(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病治療剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質の存在下でFLT3/ITDをLynと接触させ，前記試験物質がFLT3/ITDとLynとの結合を阻害するか否か，および／またはFLT3/ITDを発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害するか否かを判定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質を同定する方法，ならびに急性骨髄性白血病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Fms様チロシンキナーゼ３（Fms-like  tyrosine  kinase  3：FLT3)は，KIT，FMS，PDGFレセプター等と共にIII型レセプターチロシンキナーゼに属するレセプターである。血球系の多能性幹細胞に発現していることや，そのノックアウトマウスは血球系前駆細胞の減少を示すこと等から，そのリガンドは造血幹細胞の増殖や分化に重要であると考えられている。リガンドがレセプターに結合するとリガンドを介してレセプターが２量体を形成し，それによりレセプターが自己リン酸化して下流のシグナル伝達因子が活性化される。FLT3によるシグナルは幹細胞の分化や増殖を制御することで造血に非常に重要な役割を果たしている。【０００３】
最近，成人急性骨髄性白血病(AML)症例において活性型変異FLT3が高頻度に認められることが分かった。活性型変異FLT3が存在すると，レセプターおよびその下流のシグナル伝達因子が恒常的に活性化され，細胞増殖が促進される。活性型変異FLT3としては，FLT3傍膜部領域（JMD）の遺伝子に重複縦列変異（internal  tandem  duplication：ITD）を有するタイプ（FLT3/ITD），およびチロシンキナーゼドメインに点突然変異を持つタイプ（FLT3/TKD）（Yamamoto  Y,et  al.,(2001).Blood,97,2434-9）が知られている。FLT3/ITD変異は，AML症例の20%において認められることが報告されており（Yokota,S.,et  al.,(1997).Leukemia,11,1605-9），重複するアミノ酸配列の部分が異なる多数のバリエーションが知られている(Kiyoi  H.,et  al.,(1998).Leukemia,12,1333-7;  Hayakawa  F.,et  al.,(2000).Oncogene,19,624-31.)。活性型変異FLT3に起因するシグナル伝達の異常は，ファーストヒットあるいはセカンドヒットとして白血病の発症，進行に関与していることが動物モデルで示されている。また活性型変異FLT3の存在はAMLの予後不良因子であり，AMLや骨髄異形成症候群の疾患の進行（再発，白血病化）に関連することが報告されている（Frohling,S.,et  al.,(2002).Blood,100,4372-80;Gilliland,D.G.&  Griffin,J.D.(2002).Blood,100,1532-42;  Horiike,S.,et  al.,(1997).Leukemia,11,1442-6;  Kiyoi,H.,et  al.,(1999).Blood,93,3074-80;  Kiyoi,H.,et  al.,(2005).Int  J  Hematol,82,85-92;  Kottaridis,P.D.,et  al.,(2001).Blood,98,1752-9;  Nakano,Y.,et  al.,(1999).Br  J  Haematol,104,659-64;  Schnittger,S.,et  al.,(2002).Blood,100,59-66;  Shih,L.Y.,et  al.,(2004).Leukemia,18,466-75;  Shih,L.Y.,et  al,(2002).Blood,100,2387-92）。こうしたことからFLT3シグナルの異常は白血病の発症，進行に重要な役割を果たしていると考えられている。【０００４】
本発明者らは先に，FLT3/ITDをIL-3依存性増殖を示す細胞株である32D，BA/F3に導入し，FLT3/ITDがこれらにおいてIL-3非依存性の増殖や恒常的なMAP  キナーゼ，STAT５の活性化を引き起こすことを示した（Hayakawa,F.,et  al.,(2000).Oncogene,19,624-31）。特にSTAT5の活性化は野生型FLT3を導入した細胞においては認められない現象であり，これがIL-3非依存性増殖の原因となっている可能性が強く示唆されているが，変異FLT3とSTAT5とをつなぐシグナル伝達経路は分かっていない。【０００５】
Robinsonら（Robinson,L.J.,et  al.,(2005).Exp  Hematol,33,469-79）は野生型FLT3を発現する細胞においてFLT3リガンド刺激に伴いSrc  family  kinases  (SFK)の一員であるLynがリン酸化されることを報告している。またFLT3変異体を発現する細胞株における異常なSFKのリン酸化も示しているが，野生型FLT3について行ったものとの実験系の違いから，FLT3変異体発現細胞においてリン酸化しているのが，６種類あるSFKのうちのLynであると特定するにはいたっていない。またFLT3変異体とLynの結合などのデータも何も示されておらず，Lynのリン酸化がFLT3変異体により直接引き起こされることを示唆していない。また彼等はSFK阻害剤(PP1,PP2)によりFLT3変異体を発現する細胞においてSFKのリン酸化が阻害されること，それに伴い細胞増殖が阻害されることも報告している。しかし，この阻害に関しても，彼等の使用したSFK阻害剤が阻害したのはLynであったのか他のSFKであったのかは確認されていない。更にFLT3変異体によりLyn以外のSFKがリン酸化されるのかどうかも明らかにしていない。従って，SFKの中でもLynのリン酸化がFLT3変異体をもつ細胞の増殖に重要であるのか，すなわち白血病の治療標的となりうるのかは不明であった。【０００６】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが，本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【非特許文献１】Yokota,S.,et  al.,(1997).Leukemia,11,1605-9
