
【００２５】
本発明に用いることができる生体高分子は、より容易に結晶を作製することができるため、その純度及び均質性が高いことが好ましい。このため、本発明の生体高分子結晶の製造方法は、結晶の製造に先立って、生体高分子を精製する工程を含むことが好ましい。
結晶化前の生体高分子の精製は、公知の方法により行うことができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、慣用のクロマトグラフィー、ｒｐＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等によって行うことが好ましい。
また、核酸の結晶を製造する場合においては、公知の単離法により単離した後、精製により純度を高めた後に結晶化させることが好ましい。
また、蛋白質においては、公知の方法により純度を高め、等電点電気泳動法又は光散乱法等により純度を確認した後に結晶化させることが好ましい。
【００２６】
また、被結晶化物質や溶媒、結晶化剤以外にも、必要に応じて、被結晶化物質の溶液に公知の添加剤を添加してもよい。ただし、後述する保管工程においては、結晶化に影響が出ないよう配慮する必要があることは言うまでもない。
また、添加は１回で行っても、複数回に分けて行ってもよい。
【００２７】
＜光照射工程＞
本発明の結晶の製造方法は、被結晶化物質の溶液と接触している前記貴金属膜に光を照射する光照射工程を更に含むことが好ましい。
本発明における「光」とは、紫外光や可視光、赤外光などの電磁波であればよい。
前記光照射工程において照射する光の波長は、特に制限はないが、４００ｎｍより長波長であることが好ましく、４５０〜２，０００ｎｍであることがより好ましく、５００〜１，５００ｎｍであることが更に好ましく、５００〜１，２００ｎｍであることが特に好ましい。
また、前記光照射工程において照射する光は、少なくとも可視光及び／又は近赤外光を含むことが好ましく、可視光及び／又は近赤外光のみであることがより好ましい。
本発明における可視光は、波長４００ｎｍ〜７８０ｎｍであることが好ましい。
本発明における近赤外光は、波長７８０ｎｍを超え２，５００ｎｍ以下であることが好ましく、波長７８０ｎｍを超え２，０００ｎｍ以下であることがより好ましい。
また、前記光照射工程において照射する光は、単色光でも連続光でもよい。
照射する光の強度は、適宜選択できるが、通常は、数μＷないし数１００Ｗの範囲にある強度の光を用いることができる。
光照射は、定常光でもよく、パルス光でもよい。必要に応じて、照射強度、１パルス当たりのエネルギー、パルス間隔等を変化させることもできる。
光照射は、定常光を連続して照射することが好ましいが、間歇的に又は途中中断して行ってもよい。
前記光照射工程における光の照射時間は、特に制限はなく、結晶が生成するまで連続的に又は間歇的に照射してもよい。
【００２８】
＜保管工程＞
本発明の結晶の製造方法は、前記接触工程、又は、前記光照射工程の後、前記被結晶化物質の溶液を保管する保管工程を更に含むことが好ましい。
また、前記光照射工程と同時に保管工程を行ってもよい。例えば、光照射を行いながら被結晶化物質の溶液を静置して結晶を生成させてもよい。
保管時間は、被結晶化物質の成長が十分に行われる条件の下で適宜選択することができ、例えば、被結晶化物質や結晶化剤、使用した溶媒の種類や、結晶生成の有無、生成した結晶の大きさ等を考慮して、適宜決定すればよい。
保管時の温度は、被結晶化物質の結晶化を妨げる温度でなければ、特に制限はない。また、保管時の温度は、一定温度に保っても、変化してもよいが、温度変化が１℃以内であることが好ましい。
また、保管工程における被結晶化物質の溶液は、密閉容器に入れて保管しても、非密閉容器に入れて保管してもよい。容器内外において、雰囲気中の溶媒量、例えば、湿度は、必要に応じ、適宜設定することができる。また、容器内外の雰囲気は、使用する被結晶化物質の種類に応じて適宜選択すればよく、例えば、大気雰囲気下であっても、窒素雰囲気下であっても、アルゴン雰囲気下であってもよい。
【００２９】
また、保管工程では、静置して保管しても、撹拌しながら保管しても、連続的、間歇的又は一時的に振動を与えてもよい。撹拌しながら保管する、及び／又は、振動を与えることにより、大粒の結晶を得られることがある。
