(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するバチルス属菌微生物由来のアルカリキチナーゼ
１．作用：
キチンのβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
コロイダルキチン及びρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシドを分解する。
３．最適反応ｐＨ：
コロイダルキチンを基質として５０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約９．０である。
４．ｐＨ安定性：
コロイダルキチンを基質として４℃で２４時間処理した場合、ｐＨ５．０〜１２．０で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
コロイダルキチンを基質としてｐＨ９．０で６０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
コロイダルキチンを基質としてｐＨ９．０で３０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約６６ｋＤａである。
【請求項２】
請求項１記載のアルカリキチナーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄剤用酵素として有用なアルカリキチナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ．Ｃ．３．２．１．１４に分類されるキチナーゼは、多くの種類の微生物、植物及び動物に存在し、また、植物病原菌に対する防御機構の１つとして、抗菌活性を有することが知られている。抗菌活性を有するキチナーゼとしては、例えば、植物ではヤマイモ由来のキチナーゼ（非特許文献１）、微生物ではストレプトマイセス  グリセウス(Streptomyces griseus) (特許文献１)やバチルス  サーキュランス(Bacillus circulance)由来のキチナーゼ(非特許文献２)の報告がある。
【０００３】
洗浄剤に配合する酵素としては、アルカリ領域で作用し且つ安定で、また、界面活性剤等の洗浄剤組成物に対して高い安定性を示す等の性質を有することが望ましいが、これまで洗浄剤用酵素としてキチナーゼを検討した例は報告されていない。
【０００４】
アルカリ領域に最適反応ｐＨを示すキチナーゼとして、ビブリオ  アルギノリティカス(Vibrio alginolyticus)由来キチナーゼ（特許文献２）やバチルス  リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来キチナーゼ（特許文献３）が知られているが、いずれもキトオリゴ等製造用として利用されるものであり、洗浄剤に配合するにはアルカリ領域における安定性が十分でないという問題があった。
従って、アルカリ領域で作用し且つより安定性の高いキチナーゼが求められていた。
【特許文献１】特開2000-93182号公報
【特許文献２】特開平6-113846号公報
【特許文献３】特許第2952579号公報
【非特許文献１】キチン・キトサンの開発と応用、シーエムシー (2004)
【非特許文献２】Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(3), 602-609 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アルカリ領域で作用し、洗浄剤用酵素として使用可能なアルカリキチナーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、自然界からアルカリキチナーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、上記目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリキチナーゼを精製することに成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）〜２）に係るものである。
１）以下の酵素学的性質を有するバチルス属菌微生物由来のアルカリキチナーゼ
１．作用：
キチンのβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
コロイダルキチン及びρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシドを分解する。
３．最適反応ｐＨ：
コロイダルキチンを基質として５０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約９．０である。
４．ｐＨ安定性：
コロイダルキチンを基質として４℃で２４時間処理した場合、ｐＨ５．０〜１２．０で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
コロイダルキチンを基質としてｐＨ９．０で６０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
コロイダルキチンを基質としてｐＨ９．０で３０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約６６ｋＤａである。
２）上記１）のアルカリキチナーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアルカリキチナーゼは、最適反応ｐＨが約９．０で、ｐＨ５．０〜１２．０の広範囲で極めて安定であり、また界面活性剤やプロテアーゼに対して強い耐性を有している新規な酵素であるため、洗浄剤用酵素として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のアルカリキチナーゼは新規な酵素であり、以下の酵素学的性質を有するものである。
（１）作用
キチンに作用しこれを加水分解する。
（２）基質特異性
コロイダルキチン及びρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシドを分解する。
すなわち、ｐＨ９．０のホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液中で５０℃で各基質を作用させた場合、コロイダルキチン及びρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシドを加水分解する。
また、エチレングリコールキチン、ρ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−グルコサミン、ρ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−キトビオシド、キトサン１０、キトサン１０００、グリコールキトサン、キシラン、キシログルカン、カルボキシメチルセルロース、セルロースパウダー、アビセル、β−１，３−グルカンは加水分解しない。
【００１０】
（３）最適反応ｐＨとｐＨ依存性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、最適反応ｐＨは約９．０（９．０±０．５）で、ｐＨ７．５〜１０．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ６．０〜１０．５で最大活性の６０％以上を示す（図１）。
〔測定条件〕
基質として、０．４％（ｗ／ｖ）コロイダルキチンを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（塩化カリウム−塩酸緩衝液ｐＨ１．０、ｐＨ１．５、ｐＨ２．０、グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０）中、５０℃、６０分間反応させ、キチナーゼ活性を測定する（最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キチナーゼ活性測定にはコロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００１１】
（４）ｐＨ安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キチナーゼ活性はｐＨ５．０〜ｐＨ１２．０の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定である（図２）。
