(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物における生物時計の制御に関与する遺伝子配列を有する、以下の(a)、又は(b)のＤＮＡまたはＲＮＡからなるプローブであって、生物における生物時計の制御に関与する遺伝子またはペプチド断片探索用のプローブ。
(a)配列表の配列番号1に示す、塩基配列番号1-2846で示される塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ。
(b)前記塩基配列番号1-2846の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と95%の同一性を有するＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項２】
生物における生物時計の制御に関与する遺伝子配列を有する、以下の(a)、又は(b)のＤＮＡまたはＲＮＡからなるプローブであって、生物における生物時計の制御に関与する遺伝子またはペプチド断片探索用のプローブ。
(a)配列表の配列番号2に示す、塩基配列番号1-4554で示される塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡ。
(b)前記塩基配列番号1-4554の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と95%の同一性を有するＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプローブを用いた生物時計の制御に関与する遺伝子またはペプチド断片のスクリーニング方法。
【請求項４】
スクリーニングを、insituハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、全塩基配列決定、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、サウスウエスタン法からなる群から選択される少なくとも１種を用いて行なう請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、当該核酸をコードするアミノ酸、当該核酸及びアミノ酸からなるプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング法に関し、特に、生物時計に関与する核酸、当該核酸をコードするアミノ酸、当該核酸及びアミノ酸からなるプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外界の昼夜交替に伴う光や温度変化の日周変動に適応するため、シアノバクテリアからヒトに至るまで、ほとんど全ての生物は生物時計（概日時計または体内時計とも呼ばれる）を備えており、生理活性に２４時間周期のリズム（概日リズム）を示す。この概日リズムの発振は時計遺伝子の正と負のフィードバック発現制御によって生み出されていることが藍色細菌、アカパンカビ、ショウジョウバエ、ネズミ、ヒトなどで明らかにされている（Ｄｕｎｌａｐ，Ｃｅｌｌ，９６：２７１−２９０（１９９９）；Ｉｓｈｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５１９−１５２３（１９９８）；Ｓｔａｎｅｗｓｋｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５４：１１１−１４７（２００３））。生物界の間で時計遺伝子の類似性は見い出されていないが、リズム発振の制御メカニズムは極めて類似している。植物においては、気孔の開閉、葉の就眠運動、胚軸伸長、光合成、光周的花成、形態形成、様々な代謝活性など、ほとんど全ての生理現象が生物時計によって支配されている（Ｌｕｍｓｄｅｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌａｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｈｙｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９８）；ＭｃＣｌｕｎｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２：１３９−１６２（２００１））。また、生物時計は遺伝子発現も制御している。例えば、モデル高等植物であるシロイヌナズナでは連続明条件下で全遺伝子の約６％が日周変動を伴った発現をしていることが明らかとなっている（Ｈａｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２１１０−２１１３（２０００））。しかし、植物の時計遺伝子は未だに確定されておらず、生物時計の分子メカニズムもほとんど未解明である。
一般に、植物の時計遺伝子として必要とされる条件は以下の５点である：（１）一遺伝子の機能喪失によって全ての概日リズムが失われる、（２）一遺伝子の機能喪失によって光周性が喪失する、（３）遺伝子発現が連続明条件下および連続暗条件下で概日リズムを示す、（４）遺伝子の過剰発現は全ての概日リズムを破壊する、（５）自身の遺伝子発現をフィードバック制御する。しかし、これらの条件を全て満たす植物の遺伝子は発見されていない。
シロイヌナズナにおいては、ＣＣＡ１遺伝子（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｏｂｉｎ，Ｃｅｌｌ  ９３：１２０７−１２１７（１９９８））、ＬＨＹ遺伝子（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９３：１２１９−１２２９（１９９８））、ＴＯＣ１／ＡＰＲＲ１遺伝子（Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：５８−６９（２０００）；Ｓｔｒａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：７６８−７７１（２０００））、ＥＬＦ４遺伝子（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：７４−７７（２００２））、が時計遺伝子であるとする説が存在している（Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２：７０２−７１５（２００１）；Ｙａｎｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２６５−２７５（２００３））。また、シロイヌナズナにおいては概日リズムのパラメーター（リズムの周期や位相、および振幅）に影響する遺伝子が発見されているが、これらは光受容体および光シグナル伝達系の遺伝子である（Ｈａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．６：１３−１９（２００３）；Ｙａｎｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２６５−２７５（２００３））。
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、これらの遺伝子は、先に述べた植物の時計遺伝子として必要とされる条件を満たさない。これらの遺伝子を時計遺伝子と考える場合の最大の問題点は、これらの遺伝子はいずれも一遺伝子の機能喪失で概日リズムが喪失しないので、これらの遺伝子はリズム発振に必須ではないという点である。以上の状況から、植物の時計遺伝子はまだ同定されていないと考えられる。
そこで、本発明は、生理現象、生理活性を制御することが可能な生物時計を構成する遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質を提供することを目的とするものである。
上記目的を達成するために、本発明者らは、まず、シロイヌナズナにおいて網羅的かつ大規模な時計変異体のスクリーニングを行い、無周期変異体ｐｃｌ１−１変異体とｐｃｌ１−２変異体を得た後、これらの変異体の原因遺伝子として本発明の核酸、及び当該核酸がコードするタンパク質を見出した。
すなわち、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−２８４６で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−２８４６の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−４５５４で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４５５４の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基配列番号１−４７００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４７００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−１５０５で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１５０５の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基配列番号１−４００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−６４１で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−６４１の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基配列番号１−１４００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１４００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
また、本発明のプローブは、請求項１〜７項のいずれか１項に記載の核酸からなることを特徴とする。
また、本発明のプローブの好ましい実施態様において、生物における生物時計の制御に関与する遺伝子を探索用に使用することを特徴とする。
本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−３２３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号９に示す、アミノ酸配列番号１−２９８で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号９に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１０に示す、アミノ酸配列番号１−２３８で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１０に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１１に示す、アミノ酸配列番号１−３１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１１に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１２に示す、アミノ酸配列番号１−７０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１２に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１３に示す、アミノ酸配列番号１−１８５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１３に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１４に示す、アミノ酸配列番号１−３１４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１４に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１５に示す、アミノ酸配列番号１−１２１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１５に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１６に示す、アミノ酸配列番号１−２００で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１６に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
また、本発明のプローブは、請求項１０〜１８項のいずれか１項に記載のペプチド断片からなることを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する遺伝子のスクリーニング方法は、請求項８、９、又は１９項のいずれか１項に記載のプローブを用いたことを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与する遺伝子のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、スクリーニングを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、全塩基配列決定からなる群から選択される少なくとも１種を用いて行なうことを特徴とする。
また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定化を制御することを特徴とする。
また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、ＧＡＲＰファミリーに属するＤＮＡ結合モチーフを有することを特徴とする。
また、本発明の生物時計制御用組成物は、請求項１０〜１８項のいずれか１項に記載のペプチド断片を含有することを特徴とする。