【非特許文献２】Frohling,S.,et  al.,(2002).Blood,100,4372-80
【非特許文献３】Gilliland,D.G.&  Griffin,J.D.(2002).Blood,100,1532-42
【非特許文献４】Horiike,S.,et  al.,(1997).Leukemia,11,1442-6
【非特許文献５】Kiyoi,H.,et  al.,(1999).Blood,93,3074-80
【非特許文献６】Kiyoi,H.,et  al.,(2005).Int  J  Hematol,82,85-92
【非特許文献７】Kottaridis,P.D.,et  al.,(2001).Blood,98,1752-9
【非特許文献８】Nakano,Y.,et  al.,(1999).Br  J  Haematol,104,659-64
【非特許文献９】Schnittger,S.,et  al.,(2002).Blood,100,59-66
【非特許文献１０】Shih,L.Y.,et  al.,(2004).Leukemia,18,466-75
【非特許文献１１】Shih,L.Y.,et  al,(2002).Blood,100,2387-92）
【非特許文献１２】Hayakawa,F.,et  al.,(2000).Oncogene,19,624-31
【非特許文献１３】Robinson,L.J.,et  al.,(2005).Exp  Hematol,33,469-79
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質を同定する方法，ならびに急性骨髄性白血病の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは，FLT3/ITDとLynがITD変異特異的に結合し，これに伴ってLynがリン酸化されることを見出した。そしてLynを標的としたsiRNAを使用することにより，SFKの中でもLynのリン酸化がFLT3変異体を持つ白血病細胞株におけるSTAT5の異常活性化の原因であり，同細胞株の異常増殖の原因であることを明らかにした。またSFK阻害剤PP2に関して，本阻害剤が阻害しているSFKのリン酸化は80%以上Lynのリン酸化であり，またSTAT5のリン酸化も阻害していることを併せて示した。【０００９】
すなわち，本発明は，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質が試験管内または細胞内で活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害するか否か，および／または活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。本明細書において活性型変異FLT3とは，恒常的に活性化したFLT3キナーゼ活性を示す変異型FLT3をいう。代表的な活性型変異FLT3としては，FLT3/ITDおよびFLT3/TKDがあり，これらはいずれも，恒常的に活性化したFLT3キナーゼ活性を持ち，シグナル伝達の異常活性化をおこし，細胞の異常増殖を引き起こして，白血病の原因となる。この両者は，FLT3活性化のメカニズムに相違があるものの，それ以後のシグナル伝達の相違は報告されておらず，いずれの場合も下流のSTAT5の異常活性化が認められる。【００１０】
別の観点においては，本発明は，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をLynを発現する細胞と接触させ，試験物質がLynの発現を阻害するか否か，および／またはLynによるSTAT5のリン酸化を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。【００１１】
また別の観点においては，本発明は，Lyn遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，Lyn遺伝子に対するリボザイム，Lyn遺伝子に対するｓｉＲＮＡ，PP1，PP2，SU6656，スタウロスポリン，NS-187，KRX-123，およびBMS-354825からなる群より選択される物質を有効成分として含有する急性骨髄性白血病治療剤を提供する。【００１２】
さらに別の観点においては，本発明は，活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害する物質，活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害する物質，Lynの発現を阻害する物質，およびLynによるSTAT5のリン酸化を阻害する物質からなる群より選択される物質を有効成分として含有する急性骨髄性白血病治療剤を提供する。【００１３】
さらに別の観点においては，本発明は，急性骨髄性白血病を治療する方法であって，活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害するか，および／または活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害することを含む方法を提供する。【００１４】
さらに別の観点においては，本発明は，急性骨髄性白血病を治療する方法であって，Lynの発現を阻害するか，および／またはLynによるSTAT5のリン酸化を阻害することを含む方法を提供する。【００１５】
さらに別の観点においては，本発明は，急性骨髄性白血病を治療する方法であって，治療を必要とする患者に，Lyn遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，Lyn遺伝子に対するリボザイム，Lyn遺伝子に対するｓｉＲＮＡ，PP1，PP2，SU6656，スタウロスポリン，NS-187，KRX-123，およびBMS-354825からなる群より選択される物質を投与することを含む方法を提供する。【００１６】
