(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡを含む組み換え体プラスミドを含む形質転換体を培地で培養し、培養物中にＡ．からＥ．のいずれかに記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼを生成蓄積させ、
該培養物からピルベートオルトホスフェートジキナーゼを採取し、８０℃以上で１５分以上熱処理することを特徴とするピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において、１から１２０個の塩基が置換されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ
Ａ．
下記の理化学的性質を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（１）作用
マグネシウムイオン等の存在下で、アデノシン５'一リン酸、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸に作用して、アデノシン５'三リン酸、ピルビン酸、及びリン酸を生ずる反応及びその逆反応を触媒する；
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７〜７．５；
（３）ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
（４）熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、かつ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
（５）補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸を基質とした場合、アデノシン５'一リン酸に対して特異的に補酵素として作用し、アデノシン５'二リン酸、イノシン５'一リン酸、シチジン５'一リン酸、グアノシン５'一リン酸、チミジン５'一リン酸又はウリジン５'一リン酸に作用しない；
（６）金属イオン
マグネシウムイオンを使用した場合を１００％として、コバルトイオンを使用した場合に７４％、ニッケルイオンを使用した場合に２９％の相対活性を示す；
（７）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約８３ｋＤａ；
（８）Ｋｍ値
ホスホエノールピルビン酸に対して０．３２ｍＭ、ピロリン酸に対して１．１２ｍＭ、アデノシン５'一リン酸に対して０．０６５ｍＭ；
Ｂ．
さらに以下（９）の理化学的性質を有する前記Ａ．に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（９）−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する
Ｃ．
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来である前記Ａ．又はＢ．に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
Ｄ．
以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有する前記Ａ．からＣ．のいずれかに記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
Ｅ．
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
【請求項２】
さらにイオン交換体を用いたカラムクロマトグラフィー工程を有する請求項１に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
【請求項３】
さらに疎水的クロマトグラフィー工程を有する請求項２に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
【請求項４】
さらに脱塩する工程を有する請求項３に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡを含む組み換え体プラスミドを含む形質転換体を培地で培養し、該培養液から以下の工程（Ｉ）および（II）を経て得られるピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（Ｉ）培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．５）に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離して粗酵素液を得る工程
（II）粗酵素液を８０℃で１５分間熱処理し、遠心分離して粗精製液を得る工程
（ａ）配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において、１から１２０個の塩基が置換されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるDNA
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が高いピルベートオルトホスフェートジキナーゼとその製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｉｋｉｎａｓｅ（以下ＰＰＤＫと記載する場合もある）、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、ＥＣ２．７．９．１）は、マグネシウムイオン等の存在下で、アデノシン５’一リン酸（以下ＡＭＰと記載する場合もある）、ホスホエノールピルビン酸（以下ＰＥＰと記載する場合もある）及びピロリン酸（以下ＰＰｉと記載する場合もある）に作用して、アデノシン５’三リン酸（以下ＡＴＰと記載する場合もある）、ピルビン酸及びリン酸（以下Ｐｉと記載する場合もある）を生ずる反応及びその逆反応を触媒する酵素である。
【０００３】
ＰＰＤＫは、植物においてＣ４回路を構成する酵素の一つであると考えられ、例えば、トウモロコシ葉由来（非特許文献１）、サトウキビ葉由来（非特許文献２）、及び菊科植物由来（非特許文献３）のＰＰＤＫが報告されている。その他、微生物由来のＰＰＤＫとして、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来（非特許文献４）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ由来（非特許文献５と６）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ由来（非特許文献７）等が報告されている。
【０００４】
ＰＰＤＫは４量体であるが、低温条件（１２℃以下）で２量体もしくは単量体に解離し、急速にその活性を失う。例えば、トウモロコシ葉由来ＰＰＤＫは０℃、２０分の処理で約８０％の活性が失われる（非特許文献１）。また、比較的低温耐性があるとされる菊科植物由来のＰＰＤＫも、０℃において失活が認められる（非特許文献３）。そこで低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れたＰＰＤＫとして、ミクロビスポーラ属由来ＰＰＤＫが開発された（特許文献１）。
【０００５】
酵素はタンパク質なので、腐敗や変性を防ぐために、製造（精製）工程を低温で行い、製造（精製）工程を一旦休止する場合は凍結保存することが多い。したがって、低温域での安定性、凍結保存安定性が高い酵素の方が製造上有利である。そのような観点からは、上記文献に開示されているＰＰＤＫのうち、植物や常温性の微生物由来のＰＰＤＫは低温域における保存安定性及び凍結保存安定性が悪く、酵素の製造上不利であるが、ミクロビスポーラ属由来ＰＰＤＫ（特許文献１）は低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れており、製造上有利である。
