(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８７のアミノ酸配列からなる主Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂアレルゲンポリペプチドから誘導される修飾された組換えアレルゲン（ｍｒａ）、又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物であって、草花粉にアレルギーである患者からのＩｇＥ抗体との反応性が減少されていて、なおＴリンパ球との反応性は残されており、アレルゲンの遺伝子が、それらがコードするポリペプチドが、野性タイプと比較して領域１６〜４２、１３５〜１４９および１８０〜２０６の少なくとも１つ又は組み合わせが変わっておらず、かつ領域５０〜１３２、領域５１〜１７８または領域１５４〜１７７の欠失を示すように、遺伝子操作によって修飾されることを特徴とする、前記修飾された組換えアレルゲン。
【請求項２】
欠失が、ＩｇＥ抗体に結合する配列依存連続Ｂ細胞エピトープの能力を破壊するか、または限定する、請求項１に記載の修飾された組換えアレルゲン。
【請求項３】
野性タイプと比較して領域１８０〜２０６が変わっていない、請求項１または２に記載の修飾された組換えアレルゲン。
【請求項４】
草花粉にアレルギーである患者からのＩｇＥ抗体との反応性が減少されていて、なおＴリンパ球との反応性は残されている、修飾された組換えアレルゲン（ｍｒａ）、又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の製造方法であって、配列番号８７のアミノ酸配列からなる主Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂアレルゲンの遺伝子を、それらがコードするポリペプチドが、野性タイプと比較して、領域１６〜４２、１３５〜１４９及び１８０〜２０６の少なくとも１つ又は組み合わせが変わっておらず、かつ領域５０〜１３２、領域５１〜１７８または領域１５４〜１７７の欠失を示すように修飾する工程を含む、前記製造方法。
【請求項５】
欠失が、ＩｇＥ抗体に結合する配列依存連続Ｂ細胞エピトープの能力を破壊するか、または限定する、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
アレルゲンの遺伝子が、それらがコードするポリペプチドが、野性タイプと比較して、領域１８０〜２０６のアミノ酸が変わらないように修飾される、請求項４または５に記載の製造方法。
【請求項７】
種々の異なるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＩｇＥ仲介アレルギーを治療するために、請求項１〜３のいずれか一項に記載の１又は２以上の修飾された組換えアレルゲン、又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の１つを含み、そして適宜、付加的活性化合物及び／又は補助物質を含んでもよい医薬製剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾された組換えアレルゲン、又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の１つが、少なくとも１つの固体、液体又は半液体の担体物質又は補助物質と一緒に適当な剤形にされることを特徴とする、医薬製剤を製造するための方法。
【請求項１０】
アレルギーの免疫特異的治療（減感作）用に医薬品を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾された組換えアレルゲン、又はそれらの生理学的に無害な塩又は溶媒和物の１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出により天然の原料から得ることのできるアレルゲンから誘導される修飾された組換えアレルゲン（mra）に関する。とりわけオオアワガエリ(Phleum pratense)、ホソムギ(Lolium perenne)、カモガヤ(Dactylus glomerata)、ナガハグサ(Poa pratensis)、ギョギシバ(Cynodon dactylon)およびシラゲガヤ(Holcus lanatus)等のイネ科からの花粉粒子が天然の原料として使用される。
【０００２】
検査および治療用途のために用いられるイネ科花粉の抽出物は、タンパク質および糖タンパク質の不均一な混合物からなり、そのいくつかはアレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応し、定義によってアレルゲンと名づけられる。これらの抗原の分子的性質によって、問題のイネ科種の交差反応性が相対的に高いことに伴い、それらを６グループに分類することができる。優性アレルゲングループ（主アレルゲン）は、通常のアレルゲン分類（Ｌｉｅｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２６，４９４−５１６（１９９６）)によってグループ５および１である。Ｎ末端アミノ酸配列および／または主アレルゲンのグループ５および１の部分的または完全推定アミノ酸配列が知られている（Ｖｒｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１，４７７３−４７８１（１９９３）およびＢｕｆｅ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２６３，６−１２（１９９５））。さらに、これらの主アレルゲンをクローニングする方法が記載されている（Ｓｃｈｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８，９３−９６（１９９２））。
【０００３】
現在、イネ科花粉の水抽出物が、タイプ１アレルギーの体外診断に使用されている。これらの水抽出物はまた、体外診断および続く特異的免疫療法の基礎である（ Ｆｉｅｂｉｇ．Ｈ．，Ａｌｌｅｒｇｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７，３７７−３８２（１９９５））。
【０００４】
特異的免疫療法のために天然のアレルゲン抽出物を使用することは、これらの状況において誘発されるＩｇＥ依存性アレルギー反応（副作用）によって制限される。この理由で、天然のアレルゲン抽出物を副作用閾値以下の用量しか投与できない。治療効果に必要とされる高いアレルゲン濃度を得るためには、抽出物を維持用量まで増加する濃度に数回の連続的注射によって達成される。ゲルに吸収させることによって、より効果的で副作用をより起さない方法で減感作のアレルゲン抽出物を使用することが可能である。
【０００５】
さらなる改良は、 ＩｇＥとはより低い反応性を有するが、免疫原性を大部分残しているアレルゴイドを生成するためにアレルゲンを化学的に修飾することによって達成された（ Ｆｉｅｂｉｇ  Ｈ．，Ａｌｌｅｒｇｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７，３７７−３８２（１９９５）およびＭａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｆ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ５，８９−１０６（１９８７））。
【０００６】
ハウスダストダニアレルゲンに関する初期の研究において、ＩｇＥ反応性の減少は、指向されたアミノ酸置換によって達成できるという証拠がある（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，３３９−４０５（１９９６）およびＮｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，１０２１−１０２９（１９９５））。
【０００７】
現時点では、イネ科花粉にアレルギーである患者の確立された減感作は、すべての知られたアレルゲンそしてまた非アレルギー性だが免疫原性のマイナー成分をある程度の濃度で含む天然抽出物を使用して行われるが、アレルゲン特異的療法には、特定の患者が実際に感作されているアレルゲン分子だけが必要とされる。このことはアレルギー患者が彼の減感作に寄与しないそして副作用を起しうる成分で不可避的に治療されていることを意味する。
【０００８】
修飾された組換えアレルゲンの入手の結果として、個々のアレルゲンまたは特定の混合物を、個々の感作スペクトルに合わせた減感作のための医薬品として使用できる。
【０００９】
このことは特異的で適切な治療の可能性を提供する。
本発明は、価値ある性質を有する新規化合物、特に医薬品を製造するために使用できる化合物を発見するという目的に基づいている。
【００１０】
修飾された組換えアレルゲンの形態の本発明の化合物、そしてそれらの塩および溶媒和物は、非常に価値ある薬理学的性質を有すると同時に良好な耐容性を有することが分かった。特に、それらは減感作効果を有する。
【００１１】
この化合物は、ヒト医学および獣医学において、特にアレルギー疾患の治療および減感作アレルギー患者のための医薬活性化合物として使用できる。