さらに別の観点においては，本発明は，急性骨髄性白血病を治療する方法であって，治療を必要とする患者に，活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害する物質，活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害する物質，Lynの発現を阻害する物質，およびLynによるSTAT5のリン酸化を阻害する物質からなる群より選択される物質を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は，FLT3/ITD導入32D細胞におけるSFKのリン酸化を示す。
【図２】図２は，FLT3とLynの結合を示す。
【図３】図３は，siRNAによりLynの発現を抑制したときのSTAT５のリン酸化およびFLT3/ITDによる細胞増殖の阻害を示す。
【図４】図４は，SFK阻害剤のFLT3/ITDシグナル伝達とこれによる細胞増殖に対する影響を示す。
【図５】図５は，PP2によるC3H/HeNCjマウス内でのFLT3/ITD-32D細胞の増殖の抑制を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
非受容体型チロシンキナーゼLynはSrcファミリーキナーゼ（Src  family  kinase：SFK）の一員であり，血球系に優位に発現している。他のSFKメンバーと同様にLynは受容体に結合し，その受容体からのシグナル発生に関与すると考えられている。もともとLynはB細胞抗原受容体のシグナル伝達因子として発見されたが，最近の研究でエリスロポエチン受容体，GM-CSF受容体，CSF-1受容体，c-kit等の種々のサイトカインレセプターの細胞増殖シグナルの伝達因子としての役割もあることが明らかにされた。【００１９】
本発明においては，下記の実施例に示されるように，FLT3/ITDとLynとが細胞内でITD変異特異的に結合すること，それに伴ってLynがリン酸化されることを明らかにした。またFLT3とLynとが直接結合することを試験管内で示すとともに，その結合は野生型FLT3よりFLT3/ITDに対して親和性があり，FLT3リン酸化依存性であることを示した。FLT3/ITDを導入した32D細胞(FLT3/ITD-32D)に対して，Lynを標的としたsiRNA，またはSFK阻害剤であるPP2いずれで処理した場合でも，その増殖が抑制され，LynとSTAT５のリン酸化が減弱した。更にFLT3/ITD-32Dを移植したマウス（無治療では8週間以内に腫瘍により死亡する）に対してPP2投与を行うと腫瘍の発症が予防されたり，発症した腫瘍が縮小され，マウスの生存が延長されることが示された。これらの結果から，Lynは活性型変異FLT3特異的なシグナル伝達においてSTAT５の上流に位置し，活性型変異FLT3がもたらす細胞増殖に非常に重要な因子であることが明らかになった。さらに，Lynは活性型変異FLT3をもつAMLに対する治療標的となりうることが示された。【００２０】
スクリーニング方法
１つの観点においては，本発明は，多様な試験物質から，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングは，試験物質が試験管内または細胞内で活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害するか否か，および／または活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害するか否かを判定することにより行うことができる。試験物質が活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害する能力は，試験管内においては，単離された活性型変異FLT3と単離されたLynとを用いて，既知の結合分析法により測定することができる。細胞内においては活性型変異FLT3とLyn両方を発現する細胞と試験物質を接触させ，既知の結合分析法により測定できる。活性型変異FLT3を発現する細胞内でのLynのリン酸化は，活性型変異FLT3を発現する細胞と試験物質とを接触させ，既知の方法によりLynのリン酸化の程度を測定することにより評価することができる。これらのアッセイにより，活性型変異FLT3とLynとの結合を有意に阻害するか，および／または活性型変異FLT3を発現する細胞内でのLynのリン酸化を有意に阻害するものとして同定された物質は，急性骨髄性白血病治療剤の抑制剤の候補物質であると考えられる。【００２１】
また，本発明にしたがうスクリーニング方法は，試験物質をLynを発現する細胞と接触させ，試験物質がLynの発現を阻害するか否か，および／またはLynによるSTAT5のリン酸化を阻害するか否かを判定することにより行うことができる。試験物質がLynの発現を阻害する能力は，既知の方法によりLynのmRNA量または蛋白質量を測定することにより評価することができる。試験物質がLynによるSTAT5のリン酸化を阻害する能力は，既知の方法によりSTAT5蛋白質のリン酸化の程度を測定することにより評価することができる。これらのアッセイにより，Lynの発現またはSTAT5のリン酸化を有意に阻害するものとして同定された物質は，急性骨髄性白血病治療剤の抑制剤の候補物質であると考えられる。【００２２】
試験物質は，種々の合成または天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。【００２３】
Lyn遺伝子の発現抑制剤
本発明の急性骨髄性白血病治療剤の例としては，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等の，Lyn遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は，Lynの既知のヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計し製造することができ，Lyn遺伝子またはLynをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，LynをコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。【００２５】
