(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｃ）の工程よりなる、試料中の複数の金属の同時測定方法。
（ａ）試料と、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる蛍光プローブとを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる複数の金属と前記蛍光プローブとの蛍光性金属錯体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液を、濃縮ゲル及び分離ゲルよりなる非連続系ゲルを用いるものであって、かつ当該分離ゲルのゲル濃度が２０％Ｔを超えかつ５０％Ｔ以下のものであるゲル電気泳動法に適用することにより、形成された蛍光性金属錯体と遊離の蛍光プローブとの分離を行い、更に複数種類の金属毎に形成された蛍光性金属錯体同士を分離する工程。
（ｃ）前記ゲル電気泳動法により泳動され、分離された前記蛍光性金属錯体を測定する工程。
【請求項２】
配位部位が６座以上の配位部位である、請求項１記載の試料中の金属の測定方法。
【請求項３】
配位部位が８座以上の配位部位である、請求項１又は請求項２記載の試料中の金属の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、配位部位及び蛍光団よりなる蛍光プローブを用い、そして、ゲル電気泳動法に適用して、試料中の金属の測定を行うものであり、複数の金属をも同時に測定できる測定方法である。
本発明は、分析化学などの化学分野、又は臨床検査などの生命科学分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】  従来、試料中に微量に含まれる金属の測定には、原子吸光分析装置が繁用されてきたが、この原子吸光分析装置は大変高価であり、またその設置に広いスペースを必要とし、配管や換気装置が必要なものであった。
また、ＩＣＰ発光分析装置は、試料中の複数の金属を同時に測定することができるものであるが、これは非常に高価なものであり、そしてやはりその設置に広いスペースを必要とし、配管や換気装置が必要なものであった。【０００３】  更に、キャピラリー電気泳動法により複数の金属を分離して、紫外吸収を測定すること等により試料中に含まれていた複数の金属を同時に測定する方法が知られている。
この方法は高価な装置を使用せずに測定を行える方法であるが、しかしこのキャピラリー電気泳動法による方法においては、試料中の多くの共存化学物質もまた紫外光を吸収するため、多くの場合、測定を妨害することが知られている。
また、上記吸光検出法では、蛍光検出法に比べ感度が著しく低いことが一般に知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の目的は、試料中に微量に含まれる金属を、高価な装置を使用することなく、簡便かつ正確に測定を行うことができる測定方法を提供することにあり、特に、複数の金属を同時に測定することができる測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  下記の（ａ）〜（ｃ）の工程よりなる、試料中の複数の金属の同時測定方法。
（ａ）試料と、「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造よりなる蛍光プローブとを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる複数の金属と前記蛍光プローブとの蛍光性金属錯体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液を、濃縮ゲル及び分離ゲルよりなる非連続系ゲルを用いるものであって、かつ当該分離ゲルのゲル濃度が２０％Ｔを超えかつ５０％Ｔ以下のものであるゲル電気泳動法に適用することにより、形成された蛍光性金属錯体と遊離の蛍光プローブとの分離を行い、更に複数種類の金属毎に形成された蛍光性金属錯体同士を分離する工程。
（ｃ）前記ゲル電気泳動法により泳動され、分離された前記蛍光性金属錯体を測定する工程。
（２）  配位部位が６座以上の配位部位である、前記（１）記載の試料中の金属の測定方法。
（３）  配位部位が８座以上の配位部位である、前記（１）又は（２）記載の試料中の金属の測定方法。
【発明の効果】
【０００６】  本発明の試料中の金属の測定方法により、高価な装置を使用することなく、簡便、正確かつ高感度に、試料中に微量に含まれる複数の金属を同時に測定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】１．金属
本発明の試料中の金属の測定方法における金属は、試料中における存在の有無又はその濃度を測定しようとする金属である。
この金属としては、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属又はその他の金属を挙げることができる。【０００８】  より具体的には、アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム又はフランシウムを挙げることができる。【０００９】  また、アルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム又はラジウムを挙げることができる。【００１０】  そして、遷移金属としては、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ラドン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金又は金等を挙げることができる。【００１１】  更に、その他の金属としては、例えば、アルミニウム、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、水銀、タリウム、鉛、ビスマス又はポロニウム等を挙げることができる。【００１２】２．試料
本発明の試料中の金属の測定方法における試料は、前記の金属を含む可能性がある試料であって、これを測定しようとするものである。
金属は単体、イオン及び化合物等の種々の形態を取り、また遊離又はキャリアー（担体）に結合した状態等で存在し、そして様々な物に含まれて存在しているが、本発明の試料中の金属の測定方法により測定を行う試料中の金属は特に限定されるものではなく、直接又は処理を行うことによりゲル電気泳動法に適用することが可能であり、測定を行うことが可能なものであれば対象となる。【００１３】  本発明の測定方法は、金属を簡便、正確、かつ高感度に測定できることを特徴とするものであるので、生体試料、食肉、野菜、穀物、果物、水産物、加工食品、飲料、飲料水、井戸水、河川水、湖沼水、海水、土壌、空気、又は医薬品等の微量の金属が含まれる可能性がある試料に含まれる金属の測定に特に有効なものである。【００１４】  例えば、生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等を挙げることができる。【００１５】  本発明の測定方法による試料中の金属の測定においては、蛍光プローブと混合し、接触させる試料は液体であることが好ましい。
もし、金属を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、金属を液体中に含有させるようにしてもよい。【００１６】３．蛍光プローブ
本発明の試料中の金属の測定方法における蛍光プローブは、配位部位及び蛍光団よりなるものである。
この蛍光プローブは、測定しようとする試料中の金属と接触することにより、この金属と配位結合し、この金属との蛍光性金属錯体を形成する。
なお、この蛍光プローブにおける配位部位は、測定しようとする試料中の金属と接触することにより、この金属と配位結合し、錯体を形成することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。