(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、
前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、
を含み、
前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを結合させた状態で高周波誘導加熱を行うことにより、
前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とがハイブリダイズすることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合を弱める、アプタマー・導電性粒子複合体。
【請求項２】
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、
前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、
を含み、
前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で、前記アプタマー部分および前記プローブ部分がハイブリダイズした状態で、かつ、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを結合させた状態で、高周波誘導加熱を行うことにより、
前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とのハイブリダイゼーションを解離させることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合を強める、アプタマー・導電性粒子複合体。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記指示タンパク質が酵素である、アプタマー・導電性粒子複合体。
【請求項４】
請求項３において、
前記酵素がトロンビンである、アプタマー・導電性粒子複合体。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、
前記導電性粒子が金粒子である、アプタマー・導電性粒子複合体。
【請求項６】
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、
前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、
前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブ部分と、
を含む、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体。
【請求項７】
請求項６において、
前記指示タンパク質が酵素である、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体。
【請求項８】
請求項７において、
前記酵素がトロンビンである、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれかにおいて、
前記導電性粒子が金粒子である、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体。
【請求項１０】
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、を含むアプタマー・導電性粒子複合体を準備し、
前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを接触させた状態で高周波誘導加熱を行うこと、
を含み、
前記高周波誘導加熱は、前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で行なわれ、
前記高周波誘導加熱によって、前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とがハイブリダイズすることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が弱まる、指示タンパク質の特性を制御する方法。
【請求項１１】
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、を含むアプタマー・導電性粒子複合体を準備し、
前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で、前記アプタマー部分および前記プローブ部分がハイブリダイズした状態、かつ前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを接触させた状態で高周波誘導加熱を行うこと、
を含み、
前記高周波誘導加熱によって、前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とのハイブリダイゼーションを解離させることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が強まる、指示タンパク質の特性を制御する方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１において、
前記指示タンパク質が酵素である、指示タンパク質の特性を制御する方法。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記酵素がトロンビンである、指示タンパク質の特性を制御する方法。
【請求項１４】
請求項１０ないし１３のいずれかにおいて、
前記導電性粒子が金粒子である、指示タンパク質の特性を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高周波誘導加熱によって、指示タンパク質の特性を制御することができるアプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、特定の分子に結合する核酸分子であり、１９９０年にＧｏｌｄらによって初めてその基本概念が提示された（非特許文献１）。非特許文献１には、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Liogands by Exponential Enrichment）法と呼ばれる手法を用いてアプタマーを取得する方法が開示されている。
【０００３】
アプタマーは一般に、大量合成が容易であり、かつ修飾が簡単であるという特徴を有することから、例えば、分子認識、構造プロテオミクス、創薬の分野で有用なツールであるとして期待されている。
【非特許文献１】Tuerk, C. and Gold L., Systematic evolution of ligans by exponential enrichment: RNA ligans to bacteriopharge T4 DNA polymerase, Science, 249, 505-510, (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、特定のタンパク質と結合してその特性を変化させることができるアプタマー部分と、アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子とを含むアプタマーを用いて、該アプタマーと特定のタンパク質とを接触させた状態で高周波誘導加熱を行うことにより、特定のタンパク質の特性を制御しうることを見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、高周波誘導加熱によって、指示タンパク質の特性を制御することができるアプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法を提供することである。
【０００６】
本発明の第１の態様のアプタマー・導電性粒子複合体は、
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、
前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、
を含む。
【０００７】
高周波誘導加熱とは、被加熱物に高周波交流磁場（ＲＦＭＦ： Radio-Frequency magnetic field）を照射し、交流電流によって被加熱物の表面付近に高密度のうず電流を発生させることにより生じるジュール熱によって、被加熱物の表面を加熱することをいう。