また、本発明のベクターは、請求項１〜７項のいずれか１項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡを含有していることを特徴とする。
また、本発明の形質転換体は、請求項１〜７項のいずれか１項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡを発現可能に保持することを特徴とする。
また、本発明のペプチドの生産方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含む、ことを特徴とする。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−２１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−２１０で示されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１４３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１４３で示されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。
また、本発明のプローブは、請求項２８又は２９項に記載のペプチド断片からなる。
また本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片のスクリーニング方法は、請求項３０記載のプローブを用いることを特徴とする。
本発明によれば、ＰＣＬ１遺伝子の相同遺伝子ＯｓＰＣＬ１をイネゲノムからも単離できたので、イネにおいてもシロイヌナズナと同様な操作が可能となるという有利な効果を奏する。さらに、ＰＣＬ１遺伝子の相同遺伝子のｃＤＮＡをジャガイモ、トマト、タバコ、モロコシ、マツにおいても見出した。これらの本発明の核酸、及びペプチド断片によれば、それぞれの植物において時計遺伝子として機能していると容易に推定され、本発明のＰＣＬ１遺伝子またはＰＣＬ１相同遺伝子およびＰＣＬ１類似遺伝子を人為的に操作することで、光周的花成を含めた高等植物の様々な生理現象・生理活性を制御するために基本的な研究材料を提供し得るという有利な効果を奏する。
また、本発明によれば、時計遺伝子のコードする時計タンパク質のアミノ酸配列が明らかとなったので、時計タンパク質の活性を制御する農薬を開発することで、任意の時期に効率的に植物の生理活性を制御する道も開かれるという有利な効果を奏する。これによって、農産物の生産性向上や品種改良などを効率的に進めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、連続明条件下または連続暗条件下におけるｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを示す。野生型株Ｇ−３８（青）、ｐｃｌ１−１変異体（赤）、ｐｃｌ１−２変異体（茶）のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光を連続明条件下（ａ）または連続暗条件下（ｂ）で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは各９６個体の平均値±標準偏差である。
図２は、明暗サイクル条件下または温度サイクル条件下におけるｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを示す。野生型株Ｇ−３８（青）とｐｃｌ１−１変異体（赤）のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光を１２時間暗期／１２時間暗期の明暗サイクル（ａ；１２Ｌ１２Ｄ）または１２時間２２℃／１２時間１７℃の温度サイクル（ｂ；２２℃１７℃）を与えながら測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中の黄色いバーと水色のバーは、それぞれ２２℃の期間と１７℃の期間を表している。図中のプロットは各９６個体の平均値±標準偏差である。
図３は、ｐｃｌ１変異体の葉の就眠運動を示す。野生型株Ｇ−３８（青）とｐｃｌ１−１変異体（赤）の葉の就眠運動を連続明条件下で測定した。図中の白抜きのバーは暗期を表している。測定開始時の子葉のＹ軸方向の位置を０としてプロットした。
図４は、ｐｃｌ１変異体におけるＧＩ、ＣＡＢ２、ＴＯＣ１、ＥＬＦ４、ＣＣＡ１、ＬＨＹの遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株Ｇ−３８（青）とｐｃｌ１−１変異体（赤）の細胞内のＧＩ  ｍＲＮＡ（ａ）、ＣＡＢ２  ｍＲＮＡ（ｂ）、ＴＯＣ１  ｍＲＮＡ（ｃ）、ＥＬＦ４  ｍＲＮＡ（ｄ）、ＣＣＡ１  ｍＲＮＡ（ｅ）、ＬＨＹ  ｍＲＮＡ（ｆ）レベルのノザンブロット解析を行った。
図５は、ｐｃｌ１変異体の光周的花成を示す。野生型Ｃｏｌ−０株及びＧ−３８株、ｐｃｌ１変異体ｐｃｌ１−１及びｐｃｌ１−２を１６時間明期／８時間暗期（１６Ｌ８Ｄ；薄緑）の長日条件下または１０時間明期／１４時間暗期（１０Ｌ１４Ｄ；濃緑）の短日条件下で培養して、花成時期を決定した。
図６は、ＰＣＬ１遺伝子のマップベースクローニングとＰＣＬ１遺伝子の構造を示す。
図７は、ＰＣＬ１タンパク質の構造を示す。ＰＣＬ１タンパク質の構造とＰＣＬ１タンパク質、ＡＲＲ１タンパク質、ＡＲＲ１０タンパク質のＧＡＲＰモチーフのアミノ酸残基のアライメントを示した。ＰＣＬ１タンパク質に対して一致するアミノ酸残基を赤線で囲んだ。
図８は、ＰＣＬ１タンパク質の細胞内局在の様子を示す。（ａ，ｃ，ｅ）蛍光顕微鏡で観察したＧＦＰの蛍光。（ｂ，ｄ，ｅ）は光学顕微鏡で観察した細胞の像。（ａ，ｂ）ＧＦＰのみを発現させた場合。（ｃ，ｄ）ＰＣＬ１−ＧＦＰ１融合タンパク質を発現させた場合。（ｅ，ｆ）ＧＦＰ−ＰＣＬ１融合タンパク質を発現させた場合。
図９は、ＰＣＬ１タンパク質とＰＣＬ１類似タンパク質および相同タンパク質との比較を示す。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＰＣＬ１タンパク質、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＰＣＬ１類似タンパク質ＰＣＬＬ、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のＰＣＬ１相同タンパク質ＯｓＰＣＬ１、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）のＰＣＬ１相同タンパク質ＮｂＰＣＬ１、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のＰＣＬ１相同タンパク質ＬｅＰＣＬ１、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＰＣＬ１相同タンパク質ＳｔＰＣＬ１、マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）のＰＣＬ１相同タンパク質ＰｔＰＣＬ１の各アミノ酸配列のマルチプルアライメントを示した。一致するアミノ酸残基にはアスタリスク（＊）を、類似するアミノ酸残基にはドット（．）を付した。ギャップはバー（−）で示した。ＧＡＲＰモチーフはアミノ酸残基の上に赤線を付した。ＰＣＬ１アミノ酸配列中で赤文字で示したアミノ酸残基は、ｐｃｌ１−１変異とｐｃｌ１−２変異で停止コドンに変わっているアミノ酸残基である。
図１０は、ＰＣＬ１遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株Ｇ−３８（青）とｐｃｌ１−１変異体（赤）の細胞内のＰＣＬ１  ｍＲＮＡのレベルをノザンブロット解析した。
図１１は、ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋生物発光リズムを示す。野生型株Ｇ−３８（青）とｐｃｌ１−１変異体（赤）のＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋生物発光を連続明条件下（ａ）または連続暗条件下（ｂ）で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは各４８個体の平均値±標準偏差である。
図１２は、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンおよび葉の就眠運動を示す。（ａ，ｂ）野生型株Ｇ−３８（青）とＰＣＬ１−ｏｘ植物体（緑）のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光を連続明条件下（ａ）または連続暗条件下（ｂ）で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは、それぞれ９６個体（ａ）または４８個体（ｂ）の平均値±標準偏差である。（ｃ）野生型株Ｇ−３８（青）とＰＣＬ１−ｏｘ植物体（緑）の葉の就眠運動を連続明条件下で測定した。測定開始時の子葉のＹ軸方向の位置を０としてプロットした。図中の白抜きのバーは暗期を表している。図中のプロットは各１２個体の平均値±標準偏差である。
図１３は、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体における内在ＰＣＬ１遺伝子発現のノザンブロット解析を示す。連続明条件下における野生型株Ｇ−３８（青）、ｐｃｌ１−１変異体（赤）、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体（緑）の細胞内の内在ＰＣＬ１遺伝子由来のＰＣＬ１ｍＲＮＡのレベルをノザンブロット解析した。
図１４は、植物の生物時計のモデル図を示す。本発明で発見した遺伝子制御様式を赤線で、既知の遺伝子制御様式を青線で示した。矢印は遺伝子発現の促進を、横線は遺伝子発現の抑制を表している。ＰＣＬ１遺伝子発現の負の自己フィードバックループは時計発振に必須であり、これが植物時計の中心振動体である。
図１５−１は、ＰＣＬ１遺伝子とＰＣＬ１タンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１５−２は、ＰＣＬ１遺伝子とＰＣＬ１タンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１５−３は、ＰＣＬ１遺伝子とＰＣＬ１タンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１５−４は、ＰＣＬ１遺伝子とＰＣＬ１タンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１６−１は、ＰＣＬＬ遺伝子とＰＣＬＬタンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１６−２は、ＰＣＬＬ遺伝子とＰＣＬＬタンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１６−３は、ＰＣＬＬ遺伝子とＰＣＬＬタンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１６−４は、ＰＣＬＬ遺伝子とＰＣＬＬタンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を示す図である。
図１７−１は、ＯｓＰＣＬ１遺伝子とＯｓＰＣＬ１タンパク質（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の配列を示す図である。
図１７−２は、ＯｓＰＣＬ１遺伝子とＯｓＰＣＬ１タンパク質（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の配列を示す図である。
図１７−３は、ＯｓＰＣＬ１遺伝子とＯｓＰＣＬ１タンパク質（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の配列を示す図である。
図１７−４は、ＯｓＰＣＬ１遺伝子とＯｓＰＣＬ１タンパク質（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の配列を示す図である。
図１８−１は、ＮｂＰＣＬ１遺伝子とＮｂＰＣＬ１タンパク質（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）の配列を示す図である。
図１８−２は、ＮｂＰＣＬ１遺伝子とＮｂＰＣＬ１タンパク質（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）の配列を示す図である。
図１８−３は、ＮｂＰＣＬ１遺伝子とＮｂＰＣＬ１タンパク質（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）の配列を示す図である。
図１９は、ＮｔＰＣＬ１遺伝子とＮｔＰＣＬ１タンパク質（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の配列を示す図である。
図２０−１は、ＬｅＰＣＬ１遺伝子とＬｅＰＣＬ１タンパク質（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の配列を示すである。
図２０−２は、ＬｅＰＣＬ１遺伝子とＬｅＰＣＬ１タンパク質（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の配列を示すである。
図２１−１は、ＳｔＰＣＬ１遺伝子とＳｔＰＣＬ１タンパク質（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の配列を示す図である。
図２１−２は、ＳｔＰＣＬ１遺伝子とＳｔＰＣＬ１タンパク質（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の配列を示す図である。
図２１−３は、ＳｔＰＣＬ１遺伝子とＳｔＰＣＬ１タンパク質（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の配列を示す図である。