〔測定条件〕
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０）中、４℃で２４時間処理後、参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて活性を測定する（ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示す）。尚、キチナーゼ活性測定ではコロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素液を用いた。
【００１２】
（５）最適反応温度
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キチナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃で、４５℃〜６５℃で最大活性の８０％以上を示し、４０℃〜６０℃で最大活性の６０％以上を示す（図３）。
〔測定条件〕
参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃で反応させる（最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キチナーゼ活性測定にはコロイダルキチン分解活性で０．３ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００１３】
（６）温度安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キチナーゼ活性は５０℃、２０分間の熱処理では、９５％以上の残存活性を有しており、５０℃までは安定である（図４）。
〔測定条件〕
コロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素液を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃の各温度下で０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）中、２０分間熱処理した後、参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて残存活性を測定する（熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示す）。
【００１４】
（７）分子量
分子量マーカーとして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動スタンダードＬＯＷ（バイオラッド製）を用い、ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、１５ｍＡで約９０分間電気泳動を行い、分子量を求めると約６６ｋＤａである（ただし、電気泳動法では±５ｋＤａ程度の誤差を生じる）（図５）。
【００１５】
本発明のアルカリキチナーゼは、例えば、その生産微生物を培養し、その培養物から採取することにより取得できる。アルカリキチナーゼ生産菌としては、下記の菌学的性質を有するバチルス属に属する細菌Ｔ−４８株が挙げられる。
【００１６】
Ａ．形態学的性質（肉汁寒天培地）
（ａ）細胞の形態              ：桿菌（０．８×１．５〜２．０μｍ）
（ｂ）細胞の多形性            ：なし
（ｃ）運動性                  ：なし
（ｄ）胞子                    ：有（中央〜準端立）
（ｅ）グラム染色              ：陽性
【００１７】
Ｂ．各種培地での生育状態
（ａ）肉汁寒天培地での生育状態：コロニー（淡黄色不透明、円形、レノズ状の隆起、周縁は波状、表面の形状はスムーズ、バター様の粘稠度）を形成、色素産生はなし
（ｂ）肉汁液体培養            ：表面発育しない、培地の混濁あり
（ｃ）ゼラチン穿刺培養        ：生育し、液化する
（ｄ）リトマス・ミルク        ：凝固せず、液化しない
【００１８】
Ｃ．生理的性質（＋：陽性、−：陰性）
（ａ）硝酸塩の還元                ：−
（ｂ）脱窒反応                    ：−
（ｃ）ＭＲテスト                  ：−
（ｄ）ＶＰテスト                  ：−
（ｅ）インドールの産生            ：−
（ｆ）硫化水素の生成              ：−
（ｇ）澱粉の加水分解              ：−
（ｈ）クエン酸の利用              ：−
（ｉ）無機窒素源の利用
硝酸塩                  ：＋
アンモニウム            ：−
（ｊ）ウレアーゼ                  ：−
（ｋ）カタラーゼ                  ：＋
（ｌ）オキシダーゼ                ：−
（ｍ）β−ガラクトシダーゼ        ：＋
（ｎ）アルギニンヒドラーゼ        ：−
（ｏ）リジンデカルボキシラーゼ    ：−
（ｐ）オルニチンデカルボキシラーゼ：−
（ｑ）トリプトファンデアミナーゼ  ：−
（ｒ）ゼラチナーゼ                ：＋
（ｓ）生育の温度範囲              ：２０〜５０℃で生育
（ｔ）生育のｐＨ範囲              ：ｐＨ６〜９で生育
（ｕ）嫌気的生育性                ：−
（ｖ）糖類からの酸の生成（＋；生成する、−；生成しない）
グリセロール                ：＋
エリスリトール              ：−
Ｄ−アラビノース            ：−
Ｌ−アラビノース            ：＋
リボース                    ：＋
Ｄ−キシロース              ：−
Ｌ−キシロース              ：−
アドニトール                ：−
β−メチル−Ｄ−キシロシド  ：−
ガラクトース                ：−
グルコース                  ：＋
フラクトース                ：＋
マンノース                  ：＋
ソルボース                  ：−
ラムノース                  ：−
ズルシトール                ：＋
イノシトール                ：−
マンニトール                ：＋
ソルビトール                ：＋
α−メチル−Ｄ−マンノシド  ：−
α−メチル−Ｄ−グルコシド  ：−
Ｎ−アセチルグリコサミン    ：＋
アミグダリン                ：−
アルブチン                  ：＋
エスクリン                  ：＋
サリシン                    ：＋
セロビオース                ：＋
マルトース                  ：＋
乳糖                        ：−
メリビオース                ：−
白糖                        ：＋
トレハロース                ：＋
イヌリン                    ：−
メレチトース                ：−
ラフィノース                ：−
澱粉                        ：−
グリコーゲン                ：−
キシリトール                ：−
ゲンチオビオース            ：−
Ｄ−ツラノース              ：＋
Ｄ−リキソース              ：−
Ｄ−タガトース              ：＋
Ｄ−フコース                ：−
Ｌ−フコース                ：−
Ｄ−アラビトール            ：−
Ｌ−アラビトール            ：−
グルコネート                ：−
２−ケトグルコン酸          ：−
５−ケトグルコン酸          ：−
【００１９】
