(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロールを基質とするＤ−グリセリン酸の製造方法であって、Ｄ−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌であって、グルコノバクター（Gluconobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属、又はグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の細菌から選ばれた酢酸菌を、初発ｐＨがｐＨ８〜９であるグリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−グリセリン酸の製造方法。
【請求項２】
前記グリセロール含有培地が、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌をアルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する工程を含む、Ｄ−グリセリン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年高騰する石油資源だけに依存しない原料転換政策として、あるいは二酸化炭素削減といった地球温暖化問題に対応する技術的概念としてバイオリファイナリーが注目されている。バイオマスは再生可能なエネルギーの中でもカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールやバイオディーゼルといったバイオ燃料の導入が世界的規模で進行している。バイオディーゼルは油脂類の主成分であるトリグリセリドをエステル交換反応により脂肪酸メチルエステルにして燃料とするが、本反応に伴って副生するグリセロールの有効利用法の開発がプロセス開発の鍵となっている。近年のバイオディーゼル使用量の急速な増加を考えると、グリセロール問題の解決は急務といえる。またオレオケミカル産業においても、石油代替・再生産可能資源である植物油脂を原料としたプロセスが導入されていることから、同様にグリセロールの有効活用が大きな問題となっている。
【０００３】
これまでに、生物的および化学的な触媒システムを用いてグリセロール（グリセリン）から有用物質を生産する試みが数多くなされており、グリセロールを原料とした化学触媒によるグリセリン酸の製造法に関しては、Ｄ，Ｌ−グリセリン酸またはその塩の製造方法（例えば特許文献１、２、３）が知られている。また、酸化能を有する微生物を用いて原料基質の酸化物を得る方法において、その原料としてグリセロールを用いることも知られていた（特許文献４）が、目的とする酸化物質は２-ケト-Ｌ-グロン酸、酢酸などであって、グリセリン酸を製造しようとするものではなかった。
Ｄ，Ｌ−グリセリン酸のうち、光学活性体のＤ−グリセリン酸は、L-セリン等のアミノ酸原料として（特許文献５）、または医薬品、農薬製造の中間体として（特許文献６）、さらには樹脂等への添加剤あるいはその原料（特許文献７）として用いられる産業上有用な化学物質である。
しかしながら、化学触媒による方法（特許文献１、２、３）ではＤ，Ｌ−グリセリン酸のラセミ体が生成し、Ｄ−グリセリン酸を得るためには、ラセミ体を化学的手段または微生物学的手段によってラセミ分割してＤ−グリセリン酸を得る（特許文献８）必要がある。従って、原料のグリセロール含有溶液から、Ｄ−グリセリン酸を直接的かつ選択的に製造する方法の開発は非常に重要である。
【０００４】
これまでに、グリセロールを原料としてＤ−グリセリン酸を直接製造する方法として、酢酸菌の１種であるグルコノバクター（Gluconobacter）属細菌を用いるＤ−グリセリン酸の製造方法（特許文献９）が知られているが、その培養条件は、酢酸菌一般の最適培養条件である微酸性条件（ｐＨ４〜７）である。
バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）製造等におけるエステル交換反応は、ほとんどがアルカリ触媒法により行われるため、副生する廃グリセロール溶液（粗グリセロール）は、その製造プロセスにもよるが、一般的にｐＨ８〜１１程度のアルカリ性である。従って粗グリセロールを有効活用するという観点からみて、粗グリセロールから中和工程なしにＤ−グリセリン酸を直接生産できることが望まれる。すなわち、初発のグリセロール含有溶液のｐＨがアルカリ条件（ｐＨ８〜１１）のままでＤ−グリセリン酸が生産可能なシステムの構築が必要となる。しかしながら、これまで、アルカリ条件下で、グリセロールをＤ−グリセリン酸に変換できる微生物の報告はない。
また、エステル交換反応により副生した粗グリセロールなどの場合、一般に含まれるグリセロールの濃度が高いので、アルカリ性であることに加えて、できるだけ高濃度（例えば１５％(v/v)以上）のグリセロール濃度でも生育でき、かつＤ−グリセリン酸高生産性の微生物であることは、さらに望まれる特性である。しかし、特許文献９に記載される中性から微酸性下でのＤ−グリセリン酸製造例では、培地中のグリセロール濃度はたかだか１０％(v/v)でしかなく、満足できるものではなかった。
【特許文献１】特開平5-331100号公報
【特許文献２】特表2004-529894号公報
【特許文献３】特開昭60-226842号公報
【特許文献４】特表2001-524811号公報
【特許文献５】特開平3-91489号公報
【特許文献６】特表2006-507268号公報
【特許文献７】特開2004-67725号公報
【特許文献８】特開平1-225486号公報