【０００８】
前記アプタマー・導電性粒子複合体は、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを結合させた状態で高周波誘導加熱を行うことにより、前記指示タンパク質の特性を制御するためのアプタマー・導電性粒子複合体であることができる。
【０００９】
前記アプタマー・導電性粒子複合体において、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質とを結合させた状態で高周波誘導加熱を行うことにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合様式が変化することができる。
【００１０】
この場合、前記高周波誘導加熱は、前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で行なわれ、前記高周波誘導加熱によって、前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とがハイブリダイズすることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合様式が変化することができる。
【００１１】
前記アプタマー・導電性粒子複合体において、前記結合様式の変化は、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が弱まることであることができる。
【００１２】
前記アプタマー・導電性粒子複合体において、前記結合様式の変化は、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が強まることであることができる。
【００１３】
前記アプタマー・導電性粒子複合体において、前記指示タンパク質が酵素であることができる。
【００１４】
この場合、前記酵素がトロンビンであることができる。
【００１５】
前記アプタマー・導電性粒子複合体において、前記導電性粒子が金粒子であることができる。
【００１６】
本発明の第２の態様のアプタマー・導電性粒子・プローブ複合体は、
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、
前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、
前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブ部分と、
を含む。
【００１７】
前記アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体において、前記指示タンパク質が酵素であることができる。
【００１８】
この場合、前記酵素がトロンビンであることができる。
【００１９】
前記アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体において、前記導電性粒子が金粒子であることができる。
【００２０】
本発明の第３の態様の指示タンパク質の特性を制御する方法は、
指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、前記アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、を含むアプタマーを準備し、
前記アプタマーと前記指示タンパク質とを接触させた状態で高周波誘導加熱を行うこと、
を含む。
【００２１】
前記方法において、前記高周波誘導加熱は、前記アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブ部分の存在下で行なわれ、前記高周波誘導加熱によって、前記アプタマー部分の少なくとも一部と前記プローブ部分とがハイブリダイズすることにより、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合様式が変化することができる。
【００２２】
この場合、前記結合様式の変化は、前記アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が弱まることであることができる。
【００２３】
前記方法において、前記指示タンパク質が酵素であることができる。
【００２４】
この場合、前記酵素がトロンビンであることができる。
【００２５】
前記方法において、前記導電性粒子が金粒子であることができる。
【発明の効果】
【００２６】
前記アプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法によれば、高周波誘導加熱によって、指示タンパク質の特性を制御することができる。特に、高周波誘導加熱を用いることにより、高周波交流磁場が照射された領域のみを局所加熱することが可能であるため、高周波交流磁場が照射された領域においてのみ指示タンパク質の特性を制御することができる。すなわち、高周波交流磁場が照射された領域以外の領域は加熱されないため、高周波交流磁場が照射された領域以外の領域にダメージが加わることがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の一実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法について詳細に説明する。
【００２８】
１．アプタマー、アプタマー・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法
１．１．アプタマー
本発明の一実施形態に係るアプタマーは、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマーであって、加熱によって、前記アプタマーの少なくとも一部と、前記アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブとがハイブリダイズすることにより、前記アプタマーと前記指示タンパク質との結合様式が変化する。
【００２９】
本明細書において、「アプタマー」とは、特定の分子に結合する核酸リガンドを表す。本実施形態に係るアプタマーは、ＤＮＡ合成機で固相合成することにより容易に製造することができる。
【００３０】
これまでにアプタマーが得られているターゲットの例としては、以下のものが挙げられる：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒ１７コートタンパク質、ＭＳ２コートタンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ１タンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｒｈｏタンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ ３０Ｓ粒子＋Ｓ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ３０Ｓ粒子−Ｓ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｍｅｔＪタンパク質、ＱＢレプリカーゼ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパク質、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ−１ ｉｎｔタンパク質、ＨＩＶ−１リバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＦＩＶリバーストランスクリプターゼ、ＨＴＬＶ−１ ｒｅｘペプチド、Ｕ１Ａ、Ｕ２ＡＦ、トロンビン、エラスターゼ、テオフィリン、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン、ｐＰＬＡ２、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、抗ｇｐ−１０抗体、ＳＬＥモノクローナル抗体、抗インスリンレセプター、ＩｇＥ、ＦＭＮ、ＡＭＰ、アルギニン、シトルリン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、ヘマトポルフィリン、キチン、コール酸（Hermann, et, al., (2000), Adaptive recognition by nucleic acid aptamers, Science, 287, 820-825.）。また、アプタマーの選択および応用に関するさらに詳細な説明は、Osborene SE, Ellington, AD. (1997), Nucleic Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry. Chem Rev. Apr1; 97(2):349-370に見いだすことができる。