【００１７】  本発明の測定方法における蛍光プローブの配位部位としては、例えば、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（若しくはエチレンジアミン四酢酸）〔ＥＤＴＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｂｉｃｉｎｅ〕、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＣｙＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸〔ＥＤＤＰ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸〔ＥＤＴＡ−ＯＨ〕，Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸〔ＨＩＤＡ〕、イミノ二酢酸〔ＩＤＡ〕、ニトリロ三酢酸〔ＮＴＡ〕、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）〔ＮＴＰＯ〕、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン〔ＴＰＥＮ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン〔Ｃｙｃｌｅｎ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ビス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ＤＯ２Ａ−ｔ−ｂｕ−ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ＤＯ３Ａ−ｔ−ｂｕ−ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）〔ＤＯＴＰ〕、（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）−ａ，ａ’，ａ”，ａ’’’−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＭＡ〕、２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン〔ｐ−ＮＯ２−Ｂｚ−Ｃｙｃｌｅｎ〕、２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＯ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−アミノベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ビス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−４，１０−ビス酢酸〔ＤＯＴＡ−ｂｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）の−１０−酢酸〔ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ｍｏｎｏ−ＮＨＳ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕ）ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。【００１８】  本発明における蛍光プローブは、その蛍光団により、蛍光を測定することができる。
なお、この蛍光プローブにおける蛍光団は、励起光を照射することにより、蛍光を放出するものであれば、特に制限なく用いることができる。
この蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナトなどのフルオレセイン類縁体、キニーネ、ローダミンＢ、アクリジンオレンジ、クマリン、又はＰＯＰＯＰ等を挙げることができる。
この蛍光団としては、特に、フルオレセイン、又はフルオレセイン類縁体が好ましい。【００１９】  本発明における蛍光プローブは、配位部位及び蛍光団よりなるものであるが、この蛍光プローブは配位部位と蛍光団を結合した「配位部位−蛍光団」の構造のものであってもよいが、配位部位と蛍光団をスペーサーを介して結合させ「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造としたものであることが好ましい。
このように配位部位と蛍光団との間にスペーサーを存在させることにより、この蛍光プローブが試料中に含まれる金属と蛍光性金属錯体を形成したときに消光してしまうのを抑制することができ、高いレベルの蛍光を安定して得ることができるので好ましい。【００２０】  このスペーサーとしては、例えば、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−」、「−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−」、アルキル基やフェニル基などの炭化水素基、又はこれらの誘導体等を挙げることができる。
このスペーサーとしては、特に、「−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−」が好ましい。【００２１】  なお、本発明における蛍光プローブは、その配位部位が６座以上であるものが好ましい。
この配位部位が６座以上であることにより、６座未満のものよりも、より広い範囲の金属の測定を行うことができたり、６座未満のものでは測定することができない金属を測定することができたりする点で好ましい。
これは、配位部位が６座未満の蛍光プローブは、配位部位が６座以上の蛍光プローブよりも、金属との錯体の安定性がより小さいためではないかと推測される。【００２２】  具体的には、この６座以上の配位部位としては、例えば、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（若しくはエチレンジアミン四酢酸）〔ＥＤＴＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＣｙＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸〔ＥＤＴＡ−ＯＨ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）〔ＮＴＰＯ〕、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン〔ＴＰＥＮ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ビス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ＤＯ２Ａ−ｔ−ｂｕ−ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ＤＯ３Ａ−ｔ−ｂｕ−ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）〔ＤＯＴＰ〕、（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）−ａ，ａ’，ａ”，ａ’’’−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＭＡ〕、２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＯ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−アミノベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ビス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−４，１０−ビス酢酸〔ＤＯＴＡ−ｂｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸〔ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ｍｏｎｏ−ＮＨＳ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕ）ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。
なお、これらの配位部位は、カルボキシル基、エステル基、エーテル基又はリン酸基などの酸素原子、及び窒素原子等により６座以上のものである。【００２３】  そして、本発明における蛍光プローブは、その配位部位が８座以上であるものがより好ましい。
この配位部位が８座以上であることにより、８座未満のものよりも、更により広い範囲の金属の測定を行うことができたり、８座未満のものでは測定することができない金属を測定することができたりする点でより好ましい。
これは、配位部位が８座未満の蛍光プローブは、配位部位が８座以上の蛍光プローブよりも、金属との錯体の安定性がより小さいためではないかと推測される。【００２４】  具体的には、この８座以上の配位部位としては、例えば、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）〔ＤＯＴＰ〕、（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）−ａ，ａ’，ａ”，ａ’’’−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＤＯＴＭＡ〕、２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＯ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−アミノベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、２−ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ビス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−４，１０−ビス酢酸〔ＤＯＴＡ−ｂｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸〔ＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸−ｔ−ブチルエステル）−１０−酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ｍｏｎｏ−ＮＨＳ−ｔｒｉｓ（ｔ−ｂｕ）ｅｓｔｅｒ〕、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル）〔ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。