【０００６】
ところで、目的酵素を製造する方法として、目的酵素をコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを作成し、該組換え体プラスミドを含む形質転換体を培地で培養し、培養物中に該目的酵素を組み換え体酵素として生成蓄積させ、該培養物から該目的酵素を採取する製造方法がある。この製造方法において、該組換え体プラスミドを移入する宿主微生物としては、エシェリヒア・コリ（以下大腸菌と記載する場合もある）に属する微生物、バチラス属に属する微生物、ストレプトマイセス属に属する微生物、サッカロマイセス・セルビシエ等が通常用いられる。これらの宿主微生物は、通常１０から４５℃程度で生育する微生物であるため、宿主微生物が生成蓄積するタンパク質や酵素は、通常８０℃程度の熱処理で不活性化し凝集しやすくなる。したがって、目的酵素が、例えば８０℃でも不活性化や凝集しない安定な酵素であれば、熱処理工程を製造工程に取り入れることによって他の酵素との分離が容易となり、酵素の製造上大変優位である。
【０００７】
しかし、上記の植物や常温性の微生物由来のＰＤＤＫは熱安定性に優れたものでははない。また、保存安定性及び凍結保存安定性に優れるとして開発されたミクロビスポーラ属由来ＰＰＤＫは、ミクロビスポーラ属が好熱性の放線菌であるため（非特許文献８）、比較的熱安定性は高いがそれでも７０℃では完全に失活してしまうため（特許文献１）、製造上の優位性については不十分なものであった。したがって、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が十分に高いＰＰＤＫは製造上大変優位であるといえる。
【０００８】
【特許文献１】特開平０８−１６８３７５号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，２８６２−２８６７（１９７３）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ １１４，１１７−１２５ （１９６９）
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１，２９ ５−２９７ （１９９０）
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０，７２１−７２９ （１９７１）
【非特許文献５】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２，１９９−２１２（１９７５）
【非特許文献６】Ｔｈｅ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ  １２５，５３１−５３９（１９７１）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０４，２１１−２１８ （１９７０）
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４３１，３６３−３７３（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が高いＰＰＤＫを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
酵素の製造上大変優位である低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が高いＰＰＤＫを得るために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株の遺伝子ＴＭ０２７２がＰＰＤＫをコードする遺伝子である事を見出し、そして、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株由来ＰＰＤＫの理化学的性質を調べた結果、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株由来ＰＰＤＫが、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ、熱安定性の高い新規なＰＰＤＫであることを見出した。さらに該酵素の製造方法を確立して本発明を完成するに至った。
【００１１】
ここで、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株の遺伝子ＴＭ０２７２はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ由来ＰＰＤＫ遺伝子と５９％の同一性があるが（非特許文献８およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３７６３０−３７６３９（２００１）など）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株の遺伝子ＴＭ０２７２がコードするタンパク質の性質はこれまでに解明されていなかった。すなわち、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ由来ＰＰＤＫは凍結融解を繰り返すと活性を失い沈澱するなど温度変化に対して不安定であった（非特許文献５およびＡｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４５、８５−１５５（１９７７）など）が、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  由来のＰＰＤＫは、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が高い、本発明により初めて見出された非常に有用な新規なＰＰＤＫである。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
１）下記の理化学的性質を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（１）作用
マグネシウムイオン等の存在下で、アデノシン５’一リン酸、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸に作用して、アデノシン５’三リン酸、ピルビン酸、及びリン酸を生ずる反応及びその逆反応を触媒する；
（２）至適ｐＨ
ｐＨ７〜７．５；
（３）ｐＨ安定性
５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持する；
（４）熱安定性
８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持し、かつ、４℃で少なくとも２７日間保存後も７０％以上の活性を保持する；
（５）補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸を基質とした場合、アデノシン５’一リン酸に対して特異的に補酵素として作用し、アデノシン５’二リン酸（以下ＡＤＰと記載する場合もある）、イノシン５’一リン酸（以下ＩＭＰと記載する場合もある）、シチジン５’一リン酸（以下ＣＭＰと記載する場合もある）、グアノシン５’一リン酸（以下ＧＭＰと記載する場合もある）、チミジン５’一リン酸（以下ＴＭＰと記載する場合もある）又はウリジン５’一リン酸（以下ＵＭＰと記載する場合もある）に作用しない；
（６）金属イオン
マグネシウムイオンを使用した場合を１００％として、コバルトイオンを使用した場合に７４％、ニッケルイオンを使用した場合に２９％の相対活性を示す；
（７）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約８３ｋＤａ；
（８）Ｋｍ値
ホスホエノールピルビン酸に対して０．３２ｍＭ、ピロリン酸に対して１．１２ｍＭ、アデノシン５’一リン酸に対して０．０６５ｍＭ；