保管工程における撹拌の振動数は、１０ｒｐｍ以３００ｒｐｍ以下であることが好ましく、２０ｒｐｍ以上１００ｒｐｍ以下であることがより好ましく、３０ｒｐｍ以上６０ｒｐｍ以下であることが更に好ましい。
【００３０】
＜判定工程＞
本発明の結晶の製造方法は、前記溶液中に生成した結晶の有無を判定する判定工程を更に含むことが好ましい。
判定工程における結晶の有無を判定する方法としては、特に制限はないが、目視により観察する方法、又は、画像処理や光学的手法を用いたセンサーを使用する方法が好ましく例示できる。
判定工程は、必要に応じ、定期的に行うことが好ましく、例えば、保管開始後、１日後、２日後、３日後、５日後、７日後、３０日後、６０日後及び９０日後にそれぞれ判定工程を行ってもよい。
また、結晶の有無を確認した後、結晶が生じていない場合には、結晶が生成していない前記溶液に対し、更に光照射工程を行ってもよい。また、必要に応じて、結晶が生成するまで前記光照射工程、及び、前記保管工程を何度も繰り返してもよい。
【００３１】
本発明の結晶の製造方法において、前記溶液中に生成した結晶は、任意の方法により分離すればよい。具体的には、濾紙やフィルター等を用いて濾過する方法や、ピンセット等により結晶を採取する方法などが例示できる。
得られた結晶は、必要に応じ、洗浄を行ったり、乾燥を行ったり、大きさや形状を加工したり、また、再結晶を行ってもよい。
【００３２】
また、本発明の結晶の製造方法における結晶化の形式は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。特に、生体高分子の結晶化を行う場合には、例えば、ハンギングドロップ蒸気拡散法、シッティングドロップ蒸気拡散法、ミクロ透析法、自由界面拡散法、保管バッチ法等の方法を好適に用いることができる。
その他の生体高分子の結晶化を促進する条件は、前掲の日本生化学会編、新生化学実験講座１「蛋白質Ｉ−分離・精製・性質−」、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」、及び、A. McPherson著、“Preparation and Analysis of Protein Crystals”(John Wiley & Son, Inc.)を参照することができる。
【００３３】
本発明の結晶の製造方法に使用することができる装置としては、特に制限はなく、公知の手段や装置を組み合わせてもよい。
本発明の結晶の製造方法に使用することができる装置は、前記貴金属膜に光を照射する光照射手段を備えていることが好ましく、必要に応じて、溶液調製手段や、温度調節手段、湿度調節手段、撹拌手段、振動手段、保管手段、結晶有無の判定手段、添加剤添加手段など各種の手段を具備させることができる。
また、本発明の結晶の製造方法には、必要な手段を１以上有する装置を２以上組み合わせて使用してもよく、必要な全ての手段が備わった単一の装置を使用してもよい。
【００３４】
振動手段としては、公知の振動、撹拌、超音波発生手段等を用いることができる。
振動手段における振動子としては、圧電振動子、吸引力、電磁力など、様々な構成のものが挙げられ、振動を与えられるものであれば特に制限はない。
生体高分子溶液に振動を与える方法としては、例えば、生体高分子が溶解した溶液を入れた容器を振動している振動手段に接触させる方法、生体高分子が溶解した溶液を入れた容器をプレートに固定し、プレート全体を振動させる方法等が挙げられる。
【００３５】
また、光照射手段としては、例えば、光源、及び、光を前記溶液まで導くための光学系より構成することができる。光源から照射試料まで光を導く光路に用いられる、レンズ、ミラー等の光学部品が光を効率よく透過あるいは反射するものを用いることが好ましい。
前記光源には、前述した定常点灯光源やレーザー光源を好適に用いることができる。
前記光学系には、適宜、反射鏡、集光レンズ、光フィルター、赤外線遮断フィルター、光ファイバー、導光板、非線形光学素子等の光学部材を使用することができる。
【００３６】
温度調節手段としては、公知の加熱手段や冷却手段、及び、これらの組み合わせを例示でき、また、温度の検出は、生体高分子溶液や混合液等の内部温度を検出しても、周囲の外気温を検出してもよい。また、温度調節手段は、必要な温度調節を行うプログラム回路を備えていてもよい。
