(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸を変性する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）で変性された変性脂肪酸をクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す工程（ｂ）と、
を含む腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、上記変性脂肪酸をシリカゲルカラムを用いて分画し、ヘキサンとエーテルとの濃度比を段階的に変化させて溶出することにより、シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比６０：４０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．３３〜０．２３，０．２３〜０．１７，または０．０９〜０．０５の領域にスポットを示す画分を分画する、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ｂ）では、上記変性脂肪酸をシリカゲルカラムを用いて分画し、ヘキサンとエーテルとの濃度比を段階的に変化させて溶出し、シリカゲルプレート上で、展開溶媒としてヘキサン、エーテルおよび酢酸を、容量比４０：６０：１の割合で用い、Ｒｆ値が、０．３８〜０．２６，０．１７〜０．０９，または０．０５〜０の領域にスポットを示す画分を分画する、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちいずれか１つに記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記工程（ａ）では、上記脂肪酸として、不飽和長鎖脂肪酸，天然油脂，および，上記天然油脂から調整した脂肪酸画分から選ばれる１つの物質を用いる、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項５】
請求項４記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法において、
上記不飽和長鎖脂肪酸は、αリノレン酸またはＤＨＡであり、
上記天然油脂は、紫蘇油または魚油である、腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法。
【請求項６】
請求項２または３に記載の腸管ホルモン分泌調整剤の製造方法によって製造された腸管ホルモン分泌調整剤。
【請求項７】
請求項６に記載の腸管ホルモン分泌調整剤を有効成分として含有する糖尿病予防剤または治療剤。
【請求項８】
請求項６に記載の腸管ホルモン分泌調整剤を有効成分として含有する肥満予防剤または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，使用方法，ならびに腸管ホルモン分泌調整成分を含む機能性食品および医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、末梢でサブスタンスＰ（Subastance P）やニューロキニン（Neurokinin）がニューロキニン受容体（Neurokinin receptor）に反応することによる疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。
【０００３】
一方、食物を摂取すると腸管から種々のホルモンが分泌され、種々の生理機能を発揮することが知られている。これら腸管ホルモンのうち、膵蔵のβ細胞からインスリンを放出促進する能力を持つホルモンは、インクレチンと称されている。インクレチンとしてはグルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ-1(glucagon-like peptide 1)と呼ぶ）およびGIP（gastric inhibitory peptide）が知られている。
【０００４】
また、腸管よりインクレチン放出を促進する食物中成分として、糖類、アミノ酸、ペプチド、脂質や脂肪酸類が知られている。いずれも栄養素として人体に利用される。インクレチンをコントロールしてインスリン放出を促進し、糖尿病を治療しようとする医薬品が開発されている。体内で分解されにくいＧＬＰ-1誘導体を投与するアプローチと、体内でのＧＬＰ-1分解を抑える分解酵素阻害剤（DPP4インヒビター）が次世代糖尿病薬として注目されている。
【非特許文献１】Am J Physiol Gatrointesti Liver Physiol 279, G1298-G1306, 2000
【非特許文献２】Neuroscience,98(2), 345-352, 2000
【非特許文献３】Br. J. Pharmacol. 121(3), 375-80）1997
【非特許文献４】Am J Physiol 272, G785-93, 1997
【非特許文献５】Clin Exp Dermatol, 29, 644-648, 2004
【非特許文献６】Neurocience 125(2), 449-459, 2004
【非特許文献７】Neuroscience, 145(2), 699-707 2007
【非特許文献８】IBD (Eur J Pharmacol, 548(1-3), 150-137, 2006