図２２は、ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋生物発光リズムを示す。野生型のＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光を連続明（ａ）または連続暗（ｂ）で測定した。図中の白抜きのバーと黒塗りのバーは、それぞれ暗期と明期を表している。図中のプロットは各９６個体の平均値±標準偏差である。
図２３は、ＰＣＬＬ−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを示す。ＰＣＬ１−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光を連続明で測定した。図中の白抜きのバーは明期を表している。図中のプロットは、それぞれ９６個体の平均値±標準偏差である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
まず、本発明の核酸について説明すると、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−２８４６で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−２８４６の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。なお、本明細書において、「遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子」とは、塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子を意味する。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−４５５４で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４５５４の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは、９５％の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号２に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基配列番号１−４７００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４７００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸、からなる。本発明の遺伝子は、イネのゲノム由来の遺伝子である。遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子を意図する。当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−１５０５で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１５０５の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、タバコ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号４に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基配列番号１−４００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−４００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなる。当該核酸は、別の系統のタバコ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−６４１で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−６４１の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。当該核酸は、トマト由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号６に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明の生物時計の制御に関与する核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基配列番号１−１４００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１４００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。。当該核酸は、ジャガイモ由来のものである。本発明の核酸には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与する遺伝子探索用のプローブとして利用することができるからである。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子も生物時計の制御に関与する因子である限り、本発明の遺伝子に含まれる。
次に、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片について説明する。本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−３２３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。当該ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。なお、本明細書において、「アミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」とは、アミノ酸配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を有するアミノ酸配列を意味する。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号９に示す、アミノ酸配列番号１−２９８で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号９に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。当該ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド探索用のプローブとして利用することができるからである。またかかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１０に示す、アミノ酸配列番号１−２３８で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１０に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。当該ペプチド断片は、イネ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１１に示す、アミノ酸配列番号１−３１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１１に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本発明のペプチド断片は、タバコ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１２に示す、アミノ酸配列番号１−７０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１２に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、別の系統にかかるタバコ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１３に示す、アミノ酸配列番号１−１８５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１３に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、トマト由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１４に示す、アミノ酸配列番号１−３１４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１４に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、ジャガイモ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１５に示す、アミノ酸配列番号１−１２１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１５に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、マツ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１６に示す、アミノ酸配列番号１−２００で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号１６に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、モロコシ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−２１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−２１０で示されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
また、本発明の生物時計の制御に関与するペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１４３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１４３で示されるアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。本ペプチド断片は、シロイヌナズナ由来のものである。本発明のペプチド断片には、一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、例えば、生物時計の制御に関与するペプチド断片探索用のプローブとして利用することができるからである。かかるアミノ酸配列であっても、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。これらの配列は、本発明のペプチド断片を比較して理解することができるように、ホモロジーが非常に高く、この領域が生物時計としての機能に極めて重要な領域であることを導き出すことが出来る。したがって、これらの重要領域を、例えばプローブとして使用して、さらなる生物時計の解明にも役立たせることができる。
ここで、本発明の核酸、及びペプチド断片の精製、単離方法について説明する。上記核酸、及びペプチド断片は、特に限定されるものではないが、以下の手順によって、精製、単離することができる。
一度の測定で多検体の高等植物の生物発光リズムを全自動で測定して測定データの解析を行うために、生物発光測定装置２種類（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：１８７−１９２（２００５）；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．２８：１３０５−１３１５（２００５）；特開２００４−２６７０５８；特開２００５−１４３３７１）とリズム解析プログラム（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：１９３−２００（２００５）；特許第３７８７６３１号）から構成される生物発光リアルタイムモニタリング・スクリーニングシステムを用いることができる。