驚くべきことに、それ自体公知の遺伝子操作方法により、草花粉にアレルギーである患者のＴリンパ球と特異的に反応し、すなわち増殖するＴリンパ球を刺激したり、サイトカインを合成し、またはＴリンパ球においてアネルギーを起こすが、Ｔリンパ球ドナーの血清に存在するＩｇＥ抗体に、および草花粉にアレルギーである他の患者の血清からの草花粉特異的ＩｇＥに結合するには著しく減じられた力を示す変異体を構築するために、そのアミノ酸配列が、天然抽出物中でおこるアレルギー分子のそれと同一である組換えアレルゲンを使用する本発明に関連して成功がもたらされた。
【００１２】
天然におこるアレルゲンの場合または組換えアレルゲンの場合のいずれにおいても見られないこの効果は次の理由により、望ましい。
−  減感作中におこるＩｇＥ仲介副作用が避けられるか、または少なくとも大きく減少する、
−  アレルギー患者のＴＨメモリーリンパ球による修飾された組換えアレルゲンの認識を確かにする、
−  アレルギー患者で妨害されている種々に分化したＴＨサブポピュレーションのバランスを正常化するための条件をつくる、
−  アレルゲン反応性Ｔ細胞をアネルギー化したり、および／または除いたり、ＴＨ０／ＴＨ１配列のものにＴＨ２主体の特異的Ｔ細胞ポピュレーションを機能的に再配列することによって治療効果を可能にする、
−  免疫グロブリン合成を、アレルギー患者に典型的な特異的ＩｇＥ抗体（ＴＨ２のコントロール）の形成からＩｇＧ抗体（ ＴＨ１のコントロール）の好ましい合成へスイッチできる、
−  そして、結果として、患者の状態は、かれらがこの新規な修飾された組換えアレルゲンで治療されると著しく改善されるものと期待できる。
【００１３】
本発明は、天然の原料から抽出により得られるアレルゲンから誘導される修飾された組換えアレルゲンに関する。とりわけオオアワガエリ、ホソムギ、カモガヤ、ナガハグサ、ギョギシバ、およびシラゲガヤ等のイネ科からの花粉粒子が天然の原料として使用される。特に、本発明は、グループ１−６の主アレルゲンから誘導される修飾された組換えアレルゲンに関し、そして草花粉にアレルギーである患者のＩｇＥ抗体との反応性が除かれているか、または少なくとも減じられているが、一方Ｔリンパ球とのそれは未だ残っている。修飾された組換えアレルゲンは、アレルゲンの遺伝子が遺伝子操作法によって修飾されているため、それらがコードするポリペプチドが野性タイプと比較して１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加を示すという点で、野性型と異なる。同時に、修飾された組換えアレルゲンの主たるＴ細胞反応性領域（Ｔ細胞エピトープ）は、遺伝子操作によって変えられていない。
【００１４】
好ましくは、修飾された組換えアレルゲンは、グループ５または他にはグループ１の主アレルゲンから誘導される。特に、新規アレルゲンは、主Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂアレルゲンから誘導される。
【００１５】
アミノ酸の単一文字コードを使用すると、 Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂの配列は以下のようである。即ち、
【表１】
0005290671.tif 000002
【００１６】
本発明は、特に全体で２６５個のアミノ酸からなるＰｈｌ  ｐ  ５ｂポリペプチドの領域１６−４２、１３５−１４９および１８０−２０６の少なくとも１つまたは組み合わせたものが変えられていない修飾された組換えアレルゲンに関する。保存されるべきセグメントは、Ｔ細胞エピトープ領域である。
該アミノ酸残基はまた、誘導体化されてもよい。側鎖の修飾は、この意味で特に適当である。
【００１７】
本明細書中、アミノ酸残基の略号は、以下のアミノ酸の残基を表わす。即ち、
Ａｌａ＝Ａ           アラニン
Ａｓｎ＝Ｎ           アスパラギン
Ａｓｐ＝Ｄ           アスパラギン酸
Ａｒｇ＝Ｒ           アルギニン
Ｃｙｓ＝Ｃ           システイン
Ｇｌｎ＝Ｑ           グルタミン
Ｇｌｕ＝Ｅ           グルタミン酸
Ｇｌｙ＝Ｇ           グリシン
Ｈｉｓ＝Ｈ           ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ           イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ           ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ           リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ           メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ           フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ           プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ          セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ          スレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ          チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ          バリン
【００１８】
加えて、下記の略号は以下の意味を有する。即ち、
Ａｃ                アセチル
ＢＯＣ              ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＢＺ又はZ         ベンジルオキシカルボニル
ＤＣＣＩ            ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＦ              ジメチルフォルムアミド
ＥＤＣＩ            Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ｅｔ                エチル
ＦＣＡ              フルオレセインカルボン酸
ＦＩＴＣ            フルオレセインイソチオシアナート
Ｆｍｏｃ            ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢt              １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｍｅ                メチル
ＭＢＨＡ            ４−メチルベンズヒドリルアミン
Ｍｔｒ              ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニル
ＨＯＮＳｕ          Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＯＢｕｔ            ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｏｃｔ              オクタノイル
ＯＭｅ              メチルエステル
ＯＥｔ              エチルエステル
ＰＯＡ              フェノキシアセチル
Ｓａｌ              サリシロイル
ＴＦＡ              トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ              トリチル（トリフェニルメチル）
【００１９】
上記アミノ酸がいくつかの鏡像異性体型でおこるかぎり、これらすべての型およびまたそれらの混合物(例えばDL体)を本明細書中において含む。さらに、アミノ酸は、例えば化合物の成分として、それ自体公知の適当な保護基を付けることができる。
【００２０】
所謂プロドラッグ誘導体、即ち例えば、アルキル基またはアシル基、糖またはオリゴペプチドで修飾され、器官内で活性な新規化合物を生成するように速やかに分割される化合物がまた、新規化合物に含まれる。
これらのプロドラッグはまた、例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１５，６１−６７（１９９５）に記載されるような新規化合物の生物分解性のポリマー誘導体を含む。
【００２１】
新規アレルゲンは、１または２以上のカイラル中心を有してもよく、従って異なる立体異性体型になってもよい。本発明は、これらすべての型を含む。
Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂから誘導されるポリペプチドの以下のグループから誘導される修飾された組換えアレルゲンが特に好適である。即ち、
ＰＭ１（Ｎ３２→Ｄ，Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）
ＰＭ２（Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）
ＰＭ３（Ａ１３→Ｃ）
ＤＭ１（ΔＫ５０→Ｐ・１３２， Ｄ４９→Ｌ）
ＤＭ２（ΔＦ５１−Ｇ１７８，Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）
ＤＭ２＊（ΔＦ５１−Ｇ１７８，１７９−２１７変更配列）