【非特許文献９】Dig Liver Dis 36(5), 348-354,2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記次世代糖尿病薬などの臨床結果から、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させることが、糖尿病治療に有効であることが明確になってきている。一方、ＧＬＰ-1は満腹中枢を刺激して、食欲を抑制することが知られている。ＧＬＰ-1誘導体の臨床結果により、肥満抑制効果が明確に示された。したがって、食物を摂取すれば、腸管からＧＬＰ-1が放出され、ＧＬＰ-1の血中濃度が上昇するので、自然に食物を摂取することは、糖尿病を予防することにもつながるといえる。
【０００６】
しかしながら、食物は栄養ともなるので、食物を摂取過剰することで、肥満、ひいては糖尿病を招く。カロリーの取り過ぎで肥満状態に陥ると、生活習慣病として糖尿病が誘発されることは周知の通りである。
したがって、ＧＬＰ-1の血中濃度を上昇させるために、食物を過剰に摂取することは、糖尿病の予防または治療方法として適切でない。
【０００７】
本発明の目的は、食物中からカロリー当たりの腸管ホルンの調整機能の高い成分を取り出す手段を講ずることにより、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者達は、食物中に存在する、カロリー当たりのＧＬＰ-1放出活性など、腸管ホルモン調整機能の高い成分（分泌調整成分）を取り出すことができれば、これを摂取することにより、肥満、糖尿病の予防あるいは治療が可能ではないかと考えた。
かかる発想の下に、鋭意努力の結果、カロリー当たりの高ＧＬＰ-1放出活性を持つ成分など、腸管ホルモン調整機能の高い成分を食品より取り出すことに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法は、脂肪酸を変性し、変性脂肪酸をクロマトグラフィーにより分画して、変性脂肪酸から腸管ホルモン分泌調整成分を取り出す方法である。
【００１０】
脂肪酸としては、より好ましくは、αリノレン酸、ＤＨＡ（Docosahexanoic Acid)等の不飽和長鎖脂肪酸，紫蘇油および魚油等の天然油脂，あるいは、天然油脂から調整した脂肪酸画分が適している。
そして、これらを変性する方法としては、周知の方法を採用することができる。たとえば、高温（３０℃から１５０℃）で加熱あるいは空気中や酸素中で攪拌し、酸化させる、あるいは紫外線照射等により変性する。あるいはこれらを組み合わせて変性させるなどの方法がある。
【００１１】
天然油脂からの脂肪酸の調製方法は、周知の方法を採用して実施することができる。典型的な方法としては、以下の処理がある。
アルカリで元の油脂をけん化し、けん化物を水と石油エーテルの混合物を用いて分画し、水−エタノール画分を酸処理すると、水−エタノール画分として遊離の脂肪酸とグリセリンの混合物が得られ、石油エーテル画分として不けん化物が得られる。次に、水−エタノール画分を石油エーテルで再度洗浄すると、石油エーテル側に脂肪酸が分画され、残りにグリセリンが分画される。
【００１２】
分画の方法としては、溶媒抽出法や各種クロマトグラフィーを用いることができる。たとえば、変性脂肪酸をシリカゲルカラムを用いて分画し、ヘキサンとエーテルとの濃度比を、連続的または段階的に変化させて溶出する。
【００１３】
そして、分画する際に、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比６０：４０：１で混合した展開溶媒とを用いる）において、Ｒｆ値が、０．２３〜０．１３，０．１〜０．０５の領域にスポットを示す画分を分画することにより、または、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比４０：６０：１で混合した展開溶媒とを用いる）において、Ｒｆ値が、０．３３〜０．２３，０．２３〜０．１７，０．０９〜０．０５の領域にスポットを示す画分を分画することにより、カロリー当たりのＧＬＰ-1（Glucagon-like peptide-1）分泌促進活性が高い物質が取り出される。本明細書においては、この分泌促進成分をＳＩＨＲ（Stimulators of intestinal hormone ?release )と呼ぶことにする。ＳＩＨＲは、その物質自体がＧＬＰ-1放出促進活性を有するものである。
【００１４】
また、分画する際に、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比６０：４０：１で混合した展開溶媒とを用いる）において、Ｒｆ値が、０．２３〜０．２，０．１３〜０．０５，０．０２〜０の領域にスポットを示す画分を分画することにより、または、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレートと、ヘキサン，エーテル，酢酸を容量比４０：６０：１で混合した展開溶媒とを用いる）において、Ｒｆ値が、０．３８〜０．２６，０．０９〜０．０５，または０．０５〜０の領域にスポットを示す画分を分画することにより、ＣＣＫやサブスタンスＰの分泌抑制成分が得られる。
腸管ホルモンの過剰分泌あるいは継続的分泌は疾患の原因となり、ＣＣＫ, サブスタンスＰ（Substance P）およびニューロキニンＡ（Neurokinin A）の過剰分泌が人体に有害であることが知られている。本明細書においては、ＣＣＫ, サブスタンスＰやニューロキニンＡの分泌を抑制する食品成分成分を、ＩＩＨＲ（Inhibitor of Intestinal hormone-release）と呼ぶことにする。これら物質はＧＬＰ-1分泌抑制活性もあわせ持つが、相対的にサブスタンスＰまたはＣＣＫ分泌抑制活性が高い。これらはＩＢＳ、ＩＢＤ予防治療医薬あるいは機能性食品として有用である。
【００１５】
