(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合体の実質的に純粋に単分散の混合物であって、それぞれの結合体が少なくとも１個のオリゴマーに結合したヒトインスリンを含み、それぞれのオリゴマーが少なくとも５個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分と前記ポリエチレングリコール成分に共有結合している親油性成分を含み、前記親油性成分が１〜２８個の炭素原子を有する非置換のアルキル成分であり、前記実質的に純粋に単分散の混合物は、１０，０００よりも大きい分散係数（ＤＣ）：
【数１】
0005312720.tif 000026
［式中、
ｎはサンプル中の異なる分子の数であり、
Ｎｉはサンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍｉはｉ番目の分子の質量である］を有する結合体の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項２】
前記分散係数は１００，０００よりも大きい、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項３】
前記分散係数は５００，０００よりも大きい、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項４】
少なくとも１個のオリゴマーが第１のオリゴマーと第２のオリゴマーであり、それぞれの結合体が前記第１のオリゴマーと前記第２のオリゴマーに結合したヒトインスリンを含み、
（ａ）  前記第１のオリゴマーはインスリンのＬｙｓＢ２９で共有結合し、
（ｂ）  前記第２のオリゴマーはインスリンのＮ末端Ａ１またはＮ末端Ｂ１で共有結合
している請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項５】
前記混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のインビボ活性よりも大きなインビボ活性を有する、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項６】
前記混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも大きなインビトロ活性を有する、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項７】
前記混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合、キモトリプシンによる分解に対する増大した抵抗性を有する、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項８】
前記実質的に純粋に単分散の混合物の被験体への投与が、前記混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物の被験体間変動よりも低い被験体間変動を生ずる、請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【請求項９】
請求項１に記載される実質的に純粋に単分散の混合物および薬学的認容性のキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１０】
インスリン欠乏の治療のための医薬の製造における請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物の使用。
【請求項１１】
それぞれの結合体が、式：
【化１】
0005312720.tif 000027
［式中、
Ｂは結合成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ”は個々に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分で、かつＲ’はポリアルキレングリコール成分であるか、あるいはＲ’は親油性成分で、かつＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎはそれぞれ０または１であり、
ｐはインスリン薬物に結合されたオリゴマー数を表し、１から、インスリン薬物における求核性残基の数までの整数である］を有する請求項１に記載の実質的に純粋に単分散の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、薬物−オリゴマー結合体、特にインスリン薬物−オリゴマー結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】  糖尿病、炭化水素代謝の障害は、古代から知られている。糖尿病は、インスリンの不充分な産生またはインスリンに対する感度の低下から生じる。インスリン分子は、ジスルフィド結合により連結された２本の鎖のアミノ酸からなる（分子量６，０００）。膵臓の島のβ−細胞は、プロインスリンとして知られているインスリンの単一鎖前駆体を分泌する。プロインスリンのタンパク質分解は、４個の塩基性アミノ酸（プロインスリン鎖中の数３１、３２、６４及び６５：それぞれ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）と連結（「Ｃ」）ポリペプチドを除去する。得られる２本鎖のインスリン分子においては、Ａ鎖はアミノ末端にグリシンを有し、Ｂ鎖はアミノ末端にフェニルアラニンを有する。【０００３】  インスリンは、単量体、二量体または３個の二量体から形成される６量体として存在する。この６量体は２つのＺｎ2+原子と配位する。生物活性はこのモノマーに存在する。最近迄、ヒトの糖尿病を治療するのに、殆どウシ及びブタのインスリンのみが使用されたが、種間のインスリンの多数のバリエーションが知られている。ブタのインスリンはヒトインスリンに殆ど類似しているが、Ｂ−鎖のＣ−末端にスレオニン残基でなくアラニンを有する点でのみ異なる。これらの差に拘わらず、哺乳類のインスリンは同等の比活性を有する。最近迄、動物の抽出物がこの疾患の治療に使用するすべてのインスリンを提供している。組み換え技術の進展によって、ヒトインスリンの商業的な規模での製造が可能である（例えば、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｌｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から市販されているＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）インスリン）。【０００４】  インスリンは、身体の大部分の細胞によるグルコースの正常な利用に必要である。糖尿病の人では、グルコースを使用する正常な能力が阻害され、それによって血糖レベルを上昇させる（高血糖症）。グルコースが血液中に蓄積するに従い、過剰なレベルの糖が尿中に排出する（糖尿）。糖尿病の他の症状は、尿の量と頻度の増加、喉のかわき、かゆみ、空腹、体重減少、及び衰弱を含む。【０００５】  ２つのバリエーションの糖尿病がある。タイプＩはインスリン−依存の真性糖尿病、すなわちＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは以前若年型糖尿病と呼ばれていた。ＩＤＤＭでは、インスリンは膵臓から分泌されず、外部源から提供されなければならない。タイプＩＩの成人型糖尿病は、ある進行した病状ではインスリンを必要とするが、通常食事によりコントロールされ得る。【０００６】  １９２０年代においてインスリンが単離される前には、大多数の患者は発病後まもなく死んだ。糖尿病は、治療しないとケトーシス、血液中のケトンの蓄積、脂肪分解の生成物に至り、これに続いてむかつきと嘔吐を伴うアシドーシス（血液中での酸の蓄積）が起こる。炭化水素及び脂肪の代謝障害による毒性生成物が蓄積するのに従って、患者は糖尿病の昏睡におちいる。【０００７】  糖尿病の治療は、通常、インスリンの規則的な注射を必要とする。糖尿病の治療としてのインスリンの使用は、Ｂａｎｔｉｎｇら（「真性糖尿病の治療における膵臓抽出物」、Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１２：１４１〜１４６（１９２２）��が膵臓からの活性抽出物が糖尿病の犬で治療効果を有することを示した、１９２２年にさかのぼる。同年における膵臓抽出物による糖尿病患者の治療は、劇的な、救命につながる臨床面での改善をもたらした。インスリン注射の不便さにより、インスリン投与と生物同化作用を改善するための多大な努力が行なわれた。【０００８】  インスリンを経口投与により送達する試みが行なわれている。糖尿病患者で正常血糖を得るためのインスリンの経口投与に伴う問題は、医薬及び医療の文献によく記録されている。胃腸管中の消化酵素は、インスリンを急速に分解し、生物的に不活性な分解生成物となる。胃では、例えば、経口投与したインスリンは、酵素によるタンパク質分解と酸性分解を受ける。腸中での残存は、過剰なタンパク質分解により妨げられる。体腔中では、インスリンは、胃及び膵臓の酵素、エキソ及びエンドペプチダーゼ、及び刷子縁ペプチダーゼを含む、種々の酵素により攻撃される。この酵素の攻撃から生き残ったとしても、インスリンがインビボで受容体に達する前に越えなければならない生物的なバリアは、インスリンの経口投与を制限する。例えば、インスリンは膜透過性が低く、体腔から血液流中へと通過する能力が制限されている。【０００９】  インスリン等の医薬活性ポリペプチドは、ポリエチレングリコールの多分散の混合物またはポリエチレングリコール含有のポリマーの多分散の混合物により結合体化されて、薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物を提供する。例えば、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号は、インスリン等のポリペプチドをＵｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅにより供給されているＭＰＥＧ−１９００及びＭＰＥＧ−５０００等の種々のポリエチレングリコールにより結合体化することを提案している。【００１０】  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号は、生物活性な求核物質を５，０００ダルトンの数平均分子量を有する、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ）等のポリエチレングリコールと結合体化することを提案している。【００１１】  Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号は、インスリン等のポリペプチドをポリエチレングリコール変成のグリコ脂質ポリマーとポリエチレングリコール変成の脂肪酸ポリマーにより結合体化することを提案している。各組み合わせから得られるポリマー数平均分子量は、約５００から約１０，０００ダルトンの範囲であることが好ましい。【００１２】  ポリエチレングリコールは、通常、エチレンオキサイドの塩基触媒開環重合により製造される。この反応は、水酸化カリウムを触媒として、エチレンオキサイドをエチレングリコールに添加することにより開始される。この方法は、一定の範囲の分子量内の数平均分子量を有する、ポリエチレングリコールポリマーの多分散の混合物を生じる。例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭｉＩｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により提供されるＰＥＧ製品は、ＰＥＧ４００（Ｍn３８０〜４２０）；ＰＥＧ１，０００（Ｍn９５０〜１，０５０）；ＰＥＧ１，５００（Ｍn１，４００〜１，６００）；及びＰＥＧ２，０００（Ｍn１，９００〜２，２００）等の多分散の混合物で提供される。
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  オリゴマーがポリエチレングリコールを含む、インスリン−オリゴマー結合体の非多分散の混合物を提供することが望ましい。
【００１４】  ポリエチレングリコールを含むインスリンオリゴマー結合体の本発明の実施形態の非多分散の混合物は、同じ数平均分子量を有する類似の結合体の多分散の混合物よりも高いインビボ活性を呈することが思いがけなくも見出された。この増大した活性は、用量の必要条件を低下させる。更には、ポリエチレングリコールを含むインスリン−オリゴマー結合体の本発明の実施形態の非多分散の混合物は、通常、類似の結合体の多分散の混合物よりも腸消化のインビトロモデルで生き残るのに更に有効である。更には、また、ポリエチレングリコールを含むインスリン−オリゴマー結合体の本発明の実施形態の非多分散の混合物は、通常、類似の結合体の多分散の混合物よりも被験者間変動も少ない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  本発明の実施形態によれば、ポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物をそれぞれが含む結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。このポリエチレングリコール成分は、好ましくは少なくとも２、３、あるいは４個のポリエチレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。このオリゴマーは、好ましくは親油性成分を更に含む。このインスリン薬物は、好ましくはヒトインスリンである。このオリゴマーは、好ましくはヒトインスリンのＬｙｓB29に共有結合で結合する。この結合体は、好ましくはこの結合体が水溶性であり、生体膜に浸透することが可能であるように両親媒性的にバランスしている。この混合物は、好ましくは単分散混合物であり、最も好ましくは純粋に単分散の混合物である。ある実施形態においては、このオリゴマーは、非加水分解性結合によりインスリンに共有結合で結合した第１のポリエチレングリコール成分と加水分解性結合により第１のポリエチレングリコール成分に共有結合で結合した第２のポリエチレングリコール成分とを含む。
【００１６】  本発明の他の実施形態によれば、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル端末ポリエチレングリコール成分に、カルボン酸成分に遠位の末端で、共有結合で結合したヘキサン酸を含むオリゴマーのカルボン酸成分に、ヒトインスリンのＬｙｓB29で共有結合で結合したヒトインスリンを各結合体が含む、結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
【００１７】  本発明のこれらの実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、多分散の混合物のそれと比較した場合、好ましくは改良された性質を有する。一つの実施形態においては、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、そしてこの混合物が実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のインビボ活性よりも大きいインビボ活性を有する、結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
【００１８】  もう一つの実施形態においては、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、そしてこの混合物が実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビトロ活性よりも大きいインビボ活性を有する、結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
【００１９】  なお更にもう一つの実施形態においては、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、そしてこの混合物が実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合、キモトリプシンによる分解に対する増大した抵抗性を有する、結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
【００２０】  なお更にもう一つの実施形態においては、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、この混合物が実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する、結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
【００２１】  本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、好ましくは２つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。更に好ましくは、本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、３つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、４つの上述の性質をすべて有する。
【００２２】  本発明の更に他の実施形態によれば、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、この混合物が約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、結合体の混合物が提供される。
【００２３】  本発明のなお他の実施形態によれば、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、そしてこの混合物が１０、０００以上の分散度係数（ＤＣ）：
【数３】
0005312720.tif 000002
（式中、
ｎはこのサンプル中の異なる分子数であり、
Ｎiはこのサンプル中のｉ番目の分子数であり、
Ｍiはｉ番目の分子の質量である）を有する、結合体の混合物が提供される。
【００２４】  本発明の他の実施形態によれば、各結合体がオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、結合体の混合物が提供される。
【００２５】  本発明の更に他の実施形態によれば、各結合体が同じであり、そして式：
【化５】
0005312720.tif 000003
（式中、
Ｂは結合成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ'及びＧ''は個別に選ばれたスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分であり、Ｒ'はポリアルキレングリコール成分であるか、又はＲ'は親油性成分であり、そしてＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍ及びｎはそれぞれ０または１であり、
ｐは１とインスリン薬物上の求核性残基の数との間の整数である）を有する、結合体の混合物が提供される。
【００２６】  また、本発明の結合体混合物を含む医薬組成物並びに有効量のこのような医薬組成物を投与することにより、このような治療を必要とする被験者のインスリン欠乏を治療する方法も提供される。
【００２７】  加えて、このような結合体混合物を合成する方法が提供される。
【００２８】  本発明の実施形態のインスリン−オリゴマー結合体混合物は、慣用の多分散のインスリン−オリゴマー結合体混合物と比較した場合、増大したインビボ活性及び／または低下した被験者間変動及び／または低下したキモトリプシンによる分解を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】  本発明は、ここで記述される好ましい実施形態に関して述べられる。しかしながら、これらの実施形態は本発明を例示する目的のものであり、クレームにより規定される本発明の範囲を限定するものと考えられるべきでないことを認識するべきである。
【００３０】  ここで使用されるように、「非多分散の」という用語は、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄらへの米国特許第５，４０５，８７７号；及びＥｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号で記述されている、多分散の混合物と対照的な分散度を有する化合物の混合物を記述するのに使用される。
【００３１】  ここで使用されるように、「実質的に単分散の」という用語は、この混合物中の化合物の少なくとも約９５パーセントが同一の分子量を有する化合物の混合物を記述するのに使用される。
【００３２】  ここで使用されるように、「単分散の」という用語は、この混合物中の化合物の約１００パーセントの化合物が同一の分子量を有する化合物の混合物を記述するのに使用される。
【００３３】  ここで使用されるように、「実質的に純粋に単分散の」という用語は、この混合物中の化合物の少なくとも約９５パーセントの化合物が同一の分子量と同一の構造を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。このように、実質的に純粋に単分散の混合物は、実質的に単分散の混合物であるが、実質的に単分散の混合物は、必ずしも実質的に純粋に単分散の混合物ではない。
【００３４】  ここで使用されるように、「純粋に単分散の」という用語は、この混合物中の化合物の約１００パーセントの化合物が同一の分子量と同一の構造を有する、化合物の混合物を記述するのに使用される。このように、純粋に単分散の混合物は単分散の混合物であるが、単分散の混合物は、必ずしも実質的に純粋に単分散の混合物ではない。
【００３５】  ここで使用されるように、「重量平均分子量」という用語は、この混合物中の所定の分子に対する重量分率にこの混合物中の各分子に対する分子量を掛けた積の合計として定義される。「重量平均分子量」は記号Ｍwにより表される。
【００３６】  ここで使用されるように、「数平均分子量」という用語は、混合物の全重量を混合物中の分子数で割ったものとして定義され、記号Ｍnにより表される。
【００３７】  ここで使用されるように、「分散度係数」（ＤＣ）という用語は、式：
【数４】
0005312720.tif 000004
（式中、
ｎはサンプル中の異なる分子の数であり、
Ｎiはサンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍiはｉ番目の分子の質量である）
により定義される。
【００３８】  ここで使用されるように、「被験者内変動」という用語は、この被験者が異なる時に同一用量の薬物または医薬組成物を投与された場合、同一被験者内に起こる活性の変動を意味する。
【００３９】  ここで使用されるように、「被験者間変動」という用語は、各被験者が同一用量の一定の薬物または医薬配合物を投与された場合、２人あるいはそれ以上の間の活性の変動を意味する。
【００４０】  ここで使用されるように、「インスリン薬物」という用語は、インスリンの全部あるいは一部の生物活性を有する薬物を意味する。
【００４１】  ここで使用されるように、「インスリン」という用語は、天然、合成、あるいは遺伝子工学による原料により提供される、ヒトインスリン、ウシインスリン、ブタインスリンまたはクジラインスリンを意味する。
【００４２】  ここで使用されるように、「インスリン類縁体（Insulin analogs）」という用語は、インスリンの全部あるいは一部の活性を保ちながら、一つあるいはそれ以上のアミノ酸を置き換えたインスリンを意味する。この類縁体は、置換位置を添字として置換アミノ酸を記述し、続いてインスリンを表示することにより記述される。例えば、「ＰｒｏB29インスリン、ヒト」は、ヒトインスリン分子のＢ２９位置に通常見出されるリジンをプロリンにより置換したということを意味する。
【００４３】  当業者ならば理解するように、インスリン類縁体を種々の手段により得ることができる。例として、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位等の構造を有する相互作用性な結合能力をそれ程失わずに、あるアミノ酸をインスリン構造中の他のアミノ酸に置換してもよい。インスリンの相互作用性能力と性質は、その生物的機能の活性を規定するので、あるアミノ酸配列置換をアミノ酸配列で行って、それにも拘わらず似た性質のポリペプチドのままとすることができる。
【００４４】  このような置換を行う場合、アミノ酸の疎水性親水性指標（hydropathic index）を考慮してもよい。ポリペプチドに相互作用性の生物的機能を付与する場合のアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該分野では一般的に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性親水性は、得られるポリペプチドの二次的な構造に寄与し、次には、これがこのタンパク質の他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸には、その疎水性と電荷性能を基準にして疎水性親水性指標が次のように割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。当業者に理解されるように、あるアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標あるいは得点を有する他のアミノ酸により置換され、なお、類似の生物活性のポリペプチドを生じる、すなわち、なお機能的に同等なポリペプチドを得ることができる。このような変化を行う場合、疎水性親水性指標がお互いに±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、お互いに±１以内であるものが特に好ましく、そしてお互いに±０．５以内であるものが更に特に好ましい。
【００４５】  また、似たアミノ酸の置換を親水性を基準として有効に行うことができることも当業者では理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大の局所的な平均の親水性がその隣接したアミノ酸の親水性により支配されて、このタンパク質の生物的性質と相関することを規定している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者ならば理解するように、アミノ酸は、類似の親水性値を有するもう一つのアミノ酸に置換され、なお、生物的に同等な、特に免疫的に同等なポリペプチドを得ることができる。このような変化においては、親水性値がお互いに±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、お互いに±１以内であるものが特に好ましく、そしてお互いに±０．５以内であるものが更に特に好ましい。
【００４６】  それゆえ、上記に詳述したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、これらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前出の性能を考慮に入れた、例示の置換物（すなわち、ポリペプチドの生物活性を著しく変えずに交換できるアミノ酸）は、当業者に既知であり、例えば：アルギニン及びリジン；グルタメート及びアスパルテート；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；及びバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
【００４７】  ここで使用されるように、「インスリンフラグメント」という用語は、インスリンの全部あるいは一部の活性を保持する、インスリン中に見出されるアミノ酸配列のセグメントを意味する。インスリンフラグメントは、アミノ酸配列中の位置を記述し、続いてアミノ酸を記述することにより示される。例えば、「Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン」フラグメントは、ヒトインスリンアミノ酸配列中のＢ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０の位置に対応する、６個のアミノ酸配列である。
【００４８】  ここで使用されるように、「インスリンフラグメント類縁体」という用語は、このセグメント中の一つあるいはそれ以上のアミノ酸をインスリンの全部あるいは一部の活性を保持しながら置換した、インスリン分子中に見出されるアミノ酸配列のセグメントを意味する。
【００４９】  ここで使用されるように、「ＰＥＧ」という用語は、直鎖あるいは分岐鎖のポリエチレングリコールポリマーを指し、ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のモノメチルエーテルを含む。「ＰＥＧサブユニット」及びポリエチレングリコールサブユニットという用語は、単一のポリエチレングリコール単位、すなわち−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−を指す。
【００５０】  ここで使用されるように、「親油性」という用語は、脂質中に溶解する能力及び／または生物膜への浸透、それとの相互作用及び／または横断の能力を意味し、そして「親油性成分」または「親油性基」という用語は、親油性であり、そして／またはもう一つの化学物質に結合する場合には、このような化学物質の親油性を増大させる成分を意味する。親油性成分の例は、限定するのではないが、アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリル、アダマンチルなどを含む。
【００５１】  ここで使用されるように、「低級アルキル」という用語は、１から５個の炭素原子を有する置換あるいは非置換のアルキル成分を指す。
【００５２】  ここで使用されるように、「高級アルキル」という用語は、６個あるいはそれ以上の炭素原子を有する置換あるいは非置換のアルキル成分を指す。
【００５３】  本発明の実施形態においては、インスリン−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物が提供される。好ましくは、この混合物中の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントの結合体は同じ分子量を有する。更に好ましくは、この混合物は単分散の混合物である。なお更に好ましくは、この混合物は実質的に純粋に単分散の混合物である。更に好ましくは、この混合物中の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントの結合体は同じ分子量と同じ分子構造を有する。最も好ましくは、この混合物は純粋に単分散の混合物である。
【００５４】  このインスリン薬物は好ましくはインスリンである。更に好ましくは、このインスリン薬物はヒトインスリンである。しかしながら、例えば、プロインスリン、インスリン類縁体、インスリンフラグメント、及びインスリンフラグメント類縁体を含む、当業者に既知の種々のインスリン薬物からこのインスリン薬物を選んでもよいことを理解することができる。インスリン類縁体は、限定するのではないが、ＡｓｐB28ヒトインスリン、ＬｙｓB28ヒトインスリン、ＬｅｕB28ヒトインスリン、ＶａｌB28ヒトインスリン、ＡｌａB28ヒトインスリン、ＡｓｐB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｅｕB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＶａｌB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＡｌａB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、並びに上述の置換のガイドラインを用いて提供される類縁体を含む。インスリンフラグメントは、限定するのではないが、Ｂ２２−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２３−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２６−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２７−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｂ３０ヒトインスリン、ヒトインスリンのＡ鎖、及びヒトインスリンのＢ鎖を含む。インスリンフラグメント中で上述の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を置換することにより、インスリンフラグメント類縁体を提供することもできる。
