(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相液体クロマトグラフを用いる分子量１００７〜４４ｋＤａのあるポリペプチド（ポリペプチドＡ）の検出又は定量方法であって、以下の工程を含むポリペプチドの検出又は定量方法；
（１）ＯＦＦ相ポリペプチドＡを逆相液体クロマトグラフに導入し、有機溶媒系移動相で混合器まで移動させる工程、
（２）（１）で混合器まで移動したＯＦＦ相ポリペプチドＡに、混合器でポリペプチドＡ相転移用移動相を添加し、ＯＮ相ポリペプチドＡに相転移させ、ＯＮ相ポリペプチドＡを生成する工程、
（３）（２）で生成したＯＮ相ポリペプチドＡとカラム充填剤を相互作用させる工程、
（４）（３）で相互作用したＯＮ相ポリペプチドＡをＯＦＦ相ポリペプチドＡに相転移させ、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを生成する工程、
（５）（４）で生成したＯＦＦ相ポリペプチドＡを溶出する工程、及び
（６）（５）で溶出したポリペプチドＡを検出又は定量する工程、
ここで、ＯＦＦ相ポリペプチドは実質的に逆相カラム充填剤への吸着能を示さないポリペプチドであり、ＯＮ相ポリペプチドは逆相カラム充填剤への吸着能を示すポリペプチドである。
【請求項２】
ＯＦＦ相ポリペプチドＡが、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸及びＴＦＡから選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒（有機溶媒１、・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上７以下の整数））を含む溶液に存在するポリペプチドＡであって、下記式（１）が成立している溶液（ＯＦＦ相溶液）に存在するポリペプチドＡである、請求項１に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
【数１】
0005144273.tif 000081
（式（１）において、Ｘ１は水−有機溶媒１混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、Ｘｎは水−有機溶媒ｎ混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、ｘ１はＯＦＦ相溶液における有機溶媒１の容積比（％）、ｘｎはＯＦＦ相溶液における有機溶媒ｎの容積比（％）をそれぞれ示す）
【請求項３】
ＯＮ相ポリペプチドＡが以下の群より選ばれる溶液に存在するポリペプチドＡである、請求項１に記載のポリペプチドの検出又は定量方法；
（１）有機溶媒を含まない水溶液、及び
（２）アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸及びＴＦＡから選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒（有機溶媒１、・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上７以下の整数））を含む溶液であって、下記式（２）が成立している溶液（ＯＮ相溶液）。
【数２】
0005144273.tif 000082
（式（２）において、Ｘ１は水−有機溶媒１混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、Ｘｎは水−有機溶媒ｎ混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、ｘ１はＯＮ相溶液における有機溶媒１の容積比（％）、ｘｎはＯＮ相溶液における有機溶媒ｎの容積比（％）をそれぞれ示す）
【請求項４】
ＯＦＦ相ポリペプチドＡが下記（Ａ）で示されるポリペプチドＡであって、かつ、ＯＮ相ポリペプチドＡが下記（Ｂ）で示されるポリペプチドＡである、請求項１に記載のポリペプチドの検出又は定量方法；
（Ａ）アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸及びＴＦＡから選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒（有機溶媒１、・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上７以下の整数））を含む溶液に存在するポリペプチドＡであって、下記式（１）が成立している溶液（ＯＦＦ相溶液）に存在するポリペプチドＡ、
【数３】
0005144273.tif 000083
（式（１）において、Ｘ１は水−有機溶媒１混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、Ｘｎは水−有機溶媒ｎ混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、ｘ１はＯＦＦ相溶液における有機溶媒１の容積比（％）、ｘｎはＯＦＦ相溶液における有機溶媒ｎの容積比（％）をそれぞれ示す）及び
（Ｂ）有機溶媒を含まない水溶液、又は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸及びＴＦＡから選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒（有機溶媒１、・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上７以下の整数））を含む溶液であって、下記式（２）が成立している溶液（ＯＮ相溶液）に存在するポリペプチドＡ。
【数４】
0005144273.tif 000084
（式（２）において、Ｘ１は水−有機溶媒１混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、Ｘｎは水−有機溶媒ｎ混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、ｘ１はＯＮ相溶液における有機溶媒１の容積比（％）、ｘｎはＯＮ相溶液における有機溶媒ｎの容積比（％）をそれぞれ示す）
【請求項５】
ＯＦＦ相溶液に含まれる有機溶媒及びＯＮ相溶液に含まれる有機溶媒から選ばれる各々の有機溶媒と水の混合溶液におけるポリペプチドＡの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を決定する工程を含む、請求項４に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
【請求項６】
ポリペプチドＡが、以下の群より選ばれるいずれか１のポリペプチドである、請求項１から５のうちいずれか１項に記載のポリペプチドの検出又は定量方法；
（１）副腎皮質刺激ホルモンのアミノ酸配列第１番目から第２４番目からなるポリペプチド、
（２）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第１６番目からなるポリペプチド、
（３）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第２８番目からなるポリペプチド、
（４）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第３８番目からなるポリペプチド、
（５）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４０番目からなるポリペプチド、
（６）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４２番目からなるポリペプチド、
（７）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４３番目からなるポリペプチド、
（８）成長ホルモン放出因子、
（９）イソロイシル−セリル−ブラジキニン、
（１０）インスリン、
（１１）脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ−３２）、
（１２）Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−５３）、
（１３）ミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチド、
（１４）ニューロメジンＣ、
（１５）ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、
（１６）ノシセプチン、
（１７）オキシトシン、
（１８）ウロコルチン、
（１９）ミッドカイン、
（２０）インターフェロン−γ、
（２１）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ（１−２８））、
（２２）ラット好中球走化性因子−１（ＣＩＮＣ−１／ｇｒｏ）、
（２３）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１−８４））、
（２４）オバルブミンのアミノ酸配列第３２３番目から第３３９番目からなるポリペプチド、
（２５）オバルブミン、
（２６）アンジオテンシンＩＩ、及び
（２７）アミノ酸配列第４番目のチロシンがリン酸化されたアンジオテンシンＩＩ。
【請求項７】
ポリペプチドＡを検出又は定量する工程が、逆相液体クロマトグラフに接続されている質量分析計に備わるポリペプチドの検出又は定量手段によりポリペプチドＡを検出又は定量する工程である、請求項１から６のうちいずれか１項に記載のポリペプチドの検出又は定量方法。
【請求項８】
少なくとも、ある移動相（移動相１）を供給する移動相供給器（移動相１供給器）、移動相１とは異なる移動相（移動相２）を供給する移動相供給器（移動相２供給器）、移動相１及び２とはそれぞれ異なる移動相（移動相３）を供給する移動相供給器（移動相３供給器）、移動相１供給器と移動相２供給器とを送液管を介して接続する移動相混合器（混合器Ａ）、混合器Ａと送液管を介して接続する試料注入器、該移動相３供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器（混合器Ｂ）、混合器Ｂと送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）又は液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。
【請求項９】
少なくとも、ある移動相（移動相１）を供給する移動相供給器（移動相１供給器）、移動相１とは異なる移動相（移動相２）を供給する移動相供給器（移動相２供給器）、移動相１及び２とはそれぞれ異なる移動相（移動相３）を供給する移動相供給器（移動相３供給器）、移動相１供給器と移動相２供給器とを送液管を介して接続する混合器（混合器Ａ）、混合器Ａと送液管を介して接続する試料注入器、該移動相３供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器（混合器Ｂ）、混合器Ｂと送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続されるスイッチングバルブ、並びに該スイッチングバルブと接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）又は液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆相液体クロマトグラフィーを用いた、高感度なポリペプチドの検出又は定量方法、及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）は、固定相に移動相よりも極性の弱い物質を用いる液体クロマトグラフィーであり、薬物等の低分子化合物の定量において最も広く用いられている。近年、逆相液体クロマトグラフィーは、ポリペプチドの検出、定量においても重要な技術として用いられており、プロテオミクス研究においても重要な役割を果たしている。【０００３】
逆相液体クロマトグラフィーによるポリペプチドの高感度定量を困難とする大きな問題点の一つが、ポリペプチドの吸着である。ポリペプチドの吸着は、低濃度でより激しくなり（非特許文献１〜３）、その結果、低濃度領域での定量を困難にしていると考えられる。この低濃度での吸着を解決するために、アルブミンのようなポリペプチドや界面活性剤の添加（非特許文献１）が、これら吸着を抑制するのに効果的であることが示されてきた。しかし、測定対象となるポリペプチド毎に、添加による吸着防止効果を確認する必要があるのに加えて、添加した界面活性剤などが測定時に夾雑ピークとして現れる等の問題が発生しないことを確認する必要がある。一般的に、多量のポリペプチドの逆相液体クロマトグラフへの導入は、カラムが詰まる一因となる。また、ポリペプチド試料の容量がカラム容量を越えた場合、被験ポリペプチドのカラムへの十分な保持及びその分離が困難であり、結果、再現性が失われ、定量困難になる場合が存在する。【０００４】
一方、分析時に多量の界面活性剤が存在すると、カラムを劣化させ、マススペクトロメトリー等の装置を汚し、再現性が失われる場合が存在し、加えて、マススペクトル分析時に夾雑ピークとして現れ、解析を困難とする場合が存在する。そのため、カラムスイッチング法を用いたオンラインで界面活性剤を除去するシステムも考案されているが、個々のポリペプチドについて界面活性剤の効果を確認しなければならないなど、極めて煩雑な検討が必要となる。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９８，３３，９６７−９８３
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２２，１４９−１５５
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ２００２，７７５，２４７−２５５
【非特許文献４】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００，１７，１５５１−１５５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、簡便な手法でポリペプチドの吸着の影響を排除し、低濃度領域でも正確にポリペプチドの定量を可能とする逆相液体クロマトグラフィーによるポリペプチドの検出又は定量方法、及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究し、水及び実質的にある１種類の有機溶媒からなる混合溶液に溶解するポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能が、該混合溶液における該有機溶媒の容積比（％）に依存し、かつ一定の容積比（ポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値、単にポリペプチドの相転移臨界値と称呼することもある）を境に著しく変化すること（ポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移）を見出した。具体的には、発明者らは、ポリペプチドが溶解する該混合溶液における該有機溶媒の容積比が逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を超過する場合には、該ポリペプチドは実質的に逆相カラム充填剤への吸着能を示さないポリペプチド（ＯＦＦ相ポリペプチド）となり、逆に、該容積比が逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を下回る場合には、逆相カラム充填剤への吸着能を示すポリペプチド（ＯＮ相ポリペプチド）となることを見出した。また、本発明者らは、ポリペプチド試料の希釈時及び逆相液体クロマトグラフを用いた測定時にポリペプチドが接触する物質（逆相カラム充填剤は除く）に対しても逆相カラム充填剤に対する場合と同様の挙動をポリペプチドが示し、これら物質への吸着能の相転移臨界値とカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値が近似であることを見出した（実施例１参照）。【０００７】
更に、本発明者らは、ポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値は、ポリペプチドが溶解する溶液に含まれる有機溶媒の種類（実施例２参照）及びポリペプチド（実施例５参照）に大きく依存する一方、逆相カラムの固定相（実施例８参照）及び逆相カラムの温度（実施例９参照）がポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能の相転移に与える影響は、有機溶媒が与える影響と比較して小さいことを見出した。【０００８】
また、本発明者らは、水及び１種類以上の有機溶媒（有機溶媒１、有機溶媒２、・・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上の整数））からなる混合溶液Ｍｘに溶解するポリペプチドの逆相カラム充填剤への吸着能は、下記式（ａ）に従うことを見出した（実施例１〜４参照）。【０００９】
【数１】
0005144273.tif 000002
【００１０】
（式（ａ）において、Ｘ１は水−有機溶媒１混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、Ｘｎは水−有機溶媒ｎ混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値（％）、ｘ１は混合溶液Ｍｘにおける有機溶媒１の容積比（％）、ｘｎは混合溶液Ｍｘにおける有機溶媒ｎの容積比（％）をそれぞれ示す）【００１１】
そこで、本発明者らは、かかる知見を利用し、逆相液体クロマトグラフを用いるあるポリペプチド（ポリペプチドＡ）の定量法において、ポリペプチドＡを、逆相カラム充填剤に対して実質的に相互作用しない相（つまり、調製時に接触する物質とも実質的に相互作用しない相）であるポリペプチドＡ（ＯＦＦ相ポリペプチドＡ）としておき、これを該逆相液体クロマトグラフに導入し、導入されたＯＦＦ相ポリペプチドＡの相を該逆相カラム充填剤と相互作用する相に相転移させ、次いで相転移により生成した該カラム充填剤と相互作用する相であるＯＮ相ポリペプチドＡを該カラム充填剤と相互作用させることにより、容器等への吸着が問題となるような低濃度での微量ポリペプチドを、簡便、精度良く、且つ、試料注入量の制限なく定量できることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、逆相液体クロマトグラフを用いるあるポリペプチド（ポリペプチドＡ）の検出又は定量方法であって、以下の工程を含むポリペプチドの検出又は定量方法を提供するものである。
（１）ＯＦＦ相ポリペプチドＡを逆相液体クロマトグラフに導入する工程、
（２）（１）で導入したＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段により、ＯＮ相ポリペプチドＡを生成する工程、
（３）（２）で生成したＯＮ相ポリペプチドＡとカラム充填剤を相互作用させる工程、
（４）（３）で相互作用したＯＮ相ポリペプチドＡを相転移させ、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを生成する工程、
（５）（４）で生成したＯＦＦ相ポリペプチドＡを溶出する工程、及び
（６）（５）で溶出したポリペプチドＡを検出又は定量する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明を実施することにより、微量のポリペプチド、例えば低ｐＭ程度のポリペプチドを定量的に操作可能であると同時に、簡便且つ精度良く定量可能である。本発明は、従来の微量ポリペプチドの定量方法として広く利用されている免疫学的手法、例えばＥＬＩＳＡ等の方法による定量方法に匹敵、又は、それ以上の高感度定量が可能なポリペプチド定量法であって、医学、生化学、分子生物学など幅広い分野で利用可能な画期的な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ポリペプチド定量のための逆相液体クロマトグラフシステムの例を示す図である。ポンプ（移動相供給器）２台を用いた場合の従来システム（Ａ）と本発明システム（Ｃ）、ポンプ３台を用いた場合の従来システム（Ｂ）と本発明システム（Ｄ）。
【図２】Ｃ３０カラム及び従来システムを用いてアセトニトリル含量及び添加した酸の異なる１ｎＭウロコルチン試料溶液を測定した場合のウロコルチンピーク面積。
【図３】Ｃ４カラム及び従来システムを用いてアセトニトリル含量の異なるウロコルチン試料溶液（容積比４％の酢酸を含む）を測定した場合のマスクロマトグラム。試料溶液中アセトニトリル含量：（Ａ）０％、（Ｂ）２０％、（Ｃ）３０％、（Ｄ）４０％、（Ｅ）６０％、及び（Ｆ）８０％。
【図４】従来システムにて導入されたポリペプチド試料溶液の溶出挙動の概念図である。
【図５】従来システム（黒丸）又は本発明システム（白丸）を用いてアセトニトリル含量が異なる試料溶液を測定した場合の保持時間１．５分のピーク面積及び保持時間６．５分のピーク面積を示す図である。
【図６】グラジエント勾配とウロコルチンの保持時間とのべき乗則を示す図である。
【図７】従来システム（左）及び本発明法（右）を用いて測定したウロコルチンのベースライン付近でのピーク形状。試料溶液中アセトニトリル含量：（Ａ）０％、（Ｂ）２０％、（Ｃ）３０％、（Ｄ）４０％、（Ｅ）５０％、（Ｆ）６０％、及び（Ｇ）８０％。
【図８−１】各ポリペプチドの定量下限でのマスクロマトグラムを示す図である。
【図８−２】各ポリペプチドの定量下限でのマスクロマトグラムを示す図である。
【図９】溶液組成の異なる１８種ポリペプチド混合溶液（１、１０及び１００ｎＭ）のトータルマスクロマトグラム（従来システム）溶液組成：（Ａ）水、（Ｂ）酢酸−水（４：９６，ｖ／ｖ）、（Ｃ）酢酸−水−アセトニトリル（４：６６：３０，ｖ／ｖ／ｖ）、（Ｄ）酢酸−水−アセトニトリル（４：４６：５０，ｖ／ｖ／ｖ）。
【図１０】溶液組成の異なる１８種ポリペプチド混合溶液（１、１０及び１００ｎＭ）測定時のトータルマスクロマトグラム（本発明システム）溶液組成：（Ａ）水、（Ｂ）酢酸−水（４：９６，ｖ／ｖ）、（Ｃ）酢酸−水−アセトニトリル（４：６６：３０，ｖ／ｖ／ｖ）、（Ｄ）酢酸−水−アセトニトリル（４：４６：５０，ｖ／ｖ／ｖ）。
【図１１】従来システム（左）及び本開発システム（右）を用いて溶液組成の異なる１８種のポリペプチド混合溶液（１、１０及び１００ｎＭ）測定時のイソロイシル−セリル−ブラジキニン（上）及びウロコルチン（下）のピーク面積を示す図である。
【図１２】２０℃（Ａ）及び４０℃（Ｂ）の水−アセトニトリル混合溶液（容積比：９０：１０，８０：２０，７０：３０，６０：４０又は５０：５０）中のウロコルチンのＣＤスペクトルを示す図である。
【図１３】２０℃（Ａ）及び４０℃（Ｂ）の水−アセトニトリル混合溶液（容積比：１００：０，９５：５，９０：１０，８５：１５又は８０：２０）中のｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎのＣＤスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、逆相液体クロマトグラフを用いるポリペプチドの検出又は定量方法である。【００１６】
ここで、逆相液体クロマトグラフィーには、移動相（溶離液）が液体であり、固定相が移動相（溶離液）よりも極性の弱い物質であればすべて含まれる。固定相としては、炭化水素基などの疎水性基、例えば、トリアコンチル基（Ｃ３０）、オクタデシル基（Ｃ１８）オクチル基（Ｃ８）、ブチル基（Ｃ４）又はトリメチル基が例示される。支持体としては、シリカゲルなどの無機系ポーラスポリマー、ポリスチレン、メタアクリル、ビニルアルコール、ヒドロキシアパタイト、酸化チタンなどが例示される。充填剤としてグラファイトカーボンを用いることもできる。当業者であれば、被験ポリペプチドに応じて適宜充填剤を選択することができる。【００１７】
液体クロマトグラフとして、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）が好ましく例示される。液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）として、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が好ましく例示される。ポリペプチドの検出又は定量装置としての質量分析装置が接続されている逆相液体クロマトグラフを用いることにより、高感度なポリペプチドの検出又は定量が可能となる。【００１８】
被験ポリペプチドは、分子量、等電点、機能、構造等に限定されず、全てのポリペプチドを含む。このうち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて高感度定量を実施する場合、ＥＳＩイオン源にて生じる多価イオンの数が多いと高感度化が難しいことから、分子量が約１万Ｄａ程度以下であるポリペプチドが好ましい。被験ポリペプチドは、既知のポリペプチド又は未知のポリペプチドのいずれをも含む。ここで、ポリペプチドとは、蛋白質、ポリペプチド及びオリゴペプチドのいずれを含む総称用語であり、その最小サイズは２アミノ酸である。被験ポリペプチドは、各種組織、細胞、細菌、ウイルスなど生体由来ポリペプチドに限らず、自体公知の合成方法により合成されたポリペプチド、自体公知の遺伝子工学的手法により取得されるポリペプチド、各種プロテアーゼにより酵素消化されることにより生じたあるタンパク質のポリペプチド断片及び標品として購入できるポリペプチドのいずれをも含む。また、被験ポリペプチドは、自体公知の調製方法、例えば、遠心処理、変性処理、硫安などによる分画処理、透析処理、限外ろ過、イオンクロマトグラフィー等を用いた精製処理などの自体公知の調製方法により調製された試料中に含まれるポリペプチドであり得る。更に、生体試料、例えば、血液、尿、唾液、精液、髄液、組織、細胞などの試料からポリペプチドを取得する場合には、試料に対し自体公知の前処理を行うことができる。被験ポリペプチド試料に含まれる被験ポリペプチドは１種又は２種以上であり得る。すなわち、本方法を用いて同時に多検体のポリペプチドを検出又は定量することができる（実施例１３参照）。【００１９】