２）さらに以下（９）の理化学的性質を有する前記１）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（９）−２０℃で２週間保存後、９０％以上の活性を保持する
３）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来であることを特徴とする前記１）又は２）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
４）以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有する前記１）から３）のいずれかに記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
５）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
６）以下の（ａ）〜（e）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているDNA
（ｃ）（ａ）の塩基配列において、１から１２０個の塩基が置換されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているDNA
（ｄ）（ａ）の塩基配列において、１２０個の塩基が置換されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているDNA
（ｅ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるDNA
７）前記６）に記載のＤＮＡを含む組み換え体プラスミド。
８）前記７）に記載の組み換え体プラスミドを含む形質転換体。
９）前記８）に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に前記１）から５）のいずれかに記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼを生成蓄積させ、該培養物からピルベートオルトホスフェートジキナーゼを採取することを特徴とするピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
１０）前記９）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法で採取したピルベートオルトホスフェートジキナーゼを、８０℃以上で１５分以上熱処理する工程を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
１１）前記１０）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法で、さらにイオン交換体を用いたカラムクロマトグラフィー工程を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
１２）前記１１）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法で、さらに疎水的クロマトグラフィー工程を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
１３）前記１２）に記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法で、さらに脱塩する工程を有するピルベートオルトホスフェートジキナーゼの製造方法。
１４）前記８）に記載の形質転換体を液体培養し、該培養液から以下の工程を経て得られるピルベートオルトホスフェートジキナーゼ。
（ａ）培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．５）に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離して粗酵素液を得る工程
（ｂ）粗酵素液を８０℃で１５分間熱処理し、遠心分離して粗精製液を得る工程
１５）前記１）〜５）のいずれかに記載のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、前記６）に記載のDNA、前記７）に記載の組み換え体プラスミド、及び、前記８）に記載の形質転換体のうち少なくともいずれかを含む試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性が高いピルベートオルトホスフェートジキナーゼを提供することができ、このような性質を有する酵素の製造は、他に比べて非常に優位に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、国産化学株式会社製、シグマアルドリッチ社製、関東化学株式会社製、タカラバイオ株式会社製等市販で容易に入手できるものを使用した。
【００１５】
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｋｉｎａｓｅ）はＥＣ  ２．７．９．１であり、ピルベートホスフェートジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｋｉｎａｓｅ）ともいう。
＜酵素作用＞
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼの酵素作用は、マグネシウムイオン等の存在下で式１に示す通りである（酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８４年参照）。ＡＴＰ、ピルビン酸、及びＰｉを基質として用いたときの反応式は式１の右方向である。ＡＭＰ、ＰＥＰ、及びＰＰｉを基質として用いたときの反応式は式１の左方向である。ＰＰＤＫの酵素活性は、下記ＰＰＤＫ活性測定方法１又はＰＰＤＫ活性測定方法２によって測定することができる。下記ＰＰＤＫ活性測定方法１又はＰＰＤＫ活性測定方法２はそれぞれの特徴に応じて使い分けた。
【００１６】
ＰＰＤＫ活性測定方法１は、第一反応がＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａの生育至適温度（８０℃）に近い温度（５０℃）なので、本発明のＰＰＤＫ本来の性質に近い性質を調べることが出来るが、一方でトリクロロ酢酸を使用するので取り扱い上危険であり、また、二段階で活性測定するため操作が煩雑で、一度に多くの試料の活性測定することが出来ない。
【００１７】
ＰＰＤＫ活性測定方法２は、一段階で活性測定するため、一度に多くの試料の活性測定が出来るが、一方で、乳酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を考慮し３７℃で測定するため本発明のＰＰＤＫ本来の性質を調べることは出来ない。
【００１８】
活性測定方法１のほうが本発明のＰＰＤＫの至適温度に近いので、活性測定方法２に比べて高い活性値になる。
【００１９】
[式１]
ＡＴＰ  ＋  ピルビン酸  ＋  Ｐｉ ＜＝＞  ＡＭＰ  ＋  ＰＥＰ  ＋  ＰＰｉ
本発明のＰＰＤＫ活性とは、ＰＰＤＫの触媒作用を指す
＜ＰＰＤＫ活性測定方法１＞
（試薬組成）
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−１（濃度は最終濃度）
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ  ７．５
５ｍＭ      ＰＥＰ
２ｍＭ      ＡＭＰ
５ｍＭ      ＭｇＣｌ２
５ｍＭ      ＰＰｉ
酵素液と蒸留水を加えて４００μｌとする。
【００２０】
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−２（濃度は最終濃度）
１．１５Ｍ      Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０