以上、Ｔ−４８株の形態学及び生理学的性質から、本菌株はバチルス  プミルス(Bacillus pumilus)に近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス  プミルスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を産業技術研究所特許生物寄託センターへバチルス  エスピー  Ｔ−４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５２）として寄託した。
【００２０】
上記の菌株の培養は、菌株を資化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い行えばよい。得られた培養液中からのアルカリキチナーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うことができる。例えば、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段により目的酵素を得る。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により精製、結晶化又は造粒化することもできる。
【００２１】
斯くして得られる本発明のアルカリキチナーゼは、後記実施例に示すように、アルカリ領域において、キチン分解活性を有する。従って、各種洗剤組成物の配合用酵素として有用である。
【００２２】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
【００２３】
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００２４】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００２５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００２６】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００２７】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【００２８】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００２９】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００３０】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００３１】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００３２】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリキチナーゼ及び上記の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
【００３３】
斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。
【実施例】
【００３４】
実施例１  アルカリキチナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌約０．２ｇを滅菌生理食塩水５．０ｍＬに懸濁し、８０℃、１５分間熱処理した後、０．１ｍＬを表１に示す組成を有する液体培地１０ｍＬに添加した。３０℃の培養器で１週間、３００ｒｐｍで振とう培養後、その培養液０．１ｍＬを新しい培地に添加し、再度３０℃の培養器で１週間、３００ｒｐｍで振とう培養した。培養液を表２に示す組成を有する寒天平板培地に塗布して３０℃の培養器で静置培養し、菌の生育後、コロイダルキチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものを選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これによりアルカリキチナーゼ生産菌を取得した。
【００３５】
【表１】
0005224850.tif 000002
【００３６】
【表２】
0005224850.tif 000003
【００３７】
実施例２  アルカリキチナーゼの生産
表３に示す組成を有する液体培地１０ｍＬに、実施例１で得られたアルカリキチナーゼ生産菌１白金耳を接種し、３０℃の培養器で４日間、２５０ｒｐｍで振とう培養を行った。その培養液０．３ｍＬを新しい培地３０ｍＬに添加し、３０℃の培養器で４日間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。この方法により、アルカリキチナーゼ活性を有する培養液を１．２Ｌ調製した。
【００３８】
【表３】
0005224850.tif 000004
【００３９】
実施例３  アルカリキチナーゼの精製
実施例２で得られた培養液１．２Ｌを遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、その上清１Ｌをペンシル型モジュール（旭化成製）及びアミコンウルトラ（ミリポア製）を用いて６．０ｍＬに濃縮した。濃縮液３．０ｍＬをＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０ＤＧカラム（バイオラッド製）で４．０ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で置換し、その３．７ｍＬを同緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｓｃｒｅｅｎ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー製）に添着させた。同緩衝液約３０ｍＬでカラム内を洗浄し、０−１．０Ｍの塩化ナトリウム約７０ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行ったところ、アルカリキチナーゼ活性を示すピークを得た。アルカリキチナーゼ活性を示すピークの画分を集め（１７ｍＬ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたところ、単一のバンドを示したので、この画分を酵素精製標品とした（図５）。
【００４０】
実施例４  アルカリキチナーゼの諸性質
（１）基質特異性
参考例に示した方法に従って、本酵素のコロイダルキチン、エチレングリコールキチン、ρ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−グルコサミン、ρ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−キトビオシド、ρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシド、キトサン１０、キトサン１０００、グリコールキトサン、キシラン、キシログルカン、カルボキシメチルセルロース、セルロースパウダー、アビセル、β−１，３−グルカンに対する加水分解能を調べた結果、コロイダルキチン及びρ−ニトロフェニル−トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシドに対する加水分解能は有していたが、エチレングリコールキチン、ρ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−グルコサミン、ρ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−キトビオシド、キトサン１０、キトサン１０００、グリコールキトサン、キシラン、キシログルカン、カルボキシメチルセルロース、セルロースパウダー、アビセル、β−１，３−グルカンに対する加水分解能は有していなかった。
【００４１】
（２）最適反応ｐＨ
基質には０．４％（ｗ／ｖ）コロイダルキチンを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（塩化カリウム−塩酸緩衝液ｐＨ１．０、ｐＨ１．５、ｐＨ２．０、グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０）中、５０℃で６０分間の反応条件下で測定した。キチナーゼ活性測定にはコロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示した。コロイダルキチンを基質とした場合の最適反応ｐＨはｐＨ約９．０でｐＨ７．５〜１０．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ６．０〜１０．５で最大活性の６０％以上を示した（図１）。