例えば、副腎皮質刺激ホルモンのアミノ酸配列第１番目から第２４番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第１６番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第２８番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第３８番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４０番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４２番目からなるポリペプチド、βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４３番目からなるポリペプチド、成長ホルモン放出因子、イソロイシルーセリルーブラジキニン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ−３２）、インスリン、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−５３）、ミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチド、ニューロメジンＣ、ニューロペプチドＹ、ノシセプチン、オキシトシン、ウロコルチン、ミッドカイン、インターフェロン−γ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ（１−２８））、ラット好中球走化性因子−１（ＣＩＮＣ−１／ｇｒｏ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１−８４））、オバルブミンのアミノ酸配列第３２３番目から第３３９番目からなるポリペプチド、オバルブミン、アンジオテンシンＩＩ、アミノ酸配列第４番目のチロシンがリン酸化されたアンジオテンシンＩＩなどが例示される（実施例５〜６参照）。【００２０】
本発明において、ＯＦＦ相ポリペプチドとは、ＯＦＦ相状態のポリペプチドを意味する。ＯＦＦ相状態とは、逆相液体クロマトグラフのカラムの充填剤に対する吸着能を実質的に失った状態で溶液中にポリペプチドが存在することをいう。吸着能を実質的に失った状態とは、全く吸着しない状態又はＯＮ相状態のポリペプチドと比較して殆ど吸着しない状態を意味する。【００２１】
本発明者らは、ポリペプチドが、逆相カラム充填剤のみならずポリペプチド試料の調製やポリペプチド試料の逆相液体クロマトグラフへの導入時に接触する固体（以下、試料調製中に用いる容器等と称することもある）に対しても同様の挙動を示すことを見出した。更に、試料調製中に用いる容器等へのポリペプチドの吸着能が、シリカを基材とするカラム充填剤への吸着能と実質的に等しい又は若干低いことが示唆されたことから（実施例１参照）、ＯＦＦ相ポリペプチドは、試料調製に用いる容器等に対しても吸着能を実質的に失っていると考える。試料調製中に用いる容器等として、チップ類、サンプルバイアル、試料注入器、シリンジ、送液菅などが例示される。これらの材質として、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ステンレス、ガラス、ＰＥＥＫ樹脂、セラミック、べスペル、テフゼルなどが挙げられる。【００２２】
本発明者らは、２７種類の各被験ポリペプチドについて、水−アセトニトリル混合溶液、水−エタノール混合溶液、水−メタノール混合溶液、水−酢酸混合溶液の各々の混合溶液におけるカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値の近似値を決定した（実施例５参照）。本結果から、アセトニトリルの容積比が５０％以上である水−アセトニトリル混合溶液、エタノールの容積比が６０％以上である水−エタノール混合溶液、メタノールの容積比が７０％以上である水−メタノール混合溶液、及び酢酸の容積比が７０％以上である水−酢酸混合溶液の各々の混合溶液においては、２７種類の各被験ポリペプチド全てがＯＦＦ相であることが明らかとなった。他のポリペプチドについても同様にこれらの混合溶液においてはＯＦＦ相であると考えられる。従って、簡便には、アセトニトリルの容積比が５０％以上、エタノールの容積比が６０％以上、メタノールの容積比が７０％以上及び／又は酢酸の容積比が７０％以上であって、かつ、アセトニトリル、メタノール、エタノール及び酢酸から選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒を含む溶液、例えば、水−アセトニトリル（水とアセトニトリルの容積比は１：１）混合溶液に被験ポリペプチドを溶解することにより、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。【００２３】
また、ＯＦＦ相ポリペプチド試料は、例えば、実施例に記載の方法に従って調製することもできる。具体的には、（１）逆相液体クロマトグラフに使用可能な有機溶媒から１種又は２種以上の有機溶媒を選択する。次に、（２）選択した各有機溶媒について、水−該有機溶媒の混合溶液における被験ポリペプチドの相転移臨界値（又は相転移臨界値を超過する値）を決定する。選択した有機溶媒が１種類の場合には、（３）該有機溶媒の容積比が決定した相転移臨界値を十分に超過する容積比である水−該有機溶媒の混合溶液に被験ポリペプチドを溶解させることによって、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。選択した有機溶媒が２種類以上の場合には、（３）前記式（ａ）（ｆ＞１）の考えに従って算出した各有機溶媒の容積比を示す混合溶液に被験ポリペプチドを溶解させることによって、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。【００２４】
逆相液体クロマトグラフに使用可能な有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸、ＴＦＡなどが例示される。このうち、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、酢酸、ギ酸、ＴＦＡが好ましい。これらは１種又は２種以上を組み合せて用いられる。移動相として用いる溶媒の種類と被験ポリペプチド試料の溶媒の種類は同一であっても異なっても良い。例えば、移動相として水−アセトニトリル混合溶媒を用い、被験ポリペプチド試料の溶媒が酢酸を数％程度含有する水−メタノール及びアセトニトリルの混合溶媒であってもよい。一般的には、あるポリペプチドについて、イソプロピルアルコール＞アセトニトリル及びエタノール＞メタノール及び酢酸の順で、それらを有機溶媒として用いた場合の該ポリペプチドの相転移臨界値は減少する（実施例１５参照）。【００２５】
有機溶媒としてアセトニトリルを選択した場合について、被験ポリペプチドの相転移臨界値の決定方法を具体的に説明する。水とアセトニトリルの容積比が異なる複数の水−アセトニトリル混合溶液（例えば、水：アセトニトリルの容積比が、１０：０，９：１，８：２，７：３，６：４，５：５，４：６，３：７，２：８，１：９，０：１０である混合溶液）のそれぞれに被験ポリペプチドを溶解させ、水とアセトニトリルの容積比が異なる複数の被験ポリペプチド試料を調製する。次に、各被験ポリペプチド試料を逆相液体クロマトグラフ（図１（Ａ）又は（Ｂ）に記載の従来の逆相液体クロマトグラフ構成を例示することができる）に導入し、各被験ポリペプチド試料に含まれる被験ポリペプチドがＯＦＦ相か否かを判定する。導入用の移動相は水系移動相が好ましく、溶出用の移動相は有機溶媒系移動相が好ましい。水系移動相とは有機溶媒を含有しない又は僅かに有機溶媒を含有する移動相である。水系移動相として、例えば、０．０１〜６％程度の有機酸水溶液を例示できる。有機溶媒系移動相とは１種類以上の有機溶媒のみからなる移動相又は僅かに水を含む１種類以上の有機溶媒からなる移動相を意味する。有機溶媒系移動相として、例えば、０．０１〜６％程度の有機酸を含むアセトニトリル−メタノール混合液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むアセトニトリル溶液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むメタノール溶液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むエタノール溶液などを例示できる。有機酸としては酢酸、ギ酸、ＴＦＡを好ましく例示できる。また、有機溶媒系移動相として、１００％酢酸溶液を例示できる。被験ポリペプチドがＯＦＦ相の場合、被験ポリペプチド（又はその一部）はカラム充填剤へ吸着しない為、サンプルループ以後のデッドボリュームに相当する保持時間に溶出ピークが検出される（実施例１参照）。例えば、水：アセトニトリルの容積比が６：４，５：５，４：６，３：７，２：８，１：９，０：１０である各被験ポリペプチド試料に含まれるポリペプチドがＯＦＦ相の場合には、水−アセトニトリル混合溶液における被験ポリペプチドの相転移臨界値は３０〜４０％と判定することができる。この場合、アセトニトリルが４０％以上である水−アセトニトリル混合溶液にポリペプチドを溶解させ、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。【００２６】
有機溶媒として、アセトニトリル及びメタノールを選択した場合について、ＯＦＦ相ポリペプチド試料の調製方法を具体的に説明する。前記の方法に従って、水−アセトニトリル混合溶液、及び、水−メタノール混合溶液それぞれにおける被験ポリペプチドの相転移臨界値を決定する。次に、前記式（ａ）の考えに従って、試料におけるアセトニトリル及びメタノールの容積比を決定する。例えば、水−アセトニトリル混合溶液における被験ポリペプチドの相転移臨界値が３０〜４０％、水−メタノール混合溶液における被験ポリペプチドの相転移臨界値が４０〜５０％と決定された場合、水：アセトニトリル：メタノールの容積比が１：１：８である水−アセトニトリル及びメタノール混合溶液における被験ポリペプチドに関する前記式（ａ）の値は１を超過するため、該混合溶液に被験ポリペプチドを溶解することにより、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。【００２７】
本発明者らは、２種の移動相（水系移動相及び有機溶媒系移動相）を用いる従来の逆相液体クロマトグラフ（図１（Ａ））によって被験ポリペプチド試料を分析する際、被験ポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間にべき乗法則が成り立つことを見出した（実施例６参照）。更に、２種類のグラジエント勾配による溶出時間、それらのグラジエント勾配、及び各グラジエント勾配による被験ポリペプチドの溶出時の移動相（溶離液）組成との間に、下記式（ｂ）が成立することを見出した（実施例６参照）。ただし、この時、水系移動相は、有機溶媒及び有機酸をほとんど含まない移動相であり、有機溶媒系移動相は水を含まない移動相であり、かつ、これら移動相の測定開始時の混合比が水系移動相：有機系移動相＝１００：０となる条件下で測定した場合にあてはまる。【００２８】
【数２】
0005144273.tif 000003
【００２９】
（式（ｂ）において、ｒ１はあるグラジエント勾配（％／ｍｉｎ）、ｒ２はｒ１と異なるあるグラジエント勾配（％／ｍｉｎ）、Ｔ１はグラジエント勾配ｒ１による被験ポリペプチドの溶出時間（ｍｉｎ）、Ｔ２はグラジエント勾配ｒ２による被験ポリペプチドの溶出時間（ｍｉｎ）、Ｖは被験ポリペプチドの溶出時の移動相（溶離液）における有機溶媒系移動相の容積比（％）をそれぞれ示す。）【００３０】
溶出された被験ポリペプチドは溶出時の移動相（溶離液）においてカラム充填剤への吸着能を有していないと考えられる。従って、水系移動相と有機溶媒系移動相の容積比が（１００−Ｖ）：Ｖである混合溶液に被験ポリペプチドを溶解することによって、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することも可能である。【００３１】
本発明者らは、２種の移動相（水系移動相及び有機溶媒系移動相）を用いる従来の逆相液体クロマトグラフ（図１（Ａ））によって被験ポリペプチド試料を分析する際、被験ポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間にべき乗法則が成り立つことを見出した（実施例６参照）。べき乗関数をｙ＝Ｂｘ−ｔ（ｙ：保持時間、ｘ：グラジエント勾配、ｔ：べき指数、ただしｔ＞０）で近似する場合、定数Ｂはグラジエント勾配が１％／ｍｉｎである保持時間（溶出時間）に相当する。また、グラジエント勾配１％／ｍｉｎによる被験ポリペプチドの溶出時間は、被験ポリペプチド導入時からその溶出時までの間に、被験ポリペプチド溶出用移動相が移動相（溶離液中）において増加した割合（％）を示す（ただし、増加分にはデッドボリュームが含まれるため近似値である）。この性質を利用して、例えば、水系移動相として有機溶媒を含まない水溶液、有機溶媒系移動相として選択した１種類の有機溶媒を用い、これら移動相の測定開始時の混合比が水系移動相：有機系移動相＝１００：０となる条件下で測定した場合には、グラジエント勾配１％／ｍｉｎによる被験ポリペプチドの溶出時間を、水−該有機溶媒混合溶液における被験ポリペプチドの相転移臨界値（％）と近似することも可能である（実施例７参照）。本知見を利用して、簡便に、ＯＦＦ相ポリペプチド試料を調製することができる。【００３２】
本発明においては、前述の如く、まず（１）被験ポリペプチド（ポリペプチドＡ）をＯＦＦ相状態として逆相液体クロマトグラフに導入し、（２）次いで、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段を実行することにより、ＯＦＦ相ポリペプチドＡをＯＮ相ポリペプチドＡに相転移させ、（３）当該ＯＮ相ポリペプチドＡをカラム充填剤と相互作用させることによりＯＮ相ポリペプチドＡをカラムに保持させ、（４）カラムに保持されたＯＮ相ポリペプチドＡを相転移させることにより、ＯＮ相ポリペプチドをＯＦＦ相ポリペプチドＡに変換し、（５）ＯＦＦ相ポリペプチドＡを溶出し、（６）溶出したポリペプチドＡを検出又は定量する。以下、前記（１）〜（６）の工程毎に説明する。【００３３】
工程（１）は、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを逆相液体クロマトグラフに導入する工程である。従来の逆相液体クロマトグラフィーにおいては、被験ポリペプチドがＯＦＦ相状態にあるのか、ＯＮ相状態にあるのかについては、何ら検討されていない。例えば、後述の実施例１のように、ウロコルチンはアセトニトリル含量が高い溶液（４０％以上）中では、カラム充填剤への吸着能も極めて弱いのに対し、アセトニトリル含量が３０％未満の場合急激にカラム充填剤への吸着能が強くなることが、本発明者の検討で初めて見出された（実施例１参照）。このことから、水−アセトニトリル溶液におけるウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値は３０％から４０％の間にあると考えられる。また、試料調製中に用いる容器等へのポリペプチドの吸着能が、シリカを基材とするカラム充填剤への吸着能と実質的に等しい又は若干低いことが示唆された。例えば、後述の実施例１のように、ウロコルチンについては、試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上の場合にそのピーク面積がほぼ一定であったことから、試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上の場合には試料調製中に用いる容器等への吸着が、試料調製直後から測定開始時までほとんど起こらなかったと考えられた。ただし、アセトニトリル含量が３０％の場合でも、容器等に長時間放置された場合に容器等への吸着が起こる可能性が考えられる。従って、吸着能の相転移臨界値より低い有機溶媒含量を有するポリペプチド試料は、容器等への吸着によりその一部が失われ、定量性を失うことから、工程（１）において、被験ポリペプチドを導入前にロスなく逆相液体クロマトグラフに導入するには、被験ポリペプチド試料に含まれる被験ポリペプチドをＯＦＦ相にしておけば、容器等への吸着も回避できると考えられる。【００３４】
ＯＦＦ相ポリペプチド試料は前述の本試料の調整方法に従って調製することができる。なお、本方法によってあるポリペプチドを検出又は定量する場合には、該ポリペプチドの相転移臨界値が５〜９５％程度であることが好ましく、該ポリペプチドの相転移臨界値が１０〜９０％程度であることがより好ましい。該ポリペプチドの相転移臨界値が本範囲に位置しない場合には、試料中又は移動相中の有機溶媒の種類、カラム充填剤、カラム温度などを変更することが好ましい。このような変更は、当業者であれば、適宜行うことができる。【００３５】
本試料は試料注入器から逆相液体クロマトグラフに導入され得る。本試料を導入するための移動相は特に制限されないが、有機溶媒系移動相が好ましい。被験ポリペプチドを該移動相に溶解した際に被験ポリペプチドがＯＦＦ相となるような有機溶媒系移動相であることが好ましい。有機溶媒系移動相として、例えば、０．０１〜６％程度の有機酸を含むアセトニトリル−メタノール混合液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むアセトニトリル溶液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むメタノール溶液、０．０１〜６％程度の有機酸を含むエタノール溶液などを例示できる。有機酸として酢酸を好ましく例示できる。また、有機溶媒系移動相として、１００％酢酸溶液を例示できる。【００３６】
工程（２）は、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段を実行することにより、ＯＦＦ相ポリペプチドＡをＯＮ相ポリペプチドＡに相転移させる工程である。相転移によりＯＮ相ポリペプチドＡが生成する。生成したＯＮ相ポリペプチドＡはカラム充填剤に吸着する。【００３７】
ＯＮ相ポリペプチドは、カラム充填剤のみならず試料調製中に用いる容器等へ吸着する場合も存在する。従って、工程（２）は、固定相、すなわちカラムの直前が好ましい（図１（Ｃ）及び（Ｄ））。【００３８】
本発明において、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段とは、移動相に含まれるＯＦＦ相ポリペプチドＡからＯＮ相ポリペプチドを生成又はその生成を促進する手段を意味する。【００３９】
ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段について、具体的に説明する。ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段とは、ＯＦＦ相ポリペプチドＡが存在する移動相（移動相に含まれる有機溶媒を、有機溶媒１、２、・・・、有機溶媒ｎ（ｎは１以上の整数）とする）において、被験ポリペプチドに関する前述の式（ａ）におけるｆ値を１より小さくする手段である。ＯＦＦ相ポリペプチドＡが存在する移動相に含まれる溶媒の種類及び／又は溶媒の組成を変化させることにより、ｆ値を１より小さくすることができる。ＯＦＦ相ポリペプチドＡが存在する移動相に対して該移動相とは異なる移動相（ポリペプチドＡ相転移用移動相と称呼することもある）を添加、攪拌することにより、ＯＦＦ相ポリペプチドＡが存在する移動相に含まれる溶媒の種類及び／又は溶媒の組成を変化させることができる。本変化前のＯＦＦ相ポリペプチドＡが存在する移動相をポリペプチドＡ導入用移動相と称呼することもある。ポリペプチドＡ相転移用移動相は、該移動相にポリペプチドＡを溶解した場合にポリペプチドＡがＯＮ相となる移動相（ＯＮ相溶液）である。【００４０】
ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段を実施することにより、ｆ値を１より小さくすることができる。ｆ値を１より小さくすることにより、移動相に含まれるＯＦＦ相ポリペプチドＡが相転移し、ＯＮ相ポリペプチドＡが生成する。【００４１】
ポリペプチドＡ導入用移動相に対してポリペプチドＡ相転移用移動相を添加、攪拌することによるＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段について、より具体的に説明する。ただし、ＯＦＦ相ポリペプチドＡ試料が水、有機溶媒Ｘ、有機溶媒Ｙ及び有機溶媒Ｚからなる混合溶媒にポリペプチドＡが溶解する試料であり、ポリペプチドＡ導入用移動相が水、有機溶媒Ｌ、有機溶媒Ｍ及び有機溶媒Ｎからなる移動相であり、ポリペプチドＡ相転移用移動相が水、有機溶媒Ｏ、有機溶媒Ｐ及び有機溶媒Ｑからなる移動相である場合について説明する。【００４２】
移動相に用いる有機溶媒は、使用する逆相液体クロマトグラフに使用可能な有機溶媒、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、酢酸、ギ酸及びＴＦＡなどから適宜選択することができる。これらは１種又は２種以上を組み合せて用いることができる。【００４３】
ポリペプチドＡ相転移用移動相の添加、攪拌は、例えば、逆相液体クロマトグラフに備わる混合器（図１（Ｃ）（Ｄ））によって実施することができる。【００４４】
ポリペプチドＡ導入用移動相とポリペプチドＡ相転移用移動相の混合比（ポリペプチドＡ導入用移動相：ポリペプチドＡ相転移用移動相＝１：αとする）の決定方法について、具体的に説明する。【００４５】
本例において、水−有機溶媒Ｘ混合溶液、水−有機溶媒Ｙ混合溶液、水−有機溶媒Ｚ混合溶液、水−有機溶媒Ｌ混合溶液、水−有機溶媒Ｍ混合溶液、水−有機溶媒Ｎ混合溶液、水−有機溶媒Ｏ混合溶液、水−有機溶媒Ｐ混合溶液及び水−有機溶媒Ｑ混合溶液の各々の混合溶液におけるポリペプチドＡの相転移臨界値はそれぞれ、Ｘ（％）、Ｙ（％）、Ｚ（％）、Ｌ（％）、Ｍ（％）、Ｎ（％）、Ｏ（％）、Ｐ（％）、Ｑ（％）とする。これらの相転移臨界値は、前述の相転移臨界値の決定方法により決定されうる。本例において、ＯＦＦ相ポリペプチドＡ試料における水、有機溶媒Ｘ、有機溶媒Ｙ、有機溶媒Ｚの容積比は、それぞれ、ｗ１（％），ｘ（％），ｙ（％），ｚ（％）（ただし、ｗ１＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝１００）とする。本例において、ポリペプチドＡ導入用移動相における水、有機溶媒Ｌ、有機溶媒Ｍ及び有機溶媒Ｎの容積比は、それぞれ、ｗ２（％），ｌ（％），ｍ（％），ｎ（％）（ただし、ｗ２＋ｌ＋ｍ＋ｎ＝１００）とする。本例において、ポリペプチドＡ相転移用移動相における水、有機溶媒Ｏ、有機溶媒Ｐ及び有機溶媒Ｑの容積比は、それぞれ、ｗ３（％），ｏ（％），ｐ（％），ｑ（％）（ただし、ｗ３＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝１００）とする。【００４６】
ＯＦＦ相ポリペプチドＡ試料に存在するポリペプチドＡはＯＦＦ相であるため、前述の式（ａ）の考えに従うと、ｘ／Ｘ＋ｙ／Ｙ＋ｚ／Ｚ＞１が成立している。【００４７】
ポリペプチドＡ相転移用移動相にポリペプチドＡを溶解させた場合には、ポリペプチドＡはＯＮ相となるため、前述の式（ａ）の考えに従うと、ｏ／Ｏ＋ｐ／Ｐ＋ｑ／Ｑ＜１が成立している。当業者は、このようなポリペプチドＡ相転移用移動相を容易に調製できる。例えば、Ｏ＝２０％，Ｐ＝４０％，Ｑ＝５０％の場合には、ｏ，ｐ，ｑ全て５％にすればよい。【００４８】
ポリペプチドＡ導入用移動相に存在するポリペプチドＡがＯＦＦ相である場合（すなわち、ポリペプチドＡ導入用移動相がＯＦＦ相溶液の場合）、ｌ／Ｌ＋ｍ／Ｍ＋ｎ／Ｎ＞１が成立している。当業者は、このようなポリペプチドＡ導入用移動相を容易に調製できる。例えば、Ｏ＝２０％，Ｐ＝４０％，Ｑ＝５０％の場合には、ｏ，ｐ，ｑを全て２０％にすればよい。逆相液体クロマトグラフに導入されたポリペプチドＡ試料は、混合器等によりポリペプチドＡ導入用移動相と攪拌、混合されない限り、前後で拡散しながら配管中を後から続くポリペプチドＡ導入用移動相に押されて流れており、ポリペプチドＡ近傍の移動相は導入されたポリペプチドＡ試料の溶媒組成をほぼ保持していると考えられる（図４Ｂ，Ｃ）。従って、ポリペプチドＡ試料とポリペプチドＡ相転移用移動相を１：αで混合してなる溶液においてポリペプチドＡはＯＮ相となり、かつ、ポリペプチドＡ導入用移動相とポリペプチドＡ相転移用移動相を１：αで混合してなる溶液においてもポリペプチドＡはＯＮ相となる必要があると考える。本考えから、β＝｛（ｌ／Ｌ＋ｍ／Ｍ＋ｎ／Ｎ）−１｝／｛１−（ｏ／Ｏ＋ｐ／Ｐ＋ｑ／Ｑ）｝として、γ＝｛（ｘ／Ｘ＋ｙ／Ｙ＋ｚ／Ｚ）−１｝／｛１−（ｏ／Ｏ＋ｐ／Ｐ＋ｑ／Ｑ）｝とすると、αはβとγのうちより大きい値（βとγが同一の場合はβ又はγ）以上の値となる。【００４９】
ポリペプチドＡ導入用移動相に存在するポリペプチドＡがＯＮ相である場合（すなわち、ポリペプチドＡ導入用移動相がＯＮ相溶液の場合）、ｌ／Ｌ＋ｍ／Ｍ＋ｎ／Ｎ＜１が成立している。当業者は、このようなポリペプチドＡ導入用移動相を容易に調製できる。例えば、Ｏ＝２０％，Ｐ＝４０％，Ｑ＝５０％の場合には、ｏ，ｐ，ｑを全て５％にすればよい。この場合には、ポリペプチドＡ試料とポリペプチドＡ相転移用移動相を１：αで混合してなる溶液においてポリペプチドＡはＯＮ相となる必要があると考える。本考えから、αは前記のγとなる。【００５０】