０．１３５ｍＭ  ＮＡＤＨ
５Ｕ／ｍｌ      乳酸デヒドロゲナーゼ
遠心上精４００μｌを加えて１ｍｌとする。
（測定方法）
ＰＰＤＫ活性測定方法１は、酵素反応を2段階に分けて活性測定する方法である。適当な濃度に希釈した本発明のＰＰＤＫを用いてＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−１を調製した。このとき、酵素を加えずに調製したものを「ブランク」とし、酵素を加えたものを「テスト」とした。予め５０℃に調製したＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−１にＰＰＤＫ液と蒸留水を添加して４００μｌとして反応を開始し、１０分間インキュベートして１段階目の反応を行った。続いてこの反応液を氷冷して５０％トリクロロ酢酸を５０μｌ加えて反応を停止した。反応液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清４００μｌを、新しいエッペンドルフチューブに予め準備しておいたＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−２に移した。これを３７℃で１０分間インキュベートすることにより２段階目の反応を行った後、「ブランク」と「テスト」の３４０ｎｍの吸光度を測定してそれぞれＡｂ、Ａｔとした。酵素活性１単位（１ユニット）は、３７℃で１分間に１マイクロモルのホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変化させる酵素量として、ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−２中でのＮＡＤＨのミリモル吸光係数は６．２２として、Ａｂ−Ａｔより酵素活性を求めた。
＜ＰＰＤＫ活性測定方法２＞
（試薬組成）
ＰＰＤＫ活性測定用反応試薬２
１００ｍＭ      ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ  ７．５
５ｍＭ          ＰＥＰ
２ｍＭ          ＡＭＰ
１０ｍＭ        ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ        ＰＰｉ
０．１３５ｍＭ  ＮＡＤＨ
（測定方法）
ＰＰＤＫ活性測定方法２は、酵素反応を１段階で活性測定する方法である。１ｍｌのＰＰＤＫ活性測定用反応試薬２を層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１分間予備加温した後、５，０００Ｕ／ｍｌの乳酸デヒドロゲナーゼを１μｌ添加し、さらに１分間加温した。これに適当な濃度に希釈した本発明のＰＰＤＫを１０μｌ混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸光度差を測定した（Ａｓ）。酵素活性１単位（１ユニット）は、３７℃で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを変化させる酵素量として、上記反応液中でのＮＡＤＨのミリモル吸光係数は６．２２として、酵素活性を求めた。
＜タンパク質濃度測定法＞
タンパク質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキット（ブラッドフォード法）を用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡをスタンダードとして算出した。
＜至適ｐＨ＞
ＰＰＤＫ活性測定方法１における緩衝液（終濃度１００ｍＭ）を、ｐＨ６からｐＨ７の範囲測定用としてＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（図１中○印）、ｐＨ７からｐＨ８の範囲測定用としてＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図１中△印）、ｐＨ８からｐＨ９の範囲測定用としてグリシルグリシン／ＮａＯＨ（図１中□印）にそれぞれ変更して本発明のＰＰＤＫの活性測定を行い、本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨを測定した。図１に、最大活性を１００％とした相対活性（％）としてその結果を示した。本発明のＰＰＤＫの至適ｐＨはｐＨ７からｐＨ７．５であった。
＜ｐＨ安定性＞
本発明のＰＰＤＫをその濃度が０．０６４ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、１００ｍＭのｐＨ４からｐＨ６．５範囲測定用としてクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（図２中○印）、ｐＨ６．５からｐＨ７範囲測定用としてイミダゾール／ＨＣｌ緩衝液（図２中△印）、ｐＨ７からｐＨ８範囲測定用としてＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（図２中□印）、ｐＨ８からｐＨ９範囲測定用としてグリシルグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（図２中●印）、ｐＨ９からｐＨ１１範囲測定用としてグリシン／ＮａＯＨ緩衝液にそれぞれ溶解し（図２中▲印）、５０℃２０分間で保存してその残存活性をＰＰＤＫ活性測定方法１で測定し、最大活性が得られたものを１００％として残存活性（％）を図２に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは５０℃、２０分間でｐＨ４．５から１１の範囲で８０％以上の活性を保持した。
＜補酵素特異性＞
ＰＰＤＫ活性測定方法１におけるＡＭＰを、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰにそれぞれ変更して活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫはマグネシウムイオン存在下で、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸を基質とした場合、ＡＭＰに対して特異的に補酵素として作用し、ＡＤＰ、ＩＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及びＵＭＰに作用しなかった。
＜金属イオン＞
ＰＰＤＫ活性測定方法１におけるＭｇＣｌ２を、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、及びＺｎＣｌ２にそれぞれ変更して、予め１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２Ｍの硫酸ナトリウムを含む１００倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で２回透析した本発明のＰＰＤＫの活性測定を行った。その結果、本発明のＰＰＤＫは、金属イオンの無い場合、ＣａＣｌ２及びＺｎＣｌ２の場合は活性を示さなかったが、ＣｏＣｌ２の場合、ＮｉＣｌ２の場合は、ＭｇＣｌ２の場合を１００％として、それぞれ７４％、２９％の相対活性を示した。
＜分子量＞
９８，１０２（アミノ酸の一次配列からの計算値）。８３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定値（図３の矢印））。
＜Ｋｍ値＞
ＰＥＰ、ＰＰｉ及びＡＭＰに対する見かけのＫｍを測定した。見かけのＫｍは、ＰＰＤＫ活性測定方法１のＰＰＤＫ活性測定用反応試薬１−１中のＰＥＰ、ＰＰｉ及びＡＭＰの濃度をそれぞれ図４、図５、及び図６の横軸に示した濃度になるように調製して、図４、図５、及び図６に示したようにラインウェーバー・バーク逆数プロットにより算出した。ＰＥＰ、ＰＰｉ及びＡＭＰに対する見かけのＫｍは、それぞれ０．３２ｍＭ、１．１２ｍＭ、０．０６５ｍＭであった。