【００５５】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含む種々のオリゴマーであってもよい。好ましくは、このオリゴマーのポリエチレングリコール成分は、少なくとも２、３あるいは４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。更に好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも５あるいは６個のポリエチレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
【００５６】  このオリゴマーは、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分、及び停止成分を含む、一つあるいはそれ以上の他の成分を含んでもよい。このオリゴマー中の種々の成分は、加水分解性あるいは非加水分解性結合のいずれかにより相互に共有結合で結合する。
【００５７】  このオリゴマーは、限定するのではないが、糖、ポリアルキレンオキシド、及びポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含む、一つあるいはそれ以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリエチレングリコール成分に加えての成分）を更に含む。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるので、追加の親水性成分はポリエチレングリコール成分であってよい。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合により連結している場合には、同じ成分であると考えられる。例えば、成分
【化６】
0005312720.tif 000005
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、単一のポリエチレングリコール成分である。この成分がこのオリゴマー中の唯一の親水性成分である場合には、このオリゴマーは追加の親水性成分を含まない。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合以外の結合により連結している場合には、異なる成分であると考えられる。例えば、成分
【化７】
0005312720.tif 000006
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分と２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態のオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含み、追加の親水性成分を含まない。
【００５８】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上の親油性成分を更に含む。この親油性成分は、好ましくは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐のアルキル成分、あるいは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐の脂肪酸成分である。親油性成分がアルキル成分である場合には、これらは、好ましくは１から２８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和のアルキル成分である。更に好ましくは、このアルキル成分は、２から１２個の炭素原子を有する。親油性成分が脂肪酸成分である場合、これは好ましくは２から１８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和である天然脂肪酸成分である。更に好ましくは、この脂肪酸成分は３から１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、この脂肪酸成分は少なくとも４、５あるいは６個の炭素原子を有する。
【００５９】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上のスペーサー成分を更に含む。例えば、スペーサー成分を使用して、親油性成分から親水性成分を分離するか、インスリン薬物から親油性成分または親水性成分を分離するか、第２の親水性あるいは親油性成分から第１の親水性あるいは親油性成分を分離するか、あるいはリンカー成分から親水性成分または親油性成分を分離することができる。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロール及びグリセリン成分からなる群から選ばれる。
【００６０】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に連結するのに使用される、一つあるいはそれ以上のリンカー成分を更に含んでよい。リンカー成分は、好ましくはアルキル及び脂肪酸成分からなる群から選ばれる。
【００６１】  このオリゴマーは、インスリン薬物に連結しない、一つあるいはそれ以上のオリゴマーの末端で一つあるいはそれ以上の末端成分を更に含んでなってもよい。この末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分であり、更に好ましくは低級アルキルまたは低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、この末端成分はメチルまたはメトキシである。この末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分である一方、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、糖、コレステロール、アルコール、及び脂肪酸を含む、種々の成分であってもよいことを理解すべきである。
【００６２】  このオリゴマーは、このインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する。ある実施形態においては、このインスリン薬物は、加水分解性結合（例えば、エステルあるいはカーボネート結合）を用いてオリゴマーに連結する。加水分解性の連結は、前駆薬物として作用するインスリン薬物−オリゴマー結合体を提供する。例えばインスリン薬物オリゴマー結合体が不活性（すなわち、この結合体がインスリン薬物の主要な作用機構により身体に影響する能力を欠く）である場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーが各インスリン薬物−オリゴマー結合体から開裂して、活性な薬物をもたらすのに従って、加水分解性の連結は、インスリン薬物を一定の時間にわたって投与する時間放出あるいは制御放出効果をもたらすことができる。他の実施形態においては、このインスリン薬物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を用いて、オリゴマーに連結する。インスリン薬物−オリゴマー結合体を血液流中で長時間、好ましくは少なくとも２時間循環させることが望ましい場合には、非加水分解性の結合の使用が好ましい。当業者ならば理解するように、このオリゴマーがインスリン薬物に共有結合で結合している場合、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に共有結合で連結するのに使用される、一つあるいはそれ以上の結合成分を更に含む。結合成分は、好ましくは共有結合、エステル成分、カーボネート成分、カルバメート成分、アミド成分及び２級アミン成分からなる群から選ばれる。オリゴマー上の一つ以上の成分がインスリン薬物に共有結合で結合してもよい。
【００６３】  このオリゴマーがインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する一方で、このオリゴマーをインスリン薬物に非共有結合で結合して、非共有結合で結合体化したインスリン薬物−オリゴマー錯体を形成することは理解されるべきである。当業者ならば理解するように、非共有結合の連結は、限定するのではないが、水素結合、イオン結合、ファンデアワールス結合、及びミセルあるいはリポソームカプセル化を含む。本発明の実施形態によれば、当業者ならば理解するように、オリゴマーを好適に構成、変成し、及び／または適宜官能基化して、選ばれた方法で非共有結合の結合の能力（例えば、水素結合能力を賦与する）を賦与してもよい。本発明の他の実施形態によれば、限定するのではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、及びアミノサリチル酸誘導体を含む、種々の化合物により、オリゴマーを誘導体とすることができる。得られるオリゴマーを薬物分子、医薬製品、及び／または医薬賦形剤と非共有結合により連結（錯体）することができる。得られる錯体は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。本発明の更に他の実施形態により、オリゴマーをアミン及び／またはアルキルアミンにより誘導体とすることができる。好適な酸性条件下で、得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬製品及び／または医薬賦形剤と共に非共有結合により結合体化した錯体を形成することができる。このような錯体化から得られる製品は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。
【００６４】  一つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をインスリン薬物に連結してもよい。この複数のオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、この複数のオリゴマーはお互いに異なってもよく、あるいは、この複数のオリゴマーの一部は同一でもよく、また一部は異なってよいことを理解すべきである。複数のオリゴマーをインスリン薬物に連結する場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーを加水分解性結合を有するインスリン薬物と連結し、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーを非加水分解性結合を有するインスリン薬物と連結するのが好ましい。あるいは、この複数のオリゴマーをインスリン薬物に連結する結合のすべてが加水分解性であってもよいが、種々の程度の加水分解性を有し、例えば、一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から急速に取り外され、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から緩慢に取り外されるようであってもよい。
【００６５】  限定するのではないが、求核性ヒドロキシル官能基及び／またはアミノ官能基を含む、インスリン薬物の種々の求核残基でこのオリゴマーをインスリン薬物と連結してもよい。インスリン薬物がポリペプチドである場合には、例えばセリン及び／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見出され、そして例えばヒスチジン及び／またはリジン残基で、及び／またはポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見出される。オリゴマーがインスリンポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端に連結している場合には、この連結は、好ましくは２級アミンを形成する。このインスリン薬物がヒトインスリンである場合には、例えばこのオリゴマーをＧｌｙA1のアミノ官能基、ＰｈｅB1のアミノ官能基、及びＬｙｓB29のアミノ官能基を含む、インスリンのアミノ官能基に連結してもよい。一つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。２つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＰｈｅB1のアミノ官能基とＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。一つ以上のオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、モノ−結合体化したヒトインスリンについて高活性（改善されたグルコース低下能力）が観察される。
【００６６】  本発明のインスリン薬物−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物を種々の方法により合成することができる。例えば、オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するのに充分な条件下で、カルボン酸の実質的に単分散の混合物をポリエチレングリコールの実質的に単分散の混合物と接触させることにより、カルボン酸とポリエチレングリコールからなるオリゴマーの実質的に単分散の混合物が合成される。次に、実質的に単分散の混合物のオリゴマーが活性化され、インスリン薬物と反応して、インスリン薬物−オリゴマー結合体を提供することが可能になる。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路の一つの実施形態を図３に図示し、下記の例１１〜１８で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路のもう一つの実施形態を図４に図示し、下記の例１９〜２４で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路の更にもう一つの実施形態を図５に図示し、下記の例２５〜２９で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図６に図示し、下記の例３０〜３１で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路のもう一つの実施形態を図７に図示し、下記の例３２〜３７で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路の更にもう一つの実施形態を図８に図示し、下記の例３８で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図９に図示し、下記の例３９で説明する。活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供する合成経路のもう一つの実施形態を図１０に図示し、下記の例４０で説明する。
【００６７】  活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物をインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供するのに充分な条件下で、インスリン薬物の実質的に単分散の混合物と反応させてもよい。好ましい合成を下記の例４１で述べる。当業者ならば理解するように、この反応条件（例えば、選ばれたモル比、溶媒混合物及び／またはｐＨ）をコントロールして、活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物とインスリン薬物の実質的に単分散の混合物との反応から得られるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が実質的に単分散の混合物であるようにできる。例えば、反応溶液のｐＨをリジンのｐＫa以下に維持することにより、リジンのアミノ官能基での結合を抑制することができる。あるいは、例えば例５０で下記に述べるようにＨＰＬＣを用いて、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離、単離して、インスリン薬物−オリゴマー結合体、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−結合体の実質的に単分散の混合物を提供することができる。限定するのではないが、質量分析を含む、当業者に公知の種々の方法を用いて、特定の単離した結合体の結合度（例えば、単離した分子がモノ−、ジ−、またはトリ−結合体であるかどうか）を求め、そして／または確認することができる。限定するのではないが、配列分析、ペプチドマッピング、選択的な酵素開裂、及び／またはエンドペプチダーゼ開裂を含む、当業者に公知の種々の方法を用いて、特定の結合体構造（このオリゴマーがＧｌｙA1、ＰｈｅB1またはＬｙｓB29でヒトインスリンモノ結合体であるかどうかを）を決定し、そして／または確認することができる。
【００６８】  当業者ならば理解するように、例えば、このインスリン薬物とＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）等の好適な試剤とを反応させることにより、インスリン薬物上の一つあるいはそれ以上の反応部位をブロックすることができる。例えばインスリン薬物がポリペプチドである場合には、この方法が好ましく、そしてこのポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端でオリゴマーを有する、不飽和結合体（すなわち、すべての求核性残基が結合体化されてはいない結合体）を形成することが望ましい。このようなブロック化に続いて、このブロック化したインスリン薬物の実質的に単分散の混合物を活性化されたオリゴマーの実質的に単分散の混合物と反応させて、一つあるいはそれ以上の求核性残基に連結したオリゴマーを持ち、そして他の求核性残基に連結したブロック化成分を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供することができる。当業者ならば理解するように、この結合反応の後、このインスリン薬物オリゴマー結合体を脱ブロック化してもよい。必要ならば、次に、このインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を前述のようにして分離して、インスリン薬物−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物を提供してもよい。あるいは、脱ブロック化に先立ってこのインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離してもよい。
【００６９】  本発明の他の実施形態により、結合体の実質的に単分散の混合物が提供され、各結合体は、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル端末ポリエチレングリコール成分に、カルボン酸成分に遠位の末端で、共有結合で結合したヘキサン酸を含むオリゴマーのカルボン酸成分に、インスリンのＬｙｓB29で共有結合で結合したヒトインスリンを含む。好ましくは、実質的に単分散の混合物中の各結合体は、７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル端末ポリエチレングリコール成分に、カルボン酸成分に遠位の末端で、共有結合で結合したヘキサン酸からなるオリゴマーのカルボン酸成分にインスリンのＬｙｓB29で共有結合で結合したヒトインスリンからなる。
【００７０】  本発明のこれらの実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、好ましくは多分散の混合物の性質に比較した場合、改善された性質を有する。例えば、インスリン薬物−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビボ活性よりも大きい、インビボ活性を有する。当業者ならば理解するように、実質的に単分散の混合物の数平均の分子量と多分散の混合物の数平均の重量を、限定するのではないが、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４−４０２（第２編、１９９１）に記述されているような、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ等のサイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により測定してもよい。
【００７１】  もう一つの例として、インスリン薬物オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビトロ活性よりも大きい、インビトロ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、実質的に単分散の混合物の数平均の分子量と多分散の混合物の数平均分子量を測定してもよい。
【００７２】  当業者ならば理解するように、特定の混合物のインビトロ活性を種々の方法により測定してもよい。好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計（Microphysiometer）を用いて、このインビトロ活性を測定する。この微少生理計は、培養用孔（培養孔）中の培養細胞に添加した薬物に応答する細胞外の酸性化の速度の小さな変化をモニターする。この応答は試験下の分子の活性に比例する。好ましくは、実質的に単分散の混合物のインビトロ活性は、多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約５パーセント大きい。更に好ましくは、実質的に単分散の混合物のインビトロ活性は、多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。
【００７３】  更にもう一つの例として、インスリン薬物−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合、好ましくはキモトリプシンによる分解に増大した耐性を有する。キモトリプシンに対する耐性は、下記の例５２に概述したものと類似の方法を用いて、試験すべき分子をキモトリプシン中で消化した場合に、残存するパーセントに相当する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、実質的に単分散の混合物の数平均の分子量と多分散の混合物の数平均分子量を測定してもよい。好ましくは、実質的に単分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。更に好ましくは、実質的に単分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約２０パーセント大きい。
【００７４】  なお更にもう一つの例として、好ましくはインスリン薬物−オリゴマー結合体の実質的に単分散の混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、実質的に単分散の混合物の数平均の分子量と多分散の混合物の数平均分子量を測定してもよい。当業者ならば理解するように、この被験者間変動を種々の方法により測定してもよい。好ましくは、この被験者間変動を次のように計算する。用量応答曲線下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量応答曲線とベースラインの間の面積）を各被験者について求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者の数で割ることにより、すべての被験者に対する平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均のＡＵＣの間の差の絶対値を各被験者について求める。次に、得られる差の絶対値を足して、被験者間変動を表わす値を得る。低い値は低い被験者間変動を表わし、高い値は高い被験者間変動を表わす。好ましくは、実質的に単分散の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約１０パーセント少ない。更に好ましくは、実質的に単分散の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約２５パーセント少ない。
【００７５】  本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、好ましくは２つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。更に好ましくは、本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、３つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態の結合体の実質的に単分散の混合物は、４つの上述の性質をすべて有する。
【００７６】  本発明の更に他の実施形態においては、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、結合体の混合物が提供される。この混合物中の各結合体は、ポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結した、インスリン薬物を含む。この標準偏差は、好ましくは約１４ダルトン未満であり、更に好ましくは約１１ダルトン未満である。限定するのではないが、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ、ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４〜４０２（第２編、１９９１）に記述されているような、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ等のサイズ排除クロマトグラフィを含む、当該分野の技術者に既知の種々の方法により、この分子量分布を測定することができる。次に、当業者ならば理解するように、この分子量分布の標準偏差を統計的な方法により求めることができる。
【００７７】  このインスリン薬物は好ましくはインスリンである。更に好ましくは、このインスリン薬物はヒトインスリンである。しかしながら、例えば、プロインスリン、インスリン類縁体、インスリンフラグメント、及びインスリンフラグメント類縁体を含む、当業者に既知の種々のインスリン薬物からこのインスリン薬物を選んでもよいことを理解すべきである。インスリン類縁体は、限定するのではないが、ＡｓｐB28ヒトインスリン、ＬｙｓB28ヒトインスリン、ＬｅｕB28ヒトインスリン、ＶａｌB28ヒトインスリン、ＡｌａB28ヒトインスリン、ＡｓｐB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｅｕB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＶａｌB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＡｌａB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、並びに上述の置換のガイドラインを用いて提供される類縁体を含む。インスリンフラグメントは、限定するのではないが、Ｂ２２−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２３−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２６−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２７−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｂ３０ヒトインスリン、ヒトインスリンのＡ鎖、及びヒトインスリンのＢ鎖を含む。インスリンフラグメント中で上述の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を置換することにより、インスリンフラグメント類縁体を提供してもよい。
【００７８】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含む、種々のオリゴマーであってもよい。好ましくは、このオリゴマーのポリエチレングリコール成分は、少なくとも２、３あるいは４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。更に好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも５あるいは６個のポリエチレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
【００７９】  このオリゴマーは、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分、及び末端成分を含む、一つあるいはそれ以上の他の成分を含んでなってもよい。このオリゴマー中の種々の成分は、加水分解性あるいは非加水分解性結合のいずれかにより相互に共有結合で結合する。
【００８０】  このオリゴマーは、限定するのではないが、糖、ポリアルキレンオキシド、及びポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含む、一つあるいはそれ以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリエチレングリコール成分に加えての成分）を更に含む。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるので、追加の親水性成分はポリエチレングリコール成分である。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合により連結している場合には、同じ成分であると考えられる。例えば、成分：
【化８】
0005312720.tif 000007
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、単一のポリエチレングリコール成分である。この成分がこのオリゴマー中の唯一の親水性成分である場合には、このオリゴマーは追加の親水性成分を含まない。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合以外の結合により連結している場合には、異なる成分であると考えられる。例えば、成分：
【化９】
0005312720.tif 000008
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分と２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態のオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含み、追加の親水性成分を含まない。
【００８１】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上の親油性成分を更に含む。この親油性成分は、好ましくは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐のアルキル成分、あるいは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐の脂肪酸成分である。親油性成分がアルキル成分である場合には、これらは、好ましくは１から２８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和のアルキル成分である。更に好ましくは、このアルキル成分は、２から１２個の炭素原子を有する。親油性成分が脂肪酸成分である場合、これは好ましくは２から１８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和である天然脂肪酸成分である。更に好ましくは、この脂肪酸成分は３から１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、この脂肪酸成分は少なくとも４、５あるいは６個の炭素原子を有する。
【００８２】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上のスペーサー成分を更に含んでなってもよい。例えば、スペーサー成分を使用して、親油性成分から親水性成分を分離するか、インスリン薬物から親油性成分または親水性成分を分離するか、第２の親水性あるいは親油性成分から第１の親水性あるいは親油性成分を分離するか、あるいはリンカー成分から親水性成分または親油性成分を分離してもよい。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロール及びグリセリン成分からなる群から選ばれる。
【００８３】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に連結するのに使用する、一つあるいはそれ以上のリンカー成分を更に含む。リンカー成分は、好ましくはアルキル及び脂肪酸成分からなる群から選ばれる。
【００８４】  このオリゴマーは、インスリン薬物に連結しない、一つあるいはそれ以上のオリゴマーの末端で一つあるいはそれ以上の末端成分を更に含んでなってもよい。末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分であり、更に好ましくは低級アルキルまたは低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、この末端成分はメチルまたはメトキシである。この末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分である一方、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、糖、コレステロール、アルコール、及び脂肪酸を含む、種々の成分であってもよいことを理解すべきである。