リボザイムとは，標的とする核酸配列を切断しうる触媒的特性を有するＲＮＡ分子を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。【００２６】
急性骨髄性白血病治療剤
別の観点においては，本発明は，活性型変異FLT3とLynとの結合を阻害する物質，活性型変異FLT3を発現する細胞内でLynのリン酸化を阻害する物質およびLynの発現またはLynによるSTAT5のリン酸化を阻害する物質からなる群より選択される物質を有効成分として含有する急性骨髄性白血病治療剤を提供する。Lynを阻害しうる阻害剤としては，例えば，Lynキナーゼ阻害剤としての小化合物（例えば，PP1，PP2，SU6656，スタウロスポリン（staurosporine），NS-187，KRX-123，およびBMS-354825（ダサチニブ；Dasatinib）を含む），Lynキナーゼのアミノ酸配列に基づく基質との結合部位の予測とその部位を阻害するオリゴペプチドあるいは小化合物，Wexlerらの方法（BioTechniques39:575-576,2005）で見出されるであろうキナーゼ阻害剤，ならびにLynの転写・翻訳の抑制（siRNA，アンチセンスなど）が挙げられ，これらのいずれも本発明において用いることができる。本発明の急性骨髄性白血病治療剤は，活性型変異FLT3を有する患者において用いるのに有用であり，特に予後の改善に有用であると考えられる。【００２７】
医薬製剤および投与
本発明の急性骨髄性白血病治療剤は，被験者にそのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤して投与する。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに，本発明の急性骨髄性白血病治療剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもよい。【００２８】
本発明の急性骨髄性白血病治療剤の投与経路としては，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。【００２９】
投与量は，急性骨髄性白血病治療剤の種類や投与経路，疾患の程度等に応じて適宜選択されるが，通常，０．１μg〜１０００mg/Kg，好ましくは，１μg〜１０mg/Kgである。【００３０】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2006-155281号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００３２】
方法
細胞
L-3依存性血球系前駆細胞細胞株32Dに，野生型FLT3とFLT3/ITD（583から602番目のアミノ酸の縦列重複を持つ）遺伝子が安定的に導入され，それぞれWt  FLT3-32DとFLT3/ITD-32Dと名付けられた(Hayakawa,F.,et  al.,(2000).Oncogene,19,624-31)。細胞は，5ng/mlマウスIL-3(KIRIN  Brewery.Co.,Japan)またはFLT3リガンド(R&D  Systems,Minneapolis,MN)を添加された10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI1640培地にて培養された。【００３３】
抗体，試薬，プラスミド
Lyn,FLT3(C-20),Jak2(C-20),およびc-Src,Fyn,Lck,c-Yesに対するウサギポリクローナル抗体，ならびにLynに対するマウスモノクローナル抗体は，Santa  Cruz  Biotechnology(Santa  Cruz,CA)より購入した。JAK2,STAT5,p44/42  MAPK,Akt,Shc,Src  Family(Tyr416)に対するリン酸化特異的ウサギポリクローナル抗体，およびp44/42  MAPK,Akt,に対するリン酸化非特異的ウサギポリクローナル抗体はCell  Signaling  Technology(Beverly,MA)より購入した。抗リン酸化チロシン，抗STAT5，抗Hckマウスモノクローナル抗体は，Transduction  Laboratory(Lexington,KY)より入手した。抗GSTヤギポロクローナル抗体は，Pharmacia(Uppsala,Sweden)より入手した。SFK阻害剤はCalbiochem(La  Jolla,CA)より購入し，ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して使用された。【００３４】
ヒト全長Lyn  Bまたはその部分的断片（1-222アミノ酸，1-169アミノ酸，106-222アミノ酸）をGST融合蛋白として発現させるためのプラスミドLyn(full)/pGEX,Lyn(1-222)/pGEX,Lyn(1-169)/pGEX,Lyn(106-222)/pGEXは，LynB/pHNGAP,(Abe,A.,et  al.,(2004).Biochem  Biophys  Res  Commun,320,920-6)から制限酵素によりLyn遺伝子を切り出し，pGEX5X-1  vector(Pharmacia)へ挿入することによって作られた。FLT3蛋白の試験管内での合成のために，野生型FLT3とFLT3/ITD（583-602アミノ酸の縦列重複を持つ）のcDNAをpcDNA3.1  vector(Invitrogen,Carlsbad,CA)に組み込んだプラスミドを作製し，それぞれWtFLT3/pcDNAおよびFLT3/ITD/pcDNAと名付けた。4F  Wt  FLT3/pcDNAと8F  FLT3/ITD/pcDNAは，QuikChange（商標）site-directed  mutagenesis  kit(Stratagene,La  Jolla,CA)を用いたPCR変異誘発により作製された。【００３５】
細胞溶解液の調整，免疫沈降，イムノブロッティング