【００２１】
本発明の一態様として、本発明のＰＰＤＫを構成するアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１から８８１で表される。
【００２２】
また、本発明のＰＰＤＫを構成するアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１から８８１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の活性を発現する配列であればよく、配列番号２のアミノ酸配列の１から８８１のアミノ酸配列と実質的に均等なアミノ酸配列や、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異させたもの、例えば１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列などの均等物も含まれる。このような均等物として、配列表の配列番号６で表されるDNAがコードするタンパク質が例示される。
【００２３】
本発明の配列表の配列番号２のアミノ酸配列１から８８１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
【００２４】
また、本発明のＰＰＤＫをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２のアミノ酸配列１から８８１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の活性を発現するＤＮＡであればよく、アミノ酸配列１から８８１中のアミノ酸配列と実質的に均等なアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異させたもの、例えば１〜複数個（例えば、４０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜数個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の均等物をコードするＤＮＡであっても良い。すなわち、配列表の配列番号２のアミノ酸配列１から８８１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ）から、１〜複数個（例えば、１２０個、好ましくは１〜１２０個、より好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜数個）の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡであってもよい。さらに、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相同性（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する塩基配列で表されるDNAであって、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡであってもよい。そのようなＤＮＡの一例としては、配列表の配列番号６のＤＮＡが挙げられる。さらに、本発明の配列表の配列番号２のアミノ酸配列１から８８１で表されるＰＰＤＫのアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番号２のアミノ酸配列の１から８８１で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側は、アミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む場合であってもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチド又はＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグ、ＴＥＥ配列等が挙げられる。  
【００２５】
ＰＰＤＫをコードするＤＮＡの供与体である微生物としては、ＰＰＤＫを生産するバクテリアであればなんら限定されるものではないが、好ましくはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａが挙げられ、そのうちでもＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株が挙げられる。
【００２６】
本発明のＰＰＤＫをコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−３２ａ等のｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。このようなベクターを、ＰＰＤＫをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素により生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、ＰＰＤＫをコードするＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼにより常法に従って結合させてＰＰＤＫをコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。
【００２７】
組換え体プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＢＬ２１、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリＴｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０１、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００等が利用できる。また、宿主微生物がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウム等、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４等、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエＩＮＶＳＣ１等が使用できる。
【００２８】
また、本発明のＰＰＤＫは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわない程度にペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明のＰＰＤＫ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換する等の種々の遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得されたＰＰＤＫ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体ＰＰＤＫを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体ＰＰＤＫを製造することも可能である。
【００２９】