【００８５】  このオリゴマーは、好ましくはこのインスリン薬物に共有結合で結合する。ある実施形態においては、このインスリン薬物は、加水分解性結合（例えば、エステルあるいはカーボネート結合）を用いてオリゴマーに連結する。加水分解性の連結は、前駆薬物として作用するインスリン薬物−オリゴマー結合体を提供する。例えばインスリン薬物−オリゴマー結合体が不活性（すなわち、この結合体がインスリン薬物の主要な作用機構により身体に影響する能力を欠く）である場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーが各インスリン薬物−オリゴマー結合体から開裂して、活性な薬物をもたらすのに従って、加水分解性の連結は、インスリン薬物を一定の時間にわたって投与する時間放出あるいは制御放出効果をもたらす。一つの実施形態においては、このインスリン薬物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を用いて、オリゴマーに連結する。インスリン薬物−オリゴマー結合体を血液流中で長時間、好ましくは少なくとも２時間循環させることが望ましい場合には、非加水分解性結合の使用が好ましい。当業者ならば理解するように、このオリゴマーがインスリン薬物に共有結合で結合している場合、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に共有結合で連結するのに使用する、一つあるいはそれ以上の結合成分を更に含む。結合成分は、好ましくは共有結合の結合、エステル成分、カーボネート成分、カルバメート成分、アミド成分及び２級アミン成分からなる群から選ばれる。オリゴマー上の一つ以上の成分は、インスリン薬物に共有結合で結合してもよい。
【００８６】  このオリゴマーはインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する一方で、このオリゴマーが、インスリン薬物に非共有結合で結合して、非共有結合で結合体化したインスリン薬物−オリゴマー錯体を形成することは理解されるべきである。当業者ならば理解するように、非共有結合の連結は、限定するのではないが、水素結合、イオン結合、ファンデアワールス結合、及びミセルあるいはリポソームカプセル化を含む。本発明の実施形態によれば、当業者ならば理解するように、オリゴマーを好適に構成、変成し、そして／または適宜官能基化して、選ばれた方法で非共有結合による結合の能力（例えば、水素結合能力を賦与する）を賦与してもよい。本発明の他の実施形態によれば、限定するのではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、及びアミノサリチル酸誘導体を含む、種々の化合物により、オリゴマーを誘導体としてもよい。得られるオリゴマーを薬物分子、医薬製品、及び／または医薬賦形剤と非共有結合により連結（錯体）することができる。得られる錯体は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。本発明の更に他の実施形態によれば、オリゴマーをアミン及び／またはアルキルアミンにより誘導体としてもよい。好適な酸性条件下で、得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬製品及び／または医薬賦形剤と共に非共有結合により結合体化した錯体を形成することができる。このような錯体化から得られる製品は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。
【００８７】  一つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をインスリン薬物に連結してもよい。この複数のオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、この複数のオリゴマーはお互いに異なってもよく、あるいは、この複数のオリゴマーの一部は同じでもよく、また一部は異なってよいことを理解すべきである。複数のオリゴマーをインスリン薬物に連結する場合、一つあるいはそれ以上のオリゴマーを加水分解性結合でインスリン薬物と連結し、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーを非加水分解性結合でインスリン薬物と連結するのが好ましい。あるいは、この複数のオリゴマーをこのインスリン薬物に連結する結合のすべてが加水分解性であってもよいが、種々の程度の加水分解性を有すし、例えば、この一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から急速に取り外され、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から緩慢に取り外されるようであってもよい。
【００８８】  限定するのではないが、求核性ヒドロキシル官能基及び／またはアミノ官能基を含む、インスリン薬物の種々の求核残基でこのオリゴマーをインスリン薬物と連結してもよい。インスリン薬物がポリペプチドである場合には、例えばセリン及び／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見出され、そして例えばヒスチジン及び／またはリジン残基で、及び／またはポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見出される。オリゴマーがインスリンポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端に連結している場合には、この連結は、好ましくは２級アミンを形成する。このインスリン薬物がヒトインスリンである場合には、例えばこのオリゴマーを、ＧｌｙA1のアミノ官能基、ＰｈｅB1のアミノ官能基、及びＬｙｓB29のアミノ官能基を含む、インスリンのアミノ官能基に連結させてもよい。一つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結させる場合には、このオリゴマーは、好ましくはＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。２つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結させる場合には、このオリゴマーは、好ましくはＰｈｅB1のアミノ官能基とＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。一つ以上のオリゴマーをこのヒトインスリンに連結させる場合には、モノ−結合体化したヒトインスリンについて高活性（改善されたグルコース低下能力）が観察される。
【００８９】  約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、結合体の実質的に単分散の混合物を種々の方法により合成することができる。例えば、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、オリゴマーの混合物を提供するのに充分な条件下で、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、カルボン酸の混合物と約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、ポリエチレングリコールの単分散の混合物とを接触させることにより、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなる、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、オリゴマーの混合物が合成される。次に、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、混合物のオリゴマーは活性化され、インスリン薬物と反応して、インスリン薬物−オリゴマー結合体を提供することが可能である。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の一つの実施形態を図３に図示し、下記の例１１〜１８に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のもう一つの実施形態を図４に図示し、下記の例１９〜２４に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更にもう一つの実施形態を図５に図示し、下記の例２５〜２９に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図６に図示し、下記の例３０〜３１に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のもう一つの実施形態を図７に図示し、下記の例３２〜３７に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更にもう一つの実施形態を図８に図示し、下記の例３８に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図９に図示し、下記の例３９に述べる。約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のもう一つの実施形態を図１０に図示し、下記の例４０に述べる。
【００９０】  次に、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供するのに充分な条件下で、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物と約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物の混合物とを反応させる。好ましい合成を下記の例４１に述べる。当業者ならば理解するように、この反応条件（例えば、選ばれたモル比、溶媒混合物及び／またはｐＨ）をコントロールして、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する活性化されたオリゴマーの混合物と約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物の混合物との反応から得られるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物の混合物であるようにすることができる。例えば、反応溶液のｐＨをリジンのｐＫa以下に維持することにより、リジンのアミノ官能基での結合を抑制することができる。あるいは、例えば例５０で下記に述べるようにＨＰＬＣを用いて、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離、単離して、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体、例えばモノ−、ジ−、またはトリ−結合体の実質的に単分散の混合物を提供することができる。限定するのではないが、質量分析を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の単離した結合体の結合度（例えば、単離した分子がモノ−、ジ−、またはトリ−結合体であるかどうか）を決定し、そして／または確認することができる。限定するのではないが、配列分析、ペプチドマッピング、選択的な酵素開裂、及び／またはエンドペプチダーゼ開裂を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の結合体構造（このオリゴマーがヒトインスリンのＧｌｙA1、ＰｈｅB1またはＬｙｓB29でのモノ結合体であるかどうかを）を決定し、そして／または確認することができる。
【００９１】  当業者ならば理解するように、例えば、このインスリン薬物とＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）等の好適な試剤とを反応させることにより、インスリン薬物上の一つあるいはそれ以上の反応部位をブロックしてもよい。例えばインスリン薬物がポリペプチドである場合には、この方法が好ましく、そしてこのポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端でオリゴマーを有する、不飽和結合体（すなわち、すべての求核性残基が結合体化されてはいない結合体）を形成することが望ましい。このようなブロック化に続いて、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有するこのブロック化されたインスリン薬物の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、活性化されたオリゴマーの混合物と反応させて、一つあるいはそれ以上の求核性残基に連結したオリゴマーを持ち、また、他の求核性残基に連結したブロック化成分を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供することができる。当業者ならば理解するように、この結合反応の後、このインスリン薬物オリゴマー結合体を脱ブロック化してもよい。必要ならば、次に、このインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を前記のようにして分離して、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供してもよい。あるいは、脱ブロック化に先立ち、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離してもよい。
【００９２】  約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、本発明のこれらの実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは多分散の混合物の性質に比較した場合、改善された性質を有する。例えば、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビボ活性よりも大きい、インビボ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４〜４０２（第２編、１９９１）に記述されているような、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ等のサイズ排除クロマトグラフィを含む種々の方法により、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均の重量を測定することができる。
【００９３】  もう一つの例として、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビトロ活性よりも大きい、インビトロ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。
【００９４】  当業者ならば理解するように、特定の混合物のインビトロ活性を種々の方法により測定してもよい。好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計を用いて、このインビトロ活性を測定する。この微少生理計は、培養孔中の培養細胞に添加した薬物に応答する細胞外の酸性化の速度の小さな変化をモニターする。この応答は試験下の分子の活性に比例する。好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約５パーセント大きい。更に好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。
【００９５】  更にもう一つの例として、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合、好ましくはキモトリプシンによる分解に増大した耐性を有する。キモトリプシンに対する耐性は、下記の例５２に概述したものと類似の方法を用いて、試験すべき分子をキモトリプシン中で消化した場合に、残存するパーセントに相当する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定してもよい。好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、この多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。更に好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、この多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約２０パーセント大きい。
【００９６】  なお更にもう一つの例として、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均の分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。当業者ならば理解するように、この被験者間変動を種々の方法により測定することができる。好ましくは、この被験者間変動を次のように計算する。用量応答曲線下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量応答曲線とベースラインの間の面積）を各被験者について求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者の数で割ることにより、すべての被験者に対する平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均のＡＵＣの間の差の絶対値を各被験者について求める。次に、得られる差の絶対値を足して、被験者間変動を表わす値を得る。低い値は低い被験者間変動を表わし、高い値は高い被験者間変動を表わす。好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、この多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約１０パーセント少ない。更に好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、この多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約２５パーセント少ない。
【００９７】  約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは２つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。更に好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、３つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。最も好ましくは、約２２ダルトン未満の標準偏差の分子量分布を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、４つの上述の性質をすべて有する。
【００９８】  本発明の更なる他の実施形態によれば、各結合体がポリエチレングリコール成分を含むオリゴマーに連結したインスリン薬物を含み、そしてこの混合物が１０，０００以上の分散度係数（ＤＣ）：
【数５】
0005312720.tif 000009
（ここで、
ｎはこのサンプル中の異なる分子数であり、
Ｎiはこのサンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍiはｉ番目の分子の質量である）
を有する、結合体の混合物が提供される。結合体の混合物は、好ましくは１００，０００以上の分散度係数を有する。更に好ましくは、この結合体混合物の分散度係数は５００，０００以上であり、最も好ましくは、この分散度係数は１０，０００，０００以上である。限定するのではないが、下記に例４９に述べる方法を含めて、当業者ならば理解するような種々の方法により、変数、ｎ、Ｎi、及びＭiを求めることができる。
【００９９】  このインスリン薬物は、好ましくはインスリンである。更に好ましくは、このインスリン薬物はヒトインスリンである。しかしながら、例えば、プロインスリン、インスリン類縁体、インスリンフラグメント、及びインスリンフラグメント類縁体を含む、当業者に既知の種々のインスリン薬物からこのインスリン薬物を選んでもよいことを理解すべきである。インスリン類縁体は、限定するのではないが、ＡｓｐB28ヒトインスリン、ＬｙｓB28ヒトインスリン、ＬｅｕB28ヒトインスリン、ＶａｌB28ヒトインスリン、ＡｌａB28ヒトインスリン、ＡｓｐB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｅｕB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＶａｌB28ｐｒｏB29ヒトインスリン、ＡｌａB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、並びに上述の置換のガイドラインを用いて提供される類縁体を含む。インスリンフラグメントは、限定するのではないが、Ｂ２２−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２３−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２６−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２７−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｂ３０ヒトインスリン、ヒトインスリンのＡ鎖、及びヒトインスリンのＢ鎖を含む。インスリンフラグメント中で上述の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を置換することにより、インスリンフラグメント類縁体を提供することができる。
【０１００】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含む、種々のオリゴマーであってもよい。好ましくは、このオリゴマーのポリエチレングリコール成分は、少なくとも２、３あるいは４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。更に好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも５あるいは６個のポリエチレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
【０１０１】  このオリゴマーは、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分、及び末端成分を含む、一つあるいはそれ以上の他の成分を含んでなってもよい。このオリゴマー中の種々の成分は、加水分解性あるいは非加水分解性結合のいずれかにより相互に共有結合で結合する。
【０１０２】  このオリゴマーは、限定するのではないが、糖、ポリアルキレンオキシド、及びポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含む、一つあるいはそれ以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリエチレングリコール成分に加えての成分）を更に含む。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるので、追加の親水性成分はポリエチレングリコール成分である。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合により連結している場合には、同一成分であると考えられる。例えば、成分：
【化１０】
0005312720.tif 000010
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、単一のポリエチレングリコール成分である。この成分がこのオリゴマー中の唯一の親水性成分である場合には、このオリゴマーは追加の親水性成分を含まない。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合以外の結合により連結している場合には、異なる成分であると考えられる。例えば、成分：
【化１１】
0005312720.tif 000011
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分と２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態のオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含み、追加の親水性成分を含まない。
【０１０３】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上の親油性成分を更に含む。この親油性成分は、好ましくは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐のアルキル成分、あるいは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐の脂肪酸成分である。親油性成分がアルキル成分である場合には、これは、好ましくは１から２８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和のアルキル成分である。更に好ましくは、このアルキル成分は、２から１２個の炭素原子を有する。親油性成分が脂肪酸成分である場合、これは好ましくは２から１８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和である天然脂肪酸成分である。更に好ましくは、この脂肪酸成分は３から１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、この脂肪酸成分は少なくとも４、５あるいは６個の炭素原子を有する。
【０１０４】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上のスペーサー成分を更に含む。例えば、スペーサー成分を使用して、親油性成分から親水性成分を分離するか、インスリン薬物から親油性成分または親水性成分を分離するか、第２の親水性あるいは親油性成分から第１の親水性あるいは親油性成分を分離するか、あるいはリンカー成分から親水性成分または親油性成分を分離することができる。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロール及びグリセリン成分からなる群から選ばれる。
【０１０５】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に連結するのに使用する、一つあるいはそれ以上のリンカー成分を更に含む。リンカー成分は、好ましくはアルキル及び脂肪酸成分からなる群から選ばれる。
【０１０６】  このオリゴマーは、インスリン薬物に連結しない１つあるいはそれ以上のオリゴマーの末端に、１つあるいはそれ以上の末端成分を更に含んでもよい。末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分であり、更に好ましくは低級アルキルまたは低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、この末端成分はメチルまたはメトキシである。この末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分である一方、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、糖、コレステロール、アルコール、及び脂肪酸を含む、種々の成分であってもよいことを理解すべきである。
【０１０７】  このオリゴマーは、このインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する。ある実施形態においては、このインスリン薬物は、加水分解性結合（例えば、エステルあるいはカーボネート結合）を用いてオリゴマーに連結する。加水分解性の連結は、前駆薬物として作用するインスリン薬物−オリゴマー結合体を提供する。例えば、インスリン薬物−オリゴマー結合体が不活性（すなわち、この結合体がインスリン薬物の主要な作用機構により身体に影響する能力を欠く）である場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーが各インスリン薬物−オリゴマー結合体から開裂して、活性な薬物をもたらすのに従って、加水分解性の連結は、インスリン薬物を一定の時間にわたって投与する時間放出あるいは制御放出効果をもたらす。他の実施形態においては、このインスリン薬物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を用いて、オリゴマーに連結する。インスリン薬物−オリゴマー結合体を血液流中で長時間、好ましくは少なくとも２時間循環させることが望ましい場合には、非加水分解性結合の使用が好ましい。当業者ならば理解するように、このオリゴマーがインスリン薬物に共有結合で結合している場合、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に共有結合で連結するのに使用される、一つあるいはそれ以上の結合成分を更に含む。結合成分は、好ましくは共有結合の結合、エステル成分、カーボネート成分、カルバメート成分、アミド成分及び２級アミン成分からなる群から選ばれる。オリゴマー上の一つ以上の成分は、インスリン薬物に共有結合で結合してよい。
【０１０８】  このオリゴマーは、好ましくはインスリン薬物に共有結合で結合する一方で、このオリゴマーがインスリン薬物に非共有結合で結合して、非共有結合で結合体化したインスリン薬物−オリゴマー錯体を形成することを理解すべきである。当業者ならば理解するように、非共有結合の連結は、限定するのではないが、水素結合、イオン結合、ファンデアワールス結合、及びミセルあるいはリポソームカプセル化を含む。本発明の実施形態によれば、当業者ならば理解するように、オリゴマーを好適に構成、変性し、そして／または適宜官能基化して、選ばれた方法で非共有結合による結合の能力（例えば、水素結合能力を賦与する）を賦与してもよい。本発明の他の実施形態によれば、限定するのではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、及びアミノサリチル酸誘導体を含む、種々の化合物により、オリゴマーを誘導体としてもよい。得られるオリゴマーを薬物分子、医薬製品、及び／または医薬賦形剤と非共有結合により連結（錯体）することができる。得られる錯体は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。本発明の更に他の実施形態によれば、オリゴマーをアミン及び／またはアルキルアミンにより誘導体化してもよい。好適な酸性条件下で、得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬製品及び／または医薬賦形剤と共に非共有結合により結合体化した錯体を形成することができる。このような錯体化から得られる製品は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。
【０１０９】  一つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をインスリン薬物に連結してもよい。この複数のオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、この複数のオリゴマーはお互いに異なってもよく、あるいは、この複数のオリゴマーの一部は同一でもよく、また一部は異なってよいことを理解すべきである。複数のオリゴマーをインスリン薬物に連結する場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーを加水分解性結合でインスリン薬物と連結し、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーを非加水分解性結合でインスリン薬物と連結するのが好ましい。あるいは、この複数のオリゴマーをこのインスリン薬物に連結させる結合のすべてが加水分解性であってもよいが、種々の程度の加水分解性を有し、例えば、この一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から急速に取り外され、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から緩慢に取り外されるようであってもよい。