ＧＬＰ-1分泌促進物質を含む機能性食品、あるいはＧＬＰ-1分泌促進物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＧＬＰ-1の濃度増加にともなう対象疾患または症状として、例えば、(1)膵臓β細胞からインスリン分泌を促進することによる糖尿病治療薬  （２）膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。またはβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上；(３)胃酸分泌抑制による胃酸過多治療；(４)腸管運動抑制による下痢治療（５）神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療；及び(６)食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＧＬＰ-1の濃度亢進にともなう治療，症状改善のすべてが対象となる。
【００１６】
ＣＣＫ分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはＣＣＫ分泌抑制成分を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
ＣＣＫの濃度増加にともなう対象疾患または症状として、たとえば（１）ＣＣＫは膵炎を促進するために、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、膵炎治療が可能になる。（２）ＣＣＫは胃酸の分泌を促進するので、ＣＣＫ濃度の抑制により、胃酸過多の治療が可能になる。（３）ＣＣＫは中枢で不安、ストレスによる行動障害を起こすために、ＣＣＫ濃度の抑制により、行動障害の治療や精神安定剤としての利用が可能になる。（４）ＣＣＫはモルヒネ等の鎮痛剤に拮抗するので、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、鎮痛剤の効果増強が可能である。（５）ＣＣＫ濃度の抑止により、感染性下痢など下痢の治療が可能になる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、ＣＣＫの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【００１７】
サブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を含む機能性食品、あるいはサブタンスＰまたはニューロキニン分泌抑制物質を有効成分として含む医薬の用途としては以下の用途がある。
末梢で、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度増加にともなう対象疾患として、例えば腸管の神経性炎症（非特許文献１参照），内臓の痛み／痛覚過敏症（非特許文献２参照），下痢（非特許文献３参照），腸管や膵臓の炎症惹起（非特許文献４参照），ストレス性皮膚炎症（非特許文献５参照），神経性炎症（非特許文献６参照），急性腸炎（非特許文献７，８参照），腸管憩室疾患（非特許文献９参照）などが知られている。ＩＩＨＲ（サブスタンスＰ/ニューロキニン分泌抑制物質）により、これらの疾患または症状の治療または症状改善が可能となる。ただし、対象疾患または症状は、上記に限定されるものでなく、サブスタンスＰやニューロキニンの濃度亢進にともなう疾患の治療または症状改善のすべてが対象となり得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の腸管ホルモン分泌調整成分の製造方法，機能性食品または医薬によると、食物中からカロリー当たりの腸管ホルモン調整機能促進成分を分画して取り出すことにより、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や薬品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（実施例１）
−GPR120の活性化あるいは抑制能を持つ脂肪変性物の分離同定−
ＧＬＰ-1放出促進活性のある食品由来成分を以下のように見出した。
その際、脂肪が変性するにしたがって、腸管ホルモン分泌能が高い成分が生じると予測し、本実験をおこなった。
【００２０】
脂肪酸として、αリノレン酸（αＬＡ（Sigma））, ＤＨＡ(フナコシCAY)、紫蘇油由来脂肪酸,魚油由来脂肪酸(日油)を用いる。
溶剤は、クロロホルム, ヘキサン, ジエチエルエーテル, 酢酸, メタノール(ナカライテスク)である。
【００２１】
紫蘇油由来脂肪酸、および魚油由来脂肪酸の製造方法は下記の通りである。
アルカリで元の油脂をけん化し、けん化物を水と石油エーテルの混合物を用いて分画し、水−エタノール画分を酸処理すると、水−エタノール画分として遊離の脂肪酸とグリセリンの混合物が得られ、石油エーテル画分として不けん化物が得られる。次に、水−エタノール画分を石油エーテルで再度洗浄すると、石油エーテル側に脂肪酸が分画され、残りにグリセリンが分画される。
【００２２】
上記の処理で4種類の脂肪酸を含む画分を得た後、475μl の各脂肪酸をチューブに分注し、50℃に設定されたインキュベータ内に設置したローテーターで、7rpmの回転を2週間与え続けて、0, 1, 3, 7, 14日目に回転数10,000rpm, 5分間の遠心を行なって、50μlの各脂肪酸を採取した。14日目終了後、25μlの各14日目の脂肪酸を96穴マイクロプレート 2穴に分注し、クリーンベンチ内殺菌灯（三洋電機社製、紫外線照射量：250uW.sec/cm2、波長：253.7nm）に2日間照射してプレートごと回収した。採取した試料は カラムクロマトグラフィーを行うまでの間、-80℃にて保存した。
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）実験では、各脂肪酸をクロロホルムで10倍希釈して攪拌後、1μlを各シリカゲルプレートに載せ、ヘキサン:エーテル:酢酸(60:40:1)で展開を行った。