細胞溶解液調整のため，サイトカイン飢餓状態においた1ｘ107の細胞が，1mlのリシスバッファ(50mM  Tris-HCl[pH7.6],150mM  NaCl,1%Nonidet  P-40,0.1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS],1mM  バナジン酸ナトリウム,1mM  フッ化フェニルメチルスルホニル[PMSF],1mM  ジチオスレイトール[DTT],10mM  フッ化ナトリウム,および10μg/mlのアプロチニン,ロイペプチンおよびペプスタチンA)に溶解された。免疫沈降とイムノブロッティングは以前に報告された方法で行われた(Hong,S.H.&Privalsky,M.L.(2000).Mol  Cell  Biol,20,6612-25)。【００３６】
FLT3-Lyn試験管内結合実験
試験管内結合実験と蛋白の脱リン酸化は，以前に報告されたやり方に最小限の改良を加えて行われた(Hong,S.H.&Privalsky,M.L.(2000).Mol  Cell  Biol,20,6612-25)。
手短に述べると，GSTまたはGSTに融合させた各種Lynは大腸菌BL21内で発現された。大腸菌溶解，GST蛋白のグルタチオンビーズ(Pharmacia)への結合，精製はメーカーの手引きに従った。ビーズに結合されたGST蛋白は，SDS-PAGE後のクマシーブルー染色により定量された。野生型FLT3とFLT3/ITDは試験管内翻訳転写システム(TnT  kit,Promega,Madison,WI)を用いて，試験管内で合成された。各種FLT3の発現が同等であることは，SDS-PAGE後に抗FLT3抗体によるイムノブロッティングを行って確認した。ビーズに結合された１μgのGST蛋白と5μlのFLT3が，1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む100μlのHEMGバッファ(40mM  Hepes-NaOH[pH7.8],100mM  KCl,5mM  MgCl2,10%グリセロール,0.1%Nonidet  P-40,および0.2mM  EDTA)と供に4°Cで1時間インキュベートされた。ビーズはHEMGバッファで５回洗浄され，SDS-PAGE後，抗FLT3抗体でイムノブロッティングされた。FLT3脱リン酸化反応では結合実験の前に，5μlの合成FLT3が5Uの仔牛腸アルカリホスファターゼ(New  England  Biolabs,Beverly,MA)と供に，10μlの反応液の中で37°C，1時間インキュベートされた。【００３７】
siRNAによるLyn発現抑制
Lynのエクソン5またはエクソン7と8を標的とする2種類のデザイン済みsiRNA(siRNA  ID:156196および156197)は，Ambion(Austin,TX)より購入した。BLOCK-iT  Fluorescent  Oligo（商標）はInvitrogenより購入しコントロールとして使用された。2種類のLyn  siRNAs(各1.5μg)混合物または3μgのコントロールsiRNAはNucleofector  system(amaxa  biosystems,Gaithersburg,MD)により，メーカーの推奨する方法で，一過性に細胞内に導入された。【００３８】
PP2の生体への投与
生後８週のメスC3H/HeNCrjマウスは，Charles  River  Japan  Inc.(Atsugi,Japan)より購入した。それらは名古屋大学動物実験施設のガイドラインに従い，標準的な条件で飼育された。百万個のFLT3/ITD-32D細胞またはWt  FLT3-32D細胞がマウスの背中に皮下投与された。PP2の投与は図５に指示された時点から開始された。PP2投与量は以前の報告を参考に決定された(Nam,J.S.,et  al.,(2002).Clin  Cancer  Res,8,2430-6)。腫瘍の大きさは週２回計測され，腫瘍の重量(TW)は以下の式に従い算出された：
TW(mg)=(d2×D)/2
［d(mm)とD(mm)は腫瘍の最短径と最長径］。【００３９】
結果
FLT3/ITD導入32D細胞におけるLynのチロシンリン酸化
FLT3/ITD-32DがIL-3非依存性増殖を示し，その細胞内ではSTAT５が恒常的活性化を示すことが知られている(Hayakawa,F.,et  al.,(2000).Oncogene,19,624-31)。このため，FLT3/ITDからSTAT５に至る経路に注目し，SFKのリン酸化を調べた。結果を図１に示す。24時間サイトカイン飢餓状態で培養した後，各細胞はIL-3(IL3)またはFLT3リガンド(FL)で10分間刺激されるか，何も刺激されなかった(-)。細胞溶解液は実験方法で述べたように調整された。(A)JAK2リン酸化。10μlの溶解液を使用してSDS-PAGEに続いて抗リン酸化JAK2抗体（写真上）または抗JKA2抗体（写真下）によるイムノブロッティング(IB)が行われた。(B)Lynリン酸化。100μlの細胞溶解液を使用してウサギ(R)抗Lyn抗体により免疫沈降(IP)が行われた。免疫沈降物のそれぞれ90%と10%を用いて抗リン酸化チロシン(pTyr)抗体（写真上）とマウス(M)抗Lyn抗体（写真下）によるIBが行われた。(C)Srcリン酸化。(B)と同様にIPに抗Src抗体，IBに抗リン酸化チロシン抗体，抗Src抗体を使用して行われた。【００４０】
まずIL-3シグナル等でSTAT５の上流因子として知られるJAK2のリン酸化を調べてみたが，野生型FLT3，FLT3/ITDいずれでもJAK2のリン酸化は起きていなかった(図1A)。次に，JAK２以外にSTAT5をリン酸化することが知られているSFKのなかでいずれのSFKがリン酸化されるかを調べるために，まず野生型FLT3またはFLT3/ITDを導入した32D細胞（Wt  FLT3-32D，FLT3/ITD-32D）をサイトカインで刺激，あるいは刺激しない状態で種々のSFKのリン酸化を調べたところ，FLT3/ITD-32DではLynの恒常的なリン酸化が認められた。一方，Wt  FLT3-32DではFLT3リガンド刺激をしてものLynリン酸化は認められなかった(図1B)。別のSFKであるSrcに関してもリン酸化状態を調べてみたが，両細胞間でサイトカインの有無に関わらず差は認められなかった(図1C)。このことはLynがFLT3/ITDシグナル伝達においてSTAT５の上流因子であること，およびそのシグナル伝達はFLT3/ITDがもたらす細胞増殖作用に関与することを示唆している。図1Bで示した実験により，FLT3/ITDにより異常活性化されているとRobinsonらが報告しているSFKのリン酸化は，Lynのリン酸化であることが明らかにされた。なお，この報告では野生型FLT3によるLynのリン酸化が報告されているが，我々の実験ではこの事実は認められなかった。【００４１】