【００４２】
（３）ｐＨ安定性
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０）中、４℃で２４時間処理後、参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて活性を測定した。ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示した。本実験には０．０６ユニット／ｍＬ（キチナーゼ）の酵素液を用いた。その結果、キチナーゼ活性は、ｐＨ５．０〜ｐＨ１２．０の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定であることが判った（図２）。
【００４３】
（４）最適反応温度
参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃で反応させた。最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示した。キチナーゼ活性測定にはコロイダルキチン分解活性で０．３ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。その結果、キチナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃で、４５℃〜６５℃で最大活性の８０％以上を示し、４０℃〜６０℃で最大活性の６０％以上を示した（図３）。
【００４４】
（５）温度安定性
コロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素液を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃の各温度下で０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）中、２０分間熱処理した後、残存活性を参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて測定した。熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示した。その結果、キチナーゼ活性は、５０℃、２０分間の熱処理では、９５％以上の残存活性を有しており、５０℃までは安定であった。（図４）。
【００４５】
（６）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従い行った。尚、用いた分子量マーカーは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動スタンダードＬＯＷ（バイオラッド製）であり、標準タンパク質として、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  Ｂ（分子量；９７，４００）、ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（分子量；６６，２００）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量；４５，０００）、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（分子量；３１，０００）、ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量；２１，５００）及びｌｙｓｏｚｙｍｅ（分子量；１４，４００）を含んでいた。ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、１５ｍＡ／ゲルで約９０分間電気泳動を行い、分子量を求めた結果、分子量は約６６ｋＤａであった（図５）。
【００４６】
（７）界面活性剤の影響
コロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素液を終濃度０．１％（ｗ／ｖ）の各界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（花王製）、ＳＤＳ（バイオラッド製）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王製）、ＩＥＣ−Ａ洗剤（ｗｆｋ製））存在下で０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）中、３０℃で処理した後、残存活性を参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて測定した。界面活性剤未処理での活性を１００％とした残存活性で示した。その結果、キチナーゼ活性は、５日間後でも残存活性は１００％以上であり、界面活性剤に対して極めて安定であることが判った（図６）。
【００４７】
（８）プロテアーゼ耐性
コロイダルキチン分解活性で０．０６ユニット／ｍＬの酵素液を各プロテアーゼ（終濃度４μｇ／ｍＬトリプシン（和光製）、０．１％（ｖ／ｖ）サビナーゼ（ノボザイムズ製））存在下で０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で処理した後、残存活性を参考例に記載のキチナーゼ標準活性測定法にて測定した。プロテアーゼ未処理での活性を１００％とした残存活性で示した。その結果、キチナーゼ活性は、２７時間後でも残存活性は９０％以上であり、プロテアーゼに対して強い耐性があることが判った（図７）。
【００４８】
参考例  酵素活性測定方法
（１）コロイダルキチン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）コロイダルキチン（シグマ製キチンを用いて調製）、０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに、酵素液０.１ｍＬを添加して５０℃で６０分間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）により得られた上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）で測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、酵素液０.１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのＮ―アセチルグルコサミンを遊離する酵素量とした。
【００４９】
（２）エチレングリコールキチン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）エチレングリコールキチン（生化学工業製）を基質として、コロイダルキチン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５０】
（３）Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ρ−ニトロフェニル誘導体分解活性測定法
終濃度０．５ｍＭ Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ρ−ニトロフェニル誘導体（生化学工業製）、０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９mＬに、酵素液０.１ｍＬを添加して５０℃で２０分間反応した。１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２ｍＬを添加して反応を停止させた後、上清液の４２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）で測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬに炭酸ナトリウム溶液２ｍＬを添加後、酵素液０.１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのρ−ニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
【００５１】