被験ポリペプチドとしてウロコルチンを例に挙げて混合比について更に説明する。後述の実施例１においては、水−アセトニトリル混合溶液におけるウロコルチンの相転移臨界値が約３５％、水−エタノール混合溶液におけるウロコルチンの相転移臨界値が約４５％、水−酢酸混合溶液におけるウロコルチンの相転移臨界値が約６５％であることが明らかとなった（実施例３参照）。従って、ＯＦＦ相ウロコルチン試料の溶媒として、水、アセトニトリル及びエタノールからなる溶媒であって、水：アセトニトリル：エタノールの容積比が２０％：３５％：４５％である溶媒を例示できる。ウロコルチン導入用移動相として、水、酢酸、アセトニトリル及びエタノールからなる溶媒であって、水：酢酸：アセトニトリル：エタノールの容積比が１６．７５％：３．２５％：３５％：４５％である溶媒を例示できる。ウロコルチン相転移用移動相として、３．２５％酢酸水溶液を例示できる。本例において、β＝｛（３．２５／６５＋３５／３５＋４５／４５）−１｝／｛１−（３．２５／６５）｝、γ＝｛（３５／３５＋４５／４５）−１｝／｛１−（３．２５／６５）｝となる。すなわち、βは約１．１、γは約１．０５となる。従って、αは約１．１以上と算出することができ、例えば、ウロコルチン導入用移動相とウロコルチン相転移用移動相を１：２の混合比率で混合、攪拌すればよい。【００５１】
すなわち、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを相転移させる手段として、ＯＦＦ相ポリペプチドを含有する移動相における有機溶媒含量を低下させる手段を例示することができる。ＯＦＦ相ポリペプチドを含有する移動相の水分含量を増加させることにより、ＯＦＦ相ポリペプチドを含有する移動相における有機溶媒含量を低下させることができる。【００５２】
本発明者らは、２７種類の被験ポリペプチドを対象に、水−イソプロピルアルコール混合溶液、水−アセトニトリル混合溶液、水−エタノール混合溶液、水−メタノール混合溶液及び水−酢酸混合溶液を用いて、それぞれの有機溶媒（酢酸も含む）における相転移臨界値の概算を算出した結果、５〜７０％程度であることが明らかとなった（実施例１５参照）。今回用いた２７種のポリペプチド以外のポリペプチドについては、１〜５％程度の相転移臨界値を示す場合も存在すると考えられる。従って、溶離液中に含まれる各有機溶媒の含量を臨界値以下（ｆ＜１）、例えば０．０１〜１％程度以下、好ましくは０．０１〜０．５％程度以下に低下させることによって、ＯＦＦ相ポリペプチドを相転移させ、ＯＮ相ポリペプチドを生成することができると考えられる。
一方で、カラム圧が高い場合に、保持時間の短いポリペプチドが、カラムから早く溶出する場合が存在することが判明した（実施例７及び１５）。この原因としては、高いカラム圧によりポリペプチドの高次構造がより小さい臨界値を示す高次構造に変化するためと推察された。【００５３】
少なくとも、ある移動相（移動相１）を供給する移動相供給器（移動相１供給器）、移動相１とは異なる移動相（移動相２）を供給する移動相供給器（移動相２供給器）、移動相１供給器と送液管を介して接続する試料注入器、該移動相２供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器、該移動相混合器と送液管を介して接続する逆相分析カラム、並びに該逆相分析カラムと接続されるポリペプチドの検出又は定量器を有する逆相液体クロマトグラフ（図１（Ｃ））を用いる場合の工程（２）を説明する。【００５４】
工程（２）は、移動相混合器による移動相１と移動相２の混合と攪拌により実行される。移動相１は、移動相１に被験ポリペプチドを溶解させた場合に該被験ポリペプチドがＯＦＦ相となる移動相であればよい。このような移動相として、イソプロピルアルコールが４０％以上、アセトニトリルの容積比が５０％以上、エタノールの容積比が５０％以上、メタノールの容積比が８０％以上及び／又は酢酸の容積比が８０％以上であって、かつ、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、メタノール、エタノール及び酢酸から選ばれる１種又は２種以上の有機溶媒を含む溶液、例えば、水−アセトニトリル（水とアセトニトリルの容積比は１：１）混合溶液を例示できる。移動相２として、水又は数％の有機酸水溶液を例示できる。有機酸として好ましく酢酸、ギ酸、ＴＦＡを例示できる。工程（２）は、このような移動相１と移動相２を混合比１：１００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：２で移動相混合器によって混合と攪拌により実行されうる。
より具体的には、例えば、移動相混合器において、容積比４％の酢酸を含むアセトニトリル−メタノール混合液（容積比１：１）である移動相１と、容積比４％の酢酸水溶液である移動相２を２：８の混合比で混合、攪拌することにより工程（２）を実行することができる（実施例１参照）。【００５５】
カラムの固定相やカラム温度もポリペプチドの固定相への保持時間に影響を与えるが（実施例８及び９参照）、ポリペプチド溶液におけるそのポリペプチドのカラムの充填剤に対する吸着能の相転移が与える影響と比較すると僅かである。一般的には、カラム温度を上昇させると、ポリペプチドの固定相への保持時間が短くなることから、ポリペプチドの転移臨界値は下がり、逆にカラム温度を低下させると、ポリペプチドの固定相への保持時間が長くなることから、ポリペプチドの相転移臨界値は上昇する。また、一般的に、グラファイトカーボン充填剤はシリカゲル充填剤と比べてポリペプチドの保持力が強いことから、あるポリペプチドについて、シリカゲル充填剤を用いた場合の該ポリペプチドの相転移臨界値は、グラファイトカーボン充填剤を用いた場合の該ポリペプチドの相転移臨界値と比べて低い。【００５６】
工程（３）は、ＯＮ相ポリペプチドＡをカラム充填剤と相互作用させる工程である。工程（２）により、被験ポリペプチドは、ＯＮ相ポリペプチドＡ、すなわちカラム充填剤に吸着できる状態になっているので、全量充填剤に確実に吸着する。従来は、前述の如く、ポリペプチドの吸着能がＯＦＦ相とＯＮ相とに相転移することが知られていないことから、ＯＦＦ相の状態で導入されたポリペプチドはカラム充填剤に吸着せずに素通りしてしまい、ピークが２つに生じることもあった（実施例１参照）。一方、ＯＮ相の状態で導入されたポリペプチドは、カラム充填剤に確実に吸着するが、導入前に容器等への吸着によってその一部が失われる結果、定量性が失われ、高感度定量を困難としていた。【００５７】
工程（４）は、充填剤に吸着したＯＮ相ポリペプチドＡを相転移させて、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを生成する工程である。この工程は、移動相の有機溶媒−水の濃度を変化させる、すなわちグラジエントをかけることにより行われる。移動相中の有機溶媒含量を前記の考えに従って、該移動相がＯＦＦ相となるまで上昇させればよい。低分子化合物のカラム充填剤への保持と比べて、ポリペプチドのカラム充填剤への保持は、疎水的相互作用等の様々な相互作用が存在する中で、吸着能の影響を最も大きく受ける点が特徴である。このポリペプチドの吸着能は、相転移臨界値を境界にして著しく変化する点が特徴であり、カラム充填剤に吸着しているＯＮ相ポリペプチドは、カラム充填剤と相互作用している低分子化合物と比べて、イソクラティク条件においてカラム中を動き難いという性質を有している。この性質を利用して、工程（１）〜（３）を繰り返し実行して、その後に工程（４）を実行することもできる。その結果、カラム充填剤が有するポリペプチドの負荷量限界までカラム充填剤にポリペプチドを吸着させることが可能となり、高感度な定量が可能となる。【００５８】
工程（５）は、ＯＦＦ相ポリペプチドＡを溶出する工程である。溶離液中の有機溶媒濃度を高くする、つまり、ポリペプチドがＯＦＦ相ポリペプチドとなる溶液組成となるような溶出液を用いて、溶出すればよい。【００５９】
工程（６）は、溶出したポリペプチドＡを検出又は定量する工程であり、検出はＵＶ、蛍光、フォトダイオードアレイ等いずれでもよい。高感度定量は、マススペクトル、特にタンデムマススペクトロメトリーが好ましい。【００６０】
また、本発明には、少なくとも、ある移動相（移動相１）を供給する移動相供給器（移動相１供給器）、移動相１とは異なる移動相（移動相２）を供給する移動相供給器（移動相２供給器）、移動相１供給器と送液管を介して接続する試料注入器、該移動相２供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器、該移動相混合器と送液管を介して接続する逆相分析カラム、並びに該逆相分析カラムと接続されるポリペプチドの検出又は定量器を有する逆相液体クロマトグラフも提供する（図１（Ｃ））。本逆相液体クロマトグラフは、本検出又は定量方法に用いることができる。該逆相分析カラムとポリペプチドの検出又は定量器とは送液菅を介して接続され得る。ポリペプチドの検出又は定量器とは、ポリペプチドを検出又は定量することが可能な検出又は定量器である。【００６１】
逆相液体クロマトグラフとして、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）が好ましく例示される。液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）として、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が好ましく例示される。ポリペプチドの検出又は定量装置としての質量分析装置が接続されている逆相液体クロマトグラフを用いることにより、高感度なポリペプチドの検出又は定量が可能となる。従って、ポリペプチドの検出又は定量器として、質量分析計、好ましくは、タンデム質量分析計を挙げることができる。【００６２】
移動相として２種以上の有機溶媒と水の混合液を用いる場合などでは、移動相供給器を３つ以上有する逆相液体クロマトグラフが好ましい（図１（Ｄ））。従って、少なくとも、ある移動相（移動相１）を供給する移動相供給器（移動相１供給器）、移動相１とは異なる移動相（移動相２）を供給する移動相供給器（移動相２供給器）、移動相１及び２とはそれぞれ異なる移動相（移動相３）を供給する移動相供給器（移動相３供給器）、移動相１供給器と移動相２供給器とを送液管を介して接続する移動相混合器（混合器Ａ）、混合器Ａと送液管を介して接続する試料注入器、該移動相３供給器と該試料注入器とを送液管を介して接続する移動相混合器（混合器Ｂ）、混合器Ｂと送液管を介して接続する逆相分析カラム、該逆相分析カラムと送液管を介して接続される質量分析計を有する、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）又は液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）も本発明に含まれる。【００６３】
また、質量分析計と分析カラムが送液菅を介して接続するのではなく、質量分析計がスイッチングバルブと接続し、該スイッチングバルブが送液菅を介して逆相分析カラム接続してもよい。スイッチングバルブは、分析カラムからの溶出液を質量分析計へ移行させるか否かを切り分けることができる。例えば、ポリペプチドの検出又は定量が完了した後、分析カラムに吸着する夾雑物を洗浄する際などに、スイッチングバルブを操作し、分析カラムからの溶出液が質量分析計に移行することを止めることができる。【００６４】
本発明システム（図１（Ｃ）及び（Ｄ））と従来システム（図１（Ａ）及び（Ｂ））とを比較した図を図１に示す。【００６５】
本発明法によれば、容器等への吸着を回避できる溶液組成を有するポリペプチド試料を、ロスすることなく定量することができる。従って、装置が有する検出限界まで測定可能であり、システムへの試料導入量によっては、ｆＭオーダー以下のポリペプチドを正確に定量可能である。【００６６】
後記実施例（特に実施例１７〜２２）に記載のように、本発明者は、ポリペプチドを含有する生体由来試料に酢酸を添加すれば、該試料中のあるポリペプチドの溶解度を向上させることができることを見出した。【００６７】
生体由来試料としては、血漿、尿、各組織ホモジネート等が挙げられるが、血漿由来試料が好ましい。
酢酸の添加によって、生体由来試料中のポリペプチドの溶解度が向上する理由は明らかではないが、血漿中のポリペプチドとあるポリペプチドとの相互作用を阻害し、血漿中のポリペプチドとあるポリペプチドとの凝集を阻害することによるものと考えられる。すなわち、酢酸の添加により、インビトロにおいて、同一又は異種のポリペプチド間相互作用を阻害することができ、それらの凝集を阻害することができる。【００６８】
また、この酢酸の添加によるポリペプチドの溶解性向上作用は、ポリペプチドを含有する生体由来試料に有機溶媒を添加した場合に、特に有効である。当該有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール及びイソプロピルアルコールから選ばれる１種又は２種以上が好ましい。すなわち、血漿由来試料に、有機溶媒と酢酸とを添加することにより、該試料中のあるポリペプチド（ポリペプチドＡ）の溶解性を向上させることができる。このようにして溶解性を向上させた試料は、ＯＦＦ相ポリペプチドＡとなる。【００６９】
当該ポリペプチドとしては、分子量１万Ｄａ以上のものであってもよい。特に生体由来試料中のβアミロイド又はその部分ポリペプチドの溶解性を向上させるのに有用である。βアミロイドの部分ポリペプチドとしては、次の（１）〜（４）が挙げられる。
（１）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第３８番目までからなるポリペプチド、
（２）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４０番目までからなるポリペプチド、
（３）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４２番目までからなるポリペプチド、及び
（４）βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４３番目までからなるポリペプチド。
添加する酢酸の量は、５０％以上が好ましく、有機溶媒と組み合せて使用する場合には、有機溶媒量が、１０％以上であり、酢酸の量が５０％以上であるのが好ましい。
【実施例】
【００７０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００７１】
実施例に用いた試薬、ポリペプチド等を以下に示す。【００７２】
試薬
ＨＰＬＣ用アセトニトリル（関東化学）
ＨＰＬＣ用メタノール（関東化学）
ＨＰＬＣ用エタノール（関東化学）
ＨＰＬＣ用イソプロピルアルコール（２−プロパノール）（関東化学）
カラムクロマトグラム用  酢酸（ナカライテスク）
カラムクロマトグラム用  ギ酸（ナカライテスク）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；ナカライテスク）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；ナカライテスク）
超純水（低総有機炭素水：Ｌｏｗ  ＴＯＣ水）【００７３】
ポリペプチド（２７種）
下記ポリペプチドをペプチド研究所より購入して使用した。
・副腎皮質刺激ホルモンのアミノ酸配列第１番目から第２４番目からなるポリペプチド（ＡＣＴＨ（１−２４））＊
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第１６番目からなるポリペプチド
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６））＊
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４０番目からなるポリペプチド
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０））＊
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４２番目からなるポリペプチド＊
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２））＊
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第４３番目からなるポリペプチド
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３））＊
・成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）＊
・イソロイシルーセリルーブラジキニン（ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）＊
・脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ−３２）＊
・インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）＊
・Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−５３）＊
・ミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチド（ｍｉｄｋｉｎｅ（６０−１２１））＊
・ニューロメジンＣ（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ  Ｃ）＊
・ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）＊
・ノシセプチン（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ）＊
・オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）＊
・ウロコルチン（ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ）＊
・心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ（１−２８））
・ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ）
・ラット好中球走化性因子−１（ＣＩＮＣ−１／ｇｒｏ）
・副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ（１−８４））
下記ポリペプチドをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．より購入して使用した。
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第２８番目からなるポリペプチド
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−２８））＊
・βアミロイドのアミノ酸配列第１番目から第３８番目からなるポリペプチド
（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８））＊
（＊を付されたポリペプチドを、後述の実施例において、１８種のポリペプチドと称呼する）
下記ポリペプチドをＳｉｇｍａより購入して使用した。
・インターフェロン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）
・オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）
下記ポリペプチドをＢＡＣＨＥＭより購入して使用した。
・アンジオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）
・オバルブミンのアミノ酸配列第３２３番目から第３３９番目からなるポリペプチド（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９））
下記ポリペプチドをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入して使用した。
・アミノ酸配列第４番目のチロシンがリン酸化されたアンジオテンシンＩＩ（［Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）４］−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）【００７４】
装置
四重極型タンデムＭＳ装置：ＡＰＩ３６５（アプライドバイオシステムズ）
ＬＣシステム：ＬＣ６００（ＧＬサイエンス）【００７５】
ポリペプチド原液の調製
ＧＲＦ及びインスリンは、容積比０．１％の酢酸水溶液で溶解することで、原液（１００μＭ）を調製した。ウロコルチンは、容積比１％の酢酸水溶液で溶解することで、ウロコルチン原液（１００μＭ）を調製した。ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−２８）、（１−３８）、（１−４０）、（１−４２）及び（１−４３）は、ＤＭＳＯに溶解し、原液（１００μＭ）を調製した。［Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）４］−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  及びｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９）は、水に溶解することでポリペプチド原液（１ｍＭ）を、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩは、水に溶解することでポリペプチド原液（５０ｍＭ）を調製した。また、ｍｉｄｋｉｎｅ、ＣＩＮＣ−１／ｇｒｏ及びＰＴＨ（１−８４）は、水に溶解することでポリペプチド原液（１０μＭ）を調製した。
更に、ｏｖａｌｂｕｍｉｎは、水に溶解することでポリペプチド原液（１０ｍｇ／ｍＬ；約２００μＭ）を調製した。その他のポリペプチドは、水に溶解することでポリペプチド原液（１００μＭ）を調製した。【００７６】
ポリペプチドの多価イオン測定によるモニターイオンの設定
＜試料調製＞
ポリペプチド原液（１００μＭ）１０μＬを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比２：８０：１０：１０、４：８０：１０：１０、２：５０：２５：２５又は４：５０：２５：２５）４９０μＬ又は９９０μＬ、又は酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比２：８０：２０、４：８０：２０、２：５０：５０又は４：５０：５０）４９０μＬ又は９９０μＬに添加し、ポリペプチド試料溶液（１又は２μＭ）を調製した。ただし、［Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）４］−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  及びｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９）原液を、水にて１０倍希釈した後（１００μＭ）、その１０μＬを用いて同様に１又は２μＭの試料溶液を調製した。また、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ原液を、水にて５０倍希釈した後（１ｍＭ）、その１０μＬを用いて１又は２μＭの試料溶液を調製した。更に、ｍｉｄｋｉｎｅ、ＣＩＮＣ−１／ｇｒｏ及びＰＴＨ（１−８４）原液（１０μＭ）５０μＬを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：７０：１０：１０又は４：４０：２５：２５）４５０μＬに添加し、ポリペプチド試料溶液（１又は２μＭ）を調製した。Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ原液（１０ｍｇ／ｍＬ；約２００μＭ）１０μＬを、酢酸−水−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：８０：１０：１０又は４：５０：２５：２５）４９０μＬ又は９９０μＬに添加し、ポリペプチド試料溶液（１又は２ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
＜測定条件＞
測定モード：ＥＳＩ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ
サンプル導入法：インフュージョン法
流速：５μＬ／ｍｉｎ
＜モニターイオン設定＞
検討に用いた全てのポリペプチドにおいて、多価イオンが認められた。この多価イオンのうちの一つを親イオンとして選択して、ＭＳ／ＭＳ測定のための娘イオンの選択を実施した。その際に、ＭＳ条件に関わるパラメーターの最適化を実施した。今回、測定に用いた各ポリペプチドのモニターイオン例を表１及び表２に示す。【００７７】
【表１】
0005144273.tif 000004
【００７８】
【表２】
0005144273.tif 000005
【００７９】
実施例１（ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移現象）
＜試料調製＞