LynとFLT3の結合は明らかにFLT3/ITDにおいて強くまたFLT3のリン酸化に依存している。
次にFLT3とLynの結合はFLT3/ITDに特異的なのかどうかを調べるため，抗FLT3抗体をで免疫沈降し，抗Lyn抗体でイムノブロッティングする共沈実験を行った。結果を図２に示す。６時間サイトカイン飢餓状態で培養した後，細胞は図１で述べたようにサイトカイン刺激され，細胞溶解液が調整された。(A)細胞内におけるFLT3とLynの結合。100μlの溶解液が抗FLT3抗体による免疫沈降に使用された。免疫沈降物の90%と10%がそれぞれSDS-PAGEされた後，抗Lyn抗体(M)（写真上）または抗FLT3抗体(写真下)によりイムノブロッティングされた。(B)抗Lyn抗体(R)を免疫沈降に抗FLT3抗体または抗Lyn抗体(M)をイムノブロッティングに使用する鏡面的共沈実験が（A）と同様のやり方で行われた。(C)FLT3対Lynの試験管内結合実験。野生型と変異FLT3は試験管内で合成され，その発現が同等であることは抗FLT3抗体を用いたイムノブロッティングで確認された(データ示さず)。等量（５μl）のFLT3蛋白が，１μgのGST(G)またはGSTに融合したLyn(L)を結合したグルタチオンビーズにより沈降された。沈降物はSDS-PAGEの後抗FLT3抗体でイムノブロッティングされた（写真左）。結合実験に使われたのと同じFLT3蛋白は抗FLT3抗体でも免疫沈降され，SDS-PAGE後抗リン酸化チロシン抗体または抗FLT3抗体によりイムノブロッティングされた（写真右）。(D)脱リン酸化後の試験管内結合実験。試験管内で合成されたFLT3は結合実験の前に図中に示されているように仔牛腸アルカリホスファターゼ(CIP)を含むかまたは含まない脱リン酸化反応液と供にインキュベートされた。試験管内結合実験およびFLT3のリン酸化状態の確認は(C)で述べた如くに行われた。(E)各種Lyn，FLT3コンストラクトのシェーマFLT3/ITDの縦列重複部の位置とアミノ酸配列が図示されている。4FWt  FLT3と8F  FLT3/の黒丸はそれぞれWt  FLT3とFLT3/ITDのアミノ酸配列と同じであることを意味している。(F)Lynにおける結合領域の同定。Lynの様々な部分のGST融合蛋白が図示された如くに使用され，結合実験は（C）で述べた通り行われた。沈降物の９０％は抗FLT3抗体でイムノブロッティングされ10%は抗GST抗体によりイムノブロッティングされた。(G)FLT3の結合部位の同定。試験管内結合実験およびリン酸化状態の確認は(C)で述べた通り行われた。【００４２】
LynとFLT3の結合（共沈）は，FLT3/ITD-32Dでは認められたが，Wt  FLT3-32DではFLT3リガンド刺激しても認められなかった(図2A)。この変異特異的なFLT3とLynの結合は，免疫沈降に抗Lyn抗体，イムノブロッティングに抗FLT3抗体を使用した鏡面的共沈実験でも確認された(図2B)。更にその結合が直接的なものであるのか他の因子を介しているのかを調べるために，試験管内での結合実験を行った。LynのSH3とSH2領域が含まれるN端側半分とGSTの融合蛋白は合成FLT3と試験管内で結合し，両者は直接結合することが示唆された(図2C左パネル)。注目すべきことに，野生型FLT3もFLT3/ITDよりはずっと弱いがLynとの結合を示し，FLT3とLynの結合における変異特異性は絶対的なものではないと考えられた。多くの場合，レセプターチロシンキナーゼ（RTK）とSFKの結合はレセプターのチロシンリン酸化に依存している(Boggon,T.J.&  Eck,M.J.(2004).Oncogene,23,7918-27)。そこで試験管内結合実験に使用した合成FLT3のリン酸化状態を調べ，これがこのシステムにおけるFLT3とLynの結合に影響しているのかどうかを検討した。ウサギ網状赤血球溶解液を使用するシステムで合成されたFLT3は，自己チロシンリン酸化を起こしており，そのリン酸化はFLT3/ITDの方が野生型FLT3よりずっと強かった(図2C右パネル)。このことから，FLT3とLynの結合はFLT3のチロシンリン酸化に依存しており，FLT3のリン酸化の程度の違いが結合の違いの原因になっている可能性が示唆された。【００４３】
この結合のリン酸化依存性を調べるために，脱リン酸化されたFLT3を用いて試験管内結合実験を行った。予想通り，FLT3の脱リン酸化により野生型，変異型どちらのFLT3においてもLynとの結合が消失し，そのFLT3リン酸化依存性が示唆された。多くの場合リン酸化チロシンの認識にはSH2領域が関わっているので，この結合のFLT3チロシンリン酸化依存性を更に明らかにするため，LynのSH2領域がこの結合に関与しているのか否かを調べた。更にFLT3のLyn結合領域として最も可能性が高いと考えられる傍膜部領域のチロシン−フェニルアラニン置換の両者の結合に与える影響も調べた。図2Eに示したようなLynの様々な部分とGSTとの融合蛋白と合成FLT3/ITDを使用した試験管内結合実験により，Lyn  SH2領域のこの結合への関与が明らかになった(図2F)。使用したFLT3/ITDは傍膜部領域の中でも野生型FLT3の583-602アミノ酸に相当する部分の縦列重複を持っている。野生型FLT3およびFLT3/ITDに対してこの領域に存在する４個および８個のチロシンをフェニルアラニンに置換し（それぞれ4F置換，8F置換と命名）得られた変異FLT3をそれぞれ4F  Wt  FLT3および8F  FLT3/ITDと名付けた(図2E)。試験管内結合実験において4F  Wt  FLT3と8F  FLT3/ITDは減弱したLynとの結合（それぞれWt  FLT3とFLT3/ITDのおよそ30%位）を示した(図2G左パネル)。また4Fおよび8F置換により野生型FLT3，FLT3/ITDのチロシンリン酸化は著明に減少した(図2G右パネル)。これらのデータから，置換されたチロシンは野生型FLT3，FLT3/ITDの自己リン酸化におけるリン酸化サイトであり，これらチロシンのリン酸化はLynのSH2領域で認識されることが示唆された。図2A-Gで示された野生型および変異型FLT3とLynの結合，その結合部位の同定，ならびにその結合のFLT3リン酸化依存性は，全て本発明において初めて明らかになったことである。【００４４】