これらを用いて、例えば、シロイヌナズナの時計関連遺伝子であり遺伝子発現が概日リズムを示すことが知られているシロイヌナズナのＧＩ遺伝子（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４６７９−４６８８（１９９９）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７９−１５８２（１９９９））のプロモーター領域と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ＋；Ｐｒｏｍｅｇａ社）（ＬＵＣ＋（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセット（ＧＩ：：ＬＵＣ＋）を作製し、これを野生型シロイヌナズナのゲノムへ遺伝子移入し、生物発光レポーター株（Ｇ−３８株）を作出した。作出した発光レポーター株Ｇ−３８の種子をｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＥＭＳ）で変異原処理し、変異原処理から２世代目の植物体（Ｍ２植物体）５万個体の生物発光リズムを測定してリズム変異体をスクリーニングし、この結果、生物発光リズムが完全に消失した無周期変異体を５個分離した。これらの無周期変異体は、連続明条件下と連続暗条件下のいずれにおいてもＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子の生物発光リズムが無周期であり、さらに、葉の就眠運動リズムも無周期であり、そして、これらの無周期変異はいずれも劣性一遺伝子変異であり、３つの相補性群ＰＨＹＴＯＣＬＯＣＫ  １（ＰＣＬ１），ＰＣＬ２，ＰＣＬ３に分類できた。ＰＣＬ１，ＰＣＬ２，ＰＣＬ３遺伝子は、いずれも植物の時計遺伝子をコードしていると推測された。ＰＣＬ遺伝子の一つであるＰＣＬ１遺伝子は、マップベースクローニング法によって以下の手順で特定した。ｐｃｌ１−１変異体のＦ３ホモ個体（エコタイプＣｏｌ−０）と野生型Ｌｅｒ株とを交配し、第２世代（Ｆ２）の種子を得た。Ｆ２植物体を培養し、ＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子の生物発光を連続明条件下で測定し、ｐｃｌ１−１変異をホモで持っているホモ個体を選択した。そして、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）で公開されているＣｏｌ−０とＬｅｒの間の多型マーカー（ＣＡＰＳマーカー及びＳＳＬＰマーカー）及びＭｏｎｓａｎｔｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからリリースされたＳＮＰ多型マーカーを利用してｐｃｌ１−１変異と多型マーカーとの組換え率を算出した。組換え率がより小さくなる多型マーカーは物理的にＰＣＬ１遺伝子により近いので、様々なマーカーとの組換え率を調査することでＰＣＬ１遺伝子の染色体上の位置を決定した。その結果、ＰＣＬ１遺伝子の物理的位置を第３染色体上のＳＮＰマーカーＦ１８Ｌ１５−１（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＳＮＰ番号ＣＥＲ４６８１３９からＣＥＲ４６８１４３を含む）とＣＡＰＳマーカーＴＯＰＰ５の間の約１５０ｋｂに位置づけた。この約１５０ｋｂの領域における野生型Ｃｏｌ−０株及びＧ−３８株と無周期変異体ｐｃｌ１−１及びｐｃｌ１−２の塩基配列を決定して比較したところ、ＴＡＩＲウェブサイトのデーターベースに整理番号Ａｔ３ｇ４６６４０として整理されている遺伝子上にｐｃｌ１−１とｐ��ｌ１−２の両者で塩基置換が発見できたので、これをＰＣＬ１遺伝子であると結論した。ＰＣＬ１遺伝子の構造は、ＲＩＫＥＮ（ＲＡＲＧＥ；ｈｔｔｐ：／／ｒａｒｇｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）及びＴＡＩＲウェブサイトで公開されている完全長ｃＤＮＡの塩基配列とゲノムＤＮＡ配列とを比較することで決定した。タンパク質のアミノ酸配列は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの塩基配列から容易に推定することができる。
なお、核酸の塩基配列は、常法により、例えば、ダイターミネーター法などを用いて決定することができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から類似タンパク質又はホモログタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を予測し、その予測に基づいて様々なオリゴヌクレオチド合成して、これらをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ法でゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ等から増幅することができる。さらに、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から類似タンパク質又はホモログタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を予測し、その予測に基づいて様々なオリゴヌクレオチド合成して、これらを各種ハイブリダイゼーション法に利用することで遺伝子を同定することができる。
次に、本発明のプローブについて説明する。
本発明のプローブの使用方法としては、上述の核酸を単離したい生物種のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、ＲＮＡなどを直接又はＰＣＲ法で増幅し高分子膜にブロットして固定した後、本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。または、上述の核酸を単離したい生物種の細胞を固定し、細胞内の染色体へ直接本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。ハイブリダイズの方法は、常法により特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロッティング法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、迅速かつ、的確にスクリーニングすることができるという観点から望ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法には、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（以下、ＦＩＳＨ法という）、ラジオアイソトープｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等がある。ＲＩ施設を要求されないという観点から、ＦＩＳＨ法が望ましい。ＦＩＳＨ法の概略は、例えば、スライドグラス上に染色体標本を調製し、これに標識プローブをハイブリダイズし、直接検鏡するのが一般的である。
また、本発明のプローブのハイブリダイズに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、エマルジョン等を挙げることができる。これらは適当なカラムに充填して使用してもよい。こららのうち薄膜が好ましく、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜が好ましい。
ここで、本発明のプローブに使用される標識の例を説明する。標識の例として当業者に周知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えば、３２Ｐ、３５Ｓなどの放射性原子、ビオチン基、アジピン基、または酵素類、蛍光標識等などのほか、抗原抗体系を利用する場合には、抗原を含んでいても良い。これらも本発明の範囲に包含される。
なお、核酸プローブの場合、プローブの塩基長は、用いるスクリーニング方法により異なり、特に限定されるものではない。
上述のペプチド断片は、また、好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定化を制御する。これは、本発明者らの鋭意研究により、本発明の核酸が、生物時計の制御に関与している遺伝子の１つであることが明らかとされたことからである。本発明の遺伝子は、生物時計の中核をなすものであり、同時に他の遺伝子に対して、転写因子としても作用し、生物の概日リズムの発振と安定化を行っている。
また、本発明のペプチド断片の好ましい実施態様において、前記ペプチド断片が、ＧＡＲＰファミリーに属するＤＮＡ結合モチーフを有する。当該ＤＮＡ結合モチーフを介して他の遺伝子へ結合し、転写因子として機能することによって概日リズムを形成していると考えられる。
また、本発明の生物時計制御用組成物は、本発明のペプチド断片またはＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有し、細胞の生物時計機能活性を促進または抑制するものであり、生物時計制御用組成物の様態に制約はない。本発明の生物時計制御用組成物の対象は、生物個体や培養細胞、細胞抽出物、無細胞系の生物時計のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構築系などである。
また、本発明のベクターは、上記本発明の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含有する。また、本発明の形質転換体は、上記本発明の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を発現可能に保持する。そして、本発明のペプチドの生産方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含む。
以下、本発明の組換えベクターの作製について説明する。
本発明の組換えベクターは、本発明の生物時計に関与する遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で本発明の生物時計に関与する遺伝子から発現された生物時計に関与するタンパク質を生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシンＢ、バスタ（登録商標）などの薬剤に対する耐性遺伝子などが挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＣＡＬ１プロモーター、ａｍｙＢプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。
また、本発明の形質転換体は、宿主を本発明の組換えベクタで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２やシロイヌナズナ培養細胞、タバコ植物体、シロイヌナズナ植物体などの植物系細胞、昆虫の培養細胞、動物細胞、分裂酵母や出芽酵母などの酵母、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アカパンカビ等の糸状菌類、大腸菌やバチルス、藍色細菌などの細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。植物系細胞の場合は、例えば、アグロバクテリアを介した形質転換法（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１（１９８５）；Ｈｏｏｙｋａａｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５−３８（１９９２）；Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３（１９９８））などを用いることが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウム法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２５５−２６９（１９９５））などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：９９−１０４（１９８９）の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、自然形質転換法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２７１：５０−５９（２００４））や塩化カルシウム法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７））、電気穿孔法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−１８７（１９９０））などを用いることができる。
本発明の生物時計に関与するタンパク質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物から生物時計に関与するタンパク質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主が植物系培養細胞であり、発現制御配列がＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである場合、例えば、ショ糖を含む培地で細胞を培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が植物体であり、発現制御配列がＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである場合、例えば、植物体を土壌で培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が酵母であり、発現制御配列がＧＡＬ１プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がａｍｙＢプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより本発明の生物時計に関与するタンパク質を生産させることができる。本発明の生物時計に関与するタンパク質が宿主細胞内または菌体表面に生産された場合は、宿主細胞を培地から分離し、その細胞を適当に処理することにより本発明のタンパク質を得ることができる。例えば、細胞内に生産された場合、細胞を物理的又は酵素的に破砕した後、遠心分離および各種クロマトグラフィー等を使用して本発明の生物時計に関与するタンパク質を分離・精製することができる。培養液中に本発明の本発明の生物時計に関与するタンパク質が生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のタンパク質を得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明の生物時計に関与するタンパク質を更に純度の高いものとして精製することもできる。
本発明の生物時計に関与するタンパク質は、無細胞系のタンパク質合成系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することも出来る。無細胞系のタンパク合成系の例としては、例えば、コムギ胚芽抽出液由来の無細胞タンパク質合成システムであるＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡）（ＰＲＯＴＥＩＯＳ（登録商標））などを挙げることができる。また、本発明の生物時計に関与するタンパク質のアミノ酸配列の一部をｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的にペプチド合成することもできる。こうした本発明の生物時計に関与するタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成およびペプチド合成も本発明に含まれる。