【０１１０】  限定するのではないが、求核性ヒドロキシル官能基及び／またはアミノ官能基を含む、インスリン薬物の種々の求核残基でこのオリゴマーをインスリン薬物と連結してもよい。インスリン薬物がポリペプチドである場合には、例えばセリン及び／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見出され、そして例えばヒスチジン及び／またはリジン残基で、及び／またはポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見出される。オリゴマーがインスリンポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端に連結している場合には、この連結は、好ましくは２級アミンを形成する。このインスリン薬物がヒトインスリンである場合には、例えばこのオリゴマーをＧｌｙA1のアミノ官能基、ＰｈｅB1のアミノ官能基、及びＬｙｓB29のアミノ官能基を含む、インスリンのアミノ官能基に連結してもよい。一つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。２つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＰｈｅB1のアミノ官能基とＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。一つ以上のオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、モノ−結合体化したヒトインスリンについて高活性（改善されたグルコース低下能力）が観察される。
【０１１１】  １０，０００以上の分散度係数を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を種々の方法により合成することができる。例えば、１０，０００以上の分散度係数を有する、オリゴマーの混合物を提供するのに充分な条件下で、１０，０００以上の分散度係数を有する、カルボン酸の混合物と１０，０００以上の分散度係数を有する、ポリエチレングリコールの混合物とを接触させることにより、１０，０００以上の分散度係数を有する、カルボン酸とポリエチレングリコールからなるオリゴマーの混合物が合成される。次に、１０，０００以上の分散度係数を有する、混合物のオリゴマーを活性化して、インスリン薬物と反応させて、インスリン薬物−オリゴマー結合体を提供することが可能である。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の一つの実施形態を図３に図示し、下記の例１１〜１８に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のもう一つの実施形態を図４に図示し、下記の例１９〜２４に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更にもう一つの実施形態を図５に図示し、下記の例２５〜２９に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図６に図示し、下記の例３０〜３１に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のもう一つの実施形態を図７に図示し、下記の例３２〜３７に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路の更にもう一つの実施形態を図８に図示し、下記の例３８に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図９に図示し、下記の例３９に述べる。１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供するための合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図１０に図示し、下記の例４０に述べる。
【０１１２】  次に、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供するのに充分な条件下で、１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物を１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物の混合物と反応させる。好ましい合成を下記の例４１に述べる。当業者ならば理解するように、この反応条件（例えば、選ばれたモル比、溶媒混合物及び／またはｐＨ）をコントロールして、１０，０００以上の分散度係数を有する活性化されたオリゴマーの混合物と１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物の混合物との反応から得られるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物の混合物であるようにすることができる。例えば、反応溶液のｐＨをリジンのｐＫa以下に維持することにより、リジンのアミノ官能基での結合を抑制することができる。あるいは、例えば例５０で下記に述べるようにＨＰＬＣを用いて、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離、単離して、例えば１０，０００以上の分散度係数を有する、モノ−、ジ−、またはトリ−結合体の実質的に単分散の混合物を提供することができる。限定するのではないが、質量分析を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の単離した結合体の結合度（例えば、単離した分子がモノ−、ジ−、またはトリ−結合体であるかどうか）を決定し、そして／または確認することができる。限定するのではないが、配列分析、ペプチドマッピング、選択的な酵素開裂、及び／またはエンドペプチダーゼ開裂を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の結合体構造（このオリゴマーがヒトインスリンのＧｌｙA1、ＰｈｅB1またはＬｙｓB29でのモノ結合体であるかどうかを）を決定し、そして／または確認することができる。
【０１１３】  当業者ならば理解するように、例えば、このインスリン薬物とＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）等の好適な試剤とを反応させることにより、インスリン薬物上の一つあるいはそれ以上の反応部位をブロックすることができる。例えばインスリン薬物がポリペプチドである場合には、この方法が好ましく、そしてこのポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端でオリゴマーを有する、不飽和結合体（すなわち、すべての求核性残基が結合体化されてはいない結合体）を形成することが望ましい。このようなブロック化に続いて、１０，０００以上の分散度係数を有する、このブロック化したインスリン薬物と１０，０００以上の分散度係数を有する、活性化されたオリゴマーの混合物とを反応させて、一つあるいはそれ以上の求核性残基に連結したオリゴマーを持ち、そして他の求核性残基に連結したブロック化成分を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供することができる。当業者ならば理解するように、この結合反応の後、このインスリン薬物オリゴマー結合体を脱ブロック化してもよい。必要ならば、次に、このインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を述べたように分離して、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供することができる。あるいは、脱ブロック化に先立ち、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離してもよい。
【０１１４】  １０，０００以上の分散度係数を有する、本発明のこれらの実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは多分散の混合物の性質に比較した場合、改善された性質を有する。例えば、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビボ活性よりも大きい、インビボ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４〜４０２（第２編、１９９１）に記述されているような、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ等のサイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均の重量を測定することができる。
【０１１５】  もう一つの例として、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビトロ活性よりも大きい、インビトロ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。
【０１１６】  当業者ならば理解するように、特定の混合物のインビトロ活性を種々の方法により測定することができる。好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計を用いて、このインビトロ活性を測定する。この微少生理計は、培養孔中の培養細胞に添加した薬物に応答する細胞外の酸性化の速度の小さな変化をモニターする。この応答は試験下の分子の活性に比例する。好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約５パーセント大きい。更に好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。
【０１１７】  更にもう一つの例として、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合、好ましくはキモトリプシンによる分解に増大した耐性を有する。キモトリプシンに対する耐性は、下記の例５２に概述したものと類似の方法を用いて、試験すべき分子をキモトリプシン中で消化した場合に、残存するパーセントに相当する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、この多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。更に好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、この多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約２０パーセント大きい。
【０１１８】  なお更にもう一つの例として、好ましくは１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均の分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定してもよい。当業者ならば理解するように、この被験者間変動を種々の方法により測定してもよい。好ましくは、この被験者間変動を次のように計算する。用量応答曲線下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量応答曲線とベースラインの間の面積）を各被験者について求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者の数で割ることにより、すべての被験者に対する平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均のＡＵＣの間の差の絶対値を各被験者について求める。次に、得られる差の絶対値を足して、被験者間変動を表わす値を得る。低い値は低い被験者間変動を表わし、高い値は高い被験者間変動を表わす。好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約１０パーセント少ない。更に好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約２５パーセント少ない。
【０１１９】  １０，０００以上の分散度係数を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは２つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。更に好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、３つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。最も好ましくは、１０，０００以上の分散度係数を有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、４つの上述の性質をすべて有する。
【０１２０】  本発明の他の実施形態によれば、各結合体がオリゴマーと連結したインスリン薬物を含み、同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、結合体の混合物が提供される。
【０１２１】  このインスリン薬物は好ましくはインスリンである。更に好ましくは、このインスリン薬物はヒトインスリンである。しかしながら、例えば、プロインスリン、インスリン類縁体、インスリンフラグメント、及びインスリンフラグメント類縁体を含む、当業者に既知の種々のインスリン薬物からこのインスリン薬物を選んでもよいことを理解するべきである。インスリン類縁体は、限定するのではないが、ＡｓｐB28ヒトインスリン、ＬｙｓB28ヒトインスリン、ＬｅｕB28ヒトインスリン、ＶａｌB28ヒトインスリン、ＡｌａB28ヒトインスリン、ＡｓｐB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｅｕB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＶａｌB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＡｌａB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、並びに上述の置換のガイドラインを用いて提供される類縁体を含む。インスリンフラグメントは、限定するのではないが、Ｂ２２−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２３−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２６−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２７−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｂ３０ヒトインスリン、ヒトインスリンのＡ鎖、及びヒトインスリンのＢ鎖を含む。インスリンフラグメント中で上述の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を置換することにより、インスリンフラグメント類縁体を提供してもよい。
【０１２２】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含む種々のオリゴマーであってもよい。好ましくは、このオリゴマーのポリエチレングリコール成分は、少なくとも２、３あるいは４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。更に好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも５あるいは６個のポリエチレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは、このポリエチレングリコール成分は、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
【０１２３】  このオリゴマーは、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分、及び末端成分を含む、一つあるいはそれ以上の他の成分を含んでなってもよい。このオリゴマー中の種々の成分は、加水分解性あるいは非加水分解性結合のいずれかにより相互に共有結合で結合する。
【０１２４】  このオリゴマーは、限定するのではないが、糖、ポリアルキレンオキシド、及びポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含む、一つあるいはそれ以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリエチレングリコール成分に加えての成分）を更に含む。ポリエチレングリコールはポリアルキレンオキシドであるので、追加の親水性成分はポリエチレングリコール成分である。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合により連結している場合には、同じ成分であると考えられる。例えば、成分：
【化１２】
0005312720.tif 000012
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、単一のポリエチレングリコール成分である。この成分がこのオリゴマー中の唯一の親水性成分である場合には、このオリゴマーは追加の親水性成分を含まない。隣接したポリエチレングリコール成分は、エーテル結合以外の結合により連結している場合には、異なる成分であると考えられる。例えば、成分：
【化１３】
0005312720.tif 000013
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分と２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態のオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含み、追加の親水性成分を含まない。
【０１２５】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上の親油性成分を更に含む。この親油性成分は、好ましくは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐のアルキル成分、あるいは飽和あるいは不飽和の、直鎖あるいは分岐の脂肪酸成分である。親油性成分がアルキル成分である場合には、これは、好ましくは１から２８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和のアルキル成分である。更に好ましくは、このアルキル成分は２から１２個の炭素原子を有する。親油性成分が脂肪酸成分である場合、これは好ましくは２から１８個の炭素原子を有する、線状の、飽和あるいは不飽和である天然脂肪酸成分である。更に好ましくは、この脂肪酸成分は３から１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、この脂肪酸成分は、少なくとも４、５あるいは６個の炭素原子を有する。
【０１２６】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、一つあるいはそれ以上のスペーサー成分を更に含む。例えば、スペーサー成分を使用して、親油性成分から親水性成分を分離するか、インスリン薬物から親油性成分または親水性成分を分離するか、第２の親水性あるいは親油性成分から第１の親水性あるいは親油性成分を分離するか、あるいはリンカー成分から親水性成分または親油性成分を分離してもよい。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロール及びグリセリン成分からなる群から選ばれる。
【０１２７】  当業者ならば理解するように、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に連結するのに使用する、一つあるいはそれ以上のリンカー成分を更に含む。リンカー成分は、好ましくはアルキル及び脂肪酸成分からなる群から選ばれる。
【０１２８】  このオリゴマーは、インスリン薬物に連結しない、一つあるいはそれ以上のオリゴマーの末端で一つあるいはそれ以上の末端成分を更に含んでなってもよい。末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分であり、更に好ましくは低級アルキルまたは低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、この末端成分はメチルまたはメトキシである。この末端成分は、好ましくはアルキルあるいはアルコキシ成分である一方、当業者ならば理解するように、限定するのではないが、糖、コレステロール、アルコール、及び脂肪酸を含む、種々の成分であってもよいことを理解すべきである。
【０１２９】  このオリゴマーは、このインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する。ある実施形態においては、このインスリン薬物は、加水分解性結合（例えば、エステルあるいはカーボネート結合）を用いてオリゴマーに連結する。加水分解性の連結は、前駆薬物として作用するインスリン薬物−オリゴマー結合体を提供する。例えばインスリン薬物−オリゴマー結合体が不活性（すなわち、この結合体がインスリン薬物の主要な作用機構により身体に影響する能力を欠く）である場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーが各インスリン薬物−オリゴマー結合体から開裂して、活性な薬物をもたらすのに従って、加水分解性の連結は、インスリン薬物を一定の時間にわたって投与する時間放出あるいは制御放出効果をもたらす。他の実施形態においては、このインスリン薬物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を用いて、オリゴマーに連結する。インスリン薬物−オリゴマー結合体を血液流中で長時間、好ましくは少なくとも２時間循環させることが望ましい場合には、非加水分解性結合の使用が好ましい。当業者ならば理解するように、このオリゴマーがインスリン薬物に共有結合で結合している場合、このオリゴマーは、このオリゴマーをインスリン薬物に共有結合で連結するのに使用される、一つあるいはそれ以上の結合成分を更に含む。結合成分は、好ましくは共有結合の結合、エステル成分、カーボネート成分、カルバメート成分、アミド成分及び２級アミン成分からなる群から選ばれる。オリゴマー上の一つ以上の成分は、インスリン薬物に共有結合で結合してもよい。
【０１３０】  このオリゴマーはインスリン薬物に好ましくは共有結合で結合する一方で、このオリゴマーをインスリン薬物に非共有結合で結合して、非共有結合で結合体化したインスリン薬物−オリゴマー錯体を形成することを理解すべきである。当業者ならば理解するように、非共有結合の連結は、限定するのではないが、水素結合、イオン結合、ファンデアワールス結合、及びミセルあるいはリポソームカプセル化を含む。本発明の実施形態によれば、当業者ならば理解するように、オリゴマーを好適に構成、変成し、そして／または適宜官能基化して、選ばれた方法で非共有結合の結合能力（例えば、水素結合能力を賦与する）を賦与してもよい。本発明の他の実施形態によれば、限定するのではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、及びアミノサリチル酸誘導体を含む、種々の化合物により、オリゴマーを誘導体としてもよい。得られるオリゴマーを薬物分子、医薬製品、及び／または医薬賦形剤と非共有結合により連結（錯体）することができる。得られる錯体は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。本発明の更に他の実施形態によれば、オリゴマーをアミン及び／またはアルキルアミンにより誘導体としてもよい。好適な酸性条件下で、得られるオリゴマーは、薬物分子、医薬製品及び／または医薬賦形剤と共に非共有結合により結合体化した錯体を形成することができる。このような錯体化から得られる製品は、好ましくはバランスのとれた親油性及び親水性性質を有する。
【０１３１】  一つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をインスリン薬物に連結してもよい。この複数のオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、この複数のオリゴマーはお互いに異なってもよく、あるいは、この複数のオリゴマーの一部は同一でもよく、また一部は異なってよいことを理解すべきである。複数のオリゴマーをインスリン薬物に連結する場合には、一つあるいはそれ以上のオリゴマーを加水分解性結合を有するインスリン薬物と連結し、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーを非加水分解性結合を有するインスリン薬物と連結するのが好ましい。あるいは、この複数のオリゴマーをこのインスリン薬物に連結する結合のすべては、加水分解性であってもよいが、種々の程度の加水分解性を有し、例えば、この一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から急速に取り外され、そして一つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内で加水分解によりインスリン薬物から緩慢に取り外されるようにしてもよい。
【０１３２】  限定するのではないが、求核性ヒドロキシル官能基及び／またはアミノ官能基を含む、インスリン薬物の種々の求核残基でこのオリゴマーをインスリン薬物と連結してもよい。インスリン薬物がポリペプチドである場合には、例えばセリン及び／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見出され、そして例えばヒスチジン及び／またはリジン残基で、及び／またはポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見出される。オリゴマーがインスリンポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端に連結している場合には、この連結は、好ましくは２級アミンを形成する。このインスリン薬物がヒトインスリンである場合には、例えばこのオリゴマーをＧｌｙA1のアミノ官能基、ＰｈｅB1のアミノ官能基、及びＬｙｓB29のアミノ官能基を含む、インスリンのアミノ官能基に連結してもよい。一つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。２つのオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、このオリゴマーは、好ましくはＰｈｅB1のアミノ官能基とＬｙｓB29のアミノ官能基に連結する。一つ以上のオリゴマーをこのヒトインスリンに連結する場合には、モノ−結合体化したヒトインスリンについて高活性（改善されたグルコース低下能力）が観察される。
【０１３３】  この混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、オリゴマーの混合物を種々の方法により合成してもよい。例えば、この混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、オリゴマーの混合物を提供するのに充分な条件下で、カルボン酸の混合物と、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコールの混合物とを接触させることにより、カルボン酸と、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコールとからなるオリゴマーの実質的に単分散の混合物が合成される。次に、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するオリゴマー混合物が活性化され、インスリン薬物と反応して、インスリン薬物−オリゴマー結合体を提供することが可能になる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路の一つの実施形態を図３に図示し、下記の例１１〜１８で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路のもう一つの実施形態を図４に図示し、下記の例１９〜２４で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路の更にもう一つの実施形態を図５に図示し、下記の例２５〜２９で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図６に図示し、下記の例３０〜３１で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路のもう一つの実施形態を図７に図示し、下記の例３２〜３７で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路の更にもう一つの実施形態を図８に図示し、下記の例３８で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図９に図示し、下記の例３９で述べる。混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物を提供する合成経路のなお更にもう一つの実施形態を図１０に図示し、下記の例４０で述べる。
【０１３４】  インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供するのに充分な条件下で、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化されたオリゴマーの混合物とインスリン薬物の混合物とを反応させる。好ましい合成を下記の例４１で述べる。当業者ならば理解するように、この反応条件（例えば、選ばれたモル比、溶媒混合物及び／またはｐＨ）をコントロールして、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、活性化されたオリゴマーの混合物とインスリン薬物の混合物との反応から得られるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する結合体の混合物であるようにしてもよい。例えば、反応溶液のｐＨをリジンのｐＫa以下に維持することにより、リジンのアミノ官能基での結合を抑制してもよい。あるいは、例えば例５０で下記に述べるようにＨＰＬＣを用いて、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離、単離して、インスリン薬物−オリゴマー結合体、例えば混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、モノ−、ジ−、またはトリ−結合体のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供してもよい。限定するのではないが、質量分析を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の単離した結合体の結合度（例えば、単離した分子がモノ−、ジ−、またはトリ−結合体であるかどうか）を決定し、そして／または確認してもよい。限定するのではないが、配列分析、ペプチドマッピング、選択的な酵素開裂、及び／またはエンドペプチダーゼ開裂を含む、当業者ならば理解するような種々の方法を用いて、特定の結合体構造（このオリゴマーがヒトインスリンのＧｌｙA1、ＰｈｅB1またはＬｙｓB29でのモノ結合体であるかどうかを）を決定し、そして／または確認してもよい。
【０１３５】  当業者ならば理解するように、例えば、このインスリン薬物とＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）等の好適な試剤とを反応させることにより、インスリン薬物上の一つあるいはそれ以上の反応部位をブロックしてもよい。例えばインスリン薬物がポリペプチドである場合には、この方法が好ましく、そしてこのポリペプチドの一つあるいはそれ以上のＮ−末端でオリゴマーを有する、不飽和結合体（すなわち、すべての求核性残基が結合体化されてはいない結合体）を形成することが望ましい。このようなブロック化に続いて、このブロック化したインスリン薬物の混合物と、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、活性化されたオリゴマーの混合物とを反応させて、一つあるいはそれ以上の求核性残基と連結し、他の求核性残基と連結したブロック成分を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を提供してもよい。当業者ならば理解するように、この結合反応の後、このインスリン薬物−オリゴマー結合体を脱ブロック化してもよい。必要ならば、次に、このインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を前記のようにして分離して、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体混合物を提供してもよい。あるいは、脱ブロック化に先立ち、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を分離してもよい。