なお、これらの配位部位は、カルボキシル基、エステル基、エーテル基又はリン酸基などの酸素原子、及び窒素原子等により８座以上のものである。【００２５】  また、本発明における蛍光プローブは、その配位部位の構造が非環状であるものが好ましい。
この配位部位の構造が非環状であることにより、環状のものよりも、より広い範囲の金属の測定を行うことができたり、環状のものでは測定することができない金属を測定することができたりする点で好ましい。【００２６】  具体的には、この構造が非環状である配位部位としては、例えば、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（若しくはエチレンジアミン四酢酸）〔ＥＤＴＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｂｉｃｉｎｅ〕、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＣｙＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸〔ＥＤＤＰ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸〔ＥＤＴＡ−ＯＨ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸〔ＨＩＤＡ〕、イミノ二酢酸〔ＩＤＡ〕、ニトリロ三酢酸〔ＮＴＡ〕、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）〔ＮＴＰＯ〕、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン〔ＴＰＥＮ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。【００２７】  そして、本発明における蛍光プローブは、先に記載した理由により、その配位部位の構造が非環状でありかつ８座以上であるものがより好ましい。【００２８】  具体的には、その構造が非環状でありかつ８座以上である配位部位としては、例えば、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエス��ル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。【００２９】  前記の非環状でありかつ８座以上である配位部位としては、例えば、非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位等を挙げることができる。【００３０】  より具体的には、この非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位としては、例えば、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ〕、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、１−ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、ｐ−アミノベンジル−ジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）〔ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ｐｅｎｔａ（ｔ−ｂｕ  ｅｓｔｅｒ）〕、ｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸〔ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ〕、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕、若しくはジエチレントリアミンペンタ（酢酸−ｔ−ブチルエステル）など、又はこれらの塩、これらの水和物若しくはこれらの誘導体等を挙げることができる。
なお、これらの配位部位は、カルボキシル基、エステル基又はエーテル基などの酸素原子、及び窒素原子等により８座以上のものである。【００３１】  これらの非環状のポリアミノカルボン酸でありかつ８座以上の配位部位においては、特に、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（若しくはジエチレントリアミン五酢酸）〔ＤＴＰＡ〕、又はＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−五酢酸〔ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕が好ましい。【００３２】  本発明における蛍光プローブの具体例としては、例えば、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕（構造式を［化１］に示す）、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕（構造式を［化２］に示す）、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕（構造式を［化３］に示す）、又は１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕（構造式を［化４］に示す）等を挙げることができる。【００３３】
【化１】
0005145511.tif 000002
【００３４】
【化２】
0005145511.tif 000003
【００３５】
【化３】
0005145511.tif 000004
【００３６】
【化４】
0005145511.tif 000005
【００３７】  本発明の蛍光プローブとしては、特に、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕、又はＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕が好ましい。【００３８】４．蛍光プローブの調製方法
本発明における蛍光プローブは、前記の「配位部位」及び「蛍光団」を「配位部位−蛍光団」の構造となるように結合させて調製するか、又は前記の「配位部位」、「スペーサー」及び「蛍光団」を「配位部位−スペーサー−蛍光団」の構造となるように結合させて調製すれば良い。【００３９】  この調製の方法は、特に制限はなく、公知の方法等により行えば良い。
例えば、前記の２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕の調製方法としては、２−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸溶液に、マレイン酸、フルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液、及び超純水を加え、暗所で放置した後、１−ブタノールで抽出し、さらに１−ペンタノールで抽出し、そして塩酸で再結晶し、乾燥することにより２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を取得する方法等を挙げることができる。【００４０】  また、前記のＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕の調製方法としては、［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸溶液に、マレイン酸、５−アミノフルオレセイン、及び超純水を加え、暗所で放置することによりＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を取得する方法等を挙げることができる。【００４１】５．試料中の金属の測定
（１）試料中の金属の測定方法
本発明の試料中の金属の測定方法は、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程よりなるものである。
（ａ）試料と、配位部位及び蛍光団よりなる蛍光プローブとを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる金属と前記蛍光プローブとの蛍光性金属錯体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をゲル電気泳動法に適用する工程。
（ｃ）前記ゲル電気泳動法により泳動された前記蛍光性金属錯体を測定する工程。【００４２】（２）工程（ａ）