本発明の生物時計に関与するタンパク質には、精製の際にアフィニティークロマトグラフィーを用いるためのタグ配列を付加して生産してもよい。このようなタグ配列の例としては、例えば、ＧＳＴタグやＨｉｓタグ、Ｍｙｃタグなどを挙げることができる。
本発明は、高等植物の生物時計の中枢を構成する時計遺伝子ＰＨＹＴＯＣＬＯＣＫ  １（ＰＣＬ１）とそれがコードするタンパク質ＰＣＬ１、及びＰＣＬ１遺伝子の応用に関するものである。本発明のＰＣＬ１遺伝子が破壊されたシロイヌナズナでは、調査した全ての概日リズムが失われており、光周的花成が野生型の長日性に対して日長不感受性を示した。したがって、本発明のＰＣＬ１遺伝子を人為的に操作することで、光周的花成を含めた高等植物の様々な生理現象・生理活性を制御することが可能であると考えられる。
【実施例】
【０００６】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するための用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。
［実施例１］
本発明者らは、モデル高等植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において、シロイヌナズナのＧＩ遺伝子のプロモーターと改変型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ＋）のコード領域を接続したＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子の生物発光リズムを指標として、概日リズムに異常を示すリズム変異体を網羅的にスクリーニングし、無周期変異体を５個分離した。これらの無周期変異体は、連続明条件下と連続暗条件下のいずれにおいてもＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子の生物発光リズムが無周期であり、さらに、葉の就眠運動リズムも無周期であった。そして、これらの無周期変異はいずれも劣性一遺伝子変異であり、３つの相補性群ＰＨＹＴＯＣＬＯＣＫ  １（ＰＣＬ１），ＰＣＬ２，ＰＣＬ３に分類できた（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））。無周期変異の原因遺伝子の一つであるＰＣＬ１遺伝子をマップベースクローニング法でクローニングした。ＰＣＬ１遺伝子は、先に述べた高等植物の時計遺伝子の条件を全て満たしていたので、植物の真の時計遺伝子であり、また、ＰＣＬ１遺伝子のコードするタンパク質は、植物の時計タンパク質であると結論した。ＰＣＬ１遺伝子の相同遺伝子はイネ、タバコ、トマト、ジャガイモ、モロコシ、マツにも存在しており、植物一般に時計遺伝子として機能していることが容易に推定できる。
本発明は、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、概日リズムの発振と安定化を制御している植物の時計遺伝子ＰＣＬ１とその相同遺伝子および類似遺伝子、より詳細には、ＧＡＲＰファミリーに属するＤＮＡ結合モチーフを有することを特徴とする植物の時計タンパク質ＰＣＬ１とその相同タンパク質および類似タンパク質、それらをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ、さらにはＰＣＬ１タンパク質とＰＣＬ１相同タンパク質およびＰＣＬ１類似タンパク質の組成物、ＰＣＬ１タンパク質とＰＣＬ１相同タンパク質およびＰＣＬ１類似タンパク質の発現を可能とするベクター及び形質転換体、ＰＣＬ１タンパク質とＰＣＬ１相同タンパク質およびＰＣＬ１類似タンパク質の生産方法に関する。
実施例における植物体、培養条件、概日リズムの測定方法
ＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子をもつシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の生物発光レポーター株Ｇ−３８は、エコタイプがＣｏｌ−０であり、特に記載がない限りこれを野生型として使用した。シロイヌナズナの無周期変異体ｐｃｌ１−１とｐｃｌ１−２は、生物発光レポーター株Ｇ−３８から分離された無周期変異体であり、本発明者らの報告（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））において、それぞれ２３−１５Ｄ９と３２−５Ｅ２として分離された変異体である。無周期変異体ｐｃｌ１−１とｐｃｌ１−２は、いずれも野生型Ｇ−３８と戻し交配後の第４世代（Ｆ４）のホモ個体を使用した。シロイヌナズナは、特に言及しない限り、２２．０±０．３℃、１．５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７（１９６２））固体培地上で本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って無菌的に生育させた。植物体培養時の照射光は、７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色光であった。
＜連続明条件下または連続暗条件下におけるｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光＞
一般に、概日リズムは連続明や連続暗などの一定環境下で自律的に継続する。そこで、まず、ｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光が一定環境下で自律振動するのか否かを調べた。連続明および連続暗条件下におけるＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光の測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルまたは１２時間暗期／１２時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。
野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを図１に示した。野生型株Ｇ−３８は連続明と連続暗のいずれの条件下においても明瞭な生物発光リズムを示したが、ｐｃｌ１変異体はどちらの条件下でも無周期であり、リズムを全く示さなかった。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は、ＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光リズムに必須であることが判明した。
［実施例２］
＜明暗サイクル条件下または温度サイクル条件下におけるｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光＞
一般に、概日リズムは明暗サイクルや温度サイクルに同調する。そこで、野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光が明暗サイクルおよび温度サイクルに同調するか否かを調べた。明暗サイクルおよび温度サイクル条件下におけるＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光の測定は、植物体に１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクル（明暗サイクル中の温度は２２℃で一定）または１２時間２２℃／１２時間１７℃の温度サイクル（温度サイクル中は連続明）を与えながら行った。
明暗サイクル条件下における野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを図２ａに、温度サイクル条件下における野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１変異体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを図２ｂにそれぞれ示した。明暗サイクル条件下において野生型株Ｇ−３８は明瞭な生物発光リズムを示したが、ｐｃｌ１変異体の発光パターンは明期に発光量が一定レベルのまま高く保たれ、暗期に発光量が低下するという矩形を示した。これは、ＧＩ遺伝子が光誘導性の遺伝子であり、暗条件よりも明条件で発現量が高いことを反映しているにすぎず、ｐｃｌ１変異体の生物発光は明暗条件下でリズムを示さないことを意味している。同様に、温度サイクル条件下においても野生型株Ｇ−３８は明瞭な生物発光リズムを示したが、ｐｃｌ１変異体は１７℃よりも２２℃で発光量が僅かに高い矩形の発光パターンを示した。これは、発光タンパク質として使用しているホタルルシフェラーゼの酵素活性が１７℃よりも２２℃で僅かに高いことを反映しているにすぎず、ｐｃｌ１変異体の生物発光は温度サイクル条件下でリズムを示さないことを意味している。したがって、ＰＣＬ１遺伝子はＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光リズムの明暗サイクルおよび温度サイクルに対する同調に必須であることが判明した。
［実施例３］  ＜ｐｃｌ１変異体の葉の就眠運動＞
高等植物においては、葉の上下運動（就眠運動）が概日リズムを示すことが広く知られている（Ｌｕｍｓｄｅｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌａｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｈｙｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９８））。ｐｃｌ１変異体の生物発光の無周期性が生物時計本体の異常によってもたらされているのであれば、ＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光とは別の指標である葉の就眠運動リズムも無周期になっていると予想される。そこで、ｐｃｌ１変異体の葉の就眠運動を測定した。葉の就眠運動の測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。
野生型株とｐｃｌ１変異体の葉の就眠運動パターンを図３に示した。野生型株は明瞭な就眠運動リズムを示したが、ｐｃｌ１変異体では就眠運動は観察されず無周期であり、リズムを全く示さなかった。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は葉の就眠運動リズムに必須であることが判明した。
［実施例４］
＜ｐｃｌ１変異体におけるＧＩ、ＣＡＢ２、ＴＯＣ１、ＥＬＦ４、ＣＣＡ１、ＬＨＹの遺伝子発現のノザンブロット解析＞
高等植物の生物時計に深く関与すると考えられている遺伝子としてＧＩ、ＴＯＣ１、ＥＬＦ４、ＣＣＡ１、ＬＨＹが発見されており、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは概日リズムを示すことが知られている（Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２：７０２−７１５（２００１）；Ｓａｌｏｍ▲ｅ▼  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｈｙｔｍｓ  １９：４２５−４３５（２００４））。また、光合成系の遺伝子であるＣＡＢ２遺伝子もｍＲＮＡレベルが概日リズムを示すことが知られている（Ｍｉｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１１６１−１１６３（１９９５））。ｐｃｌ１変異体において、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルの概日リズムが損なわれているのか否かをノザンブロット解析で調べた。野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１−１変異体の細胞内のＧＩ遺伝子、ＣＡＢ２遺伝子、ＴＯＣ１遺伝子、ＥＬＦ４遺伝子、ＣＣＡ１遺伝子、ＬＨＹ遺伝子のｍＲＮＡレベルのノザンブロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌した野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１−１変異体の種子を１．５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７（１９６２））固体培地に播種し、連続明、２２．０±０．３℃の条件下で１１日間培養し、１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルを３サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色光であった。３サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を０時間目として、連続明開始時から３時間間隔で各タイムポイントごとに１０個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標））を使用して、凍結した植物体から全ＲＮＡを抽出した。５μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒドを含んだ１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写した。転写した全ＲＮＡを３２Ｐラベルした遺伝子特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、各遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量を放射活性として検出した。ＴＯＣ１遺伝子、ＣＣＡ１遺伝子、ＬＨＹ遺伝子それぞれに特異的な３２ＰラベルＤＮＡプローブは、牧野らの方法（Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：５８−６９（２００２））に従って調製した。ＧＩ遺伝子特異的な３２ＰラベルＤＮＡプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに登録番号ＮＣ＿００３０７０で登録されている塩基配列の８，０６４，６６０から８，０６６，０５２を野生型株Ｃｏｌ−０からクローニングして調製した。ＣＡＢ２遺伝子特異的な３２ＰラベルＤＮＡプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに登録番号ＮＣ＿００３０７０で登録されている塩基配列の１０，４７４，７２９から１０，４７５，０２５を野生型株Ｃｏｌ−０からクローニングして調製した。ＥＬＦ４遺伝子特異的な３２ＰラベルＤＮＡプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに登録番号ＮＣ＿００３０７０で登録されている塩基配列の１６，７４１，２９４から１６，７４２，０１９を野生���株Ｃｏｌ−０からクローニングして調製した。
