(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンが、金属イオン含有アパタイトナノ結晶の凝集構造からなる平均粒子径４０μｍ以下、比表面積が５０〜２００ｍ２／ｇ、さらに気孔率が３０〜８０％の多孔質微粒子に担持され、表面が分子量８５０００〜１６００００の範囲内のポリ乳酸からなる生分解性高分子の薄膜で覆われていることを特徴とするエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項２】
金属イオンは、亜鉛、マグネシウムおよび鉄から選択される１種または２種以上の金属イオンであることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項３】
多孔質微粒子がスプレードライ法にて製造されたものであることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項４】
アパタイトナノ結晶の長径が１００ｎｍ以下であり、生物学的に許容される金属イオンが一部置換または表面担持され、さらに炭酸イオンが一部結晶構造内部に置換していることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項５】
多孔質微粒子の生体内吸収性が３ヶ月以内であることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項６】
アパタイトのＣａ／Ｐ比が１．３〜３．４の範囲であることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項７】
生分解性高分子は、多孔質微粒子の重量に対して４０％以下であることを特徴とする請求項１に記載のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【請求項８】
請求項１から５記載の徐放製剤の作製方法であって、金属イオンを含有、担持させたアパタイトナノ結晶の凝集構造からなる多孔質微粒子を薬剤成分の水溶液に分散させて担持させた後、必要に応じてさらに金属イオン含有溶液を加え、乾燥後に生分解性高分子溶液に浸漬させ、表面に該生分解性高分子薄膜を形成する工程を含むことを特徴とするエリスロポエチンセラミックス徐放製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料、ドラッグデリバリーシステム等において有用なエリスロポエチン徐放製剤とその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
徐放製剤には、タンパク質など生体内活性物質を高分子によって直接包埋するようにしたのが一般的なものとして知られている。一方、これまでに、リン酸カルシウムの一種であるアパタイトを用いた徐放製剤についてもその作製が報告されている（非特許文献１および２）。非特許文献１では、抗生物質を吸着・徐放させており、非特許文献２では、結晶の大きさやカルシウムの溶解により吸着タンパク質が放出されると報告している。さらに非特許文献３では、比表面積３〜２２ｍ２／ｇで粒子径２００−５００ｎｍのアパタイト粒子を用いてヒト成長ホルモンの徐放を報告している。また、非特許文献４では粒子径４０〜８０μｍのアパタイト粒子に１ｗｔ％程度のヒト成長ホルモンを吸着させ徐放を報告している。しかし、積極的に薬物をリン酸カルシウムから徐放化させるものではなかった。
【０００３】
また、リン酸カルシウム顆粒からタンパク質の徐放技術も報告されている（非特許文献５−８）。これらの報告では、徐放化のためにＰＬＡやＰＥＶＡなどの生分解性高分子のコーティングを行っている。用いた粒子は２００−１０００μｍの大きさで、１１００度で焼成した緻密体である。
【０００４】
アパタイト粒子を用いた注射投与可能なタンパク質の徐放性製材についてもこれまで提案されている（特許文献１および２）。特許文献１では、多孔性アパタイト粒子内に活性物質とヒト血清タンパクと亜鉛イオンによる栓塞で活性物質の徐放化を行っている。亜鉛を含む多孔性アパタイト粒子内にヒト成長ホルモンを含有させ同様に亜鉛処理をさせることで徐放させることは別途にも報告されている（非特許文献９）。
【０００５】
以上のように生体への適応性に優れたアパタイト類を徐放性製剤に用いることについての検討が試みられている状況にあるが、実際のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などの徐放性製剤にアパタイト類を使用することには様々な問題点が残されている。