（４）キトサン１０分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）キトサン（和光製）を基質として、コロイダルキチン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５２】
（５）キトサン１０００分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）キトサン１０００（和光製）を基質として、コロイダルキチン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５３】
（６）グリコールキトサン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）グリコールキトサン（和光製）を基質として、コロイダルキチン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５４】
（７）キシラン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度１％（ｗ／ｖ）キシラン（フルカ製）、０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９mＬに、酵素液０.１ｍＬを添加して５０℃で６０分間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）により得られた上清液１ｍＬにイオン交換水４ｍＬを加え、上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をＵ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）を用いて測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、酵素液０.１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのキシロースを遊離する酵素量とした。
【００５５】
（８）キシログルカン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）キシログルカン（メガザイム製）、０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９mＬに、酵素液０.１ｍＬを添加して５０℃で６０分間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、イオン交換水４ｍＬを加え、上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をＵ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）を用いて測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、酵素液０.１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量とした。
【００５６】
（９）カルボキシメチルセルロース分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（日本製紙製）を基質として、キシログルカン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５７】
（１０）セルロースパウダー分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度１％（ｗ／ｖ）セルロースパウダー（シグマ製）、０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９mＬに、酵素液０.１ｍＬを添加して５０℃で６０分間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）により得られた上清液１ｍＬを沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、イオン交換水２ｍＬを加え、上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をＵ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）を用いて測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、酵素液０.１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量とした。
【００５８】
（１１）アビセル分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度１％（ｗ／ｖ）アビセル（メルク製）を基質として、セルロースパウダー分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【００５９】
（１２）β−１，３−グルカン分解活性測定法[ＤＮＳ法]
終濃度０．４％（ｗ／ｖ）β−１，３−グルカン（メガザイム製）を基質として、キシログルカン分解活性測定法と同様の測定法で行った。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明のアルカリキチナーゼの最適ｐＨを示すグラフである。白四角：塩化カリウム−塩酸緩衝液ｐＨ１．０、ｐＨ１．５、ｐＨ２．０、黒四角：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、白三角：酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、黒三角：トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、白丸：ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、黒丸：リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０
【図２】本発明のアルカリキチナーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。黒四角：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、白三角：酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３.５、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、黒三角：トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、白丸：ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．５、黒丸：リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１．０、ｐＨ１２．０
【図３】本発明のアルカリキチナーゼの最適反応温度を示すグラフである。
【図４】本発明のアルカリキチナーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図５】本発明の精製アルカリキチナーゼのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。レーン左：標準タンパク質、レーン右：アルカリキチナーゼ
【図６】本発明のアルカリキチナーゼの界面活性剤に対する安定性を示すグラフである。黒四角：直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、白四角：ＳＤＳ、黒丸：ポリオキシエチレンラウリルエーテル、白丸：ＩＥＣ−Ａ洗剤
【図７】本発明のアルカリキチナーゼのプロテアーゼに対する耐性を示すグラフである。白四角：トリプシン、黒丸：サビナーゼ
【図１】
0005224850.tif 000005
【図２】
0005224850.tif 000006
【図３】
0005224850.tif 000007
【図４】
0005224850.tif 000008
【図６】
0005224850.tif 000009
【図７】
0005224850.tif 000010
【図５】
0005224850.tif 000011