【００３１】
本実施形態に係るアプタマーは、アプタマーと指示タンパク質とを結合させた状態で加熱を行うことにより、指示タンパク質の特性を制御するためのアプタマーであることができる。より具体的には、本実施形態に係るアプタマーは、アプタマーと指示タンパク質とを結合させた状態で加熱を行うことにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式を変化させることができる。
【００３２】
すなわち、このアプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブおよび指示タンパク質の存在下で、加熱によって、アプタマーの少なくとも一部とプローブとがハイブリダイズすることにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式が変化し、その結果、指示タンパク質の特性が変化する。この結合様式の変化は、アプタマーの構造の変化によるか、またはプローブの構造による立体障害によるものと考えられる。しかしながら、本実施形態に係るアプタマーは、結合様式の変化のメカニズムにより限定されるものではない。
【００３３】
ここで、結合様式の変化は、例えば、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まることである。指示タンパク質が酵素である場合、アプタマーと酵素との結合が弱まることにより、アプタマーによる酵素活性の阻害が軽減され、その結果、酵素活性を高めることができる。あるいは、結合様式の変化は、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まることであってもよい。
【００３４】
１．２．指示タンパク質の特性を制御する方法
本実施形態に係る指示タンパク質の特性を制御する方法は、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマーを準備し、アプタマーと指示タンパク質とを接触させた状態で加熱を行うこと、を含む。
【００３５】
上述したように、加熱は、アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下で行なわれ、加熱によって、アプタマーの少なくとも一部とプローブとがハイブリダイズすることにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式が変化することができる。ここで、上述したように、結合様式の変化は、例えば、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まることであってもよいし、あるいは、結合様式の変化は、アプタマー部分と前記指示タンパク質との結合が強まることであってもよい。
【００３６】
１．３．指示タンパク質
指示タンパク質とは、その特性の変化により検出可能なシグナルを生ずるタンパク質である。指示タンパク質としては、例えば、酵素、蛍光タンパク質、レセプター、特定のレセプターと結合するリガンド等を用いることができる。好ましい指示タンパク質は酵素である。トロンビンは、活性の測定が容易であること、および活性を阻害するアプタマーが複数報告されていることから、本発明において指示タンパク質として用いるのに特に適している。さらに、ＳＥＬＥＸにより事実上あらゆる酵素に対してそれに結合するアプタマーを取得することが可能であるため、任意の酵素についてその活性を阻害するアプタマーを取得し、その配列に基づいて、本実施形態に係るアプタマーを設計することにより、その酵素を指示タンパク質として用いることができる。
【００３７】
指示タンパク質が酵素である場合、指示タンパク質の特性の変化は酵素活性の変化として容易に測定することができる。酵素活性の変化は、分光学的手法または電気化学的手法により測定することができる。例えば、酵素としてトロンビンを用いる場合、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを用い、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度（４１０ｎｍ）を測定することによってトロンビンの活性を測定する。あるいは、血漿に終濃度が一定になるようにフィブリノーゲンおよびトロンビンを加え、トロンビンによるフィブリノーゲンの切断によって開始される血液凝固を測定することによって、トロンビンの活性を測定することもできる。血液凝固の測定は様々な方法があり、分光学的方法による屈折率の変化の測定、血漿に金属球を添加し血液凝固に伴うその運動の停止を観察する方法、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、干渉増幅反射法（In terference Enhanced Reflection;IER）などによる測定も可能である。また、酵素として
は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の検出用の標識として用いられるいずれの酵素も用いることができる。
【００３８】
酵素反応の検出法としては、従来からよく使われている比色法など様々な方法が利用できるが、好ましくは測定系を単純化することが可能であり、微小化、集積化、量産化が可能な電気化学的測定法である。
【００３９】
指示タンパク質としてレセプターを用いる場合、レセプターとそれに対するリガンドとの結合または解離の結果として放出される物質を分光学的方法で検出することができる。また、指示タンパク質として蛍光タンパク質を用いる場合、その蛍光特性を観察すればよい。
【００４０】
１．４．アプタマー・プローブ複合体
本実施形態に係るアプタマー・プローブ複合体は、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブ部分と、を含む。
【００４１】
本発明において、「アプタマー部分」とは、指示タンパク質に対してアプタマーとして作用し、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができる領域をいう。アプタマー部分としては、例えば、上述の本実施形態に係るアプタマーが挙げられる。
【００４２】
また、プローブ部分としては、例えば、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、プローブ部分は、アプタマー部分の３’末端および５’末端の一方または両方の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
本実施形態に係るアプタマー・プローブ複合体は、例えば、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブの存在下で、上述の本実施形態に係るアプタマーおよび指示タンパク質を加熱することにより、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まるとともに、該プローブと該アプタマーの少なくとも一部とがハイブリダイズすることにより形成される。
【００４４】
１．５．具体例
以下、図面を参照して、本実施形態に係るアプタマー、アプタマー・プローブ複合体、および該アプタマーを用いて指示タンパク質の特性を制御する方法の具体例について説明する。本具体例では、図１に示すアプタマーを用いて指示タンパク質の特性を制御する方法について説明する。
【００４５】
図１は、本実施形態に係るアプタマーの一具体例の構造を模式的に示す図である。図２は、本実施形態に係るアプタマーを用いて指示タンパク質の特性を制御する方法の一具体例を模式的に示す図である。なお、図２に示されるアプタマーおよびアプタマー・プローブ複合体の構造は、単に本実施形態に係る指示タンパク質の特性を制御する方法の原理および概念を説明するための模式図であって、本実施形態に係るアプタマーおよびアプタマー・プローブ複合体の立体構造、指示タンパク質との結合様式、およびそれらの変化のしかたを限定するものではない。
【００４６】