【０００６】
その大きな課題は、薬剤成分としての固有のタンパク質との特有の組合わせによる親和性と徐放性の適合性、最適性の実現が容易ではないことにある。
【０００７】
このような背景において、本発明者らは、薬剤タンパク質成分としてのエリスロポエチンに注目し、その徐放性製剤化の可能性を検討してきた。そして、そのための手段の一つとして、アパタイトも候補物質の一つとして検討してきた。
【０００８】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、腎性貧血に対して非常に有用であって、慢性腎透析患者の８０％以上がその恩恵を受けている薬剤成分である。しかし、週に３回程度の繰り返し投与が必要であって、患者にとっては肉体的、経済的に大変に大きな負担になっている。
【０００９】
エリスロポエチン徐放製剤はこのような問題を抜本的に解消する可能性を有しているのである。
【００１０】
エリスロポエチンの徐放化・持続的放出に関しては、たとえば、特許文献３に提案されている。吸収可能なヘテロ鎖ポリマーコアと吸収可能なヘテロ鎖ポリマーコア上に一つ以上のペプチドまたはタンパク質およびその組み合わせを含むマイクロ粒子を開示している。また、特許文献４では粉末状経鼻投与組成物として公開されているが、いずれもエリスロポエチンに関しては具体的には例示されていない。特許文献５では、酸性ムコ多糖類を用いたエリスロポエチンをはじめとした持続放出に関しての報告がされており、特許文献６ではヒアルロン酸を用いたエリスロポエチンの持続的放出が報告されている。しかし、担持可能なエリスロポエチン含有量がきわめて少ないなどの問題点が残されている。
【００１１】
本発明者らは、これら従来の試みとは別に、エリスロポエチン徐放製剤にアパタイトを用いることを検討した。具体的には、本発明者らがすでに提案しているスプレードライ法で製造したアパタイト複合粒子の生体材料への応用（特許文献７）等の検討結果を踏まえて、アパタイトのエリスロポエチン徐放製剤への利用の可能性を探ってきた。
【００１２】
しかしながら、エリスロポエチンを徐放させる基材としてアパタイトを用いる場合には、エリスロポエチンを担持複合化した粒子の初期バーストの制御が難しく、in vivoで長期間効果を持続させることが必ずしも容易ではないという問題があった。このため、アパタイト利用の可能性については大きな問題点があった。
【特許文献１】特許公開２００４−０７５６６２
【特許文献２】特許公開２００５−８５４５
【特許文献３】特許公開２００５−４７９２８
【特許文献４】特許公開平９−２９１０２６
【特許文献５】特許公開平５−１８６３６４
【特許文献６】特許公開平５−６５２３１
【特許文献７】特許公開２００４−２３６８９５
【非特許文献１】K. Yamamura, H. Iwata, T. Yotsuyanagi, Journal of Biomedical Materials Research 26 : 1053-1064(1992)
【非特許文献２】T. Matsumoto, M. Okazaki, M. Inoue, S. Yamaguchi, T. Kusunose, T. Toyonaga, Y. Hamada, J. Takahashi, Biomaterials 25 : 3807−3812 (2004)
【非特許文献３】H. Gautier, J. Guicheux, G. Grimandi, A. Faivre-Chauvet, G. Daculsi, C. Merle, Journal of Biomedical Materials Research 40 : 606-613(1998)
【非特許文献４】J. Guicheux, G. Grimandi, M. Trecant, A. Faivre, S. Takahashi, G. Daculsi, Journal of Biomedical Materials Research 34 : 165-170 (1997)
【非特許文献５】W. Paul, CP. Sharma, Journal of Materials Science Letters 16 : 2050-2051 (1997)
【非特許文献６】W. Paul , CP. Sharma, Journal of materials Science-materials in medicine 10 : 383-388 (1999)
【非特許文献７】W. Paul, J. Nesamony, CP. Sharma, Journal of Biomedical Materials Research 61 : 660-662(2002)