ノザンブロット解析の結果を図４に示した。野生型株Ｇ−３８においては、いずれの遺伝子のｍＲＮＡレベルも明瞭な概日リズムを示した。これに対してｐｃｌ１変異体においては、いずれのｍＲＮＡレベルもリズムを示さなかった。また、ｐｃｌ１変異体においては、ＧＩ  ｍＲＮＡ、ＣＡＢ２  ｍＲＮＡ、ＴＯＣ１  ｍＲＮＡ、ＥＬＦ４  ｍＲＮＡのレベルが野生型株のｍＲＮＡレベルと比較して上昇しており、逆にＣＣＡ１  ｍＲＮＡ、ＬＨＹ  ｍＲＮＡのレベルは極端に低下していた。これらの結果は、ＰＣＬ１遺伝子は、ＧＩ遺伝子、ＣＡＢ２遺伝子、ＴＯＣ１遺伝子、ＥＬＦ４遺伝子のリズミックな概日発現に必須であり、また、ＰＣＬ１遺伝子がＧＩ遺伝子、ＣＡＢ２遺伝子、ＴＯＣ１遺伝子、ＥＬＦ４遺伝子の発現を抑制し、ＣＣＡ１遺伝子とＬＨＹの遺伝子の発現を促進することを示している。
［実施例５］＜ｐｃｌ１変異体の光周的花成＞
高等植物の光周的花成は生物時計によって支配されていることが広く知られている（Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｒｈｙｔｈｍｉｃ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８７）；Ｌｕｍｓｄｅｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌａｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｈｙｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９８））。ｐｃｌ１変異体が光周性を損なっているのか否かを調べた。光周的花成の測定は、大藤らの方法（Ｏｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：２５２−２６１（２００１））に従って、以下の手順で行った。野生型Ｃｏｌ−０株及びＧ−３８株、ｐｃｌ１変異体ｐｃｌ１−１及びｐｃｌ１−２の種子を吸水させた後、４℃、２日間暗黒下で静置し、土（バーミキュライト）に播種した。そして、２２．０±０．５℃、長日条件下（１６時間明期／８時間暗期）または短日条件（１０時間明期／１４時間暗期）で培養した。明期における植物体への照射光は、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色光であった。花成時期は、植物体が１．５ｃｍの高さまで抽台したときの植物体の全ての葉の数をカウントすることで定量化した。シロイヌナズナは長日植物であり、野生型では、長日条件で培養した場合よりも短日条件で培養した場合の方が、より多くの葉をつける。野生型株Ｃｏｌ−０とＧ−３８、ｐｃｌ１変異体ｐｃｌ１−１とｐｃｌ１−２の花成時期の測定結果を図５に示した。野生型株では長日条件下で葉の枚数が少なく、短日条件下で葉の枚数が多いという長日性を示したが、ｐｃｌ１変異体では長日と短日のいずれの日長でもほぼ同数の葉の枚数であり、日長不感受性であった。すなわち、ｐｃｌ１変異体は光周性を損なっていた。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は光周的花成に必須であることが判明した。
［実施例６］＜ＰＣＬ１遺伝子のマップベースクローニングとＰＣＬ１遺伝子の構造＞
ＰＣＬ１遺伝子のクローニングはマップベースクローニング法によって以下の手順で行った。ｐｃｌ１−１変異体のＦ３ホモ個体（エコタイプＣｏｌ−０）と野生型Ｌｅｒ株とを交配し、第２世代（Ｆ２）の種子を得た。Ｆ２植物体を培養し、ＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子の生物発光を連続明条件下で測定し、ｐｃｌ１−１変異をホモで持っているホモ個体を選択した。そして、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）で公開されているＣｏｌ−０とＬｅｒの間の多型マーカー（ＣＡＰＳマーカー及びＳＳＬＰマーカー）及びＭｏｎｓａｎｔｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからリリースされたＳＮＰ多型マーカーを利用してｐｃｌ１−１変異と多型マーカーとの組換え率を算出した。組換え率がより小さくなる多型マーカーは物理的にＰＣＬ１遺伝子により近いので、様々なマーカーとの組換え率を調査することでＰＣＬ１遺伝子の染色体上の位置を決定した。図６にＰＣＬ１遺伝子のマップベースクローニングの模式図とＰＣＬ１遺伝子の構造を示した。ＰＣＬ１遺伝子の物理的位置を第３染色体上のＳＮＰマーカーＦ１８Ｌ１５−１（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＳＮＰ番号ＣＥＲ４６８１３９からＣＥＲ４６８１４３を含む）とＣＡＰＳマーカーＴＯＰＰ５の間の約１５０ｋｂに位置づけた。この約１５０ｋｂの領域における野生型Ｃｏｌ−０株及びＧ−３８株と無周期変異体ｐｃｌ１−１及びｐｃｌ１−２の塩基配列を決定して比較したところ、ＴＡＩＲウェブサイトのデーターベースに整理番号Ａｔ３ｇ４６６４０として整理されている遺伝子上にｐｃｌ１−１とｐｃｌ１−２の両者で塩基置換が発見できたので、これをＰＣＬ１遺伝子であると結論した。ＰＣＬ１遺伝子の構造は、ＲＩＫＥＮ（ＲＡＲＧＥ；ｈｔｔｐ：／／ｒａｒｇｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）及びＴＡＩＲウェブサイトで公開されている完全長ｃＤＮＡの塩基配列とゲノムＤＮＡ配列とを比較することで決定した。ＰＣＬ１遺伝子の塩基配列と推定されるＰＣＬ１タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載した。ｐｃｌ１−１とｐｃｌ１−２どちらの変異も、コード領域に停止コドンを生じるナンセンス変異であった。ｐｃｌ１−１変異は配列表の配列番号１に記載の塩基配列中の６０５番目の塩基ＧがＡに置換した変異であり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中の１４９番目のアミノ酸残基Ｔｒｐが停止コドンになってしまうことが分かる。ｐｃｌ１−２変異は配列表の配列番号１に記載の塩基配列中の４７４番目の塩基ＣがＴに置換した変異であり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中の１０６番目のアミノ酸残基Ｇｌｎが停止コドンになってしまうことが判明した。
［実施例７］  ＜ＰＣＬ１タンパク質の構造＞
推定されるＰＣＬ１タンパク質の構造を図７に示した。ＰＣＬ１タンパク質は３２３アミノ酸残基から成り、既知のタンパク質との相同性をもたない新規のタンパク質であった。しかし、タンパク質の中央部分（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４３番目から２０１番目のアミノ酸残基）に植物の転写因子に広く見られるＤＮＡ結合モチーフであるＧＡＲＰモチーフを発見した。シロイヌナズナのレスポンスレギュレーターであるＡＲＲ１タンパク質（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：１２３２−１２３９（１９９８））やＡＲＲ１０タンパク質（Ｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０：７３３−７４２（１９９９））のＧＡＲＰモチーフはその機能と構造が詳細に調べられている。ＡＲＲ１タンパク質とＡＲＲ１０タンパク質は、核に局在してＧＡＲＰモチーフを介して特定のＤＮＡに結合することが知られている。また、ＡＲＲ１０タンパク質のＧＡＲＰモチーフのアミノ酸残基はヘリックス−ループ−ヘリックスのＭｙｂ様の立体構造を形成してＤＮＡに結合することも知られている（Ｈｏｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：２０１５−２０２９（２００２））。ＰＣＬ１アミノ酸配列中のＧＡＲＰモチーフはＡＲＲ１タンパク質やＡＲＲ１０タンパク質のＧＡＲＰモチーフに極めて似ていることから、ＰＣＬ１タンパク質は核に局在してＧＡＲＰモチーフを介してＤＮＡに結合し、特定のＤＮＡに結合して転写制御を行っていると考えられる。ｐｃｌ１−１変異とｐｃｌ１−２変異は、ともに劣性変異であり、ＧＡＲＰモチーフを欠いた不完全なＰＣＬ１タンパク質を生じるナンセンス変異であることから、ｐｃｌ１−１変異体とｐｃｌ１−２変異体はともにｐｃｌ１欠損変異体であると考えられる。
［実施例８］＜ＰＣＬ１タンパク質の細胞内局在＞
ＰＣＬ１タンパク質の細胞内局在は、丹羽らの方法（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１８：４５５−４６３（１９９９））を参考にして、ＧＦＰ−ＰＣＬ１融合タンパク質及びＰＣＬ１−ＧＦＰ融合タンパク質をタマネギの表皮細胞で一過的に発現させて、ＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。対照としてＧＦＰのみをタマネギ表皮細胞で一過的に発現させて、ＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ−ＰＣＬ１融合タンパク質及びＰＣＬ１−ＧＦＰ融合タンパク質は核に局在していた（図８）。したがって、ＰＣＬ１タンパク質は細胞内で核に局在すると考えられる。
［実施例９］  ＜ＰＣＬ１類似タンパク質および相同タンパク質の探索＞
ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質および類似タンパク質を公的なデータベースで検索した。その結果、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においてＰＣＬ１類似タンパク質をコードする遺伝子を、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）においてＰＣＬ１相同タンパク質をコードする遺伝子を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）においてＰＣＬ１相同タンパク質をコードするｃＤＮＡを、それぞれ発見した。ＰＣＬ１タンパク質とＰＣＬ１類似タンパク質およびＰＣＬ１相同タンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を図９に示した。シロイヌナズナにおいては、ＴＡＩＲウェブサイトのデータベースで整理番号Ａｔ５ｇ５９５７０として整理されている推定遺伝子（配列表の配列番号２の塩基配列）がＰＣＬ１タンパク質と有意に類似したタンパク質（配列表の配列番号９のアミノ酸配列）をコードしていた。本発明者らはこの遺伝子をＰＣＬ１−ＬＩＫＥ（ＰＣＬＬ）と名付けた。また、イネのゲノムＤＮＡ配列上にＰＣＬ１タンパク質と相同なアミノ酸配列（配列表の配列番号１０のアミノ酸配列）をコードする推定遺伝子（配列表の配列番号３の塩基配列）を発見し、これを本発明者らはＯｓＰＣＬ１遺伝子と名付けた。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）においては、不完全長である可能性があるが、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１１のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡ（配列表の配列番号４の塩基配列）を発見し、これを本発明者らはＮｂＰＣＬ１遺伝子と名付けた。別の系統のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）においても、不完全長ではあるが、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１２のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡ（配列表の配列番号５の塩基配列）を発見し、これを本発明者らはＮｔＰＣＬ１遺伝子と名付けた。トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）においては、不完全長ではあるが、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１３のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡ（配列表の配列番号６の塩基配列）を発見し、これを本発明者らはＬｅＰＣＬ１遺伝子と名付けた。ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）においては、不完全長である可能性があるが、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１４のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡ（配列表の配列番号７の塩基配列）を発見し、これを本発明者らはＳｔＰＣＬ１遺伝子と名付けた。マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）においては、不完全長ではあるが、、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１５のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡを発見し、これを本発明者らはＰｔＰＣＬ１遺伝子と名付けた。モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）においては、不完全長ではあるが、ＰＣＬ１タンパク質の相同タンパク質（配列表の配列番号１６のアミノ酸配列）をコードすると推定されるｃＤＮＡを発見した。