ウロコルチン原液（１００μＭ）１０μＬを、９０μＬの容積比２％の酢酸水溶液に添加し、ウロコルチン試料溶液（１０μＭ）を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液１０μＬを、容積比４％の酢酸を含む９９０μＬの水−アセトニトリル混合液（容積比１０：０、８：２、７：３、６：４、４：６又は２：８）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１００ｎＭ）を調製した。また、容積比４％の酢酸の代わりに容積比４％のギ酸、又は、容積比０．１％のＴＦＡを含む水−アセトニトリル混合液（容積比１０：０、８：２、７：３、６：４、４：６、２：８）及び酸を含まない水−アセトニトリル混合液（容積比１０：０、８：２、７：３、６：４、４：６、２：８）を用いて、同様にアセトニトリル含量の異なるウロコルチン試料（１００ｎＭ）を調製した。更に、１００ｎＭのウロコルチン試料溶液１０μＬを、９９０μＬの同じ組成の溶液で希釈することにより、１ｎＭのウロコルチン試料溶液を調製した。【００８０】
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
Ｃ３０逆相カラム（ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−３：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【００８１】
【表３】
0005144273.tif 000006
【００８２】
ただし、本発明システムでは、０．１分から３分までの間、流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。【００８３】
アセトニトリル含量及び添加した酸の異なる１ｎＭのウロコルチン試料溶液５００μＬ又は１００μＬをシステムに導入した。【００８４】
＜結果＞
溶液中のアセトニトリル含量及び添加した酸は異なるが同濃度のウロコルチン試料を、従来、ポリペプチドの定量方法として用いられる逆相液体クロマトグラフ法（図１（Ａ））及びＣ３０カラムを用いて測定した。その結果、ウロコルチンのピーク面積は、一定ではなく、図２のように変化した。酸としてＴＦＡを用いた場合を除き、ウロコルチンのピーク面積は、試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％で最大値を示した。一方、酸としてＴＦＡを用いた場合は、試料溶液中のアセトニトリル含量が４０％の時に、ウロコルチンピーク面積が最大値を示したが、その時のピーク面積は、他の酸を用いた時のピーク面積とほぼ変わらなかった。よって、ウロコルチンのピーク面積に与える酸の影響は、試料溶液中のアセトニトリル含量が与える影響よりも小さいと考えられた。【００８５】
前述のアセトニトリル含量の異なるウロコルチン試料溶液（容積比４％の酢酸を含む）を、Ｃ４カラムを用いて測定した時のマスクロマトグラムを比較した。その結果、溶液中のアセトニトリル含量が４０％以上のウロコルチン試料溶液を測定した場合に、保持時間６．５分のウロコルチンピークの他に、約１．５分の箇所に新たなピークが認められた（図３）。ウロコルチン試料溶液には、ウロコルチン以外の被験物質が含まれていないことから、本ピークがウロコルチンであると考えられた。しかし、約１．５分という保持時間から、この新たに出現したピークがウロコルチンであるためには、ウロコルチンがカラムを素通りすることが必要である。そこで、これらの現象を説明するために、次のような「ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移」が起きているとの仮説をたてた。すなわち、ウロコルチン周辺のアセトニトリル含量が、ある特異的な値（相転移現象では一般的に臨界点又は臨界値と呼ばれているため、以降、臨界点又は臨界値と呼ぶ）を超えた場合、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能は失われるが、反対に、ウロコルチン周辺のアセトニトリル含量がその臨界値より小さい場合、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能は、カラムに保持されるのに十分な吸着能を有する、つまり臨界点を境に、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能が急激に変化するものと仮説を立てた。【００８６】
前述のように想定した場合、今回の現象は、以下のように説明できる。つまり、ウロコルチン試料溶液中のアセトニトリル含量が４０％以上（臨界値を上回る）の場合、試料溶液中のウロコルチンは、カラム充填剤への吸着能を失った状態で溶液中に存在する（以降、カラム充填剤へ全く相互作用しない、又は、著しく弱く相互作用する相のウロコルチンをＯＦＦ相ウロコルチンと称することもある）。その状態で、逆相クロマトグラフに導入された試料溶液は、図４が示す通り、カラムへ導入されるまで、そのアセトニトリル含量を保っているため、その溶液中のウロコルチンはカラムと相互作用できず、カラムを素通りする。一方、アセトニトリル含量が３０％以下（臨界値を下回る）の場合、試料溶液中のウロコルチンは、カラム充填剤への吸着能を保った状態で溶液中に存在する（以降、カラム充填剤への強く相互作用する相のウロコルチンをＯＮ相ウロコルチンと称することもある）。その状態で、逆相クロマトグラフに導入された試料溶液は、図４が示す通り、カラムへ導入されるまで、そのアセトニトリル含量を保っているため、その溶液中のウロコルチンはカラムと相互作用し、カラムで保持されることとなる。【００８７】
ただし、ウロコルチン試料溶液中のアセトニトリル含量が４０％以上（臨界値を上回る）の場合でも、カラムへ導入されるまでの間に起きる試料溶液の拡散（図４（Ｂ））、つまり、試料溶液と移動相との混合が試料溶液前後で起こっていると考えられる。その拡散（特に試料溶液の後ろ側）により生じたウロコルチン周辺の（試料溶液と移動相との混合）溶液組成が、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能を示す組成となることで、保持時間６．５分のピークとして認められる結果となったと考えられた。【００８８】
なお、今回の結果から「ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移」を引き起こす試料溶液中アセトニトリル含量臨界値は、３０％から４０％の間に存在すると考えられる。【００８９】
この仮説に基づき、図１（Ｃ）及び（Ｄ）に示すシステムを、ポリペプチド定量のためのシステムとして考案した。このシステムを用いた場合、ポリペプチド試料溶液を含む流れである移動相Ｂ（もしくは移動相Ｂと移動相Ｃからなる溶離液）と、別の流れである移動相Ａは、カラム導入前に混合されることから、移動相ＡとＢの混合比を変化させることで、カラム先端でのポリペプチド周辺溶液組成は、任意に変化させることができる。例えば、図１（Ｃ）にて、移動相Ａを水、移動相Ｂをアセトニトリルとし、その混合比を８：２と設定した場合、混合後のカラム先端でのアセトニトリル含量は、アセトニトリルのみで調製されたポリペプチド試料溶液を測定した場合でも２０％のままとなる。一方、水のみで調製されたポリペプチド試料溶液を測定した場合、混合後のカラム先端でのアセトニトリル含量は一時的に０％となる。つまり、この移動相比を保つ限り、ポリペプチド試料溶液中のアセトニトリル含量に関わらず、カラム先端でのアセトニトリル含量は、最大２０％までにしかならない。そのため、例えば、ウロコルチンの場合、カラム充填剤への吸着能を失った状態（臨界値を上回るアセトニトリル含量、つまり４０％以上のアセトニトリル含量をもつ溶液組成）のウロコルチン試料をシステムに導入しても、移動相Ａ：Ｂ比をウロコルチンのカラム固定相への親和力を回復させ得る比Ａ：Ｂに設定することで、相転移によりウロコルチンのカラム充填剤への吸着能を瞬時に生じさせることができ、その結果、ウロコルチン全てをカラムに保持させ得ると考えられた。【００９０】
この仮説を検証するために、再度、溶液中のアセトニトリル含量は異なるが同濃度のウロコルチン試料溶液（容積比４％の酢酸を含む）を、Ｃ４カラムを装備した従来システム図１（Ａ）及び本発明システム図１（Ｃ）を用いて測定した（１ｎＭ；注入量１００μＬ）。その結果、従来システムを用いた場合、保持時間６．５分のウロコルチンピーク面積は前回とほぼ同様に変化し（図５（Ｂ）黒丸）、保持時間１．５分のウロコルチンピークは、溶液中のアセトニトリル含量が４０％以上の場合に認められ、その面積はアセトニトリル含量が増えるに従って増加した（図５（Ａ）黒丸）。一方、本発明システムを用いた場合、ウロコルチン試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上の場合、ウロコルチンのピーク面積はほぼ一定であり（図５（Ｂ）白丸）加えて、従来法で認められた保持時間１．５分に相当するウロコルチンピークは、本発明システムでは全く認められなかった（図５（Ａ）白丸）。また、ウロコルチン試料溶液中のアセトニトリル含量が２０％以下（臨界値を下回る）の場合、保持時間６．５分のウロコルチンピーク面積は、試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上の場合と比較して、小さくなり、更に、試料溶液中のアセトニトリル含量が０％の場合、ウロコルチンのピーク面積は、約４０分の１であった。このウロコルチンピーク面積の減少は、ウロコルチン試料を調製した器材及び容器（エッペンドルフチップ及びチューブ）や、液体クロマトグラフに用いられている器材（注入用シリンジ）への吸着によって、カラムに導入されるウロコルチンの量が減少したことに起因すると考えられた。また、ウロコルチン試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上で、ピーク面積がほぼ一定であったことから、試料溶液中のアセトニトリル含量が３０％以上の場合に、試料調製・保存時に用いる容器及び試料導入時に用いるシリンジ等への吸着が起こらなかったと考えられた。このことから、ウロコルチンの今回用いたカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値（３０％〜４０％の間）より大きい有機溶媒含量を含む溶液中でウロコルチンを取り扱うことで、試料調製時及び試料導入時のウロコルチンの容器及び装置等への吸着による損失を回避できると考えられた。【００９１】
この検討結果から、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移が確かに起こっていると考えられた。つまり、本発明システムへ導入されたＯＦＦ相ウロコルチンは、水系移動相との混合により生じた溶液中で瞬時に相転移を起こすことによって、ＯＮ相ウロコルチンとなり、全てのウロコルチンがカラムと相互作用し得る状態となり、試料導入前までに容器及びシリンジ等への吸着が認められない場合には、ほぼ同じピーク面積として検出されたと考えられた。また、今回使用したようなシリカゲルを担体とするカラムを用いてカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を把握することで、容器及び装置等への吸着を防ぐアセトニトリル含量も大体把握できることが示唆された。【００９２】
実施例２（アセトニトリル以外の因子によるウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移）
＜試料調製＞
ウロコルチン原液（１００μＭ）１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１μＭ）を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液１０μＬを、９９０μＬの下記混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。
水−アセトニトリル混合液（容積比＝７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８又は１：９）
水−エタノール混合液（容積比＝７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８又は１：９）
水−メタノール混合液（容積比＝７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８又は１：９）
水−酢酸混合液（容積比＝７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８又は１：９）
水−ギ酸混合液（容積比＝７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８又は１：９）【００９３】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【００９４】
【表４】
0005144273.tif 000007
【００９５】
１０ｎＭの各ウロコルチン試料溶液１００μＬをシステムに導入した。【００９６】
＜結果＞
ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移は、前述のアセトニトリルだけでなく、検討したすべての溶液で引き起こされることが示された（表５）。各溶液における相転移臨界値は、エタノールを用いた場合、容積比４０％〜５０％、メタノール及び酢酸を用いた場合、容積比６０〜７０％、ギ酸を用いた場合、容積比８０％〜９０％の間に存在すると考えられた。今回の結果から、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移に与える溶液中に含まれる有機溶媒の強さは、アセトニトリル＞エタノール＞メタノール及び酢酸＞ギ酸の順であることが示された。ただし、高濃度のギ酸を用いた場合、時間とともにウロコルチンのピーク面積が小さくなる現象が認められ、ウロコルチンに存在するアミノ基のホルミル化が引き起こされていると考えられた。このことから、高濃度のギ酸を試料中に用いることはあまり好ましくないと考えられた。【００９７】
【表５】
0005144273.tif 000008
【００９８】
実施例３（２種の有機溶媒を含む溶液中ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移現象）
＜試料調製＞
ウロコルチン原液（１００μＭ）１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１μＭ）を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液１０μＬを、９９０μＬの表６及び表７に示す混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。【００９９】
【表６】
0005144273.tif 000009
【０１００】
【表７】
0005144273.tif 000010
【０１０１】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１０２】
【表８】
0005144273.tif 000011
【０１０３】
各ポリペプチド混合試料溶液１００μＬをシステムに導入した。【０１０４】
＜結果＞
従来法を用いて２種の有機溶媒を含むウロコルチン試料を測定した時に、カラムに保持されず素通りしたウロコルチンのピーク面積値を表９及び表１０に示す。【０１０５】
【表９】
0005144273.tif 000012
【０１０６】
【表１０】
0005144273.tif 000013
【０１０７】
今回の結果から、有機溶媒が２種以上含まれる混合溶液中でのウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移現象は下記式（ａ）に従っていると考えた。実際に、ウロコルチン試料に用いた各有機溶媒含量を式（ａ）に代入して算出した値ｆを表１１及び表１２に示したところ、ｆが１となる前後で、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移が起きていることが確認された。ただし、計算に用いた各有機溶媒の臨界含量（％）は、クロマトグラム上でピークが２本に分かれる前後の有機溶媒含量の中間値（アセトニトリル：３５％、エタノール：４５％、メタノール：６５％、酢酸：６５％、ギ酸：８５％）とした。【０１０８】
２種以上の有機溶媒を含む試料中におけるポリペプチドＡのカラム充填剤への吸着能の相転移現象と各有機溶媒含量との関係を表す式（ａ）【０１０９】
【数３】
0005144273.tif 000014
【０１１０】
ある条件下における、
Ｘ：水−有機溶媒Ａ混合溶液中でのポリペプチドＡの相転移臨界値を示す容積％
Ｙ：水−有機溶媒Ｂ混合溶液中でのポリペプチドＡの相転移臨界値を示す容積％
Ｚ：水−有機溶媒Ｃ混合溶液中でのポリペプチドＡの相転移臨界値を示す容積％
ｘ：試料溶液中の有機溶媒Ａ含量％
ｙ：試料溶液中の有機溶媒Ｂ含量％
ｚ：試料溶液中の有機溶媒Ｃ含量％【０１１１】
【表１１】
0005144273.tif 000015
【０１１２】
【表１２】
0005144273.tif 000016
【０１１３】
実施例４（３種の有機溶媒を含む溶液中ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移現象）
＜試料調製＞
ウロコルチン原液（１００μＭ）１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１μＭ）を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液１０μＬを、９９０μＬの表１３に示す混合液に添加し、ウロコルチン試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。【０１１４】
【表１３】
0005144273.tif 000017
【０１１５】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１１６】
【表１４】
0005144273.tif 000018
【０１１７】
各ポリペプチド混合試料溶液１００μＬをシステムに導入した。【０１１８】
＜結果＞
従来法を用いて３種の有機溶媒（アセトニトリル、酢酸及びメタノール）を含むウロコルチン試料を測定した時に、カラムに保持されず素通りしたウロコルチンのピーク面積値、及び、式（１）から算出した値ｆを表１５に示す。今回の結果も、実施例３と同様、複数の有機溶媒を含む試料中のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移が式（ａ）に従っていることを示唆した。以上の結果から、水−各有機溶媒からなる混合溶媒を用いた場合のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値（容積％）をあらかじめ把握しておくことで、相転移臨界値が把握されている複数の有機溶媒を含む試料中のウロコルチンのカラム充填剤への吸着能（ＯＮ相又はＯＦＦ相状態）の予測が可能であることが示された。【０１１９】
【表１５】
0005144273.tif 000019
【０１２０】
実施例５（各有機溶媒（有機酸も含む）による各種ポリペプチドのＣ４カラム充填剤への吸着能の相転移）
＜試料調製＞
検討に用いた全２７種の各ポリペプチドのうち、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  及びｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９）を除いた２５種の各ポリペプチド原液（１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ又は１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを、それぞれ、９９０μＬの下記混合液に添加し、各ポリペプチド試料溶液（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ又は０．１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
水−アセトニトリル混合液（容積比＝９５：５，９：１，８：２，７：３，６：４，５：５，４：６又は３：７）
水−エタノール混合液（容積比＝９５：５，９：１，８：２，７：３，６：４，５：５，４：６又は３：７）
水−メタノール混合液（容積比＝９５：５，９：１，８：２，７：３，６：４，５：５，４：６又は３：７）
水−酢酸混合液（容積比＝９５：５，９：１，８：２，７：３，６：４，５：５，４：６又は３：７）
また、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９）原液（１ｍＭ）を水にて１０倍希釈した溶液（１００μＭ）及びａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ原液（５０ｍＭ）を水にて５０倍希釈した溶液（１ｍＭ）１０μＬを９９０μＬの前述の混合液に添加し、各ポリペプチド試料溶液（１μＭ又は１０μＭ）を調製した。【０１２１】
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１２２】
【表１６】
0005144273.tif 000020
【０１２３】
１μＭのポリペプチド混合試料溶液１００μＬをシステムに導入した。【０１２４】
＜結果＞
従来システム（図１（Ａ））を用いて各ポリペプチド溶液を測定した場合に認められたカラム充填剤への吸着能の相転移、つまり、測定対象ポリペプチドのピークが２本に分かれる現象が、検討に用いた全てのポリペプチドにおいて認められた。表１７に、各ポリペプチドがクロマトグラム上で１本のピークとして認められる溶液中最大有機溶媒（酢酸を含む）含量を示す（カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値はこの値をやや上回ると考えられる）。ただし、今回の検討では水−有機溶媒混合液（容積比＝９５：５）を測定した場合でもクロマトグラム上で１本のピークとして認められなかった場合、５％以下（＜５％）と表記した。
今回の結果から、ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移を引き起こす有機溶媒の強さは、ポリペプチドによってほとんど変わらず、アセトニトリル及びエタノールでほぼ等しく、次いでメタノールの順であった。一方、有機酸である酢酸が各ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移に与える影響の強さは、メタノールとほぼ同等もしくは若干弱いことが示唆された。また、これら溶液中最大有機溶媒含量と各ポリペプチドの保持時間との間に正の相関が認められたことから、ポリペプチドは、溶離液中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒及び有機酸によっても吸着能の相転移を引き起こすと予想された。従って、カラムに保持されたポリペプチドは、溶離液中に含まれる有機溶媒によって引き起こされる吸着能の相転移、つまり、カラム充填剤への吸着及び脱着を繰り返しながら溶出されていると考えられた。【０１２５】
【表１７】
0005144273.tif 000021
【０１２６】
実施例６（各ポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配のべき乗則）
＜試料調製＞
各ポリペプチド（表１の１８種の各ポリペプチド）原液（１００μＭ）１０μＬずつを、８２０μＬの酢酸−水（容積比４：１００）に添加し、ポリペプチド混合試料溶液（各１μＭ）を調製した。更に、その他９種のポリペプチド原液を酢酸−水（容積比４：１００）に添加することで、各ポリペプチドの濃度が１μＭとなるような別のポリペプチド混合試料溶液（各１μＭ）を調製した。ただし、オバルブミンの濃度は１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。【０１２７】
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１２８】
【表１８】
0005144273.tif 000022
【０１２９】
１μＭのポリペプチド混合試料溶液１０μＬをシステムに導入した。【０１３０】
＜結果＞
従来法（図１（Ａ））で、グラジエント勾配を０．５、１、２、４、６、８、１０％／ｍｉｎと変化させた時のポリペプチドの保持時間を測定した結果、カラムに保持されたポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間には、べき乗則が認められた（ただし、今回の測定条件下ではカラムにほとんど保持されないｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６）を除く）。例として、ウロコルチンの結果を図６に示す。このべき乗則に従って溶出されるポリペプチドの特徴は、グラジエント勾配を限りなく０％／ｍｉｎに近づけた場合（図６でｘ軸上を左に動いた場合）、その保持時間は限りなく無限大になる、つまり、ポリペプチドは溶出されないという点である。
次に、今回の測定条件下で、ポリペプチドＡが「カラム充填剤への吸着能の相転移」によって溶出されると仮定すると、グラジエント勾配に関わらず、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液中の有機溶媒組成は一定、つまり、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ａ及びＢの割合比は一定と考えられることから、測定システム全体のデッドボリューム及びポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ｂの割合％（ＶＢ）に関する式（３）及び（ｂ）が成り立つと考えられる。