図２は、アプタマー１０の３’末端とプローブ１１とのハイブリダイゼーションにより、指示タンパク質４０との結合が弱まるアプタマー１０の例を示している。本具体例においては、このアプタマー１０はトロンビンアプタマーであり、指示タンパク質４０はトロンビンである場合を示す。トロンビンアプタマーの具体的な構造は図１に示されている。
【００４７】
プローブ１１は、アプタマー１０の少なくとも一部とハイブリダイズしうるものであり、アプタマー１０の３’末端または５’末端の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい。例えば図１には、アプタマー１０の３’末端または５’末端の配列に相補的な配列を有する６つのオリゴヌクレオチドが例示されている。これらの６つのオリゴヌクレオチドはそれぞれ、アプタマー１０の３’末端に相補的な配列を有する８−ｍｅｒ，９−ｍｅｒ，１０−ｍｅｒプローブ、ならびに、アプタマー１０の５’末端に相補的な配列を有する９−ｍｅｒ，１０−ｍｅｒ，１１−ｍｅｒプローブである。
８−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCC 3’（配列番号３）
９−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCC 3’（配列番号４）
１０−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCCC 3’（配列番号２）
９−ｍｅｒプローブ：5 ’CTACCAGTG 3’（配列番号５）
１０−ｍｅｒプローブ：5 ’CCTACCAGTG 3’（配列番号６）
１１−ｍｅｒプローブ：5 ’ACCTACCAGTG 3’（配列番号７）
【００４８】
これらのオリゴヌクレオチドはいずれも、プローブ１１として使用可能である。なお、図２には、プローブ１１が、３’末端の配列に相補的な配列を有する１０−ｍｅｒプローブ（配列番号２）である場合が示されている。
【００４９】
アプタマー１０が加熱される前は、アプタマー１０は指示タンパク質４０と結合して、指示タンパク質４０の酵素活性が阻害される（図２左図参照）。このアプタマー１０に熱１２が付加されると（図２中央図参照）、アプタマー１０のコンフォメーションが変化し、アプタマー１０の３’末端鎖および５’末端鎖の間の結合が切断される。その結果、プローブ１１がアプタマー１０の３’末端とハイブリダイズすることにより、アプタマー１０は指示タンパク質４０と強く結合することができず、指示タンパク質４０であるトロンビンは、酵素活性を示す（図２右図参照）。これにより、アプタマー部分（アプタマー１０）と、該アプタマー部分の３’末端の配列とハイブリダイズされたプローブ部分（プローブ１１）とを含むアプタマー・プローブ複合体５０が形成される。
【００５０】
なお、後述する実施例１において、プローブ１１の存在下で図１に示すアプタマー１０を加熱した場合における指示タンパク質４０の活性を測定した実験の方法および結果を示す。
【００５１】
２．アプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法
２．１．アプタマー・導電性粒子複合体
本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体は、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、を含む。
【００５２】
より具体的には、本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体は、アプタマー部分と指示タンパク質とを結合させた状態で高周波誘導加熱を行うことにより、指示タンパク質の特性を制御するためのアプタマー・導電性粒子複合体であることができる。
【００５３】
すなわち、このアプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブおよび指示タンパク質の存在下で、高周波誘導加熱によって、アプタマーの少なくとも一部とプローブとがハイブリダイズすることにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式が変化し、その結果、指示タンパク質の特性が変化する。この結合様式の変化は、アプタマーの構造の変化によるか、またはプローブの構造による立体障害によるものと考えられる。しかしながら、本実施形態に係るアプタマーは、結合様式の変化のメカニズムにより限定されるものではない。
【００５４】
ここで、結合様式の変化は、例えば、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まることである。指示タンパク質が酵素である場合、アプタマーと酵素との結合が弱まることにより、アプタマーによる酵素活性の阻害が軽減され、その結果、酵素活性を高めることができる。
【００５５】
なお、高周波誘導加熱とともに、あるいは高周波誘導加熱を行う前後に加熱を行なってもよい。
【００５６】
本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体において、アプタマー部分としては、上記第１実施形態で例示したアプタマーを用いることができ、指示タンパク質としては、上記第１実施形態で例示した指示タンパク質を用いることができる。
【００５７】
導電性粒子の原料としては、高周波誘導加熱により発熱する材料であれば特に限定されず、例えば、金属、導電性ポリマーが挙げられる。金属としては、例えば、金、アルミ、銅、銀などの遷移金属が好ましく、金が特に好ましい。
【００５８】
導電性粒子として金粒子を用いる場合、金ナノ粒子複合体を使用することができる。金ナノ粒子複合体としては、例えば、ＮＡＮＯＧＯＬＤ（商標）（ナノプローブ社（Nanoprobes, Inc.）などの市販の金ナノ粒子複合体を用いることができる。金ナノ粒子は、銀イオンによる光学的シグナル増幅が可能であり、かつ、凝集による色の変化を観察する検出法の構築が可能であるという利点がある。このため、金ナノ粒子とアプタマーとを結合させることにより、高感度なタンパク質検出を達成することができる。
【００５９】
また、導電性粒子のかわりに、磁性粒子を使用してもよい。ここで、磁性粒子は、例えばＦｅ２Ｏ３やＦｅ３Ｏ４などの材料を含むことができる。
【００６０】
図５は、本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体の構造および該複合体の製造方法を模式的に示す図である。例えば、図５に示すように、５’末端にメルカプト基を有するアプタマー１０と、金粒子−マレイミド複合体２０とを反応させることにより、金粒子２１が５’末端に結合したアプタマー・金粒子複合体３０を得ることができる。
【００６１】
２．２．指示タンパク質の特性を制御する方法
本実施形態に係る指示タンパク質の特性を制御する方法は、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、を含むアプタマー・導電性粒子複合体を準備し、アプタマーと指示タンパク質とを接触させた状態で高周波誘導加熱を行うこと、を含む。
【００６２】
上述したように、高周波誘導加熱は、アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下で行なわれ、高周波誘導加熱によって、アプタマーの少なくとも一部とプローブとがハイブリダイズすることにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式が変化することができる。ここで、上述したように、結合様式の変化は、例えば、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まることである。
【００６３】
本実施形態に係る指示タンパク質の特性を制御する方法によれば、高周波誘導加熱を用いることにより、高周波交流磁場が照射された領域のみを局所加熱することができる。これにより、高周波交流磁場が照射された領域においてのみ指示タンパク質の特性を制御することができる。すなわち、高周波交流磁場が照射された領域以外の領域は加熱されないため、高周波交流磁場が照射された領域以外の領域にダメージが加わることがない。なお、高周波誘導加熱は、例えば、所定の電気制御回路に信号発生器からの出力を増幅し、電磁場照射コイルに供給するためのインピーダンス整合回路を付加した装置により実現できる。
【００６４】
２．３．アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体