［実施例１０］＜ＰＣＬ１遺伝子発現のノザンブロット解析＞
これまでに時計遺伝子が発見されている生物種においては、ほとんどの時計遺伝子の発現が概日リズムを示す（Ｉｓｈｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５１９−１５２３；Ｄｕｎｌａｐ，Ｃｅｌｌ  ９６：２７１−２９０）。そこで、ＰＣＬ１遺伝子発現が概日リズムを示すのか否かをノザンブロット解析で調べた。野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１変異体の細胞内のＰＣＬ１  ｍＲＮＡレベルのノザンブロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌した野生型株Ｇ−３８とｐｃｌ１−１変異体の種子を１．５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７（１９６２））固体培地に播種し、連続明、２２．０±０．３℃の条件下で１１日間培養し、１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルを３サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色光であった。３サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を０時間目として、連続明開始時から３時間間隔で各タイムポイントごとに１０個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを使用して、凍結した植物体から全ＲＮＡを抽出した。５μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒドを含んだ１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写した。転写した全ＲＮＡを３２ＰラベルしたＰＣＬ１遺伝子特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、ＰＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量を放射活として検出した。ＰＣＬ１遺伝子特異的な３２ＰラベルＤＮＡプローブは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１，０２１から１，９９２を野生型株Ｃｏｌ−０からクローニングして調製した。
ノザンブロット解析の結果を図１０に示した。野生型株Ｇ−３８においては、ＰＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡレベルは主観的夕方にピークをもつ明瞭な概日リズムを示した。これに対してｐｃｌ１変異体においては、ＰＣＬ１ｍＲＮＡレベルは概日リズムを示さなかった。したがって、ＰＣＬ１遺伝子発現は概日リズムを示し、自身のリズミックな概日発現に必須であることが判明した。
［実施例１１］＜ＰＣＬ：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株の作出と生物発光リズム＞
ＰＣＬ１遺伝子の発現を生物発光として詳細にリアルタイムモニタリングするために、ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株を以下の手順で作出した。まず、ＰＣＬ１遺伝子のプロモーター領域（配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１から１，０２０）と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ＋；Ｐｒｏｍｅｇａ社）のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセット（ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋）を作製し、これをバイナリーベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０３（１９９０））のクローニングサイトへ挿入してｐＢＩＢ／ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋を作製した。ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔの方法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３（１９９８））に従って、ｐＢＩＢ／ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋のＴ−ＤＮＡ領域（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子ＨＰＴとＰＣＬ：：ＬＵＣ＋を含む）をアグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株Ｃｏｌ−０のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、ＷｅｉｇｅｌとＧｌａｚｅｂｒｏｏｋの記載（Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００２））に従って、ハイグロマイシンＢ耐性植物体として選択し、さらに、Ｔ−ＤＮＡが一遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（Ｔ３）を選択し野生型ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株として使用した。
連続明および連続暗条件下における野生型ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルまたは１２時間暗期／１２時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。
野生型ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光パターンを図１１に示した。連続明条件下における野生型ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光は、ノザンブロット解析によるＰＣＬ１ｍＲＮＡの概日リズムと一致する明瞭な概日リズムを示した。また、生物発光量は連続明の場合と比較して約３分の１に低下したが、野生型ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光は連続暗条件においても明瞭な概日リズムを示した。これらの結果は、ＰＣＬ１遺伝子の発現が連続明と連続暗いずれの条件下においても明瞭な概日リズムを示すことを意味している。
［実施例１２］
＜ＰＣＬ１過剰発現体ＰＣＬ１−ｏｘの作出とＰＣＬ１−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンおよび葉の就眠運動＞
これまでに時計遺伝子が発見されている生物種においては、ほとんどの時計遺伝子の発現が概日リズムを示し、この概日発現を破壊すると全ての概日リズムが消失してしまうことが広く知られている（Ｉｓｈｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５１９−１５２３；Ｄｕｎｌａｐ，Ｃｅｌｌ  ９６：２７１−２９０）。そこで、ＰＣＬ１遺伝子を過剰発現するＰＣＬ１過剰発現体ＰＣＬ１−ｏｘを作出してＰＣＬ１遺伝子の概日発現を破壊した場合に、概日リズムが消失するのか否かを調べた。ＰＣＬ１過剰発現体ＰＣＬ１−ｏｘは以下の手順で作出した。まず、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ；ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに登録番号ＡＦ４８５７８３で登録されている塩基配列の４，９５１から５，８１５）とＰＣＬ１遺伝子のコード領域（配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９９７から２，００１）を接続したＰＣＬ１過剰発現カセット（ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＰＣＬ１）を作製し、これをバイナリーベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０３（１９９０））のクローニングサイトへ挿入してｐＢＩＢ／３５Ｓ：：ＰＣＬ１を作製した。ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔの方法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３（１９９８））に従って、ｐＢＩＢ／３５Ｓ：：ＰＣＬ１のＴ−ＤＮＡ領域（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子ＨＰＴと３５Ｓ：：ＰＣＬ１を含む）をアグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株Ｇ−３８（ＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子をもつ野生型株）のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、ＷｅｉｇｅｌとＧｌａｚｅｂｒｏｏｋの記載（Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００２））に従って、ハイグロマイシンＢ耐性植物体として選択し、さらに、Ｔ−ＤＮＡが一遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（Ｔ３）を選択し、植物細胞内のＰＣＬ１  ｍＲＮＡレベルが上昇していることをノザンブロット解析で確認した後、ＰＣＬ１過剰発現体ＰＣＬ１−ｏｘとして使用した。
連続明および連続暗条件下における野生型株Ｇ−３８およびＰＣＬ１−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを図１２ａと図１２ｂに示した。ＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光の測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルまたは１２時間暗期／１２時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。野生型株Ｇ−３８は連続明と連続暗のいずれの条件下においても明瞭な生物発光リズムを示したが、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体はどちらの条件下でも３〜４日目まででにリズムが消失した。また、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体では野生型株Ｇ−３８と比較してＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光のレベルが常に低かった。すなわち、ＰＣＬ１遺伝子の過剰発現は、ＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光リズムを破壊し、かつＧＩ：：ＬＵＣ＋レポーター遺伝子発現を抑制していた。
野生型株とＰＣＬ１−ｏｘ植物体の葉の就眠運動パターンを図１２ｃに示した。葉の就眠運動の測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。野生型株は明瞭な就眠運動リズムを示したが、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体では就眠運動は４日目までにリズムが消失した。すなわち、ＰＣＬ１遺伝子の過剰発現は、葉の就眠運動リズムも破壊した。
これらの結果は、ＰＣＬ１遺伝子の概日発現を破壊すると概日リズムが消失することを示している。すなわち、ＰＣＬ１遺伝子のリズミックな概日発現が概日リズム発振に必須である。
［実施例１３］＜ＰＣＬ１遺伝子発現の自己フィードバック制御＞