保管手段としては、例えば、接触した前記貴金属膜と生体高分子溶液とを保管可能な手段であれば、特に制限はないが、接触した前記貴金属膜と生体高分子溶液とを静置可能な手段であることが好ましく、接触した前記貴金属膜と生体高分子溶液とを密閉空間において静置可能な手段であることがより好ましい。
【００３７】
また、本発明の結晶の製造方法に使用することができる装置は、必要に応じて、前記溶液中における結晶核の生成、溶液のｐＨ等を検出し、また、これらを制御するための装置、回路、プログラムを具備していてもよい。結晶条件の検出及び制御のためには、複数の結晶条件検出用セルを１チップ化した装置とすることが好ましい。このような検出チップは、特開２００１−２１３６９９号公報に記載されているように、半導体装置の一般的な製造プロセスにより製造することができる。
また、本発明の結晶、特に生体高分子結晶の製造方法に使用することができる装置に、特開平６−１１６０９８号公報に記載されているような、結晶核の生成又は結晶成長には寄与しないが、結晶核の生成状況を検出するための生体高分子が吸収しない長波のレーザー光を使用する手段を備えることもできる。
【００３８】
本発明の結晶の製造方法によって得られた生体高分子結晶は、Ｘ線結晶構造解析のための試料に供されるばかりでなく、一般に保存安定性が極めて高いので、予防用又は治療用剤形として医薬組成物に使用することが可能であり、生体高分子が結晶型であることにより特に有利な投与が可能になる。生体高分子結晶は、例えば経口、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、筋肉内等の投与に適当である。本発明の結晶の製造方法によって得られた生体高分子結晶は、活性物質として、結晶化された生体高分子の薬理学的有効量、及び、必要に応じて１種又は２種以上の慣用の医薬的に許容される担体からなる医薬組成物に好適に用いることができる。
【００３９】
また、本発明の結晶の製造方法によって得られた生体高分子結晶は、原理的に、多くの生体高分子について知られているのと同じ方法で、医薬製剤中に、例えば薬理学的に有効な生体高分子０．００１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を投与するためのデポ製剤として使用することができる。したがって、広範囲の様々な生体高分子が本発明によって結晶化された形態で、例えば治療剤デポ製剤、抗原デポ製剤、ＤＮＡデポ製剤又は糖デポ製剤として使用できる。結晶中に含有される結晶化補助剤はしかも、アジュバント（ワクチン接種において）として使用される。
【００４０】
（結晶化用装置）
本発明の結晶化用装置は、本発明の結晶化用基板を備えた結晶化装置である。
また、本発明の結晶化用装置は、本発明の結晶の製造方法に好適に用いることができる。
本発明の結晶化用装置は、本発明の結晶化用基板を１つのみ備えていても、２以上備えていてもよい。
また、本発明の結晶化用装置は、本発明の結晶化用基板を、本発明の結晶化容器として備えていてもよい。
本発明の結晶化用装置の形状は、本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜と、結晶化させるものを含む溶液とを接触させることができる形状の容器であれば、特に制限はなく、所望の形状であればよい。
本発明の結晶化用容装置は、結晶化時における結晶化させるものを含む溶液の蒸発を抑制するため、本発明の結晶化用基板を備えた部分が密閉可能であることが好ましい。
【００４１】
また、本発明の結晶化用装置は、本発明の結晶化用基板における前記貴金属膜に光を照射する光照射手段を有することが好ましい。
本発明の結晶の製造方法に使用することができる装置は、必要に応じて、溶液調製手段や、保管手段、温度調節手段、湿度調節手段、撹拌手段、振動手段、結晶有無の判定手段、添加剤添加手段など各種の手段を具備させることができる。
これら各手段としては、前記結晶の製造方法において、前述した手段が好ましく挙げられる。