【０１３６】  混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、本発明のこれらの実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは多分散の混合物の性質に比較した場合、改善された性質を有する。例えば、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビボ活性よりも大きい、インビボ活性を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３９４〜４０２（第２編、１９９１）に記述されているような、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ等のサイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、混合物中の各オリゴマーが同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均重量を測定することができる。
【０１３７】  もう一つの例として、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマーの混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のインビトロ活性よりも大きい、インビトロ活性を有する。当業者ならば理解するように、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により測定することができる。
【０１３８】  当業者ならば理解するように、特定の混合物のインビトロ活性を種々の方法により測定することができる。好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計を用いて、このインビトロ活性を測定する。この微少生理計は、培養孔中の培養細胞に添加した薬物に応答する細胞外の酸性化の速度の小さな変化をモニターする。この応答は試験下の分子の活性に比例する。好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約５パーセント大きい。更に好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、この多分散の混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。
【０１３９】  更にもう一つの例として、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合、好ましくはキモトリプシンによる分解に増大した耐性を有する。キモトリプシンに対する耐性は、下記の例５２に概述したものと類似の方法を用いて、試験すべき分子をキモトリプシン中で消化した場合に、残存するパーセントに相当する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約１０パーセント大きい。更に好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散の混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約２０パーセント大きい。
【０１４０】  なお更にもう一つの例として、好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均の分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する。当業者ならば理解するように、限定するのではないが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、種々の方法により、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量とこの多分散の混合物の数平均分子量を測定することができる。当業者ならば理解するように、この被験者間変動を種々の方法により測定することができる。好ましくは、この被験者間変動を次のように計算する。用量応答曲線下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量応答曲線とベースラインの間の面積）を各被験者について求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者の数で割ることにより、すべての被験者に対する平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均のＡＵＣの間の差の絶対値を各被験者たついて求める。次に、得られる差の絶対値を足して、被験者間変動を表わす値を得る。低い値は低い被験者間変動を表わし、高い値は高い被験者間変動を表わす。好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約１０パーセント少ない。更に好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有するインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散の混合物の被験者間変動よりも少なくとも約２５パーセント少ない。
【０１４１】  混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、本発明の実施形態のインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、好ましくは２つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。更に好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、本発明の実施形態のインスリン薬物オリゴマー結合体の混合物は、３つあるいはそれ以上の上述の性質を有する。最も好ましくは、混合物中の各結合体が同じ数のポリエチレングリコールサブユニットを有する、本発明の実施形態のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、４つすべての上述の性質を有する。
【０１４２】  本発明のさらに他の実施形態によると、各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａ：
【化１４】
0005312720.tif 000014
（式中、
Ｂは結合成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ'、Ｇ''は個々に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒが親油性成分であって、Ｒ'がポリアルキレングリコール成分であるか、あるいはＲ'が親油性成分であって、Ｒがポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは端末成分であり、
ｊ、ｋ、ｍ、ｎはそれぞれ０あるいは１であり、
ｐは、１とインスリン薬物上にある求核残基の数との間にある整数である）の構造を有する複数の結合体の混合物が提供される。
【０１４３】  インスリン薬物は好適にはインスリンである。さらに好適には、そのインスリン薬物はヒトインスリンである。しかし、インスリン薬物は、例えば、プロインスリン、インスリン類縁体、インスリンフラグメント、インスリンフラグメント類縁体を含む当業者には公知のさまざまなインスリン薬物から選択されるものが良いと理解されるべきである。インスリン類縁体には、上述されている置換ガイドラインを用いてもたらされた類縁体とともに、ＡｓｐB28ヒトインスリン、ＬｙｓB28ヒトインスリン、ＬｅｕB28ヒトインスリン、ＶａｌB28ヒトインスリン、ＡｌａB28ヒトインスリン、ＡｓｐB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＬｅｕB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＶａｌB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、ＡｌａB28ＰｒｏB29ヒトインスリンが含まれるが、しかし、これらに限定されるものではない。インスリンフラグメントには、Ｂ２２−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２３−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２６−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２７−Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｂ３０ヒトインスリン、ヒトインスリンのＡ鎖、ヒトインスリンのＢ鎖が含まれるが、しかしこれらに限定されるものではない。インスリンフラグメント類縁体は、インスリンフラグメントにおいて、上述されているように、１つあるいはそれ以上のアミノ酸を置換することにより供給されることが可能である。
【０１４４】  本発明のこれらの実施形態によると、オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は好適には、少なくとも２、３ないしは４ポリアルキレングリコールサブユニットを有する。さらに好適には、ポリアルキレングリコール成分は少なくとも５ないしは６ポリアルキレングリコールサブユニットを有し、さらに好適には、ポリエチレングリコール成分が少なくとも７ポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は好適には、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分あるいはポリブチレングリコール成分などの低級ポリアルキレングリコール成分である。さらに好適には、ポリアルキレングリコール成分はポリエチレングリコール成分あるいはポリプロピレングリコール成分である。もっとも好適には、ポリアルキレングリコール成分がポリエチレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合には、その成分は好適には、均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する１つの例示的なポリプロピレングリコール成分は以下：
【化１５】
0005312720.tif 000015
のようなものである。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール連鎖において、各酸素原子に隣接して、たった１つのメチル置換された炭素原子を有するように説明されている場合がある。こうした均一なポリプロピレングリコール成分は親油性と親水性特性の両方を示し、また従って、親油性ポリマー成分を使用せずに両親媒性インスリン薬物オリゴマー結合体を供給する際に有用である場合がある。さらに、１つの薬物にポリプロピレングリコール成分の第二級アルコール成分を結合させることにより、腸で発見された、例えば、トリプシンやキモトリプリシンなどの酵素より引き起こされる分解に対して改善された抵抗力を備えた、インスリン薬物（例えば、ヒトインスリン）が供給される。
【０１４５】  本発明の実施形態による均一なポリプロピレングルコールは好適には、ここで説明される、図１１〜１３に図示説明されているように、合成される。図１１に図示説明されているように、第二級アルコール延長モノマー５４を供給するために、１，２−プロパンジオール５３は第一級アルコールブロック試薬と反応させる。第一級アルコールブロック試薬は、塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル、Ａｃ2Ｏなどのエステル化試薬などの塩化シリル化合物が含まれるが、しかしこれらに限定されるものではない。第一級アルコールブロック試薬は好適には、塩化ｔ−ブチルジフェニルシリルあるいは塩化ｔ−ブチルジメチルシリルなどの第二級アルコールとは実質的に反応しない第一級アルコールブロック試薬である。第二級アルコール延長モノマー（５４）は、第一級アルコール延長モノマーメシラート５５を供給するために、塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ2Ｃｌ）と反応させることができる。
【０１４６】  代替的には、化合物５６を供給するために、第二級アルコール延長モノマー５４は第二級アルコールブロック試薬と反応させることができる。第二級アルコールブロック試薬は、塩化ベンジルに限定されるものではないがしかしそれを含む、当業者には理解されるであろうさまざまな第二級アルコールブロック試薬であり得る。化合物５６は、ブロック成分Ｂ1を除去し、また第一級アルコール延長モノマー５７を供給するために、Ｂ1脱ブロック試薬と反応させることができる。Ｂ1脱ブロック試薬は、当業者には理解されるであろうさまざまな脱ブロック試薬から選択することができる。第一級アルコールがエステルを形成することによりブロックされた場合は、Ｂ1脱ブロック試薬は、塩基（例えば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。第一級アルコールが塩化シリルを用いてブロックされた場合は、Ｂ1脱ブロック試薬が好適にはテトラブチルアンモニウムフッ化物（ＴＢＡＦ）である。第二級アルコール延長モノマーメシラート５８を供給するために、第一級アルコール延長モノマー５７は、塩化メタンスルホニルと反応させることができる。
【０１４７】  第二級アルコール延長モノマー５４および第一級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップされる。化合物５９を供給するために、第二級アルコール延長モノマー５４は、キャップ試薬（capping reagent）と反応させることができる。キャップ試薬は、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルに限定されるものではないが、それを含む、当業者には理解されるであろうさまざまなキャップ試薬であり得る。第一級アルコールキャップモノマー６０を供給するために、化合物５９は、Ｂ1脱ブロック薬物と反応させることができる。第二級アルコールキャップモノマーメシラート６１を供給するために、第一級アルコールキャップモノマー６０は、塩化メタンスルホニルと反応させることができる。第一級アルコール延長モノマー５７は、化合物６２を供給するために、キャップ試薬と反応させることができる。キャップ試薬は上述されているようにさまざまなキャップ試薬であり得る。ブロック成分Ｂ2を除去し、また第二級アルコールキャップモノマー６３を供給するために、化合物６２はＢ2脱ブロック試薬と反応させることができる。Ｂ2脱ブロック試薬は、パラジウム／活性化炭素触媒の存在下のＨ2に限定されるものではないが、それを含む、当業者には理解されるであろうさまざまな脱ブロック薬物であり得る。第一級アルコールキャップモノマーメシラート６４を供給するために、第二級アルコールキャップモノマーは、塩化メタンスルホニルと反応させることができる。図１１に図示説明されている実施形態は、キャップモノマーの合成を示しているが、これは、同様の反応が、キャップモノマーを供給するために行われ得ると理解されるべきものである。
【０１４８】  一般的には、さまざまな均一なポリプロピレン連鎖を生じるために、第一級アルコール延長モノマー５７などの第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーを、第一級アルコール延長モノマーメシラート５５などの第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーメシラートと反応させることにより、あるいは、第二級アルコール延長モノマー５４などの第二級アルコール延長モノマーあるいはポリマーを、第二級アルコール延長モノマーメシラート５８などの第二級アルコール延長モノマーあるいはポリマーメシラートと反応させることにより、連鎖延長を実施することができる。
【０１４９】  例えば、図１２においては、ダイマー化合物６５を供給するために、第一級アルコール延長モノマーメシラート５５は、第一級アルコール延長モノマー５７と反応させる。あるいは、、ダイマー化合物６５を供給するために、第二級アルコール延長モノマーメシラート５８は、第二級アルコール延長モノマー５４と反応させることができる。第一級アルコール延長ダイマー６６を供給するために、ダイマー化合物６５上にあるＢ1ブロック成分は、上述されているように、Ｂ1脱ブロック試薬を使用して除去することができる。第二級アルコール延長ダイマーメシラート６７を供給するために、第一級アルコール延長ダイマー６６は、塩化メタンスルホニルと反応させることができる。あるいは、第二級アルコール延長ダイマー６９を供給するために、ダイマー化合物上にあるＢ2ブロック成分は、前述されているようにＢ2脱ブロック試薬を使用して除去することができる。第一級アルコール延長ダイマーメシラート７０を供給するために、第二級アルコール延長ダイマー６９は塩化メタンスルホニルと反応させることができる。
【０１５０】  当業者には理解されるであろうが、連鎖延長プロセスは、さまざまなその他の連鎖の長さを達成するために、繰り返すことができる。例えば、図１３に図示説明されているように、テトラマー化合物７２を供給するために、第一級アルコール延長ダイマー６６は、第一級アルコール延長ダイマーメシラート７０と反応させることが可能である。さらに図１３に図示説明されているように、一般的な連鎖延長反応図式には、均一なポリプロピレンポリマー７５を供給するために、第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマー７３を第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーメシラート７４と反応させるステップが含まれる。ｍとｎの値はそれぞれ、０〜１０００以上の範囲にあり得る。好適には、ｍとｎは、それぞれ０〜５０である。図１３に図示説明されている実施形態は第一級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーメシラートと反応させた第一級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを示しているが、これは、同様の反応が、第二級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーと第二級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーメシラートを使用して実施することが可能である。
【０１５１】  第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーの末端、あるいは第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーメシラートの末端は、キャップされた均一ポリプロピレン連鎖を供給するために、第一級アルコールキャップモノマーあるいはポリマーメシラートあるいは第一級アルコールキャップモノマーあるいはポリマーとそれぞれ反応させることが可能である。例えば、図１２に図示説明されているように、第一級アルコール延長ダイマーメシラート７０は、キャップされた／ブロックされた第一級アルコール延長トリマー７１を供給するために、第一級アルコールキャップモノマー６０と反応させる。当業者には理解されることであろうが、Ｂ1ブロック成分は除去され、またその結果生じるキャップされた第一級アルコール延長トリマーは、キャップされたトリマー７１の連鎖を延長するために、第一級アルコール延長モノマーあるいはポリマーメシラートと反応させることが可能である。
【０１５２】  第二級アルコール延長モノマーあるいはポリマーの末端あるいは第二級アルコールキャップモノマーあるいはポリマーメシラートは、キャップされ均一なポリプロピレン連鎖を供給するために、それぞれ、第二級アルコールキャップモノマーあるいはポリマーメシラートあるいは第二級アルコールキャップモノマーあるいはポリマーと反応させることが可能である。例えば、図１２に図示説明されているように、第二級アルコール延長ダイマーメシラート６７は、キャップされ／ブロックされた第一級アルコール延長トリマー６８を供給するために、第二級アルコールキャップモノマー６３と反応させる。Ｂ2ブロック成分は前述されているように除去され、またその結果生じるキャップされた第二級アルコール延長トリマーは、そのキャップされたトリマー６８の連鎖を延長するために、第二級アルコール延長ｍｅｒメシラートと反応させることが可能である。図１２に図示説明されている合成は、トリマーを供給するためのキャップモノマーとダイマーとの反応を示しているが、これは、そのキャッププロセスが均一なポリプロピレングリコール成分の合成におけるどの時点でも実施できるか、あるいは、均一なポリプロピレングリコール成分がキャップされないように供給できると理解されるべきものである。図１２に図示説明されている実施形態が、キャップモノマーとの合成によりポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、これは、本発明のポリブチレンオリゴマーが、図１１の中で前述されているように、キャップ試薬を使用して、直接キャップする（すなわち、キャップモノマーを添加せずに）ことが可能であると理解されるべきものである。
【０１５３】  本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール成分は、当業者には理解されるであろうさまざまな方法により、インスリン薬物、カルボン酸などの親油性成分および／またはさまざまな他の成分と結合させることが可能であるが、その方法は、ポリエチレングリコール成分に関して本出願で説明されているものに限定されるものではないが、それらを含むものである。
【０１５４】  本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者には理解されるであろう親油性成分である。この親油性成分は好適には、飽和あるいは不飽和で、直鎖あるいは枝分れアルキル成分あるいは飽和あるいは不飽和、直鎖あるいは枝分れ脂肪酸成分である。親油性成分がアルキル成分である場合は、それは好適には、１〜２８個の炭素原子を有する直鎖状、飽和、あるいは不飽和アルキル成分である。さらに好適には、アルキル成分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性成分が脂肪酸成分である場合は、それは好適には、直鎖状、飽和あるいは不飽和で、２〜１８個の炭素原子を有する天然の脂肪酸成分である。さらに好適には、脂肪酸成分は３〜１４個の炭素原子を有する。もっとも好適には、脂肪酸成分が少なくとも４、５あるいは６個の炭素原子を有する。
【０１５５】  本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分Ｇ、Ｇ'、Ｇ"は、当業者には理解されるであろうスペーサー成分である。スペーサー成分は好適には、糖、コレステロール、グリセリン成分から成る群から選択される。好適には、これらの実施形態のオリゴマーには、スペーサー成分は含まない（すなわち、ｋ、ｍ、およびｎは好適には０である）。
【０１５６】  本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分、Ｌは、当業者には理解されるであろう薬物とオリゴマーを結合させるのに使用されることが可能である。リンカー成分は好適には、アルキルおよび脂肪酸成分から成る群から選択される。
【０１５７】  本発明のこれらの実施形態によると、端末成分は好適にはアルキルあるいはアルコキシ成分であり、またさらに好適には低級アルキルあるいは低級アルコキシ成分である。もっとも好適には、端末成分はメチルあるいはメトキシである。端末成分は好適にはアルキルあるいはアルコキシ成分であるが、それは、その端末成分が糖、コレステロール、アルコール、脂肪酸に限定されるものではないが、しかしそれらを含む、当業者には理解されるであろうさまざまな成分であり得ると理解されるべきものである。
【０１５８】  本発明のこれらの実施形態によると、式Ａの構造の括弧で囲われている成分で表わされているオリゴマーは、インスリン薬物に共有的に結合される。いくつかの実施形態では、インスリン薬物は、加水分解性結合（例えば、エステルあるいはカーボネート結合）を使用してオリゴマーに結合される。加水分解性結合はプロドラッグとして作用するインスリン薬物オリゴマー結合体をもたらす。ある例では、例えば、インスリン薬物オリゴマー結合体が不活性である（その結合体がインスリン薬物の作用の第一次機構により身体に影響を及ぼす能力に欠ける）場合は、１つあるいはそれ以上のオリゴマーが、それぞれのそのインスリン薬物−オリゴマー結合体から開裂してその活性薬物を供給するにつれて、そのインスリン薬物を一定の時間にわたり投与するので、加水分解性結合は時間をかけた放出あるいは制御放出効果を生じることが可能である。他の実施形態では、インスリン薬物は非加水分解性結合を利用してそのオリゴマーに結合される（例えば、カルバメート、アミドあるいはエステル結合）。そのインスリン薬物−オリゴマー結合体を、血流中で、長時間、好適には少なくとも２時間循環させることが望ましい場合は、非加水分解性結合の使用が好ましい。結合成分Ｂは、当業者には理解されるであろうさまざまな結合成分であり得る。結合成分は好適には、共有結合、エステル成分、カーボネート成分、カルバメート成分、アミド成分、第二級アミン成分から成るグループから選択される。
【０１５９】  変数ｐは１からインスリン薬物上にある求核残基の数までの整数である。ｐが１よりも大きい場合、１つより多いオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）がそのインスリン薬物に結合される。本発明のそれらの実施形態によると、複数のオリゴマーは同じものである。複数のオリゴマーがそのインスリン薬物に結合される場合は、加水分解性結合によりそのインスリン薬物に１つあるいはそれ以上のオリゴマーを結合させ、また、１つあるいはそれ以上のオリゴマーをそのインスリン薬物に非加水分解性結合で結合させることが好ましいものであり得る。あるいは、そのインスリン薬物に複数のオリゴマーを結合させるすべての結合が、加水分解型であってもよいが、さまざまな程度の加水分解性を有し、例えば、１つあるいはそれ以上のオリゴマーが体内の加水分解によりそのインスリン薬物から急速に除去され、また１つあるいはそれ以上のオリゴマーはゆっくりとそのインスリン薬物から体内の加水分解により除去されるようであってもよい。
【０１６０】  限定されるものではないが、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含む、インスリン薬物のさまざまな求核残基でこのオリゴマーをインスリン薬物に結合させてもよい。そのインスリン薬物がポリペプチドである場合は、求核性ヒドロキシル官能基は、例えば、セリンおよび／またはチロシン残基で見つけることが可能であり、また、求核性アミノ官能基は、例えば、ヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／または１つあるいはそれ以上のポリペプチドのＮ末端で見つけることが可能である。オリゴマーは、インスリンポリペプチドのその１つあるいはそれ以上のＮ末端に結合される場合は、その結合は好適には、第二級アミンを形成する。そのインスリン薬物がヒトインスリンである場合は、例えば、そのオリゴマーは、ＧｌｙA1のアミノ官能基、ＰｈｅB1のアミノ官能基、ＬｙｓB29のアミノ官能基を含む、インスリンのアミノ官能基に結合させることが可能である。１つのオリゴマーがそのヒトインスリンに結合される場合は、オリゴマーは好適には、ＬｙｓB29のアミノ官能基に結合される。２つのオリゴマーがそのヒトインスリンに結合される場合は、そのオリゴマーは好適には、ＰｈｅＢ1のアミノ官能性およびＬｙｓＢ29のアミノ官能性に結合される。１つより多いオリゴマーがそのヒトインスリンに結合させることができる場合であっても、さらに高い活性（改善されたグルコース低下能力）が、モノ結合体化したヒトインスリンで観察される。
【０１６１】  混合物における各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、さまざまな諸方法により合成することができる。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールから成るオリゴマーの混合物が、オリゴマーの混合物を供給するのに十分な条件下で、カルボン酸の混合物とポリエチレングリコールの混合物とを接触させることにより合成される。混合物のオリゴマーは、次いで活性化され、インスリン薬物と反応して、インスリン薬物−オリゴマー結合体を供給することができる。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路の１つの実施形態が図３に図示説明され、またこれ以降の例１１〜１８において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のもう１つの実施形態が図４に図示説明され、またこれ以降の例１９〜２４において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のさらにもう１つの実施形態が図５に図示説明され、またこれ以降の例２５〜２９において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のその上もう１つの実施形態が図６に図示説明され、またこれ以降の例３０〜３１において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のもう１つの実施形態が図７に図示説明され、またこれ以降の例３２〜３７において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のさらにもう１つの実施形態が図８に図示説明され、またこれ以降の例３８において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のその上もう１つの実施形態が図９に図示説明され、またこれ以降の例３９において説明される。各オリゴマーが同じ分子量を有し、また、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を供給するための合成経路のもう１つの実施形態が図１０に図示説明され、またこれ以降の例４０において説明される。
【０１６２】  各オリゴマーが同じ分子量を有し、また式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物と、混合物中の各薬物が、インスリン薬物−オリゴマー結合体を供給するために十分な条件下で同じ分子量を有するインスリン薬物の混合物とを反応させる。１つの好適な合成は、例４１とそれ以降に説明されている。当業者には理解されるであろうが、反応条件（例えば、選択されたモル比、溶媒混合液および／あるいはｐＨ）は、各オリゴマーが同じ分子量で、式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマー混合物とインスリン薬物の混合物との反応から生じるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が、各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有する結合体の混合物であるように制御することが可能である。例えば、リシンのアミノ官能基での結合は、リシンのｐＫaよりも下に反応溶液のｐＨを維持することにより抑制することが可能である。あるいは、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、混合物中の各結合体が同じ数の分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体、例えば、モノ−、ジ−又はトリ結合体の混合物を供給するために例５０において、以下に説明されているように、例えば、ＨＰＬＣを利用して分離および単離することが可能である。特定の単利された結合体の結合の程度（例えば、その単離された分子がモノ、ジあるいはトリ結合体であるかどうか）を、質量スペクトルに限定されるものではないが、しかしそれを含む、当業者には理解されるであろうさまざまな技術を利用して測定するおよび／または証明することが可能である。特定の結合体構造（例えば、そのオリゴマーがヒトインスリン単量体結合体のＧｌｙA1、ＰｈｅB1あるいはＬｙｓB29にあるのかどうか）を、配列分析、ペプチド地図作成、選択的酵素切断および／またはエンドペプチターゼ切断に限定されるものではないが、しかしこれらを含む当業者には理解されるであろうさまざまな技術を利用して測定するおよび／または証明することが可能である。