今回の検討で、グラジエント勾配が４％／ｍｉｎ、６％／ｍｉｎ及び８％／ｍｉｎの場合に得られた各ポリペプチドの保持時間を用いて、式（３）から測定システム全体のデッドボリュームを算出した結果を表１９に示す。グラジエント勾配に関わらず、各ポリペプチドのデッドボリュームはほぼ３分で一定であり、かつ、ポリペプチドによらないことが示された。なお、分子量が小さくなるにつれて、デッドボリュームが若干大きくなる傾向が認められるが、これは、これらのペプチドがよりカラム細孔の内部まで到達できることによるものと考えられた。
続いて、実施例５の検討に用いた２７種のポリペプチドに関して、式（ｂ）から各ポリペプチドが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ｂの割合％（ＶＢ）を算出した後、各ポリペプチドが溶出される瞬間の溶離液に含まれる各有機溶媒の含量を算出し、その各有機溶媒含量を式（ａ）に代入して算出した値ｆを算出した結果を表２０に示す。なお、計算に用いた臨界有機溶媒含量（％）は、実施例５での臨界値を下回る最大有機溶媒含量（％）とピークが２本に分かれる最小有機溶媒含量（％）の中間値とした。ただし、臨界値を下回る最大有機溶媒含量（％）が５％以下の場合は、そのまま５％とした。計算の結果、各ポリペプチドはｆがほぼ１となる溶離液中に存在して溶出されていることが示された。ペプチドの中には、ｆ値が１．３０〜２．０３と１から大きく外れている場合も存在したが、これらのほとんどが、実施例５で臨界値を下回る最大有機溶媒含量（％）が５％以下を示したポリペプチドであり、式（ａ）において用いられている臨界有機溶媒含量（％）の１％の差の影響が大きいためであると考えられた。
以上の結果から、一般的にポリペプチドは、溶離液に含まれる各有機溶媒によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によってカラムから溶出されており、ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移と溶離液に含まれる各有機溶媒との関係は、実施例３で示した「複数の有機溶媒を含む試料中におけるポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移と各有機溶媒含量との関係を表す式（ａ）」と同様であることが示唆された。【０１３１】
従来システムとある２種の移動相（水系移動相Ａと有機溶媒移動相Ｂ）を用いてポリペプチドＡを測定した場合、ポリペプチドＡが「カラム充填剤への吸着能の相転移」によって溶出されると仮定すると、グラジエント勾配に関わらず、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液中の全有機溶媒含量が一定、つまり、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ａ及びＢの割合比は一定と考えられることから、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ｂの割合％（ＶＢ）に関して下記式が成り立つ。
Ｖ１＝Ｃｂ＋（Ｔ１−ｔ０）・ｒ１
Ｖ２＝Ｃｂ＋（Ｔ２−ｔ０）・ｒ２
Ｃｂ：初期測定条件での移動相Ｂの割合％
ｒ１及びｒ２：グラジエント勾配（％／ｍｉｎ）
Ｔ１：グラジエント勾配ｒ１で測定した時のポリペプチドＡの保持時間
Ｔ２：グラジエント勾配ｒ２で測定した時のポリペプチドＡの保持時間
ｔ０：デッドボリューム（カラムの空隙率とＨＰＬＣシステムのインジェクターより先の空隙の和を流速で除した値）（分）
Ｖ１＝Ｖ２とすると、
デッドボリュームｔ０は、【０１３２】
【数４】
0005144273.tif 000023
【０１３３】
更に、ポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ｂの割合％（ＶＢ）は、初期有機溶媒移動相Ｂの割合％  Ｃｂ＝０の場合、
ＶＢ＝（Ｔ１−ｔ０）・ｒ１
ＶＢ＝（Ｔ２−ｔ０）・ｒ２
の両辺を加えた
２ＶＢ＝（Ｔ１−ｔ０）・ｒ１＋（Ｔ２−ｔ０）・ｒ２
に、デッドボリュームｔ０（式（３））を代入した結果、【０１３４】
【数５】
0005144273.tif 000024
となる。【０１３５】
【表１９】
0005144273.tif 000025
【０１３６】
【表２０】
0005144273.tif 000026
【０１３７】
また、グラジエント勾配を０．５、１、２、４、６、８、１０％／ｍｉｎと変化させた場合に認められる、カラムに保持されたポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間のべき乗関数ｙ＝Ｂｘ−ｔ（ｙ：保持時間、ｘ：グラジエント勾配、ｔ：べき指数、ただしｔ＞０）の近似曲線から得られた定数Ｂを表２１に示す（ただし、今回の測定条件下ではカラムにほとんど保持されないｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６）を除く）。グラジエント勾配が１％／ｍｉｎの場合（ｘ＝１）、べき指数ｔに関わらずｙ＝Ｂとなることから、定数Ｂは、グラジエント勾配が１％／ｍｉｎの際の保持時間を示すことが明らかであり、更に、グラジエント勾配１％／ｍｉｎの場合の保持時間は、ポリペプチドが溶出されるまでに溶離液中で増加した有機溶媒容積（保持時間×グラジエント勾配）と同等であると考えられる（ただし、デッドボリューム分の容積を含む）。今回の検討条件下では、測定開始時の有機溶媒の割合が、水系移動相Ａ中に含まれる容積比４％の酢酸のみであり、また、測定システム全体のデッドボリュームが約３分であることから、得られた定数Ｂは、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値（４％の酢酸含量とデッドボリュームの差である約１分の差が存在すると考えられる）を示していると考えられた。そこで、前述のポリペプチドＡが溶出される瞬間の溶離液を構成する移動相Ｂの割合％（ＶＢ）と比較したところ、ほぼ一致する結果が得られた。
よって、今回の結果から、測定開始時の有機溶媒含量を０％、グラジエント勾配を１％／ｍｉｎとして測定して得られた保持時間が、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示していることが示された。よって、各ポリペプチドの単独有機溶媒によって引き起こされる相転移の臨界値（含量）を求めるにあたって、実施例１〜５で行ったような、測定対象ポリペプチドのピークが２本に分かれる現象を確認するような煩雑な測定を実施しなくとも、単独の有機溶媒を有機溶媒系移動相として用いて１回測定することで、各ポリペプチドの相転移臨界値の近似値を得ることが可能であると考えられた。この測定方法では、複数のポリペプチドを添加した試料を測定することが可能であり、結果、複数のポリペプチドの相転移臨界値を同時に測定することが可能であると考えられた。【０１３８】
【表２１】
0005144273.tif 000027
【０１３９】
実施例７（グラジエント勾配１％／ｍｉｎで測定した時の各ポリペプチドの保持時間と相転移臨界値との関係）
＜試料調製＞
各ポリペプチド（表１の１８種の各ポリペプチド）原液（１００μＭ）１０μＬずつを、８２０μＬの酢酸−水混合液（容積比４：１００）に添加し、ポリペプチド混合試料溶液（各１μＭ）を調製した。更に、その他９種のポリペプチド原液を酢酸−水（容積比４：１００）に添加することで、各ポリペプチドの濃度が１μＭとなるような別のポリペプチド混合溶液（各１μＭ）を調製した。ただし、オバルブミンの濃度は１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。【０１４０】
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル混合液（容積比４：１００）、酢酸−メタノール混合液（容積比４：１００）、酢酸−エタノール混合液（容積比４：１００）、又は１００％酢酸カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１４１】
【表２２】
0005144273.tif 000028
【０１４２】
１μＭのポリペプチド混合試料溶液１０μＬをシステムに導入した。【０１４３】
＜結果＞
従来法（図１（Ａ））を用い、今回用いた測定条件下で得られるグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の各保持時間は、実施例６で述べた通り、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示すことが示唆された。そこで、移動相Ｂの有機溶媒の種類を変更し、グラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の各ポリペプチドが示す保持時間を、実施例５でピークが２本に分かれる現象から推定された相転移臨界値範囲と比較したところ、予想通り、得られた保持時間の大部分が推定臨界値範囲内に存在しており、ほぼ同じ傾向を示していた（表２３）。従って、ポリペプチド溶液中の有機溶媒含量の変化によって惹起される吸着能の相転移と溶離液中の有機溶媒含量の変化によって惹起される吸着能の相転移は同質であることが示唆された。
今回の検討では、測定開始時に水系移動相に容積比約４％の酢酸が含まれていることと、検出される保持時間には約３分のデッドボリュームが含まれていることから、保持時間の短いポリペプチドでは、得られた値の取扱いに若干注意が必要であるが、今回用いたような測定条件下での保持時間から各有機溶媒が示す臨界値を推定する方法は、測定回数や、試料調製等の点で、ピークが２本に分かれる現象から推定する方法より簡便で正確であると考えられた。【０１４４】
【表２３】
0005144273.tif 000029
【０１４５】
実施例８（ポリペプチドの保持時間に与えるカラム固定相の影響）
＜試料調製＞
各ポリペプチド（表１の１８種の各ポリペプチド）原液（１００μＭ）１０μＬづつを、８２０μＬの酢酸−水混合液（容積比４：１００）に添加し、ポリペプチド混合試料溶液（各１μＭ）を調製した。【０１４６】
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８及びＣ３０逆相カラム
（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ８−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００ＯＤＳ−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１４７】
【表２４】
0005144273.tif 000030
【０１４８】
１μＭのポリペプチド混合試料溶液１０μＬをシステムに導入した。【０１４９】
＜結果＞
各ポリペプチドの保持時間に与えるカラム固定相の影響を検討した結果、各ポリペプチドは、Ｃ４カラムを用いた場合に最も短い保持時間を示したが、カラム固定相によらずほぼ一定の保持時間を有していることが示された（表２５）。今回の結果から、ポリペプチドの溶出が、低分子化合物の主要な分離要因であるカラム固定相との疎水性相互作用よりも、移動相中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒（有機酸を含む）によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によって大きく影響を受けていることが示唆された。【０１５０】
【表２５】
0005144273.tif 000031
【０１５１】
実施例９（ポリペプチドの保持時間に与えるカラム温度の影響）
＜試料調製＞
各ポリペプチド（表１の１８種の各ポリペプチド）原液（１００μＭ）１０μＬづつを、８２０μＬの酢酸−水混合液（容積比４：１００）に添加し、ポリペプチド混合試料溶液（各１μＭ）を調製した。【０１５２】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
カラム：Ｃ４逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：２０、３０、４０又は５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１５３】
【表２６】
0005144273.tif 000032
【０１５４】
１μＭのポリペプチド混合試料溶液１０μＬをシステムに導入した。【０１５５】
＜結果＞
一般的に、低分子化合物の測定においては、カラム温度を低くするにつれて低分子化合物とカラム固定相との疎水性相互作用が強くなり、保持時間がかなり長くなる。しかし、今回検討に用いた各ポリペプチドでは、より低いカラム温度でより長い保持時間を示したが、その差はほとんどの場合で小さかった（表２７）。今回の結果から、ポリペプチドの溶出は、移動相中に含まれるアセトニトリル等の有機溶媒（有機酸を含む）によって引き起こされる「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」によって大きく影響を受けると考えられた。一方、カラム温度を変化させることによっても「ポリペプチドのカラム充填剤への吸着能の相転移」を引き起こすことが可能と考えられたが、試料溶液中又は移動相中のアセトニトリル等の有機溶媒が与える影響と比較すると極めて小さいと考えられた。【０１５６】
【表２７】
0005144273.tif 000033
【０１５７】
実施例１０（ウロコルチン試料測定時の従来システムと本発明システムとの精度比較）
＜試料調製＞
ウロコルチン原液（１００μＭ）１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１μＭ）を調製した。更に、このウロコルチン試料溶液１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：１００：０、４：８０：２０、４：７０：３０、４：６０：４０、４：５０：５０、４：４０：６０又は４：２０：８０）に添加し、ウロコルチン試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。更に、同じ組成の水−アセトニトリル混合液を用いて１０倍の希釈系列のウロコルチン試料溶液（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）を調製した。【０１５８】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
移動相Ｃ：酢酸
カラム：Ｃ３０逆相カラム（ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３：内径２．０ｍｍ、長さ３５ｍｍ、粒子径３μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１５９】
【表２８】
0005144273.tif 000034
【０１６０】
新規法を用いる場合にあたって、各移動相組成、ポリペプチドが導入されるライン中の移動相を形成する有機溶媒系移動相（移動相Ｂ及びＣの混合溶液）の測定開始時の混合比、及び、各ポリペプチドを含む試料中有機溶媒含量から、混合器において混合される有機溶媒系移動相に対する水系移動相の比率（α）を、前述の式（ａ）に基づいて算出した（表２９）。ただし、ウロコルチンの水−各有機溶媒における相転移臨界値は実施例７で得られた保持時間を用いた。今回の検討では、ウロコルチンを含む試料がカラムに導入されるまでの間の水系移動相の割合が９０％程度であり（表２８）、表２９に示されている５２％又は５７％よりも大きい割合を有していることから、システムに導入されたすべてのウロコルチンはカラムへ保持したと判断された。【０１６１】
【表２９】
0005144273.tif 000035
【０１６２】
アセトニトリル含量の異なる０．１ｎＭ、１ｎＭ及び１０ｎＭのウロコルチン試料溶液１００μＬ又は４００μＬを、システムに導入した。両システムの精度比較をするために、同じ組成及び濃度のウロコルチン試料溶液を合計３回測定し、得られたピーク面積の平均値、標準偏差及び変動係数（％）を算出した（日間変動）。【０１６３】
＜結果＞
従来法及び本発明法で同濃度（０．１ｎＭ、１ｎＭ及び１０ｎＭ）のウロコルチン試料を３回測定した場合のピーク面積、標準偏差及び変動係数（％）を表３０、３１及び３２に示す。【０１６４】
【表３０】
0005144273.tif 000036
【０１６５】
【表３１】
0005144273.tif 000037
【０１６６】
【表３２】
0005144273.tif 000038
【０１６７】
従来法を用いた場合、ウロコルチンのピーク面積の変動係数（％）は、注入量及びウロコルチン濃度に関わらずほとんどの場合で１５％以上を示しバラツキが大きかった。一方、本発明法を用いた場合、容積比３０％以上のアセトニトリルを含む試料溶液中に含まれるウロコルチンのピーク面積の変動係数（％）は、ウロコルチン濃度及び注入量に関わらず１５％以内であり、この濃度範囲では容器等への吸着が起こっていない、もしくは検討した濃度範囲では問題とならない程度であると考えられた。試料溶液中アセトニトリル含量が容積比０％及び２０％の場合、変動係数％が１５％以上を示すことが多く、容器及び注入用シリンジ等への吸着が原因と考えられるバラツキが示唆された。【０１６８】
以上の結果から、ウロコルチンの容器及び注入用シリンジ等への吸着能は、ウロコルチンのカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値よりも弱いと考えられ、その結果、カラム充填剤への吸着能の相転移臨界値を上回るアセトニトリル含量を有する試料溶液中に含まれるウロコルチンのピーク面積は、従来法よりも本発明法にてバラツキが小さく、精度の点で本発明法が優っていると考えられた。【０１６９】
次に、ＬＣシステムへのウロコルチン試料溶液の注入量が１００μＬ及び４００μＬの時に得られたピーク面積の比（４００μＬ／１００μＬ）を表３３に示す。【０１７０】
【表３３】
0005144273.tif 000039
【０１７１】
従来法を用いて、今回の条件下では容器等への吸着が起こらないと考えられる容積比３０％以上のアセトニトリルを含む試料溶液を測定した場合、理論上４を示すピーク面積比は、１．０〜６．６の値を示し、理論値からの大きなバラツキが認められた。【０１７２】
一方、容器等への吸着が起こらないと考えられる容積比３０％以上のアセトニトリルを含む試料溶液を本発明法にて測定した場合、アセトニトリル含量及びウロコルチン濃度に関わらず、３．５〜４．１の値を示し、ほぼ注入量に比例した結果が得られた。試料溶液中のアセトニトリル含量が容積比０又は２０％の場合は、本発明法を用いたとしてもピーク面積比は１．０〜３．９の値を示し、大きなバラツキが認められた。【０１７３】
以上の結果から、従来法及び本発明法共に、注入量増加による高感度化の可能性が示されたが、従来法では、試料溶液中アセトニトリル含量によって、その増加率が影響を受けることが示された。また、従来法にて０．１ｎＭのウロコルチン試料を測定した場合のピーク面積／高さ比が、注入量増加に伴って大きくなる傾向が認められた。ピーク面積／高さ比は、ウロコルチンのピーク形状が三角形であると仮定した場合、ピーク高さ１／２でのピーク幅に相当すると考えられることから、この結果は、ウロコルチンのピーク幅が広がったことを示していると考えられた（表３４）。よって、従来法では、注入量増加に比例した高感度化が困難であると考えられた。一方、本発明法を用いて、容積比３０％以上のアセトニトリル（容器等への吸着を起こさないアセトニトリル含量）を含む試料溶液を測定した場合、注入量に比例したピーク面積増加が認められた。この時、ピーク面積／高さ比は注入量に関わらず、ほぼ一定の値を示していることから、注入量を増加させることによって、注入量に比例した高感度化が可能であることが示された。また、この高感度化は試料溶液中のアセトニトリル含量に関わらず可能であることから、アセトニトリル以外の因子によってカラム充填剤への吸着能の相転移臨界値が影響を受けた場合でも、本発明法を用いることによりウロコルチンのピーク面積が一定に保たれることが予想されることから、本発明システムは従来法と比較して堅牢性が高いことが示された。更に、今回の結果は、相転移理論から予測される、新規法を用いた場合の試料注入量が無制限（注入時間やカラム負荷量を考慮しない場合）であることを支持するものと考えられた。【０１７４】
【表３４】
0005144273.tif 000040
【０１７５】
実施例１１（ウロコルチンの検量線作成における両システムの比較）
＜試料調製＞
ウロコルチン濃度が１０、３０、１００、３００ｐＭ、１、３及び１０ｎＭの検量線試料を、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：１００：０、４：８０：２０、４：７０：３０、４：６０：４０、４：５０：５０、４：４０：６０又は４：２０：８０）を用いて調製した。【０１７６】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
移動相Ｃ：酢酸
カラム：Ｃ３０逆相カラム（ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３：内径２．０ｍｍ、長さ３５ｍｍ、粒子径３μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１７７】
【表３５】
0005144273.tif 000041
【０１７８】
新規法を用いる場合にあたって、各移動相組成、ポリペプチドが導入されるライン中の移動相を形成する有機溶媒系移動相（移動相Ｂ及びＣの混合溶液）の測定開始時の混合比、及び、各ポリペプチドを含む試料中有機溶媒含量から、混合器において混合される有機溶媒系移動相に対する水系移動相の比率（α）を、前述の式（ａ）に従って算出した（表３６）。ただし、ウロコルチンの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例７で得られた保持時間を用いた。今回の検討では、ウロコルチンを含む試料がカラムに導入されるまでの間の水系移動相の割合が９０％程度であり（表３５）、表３６に示されている４７％又は５７％よりも大きい割合を有していることから、システムに導入されたすべてのウロコルチンはカラムへ保持したと判断された。【０１７９】
【表３６】
0005144273.tif 000042
【０１８０】
ただし、今回用いた本開発システムでは、０．１分から８分までの間、流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。
本発明法及び従来法を用いて、１０、３０、１００、３００ｐＭ、１、３及び１０ｎＭの検量線試料を測定し、検量線の作成を行った。検量線は、低分子化合物定量法バリデーション（非特許文献４）のガイドラインの基準に従い、検量線各点を自身の検量線にてｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅした値の真度を求め、検量線作成に用いた検量線サンプル数の７５％以上の検量線サンプルにおいて、定量下限で±２０％、その他で±１５％以内となることを、検量線作成の基準とした。ただし、検量線の定量下限及び定量上限は必ず基準を満たすものとする。検量線の重み付けは濃度２乗分の１とし、最も定量下限の低い検量線を作成した。真度の算出方法は下記の通りである。【０１８１】
【数６】
0005144273.tif 000043
【０１８２】
＜結果＞
従来法及び本発明法で作成した検量線を表３７及び表３８に示す。【０１８３】
【表３７】
0005144273.tif 000044
【０１８４】
【表３８】
0005144273.tif 000045
【０１８５】
その結果、従来法を用いた場合、基準を満たす検量線は、試料溶液中アセトニトリル含量が５０％の場合を除き作成可能であった（表３７）。このとき得られた定量下限は３０ｐＭ〜３００ｐＭであった。しかし、アセトニトリル含量が０％のウロコルチン試料を測定した場合、検量線として用いることができる濃度は４点しか存在しなかったことに加えて、検量線中に真度が基準を満たさない１点を含む場合も多かったことから、従来法を用いた検量線の作成が困難であると示唆された。一方、本発明法を用いた場合、アセトニトリル含量が容積比３０％以上のウロコルチン試料を測定して作成した基準を満たす検量線は、１０ｐＭ〜１０ｎＭと広範囲の濃度範囲を有しており、その時の真度はすべて±１５％以内であった（表３８）。また、得られた検量線の傾きもほぼ同じ値を示していたことから、本発明法は、従来法と比してより高感度かつ精度のよい定量が可能であると考えられた。【０１８６】
また、図７に示す通り、従来法を用いて測定した時のウロコルチンのピーク形状は、試料溶液中のアセトニトリル含量が容積比３０％以上の場合に立ち上がりの鋭いピークが得られたが、容積比４０％以上のアセトニトリルを含む試料溶液を測定した場合、そのピークはリーディングしており、ベースライン近傍ではブロードになっているのが観察された。一方、本発明法を用いて測定したウロコルチンのピーク形状は、試料溶液中のアセトニトリル含量に関わらず、立ち上がりの鋭いピークが得られており、このピーク形状の違いも、検量線作成時の精度に影響を与えていると考えられた。【０１８７】
以上の結果から、本発明法にて、容器等への吸着を起こさせないアセトニトリルを含む試料を測定することにより、高い精度を有するポリペプチドの定量が可能であると考えられた。また、その精度の高さから本発明法を用いた場合に、より高感度な定量（検量線の定量下限が低い）が可能であると考えられた。【０１８８】