【特許文献９】特公平7-51069号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アルカリ性条件下のグリセロール含有培地で微生物によりＤ−グリセリン酸を製造する方法を提供することを目的とする。また、そのことにより、植物油脂等のエステル交換反応において副生するアルカリ性の粗グリセロールを直接Ｄ−グリセリン酸に変換できる副生物の有効利用法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、グリセロールから光学活性なグリセリン酸を生産可能な微生物を探索すべく鋭意検討した結果、酢酸菌に属する微生物が、通常の至適生育条件は中性から微酸性条件であるにもかかわらず、アルカリ性条件下のグリセロール含有培地を用いてもＤ−グリセリン酸生産能を示すばかりか、むしろ微酸性条件下での生産性以上の生産性を示すという驚くべき結果を見出し、本願発明に至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以上の知見を得て完成することができたものであり、具体的には以下の通りのものである。
〔１〕  グリセロールを基質とするＤ−グリセリン酸の製造方法であって、Ｄ−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌を、アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−グリセリン酸の製造方法。
〔２〕  前記酢酸菌が、グルコノバクター（Gluconobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属、又はグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の細菌から選ばれることを特徴とする、前記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕  前記グリセロール含有培地の初発ｐＨがｐＨ８〜９であることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕  前記グリセロール含有培地が、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液（粗グリセロール）であることを特徴とする、前記〔３〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した粗グリセロールなどのアルカリ性グリセロール含有溶液を用いて、効率よく高生産性で、工業的利用価値の高いＤ−グリセリン酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いる微生物としては、エタノールから酢酸を生産する酢酸菌に属する細菌であれば,どのような細菌であっても用いることができる。
典型的には、アセトバクター属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属に属し、グリセロールをＤ−グリセリン酸へと変換する能力を有している微生物を用いることができる。具体的な細菌の例としては、アセトバクターアセティ（Acetobacter aceti）NBRC14818株、アセトバクターシビノンジェンシス（Acetobacter cibinongensis）NBRC16605株、アセトバクターエスチュネンシス（Acetobacter estunensis）NBRC13751株、アセトバクターインドネシエンシス（Acetobacter indonesiensis）NBRC16471株、アセトバクターラバニエンシス（Acetobacter lovaniensis）NBRC13753株、アセトバクターオリエンタリス（Acetobacter orientalis）NBRC16606株、アセトバクターパスツリアヌス（Acetobacter pasteurianus）NBRC3188株、アセトバクターペルオキシダンス（Acetobacter peroxydans）NBRC13755株、アセトバクターシジギ（Acetobacter syzygii）NBRC16604株、アセトバクタートロピカリス（Acetobacter tropicalis）NBRC16470株、アセトバクター属細菌（Acetobacter sp.）NBRC3283株等が挙げられる。また、具体的なグルコンアセトバクター属細菌の例としては、グルコンアセトバクターユーロパス（Gluconacetobacter europaeus）NBRC3261株、グルコンアセトバクターハンセニ（Gluconacetobacter hansenii）NBRC14820株、グルコンアセトバクターリクファシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）NBRC12388株、グルコンアセトバクターオボディエンス（Gluconacetobacter oboediens）NBRC14822株、グルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）NBRC15273株、グルコンアセトバクター属細菌（Gluconacetobacter sp.）NBRC14815株等が挙げられる。一方、具体的なグルコノバクター属細菌の例としては、グルコノバクターセリナス（Gluconobacter cerinus）NBRC3262株、グルコノバクターサブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）NBRC3172株、グルコノバクターメラノジーナス（Gluconobacter melanogenus）NBRC3292株等が挙げられる。