また、本発明の結晶の製造方法には、必要な手段を１以上有する装置を２以上組み合わせて使用してもよく、必要な全ての手段が備わった単一の装置を使用してもよい。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１）
＜基板の作製＞
蒸着装置としてイオンスパッタリング装置（ＪＦＣ−１５００、日本電子（株）製）を使用し、金の純度９９．９９％、真空度１０-1Ｐａの条件により、カバーガラス（直径２２ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ）の片側表面に、金の薄膜を平均厚さ４０ｎｍで蒸着した。
得られたカバーガラスを原子間力顕微鏡（セイコーインスツルメンツ（株）製Ｓ−ｗｅｅｐ  ｓｐｉ３８００）により観察したところ、カバーガラスにおける金薄膜には、窪みが見られた。
また、得られたカバーガラスの金薄膜の吸収スペクトルを、分光光度計Ｕ−２１００（（株）日立ハイテクノロジーズ製）により測定した。前記金薄膜は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲に吸収を有しており、また、波長６００ｎｍにおける吸光度は、０．３８であった。
【００４４】
＜生体高分子の結晶化＞
蛋白質溶液として、１５ｍｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム、０．７Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４．３の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液を使用した。
前記カバーガラスに、前記金の薄膜と接触させるように１０マイクロリットルの蛋白質溶液を滴下し、バッチプレート（９６穴蒸気拡散用バッチプレート、ハンプトンリサーチ社製ＤＩ−０３８）内に置いた。バッチプレート内には滴下した蛋白質溶液と同じ濃度の塩化ナトリウムを含むリザーバー溶液をカバーガラスの周辺に滴下し、バッチプレートの蓋をして蛋白質溶液の蒸発が起こらないようにした。
光照射は、キセノンランプ光（ウシオ電機（株）製３００Ｗキセノンランプ）を用いた。キセノンランプ光の放射光のうち、赤外光吸収用に水フィルター、紫外光吸収用に４００ｎｍのカットフィルターを通した光を照射した。バッチプレート内のカバーガラス上の溶液にキセノンランプ光を照射しながら、２０℃のインキュベーター内で静置した。
光照射開始後、６時間経過時、１２時間経過時、及び、２４時間経過時において、溶液から出現した蛋白質の結晶の数を計測した。
また、光照射を行わない以外は、前記と同様にし、２０℃のインキュベーター内で静置し、静置後、６時間経過時、１２時間経過時、及び、２４時間経過時において、溶液から出現した蛋白質の結晶の数を計測した。
なお、得られた各結晶は、ニワトリ卵白リゾチームの正方晶の結晶であった。
結果を表１に示す。
【００４５】
（実施例２）
金の薄膜を平均厚さ２０ｎｍで蒸着した以外は、実施例１と同様に、基板の作製及び生体高分子の結晶化を行った。結果を表１に示す。
なお、得られたカバーガラスを前記原子間力顕微鏡により観察したところ、カバーガラスにおける金薄膜には、窪みが見られた。
また、得られたカバーガラスの金薄膜の吸収スペクトルを、前記分光光度計により測定したところ、前記金薄膜は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲に吸収を有しており、また、波長６００ｎｍにおける吸光度は、０．２８であった。
【００４６】
（実施例３）
金の薄膜を平均厚さ１０ｎｍで蒸着した以外は、実施例１と同様に、基板の作製及び生体高分子の結晶化を行った。結果を表１に示す。
なお、得られたカバーガラスを前記原子間力顕微鏡により観察したところ、カバーガラスにおける金薄膜には、窪みが見られた。
また、得られたカバーガラスの金薄膜の吸収スペクトルを、前記分光光度計により測定したところ、前記金薄膜は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲に吸収を有しており、また、波長６００ｎｍにおける吸光度は、０．０９であり、波長１，０００ｎｍにおける吸光度は、０．００５以上の値であった。
【００４７】