実施例１２（本発明システムを用いたポリペプチド検量線の作成）
＜試料調製＞
表１の１８種のポリペプチドのうち、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−２８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）及びｉｎｓｕｌｉｎを除く１２種ポリペプチド原液（１００μＭ）１０μＬを、９９０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、各ポリペプチド試料溶液（１μＭ）を調製した。更に、この各ポリペプチド試料溶液１０μＬを、９９０μＬの容積比４％の酢酸を含む９９０μＬの水−アセトニトリル混合液（容積比１：１）に添加し、各ポリペプチド試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。更に、同組成の溶液を用いて１０、３０、１００、３００ｐＭ、１及び３ｎＭの検量線用試料を調製した。【０１８９】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比７０：１５：１５）
カラム：Ｃ３０逆相カラム（ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−５：内径２．０ｍｍ、長さ３５ｍｍ、粒子径５μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１９０】
【表３９】
0005144273.tif 000046
【０１９１】
新規法を用いる場合にあたって、各移動相組成、及び、各ポリペプチドを含む試料中有機溶媒含量から、混合器において混合される有機溶媒系移動相に対する水系移動相の比率（α）を、前述の式（ａ）に従って算出した（表４０）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例７（Ｃ４カラムを用いた検討）で得られた保持時間を用いた。【０１９２】
【表４０】
0005144273.tif 000047
【０１９３】
各ポリペプチド試料溶液１００μＬを本開発システムに導入した。検量線は、バリデーションのガイドラインの基準に従い、検量線各点を自身の検量線にてｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅした値の真度を求め、定量下限で±２０％、その他で±１５％以内となる検量線を作成した。ただし、検量線に用いた点のうち、７５％以上の点が基準を満たし、かつ、定量下限及び定量上限は必ず基準を満たすものとした。検量線の重み付けは濃度２乗分の１とした。【０１９４】
＜結果＞
実際に各ポリペプチド試料を測定したところ、ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチドについては検量線が作成できなかったが、その他のポリペプチドでは、定量下限が１０ｐＭ又は３０ｐＭの検量線が作成できた（表４１）。各検量線から求められたサンプル濃度の真度は、前項で述べた±１５％（定量下限±２０％）の基準を満たしていた。各ポリペプチドの定量下限のクロマトグラムを図８−１，図８−２に示す。ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチドとをカラムに保持させるのに最低限必要な水系移動相の割合％に、９４％を境に明確な差その他のポリペプチドの間には、本発明法を用いて各ポリペプチドが認められた。従って、ノシセプチンとミッドカインのアミノ酸配列第６０番目から第１２１番目からなるポリペプチドの検量線が作成できなかった原因として、今回用いた測定条件下ではこれらポリペプチドのカラムへの保持が不十分であり、カラムに十分保持させるためには今回用いた測定条件より水系移動相の割合を大きくすることが必要と考えられた。【０１９５】
【表４１】
0005144273.tif 000048
【０１９６】
今回得られた定量下限は、試料注入量として１００μＬを用いた結果であり、試料注入量を１ｍＬに増加することで、１０倍の高感度化が可能である。また、今回測定に用いたＭＳ／ＭＳ装置（ＡＰＩ３６５）は、現在の最新型ＭＳ／ＭＳ装置（ＡＰＩ５０００）と比較すると、５０倍以上の感度の違いがあると言われている。以上のことから、試料注入量及び装置の変更により、さらなる高感度化、つまり、数ｐＭ〜ｆＭでの定量が可能であると考えられ、免疫学的手法に匹敵もしくは凌駕する感度が得られると考えられた。【０１９７】
実施例１３（多検体同時定量における両システムの比較）
＜試料調製＞
前述の１８種の各ポリペプチド原液（１００μＭ）１０μＬずつを、下記溶液（Ａ）〜（Ｄ）９．８２ｍＬにそれぞれ添加し、ポリペプチド混合試料溶液（１００ｎＭ）を調製した。
（Ａ）水
（Ｂ）酢酸−水（４：９６，ｖ／ｖ）
（Ｃ）酢酸−水−アセトニトリル（４：６６：３０，ｖ／ｖ／ｖ）
（Ｄ）酢酸−水−アセトニトリル（４：４６：５０，ｖ／ｖ／ｖ）
更に、このポリペプチド混合試料溶液１００μＬを、同じ組成の溶液９００μＬに添加し、ポリペプチド混合試料溶液（１０ｎＭ）を調製した。更に、同様の操作にて、１ｎＭのポリペプチド混合試料溶液を調製した。【０１９８】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水混合液（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル−メタノール混合液（容積比４：５０：５０）
移動相Ｃ：酢酸
カラム：Ｃ３０逆相カラム（ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３：内径２．０ｍｍ、長さ３５ｍｍ、粒子径３μｍ）
カラム温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０１９９】
【表４２】
0005144273.tif 000049
【０２００】
各ポリペプチド混合試料溶液１００μＬを両システムに導入した。【０２０１】
＜結果＞
従来法を用いてアセトニトリル含量が３０％もしくは５０％のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、ポリペプチド濃度に関わらずポリペプチド１８種全てはカラムにほとんど保持されなかった（図９のＣ及びＤ）。一方、従来法を用いてアセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、すべてのポリペプチドはカラムに保持されたが、濃度の減少に伴い、保持の強いポリペプチドのピークが全く認められなくなった（図９のＡ及びＢ）。
次に、本発明法を用いてアセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合は、従来法とほぼ同様の結果が得られた（図１０のＡ及びＢ）。しかし、従来法では全てのポリペプチドはほとんどカラムに保持されなかったアセトニトリル含量３０％及び５０％のポリペプチド混合試料溶液を、本発明法にて測定した場合、１ｎＭの低濃度試料においても、保持の強いポリペプチドのピークが認められ、その大きさは、ほぼ濃度に比例していた（図１０のＣ及びＤ）。【０２０２】
この時、吸着のほとんど認められない例としてイソロイシル−セリル−ブラジキニンを、保持が強く吸着の影響が大きい例としてウロコルチンのピーク面積を図１１に示した。
イソロイシル−セリル−ブラジキニンのピーク面積は、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、従来法及び本発明法共に同じ値を示した。一方、アセトニトリル含量が３０％及び５０％のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、従来法ではピーク面積の減少が認められたが、本発明法を用いた場合、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合と同様のピーク面積が得られた。従来法でのピーク面積が小さくなった原因としては、試料溶液中に含まれる臨界値以上のアセトニトリルにより、カラム充填剤への吸着能を失ったままカラムに導入されたイソロイシル−セリル−ブラジキニンのほとんどがカラムを素通りしたためであると考えられた。イソロイシル−セリル−ブラジキニンは、今回検討したポリペプチドの中では、カラムでの保持が比較的弱いポリペプチドであり、低濃度での容器等への吸着が比較的小さいと考えられた。
次に、従来法を用いて、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合のウロコルチンのピーク面積は、濃度の減少に伴い極端に小さくなった。特に水だけを用いて調製した混合試料を測定した場合、１００ｎＭ以外ではピークが認められなかった。この原因としては、希釈系列調製時の容器等への吸着及びＬＣ導入時のシリンジへの吸着により、ウロコルチンのほとんどが失われたと考えられた。アセトニトリル含量が３０％及び５０％のポリペプチド混合試料溶液（１００ｎＭ）を測定した場合、そのピーク面積は、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合と比較すると小さかったが、より低濃度（１ｎＭ及び１０ｎＭ）測定時にもウロコルチンのピークは認められ、しかも、ピーク面積はほぼ濃度に比例していた。
本発明法を用いて、アセトニトリルを含まないポリペプチド混合試料溶液を測定した場合のウロコルチンのピーク面積は、従来法同様、濃度の減少に伴い極端に小さくなった。しかし、アセトニトリル含量が３０％及び５０％のポリペプチド混合試料溶液を測定した場合、ウロコルチンのピーク面積は、従来法にて得られたピーク面積よりも大きく、かつ、濃度に比例していた。
以上の結果から、溶液中のポリペプチドが固体への吸着能を失った状態（例えば、臨界値以上のアセトニトリル含量を含む溶液中）で扱うことにより、低濃度でのポリペプチドの吸着を回避することが可能であることが示された。また、この状態の試料溶液を本発明法を用いて測定することにより、複数のポリペプチドを同時定量することが可能であることが示された。【０２０３】
実施例１４（ＣＤスペクトル解析）
＜試料調製＞
４．０ｍＬの水−アセトニトリル（容積比９０：１０，８０：２０，７０：３０，６０：５０又は５０：５０）溶液に０．１１ｍｇのウロコルチンを溶解して、５．９μＭのウロコルチン溶液（Ｅ）を調製した。
一方、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ２５ｍｇを水２．５ｍＬに溶解し、７．９ｍＭの保存溶液を調製した。この溶液４０μＬを、４．０ｍＬの水−アセトニトリル（容積比１００：０，９５：５，９０：１０，８５：１５又は８０：２０）に添加し、７９μmＭの溶液を調製した。【０２０４】
＜測定条件＞
Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ及びｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの２５０−２００ｎＭのＣＤスペクトルを得るために、試料を１０ｍｍ角型石英セル（ＪＡＳＣＯ；東京）に移し、Ｊ−７２０型円二色性分散計（ＪＡＳＣＯ；東京）を用いた。各試料とも６回測定（ｓｔｅｐ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｎｍ，１ｓ  ｅａｃｈ  ｓｔｅｐ）し、その平均化したスペクトルを得た。【０２０５】
＜結果＞
アセトニトリル含量の異なるウロコルチン溶液のＣＤスペクトルを図１２に示す。ＣＤスペクトルは、いずれの測定温度においても、溶液中アセトニトリル含量が１０％から４０％まで増加すると共に、２００−２４０ｎＭのスペクトル強度が大きく減少しており、特に、２２２ｎＭ付近のスペクトル強度の減少から、ウロコルチンはヘリックスな構造を取っていると考えられた。一方で、溶液中アセトニトリル含量が４０％から５０％まで増加しても、ＣＤスペクトルに大きな変化は認められなかった。このアセトニトリル含量４０％以上における変化は、実施例１で認められた保持時間１．５分のピークの出現と相関していると考えられた。従って、ウロコルチンの吸着能の相転移は、アセトニトリルを含めた様々な有機溶媒によってウロコルチンの立体構造が変化することに伴って引き起こされていると推察された。【０２０６】
一方、アセトニトリル含量の異なるｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ溶液のＣＤスペクトルを図１３に示す。全体的に大きな変化がないように見えるが、２２０−２４０ｎｍ付近のスペクトルに注目すると、そのスペクトル強度は溶液中アセトニトリル含量の増加と共に減少していた。特に、２２２ｎｍのスペクトル強度の減少から、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎが、アセトニトリル含量の増加に伴い、よりヘリックス構造を取っていることが示唆された。また、４０℃では、アセトニトリル含量が１５％から２０％に増加しても、スペクトルに大きな変化は認められなかった。この４０℃での結果は、実施例７で得られたグラジエント勾配が１％／ｍｉｎの時の保持時間から推定したアセトニトリルが示す臨界含量、約１２％とほぼ一致していると考えられた。従って、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｓｅｒｙｌ−ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの吸着能の相転移も、アセトニトリルを含めた様々な有機溶媒によって引き起こされる立体構造変化に起因することが推察された。【０２０７】
これらの結果から、逆相ＨＰＬＣにおけるポリペプチドの溶出は、グラジエント溶出時の溶離液中有機溶媒含量の変化によって惹起される立体構造変化に伴うポリペプチドの吸着能の相転移により制御されていると考えられた。【０２０８】
実施例１５（クロモリスカラム使用時の各ポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配のべき乗則）
＜試料調製＞
１００μＭの２０種ポリペプチド原液１０μＬづつ、１０μＭ及び１０ｍｇ／ｍＬの４種ポリペプチド原液１００μＬづつ、［Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）４］−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  及びｏｖａｌｂｕｍｉｎ（３２３−３３９）原液（各１ｍＭ）を水にて１０倍希釈した溶液（１００μＭ）１０μＬづつ、及び、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ原液（５０ｍＭ）を水にて５０倍希釈した後に更に水で１０倍希釈した溶液（１００μＭ）１０μＬを１本のエッペンドルフチューブに集め、更に３７０μＬの水に添加して、最終濃度が各１μＭ（ただしオバルブミンの濃度は１ｍｇ／ｍＬ）となるような２７種ポリペプチド混合試料溶液を調製した。【０２０９】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：酢酸−アセトニトリル（容積比４：１００）、酢酸−メタノール（容積比４：１００）、酢酸−エタノール（容積比４：１００）、酢酸−イソプロピルアルコール（容積比４：１００）、又は１００％酢酸
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径３．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０２１０】
【表４３】
0005144273.tif 000050
【０２１１】
２７種ポリペプチド混合試料溶液１０μＬをシステムに導入した。【０２１２】
＜結果＞
従来法（図１（Ａ））で、グラジエント勾配を０．５、１、２、４、６、８、１０％／ｍｉｎと変化させた時のポリペプチドの保持時間を測定した結果、検討に用いた分子量１００７から４５ｋＤの全てのポリペプチドについて、移動相に用いた有機溶媒の種類に関わらず、カラムに保持されたポリペプチドの保持時間とグラジエント勾配との間に良好なべき乗則が認められた（表４４）。【０２１３】
【表４４】
0005144273.tif 000051
【０２１４】
今回、カラム温度が６０℃であったにも関わらず、ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６）は今回用いたカラムＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅに十分保持された結果、保持時間とグラジエント勾配との間に良好な相関係数を示すべき乗則が認められた。一方、ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−１６）は、実施例６で用いたＣ４カラムＤｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５にカラム温度が５０℃の場合でもほとんど保持されず、良好な相関係数を示すべき乗則を確認できなかった。実施例８（カラム固定相の影響）及び実施例９（カラム温度の影響）の結果、及び、初期測定条件下（１００％移動相Ａ＝酢酸−水（容積比４：１００）、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ）でのＤｅｖｅｌｏｓｉｌ３００Ｃ４−ＨＧ−５が示すカラム圧（約２．１ＭＰａ；５０℃）及びＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅが示すカラム圧（約０．５ＭＰａ；６０℃）を考慮すると、この保持の差は、カラム固定相及び温度の違いによるものではなく、測定時のカラム圧の違いが原因であると考えられた。従って、これまでに得られた知見を考慮すると、低カラム圧ではカラム充填剤に対して吸着能を示しているポリペプチドは、ある一定以上のカラム圧がかかった場合に、その高次構造をより小さい臨界値を示す高次構造（もしくは吸着能を示さない高次構造）に変化させ得ると考えられた。そのために、低カラム圧条件下でカラムに保持されて臨界値を示す溶離液（ｆ＝１）中に溶出されていたポリペプチドが、高カラム圧の条件下ではその臨界値以下（ｆ＜１）を示す溶離液中に溶出されていると考えられた。【０２１５】
Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅは、カラム骨格と流路が一体となったシリカロッドタイプのカラム（クロモリス型カラム）であり、従来の粒子充填型カラムと比較して、同じ測定条件下で低カラム背圧を可能しており、今回の結果からもその低カラム背圧が確認された。このように、クロモリス型カラムは、粒子充填型カラムを用いた場合のカラム圧によってより小さい臨界値を示す高次構造（もしくは吸着能を示さない高次構造）に変化し得るポリペプチドに対しても、その低カラム背圧により十分にカラムに保持させ得ると考えられ、このようなポリペプチドの定量分析において有効であると考えられた。【０２１６】
一方、実施例６と同様に、グラジエント勾配が４％／ｍｉｎ、６％／ｍｉｎ及び８％／ｍｉｎの場合に得られた各ポリペプチドの保持時間を用いて、式（３）から測定システム全体のデッドボリュームを算出した結果（平均値±ＳＤ）を表４５に示す。移動相Ｂに用いた有機溶媒の種類及びグラジエント勾配に関わらず、デッドボリュームはほぼ一定であり、かつ、ポリペプチドによらないことが示された。ただし、ポリペプチドの分子量が大きくなるにつれて、デッドボリュームが若干小さくなる傾向が認められた。これは、小さな分子量のポリペプチドが、より深くカラム細孔内に入り込んでいることを示唆していると考えられた。【０２１７】
【表４５】
0005144273.tif 000052
【０２１８】
続いて、グラジエント勾配を１％／ｍｉｎで測定して得られた各ポリペプチドの保持時間を表４６に示す。実施例６及び７で述べた通り、グラジエント勾配を１％／ｍｉｎで測定して得られた各ポリペプチドの保持時間は、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示していると考えられる。ただし、測定開始時に水系移動相に４％程度の酢酸が含まれていることと、検出される保持時間には約４分程度のデッドボリュームが含まれていることから、保持時間の短いポリペプチドでは、得られた値の取扱いに若干注意が必要である。【０２１９】
【表４６】
0005144273.tif 000053
【０２２０】
このクロモリス型カラムを用いて得た保持時間を、粒子充填型カラムを用いて得られた保持時間（実施例７）とを比較したところ、保持の小さい、つまり臨界値の小さいポリペプチドにおいて、デッドボリュームの違い及びカラム背圧の違いが原因と考えられる比較的大きな差が認められたが、ウロコルチンのようにカラムに十分保持されているポリペプチドでは、ほぼ同じ値を示していた。従って、保持時間の短いポリペプチドについては、得られた値の取扱いに若干注意が必要であるものの、実施例７で述べた通り、グラジエント勾配を１％／ｍｉｎで測定して得られた各ポリペプチドの保持時間は、各ポリペプチドの相転移臨界値である有機溶媒含量の近似値を示していると考えられた。【０２２１】
実施例１６（血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ定量のためのマウス血漿前処理法の検討：有機溶媒による除タンパク質前処理法）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。更に、このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）２００μＬを３００μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各４００ｎＭ）を調製した。【０２２２】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）１０μＬを、４９０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。【０２２３】
＜メタノール及びアセトニトリルによる除タンパク質法＞
ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１００μＬを、４００μＬのアセトニトリル又はメタノールに添加し、攪拌後、２０，０００×ｇで１５分間（４℃）遠心し、上清を得た。【０２２４】
＜マウス血漿試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を用いて得られた上清をマウス血漿試料とした。【０２２５】
＜リファレンス試料の調製＞
ブランクマウス血漿を用いて得られた上清９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各４００ｎＭ）１０μＬを添加し、リファレンス試料（各４ｎＭ）を調製した。【０２２６】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（容積比４：１００）
移動相Ｂ：１００％酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−アセトニトリル−メタノール（容積比２０：４：４０：４０）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径３．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし、３０〜３９．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０２２７】
【表４７】
0005144273.tif 000054
【０２２８】
マウス血漿試料及びリファレンス試料５０μＬをシステムに導入した。【０２２９】
＜回収率の算出方法＞
各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比（％）とした。【０２３０】
＜結果＞
低分子化合物を分析する際に一般的に用いられているアセトニトリル又はメタノールを用いた除タンパク質前処理法にてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿を処理した場合、４種のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は表４８の通り低い値を示した。メタノールを用いた場合よりもアセトニトリルを用いた場合に回収率はより低くなり、特に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及び（１−４３）の回収率は０％を示した。この各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの低回収率の原因は、有機溶媒を用いた除タンパク質操作時にアルブミンにような高分子ポリペプチドの凝集過程に各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎが取り込まれたため、又は、これら高分子ポリペプチドと各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎとの共沈が原因と考えられた。従って、このような有機溶媒による除タンパク質法を用いたマウス血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの高感度定量は困難であると考えられた。【０２３１】
【表４８】
0005144273.tif 000055
【０２３２】