siRNAによる特異的なLynシグナルの阻害はFLT3/ITDによる細胞増殖を特異的に抑制した。
Lyn特異的なDNA配列をもとにデザインしたsiRNAによりLynの発現を抑制することで，FLT3/ITDによるサイトカイン非依存性増殖におけるLyn活性化の意義を調べた。結果を図３に示す。siRNAによるLynの発現抑制。IL-3存在下で培養されている百万個のFLT3/ITD-32Dは，3μgのコントロールsiRNA(C)または1.5μgずつ２種類のLyn  siRNAの混合物をNucleofectorシステムを用いて細胞導入された。導入の２４時間後，細胞は洗浄されてサイトカイン飢餓状態に24時間おかれた。それから細胞溶解液が調整され，SDS-PAGE後，図示の如くLyn,c-Src,Fyn,Lck,c-YesそしてHckに対する抗体によるイムノブロッティングが行われた。(B)STAT５の特異的な阻害。(A)と同じ溶解液が図示のようなリン酸化特異的抗体によるイムノブロッティングに使用された。SFK以外の各シグナル伝達因子の発現が同等であったことは対応するリン酸化非特異的抗体によるイムノブロッティングで確認された(データ示さず)。(C),(D)FLT3導入各種32D細胞の増殖に対するsiRNAによるLyn発現抑制の影響。Wt  FLT3-32DとFLT3/ITD-32Dは(A)で述べた如くIL-3存在下で培養され，siRNAを導入された。細胞は導入24時間後洗浄され，図示の如く5ng/mlのIL-3(IL3)，FLT3リガンド(FL)またはサイトカインなし(-)の培養液で，2×105個/mlの密度で再懸濁された(Time  0)。各時点での生存細胞数はトリパンブルー排除法（trypan  blue  exclusion  method）により計測され，Time  0時点での値(2×105個/ml)に対する比を算出してグラフを作成した。各実験は２重に２回行われ，その平均値と標準偏差が示されている。【００４５】
FLT3/ITD-32Dにおいて，Lyn  siRNAによりLynの発現がおよそ90%程度抑制されたことがイムノブロッティングで確認された。更に発現抑制の特異性もイムノブロッティングで確認された。すなわち，Lyn以外の５つのSFKの発現はいずれも明らかな影響は受けていなかった(図3A)。FLT3/ITDシグナル伝達におけるLyn発現抑制の影響は，各シグナル伝達因子に対するリン酸化特異的抗体によるイムノブロッティングで調べられた。SFKのリン酸化は著明に，およそ20%程度にまで減少していた。Lyn以外のSFKの発現は影響を受けていなかったことを考慮すると，このSFKリン酸化の減少はLyn発現抑制により起きていると考えられる。このことは，FLT3/ITD-32D細胞において，抗リン酸化SFK抗体により検出されたリン酸化は主にLynのリン酸化であり，この抗体はFLT3/ITD-32D細胞におけるLynのリン酸化を検出するのに使用可能であることを示している。STAT５のリン酸化はコントロールの50%程度にまで減少したが，MAPキナーゼ，Akt，Shcのリン酸化は影響を受けなかった(図3B)。ここで示したように，抗リン酸化SFK抗体の認識するリン酸化がLyn特異的な発現抑制により大幅に(80%以上)減少することを示すことで初めて，このリン酸化が（８０％以上）Lynのリン酸化であるということができる。Robinsonらの前述の報告ではこうした実験が行われていないので，観察されたリン酸化はいずれのSFKのリン酸化であるか不明である。【００４６】
Lyn発現抑制による特異的なSTAT５リン酸化の阻害はFLT3/ITDシグナル伝達経路においてLynがSTAT５の上流因子であることを示唆している。
Lyn  siRNAのFLT3導入32Dの増殖に対する影響を調べた。IL-3非存在下では，FLT3/ITD-32Dの増殖はLyn  siRNAにより著明に抑制された(図3D)。一方IL-3存在下では，Wt  FLT3-32D細胞もFLT3/ITD-32D細胞もその増殖は影響を受けなかった。FLT3リガンドによるWt  FLT3-32D細胞の増殖も影響を受けなかった(図3Cおよび3D)。これらの結果から，Lynは野生型FLT3シグナルやIL-3シグナルで誘導される細胞増殖よりも，FLT3/ITDシグナルにより誘導される細胞増殖において，より重要であると考えられた。なお，Robinsonらの前述の報告でも使用されている，PP1およびPP2といったSFK阻害剤は，SFKの中での選択性は明かではないため，SFK阻害剤で細胞の増殖が抑制されたとしても，それがどのSFKの阻害によるのか，すなわちどのSFKが細胞増殖に重要であるのかを同定することはできない。本発明において示されたように，Lyn特異的な発現抑制をすることで初めてLynが重要であることを同定することができる。すなわち，FLT3変異体を発現する細胞においてその細胞増殖にLynが重要であることが同定されたのは今回が初めてである。【００４７】
SFK阻害剤PP2によるFLT3/ITD-32D細胞増殖の抑制
FLT3/ITDによる細胞増殖におけるLynの重要性を更に確認するために，SFK阻害剤PP2(Hanke,J.H.,et  al.,(1996).J  Biol  Chem,271,695-701)の，Wt  FLT3-32DおよびFLT3/ITD-32Dの増殖に対する影響を調べた。両方の細胞株は様々な濃度のPP2で２４時間培養された。結果を図４に示す。(A)PP2による濃度依存性の増殖抑制。Wt  FLT3-32D(Wt)または  FLT3/ITD-32D(Mut)はIL-3存在下／非存在下で図示された濃度のPP2添加の下24時間培養された。24時間後の各濃度での生存細胞数はトリパンブルー排除法（trypan  blue  exclusion  method）により計測された。各数値より0μMでの値に対する比を%で算出してグラフを作成した。各実験は３重に２回行われ，その平均値と標準偏差が示されている。(B)PP2処理された細胞の増殖曲線。FLT3/ITD-32DはIL-3(2ng/ml)とPP2(10μM)を図示されたような組み合わせで添加されて培養された。生細胞数の計測とグラフの作成は図3Cと同様。各実験は３重にで２回行われ，その平均値と標準偏差が示されている。(C),(D)PP2処理されたFLT3/ITD-32Dにおけるシグナル阻害。IL-3存在下／非存在下で培養されるFLT3/ITD-32Dに10μMのPP2が添加された。図示された時点で細胞溶解液が前述のように調整された。FLT3リン酸化は，抗FLT3抗体を免疫沈降に使用した以外は図1Bと同様に調べられた。他のシグナル伝達因子のリン酸化は図3Bと同様に調べられた。各時点間での各因子の発現，あるいはFLT3免疫沈降の効率が同等であることは，対応するリン酸化非特異的抗体によるイムノブロッティングにより確認された。【００４８】