本発明の試料中の金属の測定方法の工程（ａ）において、試料と蛍光プローブを混合する際の量比は、試料中に含まれる金属の濃度や蛍光プローブの濃度等により異なるので一概に言うことはできないが、一般的には、試料量１に対して、蛍光プローブ溶液量は、０．０１〜１００とすることが好ましく、０．１〜１０とすることがより好ましい。【００４３】  また、試料と蛍光プローブを混合する際の蛍光プローブの濃度は、試料中に含まれる金属の濃度や試料と蛍光プローブ溶液の混合比率等により異なるので、これも一概に言うことはできないが、一般的には、０．０１μＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度とすることが好ましく、１μＭ〜１０ｍＭの範囲の濃度とすることがより好ましく、１０μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度とすることが特に好ましい。【００４４】  そして、試料と蛍光プローブを混合し、接触させ、この混合液中において蛍光性金属錯体を形成させる際の温度は、特に制限はなく、室温で良く、又は冷温下でも良く、又は加温下でも良い。【００４５】  試料と蛍光プローブを混合し、接触させ、この混合液中において蛍光性金属錯体を形成させるための時間は、１分間以上であることが好ましく、５分間以上であることがより好ましく、１０分間以上であることが特に好ましい。【００４６】（３）工程（ｂ）
本発明の試料中の金属の測定方法の工程（ｂ）においては、前記の工程（ａ）における試料と蛍光プローブとの混合液をゲル電気泳動法に適用する。
これは、この混合液をゲルに添加、接触させ、次に通電して、前記の蛍光性金属錯体を泳動させることにより行う。
この試料と蛍光プローブとの混合液をゲル電気泳動法に適用することにより、形成された蛍光性金属錯体と遊離の蛍光プローブとの分離を行い、更に複数種類の金属毎に形成された蛍光性金属錯体同士の分離を行う。【００４７】  このゲル電気泳動法は、支持体としてゲルを使用する電気泳動法であれば、特に制限なく用いることができる。
このゲル電気泳動法におけるゲルとしては、例えば、ポリアクリルアミドゲル、又はアガロースゲル等を挙げることができるが、特に、ポリアクリルアミドゲルを用いることが好ましい。
また、このゲル電気泳動法としては、スラブ型（垂直型）、ディスク型、又は水平型等のいずれの種類のゲル電気泳動法をも用いることができる。
そして、このゲル電気泳動法としては、通常のゲル電気泳動法、又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のいずれをも用いることができる。
更に、このゲル電気泳動法としては、一次元電気泳動法、又は二次元電気泳動法のいずれをも用いることができる。
なお、このゲル電気泳動法におけるゲルの大きさについては、特に制限はない。
適宜、適した大きさのものを使用すれば良い。【００４８】  なお、本発明の測定方法におけるゲル電気泳動法としては、濃縮ゲル及び分離ゲルよりなる非連続系ゲルを用いることが好ましい。
この場合、濃縮ゲルとしては、そのゲル濃度が、４％Ｔ以上でありかつ３０％Ｔ以下のものが好ましく、１０％Ｔ以上でありかつ２０％Ｔ以下のものがより好ましい。
また、濃縮ゲルのｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ１０の範囲のものが好ましく、ｐＨ８〜ｐＨ１０の範囲のものがより好ましい。
この濃縮ゲルの緩衝液としては、前記のｐＨ範囲において緩衝能を有する緩衝剤よりなるものであれば良い。
この緩衝液として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液等を挙げることができる。
なお、この濃縮ゲルの大きさについては、特に制限はない。
適宜、適した大きさのものを使用すれば良い。【００４９】  また、分離ゲルとしては、そのゲル濃度が、１０％Ｔ以上でありかつ７０％Ｔ以下のものが好ましく、２０％Ｔを超えかつ５０％Ｔ以下のものがより好ましい。
また、分離ゲルのｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ１１の範囲のものが好ましい。
この分離ゲルの緩衝液としては、前記のｐＨ範囲において緩衝能を有する緩衝剤よりなるものであれば良い。この緩衝液として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液等を挙げることができる。
なお、この分離ゲルの大きさについては、特に制限はない。
適宜、適した大きさのものを使用すれば良い。【００５０】  なお、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法における分離ゲルのゲル濃度は、従来、４％Ｔ以上２０％Ｔ以下の範囲で使用されていた。
これに対し、本発明者らは、分離ゲルのゲル濃度を２０％Ｔを超えかつ５０％Ｔ以下の濃度のものとすることにより、分離ゲルの細孔径が小さくなり、これにより蛍光性金属錯体の拡散を防ぐことができ、その結果、非常に細いバンドでの分離が可能となること、すなわち高感度かつ高精度での試料中の金属の測定が可能となることを見出した。
よって、本発明の試料中の金属の測定方法においては、分離ゲルのゲル濃度を２０％Ｔを超えかつ５０％Ｔ以下の濃度のものとすることがより好ましいのである。【００５１】  また、ゲルを構成するアクリルアミド（モノマー）などや緩衝剤などの試薬等には、不純物としての金属が含まれており、これが蛍光プローブと結合してしまうことにより、本発明における試料中の金属の測定結果にこの不純物金属のバンドが現れ、測定が妨害される。
しかし、分離ゲルに、キレート剤を含有させることにより、この不純物金属のバンドの出現を抑制することができるので、好ましい。
このキレート剤として、先に本発明における蛍光プローブの配位部位として挙げたもの等を用いることができる。
このキレート剤としては、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＣｙＤＴＡ〕等が好ましい。【００５２】  このキレート剤を含有させる濃度であるが、０．１μＭ〜１０００ｍＭが好ましく、１μＭ〜１００ｍＭがより好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭが特に好ましい。【００５３】  そして、この分離ゲルには、アミノ酸等の両性電解質を含有させることにより、複数の金属の分離を促進させることができるので、好ましい。
この両性電解質としては、アミノ酸が好ましく、グリシン等が特に好ましい。
この両性電解質を含有させる濃度であるが、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭが特に好ましい。【００５４】  本発明におけるゲル電気泳動法の泳動液としては、そのｐＨが、ｐＨ６〜ｐＨ１１の範囲であることが好ましい。
この泳動液の緩衝液としては、前記のｐＨ範囲において緩衝能を有する緩衝剤よりなるものであれば良い。この緩衝液として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液等を挙げることができる。【００５５】  更に、この泳動液には、電気泳動度の極めて小さい物質と大きい物質とを共存させることにより、濃縮ゲルにおいて金属のバンドを濃縮させることができるので、好ましい。
この電気泳動度の極めて小さい物質としては、グリシン等が好ましく、電気泳動度の大きい物質としては塩化物イオン等が好ましい。
これらの電気泳動度の極めて小さい物質、電気泳動度の大きい物質を共存させる濃度であるが、１μＭ〜１０００ｍＭが好ましく、１００μＭ〜５００ｍＭがより好ましく、１ｍＭ〜２００ｍＭが特に好ましい。【００５６】  本発明の測定方法において、試料と蛍光プローブの混合液をゲル電気泳動法に適用する際の、ゲルに添加、接触させる前記混合液の量は、実施するゲル電気泳動法の条件に応じ、適した量とすれば良いが、一般的には、１μＬ〜２００μＬの量を添加することが好ましい。【００５７】  本発明の測定方法でのゲル電気泳動法において、その通電条件は、実施するゲル電気泳動法の条件に応じたものとすればよいが、一般的には、電流５ｍＡ〜１００ｍＡ、電圧２００Ｖ〜５０００Ｖにおいて行えば良い。【００５８】  また、泳動時間は、実施するゲル電気泳動法の条件により異なるが、一般的には、３０分間〜３６０分間である。【００５９】（４）工程（ｃ）
本発明の試料中の金属の測定方法の工程（ｃ）においては、前記の工程（ｂ）のゲル電気泳動法で泳動された前記蛍光性金属錯体を測定する。
すなわち、前記工程（ｂ）のゲル電気泳動法において泳動されて、遊離の蛍光プローブと分離された蛍光性金属錯体、更には複数種類の金属毎に分離された蛍光性金属錯体を測定する。
この測定は、前記のゲル電気泳動法のゲルに、用いた蛍光プローブの蛍光団に適した波長の励起光を照射し、これに対して放出された蛍光を測定することにより行う。【００６０】  この蛍光の測定は、目視により前記ゲルの泳動パターン（バンド）の確認を行い定性的に金属を測定しても良いし、又はデンシトメーター若しくは蛍光光度計等により各バンドの蛍光強度を測定して、定量的に金属を測定しても良い。
また、前記ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラやスキャナー等により取り込んで、コンピュータで解析しても良い。【００６１】  そして、既知の金属、又は既知の濃度の既知金属を本発明の測定方法で測定した際のゲルの泳動パターン（バンド）、更にはその蛍光強度と比較することにより、試料中に含まれていた１種類又は複数種類の金属について、その有無、更にはそれらの濃度についての測定結果を得ることができる。
【実施例】
【参考例１】
【００６２】〔蛍光プローブ（２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕）の調製〕