実施例１７（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ定量のためのマウス血漿前処理法の検討：酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法・酢酸含量の影響）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。更に、このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）５０μＬを４５０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）を調製した。【０２３３】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）１０μＬを、４９０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿試料（２０ｎＭ）を調製した。【０２３４】
＜酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法＞
水、ブランクマウス血漿又はａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）５０μＬに対して、９５０μＬの水−酢酸−メタノール（容積比２０：７０：１０、２０：６０：２０、２０：５０：３０、２０：４０：４０又は２０：３０：５０）を加え十分に攪拌した。その混合溶液４００μＬを市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。【０２３５】
＜マウス血漿試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を用いて得られたろ過液３００μＬに対して３００μＬの水−アセトニトリル（容積比２０：８０）を添加してマウス血漿試料を調製した。【０２３６】
＜リファレンス試料の調製＞
ブランクマウス血漿を用いて得られたろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）１０μＬを添加した。このろ過液（各１ｎＭ）３００μＬに対して３００μＬの水−アセトニトリル（容積比２０：８０）を添加してリファレンス試料（各０．５ｎＭ）を調製した。【０２３７】
＜コントロールろ過試料の調製＞
マウス血漿の代わりに水を用いて得られたろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）１０μＬを添加した。このろ過液（各１ｎＭ）３００μＬに対して３００μＬの水−アセトニトリル（容積比２０：８０）を添加してコントロールろ過試料（各０．５ｎＭ）を調製した。【０２３８】
＜コントロール試料の調製＞
水５０μＬを、９５０μＬの水−酢酸−メタノール（容積比２０：７０：１０、２０：６０：２０、２０：５０：３０、２０：４０：４０又は２０：３０：５０）に添加した後、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）１０μＬを添加した。更に、この溶液（各１ｎＭ）３００μＬに対して３００μＬの水−アセトニトリル（容積比２０：８０）を添加してコントロール試料（各０．５ｎＭ）を調製した。【０２３９】
＜測定条件＞
移動相Ａ：水
移動相Ｂ：酢酸−メタノール−アセトニトリル（容積比１０：４５：４５）
移動相Ｃ：水−酢酸−メタノール−アセトニトリル（容積比４０：２０：２０：２０）
カラム：ノンポーラスＣ３０逆相カラム（Ｎ．Ｐ．Ｃ３０−５：内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子経５μｍ：野村化学による特注カラム）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：【０２４０】
【表４９】
0005144273.tif 000056
【０２４１】
各コントロール試料、コントロールろ過試料、リファレンス試料及びマウス血漿試料４００μＬをシステムに導入した。【０２４２】
＜回収率の算出方法＞
前処理操作時に用いたバイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン通過時の各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの回収率（透過率）は、コントロール試料を測定した時に得られたピーク面積に対するコントロールろ過試料を測定した時に得られたピーク面積の比（％）とした。一方、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比（％）とした。【０２４３】
＜結果＞
実施例１６の結果から、アセトニトリル又はメタノール等の有機溶媒を用いてアルブミンのような高分子ポリペプチドを凝集させる一方で、目的とするポリペプチドを効率よく血漿から回収することは困難と考えられた。そこで、血漿中の高分子ポリペプチドを凝集させずに、かつ、目的のポリペプチドをＯＦＦ相とする前処理法として、酢酸と有機溶媒とを組み合わせた血漿希釈法を検討した。これは、高含量の酢酸を含む溶液中（血漿に対する希釈倍率にもよるが一般的に２０％程度以上）では、有機溶媒が含まれていても、血漿中ポリペプチドは凝集せず溶解した状態となるという新しい知見を基に考案した方法である。今回検討に用いた混合溶液にて希釈された血漿は、全て無色透明であり、血漿中ポリペプチドは凝集していないと考えられた。一方、血漿を水とみなした場合の希釈されたマウス血漿試料（＝ろ過液）中の酢酸及びメタノール含量から計算した値ｆから、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはその試料（＝ろ過液）中でカラム充填剤に対する吸着能を失っていることが示唆された（表５０）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例１５で得られたグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の保持時間を用いた。従って、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎは、試料調製時に接触するような容器等に対して吸着能を失っていると考えられることから、バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレンに対しても吸着能も失っていると予想された。【０２４４】
【表５０】
0005144273.tif 000057
【０２４５】
一方、本発明法を用いる場合にあたって、各移動相組成、及び、ポリペプチドが導入される有機溶媒系移動相（移動相Ｂ及びＣの混合溶液）の測定開始時の混合比、及び、各試料中有機溶媒含量から、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムへ保持させるのに必要な混合器において混合される有機溶媒系移動相に対する水系移動相の比率（α）を、前述の式（ａ）に従って算出した（表５１）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例１５で得られたグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の保持時間を用いた。システムに導入された全てのａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムへ保持させるのに必要な水系移動相の割合をαから算出した結果、６６％より大きいことが示された。今回の検討では、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎを含む試料がカラムに導入されるまでの間の水系移動相の割合が８８％程度であり、システムに導入された全てのａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはカラムへ保持したと判断された。【０２４６】
【表５１】
0005144273.tif 000058
【０２４７】
＜結果＞
実際に、各試料を測定した結果、ＯＦＦ相（ｆ＞１）を示す希釈されたマウス血漿試料（＝ろ過液）中に存在する各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのバイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレンからの回収率は、予想通りほぼ１００％±１５％であった（表５２）。従って、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎがＯＦＦ相（ｆ＞１）を示す溶液中でバイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレンに対しても吸着能を失っていることが示唆された。【０２４８】
【表５２】
0005144273.tif 000059
【０２４９】
一方、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は、マウス血漿を希釈する際に用いた溶液中の酢酸含量の増加と共に増加した。全ての溶液中で各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎが物質に対する吸着能を失っているにも関わらず、このように回収率が変化した一因として、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎがメンブレンで分画される分子量１０，０００以上の高分子ポリペプチドと強く相互作用しているためにろ過液に回収されなかったと考えられた。従って、酢酸には、ポリペプチドの物質に対する吸着能を相転移させる効果の他に、ポリペプチド間の相互作用を阻害する効果をも有すると考えられた。【０２５０】
実施例１８（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ定量のためのマウス血漿前処理法の検討：酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法・希釈倍率の影響）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。まず、このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）５０μＬを２００μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２００ｎＭ）を調製した。次に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）５０μＬを４５０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）を調製した。加えて、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）４０μＬを９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各４０ｎＭ）を調製した。更に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）２０μＬを９８０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２０ｎＭ）を調製した。【０２５１】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）２０μＬを、９８０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。【０２５２】
＜酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法＞
１００倍希釈：ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１０μＬを、９９０μＬの水−酢酸−アセトニトリル（容積比１９：４０：４０）に添加した。５０倍希釈：ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）２０μＬを、９８０μＬの水−酢酸−アセトニトリル（容積比１８：４０：４０）に添加した。２０倍希釈：ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）５０μＬを、９５０μＬの水−酢酸−アセトニトリル（容積比１５：４０：４０）に添加した。１０倍希釈：ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１００μＬを９００μＬの水−酢酸−アセトニトリル（容積比１０：４０：４０）に添加した。
希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、その４００μＬを市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やした。【０２５３】
＜マウス血漿試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を用いて得られた各ろ過液をマウス血漿試料とした（１００倍希釈マウス血漿試料、５０倍希釈マウス血漿試料、２０倍希釈マウス血漿試料及び１０倍希釈マウス血漿試料）。【０２５４】
＜リファレンス試料の調製＞
１００倍希釈リファレンス試料：ブランクマウス血漿を用いて得られた１００倍希釈ろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２０ｎＭ）１０μＬを添加して調製した（各０．２ｎＭ）。５０倍希釈リファレンス試料：ブランクマウス血漿を用いて得られた５０倍希釈ろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各４０ｎＭ）１０μＬを添加して調製した（各０．４ｎＭ）。２０倍希釈リファレンス試料：ブランクマウス血漿を用いて得られた２０倍希釈ろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１００ｎＭ）１０μＬを添加して調製した（各１ｎＭ）。１０倍希釈リファレンス試料：ブランクマウス血漿を用いて得られた１０倍希釈ろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２００ｎＭ）１０μＬを添加して調製した（各２ｎＭ）。【０２５５】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（４：１００；ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：１００％酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−アセトニトリル−メタノール（２０：４：４０：４０；ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径３．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし、３０〜３９．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０２５６】
【表５３】
0005144273.tif 000060
【０２５７】
１００倍希釈マウス血漿試料及び１００倍希釈リファレンス試料５００μＬ、５０倍希釈マウス血漿試料及び５０倍希釈リファレンス試料２５０μＬ、２０倍希釈マウス血漿試料及び２０倍希釈リファレンス試料１００μＬ、及び、１０倍希釈マウス血漿試料及び１０倍希釈リファレンス試料５０μＬをシステムに導入した。【０２５８】
＜回収率の算出方法＞
各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率を、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比（％）として算出した。【０２５９】
血漿を水とみなした場合の希釈されたマウス血漿試料（＝ろ過液）中の酢酸及びアセトニトリル含量から計算した値ｆから、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはその試料（＝ろ過液）中でカラム充填剤に対する吸着能を失っており、更に、バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレンや試料調製時に用いる容器等の固体に対しても吸着能も失っていると考えられた（表５４）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例１５で得られたグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の保持時間を用いた。【０２６０】
【表５４】
0005144273.tif 000061
【０２６１】
一方、本発明法を用いる場合にあたって、各移動相組成、及び、ポリペプチドが導入される有機溶媒系移動相（移動相Ｂ及びＣの混合溶液）の測定開始時の混合比、及び、各試料中有機溶媒含量から、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムへ保持させるのに必要な混合器において混合される有機溶媒系移動相に対する水系移動相の比率（α）を、前述の式（ａ）に従って算出した（表５５）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例１５で得られたグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の保持時間を用いた。システムに導入された全てのａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムへ保持させるのに必要な水系移動相の割合をαから算出した結果、６３％より大きいことが示された。今回の検討では、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎを含む試料がカラムに導入されるまでの間の水系移動相の割合が７５％程度であり、システムに導入された全てのａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはカラムへ保持したと判断された。【０２６２】
【表５５】
0005144273.tif 000062
【０２６３】
＜結果＞
希釈倍率の異なる各試料を測定した結果、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は、希釈倍率の増加と共に増加した（表５６）。全てのマウス血漿試料中で各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎが物質に対する吸着能を失っているにも関わらず、このように回収率が変化した原因として、実施例１７での考察と同様に、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎがメンブレンで分画される分子量１０，０００以上の高分子ポリペプチドと強く相互作用しているためにろ過液に回収されなかったことが考えられた。今回の結果から、希釈倍率を増加させることで（ポリペプチド濃度を低下させることで）、ポリペプチド間の相互作用が弱くなると考えられた。【０２６４】
【表５６】
0005144273.tif 000063
【０２６５】
実施例１９（ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ定量のためのマウス血漿前処理法の検討：酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法・有機溶媒の種類の影響）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）２０μＬを９８０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２０ｎＭ）を調製した。【０２６６】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）１０μＬを、４９０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。【０２６７】
＜酢酸を含む有機溶媒による血漿希釈法＞
ブランクマウス血漿及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１０μＬを、９９０μＬの表５７に示す希釈用混合溶液に添加した。希釈された血漿を十分に攪拌後、その４００μＬを市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やした。【０２６８】
【表５７】
0005144273.tif 000064
【０２６９】
＜マウス血漿試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を用いて得られたろ過液をマウス血漿試料とした。【０２７０】
＜リファレンス試料の調製＞
ブランクマウス血漿を用いて得られた１００倍希釈ろ過液９９０μＬに、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各２０ｎＭ）１０μＬを添加し、リファレンス試料（各０．２ｎＭ）を調製した。【０２７１】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（４：１００；ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液（容積比２０：４：４０：４０）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし、３０〜３９．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０２７２】
【表５８】
0005144273.tif 000065
【０２７３】
マウス血漿試料及びリファレンス試料５００μＬをシステムに導入した。【０２７４】
＜回収率の算出方法＞
各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率を、リファレンス試料を測定した時に得られたピーク面積に対するマウス血漿試料を測定した時に得られたピーク面積の比（％）として算出した。【０２７５】
血漿を水とみなした場合の希釈されたマウス血漿試料（＝ろ過液）中の酢酸及び有機溶媒含量から計算した値ｆから、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎは希釈されたマウス血漿試料（＝ろ過液）中でカラム充填剤に対する吸着能を失っていることが示唆された。実施例１７の結果から、この時、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはバイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレンや試料調製時に用いる容器等の固体に対しても吸着能も失っていると考えられた（表５９）。【０２７６】
【表５９】
0005144273.tif 000066
【０２７７】
一方、本発明法を用いる場合にあたって、各移動相組成、及び、ポリペプチドが導入される有機溶媒系移動相（移動相Ｂ及びＣの混合溶液）の測定開始時の混合比、及び、各試料中有機溶媒含量から、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムに保持させるのに必要な有機系移動相に対する水系移動相の比率（β）及び有機溶媒及び酢酸含量の異なる希釈されたマウス血漿試料中のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎをカラムに保持させるのに必要な有機系移動相に対する水系移動相の比率（γ）を、前述の式（ａ）に基づいて算出した（表６０及び表６１）。ただし、各ポリペプチドの各有機溶媒に対する相転移臨界値は実施例１５で得られたグラジエント勾配１％／ｍｉｎの時の保持時間を用いた。算出されたβ及びγのうち、より高い値以上がαであり、この値を用いてシステムに導入された各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎがカラムへ保持するのに必要な水系移動相の割合を算出した（表６２）。その結果、水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比１０：３０：６０及び１０：４０：５０）中のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）をカラムに保持させるための水系移動相の割合として７５％より大きいことが示されたが、その他の混合溶液に対しては全ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎで７４％以下であることが示された。今回の検討では、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎを含む試料がカラムに導入されるまでの間の水系移動相の割合が７５％程度であり、前述の２種の溶液を測定する場合に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）のカラムへの不十分な保持が予想されたが、その他の場合では、システムに導入された全てのａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎはカラムへ保持したと考えられた。【０２７８】
【表６０】
0005144273.tif 000067
【０２７９】
【表６１】
0005144273.tif 000068