ＤＭ３（ΔＡ１５４−Ｔ１７７，Ａ２２０→Ｔ）
上記の配列において、修飾されるアミノ酸またはアミノ酸配列が各々の場合で示されている。
【００２２】
これに関連して、ＰＭ１はポイント変異１を示し、以下の配列を有する（ Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂと比較して置き換えられているアミノ酸が太字で印刷されている）。即ち、
【表２】
0005290671.tif 000003
【００２３】
他の特に好ましいペプチドは、以下の配列を有する。即ち、
ＰＭ２（Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）：
【表３】
0005290671.tif 000004
【００２４】
ＰＭ３（Ａ１３→Ｃ）：
【表４】
0005290671.tif 000005
【００２５】
ＤＭ１（ΔＫ５０→Ｐ・１３２， Ｄ４９→Ｌ）：
【表５】
0005290671.tif 000006
【００２６】
ＤＭ２（ΔＦ５１−Ｇ１７８，Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０−Ａ）：
【表６】
0005290671.tif 000007
【００２７】
ＤＭ２＊（ΔＦ５１−Ｇ１７８，１７９−２１７変更配列）：
この配列は、ＤＭ２のそれに対応するが、原料ペプチドＰｈｌ  ｐ  ５ｂの位置１７９−２１７のアミノ酸がさらに変更された配列を示し、続く全てのアミノ酸が無い。
【００２８】
ＤＭ３（ΔＡ１５４−Ｔ１７７，Ａ２２０→Ｔ）：
【表７】
0005290671.tif 000008
【００２９】
本発明はさらに、ポリメラーゼ連鎖反応および／またはその変法を使用することによって修飾された組換えアレルゲンを製造する方法に関する。ペプチド配列が知られると、アレルゲンはまた、それ自体公知のペプチド合成法、例えば、文献（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ； のような標準的学術書）に記載されているような改変Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法により、該反応に知られていて且つ適当な反応条件下に製造できる。これに関連して、それ自体公知であるが、ここでは詳しく述べられていない変法も使用できる。さらに、それらの官能基誘導体のひとつから、それを加溶媒分解剤または水素化分解剤で処理することによってペプチドを遊離し、および／または塩基性または酸性のペプチドをそれと酸または塩基で処理してその塩または溶媒和物のひとつに変換することができる。
【００３０】
加溶媒分解または水素化分解のための好ましい原料は、１または２以上の遊離アミノ基および／または遊離ヒドロキシル基の代りに対応する保護されたアミノ基および／または保護されたヒドロキシル基を含むものであり、好ましくはＮ原子に結合しているＨ原子の代りに、例えば、ＮＨ２基の代りにＮＨＲ′基（Ｒ′はアミノ保護基、例えばＢＯＣまたはＣＢＺである）を含むアミノ保護基をもつものである。
【００３１】
ヒドロキシル基のＨ原子の代りに、例えばヒドロキシフェニル基の代りにＲ″Ｏ−フェニル基（Ｒ″はヒドロキシル保護基である）を含むヒドロキシル保護基をもつ出発化合物がまた、好ましい。
【００３２】
いくつかの、同一または異なる保護アミノ基および／または保護ヒドロキシル基が、出発化合物の分子中に存在してもよい。存在する保護基が互いに異なるならば、それらは多くの場合、選択的に除去できる。
【００３３】
“アミノ保護基”という表現は、一般的に知られており、アミノ基を化学反応から保護する（ブロックする）ために適しているが、所望の化学反応が分子の他の位置で行われた後容易に除くことができる基を言う。この種の典型的な基は、特に、非置換または置換アシル基、アリール基、アルアルコキシメチル基またはアルアルキル基である。アミノ保護基は、所望の反応（または一連の反応）が起った後、取り除かれるので、それらの性質およびサイズは、別に重大ではない；しかし、１−２０個のＣ原子、とくに１−８個のＣ原子を有するそれらのアミノ保護基が好ましい。本方法に関連して、“アシル基”という表現は、最も広い可能な意味で解釈されるべきである。それは、脂肪族、芳香族脂式、芳香族または複素環式のカルボン酸またはスルホン酸から誘導されるアシル基、そして特にアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基および、特にアルアルコキシカルボニル基を含む。この種のアシル基の例は、アセチル、プロピオニルまたはブチリル等のアルカノイル；フェニルアセチル等のアルアルカノイル；ベンゾイルまたはトルイル等のアロイル；ＰＯＡ等のアリールオキシアルカノイル；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、ＢＯＣ又は２−ヨードエトキシカルボニル等のアルコキシカルボニル；ＣＢＺ（“カルボベンゾキシ”）、４−メトキシベンジルオキシカルボニルまたはＦＭＯＣ等のアルアルコキシカルボニル；Ｍｔｒ等のアリールスルホニルである。好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣおよびＭｔｒ、そしてまたＣＢＺ、Ｆｍｏｃ、ベンジルおよびアセチルである。
【００３４】
“ヒドロキシル保護基”という表現は、同様にして一般的に知られており、ヒドロキシル基を化学反応から保護するために適するが、所望の化学反応が分子の他の位置で行われた後、容易に除去される基を言う。この種の典型的な基は、上記の非置換または置換アリール基、アルアルキル基またはアシル基、そしてまたアルキル基である。ヒドロキシル保護基の性質およびサイズは、それらが所望の反応または一連の反応が起きた後再び取り除かれるので、重大でない；１−２０個のＣ原子、とくに１−１０個のＣ原子を有する基が好ましい。ヒドロキシル保護基の例は、就中ベンジル、ｐ−ニトロベンゾイル、ｐ−トルエンスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびアセチルであり、ベンジルおよびｔｅｒｔ−ブチルが特に好ましい。アスパラギン酸およびグルタミン酸のＣＯＯＨ基は、ｔｅｒｔ−ブチルエステル（例えば、Ａｓｐ（ＯＢｕｔ））の形で好ましく保護される。
【００３５】
用いられる保護基によって、例えば強酸、適宜ＴＦＡまたは過塩素酸、のみならず塩酸または硫酸等の他の強酸、トリクロロ酢酸等の強有機カルボン酸、またはベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸を使用して、化合物を官能基誘導体から遊離する。加えられる不活性溶媒の存在は可能であるが、必ずしも必要ではない。好ましい適当な不活性溶媒は、例えば、酢酸等のカルボン酸、テトラヒドロフランまたはジオキサン等のエーテル、ＤＭＦ等のアミド、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素、そしてさらにメタノール、エタノールまたはイソプロパノール等のアルコール、および水であある。上記溶媒の混合物も適当である。ＴＦＡは、好ましくは他の溶媒を加えること無く過剰に用いられ、過塩素酸は、酢酸と７０％過塩素酸が９：１の比率からなる混合物の形で使用される。解裂の反応温度は、好適には約０−５０°であり、反応は好ましくは１５−３０°または室温で行われる。
【００３６】
ＢＯＣ、ＯＢｕｔおよびＭｔｒ基は例えば、１５−３０°でジクロロメタン中のＴＦＡまたはジオキサン中約３−５Ｎ塩酸を使用して好ましく取り除くことができる；ＦＭＯＣ基は、１５−３０°でＤＭＦ中のジメチルアミン、ジエチルアミンまたはピペリジンの約５−５０％溶液を使用して取り除くことができる。
トリチル基を、アミノ酸、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインを保護するために用いる。所望の最終製造物によって、ＴＦＡ／１０％チオフェノールを使用して、述べたすべてのアミノ酸からトリチル基が除かれ、ＴＦＡ／アニソールまたはＴＦＡ／チオアニソールを使用して、この場合、トリチル基は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、およびＧｌｎからだけ除かれ、Ｃｙｓ側鎖に残る。
水素化分解で除去される保護基（例えば、ＣＢＺまたはベンジル）は、例えば、触媒（例えば、好適には炭素のような支持体上のパラジュウム等の貴金属触媒）の存在下、水素と処理して除去できる。この場合の適当な溶媒は、上記の溶媒であり、例えば、メタノールまたはエタノール等のアルコール、またはＤＭＦ等のアミドである。原則として、水素化分解は、約０−１００°の温度で、そして約１−２００気圧の圧力下、好ましくは２０−３０°および１−１０気圧で行われる。ＣＢＺ基の水素化分解は、例えば、メタノール中２０−３０°、５−１０％Ｐｄ／Ｃ、またはメタノール／ＤＭＦ中２０−３０°で蟻酸アンモニウム（水素の代り）を使用して満足に行われる。
【００３７】
例えば、エタノール等の不活性溶媒中当量の塩基と酸を反応させ、次いで蒸発により濃縮して、酸は塩基をその関連酸付加塩に変換するために使用できる。生理学的に有害で無い塩を生じる酸が、特にこの反応に適する。従って、例えば、硫酸、硝酸、塩酸または臭化水素酸等のハロゲン化水素酸、オルトリン酸等のリン酸、またはスルファミン酸等の無機酸、そしてまた有機酸、特に脂肪族、脂環式、芳香族脂式、芳香族または複素環モノ塩基性または多塩基性カルボン酸、スルホン酸またはスルフリル酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタンスルホン酸またはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノ−およびジスルホン酸およびラウリルスルホン酸を使用することができる。生理学的に有害で無いことのない酸との塩、例えばピクリン酸塩は、式Ｉの化合物を単離したり、および／または精製したりするために使用してもよい。