（実施例４）
金の薄膜を平均厚さ６０ｎｍで蒸着した以外は、実施例１と同様に、基板の作製及び生体高分子の結晶化を行った。結果を表１に示す。
なお、得られたカバーガラスを前記原子間力顕微鏡により観察したところ、カバーガラスにおける金薄膜には、窪みが見られた。
また、得られたカバーガラスの金薄膜の吸収スペクトルを、前記分光光度計により測定したところ、前記金薄膜は、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲に吸収を有しており、また、波長６００ｎｍにおける吸光度は、０．４６であった。
実施例４では、光照射時に得られた結晶数は、実施例１〜３と比較して少ないが、結晶の大きさは大きいものが得られた。
【００４８】
（比較例１）
金の薄膜を蒸着しなかった以外は、実施例１と同様に、基板の作製及び生体高分子の結晶化を行った。結果を表１に示す。
なお、得られたカバーガラスの吸収スペクトルを、前記分光光度計により測定したところ、５００〜１，０００ｎｍの波長範囲の全範囲で吸収が見られなかった。
【００４９】
【表１】
0005224306.tif 000002
【００５０】
表１中における「＞」との記載は、右側に記載の数値を超える数であることを表す。
また、図１に、実施例１〜４及び比較例１において作製した金の薄膜の２００〜１，０００ｎｍの波長範囲における吸収スペクトルを示す。なお、図１における縦軸は、吸光度を表し、横軸は、波長を表す。
更に、図２に、実施例１において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による３種の倍率の写真を示す図を示し、図３に、実施例２において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による４種の倍率の写真を示す図を示す。
【００５１】
（実施例５）
平均厚さ２０ｎｍの金薄膜を有するカバーガラスを作製した後、前記カバーガラスを室温からの昇温に３０分かけて５００℃で２．５時間アニールした以外は、実施例２と同様に、基板の作製及び生体高分子の結晶化を行った。
なお、得られたカバーガラスを前記原子間力顕微鏡により観察したところ、カバーガラスにおける金薄膜には、窪みが見られなかった。
図４に、実施例５において作製した金の薄膜の原子間力顕微鏡による４種の倍率の写真を示す図を示す。
２４時間経過時における結果を、実施例２及び比較例１と共に図５に示す。なお、図５は、オリンパス（株）製実体顕微鏡システムＳＺＸ９及びオリンパス（株）製顕微鏡用デジタルカメラＤＰ２５により撮影した。
実施例５で得られたカバーガラスを使用した場合、ニワトリ卵白リゾチームの正方晶の結晶が生じていることが確認されたが、実施例２の場合と比較して少ない結晶数であった。
【００５２】
（実施例６）
ニワトリ卵白リゾチームの代わりにリボヌクレアーゼＡ（RNase A）を使用した以外は、実施例１〜５と同様にして基板の作製及び生体高分子の結晶化をそれぞれ行ったところ、実施例１〜５とそれぞれ同等の数の結晶が得られる。
【００５３】
（実施例７）
ニワトリ卵白リゾチームの代わりにソーマチンを使用した以外は、実施例１〜５と同様にして基板の作製及び生体高分子の結晶化をそれぞれ行ったところ、実施例１〜５とそれぞれ同等の数の結晶が得られる。
【要約】
【課題】簡便かつ効率的に結晶、好ましくは生体高分子結晶を製造できる結晶化用基板、結晶化用容器、結晶化装置、及び、結晶の製造方法を提供すること。
【解決手段】５００〜１，０００ｎｍの波長範囲に吸収を有する貴金属膜を表面に有することを特徴とする結晶化用基板、並びに、前記結晶化用基板を準備する準備工程、及び、前記貴金属膜と被結晶化物質溶液とを接触させる接触工程、を含む結晶の製造方法。前記製造方法は、被結晶化物質溶液と接触している前記貴金属膜に光を照射する光照射工程を更に含むことが好ましい。
【選択図】図２【図１】
0005224306.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005224306.tif 000006
【図５】
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