増殖抑制効果は明らかに濃度依存性であり，IL-3非存在下で培養したFLT3/ITD-32Dにおいて強かった。IL-3不在下でのFLT3/ITD-32Dに対するGI50は，IL-3存在下のWt  FLT3-32DやFLT3/ITD-32Dのそれのおよそ３分の１であった(5μM  vs.17.7μM)(図4A)。IL-3存在下と非存在下で，PP2  10μM添加時のFLT3/ITD-32Dの細胞増殖曲線も比較された。IL-3不在下ではFLT3/ITD-32Dの増殖はPP2により完全に阻害された。ただしIL-3存在下でもある程度の増殖抑制が認められた(図4B)。PP2による細胞増殖抑制は，IL-3により誘導される細胞増殖よりも，FLT3/ITDによるものに対してより効果が高いと考えられ，このことはFLT3/ITDにより起こる癌に対してPP2が抗腫瘍薬として働く可能性を示している。次にFLT3/ITDまたはIL-3により誘導されるシグナル伝達因子のリン酸化に対するPP2の影響を，抗リン酸化抗体を用いて経時的に観察した。FLT3/ITD-32DではFLT3のリン酸化状態は10μMのPP2による処理では変化なかった(図4C,上パネル)。しかし，IL-3非存在下では，主にLynのリン酸化からなるSFKのリン酸化は１時間以内に急速に消失し，STAT５のリン酸化もそれに続いて６時間以内に消失した。MAPキナーゼリン酸化の軽度減弱が12時間後に認められ，Akt，Shcのリン酸化は影響を受けなかった(図4C)。JAK2のリン酸化はどの時点でも認めなかった(データ示さず)。一方IL-3が存在するとJAK2のリン酸化が認められ，それは12時間後に軽度抑制されていた。そしてJAK2のリン酸化が残存しているのに一致して，STAT５のリン酸化も残存していた。MAPキナーゼリン酸化の減弱はIL-3不在下と同じ程度に認められた(図4D)。AktとShcのリン酸化は影響を受けなかった(データ示さず)。これらの結果から，シグナル伝達因子のリン酸化阻害が，Lyn阻害の直接の効果であるのか，Lyn以外のSFK阻害の効果であるのか，あるいはSFK以外のキナーゼの阻害によるのかは判断できなかった。しかしPP2によるシグナル阻害は，STAT５に対してより強く起きているようにみえ，このことはLynがSTAT５の上流因子であるという仮説を裏付ける。【００４９】
マウスモデルにおけるFLT3/ITDによる腫瘍に対するPP2の治療効果
SFK阻害剤のFLT3/ITDにより起こる癌に対する治療薬としての可能性を検討するために，先に開発したFLT3/ITDにより発症した腫瘍のマウスモデル（FLT3/ITD-32Dを放射線照射していないマウスに接種することで作る）を使用した(Zhao  et  al.,(2000).Leukemia,14,374-8.)。結果を図５に示す。6匹のマウスが第１日目にFLT3/ITD-32Dを皮下に接種され，DMSOに溶解された5μgまたは10μgのPP2またはDMSOのみを週２回，第４日目から６３日目まで腹腔内投与された。FLT3/ITD-32D(1×106個の細胞)が生後８週のメスC3H/HeNCjマウスに皮下接種された。(A)PP2の先行投与は腫瘍の発症を予防する。各マウスは100μlのDMSOに溶解された5μgまたは10μgのPP2またはDMSOのみを週２回，第４日目から６３日目まで腹腔内投与(ip.)された。コントロールマウスはDMSOを投与され第８週で死亡した（クロスで表示）。(B)腫瘍発症後のPP2の投与は腫瘍の進行を抑制する。
FLT3/ITD-32Dを接種された全てのマウスは第25日目までに腫瘍を発症した。第25日目から63日目まで100μlのDMSOに溶解した図示された量のPP2を週２回腹腔内投与された。【００５０】
コントロールマウスでは第２５日目より皮下腫瘍は急速に増大し，第４５日目までに全てのマウスが死亡した。対称的に10μgのPP2を投与された群は明らかな腫瘍は発生しなかった。5μgのPP2を投与された群では第２５日目以降腫瘍が発生したが観察期間全体に渡ってその増殖は著明に抑制されていた。腫瘍の重量はコントロール群に発生した腫瘍のおよそ3分の１であった(図5A)。【００５１】
腫瘍の進行に対するPP2の効果が次に検討された。６匹のマウスにFLT3/ITD-32Dが接種され，全てが第２５日目までに腫瘍を発症した。これらマウスは腫瘍が発症してから（第２５日目）PP2またはDMSOが投与された。コントロールマウスでは皮下腫瘍は急速に増大し，第４５日目までに全てのマウスが死亡した。一方30μgのPP2が投与された群では腫瘍の進展は緩やかで全てのマウスは第６３日目でもまだ生存していた。更に60μgのPP2を投与された群では更に強い増殖抑制が認められた。すなわち第３５日目までに腫瘍は検知できないまでに縮小した(図5B)。この群のマウスは２匹ともPP2の投与終了後も20週間以上腫瘍が増大することなく生存し続けた。これらの結果は，PP2はここで使用した量においては，FLT3/ITDによる腫瘍の予防と治療に安全かつ効果的な薬剤であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は，急性骨髄性白血病治療剤の候補物質のスクリーニングならびに急性骨髄性白血病の治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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