【００３８】
他方、式Ｉの酸を塩基と反応させることにより生理学的に有害で無い金属塩またはアンモニウム塩に変換できる。この場合、適当な塩は、特にナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩、そしてまた、例えばジメチル−、モノエチル−、ジエチル−またはジイソプロピル−アンモニウム塩、シクロヘキシル−またはジシクロヘキシル−アンモニウム塩のような置換されているアンモニア塩、またはジベンジルエチレンジアンモニウム塩、そしてさらに、例えば、アルギニンまたはリジンとの塩である。
【００３９】
以下の工程は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列を確かめるために必要である。
通常の方法によって製造された抽出物のアレルゲン性構成成分が、同定され、それらの重要な物理化学的パラメターが特定されている。構成成分が、アレルギー患者のＩｇＥ抗体に結合するそれらの能力を示すことによってアレルゲンでと同定される。原則として、これはアレルギー患者の血清でＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電集中法(isoelectrofocusing)次いでウエスタンブロティングし、ＩｇＥイソタイプの結合抗体のみが展開されるそれ自体公知の方法を使用して行われる。この場合、適切な大きさの数のタイプの臨床的に証明されたアレルギー患者（２０という値は最低の数として設定すべきである）が使われることを確実にするように注意すべきである。ＣＩＥまたはＣＲＩＥ等の他の方法をまた、代りに使用できる。
このようにして同定および特定されたこれらのイネ科花粉アレルゲンを、Ｎ末端アミノ酸決定を行うことができるように分析的に製造できる。さらに、アレルゲンをまた、生化学的に精製し、モノクローナル抗体を製造するために使用できる。これらのモノクローナル抗体を、天然原料からのアレルゲンまたは組換え技術によって製造される分子の免疫学的同定および特定のために使用できる。
【００４０】
アレルゲンに関するこの情報およびそれらを同定するための方法に基づいて、公知の遺伝子操作方法を使用してクローンしたり、それらを組換えアレルゲンとして発現させることができる。通常の方法を使用して単離され、特定された組換えアレルゲンのＤＮＡクローンが、遺伝子操作によって行われ且つ新規な修飾され組換えられて製造されたアレルゲン分子を生じる修飾の基盤である。
新規な修飾された組換えアレルゲンの反応性を確保するために、Ｔ細胞エピトープを同定することも必要である。
【００４１】
このための基礎は、問題のアレルゲンのアミノ酸配列または対応する基礎になるＤＮＡ配列の知識である。通常、アミノ酸配列は組換えアレルゲンのＤＮＡ配列から推定される。従って、本発明の範囲内で、挙げられる全てのペプチド配列の関連ＤＮＡ配列が、これらのＤＮＡ配列が明確に開示されていなくても含まれるのは、それらが公知且つ簡単な方法でペプチド配列から誘導できるからである。
【００４２】
アミノ酸配列に基づいて、一連の重なるオリゴペプチドを、改変Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を使用する固相合成等の通常の方法によって製造し、アレルゲンの全体配列がカバーされる。各場合６−２０個、好ましくは９−１５個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドが、これに関連して適切に製造される。各々の場合３つのアミノ酸によりオフセットされ、対象アレルゲンの全配列をオーバーラップしてカバーするドデカペプチドが特に適する。
【００４３】
Ｔ細胞エピトープを同定するために、イネ科花粉にアレルギーの患者からのＴ細胞クローンを、通常の方法（文献）を使用して問題の精製した天然または組換え的に製造されたアレルゲンで繰り返し刺激によって樹立する。このため、十分な数のドナーから由来する相当数のＴ細胞クローンを樹立する必要がある。
これらのＴ細胞クローンを上記オーバーラップペプチドと培養し、Ｔ細胞が増殖することを刺激する後者の能力を試験する。増殖は、それ自体通常の方法によって［３Ｈ］−チミジンを取り込むことによって決定される。Ｔ細胞クローンの適当な増殖を誘導するそれらのオリゴペプチドが、Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドリガンドと見なされる。このようにして決定されたＴ細胞エピトープが、その部分で、新規な修飾組換えアレルゲンを構築する基盤を構成するアレルゲンのＴ細胞反応性領域を決めるために使用される。
【００４４】
修飾組換えアレルゲンがアレルギー患者で見い出されるＴリンパ球と反応することを確実にするため、免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むＴ細胞反応性領域の１次構造は、部分的または完全に変更から除かれる。
【００４５】
遺伝子操作は、変更された１次構造を得るためにポリペプチド（アレルゲン）の残りの領域にあるＤＮＡ配列に変異を起すために使用される。この変更された１次構造は、ＩｇＥ抗体に結合する配列依存連続Ｂ細胞エピトープの能力を破壊するか、または限定し、そして１次修飾の結果として修飾された３次構造のため、それらの抗体と反応する立体配座依存の、おそらく非連続的エピトープの力を完全または部分的になくす。
【００４６】
変異は、Ｔ細胞反応性領域以外の１つまたは数個のアミノ酸の置換であることができる。そのような点変異が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する位置特異的変異により、例えば、ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂをコードするＤＮＡに誘導される。ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂのｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐＭａｌｃ）であるプラスミドｐＧＳ１３を、この場合テンプレートとして使用できる。適当な塩基置換そしてまた新しい制限部位（Ｎｈｅ  ＩまたはＳｐｈ  Ｉ）を含む遺伝子特異的プライマーをＰＣＲに使用する。ＰＣＲで増幅され、変異をおこすフラグメントをクローニングベクターに次々結合し、完成物を次いでｐＭａｌｃ発現ベクターへ再クローンする。
【００４７】
さらに、変異を特異的に設定した欠失によって行うことができる。欠失変異体を製造するために、ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂのｃＤＮＡの切断３′−末端フラグメントを、遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲで製造する。比較的大きな３′−末端フラグメントを、内部切断部位で制限によって出発ベクター（ｐＧＳ１２またはｐＧＳ１３）から除き、そしてＰＣＲで増幅し、各ケースでより小さいフラグメントを、それらを置換するため結合する。
【００４８】
同様の方法で、１又は２以上のアミノ酸の付加を含む変異は、付加的ＤＮＡフラグメントを挿入することにより製造できる。
【００４９】
遺伝子操作によって変異され、修飾された組換えアレルゲンをコードするＤＮＡクローンを、適当な発現ベクターに再クローンし、適当なホスト生物体で発現させる。融合タンパク質を、これらホスト生物体の上清または破壊物から通常の方法で精製し、そして融合部分を取り除いた後、修飾された組換えアレルゲンを通常の生化学的方法を使用して純粋状態で製造する。修飾された組換えアレルゲンが、天然アレルゲンに対応する純粋成分としてさらなる試験に使用されることが重要である。
【００５０】
修飾された組換えアレルゲンのアレルゲン性、即ちアレルギー患者のＩｇＥ抗体に結合する力、に関する誘導された変異の効果は、ＥＡＳＴ阻害試験によって定性的および定量的に決定される。この検定は、試験される物質（修飾された組換えアレルゲン）が天然アレルゲンおよび／または組換え野性型に等しいか、または異なるかを示す。免疫化学的関連性（交差反応性）の程度はまた、定量できる。このＥＡＳＴ阻害試験は、ＩｇＥ抗体との反応だけを計る。
【００５１】
５０％阻害でＰｒｅｌと測定される阻害効果を示し、天然アレルゲンおよび／または組換え野性型と比較して少なくとも１０２のファクターで減少するそれらの修飾された組換えアレルゲン変種が、適当なものとして選択される。
このようにして選択された修飾された組換えアレルゲン変種を、それらのＴ細胞反応性が実際に残っているかどうかを見るためにチェックする。このために、Ｔ細胞反応性領域のエピトープと反応する一組のＴ細胞クローンを、第１相の試験のために取る。
【００５２】
選択されたクローンが増殖するように刺激するそれら選択された修飾された組換えアレルゲンだけが考慮される。
【００５３】