【非特許文献８】W. Paul, CP. Sharma, Journal of Biomaterials Applications 17 : 253-264(2003)
【非特許文献９】Y. Mizushima, T. Ikoma, J. Tanaka, K. Hoshi, T. Ishihara, Y. Ogawa, A. Ueno, Journal of Controlled Release, 110 (2) (2006) 269-265
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、以上のとおりの背景から、生体適合性に優れたアパタイトに注目し、これをエリスロポエチンを徐放させる基材として用いる場合の大きな問題点である初期バーストを制御し、in vivoで長期間効果を持続させることのできる新しいエリスロポエチン徐放製剤とその作製方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するものとして以下のことを特徴としている。
【００１５】
＜１＞エリスロポエチンが、金属イオン含有アパタイトナノ結晶の凝集構造からなる平均粒子径４０μｍ以下、比表面積が５０〜２００ｍ２／ｇ、さらに気孔率が３０〜８０％の多孔質微粒子に担持され、表面が分子量８５０００〜１６００００の範囲内のポリ乳酸からなる生分解性高分子の薄膜で覆われていることを特徴とするエリスロポエチンセラミックス徐放製剤。
【００１６】
＜２＞金属イオンは、亜鉛、マグネシウムおよび鉄から選択される１種または２種以上の金属イオンである。
【００１７】
＜３＞多孔質微粒子は、スプレードライ法にて製造されたものである。
【００１８】
＜４＞アパタイトナノ結晶は、長径が１００ｎｍ以下であり、生物学的に許容される金属イオンが一部置換または表面担持され、さらに炭酸イオンが一部結晶構造内部に置換している。
【００１９】
＜５＞生体内吸収性が３ヶ月以内である。
【００２０】
＜６＞Ｃａ／Ｐ比が１．３〜３．４の範囲である。
【００２２】
＜７＞生分解性高分子は、薬剤成分を担持している多孔質微粒子の重量に対して４０％以下である。
【００２３】
＜８＞上記徐放製剤の作製方法であって、金属イオンを含有、担持させたアパタイトナノ結晶の凝集構造からなる多孔質微粒子を薬剤成分の水溶液に分散させて担持させた後、必要に応じてさらに金属イオン含有溶液を加え、乾燥後に生分解性高分子溶液に浸漬させ、表面に該生分解性高分子薄膜を形成する工程を含むことを特徴とするエリスロポエチンセラミックス徐放製剤の製造方法。
【００２５】
エリスロポエチンの徐放製材としてはこれまで高分子系の素材を中心にリサーバー型やモノシック型の製材の研究・開発が進められてきた。これら高分子担体の問題点には、タンパク質が失活する、大量に担持出来ないこと等があげられ、それを克服することが困難であった。これに対し、本発明者は、一定期間安定に徐放させることが可能なアパタイトナノ結晶を基材とした徐放性製材の開発を進めた。その結果、上記のとおりの金属イオン、たとえば亜鉛イオンにより初期バーストが制御できること、および生体分解性高分子による被覆により、従来製剤より徐放効果に優れたことを見出し本発明を完成した。このような全く新しい知見に基づく本発明は、従来の技術からは全く予想、予見できないことであり、本発明の新規性と優れた進歩性は明らかであると言える。
【００２６】
アパタイト主成分も天然骨と同じであるため安全であり、生体内での消失に関しても明らかにした。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、生体刺激性がなく、生体内で分解し、エリスロポエチンを安定かつ多量に担持でき、初期バーストが殆ど無く、一定期間安定に徐放させることが可能な、金属イオン（亜鉛・マグネシウム・鉄）を含有するアパタイト多孔質粒子を基材とした徐放性製剤とその作製方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のエリスロポエチンセラミックス徐放製剤においては、基材として、アパタイトナノ結晶の凝集構造からなる多孔質微粒子が用いられるが、このものは、本発明の初期バートスの抑制と長期間の安定した徐放性を実現するとの目的、効果の観点から、以下の条件を備えることが好適に考慮される。
【００２９】
すなわち、まず、アパタイトナノ結晶としてはナノメートルサイズ、具体的には１μｍ未満の長径を有するものとして一般的に定義される。好ましくは、この長径は５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１００ｎｍ以下である。