【００６３】  本発明の試料中の金属の測定方法における蛍光プローブとして、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を調製した。
【００６４】１．調製
１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の２−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３のフルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液を２．５ｍｌ、更に超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、その後、１−ブタノールで抽出し、更に１−ペンタノールで抽出し、塩酸で再結晶し、乾燥し、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕の粉末を得た。
【００６５】２．元素分析値
前記１で調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕の元素分析を行った結果を下に示す。
測定値：Ｃ，５３．３０；Ｈ，５．２５；Ｎ，７．０５％．
計算値：Ｃ，５３．３１；Ｈ，４．５４；Ｎ，７．４０％（測定値と計算値の誤差０．７１％）
【参考例２】
【００６６】〔蛍光プローブ（Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕）の調製〕
【００６７】  本発明の試料中の金属の測定方法における蛍光プローブとして、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を調製した。
【００６８】  １０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３の５−アミノフルオレセイン溶液を２．５ｍｌ、更に超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、Ｎ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を得た。
【参考例３】
【００６９】〔蛍光プローブ（２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕）の調製〕
【００７０】  本発明の試料中の金属の測定方法における蛍光プローブとして、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕を調製した。
【００７１】１．調製
１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の２−（４−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３のフルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液を２．５ｍｌ、更に超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、その後、１−ブタノールで抽出し、更に１−ペンタノールで抽出し、塩酸で再結晶し、乾燥し、２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕の粉末を得た。
【００７２】２．元素分析値
前記１で調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕の元素分析を行った結果を下に示す。
測定値：Ｃ，５２．４５；Ｈ，５．４８；Ｎ，８．１３％
計算値：Ｃ，５２．５０；Ｈ，５．１０；Ｎ，８．３５％（測定値と計算値の誤差０．３８％）
【参考例４】
【００７３】〔蛍光プローブ（１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕）の調製〕
【００７４】  本発明の試料中の金属の測定方法における蛍光プローブとして、１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕を調製した。
【００７５】１．調製
１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３の１−（４−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸溶液２５ｍｌに１０−１ｍｏｌ  ｄｍ−３のマレイン酸（ｐＨ６．０）を５ｍｌ、１０−２ｍｏｌ  ｄｍ−３のフルオレセインイソチオシアナート  アイソマーＩ溶液を２．５ｍｌ、更に超純水を１７．５ｍｌ加えた。
その後、暗所で６時間放置し、その後、１−ブタノールで抽出し、更に１−ペンタノールで抽出し、塩酸で再結晶し、乾燥し、１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕の粉末を得た。
【００７６】２．元素分析値
前記１で調製した１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕の元素分析を行った結果を下に示す。
測定値：Ｃ，５６．７３；Ｈ，４．５８；Ｎ，６．４３％．
計算値：Ｃ，５６．７１；Ｈ，４．５１；Ｎ，６．９６％（測定値と計算値の誤差０．５３％）
【００７７】３．質量分析値
前記１で調製した１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕の質量分析を行った結果を下に示す。
ＭＳ（ＦＡＢ（−），ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｅ＝７８５［Ｍ−Ｈ］−
【００７８】４．核磁気共鳴スペクトル分析値
前記１で調製した１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕の核磁気共鳴スペクトル分析を行った結果を下に示す。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）１２．４（１Ｈ，ｂｒ），１０．１４（２Ｈ，ｓ），１０．０７（１Ｈ，ｓ），８．１８（１Ｈ，ｄ，３ＪＨＨ＝１．３Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄｄ，２ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ，３ＪＨＨ＝１．７Ｈｚ），７．３９（２Ｈ，ｄ，２ＪＨＨ＝８．６Ｈｚ），７．１９（３Ｈ，ｄ，２ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ），６．６６（２Ｈ，ｄ，３ＪＨＨ＝１．０Ｈｚ），６．５７（４Ｈ，ｍ），３．４６（５Ｈ，ｓ），３．３６（８Ｈ，ｍ），２．７７（４Ｈ，ｍ）．
【実施例１】
【００７９】〔蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属の測定〕
前記参考例１で調製した蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。【００８０】１．試料
下記の１３種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。【００８１】２．蛍光プローブ含有溶液
参考例１にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。【００８２】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。【００８３】３．ゲル電気泳動法用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。【００８４】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを調製し、分離ゲルとした。【００８５】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。【００８６】４．試料中の金属の測定
（１）  前記１の１３種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、５０ｗｔ％グリセロール水溶液と、７５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．８）と、純水とを、それぞれ１：１：０．５：１：６．５で混合し、これにより試料と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。【００８７】（２）  前記（１）の計１３種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