【００２３】
図１は、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）実験の結果をイラストで示す図である。図1に示す結果は、day0, day14, UV（day14＋UV照射）の３種類としている。
同図に示すように、サンプルNo３，６，９，１２のように、４種の脂肪酸共に変性条件が厳しくなるにつれて、サンプルの移動度が小さくなり、脂肪酸の変性が進行したことが分かる。
【００２４】
（実施例２）
−変性にともなう脂肪酸の各種腸管ホルモン分泌作用に対する影響の変化−
次に、実施例２として、脂肪酸の変性により各種腸管ホルモン分泌作用が変化するかを調べた。用いた材料・方法は、以下の通りである。
ＳＴＣ-1細胞（Am. J. Pathol. 136:1349-1363(1990)参照）を12ウェルプレートにまき、48時間培養後、αＬＡ, 100μＭあるいは各フラクションを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ-1，ＣＣＫ，サブスタンスPの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００２５】
図２（ａ），（ｂ）は、順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのＧＬＰ-1濃度を示し、図３（ａ），（ｂ）は，順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのＣＣＫ濃度を示し、図４（ａ），（ｂ）は，順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのサブスタンスＰ濃度を示し、図５（ａ），（ｂ）は，順に、紫蘇油由来脂肪酸，魚油由来脂肪酸を添加したときのＧＬＰ-1濃度を示し、図６（ａ），（ｂ）は，順に、紫蘇油由来脂肪酸，魚油由来脂肪酸を添加したときのＣＣＫ濃度を示している。
【００２６】
図２（ａ），（ｂ）〜図６（ａ），（ｂ）から、以下のことがわかる。
図２（ａ），（ｂ）に示すように、αＬＡおよびＤＨＡは変性と共に本体の画分が減少し、分解物が増加するが、ＧＬＰ-1分泌活性は経時的に上昇した。αＬＡの場合はさらに分解が進むと、ＧＬＰ-1分泌活性は再び減少した。ＤＨＡの場合は、今回の分解条件では、分解がさらに進んでも、ＧＬＰ-1分泌活性がそれほど減少していない。
【００２７】
図４（ａ），（ｂ）に示すように、サブスタンスＰ分泌活性は、ＧＬＰ-1分泌活性ほど顕著でないが、変性が進むほど増加した。
【００２８】
一方、図３（ａ），（ｂ）に示すように、ＣＣＫ分泌活性は、変性が進むと、直線的に減少した。
また、図５（ａ），（ｂ）および図６（ａ），（ｂ）に示すように、紫蘇油由来脂肪酸と、魚油由来脂肪酸とについても、変性が進むと、ＧＬＰ-1分泌活性は上昇するが、ＣＣＫ分泌活性は減少する傾向がある。
【００２９】
上述のような、ＧＬＰ-1分泌活性とＣＣＫ分泌活性の変性依存性の食い違いの理由は、この段階では解らないが、両分泌活性を作用させるシグナル伝達系に何らかの違いがあり、分解物中に生成した成分の分泌促進効果の違いによるのか、分泌活性抑制効果の違いによるのかのいずれかと、推測される。
【００３０】
また、脂肪酸の変性により悪玉ホルモンであるサブスタンスＰ分泌促進効果が増大することは、食品中の脂質が変性することにより、ＩＢＳ発症・憎悪の危険性が増加する可能性が示唆された。さらに、変性産物が悪玉ホルモンを強く分泌するというだけでなく、受容体への作用の仕方、例えば受容体に不可逆的に結合するリガンドが生じて、長期にわたってシグナルが出続けることになる等、脂肪変性物とＩＢＳ発症とのかかわりを慎重に調べる必要がある。
【００３１】
（実施例３）
−脂肪酸変性物の分離−
本実施例においては、実施例２で作成したαＬＡ変性物中の腸管ホルモン分泌促進成分あるいは抑制活性成分の存在を検討し、それらを分離した。用いた材料・方法は、以下の通りである。
【００３２】
実施例２において調製した、変性αＬＡ、50μlをヘキサン5mlに溶かして、Waters社製のシリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Light(WAT020520))にアプライした。溶出液は以下の通りである。
【００３３】
ヘキサン：エーテル
10  ：  0    0.7ml    Fraction 1
0.7ml    Fraction 2
0.7ml    fraction 3
8  ：  2    0.7ml    Fraction 4
0.7ml    Fraction 5
0.7ml    Fraction 6
6  ：  4    0.7ml    Fraction 7
0.7ml    Fraction 8
0.7ml    Fraction 9
4  ：  6    0.7ml    Fraction 10
0.7ml    Fraction 11
0.7ml    Fraction 12
3  ：  7    0.7ml    Fraction 13
0.7ml    Fraction 14
0.7ml    Fraction 15
0  ： 10    0.7ml    Fraction 16
0.7ml    Fraction 17
0.7ml    Fraction 18
メタノール     2ml      Fraction 19
【００３４】
上記各フラクション20μlを、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶媒：（ヘキサン：エーテル：酢酸＝60：40：1）法により分析した。また、乾固チューブを125μl DMSOに溶解し、ＳＴＣ-1細胞でＧＬＰ-1放出特性を測定した。