【００３０】
多孔質粒子は、このようなアパタイトナノ結晶の凝集したものとして定義される。その大きさは、金属イオン含有後において４０μｍ以下であるものとする。
【００３１】
多孔質微粒子は、好ましくは比表面積が２０ｍ2／ｇ以上で、気孔率が３０％以上のものとして使用される。より好ましくは比表面積は５０〜２００ｍ2／ｇ以上であり、気孔率は３０〜８０％の範囲内である。そしてアパタイトとしてのＣａ／Ｐ比は、好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．３〜３．４の範囲内である。
【００３２】
以上のようなアパタイト多孔質微粒子は、本発明者らがすでに開発しているスプレードライ方法（特許公開２００４−２３６８９５）によって簡便に、効率的に高品質のものとして製造することができる。もちろん、従来より知られている方法でも、本発明の目的、効果を阻害いない限り適用可能である。
【００３３】
本発明のアパタイト多孔質微粒子には、金属イオンと、エリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導仕様の生理活性を持つアミノ酸組成の異なる生理活性物質である薬剤成分とが含有、担持される。そしてこれらが含有、担持された微粒子の表面は、生分解性高分子の薄膜により覆われる。
【００３４】
ここで、金属イオンとしては、生体毒性のない、もしくは限りなく低く、安全性に問題のないものであって、しかも本発明の目的、効果に資するものから選択される。好ましくは、亜鉛、マグネシウム、そして鉄のうちの１種または２種以上である。
【００３５】
生分解性高分子としてはポリ乳酸が好ましいものとして例示されるが、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリラクトンを含めて、これらのうちの１種または２種以上であってもよい。これら高分子の担持量としては、前記のとおりの多孔質微粒子の重量に対して４０％以下であることが好ましい。
【００３６】
本発明の徐放製剤の作製方法としては、金属イオンをあらかじめ含有、担持させた、多孔質微粒子を薬剤成分の水溶液に均一分散させて担持後に、必要に応じてさらに金属イオン含有溶液を加えて担持させ、その後に生分解性高分子の溶液に浸漬することが好ましい。もちろん、細部において様々な形態であってよい。
【００３７】
そこで以下に実施例を説明する。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞
亜鉛含有水酸アパタイト多孔質微粒子の作製例と、その表面をポリ乳酸薄膜により被覆した例を示す。
【００３９】
すなわち、まず、亜鉛含有水酸アパタイトナノ結晶は、水酸化カルシウム（０．５ｍｏｌ／ｌ）懸濁液に塩化亜鉛（６．８ｇ）を加えたリン酸（０．６ｍｏｌ／ｌ）を一定速度で滴下し、終点のｐＨを８．０に調節することで合成した。その際、合成温度条件を２１℃に設定し、低結晶性の水酸アパタイトナノ結晶を得た。図１に水酸アパタイトナノ結晶のＸ線回折パターン示す。また、図２に得られたナノ結晶のＴＥＭ像を示す。得られた水酸アパタイト懸濁液をスプレードライ法にて噴霧乾燥（入り口温度１８０度、出口温度６０度）し、多孔質微粒子（Ｚｎ０．５ＨＡｐ）を作製した。図３に得られたＺｎ０．５ＨＡｐのＳＥＭ像を示す。
【００４０】
次いで、ポリ乳酸（分子量８５０００〜１６００００）を溶解した塩化メチレン（３０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｚｎ０．５ＨＡｐ１５０ｍｇを加えたナス型フラスコに１ｍｌ加え、エバポレータにて２４度にて栓塞した。図４に得られたＺｎ０．５ＨＡｐ／ＰＬＡ複合微粒子のＳＥＭ像を示す。図５には栓塞前と栓塞後の粒子表面のＳＥＭ像を示す。Ｚｎ０．５ＨＡｐ／ＰＬＡ複合微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図６に示す。また、ＺｎＨＡｐ／ＰＬＡ複合微粒子の有機物量をＴＧ−ＤＴＡにて測定した結果を図７に示す。
＜実施例２＞
摘出した組織のＣａ量の測定結果およびその病理組織図について例示する。
【００４１】