なお、この濃縮ゲル及び分離ゲルを合わせた大きさは、高さ２０ｃｍ、幅２０ｃｍであった。【００８８】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計１３種類の前記（１）の混合液のそれぞれの３μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。【００８９】  そして、電流２０ｍＡ（一定）、電圧６８０−１１５０Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。【００９０】（３）  前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。【００９１】  その後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長４７０ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図１に示した。
なお、この図１の泳動パターン（バンド）において、「Ｂｌａｎｋ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｃａ」は前記のカルシウム含有試料のバンドを示し、同様に、「Ｍｇ」は前記のマグネシウム含有試料の、「Ａｌ」は前記のアルミニウム含有試料の、「Ｆｅ」は前記の鉄含有試料の、「Ｃｕ」は前記の銅含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料の、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料の、「Ｈｇ」は前記の水銀含有試料の、そして「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料のバンドを示す。【００９２】５．測定結果
図１の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことより、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
また、更に、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる複数の金属を同時に測定することができることも確認できた。
【実施例２】
【００９３】〔蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属の測定〕
前記参考例２で調製した蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。【００９４】１．試料
下記の１４種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）１２種類の金属含有試料
０．１ｍＭの鉛イオン、０．１ｍＭの水銀イオン、０．１ｍＭのカドミウムイオン、０．１ｍＭのマンガンイオン、０．１ｍＭのコバルトイオン、０．１ｍＭのニッケルイオン、０．１ｍＭの亜鉛イオン、０．１ｍＭの銅イオン、０．１ｍＭの鉄イオン、０．１ｍＭのアルミニウムイオン、０．１ｍＭのマグネシウムイオン、及び０．１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１４）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。【００９５】２．蛍光プローブ含有溶液
参考例２にて調製したＮ−［（Ｒ）−２−アミノ−３−（ｐ−フルオレセイン−チオカルバミル−フェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−五酢酸〔ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。【００９６】  １ｍＭのＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。【００９７】３．ゲル電気泳動法用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。【００９８】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを調製し、分離ゲルとした。【００９９】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。【０１００】４．試料中の金属の測定
（１）  前記１の１４種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、５０ｗｔ％グリセロール水溶液と、７５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．８）と、純水とを、それぞれ１：１：０．５：１：６．５で混合し、これにより試料と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。【０１０１】（２）  前記（１）の計１４種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
なお、この濃縮ゲル及び分離ゲルを合わせた大きさは、高さ２０ｃｍ、幅２０ｃｍであった。【０１０２】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計１４種類の前記（１）の混合液のそれぞれの３μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。
そして、電流２０ｍＡ（一定）、電圧６８０−１１５０Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。【０１０３】（３）  前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。【０１０４】  その後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長４７０ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図２に示した。
なお、この図２の泳動パターン（バンド）において、「Ｌ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｍｅｔａｌ＊１２」は前記の１２種類の金属含有試料のバンドを示す。
そして、「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料のバンドを示し、同様に、「Ｈｇ」は前記の水銀含有試料の、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料の、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｃｕ」は前記の銅含有試料の、「Ｆｅ」は前記の鉄含有試料の、「Ａｌ」は前記のアルミニウム含有試料の、「Ｍｇ」は前記のマグネシウム含有試料の、そして「Ｃａ」は前記のカルシウム含有試料のバンドを示す。【０１０５】５．測定結果
図２の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことからも、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
また、更に、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる複数の金属を同時に測定することができることも確認できた。
【実施例３】
【０１０６】〔蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属の測定〕
前記参考例３で調製した蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。【０１０７】１．試料
下記の１３種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。【０１０８】２．蛍光プローブ含有溶液
参考例３にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。【０１０９】  ０．９ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ、及び５．５％のグリセロールを含む溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。【０１１０】３．ゲル電気泳動用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。【０１１１】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを調製し、分離ゲルとした。【０１１２】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。【０１１３】４．試料中の金属の測定
（１）前記１の１３種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、純水を、それぞれ０．５：５．５：６．５で混合し、これにより試料と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。【０１１４】（２）前記（１）の計１３種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
なお、この濃縮ゲル及び分離ゲルを合わせた大きさは、高さ２０ｃｍ、幅２０ｃｍであった。【０１１５】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計１３種類の前記（１）の混合液のそれぞれの３μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。