使用したＴＬＣプレートは、以下の通りである。
Whatman 社、Thin Layer Chromatography Plate, Partisil (R)K6F Silica Gel 60 Å with Fluorescent Indicator Size: 10x20cm Layer Thickness 250 μm, catalogue No. 4861-720 
【００３５】
αＬＡを60℃で14日回転させた。  変性をより進めるために実験番号070723よりも処理温度を上げて変性を加速した。変性αＬＡ 125μlをヘキサン:エーテル10 : 0.25に25mlに溶解し、Waters社製のシリカゲルカートリッジ（Sep-Pak Plus(WAT020520))にアプライした。
【００３６】
溶出に用いた溶媒は、以下の通りである。
ヘキサン：エーテル
10  ：  0.5   1.5ml    Fraction 1
Fraction 2
9   ：  1     1.5ml  Fraction 3
Fraction 4
8   ：  2     1.5ml  Fraction 5
Fraction 6
7   ：  3     1.5ml  Fraction 7
Fraction 8
6   ：  4     1.5ml  Fraction 9
Fraction 10
5   ：  5     1.5ml  Fraction 11
Fraction 12
4   ：  6     1.5ml  Fraction 13
Fraction 14
3   ：  7     1.5ml  Fraction 15
Fraction 16
2   ：  8     1.5ml  Fraction 17
Fraction 18
1   ：  9     1.5ml  Fraction 19
Fraction 20
0   ： 10     1.5ml  Fraction 21
Fraction 22
メタノール        2ml  Fraction 23
Fraction 24
Fraction 25
【００３７】
溶出液20μlを、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶媒：（ヘキサン：エーテル：酢酸＝４０：６０：１）法により分析した。使用したＴＬＣプレートは、上記Whatman 社のものである。そして、硫酸銅発色で有機炭素の存在を測定した。一方、溶出液の一部を乾固し、50 μl ＤＭＳＯに溶解して、ＳＴＣ-1からのＧＬＰ-1分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ-1からのホルモン分泌促進活性および抑制活性を測定した。腸管ホルモン分泌促進作用を測定する場合はＳＴＣ-1細胞を12ウェルプレートにまき、48時間培養後、αＬＡ, 100μＭあるいは各フラクションを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ-1, ＣＣＫ, およびサブスタンスＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。腸管ホルモン分泌抑制作用を測定する場合は、ＳＴＣ-1細胞を12ウェルプレートにまき、48時間培養後、αＬＡを100μＭ添加と同時に各フラクションを添加して、１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ-1, ＣＣＫ, およびサブスタンスＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００３８】
図７は、一実験（実験番号070723）による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィーにおける各フラクションのＴＬＣ測定結果を示す図である。図８は、別の実験（実験番号070920）による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィーにおける各フラクションのＴＬＣ測定結果を示す図である。いずれに実験においても、プレートとしてシリカゲルを用い、展開溶媒として、実験070723では、ヘキサン：エーテル：酢酸＝６０：４０：１（容積比）の混合液を用い、実験070920では、ヘキサン：エーテル：酢酸＝４０：６０：１（容積比）の混合液を用いている。
【００３９】
図２３は、上記実験のカラムクロマトグラフィーにおける各フラクションのＴＬＣ測定のＲｆ値と対応する物質（略称）とを表にして示している。これらの物質の意味や作用について、以下に説明する。
図２３の実験070920に示すように、分画する際に、Ｒｆ値が、０．３３〜０．２３，０．２３〜０．１７，または０．０９〜０．０５の領域にスポットを示す画分を分画することにより、カロリー当たりのＧＬＰ-1分泌促進活性が高い物質が取り出される（ＴＬＣ測定での硫酸銅発色において、本件の発色とαＬＡの発色と比較して、有機物の炭素量の比を求め、これより本件の物質の量を相対αＬＡ量に換算し、カロリー当たりのＧＬＰ−１分泌促進活性と見なしている）。この物質は、腸管ホルモンとして、ＣＣＫおよびサブスタンスＰの分泌促進活性よりもＧＬＰ-1分泌促進活性が相対的に高いものである。上述したように、本明細書においては、この分泌促進成分は、ＳＩＨＲと呼ばれる。ＳＩＨＲは、その物質自体がＧＬＰ-1放出促進活性を有するものである。
ここでは、Ｒｆ値が０３３〜０．２３である領域の画分をＳＩＨＲ１とし、Ｒｆ値が０．２３〜０．１７である領域の画分をＳＩＨＲ２とし、Ｒｆ値が０．０９〜０．０５の領域である領域の画分をＳＩＨＲ３としている。