本発明のＰＰＤＫは、本発明のＰＰＤＫを産生する微生物を培養することによって製造することができ、天然のＰＰＤＫ産生微生物や、例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株を用いてもよく、さらに前記の遺伝子工学的手法を用いて、前記ＰＰＤＫ産生微生物の遺伝子を導入した形質転換体を用いてＰＰＤＫを製造することもできる。形質転換体を用いてＰＰＤＫを製造する場合、該形質転換体を自体公知の栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該ＰＰＤＫを生成蓄積させ、該培養物から該ＰＰＤＫを採取すればよい。該ＰＰＤＫが菌体内に産生される場合は培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該ＰＰＤＫを濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的クロマトグラフィー又は脱塩を適宜組み合わせることにより処理して、純度の良いＰＰＤＫを得ることができる。また、これらの方法に従って採取されたＰＰＤＫを８０℃で１５分間熱処理することが好ましい。形質転換体の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は宿主となる微生物が発育し、ＰＰＤＫを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは１５から４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ＰＰＤＫが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＰＰＤＫを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００３０】
本発明の酵素は主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば良い。抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液等の溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理等の菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、本発明の粗酵素液を得る。
【００３１】
本発明の粗酵素液から公知のタンパク質や酵素等の単離、精製手段を用いて精製酵素を得る。例えば、粗製の本発明の酵素液にアセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して目的酵素を沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法等で単一の帯を示すまで、イオン交換体、疎水的クロマト吸着体、ゲル濾過剤、吸着体等を用いるカラムクロマトグラフィー等により精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることにより目的酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。本発明の酵素は、８０℃における熱処理が特に精製度が上がる製造（精製）工程である。
【００３２】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海面活性化剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形のＰＰＤＫを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を０．５から１０％程度添加しても良い。
【００３３】
本発明のＰＰＤＫは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素であり、特に公知の酵素より低温下及び高温下において高い安定性を示す。
【００３４】
本発明の試薬は、本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、本発明のDNA、本発明の組み換え体プラスミド、及び、本発明の形質転換体のうち少なくともいずれかを含む試薬である。本発明の試薬には、その他、緩衝液、反応停止液、反応生成物の検出剤（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、NADHなど）、反応希釈液、アデノシン５´―リン酸、及び金属イオン（例えば、マグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン）など試薬を用いた測定の実施に必要な物質を含むことができる。本試薬は、例えば、試料中のAMPやPEPの測定用試薬として用い得る。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。なお、本明細書中、常法に従い、と記述した技術は、例えばマニアティスらの方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８２、１９８９参照）やタンパク質・酵素の基礎実験法（例えば、改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂参照）、又は、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【実施例】
【００３５】
［実施例１］
＜ＤＮＡの抽出＞
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨから購入したＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株の菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液（以下ＴＥと記載する場合もある）に溶解し、適量のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルムの１：１混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体をＴＥに溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１：１混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とエタノールを加え、撹拌後、−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＳＭ  ３１０９株のＤＮＡ標品を得た。
【００３６】
［実施例２］
＜ＰＣＲ法による配列番号１に示す遺伝子の増幅＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイトＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列表の配列番号１に記載の遺伝子を挿入するように、配列番号３と配列番号４のプライマーを設計した。ｐＵＣ１１８を使用する場合は、マルチクローニングサイトにＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に配列番号１に記載の遺伝子を挿入するように配列番号４と配列番号５のプライマーを設計した。ＰＣＲは、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約２．７ｋｂｐのＰＣＲ産物は、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。
【００３７】
［実施例３］
＜発現ベクターとのライゲーション＞