本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子・プローブ複合体は、指示タンパク質と結合して該指示タンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分と、アプタマー部分に結合し、かつ、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子と、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブ部分と、を含む。
【００６５】
本実施形態に係るアプタマー・プローブ複合体を製造するために用いられるアプタマーおよびプローブとしては、例えば、上述の第１実施形態で例示されたアプタマーおよびプローブをそれぞれ用いることができる。また、導電性粒子としては、例えば、上述の本実施形態で例示された導電性粒子を用いることができる。
【００６６】
また、「プローブ部分」とは、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる領域をいう。プローブ部分としては、例えば、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、プローブ部分は、アプタマー部分の３’末端および５’末端の一方または両方の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００６７】
本実施形態に係るアプタマー・プローブ複合体は、例えば、アプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズするプローブの存在下で、上述の本実施形態に係るアプタマーおよび指示タンパク質を加熱することにより、アプタマーと指示タンパク質との結合が弱まるとともに、該プローブと該アプタマーの少なくとも一部とがハイブリダイズすることにより形成される。
【００６８】
２．４．具体例
以下、図面を参照して、本実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および該アプタマー・導電性粒子複合体を用いて指示タンパク質の特性を制御する方法の具体例について説明する。本具体例では、図５に示すアプタマー・導電性粒子複合体を用いて指示タンパク質の特性を制御する方法について説明する。
【００６９】
図６は、本実施形態に係るアプタマーを用いて指示タンパク質の特性を制御する方法の一具体例を模式的に示す図である。なお、図６に示されるアプタマー・導電性粒子複合体およびアプタマー・導電性粒子・プローブ複合体の構造は、単に本実施形態に係る指示タンパク質の特性を制御する方法の原理および概念を説明するための模式図であって、本実施形態に係る複合体の立体構造、指示タンパク質との結合様式、およびそれらの変化のしかたを限定するものではない。
【００７０】
図６は、アプタマー部分１０の３’末端とプローブ１１とのハイブリダイゼーションにより、指示タンパク質４０との結合が弱まるアプタマー部分１０の例を示している。本具体例においては、このアプタマー部分１０はトロンビンアプタマーであり、指示タンパク質４０はトロンビンである場合を示す。トロンビンアプタマー部分１０の具体的な構造は図５に示されている。
【００７１】
また、プローブ１１としては、上述の第１実施形態でプローブ１１として例示したものを使用することができる。図６には、プローブ１１がアプタマー部分１０の３’末端の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである場合が示されている。
【００７２】
アプタマー部分１０に高周波交流磁場が照射される前は、アプタマー部分１０は指示タンパク質４０と結合して、指示タンパク質４０の酵素活性が阻害される（図６左図参照）。このアプタマー部分１０に高周波交流磁場１３が照射されると、導電性粒子（金粒子）２１が発熱して、熱１２が発生する。この熱１２がアプタマー部分１０に付加されると（図６中央図参照）、アプタマー部分１０のコンフォメーションが変化し、アプタマー部分１０の３’末端鎖および５’末端鎖の間の結合が切断される。その結果、プローブ１１がアプタマー部分１０の３’末端とハイブリダイズすることにより、アプタマー部分１０は指示タンパク質４０と強く結合することができず、指示タンパク質４０であるトロンビンは、酵素活性を示す（図６右図参照）。これにより、アプタマー部分（アプタマー）１０と、アプタマー部分１０に結合する導電性粒子（金粒子）２１と、アプタマー部分１０の３’末端の配列とハイブリダイズされたプローブ部分（プローブ）１１とを含むアプタマー・導電性粒子・プローブ複合体６０が形成される。
【００７３】
なお、後述する実施例２において、プローブ１１の存在下で図５に示すアプタマー・導電性粒子複合体３０を加熱した場合における指示タンパク質４０の活性を測定した実験の方法および結果を示す。
【００７４】
３．実施例
以下、本発明の一実施形態に係るアプタマー、アプタマー・プローブ複合体、アプタマー・導電性粒子複合体、アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体、および指示タンパク質の特性を制御する方法について、実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７５】
３．１．実施例１
実施例１においては、ＤＮＡ合成機で固相合成された、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー（図１参照）を使用し、この３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのステム部分の３’末端に相補的な１０−ｍｅｒプローブの存在下で、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーを加熱した場合、該プローブと３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのステム部分とがハイブリダイズして、該アプタマーの構造およびトロンビンへの阻害能が変化するかどうかを確認した。
３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー：5 ’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTG 3’（配列番号１）
１０−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCCC 3’（配列番号２）
【００７６】
まず、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー（２００ｎＭ）と、異なる濃度の１０−ｍｅｒプローブ（２００ｎＭ，６００ｎＭ，１μＭ）と、バッファー（ｐＨ７．４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合して全量９０μｌ
とした溶液Ａを、室温にて異なる時間（３０，６０，１２０，３００ｓ）インキュベートし、次いで急冷した後、この溶液とトロンビン（１Ｕｎｉｔ）（和光純薬工業）とを混合して溶液Ｂを調製した。次に、この溶液Ｂと１．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌ（和光純薬工業）とを混合して得られた溶液Ｃについて、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図３（Ａ）〜図３（Ｃ）に示す。
【００７７】
なお、本実施例および後述する実施例において、凝固時間は、溶液が固まる時間であり、凝固時間は、自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により
測定された。
【００７８】
図３（Ａ）〜図３（Ｃ）はそれぞれ、１０−ｍｅｒプローブの使用量が２００ｎＭ，６００ｎＭ，および１μＭである場合のインキュベーション時間（秒）と溶液の凝固時間（秒）との関係を示す。なお、図３（Ａ）〜図３（Ｃ）において、各インキュベーション時間におけるグラフはそれぞれ左から、測定対象となる溶液がバッファー（バッファーのみ使用し、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーおよび１０−ｍｅｒプローブを使用しない場合）のみの場合、ならびに、測定対象となる溶液がアプタマーを含みかつ１０−ｍｅｒプローブの濃度がそれぞれ０ｎＭ，６００ｎＭである場合を示す。ここで、溶液の凝固時間が長いほど、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのトロンビンへの阻害能が高く、トロンビンの酵素活性（フィブリノーゲンからフィブリンに変換する能力）が低いといえる。