【００４０】
図２３の実験070920に示すように、分画する際に、Ｒｆ値が、０．２３〜０．１７，０．１７〜０．０９または０．０９〜０．０５の領域にスポットを示す画分を分画することにより、カロリー当たりのＧＬＰ-1分泌促進活性が高い物質が取り出される。上述したように、本明細書においては、この分泌促進成分は、ＥＩＨＲと呼ばれる。ＥＩＨＲは、その物質自体はＧＬＰ-1放出促進活性は弱いが、αリノレン酸などのGPR120に対する天然リガンドのＧＬＰ-1分泌促進作用を増強する。
ここでは、Ｒｆ値が０．２３〜０．１７である領域の画分をＥＩＨＲ１とし、Ｒｆ値が０．１７〜０．０９である領域の画分をＥＩＨＲ２とし、Ｒｆ値が０．０９〜０の領域である領域の画分をＥＩＨＲ３としている。
【００４１】
また、Ｒｆ値が、０．３８〜０．２６，０．１７〜０．０９，または０．０５〜０の領域にスポットを示す画分を分画することにより、以下のようなＣＣＫやサブスタンスＰの分泌抑制成分が得られる。
腸管ホルモンの過剰分泌あるいは継続的分泌は疾患の原因となり、ＣＣＫ, サブスタンスＰおよびニューロキニンＡの過剰分泌が人体に有害であることが知られている。上述したように、本明細書においては、ＣＣＫ, サブスタンスＰやニューロキニンＡの分泌を抑制する食品成分成分は、ＩＩＨＲと呼ばれる。これら物質はＧＬＰ-1分泌抑制活性もあわせ持つが、ＩＩＨＲは相対的にサブスタンスＰの分泌抑制活性が高く、ＩＩＨＲ４は相対的にＣＣＫ分泌抑制活性が高い。ＩＩＨＲ２およびＩＩＨＲ３は相対的にＣＣＫ分泌抑制活性が高く有用である。これらは過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）予防治療医薬あるいは機能性食品として有用である。
ここでは、Ｒｆ値が０．３８〜０．２６である領域の画分をＩＩＨＲ１とし、Ｒｆ値が０．１７〜０．０９である領域の画分をＩＩＨＲ２とし、Ｒｆ値が０．０９〜０．０５である領域の画分をＩＩＨＲ３とし、Ｒｆ値が０．０５〜０である領域の画分をＩＩＨＲ４としている。
【００４２】
後述するように、Ｒｆ値が０．３８〜０．２６、あるいは０．１７〜０．０９あるいは０．０５〜０（原点）にスポットを示す画分を分画すると、ＧＬＰ-1分泌エンハンサーが得られる。これらは糖尿病、肥満予防治療薬あるいは機能性食品として有用である。これらは、同時にＣＣＫおよびサブスタンスＰ分泌エンハンサー活性を持つために一部の患者には使用を控える必要がある。
【００４３】
図９〜図１５は、変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における分画物質のＳＴＣ-1ホルモン分泌促進活性を示す図である。図９〜図１２は、図7に示す実験による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのホルモン分泌促進活性を示す図であって、図９は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性を示す図、図１０は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性をαＬＡに換算したαＬＡ等量を示す図、図１１は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図１２は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。図１３〜図１５は、図8に示す実験による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのホルモン分泌促進活性を示す図であって、図１３は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図１４は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性をαＬＡに換算したαＬＡ等量を示す図、図１５は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【００４４】
図１６〜図２１は、変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における分画物質のＳＴＣ-1ホルモン分泌抑制活性またはエンハンス活性を示す図である。図１６〜図１８は、図7に示す実験によるカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのホルモン放出抑制活性およびエンハンス活性を示すデータであって、図１６は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図１７は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図１８は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。図１９〜図２１は、図８に示す実験によるカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのホルモン放出抑制活性およびエンハンス活性を示すデータであって、図１９は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図２０は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図、図２１は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ、sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【００４５】