そして、電流２０ｍＡ（一定）、電圧６８０−１１５０Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。【０１１６】（３）前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。【０１１７】  その後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長２５４ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図３に示した。
なお、この図３の泳動パターン（バンド）において、「Ｂｌａｎｋ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。
また、「Ｃａ」は前記のカルシウム含有試料のバンドを示し、同様に、「Ｍｇ」は前記のマグネシウム含有試料の、「Ａｌ」は前記のアルミニウム含有試料の、「Ｆｅ」は前記の鉄含有試料の、「Ｃｕ」は前記の銅含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「ＣＯ」は前記のコバルト含有試料の、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料の、「Ｈｇ」は前記の水銀含有試料の、そして「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料のバンドを示す。【０１１８】５．測定結果
図３の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことより、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
更に、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる複数の金属を同時に測定することができることも確認できた。
【実施例４】
【０１１９】〔蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ）を用いてのゲル電気泳動法による試料中の金属の測定〕
前記参考例４で調製した蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ）を用いて、ゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った。【０１２０】１．試料
下記の２種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）銀含有試料
１ｍＭの銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。【０１２１】２．蛍光プローブ含有溶液
参考例４にて調製した１−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。【０１２２】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡを含む水溶液を調製し、蛍光プローブ含有溶液とした。【０１２３】３．ゲル電気泳動法用のゲル及び泳動液
（１）濃縮ゲル
ゲル濃度が１６．５％Ｔ（１．４６％Ｃ）であり、０．０９３８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を含むポリアクリルアミドゲルを調製し、濃縮ゲルとした。【０１２４】（２）分離ゲル
ゲル濃度が３０％Ｔ（０．８％Ｃ）であり、０．１６６Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．３）、０．０８５３Ｍグリシンを含むポリアクリルアミドゲルを調製し、分離ゲルとした。【０１２５】（３）泳動液
４８ｍＭグリシンを含む６．２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を調製し、これを泳動液とした。【０１２６】４．試料中の金属の測定
（１）前記１の２種類の試料各々と、前記２の蛍光プローブ含有溶液と、５０ｗｔ％グリセロール水溶液と、７５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．８）と、純水とを、それぞれ１：１：０．５：１：６．５で混合し、これにより試料と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の試料中の金属と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。【０１２７】（２）前記（１）の計２種類の混合液のそれぞれをポリアクリルアミドゲル電気泳動法に適用して、泳動を行った。
なお、このポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、一次元・スラブ型であり、濃縮ゲルの下に分離ゲルを配置した非連続系のものである。
この濃縮ゲルとしては前記３の（１）の濃縮ゲルを用い、また、分離ゲルとしては前記３の（２）の分離ゲルを用い、そして、泳動液としては前記３の（３）の泳動液を用いた。
なお、この濃縮ゲル及び分離ゲルを合わせた大きさは、高さ７ｃｍ、幅９ｃｍであった。【０１２８】  具体的には、まず前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽にセットした。
次に、計２種類の前記（１）の混合液のそれぞれの３μＬを、前記の濃縮ゲルに添加し、接触させた。【０１２９】  そして、電流５０ｍＡ（一定）、電圧２３２Ｖで、１８０分間通電した。
この通電により、前記の蛍光性金属錯体は濃縮ゲル中で濃縮され、その後分離ゲルに移動し、分離ゲル中を泳動した。【０１３０】（３）前記（２）の通電を終了した後、前記の濃縮ゲル及び分離ゲルを泳動槽から取り外した。【０１３１】  その後、この濃縮ゲル及び分離ゲルを、紫外線照射装置の上に置き、波長４７０ｎｍの励起光を照射した。
これにより放出された蛍光による濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、デジタルカメラで撮影した。
この濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を、図４に示した。
なお、この図４の泳動パターン（バンド）において、「Ｌ」は前記の陰性対照試料のバンドを示す。また、「Ａｇ」は前記の銀含有試料のバンドを示す。【０１３２】５．測定結果
図４の濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）から、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に含まれる金属に応じたバンドが得られることが分かる。
このことより、本発明の試料中の金属の測定方法においては、試料中に微量に含まれる金属を、簡便、正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。
【参考例５】
【０１３３】〔蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ又はＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いてのキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法による試料中の金属イオンの測定〕
参考として、蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ又はＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ）を用いて、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った。
【０１３４】１．試料
下記の１３種類の試料をそれぞれ調製した。
（１）マグネシウム含有試料
１ｍＭのマグネシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（２）アルミニウム含有試料
１ｍＭのアルミニウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（３）カルシウム含有試料
１ｍＭのカルシウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（４）マンガン含有試料
１ｍＭのマンガンイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（５）鉄含有試料
１ｍＭの鉄イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（６）コバルト含有試料
１ｍＭのコバルトイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（７）ニッケル含有試料
１ｍＭのニッケルイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（８）銅含有試料