【００７９】
図３（Ａ）〜図３（Ｃ）によれば、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーと１０−ｍｅｒプローブとのインキュベーション時間が短くなるにつれて、１０−ｍｅｒプローブを混合した場合と混合しない場合との凝固時間の差が小さくなった（図２（Ａ）〜図２（Ｃ）参照）。
【００８０】
以上の結果から、加熱により３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーの構造変化を生じさせ、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーの３’末端と１０−ｍｅｒプローブとをハイブリダイズさせることにより、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのトロンビンへの阻害能が変化するかを確認するためには、インキュベート時間は３０秒間で、１０−ｍｅｒプローブの濃度は６００ｎＭまたは１μＭが適切だと考えられる。
【００８１】
３．２．実施例２
本実施例においては、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーと異なる濃度の１０−ｍｅｒプローブとを含む溶液を異なる温度にてインキュベートした場合における、該アプタマーのトロンビンの阻害能を測定した。
【００８２】
まず、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー（２００ｎＭ）と、異なる濃度の１０−ｍｅｒプローブ（６００ｎＭ，１μＭ）と、バッファー（ｐＨ７．４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合して、全量９０μlとした溶液Ｃを、異なる温度（室温，３０℃，５０℃，７０℃）で３０秒間インキュベートし、次いで急冷した後、該溶液をトロンビン（１Ｕｎｉｔ）（和光純薬工業）と混合して、溶液Ｄを得た。溶液Ｄと１．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌ（和光純薬工業）とを混合して得られた溶液Ｅについて、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図４に示す。なお、図４において、各温度のグラフはそれぞれ左から、測定対象となる溶液がバッファー（バッファーのみ使用し、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーおよび１０−ｍｅｒプローブを使用しない場合）のみの場合、ならびに、測定対象となる溶液がアプタマーを含みかつ１０−ｍｅｒプローブの濃度がそれぞれ０ｎＭ，６００ｎＭである場合を示す。
【００８３】
図４によれば、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーおよび１０−ｍｅｒプローブを含む溶液を、室温および３０℃でインキュベートする場合に比べて、５０℃および７０℃でインキュベートする場合、１０−ｍｅｒプローブを使用する場合と使用しない場合との凝固時間の差が大きいことが理解できる。このことから、加熱により、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーとトロンビンとの結合が弱まる結果、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのトロンビンの阻害能が低下し、トロンビンの酵素活性（フィブリノーゲンからフィブリンへの反応触媒活性）が上昇するため、凝固時間が短くなると推測される（図２参照）。
【００８４】
以上の結果から、図４に示すインキュベート条件によって、加熱により、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーの構造変化を生じさせて、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーの３’末端と１０−ｍｅｒプローブとがハイブリダイズすることにより、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマーのトロンビンへの阻害能を減少させることができることが理解できる。
【００８５】
３．３．実施例３
３．３．１．アプタマー・金粒子複合体の調製
金ナノ粒子（直径１．４ｎｍ）３０ｎｍｏｌに１００μｌのイソプロパノールを添加して混合物を得、該混合物をミリＱで１／１０に希釈して、全量１０００μｌとした（溶液Ｆ）。次に、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー３ｎｍｏｌを溶液Ｆに添加し、４℃で２４時間インキュベートした。次いで、得られた溶液Ｆについて、５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｌｅｘ ７５ １６／６０）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。次に、ゲルろ過クロマトグラフィーで得られた画分を脱塩し凍結乾燥を行うことにより、アプタマー・金粒子複合体を調製した（図５参照）。
【００８６】
なお、上記ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分を１１％未変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、金粒子を可視化できる銀染色溶液ＬＩ Ｓｉｌｖｅｒを用いて染色し、アプタマー・金粒子複合体形成の確認を行った。さらに、得られた該複合体のトロンビンへの阻害能を検討した。その結果を図８（Ａ）〜図８（Ｃ）に示す。図８（Ａ）は、上記ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分を示す。図８（Ｂ）は、前記ピーク画分のＰＡＧＥ結果（銀染色後）を示し、図８（Ｃ）は、アプタマー・金粒子複合体のトロンビンへの阻害能を示す。図８（Ｃ）に示すアプタマー・金粒子複合体のトロンビンへの阻害能の測定は、実施例１と同様の方法にて行なった。
【００８７】
図８（Ａ）に示すように、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果、４つのピーク（ピーク１〜４）が得られた。得られたピークのうち、アプタマー・金粒子複合体と考えられるピーク（ピーク１，２）に対してＰＡＧＥを行った結果、図８（Ｂ）に示すように、銀染色が確認されたことから、ピーク１，２はアプタマー・金粒子複合体であると推測される。また、図８（Ｃ）に示すように、ピーク１，２はトロンビンに対して、３１−ｍｅｒアプタマー単体と同等の阻害能を示したことから、ピーク１，２はアプタマー・金粒子複合体であると推測される。
【００８８】
３．３．２．アプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦの照射
次に、上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体および１０−ｍｅｒプローブ（１μＭ）を混合して全量９０μｌとした溶液Ｇに対して、ＲＦＭＦ（高周波交流磁場）を３０秒間照射した後、トロンビン（１Ｕｎｉｔ）と混合した後、この溶液に１．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌを混合して得られた溶液Ｈについて、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図７に示す。図７において、「ＲＦＭＦｏｆｆ」とは、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」とは、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液Ｈの凝固時間を示す。なお、本実施例において、バッファーの終濃度は、５０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ＝７．４であった。
【００８９】
図７によれば、アプタマー・金粒子複合体および１０−ｍｅｒプローブを含む溶液を室温でインキュベートした場合の溶液の凝固時間に比べて、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間は減少した。また、３０℃および５０℃でそれぞれインキュベートした場合の溶液の凝固時間も減少した。