図２２は、変性αＬＡのカラムクロマトグラフィーによる調整物質と各種ホルモン（ＧＬＰ-1、ＣＣＫ、サブスタンスＰ）の分泌促進活性，分泌抑制活性および分泌エンハンス活性を表中で比較して示す図である。図２２は、図９〜図２１に示すデータから相対活性を算出したものである。括弧内は、活性ピークのフラクション番号を示し、シャドウを施した部分は、図７に示す実験におけるフラクションの情報を示している。
【００４６】
図２３は、ホルモン分泌促進物質，ホルモン分泌エンハンス物質およびホルモン分泌抑制物質のカラムクロマトグラフィーにおけるＲｆ値と対応する物質とを表にして示している。カラムクロマトグラフィーにおけるＲｆ値を表にして示す図である。図２３には、上述したように、ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３、ＥＩＨＲ１, ＥＩＨＲ２, ＥＩＨＲ３、ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４に対応する物質のカラムクロマトグラフィー上のスポットＲｆ値(移動度)が示されている。各Sep-pakフラクションには複数のスポットが含まれるために、Ｒｆ値に幅がある。
【００４７】
図２４は、図７に示す実験による、変性αＬＡのTLCスポットのＲｆ値および各フラクションのホルモン分泌促進活性、ホルモン分泌エンハンス活性およびホルモン分泌抑制活性を表にして示す図である。
図２５は、図８に示す実験による、変性αＬＡのTLCスポットのＲｆ値および各フラクションのホルモン分泌促進活性、ホルモン分泌エンハンス活性およびホルモン分泌抑制活性を表にして示す図である。
図２４，図２５において、◎は、スポットの示すホルモン分泌促進活性を、×は、スポットの示すホルモン分泌抑制活性を、△は、スポットの示すホルモン分泌エンハンス活性を、○は、活性との関連が不明であるスポットの存在をそれぞれ示している。
【００４８】
図２６は、変性αＬＡからの画分ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３の相対ＧＬＰ-1放出促進活性を示す図である。図２６は、実験番号070920において、ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３のELLISA発色を画像処理し、発色が物質量に比例する仮定として、αＬＡに対するおよその相対的活性（比活性）を示している。
【００４９】
本発明者達は、上記図９〜図２６に示すデータから、以下の知見を得た。
（１）  図９〜図１５に示すデータから、成分ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３には、ＧＬＰ-1、ＣＣＫ、サブスタンスＰ泌促進作用が認められた。
図２６に示すように、成分ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３のαＬＡ（100μＭ）を１００とする相対量は、０．１以下であることから、ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３は、αＬＡに対して、1000倍以上の重量あたりのＧＬＰ-1放出活性を持つと推定される。
（２）  図１６〜図２１に示すデータから、成分ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４には、ＧＬＰ-1、ＣＣＫ、サブスタンスＰ泌促抑制活性が認められた。
（３）  図１８〜図２１に示すデータから、成分ＥＩＨＲ１, ＥＩＨＲ２, ＥＩＨＲ３はそれ自体ＧＬＰ-1、ＣＣＫ、サブスタンスＰ分泌促進作用がは低いがαＬＡのＧＬＰ-1分泌作用を促進する活性が認められた。
図２２には、上述のような各成分のホルモン分泌調整機能がまとめられている。
なお、αＬＡのＧＬＰ-1分泌作用を抑制する成分を調べたが、その存在は検出できなかった。一方、抑制効果を検出する測定系で逆にエンハンサー機能を持つ成分が発見された。
【００５０】
−機能性食品，医薬としての機能−
ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３およびＥＩＨＲ１, ＥＩＨＲ２, ＥＩＨＲ３は、糖尿病や肥満予防治療に効果があるＧＬＰ-1の腸管からの放出を促進する。通常の食事においては脂肪酸がこの働きをするが、これらの物質は、脂肪酸よりも重量当たり（カロリー当たり）のＧＬＰ-1放出活性が１００倍以上高い。よって、脂肪酸投与に比べて、カロリーが低く、高いＧＬＰ-1放出活性を発揮する、有効な糖尿病や肥満予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。
【００５１】
また、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出は炎症を惹起したり、痛みを発生したりする。ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪の原因となると考えられる。ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３およびＥＩＨＲ１, ＥＩＨＲ２, ＥＩＨＲ３は、これらのホルモン分泌も促進する。この分泌スペクトラムはαＬＡと同様である。αＬＡは通常の食事で摂取されていることから、ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３およびＥＩＨＲ１, ＥＩＨＲ２, ＥＩＨＲ３の適量の摂取はカロリーを気にしなくて良い糖尿病や肥満予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。