１ｍＭの銅イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（９）亜鉛含有試料
１ｍＭの亜鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１０）カドミウム含有試料
１ｍＭのカドミウムイオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１１）水銀含有試料
１ｍＭの水銀イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１２）鉛含有試料
１ｍＭの鉛イオンを含む、１０ｍＭ塩酸溶液を調製した。
（１３）陰性対照試料
超純水を陰性対照試料とした。
【０１３５】２．蛍光プローブ含有溶液
（１）ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液
参考例１にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−ジエチレントリアミン五酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。
【０１３６】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを含む水溶液を調製し、ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液とした。
【０１３７】（２）ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液
参考例３にて調製した２−（４−フルオレセイン−チオカルバミル−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸〔ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ〕を、蛍光プローブとして用いた。
【０１３８】  １ｍＭのＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを含む水溶液を調製し、ＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液とした。
【０１３９】３．キャピラリー電気泳動法用の泳動液
０．０５ｗｔ％のポリブレン、及び１ｍＭの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）を含む５０ｍＭリン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０９）を調製し、これを泳動液とした。
【０１４０】４．試料中の金属の測定
（１）前記１の１３種類の試料各々と、前記２の（１）のＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液と、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）と、純水とを、それぞれ０．００１：０．０５：２：８で混合し、これにより試料と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）とを接触させ、室温にて２０分間放置し、この混合液中において前記１の各試料中の金属と蛍光プローブ（ＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ）との蛍光性金属錯体を形成させた。
【０１４１】（２）前記（１）の計１３種類の混合液のそれぞれを、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）に適用して、泳動及び測定を行った。
なお、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）における高電圧電源は松定プレシジョンのＨＣＺＥ−３０Ｐを、レーザー装置はＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製ＡｒレーザーシステムＭｏｄｅｌ２６３Ｄを、レーザー誘起蛍光検出器はＰｉｃｏｍｅｔｒｉｃｓ社製ＺＥＴＡＬＩＦを使用した。
Ａｒレーザー（励起波長４８８ｎｍ）の出力は８．０ｍＷとした。
また、キャピラリー電気泳動法の印加電圧は２０ｋＶ一定とした。
キャピラリーチューブは、ジーエルサイエンス社製の内径０．０５ｍｍ、全長６０ｃｍ、及び有効長４７ｃｍの溶融シリカキャピラリーを使用した。
【０１４２】（３）このＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した結果を、図５に示した。
なお、この図において、「Ｌ２」は前記の陰性対照試料のピークを示す。
また、「Ｃｄ」は前記のカドミウム含有試料のピークを示し、同様に、「Ｍｎ」は前記のマンガン含有試料の、「Ｐｂ」は前記の鉛含有試料の、「Ｚｎ」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｎｉ」は前記のニッケル含有試料の、「Ｃｏ」は前記のコバルト含有試料のピークを示す。
そして、この図において、横軸は移動時間（分）を表し、縦軸は測定により得られた蛍光強度を表す。
【０１４３】（４）また、蛍光プローブ含有溶液として前記２の（１）のＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡ含有溶液に代えて、前記２の（２）のＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡ含有溶液を用いる他は、前記（１）及び（２）の通りに泳動及び測定を行った。
このＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した結果を、図６に示した。
なお、この図において、「Ｌ３」は前記の陰性対照試料のピークを示す。
また、「Ｃａ２＋」は前記のカルシウム含有試料のピークを示し、同様に、「Ｍｎ２＋」は前記のマンガン含有試料の、「Ｍｇ２＋」は前記のマグネシウム含有試料の、「Ｚｎ２＋」は前記の亜鉛含有試料の、「Ｃｏ２＋」は前記のコバルト含有試料の、「Ｃｕ２＋」は前記の銅含有試料の、「Ｎｉ２＋」は前記のニッケル含有試料のピークを示す。
そして、「■」は未確定なピークを示す。
なお、この図において、横軸は移動時間（分）を表し、縦軸は測定により得られた蛍光強度を表す。
【０１４４】５．測定結果
図５より、蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した場合には、試料中のカドミウム、鉛、マンガン、亜鉛、ニッケル及びコバルトの各イオン（計６種類）を測定することができたことが分かる。
【０１４５】  また、図６より、蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属を測定した場合には、試料中のカルシウム、マグネシウム、銅、マンガン、亜鉛、コバルト及びニッケルの各イオン（計７種類）を測定することができたことが分かる。
【０１４６】  なお、この参考例５における測定結果と、前記の実施例１、実施例２及び実施例３における測定結果とを比較すると、例え同じ蛍光プローブを用いたとしても、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）に適用した場合には、試料中の１２種類の金属の内６種類〜７種類の金属のピークしか得られていない。
これに対し、同じ蛍光プロープをゲル電気泳動法に適用した場合には、より多くの金属のシグナル（バンド）が得られている。
すなわち、蛍光プローブをゲル電気泳動法に適用した場合には、ゲル電気泳動法以外の方法に適用した場合よりも、より多数の金属を同時に測定することができ、ゲル電気泳動法に適用することの優位性を確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図２】蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図３】蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図４】蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＥＤＴＡを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法により試料中の金属の測定を行った際の泳動を行った濃縮ゲル及び分離ゲルの泳動パターン（バンド）を示した図である。
【図５】参考のため蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＴＰＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った際の結果を示した図である。
【図６】参考のため蛍光プローブとしてＦＴＣ−ＡＢＤＯＴＡを用いてキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により試料中の金属の測定を行った際の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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