これまでに時計遺伝子が発見されている生物種においては、時計遺伝子の発現が自身の遺伝子発現を制御する、すなわち自己フィードバック制御し、これによってリズミックな概日発現を可能としている。そして、この自己フィードバックループが時計発振の本質であることが広く知られている（Ｉｓｈｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５１９−１５２３；Ｄｕｎｌａｐ，Ｃｅｌｌ  ９６：２７１−２９０）。例えば、ショウジョウバエや哺乳類のＰｅｒｉｏｄ遺伝子、アカパンカビのｆｒｅｑｕｅｎｃｙ遺伝子や藍色細菌のｋａｉＣ遺伝子、は自身の遺伝子発現を負のフィードバック制御している。そこで、ＰＣＬ１遺伝子の発現が自己フィードバック制御されているのか否かを明らかにするため、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体（内在のＰＣＬ１遺伝子とに加えてＰＣＬ１遺伝子過剰発現カセットであるＣａＭＶ３５Ｓ：：ＰＣＬ１遺伝子を染色体上のエクトピックな部位に持っている植物体）において内在のＰＣＬ１遺伝子発現をノザンブロット解析によって調べた。野生型株Ｇ−３８、ｐｃｌ１変異体、そしてＰＣＬ１−ｏｘ植物体のノザンブロット解析は以下の手順で行った。まず、表面滅菌したそれぞれの種子を１．５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７（１９６２））固体培地に播種し、連続明、２２．０±０．３℃の条件下で１１日間培養し、１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルを３サイクル与えた後、連続明条件に戻した。植物体培養時の照射光は、５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色光であった。３サイクル目の暗期終了時、すなわち連続明開始時を０時間目として、連続明開始時から４時間間隔で各タイムポイントごとに１０個体の植物体をサンプリングして即座に液体窒素で凍結した。そして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを使用して、凍結した植物体から全ＲＮＡを抽出した。５μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒドを含んだ１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写した。転写した全ＲＮＡを内在のＰＣＬ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡのみにハイブリダイズするＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、内在ＰＣＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡ蓄積量を放射活として検出した。内在のＰＣＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするＲＮＡプローブは、３２Ｐを取り込ませながら試験管内合成したＰＣＬ１  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（配列表の配列番号１に記載の塩基配列の１，９９２から２，２３７）を使用した。
ノザンブロット解析の結果を図１３に示した。野生型株Ｇ−３８においては、ＰＣＬ１  ｍＲＮＡはリズミックに変動して明瞭な概日リズムを示したが、ＰＣＬ１−ｏｘ植物体においては、内在のＰＣＬ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルの概日リズムは３日目で消失し、かつそのレベルは野生型と比較して低レベルであった。また、ｐｃｌ１変異体では、ＰＣＬ１  ｍＲＮＡレベルは野生型と比較して高く、概日リズムを示さなかった。これらの結果は、ＰＣＬ１遺伝子発現は自分自身の遺伝子発現を負に制御している、すなわち負のＰＣＬ１遺伝子発現制御は自己フィードバックループを形成しており、このフィードバックループが概日リズム発振に必須であることを示している。
以上の結果、上述したような、高等植物における生物時計遺伝子として必要とされる条件である以下の５つ、すなわち、（１）一遺伝子の機能喪失によって全ての概日リズムが失われる、（２）一遺伝子の機能喪失によって光周性が喪失する、（３）遺伝子発現が連続明条件下および連続暗条件下で概日リズムを示す、（４）遺伝子の過剰発現は全ての概日リズムを破壊する、（５）自身の遺伝子発現をフィードバック制御する、を本発明の遺伝子が満足することが判明した。これらの条件を満たす遺伝子は、上述のように本発明が成されるまで発見されていなかった。
実施例６において本発明者らは、シロイヌナズナのゲノムから概日リズムを支配する生物時計遺伝子ＰＣＬ１をクローニングした。さらに、実施例１〜４と実施例１０においてｐｃｌ１変異体では調べた全ての概日リズムが失われていた。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は一遺伝子の機能喪失で全ての概日リズムが失われるので、上記条件（１）を満たしていることが判明した。
実施例５においてｐｃｌ１変異体では、光周的花成が日長不感受性であった。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は一遺伝子の機能喪失で光周性が喪失するので、上記条件（２）を満たしていることが判明した。
実施例１０と実施例１１においてＰＣＬ１遺伝子の発現は、連続明および連続暗条件下で概日リズムを示した。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は上記条件（３）を満たしていることが判明した。
実施例１２と実施例１３においてＰＣＬ１遺伝子の過剰発現は、調べた全ての概日リズムを破壊した。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は上記条件（４）を満たしていることが判明した。
実施例１３においてＰＣＬ１遺伝子の機能喪失は自身の発現を上昇させ、過剰発現は自身の発現を抑制した。したがって、ＰＣＬ１遺伝子は負の自己フィードバックによって自らの発現を制御しているので、上記条件（５）を満たしていることが判明した。
以上から、ＰＣＬ１遺伝子は植物の生物時計遺伝子として必要とされる条件を全て満たしていたので、植物の時計遺伝子であることが判明した。
また、実施例７と実施例８においてＰＣＬ１遺伝子は、ＧＡＲＰモチーフをもつ核局在のタンパク質をコードしていた。したがって、ＰＣＬ１タンパク質は植物細胞において核に局在して特定のＤＮＡに結合し遺伝子発現を制御する転写因子として機能していると考えられる。
実施例９においてＰＣＬ１タンパク質の類似タンパク質および相同タンパク質ををコードする遺伝子を多数の植物に見出した。これらのタンパク質は、時計タンパク質として機能していると容易に推測される。
本発明に基づく植物の生物時計のモデルを図１４に示した。ＰＣＬ１遺伝子は負の自己フィードバックループを形成し、このフィードバックループが生物時計の本質であると考えられる。また、ＰＣＬ１遺伝子は、既知の時計関連遺伝子であるＴＯＣ１、ＧＩ、ＥＬＦ４の発現を促進的に、ＣＣＡ１とＬＨＹの発現を抑制的に制御しており、これらの遺伝子発現ネットワークが概日振動を安定化させていると考えられる。
［実施例１４］＜ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株の作出と生物発光リズム＞
シロイヌナズナのＰＣＬ１類似遺伝子ＰＣＬＬの発現を生物発光として詳細にリアルタイムモニタリングするために、ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株を以下の手順で作出した。まず、ＰＣＬＬ遺伝子のプロモーター領域と改良型ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を接続した生物発光レポーター遺伝子カセット（ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋）を作製し、これをバイナリーベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０３（１９９０））のクローニングサイトへ挿入してｐＢＩＢ／ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋を作製した。ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔの方法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３（１９９８））に従って、ｐＢＩＢ／ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋のＴ−ＤＮＡ領域（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子ＨＰＴとＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋を含む）をアグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株Ｃｏｌ−０のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、ＷｅｉｇｅｌとＧｌａｚｅｂｒｏｏｋの記載（Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００２））に従って、ハイグロマイシンＢ耐性植物体として選択し、さらに、Ｔ−ＤＮＡが一遺伝子座へ挿入されたホモ植物体（Ｔ３）を選択し野生型ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋生物発光レポーター株として使用した。
連続明および連続暗条件下における野生型ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルまたは１２時間暗期／１２時間明期のサイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明または連続暗で生物発光を測定した。
野生型ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光パターンを図２２に示した。連続明と連続暗のいずれの場合においても、野生型ＰＣＬＬ：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光は、ＰＣＬ１：：ＬＵＣ＋発光レポーター株の生物発光リズムと一致する明瞭な概日リズムを示した。これらの結果は、ＰＣＬＬ遺伝子発現がＰＣＬ１遺伝子発現と全く同じパターンであることを意味している。
［実施例１５］＜ＰＣＬＬ過剰発現体ＰＣＬＬ−ｏｘの作出とＰＣＬＬ−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターン＞
実施例１１で示したように、ＰＣＬ１遺伝子を過剰発現すると、概日リズムが破壊されてしまう。ＰＣＬＬ遺伝子がＰＣＬ１遺伝子と同一または極めて類似した機能を果たしている、すなわち時計遺伝子として機能している、と仮定すると、ＰＣＬＬの過剰発現も概日リズムに深刻な影響を与えると予想される。そこで、ＰＣＬＬ過剰発現体ＰＣＬＬ−ｏｘを作出してＰＣＬＬ遺伝子の概日発現を破壊した場合に、概日リズムがどのような影響を受けるのかを調べた。ＰＣＬＬ過剰発現体ＰＣＬＬ−ｏｘは以下の手順で作出した。まず、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ；ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに登録番号ＡＦ４８５７８３で登録されている塩基配列の４，９５１から５，８１５）とＰＣＬＬ遺伝子のコード領域を接続してＰＣＬＬ過剰発現カセット（ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＰＣＬＬ）を作製し、これをバイナリーベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０３（１９９０））のクローニングサイトへ挿入してｐＢＩＢ／３５Ｓ：：ＰＣＬＬを作製した。ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔの方法（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３（１９９８））に従って、ｐＢＩＢ／３５Ｓ：：ＰＣＬＬのＴ−ＤＮＡ領域（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子ＨＰＴと３５Ｓ：：ＰＣＬＬを含む）をアグロバクテリアを介してシロイヌナズナの野生型株Ｇ−３８（ＧＩ：：ＬＵＣ＋発光レポーター遺伝子をもつ野生型株）のゲノムへ遺伝子移入した。遺伝子移入された形質転換体は、ＷｅｉｇｅｌとＧｌａｚｅｂｒｏｏｋの記載（Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００２））に従って、ハイグロマイシンＢ耐性植物体として選択し、ＰＣＬＬ過剰発現体ＰＣＬＬ−ｏｘとして使用した。
連続明におけるＰＣＬＬ−ｏｘ植物体のＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光パターンを図２３に示した。ＧＩ：：ＬＵＣ＋生物発光の測定は、本発明者らの方法（Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４１：１−１１（２００４））に従って行った。１２時間明期／１２時間暗期の明暗サイクルを与えて生物時計をリセットした後、連続明で生物発光を測定した。その結果、ＰＣＬＬ−ｏｘ植物体の生物発光リズムは、徐々に減衰しながら５日目までは野生型株と比較して約２時間短周期を示し、その後、消失した。この結果は、ＰＣＬＬ遺伝子の概日発現を破壊すると、生物時計が正常に機能しなくなってしまうことを意味している。
実施例１４と実施例１５の結果から、ＰＣＬＬ遺伝子はＰＣＬ１遺伝子に塩基配列が類似しているだけではなく、発現パターンや機能も極めて類似していることが示された。したがって、ＰＣＬＬ遺伝子は時計機能に重要な遺伝子であると言える。また、これらの結果から、本明細に記載したＰＣＬＬ遺伝子以外のＰＣＬ１類似遺伝子や、今後発見されると予想されるＰＣＬ１類似遺伝子に関してもＰＣＬＬ遺伝子と同様に、時計機能に重要な働きを持つことが強く示唆される。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【図２３】
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