Ｚｎ−ＨＡＰ（７０ｍｇ／ｍＬ生理食塩液）をラット（２５０ｇ）背部の皮下に（０．１５ｍＬ）投与し、投与後ラットを安楽死処分し、皮下に残存するＨＡＰ塊を、実体顕微鏡下で出来る限り摘出し、２０ｍＭ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）溶液に溶解した。この溶液をポリトロンにてホモジナイズし、遠心分離後、上清に含まれるＣａ量を原子吸光光度計にて測定した（図８）。投与後１２日目では、組織にＨＡＰ塊が確認できない例もあったが、それらは吸収されたものとして、データから除いた。投与したＨＡＰは２週間でほぼ投与部位から消失した。
【００４２】
Ｚｎ−ＨＡＰを皮下投与すると、異物除去反応が生じた。マクロファージと異物巨核細胞が集まり、ＨＡＰ粒子を貪食している顕微鏡像（図９）が観察される。数日後に、その周囲は結合組織性の被膜に覆われるが、ＨＡＰは徐々に分解消失し、右下に見られるように内腔とＨＡＰは消失する。正常な異物除去反応であり、病理的なものではない。
＜実施例３＞
実施例１のＺｎ０．５ＨＡｐ微粒子にエリスロポエチンを担持させる方法を比較例とともに以下に例示する。
【００４３】
すなわち、スプレードライ法にて作製した１００ｍｇのＺｎＨＡｐ粒子を５０００ＩＵのエリスロポエチンを溶解させた１０％ＰＢＳ溶液中（１０ｍｌ）に加え、１０分間吸着させた後、遠心分離（３０００Ｇ・１０分間）した。次いで、以下の試料を調整した。
【００４４】
試料１（比較例）は、さらに精製水にて洗浄して、エタノール（１０ｍｌ）を加えて遠心分離を行い乾燥させた。
【００４５】
試料２（比較例）は、吸着後、遠心分離した沈殿物（エリスロポエチンを担持させたＺｎ０．５ＨＡｐ）に２ｍｌの塩化亜鉛溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を加えて３分間分散させた。その後、遠心分離（３０００Ｇ・１０分間）を行い、精製水にて洗浄後、エタノール（１０ｍｌ）を加えて遠心分離を行い、乾燥させた。
【００４６】
試料３（比較例）は、３０ｍｇのポリ乳酸（分子量８５０００〜１６００００）を１ｍｌの塩化メチレン溶液に溶解させ、さらにエリスロポエチン担持Ｚｎ０．５ＨＡｐ／ＰＬＡ複合微粒子１００ｍｇを分散させ、エバポレータにて粒子を栓塞して乾燥させた。
＜実施例４＞
実施例１で作製したＺｎ０．５ＨＡｐ微粒子を４００℃で焼成して、エリスロポエチンを担持させる方法を例示する。すなわち、４００℃で焼成した試料を用いて、５０００ＩＵのエリスロポエチンを溶解させた１０％ＰＢＳ溶液中（１０ｍｌ）に加え、１０分間吸着させた後、遠心分離（３０００Ｇ・１０分間）した。２ｍｌの塩化亜鉛溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を加えて３分間分散させた。その後、遠心分離（３０００Ｇ・１０分間）を行い、精製水にて洗浄後、エタノール（１０ｍｌ）を加えて遠心分離を行い、乾燥させた。３０ｍｇのポリ乳酸（分子量８５０００〜１６００００）を１ｍｌの塩化メチレン溶液に溶解させ、さらにエリスロポエチン担持Ｚｎ０．５ＨＡｐ／ＰＬＡ複合微粒子１００ｍｇを分散させ、エバポレータにて粒子を栓塞して乾燥させた。これを試料４とした。
＜実施例５＞
実施例２および３で作製した試料（１〜４）１００ｍｇを５ｍＬの生理食塩水に分散させ、ＩＣＲ雄マウスに一匹当たり０．５ｍＬ皮下投与（５００ＩＵ／ｂｏｄｙ）した。投与後大静脈より全採決を行い、１，３，８，１４日後に血液学的検査およびエリスロポエチン定量を行った血液学的検査は、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の測定を行った。その結果、試料３および４については極めて優れた徐放効果が得られルことが確認された。
また、試料１および２のＰＬＡ被覆しない場合においても、亜鉛を全く担持、含有させない場合に比べて徐放効果が良好であることも確認された。
【００４７】
図１０は、亜鉛未処理の場合（比較例）と、試料３および４の結果を示したものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】水酸アパタイトナノ結晶のＸ線回折パターン。
【図２】水酸アパタイトナノ結晶のＴＥＭ像。
【図３】亜鉛に担持多孔質微粒子のＳＥＭ像。
【図４】ＰＬＡ複合微粒子のＳＥＭ像。
【図５】ＰＬＡ栓塞前後のＳＥＭ像。
【図６】複合微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果。
【図７】ＴＧ−ＤＴＡ測定結果。
【図８】Ｚｎ−ＨＡＰ消失速度の測定結果。
【図９】顕微鏡像。
【図１０】実施例５での測定結果。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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