さらに、本発明に用いる微生物には、グリセロールからＤ−グリセリン酸を生産することができる限り、上記微生物の同じ属に属する程度の変異株であれば包含される。これは、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって塩基の付加、欠失、置換等を人工的に誘発したものであってもよい。
【００１０】
一般に酢酸菌は、エタノールから酢酸を生産する能力を有しているため、耐酸性があり、至適培養ｐＨは、ｐＨ５．４からｐＨ６．３といわれている。（Singleton & Sainsbury, Dictionary of Microbiology, 1978）これまでに酢酸菌が、アルカリ性のグリセロール含有培地を用いてＤ−グリセリン酸を生産するということは知られていない。
本発明で、「アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する」というとき、初発ｐＨがアルカリ性（ｐＨ７＜）であることを指す。図１にも示されるように、酢酸菌は培地中のグリセロールを利用してＤ−グリセリン酸を産生するため、培養中にｐＨは徐々に下がる傾向にある。本発明においては、用いる培地のｐＨをアルカリ性に調整してから、本発明の酢酸菌を培養する。初発ｐＨはｐＨ７よりも高ければよく、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１１、より好ましくはｐＨ８〜ｐＨ９である。
【００１１】
これらの微生物を培養する培地中のグリセロール含有量（初発グリセロール含有量）は０．１％〜３０％（v/v）の範囲で適宜設定することができる。例えば１〜２０％（v/v）、好ましくは５〜１５％（v/v）であり、通常は１０±２％（v/v）が最も好ましいが、アセトバクター属微生物の場合は、１０〜２０％（v/v）の高濃度である方がむしろ好ましく、１５±２％（v/v）が最も好ましい。本発明においては、アルカリ性グリセロール含有溶液として、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液などを用いることができるが、これら廃グリセロール溶液は一般にグリセロール濃度が高いので、１０％（v/v）以上、さらには１５±２％（v/v）という高濃度グリセロール含有溶液でのＤ−グリセリン酸生産性が高い点はきわめて大きなメリットである。
培地のグリセロール以外の基本的組成は、当該技術分野に知られるものを任意に選択することができる。窒素源としては、酵母抽出液（例えばDIFCO社製BactoTM Yeast Extractなど）、ポリペプトン、ペプトン、コーンスティープリカー等が利用でき、特に、酵母抽出液、ポリペプトンが好ましい。その際の酵母抽出液濃度は10〜25g/l、特に20±5 g/lが最適である。その他、必要に応じて、例えば Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、FeCl3・6H2O 等の無機塩類を添加する。また、使用菌株の増殖を促進し、グリセロールからＤ−グリセリン酸への変換を促進するような有機物および無機物を適宜添加することもできる。
培養条件は特に制限はないが、例えば２５〜３５℃、好ましくは３０℃の温度で、好気条件のもと、振とう培養することができる。
このような培養条件の下、使用菌株を１〜７日間培養すると、培地中にＤ−グリセリン酸が生成される。
【００１２】
また、酢酸菌菌体またはその処理物をアルカリ条件下でグリセロールに作用させることによりＤ−グリセリン酸を生成させる場合にも、酢酸菌の培養には前述の培地組成および培養条件を用いることができるが、その場合には酢酸菌の至適培養ｐＨであるｐＨ５．４からｐＨ６．３で培養することが好ましい。酢酸菌菌体としては、例えば菌体そのもの、または菌体を含有した培養液等が挙げられる。一方、菌体処理物としては、例えば超音波処理、凍結乾燥処理、乾燥処理、機械的破砕処理、界面活性剤処理、酵素処理した菌体等が挙げられる。これらを用いてアルカリ条件下で反応させることで、水溶液中にＤ−グリセリン酸を生成させることができる。
【００１３】
培養液中に生成蓄積されたＤ−グリセリン酸の単離、精製は当業者が任意の方法により行うことができるが、遠心分離等の方法により菌体を除去した後の反応液を、例えば、イオン交換樹脂による分離方法、カルシウム・マグネシウムイオン等との金属塩とする分離方法、エステル体にしたのち蒸留する分離方法等により単離、精製することができる。
【実施例】
【００１４】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
なお下記実施例におけるグリセロールおよびＤ−グリセリン酸の定量は糖と有機酸を同時に分析するカラム（Shodex社製  SH1011）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて行った。
【００１５】
（実施例１）
各種微生物保存機関より入手した酢酸菌、アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株をグルコース0.5%、酵母抽出液0.5%、ポリペプトン0.5%、MgSO4・7H2O 0.5%の組成を有する前培養培地（５ ml／試験管）に植菌し、３０℃で４８時間往復振とう培養を行った。次いで、表１に示す組成で初発グリセロール濃度が１０％（v/v）の培地３０ mLが入った３００ mL容三角フラスコに上記培養液を１.５ mLずつ植菌した。培養は、温度３０℃、振とう２００ rpmで行った。