【００９０】
以上の結果より、アプタマー・金粒子複合体を加熱することにより、該複合体の構造が変化し、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分の３’末端と１０−ｍｅｒプローブとがハイブリダイズするため、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分とトロンビンとの結合が弱まる結果、該複合体のトロンビンへの阻害能が変化（減少）することが理解できる（図６参照）。
【００９１】
また、アプタマー・金粒子複合体にＲＦＭＦ照射することにより、金粒子が発熱し、該複合体にこの熱が付与されて、該複合体に構造変化が生じることが理解できる。より具体的には、図６に示すように、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー・金粒子複合体にＲＦＭＦ照射することにより、金粒子が発熱し、該複合体にこの熱が付与されることにより、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分の３’末端の配列と５’末端の配列との間の結合が弱まり、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分の３’末端と１０−ｍｅｒプローブとがハイブリダイズする。これにより、該複合体に構造変化が生じ、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分とトロンビンとの結合が弱まる結果、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分のトロンビンの阻害能が低下し、トロンビンの酵素活性（フィブリノーゲンからフィブリンへの反応触媒活性）が上昇するため、凝固時間が短くなると推測される。
【００９２】
以上により、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下、３１−ｍｅｒトロンビンアプタマー・金粒子複合体にＲＦＭＦ照射することにより、トロンビンの活性を制御できることが理解できる。
【００９３】
３．４．実施例４（アプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦ照射による指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性への影響）
上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体（１００ｎＭ）とトロンビン（１３．５ｎＭ）とを混合して得られた溶液１００μｌに対してＲＦＭＦ（高周波交流磁場）（１ＧＨｚ，１．５Ｗ）を５、１５、３０分間照射した。次に、この溶液に２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌを混合して得られた溶液について、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図９に示す。
なお、図９において、「ＲＦＭＦｏｆｆ」は、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」は、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間を示す。
【００９４】
図９によれば、ＲＦＭＦを５、１５、３０分間照射しても、凝固時間は殆ど減少しなかったことが理解できる。これにより、ＲＦＭＦ照射によるアプタマー・金粒子複合体の高周波誘導加熱によってトロンビンは殆ど失活しないことが確認された。
【００９５】
３．５．実施例５（プローブ存在下でのアプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦ照射による指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性の測定）
上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体（１００ｎＭ）と、１５−ｍｅｒのプローブ（１００ｎＭ、配列番号８）と、トロンビン（１３．５ｎＭ）とを混合して得られた溶液１００μｌに対してＲＦＭＦ（高周波交流磁場）（１ＧＨｚ，１．５Ｗ）を５分間照射した。次に、この溶液に２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌを混合して得られた溶液について、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図１０に示す。
なお、図１０において、「ＲＦＭＦｏｆｆ」は、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」は、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間を示し、「複合体・トロンビンのみ」とは、プローブを混合せずにアプタマー・金粒子複合体とトロンビンとを混合してＲＦＭＦ照射を行った場合における凝固時間を示し、「トロンビンのみ」とは、プローブおよびアプタマー・金粒子複合体を混合せずにトロンビンのみにＲＦＭＦ照射を行った場合における凝固時間を示す。
１５−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCCCAACCA3’（配列番号８）
【００９６】
図１０によれば、ＲＦＭＦ照射により凝固時間が減少したことが確認された。この結果から、指示タンパク質（トロンビン）存在下におけるＲＦＭＦ照射によりアプタマー・金粒子複合体が加熱される結果、アプタマーとプローブとのハイブリダイズが進行するため、アプタマーと指示タンパク質（トロンビン）との結合が弱まり、遊離の指示タンパク質（トロンビン）が増加したため、指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性が上昇したと推測される。すなわち、指示タンパク質（トロンビン）存在下において、ＲＦＭＦ照射の有無によりアプタマー・金粒子複合体の機能を制御することができることが確認された。
【００９７】
３．６．実施例６（プローブ存在下でのアプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦ照射による指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性の測定）
上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体（２００ｎＭ）と、２０−ｍｅｒのプローブ（２００ｎＭ、配列番号９）とを混合して得られた溶液９０μｌを室温で１２時間インキュベートした。次に、この溶液にトロンビン（１３．５ｎＭ）を混合して得られた溶液１００μｌを室温で３０秒間インキュベートした後、この溶液にＲＦＭＦ（高周波交流磁場）（１ＧＨｚ，１．５Ｗ）を３０分間照射した。次に、この溶液に２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌを混合して得られた溶液について、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図１１に示す。
なお、図１１において、「ＲＦＭＦｏｆｆ」は、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」は、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間を示す。
２０−ｍｅｒプローブ：5 ’ CACTGGCCCCAACCACACCA 3’（配列番号９）
【００９８】
図１１によれば、ＲＦＭＦ照射により凝固時間が増加したことが確認された。これにより、ＲＦＭＦ照射によってアプタマーとプローブとのハイブリダイゼーションが解離し、指示タンパク質（トロンビン）とアプタマーとの結合が強まったため、指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性が低下して、凝固時間が増加したと推測される。
【００９９】
３．７．実施例７（指示タンパク質（トロンビン）非存在下でのアプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦ照射後の指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性の測定）