【０２８０】
【表６２】
0005144273.tif 000069
【０２８１】
＜結果＞
有機溶媒の種類に関わらず、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのマウス血漿からの回収率は、希釈用溶液中の酢酸含量の増加と共に増加した（表６５）。一方で、希釈用混合溶液中の酢酸含量が低い（３０％〜４０％程度）場合、希釈混合溶液中の水含量が増加すると共に、回収率が増加する傾向が認められた。しかし、酢酸含量が高く（６０％以上）、水含量が２０％以上の場合に、回収率に大きな差は認められなかった。今回の結果からも、希釈用混合溶液中の酢酸が、ポリペプチドの物質に対する吸着能を相転移させつつも、ポリペプチド間の相互作用をも阻害することで、各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎマウス血漿からの回収率が上昇したと考えられた。【０２８２】
【表６３】
0005144273.tif 000070
【０２８３】
実施例２０（マウス血漿試料中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのオートサンプラー中安定性評価）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。【０２８４】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）１０μＬを、４９０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えて、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）を調製した。同様に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）１５０μＬにブランクマウス血漿１５０μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２．５ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２．５ｎＭ）１５０μＬにブランクマウス血漿１５０μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１．２５ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１．２５ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．６２５ｎＭ）を調製した。【０２８５】
＜水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液を用いた血漿希釈法＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿３０μＬを、１５００μＬの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）には、内部標準（ＩＳ）ポリペプチドとしてＮＰＹ（１０ｎＭ）が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、その４００μＬ以下を市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、１．２ｍＬ以上のろ過液を得た。【０２８６】
＜検量線試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．６２５、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｎＭ）を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した（ｎ＝１）。【０２８７】
＜オートサンプラー中安定性評価用試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１．２５及び５ｎＭ）を用いて得られたろ過液を、それぞれ、オートサンプラー中安定性評価用試料として調製した（ｎ＝３）。【０２８８】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（４：１００；ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液（容積比２０：２０：３０：３０）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし、３０．１〜３９．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０２８９】
【表６４】
0005144273.tif 000071
【０２９０】
マウス血漿試料１０００μＬをシステムに導入した。【０２９１】
＜検量線の作成＞
検量線は、ｙ軸にＩＳであるＮＰＹのピーク面積に対する各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのピーク面積を、ｘ軸にａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度（ｎＭ）を用い、濃度分の１（１／ｘ）を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出（ｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅ）した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度（％）として表し、定量下限（ＬＬＯＱ）以外で真度が±１５％以内、定量下限（ＬＬＯＱ）では±２０％となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの７５％以上（この中にＬＬＯＱ及び定量上限が含まれる）がこの基準を満たすこととした。【０２９２】
＜オートサンプラー中の安定性＞
オートサンプラー中安定性評価用試料（１．２５及び５ｎＭ各ｎ＝３）は、調製直後から２０℃に設定したオートサンプラー中に放置し、放置後２８時間及び３７時間に測定を実施した。安定性（％）は、検量線から得られた濃度の理論値に対する割合（真度）（％）として表した。【０２９３】
＜結果＞
濃度に比例した各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのピーク面積が得られ、また、ＬＬＯＱを含めて理論値の±１５％以内の良好な真度を有する濃度範囲が４０倍の検量線が得られた（表６５）。【０２９４】
【表６５】
0005144273.tif 000072
【０２９５】
更に、オートサンプラー中安定性評価用試料（１．２５及び５ｎＭ）を測定した結果、前処理後のろ過液中に存在する各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎは、２０℃のオートサンプラー中で３７時間まで安定（理論値の±１５％）であることが示された（表６６）。【０２９６】
【表６６】
0005144273.tif 000073
【０２９７】
実施例２１（マウス血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの安定性評価）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。【０２９８】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）２０μＬを、９８０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えて、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）を調製した。同様に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１５０μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１ｎＭ）１００μＬにブランクマウス血漿１００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．５ｎＭ）を調製した。一方、安定性評価用試料として、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）４５０μＬにブランクマウス血漿１５０μＬを加えたａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１５ｎＭ）を２本調製した。【０２９９】
＜水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液を用いた血漿希釈法＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿３０μＬを、１５００μＬの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）には、内部標準（ＩＳ）ポリペプチドとしてＮＰＹ（１０ｎＭ）が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、各溶液４００μＬ以下を市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、１．２ｍＬ以上のろ過液を得た。【０３００】
＜検量線試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．５、１、２、５、１０及び２０ｎＭ）を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した（ｎ＝１）。【０３０１】
＜オートサンプラー中安定性評価用試料の調製＞
安定性評価用マウス血漿（１５ｎＭ）は、調製直後から、氷冷（４℃）及び室温下で放置し、調製後０．５時間、１時間、２時間及び４時間に、水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液を用いた血漿希釈法を用いて血漿中安定性評価用試料を調製した（ｎ＝１）。【０３０２】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（４：１００；ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液（容積比２０：２０：３０：３０）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）２本直列
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし、３３．１〜４４．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０３０３】
【表６７】
0005144273.tif 000074
【０３０４】
マウス血漿試料１０００μＬをシステムに導入した。【０３０５】
＜検量線の作成＞
検量線は、ｙ軸にＩＳであるＮＰＹのピーク面積に対する各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのピーク面積を、ｘ軸にａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度（ｎＭ）を用い、濃度分の１（１／ｘ）を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出（ｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅ）した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度（％）として表し、定量下限（ＬＬＯＱ）以外で真度が±１５％以内、定量下限（ＬＬＯＱ）では±２０％となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの７５％以上（この中にＬＬＯＱ及び定量上限が含まれる）がこの基準を満たすこととした。【０３０６】
＜血漿中安定性＞
マウス血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの安定性は、検量線から得られた濃度の理論値に対する割合（真度）（％）として表した。【０３０７】
＜結果＞
今回用いた測定条件下では、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）の溶出位置に夾雑ピークが認められたことから、その他の３種のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎについて評価した。その結果、濃度に比例した各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのピーク面積が得られ、また、ＬＬＯＱを含めて理論値の±１５％以内の良好な真度を有する濃度範囲が４０倍の検量線が得られた（表６８）。【０３０８】
【表６８】
0005144273.tif 000075
【０３０９】
血漿中安定性評価用試料（１５ｎＭ）を測定したところ、室温に放置した血漿から得られた試料を測定した時に得られた各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度の真度（％）は１時間後に約７０％程度、４時間後に２６．７〜５０％程度にまで減少していた。一方、氷冷（４℃）下に放置した血漿から得られた試料を測定した時に得られた各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度の真度（％）は、４時間後も９８．２〜１０５．０％を示し、氷冷（４℃）下に放置した血漿中で各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎが安定であることが示唆された（表６９）。【０３１０】
【表６９】
0005144273.tif 000076
【０３１１】
実施例２２（マウス血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ定量法の真度及び精度）
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ標準溶液の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）及びａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４３）保存溶液（０．１ｍＭ）各１０μＬを、９６０μＬの酢酸−水−アセトニトリル混合液（容積比４：５０：５０）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）を調製した。【０３１２】
＜ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ混合溶液（各１μＭ）１０μＬを、４９０μＬのブランクマウス血漿（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｓｏｄｉｕｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に添加し、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）を調製した。このａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）２００μＬにブランクマウス血漿２００μＬを加えて、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）を調製した。同様に、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１０ｎＭ）２００μＬにブランクマウス血漿２００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（５ｎＭ）２００μＬにブランクマウス血漿３００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２ｎＭ）２００μＬにブランクマウス血漿２００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１ｎＭ）を、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１ｎＭ）２００μＬにブランクマウス血漿２００μＬを加えてａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．５ｎＭ）を調製した。ＱＣ試料用として、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（２０ｎＭ）１５０μＬにブランクマウス血漿５０μＬを加えて、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（１５ｎＭ）を調製した。【０３１３】
＜水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液を用いた血漿希釈法＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿３０μＬを、１５００μＬの水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）に添加した。この水−酢酸−イソプロピルアルコール混合溶液（容積比３０：６０：１０）には、内部標準（ＩＳ）ポリペプチドとしてＮＰＹ（１０ｎＭ）が含まれている。希釈されたマウス血漿を十分に攪拌後、各溶液４００μＬ以下を市販のウルトラフリーＭＣ遠心式フィルターユニット（バイオマックス−ＰＢ限外ろ過メンブレン装着フィルターユニット；分画分子量１０，０００）に添加し、６，０００×ｇで６０分間以上（３５℃）遠心し、ろ過液を得た。必要に応じて、フィルターユニットの本数を増やし、１．２ｍＬ以上のろ過液を得た。【０３１４】
＜検量線試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．５、１、２、５、１０及び２０ｎＭ）を用いて得られたろ過液を検量線用マウス血漿試料として測定した（ｎ＝１）。【０３１５】
＜ＱＣ試料の調製＞
ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ添加マウス血漿（０．５、１、５及び１５ｎＭ）を用いて得られたろ過液を、それぞれ、ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ及びＨＱＣ試料として調製した（ｎ＝５）。【０３１６】
＜測定条件＞
移動相Ａ：酢酸−水（４：１００；ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：酢酸
移動相Ｃ：水−酢酸−メタノール−アセトニトリル混合液（容積比２０：２０：３０：３０）
カラム：Ｃ１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ：内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）２本直列
カラム温度：６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ（ただし０．１〜１０分の間０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、３０〜３９．９分の間０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
グラジエント：【０３１７】
【表７０】
0005144273.tif 000077
【０３１８】
マウス血漿試料１０００μＬをシステムに導入した。【０３１９】
＜検量線の作成＞
検量線は、ｙ軸にＩＳであるＮＰＹのピーク面積に対する各ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎのピーク面積を、ｘ軸にａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度（ｎＭ）を用い、濃度分の１（１／ｘ）を重み付けとして用いた最小二乗法にて作成した。検量線の作成では、作成した検量線を用いて算出（ｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅ）した検量線試料濃度の理論値に対する割合を真度（％）として表し、定量下限（ＬＬＯＱ）以外で真度が±１５％以内、定量下限（ＬＬＯＱ）では±２０％となることを許容基準とした。更に、用いた検量線ポイントの７５％以上（この中にＬＬＯＱ及び定量上限が含まれる）がこの基準を満たすこととした。【０３２０】
＜真度及び精度の算出＞
真度（％）は、ＱＣ試料（ｎ＝５）を測定した時に得られた平均濃度の理論濃度に対する割合（％）として表し、精度は、変動係数（ＣＶ％）として表した。真度（％）の許容基準は、定量下限（ＬＬＯＱ）以外で理論値±１５％以内、定量下限（ＬＬＯＱ）では理論値±２０％となることとした。精度の許容基準は、ＣＶ％が定量下限（ＬＬＯＱ）以外で１５％以内、定量下限（ＬＬＯＱ）で２０％以内とした。【０３２１】
＜結果＞
今回用いた測定条件下では、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−３８）の溶出位置に夾雑ピークが認められたことから、その他の３種のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎについて評価した。その結果、濃度に比例したａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、（１−４２）及び（１−４３）のピーク面積が得られ、また、ＬＬＯＱを含めて理論値の±１５％以内の良好な真度を有する濃度範囲が４０倍の検量線が得られた（表７１）。更に、ＱＣサンプルを測定したところ、許容基準を満たす真度及び精度が得られた（表７２）。【０３２２】
【表７１】
0005144273.tif 000078
【０３２３】
【表７２】
0005144273.tif 000079
【０３２４】
今回用いた測定条件下で、マウス血漿中のａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）、（１−４２）及び（１−４３）を精度良く定量できることが確認されたことから、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を組み換え導入したトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）の血漿中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ濃度測定を実施した。その結果を表７３に示す。本発明法で得られたａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４０）の濃度は、別途ＥＬＩＳＡ法で得られた値とほぼ相関していた。一方、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ（１−４２）濃度は、ピークが検出されたものの定量下限以下であった。検量線を外挿して得られた濃度を参考値としてＥＬＩＳＡ法で得られた値と比較すると、ほぼ相関していると考えられた。従って、本発明法によって血漿中等の生体試料中ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎの定量が可能であることが示された。【０３２５】
【表７３】
0005144273.tif 000080
【０３２６】
今回用いた前処理法及び分析法は、ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒｏｔｅｉｎ以外のポリペプチドにも応用可能な方法であり、更に、保持時間とグラジエント勾配との間に認められるべき乗則を考慮すると、本発明法では、試料導入時間及びカラム負荷量が許す限りの試料量の導入に比例した高感度化も可能であることに加えて、今回の試験で用いたＡＰＩ３６５よりも約５０倍以上高感度なＭＳ／ＭＳ、例えばＡＰＩ５０００を用いることにより、さらなる高感度定量が可能であると考えられる。従って、本発明法は、最新のＭＳ／ＭＳと組み合わせることにより、免疫学的手法に匹敵もしくは凌駕する感度を有する生体試料中ポリペプチドの高感度定量法を可能とすると考えられた。更に、今回の実施例からも明らかな通り、本発明法では、ＥＬＩＳＡ法と異なり、臨界値の異なる複数のポリペプチドを一斉に定量できることから、現在プロテオミクス研究で行われているような網羅的なポリペプチド検出によるバイオマーカー探索研究においても有効であると考えられた。
【図１】
0005144273.tif 000085
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
0005144273.tif 000092
【図８−２】
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【図９】
0005144273.tif 000094
【図１０】
0005144273.tif 000095
【図１１】
0005144273.tif 000096
【図１２】
0005144273.tif 000097
【図１３】
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