第２相において、相当するアレルゲンで繰り返し刺激して樹立されたオリゴクローンＴ細胞系を試験のために用いる。再び、野性型の刺激インデックス（ＳＩ）の５０％のＳＩを少なくとも与えるそれら選択され修飾された組換えアレルゲンだけが考慮される。
【００５４】
第３相において、アレルギー患者の末梢血からのポリクローンの短時間Ｔ細胞培養を試験のために用いる。
【００５５】
特異的ＩｇＥへのアレルゲンの結合とは別に、アレルギー作用または細胞によるヒスタミンのアレルゲン誘起のＩｇＥによる遊離が、アレルギー反応（副作用）に対して病理生理学的に重要である。エフェクター細胞（好塩基球および肥満細胞）の反応性およびＦｃεＲIによって結合されるＩｇＥ抗体のエピトープ特異性もこの場合重要である。この理由で、修飾された組換えアレルゲン変種は、アレルギー患者の血液から単離されるＩｇＥを担う好塩基球の脱顆粒によるヒスタミン遊離を誘起するそれらの力の試験をする。この機能試験において、上記選択方式によって選ばれた修飾された組換えアレルゲン変種は、著しく減じられたヒスタミン遊離力を示さなければならない。
【００５６】
これら要求に合う修飾された組換えアレルゲンは、制御作用を有するＴＨ細胞の大部分との反応性を確かめ、それらの減じられたＩｇＥ反応性により、イネ科花粉にアレルギーの患者のアレルゲン特異的免疫療法（減感作）の治療剤として用いられるための必要な性質を有する。
【００５７】
本発明はさらに、ＩｇＥ仲介アレルギーを治療するための、本発明による１又は２以上の修飾された組換えアレルゲン、および／またはその生理学的に無害な塩または溶媒和物、および／または適宜付加的活性化合物、および／または補助物質を含む医薬製剤に関する。
本発明はさらに、少なくとも１つの修飾された組換えアレルゲンおよび／またはその生理学的に無害な塩または溶媒和物が、少なくとも１つの固体、液体または半液体の担体または補助物質と一緒に適当な剤形にされる医薬製剤を製造するための方法に関する。
【００５８】
本発明はさらに、特に非化学的ルートによって医薬製剤を製造するための修飾された組換えアレルゲンおよび／またはその生理学的に無害な塩または溶媒和物の使用に関する。これに関連して、それらは、少なくとも１つの固体、液体または半液体の担体または補助物質と一緒に、そして適宜、１又は２以上の付加的活性物質と組み合わせて適当な剤形にすることができる。医薬品は、免疫特異的治療、即ちアレルギーと関連して減感作に使用される。アレルギーの免疫特異的治療（減感作）用に修飾された組換えアレルゲンを直接使用することを考えることは同様にして可能である。
【００５９】
これらの製剤を、医薬品としてヒトまたは動物の医療において使用できる。適当な担体は、経腸（例えば経口）、非経腸または局所投与又は吸入スプレー形態での投与に適し、新規化合物と反応しない有機または無機物質であり、例えば水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、乳糖またはデンプンのような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは黄色ソフトパラフィンである。錠剤、ピル剤、被覆錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、ジュース剤またはドロップ剤は特に、経口用途に用いられ、一方座剤は経腸用途に用いられ、溶液剤、好ましくは油性または水性溶液剤、さらに懸濁剤、乳剤または埋め込み剤は非経腸用途に用いられ、そして軟膏剤、クリーム剤または粉剤は局所用途に用いられる。本新規化合物はまた、凍結乾燥でき、そして得られた凍結乾燥体は、例えば注射用の製剤を製造するために使用できる。上述の製剤は、滅菌することができ、および／または潤滑剤、保存料、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色料、矯味剤および／またはいくつかの付加的活性化合物、例えば、１または２以上のビタミン、等の補助的物質を含んでいてもよい。吸入スプレーとしての投与には、噴射ガスまたは噴射ガス混合物（例えばＣＯ２またはフルオロクロロ炭化水素）中に溶解または懸濁されている活性成分を含むスプレー剤が使用される。この場合、活性化合物は好適には微粒子化されて使用され、１または２以上の付加的な生理学的に許容される溶媒、例えばエタノールが存在していてもよい。吸入液は、通常の吸入器を使用して投与できる。
【００６０】
本化合物およびその生理学的に無害な塩を、アレルギー疾患、特に草類および草の花粉によって引き起こされるアレルギーをコントロールすることに関連してアレルギー患者を減感作するために使用できる。
【００６１】
この場合、新規物質は、通常、他の知られている市販ペプチドと同様にして、特にＵＳ−Ａ−４  ４７２  ３０５に記載されている化合物と同様にして投与され、そして好ましくは用量単位当たり０．０５−５００ｍｇ、特に０．５−１００ｍｇの用量で投与される。１日用量は、好ましくは約０．０１−２ｍｇ／ｋｇ体重である。しかし、個々の患者に対する特定の用量は、非常に広い種類の因子、例えば、使用される特定の化合物の効力、年齢、体重、一般健康状態そして患者の性、食事、投与の時間および経路、排泄速度、薬剤の組み合わせおよび治療の対象である特定の疾患の重症度による。非経腸投与が好ましい。
【００６２】
本明細書中、全ての温度は゜Ｃである。製造物を単離するために、必要なら水を加え、そして必要なら、混合物を最終製造物の構成によって、２−１０のｐＨ値に調整し、酢酸エチルまたはジクロロメタンで抽出する；相を分離し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして蒸発によって濃縮する；残渣を次いで、シリカゲルのクロマトグラフィーおよび／または結晶化によって精製する。
【実施例】
【００６３】
実施例１
主草花粉アレルゲンＰｈ１  ｐ５のＴ細胞反応性領域を決定するためのＴ細胞エピトープの同定
草花粉アレルギー（鼻炎）の典型的な徴候の病歴を有し、そして陽性皮膚試験（プリック試験）を与えた患者を、オオアワガエリ草（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）Ｐｈｌ  ｐ５の主グループ５花粉アレルゲンと反応するＴ細胞系（ＴＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）を樹立するために選択した。これらの患者は、ＲＡＳＴクラス３以上の循環する特異的ＩｇＥ抗体を有していた。
【００６４】
ヘパリン血４０ｍｌを各患者から得た。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を次いで、密度勾配遠心分離を使用する通常の方法によって、この血液サンプルから単離した。同様の細胞分離を、さらにＴＣＬおよびＴＣＣを特定するために照射された自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を得ることが必要な後の段階で行った。ＰＢＭＣを数えた後、インヴィトロでグループ５アレルゲンに反応するＴＣＬを、以下のようにそして他（文献１）に既に詳しく記載されているように樹立した：２４穴マイクロカルチャープレートの各ウヱルに培養培地（Ｕｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）１ｍｌ中１．５−２．０×１０６ＰＢＭＣを、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製された天然Ｐｈ１  ｐ５アレルゲン（各場合、１０μｇ／ウェル）を加えて７日刺激した。これら培養の全部で８から１０が設定された。免疫親和性クロマトグラフィーによるＰｈ１  ｐ５の単離は、詳しく記載されている（文献２）。培養の７日の終わりに、ＩＬ−２（１０−２０ＩＵ／ウェル）を、さらに５−７日の培養に対して細胞培養物に加えた。次いで個々の培養物すべてを集め、そしてＴ幼若細胞を密度勾配遠心分離によって集めた；次いで得られたＴＣＬを、特異的リンパ球増殖試験（同様に文献１を参照）で試験した。このため、２×１０４／ｍｌのＴＣＬ幼若細胞を、各場合５×１０４／ ｍｌの照射された自己ＡＰＣと９６穴マイクロカルチャープレート中の３重のサンプルで培養した。 Ｐｈｌ  ｐ５アレルゲン１０−２０μｇを特異的抗原刺激として加えた。５６時間培養後、３Ｈラベル化チミジン（１μＣｉ／ウェル）をマイクロカルチャーへピペットで入れた。さらに１６時間後、増殖Ｔ幼若細胞へとりこまれた放射活性を、ベーターカウンター（Ｍａｔｒｉｘ  ９６）で測定した。結果は、１分当たりのカウント（ｃｐｍ）で多重サンプルの算術平均として計算された。ＴＣＬの品質の基準は、Ｐｈｌ  ｐ５添加のｃｐｍ値をＰｈｌ  ｐ５を加えないものと関連して得られた刺激指数であった。
【００６５】
それらを選んだ後、ＴＣＬをクローン化した（文献１参照）。このため、０．３［ラクナ（ｌａｃｕｎａ）］のＴＣＬ幼若細胞／ウェルを、照射同種ＰＢＭＣ（５×１０４／ウェル）、ＰＨＡ（１．５ｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（２５ＩＵ／ｍｌ）を加えて、９６穴マイクロカルチャープレート（丸底）中、最終容量０．２ｍｌで培養した。１２−１４日後、培養物に、新鮮な照射ＰＢＭＣ、ＰＨＡおよびＩＬ−２を加えた。さらに、ＩＬ−２（２５ＩＵ／ｍｌ）を加えて培地交換を４−５日毎に行った。照射同種ＰＢＭＣを加えずに約１０日が、Ｐｈｌ  ｐ５特異的増殖試験を行う前に過ぎた。選択されたＴＣＣを、ＰＨＡ、照射同種ＰＢＭＣおよびＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）で繰り返し刺激することによって２４穴マイクロカルチャープレート中で増殖した。