【表１】
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【００１６】
前述した方法による本培養開始後、４日後の培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清中のＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表２の通りであった。
【表２】
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【００１７】
（実施例２）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで、表１に示す組成で初発グリセロール濃度が１０、１５、２０％（v/v）の培地３０ mLの入った３００ mL容三角フラスコに上記培養液を１．５ mLずつ植菌し、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表３の通りであった。
【表３】
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【００１８】
（実施例３）
上記検討した初発グリセロール濃度のうち、Ｄ−グリセリン酸生産量が最も高かった１５%（v/v）を実施例３以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表４に示す組成のうち、窒素源（0.5 g/l）としてポリペプトン（日本製薬製）、ぺプトン（DIFCO社製BactoTM Pepton）、酵母エキス（DIFCO社製BactoTM Yeast Extract）、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムをそれぞれ0.5 g/l入れた培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表５の通りであった。
【表４】
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【表５】
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【００１９】
（実施例４）
上記検討した窒素源のうち、Ｄ−グリセリン酸生産量が最も高かった酵母エキス（DIFCO社製BactoTM Yeast Extract）を実施例４以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表６に示す組成のうち、酵母エキス濃度を5〜40 g/lとした培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表７の通りであった。
【表６】
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【表７】
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【００２０】
（実施例５）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表８に示す組成の培地をｐＨ７〜９に調整した培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表９の通りであった。このようにいずれの菌株も、培地の初発ｐＨをｐＨ８,９といったアルカリ側に調整しても、１５％(v/v)という高濃度グリセロール含有培地であるにもかかわらず、Ｄ−グリセリン酸能を有しており、特にアセトバクタートロピカリス
NBRC16470株およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株では、中性よりもアルカリ性側でＤ−グリセリン酸の生産量は増加している。また反応液を遠心分離後、強陰イオン交換樹脂、ダウエックス1-X8 (Cl型)（ダウケミカル社製）を用いてＤ−グリセリン酸を溶出後、光学分割用カラム、キラルパックMA(+)（ダイセル化学工業製）を用いてHPLC分析した。その結果、Ｄ−グリセリン酸標品（シグマ社）とピークの保持時間が完全に一致した。
【表８】
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【表９】
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【００２１】
（実施例６）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行った。次いで、表６に示す組成の培地（ただし、酵母抽出液濃度は２０ g/l、ｐＨ8.2）５００ mlが入った1 L容ミニジャーに上記培養液を２５mlずつ植菌した。培養は、温度30℃、通気量0.8 vvm、攪拌５００ rpmで行った。生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の図１の通りであり、４日間の反応で25.1 g/lであった。このように、初発ｐＨをアルカリ性に調整しても、２４時間以上培養を続けると通常培地のｐＨは徐々に中性から微酸性に変化する傾向があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】アセトバクター属細菌のグリセロール培地での初発ｐＨ８．２からのｐＨ変化とＤ−グリセリン酸生産量の変化
【図１】
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