【０１６３】  当業者には理解されるであろうが、インスリン薬物上にある１つあるいはそれ以上の反応部位は、例えば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの適当なブロック試薬とそのインスリン薬物とを反応させることにより、ブロックすることが可能である。このプロセスは、例えば、このインスリン薬物がポリペプチドであり、また、そのポリペプチドの１つあるいはそれ以上のＮ末端にオリゴマーを有する不飽和結合体（すなわち、全求核残基が結合されていない結合体）を形成することが望まれる場合には、好適なものになり得る。こうしたブロッキングに従って、ブロックされたインスリン薬物の混合物は、その混合物中の各オリゴマーが同じ分子量を有し、また式Ａのオリゴマー構造を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させて、１つあるいはそれ以上の求核残基にオリゴマーが結合され、他の求核残基には、ブロック成分が結合されたインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を供給することができる。結合反応後、そのインスリン薬物−オリゴマー結合体は、当業者には理解されるであろうやり方で、脱ブロックすることが可能である。必要な場合には、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、その後に、その混合物中の各結合体が、同じ数の分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を供給するために、上述されているように分離することが可能である。あるいは、インスリン薬物−オリゴマー結合体を、脱ブロックする前に分離することもできる。
【０１６４】  混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有する、本発明のこれらの実施形態によるインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、多分散混合物のそれらに比較した場合に、改善された特性を有する。例えば、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数の平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のインビボ活性よりも大きなインビボ活性を有する。当業者には理解されるであろうが、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量、および多分散混合物の数平均重量は、例えば、Ｈ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ＆Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９４〜４０２（第２版、１９９１）に説明されているように、ゲルパーミエーションクロマトグラフィなどサイズ排除クロマトグラフィに限定されるものではないが、それを含む、さまざまな方法により測定することが可能である。
【０１６５】  もう１つの例、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同数の平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のインビボ活性よりも大きなインビボ活性を有する。当業者には理解されるであろうが、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均重量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィなどサイズ排除クロマトグラフィに限定されるものではないが、それを含む、さまざまな方法により測定することが可能である。
【０１６６】  特定の混合物のインビトロ活性は、当業者には理解されるであろうさまざまな方法により測定することが可能である。好適には、インビトロ活性はカリフォルニア州サニーベール市のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されていて入手可能であるＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計（Microphysiometer）を使用して測定される。微少生理計は、培養孔中の培養細胞に添加された薬物に反応して細胞外酸性化の速度における小さな変化をモニターする。この反応は試験下の分子の活性に比例している。好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、多分散混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約５％大きい。さらに好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また、式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物のインビトロ活性は、多分散混合物のインビトロ活性よりも少なくとも約１０％大きい。
【０１６７】  混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性と比較した場合に、キモトリプシンによる分解に対し増大された耐性を有する。キモトリプシンに対する耐性は、以下の例５２に概要されているものと同様の手順を用いて、試験される分子がキモトリプシンの中で加水分解されるときに残るパーセントに相当する。当業者には理解されるであろうが、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均重量は、サイズ排除クロマトグラフィに限定されるものではないが、しかしそれを含むさまざまな方法により測定することが可能である。好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体のＡ混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性よりも少なくとも約１０パーセント大である。さらに好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体のＡ混合物のキモトリプシンによる分解に対する耐性は、多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗よりも少なくとも約２０パーセント大である。
【０１６８】  その上さらにもう１つの例として、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物と同じ数平均分子量を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の多分散混合物の被験者間変動よりも少ない被験者間変動を有する。当業者には理解されるであろうが、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均重量は、サイズ排除クロマトグラフィに限定されるものではないが、しかしそれを含むさまざまな方法により測定することが可能である。当業者には理解されるであろうさまざまな方法により、その被験者間変動は測定することが可能である。被験者間変動は好適には以下のように計算される。用量応答曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち、その用量応答曲線とベースラインの間の面積）が各被験者について測定される。全被験者についての平均曲線下面積は、各被験者の曲線下面積を加算し、またその加算合計を被験者数で割ることにより求められる。被験者の曲線下面積と平均曲線下面積の間の差の絶対値はその後に各被験者について求められる。この得られた差の絶対値はその後に合算されて、被験者間変動を表わす値となる。低い値は低い被験者間変動を表わし、また高い値は高い被験者間変動を表わす。好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散混合物の被験者間変動よりも少なくとも約１０パーセント小である。さらに好適には、混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の被験者間変動は、多分散混合物の被験者間変動よりも少なくとも約２５パーセント小である。
【０１６９】  本発明の実施形態による混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、２つあるいはそれ以上の上述されている特性を有する。さらに好適には、本発明の実施形態による混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、３つあるいはそれ以上の前記の特性を有する。もっとも好適には、本発明の実施形態による混合物中の各結合体が同じ分子量を有し、また式Ａの構造を有するインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、好適には、全部で４つあるいはそれ以上の前述の特性を有する。
【０１７０】  本発明の実施形態による結合体混合物を含む製薬組成物も提供される。前記のインスリン薬物−オリゴマー結合体は、公知の技術により製薬キャリア中への投与用に製剤化することが可能である。これについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ編のＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （第９版、１９９５年刊）を参照されたい。本発明の実施形態による製薬組成物の製造においては、インスリン薬物−オリゴマー結合体は、典型的には、とりわけ、薬学的に許容できるキャリアと混合される。そのキャリアは、もちろん、その製薬組成物中のその他のいずれとも適合するという意味で受入れ可能でなければならず、また、その被験者に対して有害なものであってはならない。キャリアは固体あるいは液体、あるいは両方であり得るものであり、また、好適には、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の、約０．０１又は０．５重量％から約９５重量％又は９９重量％までを含有することが可能な用量単位製剤、例えば、錠剤として処方される。製薬組成物は、１つあるいはそれ以上の補助成分を任意に含む成分を混合するステップに限定されるものではないが、しかしこれを含む、薬学の周知技術のいずれかにより調製される。
【０１７１】  本発明の実施形態による製薬組成物は、経口、直腸内、局所、吸入（例えば、エアゾールによる）、頬内（例えば、舌下）、膣内、非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、関節腔内、胸膜腔内、腹腔内、大脳内、動脈内あるいは静脈内）、局所（すなわち、気道表面を含む皮膚と粘膜表面の両方）、経皮的投与に適しているが、任意のケースにおけるもっとも適当な経路は、治療されている状態の性質および重篤度や、使用されているインスリン薬物−オリゴマー結合体の特定の混合物の性質による。
【０１７２】  経口投与に適している製薬組成物は、粉末あるいは顆粒、水溶性あるいは非水溶性の液体中の溶液あるいは懸濁液、あるいは水中油あるいは油中水エマルジョンといったような形で、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の所定量をそれぞれ含んでいる、カプセル、カシェ剤、舐剤あるいは錠剤などの別々のユニットの中に存在しているものであってよい。こうした製剤は、インスリン薬物−オリゴマー結合体と適当なキャリアとの混合物（これには、上で特記しているように１つあるいはそれ以上の補助成分が含まれる）を結合させるステップを含む薬学のいずれかの適当な方法により調製され得る。一般的には、本発明の実施形態による製薬組成物は、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を、液体あるいは微細に分割された固体キャリア、あるいは両方と均一にまた堅く混ぜ合わせることにより調製され、また、必要な場合には、生じた混合物を形作りする。例えば、錠剤は任意には１つあるいはそれ以上の補助成分とともに、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を含む粉末あるいは顆粒を圧縮あるいは成形することにより調製することが可能である。圧縮錠剤は、適当な機械で、任意に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤および／または表面活性／分散剤と混合される粉末あるいは顆粒のような易流動性形態にある混合物を圧縮することにより、調製することが可能である。成形錠剤は、適当な機械で、不活性液体結合剤により湿らせた粉末化合物を成形することにより作成することが可能である。
【０１７３】  頬内（舌下）投与に適している製薬組成物には、通常はショ糖およびアカシア（アラビアゴム）あるいはトラガカントである香料ベースのインスリン薬物−オリゴー結合体の混合物を含む舐剤、およびゼラチンおよびグリセリンあるいはショ糖およびアカシアのような不活性ベースのインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を含む香錠が含まれる。
【０１７４】  非経口投与に適している本発明の実施形態による製薬組成物は、その製剤が好適にはその対象となるレシピエントの血液と好適には等張性である、インスリン薬物−オリゴマー結合体混合物の無菌水溶性および非水溶性注射溶液から成る。これらの製剤には、組成物を対象となるレシピエントの血液と等張性にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、溶質が含まれ得る。水溶性および非水溶性無菌懸濁液には、懸濁薬物と増粘剤が含まれ得る。その組成物には、単位／用量あるいは複数回用量のコンテナー、例えば、密封アンプルおよびバイアル中に存在し得るし、また、使用直前に無菌液体キャリア、例えば、生理食塩水あるいは注射用水を付加するだけが必要な凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時調合注射溶液および懸濁液は、前記の種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。例えば、密封コンテナー中の単位用量形態で、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を含む注射可能で、安定していて、無菌である組成物が提供され得る。インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物は、凍結乾燥剤の形態で供給され、これは、被験者への注射に適する液体組成物を形成するために、適当な薬学的に許容できるキャリアにより再構成され得る。単位用量形態は、典型的には、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の約１０ｍｇ〜約１０ｇを含む。インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物が実質的に水溶性である場合には、生理学的に受入れ可能である乳化剤の十分量が、水溶性キャリアの中のインスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物を乳化するのに十分な量で用いられ得る。こうした有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。
【０１７５】  直腸内投与に適している製薬組成は好適には、単位用量坐薬として提供される。これらは、１つあるいはそれ以上の通常の固体キャリア、例えば、ココアバターと、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物とを混合し、次いで、生じた混合物を形作ることにより調製され得る。
【０１７６】  皮膚への局所的適用に適している製薬組成物は、好適には、軟膏剤、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾールあるいは油の形態をとる。使用され得るキャリアには、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮促進剤および２つあるいはそれ以上のそれらの組み合わせが含まれる。
【０１７７】  経皮投与に適している製薬組成物は、期間延長のためにレシピエントの上皮と密接に接触して残るように適応される個別のパッチとして提供され得る。経皮投与に適している組成はまた、イオン泳動（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６）：３１８（１９８６）を参照されたい）によりデリバリーすることが可能であり、また典型的には、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の任意に緩衝された水溶液の形態をとる。適当な製剤は、クエン酸塩、あるいはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）あるいはエタノール／水を含み、また０．１〜０．２Ｍの活性成分が含まれる。
【０１７８】  こうした製薬組成物の効果的な量を投与することにより、こうした治療を必要としている被験者におけるインスリン欠乏を治療する諸方法もまた提供される。その使用が本発明の範囲内にある、インスリン薬物−オリゴマー結合体の任意の混合物の有効量は、混合物及び被験者によりいくらか変化し、また、年齢や被験者の状態やデリバリーの経路などの要素によるであろう。こうした投与は当業者には公知の日常的な薬理学的手順により決めることができる。一般的な提案として、インスリン薬物−オリゴマー結合体の混合物の重量に基づいて計算される全重量で、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が治療上の効果を有している。非常に高い値になると関係してくる毒性は、活性ベースの重量に基づいて計算された全重量で、約１０ｍｇ／ｋｇまでといった低い値に静脈内投与を制限することが可能である。約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量は、経口投与に用いられ得る。典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量は、筋肉注射に用いられる。投与の回数は、通常は１日当たり１回、２回あるいは３回あるいは、その状態を制御するのに必要な回数である。あるいは、その薬物−オリゴマー結合体は連続輸液により投与することが可能である。治療期間は、治療されているインスリン欠乏のタイプに依存し、その被験者の生涯の長きにわたって治療されることが多い。
【０１７９】  本発明の実施形態による結合体混合物を合成する諸方法もまた提供される。合成経路の以下の実施形態は、実質的に単分散混合物の合成に関しているが、同様の合成経路が、本発明の実施形態によるその他のインスリン薬物−オリゴマー結合体を合成するために利用され得る。
【０１８０】  ポリエチレングリコールから成るポリマーの実質的に単分散混合物が、反応１に説明されているように提供される。すなわち、
【化１６】
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【０１８１】  Ｒ1はＨあるいは親油性成分である。Ｒ1は好適にはＨ、アルキル、アリールアルキル、芳香族成分、脂肪酸成分、脂肪酸成分のエステル、コレステリルあるいはアダマンチルである。Ｒ1はさらに好適には、Ｈ、低級アルキル、あるいは芳香族成分である。Ｒ1は最も好適にはＨ、メチル、あるいはベンジルである。
【０１８２】  式Ｉでは、ｎは１〜２５である。好適にはｎは１〜６である。
【０１８３】  Ｘ+は陽イオンである。好適にはＸ+は、ＰＥＧ上のヒドロキシル成分をイオン化することができる強塩基などの化合物中のいずれかの陽イオンである。陽イオンの例には、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、タリウムイオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８４】  Ｒ2はＨあるいは親油性成分である。Ｒ2は好適には直鎖状あるいは枝分かれしたアルキル、アリールアルキル、芳香族成分、脂肪酸成分あるいは脂肪酸成分のエステルである。Ｒ2はさらに好適には低級アルキル、ベンジル、１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸成分、あるいは１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸成分のエステルである。Ｒ2はもっとも好適には、メチル、１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸成分、あるいは１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸成分のエチルエーテルである。
【０１８５】  式ＩＩでは、ｍは１〜２５である。好適には、ｍは１〜６である。
【０１８６】  Ｍｓはメシラート成分（すなわち、ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）−）である。
【０１８７】  反応１に説明されているように、式Ｉの構造を有する化合物の混合物は、ポリエチレングリコール成分から成り、また式ＩＩＩの構造を有するポリマーの混合物を供給するために、式ＩＩの構造を有する化合物の混合物と反応させる。式Ｉの構造を有する化合物の混合物は実質的に単分散混合物である。好適には、式Ｉの化合物の混合物中にある化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントが、同じ分子量を有し、また、さらに好適には、式Ｉの化合物の混合物は、実質的には単分散混合物である。式ＩＩの化合物の混合物は実質的には単分散混合物である。好適には、式ＩＩの化合物の混合物中にある化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントが、同じ分子量を有し、また、さらに好適には、式ＩＩの化合物の混合物は、実質的には単分散混合物である。式ＩＩＩの化合物の混合物は実質的には単分散混合物である。好適には、式ＩＩＩの化合物の混合物中にある化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントが、同じ分子量を有する。さらに好適には、式ＩＩＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。
【０１８８】  反応１は好適には約０℃と約４０℃の間で行われ、さらに好適には、約１５℃と約３５℃の間で行われ、また、もっとも好適には、室温にて（およそ２５℃）行われる。
【０１８９】  反応１は、当業者には理解されるであろうさまざまな期間で行われる。反応１は好適には、約０．２５、０．５あるいは０．７５時間および約２、４あるいは８時間の間にある期間で行われる。
【０１９０】  反応１は好適には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、あるいはそれらの混合物などの非プロトン性溶媒中で実施されるが、これらに限定されるものではない。さらに好適には、その溶媒はＤＭＦ、ＤＭＡあるいはトルエンである。
【０１９１】  式ＩＩの化合物に対する式Ｉの化合物のモル比は好適には、約１：１よりも大きい。さらに好適には、そのモル比は少なくとも約２：１である。式Ｉの化合物を過剰に供給することにより、式ＩＩの化合物の全てが実質的に反応し、以下に論じられているように、式ＩＩＩの化合物の回収において助けとなることができる。
【０１９２】  式Ｉの化合物は、好適には、反応２：
【化１７】
0005312720.tif 000017
に説明されているように作成される。
【０１９３】  Ｒ1とＸ+は、前記のものであり、また式ＩＶの化合物の混合物は実質的に単分散である。好適には、式ＩＶの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有し、またさらに好適には、式ＩＶの化合物の混合物は単分散である。
【０１９４】  式ＩＶの化合物のＰＥＧ成分上のヒドロキシ成分をイオン化することができるさまざまな化合物は当業者には理解されるであろう。ヒドロキシ成分をイオン化することができる化合物は好適には、強塩基である。さらに好適には、ヒドロキシ成分をイオン化することができる化合物は、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ナトリウムｔ−ブトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）、リチウムジイソプロピルアミンから成るグループから選択される。ヒドロキシ成分をイオン化することができるその化合物はさらに好適には水素化ナトリウムである。
【０１９５】  式ＩＶの化合物に対する式ＩＶの化合物のＰＥＧ上のヒドロキシ成分をイオン化することができる化合物のモル比は好適には、少なくとも約１：１よりも大きい。さらに好適には、そのモル比は少なくとも約２：１である。ヒドロキシ成分をイオン化することができる化合物を過剰供給することにより、式ＶＩの化合物の全てを実質的に反応させて、式Ｉの化合物を供給することが確実なものとなる。従って、式ＩＶの化合物と式Ｉの化合物の両方が反応産物混合において存在した場合に起こり得る分離困難は、回避することが可能である。
【０１９６】  反応２は好適には約０℃と約４０℃の間で行われ、さらに好適には、約１５℃と約３５℃の間で行われ、また、もっとも好適には、室温にて（およそ２５℃）行われる。
【０１９７】  反応２は、当業者には理解されるであろうさまざまな期間で行われる。反応２は好適には、約０．２５、０．５あるいは０．７５時間および約２、４あるいは８時間の間にある期間で行われる。
【０１９８】  反応２は好適には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、あるいはそれらの混合物などの非プロトン性溶媒の中で実施され、溶媒は、これらに限定されるものではない。さらに好適には、その溶媒はＤＭＦ、ＤＭＡあるいはトルエンである。
【０１９９】  式ＩＩの化合物は好適には、反応３：
【化１８】
0005312720.tif 000018
に説明されているように作成される。
【０２００】  Ｒ2とＭｓは、前記のものを表し、また式Ｖの化合物の混合物は実質的に単分散として存在する。好適には、式Ｖの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有し、またさらに好適には、式Ｖの化合物の混合物は単分散である。
【０２０１】  Ｑはハロゲン化物であり、好適には塩化物あるいはフッ化物である。
【０２０２】  ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）Ｑはハロゲン化メタンスルホニルである。そのハロゲン化メタンスルホニルは好適には、塩化メタンスルホニルあるいはフッ化メタンスルホニルである。
【０２０３】  式Ｖの化合物に対するハロゲン化メタンスルホニルのモル比は好適には、少なくとも約１：１よりも大きい。さらに好適には、そのモル比は少なくとも約２：１である。ハロゲン化メタンスルホニルを過剰供給することにより、式Ｖの化合物の全てが実質的に反応して、式ＩＩの化合物が生じることが確実となる。従って、式Ｖの化合物と式ＩＩの化合物の両方が反応産物混合において存在した場合に起こり得る分離困難は、回避することが可能である。
【０２０４】  反応３は好適には約−１０℃と約４０℃の間で行われ、さらに好適には、約１０℃と約３５℃の間で行われ、また、もっとも好適には、室温にて（およそ２５℃）行われる。
【０２０５】  反応３は、当業者には理解されるであろうさまざまな期間で行われる。反応３は好適には、約０．２５、０．５あるいは０．７５時間および約２、４あるいは８時間の間にある期間で行われる。
【０２０６】  反応３は好適には、モノメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノイソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、モノ−ｎ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、モノクロロヘキシルアミン、ジクロロヘキシルアミン、あるいはそれらの混合物を含む脂肪族アミンの存在下で実施されるが、脂肪族アミンは、これらに限定されるものではない。さらに好適には、脂肪族アミンは、トリエチルアミンなどの第三級アミンである。
【０２０７】  当業者には理解されるであろうが、式Ｖの化合物のさまざまな実質的に単分散混合物は市販されており、入手可能である。例えば、Ｒ2がＨあるいはメチルであり、式Ｖの化合物がそれぞれＰＥＧあるいはｍＰＥＧ化合物である場合には、それらは、市販されており、ミシガン州ミルウォーキー市のＡｌｄｒｉｃｈ社、スイスのＦｌｕｋａ社および／またはオレゴン州ポートランド市のＴＣｌアメリカから入手可能である。
【０２０８】  Ｒ2が例えば、高級アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリルあるいはアダマンチルなどの親油性成分である場合は、式Ｖの化合物は当業者には理解されるであろうさまざまな方法により供給することが可能である。式Ｖの化合物は好適には以下のように提供される。すなわち、
【化１９】
0005312720.tif 000019
【化２０】
0005312720.tif 000020
【０２０９】  Ｒ2は、親油性成分であり、好適には高級アルキル、脂肪酸のエステル、コレステリルあるいはアダマンチルであり、さらに好適には、脂肪酸の低級アルキルエステルであり、またもっとも好適には、１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸のエチルエステルである。
【０２１０】  Ｒ3は、Ｈ、ベンジル、トリチル、テトラヒドロピラン、あるいは当業者には理解されるであろうその他のアルコール保護基である。
【０２１１】  Ｘ2+はＸ+に関して前記される、陽イオンである。
【０２１２】  ｍの値は前記のものを表す。
【０２１３】  反応４に関しては、式ＶＩの化合物の混合物は、反応１に参照して前記されているものと同様の反応条件下で、式ＶＩＩの化合物の混合物と反応させる。式ＶＩの化合物の混合物は実質的に単分散混合物である。好適には、式ＶＩの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有する。さらに好適には、式ＶＩの化合物の混合物は単分散である。式ＶＩＩの化合物の混合物は実質的には単分散である。好適には、式ＶＩＩの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有する。さらに好適には、式ＶＩＩの化合物の混合物は単分散である。
【０２１４】  反応５に関しては、式ＶＩＩＩの化合物は、当業者には理解されるであろうさまざまな方法によりＲ3成分をアルコールに変換するために加水分解され得る。Ｒ3はベンジルあるいはトリチルである場合は、加水分解は好適には、当業者には公知のものであるパラジウム−チャコール触媒の存在下でＨ2を使用して行われる。もちろん、Ｒ3はＨである場合は、反応５は不必要である。
【０２１５】  式ＶＩの化合物は市販されており、入手可能であり、あるいは反応３に関し、前記されたようにして製造されることが可能である。式ＶＩＩの化合物は反応２に関して前記されたようにして製造されることが可能である。
【０２１６】  ＰＥＧ成分から成り、また上の式ＩＩＩの構造を有するポリマーの実質的に単分散混合物は、さらに、ＰＥＧ鎖を延長するために、その他の、ＰＥＧ成分から成る実質的に単分散ポリマーと反応させることができる。例えば、以下の図式：
【化２１】
0005312720.tif 000021
【化２２】
0005312720.tif 000022
を用いることが可能である。
【０２１７】  Ｍｓ，ｍとｎは反応１に関し、前記されたものである。ｐはｎとｍと同様であり、またＸ2+は、反応１に関して、前記されたＸ+と同様である。Ｑは反応３に関し、前記されたものである。Ｒ2は反応１に関し、前記されたものであり、また好適には低級アルキルである。Ｒ1はＨである。反応６は好適には、反応３に関して、前記されたものと同様なやり方で行われる。反応７は好適には、反応１に関して前記されているものと同様なやり方で行われている。好適には、式ＩＩＩの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有し、また、さらに好適には、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散である。式Ｘの化合物の混合物は実質的には単分散である。好適には、式Ｘの化合物の混合物における化合物の少なくとも約９６、９７、９８あるいは９９パーセントは同じ分子量を有し、また、さらに好適には、式Ｘの化合物の混合物は単分散である。