ＴＣＬをクローン化した（下記参照）後、単離ＴＣＣの特異性を述べたようにして決定した。少なくとも５の刺激指数を、ＴＣＣ陽性であると評価した。グループ５アレルゲン上のＴ細胞反応性領域を定めるためのＴ細胞エピトープの決定がまた、特異的増殖試験を使用して行われ、合成ドデカペプチド１−２μｇ／ｍｌがこの目的のため各々の場合で使用された（下記参照）。
【００６６】
Ｂｕｆｅら（文献３）によって決定されたＰｈｌ  ｐ  ５ｂアレルゲンの公知１次構造に基づいて製造された全部で８６個の重なる合成ドデカペプチドを、 Ｔ細胞エピトープの決定のために使用した。これらペプチドは、ＣＨＩＲＯＮ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ／Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａによって供給される市販の合成キットを使用して製造される。これらのペプチドのアミノ酸配列は９個のアミノ酸の重なり程度であった（表１）。特異的増殖試験で使用されるペプチドの１つに対するＴＣＣの反応を、計算した刺激指数が少なくとも５であると陽性であるとして評価した。
【００６７】
草花粉にアレルギーであった１８名の患者が研究に含められた。これらから、Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂ配列に基づくドデカペプチドと特異的に反応した５４のＴ細胞クローンを単離することに成功した。これらのＴＣＣの分析は、ペプチドリガンドの認識は、３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域に明らかに集中していることを示す。５４個のＴ細胞クローンのうち、８５％に相当する４６個は、Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂの３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａ、ＢおよびＣのペプチドと反応する（表１ａ）。８個のＴ細胞クローンだけが、５つの異なるペプチドリガンドと反応し、各場合３個のペプチドが２つの異なるクローンによって認識された。免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａは、位置１８１−２０７に対応し、アミノ酸１８１−１９５からなるコア領域を有するペプチド（２７ｍｅｒ）を包含する。５１％に相当する５４Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂ反応性ＴＣＣの２８個だけが、この免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａと反応する。
【００６８】
Ｔ細胞クローンの９個（１７％）と９個（１７％）とが、Ｔ細胞反応性領域Ｃ（位置１６−４８；３３ｍｅｒ）およびＴ細胞反応性領域Ｂ（位置１３３−１５０ ）それぞれと反応する。主アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ５ｂの３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域の認識についての研究された枠の濃度のＴＨ細胞は、これらの領域が点変異、欠失変異または付加変異によって影響されないＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体を構築することを可能にする。このことが、アレルギー患者に存在するアレルゲン反応性ＴＨ細胞と反応し、そしてこれらの細胞に治療的影響を与えるこれらアレルゲン変異体の必要条件をつくる。
【００６９】
【表８】
0005290671.tif 000009
【００７０】
【表９】
0005290671.tif 000010
【００７１】
【表１０】
0005290671.tif 000011
【００７２】
文献：
１．Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＷＤ，Ｋａｒａｍｆｉｌｏｖ  Ｔ，Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ  Ｂ，Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ  Ｈ，Ｊaｅｇｅｒ  Ｌ：
“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｕｐ  Ｖ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ”．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１０５：３９１−３９６．
２．Ｊｕｎｇ  Ｋ，Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ Ｂ， Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＷＤ，Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｄ，Ｄｉｅｎｅｒ  Ｃ，Ｊaｅｇｅｒ  Ｌ：
“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｍｏｔｈｙ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）１９８９，３５：２８７−２９４．
３．Ｂｕｆｅ  Ａ，Ｓｃｈｒａｍｍ  Ｇ，Ｋｅｏｗｎ  ＭＢ，Ｓｃｈｌａａｋ  Ｍ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＷＭ：  
“Ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｐｈ１  ｐ  ５ｂ  ｉｎ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｌｅｎ  Ｒｎａｓｅ”．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９５，２６３：６−１２．
【００７３】
実施例２
ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂの変異体ＰＭ１、ＰＭ２（ Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）およびＰＭ３（Ａ１３→Ｃ）の製造
ＰＭ２：
プラスミドｐＧＳ１３を出発ベクターとして使用した。これは、Ｂａｍ  ＨＩ位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ位間にクローン化されるｗｔ  ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ  に対するｃＤＮＡを含むｐＭａｌｃベクター（Ｂｉｏｌａｂｓ）である。 ｒＰｈ  ｐ  ５ｂ  に対するｃＤＮＡのフラグメント１（ｂｐ：１−１５３）および２（ｂｐ：１４１−１３７４）をＰＣＲ反応によって増幅した。以下のプライマー（制限部位をアンダーラインする）がこの反応に使用された。
【００７４】
【表１１】
0005290671.tif 000012
【００７５】
ｗｔ配列と比較して、２つの変異プライマー ＭＰ１センスおよびＭＰ１アンチセンスが、酵素Ｎｈｅ  Ｉの新しい制限切断部位をさらに与える６塩基置換を含む。
増幅されたフラグメント１をＢａｍ  ＨＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化し、ベクターｐＵＨ８９（Ｊｅｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ：１５４，５５−５９；１９９５）にクローン化した。得られるプラスミドｐＧＳ１０を再度Ｎｈｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、フラグメント２（ Ｎｈｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）をこれらの切断部位へ入れた。このプラスミドｐＧＳ１１は、ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂをコードするが、所望の塩基置換を含有する完全なｃＤＮＡを含む。点変異体ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ  ＰＭ２を発現するために、変異ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭａｌｃのＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位間で再クローン化した。得られたプラスミドはｐＧＳ２１と命名された。
点変異体ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ  ＰＭ１をＰＭ２と同様にして製造した。それは、ＰＣＲエラーの結果として、さらなる点変異、即ちＮ３２→Ｄを含む。
【００７６】