実施例２で精製した配列番号３と配列番号４のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＡ）。実施例２で精製した配列番号４と配列番号５のプライマーを使用したＰＣＲ産物はＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより常法に従って制限酵素処理した（インサートＢ）。これらインサートＡとＢは、例えばＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いる等、常法に従って精製した。インサートＡはＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＥＴ２１ａ（＋）又はｐＥＴ２８ａ（＋）と常法に従ってライゲーションし、ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２又はｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を作成した。インサートＢはＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素処理し精製したｐＵＣ１１８と常法に従ってライゲーションし、ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を作成した。コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換え体プラスミドは、ＤＮＡシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。
【００３８】
［実施例４］
＜ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２又はｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２の発現チェック＞
ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＴＭ０２７２、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２又をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に、ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２をエシェリヒア・コリＪＭ１０９に常法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール５ｍｌを蒸留水０．９Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌する。リン酸一水素カリウム１２．５ｇ、リン酸二水素カリウム３．８ｇを蒸留水０．１Ｌに溶かして１２１℃２０分間滅菌する。それぞれを室温まで冷却後混合して１ＬのＳＢ培地とした。）に植菌した。３７℃で３時間培養後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えて、さらに３時間培養を行った。培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の４倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【００３９】
［実施例５］
＜粗酵素液の熱処理＞
実施例４で得た粗酵素液は８０℃で１５分間熱処理し遠心分離して、上清を粗精製液とした。この粗精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図３に示した。
【００４０】
［実施例６］
＜ＰＰＤＫの精製１＞
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のＵｎｏＱ（登録商標）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに、実施例５の粗精製液をアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）と０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１００倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析する事により脱塩した。
【００４１】
［実施例７］
＜ＰＰＤＫの精製２＞
１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のハイドロキシアパタイトを用いたカラムに実施例６の脱塩したＰＰＤＫをアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いてベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１ｍＭのＤＴＴを含む１００倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析する事により脱塩し、精製酵素とした。
【００４２】
［実施例８］
＜ＰＰＤＫの精製３＞
１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したバイオラッド社のハイドロキシアパタイトを用いたカラムに実施例６の脱塩したＰＰＤＫをアプライした。カラムをベッド体積の５倍以上の１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いてベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨで平衡化したゲル濾過剤であるＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して脱塩し、精製酵素とした。
【００４３】
【表１】
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実施例４において、ｐＵＣ１１８／ＴＭ０２７２を形質転換したエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を５００ｍｌ培養し、得られた粗酵素液を実施例５から実施例７に従って精製し、各精製工程で得られたＰＤＤＫ活性を測定し結果を表１に示した。ＰＰＤＫ活性はＰＰＤＫ活性測定方法１で測定した。これより、粗酵素液を８０℃で１５分間熱処理し遠心分離する事により、比活性は１１倍以上向上しており、熱処理工程が大変有効な製造（精製）工程である事が分かる。
【００４４】
［実施例９］
＜ＰＰＤＫの精製４＞
実施例４において、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ＴＭ０２７２を形質転換したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を５００ｍｌ培養し、得られた粗酵素液を用いて実施例５に記載の方法で粗精製液を得た場合は、以下のような精製も実施した。
【００４５】
０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したシグマアルドリッチ社のニッケルアフィニティーゲルクロマトグラフィーカラムに、上記の粗精製液をアプライした。０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄した後、０．２ＭのＮａＣｌと０．２Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で吸着画分の溶出を行った。
【００４６】
溶出した活性画分に２０%の硫酸アンモニウムを添加し、２０%の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニルトヨパールクロマトグラフィーカラム（東ソー社製）にアプライした。２０%の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）でカラムをベッド体積の５倍以上洗浄した後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を用いたベッド体積の１２倍量のリニアグラジエント溶出を行った。溶出した活性画分の一部は１００倍量の１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で透析する事により脱塩した。又は、１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨで平衡化したゲル濾過剤であるＧ−２５を使用して脱塩した。透析する事により脱塩した場合、及び、Ｇ−２５を使用して脱塩した場合の本実施例により得られたＰＰＤＫの比活性は、７Ｕ／ｍｇだった。