【００５２】
一方、ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４は、サブスタンスＰおよびＣＣＫの放出を抑制するので、これらの成分を利用して、ＩＢＳ、ＩＢＤなどの腸炎の発症あるいは増悪をおさえる予防治療薬あるいは機能性食品を提供できる。ＩＩＨＲ１, ＩＩＨＲ２, ＩＩＨＲ３, ＩＩＨＲ４は、ＧＬＰ-1の分泌も抑制するが、ＩＢＳ，ＩＢＤの発症、増悪の環境では脂肪酸に対する反応が過敏になっていることから、これを抑制することは、ＩＢＳ，ＩＢＤに対する重要な医薬あるいは機能性食品を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤は、医薬だけでなく、栄養補助剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１におけるＴＬＣ実験の結果をイラストで示す図である。
【図２】（ａ），（ｂ）は、順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのＧＬＰ-1濃度を示す図である。
【図３】（ａ），（ｂ）は，順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのＣＣＫ濃度を示す図である。
【図４】（ａ），（ｂ）は，順に、変性過程を経時的にサンプリングし、100μＭの未変性もしくは変性 αＬＡ，あるいはＤＨＡを添加したときのサブスタンスＰ濃度を示す図である。
【図５】（ａ），（ｂ）は，順に、紫蘇油由来脂肪酸，魚油由来脂肪酸を添加したときのＧＬＰ-1濃度を示す図である。
【図６】（ａ），（ｂ）は，順に、紫蘇油由来脂肪酸，魚油由来脂肪酸を添加したときのＣＣＫ濃度を示している。
【図７】実験070723による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＴＬＣ結果を示す図である。
【図８】実験070920による変性αＬＡのカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＴＬＣ結果を示す図である。
【図９】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性を示す図である。
【図１０】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性をαＬＡに換算したαＬＡ等量を示す図である。
【図１１】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１２】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１３】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１４】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出促進活性をαＬＡに換算したαＬＡ等量を示す図である。
【図１５】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出促進活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１６】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＧＬＰ-1放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１７】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１８】実験070723によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図１９】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのフラクションのＧＬＰ-1放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図２０】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのＣＣＫ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図２１】実験070920によるカラムクロマトグラフィー（sep-pak）における各フラクションのサブスタンスＰ放出抑制活性およびエンハンス活性（100μＭ  αＬＡ相対活性）を示す図である。
【図２２】変性αＬＡのカラムクロマトグラフィーによる調整物質と各種ホルモンの分泌促進活性，分泌抑制活性および分泌エンハンス活性を表中で比較して示す図である。
【図２３】ホルモン分泌促進物質，ホルモン分泌エンハンス物質およびホルモン分泌抑制物質のＴＬＣにおけるＲｆ値を表にして示す図である。
【図２４】実験070723による変性αＬＡのＴＬＣにおけるＲｆ値および各フラクションのホルモン分泌促進活性、ホルモン分泌エンハンス活性およびホルモン分泌抑制活性を表にして示す図である。
【図２５】実験070920による変性αＬＡのＴＬＣにおけるＲｆ値および各フラクションのホルモン分泌促進活性、ホルモン分泌エンハンス活性およびホルモン分泌抑制活性を表にして示す図である。
【図２６】変性αＬＡからの画分ＳＩＨＲ１, ＳＩＨＲ２, ＳＩＨＲ３の相対ＧＬＰ-1放出促進活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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