上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体（２００ｎＭ）と、１０−ｍｅｒのプローブ（１μＭ、配列番号２）とを混合して得られた溶液１００μｌに対してＲＦＭＦ（高周波交流磁場）（１ＧＨｚ，１．５Ｗ）を３０秒間、３０分間、または１時間照射した。次に、この溶液にトロンビン（１３．５ｎＭ）および２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン１００μｌを混合して得られた溶液について、凝固時間（秒）を測定した。その結果を図１２に示す。
なお、図１２において、「ＲＦＭＦ」は、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」は、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間を示す。
１０−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCCC3’（配列番号２）
【０１００】
図１２によれば、ＲＦＭＦ照射により凝固時間が減少したことが確認された。これにより、ＲＦＭＦ照射によってアプタマーとプローブとのハイブリダイゼーションが進行し、指示タンパク質（トロンビン）とアプタマーとの結合が弱まり、遊離の指示タンパク質（トロンビン）が増加したため、指示タンパク質（トロンビン）の酵素活性が増加して、凝固時間が減少したと推測される。
【０１０１】
３．８．実施例８（アプタマー・金粒子複合体へのＲＦＭＦ照射によるアプタマーとプローブとのハイブリダイゼーションの確認）
上記３．３．１．で得られたアプタマー・金粒子複合体（２００ｎＭ）と、１０−ｍｅｒのプローブ（１μＭ、配列番号２）とを混合して得られた溶液１００μｌに対してＲＦＭＦ（高周波交流磁場）（１ＧＨｚ，１．５Ｗ）を３０分間照射した。次に、この溶液について１１％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による解析を行った。その結果を図１３に示す。
なお、図１３において、「ＲＦＭＦ」は、ＲＦＭＦを照射しなかった場合の溶液の凝固時間を示し、「ＲＦＭＦｏｎ」は、ＲＦＭＦを照射した場合の溶液の凝固時間を示し、「ＦＩＴＣ」は、蛍光ラベル化剤（フルオレセイン イソチオシアネート（Fluorescein isothiocianate））を示す。
１０−ｍｅｒプローブ：5 ’CACTGGCCCC3’（配列番号２）
【０１０２】
図１３によれば、ＲＦＭＦ照射を行ったレーン３，４は、ＲＦＭＦ照射を行わなかったレーン１，２よりもバンド強度が強いことが確認された。この結果から、ＲＦＭＦ照射によってアプタマーとプローブとのハイブリダイゼーションが進行したと推測される。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明のアプタマー・導電性粒子複合体は、タンパク質、酵素、核酸、小分子等の特性の制御に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係るアプタマーの構造、該アプタマーの少なくとも一部に相補的なプローブの配列を模式的に示す図である。
【図２】図２は、本発明の第１実施形態に係るアプタマーを加熱することにより、アプタマーと指示タンパク質との結合様式が変化する機構を模式的に示す図である。
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、本発明の第１実施形態に係るアプタマーを、該アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下で加熱して得られたアプタマー・プローブ複合体を用いて、トロンビン阻害能を測定した結果を示す（図３（Ａ）〜図３（Ｃ）はそれぞれ、プローブの量が２００ｎＭ，６００ｎＭ，１μＭの場合を示す）。
【図４】図４は、実施例１において、該アプタマーの少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下で、アプタマーを室温、３０℃、５０℃、および７０℃にそれぞれ加熱して得られたアプタマー・プローブ複合体を用いて、トロンビン阻害能を測定した結果を示す。
【図５】図５は、本発明の第２実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体の構造および該複合体の製造方法を模式的に示す図である。
【図６】図６は、プローブの存在下で、本発明の第２実施形態に係るアプタマー・導電性粒子複合体を高周波誘導加熱することにより、アプタマー部分と指示タンパク質との結合様式が変化する機構を模式的に示す図である。
【図７】図７は、実施例２で得られたアプタマー・導電性粒子複合体を、該複合体のアプタマー部分の少なくとも一部とハイブリダイズしうるプローブの存在下で、高周波誘導加熱または３０℃および５０℃にそれぞれ加熱して得られたアプタマー・導電性粒子・プローブ複合体を用いて、トロンビン阻害能を測定した結果を示す。
【図８】図８（Ａ）は、実施例２において、ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分を示し、図８（Ｂ）は、前記ピーク画分のＰＡＧＥ結果（銀染色後）を示し、図８（Ｃ）は、アプタマー・金粒子複合体のトロンビンへの阻害能の測定結果を示す。
【図９】図９は、実施例４において、ＲＦＭＦ照射を行った場合およびＲＦＭＦ照射を行わなかった場合におけるアプタマー・金粒子複合体の指示タンパク質（トロンビン）への阻害能の測定結果を示す。
【図１０】図１０は、実施例５において、１５ｍｅｒ−プローブ存在下において、ＲＦＭＦ照射を行った場合およびＲＦＭＦ照射を行わなかった場合におけるアプタマー・金粒子複合体の指示タンパク質（トロンビン）への阻害能の測定結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例６において、２０ｍｅｒ−プローブ存在下において、ＲＦＭＦ照射を行った場合およびＲＦＭＦ照射を行わなかった場合におけるアプタマー・金粒子複合体の指示タンパク質（トロンビン）への阻害能の測定結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例７において、１０ｍｅｒ−プローブ存在下およびトロンビン非存在下において、アプタマー・金粒子複合体にＲＦＭＦ照射を行った場合およびＲＦＭＦ照射を行わなかった場合におけるアプタマー・金粒子複合体の指示タンパク質（トロンビン）への阻害能の測定結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例８において、１０ｍｅｒ−プローブ存在下でアプタマー・金粒子複合体にＲＦＭＦ照射を行った場合およびＲＦＭＦ照射を行わなかった場合におけるハイブリダイゼーション形成能の測定結果を示す。
【符号の説明】
【０１０５】
１０・・・アプタマー（アプタマー部分）
１１・・・プローブ（プローブ部分）
１２・・・熱
１３・・・ＲＦＭＦ（高周波誘導磁場）
２０・・・導電性粒子−マレイミド複合体（金粒子−マレイミド複合体）
２１・・・導電性粒子（金粒子）
２２・・・マレイミド
３０・・・アプタマー・導電性粒子複合体
４０・・・指示タンパク質
５０・・・アプタマー・プローブ複合体
６０・・・アプタマー・導電性粒子・プローブ複合体
【図１】
0005145554.tif 000002
【図２】
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【図３】
0005145554.tif 000004
【図４】
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【図５】
0005145554.tif 000006
【図６】
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【図７】
0005145554.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005145554.tif 000013
【図１３】
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【配列表】
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