この点変異体をクローン化するために、ベクター ｐＧＳ１３中のｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂに対する全ｃＤＮＡを以下のプライマーを使用するＰＣＲで増幅した。
ＰＣｙｓＭ１：
【表１２】
0005290671.tif 000013
Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂ  アンチセンス：上記参照。
【００７７】
ｗｔ配列と比較して、変異プライマー ＰＣｙｓＭ１は、アラニン残基がシステイン残基で置き換えられ、そして同時に酵素Ｓｐｈ  Ｉに対する新しい制限切断部位を与える３塩基置換を含む。ＰＣＲ製造物は、ｐＭａｌｃ発現ベクター（Ｂａｍ  ＨＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）へ直接クローン化された。得られるベクターを、ｐＣｙｓＭ１と命名した。変異の成功は、Ｓｐｈ  Ｉを使用する切断分析でチェックされた。
【００７８】
実施例３
欠失変異体ＤＭ１（ΔＫ５０→Ｐ１３２，Ｄ４９→Ｌ）、ＤＭ２（ΔＦ５１−Ｇ１７８，Ｄ４９→Ｌ，Ｋ５０→Ａ）およびＤＭ３（ΔＡ１５４−Ｔ１７７，Ａ２２０→ ）の製造
プラスミドｐＧＳ２１（上記参照）を欠失変異体ＤＭ１をクローン化するための出発ベクターとして使用した。ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂに対するｃＤＮＡのｂｐ３９９−１３７４フラグメントを、以下のプライマーを使用するＰＣＲで増幅した。
ＭＰ２  センス：
【表１３】
0005290671.tif 000014
Ｐｈ  ｐ  ５ｂ  アンチセンス：上を参照。
ベクター ｐＧＳ２１をＢａｍ  ＨＩおよびＮｈｅ  Ｉで切断し、切り出されたフラグメントから分離した。 またＮｈｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断されたＰＣＲ製造物を次いで、残りのベクターに結合した。これ、即ちｐＤＭ１から得られるベクターは、２５２ｂｐの欠失を有し且つ欠失変異体ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂＤＭ１をコードするｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ  ｃＤＮＡを含有する。欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ３を同様の方法で製造した。
【００７９】
実施例４
組換えＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体の減じられたアレルゲン性（ＩｇＥ反応性）を示すためのＥＡＳＴ阻害試験の使用
ＩｇＥ抗体によるアレルゲンの結合は、タイプＩアレルギーにおけるエフェクター細胞（肥満細胞、就中好塩基球）のアレルゲン特異的活性化の基本的な必要条件である。酵素／アレルゲン吸収試験（ＥＡＳＴ）のアレルゲン特異的阻害が、ＩｇＥ抗体へのアレルゲンの結合を定性的および定量的に記録するための最良の手段である。ＥＡＳＴ阻害試験を以下のように行う。ミクロタイタープレートをアレルゲン（天然または組換えＰｈｌ  ｐ  ５またはＰｈｌ  ｐ  ５ｂ）（１μｇ／ｍｌ）で覆う。非結合アレルゲン分子を洗浄によって除いた後、非特異的プラスチック結合部位を、牛血清アルブミン（０．５％）でブロックする。１０−３０ドナーの代表的なプールとして、または個々の血清としてアレルギー患者からの抗ＩｇＥを、アレルゲン被覆ミクロタイタープレートで適当に希釈して培養する。結合アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を、酵素結合抗ＩｇＥ抗体（例えば、アルカリホスファターゼ−ａ− ＩｇＥ抗体）を使用して定量する。この結合は、溶解性アレルゲンまたは試験される物質（アレルゲン変異体）によって、濃度に依存して阻害される。精製天然アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ５ｂで得られる阻害カーブを対照として使用する。
【００８０】
図１に表わされている阻害カーブは、代表的なアレルギー患者血清プールＢｏｒ  １８／１００（２０ドナー）で得られる。
ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ（野性タイプ）およびＰＭ３は、アフィニティークロマトグラフィーで得られたものに似た結合カーブを示す。低い範囲でよりよい阻害効果そして高い濃度でより不十分な阻害による少しばかりの差異が見られる。この理由は分からぬが、少しばかり程度が異なる立体的なエピトープによって説明されるかもしれない。
【００８１】
点変異体ＰＭ１は、この効果を高い範囲でいくらかより大きな程度まで効果を示す。欠失変異体ＤＭ１およびＤＭ３は、著しく減じられた阻害効果を示す。このことは、これらのアレルゲン変異体の強く減じられたアレルゲン性を立証していて、その結果、化学的に修飾されたアレルゲン（アレルゴイド）と同程度である。
【００８２】
欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ２＊は、アレルゲン−ＩｇＥ反応に極めて低い阻害効果を示す。このことは、これらの変異体のアレルゲン性が大部分除去されていることを示す。アレルギー患者（Ｗｅ ６／９７）からの異なる血清そしてまたアレルギー患者ＩＩ３、ＩＩ１２およびＩＩ１７からの各血清は、変異体とその阻害カーブにおいて少し変化を示すが、それにもかかわらずそれらは、欠失変異体ＤＭ１およびＤＭ３が大きく減じられたアレルゲン性（図２−５）を示すことを確かめている。低い残存活性は別にして、欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ２＊の阻害効果は除去されている。点変異体ＰＭ１およびＰＭ３は、全く減少を示さないか、またはアレルゲン性（例えば、プールＷｅ  ６／９７および各血清ＩＩ  １７についてのＰＭ１）において，大部分わずかな減少を示す。修飾アレルゲンの阻害能を、２５％または５０％阻害でのＰｒｅｌ値を計算して定量できる（１）。対応阻害値そしてまた２５％または５０％阻害で測定されたアレルゲン性力価（ Ｐｒｅｌ）を、表２−６に血清プールおよび各血清に対して示す。
【００８３】
欠失変異体ＤＭ２およびＤＭ２＊は、極めて低いかまたは意味ある方法で決定できないそれらのＰｒｅｌ値によってアレルゲン性の失活を示す。点変異体ＰＭ１およびＰＭ３は、アレルゲン性の部分的な失活を示すが、この失活は実際の使用にとって適当でない。欠失変異体ＤＭ１およびＤＭ３は、アレルゲン性の著しい減少を示す。ＩｇＥ反応性の減少は、以前に知られている化学的に修飾されたアレルゲンのそれよりも優れているかまたは同程度であり、それによってこれらの変異体を免疫療法に対して特に適する候補にするものである。
【００８４】
文献
Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＭＣ  ａｎｄ  Ｂａｅｒ  Ｈ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ＲＡＳＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）。
【００８５】
【表１４】
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【００８６】
【表１５】
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【００８７】
【表１６】
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【００８８】
【表１７】
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【００８９】
【表１８】
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【００９０】
実施例５
ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体による好塩基球からの減少したヒスタミン遊離
製造された点変異体ＰＭ３および欠失変異体ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ２＊およびＤＭ３の好塩基球からのヒスタミン遊離能を試験し、野性タイプｒＰｈ１  ｐ  ５ｂのそれと比較した。
ヒスタミン遊離試験を行う前に、アレルギー患者（ＰＳ−Ｗ）のＥＤＴＡ血から好塩基性白血球を、先ずデキストラン沈降によって濃縮し、次いで最終濃度１００，０００好塩基球／ｍｌに調整した。好塩基球からヒスタミンを遊離するために、２００μｌの細胞懸濁液を、各々の場合５０μｌの抗原溶液と３７゜Ｃで４０分培養した。このために、ｒＰｈ１  ｐ  ５ｂおよび変異体をいろいろの濃度（１０−５−１０−１２  Ｍ）で用いた。遊離したヒスタミンを、ＰｈａｒｍａｃｉａのメチルヒスタミンＲＩＡを使用し、製造者の指示に従って各上清で決定した。
ヒスタミン遊離試験において、検討されたすべての組換えタンパク質は、濃度が増すごとに典型的なベル形カーブを描いた（図６）。点変異体は、ヒスタミンを遊離能において野性タイプのｒＰｈ１  ｐ  ５ｂと比較してなんら有意な差を示さなかった。３０％ヒスタミン遊離をもたらすために必要とされる欠失変異体ＤＭ３、ＤＭ１およびＤＭ２のの濃度は、それぞれ３倍、２０倍そして５００倍であった。従って、欠失変異体は明白に好塩基球からヒスタミンを遊離能の減少を示した。