【０２１８】  本発明の実施形態によるプロセスは、ここで説明される、図１に示されている図式により図示説明される。実質的な単分散ポリエチレングリコール含有オリゴマーの合成は、実質的には単分散ポリエチレングリコールであるモノベンジルエーテル（１）の作成により始まる。市販されていて入手可能な実質的な単分散ポリエチレングリコールの過剰量を、Ｃｏｕｄｅｒｔら（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１６（１）：１９〜２６（１９８６））により説明されているように、水溶性水酸化ナトリウムの存在下で塩化ベンジルと反応させる。１のナトリウム塩はその後に、ＮａＨを添加することにより、作成され、またこのナトリウム塩は、ヒドロキシアルカン酸のエステル（２）から合成されるメシラートと反応することが可能となる。アルコール（４）を得るために、メシラートの置換の産物（３）が接触水素添加により脱ベンジル化される。このアルコールのメシラート（５）は、塩化メタンスルホニルを加えることにより製造でき、また、実質的な単分散ポリエチレングリコール誘導体のモノエチルエーテルのナトリウム塩との反応で求電子試薬として使用され、それによって、オリゴマーのポリエチレングリコール成分を延長させて所望の長さにし、延長されたエステルを得る（６）。このエステルは、水溶性塩基の中で加水分解されて酸（７）になり、また、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応することにより活性化されたエステル（８）に転換される。図１に図示説明されているオリゴマーがＮ−ヒドロキシスクシンミドを使用して活性化されるが、これは、クロロギ酸パラ−ニトロフェニル、３，４−クロロギ酸フェニル、３，４−フェニルジクロロギ酸塩などの活性クロロギ酸フェニル、トリチル化、およびアセタール形成を含むさまざまな他の試薬を、本発明のオリゴマーを活性化するのに使用でき、試薬は、これらに限定されるものではないことは理解されるべきことである。
【０２１９】  その上さらに図１を参照すると、ｑは１〜２４である。好適には、ｑは１〜１８であり、またｑはさらに好適には、４〜１６である。Ｒ4はカルボン酸を供給するために、加水分解を受けることが可能な成分である。Ｒ4は好適には低級アルキルであり、またさらに好適にはエチルである。変数ｎとｍは反応１に関し、前記されたものである。
【０２２０】  本出願で説明されている手順で使用される全ての出発原料は市販されていて入手可能なものか、あるいは市販されていて入手可能な出発原料を使用して当業者に公知の方法により作成することができる。
【０２２１】  ここでは、本発明は以下の例に参照して説明される。これらの例は本発明の実施形態を説明するという目的のためのものであり、請求項により定義されているような本発明の範囲を制限するものではない。
【０２２２】［実施例］
例１〜１０
例１〜１０における反応は、別に指定しない限り窒素下で磁気撹拌しながら行った。「処理」は、有機溶媒で抽出して、ＮａＣｌ飽和溶液で有機相を洗浄し、乾燥させて（ＭｇＳＯ4）、蒸発させる（ロータリーエバポレーター）ことを示す。シリカゲル６０°Ｆ−２５４を下塗りしたＭｅｒｃｋガラス板を用いて薄相クロマトグラフィーを行い、スポットをヨウ素蒸気によって視覚化した。すべての質量スペクトルは、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＯが測定し、ｍ／ｚ（相対強度）の順に報告されている。元素分析および融点は、テネシー州、ノックスヴィルのＧａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．が行った。例１〜１０は、図２に示す図式に関連している。
【０２２３】  例１
８−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（９）
乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の非多分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍＬ、４．１９ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２６ｍＬ、３．０９ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の塩化メタンスルホニル（２．３７ｍＬ、３．５１ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加漏斗から一滴ずつ添加した。その塩化物の添加が完了した１０分後、反応混合物を氷浴から取出し、放置して室温になるようにした。混合物をさらに１時間撹拌し、この時、ＴＬＣ（溶離剤として、１５％のＭｅＯＨを伴うＣＨＣｌ3）は、トリエチレングリコールモノメチルエーテルが残っていないことを示した。
【０２２４】  別の７５ｍＬのジクロロメタンを用いて反応混合物を希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3、水、そしてブラインで順次洗浄した。有機物をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥させて、濾過し、真空下で濃縮して、化合物９の非多分散混合物を透明油状物として得た（５．３１ｇ、８６％）。
【０２２５】  例２
エチレングリコールモノメチルエーテル（１０）（ｍ＝４、５、６）
Ｎ2下、乾燥ＤＭＦ（２５．７ｍＬ）中の非多分散化合物１１（３５．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、鉱物油中のＮａＨ６０％分散液を少しずつ添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。この塩１２に、乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）中の非多分散メシレート９（２３．３６）の溶液を一度に添加し、混合物を室温で３．５時間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（１２％ＣＨ3ＯＨ−ＣＨＣｌ3）によってモニターした。反応混合物を同量の１Ｎ  ＨＣｌで希釈し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出して捨てた。水溶液の抽出および処理によって、非多分散ポリマー１０を得た（収率８２〜８４％）。
【０２２６】  例３
３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサドコサノール（１０）（ｍ＝４）
油状物；Ｒｆ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ15Ｈ32Ｏ8についての計算値  ３４０．２１（Ｍ+＋１）、実測値  ３４１．２。
【０２２７】  例４
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサペンタコサノール（１０）（ｍ＝５）
油状物；Ｒｆ０．４３（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ17Ｈ36Ｏ9についての計算値  ３８４．２４（Ｍ+＋１）、実測値  ３８５．３。
【０２２８】  例５
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサオクタコサノール（１０）（ｍ＝６）
油状物；Ｒｆ０．４２（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ19Ｈ40Ｏ10についての計算値  ４２８．２６（Ｍ+＋１）、実測値  ４２９．３。
【０２２９】  例６
２０−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（１４）
非多分散化合物１４は、９について説明したように、アルコール１３（ｍ＝４）および塩化メタンスルホニルから定量収率で、油状物として得た；Ｒｆ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ17Ｈ37Ｏ10についての計算値  ４３３．２１（Ｍ+＋１）、実測値  ４３３．４６９。
【０２３０】  例７
エチレングリコールモノメチルエーテル（１５）（ｍ＝３、４、５）
非多分散化合物１５は、化合物１０について上で説明した手順を用いて、ジオールから調製した。
【０２３１】  例８
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘンエコサノール（１５）（ｍ＝３）
油状物；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ21Ｈ44Ｏ11についての計算値  ４７２．２９（Ｍ+＋１）、実測値  ４７２．２９。
【０２３２】  例９
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサテトラトリコサノール（１５）（ｍ＝４）
油状物；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ23Ｈ48Ｏ12についての計算値  ５１６．３１（Ｍ+＋１）、実測値  ５１６．３１。
【０２３３】  例１０
３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサヘプタトリコサノール（１５）（ｍ＝５）
油状物；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ25Ｈ52Ｏ13についての計算値  ５６０．６７（Ｍ+＋１）、実測値  ５６０．６７。
【０２３４】  例１１〜１８は、図３に示す図式に関連している。
【０２３５】  例１１
ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１６）
４ｍＬの水に３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを溶解することによって調製した水酸化ナトリウム水溶液を、非多分散ヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ、２５ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加した。塩化ベンジル（３．９ｇ、３０．８ｍｍｏｌ、３．５４ｍＬ）を添加して、反応混合物を撹拌しながら１００℃に１８時間加熱した。その後、反応混合物を冷却して、ブライン（２５０ｍＬ）で希釈し、塩化メチレン（２００ｍＬ×２）で抽出した。有機相を集めて、ブレインで一回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥させて、濾過し、真空下で濃縮して、暗褐色油状物にした。粗生成混合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離勾配：酢酸エチル  →  ９／１の酢酸エチル／メタノール）によって精製して、８．０９９ｇ（７０％）の非多分散１６を黄色油状物として生じた。
【０２３６】  例１２
６−メチルスルホニルオキシヘキサン酸エチル（１７）
乾燥ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の非多分散６−ヒドロキシヘキサン酸エチル（５０．７６ｍＬ、５０．４１ｇ、２２７ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（３４．４３ｍＬ、２４．９９ｇ、２４７ｍｍｏｌ）を添加した。乾燥ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の塩化メタンスルホニル（１９．１５ｍＬ、２８．３ｇ、２４７ｍｍｏｌ）の溶液を、添加漏斗から一滴ずつ添加した。混合物を３時間半撹拌し、放置して、氷浴が溶けるにつれてゆっくりと室温にした。シリカゲルを通して混合物を濾過し、濾液を、水、飽和ＮａＨＣＯ3、水そしてブラインで順次洗浄した。有機物をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥させて、濾過し、真空下で濃縮して淡黄色油状物にした。粗生成物の最終精製をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１のヘキサン／酢酸エチル）によって達成して、非多分散生成物（４６．１３ｇ、８５％）を透明無色油状物として得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２３９（Ｍ＋Ｈ）、１９３（Ｍ−Ｃ2Ｈ5Ｏ）。
【０２３７】  例１３
６｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１８）
水素化ナトリウム（３．２２５ｇまたは６０％油状物分散液、８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水トルエンに懸濁させて、窒素雰囲気下に置き、氷浴で冷却した。８０ｍＬの乾燥トルエン中の非多分散アルコール１６（２７．３ｇ、７３．３ｍｍｏｌ）の溶液をＮａＨ懸濁液に添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、放置して室温にして、もう５時間撹拌した。この間に、混合物は、透明な褐色溶液になった。８０ｍＬの乾燥トルエン中の非多分散メシレート１７（１９．２１ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ／アルコール混合物に添加し、溶液を集めて、室温で３日間撹拌した。５０ｍＬのメタノールを用いて反応混合物の反応を停止させて、塩基性アルミナを通して濾過した。濾液を真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離勾配：３／１の酢酸エチル／ヘキサン  →  酢酸エチル）によって精製して、非多分散生成物を淡黄色油状物として生じた（１６．５２ｇ、４４％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
【０２３８】  例１４
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１９）
非多分散ベンジルエーテル１８（１．０３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を２５ｍＬのエタノールに溶解した。この溶液に、２７０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを添加し、混合物を水素雰囲気下に置いて、４時間撹拌した。この時、ＴＬＣは、出発原料の完全消失を示した。Ｃｅｌｉｔｅ５４５を通して反応混合物を濾過して、触媒を除去し、濾液を真空下で濃縮して、非多分散表題化合物を透明油状物として生じた（０．６７ｇ、７９％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４２５（Ｍ＋Ｈ）、４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２３９】  例１５
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（２０）
非多分散アルコール１９（０．８３５ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を３．５ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解して、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．３０１ｍＬ、０．２１９ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷浴で冷却した。２分後、塩化メタンスルホニル（０．１６ｍＬ、０．２４８ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間、０℃で撹拌し、その後、室温で２時間撹拌した。シリカゲルを通して反応混合物を濾過して、塩化トリエチルアンモニウムを除去し、濾液を、水、飽和ＮａＨＣＯ3、水そしてブラインで順次洗浄した。有機物をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥させ、濾過して、真空下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９／１の酢酸エチル／メタノール）によって精製して、非多分散化合物２０を透明油状物として得た（０．８１９ｇ、８３％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
【０２４０】  例１６
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸エチルエステル（２１）
ＮａＨ（８８ｍｇの６０％油中分散液、２．２ｍｍｏｌ）を、Ｎ2下で無水トルエン（３ｍＬ）に懸濁させ、０℃に冷却した。トルエンとの共沸蒸留によって乾燥させた非多分散ジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍＬ、０．２６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を放置して室温に温め、４時間撹拌した。この間に、濁ったグレーの懸濁液が透明になり、黄色になり、そしてその後、褐色に変わった。２．５ｍＬの乾燥トルエン中のメシレート２０（０．５０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩撹拌した後、２ｍＬのメタノールの添加によって反応を停止させ、得られた溶液は、シリカゲルを通して濾過した。濾液を真空下で濃縮した。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ）、５２１（Ｍ＋Ｎａ）。分取クロマトグラフィー（シリカゲル、１９／３のクロロホルム／メタノール）によりさらに精製することによって、非多分散生成物を透明黄色油状物として生じた（０．３０２ｇ、５７％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５２７（Ｍ＋Ｈ）、５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２４１】  例１７
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸（２２）
非多分散エステル２１（０．２５ｇ、０，０４６ｍｍｏｌ）を０．７１ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ中で、１８時間撹拌した。１８時間後、混合物を真空下で濃縮して、アルコールを除去し、残留物をさらなる１０ｍＬの水に溶解した。その水溶液を２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、その生成物をジクロロメタン（３０ｍＬ×２）に抽出した。その後、有機相を集めて、ブライン（２５ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥させて、濾過し、真空下で濃縮して、非多分散表題化合物を黄色油状物として生じた（０．１４７ｇ、６２％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ）、５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２４２】  例１８
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２３）
非多分散酸２２（０．２０９ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を４ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解し、既にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）とＥＤＣ（塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイジド）（９８．０ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）が入っている乾燥フラスコに、Ｎ2雰囲気下で添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、シリカゲルを通して濾過して、過剰の試薬を除去し、ＥＤＣから尿素を生成した。濾液を真空下で濃縮して、非多分散成生物を暗黄色油状物として生じた（０．２３５ｇ、９４％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５９６（Ｍ＋Ｈ）、６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２４３】  例１９〜２４は、図４に示す図式に関連している。
【０２４４】  例１９
トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート（２４）
氷浴で０℃に冷却したＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）の溶液に、非多分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、トリエチルアミン（２９．５ｍＬ、０．２２ｍｏｌ）を添加して、溶液を１５分間、０℃で撹拌し、続いて、塩化メタンスルホニル（１３．８ｍＬ、０．１８ｍｏｌ、２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解）を一滴ずつ添加した。反応混合物を３０分間、０℃で撹拌し、放置して室温に温め、その後、２時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過し、その後、Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ3（３００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。その後、油状物を〜２時間、真空ライン上に配置して、確実に乾燥させ、非多分散表題化合物を黄色油状物として生じた（２９．１５ｇ、収率８０％）。
【０２４５】  例２０
ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（２５）
ＴＨＦ（１Ｌ）中の非多分散テトラエチレングリコール（５１．５ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１４．８ｇ、０．１３ｍｏｌ、〜３０分間かけて少しずつ）を添加した。次に、反応混合物を１時間撹拌し、その後、ＴＨＦ（９０ｍＬ）に溶解した２４（２９．１５ｇ、０．１２ｍｏｌ）を一滴ずつ添加し、反応混合物を一晩撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過し、乾燥するまで蒸発させた。その後、油状物をＨＣｌ（２５０ｍＬ、１Ｎ）に溶解し、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で洗浄して、過剰の２４を除去した。残存する２４を除去するために、酢酸（１２５ｍＬ）での追加洗浄が必要なこともある。２５の大部分が水性相から除去されるまで、水性相をＣＨ2Ｃｌ2（１２５ｍＬ量）で繰返し洗浄した。最初の抽出は、２４、２５、および二結合副生成物を含有するであろうから、ＨＣｌ（１２５ｍＬ、１Ｎ）で逆抽出しなければならない。有機相を集めて、乾燥するまで蒸発させた。その後、得られた油状物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解し、２５が除去されるまで、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬ量）で繰返し洗浄した。水性画分を集め、全量５０ｍＬ、溶液が濁ってくるまでＮａＣｌを添加し、その後、ＣＨ2Ｃｌ2（２×５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を集めて、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、非多分散表題化合物を油状物として生じた（１６．９ｇ、収率４１％）。確実に高純度にするために、一段階以上の精製手順を繰り返すことが望ましいこともある。
【０２４６】  例２１
８−ブロモオクタネート（２６）
エタノール（１００ｍＬ）中の８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ2ＳＯ4（０．３６ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を撹拌しながら３時間加熱して還流させた。粗反応混合物を室温に冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、透明油状物が得られた（５．５ｇ、収率９８％）。
【０２４７】  例２２
ＭＰＥＧ７−Ｃ８エステルの合成（２７）
エーテル（９０ｍＬ）中の非多分散化合物２５（３．０ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１時間撹拌した。その後、エーテル（１０ｍＬ）に溶解した非多分散化合物２６（２．４ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加し、反応混合物を一晩撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（２００ｍＬ以下のＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過し、乾燥するまで蒸発させた。得られた油状物を酢酸エチルに溶解し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル対酢酸エチル／メタノール、１０：１）を実施し、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（０．８４３８、収率１９％）。
【０２４８】  例２３
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２８）
非多分散化合物２７（０．７０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の油状物に、１ＮのＮａＯＨ（２．０ｍＬ）を添加し、反応混合物を４時間撹拌した。粗反応混合物を濃縮し、酸性化（ｐＨ〜２）して、ＮａＣｌで飽和し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を集め、飽和ＮａＣｌで洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（０．３５ｇ、収率５３％）。
【０２４９】  例２４
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸の活性化（２９）
非多分散ｍＰＥＧ７−Ｃ８酸２８（０．３１ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水塩化メチレンに溶解し、その後、無水塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を数時間撹拌し、その後、１ＮのＨＣｌ、水で洗浄して、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させ、濾過して、濃縮した。粗材料をカラムクロマトグラフィーによって精製し、濃縮して、非多分散表題化合物を透明油状物として得、減圧により乾燥させた。
【０２５０】  例２５〜２９は、図５に示す図式に関連している。
【０２５１】  例２５
１０−ヒドロキシデカノエート（３０）
エタノール（１００ｍＬ）中の非多分散１０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ2ＳＯ4（０．４３ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を撹拌しながら３時間加熱して還流させた。粗反応混合物を室温に冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、非多分散表題化合物が透明油状物として生じた（６．９ｇ、収率９８％）。
【０２５２】  例２６
１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート（３１）
ＣＨ2Ｃｌ2（２７ｍＬ）の溶液に、非多分散１０−ヒドロキシデカノエート３０（５．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（５ｍＬ、３７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１５分間、０℃で撹拌した。その後、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）に溶解した塩化メチルスルホニル（２．７ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌して、氷浴を取り外し、反応物をさらに２時間、室温で撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過し、濾液を、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、非多分散表題化合物を黄色がかった油状物として得た（７．４２ｇ、収率９７％）。
【０２５３】  例２７
ＭＰＥＧ7−Ｃ10エステル（３２）
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の非多分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル２５（２．５ｇ、７．３ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（０．１９４ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１時間撹拌した。その後、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解した非多分散１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート３１（２．４ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加して、反応混合物一晩撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（２００ｍＬ以下のＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過して、乾燥するまで蒸発させた。得られた油状物を酢酸エチルに溶解し、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、クロマトグラフィー（シリカ、１０：１の酢酸エチル／メタノール）に付し、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）に付して、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（０．５７０ｇ、収率１５％）。
【０２５４】  例２８
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（３３）
非多分散ｍＰＥＧ7−Ｃ10エステル３２（０．５７０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の油状物に、１ＮのＮａＯＨ（１．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。粗反応混合物を濃縮し、酸性化（ｐＨ〜２）して、ＮａＣｌで飽和し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を集め、飽和ＮａＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（０．３４０ｇ、収率６２％）。
【０２５５】  例２９
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸の活性化（３４）
上の例２４で説明したものに類似した手順を用いて、非多分散酸３３を活性化した。
【０２５６】  例３０および３１は、図６に示す図式に関連している。
【０２５７】  例３０
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（３６）の合成