【００４７】
［実施例１０］
＜ＰＰＤＫ活性の確認＞
ＡＭＰを基質とした時に反応によって生ずるＡＴＰを高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記載する場合もある）によって検出することで本発明のＰＰＤＫの活性を確認した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＡＭＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＰＥＰ、１ｍＭ  ＰＰｉからなる反応液に実施例７で得たＰＰＤＫ  １０μｌを添加し、５０℃で２０分間反応した。反応液をＡｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−３２０（昭和電工株式会社製）を用いたＨＰＬＣで分析した。移動相は２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ３）で、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温で２６０ｎｍの吸光を測定した。図７はこの条件でＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンを分離した結果である。図８は反応前の反応液を分離した結果である。図９は反応後の反応液を分離した結果である。これらの分析結果から明らかなように、ＡＭＰを基質とした時にＡＴＰが反応によって生じており、ＰＰＤＫ活性が確認できた。
【００４８】
［実施例１１］
＜ＰＰＤＫ凍結保存安定性＞
実施例９で得た脱塩していないＰＰＤＫをそのまま−２０℃で凍結保存して２週間後に融解し、凍結保存前後の活性を比較した結果、凍結保存後も９４％の残存活性があり、凍結保存安定性に優れている事が示された。なお、ＰＰＤＫ活性はＰＰＤＫ活性測定方法２で測定した。
【００４９】
［実施例１２］
＜ＰＰＤＫ冷蔵保存安定性＞
実施例９で得た脱塩していないＰＰＤＫをそのまま４℃で保存して、０、５、８、１２、１９、２７日後に活性測定した結果を図１０に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは冷蔵保存下で、２７日保存後も８０％以上の残存活性があり、低温域における保存安定性に優れている事が示された。なお、ＰＰＤＫ活性はＰＰＤＫ活性測定方法１で測定した。
［実施例１３］
＜熱安定性１＞
２１３μｇ／ｍｌの実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを５０℃から１００℃の範囲で２０分間熱処理した。残存活性をＰＰＤＫ活性測定方法１で測定し、未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図１１に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、２０分間の熱処理で、９０％以上の活性を保持した。
【００５０】
［実施例１４］
＜熱安定性２＞
２１３μｇ／ｍｌの実施例７で得た脱塩したＰＰＤＫを８０℃又は９０℃で、０から１時間の範囲で熱処理した。残存活性をＰＰＤＫ活性測定方法１で測定し、未処理の酵素活性を１００％として残存活性（％）を図１２に示した。その結果、本発明のＰＰＤＫは９０℃、1時間の熱処理で、７０％以上の活性を保持し、８０℃、１時間の熱処理で９０％以上の活性を保持した。
［実施例１５］
＜ＰＰＤＫ発現の改良＞
配列表の配列番号１に示す遺伝子の中で、大腸菌において使用頻度が低いと考えられるコドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＴＡ、ＣＧＧ、ＣＣＣ、ＣＵＡ）全てを大腸菌において使用頻度が高いコドンに変換して配列表の配列番号６の遺伝子を作成した。コドン変換は、合成プライマーを使用したＰＣＲによる常法で行い、実施例２、３、４と同様の方法で粗酵素液を得た。本粗酵素液をさらに実施例５と同様の方法で熱処理して、熱処理された粗精製液を得た。本粗精製液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理することにより、配列表の配列番号１の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（図１３（Ａ））と配列表の配列番号６の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（図１３（Ｂ））を比較した。配列表の配列番号６の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量は、配列表の配列番号１の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量に比べて改善された。又、配列表の配列番号６の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価は、配列表の配列番号１の遺伝子によるＰＰＤＫの培養力価に比べて約３倍高くなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本酵素は、低温域における保存安定性及び凍結保存安定性に優れ、かつ熱安定性の高いピルベートオルトホスフェートジキナーゼであるので、効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの至適ｐHを示す。
【図２】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼのｐH安定性を示す。
【図３】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの位置を矢印で示す。
【図４】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼのＰＥＰに対するラインウェーバー・バーク逆数プロットを示す。
【図５】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼのＰＰｉに対するラインウェーバー・バーク逆数プロットを示す。
【図６】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼのＡＭＰに対するラインウェーバー・バーク逆数プロットを示す。
【図７】実施例１０記載のＨＰＬＣ条件で、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンを分離した結果を示す。
【図８】実施例１０記載の反応液の反応前を、実施例１０記載のＨＰＬＣ条件で分離した結果を示す。
【図９】実施例１０記載の反応液に実施例７で得たＰＰＤＫ  １０μｌを添加し、５０℃で２０分間反応した反応液を、実施例１０記載のＨＰＬＣ条件で分離した結果を示す。
【図１０】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの冷蔵保存（４℃）安定性を示す。
【図１１】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの熱安定性を示す。
【図１２】本発明のピルベートオルトホスフェートジキナーゼの熱安定性を示す。
【図１３】配列表の配列番号１の遺伝子によるＰＰＤＫとの発現量（Ａ）と、配列表の配列番号６の遺伝子によるＰＰＤＫの発現量（Ｂ）を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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