【００９１】
実施例６
草花粉にアレルギーである患者のＴ細胞クローンとの組換えＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体の反応性の証明
組換えＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体の反応性を、知られている特異性の樹立Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ）で試験した。 ＴＣＣｓは、草花粉にアレルギーである患者から得（実施例１参照）そしてＴ細胞反応性領域Ａ（図７）、Ｂ（図８）およびＣ（図９）に対して向けられた。Ｔ細胞反応性を、クローンを増殖するように刺激することによって測定した。結果は明らかに、ＴＣＣｓが対応エピトープを変えなければＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体と特異的に反応し、期待通り、このエピトープが欠如したり、点変異によって変更されていればなんらの反応も示さないことを明確に示している。
【００９２】
実施例７
草花粉にアレルギーである患者のＴ細胞系との組換えＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体の反応性試験
草花粉にアレルギーである８名の患者からのオリゴクローナルＴ細胞系（ＴＣＬｓ）（実施例１参照）を、天然Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂ（ａ＋ｂ）、または組換えｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ、または５ａ＋５ｂで繰り返し活性化して樹立した。
これらのＴＣＬｓの増殖反応を、ｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体を使用して試験した（図１０）。これは、すべての変異体がＴＣＬｓを活性化するが、定量的な差があることを示している。欠失変異体ＤＭ３は、ほとんどのＴＣＬｓとの強い特異的刺激を示している。
【００９３】
実施例１−７に記載された結果の概括的評価
草花粉にアレルギーである患者からのＴヘルパー細胞によって認識される主アレルゲンＰｈ１  ｐ  ５ｂのエピトープのマッピングは、個々のＴ細胞系（ＴＣＬｓ）がＰｈ１  ｐ  ５ｂの全配列に分布していることを示した。しかし、８５％のＴＣＬｓによって認識される３つの免疫優性Ｔ細胞反応性領域を困難なく明らかにできる（実施例１）。点変異（実施例２）および欠失変異（実施例３）によって組換えＰｈ１  ｐ  ５ｂ変異体を製造しることができた。ＥＡＳＴ阻害試験で測定された点変異体（ＰＭ１およびＰＭ３）のＩｇＥ反応性（実施例４）は、野性タイプのＰｈ１  ｐ  ５ｂのそれと有意には変わらない。欠失変異ＤＭ１およびＤＭ３のＩｇＥ反応性は大きく減少するが、依然として検出可能である。対照的に、変異体ＤＭ２およびＤＭ２＊のＩｇＥ結合は非常に大きく減少する。ｒＰｈ１  ｐ  ５ｂ変異体のアレルゲン性のこの漸進的な減少はまた、アレルギー患者の血液からの特異的ＩｇＥ結合好塩基球を使用するヒスタミン遊離試験によって確認される（実施例５）。エピトープ地図化Ｔ細胞クローンでのｒＰｈ１  ｐ  ５ｂ変異体の試験は、点変異および欠失変異が期待するようにＴＣＣｓと反応したり、または刺激をできないことを確かめている（実施例６）。草花粉にアレルギーである患者の血液からＰｈ１  ｐ  ５での刺激により樹立されたオリゴクローナルＴ細胞系を使用して、変異体はこの種のオリゴクローナルＴＣＬｓを刺激できることを示すことができた（実施例７）。アレルゲン性の減少の結果とＴ細胞刺激の保持を一緒にすると、特に欠失変異体が、特異的免疫治療に適しそうな組換えアレルゲン変種を構成する。
【００９４】
次の実施例は医薬製剤に関するものである。
実施例Ａ：注射バイアル剤
２回蒸留水３リットル中の修飾された組換えアレルゲンに基づく活性化合物または活性化合物混合物１００ｇおよび重リン酸ソーダ５ｇの溶液を、２Ｎ塩酸によりｐＨ６．５に調節し、ろ過滅菌し、注射用バイアルに分注し、無菌条件下に凍結乾燥し、バイアルを次いで無菌的に封をする。各注射用バイアルは５ｍｇの活性化合物を含有する。
【００９５】
実施例Ｂ：座剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物２０ｇ、大豆レシチン１００ｇおよびココアバター１４００ｇを混合したものを溶かし、型にながし、冷やす。各座剤は２０ｍｇの活性化合物を含有する。
【００９６】
実施例Ｃ：溶液剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ９．３８ｇ、 Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２８．４８ｇおよび塩化ベンザルコニウム０．１ｇを２回蒸留水９４０ｍｌに溶かす。溶液はｐＨ６．８に調節され且つ１リットルとされ、照射によって滅菌される。この溶液は点眼剤の形で使用できる。
【００９７】
実施例Ｄ：軟膏剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物５００ｍｇを無菌条件下に黄色ソフトパラフィン９９．５ｇと混合する。
【００９８】
実施例Ｅ：錠剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ｋｇ、ラクトース４ｋｇ、ポテト澱粉１．２ｋｇ、タルク０．２ｋｇ、およびステアリン酸マグネシウム０．１ｋｇの混合物を、通常の方法で圧縮し、各錠剤が１０ｍｇの活性化合物を含有するように錠剤とする。
【００９９】
実施例Ｆ：被覆錠剤
実施例Ｅで述べた様にして、錠剤は圧縮され、次いでショ糖、ポテト澱粉、タルク、トラガントガムおよび着色料からなるコーティング剤で通常の方法で被覆される。
【０１００】
実施例Ｇ：カプセル剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物２ｋｇを、各カプセルが活性化合物２０ｍｇを含有するように、硬質ゼラチンカプセルへ通常の方法で分注する。
【０１０１】
実施例Ｈ：アンプル剤
２回蒸留水６０リットル中の修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１ｋｇの溶液を、ろ過滅菌し、アンプルに分注し、無菌条件下に凍結乾燥し；アンプルを次いで滅菌的に封をする。各アンプルは１０ｍｇの活性化合物を含有する。
【０１０２】
実施例Ｉ：吸入スプレー剤
修飾された組換えアレルゲンの形の活性化合物１４ｇを等張ＮａＣｌ溶液１０リットルに溶解し、そして溶液を、商業的に入手できるポンプ機能を有するスプレー容器に分注する。溶液は、口または鼻にスプレーすることができる。１回のスプレー噴射（約０．１ｍｌ）は、約０．１４ｍｇの用量に相当する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】アレルギー患者血清プールＢｏｒ  １８／１００を使用するＰｈｌ  ｐ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ
【図２】アレルギー患者血清プールＷｅ  ６／９７を使用するＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ
【図３】各アレルギー患者血清ＩＩ／３を使用するＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ
【図４】各アレルギー患者血清ＩＩ／１２を使用するＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ
【図５】各アレルギー患者血清ＩＩ／１７を使用するＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体のＥＡＳＴ阻害カーブ
【図６】アレルゲンおよびアレルゲン変異体との反応後のヒト好塩基球からのヒスタミン遊離
【図７】アレルギーで患者のＰｈｌ  ｐ  ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ）のｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体との増殖反応（特異性：  免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ａ）
【図８】アレルギーで患者のＰｈ１  ｐ  ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ）のｒＰｈｌ  ｐ  ５ｂ変異体との増殖反応（特異性：  免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ｂ）
【図９】アレルギーで患者のＰｈｌ  ｐ  ５ｂ反応性Ｔ細胞クローン（ＴＣＣｓ）のｒＰｈ１  ｐ  ５ｂ変異体との増殖反応（特異性：  免疫優性Ｔ細胞反応性領域Ｃ）
【図１０】アレルギーである患者のＰｈ１  ｐ  ５ｂ反応性Ｔ細胞系（ＴＣＬｓ）のｒＰｈ１  ｐ  ５ｂ変異体との増殖反応
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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