非多分散塩化ステアロイル３５（０．７ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、ベンゼン中のＰＥＧ６（５ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）とピリジン（０．９７ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）の混合物にゆっくりと添加した。反応混合物を数時間（５時間以内）撹拌した。展開溶媒として酢酸エチル／メタノールを用いるＴＬＣによって、反応を追跡した。その後、反応混合物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させて、濃縮し、減圧によって乾燥させた。精製非多分散化合物３６をＦＡＢＭＳによって分析した：ｍ／ｅ  ５４９／Ｍ+Ｈ。
【０２５８】  例３１
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化
非多分散Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化は、二段階で行った。
１）  非多分散ステアロイル−ＰＥＧ６  ３６（０．８ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解して、ホスゲン溶液（１０ｍＬ、トルエン中２０％）に添加し、これを氷浴で冷却した。反応混合物を０℃で１時間、その後、室温で３時間撹拌した。その後、ホスゲンおよびトルエンを蒸留して除去し、残留非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３７をＰ2Ｏ5を用いて一晩乾燥させた。
２）無水塩化メチレン中の非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３６（０．７８ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（１２８ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を添加した。反応混合物を１６時間撹拌し、その後、水で洗浄して、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させ、濾過して、濃縮し、減圧によって乾燥させて、非多分散活性化Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー３８が得られた。
【０２５９】  例３２〜３７は、図７に示す図式に関連している。
【０２６０】  例３２
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（３９）
非多分散テトラエチレングリコールの油状物（１９．４ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）に、ＮａＯＨの溶液（４．０ｍＬ中４．０ｇ）を添加して、反応物を１５分間撹拌した。塩化ベンジル（３．５４ｍＬ、３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１００℃に加熱して、一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却して、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を集め、飽和ＮａＣｌで洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）に付して、非多分散表題化合物を黄色油状物として得た（６．２１ｇ、収率７１％）。
【０２６１】  例３３
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート（４０）
ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）の溶液に、テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル３９（６．２１ｇ、２２ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（３．２ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１５分間、０℃で撹拌した。その後、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｍＬ）に溶解した塩化メタンスルホニル（１．７ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌して、氷浴を取り外し、反応物を室温でさらに２時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過して、濾液をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。得られた黄色油状物を活性炭（１０ｇ）を含むシリカのパッドを用いたクロマトグラフィーに付して、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（７．１０ｇ、収率８９％）。
【０２６２】  例３４
オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（４１）
水素化ナトリウム（０．４３ｇ、１８ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン（１４０ｍＬ）の溶液に、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の非多分散テトラエチレングリコール（３．５ｇ、１８ｍｍｏｌ）の溶液を一滴ずつ添加して、反応混合物を１時間撹拌した。その後、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解したテトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート４０（６．０ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加して、反応混合物を一晩撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（２５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄したもの）を通して粗反応混合物を濾過し、濾液をＨ2Ｏで洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。得られた油状物をクロマトグラフィー（シリカ、１０：１の酢酸エチル／メタノール）に付し、クロマトグラフィー（シリカ、２５：１のクロロホルム／メタノール）に付して、非多分散表題化合物を透明油状物として得た（２．６２ｇ、収率３４％）。
【０２６３】  例３５
ステアレートＰＥＧ８−ベンジル（４３）の合成
非多分散オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル４１（０．９９８ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）とピリジン（１６３．９ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）の撹拌冷却溶液に、ベンゼン中の非多分散塩化ステアロイル４２（６２７．７ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩（１８時間）撹拌した。翌日、反応混合物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させて、濃縮し、減圧によって乾燥させた。その後、粗生成物を、１０％メタノール／９０％クロロホルムを用いるフラッシュシリカゲルカラムのクロマトグラフィーに付した。生成物を含有する画分を集めて、濃縮し、減圧によって乾燥させて、非多分散表題化合物を得た。
【０２６４】  例３６
ステアレート−ＰＥＧ８−ベンジルの水添分解
非多分散ステアレート−ＰＥＧ８−ベンジル４３（０．８５４ｇ、１．１３８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（活性炭上１０重量％のパラジウム）を添加した。反応混合物を一晩（１８時間）、水素下で撹拌した。その後、溶液を濾過し、濃縮して、１０％メタノール／９０％クロロホルムを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、Ｒt＝０．６の画分を回収して、濃縮し、乾燥させて、非多分散酸４４を得た。
【０２６５】  例３７
Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマーの活性化
例３１においてステアレート−ＰＥＧ６について説明したように、非多分散ステアレート−ＰＥＧ８オリゴマーの二段階活性化を行って、非多分散活性化Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー４５を得た。
【０２６６】  例３８
活性化トリエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
以下の説明は、図８に示す図式に関係している。２０％のホスゲンを含有するトルエンの溶液（１００ｍＬ、約１８．７ｇ、１８９ｍｍｏｌのホスゲン）をＮ2雰囲気下で０℃に冷却した。非多分散ｍＴＥＧ（トリエチレングリコール、モノメチルエーテル、７．８ｇ、４７．５ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの無水酢酸エチルに溶解し、冷却したホスゲン溶液に添加した。混合物を１時間、０℃で撹拌し、その後、放置して室温に温め、さらに２時間半撹拌した。残存するホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンを減圧蒸留によって除去して、非多分散ｍＴＥＧクロロホルメート４６が透明油状物性残留物として残った。
【０２６７】  非多分散残留物４６を５０ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解し、これにＴＥＡ（トリエチルアミン、６．６２ｍＬ、４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、５．８ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温、乾燥雰囲気下で、２０時間撹拌し、この間に、大量の白色沈殿が出現した。混合物を濾過してこの沈殿物を除去し、真空下で濃縮した。得られた油状物４７をジクロロメタンに取り、冷脱イオン水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そしてブラインで１回洗浄した。有機物をＭｇＳＯ4を用いて乾燥させ、濾過して、濃縮し、非多分散表題化合物を透明な淡黄色油状物として得た。必要な場合には、溶離剤としてＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによってＮＨＳエステルをさらに精製してもよい。
【０２６８】  例３９
活性化パルミテート−ＴＥＧオリゴマーの合成
以下の説明は、図９に示す図式に関係している。非多分散無水パルミチン酸（５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、室温で撹拌した。撹拌溶液に、３ｍｏｌ過剰のピリジンを添加し、続いて非多分散トリエチレングリコール（１．４ｍＬ）を添加した。この反応混合物を１時間撹拌した（反応の進行をＴＬＣ（３：７の酢酸エチル：クロロホルム）によってモニターした）。反応終了時、ＴＨＦを除去し、生成物を１０％Ｈ2ＳＯ4酸と混合して、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。集めた抽出物を水、ブラインで順次洗浄して、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させ、蒸発させて、非多分散成生物４８を得た。ＤＭＦ（〜１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の非多分散成生物４８（１ｍｍｏｌ）の溶液に、撹拌しながら添加する。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加する。反応混合物を数時間（例えば５時間）撹拌する。ジエチルエーテルを添加して、活性オリゴマーを沈殿させる。この工程を３回繰返し、最終的には生成物を乾燥させる。
【０２６９】  例４０
活性ヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
以下の説明は、図１０に示す図式に関係している。非多分散活性ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは、例３９の非多分散トリエチレングリコールと類似に調製した。ホスゲン２０％のトルエン溶液（３５ｍＬ、６．６６ｇ、６７．４ｍｍｏｌのホスゲン）を、Ｎ2雰囲気下、氷／塩水浴で冷却した。非多分散ヘキサエチレングリコール５０（１．８５ｍＬ、２．０ｇ、６．７４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＥｔＯＡｃに溶解し、注射器によってホスゲン溶液に添加した。反応混合物を氷浴内で１時間撹拌し続け、取出して、さらに室温で２．５時間撹拌した。ホスゲン、ＥｔＯＡｃおよびトルエンを減圧蒸留によって除去して、非多分散化合物５１が透明油状物性残留物として残った。
【０２７０】  非多分散残留物５１を２０ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解し、乾燥させた不活性雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍＬ、０．６８ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、そしてその後、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、０．８２ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。シリカゲルを通して混合物を濾過して、白色沈殿を除去し、真空下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに取り、冷水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そしてブラインで１回洗浄した。その有機物をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥させ、濾過して、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡ）によって最終精製を行って、ＵＶ活性非多分散ＮＨＳエステル５２を得た。
【０２７１】  例４１
インスリン−オリゴマー結合体の合成
２２±４℃における２５ｍＬのジメチルスルホキシド（純度＞９９％）中のヒトインスリン（亜鉛または亜鉛不含、乾燥重量を基準にして、２ｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）に、８ｍＬのトリエチルアミン（純度＞９９％）を添加した。得られた混合物を５〜１０分間、２２±４℃で撹拌した。前記に、２２±４℃、撹拌下で、７．５ｍＬのアセトニトリル中の前記例１８の活性化オリゴマー（活性化１００％を基準にして、０．１８８ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を迅速に添加した。溶液を４５分間撹拌し、温度を２７℃以下に維持しながら、酢酸溶液で反応を停止させた。ＨＰＬＣ分析によって反応をモニターした。この反応条件は、Ｂ２９位で単一結合したＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン（Ｂ２９単一結合ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン）を収率４０〜６０％で生成する。粗反応混合物（Ｂ２９単一結合のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン４０〜６０％、未反応のインスリン８〜２５％、関連物質１５〜３５％）を透析するかまたはダイアフィルトレーションして（３０００〜３５００の分子量削除、ＭＷＣＯ）、有機溶媒と低分子量不純物を除去し、酢酸アンモニウム緩衝液を交換して、冷凍乾燥させた。
【０２７２】  Ｂ２９位で単一結合するＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンの結合反応をＨＰＬＣ分析によってモニターした。このＨＰＬＣ分析法には、内径１５０×３．９ｍｍ、５μｍ、３００ÅのＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムを用いた。溶媒系は、溶媒Ｂ（５０／５０のメタノール／水中の０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｄ（メタノール中の０．１％ＴＦＡ）から成った。勾配系は、以下のとおりであった。
【０２７３】
【表１】
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【０２７４】  例４２
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例２４の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２７５】  例４３
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例３１の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２７６】  例４４
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例３７の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２７７】  例４６
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例３８の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２７８】  例４７
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例３９の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２７９】  例４８
例４１の手順を用いて、ヒトインスリンを例４０の活性化オリゴマーと結合させる。
【０２８０】  例４９
ヒトインスリン−オリゴマー結合体の混合物に関する分散係数の測定
ヒトインスリン−オリゴマー結合体の混合物に関する分散係数は、以下のように測定する。例えば、上の例４１で説明したようなヒトインスリン−オリゴマー結合体の混合物を提供する。混合物の第一サンプルをＨＰＬＣによって精製して、サンプル中の種々のヒトインスリン−オリゴマー結合体を分離し、単離する。各単離画分が、純粋に単一分散した結合体の混合物を含有すると仮定すると、「ｎ」は、回収される画分の数に等しい。混合物は、以下の結合体を一つ以上含むことができる。これらの結合体は、結合位置を規定し、続いて結合度：ＧｌｙA1一結合；ＰｈｅB1一結合；ＬｙｓB29一結合；ＧｌｙA1、ＰｈｅB1二結合；ＧｌｙA1、ＬｙｓB29二結合；ＰｈｅB1、ＬｙｓB29二結合；および／またはＧｌｙA1、ＰｈｅB1、ＬｙｓB29三結合を規定することによって説明される。混合物の各単離画分は、質量分光法によって分析して面分の質量を決定し、これによって、各単離画分をモノ、ジまたはトリ結合体として分類することができ、サンプルにおける各結合体についての変数「Ｍi」の値を提供することができる。
【０２８１】  混合物の第二サンプルをＨＰＬＣによって分析して、ＨＰＬＣトレースを提供する。モル吸光度が結合の結果として変化しないと仮定すると、混合物中の特定の結合体の重量パーセントは、ＨＰＬＣトレースのすべてのピークの下の総面積のパーセンテージとして、特定の結合体に対応するＨＰＬＣトレースのピークの下の面積によって提供される。サンプルを回収し、乾燥するまで冷凍乾燥させて、サンプルの無水のグラム重量を測定する。サンプルのグラム重量にサンプル中の各成分の重量パーセントを掛けて、サンプル中の各結合体のグラム重量を決定する。特定の結合体（第ｉ番目の結合体）について、変数「Ｎi」は、サンプル中の特定の結合体のグラム重量を、特定の結合体の質量、上で測定したＭi、で割り、割った答えにアボガドロ数（６．０２２０５×１０23ｍｏｌ-1）を掛けて、もとめ、サンプル中の特定の結合体の分子数、Ｎiを得る。その後、各結合体について測定したｎ、Ｍi、および各結合体について決定したＮiを用いて、分散係数を計算する。
【０２８２】  例５０
粗混合物からのＢ２９変性ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンモノ結合体の精製
分取ＨＰＬＣシステムを用いて、例４１の粗混合物からＢ２９一結合のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンを精製した。冷凍乾燥粗混合物（０．５ｇ、組成：Ｂ２９一結合のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン４０〜６０％、未反応のインスリン８〜２５％、関連物質１５〜３５％）を５〜１０ｍＬの０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．４に溶解し、０．５％トリエチルアミン／０．５％リン酸緩衝液ＴＥＡＰ  Ａで平衡させたＣ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（１５０×３．９ｍｍ）に充填した。カラムは、ＴＥＡＰ  ＡおよびＴＥＡＰ  Ｂ（８０％アセトニトリルおよび２０％ＴＥＡＰ  Ａ）溶媒系を用いて、勾配流で溶離した。粗混合物からのＢ２９一結合のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンを分取ＨＰＬＣ精製するための勾配系は、以下のとおりであった。
【０２８３】
【表２】
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画分をＨＰＬＣによって分析し、Ｂ２９モノ結合体のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンの純度が９７％より高い生成物面分をプールした。酢酸アンモニウム緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）に対する透析またはダイアフィルトレーション（ＭＷＣＯ  ３０００〜３５００）によって溶離緩衝液および溶媒を除去して、酢酸アンモニウム緩衝液に交換し、冷凍乾燥させて、Ｂ２９モノ結合体のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンの白色粉末を得た（純度＞９７％）。
【０２８４】  反応をモニターするために例４１で用いた方法と同じカラムおよび溶媒系を用いるＨＰＬＣ分析法を、Ｂ２９モノ結合体のＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンの分析に用いた。しかし、勾配条件は以下のとおりであった。
【表３】
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【０２８５】  例５１
サイトセンサ（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）の研究
約１８時間、血清剥奪したＣｏｌｏ２５（ＡＴＣＣからの結腸直腸腺癌細胞、カタログ番号＃ＣＣＬ−２２２）細胞を、３：１のサイトセンサ低緩衝ＲＰＭＩ−１６４０媒質：サイトセンサガロースエントラップメント媒質に懸濁させて、細胞１００，０００個／小滴１０μｍで、サイトセンサカプセルカップに播種した。細胞は、サイトセンサ上で、基準酸性化率が安定するまで、約３時間、１分につき１００μＬの流量で、低緩衝ＲＰＭＩ−１６４０媒質に平衡させた。インスリン薬物（インスリンまたはインスリン結合体）は、低緩衝ＲＰＭＩ−１６４０媒質中５０ｎＭに希釈して、１００μＬ／分で２０分間、細胞に適用した。この暴露の後、薬物溶液を使用をやめて、細胞を再び低緩衝媒質単独の連続流のもとで潅流させた。酸性化率が基準レベルに戻るまで（薬物溶液の適用から約１時間）、データの回収を継続した。結果を図１４に示す。図１４で用いるインスリンは、ヒトインスリンであり、ＰＥＧ４は、ｍＰＥＧ４−ヘキシル−インスリンモノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ１０は、ｍＰＥＧ１０−ヘキシル−インスリンモノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ７は、ｍＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンモノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ７AVGは、ｍＰＥＧ７AVG−ヘキシル−インスリンモノ結合体の多分散混合物である。
【０２８６】  例５２
酵素安定性
キモトリプシンの消化をｐＨ７．４のリン酸緩衝液中、３７℃、振盪水浴内で行った。インスリン／インスリン結合体濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬであった。キモトリプシン濃度は、２単位／ｍＬであった。１００μＬのサンプルを指示された時点で除去し、０．１％トリフルオロ酢酸：イソプロピルアルコールの１：１混合物２５μＬで反応を停止させた。逆相ＨＰＬＣによってサンプルを分析し、曲線の下の面積を計算することによって、インスリン／インスリン結合体の相対濃度を決定した。
【０２８７】  図１５に用いるインスリンは、ヒトインスリンであり、ＰＥＧ４は、ｍＰＥＧ４−ヘキシル−インスリン、モノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ１０は、ｍＰＥＧ１０−ヘキシル−インスリン、モノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ７は、ｍＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン、モノ結合体の非多分散混合物であり、ＰＥＧ７AVGは、ｍＰＥＧ７AVG−ヘキシル−インスリン、モノ結合体の多分散混合物である。
【０２８８】  例５３
用量依存活性
製剤を評価するために有効な動物モデルには、絶食させた正常なビーグル犬を用いる。これらのイヌに０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇのインスリン結合体を投与して、多様な製剤の有効性を評価する。このモデルを用いて、本発明によるインスリン結合体が、本発明の一部ではなく比較のため提供する多分散インスリン結合体に比べて、良好な用量依存様式で、低いグルコースレベルをもたらすことを実証した。
【０２８９】  イヌの実験用プロトコルにより、薬物を投与する直前の時間０における血液グルコース測定が求められる。その後、固体経口剤形の製剤をイヌの口に挿入する。１５、３０、６０および１２０分で採血し、グルコースレベルを測定してグラフにする。グルコースレベルが低いほど、インスリン結合体の活性は良好である。図１６には、本発明の結合体のグルコース低下、従って活性低下は、用量依存性であることが示されている。比較のために、図１７は、本発明の一部ではないカプセル製剤における多分散インシュリン結合体のグルコース低下が、本発明の結合体に比べて用量依存性が低いことを示している。
【０２９０】  例５４
活性および被験者間変動
製剤を評価するために有効な動物モデルには、絶食させた正常なビーグル犬を用いる。これらのイヌに０．２５ｍｇ／ｋｇのインスリン結合体を投与して、多様な製剤の有効性を評価する。このモデルを用いて、本発明によるインスリン結合体が、本発明の一部ではないが、比較のために提供する多分散インスリン結合体に比べて、低い被験者間変動および良好な活性をもたらすことを実証した。
【０２９１】  イヌの実験用プロトコルにより、薬物を投与する直前の時間０における血液グルコース測定が求められる。その後、液体経口剤形の製剤をイヌの口の奥に噴射する。各ケースにおいて、イヌは、この溶液の０．２５ｍｇ／ｋｇを摂取した。１５、３０、６０および１２０分で採血し、グルコースレベルを測定してグラフにする。グルコースレベルが低いほど、インスリン結合体の活性は良好である。図１８、１９および２０において、ＰＥＧ４−ヘキシル−インスリン、モノ結合体；ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン、モノ結合体；およびＰＥＧ１０−ヘキシル−インスリン、モノ結合体、それぞれを用いて得られた結果は、本発明のこれらのＰＥＧ結合体が、本発明の一部ではなく比較のために提供する多分散ＰＥＧ７AVG−ヘキシル−インスリン、モノ結合体に関する図２１に示されている結果に比べて、被験者間変動が小さく、活性が高くなることを示している。
【０２９２】  本明細書に、本発明の典型的な好ましい実施形態を開示した。特定的な用語を用いたが、それらは、一般的および説明的な意味で用いられており、前記の請求範囲に示された、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ポリエチレングリコール成分と脂肪酸成分を含む活性化されたポリマーの本発明の実施形態の混合物を合成する包括的な図式を図示する。
【図２】  本発明の実施形態のｍＰＥＧの混合物を合成する図式を図示する。
【図３】  本発明の実施形態の活性化されたｍＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図４】  本発明の実施形態の活性化されたｍＰＥＧ７−オクチルオリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図５】  本発明の実施形態の活性化されたｍＰＥＧ−デシルオリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図６】  本発明の実施形態の活性化されたステアレート−ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図７】  本発明の実施形態の活性化されたステアレート−ＰＥＧ８オリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図８】  本発明の実施形態の活性化されたＰＥＧ３オリゴマー混合物を合成する図式を図示する。
【図９】  本発明の実施形態の活性化されたパルミテート−ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図１０】  本発明の実施形態の活性化されたＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成する図式を図示する。
【図１１】  本発明の実施形態の種々のプロピレングリコールモノマーを合成する図式を図示する。
【図１２】  本発明の実施形態の種々のプロピレングリコールポリマーを合成する図式を図示する。
【図１３】  本発明の実施形態の種々のプロピレングリコールポリマーを合成する図式を図示する。
【図１４】  化合物の活性を示すＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）微少生理計を用いて、比較目的で提供され、本発明の成分を構成しない多分散の結合体混合物及びインスリンと比較して、本発明の実施形態のインスリン−オリゴマー結合体の混合物に関し得られた結果を図示する。
【図１５】  比較目的で提供され、本発明の成分を構成しない慣用のインスリン−オリゴマー結合体の多分散の混合物に対する、本発明の実施形態のインスリン−オリゴマー結合体のキモトリプシン分解の比較を図示する。
【図１６】  本発明の実施形態のモノ結合体のｍＰＥＧ７−ヘキシルインスリンの混合物の絶食させたビーグル犬の血漿グルコースに及ぼす影響を図示する。
【図１７】  本発明の成分を構成しない、モノ結合体のｍＰＥＧ７avg−ヘキシルインスリンの多分散の混合物の絶食させたビーグル犬の血漿グルコースに及ぼす影響を図示する。
【図１８】  絶食させたビーグル犬に投与した本発明の実施形態のモノ結合体のｍＰＥＧ４−ヘキシルインスリンの混合物の被験者間変動を図示する。
【図１９】  絶食させたビーグル犬に投与した本発明の実施形態のモノ結合体のｍＰＥＧ７−ヘキシルインスリンの混合物の被験者間変動を図示する。
【図２０】  絶食させたビーグル犬に投与した本発明の実施形態のモノ結合体のｍＰＥＧ１０−ヘキシルインスリンの混合物の被験者間変動を図示する。
【図２１】  絶食させたビーグル犬に投与した本発明の成分を構成しない、モノ結合体のｍＰＥＧ７avg−ヘキシル−インスリンの混合物の被験者間変動を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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